HU218732B

HU218732B - Eljárás sejtek immunválaszának megváltoztatására receptor kimérák segítségével

Info

Publication number: HU218732B
Application number: HU9302524A
Authority: HU
Inventors: Waldemar Kolanus; Charles Romeo; Brian Seed
Original assignee: General Hospital Corp.
Priority date: 1991-03-07
Filing date: 1993-03-06
Publication date: 2000-11-28
Also published as: NO933169L; ATE232107T1; MX9201002A; BR9205736A; DE69232921D1; NO933169D0; FI933882A0; DE69232921T2; KR100257780B1; AU3032895A; CZ184093A3; EP0574512B1; ES2191006T3; JP3696232B2; CA2104957C; IL101147A; RU2161044C2; CA2104957A1; HUT65631A; UA41870C2

Abstract

A találmány tárgya eljárás arra, hogy egy emlősben a sejtválasztirányítsák, oly módon, hogy az emlős egy sejtjében egy kimérareceptortexpresszálnak, amelynek hatására a sejtek specifikusan felismerik afertőző ágenst, egy, a fertőző ágenssel fertőzött sejtet, egy tumor-vagy rákos sejtet, illetve egy autoimmun folyamatban keletkezettsejtet, és elpusztítják azt. A találmány tárgyát képezik még azok asejtek, amelyek a kimérarecep- torokat expresszálják, valamint akimérareceptorokat kódoló DNS-molekulák. ŕ

Description

A találmány tárgyát funkcionális T-sejt-receptor, Fcreceptor vagy B-sejt-receptor kimérák képezik, amelyek képesek az immunrendszer működését átirányítani. Pontosabban, a találmány tárgya limfociták, makrofágok, természetes ölősejtek vagy granulociták szabályozása olyan kimérák expressziója révén az említett sejtekben, amelyek arra késztetik a sejteket, hogy a kimérák által felismert célpontokra reagáljanak. A találmány tárgyát képezik továbbá T-sejt-receptor, Fc-receptor vagy B-sejt-receptor kimérák, amelyek képesek a terápiás sejteket úgy irányítani, hogy azok specifikusan felismerjenek és elpusztítsanak egy specifikus fertőző ágenssel fertőzött sejteket, magát a fertőző ágenst, egy tumorsejtet, vagy egy autoimmungenerált sejtet pusztítsanak el. Pontosabban, a találmány tárgyát olyan T-sejt-receptor vagy Fc-receptor kimérák képezik, amelyek úgy irányítják a citotoxikus T-limfocitákat, hogy azok specifikusan felismeijék és lizálják a HlV-burokfehérjéket expresszáló sejteket. A találmány tárgyát képezi ennélfogva különböző betegségek, például a HIV-vírus által okozott AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) kezelésére alkalmas eljárás.

Az antigén T-sejt felismerése a T-sejt-receptoron keresztül az immunológiai jelenségek egy körének az alapja. A T-sejtek irányítják azt a jelenséget, amelyet sejtközvetített immunitásnak nevezünk. Ez magában foglalja idegen szövetek vagy fertőzött sejtek elpusztítását az immunrendszer sejtjeivel. Számos különböző Tsejt létezik, beleértve a „helper” (segítő) és a „szuppresszor” (elnyomó) sejteket, amelyek befolyásolják az immunválaszt, valamint a citotoxikus vagy „ölő” sejteket, amelyek képesek közvetlenül elpusztítani a rendellenes sejteket.

Egy T-sejt, amely felismer és kötődik egy másik sejt felszínén megjelenő antigénhez, aktiválódik; képes szaporodni, és ha ez egy citotoxikus sejt, akkor el is tudja pusztítani a hozzá tapadó sejtet.

Az autoimmunbetegséget vagy olyan antitestek termelése jellemzi, amelyek reagálnak a gazdaszervezet szöveteivel, vagy pedig olyan immuneffektor T-sejtek termelése jellemzi, amelyek autoreaktívak. Néhány esetben az autoantitestek antigéneket tartalmazó idegen anyagok vagy szervezetek által aktivált normális T- és B-sejt-válaszból származhatnak, amelyek a testszövetekben jelen levő hasonló vegyületekkel keresztreakciókat adnak. A klinikailag releváns autoantitestek acetilkolin receptor elleni antitestek a myasthenia gravisban (izomsorvadás); valamint anti-DNS, antieritrocita és antivérlemezke antitestek a szisztémás lupus erythematosusban.

1984-ben kimutatták, hogy az AIDS etiológiai ágense a HÍV. Ettől az időponttól kezdve az AIDS meghatározását számos esetben revízió alá vették abból a szempontból, hogy milyen kritériumokat szükséges bevenni a diagnózisba. A diagnosztikai paraméterek fluktuációja ellenére azonban az egyszerű, általános jellemzője az AIDS-nek a HIV-vel való fertőződés, majd ezt követően a mindig kifejeződő szimptómák és az AIDS-et követő betegségek megjelenése, mint például a másodlagos fertőzések, neopláziák és neurológiai betegségek [Harrison’s Principles of Internál Medicine, 12th ed.,

McGraw Hill (1991)] megjelenése.

A HÍV egy lentivíruscsoportba tartozó humán retrovírus. A négy felismert humán retrovírus két csoportba tartozik: a humán T-limfotróp (vagy leukémia) retrovírusokhoz, ilyen a HTLV-1 és HTLV-2, valamint a humán immundeficiencia-vírusokhoz, ilyen például a HIV-1 és HIV-2. Az előzőek transzformáló vírusok, míg az utóbbiak citopátiás vírusok.

A HÍV-1-et úgy azonosították, mint amely az egész világban az AIDS legáltalánosabb okozója. A HIV-2 és a HIV-1 közötti szekvenciahomológia körülbelül 40%-os, azzal, hogy a HIV-2 sokkal közelebbi rokonságban áll a majom immundeficiencia-vírusok (SIV) egy csoportjának néhány tagjával [Curran, J. et al., Science, 329, 1357-1359 (1985); Weiss, R. et al., Natúré, 324, 572-575 (1986)].

A HIV-nek megvannak a szokásos retrovirális génjei (env, gag és ροΓ), valamint hat extra génje van, amelyek a vírus replikációjában és más biológiai aktivitásában játszanak szerepet. Amint azt korábban kijelentettük, az AIDS közös jellemzője egy nagyon erős immunszuppresszió, túlnyomóan a sejtközvetített immunitásé. Ez az immunszuppresszió vezet számos különböző opportunista megbetegedéshez, főleg bizonyos fertőzésekhez és neoplazmákhoz.

Az immundefektus fő okát az AIDS-ben úgy azonosították, mint a tímuszeredetű (T) limfociták, a T4 populáció mennyiségi és minőségi hiányát. A sejteknek ezt az alcsoportját fenotipikusan a CD4 felszíni molekula jelenléte jellemzi, amelyről kimutatták, hogy a HÍV celluláris receptora [Dalgleish et al., Natúré, 312, 763 (1984)]. Jóllehet a T4 sejt a HIV-vel fertőzött fő sejttípus, lényegében bármely, a felszínén CD4 molekulákat expresszáló humán sejt képes megkötni, illetve megfertőződni a HIV-vírussal.

A CD4⁺ T-sejteknek tradicionálisan a helper/inducer szerepet határozták meg, jelezve ezzel azt a funkciójukat, hogy aktiváló jelet adnak a B-sejteknek, illetve Tlimfocitákat indukálnak, amelyek a reciprok CD8 markért hordozzák, hogy azok citotoxikus/szuppresszor sejtekké váljanak [Reinherz and Schlossman, Cell, 19, 821-827 (1980); Goldstein et al., Immunoi. Rév., 68, 5-42(1982)].

A HÍV specifikusan és nagy affinitással a vírus burkában levő aminosavakon keresztül (gpl20) kötődik a CD4 molekula N-terminálisához közeli VI régió egy részéhez. A kötődést követően a vírus fuzionál a megcélzott sejtmembránnal, és intemalizálódik, azaz bejut a sejtbe. Ha egyszer már benn van, akkor a reverz transzkriptáz enzimet használja arra, hogy a genomiális RNS-ét DNS-sé átírja, amely integrálódik a celluláris DNS-be, és a sejt élete során „provírus”-ként létezik.

A provírus maradhat latens, illetve aktiválódhat arra, hogy átírja az mRNS-t és a genomiális RNS-t, ezzel előidézve a fehéqeszintézist, az új virion képződését a fehérjék összeillesztődése révén, és a vírus kidudorodását a sejt felszínén. Jóllehet a pontos mechanizmus, amely révén a vírus a sejt pusztulását okozza, még nem ismert, az a feltételezés, hogy a fő ok a vírusok tömeges

HU 218 732 Β kidudorodása a sejt felszínén, ezzel a plazmamembrán tönkremegy, és ozmotikus instabilitás jön létre.

A fertőzés során a gazdaszervezet antitesteket termel a virális fehérjék ellen, beleértve a gpl20 és gp41 fő burokglikoproteineket. Ennek a humorális immunitásnak az ellenére a betegség tovább fejlődik, és halálos immunszuppresszióhoz vezet, amelyet sokszoros opportunista fertőzés, parazitémia, demencia és halál jellemez. A fertőzésben az egyik legnyugtalanítóbb és legriasztóbb dolog az, hogy a gazdaszervezet antivirális antitestjei nem képesek megállítani a betegség fejlődését, és előre láthatóvá teszi, hogy a szokványos megközelítésen alapuló vakcinálási erőfeszítéseknek nem lesz nagy eredményük.

Két faktor játszhat szerepet az immundeficiencia-vírusokra adott humorális válasz hatásosságában. Először más RNS-vírusokhoz hasonlóan (és különösen a retrovírusokhoz hasonlóan) az immundeficiencia-vírus magas mutációs rátával rendelkezik a gazdaszervezet immunfelderítésére adott válaszként. Másodszor, a burokglikoproteinek maguk is erősen glikozilezett molekulák, amelyek a nagy affinitású antitestkötődés számára kevés epitópot mutatnak be. A gyengén antigén célpont, amelyet a virális burok jelent, a gazdaszervezetnek kevés esélyt ad a virális fertőzés korlátozására a specifikus antitesttermelésen keresztül.

A HIV-vírussal fertőzött sejtek a gpl20 glikoproteint expresszálják a felszínükön. A gpl20 irányítja a fúziós eseményeket a CD4+ sejtek között egy olyan reakción keresztül, amely hasonló ahhoz, amellyel a vírus a fertőzetlen sejtbe bejut, és ezzel rövid életű, többmagvú óriássejtek képződéséhez vezet. A syncytiumképződés a gpl20 burokglikoproteinnek a CD4 fehérjével való közvetlen kölcsönhatásától függ [Dalgleish et al., Natúré, 312, 763 (1984); Klatzman, D. et al., Natúré, 312, 763 (1984); McDougal, J. S. et al., Science, 231, 382 (1986); Sodroski, J. et al., Natúré, 323, 470 (1986); Lifson, J. D. et al., Natúré, 323, 275 (1986); Sodroski, J. et al., Natúré, 321,4 12 (1986)].

Annak bizonyítékául, hogy a CD4-gpl20 kötődés a felelős a CD4 antigént hordozó sejtek megfertőzéséért, szolgál az a felfedezés is, hogy egy specifikus komplex jön létre a gpl20 és a CD4 között [McDougal, J. S. et al., Science, 231, 382 (1986)]. Más kutatók kimutatták, hogy azok a sejtvonalak, amelyek nem fertőzhetők meg HIV-vel, fertőzhető sejtvonalakká alakíthatók, a humán CD4 cDNS-génnel való transzfekciót és expressziót követően [Maddon et al., Cell, 46, 333-348 (1986)].

Az oldható CD4-en mint a virális adszorpció és a syncytiumközvetített sejtes transzmisszió megzavarására alkalmas passzív hatóanyagon alapuló terápiás programokat javasoltak, és in vitro sikeresen igazolták is a használatukat [Deen et al., Natúré, 332, 82-84 (1988); Fisher et al., Natúré, 331, 76-78 (1988); Hussey et al., Natúré, 331, 78-81 (1988); Sith et al., Science, 238, 1704-1707 (1987); Traunecker et al., Natúré, 331, 84-86 (1988)]; ezek után CD4 immunglobulin fúziós fehérjéket fejlesztettek ki, amelyeknek hosszabb a féléletidejük és közepes a biológiai aktivitásuk [Capon et al., Natúré, 337, 525-531 (1989); Traunecker et al., Natúré, 339, 68-70 (1989); Bym et al., Natúré, 344, 667-670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Bioi., 9, 347-353 (1990)]. Jóllehet a CD4 immunotoxin konjugátumok, illetve a fúziós fehérjék hatásos citotoxicitást mutattak in vitro a fertőzött sejtekkel szemben [Chaudhary et al., Natúré, 335, 369-372 (1988); Till et al, Science, 242,1166-1168 (1988)], az immundeficiencia szindróma látenciája valószínűtlenné teszi, hogy bármiféle egyfajta kezelés hatásos lehet a vírusteher eliminálásában, és az idegen fúziós fehérjék antigenicitása valószínűleg korlátozza a felhasználhatóságukat az ismétlődő dózisokat igénylő kezelésekben. A SIV-vel fertőzött majmokkal végzett kísérletek kimutatták, hogy az oldható CD4, ha olyan állatoknak adják be, amelyeknek nincs markáns CD4 citopéniájuk, csökkentheti a SIV-titert és javítja a mieloidpotenciál in vitro értékét [Watanabe et al., Natúré, 337, 267-270 (1989)]. Azonban a kezelés megszakítása után azonnal a vírusok újra megjelenése figyelhető meg, sugallva ezzel, hogy egy életen át tartó kezelés szükséges a progresszív immunrendszer-leromlás megakadályozására.

A T-sejt antigénreceptor (TCR) leggyakoribb formájának sejtfelszíni expressziójához legalább 6 különböző polipeptidlánc koexpressziójára van szükség [Weiss et al., J. Exp. MEd., 160, 1284-1299 (1984); Orloffhashi et al., Natúré, 316, 606-609 (1985); Berkhut et al., Journal of Biological Chemistry, 263, 8528-8636 (1988); Sussman et al., Cell, 52, 85-95 (1988)], az α/β antigénkötő láncok, a CD3 komplex három polipeptidje és a dzéta. Ha bármelyik lánc hiányzik, akkor a komplex többi tagjának stabil expressziója nem lehetséges. A dzéta a korlátozó polipeptid a teljes komplex felszíni expressziójában [Sussman et al., Cell, 52, 85-95 (1988)], és az a vélemény alakult ki róla, hogy a ligandum receptorfelismerése által beindított celluláris aktiváló programnak legalább egy részét befolyásolja [Weissman et al., EMBO J., 8, 3651-3656 (1989); Frank et al., Science, 249, 174-177 (1990)]. Egy 32 kD méretű I-es típusú membrán homodimer, a dzéta, 9 csoportból álló extracelluláris doménnel rendelkezik, amelyen nincsen az N-kapcsolt glikán hozzáadásához szükséges hely, és rendelkezik egy 112 csoportból (egér) vagy 113 csoportból (humán) álló intracelluláris doménnel [Weissman et al., Science, 238, 1018-1020 (1988a); Weissman et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 9709-9713 (1988b)]. A dzétának egy izoformja, jele éta [Baniyash et al., Journal of Biological Chemistry, 263, 9874-9878 (1988); Orloff et al., Journal of Biological Chemistry, 263, 14 812-14 817 (1989)], amely egy eltérő mRNS-illesztési útból származik [Jin et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, 3319-3233 (1990)], az antigénreceptort expresszáló sejtekben csökkent mennyiségben van jelen. A dzéta-éta heterodimerekről úgy gondolják, hogy befolyásolják az inozitol-foszfátok keletkezését, valamint a receptoriniciált programozott sejtpusztulást, aminek a neve apoptosis [Mercep et al., Science, 242, 571-574 (1988); Mercep et al., Science, 246, 1162-1165 (1989)].

HU 218 732 Β

A dzétához és az étához hasonlóan az Fc-receptorhoz kapcsolódó gamma-lánc a sejtfelszíni komplexben expresszálódik további polipeptidekkel együtt, amelyek közül néhány befolyásolja a ligandumfelismerést, a többieknek nincs meghatározott funkciójuk. A gamma homodimer szerkezettel rendelkezik, a szerveződése összességében nagyon hasonló a dzétáéhoz, és mind a hízósejt/bazofil nagy affínitású IgE, mind az Fc-epszilon-Rl receptor egy komponense, amely legalább három különböző polipeptidláncból áll [Blank et al., Natúré, 337, 187-189 (1989); Ra et al., Natúré, 241, 752-754 (1989)]; és egyike az IgG kis affínitású receptorainak, amelyet az egerekben az FC-gamma-RIIa képvisel [Ra et al., Journal of Biological Chemistry, 264, 15 323-15 327 (1989)], az emberekben pedig a makrofágok és természetes ölósejtek által expresszált CD 16 altípus, a CD16_TM-nak (CD 16 transzmembrán) [Lanier et al., Natúré, 342, 803-805 (1989); Anderson et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, 2274-2278 (1990)], egy azonosítatlan funkciójú polipeptiddel [Anderson et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, 2274-2278 (1990)]. Újabban közölték, hogy a gammát egy egér T-sejt-vonal, a CTL expresszálja, amelyben heterodimereket, valamint gamma-dzéta és gamma-éta heterodimereket hoz létre [Orloff et al., Natúré, 347, 189-191 (1990)].

Az Fc-receptorok befolyásolják az immun-komplexek fagocitózisát, a transzcitózist, és az antitest-dependens celluláris citotoxicitást (ADCC) [Raveth and Kínét, Annu. Rév. Immunoi., 9, 457-492 (1991); Unkeless et al., Annu. Rév. Immunoi., 6, 251-281 (1988); and Mellman, Curr. Opin. Immunoi., 1, 16-25 (1988)]. Újabban kimutatták, hogy a rágcsáló kis affínitású Fc-receptorok egyik izoformája (FcR-gamma-IIIB1) befolyásolja az IgG-vel borított célpontok intemalizációját klatrinnal borított üregekben, és más kis affinitású receptor (Fcr-gamma-IIIA) befolyásolja az ADCC-t a „ravasz molekulák” kis csoportjának egy vagy több tagjával [Miettinen et al., Cell, 58, 317-327 (1989); és Hunziker and Mellman, J. Cell Bioi., 109, 3291-3302 (1989)]. Ezek a ravasz molekulák, a T-sejt-receptor (TCR) dzéta-lánca, a TCR éta-lánca és az Fc-receptor gamma-lánca, kölcsönhatásba lépnek a különböző immunrendszer-receptorok ligandfelismerő doménjeivel, és képesek autonóm iniciálni a celluláris effektorprogramokat, beleértve a citolízist, az aggregációt követően [Samelson et al., Cell, 43, 223-231 (1985); Weissman et al., sci 239, 1018-1020 (1988); Jint et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, 3319-3323 (1990); Blank et al., Natúré, 337,187-189 (1989); Lanier et al., Natúré, 342, 803-805 (1989); Kurosaki and Ravetch, Natúré, 342, 805-807 (1989); Hibbs et al., Science, 246,1608-1611 (1989); Anderson et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, 2274-2278 (1990); és Irwing and Weiss, Cell, 64, 891-901 (1991)].

Párhuzamot vonva azonban a rágcsáló és a humán kis affínitású Fc-receptor-családok között, nyilvánvalóvá vált, hogy a humán FcR-gamma-IIA és C izoformáknak nincs meg a rágcsálópárjuk. Részben emiatt, ezeknek a funkcióját még meg kell határozni.

Mivel a CD4 alapú humorális ágenseknek in vivő korlátozott lehet a használhatóságuk, a feltalálók elkezdték vizsgálni annak lehetőségét, hogy a celluláris immunitást irányítsák a HÍV ellen. Ennek eredményeképpen olyan fehérjekimérák készítését írják le, amelyekben a CD4 extracelluláris doménje a T-sejt-receptor, az IgG Fc-receptor transzmembrán és/vagy intracelluláris doménjeivel, vagy a B-sejt-receptor szignál transzdukciós elemeihez van fúzionáltatva. Az olyan kimérákat expresszáló citolitikus T-sejtek, amelyek egy extracelluláris CD4 domént tartalmaznak, a HlV-burokfehéijéket expresszáló celluláris célpontok potens MHC-fuggetlen elpusztítását mutatják. Ennek a megközelítésnek egy kivételesen fontos és új komponense az egyedi T-sejt-receptor vagy Fc-receptor azonosítása volt, valamint azoknak a B-sejt-receptor láncoké, amelyek aggregációja elegendő a celluláris válasz iniciálásához.

Ennek a megközelítésnek egy különösen hasznos alkalmazása olyan kimérák felfedezése a CD4 és a dzéta, éta vagy gamma között, amelyek a T-limfociták közvetlen citolízisét irányítják, hogy a HIV-gpl20-at expresszáló sejteket felismeijék és elpusztítsák.

Jóllehet a természetes Τ-sejt-, B-sejt- és Fc-receptorok általában nagyon bonyolult multimer szerkezetűek, így nem teszik lehetővé, hogy könnyen manipulálhatók legyenek, a jelen találmánnyal igazoljuk, hogy lehetséges kimérákat létrehozni számos különböző olyan molekula intracelluláris doménje között, amelyek képesek a célpontfelismerés feladatát ellátni. Pontosabban, a T-sejt/Fc-receptor dzéta-, éta- vagy gamma-láncait egy alkalmasan megváltoztatott antitestmolekulához kapcsolva tartalmazó kimérák készítése lehetővé teszi, hogy egy immunrendszer sejtcélpont-feiismerési potenciálja specifikusan átirányítódjon az extracelluláris antitestrész által felismert antitestre. így egy olyan antitestrésszel, amely képes felismerni néhány determinánst egy patogén felszínén, a kimérával felfegyverkezett immunrendszersejtek reagálnának a patogén jelenlétére, a leszármazásuknak megfelelő effektorprogrammal, például a helper T-limfociták a célpont elleni citotoxikus aktivitással reagálnának, és a B-limfociták aktiválódnának az antitest szintézisére. A makrofágok és a granulociták elvégeznék az effektorprogramjaikat, beleértve a citokinfelszabadulást, a fagocitózist és a reaktív oxigén képződését. Hasonlóképpen, a tumorsejteket felismerni képes antitestrésszel az immunrendszer válasza előnyösen magasabb lehet. Egy olyan antitesttel, amely képes felismerni azokat az immunsejteket, amelyeknek nem elégséges az aktivitásuk az öndeterminánsokra, az autoreaktív sejtek szelektíven irányíthatók lehetnek a pusztításhoz. Jóllehet ezek a példák az antitestkimérák használatára mint kényelmes eszközökre mutatnak rá, a találmány oltalmi köre nem korlátozódik az antitestkimérákra, és valóban, a specifikus nemantitest extracelluláris doméneknek lehetnek fontos előnyeik. Például egy extracelluláris résszel, amely egy vírus, egy baktérium vagy egy parazita receptora, a kimérákkal

HU 218 732 Β felfegyverzett sejtek specifikusan megcélozzák a virális, bakteriális vagy parazita determinánsokat. Ennek a megközelítésnek az antitestek használatával szemben az az előnye, hogy a patogén természetes receptora egyedülállóan nagy szelektivitással vagy affinitással rendelkezik a patogénre, lehetővé téve egy nagyobb pontosságot a keletkező immunválaszban. Hasonlóképpen azoknak az immunrendszereknek a törlésére, amelyek nem megfelelően reagálnak egy önantigénnel, elegendő lehet, ha az antigént (akár érintetlen fehérjeként, a B-sejt-megvonásos terápiákban, vagy MHC-komplexként, a T-sejt-megvonásos terápiákban az intracelluláris dzéta-, éta- vagy gamma-láncokhoz kapcsoljuk, és ezzel befolyásoljuk azoknak a sejteknek a specifikus irányítottságát, amelyek az öndeterminánsokra nem megfelelően reagálnak.

A kimérák másik alkalmazása a sejtpopulációk in vivő kontrollja, más génsebészeti eljárások alkalmazását követően. Például javasolták a tumorba beszűrődő limfociták vagy természetes ölősejtek használatát a citotoxikus hatásnak a tumor helyére való juttatásában. A jelen találmány tárgya egy kényelmes eszköz az ilyen limfociták és sejtek számának és aktivitásának szabályozására, anélkül, hogy in vitro amplifikálás céljából eltávolítanánk őket a beteg testéből. így, mivel a kimérareceptorok intracelluláris doménjei befolyásolják a sejtek proliferatív reakcióit, az extracelluláris domének koordinálása számos különböző, az extracelluláris doménekre specifikus stimulussal (például egy, az extracelluláris doménre specifikus antitesttel), a kimérákat hordozó sejtek szaporodását eredményezi.

Jóllehet a jelen találmány specifikus megvalósítási módjai a dzéta-, éta- vagy gamma-láncokból, illetve aktív fragmentjeikből készült (például amelyeket az alábbiakban tárgyalunk) kimérákat tartalmazzák, bármely receptorlánc, amely ezekhez a molekulákhoz hasonló funkciókkal rendelkezik, például a granulocitákban vagy B-limfocitákban, használható az itt leírt célokra. A számunkra fontos immunsejt „ravasz” molekulák megkülönböztető tulajdonságai közé tartozik, hogy legyen képes autonóm módon (azaz mint egy egyetlen lánc) expresszálni, legyen képes egy extracelluláris doménhez fuzionálni oly módon, hogy a keletkező kiméra a terápiás sejt felszínén legyen, és legyen képes celluláris effektorprogramok beindítására, egy célliganddal való összetalálkozásra lejátszódó másodlagos aggregáció hatására.

