KR20140002649A - Ｃｄ７０－양성 악성 종양에 대해 ｔ 세포를 재지정하기 위한 키메라 ｃｄ２７ 수용체 - Google Patents
Ｃｄ７０－양성 악성 종양에 대해 ｔ 세포를 재지정하기 위한 키메라 ｃｄ２７ 수용체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 CD70-양성 악성 종양의 면역 치료요법을 위해 CD70에 대해 재지정된 T 세포와 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 양상에서, CD70-특이적인 T 세포를 사용한다. 특수 양상에서, T-세포 수용체 착체의 제타 신호전달 도메인에 융합된 전장 CD70 수용체(CD27)를 포함하는 신규 분자를 발현하는 T 세포가 존재한다. 이러한 T 세포는 CD70-양성 종양 세포를 재조직하고, CD70-양성 암 세포에 대한 세포용해 활성을 갖는다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2010년 10월 27일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/407,189호에 대한 우선권을 주장하고, 이는 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
미국 정부의 지원을 받는 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 NIH/NCI에 의해 수여된 PO1 CA094237 및 NIH/NIDDK에 의해 수여된 T32 DK64717 및 NIH에 의해 수여된 5T32HL092332-07 하의 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 있어서 소정 권한을 갖는다.
기술 분야
본 발명의 실시형태는 세포 생물학, 분자 생물학, 면역학, 및 의학의 분야에 관한 것이다.
본 발명의 배경
항원-특이적 T 세포를 이용한 면역 치료요법은 전임상(preclinical) 모델에서뿐만 아니라 I/II 상(phase) 임상 연구에서도 혈액학적 악성 종양의 치료에 유망한 것으로 나타났다(Leen et al., 2007; Bollard et al., 2007; June, 2007; Rosenberg et al., 2008; Di Stasi et al., 2009; Vera et al., 2006). 종양-특이적 T 세포를 생성하기 위한 하나의 매력적인 전략은 키메라 항원 수용체(CAR)를 이용한 유전적 변형에 의한 것이고, 이는 세포외 항원 인식 도메인, 막관통 도메인, 및 흔히 공동자극 분자 엔도도메인(endodomain)에 연결된 T-세포 수용체 CD3-δ 쇄로부터 유도된 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진다(Rossig and Brenner, 2004; Sadelain et al., 2003). 혈액학적 악성 종양의 치료를 위한 CD19 및 CD20 항원을 표적화하는 CAR은 광범위하게 연구되어 왔지만, 이러한 접근법은 B-세포 유도된 악성 종양에 한정되고, T 세포의 잠재적으로 긴 수명 때문에 체액성 면역의 손상을 연장시킬 수 있다(Till et al., 2008; Cooper et al., 2005). 따라서, 잠재적으로 치료가능한 종양의 범위를 넓히고/넓히거나 정상 세포에 대한 손상을 감소시킬 수 있는 대안의 항원에 대해 지정된 CAR을 제조하는 것이 바람직하다.
CD70은 CD27 수용체의 막 결합 리간드이고, 이는 종양 괴사 인자 수용체 상과에 속한다(Hintzen et al., 1994; Bowman et al., 1994). CD70은 미만성 거대 B-세포 및 여포성 림프종에 의해, 또한 호지킨 림프종, 발덴스트롬 매크로글로불린혈증 및 다발성 골수종의 악성 종양 세포에 의해, 그리고 HTLV-1-관련 및 EBV-관련 악성 종양에 의해 발현된다(Agathanggelou et al,. 1995; Hunter et al., 2004; Lens et al., 1999; Baba et al., 2008). 또한, CD70은 신세포 암종 및 교모세포종과 같은 비-혈액학적 악성 종양에 의해서 발현된다(Junker et al., 2005; Chahlavi et al., 2005). 생리학적으로, CD70 발현은 일시적이고, 고도로 활성화된 T 세포, B 세포, 및 수지상 세포의 서브세트에 제한된다. CD70/CD27 공동자극은 T-세포 활성화 역할을 하지만, CD27 녹아웃 마우스가 명시적인 면역결핍증을 갖지 않고 야생형 마우스와 동일한 시간 프레임 내에서 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 회복되므로, CD70/CD27 신호전달은 기능성 면역 시스템의 개발 및 유지에 필수적인 것은 아니다(Hendriks et al., 2000; Nolte et al., 2009).
본 발명의 간단한 요약
본 발명은 암의 치료 및/또는 예방을 위한 면역 치료요법에 관한 방법 및/또는 조성물에 관한 것이다. 구체적 양상에서, 본 발명의 실시형태는, 예를 들면 악성 종양을 포함하는 CD70-양성 세포의 면역 치료요법을 위해 CD70에 대해 재지정된 T 세포에 관한 것이다. 본 발명은 사람, 개, 고양이, 말 등을 포함하는 임의의 포유동물, 수컷 또는 암컷에 대해 사용될 수 있다.
종양 괴사 인자 상과의 구성요소인 CD70의 발현은 활성화된 T-림프구 및 B-림프구 및 성숙 수지상 세포에 제한된다. CD70의 수용체인 CD27에 대한 CD70의 결합은 프라이밍, 효과기 기능, T-세포의 분화 및 메모리 형성뿐만 아니라 혈장 및 메모리 B-세포 생성에서 중요하다. 특히, CD70은 a) 예를 들면, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종의 혈액학적 악성 종양; b) 신세포 암종, 췌장, 난소, 폐 및 비인두 암종의 고형 종양; 및 c) 예를 들면, 다형성 교모세포종의 뇌 종양의 광범위한 스펙트럼에서 발현된다. 단클론 항체를 이용한 동물 모델에서의 전임상 연구는 면역치료학적 표적으로서 CD70을 입증하였다. 현재, 본 발명자들은 CD70-양성 악성 종양에 대한 유전적 접근법을 이용하여 T 세포를 재지정하였다. 이러한 목적을 위해, 본 발명자들은 T-세포 수용체 착체의 제타 신호전달 도메인에 융합된 전장(full-length) CD70 수용체(CD27)로 이루어진 신규 분자(CD27제타)를 작제하였다. CD27제타를 발현하는 T 세포는 레트로바이러스 형질도입, 및 CD70-양성 종양 세포를 이용한 공동배양 후의 비-형질도입된 T 세포와는 대조적으로 IL-2뿐만 아니라 IFN-γ를 증식 및 제조하는 능력에 의해 판단되는 바와 같이 CD27제타 발현 T 세포 인식된 CD70-양성 종양 세포에 의해 생성되었다. 또한, CD27제타 발현 T 세포는 세포용해 활성을 가졌고, CD70-양성 종양 세포를 사멸시켰고, 반면 CD70-음성 종양 세포는 사멸되지 않았다.
본 발명의 한 실시형태로, 종양을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 개체의 분리된 T 세포에 본 발명의 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 작제물을 도입하는 단계, 및 상기 T 세포를 상기 개체에 (주사 등에 의해) 전달하여 T 세포의 표면 상에 상기 키메라 수용체가 발현되어 개체의 항-종양 면역성을 활성화시켜 종양을 감소시키거나 예방하는 단계를 포함하는, 종양을 감소시키거나 예방하는 방법이 있다.
본 발명의 한 실시형태로, CD70 항원을 인식하고 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체가 있다. 구체적 실시형태에서, T 세포와 같은 세포 상에 상기 수용체가 존재한다. 구체적 실시형태에서, 상기 수용체는 예를 들면, CD27과 같은 CD70 수용체로서 추가로 정의된다. 구체적 실시형태에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 T-세포 수용체 CD3-ζ 쇄이다.
본 발명의 일부 실시형태로, 상기 세포에 본 발명의 키메라 수용체를 포함하는 다른 세포를 제공하는 단계를 포함하는, CD70 항원을 갖는 세포를 표적화하는 방법이 있다. 구체적 실시형태에서, 표적화되는 세포는 암 세포를 포함하는 CD70 항원을 포함하는 임의의 종류의 세포일 수 있고, 구체적 실시형태에서, 이들은 예를 들면, 혈액학적 악성 종양 세포이다. 특정 양상에서, 이들은 예를 들면, 림프종 세포, 신세포 암종 세포, 또는 교모세포종 세포이다. 특정 양상에서, 암 세포는 예를 들면, HTLV-1-결합된 악성 종양 세포 또는 EBV-결합된 악성 종양 세포이다. 구체적 실시형태에서, 암 세포는 CD70-양성이다. 구체적 실시형태에서, 치료되는 암은 신세포암, 흉선 암종, 비인두 암종, 뇌 종양, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 발덴스트롬 거대 글로불린 혈증, 만성 림프구성 백혈병, T-세포 백혈병, 다발성 골수종, EBV- 및 HTLV-I 결합된 악성 종양, 신장암, 췌장암, 후두암, 인두암, 흑색종, 난소암, 폐암(폐 선암종 포함), 결장암, 유방암, 또는 뇌암이다.
