KR20240042250A - 항-cd19 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 - Google Patents

항-cd19 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 Download PDF

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존 버드
제이슨 두보브스키
조셉 프라이에타
사르 길
데이비드 글래스
에이미 존슨
칼 에이치. 준
사드 켄더리안
조안 마닉
마셀라 마우스
레온 머피
나타라잔 무수사미
데이비드 엘. 포터
마르코 루엘라
윌리엄 라즈 셀러스
마리우츠 와시크
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노파르티스 아게
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Abstract

본 발명은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 CD19 CAR을 포함하는 재조합 T 세포를 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제와 조합하여 투여함으로써 CD19의 발현과 연관된 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 키트 및 조성물을 제공한다.

Description

항-CD19 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 {TREATMENT OF CANCER USING ANTI-CD19 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR}
본 출원은 2014년 4월 7일에 출원된 미국 일련 번호 61/976,396, 2014년 6월 3일에 출원된 미국 일련 번호 62/007,309, 2014년 8월 12일에 출원된 미국 일련 번호 62/036,493, 2014년 11월 6일에 출원된 미국 일련 번호 62/076,238, 2014년 12월 5일에 출원된 미국 일련 번호 62/087,888, 및 2014년 12월 29일에 출원된 미국 일련 번호 62/097,278을 우선권 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2015년 4월 6일에 생성된 상기 ASCII 카피는 N2067-7051WO_SL.txt로 명명되고 252,236 바이트 크기이다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분화 클러스터 19 단백질 (CD19)의 발현과 연관된 질환을 치료하기 위해, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작한 T 세포를, 예를 들어 또 다른 작용제, 예컨대 예를 들어 키나제 억제제 및/또는 시토카인과 조합하여 사용하는 것에 관한 것이다.
B 세포 악성종양에 걸린 많은 환자는 표준 요법으로 치유할 수 없다. 또한, 전통적인 치료 옵션은 종종 심각한 부작용을 갖는다. 암 면역요법에서 많은 시도가 이루어졌지만, 여러 장애물이 임상 유효성 달성이라는 목표를 매우 어렵게 만든다. 수백개의 소위 종양 항원이 확인되었지만, 이들은 일반적으로 자기 유래이고, 따라서 면역원성이 낮다. 또한, 종양은 그 자체를 면역 공격의 개시 및 전파에 적대적이게 만드는 여러 메카니즘을 사용한다.
T 세포를 암 세포, 예컨대 B 세포 악성종양 상의 적합한 세포-표면 분자로 재지시하는 것에 의존하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 변형된 자가 T 세포 (CART) 요법을 사용한 최근의 개발은 B 세포 악성종양 및 다른 암을 치료하기 위해 면역계의 힘을 사용하는데 있어서의 유망한 결과를 보여준다 (예를 들어, 문헌 [Sadelain et al., Cancer Discovery 3:388-398 (2013)] 참조). 뮤린 유래 CART19 (즉, "CTL019")의 임상 결과는 CLL을 앓고 있는 환자에서 뿐만 아니라 소아기 ALL에서 완전한 완화를 확립하는데 있어서 유망한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 문헌 [Kalos et al., Sci Transl Med 3:95ra73 (2011), Porter et al., NEJM 365:725-733 (2011), Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)] 참조). 유전자 변형된 T 세포 상의 키메라 항원 수용체가 표적화 세포를 인식하고 파괴하는 능력 이외에, 성공적인 치료 T 세포 요법은 시간 경과에 따라 증식 및 지속되는 능력을 가지며 백혈병성 세포 도망자를 추가로 모니터링하는 것을 필요로 한다. 그것이 무반응, 억제 또는 소진의 결과인지에 관계없이 T 세포의 가변적인 품질은 CAR-형질전환된 T 세포의 성능에 영향을 미칠 것이지만, 이때 숙련된 진료의의 이에 대한 제어는 제한된다. 유효하기 위해서는, CAR 형질전환된 환자 T 세포는 CAR의 항원에 반응하여 증식하는 능력이 지속 및 유지될 필요가 있다. ALL 환자 T 세포는 뮤린 scFv를 포함하는 CART19를 사용하여 이를 수행할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 문헌 [Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)] 참조).
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 키메라 항원 수용체 (CAR) 분자 (예를 들어, B-세포 항원, 예를 들어 분화 클러스터 19 단백질 (CD19) (예를 들어, OMIM 수탁 번호 107265, 스위스 프롯. 수탁 번호 P15391)에 결합하는 CAR)를 발현하는 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 사용하여 장애, 예컨대 암 (예를 들어, 혈액암 또는 다른 B-세포 악성종양)을 치료하는 조성물 및 방법을 특색으로 한다. 조성물은 CAR을 표적화하는 B 세포를 발현하는 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 키나제 억제제 (예를 들어, CDK4/6 억제제, BTK 억제제, mTOR 억제제, MNK 억제제, 이중 PI3K/mTOR 억제제, 또는 그의 조합 중 1종 이상)와 조합하여 포함하고, 방법은 이를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조합물은 어느 하나의 요법 단독과 비교하여 더 나은 임상 유효성을 유지하거나 갖는다. 본 발명은 추가로 B-세포 항원, 예를 들어 CD19의 발현과 연관된 장애 (예를 들어 암, 예를 들어 혈액암)를 치료하기 위해, B-세포 항원, 예를 들어 CD19에 결합하는 CAR 분자를 발현하도록 조작된 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를, 키나제 억제제 (예를 들어, 시클린 의존성 키나제 4 (CDK4) 억제제, 브루톤 티로신 키나제 (BTK) 억제제, mTOR 억제제, 미토겐 활성화 단백질 키나제 상호작용 키나제 (MNK) 억제제, 이중 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)/mTOR 억제제, 또는 그의 조합 중 1종 이상으로부터 선택된 키나제 억제제)와 조합하여 사용하는 것에 관한 것이다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 B-세포 항원, 예를 들어 CD19의 발현과 연관된 질환에 걸린 대상체, 예를 들어 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 포유동물에게 유효량의 세포, 예를 들어 B-세포 항원에 결합하는 CAR 분자를 발현하는 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR 분자는 CD19에 결합하며, 예를 들어 CAR 분자는 본원에 기재된 CD19에 결합한다. 다른 실시양태에서, CAR 분자는 CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상에 결합한다.
한 실시양태에서, B-세포 항원의 발현 (예를 들어, CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상의 발현)과 연관된 질환은 증식성 질환, 예컨대 암, 악성종양 또는 전암성 상태, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병으로부터 선택되거나, 또는 B-세포 항원, 예를 들어 CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증이다. 한 실시양태에서, 질환은 고형 또는 액상 종양이다. 한 실시양태에서, 암은 췌장암이다. 한 실시양태에서, 질환은 혈액암이다. 한 실시양태에서, 혈액암은 백혈병이다. 한 실시양태에서, 암은 B-세포 급성 림프성 백혈병 (BALL), T-세포 급성 림프성 백혈병 (TALL), 소림프구성 백혈병 (SLL), 급성 림프성 백혈병 (ALL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 급성 백혈병; 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 만성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 혈액암 또는 혈액 상태는 외투 세포 림프종 (MCL), B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 상태, MALT 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, B-세포 항원 (예를 들어, 예를 들어 CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상) 발현과 연관된 질환은 골수 혈액 세포의 비유효 생산 (또는 이형성증)에 의해 통합된 혈액 상태의 다양한 집합인 "전백혈병"이다. 일부 실시양태에서, B-세포 항원 (예를 들어, CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상) 발현과 연관된 질환은 B-세포 항원 (예를 들어, CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상)을 발현하는 비정형 및/또는 비-전형적 암, 악성종양, 전암성 상태 또는 증식성 질환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 B-세포 항원 (예를 들어, CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상) 발현과 연관된 질환의 임의의 조합은 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있다.
한 실시양태에서, B-세포 항원 (예를 들어, CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상)의 발현과 연관된 질환은 림프종, 예를 들어 MCL, 호지킨 림프종, 또는 DLBCL이다. 한 실시양태에서, B-세포 항원 (예를 들어, CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상)의 발현과 연관된 질환은 백혈병, 예를 들어 SLL, CLL 및/또는 ALL이다. 한 실시양태에서, B-세포 항원의 발현과 연관된 질환은 다발성 골수종 (예를 들어 CD19-음성인, 예를 들어 유동 세포측정법 및 RT-PCR 둘 다에 의해 검출된 바와 같이, 예를 들어 대부분 (99.95%)의 신생물성 형질 세포가 CD19-음성 표현형을 갖는 다발성 골수종)이다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 CDK4 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 CDK4 억제제, 예를 들어 CD4/6 억제제, 예컨대 예를 들어, 6-아세틸-8-시클로펜틸-5-메틸-2-(5-피페라진-1-일-피리딘-2-일아미노)-8H-피리도[2,3-d]피리미딘-7-온, 히드로클로라이드 (팔보시클립 또는 PD0332991로도 지칭됨)이다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 BTK 억제제, 예컨대 예를 들어, 이브루티닙이다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTOR 억제제, 예컨대 예를 들어, 라파마이신, 라파마이신 유사체, OSI-027이다. mTOR 억제제는, 예를 들어 mTORC1 억제제 및/또는 mTORC2 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTORC1 억제제 및/또는 mTORC2 억제제일 수 있다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 MNK 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 MNK 억제제, 예컨대 예를 들어, 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘이다. MNK 억제제는, 예를 들어 MNK1a, MNK1b, MNK2a 및/또는 MNK2b 억제제일 수 있다. 한 실시양태에서, 억제제는 이중 PI3K/mTOR 억제제, 예를 들어 PF-04695102일 수 있다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 알로이신 A; 플라보피리돌 또는 HMR-1275, 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-[(3S,4R)-3-히드록시-1-메틸-4-피페리디닐]-4-크로메논; 크리조티닙 (PF-02341066); 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-[(2R,3S)-2-(히드록시메틸)-1-메틸-3-피롤리디닐]-4H-1-벤조피란-4-온, 히드로클로라이드 (P276-00); 1-메틸-5-[[2-[5-(트리플루오로메틸)-1H-이미다졸-2-일]-4-피리디닐]옥시]-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-1H-벤즈이미다졸-2-아민 (RAF265); 인디술람 (E7070); 로스코비틴 (CYC202); 팔보시클립 (PD0332991); 디나시클립 (SCH727965); N-[5-[[(5-tert-부틸옥사졸-2-일)메틸]티오]티아졸-2-일]피페리딘-4-카르복스아미드 (BMS 387032); 4-[[9-클로로-7-(2,6-디플루오로페닐)-5H-피리미도[5,4-d][2]벤즈아제핀-2-일]아미노]-벤조산 (MLN8054); 5-[3-(4,6-디플루오로-1H-벤즈이미다졸-2-일)-1H-인다졸-5-일]-N-에틸-4-메틸-3-피리딘메탄아민 (AG-024322); 4-(2,6-디클로로벤조일아미노)-1H-피라졸-3-카르복실산 N-(피페리딘-4-일)아미드 (AT7519); 4-[2-메틸-1-(1-메틸에틸)-1H-이미다졸-5-일]-N-[4-(메틸술포닐)페닐]-2-피리미딘아민 (AZD5438); XL281 (BMS908662); 및 리보시클립으로부터 선택된 CDK4 억제제이다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 CDK4 억제제, 예를 들어 팔보시클립 (PD0332991)이고, 팔보시클립은 일정 기간 동안 매일, 예를 들어 28일 사이클의 14-21일 동안 매일 또는 21일 사이클의 7-12일 동안 매일 약 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (예를 들어, 75 mg, 100 mg 또는 125 mg)의 용량으로 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 초과의 사이클의 팔보시클립이 투여된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 이브루티닙 (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된 BTK 억제제이다. 바람직한 실시양태에서, BTK 억제제는 인터류킨-2-유도성 키나제 (ITK)의 키나제 활성을 감소시키거나 억제하지 않고, GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, 예를 들어 이브루티닙 (PCI-32765)이고, 이브루티닙은 일정 기간 동안 매일, 예를 들어 21일 사이클 동안 매일 또는 28일 사이클 동안 매일 약 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (예를 들어, 250 mg, 420 mg 또는 560 mg)의 용량으로 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 초과의 사이클의 이브루티닙이 투여된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 템시롤리무스; 리다포롤리무스 (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시시클로헥실 디메틸포스피네이트 (AP23573 및 MK8669로도 공지됨); 에베롤리무스 (RAD001); 라파마이신 (AY22989); 세마피모드; (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올 (AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF04691502); 및 N2-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파르틸L-세린-, 내부 염 (SF1126); 및 XL765로부터 선택된 mTOR 억제제이다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신이고, 라파마이신은 일정 기간 동안 매일, 예를 들어 21일 사이클 동안 매일 또는 28일 사이클 동안 매일 약 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (예를 들어, 6 mg)의 용량으로 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 초과의 사이클의 라파마이신이 투여된다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 에베롤리무스이고, 에베롤리무스는 일정 기간 동안 매일, 예를 들어 28일 사이클 동안 매일 약 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (예를 들어, 10 mg)의 용량으로 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 초과의 사이클의 에베롤리무스가 투여된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 CGP052088; 4-아미노-3-(p-플루오로페닐아미노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘 (CGP57380); 세르코스포라미드; ETC-1780445-2; 및 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘으로부터 선택된 MNK 억제제이다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF-04691502); N-[4-[[4-(디메틸아미노)-1-피페리디닐]카르보닐]페닐]-N'-[4-(4,6-디-4-모르폴리닐-1,3,5-트리아진-2-일)페닐]우레아 (PF-05212384, PKI-587); 2-메틸-2-{4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디히드로-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐}프로판니트릴 (BEZ-235); 아피톨리십 (GDC-0980, RG7422); 2,4-디플루오로-N-{2-(메틸옥시)-5-[4-(4-피리다지닐)-6-퀴놀리닐]-3-피리디닐}벤젠술폰아미드 (GSK2126458); 8-(6-메톡시피리딘-3-일)-3-메틸-1-(4-(피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2(3H)-온 말레산 (NVP-BGT226); 3-[4-(4-모르폴리닐피리도[3',2':4,5]푸로[3,2-d]피리미딘-2-일]페놀 (PI-103); 5-(9-이소프로필-8-메틸-2-모르폴리노-9H-퓨린-6-일)피리미딘-2-아민 (VS-5584, SB2343); 및 N-[2-[(3,5-디메톡시페닐)아미노]퀴녹살린-3-일]-4-[(4-메틸-3-메톡시페닐)카르보닐]아미노페닐술폰아미드 (XL765)로부터 선택된 이중 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K) 및 mTOR 억제제이다.
한 실시양태에서, 세포는 항-CD19 결합 도메인 (예를 들어, CD19에 특이적으로 결합하는 뮤린 또는 인간화 항체 또는 항체 단편), 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 CAR 분자를 발현한다. 한 실시양태에서, CAR은 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CD19에 특이적으로 결합하는 뮤린 또는 인간화 항체 또는 항체 단편), 본원에 기재된 막횡단 도메인, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
한 실시양태에서, CAR 분자는 CD19 (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 인간 CD19)에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, CAR 분자는 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하는 항-CD19 결합 도메인, 예를 들어 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함하는 항-CD19 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 항-CD19 결합 도메인은 각각 본원에 기재된 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 2개의 가변 중쇄 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 7 내) 뮤린 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 표 7 내) 뮤린 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 표 7의 아미노산 서열의 뮤린 경쇄 및 뮤린 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 7에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 7의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 7에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 7의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호(SEQ ID NO): 59의 서열 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 표 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4이다 (서열식별번호: 53). scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역으로 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, CAR 분자는 본원에 기재된 인간화 항-CD19 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및 본원에 기재된 인간화 항-CD19 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하는 인간화 항-CD19 결합 도메인, 예를 들어 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함하는 인간화 항-CD19 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 적어도 HC CDR2를 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 본원에 기재된 인간화 항-CD19 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간화 항-CD19 결합 도메인은 각각 본원에 기재된 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 2개의 가변 중쇄 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 적어도 HC CDR2를 포함한다. 한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 VK3_L25 배선 서열의 1, 2, 3 또는 모든 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 서열식별번호: 58의 뮤린 경쇄 가변 영역 내의 상응하는 위치에서 발견되는 1개 이상의 아미노산의 치환, 예를 들어 위치 71 및 87 중 1개 이상에서의 치환)을 갖는다. 한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 VH4_4-59 배선 서열의 1, 2, 3 또는 모든 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 서열식별번호: 58의 뮤린 중쇄 가변 영역 내의 상응하는 위치에서 발견되는 1개 이상의 아미노산의 치환, 예를 들어 위치 71, 73 및 78 중 1개 이상에서의 치환)을 갖는다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 3 내) 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 표 3 내) 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 표 3의 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 3에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 3의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 3에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 3의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 12로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 표 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4이다 (서열식별번호: 53). scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역으로 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, CAR 분자는 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 15의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 15의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 코딩된 힌지 영역은 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 45, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, CAR 분자는 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 16의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 51의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, CAR 분자는 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 16의 서열 및/또는 서열식별번호: 17의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 16의 서열 및/또는 서열식별번호: 43의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD27의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 51의 서열 및/또는 서열식별번호: 17의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 51의 서열 및/또는 서열식별번호: 43의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 43의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 43의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 51의 서열 및 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 43의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
한 실시양태에서, CAR 분자는 리더 서열, 예를 들어 본원에 기재된 리더 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 리더 서열은 서열식별번호: 13의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, CAR 분자는 리더 서열, 예를 들어 본원에 기재된 리더 서열, 예를 들어 서열식별번호: 13 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 리더 서열; 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 항-CD19 결합 도메인, 예를 들어 표 7에 기재된 뮤린 항-CD19 결합 도메인, 표 3에 기재된 인간화 항-CD19 결합 도메인, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열; 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지 영역, 예를 들어 서열식별번호: 14 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 힌지 영역; 막횡단 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 막횡단 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 15의 서열 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 막횡단 도메인; 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 51의 서열 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인, 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 43의 서열 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, CAR 분자는 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41 또는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41 또는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 또는 30개의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖지만 60, 50 또는 40개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41 또는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다 (예를 들어, 이것으로 이루어진다).
한 실시양태에서, CAR 분자를 발현하는 세포는 CAR 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 한 실시양태에서, 벡터는 프로모터를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 프로모터는 EF-1 프로모터이다. 한 실시양태에서, EF-1 프로모터는 서열식별번호: 100의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 시험관내 전사되는 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 핵산 분자의 RNA를 전사하는 벡터이다. 한 실시양태에서, 시험관내 벡터 내의 핵산 서열은 폴리(A) 테일, 예를 들어 약 150개의 아데노신 염기를 포함하는 본원에 기재된 폴리 A 테일 (서열식별번호: 104)을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 시험관내 벡터 내의 핵산 서열은 3' UTR, 예를 들어 인간 베타-글로불린으로부터 유래된 3' UTR의 적어도 1개의 반복부를 포함하는, 예를 들어 본원에 기재된 3' UTR을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 시험관내 벡터 내의 핵산 서열은 프로모터, 예를 들어 T2A 프로모터를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 조성물 및 방법의 특정 실시양태에서, CAR 분자를 발현하는 세포 (본원에서 "CAR-발현 세포"로도 지칭됨)는 본원에 기재된 바와 같은 세포 또는 세포의 집단, 예를 들어 인간 면역 이펙터 세포 또는 세포의 집단 (예를 들어, 인간 T 세포 또는 인간 NK 세포, 예를 들어 본원에 기재된 인간 T 세포 또는 본원에 기재된 인간 NK 세포)이다. 한 실시양태에서, 인간 T 세포는 CD8+ T 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 자가 T 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 동종 T 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 T 세포이고, T 세포는 디아글리세롤 키나제 (DGK) 결핍 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 T 세포이고, T 세포는 이카로스(Ikaros) 결핍 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 T 세포이고, T 세포는 DGK 및 이카로스 둘 다의 결핍 세포이다. 용어 "세포"를 언급하는 본원에 개시된 조성물 및 방법은 1개 이상의 세포, 예를 들어 세포의 집단을 포함하는 조성물 및 방법을 포괄한다는 것을 이해한다.
또 다른 실시양태에서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 CAR 분자를 발현하는 세포는 또 다른 작용제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 추가로 발현할 수 있다.
한 실시양태에서, 방법은 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 바와 같은 CAR 분자를 발현하는 세포를 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제와 조합하여 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 시토카인, 예를 들어 IL-7, IL-15, IL-21, 또는 그의 조합이다. 한 실시양태에서, 방법은 대상체에게 IL-7을 투여하는 것을 포함한다. 시토카인은 CAR-발현 세포의 투여와 조합되어, 예를 들어 동시에 또는 그 직후에 전달될 수 있다. 대안적으로, 시토카인은 CAR-발현 세포의 투여 후 장기간 후에, 예를 들어 CAR-발현 세포에 대한 대상체의 반응의 평가 후에 전달될 수 있다.
다른 실시양태에서, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제는 면역 억제 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 면역 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 한 실시양태에서, 면역 억제 분자를 억제하는 작용제는 세포에게 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된 제1 폴리펩티드, 예를 들어 면역 억제 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 예를 들어 억제 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타, 또는 임의의 이들의 단편 (예를 들어, 임의의 이들의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인) 포함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 PD1 또는 그의 단편 (예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 림프구 주입, 예를 들어 동종 림프구 주입이 암의 치료에 사용되며, 여기서 림프구 주입은 본원에 기재된 바와 같은 B-세포 항원 (예를 들어, CD19)에 결합하는 적어도 1종의 CAR-발현 세포 (본원에서 CD19 CAR-발현 세포로도 지칭됨)를 포함한다. 한 실시양태에서, 자가 림프구 주입이 암의 치료에 사용되며, 여기서 자가 림프구 주입은 적어도 1종의 CD19-발현 세포를 포함한다.
한 실시양태에서, CD19 CAR 발현 세포, 예를 들어 T 세포는 이전에 줄기 세포 이식, 예를 들어 자가 줄기 세포 이식을 제공받은 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, CD19 CAR 발현 세포, 예를 들어 T 세포는 이전에 멜팔란의 용량을 제공받은 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 CAR 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 1종 이상의 부작용을 개선시키는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 키나제 억제제의 투여와 연관된 1종 이상의 부작용을 개선시키는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포 및 키나제 억제제는 CD19와 연관된 질환을 치료하는 추가의 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 추가의 작용제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 본원에 기재된 용량 및/또는 투여 스케줄로 투여된다.
한 실시양태에서, CAR 분자는 예를 들어 시험관내 전사를 사용하여 T 세포 내에 도입되고, 대상체 (예를 들어, 인간)는 CAR 분자를 포함하는 세포의 초기 투여, 및 CAR 분자를 포함하는 세포의 1회 이상의 후속 투여를 제공받고, 여기서 1회 이상의 후속 투여는 이전 투여 후 15일 미만에, 예를 들어 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2일에 투여된다. 한 실시양태에서, CAR 분자를 포함하는 세포의 1회 초과의 투여는 1주에 대상체 (예를 들어, 인간)에게 투여되고, 예를 들어 CAR 분자를 포함하는 세포의 2, 3, 또는 4회 투여가 1주에 투여된다. 한 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)는 1주에 CAR 분자를 포함하는 세포의 1회 초과의 투여 (예를 들어, 1주에 2, 3 또는 4회 투여) (본원에서 사이클로도 지칭됨)를 제공받고, 이어서 CAR 분자를 포함하는 세포를 1주 투여하지 않은 다음, CAR 분자를 포함하는 세포의 1회 이상의 추가의 투여 (예를 들어, 1주에 CAR 분자를 포함하는 세포의 1회 초과의 투여)를 대상체에게 투여한다. 또 다른 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)는 CAR 분자를 포함하는 세포의 1회 초과의 사이클을 제공받고, 각각의 사이클 사이의 시간은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3일 미만이다. 한 실시양태에서, CAR 분자를 포함하는 세포는 1주에 3회 투여를 위해 격일로 투여된다. 한 실시양태에서, CAR 분자를 포함하는 세포는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 초과의 주 동안 투여된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제 및 CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포의 조합은 질환, 예를 들어 암, 예를 들어 본원에 기재된 암에 대한 1차 치료로서 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 키나제 억제제 및 CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포의 조합은 질환, 예를 들어 암, 예를 들어 본원에 기재된 암에 대한 2, 3, 4차 치료로서 투여된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 (예를 들어, 세포의 집단)가 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, 방법은 세포의 집단을 투여하는 것을 포함하며, 복수의 세포의 집단은 본원에 기재된 CAR 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR-발현 세포의 집단은 상이한 CAR을 발현하는 세포의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, CAR-발현 세포의 집단은 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 제1 세포에 의해 발현된 CAR의 항-CD19 결합 도메인과 상이한, 상이한 항-CD19 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, CAR-발현 세포의 집단은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 항-CD19 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 CD19 이외의 표적 (예를 들어, CD123 또는 메소텔린)에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포의 집단은, 예를 들어 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 2차 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 세포의 집단 (여기서 집단 내의 적어도 1종의 세포는 본원에 기재된 항-CD19 도메인을 갖는 CAR을 발현함) 및 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 발현하는 제2 세포를 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 작용제는 면역 억제 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 면역 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 한 실시양태에서, 면역 억제 분자를 억제하는 작용제는 세포에게 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 예를 들어 억제 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타, 또는 임의의 이들의 단편 (예를 들어, 임의의 이들의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인) 포함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 PD1 또는 그의 단편 (예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)와 조합하여 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포와 조합하여 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 B-세포 항원 (예를 들어, CD19)을 발현하는 질환의 치료에서 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)와 조합하여 사용하기 위한 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 B-세포 항원 (예를 들어, CD19)을 발현하는 질환의 치료에서 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포와 조합하여 사용하기 위한 본원에 기재된 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)에 관한 것이다. 질환은 예를 들어 암, 예컨대 혈액암일 수 있다. 암은 예를 들어 림프종, CLL, MCL, ALL, DLBCL, 다발성 골수종, 또는 본원에 기재된 또 다른 암일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 시토카인, 예를 들어 IL-7, IL-15 및/또는 IL-21과 조합하여 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포와 조합하여 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 시토카인에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CD19를 발현하는 질환의 치료에서 본원에 기재된 바와 같은 시토카인, 예를 들어 IL-7, IL-15 및/또는 IL-21과 조합하여 사용하기 위한 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 CD19를 발현하는 질환의 치료에서 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포와 조합하여 사용하기 위한 본원에 기재된 시토카인에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 호지킨 림프종에 걸린 포유동물에게 CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포 (예를 들어, 세포들)의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 CAR 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 CAR 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 1종 이상의 부작용을 개선시키는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 호지킨 림프종을 치료하는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 낮은, 면역 증진, 용량의 mTOR 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTOR 억제제와 조합되어 투여된다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 낮은, 면역 증진, 용량 (예를 들어, 면역계를 완전히 억제하기에 불충분하지만 면역 기능을 개선시키기에는 충분한 용량)을 사용한 치료는 PD-1 양성 T 세포의 감소 또는 PD-1 음성 세포의 증가를 동반하는 것으로 여겨진다. PD-1 양성 T 세포는 PD-1 리간드, 예를 들어 PD-L1 또는 PD-L2를 발현하는 세포와의 연관에 의해 고갈될 수 있지만, PD-1 음성 T 세포는 그렇지 않다.
한 실시양태에서, 이러한 접근법은 대상체에서 본원에 기재된 CAR 세포의 성능을 최적화하는데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 한 실시양태에서, 내인성, 비-변형된 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 성능이 개선된 것으로 여겨진다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 한 실시양태에서, CD19 CAR 발현 세포의 성능이 개선된 것으로 여겨진다. 다른 실시양태에서, CAR을 갖거나 CAR을 발현하도록 조작될 세포, 예를 들어 T 세포는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수를 증가시키거나 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포/PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 비를 증가시키는 양의 mTOR 억제제와의 접촉에 의해 생체외에서 처리될 수 있다.
한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진, 용량의 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001 또는 촉매 억제제의 투여는 본원에 기재된 CAR 발현 세포, 예를 들어 T 세포의 투여 전에 개시된다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제는 RAD001 또는 라파마이신이다. 한 실시양태에서, CAR 세포는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수준, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포/PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 비가 적어도 일시적으로 증가하도록 충분한 시간, 또는 mTOR 억제제의 충분한 투여 후에 투여된다.
한 실시양태에서, CAR을 발현하도록 조작될 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 대상체 내의 또는 대상체로부터 수거된 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수준, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포/PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 비가 적어도 일시적으로 증가하도록 충분한 시간 후에, 또는 낮은, 면역 증진, 용량의 mTOR 억제제의 충분한 투여 후에 수거된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 방법은, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자, 예를 들어 CD19에 결합하는 CAR 분자를 발현하는 1종 이상의 세포를 투여하기 전에, 대상체에 대해 림프구고갈을 수행하는 것을 추가로 포함한다. 림프구고갈은, 예를 들어 멜팔란, 시톡산, 시클로포스파미드 및 플루다라빈 중 1종 이상을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 투여되는 CAR-발현 세포는 조절가능한 CAR (RCAR), 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 RCAR을 포함한다. RCAR은, 예를 들어 세포내 신호전달 도메인 및 제1 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성원, CD19에 결합하는 항원 결합 도메인 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원; 및 막횡단 도메인을 포함할 수 있다. 방법은 이량체화 분자를, 예를 들어 제1 스위치 및 제2 스위치 도메인의 이량체화를 유도하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR-발현 세포 및 키나제 억제제는, 예를 들어 1차 요법으로서, 동시에 또는 실질적으로 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 1차 요법으로서 BTK 억제제 (예를 들어, 이브루티닙) 및 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)의 조합을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, CAR-발현 세포 및 키나제 억제제는 순차적으로 투여된다. 예를 들어, 키나제 억제제는 CAR-발현 세포 전에 투여되거나, 또는 CAR-발현 세포는 키나제 억제제 전에 투여된다.
일부 실시양태에서, CD19의 발현과 연관된 질환은 혈액암 (예를 들어, 본원에 기재된 혈액암, 예컨대 CLL, MCL, 또는 ALL)이고, 대상체는 혈액암에 대한 1종 이상의 요법, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙에 대한 부분 반응자, 비-반응자, 또는 재발자이거나, 또는 그로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 BTK 돌연변이를 갖거나, 또는 BTK 돌연변이를 갖는 것으로서 확인된다. 돌연변이는, 예를 들어 점 돌연변이, 삽입, 또는 결실일 수 있다. 돌연변이는, 예를 들어 BTK 억제제에 대한 결합 부위에서의, 예를 들어 ATP-결합 포켓 또는 그 근처에서의 돌연변이일 수 있다. 돌연변이는 BTK 억제제에 대한 감소된 반응 (예를 들어, 저항성)을 부여할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 BTK 억제제 (예를 들어, 이브루티닙)를 대상체에게 투여하는 단계, BTK 억제제의 양을 감소시키는 단계 (예를 들어, 투여를 중지하는 단계), 및 이어서 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 BTK 억제제 (예를 들어, 이브루티닙)를 대상체에게 투여하는 단계 및 이어서 BTK 억제제 및 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)의 조합을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 BTK 억제제 (예를 들어, 이브루티닙)를 대상체에게 투여하는 단계, BTK 억제제의 양을 감소시키는 단계 (예를 들어, 투여를 중지 또는 중단하는 단계), 및 이어서 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포) 및 제2 BTK 억제제 (예를 들어, 제1 BTK 억제제 이외의, 예를 들어 이브루티닙 이외의 BTK 억제제)의 조합을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 BTK 억제제는 GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774, 또는 LFM-A13, 또는 그의 조합 중 1종 이상으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, B-세포 항원 (예를 들어, CD19)의 발현과 연관된 질환은 혈액암 (예를 들어, 본원에 기재된 혈액암, 예를 들어 CLL, MCL, 또는 ALL)이고, 방법은 대상체에서 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙), CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포), 또는 둘 다에 대한 저항성을 지연 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, CD19의 발현과 연관된 질환은 혈액암 (예를 들어, 본원에 기재된 혈액암, 예를 들어, CLL, MCL, 또는 ALL)이고, 여기서 방법은 혈액암의 완화를 지속시키거나 또는 그의 재발을 지연시킨다. 예를 들어, 키나제 억제제 또는 CAR-발현 세포의 단독요법으로 치료된 경우의 질환의 예상 과정과 비교하여, 완화가 지속될 수 있거나, 재발이 지연될 수 있거나, 저항성이 지연될 수 있거나, 또는 저항성이 감소될 수 있다.
임의의 상기 언급된 방법에 사용될 수 있는 예시적인 치료 요법은 하기 중 1종 이상을 포함한다:
한 실시양태에서, 키나제 억제제 및 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)가 1차 요법으로서 대상체, 예를 들어 포유동물에게 투여된다.
또 다른 실시양태에서, CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)는 키나제 억제제의 투여 후에 대상체, 예를 들어 포유동물에게 투여된다.
다른 실시양태에서, CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)는 키나제 억제제의 투여를 중지한 후에 투여된다.
다른 실시양태에서, 키나제 억제제의 투여는 CAR19-발현 세포의 투여 전에 시작되고, CAR19-발현 세포는 키나제 억제제의 연속 투여와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, 대상체에게, 예를 들어 1차 요법으로서 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)가 투여된다. 미리 결정된 시간 간격 (예를 들어, 1 또는 2개월, 뿐만 아니라 2주, 3주, 1개월, 1.5개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 9개월, 12개월, 15개월, 또는 18개월) 후에, CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)는 대상체에게 단독으로, 또는 키나제 억제제와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료에 대한 대상체의 반응은 미리 결정된 시간 간격에, 예를 들어 키나제 억제제 및/또는 CAR-발현 세포를 사용한 치료 전 또는 그 동안 평가된다. 평가가 대상체가 완전 반응자임을 나타내는 경우에, CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)는 투여되지 않는다. 평가가 대상체가 부분 반응자이거나 또는 키나제 억제제에 대한 반응에서 안정 질환을 갖는다고 나타내는 경우에, CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 키나제 억제제와 조합되어 투여된다. 평가가 대상체가 비-반응자 또는 재발자임을 나타내는 경우에, CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)는 키나제 억제제 또는 제2 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 제2 키나제 억제제와 조합되어 투여된다.
다른 실시양태에서, 대상체, 예를 들어 포유동물은 BTK 억제제 (예를 들어, 이브루티닙)에 대한 완전 또는 부분 반응자, 또는 CAR19-발현 세포에 대한 완전 또는 부분 반응자이거나, 또는 그러한 것으로서 확인된다.
일부 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)에 대한 완전 반응자인 (또는 그러한 것으로서 확인된) 경우에, 완전 반응의 기간 동안 대상체에게 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)는 투여되지 않는다. 다른 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제에 대한 완전 반응자 (예를 들어, 이브루티닙에 대한 완전 반응자)인 (또는 그러한 것으로서 확인된) 경우에, 완전 반응의 기간 동안 대상체에게 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)가 투여된다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포) 후에, 대상체는 (예를 들어, CAR 요법의 부재 하에 치료된 경우의 질환의 예상 과정과 비교하여) 지속된 반응 또는 지연된 재발을 경험한다.
일부 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)에 대한 부분 반응자인 (또는 그러한 것으로서 확인된) 경우에, 부분 반응의 기간 동안 대상체에게 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)는 투여되지 않는다. 다른 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제에 대한 부분 반응자인 (또는 그러한 것으로서 확인된) 경우에, 부분 반응의 기간 동안 대상체에게 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)가 (단독으로 또는 BTK 억제제와 조합되어) 투여된다. 한 실시양태에서, CAR 요법 후에, 대상체는 (예를 들어, CAR 요법의 부재 하에 치료된 경우의 질환의 예상 과정과 비교하여) 완전 반응 및/또는 지속된 반응 또는 지연된 재발을 경험한다.
일부 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)를 사용한 치료 후에 안정 질환을 갖는 (또는 안정 질환을 갖는 것으로서 확인된) 경우에, 안정 질환의 기간 동안 대상체에게 CAR 요법은 투여되지 않는다. 다른 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제를 사용한 치료 후에 안정 질환을 갖는 (또는 안정 질환을 갖는 것으로서 확인된) 경우에, 안정 질환의 기간 동안 대상체에게 CAR 요법이 투여된다. 한 실시양태에서, CAR 요법 후에, 대상체는 (예를 들어, CAR 요법의 부재 하에 치료된 경우의 질환의 예상 과정과 비교하여) 부분 반응, 완전 반응 및/또는 지속된 반응 또는 지연된 재발을 경험한다.
일부 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)를 사용한 치료 후에 진행성 질환을 갖는 (또는 진행성 질환을 갖는 것으로서 확인된) 경우에, 진행성 질환의 기간 동안 대상체에게 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)는 투여되지 않는다. 다른 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제에 의한 치료 후에 진행성 질환을 갖는 (또는 진행성 질환을 갖는 것으로서 확인된) 경우에, 진행성 질환의 기간 동안 대상체에게 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)가 투여된다. 한 실시양태에서, CAR 요법 후에, 대상체는 (예를 들어, CAR 요법의 부재 하에 치료된 경우의 질환의 예상 과정과 비교하여) 안정 질환, 부분 반응, 완전 반응 및/또는 지속된 반응 또는 지연된 재발을 경험한다.
다른 실시양태에서, 포유동물이 이브루티닙에 대한 비-반응자 또는 재발자이거나 또는 그러한 것으로서 확인된 경우에, CAR-발현 세포는 제2 키나제 억제제와 조합되어 투여되며, 여기서 제2 키나제 억제제는 이브루티닙 이외의 것이다. 제2 키나제 억제제는 GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774, 또는 LFM-A13, 또는 그의 조합 중 1종 이상으로부터 선택될 수 있다.
다른 실시양태에서, 대상체, 예를 들어 포유동물은 키나제 억제제에 대한 부분 반응자이고 (또는 그러한 것으로서 확인되고), 부분 반응의 기간 동안 대상체에게 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)가 단독으로 또는 BTK 억제제와 조합되어 투여된다.
다른 실시양태에서, 대상체, 예를 들어 포유동물은 이브루티닙을 사용한 치료 후에 진행성 또는 안정 질환을 갖는 비-반응자이고 (또는 그러한 것으로서 확인되고), 진행성 또는 안정 질환의 기간 동안 대상체에게 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)가 단독으로 또는 제2 BTK 억제제와 조합되어 투여되며, 여기서 제2 키나제 억제제는 이브루티닙 이외의 것이다.
또 다른 측면에서, B-세포 항원 (예를 들어, CD19)의 발현과 연관된 질환에 걸린 대상체, 예를 들어 포유동물을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 키나제 억제제 (예를 들어, 본원에 기재된 BTK 키나제 억제제, 예를 들어 이브루티닙) 및 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)를 조합하여 (예를 들어 동시에 (또는 실질적으로 동시에), 또는 순차적으로) 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키나제 억제제 및 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19 세포)는, 예를 들어 1차 요법으로서 조합되어 투여된다.
일부 실시양태에서, 키나제 억제제가, 예를 들어 단독요법 또는 1차 요법으로서 처음에 투여되고; 키나제 억제제의 양을 감소시킨 (예를 들어, 투여를 중지 또는 중단한) 후에, CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)가 대상체에게 투여된다.
다른 실시양태에서, 키나제 억제제가, 예를 들어 단독요법 또는 1차 요법으로서 처음에 투여되고; 이어서 키나제 억제제 및 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)의 조합이 대상체에게 투여된다.
다른 실시양태에서, 키나제 억제제가, 예를 들어 단독요법 또는 1차 요법으로서 처음에 투여되고; 키나제 억제제의 양을 감소시킨 (예를 들어, 투여를 중지 또는 중단한) 후에, 제2 키나제 억제제 및 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)의 조합이 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 치료에 대한 대상체의 반응은 미리 결정된 시간 간격에, 예를 들어 키나제 억제제 및/또는 CAR-발현 세포를 사용한 치료 전 또는 그 동안 평가된다. 평가가 대상체가 완전 반응자임을 나타내는 경우에, CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)는 투여되지 않는다. 평가가 대상체가 부분 반응자이거나 또는 키나제 억제제에 대한 반응에서 안정 질환을 갖는다고 나타내는 경우에, CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 키나제 억제제와 조합되어 투여된다. 평가가 대상체가 비-반응자 또는 재발자임을 나타내는 경우에, CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR19-발현 세포)는 키나제 억제제 또는 제2 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 제2 키나제 억제제와 조합되어 투여된다.
일부 실시양태에서, B-세포 항원 (예를 들어, CD19)의 발현과 연관된 질환은 혈액암, 백혈병, 림프종, MCL, CLL, ALL, 호지킨 림프종, 또는 다발성 골수종이다.
일부 실시양태에서, 키나제 억제제는 이브루티닙, GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774, 또는 LFM-A13으로부터 선택된 BTK 억제제; 팔보시클립, 알로이신 A, 플라보피리돌, 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-[(3S,4R)-3-히드록시-1-메틸-4-피페리디닐]-4-크로메논으로부터 선택된 CDK4 억제제; 크리조티닙 (PF-02341066, P276-00, RAF265, 인디술람, 로스코비틴, 디나시클립, BMS 387032, MLN8054, AG-024322, AT7519, AZD5438, BMS908662; 또는 리보시클립; 라파마이신, 라파마이신 유사체, 예컨대 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, 세마피모드, AZD8055, PF04691502, SF1126, XL765, 또는 OSI-027로부터 선택된 mTOR 억제제; 또는 CGP052088, CGP57380, 세르코스포라미드, 또는 ETC-1780445-2, 또는 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘으로부터 선택된 MNK 억제제이다.
일부 측면에서, 본 발명은 호지킨 림프종에 걸린 대상체, 예를 들어 포유동물에서의 치료 또는 항종양 면역 제공 방법을 특색으로 한다. 방법은 대상체에게 CD19에 결합하는 CAR 분자를 발현하는 세포의 유효량을 단독으로 또는 제2 요법과 조합하여 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다발성 골수종 (예를 들어, CD19-양성 다발성 골수종 또는 CD19-음성 골수종)에 걸린 대상체, 예를 들어 포유동물을 치료하거나 그에 항종양 면역을 제공하는 방법을 특색으로 한다. 한 실시양태에서, 다발성 골수종은 CD19-음성이고, 예를 들어 유동 세포측정법 및 RT-PCR 둘 다에 의해 검출된 바와 같이, 예를 들어 대부분 (99.95%)의 신생물성 형질 세포가 CD19-음성 표현형을 갖는다. 방법은 대상체에게 CD19에 결합하는 CAR 분자를 발현하는 세포의 유효량을 단독으로 또는 제2 요법 (예를 들어, 다발성 골수종에 대한 표준 치료 요법)과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 방법은 본원에 기재된 바와 같은 키나제 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
호지킨 림프종 또는 다발성 골수종에 관한 방법의 실시양태에서, CAR 분자는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 인간화 CAR 분자이다. 실시양태에서, CAR 분자는 본원에 기재된 바와 같은 CAR 분자이다. 예를 들어, 실시양태에서 CAR 분자는 서열식별번호: 5의 LC CDR1, 서열식별번호: 26의 LC CDR2, 및 서열식별번호: 27의 LC CDR3; 서열식별번호: 19의 HC CDR1, 서열식별번호: 20-23 중 임의의 것의 LC CDR2, 및 서열식별번호: 24의 HC CDR3 중 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5개, 또는 모두)을 포함하는 항-CD19 결합 도메인을 포함한다.
호지킨 림프종 또는 다발성 골수종에 관한 방법의 일부 실시양태에서, CAR 분자 (예를 들어, CART19 또는 CTL019)는 단독요법으로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제 (예컨대, 이브루티닙), CDK4 억제제, mTOR 억제제, 또는 MNK 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
다발성 골수종에 관한 방법의 일부 실시양태에서, CAR 분자 (예를 들어, CART19 또는 CTL019)는 다발성 골수종에 대한 표준 치료 요법과 조합되어, 예를 들어 골수절제 화학요법 및/또는 자가 줄기 세포 이식 구출 (예를 들어, 멜팔란 투여 (예를 들어, 고용량 멜팔란) 후)과 함께 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 B 세포 항원 (예를 들어, CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상)에 결합하는 CAR 분자를 발현하는 세포 및 1종 이상의 키나제 억제제를 포함하는 조성물을 특색으로 하며, 여기서 키나제 억제제는 브루톤 티로신 키나제 (BTK) 억제제, 시클린 의존성 키나제 4 (CDK4) 억제제, mTOR 억제제, 또는 미토겐 활성화 단백질 키나제 상호작용 키나제 (MNK) 억제제로부터 선택된다. CAR-발현 세포 및 1종 이상의 키나제 억제제는 단일 투여 형태로 또는 2개 이상의 투여 형태로서 존재할 수 있다.
실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 의약으로서 사용하기 위한 것이다.
실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 B-세포 항원 (예를 들어, CD19)의 발현과 연관된 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다.
CAR-발현 세포를 생산하기 위한 방법 및 조성물
본 개시내용은 또한, 특정 측면에서, 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 집단을 제공하는 단계; 및 면역 이펙터 세포를 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)의 표적 (예를 들어, BTK 및/또는 ITK)을 억제하는데 충분한 조건 하에 키나제 억제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, CAR (예를 들어, 본원에 기재된 CAR)을 발현하도록 조작될 수 있는 면역 이펙터 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 면역 이펙터 세포를 CAR 분자를 코딩하는 핵산과 접촉시키는 것, 예를 들어 CAR 분자를 코딩하는 핵산으로 형질도입시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 개시내용은 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR-발현 면역 이펙터 세포 또는 세포의 집단)를 제조하는 방법을 제공하며, 이는 세포 또는 세포의 집단을 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 접촉시키는 단계; 및 CAR 분자를 코딩하는 핵산을 CAR 분자가 발현되도록 하는 조건 하에 세포 또는 세포의 집단 내로 도입 (예를 들어, 형질도입)시키는 단계를 포함한다.
CAR-발현 세포를 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 핵산에 의해 코딩된 CAR 분자는 CD19에 결합하는 CAR 분자이다. 실시양태에서, 방법은 세포 또는 세포들을 세포 또는 적어도 세포의 하위-집단이 CAR 분자를 발현하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 세포는 T 세포 또는 NK 세포이거나, 또는 세포의 집단은 T 세포, NK 세포, 또는 둘 다를 포함한다. 실시양태에서, 방법은 세포 또는 세포들을 키나제 억제제와 (예를 들어, 10-20, 20-30, 30-40, 40-60, 또는 60-120분 동안) 접촉시키는 단계 및 이어서 세포 또는 세포들로부터 대부분의 또는 모든 키나제 억제제를 제거하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 키나제 억제제는 세포 또는 세포들을 수거한 후 또는 세포 또는 세포들을 자극하기 전에 첨가된다. 실시양태에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, CDK4 억제제, mTOR 억제제, 또는 MNK 억제제이다. 실시양태에서, 키나제 억제제는 이브루티닙이다. 실시양태에서, 세포의 집단은 또한 암 세포, 예를 들어 백혈병 또는 림프종 세포를 포함한다. 암 세포는, 예를 들어 CLL, MCL, 또는 ALL 세포일 수 있다. 실시양태에서, 키나제 억제제는 암 세포에서 표적 (예를 들어, BTK)을 억제하고, 예를 들어 그의 활성을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 감소시킨다. 실시양태에서, 키나제 억제제는 면역 이펙터 세포에서 표적 (예를 들어, ITK)을 억제하고, 예를 들어 그의 활성을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 감소시킨다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 키나제 억제제 (예를 들어, BTK 억제제) 및 CAR 분자 또는 CAR 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 반응 혼합물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 면역 이펙터 세포의 집단을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 이펙터 세포 중 1종 이상은 CAR 분자를 발현하거나, 또는 CAR 분자를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, CDK4 억제제, mTOR 억제제, 또는 MNK 억제제로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, BTK 억제제는 이브루티닙, GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774, 또는 LFM-A13으로부터 선택된다. 실시양태에서, 반응 혼합물은 암 세포, 예를 들어 혈액암 세포를 포함한다. 암 세포는, 예를 들어 면역 이펙터 세포가 대상체로부터 수거된 경우에 대상체로부터 수거된 세포일 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 또한 면역 이펙터 세포의 집단 및 CAR 분자 또는 CAR 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 반응 혼합물을 제공하며, 여기서 면역 이펙터 세포는 공유적으로 불활성화된 ITK를 포함한다. 실시양태에서, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 ITK가 공유적으로 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 암 세포를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 암 세포는 공유적으로 불활성화된 BTK를 포함한다. 실시양태에서, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 BTK가 공유적으로 불활성화된다. 실시양태에서, BTK 또는 ITK는 그의 ATP 결합 도메인 또는 그 근처에서 소분자, 예컨대 이브루티닙에 대해 공유 결합을 형성한다. 실시양태에서, BTK는 그의 시스테인-481 또는 그 근처에서 소분자, 예컨대 이브루티닙에 대해 공유 결합을 형성한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 반응 혼합물은 완충제 또는 다른 시약, 예를 들어 PBS 함유 용액을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 반응 혼합물은 집단의 세포를 활성화시키고/거나 확장시키는 작용제, 예를 들어 신호와 연관된 CD3/TCR 복합체를 자극하는 작용제 및/또는 세포의 표면 상의 공동자극 분자를 자극하는 리간드를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 작용제는 항-CD3 항체 또는 그의 단편, 및/또는 항-CD28 항체 또는 그의 단편과 접합된 비드이다. 실시양태에서, 반응 혼합물은 혈청 (예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α 또는 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 비롯하여, 증식 및/또는 생존율을 위한 1종 이상의 인자를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 반응 혼합물은 IL-15 및/또는 IL-7을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 반응 혼합물 중 집단의 복수의 세포는 CAR 코딩 서열, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 예를 들어 CD19 CAR 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자, 예를 들어 본원에 기재된 핵산 분자를 포함한다. 실시양태에서, 반응 혼합물 중 집단의 복수의 세포는 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 CD19 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 실시양태에서, 벡터는 본원에 기재된 벡터, 예를 들어 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 벡터이다. 실시양태에서, 반응 혼합물은 동결보호제 또는 안정화제, 예컨대 예를 들어, 사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드 및 폴리올 (예를 들어, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 락토스, 수크로스, 글루코스 및 덱스트란), 염 및 크라운 에테르를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 동결보호제는 덱스트란이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제조 방법은 면역 이펙터 세포의 집단을 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어 hTERT를 코딩하는 핵산과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 텔로머라제 서브유닛을 코딩하는 핵산은 DNA일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제조 방법은 2% hAB 혈청을 포함하는 혈청 중에서 면역 이펙터 세포의 집단을 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
항목, 하위-항목 또는 숫자화 또는 문자화 요소, 예를 들어 (a), (b), (i) 등은 단지 읽기의 용이성을 위해 제시된다. 본 문서에서 항목 또는 숫자화 또는 문자화 요소의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳 순서로 수행될 것 또는 단계 또는 요소가 반드시 서로 개별적일 것을 요구하지 않는다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 발명의 다른 특색, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면으로부터, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a, 1b 및 1c는 본 발명의 마우스 항-CD19 CAR 또는 인간화 항-CD19 CAR로 형질도입되고 도 1a에 제시된 바와 같은 CD19를 발현하지 않는 대조군 K562 세포 (K562cc), 도 1b에 제시된 바와 같은 CD19로 형질전환된 K562 세포 (K562.CD19) 또는 도 1c에 제시된 바와 같은 CLL 환자로부터 단리된 악성 B 세포 (Pt 14 B 세포 단리물)와 함께 배양된 ND317 (정상 공여자) T 세포에서 검정된 바와 같은 세포독성의 그래프 표현이다.
도 2a 및 2b는 CD19+ 세포로의 인간화 및 마우스 항-CD19 CAR-발현 세포의 증식 반응을 보여주는 그래프이고, 여기서 보다 많은 수의 생존 CAR+ T 세포는 1차 CLL 세포로의 최대 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 보여주는 집단과 상관된다.
도 3은 본 발명의 scFv에 대한 디컨볼루션된 HPLC 질량 스펙트럼의 그래프 표현이고, 여기서 상단 열은 비처리된 scFv를 도시하고, 하단 열은 동족 탈글리코실화 scFv를 도시한다.
도 4는 시차 주사 형광측정법에 의해 측정된 바와 같은 입체형태 안정성의 그래프 표현이다. 마우스 scFv의 Tm은 57℃이다 (굵은 선). 모든 인간화 scFv 변이체는 모 마우스 scFv와 비교하여 약 70℃에서 더 높은 Tm을 나타낸다. 인간화에 의해 도입된 잔기는 Tm을 10℃ 초과로 개선시켰다.
도 5는 CD19 CAR 형질도입된 T 세포 증식의 그래프 표현이고, 여기서 CART19 세포는 (a) CD19의 발현에 대해 음성이고 따라서 음성 대조군으로서 사용되는 만성 골수 백혈병 ("CML") 세포주; (b) CD19의 발현에 대해 양성이고 따라서 양성 대조군으로서 사용되는 재조합 K562 세포; 또는 (c) CLL 환자로부터 단리된, 세포 표면 상에 CD19를 발현하는 Pt14 B 세포로 지시된다.
도 6a 및 6b는 대표적인 CAR의 개략도이다.
도 7은 CD19 형질도입된 CAR T 세포로 처리한 후 NSG 마우스에서의 HALLX5447 1차 ALL 질환 진행을 도시한다. CD19에 특이적인 CAR T 세포로 처리한 후 NSG 마우스에서의 1차 인간 ALL 세포의 성장은 질환 진행의 제어를 입증하였다. CD19+ 인간 ALL 세포의 평균 백분율은 종양 이식 후 제65일까지 NSG 마우스에서의 말초 혈액 내의 질환 부담의 지표였다. 흑색 원형: 꼬리 정맥을 통해 100ul의 PBS로 처리된 마우스; 적색 정사각형: 모의 형질도입된 T 세포로 처리된 마우스; 청색 삼각형: 뮤린 CD19 CAR 형질도입된 T 세포로 처리된 마우스; 및 자주색 역삼각형: 인간화 CD19 CAR 형질도입된 T 세포로 처리된 마우스. ANOVA에 의해 계산된 유의성; *는 P<0.01을 나타낸다.
도 8은 환자의 종양 세포에서의 CD19 발현을 도시한다. CD138+ CD45dim 종양 세포를 CD19 (x-축) 및 CD38 (y-축)에 대해 염색하였다. 대략 1-2%의 종양 세포가 CD19 항원을 발현하였다.
도 9는 증가하는 농도의 이브루티닙 (10 nM, 100 nM, 및 1000 nM)으로 처리한 경우의 CART19 세포의 세포 증식 및 세포 크기를 보여주는 2개의 그래프이다.
도 10a 및 10b는 이브루티닙의 존재 또는 부재 하에서의 MCL 세포주에 의해 자극된 CART19 세포의 증식을 보여준다. 도 10a는 증가하는 농도의 이브루티닙 (10 nM, 100nM, 및 1000 nM)의 존재 또는 부재 하에서의 종양 세포주 MOLM14, JEKO-1, 및 RL로 자극된 CART19 세포의 증식을 보여주는 일련의 히스토그램이다. 세포를 CFSE에 의해 염색하고, 유동 세포측정법에 의해 분석하여, 증식성 세포의 백분율을 결정하고, 이를 각각의 히스토그램에서 막대로 나타내었다. 도 10b는 도 10a의 대표적인 히스토그램의 정량화이다.
도 11a 및 11b는 이브루티닙의 존재 또는 부재 하에서의 MCL 세포주에 의해 자극된 CART19 세포의 CD107a 탈과립화를 보여준다. 도 11a는 증가하는 농도의 이브루티닙 (10 nM, 100nM, 및 1000 nM)의 존재 또는 부재 하에서의 종양 세포주 (MOLM14, JEKO-1, 및 RL)로 자극된 CART19 세포의 CD107a 탈과립화를 보여주는 일련의 유동 세포측정 프로파일이다. CD107a 발현은 y-축에서 측정된다. 도 11b는 도 11a로부터의 결과의 정량화이다.
도 12는 증가하는 농도의 이브루티닙 (10 nM, 100nM, 및 1000 nM)의 존재 또는 부재 하에서의 종양 세포주 (MOLM14, JEKO-1, 및 RL)로 자극된 CART19 세포에 의한 세포질내 IL-2 생산을 보여주는 일련의 유동 세포측정 프로파일이다. y-축은 IL-2 발현을 나타낸다.
도 13은 증가하는 농도의 이브루티닙 (10 nM, 100nM, 및 1000 nM)의 존재 또는 부재 하에서의 종양 세포주 (MOLM14, JEKO-1, 및 RL)로 자극된 CART19 세포에 의한 세포질내 TNF-a 생산을 보여주는 일련의 유동 세포측정 프로파일이다. y-축은 TNF-a 발현을 나타낸다.
도 14는 증가하는 농도의 이브루티닙 (10 nM, 100nM, 및 1000 nM)의 존재 또는 부재 하에서의 종양 세포주 (MOLM14, JEKO-1, 및 RL)로 자극된 CART19 세포에 의한 세포질내 IFN-g 생산을 보여주는 일련의 유동 세포측정 프로파일이다. y-축은 IFN-g 발현을 나타낸다.
도 15는 증가하는 농도의 이브루티닙 (10 nM, 100nM, 및 1000 nM)의 존재 또는 부재 하에서의 종양 세포주 (MOLM14, JEKO-1, 및 RL)로 자극된 CART19 세포로부터의 시토카인 분비를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 16a, 16b, 16c, 16d, 16e, 및 16f는 종양 세포, MOLM14 (도 16a 및 16d), JEKO (도 16b 및 16e), 및 RL (도 16c 및 16f) 단독의 또는 증가하는 농도의 이브루티닙의 존재 하에서의 CART19 사멸을 보여주는 그래프이다. 비형질도입 (UTD) 또는 CART19 세포를 종양 세포와 함께 다양한 비로 인큐베이션하고, 세포의 총 유동 (도 16a, 16b, 및 16c) 및 사멸 세포의 백분율을 평가하였다 (16d, 16e, 및 16f).
도 17a, 17b, 및 17c는 세포의 총 수를 카운팅하기 위해 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같은 24시간 후의 종양 세포의 CART19 사멸의 그래프 표현이다. 종양 세포주 MOLM14 (도 17a), JEKO (도 17b), 및 RL (도 17c)을 비형질도입 (UTD) 또는 CART19 세포 단독 (단독)과, 또는 다양한 농도의 이브루티닙과 조합하여 인큐베이션하였다.
도 18a, 18b, 18c, 및 18d는 RL MCL 마우스 모델에서의 CART19 용량 설정의 그래프 표현이다. 종양 부담을 시간의 경과에 따라 생물발광 영상화 (BLI)에 의해 모니터링하였다 (도 18a 및 18b). 전체 생존을 시간의 경과에 따라 모니터링하였다 (도 18c).
도 19a 및 19b는 JEKO-1 MCL 마우스 모델에서의 CART19 용량 설정의 그래프 표현이다. 종양 크기를 시간의 경과에 따라 생물발광 영상화 (BLI)에 의해 모니터링하고 (도 19a), 전체 생존을 또한 시간의 경과에 따라 모니터링하였다 (도 19b).
도 20은 생체내 마우스 모델에서의 CART19 및 이브루티닙 조합 요법의 투여 및 평가를 위한 프로토콜을 보여주는 개략도이다.
도 21a, 21b, 21c, 및 21d는 형질도입 전에 세포를 이브루티닙으로 처리한 경우의 CART19 T 세포를 생성하는 것에 대한 PBMC의 형질도입 효율을 보여주는 그래프 표현이다. 비처리 PBMC를 형질도입 전 (도 21a) 및 형질도입 후 (도 21c)에 CAR19 발현에 대해 분석하였다. 이브루티닙-처리된 PBMC를 형질도입 전 (도 21b) 및 형질도입 후 (도 21d)에 CAR19 발현에 대해 분석하였다.
도 22a, 22b, 22c, 22d, 및 22e는 CD3/CD28-자극된 T 세포 증식에 대한 이브루티닙 처리의 효과의 그래프 표현이다. 증가하는 농도의 이브루티닙을 평가하였다: 비처리 (도 22a); 0.1 μM 이브루티닙 (도 22b); 0.5 μM 이브루티닙 (도 22c), 1 μM 이브루티닙 (도 22d), 및 5 μM 이브루티닙 (도 22e).
도 23은 이브루티닙이 CART19 세포독성에 영향을 미치지 않음을 입증하는 그래프 표현이다.
도 24는 이브루티닙 처리가 CART19 세포에서 TH1/TH2 시토카인의 편향을 촉진하지 않음을 입증하는 일련의 그래프 표현이다.
도 25a 및 25b는 이브루티닙의 연속 투여가 생체내에서 종양 세포를 제거하는데 있어서 CART19 기능에 영향을 미치지 않음을 보여주는 그래프 표현이다. 도 25a는 각각의 처리 요법 동안 말초 혈액에서 검출된 Nalm/6 세포를 보여준다. 도 25b는 이브루티닙 투여의 존재 또는 부재 하에 CART19를 제공받은 마우스의 생존을 비교한 카플란-마이어 생존 곡선을 보여준다.
도 26a, 26b, 26c, 26d, 26e, 및 26f는 이브루티닙 처리 동안 제시된 시점에서의 CLL 환자 세포 내 CAR19 형질도입의 효율을 보여주는 그래프 표현이다. 세포는 형질도입되지 않거나 (도 26a, 26b, 및 26c), 또는 CAR19로 형질도입되었다 (도 26d, 26e, 및 26f). GAM으로 염색된 세포는 CAR19를 발현하고, 각각의 프로파일에서 박스 내에 제시된다.
도 27은 환자의 패널로부터의 이브루티닙 처리 동안 제시된 시점에서 CAR19로 형질도입된 세포와 비교하여 비형질도입 세포의 증식률을 도시한 일련의 그래프 표현이다.
도 28a, 28b, 및 28c는 CLL 환자에서 이브루티닙 처리가 림프구증가증을 유도함을 입증하는 그래프 표현이다. 환자로부터의 세포를 제시된 시점에서 단리하였다: 기준선 (도 28a); 사이클 2, 제1일 (도 28b); 및 사이클 12, 제1일 (도 28c).
도 29a, 29b, 및 29c는 3명의 CLL 환자에서 이브루티닙 처리가 CLL에서 시간의 경과에 따라 종양 세포 상에서의 CD200 발현을 감소시킴을 입증하는 그래프 표현이다. 각각의 프로파일은 제시된 시점에 단리된 세포로부터의 CD200 발현 히스토그램의 오버레이를 함유한다: 기준선 (스크린); 사이클 2, 제1일; 및 사이클 12, 제1일.
도 30a, 30b, 및 30c는 CLL 환자에서 이브루티닙 처리가 시간의 경과에 따라 PD1+ T 세포의 빈도를 감소시킴을 입증하는 그래프 표현이다. 환자로부터 세포를 제시된 시점에 단리하였다: 기준선 (도 30a); 사이클 2, 제1일 (도 30b); 및 사이클 12, 제1일 (도 30c).
도 31a 및 31b는 이브루티닙 처리에 대한 MCL 세포주 RL (도 31a) 및 JEKO-1 (도 31b)의 감수성을 입증하는 그래프 표현이다.
도 32는 생체내 MCL 모델에서의 이브루티닙 처리의 효과를 입증하는 그래프 표현이다.
도 33a 및 b는 종양에 존재하는 CD19 발현 세포를 보여주는 호지킨 림프종의 면역조직화학적 분석의 영상이다. 도 33a는 1X 배율이고, 도 33b는 20X 배율이다.
도 34는 호지킨 림프종에 걸린 환자에서 CART19 처리의 치료 효능을 평가하기 위한 연구를 위한 실험 설정의 개략적 다이어그램이다.
도 35a, 35b, 35c, 및 35d는 T 세포 상에서의 PD1 및 CAR19 발현의 유동 세포측정 분석을 보여준다. 도 35a 및 35b는 CART 요법에 대한 완전 반응자 (CR) 또는 비-반응자 (NR)인 대상체로부터의 CD4+ T 세포 상에서의 PD-1 및 CAR19 발현의 분포를 입증하는 대표적인 유동 세포측정 프로파일이다. 도 35c는 CART 요법에 대해 상이한 반응을 갖는 대상체의 군으로부터의 CD4+ T 세포 집단 내 PD1 세포의 퍼센트를 보여주는 그래프이다. 도 35d는 CART 요법에 대해 상이한 반응을 갖는 대상체의 군으로부터의 CD8+ T 세포 집단 내 PD1 세포의 퍼센트를 보여주는 그래프이다.
도 36a 및 36b는 CART 요법에 대해 상이한 반응을 갖는 대상체의 군으로부터의 CD4 및 CAR19-발현 세포 (도 36a) 또는 CD8 및 CAR19-발현 세포 (도 36b) 내 PD1 발현의 분포를 보여준다.
도 37은 CART 요법에 대한 완전 반응자 (CR) 또는 비-반응자 (NR)인 대상체로부터의 T 세포 상에서의 PD1, CAR 19, LAG3, 및 TIM3 발현의 유동 세포측정 분석을 보여준다.
도 38a 및 38b는 CART 요법에 대해 상이한 반응을 갖는 대상체의 군으로부터의 PD1 및 LAG3 발현 (도 38a) 또는 PD1 및 TIM3 발현 (도 38b)의 분포를 보여준다.
도 39는 CART19 요법에 대한 반응을 입증하는, CART19를 제공받은 골수종 환자로부터의 형질 세포 IgA 면역표현형결정을 보여준다.
도 40a 및 40b는 위약과 비교하여 인플루엔자 백신 균주에 대한 역가의 증가를 보여주는 그래프이다. 도 40a에서, 백신접종 4주 후 위약 코호트에서의 증가 대비 3종의 인플루엔자 백신 균주 (H1N1 A/캘리포니아/ 07/2009, H3N2 A/빅토리아/210/2009, B/브리즈번/60/ 2008) 각각에 대한 인플루엔자 기하 평균 역가에서의 기준선을 초과한 증가가 치료 의향 집단 내 각각의 RAD001 투여 코호트에 대해 제시된다. 굵은 흑색 선은 연구의 1차 종점을 충족시키기 위해 3종의 인플루엔자 백신 균주 중 2종에 대해 충족될 것이 요구되는 위약 대비 역가의 1.2배 증가를 나타낸다. 별표 "*"는 위약 대비 GMT 역가의 증가가 적어도 80%의 사후 확률로 1을 초과한다는 것을 나타낸다. 도 40b는 기준선 인플루엔자 역가 <= 1:40인 대상체의 하위세트에 대한 도 40a에서와 동일한 데이터의 그래프이다.
도 41은 RAD001 농도 대 백신접종 4주 후의 각각의 인플루엔자 백신 균주에 대한 기하 평균 역가의 배수 증가의 산점도를 보여준다. 대상체에게 4주 동안 투여한 후 RAD001 농도 (투여 1시간 후)를 측정하였다. 약동학 측정치가 있는 모든 대상체가 분석 세트에 포함되었다. 기준선 대비 백신접종 4주 후의 기하 평균 역가의 배수 증가가 y 축에 제시된다.
도 42는 위약과 비교하여 이종 인플루엔자 균주에 대한 역가의 증가를 보여주는 그래프 표현이다. 백신접종 4주 후의 위약 코호트에서의 증가 대비 인플루엔자 백신 내에 함유되지 않은 2종의 이종 인플루엔자 균주 (A/H1N1 균주 A/뉴저지/8/76 및 A/H3N2 균주 A/빅토리아/361/11)에 대한 인플루엔자 기하 평균 역가의 기준선을 초과하는 증가가 치료 의향 집단 내의 각각의 RAD001 투여 코호트에 대해 제시된다. *는 위약 대비 역가의 증가가 적어도 80%의 사후 확률로 1을 초과한다는 것을 나타낸다.
도 43a 및 43b는 인플루엔자 백신접종 전 및 후의 IgG 및 IgM 수준의 그래프 표현이다. 항-A/H1N1/캘리포니아/07/2009 인플루엔자 IgG 및 IgM의 수준을 인플루엔자 백신접종 전 및 4주 후에 대상체로부터 수득한 혈청에서 측정하였다. RAD001 및 위약 코호트 사이에 항-H1N1 인플루엔자 IgG 및 IgM 수준에서의 기준선으로부터 백신접종 4주 후까지의 변화에서 어떠한 유의차도 검출되지 않았다 (크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 순위 합계 검정에 의해 모든 p 값 > 0.05).
도 44a, 44b, 및 44c는 RAD001 처리 후의 PD-1-양성 CD4 및 CD8의 퍼센트의 감소 및 PD-1-음성 CD4 T 세포의 증가의 그래프 표현이다. PD-1-양성 CD4, CD8 및 PD-1-음성 CD4 T 세포의 퍼센트를 PBMC 샘플의 FACS 분석에 의해 기준선, 연구 약물 처리 6주 후 (제6주), 및 연구 약물 중단 6주 후 및 인플루엔자 백신접종 4주 후 (제12주)에 결정하였다. 도 44a는 0.5mg/일 (n=25), 5mg/주 (n=29) 및 20 mg/주 (n=30)의 용량 수준으로 RAD001을 제공받은 코호트에서, 위약 코호트 (n=25)와 비교하여 각각 p=0.002 (0.02), p=0.003 (q=0.03), 및 p= 0.01 (q=0.05)로 제12주에 PD-1-양성 CD4 T 세포의 유의한 감소 (-37.1 - -28.5%)가 존재함을 보여준다. 도 44b는 0.5mg/일 (n=25), 5mg/주 (n=29) 및 20 mg/주 (n=30)의 용량 수준으로 RAD001을 제공받은 코호트 (n=109)에서, 위약 코호트 (n=25)와 비교하여 각각 p=0.01 (0.05), p=0.007 (q=0.04), 및 p= 0.01 (q=0.05)로 제12주에 PD-1-양성 CD8 T 세포의 유의한 감소 (-43.3 - -38.5%)가 존재함을 보여준다. 도 44c는 0.5mg/일 (n=25), 5mg/주 (n=29) 및 20 mg/주 (n=30)의 용량 수준으로 RAD001을 제공받은 코호트 (n=109)에서, 위약 코호트 (n=25)와 비교하여 각각 p=0.0007 (0.02), p=0.03 (q=0.07), 및 p= 0.03 (q=0.08)로 제12주에 PD-1-음성 CD4 T 세포의 유의한 증가 (3.0 - 4.9%)가 존재함을 보여준다.
도 45a 및 45b는 기준선 PD-1 발현에서의 차이에 대해 조정된 RAD001 처리 후의 PD-1-양성 CD4 및 CD8의 퍼센트의 감소 및 PD-1-음성 CD4 T 세포의 증가의 그래프 표현이다. PD-1-양성 CD4, CD8 및 PD-1-음성 CD4 T 세포의 퍼센트를 PBMC 샘플의 FACS 분석에 의해 기준선, 연구 약물 처리 6주 후 (제6주), 및 연구 약물 중단 6주 후 및 인플루엔자 백신접종 4주 후 (제12주)에 결정하였다. 도 45a는 풀링된 RAD 코호트 (n=84)에서, 위약 코호트 (n=25)와 비교하여 p=0.03 (q=0.13)으로 제6주에 PD-1+ CD4 T 세포의 30.2%의 유의한 감소를 보여준다. 위약 코호트와 비교하여 풀링된 RAD에서 제12주의 PD-1-양성 CD4 T 세포의 감소는 p=0.05 (q=0.19)로 32.7%이다. 도 45b는 풀링된 RAD001 코호트 (n=84)에서, 위약 코호트 (n=25)와 비교하여 p=0.008 (q=0.07)로 제6주에 PD-1-양성 CD8 T 세포의 37.4%의 유의한 감소를 보여준다. 위약 코호트와 비교하여 풀링된 RAD001에서 제12주의 PD-1-양성 CD8 T 세포의 감소는 p=0.066 (q=0.21)으로 41.4%이다. 도 45a 및 45b는 도 44a, 44b, 및 44c의 데이터이지만 도 45a 및 45b의 단일 RAD001-처리군으로 풀링된 도 44a, 44b, 및 44c의 상이한 RAD001 투여량 군에 의한 데이터를 나타낸다.
도 46은 RAD001에 반응한 고령 대상체에서의 운동 및 에너지의 증가를 도시한다.
도 47a 및 47b는 세포에서의 P70 S6K 활성에 대한 RAD001의 예측 효과를 도시한다. 도 47a는 더 높은 용량의 매주 및 매일 RAD001에 의한 P70 S6 키나제 억제를 도시하고; 도 47b는 더 낮은 용량의 매주 RAD001에 의한 P70 S6 키나제 억제를 도시한다.
도 48a 및 48b는 암 세포주 및 CART 세포 상에서의 IL-7 수용체 (CD127) 발현을 보여준다. CD127의 발현은 3종의 암 세포주: RL (외투 세포 림프종), JEKO (Jeko-1로도 공지됨, 외투 세포 림프종), 및 Nalm-6 (B-ALL)에서 유동 세포측정 분석에 의해 측정하였다 (도 48a). CD127 발현은 주입되어 NSG 마우스 내에서 순환 중인 CD3 양성 (CART) 세포에 대한 유동 세포측정 분석에 의해 측정하였다 (도 48b).
도 49a, 49b, 및 49c는 CART19 처리 및 후속 IL-7 처리 후의 항종양 반응을 보여준다. 제0일에 루시페라제-발현 외투 림프종 세포주 (RL-luc)를 생착한 NSG 마우스를 제6일에 다양한 투여량의 CART19 세포로 처리하고, 종양 부담을 모니터링하였다. 마우스를 4개의 군으로 나누고, 어떠한 CART19 세포도 제공하지 않거나, 0.5x106개의 CART19 세포 (CART19 0.5E6), 1x106개의 CART19 세포 (CART19 1E6), 또는 2x106개의 CART19 세포 (CART19 2E6)를 제공하였다. CART 처리 후 종양 부담을 생물발광 (평균 BLI)의 검출에 의해 측정하였다 (도 49a). 0.5x106개의 CART19 세포 (CART19 0.5E6) 또는 1x106개의 CART19 세포 (CART19 1E6)를 제공받은 마우스를 무작위화하여 재조합 인간 IL-7 (rhIL-7)를 제공하거나 또는 제공하지 않았다. 여기서 평균 생물발광 (BLI)에 의해 나타내어지는 종양 부담을, 제85일부터 IL-7로 처리된 도 49a로부터의 3마리의 마우스 (#3827, #3829, 및 #3815, 제시된 초기 CART19 용량을 제공받음)에 대해 모니터링하였다 (도 49b). IL-7을 IP 주사를 통해 매주 3회 투여하였다. 여기서 평균 생물발광 (BLI)에 의해 나타내어지는 종양 부담을, 제85일 전 (전) 및 제115일 후 (후)에, IL-7을 제공받지 않은 마우스 (CTRL)와 IL-7 처리를 제공받은 마우스 (IL-7) 사이에서 비교하였다 (도 49c).
도 50a 및 50b는 IL-7 처리 후의 T 세포 역학을 보여준다. 혈액에서 검출된 인간 T 세포의 수준을 IL-7을 제공받은 마우스 또는 대조군 마우스 각각에 대해 모니터링하였다 (도 50a). 혈액에서 검출된 CART19 세포 (CD3+ 세포)의 수준을 IL-7 처리의 개시 전 (전) 및 14일 후 (제14일)에 측정하였다 (도 50b).
도 51은 2종의 예시적인 RCAR 형상의 구조를 도시한다. 항원 결합 구성원은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 스위치 도메인을 포함한다. 세포내 결합 구성원은 스위치 도메인, 공동-자극 신호전달 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 2종의 형상은 본원에 기재된 제1 및 제2 스위치 도메인이 항원 결합 구성원 및 세포내 결합 구성원에 대해 상이한 배향으로 존재할 수 있음을 입증한다. 다른 RCAR 형상이 본원에 추가로 기재된다.
도 52a는 RL 세포주의 영상이다.
도 52b는 RL 1차 및 RL 세포주에서 CD19 및 CD5의 발현을 보여주는 유동 세포측정법 산점도의 세트이다.
도 52c는 형광 계내 혼성화 (FISH)에 의한 t(11;14) 전위를 보여주는 영상이다.
도 52d는 상이한 세포주에서의 이브루티닙 억제의 IC50 (백분율 MTT 전환에 의함)을 보여주는 그래프이다.
도 52e는 NOD-SCID-감마 쇄 녹아웃 (NSG) 마우스에서 RL 세포의 생착 및 생성된 종양 부담을 보여주는 영상 및 그래프의 세트이다.
도 52f는 마우스의 다양한 기관으로의 MCL 세포의 국재화를 보여주는 조직학적 영상의 세트이다.
도 52g는 MCL-RL 세포로 주사된 마우스의 조직학적 영상의 세트이다.
도 53a는 다양한 MCL 세포주에 노출된 경우의 CD107a+ CART19 세포의 수를 보여주는 그래프의 세트이다.
도 53b는 다양한 MCL 세포주에 노출된 경우에 CART19 세포에 의해 생산된 IL-2 및 TNF-알파의 양을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 53c는 다양한 이펙터:표적 세포 비에서의 CART19 세포에 의한 다양한 MCL 세포주의 퍼센트 사멸을 보여주는 그래프이다.
도 53d는 다양한 MCL 세포주에 노출된 CART19 세포에서의 증식의 척도인 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)의 양을 보여주는 그래프이다.
도 53e는 확장 전 및 후의 T 세포의 백분율을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 53f는 다양한 생체분자 (예를 들어, 시토카인)를 발현하거나 생산하는 비형질도입 또는 CAR-19 형질도입된 T 세포의 백분율을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 54a는 CART19 세포가 특이적 또는 비-특이적으로 자극된 경우에 인터류킨-2-유도성 T-세포 키나제 (ITK)의 활성화를 보여주는 영상의 세트이다.
도 54b는 다양한 농도의 이브루티닙과 함께 CART19 세포에 의한 CD107a 표면 발현 (탈과립화의 척도), IL-2 생산, 및 TNF-알파 생산을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 54c는 다양한 농도의 이브루티닙에 의한, 다양한 MCL 세포주에 노출된 CART19 세포에서의 CFSE의 양을 보여주는 히스토그램의 세트이다.
도 54d는 상이한 농도의 이브루티닙과 조합된 경우에 CART19 세포의 Th1 또는 Th2 상태의 지표로서 다양한 시토카인 및 바이오마커의 발현 또는 생산을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 54e는 상이한 농도의 이브루티닙과 조합된 경우에 다양한 MCL 세포주의 CART19 세포에 의한 백분율 사멸을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 54f는 다양한 농도의 이브루티닙과 조합된 경우에 CART19 세포의 고유한 세포독성 기능의 다양한 마커의 발현을 보여주는 막대 그래프이다.
도 55는 MCL-RL-주사된 마우스에 대한 CART19 및/또는 이브루티닙의 효과를 시험하기 위한 생체내 마우스 모델 실험 설정의 개략도이며, 판독은 발광 (종양 세포의 수의 척도)에 의한다.
도 56은 MCL-RL-주사된 마우스에 대한 CART19 및/또는 이브루티닙의 효과를 시험하기 위한 생체내 마우스 모델 실험 설정의 개략도이며, 판독은 발광 (종양 세포의 수의 척도)에 의한다.