Jelenleg a kiméráknak az immunrendszerbe való bejuttatására a legegyszerűbb módszer a génterápia néhány formája. Azonban a kimérareceptort tartalmazó immunrendszersejteknek a helyreállítása olyan sejtek keverékével, amelyek megfelelően oldható formába vitt tisztított kimérafehérjékkel rendelkeznek, szintén olyan, tudatosan megváltoztatott sejtpopulációt eredményez, amely képes a kimérák extracelluláris doménjei által felismert célpontokra reagálni. Hasonló megközelítéseket használtak például az intakt HIV-receptor, a CD4 bejuttatására eritrocitákba, terápiás célból. Ebben az esetben a megváltoztatott sejtpopuláció nem lenne képes az önmegújulásra.

A jelen találmány tárgyát funkcionális egyszerűsített T-receptor, B-receptor és Fc-receptor kimérák képezik, amelyek képesek az immunrendszer funkcióit átirányítani. Pontosabban, a találmány limfociták, makrofágok, természetes ölősejtek vagy granulociták szabályozására vonatkozik, olyan kiméráknak az említett sejtekben való expressziójával, amelyek a sejtet ráveszik, hogy a kimérák által felismert célpontokra reagáljanak. A találmány tárgya továbbá eljárás a celluláris reakciónak egy fertőző ágens, egy tumor- vagy rákos sejt, vagy egy autoimmun folyamatban keletkezett sejt ellen irányítására. Egy emlősben a celluláris válasz irányítása abban áll, hogy az említett emlősnek a terápiás sejtekből hatásos mennyiséget adunk be, az említett sejtek képesek felismerni és elpusztítani az említett fertőző ágenst, tumor-, rákos sejtet vagy autoimmun folyamatban keletkezett sejtet.

Egy másik megvalósítási mód szerint a celluláris válasz egy fertőző ágens ellen irányítása abban áll, hogy az említett ágenst felismerni és elpusztítani képes terápiás sejteket juttatjuk be a szervezetbe, amikor is az említett ágens egy specifikus vírus, baktérium, protozoa vagy gomba. Még pontosabban az eljárás olyan ágensek ellen irányul, mint például a HÍV és a Pneumocystis carinii.

A találmány tárgya specifikusan eljárás sejtválasznak egy HIV-vel fertőzött sejt ellen irányítására. A módszer abban áll, hogy a betegnek citotoxikus Tlimfociták hatásos mennyiségét adjuk be, az említettlimfociták képesek specifikusan felismerni és lizálni a HIV-vel fertőzött sejteket.

Egy további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás a celluláris reakció HIV-vel fertőzött sejtekre való irányítására, ami abban áll, hogy a betegnek olyan citotoxikus T-limfociták hatásos mennyiségét adjuk be, amelyek képesek specifikusan felismerni és lizálni a HIV-vel fertőzött sejteket.

Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát olyan kimérareceptor-fehérjék képezik, amelyek a citotoxikus T-limfocitákat úgy irányítják, hogy azok felismerjék és lizálják a HIV-vel fertőzött sejtet. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát egy, a kimérareceptorokat tartalmazó vektor képezi.

Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát olyan antitest képezi, amely a találmány szerinti kimérareceptorokra specifikus.

Abból a célból, hogy olyan citotoxikus T-limfocitákat kapjunk, amelyek specifikusan kötődnek és lizálják a HIV-vel fertőzött sejteket, a jelen találmány szerzői megkísérelték receptor kimérák előállítását, amelyet az alábbiakban ismertetnek. Ezek a kimérareceptorok funkcionálisan aktívak, és azzal a rendkívüli képességgel rendelkeznek, hogy képesek specifikusan felismerni és lizálni a gpl20-at expresszáló sejteket.

A jelen találmány tárgyát képezi ezek után egy, HIV-vel fertőzött egyének kezelésére alkalmas eljárás. A jelen találmány szerinti eljárás ily módon számos fontos előnyt hordoz az AIDS gyógyításában.

A jelen találmánynak ezek és egyéb, nem korlátozó szempontjai a szakterületen jártas szakember számára

HU 218 732 Β nyilvánvalóak lesznek a találmány alábbi, részletes leírásából.

Az alábbi részletes leírásban számos olyan különböző módszerre hivatkozunk, amelyek a molekuláris biológia és immunológia területén jártas szakember számára ismertek. Az ilyen ismert módszereket közlő publikációkat és egyéb anyagokat, amelyekre hivatkozunk, teljes egészében referenciaként kezeljük.

A standard referenciamunkák közé, amelyek a rekombináns DNS-technológia általános elveit tartalmazzák, tartoznak az alábbiak: Watson, J. D. et al., Molecular Biology of the Gene, I és II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); Danteii, J. E. et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Publisher, New York, Ν. Y. (1986); Lewin, Β. M., Genes II, John Wiley & Sons, Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2nd edition, University of Califomia Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); és Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York (1989).

A „klónozás” szakkifejezés alatt in vitro technikák alkalmazását értjük egy bizonyos gén vagy más DNSszekvencia bejuttatására egy vektormolekulába. Abból a célból, hogy egy gént sikeresen klónozzunk, ahhoz az szükséges, hogy a DNS-fragmentek létrehozásának módszereit alkalmazzuk, amelyeket vektormolekulákkal kapcsolunk össze, majd az összetett molekulát egy olyan gazdasejtbe juttatjuk be, amelyben képes replikálódni, és a befogadó gazdasejtek közül szelektáljuk azt a kiónt, amely a kiválasztott gént tartalmazza.

A „cDNS” szakkifejezés alatt komplementer vagy kópia DNS-t értünk, amelyet egy RNS-templátról állítottunk elő az RNS-dependens DNS-polimeráz (reverz transzkriptáz) alkalmazásával. így a „cDNS-klón” egy olyan duplex DNS-szekvenciát jelent, amely komplementer egy számunkra fontos RNS-molekulával, és amelyet egy klónozó vektor hordoz.

A cDNS-könyvtár szakkifejezés alatt egy olyan rekombináns DNS-molekula-gyűjteményt értünk, amely olyan cDNS-inszerteket tartalmaz, amelyek a cDNSkönyvtár készítésének időpontjában a sejt által expresszált mRNS-ek DNS-kópiáit tartalmazzák. Egy ilyen cDNS-könyvtár a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel készíthetők, leírásuk laboratóriumi kézikönyvekben is megtalálható [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Általában, az RNS-t először egy olyan szervezet sejtjeiből izoláljuk, amelynek a genomjából egy bizonyos gént akarunk klónozni. A jelen találmány szempontjából előnyösek az emlős-, különösen a humán limfocita sejtvonalak. Egy erre a célra jelenleg előnyösnek tartott vektor a vakcíniavírus WR-törzse.

A „vektor” szakkifejezés alatt egy olyan DNS-molekulát értünk, amely például egy plazmidból, bakteriofágból, illetve emlős- vagy rovarvírusból származik, és amelybe DNS-fragmentek illeszthetők vagy klónozhatok. A vektor egy vagy több egyedi restrikciós hasítási helyet tartalmaz, képes lehet az önálló replikációra egy meghatározott gazdaszervezetben vagy hordozószervezetben, úgyhogy a klónozott szekvencia reprodukálható. így a „DNS expressziós vektor” szakkifejezés bármely olyan autonóm elemre vonatkozik, amely egy rekombináns peptid szintézisét képes irányítani. Az ilyen DNS expressziós vektorok közé tartoznak a bakteriális plazmidok és fágok, valamint az emlős- és rovarplazmidok és -vírusok.

A „lényegében tiszta” szakkifejezés alatt egy olyan vegyületet, például fehérjét, polipeptidet vagy antitestet értünk, amely lényegében mentes azoktól a komponensektől, amelyek a természetben kísérik. Egy vegyületet általában lényegében tisztának mondunk, ha a számunkra érdekes vegyület legalább 60%-át, előnyösebben legalább 75%-át, és legelőnyösebben legalább 90%-át képezi egy minta összanyagtartalmának. A tisztaságot bármely megfelelő módszerrel mérhetjük, azaz például kromatográfiával, poli(akril-amid) gélelektroforézissel vagy HPLC-elemzéssel. Ha nukleinsavról beszélünk, akkor a „lényegében tiszta” szakkifejezés alatt egy olyan nukleinsavszekvenciát, -szegmentet vagy -fragmentet értünk, amely mentes azoktól a génektől, amelyek természetes állapotában határolják (azaz mentes azoktól a szekvenciáktól, amelyek a nukleinsavat a természetes genomiális pozíciójában határolják). A „funkcionális származék” szakkifejezés jelentése „fragmentek”, „variánsok”, „analógok” vagy „kémiai származékok” egy molekulából. Egy molekula „fragmentje”, úgymint a jelen találmány szerinti bármely cDNS-szekvencia fragmentje, a molekulának bármely nukleotid-alcsoportját jelenti. Egy ilyen molekulának egy „variánsa” egy természetben előforduló molekulának felel meg, amely lényegében hasonló a teljes molekulához, illetve annak egy fragmentjéhez. Egy molekuláról azt mondjuk, hogy „lényegében hasonló” egy másik molekulához, ha a két molekulában az aminosavak szekvenciája lényegében ugyanaz. A lényegében azonos aminosavsorrenddel rendelkező molekulák hasonló biológiai aktivitással rendelkeznek. Tehát, azzal a feltétellel, hogy a két molekula hasonló aktivitással rendelkezik, variánsoknak tekintjük őket, a szakkifejezésnek ebben a szabadalmi leírásban való értelmezése alapján, még akkor is, ha egyik vagy másik molekula több vagy kevesebb aminosavat tartalmaz, mint a másik molekula, illetve ha az aminosavcsoportok szekvenciája nem azonos. A továbbiakban egy molekuláról akkor mondjuk, hogy egy másik molekula „kémiai származéka”, ha további olyan kémiai egységeket tartalmaz, amelyek normális körülmények között nem képezik a molekula részét. Ezek az egységek javíthatják a molekula oldhatóságát, abszorpcióját, biológiai fél-életidejét stb. Az egységek alternatív módon csökkenthetik a molekula toxicitását, eliminálhatják vagy gyengíthetik a molekula bármely nemkívánatos mellékhatását stb. Az ilyen hatások közvetítésére alkalmas egységeket összefoglaló munkákban írták le [Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980)].

HU 218 732 Β

Hasonlóképpen egy, a jelen találmány szerinti receptor kiméra „funkcionális származéka” szakkifejezés a génnek olyan „ffagmentjeire”, „variánsaira” vagy „analógjaira” vonatkozik, amelyek lényegében hasonló nukleotidszekvenciával rendelkeznek, és amelyek egy olyan molekulát kódolnak, amely hasonló aktivitással rendelkezik, például egy T-sejt, B-sejt vagy Fc-receptor kiméra.

Tehát a továbbiakban egy T-sejt, B-sejt vagy Fc-receptor kimérafehérje lehet bármely funkcionális származék, variáns, analóg vagy kémiai származék, amely lényegében hasonló a „vad típusú” kimérákhoz, és amely hasonló aktivitással rendelkezik (azaz a legelőnyösebb, ha aktivitása 90%, nagyon előnyös, ha 70%, előnyös, ha 40%, de legalább 10% legyen a vad típusú receptor kiméra aktivitásának). Egy funkcionális kimérareceptor-származék aktivitása tartalmazhat specifikus kötődést (az extracelluláris részével) egy megcélzott ágenshez vagy sejthez, és eredményezheti az említett ágens vagy sejt elpusztítását (az intracelluláris vagy transzmembrán része által vezérelve); az ilyen aktivitás vizsgálható például bármely, az alábbiakban ismertetett vizsgálat alkalmazásával.

A jelen találmány szerinti T-sejt, B-sejt vagy Fc-receptor kimérát kódoló DNS-szekvencia vagy annak funkcionális származéka kombinálható egy vektor DNS-sel, a szokványos technikák alkalmazásával, beleértve a tompa végű vagy tapadós végű fragmentek ligálását, a restrikciós enzimes emésztést a megfelelő végű fragmentek előállítása céljából, ha szükséges, akkor a tapadós végek feltöltését, az alkalikus foszfatázzal való kezelést a nemkívánatos kapcsolódások elkerülésére, és a megfelelő ligázokkal végzett ligálást. Az említett manipulációkat, technikákat Maniatis és munkatársai laboratóriumi kézikönyvében találjuk meg [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)], és a szakterületen jártas szakember számára jól ismertek.

Egy nukleinsavmolekuláról, például egy DNS-ről akkor mondjuk, hogy „képes egy fehérje expresszálására”, ha olyan nukleotidszekvenciákat tartalmaz, amelyekben transzkripciós és transzlációs szabályozó információt hordozó részek vannak, és ezek a szekvenciák „működés szempontjából” a polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciákhoz kötődnek. Egy működés szempontjából való kötődés egy olyan kötődés, amelyben a szabályozó DNS-szekvenciák és az a szekvencia, amelynek számunkra fontos az expressziója, oly módon vannak összekapcsolva, hogy az lehetővé teszi az expressziót. A gének expressziójához szükséges szabályozó régiók pontos természete szervezetről szervezetre változhat, de általában tartalmaznak egy promoterrégiót, amely prokariótákban mind a promotert (amely az RNS-transzkripciót iniciálja), mind pedig azokat a DNS-szekvenciákat tartalmazza, amelyek RNS-sé átíródva a fehéijeszintézis iniciációját jelzik. Az ilyen régiók normális körülmények között tartalmazzák azokat az 5’-nemkódoló szekvenciákat, amelyek a transzkripció és a transzláció iniciálásában játszanak szerepet, például a TATA boxot, a lezáró (capping) szekvenciát, a

CAAT szekvenciát és hasonlókat.

Ha szükséges, akkor a fehérjét kódoló génszekvencia 3 ’ nemkódoló régióját az előzőkben leírt módszerekkel állíthatjuk elő. Ezt a régiót visszatarthatjuk a transzkripciós terminációs szabályozószekvenciái miatt, azaz a termináció és a poliadenilezés miatt. Tehát, megtartva a fehérjét kódoló DNS-szekvenciát 3’ irányban természetes körülmények között határoló régiót, a transzkripciós terminációs szignált biztosíthatjuk. Ha a transzkripciós terminációs szignálok nem működnek megfelelően a gazdasejt expressziós rendszerében, akkor a gazdasejt 3’ funkcionális régióival helyettesíthetők.

Két DNS-szekvenciáról (azaz egy promoterrégiószekvencia és egy T-sejt-receptor, egy B-sejt-receptor vagy Fc-receptor kimérát kódoló szekvencia) akkor mondjuk, hogy működés szempontjából egymáshoz vannak kapcsolva, ha a két DNS-szekvencia közötti kötés természete nem eredményez (1) ffame-shift mutációt, (2) zavaija a promoterrégió-szekvenciának azt a képességét, hogy irányítja a receptor kiméra génszekvenciájának transzkripcióját, vagy (3) zavarja a receptor kiméra génszekvenciájának azt a képességét, hogy a promoterrégió szekvenciájával átírható.

Egy promoterrégió akkor kapcsolódik működés szempontjából egy DNS-szekvenciához, ha a promoter képes az említett DNS-szekvencia transzkripcióját befolyásolni. Tehát egy fehérje expressziójához a megfelelő gazdaszervezet által felismert transzkripciós és transzlációs szignálok szükségesek.

A jelen találmány tárgya egy T-sejt-receptor, Bsejt-receptor vagy Fc-receptor kimérafehérje (vagy annak funkcionális származéka) expressziója prokarióta vagy eukarióta sejtekben, jóllehet az eukarióta (és különösen a humán limfocita) sejtekben való expressziót tartjuk előnyösnek.

A találmány szerinti antitestek bármely ismert módszerrel előállíthatók. Például a receptor kimérafehérjét vagy annak funkcionális származékát expresszáló sejteket beadhatjuk egy állatnak abból a célból, hogy olyan szérumok termelődését indukáljuk vele, amelyek a kimérát megkötni képes poliklonális antitesteket termelnek.

Egy előnyös módszer szerint a jelen találmány szerinti antitestek monoklonális antitestek. Az ilyen monoklonális antitesteket a hibridómatechnológiával lehet előállítani [Köhler et al, Natúré, 256, 495 (1975); Köhler et al., Eur. J. Immunoi., 6, 292 (1976); Hammerling et al„ in: Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas, Elsevier, N. Y„ 563-684 (1981)]. Általában az ilyen eljárások magukban foglalják egy állat immunizálását a T-sejt receptor, B-sejt-receptor vagy Fc receptor kiméraantigénnel. Az ilyen állatok szplenocitáit kivonjuk, és egy alkalmas mielóma-sejtvonallal fuzionáltatjuk. Bármely alkalmas mielóma-sejtvonal használható a jelen találmány szerint. A fúzió után a keletkező hibridómasejteket szelektíven fenntartjuk HAT táptalajon, majd a határhígítási módszerrel klónozzuk,

HU 218 732 Β

Wands, J. R. és munkatársai leírása szerint [Gastroenterology, 80, 225-232 (1981)]. Egy ilyen szelekció után kapott hibridómasejteket átvizsgáljuk, hogy azonosítsuk azokat a kiónokat, amelyek a kiméra megkötésére képes antitesteket szekretálják.

A jelen találmány szerinti antitestek lehetnek poliklonálisak, illetve előnyösebben régióspecifikus poliklonális antitestek.

A jelen találmány szerinti T-sejt-receptor, B-sejtreceptor vagy Fc-receptor kimérák elleni antitesteket használhatjuk a kimérareceptor (vagy a kimérareceptorokat hordozó sejtek) mennyiségének meghatározására egy betegben. Ezek az antitestek nagyon jól használhatók a szakterületen jártas szakember számára ismert immundiagnosztikai módszerekben, beleértve az olyan immunometriás vagy „szendvics” vizsgálatokat, mint a szendvics, fordított szendvics és a szimultán szendvics vizsgálatok. Az antitestek bármely kombinációban használhatók, és a szakterületen jártas szakember, anélkül hogy felesleges kísérleteket kellene végeznie, meghatározhatja a körülményeket, hogy az immunesszében elfogadható specifitást, érzékenységet és pontosságot kapjon.

Az immunológia általános elveit számos, referenciaként használt könyvben foglalták össze [Roitt, I., Essential Immunology, Sixth ed., Blackwell Scientific Publications, Publisher, Oxford (1988); Kimball, J. W:, Introduction tolerancia Immunology, Second ed., McMillan Publishing Co., Publisher, New York (1986); Roitt, I. et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., Publisher, London (1985); Campbell, A., „Monoclonal Antibody Technology” in: Burdon, R. et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier, Publisher, Amsterdam (1984); Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, Publisher, New York (1982); and Kennett, R. et al., eds., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, Publisher, New York (1980)].

A „kimutatás” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy meghatározzuk egy anyag jelenlétét vagy hiányát, illetve meghatározzuk egy anyag mennyiségét. A szakkifejezés tehát a jelen találmány szerinti anyagokra, készítményekre és módszerekre vonatkozik a mennyiségi és minőségi meghatározásokban való alkalmazás céljából.

Más olyan hibridómák izolálása, amely az előzőkben leírt specifitással rendelkező monoklonális antitesteket szekretálnak, az antiidiotípusos screening technikával hajtható végre [Potocmjak et al., Science, 215, 1637 (1982)]. Röviden, egy antiidiotípusos antitest egy olyan antitest, amely a számunkra érdekes klón által termelt antitesten levő egyedi determinánsokat felismeri. Az antiidiotípusos antitestet úgy állítjuk elő, hogy egy ugyanabba a törzsbe tartozó állatot, mint amelyet a monoklonális antitest forrásaként használtunk, a számunkra érdekes monoklonális antitesttel immunizálunk. Az immunizált állat felismeri, és reagál az immunizáló antitest idiotípusos determinánsaira oly módon, hogy ezekre az idiotípusos determinánsokra specifikus antitesteket termel (antiidiotípusos antitest).

A replikációhoz a hibrid sejteket mind in vitro, mind in vivő tenyészthetjük. Jelenleg előnyösnek a magas in vivő tenyésztési módszert tartjuk. Röviden, az egyes hibrid törzsekből származó sejteket intraperitonálisan injekciózzuk „pristane-primed” BALB/c egerekbe, hogy olyan aszcitesz folyadékot kapjunk, amely nagy koncentrációban tartalmazza a keresett monoklonális antitesteket. Az IgM vagy IgG izotípusba tartozó monoklonális antitesteket a tenyészet felülúszójából tisztíthatjuk, a szakterületen jártas szakember számára jól ismert oszlopkromatográfiás módszert alkalmazva.

A jelen találmány szerinti antitestek különösen alkalmasak immunesszékben való felhasználásra, amikor is mind folyadékfázisban, mind szilárd fázishoz kötve alkalmazhatók. Emellett az ezekben az immunesszékben alkalmazott antitestek különböző módszerekkel kimutathatóan jelezhetők.

A szakterületen jártas szakember számára számos jelzés és jelzési módszer ismert. A jelen találmányban alkalmazható jelölések típusa, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, lehet enzim, radioaktív izotóp, fluoreszcens vegyület, kemilumineszcens vegyület, biolumineszcens vegyület és fémkelát. A szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember más alkalmas, az antitestekhez való kötéshez megfelelő jelzést is ismer, illetve képes a rutinkísérletekben alkalmazni. Továbbá, ezeknek a jelzéseknek az antitestekhez való kötődése kiváltható a szakterületen jártas szakember számára ismert, standard módszerekkel.

Az egyik mód, ahogyan a jelen találmány szerinti antitestek kimutathatóan jelezhetők, ha az antitestet egy enzimhez kapcsoljuk. Ez az enzim viszont, ha később a szubsztrátjával kerül érintkezésbe, a szubsztráttal úgy reagál, hogy egy olyan kémiai egységet hoz létre, amely például spektrofotometriás vagy fluorometriás módszerekkel mutatható ki. Az antitestek kimutatható jelzésére használatos enzimek közé tartozik például a malát-dehidrogenáz, Staphylococcus nukleáz, delta-Vektor-szteroid-izomeráz, élesztő-alkohol-dehidrogenáz, alfa-glicerofoszfát-dehidrogenáz, trióz-foszfát-izomeráz, biotinavidin-peroxidáz, torma-peroxidáz, alkalikus foszfatáz, aszparagináz, glükóz-oxidáz, β-galaktozidáz, ribonukleáz, ureáz, kataláz, glükóz-VI-foszfát-dehidrogenáz, glükoamiláz és acetilkolin-észteráz.

A kimutathatóan jelzett antitestek jelenlétét radioaktív izotópok mint jelzések alkalmazásával is elérhetjük, amelyeket azután gamma-számlálóval vagy szcintillációs számlálóval határozhatunk meg. A jelen találmány céljaira különösen jól használható izotópok az alábbiak: ³H, ³⁷ P, ^l25I, «s, i-»C, ⁵¹Cr, 36C1,⁵⁷Co, ™Co, We és ⁷⁵Se.

Úgy is lehetséges a kimutathatóan jelzett antitestek kimutatása, ha az antitestet egy fluoreszcens vegyülettel jelezzük. Ha egy fluoreszcensen jelzett antitestet a megfelelő hullámhosszúságú fény hatásának teszünk ki, akkor a jelenlétét a festék fluoreszcenciája révén lehet kimutatni. A legáltalánosabban használt fluoreszcens jelző vegyületek a fluoreszcein, az izotiocianát, a

HU 218 732 Β rodamin, a fikoeritrin, a fikocianin, allofikocianin, oftálaldehid és a fkioreszkamin.

A találmány szerinti antitestek kimutathatóan jelezhetők még fluoreszcens fényt kibocsátó fémekkel, például ¹⁵²Eu-val, vagy más, a lantanidasorozatba tartozó fémmel. Ezeket a fémeket az antitestmolekulához fémkelátképző csoportokkal, például dietil-enteriamin-pentaecetsawal (DTPA) vagy etilén-diamin-tetraecetsavval (EDTA) kapcsolhatjuk hozzá.

Az antitestek kimutathatóan jelezhetők még egy kemilumineszcenciás vegyülethez való kapcsolással. A kemilumineszcenciásan jelzett antitest jelenlétét azután a lumineszcencia alapján lehet igazolni, amely a kémiai reakció során keletkezik. A különösen jól használható kemilumineszcens jelző vegyületek közé tartoznak például a huninál, az izoluminol, a theromatikus akridinium-észter, az imidazol, az akridiniumsók, az oxalát-észter és a dioxetán.

Hasonlóképpen, egy biolumineszcens vegyület is használható a jelen találmány szerinti antitestek jelzésére. A biolumineszcencia egy olyan típusú kemilumineszcencia, amelyet olyan biológiai rendszerekben találhatunk, ahol egy katalitikus fehérje fokozza a kemilumineszcens reakció hatékonyságát. Egy biolumineszcens antitest jelenlétét a lumineszcencia jelenléte alapján mutatjuk ki. A jelzéshez jól használható, fontos biolumineszcens vegyület a luciferin és a luciferáz aequorin.

A jelen találmány szerinti antitest és a lényegében tiszta antigén ideálisan alkalmas egy kit készítésére. Egy ilyen kit tartalmazhat egy hordozóeszközt, amely olyan rekeszeket tartalmaz, amely szoros közelségben egy vagy több tartóeszközt, például csöveket, edénykéket és hasonlókat tartalmaz, és mindegyik tartóeszköz a használandó esszé külön-külön elemét tartalmazza.

A kit formába vihető esszétípusok közé tartozhatnak például a kompetitív és nem kompetitív esszék. A találmány szerinti antitesteket használó tipikus esszék a radioimmunesszék (RIA), az enzim-immunesszék (EIA), az enzimkapcsolt immunszorbens esszék (ELISA) és az immunometriás vagy szendvics immunesszék.

Az „immunometriás esszé” vagy „szendvics immunesszé” szakkifejezés alatt szimultán szendvics, szendvics és fordított szendvics immunesszéket értünk. A szakterületen jártas szakember számára ezek a szakkifejezések jól ismertek. A szakterületen jártas szakemberek számára az is nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerinti antitestek más, jelenleg ismert, illetve a jövőben kifejlesztendő esszévariációkban és -formákban is hasznosak lesznek. Ezeket is a jelen találmány oltalmi körébe tartozónak tartjuk.