본 발명의 구체적 실시형태에서, 키메라 수용체를 포함하는 T 세포는 표적화되는 세포가 암성인지의 여부와 관계없이 CD70 항원을 포함하는 임의의 세포를 표적화한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 본 발명과 관련된 특정 양상에서와 같이 자가면역성을 부여하는 CD70-CD27 공동-자극의 조절 이상이 존재하므로, CD70은 자가면역 장애와 관련된 세포 상에 발현된다. 구체적 실시형태에서, CD70 세포는 류마티스 관절염(RA), 관절염(건선 관절염 포함), 염증, 자가면역 뇌염, 염증성 장 질환, 결장염, 및 루푸스와 같은 자가면역 장애를 갖는 개체 내에 존재한다.
본 발명의 한 실시형태로, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 포함하는 종양-특이적 T 세포를 이용하여 CD70-양성 악성 종양 세포를 표적화하는 단계를 포함하는, 개체 내의 CD70-양성 악성 종양 세포를 치료하는 방법이 있다. 구체적 실시형태에서, 개체는 예를 들면, 외과술, 방사선, 화학 치료요법, 면역 치료요법, 또는 호르몬 치료요법과 같은 추가의 항암 치료요법을 받아왔거나, 받고 있거나, 또는 받을 것이다.
상기는 이하가 보다 잘 이해될 수 있는 본 발명의 상세한 설명을 상세히 설명하기 위해 본 발명의 특징 및 기술적 이점의 다소 광범위한 개요였다. 본 발명의 추가의 특징 및 이점은 하기에 기술될 것이고, 이는 본 발명의 특허청구범위의 주제를 형성한다. 기술된 개념 및 구체적 실시형태는 본 발명의 동일한 목적을 수행하기 위한 다른 구조를 변형하거나 고안하기 위한 기초로서 용이하게 이용될 수 있다는 것이 당해 분야 숙련가들에 의해 이해되어야만 한다. 또한, 당해 분야 숙련가들은 이러한 등가의 구조는 첨부된 특허청구범위에 제시된 바와 같은 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않음을 인식해야만 한다. 추가의 목적 및 이점과 함께, 본 발명의 구성 및 조작 방법 둘 다에 관한, 본 발명의 특징인 것으로 생각되는 신규 특징은 하기 설명으로부터 첨부된 도면과 연결하여 고려할 때 더욱 잘 이해될 것이다. 그러나, 각각의 도면은 도해 및 설명의 목적을 위해서 제공되는 것이고 본 발명의 한계의 정의로서 의도되는 것은 아님이 명확히 이해되어야 한다.
본 발명의 보다 완전한 이해를 위해서, 이하 설명을 첨부된 도면과 함께 고려하여 하기에 참조된다.
도 1: CD70-CAR 생성, 세포-표면 발현, 및 사람 T 세포의 형질도입. (도 1a) CD70-CAR은 전장 CD27을 CD3-ζ 쇄의 신호전달 도메인에 융합시킴으로써 생성되었고, IRES 서열 및 tCD19는 유전적으로 변형된 T 세포의 검출을 위해 포함되었다. (도 1b) CD70-CAR 작제물로 형질감염된 293T 세포는 CD27 및 마커 유전자 tCD19 둘 다를 발현한다. (도 1c) 형질도입된 사람 T 세포 상의 CD70-CAR 발현은 tCD19 염색에 의해 측정시 45%(+/-6)였다. (도 1d) CD4 및 CD8 T 세포 둘 다는 유전적으로 변형되었다.
도 2: CD70은 몇몇의 종양 세포주에서 과발현되지만, 정상 림프구에서는 과발현되지 않는다. 건강한 공여자의 말초혈 유래의 B 및 T 림프구의 5% 미만이 CD70을 발현한다. K562 및 K562.70은 음성 및 양성 대조군으로서 작용하였다. CD70 과발현은 비-호지킨(Daudi, SNK6, SNT16), 호지킨(L1236), ALL(CCL-120), 및 다발성 골수종(U266) 세포에서 관찰되었다.
도 3: CD70-특이적 T 세포는 IFN-γ, IL-2를 방출하고, CD70-양성 표적 세포에 반응하여 증식한다. (도 3a) 3명의 공여자 유래의 T 세포는 CD70-CAR를 이용하여 형질도입되거나(흑색), 비형질도입되고(회색), IFN-γ ELISA를 수행하기 전에 48시간 동안 K562.70 및 K562뿐만 아니라 각종 CD70-발현 종양 세포주와 함께 공동-배양되었다. 흑색 및 회색 직사각형은 각각 CD70-CAR 형질도입된 또는 비형질도입된 T 세포의 평균 IFN-γ 방출을 나타낸다. K562 세포에 비해 K562.70의 존재시 IFN-γ가 보다 현저하게(p<0.03) 방출되었으므로, CD70-CAR T 세포는 CD70에 대해 특이적이었다. 또한, CD70-CAR T 세포는 CD70-발현 종양 세포주와 공동-배양할 때 비-형질도입된 T 세포보다 현저하게 많은(p<0.0001) IFN-γ를 방출하였다. (도 3b) 그러나, 동일한 공동-배양 실험을 IL-2의 존재에 대해 검사하였다. CD70-CAR T 세포는 CD70-발현 종양의 존재시 비-형질도입된 T 세포보다 현저하게 많은(p<0.0001) IL-2를 방출한다. (도 3c) T 세포는 CFSE로 표지되었고, 외인성 IL-2의 부재 하에, K562, K562.70, SNT16, 또는 Daudi와 5일 동안 공동-배양되었고, CFSE 희석은 유동 세포측정법에 의해 분석되었다. CD70-CAR T 세포는 CD70 과발현 표적 K562.70 및 SNT16과 공동배양할 때에는 증식하였지만, CD70-dim Daudi 세포 또는 CD70-음성 K562 세포와 공동배양할 때에는 증식하지 않았다.
도 4: CD70-특이적 T 세포는 CD70-양성 종양 세포주를 사멸시킨다. (도 4a) CD70-CAR T 세포(실선)는 K562.70 세포를 사멸시켰지만, 모 K562 세포는 사멸시키지 않았다. 비-형질도입된 대조군 T 세포(파선)는 어느 하나의 표적을 사멸시키지 않았다. (도 4b) CD70-CAR T 세포(실선)는 CD70-양성 Daudi, U266, SNK6, 및 SNT16 종양 세포주를 사멸시켰고, 대조군 T 세포(파선)는 사멸시키지 않았다. (도 4c) CD70-특이적 T 세포 또는 비형질도입된 T 세포는 CFSE로 표지되었고, 2:1의 비율로 SNT16 세포와 공동-배양되었다. CD70-특이적 T 세포는 증식하였고, CD3+ 세포의 CFSE 희석 및 비-형질도입된 T 세포와 비교하여 배양액 중의 CD3/CFSE-음성 세포의 결여에 의해 나타내어진 바와 같이 SNT16 세포를 사멸시켰다. (도 4d) 모든 공동배양 실험에 있어서, CD70-특이적 T 세포만이 CD3/CFSE-음성 CD70+ 종양 세포 Daudi, U266, SNK6, 및 SNT16을 제거하였다.