도 57은 상이한 농도의 이브루티닙으로 처리된 마우스에서의 발광 (종양 세포 수의 척도) 및 처리 후 그의 전체 생존을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 58은 이브루티닙 또는 CART19 세포로 처리된 마우스에서의 발광 (종양 세포 수의 척도) 뿐만 아니라 처리 후 그의 전체 생존을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 59는 이브루티닙, 비형질도입 T 세포, 비형질도입 T 세포와 함께 이브루티닙, CART19 세포, 및 이브루티닙과 함께 CART19로 처리한 후의 마우스에서의 발광 (종양 세포 수의 척도)을 보여주는 그래프이다.
도 60은 이브루티닙 단독, CART19 세포 단독, 또는 이브루티닙과 CART19 세포의 조합으로 처리한 후의 마우스에서의 발광 (종양 세포 수의 척도)을 보여주는 그래프이다.
도 61a는 이브루티닙 및/또는 CART19 세포로 처리된 마우스에서 생산된 Th1 시토카인의 수준을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 61b는 이브루티닙 및/또는 CART19 세포로 처리된 마우스에서 생산된 Th2 시토카인의 수준을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 61c는 CART19 세포 또는 CART19 세포 플러스 이브루티닙으로 처리된 마우스에서의 증식 마커 Ki67을 발현하는 세포의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 61d는 CART19 세포 또는 CART19 세포 플러스 이브루티닙으로 처리된 마우스에서의 항아폽토시스 마커 BCL-2를 발현하는 세포의 백분율을 보여주는 그래프이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
용어 단수형태는 문장의 1개 또는 1개 초과의 (즉, 적어도 1개의) 문법적 대상을 나타낸다. 예로서, "요소"는 1개의 요소 또는 1개 초과의 요소를 의미한다.
측정가능한 값, 예컨대 양, 시간 기간 등을 언급하는 경우의 용어 "약"은, 명시된 값으로부터 ±20% 또는 일부 경우에 ±10%, 또는 일부 경우에 ±5%, 또는 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 변동을 포괄하는 의미이며, 그 이유는 이러한 변동이 개시된 방법의 수행에 적절하기 때문이다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"은 면역 이펙터 세포에서의 경우에 세포에게 표적 세포, 전형적으로 암 세포에 대한 특이성 및 세포내 신호 생성을 제공하는, 가장 단순한 실시양태에서는 전형적으로 2개인, 폴리펩티드의 세트를 지칭한다. 일부 실시양태에서, CAR은 적어도 하기 정의되는 바와 같은 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 자극 분자 및/또는 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인 (본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리펩티드의 세트는 서로 인접해있고, 예를 들어 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 있다 (예를 들어, 키메라 융합 단백질을 포함함). 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 세트는 서로 인접해있지 않고, 예를 들어 상이한 폴리펩티드 쇄 내에 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 세트는 이량체화 분자의 존재 시 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인과 커플링시킬 수 있는, 이량체화 스위치를 포함한다. 한 측면에서, 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 회합된 제타 쇄이다. 한 측면에서, 세포질 신호전달 도메인은 하기 정의된 바와 같은 적어도 1개의 공동자극 분자로부터 유래된 1개 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 공동자극 분자는 본원에 기재된 공동자극 분자, 예를 들어 4-1BB (즉, CD137), CD27 및/또는 CD28로부터 선택된다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 1개 이상의 공동자극 분자(들)로부터 유래된 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 1개 이상의 공동자극 분자(들)로부터 유래된 적어도 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노-말단 (N-ter)에서 임의적인 리더 서열을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에서 리더 서열을 추가로 포함하고, 여기서 리더 서열은 세포 프로세싱 및 CAR의 세포막으로의 국재화 동안 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv)으로부터 임의로 절단된다.
용어 "신호전달 도메인"은 제2 메신저를 생성하거나 또는 이러한 메신저에 반응하여 이펙터로서 기능함으로써 규정된 신호전달 경로를 통한 세포 활성을 조절하기 위해 정보를 세포 내로 전달하는 것에 의해 작용하는 단백질의 기능성 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "CD19"는 백혈병 전구체 세포 상에서 검출가능한 항원 결정기인 분화 클러스터 19 단백질을 지칭한다. 인간 및 뮤린 아미노산 및 핵산 서열은 공개 데이터베이스, 예컨대 진뱅크(GenBank), 유니프롯(UniProt) 및 스위스-프롯에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간 CD19의 아미노산 서열은 유니프롯/스위스-프롯 수탁 번호 P15391에서 확인할 수 있고, 인간 CD19를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 NM_001178098에서 확인할 수 있다. 본원에 사용된 "CD19"는 전장 야생형 CD19의 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이, 단편, 삽입, 결실 및 스플라이스 변이체를 포함하는 단백질을 포함한다. CD19는 예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병 및 비-호지킨 림프종을 비롯한 대부분의 B 계열 암 상에서 발현된다. CD19를 발현하는 다른 세포를 하기 "CD19의 발현과 연관된 질환"의 정의에서 제공한다. 이것은 또한 B 세포 전구체의 초기 마커이다. 예를 들어, 문헌 [Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)]을 참조한다. 한 측면에서, CART의 항원-결합 부분은 CD19 단백질의 세포외 도메인 내의 항원을 인식하고 결합한다. 한 측면에서, CD19 단백질은 암 세포 상에서 발현된다.
본원에 사용된 용어 "CD20"은 B 세포 상에서 검출가능한 것으로 공지된 항원 결정기를 지칭한다. 인간 CD20은 또한 막-관통 4-도메인, 서브패밀리 A, 구성원 1 (MS4A1)로도 불린다. 인간 및 뮤린 아미노산 및 핵산 서열은 공개 데이터베이스, 예컨대 진뱅크, 유니프롯 및 스위스-프롯에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간 CD20의 아미노산 서열은 수탁 번호 NP_690605.1 및 NP_068769.2에서 확인할 수 있고, 인간 CD20의 전사체 변이체 1 및 3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 수탁 번호 NM_152866.2 및 NM_021950.3에서 확인할 수 있다. 한 측면에서, CAR의 항원-결합 부분은 CD20 단백질의 세포외 도메인 내의 항원을 인식하고 결합한다. 한 측면에서, CD20 단백질은 암 세포 상에서 발현된다.
본원에 사용된 용어 "CD22"는 백혈병 전구체 세포 상에서 검출가능한 것으로 공지된 항원 결정기를 지칭한다. 인간 및 뮤린 아미노산 및 핵산 서열은 공개 데이터베이스, 예컨대 진뱅크, 유니프롯 및 스위스-프롯에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 이소형 1-5 인간 CD22의 아미노산 서열은 각각 수탁 번호 NP 001762.2, NP 001172028.1, NP 001172029.1, NP 001172030.1, 및 NP 001265346.1에서 확인할 수 있고, 인간 CD22의 변이체 1-5를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 수탁 번호 NM 001771.3, NM 001185099.1, NM 001185100.1, NM 001185101.1, 및 NM 001278417.1에서 확인할 수 있다. 한 측면에서, CAR의 항원-결합 부분은 CD22 단백질의 세포외 도메인 내의 항원을 인식하고 결합한다. 한 측면에서, CD22 단백질은 암 세포 상에서 발현된다.
본원에 사용된 용어 "ROR1"은 백혈병 전구체 세포 상에서 검출가능한 것으로 공지된 항원 결정기를 지칭한다. 인간 및 뮤린 아미노산 및 핵산 서열은 공개 데이터베이스, 예컨대 진뱅크, 유니프롯 및 스위스-프롯에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간 ROR1의 이소형 1 및 2의 아미노산 서열은 각각 수탁 번호 NP_005003.2 및 NP_001077061.1에서 확인할 수 있고, 이를 코딩하는 mRNA 서열은 각각 수탁 번호 NM_005012.3 및 NM_001083592.1에서 확인할 수 있다. 한 측면에서, CAR의 항원-결합 부분은 ROR1 단백질의 세포외 도메인 내의 항원을 인식하고 결합한다. 한 측면에서, ROR1 단백질은 암 세포 상에서 발현된다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날, 다중 또는 단일 쇄, 또는 무손상 이뮤노글로불린일 수 있고, 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 이뮤노글로불린 분자의 사량체일 수 있다.
용어 "항체 단편"은 항원의 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의해) 능력을 보유하는 항체의 적어도 하나의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, 디술피드-연결된 Fv (sdFv), VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대 sdAb (VL 또는 VH), 낙타류 VHH 도메인, 항체 단편, 예컨대 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편으로 형성된 다중-특이적 항체, 및 단리된 CDR 또는 항체의 다른 에피토프 결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내에 통합될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조). 항원 결합 단편은 또한 폴리펩티드, 예컨대 피브로넥틴 유형 III (Fn3)을 기초로 하여 스캐폴드 내로 그라프트될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기재한 미국 특허 번호 6,703,199 참조).
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 1개의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 1개의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 예를 들어 합성 링커, 예를 들어 짧은 가요성 폴리펩티드 링커를 통해 인접하여 연결되고, 단일 쇄 폴리펩티드로서 발현될 수 있고, 여기서 scFv는 그것이 유래된 무손상 항체의 특이성을 보유한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 scFv는 VL 및 VH 가변 영역을 임의의 순서로 가질 수 있고, 예를 들어 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 끝부분과 관련하여, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 또는 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR의 부분은 항원 결합 도메인이 예를 들어 단일 도메인 항체 단편 (sdAb), 단일 쇄 항체 (scFv), 인간화 항체 또는 이중특이적 항체를 포함하는 인접 폴리펩티드 쇄의 일부로서 발현되는 다양한 형태로 존재할 수 있다 (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). 한 측면에서, 본 발명의 CAR 조성의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("카바트(Kabat)" 넘버링 스킴), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("코티아(Chothia)" 넘버링 스킴)] 또는 그의 조합에 기재된 것을 비롯하여 널리 공지된 다수의 스킴 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 적어도 1개의 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예를 들어 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편을 지칭한다. 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 항체 및 항체 단편을 포괄한다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자이고, 예를 들어 이는 복수개의 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 포함하며, 여기서 복수개 중 제1 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖고, 복수개 중 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 제1 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다.
항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR의 부분은 항원 결합 도메인이 예를 들어 단일 도메인 항체 단편 (sdAb), 단일 쇄 항체 (scFv), 인간화 항체, 또는 이중특이적 항체를 포함하는 인접 폴리펩티드 쇄의 일부로서 발현되는 다양한 형태로 존재할 수 있다 (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). 한 측면에서, 본 발명의 CAR 조성의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
용어 "항체 중쇄"는 그의 자연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하고 통상적으로 항체가 속하는 부류를 결정하는, 폴리펩티드 쇄의 2개의 유형 중 더 큰 것을 지칭한다.
용어 "항체 경쇄"는 그의 자연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하는 폴리펩티드 쇄의 2개의 유형 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파 (κ) 및 람다 (λ) 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 예컨대 예를 들어 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체를 지칭한다. 상기 용어는 또한 항체를 코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하고, DNA 분자는 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 관련 기술분야에서 이용가능하고 널리 공지된 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된다.
용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이러한 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적 면역-적격 세포의 활성화, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 통상의 기술자는 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 비롯한 임의의 거대분자가 항원으로 역할을 할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 따라서, 통상의 기술자는 면역 반응을 도출하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가, 본원에 사용된 용어 "항원"을 코딩함을 이해할 것이다. 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요는 없음을 이해할 것이다. 본 발명은 1개 초과의 유전자의 부분적인 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니고, 이들 뉴클레오티드 서열은 목적하는 면역 반응을 도출하는 폴리펩티드를 코딩하기 위해 다양한 조합으로 배열됨이 분명하다. 또한, 통상의 기술자는 항원이 "유전자"에 의해 코딩될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원은 합성되어 생성될 수 있거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 또는 폴리펩티드 이외의 거대분자일 수 있음이 분명하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "항암 효과"는, 예를 들어 종양 부피의 감소, 암 세포의 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암 세포 증식의 감소, 암 세포 생존의 감소, 또는 암성 상태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 호전을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 수단에 의해 나타내질 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항암 효과"는 또한 먼저 암 발생의 예방에서 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타내질 수 있다. 용어 "항종양 효과"는 예를 들어 종양 부피의 감소, 종양 세포의 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소, 또는 종양 세포 생존의 감소를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 수단에 의해 나타내질 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.
용어 "자가"는 이후 개체에게 재도입될 예정인, 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "동종"은 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 2종 이상의 개체는 1개 이상의 유전자좌의 유전자가 동일하지 않을 때 서로 동종인 것으로 언급된다. 일부 측면에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종 물질은 항원과 상호작용하기에 유전적으로 충분히 다를 수 있다.
용어 "이종"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
용어 "암"은 이상 세포의 비제어 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암 세포는 국부로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 다양한 암의 예가 본원에 기재되어 있고, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 용어 "종양" 및 "암"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 예를 들어 둘 다의 용어는 고형 및 액상, 예를 들어 확산 또는 순환성 종양을 포괄한다. 본원에 사용된 용어 "암" 또는 "종양"은 전암성, 뿐만 아니라 악성 암 및 종양을 포함한다.
어구 "CD19의 발현과 연관된 질환"은 CD19의 발현과 연관된 질환, 또는 예를 들어 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양 또는 전암성 상태, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병을 비롯하여 CD19를 발현하거나 또는 임의의 시점에 발현했던 세포와 연관된 상태; 또는 CD19를 발현하는 세포와 연관된 비암 관련 적응증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 의심을 피하기 위해, CD19의 발현과 연관된 질환은, 예를 들어 CD19를 표적화하는 분자, 예를 들어 CD19 CAR을 사용한 치료로 인해 예를 들어 CD19 발현이 하향조절되었지만 이전에 CD19를 발현하였기 때문에, 현재 CD19를 발현하지 않은 세포와 연관된 상태를 포함할 수 있다. 한 측면에서, CD19의 발현과 연관된 암은 혈액암이다. 한 측면에서, 혈액암은 백혈병 또는 림프종이다. 한 측면에서, CD19의 발현과 연관된 암은 예를 들어 B-세포 급성 림프성 백혈병 (BALL), T-세포 급성 림프성 백혈병 (TALL), 급성 림프성 백혈병 (ALL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 급성 백혈병; 예를 들어, 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 림프성 백혈병 (CLL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 만성 백혈병을 포함하나 이에 제한되지는 않는 암 및 악성종양을 포함한다. CD19의 발현과 연관된 추가의 암 또는 혈액 상태는, 예를 들어 B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 상태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종 (MCL), 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 골수 혈액 세포의 비효과적인 생산 (또는 이형성증)과 연관된 혈액 상태의 다양한 집단인 "전백혈병"을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. CD19 발현과 연관된 추가의 질환은, 예를 들어 CD19의 발현과 연관된 비정형 및/또는 비전형 암, 악성종양, 전암성 상태 또는 증식성 질환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. CD19의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증은, 예를 들어 자가면역 질환 (예를 들어, 루푸스), 염증성 장애 (알레르기 및 천식) 및 이식을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 종양 항원-발현 세포는 종양 항원을 코딩하는 mRNA를 발현하거나 또는 임의의 시점에 발현하였다. 한 실시양태에서, 종양 항원-발현 세포는 종양 항원 단백질 (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체)을 생산하고, 종양 항원 단백질은 정상 수준 또는 감소된 수준으로 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 종양 항원-발현 세포는 종양 항원 단백질을 한 시점에 검출가능한 수준으로 생산하고, 이어서 실질적으로 검출가능하지 않은 종양 항원 단백질을 생산한다.
어구 "B-세포 항원의 발현과 연관된 질환"은 CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상의 발현과 연관된 질환, 또는 예를 들어 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양 또는 전암성 상태, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병을 비롯하여 CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상을 발현하거나 또는 임의의 시점에 발현했던 세포와 연관된 상태; 또는 CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상을 발현하는 세포와 연관된 비암 관련 적응증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 의심을 피하기 위해, B-세포 항원의 발현과 연관된 질환은, 예를 들어 B-세포 항원을 표적화하는 분자, 예를 들어 B-세포 표적화 CAR을 사용한 치료로 인해 예를 들어 항원 발현이 하향조절되었지만 이전에 항원을 발현하였기 때문에, 현재 B-세포 항원을 발현하지 않은 세포와 연관된 상태를 포함할 수 있다. 어구"B-세포 항원의 발현과 연관된 질환"은 본원에 기재된 바와 같은 CD19의 발현과 연관된 질환을 포함한다.
용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특징에 유의한 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 관련 기술분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체 또는 항체 단편 내에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 교체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 관련 기술분야에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 CAR 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있고, 변경된 CAR은 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 시험될 수 있다.
용어 "자극"은 자극 분자 (예를 들어, TCR/CD3 복합체 또는 CAR)가 그의 동족 리간드 (또는 CAR의 경우에 종양 항원)와 결합하여 신호 전달 사건, 예컨대 비제한적으로 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달 또는 적절한 NK 수용체 또는 CAR의 신호전달 도메인을 통한 신호 전달을 매개함으로써 유도되는 1차 반응을 지칭한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다.
용어 "자극 분자"는 면역 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 측면에 대한 자극 방식에서 면역 세포의 활성화를 조절하는 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, B 세포)에 의해 발현되는 분자를 지칭한다. 한 측면에서, 신호는 예를 들어 펩티드로 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 개시되는 1차 신호이고, 이것은 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포 반응의 매개로 이어진다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열 ("1차 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 본 발명에서 특히 유용한 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, 통상적인 FcR 감마 (FCER1G), Fc 감마 RIIa, FcR 베타 (Fc 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10, 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 특정 CAR에서, 본 발명의 임의의 1종 이상의 CAR 내의 세포내 신호전달 도메인은 세포내 신호전달 서열, 예를 들어 CD3-제타의 1차 신호전달 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 CAR에서, CD3-제타의 1차 신호전달 서열은 서열식별번호: 17로서 제공된 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다. 본 발명의 특정 CAR에서, CD3-제타의 1차 신호전달 서열은 서열식별번호: 43에 제공된 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 그의 표면 상에 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 복합체화된 외래 항원을 디스플레이하는 면역계 세포, 예컨대 보조 세포 (예를 들어, B-세포, 수지상 세포 등)를 지칭한다. T-세포는 그의 T-세포 수용체 (TCR)를 사용하여 이들 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 프로세싱하고, 이를 T-세포에 제시한다.
본원에 사용된 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR 함유 세포, 예를 들어 CART 세포의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 예를 들어 CART 세포에서 면역 이펙터 기능의 예는 시토카인의 분비를 비롯하여 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 1차 세포내 신호전달 도메인은 1차 자극, 또는 항원 의존성 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호, 또는 항원 비의존성 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, CART의 경우에, 1차 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체의 세포질 서열을 포함할 수 있고, 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 보조-수용체 또는 공동자극 분자로부터의 세포질 서열을 포함할 수 있다.
1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, 통상적인 FcR 감마 (FCER1G), Fc 감마 RIIa, FcR 베타 (Fc 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10, 및 DAP12로부터 유리된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타 쇄", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 진뱅크 수탁 번호 BAG36664.1로서 제공된 단백질 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로서 정의되고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화를 위해 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한 제타 쇄 또는 그의 기능적 유도체의 세포질 도메인으로부터의 아미노산 잔기로서 정의된다. 한 측면에서, 제타의 세포질 도메인은 진뱅크 수탁 번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164, 또는 그의 기능적 오르토로그인 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 포함한다. 한 측면에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열식별번호: 17로서 제공된 서열이다. 한 측면에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열식별번호: 43으로서 제공된 서열이다.
용어 "공동자극 분자"는 공동자극 리간드에 특이적으로 결합하여, T 세포에 의한 공동자극 반응, 예컨대 비제한적으로 증식을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극 분자는 효율적인 면역 반응에 기여하는 항원 수용체 이외의 다른 세포 표면 분자 또는 그의 리간드이다. 공동자극 분자는 MHC 부류 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체, 뿐만 아니라 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) , ICOS (CD278), 및 4-1BB (CD137)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 공동자극 분자의 추가의 예는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공동자극 분자는 다음 단백질 패밀리에서 나타내어질 수 있다: TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 및 활성화 NK 세포 수용체. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.
세포내 신호전달 도메인은 그것이 유래된 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 천연 세포내 신호전달 도메인, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다.
용어 "4-1BB"는 진뱅크 수탁 번호 AAA62478.2로서 제공된 아미노산 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 갖는 TNFR 수퍼패밀리의 구성원을 지칭하고; "4-1BB 공동자극 도메인"은 진뱅크 수탁 번호 AAA62478.2의 아미노산 잔기 214-255, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로서 정의된다. 한 측면에서, "4-1BB 공동자극 도메인"은 서열식별번호: 16으로 제공된 서열 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다.
본원에 사용된 용어 "면역 이펙터 세포"는 면역 반응, 예를 들어 면역 이펙터 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포의 예는 T 세포, 예를 들어 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 자연 킬러 T (NKT) 세포, 비만 세포 및 골수-유래 식세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "면역 이펙터 기능 또는 면역 이펙터 반응"은, 예를 들어 표적 세포의 면역 공격을 증진시키거나 촉진하는 면역 이펙터 세포의 기능 또는 반응을 지칭한한다. 예를 들어, 면역 이펙터 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸, 또는 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T 또는 NK 세포의 특성을 지칭한다. T 세포의 경우에, 1차 자극 및 공동자극은 면역 이펙터 기능 또는 반응의 예이다.
용어 "코딩하는"은 뉴클레오티드 (예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 규정된 서열 또는 아미노산의 규정된 서열 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 갖는, 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 기능하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA 내의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA, 또는 RNA는 그러한 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산할 경우에 단백질을 코딩한다. 그의 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에서 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다는 그러한 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 코딩하는 것으로서 지칭될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로 축중성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어구 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 본원에 기재된 바와 같이 특정한 생물학적 결과를 달성하는데 유효한 화합물, 제제, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의, 또는 그 내부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템의 외부로부터 도입되거나 외부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "발현"은 프로모터에 의해 유도되는 특정한 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부에 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 친양쪽성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "전달 벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 핵산의 세포 내로의 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예컨대 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 추가로 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 전달 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "발현 벡터"는 발현시킬 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드이거나 또는 리포솜 내에 포함됨) 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 관련 기술분야에 공지된 모든 것을 포함한다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로비리다에(Retroviridae) 패밀리의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 특유한 것이고; 유의한 양의 유전자 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있고, 따라서 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV, 및 FIV가 렌티바이러스의 모든 예이다.
용어 "렌티바이러스 벡터"는 특히 문헌 [Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]에서 제공되는 바와 같은 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터를 비롯한, 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는, 예를 들어 옥스포드 바이오메디카(Oxford BioMedica)로부터의 렌티벡터(LENTIVECTOR)® 유전자 전달 기술, 렌티겐(Lentigen)으로부터의 렌티맥스(LENTIMAX)™ 벡터 시스템 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비임상 유형의 렌티바이러스 벡터가 또한 이용가능하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다.
용어 "상동성" 또는 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 2개의 핵산 분자, 예컨대, 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 분자 둘 다 내의 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유된 경우; 예를 들어, 각각의 2개의 DNA 분자 내의 위치가 아데닌에 의해 점유된 경우에, 이들은 그 위치에서 상동이거나 동일하다. 2개의 서열 사이의 상동성은 매칭되는 또는 상동성 위치의 수의 직접적인 함수이고; 예를 들어, 2개의 서열 내의 위치의 절반 (예를 들어, 중합체 10개 서브유닛 길이 내의 5개의 위치)이 상동성일 경우에, 2개의 서열은 50% 상동성이고; 90%의 위치 (예를 들어, 10개 중 9개)가 매칭되거나 상동성일 경우에, 2개의 서열은 90% 상동성이다.
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대개, 인간화 항체 및 그의 항체 단편은 수용자의 상보성-결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 교체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체/항체 단편은 수용자 항체에서도 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 추가로 정밀화하고 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 그의 항체 단편은 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 그것에 상응하고, FR 영역의 모든 또는 유의한 부분은 인간 이뮤노글로불린 서열의 그것이다. 인간화 항체 또는 항체 단편은 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 그것을 포함할 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992]을 참조한다.
"완전 인간"은 전체 분자가 인간 기원이거나 또는 항체 또는 이뮤노글로불린의 인간 형태와 동일한 아미노산 서열로 이루어진 이뮤노글로불린, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "단리된"은 천연 상태로부터 변경되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 천연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 통상적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "전사 제어"는 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 후자의 발현을 야기한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 위치하는 경우에 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 서로 인접할 수 있고, 예를 들어 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우에, 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다.
용어 면역원성 조성물의 "비경구" 투여는, 예를 들어 피하 (s.c), 정맥내 (i.v.), 근육내 (i.m.), 또는 흉골내 주사, 종양내, 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 및 그의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명확하게 나타낸 서열 뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP, 및 상보적 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하고, 단백질 또는 펩티드 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 존재하지 않는다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 상기 용어는 관련 기술분야에서 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 통상적으로 지칭되는 짧은 쇄, 및 많은 종류가 존재하는, 일반적으로 관련 기술분야에서 단백질로 지칭되는 더 긴 쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 또는 그의 조합을 포함한다.
용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시하는데 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다.
용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 산물의 발현을 위해 필요한 핵산 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 다른 예에서 이 서열은 또한 인핸서 서열, 및 유전자 산물의 발현을 위해 필요한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.
용어 "구성적" 프로모터는, 유전자 산물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우에 유전자 산물이 세포의 대부분의 또는 모든 생리학적 조건 하에 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "유도성" 프로모터는, 유전자 산물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우에 실질적으로 프로모터에 상응하는 유도인자가 세포에 존재할 때에만 유전자 산물이 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "조직-특이적" 프로모터는, 유전자에 의해 코딩되거나 특정되는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우에 실질적으로 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 유전자 산물이 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
scFv의 문맥에서 사용된 용어 "가요성 폴리펩티드 링커" 또는 "링커"는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께 연결하기 위해 단독으로 또는 조합되어 사용되는 아미노산, 예컨대 글리신 및/또는 세린 잔기로 이루어진 펩티드 링커를 지칭한다. 한 실시양태에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이고, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n=1, n=2, n=3. n=4, n=5 및 n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10 (서열식별번호: 105)이다. 한 실시양태에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 (Gly4 Ser)4 (서열식별번호: 106) 또는 (Gly4 Ser)3 (서열식별번호: 107)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 (Gly2Ser), (GlySer) 또는 (Gly3Ser) (서열식별번호: 108)의 다중 반복부를 포함한다. 또한, 본원에 참조로 포함되는 WO2012/138475에 기재된 링커가 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본원에 사용된 5' 캡 (RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡으로도 불림)은 전사 출발 직후에 진핵 메신저 RNA의 "전면" 또는 5' 말단에 부가된 변형된 구아닌 뉴클레오티드이다. 5' 캡은 제1 전사되는 뉴클레오티드에 연결된 말단 기로 이루어진다. 그의 존재는 리보솜에 의한 인식 및 RNase로부터의 보호를 위해 중요하다. 캡 부가는 전사와 커플링되고, 각각 서로 영향을 미치도록 공동-전사 방식으로 발생한다. 전사 출발 직후에, 합성 중인 mRNA의 5' 말단은 RNA 폴리머라제와 회합된 캡-합성 복합체에 의해 결합된다. 이러한 효소 복합체는 mRNA 캡핑에 필요한 화학 반응을 촉매한다. 합성은 다단계 생화학적 반응으로서 진행된다. 캡핑 모이어티는 mRNA의 기능성, 예컨대 그의 안정성 또는 번역 효율을 조정하도록 변형될 수 있다.
본원에 사용된 "시험관내 전사된 RNA"는 시험관내에서 합성된 RNA, 바람직하게는 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 시험관내 전사된 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 생성된다. 시험관내 전사 벡터는 시험관내 전사된 RNA를 생성하기 위해 사용되는 주형을 포함한다.
본원에 사용된 "폴리(A)"는 폴리아데닐화에 의해 mRNA에 부착된 일련의 아데노신이다. 일시적 발현을 위한 구축물의 바람직한 실시양태에서, 폴리A는 50 내지 5000개 (서열식별번호: 109), 바람직하게는 64개 초과, 보다 바람직하게는 100개 초과, 가장 바람직하게는 300 또는 400개 초과이다. 폴리(A) 서열은 mRNA 기능성, 예컨대 국재화, 안정성 또는 번역 효율을 조정하기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 "폴리아데닐화"는 폴리아데닐릴 모이어티, 또는 그의 변형된 변이체의 메신저 RNA 분자에 대한 공유 연결을 지칭한다. 진핵 유기체 내에서, 대부분의 메신저 RNA (mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화된다. 3' 폴리(A) 테일은 효소, 폴리아데닐레이트 폴리머라제의 작용을 통해 프리-mRNA에 부가된 아데닌 뉴클레오티드 (종종 수백 개)의 긴 서열이다. 고등 진핵생물에서, 폴리(A) 테일은 특정 서열, 폴리아데닐화 신호를 함유하는 전사체 상에 부가된다. 폴리(A) 테일 및 그에 결합된 단백질은 mRNA를 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호하는 것을 돕는다. 폴리아데닐화는 또한 전사 종결, mRNA의 핵으로부터의 유출, 및 번역에 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA의 RNA로의 전사 직후에 핵에서 일어나지만, 추가로 세포질에서 추후 일어날 수도 있다. 전사가 종결된 후에, mRNA 쇄는 RNA 폴리머라제와 연관된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용을 통해 절단된다. 절단 부위는 통상적으로 절단 부위 근처의 염기 서열 AAUAAA의 존재를 특징으로 한다. mRNA가 절단된 후에, 아데노신 잔기는 절단 부위의 자유 3' 말단에 부가된다.
본원에 사용된 "일시적"은 수시간, 수일 또는 수주의 기간 동안의 비-통합된 트랜스진의 발현을 지칭하고, 여기서 발현 기간은 게놈 내로 통합되거나 숙주 세포 내의 안정한 플라스미드 레플리콘 내에 함유된 경우에 유전자의 발현을 위한 시간 미만이다.
용어 "신호 전달 경로"는 신호를 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로의 전달에서 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 어구 "세포 표면 수용체"는 신호를 수신하고 세포막을 가로질러 신호를 전달할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 도출될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유동물, 인간)를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "실질적으로 정제된" 세포는 다른 세포 유형이 본질적으로 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 그의 자연 발생 상태에서 정상적으로 회합되어 있는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 다른 경우에, 이 용어는 단순히 그의 천연 상태에서 자연적으로 회합되어 있는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 측면에서, 세포는 시험관내에서 배양된다. 다른 측면에서, 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 치료를 의미한다. 치료 효과는 질환 상태의 감소, 억제, 완화, 또는 근절에 의해 수득된다.
본원에 사용된 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적 치료를 의미한다.
본 발명의 문맥에서, "종양 항원" 또는 "과다증식성 장애 항원" 또는 "과다증식성 장애와 연관된 항원"은 특정 과다증식성 장애에 공통적인 항원을 지칭한다. 특정 측면에서, 본 발명의 과다증식성 장애 항원은 원발성 또는 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암 및 선암종, 예컨대 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 암으로부터 유래된다.
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염된, 형질전환된 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 1차 대상체 세포 및 그의 자손을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합한다"는 샘플 내에 존재하는 결합 파트너 (예를 들어, 자극 종양 항원) 단백질을 인식하고 결합하지만 샘플 내의 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체 또는 리간드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "조절가능한 키메라 항원 수용체 (RCAR)"는 RCARX 세포에서의 경우에 RCARX 세포에게 표적 세포, 전형적으로 암 세포에 대한 특이성 및 조절가능한 세포내 신호 생성 또는 증식을 제공하는 (이는 RCARX 세포의 면역 이펙터 특성을 최적화할 수 있음), 가장 단순한 실시양태에서는 전형적으로 2개인, 폴리펩티드의 세트를 지칭한다. RCARX 세포는 적어도 부분적으로는, 항원 결합 도메인에 의해 결합된 항원을 포함하는 표적 세포에 대한 특이성을 제공하기 위해 항원 결합 도메인에 의존한다. 한 실시양태에서, RCAR은 이량체화 분자의 존재 시 세포내 신호전달 도메인을 항원 결합 도메인과 커플링시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "막 앵커" 또는 "막 테더링 도메인"은 세포외 또는 세포내 도메인을 형질 막에 고정시키기에 충분한 폴리펩티드 또는 모이어티, 예를 들어 미리스토일 기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "스위치 도메인"은, 예를 들어 RCAR을 언급하는 경우에, 이량체화 분자의 존재 하에 또 다른 스위치 도메인과 회합하는 엔티티, 전형적으로 폴리펩티드-기반 엔티티를 지칭한다. 회합은 제1 스위치 도메인에 연결된, 예를 들어 그에 융합된 제1 엔티티, 및 제2 스위치 도메인에 연결된, 예를 들어 그에 융합된 제2 엔티티의 기능적 커플링을 생성한다. 제1 및 제2 스위치 도메인은 집합적으로 이량체화 스위치로서 지칭된다. 실시양태에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 서로 동일하고, 예를 들어 이들은 동일한 1차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 집합적으로 동종이량체화 스위치로 지칭된다. 실시양태에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 서로 상이하고, 예를 들어 이들은 상이한 1차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 집합적으로 이종이량체화 스위치로 지칭된다. 실시양태에서, 스위치는 세포내 존재한다. 실시양태에서, 스위치는 세포외 존재한다. 실시양태에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드-기반 엔티티, 예를 들어 FKBP 또는 FRB-기반 엔티티이고, 이량체화 분자는 소분자, 예를 들어 라파로그이다. 실시양태에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드-기반 엔티티, 예를 들어 myc 펩티드에 결합하는 scFv이고, 이량체화 분자는 폴리펩티드, 그의 단편, 또는 폴리펩티드의 다량체, 예를 들어 myc 리간드 또는 1개 이상의 myc scFv에 결합하는 myc 리간드의 다량체이다. 실시양태에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드-기반 엔티티, 예를 들어 myc 수용체이고, 이량체화 분자는 항체 또는 그의 단편, 예를 들어 myc 항체이다.
본원에 사용된 용어 "이량체화 분자"는, 예를 들어 RCAR을 언급할 때, 제1 스위치 도메인과 제2 스위치 도메인의 회합을 촉진하는 분자를 지칭한다. 실시양태에서, 이량체화 분자는 대상체에서 자연 발생되지 않거나, 또는 유의한 이량체화를 야기할 농도로 발생되지 않는다. 실시양태에서, 이량체화 분자는 소분자, 예를 들어 라파마이신 또는 라파로그, 예를 들어 RAD001이다.
용어 "생물학적 동등성"은 참조 용량 또는 참조량의 참조 화합물 (예를 들어, RAD001)에 의해 생성된 효과와 동등한 효과를 생성하는데 요구되는 참조 화합물 (예를 들어, RAD001) 이외의 작용제의 양을 지칭한다. 한 실시양태에서, 효과는 예를 들어 P70 S6 키나제 억제에 의해 측정된 바와 같은, 예를 들어 생체내 또는 시험관내 검정에서 평가된 바와 같은, 예를 들어 본원에 기재된 검정, 예를 들어 불레이(Boulay) 검정에 의해 측정된 바와 같은 mTOR 억제 수준, 또는 웨스턴 블롯에 의한 인산화 S6 수준의 측정이다. 한 실시양태에서, 효과는 세포 분류에 의해 측정된 바와 같은 PD-1 양성/PD-1 음성 T 세포의 비의 변경이다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제의 생물학적 동등 양 또는 용량은 참조 용량 또는 참조량의 참조 화합물과 동일한 수준의 P70 S6 키나제 억제를 달성하는 양 또는 용량이다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제의 생물학적 동등 양 또는 용량은 참조 용량 또는 참조량의 참조 화합물과 동일한 수준의 PD-1 양성/PD-1 음성 T 세포의 비의 변경을 달성하는 양 또는 용량이다.
용어 "낮은, 면역 증진, 용량"이 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 RAD001 또는 라파마이신, 또는 촉매 mTOR 억제제와 함께 사용된 경우에, 이는 예를 들어 P70 S6 키나제 활성의 억제에 의해 측정된 바와 같이 부분적이지만 전적이지는 않게 mTOR 활성을 억제하는 mTOR 억제제의 용량을 지칭한다. 예를 들어, P70 S6 키나제의 억제에 의해 mTOR 활성을 평가하는 방법이 본원에서 논의된다. 용량은 완전 면역 억제를 발생시키는데는 불충분하지만, 면역 반응을 증진시키는데 충분하다. 한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진, 용량의 mTOR 억제제는 PD-1 양성 T 세포의 개수의 감소 및/또는 PD-1 음성 T 세포의 개수의 증가, 또는 PD-1 음성 T 세포/PD-1 양성 T 세포의 비의 증가를 발생시킨다. 한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진, 용량의 mTOR 억제제는 나이브 T 세포의 개수의 증가를 발생시킨다. 한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진, 용량의 mTOR 억제제는 하기:
예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 하기 마커: CD62L고, CD127고, CD27+, 및 BCL2 중 1개 이상의 발현의 증가;
예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 KLRG1의 발현의 감소; 및
기억 T 세포 전구체, 예를 들어 하기 특징 중 어느 하나 또는 그의 조합을 갖는 세포의 개수의 증가: 증가된 CD62L고, 증가된 CD127고, 증가된 CD27+, 감소된 KLRG1, 및 증가된 BCL2
중 1개 이상을 발생시키며, 여기서 임의의 상기 기재된 변화는, 예를 들어 미처리 대상체와 비교하여, 예를 들어 적어도 일시적으로 발생한다.
본원에 사용된 "불응성"은 치료에 반응하지 않는 질환, 예를 들어 암을 지칭한다. 실시양태에서, 불응성 암은 치료의 시작 전 또는 시작 시 치료에 저항성일 수 있다. 다른 실시양태에서, 불응성 암은 치료 동안 불응성이 될 수 있다.
본원에 사용된 "완전 반응자"는 치료에 대해 완전 반응, 예를 들어 완전 완화를 나타내는 질환, 예를 들어 암에 걸린 대상체를 지칭한다. 완전 반응은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 체손(Cheson) 기준을 사용하여 확인될 수 있다.
본원에 사용된 "부분 반응자"는 치료에 대해 부분 반응, 예를 들어 부분 완화를 나타내는 질환, 예를 들어 암에 걸린 대상체를 지칭한다. 부분 반응은, 예를 들어 Cheson 기준을 사용하여 확인될 수 있다.
본원에 사용된 "비-반응자"는 치료에 대해 반응을 나타내지 않는 질환, 예를 들어 암에 걸린 대상체를 지칭하며, 예를 들어 환자는 안정 질환 또는 진행성 질환을 갖는다. 비-반응자는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 체손 기준을 사용하여 확인될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "재발"은 반응성 (예를 들어, 완전 반응 또는 부분 반응)의 초기 기간 후 질환 (예를 들어, 암)의 재출현을 지칭한다. 반응성의 초기 기간은 특정 역치 미만, 예를 들어 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만으로 떨어진 암 세포의 수준을 수반할 수 있다. 재출현은 특정 역치 초과, 예를 들어 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 초과로 상승한 암 세포의 수준을 수반할 수 있다. 재발은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 체손 기준을 사용하여 확인될 수 있다.
범위: 본 개시내용에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면은 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결함을 위한 것임을 이해하여야 하고, 본 발명의 범주에 대한 불변의 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위의 기재는 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 그러한 범위 내의 개별 수치 값을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 범위, 예컨대 1 내지 6의 기재는 구체적으로 개시된 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 그러한 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 또 다른 예로서, 95-99% 동일성과 같은 범위는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 것을 포함하고, 하위범위, 예컨대 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% 및 98-99% 동일성을 포함한다. 이것은 범위의 폭에 상관없이 적용된다.
설명
본원은 키메라 항원 수용체 (CAR) (예를 들어, B-세포 마커, 예컨대 CD19를 표적화하는 CAR)를 발현하는 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 사용하여 질환, 예컨대 암 (예를 들어, 혈액암 또는 다른 B 세포 악성종양)의 치료를 위해 사용하는 물질의 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 방법은, 특히, 본원에 기재된 CAR을 표적화하는 B 세포를 발현하는 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 또 다른 작용제, 예컨대 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, CAR 요법 (예를 들어, B-세포 표적화 CAR 요법) 및 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙의 조합의 높은 효능을 지지하는 실험를 제공한다. 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 CAR 요법의 조합은 키나제 억제제의 단독 요법, 또는 CAR-발현 세포의 투여, 또는 둘 다에 비해 조합 요법의 효능을 증가시킬 수 있다. 이들 유익한 효과는, 예를 들어 효능을 유지시키면서 키나제 억제제 또는 CAR-발현 세포, 또는 둘 다의 용량을 보다 낮게 하는 것일 수 있다. 본원의 결과는 광범위한 암, 예를 들어 혈액암 및 다른 B 세포 악성종양에 적용가능하다. 예를 들어, 이브루티닙은 대부분의 림프종에서 상승되는 BTK를 억제한다. CAR19를 발현하는 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 대부분의 B 세포 악성종양에서 발현되는 CD19 표면 발현을 갖는 암을 표적화한다. 대안적으로 또는 CAR19와 조합되어, 임의의 다른 B-세포 표적화 CAR (예를 들어, CD20, CD22, 또는 ROR1 중 1종 이상을 표적화하는 CAR)은 본원에 기재된 조합 요법에 사용될 수 있다. 따라서, CAR 요법 (예를 들어, CD19 CAR, CD20 CAR, CD22 CAR 또는 ROR1 CAR 요법 중 1종 이상)과 BTK 억제제 (예를 들어, 이브루티닙)의 조합은 림프종 (예를 들어, 호지킨 림프종), MCL, CLL, DLBCL, 및 다발성 골수종을 비롯하여 B 세포의 과다증식을 수반하는 광범위한 암을 치료하는데 적합하다.
본 발명에 따르면, 이브루티닙은 종양 덩이를 감소시킬 수 있고, 말초 혈액에서 신생물성 B 세포를 이동시킬 수 있다 (예를 들어, 본원의 실시예 8 참조). 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 특정 림프종, 예컨대 MCL은 림프절의 증식 중심에서의 암성 세포의 덩이를 특징으로 한다. CAR-발현 면역 이펙터 세포는 때때로 이들 빽빽하게 충전된 덩이를 관통하는데 어려움을 갖는다. 따라서, BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙은 종양 덩이를 감소시킬 수 있고, 말초 혈액에서 신생물성 B 세포를 이동시켜, 림프종 세포를 CAR-발현 세포에 대해 보다 취약하게 만들 수 있다.
대안적으로 또는 조합되어, BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙은 또한 CAR-발현 세포에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명은 이브루티닙 처리가 순환 CART19 세포의 수준을 증가시킴을 입증한다 (예를 들어, 실시예 8에 제시된 데이터 참조). 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 순환 CART19 세포의 수준의 증가는, 예를 들어 증가된 증식, T 세포 표현형의 변경, 또는 다른 요인의 결과일 수 있다. 예를 들어, 이브루티닙은 BTK와 상동성 키나제인 ITK를 억제할 수 있다. ITK는 T 세포에서 발현되고, 그의 억제는 T 세포 표현형을 변경시킬 수 있다. 키나제 억제제, 예컨대 이브루티닙으로의 처리는 T 세포 표현형을 Th2 표현형으로부터 Th1 표현형으로 변경시켜, T 세포 증식 능력을 증가시킬 수 있다. 대상체에게의 BTK 억제제의 사전-처리 또는 공-투여는 대상체에서 T 세포 증식 능력을 증가시켜 순환 CAR-발현 세포의 수준을 증가시킬 수 있다. 또한, BTK 억제제, 예를 들어 이브루티닙으로 사전-처리된 대상체는, CAR 제조를 위한 그의 분리반출술에서 더 높은 증식 능력을 갖는 T 세포 집단을 가질 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 B-세포 항원 (예를 들어, CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 단백질 중 1종 이상으로부터 선택됨)에의 특이적 결합을 위해 조작된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 다수의 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 CAR을 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, T 세포)를 제공하며, 여기서 CAR T 세포 ("CART")는 항암 특성을 나타낸다. 한 측면에서, 세포는 CAR로 형질전환되고, CAR은 세포 표면 상에 발현된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예를 들어, T 세포)는 CAR을 코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 이러한 실시양태에서, 세포는 CAR을 안정하게 발현할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포 (예를 들어, T 세포)는 CAR을 코딩하는 핵산, 예를 들어 mRNA, cDNA, DNA로 형질감염된다. 일부 이러한 실시양태에서, 세포는 CAR을 일시적으로 발현할 수 있다.
한 측면에서, CAR의 항-CD19 단백질 결합 부분은 scFv 항체 단편이다. 한 측면에서, 이러한 항체 단편은 동등한 결합 친화도를 보유하는, 예를 들어 그것이 유래되는 IgG 항체와 대등한 친화도로 동일한 항원에 결합한다는 점에서 기능적이다. 한 측면에서, 이러한 항체 단편은 통상의 기술자가 이해할 바와 같이 면역 반응의 활성화, 그의 표적 항원으로부터 신호-전달 개시의 억제, 키나제 활성의 억제 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 생물학적 반응을 제공한다는 점에서 기능적이다. 한 측면에서, CAR의 항-CD19 항원 결합 도메인은 그것이 유래되는 scFv의 뮤린 서열과 비교하여 인간화된 scFv 항체 단편이다. 한 측면에서, 모 뮤린 scFv 서열은 PCT 공개 WO2012/079000 (본원에 참조로 포함됨)에 제공되고 본원에 서열식별번호: 59로서 제공된 CAR19 구축물이다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 WO2012/079000에 기재되고 서열식별번호: 59에 제공된 scFv이다.
일부 측면에서, 본 발명의 항체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 내로 도입된다. 한 측면에서, CAR은 PCT 공개 WO2012/079000에 서열식별번호: 12로서 제공되고 본원에 서열식별번호: 58로서 제공된 폴리펩티드 서열을 포함하고, 여기서 scFv 도메인은 서열식별번호: 1-12로부터 선택된 1개 이상의 서열에 의해 치환된다. 한 측면에서, 서열식별번호: 1-12의 scFv 도메인은 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 뮤린 기원의 scFv 단편인 서열식별번호: 59의 scFv 도메인의 인간화 변이체이다. 이러한 마우스 scFv의 인간화는 마우스-특이적 잔기가 CART19 처리, 예를 들어 CAR19 구축물로 형질도입된 T 세포를 사용한 치료를 받는 환자에서 인간-항-마우스 항원 (HAMA) 반응을 유도할 수 있는 임상 세팅을 위해 바람직할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 CAR의 항-CD19 결합 도메인, 예를 들어 인간화 scFv 부분은 그의 서열이 포유동물 세포 내에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 트랜스진에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 본 발명의 전체 CAR 구축물은 그의 전체 서열이 포유동물 세포 내에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 트랜스진에 의해 코딩된다. 코돈 최적화는 코딩 DNA 내의 동의어 코돈 (즉, 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈)의 발생 빈도가 상이한 종에서 편향된다는 발견을 지칭한다. 이러한 코돈 축중성은 동일한 폴리펩티드가 다양한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있도록 한다. 다양한 코돈 최적화 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 적어도 미국 특허 번호 5,786,464 및 6,114,148에 개시된 방법을 포함한다.
한 측면에서, 인간화 CAR19는 서열식별번호: 1에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CAR19는 서열식별번호: 2에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CAR19는 서열식별번호: 3에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CAR19는 서열식별번호: 4에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CAR19는 서열식별번호: 5에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CAR19는 서열식별번호: 6에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CAR19는 서열식별번호: 7에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CAR19는 서열식별번호: 8에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CAR19는 서열식별번호: 9에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CAR19는 서열식별번호: 10에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CAR19는 서열식별번호: 11에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CAR19는 서열식별번호: 12에 제공된 scFv 부분을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 CAR은 특정 항체의 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 분자와 조합한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 세포내 신호전달 분자는 CD3-제타 쇄, 4-1BB 및 CD28 신호전달 모듈 및 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 측면에서, CD19 CAR은 서열식별번호: 31-42 중 1개 이상에 제공된 서열로부터 선택된 CAR을 포함한다. 한 측면에서, CD19 CAR은 서열식별번호: 31에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD19 CAR은 서열식별번호: 32에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD19 CAR은 서열식별번호: 33에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD19 CAR은 서열식별번호: 34에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD19 CAR은 서열식별번호: 35에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD19 CAR은 서열식별번호: 36에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD19 CAR은 서열식별번호: 37에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD19 CAR은 서열식별번호: 38에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD19 CAR은 서열식별번호: 39에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD19 CAR은 서열식별번호: 40에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD19 CAR은 서열식별번호: 41에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD19 CAR은 서열식별번호: 42에 제공된 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 CD19 CAR 조성물, 및 다른 질환 중에서, CD19를 발현하는 세포 또는 조직을 수반하는 암 또는 임의의 악성종양 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 의약 또는 방법에서의 그의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명의 CAR은 CD19-발현 정상 세포를 근절시키기 위해 사용될 수 있고, 이에 의해 세포 이식 전에 세포 조건화 요법으로서 사용하기 위해 적용가능할 수 있다. 한 측면에서, CD19-발현 정상 세포는 CD19-발현 정상 줄기 세포이고, 세포 이식은 줄기 세포 이식이다.
한 측면에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, T 세포)를 제공하고, 여기서 CAR-발현 세포, 예를 들어 CAR T 세포 ("CART")는 항암 특성을 나타낸다. 바람직한 항원은 CD19이다. 한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 부분 인간화 항-CD19 항체 단편을 포함한다. 한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하는 부분 인간화 항-CD19 항체 단편을 포함한다. 따라서, 본 발명은 인간화 항-CD19 결합 도메인을 포함하고 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포 내로 조작된 CD19-CAR 및 입양 요법을 위한 그의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, CD19-CAR은 CD137 (4-1BB) 신호전달 도메인, CD28 신호전달 도메인, CD3제타 신호 도메인, 및 그의 임의의 조합의 군으로부터 선택된 적어도 1개의 세포내 도메인을 포함한다. 한 측면에서, CD19-CAR은 CD137 (4-1BB) 또는 CD28 이외의 1개 이상의 공동-자극 분자(들)로부터의 적어도 1개의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
키메라 항원 수용체 (CAR)
본 발명은 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA 구축물을 포괄하며, 여기서 CAR은 B-세포 항원 (예를 들어 CD19, 예를 들어 인간 CD19)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 여기서 항체 단편의 서열은 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 위치한다. 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 제타 쇄을 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 도메인의 적어도 일부를 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 뮤린 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 인간화 항체 또는 항체 단편이다.
구체적 측면에서, 본 발명의 CAR 구축물은 서열식별번호: 1-12로 이루어진 군으로부터 선택된 scFv 도메인 또는 서열식별번호: 59의 scFV 도메인을 포함하고, 여기서 scFv는 예컨대 서열식별번호: 13에 제공된 임의적인 리더 서열이 선행하고, 이어서 예컨대 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 45 또는 서열식별번호: 47 또는 서열식별번호: 49에 제공된 임의적인 힌지 서열, 예컨대 서열식별번호: 15에 제공된 막횡단 영역, 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 51을 포함하는 세포내 신호전달 도메인 및 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 43을 포함하는 CD3 제타 서열이 뒤따를 수 있으며, 여기서 도메인은 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하여 단일 융합 단백질을 형성한다. 또한, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 59로 이루어진 군으로부터 선택된 각각의 scFv 단편의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 포함된다. 또한, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 59로 이루어진 군으로부터 선택된 각각의 scFv 단편, 및 서열식별번호: 13-17의 각각의 도메인, 플러스 본 발명의 코딩된 CD19CAR 융합 단백질의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 포함된다. 한 측면에서, 예시적인 CD19CAR 구축물은 임의적인 리더 서열, 세포외 항원 결합 도메인, 힌지, 막횡단 도메인, 및 세포내 자극 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 예시적인 CD19CAR 구축물은 임의적인 리더 서열, 세포외 항원 결합 도메인, 힌지, 막횡단 도메인, 세포내 공동자극 도메인 및 세포내 자극 도메인을 포함한다. 본 발명의 인간화 scFv 도메인을 포함하는 특이적 CD19 CAR 구축물은 서열식별번호: 31-42, 또는 뮤린 scFv 도메인은 서열식별번호: 59로서 제공된다.
전장 CAR 서열이 또한 표 7 및 표 3에 제시된 바와 같이 서열식별번호: 31-42 및 58로서 본원에 제공된다.
예시적인 리더 서열은 서열식별번호: 13으로서 제시된다. 예시적인 힌지/스페이서 서열은 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 45 또는 서열식별번호: 47 또는 서열식별번호: 49로서 제공된다. 예시적인 막횡단 도메인 서열은 서열식별번호: 15로서 제공된다. 4-1BB 단백질의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열식별번호: 16으로서 제공된다. CD27의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열식별번호: 51로서 제공된다. 예시적인 CD3제타 도메인 서열은 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 43으로서 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포괄하며, 여기서 핵산 분자는 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는, 예를 들어 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 1-12 및 58 중 1개 이상으로부터 선택된다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 61-72 및 59 중 1개 이상에서 제공되는 서열의 뉴클레오티드 잔기 64 내지 813에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 61의 뉴클레오티드 잔기 64 내지 813에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 62의 뉴클레오티드 잔기 64 내지 813에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 63의 뉴클레오티드 잔기 64 내지 813에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 64의 뉴클레오티드 잔기 64 내지 813에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 65의 뉴클레오티드 잔기 64 내지 813에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 66의 뉴클레오티드 잔기 64 내지 813에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 67의 뉴클레오티드 잔기 64 내지 813에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 68의 뉴클레오티드 잔기 64 내지 813에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 69의 뉴클레오티드 잔기 64 내지 813에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 70의 뉴클레오티드 잔기 64 내지 813에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 71의 뉴클레오티드 잔기 64 내지 813에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 72의 뉴클레오티드 잔기 64 내지 813에 의해 코딩된다.
한 측면에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포괄하며, 여기서 핵산 분자는 서열식별번호: 61-72 중 1개 이상으로부터 선택된 항-CD19 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 서열은 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. CAR에 사용될 수 있는 예시적인 세포내 신호전달 도메인은, 예를 들어 CD3-제타, CD28, 4-1BB 등의 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, CAR은 CD3-제타, CD28, 4-1BB 등의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 85-96 중 1개 이상으로부터 선택된다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 85이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 86이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 87이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 88이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 89이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 90이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 91이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 92이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 93이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 94이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 95이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 96이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 97이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 98이다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 99이다.
목적하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 관련 기술분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득할 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산은 클로닝하기 보다는 합성적으로 생산할 수 있다.
본 발명은 세포 내로 직접 형질도입될 수 있는 CAR을 발현하는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 구축물을 포함한다.
본 발명은 또한 세포 내로 직접 형질감염될 수 있는 RNA 구축물을 포함한다. 형질감염에 사용하기 위한 mRNA를 생성하는 방법은 특수하게 설계된 프라이머를 사용한 주형의 시험관내 전사 (IVT)에 이은 폴리A 첨가를 수반하며, 이는 3' 및 5' 비번역 서열 ("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 발현시킬 핵산, 및 폴리A 테일을 함유하는, 전형적으로 50-2000개 염기 길이의 구축물 (서열식별번호: 118)을 생산한다. 이와 같이 생산된 RNA는 상이한 유형의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 주형은 CAR에 대한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, RNA CAR 벡터는 전기천공에 의해 T 세포 내로 형질도입된다.
항원 결합 도메인
한 측면에서, 본 발명의 CAR은 달리 항원 결합 도메인으로도 언급되는 표적-특이적 결합 요소를 포함한다. 모이어티의 선택은 표적 세포의 표면을 규정하는 리간드의 유형 및 수에 따라 달라진다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 특정한 질환 상태와 연관된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명의 CAR 내의 항원 결합 도메인에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염, 자가면역 질환 및 암 세포와 연관된 것을 포함한다.
한 측면에서, CAR-매개 T-세포 반응은 목적하는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 CAR 내로 조작하는 방식에 의해 관심 항원으로 지시될 수 있다.
한 측면에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR의 부분은 CD19를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간 CD19를 표적화한다. 한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 문헌 [Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)]에 기재된 FMC63 scFv 단편과 동일하거나 유사한 결합 특이성을 갖는다. 한 실시양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 문헌 [Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)]에 기재된 scFv 단편을 포함한다.
항원 결합 도메인은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 뮤린 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 및 단일-도메인 항체, 예컨대 중쇄 가변 도메인 (VH), 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 낙타류 유래 나노바디의 가변 도메인 (VHH)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 그의 기능적 단편, 및 항원 결합 도메인으로 기능하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 대안적 스캐폴드, 예컨대 재조합 피브로넥틴 도메인 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 항원에 결합하는 임의의 도메인일 수 있다.
한 실시양태에서, CAR 분자는 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하는 항-CD19 결합 도메인, 예를 들어 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함하는 항-CD19 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 항-CD19 결합 도메인은 각각이 본원에 기재된 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 2개의 가변 중쇄 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 7 내) 뮤린 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 표 7 내) 뮤린 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 표 7의 아미노산 서열의 뮤린 경쇄 및 뮤린 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 7에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 7의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 7에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 7의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 59의 서열 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 표 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4이다 (서열식별번호: 53). scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역으로 존재할 수 있다.
일부 경우에, 항원 결합 도메인은, CAR이 궁극적으로 사용될 종과 동일한 종으로부터 유래되는 것이 유익하다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, CAR의 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인에 대한 인간 또는 인간화 잔기를 포함하는 것이 유익할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간화 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 본원에 기재된 뮤린 또는 인간화 항-CD19 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및/또는 본원에 기재된 뮤린 또는 인간화 항-CD19 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간화 항-CD19 결합 도메인은 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 본원에 기재된 뮤린 또는 인간화 항-CD19 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간화 항-CD19 결합 도메인은 각각이 본원에 기재된 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 2개의 가변 중쇄 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 3 내) 인간화 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 표 3 내) 인간화 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 3 내) 인간화 중쇄 가변 영역, 예를 들어 본원에 기재된 (예를 들어, 표 3 내) 적어도 2개의 인간화 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 표 3의 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 3에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 3의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 3에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 3의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 및 서열식별번호: 12로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 62, 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 64, 서열식별번호: 65, 서열식별번호: 66, 서열식별번호: 67, 서열식별번호: 68, 서열식별번호: 70, 서열식별번호: 71 및 서열식별번호: 72로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 표 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4 (서열식별번호: 53)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역으로 존재할 수 있다.
한 측면에서, 항원 결합 도메인 부분은 서열식별번호: 1-12로부터 선택된 1개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CAR은 서열식별번호: 31-42로부터 선택된 1개 이상의 서열로부터 선택된다. 일부 측면에서, 비-인간 항체는 인간화되고, 항체의 특정 서열 또는 영역은 인간에서 자연적으로 생산되는 항체 또는 그의 단편에 대한 유사성을 증가시키도록 변형된다.
인간화 항체는 CDR-그라프팅 (예를 들어, 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 유럽 특허 번호 EP 239,400; 국제 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 5,225,539, 5,530,101, 및 5,585,089 참조), 베니어링 또는 재표면화 (예를 들어, 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 유럽 특허 번호 EP 592,106 및 EP 519,596; 문헌 [Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; 및 Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973] 참조), 쇄 셔플링 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,565,332 참조), 및 예를 들어 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0042664, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0048617, 미국 특허 번호 6,407,213, 미국 특허 번호 5,766,886, 국제 공개 번호 WO 9317105, 문헌 [Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), 및 Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)]에 개시된 기술을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 종종, 프레임워크 영역 내의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경하기 위해, 예를 들어 개선시키기 위해 CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정한 위치에서 비통상적인 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,585,089 (Queen et al.); 및 [Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323] 참조).
인간화 항체 또는 항체 단편은 비인간인 공급원으로부터의 것에 남아있는 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로 지칭되고, 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 유래된다. 본원에 제공된 바와 같이, 인간화 항체 또는 항체 단편은 비인간 이뮤노글로불린 분자로부터의 1개 이상의 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하며, 여기서 프레임워크를 포함하는 아미노산 잔기는 완전히 또는 대부분 인간 배선으로부터 유래된다. 항체 또는 항체 단편의 인간화를 위한 다수의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써, 즉 CDR-그라프팅 (EP 239,400; PCT 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 4,816,567; 6,331,415; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 6,548,640, 그의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 의해 본질적으로 윈터(Winter)와 그의 동료들의 방법에 따라 수행될 수 있다 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)). 이러한 인간화 항체 및 항체 단편에서, 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 부분이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 바 있다. 인간화 항체는 종종 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 (FR) 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다. 항체 및 항체 단편의 인간화는 또한 베니어링 또는 재표면화 (EP 592,106; EP 519,596; 문헌 [Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); 및 Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)]) 또는 쇄 셔플링 (미국 특허 번호 5,565,332)에 의해 달성될 수 있고, 상기 참고문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
인간화 항체의 제조에 사용될 경쇄 및 중쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시킨다. 소위 "최적-피트" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 이어서, 설치류의 것과 가장 가까운 인간 서열이 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크 (FR)로서 수용된다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)], 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크가 여러 개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 (예를 들어, 그의 내용 전문이 본원에 참조로 포함되는 [Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조). 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역, 예를 들어 모든 4개의 프레임워크 영역은 VH4_4-59 배선 서열로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 프레임워크 영역은 예를 들어 상응하는 뮤린 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 59의)에서의 아미노산으로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형, 예를 들어 치환을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역, 예를 들어 모든 4개의 프레임워크 영역은 VK3_1.25 배선 서열로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 프레임워크 영역은 예를 들어 상응하는 뮤린 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 59의)에서의 아미노산으로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형, 예를 들어 치환을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR 조성의 부분은 표적 항원에 대한 고친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하면서 인간화된다. 본 발명의 한 측면에 따르면, 인간화 항체 및 항체 단편은 모 및 인간화 서열의 3-차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3-차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3-차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 예를 들어 후보 이뮤노글로불린이 표적 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 목적하는 항체 또는 항체 단편 특징, 예컨대 표적 항원에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 유입 서열로부터 선택 및 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적 및 가장 실질적으로 관여한다.
인간화 항체 또는 항체 단편은 원래의 항체와 유사한 항원 특이성, 예를 들어 본 발명에서 인간 CD19에 결합하는 능력을 보유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체 단편은 인간 CD19에 대한 개선된 친화도 및/또는 결합 특이성을 가질 수 있다.
한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편의 특정한 기능성 특색 또는 특성을 특징으로 한다. 예를 들어, 한 측면에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 CAR 조성의 부분은 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간 CD19에 대해 문헌 [Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)]에 기재된 FMC63 scFv와 동일하거나 유사한 결합 특이성을 갖는다. 한 측면에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항원 결합 도메인에 관한 것이며, 여기서 항체 결합 도메인은 CD19 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하고, 여기서 항체 또는 항체 단편은 서열식별번호: 1-12 또는 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄를 포함한다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 서열식별번호: 1-12 또는 서열식별번호: 59로부터 선택된 scFv의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, scFv는 리더 서열과 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. 한 측면에서, 리더 서열은 서열식별번호: 13으로서 제공된 폴리펩티드 서열이다.
한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 단편, 예를 들어 단일 쇄 가변 단편 (scFv)이다. 한 측면에서, 항-CD19 결합 도메인은 Fv, Fab, (Fab')2, 또는 이중-기능적 (예를 들어, 이중-특이적) 하이브리드 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)]). 한 측면에서, 본 발명의 항체 및 그의 단편은 야생형 또는 증진된 친화도로 CD19 단백질에 결합한다.
일부 경우에, scFv는 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-426 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). scFv 분자는 가요성 폴리펩티드 링커를 사용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생산될 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 링커 (예를 들어, Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv의 가변 영역이 폴딩하고 상호작용하는 방식에 크게 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 짧은 폴리펩티드 링커가 사용되면 (예를 들어, 5-10개 아미노산), 쇄내 폴딩이 방지된다. 쇄간 폴딩은 또한 2개의 가변 영역을 함께 모아 기능적 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 필요하다. 링커 배향 및 크기의 예에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448], 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, 및 PCT 공개 번호 WO2006/020258 및 WO2007/024715를 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
scFv는 그의 VL 및 VH 영역 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개, 또는 그 초과의 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열은 임의의 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 반복부의 세트, 예컨대 (Gly4Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다 (서열식별번호: 18). 한 실시양태에서, 링커는 (Gly4Ser)4 (서열식별번호: 106) 또는 (Gly4Ser)3 (서열식별번호: 107)일 수 있다. 링커 길이의 변동은 활성을 유지 또는 증진시켜 활성 연구에서 우월한 효능을 유도할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인 (또는 다른 부분 또는 전체 CAR)의 아미노산 서열은 변형될 수 있고, 예를 들어 본원에 기재된 아미노산 서열은 예를 들어 보존적 치환에 의해 변형될 수 있다. 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 비롯하여, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 관련 기술분야에서 정의되어 있다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 퍼센트 동일성은 동일한 2개 이상의 서열에 대한 것이다. 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 측정된 바와 같은 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응을 위해 비교 및 정렬했을 때, 2개의 서열이 명시된 백분율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 가질 경우에 (예를 들어, 명시된 영역에 걸쳐, 또는 명시되지 않은 경우에 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 임의로 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성), 2개의 서열은 "실질적으로 동일하다". 임의로, 동일성은 길이가 적어도 약 50개 뉴클레오티드 (또는 10개 아미노산)인 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 길이가 100 내지 500 또는 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 20, 50, 200개 또는 그 초과의 아미노산)인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 1개의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우에 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기초로 하여 참조 서열 대비 시험 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 (위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 (예를 들어, 문헌 [Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위해 적합한 알고리즘의 2가지 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이것은 각각 문헌 [Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 및 Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물 정보 센터를 통해 공중 이용가능하다.
2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하는, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된 문헌 [E. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com에서 이용가능) 내의 GAP 프로그램에 통합된 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453] 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 기능적으로 동등한 분자를 생성하는 출발 항체 또는 단편 (예를 들어, scFv) 아미노산 서열의 변형을 고려한다. 예를 들어, CAR 내에 포함된 항-CD19 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 VH 또는 VL은 항-CD19 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 출발 VH 또는 VL 프레임워크 영역의 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 보유하도록 변형될 수 있다. 본 발명은 기능적으로 동등한 분자를 생성하기 위해 전체 CAR 구축물의 변형, 예를 들어 CAR 구축물의 다양한 도메인의 1개 이상의 아미노산 서열의 변형을 고려한다. CAR 구축물은 출발 CAR 구축물의 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 보유하도록 변형될 수 있다.
이중특이적 CAR
한 실시양태에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 단백질 (또는 다랑체 단백질의 서브유닛) 상에 존재한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩된다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩되지 않는다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 항원, 예를 들어 상이한 단백질 (또는 다랑체 단백질의 상이한 서브유닛) 상에 존재한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 그의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 그의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 그의 단편을 포함한다.
막횡단 도메인
막횡단 도메인과 관련하여, 다양한 실시양태에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 부착된 막횡단 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 막횡단 도메인은 막횡단 영역에 인접한 1개 이상의 추가의 아미노산, 예를 들어 막횡단 도메인이 유래된 단백질의 세포외 영역과 회합된 1개 이상의 아미노산 (예를 들어, 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산) 및/또는 막횡단 도메인이 유래된 단백질의 세포내 영역과 회합된 1개 이상의 추가의 아미노산 (예를 들어, 세포내 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 막횡단 도메인은 CAR의 다른 도메인 중 1개와 회합된 것이고, 예를 들어 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 신호전달 도메인, 공동자극 도메인 또는 힌지 도메인이 유래된 동일한 단백질로부터의 것일 수 있다. 또 다른 측면에서, 막횡단 도메인은 CAR의 임의의 다른 도메인이 유래된 동일한 단백질로부터 유래되지 않는다. 일부 경우에, 막횡단 도메인은 이러한 도메인이 동일 또는 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 결합하는 것을 피하기 위해, 예를 들어 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 선택될 수 있거나 또는 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 한 측면에서, 막횡단 도메인은 CAR-발현 세포의 세포 표면 상의 또 다른 CAR과 동종이량체화가 가능하다. 상이한 측면에서, 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 동일한 CAR-발현 세포에 존재하는 천연 결합 파트너의 결합 도메인과의 상호작용을 최소화하기 위해 변형되거나 치환될 수 있다.
막횡단 도메인은 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우에, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 한 측면에서, 막횡단 도메인은 CAR이 표적에 결합할 때마다 세포내 도메인(들)에 신호전달을 할 수 있다. 본 발명에서 특히 유용한 막횡단 도메인은 적어도 예를 들어 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 적어도, 예를 들어 KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R α, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C의 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 막횡단 도메인은 힌지, 예를 들어 인간 단백질로부터의 힌지를 통해 CAR의 세포외 영역, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 힌지는 인간 Ig (이뮤노글로불린) 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지, IgD 힌지, GS 링커 (예를 들어, 본원에 기재된 GS 링커), KIR2DS2 힌지 또는 CD8a 힌지일 수 있다. 한 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 15의 막횡단 도메인을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다).
한 측면에서, 힌지 또는 스페이서는 IgG4 힌지를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 하기 아미노산 서열의 힌지를 포함한다:
Figure pat00001
일부 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 하기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 힌지를 포함한다:
Figure pat00002
한 측면에서, 힌지 또는 스페이서는 IgD 힌지를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 하기 아미노산 서열의 힌지를 포함한다:
Figure pat00003
일부 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 하기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 힌지를 포함한다:
Figure pat00004
한 측면에서, 막횡단 도메인은 재조합일 수 있고, 이 경우에 이는 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 우세하게 포함할 것이다. 한 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 재조합 막횡단 도메인의 각각의 말단에서 발견될 수 있다.
임의로, 2 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 CAR의 막횡단 도메인과 세포질 영역 사이에 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 특히 적합한 링커를 제공한다. 예를 들어, 한 측면에서, 링커는 GGGGSGGGGS (서열식별번호: 49)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (서열식별번호: 50)의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
한 측면에서, 힌지 또는 스페이서는 KIR2DS2 힌지를 포함한다.
세포질 도메인
CAR의 세포질 도메인 또는 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 일반적으로 CAR이 도입된 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 1종의 활성화를 담당한다. 용어 "이펙터 기능"은 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. T 세포의 이펙터 기능은 예를 들어 시토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 전문화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 통상적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 말단절단된 부분이 사용되는 정도로, 이러한 말단절단된 부분은 이펙터 기능 신호를 전달하는 한 무손상 쇄 대신 사용될 수 있다. 용어 세포내 신호전달 도메인은 따라서 이펙터 기능 신호를 전달하는데 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 말단절단된 부분을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 항원 수용체 관여 후에 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 T 세포 수용체 (TCR) 및 보조-수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 동일한 기능적 능력을 갖는 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 임의의 재조합 서열을 포함한다.
TCR을 통해 생성된 신호 단독은 T 세포의 완전한 활성화를 위해 불충분하고 2차 및/또는 공동자극 신호가 또한 필요함이 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 2개의 별개의 부류에 의해 매개된다고 언급될 수 있다: TCR을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것 (1차 세포내 신호전달 도메인) 및 2차 또는 공동자극 신호를 제공하기 위해 항원-비의존성 방식으로 작용하는 것 (2차 세포질 도메인, 예를 들어 공동자극 도메인).
1차 신호전달 도메인은 TCR 복합체의 1차 활성화를 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에 특히 유용한 1차 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, 통상적인 FcR 감마 (FCER1G), Fc 감마 RIIa, FcR 베타 (Fc 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10, 및 DAP12의 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3-제타의 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 1차 신호전달 도메인은 천연 ITAM 도메인과 비교하여 변경된 (예를 들어, 증가된 또는 감소된) 활성을 갖는 변형된 ITAM 도메인, 예를 들어 돌연변이된 ITAM 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 1차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM-함유 1차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 최적화된 및/또는 말단절단된 ITAM-함유 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 1차 신호전달 도메인은 1, 2, 3 또는 4개 또는 그 초과의 ITAM 모티프를 포함한다.
본 발명에 특히 유용한 1차 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 분자의 추가의 예는 DAP10, DAP12, 및 CD32의 것을 포함한다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 신호전달 도메인을 단독으로 포함할 수 있거나, 또는 본 발명의 CAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 신호전달 도메인(들)과 조합될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 쇄 부분 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 공동자극 분자는 항원 수용체 이외의 세포 표면 분자 또는 림프구의 항원에 대한 효율적인 반응을 위해 필요한 그의 리간드이다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 예를 들어, CD27 공동자극은 시험관내에서 인간 CART 세포의 확장, 이펙터 기능, 및 생존을 증진시키고, 생체내에서 인간 T 세포 지속성 및 항종양 활성을 증대시키는 것으로 입증된 바 있다 (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706). 이러한 공동자극 분자의 추가의 예는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), NKG2D, CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, 및 CD19a를 포함한다.
본 발명의 CAR의 세포질 부분 내의 세포내 신호전달 서열은 서로 무작위로 또는 명시된 순서로 연결될 수 있다. 임의로, 예를 들어 2 내지 10개 아미노산 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산) 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 세포내 신호전달 서열 사이에 연결을 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 글리신-세린 이중체가 적합한 링커로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 단일 아미노산, 예를 들어 알라닌, 글리신이 적합한 링커로서 사용될 수 있다.
한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 공동자극 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 실시양태에서, 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 공동자극 신호전달 도메인은 링커 분자, 예를 들어 본원에 기재된 링커 분자에 의해 분리된다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 분자는 글리신 잔기이다. 일부 실시양태에서, 링커는 알라닌 잔기이다.
한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, 4-1BB의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 16의 신호전달 도메인이다. 한 측면에서, CD3-제타의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 17의 신호전달 도메인이다.
한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD27의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, CD27의 신호전달 도메인은
Figure pat00005
의 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD27의 신호전달 도메인은 하기 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pat00006
한 측면에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 제2 CAR, 예를 들어 동일한 표적 (CD19) 또는 상이한 표적 (예를 들어, CD123 또는 메소텔린)에 대한 예를 들어 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 CAR을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포가 2개 이상의 상이한 CAR을 포함하는 경우에, 상이한 CAR의 항원 결합 도메인은 항원 결합 도메인이 서로 상호작용하지 않도록 하는 것일 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 CAR을 발현하는 세포는 제1 CAR의 항원 결합 도메인을, 예를 들어 제2 CAR의 항원 결합 도메인과 회합을 형성하지 않는 단편, 예를 들어 scFv로서 가질 수 있고, 예를 들어 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 VHH이다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 또 다른 작용제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 추가로 발현할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 억제 분자, 예를 들어 PD1는 일부 실시양태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 분자를 억제하는 작용제는 양성 신호를 세포에 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 예를 들어 억제 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타의 제1 폴리펩티드, 또는 임의의 이들의 단편 (예를 들어, 임의의 이들의 세포외 도메인의 적어도 일부), 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인) 포함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 PD1의 제1 폴리펩티드 또는 그의 단편 (예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부), 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다. PD1은 CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA를 또한 포함하는 CD28 패밀리의 수용체의 억제 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에서 발현된다 (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). PD1, PD-L1 및 PD-L2에 대한 2개의 리간드는 PD1에 결합 시 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 제시된 바 있다 (Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1은 인간 암에서 풍부하다 (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). 면역 억제는 PD1과 PD-L1의 국부 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있다.
한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자의 세포외 도메인 (ECD)을 포함하고, 예를 들어 프로그램화된 사멸 1 (PD1)은 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 41BB 및 CD3 제타 (본원에서 PD1 CAR로도 지칭됨)에 융합될 수 있다. 한 실시양태에서, PD1 CAR은 본원에 기재된 CD19 CAR과 조합되어 사용되는 경우에 T 세포의 지속성을 개선시킨다. 한 실시양태에서, CAR은 서열식별번호: 121에 밑줄로 표시한 PD1의 세포외 도메인을 포함하는 PD1 CAR이다. 한 실시양태에서, PD1 CAR은 서열식별번호: 121의 아미노산 서열을 포함한다.
Figure pat00007
한 실시양태에서, PD1 CAR은 하기 제공된 아미노산 서열 (서열식별번호: 119)을 포함한다.
Figure pat00008
한 실시양태에서, 작용제는 PD1 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 PD1 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, PD1 CAR에 대한 핵산 서열이 하기 제시되고, 여기서 PD1 ECD는 하기 서열식별번호: 120에서 밑줄로 표시된다.
Figure pat00009
또 다른 측면에서, 본 발명은 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART 세포의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, CAR-발현 세포의 집단은 상이한 CAR을 발현하는 세포의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, CAR-발현 세포의 집단은 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 제1 세포에 의해 발현된 CAR 내의 항-CD19 결합 도메인과 상이한, 상이한 항-CD19 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, CAR-발현 세포의 집단은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 항-CD19 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 CD19 이외의 표적 (예를 들어, CD123)에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포의 집단은 예를 들어 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 2차 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 집단 내의 적어도 1종의 세포는 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하고 제2 세포는 또 다른 작용제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 발현하는 세포의 집단을 제공한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 억제 분자는 예를 들어 일부 실시양태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타를 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 분자를 억제하는 작용제는 양성 신호를 세포에 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 예를 들어 억제 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타의 제1 폴리펩티드, 또는 임의의 이들의 단편 (예를 들어, 임의의 이들의 세포외 도메인의 적어도 일부), 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인) 포함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 PD1의 제1 폴리펩티드 또는 그의 단편 (예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부), 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
조절 가능한 키메라 항원 수용체
일부 실시양태에서, CAR 활성이 제어될 수 있는 조절가능한 CAR (RCAR)은 CAR 요법의 안전성 및 효능을 최적화하는데 바람직하다. CAR 활성을 조절할 수 있는 많은 방식이 존재한다. 예를 들어, 이량체화 도메인에 융합된 카스파제를 사용한 예를 들어 유도성 아폽토시스 (예를 들어, 문헌 [Di Stasa et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683] 참조)가 본 발명의 CAR 요법에서 안전성 스위치로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CAR을 발현하는 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 유도성 아폽토시스 스위치를 추가로 포함하며, 여기서 인간 카스파제 (예를 들어, 카스파제 9) 또는 변형된 버전이 조건화 이량체화를 가능하게 하는 인간 FKB 단백질의 변형에 융합된다. 소분자, 예컨대 라파로그 (예를 들어, AP 1903, AP20187)의 존재 하에, 유도성 카스파제 (예를 들어, 카스파제 9)가 활성화되고, 이는 본 발명의 CAR을 발현하는 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 신속한 아폽토시스 및 사멸로 이어진다. 카스파제 기반 유도성 아폽토시스 스위치 (또는 이러한 스위치의 1종 이상의 측면)의 예는, 예를 들어 US2004040047; US20110286980; US20140255360; WO1997031899; WO2014151960; WO2014164348; WO2014197638; WO2014197638에 기재되어 있고; 이는 모두 본원에 참조로 포함된다.
한 측면에서, RCAR은, 가장 단순한 실시양태에서는 전형적으로 2개인 폴리펩티드의 세트를 포함하며, 여기서 본원에 기재된 표준 CAR, 예를 들어 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인의 성분은 개별 폴리펩티드 또는 구성원 상에 분할된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 세트는 이량체화 분자의 존재 시 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CAR은, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO2014127261에 기재된 것과 같은 이량체화 스위치를 사용한다.