A vizsgálatok előnyös végrehajtási módjában fontos, hogy bizonyos „blokkolók” legyenek jelen az inkubáló táptalajban (általában a jelzett oldható antitesttel adjuk hozzá). A „blokkolók”-at azért adjuk a rendszerhez, hogy biztosítsuk azt, hogy a nem specifikus fehérjék, proteázok, vagy egér-immunglobulinok elleni antitestek, amelyek a kísérleti mintában megtalálhatók, ne okozzanak keresztkötést, illetve ne tegyék tönkre a szilárd hordozón található antitesteket, illetve a radioaktív izotópokkal jelzett indikátor antitestet, és ezzel ne okozzanak fals pozitív, illetve fals negatív eredményeket. A „blokkolók” szelekciója ennélfogva lényegesen megjavítja a jelen találmány szerinti esszék specificitását.

Kiderült, hogy számos irreleváns (azaz aspecifikus), ugyanabba az osztályba vagy alosztályba tartozó (izotípusú) antitest, mint amelybe a vizsgálatokban használt antitestek tartoznak (például az IgG_b az IgG_2a, az IgM stb.), használható „blokkolóként”. A „blokkolók” koncentrációja (normális körülmények között 1-100 pg/μΙ) lényeges, ha fenn akarjuk tartani a megfelelő érzékenységet, és mégis gátolni akarjuk a nemkívánatos interferenciát, a humán szérumban kölcsönösen fellépő, keresztreakciókat adó fehéijék révén. Emellett a „blokkolókat” tartalmazó pufferrendszert optimalizálni kell. Az előnyös pufferek gyenge szerves savakon alapulnak, például az imidazolon, HEPPS-en, MOPSon, TES-en, ADA-n, ACES-en, HEPES-en, PIPES-en, TRIS-en és hasonlókon, a fiziológiás pH-tartományokban. Valamivel kevésbé előnyösek a szervetlen pufferek, például a foszfát-, borát- vagy karbonátpufferek. Végezetül, az ismert proteáz inhibitorokat hozzá kell adni (normális körülmények között 0,01-10 pg/ml koncentrációban) a pufferhez, amely a „blokkolókat” tartalmazza.

Számos szilárd fázisú immunadszorbens létezik, amely a jelen találmány szerinti eljárásokban alkalmazható. A jól ismert immunadszorbensek közé tartozik az üveg, a polisztirol, a polipropilén, dextrán, nejlon és más anyagok, csövek, gyöngyök és mikrotiterlemezek formájában, amelyek ezekből az anyagokból készültek, illetve ezekkel az anyagokkal vannak borítva, és a hasonló anyagok. Az immobilizált antitesteket vagy kovalens, vagy egyéb fizikai kötéssel rögzíthetjük a szilárd fázisú immunadszorbenshez, például amid- vagy észterkötést alkalmazó technikával vagy abszorpcióval. A szakterületen jártas szakember számára számos más alkalmas, szilárd fázisú immunadszorbens is ismert, valamint módszerek arra, hogy az antitesteket rajtuk immobilizáljuk, illetve képesek ilyenek kidolgozására, csupán rutinkísérletek alkalmazásával.

Az in vivő, in vitro vagy in situ diagnózishoz a jelzéseket, például a radioaktív atommagokat a jelen találmány szerinti antitestekhez vagy közvetlenül, vagy intermedier funkciós csoporton keresztül kapcsolhatjuk hozzá. Egy intermedier csoport, amelyet gyakran használnak fémkation formában létező radioaktív izotópok antitestekhez való kötésére, a dietilén-triamin-pentaecetsav (DTPA). Az ily módon kötött fémkationok tipikus példái: ^99mTc, ¹²³I, ^1HIn, ¹³¹1,⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga és ⁶⁸Ga. A találmány szerinti antitestek a diagnosztizálás céljából nem radioaktív izotópokkal is jelezhetők. Az ebből a szempontból különösen jól használható elemek például a ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr és az ⁵⁶Fe.

A találmány szerinti antigént lényegében tiszta formában izolálhatjuk, a jelen találmány szerinti antitestek alkalmazásával. Ezért a jelen találmány egyik megvalósítási módjában a találmány tárgyát eljárás képezi lényegében tiszta T-sejt-receptor, B-sejt-receptor vagy Fcreceptor kiméra előállítására, és az említett antigént az

HU 218 732 Β jellemzi, hogy a jelen találmány szerinti antitestek felismerik, és azokhoz kötődik. Egy másik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya eljárás a receptor kiméra antigénjének izolálására és tisztítására oly módon, hogy az említett antigénből és egy vagy több, a receptor kiméra elleni antitestből komplexet képezünk.

A jelen találmány szerinti lényegében tiszta T-sejtreceptor, B-sejt-receptor vagy Fc-receptor kiméra antigének emellett használhatók a kiméra elleni antitest kimutatására vagy mérésére egy mintában, például szérumban vagy vizeletben. Tehát a jelen találmány egyik megvalósítási módja szerinti a találmány tárgyát eljárás képezi a receptor kiméra antigén jelenlétét vagy mennyiségét egy mintában meghatározó eljárás, azzal jellemezve, hogy az egy antitest elleni kiméraantigént tartalmazó mintát kimutathatóan jelzett receptor kimérával hozzuk érintkezésbe, majd az említett jelzést kimutatjuk. Az nyilvánvaló, hogy a kiméra immunreaktív frakciói és immunreaktív analógjai is használhatók. Az „immunreaktív frakció” szakkifejezés alatt a kiméraantigén bármely olyan része értendő, amely egy, a receptor kiméra elleni antitesttel ekvivalens immunválaszt mutat. Az „immunreaktív analóg” szakkifejezés alatt olyan fehérjét értünk, amely egy vagy több aminosavban eltér a receptor kimérafehéijétől, de a találmány szerinti antitesttel ekvivalens immunválaszt mutat.

A „specifikusan felismer és kötődik hozzá” szakkifejezés alatt egy olyan antitestet értünk, amely egy kimérareceptor polipeptidet felismer és megköt, de amely lényegében nem ismer fel és nem köt meg más, a mintában (például egy, a receptor polipeptidet tartalmazó biológiai mintában) található molekulákat.

Az „autoimmunfolyamatban keletkező sejt” olyan sejteket jelent, amelyek a gazdaszervezet szöveteivel reagáló antitesteket termel, illetve autoreaktív immuneffektor T-sejteket; az ilyen sejtek acetilkolin-receptorok elleni antitesteket (amelyek például izomsorvadást okoznak) vagy anti-DNS, antieritrocita és antivérlemezke autoantitesteket (amelyek a lupus erythematosushoz vezetnek) tartalmaznak.

A „terápiás sejt” szakkifejezés alatt egy olyan sejtet értünk, amelyet egy, a jelen találmány szerinti kimérával transzformáltunk, és ezáltal a sejt képes felismerni és elpusztítani egy specifikus fertőző ágenst, egy specifikus ágenssel fertőzött sejtet, egy tumor- vagy rákos sejtet vagy egy autoimmun folyamatban keletkező sejtet; ezek a terápiás sejtek előnyösen a hematopoietikus rendszer sejtjei.

Az „extracelluláris” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy a molekulának legalább egy része a sejt felszínén található. Az „intracelluláris” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy a molekulának legalább egy része a terápiás sejt citoplazmájában található. A „transzmembrán” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy a molekulának legalább egy része keresztülér a plazma membránján. A továbbiakban az „extracelluláris rész”, „intracelluláris rész” és a „transzmembrán” részjelentése olyan határoló aminosavszekvencia, amely a szomszédos celluláris kompartmentekbe nyúlik bele.

Az „oligomerizál” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy más fehéijékkel képzett komplex keletkezése révén dimerek, trimerek, tetramerek vagy más, nagyobb tagszámú oligomerek jönnek létre. Ezek az oligomerek lehetnek homooligomerek vagy heterooligomerek. Egy „oligomerizáló rész” a molekulának az a régiója, amely a komplex (azaz oligomer) képződését irányítja.

A „citolitikus” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy képes egy sejtet elpusztítani (például egy patogénnel fertőzött sejtet, egy tumor- vagy rákos sejtet, vagy egy autoimmunfolyamatban keletkező sejtet), illetve képes egy fertőző ágenst (például egy vírust) elpusztítani.

Az „immundeficiencia-vírus” szakkifejezés alatt egy retrovírust értünk, amely vad típusú formájában képes főemlős Y4 sejtjeit megfertőzni, és a lentivíruscsalád virális morfogenezisével, illetve morfológiai jellemzőivel rendelkezik. A szakkifejezés vonatkozik, korlátozások nélkül, a HÍV és a SIV összes variánsaira, beleértve a HIV-1, HIV-2, SlVmac, SIVagm, SlVmnd, SlVsmm, SlVman, SlVmand és SIVcpz vírusokat.

Az „MHC-független” szakkifejezés azt jelenti, hogy a celluláris citolitikus válasznak nincs szüksége egy MHC II osztályba tartozó antigén jelenlétére a megcélzott sejt felszínén.

A „funkcionális citolitikus szignál-transzdukáló származék” szakkifejezés alatt egy olyan funkcionális származékot értünk (a fentiekben leírt módon), amely képes a vad típusú molekula biológiai aktivitásának legalább 10, előnyösen 40, még előnyösebben 70, legelőnyösebben legalább 90%-át irányítani. A továbbiakban egy „funkcionális citolitikus szignál-transzdukáló származék” úgy működhet, hogy közvetlenül jelez a terápiás sejtnek, hogy pusztítson el egy receptorhoz kötött ágenst vagy sejtet (például egy intracelluláris kimérareceptor rész esetében), illetve hathat indirekt módon is, oly módon, hogy elősegíti az oligomerizációt a terápiás sejt citolitikus szignál-transzdukáló fehérjéivel (azaz például egy transz-membrán dómén esetében). Az ilyen származékok hatékonysága vizsgálható, például az alábbiakban ismertetett in vitro vizsgálatokkal.

A „funkcionális HIV-burok-kötő származék” szakkifejezés alatt egy olyan funkcionális származékot értünk (az előző meghatározás alapján), amely képes bármely HIV-burokfehérje megkötésére. A funkcionális származékokat például az alábbiakban ismertetett in vitro vizsgálatokkal lehet azonosítani.

A jelen találmány szerinti transzformált sejtek számos betegség kezelésében használhatók. Az ilyen transzformált sejtek beadásának jelenlegi módszere az adoptív immunterápia vagy sejttranszferterápia. Ezek a módszerek lehetővé teszik, hogy a transzformált immunrendszersejtek visszatérjenek a véráramba [Rosenberg, S. A., Scientific American, 62 (1990. május); Rosenberg et al., The New England Journal of Medicine, 323(9), 570 (1990)].

A találmány szerinti gyógyászati készítmények bármely olyan állatnak beadhatók, amely élvezi a találmány szerinti hatóanyagok előnyös hatásait. Az ilyen állatok közül legfontosabbak az emberek, bár a jelen találmány nem korlátozódik rájuk.

HU 218 732 Β

A továbbiakban ismertetjük a mellékletben szereplő ábrákat.

Az 1. ábrán a CD4 kimérák jellemzése látható. Az la. ábrán látjuk a CD4 (1-369-es aminosavmaradékok) és a különböző receptorláncok fúziós helye aminosavsorrendjét. Az aláhúzott szekvencia mutatja azoknak az aminosavaknak a sorrendjét, amelyek a fúziós konstrukcióban használt BamHI hasítási helyen belül találhatók. A transzmembrán dómén kezdetét egy függőleges vonal jelzi. Az éta-szekvencia azonos a dzéta-szekvenciával az N-terminálisnál, de a C-terminálisnál eltérnek egymástól [Jin et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, 3319-3323 (1990)]. Az lb. ábrán a CD4, CD4:dzéta, CD4: gamma és a CD4:éta CV1 sejtekben való sejtfelszíni expressziójának áramlási citometriai elemzése látható. A sejteket CD4 kimérákat vagy CDlópj-t expresszáló vírusokkal fertőztük, 9 óra hosszat inkubáltuk 37 °C-on, majd fikoeritrinnel konjugált anti-CD4 MAb Leu3A-val festettük. Az le. ábrán a CV1 sejtekben expresszált jelzett CD4: dzéta, CD4: gamma vagy természetes CD4 immunprecipitációját mutatja. Az egyes sávokat redukálószerrel (R) vagy redukálószer nélkül (NR) futtattuk. A molekulasúly-standardok a bal oldalon láthatók kDa-ban.

A 2. ábrán a CD16j_M sejtfelszíni expressziója látható, csak CDló-j^-mel végzett együttfertőzés után (fekete pontok), CD4: gammát vagy CD4: dzétát expresszáló vírussal való együttfertőzés után (vonalak, illetve folyamatos vonal). A ritka pontok a csak CD4: dzétával fertőzött sejteket jelentik, 3G8-cal festve [Fleit et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79, 3275-3279 (1982)] (anti-CD16 MAb).

A 3. ábrán az látható, hogy a dzéta Asp- 15-öt tartalmazó mutáns CD4:dzéta-kimérareceptorok nem támogatják a CD16_tm koexpresszióját. A 3a. ábrán egy autoradiogram látható az immunprecipitált mutáns kimérákról, amelyeket redukció (R) után, vagy redukció nélkül (NR) elektroforetizáltunk. A 3b. ábrán a CD 16_TM felszíni expressziójának részletei láthatók, CD16_TM-et és az alábbi dzéta-kimérákat expresszáló vírusokkal való együttfertőzés után: CD4:dzéta (vastag vonal), CD4: dzéta C11G (folyamatos vonal); CD4: dzéta (szaggatott vonal); CD4:dzéta C11G/D15G (sűrű pontok); nincs együttfertőzés (csak a CD16_TM, ritka pontok). A sejteket anti-CD16 MAb 3G8-cal inkubáltuk, majd fikoeritrinnel konjugált Fab’₂, egér-IgG elleni kecskeantitestekkel inkubáltuk. A dzéta-kimérák expressziójának szintje lényegében azonos a vizsgált különböző mutánsok esetében, és a sejtek együttfertőzése olyan vírusokkal, amelyek CD16_TM és dzéta-kimérákat expresszálnak, nem változtatja meg lényegesen a kimérák sejtfelszíni expresszióját (nem közölt adatok).

A 4. ábrán az látható, hogy megnövekedett intracelluláris szabad kalciumion-tartalom követi a mutáns dzéta-kimérák keresztkötésének kialakulását T-sejtvonalban. Jurkat E6 sejteket [Weiss et al., J. Immunoi., 133,123-128 (1984)] fertőzünk rekombináns vakcíniavírusokkal, és áramlási citometriával elemezzük. A bemutatott eredmények a kapott CD4+ populációra vonatkoznak, úgyhogy csak a releváns kimérafehérjét expresszáló sejteket elemezzük. Az ibolya és a kék Indo-1 fluoreszcencia átlagos aránya tükrözi az intracelluláris szabad kalciumkoncentrációt az egész populációban, és a reagáló sejtek százaléka tükrözi azoknak azt a sejtfrakciót, amely sejtek meghaladnak egy előre meghatározott küszöbértéket (úgy van beállítva, hogy a kezeletlen sejtek 10%-a pozitív). A 4a. és a 4b. ábrán olyan Jurkat-sejtek láthatók, amelyek CD4: dzétát (folyamatos vonal) vagy CD16: dzétát (szaggatott vonal) expresszálnak, és amelyeket anti-CD4 MAb Leu3A-val (fikoeritrin konjugátum) hoztunk érintkezésbe, majd egér-IgG elleni kecskeantitesttel keresztkötéseket hoztunk létre. A pontozott vonal a nem fertőzött sejtek által az anti-CD3 MAb OKT3-ra adott választ mutatja. A 4c. és 4d. ábrákon olyan, CD4:dzétaD15G-t (folyamatos vonal); CD4:dzétaCllG/D15G-t (szaggatott vonal); vagy CD4:dzétaCllG-t (pontok) expresszáló Jurkat-sejteket láthatunk, amelyeket a 4a. és 4b. ábránál leírt módon kezeltünk és elemeztünk.

Az 5. ábrán az látható, hogy a CD4: dzéta-, CD4:éta- és CD4: gamma-receptorok lehetővé teszik, hogy a citolitikus T-limfociták (CTL) elpusztítsák a HIV-1 gp 120/41-et expresszáló célpontokat. Az 5a. ábrán a teli körök azt a CD4: dzétát expresszáló CTL-t jelentik, amelyet gp 120/41-et expresszáló HeLa-sejtekkel inkubáltunk; az üres körök azokat a CD4: dzétát expresszáló sejteket jelentik, amelyeket fertőzetlen HeLa-sejtekkel inkubáltunk; a teli négyszögek azokat a fertőzetlen CTL-sejteket jelentik, amelyeket gpl20/41-et expresszáló HeLa-sejtekkel inkubáltunk; az üres négyszögek azokat a fertőzetlen CTL-sejteket jelentik, amelyeket fertőzetlen HeLa-sejtekkel inkubáltunk. Az 5b. ábrán a teli körök jelentése CD4: dzétát expresszáló CTL, gpl20/41-et expresszáló HeLa-sejtekkel inkubálva; az üres körök jelentése CD4: gammát expresszáló CTL, gpl20/41-et expresszáló HeLa-sejtekkel inkubálva; az üres négyszögek jelentése a Cl 1G/D15G dupla mutáns CD4: dzéta kimérát expresszáló CTL, gpl20/41-et expresszáló HeLa-sejtekkel inkubálva. Az 5c. ábrán az 5b. ábránál használt CTL CD4 expressziójának áramlási citometriás elemzése látható. A célpont-effektor arány helyesbítésére a CD4 kimérát expresszáló sejtek százalékát meghatároztuk, oly módon, hogy a méretezett negatív (fertőzetlen) populációt kivontuk, hisztogram-szuperpozíció alkalmazásával; összehasonlítás céljából ezen az ábrán a fertőzetlen sejtekhez egy önkényes küszöbértéket rendeltünk hozzá, amely durván ugyanazt, a más sejtpopulációkra pozitív frakciót adja, mint a hisztogramkivonás.

A 6. ábrán a CD4-irányított citolízis specifitása látható. A 6a. ábrán a tele körök jelentése CD4: dzétát expresszáló CTL, CD16_P]-t expresszáló HeLa-sejtekkel inkubálva; az üres körök jelentése CD4-et expresszáló CTL, gpl20-at expresszáló HeLa-sejtekkel inkubálva; a teli négyszögek jelentése CDI6: dzétát expresszáló CTL, gpl20/41-et expresszáló HeLasejtekkel inkubálva; az üres négyszögek jelentése CD16pj-t expresszáló CTL, gpl20/41-et expresszáló HeLa-sejtekkel inkubálva. A 6b. ábrán a tele körök jelentése CD4: dzétát expresszáló CTL, Raji (MHC II⁺

HU 218 732 Β osztály) sejtekkel inkubálva; az üres körök jelentése fertőzetlen CTL-sejtek, RJ2. 2. 5 (MHC II. osztály Raji mutáns) sejtekkel inkubálva; a tele négyszögek jelentése fertőzetlen CTL-sejtek, Raji (MHC 11+ osztály) sejtekkel inkubálva; az üres négyszögek jelentése CD4:dzétát expresszáló CTL-sejtek, RJ2. 2. 5 (MHC II- osztály) sejtekkel inkubálva. Az ordináta skálája nyújtott.

A 7. ábrán a CD16:dzéta-kimérareceptor jellemzése látható. A 7a. ábra a CD16: dzéta fúziós fehéije sematikus diagramja. A monomer CD 16 foszfatidil-inozitolkapcsolt formájának extracelluláris részét összekötjük a dimer dzétával, éppen a transzmembrán dómén külsején. A fúziós kapcsolódás fehérjeszekvenciáját az alján mutatjuk be. A 7b. ábrán a kalciummobilizáció áramlási citometriás elemzését láthatjuk, a CD16:dzéta-kiméra keresztkötés kialakítása után mind a TCR pozitív vagy TCR negatív sejtvonal után. Az ibolya és a kék fluoreszcencia átlagos arányát (amely a relatív kalciumion koncentrációjának a mértéke) mutatjuk a 0 időpontban antitestekkel kezelt sejtpopulációknál. A tele négyszögek jelentése a Jurkat-sejtek válasza az anti-CD3 MAb OKT3-ra; a tele háromszögek jelentése a CD16: dzéta válasza az anti-CD16 MAb 3G8 keresztkötésére a REX33A TCR- mutánsban; az üres négyszögek jelentése a CD16:dzéta keresztkötésre adott válasz a JRT3. T3. 5 Jurkat TCR- mutáns sejtvonalban; az üres háromszögek jelentése a CDI6: dzéta keresztkötésre adott válasz a Jurkat-sejtekben; a keresztek jelentése a nem kiméra CD16-ra adott válasz a Jurkat-sejtekben; a pontok jelentése pedig a nem kiméra CD16-ra adott válasz a REX33A TCR sejtvonalban.

A 8. ábrán a citolitikus potenciál deléciós elemzése látható. A 8a. ábrán a dzéta-deléciós végpontok helye látható. Itt csakúgy, mint máshol, a dzétában levő mutációkat az eredeti csoport lokalizációja-mutáns csoport konvenció alapján mutatjuk be úgy, hogy a D66* például az Asp-66 helyettesítését jelenti egy terminációs kodonnal. A 8b. ábrán a nem törölt CD16: dzéta és a kiemelkedő dzéta-deléciók citolitikus vizsgálatának eredményei láthatók. A CD 16 elleni sejtfelszíni antitesteket expresszáló hibridómasejteket ⁵¹Cr-mal feltöltjük, majd növekvő számú humán citolitikus limfocitával (CTL) inkubáljuk, amelyeket CD16:dzéta-kimérákat expresszáló vakcíniarekombinánsokkal fertőztünk. A felszabadult ⁵¹Cr százalékát az effektor (CTL) sejtnek a megcélzott (hibridóma) sejt arányának függvényében (e/t) ábrázoljuk. A tele körök jelentése a CD16:dzétát (mft 18,7) expresszáló sejtek által kifejtett citolízis; a tele négyzetek jelentése CD16: dzéta Asp66*-ot (mfi 940,2) expresszáló sejtek által kifejtett citolízis; az üres négyzetek jelentése CD16: dzéta Glu60*-at (mfi 17,8) expresszáló sejtek által kifejtett citolízis; az üres körök jelentése CD16:dzéta Tyr51*-et (mfi 17,4) expresszáló sejtek által kifejtett citolízis; a tele háromszögek jelentése CD16: dzéta Phe34*-et (mfi 17,8) expresszáló sejtek által kifejtett citolízis; az üres háromszögek jelentése pedig a nem kiméra CD16-ot (mfi 591) expresszáló sejtek által kifejtett citolízis. Jóllehet ebben a kísérletben a CD16: dzéta Asp* expressziója nem volt olyan, mint más fúziós fehérjéké, a CD16:dzétát az ugyanabban a kísérletben azonos szinten expresszáló sejtek által kifejtett citolízis lényegében ugyanolyan eredményeket adott, mint amilyeneket a CDI6: dzéta Asp66*-ot expresszáló sejtekkel kapunk (nem közölt adatok).

A 9. ábrán az látható, hogy a transzmembrán kölcsönhatások potenciáljának az eliminálása egy olyan rövid dzéta-szegmentet tár fel, amely képes befolyásolni a citolízist. A 9a. ábra a monomer bipartita és tripartita kimérák sematikus diagramja. A felső részen látható a CD16: dzéta konstrukció, amely a 65-ös pozícióban csonkult, és hiányzik róla a transzmembrán Cys és Asp rész. Az alsó részen látható a CD16: CD5: dzéta és CD16: CD7: dzéta konstrukció, valamint a kapcsolódó kontrollok. Az intracelluláris domének peptidszekvenciái láthatók alul. A 9b. ábrán a monomer kiméra deléciós mutánsok citolitikus aktivitása látható. A CD16:dzétát expresszáló sejtek citolitikus aktivitását (tele körök; mfi 495) hasonlítjuk össze a CD16: dzéta Asp66*-ot expresszáló sejtek citolitikus aktivitásával (tele négyzetek; mfi 527), illetve a CD16:dzéta CysllGly/Aspl5Gly/Asp66* mutáns citolitikus aktivitásával (üres négyzetek; mfi 338) és a CD16: dzéta CysllGly/Aspl5Gly/Glu60* citolitikus aktivitásával (tele háromszögek; mfi 259). A 9c. ábrán a tripartita fúziós fehérjék által kifejtett citolitikus aktivitás látható. A tele háromszögek jelentése CD16: dzéta Asp66*; az üres négyzetek jelentése CD16:7:dzéta(48-59); az üres körök jelentése CD16:5; a tele körök jelentése CD16:7. A 9d. ábrán látható a mutánsok és tripartita kimérák által kifejtett kalciummobilizáció TCR negatív Jurkat JRT3.T3.5 mutáns sejtvonalban. Az üres körök jelentése a dimer CD16: dzéta Asp66*-ot expresszáló sejtek válasza; a tele négyzetek jelentése a CD16: dzéta CysllGly/Aspl5Gly/Asp66*-ot expresszáló sejtek válasza; az üres négyzetek jelentése a CDI6: dzéta CysllGly/Aspl5Gly/Glu60*-at expresszáló sejtek által adott válasz; a tele háromszögek jelentése a CD16:7:dzéta(48-65)-öt expresszáló sejtek által adott válasz; az üres háromszögek jelentése pedig a CD16:dzétát(48-59) expresszáló sejtek által adott válasz.

