CZ281881B6 - Buňka, která expresí poskytuje proteinovou membránou vázaný chimeruí receptor - Google Patents

Abstract

Je popsán způsob směrování buněčné odpovědi na infekční činidlo, na buňku infikovanou takovým činidlem, nádorovou nebo rakovinnou buňku nebo na autoimunně generovanou buňku u savce, vyznačující se tím, že se savci podává efektivní množství terapeutických buněk, přičemž tyto buňky jsou schopny specificky rozpoznávat a ničit uvedené činidlo nebo buňky. Tyto terapeutické buňky expresí poskytují na membránu proteinový chimerní receptor, který obsahuje a) extracelulární část, která je schopna specificky rozpoznávat a vázat uvedené činidlo nebo buňku, a b) intracelulární nebo transmembránovou část, která je schopna signalizovat therapeutické buňce, aby ničila činidlo navázané na receptor nebo buňku navázanou na receptor. Je popsána také DNA kodující shora uvedený chimerní receptor, vektor, který obsahuje DNA chimerního receptoru, a v podstatě čistá protilátka, která specificky rozpoznává chimerní receptor.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká chimemích receptorových proteinů, DNA, vektorů a buněk, tj. funkčních T buněčných receptorových chimér, Fc receptorových chimér nebo B buněčných receptorových chimér, které jsou schopny přesměrovat funkci imunitního systému. Blíže se tento vynález týká regulace lymfocytů, makrofágů, přírodních buněk-zabíječů nebo granulocytů expresí v uvedených buňkách chimér, které způsobují, že buňky odpovídají na cíle rozpoznávané chimérami. Vynález se týká také funkčních T buněčných receptorových chimér, Fc receptorových chimér nebo B buněčných receptorových chimér, které jsou schopny přesměrovat terapeutické buňky tak, aby specificky rozpoznávaly a ničily buď buňky infikované specifickým infekčním činidlem, infekční činidlo samotné, nádorovou buňku, nebo autoimunně generovanou buňku. Podrobněji se tento vynález týká přípravy T buněčných receptorových chimér nebo Fc receptorových chimér, které jsou schopny směrovat cytotoxické T lymfocyty tak, aby specificky rozpoznávaly a lyžovaly buňky, které expresí poskytují HTV obalové proteiny. Vynález se tudíž týká terapie takových onemocnění, jako je např. AIDS (syndrom získané imunitní nedostatečnosti), které je způsobováno virem HIV.

Dosavadní stav techniky

Základem imunologických jevů je rozpoznávání T buněk antigenů receptorem T buněk. T buňky řídí to, co se nazývá imunita zprostředkovaná buňkami. Tento jev zahrnuje destrukci buňkami imunitního systému cizích tkání nebo infikovaných buněk. Existují různé druhy T buněk, včetně helper (pomocných) nebo supressor (supresorových) buněk, které modulují imunitní odpověď, a cytotoxických buněk (nebo zabiječů, tj. killer) buněk, které mohou přímo zabíjet abnormální buňky.

T buňka, která rozpoznává a váže jedinečný antigen nacházející se na povrchu jiné buňky, se aktivuje. Potom se může rozmnožit a jestliže je to cytotoxická buňka, může zabít navázanou buňku.

Autoimunní onemocnění je charakterizováno tím, že dochází k produkci buď protilátek, které reagují s hostitelskou tkání, nebo imunních efektorových T buněk, které jsou autoreaktivní. V některých případech se protilátky získají jako odpověď normálních T- a B-buněk aktivovaných cizími sloučeninami nebo organismy, které obsahují antigeny, které zkříženě reagují s podobnými sloučeninami v tělesných tkáních. Příklady klinicky relevantních protilátek jsou protilátky proti acetylcholinovým receptorům u myastenie gravis a anti-DNA, anti-erythrocytové a anti-destičkové protilátky u systémové lupus erythromatodes.

HIV a imunopathogenese: V roce 1984 bylo prokázáno, že HIV je etiologickým činidlem AIDSu. Od té doby byla definice AIDSu mnohokrát revidována, pokud jde o kriteria diagnosy. Navzdory fluktuaci v diagnostických parametrech, jednoduchým obecným jmenovatelem AIDSu je infekce HIV a následný vývoj persistentních konstitučních symptomů a AIDS definující nemoci, jako jsou například sekundární infekce, novotvary a neurologické onemocnění. Harrison’s Principles of Intemal Medicine, 12. vydání, McGraw Hill (1991).

HIV je lidský retrovirus skupiny lentivirus. Čtyři rozpoznávané lidské retroviry náleží ke dvěma různým skupinám: mezi lidské T lymfotropní (nebo leukemové) retroviry, HTLV-1 a HTLV-2, a viry lidské imunitní nedostatečnosti, HTV-1 a HTV-2. První z nich jsou transformující viry, druhé dva

- 1 CZ 281881 B6 jsou cythopatické viry.

HTV-1 byl identifikován jako nejobvyklejší případ AIDSu po celém světě. Homologie sekvencí mezi HTV-2 a HIV-1 je asi 40 % s tím, že HIV-2 je příbuznější s některými skupinami opičího viru imunitní nedostatečnosti (SIV). Viz Curran J. a spol.: Science 329, 1357 až 1359 (1985), Weiss R. a spol.: Nátuře 324. 572 až 575 (1986).

HTV má obvyklé retrovirové geny (env, gag, a pol) a také šest dalších genů obsažených v replikaci a další biologické aktivity viru. Jak bylo shora uvedeno, obvyklým jmenovatelem AIDSu je zásadní potlačení imunity, převážně imunity zprostředkovávané buňkami. Toto potlačení imunity vede k různým příležitostným onemocněním, zvláště k jistým infekcím a k nádorovým onemocněním.

Jako hlavní příčina poruchy imunity u AIDS byla definována kvantitativní a kvalitativní nedostatečnost v podřadě lymfocytů odvozených od brzlíku (T), T4 populace. Tato podřada buněk je fenotypicky definována přítomností CD4 povrchové molekuly, o níž bylo ukázáno, že je buněčným receptorem HTV. Dalgleish a spol.: Nátuře 312, 763 (1984). I když T4 buňka je hlavním buněčným typem infikovaným HTV, v podstatě jakákoliv lidská buňka, která expresí poskytuje na svém povrchu CD4 molekulu, je schopna navázat se na HIV a schopna být infikována HTV.

Tradičně je CD4⁺ T buňkám připisována role pomocných/indukčních buněk (helper/inducer), což ukazuje na jejich funkci v poskytování aktivačního signálu B buňkám nebo indukování T lymfocytů nesoucích CD8 markér tak, že se stanou cytotoxickými/supresorovými buňkami. Reinherz a Schlossman: Cell 19, 821 až 827 (1980), Goldstein a spol.: Immunol. Rev. 68, 5 až 42 (1982).

HIV se váže specificky a s vysokou afinitou, prostřednictvím natažených aminokyselin ve virové obálce (gpl20), na část VI oblasti CD4 molekuly umístěné blízko jejího N-konce. Po navázání se virus fúzuje s membránou cílové buňky a intemalizuje se. Jakmile je jednou intemalizován, použije enzym reversní transkriptásu k transkripci (přepsání) jeho genomové RNA na DNA, která se integruje do buněčné DNA, kde existuje po dobu života nebo do buňky jako provirus.

Provirus může zůstat latentní nebo může být aktivován pro transkripci mRNA a genomové RNA, vedoucí k syntéze proteinu, sestavení, tvorbě nového virionu a vypučení viru z povrchu buňky. I když přesný mechanismus, kterým virus indukuje smrt buňky není stanoven, je pociťováno, že hlavním mechanismem je masivní virové pučení z povrchu buňky, které vede k porušení plasmové membrány a výsledkem je porušení osmotické rovnováhy.

Během postupu infekce hostitelský organismus vyvíjí protilátky proti virovým proteinům, včetně hlavních obálkových glykoproteinů gpl20 a gp41. Přes humorální imunity onemocnění pokračuje, což vede k letálnímu potlačení imunity, které je charakterizováno násobnými příležitostnými infekcemi, parasitemií, demencí a smrtí. Selhání hostitelských protivirových protilátek při zabránění postupu onemocnění představuje jeden z nejnepříjemnějších a alarmujících aspektů tohoto vynálezu a znamená současně pouze slabý popud pro očkování, které by bylo založeno na konvenčních přístupech.

V účinnosti humorální odpovědi na viry imunitní nedostatečnosti mohou hrát roli dva faktory. Prvním, podobně jako u jiných RNA virů (a zvláště podobně jako u retrovirů) je to, že viry imunitní nedostatečnosti vykazují vysokou intensitu mutace při odpovědi na hostitelský imunitní dozor. Druhým faktorem je to, že obálkové glykoproteiny samy jsou těžko glykosylovatelnými molekulami, které mají několik epitopů vhodných pro navázání protilátky s vysokou afinitou. Slabý antigenový cíl, který virová obálka presentuje, poskytuje hostiteli pouze malou příležitost v omezení virové infekce produkcí specifických protilátek.

-2CZ 281881 B6

Buňky, které jsou infikovány HTV virem, expresují na svém povrchu glykoprotein gpl20. Gpl20 zprostředkuje fuze mezi CD4⁺ buňkami podobnou reakcí, jako je ta, kterou virus vstupuje do neinfikovaných buněk, což vede k tvorbě vícejademých obrovských buněk s krátkou životností. Tvorba syncytia (buněčného celku) závisí na přímé interakci obálkového glykoproteinu gpl20 s CD4 proteinem. Dalgleish a spol.: viz výše; Klatzman D. a spol.: Nátuře 312. 763 (1984); McDougal J. S. a spol.: Science 231, 382 (1986); Sodroski J. a spol.: Nátuře 322. 470 (1986); Lifson J. D. a spol.: Nátuře 323. 725 (1986); Sodroski J. a spol.: Nátuře 321, 412 (1986).

Důkaz, že vazba CD4-gpl20 je zodpovědná za virovou infekci buněk nesoucích CD4 antigen, zahrnuje zjištění, že se mezi gpl20 a CD4 tvoří specifický komplex. McDougal a spol.: viz výše. Další výzkumníci ukázali, že buněčné linie, které nebyly infekční pro HIV, byly převedeny na infikovatelné buněčné linie po transfekci a expresi lidského CD4 cDNA genu. Maddon a spol.: Cell 46,333 až 348 (1986).

Byly navrženy a úspěšně demonstrovány in vivo četnými skupinami (Deen a spol.: Nátuře 331, 82 až 84 (1988); Fisher a spol.: Nátuře 331, 76 až 78 (1988); Hussey a spol: Nátuře 331. 78 až 81 (1988); Smith a spol.: Scince 238. 1704 až 1707 (1987); Traunecker a spol.: Nátuře 331. 84 až 86 (1988).) terapeutické programy založené na rozpustné CD4 jako pasivním činidle, které interferuje s virovou adsorpcí a syncytiem zprostředkované buněčné transmise. Následně byly vyvinuty CD4 imunoglobulinové napojené proteiny s prodlouženou životností a mírnou biologickou aktivitou (Capon a spol.: Nátuře 337, 525 až 531 (1989); Traunecker a spol.: Nátuře 339. 68 až 70 (1989); Bym a spol.: Nátuře 344. 667 až 670 (1990) a Zettlmeissl a spol.: DNA Cell Biol.: 9, 347 až 353 (1990).). I když CD4 imunotoxinové konjugáty nebo fúzované proteiny vykazují silnou cytotoxicitu na infikované buňky in vitro (Chaundhary a spol.: Nátuře 335, 369 až 372 (1988); Till a spol.: Scince 242. 1166 až 1168 (1988).), bezpříznakové období nemoci syndromu imunitní nedostatečnosti způsobuje, že by bylo nepravděpodobné, aby nějaká jednoduchá terapie byla účinná při odstraňování virových problémů, a antageničnost cizích fúzovaných proteinů pravděpodobně omezuje jejich přijatelnost při léčení, které vyžaduje opakování dávek. Pokusy s opicemi s SIV ukázaly, že rozpustný CD4, jestliže se podává zvířeti bez význačné CD4 cytopenie, může snížit SIV titr a zlepšit in vivo míry myeloidního potenciálu (Watanabe a spol.: Nátuře 337. 267 až 270 (1989).). Avšak po tom, co se přeruší léčení, se objeví okamžitá náhlá virová příhoda, což ukazuje na to, že by bylo nutné dlouhodobé podávání, aby se zabránilo oslabení progresivního imunitního systému.

T buněčné a Fc receptory: Exprese nejhojnější formy T buněčného antigenového receptorů (TCR) povrchem buněk vyžaduje koexpresi alespoň 6 různých polypeptidových řetězců (Weiss a spol.: J. Exp. Med. 160, 1284 až 1299 (1984); Orloffhashi a spol: Nátuře 316, 606 až 609 (1985); Berkhout a spol.: J. Biol. Chem. 263, 8528 až 8536 (1988); Sussman a spol.: Cell 52. 85 až 95 (1988).), a/(antigen vázajících řetězců, tří polypeptidů CD3 komplexu a zeta. Jestliže není přítomen kterýkoliv z řetězců, nedochází ke stabilní expresi zbývajících členů komplexu. Zeta je limitujícím polypeptidem povrchové exprese úplného komplexu (Sussman a spol.: Cell 52, 85 až 95 (1988).). Předpokládá se, že zprostředkovává alespoň frakci buněčných aktivačních programů spouštěných receptorovým rozpoznáním ligandu (Weissman a spol.: EMBO J. 8, 3651 až 3656 (1989); Frank a spol.: Science 249, 147 až 177 (1990).). Integrální membránový homodimer typu I o molekulové hmotě 32 000 zeta má extracelulámí doménu o 9 zbytcích s žádným místem pro adici N-navázaného glykanu a intracelulámí doménu se 112 zbytky (myší) nebo se 113 zbytky (lidskou) (Weissman a spol.: Science 238. 1018 až 1020 (1988a); Weissman a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 9709 až 9713 (1988b).). Isoform zety nazývaný eta (Baniyash a spol.: J. Biol. Chem. 263. 9874 až 9878

-3CZ 281881 B6 (1988); Orloff a spol.: J. Biol. Chem. 264, 14812 až 14817 (1989).), který vzniká při alternativním mRNA štěpení (Jin a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 3319 až 3233 (1990).), je přítomen ve sníženém množství v buňkách, které expresí poskytují antigenový receptor. Předpokládá se, že zetaeta heterodimery zprostředkovávají tvorbu inositol-fosfátů a také receptorem iniciovanou programovanou smrt buněk nazývanou apoptosa (Mercep a spol.: Science 242, 571 až 574 (1988); Mercep a spol.: Science 246, 1162 až 1165 (1989).).

Podobně jako zeta a eta, s Fc receptorem asociovaný gama (τ) řetězec se získává expresí v komplexu z buněčného povrchu spolu s dalšími polypeptidy, z nichž některé zprostředkovávají rozpoznávání ligandu a jiné mají nedefinovanou funkci. Gama nese homodimemí strukturu. Celková organizace je velice podobná organizaci ety. Gama je složkou jak IgE receptorů žímých buněk/basofilních o vysoké afinitě, FcsRI, který sestává z alespoň tří rozdílných polypeptidových řetězců (Blank a spol.: Nátuře 337. 187 až 189 (1989); Ra a spol.: Nátuře 141, 752 až 754 (1989).), tak z jednoho z receptorů pro IgG s nízkou afinitou, u myší representovaného FcxRII((RA a spol.: J. Biol. Chem. 264, 15323 až 15327 (1989).) a u lidí CD 16 subtypem exprese makrofágy a přirozenými zabíječi, CD16tm (CD16 transmembrána) (Lanier a spol.: Nátuře 342, 803 až 805 (1989); Anderson a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 2274 až 2278 (1990).) tak polypeptidem neidentifikované funkce (Anderson a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 2274 až 2278 (1990).). Nedávno bylo popsáno, že k expresi gama dochází myšími T buněčnými liniemi, CTL, v nichž se tvoří homodimery stejně jako heterodimery gama-zeta a gama-eta (Orloff a spol.: Nátuře 347, 189 až 191 (1990).).

Fc receptory zprostředkovávají fagocytosu imunitních komplexů, transcytosu a na protilátkách závislou buněčnou cytotoxicitu (ADCC) (Ravetch a Kinet: Annu. Rev. Immunol. 9, 457 až 492 (1991); Unkeless a spol.: Annu. Rev. Immunol. 6, 251 až 281 (1988) a Mellman: Curr. Opin. Immunol. L, 16 až 25 (1988).). Nedávno bylo ukázáno, že jedna z myších nízkoafinitních Fc receptorových isoforem (FcRxIIIBl) zprostředkovává intemalizaci Ig-potažených cílů v jamkách potažených klathrinem a že nízkoafinitní receptor (FcRxIIIA) zprostředkovává ADCC asociací s jedním nebo více členy malé rodiny spouštěcích molekul (Miettinen a spol.: Cell 58, 317 až 327 (1989) a Hunziker a Mellman: j. Cell Biol. 109, 3291 až 3302 (1989).). Tyto spouštěcí molekuly, T buněčný receptorový (TCR) zeta řetězec, TCR eta řetězec a Fc receptorový gama řetězec interagují s ligandovými rozpoznávacími doménami různých receptorů imunitního systému a mohou autonomně iniciovat buněčné efektorové programy včetně cytolysy následující po agregaci (Samelson a spol.: Cell 43, 223 až 231 (1985); Weissman a spol.: Science 239, 1018 až 1020 (1988); Jin a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 3319 až 3323 (1990); Blank a spol.: Nátuře 337. 187 až 189 (1989); Lanier a spol.: Nátuře 342, 803 až 805 (1989); Kurosaki a Ravetch: Nátuře 342, 805 až 807 (1989); Hibbs a spol.: Science 246. 1608 až 1611 (1989); Anderson a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 2274 až 2278 (1990) a Irving a Weiss: Cell 64, 891 až 901 (1991).).

Při kreslení paralel mezi myšími a lidskými nízkoafinitními Fc receptorovými čeleďmi je však zřejmé, že lidské FcRxILA a C isoformy nemají žádný myší protějšek. Zčásti protože tyto jejich funkce ještě nebyly definovány.

Jelikož humorální činidla na bázi CD4 mohou mít omezenou užitečnost in vivo, vynálezci začali zkoumat možnost zvýšení buněčné imunity na HIV. Výsledek, který zde uvádějí, je příprava proteinových chimér, v nichž extracelulámí doména CD4 je napojena na transmembránovou a/nebo intracelulámí doménu signálních transdukujících prvků T buněčného receptorů, IgG Fc receptorů nebo B buněčného receptorů. Chiméry expresující cytolytické T buňky, které zahrnují extracelulámí CD4 doménu, vykazují silnou na MHC nezávislou destrukci buněčných cílů expresujících HTV obálkové proteiny. Mimořádně důležitou a novou složkou tohoto přístupu je identifikace řetězců

-4CZ 281881 B6 jediného T buněčného receptoru nebo Fc receptoru a B buněčného receptoru, jejichž agregace postačuje k inicaci buněčné odpovědi.

Jednou zvláště důležitou aplikací tohoto přístupu je vynález chimér mezi CD4 a zeta, eta nebo gama, které směrují cytolytické L lymfocyty na rozpoznávání a zabíjení buněk, které expresí poskytují HTV gpl20.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou chimemí receptorové proteiny, DNA, vektory a buňky.

Jedním předmětem vynálezu je buňka poskytující expresí proteinovou membránou vázaný chimemí receptor, který obsahuje

a) extracelulámí část schopnou specificky rozpoznávat a vázat infekční činidlo, buňku infikovanou infekčním činidlem, nádorovou nebo rakovinnou buňku nebo autoimunně generovanou buňku, a

b) intracelulámí nebo transmembránovou část odvozenou od T buněčného receptoru zeta, eta, CD3 delta, nebo T3 gama proteinu, Fc receptoru gama proteinu, nebo B buněčného receptoru mbl nebo B29 proteinu, která je schopná signalizovat buňce, aby ničila činidlo nebo buňku navázané ne receptor, přičemž uvedená buňka je vybrána ze skupiny zahrnující (a) T nebo B lymfocyty, (b) cytotoxické T lymfocyty, (c) přírodní umrtvující buňky (zabíječe), (d) neutrofily, (e) granulocyty, (f) makrofágy, (g) stěžňové (žimé) buňky, (h) HeLa buňky a (i) embryové kmenové (ES) buňky.

Buňka může obsahovat navázání nezávislé na MHC.

Buňka podle vynálezu obsahuje chimemí receptor obsahující

a) aminokyseliny 421 až 532 sekvence id. č. 6,

b) aminokyseliny 423 až 455, 438 až 455, 461 až 494 nebo 494 až 528 sekvence id. č. 6,

c) aminokyseliny 400 až 420 sekvence id. č. 6,

d) aminokyseliny 421 až 575 sekvence id. č. 4,

e) aminokyseliny 423 až 455, 438 až 455, 461 až 494 nebo 494 až 528 sekvence id. č. 4,

f) aminokyseliny 400 až 420 sekvence id. č. 4,

g) aminokyseliny 421 až 462 sekvence id. č. 5,

h) aminokyseliny 402 až 419 sekvence id. č. 5,

i) aminokyseliny Tyr282 až Tyr298 včetně, jak je uvedeno na obrázku 15 A,

j) aminokyseliny 132 až 171 na obrázku 16 (sekvence id. č.24),

k) aminokyseliny 140 až 182 na obrázku 17 (sekvence id. č.25),

l) aminokyseliny 162 až 220 na obrázku 18 (sekvence id. č.26),

m) aminokyseliny 183 až 228 na obrázku 19 (sekvence id. č.27).

Buňka podle vynálezu má extracelulámí část obsahující část CD4 vázající HIV obalový protein nebo její funkční derivát vázající HTV obalový protein.

-5CZ 281881 B6

Jako cytotoxický T lymfocyt se v buňce podle vynálezu používají CD8⁺ cytotoxické T lymfocyty. Extracelulámí částí v buňce podle vynálezu je imunoglobulinová molekula nebo její antigen vázající fragment.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je DNA kódující shora popsaný chimemí receptor.

Jiným předmětem tohoto vynálezu je vektor, který obsahuje DNA shora popsaného chimemího receptoru.

Dalším předmětem vynálezu je protilátka specificky rozpoznávající a vázající chimemí receptor, jak byl popsán shora.

Ještě jiným předmětem tohoto vynálezu je chimemí receptor vázaný proteinovou membránou, obsahující

a) extracelulámí část schopnou specificky rozpoznávat a vázat infekční činidlo, buňku infikovanou infekčním činidlem, nádorovou nebo rakovinnou buňku nebo autoimunně generovanou buňku a

b) intracelulární nebo transmembránovou část odvozenou od T buněčného receptoru zeta, eta, CD3 delta, nebo T3 gama proteinu, Fc receptoru gama proteinu, nebo B buněčného receptoru mbl nebo B29 proteinu, která je schopná signalizovat hostitelské buňce nesoucí uvedený receptor, aby ničila činidlo nebo buňku navázané na receptor.