한 측면에서, RCAR은 2개의 폴리펩티드 또는 구성원: 1) 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 1차 세포내 신호전달 도메인, 및 제1 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성원; 2) 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 CD19를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원, 및 제2 스위치 도메인을 포함한다. 임의로, RCAR은 본원에 기재된 막횡단 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 세포내 신호전달 구성원에, 항원 결합 구성원에, 또는 둘 다에 배치될 수 있다. (달리 나타내지 않는 한, RCAR의 구성원 또는 성분이 본원에 기재된 경우에, 순서는 제공된 바와 같을 수 있지만, 다른 순서가 또한 포함된다. 다시 말해서, 한 실시양태에서 순서는 명세서에 제시된 바와 같지만, 다른 실시양태에서 순서는 상이할 수 있다. 예를 들어, 막횡단 영역의 한 측면 상의 요소의 순서는 예와 상이할 수 있고, 예를 들어 세포내 신호전달 도메인에 대해 스위치 도메인의 배치는 상이하고, 예를 들어 반대로 될 수 있다).
한 실시양태에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 세포내 또는 세포외 이량체화 스위치를 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 이량체화 스위치는 예를 들어 제1 및 제2 스위치 도메인이 동일한 동종이량체화 스위치, 또는 예를 들어 제1 및 제2 스위치 도메인이 서로 상이한 이종이량체화 스위치일 수 있다.
실시양태에서, RCAR은 "다중 스위치"를 포함할 수 있다. 다중 스위치는 이종이량체화 스위치 도메인 또는 동종이량체화 스위치 도메인을 포함할 수 있다. 다중 스위치는 제1 구성원, 예를 들어 항원 결합 구성원, 및 제2 구성원, 예를 들어 세포내 신호전달 구성원 상에 독립적으로 복수의, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 스위치 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 구성원은 복수의 제1 스위치 도메인, 예를 들어 FKBP-기반 스위치 도메인을 포함할 수 있고, 제2 구성원은 복수의 제2 스위치 도메인, 예를 들어 FRB-기반 스위치 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 구성원은 제1 및 제2 스위치 도메인, 예를 들어 FKBP-기반 스위치 도메인 및 FRB-기반 스위치 도메인을 포함할 수 있고, 제2 구성원은 제1 및 제2 스위치 도메인, 예를 들어 FKBP-기반 스위치 도메인 및 FRB-기반 스위치 도메인을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 구성원은 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 1차 세포내 신호전달 도메인 및 1개 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 1개 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 본원에 기재된, 예를 들어 41BB, CD28, CD27, ICOS, 및 OX40으로부터 선택된 복수의, 예를 들어 2 또는 3개의 공동자극 신호전달 도메인을 포함하고, 실시양태에서 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 세포외로부터 세포내 방향으로 하기 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다: 41BB-CD27; 41BB-CD27; CD27-41BB; 41BB-CD28; CD28-41BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-41BB; 또는 41BB-CD28. 이러한 실시양태에서, 세포내 결합 구성원은 CD3제타 도메인을 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, RCAR은 (1) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 2개의 공동자극 도메인 및 제1 스위치 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원; 및 (2) 막횡단 도메인 또는 막 테더링 도메인 및 적어도 1개의 1차 세포내 신호전달 도메인, 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태는 항원 결합 구성원이 CAR 세포의 표면에 테더링되지 않은 RCAR을 제공한다. 이는 세포를 항원 결합 구성원을 코딩하는 서열로 형질전환시키지 않으면서, 세포내 신호전달 구성원을 갖는 세포가 1개 이상의 항원 결합 도메인과 편리하게 쌍형성되도록 한다. 이러한 실시양태에서, RCAR은 1) 제1 스위치 도메인, 막횡단 도메인, 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 1차 세포내 신호전달 도메인, 및 제1 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성원; 및 2) 항원 결합 도메인, 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원 (여기서 항원 결합 구성원은 막횡단 도메인 또는 막 테더링 도메인을 포함하지 않고, 임의로, 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않음)을 포함한다. 일부 실시양태에서, RCAR은 3) 제2 항원 결합 도메인, 예를 들어 항원 결합 도메인에 의해 결합되는 것과 상이한 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인; 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 구성원을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 항원 결합 구성원이 이중특이적 활성화 및 표적화 능력을 포함하는 RCAR이 본원에 제공된다. 이러한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 복수의, 예를 들어 2, 3, 4, 또는 5개의 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 항원 결합 도메인은 표적 항원, 예를 들어 상이한 항원 또는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 항원 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 복수의 항원 결합 도메인은 탠덤으로 존재하고, 임의로 링커 또는 힌지 영역이 각각의 항원 결합 도메인 사이에 배치된다. 적합한 링커 및 힌지 영역이 본원에 기재되어 있다.
한 실시양태는 증식의 전환을 가능하게 하는 형상을 갖는 RCAR을 제공한다. 이러한 실시양태에서, RCAR은 1) 임의로, 막횡단 도메인 또는 막 테더링 도메인; 예를 들어 41BB, CD28, CD27, ICOS, 및 OX40으로부터 선택된 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인, 및 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성원; 및 2) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 1차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3제타 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원 (여기서 항원 결합 구성원은 스위치 도메인을 포함하지 않거나, 또는 세포내 신호전달 구성원 상의 스위치 도메인과 이량체화하는 스위치 도메인을 포함하지 않음)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 구성원은 동종이량체화 스위치로부터의 스위치 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 구성원은 이종이량체화 스위치의 제1 스위치 도메인을 포함하고, RCAR은 이종이량체화 스위치의 제2 스위치 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 구성원을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 제2 세포내 신호전달 구성원은 세포내 신호전달 구성원과 동일한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 이량체화 스위치는 세포내에 존재한다. 한 실시양태에서, 이량체화 스위치는 세포외에 존재한다.
본원에 기재된 임의의 RCAR 형상에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 FKBP-FRB-기반 스위치를 포함한다.
또한, 본원에 기재된 RCAR을 포함하는 세포가 본원에 제공된다. RCAR을 발현하도록 조작된 임의의 세포가 RCARX 세포로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서 RCARX 세포는 T 세포이고, RCART 세포로서 지칭된다. 한 실시양태에서, RCARX 세포는 NK 세포이고, RCARN 세포로서 지칭된다.
또한, RCAR 코딩 서열을 포함하는 핵산 및 벡터가 본원에 제공된다. RCAR의 다양한 요소를 코딩하는 서열은 동일한 핵산 분자, 예를 들어 동일한 플라스미드 또는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 배치될 수 있다. 한 실시양태에서, (i) 항원 결합 구성원을 코딩하는 서열 및 (ii) 세포내 신호전달 구성원을 코딩하는 서열은 동일한 핵산, 예를 들어 벡터 상에 존재할 수 있다. 상응하는 단백질의 생산은, 예를 들어 개별 프로모터의 사용에 의해, 또는 비시스트론 전사 산물 (단일 번역 산물의 절단에 의해 또는 2개의 개별 단백질 산물의 번역에 의해 2개의 단백질의 생산을 발생시킬 수 있음)의 사용에 의해 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 절단가능한 펩티드를 코딩하는 서열, 예를 들어 P2A 또는 F2A 서열은 (i)과 (ii) 사이에 배치된다. 한 실시양태에서, IRES, 예를 들어 EMCV 또는 EV71 IRES를 코딩하는 서열이 (i)과 (ii) 사이에 배치된다. 이들 실시양태에서, (i) 및 (ii)는 단일 RNA로서 전사된다. 한 실시양태에서, (i) 및 (ii)가 개별 mRNA로서 전사되도록, 제1 프로모터는 (i)에 작동가능하게 연결되고, 제2 프로모터는 (ii)에 작동가능하게 연결된다.
대안적으로, RCAR의 다양한 요소를 코딩하는 서열은 상이한 핵산 분자, 예를 들어 상이한 플라스미드 또는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 배치될 수 있다. 예를 들어, (i) 항원 결합 구성원을 코딩하는 서열은 제1 핵산, 예를 들어 제1 벡터 상에 존재할 수 있고, (ii) 세포내 신호전달 구성원을 코딩하는 서열은 제2 핵산, 예를 들어 제2 벡터 상에 존재할 수 있다.
이량체화 스위치
이량체화 스위치는 비-공유 또는 공유일 수 있다. 비-공유 이량체화 스위치에서, 이량체화 분자는 스위치 도메인 사이의 비-공유 상호작용을 촉진한다. 공유 이량체화 스위치에서, 이량체화 분자는 스위치 도메인 사이의 공유 상호작용을 촉진한다.
한 실시양태에서, RCAR은 FKBP/FRAP 또는 FKBP/FRB-기반 이량체화 스위치를 포함한다. FKBP12 (FKBP 또는 FK506 결합 단백질)은 천연 산물 면역억제 약물인 라파마이신에 대한 초기 세포내 표적으로서 기능하는 풍부한 세포질 단백질이다. 라파마이신은 FKBP 및 대형 PI3K 상동체 FRAP (RAFT, mTOR)에 결합한다. FRB는 FKBP-라파마이신 복합체에 결합하는데 충분한 FRAP의 93개의 아미노산 부분이다 (Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51.)
실시양태에서, FKBP/FRAP, 예를 들어 FKBP/FRB 기반 스위치는 이량체화 분자, 예를 들어 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 사용할 수 있다.
FKBP의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pat00010
실시양태에서, FKBP 스위치 도메인은 라파마이신 또는 라파로그의 존재 하에 FRB 또는 그의 단편 또는 유사체에 결합하는 능력을 갖는 FKBP의 단편, 예를 들어
Figure pat00011
인, 서열식별번호: 122의 밑줄친 부분을 포함할 수 있다.
FRB의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pat00012
본원에 사용된 용어 "FKBP/FRAP, 예를 들어 FKBP/FRB 기반 스위치"는 라파마이신 또는 라파로그, 예를 들어 RAD001의 존재 하에 FRB, 또는 그의 단편 또는 유사체에 결합하는 능력을 갖는 FKBP 단편 또는 그의 유사체를 포함하고, 서열식별번호: 122 또는 123의 FKBP 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖거나 또는 그와 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 제1 스위치 도메인; 및 라파마이신 또는 라파로그의 존재 하에 FRB, 또는 그의 단편 또는 유사체에 결합하는 능력을 갖는 FRB 단편 또는 그의 유사체를 포함하고, 서열식별번호: 124의 FRB 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖거나 또는 그와 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 제2 스위치 도메인을 포함하는 이량체화 스위치를 지칭한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 RCAR은 서열식별번호: 122 (또는 서열식별번호: 123)에 개시된 아미노산 잔기를 포함하는 1개의 스위치 도메인 및 서열식별번호: 124에 개시된 아미노산 잔기를 포함하는 1개의 스위치 도메인을 포함한다.
실시양태에서, FKBP/FRB 이량체화 스위치는 FRB-기반 스위치 도메인, 예를 들어 변형된 FRB 스위치 도메인, FKBP-기반 스위치 도메인과 이량체화 분자, 예를 들어 라파마이신 또는 라파로그, 예를 들어 RAD001 사이에 변경된, 예를 들어 증진된 복합체 형성을 나타내는 변형된 FRB 스위치 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 FRB 스위치 도메인은 아미노산 위치(들) L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105, 및 F2108에서의 돌연변이로부터 선택된, 1개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 돌연변이를 포함하며, 여기서 야생형 아미노산은 임의의 다른 자연-발생 아미노산으로 돌연변이된다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 E2032에서 돌연변이를 포함하고, 여기서 E2032는 페닐알라닌 (E2032F), 메티오닌 (E2032M), 아르기닌 (E2032R), 발린 (E2032V), 티로신 (E2032Y), 이소류신 (E2032I), 예를 들어 서열식별번호: 125, 또는 류신 (E2032L), 예를 들어 서열식별번호: 126으로 돌연변이된다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 T2098에서 돌연변이를 포함하고, 여기서 T2098은 페닐알라닌 (T2098F) 또는 류신 (T2098L), 예를 들어 서열식별번호: 127로 돌연변이된다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 E2032 및 T2098에서 돌연변이를 포함하고, 여기서 E2032는 임의의 아미노산으로 돌연변이되고, 여기서 T2098은 임의의 아미노산, 예를 들어 서열식별번호: 128로 돌연변이된다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 E2032I 및 T2098L 돌연변이, 예를 들어 서열식별번호: 129를 포함한다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 E2032L 및 T2098L 돌연변이, 예를 들어 서열식별번호: 130을 포함한다.
<표 13> 이량체화 분자에 대해 증가된 친화도를 갖는 예시적인 돌연변이체 FRB
Figure pat00013
다른 적합한 이량체화 스위치는 GyrB-GyrB 기반 이량체화 스위치, 지베렐린-기반 이량체화 스위치, 태그/결합제 이량체화 스위치, 및 할로-태그/스냅-태그 이량체화 스위치를 포함한다. 본원에 제공된 안내에 따라, 이러한 스위치 및 관련 이량체화 분자는 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
이량체화 분자
스위치 도메인 사이의 회합은 이량체화 분자에 의해 촉진된다. 이량체화 분자의 존재 하에, 스위치 도메인 사이의 상호작용 또는 회합은 제1 스위치 도메인과 회합된, 예를 들어 융합된 폴리펩티드와 제2 스위치 도메인과 회합된, 예를 들어 융합된 폴리펩티드 사이의 신호 전달을 허용한다. 비-제한적 수준의 이량체화 분자의 존재 하에, 신호 전달은 예를 들어 본원에 기재된 시스템에서 측정 시 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 5, 10, 50, 100 배 증가된다.
라파마이신 및 라파마이신 유사체 (때때로 라파로그로 지칭됨), 예를 들어 RAD001은 본원에 기재된 FKBP/FRB-기반 이량체화 스위치에서 이량체화 분자로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이량체화 분자는 라파마이신 (시롤리무스), RAD001 (에베롤리무스), 조타롤리무스, 템시롤리무스, AP-23573 (리다포롤리무스), 비올리무스 및 AP21967로부터 선택될 수 있다. FKBP/FRB-기반 이량체화 스위치와 함께 사용하기에 적합한 추가의 라파마이신 유사체는 섹션 표제 "조합 요법", 또는 서브섹션 표제 "예시적인 mTOR 억제제"에 추가로 기재되어 있다.
스플릿 CAR
일부 실시양태에서, CAR-발현 세포는 스플릿 CAR을 사용한다. 스플릿 CAR 접근법은 공개 WO2014/055442 및 WO2014/055657에 보다 상세하게 기재되어 있다. 간략하게, 스플릿 CAR 시스템은 제1 항원 결합 도메인 및 공동자극 도메인 (예를 들어, 41BB)을 갖는 제1 CAR을 발현하는 세포를 포함하고, 세포는 또한 제2 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3 제타)을 갖는 제2 CAR을 발현한다. 세포가 제1 항원을 만난 경우에, 공동자극 도메인이 활성화되고 세포는 증식한다. 세포가 제2 항원을 만난 경우에, 세포내 신호전달 도메인이 활성화되고 세포-사멸 활성이 개시된다. 따라서, CAR-발현 세포는 오직 둘 다의 항원의 존재 하에서만 활성화된다.
RNA 형질감염
시험관내 전사된 RNA CAR을 생산하는 방법이 본원에 개시된다. 본 발명은 또한 세포 내로 직접 형질감염될 수 있는 CAR 코딩 RNA 구축물을 포함한다. 형질감염에 사용하기 위한 mRNA을 생성하는 방법은 특수하게 설계된 프라이머를 사용한 주형의 시험관내 전사 (IVT)에 이은 폴리A 첨가를 수반할 수 있으며, 이는 3' 및 5' 비번역 서열 ("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 발현시킬 핵산, 및 폴리A 테일을 함유하는, 전형적으로 50-2000개 염기 길이의 구축물 (서열식별번호: 118)을 생산한다. 이와 같이 생산된 RNA는 상이한 유형의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 한 측면에서, 주형은 CAR에 대한 서열을 포함한다.
한 측면에서, 항-CD19 CAR은 메신저 RNA (mRNA)에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-CD19 CAR을 코딩하는 mRNA는 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART 세포 또는 CAR NK 세포의 생산을 위해 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포 내로 도입된다.
한 실시양태에서, 시험관내 전사된 RNA CAR은 일시적 형질감염의 형태로서 세포에 도입될 수 있다. RNA는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)-생성 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생산된다. 임의의 공급원으로부터의 관심 DNA는 적절한 프라이머 및 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 PCR에 의해 직접 전환될 수 있다. DNA의 공급원은 예를 들어 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 임의의 다른 적절한 DNA 공급원일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 목적하는 주형은 본 발명의 CAR이다. 예를 들어, RNA CAR을 위한 주형은 항종양 항체의 단일 쇄 가변 도메인을 포함하는 세포외 영역; 힌지 영역, 막횡단 도메인 (예를 들어, CD8a의 막횡단 도메인); 및 예를 들어 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. DNA는 유기체의 게놈으로부터 자연 발생 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 일부 또는 모두의 5' 및/또는 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함할 수 있다. 핵산은 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 인간 핵산 서열이다. 또 다른 실시양태에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 핵산 서열이다. DNA는 대안적으로 자연 발생 유기체에서 정상적으로는 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적인 인공 DNA 서열은 함께 라이게이션되어 융합 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 형성하는 유전자의 부분을 함유하는 것이다. 함께 라이게이션되는 DNA의 부분은 단일 유기체로부터 또는 1종 초과의 유기체로부터 유래될 수 있다.
PCR은 형질감염을 위해 사용되는 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해 사용된다. PCR을 수행하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머는 PCR을 위한 주형으로서 사용되는 DNA의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 설계된다. 본원에 사용된 "실질적으로 상보적인"은 프라이머 서열 내의 대부분의 또는 모든 염기가 상보적이거나 또는 1개 이상의 염기가 비-상보적이거나 미스매치된 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열은 PCR을 위해 사용되는 어닐링 조건 하에서 의도된 DNA 표적과 어닐링하거나 혼성화할 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 5' 및 3' UTR을 포함하는, 세포에서 정상적으로 전사되는 핵산의 부분 (오픈 리딩 프레임)을 증폭하도록 설계될 수 있다. 프라이머는 또한 특정한 관심 도메인을 코딩하는 핵산의 부분을 증폭하도록 설계될 수 있다. 한 실시양태에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 cDNA의 코딩 영역을 증폭하도록 설계될 수 있다. PCR을 위해 유용한 프라이머는 관련 기술분야에 널리 공지된 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. "정방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 상류에 존재하는 DNA 주형 상의 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "상류"는 코딩 가닥과 관련하여 증폭시킬 DNA 서열에 대해 5' 위치를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭시킬 DNA 서열의 하류에 존재하는 이중-가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "하류"는 코딩 가닥과 관련하여 증폭시킬 DNA 서열의 3' 위치를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
PCR에 유용한 임의의 DNA 폴리머라제가 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 시약 및 폴리머라제는 수많은 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력을 갖는 화학 구조도 사용될 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 한 실시양태에서, 5' UTR은 1 내지 3000개 뉴클레오티드 길이이다. 코딩 영역에 부가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 상이한 영역에 어닐링하는 PCR용 프라이머의 설계를 포함하나 이에 제한되지는 않는 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 전사된 RNA의 형질감염 후에 최적 번역 효율을 달성하기 위해 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 핵산에 대한 자연 발생, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 정방향 및 역방향 프라이머 내로 혼입시킴으로써 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 부가될 수 있다. 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율의 변형을 위해 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열 내의 AU-풍부 요소가 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다고 공지되어 있다. 따라서, 3' UTR은 관련 기술분야에 널리 공지된 UTR의 특성을 기초로 하여 전사되는 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
한 실시양태에서, 5' UTR은 내인성 핵산의 코작(Kozak) 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 내인성이 아닌 5' UTR이 상기 기재된 바와 같이 PCR에 의해 부가되는 경우에, 컨센서스 코작 서열은 5' UTR 서열의 부가에 의해 재설계될 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 효율적인 번역을 가능하게 하기 위해 모든 RNA에 필요한 것으로 보이지는 않는다. 많은 mRNA에 대한 코작 서열의 필요성은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 다른 실시양태에서, 5' UTR은 그의 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스의 5' UTR일 수 있다. 다른 실시양태에서, 다양한 뉴클레오티드 유사체가 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 저해하기 위해 3' 또는 5' UTR에 사용될 수 있다.
유전자 클로닝을 필요로 하지 않으면서 RNA를 DNA 주형으로부터 합성할 수 있기 위해, 전사 프로모터는 전사시킬 서열의 상류의 DNA 주형에 부착되어야 한다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터로서 기능하는 서열이 정방향 프라이머의 5' 말단부에 부가되는 경우에, RNA 폴리머라제 프로모터는 전사되는 오픈 리딩 프레임의 상류의 PCR 산물 내로 혼입된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 T7 폴리머라제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는 T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 컨센서스 뉴클레오티드 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
바람직한 실시양태에서, mRNA는 세포에서 리보솜 결합, 번역의 개시 및 mRNA의 안정성을 결정하는 5' 말단 및 3' 폴리(A) 테일 상에 둘 다의 캡을 갖는다. 원형 DNA 주형, 예를 들어 플라스미드 DNA에서, RNA 폴리머라제는 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 콘카테머 산물을 생산한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사 후에 폴리아데닐화된 경우에도 진핵 형질감염에 유효하지 않은 정상 크기의 mRNA를 생성한다.
선형 DNA 주형 상에서, 파지 T7 RNA 폴리머라제는 주형의 마지막 염기를 넘어 전사체의 3' 말단을 연장시킬 수 있다 (Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)).
폴리A/T 스트레치의 DNA 주형 내로의 통상적인 통합 방법은 분자 클로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA 내로 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발할 수 있고, 이것은 박테리아 세포로부터 수득된 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 다른 이상에 의해 고도로 오염되는 이유이다. 이는 클로닝 절차를 어렵고 시간 소모적으로 만들 뿐만 아니라 종종 신뢰할 수 없게 만든다. 이러한 이유 때문에, 클로닝 없이 폴리A/T 3' 스트레치를 갖는 DNA 주형의 구축을 가능하게 하는 방법이 매우 바람직하다.
전사 DNA 주형의 폴리A/T 절편은 폴리T 테일, 예컨대 100T 테일 (서열식별번호: 110) (크기는 50-5000 T일 수 있음 (서열식별번호: 111))을 함유하는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 동안, 또는 DNA 라이게이션 또는 시험관내 재조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 다른 방법에 의해 PCR 후에 생산될 수 있다. 폴리(A) 테일은 또한 안정성을 RNA에 제공하고, 그의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 테일의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관관계가 있다. 한 실시양태에서, 폴리(A) 테일은 100 내지 5000개 아데노신 (서열식별번호: 112)이다.
RNA의 폴리(A) 테일은 폴리(A) 폴리머라제, 예컨대 이. 콜라이 폴리A 폴리머라제 (E-PAP)를 사용하여 시험관내 전사 후에 추가로 연장될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리(A) 테일의 길이를 100개의 뉴클레오티드로부터 300 내지 400개의 뉴클레오티드 (서열식별번호: 113)로 증가시키는 것은, RNA의 번역 효율의 약 2-배 증가를 발생시킨다. 추가로, 상이한 화학기의 3' 말단에 대한 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형된/인공 뉴클레오티드, 압타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 폴리(A) 테일 내로 혼입될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
5' 캡이 또한 RNA 분자에게 안정성을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 관련 기술분야에 공지되고 본원에 기재된 기술을 사용하여 제공된다 (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열을 함유할 수 있다. IRES 서열은 mRNA에 대한 캡-비의존성 리보솜 결합을 개시하고 번역의 개시를 용이하게 하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다. 세포 투과성 및 생존을 용이하게 하는 인자, 예컨대 당, 펩티드, 지질, 단백질, 항산화제, 및 계면활성제를 함유할 수 있는, 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질이 포함될 수 있다.
RNA는 임의의 수많은 상이한 방법, 예를 들어 전기천공 (아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector)-II (아막사 바이오시스템즈(Amaxa Biosystems), 독일 쾰른), (ECM 830 (BTX) (하버드 인스트루먼츠(Harvard Instruments), 매사추세츠주 보스턴) 또는 진 펄서(Gene Pulser) II (바이오라드(BioRad), 콜로라도주 덴버), 멀티포레이터(Multiporator) (에펜도르프(Eppendort), 독일 함부르크), 리포펙션을 사용한 양이온성 리포솜 매개 형질감염, 중합체 캡슐화, 펩티드 매개 형질감염, 또는 바이오리스틱 입자 전달 시스템, 예컨대 "유전자 총" (예를 들어, 문헌 [Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 상업적으로 입수가능한 방법을 사용하여 표적 세포 내로 도입될 수 있다.
비-바이러스 전달 방법
일부 측면에서, 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산을 세포 또는 조직 또는 대상체 내로 전달하는데 비-바이러스 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-바이러스 방법은 트랜스포손 (전위가능 요소로도 불림)의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스포손은 게놈 내 위치에서 그 자체를 삽입할 수 있는 DNA 조각, 예를 들어 자기-복제 및 그의 카피의 게놈 내로의 삽입이 가능한 DNA 조각, 또는 보다 긴 핵산으로부터의 스플라이싱 및 게놈 내 또 다른 위치 내로의 삽입이 가능한 DNA 조각이다. 예를 들어, 트랜스포손은 전위를 위한 역전된 반복부 플랭킹 유전자로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
트랜스포손을 사용한 핵산 전달의 예시적인 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템(Sleeping Beauty transposon system) (SBTS) 및 피기백(piggyBac) (PB) 트랜스포손 시스템을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; 및 Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83]을 참조하고, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다.
SBTS는 2개의 성분: 1) 트랜스진을 함유하는 트랜스포손 및 2) 트랜스포사제 효소의 공급원을 포함한다. 트랜스포사제는 트랜스포손을 캐리어 플라스미드 (또는 다른 공여자 DNA)로부터 표적 DNA, 예컨대 숙주 세포 염색체/게놈으로 전위시킬 수 있다. 예를 들어, 트랜스포사제는 캐리어 플라스미드/공여자 DNA에 결합하고, 플라스미드로부터 트랜스포손 (트랜스진(들) 포함)을 잘라내고, 이를 숙주 세포의 게놈 내로 삽입한다. 예를 들어, 상기 문헌 [Aronovich et al.]을 참조한다.
예시적인 트랜스포손은 pT2-기반 트랜스포손을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47; 및 Singh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971]을 참조하고, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 예시적인 트랜스포사제는 Tc1/마리너-유형 트랜스포사제, 예를 들어 SB10 트랜스포사제 또는 SB11 트랜스포사제 (예를 들어 시토메갈로바이러스 프로모터로부터 발현될 수 있는 과다활성 트랜스포사제)를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Aronovich et al.; Kebriaei et al.; 및 Grabundzija et al.]을 참조하고, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다
SBTS의 사용은 트랜스진, 예를 들어 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산의 효율적인 통합 및 발현을 허용한다. 예를 들어 트랜스포손 시스템, 예컨대 SBTS를 사용하여 본원에 기재된 CAR을 안정적으로 발현하는 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 생성하는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 방법에 따라, 일부 실시양태에서, 1종 이상의 핵산, 예를 들어 SBTS 성분을 함유하는 플라스미드가 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포)에게 전달된다. 예를 들어, 핵산(들)은 핵산 (예를 들어, 플라스미드 DNA) 전달의 표준 방법, 예를 들어 본원에 기재된 방법, 예를 들어 전기천공, 형질감염 또는 리포펙션에 의해 전달된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 트랜스진, 예를 들어 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스포손을 함유한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 트랜스진 (예를 들어, 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산) 뿐만 아니라 트랜스포사제 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포손을 함유한다. 다른 실시양태에서, 2개의 핵산을 갖는 시스템, 예를 들어 이중-플라스미드 시스템이 제공되며, 예를 들어 여기서 제1 플라스미드는 트랜스진을 포함하는 트랜스포손을 함유하고, 제2 플라스미드는 트랜스포사제 효소를 코딩하는 핵산 서열을 함유한다. 예를 들어, 제1 및 제2 핵산은 숙주 세포 내로 공동-전달된다.
일부 실시양태에서, SBTS를 사용한 유전자 삽입 및 뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), CRISPR/Cas 시스템, 또는 조작된 메가뉴클레아제 재조작된 귀소 엔도뉴클레아제)를 사용한 유전자 편집의 조합을 사용하는 것에 의해, 본원에 기재된 CAR을 발현하는 세포, 예를 들어 T 또는 NK 세포가 생성된다.
일부 실시양태에서, 전단의 비-바이러스 방법의 사용은 세포, 예를 들어 T 또는 NK 세포의 재프로그래밍 및 세포의 대상체 내로의 직접 주입을 허용한다. 비-바이러스 벡터의 이점은 환자 집단을 충족시키는데 필요한 충분한 양을 생산하는 것의 용이성 및 상대적으로 낮은 비용, 저장 동안의 안정성, 및 면역원성의 결여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
CAR을 코딩하는 핵산 구축물
본 발명은 또한 본원에 기재된 1개 이상의 CAR 구축물을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 핵산 분자는 메신저 RNA 전사체로서 제공된다. 한 측면에서, 핵산 분자는 DNA 구축물로서 제공된다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 CAR은 항-CD19 결합 도메인 (예를 들어, 인간화 항-CD19 결합 도메인), 막횡단 도메인, 및 자극 도메인, 예를 들어 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 제타 쇄를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 본원에 기재된 항-CD19 결합 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 59로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항-CD19 결합 도메인이다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인이다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 15의 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 45 또는 서열식별번호: 47 또는 서열식별번호: 49, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인이다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 16의 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 51의 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 43의 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임에서 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 13의 리더 서열, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 59로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 (또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 scFv 도메인, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 45 또는 서열식별번호: 47 또는 서열식별번호: 49 (또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열)의 힌지 영역, 서열식별번호: 15의 서열 (또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 막횡단 도메인, 서열식별번호: 16의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인 또는 서열식별번호: 51의 서열 (또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 CD27 공동자극 도메인, 및 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 43의 서열 (또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함하는 CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 분자는 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 59로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항-CD19 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 분자를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 상기 항-CD19 결합 도메인은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 59로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 CAR 분자는 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인이다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 16의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인이다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 15의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 16의 서열 및 서열식별번호: 17의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임에서 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 서열식별번호: 14를 포함한다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 서열식별번호: 45 또는 서열식별번호: 47 또는 서열식별번호: 49를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 13의 리더 서열, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 59, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 scFv 도메인, 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 45 또는 서열식별번호: 47 또는 서열식별번호: 49의 힌지 영역, 서열식별번호: 15의 서열을 갖는 막횡단 도메인, 서열식별번호: 16의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인 또는 서열식별번호: 51의 서열을 갖는 CD27 공동자극 도메인, 및 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 43의 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함하는 코딩된 CAR 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 코딩된 CAR 분자는 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 및 서열식별번호: 59로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
목적하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 관련 기술분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득할 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 클로닝하기 보다는 합성적으로 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA가 삽입된 벡터를 제공한다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 딸세포에서 트랜스진의 장기간의 안정한 통합 및 그의 증식을 가능하게 하기 때문에 장기간의 유전자 전달을 달성하기 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 비-증식 세포, 예컨대 간세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 종양-레트로바이러스, 예컨대 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가의 이점을 갖는다. 이는 또한 낮은 면역원성의 추가의 이점을 갖는다. 레트로바이러스 벡터는 또한, 예를 들어 감마레트로바이러스 벡터일 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는, 예를 들어 프로모터, 패키징 신호 (Ψ), 프라이머 결합 부위 (PBS), 1개 이상 (예를 들어, 2개)의 긴 말단 반복부 (LTR), 및 관심 트랜스진, 예를 들어 CAR을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는 바이러스 구조 유전자, 예컨대 gag, pol, 및 env가 결여되어 있을 수 있다. 예시적인 감마레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV), 비장-초점 형성 바이러스 (SFFV), 및 골수증식성 육종 바이러스 (MPSV), 및 그로부터 유래된 벡터를 포함한다. 다른 감마레트로바이러스 벡터가, 예를 들어 문헌 [Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713]에 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 목적하는 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노바이러스 벡터 (A5/35)이다. 또 다른 실시양태에서, CAR을 코딩하는 핵산의 발현은 트랜스포손, 예컨대 슬리핑 뷰티, 크리스퍼, CAS9, 및 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하여 달성할 수 있다. 하기 문헌 [June et al. 2009Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716]을 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
간단히 요약하면, CAR을 코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩티드 또는 그의 부분을 코딩하는 핵산을 프로모터에 작동가능하게 연결하고, 구축물을 발현 벡터 내로 혼입시킴으로써 달성된다. 벡터는 복제 및 통합 진핵세포에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 목적하는 핵산 서열의 발현의 조절을 위해 유용한 프로모터를 함유한다.
본 발명의 발현 구축물은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용한 핵산 면역화 및 유전자 요법을 위해 사용될 수 있다. 유전자 전달을 위한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함하는 미국 특허 번호 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466을 참조한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 유전자 요법 벡터를 제공한다.
핵산은 수많은 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특정한 관심 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 서열분석 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY], 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 포진 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 적합한 벡터는 적어도 1종의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 1개 이상의 선택 마커를 함유한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
수많은 바이러스 기반 시스템이 포유동물 세포 내로의 유전자 전달을 위해 개발된 바 있다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입되고 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고, 생체내에서 또는 생체외에서 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 수많은 레트로바이러스 시스템이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 수많은 아데노바이러스 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 출발 부위의 30-110 bp 상류의 영역에 위치하지만, 수많은 프로모터는 기능적 요소를 또한 출발 부위의 하류에 함유하는 것으로 밝혀진 바 있다. 프로모터 요소 사이의 간격은 빈번하게 탄력적이어서, 프로모터 기능은 요소가 역전되거나 서로에 대해 이동할 때 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전 50 bp까지 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화하기 위해 협동적 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다. 예시적인 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1α, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나제 (PGK) 프로모터를 포함한다.
포유동물 T 세포에서 CAR 트랜스진을 발현할 수 있는 프로모터의 예는 EF1a 프로모터이다. 천연 EF1a 프로모터는 아미노아실 tRNA의 리보솜으로의 효소적 전달을 담당하는 신장 인자-1 복합체의 알파 서브유닛의 발현을 구동한다. EF1a 프로모터는 포유동물 발현 플라스미드에서 광범하게 사용된 바 있고, 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝된 트랜스진으로부터 CAR 발현을 구동하는데 유효한 것으로 밝혀진 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 한 측면에서, EF1a 프로모터는 서열식별번호: 100으로서 제공된 서열을 포함한다.
프로모터의 또 다른 예는 극초기 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 그에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 그러나, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 극초기 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 예컨대 비제한적으로 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 신장 인자-1α 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터인 인간 유전자 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용으로 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현을 목적으로 하는 경우에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 개시시킬 수 있거나, 또는 발현을 목적으로 하지 않는 경우에 발현을 종료시킬 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라시클린 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
벡터는 또한, 예를 들어 분비를 용이하게 하는 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자 (예를 들어, 소 성장 호르몬 (BGH) 유전자로부터), 에피솜 복제 및 원핵생물에서의 복제를 가능하게 하는 요소 (예를 들어 SV40 기원 및 ColE1 또는 관련 기술분야에 공지되어 있는 다른 것) 및/또는 선택을 가능하게 하는 요소 (예를 들어, 암피실린 저항성 유전자 및/또는 제오신 마커)를 포함할 수 있다.
CAR 폴리펩티드 또는 그의 부분의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입되는 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염되거나 감염될 것이 모색되는 세포의 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 하기 위한 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 다를 함유할 수 있다. 다른 측면에서, 선택 마커는 DNA의 개별 조각 상에 보유되고, 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택 마커 및 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서 발현이 가능하도록 하는 적절한 조절 서열과 플랭킹될 수 있다. 유용한 선택 마커는 예를 들어 항생제-저항성 유전자, 예컨대 neo 등을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로 리포터 유전자는, 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않고, 그의 발현이 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어 효소적 활성에 의해 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제를 코딩하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 널리 공지되어 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조하거나 상업적으로 입수할 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 수준의 발현을 보이는, 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 구축물은 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고, 프로모터-구동 전사를 조정하는 능력에 대해 작용제를 평가하는데 사용될 수 있다.
유전자를 세포 내로 도입시키고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 관련 기술분야의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 옮겨질 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY]을 참조한다. 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드의 도입을 위한 바람직한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
숙주 세포 내로 관심 폴리뉴클레오티드를 도입시키기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362를 참조한다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입시키기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀, 및 리포솜을 비롯한 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜 (예를 들어, 인공 막 소포)이다. 핵산의 최신 기술의 표적화된 전달, 예컨대 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 마이크로미터-미만 크기의 전달 시스템을 사용한 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 다른 방법이 이용가능하다.
비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제제의 사용은 숙주 세포 내로의 핵산의 도입 (시험관내, 생체외 또는 생체내)을 위해 고려된다. 또 다른 측면에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 점재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜 내에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질 함유 용액 중에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 내에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함께 함유 또는 복합체되거나, 또는 지질과 달리 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 중의 임의의 특정한 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조로, 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액 중에 점재되고, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연 발생하는 지방 액적, 뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 그의 유도체, 예컨대 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜, 및 알데히드를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다.
사용하기 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 미주리주 세인트 루이스의 시그마(Sigma)로부터 수득할 수 있고; 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 케이 & 케이 래보러토리즈(K & K Laboratories) (뉴욕주 플레인뷰)로부터 수득할 수 있고; 콜레스테롤 ("Chol")은 칼바이오켐-베링(Calbiochem-Behring)으로부터 수득할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 다른 지질은 아반티 폴라 리피즈, 인크.(Avanti Polar Lipids, Inc.) (앨라배마주 버밍엄)로부터 수득할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 내의 지질의 원액은 약 -20℃에서 저장될 수 있다. 클로로포름이 메탄올보다 더 용이하게 증발되기 때문에, 클로로포름이 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 둘러싸는 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다층막 지질 비히클을 포괄하는 일반적 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액 중에 현탁될 경우에 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄된 구조의 형성 전에 자기-재배열을 거치고, 물 및 지질 이중층들 사이의 용해된 용질을 포획한다 (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 정상 소포 구조가 아니라 용액 중에서 상이한 구조를 갖는 조성물도 포괄된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 가정할 수 있거나 또는 단지 지질 분자의 불균일 응집체로서 존재할 수 있다. 또한, 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입시키거나 또는 달리 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키기 위해 사용된 방법과 상관없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 "분자 생물학적" 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 발명의 범주 내에 포함되는 작용제를 확인하기 위해 본원에 기재된 검정에 의해, 예컨대 특정한 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 "생화학적" 검정을 포함한다.
본 발명은 CAR 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 한 측면에서, CAR 벡터는 세포, 예를 들어 T 세포 내로 직접 형질도입될 수 있다. 한 측면에서, 벡터는 클로닝 또는 발현 벡터, 예를 들어 1종 이상의 플라스미드 (예를 들어, 발현 플라스미드, 클로닝 벡터, 미니서클, 미니벡터, 이중 미세 염색체), 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 구축물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 벡터이다. 한 측면에서, 벡터는 포유동물 T 세포에서 CAR 구축물을 발현할 수 있다. 한 측면에서, 포유동물 T 세포는 인간 T 세포이다.
세포의 공급원
확장 및 유전적 변형 또는 다른 변형 전에, 세포, 예를 들어 T 세포 또는 자연 킬러 (NK) 세포의 공급원을 대상체로부터 수득할 수 있다. 용어 "대상체"는 면역 반응이 도출될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유동물)를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 인간, 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 그의 트랜스제닉 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 비롯한 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다.
본 개시내용의 특정 측면에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 많은 기술, 예컨대 피콜(Ficoll)™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 하나의 바람직한 측면에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출술에 의해 수득된다. 분리반출술 산물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포를 비롯한 림프구, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다. 한 측면에서, 분리반출술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 임의로 세포를 후속 프로세싱 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지에 두기 위해 세척될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세척한다. 대안적 실시양태에서, 세척 용액은 칼슘이 결여되어 있고, 마그네슘이 결여될 수 있거나 또는 전부는 아니지만 많은 2가 양이온이 결여될 수 있다.
칼슘의 부재 하에 초기 활성화 단계는 확대된 활성화로 이어질 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백한 바와 같이, 세척 단계는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 반-자동화 "관통형" 원심분리기 (예를 들어, 코브(Cobe) 2991 세포 프로세서, 박스터 시토메이트(Baxter CytoMate), 또는 해모네틱스 셀 세이버 5(Haemonetics Cell Saver 5))를 제조업체의 지침에 따라 사용하는 것에 의해 달성할 수 있다. 세척 후에, 세포를 다양한 생체적합성 완충제, 예컨대 Ca-무함유, Mg-무함유 PBS, 플라스마라이트 A(PlasmaLyte A), 또는 완충제 존재 또는 부재 하의 다른 염수 용액 중에 재현탁시킬 수 있다. 대안적으로, 분리반출술 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지 내에 직접 재현탁시킬 수 있다.
한 측면에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 퍼콜(PERCOLL)™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 분리에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다.
본원에 기재된 방법은, 예를 들어 본원에 기재된 예를 들어 음성 선택 기술을 사용하여, 예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 특정 하위집단, T 조절 세포-고갈 집단, CD25+ 고갈 세포의 선택을 포함할 수 있다. 바람직하게는, T 조절 고갈 세포의 집단은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만의 CD25+ 세포를 함유한다.
한 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포는 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드, IL-2를 사용하여 집단으로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드는 기질, 예를 들어 비드에 접합되거나, 또는 달리 기질, 예를 들어 비드 상에 코팅된다. 한 실시양태에서, 항-CD25 항체 또는 그의 단편은 본원에 기재된 바와 같은 기질에 접합된다.
한 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포는 밀테니(Miltenyi)™로부터의 CD25 고갈 시약을 사용하여 집단으로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 세포 대 CD25 고갈 시약의 비는 1e7개 세포 대 20 uL, 또는 1e7개 세포 대 15 uL, 또는 1e7개 세포 대 10 uL, 또는 1e7개 세포 대 5 uL, 또는 1e7개 세포 대 2.5 uL, 또는 1e7개 세포 대 1.25 uL이다. 한 실시양태에서, 예를 들어 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 고갈을 위해, 500 x 106개 초과의 세포/ml가 사용된다. 추가 측면에서, 600, 700, 800, 또는 900 x 106개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다.
한 실시양태에서, 고갈될 면역 이펙터 세포의 집단은 약 6 x 109개의 CD25+ T 세포를 포함한다. 다른 측면에서, 고갈될 면역 이펙터 세포의 집단은 약 1 x 109개 내지 1x 1010개의 CD25+ T 세포, 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함한다. 한 실시양태에서, T 조절 고갈 세포의 생성된 집단은 2 x 109개의 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포, 또는 그 미만 (예를 들어, 1 x 109개, 5 x 108개, 1 x 108개, 5 x 107개, 1 x 107개, 또는 그 미만의 CD25+ 세포)을 갖는다.
한 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포는 고갈 튜빙 세트, 예컨대 예를 들어 튜빙 162-01이 구비된 클리니맥(CliniMAC) 시스템을 사용하여 집단으로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 클리니맥 시스템은 고갈 설정, 예컨대 예를 들어, DEPLETION2.1로 가동된다.
특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 분리반출술 전 또는 CAR-발현 세포 산물의 제조 동안 대상체에서 면역 세포의 음성 조절자의 수준을 감소시키는 것 (예를 들어, 원치않는 면역 세포, 예를 들어 TREG 세포의 수를 감소시키는 것)은 대상체의 재발 위험을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, TREG 세포를 고갈시키는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. TREG 세포를 감소시키는 방법은 시클로포스파미드, 항-GITR 항체 (본원에 기재된 항-GITR 항체), CD25-고갈 및 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 제조 방법은 CAR-발현 세포의 제조 전에 TREG 세포의 수를 감소시키는 것 (예를 들어, 고갈시키는 것)을 포함한다. 예를 들어, 제조 방법은, 예를 들어 CAR-발현 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포) 산물의 제조 전에 TREG 세포를 고갈시키기 위해 샘플, 예를 들어 분리반출술 샘플을 항-GITR 항체 및/또는 항-CD25 항체 (또는 그의 단편 또는 CD25-결합 리간드)와 접촉시키는 것을 포함한다
한 실시양태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 산물 제조를 위한 세포의 수집 전에 TREG 세포를 감소시키는 1종 이상의 요법으로 사전-처리되고, 그에 의해 CAR-발현 세포 처리에 대한 대상체의 재발 위험이 감소된다. 한 실시양태에서, TREG 세포를 감소시키는 방법은 대상체에게 시클로포스파미드, 항-GITR 항체 중 1종 이상의 투여, CD25-고갈, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 시클로포스파미드, 항-GITR 항체 중 1종 이상의 투여, CD25-고갈, 또는 그의 조합은 CAR-발현 세포 산물의 주입 전, 그 동안 또는 그 후에 일어날 수 있다.
한 실시양태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 산물 제조를 위한 세포의 수집 전에 시클로포스파미드로 사전-처리되고, 그에 의해 CAR-발현 세포 처리에 대한 대상체의 재발 위험이 감소된다. 한 실시양태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 산물 제조를 위한 세포의 수집 전에 항-GITR 항체로 사전-처리되고, 그에 의해 CAR-발현 세포 처리에 대한 대상체의 재발 위험이 감소된다.
한 실시양태에서, 제거될 세포의 집단은 조절 T 세포도 또는 종양 세포도 아니지만, CART 세포의 확장 및/또는 기능에 달리 음의 영향을 미치는 세포, 예를 들어 CD14, CD11b, CD33, CD15, 또는 잠재적으로 면역 억제 세포에 의해 발현되는 다른 마커를 발현하는 세포이다. 한 실시양태에서, 이러한 세포는 조절 T 세포 및/또는 종양 세포와 공동으로, 또는 상기 고갈 후에, 또는 또 다른 순서로 제거되는 것이 고려된다.
본원에 기재된 방법은 1개 초과의 선택 단계, 예를 들어 1개 초과의 고갈 단계를 포함할 수 있다. 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는, 예를 들어 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커로 지시되는 항체의 조합에 의해 달성될 수 있다. 1가지 방법은 음성 선택된 세포의 표면 상에 존재하는 세포 표면 마커로 지시되는 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유동 세포측정법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화 하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 종양 항원, 예를 들어 CD25를 포함하지 않는 종양 항원, 예를 들어 CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 또는 CD11b를 발현하는 집단으로부터 세포를 제거하여 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 CAR의 발현에 적합한 T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 및 종양 항원 고갈 세포의 집단을 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 종양 항원 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어, 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 및 항종양 항원 항체 또는 그의 단편은 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 동일한 기질, 예를 들어 비드에 부착될 수 있거나, 또는 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 항종양 항원 항체 또는 그의 단편은 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 혼합물인 개별 비드에 부착될 수 있다. 다른 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포의 제거 및 종양 항원 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 하나의 순서로 일어날 수 있다.
또한, 체크 포인트 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 체크 포인트 억제제를 발현하는 집단으로부터 세포, 예를 들어 PD1+ 세포, LAG3+ 세포, 및 TIM3+ 세포 중 1종 이상을 제거하여, T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 세포 및 체크 포인트 억제제 고갈 세포, 예를 들어 PD1+, LAG3+ 및/또는 TIM3+ 고갈 세포의 집단을 제공하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 예시적인 체크 포인트 억제제는 B7-H1, B7-1, CD160, P1H, 2B4, PD1, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, TIGIT, CTLA-4, BTLA 및 LAIR1을 포함한다. 한 실시양태에서, 체크 포인트 억제제 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어, 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 및 항체크 포인트 억제제 항체 또는 그의 단편은 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 동일한 비드에 부착될 수 있거나, 또는 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 항체크 포인트 억제제 항체 또는 그의 단편은 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 혼합물인 개별 비드에 부착될 수 있다. 다른 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포의 제거 및 체크 포인트 억제제 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 하나의 순서로 일어날 수 있다.
본원에 기재된 방법은 양성 선택 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 항-CD3/항-CD28 (예를 들어, 3x28)-접합된 비드, 예컨대 디나비즈(DYNABEADS)® M-450 CD3/CD28 T와의, 목적하는 T 세포의 양성 선택을 위해 충분한 일정 기간 동안의 인큐베이션에 의해 단리될 수 있다. 한 실시양태에서, 일정 기간은 약 30분이다. 추가 실시양태에서, 일정 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 초과 및 그 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 추가 실시양태에서, 일정 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 또 다른 실시양태에서, 일정 기간은 10 내지 24시간, 예를 들어 24시간이다. 다른 세포 유형과 비교하여 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서, 예컨대 종양 조직으로부터 또는 면역손상 개체로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 단리하는데 있어서, T 세포를 단리하기 위해 보다 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 또한, 보다 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 단순히 시간을 단축하거나 연장함으로써 T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 하고/거나, 비드 대 T 세포의 비를 증가시키거나 감소시킴으로써 (본원에 추가로 기재되는 바와 같음), 배양 개시 시 또는 과정 동안의 다른 시점에 T 세포의 하위집단을 우선적으로 선택할 수 있다. 추가로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 시 또는 다른 목적하는 시점에 우선적으로 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B 및 퍼포린, 또는 다른 적절한 분자, 예를 들어 다른 시토카인 중 1종 이상을 발현하는 T 세포 집단이 선택될 수 있다. 세포 발현에 대해 스크리닝하는 방법은 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2013/126712에 기재된 방법에 의해 결정될 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의한 세포의 목적하는 집단의 단리를 위해, 세포의 농도 및 표면 (예를 들어, 입자, 예컨대 비드)은 변할 수 있다. 특정 측면에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는 (예를 들어, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 10 x 109개 세포/ml, 9 x 109개/ml, 8 x 109개/ml, 7 x 109개/ml, 6 x 109개/ml, 또는 5 x 109개/ml의 농도가 사용된다. 한 측면에서, 1 x 109개 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가의 한 측면에서, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 x 106개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가 측면에서, 125 또는 150 x 106개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다.
높은 농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 발생시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T 세포의, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플 (예를 들어, 백혈병성 혈액, 종양 조직 등)로부터의 보다 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포의 집단은 치료 가치를 가질 수 있고, 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어 높은 농도의 세포를 사용하는 것은, 정상적으로는 보다 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 가능하게 한다.
관련 측면에서, 보다 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면 (예를 들어, 입자, 예컨대 비드)의 혼합물을 유의하게 희석시킴으로써, 입자와 세포 사이에 상호작용이 최소화된다. 이것은 입자에 결합되는 다량의 목적하는 항원을 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 보다 높은 수준의 CD28을 발현하고, 희석 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 한 측면에서, 사용된 세포의 농도는 5 x 106개/ml이다. 다른 측면에서, 사용된 농도는 약 1 x 105개/ml 내지 1 x 106개/ml, 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
다른 측면에서, 세포를 2-10℃ 또는 실온에서 상이한 속도로 상이한 시간 길이 동안 회전장치 상에서 인큐베이션할 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 산물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포는 동결 용액 중에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 파라미터가 관련 기술분야에 공지되어 있고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라스마라이트-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO, 또는 예를 들어, 헤스판(Hespan) 및 플라스마라이트 A를 함유하는 다른 적합한 세포 동결 매질을 함유하는 배양 배지를 사용하는 것을 수반하고, 세포는 이어서 1분에 1℃의 속도로 -80℃로 동결되고, 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장된다. 다른 제어 동결 방법 뿐만 아니라 -20℃에서의 또는 액체 질소 내의 즉각적인 비제어 동결이 사용될 수 있다.
특정 측면에서, 동결보존된 세포는 본원에 기재된 바와 같이 해동 및 세척되고, 1시간 동안 실온에서 휴지되도록 한 후, 본 발명의 방법을 사용하여 활성화된다.
또한, 본 발명과 관련하여 본원에 기재된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수 있을 때 그 전의 일정 기간에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 분리반출술 산물을 수집하는 것이 고려된다. 따라서, 확장시킬 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에 수집될 수 있고, 목적하는 세포, 예컨대 T 세포가 단리되고, 면역 이펙터 세포 요법으로부터 이익을 얻을 임의의 수많은 질환 또는 상태, 예컨대 본원에 기재된 것에 대한 면역 이펙터 세포 요법에 추후 사용하기 위해 동결될 수 있다. 한 측면에서, 혈액 샘플 또는 분리반출술은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취된다. 특정 측면에서, 혈액 샘플 또는 분리반출술은 질환이 발생할 위험이 있지만 아직 질환이 발생하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취되고, 관심 세포가 단리되고, 추후 사용을 위해 동결된다. 특정 측면에서, T 세포는 확장, 동결되고, 나중에 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 특정한 질환의 진단 직후에, 그러나 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가 측면에서, 세포는 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역절제제, 예컨대 캄파트(CAMPATH), 항-CD3 항체, 시톡산, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228과 같은 작용제, 및 방사선조사를 사용하는 치료를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 수많은 관련 치료 양식 전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 분리반출술로부터 단리된다.
본 발명의 추가 측면에서, T 세포는 기능적 T 세포를 사용한 대상체의 치료 후에 환자로부터 직접 수득된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물을 사용한 치료 후, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복되는 기간 동안의 치료 직후에, 수득된 T 세포의 품질은 생체외에서 확장되는 그의 능력이 최적화되거나 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 사용한 생체외 조작 후에, 이들 세포는 증진된 생착 및 생체내 확장을 위한 바람직한 상태로 존재할 수 있다. 따라서, 이러한 회복기 동안 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계열의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 문맥 내에서 고려된다. 추가로, 특정 측면에서, 특히 요법 후의 규정된 시간 윈도우 동안 특정한 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생, 및/또는 확장이 유리한 조건을 대상체에서 생성하기 위해 가동화 (예를 들어, GM-CSF를 사용한 가동화) 및 조건화 요법이 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 면역 이펙터 세포는 낮은, 면역 증진, 용량의 mTOR 억제제를 제공받은 대상체로부터 수득된다. 한 실시양태에서, CAR를 발현하도록 조작될 면역 이펙터 세포의 집단, 예를 들어 T 세포는 대상체 내의 또는 대상체로부터 수거된 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수준, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포/ PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 비가 적어도 일시적으로 증가되도록 충분한 시간 후에, 또는 낮은, 면역 증진, 용량의 mTOR 억제제의 충분한 투여 후에 수거된다.
다른 실시양태에서, CAR을 발현하도록 조작되었거나 또는 조작될 면역 이펙터 세포의 집단, 예를 들어 T 세포는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수를 증가시키거나 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포/ PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 비를 증가시키는 mTOR 억제제의 양과의 접촉에 의해 생체외에서 처리될 수 있다.
한 실시양태에서, T 세포 집단은 디아글리세롤 키나제 (DGK)-결핍이다. DGK-결핍 세포는 DGK RNA 또는 단백질을 발현하지 않거나 또는 감소 또는 억제된 DGK 활성을 갖는 세포를 포함한다. DGK-결핍 세포는 유전적 접근법에 의해, 예를 들어 RNA-간섭제, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 DGK 발현을 감소 또는 방지하는 것에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, DGK-결핍 세포는 본원에 기재된 DGK 억제제를 사용한 처리에 의해 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, T 세포 집단은 이카로스(Ikaros)-결핍이다. 이카로스-결핍 세포는 이카로스 RNA 또는 단백질을 발현하지 않거나 또는 감소 또는 억제된 이카로스 활성을 갖는 세포를 포함하고, 이카로스-결핍 세포는 유전적 접근법에 의해, 예를 들어 RNA-간섭제, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 이카로스 발현을 감소 또는 방지하는 것에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 이카로스-결핍 세포는 이카로스 억제제, 예를 들어 레날리도미드를 사용한 처리에 의해 생성될 수 있다.
실시양태에서, T 세포 집단은 DGK-결핍 및 이카로스-결핍이고, 예를 들어 DGK 및 이카로스를 발현하지 않거나 또는 감소 또는 억제된 DGK 및 이카로스 활성을 갖는다. 이러한 DGK 및 이카로스-결핍 세포는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, NK 세포는 대상체로부터 수득된다. 또 다른 실시양태에서, NK 세포는 NK 세포주, 예를 들어 NK-92 세포주 (콘퀘스트(Conkwest))이다.
동종 CAR
본원에 기재된 실시양태에서, 면역 이펙터 세포는 동종 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 동종 T 세포, 예를 들어 기능적 T 세포 수용체 (TCR) 및/또는 인간 백혈구 항원 (HLA), 예를 들어, HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II의 발현이 결여된 동종 T 세포일 수 있다.
기능적 TCR이 결여된 T 세포는 예를 들어 그의 표면 상에 임의의 기능적 TCR을 발현하지 않도록 조작되거나, 기능적 TCR을 포함하는 1개 이상의 서브유닛을 발현하지 않도록 조작되거나, 또는 그의 표면 상에 매우 적은 기능적 TCR을 생산하도록 조작될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 예를 들어 TCR의 서브유닛 중 1개 이상의 돌연변이된 또는 말단절단된 형태의 발현에 의해 실질적으로 손상된 TCR을 발현할 수 있다. 용어 "실질적으로 손상된 TCR"은 이러한 TCR이 숙주에서 유해한 면역 반응을 도출하지 않을 것임을 의미한다.
본원에 기재된 T 세포는 예를 들어 그의 표면 상에 기능적 HLA를 발현하지 않도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 T 세포는 세포 표면 발현 HLA, 예를 들어, HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II가 하향조절되도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, T 세포는 기능적 TCR 및 기능적 HLA, 예를 들어 HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II가 결여될 수 있다.
기능적 TCR 및/또는 HLA의 발현이 결여된 변형된 T 세포는 TCR 또는 HLA의 1개 이상의 서브유닛의 녹아웃 또는 녹다운을 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 siRNA, shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN)를 사용한 TCR 및/또는 HLA의 녹다운을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 동종 세포는 예를 들어 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 억제 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 예를 들어 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있는 억제 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포일 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서의 억제에 의한 억제 분자의 억제는 CAR-발현 세포 성능을 최적화할 수 있다. 실시양태에서, 억제 핵산, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 예를 들어 억제 핵산, 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR), 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN)가 사용될 수 있다.
TCR 또는 HLA를 억제하는 siRNA 및 shRNA
일부 실시양태에서, TCR 발현 및/또는 HLA 발현은 T 세포에서 TCR 및/또는 HLA를 코딩하는 핵산을 표적화하는 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 억제될 수 있다.
T 세포에서 siRNA 및 shRNA의 발현은 임의의 통상적인 발현 시스템, 예를 들어 렌티바이러스 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있다.
TCR의 성분의 발현을 하항조절하는 예시적인 shRNA는 예를 들어 미국 공개 번호 2012/0321667에 기재되어 있다. HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II 유전자의 발현을 하항조절하는 예시적인 siRNA 및 shRNA는 예를 들어 미국 공개 번호 US 2007/0036773에 기재되어 있다.
TCR 또는 HLA를 억제하는 CRISPR
본원에 사용된 "CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하는 CRISPR"은 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부의 세트, 또는 이러한 반복부의 세트를 포함하는 시스템을 지칭한다. 본원에 사용된 "Cas"는 CRISPR-연관 단백질을 지칭한다. "CRISPR/Cas" 시스템은 TCR 및/또는 HLA 유전자를 침묵 또는 돌연변이시키기 위해 사용될 수 있는, CRISPR 및 Cas로부터 유래된 시스템을 지칭한다.
자연-발생 CRISPR/Cas 시스템은 서열분석된 유박테리움 게놈의 대략 40% 및 서열분석된 고세균의 90%에서 발견된다. 문헌 [Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172]. 이러한 시스템은 외래 유전 요소, 예컨대 플라스미드 및 파지에 저항성을 부여하는 원핵 면역계의 유형이고, 후천성 면역 형태를 제공한다. 문헌 [Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. ( 2008) Science 322: 1843-1845].
CRISPR/Cas 시스템은 진핵생물, 예컨대 마우스 또는 영장류에서의 유전자 편집 (특정 유전자를 침묵, 증진 또는 변화시키는 것)에 사용하기 위해 변형된 바 있다. 문헌 [Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8]. 이는 특이적으로 설계된 CRISPR 및 1개 이상의 적절한 Cas를 함유하는 플라스미드를 진핵 세포 내로 도입함으로써 달성된다.
때때로 CRISPR 유전자좌로 불리는 CRISPR 서열은 교대 반복부 및 스페이서를 포함한다. 자연-발생 CRISPR에서, 스페이서는 통상적으로 박테리아에 외래인 서열, 예컨대 플라스미드 또는 파지 서열을 포함하고; TCR 및/또는 HLA CRISPR/Cas 시스템에서 스페이서는 TCR 또는 HLA 유전자 서열로부터 유래된다.
CRISPR 유전자좌로부터의 RNA는 구성적으로 발현되고, Cas 단백질에 의해 작은 RNA로 프로세싱된다. 이들은 반복부 서열과 플랭킹된 스페이서를 포함한다. RNA는 RNA 또는 DNA 수준에서 외인성 유전 요소를 침묵시키기 위해 다른 Cas 단백질을 안내한다. 문헌 [Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7]. 스페이서는 따라서 siRNA와 유사하게 RNA 분자에 대한 주형으로서 역할을 한다. 문헌 [Pennisi (2013) Science 341: 833-836].
이들은 많은 상이한 유형의 박테리아에서 자연 발생하기 때문에, CRISPR의 정확한 배열 및 Cas 유전자의 구조, 기능, 및 수, 및 그의 산물은 종별로 다소 상이하다. 문헌 [Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663; 및 Stern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340]. 예를 들어, Cse (Cas 하위유형, 이. 콜라이) 단백질 (예를 들어, CasA)은 CRISPR RNA 전사체를 기능적 복합체인 캐스케이드를 보유하는 스페이서-반복부 단위로 프로세싱하는 캐스케이드를 형성한다. 문헌 [Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964]. 다른 원핵생물에서, Cas6은 CRISPR 전사체를 프로세싱한다. 이. 콜라이에서의 CRISPR-기반 파지 불활성화는 캐스케이드 및 Cas3을 필요로 하지만, Cas1 또는 Cas2는 필요로 하지 않는다. 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 및 다른 원핵생물에서 Cmr (Cas RAMP 모듈) 단백질은 상보성 표적 RNA를 인식하고 절단하는 작은 CRISPR RNA와 기능적 복합체를 형성한다. 보다 단순한 CRISPR 시스템은 이중 나선의 각각의 나선에 대해 1개씩, 2개의 활성 절단 부위를 갖는 뉴클레아제인 단백질 Cas9에 의존한다. Cas9 및 변형된 CRISPR 유전자좌 RNA의 조합이 유전자 편집을 위해 시스템에서 사용될 수 있다. 문헌 [Pennisi (2013) Science 341: 833-836].
CRISPR/Cas 시스템은 따라서 TCR 및/또는 HLA 유전자의 편집 (염기쌍의 부가 또는 결실), 또는 TCR 및/또는 HLA의 발현을 감소시키는 조기 정지의 도입을 위해 사용될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 대안적으로 RNA 간섭처럼 사용되고, TCR 및/또는 HLA 유전자를 가역적인 방식으로 종료시킬 수 있다. 포유동물 세포에서, 예를 들어 RNA는 Cas 단백질을 TCR 및/또는 HLA 프로모터로 안내하여, RNA 폴리머라제를 입체적으로 차단할 수 있다.
관련 기술분야에 공지된, 예를 들어 미국 공개 번호 20140068797, 및 문헌 [Cong (2013) Science 339: 819-823]에 기재된 기술을 사용하여 TCR 및/또는 HLA를 억제하는 인공 CRISPR/Cas 시스템이 생성될 수 있다. 또한 TCR 및/또는 HLA를 억제하는 관련 기술분야에 공지된, 예를 들어 문헌 [Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576], 미국 특허 번호 8,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; 및 8,697,359에 기재된 다른 인공 CRISPR/Cas 시스템이 또한 생성될 수 있다.
TCR 및/또는 HLA를 억제하는 TALEN
"TALEN" 또는 "HLA 및/또는 TCR에 대한 TALEN" 또는 "HLA 및/또는 TCR을 억제하는 TALEN"은 HLA 및/또는 TCR 유전자를 편집하기 위해 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제를 지칭한.
TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 인공적으로 생산된다. 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE)는 HLA 또는 TCR 유전자의 부분을 포함하는 임의의 목적하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 TALE를 DNA 절단 도메인과 조합함으로써, HLA 또는 TCR 서열을 포함하는 임의의 목적하는 DNA 서열에 특이적인 제한 효소가 생산될 수 있다. 이어서, 이들은 세포 내로 도입될 수 있고, 여기서 이들은 게놈 편집을 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6; 및 Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501].
TALE는 크산토모나스(Xanthomonas) 박테리아에 의해 분비되는 단백질이다. DNA 결합 도메인은 제12 및 제13 아미노산을 제외하고, 반복된, 고도로 보존된 33-34개 아미노산 서열을 함유한다. 이들 2개의 위치는 매우 가변적이고, 이것은 특정 뉴클레오티드 인식과의 강한 상관관계를 보여준다. 따라서, 이들은 목적하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다.
TALEN을 생산하기 위해, TALE 단백질은 야생형 또는 돌연변이된 FokI 엔도뉴클레아제인 뉴클레아제 (N)에 융합된다. TALEN에서의 사용을 위해 FokI에 대한 여러 돌연변이가 이루어진 바 있고; 이들은 예를 들어 절단 특이성 또는 활성을 개선시킨다. 문헌 [Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; 및 Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96].
FokI 도메인은 이량체로서 기능하고, 적절한 배향 및 간격으로 표적 게놈 내의 부위에 대해 특유한 DNA 결합 도메인을 갖는 2개의 구축물을 필요로 한다. TALE DNA 결합 도메인과 FokI 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수 및 2개의 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 수 둘 다는 높은 활성 수준의 달성을 위해 중요한 파라미터인 것으로 보인다. 문헌 [Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8].
HLA 또는 TCR TALEN은 이중-가닥 파단부 (DSB)를 생산하기 위해 세포 내에서 사용될 수 있다. 돌연변이는 복구 메카니즘이 비-상동 말단 연결을 통해 파단부를 부적절하게 복구하는 경우에 파단 부위에 도입될 수 있다. 예를 들어, 부적절한 복구는 프레임 시프트 돌연변이를 도입할 수 있다. 대안적으로, 외래 DNA가 TALEN과 함께 세포 내로 도입될 수 있고; 외래 DNA의 서열 및 염색체 서열에 따라, 이러한 과정은 HLA 또는 TCR 유전자 내의 결함을 교정하거나 또는 이러한 결함을 wt HLA 또는 TCR 유전자 내에 도입시켜 HLA 또는 TCR의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
HLA 또는 TCR 내의 서열에 특이적인 TALEN은 모듈 성분을 사용하는 다양한 방식을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 구축될 수 있다. 문헌 [Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509].
HLA 및/또는 TCR을 억제하는 아연 핑거 뉴클레아제
"ZFN" 또는 "아연 핑거 뉴클레아제" 또는 "HLA 및/또는 TCR에 대한 ZFN" 또는 "HLA 및/또는 TCR을 억제하는 ZFN"은 HLA 및/또는 TCR 유전자를 편집하기 위해 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인 아연 핑거 뉴클레아제를 지칭한다.
TALEN처럼, ZFN은 DNA-결합 도메인에 융합된 FokI 뉴클레아제 도메인 (또는 그의 유도체)을 포함한다. ZFN의 경우에, DNA-결합 도메인은 1개 이상의 아연 핑거를 포함한다. 문헌 [Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782; 및 Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160].
아연 핑거는 1개 이상의 아연 이온에 의해 안정화된 작은 단백질 구조 모티프이다. 아연 핑거는 예를 들어 Cys2His2를 포함할 수 있고, 대략 3-bp 서열을 인식할 수 있다. 공지된 특이성의 다양한 아연 핑거를 조합하여 약 6, 9, 12, 15 또는 18-bp 서열을 인식하는 다중-핑거 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 파지 디스플레이, 효모 1-하이브리드 시스템, 박테리아 1-하이브리드 및 2-하이브리드 시스템, 및 포유동물 세포를 비롯하여, 특정 서열을 인식하는 아연 핑거 (및 그의 조합)를 생성하기 위한 다양한 선택 및 모듈 어셈블리 기술이 이용가능하다.
TALEN처럼, ZFN은 DNA를 절단하기 위해 이량체화되어야 한다. 따라서, 한 쌍의 ZFN이 비-회문식 DNA 부위를 표적화하기 위해 필요하다. 2개의 개별 ZFN은 DNA의 대향하는 가닥에 결합해야 하고, 그의 뉴클레아제는 적절하게 이격된다. 문헌 [Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5].
또한, TALEN처럼, ZFN은 DNA에 이중-가닥 파단부를 생성할 수 있고, 이것은 부적절하게 복구되는 경우에 프레임-시프트 돌연변이를 생성할 수 있고, 이는 세포 내 HLA 및/또는 TCR의 발현 및 양의 감소로 이어질 수 있다. ZFN은 또한 HLA 또는 TCR 유전자를 돌연변이시키기 위해 상동 재조합과 함께 사용될 수 있다.
HLA 및/또는 TCR 내의 서열에 특이적인 ZFN은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; 및 Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96]; 미국 특허 공개 2011/0158957; 및 미국 특허 공개 2012/0060230을 참조한다.
텔로머라제 발현
어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 일부 실시양태에서, 치료 T 세포는 T 세포의 단축된 텔로미어로 인해 환자에서 단기 지속성을 갖고; 따라서, 텔로머라제 유전자에 의한 형질감염은 T 세포의 텔로미어를 늘이고 환자에서의 T 세포의 지속성을 개선시킬 수 있다. 문헌 [Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)]을 참조한다. 따라서, 한 실시양태에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포는 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어 텔로머라제의 촉매 서브유닛, 예를 들어 TERT, 예를 들어 hTERT를 이소적으로 발현한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 세포를 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어 텔로머라제의 촉매 서브유닛, 예를 들어 TERT, 예를 들어 hTERT를 코딩하는 핵산과 접촉시키는 것을 포함하는, CAR-발현 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 세포는 CAR을 코딩하는 구축물과의 접촉 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 핵산과 접촉될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 집단을 제조하는 방법을 특색으로 한다. 한 실시양태에서, 방법은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 집단을 제공하는 단계, CAR 및 텔로머라제 발현을 가능하게 하는 조건 하에, 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR을 코딩하는 핵산과 접촉시키는 단계; 및 면역 이펙터 세포의 집단을 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어 hTERT을 코딩하는 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 텔로머라제 서브유닛을 코딩하는 핵산은 DNA이다. 한 실시양태에서, 텔로머라제 서브유닛을 코딩하는 핵산은 텔로머라제 서브유닛의 발현을 구동시킬 수 있는 프로모터를 포함한다.
한 실시양태에서, hTERT는 하기와 같은, 진뱅크 단백질 ID AAC51724.1의 아미노산 서열을 갖는다 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795):
Figure pat00014
한 실시양태에서, hTERT는 서열식별번호: 131의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96^, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, hTERT는 서열식별번호: 131의 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, hTERT는 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에서 결실 (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 또는 30개 이하의 아미노산)을 포함한다. 한 실시양태에서, hTERT는 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에서 트랜스제닉 아미노산 서열 (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 또는 30개 이하의 아미노산)을 포함한다.
한 실시양태에서, hTERT는 진뱅크 수탁 번호 AF018167의 핵산 서열에 의해 코딩된다 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795):
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한 실시양태에서, hTERT는 서열식별번호: 132의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서, hTERT는 서열식별번호: 132의 핵산에 의해 코딩된다.
면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)의 활성화 및 확장
면역 이펙터 세포, 예컨대 T 세포는 일반적으로 예를 들어 미국 특허 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개 번호 20060121005에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
조혈 줄기 및 전구체 세포의 생체외 확장 절차는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,199,942에 기재되어 있고, 이는 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 따라서 본 발명은 세포의 생체외 확장의 임의의 특정한 방법으로 제한되지 않는다. 간략하게, T 세포의 생체외 배양 및 확장은 (1) 포유동물로부터의 말초 혈액 수거물 또는 골수 외식편으로부터 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포를 수집하는 단계; 및 (2) 이러한 세포를 생체외에서 확장시키는 단계를 포함할 수 있다. 미국 특허 번호 5,199,942에 기재된 세포 성장 인자에 더하여, 다른 인자, 예컨대 flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드가 세포의 배양 및 확장을 위해 사용될 수 있다.
일반적으로, 면역 이펙터 세포의 집단, 예를 들어 T 조절 세포 고갈 세포는 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상의 공동자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 본원에 기재된 바와 같이, 예컨대 표면에 고정된 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성화제 (예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공동-자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체가 사용될 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28 (디아클론(Diaclone), 프랑스 브장송)을 포함하고, 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 다른 방법이 사용될 수 있다 (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
특정 측면에서, T 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공동자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 존재하거나 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링되는 경우에, 작용제는 동일한 표면 (즉, "시스" 형태) 또는 개별 표면 (즉, "트랜스" 형태)에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 한 작용제는 표면에 커플링되고 다른 작용제는 용액 중에 존재할 수 있다. 한 측면에서, 공동자극 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합되고, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 존재하거나 표면에 커플링된다. 특정 측면에서, 둘 다의 작용제는 용액 중에 존재할 수 있다. 한 측면에서, 작용제는 가용성 형태로 존재한 후, 표면, 예컨대 Fc 수용체 또는 항체 또는 다른 결합제를 발현하는 세포에 가교될 수 있고, 이것이 작용제에 결합할 것이다. 이와 관련하여, 본 발명에서 T 세포를 활성화 및 확장하는데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 대한, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 20040101519 및 20060034810을 참조한다.
한 측면에서, 2종의 작용제는 동일한 비드, 즉 "시스" 또는 개별 비드, 즉 "트랜스"의 비드 상에 고정된다. 예로서, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 공동자극 신호를 제공하는 작용제는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며; 둘 다의 작용제는 동일한 비드에 동등한 분자량으로 공동-고정된다. 한 측면에서, CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 1:1 비의 비드에 결합된 각각의 항체가 사용된다. 본 발명의 특정 측면에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비는 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 T 세포 확장의 증가가 관찰되도록 사용된다. 하나의 특정한 측면에서, 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장에 비교하여 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비는 100:1 내지 1:100 및 그 사이의 모든 정수 값이다. 한 측면에서, 항-CD3 항체보다 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되고, 즉 CD3:CD28의 비는 1 미만이다. 특정 측면에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비는 2:1보다 크다. 하나의 특정한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:100 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:75 CD3:CD28 비가 사용된다. 추가 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:50 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:30 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 바람직한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:10 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:3 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 3:1 CD3:CD28 비가 사용된다.
1:500 내지 500:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 입자 대 세포의 비가 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하기 위해 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 인식할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비는 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 소수의 세포에만 결합할 수 있지만, 보다 큰 비드는 많은 세포에 결합할 수 있다. 특정 측면에서, 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 범위이고, 추가의 측면에서 비는 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함하고, 이는 또한 T 세포를 자극하기 위해 사용될 수 있다. T 세포 자극을 발생시키는 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 입자 대 T 세포의 비는 상기 언급된 바와 같이 달라질 수 있지만, 특정의 바람직한 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하고, 하나의 바람직한 비는 T 세포 당 적어도 1:1 입자이다. 한 측면에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비가 사용된다. 하나의 특정한 측면에서, 바람직한 입자: 세포 비는 1:5이다. 추가의 측면에서, 입자 대 세포의 비는 자극 일에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 입자 대 세포의 비는 제1일에 1:1 내지 10:1이고, 추가의 입자는 이후에 10일까지 매일 또는 격일로, 1:1 내지 1:10의 최종 비 (첨가 일의 세포 수 기준)로 세포에 첨가된다. 하나의 특정한 측면에서, 입자 대 세포의 비는 자극 제1일에 1:1이고, 자극 제3일 및 제5일에 1:5로 조정된다. 한 측면에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극의 제1일에 1:1, 제3일 및 제5일에 1:5의 최종 비로 첨가된다. 한 측면에서, 입자 대 세포의 비는 자극 제1일에 2:1이고, 자극 제3일 및 제5일에 1:10으로 조정된다. 한 측면에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극의 제1일에 1:1, 제3일 및 제5일에 1:10의 최종 비로 첨가된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 다른 비가 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 비는 입자 크기 및 세포 크기 및 종류에 따라 달라질 것이다. 한 측면에서, 사용하기에 가장 일반적인 비는 제1일에 대략 1:1, 2:1 및 3:1이다.
추가 측면에서, 세포, 예컨대 T 세포는 작용제-코팅된 비드와 조합되고, 비드 및 세포를 후속적으로 분리한 후, 세포를 배양한다. 다른 측면에서, 배양 전에, 작용제-코팅된 비드 및 세포를 분리하지 않고, 함께 배양한다. 추가의 측면에서, 비드 및 세포는 먼저 힘, 예컨대 자력을 인가하여 농축함으로써, 세포 표면 마커의 라이게이션을 증가시켜 세포 자극을 유도한다.
예를 들어, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착되는 상자성 비드 (3x28 비드)가 T 세포에 결합하도록 함으로써 라이게이션될 수 있다. 한 측면에서, 세포 (예를 들어, 104 내지 109개 T 세포) 및 비드 (예를 들어, 1:1 비율의 디나비즈® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)를 완충제, 예를 들어 PBS (2가 양이온, 예컨대, 칼슘 및 마그네슘 미함유) 내에 조합한다. 다시, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플에 매우 드물 수 있고, 단지 샘플의 0.01%만을 이루거나 또는 전체 샘플 (즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수가 본 발명의 측면에 포함된다. 특정 측면에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는 (즉, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 약 10 x 109개 세포/ml, 9 x 109개/ml, 8 x 109개/ml, 7 x 109개/ml, 6 x 109개/ml, 5 x 109개/ml, 또는 2 x 109개 세포/ml의 농도가 사용된다. 한 측면에서, 100 x 106개 세포/ml 초과의 농도가 사용된다. 추가의 측면에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 x 106개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 한 측면에서 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 x 106개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 측면에서, 125 또는 150 x 106개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 유도할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T 세포의 보다 효율적인 포획을 가능하게 한다. 그러한 세포의 집단은 치료 가치를 가질 수 있고, 특정 측면에서 얻는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 높은 농도의 세포를 사용하면, 정상적으로는 보다 약한 CD28 발현을 보이는 CD8+ T 세포를 보다 효율적으로 선택할 수 있다.