A 10. ábrán az egyes aminosavaknak a 18 csoportból álló citolitikus szignál-transzdukáló motívum aktivitásához való hozzájárulása látható. A 10a. és 10b. ábrákon a citolitikus aktivitás, a 10c. ábrán pedig a Cterminális tirozinhoz közel pontmutációkat hordozó kimérák (Y62) által kifejtett kalciumion-mobilizáció látható. A 10a. és 10b. ábra olyan sejtekkel kapott adatokat mutat be, amelyek a CD16: dzéta fúziós fehérjét kis és nagy mennyiségben expresszálják. Azonos szimbólumokat használunk a kalciummobilizációs és citolitikus vizsgálatokban, ezeket egybetűs kóddal a jobb oldalon mutatjuk be. A tele körök jelentése CD16:dzétát (mfi A, 21; B, 376); a tele négyzetek jelentése CD16:dzéta (48—65)-öt (mfi A, 31; B, 82) expresszáló sejtek; a keresztek jelentése CD 16:7: dzéta(49-65)Asp63Asn-t (mfi A, 30; B, 74) expresszáló sejtek; a tele háromszögek jelentése CD16:7:dzéta(48-65)Tyr62Phe-t (mfi A, 24; B, 88) expresszáló sejtek; az üres körök jelenté12

HU 218 732 Β se CD16:7:ddzéta(48-65)Glu61Gln-t (mfi A, 20; B, 62) expresszáló sejtek; az üres háromszögek jelentése pedig CD16:7:ddzéta(48-65)Tyr62Ser-t (mfí B, 64) expresszáló sejtek. A lOd. és lOe. ábrákon citolitikus aktivitást látunk, a lOf. ábrán az N-terminális tirozinhoz közel pontmutációkat hordozó kimérák (Y51) által kifejtett kalciumion-mobilizáció látható. Azonos szimbólumokat használunk a kalciummobilizációhoz és a citolitikus vizsgálatokhoz, ezeket a jobb oldalon mutatjuk be. A tele körök jelentése CD16:zétát (mfí D 21,2; E, 672) expresszáló sejtek; a tele négyzetek jelentése CD16:7:ddzéta(48-65)-öt (mfí D, 31,3; E, 179) expresszáló sejtek; a tele háromszögek jelentése CD16:7:ddzéta(48-65)Asn84Ser-t (mfí D, 22,4; E, 209) expresszáló sejtek; az üres négyzetek jelentése CD16:7:ddzéta(48-65)Leu50Ser-t (mfí D, 25,0, E, 142) expresszáló sejtek; az üres háromszögek jelentése pedig CD16:7:ddzéta(48-65) Tyr51Phe-t (mfí D, 32,3; E, 294) expresszáló sejtek.

All. ábrán a dzéta belső ismétlődő szakaszai láthatók, valamint a citolízist támogató képességük összehasonlítása. A 11a. ábra a kimérák sematikus diagramját mutatja, amelyek úgy jöttek létre, hogy a dzéta intracelluláris doménjét harmadokra osztjuk, és a CD16:7 kiméra transzmembrán doménjéhez kapcsoljuk. Az intracelluláris domének szekvenciáit mutatjuk az alábbiakban, a közös csoportokat bekeretezve, a rokon csoportokat pedig csillaggal jelezve. A 1 lb. ábrán a három dzéta szubdomén citolitikus potenciálja látható. A tele körök jelentése olyan sejtek, amelyek CD16:dzétát (mfí 476) expresszálnak; a tele négyzetek jelentése olyan sejtek, amelyek CD16:dzéta(33-76)-ot (mfí 68) expresszálnak; az üres négyzetek jelentése olyan sejtek, amelyek CD16:7:dzéta(71-104)-et (mfí 114) expresszálnak; a teli háromszögek jelentése olyan sejtek, amelyek CD16 :7:dzéta(104-138)-at (mfí 104) expresszálnak,

A 12. ábrán a CD16:FcR-gamma-II kimérák sematikus diagramja látható.

A 13. ábrán a CD4: FcR-gamma-II és a CD16:FcR-gamma-II kimérák keresztkötése utáni kalciummobilizáció látható. A 13a. ábra a kalciumérzékeny Indo-I fluoroforral töltött sejtek által kibocsátott ibolya és a kék fluoreszcencia arányát mutatja az idő függvényében, a CD16 extracelluláris doménjének antitestekkel való keresztkötése után. A 13b. ábrán a CD4:Fc-gamma-II kimérákat hordozó sejtek ibolyakék fluoreszcenciájának arányában beállt változás látható, az antitestekkel való keresztkötés kialakulása után.

A 14. ábrán a CD4:FcR-gamma-II és a CD16:Fc-gamma-II kimérák citolízisvizsgálata látható. A 14a. ábrán az anti-CD16 hibridóma (cél)-sejtekről felszabaduló ^5lCr százalékát láthatjuk, ha a sejteket növekvő mennyiségű olyan citotoxikus T-limfocita hatásának tesszük ki, amelyek CD16:Fc-gamma-II kimérákat expresszálnak (effektorsejtek). A 14b. ábrán a citotoxicitás hasonló elemzése látható, amely citotoxicitást a HIV-burok glikoproteint expresszáló célsejtek elleni CD4: Fc-gamma-II kimérák befolyásolnak.

A 15. ábrán a citolízis szempontjából az FcR-gamma-II A farkában található csoportok azonosítása látható. A 15a. diagram egy sematikus ábrázolása a deléciós konstrukcióknak, A 15b. és 15c. ábrákon a CD16:FcR-gamma-II A C-terminális deléciós variánsainak kalciummobilizációja és citolízise látható. A 15d. és 15e. ábrákon a CD16: FcR-gamma-Π A intracelluláris farkának N-terminálisából egyre kevesebbet tartalmazó tripartita kimérák kalciummobilizálása és citolízise látható.

A 16. ábrán (SEQ ID NO. 24) a CD3 delta-receptor fehérje aminosavszekvenciája látható; a bekeretezett szekvencia egy előnyös citolitikus szignál-transzdukáló részt jelent.

A 17. ábrán (SEQ ID NO. 25) a T3 gamma-receptor fehéije aminosavszekvenciája látható; a bekeretezett szekvencia egy előnyös citolitikus szignál-transzdukáló részt jelent.

A 18. ábrán (SEQ ID NO. 26) az mbl receptorfehérje aminosavszekvenciája látható; a bekeretezett szekvencia egy előnyös citolitikus szignál-transzdukáló részt jelent.

A 19. ábrán (SEQ ID NO. 27) a B29 receptor fehérje aminosavszekvenciája látható; a bekeretezett szekvencia egy előnyös citolitikus szignál-transzdukáló részt jelent.

I. példa

A humán IgGl: re kimérák készítésére

A humán IgGl nehézlánc-szekvenciákat úgy állítjuk elő, hogy a C_H3 doménban levő szekvenciákat egy olyan cDNS-fragmenthez kapcsoljuk, amely az antitest mRNS-transzmembrán formája 3’-végéből származik. A 3’-végi fragmentet úgy állítjuk elő, hogy polimeráz láncreakciót hajtunk végre egy mandula cDNSkönyvtáron mint szubsztráton, valamint az alábbi szekvenciával rendelkező oligonukleotidokkal:

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (SEQ ID NO. 7) és

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (SEQ ID NO. 8), amelyek a keresett DNS-szekvenciák 5’-, illetve 3’-végének felelnek meg. Az 5’ oligonukleotid a humán IgGl C_H1 doménje egyik helyének felel meg, a 3’ oligonukleotid pedig egy olyan hellyel komplementer, amely a membránon átnyúló domént kódoló szekvenciáktól közvetlenül 5’-irányban levő hellyel komplementer. A PCR-terméket BstXI és BamHl restrikciós enzimmel emésztjük, majd egy szemiszintetikus IgGl antitestgén BstXI és BamHl hasítási helyével ligáljuk, amely konstans és variábilis régiókat hordoz. A BstXI-BamHI fragment beépítését követően a konstrukció amplifikált részét a C_H3 Smal helyéig kicseréljük, restrikciós fragment cserével, oly módon hogy csak a Smal és a 3’ oligonukleotid közötti rész származik a PCR-reakcióból.

Egy humán IgGl; dzéta-kimérareceptor készítéséhez az egy BamHl hasítási helyben végződő nehézláncgént a dzéta kimérának az alábbiakban ismertetett BamHl hasítási helyéhez kapcsoljuk oly módon, hogy a keletkező antitestszekvenciák hozzák létre az extracel13

HU 218 732 Β luláris részt. A kimérát kódoló plazmiddal transzfektált COS sejtek áramlási citometriás elemzése azt mutatja, hogy az antitestdeterminánsok magas szintű expresszióját mutatják, ha egy könnyűlánc cDNS-kódoló expressziós plazmiddal kotranszfektáljuk, és az antitestdeterminánsok közepes szintű expressziója figyelhető meg, ha a könnyűláncot kódoló plazmid hiányzik.

Hasonló kimérák állíthatók elő, beleértve a dzétához vagy étához fuzionált humán IgG-t (lásd az alábbiakban), vagy egy T-sejt-receptor vagy Fc-receptor-fehérje bármely szignáltranszdukciós része általában előállítható, a molekuláris biológia standard technikáinak alkalmazásával.

Egy olyan transzkripciós egység készítése céljából, amely lehetővé teszi, hogy mind a nehéz-, mind a könnyűlánc expresszálhasson egyetlen promoterről, egy olyan plazmidot készítünk, amely mind a nehéz-, mind a könnyűláncot kódoló bicisztronos mRNS-t tartalmaz, valamint a 78 kDA méretű, glükóz által szabályozott fehérjét kódoló mRNS 5’ nem transzlálódó részét, amely más néven grp78 vagy BiP néven is ismert. A grp78 szekvenciákat humán genomiális DNS-ből állítjuk elő, az alábbi szekvenciával rendelkező indítómolekulák alkalmazásával:

CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEQ ID NO. 9) és

CGC CTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ ID NO. 10) az 5’-, illetve 3’-végeken. Ezekkel az oligonukleotidokkal a polimeráz láncreakciót 10% dimetil-szulfoxid jelenlétében végezzük. A PCR-rel kapott fragmentet NotI és HincII restrikciós enzimmel emésztjük, majd a humán IgGl-et kódoló szekvenciák utáni NotI és Hpal hasítási helye közé építjük be. A humán IgG kappakönnyűláncot kódoló cDNS-t ez után egy grp78 leaderszekvencia után építjük be, a HincII, valamint egyéb hasítási helyek alkalmazásával. Az ezekből a manipulációkból származó expressziós plazmidok egy félszintetikus nehézláncgént tartalmaznak, ezt követi a grp78 leaderszekvencia, majd ezt követi a kappa-könnyűlánc cDNS-szekvencia és az SV40 DNS-fragmentből származó poliadenilezési szignál. A COS-sejtek transzfekciója az expressziós plazmiddal jelentősen megnövekedett expressziót ad a nehézlánc-determinánsokra, összehasonlítva a csak nehézlánc-determinánsokat kódoló plazmiddal végzett transzfekcióval.

Abból a célból, hogy egy nehézlánc/receptor kimérát és egy könnyűláncot tartalmazó bicisztronos gént készítsünk, az upstream nehézlánc-szekvenciákat bármely, az alábbiakban ismertetett kiméra nehézlánc/receptor génnel helyettesíthetjük.

IL példa

CD4 receptor kimérák készítése

Humán dzéta [Weissman et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 9709-9713 (1988b)] és gamma [Küster et al., Journal of Biological Chemistry, 265, 6448-6452 (1990)] cDNS-eket izolálunk a polimeráz láncreakció segítségével a HPB-ALL tumorsejtvonalból készített könyvtárakból [Aruffo et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 8573-8577 (1987b)], valamint humán természetes ölősejtekből, míg az éta-cDNS-t [Jin et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, 3319-3323 (1990)] rágcsáló-timocitakönyvtárból állítjuk elő. A dzéta-, éta- és gamma-cDNS-eket a CD4 egy megváltoztatott formája extracelluláris doménjéhez kapcsoljuk, amely egy BamHI restrikciós hasítási helyet tartalmaz közvetlenül a membránon átnyúló szakasz előtt [Aruffo et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 8573-8577 (1987b); Zettlmeissl et al., DNA Cell Bioi., 9, 347-353 (1990)], amelyet a dzéta- és az éta-cDNS-ekben hasonló helyen a membránon átnyúló dómén előtt természetesen megtalálható BamHI helyhez kapcsoljuk (SEQ ID NO. 1, 3, 4 és 6). A gamma fúziós fehérjéjének az előállításához egy BamHI hasítási helyet építünk be a szekvenciába, ugyanabban a közelítő pozícióban (1. ábra; SEQ ID NO. 2 és 5). A génfüziókat egy olyan vakcíniavírus expressziós plazmidba juttatjuk be, amely szelekciós markerként az Escherichia coli gpt génjét hordozza [M. Amiot és B. S., nem publikált eredmény), majd a vakcínia WR törzs genomjába építjük be homológ rekombinációval, a növekedés szelekcióját mikofenolsav jelenlétében végezzük [Falkner et al., J. Virol., 62, 1849-1854 (1988); Boyle et al., Gene, 65, 123-128 (1988)]. Az áramlási citometriás elemzés azt mutatja, hogy a vakcíniarekombinánsok irányítják a CD4: dzéta és CD4:éta fúziós fehérjék nagy mennyiségű expresszióját a sejt felszínén, míg a CD4:éta expressziója lényegesen gyengébb (1. ábra). Az utóbbi megfigyelés azzal a legújabb jelentéssel, hogy egy éta cDNS-expressziós plazmid transzfekciója egy rágcsáló-hibridómasejtvonalba lényegesen kisebb expressziót eredményez, mint egy összehasonlítható dzéta expressziós plazmiddal végzett transzfekció [Clayton et al., J. Exp. Med., 172, 1243-1253 (1990)]. A vakcíniarekombinánsokkal fertőzött sejtek immunprecipitációja felfedte, hogy a fúziós fehérjék kovalens dimereket hoznak létre, eltérően a természetes CD4 antigéntől (1. ábra). A monomer CD4: dzéta és CD4: gamma fúziós fehérjék és a természetes CD4 molekulasúly 63, 55, illetve 53 kDa. A fúziós fehérjék nagyobb molekulasúlya lényegében konzisztens az intracelluláris rész nagyobb hosszával, amely 75 aminosavval (CD4:zéta), illetve 5 aminosavval (CD4: gamma) meghaladja a természetes CD4 hosszát.

III. példa

A CD4 kimérák asszociálódhatnak más receptor láncokkal

A humán Fc-gamma-RIII (CD16_TM) makrofág/természetes ölősejt formájának sejtfelszíni expresszióját a transzfektánsokon meg lehet könnyíteni rágcsáló [Kurosaki et al., Natúré, 342, 805-807 (1989)] vagy humán [Hibbs et al., Science, 246, 1608-1611 (1989)] gamma, valamint humán dzéta [Lanier et al., Natúré, 342, 803-805 (1989)] szekvenciákkal való kotranszfekcióval.

HU 218 732 Β

Ezekkel a közlésekkel összhangban, a kimérák expressziója is lehetővé tette a CDI 6™ sejtfelszíni expresszióját, ha a célsejtbe vagy kotranszfekcióval vagy koinfekcióval bejuttatjuk rekombináns vakcíniavírusok alkalmazásával (2. ábra). A CD 16™ sejtfelszíni expressziójának elősegítése dzéta segítségével sokkal erősebb, mint a gammával való elősegítés (2. ábra) a vizsgált sejtvonalakban, míg a natív CD4 (nem közölt adatok) nem fokozzák a CD 16™ sejtfelszíni expresszióját.

IV. példa

Az Asp dzéta mutánsok nem koasszociálódnak az

Fc-receptorral

Olyan kimérák előállítása céljából, amelyek nem asszociálódnak már meglevő antigénekkel vagy Fc-receptorokkal, mutáns dzéta fúziós fehérjéket állítunk elő, amelyekről hiányzik vagy az intramembrán Asp, vagy az intramembrán Cys, vagy mindkettő. Az áramlási citonetria azt mutatja, hogy a különböző mutáns kimérák sejtfelszíni expressziójának intenzitása nem volt lényegesen eltérő a mutálatlan prekurzorétól (nem közölt adatok), és az immunprecipitációs kísérletek azt mutatják, hogy a kimérák összexpressziója is hasonló volt (3. ábra). Amint várható volt, azokról a mutáns kimérákról, amelyekről hiányzott a transzmembrán ciszteincsoport, kiderült, hogy nem képeznek diszulfidhidakkal kapcsolt dimereket (3. ábra). A két mutáns kiméra, amelyekről az Asp hiányzik, nem képes támogatni a CD16™ expresszióját, míg a Cys-t nem tartalmazó, de az Asp-t tartalmazó monomer kimérák lehetővé tették, hogy a CD16™ koexpresszáljon, de kisebb hatékonysággal, mint a szülői dimer (3. ábra).

V. példa

A mutáns receptorok megtartják azt a képességüket, hogy a kalciumválaszt iniciálják

Annak meghatározására, hogy keresztkötések kialakítása a fúziós fehérjékben lehetővé teszi-e a szabad intracelluláris kalcium akkumulálódását ahhoz hasonló módon, mint amelyről ismert, hogy a T-sejt antigén receptorral előfordul, a humán T-sejt leukémia sejtvonalat, Jurkat E6 (ATTC letéti szám TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD) vakcíniarekombinánssal fertőzzük, majd az extracelluláris domének antigénekkel való keresztkötésének kialakulása után a relatív citoplazmatikus kalciumkoncentrációt mérjük. Áramlási citometriás méréseket végzünk olyan sejtekkel, amelyek a kalciumérzékeny Indo-1 festékkel vannak töltve [Grynkiewicz et al., Journal of Biological Chemistry, 260, 3340-3450 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunoi., 137, 952-961 (1986)]. A 4. ábrán láthatók a kalciumfluxus-kísérletek eredményei olyan sejtekkel, amelyeket CD4: dzétával, illetve a dzéta Asp*- és Cys~-mutánsaival fertőztünk. A kimérákkal kialakított keresztkötések reprodukálhatóan növelték az intracelluláris kalcium mennyiségét. A CD4: éta és a CD4: gamma hasonló módon lehetővé tette az intracelluláris kalcium felhalmozódását fertőzött sejtekben (nem közölt adatok). A Jurkat-sejtek alacsony szinten expresszálják a CD4-et a sejt felszínén, azonban ha keresztkötést hozunk létre a természetes CD4-gyel a

CD16: dzéta [C. R. és B. S., nem publikált eredmények] (4. ábra, valamint nem publikált adatok)

CD16: dzéta jelenlétében vagy távollétében, ez nem változtatja meg az intracelluláris kalciumszintet.

VI. példa

A CD4: dzéta- és : gamma-kimérák befolyásolják a

HÍVgpl20/41-et expresszáló célsejtek citolizisét

Annak meghatározására, hogy a kimérareceptorok citolitikus effektorprogramokat indítanak-e be, egy modell célpont:effektor rendszert hozunk létre, amely azon alapul, hogy a CD4 felismeri a HIV-burok gpl20/gp41 komplexet. HeLa-sejteket fertőzünk rekombináns vakcíniavírusokkal, amelyek a gpl20/gp41et expresszálják [Chakrabarti et al., Natúré, 320, 535-537 (1986); Earl et al., J. Virol., 64, 2448-2451 (1990)], majd ^5,Cr-rel jelezzük. A jelzett sejteket olyan sejtekkel inkubáljuk, amelyek a CD4: dzéta, CD4:éta vagy CD4: gamma kimérákat, vagy a CD4:dzétaCysllGly: Aspl5Gly dupla mutáns kimérát expresszáló rekombináns vakcíniavírussal fertőzött humán allospecifikus, citotoxikus T-limfocita sejtvonalból (CD8+, CD4 ) származnak. Az 5. ábrán látható, hogy a gpl20/41-et expresszáló HeLa-sejteket specifikusan lizálják a CD4 kimérákat expresszáló citotoxikus Tlimfociták (CTL). A fertőzetlen HeLa-sejtek nem voltak célpontjai a CD4: dzéta kimérákkal felfegyverzett CTL-eknek, és a gpl20/41-et expresszáló HeLasejteket nem ismerik fel a fertőzetlen CTL-ek. A különböző kimérák hatékonyságának összehasonlítására az effektor-cél arányt helyesbítettük a CD4 kimérákat expresszáló CTL-frakcióra, valamint a gpl20/41-et expresszáló HeLa-sejtekre, áramlási citometriás mérések alapján. Az 5c. ábrán a 4a. és 4b. citolíziskísérletekben használt CTL CD4 expressziójának citometriás elemzése látható. Jóllehet a sejtfelszíni CD4: dzéta átlagos sűrűsége nagymértékben meghaladja a CD4: éta átlagos sűrűségét, a bármelyik formát expresszáló sejtek citolitikus hatékonysága hasonló volt. A gpl 20-at expresszáló célsejtekre helyesbítve, a CD4: dzéta és CD4: éta fehérjék által közvetített citolízis hatékonysága összemérhető azokkal a legjobb hatékonyságokkal, amelyeket a specifikus T-sejt-receptor cél:effektor párokra leírtak (az átlagos effektor:cél arány a CD4:dzétát expresszáló T-sejtek 50%-os felszabadulására l,9±0,99, n=10). A CD4:gamma fúzió kevésbé aktív, mint a transzmembrán Asp és Cys csoportokat nem tartalmazó CD4:zéta fiizió. Azonban mindkét esetben jelentős citolízis figyelhető meg (5. ábra).

Annak az eshetőségnek az ellenőrzésére, hogy a vakcíniafertőzés elősegítheti a CTL műtermék jellegű felismerését, hasonló citolíziskísérleteket végzünk olyan vakcíniarekombinánsokkal fertőzött célsejtekkel, amely rekombinánsok a CD 16 foszfatidil-inozitollal kapcsolt formáját (CD16_PI) expresszálják, majd⁵ •Cr-mal jelöljük, valamint olyan CTL-ekkel, amelyeket vagy CD16_PI-t vagy CD16:dzétát expresszáló kontrollrekombinánsokkal fertőzünk. A 6a. ábra azt mutatja, hogy a nem CD4 kimérákat expresszáló T-sejtek nem ismerik fel a

HU 218 732 Β természetes HeLa-sejteket, illetve a gpl20/41-et expresszáló HeLa-sejteket, és hasonlóképpen, a CD4 kimérákat expresszáló T-sejtek nem ismerik fel a más, vakcinián kódolt sejtfelszíni fehéijéket expresszáló HeLa-sejteket. Emellett, a nem kiméra CD4-et expresszáló CTL-ek nem lizálják szignifikánsan a gpl20/41-et expresszáló HeLa-sejteket (6a. ábra).

VII. példa

Az MHC ΙΙ-es osztályt hordozó sejtek nem célpontjai a kiméráknak

A CD4-ről az a vélemény alakult ki, hogy egy, az MHC II osztály antigénje által expresszált nem polimorf szekvenciával lép kölcsönhatásba [Gay et al., Natúré, 328, 626-629 (1987); Sleckman et al., Natúré, 328, 351-353 (1987)]. Jóllehet specifikus kölcsönhatást soha nem igazoltak a CD4 és a II osztály antigénje között tisztított fehérjékkel, bizonyos körülmények között igazolható tapadás a CD4-et és a II osztály antigénjét expresszáló sejtek között [Doyle et al., Natúré, 330, 256-259 (1987); Clayton et al., J. Exp. Med., 172, 1243-1253 (1990); Lamarre et al., Science, 245, 743-746 (1989)]. A következő vizsgálat annak kiderítését célozta, hogy kimutatható-e pusztító hatás a II osztályt hordozó sejtekkel szemben. A 6b. ábrán látható, hogy nincs a CD4: dzéta által irányított specifikus citolízis a Raji B sejtvonallal szemben, amely nagy mennyiségben expresszál II osztályba tartozó antigént. Jóllehet egy enyhe (körülbelül 5%-os) citolízis megfigyelhető, a Rajinak egy II osztálynegatív mutánsa [Accolla, R. S., J. Exp. Med., 157,1053-1058 (1983)] hasonló érzékenységet mutat, mint a fertőzetlen T-sejtekkel inkubált Raji-sejtek.

Vili. példa

Szekvenciafeltételek a T-sejt antigén/Fc-receptor dzéta-lánc által kiváltott citolízis indukciójához Jóllehet a CD4 és a dzéta között létrehozott kimérák képesek arra felfegyverezni a citotoxikus T-limfocitákat (CTL), hogy a HÍV gpl20-at expresszáló célsejteket elpusztítsák, a CD4-nek egy alternatíváját kerestük, hogy egyértelműen összehasonlítsuk a humán T-sejtvonalakba bejuttatott dzéta-kimérák tulajdonságait. Az ilyen sejtvonalak képesek a CD4 expressziójára, ezzel megnehezítik, hogy specifikusan meghatározzuk a kalciummobilizáció típusa és mértéke, valamint a különböző kimérák citotoxikus potenciálja közötti kapcsolatot. Ennek megkerülésére kimérákat hoztunk létre a dzéta és a CD 16 között, amelyekben a CD 16 extracelluláris doménjét a dzéta transzmembrán és intracelluláris szekvenciáihoz kapcsoljuk (7a. ábra). A génfúziókat egy, szelekciós markerként Escherichia coli gpt gént hordozó vakcíniavírus expressziós plazmidba juttatjuk be, majd a vakcínia WR törzs genomjába illesztjük homológ rekombinációval, majd mikofenolsav jelenlétében növesztve szelektáljuk a transzformánsokat [Falkner and Moss, J. Virol., 62, 1849 (1988); Boyle and Coupar, Gene, 65, 123 (1988)].