도 5: CD27 공동 자극은 T-세포 생존능을 향상시킨다. (도 5a) Co-IP 실험에서, 전장 CD27-ζ만이 TRAF2와 결합하였다. (도 5b) CD70-CAR 또는 ΔCD70-CAR을 발현하는 T 세포는 51Cr 방출 검사에서 CD70+ LCL 및 U266 세포의 동등한 사멸을 나타냈지만, CD70- K562 세포는 사멸시키지 않았다. (도 5c) CD70을 발현하도록 유전적으로 변형된 자가 섬유모세포를 이용하여 활성화된 CD70-CAR 또는 ΔCD70-CAR을 발현하는 T 세포의 현미경 평가(10X)는 CD70-CAR을 발현하는 T 세포의 보다 큰 'T-세포 클럼프'를 나타냈지만, CFSE 희석 분석은 그룹 사이의 증식에 있어서 현저한 차이를 나타내지 않았다. (도 5d) ΔCD70-CAR T 세포의 생존능은 CD70-CAR을 발현하는 T 세포의 생존능의 35%(+/-16%)였다(n=5). (도 5e) Bcl-xl에 대한 세포내 염색은 CD70 형질전환 자가 섬유모세포를 이용한 자극 3일 후에 T 세포에 대해 수행하였다. Bcl-xl 발현은 ΔCD70-CAR T 세포와 비교하여 CD70-CAR T 세포에서 연속적으로 증가하였다(n=3). 하나의 대표적인 FACS 분석을 나타낸다.
도 6: CD70-특이적 T 세포는 원발성 CD70-양성 림프종을 인식하고 사멸시킨다. (도 6a) B-세포 림프종을 갖는 3명의 환자들 및 T-세포 급성 림프구성 백혈병을 갖는 1명의 환자로부터의 CD70 과발현 종양 세포를 IFN-γ ELISA를 수행하기 전에 건강한 공여자 유래의 CD70-특이적 또는 비-형질도입된 T 세포와 48시간 동안 공동배양하였다. 모든 경우에 있어서, CD70-특이적 T 세포는 환자의 종양 세포 존재시 IFN-γ를 방출하였고, 반면 비-형질도입된 세포는 IFN-γ를 거의 방출하지 않았다. (도 6b, 도 6c) 원발성 종양 세포 및 CFSE 표지된 T 세포를 이용하여 공동 배양 검사를 수행하여 FACS 분석에 의해 효과기 및 표적 세포를 구별하였다. CD70-특이적 T 세포(CD3/CFSE 양성 세포)는 환자 종양 세포를 근절시킬 수 있었다(p=0.036).
도 7: CD70-특이적 T 세포는 림프종의 뮤린 이종이식 모델에서 생체내 항-종양 활성을 나타낸다. (도 7a, 도 7b) eGFP-FFLuc 유전자를 발현하는 Daudi 세포(5×105)를 SCID 마우스에게 복강내 주사하였다. 광 신호(광자/sec/㎠/sr)가 증가함에 따라 종양 성장을 측정하였다. 10일, 11일 및 17일째에, 마우스에게 1×107 CD70-특이적 또는 비-형질도입된 T 세포를 주사하였다. 치료 7일 후에, CD70-특이적 T 세포를 이용하여 치료된 종양은 퇴행되었고, 반면 비-형질도입된 T 세포를 이용하여 치료된 종양은 퇴행되지 않았다(P=0.002). 도 7a는 대표적인 동물의 영상을 나타낸다. 도 7b는 정량적 생물발광 영상을 나타낸다. 도 7c 및 도 7d에서, SCID 마우스에게 Raji 세포(2×105)를 정맥내 주사하였다. 4일, 5일, 및 11일째에, 마우스에게 1×107 CD70-특이적 또는 비형질도입된 T 세포를 주사하였다. (도 7c) 전신성 종양은 생물발광 영상을 이용하여 열거하였다. 종양 세포 주사 3주 및 4주 후에, CD70-특이적 T 세포보다 비형질도입된 T 세포로 치료받은 마우스에서 더욱 현저하게 높은 종양 부하가 존재하였다(3주, P= .012; 4주[n=12], P .010). (도 7d) CD70-특이적 T 세포를 이용하여 치료된 마우스는 비형질도입된 T 세포로 치료받은 마우스에 비해 현저한 생존 이점을 나타냈다(P< .05).
도 8: CD70-특이적 T 세포는 자가 B 및 T 세포에 대해 최소 반응성을 나타낸다. (도 8a) 3명의 건강한 공여자 유래의 CD70-특이적 T 세포(1×105)를 5×104 자가 T 세포, B 세포, 또는 Raji 세포의 존재시 단독으로 플레이팅하거나, PMA/이오노마이신을 이용하여 자극하였다. IFN-γ ELISPOT에 의해 측정시, PMA/이오노마이신 치료 후에 Raji 세포에 대해 강한 반응성이 나타나지만, 자가 T 또는 B 세포에 대해서는 나타나지 않는다. (도 8b) 4h 51크로뮴 방출 검사에서, CD70-특이적 T 세포는 Raji 세포를 사멸시키고, B 세포는 파쇄(blast)되지만, OKT3은 파쇄되지 않는다. 비-형질도입된 세포는 임의의 표적의 사멸을 나타내지 않는다(실선 CD70-특이적 T 세포, 파선 비-형질도입된 T 세포).
도 9: CD70-CAR 및 ΔCD70-CAR DsRed 발현 T 세포의 생성. (도 9a) 형질도입된 T 세포의 검출 및 선별을 위해 DsRed를 포함하도록 CD70-CAR 발현 카세트를 변형시켰다. ΔCD70-CAR은 CD27 엔도도메인 내의 23개의 아미노산의 PCR 결실에 의해 생성되었고, DsRed 발현 카세트에 클로닝되었다. (도 9b) 형질도입 효율은 CD70-CAR-I-DsRed 또는 ΔCD70-CAR-IDsRed를 발현하는 T 세포들 사이의 형질도입 효율은 비교가능하였다.
도 1: CD70-CAR 생성, 세포-표면 발현, 및 사람 T 세포의 형질도입. (도 1a) CD70-CAR은 전장 CD27을 CD3-ζ 쇄의 신호전달 도메인에 융합시킴으로써 생성되었고, IRES 서열 및 tCD19는 유전적으로 변형된 T 세포의 검출을 위해 포함되었다. (도 1b) CD70-CAR 작제물로 형질감염된 293T 세포는 CD27 및 마커 유전자 tCD19 둘 다를 발현한다. (도 1c) 형질도입된 사람 T 세포 상의 CD70-CAR 발현은 tCD19 염색에 의해 측정시 45%(+/-6)였다. (도 1d) CD4 및 CD8 T 세포 둘 다는 유전적으로 변형되었다.
도 2: CD70은 몇몇의 종양 세포주에서 과발현되지만, 정상 림프구에서는 과발현되지 않는다. 건강한 공여자의 말초혈 유래의 B 및 T 림프구의 5% 미만이 CD70을 발현한다. K562 및 K562.70은 음성 및 양성 대조군으로서 작용하였다. CD70 과발현은 비-호지킨(Daudi, SNK6, SNT16), 호지킨(L1236), ALL(CCL-120), 및 다발성 골수종(U266) 세포에서 관찰되었다.
도 3: CD70-특이적 T 세포는 IFN-γ, IL-2를 방출하고, CD70-양성 표적 세포에 반응하여 증식한다. (도 3a) 3명의 공여자 유래의 T 세포는 CD70-CAR를 이용하여 형질도입되거나(흑색), 비형질도입되고(회색), IFN-γ ELISA를 수행하기 전에 48시간 동안 K562.70 및 K562뿐만 아니라 각종 CD70-발현 종양 세포주와 함께 공동-배양되었다. 흑색 및 회색 직사각형은 각각 CD70-CAR 형질도입된 또는 비형질도입된 T 세포의 평균 IFN-γ 방출을 나타낸다. K562 세포에 비해 K562.70의 존재시 IFN-γ가 보다 현저하게(p<0.03) 방출되었으므로, CD70-CAR T 세포는 CD70에 대해 특이적이었다. 또한, CD70-CAR T 세포는 CD70-발현 종양 세포주와 공동-배양할 때 비-형질도입된 T 세포보다 현저하게 많은(p<0.0001) IFN-γ를 방출하였다. (도 3b) 그러나, 동일한 공동-배양 실험을 IL-2의 존재에 대해 검사하였다. CD70-CAR T 세포는 CD70-발현 종양의 존재시 비-형질도입된 T 세포보다 현저하게 많은(p<0.0001) IL-2를 방출한다. (도 3c) T 세포는 CFSE로 표지되었고, 외인성 IL-2의 부재 하에, K562, K562.70, SNT16, 또는 Daudi와 5일 동안 공동-배양되었고, CFSE 희석은 유동 세포측정법에 의해 분석되었다. CD70-CAR T 세포는 CD70 과발현 표적 K562.70 및 SNT16과 공동배양할 때에는 증식하였지만, CD70-dim Daudi 세포 또는 CD70-음성 K562 세포와 공동배양할 때에는 증식하지 않았다.