한 실시양태에서, CAR, 예를 들어, 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산으로 형질도입된 세포는, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 확장된다. 한 실시양태에서, 세포는 배양 중 수시간 (예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21시간) 내지 약 14일 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일)의 기간 동안 확장된다. 한 실시양태에서, 세포는 4 내지 9일의 기간 동안 확장된다. 한 실시양태에서, 세포는 8일 이하, 예를 들어 7, 6 또는 5일의 기간 동안 확장된다. 한 실시양태에서, 세포, 예를 들어 본원에 기재된 CD19 CAR 세포는 배양 중 5일 동안 확장되고, 생성된 세포는 동일한 배양 조건 하에 배양 중 9일 동안 확장된 동일한 세포보다 더 강력하다. 효력은, 예를 들어 다양한 T 세포 기능, 예를 들어 증식, 표적 세포 사멸, 시토카인 생산, 활성화, 이동, 또는 그의 조합에 의해 규정될 수 있다. 한 실시양태에서, 5일 동안 확장된 세포, 예를 들어 본원에 기재된 CD19 CAR 세포는 동일한 배양 조건 하에 배양 중 9일 동안 확장된 동일한 세포와 비교하여 항원 자극 시 세포 배가에서 적어도 1, 2, 3 또는 4배 증가를 보인다. 한 실시양태에서, 세포, 예를 들어 본원에 기재된 CD19 CAR을 발현하는 세포는 배양 중 5일 동안 확장되고, 생성된 세포는 동일한 배양 조건 하에 배양 중 9일 동안 확장된 동일한 세포와 비교하여 보다 높은 염증유발 시토카인 생산, 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준을 나타낸다. 한 실시양태에서, 5일 동안 확장된 세포, 예를 들어 본원에 기재된 CD19 CAR 세포는 동일한 배양 조건 하에 배양 중 9일 동안 확장된 동일한 세포와 비교하여 pg/ml 단위의 염증유발 시토카인 생산, 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10배 또는 그 초과의 증가를 보인다.
또한, T 세포의 배양 시간이 60일 이상이 될 수 있도록 여러 사이클의 자극이 바람직할 수 있다. T 세포 배양을 위해 적절한 조건은 혈청 (예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α 또는 통상의 기술자에게 알려진 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는 증식 및 생존에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 배지 (예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-vivo 15 (론자(Lonza)))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 배지는 혈청-비함유 또는 적절한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 규정된 세트의 호르몬으로 보충된 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장을 위해 충분한 양의 시토카인(들)과 함께 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, 최적화제를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험적 배양에만 포함되고, 대상체 내에 주입되어야 하는 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하기 위해 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도 (예를 들어, 37℃) 및 분위기 (예를 들어, 공기 플러스 5% CO2) 하에 유지된다.
한 실시양태에서, 세포는, 예를 들어 본원에 기재된 방법, 예컨대 유동 세포측정법에 의해 측정 시 14일 확장 기간에 걸쳐 세포의 적어도 200-배 (예를 들어, 200-배, 250-배, 300-배, 350-배) 증가를 발생시키는, 1종 이상의 인터류킨을 포함하는 적절한 배지 (예를 들어, 본원에 기재된 배지 중에서 확장된다. 한 실시양태에서, 세포는IL-15 및/또는 IL-7 (예를 들어, IL-15 및 IL-7)의 존재 하에 확장된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 방법, 예를 들어 CAR-발현 세포 제조 방법은, 예를 들어 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드, IL-2를 사용하여 세포 집단으로부터 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포를 제거하는 것을 포함한다. 세포 집단으로부터 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포를 제거하는 방법은 본원에 기재되어 있다. 실시양태에서, 방법, 예를 들어 제조 방법은 세포 집단 (예를 들어, T 조절 세포, 예컨대 CD25+ T 세포가 고갈된 세포 집단; 또는 항-CD25 항체, 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드와 이전에 접촉시킨 세포 집단)을 IL-15 및/또는 IL-7과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 세포 집단 (예를 들어, 항-CD25 항체, 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드와 이전에 접촉시킨 것)은 IL-15 및/또는 IL-7의 존재 하에 확장된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 인터류킨-15 (IL-15) 폴리펩티드, 인터류킨-15 수용체 알파 (IL-15Ra) 폴리펩티드, 또는 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드, 예를 들어 hetIL-15 둘 다의 조합을 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체외에서 접촉된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체외에서 접촉된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15 Ra 폴리펩티드 둘 다의 조합을 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체외에서 접촉된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 hetIL-15를 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체외에서 접촉된다.
한 실시양태에서 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 생체외 확장 동안 hetIL-15를 포함하는 조성물과 접촉된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 생체외 확장 동안 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 접촉된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 생체외 확장 동안 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드 둘 다를 포함하는 조성물과 접촉된다. 한 실시양태에서, 접촉은 림프구 하위집단, 예를 들어 CD8+ T 세포의 생존 및 증식을 발생시킨다.
상이한 자극 횟수에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 일반적인 혈액 또는 성분채집된 말초 혈액 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 억제인자 T 세포 집단 (TC, CD8+)보다 큰 헬퍼 T 세포 집단 (TH, CD4+)을 갖는다. 자극성 CD3 및 CD28 키메라에 의한 T 세포의 생체외 확장은 약 제8-9일 이전에는 주로 TH 세포로 이루어진 T 세포의 집단을 생산하는 반면, 약 제8-9일 후에 T 세포의 집단은 TC 세포의 점증하는 더 큰 집단을 포함한다. 따라서, 치료의 목적에 따라, 대상체에게 주로 TH 세포를 포함하는 T 세포 집단을 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 하위세트가 단리되면, 이 하위세트를 더 큰 정도로 확장시키는 것으로 유익할 수 있다.
추가로, CD4 및 CD8 마커에 더하여, 다른 표현형 마커는 세포 확장 과정 동안 유의하게, 그러나 대부분 재현가능하게 상이하다. 따라서, 그러한 재현가능성 때문에, 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 생성물을 적합하게 조정할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 개시된 제조 방법은 면역 이펙터 세포의 집단을 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어 hTERT를 코딩하는 핵산과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 텔로머라제 서브유닛을 코딩하는 핵산은 DNA일 수 있다.
일부 실시양태에서, 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)은 CAR 세포 제조 과정 동안 첨가된다. 본원의 비-제한적 이론에 따르면, 키나제 억제제는 생산되는 세포의 집단의 품질을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, CAR-발현 세포는 종종 암 세포를 함유할 수 있는 암 환자의 자체 혈장 분리반출술 샘플로부터 생산되고, 키나제 억제제는 그러한 암 세포 (예를 들어, BTK-발현 암, 예컨대 CLL 또는 MCL)에서의 신호전달을 변경시켜, 예를 들어 그의 증식을 감소시키거나 아폽토시스의 수준을 증가시킬 수 있다. 또 다른 예로서, 키나제 억제제는, 예를 들어 T 세포에서 ITK를 억제함으로써 CAR-발현 세포 (또는 CAR을 발현하기 전의 면역 이펙터 세포)에서 신호전달을 변경시킬 수 있다. 키나제 억제제는 T 세포의 균형을 TH2 세포에서 TH1 세포로 이동시킬 수 있다.
키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)는 반응 혼합물에 그의 표적, 예를 들어 BTK를 억제하는데 충분한 수준으로 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)는 약 0.1-0.2, 0.2-0.5, 0.5-1, 1-2, 2-5, 또는 5-10 μM의 농도로 첨가된다. 일부 실시양태에서, 키나제 억제제는 공유 억제제 (예컨대 이브루티닙)이고, 짧은 펄스는 비특이적 독성을 피하면서 표적을 비가역적으로 불활성화시키는데 충분하다. 따라서, 키나제 억제제는, 예를 들어 10-20, 20-30, 30-40, 40-60, 또는 60-120분 동안 첨가될 수 있다. 키나제 억제제는 또한, 예를 들어 키나제 억제제가 비공유 작용 방식을 갖는 경우에 더 긴 일정 기간 동안 첨가될 수 있다. 따라서, 키나제 억제제는, 예를 들어 2-4, 4-6, 6-8, 8-12, 12-18, 또는 18-24시간 동안, 또는 1-2, 2-3, 3-4, 4-6, 6-8, 8-10일 동안, 또는 세포가 배양되는 전체 일정 기간 동안 첨가될 수 있다. 키나제 억제제는 제조 과정 동안 다양한 시점에, 예를 들어 세포를 수거한 후, 비드로 자극하기 전, 비드로 자극한 후, 형질도입 전, 형질도입 후, 또는 환자에게 세포를 투여하기 전에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)는 세포를 수거한 후 또는, 예를 들어 비드로 자극하기 전에 첨가된다. 이러한 문맥에서 전 및 후는, 예를 들어 약 1, 5, 15, 30, 45, 또는 60분 전 또는 후, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간 전 또는 후를 지칭할 수 있다.
CD19 CAR이 구축되면, 예컨대 항원 자극 후에 T 세포를 확장시키고, 재자극 부재 하에 T 세포 확장을 유지하는 능력, 및 적절한 시험관내 및 동물 모델에서의 항암 활성을 포함하나 이에 제한되지는 않는 분자의 활성을 평가하기 위해 다양한 검정이 사용될 수 있다. CD19 CAR의 효과를 평가하기 위한 검정을 아래에 추가로 상세히 설명된다.
1차 T 세포에서 CAR 발현의 웨스턴 블롯 분석은 단량체 및 이량체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8):1453-1464 (2009)]을 참조한다. 아주 간단히 설명하면, CAR을 발현하는 T 세포 (CD4+ 및 CD8+ T 세포의 1:1 혼합물)를 10일 초과 동안 시험관내에서 확장시킨 후, 용해 및 환원 조건 하의 SDS-PAGE를 수행한다. 전장 TCR-ζ 세포질 도메인 및 내인성 TCR-ζ 쇄를 포함하는 CAR은 TCR-ζ 쇄에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된다. 동일한 T 세포 하위세트는 공유 이량체 형성의 평가를 허용하는 비-환원 조건 하의 SDS-PAGE 분석을 위해 사용된다.
항원 자극 후에 CAR+ T 세포의 시험관내 확장은 유동 세포측정에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물을 αCD3/αCD28 비드로 자극한 후, 분석할 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한다. 예시적인 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1α, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나제 (PGK) 프로모터를 포함한다. GFP 형광은 유동 세포측정에 의해 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 하위세트에서 배양 제6일에 평가된다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8):1453-1464 (2009)]을 참조한다. 대안적으로, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물을 제0일에 αCD3/αCD28 코팅된 자기 비드로 자극하고, 2A 리보솜 스키핑 서열을 사용하여 eGFP와 함께 CAR을 발현하는 2시스트론성 렌티바이러스 벡터를 사용하여 제1일에 CAR로 형질도입한다. 배양물을 세척 후에 항-CD3 및 항-CD28 항체 (K562-BBL-3/28)의 존재 하에 CD19+ K562 세포 (K562-CD19), 야생형 K562 세포 (K562 야생형) 또는 hCD32 및 4-1BBL을 발현하는 K562 세포로 재자극한다. 외인성 IL-2를 배양물에 격일로 100 IU/ml로 첨가한다. GFP+ T 세포를 비드-기반 카운팅을 사용하여 유동 세포측정에 의해 카운팅한다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다.
재자극의 부재 하에 지속된 CAR+ T 세포 확장을 또한 측정할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8):1453-1464 (2009)] 참조). 간단히 설명하면, 평균 T 세포 부피 (fl)은 제0일에 αCD3/αCD28 코팅된 자기 비드를 사용한 자극, 및 제1일에 나타낸 CAR을 사용한 형질도입 후에 쿨터 멀티사이저(Coulter Multisizer) 입자 계수기, 넥셀롬 셀로미터 비전(Nexcelom Cellometer Vision) 또는 밀리포어 셉터(Millipore Scepter)를 사용하여 배양 제8일에 측정한다.
CART 활성을 측정하기 위해 동물 모델을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 면역결핍 마우스에서 1차 인간 프리-B ALL을 치료하기 위해 인간 CD19-특이적 CAR+ T 세포를 사용하는 이종이식편 모델을 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8):1453-1464 (2009)] 참조). 간단히 설명하면, ALL의 확립 후에, 마우스를 처리군으로 무작위로 나누었다. 상이한 수의 αCD19-ζ 및 αCD19-BB-ζ 조작된 T 세포를 1:1 비로 B-ALL를 보유하는 NOD-SCID-γ-/- 마우스 내에 동시주사하였다. 마우스로부터의 비장 DNA 내의 αCD19-ζ 및 αCD19-BB-ζ 벡터의 카피수를 T 세포 주사 후에 다양한 시간에 평가한다. 동물을 백혈병에 대해 매주 간격으로 평가한다. 말초 혈액 CD19+ B-ALL 모세포 카운트를 αCD19-ζ CAR+ T 세포 또는 모의-형질도입한 T 세포를 주사한 마우스에서 측정하였다. 군에 대한 생존 곡선을 로그 순위 검정을 사용하여 비교한다. 또한, NOD-SCID-γ-/- 마우스에서 T 세포 주사 4주 후에 절대 말초 혈액 CD4+ 및 CD8+ T 세포 카운트를 또한 분석할 수 있다. 마우스에게 백혈병 세포를 주사하고, 3주 후에 eGFP에 연결된 CAR을 코딩하는 2시스트론성 렌티바이러스 벡터에 의해 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포를 주사한다. T 세포를 주사 전에 모의-형질도입된 세포와 혼합함으로써 45-50% 투입 GFP+ T 세포로 표준화하고, 유동 세포측정에 의해 확인한다. 1주 간격으로 백혈병에 대해 동물을 평가한다. CAR+ T 세포군에 대한 생존 곡선을 로그 순위 검정을 사용하여 비교한다.
용량 의존성 CAR 치료 반응을 평가할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조). 예를 들어, 제21일에 CAR T 세포, 동등한 수의 모의-형질도입된 T 세포를 주입하거나 또는 T 세포를 주입하지 않은 마우스에서 백혈병 확립 35-70일 후에 말초 혈액을 얻는다. 각각의 군으로부터의 마우스를 말초 혈액 CD19+ ALL 모세포 카운트의 결정을 위해 무작위로 채혈한 후, 제35일 및 제49일에 치사시킨다. 남아있는 동물을 제57일 및 제70일에 평가한다.
세포 증식 및 시토카인 생산의 평가는 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8):1453-1464 (2009)]에서 이전에 설명되었다. 간단히 설명하면, CAR-매개 증식의 평가는 세척된 T 세포를 CD19 (K19) 또는 CD32 및 CD137 (KT32-BBL)을 발현하는 K562 세포와 2:1의 최종 T-세포:K562 비로 혼합함으로써 마이크로타이터 플레이트에서 수행된다. K562 세포에 사용 전에 감마-방사선을 조사한다. 항-CD3 (클론 OKT3) 및 항-CD28 (클론 9.3) 모노클로날 항체를 배양물에 첨가하고, KT32-BBL 세포는 T-세포 증식을 자극하기 위한 양성 대조군으로 기능하고, 이것은 이들 신호가 생체외에서 장기간 CD8+ T 세포 확장을 지지하기 때문이다. T 세포는 제조자가 설명한 바와 같이 카운트브라이트(CountBright)™ 형광 비드 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스바드) 및 유동 세포측정을 사용하여 배양물에서 카운팅한다. CAR+ T 세포는 eGFP-2A 연결 CAR-발현 렌티바이러스 벡터로 조작된 T 세포를 사용한 GFP 발현에 의해 확인된다. GFP를 발현하지 않는 CAR+ T 세포에 대해, CAR+ T 세포는 비오티닐화 재조합 CD19 단백질 및 2차 아비딘-PE 접합체로 검출된다. T 세포 상의 CD4+ 및 CD8+ 발현은 또한 특이적 모노클로날 항체 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))로 동시에 검출된다. 시토카인 측정은 제조자의 지시에 따라 인간 TH1/TH2 시토카인 세포측정 비드 어레이 키트 (비디 바이오사이언시스, 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하여 재자극 24시간 후에 상청액에 대해 수행된다. 형광을 FACS칼리버(FACScalibur) 유동 세포측정기를 사용하여 평가하고, 데이터를 제조자의 지시에 따라 분석한다.
세포독성은 표준 51Cr-방출 검정에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8):1453-1464 (2009)]을 참조한다. 간단히 설명하면, 표적 세포 (K562 세포주 및 1차 프로-B-ALL 세포)를 37℃에서 2시간 동안 빈번하게 교반하면서 51Cr (NaCrO4로서, 뉴 잉글랜드 뉴클리어(New England Nuclear), 매사추세츠주 보스턴)을 로딩하고, 완전 RPMI 내에 2회 세척하고, 마이크로타이터 플레이트 내로 플레이팅한다. 이펙터 T 세포를 웰 내에서 완전 RPMI 내에서 표적 세포와, 이펙터 세포:표적 세포 (E:T)의 다양한 비로 혼합한다. 배지만 함유하는 (자연 방출, SR) 또는 트리톤-X100 세제의 1% 용액 (총 방출, TR)을 함유하는 추가의 웰을 또한 제조한다. 37℃에서 4시간 인큐베이션한 후, 각각의 웰로부터 상청액을 수거한다. 이어서, 방출된 51Cr을 감마 입자 계수기 (패카드 인스트루먼트 코포레이션(Packard Instrument Co.), 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 측정한다. 각각의 조건은 적어도 삼중으로 수행되고, 용해 백분율은 다음 식을 사용하여 계산된다: % 용해 = (ER - SR)/(TR - SR) (여기서, ER은 각각의 실험 조건에서 방출된 평균 51Cr을 나타낸다).
영상화 기술이 종양-보유 동물 모델에서 CAR의 특이적 수송 및 증식을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 상기 검정은 예를 들어 문헌 [Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)]에 기재되어 있다. 간단히 설명하면, NOD/SCID/γc-/- (NSG) 마우스에게 Nalm-6 세포를 IV 주사하고, 7일 후에 CAR 구축물을 사용한 전기천공 4시간 후에 T 세포를 주사한다. T 세포를 반딧불이 루시페라제를 발현하도록 렌티바이러스 구축물로 안정하게 형질감염시키고, 마우스를 생체발광에 대해 영상화한다. 대안적으로, Nalm-6 이종이식편 모델에서 CAR+ T 세포의 단일 주사의 치료 효능 및 특이성은 다음과 같이 측정할 수 있다: 반딧불이 루시페라제를 발현하도록 형질도입된 NSG 마우스에게 Nalm-6을 주사한 후, 7일 후에 CD19 CAR로 전기천공된 T 세포를 꼬리-정맥에 1회 주사한다. 동물을 주사 후 다양한 시점에서 영상화한다. 예를 들어, 제5일 (치료 2일 전) 및 제8일 (CAR+ PBL 24 hr 후)에 대표적인 마우스에서 반딧불이 루시페라제 양성 백혈병의 광자-밀도 열 지도를 생성할 수 있다.
본원의 실시예 섹션에서 설명되는 것 및 관련 기술분야에 알려진 것을 포함하는 다른 검정도 본 발명의 CD19 CAR 구축물을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
키나제 억제제
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 CDK4 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 CDK4 억제제, 예를 들어 CDK4/6 억제제, 예컨대 예를 들어 6-아세틸-8-시클로펜틸-5-메틸-2-(5-피페라진-1-일-피리딘-2-일아미노)-8H-피리도[2,3-d]피리미딘-7-온, 히드로클로라이드 (팔보시클립 또는 PD0332991로도 지칭됨)이다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 BTK 억제제, 예컨대 예를 들어 이브루티닙이다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTOR 억제제, 예컨대 예를 들어 라파마이신, 라파마이신 유사체, OSI-027이다. mTOR 억제제는, 예를 들어 mTORC1 억제제 및/또는 mTORC2 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTORC1 억제제 및/또는 mTORC2 억제제일 수 있다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 MNK 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 MNK 억제제, 예컨대 예를 들어 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘이다. MNK 억제제는, 예를 들어 MNK1a, MNK1b, MNK2a 및/또는 MNK2b 억제제일 수 있다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 알로이신 A; 플라보피리돌 또는 HMR-1275, 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-[(3S,4R)-3-히드록시-1-메틸-4-피페리디닐]-4-크로메논; 크리조티닙 (PF-02341066; 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-[(2R,3S)-2-(히드록시메틸)-1-메틸-3-피롤리디닐]-4H-1-벤조피란-4-온, 히드로클로라이드 (P276-00); 1-메틸-5-[[2-[5-(트리플루오로메틸)-1H-이미다졸-2-일]-4-피리디닐]옥시]-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-1H-벤즈이미다졸-2-아민 (RAF265); 인디술람 (E7070); 로스코비틴 (CYC202); 팔보시클립 (PD0332991); 디나시클립 (SCH727965); N-[5-[[(5-tert-부틸옥사졸-2-일)메틸]티오]티아졸-2-일]피페리딘-4-카르복스아미드 (BMS 387032); 4-[[9-클로로-7-(2,6-디플루오로페닐)-5H-피리미도[5,4-d][2]벤즈아제핀-2-일]아미노]-벤조산 (MLN8054); 5-[3-(4,6-디플루오로-1H-벤즈이미다졸-2-일)-1H-인다졸-5-일]-N-에틸-4-메틸-3-피리딘메탄아민 (AG-024322); 4-(2,6-디클로로벤조일아미노)-1H-피라졸-3-카르복실산 N-(피페리딘-4-일)아미드 (AT7519); 4-[2-메틸-1-(1-메틸에틸)-1H-이미다졸-5-일]-N-[4-(메틸술포닐)페닐]- 2-피리미딘아민 (AZD5438); 및 XL281 (BMS908662)로부터 선택된 CDK4 억제제이다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 CDK4 억제제, 예를 들어 팔보시클립 (PD0332991)이고, 팔보시클립은 일정 기간 동안 매일, 예를 들어 28일 사이클의 14-21일 동안 매일, 또는 21일 사이클의 7-12일 동안 매일 약 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (예를 들어, 75 mg, 100 mg 또는 125 mg)의 용량으로 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 초과의 사이클의 팔보시클립이 투여된다.
예시적인 CDK4/6 억제제는 LEE011 (리보시클립으로도 불림)이고, 그의 구조가 하기 제시된다.
Figure pat00019
이론에 얽매이지는 않지만, CDK4/6 억제제 (예를 들어, LEE011 또는 본원에 기재된 다른 CDK4/6 억제제)와 함께 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여는, 예를 들어 CDK4/6 억제제 단독과 비교하여, 예를 들어 더 높은 완화율 및/또는 더 낮은 재발률을 갖는 더 높은 반응성을 달성할 수 있는 것으로 여겨진다.
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 일부 실시양태에서 CDK4/6 억제제는 암 세포, 예를 들어 MCL 세포에서 시클린 D1 활성을 감소시키는 작용을 한다. 일부 암 세포는 전위로 인한 상승된 시클린 D1 수준을 특징으로 한다. CDK4는 시클린 D와 복합체화되어 세포 사이클 진행을 촉진한다. 따라서, 일부 실시양태에서 CK4/6 억제제의 투여는 암 세포 증식을 감소시킨다. 예를 들어, 문헌 [Marzec et al., "Mantle cell lymphoma cells express predominantly cyclin D1a isoform and are highly sensitive to selective inhibition of CDK4 kinase activity." Blood. 2006 Sep 1;108(5):1744-50. Epub 2006 May 11]을 참조한다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 이브루티닙 (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된 BTK 억제제이다. 한 실시양태에서, BTK 억제제는 인터류킨-2-유도성 키나제 (ITK)의 키나제 활성을 감소 또는 억제하지 않고, GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, 예를 들어 이브루티닙 (PCI-32765)이고, 이브루티닙은 일정 기간 동안 매일, 예를 들어 21일 사이클 동안 매일, 또는 28일 사이클 동안 매일 약 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (예를 들어, 250 mg, 420 mg 또는 560 mg)의 용량으로 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 초과의 사이클의 이브루티닙이 투여된다.
실시양태에서, BTK 억제제 (예를 들어, 이브루티닙)는 CLL, 외투 세포 림프종 (MCL), 또는 소림프구성 림프종 (SLL)에 걸린 대상체에게 투여된다. 예를 들어, BTK 억제제가 투여된 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실 (del(17p), 예를 들어 백혈병성 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, BTK 억제제가 투여된 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시양태에서, BTK 억제제가 투여된 대상체는 재발성 CLL 또는 SLL을 갖고, 예를 들어 대상체는 이전에 암 요법을 투여받은 바 있다 (예를 들어, 이전에 1, 2, 3, 또는 4종의 선행 암 요법을 투여받은 바 있음). 실시양태에서, BTK 억제제가 투여된 대상체는 불응성 CLL 또는 SLL을 갖는다. 다른 실시양태에서, BTK 억제제가 투여된 대상체는 여포성 림프종, 예를 들어 재발 또는 불응성 여포성 림프종을 갖는다.
이브루티닙 (1-[(3R)-3-[4-아미노-3-(4-페녹시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일]피페리딘-1-일]프로프-2-엔-1-온)의 구조가 하기 제시된다.
Figure pat00020
대략 400nM을 초과하는 이브루티닙의 농도는 임상적으로 적절하지 않다. 문헌 [Advani et al. (J Clin Oncol 2012;31:88)]의 연구에서, 이브루티닙의 평균 피크 혈청 농도는 약 130ng/ml이고, 이는 295nM과 동등하다 (이브루티닙의 분자량 440.5를 기준으로 함). 따라서, 1uM의 농도에서 T 세포에 대해 이브루티닙의 효과를 나타내는 데이터는 생체내에서 임상적으로 적절한 농도를 유의하게 초과한다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 템시롤리무스; 리다포롤리무스 (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23, 29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.04,9] 헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시시클로헥실 디메틸포스피네이트 (AP23573 및 MK8669로도 공지됨); 에베롤리무스 (RAD001); 라파마이신 (AY22989); 시마피모드; (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올 (AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF04691502); 및 N2-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파르틸L-세린-, 내부 염 (SF1126); 및 XL765로부터 선택된 mTOR 억제제이다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신이고, 라파마이신은 일정 기간 동안 매일, 예를 들어, 21일 사이클 동안 매일, 또는 28일 사이클 동안 매일 약 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (예를 들어, 6 mg)의 용량으로 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 초과의 사이클의 라파마이신이 투여된다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 에베롤리무스이고, 에베롤리무스는 일정 기간 동안 매일, 예를 들어, 28일 사이클 동안 매일 약 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (예를 들어, 10 mg)의 용량으로 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 초과의 사이클의 에베롤리무스가 투여된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 CGP052088; 4-아미노-3-(p-플루오로페닐아미노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘 (CGP57380); 세르코스포라미드; ETC-1780445-2; 및 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘으로부터 선택된 MNK 억제제이다.
실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR-발현 세포는, 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제 (예를 들어, 본원에 기재된 PI3K 억제제, 예를 들어 이델라리십 또는 두벨리십) 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 이델라리십 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 두벨리십 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 이델라리십 (GS-1101 또는 CAL-101로도 불림; 길리아드(Gilead))은 PI3K의 델타 이소형을 차단하는 소분자이다. 이델라리십 (5-플루오로-3-페닐-2-[(1S)-1-(7H-퓨린-6-일아미노)프로필]-4(3H)-퀴나졸리논)의 구조가 하기 제시된다.
Figure pat00021
두벨리십은 PI3K-δ,γ를 차단하는 소분자이다. 두벨리십 (8-클로로-2-페닐-3-[(1S)-1-(9H-퓨린-6-일아미노)에틸]-1(2H)-이소퀴놀리논)의 구조가 하기 제시된다.
Figure pat00022
실시양태에서, 대상체는 CLL에 걸렸다. 실시양태에서, 대상체는 재발성 CLL에 걸렸고, 예를 들어 대상체는 이전에 암 요법을 투여받은 바 있다 (예를 들어, 이전에 항-CD20 항체를 투여받은 바 있거나, 또는 이전에 이브루티닙을 투여받은 바 있음). 예를 들어, 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실 (del(17p), 예를 들어 백혈병성 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함하지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 긴 아암의 염색체 11에서 결실 (del(11q))을 갖는다. 다른 실시양태에서, 대상체는 del(11q)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 이델라리십은 약 100-400 mg (예를 들어, 100-125, 125-150, 150-175, 175-200, 200-225, 225-250, 250-275, 275-300, 325-350, 350-375, 또는 375-400 mg)의 투여량으로, 예를 들어 BID 투여된다. 실시양태에서, 두벨리십은 약 15-100 mg (예를 들어, 약 15-25, 25-50, 50-75, 또는 75-100 mg)의 투여량으로, 예를 들어 1일에 2회 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 350-550 mg/m2 (예를 들어, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, 또는 475-500 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF-04691502); N-[4-[[4-(디메틸아미노)-1-피페리디닐]카르보닐]페닐]-N'-[4-(4,6-디-4-모르폴리닐-1,3,5-트리아진-2-일)페닐]우레아 (PF-05212384, PKI-587); 2-메틸-2-{4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디히드로-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐}프로판니트릴 (BEZ-235); 아피톨리십 (GDC-0980, RG7422); 2,4-디플루오로-N-{2-(메틸옥시)-5-[4-(4-피리다지닐)-6-퀴놀리닐]-3-피리디닐}벤젠술폰아미드 (GSK2126458); 8-(6-메톡시피리딘-3-일)-3-메틸-1-(4-(피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2(3H)-온 말레산 (NVP-BGT226); 3-[4-(4-모르폴리닐피리도[3',2':4,5]푸로[3,2-d]피리미딘-2-일]페놀 (PI-103); 5-(9-이소프로필-8-메틸-2-모르폴리노-9H-퓨린-6-일)피리미딘-2-아민 (VS-5584, SB2343); 및 N-[2-[(3,5-디메톡시페닐)아미노]퀴녹살린-3-일]-4-[(4-메틸-3-메톡시페닐)카르보닐]아미노페닐술폰아미드 (XL765)로부터 선택된 이중 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K) 및 mTOR 억제제이다.
실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 역형성 림프종 키나제 (ALK) 억제제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 예시적인 ALK 키나제 억제제는 크리조티닙 (화이자(Pfizer)), 세리티닙 (노파르티스(Novartis)), 알렉티닙 (츄가이(Chugai)), 브리가티닙 (AP26113으로도 불림; 아리아드(Ariad)), 엔트렉티닙 (이그니타(Ignyta)), PF-06463922 (화이자), TSR-011 (테사로(Tesaro)) (예를 들어, 임상 시험 식별 번호 NCT02048488 참조), CEP-37440 (테바(Teva)), 및 X-396 (엑스커버리(Xcovery))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 고형 암, 예를 들어 본원에 기재된 고형 암, 예를 들어 폐암을 갖는다.
크리조티닙의 화학 명칭은 3-[(1R)-1-(2,6-디클로로-3-플루오로페닐)에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일피라졸-4-일)피리딘-2-아민이다. 세리티닙의 화학 명칭은 5-클로로-N2-[2-이소프로폭시-5-메틸-4-(4-피페리디닐)페닐]-N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-2,4-피리미딘디아민이다. 알렉티닙의 화학 명칭은 9-에틸-6,6-디메틸-8-(4-모르폴리노피페리딘-1-일)-11-옥소-6,11-디히드로-5H-벤조[b]카르바졸-3-카르보니트릴이다. 브리가티닙의 화학 명칭은 5-클로로-N2-{4-[4-(디메틸아미노)-1-피페리디닐]-2-메톡시페닐}-N4-[2-(디메틸포스포릴)페닐]-2,4-피리미딘디아민이다. 엔트렉티닙의 화학 명칭은 N-(5-(3,5-디플루오로벤질)-1H-인다졸-3-일)-4-(4-메틸피페라진-1-일)-2-((테트라히드로-2H-피란-4-일)아미노)벤즈아미드이다. PF-06463922의 화학 명칭은 (10R)-7-아미노-12-플루오로-2,10,16-트리메틸-15-옥소-10,15,16,17-테트라히드로-2H-8,4-(메테노)피라졸로[4,3-h][2,5,11]-벤족사디아자시클로테트라데신-3-카르보니트릴이다. CEP-37440의 화학 구조는 (S)-2-((5-클로로-2-((6-(4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일)-1-메톡시-6,7,8,9-테트라히드로-5H-벤조[7]아눌렌-2-일)아미노)피리미딘-4-일)아미노)-N-메틸벤즈아미드이다. X-396의 화학 명칭은 (R)-6-아미노-5-(1-(2,6-디클로로-3-플루오로페닐)에톡시)-N-(4-(4-메틸피페라진-1-카르보닐)페닐)피리다진-3-카르복스아미드이다.
실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO) 억제제와 조합되어 대상체에게 투여된다. IDO는 아미노산, L-트립토판의 키누레닌으로의 분해를 촉매하는 효소이다. 많은 암, 예를 들어 전립선, 결장직장, 췌장, 자궁경부, 위, 난소, 머리 및 폐암이 IDO를 과다발현한다. pDC, 대식세포 및 수지상 세포 (DC)는 IDO를 발현할 수 있다. 이론에 얽매이지는 않지만, L-트립토판의 감소 (예를 들어, IDO에 의해 촉매됨)는 T-세포 무반응 및 아폽토시스를 유도함으로써 면역억제 환경을 발생시키는 것으로 생각된다. 따라서, 이론에 얽매이지는 않지만, IDO 억제제는 예를 들어 CAR-발현 면역 세포의 억제 또는 사멸을 감소시킴으로써 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 효능을 증진시킬 수 있는 것으로 생각된다. 실시양태에서, 대상체는 고형 종양, 예를 들어 본원에 기재된 고형 종양, 예를 들어 전립선, 결장직장, 췌장, 자궁경부, 위, 난소, 머리 또는 폐암을 갖는다. IDO의 예시적인 억제제는 1-메틸-트립토판, 인독시모드 (뉴링크 제네틱스(NewLink Genetics)) (예를 들어, 임상 시험 식별 번호 NCT01191216; NCT01792050 참조), 및 INCB024360 (인사이트 코포레이션(Incyte Corp.)) (예를 들어, 임상 시험 식별 번호 NCT01604889; NCT01685255 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 골수-유래 억제자 세포 (MDSC)의 조정제와 조합되어 대상체에게 투여된다. MDSC는 많은 고형 종양의 주변 및 종양 부위에 축적된다. 이들 세포는 T 세포 반응을 억제함으로써 CAR-발현 세포 요법의 효능을 방해한다. 이론에 얽매이지는 않지만, MDSC 조정제의 투여는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 효능을 증진시키는 것으로 생각된다. 한 실시양태에서, 대상체는 고형 종양, 예를 들어 본원에 기재된 고형 종양, 예를 들어 교모세포종을 갖는다. MDSC의 예시적인 조정제는 MCS110 및 BLZ945를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. MCS110은 대식세포 콜로니-자극 인자 (M-CSF)에 대한 모노클로날 항체 (mAb)이다. 예를 들어, 임상 시험 식별 번호 NCT00757757을 참조한다. BLZ945는 콜로니 자극 인자 1 수용체 (CSF1R)의 소분자 억제제이다. 예를 들어, 문헌 [Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72]을 참조한다. BLZ945의 구조가 하기 제시된다.
Figure pat00023
일부 실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 인터류킨-15 (IL-15) 폴리펩티드, 인터류킨-15 수용체 알파 (IL-15Ra) 폴리펩티드, 또는 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드, 예를 들어 hetIL-15 (애드뮨 테라퓨틱스, 엘엘씨(Admune Therapeutics, LLC)) 둘 다의 조합과 조합되어 대상체에게 투여된다. hetIL-15는 IL-15 및 IL-15Ra의 이종이량성 비-공유 복합체이다. hetIL-15는, 예를 들어 본원에 참조로 포함된 U.S. 8,124,084, U.S. 2012/0177598, U.S. 2009/0082299, U.S. 2012/0141413, 및 U.S. 2011/0081311에 기재되어 있다. 실시양태에서, het-IL-15는 피하로 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 암, 예를 들어 고형 암, 예를 들어 흑색종 또는 결장암을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 전이성 암을 갖는다.
치료 용도
CD19 연관 질환 및/또는 장애
한 측면에서, 본 발명은 CD19 발현과 연관된 질환의 치료 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 종양의 일부는 CD19에 대해 음성이고 종양의 일부는 CD19에 대해 양성인 질환의 치료 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 CAR은 상승된 CD19의 발현과 연관된 질환의 치료를 거친 대상체의 치료에 유용하고, 여기서 상승된 수준의 CD19에 대한 치료를 거친 대상체는 상승된 수준의 CD19와 연관된 질환을 나타낸다.
본원에 기재된 요법은, 예를 들어 키나제 억제제, 예컨대 이브루티닙에 반응하는 대상체 (예를 들어, 부분 반응 또는 완전 반응) 또는 그렇지 않은 대상체 (예를 들어, 비-반응자 또는 재발자)를 치료하는데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)에 의한 치료를 거친 수많은 환자는 치료에 대해 감소된 반응을 보일 수 있다 (예를 들어, 치료에 대해 부분 또는 비-반응자이거나, 또는 치료 동안 재발함). 따라서, 키나제 억제제와 조합된 본원에 개시된 CAR-요법의 투여는 유익한 효과를 발생시킬 수 있다.
이들 대상체를 위한 예시적인 치료 요법이 하기 기재된다.
일부 경우에, 대상체가 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)에 대한 비-반응자 또는 재발자인 경우에, 키나제 억제제가 철회되고, CAR 요법이 투여된다. 다른 경우에, 대상체가 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)에 대해 반응하지 않는 경우에, 키나제 억제제 요법이 계속되고, CAR 요법이 요법에 추가된다. 이러한 사용은, 예를 들어 CAR 요법이 이브루티닙-저항성 세포에서 단독요법으로서 유효함을 나타내는 본원의 실시예 8의 실험에 의해 지지된다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 키나제 억제제 요법을 계속하는 것은, 예를 들어 혈류 중 CAR-발현 세포의 수를 증가시킴으로써 CAR 요법의 효능을 개선시킬 수 있다 (본원의 실시예 8 참조).
이론에 얽매이지는 않지만, 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)에 대해 비-반응자 또는 재발자인 대상체는 적어도 2가지 이유로 비-반응성일 수 있다: 대상체가 표적 억제를 방지하는 약물 표적 내 돌연변이 (예를 들어, BTK, 예를 들어 C481S 돌연변이)를 가질 수 있거나, 또는 표적이 적절히 억제된 경우에도 증식을 가동시킬 수 있는 다른 경로에서의 변경을 가질 수 있음 (예를 들어 PLCγ에서의 돌연변이, 예컨대 구성적 BTK-비의존성 세포 신호전달을 발생시키는 PLCγ에서의 활성화 돌연변이). 치료는 비-반응성의 원인에 따라 변경될 수 있다. 예를 들어, 제1 상황에서 (일부 실시양태에서), 대상체가 키나제 억제제가 그의 표적을 억제하는 것을 방지하는 돌연변이를 갖는 (또는 갖는 것으로서 확인된) 경우에, 제2 키나제 억제제 (예를 들어, 동일한 표적에 대해 지시됨)가 키나제 억제제를 대체할 (또는 그와 조합되어 투여될) 수 있다. 보다 구체적으로, 일부 실시양태에서 환자가 이브루티닙이 BTK를 억제하는 것을 방지하는 돌연변이를 갖는 (또는 갖는 것으로서 확인된) 경우에, 제2 BTK 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 BTK 억제제, 예컨대 GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774, 또는 LFM-A13이 이브루티닙을 대체할 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 제2 키나제 억제제는 돌연변이에 의해 방해받지 않는 표적의 영역에서 작용할 수 있고, 따라서 대상체는 제2 키나제 억제제에 대해 감수성이다. 다른 실시양태에서, 원래의 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)가 유지된다. 여기서 비-제한적인 이론에 따르면, 원래의 키나제 억제제는 CAR-발현 세포에 대해 유용한 활성, 예를 들어 TH1 표현형을 촉진하는 것, 증식을 촉진하는 것, 또는 달리 세포의 수준 또는 활성을 증가시키는 것을 가질 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 경우에서, 대상체가 표적이 적절히 억제된 경우에도 증식을 가동시킬 수 있는 또 다른 경로에서의 변경 (예를 들어, 돌연변이)을 갖기 때문에, 대상체는 비-반응성이다. 따라서, 대상체가 키나제 억제제의 활성을 효과적이지 않게 하는 경로에서의 변경을 갖는 (또는 갖는 것으로서 확인된) 경우에, 키나제 억제제 요법이 유지될 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙) 활성은 키나제 억제제 단독이 증식을 늦추는데 충분하지 않은 경우에도 암 세포에서 유용한 생물학적 변화를 촉진할 수 있다. 예를 들어, 키나제 억제제는 암 세포를 림프절로부터 이동시켜 그것을 CAR 요법에 보다 취약하게 만드는데 충분할 수 있다.
이제 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)에 반응하는 대상체로 돌아가서, 다양한 치료 요법이 현재 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제에 대한 완전 반응자인 (또는 그러한 것으로서 확인된) 경우에, 완전 반응의 기간 동안 대상체에게 CAR 요법이 투여되지 않는다. 다른 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제에 대한 완전 반응자인 (또는 그러한 것으로서 확인된) 경우에, 완전 반응의 기간 동안 대상체에게 CAR 요법이 투여된다. 한 실시양태에서, CAR 요법 후에, 대상체는 (예를 들어, CAR 요법의 부재 하에 치료된 경우의 질환의 예상 과정과 비교하여) 지속된 반응 또는 지연된 재발을 경험한다. 예를 들어, 이브루티닙 단독요법으로 치료된 MCL은 약 17.5개월의 중간 반응 지속기간을 갖는다.
일부 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)에 대한 부분 반응자인 (또는 그러한 것으로서 확인된) 경우에, 부분 반응의 기간 동안 대상체에게 CAR 요법이 투여되지 않는다. 다른 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제에 대한 부분 반응자인 (또는 그러한 것으로서 확인된) 경우에, 부분 반응의 기간 동안 대상체에게 CAR 요법이 투여된다. 한 실시양태에서, CAR 요법 후에, 대상체는 (예를 들어, CAR 요법의 부재 하에 치료된 경우의 질환의 예상 과정과 비교하여) 완전 반응 및/또는 지속된 반응 또는 지연된 재발을 경험한다.
일부 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)를 사용한 치료 개시 후에 안정 질환을 갖는 (또는 갖는 것으로서 확인된) 경우에, 안정 질환의 기간 동안 대상체에게 CAR 요법이 투여되지 않는다. 다른 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제를 사용한 치료 개시 후에 안정 질환을 갖는 (또는 갖는 것으로서 확인된) 경우에, 안정 질환의 기간 동안 대상체에게 CAR 요법이 투여된다. 한 실시양태에서, CAR 요법 후에, 대상체는 (예를 들어, CAR 요법의 부재 하에 치료된 경우의 질환의 예상 과정과 비교하여) 부분 반응, 완전 반응 및/또는 지속된 반응 또는 지연된 재발을 경험한다.
일부 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)를 사용한 치료 개시 후에 진행성 질환을 갖는 (또는 갖는 것으로서 확인된) 경우에, 진행성 질환의 기간 동안 대상체에게 CAR 요법이 투여되지 않는다. 다른 실시양태에서, 대상체가 키나제 억제제를 사용한 치료 개시 후에 진행성 질환을 갖는 (또는 갖는 것으로서 확인된) 경우에, 진행성 질환의 기간 동안 대상체에게 CAR 요법이 투여된다. 한 실시양태에서, CAR 요법 후에, 대상체는 (예를 들어, CAR 요법의 부재 하에 치료된 경우의 질환의 예상 과정과 비교하여) 안정 질환, 부분 반응, 완전 반응 및/또는 지속된 반응 또는 지연된 재발을 경험한다.
따라서, 치료 과정이 주어진 환자에게 적합한지 결정하기 위해 1회 이상의 질환 평가 단계가 치료 전 또는 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 대상체에게 1차 요법으로서 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)가 투여될 수 있다. 이어서, 일정 기간 (예를 들어, 1 또는 2개월 뿐만 아니라 2주, 3주, 1개월, 1.5개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 9개월, 12개월, 15개월, 또는 18개월) 후에 환자의 반응이 평가될 수 있다. 평가가 대상체가 완전 반응자인 것으로 나타난 경우에, 일부 실시양태에서 CAR 요법이 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 투여되지 않는다. 평가가 대상체가 부분 반응자이거나 안정 질환을 갖는 것으로 나타난 경우에, 일부 실시양태에서 CAR 요법은 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 키나제 억제제와 조합되어 투여된다. 평가가 대상체가 비-반응자 또는 재발자인 것으로 나타난 경우에, 일부 실시양태에서 CAR 요법은 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 키나제 억제제 또는 제2 키나제 억제제와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 키나제 억제제는 CAR-발현 세포를 제조하면서, 예를 들어 환자의 자체 T 세포가 CAR 및/또는 다른 인자를 발현하도록 조작하면서 질환을 제어한다.
환자의 반응자 상태 또는 재발자 상태를 분류하는 임상 표준은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예로서, 악성 림프종의 경우에, 표준화된 반응 기준이 문헌 [Cheson et al., J Clin Oncol 17:1244 (1999) 및 Cheson et al., "Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma", J Clin Oncol 25:579-586 (2007)]에 기재되어 있다 (둘 다 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 따라서, 일부 실시양태에서, 대상체는 체손 기준 또는 변형된 체손 기준에 따라 완전 반응자, 부분 반응자, 안정 질환을 갖는 것, 비-반응자, 또는 재발자로 간주된다. 다른 혈액 악성종양을 분류하기 위한 기준이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
체손 2007의 표 2의 기준에 따르면, 완전 반응자는 질환의 모든 증거의 소멸을 갖고; 부분 반응자는 측정가능한 질환의 퇴화 및 무 신규 부위를 갖고; 안정 질환을 갖는 환자는 CR/PR 또는 PD 달성의 실패를 갖고; 재발성 질환 또는 진행성 질환을 갖는 환자는 임의의 신규 병변 또는 이전에 수반된 부위의 최저점으로부터의 50% 이상의 증가를 갖는다. 평가는 질환이 FDG-활성, PET 양성 또는 음성인지, 예를 들어 간 또는 비장에서 촉지가능한 결절이 존재하는지, 및 골수가 투명해졌거나 관여를 보이는지의 결정을 수반할 수 있다.
CAR 요법 및 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)는, 예를 들어 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR 요법은 키나제 억제제 요법 개시와 실질적으로 동시에 개시된다. 일부 실시양태에서, CAR 요법은 키나제 억제제 요법 개시 전에 개시된다. 일부 실시양태에서, CAR 요법은 키나제 억제제 요법 개시 후에 개시된다. 예를 들어, CAR 요법은 키나제 억제제 요법 개시 후, 예를 들어 적어도 1, 2, 3, 또는 4주, 또는 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12, 15, 18, 또는 24개월 후에 개시될 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR 요법은 환자가 그의 신체 내에서 생리학상 적절한 수준의 키나제 억제제을 갖는 동안 개시된다.
조합하여 투여하는 경우에, CAR 요법 및 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙), 또는 둘 다는 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 높거나, 낮거나 또는 동일한 양 또는 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, CAR 요법, 키나제 억제제, 또는 둘 다의 투여되는 양 또는 투여량은 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 낮다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%). 다른 실시양태에서, 목적하는 효과 (예를 들어, 암의 치료)를 발생시키는 CAR 요법, 키나제 억제제, 또는 둘 다의 양 또는 투여량은 동일한 치료 효과를 달성하는데 요구되는, 개별적으로 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 낮다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 낮다).
조합하여 투여하는 경우에, CAR 요법 및 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙), 또는 둘 다는 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 지속기간보다 길거나, 짧거나 또는 동일한 지속기간으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, CAR 요법, 키나제 억제제, 또는 둘 다의 투여 지속기간은 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 지속기간보다 짧다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%). 다른 실시양태에서, 목적하는 효과 (예를 들어, 암의 치료)를 발생시키는 CAR 요법, 키나제 억제제, 또는 둘 다의 투여의 지속기간은 동일한 치료 효과를 달성하는데 요구되는, 개별적으로 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 지속기간보다 짧다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 짧다). 일부 실시양태에서, 환자에게 키나제 억제제 (예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙)의 단축된 과정이 투여된다. 예를 들어, 키나제 억제제의 단축된 과정은 CAR 요법의 투여 후에 총 약 0-2, 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-12, 12-15, 15-18, 18-21, 또는 21-24개월 지속될 수 있거나, 또는 약 0-2, 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-12, 12-15, 15-18, 18-21, 또는 21-24개월 지속될 수 있다. 실시양태에서, 키나제 억제제의 단축된 과정은 재발 전에 끝난다. 실시양태에서, 키나제 억제제는 단축된 과정 동안 보통 (예를 들어, 단독요법) 수준으로 투여된다.
실시양태에서, CAR-발현 세포의 단일 용량은 약 5 x 108개의 CD19 CART 세포를 포함한다. CAR-발현 세포의 용량은 또한 약 5 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 또는 5 x 109개의 세포, 예를 들어 CD19 CAR 세포, 예를 들어 CD19 CART 세포를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 포유동물 세포, 예를 들어 T 세포에서의 발현을 위해 프로모터에 작동가능하게 연결된 CD19 CAR을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 CD19-발현 종양을 치료하는데 사용하기 위한 CD19 CAR을 발현하는 재조합 세포, 예를 들어 T 세포를 제공하고, 여기서 CD19 CAR을 발현하는 재조합 T 세포는 CD19 CART로 명명된다. 한 측면에서, 본원에 기재된 CD19 CART는 CART가 종양 세포를 표적화하고 종양의 성장이 억제되도록 종양 세포를 그의 표면 상에 발현된 적어도 1개의 CD19 CAR과 접촉시킬 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 CART가 항원에 반응하여 활성화되고 암 세포를 표적화하도록 종양 세포를 CD19 CAR 발현 세포, 예를 들어 본원에 기재된 CD19 CART 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 CD19-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이이며, 여기서 종양의 성장은 억제된다. CD19 CAR-발현 세포, 예를 들어 T 세포는 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제와 조합되어 투여된다.
본원에 사용된 "조합되어" 투여된은, 2종 (또는 그 초과)의 상이한 치료가 대상체가 장애를 앓는 동안 대상체에게 전달됨을 의미하고, 예를 들어 대상체가 장애로 진단된 후 및 장애가 치유 또는 제거되기 전 또는 치료가 다른 이유로 중지되기 전에 2종 이상의 치료가 전달된다. 일부 실시양태에서, 1종의 치료의 전달은 제2 전달이 개시될 때 여전히 발생하여, 투여 기간이 중첩된다. 이것은 때때로 본원에서 "동시" 또는 "공동 전달"로 지칭된다. 다른 실시양태에서, 1종의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 개시되기 전에 종료된다. 어느 하나의 경우의 일부 실시양태에서, 조합 투여로 인해 치료가 보다 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료가 보다 효과적이고, 예를 들어 더 적은 제2 치료에 의해 동등한 효과가 관찰되거나, 또는 제1 치료의 부재 하에 제2 치료가 투여된 경우에 관찰될 것보다 더 큰 정도로 제2 치료가 증상을 감소시키거나, 또는 제1 치료에 의해 유사한 상황이 관찰된다. 일부 실시양태에서, 증상 또는 장애와 관련된 다른 파라미터의 감소가 다른 것의 부재 하에 전달된 1종의 치료에 의해 관찰될 것보다 더 크도록 전달된다. 2종의 치료의 효과는 부분적으로 부가적이거나, 전체적으로 부가적이거나, 또는 부가적인 것보다 클 수 있다. 전달된 제1 치료의 효과가 제2 치료가 전달될 때 여전히 검출가능하도록 전달될 수 있다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포는 본원에 기재된 용량 및/또는 투여 스케줄로 투여되고, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 키나제 억제제 또는 작용제는 본원에 기재된 용량 및/또는 투여 스케줄로 투여된다.
본 발명은 T 세포를 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형시키고, CAR T 세포를 그를 필요로 하는 수용자에 주입하는 세포 요법의 유형을 포함한다. 주입된 세포는 수용자 내에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 치료제와는 달리, CAR-변형된 T 세포는 생체내에서 복제할 수 있어 장기간 존속하고, 이에 의해 지속된 종양 제어가 가능하다. 다양한 측면에서, 환자에 투여된 T 세포, 또는 그의 자손체는 환자에게 T 세포를 투여한 후에 환자 내에서 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 또는 5년 동안 지속된다.
본 발명은 또한 T 세포를 키메라 항원 수용체 (CAR)를 일시적으로 발현하도록, 예를 들어 시험관내 전사된 RNA에 의해 변형시키고, CAR T 세포를 그를 필요로 하는 수용자에 주입하는 일종의 세포 요법을 포함한다. 주입된 세포는 수용자 내에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양한 측면에서, 환자에게 투여된 T 세포는 환자에게 T 세포 투여 후에 1개월 미만, 예를 들어 3주, 2주, 1주 동안 존재한다.
임의의 특정 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, CAR-변형된 T 세포에 의해 유도된 항종양 면역 반응은 능동 또는 수동 면역 반응일 수 있거나, 또는 대안적으로 직접 대 간접 면역 반응에 의한 것일 수 있다. 한 측면에서, CAR 형질도입한 T 세포는 CD19를 발현하는 인간 암 세포에 반응하여 특이적 전염증성 시토카인 분비 및 강력한 세포용해 활성을 보이고, 가용성 CD19 억제에 저항하고, 방관자 사멸을 매개하고, 확립된 인간 종양의 퇴행을 매개한다. 예를 들어, CD19-발현 종양의 불균일 영역 내의 항원이 없는 종양 세포는 인접한 항원-양성 암 세포에 대해 이전에 반응한 CD19-재지시된 T 세포에 의한 간접적인 파괴에 감수성일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 완전-인간 CAR-변형된 T 세포는 포유동물에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 요법을 위한 백신의 일종일 수 있다. 한 측면에서, 포유동물은 인간이다.
생체외 면역화에 관하여, 다음 중 적어도 하나가 세포를 포유동물 내로 투여하기 전에 시험관내에서 발생한다: i) 세포의 확장, ii) CAR을 코딩하는 핵산의 세포 내로의 도입 또는 iii) 세포의 동결보존.
생체외 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 아래에 보다 상세히 논의한다. 간단히 설명하면, 세포은 포유동물 (예를 들어, 인간)로부터 단리하고, 본원에 개시된 CAR을 발현하는 벡터로 유전자 변형된다 (즉, 시험관내에서 형질도입 또는 형질감염된다). CAR-변형된 세포는 치료 이익을 제공하도록 포유동물 수용자에게 투여될 수 있다. 포유동물 수용자는 인간일 수 있고, CAR-변형된 세포는 수용자에 관하여 자가일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수용자에 관하여 동종, 동계 또는 이종일 수 있다. 생체외 면역화와 관련하여 세포-기반 백신을 사용하는 것에 더하여, 환자에서 항원에 대한 면역 반응을 도출하는 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법이 또한 본원에 기재된 방법에 포함된다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포는 면역손상된 개체에서 발생하는 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CD19의 발현과 연관된 질환, 장애 및 상태의 치료에 사용된다. 특정 측면에서, 세포는 CD19의 발현과 연관된 질환, 장애 및 상태의 발생 위험이 있는 환자의 치료에 사용된다. 따라서, 본 발명은 CD19의 발현과 연관된 질환, 장애 및 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 CAR-발현 세포를 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, CD19의 발현과 연관된 질환, 장애 및 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 CD19-발현 세포를 포함하는 세포의 집단을 CD19-발현 세포에 결합하는 본원에 기재된 항-CD19 CAR-발현 세포와 접촉시키는 단계, 및 CD19-발현 세포의 집단을 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, CD19-발현 세포 집단의 증식을 억제하거나 그를 감소시키는 방법을 제공한다. 구체적 측면에서, 본 발명은 CD19-발현 암 세포 집단을 CD19-발현 세포에 결합하는 본원에 기재된 항-CD19 CAR-발현 세포와 접촉시키는 단계, 및 CD19-발현 세포를 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, CD19를 발현하는 암 세포의 증식을 억제하거나 그의 집단을 감소시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 CD19-발현 암 세포 집단을 CD19-발현 세포에 결합하는 본원에 기재된 항-CD19 CAR-발현 세포와 접촉시키는 단계 및 CD19-발현 세포를 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, CD19를 발현하는 암 세포의 증식을 억제하거나 그의 집단을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 본원에 기재된 항-CD19 CAR-발현 세포 및 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제의 조합은, 음성 대조군 대비 CD19-발현 세포와 연관된 혈액암 또는 또 다른 암에 걸린 대상체 또는 그에 대한 동물 모델에서 세포 및/또는 암 세포의 품질, 수, 양 또는 백분율을 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 감소시킨다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한 CD19-발현 세포와 연관된 질환 (예를 들어, 혈액암 또는 CD19를 발현하는 비정형 암)의 예방, 치료 및/또는 관리를 필요로 하는 대상체에게 CD19-발현 세포에 결합하는 항-CD19 CAR-발현 세포를 투여하는 단계 및 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, CD19-발현 세포와 연관된 질환 (예를 들어, 혈액암 또는 CD19를 발현하는 비정형 암)을 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다. CD19-발현 세포와 연관된 장애의 비-제한적인 예는 자가면역 장애 (예컨대 루푸스), 염증성 장애 (예컨대 알레르기 및 천식) 및 암 (예컨대 혈액암 또는 CD19를 발현하는 비정형 암)을 포함한다.
본 발명은 또한 CD19-발현 세포와 연관된 질환의 예방, 치료 및/또는 관리를 필요로 하는 대상체에게 CD19-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-CD19 CART 세포를 투여하는 단계를 포함하는, CD19-발현 세포와 연관된 질환을 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 CD19-발현 세포와 연관된 암의 재발의 예방을 필요로 하는 대상체에게 CD19-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-CD19 발현 세포 (예컨대 항-CD19 CART 세포)를 투여하는 단계를 포함하는, CD19-발현 세포와 연관된 암의 재발을 예방하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 CD19-발현 세포에 결합하는 유효량의 본원에 기재된 항-CD19 발현 세포 (예컨대 항-CD19 CART 세포)를 유효량의 또 다른 요법과 조합하여 투여하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 대상체에게 암이 치료되도록 대상체에게 본원에 기재된 B-세포 표적화 CAR을 발현하는 세포 (예를 들어, 면역 이펙터 세포), 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 방법에 의해 치료가능한 암의 예는 B-세포 항원, 예를 들어 CD19의 발현과 연관된 암이다. 한 실시양태에서, 질환은 고형 또는 액상 종양이다. 한 실시양태에서, 질환은 혈액암이다. 한 실시양태에서, 혈액암은 백혈병이다. 한 실시양태에서, 혈액암은 예를 들어 WHO 분류에 따른 성숙 B 세포 신생물이다. 한 실시양태에서, 혈액암은 CD19+ B-림프구-유래 악성종양이다. 한 실시양태에서, 암은 B-세포 급성 림프성 백혈병 (BALL), T-세포 급성 림프성 백혈병 (TALL), 소림프구성 백혈병 (SLL), 급성 림프성 백혈병 (ALL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 급성 백혈병; 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 만성 백혈병; 외투 세포 림프종 (MCL), B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종 (DLBCL) (예를 들어, T-세포/조직구 풍부 대 B-세포 림프종, CNS의 원발성 DLCBL, 원발성 피부 DLBCL 하지 유형 또는 고령 EBV+ DLBCL), 만성 염증과 연관된 DLBCL, 여포성 림프종, 소아 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 상태, MALT 림프종 (점막-연관 림프성 조직의 림프절외 변연부 림프종), 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 비장 변연부 림프종, 비장 림프종/백혈병 (예를 들어, 분류가능하지 않음), 비장 미만성 적색 속질 소 B-세포 림프종, 모발상 세포 백혈병-변형, 림프형질세포성 림프종, 중쇄 질환 (예를 들어, 알파 중쇄 질환, 감마 중쇄 질환 또는 뮤 중쇄 질환), 형질 세포 골수종, 골의 고립 형질세포종, 골외 형질세포종, 결절성 변연부 림프종, 소아 결절성 변연부 림프종, 원발성 피부 여포 중심세포 림프종, 림프종성 육아종증, 원발성 종격 (흉선) 대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, ALK+ 대 B-세포 림프종, HHV8-연관 다중심성 캐슬만병에서 발생한 대 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, B-세포 림프종, 분류가능하지 않은 것 (예를 들어, DLBCL과 버킷 림프종 사이의 중간 또는 DLBCL과 통상적인 호지킨 림프종 사이의 중간의 특색을 가짐), 및 골수 혈액 세포의 비유효 생산 (또는 이형성증)에 의해 통합된 혈액 상태의 다양한 집합인 "전백혈병"을 포함하나 이에 제한되지는 않는 추가의 혈액암 또는 혈액학적 상태로 이루어진 군으로부터 선택되고, B-세포 항원- (예를 들어, CD19-) 발현과 연관된 질환은 B-세포 항원 (예를 들어, CD19)을 발현하는 비정형 및/또는 비-통상적인 암, 악성종양, 전암성 상태 또는 증식성 질환; 및 그의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 암은 호지킨 림프종이고, 환자는 CAR 발현 세포에 의해, 예를 들어 단독요법으로서 또는 1종 이상의 추가의 치료와 조합되어 치료된다. 실시양태에서, 호지킨 림프종은 병기 I, II, III, 또는 IV이다. 추가의 치료는, 예를 들어 키나제 억제제, 예컨대 이브루티닙과 같은 BTK 억제제를 포함할 수 있다. 추가의 치료는 호지킨 림프종을 위한 치료를 포함할 수 있다. 추가의 치료는, 예를 들어 방사선 요법, MOPP (머스타르겐, 온코빈, 프레드니손 및 프로카르바진), ABVD (아드리아마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진), 스탠포드 V (화학요법 및 방사선 치료에 의한 요법) 또는 BEACOPP (블레오마이신, 에토포시드, 아드리아마이신, 시클로포스파미드, 온코빈, 프로카르바진, 프레드니손)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이전에 방사선 요법, MOPP, 스탠포드 V, 또는 BEACOPP 중 1종 이상으로 치료된 바 있거나, 그에 대해 저항성이거나, 또는 그에 대해 불응성이다.
B-세포 항원, 예를 들어 CD19, CD20, CD22 또는 ROR1 중 1종 이상의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증은, 예를 들어 자가면역 질환 (예를 들어, 루푸스), 염증성 장애 (알레르기 및 천식) 및 이식을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조합에 의해 치료될 수 있는 암은 다발성 골수종이다. 다발성 골수종은 골수 내의 형질 세포 클론의 축적을 특징으로 하는 혈액의 암이다. 다발성 골수종에 대한 현행 요법은 탈리도미드의 유사체인 레날리도미드를 사용하는 치료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 레날리도미드는 항종양 활성, 혈관신생 억제, 및 면역조정을 포함하는 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 CD19 CAR 은 골수종 세포를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조합은 1종 이상의 추가의 요법, 예를 들어 레날리도미드 치료와 함께 사용될 수 있다.
본원에 기재된 CAR-발현 세포는 단독으로, 또는 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 시토카인 또는 세포 집단과 같은 다른 성분과 조합된 제약 조성물로서 투여될 수 있다.
실시양태에서, 림프구고갈 화학요법은 CAR 세포, 예를 들어 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입) 전, 그와 공동으로, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다. 예에서, 림프구고갈 화학요법은 CAR 세포의 투여 전에 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 림프구고갈 화학요법은 CAR 세포 주입 1-4일 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4일) 전에 종료된다. 실시양태에서, CAR 세포의 다중 용량이 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 투여된다. 예를 들어, 단일 용량은 약 5 x 108개의 CAR 세포를 포함한다. 실시양태에서, 림프구고갈 화학요법은 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입) 전, 그와 공동으로, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다.
혈액암
혈액암 상태는 암의 유형, 예컨대 혈액, 골수 및 림프계에 영향을 미치는 백혈병, 림프종 및 악성 림프증식성 상태이다.
백혈병은 급성 백혈병 및 만성 백혈병로서 분류될 수 있다. 급성 백혈병은 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 급성 림프성 백혈병 (ALL)으로서 추가로 분류될 수 있다. 만성 백혈병은 만성 골수성 백혈병 (CML) 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함한다. 다른 관련 상태는 골수성 혈액 세포의 비효과적인 생산 (또는 이형성) 및 AML로의 변환 위험과 연관된 혈액 상태의 다양한 집단인 골수이형성 증후군 (MDS, 이전에 "전백혈병"으로 공지됨)을 포함한다.
림프종은 림프구에서 발생한 혈액 세포 종양의 군이다. 예시적인 림프종은 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종을 포함한다.
조합 요법
본원에 기재된 CAR-발현 세포 (예를 들어, 및 본원에 기재된 키나제 억제제)의 조합은 다른 공지된 작용제 및 요법과 조합되어 사용될 수 있다.
본원에 기재된 CAR-발현 세포, 키나제 억제제 및/또는 적어도 1종의 추가의 치료제는 동시에, 동일한 조성물 내에 또는 개별 조성물 내에, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적인 투여를 위해, 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 먼저 투여될 수 있고 추가의 작용제는 두 번째로 투여될 수 있거나, 투여 순서가 역전될 수 있다.
CAR 요법 및/또는 다른 치료제, 절차 또는 양식은 장애의 활성 기간 동안, 또는 질환의 완화 또는 보다 낮은 활성 기간 동안 투여될 수 있다. CAR 요법은 장애의 또 다른 치료 전, 치료와 공동으로, 치료-후, 또는 완화 동안 투여될 수 있다.
조합되어 사용되는 경우에, CAR 요법 및 1종 이상의 추가의 작용제 (예를 들어, 키나제 억제제 및/또는 제3 작용제), 또는 모두는 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 높거나, 낮거나, 또는 동일한 양 또는 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, CAR 요법, 추가의 작용제 (예를 들어, 키나제 억제제 및/또는 제3 작용제), 또는 모두의 투여되는 양 또는 투여량은 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 낮다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%). 다른 실시양태에서, 목적하는 효과 (예를 들어, 암의 치료)를 발생시키는 CAR 요법, 추가의 작용제 (예를 들어, 키나제 억제제 및/또는 제3 작용제), 또는 모두의 양 또는 투여량은 동일한 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 개별적으로 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 낮다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 낮다).
추가 측면에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포 (예를 들어, 및 키나제 억제제)의 조합은 수술, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역절제제, 예컨대 캄파트, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 치료제, 사이톡신, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 시토카인, 및 방사선조사, 펩티드 백신, 예컨대 문헌 [Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971]에 기재된 것과 조합되어 치료 요법에서 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포 (예를 들어, 및 본원에 기재된 키나제 억제제)의 조합은 또 다른 화학치료제와 조합되어 사용될 수 있다. 예시적인 화학치료제는 안트라시클린 (예를 들어, 독소루비신 (예를 들어, 리포솜 독소루비신)); 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈); 알킬화제 (예를 들어, 시클로포스파미드, 데카르바진, 멜팔란, 이포스파미드, 테모졸로미드); 면역 세포 항체 (예를 들어, 알렘투주맙, 겜투주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 토시투모맙, 브렌툭시맙); 항대사물 (예를 들어, 폴산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 데아미나제 억제제 (예를 들어, 플루다라빈) 포함); TNFR 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질 (GITR) 효능제; 프로테아솜 억제제 (예를 들어, 아클라시노마이신 A, 글리오톡신 또는 보르테조밉); 면역조정제, 예컨대 탈리도미드 또는 탈리도미드 유도체 (예를 들어, 레날리도미드)를 포함한다.
조합 요법에서 사용되는 것으로 고려되는 일반적인 화학치료제는 아나스트로졸 (아리미덱스(Arimidex)®), 비칼루타미드 (카소덱스(Casodex)®), 블레오마이신 술페이트 (블레녹산(Blenoxane)®), 부술판 (밀레란(Myleran)®), 부술판 주사 (부설펙스(Busulfex)®), 카페시타빈 (젤로다(Xeloda)®), N4-펜톡시카르보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카르보플라틴 (파라플라틴(Paraplatin)®), 카르무스틴 (비아이시엔유(BiCNU)®), 클로람부실 (류케란(Leukeran)®), 시스플라틴 (플라티놀(Platinol)®), 클라드리빈 (류스타틴(Leustatin)®), 시클로포스파미드 (시톡산® 또는 네오사르(Neosar)®), 시타라빈, 시토신 아라비노시드 (시토사르-유(Cytosar-U)®), 시타라빈 리포솜 주사 (데포사이트(DepoCyt)®), 다카르바진 (디티아이씨-돔(DTIC-Dome)®), 닥티노마이신 (악티노마이신 디(Actinomycin D), 코스메간(Cosmegan)), 다우노루비신 히드로클로라이드 (세루비딘(Cerubidine)®), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사 (다우노솜(DaunoXome)®), 덱사메타손, 도세탁셀 (탁소테레(Taxotere)®), 독소루비신 히드로클로라이드 (아드리아마이신(Adriamycin)®, 루벡스(Rubex)®), 에토포시드 (베페시드(Vepesid)®), 플루다라빈 포스페이트 (플루다라(Fludara)®), 5-플루오로우라실 (아드루실(Adrucil)®, 에푸덱스(Efudex)®), 플루타미드 (유렉신(Eulexin)®), 테자시티빈, 겜시타빈 (디플루오로데옥시시티딘), 히드록시우레아 (히드레아(Hydrea)®), 이다루비신 (이다마이신(Idamycin)®), 이포스파미드 (이펙스(IFEX)®), 이리노테칸 (캄프토사르(Camptosar)®), L-아스파라기나제 (엘스파르(ELSPAR)®), 류코보린 칼슘, 멜팔란 (알케란(Alkeran)®), 6-메르캅토퓨린 (퓨린톨(Purinethol)®), 메토트렉세이트 (폴렉스(Folex)®), 미톡산트론 (노반트론(Novantrone)®), 밀로타르그, 파클리탁셀 (탁솔(Taxol)®), 포에닉스(phoenix) (이트륨90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카르무스틴 임플란트를 갖는 폴리페프로산 20 (글리아델(Gliadel)®), 타목시펜 시트레이트 (놀바덱스(Nolvadex)®), 테니포시드 (부몬(Vumon)®), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민 (티라존(Tirazone)®), 주사용 토포테칸 히드로클로라이드 (하이캄틴(Hycamptin)®), 빈블라스틴 (벨반(Velban)®), 빈크리스틴 (온코빈(Oncovin)®), 및 비노렐빈 (나벨빈(Navelbine)®)을 포함한다.
예시적인 알킬화제는 비제한적으로 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠): 우라실 머스타드 (아미노우라실 머스타드(Aminouracil Mustard)®, 클로레타미나실(Chlorethaminacil)®, 데메틸도판(Demethyldopan)®, 데스메틸도판(Desmethyldopan)®, 해만타민(Haemanthamine)®, 노르도판(Nordopan)®, 우라실 질소 머스타드(Uracil nitrogen mustard)®, 우라실로스트(Uracillost)®, 우라실모스타자(Uracilmostaza)®, 우라무스틴(Uramustin)®, 우라무스틴(Uramustine)®), 클로르메틴 (머스타르겐(Mustargen)®), 시클로포스파미드 (시톡산®, 네오사르(Neosar)®, 클라펜(Clafen)®, 엔독산(Endoxan)®, 프로시톡스(Procytox)®, 레비뮨(Revimmune)™), 이포스파미드 (미톡사나(Mitoxana)®), 멜팔란 (알케란®), 클로람부실 (류케란®), 피포브로만 (아메델(Amedel)®, 베르사이트(Vercyte)®), 트리에틸렌멜라민 (헤멜(Hemel)®, 헥살렌(Hexalen)®, 헥사스타트(Hexastat)®), 트리에틸렌티오포스포르아민, 테모졸로미드 (테모다르(Temodar)®), 티오테파 (티오플렉스(Thioplex)®), 부술판 (부실벡스(Busilvex)®, 밀레란®), 카르무스틴 (비아이시엔유®), 로무스틴 (시이이엔유(CeeNU)®), 스트렙토조신 (자노사르(Zanosar)®), 및 다카르바진 (디티아이씨-돔®)을 포함한다. 추가의 예시적인 알킬화제는 비제한적으로 옥살리플라틴 (엘록사틴(Eloxatin)®); 테모졸로미드 (테모다르® 및 테모달®); 닥티노마이신 (악티노마이신-디, 코스메겐(Cosmegen)®으로도 공지됨); 멜팔란 (L-PAM, L-사르코리신, 및 페닐알라닌 머스타드, 알케란®으로도 공지됨); 알트레타민 (헥사메틸멜라민 (HMM), 헥살렌®으로도 공지됨); 카르무스틴 (비아이시엔유®); 벤다무스틴 (트레안다(Treanda)®); 부술판 (부술펙스® 및 밀레란®); 카르보플라틴 (파라플라틴®); 로무스틴 (시시엔유(CCNU), 시이이엔유®로도 공지됨); 시스플라틴 (CDDP, 플라티놀® 및 플라티놀®-AQ로도 공지됨); 클로람부실 (류케란®); 시클로포스파미드 (시톡산® 및 네오사르®); 다카르바진 (디티아이씨(DTIC), 디아이씨(DIC) 및 이미다졸 카르복스아미드, 디티아이씨-돔®으로도 공지됨); 알트레타민 (헥사메틸멜라민 (HMM), 헥살렌®으로도 공지됨); 이포스파미드 (이펙스®); 프레드누무스틴; 프로카르바진 (마툴란(Matulane)®); 메클로레타민 (질소 머스타드, 무스틴 및 메클로로에타민 히드로클로라이드, 머스타르겐®으로도 공지됨); 스트렙토조신 (자노사르®); 티오테파 (티오포스포아미드, 테스파 및 티에스피에이(TSPA), 티오플렉스®로도 공지됨); 시클로포스파미드 (엔독산®, 시톡산®, 네오사르®, 프로시톡스®, 레비뮨®); 및 벤다무스틴 HC1 (트레안다®)을 포함한다.
실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 플루다라빈, 시클로포스파미드 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 플루다라빈, 시클로포스파미드, 및 리툭시맙 (FCR)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 예를 들어, 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실 (del(17p), 예를 들어 백혈병성 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함하지 않는다. 실시양태에서, 플루다라빈은 약 10-50 mg/m2 (예를 들어, 약 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 또는 45-50 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 시클로포스파미드는 약 200-300 mg/m2 (예를 들어, 약 200-225, 225-250, 250-275, 또는 275-300 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 400-600 mg/m2 (예를 들어, 400-450, 450-500, 500-550, 또는 550-600 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 벤다무스틴 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 예를 들어, 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실 (del(17p), 예를 들어 백혈병성 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함하지 않는다. 실시양태에서, 벤다무스틴은 약 70-110 mg/m2 (예를 들어, 70-80, 80-90, 90-100, 또는 100-110 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 400-600 mg/m2 (예를 들어, 400-450, 450-500, 500-550, 또는 550-600 mg/m2) 의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및/또는 코르티코스테로이드 (예를 들어, 프레드니손)와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손 (R-CHOP)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL)을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 비벌키 제한-병기 DLBCL을 갖는다 (예를 들어, 7 cm 미만의 크기/직경을 갖는 종양을 포함함). 실시양태에서, 대상체는 방사선으로 R-CHOP과 조합되어 치료된다. 예를 들어, 대상체에게 R-CHOP (예를 들어 1-6 사이클, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6사이클의 R-CHOP) 이 투여된 다음, 방사선이 투여된다. 일부 경우에, 대상체에게 방사선 후에 R-CHOP (예를 들어 1-6 사이클, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 사이클의 R-CHOP)이 투여된다.
실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 시클로포스파미드, 독소루비신 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 시클로포스파미드, 독소루비신 및 리툭시맙 (EPOCH-R)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 용량-조정된 EPOCH-R (DA-EPOCH-R)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 B 세포 림프종, 예를 들어 Myc-재배열 공격성 B 세포 림프종을 갖는다.
실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙 및/또는 레날리도미드와 조합되어 대상체에게 투여된다. 레날리도미드 ((RS)-3-(4-아미노-1-옥소 1,3-디히드로-2H-이소인돌-2-일)피페리딘-2,6-디온)은 면역조정제이다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙 및 레날리도미드와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 여포성 림프종 (FL) 또는 외투 세포 림프종 (MCL)을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 FL을 갖고, 이전에 암 요법으로 치료받은 바 없다. 실시양태에서, 레날리도미드는 약 10-20 mg (예를 들어, 10-15 또는 15-20 mg)의 투여량으로, 예를 들어 매일 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 350-550 mg/m2 (예를 들어, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, 또는 475-500 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
예시적인 면역조정제는 예를 들어 아푸투주맙 (로슈(Roche)®로부터 이용가능함); 페그필그라스팀 (뉴라스타(Neulasta)®); 레날리도마이드 (CC-5013, 레블리미드(Revlimid)®); 탈리도미드 (탈로미드(Thalomid)®), 포멜리도미드, 악티미드 (CC4047); 및 IRX-2 (인터류킨 1, 인터류킨 2, 및 인터페론 γ를 비롯한 인간 시토카인의 혼합물, CAS 951209-71-5, IRX 테라퓨틱스(IRX Therapeutics)로부터 이용가능함)을 포함한다.
예시적인 안트라시클린은 예를 들어 독소루비신 (아드리아마이신® 및 루벡스®); 블레오마이신 (블레녹산®); 다우노루비신 (다우노루비신 히드로클로라이드, 다우노마이신, 및 루비도마이신 히드로클로라이드, 세루비딘®); 다우노루비신 리포솜 (다우노루비신 시트레이트 리포솜, 다우녹솜®); 미톡산트론 (DHAD, 노반트론®); 에피루비신 (엘렌스(Ellence)™); 이다루비신 (이다마이신®, 이다마이신 PFS®); 미토마이신 C (뮤타마이신(Mutamycin)®); 겔다나마이신; 헤르비마이신; 라비도마이신; 및 데스아세틸라비도마이신을 포함한다.
예시적인 빈카 알칼로이드는 예를 들어 비노렐빈 타르트레이트 (나벨빈®), 빈크리스틴 (온코빈®), 및 빈데신 (엘디신(Eldisine)®)); 빈블라스틴 (빈블라스틴 술페이트, 빈카류코블라스틴 및 VLB, 알카반(Alkaban)-AQ® 및 벨반®으로도 공지됨); 및 비노렐빈 (나벨빈®)을 포함한다.
예시적인 프로테오솜 억제제는 보르테조밉 (벨케이드(Velcade)®); 카르필조밉 (PX-171-007, (S)-4-메틸-N-((S)-1-(((S)-4-메틸-1-((R)-2-메틸옥시란-2-일)-1-옥소펜탄-2-일)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)-2-((S)-2-(2-모르폴리노아세트아미도)-4-페닐부탄아미도)-펜탄아미드); 마리조밉 (NPI-0052); 익사조밉 시트레이트 (MLN-9708); 델란조밉 (CEP-18770); 및 O-메틸-N-[(2-메틸-5-티아졸릴)카르보닐]-L-세릴-O-메틸-N-[(1S)-2-[(2R)-2-메틸-2-옥시라닐]-2-옥소-1-(페닐메틸)에틸]-L-세린아미드 (ONX-0912)를 포함한다.
실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 브렌툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 브렌툭시맙은 항-CD30 항체 및 모노메틸 아우리스타틴 E의 항체-약물 접합체이다. 실시양태에서, 대상체는 호지킨 림프종 (HL), 예를 들어 재발성 또는 불응성 HL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 CD30+ HL을 포함한다. 실시양태에서, 대상체는 자가 줄기 세포 이식 (ASCT)을 겪은 바 있다. 실시양태에서, 대상체는 ASCT를 겪은 바 없다. 실시양태에서, 브렌툭시맙은 약 1-3 mg/kg (예를 들어, 약 1-1.5, 1.5-2, 2-2.5, 또는 2.5-3 mg/kg)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로, 예를 들어 3주마다 투여된다.