A T-sejtvonalakat a vakcíniarekombinánsokkal fertőzzük, és a relatív citoplazmatikus szabad kalciumionkoncentrációt az extracelluláris doméneknek antitestekkel való keresztkötések kialakítását követően mérjük. Mind a spektrofluorimetriás (tömeges populáció), mind az áramlási citometriás (egyes sejt) méréseket elvégeztük, Indo-1 festékkel töltött sejtekkel [Grynkiewicz et al., Journal of Biological Chemistry, 260, 3440 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunoi., 137, 952 (1986)]. A 7b. ábrán a CD16: dzéta fúziós fehérjét expresszáló vakcíniarekombinánsokkal fertőzött Jurkat humán Tsejtes leukémia-sejtvonalból származó sejtekből nyert adatok elemzése látható. A kimérák közötti kölcsönhatások létrehozása reprodukálhatóan növelte az intracelluláris kalcium mennyiségét, míg a nem kiméra CD16-ot expresszáló sejtekkel való hasonló kezelésnek nem volt, vagy csak nagyon kis hatása volt. Ha a kimérát az antigénreceptort nem tartalmazó mutáns sejtvonalakban expresszáltuk, vagy REX33A [Breitmeyer et al., J. Immunoi., 138, 726 (1987); Sancho et al., Journal of Biological Chemistry, 264, 20 760 (1989)] vagy mutáns JRT3.T3.5 [Weiss et al., J. Immunoi., 135, 123 (1984)]; vagy egy erős válasz volt megfigyelhető a CD16 antitest keresztkötésre. Hasonló adatokat nyertek a REX20A mutáns sejtvonalon [Breitmeyer et al., J. Immunoi., 138, 726 (1987); Blumberg et al., Journal of Biological Chemistry, 265, 14 036 (1990)], és a laboratóriumunkban létrehozott CD3/TÍ negatív Jurkat-sejtvonalmutánson (nem közölt adatok). A CD16:dzétát expresszáló rekombinánsokkal végzett fertőzés nem állította helyre az anti-CD3 antitestre adott választ, jelezve ezzel, hogy a fúziós fehérje nem úgy működik, hogy megmenti az intracelluláris CD3 komplex láncokat (nem közölt adatok).

A kimérák azon tulajdonságainak értékeléséhez, hogy átirányítják a sejtek által közvetített immunitást, a CTL-eket CD 16 kimérákat expresszáló vakcíniarekombinánsokkal fertőztük, és arra használtuk, hogy specifikusan lizáljuk a membránhoz kötött anti-CD16 antitesteket expresszáló hibridómasejteket (lásd alább). Ez a vizsgálat egy kiterjesztése annak a hibridómacitotoxicitási vizsgálatnak, amelyet eredetileg arra fejlesztettek ki, hogy elemezzék vele az Fc-receptorokat hordozó sejtek effektormechanizmusait [Graziano and Fanger, J, Immunoi., 139, 35-36 (1987); Shen et al., Mól. Immunoi., 26, 959 (1989); Fanger et al., Immunoi. Today, 10, 92 (1989)]. A 8b. ábrán látható, hogy a CD16: dzéta expressziója a citotoxikus T-limfocitákban lehetővé teszi, hogy a felfegyverzett CTL elpusztítsa a 3G8 hibridómasejteket [anti-CD16; Fleit et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79, 3275 (1982)], míg a foszfatidil-inozitolhoz kapcsolt CD16 formát expresszáló CTL inaktív. A CD16:dzétával felfegyverzett CTL szintén nem pusztítja el az egy irreleváns antitestet expresszáló hibridómasejteket (nem közölt adatok).

A citolízishez szükséges minimális dzéta-szekvenciák azonosításához egy sorozat deléciós mutánst készítettünk, amelyekben a dzéta intracelluláris doménjének egyre nagyobb részét távolítjuk el a C-terminálisról (8a. ábra). A dzéta intracelluláris doménjének legnagyobb része eltávolítható anélkül, hogy a legkisebb ha16

HU 218 732 Β tással lenne a citolitikus potenciálra; a teljes hosszúságú CD16:ddzéta-kiméra hatékonysága lényegében megegyezett a 65. csoportig deléciót szenvedett kiméra, a CD16:ddzétaAsp66* hatékonyságával. A citotoxicitásban lényeges különbség figyelhető meg, ha a zétában az 59-es csoportig hajtunk végre deléciót (CD16:ddzétaGlu60* kiméra), majd további, az 50-es csoportig terjedő deléció valamivel kisebb aktivitást eredményezett. Az aktivitás teljes elvesztését azonban nem figyelhettük meg, még akkor sem, ha az intracelluláris domént egy három csoportból álló transzmembrán horgonyra redukáltuk (8b. ábra).

Mivel a dzéta egy diszulfidkötést tartalmazó dimer, a citolitikus aktivitás megmaradásának egyik magyarázata az, hogy az endogén dzéta heterodimereket hoz létre a kiméra dzéta deléciós származékokkal, és ezzel helyreállítja az aktivitást. Ennek az elképzelésnek az ellenőrzésére a dzéta 11-es és 15-ös csoportját Asp-ról, illetve Cysről Gly-re változtatjuk (CysllGly/Aspl5Gly), majd immunprecipitációt végzünk az alábbiak szerint. Körülbelül 2χ 10⁶ CV1 sejtet fertőzünk egy óra hosszat, szérummentes DME táptalajban rekombináns vakcíniavírussal, legalább tízes fertőzési multiplicitás (moi) mellett. A fertőzés után hat-nyolc órával a sejteket PBS/1 mmol/1 EDTA segítségével leválasztjuk a lemezekről, majd a felszínükön jelezzük 0,2 mCi ¹²⁵I-dal (2xl0⁶ sejtre számítva), laktoperoxidázt és H₂O₂-ot használva Clark és Einfeld módszerével [Leukocyte Typing II, 155-167, Springer Verlag, NY (1968)]. Ajelzett sejteket centrifugálással nyerjük ki, majd 1%-os NP-40, 0,1% SDS, 0,15 mol/1 NaCl, 0,05 mol/1 TRIS pH=8,0, 5 mmol/1 MgCl₂, 5 mmol/1 KC1. 0,2 mol/1 jódacetamid és 1 mmol/1 PMSF összetételű oldatban. A magokat centrifugálással távolítjuk el, majd a CD16 fehérjéket 3G8 antitesttel és antiegér IgG agarózzal (Cappel, Durham, NC) immunprecipitáljuk [Fleit et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79, 3275 (1982); Medarex]. A mintákat 8%-os poliakrilamid/SDS gélen elektroforetizáljuk nem redukáló körülmények között, illetve 10%-os gélen, redukáló körülmények között. Ezek az immunprecipitációk megerősítették, hogy a CD16:dzéta CysllGly/Aspl5Gly kiméra nem asszociálódik a diszulfiddal kapcsolt dimer struktúrákban.

A mutáns receptorok citolitikus aktivitását is vizsgáljuk. A 65-ös csoportig törölt mutáns kiméra (CD16:dzéta CysllGly/Aspl5Gly/Asp66*) a vizsgálati körülményektől függően kétszer-nyolcszor kevésbé aktívnak bizonyult a citolízisvizsgálatban, mint a vele összehasonlítható nem mutált kiméra (CD16: dzéta Asp66*), amelynek aktivitása általában egy kettes faktoron belül volt, illetve nem volt megkülönböztethető a CD16: dzéta aktivitásától (9b. ábra). A mutáns kimérák aktivitásának csökkenése összehasonlítható azzal a redukcióval, amelyet a hasonló szerkezetű CD4 kiméráknál figyelhetünk meg (lásd fent), és ez legnagyobb valószínűséggel a dzéta-monomereknek a dimerekhez viszonyított kisebb hatékonyságával magyarázható. Ezzel szemben, az Asp , Cys , az 59-es csoportig deléciót szenvedett mutáns kiméra nem rendelkezik citolitikus aktivitással (9b. ábra), alátámasztva ezzel azt a hipotézist, hogy a más láncokkal való asszociáció, amelyet a transzmembrán Cys és/vagy Asp csoportok közvetítenek, a felelős a citolitikus aktivitás gyenge fennmaradásáért a 65-ös csoportnál jobban az N-terminális felé található deléciókban.

Az áramlási citometriai vizsgálatok azt mutatják, hogy azok a deléciós mutánsok, amelyekről a transzmembrán Asp és Cys csoport hiányzik, még elő tudják segíteni a szabad intracelluláris kalciumion mennyiségének növekedését egy TCR^- mutáns Jurkat-sejtvonalban, az antitest keresztkötésre adott válaszként (9d. ábra). Hasonló eredményeket lehet kapni a kiindulási Jurkat-sejtvonalban expresszálódó kimérákkal (nem közölt adatok). A CD16: dzéta CysllGly/Aspl5Gly/Glu60* esetében ezek az adatok azt mutatják, hogy a kalciumra adott válasz befolyásolásának képessége mutációs úton elválasztható a citolízis támogatásától.

Hogy definitíven elimináljuk a dzéta-transzmembrán csoportok lehetséges hozzájárulását, a dzéta-transzmembrán, valamint első 17 citoplazmatikus csoportját olyan szekvenciákkal helyettesítjük, amelyek a CD5 vagy CD7 antigének membránon átnyúló részét, valamint az első 14 vagy az első 17 citoplazmatikus csoportját kódolják (9a. ábra). A keletkező tripartita fúziós fehérjék, a CD16:5:dzéta(48-65) és a CD16:7:dzéta(48-65) nem képeznek diszulfidhíddal kapcsolt dimereket, mint az egyszerűbb CD16:dzéta-kimérák, mivel hiányzik belőlük a dzéta-transzmembrán doménjéban található ciszteincsoport. Mind a két tripartita kiméra képes mobilizálni a kalciumot a Jurkat és TCR negatív sejtvonalakban (9d. ábra), és citolitikus választ képes kiváltani CTL-ben (9c. ábra és nem közölt adatok). Jóllehet a CD16:7:dzéta(48-59) kimérában a dzétarész 59 csoportra való csonkítása eltörli a tripartita fúziónak azt a képességét, hogy a kalciumra adott válaszképességet irányítsa TCR pozitív vagy negatív Jurkatsejtekben, illetve irányítsa a citolízist az érett CTL-ben (9c. és 9d. ábrák, valamint nem közölt adatok).

A 18 csoportos motívumban található egyes csoportok hozzájárulásának vizsgálatához helyspecifikus mutagenezissel előállítottunk egy sorozat mutánst, és kiértékeltük azt a képességüket, hogy mennyire befolyásolják a receptorvezérelt pusztítást, a kimérareceptor alacsony (10a. és löd. ábrák), illetve magas (10b. és lOe. ábrák) expressziója mellett. A 10. ábráról látható, hogy számos, viszonylag konzervatív szubsztitúció (például a savas csoportok helyettesítése a nekik megfelelő amidokkal, illetve a tirozin helyettesítése fenilalaninnal), amely az 59-63-as csoportoknál jött létre, a citolitikus hatékonyságot alig befolyásolta, a variánsok általában megtartották a kalciummobilizálási képességüket. Azonban összességükben ezek a csoportok egy fontos szubmotívumot tartalmaznak, amennyiben deléciójuk eliminálja a citolitikus aktivitást. A Tyr62-t Phe vagy Ser csoportokra cserélve mind a citotoxikus, mind a kalciumválaszok eliminálódnak. A 18 csoportból álló szegment aminoterminálisánál a Tyr51 Phe-vei való helyettesítése mind a kalciummobilizációs, mind a citolitikus aktivitást megszünteti, míg ha az 50-es pozí17

HU 218 732 Β cióban a Leu-t Ser-re cseréljük, ez eliminálja a kalciumválaszt, de csak részlegesen gátolja a citolízist. Anélkül, hogy egyetlen elmélethez kötődnénk, azt tételezzük fel, hogy a Leu50Ser mutánsnak az a tulajdonsága, hogy nem képes a kalciumot mobilizálni rövid időtartamú áramlási citometriás vizsgálatokban, nem tükrözi teljesen azt a képességét, hogy a citolízisvizsgálat hosszabb időtartama alatt képes a szabad intracelluláris kalciumion mennyiségének lényeges növekedését közvetíteni. Azonban kalciumra érzéketlen citolitikus vizsgálatokat közöltek néhány citolitikus T-sejt-vonalra, és nem zárták ki, hogy egy hasonló jelenség igazolja az itt közölt eredményeket is. Ha az Asn48-at Ser-rel helyettesítjük, akkor ez néhány kísérletben részlegesen gátolta a citotoxicitást, míg más kísérletekben kis hatása volt.

A redundáns szekvenciaelemek potenciális szerepének vizsgálatához a dzéta intracelluláris doménjét három szegmentre osztjuk, a 33-65-ös, a 71-104-es és a 104-138-as szegmentre. Mindegyik szegmentet egy CD16:CD7 kimérához kapcsoljuk, egy Miül hasítási hely felhasználásával, amely a CD7 intracelluláris doménje bázikus membránhorgonyzó szekvenciájától éppen disztálisan helyezkedik el (lásd alább: 11a. ábra). A három szegment citolitikus aktivitásának összehasonlítása azt mutatja, hogy ezek lényegében egyformán hatékonyak (11b. ábra). A szekvenciák összehasonlítása azt mutatja, hogy a második motívumban tizenegy csoport van a tirozinek között, míg az első és a harmadik motívumban tíz.

Jóllehet a T-sejt-aktiválás folyamatának pontos megismerése még hátravan, az világos, hogy az antigénreceptor, vagy a dzéta intracelluláris szekvenciákat hordozó receptor kimérák aggregációja indítja be a kalcium mobilizálását, a citokinek és a granulumok felszabadulását, és az aktiválás sejtfelszíni markereinek a megjelenését. A dzéta aktív helye, egy rövid lineáris peptidszekvencia valószínűleg túl kicsi ahhoz, hogy enzimaktivitással rendelkezzen, valószínűleg néhány fehérjével lép kölcsönhatásba, hogy közvetítse a celluláris aktiválást. Az is világos, hogy a szabad kalcium mobilizálása önmagában nem elegendő a celluláris aktiváláshoz, mivel a citolízis közvetítésének képességét mutációs módszerekkel el lehet választani a kalciumakkumulálás közvetítésének képességétől.

Amint azt az alábbiakban bemutatjuk, ha a dzéta intracelluláris doménjéből 18 csoportot hozzáadunk két nem rokon fehéije transzmembrán és intracelluláris doménjéhez, akkor ez lehetővé teszi, hogy a kapott kimérák átirányítsák a citolitikus aktivitást olyan célsejtekre, amelyek a fúziós fehéijék extracelluláris részéhez kötődnek. Jóllehet a 18 csoportból álló motívumot hordozó kimérák körülbelül nyolcszor kisebb aktivitással rendelkeznek, mint a teljes hosszúságú dzétára alapuló kimérák, a csökkent aktivitás a transzmembrán kölcsönhatások elvesztésének tulajdonítható, amelyek normális körülmények között lehetővé teszik, hogy a vad típusú dzéta diszulfidhíddal kapcsolódó dimereket hozzon létre. Azaz, azok a dzéta deléciós konstrukciók, amelyek ugyanazzal a C-terminálissal rendelkeznek, mint a motívum, és hiányzik belőlük a transzmembrán Cys és Asp csoport, tipikusan valamivel kisebb aktivitást mutatnak, mint a csak 18 csoportból álló motívumot hordozó kimérák.

A citolitikus kompetenciaelem, amelyre koncentráltunk, két tirozincsoportot tartalmaz, de nem tartalmaz szerbieket vagy treoninokat, ezzel megakadályozza a foszforilezés lehetséges hozzájárulását az aktivitáshoz. Bármelyik tirozin mutációs úton való megváltoztatása azonban tönkreteszi az aktivitást, és jóllehet az előzetes kísérletek nem mutatnak arra, hogy lényeges tirozinfoszforiláció követi a 18 csoportos motívumot hordozó kiméra sejtfelszíni antigének keresztkötésének kialakulását, az ilyen foszforiláció alacsony szintű lehetséges hozzájárulását nem lehet kizárni. A két tirozincsoportnál említett hatások mellett számos aminosavhelyettesítés a motívum N-terminálisánál és C-terminábsánál, csökkenti az aktivitást alacsony receptorsűrűség mellett.

A dzéta aktív motívumhoz hasonló szekvenciák megtalálhatók számos más transzmembránfehéije citoplazmatikus doménjében, beleértve a CD3 delta- és gamma-molekulákat, a sejtfelszíni IgM-hez kapcsolódó mbl és B29 fehérjét, valamint a nagy affinitású IgE receptor béta- és gamma-láncát [Reth, Natúré, 338, 383 (1989)]. Jóllehet ezeknek a szekvenciáknak a funkciója nem ismert, mégis, ha hatékonyan expresszálnak, akkor mindegyik képes az autonóm T-sejt-aktiválásra, és az ilyen aktivitást a dzéta-negatív mutáns sejtvonalakban található maradék TCR válaszképességgel lehet magyarázni [Sussman et al., Cell, 52, 85 (1988)].

A dzéta maga három ilyen szekvenciát hordoz, amelyek körülbelül egyforma távolságban helyezkednek el egymástól, és az intracelluláris dómén durva három részre vágása azt mutatja, hogy mindegyik képes citolitikus válasz kiváltására. Az éta, amely egy illesztési izoformája a dzétának [Jin et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, 3319-3323 (1990), Clayton et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 88, 5202 (1991)], nem tartalmazza a harmadik motívum karboxilfelét. Mivel az első motívum karboxilfelének az eltávolítása eltünteti az aktivitást, az valószínűnek tűnik, hogy az éta biológiai hatékonyságának legnagyobb része az első két motívumnak tulajdonítható. Jóllehet különböző módszerekkel mérve az éta ugyanolyan aktív, mint a dzéta az antigénközvetített citokinfelszabadulásban [Bauer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 88, 3842 (1991)] vagy az átirányított citolízisben (lásd fent), az éta nincs foszforilezve a receptorstimulálásra adott válaszként [Bauer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 88, 3842 (1991)]. Ezzel kiderült, hogy mindhárom motívum jelenlétére szükség van a foszforilezéshez, illetve a harmadik motívum egy előnyben részesített szubsztrátumot jelent egy azonosítatlan tirozin-kináz számára.

IX. példa

A humán Fc-receptor citolitikus szignál-transzdukciója

A különböző humán receptor altípusok akcióinak értékelésére kiméramolekulákat hozunk létre, amelyek18

HU 218 732 Β ben a humán CD4, CD5 vagy CD 16 antigének extracelluláris doménjét az Fc-RII-gamma-A, Bl, B2 és C altípusok transzmembrán és intracelluláris doménjeihez [Ravetch és Kinet nevezéktana, Ann. Rév. Immunoi., 9,457 (1991)]. Specifikusan, a korábban ismertetett FcRIIA, Bl és B2 izoformák transzmembrán és citoplazmatikus doménjeinek megfelelő cDNS-szekvenciákat amplifikáljuk a már létező PC23 klónból vagy egy humán mandula cDNS-könyvtárból (ezt standard módszerekkel állítottuk elő), az alábbi oligonukleotid indítómolekulák alkalmazásával:

CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEQ ID NO. 18; FcRIIA előre)

CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ ID NO. 19; FcRIIA vissza);

GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ ID NO. 20; FcRIIBl és FcRIIB2 előre); és

GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID NO. 21; FcRIIBl és FcRIIB2 fordított).

Ezek az indítómolekulák a BamHl és NotI restrikciós enzimek hasítási helyeit tartalmazzák, szándékosan az 5’-végtől számítva 6 csoport távolságban. A NotI hasítási helyet közvetlenül követi egy antiszensz stopkodon, CTA vagy TTA. Mindegyik indítómolekula 18 csoportot tartalmaz még, amelyek komplementerek a kiválasztott fragmentek 5’- és 3’-végeivel. Az FcRII-gamma-C citoplazmatikus doménnek megfelelő cDNS-ffagmentet, amely a IIA izoformától csak egyetlen aminosavban tér el (P helyett L a 268-as pozícióban), helyspecifikus mutagenezissel állítjuk elő átfedő PCR-rel, az alábbi indítómolekula-szekvenciák alkalmazásával :

TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEQ ID NO. 22) és

TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ ID NO. 23).

A PCR-fragmenteket vakcíniavírus expressziós vektorokba építjük be, amelyek a CDI6 vagy CD4 extracelluláris domént tartalmazzák, majd ezt követően vad típusú vakciniába juttatjuk be, a timidin-kináz fókusznál lejátszódó rekombináció segítségével, az Escherichia coli gpt kointegrációján alapuló szelekciót használva a kiválasztott rekombináns azonosításának megkönnyítésére. Mindegyik izoformának az azonosságát (a 12. ábrán látható) didezoxi-szekvenálással erősítettük meg.

A kimérareceptor-fehérje előállítását immunprecipitációs vizsgálatokkal is megerősítettük. Körülbelül 10⁷ JRT3.T3.5 sejtet fertőzünk egy óra hosszat, szérummentes IMDM táptalajban rekombináns vakcíniavírussal, legalább tízes fertőzési multiplicitás (moi) mellett. A fertőzés után tizenkét órával a sejteket kinyerjük, majd a felszínükön jelezzük 0,5 mCi ¹²⁵I-dal (2xl0⁷sejtre számítva), laktoperoxidázt és H₂O₂-ot használva Clark és Einfeld módszerével [Leukocyte Typing II, 155-167, Springer Verlag, NY (1968)]. A jelzett sejteket centrifügálással nyerjük ki, majd 1%-os NP-40,

0,1 mmol/1 MgCl₂, 5 mmol/1 KC1, 0,2 mmol/1 jódacetamid és 1 mmol/1 PMSF összetételű oldatban lizáljuk. A magokat centrifügálással távolítjuk el, majd a CDI6 fúziós fehérjéket 4G8 antitesttel és antiegér IgG agarózzal (Cappel, Durham, NC) immunprecipitáljuk [Fleit et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79, 3275 (1982); Medarex]. A mintákat elektroforetizáljuk redukálókörülmények között. Mindegyik immunprecipitált kimérareceptor-molekula a várt molekulasúllyal rendelkezett.

Annak vizsgálatára, hogy a kimérareceptorok képesek-e közvetíteni a citoplazmatikus szabad kalciumion mennyiségének növekedését, a rekombináns vírusokat használjuk a TCR^- mutáns Jurkat-sejtvonal (JRT3.T3.5) fertőzésére, az előzőkben leírt módon, és a citoplazmatikus szabad kalciumot mérjük a sejtekben (az előzőkben leírt módon), a receptor extracelluláris doménje és a 3G8 vagy Leu-3A monoklonális antitest között kialakuló keresztkötések létrejötte után (az előzőkben leírt módon). Ezek a kísérletek felfedték, hogy az FcR-gamma-IIA és C intracelluláris doménjei képesek a citoplazmatikus szabad kalciumion mennyiségének növekedését közvetíteni az extracelluláris doméneken kialakuló keresztkötések létrejötte után, míg az FcR-gamma-II Bl és B2 azonos körülmények között inaktívak (13a. és 13b. ábra). Az FcR-gamma-II A CD4, CD5 és CD 16 hibridjeinek lényegében egyforma a kapacitásuk a kalciumválasz elősegítésére (13. ábra, valamint nem közölt adatok). Más sejtvonalak, mind a monocita, mind a limfocita vonalból, képesek az extracelluláris domének keresztkötése által iniciált szignálra válaszolni (nem közölt adatok).

Annak vizsgálatára, hogy a különböző FcR-gamma-II intracelluláris domének mennyire vesznek részt a citolízisben, humán citotoxikus T-limfocitákat (CTL) fertőzünk vakcíniarekombinánsokkal, amelyek a CD16:FcR-gamma-IIA, Bl, B2 és C kimérákat expresszálják. A fertőzött sejteket együtt tenyésztjük ⁵¹Crmal feltöltött hibridómasejtekkel (azaz 3G8 10-2 sejtekkel), amelyek CD 16 elleni sejtfelszíni antitestet expresszálnak. Ebben a vizsgálatban a CDI6 kimérát hordozó CTL-ek elpusztították a hibridóma célsejteket (ezzel ⁵¹Cr szabadult fel), ha a kiméra CD 16 extracelluláris doménjét egy olyan intracelluláris szegmenthez kapcsoltuk, amely képes a limfocita-effektorprogram aktiválására; ezt a citolízisvizsgálatot részletesen közöljük az alábbiakban. A 14a. ábrán látható, hogy a CD16:FcR-gamma-IIA-val és C-vel felfegyverzett, de FcR-gamma-IIBl-gyel vagy B2-vel nem felfegyverzett CTL képes a sejtfelszíni anti-CD16 antitestet expresszáló célsejtek lizálására.

Annak a lehetőségnek az eliminálása céljából, hogy a specifikus citolízis valamilyen módon hozzájárul a CD16-tal való kölcsönhatáshoz, olyan citolíziskísérleteket végeztünk, amelyekben az FcRII intracelluláris doméneket egy CD4 extracelluláris doménhez kötöttük. Ebben az esetben a célsejtek HIV-burok gpl20/41 fehérjéket expresszáló HeLa-sejtek voltak (pontosabban a vPE16 vakcíniavektorral fertőzött HeLa-sejtek, amelyek a National Institute of Allergy and Infectious Disease

HU 218 732 Β

AIDS Depository, Bethesda, MD-nél hozzáférhetők). Csakúgy, mint a CD16 rendszerben, a HIV-burkot expresszáló célsejtek érzékenyek voltak a CD4:FcR-gamma-IIA kimérát expresszáló T-sejtek általi lízisre, de nem voltak érzékenyek az FcR-gamma-II Bl-et vagy B2-t expresszáló sejtekre (14b. ábra).