도 4: CD70-특이적 T 세포는 CD70-양성 종양 세포주를 사멸시킨다. (도 4a) CD70-CAR T 세포(실선)는 K562.70 세포를 사멸시켰지만, 모 K562 세포는 사멸시키지 않았다. 비-형질도입된 대조군 T 세포(파선)는 어느 하나의 표적을 사멸시키지 않았다. (도 4b) CD70-CAR T 세포(실선)는 CD70-양성 Daudi, U266, SNK6, 및 SNT16 종양 세포주를 사멸시켰고, 대조군 T 세포(파선)는 사멸시키지 않았다. (도 4c) CD70-특이적 T 세포 또는 비형질도입된 T 세포는 CFSE로 표지되었고, 2:1의 비율로 SNT16 세포와 공동-배양되었다. CD70-특이적 T 세포는 증식하였고, CD3+ 세포의 CFSE 희석 및 비-형질도입된 T 세포와 비교하여 배양액 중의 CD3/CFSE-음성 세포의 결여에 의해 나타내어진 바와 같이 SNT16 세포를 사멸시켰다. (도 4d) 모든 공동배양 실험에 있어서, CD70-특이적 T 세포만이 CD3/CFSE-음성 CD70+ 종양 세포 Daudi, U266, SNK6, 및 SNT16을 제거하였다.
도 5: CD27 공동 자극은 T-세포 생존능을 향상시킨다. (도 5a) Co-IP 실험에서, 전장 CD27-ζ만이 TRAF2와 결합하였다. (도 5b) CD70-CAR 또는 ΔCD70-CAR을 발현하는 T 세포는 51Cr 방출 검사에서 CD70+ LCL 및 U266 세포의 동등한 사멸을 나타냈지만, CD70- K562 세포는 사멸시키지 않았다. (도 5c) CD70을 발현하도록 유전적으로 변형된 자가 섬유모세포를 이용하여 활성화된 CD70-CAR 또는 ΔCD70-CAR을 발현하는 T 세포의 현미경 평가(10X)는 CD70-CAR을 발현하는 T 세포의 보다 큰 'T-세포 클럼프'를 나타냈지만, CFSE 희석 분석은 그룹 사이의 증식에 있어서 현저한 차이를 나타내지 않았다. (도 5d) ΔCD70-CAR T 세포의 생존능은 CD70-CAR을 발현하는 T 세포의 생존능의 35%(+/-16%)였다(n=5). (도 5e) Bcl-xl에 대한 세포내 염색은 CD70 형질전환 자가 섬유모세포를 이용한 자극 3일 후에 T 세포에 대해 수행하였다. Bcl-xl 발현은 ΔCD70-CAR T 세포와 비교하여 CD70-CAR T 세포에서 연속적으로 증가하였다(n=3). 하나의 대표적인 FACS 분석을 나타낸다.
도 6: CD70-특이적 T 세포는 원발성 CD70-양성 림프종을 인식하고 사멸시킨다. (도 6a) B-세포 림프종을 갖는 3명의 환자들 및 T-세포 급성 림프구성 백혈병을 갖는 1명의 환자로부터의 CD70 과발현 종양 세포를 IFN-γ ELISA를 수행하기 전에 건강한 공여자 유래의 CD70-특이적 또는 비-형질도입된 T 세포와 48시간 동안 공동배양하였다. 모든 경우에 있어서, CD70-특이적 T 세포는 환자의 종양 세포 존재시 IFN-γ를 방출하였고, 반면 비-형질도입된 세포는 IFN-γ를 거의 방출하지 않았다. (도 6b, 도 6c) 원발성 종양 세포 및 CFSE 표지된 T 세포를 이용하여 공동 배양 검사를 수행하여 FACS 분석에 의해 효과기 및 표적 세포를 구별하였다. CD70-특이적 T 세포(CD3/CFSE 양성 세포)는 환자 종양 세포를 근절시킬 수 있었다(p=0.036).
도 7: CD70-특이적 T 세포는 림프종의 뮤린 이종이식 모델에서 생체내 항-종양 활성을 나타낸다. (도 7a, 도 7b) eGFP-FFLuc 유전자를 발현하는 Daudi 세포(5×105)를 SCID 마우스에게 복강내 주사하였다. 광 신호(광자/sec/㎠/sr)가 증가함에 따라 종양 성장을 측정하였다. 10일, 11일 및 17일째에, 마우스에게 1×107 CD70-특이적 또는 비-형질도입된 T 세포를 주사하였다. 치료 7일 후에, CD70-특이적 T 세포를 이용하여 치료된 종양은 퇴행되었고, 반면 비-형질도입된 T 세포를 이용하여 치료된 종양은 퇴행되지 않았다(P=0.002). 도 7a는 대표적인 동물의 영상을 나타낸다. 도 7b는 정량적 생물발광 영상을 나타낸다. 도 7c 및 도 7d에서, SCID 마우스에게 Raji 세포(2×105)를 정맥내 주사하였다. 4일, 5일, 및 11일째에, 마우스에게 1×107 CD70-특이적 또는 비형질도입된 T 세포를 주사하였다. (도 7c) 전신성 종양은 생물발광 영상을 이용하여 열거하였다. 종양 세포 주사 3주 및 4주 후에, CD70-특이적 T 세포보다 비형질도입된 T 세포로 치료받은 마우스에서 더욱 현저하게 높은 종양 부하가 존재하였다(3주, P= .012; 4주[n=12], P .010). (도 7d) CD70-특이적 T 세포를 이용하여 치료된 마우스는 비형질도입된 T 세포로 치료받은 마우스에 비해 현저한 생존 이점을 나타냈다(P< .05).
도 8: CD70-특이적 T 세포는 자가 B 및 T 세포에 대해 최소 반응성을 나타낸다. (도 8a) 3명의 건강한 공여자 유래의 CD70-특이적 T 세포(1×105)를 5×104 자가 T 세포, B 세포, 또는 Raji 세포의 존재시 단독으로 플레이팅하거나, PMA/이오노마이신을 이용하여 자극하였다. IFN-γ ELISPOT에 의해 측정시, PMA/이오노마이신 치료 후에 Raji 세포에 대해 강한 반응성이 나타나지만, 자가 T 또는 B 세포에 대해서는 나타나지 않는다. (도 8b) 4h 51크로뮴 방출 검사에서, CD70-특이적 T 세포는 Raji 세포를 사멸시키고, B 세포는 파쇄(blast)되지만, OKT3은 파쇄되지 않는다. 비-형질도입된 세포는 임의의 표적의 사멸을 나타내지 않는다(실선 CD70-특이적 T 세포, 파선 비-형질도입된 T 세포).
도 9: CD70-CAR 및 ΔCD70-CAR DsRed 발현 T 세포의 생성. (도 9a) 형질도입된 T 세포의 검출 및 선별을 위해 DsRed를 포함하도록 CD70-CAR 발현 카세트를 변형시켰다. ΔCD70-CAR은 CD27 엔도도메인 내의 23개의 아미노산의 PCR 결실에 의해 생성되었고, DsRed 발현 카세트에 클로닝되었다. (도 9b) 형질도입 효율은 CD70-CAR-I-DsRed 또는 ΔCD70-CAR-IDsRed를 발현하는 T 세포들 사이의 형질도입 효율은 비교가능하였다.
본 발명의 상세한 설명
본원에 사용된 바와 같이, 특허청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우 단어 "하나"는 "하나"를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나를 초과하는"의 의미와 일치한다. 본 발명의 몇몇 실시형태는 하나 이상의 요소들, 방법 단계들, 및/또는 본 발명의 방법들로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본원에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 시행될 수 있음이 고려된다.