실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 브렌툭시맙 및 다카르바진과 조합되어 또는 브렌툭시맙 및 벤다무스틴과 조합되어 대상체에게 투여된다. 다카르바진은 5-(3,3-디메틸-1-트리아제닐)이미다졸-4-카르복스아미드의 화학 명칭을 갖는 알킬화제이다. 벤다무스틴은 4-[5-[비스(2-클로로에틸)아미노]-1-메틸벤즈이미다졸-2-일]부탄산의 화학 명칭을 갖는 알킬화제이다. 실시양태에서, 대상체는 호지킨 림프종 (HL)을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 이전에 암 요법으로 치료받은 바 없다. 실시양태에서, 대상체는 적어도 60세, 예를 들어 60, 65, 70, 75, 80, 85세 또는 그 초과이다. 실시양태에서, 다카르바진은 약 300-450 mg/m2 (예를 들어, 약 300-325, 325-350, 350-375, 375-400, 400-425, 또는 425-450 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 벤다무스틴은 약 75-125 mg/m2 (예를 들어 75-100 또는 100-125 mg/m2, 예를 들어 약 90 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 브렌툭시맙은 약 1-3 mg/kg (예를 들어, 약 1-1.5, 1.5-2, 2-2.5, 또는 2.5-3 mg/kg)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로, 예를 들어 3주마다 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CD20 억제제, 예를 들어 항-CD20 항체 (예를 들어, 항-CD20 단일- 또는 이중특이적 항체) 또는 그의 단편과 조합되어 대상체에게 투여된다. 예시적인 항-CD20 항체는 리툭시맙, 오파투무맙, 오크렐리주맙, 벨투주맙, 오비누투주맙, TRU-015 (트루비온 파마슈티칼스(Trubion Pharmaceuticals)), 오카라투주맙, 및 Pro131921 (제넨테크(Genentech))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 항-CD20 항체는 리툭시맙을 포함한다. 리툭시맙은 예를 들어 www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf에 기재된 바와 같은, CD20에 결합하고 CD20 과다발현 세포의 세포용해를 유발하는 키메라 마우스/인간 모노클로날 항체 IgG1 카파이다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 CLL 또는 SLL을 갖는다.
일부 실시양태에서, 리툭시맙은 정맥내로, 예를 들어 정맥내 주입으로서 투여된다. 예를 들어, 각각의 주입은 약 500-2000 mg (예를 들어, 약 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900, 또는 1900-2000 mg)의 리툭시맙을 제공한다. 일부 실시양태에서, 리툭시맙은 150 mg/m2 내지 750 mg/m2, 예를 들어 약 150-175 mg/m2, 175-200 mg/m2, 200-225 mg/m2, 225-250 mg/m2, 250-300 mg/m2, 300-325 mg/m2, 325-350 mg/m2, 350-375 mg/m2, 375-400 mg/m2, 400-425 mg/m2, 425-450 mg/m2, 450-475 mg/m2, 475-500 mg/m2, 500-525 mg/m2, 525-550 mg/m2, 550-575 mg/m2, 575-600 mg/m2, 600-625 mg/m2, 625-650 mg/m2, 650-675 mg/m2, 또는 675-700 mg/m2의 용량으로 투여되며, 여기서 m2는 대상체의 체표면적을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리툭시맙은 적어도 4일, 예를 들어 4, 7, 14, 21, 28, 35일, 또는 그 초과의 투여 간격으로 투여된다. 예를 들어, 리툭시맙은 적어도 0.5주, 예를 들어 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 초과의 투여 간격으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 리툭시맙은, 예를 들어 적어도 2주, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20주 또는 그 초과의 일정 기간 동안 본원에 기재된 용량 및 투여 간격으로 투여된다. 예를 들어, 리툭시맙은 치료 사이클당 총 적어도 4용량 (예를 들어, 치료 사이클당 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 그 초과의 용량) 동안 본원에 기재된 용량 및 투여 간격으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 항-CD20 항체는 오파투무맙을 포함한다. 오파투무맙은 대략 149 kDa의 분자량을 갖는 항-CD20 IgG1κ 인간 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 오파투무맙은 트랜스제닉 마우스 및 하이브리도마 기술을 사용하여 생성되고, 재조합 뮤린 세포주 (NS0)로부터 발현 및 정제된다. 예를 들어, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf; 및 임상 시험 식별 번호 NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352, 및 NCT01397591을 참조한다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 오파투무맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 CLL 또는 SLL을 갖는다.
일부 실시양태에서, 오파투무맙은 정맥내 주입으로 투여된다. 예를 들어, 각각의 주입은 약 150-3000 mg (예를 들어, 약 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1200, 1200-1400, 1400-1600, 1600-1800, 1800-2000, 2000-2200, 2200-2400, 2400-2600, 2600-2800, 또는 2800-3000 mg)의 오파투무맙을 제공한다. 실시양태에서, 오파투무맙은, 예를 들어 약 11 용량 동안, 예를 들어 24주 동안 약 300 mg의 출발 투여량에 이어서 2000 mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 오파투무맙은 적어도 4일, 예를 들어 4, 7, 14, 21, 28, 35일 또는 그 초과의 투여 간격으로 투여된다. 예를 들어, 오파투무맙은 적어도 1주, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 26, 28, 20, 22, 24, 26, 28, 30주 또는 그 초과의 투여 간격으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 오파투무맙은 일정 기간, 예를 들어 적어도 1주, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60주 또는 그 초과, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 또는 그 초과, 또는 1, 2, 3, 4, 5년 또는 그 초과 동안 본원에 기재된 용량 및 투여 간격으로 투여된다. 예를 들어, 오파투무맙은 치료 사이클당 총 적어도 2 용량 (예를 들어, 치료 사이클당 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20 또는 그 초과의 용량) 동안 본원에 기재된 용량 및 투여 간격으로 투여된다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 오크렐리주맙을 포함한다. 오크렐리주맙은, 예를 들어 임상 시험 식별 번호 NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570, 및 문헌 [Kappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87]에 기재된 바와 같은 인간화 항-CD20 모노클로날 항체이다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 벨투주맙을 포함한다. 벨투주맙은 CD20에 대한 인간화 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 임상 시험 식별 번호 NCT00547066, NCT00546793, NCT01101581, 및 문헌 [Goldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55]을 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 GA101을 포함한다. GA101 (오비누투주맙 또는 RO5072759로도 불림)은 인간화 및 글리코-조작된 항-CD20 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 문헌 [Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96]; 임상 시험 식별 번호: NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422, 및 NCT01414205; 및 www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf를 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 AME-133v를 포함한다. AME-133v (LY2469298 또는 오카라투주맙으로도 불림)는 리툭시맙과 비교하여 FcγRIIIa 수용체에 대해 증가된 친화도 및 증진된 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는 CD20에 대한 인간화 IgG1 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 문헌 [Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; 및 Forero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403]을 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 PRO131921을 포함한다. PRO131921은 리툭시맙과 비교하여 FcγRIIIa에 대한 보다 나은 결합 및 증진된 ADCC를 갖도록 조작된 인간화 항-CD20 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 문헌 [Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; 및 Casulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46]; 및 임상 시험 식별 번호 NCT00452127을 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 TRU-015를 포함한다. TRU-015는 CD20에 대한 항체의 도메인으로부터 유래된 항-CD20 융합 단백질이다. TRU-015는 모노클로날 항체보다 작지만, Fc-매개 이펙터 기능을 보유한다. 예를 들어, 문헌 [Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25]을 참조한다. TRU-015는 인간 IgG1 힌지, CH2, 및 CH3 도메인에 연결된 항-CD20 단일-쇄 가변 단편 (scFv)을 함유하지만, CH1 및 CL 도메인은 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD20 항체는 치료제, 예를 들어 본원에 기재된 화학요법제 (예를 들어, 시톡산, 플루다라빈, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 탈메틸화제, 펩티드 백신, 항종양 항생제, 티로신 키나제 억제제, 알킬화제, 항미세관제 또는 항유사분열제), 항알레르기제, 항오심제 (또는 항구토제), 통증 완화제 또는 세포보호제에 접합되거나 달리 결합된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 B-세포 림프종 2 (BCL-2) 억제제 (예를 들어, 베네토클락스, ABT-199 또는 GDC-0199로도 불림) 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 베네토클락스 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 베네토클락스는 항아폽토시스 단백질, BCL-2를 억제하는 소분자이다. 베네토클락스 (4-(4-{[2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸시클로헥스-1-엔-1-일]메틸}피페라진-1-일)-N-({3-니트로-4-[(테트라히드로-2H-피란-4-일메틸)아미노]페닐}술포닐)-2-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-일옥시)벤즈아미드)의 구조가 하기 제시된다.
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실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 재발성 CLL을 갖고, 예를 들어 대상체는 이전에 암 요법을 투여받은 바 있다. 실시양태에서, 베네토클락스는 약 15-600 mg (예를 들어, 15-20, 20-50, 50-75, 75-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 또는 500-600 mg)의 투여량으로, 예를 들어 매일 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 350-550 mg/m2 (예를 들어, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, 또는 475-500 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로, 예를 들어 매월 투여된다.
한 실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR을 발현하는 세포는 Treg 세포 집단을 감소시키는 분자와 조합되어 대상체에게 투여된다. Treg 세포의 수를 감소시키는 (예를 들어, 고갈시키는) 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 CD25 고갈, 시클로포스파미드 투여, GITR 기능 조정을 포함한다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 분리반출술 전 또는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여 전에 대상체에서 Treg 세포의 수를 감소시키는 것은 종양 미세환경에서 원치않는 면역 세포 (예를 들어, Treg)의 수를 감소시키고 대상체의 재발 위험을 감소시키는 것으로 여겨진다. 한 실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR을 발현하는 세포는 GITR 표적화하고/거나 GITR 기능을 조정하는 분자, 예컨대 조절 T 세포 (Treg)를 고갈시키는 GITR 효능제 및/또는 GITR 항체와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 CAR을 발현하는 세포는 시클로포스파미드와 조합되어 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, GITR 결합 분자 및/또는 GITR 기능을 조절하는 분자 (예를 들어, GITR 효능제 및/또는 Treg 고갈 GITR 항체)는 CAR-발현 세포의 투여 전에 투여된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, GITR 효능제는 세포의 분리반출술 전에 투여될 수 있다. 실시양태에서, 시클로포스파미드는 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입 또는 재-주입) 전 또는 세포의 분리반출술 전에 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 시클로포스파미드 및 항-GITR 항체는 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입 또는 재-주입) 전 또는 세포의 분리반출술 전에 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, 대상체는 암 (예를 들어, 고형 암 또는 혈액암, 예컨대 ALL 또는 CLL)을 갖는다. 한 실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 ALL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 고형 암, 예를 들어 본원에 기재된 고형 암을 갖는다.
예시적인 GITR 효능제는, 예를 들어 GITR 융합 단백질 및 항-GITR 항체 (예를 들어, 2가 항-GITR 항체), 예컨대 예를 들어, 미국 특허 번호 6,111,090, 유럽 특허 번호 090505B1, 미국 특허 번호 8,586,023, PCT 공개 번호 WO 2010/003118 및 2011/090754에 기재된 GITR 융합 단백질, 또는 예를 들어 미국 특허 번호 7,025,962, 유럽 특허 번호 1947183B1, 미국 특허 번호 7,812,135, 미국 특허 번호 8,388,967, 미국 특허 번호 8,591,886, 유럽 특허 번호 EP 1866339, PCT 공개 번호 WO 2011/028683, PCT 공개 번호 WO 2013/039954, PCT 공개 번호 WO2005/007190, PCT 공개 번호 WO 2007/133822, PCT 공개 번호 WO2005/055808, PCT 공개 번호 WO 99/40196, PCT 공개 번호 WO 2001/03720, PCT 공개 번호 WO99/20758, PCT 공개 번호 WO2006/083289, PCT 공개 번호 WO 2005/115451, 미국 특허 번호 7,618,632, 및 PCT 공개 번호 WO 2011/051726에 기재된 항-GITR 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포 및 본원에 기재된 키나제 억제제의 조합은 GITR 효능제, 예를 들어 본원에 기재된 GITR 효능제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, GITR 효능제는 CAR-발현 세포 전에 투여된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, GITR 효능제는 세포의 분리반출술 전에 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다.
칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린을 억제하는 약물 (시클로스포린 및 FK506) 또는 성장 인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제를 억제하는 약물 (라파마이신) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)이 또한 사용될 수 있다. 추가의 측면에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 플루다라빈과 같은 화학요법제를 사용하는 T 세포 절제 요법, 외부-빔 방사선 요법 (XRT), 시클로포스파미드, 및/또는 항체, 예컨대 OKT3 또는 캄파트와 공동으로(예를 들어, 이전에, 동시에 또는 이후에) 환자에게 투여될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 세포 조성물은 B-세포 절제 요법, 예컨대 CD20과 반응하는 작용제, 예를 들어 리툭산(Rituxan) 이후에 투여된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 대상체는 말초 혈액 줄기 세포 이식 이후 고용량 화학요법을 이용한 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 실시양태에서, 이식 이후에, 대상체는 본 발명의 확장된 면역 세포의 주입을 받는다. 추가의 실시양태에서, 확장된 세포는 수술 전에 또는 수술 이후에 투여된다.
한 실시양태에서, 대상체는 CAR-발현 세포의 투여와 연관된 부작용을 감소 또는 개선시키는 작용제를 투여받을 수 있다. CAR-발현 세포의 투여와 연관된 부작용은 CRS, 및 혈구포식성 림프조직구증식증 (HLH, 또한 대식세포 활성화 증후군 (MAS)으로 칭함)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. CRS의 증상은 고열, 오심, 일시적 저혈압, 저산소증 등을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 CAR-발현 세포를 대상체에게 투여하고, CAR-발현 세포를 사용하는 치료로부터 발생하는 상승된 수준의 가용성 인자를 관리하기 위해 작용제를 추가로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체에서 상승되는 가용성 인자는 IFN-γ, TNFα, IL-2 수용체 및 IL-6 중 1종 이상이다. 따라서, 상기 부작용을 치료하기 위해 투여되는 작용제는 이들 가용성 인자 중 1종 이상을 중화시키는 작용제일 수 있다. 이러한 작용제의 예는 스테로이드 (예를 들어, 코르티코스테로이드), TNFα의 억제제, 및 IL-6의 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. TNFα 억제제의 예는 항-TNFα 항체 분자, 예컨대 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골 및 골리무맙이다. TNFα 억제제의 또 다른 예는 융합 단백질, 예컨대 엔타너셉트이다. TNFα의 소분자 억제제는 크산틴 유도체 (예를 들어 펜톡시필린) 및 부프로피온을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. IL-6 억제제의 예는 항-IL-6 항체 분자 또는 항-IL-6 수용체 항체 분자, 예컨대 토실리주맙 (toc), 사릴루맙, 엘실리모맙, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301, 및 FM101이다. 한 실시양태에서, 항-IL-6 항체 분자는 토실리주맙이다. IL-1R 기반 억제제의 예는 아나킨라이다.
한 실시양태에서, 대상체에게 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 투여할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 억제 분자, 예를 들어 프로그램화된 사멸 1 (PD1)은 일부 실시양태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서 억제에 의한 억제 분자의 억제는 CAR-발현 세포 성능을 최적화할 수 있다. 실시양태에서, 억제 핵산, 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR), 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN)와 같은 억제 핵산이 CAR-발현 세포에서 억제 분자의 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 억제제는 shRNA이다. 한 실시양태에서, 억제 분자는 CAR-발현 세포 내에서 억제된다. 이들 실시양태에서, 억제 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자는 CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 코딩하는 핵산에 연결된다. 한 실시양태에서, 억제 신호의 억제제는 예를 들어, 억제 분자에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 예를 들어, 작용제는 PD1, PD-L1, PD-L2 또는 CTLA4 (예를 들어, 이필리무맙 (MDX-010 및 MDX-101로도 지칭되고, 예르보이(Yervoy)®로서 시판됨; 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb); 트레멜리무맙 (화이자(Pfizer)로부터 이용가능한 IgG2 모노클로날 항체, 이전에 티실리무맙, CP-675,206으로서 공지됨))에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 한 실시양태에서, 작용제는 TIM3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 작용제는 LAG3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 작용제는 CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5)에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
PD1은 CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA를 또한 포함하는 CD28 패밀리의 수용체의 억제 구성원이다. PD1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수성 세포 상에서 발현된다 (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). PD1, PD-L1 및 PD-L2에 대한 2개의 리간드는 PD1에 결합할 때 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 나타났다 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1은 인간 암에 풍부하다 (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). 면역 억제는 PD1과 PD-L1의 국소 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있다. PD1, PD-L1 및 PD-L2의 항체, 항체 단편 및 다른 억제제는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 기재된 CD19 CAR과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 니볼루맙 (BMS-936558 또는 MDX1106으로도 지칭됨; 브리스톨-마이어스 스큅)은 PD1을 특이적으로 차단하는 완전 인간 IgG4 모노클로날 항체이다. 니볼루맙 (클론 5C4) 및 PD1에 특이적으로 결합하는 다른 인간 모노클로날 항체는 US 8,008,449 및 WO2006/121168에 기재되어 있다. 피딜리주맙 (CT-011; 큐어 테크(Cure Tech))은 PD1에 결합하는 인간화 IgG1k 모노클로날 항체이다. 피딜리주맙 및 다른 인간화 항-PD1 모노클로날 항체는 WO2009/101611에 기재되어 있다. 펨브롤리주맙 (이전에 람브롤리주맙으로 공지됨, 또한 케이트루다, MK03475로도 지칭됨; 머크(Merck))은 PD1에 결합하는 인간화 IgG4 모노클로날 항체이다. 펨브롤리주맙 및 다른 인간화 항-PD1 항체는 US 8,354,509 및 WO2009/114335에 개시되어 있다. MEDI4736 (메드이뮨(Medimmune))은 PDL1에 결합하고 리간드와 PD1의 상호작용을 억제하는 인간 모노클로날 항체이다. MDPL3280A (제넨테크(Genentech)/로슈)는 PD-L1에 결합하는 인간 Fc 최적화된 IgG1 모노클로날 항체이다. MDPL3280A 및 PD-L1에 대한 다른 인간 모노클로날 항체는 미국 특허 7,943,743 및 미국 특허 출원 공개 20120039906에 개시되어 있다. 다른 항-PD-L1 결합제는 YW243.55.S70 (중쇄 및 경쇄 가변 영역이 WO2010/077634의 서열식별번호: 20 및 21에 제시되어 있다) 및 MDX-1 105 (BMS-936559로도 지칭됨, 예를 들어 WO2007/005874에 개시된 항-PD-L1 결합제)을 포함한다. AMP-224 (B7-DCIg; 암플리뮨 (Amplimmune); 예를 들어 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 개시됨)는 PD1 및 B7-H1 사이의 상호작용을 차단하는 PD-L2 Fc 융합 가용성 수용체이다. 다른 항-PD1 항체는 AMP 514 (암플리뮨), 특히 예를 들어 US 8,609,089, US 2010028330 및/또는 US 20120114649에 개시된 항-PD1 항체를 포함한다.
TIM3 (T 세포 이뮤노글로불린-3)은 또한, 특히 IFN-g-분비 CD4+ T 헬퍼 1 및 CD8+ T 세포독성 1 세포에서 T 세포 기능을 음성적으로 조절하고, T 세포 소진에서 중요한 역할을 한다. TIM3 및 그의 리간드, 예를 들어 갈렉틴-9 (Gal9), 포스포티딜세린 (PS), 및 HMGB1 사이의 상호작용의 억제는 면역 반응을 증가시킬 수 있다. TIM3 및 그의 리간드의 항체, 항체 단편, 및 다른 억제제는 관련 기술분야에서 이용가능하고, 본원에 기재된 CD19 CAR과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, TIM3을 표적화하는 항체, 항체 단편, 소분자, 또는 펩티드 억제제는 TIM3의 IgV 도메인에 결합하여, 그의 리간드와의 상호작용을 억제한다. TIM3을 억제하는 항체 및 펩티드는 WO2013/006490 및 US20100247521에 개시되어 있다. 다른 항-TIM3 항체는 인간화 버전의 RMT3-23 (문헌 [Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551]에 개시됨), 및 클론 8B.2C12 (문헌 [Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541]에 개시됨)을 포함한다. TIM3 및 PD-1을 억제하는 이중-특이적 항체는 US20130156774에 개시되어 있다.
다른 실시양태에서, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제는 CEACAM 억제제 (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5 억제제)이다. 한 실시양태에서, CEACAM의 억제제는 항-CEACAM 항체 분자이다. 예시적인 항-CEACAM-1 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 34B1, 26H7, 및 5F4가 WO 2010/125571, WO 2013/082366 WO 2014/059251 및 WO 2014/022332에 기재되어 있거나; 또는 그의 제조합 형태는 예를 들어 US 2004/0047858, US 7,132,255 및 WO 99/052552에 기재된 바와 같다. 다른 실시양태에서, 항-CEACAM 항체는 예를 들어 문헌 [Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)]에 기재된 바와 같이 CEACAM-5에 결합하거나, 또는 예를 들어 WO 2013/054331 및 US 2014/0271618에 기재된 바와 같이 CEACAM-1 및 CEACAM-5와 교차반응한다.
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 암배아성 항원 세포 부착 분자 (CEACAM), 예컨대 CEACAM-1 및 CEACAM-5는, 적어도 부분적으로, 항종양 면역 반응의 억제를 매개하는 것으로 여겨진다 (예를 들어, 문헌 [Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529] 참조). 예를 들어, CEACAM-1은 TIM-3에 대한 이종친화성 리간드로서 및 TIM-3-매개 T 세포 관용 및 소진에서 역할을 하는 것으로서 기재되어 있다 (예를 들어, WO 2014/022332; 문헌 [Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848] 참조). 실시양태에서, CEACAM-1 및 TIM-3의 공동-차단은 이종이식편 결장직장암 모델에서 항종양 면역 반응을 증진시키는 것으로 밝혀진 바 있다 (예를 들어, WO 2014/022332; 상기 문헌 [Huang, et al. (2014)] 참조). 다른 실시양태에서, CEACAM-1 및 PD-1의 공동-차단은 예를 들어 WO 2014/059251에 기재된 바와 같이 T 세포 관용을 감소시킨다. 따라서, CEACAM 억제제는 본원에 기재된 다른 면역조정제 (예를 들어, 항-PD-1 및/또는 항-TIM-3 억제제)와 함께 사용되어 암, 예를 들어 흑색종, 폐암 (예를 들어, NSCLC), 방광암, 결장암, 난소암 및 본원에 기재된 바와 같은 다른 암에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다.
LAG3 (림프구 활성화 유전자-3 또는 CD223)은 CD8+ T 세포 소진에서 역할을 하는 것으로 밝혀진 바 있는 활성화된 T 세포 및 B 세포 상에서 발현되는 세포 표면 분자이다. LAG3 및 그의 리간드의 항체, 항체 단편, 및 다른 억제제는 관련 기술분야에서 이용가능하고, 본원에 기재된 CD19 CAR과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, BMS-986016 (브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squib))은 LAG3을 표적화하는 모노클로날 항체이다. IMP701 (이뮤텝(Immutep))은 길항제 LAG3 항체이고, IMP731 (이뮤텝 및 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline))은 고갈 LAG3 항체이다. 다른 LAG3 억제제는, MHC 부류 II 분자에 결합하고 항원 제시 세포 (APC)를 활성화시키는 LAG3의 가용성 부분 및 Ig의 재조합 융합 단백질인 IMP321 (이뮤텝)을 포함한다. 다른 항체는 예를 들어 WO2010/019570에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, CAR 요법 및 키나제 억제제는 톨 유사 수용체 (TLR) 효능제와 조합되어 투여된다. TLR 효능제는 TLR9 효능제일 수 있다. 일부 실시양태에서, TLR 효능제는 올리고데옥시뉴클레오티드, 예를 들어 CG-풍부 올리고데옥시뉴클레오티드, 예를 들어 비메틸화 CG-풍부 올리고데옥시뉴클레오티드이다. 예를 들어, 문헌 [Sagiv-Barfi et al., "Ibrutinib enhances the antitumor immune response induced by intratumoral injection of a TLR9 ligand in syngeneic mouse lymphoma model." Blood. 2015 Feb 6. pii: blood-2014-08-593137]을 참조하고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, TLR 효능제는 CAR-발현 NK 세포와 조합되어 투여된다. 이론에 얽매이지는 않지만, TLR 효능제는 NK 세포, 예컨대 CAR-발현 NK 세포의 활성화를 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, TLR 효능제는 주사, 예를 들어 종양내 주사에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제는 예를 들어, 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 여기서 제1 도메인은 억제 분자 또는 그의 단편이고, 제2 도메인은 양성 신호와 연관된 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 양성 신호와 연관된 폴리펩티드는 CD28, CD27, ICOS의 공동자극 도메인, 예를 들어 CD28, CD27 및/또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인, 및/또는 예를 들어, 본원에 설명된것과 같은 CD3 제타의 1차 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 융합 단백질은 CAR을 발현하는 동일한 세포에 의해 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 항-CD19 CAR을 발현하지 않는 세포, 예를 들어 T 세포에 의해 발현된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제는 miR-17-92이다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR의 활성을 증진시키는 작용제는 시토카인이다. 시토카인은 T 세포 확장, 분화, 생존, 및 항상성과 관련하여 중요한 기능을 갖는다. 본원에 기재된 CAR-발현 세포를 제공받은 대상체에게 투여될 수 있는 시토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18, 및 IL-21, 또는 그의 조합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 투여되는 시토카인은 IL-7, IL-15, 또는 IL-21, 또는 그의 조합이다. 시토카인은 1일에 1회, 또는 1일에 1회 초과, 예를 들어 1일에 2회, 1일에 3회, 또는 1일에 4회 투여될 수 있다. 시토카인은 1일 초과 동안 투여될 수 있고, 예를 들어 시토카인은 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주 또는 4주 동안 투여된다. 예를 들어, 시토카인은 7일 동안 1일에 1회 투여된다.
실시양태에서, 시토카인은 CAR-발현 세포와 조합되어 투여된다. 시토카인은 CAR-발현 세포와 동시에 또는 공동으로 투여, 예를 들어 동일한 날에 투여될 수 있다. 시토카인은 CAR-발현 세포와 동일한 제약 조성물 내에 제조될 수 있거나, 또는 개별 제약 조성물로 제조될 수 있다. 대안적으로, 시토카인은 CAR-발현 T 세포의 투여 직후, 예를 들어 CAR-발현 세포의 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후에 투여될 수 있다. 시토카인이 1일 초과에 걸쳐 이루어지는 투여 요법으로 투여되는 실시양태에서, 시토카인 투여 요법의 제1일은 CAR-발현 세포에 의한 투여와 동일한 날일 수 있거나, 또는 시토카인 투여 요법의 제1일은 CAR-발현 T 세포의 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후일 수 있다. 한 실시양태에서, 제1일에 CAR-발현 세포가 대상체에게 투여되고, 제2일에 시토카인이 다음 7일 동안 1일에 1회 투여된다. 바람직한 실시양태에서, CAR-발현 세포와 조합되어 투여되는 시토카인은 IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21이다.
다른 실시양태에서, 시토카인은 CAR-발현 세포의 투여 충분한 일정 기간 후, 예를 들어 CAR-발현 세포의 투여 적어도 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 1년 또는 그 초과 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 시토카인은 CAR-발현 세포에 대한 대상체의 반응의 평가 후에 투여된다. 예를 들어, 본원에 기재된 투여량 및 요법에 따라 대상체에게 CAR-발현 세포가 투여된다. CART 요법에 대한 대상체의 반응은 종양 성장의 억제, 순환 종양 세포의 감소, 또는 종양 퇴행을 비롯한 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여, CAR-발현 세포의 투여 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 1년 또는 그 초과 후에 평가된다. CART 요법에 대해 충분한 반응을 나타내지 않는 대상체에게 시토카인이 투여될 수 있다. CART 요법에 대해 준-최적 반응을 갖는 대상체에게의 시토카인의 투여는 CART 효능 및/또는 항종양 활성을 개선시킨다. 바람직한 실시양태에서, CAR-발현 세포의 투여 후에 투여되는 시토카인은 IL-7이다.
저용량의 mTOR 억제제와의 조합
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 낮은, 면역 증진, 용량의 mTOR 억제제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, mTOR 억제제의 용량은 적어도 5 내지 90% 이하, 적어도 10 내지 90% 이하, 적어도 15 내지 90% 이하, 적어도 20 내지 90% 이하, 적어도 30 내지 90% 이하, 적어도 40 내지 90% 이하, 적어도 50 내지 90% 이하, 적어도 60 내지 90% 이하, 또는 적어도 70 내지 90% 이하의 mTOR 억제와 연관되거나 또는 mTOR 억제를 제공한다.
한 실시양태에서, mTOR 억제제의 용량은 적어도 5 내지 80% 이하, 적어도 10 내지 80% 이하, 적어도 15 내지 80% 이하, 적어도 20 내지 80% 이하, 적어도 30 내지 80% 이하, 적어도 40 내지 80% 이하, 적어도 50 내지 80% 이하, 또는 적어도 60 내지 80% 이하의 mTOR 억제와 연관되거나 또는 mTOR 억제를 제공한다.
한 실시양태에서, mTOR 억제제의 용량은 적어도 5 내지 70% 이하, 적어도 10 내지 70% 이하, 적어도 15 내지 70% 이하, 적어도 20 내지 70% 이하, 적어도 30 내지 70% 이하, 적어도 40 내지 70% 이하, 또는 적어도 50 내지 70% 이하의 mTOR 억제와 연관되거나 또는 mTOR 억제를 제공한다.
한 실시양태에서, mTOR 억제제의 용량은 적어도 5 내지 60% 이하, 적어도 10 내지 60% 이하, 적어도 15 내지 60% 이하, 적어도 20 내지 60% 이하, 적어도 30 내지 60% 이하, 또는 적어도 40 내지 60% 이하의 mTOR 억제와 연관되거나 또는 mTOR 억제를 제공한다.
한 실시양태에서, mTOR 억제제의 용량은 적어도 5 내지 50% 이하, 적어도 10 내지 50% 이하, 적어도 15 내지 50% 이하, 적어도 20 내지 50% 이하, 적어도 30 내지 50% 이하, 또는 적어도 40 내지 50% 이하의 mTOR 억제와 연관되거나 또는 mTOR 억제를 제공한다.
한 실시양태에서, mTOR 억제제의 용량은 적어도 5 내지 40% 이하, 적어도 10 내지 40% 이하, 적어도 15 내지 40% 이하, 적어도 20 내지 40% 이하, 적어도 30 내지 40% 이하, 또는 적어도 35 내지 40% 이하의 mTOR 억제와 연관되거나 또는 mTOR 억제를 제공한다.
한 실시양태에서, mTOR 억제제의 용량은 적어도 5 내지 30% 이하, 적어도 10 내지 30% 이하, 적어도 15 내지 30% 이하, 적어도 20 내지 30% 이하, 또는 적어도 25 내지 30% 이하의 mTOR 억제와 연관되거나 또는 mTOR 억제를 제공한다.
한 실시양태에서, mTOR 억제제의 용량은 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 내지 20% 이하, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 내지 30% 이하, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 내지 35 이하, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 내지 40% 이하, 또는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 내지 45% 이하의 mTOR 억제와 연관되거나 또는 mTOR 억제를 제공한다.
한 실시양태에서, mTOR 억제제의 용량은 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 내지 90% 이하의 mTOR 억제와 연관되거나 또는 mTOR 억제를 제공한다.
본원에 논의된 바와 같이, mTOR 억제의 정도는 P70 S6 키나제 억제의 정도로서 표현될 수 있고, 예를 들어 mTOR 억제의 정도는 P70 S6 키나제 활성의 감소 수준에 의해, 예를 들어 P70 S6 키나제 기질의 인산화의 감소에 의해 결정될 수 있다. mTOR 억제의 수준은 본원에 기재된 방법에 의해, 예를 들어 불레이 검정, 또는 웨스턴 블롯에 의한 인산화 S6 수준의 측정에 의해 평가될 수 있다.
예시적인 mTOR 억제제
본원에 사용된 용어 "mTOR 억제제"는 세포에서 mTOR 키나제를 억제하는 화합물 또는 리간드, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 지칭한다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제는 알로스테릭 억제제이다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제는 촉매 억제제이다.
알로스테릭 mTOR 억제제는 중성 트리시클릭 화합물 라파마이신 (시롤리무스), 예를 들어 라파마이신 유도체, 라파마이신 유사체 (라파로그로도 지칭됨) 및 mTOR 활성을 억제하는 다른 마크롤리드 화합물을 비롯한 라파마이신과 구조적 및 기능적 유사성을 갖는 화합물인 라파마이신-관련 화합물을 포함한다.
라파마이신은 하기 화학식 A에 제시된 구조를 갖는 스트렙토미세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에 의해 생산된 공지된 마크롤리드 항생제이다.
<화학식 A>
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예를 들어, 문헌 [McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433]; 미국 특허 번호 3,929,992를 참조한다. 라파마이신에 대해 제안되는 다양한 넘버링 스킴이 존재한다. 혼동을 피하기 위해, 특정 라파마이신 유사체가 본원에서 명명되는 경우에, 명칭은 화학식 A의 넘버링 스킴을 사용하는 라파마이신과 관련하여 주어진다.
본 발명에서 유용한 라파마이신 유사체는, 예를 들어 라파마이신의 시클로헥실 고리 상의 히드록실 기가 OR1 (여기서 R1은 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬, 아실아미노알킬 또는 아미노알킬임)에 의해 대체된 O-치환된 유사체; 예를 들어 그 내용이 참조로 포함되는 US 5,665,772 및 WO94/09010에 기재된 바와 같은 에베롤리무스로도 공지된 RAD001이다. 다른 적합한 라파마이신 유사체는 26- 또는 28-위치에서 치환된 것을 포함한다. 라파마이신 유사체는 상기 언급된 유사체의 에피머, 특히 위치 40, 28 또는 26에서 치환된 유사체의 에피머일 수 있고, 예를 들어 그 내용이 참조로 포함되는 US 6,015,815, WO95/14023 및 WO99/15530에 기재된 바와 같이 임의로 추가로 수소화될 수 있고, 예를 들어 그 내용이 참조로 포함되는 US 7,091,213, WO98/02441 및 WO01/14387에 기재된 조타롤리무스로도 공지된 ABT578 또는 라파마이신 유사체, 예를 들어 리다포롤리무스로도 공지된 AP23573이다.
US 5,665,772로부터의 본 발명에서 사용하기에 적합한 라파마이신 유사체의 예는 40-O-벤질-라파마이신, 40-O-(4'-히드록시메틸)벤질-라파마이신, 40-O-[4'-(1,2-디히드록시에틸)]벤질-라파마이신, 40-O-알릴-라파마이신, 40-O-[3'-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4(S)-일)-프로프-2'-엔-1'-일]-라파마이신, (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-디히드록시펜트-2'-엔-1'-일)-라파마이신, 40-O-(2-히드록시)에톡시카르보닐메틸-라파마이신, 40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신, 40-O-(3-히드록시)프로필-라파마이신, 40-O-(6-히드록시)헥실-라파마이신, 40-O-[2-(2-히드록시)에톡시]에틸-라파마이신, 40-O-[(3S)-2,2-디메틸디옥솔란-3-일]메틸-라파마이신, 40-O-[(2S)-2,3-디히드록시프로프-1-일]-라파마이신, 40-O-(2-아세톡시)에틸-라파마이신, 40-O-(2-니코티노일옥시)에틸-라파마이신, 40-O-[2-(N-모르폴리노)아세톡시]에틸-라파마이신, 40-O-(2-N-이미다졸릴아세톡시)에틸-라파마이신, 40-O-[2-(N-메틸-N'-피페라지닐)아세톡시]에틸-라파마이신, 39-O-데스메틸-39,40-O,O-에틸렌-라파마이신, (26R)-26-디히드로-40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신, 40-O-(2-아미노에틸)-라파마이신, 40-O-(2-아세트아미노에틸)-라파마이신, 40-O-(2-니코틴아미도에틸)-라파마이신, 40-O-(2-(N-메틸-이미다조-2'-일카르브에톡사미도)에틸)-라파마이신, 40-O-(2-에톡시카르보닐아미노에틸)-라파마이신, 40-O-(2-톨릴술폰아미도에틸)-라파마이신 및 40-O-[2-(4',5'-디카르보에톡시-1',2',3'-트리아졸-1'-일)-에틸]-라파마이신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 다른 라파마이신 유사체는 라파마이신의 시클로헥실 고리 상의 히드록실 기 및/또는 28 위치의 히드록실 기가 히드록시에스테르 기로 대체된 유사체이고, 예를 들어 US RE44,768에서 확인되는 라파마이신 유사체, 예를 들어 템시롤리무스가 공지되어 있다.
본 발명에 유용한 다른 라파마이신 유사체는 16 위치의 메톡시 기가 또 다른 치환기, 바람직하게는 (임의로 히드록시-치환된) 알키닐옥시, 벤질, 오르토메톡시벤질 또는 클로로벤질에 의해 대체되고/거나 39 위치의 메톡시 기가 39 탄소와 함께 결실되어 라파마이신의 시클로헥실 고리가 39 위치 메톡시 기가 결여된 시클로펜틸 고리로 된 것; 예를 들어 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 WO95/16691 및 WO96/41807에 기재된 바와 같은 것을 포함한다. 유사체는 라파마이신의 40-위치의 히드록시가 알킬화되고/거나 32-카르보닐이 환원되도록 추가로 변형될 수 있다
WO95/16691로부터의 라파마이신 유사체는 16-데메톡시-16-(펜트-2-이닐)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-(부트-2-이닐)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-(프로파르길)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-(4-히드록시-부트-2-이닐)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-벤질옥시-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 16-데메톡시-16-벤질옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-오르토-메톡시벤질-라파마이신, 16-데메톡시-40-O-(2-메톡시에틸)-16-펜트-2-이닐)옥시-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-포르밀-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-히드록시메틸-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-카르복시-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-(4-메틸-피페라진-1-일)카르보닐-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-(모르폴린-4-일)카르보닐-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-[N-메틸, N-(2-피리딘-2-일-에틸)]카르바모일-42-노르-라파마이신 및 39-데메톡시-40-데스옥시-39-(p-톨루엔술포닐히드라조노메틸)-42-노르-라파마이신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
WO96/41807로부터의 라파마이신 유사체는 32-데옥소-라파마이신, 16-O-펜트-2-이닐-32-데옥소-라파마이신, 16-O-펜트-2-이닐-32-데옥소-40-O-(2-히드록시-에틸)-라파마이신, 16-O-펜트-2-이닐-32-(S)-디히드로-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 32(S)-디히드로-40-O-(2-메톡시)에틸-라파마이신 및 32(S)-디히드로-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 적합한 라파마이신 유사체는 그 내용이 참조로 포함되는 US2005/0101624에 기재된 바와 같은 우미롤리무스이다.
달리 에베롤리무스 (아피니토르(Afinitor)®)로도 공지된 RAD001은 화학 명칭 (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-히드록시에톡시)-3-메톡시시클로헥실]-1-메틸에틸}-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-11,36-디옥사-4-아자-트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-2,3,10,14,20-펜타온을 갖는다.
알로스테릭 mTOR 억제제의 추가의 예는 시롤리무스 (라파마이신, AY-22989), 40-[3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]-라파마이신 (템시롤리무스 또는 CCI-779로도 불림) 및 리다포롤리무스 (AP-23573/MK-8669)를 포함한다. 알로스테릭 mTOR 억제제의 다른 예는 조타롤리무스 (ABT578) 및 우미롤리무스를 포함한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 촉매 ATP-경쟁적 mTOR 억제제는 mTOR 키나제 도메인을 직접적으로 표적화하고, mTORC1 및 mTORC2 둘 다를 표적화하는 것으로 발견되었다. 이들은 라파마이신-저항성 mTORC1 결과물, 예컨대 4EBP1-T37/46 인산화 및 캡-의존성 번역을 조정하기 때문에, 또한 라파마이신으로서 이러한 알로스테릭 mTOR 억제제보다 mTORC1의 보다 유효한 억제제이다.
촉매 억제제는 BEZ235 또는 2-메틸-2-[4-(3-메틸-2-옥소-8-퀴놀린-3-일-2,3-디히드로-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)-페닐]-프로피오니트릴 또는 모노토실레이트 염 형태 (BEZ235의 합성은 WO2006/122806에 기재되어 있음); 화학 명칭 {5-[2,4-비스-((S)-3-메틸-모르폴린-4-일)-피리도[2,3d]피리미딘-7-일]-2-메톡시-페닐}-메탄올을 갖는 CCG168 (달리 AZD-8055로 공지됨, 문헌 [Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298]); 3-[2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]-N-메틸벤즈아미드 (WO09104019); 3-(2-아미노벤조[d]옥사졸-5-일)-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민 (WO10051043 및 WO2013023184); N-(3-(N-(3-((3,5-디메톡시페닐)아미노)퀴녹살린-2-일)술파모일)페닐)-3-메톡시-4-메틸벤즈아미드 (WO07044729 및 WO12006552); 화학 명칭 1-[4-[4-(디메틸아미노)피페리딘-1-카르보닐]페닐]-3-[4-(4,6-디모르폴리노-1,3,5-트리아진-2-일)페닐]우레아를 갖는 PKI-587 (Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645); 화학 명칭 2,4-디플루오로-N-{2-메톡시-5-[4-(4-피리다지닐)-6-퀴놀리닐]-3-피리디닐}벤젠술폰아미드를 갖는 GSK-2126458 (ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43); 5-(9-이소프로필-8-메틸-2-모르폴리노-9H-퓨린-6-일)피리미딘-2-아민 (WO10114484); (E)-N-(8-(6-아미노-5-(트리플루오로메틸)피리딘-3-일)-1-(6-(2-시아노프로판-2-일)피리딘-3-일)-3-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2(3H)-일리덴)시안아미드 (WO12007926)를 포함한다.
촉매 mTOR 억제제의 추가의 예는 8-(6-메톡시-피리딘-3-일)-3-메틸-1-(4-피페라진-1-일-3-트리플루오로메틸-페닐)-1,3-디히드로-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-온 (WO2006/122806) 및 Ku-0063794 (문헌 [Garcia-Martinez JM, et al.,Biochem J., 2009, 421(1), 29-42..] Ku-0063794는 라파마이신 (mTOR)의 포유동물 표적의 특이적 억제제임)를 포함한다. WYE-354는 촉매 mTor 억제제의 또 다른 예이다 (Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240).
본 발명에 따라 유용한 mTOR 억제제는 상기 중 임의의 것의 전구약물, 유도체, 제약상 허용되는 염, 또는 그의 유사체를 또한 포함한다.
mTOR 억제제, 예컨대 RAD001은 본원에 기재된 특정한 투여량을 기초로 하여 관련 기술분야에 널리-확립되어 있는 방법을 기초로 전달을 위해 제제화될 수 있다. 특히, 미국 특허 6,004,973 (본원에 참조로 포함됨)은 본원에 기재된 mTOR 억제제와 함께 사용가능한 제제의 예를 제공한다.
mTOR 억제의 평가
mTOR은 키나제 P70 S6을 인산화하여, P70 S6 키나제를 활성화시키고 그의 기질을 인산화시키도록 한다. mTOR 억제의 정도는 P70 S6 키나제 억제의 정도로서 표현될 수 있고, 예를 들어 mTOR 억제의 정도는 P70 S6 키나제 활성의 감소 수준에 의해, 예를 들어 P70 S6 키나제 기질의 인산화의 감소에 의해 결정될 수 있다. mTOR 억제의 수준은 억제제의 부재 하에, 예를 들어 억제제의 투여 전에, 및 억제제의 존재 하에, 또는 억제제의 투여 후에 P70 S6 키나제 활성 (기질을 인산화하는 P70 S6 키나제의 능력)을 측정함으로써 결정할 수 있다. P70 S6 키나제의 억제의 수준은 mTOR 억제의 수준을 제공한다. 따라서, P70 S6 키나제가 40% 억제되면, P70 S6 키나제 활성에 의해 측정되는 바와 같은 mTOR 활성은 40% 억제된다. 본원에 언급된 억제 정도 또는 수준은 투여 간격에 걸친 평균 억제 수준이다. 예로서, 억제제가 1주에 1회 주어지면, 억제 수준은 이러한 간격, 즉 1주일에 걸친 평균 억제 수준에 의해 주어진다.
본원에 참조로 포함되는 문헌 [Boulay et al., Cancer Res, 2004, 64:252-61]은 mTOR 억제 수준을 평가하는데 사용될 수 있는 검정 (본원에서 불레이 검정으로 지칭됨)을 교시한다. 한 실시양태에서, 이러한 검정은 mTOR 억제제, 예를 들어 RAD001의 투여 전 및 후의 생물학적 샘플로부터의 P70 S6 키나제 활성의 측정에 의존한다. mTOR 억제제로의 치료 후의 미리 선택된 시간에, 예를 들어 치료 24, 48, 및 72시간 후에 샘플을 채취할 수 있다. 예를 들어, 피부 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터의 생물학적 샘플을 사용할 수 있다. 전체 단백질 추출물을 샘플로부터 제조한다. P70 S6 키나제를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 면역침전에 의해 단백질 추출물로부터 P70 S6 키나제를 단리한다. 단리된 P70 S6 키나제의 활성을 시험관내 키나제 검정에서 측정할 수 있다. 단리된 키나제를 기질의 인산화를 허용하는 조건 하에 40S 리보솜 서브유닛 기질 (이는 P70 S6 키나제의 내인성 기질임) 및 감마-32P와 함께 인큐베이션할 수 있다. 이어서, 반응 혼합물을 SDS-PAGE 겔 상에서 해상시킬 수 있고, 포스포르이미저를 사용하여 32P 신호를 분석할 수 있다. 40S 리보솜 서브유닛의 크기에 상응하는 32P 신호는 인산화된 기질 및 P70 S6 키나제의 활성을 나타낸다. 인산화된 기질의 32P 신호의 면적 및 강도를 정량화하고 (예를 들어, 몰레큘라 다이나믹스(Molecular Dynamics)의 이미지콴트(ImageQuant)를 사용함), 정량화된 신호에 임의의 단위 값을 할당하고, 투여 후로부터의 값을 투여 전으로부터의 값 또는 기준 값과 비교함으로써 키나제 활성의 증가 및 감소를 계산할 수 있다. 예를 들어, 키나제 활성의 퍼센트 억제는 하기 식을 사용하여 계산할 수 있다: 1-(투여 후 수득된 값/투여 전 수득된 값) X 100. 상기 기재된 바와 같이, 본원에 언급된 억제 정도 또는 수준은 투여 간격에 걸친 평균 억제 수준이다.
키나제 활성, 예를 들어, P70 S6 키나제 활성의 평가 방법이 본원에 참조로 포함되는 US 7,727,950에서 또한 제공된다.
PD1 음성 대 PD1 양성 T 세포의 비의 변화에 의해 mTOR 억제 수준을 또한 평가할 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 말초 혈액으로부터의 T 세포가 PD1 음성 또는 양성으로서 확인될 수 있다.
저용량 mTOR 억제제
본원에 기재된 방법은 낮은, 면역 증진, 용량의 mTOR 억제제, 라파로그, 예컨대 RAD001을 비롯한 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제의 용량을 사용한다. 대조적으로, mTOR 경로를 완전히 또는 거의 완전히 억제하는 수준의 억제제는 면역억제성이고, 예를 들어 기관 이식 거부를 방지하기 위해 사용된다. 또한, mTOR을 완전히 억제하는 고용량의 라파로그는 또한 종양 세포 성장을 억제하고, 다양한 암을 치료하기 위해 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvadori M. World J Transplant. 2012 Oct 24;2(5):74-83; Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition. Finn RS. Liver Cancer. 2012 Nov;1(3-4):247-256; Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornella H, Villanueva A. Liver Cancer. 2012 Sep;1(2):83-93; Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013 Sep 20.; Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2013 Oct 2] 참조).
본 발명은, 적어도 부분적으로, 현행 임상 세팅에서 사용되는 것보다 꽤 낮은 용량의 mTOR 억제제가 대상체에서 면역 반응을 증가시키고 PD-1 음성 T 세포/PD-1 양성 T 세포의 비를 증가시키는데 뛰어난 효과를 갖는다는 놀라운 발견을 기초로 한다. mTOR 활성의 단지 부분적인 억제를 생성하는 저용량의 mTOR 억제제가 효과적으로 인간 대상체에서 면역 반응을 개선시킬 수 있고 PD-1 음성 T 세포/PD-1 양성 T 세포의 비를 증가시킬 수 있었다는 것은 놀라운 것이었다.
대안적으로 또는 추가적으로, 어떠한 이론에도 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 그러한 낮은, 낮은, 면역 증진, 용량의 mTOR 억제제가, 예를 들어 비-치료 대상체와 비교하여, 예를 들어 적어도 일시적으로, 나이브 T 세포 수를 증가시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 대안적으로 또는 추가적으로, 다시 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 충분한 양의 시간 또는 충분한 투여 후의 mTOR 억제제에 의한 치료가 하기:
예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 하기 마커: CD62L고, CD127고, CD27+, 및 BCL2 중 1개 이상의 발현의 증가;
예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 KLRG1의 발현의 감소; 및
기억 T 세포 전구체, 예를 들어 하기 특징: 증가된 CD62L고, 증가된 CD127고, 증가된 CD27+, 감소된 KLRG1, 및 증가된 BCL2 중 어느 하나 또는 그의 조합을 갖는 세포의 수의 증가;
중 1개 이상을 발생시키고, 상기 기재된 임의의 변화는, 예를 들어 비-치료 대상체와 비교하여, 예를 들어 적어도 일시적으로 발생하는 것으로 여겨진다 (Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112). 기억 T 세포 전구체는 분화 프로그램에서 초기의 기억 T 세포이다. 예를 들어, 기억 T 세포는 하기 특징: 증가된 CD62L고, 증가된 CD127고, 증가된 CD27+, 감소된 KLRG1, 및/또는 증가된 BCL2 중 1개 이상을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 선택된 투여 요법, 예를 들어 1일에 1회 또는 1주에 1회로 투여된 경우에, 완전 또는 유의한 면역 억제와는 연관되지 않지만 면역 반응의 증진과 연관된, mTOR 억제의 수준과 연관된 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 라파로그, 라파마이신, 또는 RAD001, 또는 촉매 mTOR 억제제의 조성물 또는 투여 형태에 관한 것이다.
mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 라파로그, 라파마이신, 또는 RAD001, 또는 촉매 mTOR 억제제는 지속 방출 제제로 제공될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 단위 투여 형태가 지속 방출 제제로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 지속 방출 제제는 즉시 방출 제제보다 낮은 생체이용률을 가질 것이다. 예를 들어, 실시양태에서, 즉시 방출 제제와 유사한 치료 효과를 달성하기 위해, 지속 방출 제제는 즉시 방출 제제에서 제공되는 억제제의 양의 약 2 내지 약 5, 약 2.5 내지 약 3.5, 또는 약 3배를 가질 것이다.
한 실시양태에서, 단위 투여 형태 당 0.1 내지 20, 0.5 내지 10, 2.5 내지 7.5, 3 내지 6, 또는 약 5 mg을 갖는, 전형적으로 1주에 1회 투여를 위해 사용되는, 예를 들어 RAD001의 즉시 방출 형태가 제공된다. 1주에 1회 투여에 대해, 이러한 즉시 방출 제제는 각각 0.3 내지 60, 1.5 내지 30, 7.5 내지 22.5, 9 내지 18, 또는 약 15 mg의 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 갖는 지속 방출 형태에 상응한다. 실시양태에서, 둘 다의 형태가 1회/주를 기초로 투여된다.
한 실시양태에서, 단위 투여 형태 당 0.005 내지 1.5, 0.01 내지 1.5, 0.1 내지 1.5, 0.2 내지 1.5, 0.3 내지 1.5, 0.4 내지 1.5, 0.5 내지 1.5, 0.6 내지 1.5, 0.7 내지 1.5, 0.8 내지 1.5, 1.0 내지 1.5, 0.3 내지 0.6, 또는 약 0.5 mg을 갖는, 전형적으로 1일에 1회 투여를 위해 사용되는, 예를 들어 RAD001의 즉시 방출 형태가 제공된다. 1일에 1회 투여에 대해, 이러한 즉시 방출 형태는 각각 0.015 내지 4.5, 0.03 내지 4.5, 0.3 내지 4.5, 0.6 내지 4.5, 0.9 내지 4.5, 1.2 내지 4.5, 1.5 내지 4.5, 1.8 내지 4.5, 2.1 내지 4.5, 2.4 내지 4.5, 3.0 내지 4.5, 0.9 내지 1.8, 또는 약 1.5 mg의 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 갖는 지속 방출 형태에 상응한다. 1주에 1회 투여에 대해, 이러한 즉시 방출 형태는 각각 0.1 내지 30, 0.2 내지 30, 2 내지 30, 4 내지 30, 6 내지 30, 8 내지 30, 10 내지 30, 1.2 내지 30, 14 내지 30, 16 내지 30, 20 내지 30, 6 내지 12, 또는 약 10 mg의 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 갖는 지속 방출 형태에 상응한다.
한 실시양태에서, 단위 투여 형태 당 0.01 내지 1.0 mg을 갖는, 전형적으로 1일에 1회 투여를 위해 사용되는, 예를 들어 RAD001의 즉시 방출 형태가 제공된다. 1일에 1회 투여에 대해, 이러한 즉시 방출 형태는 각각 0.03 내지 3 mg의 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 갖는 지속 방출 형태에 상응한다. 1주에 1회 투여에 대해, 이러한 즉시 방출 형태는 각각 0.2 내지 20 mg의 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 갖는 지속 방출 형태에 상응한다.
한 실시양태에서, 단위 투여 형태 당 0.5 내지 5.0 mg을 갖는, 전형적으로 1주에 1회 투여를 위해 사용되는, 예를 들어 RAD001의 즉시 방출 형태가 제공된다. 1주에 1회 투여에 대해, 이러한 즉시 방출 형태는 각각 1.5 내지 15 mg의 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 갖는 지속 방출 형태에 상응한다.
상기 기재된 바와 같이, mTOR 경로의 1종의 표적은 P70 S6 키나제이다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 유용한 mTOR 억제제의 용량은, 예를 들어 본원에 기재된 검정, 예를 들어 불레이 검정에 의한 측정 시, mTOR 억제제의 부재 하의 P70 S6 키나제의 활성 대비 P70 S6 키나제 활성의 80% 이하의 억제를 달성하는데 충분한 것이다. 추가 측면에서, 본 발명은 mTOR 억제제의 부재 하의 P70 S6 키나제 활성 대비 P70 S6 키나제 활성의 38% 이하의 억제를 달성하는데 충분한 mTOR 억제제의 양을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 mTOR 억제제의 용량은, 예를 들어 인간 대상체에게 투여된 경우에, 예를 들어 본원에 기재된 검정, 예를 들어 불레이 검정에 의한 측정 시, P70 S6 키나제 활성의 90 +/-5 % (즉, 85-95%), 89+/-5 %, 88+/-5 %, 87+/-5 %, 86+/-5 %, 85+/-5 %, 84+/-5 %, 83+/-5 %, 82+/-5 %, 81+/-5 %, 80+/-5 %, 79+/-5 %, 78+/-5 %, 77+/-5 %, 76+/-5 %, 75+/-5 %, 74+/-5 %, 73+/-5 %, 72 +/-5%, 71 +/-5%, 70 +/-5%, 69 +/-5%, 68 +/-5%, 67 +/-5%, 66 +/-5%, 65 +/-5%, 64 +/-5%, 63 +/-5%, 62 +/-5%, 61 +/-5%, 60 +/-5%, 59 +/-5%, 58 +/-5%, 57 +/-5%, 56 +/-5%, 55 +/-5%, 54 +/-5%, 54 +/-5%, 53 +/-5%, 52 +/-5%, 51 +/-5%, 50 +/-5%, 49 +/-5%, 48 +/-5%, 47 +/-5%, 46 +/-5%, 45 +/-5%, 44 +/-5%, 43 +/-5%, 42 +/-5%, 41 +/-5%, 40 +/-5%, 39 +/-5%, 38 +/-5%, 37 +/-5%, 36 +/-5%, 35 +/-5%, 34 +/-5%, 33 +/-5%, 32 +/-5%, 31 +/-5%, 30 +/-5%, 29 +/-5%, 28 +/-5%, 27 +/-5%, 26 +/-5%, 25 +/-5%, 24 +/-5%, 23 +/-5%, 22 +/-5%, 21 +/-5%, 20 +/-5%, 19 +/-5%, 18 +/-5%, 17 +/-5%, 16 +/-5%, 15 +/-5%, 14 +/-5%, 13 +/-5%, 12 +/-5%, 11 +/-5%, 또는 10 +/-5% 억제를 달성하는데 충분하다.
대상체의 P70 S6 키나제 활성은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 예컨대 예를 들어 미국 특허 7,727,950에 기재된 방법에 따라, 포스포P70 S6K 수준 및/또는 포스포P70 S6 수준의 이뮤노블롯 분석에 의해 또는 시험관내 키나제 활성 검정에 의해 측정될 수 있다.
mTOR 억제제의 용량과 관련하여 본원에 사용된 용어 "약"은 mTOR 억제제의 양의 +/-10%까지의 가변성을 지칭하지만, 언급된 용량 주변의 가변성을 포함하지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 표적 최저 수준 내의 투여량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 최저 수준은 기관 이식 및 암 환자에서 사용되는 투여 요법과 연관된 최저 수준보다 유의하게 더 낮다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제, 예를 들어 RAD001 또는 라파마이신은 면역억제 또는 항암 효과를 발생시키는 최저 수준의 1/2, 1/4, 1/10, 또는 1/20 미만인 최저 수준을 발생시키도록 투여된다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제, 예를 들어 RAD001 또는 라파마이신은 면역억제 또는 항암 적응증에 사용하기 위한 FDA 승인 포장 삽입물에서 제공되는 최저 수준의 1/2, 1/4, 1/10, 또는 1/20 미만인 최저 수준을 발생시키도록 투여된다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에게 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 0.1 내지 10 ng/ml, 0.1 내지 5 ng/ml, 0.1 내지 3 ng/ml, 0.1 내지 2 ng/ml, 또는 0.1 내지 1 ng/ml의 표적 최저 수준을 제공하는 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에게 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 0.2 내지 10 ng/ml, 0.2 내지 5 ng/ml, 0.2 내지 3 ng/ml, 0.2 내지 2 ng/ml, 또는 0.2 내지 1 ng/ml의 표적 최저 수준을 제공하는 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에게 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 0.3 내지 10 ng/ml, 0.3 내지 5 ng/ml, 0.3 내지 3 ng/ml, 0.3 내지 2 ng/ml, 또는 0.3 내지 1 ng/ml의 표적 최저 수준을 제공하는 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에게 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 0.4 내지 10 ng/ml, 0.4 내지 5 ng/ml, 0.4 내지 3 ng/ml, 0.4 내지 2 ng/ml, 또는 0.4 내지 1 ng/ml의 표적 최저 수준을 제공하는 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에게 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 0.5 내지 10 ng/ml, 0.5 내지 5 ng/ml, 0.5 내지 3 ng/ml, 0.5 내지 2 ng/ml, 또는 0.5 내지 1 ng/ml의 표적 최저 수준을 제공하는 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에게 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 1 내지 10 ng/ml, 1 내지 5 ng/ml, 1 내지 3 ng/ml, 또는 1 내지 2 ng/ml의 표적 최저 수준을 제공하는 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "최저 수준"은 다음 용량 직전의 혈장 내 약물의 농도, 또는 2개의 용량 사이의 최소 약물 농도를 지칭한다.
일부 실시양태에서, RAD001의 표적 최저 수준은 약 0.1 내지 4.9 ng/ml의 범위 내이다. 한 실시양태에서, 표적 최저 수준은 3 ng/ml 미만이고, 예를 들어 0.3 이하 내지 3 ng/ml이다. 한 실시양태에서, 표적 최저 수준은 3 ng/ml 미만이고, 예를 들어 0.3 이하 내지 1 ng/ml이다.
추가 측면에서, 본 발명은 RAD001에 대해 명시된 표적 최저 수준과 생물학적으로 동등한 표적 최적 수준과 연관된 양의, RAD001 이외의 mTOR 억제제를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, RAD001 이외의 mTOR 억제제에 대한 표적 최저 수준은 본원에 기재된 RAD001의 최저 수준과 동일한 수준의 mTOR 억제 (예를 들어, 본원, 예를 들어 P70 S6 키나제의 억제에 기재된 방법에 의해 측정된 바와 같음)를 제공하는 수준이다.
제약 조성물: mTOR 억제제
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 CAR 세포와 조합하여 사용하기 위해 제제화된, mTOR 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTOR 억제제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, mTOR 억제제는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 첨가제와 조합되어 투여되기 위해 제제화된다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 1종 이상의 치료제와 조합되어 관련 기술분야에 공지된 임의의 통상적이고 허용되는 방식을 통해 상기 기재된 바와 같이 치료 유효량으로 투여될 것이다.
제약 제제는 통상적인 용해 및 혼합 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 벌크 약물 물질 (예를 들어, mTOR 억제제 또는 화합물의 안정화된 형태 (예를 들어, 시클로덱스트린 유도체 또는 다른 공지된 복합체화 작용제와의 복합체))이 본원에 기재된 부형제 중 1종 이상의 존재 하에 적합한 용매 중에 용해된다. 전형적으로 mTOR 억제제는 용이하게 제어가능한 투여량의 약물을 제공하도록, 및 환자에게 우아하고 용이하게 취급가능한 제품을 제공하도록 제약 투여 형태 내로 제제화된다.
본 발명의 화합물은 제약 조성물로서 임의의 통상적인 경로에 의해, 특히 경장으로, 예를 들어 경구로, 예를 들어 정제 또는 캡슐의 형태로, 또는 비경구로, 예를 들어 주사가능한 용액 또는 현탁액의 형태로, 국소로, 예를 들어 로션, 겔, 연고 또는 크림의 형태로, 또는 비강 또는 좌제 형태로 투여될 수 있다. mTOR 억제제가 본원에 기재된 바와 같은 또 다른 작용제와 조합되어 (이와 동시에 또는 개별적으로) 투여되는 경우에, 한 측면에서, 둘 다의 성분이 동일한 경로에 의해 (예를 들어, 비경구로) 투여될 수 있다. 대안적으로, 또 다른 작용제가 mTOR 억제제와 관련하여 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, mTOR 억제제는 경구로 투여될 수 있고, 다른 작용제는 비경구로 투여될 수 있다.
지속 방출
본원에 개시된 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제 또는 촉매 mTOR 억제제는, 제품 안정성 요건을 만족시키고/거나 즉시 방출 (IR) 정제에 비해 유리한 약동학적 특성, 예컨대 감소된 평균 혈장 피크 농도, 약물 흡수 정도 및 혈장 피크 농도에서의 감소된 환자간 및 환자내 변동성, 감소된 Cmax / Cmin 비, 및/또는 감소된 음식물 영향을 갖는, 본원에 개시된 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 포함하는 경구 고체 투여 형태의 형태로 제약 제제로서 제공될 수 있다. 제공된 제약 제제는 보다 정확한 용량 조정이 가능할 수 있고/거나 유해 사건의 빈도를 감소시킬 수 있고, 따라서 본원에 개시된 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001로 환자에게 보다 안전한 치료를 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 다중-미립자 시스템이고 기능성 층 및 코팅을 가질 수 있는, 본원에 개시된 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001의 안정한 연장 방출 제제를 제공한다.
본원에 사용된 용어 "연장 방출, 다중-미립자 제제"는 본원에 개시된 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001의 연장된 기간에 걸친, 예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간에 걸친 방출을 가능하게 하는 제제를 지칭한다. 연장 방출 제제는 섭취 후에 연장된 기간에 걸쳐 활성 성분이 이용가능하게 하는 방식으로 제제화된, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 특수 부형제로 제조된 매트릭스 및 코팅을 함유할 수 있다.
용어 "연장 방출"은 용어 "지속 방출" (SR) 또는 "장기간 방출"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 용어 "연장 방출"은 경구 투여 후 즉시 활성 약물 물질을 방출하지 않지만, 정제 및 캡슐의 경우에 약전 [Ph. Eur. (7th 판)] 모노그래프 및 제약 투여 형태의 경우에 USP 일반 챕터 <1151>의 정의에 따라 연장된 기간에 걸쳐 방출하는 제약 제제에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "즉시 방출" (IR)은 문헌 ["Guidance for Industry: "Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms" (FDA CDER, 1997)]의 정의에 따라 활성 약물 물질의 85%를 60분 미만 이내에 방출하는 제약 제제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 "즉시 방출"은, 예를 들어 본원에 기재된 용해 검정에 의한 측정 시, 에베롤리무스가 정제로부터 30분 이내에 방출되는 것을 의미한다.
본원에 기재된 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001의 안정한 연장 방출 제제는 관련 기술분야에 공지된 검정, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 용해 검정 (용해 용기를 소듐 도데실 술페이트 0.2%를 함유하는 900 mL 포스페이트 완충제 pH 6.8로 37℃에서 채우고, 각각 USP 시험 모노그래프 711에 의한 USP, 및 Ph.Eur. 시험 모노그래프 2.9.3.에 따라 패들 방법을 사용하여 75 rpm에서 용해를 수행함)을 사용한 시험관내 방출 프로파일을 특징으로 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001의 안정한 연장 방출 제제는 시험관내 방출 검정에서 하기 방출 상세에 따라 mTOR 억제제를 방출한다:
0.5h: <45%, 또는 <40, 예를 들어, <30%
1h: 20-80%, 예를 들어, 30-60%
2h: >50%, 또는 >70%, 예를 들어, >75%
3h: >60%, 또는 >65%, 예를 들어, >85%, 예를 들어, >90%.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001의 안정한 연장 방출 제제는 시험관내 용해 검정에서 45, 60, 75, 90, 105분 또는 120분 이후에 mTOR 억제제의 50%를 방출한다.
생체중합체 전달 방법
일부 실시양태에서, 임의로 키나제 억제제, 예를 들어 BTK 억제제, 예컨대 이브루티닙과 조합된 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 CAR-발현 세포는 생체중합체 스캐폴드, 예를 들어 생체중합체 임플란트를 통해 대상체에게 투여 또는 전달될 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 전달, 확장, 및/또는 분산을 지지 또는 증진시킬 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 자연 발생적 또는 합성적일 수 있는 생체적합성 (예를 들어, 염증 또는 면역 반응을 실질적으로 유도하지 않음) 및/또는 생분해성 중합체를 포함한다.
적합한 생체중합체의 예는 단독의, 또는 임의의 다른 중합체 조성물과 임의의 농도 및 임의의 비로 조합된 한천, 아가로스, 알기네이트, 알기네이트/칼슘 포스페이트 시멘트 (CPC), 베타-갈락토시다제 (β-GAL), (1,2,3,4,6-펜타아세틸 a-D-갈락토스), 셀룰로스, 키틴, 키토산, 콜라겐, 엘라스틴, 젤라틴, 히알루론산 콜라겐, 히드록시아파타이트, 폴리(3-히드록시부티레이트-코-3-히드록시-헥사노에이트) (PHBHHx), 폴리(락티드), 폴리(카프로락톤) (PCL), 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG), 폴리에틸렌 옥시드 (PEO), 폴리(락트산-코-글리콜산) (PLGA), 폴리프로필렌 옥시드 (PPO), 폴리비닐 알콜 (PVA), 실크, 대두 단백질, 및 대두 단백질 단리물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 생체중합체는 부착- 또는 이동-촉진 분자, 예를 들어 림프구의 콜라겐 수용체에 결합하는 콜라겐-모방체 펩티드, 및/또는 자극 분자에 의해 증대 또는 변형되어, 전달되는 세포의 전달, 확장, 또는 기능, 예를 들어 항암 활성을 증진시킬 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 주사가능한, 예를 들어 겔 또는 반-고체, 또는 고체 조성물일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 대상체에게의 전달 전에 생체중합체 스캐폴드 상에 시딩될 수 있다. 실시양태에서, 생체중합체 스캐폴드는, 예를 들어 스캐폴드의 생체중합체에 혼입되거나 접합된, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 본원에 기재된 1종 이상의 추가의 치료제 (예를 들어, 또 다른 CAR-발현 세포, 항체, 또는 소분자) 또는 작용제를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 생체중합체 스캐폴드는 예를 들어 종양내로 주사되거나, 또는 종양에 또는 항종양 효과를 매개하기에 충분히 종양에 근접하여 외과적으로 이식된다. 생체중합체 조성물 및 그의 전달 방법의 추가의 예가 문헌 [Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101]; 및 WO2014/110591에 기재되어 있다.
제약 조성물 및 치료
본 발명의 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 CAR-발현 세포, 예를 들어 복수의 CAR-발현 세포를 하나 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합으로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아주반트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 한 측면에서 정맥내 투여를 위해 제제화된다.
본 발명의 제약 조성물은 치료할 (또는 예방할) 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양 및 빈도는 환자의 상태, 환자의 질환의 종류 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 것이다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 예를 들어 내독소, 미코플라스마, 복제 적격 렌티바이러스 (RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드, 마우스 항체, 모여진 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 박테리아 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택된 오염물이 실질적으로 없고, 예를 들어 검출가능한 수준의 오염물이 없다. 한 실시양태에서, 박테리아는 알칼리게네스 패칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 나이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 및 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 그룹 A로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나이다.
"면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양-억제 유효량", 또는 "치료량"이 지시될 때, 투여할 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자 (대상체)의 상태에서의 개체 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 본원에 기재된 T 세포를 포함하는 제약 조성물은 104 내지 109 세포/kg 체중, 일부 경우에 105 내지 106 세포/kg 체중 (상기 범위 내의 모든 정수 값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있는 것으로 일반적으로 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 투여량으로 다수의 횟수로 투여할 수 있다. 세포는 면역요법에서 일반적으로 알려진 주입 기술을 사용하여 투여할 수 있다 (예를 들어 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조).
특정 측면에서, 활성화된 T 세포를 대상체에게 투여한 후, 후속적으로 혈액을 재채취하고 (분리반출술을 수행하고), 본 발명에 따라 그로부터 T 세포를 활성화하고, 환자에게 이들 활성화되고 확장된 T 세포를 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 과정은 수주마다 다수의 횟수로 수행할 수 있다. 특정 측면에서, T 세포는 10 cc 내지 400cc의 혈액 채취로부터 활성화될 수 있다. 특정 측면에서, T 세포는 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc 또는 100 cc의 혈액 채취로부터 활성화된다.
대상 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 채내이식 또는 이식에 의한 것을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행할 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 경동맥, 피하, 피부내, 종양내, 결절내, 수질내, 근육내, 정맥내 (i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 피부내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 한 측면에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다. T 세포의 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위 내로 직접 투여될 수 있다.
특정 예시적인 측면에서, 대상체는 백혈구분리반출술을 받을 수 있고, 여기서 백혈구는 수집되고, 농축되거나, 또는 생체외에서 고갈되어 관심 세포, 예를 들어 T 세포를 선택하고/거나 단리한다. 이들 T 세포 단리물은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 확장되고, 본 발명의 하나 이상의 CAR 구축물이 도입되어, 본 발명의 CAR T 세포를 생성할 수 있도록 처리될 수 있다. 그를 필요로 하는 대상체는 후속적으로 말초 혈액 줄기 세포 이식 이후 고용량 화학요법을 이용한 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 측면에서, 이식 이후에 또는 이식과 동시에, 대상체는 본 발명의 확장된 CAR T 세포의 주입을 받는다. 추가의 측면에서, 확장된 세포는 수술 전에 또는 수술 이후에 투여된다.
환자에게 투여할 상기 치료제의 투여량은 치료되는 상태의 정확한 성질 및 치료의 수용자에 따라 변할 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 스케일링은 관련 기술분야에 인정되는 실무에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 캄파트에 대한 용량은 대체로 1 내지 30일 기간 동안 매일 투여되는, 성인 환자에 대해 1 내지 약 100 mg 범위일 것이다. 바람직한 일일 용량은 1 내지 10 mg/일이지만, 일부 경우에 40 mg/일까지의 보다 많은 용량을 사용할 수 있다 (미국 특허 6,120,766에 기재된).
한 실시양태에서, CAR 분자는 예를 들어, 시험관내 전사를 사용하여 T 세포 내에 도입되고, 대상체 (예를 들어, 인간)에게 본 발명의 CAR T 세포를 초기 투여하고, 본 발명의 CAR T 세포를 1회 이상 후속 투여하고, 여기서 1회 이상의 후속 투여는 선행 투여 후 15일 이내에, 예를 들어 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2일에 투여된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CAR T 세포의 1회 초과의 투여는 매주 대상체 (예를 들어, 인간)에게 투여되고, 예를 들어 본 발명의 CAR T 세포는 매주 2, 3 또는 4회 투여된다. 한 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에게 CAR T 세포를 매주 1회 초과로 투여한 후 (예를 들어, 매주 2, 3 또는 4회 투여) (본원에서 사이클로도 칭함), 1주 동안 CAR T 세포를 투여하지 않고, 이어서, CAR T 세포의 1회 이상의 추가 투여 (예를 들어, 매주 CAR T 세포의 1회 초과의 투여)를 대상체에게 실시한다. 또 다른 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에게 CAR T 세포를 1회 초과의 사이클로 투여하고, 각각의 사이클 사이의 시간은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3일 미만이다. 한 실시양태에서, CAR T 세포는 매주 3회 투여를 위해 격일로 투여된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 초과 동안 투여된다.
한 측면에서, CAR-발현 세포는 렌티바이러스 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스를 사용하여 생성된다. 그러한 방식으로 생성된 세포, 예를 들어 CART는 안정한 CAR 발현을 가질 것이다.
한 측면에서, CAR-발현 세포, 예를 들어 CART는 바이러스 벡터, 예컨대 감마레트로바이러스 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 감마레트로바이러스 벡터를 사용하여 생성된다. 이들 벡터를 사용하여 생성된 CART는 안정한 CAR 발현을 갖는다.
한 측면에서, CART은 형질도입 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15일 동안 CAR 벡터를 일시적으로 발현한다. CAR의 일시적 발현은 RNA CAR 벡터 전달에 의해 실행될 수 있다. 한 측면에서, CAR RNA는 전기천공에 의해 T 세포 내로 형질도입된다.
일시적으로 발현하는 CAR T 세포를 사용하여 (특히, 뮤린 scFv 보유 CART를 사용하여) 치료받는 환자에서 일어날 수 있는 잠재적인 문제는 다수 치료 후 아나필락시스이다.
상기 이론에 매이지 않지만, 그러한 아나필락시스 반응은 체액성 항-CAR 반응, 즉, 항-IgE 이소형을 갖는 항-CAR 항체를 생성하는 환자에 의해 유발될 수 있는 것으로 생각된다. 환자의 항체 생산 세포는 항원에의 노출에서 10 내지 14일 휴지기가 있을 때 IgG 이소형 (아나필락시스를 유발하지 않는)으로부터 IgE 이소형으로 부류 전환을 겪는 것으로 생각된다.
환자가 일시적 CAR 요법 (예컨대, RNA 형질도입에 의해 생성된 것)의 과정 동안 항-CAR 항체 반응을 일으킬 위험이 크면, CART 주입 휴지기는 10 내지 14일 초과로 지속되어서는 안 된다.
실시예
본 발명은 다음 실험 실시예를 참조로 추가로 상세히 설명된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고, 달리 명시하지 않으면 제한을 의도하지 않는다. 따라서, 본 발명은 어떠한 방식으로도 다음 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 않되고, 대신에 본원에 제공된 교시내용의 결과로서 자명해지는 임의의 및 모든 변이를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 설명 없이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 선행하는 상세한 설명과 아래의 예시적인 실시예를 사용하여, 본 발명의 화합물을 제조하고 이용하고 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 생각된다. 다음 실시예는 본 발명의 다양한 측면을 구체적으로 나타내고, 나머지 개시내용을 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 뮤린 항-CD19 항체의 인간화
CD19 항체 분자는, 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO2014/153270에 기재된 항체 분자 (예를 들어, 인간화 항-CD19 항체 분자)일 수 있다. 뮤린 CD19 항체의 인간화는 마우스-특이적 잔기가 CART19 처리에서 인간-항-마우스 항원 (HAMA) 반응을 유도할 수 있는 임상 상황에서, 즉, CAR19 구축물을 형질도입한 T 세포를 사용한 치료를 받는 환자에서 요구된다. 하이브리도마 유래된 뮤린 CD19 항체의 VH 및 VL 서열은 공개된 문헌으로부터 추출하였다 (Nicholson et al., 1997, 상기 문헌). 인간화는 뮤린 CD19 항체로부터 CDR 영역을 인간 배선 수용자 프레임워크 VH4_4-59 및 VK3_L25 (vBASE 데이터베이스) 상으로 그라프팅함으로써 달성하였다. CDR 영역에 추가로, CDR 영역의 구조적 온전성을 지지하는 것으로 생각되는 5개의 프레임워크 잔기, 즉, VH #71, #73, #78 및 VL #71, #87이 뮤린 서열로부터 보유되었다. 추가로, 인간 J 요소 JH4 및 JK2는 각각 중쇄 및 경쇄에 대해 사용되었다. 인간화 항체의 생성되는 아미노산 서열을 각각 FMC63_VL_hz 및 FMC63_VH_hz1로 지정하고 아래 표 1에 제시한다. 잔기 넘버링은 카바트(Kabat) (Kabat E.A. et al., 1991, 상기 문헌)에 따른다. CDR 정의를 위해, 카바트 뿐만 아니라 코티아(Chothia) (Chothia et al., 1987 상기 문헌)를 둘 다 사용하였다. 마우스 CD19로부터 오는 잔기는 굵게/이탤릭체로 제시한다. 상자표시한 위치 #60/61/62는 CDR H2 (HCDR2로도 명명됨) 내의 잠재적인 번역후 변형 (PTM) 부위를 나타낸다.
<표 1> 인간화 CD19 가변 도메인의 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 114-117, 출현 순서).
Figure pat00026
이들 인간화 CD19 IgG를 사용하여, 발현에 대해 시험하기 위한 가용성 scFv 및 전체 CART CD19 구축물에 대한 scFv를 생성하였다 (아래 실시예 참조). 인간화 동안, CDRH2 영역 내의 위치 62가 뮤린 CDRH2 내에 존재하는 알라닌보다는 세린 잔기인 것을 선호하는 것은 흥미롭다. 뮤린 서열은 번역후 변형 (PTM)이 결핍되고, CDRH2 내에 위치 60/61/62에서 각각 아스파라긴-세린-알라닌을 갖는다. 이것은 인간화 과정 동안 잠재적인 PTM 모티프 (CDRH2 내에 상자표시한 부위로서 나타냄)를 생성한다. 인간화 과정 동안 생성된 PTM 부위가 실제로 "진정한" PTM 부위인지 또는 단지 이론적인 것인지 시험하였다. 아미노산 모티프 아스파라긴 이후 세린 (NS)은 번역후 탈아미드화에 감수성일 수 있지만 이것은 쉽게 명백하지 않은 것으로 가정되었다. 아스파라긴 이후 프롤린을 제외한 임의의 아미노산, 이어서 세린 (NxS, x≠P)은 번역후 N-글리코실화에 감수성일 수 있음이 또한 가정되었다. 상기 가설을 시험하기 위해, 위치 60 (글리코실화 부위인 것으로 공지됨)에서 아스파라긴이 세린 또는 글루타민으로 돌연변이되는 2개의 IgG 변이체를 생성하고, 각각 FMC63_VH_hz2 (N60S) 및 FMC63_VH_hz2 (N60Q)로 지정하였다. 이들 구축물은 잠재적인 번역후 변형 부위 (PTM)를 제거하고 보유된 활성에 대해 시험하기 위해 생성하였다 (아래 실시예 2 참조).