Az FcR-gamma-IIA és C intracelluláris doménjeinek nincsenek bármely más fehérjével lényeges homológiát mutató szekvenciaszakaszai, beleértve a kiterjesztett FcR-gamma/TCR-dzéta család tagjait. A citolízis indukciójához szükséges szekvenciaelemek meghatározásához az intracelluláris domént kódoló szekvenciából 5’ és 3’ deléciókat készítünk (az alábbiakban íijuk le a készítést és a 15a. ábrán mutatjuk be), és értékeljük a hatékonyságukat a kalcium mobilizációjában és a citolízisvizsgálatokban (az alábbiakban ismertetett módon). Azokban a kísérletekben, amelyekben az intracelluláris dómén N-terminális részét eltávolítottuk, az FcR-gamma-Π transzmembrán részét a nem rokon CD7 antigén transzmembrán doménjével helyettesítettük, hogy kizárjuk a membránon átnyúló dómén által közvetített kölcsönhatások lehetséges hozzájárulását.

A 15b. és 15c. ábrákon az látható, hogy a 14 Cterminális csoport eltávolítása, beleértve a 298-as tirozint is, a citolitikus kapacitás teljes elvesztését, valamint a kalciummobilizációs potenciál lényeges csökkenését eredményezte. Az éppen a 282-es tirozin előtt végződő további deléciók azonos fenotípust eredményeztek (15b. és 15c.). Az intracelluláris dómén N-terminálisának a 268-as csoportig való deléciója nem volt lényeges hatással sem a kalciumprofilra, sem a citolitikus potenciálra, míg a 275-ös csoportig terjedő deléció jelentősen gátolta a szabad kalcium felszabadulását, de csak csekély hatással volt a citolízisre (15d. és 15e. ábrák). Az ezekkel a durva mérésekkel meghatározott „aktív elem” viszonylag nagy (36 aminosav), és két, 16 csoport által elválasztott tirozint tartalmaz.

X. példa

Más, a találmány szerinti intracelluláris és transzmembrán szignált transzdukáló domének a T-sejt-receptor fehérjékből, a CD3 delta és T3 gamma, valamint az mbl és B29 B-sejt-receptor fehérjékből származnak. Ezeknek a fehérjéknek az aminosavszekvenciáját a 16. ábrán (CD3 delta; SEQ ID NO. 24), a 17. ábrán (T3 gamma; SEQ ID NO. 25), a 18. ábrán (mbl; SEQ ID NO. 26) és a 19. ábrán (B29; SEQ ID NO. 27) mutatjuk be. A citolitikus szignál-transzdukcióhoz elegendő szekvenciarészeket (amelyek ennélfogva előnyösen benne vannak egy, a találmány szerinti kimérareceptorban) zárójelben mutatjuk be. Az ezeket a fehérjedoméneket tartalmazó kimérareceptorokat elkészítjük, és a találmány szerinti terápiás módszerekben általánosan használjuk, az alábbiakban ismertetett módon.

XI. példa

Kísérleti módszerek

Vakcíniafertőzés és radio-immunprecipitáció

Körülbelül 5xl0⁶ CVl-sejtet fertőzünk egy óra hosszat szérummentes DME táptalajban rekombináns vakcíniával legalább tízes fertőzési multiplicitás (moi) mellett (a titert CVI sejteken mérjük). A sejteket friss táptalajra visszük a fertőzés után, és hat óra hosszat metabolikusan jelezzük 200 pCi/ml ³⁵S-metionin plusz ciszteinnel (Trans ³⁵S-jelzés, ICN; Costo Mesa, CA) metionint és ciszteint nem tartalmazó DMEM táptalajban (Gibco; Grand Island, NY). A jelzett sejteket 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó PBS-sel leválasztjuk, centrifugálással összegyűjtjük, majd 1%-os NP-40, 0,1% SDS, 0,15 mol/1 NaCl, 0,05 mol/1 TRIS pH=8,0, 5 mmol/1 EDTA és 1 mmol/1 PMSF összetételű oldatban lizáljuk. A magokat centrifugálással távolítjuk el, majd a CD4 fehérjéket OKT4 antitesttel és antiegér IgG agarózzal (Cappel, Durham, NC) immunprecipitáljuk [Fleit et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79, 3275 (1982); Medarex]. A mintákat 8%-os poliakrilamid/SDS gélen elektroforetizáljuk nem-redukáló körülmények között, illetve 10%-os gélen, redukáló körülmények között. A ³⁵S-sel jelzett mintákat tartalmazó géleket En³Hance-val (New England Nuclear, Boston, MA) impregnáljuk az autoradiográfia előtt. A CD 16 transzmembrán formájának, a CD16_TM-nek a megkönnyített expresszióját úgy mérjük, hogy a CD16_TM-mel egyszeresen fertőzött CVI sejtekben való expresszióját olyan sejtekben való expresszióval hasonlítjuk össze, amelyeket CD16_TM-et és dzéta- vagy éta-kimérákat kódoló vírusokkal együtt fertőztünk meg. A fertőzés és a hat óráig vagy még tovább tartó inkubálás után a sejteket PBS, 1 mmol/1 EDTA összetételű oldattal leválasztjuk a lemezekről, és a CDI6_tm vagy a kimérák expresszióját indirekt immunfluoreszcenciával és áramlási citometriával mérjük.

Kalciumfluxus-vizsgálat

Jurkat E6 alsejtvonalba [Weiss et al., J. Immunok, 133, 123-128 (1984)] tartozó sejteket fertőzünk rekombináns vakcíniavírusokkal egy óra hosszat, szérummentes IMDM táptalajban 10-es moi értékkel, majd három-kilenc óra hosszat inkubáljuk IMDM; 10% FBS összetételű oldatban. A sejteket centrifugálással nyeljük ki, majd 3xl0⁶ sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk 1 mmol/1 Indo-1 aceto-metoxi-észtert tartalmazó komplett táptalajban [Grynkiewicz et al., Journal of Biological Chemistry, 260, 3340-3450 (1985)] (Molecular Probes), majd 45 percig 37 °C-on inkubáljuk. Az Indo-1gyel feltöltött sejteket ülepítjük és 1 χ 10⁶/ml koncentrációban szuszpendáljuk szérummentes IMDM-ben, és szobahőmérsékleten, sötétben tároljuk. A sejteknek méijük a szabad kalciumion-tartalmát, ezzel párhuzamosan méijük áramlási citometriával az ibolya és a kék fluoreszcencia emisszióját [Rabinovitch et al., J. Immunoi., 137, 952-961 (1986)]. A kalciumfluxus iniciálására vagy fikoeritrinnel (PE) konjugált Leu-3A-t (anti-CD4) (Becton-Dickinson, Lincoln Park, NJ) adunk a sejtszuszpenzióhoz 1 pg/ml koncentrációban, majd 10 pg/ml konjugálatlan kecske antiegér IgG-t adunk hozzá a 0 időpontban, illetve konjugálatlan 3G8 monoklonális antitestet (anti-CD16) adunk a sejtszuszpenzióhoz 1 pg/ml koncentrációban, majd 10 pg/ml PE-vel konjugált Fab₂’ kecske antiegér IgG-t adunk hozzá a sejtszuszpenzióhoz. Az ibolya/kék emisszió arányának hisztog20

HU 218 732 Β ramját a PE-pozitív sejtpopulációkból készítjük, amelyek tipikusan a sejtek 40 80%-át reprezentálják. A Tsejt antigén receptorválaszt a fertőzetlen sejtekben 0K.T3 antitesttel váltjuk ki, keresztkötések nélkül. A CD16 kimérareceptorokat is érintő kísérletekben azokat a mintákat kihagyjuk az elemzésből, amelyek alapvonal-sodródást mutatnak az alacsonyabb intracelluláris kalcium irányába (antitest nélkül). A hisztogram adatait ezt követően elemezzük, oly módon, hogy a bináris adatokat ASCII formátumra hozzuk, a Write Hand Mán (Cooper City, FL) szoftver alkalmazásával, majd egy FORTRAN programokat tartalmazó programcsomaggal elemezzük. A második antitestreagens hozzáadása előtti ibolya/kék emissziós arányt használjuk a normalizált kezdeti arány meghatározásához, ezt egységnyinek vesszük, majd a nyugvó küszöbértéket úgy állítjuk be, hogy a pihenő populáció 10%-a haladja meg a küszöbértéket.

Citolízisvizsgálat

A WH3 humán T-sejtvonalat, egy CD8+ HLA B44 gátolt citolitikus sejtvonalat IMDM-ben tartunk fenn, amely 10% humán szérumot és 100 E/ml IL-2-t tartalmaz, majd periodikusan serkentjük, vagy aspecifikusan, besugárzott (3000 rád) HLA-nem illeszkedő perifériális vérlimfocitákkal és 1 pg/ml fitohemagglutininnel, vagy specifikusan, besugárzott B44-hordozó mononukleáris sejtekkel. Egynapi aspecifikus serkentés után a PHA-t 0,5 pg/ml-re hígítjuk friss táptalaj hozzáadásával, majd három nap elteltével a táptalajt megváltoztatjuk. A sejteket legalább 10 napig növesztjük a serkentés után, mielőtt a citotoxicitási vizsgálatban használnánk. A sejteket szérummentes táptalajban egy óra hosszat fertőzzük rekombináns vakcíniával legalább 10-es fertőzésimultiplicitás-érték mellett, majd komplett táptalajban egy óra hosszat inkubáljuk. A sejteket centrifugálással nyerjük ki, majd 1 χ 10⁷ sejt/ml sejtsűrűség mellett szuszpendáljuk. Egy U fenekű mikrotiterlemez minden egyes lukába 100 pl-t adunk, amely lukak 100 pl komplett táptalajt tartalmaznak. A sejteket kétszeres hígítási lépésekben hígítjuk. Minden egyes mintánál két luk nem tartalmaz limfocitákat, hogy ezzel a spontán krómfelszabadulás és a teljes krómfelvétel mérhető legyen. A HeLa S3 alsejtvonalból származó célsejteket 6,0 vagy 10,0 cm-es lemezeken fertőzzük körülbelül 10-es moi érték mellett, egy óra hosszat, szérummentes táptalajban, majd komplett táptalajban három óra hosszat inkubáljuk. Egy 10⁶ sejtet tartalmazó alikvot részt [Hela, Raji vagy RJ2.2.5 sejtek a CD4 kimérareceptor-kísérleteknél, és 3G8 10 2 sejtek; Shen et al., Mól. Immunoi., 26, 959 (1989); a CD16 kimérareceptor kísérletek esetében] centrifugálunk, majd 50 pl steril ⁵¹Cr-nátrium-kromát (1 mCi/ml, Dupont Wilmington, DE) oldatban szuszpendáljuk egy óra hosszat 37 °C-on, időnként megkeverve a szuszpenziót, majd háromszor mossuk PBS-sel. 100 pl jelzett sejtet 10⁵ sejt/ml koncentrációban szuszpendálunk a közegben, ezt adjuk az egyes lukakhoz. A Raji és az RJ2.2.5 célsejteket ugyanúgy jelezzük, mint a HeLa-sejteket. A mikrotiterlemezt 750 xg-vei 1 percig centrifugáljuk, majd 4 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. Az inkubálási periódus végén az egyes lukakban található sejteket óvatos pipettázással felszuszpendáljuk, egy alikvot részt eltávolítunk az összes beépült aktivitás meghatározására, majd a mikrotiterlemezt 750xg-vei 1 percig centrifugáljuk. A felülúszóból 100 pl alikvot részt eltávolítunk, és egy gamma-sugaras szcintillációs számlálóban megmérjük. A százalékos pusztítást helyesbítjük a fertőzött célsejtek frakciójára (általában 50-90%), amelyet áramlási citometriával mérünk. A fertőzött effektor sejteknél az effektor:cél arányt helyesbítjük a fertőzött sejtek százalékával (általában 20-50% a CD4 kimérareceptor-kísérletekben és >70% a CD 16 kimérareceptor-kísérletekben).

A dzéta-szekvencia in vitro mutagenezise

A dzéta-szekvencia 11-es és 15-ös aminosavainál pontmutációk előállítása céljából a dzéta transzmembrán dómén előtti BamHI helytől induló szintetikus oligonukleotid indítómolekulákat készítünk, amelyek a natív dzéta 11-es Cys csoportját Gly-re alakítják át (C11G), vagy a 15-ös csoportot Asp-ról Gly-re alakítják át (D15G), illetve mindkét átalakítást elvégzik (C11G/D15G), majd PCR-reakciókban alkalmazzuk, hogy mutáns fragmenteket állítsunk elő, amelyeket a vad típusú CD4: dzéta konstrukciókba viszünk vissza.

A dzéta-deléciók előállítása céljából a dzéta cDNSszekvenciákat PCR-rel amplifikáljuk, olyan szintetikus oligonukleotid indítómolekulák alkalmazásával, amelyek az 50-es, 59-es vagy 65-ös csoportok után egy stopkodont (UAG) hoznak létre. Az indítómolekulák a NotI restrikciós enzim hasítási helyét tartalmazzák öt vagy hat bázis távolságban az 5’-végtől, általában a CGC GGG CGG CCG CTA szekvencia formájában (SEQ ID NO. 11), ahol az utolsó három csoport a stop antikodonnak felel meg. A NotI és stop antikodon szekvenciákat 18 vagy több olyan csoport követi, amelyek komplementerek a ffagment kiválasztott 3’-végével. A keletkező kimérák jelzése CD16:dzétaY51*, CD16:dzétaE60* és CD16:dzétaD66*. A transzmembrán dómén előtti BamHI hasítási helyet és a NotI hasítási helyet használjuk fragmentek generálására, amelyeket azután visszaviszünk a vad típusú CD16: dzéta konstrukcióba. Monomer dzéta-kimérákat úgy állítunk elő, hogy a dzéta-transzmembrán és -membrán szomszédos intracelluláris szekvenciáit az Asp és CysCD4: dzéta konstrukció BamHI és SacI emésztésével felszabadítjuk, majd a fragmentet a CD16:dzétaE60* és CD16: dzétaD66* konstrukcióba építjük be.

CD16:7:dzéta(48-65) és CD16:7dzéta(48-59) tripartita kimérakonstrukció A CD16:dzétaD66* konstrukció készítéséhez a transzmembrán doménnek és a citoplazmatikus dómén következő 17 csoportjának megfelelő dzéta cDNSszekvenciát a CD5 és CD7 cDNS-ből nyert megfelelő transzmembrán és citoplazmatikus dómén régióval helyettesítjük. A CD5 és CD7 fragmenteket PCR-reakcióval állítjuk elő, előrevivő oligonukleotidként egy BamHI restrikciós hasítási helyet tartalmazó oligonukleotidot használva, amely megfelel annak a régiónak, amely a CD5 és CD7 közvetlenül a transzmembrán dómén előtti régiójának felel meg, a fordított oligonuk21

HU 218 732 Β leotidok átfedik a CD5 és CD7 szekvenciákat, és a dzéta-szekvenciát, amely a SacI restrikciós hasítási helyet tartalmazza.

CD5: dzéta: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEQ ID NO. 12)

CD7:dzéta: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (SEQ ID NO. 13).

A CDS és CD7 PCR termékeket BamHI és SacI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd BamHI és SacI restrikciós enzimmel emésztett CD16:dzétaE60*-nal ligáljuk, és a BamHI-SacI dzéta-szekvenciát a CD7 fragmenttel helyettesítjük. A CD16:CD5 és CD16:CD7 konstrukciók elkészítéséhez a CD5 és CD7 ffagmenteket PCR-rel állítjuk elő, olyan oligonukleotid alkalmazásával, amely egy NotI restrikciós hasítási helyet tartalmaz, és egy stopkodont (UAA) kódol a Gln416, illetve Alal93 csoport után a CD5-ben, illetve a CD7-ben. A CD5 és CD7 PCR-fragmentet BamHI és NotI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a CD16:dzétaAsp66* konstrukcióba építjük be.

Az N-terminális csoportok in vitro mutagenezise a dzéta citolitikus szignál-transzdukáló motívumán belül

A dzéta-motívum belsejében levő SacI hasítási helytől kezdődő oligonukleotid indítómolekulákat állítunk elő, amelyek a 48-as natív csoportot Asn-ről Ser-re konvertálják (N48S), az 50-es natív csoportot Leu-ról Serre konvertálják (L50S) és az 51-es natív csoportot Tyrről Phe-re konvertálják (Y51F), és PCR-reakcióban alkalmazzuk olyan fragmentek előállítása céljából, amelyeket a vad típusú CD16:7: dzéta(48-65)-ös konstrukcióba viszünk vissza.

A C-terminális csoportok in vitro mutagenezise a dzéta citolitikus szignál-transzdukáló motívumában A NotI 3’-végétől a stopkodonig terjedő, és a 60-as

Glu-t Gln-re (E60Q), a 61-es Glu-t Gln-re (E61Q), a

62- es Tyr-t Phe-re vagy Ser-re (Y62F vagy Y62S), és a

63- as Asp-ot Asn-re (D63N) konvertáló szintetikus oligonukleotid indítómolekulákat szintetizálunk, és ezeket használjuk a PCR reakciókban olyan fragmentek előállítására, amelyeket a vad típusú CD16:dzétaD66* konstrukcióba szubklónozunk a BamHI helytől a NotI helyig.

CD16:7:dzéta(33- 65), CD16:7:dzéta(71-104),

CD16:7:dzéta(104-137) kiméra konstrukciók

Egy CD7 transzmembránfragmentet, amely Miül és NotI hasítási helyeket tartalmaz a transzmembrán és az intracelluláris domének kapcsolódásánál, PCR-rel állítunk elő, egy, az alábbi szekvenciájú oligonukleotid alkalmazásával :

CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO. 14).

A kapott PCR-fragmentet BamHI és NotI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a CD16:7:dzéta(48-65) konstrukcióba visszük vissza. A 33-65, 71-104 és 104-137 csoportokat kódoló dzéta-fragmenteket PCRreakcióval állítjuk elő, olyan indítómolekula-párokat alkalmazva, amelyek az előrevivő indítómolekula 5’-végén Miül hasítási helyet tartalmaz, a fordított irányú indító molekula 5’-végén pedig stopkodont, valamint NotI hasítási helyet tartalmaz. Mindegyik esetben a restrikciós hasítási helyeket az indítómolekula 5'-végétől hat csoport távolságra helyezzük el, hogy biztosítsuk a restrikciós enzim hasítási helyét.

dzéta 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO. 15);

dzéta 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ ID NO. 16); és dzéta 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID NO. 17).

Az FcR-gamma-lIA deléciós mutánsok előállítása

C-terminális FcRIIA deléciós mutánsokat készítünk PCR-rel, ugyanúgy, mint a teljes hosszúságú konstrukciókat, a 282-es és 298-as pozíciókban található tirozinokat stopkodonokká (TAA) alakítva. Az N-terminális deléciókat úgy készítjük, hogy olyan fragmenteket amplifikálunk PCR-rel, amelyek az intracelluláris doménből egyre kevesebbet tartalmaznak, olyan oligonukleotidokat alkalmazva, amelyek lehetővé teszik, hogy a keletkező fragmentet Miül és NotI restrikciós hasítási helyek közé tudjuk beépíteni egy előre elkészített expressziós plazmidba, amely a CD16 extracelluláris domént a CD7 transzmembrán doménhez füzionálva kódolja, és az utóbbi egy Miül hasítási helyben végződik a transzmembrán és az intracelluláris dómén találkozási pontjánál.

Egyéb megvalósítási módok

Az előzőkben ismertetett példák azt mutatják, hogy a dzéta-, éta- vagy gamma-kimérák aggregációja elegendő ahhoz, hogy a T-sejtekben citolitikus effektor sejt-választ iniciáljanak. A dzéta, éta és gamma ismert expressziós tartománya, amelybe beletartoznak a T-limfociták, természetes ölősejtek, bazofil granulociták, makrofágok és hízósejtek, azt sugallja, hogy a konzervált szekvenciamotívumok kölcsönhatásba léphetnek a hematopoietikus eredetű sejtekben közös érzékelőapparátussal, és hogy a gazdaszervezet védekezőrendszerének egy fontos komponense az immunrendszerben befolyásolható receptoraggregációs eseményekkel.

A citolitikus válasz potenciálja és a válasz hiánya olyan célsejtekre, amelyek MHC II osztályba tartozó receptorokat hordoznak, azt igazolja, hogy a dzéta-, étavagy gamma-alapú kimérák szolgálnak az AIDS-ellenes genetikai beavatkozás alapjául, adoptív immunterápián keresztül. Az endogén dzéta és a gamma széles eltelj edése, valamint az a bizonyíték, hogy a gammával asszociálódott Fc-receptorok közvetítik a citotoxicitást a különböző sejttípusokban [Fanger et al., Immunoi. Today, 10, 92-99 (1989)], lehetővé teszi, hogy számos különböző sejtet figyelembe vehessünk erre a célra. Például a neutrofil granulociták, amelyeknek nagyon rövid az élettartamuk (körülbelül 4 óra) a keringésben, és erősen citolitikusak, vonzó célsejtek a kimérák expressziójához. A neutrofílek HIV-vel való fertőzése nem valószínű, hogy a vírus kiszabadulását eredményezi, és ezeknek a sejteknek a bősége (a legjelentősebb a leukociták közül) elősegítheti a gazdaszervezet védekezését. Egy másik vonzó lehetőség a gazdasejtekre az érett Tsejtek, egy olyan populáció, amely újabban hozzáférhe22

HU 218 732 Β tő a retrovirális megváltoztatás céljaira [Rosenberg, S. A. Sci. Am., 262, 62-69 (1990)]. A rekombináns IL-2 segítségével a T-sejt-populációk viszonylag könnyen kiterjeszthetők tenyészetben, és a kiterjesztett populációknak tipikusan rövidebb az élettartamuk reinfúzió esetében [Rosenberg et al., New England Journal of Medicine, 323, 570-578 (1990)].

A megfelelő körülmények között a HIV-felismerés CD4 kimérákat expresszáló sejtekkel szintén mitogén stimulusokat adhat, ezzel lehetővé téve azt, hogy a felfegyverzett sejtpopuláció dinamikusan tudjon válaszolni a virális terhelésre. Jóllehet itt mi a fúziós fehérjék citolitikus T-limfocitákban való viselkedésére fókuszáltunk, a kimérák expressziója helperlimfocitákban a citokineknek egy HIV-mobilizált forrását adhatja, amelyek ellenhatást fejthetnek ki a helpersejtalcsoport összeomlásával szemben AIDS-ben. A legfrissebb közlemények, amelyek különböző sémákat írnak le a fertőzés elleni rezisztencia kialakítására a vírus behatolásától eltérő lépésekben [Friedman et al., Natúré, 335, 452-454 (1988); Green et al., Cell, 58, 215-223 (1989); Malim et al., Cell, 58, 205-214 (1989); Trono et al., Cell, 59, 113-120 (1989); Buonocore et al., Natúré, 345, 625-628 (1990)] azt sugallják, hogy CD4 kimérákat hordozó sejtek tervezhetők, amelyek megakadályozzák a vírustermelést, oly módon, hogy egy intracelluláris támadásponttal rendelkező megfelelő ágenseket termelnek.

Az a képesség, hogy autonóm kimérákkal jeleket lehet átvinni T-limfocitákba, megadja azt a lehetőséget is, hogy a retrovirálisan megváltoztatott limfocitákat in vivő szabályozzuk. A keresztkötési hatások, amelyeket például specifikus IgM antitestek közvetítenek, amelyeket úgy változtattak meg, hogy eltávolítsák a komplementkötő doméneket, lehetővé teszik, hogy az ilyen limfociták száma in situ megnövekedjen, míg a hasonló specifikus IgG antitestekkel való kezelés (például a kiméraláncba bevitt aminosavvariáció felismerése) szelektíven kiüríti a megváltoztatott populációt. Emellett, az anti-CD4 IgM antitesteknek nincs szükségük további keresztkötésekre ahhoz, hogy mobilizálják a kalciumot CD4: dzéta kimérákat expresszáló Jurkat-sejtekben (nem közölt adatok). Az a lehetőség, hogy a sejtpopulációkat szabályozni lehet anélkül, hogy visszatérnénk az ismételt extrakoiporális amplifikációhoz, lényegesen kiterjeszti a génsebészeti úton megváltoztatott T-sejtek jelenlegi alkalmazásának tartományát és hatékonyságát.

Más, dzéta, éta vagy gamma intracelluláris szekvenciákat tartalmazó kimérák előállításához a receptor egy extracelluláris doménjét kódoló cDNS- vagy genomiális szekvenciákat egy restrikciós hasítási hellyel látunk el, közvetlenül a választott transzmembrán domént megelőző helyre beépítve. A restrikciós hasítási helyben végződő extracelluláris dómén fragmentet azután dzéta-, éta- vagy gamma-szekvenciákhoz kapcsolhatjuk. A tipikus extracelluláris domének olyan receptorokból származhatnak, amelyek felismerik a komplementet, szénhidrátokat, virális fehérjéket, baktériumokat, protozoákat vagy metazoa parazitákat, illetve az általuk indukált fehérjéket. Hasonlóképpen, a patogének vagy tumorsejtek által expresszált ligandumok vagy receptorok kapcsolhatók a dzéta-, éta- vagy gamma-szekvenciákhoz, hogy az ilyen ligandumokat felismerő receptorokat hordozó sejtek elleni immunválaszt irányítsuk.

Jóllehet a találmányt specifikus megvalósítási módjain keresztül írtuk le, az nyilvánvaló, hogy módosítások tehetők az eljárásban, és a bejelentés célja, hogy a találmány további módosításait, alkalmazásait vagy adaptációit is védje, beleértve a jelen leírástól való olyan eltéréseket, amelyek a találmány szakterületén bekövetkeznek, és az előzőkben leírt lényeges tulajdonságokra alkalmazhatók, a függelékben közölt igénypontok szerint.