I když receptoiy přírodní T buňky, B buňky nebo Fc jsou nebo mohou být velice komplikovanými multimemími strukturami, které se nepropůjčují pro vhodnou manipulaci, tento vynález demonstruje proveditelnost vytvoření chimér mezi intracelulární doménou jakékoliv z mnoha molekul, které jsou schopny splnit úkol cílového rozpoznávání. Příprava chimér sestávajících z intracelulární části T buněčných/Fc receptářových zeta, eta nebo gama řetězců spojených s extracelulámí částí vhodně připravené molekuly protilátky umožňuje, aby cílový rozpoznávací potenciál imunitního systému buňky byl specificky přesměrován na antigen rozpoznávaný extracelulámí částí protilátky. Tedy protilátkovou částí schopnou rozpoznávat determinantu na povrchu pathogenu by buňky imunitního systému vyzbrojené chimérou odpovídaly na přítomnost pathogenu efektorovým programem příslušným jejich rodu, např. pomocné T lymfocyty by odpovídaly cytotoxickou aktivitou na cíl a B lymfocyty by byly aktivovány tak, aby syntetizovaly protilátku. Makrofágy a granulocyty by prováděly jejich efektorové programy, včetně uvolňování cytokinů, fagocytosy a generace reaktivního kyslíku. Podobně by částí protilátek schopných rozpoznávat nádorové buňky byla příznivě zvýšena odpověď imunitního systému na nádor. Pomocí protilátky schopné rozpoznávat imunitní buňky, které nemají příslušnou reaktivitu s jejich determinantami, by mohly být autoreaktivní buňky selektivně cíleny na destrukci. I když tyto příklady rýsuji použití protilátkových chimér jako vhodného vysvětlujícího nástroje, tento vynález není omezen pokud jde o rozsah protilátkových chimér. A skutečně, použití specifických extracelulámích domén může mít důležité výhody. Například extracelulámí část, která je receptorem pro virus, bakterii nebo parasita, buněk vyzbrojených chimérami by specificky směrovala na buňky, které expresí poskytují virové, bakteriové nebo parasitámí determinanty. Výhodou tohoto postupu ve srovnání s používáním protilátek je to, že přírodní receptor pro pathogen může mít jedinečně vysokou selektivitu nebo afinitu pro pathogen, což umožňuje větší stupeň precisního směrování výsledné imunitní odpovědi. Podobně, vypuštění buněk imunitního systému, které příslušně nereagují se svým antigenem, může postačovat k připojení antigenů (buď jako neporušený protein, v případě vyčerpání terapie B buňkami, nebo jako MHC komplex, v případě vyčerpání terapie T buňkami) k intracelulámím zeta, eta nebo gama řetězcům a tím ovlivňovat specifické cílení buněk příslušně neodpovídajících na své determinanty.

-6CZ 281881 B6

Jiným použitím těchto chimér je regulace populací buněk in vivo. Například bylo navrženo použití nádor infiltrujících lymfocytů nebo buněk přirozených zabíječů pro nesení cytotoxických principů na místo nádorů. Tento vynález poskytuje vhodné prostředky pro regulaci počtu a aktivity takových 5 lymfocytů a buněk bez jejich odstraňování z těla pacienta pro amplifikaci in vitro. Jelikož intracelulámí domény chimemích receptorú zprostředkovávají proliferační odpovědi buněk, koordinace extracelulámích domén různými agregačními podněty specifickými pro extracelulámí domény (např. protilátka specifická pro extracelulámí doménu) povede k proliferaci buněk, které nesou chiméry.

I když specifická uspořádání tohoto vynálezu obsahují chiméry mezi zeta, eta nebo gama řetězci nebo jejich aktivními fragmenty (např. těmi, které jsou diskutovány níže), mohl by se pro zde popsané účely použít jakýkoliv receptorový řetězec, který má podobnou funkci jako tyto molekuly, např. v granulocytech nebo B lymfocytech. Rozeznatelnými vlastnostmi žádoucích imunitních 15 buněčných spouštěcích molekul jsou schopnost autonomní exprese (tj. jako jednoduchý řetězec), schopnost být fúzován s extracelulámí doménou tak, aby výsledná chiméra byla přítomna na povrchu terapeutické buňky a schopnost iniciovat buněčné efektorové programy po agregaci sekundárně při setkání s cílovým ligandem.

V této době je nejvhodnějším způsobem dodávání chimér do imunitního systému buňky některým ze způsobů genetické terapie. Avšak rekonstituováním buněk imunitního systému s chimemími receptory směsí buněk s vhodně solubilizovaným vyčištěným chimemím proteinem by také vedlo ke tvorbě sestrojené buněčné populace, která je schopna odpovídat na cíle rozpoznávané extracelulámí doménou chimér. Podobný přistup byl použit například pro zavedení neporušeného HIV receptorú, 25 CD4, do erytrocytů pro terapeutické účely. V tomto případě by sestavená buněčná populace nebyla schopna samoobnovení.

Tento vynález se týká funkčních zjednodušených T buněčných receptorových chimér, B buněčných receptorových chimér a Fc receptorových chimér, které jsou schopny přesměrovat funkci imunitního 30 systému. Podrobněji se tento systém týká regulace lymfocytů, makrofágů, přírodních buněk zabiječe nebo granulocytů expresí v uvedených buňkách nebo chimérách, které způsobují, že buňky odpovídají na cíle rozpoznávané chimérami. Tento vynález se týká také způsobu směrování buněčné odpovědi na infekční činidlo, nádorovou nebo rakovinovou buňku nebo na autoimunně generovanou buňku. Způsob směrování buněčné odpovědi u savce se vyznačuje tím, že se podává efektivní 35 množství terapeutických buněk uvedenému savci, při čemž shora uvedené buňky jsou schopné rozpoznávat a ničit uvedené infekční činidlo, nádor, rakovinnou buňku nebo autoimunně generovanou buňku.

V jiném uspořádání způsob směrování buněčné odpovědi na infekční činidlo zahrnuje podávání 40 terapeutických buněk schopných rozpoznávat a ničit uvedené činidlo, při čemž toto činidlo znamená specifický virus, bakterii, protozoa nebo houby. Dokonce ještě specifičtěji - tento způsob je namířen proti takovým činidlům, jako je například HIV a Pneumocystis carinii.

Tento vynález specificky poskytuje způsob směrování buněčné odpovědi na buňku infikovanou HTV. 45 Tento způsob zahrnuje podávání efektivního množství cytotoxických T lymfocytů pacientovi, při čemž uvedené lymfocyty jsou schopny specificky rozpoznávat a lyžovat buňky, které jsou infikovány HTV.

V jednom uspořádání se tedy podle tohoto vynálezu získává způsob směrování buněčné odpovědi na 50 buňky infikované HIV, vyznačující se tím, že se pacientovi podává efektivní množství cytotoxických

-7CZ 281881 B6

T lymfocytů, které jsou schopny specificky rozpoznávat a lyžovat buňky infikované HIV.

Podle ještě jiného uspořádání se získávají chimemí receptorové proteiny, které směrují cytotoxické T lymfocyty tak, aby rozpoznávaly a lyžovaly buňku infikovanou HIV. Ještě jiné uspořádání podle vynálezu zahrnuje hostitelské buňky, které jsou transformovány vektorem obsahujícím chimemí 5 receptory.

Podle ještě jiného uspořádání tento vynález poskytuje protilátku proti chimemím receptorům podle vynálezu.

Aby se získaly cytotoxické T lymfocyty, které specificky vážou a lyžují buňky infikované HIV, autoři tohoto vynálezu se pokusili získat receptorové chiomery. Tyto chimemí receptory jsou funkčně aktivní a mají mimořádnou schopnost specificky se vázat a lyžovat buňky, které expresí poskytují gpl20.

Předmětem tohoto vynálezu je tedy získání způsobu léčení jednotlivců, kteří jsou infikováni HIV. 15 Tento vynález tedy poskytuje četné důležité výhody při terapii AIDS.

Tyto a další neomezující uspořádání tohoto vynálezu budou zřejmá odborníkům z následujícího podrobného popisu vynálezu.

V následujícím podrobném popisu jsou uvedeny odkazy na různé způsoby známé odborníkům pracujícím v oblasti molekulární biologie a imunologie. Publikace a další materiály, které vysvětlují takové známé způsoby a na něž se zde odkazuje, jsou zde zahrnuty jako citace.

Standardní citované práce vykládají obecné principy technologie rekombinace DNA. Patří sem práce 25 Watsona J. D. a spol.: Molecular Biology of the Gene, díly I a II, the Benjamin/Cummings

Publishing Company, lne., vydavatel, Menlo Park, Kalifornie (1987); Damell J. E. a spol.: Molecular Cell Biology, Scientific Američan Books, lne., vydavatel, New York, Ν. Y. (1986); Lewin B. M.; Genes II, John Wiley and Sons, vydavatelé, New York, N. Y. (1985): Old R. W. a spol.: Principles of Gene Manipulation; An Introduction to Genetic Engineering, druhé vydání, 30 University of Califomia Press, vydavatel, Berkeley, Kalifornie (1981); Maniatis T. a spol.:

Molecular Cloning; A Laboratory Manual , druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, vydavatel, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) a Ausubel a spol.: Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, N. Y. (1989).

V následující části tohoto spisu budou uvedeny a vysvětleny definice některých pojmů.

Pojmem klonováni se rozumí použití in vitro technik rekombinace pro vložení (inserci) příslušného genu nebo jiné DNA sekvence do molekuly vektoru. Aby se žádaný gen úspěšně klonoval, je nutné použít způsoby generace DNA fragmentů pro napojení fragmentů k vektorovým 40 molekulám, pro zavedení složené DNA molekuly do hostitelské buňky, v níž se může replikovat a pro vybrání klonu, který má cílový gen mezi hostitelskými buňkami příjemce.

Pojem cDNA znamená komplementární DNA připravenou z RNA templátu působením DNA polymerasy dependentní na RNA (reversní transkriptása). Potom cDNA klon tedy znamená 45 dvoušroubovicovou DNA sekvenci komplementární k RNA molekule, o kterou se jedná, nesenou v klonovacím vektoru.

Pojmem cDNA knihovna (cDNA banka) se rozumí sbírka rekombinantních DNA molekul obsahujících cDNA inserty, které obsahují DNA kopie mRNA, která je získávána expresí buňkou v 50 době, kdy se tvoři cDNA knihovna. Taková cDNA knihovna se může připravovat způsoby známými

-8CZ 281881 Β6 odborníkům a je popsána například v knize Maniatise a spol.: Molecuiar Cloning: A Laboratory Manual, viz výše. Obecně je postup takový, že RNA se nejdříve isoluje z buněk organismu, z jehož genomu je žádoucí klonovat příslušný gen. Pro tento účel jsou výhodnými savčí a zvláště lidské lymfocytové buněčné linie. Pro účely podle tohoto vynálezu je výhodným vektorem kmen viru vakcínie WR.

Pojem vektor znamená DNA molekulu, odvozenou například od plasmidu, bakteriofágu nebo savčího či hmyzího viru, do něhož mohou být vloženy nebo klonovány fragmenty DNA. Vektor bude obsahovat jedno nebo více jedinečných restrikčních míst. Může být schopen autonomní replikace v definovaném hostiteli nebo vektorovém organismu tak, že klonované sekvence jsou reprodukovatelné. Pojem DNA expresní vektor pak tedy znamená jakýkoliv autonomní prvek, •který je schopen řídit syntézu rekombinantního peptidu. Mezi takové DNA expresní vektory patří bakteriální plasmidy a fágy a savčí a hmyzí plasmidy a viry.

Pojem v podstatě čistý znamená sloučeninu, například protein, polypeptid nebo protilátku, která v podstatě neobsahuje složky, které ji přirozeně doprovázejí. Obecně to znamená, že sloučenina je v podstatě čistá, jestliže alespoň 60, výhodněji alespoň 75 %, a nejvýhodněji alespoň 90 % materiálu vzorku znamená sloučeninu, o kterou se jedná. Čistota může být měřena jakýmkoliv vhodným způsobem, např. chromatografií na koloně, elektroforesou na polyakrylamidovém gelu nebo HPLC analýzou. V souvislosti s nukleovou kyselinou pojem v podstatě čistá znamená sekvenci nukleové kyseliny, segment nebo fragment, který neobsahuje geny, které ho obklopují ve stavu, ve kterém se přirozeně nachází (např. neobsahuje ty sekvence, které obklopují nukleovou kyselinu v její přírodní genomové poloze). Pojmem funkční derivát.je rozuměn pojem fragmenty, varianty, analogy nebo chemické deriváty molekuly. Pojem fragment molekuly, jako například jakákoliv cDNA sekvence podle tohoto vynálezu, znamená jakoukoliv nukleotidovou podřadu molekuly. Pojem varianta takové molekuly znamená, že se jedná o přirozeně se vyskytující molekulu, která je v podstatě podobná buď celé molekule, nebo jejímu fragmentu. Pojem analog molekuly znamená přirozeně se nevyskytující molekulu, která je v podstatě podobná buď celé molekule, nebo jejímu fragmentu. O molekule se uvádí, že je v podstatě podobná jiné molekule, jestliže sekvence aminokyselin v obou molekulách jsou v podstatě shodné. V podstatě podobné molekuly aminokyselin mají podobné vlastnosti. Za předpokladu, že dvě molekuly mají podobnou aktivitu, jsou tyto dvě molekuly považovány za varianty podle toho, jak je zde tento pojem používán, i když jedna z těchto molekul obsahuje další nebo několik dalších zbytků aminokyselin, které druhá molekula neobsahuje, nebo jestliže sekvence zbytků aminokyselin není identická. O molekule se mluví jako o chemickém derivátu jiné molekuly (jak je tento pojem zde používán), jestliže obsahuje další chemické části, které normálně nejsou částí této molekuly. Takové části mohou zlepšovat stabilitu molekuly, absorpci, biologickou životnost atd. Takové části mohou také snižovat toxicitu molekuly, odstraňovat nebo zmírňovat jakýkoliv nežádoucí vedlejší účinek molekuly atd. Části, které jsou schopné zprostředkovávat takové účinky, jsou popsány například v Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

Podobně se pod pojmem funkční derivát receptorové chiméry podle tohoto vynálezu rozumí to, že zahrnuje fragmenty, varianty nebo analogy genu, které mohou být v podstatě podobné pokud jde o sekvenci nukleotidů a které kódují molekulu mající podobnou aktivitu, například T buněčné, B buněčné nebo Fc receptorové chiméry.

Pojem protein T buněčné, B buněčné nebo Fc receptorové chiméry tak, jak je zde používán, znamená také jakýkoliv funkční derivát, fragment, analog nebo chemický derivát, který může být v podstatě podobný divoké chimeře (tj. chimeře přírodního typu) a který má podobnou aktivitu (tj. nejvýhodněji 90 %, výhodněji 70 %, s výhodou 40 %, nebo alespoň 10 % aktivity receptorových

-9CZ 281881 B6 chimér přírodního typu). Aktivita funkčních chimerových receptorových derivátů zahrnuje specifické navázání (jeho extracelulámí části) na cílové činidlo nebo buňku a výslednou destrukci (řízenou jeho intracelulámí nebo transmembránovou částí) tohoto činidla nebo buňky, taková aktivita může být testována například použitím jakýchkoliv zde popsaných analýz.

DNA sekvence kódující T buněčnou, B buněčnou nebo Fc receptorovou chiméru podle tohoto vynálezu nebo její funkční deriváty mohou být rekombinovány s vektorovou DNA konvenčními způsoby, mezi něž patří ligace se zarovnanými konci nebo s přečnívajícími konci, štěpení příslušného konce restrikčním enzymem, doplnění kohezivních konců podle potřeby, zpracováním s alkalickou fosfatasou tak, aby se vyhnulo nežádoucímu napojení a ligace příslušnými ligasami. Způsoby těchto manipulací jsou popsány Maniatisem T. a spol. (viz výše) a jsou velmi dobře známy odborníkům.

O molekule nukleové kyseliny, jako je například DNA, se mluví jako o molekule schopné expresí poskytovat (schopné expresovat) polypeptid, jestliže obsahuje sekvence nukleotidů, které obsahují transkripční a translační regulační informaci. Takové sekvence jsou odštěpitelné napojeny na sekvence nukleotidů, které kódují polypeptid. Odštěpitelná vazba je taková vazba, v níž regulační DNA sekvence a DNA sekvence, která má být expresována, jsou spojeny takovým způsobem, aby to umožnilo expresi genu. Přesná povaha regulačních oblastí potřebných pro expresi genu se může měnit od organismu k organismu, ale obecně bude obsahovat promotorovou oblast, která v prokaryotech obsahuje jak promotor (který řídí iniciaci transkripce RNA), tak DNA sekvenci, která, po transkribování na RNA, dá signál k iniciaci syntézy proteinu. Tyto oblasti budou normálně obsahovat takové 5’-nekodující sekvence zahrnuté v iniciaci transkripce a translace, jako jsou například TATA box, sekvenci s čepičkou, CAAT sekvenci a podobné.

Jestliže je to žádoucí, může se shora popsanými způsoby získat nekódující oblast 3’ k sekvenci genu kódující protein. Tato oblast může být zachována pro transkripční terminační regulační sekvence, jako je například terminace a polyadenylace. Zachováním 3’-oblasti přirozeně přiléhající k DNA sekvenci kódující protein se mohou získat terminační signály transkripce. Jestliže tyto terminační signály transkripce nejsou při expresi uspokojivě funkční, potom mohou být nahrazeny v hostitelské buňce 3’ oblastí funkční v hostitelské buňce.

O těchto DNA sekvencích (jako je například sekvence promotorové oblasti a sekvence kódující chiméry T buněčného receptoru, B buněčného receptoru a Fc receptoru) lze říci, že jsou odštěpitelné napojeny, jestliže povaha vazby mezi těmito dvěma sekvencemi: 1) nevede k zavedení posunové mutace, 2) neinterferuje se schopností sekvence promotorové oblasti řídit transkripci sekvence genu receptorové chiméry nebo 3) neinterferuje se schopností sekvence genu receptorové chiméry být transkribována sekvencí promotorové oblasti. Promotorova oblast by byla odštěpitelné napojena na DNA sekvenci, kdyby promotor byl schopen uskutečnit transkripci této DNA sekvence. Pro expresi proteinu jsou tedy nutné transkripční a translační signály rozpoznávané příslušným hostitelem.

Tento vynález zahrnuje expresi proteinu T buněčných receptorových chimér, B buněčných receptorových chimér nebo Fc receptorových chimér (nebo jejich funkčních derivátů) buď v prokaryotických, nebo eukaryotických buňkách, i když exprese je výhodná v eukaryotických buňkách (a zvláště v lidském lymfocytu).

Protilátky podle tohoto vynálezu se mohou připravovat kterýmkoliv z mnoha různých způsobů. Například buňky, které expresí poskytují protein receptorové chiméry nebo jejího funkčního derivátu, se mohou podat živočichovi, aby se indukovala produkce séra obsahujícího polyklonální protilátky, které jsou schopny vázat chiméru.

- 10CZ 281881 B6

Podle výhodného způsobu protilátkami podle tohoto vynálezu jsou monoklonálni protilátky. Tyto monoklonální protilátky se mohou připravovat technologií hybridomu (Kohler a spol.: Nátuře 256, 495 (1975), Kohler a spol.: Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976), Kohler a spol.: Eur. J. Immunol. 6, 292 (1976), Hammerling a spol. v: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., str. 563 až 684 (1981).). Obecně tyto procedury zahrnují imunizaci živočicha antigenem chiméry T buněčného receptoru, B buněčného receptoru nebo Fc receptoru. Splenocyty (buňky sleziny) takových zvířat se extrahují a fuzují se s vhodnou myelomovou buněčnou linií. V souladu s tímto vynálezem se může používat jakákoliv vhodná myelomová buněčná linie. Po fúzi se výsledné hybridomové buňky selektivně uchovávají v médiu HAT. Potom se klonují omezujícím zředěním, jak je to popsáno Wandsem J. R. a spol.: Gastroenterology 80, 225 až 232 (1981). Hybridomové buňky, které se získají touto selekcí, se testují tak, aby se identifikovaly klony, které vylučují protilátky schopné vázat chiméru.

Protilátkami podle tohoto vynálezu mohou být také polyklonální nebo s výhodou regionálně specifické polyklonální protilátky.

Protilátky proti chimérám T buněčného receptoru, B buněčného receptoru nebo Fc receptoru podle tohoto vynálezu se mohou používat pro monitorování množství chimemího receptoru (nebo buňky, která nese chimemí receptor) u pacienta. Takové protilátky jsou dobře vhodné pro použití ve standardním imunodiagnostickém testu známém odborníkům, jako jsou například imunometrické nebo sendvičové analýzy, jako je například přímá sendvičová, reversní sendvičová nebo simultánní sendvičová analýza. Protilátky se mohou používat v jakémkoliv počtu kombinací, protože je lze stanovit zručnými odborníky bez nepatřičného experimentování. Získají se tak imunoanalýzy o přijatelné specifičnosti, citlivosti a přesnosti.

Standardní odkazy vysvětlují obecné principy imunologie. Patří mezi ně práce Roitta I.: Essential Immunology, šesté vydání, Blackwell Scientific Publications, vydavatel, Oxford (1988); Kimball J. W.: Introduction to Immunology, druhé vydání, Macmillan Publishing Co., vydavatel, New York (1986); Roitt I. a spol.: Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., vydavatel, Londýn (1985); Campbell A.: Monoclonal Antibody Technology v Burden R. a spol., redaktoři: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, díl 13, Elsevier, vydavatel, Amsterodam (1984); Klein J.: Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley and Sons, vydavatel, New York (1982) a Kennett R. a spol., red.: Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenům Press, vydavatel, New York (1980).).

Pojem detegování zahrnuje stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti látky nebo stanovení množství látky. Tento pojem se tedy týká použití materiálů, prostředků a způsobů podle tohoto vynálezu pro kvalitativní a kvantitativní stanovení.

Isolace jiných hybridomů sekretujících monoklonální protilátky stejné specifičnosti jako jsou ty, které jsou zde popsány, se provádí způsobem anti-idiotypového vyhledávání (skriningu) (Potocmjak a spol.: Science 215, 1637 (1982).) Ve stručnosti - anti-idiotypová protilátka je protilátka, která rozpoznává jedinečné determinanty přítomné na protilátce produkované klonem, o který se jedná. Tato anti-idiotypová protilátka se připravuje imunizací živočicha stejného kmene, jako je zdroj monoklonální protilátky s monoklonální protilátkou, o kterou se jedná. Imunizovaný živočich bude rozpoznávat a odpovídat na idiotypové determinanty imunizující protilátky prokudcí protilátky na tyto idiotypové determinanty (anti-idiotypová protilátka).

Pro replikaci se hybridní buňky mohou kultivovat jak in vitro, tak in vivo. Výhodným způsobem kultivace je způsob in vivo pro své vysoké výtěžky. Ve stručnosti - buňky jednotlivých hybridních

- 11 CZ 281881 B6 kmenů se intraperitoneálně injekčně podávají myším BALB/c. Získá se tak ascitová tekutina, která obsahuje vysoké koncentrace žádaných monoklonálních protilátek. Z kultivačních supematantů se monoklonáiní protilátky isotypu IgM nebo IgG mohou vyčistit způsoby chromatografie na koloně dobře známými odborníkům.

Protilátky podle tohoto vynálezu jsou zvláště vhodné pro použití při imunoanalýzách, při nichž se mohou používat v kapalné fázi nebo navázané na nosič v pevné fázi. Protilátky pro tyto imunoanalýzy lze také různými způsoby označit, aby je bylo možné detegovat.