CD70-특이적 단클론 항체를 이용한 CD70-양성 악성 종양의 표적화는 전임상 동물 모델에서 유망한 것으로 나타났고(McEarchern et al., 2008: Israel et al., 2005; McEarchern et al., 2007), 본 발명자들은 본 발명에서 T 세포가 적절한 CAR의 강제적 발현에 의해 CD70에 대해 재지정될 수 있는지의 여부를 평가하였다. CAR은 뮤린 단클론 항체로부터 유도된 세포외 항원 인식 도메인으로 이루어지므로, 이들은 완전히 인간화되지 않은 경우라도 융합시 사람 항마우스 항체(HAMA)를 유도할 수 있다(Miotti et al., 1999; Kershaw et al., 2006). 이러한 한계를 극복하기 위한 하나의 잠재적인 전략은 단클론 항체보다는 내인성 단백질 리간드 또는 수용체를 이용하여 항원 인식 도메인을 조작하는 것이다(Kahlon et al., 2004; Zhang et al., 2006). T 세포를 이용한 CD70을 표적화하기 위해서, 본 발명자들은 생리학적 CD70/CD27 상호작용의 이점을 이용하여 CD70-특이적 CAR을 생성시켰고, 이는 CD3-ζ 쇄의 세포내 도메인에 융합된 항원 인식 도메인으로서의 전장 CD27로 이루어진다. CD70 리간드를 발현하는 종양 표적에 의한 키메라 CD27-ζ의 관련은 T-세포 활성화 및 CD27 공동 자극을 초래하였고, 이는 CD27의 세포질 테일(cytoplasmic tail) 내의 TRAF2 결합 부위의 존재에 의존하였다. CD70-특이적 T 세포는 CD70-양성 종양 세포주뿐만 아니라 원발성 종양도 사멸시켰고, 뮤린 SCID 이종이식 모델에서 항종양 활성을 가졌다.
I. 본 발명의
키메라
수용체 및 이의 용도의 실시형태
본 발명의 실시형태로, CD70의 수용체 및 세포내 신호전달 도메인을 암호화하는 키메라 수용체가 있다. 구체적 양상에서, CD70 수용체는 CD70 항원을 인식하는 폴리펩타이드이다. 구체적 실시형태에서, CD70의 수용체는 CD27이다.
특수 실시형태에서, 본 발명의 키메라 수용체에서 임의의 적합한 세포내 도메인이 사용되지만, 구체적 실시형태에서는 CD3의 제타 쇄의 일부 또는 전부이다. 구체적 실시형태에서, 세포내 수용체 신호전달 도메인은 CD3의 제타 쇄 등의 T 세포 항원 수용체 착체의 신호전달 도메인이고, 또한 예를 들면, Fcγ RIII 공동자극 신호전달 도메인, CD28, DAP10, CD2, 단독 또는 CD3제타와의 시리즈이다. 구체적 실시형태에서, 세포내 도메인(이는 세포질 도메인으로서 언급될 수 있다)은 TCR 제타 쇄, CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, ILRB/CD122, IL-2RG/CD132, 및 CD40 중 하나 이상의 일부 또는 전부를 포함한다. 하나 또는 다수의 세포질 도메인을 소위 제3 생성으로서 사용할 수 있고, CAR은 예를 들면, 첨가제 또는 시너지 효과를 위해 함께 융합된 적어도 2 또는 3개의 신호전달 도메인을 갖는다.
본 발명에 따른 면역 수용체는 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 수단에 의해 제조될 수 있지만, 바람직하게는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된다. 키메라 수용체의 몇몇의 영역을 암호화하는 핵산 서열은 분자 클로닝의 표준 기술(게놈 라이브러리 스크리닝, PCR, 프라이머-보조 라이게이션, 부위-지정된 돌연변이 등)에 의해 완전한 암호화 서열로 제조 및 조립될 수 있다. 얻어진 암호화 영역은 바람직하게 발현 벡터 내로 삽입되어, 면역 수용체의 발현을 위해, 적합한 발현 숙주 세포주, 바람직하게는 T 림프구 세포주, 및 가장 바람직하게는 자가 T 림프구 세포주, 제3자 유도된 T 세포주/클론, 형질전환된 체액 또는 이종발생성 면역학적 효과기 세포주를 형질전환하는데 사용된다. 또한, NK 세포, 대식 세포, 호중구, LAK 세포, LIK 세포, 및 이들 세포로 분화하는 줄기 세포도 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 류코파레시스(leukopharesis)에 의해 림프구를 환자로부터 수득하고, 자가 T 세포를 형질도입하여 제타카인을 발현시키고, 임의의 임상적으로 허용가능한 수단에 의해 개체에게 다시 투여하여 항암 치료요법을 달성한다.
치료학적 효과를 위한 적합한 용량은 바람직하게는 일련의 투약 주기에 있어서 용량당 약 106 내지 약 109 세포일 것이다. 바람직한 투약 요법은 0일째에 약 107 세포에서 출발하여 5일째까지 약 108 세포의 목표 용량까지 증분 증가하는 상승 용량의 1주 4회 투약 주기로 이루어진다. 적합한 투여 방식은 정맥내, 피하, 강내(예를 들면, 리저버-액세스(reservoir-access) 장치), 복강내, 및 종양 덩어리로의 직접 주사를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 작제물 또는 핵산 서열은, 형질전환되거나 T 세포에 도입되어, 전사 및 해독되어 생성물(예를 들면, 키메라 수용체)을 제조할 수 있는 DNA 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 그 예로, GenBank® 수탁 번호 제NM_001242호는 CD27에 대한 뉴클레오타이드 서열을 제공하고, 이는 본원에 참조로 인용된다. CD27 이외에, CD27-ζ 분자는 CD3-ζ 쇄의 신호전달 도메인을 함유한다(GenBank® 수탁 번호 제NP_000725.1호 및 제NP_932170.1호).
본 발명에서 사용된 핵산 작제물에 있어서, 프로모터는 본 발명의 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되고, 즉 이들은 키메라 수용체를 암호화하는 DNA로부터의 메신저 RNA의 전사를 촉진하도록 위치한다. 프로모터는 게놈 기원이거나 합성적으로 생성될 수 있다. T 세포에서 사용하기 위한 다양한 프로모터는 당해 분야에 잘 알려져 있다(예를 들면, Marodon et al. (2003) Blood 101(9): 3416-23에 의해 기재된 CD4 프로모터). 프로모터는 항상성 또는 유도성일 수 있고, 여기서 유도는 예를 들면, 특정 세포 유형 또는 특정 수준의 성숙과 관련된다. 대안으로, 다수의 잘 알려져 있는 바이러스 프로모터도 적합하다. 목적의 프로모터로는 β-액틴 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 사람 사이토메갈로바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 및 프렌드 비장 병소-형성 바이러스 프로모터(Friend spleen focus-forming virus promoter)가 포함된다. 프로모터는 인핸서와 관련되거나 관련되지 않을 수 있고, 여기서 인핸서는 자연히 특수 프로모터와 관련되거나 상이한 프로모터와 관련될 수 있다.
키메라 수용체를 암호화하는 개방 판독 프레임의 서열은 게놈 DNA 근원, cDNA 근원으로부터 수득할 수 있거나, 합성될 수 있거나(예를 들어, PCR을 통해), 이들의 조합일 수 있다. 인트론이 mRNA를 안정화하거나 T 세포-특이적 발현을 제공한다는 것이 발견되었으므로(Barthel and Goldfeld (2003) J. Immunol. 171(7):3612-9), 게놈 DNA의 크기 및 인트론의 수에 따라 cDNA 또는 이들의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 내인성 또는 외인성 비-암호화 영역을 사용하여 mRNA를 안정화하는 것이 더욱 유리할 수 있다.
본 발명의 키메라 수용체의 발현을 위해, 키메라 수용체의 N-말단 성분을 암호화하는 핵산 서열의 자연 발생 또는 내인성 전사 개시 영역을 사용하여 표적 숙주에서 키메라 수용체를 생성할 수 있다. 대안으로, 항상성 또는 유도성 발현을 가능하게 하는 외인성 전사 개시 영역을 사용할 수 있고, 여기서 발현은 표적 숙주, 목적하는 발현의 수준, 표적 숙주의 특성 등에 따라 제어될 수 있다.
유사하게, 키메라 수용체를 표면 막에 지정하는 신호 서열은 키메라 수용체의 N-말단 성분의 내인성 신호 서열일 수 있다. 부가적으로, 일부 예에서, 이러한 서열을 상이한 신호 서열로 교환하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 선택된 신호 서열은 키메라 수용체가 T 세포의 표면 상에 나타나도록 T 세포의 분비 경로와 호환성(compatible)이어야만 한다.