클로닝:
마우스 및 인간화 VL 및 VH 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 얻고, 구축물에 대한 코돈을 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터의 세포 내에서 발현을 위해 최적화하였다.
VL 및 VH 도메인을 코딩하는 서열을 클로닝 벡터로부터 포유동물 세포 내에서 분비를 위해 적합한 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄를 공동-형질감염을 허용하는 개별 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 발현 벡터의 요소는 프로모터 (시토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서-프로모터), 분비를 촉진하는 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자 (소 성장 호르몬 (BGH) 유전자), 에피솜 복제 및 원핵세포 내의 복제를 허용하는 요소 (예를 들어 SV40 기원 및 ColE1 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 것), 및 선택을 허용하는 요소 (암피실린 저항성 유전자 및 제오신 마커)를 포함한다.
발현:
키메라 및 인간화 IgG 후보물질을 1 ml 규모로 HEK293F 포유동물 세포 내에서 발현시켰다. 청정화된 상청액을 FACS 결합 연구를 위해 사용하였다. 보다 정확하게, HEK293F 세포를 Pen/Strep을 보충한 프리스타일(FreeStyle) 배지 내에 5E5개의 세포/ml로 희석하고, 1 ml을 24 둥근 바닥 딥 웰 플레이트 내로 옮겼다. 0.5 μg의 경쇄 및 0.5 μg의 중쇄 포유동물 발현 플라스미드를 동일한 배지 내에 4 μl의 퓨진(FuGENE) HD (로슈 REF 04709705001)와 함께 희석하였다. 15분 RT 인큐베이션 후에, DNA/퓨진 혼합물을 세포에 적가하고, 5% CO2 인큐베이터 내에 250 rpm, 37℃에서 5일 동안 넣었다. 이어서, 상청액을 원심분리에 의해 세포로부터 분리하였다. IgG 함량을 측정하기 위해, 200 μL의 분취액을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰 내에 넣었다. 모든 샘플 및 표준물은 단백질 A 딥 앤드 리드(Dip and read) 바이오센서 (포르테바이오(Fortebio) 카탈로그 번호 18-5010)을 사용하여 이중으로 측정하였다. 플레이트를 옥테트 기구 (포르테바이오) 내에 넣고, 온도조절 챔버 내에서 27℃로 평형화시켰다. 데이터를 옥테트 유저 소프트웨어 버전 3.0을 사용하여 자동으로 처리하고, IgG 표준 곡선에 비교함으로써 농도를 결정하였다.
FACS에 의한 결합 분석:
인간화 항체 및 키메라 항체를 세포주 300.19-hsCD19FL을 사용한 유동 세포측정 결합 검정을 사용하여 평가하였다. 상기 세포주는 마우스 preB 세포주 300.19를 제오신 저항성 유전자뿐만 아니라 천연 프로모터 및 전장 인간 CD19 코딩 서열을 코딩하는 벡터 (hCD19 FL/pEF4-myc-His A)로 형질감염시킴으로써 생성하였다. 간단히 설명하면, 300.19 세포를 선형화된 플라스미드를 사용하여 전기천공시키고, 이어서 높은 수준의 hsCD19를 발현하는 세포를 APC-접합된 항-인간 CD19 Ab (BD 555415로부터 클론 HIB19)을 사용하여 확인하고, 후속적으로 FACS 아리아(Aria) 유동 세포측정기를 사용하여 분류하였다. 분류된 hsCD19+ 세포를 배양하였고, 높은 수준의 hsCD19를 안정하게 발현하는 것을 확인하였다.
결합 검정은 발현된 IgG를 함유하는 혈청 비함유 배양 배지를 사용하여 직접 수행할 수 있었다. 모든 평가된 IgG를 동일한 농도 (85 nM)로 표준화한 후, 3배 연속 희석에 의해 1.4 pM까지 희석하였다. 이어서, 96-웰 플레이트 내에서, 5 x 105개 세포/웰의 분취액을 희석된 IgG와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제 (PBS 내 0.5% BSA)로 2회 세척한 후, FACS 완충제 내에 1:1000 희석시킨 검출 항체 (APC 접합된 염소 항-hu IgG, Fc 단편 특이적 (디아노바(Dianova) #109-136-098))를 첨가하였다. 세포를 4℃에서 추가로 30분 동안 인큐베이션한 후, FACS 완충제 내에 2회 세척하고, FACS 칼리버 (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 검정하였다. 결합 곡선 플롯팅 (형광 강도의 중간값 대 IgG 농도) 및 EC50 결정은 비선형 회귀 분석, S자형 용량 반응 (가변 기울기)을 갖는 그래프패드(GraphPad) 프리즘(Prism)™ 3.0 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
FACS 분석은 모든 평가된 IgG에 대한 겉보기 결합은 매우 다양할 수 있고, 여기서 몇몇 구축물은 IgG 대 scFv로서 EC50에서 5 내지 10배 이동을 보였음을 보여준다. EC50 값에 기반하여, 키메라 참조물에 비해 2의 인수 내의 또는 더 우수한 결합 친화도를 갖는 선도 후보물질을 선택하였다.
실시예 2: 인간화 CD19 IgG 항체로부터 유래된 항-CD19 가용성 scFv 단편의 특성화
표준 분자 생물학 기술을 사용하여 실시예 1에 설명된 인간화 CD19 IgG로부터 가용성 scFv 단편을 생성하였다. 이들 가용성 scFv는 scFv의 안정성, 세포 표면 발현, 및 결합 특성을 검토하기 위해 특성화 연구에서 사용하였다. 추가로, 인간화 과정 동안 도입된 잠재적인 PTM의 영향을 조사하기 위해 또한 실험을 수행하였다.
scFv 발현 및 정제
각각의 scFv 구축물의 형질감염을 위해, 약 3e8개의 293F 세포를 형질감염 시약으로서 3:1 (PEI:DNA)의 비로 PEI를 사용하여 100 μg의 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포를 37℃, 125 rpm, 8% CO2에서 진탕기 플라스크 내에서 100 ml EXPi293 발현 배지 (인비트로젠) 내에서 성장시켰다. 배양물을 6일 후에 수거하고, 단백질 정제를 위해 사용하였다.
293F 세포는 3500g에서 20분 동안 원심분리하여 수거하였다. 상청액을 수집하고, 배큐캡(VacuCap)90 PF 필터 유닛 (w/0.8/0.2㎛ 수퍼 멤브레인(Super Membrane), PALL)을 통해 여과하였다. 약 400 μl의 Ni-NTA 아가로스 비드 (퀴아젠(Qiagen))를 상청액에 첨가하였다. 혼합물을 회전시키고 4℃에서 4 hr 동안 인큐베이션하였다. 이것을 정제 칼럼 상에 로딩하고, 20 mM 히스티딘을 함유하는 세척 완충제로 세척하였다. 단백질을 300 mM 히스티딘을 함유하는 500 μl 용리 완충제로 용리시켰다. 샘플을 4℃에서 PBS 완충제에 대해 밤새 투석하였다. 단백질 샘플을 나노드롭 2000c를 사용하여 정량하였다.
scFv 입체형태 및 콜로이드 안정성 분석
scFv의 열안정성을 DSF에 의해 결정하였다: 10-20 μl의 단백질 샘플을 PBS 내에 25 μl의 총 부피 내에서 1:1000의 최종 희석비의 염료 사이프로 오렌지(Sypro Orange) (인비트로젠 Cat#S6650)와 혼합하고, 바이오라드 CFX1000 (25℃에서 2분, 이어서 30초 동안 0.5℃ 증가량, 25 내지 95℃).
분석적 SEC 실험을 위해, 20 μl PBS 내의 약 15-20 μg의 scFv 단백질 샘플을 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 상에서 0.3 ml/분 유속으로 TSKgel Super SW2000 상으로 주입하였다.
FACS 결합에 의한 EC50
마우스 세포주 300.CD19를 0.5 mg/ml 제오신을 갖는 RPMI 1640 내에서 성장시켰다. 약 5e5개의 세포/웰을 BD 팔콘(Falcon) 96 웰 플레이트에 옮겼다. 세포를 900 rpm (소르발 레젠드(Sorval Legend) XT 원심분리기)에서 3분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하였다. 항-CD19 scFv 단백질 샘플을 5% FBS를 함유하는 DPBS 내에 희석하였다. 샘플을 웰에 첨가하고, 세포와 잘 혼합하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 5% FBS를 함유하는 DPBS 내에 2회 세척하였다. 세포를 항폴리 His PE (R&D)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 2회 세척한 후, FACS 분석 (비디 바이오사이언시스의 LSRII)하였다.
프로테온에 의한 운동학 분석
운동학은 바이오-라드(Bio-Rad) 프로테온을 사용하여 결정하였다. 고정은 GLC 센서 칩 상에서 표준 아민 커플링을 사용하여 수행하였다. scFv 샘플을 아세테이트 (pH 4.5) 내에 0.03 mg/mL로 희석하고, 칩에 30 μL/분의 유속으로 300초 동안 적용하였다. 이어서, CD19 리간드를 PBS-Tween 내에 연속 희석하고, 480초의 해리 시간을 가지면서 50 μL/분의 유속으로 120초 동안 적용하였다. 칩 표면은 글리신 (pH 2.5)로 재생하였다. 데이터를 1:1 랭뮤어(Langmuir) 모델을 사용하여 피팅시켰다.
CART19 구축물의 표면 발현 및 FACS에 의한 염색
상이한 항-hCD19 CART로 일시적으로 형질감염시킨 HEK293F 현탁 세포를 형질감염 2일 후에 수거하였다. 대략 1e6개의 세포를 V자형 96 웰 플레이트 (그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One, 독일))의 각각의 웰 내에 넣고, 0.2 ml FACS 완충제 (4% 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 1XPBS (BSA 분획 V, 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))로 3회 세척하였다. 세포를 0.2 μg의 비오티닐화 단백질 L (젠스크립트(GenScript, 미국 뉴저지주 피츠카타웨이)) 또는 100 nM의 hCD19(AA 1-291)-hIgG1 Fc (NIBRI에서 생성됨)와 함께 0.2 ml의 FCAS 완충제 내에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 0.2 ml의 FACS 완충제로 3회 세척하고, 단백질 L을 갖는 샘플에 대해 1 μl 스트렙타비딘 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 뉴욕주 그랜드아일랜드)와 함께 0.2 ml의 FACS 완충제 내에서, 또는 hCD19-hIgG1 Fc를 갖는 샘플에 대해 2 μl의 PE 항-인간 FCγ (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories), 펜실베니아주 웨스트그로브)와 함께 0.2 ml의 FACS 완충제 내에서 30분 동안 4℃에서 암소에서 인큐베이션하였다. 0.2 ml의 FACS 완충제로 3회 세척한 후, 세포를 LSRII (비디 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세) 기기 상에서 FACSDiva 소프트웨어 (비디 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)를 사용하여 분석하였다. 면역형광 염색을 생존 세포의 상대적인 로그 형광으로서 분석하고, 알렉사 플루오르 488 양성 또는 PE 양성 세포의 백분율을 측정하였다.
인간화 과정 동안 생성된 잠재적인 PMT의 분석
인간화 동안, CDRH2 영역 내의 위치 62가 실시예 1에 설명된 바와 같이 뮤린 CDRH2 내에 존재하는 알라닌보다는 세린 잔기인 것을 선호하는 것은 흥미롭다. 인간화 과정 동안 생성된 PTM 부위가 실제로 "진정한" PTM 부위인지 또는 단지 이론적인 것인지 시험하였다. 위치 60 (글리코실화 부위인 것으로 공지됨)에서 아스파라긴이 세린 또는 글루타민으로 돌연변이되는 2개의 IgG 변이체를 생성하고, 각각 FMC63_VH_hz2 (N60S) 및 FMC63_VH_hz2 (N60Q)로 지정하였다. 이들 구축물은 잠재적인 번역후 변형 부위 (PTM)를 제거하고 보유된 활성에 대해 시험하기 위해 생성하였다.
결과
항-CD19 인간화 scFvs 및 마우스 scFv를 293F 세포 내에서 발현시키고, His 태그를 통해 정제하였다. 모든 인간화 scFv의 발현 및 수율은 원래의 마우스 scFv보다 훨씨 더 높았다 (데이터를 제시하지 않음).
정체를 확인하고 온전성을 평가하기 위해, scFv 구축물을 N-글리카나제 F (PNGaseF)와 함께 또는 그 없이 인큐베이션한 후 고-성능 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법 (HPLC-MS) (도 3 참조) 및 SDS-PAGE (데이터를 제시하지 않음) 모두를 사용하여 분석하였다. PNGaseF는 컨센서스 서열 N-X-S/T/C (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)로부터 N-연결된 글리칸 구조의 제거를 위한 특이적 효소이다. 간단히 설명하면, 샘플을 물 중에 0.1 μg/μL로 희석하고, 비처리 상태로 두거나 1:2(w/w) PNGaseF:scFV 비로 PNGaseF와 함께 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
SDS-PAGE 분석은 NuPAGE 4-12% 비스-트리스 겔 (노벡스(Novex))을 사용하여 수행하였다. 대략 2 μg scFV를 각각의 레인 내에 로딩하고, 200 V 정전압에서 40분 동안 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후에, 겔을 파스트겔 블루 (PhastGel Blue) R 250 스테인 (아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia))을 사용하여 염색하고, 10% 아세트산, 30% 메탄올을 사용하여 탈염시켰다.
HPLC-MS 분석은 Xevo-Tof 질량 분광분석기에 결합된 워터스 액퀴티 UPLC 시스템 상에서 수행하였다. 대략 1 μg의 각각의 샘플을 60℃로 설정한 R 1/10 2.1x100 mm 10 ㎛ POROS 칼럼 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosciences)) 상으로 0.5 mL/분의 유속으로 로딩하였다. 이동상은 0.1% 포름산 (A) 및 0.1% 포름산, 75% 이소프로판올, 25% 아세토니트릴 (B)로 이루어졌다. 12분 내에 25%-90% B의 역상 구배를 사용하여 단백질을 칼럼으로부터 용리시켰다. 획득은 전원 콘 전압 램프 20-50 V를 사용하여 600-4000 Da의 m/z 범위에서 전기분무 양이온 스캔을 사용하여 수행하였다. 생성되는 스펙트럼은 MaxEnt1을 사용하여 디컨볼루션시켰다.
글리코실화 부위는 인간화의 과정 동안 도입되었다. 비-PTM 변이체 (VH: N60S 또는 N60Q)는 상기 추가의 형태를 갖지 낳았다. 구축물은 HC CDR2 내에 N-연결된 글리코실화의 컨센서스 부위를 갖는 유일한 것이다. SDS-PAGE 분석으로부터, 단일 밴드로서 이동한 비처리된 샘플은 이중체가 관찰된 103101-WT (S/N)을 제외한 모든 구축물에 대한 서열의 근사 분자량과 일치한다. 상기 구축물은 H-CDR2 내에 N-연결된 글리코실화의 컨센서스 부위를 갖는 유일한 것이다. PNGaseF로 처리할 때, 이중체의 보다 고분자량 밴드는 더 이상 존재하지 않고, 이것은 부위의 부분적인 점유를 제안한다. 유사하게, 디컨볼루션된 질량 스펙트럼으로부터 관찰된 분자량은 아미노산 서열로부터 예측된 것과 일치한다. 그러나, 다른 구축물은 단일 주요 분자 종을 나타냈지만, 103101-WT (S/N)는 또한 PNGaseF를 사용한 처리 후에 더 이상 존재하지 않는 서열로부터 예측된 것보다 더 높은 집단 1217 달톤을 가졌다. 이것은 단일의 우세한 N-연결된 당형태 (질량에 기초하여 아마도 올리고만노스 5)의 존재와 일치한다. 글리코실화된 형태의 존재는 도 3에 제시한 바와 같이 MS 분석에 의해 확인하였다.
입체형태적 안정성을 시차 주사 형광측정법 (DSF)에 의해 측정하였다. 도 4에 제시한 바와 같이, 마우스 scFv의 Tm은 57℃인 반면, 인간 변이체는 약 70℃로 더 높은 Tm을 보여주었다. 모든 인간화 scFv에 대한 Tm은 뮤린 scFv보다 훨씬 더 우수하였고, 이것은 모든 인간화 scFv가 뮤린 scFv보다 더 안정함을 명백하게 보여준다. 상기 안정성은 아마도 CART19 구축물로 번역될 것이고, 아마도 개선된 치료 특성으로 이어질 수 있다.
정제된 scFv의 활성은 SPR 기반 검출 방법을 사용하여 hCD19 발현 세포에 대한 결합에 의해 및 hCD19 항원에 대한 결합에 의해 측정하였다. scFv의 결합을 결정하기 위해 마우스 세포주 300을 사용하였다. hCD19에 대한 마우스 scFv의 EC50은 약 06-1.6 nM이었다. 인간화 변이체는 낮은 또는 nM 미만 EC50 범위 내에서 동일한 범위의 EC50을 보여주었다.
실시예 3: CD19 CAR 구축물
최종 CAR 구축물 내에 사용할 scFv는 실시예 1에 기재된 인간화 IgG로부터 유래하였다. VL 및 VH 도메인이 scFv 내에서 나타나는 순서는 변하였고 (즉, VL-VH, 또는 VH-VL 배향), 여기서, 3 또는 4개의 카피의 "G4S" (서열식별번호: 18) 서브유닛 (여기서, 각각의 서브유닛은 서열 GGGGS (서열식별번호: 18) (예를 들어, (G4S)3 (서열식별번호: 107) 또는 (G4S)4 (서열식별번호: 106))을 포함한다)은 가변 도메인을 연결하여 표 2에 제시된 바와 같이 전체 scFv 도메인을 생성한다.
<표 2> VH 및 VL 배향 및 링커 길이를 보여주는 인간화 CD19 scFv 구축물 ("3G4S"는 서열식별번호: 107로서 개시되고, "4G4S"는 서열식별번호: 106으로서 개시된다).
Figure pat00027
인간화 scFv 단편의 서열 (서열식별번호: 1-12)을 아래 표 3에 제공한다. 전체 CAR 구축물은 서열식별번호: 31-42의 전체 CAR 구축물을 생성하기 위해 서열식별번호: 1-12를 아래 제시된 추가의 서열, 즉, 서열식별번호: 13-17과 함께 사용하여 생성하였다.
Figure pat00028
리더 (아미노산 서열) (서열식별번호: 13)
Figure pat00029
Figure pat00030
리더 (핵산 서열) (서열식별번호: 54)
Figure pat00031
Figure pat00032
CD8 힌지 (아미노산 서열) (서열식별번호: 14)
Figure pat00033
Figure pat00034
CD8 힌지 (핵산 서열) (서열식별번호: 55)
Figure pat00035
Figure pat00036
CD8 막횡단 (아미노산 서열) (서열식별번호: 15)
Figure pat00037
Figure pat00038
막횡단 (핵산 서열) (서열식별번호: 56)
Figure pat00039
Figure pat00040
4-1BB 세포내 도메인 (아미노산 서열) (서열식별번호: 16)
Figure pat00041
Figure pat00042
4-1BB 세포내 도메인 (핵산 서열) (서열식별번호: 60)
Figure pat00043
Figure pat00044
CD3 제타 도메인 (아미노산 서열) (서열식별번호: 17)
Figure pat00045
Figure pat00046
CD3 제타 (핵산 서열) (서열식별번호: 101)
Figure pat00047
Figure pat00048
CD3 제타 도메인 (아미노산 서열; NCBI 참조 서열 NM_000734.3) (서열식별번호: 43)
Figure pat00049
Figure pat00050
CD3 제타 (핵산 서열; NCBI 참조 서열 NM_000734.3) (서열식별번호: 44)
Figure pat00051
Figure pat00052
IgG4 힌지 (아미노산 서열) (서열식별번호: 102)
Figure pat00053
Figure pat00054
IgG4 힌지 (뉴클레오티드 서열) (서열식별번호: 103)
Figure pat00055
이들 클론은 모두 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 도메인의 신호 도메인 내에 Q/K 잔기 변화를 함유하였다.
<표 3> 인간화 CD19 CAR 구축물
Figure pat00056
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<표 7> 뮤린 CD19 CAR 구축물
Figure pat00075
Figure pat00076
scFv 도메인의 인간화 CDR 서열의 서열을 중쇄 가변 도메인에 대해 표 4에, 및 경쇄 가변 도메인에 대해 표 5에 제시한다. "ID"는 각각의 CDR에 대한 각각의 서열 번호를 나타낸다.
<표 4> 중쇄 가변 도메인 CDR (카바트)
<표 5> 경쇄 가변 도메인 CDR
Figure pat00078
표 6은 CD19 구축물 수치 명칭을 scFv의 경쇄 및 중쇄의 특이적 배향, 중쇄 및 경쇄를 분리시키는 링커 단위의 수 (즉 (G4S)3 (서열식별번호: 107) 또는 (G4S)4 (서열식별번호: 106)), 및 중쇄 CDR2 내의 특징적인 아미노산 서열에 상호관련시키는 식별 키이다.
<표 6> CD19 CAR 명칭.
Figure pat00079
이어서, CAR scFv 단편을 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝하여, 발현을 위해 EF1 알파 프로모터 (서열식별번호: 100)를 사용하여 단일 코딩 프레임 내에 전장 CAR 구축물을 형성하였다.
EF1 알파 프로모터
Figure pat00080
인간화 CAR 구축물의 분석을 실시예 4에 설명된 바와 같이 수행하였다.
실시예 4: CART 내 인간화 CD19 구축물의 분석
CAR 기술을 통한 표적화 CD19의 실행성을 평가하기 위해, 항-CD19 항체에 대한 단일 쇄 가변 단편을 CD3제타 쇄와 함께 렌티바이러스 CAR 발현 벡터 내로 클로닝하고, 4개의 상이한 입체형태의 4-1BB 공동자극 분자 및 최적 구축물을 CD19+ 표적에 반응한 CD19 CAR 형질도입한 T 세포 ("CART19" 또는 "CART19 T 세포")의 이펙터 T 세포 반응의 양 및 품질에 기반하여 선택하였다. 이펙터 T 세포 반응은 세포 확장, 증식, 배가, 시토카인 생산 및 표적 세포 사멸 또는 세포용해 활성 (탈과립)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
물질 및 방법
재지시된 인간화 CART19 T 세포의 생성
인간화 CART19 렌티바이러스 전달 벡터를 VSVg 슈도타이핑된 렌티바이러스 입자로 패키징되는 게놈 물질을 생산하기 위해 사용하였다. 렌티바이러스 전달 벡터 DNA를 리포펙타민 시약과 조합하여 VSVg의 3가지 패키징 성분, 즉 gag/pol 및 rev와 혼합하여, 이들을 함께 293T 세포 내로 형질감염시켰다. 24 및 48 hr 후에, 배지를 수집하고, 여과하고, 초원심분리에 의해 농축하였다. 생성되는 바이러스 제제를 -80℃에서 저장하였다. 형질도입 단위의 수를 SupT1 세포 상에서 적정에 의해 결정하였다. 재지시된 CART19 T 세포는 CD3x28 비드를 24hr 동안 결합시킨 후, 목적하는 백분율의 형질도입된 T 세포를 얻기 위해 적절한 수의 형질도입 단위를 첨가함으로써 신선한 나이브 T 세포를 활성화함으로써 생산하였다. 이들 변형된 T 세포를 휴지되고 크기가 줄어들 때까지 확장시키고, 이 때 나중의 분석을 위해 동결보존시켰다. 세포 수 및 크기를 코울터 멀티사이저 III을 사용하여 측정하였다. 동결보존 전에, (세포 표면 상에 CART19를 발현하는) 형질도입된 세포의 백분율 및 그 발현의 그들의 상대 형광 강도를 LSRII 상에서 유동 세포측정 분석에 의해 결정하였다. 히스토그램 플롯으로부터, CAR의 상대 발현 수준은 형질도입된 백분율을 그들의 상대 형광 강도와 비교함으로써 검사할 수 있다.
인간화 CART19 재지시된 T 세포의 세포용해 활성, 증식 능력 및 시토카인 분비의 평가.
사멸, 증식 및 시토카인 분비의 인간화 CAR19 T 세포의 기능적 능력을 평가하기 위해, 세포를 해동시키고 밤새 회복시켰다. 인간화 CART19에 추가로, 뮤린 CART19를 비교 목적을 위해 사용한 한편, SS1-BBz를 배경 CAR/T 세포 효과에 대해 비-표적화 발현된 CAR로서 사용하였다. "대조군" 금 표준물 (GS) CART19를 검정 편차를 비교하기 위해 모든 검정에서 사용하였다. 중요하게는, GS CART19는 연구 등급 (즉, 임상 등급이 아님) 제조 조건에서 생산된 세포이고, 성장 배양물 내에 IL-2의 첨가를 포함한다. 이것은 아마도 이들 세포의 전체 생존력 및 기능성에 영향을 미치고, 다른 형질도입된 T 세포 집단의 연구 등급 생산에 대한 직접 비교로서 평가되어서는 안 된다. T 세포를 K562 (CD19를 발현하거나 발현하지 않는 만성 골수성 백혈병 세포주), 또는 Pt14 (CLL 환자로부터 단리된 B 세포)를 향해 유도하였다. 상기 유동 기반 세포독성 검정을 위해, 표적 세포를 그들의 존재를 정량하기 위해 CSFE로 염색하였다. 표적 세포를 유사한 표적 항원 수준을 확인하기 위해 CD19 발현에 대해 염색하였다. CAR19 T 세포의 세포용해 활성은 10:1, 3:1, 1:1, 0.3:1 및 0:1의 이펙터:표적 세포 비의 적정에서 측정하였고, 여기서 이펙터는 항-CD19 키메라 수용체를 발현하는 T 세포로서 규정되었다. 검정은 적절한 수의 T 세포를 불변 수의 표적 세포와 혼합함으로써 개시하였다. 16 hr 후에, 각각의 혼합물의 총 부피를 제거하고, 세척된 각각의 웰을 적절하게 합하였다. T 세포를 CD2에 대해 염색하고, 모든 세포를 마커 7AAD로 생존/사멸에 대해 염색하였다. 최종 세척 후에, 펠렛화시킨 세포를 예정된 수의 카운트 비드와 함께 특정한 부피 내에 재현탁하였다. 세포 염색 데이터를 LSRII 유동 세포측정에 의해 수집하고, 결과를 정량하기 위해 비드를 사용하여 FloJo 소프트웨어로 분석하였다.
인간화 CAR19 T 세포의 세포 증식 및 시토카인 생산을 측정하기 위해, 세포를 해동시키고 밤새 회복시켰다. 인간화 CART19에 추가로, 뮤린 CART19를 비교 목적을 위해 사용한 한편, SS1-BBz를 배경 CAR/T 세포 효과에 대해 비-표적화 발현된 CAR로서 사용하였다. "대조군" 금 표준물 (GS) CART19를 검정 편차를 비교하기 위해 모든 검정에서 사용하였다. T 세포를 K562 (CD19를 발현하거나 발현하지 않는 만성 골수성 백혈병 세포주), 또는 Pt14 (CLL 환자로부터 단리된 B 세포)를 향해 유도하였다. 또한, 내인성 면역학적 신호에 반응하여 T 세포의 잠재력을 평가하기 위해 CD3x28 비드를 사용하였다. 증식을 분석하기 위해, T 세포를 CSFE로 염색하였다. 증식은 이제 2개의 딸 세포로의 모 마킹의 분리를 반영하는 CSFE 염색의 희석이다. 검정은 단지 1:1 및 1:0의 이펙터:표적 비를 시험하고, 여기서 이펙터는 항-CD19 키메라 수용체를 발현하는 T 세포로서 규정되었다. 검정은 이중으로 수행하고, 세포의 혼합 24 hr 후에, 50%의 배지를 인간 시토카인 검출의 루미넥스(Luminex) 10-플렉스 패널을 사용하여 시토카인 분석에 대해 제거/교체하였다. 5일 후에, T 세포를 CAR 발현에 대해 염색하고, CD4 또는 CD8 세포로서 표현형 결정하고, 생존/사멸에 대해 7AAD로 염색하였다. 최종 세척 후에, 펠렛화시킨 세포를 예정된 수의 BD 카운트 비드와 함께 특정한 부피 내에 재현탁하였다. 세포 염색 데이터를 LSRII 유동 세포측정에 의해 수집하고, 결과를 정량하기 위해 비드를 사용하여 FloJo 소프트웨어로 분석하였다. 총 세포 카운트는 특정한 수의 비드에 비해 카운팅된 세포의 수에 카운팅할 비드의 분율을 곱하여 결정하였다.
현재 성공적인 뮤린 CART19와 유사하게 기능하는 인간화 CART19 세포에 대한 잠재성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 표적화 세포를 치사시키고, 표적화된 항원에 반응하여 증식하고, 존속의 징후를 보이는 그들의 능력을 시험관내에서 평가하기를 원하였다. 각각의 인간화 CART19 렌티바이러스 구축물을 패키징하고 이들을 SupT1 세포 상에 적정함으로써, 본 발명자들은 형질도입을 약 50%로 표준화하기 위한 바이러스의 양을 결정할 수 있었다. 이것은 세포당 유사한 평균 통합 부위로 출발하여 활성의 보다 직접적인 비교를 가능하게 한다.
치료적 CAR19 T 세포는 그의 나이브 T 세포가 T 세포, CD4+ 및 CD8+ 림프구에 대한 음성 선택에 의해 수득되는, 정상 성분채집된 공여자로부터의 혈액을 출발물질로 사용하여 생성하였다. 이들 세포를 37℃, 5% CO2에서 10% RPMI 내에서 CD3x28 비드에 의해 활성화시켰다.
24hr 후에, T 세포는 파열하고, 표준화된 양의 바이러스를 첨가하였다. T 세포는 대수 성장 패턴으로 분할하기 시작하였고, 이것은 1 ml당 세포 카운트 및 세포 크기를 측정함으로써 모니터링한다. T 세포가 휴지되기 시작함에 따라, 대수 성장은 약해지고, 세포 크기는 줄어든다. 느려지는 성장 속도 및 ~300 fl에 접근하는 T 세포 크기의 조합은 동결보존되거나 재자극시킬 T 세포에 대한 상태를 결정한다.
크기에 의해 보이는 바와 같이 휴지되는 T 세포의 매우 유사한 경향이 존재한다. UTD 집단 및 현재 뮤린 CART19를 갖는 인간화 CART 세포들 사이에 거의 중첩하는 패턴은 활성화 이후 정상 T 세포 확장에 대한 인간화 CAR19의 흔치 않은 효과가 없음을 나타낸다. 대조군으로서, SS1-BBz를 원치않는 항원 비의존성 CAR 활성을 규정하도록 사용하였다. 총 세포 수에서 확장 프로파일은 아마도 주로 세포의 상이한 출발 수 때문에 개별 확장에서 실제 수의 차이를 보여준다. 출발 T 세포 수를 표준화함으로써, 밀접한 클러스터가 모든 CART19 세포에 대해 나타났다. 또한, 항원 비의존성 CAR 활성화의 원치않는 효과가 군으로부터 멀어지고 보다 아래로 가는 선에서 검출되었다.
각각의 이들 CAR19 발현 세포에 대한 표면 발현의 수준을 결정하였다. 형질도입을 위해 표준화된 적정된 바이러스는 형질도입 효능, 형질도입된 세포%와 상호관련하는 대등한 발현 수준을 보여준다. 일부 CAR은 보다 조기 패키징으로부터 추론된 그들의 역가를 가졌고, 그들의 형질도입된 백분율은 낮지만, 그들의 MFI는 또한 예상된 바와 같이 감소하였다. 결과는 UTD 및 뮤린 CAR19 T 세포에 비해, 정상적으로 확장하는 세포 능력에 대한 인간화 CAR19의 검출가능한 부정적인 효과가 없음을 나타낸다.
세포 상에 발현된 세포 표면 특이적 에피토프를 선택적으로 포착하고 그를 파괴하는 인간화 CART19 세포의 능력을 분석하였다. 야생형 K562 세포는 CD19를 발현하지 않지만, CD19를 발현하도록 형질도입될 수 있다. 이들 치사 곡선을 비교하면, 이펙터 세포의 양을 적정하면 CD19를 발현하는 세포가 파괴되는 것을 보여준다. 인간화 CART19 세포 또는 현재 임상 뮤린 CART19 세포로 변형된, 동일한 공여자로부터의 재지시된 T 세포는 그의 사멸 능력에서 차이가 없음을 나타낸다. 치사 곡선은 환자 14로부터 CD19+ CLL 세포를 표적화하는 인간화 CART19 세포 사이에 매우 유사한 치사 능력이 발견됨을 보여준다. 흥미롭게도, 특히 GS CART19에서 전체 세포용해 활성의 감소가 존재하고, 이것은 이들 세포가 특이적 억제 특성을 가질 수 있음을 제안한다. 표적 세포 상에 발현된 유사한 수준의 CD19는 발현 수준이 세포 치사에서의 차이에 대한 이유가 아님을 나타낸다.
표적 세포를 만난 후 증식하는 인간화 CART19 세포의 필수 특성은 대조군 CD3x28 비드 및 CD19 발현 표적에 의해 자극된 후 모든 구축물에서 발견된다. 표적화 Pt14 CLL 세포는 경쇄 대 중쇄 배향을 갖는 scFv를 사용하여 근소하게 더 큰 증식률을 나타내는 것으로 나타나고, 여기서 3x 또는 4x GGGGS 연결 (각각 서열식별번호: 107 및 106)을 가질 때 편향은 보이지 않았다. 증식 결과는 5일에 걸쳐 축적된 세포의 총수를 반영하고, 이것은 인간화 CART19, 2146, 2144, 2136, 2141 및 2137이 보다 많은 증식 신호를 T 세포에 보내는 것을 나타낸다. 인상적으로, 이것은 Pt14 CLL 세포를 표적화하는 인간화 CART19 세포에서 검출되었다.
종합하면, 인간화 CART19 구축물은 세포용해 활성, 증식 반응 및 항원 특이적 표적에 대한 시토카인 분비에서 현재 뮤린 CART19와 매우 유사한 특징을 보인다. 표적 활성화시에 보다 많은 증식 신호를 T 세포에 보내는 인간화 CART19 세포 (2146, 2144, 2136, 2141 및 2137)의 잠재성은 치료 반응을 잠재적으로 증진시키기 위해 이들 새로운 구축물의 잉여 이익인 것으로 보일 것이다.
결과
탈과립 및 시토카인 생산 검정 모두를 사용하여, 조작된 CART19 T 세포가 CD19+ 세포를 특이적으로 표적화함을 입증하였다.
본 발명의 인간화 CD19CAR 구축물 ("huCART19"로도 공지됨)로 형질도입한 ND317 세포를 분석하였다. 뮤린 CART19 및 비변형된 (UTD) T 세포에 비해 인간화 CART19 후보물질을 사용한 CD3x28 활성화 및 형질도입 후에, 그들의 확장 동안 T 세포의 크기에서 밀접한 유사성이 존재하였다.
실험에서는 뮤린 CART19 및 비변형된 (UTD) T 세포에 비해 상이한 인간화 CART19 후보물질을 사용한 CD3x28 활성화 및 형질도입 후에, 그들의 확장 동안 축적된 T 세포의 수에서 차이가 적음을 보여주었다.
인간화 CART19의 세포 표면 발현은 뮤린 CART19와 대등하고 발현 수준은 매우 유사하였다. 히스토그램의 오버레이는 각각의 인간화 CART19 형질도입 T 세포의 세포 표면 발현 염색 패턴을 플롯팅하고, 이들 프로파일로부터 계산된 평균 형광 강도 (MFI)는 형질도입된 세포의 백분율과 잘 상호관련되었다.
또한, 인간화 CART19는 CD19 발현 표적 세포를 표적화하는데 있어서 뮤린 CART19와 유사한 특이적 세포독성 활성을 갖고 대등하였다. CSFE 표지된 K562cc (도 1a, 비-발현 CD19 대조군), K562.CD19 (도 1b, CD19를 발현하도록 형질도입된 K562 세포) 또는 Pt14 (도 1c, CLL 환자로부터의 B 세포)를 표적화하는 이펙터 인간화 CART19 세포를 사용하여 이펙터 대 표적 (E:T) 비의 적정을 이용하는 16 hr-유동-기반 사멸 검정으로부터 플롯팅하였다. 모든 인간화 CART19 세포의 세포용해 활성은 뮤린 CART19와 유사하고 대등하다. 상이한 표적 사이에 세포용해 활성에서의 차이는 유사하고 대등하였고, 이것은 뮤린 CART19의 활성이 인간화 형태의 CART19에서 보존됨을 나타낸다.
표적 세포와 혼합한 6일 후 CFSE 표지된 인간화 CART19 세포의 히스토그램 오버레이는 그들의 증식 능력을 보여준다 (도 5). CAR19로부터 전달된 증식 반응은 양성 임상 반응을 생성하기 위해 표적 세포와의 결합 및 그의 사멸 후 필수적인 반응이다. SS1-BBz CSFE 염색 (모 세포 염색을 희석시키는 분할하는 딸 세포의 표시자)은 표적화 비의존성 메카니즘에서 분할을 유지시키는 휴지되지 않는 T 세포의 결과이다.
증식하는 세포 집단 전체 능력은 TCR과 공동-자극물질 CD28의 내인성 결합을 모방하는 CD3x28 비드를 사용하여 평가하였다. 데이터는 각각의 세포 집단이 대등한 증식 잠재력을 가짐을 나타냈다. 모든 인간화 CART19 세포 및 뮤린 CART19 세포는 CD19를 발현하는 K562 세포와 결합 시에 대등하게 강하게 증폭하였다. 인간화 CART19 세포는 또한 CLL 환자로부터 얻어진 B 세포에 잘 반응하였지만, 몇몇은 근소하게 더 적게 반응하는 것으로 보였다. 도 2a 및 2b에 제시된 바와 같이, 인간화 CART19 세포 2136, 2137, 2140, 2141, 2144 및 2146은 CSFE 염색의 보다 큰 희석에 의해 입증된 바와 같이 근소하게 더 강건한 증식을 갖는 것으로 보일 수 있다. 이들 구축물은 모두 경쇄 대 중쇄의 동일한 가변 쇄 배향을 가졌고, 이것은 배향의 선택임을 나타낸다. 중쇄 CDR2 부위에서 아미노산 변화를 보다 자세히 살펴보면 (표 1) 각각의 3개의 변이 YSSSL, YQSSL 및 YNSSL (각각 서열식별번호: 28, 29 및 30)은 표적을 만난 후 보다 강건한 증식을 갖는 것으로 보이는 구축물에서 나타남을 밝혀졌다. 또한, 이들 관찰된 구축물은 3개 카피의 서브유닛 (3G4S)을 함유하는 G4S 링커 (서열식별번호: 107) 및 4개 카피의 서브유닛 (4G4S)을 함유하는 G4S 링커 (서열식별번호: 106)를 모두 갖고, 이것은 링커 크기가 기능에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
상기 설명된 증식성 확장으로부터, 종양 결합 이후 5일 후의 총 세포 수를 결정하였다. 세포는 초기 접종된 것보다 수의 감소를 보여주었고, 이것은 생존을 유지하기 위해 활성화가 요구됨을 나타낸다. 6일의 끝에 총 세포 카운트가 유사하였음을 보여주기 위해 내인성 활성화 대조군을 분석하였다. CD19를 발현하는 K562 세포를 표적화하는 인간화 CART19 세포는 2개의 뮤린 CART19 세포가 둘 다 보다 많은 세포 수를 갖게 되었음을 보여주고, 여기서 2146이 유사한 값을 갖는 모든 다른 구축물에 비해 근소하게 더 높았다. 총 세포 수를 또한 환자 14 (pt14)로부터의 B 세포에의 노출 6일 후에 분석하였고, 흥미롭게도 앞서 선택된 인간화 CART19 구축물 2146, 2144, 2136, 2141 및 2137 (이들은 모든 경쇄 대 중쇄 배향을 갖고 3개의 아미노산 변이 YSSSL, YQSSL 및 YNSSL (각각 서열식별번호: 28, 29 및 30)을 나타낸다)이 뮤린 CART19보다 더 높은 총 세포 수를 생성시킴을 보여준다. 다양한 인간화 항-CD19CAR 클론들 사이의 상기 예상되지 않은 구별은 이들 구축물을 형질도입한 CART 세포의 보다 우수한 임상 효능으로 번역될 수 있다.
CD19를 발현하지 않는 대조군 K562 세포에 노출된 후 인간화 CART19 세포로부터 생산된 시토카인의 배경 수준을 분석하였다. 24 hr 상청액을 루미넥스 30-플렉스 패널을 사용하여 분석하였다. CD3x28 비드를 사용한 내인성 면역계의 자극으로부터 잠재적인 시토카인 프로파일은 각각의 세포 집단이 대등한 시토카인 프로파일을 가짐을 나타낸다.
데이터는 또한 인간화 CART19 및 뮤린 CART19가 동일한 표적에 반응할 때 유사한 수준에서 유사한 시토카인 프로파일을 생산함을 보여준다. 시토카인 프로파일은 Pt14 표적 세포에 표적화할 때 더 낮지만 유사하였다.
실시예 5: 생체내 ALL 모델에서 인간화 CD19 CAR T 세포 처리.
1차 인간 ALL 세포는 시험관내에서 배양해야 할 필요 없이 면역손상된 마우스 내에서 성장할 수 있다. 진료소에 발견될 환자 집단을 나타내는 모델에서 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포의 효능을 시험하기 위해 이들 마우스를 사용할 수 있다. 본원에서 사용된 모델 HALLX5447을 CAR T 세포의 효능을 시험하는 연구에서 사용하기에 앞서 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스에서 2회 계대배양하였다.
뮤린 CD19 CAR T 세포는 이전에 1차 인간 ALL의 NSG 마우스 모델에서 백혈병 세포를 표적화하고 사멸시키는 것으로 나타났다. CD19 scFv (단일 쇄 Fc 가변 단편)은 인간화되었고, 본 실시예는 생체내에서 ALL 종양 세포를 제거하는 인간화 CD19 CAR을 발현하는 T 세포 (CAR 2)의 능력을 뮤린 CD19 CAR T 세포에 비교하였다. 여기서, 이들 세포의 효능을 인간 CD19+ 세포의 말초 혈액 FACS 분석에 의해 검정할 때 확립된 1차 인간 ALL을 갖는 마우스에서 직접 비교하였다. 1.5x106개의 1차 ALL 세포의 정맥내 이식 후에, 혈액 내에 2.5-4% CD19+ 인간 세포의 질환 부담을 종양 이식 2주 후에 달성하였다. 상기 CD19 백분율은 마우스의 혈액 내의 총 세포에 대한 비율이다. CAR T 세포를 사용한 처리 이전에 마우스 내의 인간 세포의 100%는 종양 세포이다. 말초 혈액 내에 2% 초과의 CD19+ 인간 세포의 백분율을 상기 모델에서 확립된 인간 ALL 질환인 것으로 간주하였다. 백혈병-보유 마우스를 일단 백혈병이 마우스에서 확립된 후에, 대략 종양 이식의 대략 2 내지 3주 후에 CAR T 세포로 처리하였다. 각각의 군의 마우스를 5x106개의 총 인간 T 세포로 처리하였다. CAR 발현 렌티바이러스를 사용한 공여자 인간 T 세포의 형질도입 효능은 40-60%이었다. T 세포를 사용한 처리 이후에, 질환 진행에 대한 생체마커로서 혈액 내의 CD19+ 인간 세포의 백분율 분석을 위해 마우스를 매주 채혈하였다.
물질 및 방법:
1차 인간 ALL 세포: 1차 세포를 이식에 앞서 시험관내에서 배양하지 않았다. 이들 세포를 ALL 환자로부터 수거한 후에, 확립 및 확장을 위해 마우스 내로 전달하였다. 종양 세포가 마우스 내에서 확장된 후, 골수 및 비장세포를 수거하고, 재이식을 위해 별개의 배치로 생존가능하게 동결시켰다. 세포를 90% FBS 및 10% DMSO 내에서 5x106개 세포/ml의 최소 농도로 동결시켰다. 재이식을 위해, 동결된 ALL 세포를 해동한 후, NSG 마우스에게 정맥내 주사하여, 인간화 CD19 CAR T 세포 및 뮤린 CD19 CAR T 세포의 항종양 효능을 비교하기 위해 사용할 ALL을 갖는 마우스를 생성하였다.
마우스: 6주령 NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) 마우스를 잭슨 래보래토리(Jackson Laboratory) (스톡(stock) 번호 005557)로부터 입수하였다. 동물을 실험에 앞서 노파르티스(Novartis) NIBRI 동물 시설에서 적어도 3일 동안 적응시켰다. 동물은 노파르티스 ACUC 규정 및 지침에 따라 취급하였다.
종양 이식: 생체내 연속 계대배양한 1차 인간 ALL 세포, 모델 HALLX5447을 37℃ 수조 내에서 해동시켰다. 이어서, 세포를 15 ml 원뿔형 튜브에 옮기고, 냉 멸균 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 1차 ALL 세포를 카운팅하고, 15x106개 세포/ml의 PBS의 농도로 재현탁시켰다. 세포를 얼음 상에 놓고, 마우스에 즉시 (1시간 이내에) 이식하였다. ALL 세포를 100 μl 부피 내에서 꼬리 정맥을 통해 마우스당 총 1.5x106개 세포로 정맥내 주사하였다.
CAR T 세포 투여: 마우스에게 종양 이식의 16일 후에 5x106개 T 세포를 투여하였다. 세포를 섭씨 37도 수조 내에서 부분적으로 해동시키고, 세포를 담은 튜브에 1 ml의 냉 멸균 PBS를 첨가하여 완전히 해동시켰다. 해동시킨 세포를 15 ml 팔콘 튜브에 옮기고, PBS를 사용하여 10 ml의 최종 부피로 조정하였다. 세포를 1000rpm에서 각각 10분 동안 2회 세척한 후, 혈구계 상에서 카운팅하였다. 이어서, T 세포를 50x106개 세포/ml의 냉 PBS의 농도로 재현탁시키고, 마우스에게 투여할 때까지 얼음 상에 유지하였다. 마우스에게 5x106개 T 세포/마우스의 용량에 대해 100 μl의 CAR T 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 군 당 5마리 마우스를 100 μl의 PBS 단독 (PBS), 비형질도입 T 세포 (모의), 뮤린 CD19 CAR T 세포 (muCTL019), 또는 인간화 CD19 CAR T 세포 (huCTL019)로 처리하였다. 비형질도입 T 세포, muCTL019 T 세포, 및 huCTL019 T 세포는 모든 동일한 인간 공여자로부터 평행으로 제조하였다.
동물 모니터링: 매주 2회 체중 측정을 비롯하여 마우스의 건강 상태를 매일 모니터링하였다. 체중 변화 %는 (BW현재 - BW초기)/(BW초기) x 100%로서 계산하였다. 종양 부담은 말초 혈액 FACS 분석에 의해 매주 모니터링하였다. 마우스를 꼬리 정맥을 통해 얼음 상에 유지시킨 EDTA 코팅된 튜브 내로 매주 채혈하였다. 10-20 μl의 혈액을 튜브로부터 얼음 상의 96 웰 플레이트로 플레이팅하였다. 적혈구를 ACK 적혈구 용해 완충제 (라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 A10492-01)로 용해시킨 후, 냉 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 인간 및 마우스 Fc 블록(block)의 Fc 차단 믹스(blocking mix) (밀테나이이 바이오텍(Miltenyi Biotec), 카탈로그 번호 130-059-901 및 130-092-575)와 함께 30분 동안 인큐베이션한 후, 항-인간 CD19 항체와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2% 파라포름알데히드 용액으로 20분 동안 고정시키고, 세척하고, PBS + 2% FBS 내에 밤새 저장한 후, 비디 칸토(BD Canto) 또는 포르테사(Fortessa) 상에서 분석하고, 이어서 플로우조(FlowJo) FACS 분석 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석하였다. 세포를 인간 HALLX5447 ALL 종양-보유 NSG 마우스의 혈액 내에 인간 CD19+ 세포의 비율을 결정하기 위해 분석하였다. 혈액 내의 CD19 백분율을 평균±평균의 표준 오차 (SEM)로서 기록하였다.
% 처리군/대조군 (T/C) 값은 다음 식을 사용하여 계산하였다:
ΔΤ≥0인 경우에 % T/C = 100 x ΔΤ/ΔC;
ΔΤ<0인 경우에 % 퇴행 = 100 x ΔT/T최초;
여기서, T = 최종 연구일에 약물 처리군의 평균 말초 혈액 CD19 백분율; T최초 = 최초 투여일에 약물 처리군의 말초 혈액 CD19 백분율; ΔΤ = 최종 연구일에 약물 처리군의 평균 말초 혈액 CD19 백분율 - 최초 투여일에 약물 처리군의 평균 말초 혈액 CD19 백분율; C = 최종 연구일에 대조군의 평균 말초 혈액 CD19 백분율; ΔC = 최종 연구일에 대조군의 평균 말초 혈액 CD19 백분율 - 최초 투여일에 대조군의 평균 말초 혈액 CD19 백분율.
100% 내지 42% 범위의 T/C 값은 항종양 활성을 전혀 갖지 않거나 최소로 갖는 것으로 해석되고; T/C 값 ≤ 42% 및 > 10%는 항종양 활성 또는 종양 성장 억제를 갖는 것으로 해석된다. T/C 값 ≤ 10% 또는 퇴행 값 ≥-10%는 종양 정체인 것으로 해석된다. 퇴행 값 < -10%를 퇴행으로서 기록한다.
결과:
인간 ALL의 1차 모델에서 뮤린 및 인간화 CD19 CAR T 세포의 항종양 활성을 평가하고 직접 비교하였다. 제0일에 종양 이식 이후에, 마우스를 처리군으로 무작위로 나누고, 제16일에 5x106개 T 세포로 정맥내 처리하였다. 동물이 종점에 도달할 때까지 ALL 질환 부담 및 동물 건강을 모니터링하였다. 모든 군 내의 마우스를 대조군 내의 질환 부담이 말초 혈액 내에서 80% 초과의 인간 CD19+ 세포일 때 종양 이식 후 제65일에 안락사시켰다.
대조군, 및 뮤린 또는 인간화 CD19 CAR T 세포로 처리한 군 사이에서 P<0.01을 갖는 질환 부담의 명백한 차이가 보였고, 이것은 종양 이식 후 제24일부터 제65일의 연구 끝까지 지속하였다. 뮤린 및 인간 CD19 CAR T 세포는 NSG 마우스에서 인간 HALLX5447 ALL 종양 세포 성장을 제어하는 유사한 능력을 나타냈다. 두 군은 HALLX5447 이식 후 제21일에 12-15% 인간 CD19+ 세포의 피크 말초 혈액 질환 수준을 보여주었다. 종양 세포 이식의 42일 후에, huCTL019 군에서 인간 CD19+ 세포는 검출가능하지 않은 반면, muCTL019 군에서 인간 CD19+ 세포의 백분율은 약 1%로 하락하였다. 뮤린 및 인간화 CD19 CAR T 세포는 둘 다 상기 모델에서 1차 인간 ALL 세포의 확장을 제어하는 대등한 능력을 야기하였다 (P>0.05). 모의 형질도입된 T 세포 군에 대한 % T/C 값은 94.40%이었고, 이것은 모의 형질도입된 T 세포는 항종양 활성을 갖지 않음을 나타낸다. muCTL019 군의 % 퇴행은 -89.75%이고 huCTL019 군은 -90.46%이었고, 이것은 이들 처리 둘 다가 HALLX5447 종양 모델의 퇴행을 유발할 수 있음을 입증한다. 이들 마우스에서 질환 부담의 척도로서 말초 혈액 인간 CD19+ 세포 백분율을 도 7에 제시한다. 임의의 T 세포를 투여받지 않은 PBS 처리군은 정맥내 이식된 NSG 마우스에서 기준선 1차 ALL 종양 성장 운동학을 나타냈다. 모의 처리군은 CAR T 세포와 동일한 시험관내 확장 과정을 거친 비형질도입 T 세포를 투여받았다. 이들 세포는 상기 종양 모델에서 T 세포의 비-특이적 반응을 보여주는 T 세포 대조군으로서 역할을 한다. PBS 및 모의 형질도입된 T 세포 처리군은 둘 다 실험 내내 지속적인 종양 진행을 나타냈다. 뮤린 및 인간화 CD19 CAR T 세포는 둘 다 5x106개 T 세포 주사의 1주 이내에 질환의 진행을 제어하고, 상기 65일 연구 과정에 걸쳐 질환 제어를 지속시키는 유사한 능력을 나타냈다.
뮤린 및 인간화 CD19 CAR 형질도입된 T 세포의 항종양 활성을 1차 인간 ALL 모델, HALLX5447을 보유하는 NSG 마우스에서 효능 연구로 평가하였다. 상기 연구는 뮤린 및 인간화 CD19 CAR T 세포 (muCTL019 및 huCTL019)가 둘 다 인간 ALL의 1차 모델에서 항종양 반응을 시작시킬 수 있음을 입증하였다. 또한, 말초 혈액 질환 부담에 의해 검정할 때 상기 반응은 muCTL019 및 huCTL019 세포에 대해 동일하였다. 뮤린 및 인간화 CD19 CAR T 세포는 둘 다 T 세포를 투여한 마우스의 1주 이내에 1차 ALL 성장을 제어한다. 처리 후 초기에, 질환 부담은 실질적으로 검출불가능한 수준으로 감소하기 전에 계속 증가하였다. 뮤린 또는 인간화 CAR T 세포를 사용한 1회 처리는 대조군 처리된 마우스에서 65일 질환 진행의 과정에 걸쳐 지속된 항종양 반응을 야기하였다. 인간화 CD19 CAR T 세포는 뮤린 CD19 CAR T 세포에서 보인 바와 같이 효과적인 항-CD19 종양 반응을 시작시키고 ALL 질환 부담을 제어하는 유사한 능력을 나타냈다.
실시예 6: 다발성 골수종을 치료하는데 사용하기 위한 CD19 CAR T 세포.
화학요법, 표적화 요법 및 자가 줄기 세포 이식의 현재 요법을 사용하더라도, 골수종은 불치의 질환으로 여겨진다. 본 실시예에서는 키메라 항원 수용체를 갖는 CD19에 대해 생성된 자가 T 세포 (렌티바이러스/CD19:4-1BB:CD3제타; "CART19" 또는 CTL019로도 공지됨)를 사용하는 다발성 골수종 (MM)의 치료를 설명한다. 본 실시예는 CD19-유도된 CAR 요법이 매우 낮은 (대부분의 방법에 의해 검출불가능한) 수준의 CD19를 발현하는 골수종 줄기 세포 및/또는 종양 세포를 표적화하는데 기반한 깊은 장기간의 오래가는 회복을 확립하는 잠재력을 갖는 것을 입증한다.
침습성 2차 형질 세포 백혈병에 걸린 환자를 치료하는데 있어서, 본 발명자들은 구제 자가 줄기 세포 이식의 2일 후에 투여된 CART19가 다중 라인의 화학요법을 통해 진행된 환자에서 형질 세포 백혈병의 신속한 클리어런스 및 매우 우수한 부분적인 반응을 일으켰음을 발견하였다. 상기 환자는 치료에 앞서 수개월 동안 수혈-의존성이었고; 치료의 2개월 후에, 혈액 카운트 (정상-범위 혈소판 카운트 및 백혈구 카운트를 갖는)를 회복하였고, 치료로부터 병원에서 퇴원한 이래로 수혈을 필요로 하지 않았다.
골수종 세포는 자연적으로 CD19를 발현하지 않기 때문에, CART19 처리가 상기 종양에서 신속하고 유의한 종양 반응을 유도하였다는 발견은 놀라웠다. 특정 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 다음 이유 때문에 CART19가 골수종을 치료하기 위해 사용될 수 있는 것으로 추론되었다: (1) 골수종 세포는 전통적으로 유동 세포측정에 의해 CD19 발현에 대해 음성인 것으로 생각되었지만, 발현이 RNA에 의해서 검출가능하지만 유동 세포측정 또는 면역조직화학에 의해 측정가능하지 않은 정도로, 골수종 세포가 매우 낮은 수준의 CD19를 발현할 수 있다는 것을 나타내는 데이터가 존재한다; (2) 특히 화학요법에 저항성이고, 다발성 골수종을 일으키는 암성 줄기 세포인 것으로 생각되는 클론형 B 세포를 표적화하는 개념. B 세포 및 골수종 종양 세포 사이에 클론 관계가 존재하지만, 전통적인 골수종 요법은 B 세포보다는 악성 형질 세포를 목표로 한다. 따라서, 골수종을 치료하기 위한 CART19는 대부분의 골수종 요법과는 상이한 세포 집단을 표적으로 한다.
본 발명자들의 단일 환자 경험에서, 환자는 순환 형질 세포를 갖고, 본 발명자들은 그녀의 종양 세포를 CD19의 발현에 대해 시험할 수 있었다. 종양 세포의 대략 1-2%가 CD19 항원을 발현하였다 (도 8). 따라서, CART19는 종양 세포의 매우 작은 집단에 대해 직접적인 효과를 가질 수 있는 것으로 추론되었고; 이것은 단지 CD19+ 종양 세포의 매우 작은 집단을 표적화하는데 기반하여 예측되지 않았지만 매우 우수한 부분적인 반응이었다.
본 사례에서, 고-용량 멜팔란 후 자가 줄기 세포 이식 구조 이후에 CART19를 투여하였다. 이것은 골수종에서 표준 요법이지만, 치유하는 것은 아니다. 또한, 상기 환자는 이전에 직렬식 자가 줄기 세포 이식을 받았고 이식 후 조기에 (<6개월) 재발하였다. 어떠한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 실시예에 설명된 바와 같은 CART19 세포의 사용은 구제 자가 줄기 세포 이식과 조합할 때 골수종 치료에서 중첩하지 않는 메카니즘을 가질 수 있다.
불응성 다발성 골수종에 걸린 환자를 골수절제 화학요법 및 ASCT 후 CTL019로 처리하였다. 검출가능한 CTL019의 상실 및 정상 CD19-양성 B 세포의 재구성에도 불구하고 완화가 유지되었고, 이는 이러한 반응이 지속 CTL019 활성을 필요로 하지 않음을 나타낸다. 또한, 이러한 환자의 반응은 대부분 (99.95%)의 신생물성 형질 세포가 유동 세포측정법 및 RT-PCR 둘 다에 의해 CD19-음성인 경우에도 실현되었다.
환자의 우성 신생물성 형질 세포 집단에서의 검출가능한 CD19 발현의 부재는 CTL019의 임상적으로 관련된 표적이 이러한 우성 CD19-음성 집단 외부에 존재함을 시사한다. 다발성 골수종 환자의 신생물성 형질 세포는 유전적, 면역표현형적, 및 기능적 이질성을 나타낸다. 특정한 하위집단은 항골수종 요법을 통해 클론의 생존을 필요로 할 수 있다. 본원에 보고된 환자에서, 예를 들어 형질 세포의 작은 CD19-발현 하위세트는 상대적으로 멜팔란-저항성이지만 CTL019에 대해 감수성일 수 있다. 이러한 발견은 클론의 작은 하위세트의 치료적 표적화가 통상적인 항골수종 요법과 커플링된 경우에 지속적인 임상 이익으로 이어질 수 있음을 시사한다.
대안적으로, 이러한 환자에서 CTL019의 임상적으로 관련된 표적은 신생물성 형질 세포 집단 외부에 존재할 수 있다. 예를 들어, CTL019는 상대적으로 작지만 신생물성 형질 세포를 발생시키는 줄기 세포 집단을 표적화할 수 있다. 따라서 다발성 골수종은 직전에 말단 분화된 형질 세포가 아닌 다중 후기 B-계열 세포 유형의 질환일 수 있고, 이는 B 림프구를 표적화하는 CTL019와 같은 요법이 형질 세포를 직접 표적화하는 요법에 대한 유용한 보조 요법일 수 있도록 한다.
추가의 10명의 다발성 골수종 환자가 I상 시험에서 CART19로 처리될 것이고, 적어도 3명의 환자는 현재까지 처리된 바 있다.
용량 근거 및 위험/이익
본 발명자들은 상기 프로토콜에 대해 정맥내 투여 경로를 통한 평편 (flat) 용량을 사용하기 위해 선택하였다. 상기 프로토콜의 1차 목적은 다발성 골수종의 환자에게 CART-19 세포를 투여하는 안전성 및 실행성을 시험하는 것이다. 예상되는 1차 독성은 (I) CAR이 악성 또는 정상 B 세포 상에서 그들의 대리 CD19 항원을 만날 때 시토카인 방출; (2) 리툭시맙 요법과 유사한 정상 B 세포의 고갈; (3) 확장된/공동자극된 자가 T-세포를 MM에 대해 ASCT와 결합할 때 이전에 보인 바와 같은 이식편-대-숙주 질환을 흉내내는 스테로이드-반응성 피부 및 위장관 증후군. 이론적인 관심은 CART-19 T 세포의 형질전환 또는 제어되지 않은 증식은 높은 수준의 CD19에 반응하여 일어날 수 있는지 여부였다. 이것은 CLL 환자의 또 다른 연구에 비해 본원에서 덜 문제가 되었고, 이것은 MM에서 클론형 B-세포의 부담은 상기 연구에서 치료된 난치성 CLL 환자에서 악성 B-세포의 부담보다 훨씬 더 낮은 것으로 예상되기 때문이다.
용량 근거
처음 3명의 환자에서, 본 발명자들은 1.4 x 107 내지 1.1 x 109개 CART-19 세포 범위의 용량에서 임상 활성을 관찰하였다. 상기 관찰은 적어도 치료된 처음 3명의 환자에서, 명백한 용량 반응 관계가 존재하지 않음을 보여준다. 완전 반응은 용량에서 2 로그 배수 차이를 투여된 환자에서 관찰되었다. 따라서, 대사되는 표준 약물과는 달리, CAR T 세포는 넓은 용량 반응 범위를 가질 수 있다. 이것은 아마도 CAR T 세포가 환자 내에서 광범하게 증식할 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명자들은 주입을 위해 1-5 x 108개 CART-19 세포의 용량 범위를 설정하였다. 동정적 사용에 기초하여 제공된 상기 단일-환자 연구에서, 환자는 5 x 108개까지의 CART19 세포를 제공받을 것이고, 여기서 용량 하한은 없다. 10명의 환자 시험에 대해, 환자는 1-5 x 107개 CART-19 세포를 제공받을 것이다.
일반적인 설계
이것은 동정적 사용에 기초하여 제공된 단일 환자-연구이고; CART-19를 발현하도록 형질도입된 자가 T 세포의 주입이 안전한지 결정하기 위해 I상 연구 후 모델을 제시하였다. 연구의 1차 목표는 처음 ASCT 이후 조기 재발한 후 구제 ASCT를 받은 환자에서 CART-19 T 세포의 안전성, 내약성 및 이식 능력을 결정하는 것이었다. 프로토콜은 공개 파일럿 연구로 이루어진다.
도입 시에, 대상체는 골수 생검 및 그들의 MM의 일상적 실험실 시험 및 영상화 평가를 받을 것이다. 적격 대상체는 CART-19 제조를 위한 많은 수의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 얻기 위해 정상 상태 분리반출술을 받을 것이다. T 세포를 PBMC로부터 정제시키고, TCRζ/4-1BB 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키고, 시험관내에서 확장시킨 후, 미래의 투여를 위해 동결시킬 것이다. 성공적으로 제조된 T 세포를 갖는 환자의 수에 비해 부적당한 T 세포 수집물, 확장 또는 제조를 갖는 환자의 수가 기록될 것이다; 제품 제조의 실행성은 상기 환자 집단에서 문제가 되는 것으로 예상되지 않는다.
대상체는 일반적으로 2회의 추가 ASCT를 수행하기 위해, 그들의 처음 ASCT에 대한 준비에서 수행된 동원/수집으로부터 저장되어 남아있는 적당한 말초 혈액 줄기 세포를 가질 것이다. 치료 의사의 선호도에 따른 요법으로 그들의 정상 상태 분리반출술 전 또는 후에 제2 동원/수집 절차를 받지 않을 것이다. 초기 백혈구분리반출술의 대략 2주 후에, 대상체는 병원에 입원하고 고-용량 멜팔란 (제 -2일)에 이어서, 2일 후 (제0일)에 자가 줄기 세포의 주입을 받을 것이고, 모든 대상체는 12 내지 14일 후 (제+12-14일)에 CART-19 세포의 주입을 받을 것이다. 10명까지의 환자가 등록될 것이다.
모든 대상체는 연구의 제4주까지 규칙적인 간격으로 CART-19 세포의 안전성, 및 이식 및 존속을 평가하기 위해 혈액 시험을 받을 것이다. 제 +42일 및 제 +100일에, 대상체는 골수 형질 세포 부담 및 골수로의 CART-19 세포의 수송을 평가하기 위해 골수 흡인물/생검을 받을 것이다. 공식적인 반응 평가는 제100일에 국제 골수암 실무 그룹(International Myeloma Working Group; IMWG) 기준 136에 따라 이루어질 것이고, TTP는 다발성 골수종의 환자에 대한 일상적 임상 실무에 따라 모니터링될 것이다. 상기 연구에서 측정된 주요 효능 성과는 상기 연구에서 ASCT 이후 TTP에 대한 환자의 초기 ASCT 이후 TTP의 비교일 것이다.
본 연구의 1차 종점은 ASCT와 함께 CART-19 세포의 주입의 안전성 및 실행성이므로, 연구에서는 초기 중단 원칙을 이용할 것이다. 간단히 설명하면, 치료한 처음 5명의 대상체 사이에 2개 미만의 중대한 예상치 않은 유해 사건이 발생하면, 연구에서는 10명의 표적 등록을 향해 추가의 5명의 대상체를 축적할 것이다. 본 발명자들은 치료된 대상체를 5명의 대상체를 등록시키고 관찰할 때까지 후속 대상체를 등록하기 전에 CART-19 주입 후 40일 동안 관찰할 것이다 (즉, 제42일에 처음 공식적 반응 평가). 제2 군의 5명의 환자의 치료를 위해, 대상체들 사이에 대기 기간은 요구되지 않을 것이다.
6개월의 광범한 추적조사 이후, 대상체를 병력, 신체 검사 및 혈액 시험으로 2년 동안 적어도 연 4회 평가할 것이다. 상기 평가 후에, 대상체는 새로운 악성종양의 발병과 같은 장기간 건강 문제의 진단을 평가하기 위해 추가로 13년까지 전화 및 질문지에 의한 매년 추적조사를 위해 연장 연구에 도입될 것이다.
1차 연구 종점
상기 파일럿 시험은 처음 ASCT 후 조기 재발한 후에 MM에 대한 구제 ASCT를 받은 환자에서 CD19 TCRζ/4-1BB로 형질도입한 자가 T 세포의 안전성 및 실행성을 시험하기 위해 설계되었다.
1차 안전성 및 실행성 종점은 다음을 포함한다:
NCJ CTC 2로서 규정된 연구-관련 유해 사건의 발생: 주입으로부터 제24주까지 임의의 시간에 가능하게, 아마도 또는 명백히 연구 치료와 관련된 등급 3 징후/증상, 실험실 독성 및 임상 사례. 이것은 주입 독성, 및 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 가능하게 CART-19 세포에 관련된 임의의 독성을 포함할 것이다:
a. 열
b. 발진
c. 호중구감소증, 혈소판감소증, 빈혈, 골수 무형성증
d. 간 기능장애
e. 폐 침윤물 또는 다른 폐 독성
f. 위장관 또는 피부에 침범하는 GVHD-유사 증후군.
환자 분리반출술 생성물로부터 CART-19 세포를 제조하는 실행성. 벡터 형질도입 효능, T 세포 순도, 생존력, 멸균성 및 종양 오염에 대해 방출 기준을 만족하지 않는 제조된 생성물의 수가 결정될 것이다.
CART19를 갖는 자가 줄기 세포 이식 이후 반응의 깊이 및 지속시간을 표준 자가 줄기 세포 이식 이후 각각의 환자가 초기에 달성한 반응의 깊이 및 지속시간에 비교할 것이다.
대상체 선택 및 철회
포함 기준
대상체는 MM에 대해 선행 ASCT를 받고 줄기 세포 주입의 365일 이내에 진행되어야야 한다. 계획된 직렬식 ASCT 강화 요법의 일부로서 2회 선행 ASCT를 받은 대상체가 적격이다. 진행은 진행성 질환에 대한 IMWG 기준에 따라, 또는 초기 ASCT 이후 CR 또는 sCR을 획득한 환자에 대해 CR로부터 재발에 대한 기준에 따라 규정될 것이다 (Durie et al. Leukemia 2006;20(9): 1467-1473). N.B.: 환자는 선행 ASCT의 365일 이내에 등록되어야 하고, 환자는 상기 연구에 대한 등록 이전에 선행 ASCT 후 재발/진행 이후에 실험 약제를 포함한 다른 약제로 치료받을 수 있다는 필요 요건이 존재하지 않는다.
대상체는 피험자 동의서에 서명해야 한다.
대상체는 멜팔란 주입 날짜의 12주 이내에 측정된, 다음 기준에 의해 규정된 바와 같이 고-용량 멜팔란을 투여받기 위해 적당한 생명에 필수적인 기관 기능을 가져야 한다: a. 혈청 크레아티닌 ≤ 2.5 또는 추정된 크레아티닌 클리어런스율 ≥ 30 ml/분 및 투석-의존성이 아님. b. SGOT ≤ 3x 정상의 상한, 및 총 빌리루빈 ≤ 2.0 mg/dl (과빌리루빈혈증이 길버트 증후군에 기인하는 환자를 제외함). c. 좌심실 박출률 (LVEF) ≥ 45%, 또는 LVEF가 <45%이면 임상적으로 유의한 심혈관 기능 손상이 없는 것을 확인한 심장 전문의에 의한 공식적인 평가. LVEF 평가는 등록 6주 이내에 수행되어야 한다. d. FEV1, FVC, TLC, DLCO (폐 부피 및 헤모글로빈 농도에 대한 적절한 조정 후에) ≥ 예측된 값의 40%를 갖는 적당한 폐 기능. 폐 기능 시험은 등록 6주 이내에 수행되어야 한다.
대상체는 보다 높은 수행 상태가 전적으로 뼈 통증으로 인한 것이 아니라면 0-2의 ECOG 수행 상태를 가져야 한다.
배제 기준
대상체는 임의의 활동성 및 제어되지 않은 감염을 갖지 않아야 한다.
대상체는 활동성 B형 간염, C형 간염, 또는 HIV 감염을 갖지 않아야 한다.
대상체는 개략한 바와 같이 참여를 방해하는 임의의 제어되지 않은 의학적 장애를 갖지 않아야 한다.
치료 요법
재발/진행성 다발성 골수종에 대한 요법
환자는 등록에 앞서 그들의 치료 의사의 선호도에 따라 재발/진행성 다발성 골수종에 대한 요법을 받을 수 있다. 치료는 등록 시에 지속할 수 있다.
환자는 분리반출술에 앞서 2주 동안 및 고-용량 멜팔란에 앞서 2주 동안 모든 요법을 중단해야 한다. 분리반출술 및 고-용량 멜팔란 사이에 2주 초과로 경과할 것이 예상되면, 환자는 그들의 치료 의사의 재량으로 분리반출술 후에 요법을 재개할 수 있다.
고-용량 멜팔란 (제 -2일)
환자는 제 -3일 또는 제 -2일에 병원에 입원할 것이고, 담당의, 및 치료 프로토콜의 개시에 앞서 종양 용해 증후군에 대한 파라미터를 모니터링하는 것을 포함하는 일상적 실험실 시험에 의해 검사를 받을 것이다. MM 모니터링 실험실 시험 (SPEP, 정량적 이뮤노글로불린, 및 혈청 비함유 경쇄 분석)을 위한 혈액은 그러한 시험이 입원 7일 이내에 취해지지 않았다면 요법의 개시에 앞서 채취될 것이다.
고-용량 요법은 제 -2일에 대략 20분에 걸쳐 정맥내 투여되는 200 mg/m2의 용량의 멜팔란으로 이루어질 것이다. 환자 >70세, 또는 치료 의사의 재량에서 200 mg/m2의 용량을 허용할 수 없는 임의의 연령의 환자에 대해 멜팔란의 용량은 140 mg/m2으로 감소될 것이다. 모든 환자는 덱사메타손을 포함할 수 있는 표준 항구토제 예방, 및 표준 항생제 예방을 투여받을 것이다.
줄기-세포 재-주입 (제0일)
줄기 세포 주입은 제0일에, 고-용량 멜팔란의 투여의 적어도 적어도 18시간 후에 일어날 것이다. 줄기 세포는 표준 기관 실무에 따라 예비투여 후 대략 20-60분에 걸쳐 정맥내 주입될 것이다. 체중 1 kg당 적어도 2 x 106개 CD34+ 전구체를 주입할 것이다. 추가로, 체중 1 kg당 적어도 1 x 106개 CD34+ 전구체가 지연된 이식 또는 후기 이식 실패의 경우에 주입할 예비 줄기 세포 제품으로서 이용가능해야 한다. G-CSF는 표준 기관 실무에 따른 용량으로 제 +5일에 시작하여 SQ 투여되어야 한다. 수혈 지원과 같은 다른 지원 가료 수단은 표준 기관 지침에 따라 이루어질 것이다.
CART19 세포 주입 (제 +12-14일)
5 x 107개 이하의 CART-19 세포로 이루어지는 단일 용량의 CART-19 형질도입된 T 세포가 제공될 것이다. CD19 TCRζ/4-1BB로 벡터로 형질도입한 세포의 주입에 대한 최소 허용 용량은 1 x 107개이다. CART-19 세포는 줄기 세포 주입 후 제 +12-14일에 신속 i.v. 주입에 의한 단일 용량으로서 제공될 것이다. 환자가 12-14일 윈도우 내에 본원에 기재된 임의의 포함 기준을 충족시키는데 실패한 경우에, CART-19 주입은 기준이 만족될 때까지 제 +12-14일을 넘어 지연될 것이다.
유지 레날리도마이드
처음 ASCT 후에 유지 레날리도마이드를 투여받고 허용하는 대상체는 치료 의사의 판단으로 금기가 없는 것으로 여겨지면 대략 제 +100일에 레날리도마이드 유지 요법을 재개할 것이다. 출발 용량은 선행 실험이 특정한 환자에 대한 대안적 출발 용량을 좌우하지 않는 한 매일 10 mg일 것이다. 유지 요법은 질환 진행 또는 불관용까지 계속될 것이다.
연구 약물의 제조 및 투여
CART-19 T 세포는 CVPF내에서 제조하고, 주입 세포에 대한 FDA 승인 방출 기준 (예를 들어, 세포 용량, 세포 순도, 무균성, 벡터/세포의 평균 카피수 등)이 만족될 때까지 CVPF로부터 방출되지 않는다. 방출 시에, 세포를 투여를 위해 병상에서 취한다.
세포 해동. 동결된 세포를 드라이아이스 내에서 대상체 병상으로 옮길 것이다. 세포를 36℃ 내지 38℃로 유지한 수조를 사용하여 병상에서 해동할 것이다. 세포가 막 해동할 때까지 백 (bag)을 부드럽게 주무를 것이다. 동결된 덩어리가 용기 내에 남지 않아야 한다. CART-19 세포 제품이 손상된 것으로 보이거나 백이 누출되거나 달리 손상된 것으로 보이면, 주입하지 않고 아래 명시된 바와 같이 CVPF로 돌려보내야 한다.
예비투여. T 세포 주입 후 부작용은 일시적인 열, 오한 및/또는 오심을 포함한다 (검토를 위해 문헌 [Cruz et al. (Cytotherapy 2010;12(6):743-749)] 참조). 대상체에게 CART-19 세포의 주입에 앞서 아세트아미노펜 및 디펜히드라민 염산염을 예비투여하는 것이 권장된다. 이들 투여는 필요하면 6시간마다 반복할 수 있다. 환자가 아세트아미노펜에 의해 완화되지 않고 계속하여 열이 나는 경우에 비스테로이드성 소염제 의약의 과정이 처방될 수 있다. T 세포에 대한 유해한 효과를 가질 수 있으므로, 생명을 위협하는 응급 상황을 제외하고는 환자는 임의의 시간에 전신 코르티코스테로이드, 예컨대 히드로코르티존, 프레드니존, 메틸프레드니솔론 또는 덱사메타손을 투여받지 않는 것이 권장된다.
열성 반응. CAR T 세포 주입 후에 대상체가 패혈증 또는 전신 박테리아혈증을 발병할 가능성이 적은 경우에, 적절한 배양 및 의료 관리가 개시되여야 한다. 오염된 CART-19 T 세포 제품이 예상되면, 제품은 CVPF에 저장된 보존 샘플을 사용하여 무균성에 대해 재시험될 수 있다.
투여. 주입은 면역억제된 환자에 대한 예방책을 사용하여 로즈 (Rhoads) 내의 격리실에서 일어날 것이다. 형질도입된 T 세포는 3-방향 꼭지 (stopcock)를 갖는 18-게이지 라텍스 비함유 Y자형 혈액 세트를 통해 대략 1분에 10 mL 내지 20 ml의 유속으로 신속 정맥내 주입에 의해 투여할 것이다. 주입 지속시간은 주입될 총 부피 및 권고되는 주입 속도에 기초할 것이다. 각각의 주입 백에는 다음 내용을 포함한 라벨을 부착할 것이다: "절대 자가 용도". 또한, 라벨은 적어도 2개의 특유한 식별자, 예컨대 대상체의 이니셜, 출생일자 및 연구 번호를 포함할 것이다. 주입에 앞서, 2명의 개인이 대상체의 존재 하에 상기 모든 정보를 독립적으로 확인하여, 정보가 참여자에게 정확하게 일치하는지 확인할 것이다.
대상체가 주입에 대해 알러지성 반응, 또는 중증 저혈압 발작, 또는 임의의 다른 반응을 일으키는 경우에 주입 동안 응급 의료 장비 (즉, 응급 카트)가 이용가능할 것이다. 생명 징후 (체온, 호흡 속도, 맥박 및 혈압)를 주입 전후에, 이어서 적어도 1시간 동안 15분마다, 및 이들 징후가 만족스럽고 안정할 때까지 검토할 것이다. 대상체에게 치료 의사가 안전한 것으로 여길 때까지 떠나지 않도록 요청할 것이다.