Existuje mnoho různých markérů (značek) a mnoho různých způsobů označování známých odborníkům. Mezi příklady typů markérů, které se mohou používat podle tohoto vynálezu, ale bez omezení jenom na tyto, jsou enzymy, radioisotopy, fluorescenční sloučeniny, chemiluminiscenční sloučeniny, bioluminiscenční sloučeniny a komplexy kovů. Odborníci znají jiné vhodné markéry pro navázání na protilátky nebo budou schopni určit tyto markéry na základě rutinních pokusů. Navázání těchto značek (markérů) na protilátky lze provádět standardními způsoby dobře známými odborníkům.

Jedním způsobem, kterým se mohou protilátky podle tohoto vynálezu detegovatelně označovat, je navázání protilátky na enzym. Tento enzym pak, jestliže je vystaven působení substrátu, bude reagovat se substrátem takovým způsobem, aby se získala chemická částice, kterou lze detegovat, například spektrofotometricky nebo fluorometricky. Mezi příklady enzymů, které mohou být použity pro detegovatelně označené protilátky, patří malátdehydrogenasa, stafylokoková nukleasa, delta-5steroidní isomerasa, kvasinková alkohol-dehydrogenasa, alfa-glycerofosfát-dehydrogenasa, triosofosfát-isomerasa, botinavidinová peroxidasa, křenová peroxidasa, alkalická fosfatasa, asparaginasa, glukosooxidasa, β-gaiaktosidasa, ribonukleasa, ureasa, katalasa, glukoso-6-fosfát-dehydrogenasa, glukoamylasa a acetylcholin-esterasa.

Přítomnost detegovatelně označených protilátek lze také stanovovat označováním protilátek radioaktivním isotopem, který se pak může stanovovat takovými prostředky, jako je například počítač gama impulsů nebo počítač scintilací. Isotopy, které jsou zvláště užitečné pro účely podle tohoto vynálezu, jsou Ή, ¹²⁵I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶CI, ⁵⁷Co, ⁵⁹Fe a ⁷⁵Se.

Je možné také detegovat navázání detegovatelně označených protilátek označením protilátek fluorescenční sloučeninou. Jestliže se fluorescenčně označená protilátka vystaví působení světla příslušné vlnové délky, její přítomnost lze pak detegovat díky fluorescenci barviva. Nejobvykleji používanými fluorescenčními značkovacími sloučeninami jsou fluorescein, isothiokyanát, rhodamin, fykoerythrin, fykokyanin, allofykokyanin, o-ftalaldehyd a fluoreskamin.

Protilátky podle vynálezu se mohou detegovatelně označovat také použitím kovů emitujících fluorescenci, jako je například ^l52Eu nebo jiné kovy ze série lanthanidů. Tyto kovy se mohou k molekule protilátky připojit takovými chelatotvomými skupinami, jako je například kyselina diethylenteraminopentaoctová (DPTA) nebo ethylendiaminotetraoctová (EDTA).

Protilátky se mohou detegovatelně označit také kondenzací s chemiluminiscenční sloučeninou. Přítomnost chemiluminiscenčně označené protilátky se pak stanoví detekcí přítomnosti luminiscence, která stoupá během chemické reakce. Příklady zvláště užitečných chemiluminiscenčních značících sloučenin jsou luminal, isoluminol, aromatický akridinium-ester, imidazol, akridiniové soli, oxalatový ester a dioxetan.

- 12CZ 281881 B6

Podobně se pro značení protilátek podle tohoto vynálezu může používat bioiuminiscenční sloučenina. Bioluminiscence je typem chemiluminiscence, která se nachází v biologických systémech, v nichž katalytický protein zvyšuje účinnost chemiluminiscenční reakce. Přítomnost bioiuminiscenční protilátky se stanovuje detegováním přítomnosti luminiscence. Mezi důležité 5 bioiuminiscenční sloučeniny pro účely značení patří luciferin a luciferasový ekvorin.

Protilátky a v podstatě vyčištěný antigen podle tohoto vynálezu jsou ideálně vhodné pro přípravu sady (kitu). Taková sada může obsahovat nosiče, které sestávají z jednotlivých částí, které jsou obsaženy v jedné nebo více nádobách, jako jsou například baňky, zkumavky a podobné. Každá z 10 nádobek obsahuje jednotlivé prvky pro analýzu.

Typů analýz, které může sada obsahovat, je mnoho. Patří- mezi ně například analýzy kompetitivní a nekompetitivní. Typickými příklady analýz, které využívají protilátky podle tohoto vynálezu, jsou radioimunoanalýzy (RIA), enzymové imunoanalýzy (EIA), analýzy typu ELISA (enzyme-linked 15 immunosorbent assays) a imunometrické, nebo sendvičové, imunoanalýzy.

Pod pojmem imunometrická analýza nebo sendvičová imunoanalýza se zde rozumí taková analýza, která zahrnuje simultánní sendvičovou, přímou sendvičovou nebo reversní sendvičovou imunoanalýzu. Těmto pojmům dobře rozumí odborníci. Zkušení odborníci také ocení, že protilátky 20 podle tohoto vynálezu budou užitečné v jiných variacích a formách analýz, které jsou dnes známy nebo které mohou být v budoucnosti vyvinuty. Tyto analýzy jsou rovněž zahrnuty v rozsahu tohoto vynálezu.

Ve výhodném způsobu provádění analýz je důležité, aby v inkubačním médiu (obvykle přidávaném 25 se značenou rozpustnou protilátkou) byly přítomny jisté blokátory. Tyto blokátory se přidávají proto, aby se zajistilo, aby nespecifické proteiny, proteasa nebo lidské protilátky na myší imunoglobuliny přítomné v experimentálním vzorku nezesíťovaly nebo neničily protilátky na nosiči v pevné fázi nebo radioaktivně označenou indikátorovou protilátku, čímž by se získaly falešné positivní nebo falešné negativní výsledky. Výběr blokátorů” tedy podstatně přidává na specifičnosti 30 analýz, které jsou popsány v tomto vynálezu.

Bylo zjištěno, že jako blokátory se mohou používat četné nerelevantní (tj. nespecifické) protilátky stejné třídy nebo podtřídy (isotypu) jako jsou ty, které se používají při analýze (např. IgGi, IgG2_a, IgM atd.). Koncentrace blokátorů (normálně 1 až 100 pg/μΐ) je důležitá, aby se zachovala 35 příslušná citlivost a ještě se inhibovala jakákoliv nechtěná interference vzájemně se vyskytujícími zkříženě reaktivními proteiny v lidském séru. Pufrovací systém obsahující blokátory potřebuje být optimalizován. Výhodnými pufry jsou ty, které jsou založeny na slabých organických kyselinách, jako je například imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS a podobné, při fysiologickém rozmezí pH. Poněkud méně výhodnými pufry jsou anorganické pufry, jako je 40 například fosforečnan, boritan nebo uhličitan. Nakonec by se k pufru, který obsahuje blokátory, přidaly známé inhibitory proteasy (normálně v množství 0,01 až 10 gg/ml).

Existuje mnoho imunoadsorbentů v pevné fázi, které se používají a které se mohou používat podle tohoto vynálezu. Mezi dobře známé imunoadsorbenty patří sklo, polystyren, polypropylen, dextran, 45 nylon a další materiály, ve formě zkumavek, perliček a mikrotitrovacích desek z těchto materiálů nebo potažených těmito materiály, a podobně. Imobilizované protilátky mohou být buď kovalentně, nebo fyzikálně navázány na imunoadsorbent v pevné fázi způsoby, jako je například kovalentní navázání amidovou nebo esterovou vazbou nebo absorpcí. Odborníci znají mnoho jiných vhodných imunoadsorbentů v pevné fázi a způsobů imobilizace protilátek na těchto imunoadsorbentech nebo 50 budou schopni tuto imobilizaci provést s pouhým rutinním experimentováním.

- 13CZ 281881 B6

Při in vivo, in vitro nebo in šitu diagnose mohou být značky (markéry), jako jsou například radionuklidy, navázány na protilátky podle tohoto vynálezu buď přímo, nebo prostřednictvím funkční skupiny. Touto funkční skupinou, která se často používá k navázání radioisotopů, které existují jako kationty kovů, na protilátky, je diethylentriaminopentaoctová kyselina (DPTA). Typickými příklady kationty kovů, které jsou vázány tímto způsobem jsou: 'Tc, ¹²³I, ^HIIn, ^l31I, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga a ⁶⁸Ga. Protilátky podle tohoto vynálezu mohou být pro účely diagnosy značeny také neradioaktivními isotopy. Prvky, které jsou zvláště užitečné v tomto způsobu jsou ^l57Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr a ⁵⁶Fe.

Antigen podle tohoto vynálezu se může isolovat v v podstatě čisté formě, jestliže se používají protilátky podle tohoto vynálezu. Uspořádání podle tohoto vynálezu tedy poskytuje v podstatě čistou chiméru T buněčného receptoru, B buněčného receptoru nebo Fc receptoru. Tento antigen se vyznačuje tím, že je rozpoznáván a váže se na protilátky podle tohoto vynálezu. V jiném uspořádání tento vynález poskytuje způsob isolace nebo čištění receptorového chimemího antigenů tím, že se vytvoří komplex uvedeného antigenů s jednou nebo více protilátkami směrovanými proti receptorové chimeře.

V podstatě čisté antigeny chiméry T buněčného receptoru, B buněčného receptoru nebo Fc receptoru podle tohoto vynálezu se mohou také používat pro detekci nebo měření protilátek chimér ve vzorku, jako je například sérum nebo moč. Jedno uspořádání tohoto vynálezu tedy obsahuje způsob detegování přítomnosti nebo množství protilátky na antigen receptorové chiméry ve vzorku, vyznačující se tím, že vzorek, který obsahuje protilátku na chimemí antigen, se uvede do kontaktu s detegovatelně značenou receptorovou chimérou a uvedený markér se deteguje. Je třeba ocenit, že se mohou používat také imunoreaktivní frakce a imunoreaktivní analogy chiméry. Pojem imunoreaktivní frakce znamená jakoukoliv část chimemího antigenů, který vykazuje ekvivalentní imunitní odpověď na protilátku směrovanou proti receptorové chimeře. Pojem imunoreaktivní analog” znamená protein, který se odlišuje od proteinu receptorové chiméry jednou nebo více aminokyselinami, ale který vykazuje ekvivalentní imunitní odpověď na protilátku podle tohoto vynálezu.

Pojem specificky rozpoznává a váže znamená protilátku, která rozpoznává a váže polypeptid chimemího receptoru, ale který v podstatě nerozpoznává ani neváže jiné molekuly ve vzorku, např. v biologickém vzorku, který obsahuje polypeptid receptoru.

Pojem autoimunně-generovaná buňka znamená buňky, které produkují protilátky, které reagují s hostitelskou tkáni nebo imunitní efektorové T buňky, které jsou autoreaktivní. Mezi takové buňky patří protilátky proti acetylcholínovým receptářům (vedoucí např. k myastenii gravis) nebo antiDNA, anti-erythrocytové a anti-destičkové autoprotilátky (vedoucí např. k lupus erythromatodes).

Pojem terapeutická buňka znamená buňku, která byla transformována chimérou podle tohoto vynálezu tak, že je schopná rozpoznávat a ničit specifické infekční činidlo, buňku infikovanou specifickým činidlem, nádorovou nebo rakovinovou buňku nebo autoimunně-generovanou buňku. S výhodou jsou těmito terapeutickými buňkami buňky hematopoietního systému.

Pojem extracelulámí znamená, že alespoň část molekuly je na povrchu buňky. Pojem intracelulámí znamená, že alespoň část molekuly je vystavena působení terapeutické buněčné cytoplasmy. Pojem transmembrána znamená, že alespoň částí molekuly je překlenuta plasmová membrána. Pojmy extracelulámí část, intracelulámí část a transmembránová část tak, jak jsou používány zde, znamenají, že mohou obsahovat obklopující aminokyselinové sekvence, které se nacházejí v přilehlých strukturních částech buňky.

- 14CZ 281881 B6

Pojem oligomerovat znamená vytvořit komplex s jinými proteiny za vzniku dimerů, trimerů, tetramerů nebo jiných oligomerů vyšších řádů. Tyto oligomery mohou být homooligomery nebo heterooligomery. Oligomerizující část je ta oblast molekuly, která řídí tvorbu komplexu (tj. oligomerů).

Pojem cytolytický znamená, schopnost ničit buňku (např. buňku infikovanou pathogenem, nádorovou nebo rakovinnou buňku nebo autoimunitně-generovanou buňku) nebo schopnost ničit infekční činidlo (např. virus).

Pojem virus imunitní nedostatečnosti znamená retrovirus, který ve své divoké (přírodní) formě je schopen infikovat T4 buňky hostitele (primátu) a nést virovou morfogenesi a morfologii charakteristickou pro podčeleď lentiviru. Pod tento pojem patří, bez omezení, všechny varianty HIV a SIV včetně HIV-l, HIV-2, SlVmac, SIVagm, SIVmnd, SlVsmm, SlVman, SIVmand a SIVcpz.

Pojem MHC-independentní znamená, že buněčná cytolytická odpověď nevyžaduje přítomnost antigenu MHC třídy II na povrchu cílové buňky.

Pojem funkční derivát transdukující cytolytický signál znamená funkční derivát (jak shora uvedeno), který je schopen řídit alespoň 10 %, s výhodou 40 %, výhodněji 70 % nebo nej výhodněji alespoň 90 % biologické aktivity přírodní molekuly. Tak, jak je následující pojem používán zde, znamená, že funkční derivát transdukující cytolytický signál může působit přímo signalováním terapeutické buňce ničit činidla nebo buňku vážící receptor (např. v případě části intracelulamího chimemího receptoru) nebo může působit nepřímo podporováním oligomerace proteinů terapeutické buňky transdukujících cytolytický signál (např. v případě transmembránové domény). Tyto deriváty se mohou testovat na účinnost, např. zde popsanými in vitro analýzami.

Pojem funkční derivát vázající HTV obálkový protein znamená funkční derivát (shora uvedený), který je schopen vázat jakýkoliv HIV obálkový protein. Funkční deriváty se mohou identifikovat například zde popsanými in vitro analýzami.

Terapeutické podávání: Transformované buňky podle tohoto vynálezu se mohou používat pro terapii četných onemocnění. Mezi běžné způsoby podávání těchto transformovaných buněk patří adoptivní imunoterapie nebo terapie přenosem buňky. Tyto způsoby umožňují návrat buněk stransformoanovým imunitním systémem do krevního oběhu. Rosenberg S. A.: Scientific Američan 62 (květen 1990); Rosenberg a spol.: The New England Joumal of Medicíně 323(9), 570 (1990).

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou podávat jakémukoliv živočichovi, kterému sloučeniny podle vynálezu přinášejí příznivé účinky. Především se jedná o člověka, i když tento vynález není zamýšlen tak, aby byl omezen pouze na člověka.

V následující části tohoto spisu bude vynález podrobně popsán. Nejdříve budou popsány obrázky. Stručný popis obrázků:

Obrázek 1. Charakterizace CD4 chimér. Obrázek 1A ukazuje sekvenci aminokyselin kolem místa napojení mezi CD4 (zbytky 1 až 369) a různými receptorovými řetězci. Podtržená sekvence ukazuje polohu aminokyselin kódovaných uvnitř místa BamHI použitého pro konstrukci fuze. Začátek transmembránové domény je označen vertikální čarou. Sekvence eta je identická se sekvencí zeta na aminovém konci, ale rozchází se s ní na karboxylovém konci (Jin a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 3319 až 3323 (1990).). Obrázek 1B ukazuje průtokovou cytometrickou analýzu povrchové exprese CD4, CD4:zeta, CD4:gama a CD4:eta v buňkách CV1. Buňky byly infikovány virem, který

- 15CZ 281881 B6 expresí poskytuje CD4 chiméry nebo CD16_Pi, inkubovány 9 hodin při teplotě 37 °C a vybarveny anti-CD4 MAb Leu3A konjugovanou s fykoerythrinem. Obrázek 1C ukazuje imunoprecipitaci značených CD4:zeta, CD4:gama nebo přírodní CD4 expresovaných v buňkách CVl. Pásy jsou uvedeny s redukujícím (R) nebo bez redekujícího (NR) činidla. Standardy molekulové hmoty v tisících jsou uvedeny vlevo.

Obrázek 2. Povrchová exprese CD 16™ po koinfekci CD16™ samotných (husté tečky) nebo koinfikovaných virem expresujícím CD4:gama (čárky) nebo CD4:zeta (plná čára). Řídké tečky označují buňky infikované samotnou CD4:zeta vybarvené 3G8 (Fleit a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79. 3275 až 3279 (1982).) (anti-CD16 MAb).

Obrázek 3. Mutantní CD4:zeta chimerové receptory, kterým chybí zeta Asp-15, nepodporují koexpresi CD 16™. Obrázek 3A je autoradiogram imunoprecipitovaných mutantních chimér po elektroforese buď s redukujícím činidlem (R), nebo bez redukujícího činidla (NR). Obrázek 3B ukazuje povrchovou expresi CD 16™ po koinfekci viry, které expresí poskytují CD 16™ a následující zeta chiméry: CD4:zeta (silná čára), CD4:zeta C11G (plná čára), CD4:zeta (čárkovaná čára), CD4:zeta C11G/D15G (husté tečky); bez koinfekce (CD 16™ samotná, řídké tečky). Buňky byly inkubovány s anti-CD16 MAb 3G8 a s fykoerythrinem konjugovanými Fab’₂ kozími protilátkami na myší IgG. Úroveň exprese zeta chimér byla v podstatě identická pro různé analyzované mutanty. Koinfekce buněk viry expresujícími CD 16™ a zeta chiméry nezměnila zřetelně povrchovou expresi chimér (data nejsou uvedena).

Obrázek 4. Zvýšení intracelulámích volných iontů vápníku následuje zesíťování mutantních zeta chimér v T buněčné linii. Buňky Jurkat E6 (Weiss a spol.: J. Immunol. 133, 123 až 128 (1984).) byly infikovány rekombinantním virem vakcínie a analyzovány průtokovou cytometrií. Výsledky jsou uvedeny pro hradlovou CD4* populaci, takže jsou analyzovány pouze buňky, které expresí poskytují relevantní chimemí protein. Střední poměr fialové k modré Indo-1 fluorescenci vyjadřuje intracelulámí koncentraci volného vápníku v populaci jako celku. Procento odpovídajících buněk znamená frakci buněk, která přesahuje předem stanovený prahový poměr (stanovený tak, aby 10 % nezpracovaných buněk bylo positivních). Obrázky 4A a 4B ukazují buňky Jurkat expresující CD4:zeta (plná Čára) nebo CD16:zeta (čárkovaná čára), které byly vystaveny působení anti-CD4 MAb Leu3a (fykoerythrinový konjugát), s následujícím zesíťováním kozí protilátkou na myší IgG. Tečkovaná čára ukazuje odpověď neinfikovaných buněk na anti-CD3 MAb OKT3. Obrázky 4C a 4D ukazují buňky Jurkat expresující CD4:zetaDl5G (plná čára), CD4:zetaCl 1G/D15G (čárkovaná čára) nebo CD4:zetaCI IG (tečky), které byly zpravovány a analyzovány stejně jako na obrázcích 4A a 4B.

Obrázek 5. CD4:zeta, CD4:eta a CD4:gama receptory umožňují cytolytickým T lymfocytům (CTL) zabíjet cíle expresující HTV-1 gpl20/4l. Obrázek 5A: plná kolečka se týkají CTL expresujících CD4:zeta inkubovaných s HeLa buňkami expresujícími gp 120/41; prázdná kolečka se týkají CTL expresujících CD4:zeta inkubovaných neinfikovanými HeLa buňkami; plné čtverečky se týkají neinfikovaných CTL inkubovaných s HeLa buňkami expresující gp 120/41; prázdné čtverečky znamenají neinfikované CTL inkubované s neinfikovanými HeLa buňkami. Obrázek 5B: plná kolečka znamenají CTL expresující CD4:eta inkubovanou s HeLa buňkami expresujícími gpl20/41; prázdná kolečka znamenají CTL expresující CD4:gama inkubované s HeLa buňkami expresujícími gpl20/41; prázdné čtverečky znamenají CTL expresující C11G/D15G dvojitou mutantovou CD4:zeta chiméru inkubované s HeLa buňkami expresujícími gp 120/41. Obrázek 5C: Analýza průtokovou cytometrií CD4 exprese CTL použitých na obr. 5B. Pro opravu cíle na efektorové poměry se stanoví procento buněk expresujících CD4 chiméru odečtením negativní (neinfikované) populace superposicí histogramu. Pro srovnávací účely na tomto obrázku je neinfikovaným buňkám přiřazen libovolný práh, který má zhruba stejnou frakci positivní pro jiné buněčné populace jako by

- 16CZ 281881 B6 mělo odečtení na histogramu.

Obrázek 6. Specifičnost CD4-směrované cytolýzy. Obrázek 6A: plná kolečka znamenají CTL expresující CD4:zeta inkubovanou s HeLa buňkami expresujícimi CD16_PI, prázdná kolečka znamenají CTL expresující CD4 inkubovanou s HeLa buňkami expresujícimi gpl20; plné čtverečky znamenají CTL expresující CD16:zeta inkubovanou s HeLa buňkami expresujícimi gpl20/41; prázdné čtverečky znamenají CTL expresující CD16_PI inkubovanou s HeLa buňkami expresujícimi gpl20741. Obrázek 6B: plná kolečka znamenají CTL expresující CD4:zeta inkubovanou s Ráji (MHC třída ΙΓ) buňkami; prázdná kolečka znamenají neinfikované CTL buňky inkubované s RJ2.2.5 (MHC třída IFRaji mutantu) buňkami; plné čtverečky znamenají neinfikované CTL inkubované s Ráji (MHC třída ΙΓ) buňkami; prázdné čtverečky znamenají CTL expresující CD4:zeta inkubované s RJ2.2.5 (MHC třída ΙΓ) buňkami. Stupnice na svislé oseje expandována.

Obrázek 7. Charakterizace CD16:zeta chimemího receptoru. Obrázek 7A je schematický diagram CD16:zeta napojeného proteinu. Extracelulámí část fosfatidylinositol-navázané formy monomemí CD 16 byla napojena na dimemí zeta externě k transmembránové doméně. Sekvence proteinu v místě fůze je uvedena ve spodní části. Obrázek 7B ukazuje analýzu průtokovou cytometrií mobilizace vápníku po zesíťování CDl6:zeta chiméry v buď TCR positivní, nebo TCR negativní buněčné linii. Je uveden střední poměr fialové k modré fluorescenci (míra relativní koncentrace iontu vápníku) buněčných populací zpracovaných s protilátkami v čase 0. Plné čtverečky znamenají odpověď Jurkat buněk na anti-CD3 MAb OK.T3; plné trojúhelníky znamenají odpověď CD16:zeta na anti-CD16 MAb 3G8 zesíťování v REX33A TCR' mutantu; prázdné čtverečky znamenají odpověď na CD16:zeta zesíťování v Jurkat TCR’ mutantní linii JRT3.T3.5; prázdné trojúhelníky znamenají odpověď na CD16:zeta zesíťování v Jurkat buňkách; křížky znamenají odpověď na nechimemí CDI6 v Jurkat buňkách a tečky znamenají odpověď na nechimemí CD16 v REX33A TCR buněčné linii.