Szekvencialisták (1) Általános információk:

(1) BEJELENTŐK: The General Hospital Corporation (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Redirection of Cellular Immunity by Receptor Chimeras (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 27 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:

(A) CÍMZETT: Fish&Richardson (B) UTCA: 225 Franklin Street (C) VÁROS: Boston (D) ÁLLAM: MA (E) ORSZÁG: USA (F) IRÁNYITÓSZÁM: 02110-2804 (v) SZÁMÍTÓGÉPPEL OLVASHATÓ FORMA:

(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: 3,5”, 1,44 MB lemez (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PS/2 Model 50Z vagy 55SX (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: IBM P. C. DOS (3.30 verzió) (D) SZOFTVER: Wordperfect (5.0 verzió) (vi) A JELENLEGI BEJELENTÉS ADATAI:

(A) A BEJELENTÉS SORSZÁMA:

(B) BEJELENTÉS IDŐPONTJA:

(C) OSZTÁLYOZÁS:

(vii) AZ ELŐZŐ BEJELENTÉS ADATAI (A) A BEJELENTÉS SZÁMA: 07/665,961 (B) BEJELENTÉS IDŐPONTJA: 1991. március 7.

(C) OSZTÁLYOZÁS:

(viii) ÜGYVÉD/ÜGYNŐK INFORMÁCIÓ:

(A) NÉV: Clark, Paul T.

(B) REGISZTRÁCIÓ SORSZÁMA: 30,162 (C) REFERENCIASZÁM: 00786/119002 (ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS INFORMÁCIÓ:

(A) TELEFON: (617) 542-5070 (B) TELEFAX: (617) 542-8906 (C) TELEX: 200154 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 1-RŐL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 1728 bázispár (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 1

HU 218 732 Β

AXQAACCOOO OAOXCCCXTX XAGOCACTXO CTTCTOOTOC TOCAACXQOC SO

OCZCCSCCCA OCAOCCACTC AOOGAAACAA AOTOOIOCTO OOCAAAAAAO 100

OOOAXACAOT OOAACTOACC TOTACAOCTT CCCAOAAOAA OAQCAXACAA ISO

XTCCACTOOA AAAACTCCAA CCAQAXAAAO ATTCTOOOAA AXCAOOOCTC 200

CTTCTTAACT AAAOOTCCAX CCAAOCTOAA TOATCOCOCT OACTCAAOAA 250 autoccnxo OOACCAAOGA AACTTCCCCC TOATCATCAA OAATCTXAAO 300

AZAQAAQACT CAOAIACTTA CATCTOTOAA OTOOAOGACC ΑΟλλΟΟΜΟλ 350 ogtocaatto ctaotottco oattoactoc caactctoac acccacctoc «00

TTCAOOOOCA OAOCCTOACC CTOACCTTOO AOAOCCCCCC TOOTAOTAOC «50

CCCTCAOTQC AATOTAOOAO TCCAAOOOOT AAAAACAXAC AOGGOOOOAA 500

OACCCTCTCC OTOTCTCAOC TOOAOCTCCA OOAXAQTOOC ACCTOOACAX 550

OCACTOTCTX OCAOAACCAO AAOAAOOTOO AOTTCAAAAT AOACAXCOTO «00

OTOCXAOCZT TCCAOAAOOC CTCCAOCAXA OTCZAXAAGA AAOAOOOOOA «50

ACAOOTOOAO TTCTCCTTCC CACTCOCCTT TACAOTTOAA AAOCTOACOO 700

OCAOTQQCQA GCTQTOOTGO CAQOCOOAOA OOOCTTCCTC CTCCAAOTCT 750

TOOAXCACCX TTOACCTOAA OAACAAGQAA OTOTCXOTAA AACOOOTZAC «00

CCAOOACCCT AAOCTCCAQA TOOOCAAQAA OCTCCCOCTC CACCTCACCC «50

ZOCCCCAOOC CTTOCCTCAO TATOCTOOCT CTOOAAACCT CACCCTOOCC 900

CTTQAAOCOA AAACAOOAAA OTTOCATCAO OAAOTOAACC TOGTQGTOAX 950

OAQAOCCACT CAOCTCCAGA AAAAXXTOAC CTOTQAGOTO ZOOOOACCCA 1000

CCTCCCCTAA OCTOATOCTO AGCTTGAAAC TOOAOAACAA OOAOOCAAAO 1050

OTCTCOAAOC QGGAGAAQCC QGTGTOQGTO CTQAACCCTO AOGCOOOGAX 1100

OTGOCAQTOT CTOCTOAOTO ACTCOOOACA OOZCCIGCTO OAATCCAACA 1150

XCAAQOTTCX GCCCACAXOO TCCACCCCOO TOCACOCGOA TCCCAAACTC 1200

TOCTACTTOC XAOAXOOAAX CCXCXXCAXC TACOOAOTCA TCAXCACA0C 1250

CCTOCACCTe AOAOCAAAAT TCAOCAOOAO TOCAOAÖACT OCTOCCAACC 1300

TOCAOOACCC aULCOOCXC TAGAAXOAOC TCAATCTAOO OCOAAOAOAO 1350

OAAXAXOACO TCTTOOAOAA OAAOCGOOCT COOOAXCCAO AOATOOOAOO 1400

HU 218 732 Β

CAAACAOCAO ΑΟΟΑΟβλθΟΑ ACCCCCAOGA MaCOXKOM AATQCACTQC 1450

AOAAAOACAA OAXOCCAOAA OCCZACAOXO AOATCOOCAC JUUUUMCOAO 1500

ΑΟΟΟΟβλβλΟ OOUUMGOCA COJUNMCCZS TACCAOOACA OCCACTTCCA 1550

MCMSOCM nCOOOAACA ΟλλΟλβΑβλβ AOAAOOTTCA OAACTCACAA 1500

OOACCCTXOO OZXJUUU0CC OOCCCCU&O OTOAAAOCAC CCAOCAOAOT 1550

AOCCAAXCCX 9TQCCA0COT CTTCAOCATC CCCACTCTOT OOAOTCCATO 1700

OCCACCCAOT MCAOCXCCC AOCTCTAA 1725 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 2-RŐL (C) SZÁLFAJTA: kétszálú (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (D) TOPOLÓGIA: lineáris (A) HOSSZA: 1389 bázispár (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (B) TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 2

ATOAACCOOO OAOTCCCZTT ZAOOCACITO CTTCTOOTOC TOCAACTOOC 50

OCTCCTCCCA OCAOCOCTC AOOOAAACAA AOTOOTOCTO OQCAAAAAAO 100

OOOATACAOT OOAACXOACC TOTACAOCTT CCCAOAAOAA GAQCATACAA 150

TTCCACTOGA AAAACTCCAA CCAOAIAAAO ATTCTOOOAA ATOOOOCTC 200

CTTCTTAACT AAAOOTCOT CCAAOCTOAA TOATCOCOCT OACTCMOM 250 flUOCOTW OOACCAAOOA AACTTCCCCC TCAICATCAA OAATCTTAAO 300

OGATACTTA CATCTOTOAA OTOOAOGACC ACAAOOAOO 350

OOTOCAATTO CTAOTOTTCO OATTOACTOC CAACTCTOAC ACCOCCTOC 400 ttcaooooca oaocctoacc ctoaccttoo aoaocccccc tootaotaoc 450

CCCICAOTQC aatotaooao tccaaoooot aaaaacaxac aoooooooaa 500

OACCCTCSCC OTOTCTCAOC XOOMCZCCA OOATAOTOOC ACCTOOACAX 550

OCACTOTCXT OCAOAACCAO AAOAAOOTOO AOTTCAAAAT AQACATCOTO 400

OTOCXAOCZT TCCAOAAOOC CTCCAOCATA GTCTATAAOA AAOAOOOOOA 550

ACAOQXQOAO TTCTCCTTCC OCTCOCCTT TACAOTTOAA AAOCTOACOO 700

OCAQTOOCOA OCTOTOOTOO CAOOCOOAOA OOOCTTCCTC CXCCAAOTCX 750

TOOATCACCT TTOACCTOAA OAACAAOOAA OTOTCTOTAA AACOOOTTAC 500

CCAOOACCCX AAOCXCCAOA TOOOCAAOAA OCTCCCÖCTC CACCTCACCC 450

TOCCCCAOOC CTTOCCTCAO TATOCTOOCT CTOOAAACCT CACCCTOOCC »00

HU 218 732 Β crrcuutocoit aaacmomui onocAScuo oaaotoaacc tootootoax «50 «MUOCCACX CMCXCIM JUUUOTXQAC CTOTOAOOTO IOOOOACCCA 1000

CCTCCCCXAA OCZOAXOCTO AOCTZOAAAC TOCAOAACAA OOAOOCAAAO 1050

OTCXCOAAOC OOOAOAAOCC OOXOTOOGZO CTOAACCCTO AOOCOOOOAZ 1100

OXOOCAOXQZ CTOCTOAOTO ACXCQOOACA OOTCCXOCTO OAAXCCAACA 1150

ZCAAOOIXCZ OCCCACAXOO TCCACCCCOO TOCACOCOOA TCCOCAQCTC 1200

TOCZASAXCC TOOATOCCAX CCTOZZTZZO ZAXOOTAXTO TCCTTACCCT 1250

OCTCXACTOT COACTCAAOA TCCAOOTCCO AAAOGCAOAC AXAOCCAOCC 1300

QTOAQAAATC AOATOCTOTC XACACOOOCC TOAACACCCO OAACCAOOAO 1350

ACAXASQAOA CTCIQAAACA TGAQAAACCA CCCCAASAO 13M (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 3-RÓL (C) SZÁLFAJTA: kétszálú (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (D) TOPOLÓGIA: lineáris (A) HOSSZA: 1599 bázispár ^5 (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (B) TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 3

AXOAACCOOO OAOTCCCTTT ZAOOCACTXO CTTCTOOIOC TOCAACTOOC 50

OCTCCTCCCA QCAOCCACTC AOQOAAACAA AOTOOTOCTO OOCAAAAAAO 100

OOOATACAGT OOAACTOACC TCTACAOCTT CCCAGAAOAA OAOCATACAA 150

TTCCACTOOA AAAACTCCAA CGAOAXAAAO ATTCTOOOAA AXCAOOOCZC 200

CTTCXZAACT AAAOOXCCAX CCAAOCXGAA TOAXCOCOCT OACXCAAOAA 250

OAAOCCTTTO OOACCAAOOA AACTTCCCCC TOATCATCAA OAATCTTAAO 300

AXAOAAOACX CAOAXACTTA CATCTOTGAA OTOOAOOACC AOAAOOAOOA 350

OOTOCAAXXO CZAOTOIZCO OATTOACTOC CAACTCTGAC ACCCACCTOC <00

XTCAOOOOCA OAOCCTOACC CTOACCTXOO AOAOCCCCCC ZOOZAOXAOC <50

CCCTCAOTOC AAXOZAOOAO TCCAAOOOOX AAAAACAIAC AOOOOOOOAA 500

OACCCTCXCC OTOTCTCAOC ZOOAOCTCCA OOAIAOTOOC ACCXOOACAX 550

OCACTOTCXZ OCAOAACCAO AAOAAOOTOO AOTTCAAAAX AOACAXCOZO <00

OTOCTAOCTT TCCAOAAOOC CTCCAOCATA OTCXATAAOA AAGAQOOOGA <50

ACAOOTOOAO ZTCTCCTTCC CACTCOCCTT TACAOTTOAA AAOCTOACOO 700

OCAOTOOCOA OCTOTOOTOO CAOOCOOAOA OOOCXTCCTC CXCGAAOXCZ 750

HU 218 732 Β

XOOATCACCT XXQACCXOAA QAACAAQQAA OTOTCTOTAA AACOOOTXAC 800

CCAOOACCCT AAOCXCCAOA TOOOCAAOAA OCTCCCOCXC CACCTCACCC 850

TOCCCCAOOC CTTOCCTCAO TATOCTOOCT CTOOAAACCT CACCCXOOCC 900

CTTOAAOCOA AAACAOGAAA QTTOCAXCAO OAAOTOAACC TOOTOOTQAX 950

OAOAOCCACT CAOCTCCAOA AAAATTTOAC CTOXQAOOTO TOOOOACCCA 1000

CCTCCCCTAA OCSOATOCTO AOCTTQAAAC TGGAQAACAA OOAOOCAAAO 1050

OTCTCOAAOC OOOAOAAOCC OOXOXOOOIO CTOAACCCXO AOOCOOOOAT 1100

OXOOCAOTOT CXOCTOAOTO ACTCOOOACA OOXCCTOCXO OAAXCCAACA 1150

TCAAOOTTCT OCCCACATOO TCCACCCCOO TOCACOCOOA TCCCAAACTC 1200

XOCXACCIQC XQQAXOOAAT CCTCTTCATC TATOOTOTCA TTCTCACTOC 1250

CTTOTTCCXO AOAGTOAAQT TCAGCAOOAO COCAOAOCCC CCCOCOZACC 1300

AOCAOOOCCA OAACCAOCTC TATAACGAOC XCAAXCXAOO ACOAAOAOAO 1350

OAOXACOAXO TXTXQGACAA OAOACOXOOC COOOACCCXO AOAXOOOOOO 1400

AAAOCCOAOA AOOAAOAACC CXCAOOAAOO CCXOXACAAX OAACTOCAQA 1450

AAOAXAAOAX OOOOOAOOCC XACAOXOAOA XXOOOAXOAA MOCOAOCOC 1500

OOOAOOOOCA AOOOOCACOA XOOCCXXXAC CAOOOTCTCA OXACAOCCAC 1550

CAAOOACACC XACOACOCCC TTCACATOCA OOCCCTOCCC CCTCOCXAA 1599 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 4-ROL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 575 aminosav (B) TÍPUSA: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 4

ltot Asn Arg oly Val Pro Ph· Arg Ble Leu Leu Leu Val Leu Óla Leu
1	5	10	15
Alá Leu Leu Pro Alá Alá	Xhr Óla Oly Asa Lya Val	Val Leu Oly Lye
	20	25	30
Lys Oly Asp Thr Val Olu	Leu Xhr Cys Xhr Alá Ser	Óla Lys Lys Ser
	35	40	45
Ile	Óla Phe Bis Trp Lys	Asa Ser Asn Óla Ile Lys	Ile Leu Oly Asa
	50	55 «0
Óla	Oly Ser Phe Leu Xhr	Lys Oly Pro Ser Lys Leu	Asa Asp Arg Alá
<5	70	75	80
Asp	Ser Arg Arg Ser Leu	Trp Asp Óla Oly Asa Phe	Pro Leu Ile Ile
	85	90	95
x-T·	Asn Leu Lys Ile Olu	Asp Ser Asp Thr Tyr Ile	Cye Olu Val Olu
	100	105	110
Asp	Óla Lya Olu Olu Val	Óla Leu Leu Val Phe Oly	Leu Thr Alá Asa
	115	120	125
Ser	Asp Xhr Bis Leu Leu	Oln Oly Óla Ser Leu Xhr	Len Thr Leu Olu
	130	135 140

HU 218 732 Β

Bar 145 x-y·	Pro Pro	Oly 8ar	Bar Pro 8ar Val Óla Cys Arg Bar Pro Arg Oly
150 Oly Lys	155	1(0 Lau
Un	XI·	Óla	Oly 1(9	Thr Lau	Bar Val Bar Óla Lau Olu
170	175
Óla	Lap Mr Oly Thr Trp Thr	Cys Thr	Val	Lau Óla Lsa 01a Lys	Ly·
			110			1B5		190
▼al	Óla Ph·	Ly· Xlo Asp XI·	▼al Val	Lau	Alá Pha óla Lys Lla	Bar
		199				200		205
Mr	11·	▼al	Tyr Ly· Lys Olu	Oly Olu	01a	Val 01a Pha Bar Pha	Pro
	210				215			220
Lia	111	Ph·	Thr Val	Olu Ly·	Lau Thr	Oly	Bar Oly Olu Lau Trp Trp
229					230			235	240
Óla	Lia	Olu	hx9	Lla	Bar Bar	8ar Lys	Bar	Trp lla Thr Pha Asp	Lau
				249			250	255
Lya	Asa	Ly·	Óla	Val	Bar Val	Lys Arg	Val	Thr Óla Asp Pro Lys	Lau
			2(0			2(5		270
Óla	Hat	Oly Ly· Lys	Lau Pro	Lau Bis	Lau	Thr Lau Pro Óla Alá	Lau
		275				280		285
Pro	01a	Tyr	Lia	Oly	Bar Oly	Asa Lau	Thr	Lau Alá Lau Olu Alá	Ly·
	290				295			300
Thr	Oly Ly·	Lau	Vi·	01a Olu	Val Asa	Lau	Val Val ltot Arg Alá	Thr
309					310			315	320
01a	Lau	01a	Ly·	Lsa	Leu Thr	Cys Olu	Val	Trp Oly Pro Thr Bar	Pro
				325			330	335
ly·	Lau	ltot	Lm	Bar	Lau Lys	Lau Glu	Aaa	Ly· Olu Alá Ly· Val	Bar
			340			345		350
Ly·	hrp	Olu	Ly·	Pro	▼al Trp	Val Lau	Asa	Pro Olu Alá Oly ltot	Trp
		355				3(0		3(5

Óla	cy· 370	Lau Lau	Bar	Asp	Bar oly óla Val Lau Lau Olu Bar Asa Xla
375	3(0
Lys	Val	Lau Pro	Thr Trp	Ser	Thr Pro Val Bis Alá Asp Pro Ly· Lau
3(9				390		399 400
cy«	Tyr	Lau Lau	Asp Oly	Xla	Lm Pha Xla Tyr Oly Val Xla Xla Thr
			405			410 419
Lla	Lau	Tyr Lau	Arg	Alá	Lys	Pha Bar Arg Bar Lla Olu Thr Lla Lla
		420				425 430
Lea	Lau	Óla Asp	Pro	Asa	Óla	Lau Tyr Asa Olu Lau Asa Lau Oly Lrg
		435				440 445
Arg	Olu	Olu Tyr Asp	Val	Lau	Olu Ly· Lys Arg Alá Arg Asp Pro Olu
	450				455	4(0
Kát	Oly Oly Lys	Óla	Óla	Arg Arg Arg Asa Pro Óla Olu Oly val Tyr
4(5				470		475 480
Asa	Alá Lau 01a	Ly· Lep Lys Nat Pro Olu Alá Tyr Bar Olu Xla Oly
			489			490 495
Thr	Lys Oly Olu	Lrg Lrg Arg Oly Ly· Oly Bis Asp Oly Lau Tyr Óla
		500				505 510
Lep	Bar	Via Pha	Óla	Alá	Val	Óla Pha Oly Asa Arg Arg Olu Arg Olu
		519				520 525
Oly	Bar	Olu Leu	Thr	Arg	Thr	Lau Oly Lau Arg Alá Lrg Pro Lys Oly
	530				535	540
Olu	Bar	Thr Olu	óla	Bar	Bar	Óla 8ar Cys Alá Bar Val Pha Bar Xla
559				550		5(9 5(0
Pro	Thr	Lau Trp	Bar	Pro	Trp	Pro Pro Bar Bar Bar Bar Óla Lau
			5(5			570 575

HU 218 732 Β (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 5-RŐL (D) TOPOLÓGIA: lineáris (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (A) HOSSZA: 462 aminosav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 5 (B) TÍPUSA: aminosav

Met Aan Arg Oly Tál	Pro	Pha Arg Kis	lau Lau Lau Tál lau Óla Lau
1	5	10	15
Ala Lan Leu Pro Ala	Ala	Thr Óla Oly	Asn	Lya Tál Tál Laa Oly Lya
	20		25		30
Lya Oly Asp Thr Tál	Olu	Lau Thr Cya	Thr	Ala Bar olu Lya Lya Bar
	35		40		45
Zlo	Óla Pha Bia Trp Lya	Aaa Bar Aaa	Óla	Zla Lys Zla Lau Oly Aaa
	50		55		40
Óla	Oly Bar Pha Lan	Thr	Lya Oly Pro	Bar	Lya Xau Aaa Asp Arg Ala
65		70			75 BO
Aap	Bar Arg Arg Bar	Lau	Trp Aap Óla	Oly	Aaa Pha Pro Laa Zla Zla
	•5			90	95
Lya	Aaa Laa Lya Zla	Olu	Asp Ser Aap	Thr	Tyr Zla Cya Olu Tál Olu
	100		105		110
Aap	Óla Lya Óla Olu	Tál	Óla Lau Lau	Tál	Pha Oly Leu Thr Ala Aaa
	115		120		125
Bar	Aap Thr Bis Leu	Lau	Óla Oly Óla	Bar	Lau Thr Lau Thr Lau olu

130	135	140
Bar Pro Pro	Oly Bar Bar Pro 8ar Tál	Óla Cys Arg 8er Pro Arg Oly
145	150	155 160
Lya Aaa Zla	Óla Oly Oly Lya Thr Leu	Bar Tál Bar Óla Lau Olu Lau
	145	170 175
Óla Aap Bar	Oly Thr Trp Thr Cya Thr	Tál Lau Óla Aaa 01a Lya Lya
	140 IBS	190
Tál Óla Pha	Lya Zla Asp Zla Val Val	Laa Ala Pha Óla Lya Ala Bar
195	200	205
Bar Zla Tál	Tyr Lya Lys olu oly Olu	Óla Val Olu Pha Bar Pha Pro
210	215	220
Lau Ala Pha	Thr Tál Olu Lya Lau Thr	Oly Bar Oly Olu Lau Txp Trp
225	230	235 240
Óla Ala Olu	Arg Ala Bar Bar Ser Lya	Bar Trp Zla Thr Pha Aap Lau
	245	250 255
Lys Aaa Lya	Olu Tál Bar Tál Lya Arg	Val Thr Óla Asp Pro Lys Lau
	240 245	270
01a Mát Oly Lys Lya Lau Pro Lau Bia	Lau Thr Lau Pro Óla Ala lou
275	280	285
Pro Óla Tyr	Ala Oly Ser Oly Asn Lau	Thr Leu Ala Leu Olu Al* Lys
290	295	300
Thr Oly Lys	Leu Bia Óla Olu Val Aaa	Lau Val Tál Mát Arg Ala Thr
305	310	315 320
Óla Lau Óla	Lys Aaa Z<au Thr Cya Olu	Tál Trp Oly Pro Thr tar Pro
	325	330 335
Lya Z«au Mát	Lau Ser Lau Lys Leu Olu	Aaa Lya Olu Ala Lya Val Bar
	340 345	350
Lys Arg Olu	Lys Pro Tál Trp Tál Laa	Aaa Pro Óla Ala Oly Mát Trp
355	340	365
Óla Cys lau	Laa Bar Asp Bar Oly Óla	Tál Lau Lau 01a Bar Aaa Zle
370	375	380
Lya Tál Lau	Pro Thr Trp Ser Thr Pro	Tál Bia Ala Asp Pro Óla Lau
315	390	395 400

HU 218 732 Β

cy·

Xla lan

Asp 405

Alá Xla Xan

Pho Xan Tyr Oly Xla Val Xan Thr

410

415

Xan

Tyr

Cya

Arg

Xau

X.ya

Xla

Óla

Val

Arg Lya

Alá

Asp

Xlo

Alá

420

425

430

Bar

Arg

Oln

Lya

Bar

Aap

Alá

Val

Tyr

Thr

Oly lan

Aan

Thr

Arg

Aan

435

440

445

Óla

Oln

Thr

Tyr

Oln

Thr

Xan

Lya

Bla

Oln

Lys Pro

Pro

Óla

450

455

460

462

(2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 6-RÓL (D) TOPOLÓGIA: lineáris (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (A) HOSSZA: 532 aminosav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 6 (B) TÍPUSA: aminosav

Hat Asn Arg Oly Val Pro Ph· Arg Bi* Xau lan lan Val Xau Óla lan 15 10 15

Alá	Lan Lan	Pro Alá Alá Thr Oln Oly Asn Lya Val Val Xan Oly Lya
20	25	30
Lya Oly Aap	Thr Val Olu Xau Thr	Cys Thr	Alá Bar Oln Lys Lys Bar
	35	40		45
Zla	Óla Pha	Bis Trp Lya Aan Bar	Asn Oln	Xla Lys Xla Xau Oly Asn
	50	55		<0
Óla	Oly Bar	Pho Xan Thr Lya Oly	Pro Bar	Lya Lan Asn Aap Arg Alá
65		70		75 50
Aap	Bar Arg Arg Bar Xan Trp Aap 01a Oly	Asn Pha Pro Xau Xlo Zlo
		55	90	95
Lys	Asn Lan	Lya Zlo Olu Asp Bar	Aap Thr	Tyr Xlo Cys Oln Val Olu
		100	105	110
Asp	Oln Lys	Oln Oln Val Oln lan	Lan Val	Pha oly Xan Thr Alá Asn
	115	120		125
Bor	Asp Thr	Bia Xan Xau Oln Oly	Oln Bar	Lan TbrXau Thr Lan oln
	130	135		140
Bar	Pro Pro	Oly Bor Bar Pro Bar	Val Oln	Cya Arg Bar Pro Arg Oly
145		150		155 140
Lya	Asn Xlo	Oln Oly Oly Lys Thr	Xan Bar	Val Sor Óla Xau Olu lan
		165	170	175
Oln	Asp Bar	Oly Thr Trp Thr Cys	Thr Val	lan oln Asn Oln Lys Lys
		180	185	190
Val	Oln Pha	Lys Xla Asp Xla Val	Val Lan	Alá Pho Oln Lya Alá Bor
	195	200		205
Bar	Xla Val	Tyr Lys Lya Oln Oly	Oln Oln	Val Olu Pho Bor Pho Pro
	210	215		220
Xan	Alá Pha	Thr Val Oln Lys Xau	Thr Oly	Bar Oly Oln Xan Trp Trp
225		230		235 240
Oln	Alá Oln	Arg Alá Bar Bar Bar	Lys Bar	Trp Xlo Thr Pho Asp lan
		245	250	255
Lya	Asn Lys	Oln Val Bar Val Lys Arg Val	Thr Oln Asp Pro Lya Len
		250	245	270
Oln	Hat Oly Lya Lya Lan Pro Lan	Bis Lan	Thr lan Pro Oln Alá Lan
	275	2B0		2B5
Pro	Oln Tyr Alá Oly Bar Oly Aan	Xau Thr	Xan Alá Xan Oln Alá Lya
	290	295		300
Thr	Oly Lys lan Bi· Oln Oln Val	Asn Lan	Val Val Nőt Arg Alá Thr
305		310		315 320