유사하게, 종료 영역은 키메라 수용체의 C-말단 성분을 암호화하는 핵산 서열의 자연 발생 또는 내인성 전사 종료 영역에 의해 제공될 수 있다. 대안으로, 종료 영역은 상이한 근원으로부터 유도될 수 있다. 보통, 종료 영역의 근원은 일반적으로 재조합 단백질의 발현에 중요한 것으로 여겨지지 않고, 매우 다양한 종료 영역이 발현에 유해한 효과를 미치지 않고 사용될 수 있다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 일부 예에서, CD27의 말단에서의 몇몇의 아미노산은 예를 들면, 일반적으로 10개 미만, 보다 일반적으로는 5개 미만의 잔기가 결실될 수 있다. 또한, 경계에 소수의 아미노산, 일반적으로 10개 미만, 보다 일반적으로 5개 미만의 잔기를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 아미노산의 결실 또는 삽입은 편리한 제한 부위, 조작의 용이성, 또는 발현 수준의 향상 등을 제공하는 작제의 요구 결과로서 존재할 수 있다. 추가로, 하나 이상의 아미노산의 상이한 아미노산으로의 치환은 유사한 이유로 발생할 수 있고, 임의의 하나의 도메인에서 일반적으로 약 5개 초과의 아미노산을 치환하지 않는다.
본 발명에 따른 키메라 수용체를 암호화하는 키메라 작제물은 종래 방식으로 제조될 수 있다. 보통, 천연 서열이 사용될 수 있기 때문에, 천연 유전자는 각종 성분의 적절한 참여가 가능하도록 적절하게 분리 및 조작될 수 있다. 따라서, 키메라 수용체의 N-말단 및 C-말단 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 적합한 프라이머를 이용한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용함으로써 분리될 수 있고, 이는 유전자의 바람직하지 못한 부분의 결실을 초래한다. 대안으로, 클로닝된 유전자의 제한효소 분해를 이용하여 키메라 작제물을 생성할 수 있다. 둘 중 어느 한 경우에서, 서열은, 둔단(blunt-ended)이거나 상보성 오버랩을 갖는 제한 부위를 제공하도록 선택될 수 있다.
키메라 작제물을 제조하기 위한 각종 조작은 시험관내에서 수행할 수 있고, 특수 실시형태에서 키메라 작제물은 표준 형질전환 또는 형질감염 방법을 이용한 적절한 숙주에서의 클로닝 및 발현을 위해 벡터 내에 도입된다. 따라서, 각 조작 후, DNA 서열의 참여로부터 얻어진 작제물을 클로닝하고, 벡터를 분리하고, 서열을 스크리닝하여 서열이 바람직한 키메라 수용체를 암호화함을 확인한다. 서열은 제한 분석, 또는 서열분석 등에 의해 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 키메라 작제물은, 암을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 종양의 크기를 감소시키거나 종양의 성장 또는 재-성장을 예방함으로써 암을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서의 적용을 발견한다. 따라서, 본 발명은 추가로, 본 발명의 키메라 작제물을 대상체의 분리된 T 세포에 도입하고 형질전환된 T 세포를 대상체에 재도입하여 대상체에서 종양을 감소시키거나 제거하는 항-종양 반응을 유효화함으로써 대상체에서 종양 성장을 감소시키거나 종양 형성을 예방하는 방법에 관한 것이다. 사용될 수 있는 적합한 T 세포로는 세포독성 림프구(CTL), 종양-침윤성-림프구(TIL) 또는 활성화시 표적 세포를 사멸시킬 수 있는 기타 세포가 포함된다. 당해 분야 숙련가에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 대상체로부터 이들 세포를 분리하기 위해 각종 방법이 용이하게 이용가능하다. 예를 들면, 세포 표면 마커 발현을 사용하거나 시판 키트(예를 들면, ISOCELLTM, 제조사: Pierce, Rockford, Ill)를 사용한다.
나출(naked) DNA로서의 대상체 자신의 T 세포 또는 적합한 벡터에 키메라 작제물을 도입할 수 있다는 것이 고려된다. 나출 DNA를 이용한 전기천공법에 의해 T 세포를 안정하게 형질감염시키는 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6,410,319호를 참조한다. 나출 DNA는 일반적으로 발현에 적절한 배향으로 플라스미드 발현 벡터에 함유된 본 발명의 키메라 수용체를 암호화하는 DNA를 말한다. 유리하게, 나출 DNA의 사용은 본 발명의 키메라 수용체를 발현하는 T 세포를 제조하는데 요구되는 시간을 감소시킨다.
대안으로, 바이러스 벡터(예를 들면, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터)를 사용하여 키메라 작제물을 T 세포에 도입할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 사용하기에 적합한 벡터는 대상체의 T 세포에서 비-복제성이다. 바이러스에 기초한 다수의 벡터가 공지되어 있고, 여기서 세포 내에 유지된 바이러스의 복제 개수(copy number)는 세포의 생존성을 유지하기에 충분히 낮다. 예시의 벡터로는 본원에 기재된 pFB-neo 벡터(STRATAGENE®)뿐만 아니라 HIV, SV40, EBV, HSV, 또는 BPV에 기초한 벡터가 포함된다.
일단 형질감염되거나 형질도입된 T 세포가 바람직하게 조절되어 바람직한 수준으로 표면 막 단백질로서 키메라 수용체를 발현할 수 있음이 확립되면, 키메라 수용체가 숙주 세포에서 기능성이어서 바람직한 신호 유도를 제공하는지의 여부를 결정할 수 있다. 후속적으로, 형질도입된 T 세포를 대상체에게 재도입하거나 투여하여 대상체에서 항-종양 반응을 활성화한다. 투여를 용이하게 하기 위해서, 본 발명에 따른 형질도입된 T 세포를 적절한 담체 또는 희석제와 함께 약제학적 조성물로 제조하거나 생체내 투여에 적절한 임플란트로 제조할 수 있고, 이는 추가로 약제학적으로 허용가능할 수 있다. 이러한 조성물 또는 임플란트를 제조하는 수단은 당해 분야에 기술되어 있다(예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. (1980) 참조). 적절한 경우, 형질도입된 T 세포는 이들의 각각의 투여 경로를 위한 일반적인 방식으로 캡슐, 용액, 주사액, 흡입제 또는 에어로졸과 같은 반고체 또는 액체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 당해 분야에 공지되어 있는 수단을 이용하여, 표적 조직 또는 기관에 도달할 때까지 조성물의 방출 및 흡수를 예방하거나 최소화하거나, 조성물의 지연된 방출을 확보할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 형태를 사용하고, 이는 키메라 수용체를 발현하는 세포를 비유효화하지 않는다. 따라서, 바람직하게는 형질도입된 T 세포를 평형 염 용액(balanced salt solution), 바람직하게는 Hanks 평형 염 용액, 또는 일반 염수를 함유하는 약제학적 조성물로 제조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 암을 치료하는데 유용한 기타 잘-확립된 제제와 병용하여 사용될 수 있다. 단독으로 또는 다른 제제와 병용되어 전달되는지에 관계없이, 본 발명의 약제학적 조성물은 각종 경로를 통해 포유동물, 특히 사람 신체의 각종 부위에 전달되어 특수 효과를 달성할 수 있다. 당해 분야 숙련가는, 하나 이상의 경로가 투여에 사용될 수 있지만 특수 경로가 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 흑색종의 치료를 위해서는 흡입보다 피내 전달이 유리하게 사용될 수 있다. 제형의 체강으로의 도포 또는 점적(instillation), 에어로졸의 흡입(inhalation) 또는 취입(insufflation)을 포함한 투여에 의해, 또는 근육내, 정맥내, 문맥내(intraportal), 폐내, 복막, 피하, 또는 피내 투여를 포함하는 비경구 도입에 의해 국소 전달 또는 전신 전달이 달성될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단위 용량 형태로 제공될 수 있고, 여기서 각각의 용량 단위, 예를 들면, 주사는 소정량의 조성물을 단독으로 또는 다른 활성 제제와 적절히 병용하여 함유한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 단위 용량 형태는 사람 및 동물 대상체에 대한 단일의 용량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 말하고, 각각의 단위는 소정량의 본 발명의 조성물을 단독으로 또는 다른 활성 제제와 병용하여 함유하고, 적절한 경우 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 비히클과 관련하여 바람직한 효과를 생산하기에 충분한 양으로 계산된다. 본 발명의 신규 단위 용량 형태에 대한 사양은 특수 대상체에서 약제학적 조성물과 관련된 특수 약력학에 의존한다.