Obrázek 8. DeleČní analýza cytolytického potenciálu. Obrázek 8A ukazuje umístění zeta delečních koncových bodů. Zde jako jinde mutace v zeta jsou representovány původní konvencí o umístění zbytků v mutantech, takže D66* znamená například náhradu Asp-66 terminačním kodonem. Obrázek 8B ukazuje výsledky cytolytické analýzy nedeletované CDl6:zeta a hlavní zeta delece. Hybridomové buňky expresující povrchovou protilátku na CD 16 byly naplněny ⁵¹Cr a inkubovány se zvyšujícími se počty lidských cytolytických lymfocytů (CTL) infikovaných rekombinanty vakcínie expresujícimi CD16:zeta chiméry. Procento uvolněného ”Cr je vyneseno jako funkce poměru efektoru (CTL) k cílové (hybridomové) buňce (e/t). Plná kolečka znamenají cytolýzu zprostředkovanou buňkami expresujícimi CD16:zeta (mfi 18.7); plné Čtverečky znamenají cytolýzu zprostředkovanou buňkami expresujícimi CD16:zeta Asp66* (mfi 940.2); prázdné čtverečky znamenají cytolýzu zprostředkovanou buňkami expresujícimi CD16:zetaGlu60* (mfi 16.0); prázdná kolečka znamenají cytolýzu zprostředkovanou buňkami expresujícimi CD126:zetaTyr51* (mfi 17.4); plné trojúhelníky znamenají cytolýzu zprostředkovanou buňkami expresujícimi CDl6:zetaPhe34* (mfi 17.8) a prázdné trojúhelníky znamenají cytolýzu zprostředkovanou buňkami expresujícimi nechimemí CD 16 (mfi 591). I když v těchto pokusech se exprese CD16:zetaAsp66* nehodila k expresi jiných fúzovaných proteinu, cytolýza buňkami expresujícimi CD16:zeta ve stejných hladinách ve stejném pokusu poskytla výsledky v podstatě identické s výsledky získanými u buněk expresujících CD16:zetaAsp66* (neuvedeno).

Obrázek 9. Odstranění potenciálu pro transmembránové interakce odhaluje krátký zeta segment schopný zprostředkovat cytolýzu. Obrázek 9A je schematický diagram monomemích dvojdílných a trojdílných chimér. Nahoře je CD16:zeta konstrukce seříznutá u zbytku 65 s chybějícími

- 17CZ 281881 Β6 transmembránovými Cys a Asp zbytky. Pod ní jsou konstrukce CD16:CD5:zeta a CD16:CD7:zeta a příslušné kontroly. Peptidové sekvence intracelulámích domén jsou uvedeny dole. Obrázek 9B ukazuje cytolytickou aktivitu monomemích chimemích delečních mutantů. Cytolytická aktivita buněk expresujících CDl6:zeta (plná kolečka; mfi 495) byla srovnána s cytolytickou aktivitou buněk expresujících CD16:zeta Asp66* (plné čtverečky; mfi 527) nebo mutantů CDl6:zeta. Cysl lGly/Aspl5Gly/Asp66* (prázdné čtverečky; mfi 338) a CD16:zetaCysl lGly/Aspl5Gly/GIu608 (plné trojúhelníky; mfi 259). Obrázek 9C ukazuje cytolytickou aktivitu zprostředkovanou trojdílnými fúzovanými proteiny. Plné trojúhelníky znamenají CD16:zetaAsp66*; prázdné čtverečky znamenají CD16:5:zeta (48 až 65), plné čtverečky znamenají CD16:7:zeta (48 až 65), prázdné trojúhelníky znamenají CDl6:7:zeta (48 až 59), prázdná kolečka znamenají CDI6:5 a plná kolečka znamenají CD16.7. Obrázek 9D ukazuje mobilizaci vápníku mutantem a trojdílnými chimérami v TCR negativní Jurkat JRT3.T-3.5 mutantní buněčné linii. Prázdná kolečka znamenají odpověď buněk expresujících dimemí CD16:zetaAsp66*; plné čtverečky znamenají odpověď buněk expresujících CD16:zetaCysl lGly/Aspl5Gly/Asp66*; prázdné čtverečky znamenají odpověď buněk expresujících CD16:zetaCysl lGly/Aspl5Gly/Glu60*; plné trojúhelníky znamenají odpověď buněk expresujících CDl6:7:zeta (48 až 65) a prázdné trojúhelníky znamenají odpověď buněk expresujících CD16:zeta (48 až 59).

Obrázek 10. Příspěvek jednotlivých aminokyselin k aktivitě cytolytického signál transdukujícího motifu o 18 zbytcích. Obrázky 10A a 10B ukazují cytolytickou aktivitu a obrázek 10C ukazuje mobilizaci iontu vápníku zprostředkovanou chimérami nesoucími bod mutací blízko karboxylového konce tyrosinu (Y62). Obrázky 10A a 10B představují data shromážděná u buněk expresujících nízká, respektive vysoká množství CD16:zeta fúzovaných proteinů. Pro mobilizaci vápníku a analýzy cytolýzy byly použity stejné symboly. Jsou uvedeny napravo v jednopísmenkovém kódu. Plná kolečka znamenají buňky expresující CD16:zeta (mfi v A, 21; B, 376); plné čtverečky znamenají buňky expresující CD16:7:zeta (48 až 65) (mfi A, 31; B, 82); prázdné Čtverečky znamenají CDI6:7:zeta (48 až 65)Glu60Gln (mfi A, 33; B, 92); křížky znamenají CD16:7:zeta (48 až 65)Asp63Asn (mfi A, 30; B, 74); plné trojúhelníky znamenají CD16:7:zeta (48 až 65)Tyr62Phe (mfi A, 14; B, 88); prázdná kolečka znamenají CD16:7:zeta (48 až 65)Glu61Gln (mfi A, 20; B, 62) a prázdné trojúhelníky znamenají CD16:7:zeta (48 až 65)Tyr62Ser (mfi B, 64). Obrázky 10D a 10E ukazují cytolytickou aktivitu a obrázek 10F ukazuje mobilizaci iontů vápníku chimérami nesoucími bod mutací blízkou aminového konce tyrosinu (Y51). Pro mobilizaci vápníku a analýzy cytolýzy byly použity stejné symboly. Tyto symboly jsou uvedeny na pravé straně. Plná kolečka znamenají buňky expresující CD16:zeta (mfi v D, 21,2; v E, 672); plné čtverečky znamenají buňky expresující CD16:7:zeta (48 až 65) (mfi D, 31,3; E, 179); plné trojúhelníky znamenají CD16:7:zeta (48 až 65)Asn48Ser (mfi D, 22,4; E, 209); prázdné čtverečky znamenají CD16:7:zeta (48 až 65)Leu50Ser (mfi D, 25,0; E, 142) a prázdné trojúhelníky znamenají CD16:7:zeta (48 až 65)Tyr51Phe (mfi D, 32,3; E, 294).

Obrázek 11. Uspořádání vnitřních opakování zeta a srovnání jejich schopnosti podporovat cytolýzu. Obrázek 11A je schematický diagram chimér vytvořený rozdělením zeta intracelulámích chimér na třetiny a jejich připojením k transmembránové doméně chiméry CD16:7. Dále jsou uvedeny sekvence intracelulámích domén, sdílené zbytky jsou uvedeny v rámečcích a vzájemně související zbytky jsou označeny hvězdičkami. Obrázek 1IB ukazuje cytolytickou potenci tří zeta poddomén. Plná kolečka znamenají buňky expresující CDl6:zeta (mfi 476); plné čtverečky znamenají CD16:7:zeta (33 až 65) (mfi 68); prázdné čtverečky znamenají CD16:7:zeta (71 až 104) (mfi 114) a plné trojúhelníky znamenají CD16:7:zeta (104 až 138) (mfi 104).

Obrázek 12 je schematický diagram CD16:FcRgamaII chimér.

- 18CZ 281881 B6

Obrázek 13. Mobilizace vápníku po zesíťování CD4:FcRgamaII a CD16:FcRgamaII chimér. Obrázek 13A ukazuje poměr fialové k modré fluorescenci emitované buňkami s náplní fluoroforu Indo-I citlivého na vápník, který je uveden jako funkce času po zesíťování CD 16 extracelulámí domény protilátkami. Obrázek 13B ukazuje podobnou analýzu zvýšení poměru fialové k modré 5 fluorescenci buněk nesoucích CD4:FcRgamaII chiméry po zesíťování s protilátkami.

Obrázek 14. Cytolytická analýza CD4:FcRgamaII a CD16:FcRgamaII chimér. Obrázek 14A ukazuje procento ^SICr uvolněného z anti-CD16 hybridomových (cílových) buněk, jestliže se buňky vystaví zvyšujícímu se počtu cytotoxických T lymfocytů expresujících CD16:FcRgamaII chiméry ío (efektorové buňky). Obrázek 14B ukazuje podobnou analýzu cytotoxicity zprostředkované CD4:FcRgamaII chimérami proti cílovým buňkám expresujícím HIV obálkové glykoproteiny.

Obrázek 15. Identifikace zbytků v FcRgamall A konci, který je důležitý pro cytolýzu. Obrázek 15A je schematický diagram delečních konstrukcí. Obrázky 15B a 15C ukazují mobilizaci vápníku a 15 cytolýzu delečních variant CD16:FcRgamaII A. Obrázky 15D a 15E ukazují mobilizaci vápníku a cytolýzu trojdílnými chimérami nesoucími progresivně menší aminový konec intracelulámího konce CD16:FcRgamaII A.

Obrázek 16 (sekvence id. č. 24) ukazuje sekvenci aminokyselin CD3 delta receptorového proteinu; 20 sekvence v rámečku znamená výhodnou část transdukující cytolytický signál.

Obrázek 17 (sekvence id. č. 25) ukazuje sekvenci aminokyselin T3 gama receptorového proteinu; sekvence v rámečku znamená výhodnou část transdukující cytolytický signál.

Obrázek 18 (sekvence id. č. 26) ukazuje sekvenci aminokyselin mbi receptorového proteinu; sekvence v rámečku znamená výhodnou část transdukující cytolytický signál.

Obrázek 19 (sekvence id. č. 27) ukazuje sekvenci aminokyselin B29 receptorového proteinu; sekvence v rámečku znamená výhodnou část transdukující cytolytický signál.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce lidských IgGl:receptorových chimér

Sekvence těžkých řetězců lidského IgGl se připraví připojením sekvencí v C_H3 doméně k cDNA 40 fragmentu odvozenému od 3’ konce transmembránové formy protilátkové mRNA. Fragment s 3’koncem se získá polymerasovou řetězovou reakcí knihovny mandlové cDNA jako substrátu s oligonukleotidy o sekvencích: CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (sekvence id. č. 7) a CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (sekvence id. č. 8), odpovídajících 5’ a 3’ koncům fragmentům žádané DNA. 5’ 45 Oligo je doplňkový k místu v C_H1 doméně lidského IgGl a 3’ oligo je doplňkový k místu 5’ sekvencí kódujících membránovou překlenující doménu. PCR produkt se rozštěpí působením BstXI a BamHI a liguje se mezi místa BstXI a BamHI polosyntetického genu IgGl protilátky nesoucí variabilní a konstantní oblasti. Po inserci BstXI do BamHI fragmentu se amplifikované části konstrukce nahradí až do Smál místa v Ch3 změnou, restrikčního fragmentu, takže od PCR reakce je odvozena pouze 50 část mezi Smál místem a 3’oligo.

- 19CZ 281881 B6

Pro vytvoření lidského IgGkzeta chimemího receptorů se gen těžkého řetězce končící v BamHI místě spojí s dále popsaným BamHI místem zeta chiméry, takže sekvence protilátek vytvoří extracelulámí část. Průtoková cytometrie COS buněk transfektovaných plasmidem kódujícím chiméru vykazuje vysokou úroveň exprese proti látkových determinant, jestliže byl kotransfektován 5 expresní plasmid kódující cDNA s lehkým řetězcem, a mírnou expresi proti látkových determinant, jestliže expresní plasmid s lehkým řetězcem nebyl přítomen.

Shora popsanými standardními způsoby molekulární biologie mohou být zkonstruovány podobné chiméry obsahující lidský IgGl fúzovaný s eta nebo gama (viz níže) nebo jakákoliv signál 10 transdukující část proteinu T buněčného receptorů nebo Fc receptorů.

Pro vytvoření jediné transkripční jednotky, která by umožnila, aby jak těžký, tak lehký řetězec byly expresovány z jediného promotoru, se ze sekvencí kódujících těžký a lehký řetězec a z 5’ nepřeložené části mRNA kódující protein regulovaný glukosou o molekulové hmotě 78 000, jinak 15 známý jako grp78 nebo BiP, vytvoří plasmid kódující bicistronovou mRNA. Sekvence grp78 byly získány PCR lidské genomové DNA pomocí primerů, které mají sekvence: CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (sekvence id. č. 9) a CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (sekvence id. č. 10) na 5’, respektive na 3’ konci. Polymerasové řetězové reakce s těmito oligo se provádějí v přítomnosti 10 % dimethylsulfoxidu. Fragment, který se získá 20 PCR, se rozštěpí působením Notl a HincII a vloží se mezi Notl a Hpal místa po směru řetězce od sekvencí kódujících lidský IgGl. Sekvence, které kódují lehký řetězec cDNA lidského IgG kapa, se pak vloží po směru vlákna od grp78 leaderu s použitím místa HincII a dalšího místa ve vektoru. Expresní plasmid, který se získá těmito manipulacemi, sestává v podstatě z genu semisyntetického těžkého řetězce, po němž následují sekvence grp78 leatického těžkého řetězce, po němž následují 25 sekvence grp78 leader, sekvence kapa lehkého řetězce cDNA a polyadenylační signály odvozené od

SV40 DNA fragmentu. Transfekce COS buněk expresním plasmidem poskytla značně zlepšenou expresi determinant těžkého řetězce ve srovnání s transfekcí plasmidu kódujícího determinanty těžkého řetězce samotné.

Při tvorbě bicistronového genu obsahujícího chiméru těžký řetězec/receptor a lehký řetězec se mohou sekvence těžkého řetězce proti směru vlákna nahradit jakýmkoliv zde popsaným chimemím genem těžký řetězec/receptor.

Příklad 2

Konstrukce CD4 receptorových chimér

Lidské zeta (Weissman a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 9709 až 9713 (1988b).) a gama 40 (Kuster a spol.: J. Biol. Chem. 265, 6448 až 6452 (1990).) cDNA se isolují polymerasovou řetězovou reakcí z knihoven připravených z HPB-ALL nádorové buněčné linie (Aruffo a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84. 8573 až 8577 (1987b).) a z lidských přírodních buněk zabiječe, zatímco eta cDNA (Jin a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87. 3319 až 3323 (1990).) se isoluje z myší thymocytové knihovny. Zeta, eta a gama cDNA se napojí na extracelulámí doménu sestavené formy 45 CD4 nesoucí BamHI místo právě proti směru vlákna membránové překlenovací domény (Aruffo a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 8573 až 8577 (1987b); Zettlmeissl a spol.: DNA Cell Biol. 9, 347 až 353 (1990.), která se napojí na BamHI místo přirozeně přítomné v zeta a eta cDNA v místě umístěném několik zbytků proti směru vlákna membránové překlenovací domény (sekvence id. č. 1, 3, 4 a 6). Při tvorbě fúzovaného proteinu s gama se BamHI místo sestaví tak, aby bylo v sekvenci s 50 přibližně stejným umístěním (obr. 1, sekvence id. č. 2 a 5). Genové fúze se zavedou do expresního

-20CZ 281881 B6 plasmidu viru vakcínie nesoucího E. coli gpt gen jako selektovatelný markér (M. Amiot a B. S., nepublikováno.) a vloží se do genomu vakcínie kmene WR homologní rekombinací a selekcí na růst v mykofenolové kyselině (Falkner a spol.: J. Virol. 62, 1849 až 1854 (1988); Boyle a spol.: Gene 65, 123 až 128 (1988).). Analýza průtokovou cytometrií ukázala, že rekombinanty vakcínie směrují hojnou produkci CD4:zeta a CD4:gama fúzovaných proteinů na buněčný povrch, zatímco exprese CD4:eta je podstatně slabší (obr. 1). Později uvedené zjištění je v souladu s nedávnou zprávou, že transfekce eta cDNA expresního plasmidu do myší hybridomové buněčné linie poskytuje podstatně menší expresi než transfekce srovnatelného zeta expresního plasmidu (Clayton a spol.: J. Exp. Med. 172, 1243 až 1253 (1990).). Imunoprecipitace buněk infikovaných rekombinanty vakcínie odhalila, že fúzované proteiny tvoří kovalentní dimery, na rozdíl od přirozeně se vyskytujícího CD4 antigenů (obr. 1). Bylo zjištěno, že monomerni CD4:zeta a CD4:gama fúzované proteiny a nativní CD4 mají molekulovou hmotu 63 000, 55 000 a 53 000. Větší hmoty fúzovaných proteinů jsou přibližně v souladu s větší délkou intracelulámí části, která přesahuje přírodní CD4 o 75 (CD4:zeta) nebo 5 (CD4:gama) zbytků.

Příklad 3

CD4 chiméry mohou asociovat s jinými receptorovými řetězci

Exprese buněčným povrchem formy makrofág/buňka přirozeného zabiječe lidského FcgamaRIII (CD16tm) na transfektantech je usnadněna kotransfekcí s myším (Kurosaki a spol.: Nátuře 342, 805 až 807 (1989).) nebo lidským (Hibbs a spol.: Science 246. 1608 až 1611 (1989) gama a také s lidským zeta (Lanier a spol.: Nátuře 342. 803 až 805 (1989).).

V souladu s těmito zprávami exprese chimér umožňuje také povrchovou expresi CD 16™, jestliže se dodá do cílové buňky buď kotransfekcí, nebo koinfekcí viry rekombinantní vakcínie (obr. 2). Podpora (CD 16™) povrchové exprese zetou byla význačnější než podpora gamou (obr. 2) ve zkoumané buněčné linii, zatímco přírodní CD4 (data nejsou uvedena) nezvyšovala CD16™ povrchovou expresi.

Příklad 4

Asp zeta mutanty nekoasociují s Fc receptorem

Pro vytvoření chimér, které by neasociovaly s existujícími antigenovými nebo Fc receptory, se připraví mutantní zeta fúzované proteiny, kterým chybí buď intramembránový Asp, nebo intramembránový Cys zbytek nebo oba dva. Průtoková cytometrie ukázala, že intensita exprese buněčným povrchem různými mutantními chimérami nebyla zřetelně odlišná od nemutovaného prekursoru (data neuvedena). Pokusy imunoprecipitace ukázaly, že celková exprese chimérami byla podobná (obr. 3). Jak bylo očekáváno, bylo zjištěno, že mutantní chiméry, kterým chybí transmembránový cysteinový zbytek, netvoří dimery spojené disulfidovou vazbou (obr. 3). Dva mutantní chiméry, kterým chybí Asp, nebyly schopny podporovat povrchovou expresi CD 16™, zatímco monomerni chiméry, kterým chybí Cys, ale které nesou Asp, umožňovaly koexpresi CD16™, ale s nižší účinností než rodičovský dimer (obr. 3).

-21 CZ 281881 B6

Příklad 5

Mutantní receptory zachovávají schopnost iniciovat odpověď vápníku

Pro zjištění toho, jestli zesiťování fúzovaných proteinů umožňuje akumulaci volného intracelulámího vápníku podobným způsobem, jako je to známo u antigenového receptorů T buněk, se buňky leukemové linie lidských T buněk, Jurkat E6 (ATCC číslo TIB 152, Americká sbírka typů kultur, Rockville, Md.) infikuje rekombinanty vakcínie. Měří se relativní koncentrace cytoplasmového vápníku po zesiťování extracelulámí domény proti látkami. Měření průtokovou cytometrií se prováděla s buňkami naplněnými barvivém Indo-1 citlivým na vápník (Grynkiewicz a spol.: J. Biol. Chem. 260, 3340 až 3450 (1985); Rabinovitch a spol.: J. Immunol. 137, 952 až 961 (1986).). Obrázek 4 ukazuje výsledky pokusů toku vápníku u buněk infikovaných CD4:zeta a Asp⁺ a Cys’ mutantů zeta. Zesiťování chimér reprodukovatelně zvýšilo intracelulámí vápník. CD4:eta a CD4:gama podobně umožnily akumulaci intracelulámího vápníku v infikovaných buňkách (data nejsou uvedena). Buňky Jurkat expresují nízké hladiny CD4 na povrchu buněk, avšak zesiťování přírodní CD4 v přítomnosti nebo nepřítomnosti CDl6:zeta (C. R. a B. S.: nepublikováno) (obr. 4 a data neuvedena) nemění hladiny intracelulámího vápníku.

Příklad 6

CD4:zeta, eta a gama chiméry zprostředkují cytolýzu cílů expresujících HIV gp 120/41

Pro stanovení toho, jestli chimemí receptory spouštějí cytolytický efektorový program, byl vytvořen modelový systém cíkefektor založený na CD4 rozpoznávání HTV obálkového gpl20/gp41 komplexu. Buňky Hela byly infikovány rekombinantními viry vakcínie, které expresí poskytují gpl20/gp41 (Chakrabarti a spol.: Nátuře 320, 535 až 537 (1986) a Earl a spol.: J. Virol. 64, 2448 až 2451 (1990).), a označeny ^5ICr. Označené buňky byly inkubovány s buňkami z lidské allospecifické (CD8\ CD4’) cytotoxické T lymfocytové linie, která byla infikována rekombinanty vakcínie, které expresí poskytují CD4:zeta, CD4:eta nebo CD4:gama chiméry nebo CD4:zetaCysl lGly:Aspl5Gly dvojitou mutantní chiméru. Obrázek 5 ukazuje, že buňky HeLa, které expresí poskytují gpl20/41, byly specificky lyžovány cytotoxickými T lymfocyty (CTL), které expresí poskytují CD4 chiméry. Neinfikované buňky HeLa nebyly cíleny CTL vyzbrojenými CD4:zeta chimérami a buňky HeLa, které expresí poskytují gpl20/41, nebyly rozpoznávány neinfikovanými CTL. Pro srovnání účinnosti různých chimér se opraví poměry efektoru k cíli pro frakci CTL, která expresuje CD4 chiméry, a pro frakci buněk HeLa, které expresují gp 120/41, podle toho, jak to bylo změřeno průtokovou cytometrií. Obrázek 5C ukazuje cytometrickou analýzu exprese CD4 CTL použitou při pokusech cytolýzy uvedených na obrázcích 4A a 4B. I když střední hustota povrchové CD4:zeta velice převyšuje střední hustotu CD4:eta, cytolytické účinnosti buněk expresujících kteroukoliv formu byly podobné. Po opravě na frakci cílů expresujících gpl20, je účinnost cytolýzy zprostředkované proteiny CD4:zeta a CD4:eta srovnatelná s nejlepšími účinnostmi popsanými pro specifické páry T buněčný receptorový cíkefektor (střední poměr efektoru k cíli pro 50% uvolňování T buňkami expresujícími CD4:zeta byl 1,9 ± 0,99, n = 10). Fůze CD4:gama byla méně aktivní než fůze CD4:zeta, které chybí transmembránové zbytky Asp a Cys. V obou případech však byla pozorována významná cytolýza (obrázek 5).