패키징
주입은 1-5 x 107개 CA T19-형질도입된 세포의 단일 용량으로 이루어질 것이고, 여기서 최소 허용 용량은 주입에 대해 1 x 107개 CART-19 세포이다. 각각의 백은 다음 주입 등급 시약 (% v/v)을 함유하는 냉동매질의 분취액 (용량에 의존한 부피)을 담을 것이다: 31.25% 플라스마라이트-에이-A, 31.25% 덱스트로스 (5%), 0.45% NaCl, 7.5% 이하 DMSO, 1% 덱스트란 40, 5% 인간 혈청 알부민.
분리반출술
대량 부피 (12-15 리터 또는 4-6 혈액 부피) 분리반출술 절차를 분리반출술 센터에서 수행한다. 상기 절차 동안 CART-19를 위한 PBMC를 얻는다. 단일 백혈구분리반출술로부터, 목적은 CART-19 T 세포를 제조하기 위해 적어도 5 x 109개 백혈구를 수거하는 것이다. FDA 역추적조사 요건을 위한 및 연구를 위한 기준선 혈액 백혈구를 또한 얻고 동결보존한다. 세포 제품은 대략 2-4주 후 방출을 위해 준비되는 것으로 예상된다. CD19 및 CD20 B 세포 결정을 비롯한 유동 세포측정 림프구 하위세트 정량. 기준선 평가는 인간 항-VSV-G 및 항-뮤린 항체 (HAMA)에 대해 이루어진다. 대상체가 이전에 클리니컬 셀 앤드 백신 프러덕션 퍼실리티(Clinical Cell and Vaccine Production Facility)에서 현재 우수 제조 실무(Good Manufacturing Practices)에 따라 쌓여진 적당한 분리반출술 수집을 받았으면, 이들 세포는 CART-19 제조를 위한 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다. 쌓여진 분리반출술 제폼을 사용하는 것은 추가의 분리반출술 수집을 받는 대상체에 대한 비용, 시간 및 위험을 방지할 것이다.
세포감소 화학요법
림프구 고갈 화학요법은 본원에 기재된 바와 같은 고용량 멜팔란일 것이다.
CART-19 주입
주입은 줄기 세포 재주입 후 제 +12-14일에 시작할 것이다.
제1 주입에 앞서 제 +12-14일에, 화학요법이 부분적으로 림프구감소증을 유도하기 위해 제공되기 때문에 환자는 CD3, CD4 및 CD8 카운트의 차이 및 평가를 갖는 CBC를 받을 것이다.
제1 용량은 단일 용량을 사용하여 투여될 것이다. 세포를 환자 병상에서 해동시킨다. 해동된 세포는 주입 지속시간이 대략 10-15분이 되도록 하는 허용되는 한 신속한 주입 속도로 제공될 것이다. 혼합을 용이하게 하기 위해, 세포를 Y-어댑터를 사용하여 동시에 투여할 것이다. 대상체에게 본원에 기재된 바와 같이 주입하고 예비투여할 것이다. 대상체의 생명 징후를 평가할 것이고, 펄스 산소측정은 투여 전에, 주입의 끝에, 및 그 후 15분마다 1시간 동안 및 이들이 안정하고 만족스러울 때까지 이루어진다. 기준선 CART-19 수준의 결정을 위한 혈액 샘플은 제1 주입에 앞서 및 각각의 주입의 20분 내지 4시간 후 임의의 시간에 얻는다 (그리고 TCSL에 보낸다).
고-용량 멜팔란에 관련된 독성을 겪은 환자는 이들 독성이 해소될 때까지 그들의 주입 일정을 지연시킬 것이다. T 세포 주입의 지연이 정당한 것으로 인정되는 구체적인 독성은 다음의 것을 포함한다: 1) 폐: 포화를 95% 초과로 유지하기 위해 보충적 산소에 대한 요건 또는 진행성인 흉부 x-선 상의 방사선사진상 이상의 존재; 2) 심장: 의학적 관리로 제어되지 않는 새로운 심 부정맥, 3) 승압제 지원을 요구하는 저혈압. 4) 활성형 감염: T 세포 주입의 48-시간 이내에 박테리아, 진균, 또는 바이러스에 대한 양성 혈액 배양.
독성의 관리
제어되지 않은 T 세포 증식. 동종 또는 자가 T 세포 주입와 연관된 독성은 약물학적 면역억제의 과정에서 관리되었다. T 세포 연관 독성은 전신 코르티코스테로이드에 반응하는 것으로 보고되었다. 제어되지 않은 T 세포 증식이 발생하면 (CART-19 세포에 관련된 등급 3 또는 4 독성), 대상체를 코르티코스테로이드로 치료할 수 있다. 대상체는 펄스 메틸프레드니솔론 (2 mg/kg i.v., q8 hr마다 분할 x 2일)로 치료한 후, 신속하게 투여량을 감소시킬 것이다.
또한, 또 다른 프로토콜로 치료한 대상체의 관찰에 기반하여, CD19+ 종양 부담이 CLL의 환자보다 골수종의 환자에서 훨씬 더 낮은 것으로 예상되지만 대식세포 활성화 증후군 (MAS)에 대한 몇몇 문제가 있다. 상기 독성의 치료 및 치료 시기는 환자의 의사 및 연구 조사자의 재량으로 결정될 것이다. 제안된 관리는 다음을 포함할 수 있다: 대상체가 연속 2일 넘게 지속하는 101℉ 초과의 열이 있고 감염의 증거가 없으면 (음성 혈액 배양, CXR 또는 다른 공급원), 토실리주맙 4 mg/kg를 고려할 수 있다. 코르티코스테로이드 및 항-TNF 요법의 추가는 의사 재량으로 고려될 수 있다.
B 세포 고갈. B 세포 고갈 및 저감마글로불린혈증이 발생하는 것이 가능하다. 이것은 항-CD20 유도 요법에서 흔하다. 임상적으로 유의한 저감마글로불린혈증 (즉, 전신 감염)의 경우에, 대상체에게 정상 수준의 혈청 이뮤노글로불린 수준을 회복하기 위해 확립된 임상 투여 지침에 의해 정맥내 이뮤노글로불린 (IVIG)을 제공할 것이고, 이것은 리툭시맙과 함께 이루어진다.
1차 이식 실패. 1차 이식 실패 (즉, 비-이식)은 제1 ASCT에 비해 제2 ASCT 후에 더 일반적일 수 있다. 적격 기준은 1차 이식 실패의 경우에 치료 의사의 재량으로 구조 재주입을 위해 충분한 줄기 세포가 이용가능해야 하는 것을 규정한다.
결과
3명의 치료-불응성, 진행성 다발성 골수종 환자를 현재 진행 중인 시험에서 CTL019로 처리하였다. 이들 환자 중 2명에 대한 결과는 둘 다 3-개월 시점에서의 1차 효능 평가에 기초하여 CTL019 요법으로부터 실질적인 항종양 효과를 갖는 것으로 나타났다. 제3 환자는 아직 3-개월 시점에 도달하지 않았다. 2명의 환자에 대한 결과를 이하에서 보다 상세하게 기재한다.
제1 골수종 환자는 그의 +100일 반응 평가를 완료하였고, CART19 요법에 대해 매우 양호한 반응을 가졌다. 하기 시험을 수행하여 하기 결과가 나왔다:
-SPEP/면역고정: 음성
-소변 면역고정: 면역고정에 대한 희미한 측정불가능한 카파 경쇄 밴드 (또한 제38일에 존재함, 따라서 신규한 것이 아님)
달리, 환자는 하기를 비롯한 엄격한 완전 완화에 대한 기준을 충족시켰다:
-무혈청 경쇄 비: 정상
-골수 생검: 음성
-IgA 면역표현형결정: IgA는 검출 한계 미만임
소변 면역고정으로부터 발생한 희미한 측정불가능한 카파 경쇄 외에는, 환자는 "엄격한 완전 완화"에 대한 모든 기준을 충족시켰다. 3회 시점 (제-2일, 제+38일, 제+103일)에서의 형질 세포 면역표현형결정의 요약을 도 39에 제시하고, 이는 환자의 IgA가 검출 한계 미만임을 입증한다. 요약은 제-2일에 무거운 골수종 부담, 및 제+38일 및 제+103일에 검출가능하지 않음을 보여주고, 이는 유동 분석에 의하면 환자를 "MRD 음성"으로 분류한다. 제+103일에, 요약은 정상, 폴리클로날, CD19+ 형질 세포 및 B 세포의 회복을 보여준다. 환자는 질환 또는 요법의 어떠한 증상도 갖지 않았고, 정상 인간과 마찬가지로 기능적이다.
처리된 제2 환자는 아직 제+100일 시점에 도달하지 않았다. 그러나, 이 시점에, 잘 활동하고 있지만, CTL019 주입의 효과를 결정하기에는 너무 이르다.
실시예 7: 외투 세포 림프종에 대한 키나제 억제제/CAR19 T-세포 조합 요법
입양 T-세포 요법은 림프성 악성종양의 치료를 위한 상당한 약속을 제공한다. CTL109를 사용하여 B-세포 특이적 CD19 항원에 대한 키메라 항원 수용체 (CAR)에 의해 형질도입된 자가 T 세포 (CAR19 T 세포/CART19 세포)의 입양 전달을 사용한 소림프구성 림프종/만성 림프구성 백혈병 (SLL/CLL) 및 급성 림프구성 백혈병 (ALL)에서의 유망한 임상 반응. 본 발명자들은 CD19-특이적 CAR (CAR19 T 세포/CART19 세포)을 사용하여 CD19-양성 악성종양을 치료하기 위해 I상 시험에 등록된 화학요법-불응성 SLL/CLL에 걸린 3명의 환자에 대한 초기 데이터를 최근 보고하였다. 사용된 접근법은 CD137 및 TcRz로부터 유래된 신호전달 도메인을 함유하는 CD19-표적화 CAR을 발현하도록 렌티바이러스를 사용한 환자-유래 벌크 T 세포의 유전자 변형을 수반하였다. 이러한 연구를 위해, 본 발명자들의 항-CD3 및 -CD28 비드 확장 방법론을 사용하여 세포를 확장시키고, 시토카인 지원 없이 림프구고갈 후 초기에 세포를 주입하였다 (Kalos M, et al. (2011) Sci Transl Med. 3: 95ra73; 및 Porter DL, et al. (2011) N Engl J Med. 365: 725-733). 이들 초기 결과는 매우 유망하였다: (i) 단일 치료 과정 후 2/3명의 환자가 완전 완화를 달성하였고, 치료 후 15+ 개월째인 현재 질환 없이 남아있으며, T 세포 주입 후 곧 코르티코스테로이드로 치료된 제3 환자는 강력한 부분 반응을 입증하였다. (ii) 이들 환자에서, 본 발명자들은 입양 T 세포 요법-기반 전략의 궁극적인 효능, 즉 강건한 생체내 T 세포 확장, 질환 근절, T 세포 수축, 및 장기간 기능 지속에 요구되는 것으로 생각되는 요소를 재현할 수 있었다. 지금까지 10명의 SLL/CLL 환자가 치료받았고, 2명은 완전한 임상 및 분자 완화로 남아있고, 5명은 부분 완화를 경험하였고, 3명은 측정가능한 반응의 결여를 보였다. 또 다른 연구에서, B 세포 ALL에 걸린 2명의 환자는 완전 완화를 달성하였고, 1명은 CD19 발현이 결여된 백혈병성 세포가 재발하였다.
대세포 형질전환 전 및 후 둘 다의 외투 세포 림프종 (MCL)이 또한 CART19-기반 입양 요법으로부터, 특히 키나제 억제제, 예컨대 MCL 세포에 대해 직접적인 영향을 미치는 것과 조합된 경우에 이익을 얻을 수 있을 것이다.
키나제 억제제와 조합된 CART19-기반 입양 요법의 조합을 추가로 분석하기 위해, 고처리량 스크린이 CART19 세포와 조합된 MCL 발병기전에 중요한 키나제를 표적화하는 여러 억제제: CDK4/6, BTK, 및 mTOR을 평가하기 위해 사용될 것이다. 가장 유망한 조합은 시험관내 및 MCL 이종이식 마우스 모델의 생체내 둘 다에서 보다 상세하게 평가될 것이고, 이는 궁극적으로 MCL 환자에서 소분자 키나제 억제제 및 CART 세포 면역요법의 조합을 평가하기 위한 임상 프로토콜의 개발을 안내할 수 있다.
이러한 연구에서, 전임상 연구는 MCL의 다양한 하위유형에서 이러한 접근법의 잠재적인 임상 효능을 결정하고 CART19 세포를 사용하여 MCL 세포를 치료적으로 표적화하는 능력을 평가하기 위해, 단독으로 또는 MCL 세포의 생존 및 성장에 중요한 키나제 패밀리 발현 및 활성으로부터 선택된 단백질의 소분자 억제제와 조합되어 수행될 것이다.
연구 계획
전임상 세팅에서, MCL 및 CART19 세포에서 보고된 병원성 관련성을 갖는 키나제 억제제를 사용하여 배양된 세포 및 1차-유형 세포 둘 다의 MCL 세포를 치료적으로 표적화하는 능력이 평가될 것이다. 고처리량 MTT 검정이 이들 작용제의 효과를 결정하여 잠재적인 최적 조합, 투여 및 작용제 적용 시점을 확인하기 위해 사용될 것이다. 가장 유망한 2-3종의 조합은 세포 기능, 인산화-기반 세포 신호전달, 및 유전자 발현과 관련하여 먼저 시험관내에서 그리고 나중에는 MCL 이종이식 모델의 생체내에서 보다 상세하게 평가될 것이다.
키나제 억제제/CART-19 세포 조합이 MCL 세포를 효과적으로 표적화하는 능력을 특징화하기 위한 시험관내 연구
본 목적에서, MCL 세포에 대한 소분자 키나제 억제제의 시험관내 영향을 연구하고 뿐만 아니라 CART19 세포와 MCL 세포 사이의 상호작용 및 이들 상호작용에 대한 억제제의 영향을 검사하기 위해 상기 열거된 상세화된 기능, 표현형, 생화학, 및 분자 검정이 검사될 것이다.
본 목적을 달성한 것에 대한 벤치마크는 포괄적 데이터 세트를 생성하여
i. CART19 세포가 활성화되고, 배양된 및 1차 MCL 세포를 용해시킴을 보고하고;
ii. 선택된 키나제 억제제가 용량 및, 일부는, 억제제 vs. CART19 세포 투여의 시점과 관련하여 적절하게 적용된 경우에 CART19 세포 기능에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 각각의 다른 및/또는 CART19 세포가 MCL 세포를 제거하는 능력을 증진시킨다는 것을 입증하고;
iii. NSG 마우스를 사용한 생체내 MCL 이종이식 실험에 사용될 BTK 억제제에 대한 스케줄 및 용량에 대한 요법을 확립하는
것일 것이다.
이러한 연구의 목표는, 예를 들어 MCL 병리생물학에 중요한 키나제를 표적화하는 소분자 억제제: CDK4, BTK, 및 mTOR의 CART19 세포와의 최적 치료 조합을 확인하여 평가하고, CART19 활성을 모니터링하고, 및 MCL에 대한 요법의 기능적, 생화학적, 및 분자적 효과를 특징화하는 것이다.
이들 연구는 목적 2에서 생체내 평가될 CART19 요법과 함께 BTK 치료 키나제 억제제의 시점 및 용량에 대한 스케줄에 대한 합리적인 개요를 확립하여야 한다.
CART19 세포가 단독으로 및 BTK 억제제와 조합되어 여포성 림프종을 표적화하는 능력을 평가하기 위한 시험관내 연구
본 목적에서, 본 발명자들은 동물 모델에서 선택된 억제제/CART19 세포 조합(들)이 확립된 및 1차 MCL 세포의 성장에 영향을 미치는 능력을 시험할 것이다.
본 목적을 달성한 것에 대한 벤치마크는 데이터 세트를 생성하여
i. 선택된 억제제/CART19 세포 조합이 대조군 (단일 또는 모의 작용제 처리 동물)과 비교하여 MCL가 생착된 동물의 생존을 현저하게 증진시킨다는 것을 입증하고;
ii. 미래의 임상 시험을 위한 기준으로서 사용될 선택된 키나제 억제제/CART19 조합에 대한 스케줄 및 투여에 대한 요법을 확립하는
것일 것이다.
이러한 연구의 목표는 확인된 키나제 억제제/CART19 플러스 BTK 억제제 조합에 대해 목적 1에서 규정된 치료 및 용량 스케줄을 평가하고, BTK 처리가 배양된 것 및 1차 둘 다인 MCL 세포로 이종이식된 NSG 마우스에서 MCL을 표적화하는데 CART19와 상승작용하는지 여부를 시험하는 것을 포함한다.
하기 세포 유형, 화합물, 동물 및 실험 방법론이 제안된 목적을 달성하는데 사용될 것이다.
MCL 세포:
4종의 MCL 세포주 (Jeko-1, Mino, SP-49, 및 SP-53) 및 15종의 1차 MCL (12 전형적 및 3 모구성)로부터의 생존가능하게 동결된 샘플. 세포주는 자발적으로 잘 성장하는 한편, 1차 세포는 단독으로, 뿐만 아니라 그의 생존율을 개선시키기 위해 HS5 골수 기질 세포로부터 수집된 조건화 배지의 존재 하에 배양될 것이다.
CART19 세포:
CAR19를 발현하도록 조작된 1차 인간 T 세포는 렌티바이러스 형질도입을 사용하고 확립된 프로토콜을 사용하여 생성될 것이다 ((Kalos M, et al. (2011) Sci Transl Med. 3: 95ra73; 및 Porter DL, et al. (2011) N Engl J Med. 365: 725-733). 단일 형질도입 사건 후, T 세포는 전형적으로 CAR19를 30%를 초과하는 빈도로 발현한다.
본 발명자들의 연구는 5명의 SLL/CLL 환자로부터의 CART 19 집단을 사용할 것이다 (1x107개 세포/바이알의 50-100개 바이알/환자가 이미 이용가능함). CART19 세포는 항-CAR19-특이적 이디오타입 항체 (STM)를 사용하여 확인될 것이다. CART19 활성은 CD19+ NALM-6, CD19-음성 K562, 및 CD19-형질도입된 K562 세포주를 사용하여 표준화된 방법으로 시험관내 및 NSG 마우스의 생체내 둘 다에서 제어될 것이다. CART19 세포 기능이 MHC 제한적이지 않지만, 적어도 5명의 MCL 환자로부터의 CART19 세포가 또한 사용될 것이다.
키나제 억제제.
하기 키나제의 억제제가 시험될 것이다: CDK4/6 (PD0332991), BTK (PCI-32765), mTORC1 (라파마이신), MNK (4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d]피리미딘 (Marzec M, et al. PLoS One 6:e24849); 및 일라이 릴리(Eli Lilly)로부터의 신규 화합물 (Gupta M, et al. (2012) Blood 119:476-487); mTOR (OSI-027), 및 이중 PI3K/mTOR (PF-04691502).
화합물은 먼저, 최적 키나제 억제를 보장하기 위해 환자의 혈청에서 도달된 비-독성 농도를 비롯하여 사전-결정된 유효 용량 스펙트럼에서 평가될 것이다.
동물:
생체내 실험은 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory) (바 하버)로부터 입수된 번식자를 사용하여, 스템 셀 앤드 제노그라프트 코어(Stem Cell and Xenograft Core)로부터 번식되고 입수가능한 NOD-SCID-IL-2Rgc 널 (NSG) 마우스를 사용하여 수행될 것이다. 마우스는 헤파필터가 달린 마이크로아이솔레이터를 사용하여 멸균 조건 하에 수용되고, 방사선조사 식품 및 산성수로 사육될 것이다.
이식된 마우스는 실험 기간 동안 항생제 (네오마이신 및 폴리믹신)로 처리된다. 수컷 및 암컷이 동일하게 혼합된 6 내지 8주령의 동물이 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인받은 프로토콜에 따라 모든 연구에 활용될 것이다.
본 발명자들은 구체적으로 CART19 세포의 차등 활성을 평가하기 위해 이전의 T 세포 입양 전달 연구에서의 NSG 동물을 사용하였다 (Witzig TE, et al. (2010) Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2010:265-270, MTT assay). MCL 세포 성장을 평가하기 위한 고처리량 MTT 검정이 단독으로 또는 다양한 조합으로 적용된 키나제 억제제에 대한 반응에서 먼저 수행될 것이다. 이러한 검정은 세포 증식률 및 생존율을 동시에 결정할 수 있고, CART19 세포의 존재 또는 부재 하에 소분자 억제제의 많은 가능한 조합의 효율적인 평가를 가능하게 한다. 이러한 분석의 핵심 측면은 약물 효과를 잠재적인 상승작용적, 부가적, 또는 길항 효과에 대하여 특징화하는 것일 것이다. 또한, CART19 세포에 대한 소분자 억제제의 효과가 평가될 것이다. BTK 억제는 B-세포 특이적일 것이고, mTOR 및 CDK4/6 억제는 CART19 세포에 영향을 미칠 것이다. CART19 세포에 대한 그의 잠재적인 효과를 최소화하기 위해 약물 적용의 적절한 시점을 확립하는 것은 이들 실험의 목적 중 하나일 것이다.
시험을 수행하기 위해, MCL 세포를 96-웰 플레이트에 1x104개 세포/웰로 3중으로 시딩하고, CART-19 세포의 다양한 조합 및 다양한 농도의 배지 또는 키나제 억제제에 노출시킬 것이다. 48 및 74시간 후, 대사적 활성 세포의 상대 수는 MTT 환원 비색 검정 (프로메가(Promega))의 사용에 의해 결정될 것이다.
대조군 및 상이한 처리 조건의 평균 값 (+/- S.D.) 사이의 차이의 유의성은 스튜던트 t-검정을 사용하여 평가될 것이고, P 값 <0.05가 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.
세포 증식 및 아폽토시스 검정:
이어서, MCL 세포 성장 억제의 세포증식억제성 및 세포독성 성분 둘 다를 결정하기 위해 가장 유망한 약물 조합이 CFSE 표지화 및 말단 dUTP 닉-말단 표지화 (tunel) 검정에서 각각 평가될 것이다. 이전 검정에서, MCL 세포는 BTK 억제제의 CFSE 첨가에 의해 표지화되고/거나 비표지화 CART-19 세포가 될 것이다. 48시간 후, 배양된 세포는 MCL-유형 세포의 CFSE 표지화 패턴에 대해 FACS에 의해 분석될 것이다. tunel 검정은 비디 바이오사이언시스로부터의 아포아럴트 DNA 단편화 검정 키트(ApoAlert DNA Fragmentation Assay Kit)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 이루어질 것이다.
간략하게, MCL 세포는 억제제 및/또는 CART19 세포와 함께 48 또는 72시간 동안 배양될 것이다. 세척 후, 세포를 표지된 항-CD20 항체로 염색 및 투과화하고, 세척하고, TdT 완충제 중에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션할 것이다. 반응을 중지시키고, 세포를 세척하고, 재현탁시키고, 셀퀘스트 프로 소프트웨어를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석할 것이다.
CART19 기능적 검정:
본 발명자들은 CD107 탈과립화, 세포내 시토카인 분비 (ICS) 검정, 증식세포용해 검정, 및 멀티플렉스 시토카인 검출 검정 (32)을 사용하여 MCL 세포주에 대한 CART19 세포의 이펙터 활성을 측정할 것이다. 탈과립화 및 ICS 검정을 위해, 이펙터 (T 세포) 및 표적 (종양 세포)을 항-CD107 항체의 존재 하에 4시간 동안 0.2:1의 E:T로 공동-인큐베이션한 다음, 확립된 프로토콜에 따라 표면 (CAR19, CD3, CD8, CD4) 및 세포내 시토카인 마커에 대해 염색할 것이다. MCL 세포의 세포용해는 유동-세포측정법-기반 세포용해 검정을 사용하여 평가될 것이다. 증식 검정의 경우에, 이펙터 세포는 CFSE (카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르카르복시-플루오레세인-숙시닐 에스테라제)와 함께 사전-로딩되고, 표적 세포와 0.2:1의 E:T로 혼합되고, 37℃에서 4일 동안 공동-인큐베이션되고, 표면 마커 (CAR19, CD3, CD8, CD4)에 대해 염색되고, 유동-세포측정법에 의해 CFSE의 희석에 대해 분석될 것이다.
멀티플렉스 시토카인 검정.
본 발명자들은 (STM32)에 기재된 바와 같은 루미넥스-기반 비드 검정을 사용하여 MCL 표적에 반응한 CART19 세포에 의한 시토카인의 생산을 측정할 것이다. 이들 분석을 위해, 본 발명자들은 혈청, 혈장 또는 조직 배양 상청액에서 IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p40/p70), IL-13, IL-15, IL-17, TNF-α, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, IP-10, MIG, 에오탁신, RANTES, MCP-1, VEGF, G-CSF, EGF, FGF-염기성, 및 HGF를 동시에 측정하는 인비트로젠 30-플렉스 키트를 사용할 것이다.
CART19T 세포의 다중파라미터 유동 세포측정 분석:
본 발명자들은 펜실베니아 대학교 아브람손 암 센터 유동 세포측정법 코어를 통해 이용가능한 4색 유동 세포측정법 및 4개의 레이저가 장착된 맞춤 BD LSR II (청색 (488 nM), 보라색 (405 nM), 녹색 (532 nM), 및 적색 (633 nM))를 사용하여, 종양 세포와의 공동-인큐베이션 후에 CART19 세포에 대한 기능적 활성화 및 억제와 연관된 표면 마커의 조정을 측정할 것이다. 모든 유동 세포측정 데이터는 플루우조 소프트웨어 (트리스타(TreeStar), 캘리포니아주 산카를로스)를 사용하여 분석될 것이다. 이들 분석은 본질적으로 (STM42)에 기재된 바와 같이 사멸 세포 및 표적 세포 (CD19+)를 배제하기 위한 덤프 채널, 및 CART19 세포 (STM)를 검출하기 위한 CAR19 이디오타입-특이적 시약을 사용하여 수행될 것이다. 본 발명자들은 필요에 따라 무손상 또는 투과화된 세포에 대해, 종양 세포와의 공동-인큐베이션 후 CART19-양성 및 -음성 세포 (CD3+/CD8+ 및 CD3+/CD4+) 상의 하기 마커를 평가할 것이다. 본 발명자들은 이들 마커에 대한 다중-파라미터 패널을 확립하였다:
- 활성화/이펙터 기능: CD25, CD154, CD134, CD137, CD69, CD57, CD28, T-bet
- 억제: CD152 (CTLA4), PD1, LAG3, CD200
- 억제 (Treg) CD4+/CD25++/CD127-, Fox-P3+
동시에, CD19 및 CD5 염색에 의해 확인된 MCL 세포는 면역억제 단백질: CD174 (PD-L1) CD173 (PD-L2) 및 CD152의 발현에 대해 검사될 것이다.
세포 신호전달에 대한 억제제 영향:
연구의 이 부분은 단지 선택된 화합물; 상기 기재된 기능적 검정 (세포 성장, 증식, 및 아폽토시스)에서 가장 유효한 것으로 입증된 것에 대해서만 초점을 맞출 것이다. 효과는 각각의 약물에 대해 및 선택된 조합에 대해 개별적으로 연구될 것이고, 연구는 특정 화합물에 대해 조정될 것이다. 예를 들어, mTORC1 및 MNK 억제제 조합은 mTORC1 신호전달, 특히 eIF-4E 인산화를 평가할 것이고, BTK 억제는 PI3K-AKT 및 MEK-ERK 경로에, 및 CDK4/6 억제는 Rb 인산화에 초점을 맞출 것이다. 이들 연구는 문헌 [Marzec M, et al. (2006) Blood. 108:1744-1750; Marzec M, et al. (2008) Blood 111: 2181-2189; Zhang Q, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108: 11977-11982]에 기재된 바와 같이 포스포-특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 수행될 것이다. 간략하게, MCL 세포는 용해될 것이고, 단백질 추출물은 로우리 방법 (바이오-라드)을 사용하여 검정되고 폴리아크릴아미드 겔에 로딩될 것이다. 단백질 인산화를 검사하기 위해, 블롯팅된 막을 포스포-특이적 항체, 예를 들어 S6rp S235/236, eIF4E S209, 4E-BP1 T37/46, 4E-BP1 T70에 대해 특이적인 것 (셀 시그널링(Cell Signaling))과 함께 인큐베이션하여 mTORC1 및 MNK 활성 및 그의 억제를 평가할 것이다. 이어서, 막을 적절한 2차, 퍼옥시다제-접합된 항체와 함께 인큐베이션할 것이다. 블롯을 아머샴(Amersham)으로부터의 ECL 플러스 시스템을 사용하여 현상할 것이다.
게놈-규모 유전자 발현 분석:
세포 신호전달의 억제는 전형적으로 유전자 전사에서의 변화로 이어진다. 선택된 억제제 또는 소수의 억제제의 MCL에서의 유전자 전사에 대한 효과를 결정하기 위해, 게놈-규모 유전자 발현 분석을 문헌 [Marzec M, et al. (2008) Blood 111: 2181-2189; Zhang Q, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108: 11977-11982]에 기재된 바와 같이 수행할 것이다. 간략하게, 3중 배양물 중의 세포를 선택된 억제제 또는 그의 희석제로 0, 4, 및 8시간 동안 처리할 것이다. 전체 RNA를 추가로 정제하여 mRNA를 풍부화할 것이고, 이를 역전사시키고, 표지하고, 모든 공지된 유전자 엑손에 대한 아피메트릭스 마이크로칩에 대해 혼성화에 의해 검사할 것이다. 마이크로어레이 데이터를 정규화하고, 진스프링(GeneSpring) 및 MAS5 알고리즘에 구현된 바와 같은 RMA를 사용하여 요약할 것이다. 생성된 p 값은 오류 발견율 (FDR)을 사용하여 벤자미니-호크베르크(Benjamini-Hochberg) 증강 방법에 의해 다중 시험에 대해 교정할 것이다. 차등 발현 시험은 SAM 및 파르테크프로(PartekPro)를 비롯한 다양한 도구를 사용하여 달성될 것이다. 이어서 발현 패턴 (진스프링 또는 스팟파이어(Spotfire))에 기초하여 신생 관심 유전자가 군집화될 것이고, 군집은 검색 도구로서 KEGG, 독창적 경로 분석, 및 NIH-다비드(NIH-David)를 사용한 유전자 온톨로지 데이터베이스에서 기능적 군 및 경로에 대해 분석될 것이다. 데이터에 기초하여 확인된 유전자에 대한, 정량적 RTPCR에 의한 비의존성 발현 입체형태는 다양한 유형의 MCL (표준 vs. 모구성 및 SOX11-양성 vs. SOX11-음성)의 보다 큰 풀의 샘플 (적어도 20)에 대해 수행될 것이다.
전체-엑솜 DNA 서열 분석:
그의 발병기전 및, 가능한 정도로, 본원에 제안된 조합 요법에 대한 반응과 관련하여 MCL 사례를 보다 더 특징화하기 위해, 엑솜 DNA의 서열을 검사할 것이다. MCL 및 정상 말초 혈액 DNA 샘플의 전체-엑솜 포획 및 차세대 서열분석은 님블레젠(NimbleGen) 서열 포획 2.1M 인간 엑솜 어레이 및 HiSeq 2000/1000 일루미나 기기를 사용하여 수행할 것이다.
이종이식된 종양에서의 치료 효과의 평가:
NSG 마우스는 MCL 종양 (조직 단편, 또는 덜 바람직하게는, 세포 현탁액으로서 이식된 둘 다의 MCL 세포주: Jeko 및 Mino 및 1차 세포로부터 유래됨)을 보유할 것이다. 종양은 작은 종양 단편의 피하 이식에 의해 증식될 것이다. 요법은 종양이 직경 0.2-0.3 cm에 달하면 개시될 것이다. 키나제 억제제(들)는 시험관내에서 미리 선택된 용량 및 시점으로 위관영양에 의해 투여될 것이다 (예를 들어, 본 발명자들은 그의 B-세포 특이성 및 CART19 세포에 대한 임의의 억제 효과의 예상되는 결여를 고려하여 BTK 억제제를 CART19 세포와 동시에 적용할 것을 예상함). CART-19 세포는 종양-보유 마우스의 꼬리 정맥으로 1x107개/동물의 용량으로 주사될 것이고, 키나제 억제제(들)는 시험관내에서 미리 선택된 용량 (본 발명자들이 악성 세포를 재현가능하게 근절하기에 충분하고, 동시에, 이종-이식편 대 숙주 질환을 유발하지 않는 것으로 확립한 용량) 및 시점으로 위관영양에 의해 투여될 것이다. CART19 세포의 대형 마스터 스톡 (1x 1010)이 생성될 것이고, 이펙터 세포 차이와 연관된 변동성을 최소화하기 위해 동결될 것이다. 이들 실험으로부터의 1차 측정은 생존일 것이고, 본 발명자들은 카플란/마이어 곡선을 사용하여 평가할 것이다. 2차 측정으로서, 본 발명자들은 T 세포 주입 후 동물에서의 CART19 세포의 차등 확장을 평가할 것이다. 이는 주입된 T 세포 산물이 규정된 비의 CART19-양성 및 -음성 세포로 구성될 것이라는 사실에 의해 가능해질 것이다. 이들 분석을 위해, 꼬리 정맥 출혈에 의해 매주 동물을 출혈시킨 다음 (각 시점에 25 마이크로리터), 적혈구를 용해시키고, 인간 CD3, CD4, CD8, 및 CART19에 대해 염색할 것이다. CART19 세포의 우선적인 확장 (CART19+/CART19- 비에서의 적어도 2-배 증가)은 선택적 MCL-유도 CART19 세포 확장에 대한 증거일 것이다. 처리 결과를 평가하기 위해, 이식된 피하 종양의 부피를 하기와 같은 식에 따라 결정할 것이다: 부피 = 0.4ab2, 여기서 a 및 b는 각각 종양의 장 및 단 직경을 나타냄. 마우스의 처리 및 비처리 군 사이의 종양 부피 차이는 표준 t-검정을 사용하여 통계적으로 분석될 것이다. 마우스는 실험의 종점에 (>30일), 또는 종양이 직경 > 1.2 cm에 달한 경우에, 또는 동물 곤란의 임의의 증거가 나타났을 때 희생될 것이다. 마우스의 처리 및 비처리 군 사이의 종양 부피 차이는 표준 t-검정을 사용하여 통계적으로 분석될 것이다. 종양 뿐만 아니라 내부 기관도 수거되고, 프로세싱되고, 및 조직학에 의해 분석될 것이고, 선택된 조직의 경우에는 B 세포 (CD20, CD79a, Pax-5, CD10, BCL-6) 및 T 세포 (CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TIA-1), 및 증식 마커 Ki-67에 대한 항체 배터리를 사용하여 면역-조직화학에 의해 분석될 것이다.
통계적 분석:
시험관내 기능적 연구에서, 대조군 및 상이한 처리 조건의 평균 값 (+/- S.D.) 사이의 차이의 유의성은 스튜던트 t-검정을 사용하여 평가될 것이고, P 값 <0.05가 통계적으로 유의한 것으로 간주된다. 본 발명자들의 이전의 실험에 기초하여, 실험 마우스 군 사이의 차이는 클 것으로 예상된다. 따라서, 10마리의 NSG 마우스를 각각의 처리 군에 대해 사용할 것이고, 이는 처리 수단에서의 차이 사이의 비를 고려하여 양측 2 샘플 /-검정에 의해 0.05 유형 1 오차 수준에서 적어도 90% 파워를 보장할 것이고, 예상되는 표준 편차는 적어도 3이다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시될 것이다. 군 사이의 비교는 2 샘플 t-검정을 사용하여 이루어질 것이다. p < 0.05의 값이 유의한 것으로 간주된다. 종양-무함유 생존 연구를 위해, 10마리의 마우스의 군을 생존 비교에 사용할 것이고, 각각의 마우스에 대한 질환 상태 (종양 vs. 무 종양) 및 종양-무함유 시간이 기록될 것이다. 카플란-마이어 생존 곡선이 플롯팅될 것이고, 생존 곡선을 비교하기 위해 로그-순위 검정이 수행될 것이다. 유의한 수준은 0.05에서 제어된다.
실시예 8: 외투 세포 림프종에 대한 이브루티닙/CAR19 T-세포 조합 요법
본 실시예에 기재된 실험은 시험관내 및 생체내에서 외투 세포 림프종을 치료하기 위한 이브루티닙 처리와 조합된 CART19 활성을 특징화한다. 이브루티닙은 일부 혈액암의 치료에 종종 사용되는 BTK의 소분자 억제제이다. 본원에 기재된 시험관내 실험은 증식, 시토카인 생산, CD107a 탈과립화, 및 세포독성의 평가를 포함한다. 이종이식 마우스 모델을 사용하여 생체내에서 이브루티닙 처리와의 CART19의 효능 및 최적 투여량을 조사하였다. 이브루티닙이 MCL에서 상당한 활성을 나타내지만, 약 30%의 환자는 반응하지 않았고, 반응자 중 단지 21% 내지 약 1/3만이 완전 완화를 경험하였다 (Wang et al. NEJM 369.6(2013):507-16). 완전 완화의 달성은 개선된 무진행 생존과 연관된다. 게다가, 요법은 17.5개월의 중간 반응의 지속기간에 의해 약물 저항성으로 이어질 수 있다. 일부 세팅에서, BTK 결합 부위 내 또는 바로 하류의 돌연변이가 이브루티닙 요법 후에 관찰되었고, 이는 점점 빈번해질 수 있는 약물 저항성의 메카니즘을 강조한다. 예를 들어, 문헌 [Woyach et al. NEJM. 370.24(2014):2286-94]을 참조한다. 또한, BTK 기능의 차단은 B 세포 수용체 (BCR) 신호전달의 억제로 이어지고, 직접적으로 세포독성이지 않다. 예를 들어, 문헌 [Ponader et al. Blood. 119.5(2012):1182-89]을 참조한다. 세포독성의 결여 및 악성 클론 근절의 실패는 선택 압력 하에서의 클론 진화를 유발한다. 또한, CLL에 대해 이브루티닙으로 처리된 환자에서 공격성 질환으로의 증가된 변환의 예비 발견이 우려되고 있다. 예를 들어, 문헌 [Byrd et al. NEJM. 369.1(2013):32-42; 및 Parikh et al. Blood. 123.11(2014):1647-57]을 참조한다.
B-세포 특이적 CD19 항원에 대한 키메라 항원 수용체 (CAR)로 형질도입된 자가 T 세포 (CTL019, CART19)의 주입은 다양한 B-세포 신생물, 주목할 만하게는 급성 림프모구성 백혈병 (ALL)에 걸린 환자의 대부분에서 극적인 임상 반응으로 이어진다. 예를 들어, 문헌 [Maude et al. NEJM. 371.16(2014):1507-17; 및 Ruella et al. Expert Opin. Biol. Ther. (2015):1-6]을 참조한다. 림프절 덩이 또는 벌키 질환의 존재는 감소된 T 세포 침윤 및 결과적으로 감소된 항종양 활성으로 이어질 수 있다. 벌키 림프절병증은 이브루티닙에 대한 반응을 손상시키는 것으로 보이지 않는다. 문헌 [Wang et al. NEJM. 369.6(2013):507-16]. 또한, 이브루티닙은 종양 덩이를 감소시키고 말초 혈액 중 신생물성 B 세포를 이동시키는데 있어서 특정한 효능을 나타낸다.
방법
세포주 및 1차 샘플. MCL 세포주를 ATCC로부터 수득하고 (Mino, Jeko-1, SP-49), MCL-RL은 MCL 환자의 진행성 흉막 삼출로부터 생성하였다. 시험관내 실험을 위해, 세포주를 10% 소 태아 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지가 담긴 배양물 중에 유지시켰다. 일부 실험을 위해, MCL-RL 및 Jeko-1 세포를 방아벌레 녹색 루시페라제/eGFP로 형질도입한 다음, 분류하여 >99% 양성 집단을 수득하였다. 급성 백혈병 세포주 MOLM-14, K562 또는 NALM-6 및 T-ALL 세포주 JURKAT를 대조군으로서 사용하였다. 이들 세포주는 원래 ATCC로부터 수득하였다. 식별방지 1차 인간 MCL 골수 (BM) 및 말초 혈액 (PB) 시편은 펜실베니아 대학교의 임상 실시로부터 수득하였다. 모든 기능적 연구를 위해, 1차 세포를 적어도 실험 12시간 전에 해동시키고, 37℃에서 휴지시켰다.
CAR 구축물 및 CAR T 세포의 생성. 뮤린 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CD8 힌지, 41BB 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인 함유)를 이전에 기재된 바와 같이 생성하였다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al. Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 17.8(2009):1453-64]을 참조한다. CAR-발현 T 세포의 생산을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 예를 들어, 문헌 [Gill et al. Blood. 123.15(2014):2343-54]을 참조한다. 정상 공여자 CD4 및 CD8 T 세포 또는 PB 단핵 세포 (PBMC)를 펜실베니아 대학교의 인간 면역학 코어로부터 수득하였다. T 세포를 1:1의 CD4:CD8 비로 1x106개/ml로 플레이팅하고, 엑스-비보(X-vivo) 15 배지 (론자(Lonza), 04-418Q), 인간 혈청 AB 5% (게미니(Gemini), 100-512), 페니실린/스트렙토마이신 (깁코(Gibco), 15070063) 및 글루타맥스 (깁코, 35050061) 중에서, 배양의 제1일에 첨가되고 제6일에 제거되는 항-CD3/CD28 디나비즈 (라이프 테크놀로지스, 11161D)를 사용하여 확장시켰다. T 세포를 제2일에 렌티바이러스로 형질도입시켰다. T 세포를 배양물 중에서 8-15일 동안 확장시키고, 중간 세포 부피가 300 fl 미만일 때 수거하였다. 이어서 미래의 실험을 위해 T 세포를 FBS 10% DMSO 중에서 동결보존시켰다. 모든 실험 전에, T 세포를 해동시키고, 37℃에서 밤새 휴지시켰다.
이브루티닙. 이브루티닙 (PCI-32765)은 메드쿠(MedKoo) (#202171) 또는 셀렉 바이오케미칼스(Selleck Biochemicals) (#S2680)에서 분말 또는 DMSO 용액으로서 구입하였다. 시험관내 실험을 위해, 이브루티닙을 10, 100 및 1000 nM의 농도로 희석시켰다. 생체내 실험을 위해, 이브루티닙 분말을 10% HP-베타-시클로덱스트린 용액 중에 용해시키고 (1.6 mg/ml), 음용수로서 마우스에게 투여하였다.
다중파라미터 유동 세포측정 분석. 항-인간 항체를 바이오레전드(Biolegend), 이바이오사이언스(eBioscience) 또는 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)에서 구입하였다. 시험관내 배양물 또는 동물로부터 세포를 단리하고, 2% 소 태아 혈청으로 보충된 PBS 중에서 1회 세척하고, 실온에서 15분 동안 염색하였다. 세포 수 정량화를 위해, 카운트브라이트(Countbright) (인비트로젠) 비드를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 모든 분석에서, 관심 집단을 전방 vs. 측방 산란 특징에 기초하여 게이팅한 다음 단일선 게이팅하고, 살아있는 세포는 라이브 데드 아쿠아(Live Dead Aqua) (인비트로젠)를 사용하여 게이팅하였다. 품질 관리를 위해 시간 게이팅을 포함시켰다. CAR19의 표면 발현을 이전에 기재된 바와 같이 검출하였다. 예를 들어, 문헌 [Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73]을 참조한다. 유동 세포측정법을 4-레이저 포르테사-LSR 세포측정기 (벡톤-디킨슨) 상에서 수행하고, 플루우조 X 10.0.7r2 (트리 스타)에 의해 분석하였다.
탈과립화 검정. 탈과립화 검정을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 예를 들어, 문헌 [Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73]을 참조한다. T 세포를 T 세포 배지 중에서 표적 세포와 1:5 비로 인큐베이션시켰다. 항-CD107a-PECY7 (바이오레전드), 항-CD28 (비디 바이오사이언시스), 항-CD49d (비디 바이오사이언시스) 항체 및 모넨신 (비디 바이오사이언시스)을 공동-배양물에 첨가하였다. 4시간 후, 세포를 수거하고, CAR 발현, CD3, CD8 및 라이브 데드 아쿠아 염색 (인비트로젠)에 대해 염색하였다. 세포를 고정 및 투과화한 다음 (인비트로젠 Fix/Perm 완충제), 세포내 염색을 수행하여 다중 시토카인 (IFN, TNFa, IL-2, GM-CSF, MIP1b)을 검출하였다.
증식 검정. T 세포를 세척하고, 100 ul의 PBS 중에 1x107개/ml로 재현탁시키고, 100 ul의 CFSE 2.5 uM (인비트로젠)으로 37℃에서 5분 동안 염색하였다. 이어서 반응을 차가운 배지로 켄칭시키고, 세포를 3회 세척하였다. 표적을 100 Gy의 용량으로 조사하였다. T 세포를 방사선조사된 표적 세포와 1:1 비로 120시간 동안 인큐베이션하고, 24시간에 배지를 첨가하였다. 이어서 세포를 수거하고, CD3, CAR 및 라이브 데드 아쿠아 (인비트로젠)에 대해 염색하고, 절대 정량화를 위해 유동 세포측정 분석 전에 카운트브라이트 비드 (인비트로젠)를 첨가하였다.
세포독성 검정. 루시페라제/eGFP+ NALM-6 또는 RL 세포를 세포독성 검정에 이전에 기재된 바와 같이 사용하였다. 예를 들어, 문헌 [Gill et al. Blood. 123.15(2014):2343-54]을 참조한다. 표적을 이펙터 T 세포와 제시된 비로 4 또는 16시간 동안 인큐베이션하였다. 제노겐 IVIS-200 스펙트럼 카메라 상에서 생물발광 영상화에 의해 사멸을 계산하였다.
시토카인 측정. 이펙터 및 표적 세포를 1:1 비로 T 세포 배지 중에서 24시간 동안 공동-인큐베이션하였다. 상청액을 수거하고, 30-플렉스 루미넥스 어레이 (루미넥스 코포레이션(Luminex Corp), 플렉스맵(FLEXMAP) 3D)에 의해 제조업체의 프로토콜 (인비트로젠)에 따라 분석하였다. 예를 들어, 문헌 [Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73]을 참조한다.
생체내 실험. 원래 잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories)로부터 입수되는 NOD-SCID-γ 쇄-/- (NSG) 마우스를 펜실베니아 대학교의 스템 셀 앤드 제노그라프트 코어에서 구입하였다. 모든 실험은 동물 실험 윤리 위원회 (IACUC)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다. 사용된 이종이식편 모델의 개요가 본원에 논의된다. 200 ul의 PBS 중의 세포 (MCL 세포주 또는 T 세포)를 제시된 농도로 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 제노겐 IVIS-200 스펙트럼 카메라를 사용하여 생물발광 영상화를 수행하고, 리빙이미지 소프트웨어 v. 4.3.1 (캘리퍼 라이프사이언시스(Caliper LifeSciencies))에 의해 분석하였다. 실험 종료 시 또는 IACUC 프로토콜에 따라 사전-명시된 종점을 충족시킨 경우에 동물을 안락사시켰다.
면역조직화학. 레이카 결합-III 기기 상에서 결합 중합체 정밀화 검출 시스템을 사용하여 포르말린 고정 파라핀 포매된 조직의 면역조직화학적 (IHC) 염색을 수행하였다. CD3, CD4, CD8, Pax5 및 시클린D1에 대한 항체를 비희석상태로 사용하였다. ER2 용액 (레이카 마이크로시스템즈 AR9640)을 사용하여 20분 동안 열-유도 에피토프 회수를 수행하였다. 영상을 아페리오 스캔스코프(Aperio ScanScope)™를 사용하여 디지털로 획득하였다.
통계적 분석. 모든 통계는 윈도우, 버전 6.04용 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 수행하였다.
외투 세포 림프종 세포주
존재하는 대부분의 외투 세포 림프종 (MCL) 세포주는 시험관내에서 많은 세대 동안 불멸화 및 증식되어, B 세포 수용체 신호전달에 대한 그의 의존성을 상실하였다. 따라서, 이는 이브루티닙에 대해 불량한 감수성을 갖는다. 시험관내 실험을 수행하여 이브루티닙 처리에 대한 MCL 세포주의 감수성을 결정하였다. 또한 본 실시예에서 추가로 논의되는 실험에서 이들 세포주를 사용하여 이브루티닙/CART19 조합 처리의 효능을 평가하였다. 다중 재발된 MCL에 걸린 환자의 흉막 삼출로부터 MCL 세포를 수거하였다. 원래의 세포 (RL1차) 및 그로부터 유래된 세포주 (RL) 둘 다는 전형적 MCL 면역표현형인 모구성 형태학을 갖고, 형광 계내 혼성화 (FISH)에 의하면 전형적인 t(11;14) 전위에 대해 양성이었다 (도 52a, 52b, 52c).
RL 및 JEKO-1 세포를 상이한 용량의 이브루티닙 (0.1 nM, 1nM, 10nM, 100nM, 1μM, 및 10 μM)과 함께 배양하고, 생물발광 (BLI)의 감소를 측정함으로써 이브루티닙에 대한 감수성을 결정하였다. 도 31a에 제시된 바와 같이, RL 세포는 이브루티닙 처리에 대해 용량-의존성 방식으로 감수성이었다. 그러나, JEKO-1 세포는 이브루티닙 처리에 대해 저항성이었다 (증가된 이브루티닙 투여량의 함수로서 감소된 생물발광의 어떠한 증거도 없음).
RL, Jeko-1, 및 Mino 세포의 이브루티닙에 대한 감수성을 또한 MTT 검정을 사용하여 검정하였다. 시험관내에서 증가하는 농도의 이브루티닙에 대한 RL의 노출은 증식 및 하류 매개자 인산화의 용량-의존성 억제로 이어졌고, 이는 IC50 10nM으로의 이브루티닙의 온-타겟 효과를 나타낸다. 대조적으로, 확립된 MCL 세포주 Jeko-1 및 Mino는 IC50 결과가 최대 10 μM로 이브루티닙에 대해 비교적 저항성이었다 (도 52d). RL을 생체내 실험을 위한 생존 모델로서 확인하기 위해, 면역결핍 NOD-SCID-γ 쇄 녹아웃 (NSG) 마우스를 1x106개 루시페라제-발현 RL 세포로 생착시켰다 (도 52e). 그의 종양 부담 및 생존을 평가하였다. 정맥내 주사 후, 모든 마우스에서 MCL 생착되었고, 비장 및 간에 국재화된 다음, 골수, 혈액 및 림프절로 파종되었다 (도 52f). 이환된 비장 및 간의 조직학은 MCL의 실질 침윤과 일치한다 (도 52g).
이들 결과는 이들 상이한 세포주가 따라서 이브루티닙-감수성 및 이브루티닙-저항성 MCL 둘 다를 모델링하는데 사용될 수 있음을 보여주었다.
외투 세포 림프종 세포는 CART19에 의한 사멸에 감수성이다
CART19의 효능을 보여주는 대부분의 전임상 작업은 이브루티닙에 대해 감수성이지 않은 B-ALL 세포주를 사용하여 이루어졌다. 게다가, 지금까지 최상 임상 반응은 B-ALL에 걸린 환자에서 보고된 반면에, 무통성 B-세포 악성종양에 걸린 환자는 보고된 바로는 보다 낮은 반응을 갖는다
MCL이 이 모델에서 CART19에 의한 사멸에 감수성인지를 보여주기 위해, 건강한 공여자 T 세포를 임상 시험에 사용된 항-CD19 CAR 구축물로 형질도입시켰다. 예를 들어, 문헌 [Porter, NEJM 2011]을 참조한다. 일련의 시험관내 실험을 수행하여 이브루티닙-감수성 세포주 RL 및 이브루티닙-저항성 세포주 Jeko-1이 동등한 CART-19 탈과립화, 시토카인 생산, 사멸 및 증식으로 이어짐을 보여주었다 (도 53a, 53b, 53c, 53d). 또한, 백혈병성 상의 MCL에 걸린 2명의 환자로부터 말초 혈액 또는 골수를 수득하여, 항-CD19 CAR에 의한 자가 T 세포의 확장 및 형질도입을 허용하였다. 자가 환자-유래 CART19 세포는 MCL과 반응성인 반면에, 비형질도입된 T 세포는 그의 각각의 자가 MCL과 비반응성이었다 (도 53e, 53f). 이들 결과는 MCL가 CART19의 이펙터 기능에 감수성임을 나타낸다.
시험관내 이브루티닙/CART19 처리의 평가
T 세포에 대한 이브루티닙의 효과를 문헌 [Honigberg et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107(2010):13075-80]에 기재된 바와 같이 단기간 활성 검정에 기초하여 사전에 참작하였다. 이후에, Th2-유형 분극을 억제하는 것에 의한 CD4 T 세포에 대한 이브루티닙의 면역조정 역할을 지지하는 T 세포 키나제 ITK에 대한 이브루티닙의 효과의 분석이 보고되었다. 문헌 [Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49]을 참조한다. 여러 군에 의해 CART19로 처리된 환자의 시토카인 분석은 CART19 요법이 Th1 (IL2, IFNγ, TNF), Th2 (IL-4, IL-5, IL-10) 및 다른 시토카인 둘 다와 연관됨을 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Kalos et al. Science Translational Medicine 3.95(2011):95ra73] 참조). 이 실시예에서, CART19 기능의 효과는 환자에서 예상되는 이브루티닙 농도, 그 초과, 및 그 미만의 이브루티닙에 의해 평가되었다 (혈청 중 평균 피크 농도 100-150ng/ml). 문헌 [Advani et al. J. Clin. Oncol. 2013;31:88]을 참조한다.
CART19 세포는 ITK를 함유하는 것으로 발견되었다. 이브루티닙의 존재 하에 TCR을 통한 CART19 세포의 비-특이적 자극은 CD4+ T 세포에 대해 이전에 보고된 바와 같은 인산화된 ITK (pITK-Y180)의 감소로 이어졌다. 문헌 [Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49]을 참조한다. 대조적으로, CAR을 통한 CART19 세포의 특이적 자극은 감소된 ITK 활성화로 이어지지 않았다 (도 54a). 이러한 관찰은 CART19 기능이 이브루티닙에 대한 노출에 의해 유해하게 영향받지 않을 것임을 나타낸다.
또한, 이브루티닙의 존재 하에서의 CART19 세포의 단기간 및 장기간 시험관내 기능을 결정하였다. 생리학적 농도 초과에서 아마도 비-특이적 독성을 나타내는 CART19 세포 기능의 억제가 존재하였지만; 임상적으로 적절한 농도의 이브루티닙은 CART19 세포 증식, 탈과립화 또는 시토카인 생산을 손상시키지 않았다 (도 54b, 54c, 10b).
특히, 정상 건강한 공여자로부터 단리된 PBMC를 상기 기재된 바와 같이 렌티바이러스 항-CD19 CAR 구축물로 형질도입시켰다. 생성된 CAR19-발현 T 세포 (CART19)를 배양하고, 계대배양하여 증식 및 확장 능력을 결정하였다. 1:1 비의 CD4:CD8 발현 T 세포를 상이한 농도의 이브루티닙 (10nM, 100nM, 및 1000 nM 이브루티닙)의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. 각각의 세포 계대에 이브루티닙을 첨가하였다. 세포의 수를 제0일, 제5일, 제6일, 제7일, 제9일, 및 제10일에 카운팅하였다 (도 9a). 또한 세포 부피를 모니터링하였다 (도 9b).
또한 CFSE-염색 및 유동 세포측정 분석을 사용하여 이브루티닙의 존재 하에 종양 세포주 MOLM14, JEKO-1, 및 RL에 의한 자극 후 CART19 세포의 증식을 평가하였다. MOLM14는 AML 세포주이고, JEKO-1 및 RL은 외투 세포 림프종 세포주이다. 구체적으로, RL 세포는 재발성 MCL 환자의 흉막 삼출로부터 수득된 신생물성 B-세포로부터 유래된 신규 MCL 세포주이다. CART19 세포 및 종양 세포를 1:1 비로 혼합하고, 5일에 걸쳐 증식을 평가하였다. 증식하는 세포의 백분율을 도 10a의 각각의 히스토그램에 지정하였다. 도 10b에 제시된 바와 같은 증식의 정량화는 고용량의 이브루티닙이 MCL 세포주와의 공동-배양 동안 CART 19 세포 증식을 억제할 수 있음을 보여준다.
T 세포의 탈과립화는 세포용해 T 세포의 활성화 및 항원-특이적 세포독성을 개시하는 능력을 나타낸다. CD107a는 T 세포 자극 후 세포 표면 상에서 일시적으로 발현된 T 세포의 탈과립화의 기능적 마커이다. 유동 세포측정 분석을 사용하여 종양 세포주 MOLM14, JEKO-1, 및 RL에 의한 자극 후 CD107a-발현 CART19 T 세포를 정량화하였다. CD107a-발현 세포는 도 11a에 제시된 세포 프로파일의 Q2 (4분면 2)에 존재하였다. 도 11a의 프로파일로부터 수득된 결과의 정량화를 도 11b에 제시한다. 이들 결과는 CART19 세포의 MCL-RL 또는 JEKO-1과의 공동-배양이 대량의 CAR-특이적 CD107a 탈과립화로 이어짐을 나타낸다.
이브루티닙의 존재 하에서의 CART19 T 세포에 의한 시토카인 생산을 또한 상이한 종양 세포주에 의한 자극 후에 정량화하였다. IL-2, TNF-α, 및 IFN-γ 생산을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 시토카인을 생산하는 세포는 도 12, 도 13, 및 도 14에 제시된 프로파일의 4분면 2에 존재한다. JEKO-1 및 RL에 의해 자극된 CART19 T 세포는 시토카인 발현에서 증가를 보였다. 또한, 증가하는 농도의 이브루티닙 처리는 CART19 시토카인-생산 세포의 백분율에 영향을 미치지 않았다.
종양 세포에 의한 자극 후 및 다양한 농도의 이브루티닙의 존재 하에서의 CART19 세포로부터의 시토카인 분비를 30-플렉스 루미넥스 검정에 의해 분석하였다. TH1 세포, 예컨대 IL-2, IFN-γ, 및 TNF-α에 의해 분비된 시토카인을 검정하였다. IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-15, IL-17, MIP1a, GM-CSF, MIP-1b, CP-1, IL-1Ra, IL-7, IP-10, IL-1b, VEGF, G-CSF, EGF, HGF, IFNa, IL-12, RANTES, 에오탁신, IL-2R, MIG, 및 IL-8을 비롯한, TH2 세포에 의해 분비된 시토카인을 검정하였다. 도 15에 제시된 바와 같이, TH1 및 TH2 시토카인이 CART19 T 세포에 의해 분비되었다.
또한, 2종의 상이한 기술을 사용한 실험은 이브루티닙-노출 및 이브루티닙-비노출 CART19 세포 사이에 Th1/Th2 분극에서 어떠한 차이도 없음을 나타내었다 (도 54d).
CART19 세포에 의한 MCL 세포의 사멸이 이브루티닙의 존재 하에 증대되었고, 이는 조합으로부터의 적어도 상가적 효과를 시사한다 (도 54e). 그러나, CART19 세포의 고유 세포독성 기능은 이브루티닙의 존재 하에 증대되지 않았다. (도 54f).
추가의 생물발광 검정을 수행하여 종양 세포의 CART19 세포 사멸을 평가하였다. CART19 세포를 다양한 비, 예컨대 1:1; 1:0.5; 1:0.25; 및 1:0의 루시페라제 리포터를 보유하는 종양 세포 MOLM14, JEKO-1, 및 RL과 함께 96 웰 플레이트에 2중으로 플레이팅하였다. 24시간 후, 생물발광을 검출 및 정량화하였다. 결과는 MOLM14 샘플에서의 생물발광이 CART19 세포와의 인큐베이션 후에 감소되지 않음을 나타내었다. 그러나, JEKO-1 및 RL 세포의 경우에, 생물발광은 CART19 세포의 존재 하에 감소되었고, 이는 CART19 세포가 JEKO-1 및 RL 세포 사멸을 매개함을 나타낸다 (도 16a, 16b, 16c, 16d, 16e, 및 16f). 이브루티닙으로 처리한 경우에 생물발광에서 추가의 감소가 존재하였고, 이는 이브루티닙 및 CART19의 조합이 CART19 처리 단독보다 증가된 JEKO-1 및 RL 세포 사멸을 유발함을 나타낸다. 이들 결과와 일치하여, 각각의 처리 후 총 세포의 계산은 JEKO-1 및 RL 세포의 CART19 처리가 세포 수에서의 감소를 유발하고, CART19 및 이브루티닙으로 처리한 경우에 추가의 감소를 유발함을 나타내었고 (도 17b 및 17c), 이는 조합 요법이 MCL 세포를 사멸시키는데 효과적일 뿐만 아니라, MCL 세포주의 효율적인 사멸로 이어짐을 시사한다.
생체내 이브루티닙/CART19 처리의 평가
이들 실험에서, 외투 세포 림프종의 마우스 모델을 사용하여 생체내 CART19 및 이브루티닙 조합 요법을 평가하였다.
도 20, 55, 및 5a에 제시된 것과 같은 개요를 본 실시예에 사용하였다. 도 20은 MCL의 생체내 마우스 모델에서 CART19/이브루티닙 조합 요법을 시험하는 것의 개요를 보여준다. RL (MCL-3), JEKO-1 (MCL-4), 및 NALM6 (MCL-5) 세포주로부터의 1x106개의 세포를 NSG 마우스 (각각의 실험에 대해 20마리의 마우스)에 주사하였다. 생착되도록 하는 1주 후, 제0일에 처리를 개시하였고, 여기서 처리는 0.5-1x106개의 CART19 세포 (주사를 통함), 25 mg/kg/일 이브루티닙 (경구 위관영양), 또는 CART19 + 이브루티닙 처리이다. 제7일, 제14일, 제21일, 및 제28일에, 생물발광을 영상화하여 종양 크기를 모니터링하였다. 이브루티닙 처리를 제공받은 마우스를 이브루티닙으로 계속 처리하였다. 마우스의 생존을 또한 모니터링하였다. 도 55 및 56은 MCL의 생체내 마우스 모델에서 CART19/이브루티닙 조합 요법을 시험하는 것의 추가의 개요를 보여준다. 2 x 106개의 MCL-RL 세포를 NSG 마우스에 주사하였다. 생착되도록 하는 1주 후 (생착은 생물발광 영상화에 의해 확인됨), 제7일에 처리를 개시하였고 (MCL-RL 세포 주사 후), 여기서 처리는 비히클 대조군, CART19 세포 (2 x 106개 세포), 및/또는 이브루티닙 (125 mg/kg/일)이다. 제14일, 제21일, 제28일, 및 제35일 (MCL-RL 세포의 주사 후)에, 생물발광을 영상화하여 종양 크기를 모니터링하였다.
MCL의 생체내 마우스 모델에 대한 이브루티닙 처리 단독의 효과를 검사하였다. GFP/루시페라제 유전자로 형질감염된 RL 세포를 면역결핍 NSG 마우스에 정맥내로 주사하였고, 이는 간 및 비장에서 100% MCL 생착을 발생시키고, 궁극적으로 림프절 및 골수로 확산된다. 마우스를 다양한 용량의 이브루티닙, 25 mg/kg/일 및 250 mg/kg/일로 처리하였다. 종양 성장을 나타내는 평균 생물발광을 다양한 시점에 평가하였다. 도 32에 제시된 바와 같이, RL-유래 종양은 용량-관련 감수성을 입증하였다. RL 세포-함유 마우스에서 이브루티닙 용량을 적정하는 추가의 실험을 수행하였고, 도 57에 제시한다. 보다 높은 용량의 이브루티닙이 MCL에 대한 임상에서 사용된 것과 일치하여, 보다 높은 용량은 독성을 증가시키지 않으면서 보다 우수한 항종양 활성으로 이어졌다 (Wang et al. NEJM 369.6(2013):507-16).
CART19 용량 설정을 또한 수행하였다. GFP-루시페라제 리포터를 보유하는 2종의 MCL 세포주, RL (MCL-1) 및 JEKO-1 (MCL-2)을 제0일에 NSG 마우스에 주사하였다. CART19 T 세포를 제7일에 다양한 투여량으로, 예를 들어 0.5 x e6개 세포, 1 x e6개 세포, 또는 2 x e6개 세포로 주사하였다. 마우스를, 예를 들어 100일 동안 모니터링하였다. 다양한 시점에, 마우스를 종양 크기에 대해 (예를 들어, 생물발광 영상화) (도 18a 및 18b, 및 도 19a), 및 전체 생존에 대해 (예를 들어, 카플란-마이어 생존 곡선) (도 18c 및 도 19b) 모니터링하였다. 상이한 용량의 CART19 세포가 용량-의존성 항종양 효능을 나타내었고, 2 x 106개 CART19 세포/마우스가 가장 유효한 용량이었다 (도 19a).
이들 연구는 MCL에 대한 요법 중 2종의 헤드-투-헤드 비교를 수행하기 위한 기회를 제공하였다. 도 58에 제시된 바와 같이, 장기간 생존은 CART-19 세포로 처리된 마우스에서만 달성되었다. 비형질도입된 T 세포 플러스 이브루티닙과 이브루티닙 단독을 비교한 경우에 항종양 효과에서 어떠한 차이도 존재하지 않았다. 따라서, 모든 후속 실험에서, 대조군은 비히클 및 이브루티닙 단독이다 (도 59).
도 56의 개요에 상세화된 바와 같이 이브루티닙에의 CART19의 첨가를 또한 시험하였다. 종양 부담에 대한 이브루티닙의 효과의 평가는 초기 시점에 적당히 지연된 종양 성장을 나타내었다. 대조적으로, CART19 세포 요법은 수주 동안의 종양 부담의 분명한 감소로 이어졌다. CART19 세포를 단독으로 제공받은 마우스에서, 이어서 무통성 재발이 제40일에 시작된 반면에, CART19 세포 뿐만 아니라 이브루티닙으로 처리된 마우스는 제80일까지 어떠한 검출가능한 질환도 갖지 않았다 (도 60). 실험의 종료 시 수거된 기관의 조직병리학은 모든 대조군 및 이브루티닙 처리된 마우스에서 질환의 지속을 나타내었고, 이브루티닙-처리된 것에서 종양 괴사의 병소가 존재하였다. CART19 단독으로 처리된 대부분의 마우스는 CART19 세포의 지속을 동반한 장기간의 무통성 재발을 나타낸 반면에, CART19-이브루티닙으로 처리된 마우스는 관여 기관으로부터의 종양의 클리어런스 및 CART19의 소멸을 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음).
CART19 및 이브루티닙의 조합 효과의 메카니즘
본원의 시험관내 실험은 이브루티닙이 단기간 CART19 이펙터 기능을 손상시키거나 분명하게 증대시키지 않음을 나타내었다. 생체내 연구는 이브루티닙 단독요법이 중간 정도의 항종양 효과를 가짐을 나타내었다. 결과는 이브루티닙이 CART19 세포의 항종양 기능을 유의하게 증진시킬 수 있음을 나타내었다 (도 60). 따라서, 이러한 효과에 대한 메카니즘을 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
ITK의 억제는 Th1 표현형으로의 Th2 분극화 및 편향을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49). CART19 세포 및 이브루티닙으로 처리된 마우스에서, CART19 세포 단독요법과 비교할 경우에, Th1 세포의 증가는 본 검정을 사용하여 관찰되지 않았다 (도 61a, 61b). 그러나, 이브루티닙에 대한 마우스의 노출은 말초 CART19 세포의 증가로 이어졌다. 처리군 및 대조군 사이에 증식 마커 Ki67에서 어떠한 차이도 존재하지 않았고 (도 61c), 따라서 본 검정은 증식에서의 차이를 검출하지 못했다. 유사하게, 항아폽토시스 마커 Bcl2 또는 아폽토시스 마커 포스포티딜 세린에 어떠한 차이도 존재하지 않았고, 이는 CART 세포 수에서의 차이가 아폽토시스의 손상과 관련되지 않음을을 시사한다 (도 61d). 이브루티닙이 환자에서의 말초 림프구증가증과 연관되기 때문에, 이것이 이브루티닙 단독으로 처리된 마우스에서도 또한 발견되는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 이브루티닙 개시 1주 후, 이브루티닙-처리된 마우스에서 보다 많은 순환 MCL 세포 및 보다 적은 결절/기관 MCL 세포가 존재하였다. 흥미롭게도, 이는 급성 백혈병 세포주 NALM-6으로 생착된 NSG 마우스에서도 관찰되었기 때문에 (데이터는 제시되지 않음), 이러한 증가는 이브루티닙-감수성 및 -저항성 생체내 모델 둘 다에서 관찰되었다.
생체내 T 세포 확장에서 이브루티닙의 역할을 이해하기 위해, 본 발명자들은 NSG 마우스를 MCL-RL WT 세포로 생착시키고, 이를 루시페라제-양성 T 세포로 처리하였다. CTL019 및 CTL019-이브루티닙 둘 다로 처리된 마우스는 UTD 또는 UTD-이브루티닙과 비교하여 강한 T 세포 확장을 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음). 이어서 본 발명자들은 생체내에서 상이한 T 세포 하위세트의 빈도를 조사하였고, T 세포 주입 1주 후에 PB T 세포에서 차이는 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). CXCR4가 인간에서 이브루티닙-유도 B 세포 가동화에 관여하기 때문에, 본 발명자들은 CTL019 또는 CTL019-이브루티닙으로 처리된 마우스의 PB T 세포에서 생체내 CXCR4의 발현을 체크하였고: CXCR4 수준은 2개의 군에서 유사하였다 (데이터는 제시되지 않음). 마지막으로, CART19 및 CART19-이브루티닙으로 처리된 마우스의 T 세포의 PB 상에서의 억제/공동자극 수용체의 발현을 분석하였다. TIM3, LAG3, CD137 또는 CTLA4의 발현에서는 어떠한 차이도 증명되지 않았지만, 감소된 PD-1 발현으로의 경향이 이브루티닙과 조합되어 CTL019 및 UTD로 처리된 마우스에서 나타났다.
결론
B-세포 악성종양에 대한 요법은 BCR 신호전달의 소분자 억제제 및 CD19-지시된 T 세포 기반 요법을 포함한다. 재발성 MCL의 세팅에서, BTK 억제제 이브루티닙이 현재 FDA에 의한 승인을 받았고, 이는 높은 초기 반응률을 발생시킨다. 불행하게도, 이들 반응은 일시적인 경향이 있고, CLL에 사용되는 것보다 높은 약물 용량을 필요로 한다. CART-19는 고-위험 B-ALL에 걸린 환자에서 지속적인 반응으로 이어지고, 뿐만 아니라 다른 B-세포 악성종양에서 효과적일 수 있다. 예비 데이터는 CART-19에 대한 성숙 B-세포 악성종양의 반응이 B-ALL의 그것보다 낮을 수 있지만, 이러한 불일치 메카니즘은 아직 확인되지 않았음을 시사한다. 본 실시예는 MCL의 치료에서의 CART19에 이브루티닙을 첨가한 것의 영향을 조사하였다.
이브루티닙에 대해 가변적인 감수성을 갖는 상이한 MCL 세포주 (IC50 범위가 10 nM 내지 10 μM)를 시험관내 실험에 사용하였다. 이들 상이한 세포주를 사용하여 이브루티닙-감수성 및 이브루티닙-저항성 MCL 둘 다를 모델링하였다. 거의 최고 용량의 이브루티닙에서, CART19 세포 기능은 손상되지 않았고, 무손상 T 세포 확장 동역학, 종양 인식 및 사멸, 및 시토카인 생산을 보유하였다. 게다가, 결과는 이브루티닙 노출 시 T 헬퍼 분극을 밝혀내지 못했다. 이러한 발견은, 문헌 [Dubovksy et al. Blood 122.15(2013):2539-49]에서 수행된 CD4-단독 실험 모델과 대조적으로, CD4 및 CD8 세포의 혼합 배양의 사용을 비롯한 인자의 조합으로 인한 것일 수 있다. 이브루티닙-감수성 및 이브루티닙-저항성 세포주 둘 다는 CART19 세포를 강력하게 활성화시켰고, 사멸, 시토카인 생산 및 증식을 유도하였다. 시험관내 CART19 및 이브루티닙의 조합은 적어도 상가적 종양 사멸로 이어졌다. 본 실시예에서의 결과는 각각이 임상적으로 적절한 용량 및 투여 스케줄 (CART19의 경우에 단일 용량, 이브루티닙의 경우에 연속 투여)로 단독요법으로서 사용된 경우의 이브루티닙보다 CART19의 우월함을 보여준다.
실험실에서 생성한 MCL-RL 세포주를 사용하여, 본 실시예에서 또한 전신 이종이식편 MCL 모델을 생성하였다. 상이한 용량의 동종 CAR19 T 세포에 의한 이들 마우스의 처리는 용량 의존성 항종양 효과로 이어졌다. CART-19에 대한 유사한 용량 반응이 또한 이브루티닙 저항성 JEKO-1 세포주에서 관찰되었다. MCL-RL를 상이한 용량 (예를 들어, 0, 25 및 125 mg/kg/일)의 이브루티닙으로 생체내 처리하였고, 이는 각각 70, 81 및 100일의 중간 전체 생존으로 이어졌다 (p<0.001). 이브루티닙 125mg/kg 및 CART19의 직접 생체내 비교는 CART19 처리된 마우스에 대해 유의하게 개선된 종양 제어를 보여주었다. 또한, MCL-RL 생착된 마우스를 비히클, 이브루티닙, CART19 또는 CART19 및 이브루티닙의 조합 (iCART19)으로 처리하였다. 임상적으로 적절한 용량에서, CART19에 의한 단독요법의 MCL은 이브루티닙에 의한 단독요법보다 뛰어났고, 이브루티닙과 CART19의 조합은 증대된 항종양 효과로 이어졌다. 특히, 생체내 iCART19 조합은 CART19 세포의 초기 보다 높은 순환 수준에 이어 심층 종양 반응으로 이어졌고, 이브루티닙을 CART19에 첨가한 경우에 재발이 유의하게 지연되었다. iCART19 조합은 개선된 종양 제어를 발생시켰고, 마우스의 80%가 완전 완화 및 장기간 무질환 생존에 이르렀다. 기계론적으로, 이브루티닙으로 처리된 마우스는 Th1/Th2 또는 기억 표현형에서의 변화 없이 보다 많은 수의 CART19 세포를 가졌다. 따라서, 본원의 결과는 이브루티닙이 합리적인 방식으로 CART19와 조합될 수 있음을 나타내고, 각각의 이들 요법의 특성은 다른 것의 결핍을 보상하여 증진된 장기간의 항종양 효과로 이어질 수 있음을 시사한다. BCR 신호전달 억제를 항-CD19 지시된 T 세포 요법과 조합하는 실험 및 그의 결과는 B 세포 악성종양에 대한 비-교차저항성 요법의 합리적인 조합에 대한 길을 열었다.
종양 반응 및 재발의 동역학은 이브루티닙이 CTL019 단독에 의해 달성되는 초기 반응을 심층화하거나, 또는 CTL019 세포의 장기간의 면역감시 능력을 증진시키는 기능을 함을 시사한다.
실시예 9: 만성 림프구성 백혈병에 대한 이브루티닙/CAR19 T-세포 조합 요법
이브루티닙은 또한 만성 림프구성 백혈병 (CLL)의 치료를 위해 사용된다. 이브루티닙은 T 세포 또는 NK 세포에 대한 세포독성 효과가 입증되지 않았다. 그러나, CLL 세포에서, 이브루티닙은 프로그램화된 세포 사멸을 촉진하고, 종양 세포 이동 및 부착을 억제한다. 본 실시예에서, 1) 이브루티닙 요법을 거친 환자로부터의 CART19 생산에 대한 이브루티닙의 효과; 및 2) 최적 생체내 기능을 위한 CART19와 조합된 이브루티닙을 사용한 치료의 최적 시점을 검사하기 위해 실험을 수행하였다.
CART19 생산 및 기능에 대한 이브루티닙의 효과
정상 공여자 PBMC를 본원, 예를 들어 실시예 6에 기재된 바와 같은 분리반출술을 사용하여 수득하였다. PBMC를 5 μM의 이브루티닙과 함께 30분 동안 인큐베이션하거나, 또는 비처리로 둔 다음 (대조군의 경우), 세포를 2회 세척하였다. 이어서 본원, 예를 들어 실시예 4에 기재된 방법을 사용하여 세포를 CAR19를 함유하는 렌티바이러스 구축물로 형질도입시켜 CART19 T 세포를 생성하였다. FACs 분석을 수행하여 이브루티닙-처리된 PBMC로부터 생성된 CART19 T 세포의 수를 비처리 PBMC와 비교하여 결정하였다. 도 21에 제시된 바와 같이, 형질도입된 이브루티닙-처리된 PBMC의 15%가 CAR19를 발현하였고, 형질도입된 미처리 PBMC의 12%가 CAR19를 발현하였다. 이들 결과는 이브루티닙 처리가 렌티바이러스 형질도입 효율 또는 CART19 T 세포 생산에 영향을 미치지 않음을 입증한다. 따라서, CART19 T 세포를 이브루티닙 처리를 거친 CLL 환자로부터 제조할 수 있다.
추가의 시험관내 분석을 수행하여 CART19 T 세포 증식, CART19 세포독성, 및 TH1:TH2 시토카인 생산의 비에 대한 이브루티닙의 효과를 결정하였다.
세포 증식을 측정하기 위해, 증식 중인 세포의 검출을 위한 CFSE로 세포를 염색하고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 FACS에 의해 분석하였다. CART19 T 세포를 다양한 농도의 이브루티닙 (0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 및 5 μM)과 함께 인큐베이션하고, CD3/CD28 비드로 자극하거나 또는 비자극인 채로 두었다. 도 22에서, 이브루티닙 각각의 농도에서 비자극 대 CD3/CD28 자극된 CART19 T 세포를 비교하기 위해 히스토그램을 오버레이시켰다. 이브루티닙 각각의 농도에 대해, CD3/CD28-자극된 T 세포 증식이 관찰되었고, 그에 의해 이브루티닙 처리가 CART19 세포 증식에 영향을 미치지 않음이 입증되었다.
또한, 실시예 4에 기재된 방법을 사용하여 CART19 T 세포의 세포독성에 대한 이브루티닙의 효과를 평가하였다. 비형질도입 및 CAR19-형질도입된 T 세포를 배지, DMSO, 또는 1μM 이브루티닙으로 처리하였다. CD19-발현 표적 세포에 대한 특이적 세포독성 활성을 결정하기 위해 이펙터 CART19 세포 (배지, DMSO, 또는 이브루티닙-처리됨)에 의해 이펙터 대 표적 (E;T) 비를 적정하는 것을 사용하여 유동-기반 사멸 검정을 수행하였다. 도 23에 제시된 바와 같이, 이브루티닙으로 처리된 CART19 T 세포는 대조군 (배지 또는 DMSO로 처리된 CART19 T 세포)과 동일한 백분율의 CD19-발현 표적 세포에 대한 특이적 세포독성 활성을 입증하였다. 따라서, 이브루티닙 처리는 CART19 세포독성에 영향을 미치지 않는다.