바람직하게는 유효량 또는 충분한 수의 분리된 형질도입된 T 세포가 조성물 중에 존재하고, 대상체에 도입되어 종양의 크기를 감소시키거나 이러한 치료의 부재시 초래되는 것에 비해 종양 성장 또는 재성장을 제거하도록 장기, 특이적, 항-종양 반응을 확립한다. 바람직하게는 형질도입된 T 세포의 대상체로의 재도입량은, 형질도입된 T 세포가 존재하지 않는 것을 제외하고는 동일한 조건에 대해 비교시 종양 크기에 있어서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%의 감소를 야기한다.
따라서, 형질도입된 T 세포의 투여량은 투여의 경로를 고려해야만 하고, 충분한 수의 형질도입된 T 세포가 도입되어 바람직한 치료학적 반응을 달성하도록 해야만 한다. 또한, 본원에 기술된 조성물에 포함된 각각의 활성 제제의 양(예를 들면, 각 세포당 접촉되는 양 또는 특정 체중당 양)은 다양한 적용에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로, 형질도입된 T 세포의 농축은 치료되는 대상체에게 바람직하게는 적어도 약 1×106 내지 약 1×109의 형질도입된 T 세포, 보다 바람직하게는 약 1×107 내지 약 5×108의 형질도입된 T 세포를 제공하기에 충분하여야 하지만, 상기 중 어느 하나의 임의의 적합한 양, 예를 들면 5×108 초과의 세포, 또는 예를 들면, 1×107 미만의 세포를 사용할 수 있다. 투약 스케쥴은 잘-확립된 세포-기반 치료요법(예를 들면, Topalian and Rosenberg (1987) Acta Haematol. 78 Suppl 1:75-6; 미국 특허 제4,690,915호 참조)에 기초할 수 있거나, 또는 대안의 연속 융합 전략으로 사용할 수 있다.
이들 값은 본 발명을 수행하기 위한 본 발명의 방법의 최적화에 따라 수행자에 의해 사용되는 형질도입된 T 세포의 범위의 일반적 지침을 제공한다. 이러한 범위의 본원에서의 인용은 특수 적용에서 보증될 수 있는 바와 같이, 보다 많거나 보다 적은 양의 성분을 사용하는 것을 불가능하게 하는 것은 결코 아니다. 예를 들면, 실제 용량 및 스케쥴은 조성물이 다른 약제학적 조성물과의 조합으로 투여되는지의 여부에 따라, 또는 약동학, 약물 기질, 및 대사에서의 개인 간의 차이에 따라 변할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 특수 상황의 요건에 따라 임의의 필요한 조정을 쉽게 행할 수 있다.
II
. 본 발명의
키트의
실시형태
본원에 기재된 조성물 중 어느 하나가 키트에 포함될 수 있다. 비제한적 예시로는 키메라 수용체 발현 작제물, 키메라 수용체 발현 작제물을 생성하기 위한 하나 이상의 시약, 발현 작제물의 형질감염을 위한 세포, 및/또는 발현 작제물의 형질감염을 위한 자가 세포를 수득하기 위한 하나 이상의 기기(이러한 기기는 시린지, 피펫, 포셉스, 및/또는 임의의 이러한 의학적으로 승인된 장치일 수 있다)가 있다.
키트는 적합하게 분획된 하나 이상의 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 조성물을 생성하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트의 성분은 수성 매체 또는 동결건조 형태 중 어느 하나로 패키징될 수 있다. 키트의 용기 수단은 적어도 하나의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 보틀, 시린지, 또는 기타 용기 수단을 포함할 수 있고, 용기 수단에는 성분이 위치될 수 있고, 바람직하게는 적합하게 분획될 수 있다. 키트 내에 1개 초과의 성분이 존재하는 경우, 키트는 일반적으로 추가의 성분이 별도로 위치될 수 있는 제2, 제3, 또는 기타 추가의 용기 또한 함유할 것이다. 그러나, 성분의 각종 조합은 바이알에 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 전형적으로 키메라 수용체 작제물을 함유하기 위한 수단 및 임의의 기타 시약 용기를 시판용 밀폐 컨파인먼트(close confinement) 내에 포함할 것이다. 이러한 용기로는 주사 또는 예를 들면, 바람직한 바이알이 유지되는 블로우 성형(blow molded) 플라스틱 용기가 포함될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 일부 실시형태를 입증하기 위해 포함된다. 본 발명의 수행시 양호하게 작용시키기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 대표적 기술에 따른 기술이 본 실시예에 기재되고, 이의 수행을 위해 일부 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있음은 당해 분야 숙련가에 의해 이해되어야만 한다. 그러나, 본 기재내용의 관점에서 당해 분야 숙련가는 기재되어 있는 특정 실시형태에서 많은 변화가 이루어져도 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 동일하거나 유사한 결과를 여전히 수득할 수 있음을 이해해야만 한다.
CD19 또는 CD20을 표적화하는 유전적으로 변형된 T 세포를 이용한 T-세포 치료요법은 유망한 혈액학적 악성 종양의 면역 치료요법이다. 그러나, 이들 표적은 B-세포 유도된 악성 종양 상에만 존재하고, 이들은 조혈계에서 광범위하게 발현되므로 이들의 표적화는 바람직하지 못한 결과를 가질 수 있다. B 세포 유도된 것이 아닌 혈액학적 악성 종양에 대한 T-세포 치료요법을 확장하기 위해서, 본 발명자들은 T 세포가 CD70에 대해 재지정될 수 있는지의 여부를 측정하였고, 항원은 정상 림프구 및 수지상 세포의 한정된 서브세트에 의해 발현되었지만, 광범위한 혈액학적 악성 종양 및 몇몇의 고형 조양에 의해 비정상적으로 발현되었다. CD70-특이적 T 세포를 생성하기 위해, 본 발명자들은 CD3-ζ 쇄에 융합된 CD70 수용체(CD27)를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 작제하였다. CD70-특이적 CAR을 발현하는 T 세포의 자극은 IFN-γ 및 IL-2 분비에 의해 그리고 종양 세포 사멸에 의해 나타낸 바와 같이 CD27 공동자극 및 CD70-양성 종양 세포주 및 원발성 종양 세포의 인식을 초래하였다. 양자 도입된(adoptively transferred) CD70-특이적 T 세포는 확립된 뮤린 이종이식체의 지속적인 퇴행을 유도하였다. 따라서, CD70-특이적 T 세포는 CD70-양성 악성 종양에 대해 유용한 면역치료학적 접근법이다.
실시예
1
예시 재료 및 방법
세포주 및 종양 세포
혈액 샘플 또는 원발성 종양 세포를 수득하기 위한 프로토콜은 베일러 컬리지 오브 메드신 인스티튜셔날 리뷰 보드(IRB)에 의해 승인되었다. 세포주 Daudi, CCL-120, U266, 및 K562는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 수득하였다. CD70을 발현하는 K562 세포(K562.70)는 사람 CD70 및 GFP를 암호화하는 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터를 이용하여 K562 세포를 형질도입함으로써 생성시켰다. L1236은 DSMZ(Braunschweig, Germany)로부터 수득하였다. SNK6 및 SNT16은 노리오 시미주 박사(Tokyo Medical and Dental University, Japan)에 의해 제공되었다(Nagata et al., 2001). 시험관내에서 배양하지 않고 저온보존된 원발성 B-세포 비-호지킨 림프종이 슈테판 안셀 박사(Mayo Clinic, Rochester, MN, USA)에 의해 제공되었다.
CD70-특이적 CAR 작제물의 생성
전장 사람 CD27(CD70 수용체)은 프레임 내에서 오버랩 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 T-세포 수용체 ζ-쇄(TCR-ζ)의 신호전달 도메인(아미노산 52-164)에 융합되었고, pORF.CD27(Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 pSFG.FRP5.ζ(Ahmed et al., 2007)는 PCR 주형(template)으로서 작용하였다. 프라이머는 변형되어 5'-NcoI 및 3'-SphI 제한 부위를 생성하였고, CD27 TCR-ζ 융합 유전자(CD70-CAR)는 SFG 레트로바이러스 벡터로 서브클로닝되었다. 형질도입된 T 세포의 명백한 검출을 용이하게 하기 위해서, 내부 리보솜 유입 서열(IRES) 절단된 CD19(tCD19)(Tey et al., 2007) 발현 카세트(IRES-tCD19)는 오버랩 PCR에 의해 생성되었고, CD27 TCR-ζ 융합 유전자의 3'을 SFG 레트로바이러스 벡터의 5'-SphI 및 3'-AccIII 제한 부위로 서브클로닝하였다(pSFG.CD70-CAR-IRES-tCD19; 도 1a). 또한, CD27의 23개의 아미노산 TRAF2 결합 부위(잔기 238-260)가 결실된 CD70-CAR-IRES-DsRed 발현 카세트 또는 ΔCD70-CAR-IRES-DsRed 발현 카세트를 함유하는 레트로바이러스 벡터가 생성되었다((Yamamoto et al., 1998); 도 8).