Pro kontrolu možnosti, že infekce vakcínií může podporovat artefaktové rozpoznávání CTL, byly provedeny podobné cytolytické pokusy s cílovými buňkami infikovanými rekombinanty vakcínie, které expresí poskytují fosfatidylinositolem vázanou formu CD16 (CD16_n) a označené ⁵¹Cr, a CVTL infikovanou kontrolními rekombinanty expresujícími buď CDlón, nebo CD16:zeta. Obrázek 6A

-22CZ 281881 B6 ukazuje, že buňky, které expresí poskytují CD4 chiméry, nerozpoznávají přírodní HeLa buňky nebo buňky HeLa expresující gp 120/41, a podobně, že T buňky, které expresí poskytují CD4 chiméry, nerozpoznávají HeLa buňky expresující jiné povrchové proteiny kódované vakcínií. A dále, CTL, které expresí poskytují nechimemí CD4, nelyžují významnou měrou HeLa buňky, které expresí poskytují gp 120/41 (obr. 6A).

Příklad 7

Buňky nesoucí MHC třídy II nejsou cílem chimér

O CD4 se předpokládá, že interaguje s nepolymorfiií sekvencí expresovanou antigenem MHC třídy II (Gay a spol.: Nátuře 328. 626 až 629 (1987); Sleckman a spol.: Nátuře 328, 351 až 353 (1987).). I když specifická interakce mezi CD4 a antigenem třídy II nikdy nebyla dokumentována s vyčištěnými proteiny, za jistých podmínek lze prokázat adhezi mezi buňkami expresujícími CD4 a buňkami expresujícími molekuly třídy II (Doyle a spol.: Nátuře 330, 256 až 259 (1987); Clayton a spol.: J. Exp. Med. 172. 1243 až 1253 (1990); Lamarre a spol.: Science 245. 743 až 746 (1989).). Dále bylo zkoumáno, jestli lze zjistit zabíjení mezi buňkami nesoucími třídu II. Obrázek 6B ukazuje, že neexistuje žádná specifická cytolýza řízená CD4:zeta proti Ráji B buněčné linii, která expresuje hojná množství antigenů třídy II. I když existuje mírná cytolýza (asi 5 %), mutant Ráji negativní na třídu II, RJ2.2.5 (Accolla R. S.: J. Exp. Med. 157, 1053 až 1058 (1983).) vykazuje podobnou vnímavost jako buňky Ráji, které jsou inkubovány s neinfikovanými T buňkami.

Příklad 8

Požadavky na sekvenci, aby došlo k indukci cytolýzy řetězcem T buněčný antigen/Fc receptor zeta I když chiméry mezi CD4 a zeta mohou vyzbrojit cytotoxické T lymfocyty (CTL) tak, aby zabíjely cílové buňky, které expresí poskytují HIV gpl20, byla hledána alternativa k CD4, aby se nedvojznačně srovnaly vlastnosti zeta chimér zavedených do linií lidských T buněk. Takové linie mohou expresovat CD4, což způsobuje těžkosti se specifickým definováním vzájemného vztahu mezi typem nebo stupněm mobilizace vápníku a cytotoxickým potenciálem různých chimér. Aby se to mohlo obejít, byly vytvořeny chiméry mezi zeta a CD 16, v nichž je extracelulámí doména CD 16 připojena k transmembránovým a intracelulámím sekvencím zety (obrázek 7A). Do expresního plasmidu viru vakcínie, nesoucího E. coli gpt gen jako selektovatelný markér, se zavedou genové fůze a homologní rekombinací a selekcí na růst v mykofenolové kyselině se vloží do genomu vakcínie kmene WR (Falkner a Moss: J. Virol. 62, 1849 (1988); Boyle a Coupar: Gene 65, 123 (1988).).

T buněčné linie se infikují rekombinanty vakcínie. Po zesíťování extracelulámích domén s protilátkami se měří relativní koncentrace cytoplasmových volných iontů. Byla provedena jak spektrofluorimetrická (velké populace), tak průtoková cytometrická (jednotlivá buňka) měření s buňkami naplněnými barvivém Indo-l (Grynkiewicz a spol.: J. Biol. Chem_; 260, 3440 (1985); Rabinowitch a spol.: J. Immunol. 137. 952 (1986).). Obrázek 7B ukazuje analýzu dat získaných z buněk Jurkat leukemové linie lidských T buněk infikovaných rekombinanty vakcínie expresujících CD16:zeta fúzovaný protein. Zesíťování chimér reprodukovatelně zvyšuje intracelulární vápník, zatímco podobné zpracování buněk, které expresí poskytují nechimemí CD 16, má malý nebo vůbec nemá žádný vliv. Jestliže chiméra je expresována v mutovaných buněčných liniích, kterým chybí antigenový receptor, je vidět buď REX33A (Breitmeyer a spol.: J. Immunol. 138, 726 (1987); Sancho a spol.: J. Biol. Chem. 264. 20760 (1989).), Jurkat mutant JRT3.T3.5 (Weiss a spol.: J.

-23 CZ 281881 B6

Immunol. 135, 123 (1984).), nebo silná odpověď na zesíťování CD 16 protilátkou. Podobná data se získají s REX20A (Breitmeyer a spol.: viz výše, 1987; Blumberg a spol.: J. Biol. Chem. 265, 14036 (1990).) mutovanou buněčnou linií a s CD3/TÍ negativním mutantem buněčné linie Jurkat získané v této laboratoři (data nejsou uvedena). Infekce rekombinanty expresujícími CD16:zeta neobnovuje odpověď na anti-CD3 protilátku, což ukazuje, že fúzovaný protein nepůsobí intracelulámími řetězci CD3 komplexu (data neuvedena).

Pro vyhodnocení schopnosti chimér přesměrovat buněčně zprostředkovanou imunitu se CTL infikují rekombinanty vakcínie expresujícími CD 16 chiméry a použijí se pro specifické lyžování hybridomových buněk expresujících anti-CD16 protilátky navázané na membránu (viz níže). Tato analýza je rozšířením analýzy hybridomové cytotoxicity původně vyvinuté pro analyzování efektorových mechanismů buněk nesoucích Fc receptory (Graziano a Fanger: J. Immunol. 138, 945 (1987); Graziano a Fanger: J. Immunol. 139, 35 až 36 (1987); Shen a spol.: Mol. Immunol. 26, 959 (1989); Fanger a spol.: Immunol. Today 10, 92 (1989).). Obrázek 8B ukazuje, že exprese CD16:zeta v cytotoxických T lymfocytech umožňuje vyzbrojeným CTL zabíjet 3G8 (anti-CDI6; Fleit a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79, 3275 (1982).) hybridomové buňky, zatímco CTL expresující fosfatidylinositol-navázanou formu CD16 jsou neaktivní. CTL vyzbrojené CD16:zeta také nezabíjejí hybridomové buňky expresující irelevantní protilátku (data neuvedena).

Pro identidikaci minimálních zeta sekvencí nutných pro cytolýzu se připraví série delečních mutantů, v nichž se z karboxylového konce odstraňuje postupně větší zeta intracelulámí doména (obr. 8A). Většina intracelulámí domény zeta by se mohla odstranit s malými důsledky pro cytolytický potenciál. Plná délka chiméry CD16:zeta měla v podstatě stejnou účinnost jako chiméra deletovaná až ke zbytku 65, CD16:zetaAsp66* (obr. 8B). Podstatné snížení cytotoxicity bylo pozorováno při deleci zeta až ke zbytku 59 (chiméra CD16:zetaGlu60*), další delece do zbytku 50 vedla k mírně menší aktivitě. Avšak úplná ztráta aktivity nebyla pozorována ani tehdy, když intracelulámí doména byla snížena na tři zbytky transmembránové kotvy (obr. 8B).

Jelikož zeta je dimer s disulfídovým můstkem, jedním vysvětlením zachování cytolytické aktivity je to, že endogenní zeta vytváří heterodimery s chimemí zeta deleci a tím, rekonstituje aktivitu. Pro testování této myšlenky byly zbytky 11 a 15 v zeta změněny z Asp a Cys na Gly (Cysl lGly/Aspl5Gly). Následujícím způsobem byla provedena imunoprecipitace. Přibližně 2.10⁶ buněk CV1 se infikuje jednu hodinu v DME médiu bez séra rekombinantni vakcínií na multiplicitu infekce (moi) alespoň deset. Šest až deset hodin po infekci se buňky odeberou z desek PBS s lmM EDTA a povrchově se označí 0,2 mCi ¹²⁵I na 2.10⁶ buněk laktoperoxidasou a peroxidem vodíku způsobem podle Clarka a Einfelda (Leukocyte Typing Π, strany 155 až 167, Springer-Verlag, NY, 1986). Označené buňky se isolují odstřeďováním a lyžují se v l % obj. NP-40, 0,1 % hmotn./obj. SDS, 0,15MNaCl, 0,05M Tris, pH 8,0, 5mM MgCb, 5mM KC1, 0,2M jodacetamidu a lmM PMSF. Jádra se odstraní odstřeďováním a CD 16 proteiny se vysráží imunoprecipitací protilátkou 3G8 (Fleit a spol.: viz výše, 1982; Medarex) a protimyší IgG agarosou (Cappel, Durham, NC). Vzorky se elektroforesují na 8 % hmotn./obj. polyakrylamidu/SDS gelu za neredukujících podmínek nebo 10 % hmotn./obj. gelu za redukujících podmínek. Tato imunoprecipitace potvrdila, že chiméra CD16:zetaCysl lGly/Aspl5Gly neasociuje ve formě dimerových struktur spojených disulfídovým můstkem.

Byla testována také cytolytická aktivita mutantních receptorů. Mutovaná chiméra (CD16:zetaCysl lGly/Asp!5Gly/Asp66*) deletovaná až ke zbytku 65 byla, podle podmínek analýzy, dva až osmkrát méně aktivní v testu cytolýzy než srovnatelná nemutovaná chiméra (CD16:zetaAsp66*), která byla obvykle dvakrát nebo nerozlišitelně méně aktivní než CD16:zěta (obrázek 9B). Snížení aktivity mutantních chimér je srovnatelné se snížením pozorovaným u CD4

-24CZ 281881 B6 chimér o podobné struktuře (viz výše). Nejpravděpodobněji se připisuje nižší účinnosti zeta monomerů ve srovnání s dimery. Naproti tomu Asp' a Cys mutanovaná chiméra deletovaná až ke zbytku 59 nemá žádnou cytolytickou aktivitu (obrázek 9B), což podporuje hypotézu, že za slabé přetrvávání cytolytické aktivity v delecích blíže aminovému konci než zbytek 65 je zodpovědná asociace s jinými řetězci zprostředkovaná transmembránovým Cys a/nebo Asp zbytkem.

Studie průtokovou cytometrií ukázaly, že deleční mutanty, kterým chybí transmembránové Asp a Cys zbytky, by stále ještě mohly podporovat zvýšení volného intracelulámího iontu vápníku jako odpověď na protilátkové zesíťování u TCR‘ mutované Jurkat buněčné linie (obr. 9D). Podobné výsledky byly získány u chimér expresovaných v rodičovské linii Jurkat (neuvedeno). V případě CD16:zetaCysl !Gly/Aspl5Gly/Glu60* tato data demonstrují, že schopnost zprostředkovat odpověď vápníku může být mutačně oddělena od schopnosti podporovat cytolýzu»

Aby se definitivně odstranil možný příspěvek zeta transmembránových zbytků, byla transmembrána a prvních 17 cytoplasových zbytků nahrazeno sekvencemi, které kódují překlenutí membrány a prvních 14 nebo 17 cytoplasmových zbytků CD5 nebo CD7 antigenů (obr. 9A). Výsledné trojdílné fúzované proteiny CD16:5:zeta (45 až 65) a CD16:7:zeta (48 až 65) netvoří dimery s disulfidovým můstkem jako je tomu u jednodušších CD16:zeta chimér, protože jim chybí cysteinový zbytek v zeta transmembránové doméně. Obě trojdílné chiméry byly schopny mobilizovat vápník v Jurkat a TCR negativních buněčných liniích (obr. 9D) a vnést cytolytickou odpověď do CTL (obr. 9C a data neuvedená). Avšak odříznutí zeta části až do zbytku 59 v chimeře CD16:7:zeta (48 až 59) odstraňuje schopnost trojdílné fuze řídit odpovědi vápníku v TCR positivních nebo negativních Jurkat buňkách nebo cytolýzy v maturovaném CTL (obr. 9C a 9D a data neuvedená).

Při zkoumání příspěvků jednotlivých zbytků v motifu s 18 zbytky jsme připravili místně řízenou mutagenesí četné mutované varianty a vyhodnotili jsme jejich schopnost zprostředkovat receptorem řízené zabíjení za podmínek nízké (obr. 10A a 10D) nebo vysoké (obr. 10B a 10E) exprese chimemího receptoru. Obrázek 10 ukazuje, že zatímco četné relativně konservativní substituce (tj. nahrazení kyselých zbytků jejich obdobnými amidy nebo tyrosinem s fenylalaninem), které překlenují zbytky 59 až 63, vedou k přiměřenému kompromisu pokud jde o cytolytickou aktivitu, obecně si varianty zachovávají schopnost mobilizovat vápník. Souhrnně však tyto zbytky obsahují důležitý submotif, vzhledem k tomu, že jejich delece odstraňuje cytolytickou aktivitu. Převedení Tyr 62 buď na Phe, nebo Ser odstraňuje jak cytotoxickou, tak vápníkovou odpověď. Náhrada Tyr 51 Phe na aminovém konci segmentu o 18 zbytcích odstraňuje jak mobilizaci vápníku, tak cytolytickou aktivitu, zatímco substituce Leu za Ser v poloze 50 odstraňuje odpověď vápníku, avšak cytolýzu zhoršuje pouze částečně. Předpokládá se, aniž bychom se vázali na příslušnou hypotézu, že neschopnost mutantu Leu50Ser mobilizovat vápník v krátkodobých analýzách průtokovou cytometrií neodráží plně jeho schopnost zprostředkovávat podstatné zvýšení volného intracelulámího vápenatého iontu po delší dobu cytolytické analýzy. Pro některé cytolytické T buněčné linie však byla popsána cytolytická aktivita necitlivá na vápník. Možnost, že podobný jev je podkladem zde popsaných výsledků není vyloučen. Náhrada Asn48 za Ser v některých pokusech částečně zhoršuje cytotoxicitu, zatímco v jiných pokusech má pouze malý vliv.

Při výzkumu potenciální úlohy nadbytečných prvků sekvence byla intracelulámí doména zety rozdělena na tři segmenty, zbytky od 33 do 65, od 71 do 104 a od 104 do 138. Každý z těchto segmentů byl připojen na CD16.CD7 chiméru místem Mlul zavedeným právě vedle základních sekvencí zakotvujících membránu intracelulámí domény CD7 (viz níže; obrázek 1 IA). Srovnání cytolytické účinnosti těchto tří prvků ukázalo, že byly v podstatě stejně účinné (obr. 1 IB). Srovnání sekvencí (obr. 11 A) ukazuje, že druhý motif nese jedenáct zbytků mezi tyrosiny, zatímco první a třetí motif nesou deset zbytků.

-25CZ 281881 B6

I když přesné spočtení procesu aktivace T buněk nebylo provedeno, je zřejmé, že agregace antigenového receptorů nebo receptorových chimér, které nesou zeta intracelulámí sekvence, spouští mobilizaci vápníku, uvolnění cytokinu a granulí a objevuje se aktivace markérů buněčného povrchu. Aktivní místo zety, krátká lineární peptidová sekvence, možná příliš malá na to, aby měla přirozenou 5 enzymatickou aktivitu, pravděpodobně interaguje s jedním nebo několika proteiny při zprostředkování buněčné aktivace. Je také nanejvýš jasné, že mobilizace volného vápníku není sama o sobě dostatečná pro buněčnou aktivaci, jelikož schopnost zprostředkovat cytolýzu může být mutačně oddělena od schopnosti zprostředkovat akumulaci vápníku.

Jak zde bylo ukázáno, přidání 18 zbytků z intracelulámí domény zeta do transmembránové a intracelulámí domény dvou nepodobných proteinů umožňuje výsledným chimérám přesměrovat

- cytolytickou aktivitu proti cílovým buňkám, které se vážou na extracelulámí část napojených proteinů. I když chiméry nesoucí motif s 18 zbytky jsou přibližně osmkrát méně aktivní než chiméry na bázi plné délky zeta, je možné přičíst sníženou aktivitu ztrátě transmembránových interakcí, které 15 normálně umožňují přírodní zeta vytvořit dimery vázané disuifidovým můstkem. To znamená, že konstrukce zeta delece (které mají stejný karboxylový konec jako motif a kterým chybí jim transmembránový Cys a Asp zbytek) typicky vykazují menší aktivitu než chiméry nesoucí pouze motif s 18 zbytky.

Prvek s cytolytickou schopností, na který jsme se soustředili, má dva tyrosiny a nemá žádné šeřiny ani threoniny, což omezuje možné příspěvky fosforylace k aktivitě. Mutace kteréhokoliv tyrosinu však ničí aktivitu, i když předběžné pokusy neukazují na podstatnou fosforylaci tyrosinu po zesíťování chimemích povrchových antigenů nesoucích motif s 18 zbytky. Nelze vyloučit možnou účast takové fosforylace v nízké hladině. Vedle účinků na dvou tyrosinových zbytcích zeslabují 25 aktivitu za podmínek nízké hustoty receptorů četné substituce aminokyselin na aminovém a karboxylovém konci motifu.

Sekvence, které jsou podobné zeta aktivnímu motifu, lze nalézt v cytoplasmových doménách několika dalších transmembránových proteinů, včetně molekul CD3 delta a gama, proteinů mbl a 30 B29 asociovaných s IgM a beta a gama řetězců IgE receptorů o vysoké afinitě, FcepsilonRI (Reth:

Nátuře 338. 383 (1989).). I když funkce těchto sekvencí nejsou jisté, jestliže jsou účinně expresovány, každá může být schopna autonomní aktivace T buněk. Taková aktivita může vysvětlovat zbytkovou TCR odpověď, kterou lze vidět v zeta-negativní mutované buněčné linii (Sussman a spol.: Cell 52. 85 (1988).).

Zeta sama nese tři takové sekvence, přibližně stejně umístěné. Hrubé rozdělení intracelulámí domény na tři díly ukazuje, že každý díl je schopen iniciovat cytolytickou odpověď. Eta, střihové isoformě zeta (Jin a spol.: viz výše, 1990; Clayton a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 5202 (1991).), chybí karboxylová polovina třetího motifu. Jelikož odstranění karboxylové poloviny 40 prvního motifu odstraňuje aktivitu, zdá se pravděpodobné, že hlavní biologické účinnosti ety lze připsat prvním dvěma motifum. I když podle různých měření je eta stejně aktivní jako zeta při podpoře uvolňování cytokinu vyvolaného antigenem (Bauer a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 3842 (1991).) nebo při přesměrování cytolýzy (viz shora), eta není fosforylována jako odpověď na stimulaci receptorů (Bauer a spol.: viz výše, (1991).). Pro fosforylaci je tedy potřebná buď 45 přítomnost všech třech motifu, nebo třetí motif představuje výhodný substrát pro neidentifikovanou tyrosin-kinasu.

-26CZ 281881 B6

Příklad 9

Transdukce cytolytického signálu lidským Fc receptorem

Pro vyhodnocení působení různých podtypů lidského Fc receptorů se vytvoří chimemí molekuly, v nichž je extracelulámí doména lidského CD4, CD5 nebo CD 16 antigenů napojena na transmembránovou a intracelulámí doménu FcRIIgamaA, Bl, B2 a C subtypů (nomenklatura podle Ravetche a Kineta: Ann. Rev. Immunol. 9, 457 (1991).). Specificky, cDNA sekvence odpovídající transmembránovým a cytoplasmovým doménám dříve popsaných FcRILA, Bl a B2 isoforem se io amplifikují z dříve existujícího klonu PC23 nebo z lidské mandlové cDNA knihovny (zkonstruované standardními způsoby) použitím oligonukleotidových primerů:

CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (sekvence id. č. 18; FcRILA přímá),

CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (sekvence id. č. 19; FcRILA reversní),

GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (sekvence id. č. 20; FcRIIB 1 a FcRIIB2 přímé) a

GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (sekvence id. č. 21; FcRIIB 1 a RcRIIB2 reversní).

Tyto primeiy obsahovaly místa štěpení pro enzymy BamHI a Notl oddělené 6 zbytky od 5’ konce. Po místu Notl bezprostředně následoval stop kodon positivního řetězce, buď CTA, nebo TTA. Všechny primery obsahovaly 18 nebo více zbytků doplňkových k 5’ a 3’ koncům žádaných fragmentů. cDNA fragment odpovídající FcRIIgamaC cytoplasmové doméně (která se liší od IIA isoformy pouze jedním zbytkem aminokyseliny (L za P ve zbytku 268)) se generuje místně řízenou mutagenesí překryvem PCR s použitím primerů o sekvencích:

TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (sekvence id. č. 22) a

TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (sekvence id. č. 23).

PCR fragmenty byly vloženy do expresních vektorů viru vakcínie, které obsahovaly extracelulámí domény CD16 nebo CD4 a postupně vloženy do přírodní vakcínie rekombinací v místě thymidinkinasy s výběrem na kointegraci E. coli gpt, aby se usnadnila identifikace žádaných rekombinantů. Identity všech isoforem (uvedené na obr. 12) byly potvrzeny dideoxy-sekvenováním.

Produkce chimemích receptorových proteinů byla dále potvrzena imunoprecipitačními studiemi. Přibližně 10⁷ buněk JRT3.T3.5 se infikuje jednu hodinu v médiu IMDM bez séra rekombinantní vakcínií na multiplicitu infekce alespoň deset. Dvanáct hodin po infekci se buňky isolují a povrch se označí 0,5 mCi ^l2íI na IO⁷ buněk způsobem laktoperoxidasa/glukosooxidasa podle Clarka a Einfelda, viz výše. Označené buňky se isolují odstřeďováním a lyžují se 1 % obj. NP-40, 0, lmM MgCl₂,

5mM K.C1, 0,2M jodacetamidem a lmM PMSF. Jádra se odstraní odstřeďováním. CD16 fúzované proteiny se imunoprecipitují protilátkou 4G8 a protimyší IgG agarosou. Vzorky se elektroforesují za redukujících podmínek. Všechny imunoprecipitované molekuly chimemího receptorů měly očekávané molekulové hmoty. ⁵⁰

-27CZ 281881 B6

Při testování schopnosti chimemích receptorů zprostředkovat (vyvolávat) zvýšení cytoplasmového volného iontu vápníku se pro infikování TCR' mutované Jurkat buněčné linie JRT3.T3.5 (jak zde popsáno) používají rekombinantní viry. Cytoplasmový volný vápník v buňkách se měří (jak shora popsáno) po zesíťování receptorových extracelulámích domén monoklonální protilátkou 3G8 nebo Leu-3A (jak zde popsáno). Tyto pokusy odhalily, že intracelulámí domény FcRgamalI A a C byly schopny zprostředkovat zvýšení cytoplasmového volného iontu vápníku po zesíťování extracelulámích domén, zatímco intracelulámí domény FcRgamalI B1 a B2 byly za srovnatelných podmínek neaktivní (obr. 13A a 13B). CD4, CD5 a CD16 hybridy FcRgamalI A měly v podstatě stejnou kapacitu podporovat odpověď vápníku (obr. 13 a neuvedená data). Jiné buněčné linie, jak z monocytických, tak z lymfocytických rodů byly schopny odpovídat na signál iniciovaný zesíťováním extracelulámích domén (data nejsou uvedena).