이브루티닙 처리는 TH2 활성화를 제한할 수 있고, 따라서 인간 CLL 환자에서 T 세포에서의 TH1 선택 압력을 촉진하고 TH1/TH2 시토카인으로 편향시킬 수 있다. 이브루티닙 또는 DMSO (대조군)의 존재 또는 부재하에서의 TH1 및 TH2 시토카인 생산을 측정하기 위해 검정을 수행하였다. 도 24에 제시된 바와 같이, 이브루티닙은 CART 19 세포에서 TH1 및 TH2 시토카인의 편향을 촉진하지 않는다.
생체내 이브루티닙/CART19 조합 치료의 효능
CART19 기능을 생체내 마우스 모델에서 평가하였다. Nalm/6 세포 (인간 급성 림프모구성 백혈병 세포주)를 NSG 마우스에 이식하고, 마우스를 적어도 50일 동안 매일 모니터링하였다. Nalm/6 종양 모델은 이브루티닙에 대해 감수성이지 않은 종양을 생산하고, 따라서 종양 부피 감소/암 치료에 있어서의 생체내 CART19 기능 및 효능의 분석을 가능하게 한다. 제7일에 시작하여, 마우스에게 DMSO (대조군) 또는 이브루티닙을 매일 경구 위관영양에 의해 투여하였다. CART19를 제7일 또는 제9일에 투여하거나, 또는 마우스를 비처리로 두었다 (대조군). 제4일, 제11일, 제18일, 제25일 및 제32일에, 마우스 내에서 순환하는 Nalm/6 세포의 수를, 예를 들어 말초 혈액 FACS 분석에 의해 측정하여 이브루티닙의 존재 또는 부재 하에 Nalm/6 세포를 제거하는 것에 대한 CART19의 효능을 결정하였다. 예를 들어, 세포를 항-인간 CD19 항체로 염색하여 종양-보유 NSG 마우스의 혈액 중 인간 CD19+ (Nalm/6) 세포의 퍼센트를 결정하였다.
도 25a에 제시된 바와 같이, CART19 주사를 제공받지 않은 마우스는 종양 Nalm/6 세포의 증가를 나타내었다. 그러나, DMSO의 매일 투여와 조합된 CART19 주사를 제공받은 마우스는 Nalm/6 세포의 성공적인 제거 (감소)를 나타내었다. 이브루티닙의 매일 투여와 조합된 CART19 주사를 제공받은 마우스도 또한 DMSO 처리를 제공받은 마우스와 동일한 동역학 및 효능으로 Nalm/6 세포의 성공적인 제거를 나타내었다. 따라서, 이들 결과는 이브루티닙 처리가 이러한 종양 모델에서 Nalm/6 세포를 제거하는 CART19 기능을 손상시키지 않음을 입증한다.
마우스의 건강 상태를 Nalm/6 세포의 주사 후 적어도 50일 동안 모니터링하였다. 도 25b의 카플란-마이어 생존 곡선은 비처리 (CART19 T 세포를 제공받지 않음) 및 DMSO 또는 이브루티닙을 제공받은 어떠한 마우스도 Nalm/6 세포의 주사 후 30일을 초과하여 생존하지 못함을 보여준다. 그러나, DMSO와 함께 또는 이브루티닙과 함께 CART19 T 세포를 사용한 치료는 마우스의 생존을 증가시켰다. 따라서, 이들 결과는 도 13a로부터의 종양 부담 결과와 더불어, 이브루티닙 처리가 생체내 NSG-Nalm/6 종양 모델로부터 종양 세포를 제거하는 CART19 기능을 손상시키지 않음을 입증한다.
CLL 환자에서의 이브루티닙/CART19 조합 처리의 최적 시점
1년 동안 이브루티닙 처리를 거친 CLL 환자로부터의 샘플을 사용하여 CART19의 투여를 위한 CLL의 이브루티닙 처리 동안의 최적 시점을 평가하였다. 9명의 CLL 환자 (환자 111330026, 환자 111330030, 환자 111330039, 환자 111330056, 환자 111330073, 환자 111330074, 환자 111330081, 환자 111330086, 및 환자 111330111)로부터의 PBMC 샘플을 이브루티닙 처리의 상이한 사이클에 단리하고, CART19 T 세포를 제조하는데 사용하였다. PBMC 샘플을 이브루티닙 처리 전에 수집하여 기준선을 확립한 다음, 이브루티닙 처리 동안 사이클 2, 제1일 및 사이클 12, 제1일에 수집하였다. CART19 제조의 여러 상이한 파라미터, 예컨대 형질도입, 증식, 세포독성, 및 시토카인 생산을 평가하였다. 다른 평가는 생체외 면역표현형결정, 예컨대 기억, 억제 분자, 및 소진의 평가를 포함할 수 있다.
도 26은 환자 111330030으로부터의 T 세포의 CAR19 형질도입으로부터의 유동 세포측정 분석 결과를 보여주고, 이는 CAR 형질도입 후 다른 8명의 환자로부터 수득된 결과를 대표한다. PBMC를 환자로부터 제시된 시점 (기준선, 예를 들어 처리 전; 사이클 2, 제1일; 및 사이클 12, 제1일)에 수집하고, 예를 들어 실시예 4에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 CAR19를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 이어서 형질도입된 PBMC를 아넥신, CD3, CD4, 및 GAM (CAR을 검출하기 위함)에 대해 염색한 다음, FACS 분석에 의해 분석하였다. 도 14의 그래프에서 박스표시된 영역은 GAM 양성, 및 CART19 T 세포로 성공적으로 형질도입된 세포의 백분율을 보여준다. 하부 3개의 그래프는 CAR19가 기준선에서 세포의 약 23%, 사이클 2, 제1일에서 세포의 28%, 및 사이클 12, 제1일에서 세포의 44% 내에 성공적으로 형질도입되었음을 보여준다.
다음으로, CART19 세포 또는 비형질도입된 세포 (대조군)의 증식률 (또는 집단 배가)을 12일 동안 각각의 시점 (기준선, 사이클 2, 제1일 및 사이클 12, 제1일)에 평가하였다. 도 27은 3명의 환자, 환자 111330039 (#39), 환자 111330026 (#26), 및 환자 111330030 (#30)에 대한 12일에 걸친 집단 배가의 그래프 표현을 보여준다. 이들 결과는 증식률과 관련하여 사이클 2, 제1일과 사이클 12, 제1일 사이, 또는 사이클 2, 제1일 및 사이클 12, 제1일에 단리된 PBMC가 CAR 형질도입을 위해 바람직함을 나타낸다.
CART19 기능에 영향을 미치는 이브루티닙 처리에 대한 잠재적 메카니즘
CART19 기능에 영향을 미칠 수 있는 이브루티닙 처리의 다양한 메카니즘을 CLL 환자 샘플로부터 평가하였다.
CD19-발현 (CD19+) 세포의 분석을 FACS 분석에 의해 평가하였다. 이브루티닙 처리를 거친 CLL 환자로부터의 PBMC를 기준선 (이브루티닙 처리 전), 사이클 2, 제1일 및 사이클 12, 제1일에 단리하고, 이어서 CD19에 대해 염색하였다. FACS 분석은 이브루티닙이 CD19-발현 세포의 감소를 유발함을 보여주었다 (도 28a, 도 28b, 및 도 28c). 따라서, 이들 결과는 이브루티닙 처리가 림프구증가증을 유도함을 나타낸다.
추가의 분석을 수행하여 이브루티닙 처리 동안의 시간에 걸친 종양 세포 상에서의 CD200 발현을 검사하였다. 면역-억제 분자 CD200은 1차 B 세포 CLL 종양 세포 상에서 상향-조절된다. CD200은 그의 수용체, CD200R에 결합하고, 이는 단핵구/대식세포 계열의 세포 상 및 T 림프구 상에서 발현된다. CD200과 그의 수용체의 상호작용은 대식세포 계열에 억제 신호를 전달하여 시토카인 프로파일을 TH1에서 TH2로 변경시키고, 조절 T 세포의 유도를 발생시킨다. 기준선 (스크리닝), 사이클 2, 제1일 및 사이클 12, 제1일의 환자 111330030, 111330026, 및 111330039로부터의 샘플을 아넥신, CD19 (CD19-발현 종양 세포에 대한 분류를 위함), 및 CD200에 대해 염색하고, FACS에 의해 분석하였다. 각각의 시점으로부터 종양 세포 상에서의 CD200 발현을 검출한 히스토그램을 각각의 환자에 대해 오버레이시켰다 (도 29a, 29b, 및 29c). 일반적으로, 종양 세포 상에서의 CD200 발현은 이브루티닙 처리 동안 시간에 걸쳐 감소하였다.
이브루티닙 처리 동안의 PD1-발현 T 세포의 빈도를 또한 평가하였다. 환자로부터의 샘플을 기준선, 사이클 2, 제1일 및 사이클 12, 제1일에 수득하고, 아넥신, CD3, CD8, 및 PD1로 염색하였다. 아넥신에 대해 음성 및 CD3에 대해 양성인 세포를 CD8 및 PD1 발현에 대해 분석하였다. CD8 및 PD1을 발현하는 세포를 도 30a, 30b, 및 30c에서 박스로 나타내었다. 기준선 (도 30a), 사이클 2, 제1일 (도 30b), 및 사이클 12, 제1일 (도 30c)에서의 세포의 FACS 프로파일의 비교는 이브루티닙 처리가 시간에 걸쳐 PD1-발현 세포의 빈도를 감소시킴을 나타낸다.
상기 기재된 실험으로부터 수득된 데이터는 이브루티닙을 제공받은 CLL 환자에게 CART19 요법을 투여하기 위한 최적 시점은 사이클 2와 사이클 12 사이, 또는 사이클 12임을 나타내었다.
실시예 10: 호지킨 림프종에 대한 CAR19 T 세포 요법
또한 CAR19 T 세포 요법을 사용하여 호지킨 림프종 (HL)을 치료할 수 있다. 호지킨 림프종은 클론 배 중심 B 세포로부터 유래된 악성 호지킨 리드-스턴버그 (HRS) 세포의 존재를 특징으로 한다. HL에 대한 CAR19 T 세포 요법의 치료 효능을 나타내는 여러 인자가 존재한다. HL 종양의 CD19 염색은 종양 및 종양 미세환경 내의 CD19-발현 (CD19+) 세포를 보여준다 (도 33). 연구는 CD19를 발현하는 클론 B 세포 집단 (CD20+CD27+ALDH+)이 호지킨 림프종 세포주의 생성 및 유지를 담당하고, 또한 대부분의 HL 환자의 혈액에서 순환함을 보여주었다 (Jones et al., Blood, 2009, 113(23):5920-5926). 이러한 클론 B 세포 집단은 또한 악성 HRS 세포의 생성을 발생시키거나 그에 기여하는 것으로 시사된다. 따라서, CART19 요법은 종양발생 또는 종양 세포의 유지에 기여하는 이러한 B 세포 집단을 고갈시킬 것이다. 또 다른 연구는 B 세포 고갈이 다중 뮤린 모델에서 고형 종양 성장을 지연시킴을 보여주었다 (Kim et al., J Immunotherapy, 2008, 31(5):446-57). HL 종양 미세환경에서의 B 세포의 고갈이 일부 항종양 효과를 발생시킨다는 아이디어를 지지하여, 현행 요법, 예컨대 리툭산이 HL에서의 종양 B 세포의 표적화 및 고갈에 대해 임상 시험되고 있다 (Younes et al., Blood, 2012, 119(18):4123-8). 만성 염증과 관련된 신생 발암이 또한 B-세포 의존성인 것으로 밝혀진 바 있다 (de Visser, et al., Cancer Cell, 2005, 7(5):411-23). 이들 연구로부터의 결과는 특히 HL 종양 미세환경에서의 B 세포 집단의 표적화는 질환 진행 또는 종양 성장을 감소 또는 억제함으로써 HL을 치료하는데 유용할 것임을 나타낸다.
또한, 정상 CD19-발현 B 세포가 또한 HL에서 종양 미세환경으로 침윤한다. CLL 및 ALL에서의 CART19 요법에 의한 이전 연구 (예를 들어, 실시예 4 및 5에 기재됨)는 CD19+ 표적에 대한 CART19 노출이 시토카인 생산 및 대식세포 생산으로 이어짐을 보여준다. 따라서, 종양-촉진 미세환경으로부터 항종양 미세환경으로의 HL 종양 미세환경의 조정은 CART19를 주입하여 HL 내에 존재하는 정상 CD19+ B 세포와 상호작용시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, CD19-발현 표적에 대한 CART19 노출은 세포독성 T 세포의 확장, 대식세포의 활성화, 및 종양 성장을 억제하는 다양한 기능을 갖는 다른 면역 이펙터 세포, 예컨대 백혈구, 대식세포, 및 항원-제시 세포의 동원을 통해 항종양 활성을 촉진하는 시토카인 생산, 예를 들어 염증성 시토카인 생산을 유발한다. 표적 CD19+ B 세포가 악성이지 않을 수 있기 때문에 (예를 들어, 정상적으로 순환하는 B 세포), 종양 미세환경의 조정을 위해 연장된 CART19 효과보다는 일시적인 것이 바람직할 수 있다.
HL 환자에서 CART19 요법의 치료 효능을 검사하기 위한 연구을 하기 기재된 바와 같이 수행할 수 있다 (도 34). 연구는 또한 HL 대상체에서의 CART19의 안전성 및 내약성을 평가하고, HL 종양 미세환경에 대한 CART19 세포의 효과를 결정할 것이다.
전형적인 HL에 걸린 8명의 환자를 본 연구에서 처리하였다. 소아 및 성인 환자에 대해 약물 전달을 위한 개별 프로토콜이 확립되어 있을 수 있지만, 환자는 모든 연령의 환자이다. 본 연구의 환자는 어떠한 이용가능한 잠재적인 치유적 치료 옵션 (예컨대, 자가 (ASCT) 또는 동종 줄기 세포 이식)을 갖지 않거나, 또는 이러한 치유적 치료 옵션에 적합하지 않다. 예를 들어, 환자는 하기 중 임의의 것일 수 있다: 샐비지 화학요법 후 PET+, 브렌툭시맙에 의한 치료 후 PET+, 또는 선행 브렌툭시맙 노출의 존재 또는 부재 하에서의 ASCT 후 PET+. 환자는 현재 이용가능한 요법에 의해 제한된 예후 (수개월 내지 2년 이하의 예상)를 가질 것이다. 그리고 마지막으로, 환자는 항-CD20 항체 요법을 제공받지 않을 것이다. 예를 들어 환자가 CART19의 6회 주입 동안 불충분한 수의 T 세포를 갖는 경우에, 환자는 실행가능성의 결여로 인해 배제된다.
mRNA CAR19는 시험관내 전사에 의해 생산된다. CAR19 mRNA를 공여자 T 세포 내로 전기천공하고, 생성된 세포를 확장시키고, CD3/CD28 비드와의 인큐베이션에 의해 자극하였다. 1x108 - 5x108개의 RNA-전기천공된 CAR19 T 세포를 함유하는 투여량을 환자에게 2주 동안 1주에 3회 (예를 들어, 제0일, 제2일, 제4일, 제7일, 제9일 및 제11일) 전달하였다. 전체 반응률은 처리 1개월 후에 임상, CT, 및 PET 스캐닝에 의해 평가될 것이다. 반응 및 생존은 제1 CART19 주입 (제0일) 후 처음 6개월 동안 매월, 이어서 2년까지 3개월마다 모니터링될 것이다. 모니터링 기술은 CART19 처리 전 및 후의 종양 또는 림프절의 생검 (예를 들어, 면역조직화학적 분석의 경우, 및/또는 유전자 발현 프로파일링의 경우에 RNA) 및 PET 스캐닝을 포함한다. 예를 들어, HL 종양 미세환경에 대한 CART19 세포의 효과는 처리 전 및 처리 대략 1주 후 (또는 세포 표현형의 변경을 가능하게 하는 치료 후 적절한 시점)에 선택된 환자로부터의 접근가능한 림프절 생검에 대해 수행된 유전자 발현 프로파일링의 결과를 비교함으로써 분석된다. CART19 처리의 안전성 및 내약성을 평가하기 위해, 시토카인 방출 증후군 (CRS) 및 대식세포 활성화 증후군 (MAS)의 빈도를 비롯한 유해 사건의 빈도 및 중증도를 보고하였다.
화학요법이 CART19 처리와 공동으로 투여될 수 있다. CART19의 제1 용량에 앞서 림프구고갈 화학요법, 예를 들어 시툭산이 선행될 수 있다.
실시예 11: CLL 환자의 비-반응자 하위세트는 면역 체크포인트 억제제 분자의 증가된 발현을 나타낸다
본 연구에서, 34명의 CLL 환자로부터의 임상 제조로부터의 CART19 세포를 면역 체크포인트 억제제 분자, 예컨대 PD-1, LAG3, 및 TIM3의 발현에 대해 평가하였다. CART19에 대한 이러한 코호트의 반응은 공지되어 있고, 따라서 반응과 바이오마커 발현 패턴 사이의 상관관계가 평가될 수 있다.
CART 요법에 대해 상이한 반응을 갖는 CLL 환자로부터 제조된 CART19 세포를 유동 세포측정법에 의해 분석하여 CAR 및 면역 체크포인트 억제제 분자 PD-1, LAG3, 및 TIM3의 발현을 결정하였다. CART19 세포는 하기로부터의 것이다: 건강한 공여자 (HD) (n=2); CART 요법에 반응한 CLL 환자 (CR) (n=5); CART 요법에 부분적으로 반응한 CLL 환자 (PR) (n=8); CART 요법에 반응하지 않은 CLL 환자 (NR) (n=21). 세포를 관련 기술분야에 공지된 유동 세포측정 분석을 위한 표준 방법에 따라 CD3, CD4, CD8, CD27, CD45RO, CAR19 분자, 및 면역 체크포인트 분자 PD-1, LAG3, 및 TIM3을 특이적으로 인식하는 형광 표지된 항체로 염색하였다. 각각의 마커, 예를 들어 CD4+, CD8+ 등의 발현을 유동 세포측정 분석 소프트웨어에 의해 결정하고, 하위집단 (예를 들어, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CAR19-발현 T 세포)을 면역 체크포인트 분자 PD-1, LAG3, 및 TIM3의 발현에 대해 추가로 분석하였다.
표면 마커 발현을 결정하는데 사용된 유동 세포측정 프로파일 분석의 예를 도 35a 및 35b에 제시한다. CD4를 발현하는 T 세포를 유동 세포측정법을 사용하여 결정하고, CAR19 및 PD-1 발현에 대해 추가로 분석하여, 프로파일의 x-축이 CAR19 발현을 나타내고 (상부 좌측 (Q5) 및 하부 좌측 (Q8) 4분면은 CAR19-음성 CD4+ 세포를 보여주고, 상부 우측 (Q6) 및 하부 우측 (Q7) 4분면은 CAR19-발현 CD4+ 세포를 보여줌) y-축이 PD-1 발현을 보여주도록 하였다 (하부 좌측 (Q8) 및 우측 (Q7) 4분면은 PD-1 음성 CD4+ 세포를 보여주고, 상부 좌측 (Q5) 및 우측 (Q6) 4분면은 PD-1-발현 CD4+ 세포를 보여줌). CART 반응자로부터의 CD4+ 집단에서, CD4+ 세포 전체의 44.7%가 PD-1을 발현하였고, CAR19-발현 세포의 약 22.3%는 PD-1 양성이고, CAR19-발현 세포의 27.2%는 PD-1 음성이었다 (도 35a). 대조적으로, 비-반응자로부터의 CD4+ 집단에서, 전체적인 CAR19-발현 세포의 유의한 감소가 존재하였고 (CR에서의 49.5%와 비교하여 약 15.3%), CAR19-발현 세포의 14.7%는 PD-1 양성이고, 단지 0.64%만이 PD-1 음성이었다 (도 35b). 도 35a 및 도 35b의 프로파일 사이의 비교는 CART 반응자와 비교하여 (약 44.7%) 비-반응자로부터 훨씬 더 높은 백분율의 CD4+ 세포가 PD-1을 발현함 (약 92.9%)을 보여준다.
상기 기재된 방법 및 분석을 사용하여, CD4+ 집단 및 CD8+ 집단의 PD-1 발현 (PD-1+) 세포의 백분율을 각각의 반응 군에서 각각의 환자에 대해 결정하였다. 비-반응자는 CAR 요법에 반응하는 것 (CR)과 비교하여 CD4+ (도 35c) 및 CD8+ (도 35d) 집단 둘 다에서 보다 큰 백분율의 PD-1+ 세포를 갖는 것으로 나타났고; 평균 PD-1 백분율의 증가는 CD4+ 및 CD8+ 집단 둘 다에 대해 통계적으로 유의하였다. 부분 반응자 (PR)는 CD4+ (도 35c) 및 CD8+ (도 35d) 둘 다의 집단에서 반응자 (CR)보다 더 높은 백분율의 PD-1+ 세포를 나타내었다.
다음으로, CAR19-발현 CD4+ 집단 및 CAR19-발현 CD8+ 집단의 PD-1 발현 (PD-1+) 세포의 백분율을 각각의 반응 군에서 각각의 환자에 대해 결정하였다. CD4+ 및 CD8+ 세포를 CAR19-발현에 대해 분석하고, CAR19-발현 세포의 확인 후 CAR19-발현 세포의 집단으로부터 PD-1 발현을 갖는 세포의 백분율을 결정하는 추가의 단계와 함께, 상기와 유사한 분석을 수행하였다. CD4+ 및 CD8+ 전체 집단에서 관찰된 것과 유사한 경향이 CAR19 발현 CD4+ 및 CD8+ 집단에서 관찰되었고: 비-반응자는 CAR 요법에 반응하는 것 (CR)과 비교하여 CD4+ (도 36a) 및 CD8+ (도 36b) 집단 둘 다에서 보다 큰 백분율의 PD-1+ 세포를 갖는 것으로 나타났고; 평균 PD-1 백분율의 증가는 CD4+ 및 CD8+ 집단 둘 다에 대해 통계적으로 유의하였다. 부분 반응자 (PR)는 CD4+ (도 36a) 및 CD8+ (도 36b) 둘 다의 집단에서 반응자 (CR)보다 더 높은 백분율의 PD-1+ 세포를 나타내었다.
추가의 분석을 수행하여 CAR 요법에 대해 상이한 반응을 갖는 환자로부터 PD-1, LAG3, 및 TIM3을 발현하는 세포의 분포를 결정하였다. CD4+ 집단에서의 PD-1, LAG3, 및 TIM3발현에 대한 대표적인 세포 프로파일 분석이 도 37에 제시된다. 세포 집단을 먼저 CD4+ 및 CD8+ 발현에 대해 분석하였다. 이어서 CD4+ 집단 (또는 CD8+ 집단, 제시되지 않음)을 PD-1 및 CAR19 발현에 대해 분석하였다 (도 37, 좌측 프로파일). 이전에 기재된 바와 같이, 비-반응자 (NR)는 CART 반응자 (CR)와 비교하여 PD-1+ 전체인, 유의하게 증가된 백분율의 세포를 가졌다 (CR의 경우에 44.7% PD-1 양성인 것과 비교하여 NR의 경우에 약 92.9% PD-1 양성). 게다가, 비-반응자에서, CAR19-발현 세포는 대부분 PD-1 양성이었다 (0.64% PD-1 음성 및 CAR+와 비교하여 14.7% PD-1 양성 및 CAR+). 이어서 집단을 PD-1 및 LAG3 공동-발현에 대해 분석하였다 (도 37, 중간 프로파일). PD-1 및 LAG3 둘 다를 발현하는 세포를 상부 우측 4분면 (Q2)에 제시한다. 비-반응자는 CART 반응자와 비교하여 면역 체크포인트 억제제, PD-1 및 LAG3 둘 다를 발현하는 유의하게 증가된 백분율의 세포를 가졌다 (7.31%와 비교하여 67.3%). PD-1 발현을 또한 TIM3 발현에 의해 분석하였다. 도 37, 우측 프로파일에서, 박스는 PD-1 및 TIM3 둘 다를 발현하는 세포를 나타낸다. PD-1 및 LAG3에 의해 수득된 결과와 유사하게, 비-반응자는 CART 반응자와 비교하여 면역 체크포인트 억제제, PD-1 및 TIM3 둘 다를 발현하는 유의하게 더 높은 백분율의 세포를 가졌다 (28.5%와 비교하여 83.3%). PD-1 발현 세포 (PD1+), PD-1 및 LAG3-발현 세포 (PD1+LAG3+), 및 PD-1 및 TIM3-발현 세포 (PD1+TIM3+)의 백분율을 상기 기재된 바와 같은 유동 세포측정 분석을 사용하여 각각의 반응 군에서 각각의 환자에 대해 결정하였다. 비-반응자는 CART 반응자와 비교하여 PD1+ LAG3+ 세포 (도 38a) 및 PD1+TIM3+ 세포 (도 38b)의 증가된 백분율을 갖는 것으로 나타났고, 이는 둘 다의 세포 집단에 대해 통계적으로 유의하였다. 부분 반응자도 또한 CART 반응자와 비교하여 둘 다의 세포 집단의 증가된 백분율을 나타내었고, 평균은 비-반응자와 비교하여 감소되었다.
이들 결과는 CAR 요법에 반응하지 않는 환자가 CAR 요법에 반응하거나 부분적으로 반응하는 환자와 비교하여 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어, PD-1, LAG3, 및 TIM3)의 증가된 발현을 나타냄을 보여준다. 따라서, 이들 결과는 면역 체크포인트 억제제, 예를 들어 PD-1, LAG3, 또는 TIM3의 발현을 억제 또는 감소시키는 작용제가 면역 체크포인트 경로를 통한 (예를 들어, PD-1, LAG3, 또는 TIM3에 의해 매개되는) 면역 억제를 방지하여 CAR-발현 세포의 효능을 증가시키기 위해 CAR 요법을 제공받는 환자에게 투여하는데 유용할 수 있음을 보여준다.
실시예 12: Elderly에서의 면역노화에 대한 mTOR 억제의 효과
가장 명백하게 노화와 연결된 경로 중 하나는 mTOR 경로이다. mTOR 억제제 라파마이신은 마우스에서 수명을 연장시키고, 늙은 마우스에서 다양한 노화-관련 상태를 개선시키는 것으로 밝혀진 바 있다 (Harrison, DE et al. (2009) Nature 460:392-395; Wilkinson JE et al. (2012) Aging Cell 11:675-682; 및 Flynn, JM et al. (2013) Aging Cell 12:851-862). 따라서, 이러한 발견은 mTOR 억제제가 인간에서의 노화 및 노화-관련 상태에 대해 유익한 효과를 가질 수 있음을 나타낸다.
짧은 임상 시험 시간틀 내에서 연구될 수 있는 연령-관련 표현형은 면역노화이다. 면역노화는 고령에 발생하는 면역 기능의 저하로, 이는 감염에 대한 증가된 감수성 및 인플루엔자 백신접종을 비롯한 백신접종에 대한 감소된 반응으로 이어진다. 연령에 따른 면역 기능의 저하는 나이브 림프구를 생성하는 조혈 줄기 세포 (HSC)의 능력의 감소 및 항원 자극에 대해 결손 반응을 갖는 소진된 PD-1 양성 림프구의 수의 증가를 비롯한 면역 결함의 축적에 기인한다 (Boraschi, D et al. (2013) Sci. Transl. Med.5:185ps8; Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798; 및 Shimatani, K et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:15807-15812). 고령 마우스에서의 연구는 mTOR 억제제 라파마이신에 의한 6주 처리가 HSC 기능을 회생시켜, 나이브 림프구의 증가된 생산, 인플루엔자 백신접종에 대한 개선된 반응, 및 수명 연장으로 이어진다는 것을 보여주었다 (Chen, C et al. (2009) Sci. Signal. 2:ra75).
인간 노화-관련 표현형에 대한 mTOR 억제의 효과 및 mTOR 억제제 RAD001이 면역노화를 개선시키는지 여부를 평가하기 위해, RAD001 또는 위약을 제공받은 고령 지원자에서 인플루엔자 백신에 대한 반응을 평가하였다. 본원에 제시된 발견은 잘 허용되는 용량에서의 RAD001이 고령 지원자에서 인플루엔자 백신에 대한 반응을 증진시킨다는 것을 시사한다. RAD001은 연령에 따라 축적되는 프로그램화된 사멸 (PD)-1 양성 CD4 및 CD8 T 림프구의 백분율을 또한 감소시켰다. 이들 결과는 mTOR 억제가 고령 지원자에서 면역노화에 대해 유익한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
본원에 기재된 바와 같이, 라파마이신의 유사체인 mTOR 억제제 RAD001에 의한 6주 처리는 고령 인간 지원자에서 인플루엔자 백신접종에 대한 반응을 개선시켰다.
방법
연구 집단
불안정한 기저 의학적 질환이 없는 >= 65세의 고령 지원자가 뉴질랜드 및 호주의 9개의 장소에서 등록되었다. 스크리닝 시 배제 기준은 헤모글로빈 < 9.0 g/dL, 백혈구 카운트 <3,500/mm3, 호중구 카운트 <2,000/mm3, 또는 혈소판 카운트 <125,000/mm3, 비제어 당뇨병, 불안정한 허혈성 심장 질환, 임상적으로 유의한 기저 폐 질환, 면역결핍 또는 면역억제 요법을 제공받은 이력, 응고병증 또는 장기간 항응고를 필요로 하는 의학적 상태의 이력, 예측 사구체 여과 속도 < 30 ml/분, 중증 비제어 고콜레스테롤혈증 (>350 mg/dL, 9.1 mmol/L) 또는 고트리글리세리드혈증 (>500 mg/dL, 5.6 mmol/L)의 존재를 포함하였다.
치료 부문 사이의 기준선 인구통계는 유사하였다 (표 7). 등록된 218명의 대상체 중에서, 211명이 연구를 완료하였다. 7명의 대상체가 연구를 철회하였다. 5명의 대상체는 유해 사건 (AE)으로 인해 철회하였고, 1명의 대상체는 동의를 철회하였고, 1명의 대상체는 프로토콜을 위반한 결과로서 연구를 그만두었다.
<표 7> 연구 환자의 인구통계 및 기준선 특징
Figure pat00081
*체질량 지수는 체중 (킬로그램)을 키 (미터)의 제곱으로 나누었다.
연구 설계 및 수행
2011년 12월부터 2012년 4월까지, 218명의 고령 지원자가 무작위, 관찰자-맹검, 위약-제어 시험에 등록되었다. 인증된 자동 무작위화 시스템을 사용하여 각각의 처리 부문에서 5:2의 RAD001 대 위약의 비로 대상체가 처리 부문에 무작위화되었다. 처리 부문은 하기와 같았다:
RAD001 0.5 mg 매일 또는 위약
RAD001 5 mg 매주 또는 위약
RAD001 20 mg 매주 또는 위약
RAD001 0.5 mg 매일 및 20 mg 매주 코호트에서의 위약이 그러한 코호트에서의 RAD001 정제와 약간 상이하였기 때문에 실험은 관찰자-맹검이었다. 대상체를 평가하는 연구원이 연구 의약을 보지 못했고, 따라서 충분히 맹검이었다. 모든 코호트에 대한 치료 지속기간은 6주였고, 이러한 시간 동안 대상체는 2주마다 진료소에서 안전성 평가를 받았다. 대상체에게 4주 동안 투여한 후, RAD001 정상 상태 수준을 투여 전 및 투여 1시간 후에 측정하였다. 6주의 연구 약물 과정을 완료한 후, 대상체에게 임의의 가능한 RAD001-유도 면역억제를 역전시키도록 약물이 없는 2주를 제공한 다음, 균주 H1N1 A/캘리포니아/ 07/2009, H3N2 A/빅토리아/210/2009, B/브리즈번/60/ 2008을 함유하는 2012년 계절성 인플루엔자 백신접종 (아그리팔(Agrippal)®, 노파르티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스(Novartis Vaccines and Diagnostics), 이탈리아 시에나)을 제공하였다. 인플루엔자 백신접종 4주 후에, 인플루엔자 역가 측정을 위해 대상체에서 혈청을 수집하였다. 3종의 인플루엔자 백신 균주 뿐만 아니라 2종의 이종 균주 (A/H1N1 균주 A/뉴저지/8/76 및 A/H3N2 균주 A/빅토리아/361/11)에 대한 항체 역가를 표준 적혈구응집 억제 검정 (Kendal, AP et al. (1982) Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention B17-B35)에 의해 측정하였다. A/H1N1/캘리포니아/07/2009에 특이적인 IgG 및 IgM의 수준을 인플루엔자 백신접종 전 및 4주 후에 채취한 혈청 샘플에서 이전에 기재된 바와 같이 측정하였다 (Spensieri, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14330-14335). 결과를 형광 강도로서 표현하였다.
모든 대상체가 사전 동의서를 제공하였다. 연구는 우수한 임상 실시의 원칙에 따라 수행되었고, 적절한 윤리 위원회 및 규제 기관에 의해 승인받았다.
안전성
유해 사건 평가 및 혈액학적 및 생화학적 안전성 평가를 위한 혈액 수집을 연구 방문 동안 수행하였다. 또한 연구 약물이 진행 중인 6주 동안 대상체가 가정에서 작성한 다이어리에서 유해 사건 정보를 수집하였다. 모든 유해 사건에 대한 데이터를 사전 동의 시점부터 최종 연구 방문 30일 후까지 수집하였다. 사건은 조사자에 의해 경도, 중등도 또는 중증으로 분류되었다.
통계적 분석
기하 평균 역가 비의 1차 분석을 비-정보적 사전분포와 함께 통상적인 베이지언 회귀 모델을 사용하여 행하였다. 로그 척도의 각각의 항체 역가에 이러한 모델을 피팅시켰다. 각각의 모델에서의 1차 결과는 제84일 측정치였다. 제63일 측정치가 결과 벡터에 포함되었다. 사전 진술과 혼합된 SAS 9.2 proc를 사용하여 모델을 피팅시켰다. 행렬의 공분산 구조는 비구조적인 것으로 간주되었다 (옵션 유형=UN). 편평 사전분포가 사용되었다. 혈청전환율의 2차 분석의 경우에, 로지스틱 회귀가 사용되었다.
치료 의향 집단은 적어도 1회의 전체 용량의 연구 약물이 제공되었고 효능 데이터에 영향을 미치는 주요 프로토콜 일탈이 없는 모든 대상체로서 정의되었다. 연구에 등록된 총 218명의 대상체 중 199명이 치료 의향 집단에 속했다.
면역표현형결정
말초 혈액 단핵 세포를 3가지 시점에 수집된 전혈로부터 단리하였다: 기준선; 연구 약물 처리 6주 후; 및 대상체가 6주 동안의 연구 약물을 끝내고 인플루엔자 백신접종 4주 후인 연구 종료 시. 76개의 PBMC 하위세트를 이전에 기재된 바와 같이 미국 캘리포니아주의 스탠포드 대학교의 인간 면역 모니터링 센터에서 8-색 면역표현형결정 패널을 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다 (Maecker, HT et al. (2012) Nat Rev Immunol. 12:191-200). 76개의 PBMC 하위세트를 8-색 동결건조된 면역표현형결정 패널 (비디 리오플레이트(BD Lyoplate), 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 생존율 > 80% 및 수율 2x106개 세포 이상인 PBMC 샘플을 분석에 포함시켰다.
기준선으로부터 연구 약물 처리의 제6주까지 및 기준선으로부터 연구 종료 (제12주)까지의 면역표현형의 상대 변화를 각각의 RAD001 투여 코호트에 대해 계산하였다. 기준선으로부터 2가지 혈액 샘플링 시점까지의 면역표현형의 상대 변화가 각각의 투여 군에서 위약 효과에 대해 조정한 후에 각각 유의하게 0과 상이한지 여부를 검사하기 위해 스튜던트 T 검정을 수행하였다. 처리 효과 분석에서 누락 데이터 대체는 수행하지 않았다. 따라서, 환자의 기준선에서의 표현형 데이터가 누락된 경우에, 이러한 환자는 이러한 표현형에 대한 분석에 포함시키지 않았다. 환자의 표현형 데이터가 제6주 또는 제12주에 누락된 경우에, 이러한 환자는 영향을 받은 시점에 대해 이러한 표현형의 분석에 기여하지 않았다.
3가지 투여군 하의 76개의 표현형에서 608회의 시험을 수행하여, 처리 효과를 위약 효과에 대해 비교하였다. 다중 시험과 연관된 가양성의 발생을 제어하되 상당히 보다 양호한 파워를 제공하도록, 층화 오류 발견율 (FDR) 제어 방법론을 실행하였다. 세포 유형 군을 계층화 인자로서 취하였고, 각각의 계층 내에서 FDR (q-값) 계산을 각각 수행하였다. 모든 귀무-가설은 상응하는 q-값 ≤ 0.1로 0.05 유의 수준에서 기각되었다. 0.05 유의 수준 및 상응하는 q<0.1에서 기각되는 다중 시험 조정 전략은 10% 미만의 발견이 오류임을 보장하였다.
제2분석에서, 면역표현형이 풀링된 처리 및 위약 군 사이에 변화하였고, 여기서 모든 3가지 RAD001 투여 군을 조합하였다. 어떠한 면역표현형 변화가 처리 및 위약 군 사이에 상이한지 결정하기 위해, 각각의 측정된 표현형에 대한 환자-내 세포 카운트 비를 기준선과 연구 약물 처리의 제6주 사이 및 기준선과 연구 종료 (제12주) 사이에서 계산하였다. 비를 로그 변환하고, 풀링된 처리 및 위약 군 사이의 차이를 검출하기 위해 각각의 시점에서 공분산 분석에 의해 분석하였다. 76개의 표현형에서 152회의 시험을 수행하여 풀링된 치료의 효과를 위약 효과에 대해 비교하였다. 다중 시험과 연관된 가양성의 발생을 제어하되 상당히 보다 양호한 파워를 제공하도록, 층화 오류 발견율 (FDR) 제어 방법론을 실행하였다 (Benjamini, Y. et al. (1995) J. Roy. Statist. 57:289-300; 및 Sun, L. et al. (2006) Genet. Epidemiol. 30:519-530). 세포 유형 군을 층화 인자로서 취하였고, 각각의 계층 내에서 FDR (q-값) 계산을 각각 수행하였다. 0.05 유의 수준 및 20% 미만의 q-값의 모든 귀무-가설이 기각되었다. 이는 P 값이 0.05 미만이고 각각의 관찰된 유의한 결과가 다중 시험에 기인할 확률이 20% 미만인 가설들만 기각하는 것으로 해석될 수 있다.
결과
일반적으로, RAD001, 특히 0.5 mg 매일 및 5 mg 매주 투여 요법이 잘 허용되었다. 연구 동안 사망은 발생하지 않았다. 3명의 대상체가 4가지 심각한 유해 사건 (SAE)을 경험하였고, 이는 RAD001과 관련되지 않는 것으로 평가되었다. 4가지 SAE는 5 mg 매주 RAD001의 6주 과정을 6주 전에 완료한, 정상 혈소판 카운트를 갖는 대상체에서의 왼쪽 눈의 망막 출혈 및 후속 실명; 위약으로 처리된 대상체에서의 중증 요통, 및 위약으로 처리된 대상체에서의 중증 위장염이었다. 임의의 처리 군에서의 발생률이 >2%인 처리-관련 유해 사건 (AE)의 목록이 표 8에 제공된다. 가장 통상적인 RAD001-관련 AE는 구강 궤양이었고, 이는 대부분의 사례에서 중증도가 경도였다. 전반적으로, RAD001이 제공된 대상체는 중증 AE의 발생률이 위약으로 처리된 대상체와 유사하였다. 오직 1가지의 중증 AE가 20 mg 매주 RAD001로 처리된 대상체에서의 RAD001 관련 구강 궤양으로서 평가되었다.
<표 8> 바람직한 측면에서 임의의 처리군에서 >2%의 처리-관련 AE의 발생률
2012년 계절성 인플루엔자 백신에 대한 혈청학적 반응을 측정함으로써 고령 지원자에서 면역 기능을 개선시키는 RAD001의 능력을 평가하였다. 기준선 및 인플루엔자 백신접종 4주 후에 각각의 3종의 인플루엔자 백신 균주에 대한 적혈구응집 억제 (HI) 기하 평균 역가 (GMT)를 표 9에 제공한다. 1차 분석 변수는 HI GMT 비 (백신접종 4주 후/기준선)였다. 연구는 3종의 인플루엔자 백신 균주 중 적어도 2종에서 1) 위약 대비 ≥ 1.2-배 GMT 증가; 및 2) 위약-보정 GMT 비가 1을 초과하는 80% 이상의 사후 확률이 존재함을 입증할 수 있도록 작동되었다. MF-59 백신 아주반트에 의해 유도된 인플루엔자 GMT 비의 1.2-배 증가가 인플루엔자 질병의 감소와 연관되었기 때문에 이러한 종점이 선택되었다 (Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect 133:687-693).
<표 9> 기준선 및 인플루엔자 백신접종 4주 후에 각각의 인플루엔자 백신 균주에 대한 HI GMT
기준선은 인플루엔자 백신접종 2주 전을 나타낸다.
제4주는 인플루엔자 백신접종 4주 후를 나타낸다.
N은 코호트당 대상체의 수이다.
GMT는 기하 평균 역가이다.
GMT 비는 백신접종 4주 후의 GMT/기준선의 GMT이다.
CV%는 변동 계수를 나타낸다.
치료 의향 (ITT) 집단에서, 낮은, 면역 증진, 용량의 RAD001 (0.5 mg 매일 또는 5 mg 매주) 코호트는 연구의 1차 종점을 충족하였지만, 보다 고용량 (20 mg 매주)의 코호트는 그렇지 않았다 (도 40a). 이는 보다 낮은 용량에서 RAD001의 독특한 면역조정 메카니즘이 존재한다는 것 및 보다 높은 용량에서는 mTOR 억제의 공지된 면역억제 효과가 일어날 수 있다는 것을 입증한다. 게다가, 결과는 낮은, 면역 증진, 용량의 RAD001 처리 후에 고령자에서 개선된 면역 기능의 경향을 시사한다.
하위군 분석에서, 낮은 기준선 인플루엔자 역가 (≤ 1:40)를 갖는 대상체의 하위세트가 ITT 집단보다 더 큰 역가의 RAD001-연관 증가를 경험하였다 (도 40b). 이러한 데이터는 RAD001이, 기준선에서 보호성 (>1:40) 역가를 갖지 않았고 따라서 인플루엔자 질병의 위험이 가장 높았던 대상체의 인플루엔자 백신 반응을 증진시키는데 특히 유효함을 나타낸다.
RAD001 농도 대 각각의 인플루엔자 백신 균주에 대한 역가의 증가의 산점도는 역의 노출/반응 관계를 나타낸다 (도 41). S6 키나제 (S6K)의 mTOR 매개 인산화를 기초로 하는 모델링 및 시뮬레이션은, 투여 간격 동안 20 mg 매주 투여 요법은 mTOR-매개 S6K 활성을 거의 완전히 억제하고, 5 mg 매주 투여 요법은 S6K 활성을 50% 초과만큼 억제하고, 0.5 mg 매일 투여 요법은 S6K 인산화를 대략 38% 만큼 억제하는 것으로 예측한다 (Tanaka, C et al. (2008) J. Clin. Oncol 26:1596-1602). 따라서, 낮은, 면역 증진, 용량의 RAD001에 의한 부분적인 mTOR 억제, 예를 들어 mTOR-매개 S6K 인산화는 고령자의 면역 반응을 증진시키는데 고용량 RAD001에 의한 거의 완전한 mTOR 억제보다 더 효과적이지는 않더라도, 효과적일 수 있다.
인플루엔자 백신접종 4주 후 혈청전환율을 또한 평가하였다. 혈청전환은 음성 백신접종전 역가 (즉, HI 역가 <1:10)로부터, 비-음성 (≥ 1:10) 백신접종전 HI 역가로부터의 ≥ 1:40 또는 적어도 4-배 증가인 백신접종후 HI 역가로의 변화로서 규정된다. 치료 의향 집단에서, H3N2 및 B 균주의 경우에 혈청전환율은 위약 코호트와 비교하여 RAD001에서 증가되었고, 증가는 통계적 유의성을 충족시키지는 못했다 (도 10). 기준선 인플루엔자 역가 <= 1:40을 갖는 대상체의 하위집단에서, RAD001 처리는 또한 H3N2 및 B 균주에 대해 혈청전환율을 증가시켰고, 이들 결과는 B 균주의 경우에 0.5 mg 매일 투여 코호트에서 통계적 유의성에 도달하였다. 이들 데이터는 RAD001이 고령자에서 인플루엔자 백신접종에 대한 혈청학적 반응을 증진시킴을 추가로 보여준다.
<표 10> 백신접종 4주 후에 인플루엔자에 대한 혈청전환을 갖는 대상체의 퍼센트
* RAD001 및 위약 사이의 혈청전환에 대한 오즈비는 1보다 유의하게 상이함 (처리를 고정 효과로 하여 로지스틱 회귀에 의해 수득된 양측 p-값 < 0.05)
현재의 계절성 인플루엔자 백신은 이전의 유행 바이러스의 변이체로서 존재하는 계속적인 신생 인플루엔자 균주에 대해 종종 불충분한 보호를 제공한다. 그러나, 위약과 비교하여 mTOR 억제제 라파마이신의 존재 하에 인플루엔자에 대해 백신접종된 마우스에서 인플루엔자에 대한 보다 넓은 혈청학적 반응이 발생하였다. 보다 넓은 혈청학적 반응은 인플루엔자의 다중 하위유형에 의해 발현되는 보존된 에피토프에 대한 항체를 포함하였고, 이는 백신 내에 함유되지 않은 이종 인플루엔자 균주에 의한 감염에 대해 보호를 제공하였다 (Keating, R et al. (2013) Nat Immunology 14:2166-2178). RAD001이 고령 지원자에서 인플루엔자에 대한 혈청학적 반응을 넓혔는지 여부를 결정하기 위해, 인플루엔자 백신 내에 함유되지 않은 2종의 이종 인플루엔자 균주 (A/H1N1 균주 A/뉴저지/8/76 및 A/H3N2 균주 A/빅토리아/361/11)에 대한 HI 역가를 측정하였다. 이종 균주에 대한 HI GMT 비의 증가는 위약 코호트와 비교하여 RAD001에서 더 높았다 (도 42). 또한, 이종 균주에 대한 혈청전환율이 위약 코호트와 비교하여 RAD001에서 더 높았다. H3N2 이종 균주에 대해 5 및 20 mg 매주 RAD001 투여 코호트에서의 혈청전환율의 증가가 통계적으로 유의하였다 (표 11). 위약 코호트에 대한 20%에 대해 풀링된 RAD001 코호트에 대한 H3N2 혈청전환율은 39%였다 (p=0.007). 본원에 제시된 결과는 mTOR 억제가 인플루엔자 백신접종에 대한 고령 지원자의 혈청학적 반응을 넓히고, 계절성 인플루엔자 백신 내에 함유되지 않은 이종 인플루엔자 균주에 대한 항체 역가를 증가시킨다는 것을 시사한다.
라파마이신으로 처리된 마우스에서의 이종 인플루엔자 균주에 대한 넓어진 혈청학적 반응이 B 세포에서의 부류 전환의 억제 및 항-인플루엔자 IgM 수준의 증가와 연관되었다 (Keating, R. et al. (2013) Nat Immunol 14:2166-2178). 그러나, 백신접종후 항-인플루엔자 IgM 및 IgG 수준이 RAD001 및 위약 처리 코호트 사이에서 상이하지 않았기 때문에, RAD001로 처리된 인간에서의 넓어진 혈청학적 반응에서는 부류 전환의 억제가 수반되지 않을 수 있다 (도 43).
<표 11> 계절성 인플루엔자 백신접종 4주 후에 인플루엔자의 이종 균주로 혈청전환되는 대상체의 백분율
Figure pat00085
* RAD001 및 위약 사이의 혈청전환에 대한 오즈비는 1보다 유의하게 상이함 (처리를 고정 효과로 하여 로지스틱 회귀에 의해 수득된 양측 p-값 < 0.05)
RAD001이 고령 지원자에서 면역 기능을 증진시키는 메카니즘을 다루기 위해, 면역표현형결정을 기준선, 연구 약물 처리 6주 후, 및 인플루엔자 백신접종 4주 후 (연구 약물 중단 6주 후)에 대상체로부터 수득된 PBMC 샘플에 대해 수행하였다. 대부분의 PBMC 하위세트의 백분율이 RAD001과 위약 코호트 사이에서 상이하지 않았지만, PD-1 양성 CD4 및 CD8 세포의 백분율이 위약 코호트와 비교하여 RAD001에서 더 낮았다 (도 44). PD-1 양성 CD4 및 CD8 세포는 연령에 따라 축적되고, 항원 자극에 대해 결손된 반응을 갖는데, 이는 PD-1이 T 세포 수용체-유도 T 세포 증식, 시토카인 생산 및 세포용해성 기능을 억제하기 때문이다 (Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798). 위약 코호트에서 시간의 경과에 따라 PD-1 양성 T 세포의 백분율의 증가가 존재하였다. 제12주 (백신접종 4주 후)에, 인플루엔자 바이러스가 PD-1 양성 T 세포를 증가시키는 것으로 나타났기 때문에 이러한 증가는 인플루엔자 백신접종으로 인한 것일 수 있다 (Erikson, JJ et al. (2012) JCI 122:2967-2982). 그러나, 모든 RAD001 코호트에서는 CD4 PD-1 양성 T 세포의 백분율이 제6주 및 제12주에 기준선으로부터 감소되었다 (도 44a). CD8 PD-1 양성 세포의 백분율은 또한 2개의 보다 낮은 용량 RAD001 코호트에서 제6주 및 제12주 둘 다에 기준선으로부터 감소되었다 (도 44b). PD-1 음성 CD4 T 세포의 백분율을 평가하였고, 위약 코호트와 비교하여 RAD001 코호트에서 증가되었다 (도 44c).
보다 엄격한 통계적 분석 하에서, RAD001 코호트로부터의 결과를 풀링하고 기준선 PD-1 발현에서의 차이에 대해 조정한 경우에, 위약 코호트 (n=25)와 비교하여 p=0.03 (q=0.13)으로, 풀링된 RAD 코호트 (n=84)에서 제6주에 PD-1 양성 CD4 T 세포의 30.2%의 통계적으로 유의한 감소가 존재하였다 (도 45a). 위약 코호트와 비교하여 풀링된 RAD에서의 제12주의 PD-1 양성 CD4 T 세포의 감소는 p=0.05 (q=0.19)로 32.7%이다. 도 45b는 위약 코호트 (n=25)와 비교하여 p=0.008 (q=0.07)로, 풀링된 RAD001 코호트 (n=84)에서의 제6주의 PD-1 양성 CD8 T 세포의 37.4%의 통계적으로 유의한 감소를 나타낸다. 위약 코호트와 비교하여 풀링된 RAD001에서의 제12주의 PD-1 양성 CD8 T 세포의 감소는 p=0.066 (q=0.21)으로 41.4%이다. 따라서, 도 44 및 45으로부터의 결과는 함께 PD-1 양성 CD4 및 CD8 T 세포의 백분율의 RAD001-연관 감소가 증진된 면역 기능에 기여할 수 있다는 것을 시사한다.
결론
결론적으로, 본원에 제시된 데이터는 mTOR 억제제 RAD001이 인플루엔자 백신접종에 대한 반응에 의해 평가 시 인간 고령자의 면역학적 기능의 연령-관련 저하를 개선시키고, 이러한 개선이 허용가능한 위험/이익 균형으로 수득된다는 것을 보여준다. 고령 마우스의 연구에서, mTOR 억제제 라파마이신으로의 6주 처리는 인플루엔자 백신접종에 대한 반응을 증진시킬 뿐만 아니라 수명을 연장시켰고, 이는 면역노화의 개선이 노화-관련 표현형에 대한 보다 넓은 효과의 마커일 수 있음을 시사한다.
RAD001 투여가 백신접종 2주 전에 중단되었기 때문에, 약물 처리의 중단 후에 지속되는 관련 세포 집단에서의 변화에 의해 RAD001의 면역 증진 효과가 매개될 수 있다. 본원에 제시된 결과는 위약과 비교하여 RAD001이 소진된 PD-1 양성 CD4 및 CD8 T 세포의 백분율을 감소시켰음을 보여준다. PD-1 발현은 TCR 신호전달에 의해 유도되고, 만성 바이러스 감염을 비롯한 지속적인 항원 자극의 환경에서 높게 유지된다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, RAD001이 고령 지원자에서 만성 면역 활성화를 감소시키고, 이는 PD-1 발현의 감소로 이어질 수 있다. 이뮤노필린 시클로스포린 A에 대해 보고된 바와 같이 (Oestreich, KJ et al. (2008) J Immunol. 181:4832-4839), RAD001은 또한 PD-1 발현을 직접적으로 억제할 수 있다. PD-1 양성 T 세포의 백분율의 RAD001-유도 감소는 T 세포 반응의 품질을 개선시킬 수 있다. 이는 mTOR 억제가 마우스 및 영장류에서 백신접종에 대한 기억 CD8 T 세포 반응의 품질을 개선시킨다는 것을 보여주는 이전 연구 (Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)와 일치한다. 노화된 마우스에서, mTOR 억제는 조혈 줄기 세포의 수를 증가시키고, 이는 나이브 림프구의 증가된 생산으로 이어지는 것으로 또한 밝혀진 바 있다 (Chen, C et al. (2009) Sci Signal 2:ra75). RAD001 대 위약 코호트에서의 나이브 림프구의 백분율의 유의차가 이러한 예에서 검출되지 않았지만, 이러한 가능한 메카니즘이 추가로 조사될 수 있다.
RAD001이 이종 인플루엔자 균주에 대한 혈청학적 반응을 넓히는 메카니즘을 추가로 조사할 수 있다. 라파마이신은 인플루엔자 백신접종 후 B 세포에서 부류 전환을 억제하는 것으로 또한 밝혀진 바 있다. 그 결과, 인플루엔자 백신 내에 함유되지 않은 인플루엔자 바이러스 하위유형에 의한 치사 감염에 대해 교차-균주 보호를 촉진하는 항-인플루엔자 항체의 독특한 레퍼토리가 생성되었다 (Keating, R et al. (2013) Nat Immunol. 14:2166-2178). 본원에 기재된 결과는 인플루엔자 백신접종 2주 전에 RAD001을 중단한 고령 대상체에서 RAD001이 B 세포 부류 전환을 변경시켰음을 나타내지 않았다. 기저 메카니즘은 추가적인 해명을 필요로 하지만, 본원에 기재된 이종 인플루엔자 균주에 대한 증가된 혈청학적 반응은 계절성 백신과 지역사회의 유행 중인 인플루엔자 균주 사이의 매칭이 불량한 해에 인플루엔자 질병에 대해 증진된 보호를 부여할 수 있다.
인플루엔자 항체 역가에 대한 RAD001의 효과는 인플루엔자 백신접종에 대한 고령자의 반응을 증진시키는 것으로 입증된 MF59 백신 보조제의 효과와 대등하였다 (Podda, A (2001) Vaccine 19:2673-2680). 따라서, 인플루엔자 백신접종에 대한 항체 반응의 RAD001-구동 증진은 고령자에서 MF59-보조 인플루엔자 백신에 의해 입증된 바와 같은 임상 이익으로 해석될 수 있다 (Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect. 133:687-693). 그러나, RAD001은 또한 기관 이식 환자의 면역 반응을 억제하는데 사용된다. 이러한 겉보기에 역설적인 발견은 mTOR 억제제의 면역조정 효과가 용량 및/또는 항원-의존적일 수 있다는 가능성을 제기한다 (Ferrer, IR et al. (2010) J Immunol. 185:2004-2008). 역의 RAD001 노출/백신접종 반응 관계로의 경향이 본원에서 관찰되었다. 완전한 mTOR 억제는 정상적인 시클로필린-라파마이신 메카니즘을 통해 면역 기능을 억제하는 반면에, 부분적인 mTOR 억제는, 적어도 고령자에서, 독특한 노화-관련 표현형 억제로 인해 면역 기능을 증진시키는 것이 가능하다. 흥미롭게도, 노화 동물 모델에서 조혈 줄기 세포를 포함하는 다양한 조직에서 mTOR 활성이 증가된다 (Chen C. et al. (2009) Sci Signal 2:ra75 및 Barns, M. et al. (2014) Int J Biochem Cell Biol. 53:174-185). 따라서, mTOR 활성을 어린 조직에서 관찰되는 수준으로 낮추는 것이, mTOR 활성의 보다 완전한 억제와 대조적으로, 노화 적응증에서 임상적으로 유익할 수 있다.
노화-관련 적응증의 치료에서의 mTOR 억제제, 예컨대 RAD001의 안전성 프로파일이 우려되었다. 종양학 또는 기관 이식 적응증에서 사용된 용량에서의 RAD001의 독성은 많은 노화-관련 적응증에서 허용불가능할 구내염, 설사, 오심, 혈구감소증, 고지질혈증 및 고혈당의 비율을 포함한다. 그러나, 이들 AE는 혈액 내의 RAD001의 최저 수준과 관련된다. 따라서, 이러한 연구에서 사용된 RAD001 투여 요법은 최저 수준을 최소화하도록 선택되었다. 0.5 mg 매일, 5 mg 매주 및 20 mg 매주 투여 코호트의 평균 RAD001 최저 수준은 각각 0.9 ng/ml, 0.3 ng/ml (정량 하한치) 미만, 및 0.7 ng/ml였다. 이들 최저 수준은 기관 이식 및 암 환자에서 사용된 투여 요법과 연관된 최저 수준보다 유의하게 더 낮다. 또한, 제한된 6주 과정의 처리가 유해 사건의 위험을 감소시켰다. 이러한 발견은 이러한 연구에 사용된 투여 요법이 고령자의 일부 상태에 대해 허용되는 위험/이익을 갖는다는 것을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 본원에 기재된 실험의 유의한 수의 대상체에서 0.5 mg 매일만큼 낮게 투여한 경우에도 구강 궤양이 발생하였다. 따라서, 낮은, 면역 증진, 용량의 RAD001의 안전성 프로파일은 추가의 연구를 정당화한다. 현재 이용가능한 라파로그보다 안전성 프로파일이 보다 훌륭한 mTOR 억제제의 개발은 추후에 노화-연관 상태에 대해 보다 양호한 치료 옵션을 제공할 수 있다.
실시예 13: 고령 대상체에서의 백신에 대한 면역 반응의 증진
고령자에서는 면역 기능이 저하되고, 이는 감염 발생률 증가 및 백신접종에 대한 감소된 반응으로 이어진다. mTOR 억제가 인간에서 항노화 효과가 있는지를 결정하는 제1 단계로서, 고령 지원자에서 백신접종에 대한 반응에 의해 평가 시 mTOR 억제제 RAD001이 면역 기능에서 노화-관련 저하를 역전시키는지 여부를 결정하기 위해 무작위화 위약-제어 시험을 수행하였다. 모든 경우에, 적절한 환자 동의서를 수득하였고, 국가 보건 기관에 의해 연구를 승인받았다.
RAD001의 하기의 3가지 투여 요법이 연구에서 사용되었다:
20 mg 매주 (최저 수준: 0.7 ng/ml)
5 mg 매주 (최저 수준이 검출 한계 미만임)
0.5 mg 매일 (최저 수준: 0.9 ng/ml)
이식 및 종양학 적응증에 대해 승인된 RAD001의 용량보다 낮은 최저 수준을 가졌기 때문에 이러한 투여 요법을 선택하였다. 최저 수준은 신체 내에서의 약물의 가장 낮은 수준이다. 10 mg 매일의 종양학 투여 요법과 연관된 RAD001의 최저 수준은 대략 20 ng/ml이다. 0.75-1.5 mg bid 이식 투여 요법과 연관된 최저 수준은 대략 3 ng/ml이다. 대조적으로, 본 발명자들의 면역화 연구에 사용된 투여 요법과 연관된 최저 수준은 3-20배 더 낮았다.
RAD001-관련 AE는 최저 수준과 연관되기 때문에, 3가지 투여 요법은 정상 지원자에 대해 적합한 안전성을 가질 것으로 예측되었다. 또한, 3가지 용량은 일정 범위의 mTOR 억제를 제공할 것으로 예측되었다. P70 S6 키나제 (P70 S6K)는 mTOR에 의해 인산화되는 하류 표적이다. P70 S6K 인산화의 수준이 mTOR 활성의 척도로서의 역할을 한다. RAD001의 전임상 및 임상 연구에서 수득된 P70 S6K 인산화 데이터의 모델링 및 시뮬레이션을 기초로, 20 mg 매주는 일주일 내내 mTOR 활성을 거의 완전히 억제할 것으로 예측된 반면에, 5 mg 매주 및 0.5 mg 매일은 mTOR 활성을 부분적으로 억제할 것으로 예측되었다.
>= 65세의 고령 지원자를 3가지 RAD001 처리 군 중 하나 (부문당 50명의 대상체) 또는 위약 (부문당 20명의 대상체)으로 무작위화하였다. 대상체를 연구 약물로 6주 동안 처리하고, 2주 중단한 후, 인플루엔자 (아그리팔, 노파르티스) 및 폐렴구균 (뉴모박스(Pneumovax) 23, 머크(Merck)) 백신접종을 제공하였다. 백신접종 4주 후 인플루엔자 백신 내의 3가지 인플루엔자 균주 (H1N1, H3N2 및 B 인플루엔자 하위유형)에 대해 적혈구응집 억제 검정에 의해 기하 평균 역가 (GMT)를 측정함으로써 인플루엔자 백신접종에 대한 반응을 평가하였다. 연구의 1차 종점은 (1) 안전성 및 내약성, 및 (2) 백신접종 4주 후 인플루엔자 백신 균주의 2/3에서의 위약과 비교하여 인플루엔자 역가의 1.2배 증가였다. 인플루엔자 역가의 1.2배 증가가 백신접종후 인플루엔자 질병의 감소와 연관되고, 따라서 임상적으로 관련되기 때문에 이러한 종점이 선택되었다. 5 mg 매주 및 0.5 mg 매일 용량이 잘 허용되었고, 20 mg 매주 용량과는 달리 GMT 1차 종점을 충족시켰다 (도 40a). RAD001은 인플루엔자 백신접종에 대한 반응을 개선시킬 뿐만 아니라, 고령 지원자에서 위약과 비교하여 폐렴구균 백신접종에 대한 반응을 개선시켰다. 폐렴구균 백신은 23가지의 폐렴구균 혈청형으로부터의 항원을 함유한다. 혈청형 중 7가지에 대한 항체 역가를 본 발명의 대상체에서 측정하였다. 6/7 혈청형에 대한 항체 역가가 위약과 비교하여 모든 3가지 RAD 코호트에서 증가되었다.
조합된 인플루엔자 및 폐렴구균 역가 데이터는 부분적인 (80-100% 미만) mTOR 억제가 보다 완전한 mTOR 억제보다 면역 기능의 노화-관련 저하를 역전시키는데 더 유효하다는 것을 시사한다.
실시예 14: 저용량 mTOR 억제는 에너지 및 운동을 증가시킨다
전임상 모델에서, 라파로그 라파마이신에 의한 mTOR 억제는 늙은 마우스에서 자발적인 신체 활동을 증가시킨다 (Wilkinson et al. Rapamycin slows aging in mice. (2012) Aging Cell; 11:675-82). 흥미롭게도, 실시예 13에 기재된 0.5 mg 매일 투여 코호트의 대상체는 또한 투여 1년 후에 제출된 설문지에서 위약과 비교하여 증가된 에너지 및 운동 능력을 보고하였다 (도 46). 이러한 데이터는 라파로그에 의한 부분적인 mTOR 억제가 면역 기능만을 넘어서는 노화-관련 이환율에 대한 유익한 효과를 가질 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 15: RAD001에 의한 P70 S6 키나제 억제
mTOR 활성을 부분적으로 억제할 것으로 예측되는 RAD001의 매일 및 매주 용량 범위를 예측하기 위해 모델링 및 시뮬레이션을 수행하였다. 상기 언급된 바와 같이, P70 S6K는 mTOR에 의해 인산화되고, P70 S6K의 녹아웃이 수명을 증가시키기 때문에, 노화와 가장 밀접하게 연관되는 mTOR의 하류 표적이다. 따라서, P70 S6K 활성을 부분적으로 억제하는 RAD001의 용량의 모델링을 행하였다. >= 0.1 mg 및 < 20 mg의 범위로의 매주 투여는 P70 S6K 활성의 부분 억제를 달성할 것으로 예측된다 (도 47).
매일 투여의 경우에, 30 pM 내지 4 nM의 RAD001 농도가 세포주에서 P70 S6K 활성을 부분적으로 억제하였다 (표 12). 이들 혈청 농도는 >= 0.005 mg 내지 < 1.5 mg 매일의 RAD001 용량에 의해 달성되는 것으로 예측된다.
<표 12> 시험관내 HeLa 세포에서의 P70 S6K 활성의 퍼센트 억제
Figure pat00086
결론
P70 S6K를 단지 부분적으로만 억제하는 용량의 mTOR 억제제에 의해, 노화-연관 이환율을 치료하거나 또는 일반적으로 면역 반응을 증진시키는 방법. 노화 적응증에서의 저용량의 RAD001에 의한 부분적인 mTOR 억제의 효능은 예상외의 발견이다. >= 0.1 mg 내지 < 20 mg 매주 및 >= 0.005 mg 내지 < 1.5 mg 매일의 RAD001 용량 범위는 부분적인 mTOR 억제를 달성할 것이고, 따라서 노화-관련 이환율 또는 면역 반응의 증진에서 효능을 가질 것으로 예상된다.
실시예 16: 외인성 IL-7은 CAR T 세포의 기능을 증진시킨다
CAR T 세포의 입양 전달 후에, 일부 환자는 항종양 활성의 준최적 수준을 발생시킬 수 있는 CAR T 세포의 제한된 지속을 경험한다. 본 실시예에서는, 외인성 인간 IL-7의 투여 효과를 CAR T 세포에 대해 초기 준최적 반응이 관찰된 바 있는 마우스 이종이식편 모델에서 평가한다.
먼저 IL-7 수용체 CD127의 발현을 상이한 암 세포주 및 CAR-발현 세포에서 평가하였다. 2종의 외투 세포 림프종 세포주 (RL 및 Jeko-1) 및 1종의 B-ALL 세포주 (Nalm-6)를 CD127 발현에 대해 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 도 48a에 제시된 바와 같이, 시험된 3종의 암 세포주 중에서, RL은 CD127의 최고 발현을 갖는 것으로 나타났고, Jeko-1 및 Nalm-6가 그 뒤를 따랐다. CART19 세포를 NSG 마우스 내로 주입하고, CD127 발현을 유동 세포측정법에 의해 순환 중인 CART19 세포에 대해 평가하였다. 도 48b에 제시된 바와 같이, CD127은 모든 순환 중인 CART19 세포 상에서 균일하게 발현된다.
다음으로, CART19 세포의 항종양 활성에 대한 외인성 IL-7 처리의 효과를 림프종 동물 모델에서 평가하였다. NSG 마우스를 루시페라제-발현 외투 세포주 (RL luc)로 제0일 (D0)에 생착시킨 다음, 제6일에 CART19 세포로 처리하였다. NSG 마우스를, 1개의 군은 어떠한 CART19 세포도 제공받지 않고, 제2 군은 0.5 x106개의 CART19 세포를 제공받고, 제3 군은 1x106개의 CART19 세포를 제공받고, 제4 군은 2x106개의 CART19 세포를 제공받는 군으로 나누었다. 80일 초과에 걸쳐 생착된 종양의 평균 생물발광을 측정함으로써 종양 크기를 모니터링하였다. 2x106개의 CART19 세포를 제공받은 마우스만이 종양의 거부 및 종양 성장의 억제를 입증하였다 (도 49a). 0.5 x106개의 CART19 세포 또는 1x106개의 CART19 세포를 제공받은 2개의 군으로부터의 마우스는 준최적 항종양 반응을 보였다. 이어서 이들 2개의 군으로부터의 마우스를 무작위화하였고, 여기서 3마리의 마우스 (0.5x106개의 CART19 세포를 제공받은 마우스 #3827 및 #3829, 및 1x106개의 CART19 세포를 제공받은 마우스 #3815)에게 외인성 재조합 인간 IL-7을 200 ng/마우스의 투여량으로 복강내 주사에 의해 제85일에 시작하여 매주 3회 제공하고, 2마리의 마우스에게는 제공하지 않았다. 평균 생물발광에 의해 검출된 바와 같은, 제85일-제125일에 외인성 IL-7을 제공받은 마우스의 종양 부담을 도 49b에 제시한다. IL-7을 제공받은 모든 마우스는 종양 부담에서 1-3 로그 감소의 극적인 반응을 나타내었다. 원래 보다 높은 용량의 CART19 세포를 제공받은 마우스 (1x106개의 CART19 세포를 제공받은 마우스 #3815)는 보다 현저한 반응을 나타내었다. IL-7 처리를 제공받은 마우스의 종양 부담을 대조군, IL-7 처리 전 및 후와 비교한 경우에, 종양 부담에서의 종양 감소는 IL-7 처리를 제공받은 마우스에서만 관찰되었다 (도 49c).
림프종 동물 모델에서 IL-7 처리 후의 T 세포 역학을 또한 검사하였다. 인간 CART19 세포는 IL-7 처리 전 혈액 중에서 검출가능하지 않았다. IL-7의 처리 시, 처리된 마우스에서 T 세포 수의 신속하지만 가변적인 증가가 존재하였다 (도 50a). IL-7을 제공받은 마우스에서 관찰된 T 세포 확장의 정도가 또한 종양 반응과 상관되었다. IL-7 처리 동안 혈액 중에서 최고 확장으로 검출된 최고의 T 세포 수를 갖는 마우스 (마우스 #3815)는 종양 부담에서 가장 강건한 감소를 가졌다 (도 49b 참조). 또한, 최고 확장의 시간은 기준선으로서 주사된 T 세포 용량과 상관되었다. 혈액 중 CD3-발현 세포 수/수준을 또한 IL-7 처리 전 및 후에 측정하였다. 대조군 마우스에서 매우 소수의 CD3-발현 세포가 검출되었고, IL-7-처리된 마우스는 IL-7 처리 후 CD3+ 세포의 유의한 증가를 나타내었다 (도 50b).
종합하면, 본 실시예의 결과는 외인성 IL-7 처리가 생체내 T 세포 증식 및 항종양 활성을 증가시킴을 입증하며, 이는 CAR 요법 후 준최적 결과를 갖는 환자에서의 IL-7의 사용이 이들 환자에서 항종양 반응을 개선시킬 수 있음을 나타낸다.
등가물
본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원 및 공개의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 발명은 구체적 측면을 참조로 하여 개시되지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명의 진정한 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 측면 및 변형을 고안할 수 있을 것임이 명백하다. 첨부된 청구항은 그러한 모든 측면 및 균등한 변형을 포함하는 것으로 해석되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> BROGDON, Jennifer BYRD, John DUBOVSKY, Jason FRAIETTA, Joseph GILL, Saar GLASS, David JOHNSON, Amy JUNE, Carl KENDERIAN, Saad MANNICK, Joan MAUS, Marcela MURPHY, Leon MUTHUSAMY, Natarajan PORTER, David RUELLA, Marco SELLERS, William Raj WASIK, Mariusz <120> TREATMENT OF CANCER USING ANTI-CD19 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR <130> N2067-7051WO <140> <141> <150> 62/097,278 <151> 2014-12-29 <150> 62/087,888 <151> 2014-12-05 <150> 62/076,238 <151> 2014-11-06 <150> 62/036,493 <151> 2014-08-12 <150> 62/007,309 <151> 2014-06-03 <150> 61/976,396 <151> 2014-04-07 <160> 132 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr 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aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1320 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1380 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1440 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1500 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1560 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1620 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1680 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1740 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1800 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1860 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1920 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1980 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2040 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2100 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2160 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2220 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2280 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2340 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2400 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2460 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2520 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2580 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2640 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2700 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2760 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2820 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2880 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2940 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3000 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3060 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3120 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3180 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3240 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3300 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3360 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3420 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3480 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3540 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3600 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3660 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3720 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3780 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3840 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3900 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3960 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4020 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4080 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4140 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4200 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4260 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4320 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4380 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4440 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4500 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4560 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4620 tttttttttt 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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 126 Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu 20 25 30 Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp 50 55 60 Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala 65 70 75 80 Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser 85 90 95 <210> 127 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 127 Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu 20 25 30 Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp 50 55 60 Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly 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Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp 1025 1030 1035 Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly 1040 1045 1050 Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu 1055 1060 1065 Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr 1070 1075 1080 Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr 1085 1090 1095 Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr 1100 1105 1110 Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys 1115 1120 1125 Thr Ile Leu Asp 1130 <210> 132 <211> 4027 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc 60 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc 120 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg 180 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg 240 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg 300 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg 360 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct 420 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc 480 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg 540 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca 600 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg 660 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga 720 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg 780 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga 840 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag 900 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc 960 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc 1020 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc 1080 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg 1140 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc 1200 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc 1260 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag 1320 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg 1380 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt 1440 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc 1500 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca 1560 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca 1620 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg 1680 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt 1740 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga 1800 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt 1860 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc 1920 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag 1980 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt 2040 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg 2100 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc 2160 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc 2220 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc 2280 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc 2340 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg 2400 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca 2460 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg 2520 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct 2580 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc 2640 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa 2700 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga 2760 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga 2820 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg 2880 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc 2940 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt 3000 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct 3060 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc 3120 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc 3180 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg 3240 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc 3300 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc 3360 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg 3420 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg 3480 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc 3540 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct 3600 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc 3660 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc 3720 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc 3780 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc 3840 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt 3900 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg 3960 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaa 4027

Claims (31)

  1. CD19의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유동물의 치료에 mTOR 억제제와 조합하여 사용하기 위한 CD19에 결합하는 CAR 분자를 발현하는 세포 ("CAR19-발현 세포")의 집단을 포함하는 제약 조성물.
  2. CD19의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유동물의 치료에 사용하기 위한, CD19에 결합하는 CAR 분자를 발현하는 세포 ("CAR19-발현 세포")의 집단을 포함하는 제약 조성물이며, 여기서 포유동물은 이전에 mTOR 억제제를 제공받은 것인 제약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, mTOR 억제제 및 CAR19-발현 세포가 포유동물에게 1차 요법으로서 투여되는 것인 제약 조성물.
  4. 제1항에 있어서, CAR19-발현 세포 및 mTOR 억제제가 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것인 제약 조성물.
  5. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CAR19-발현 세포가 mTOR 억제제의 치료 후에 적어도 2주, 3주, 1개월, 1.5개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 9개월, 12개월, 15개월 또는 18개월에 투여되는 것인 제약 조성물.
  6. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) CAR19-발현 세포는 mTOR 억제제의 투여를 중단한 후에 투여되거나; 또는
    (ii) mTOR 억제제의 투여는 CAR19-발현 세포의 투여 전에 시작되고, CAR19-발현 세포는 mTOR 억제제의 계속된 투여와 조합되어 투여되는 것인
    제약 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, mTOR 억제제가 라파마이신인 제약 조성물.
  8. 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, mTOR 억제제가 라파마이신이고, 여기서 라파마이신은 21일 사이클 또는 28일 사이클 동안 매일 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 또는 10 mg의 용량으로 투여되는 것인 제약 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 초과의 사이클의 라파마이신이 투여되는 것인 제약 조성물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, mTOR 억제제가 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, 세마피모드, AZD8055, PF04691502, SF1126, XL765, 또는 OSI-027로부터 선택된 라파마이신 유사체인 제약 조성물
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, mTOR 억제제가 에베롤리무스인 제약 조성물.
  12. 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, mTOR 억제제가 에베롤리무스이고, 에베롤리무스가 28일 사이클 동안 매일 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg 또는 15 mg의 용량으로 투여되는 것인 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 초과의 사이클의 에베롤리무스가 투여되는 것인 제약 조성물.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CD19에 결합하는 CAR 분자가 항-CD19 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 항-CD19 결합 도메인이 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하는 것인 제약 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 항-CD19 결합 도메인이 서열식별번호: 59의 아미노산 서열, 또는 그에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 막횡단 도메인이 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  18. 제14항에 있어서, 항-CD19 결합 도메인이 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된 것인 제약 조성물.
  19. 제14항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 공동자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 것인 제약 조성물.
  20. 제14항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  21. 제14항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  22. 제14항에 있어서, CAR 분자가 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 리더 서열을 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
  23. 제14항에 있어서, CAR 분자가 서열식별번호: 58의 아미노산 서열, 또는 그에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  24. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 제약 조성물은 1-5 x 108개의 CAR19-발현 세포를 포함하거나;
    (ii) 제약 조성물은 5 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 또는 5 x 107개의 CAR19-발현 세포를 포함하거나; 또는
    (iii) CAR19-발현 세포가 104 내지 109개 CAR19-발현 세포/kg 체중의 투여량으로 투여되는 것인
    제약 조성물
  25. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 면역 이펙터 세포를 포함하는 것인 제약 조성물.
  26. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 T 세포, NK 세포, 또는 둘 다를 포함하는 것인 제약 조성물.
  27. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CD19의 발현과 연관된 질환이 암인 제약 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 암이 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 외투 세포 림프종 (MCL), 다발성 골수종, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 호지킨 림프종, B-세포 급성 림프모구성 백혈병 (BALL), T-세포 급성 림프모구성 백혈병 (TALL), 소림프구성 백혈병 (SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종 (DLBCL), 만성 염증과 연관된 DLBCL, 여포성 림프종, 소아 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 상태, MALT 림프종 (점막-연관 림프성 조직의 림프절외 변연부 림프종), 변연부 림프종, 골수이형성 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 비장 변연부 림프종, 비장 림프종/백혈병, 비장 미만성 적색 속질 소 B-세포 림프종, 모발상 세포 백혈병-변형, 림프형질세포성 림프종, 중쇄 질환, 형질 세포 골수종, 골의 고립 형질세포종, 골외 형질세포종, 결절성 변연부 림프종, 소아 결절성 변연부 림프종, 원발성 피부 여포 중심세포 림프종, 림프종성 육아종증, 원발성 종격 (흉선) 대 B-세포 림프종, 혈관내 대 B-세포 림프종, ALK+ 대 B-세포 림프종, HHV8-연관 다중심성 캐슬만병에서 발생한 대 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, B-세포 림프종, 및 분류가능하지 않은 림프종으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 암이 MCL, CLL, ALL, 호지킨 림프종, 및 다발성 골수종으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  30. 제27항에 있어서, 암이 혈액암인 제약 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 혈액암이 백혈병 또는 림프종인 제약 조성물.
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