HU 218 732 Β

Óla Leu Óla Ly·	Aaa 325	Lau	Xhr Cy· Olu Val Xrp Oly Pro Xhr 8«r Pro
330	335
Lya Laa ltot Lau	8ar	Lau	Lys Lau Olu Aaa Ly· Olu Alá Lya	Val Sár
340			345 350
Lya Arg Óla Lya	Pro	Val	Xrp Val Lau Aaa Pro Olu Alá Oly	Hat Xrp
35S			360 345
Óla Cy· Lau Leu	Sár	A«p	Sár Oly Óla Val Lau Lau Olu'Bar	Aaa Xla
370			375 380
Ly· Val Lau Pro	Xhr	Xrp	Sár Xhr Pro Val Bla Alá Aap Pro	Lya Xau
385		390	395	600
Cy· Xyr Lau Lau	Α·ρ	Oly	Ila Leu Pha Xla Xyr Oly Val Xla	Lau Xhr
	405		410	415
Alá Lau Pha Lau	Arg	Val	Lya Pha Sár Arg Sár Alá Olu Pro	Pro Alá
420			425 430
Xyr Óla Óla Oly	Óla	A*a	Óla Lau Xyr Aaa Óla Leu Aaa Lau	Oly Arg
435			440 445
Arg Óla Óla Xyr	Α·ρ	Val	Lau Aap Lya Arg Arg Oly Arg Aap	Pro Olu
450			455 460
ltot Oly Oly Lya	Pro	Arg Arg Ly· Asn Pro Óla Olu Oly Lau	Xyr Aaa
445		470	675	480
Óla Lau Óla Lya Aap Lya ltot Alá Olu Alá Xyr Sár Óla Xla	Oly Met
	455		690	498
Ly· Oly Óla Arg Arg Arg Oly Ly· Oly 11· Aap Oly Lau Xyr	Óla Oly
500			505 510
Lau Bar Xhr Alá	Xhr Lya Asp Xhr Xyr Aap Alá Laa Bla ltot	Óla Alá

SIS 520 S2S

Xaa Pro Pro Arg S30 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 7-ROL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 33 bázis 35 (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZALFAJTA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 7

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC 33 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 8-RÓL 40 (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 50 bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 8

CGCGGGGATC CGTCGTCCAGAGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 9-RŐL (C) SZÁLFAJTA: egyszálú (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (D) TOPOLÓGIA: lineáris (A) HOSSZA: 33 bázis (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (B) TÍPUSA: nukleinsav 50 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 9

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAG 33 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 10-RŐL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 33 bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: egyszálú 55 (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 10

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33

HU 218 732 Β (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 11-RŐL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 15 bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: egyszálú 5 (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 11 CGCGGGCGGC CGCTA 15 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 12-RŐL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 42 bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 12

CGCGGGCTCG TTATAGAGCTGGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG 42 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 13-RÓL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 48 bázis 15 (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZALFAJTA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 13

CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCCG 48 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 14-RŐL 20 (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 33 bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 14

CGCGGGGCGG CCACGCGTTC TCGCCAGCACACA 33 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 15-RŐL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 36bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav 30 (C) SZÁLFAJTA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 15

CGCGGGACGC GTTTCAGCCG TCCTCGCCAGCACACA 36 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 16-RÓL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 33 bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: egyszálú 35 (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 16

CGCGGGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG 33 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 17-RŐL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 33 bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 17

CGCGGGACGC GTATTGGGATGAAAGGCGAG CGC 33 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 18-RÓL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 26 bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 18 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 19-RŐL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 42 bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 19

CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT 26

CGCGGGGCGG CCGCTTTAGTTATTACGTTGACATGGTCG TT 42

HU 218 732 Β (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 20-ROL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 30 bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 20

GCGGGGGGATCCCACTGTCCAAGCTCCCAG 30 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 21-ROL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 32 bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 21

GCGGGGGCGG CCGCCTAAATACGGTTCTGG TC 32 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 22-ROL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 31 bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 22

TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A 31 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 23-ROL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 31 bázis (B) TÍPUSA: nukleinsav (C) SZÁLFAJTA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: nukleinsav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 23

TTGTTGGTTT CTTCA GGTTG TGTCTTTCTG A 31 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 24-RŐL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 171 aminosav (B) TÍPUSA: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris 30 (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: aminosav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 24

ltot elv ai·	Sor Xbr Pba Laa Ser Oly Laa Val Loa bla Xbr Lou Leu
5	10	15
Sor Óla Val	Sor Pro	Pba Lys Xla Pro Zla Óla	Óla Lob Olv Asp Arg
	30	35	30
Val Pb· Val	Asa Cys	Ara Xbr Sor Zlo Xbr Trp	Val Óla Oly Xbr Val
35		40	45
Oly Xbr Loa	Loa Sor	Asp Xlo Xbr Arg Loa Aap Loa Oly Lyo Arg Zlo
50		55	60
Loa Asp Pro	Arg Oly	Zlo Xyr Ars Cp· Ara Oly	Xbr Asp Zlo Xyr Lys
65		70 75	SO
Asp Lyo Óla	Sor Xbr	Val Óla Val Ila Xyr Arg	ltot Cys Óla Sor Cys
	•5	90	95
Val Óla l*a	Asp Pro	Alá Xbr Val Alá Oly Xla	Zlo Val Xbr Asp Val
	100	105	110
Aló Ila Xbr	Loa Lav	Loa Alá Loa Oly Val Pba	Cys Pb· Alá Oly Mis
115		130	135
Óla Xbr Oly	Ars Lav	Sor Oly Alá Aló Asp Xbr	Óla Alá Lou Loa Arg
130		135	140
Asa Aap Óla	Val Xyr	Óla Pro lou Arg Asp Arg Asp Asp Alá Óla Tyr
165		ISO 155	160
Sor Iii Laa	Oly Oly	Asa Trp Alá Arg Asu Lys

165 170

HU 218 732 Β (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 25-ROL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZA: 182 aminosav (B) TÍPUSA: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: aminosav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 25

Met 01» Óla Oly Lys Oly Lau Als Val Leu II· Leu Alá II· S 10

II· L*u IS

Leu	Oln oly zhr Leu Alá 20	Oln	Ser
Val	Tyr Asp Tyr oln Oln 35	Asp Oly 40
Olu	Alá Lys Asa 11· Thr 50	Trp 55	Fh·
Leu <5	Thr Olu Asp Lys Lys Lys 70	Trp
Pro	Arg Oly Met Tyr Oln •5	Cys	Lys
Leu	Olu Val Tyr Tyr 100	Met	Cys
Alá	Thr 11· Ser Oly Fh· 115	Leu	Fh· 120
Leu	Als Val Oly Val Tyr 130	Fh· 135	11·
Ser 145	Arg Al· Ser Asp Lys ISO	Olu	Thr
Óla Asn	Pro Leu Lys Asp Arg 145 Oln Leu Arg Arg Asa	Olu	Asp

100

11«	Lys	Oly Asa Sis	Leu	Val	Lys
25			30
Ser	Val Leu Lm Thr 45	Cys Asp	Al·
Lys Asp Oly Lys Mát 40	11·	Oly	Fh·
Asa	Leu	Oly Ser Asa 75	Als	Lys	Atp •0
Oly	Ser 90	Óla Asa Lys	Ser	Lys 95	Pro
Olu 105	Asa	Cys 11· Olu	Lm 110	Asa	Als
Als	Olu	11· Val Mr 125	11·	Fh·	Val
Als	Oly	Olu Asp Oly 140	Val	Arg	Óla
Leu	Leu	Pro Asa Asp 155	Óla	L«u	Tyr 140
ASP	Olu 170	Tyr tor Als	Lau	Olu 175	Oly

(2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 26-RÓL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 35 (A) HOSSZA: 220 aminosav (B) TÍPUSA: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: aminosav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 26

Met

Pro

Oly

Oly Lm Olu Als Leu Arg Als Leu Pro Lm Lm Leu Phe

S

10

15

Lm

Ser

Tyr

Alá

Cy·

Leu

Oly

Pro

Oly

cys

Óla

Alá

Leu

Arg

Val

Olu

20

25

30

Oly Oly

Pro

Ser

Leu

Thr

Vsl

Asn

Leu

Oly

Olu

Oln

Ua

Arg

Leu

35

40

45

Thr

Cys

Olu

Asa

Oly Arg

Asa

Pro

Asa

11·

Thr

Trp Trp

Fh·

Ser

50

55

40

Leu

Oln

Ser

Asa

Ile

Thr

Trp

Pro

Val

Pro

Leu

oly

Pro

oly

Olu

45

70

75

80

Oly

Thr

Oly

Óla

Leu

Phe

Fh·

Pro

Olu

Val

Asn

Lya

Asa

Thr

oly

SS

90

95

Alá

Cys

Thr

Oly

cys

Óla

Val

lle

Olu

Asa

Ile

Leu

Lys Arg

Ser

100

105

110

Cys

Oly

Thr

Tyr

Leu

Arg

Val

Arg

Asa

Pro

Val

Pro

Arg

Pro

Fh·

Leu

115

120

125

Asp

Met

Oly

Óla

Oly

Thr

Lys

Asa

Arg

Ile

Xl·

Thr

Alá

Olu

oly

11·

130

135

140

11·

Len

Leu

Fh·

cy·

Alá

Vsl

Val

Pro

Oly

Thr

Lm

Lau

Lm

Fh·

Arg

145

150

155

140

HU 218 732 Β

Ly· Arg Trp Óla Asn Óla Lys Ph· 1(S

Olu Aep Óla Aea Leu Tyr Olu Oly ISO

Tyr 01a Α·ρ XI· Mr Arg Oly Lw 195 200

Aea Lm Ale XI· Oly A*p Al· Óla 210 21S

Oly Val Aep Met Pro Aep Aep Tyr 170 17S

Len Asa Leu Aep Aep Cya Mer Met

1SS ISO

Óla Oly Thr Tyr Óla Aep Vei Oly

20S

Lea Olu Lye Pro 220 (2) INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 27-RŐL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

(A) HOSSZA: 228 aminosav (B) TÍPUSA: aminosav (D)TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: aminosav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 27

Met	Ale	Thr	Leu	Vei 5	Leu	Ser	Ser
Leu	Len	Leu	Len 20	Phe	Ser	Oly	Oln
Aep	Lett	Pro 33	Leu	Aea	Ph·	Óla	Oly 40
Ile	Pro SO	Arg	Ph·	Ala	Ala	Lye 55	Lye
Cy· <5	Tyr	Thr	Asa	Ml·	Mer 70	Oly	Ala
ser	Óla	Óla	Pro	Óla 85	Olu	Lm	Vei
Thr	Óla	Asa	Oly 100	Ser	Val	Tyr	Thr
Óla	Aep	Aea 115	Oly	XI·	Tyr	Phe	cy· 120
Ml·	Aen 130	Val	Thr	Aep	Sár	Cy· 135	Oly
Ser 145	Thr	Lea	Aep	Óla	Lea 150	Lye	Arp
XI·	1«	11·	Óla	Thr 185	Lm	XiOtt	Xle
Phe	Lm	Lm	Lm 180	Aep Lye Aep Aep
Ml·	Thr	Tyr 195	Óla	Oly	Lea	Aea	Xle 200
XI· Pro 225	Val 210 Oly	Thr Óla	Len Óla	Arg	Thr	Oly 215	Oln

Met Pro Cy· Ml· Trp Leu Leu Ph·
	10	15
Pro 25	Val	Pro Ala Met Thr Ser Ser 30
Ser	Pro	Cy· Ser Óla Xle Trp Óla 45
Arg	Sor	Ser Met Val Lye Phe Mis 40
Len	Thr	Trp Phe Arg Lye Arg Oly 75 SO
Mer	Olu 90	Oltt Oly Arg Xle Val Óla 95
Len 105	Thr	XI· Óla Asa Xle 01a Tyr 110
Lye	Óla	Lye Cya Aep Ser Ale Aea 125
Thr	Olu	I<en Lea Vei !<·« Oly Phe 140
Arg	Aen	Thr Len Lye Aep Oly 11· 155 140
Xle	Len 170	Phe Xle Xle Val Pro Xle 175
Oly Lye 185	Ala Oly Met Olu Olu Aep 190
Aep	Óla	Thr Ala Thr Tyr Óla Aep 205
Val	Lye	Trp Ser Vei Oly Oln Ml· 220

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás emlősben fertőző ágens, tumor- vagy rákos sejt, vagy autoimmun folyamatban keletkezett sejt elleni sejtválasz irányítására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy összekeverünk

- membránhoz kötött, fehérje jellegű kimérareceptort expresszáló terápiás sejteket hatásos mennyiségben, amely kimérareceptor tartalmaz (a) egy extracelluláris részt, amely képes a fertőző célágenst vagy a célsejtet specifikusan felismerni és ahhoz hozzákapcsolódni, és (b) egy T-sejt-receptor CD3-, dzéta- vagy éta-polipeptidből, egy B-sejt-receptor polipeptidből vagy egy Fc-receptor polipeptidből származó intracelluláris vagy transzmembrán részt, amely képes jeleket adni a sejtnek, egy receptorhoz kötött célsejt vagy egy receptorhoz kötött fertőző ágens elpusztítására; és

- gyógyászatilag elfogadható hordozót.

HU 218 732 Β
2. Eljárás emlősben fertőző ágens, tumor- vagy rákos sejt, vagy autoimmun folyamatban keletkezett sejt elleni sejtválasz irányítására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy

- terápiás sejteket hatásos mennyiségben, amely terápiás sejtek egy membránhoz kötött, fehérje jellegű kimérareceptort expresszálnak, amely tartalmaz (a) egy extracelluláris CD4-részt, amely képes a fertőző célágenst vagy a célsejtet specifikusan felismerni és ahhoz hozzákapcsolódni, és (b) egy T-sejt-receptor, egy B-sejt-receptor vagy egy Fc-receptor polipeptidből származó intracelluláris vagy transzmembrán részt, amely képes specifikus jeleket adni a sejtnek, egy receptorhoz kötött célsejt vagy egy receptorhoz kötött fertőző ágens elpusztítására;

- és gyógyászatilag elfogadható hordozót összekeverünk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy MHC-től nem függő sejtválasz irányítására alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy terápiás sejtként dzéta, éta, gamma, CD3 delta, T3 gamma, mbl vagy a B29 receptorfehérjét tartalmazó kimérareceptort expresszáló sejtet alkalmazunk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy terápiás sejtként:

(a) a SEQ ID NO. 6 421-532-es aminosavait;

(b) a SEQ ID NO. 6 423-455, 438-455, 461-494 vagy 494-528-as aminosavait;

(c) a SEQ ID NO. 6 400-420 aminosavait;

(d) a SEQ ID NO. 4 421-575 aminosavait;

(e) a SEQ ID NO. 4 423-455, 438-455, 461-494 vagy 494-528-as aminosavait;

(f) a SEQ ID NO. 4 400-420 aminosavait;

(g) a SEQ ID NO. 5 421-462 aminosavait;

(h) a SEQ ID NO. 5 402-419 aminosavait;

(i) a 15a. ábra szerinti Tyr282-Tyr298 aminosavakat;

(j) a 16. ábra (SEQ ID NO. 24) 132-171-es aminosavait;

(k) a 17. ábra (SEQ ID NO. 25) 140-182-es aminosavait;

(l) a 18. ábra (SEQ ID NO. 26) 162-220-as aminosavait és/vagy (m) a 19. ábra (SEQ ID NO. 27) 183-228-as aminosavait tartalmazó kimérareceptort expresszáló sejtet alkalmazunk.
6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy terápiás sejtként az alábbiak bármelyikét alkalmazzuk:

(a) T-limfociták;

(b) citotoxikus T-limfociták;

(c) természetes ölősejtek;

(d) neutrofilek;

(e) granulociták;

(f) makrofágok;

(g) hízósejtek;

(h) HeLa-sejtek; és (i) embrionális őssejtek (ES).
7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy fertőző ágensként immundeficiencia-vírus elleni sejtválasz irányítására alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett extracelluláris részként a CD4-nek egy, HIV-burkot kötő részét tartalmazó, illetve annak egy fünkcionális, HIV-burkot kötő származékát tartalmazó terápiás sejteket alkalmazunk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy terápiás sejtként CD8+ citotoxikus T-limfocitát alkalmazunk.
10. Sejt, amely egy membránhoz kötött, fehérje jellegű kimérareceptort expresszál, azzal jellemezve, hogy ez a receptor tartalmaz (a) egy extracelluláris részt, amely képes egy fertőző ágenst, egy fertőző ágenssel fertőzött sejtet, egy tumor- vagy rákos sejtet, vagy egy autoimmunfolyamatban keletkező sejtet specifikusan felismerni és ahhoz hozzákapcsolódni, és (b) egy T-sejt-receptor CD3-, dzéta- vagy éta-polipeptidből, egy B-sejt-receptor polipeptidből vagy egy Fc-receptor polipeptidből származó intracelluláris vagy transzmembrán részt, amely képes jeleket adni a sejtnek, a receptorhoz kötött célsejt vagy a receptorhoz kötött fertőző ágens elpusztítására.
11. Sejt, amely egy membránhoz kötött, fehérje jellegű kimérareceptort expresszál, azzal jellemezve, hogy ez a receptor tartalmaz (a) egy extracelluláris CD4-részt, és (b) egy T-sejt-receptor, egy B-sejt-receptor vagy egy Fc-receptor polipeptidből származó intracelluláris vagy transzmembrán részt, amely képes jeleket adni a sejtnek, a receptorhoz kötött célsejt vagy a receptorhoz kötött fertőző ágens elpusztítására.
12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy az MHC-tól nem függő módon kapcsolódik.
13. A 10. vagy 11. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy receptorfehérjeként dzétából, étából, gammából, CD3 deltából, T3 gammából, mbl-bői vagy a B29-ből származó részt tartalmazó kimérareceptort expresszál.
14. A 13. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavakat tartalmazó kimérareceptort expresszál:

(a) a SEQ ID NO. 6 421-532-es aminosavait;

(b) a SEQ ID NO. 6 423-455, 438-455, 461-494 vagy 494-528-as aminosavait;

(c) a SEQ ID NO. 6 400-420 aminosavait;

(d) a SEQ ID NO. 4 421-575 aminosavait;

(e) a SEQ ID NO. 4 423-455, 438-455, 461-494 vagy 494-528-as aminosavait;

(f) a SEQ ID NO. 4 400-420 aminosavait;

(g) a SEQ ID NO. 5 421-462 aminosavait;

(h) a SEQ ID NO. 5 402-419 aminosavait;

(i) a 15a. ábra szerinti Tyr282-Tyr298 aminosavakat;

HU 218 732 Β (j) a 16. ábra (SEQ ID NO. 24) 132-171-es aminosavait;

(k) a 17. ábra (SEQ ID NO. 25) 140-182-es aminosavait;

(l) a 18. ábra (SEQ ID NO. 26) 162-220-as aminosavait; és/vagy (m) a 19. ábra (SEQ ID NO. 27) 183-228-as aminosavait.
15. A 10. vagy 11. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy az alábbiak bármelyike:

(a) T-limfocita;

(b) citotoxikus T-limfocita;

(c) természetes ölősejt;

(d) neutrofil;

(e) granulocita;

(f) makrofág;

(g) hízósejt;

(h) HeLa-sejt; és (i) embrionális őssejt (ES).
16. A 10. vagy 11. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy CD4-nek egy HIV-burkot kötő részét, vagy annak egy funkcionális, HIV-burkot kötő származékát tartalmazó extracelluláris részt tartalmazó kimérareceptort expresszál.
17. A 16. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy a terápiás sejt CD8+ citotoxikus T-limfocita.
18. A 10. vagy 11. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy extracelluláris részként immunglobulinmolekulát vagy annak egy antigénkötő fragmentjét tartalmazó kimérareceptort hordoz.
19. Kimérareceptort kódoló DNS, azzal jellemezve, hogy a 10. vagy all. igénypont szerinti kimérareceptort kódolt
20. Kimérareceptort kódoló DNS-t tartalmazó vektor, azzal jellemezve, hogy a 19. igénypont szerinti kimérareceptort tartalmaz,
21. Eljárás immundeficienciavirus-fertőzés kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 16. igénypont szerinti gazdasejtet gyógyászatilag elfogadható hordozóval összekeverünk.
22. Egy lényegében tiszta antitest, azzal jellemezve, hogy specifikusan felismeri a 10. vagy 11. igénypont szerint meghatározott kimérareceptort és kötődik hozzá.
23. Eljárás membránhoz kötött, fehéije jellegű kimérareceptort expresszáló sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy génsebészeti, molekuláris biológiai és/vagy sejtbiológiai úton, önmagában ismert módon az alábbiakat tartalmazó receptort expresszáló sejtet állítunk elő;

(a) egy extracelluláris részt, amely képes egy fertőző ágenst, egy fertőző ágenssel fertőzött sejtet, egy tumor- vagy rákos sejtet, vagy egy autoimmunfolyamatban keletkező sejtet specifikusan felismerni és ahhoz hozzákapcsolódni, és (b) egy T-sejt-receptor CD3-, dzéta- vagy éta-polipeptidből, egy B-sejt-receptor polipeptidből vagy egy Fc-receptor polipeptidből származó intracelluláris vagy transzmembrán részt, amely képes jeleket adni a sejtnek, a receptorhoz kötött célsejt vagy a receptorhoz kötött fertőző ágens elpusztítására.
24. Eljárás membránhoz kötött, fehérje jellegű kimérareceptort expresszáló sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy génsebészeti, molekuláris biológiai és/vagy sejtbiológiai úton, önmagában ismert módon az alábbiakat tartalmazó receptort expresszáló sejtet állítunk eló:

(a) egy extracelluláris CD4-részt és (b) egy T-sejt-receptor, egy B-sejt-receptor vagy egy Fc-receptor polipeptidből származó intracelluláris vagy transzmembrán részt, amely képes jeleket adni a sejtnek, a receptorhoz kötött célsejt vagy a receptorhoz kötött fertőző ágens elpusztítására.
25. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az MHC-tól nem függő kapcsolódású sejtet állítunk elő.
26. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy receptorfehéijeként dzétából, étából, gammából, CD3 deltából, T3 gammából, mb 1-ből vagy a B29-ből származó részt tartalmazó kimérareceptort expresszáló sejtet állítunk elő.
27. A 26. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy a kimérareceptorként az alábbi aminosavakat tartalmazó kimérareceptort expresszáló sejtet állítunk eló:

(a) a SEQ ID NO. 6 421-532-es aminosavait;

(b) a SEQ ID NO. 6 423-455, 438-455, 461-494 vagy 494-528-as aminosavait;

(c) a SEQ ID NO. 6 400-420 aminosavait;

(d) a SEQ ID NO. 4 421-575 aminosavait;

(e) a SEQ ID NO. 4 423-455, 438-455, 461-494 vagy 494-528-as aminosavait;

(f) a SEQ ID NO. 4 400-420 aminosavait;

(g) a SEQ ID NO. 5 421-462 aminosavait;

(h) a SEQ ID NO. 5 402-419 aminosavait;

(i) a 15a. ábra szerinti Tyr282-Tyr298 aminosavakat;

(j) a 16. ábra (SEQ ID NO. 24) 132-171-es aminosavait;

(k) a 17. ábra (SEQ ID NO. 25) 140-182-es aminosavait;

(l) a 18. ábra (SEQ ID NO. 26) 162-220-as aminosavait; és/vagy (m) a 19. ábra (SEQ IDNO. 27) 183-228-as aminosavait.
28. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy terápiás sejtként az alábbiak bármelyikét állítjuk elő:

(a) T-limfociták;

(b) citotoxikus T-limfociták;

(c) természetes ölősejtek;

(d) neutrofilek;

(e) granulociták;

(f) makrofágok;

(g) hízósejtek;

(h) HeLa-sejtek; és (i) embrionális őssejtek (ES).
29. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy CD4-nek egy HIV-burkot kötő részét, vagy annak egy funkcionális, HIV-burkot kötő szárma37

HU 218 732 Β zékát tartalmazó extracelluláris részt tartalmazó kiméra receptort expresszáló sejtet állítunk elő.
30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy citotoxikus T-limfocitaként egy CD8+ citotoxikus T-limfocitát állítunk elő.
31. A 23. vagy 24. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy extracelluláxis részként immunglobulin- molekulát vagy annak egy antigénkötő fragmentjét tartalmazó kimérareceptort expresszáló sejtet állítunk elő.
32. Eljárás kimérareceptort kódoló DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy génsebészeti, molekuláris biológiai és/vagy szerves szintetikus úton, önmagában ismert módon a 23. vagy a 24. igénypont szerint előállított sejt által expresszált kimérareceptort kódoló DNS-t állítunk elő.
33. Eljárás kimérareceptort tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy génsebészeti, molekulá5 ris biológiai és/vagy szerves szintetikus úton, önmagában ismert módon a 32. igénypont szerint előállított DNS által kódolt kimérareceptort tartalmazó vektort állítunk elő.
34. Eljárás lényegében tiszta antitest előállítására,

10 azzal jellemezve, hogy molekuláris biológiai, immunológiai és/vagy enzimológiai úton, önmagában ismert módon a 10. vagy 11. igénypont szerinti kimérareceptort specifikusan felismerő és ahhoz kötődő antitestet állítunk elő.