Při výzkumu role různých FcRgamalI intracelulámích domén v cytolýze se lidské cytotoxické T lymfocyty (CTL) infikují rekombinanty vakcínie, které expresí poskytují CD16:FcRgamaII A, Bl, B2 a C chiméry. Infikované buňky se pak kokultivují hybridomovými buňkami naplněnými ^3lCr (tj. 3G8 10-2 buňky), které expresí poskytují na buněčném povrchu protilátku na CD16. Při tomto testu CTL nesoucí CD 16 chiméru zabíjely hybridomové cílové buňky (což umožňuje uvolňování volného ”Cr), jestliže CD 16 extracelulámí doména chimér je napojena na intracelulámí segment schopný aktivovat lymfocytový efektorový program, tento cytolytický test je níže popsán podrobně. Obrázek 14A ukazuje, že CTL vyzbrojené CD16:FcRgamaII A a C, ale nikoliv FcRgamalI Bl nebo B2, jsou schopny lyžovat cílové buňky, které expresí poskytují anti-CD16 protilátky na buněčném povrchu.

Aby se odstranila možnost, že specifická cytolýza nějak souvisí s interakcí s CD 16 částí, byly provedeny pokusy cytolýzy, při nichž FcRII intracelulámí domény byly připojeny na CD4 extracelulámí doménu. V tomto případě byly cílovými buňkami HeLa buňky expresující HIV obálkové gpl20/41 proteiny (specificky HeLa buňky infikované vektorem vakcínie vPE16 (dostupným z National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, Md.)). Stejně jako v systému CD 16 byly cílové buňky, které expresí poskytují HTV obálkové proteiny, citlivé na lyzy T buňkami, které expresuji CD4:FcRgamaII A chiméru, ale nikoliv FcRgamalI Bl nebo B2 (obr. 14B).

Intracelulámí domény FcRgamalI A a C nesdílejí žádnou znatelnou homologii sekvencí s jiným proteinem, včetně členů rozsáhlé podčeledi FcRgama/TCRzeta. Pro definici prvků sekvence, které jsou zodpovědné za indukci cytolýz, byly připraveny 5’ a 3’ delece intracelulámí domény kódující sekvence (popsané níže a uvedené na obrázku 15A). Byly vyhodnoceny na účinnost mobilizace vápníku a analýzou cytolýzy (jak zde popsáno). Při pokusech, při nichž se odstraní aminová koncová část intracelulámí domény, se transmembránová doména FcRgamalI nahradí transmembránovou doménou nepříbuzného CD7 antigenů. Eliminuje se tak možný příspěvek interakcí zprostředkovaných doménou překlenuj ící membránu.

Obrázky 15B a 15C ukazují, že odstranění 14 zbytků z karboxylového konce, včetně tyrosinu 298, vede k úplné ztrátě cytolytické kapacity a k podstatnému snížení mobilizačního potenciálu vápníku. Další delece až k místu právě před tyrosinem 282 poskytuje identický fenotyp (obrázky 15B a 15C). Delece od N-konce intracelulámí domény ke zbytku 268 nemá žádný podstatný vliv jak na profil vápníku, tak na cytolytický potenciál, zatímco delece do zbytku 275 značně zhoršuje uvolňování volného vápníku, ale má malý vliv na cytolýzu (obrázky 15D a 15E). Další delece, do zbytku 282, poskytuje FcRgamalI konec, kterému chybí schopnost buď mobilizovat vápník, nebo spouštět cytolýzu (obr. 15D a 15E). Aktivní prvek definovaný těmito mírami je relativně velký (36 aminokyselin) a obsahuje dva tyrosiny oddělené 16 zbytky.

-28CZ 281881 B6

Příklad 10

Jiné domény transdukujicí intracelulámi a transmembránový signál podle vynálezu mohou být odvozeny od proteinů T buněčného receptorů, CD3 delta a T3 gama, a proteinů B buněčného receptorů, mbl a B29. Sekvence aminokyselin těchto proteinů je uvedena na obrázku 16 (CD3 delta; sekvence id. č. 24), obrázku 17 (T3 gama; sekvence id. č. 25), obrázku 18 (mbl; sekvence id. č. 26) a obrázku 19 (B29; sekvence id. č. 27). Části sekvencí postačujících pro transdukci cytolytického signálu (a tedy s výhodou obsažené v chimemím receptorů podle tohoto vynálezu) jsou uvedeny v závorkách. Chimemí receptory, které zahrnují tyto proteinové domény, jsou zkonstruovány a používány v terapeutických metodách podle vynálezu obvykle jak shora popsáno.

Příklad 11

Metody použité v příkladech

Infekce vakcínií a radioimunoprecipitace

Přibližně 5.10⁶ CV1 buněk se infikuje jednu hodinu v médiu DME bez séra rekombinantní vakcínií na multiplicitu infekce (moi) alespoň deset (titr měřený na CV1 buňkách). Tyto buňky se po infikování umístí do čerstvého média a metabolicky se značí 200 pCi/ml ³⁵S-methioninu plus cysteinu (Trans³⁵S-label, ICN; Costa Mesa, Ka.) v médiu DMEM bez methioninu a cysteinu (Gibco; Grand Island, NY) šest hodin. Označené buňky se odeberou PBS obsahujícím lmM EDTA, isolují se odstřeďováním a lyžují se v 1 % obj. NP-40, 0,1 % hmotn./obj. SDS, 0,15M NaCl, 0,05M Tris, pH 8,0, 5mM EDTA a lmM PMSF. Jádra se odstraní odstřeďováním a CD4 proteiny se imunoprecipitují protilátkou OK.T4 a protimyší IgG agarosou (Cappel, Durham, NC.). Vzorky se elektroforesují 8 % hmotn./obj. polyakrylamidovými SDS gely za neredukujících (NR) a redukujících (R) podmínek. Gely obsahující ^3ÍS značené, vzorky se před autoradiografií impregnují En³Hance (New England Nuclear, Boston, Ma.). Usnadněná exprese transmembránové formy CD 16, CD 16™, se měří srovnáním její exprese v CV1 buňkách jednou infikovaných CD 16™ s expresí v buňkách koinfikovaných viry kódujícími CD 16™ a zeta nebo gama chimérami. Po infikování a inkubaci po dobu šesti nebo více hodin, se buňky odstraní z desek PBS a lmM EDTA. Exprese CD 16™ nebo chimér se měří nepřímou imunofluorescencí a průtokovou cytometrií.

Průtoková analýza vápníku

Podlinie E6 buněk Jurkat (Weiss a spol.: J. Immunol. 133, 123 až 128 (1984).) se infikuje rekombinantním virem vakcínie jednu hodinu v IMDM bez séra (moi 10) a inkubuje se tri až devět hodin v IMDM s 10 % FBS. Buňky se isolují odstřeďováním, resuspendují se v množství 3.10⁶ buněk na ml v úplném médiu obsahujícím lmM Indo-l acetomethoxyester (Grynkiewicz a spol.: J. Biol. Chem. 260, 3340 až 3450 (1985).) (molekulární sondy) a inkubují se 45 minut při teplotě 37 °C. Buňky naplněné Indo-l se peletují a resuspendují v množství 1.10⁶/ml v IMDM bez séra a skladují se při teplotě místnosti ve tmě. Buňky se analyzují na obsah volných iontů vápníku simultánním měřením fialové a modré fluorescenční emise průtokovou cytometrií (Rabinovitch a spol.: J. Immunol. 137, 952 až 961 (1986).). Pro iniciaci toku vápníku se k buněčné suspenzi přidá buď fykoerythrin (PE)-konjugovaný s Leu-3A (anti-CD4) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ.) v množství 1 pg/ml s následujícím přidáním 10 pg/ml nekonjugovaného kozího protimyšího IgG v čase 0, nebo se k buněčné suspenzi přidá nekonjugovaná 3G8 (anti-CD16) monoklonální protilátka v množství 1 pg/ml s následujícím přidáním 10 pg/ml PE-konjugovaného Fab?’ kozího protimyšího

-29CZ 281881 B6

IgG v čase 0. Z PE positivní (infikované) buněčné populace, která typicky představuje 40 až 80 % ze všech buněk, se odeberou histogramy emisního poměru fialová/modrá. Odpověď T buněčného antigenového receptorů v neinfikovaných buňkách byla spuštěna protilátkou OKT3, bez zesíťování. U pokusů zahrnujících CD 16 chimemí receptory se z analýzy vyloučí vzorky, které vykazují tendenci základní linie směrem k nižšímu intracelulámímu vápníku (bez protilátek). Histogramová data byla postupně analyzována konversí binárních dat na ASCII s použitím programu (software) Write Hand Man (Cooper City, Fl.) s následující analýzou sbírkou programů FORTRAN. Pro zjištění normálního iniciačního poměru se použije poměr emise fialová/modrá před adicí druhého protilátkového reakčního činidla, nastaví se na jednotnost a zbývající prahový poměr se nastaví tak, aby 10 % zbývající populace přesahovalo práh.

Analýza cytolýzy

Lidská T buněčná linie WH3, CD8* CD4‘ HLA B44 omezená cytolytická linie se uchovává v IMDM s 10 % lidského séra se 100 jednotkami IL-2 na mililitr a periodicky se stimuluje buď nespecificky ozářenými (3000 rad) HLA-nepodobnými periferními krevními lymfocyty a 1 pg/ml fýtohemaglutininu, nebo specificky jednojademými buňkami nesoucími ozářený B44. Po jednom dnu ne specifické stimulace se PHA zředí na koncentraci 0,5 pg/ml přidáním čerstvého média. Po třech dnech se médium vymění. Buňky se po stimulaci nechají růst alespoň deset dnů před použitím v analýzách cytotoxicity. Tyto buňky se infikují rekombinantní vakcínií na multiplicitu infekce alespoň deset jednu hodinu v médiu bez séra. Následuje inkubace v úplném médiu po dobu tri hodin. Buňky se isolují odstřeďováním a resuspendují se na hustotu 1.10⁷ buněk na mililitr. Do každé jamky mikrotitrovací desky ve tvaru U obsahující 100 μΐ média na jamku se přidá po 100 μΐ. Buňky se zředí dvojnásobným seriálovým zředěním. Dvě jamky každého vzorku neobsahovaly lymfocyty, aby se umožnilo spontánní uvolňování chrómu. Změří se celkový příjem chrómu. Cílové buňky, z HeLa podlinie S3, se infikují na 6,0 nebo 10,0 cm deskách na moi přibližně 10 jednu hodinu v médiu bez séra. Následuje tříhodinová inkubace v úplném médiu. Potom se pomocí PBS s ImM EDTA odeberou s desek a spočítají. Podíl 10⁶ cílových buněk (HeLa, Ráji nebo RH2.2.5 buňky pro pokusy s CD4 chimemím receptorem a 3G7 10-2 buňkami (Shen a spol.: Mol. Immunol. 26, 959 (1989).) pro pokusy s CD 16 chimemím receptorem) se odstřeďuje a resuspenduje se v 50 μΐ sterilního ^5lCrchromanu sodného (1 mCi/ml, Dupont Wilmington, De.) jednu hodinu při teplotě 37 °C s přerušovaným mícháním, potom se promyje třikrát PBS. Do každé jamky se přidá 100 μΐ označených buněk resuspendovaných v médiu v množství 10³ buněk/ml. Stejným způsobem jako cílové buňky se označují buňky Ráji a RJ2.2.5. Mikrotitrovací deska se odstřeďuje při 750xg jednu minutu a inkubuje se 4 hodiny při 37 °C. Na konci inkubační doby se buňky v každé jamce resuspendují opatrným pipetováním. Vzorek se odstraní, aby se stanovilo množství impulsů obsažených ve vzorku. Mikrotitrovací deska se odstřeďuje při 750xg jednu minutu. Odeberou se 10 μΐ podíly supematantu a spočítají se ve scintilačním počítači paprsků gama. Procento zabití se opraví na frakci infikovaných cílových buněk (obvykle 50 až 90 %) změřenou průtokovou cytometrií. Pro infikované efektorové buňky byl poměr efektor:cíl opraven na procento infikovaných buněk (obvykle 20 až 50 procent pro pokusy s CD4 chimemím receptorem a více než 70 % pro pokusy s CD 16 chimemím receptorem).

In vitro mutagenese zeta sekvence

Aby se vytvořily mutace ve zbytcích aminokyselin 11 a 15 zeta sekvence, připraví se syntetické oligonukleotidové primery od místa BamHI proti směru vlákna zeta transmembránové domény a změní se přírodní zeta zbytek 11 z Cys na Gly (Cl 1G) nebo zbytek 15 z Asp na Gly (D15G) nebo se změní obojí (C11G/D15G). Tyto primery se použijí v PCR reakcích pro generaci mutovaných

-30CZ 281881 B6 fragmentů, které byly znovu vloženy do přírodního typu konstrukcí CD4:zeta.

Aby se vytvořily zeta delece, byly zeta cDNA sekvence amplifikovány PCR s použitím syntetických oligonukleotidových primerů, které jsou určeny pro vytvoření stop kodonu (UAG) po zbytku 50, 59 nebo 65. Tyto příměry obsahovaly místo štěpení pro enzym Notl umístěný pět nebo šest zbytků od 5’ konce, obvykle v sekvenci CGC GGG CGG CCG CTA (sekvence id. č. 11), kde poslední tři zbytky odpovídají stop antikodonu. Po sekvencích Notl a stop antikodonu následovalo 18 nebo více zbytků doplňkových k žádoucímu 3’ konci fragmentu. Výsledné chiméry byly označeny CD16:zetaY51*, CD16:zetaE60* a CD16:zetaD66*. Místo BamHI proti směru vlákna transmembránové domény a místo Notl byla použita pro generaci fragmentů, které byly znovu zavedeny do divokého (přírodního) typu konstrukce CD16:zeta. Monomemí zeta chiméry se vytvoří uvolněním zeta transmembrány -a membrány vedle intracelulámích sekvencí štěpením působením BamHI a Sací shora popsané Asp' a Cys' CD4:zeta konstrukce a vložením tohoto fragmentu do konstrukce CD16:zetaE60*, respektive CD16:zetaD66.

Konstrukce trojdílné chiméry CD16:7:zeta (48 až 65) a CD16:7:zeta (48 až 59)

Při přípravě konstrukce CD16:zetaD66* se zeta cDNA sekvence odpovídající transmembránové doméně a následujících 17 zbytků cytoplasmové domény nahradí odpovídající transmembránovou a cytoplasmovou doménou získanou z CD5 a CD7 cDNA. CD5 a CD7 fragmenty byly generovány PCR reakcí s použitím přímých oligonukleotidů obsahujících místo štěpení restrikční endonukleasou BamHI a odpovídající oblasti proti směru vlákna transmembránové domény CD5, respektive CD7, s následujícím použitím reversních oligonukleotidů překrývajících CD5, respektive CD7 sekvence a zeta sekvence, která obsahuje místo štěpení restrikční endonukleasou Sací.

CD5:zeta: CGC GGG CTC GTT AT A GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (sekvence id. č. 12).

CD7:zeta: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (sekvence id. č. 13).

PCR produkty CD5 a CD7 se rozštěpí působením BamHI a Sací a ligují se s CD16:zetaE60* rozštěpenou působením BamHI a Scal. Zeta sekvence od BamHI do Scal se nahradí fragmentem CD7. Aby se připravily konstrukce CD16:CD5 a CD16:CD7, PCR reakcí se s použitím oligonukleotidů obsahujícího místo štěpení restrikční endonukleasou Notl a kódující stop kodon (UAA) za zbytky Gln416 Alal93 fragmentu CD5, respektive CD7, získají fragmenty CD5 a CD7. CD5 a CD7 PCR fragmenty se rozštěpí působením BamHI a Notl a vloží se do konstrukce CD 16:zetaAsp66*.

In vitro mutagenese zbytků na N-konci v motifu transdukujícím zeta cytolytický signál

Syntetizují se syntetické oligonukleotidové primery od místa Sací v zeta motifu a přírodní zbytek 48 se změní z Asn na Ser (N48S), zbytek 50 z Leu na Ser (L50S) a zbytek 51 z Tyr na Phe (Y51F). Tyto primery se použijí v PCR reakci pro generaci fragmentů, které se opět zavedou do přírodní konstrukce CD16:7:zeta (48 až 65).

In vitro mutagenese zbytků na C-konci v motifu transdukujícím zeta cytolytický signál

Syntetizují se syntetické oligonukleotidové primery od místa Notl na 3’ konci do stop kodonu a přírodní zbytek 60 se převede z Glu na Gin (E60Q), zbytek 61 z Glu na Gin (E6IQ), zbytek 62 z Tyr

-31 CZ 281881 B6 na Phe nebo Ser (Y62F nebo Y62S) a zbytek 63 z Asp na Asn (D63N). Tyto primery se použijí v PCR reakci ke generaci fragmentů, které se subklonují do přírodního typu konstrukce CD16:zetaD66* od místa BamHI do místa Notl.

Konstrukce chimér CD16:7:zeta (33 až 65), CD16:7:zeta (71 až 104) a CD16:7:zeta (104 až 137)

PCR reakcí se s použitím oligonukleotidu o následující sekvenci získá CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (sekvence id. č. 14) získá CD7 transmembránový fragment nesoucí místa Mlul a Notl na spojení mezi transmembránovou a intracelulámí doménou. Výsledný PCR fragment se rozštěpí působením BamHI a Notl a znovu se vloží do konstrukce CD16:7:zeta (48 až 65). Zeta fragmenty kódující zbytky 33 až 65, 71 až 104 a 104 až 137 se získají PCR reakcí s použitím párů primerů obsahujících místa Mlul na 5’ konci přímých primerů a stop kodonů následovaných místy Notl na 5’ konci reversních primerů. V každém případě byla restrikční místa oddělena Šesti zbytky od 5’ konce primerů, aby se zajistilo štěpení restrikčním enzymem.

zeta 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (sekvence id. č. 15),

I zeta 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA GGA AAG (sekvence id. č. 16) a zeta 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (sekvence id. č. 17).

Konstrukce FcRgamalIA delečních mutantů

FcRgamalIA deleční mutanty na karboxylovém konci byly zkonstruovány PCR reakcí stejným způsobem jako konstrukce plných délek, převedením sekvencí kódujících tyrosin v polohách 282 a 298 na stop kodony (TAA). Delece na N-konci byly generovány amplifikováním fragmentů kódujících podstatně menší intracelulámí domény PCR s použitím oligonukleotidu, které umožňují, že výsledné fragmenty jsou vloženy mezi Mlul a Notl restrikční místa do předem zkonstruovaného expresního plasmidu kódujícího CD 16 extracelulámí doménu fúzovanou s CD7 transmembránovou doménou, druhá z nich končí v místě Mlul přechodu mezi transmembránovou a intracelulámí doménou.

Jiná uspořádání

Shora popsané příklady ukazují, že agregace zeta, eta a gama chimér postačuje k iniciaci buněčné odpovědi cytolytického efektoru v T buňkách. Známý rozsah exprese zeta, eta a gama, který zahrnuje T lymfocyty, přírodní buňky zabíječe, basofilní granulocyty, makrofágy a žímé buňky, ukazuje na to, že motify zachované sekvence mohou interagovat se smyslovým aparátem obvyklým pro buňky hematopoietního původního a že důležitá složka hostitelské obrany v imunitním systému může být zprostředkována agregačními událostmi receptoru.

Potence cytolytické odpovědi a nepřítomnost odpovědi na cílové buňky nesoucí MHC třídy II receptory ukazuje, že chiméry na bázi zeta, eta nebo gama tvoří základ pro genetickou intervenci AIDSu prostřednictvím adoptivní imunoterapie. Široká distribuce endogenní zeta a gama a důkaz, že Fc receptory asociované s gama zprostředkují cytotoxicitu u různých typů buněk (Fanger a spol.: Immunol. Today 10, 92 až 99 (1989).) umožňuje, aby pro tento účel byly brány v úvahu rozmanité buňky. Například neutrofílní granulocyty, které mají velmi krátkou životnost (asi 4 hodiny) v oběhu a které jsou silně cytolytické, jsou atraktivními cílovými buňkami pro expresi chimér. Infekce neutrofilů HIV pravděpodobně nevede k uvolnění viru a hojný výskyt těchto buněk (nejvlivnějších z leukocytů) by měl usnadnit obranu hostitele. Jinou atraktivní možností hostitelských buněk jsou

-32CZ 281881 B6 maturované T buňky, populace, která je dnes dostupná retrovirovým inženýrstvím (Rosenberg S. A.: Sci. Am. 262, 62 až 69 (1990).). Pomocí rekombinantu ÍL-2 mohou být populace T buněk relativně snadno namnoženy v kultuře. Tyto namnožené populace mají typicky omezenou životnost, pokud jsou zpětně zavedeny infusí (Rosenberg a spol.: N. Engl. J. Med. 32, 570 až 578 (1990).).

Za příslušných podmínek by mohlo rozpoznávání HTV buňkami, které expresí poskytují CD4 chiméry, poskytovat mitogenní stimuly, což by umožnilo, že by vyzbrojená populace buněk dynamicky odpovídala na virové potíže. I když jsme se zde soustředili na chování fúzovaných proteinů v cytolytických T lymfocytech, exprese chimér v pomocných (helper) lymfocytech by mohla po skytnout HTV-mobilizovaný zdroj cytokinů, který by mohl působit proti kolapsu pomocných buněk při AIDS. Nedávný popis několika schémat resistence (genetickým inženýrstvím) proti infekci v jiných stupních, než·je pronikání viru (Friedman a spol.: Nátuře 335, 452 až 454 (1988); Green a spol.: Cell 58. 215 až 223 (1989); Malim a spol.: Cell 58, 205 až 214 (1989); Trono a spol.: Cell 59, 113 až 120 (1989); Buonocore a spol.: Nátuře 345, 625 až 628 (1990).), navrhuje, že by mohly být navrženy CD4 chiméry, které by mařily produkci viru expresí příslušných činidel, která mají intracelulámí místo působení.

Schopnost přenášet signály na T lymfocyty autonomními chimérami poskytuje také schopnost regulace retrovirově sestrojených lymfocytů in vivo. Zesíťování stimulů, zprostředkované například specifickými IgM protilátkami sestrojenými tak, aby odstranily domény vázající komplement, může umožnit, aby se zvýšil počet takových lymfocytů in šitu, zatímco působením podobných specifických IgG protilátek (například rozpoznávajících variaci aminokyselin vloženou do chimemího řetězce způsobem genetického inženýrství) by mohlo selektivně ochudit tuto sestrojenou populaci. A dále, anti/CD4 IgM protilátky nevyžadují další zesíťování pro mobilizaci vápníku v Jurkat buňkách expresujících CD4:zeta chiméry (data nejsou uvedena). Schopnost regulovat buněčné populace bez pomoci opakované mimotělní amplifikace může podstatně rozšířit rozsah a účinnost běžného použití navrhovaného pro T buňky připravené genetickým inženýrstvím.

Pro vytvoření jiných chimér sestávajících ze zeta, eta nebo gama intracelulámích sekvencí se mohou cDNA nebo genomové sekvence kódující extracelulámí doménu receptorů vybavit restrikčním místem zavedeným v místě právě předcházející zvolené transmembránové doméně. Fragment extracelulámí membrány končící v restrikčním místě se pak může spojit ze sekvencemi zeta, eta nebo gama. Typické extracelulámí domény mohou být odvozeny od receptorů, které rozpoznávají komplement, sacharidy, virové proteiny, bakterie, protozoické nebo metazoické parasity nebo proteiny jimi indukované. Podobně ligandy nebo receptory pocházející od exprese pathogeny nebo nádorovými buňkami, mohou být připojeny na sekvence zeta, eta nebo gama, aby řídily imunitní odpovědi proti buňkám nesoucím receptory rozpoznávající tyto ligandy.

I když je tento vynález popsán v souvislosti se specifickými uspořádáními, je tomu třeba rozumět tak, že jsou možné další modifikace. Tato přihláška je zamýšlena tak, že zahrnuje variace, použití nebo adaptace tohoto vynálezu a také takové odchylky od zde uvedeného popisu, o kterých je odborníkům zřejmé, že náleží k tomuto vynálezu a které mají podstatné rysy zde uvedené a spadají tedy do rozsahu připojených nároků.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Žadatelé: The Generál Hostital Corporation

-33CZ 281881 B6 (ii)Název vynálezu: Buňka poskytující expresí proteinovou membránou vázaný chimemí receptor, chimemí receptor, vektor, DNA a protilátka (iii) Počet sekvencí: 27 (iv) Korespondenční adresa:

(A) adresát: Fish and Richardson (B) ulice: 225 Franklin Street (C) město: Boston (D) stát: Ma.

(E) země: USA (F) poštovní směrovací číslo: 02110-2804 (v) Počítačová čtecí forma:

(A) typ média: disketa 3,5, 1,44 Mb (B) počítač: IBM PS/2 model 50Z nebo 55SX (C) operační systém: IBM P. C. DOS (verse 3.30) (D) počítačový program (software): Wordperfect (verse 5.0) (vi) Údaje o současné přihlášce:

(A) číslo přihlášky:

(B) datum podání:

(C) klasifikace:

(vii) Údaje o předchozí přihlášce:

(A) číslo přihlášky: 07/665,961 (B) datum podání: 7. března 1991 (C) klasifikace:

(viii) Informace o zástupci:

(A) Jméno: Clark Paul T.

(B) číslo registrace: 30,162 (C) odkaz/číslo spisu: 00786/119002 (ix) Informace o spojení:

(A) telefon: (617) 542-5070 (B) fax: (617) 542-8906 (C) telex: 200154 (2) Informace o sekvenci id. č. 1:

(i) Vlastnosti sekvence:

-34CZ 281881 B6 (A) délka: 1728 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: dvouvláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 1:

ATGAACCGGG GCTCCTCCCA GGGATACAGT TTCCACTGGA CTTCTTAACT GAAGCCTTTG ATAGAAGACT GGTGCAATTG TTCAGGGGCA CCCTCAGTGC GACCCTCTCC GCACTGTCTT GTGCTAGCTT ACAGGTGGAG GCAGTGGCGA TGGATCACCT CCAGGACCCT TGCCCCAGGC CTTGAAGCGA GAGAGCCACT CCTCCCCTAA GTCTCGAAGC GTGGCAGTGT TCAAGGTTCT TGCTACTTGC CCTGTACCTG TGCAGGACCC GAATATGACG CAAACAGCAG AGAAAGACAA AGGCGGAGAG AGCAGTGCAG GGACCCTTGG AGCCAATCCT GCCACCCAGT

GAGTCCCTTT GCAGCCACTC GGAACTGACC AAAACTCCAA AAAGGTCCAT GGACCAAGGA CAGATACTTA CTAGTGTTCG GAGCCTGACC AATGTAGGAG GTGTCTCAGC GCAGAACCAG TCCAGAAGGC TTCTCCTTCC GCTGTGGTGG TTGACCTGAA AAGCTCCAGA CTTGCCTCAG AAACAGGAAA CAGCTCCAGA GCTGATGCTG GGGAGAAGCC CTGCTGAGTG GCCCACATGG TAGATGGAAT AGAGCAAAAT CAACCAGCTC TCTTGGAGAA AGGAGGAGGA GATGCCAGAA GCAAGGGGCA TTCGGGAACA GTTAAGAGCC GTGCCAGCGT AGCAGCTCCC

TAGGCACTTG AGGGAAACAA TCTACAGCTT CCAGATAAAG CCAAGCTGAA AACTTCCCCC CATCTGTGAA GATTGACTGC CTGACCTTGG TCCAAGGGGT TGGAGCTCCA AAGAAGGTGG CTCCAGCATA CACTCGCCTT CAGGCGGAGA GAACAAGGAA TGGGCAAGAA TATGCTGGCT GTTGCATCAG AAAATTTGAC AGCTTGAAAC GGTGTGGGTG ACTCGGGACA TCCACCCCGG CCTCTTCATC TCAGCAGGAG TACAATGAGC GAAGCGGGCT ACCCCCAGGA GCCTACAGTG CGATGGCCTT GAAGAGAGAG CGCCCCAAAG CTTCAGCATC AGCTCTAA

CTTCTGGTGC AGTGGTGCTG .CCCAGAAGAA ATTCTGGGAA TGATCGCGCT TGATCATCAA GTGGAGGACC CAACTCTGAC AGAGCCCCCC AAAAACATAC GGATAGTGGC AGTTCAAAAT GTCTATAAGA TACAGTTGAA GGGCTTCCTC GTGTCTGTAA GCTCCCGCTC CTGGAAACCT GAAGTGAACC CTGTGAGGTG TGGAGAACAA CTGAACCCTG GGTCCTGCTG TGCACGCGGA TACGGAGTCA TGCAGAGACT TCAATCTAGG CGGGATCCAG AGGCGTATAC AGATCGGCAC TACCAGGACA AGAAGGTTCA GTGAAAGCAC CCCACTCTGT

TGCAACTGGC GGCAAAAAAG GAGCATACAA ATCAGGGCTC GACTCAAGAA GAATCTTAAG AGAAGGAGGA ACCCACCTGC TGGTAGTAGC AGGGGGGGAA ACCTGGACAT AGACATCGTG AAGAGGGGGA AAGCTGACGG CTCCAAGTCT AACGGGTTAC CACCTCACCC CACCCTGGCC TGGTGGTGAT TGGGGACCCA GGAGGCAAAG AGGCGGGGAT GAATCCAACA TCCCAAACTC TCATCACAGC GCTGCCAACC GCGAAGAGAG AGATGGGAGG AATGCACTGC AAAAGGCGAG GCCACTTCCA GAACTCACAA CCAGCAGAGT GGAGTCCATG

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700 1728 (2) Informace o sekvenci id. č. 2:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 1389 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina

-35CZ 281881 B6 (C) typ vlákna: dvouvláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (ix) popis sekvence: sekvence id. č. 2:

ATGAACCGGG	GAGTCCCTTT	TAGGCACTTG	CTTCTGGTGC	TGCAACTGGC	50
GCTCCTCCCA	GCAGCCACTC	AGGGAAACAA	AGTGGTGCTG	GGCAAAAAAG	100
GGGATACAGT	GGAACTGACC	TGTACAGCTT	CCCAGAAGAA	GAGCATACAA	150
TTCCACTGGA	AAAACTCCAA	CCAGATAAAG	ATTCTGGGAA	ATCAGGGCTC	200
CTTCTTAACT	AAAGGTCCAT	CCAAGCTGAA	TGATCGCGCT	GACTCAAGAA	250
GAAGCCTTTG	GGACCAAGGA	AACTTCCCCC	TGATCATCAA	GAATCTTAAG	300
ATAGAAGACT	CAGATACTTA	CATCTGTGAA	GTGGAGGACC	AGAAGGAGGA	350
GGTGCAATTG	CTAGTGTTCG	GATTGACTGC	CAACTCTGAC	ACCCACCTGC	400
TTCAGGGGCA	GAGCCTGACC	CTGACCTTGG	AGAGCCCCCC	TGGTAGTAGC	450
CCCTCAGTGC	AATGTAGGAG	TCCAAGGGGT	AAAAACATAC	AGGGGGGGAA	500
GACCCTCTCC	GTGTCTCAGC	TGGAGCTCCA	GGATAGTGGC	ACCTGGACAT	550
GCACTGTCTT	GCAGAACCAG	AAGAAGGTGG	AGTTCAAAAT	AGACATCGTG	600
GTGCTAGCTT	TCCAGAAGGC	CTCCAGCATA	GTCTATAAGA	AAGAGGGGGA	650
ACAGGTGGAG	TTCTCCTTCC	CACTCGCCTT	TACAGTTGAA	AAGCTGACGG	700
GCAGTGGCGA	GCTGTGGTGG	CAGGCGGAGA	GGGCTTCCTC	CTCCAAGTCT	750
TGGATCACCT	TTGACCTGAA	GAACAAGGAA	GTGTCTGTAA	AACGGGTTAC	800
CCAGGACCCT	AAGCTCCAGA	TGGGCAAGAA	GCTCCCGCTC	CACCTCACCC	850
TGCCCCAGGC	CTTGCCTCAG	TATGCTGGCT	CTGGAAACCT	CACCCTGGCC	900
CTTGAAGCGA	AAACAGGAAA	GTTGCATCAG	GAAGTGAACC	TGGTGGTGAT	950
GAGAGCCACT	CAGCTCCAGA	AAAATTTGAC	CTGTGAGGTG	TGGGGACCCA	1000
CCTCCCCTAA	GCTGATGCTG	AGCTTGAAAC	TGGAGAACAA	GGAGGCAAAG	1050
GTCTCGAAGC	GGGAGAAGCC	GGTGTGGGTG	CTGAACCCTG	AGGCGGGGAT	1100
GTGGCAGTGT	CTGCTGAGTG·	ACTCGGGACA	GGTCCTGCTG	GAATCCAACA	1150
TCAAGGTTCT	GCCCACATGG	TCCACCCCGG	TGCACGCGGA	TCCGCAGCTC	1200
TGCTATATCC	TGGATGCCAT	CCTGTTTTTG	TATGGTATTG	TCCTTACCCT	1250
GCTCTACTGT	CGACTCAAGA	TCCAGGTCCG	AAAGGCAGAC	ATAGCCAGCC	1300
GTGAGAAATC	AGATGCTGTC	TACACGGGCC	TGAACACCCG	GAACCAGGAG	1350
ACATATGAGA	CTCTGAAACA	TGAGAAACCA	CCCCAATAG		1389

(2) Informace o sekvenci id. č. 3:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 1599 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: dvouvláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 3:

-36CZ 281881 B6

ATGAACCGGG GCTCCTCCCA GGGATACAGT TTCCACTGGA CTTCTTAACT GAAGCCTTTG ATAGAAGACT GGTGCAATTG TTCAGGGGCA CCCTCAGTGC GACCCTCTCC GCACTGTCTT GTGCTAGCTT ACAGGTGGAG GCAGTGGCGA TGGATCACCT CCAGGACCCT TGCCCCAGGC CTTGAAGCGA GAGAGCCACT CCTCCCCTAA GTCTCGAAGC GTGGCAGTGT TCAAGGTTCT TGCTACCTGC CTTGTTCCTG AGCAGGGCCA GAGTACGATG AAAGCCGAGA AAGATAAGAT CGGAGGGGCA CAAGGACACC

GAGTCCCTTT GCAGCCACTC GGAACTGACC AAAACTCCAA AAAGGTCCAT GGACCAAGGA CAGATACTTA CTAGTGTTCG GAGCCTGACC AATGTAGGAG GTGTCTCAGC GCAGAACCAG TCCAGAAGGC TTCTCCTTCC GCTGTGGTGG TTGACCTGAA AAGCTCCAGA CTTGCCTCAG AAACAGGAAA CAGCTCCAGA GCTGATGCTG GGGAGAAGCC CTGCTGAGTG GCCCACATGG TGGATGGAAT AGAGTGAAGT GAACCAGCTC TTTTGGACAA AGGAAGAACC GGCGGAGGCC AGGGGCACGA TACGACGCCC

TAGGCACTTG AGGGAAACAA TGTACAGCTT CCAGATAAAG CCAAGCTGAA AACTTCCCCC CATCTGTGAA GATTGACTGC CTGACCTTGG TCCAAGGGGT TGGAGCTCCA AAGAAGGTGG CTCCAGCATA CACTCGCCTT CAGGCGGAGA GAACAAGGAA TGGGCAAGAA TATGCTGGCT GTTGCATCAG AAAATTTGAC AGCTTGAAAC GGTGTGGGTG ACTCGGGACA TCCACCCCGG CCTCTTČATC TCAGCAGGAG TATAACGAGC GAGACGTGGC CTCAGGAAGG TACAGTGAGA TGGCCTTTAC TTCACATGCA

CTTCTGGTGC AGTGGTGCTG CCCAGAAGAA ATTCTGGGAA TGATCGCGCT TGATCATCAA GTGGAGGACC CAACTCTGAC AGAGCCCCCC AAAAACATAC GGATAGTGGC AGTTCAAAAT GTCTATAAGA TACAGTTGAA GGGCTTCCTC GTGTCTGTAA GCTCCCGCTC CTGGAAACCT GAAGTGAACC CTGTGAGGTG TGGAGAACAA CTGAACCCTG GGTCCTGCTG TGCACGCGGA TATGGTGTCA CGCAGAGCCC TCAATCTAGG CGGGACCCTG CCTGTACAAT TTGGGATGAA CAGGGTCTCA GGCCCTGCCC

TGCAACTGGC GGCAAAAAAG GAGCATACAA ATCAGGGCTC GACTCAAGAA GAATCTTAAG AGAAGGAGGA ACCCACCTGC TGGTAGTAGC AGGGGGGGAA ACCTGGACAT AGACATCGTG AAGAGGGGGA AAGCTGACGG CTCCAAGTCT AACGGGTTAC CACCTCACCC CACCCTGGCC TGGTGGTGAT TGGGGACCCA GGAGGCAAAG AGGCGGGGAT GAATCCAACA TCCCAAACTC TTCTCACTGC CCCGCGTACC ACGAAGAGAG AGATGGGGGG GAACTGCAGA AGGCGAGCGC GTACAGCCAC CCTCGCTAA

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1599 (2) Informace o sekvenci id. č. 4:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 575 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (ix) popis sekvence: sekvence id. č. 4:

Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gin Leu 15 10 15

Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gin Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys

25 30

-37CZ 281881 B6

Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gin Lys Lys Ser 35 4045

Ile Gin Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gin Ile Lys Ile Leu Gly Asn 50 5560

Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 7580

Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile 85 9095

Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu 100 105110

Asp Gin Lys Glu Glu Val Gin Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120125

Ser Asp Thr His Leu Leu Gin Gly Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135140

Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gin Cys Arg Ser Pro Arg Gly 145 150 155160

Lys Asn Ile Gin Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gin Leu Glu Leu 165 170175

Gin Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gin Asn Gin Lys Lys 180 185190

Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gin Lys Ala Ser 195 200205

Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gin Val Glu Phe Ser Phe Pro 210 215220

Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 225 230 235240

Gin Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu 245 250255

Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gin Asp Pro Lys Leu 260 265270

Gin Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gin Ala Leu 275 280285

Pro Gin Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 290 295300

Thr Gly Lys Leu His Gin Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg AlaThr

305 310 315320

Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr SerPro

325 330335

Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser 340 345350

Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp 355 360365

Gin Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gin Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile 370 375380

Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro LysLeu

385 390 395400

Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile IleThr

405 410415

Ala Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala

420 425430

-38CZ 281881 B6

Asn Leu Gin Asp Pro Asn Glu Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 435 440445

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu 450 455460

Met Gly Gly Lys Gin Gin Arg Arg Arg Asn Pro Gin Glu Gly ValTyr

465 470 475480

Asn Ala Leu Gin Lys Asp Lys Met Pro Glu Ala Tyr Ser Glu IleGly

485 490495

Thr Lys Gly Gly Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gin 500 505510

Asp Ser His Phe Gin Ala Val Gin Phe Gly Asn Arg Arg Glu Arg Glu 515 520525

Gly Ser Glu Leu Thr Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ala Arg Pro Lys Gly 530 535540

Glu Ser Thr Gin Gin Ser Ser Gin Ser Cys Ala Ser Val Phe Ser Ile 545 550 555560

Pro Thr Leu Trp Ser Pro Trp Pro Pro Ser Ser Ser Ser Gin Leu

565 570575 (2) Informace o sekvenci id. č. 5:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 462 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (ix) popis sekvence: sekvence id. č. 5:

MetAsn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gin Leu 5 1015

Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gin Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys 20 2530

Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gin Lys Lys Ser 35 4045

Ile Gin Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gin Ile Lys Ile Leu Gly Asn 50 5560

Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala

70 75· 80

Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile 85 9095

Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu 100 105110

Asp Gin Lys Glu Glu Val Gin Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120125

-39CZ 281881 B6

Ser Asp Thr His Leu 130

Ser Pro Pro Gly Ser

145

Lys Asn Ile Gin Gly

165

Gin Asp Ser Gly Thr 180

Val Glu Phe Lys Ile 195

Ser Ile Val Tyr Lys 210

Leu Ala Phe Thr Val 225

Gin Ala Glu Arg Ala

245

Lys Asn Lys Glu Val 260

Gin Met Gly Lys Lys 275

Pro Gin Tyr Ala Gly 290

Thr Gly Lys Leu His

305

Gin Leu Gin Lys Asn

325 Lys Leu Met Leu Ser 340

Lys Arg Glu Lys Pro 355

Gin Cys Leu Leu Ser 370

Lys Val Leu Pro Thr 385

Cys Tyr Ile Leu Asp

405 Leu Leu Tyr Cys Arg 420

Ser Arg Glu Lys Ser

435

Gin Glu Thr Tyr Glu

450

Leu Gin Gly Gin Ser Leu 135

Ser Pro Ser Val Gin Cys

150 155

Gly Lys Thr Leu Ser Val 170

Trp Thr Cys Thr Val Leu 185

Asp Ile Val Val Leu Ala 200

Lys Glu Gly Glu Gin Val

215

Glu Lys Leu Thr Gly Ser 230 235

Ser Ser Ser Lys Ser Trp 250

Ser Val Lys Arg Val Thr 265

Leu Pro Leu His Leu Thr

280

Ser Gly Asn Leu Thr Leu 295

Gin Glu Val Asn Leu Val

310 315

Leu Thr Cys Glu Val Trp 330

Leu Lys Leu Glu Asn Lys

345

Val Trp Val Leu Asn Pro 360

Asp Ser Gly Gin Val Leu 375

Trp Ser Thr Pro Val His 390 395

Ala Ile Leu Phe Leu Tyr 410

Leu Lys Ile Gin Val Arg

425

Asp Ala Val Tyr Thr Gly

440

Thr Leu Lys His Glu Lys 455

Thr Leu Thr Leu Glu

140

Arg Ser Pro Arg Gly

160

Ser Gin Leu Glu Leu

175

Gin Asn Gin Lys Lys 190

Phe Gin Lys Ala Ser 205

Glu Phe Ser Phe Pro

220

Gly Glu Leu Trp Trp

240

Ile Trp Phe Asp Leu

255

Gin Asp Pro Lys Leu 270

Leu Pro Gin Ala Leu

285

Ala Leu Glu Ala Lys 300

Val Met Arg Ala Thr

320

Gly Pro Thr Ser Pro

335

Glu Ala Lys Val Ser 350

Glu Ala Gly Met Trp 365

Leu Glu Ser Asn Ile

380

Ala Asp Pro Gin Leu

400

Gly Ile Val Leu Thr

415

Lys Ala Asp Ile Ala 430

Leu Asn Thr Arg Asn 445

Pro Pro Gin

460 462 (2) Informace o sekvenci id. č. 6:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 532 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární

-40CZ 281881 B6 (ii) typ molekuly: protein (ix) popis sekvence: sekvence id. č. 6:

Met Asn Arg Gly Val

5

Ala Leu Leu Pro Ala 20

Lys Gly Asp Thr Val 35

Ile Gin Phe His Trp 50

Gin Gly Ser Phe Leu 65

Asp Ser Arg Arg Ser 85 Lys Asn Leu Lys Ile 100 Asp Gin Lys Glu Glu 115

Ser Asp Thr His Leu 130

Ser Pro Pro Gly Ser 145

Lys Asn Ile Gin Gly 165 Gin Asp Ser Gly Thr 180

Val Glu Phe Lys Ile

195

Ser Ile Val Tyr Lys 210

Leu Ala Phe Thr Val 225

Gin Ala Glu Arg Ala 245

Lys Asn Lys Glu Val 260

Gin Met Gly Lys Lys

275

Pro Gin Tyr Ala Gly 290

Thr Gly Lys Leu His 305

Gin Leu Gin Lys Asn 325 Lys Leu Met Leu Ser 340

Pro Phe Arg His Leu Leu 10

Ala Thr Gin Gly Asn Lys 25

Glu Leu Thr Cys Thr Ala 40

Lys Asn Ser Asn Gin Ile 55

Thr Lys Gly Pro Ser Lys

75

Leu Trp Asp Gin Gly Asn 90

Glu Asp Ser Asp Thr Tyr

105

Val Gin Leu Leu Val Phe

120

Leu Gin Gly Gin Ser Leu 135

Ser Pro Ser Val Gin Cys 150 155

Gly Lys Thr Leu Ser Val 170

Trp Thr Cys Thr Val Leu 185

Asp Ile Val Val Leu Ala

200

Lys Glu Gly Glu Gin Val

215

Glu Lys Leu Thr Gly Ser

230 235

Ser Ser Ser Lys Ser Trp 250

Ser Val Lys Arg Val Thr

265

Leu Pro Leu His Leu Thr

280

Ser Gly Asn Leu Thr Leu 295

Gin Glu Val Asn Leu Val

310 315

Leu Thr Cys Glu Val Trp 330

Leu Lys Leu Glu Asn Lys

345

Leu Val Leu Gin Leu

Val Val Leu Gly Lys 30

Ser Gin Lys Lys Ser 45

Lys Ile Leu Gly Asn 60

Leu Asn Asp Arg Ala

Phe Pro Leu Ile Ile

Ile Cys Glu Val Glu

110

Gly Leu Thr Ala Asn

125

Thr Leu Thr Leu Glu 140

Arg Ser Pro Arg Gly

160

Ser Gin Leu Glu Leu

175

Gin Asn Gin Lys Lys 190

Phe Gin Lys Ala Ser 205

Glu Phe Ser Phe Pro

220

Gly Glu Leu Trp Trp

240

Ile Thr Phe Asp Leu

255

Gin Asp Pro Lys Leu

270

Leu Pro Gin Ala Leu

285

Ala Leu Glu Ala Lys

300

Val Met Arg Ala Thr

320

Gly Pro Thr Ser Pro

335

Glu Ala Lys Val Ser

350

-41 CZ 281881 B6

Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp

355 360365

Gin Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gin Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile

370 375380

Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro LysLeu

385 390 395400

Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile LeuThr

405 410415

Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala

420 425430

Tyr Gin Gin Gly Gin Asn Gin Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

435 440 ·445

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Glu Arg Asp Pro Glu

450 455460

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gin Glu Gly Leu TyrAsn

465 470 475480

Glu Leu Gin Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile GlyMet

485 490495

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gin Gly

500 505510

Leu Ser Thr Ala The Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gin Ala

515 520525

Leu Pro Pro Arg

530 (2) Informace o sekvenci id. č. 7:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 33 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 7:

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC (2) Informace o sekvenci id. č. 8:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 50 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 8:

-42CZ 281881 B6

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA (2) Informace o sekvenci id. č. 9:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 33 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 9:

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC 33 (2) Informace o sekvenci id. č. 10 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 33 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 10:

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33 (2) Informace o sekvenci id. č. 11:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 15 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 11:

CGCGGGCGGC CGCTA 15 (2) Informace o sekvenci id. č. 12:

(i) Vlastnosti sekvence:

-43 CZ 281881 B6 (A) délka: 42 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 12:

CGCGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG 42 (2) Informace o sekvenci id. č. 13:

(1) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 48 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 13:

CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCCG (2) Informace o sekvenci id. č. 14 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 33 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 14:

CGCGGGGCGG CCACGCGTCC TCGCCAGCAC ACA 33 (2) Informace o sekvenci id. č. 15:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 36 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární

-44CZ 281881 B6 (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 15:

CGCGGGACGC GTTTCAGCCG TCCCTCGCCAG CACACA (2) Informace o sekvenci id. č. 16:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 33 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 16:

CGCGGGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG (2) Informace o sekvenci id. č. 17:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 33 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 17:

CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC (2) Informace o sekvenci id. č. 18:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 26 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 18:

CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT

-45CZ 281881 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 19:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 42 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence:· sekvence id. č. 19:

CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT (2) Informace o sekvenci id. č. 20:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 30 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 20:

GCGGGGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG (2) Informace o sekvenci id. č. 21:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 32 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 21:

GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC (2) Informace o sekvenci id. č. 22:

(i) Vlastnosti sekvence:

-46CZ 281881 B6 (A) délka: 31 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 22:

TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A (2) Informace o sekvenci id. č. 23:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 31 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 23:

TTGTTGGTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A 31 (2) Informace o sekvenci id. č. 24:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 171 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: aminokyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 24:

Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu 5 1015

Ser Gin Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg 20 2530

Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val 35 4045

Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile 50 5560

Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys 65 70 7580

Asp Lys Glu Ser Thr Val Gin Val His Tyr Arg Met Cys Gin Ser Cys 85 9095

-47CZ 281881 B6

Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val 100 105110

Ala Ile Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His 115 120125

Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gin Ala Leu Leu Arg 130 135140

Asn Asp Gin Val Tyr Gin Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gin Tyr 145 150 155160

Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys

165170 (2) Informace o sekvenci id. č. 25:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 182 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: aminokyselina (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 25:

Met

Glu

Gin

Gly

Lys

Gly

Leu

Ala Val

Leu

Ile

Leu

Ala Ile

Ile

Leu

5

10

15

Leu

Gin

Gly

Thr

Leu

Ala

Gin

Ser Ile

Lys

Gly

Asn

His Leu

Val

Lys

20

25

30

Val

Tyr

Asp

Tyr

Gin

Glu

Asp

Gly Ser

Val

Leu

Leu

Thr Cys

Asp

Ala

35

40

45

Glu

Ala

Lys

Asn

Ile

Thr

Trp

Phe Lys

Asp

Gly

Lys

Met Ile

Gly

Phe

50

55

60

Leu

Thr

Glu

Asp

Lys

Lys

Lys

Trp Asn

Leu

Gly

Ser

Asn Ala

Lys

Asp

65

70

75

80

Pro

Arg

Gly

Met

Tyr

Gin

Cys

Lys Gly

Ser

Gin

Asn

Lys Ser

Lys

Pro

85

90

95

Leu

Gin

Val

Tyr

Tyr

Arg

Met

Cys Gin

Asn

Cys

Ile

Glu Leu

Asn

Ala

100

105

1

10

Ala

Thr

Ile

Ser

Gly

Phe

Leu

Phe Ala

Glu

Ile

Val

Ser Ile

Phe

Val

115

120

125

Leu

Ala

Val

Gly

Val

Tyr

Phe

Ile Ala

Gly

Gin

Asp

Gly Val

Arg

Gin

130

.135

140

Ser

Arg

Ala

Ser

Asp

Lys

Gin

Thr Leu

Leu

Pro

Asn

Asp Gin

Leu

Tyr

145

150

155

160

Gin

Pro

Leu

Lys

Asp

Arg

Glu

Asp Asp

Gin

Tyr

Ser

His Leu

Gin

Gly

165 170 175

Asn Gin Leu Arg Arg Asn

180

-48CZ 281881 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 26:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 220 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: aminokyselina (ix) popis sekvence: sekvence id. č. 26:

Met Pro Gly Gly Leu Gin Ala Leu Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Phe 5 1015

Leu Ser Tyr Ala Cys Leu Gly Pro Gly Cys Gin Ala Leu Arg Val Glu 20 2530

Gly Gly Pro Pro Ser Leu Thr Val Asn Leu Gly Glu Glu Ala Arg Leu 35 4045

Thr Cys Glu Asn Asn Gly Arg Asn Pro

55

Leu Gin Ser Asn lín Thr Trp Pro 65 70

Gly Thr Thr Gly Gin Leu Phe Phe

Ala Cys Thr Gly Cys Gin Val Ile

100

Asn Ile Thr Trp Trp Phe Ser 60

Pro Val Pro Leu Gly Pro Gly Gin

7580

Pro Glu Val Asn Lys Asn Thr Gly 9095

Glu Asn Asn Ile Leu Lys Arg Ser 105110

Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Asn Pro Val Pro Arg Pro Phe Leu 115 120125

Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile 130 135140

Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu PheArg

145 150 155160

Lys Arg Trp Gin Asn Glu Lys Phe Gly Val Asp Met Pro Asp AspTyr

165 170175

Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met 180 185190

Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Glu Gly Thr Tyr Gin Asp Val Gly 195 200205

Asn Leu His Ile Gly Asp Ala Gin Leu Glu Lys Pro

210 215220 (2) Informace o sekvenci id. č. 27:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 228 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární

(ii) typ molekuly: aminokyselina (ix) popis sekvence: sekvence id. č. 27:

Met Ala Thr Leu Val Leu Ser Ser Met Pro Cys His Trp Leu Leu Phe 5 1015

Leu Leu Leu Leu Phe Ser Gly Glu Pro Val Pro Ala Met Thr Ser Ser 20 2530

Asp Leu Pro Leu Asn Phe Gin Gly Ser Pro Cys Ser Gin Ile Trp Gin 35 4045

His Pro Arg Phe Ala Ala Lys Lys Arg Ser Ser Met Val Lys Phe His 50 5560

Cys Tyr Thr Asn His Ser Gly Ala Leu Thr Trp Phe Arg Lys Arg Gly

70 7580

Ser Gin Gin Pro Gin Glu Leu Val Ser Glu Glu Gly Arg Ile Val Gin

9095

Thr Gin Asn Gly Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ile Gin Asn Ile Gin Tyr 100 105110

Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Lys Gin Lys Cys Asp Ser Ala Asn 115 120125

His Asn Val Thr Asp Ser Cys Gly Thr Glu Leu Leu Val Leu Gly Phe 130 135140

Ser Thr Leu Asp Gin Leu Lys Arg Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly Ile

145 150 155160

Ile Leu Ile Gin Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val Pro Ile

165 170175

Phe Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Gly Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp 180 185190

His Thr Tyr Glu Gly Leu Asn Ile Asp Gin Thr Ala Thr Tyr Glu Asp 195 200205

Ile Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His 210 215220

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Buňka poskytující expresí proteinovou membránou vázaný chimemí receptor, který obsahuje

   a) extracelulámí část schopnou specificky rozpoznávat a vázat infekční činidlo, buňku infikovanou infekčním činidlem, nádorovou nebo rakovinnou buňku nebo autoimunně enerovanou buňku, a

   b) intracelulámí nebo transmembránovou část odvozenou od T buněčného receptoru zeta, eta, CD3 delta, nebo T3 gama proteinu, Fc receptoru gama proteinu, nebo B buněčného receptoru

   -50CZ 281881 B6 mbl nebo B29 proteinu, která je schopná signalizovat buňce, aby ničila činidlo nebo buňku navázané na receptor, přičemž uvedená buňka je vybrána ze skupiny zahrnující T nebo B lymfocyty, cytotoxické T lymfocyty, přírodní umrtvující buňky, neutrofily, granulocyty, makrofágy, stěžňové buňky, HeLa buňky a embryové kmenové (ES) buňky.
2. 2. Buňka podle nároku 1 obsahující navázání nezávislé na MHC.
3. 3. Buňka podle nároků 1 a 2 s chimemím receptorem obsahujícím

   a) aminokyseliny 421 a 532 sekvence id. č. 6:

   Met 1 Asn Arg Gly Val 5 Pro Phe Arg His Leu 10 Leu Leu Val Leu Gin 15 Leu Ala Leu Leu Pro 20 Ala Ala Thr Gin Gly 25 Asn Lys Val Val Leu 30 Gly Lys Lys Gly Asp 35 Thr Val Glu Leu Thr 40 Cys Thr Ala Ser Gin 45 Lys Lys Ser Ile Gin 50 Phe His Trp Lys Asn 55 Ser Asn Gin Ile Lys 60 Ile Leu Gly Asn Gin 65 Gly Ser Phe Leu Thr 70 Lys Gly Pro Ser Lys 75 Leu Asn Asp Arg Ala 80 Asp Ser Arg Arg Ser 85 Leu Trp Asp Gin Gly 90 Asn Phe Pro Leu Ile 95 Ile Lys Asn Leu Lys 100 Ile Glu Asp Ser Asp 105 Thr Tyr Ile Cys Glu 110 Val Glu Asp Gin Lys 115 Glu Glu Val Gin Leu 120 Leu Val Phe Gly Leu 125 Thr Ala Asn Ser Asp 130 Thr His Leu Leu Gin 135 Gly Gin Ser Leu Thr 140 Leu Thr Leu Glu Ser 145 Pro Pro Gly Ser Ser 150 Pro Ser Val Gin Cys 155 Arg Ser Pro Arg Gly 160 Lys Asn Ile Gin Gly 165 Gly Lys Thr Leu Ser 170 Val Ser Gin Leu Glu 175 Leu Gin Asp Ser Gly 180 Thr Trp Thr Cys Thr 185 Val Leu Gin Asn Gin 190 Lys Lys Val Glu Phe 195 Lys Ile Asp Ile Val 200 Val Leu Ala Phe Gin 205 Lys Ala Ser Ser Ile 210 Val Tyr Lys Lys Glu 215 Gly Glu Gin Val Glu 220 Phe Ser Phe Pro Leu 225 Ala Phe Thr Val Glu 230 Lys Leu Thr Gly Ser 235 Gly Glu Leu Trp Trp 240 Gin Ala Glu Arg Ala 245 Ser Ser Ser Lys Ser 250 Trp Ile Thr Phe Asp 255 Leu Lys Asn Lys Glu 260 Val Ser Val Lys Arg 265 Val Thr Gin Asp Pro 270 Lys Leu Gin Met Gly 275 •Lys Lys Leu Pro Leu 280 His Leu Thr Leu Pro 285 Gin Ala Leu

   -51 CZ 281881 B6

   Pro Gin 290 Tyr Ala Gly Ser Gly 295 Asn Leu Thr Leu Ala 300 Leu Glu Ala Lys Thr Gly Lys Leu His Gin Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr 305 310 315 320 Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335 Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser 340 345 350 Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp 355 360 365 Gin Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gin Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile 370 375 380 Lys Val Leu Pro Thr Trp Sér Thr Pro Val His Ala Asp Pro Lys Leu 385 390 395 400 Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr 405 410 415 Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala 420 425 430 Tyr Gin Gin Gly Gin Asn Gin Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 435 440 445 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Glu Arg Asp Pro Glu 450 455 460 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gin Glu Gly Leu Tyr Asn 465 470 475 480 Glu Leu Gin Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 485 490 495 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gin Gly 500 505 510 Leu Ser Thr Ala The Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gin Ala 515 520 525 Leu Pro Pro Arg

   530

   b) aminokyseliny 423 až 455, 438 až 455, 461 až 494 nebo 494 až 528 shora uvedené sekvence id. č. 6,

   c) aminokyseliny 400 až 420 shora uvedené sekvence id. č. 6,

   d) aminokyseliny 421 až 575 sekvence id. č. 4:

   Met 1 Asn Arg Gly Val 5 Pro Phe Arg His Leu 10 Leu Leu Val Leu Gin 15 Leu Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gin Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gin Lys Lys Ser 35 40 45 Ile Gin Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gin Ile Lys Ile Leu Gly Asn 50 55 60 Gin Gly Ser Phe Leu •Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80

   -52CZ 281881 B6

   Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile 85 90 95 Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu 100 105 110 5 Asp Gin Lys Glu Glu Val Gin Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125 Ser Asp Thr His Leu Leu Gin Gly Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140 Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gin Cys Arg Ser Pro Arg Gly ίο 145 150 155 160 Lys Asn Ile Gin Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gin Leu Glu Leu 165 170 175 Gin Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gin Asn Gin Lys Lys 180 185 190 15 Val Glu Phe Lys Ile. Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gin Lys Ala Ser 195 200 205 Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gin Val Glu Phe Ser Phe Pro 210 215 220 Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 20 225 230 235 240 Gin Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu 245 250 255 Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gin Asp Pro Lys Leu 260 265 270 25 Gin Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gin Ala Leu 275 280 285 Pro Gin Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 290 295 300 Thr Gly Lys Leu His Gin Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr 30 • 305 310 315 320 Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335 Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser 340 345 350 35 Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp 355 360 365 Gin Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gin Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile 370 375 380 40 Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Lys Leu 385 390 395 400 Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Ile Thr 405 410 415 Ala Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala 45 420 425 430 Asn Leu Gin Asp Pro Asn Glu Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 435 440 445 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu 450 455- 460 50 Met Gly Gly Lys Gin Gin Arg Arg Arg Asn Pro Gin Glu Gly Val Tyr 465 - 470 475 480

   -53CZ 281881 B6

   Asn Ala Leu Gin Lys 485 Asp Lys Met Pro Glu 490 Ala Tyr Ser Glu Ile 495 Gly Thr Lys Gly Gly Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gin 500 505 510 Asp Ser His Phe Gin Ala Val Gin Phe Gly Asn Arg Arg Glu Arg Glu 515 520 525 Gly Ser Glu Leu Thr Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ala Arg Pro Lys Gly 530 535 540 Glu Ser Thr Gin Gin Ser Ser Gin Ser Cys Ala Ser Val Phe Ser Ile 545 550 555 560 Pro Thr Leu Trp Ser Pro Trp Pro Pro Ser Ser Ser Ser Gin Leu 565 570 575

   e) aminokyseliny 423 až 455, 438 až 455, 461 až 494 nebo 494 až 528 shora uvedené sekvence id. č. 4,

   f) aminokyseliny 400 až 420 shora uvedené sekvence id. č. 4,

   g) aminokyseliny 421 až 462 sekvence id. Č. 5:

   Met Asn Arg Gly Val 5 Pro Phe Arg His Leu 10 Leu Leu Val Leu Gin 15 Leu Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gin Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gin Lys Lys Ser 35 40 45 Ile Gin Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gin Ile Lys Ile Leu Gly Asn 50 55 60 Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile 85 90 95 Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu 100 105 110 Asp Gin Lys Glu Glu Val Gin Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser 115 120 125 Asp Thr His Leu Leu Gin Gly Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser 145 130 135 140 Pro Pro Gly Ser Ser 150 Pro Ser Val Gin Cys 155 Arg Ser Pro Arg Gly 160 Lys Asn Ile Gin Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gin Leu Glu Leu Gin 165 170 175 Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gin Asn Gin Lys Lys Val 180 185 190 Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gin Lys Ala Ser Ser Ile 195 200 205 Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gin Val Glu Phe Ser Phe Pro 210 215 220 Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp

   -54CZ 281881 B6

   225 230 235 240 Gin Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Trp Phe Asp Leu 245 250 255 Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gin Asp Pro Lys Leu 260 265 270 Gin Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gin Ala Leu 275 280 285 Pro Gin Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 290 295 300 Thr Gly Lys Leu His Gin Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr 305 310 315 320 Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335 Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser 340 345 350 Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp 355 360 365 Gin Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gin Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile 370 375 380 Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Gin Leu 385 390 395 400 Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr 405 410 415 Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile Gin Val Arg Lys Ala Asp Ile Ala 420 425 430 Ser Arg Glu Lys Ser Asp Ala Val Tyr Thr Gly Leu Asn Thr Arg Asn 435 440 445 Gin Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gin 450 455 460 462

   h) aminokyseliny 402 až 419 shora uvedené sekvence id. č. 5,

   i) aminokyseliny Tyr282 až Tyr298 včetně, jak je uvedeno na obrázku 15 A,

   j) aminokyseliny 132 až 171 sekvence id. č. 24:

   Met Glu His Ser Thr 5 Phe Leu Ser Gly Leu 10 Val Leu Ala Thr Leu 15 Leu Ser Gin Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg 20 25 30 Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val 35 40 45 Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile 50 55 60 Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Lys Glu Ser Thr Val Gin Val His Tyr Arg- Met Cys Gin Ser Cys 85 90 95 Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val 100 105 110

   -55CZ 281881 B6

   Ala Ile Thr 115 Leu Leu Leu Ala Leu 120 Gly Val Phe Cys Phe 125 Ala Gly His Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gin Ala Leu Leu Arg 130 135 140 Asn Asp Gin Val Tyr Gin Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gin Tyr 145 150 155 160 Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys

   165 170

   k) aminokyseliny 140 až 182 sekvence id. č. 25:

   Met . Glu Gin Gly Lys 5 Gly Leu Ala Val Leu 10 Ile Leu Ala Ile Ile 15 Leu Leu Gin Gly Thr 20 Leu Ala Gin Ser Ile 25 Lys Gly Asn His Leu 30 Val Lys Val Tyr Asp 35 Tyr Gin Glu Asp Gly 40 Ser Val Leu Leu Thr 45 Cys Asp Ala Glu Ala 50 Lys Asn Ile Thr Trp 55 Phe Lys Asp Gly Lys 60 Met Ile Gly Phe Leu 65 Thr Glu Asp Lys Lys 70 Lys Trp Asn Leu Gly 75 Ser Asn Ala Lys Asp 80 Pro Arg Gly Met Tyr 85 Gin Cys Lys Gly Ser 90 Gin Asn Lys Ser Lys 95 Pro Leu Gin Val Tyr 100 Tyr Arg Met Cys Gin 105 Asn Cys Ile Glu Leu 110 Asn Ala Ala Thr Ile 115 Ser Gly Phe Leu Phe 120 Ala Glu Ile Val Ser 125 Ile Phe Val Leu Ala 130 Val Gly Val Tyr Phe 135 Ile Ala Gly Gin Asp 140 Gly Val Arg Gin Ser 145 Arg Ala Ser Asp Lys 150 Gin Thr Leu Leu Pro 155 Asn Asp Gin Leu Tyr 160 Gin Pro Leu Lys Asp 165 Arg Glu Asp Asp Gin 170 Tyr Ser His Leu Gin 175 Gly

   Asn Gin Leu Arg Arg Asn

   180

   1) aminokyseliny 162 až 220 sekvence id. č. 26:

   Met Pro Gly Gly Leu 5 Gin Ala Leu Arg Ala 10 Leu Pro Leu Leu Leu 15 Phe Leu Ser Tyr Ala 20 Cys Leu Gly Pro Gly 25 Cys Gin Ala Leu Arg 30 Val Glu Gly Gly Pro 35 Pro Ser Leu Thr Val 40 Asn Leu Gly Glu Glu 45 Ala Arg Leu Thr Cys 50 Glu Asn Asn Gly Arg 55 Asn Pro Asn Ile Thr 60 Trp Trp Phe Ser Leu 65 Gin Ser Asn Iln Thr 70 Trp Pro Pro Val Pro 75 Leu Gly Pro Gly Gin 80

   -56CZ 281881 B6

   Gly Ala Thr Cys Thr Thr Gly Gly 100 Gin 85 Cys Leu Gin Phe Val Phe Ile Pro Glu 105 Glu 90 Asn Val Asn Asn Ile Lys Leu Asn Lys HO Thr 95 Arg Gly Ser 5 Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Asn Pro Val Pro Arg Pro Phe Leu 115 120 125 Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile 130 135 140 Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg 10 145 150 155 160 Lys Arg Trp Gin Asn Glu Lys Phe Gly Val Asp Met Pro Asp Asp Tyr 165 170 175 Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met 180 185 190 15 Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Glu Gly Thr Tyr Gin Asp Val Gly 195 200 205 Asn Leu His Ile Gly Asp Ala Gin Leu Glu Lys Pro 210 215 220 20 m) aminokyseliny 183 až 228 sekvence id. č. 27: Met Ala Thr Leu Val Leu Ser Ser Met Pro Cys His Trp Leu Leu Phe 5 10 15 25 Leu Leu Leu Leu Phe Ser Gly Glu Pro Val Pro Ala Met Thr Ser Ser 20 25 30 Asp Leu Pro Leu Asn Phe Gin Gly Ser Pro Cys Ser Gin Ile Trp Gin 35 40 45 His Pro Arg Phe Ala Ala Lys Lys Arg Ser Ser Met Val Lys Phe His 30 50 55 60 Cys Tyr Thr Asn His Ser Gly Ala Leu Thr Trp Phe Arg Lys Arg Gly 65 70 75 80 — ... . • —· Ser Gin Gin Pro Gin Glu Leu Val Ser Glu Glu Gly Arg Ile Val Gin 35 85 90 95 Thr Gin Asn Gly Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ile Gin Asn Ile Gin Tyr 100 105 110 Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Lys Gin Lys Cys Asp Ser Ala Asn 115 120 125 40 His Asn Val Thr Asp Ser Cys Gly Thr Glu Leu Leu Val Leu Gly Phe 130 135 140 Ser Thr Leu Asp Gin Leu Lys Arg Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly Ile 145 150 155 160 Ile Leu Ile Gin Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val Pro Ile 45 165 170 175 Phe Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Gly Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp 180 185 190 His Thr Tyr Glu Gly Leu Asn Ile Asp Gin Thr Ala Thr Tyr Glu Asp 195 200 205 50 Ile Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His

   -57CZ 281881 B6

   210 215 220

   Pro Gly Gin Glu

   225
4. 4. Buňka podle nároku 1 s extracelulámí částí obsahující část CD4 vázající HIV obalový protein nebo její funkční derivát vázající HTV obalový protein.
5. 5. Buňka podle nároku 6, v níž se jako cytotoxický T lymfocyt používají CD8⁺ cytotoxické T lymfocyty.
6. 6. Buňka podle nároku 1, v níž extracelulámí částí je imunoglobulinová molekula nebo její antigen vázající fragment.
7. 7. DNA kódující chimemí receptor podle nároku 1.
8. 8. Vektor obsahující DNA chimemího receptoru podle nároku 7.
9. 9. Protilátka specificky rozpoznávající a vázající chimemí receptor podle nároku 1.
10. 10. Chimemí receptor podle nároku 1 vázaný proteinovou membránou, obsahující

    a) extracelulámí část schopnou specificky rozpoznávat a vázat infekční činidlo, buňku infikovanou infekčním činidlem, nádorovou nebo rakovinnou buňku nebo autoimunně generovanou buňku a

    b) intracelulární nebo transmembránovou část odvozenou od T buněčného receptoru zeta, eta, CD3 delta, nebo T3 gama proteinu, Fc receptoru gama proteinu, nebo B buněčného receptoru mbl nebo B29 proteinu, která je schopná signalizovat hostitelské buňce nesoucí uvedený receptor, aby ničila činidlo nebo buňku navázané na receptor.