레트로바이러스 제조 및 T-림프구의 형질도입
RD114 슈도타입(pseudotyped) 레트로 바이러스 입자는 GeneJuice 형질감염 시약(Novagen, San Diego, CA)을 이용하여 CD70-CAR SFG 레트로바이러스 벡터, MoMLV gag-pol에 대한 서열을 함유하는 Peg-Pam-e 플라스미드, 및 RD114 엔벨로프를 함유하는 RDF 플라스미드(Kelly et al., 2000)로의 293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성되었다(Vera et al., 2006). 48 내지 72시간 후에 레트로바이러스를 함유한 상청액을 수집하였다. 레트로바이러스 형질도입을 위해, 비-조직 배양액 처리된 24-웰 플레이트를 OKT3(Ortho Biotech, Bridgewater, NJ) 및 CD28(Becton Dickinson, Mountain View, CA) 항체로 밤새 처리하였다. 다음날, 0.5×106의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 각각의 웰에 가하고, 10% 가열 불활성화된 소 태아 혈청(FCS) 및 1% GlutaMaxTM(Gibco-BRL)를 함유하는 RPMI 1640 완전 배지(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)에서 배양하였다. 3일째에 상기 배양액에 재조합 사람 인터류킨-2(rhIL-2; 200U/mL; Proleukin; Chiron; Emeryville, CA)를 가하였다. 바이러스 상청액을 RetroNectin®(Takara Shuzo, Otsu, Japan)으로 사전-처리한 바이러스 상청을 24-웰 플레이트에 가하였고, 배양된 OKT3/CD28 자극 세포를 각 웰에 가하였다(5×105 세포/웰). 세포를 회전시키고 5% CO2 중의 37℃에서 항온배양하였다. T 세포 상의 CAR 발현을 72시간 후에 측정하였고, 세포는 3일마다 rhIL-2(50 내지 100U/mL)를 첨가하여 완전 배지에서의 배양을 유지하였다. 대조군으로서 사용된 비-형질도입된 T 세포는 OKT3/CD28을 이용하여 활성화시켰고, 사용하기 전에 10 내지 15일 동안 mL당 50 내지 100 단위의 IL-2 존재시 증식하였다.
유동 세포측정법
FACS Calibur 기기(BD Biosciences)를 사용하여 면역형광 데이터를 획득하였고, 이 데이터는 FCS Express 소프트웨어 버젼 3(De Novo Software, Los Angeles, CA)을 이용하여 분석하였다. 표면 염색을 위한 모든 항체는 BD Biosciences로부터 구매하였다. 이소타입 대조군은 면역글로불린 G1-플루오레세인 이소티오시아네이트(IgG1-FITC), IgG1-피코에리트린(IgG1-PE), IgG1-페리디닌 클로로필 단백질(IgG1-PerCP), 및 IgG1-알로피코시아닌(IgG1-APC)이었다. 사멸 세포로부터 살아있는 세포를 식별하기 위해서 전방 및 측방 산란 게이팅(forward and side scatter gating)을 사용하였다. CD70-CAR 발현은 CD27-FITC, CD19-PE를 이용하여 293 T 세포 상에서 그리고 CD19-PE, CD3-FITC, CD4-PerCP, 및 CD8-APC를 이용하여 사람 CD3/CD28 자극된 T 세포 상에서 분석하였다. 종양 세포 상의 CD70 발현은 CD70-PE를 이용하여 측정하였다. 세포내 염색을 위해, 세포를 4% 파라포름알데하이드(BD)로 고정시키고 1% 사포닌(Sigma)으로 투과화시켰다. 1차 염색을 위해 Bcl-xl에 대한 마우스 단클론 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)를 사용하였고, 2차 염색을 위해 염소 항-마우스 APC(GAM-APC; BD)를 사용하였다. 이소타입 대조군은 GAMAPC만을 이용하여 항온배양된 세포였다.
사이토킨 제조의 분석
건강한 공여자 유래의 CD70-특이적 또는 비-형질도입된 T 세포는 48-웰 플레이트에서 2:1의 효과기 대 표적 비율로 CD70-양성 세포주 또는 원발성 CD70-양성 림프종과 공동-배양하였다. 항온배양 24시간 후, 배양 상청을 수거하였고, 본 발명자들은 제조사(R&D Systems, Minneapolis, MN)의 지침에 따라 ELISA에 의해 IFN-γ 및 IL-2를 측정하였다.
IFN-γ ELISPOT 검사
본 발명자들은 앞서 설명한 바와 같이 ELISPOT 검사를 사용하여(Gottschalk et al., 2003) IFN-γ-분비 T 세포의 빈도를 측정하였다. CD70-CAR 또는 비형질도입된 T 세포를 1×105으로 플레이팅하고, 적절하게 자극하면서 18시간 동안 항온배양하였다. 이어서, 플레이트를 전개시키고, 밤새 건조하여, 정량을 위해 ZellNet Consulting(New York, NY)으로 보내었다.
공동-면역침전
CD70-CAR 또는 ΔCD70-CAR을 안정하게 발현하는 293 T 세포는 레트로바이러스 형질도입에 의해 생성되었다. CAR을 발현하는 세포를 GeneJuice 형질감염 시약(Novagen, San Diego, CA)을 이용하여 Jinhua Yang 박사(Baylor College of Medicine)에 의해 제공된 2μg의 FLAG-태그된 TRAF2로 형질감염시켰다. 형질 감염 24시간 후, 세포를 K562.70 세포와 1:1 비율로 공동-배양하여 수용체를 가교시켰다. 12시간 후, 세포를 빙냉 PBS(Sigma, St. Louis, MO)로 세척하고, 비-부착 K562.70 세포를 배양액으로부터 흡입하였다. 잔존하는 293 T 세포를 용해시키고, 단백질은 μMACSTM 단백질 G MicroBeads 및 μColumn(Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA)을 이용하여 항-FLAG® M2 항체(Sigma)와 함께 침전시켰다. 면역침전물을 SDS-PAGE에 의해 분리하였고, CD3-ζ 항체(Santa Cruz Biotechnology)로 블로팅하였다.
크로뮴-방출 검사
사전에 기술된 바와 같이 3중으로 표준 크로뮴-방출 검사를 수행하였다(Gottschalk et al., 2003). 간략하게, 1×106 표적 세포를 0.1mCi(3.7MBq) 51Cr로 표지하였고, 효과기 세포의 수를 감소시키면서 혼합하여 40:1, 20:1, 10:1 및 5:1의 효과기 대 표적 비율을 제공하였다. 완전 배지 단독 또는 1% Triton X-100에서 항온배양된 표적 세포를 사용하여 자발적인 51Cr 방출 및 최대 51Cr 방출을 각각 측정하였다. 4시간 후, 상청을 수집하였고, 감마 카운터(Cobra Quantum; PerkinElmer; Wellesley; MA)에서 방사능을 측정하였다. 하기 식에 따라 3중 웰의 특이적 용해의 평균 백분율을 계산하였다: [시험 방출 - 자발적 방출] / [최대 방출 - 자발적 방출] × 100.
CFSE 증식 및 장기 사멸 검사
T-세포 증식 및 장기 사멸을 측정하기 위해서, 본 발명자들은 1×107의 T 세포를 1.5μM의 카복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)와 실온에서 10분 동안 항온배양하였다. 본 발명자들은 CFSE-표지된 T 세포를 외인성 IL-2의 부재 하에 적절한 CD70-양성 또는 CD70-음성 종양 세포와 2:1의 효과기:표적 비율로 배양하였다. 공동-배양 5 내지 7일 후, 세포를 수집하고, CD3으로 염색하고, FACS 분석에 의해 CFSE 희석액에 대해 분석하였다. 증식 실험을 위한 양성 및 음성 대조군은 각각 100U/ml의 rhIL-2의 존재하에 배양된 T 세포 및 사이토킨 부재 하의 단독의 T 세포였다. 장기 사멸 실험을 위해, 전방 및 측방 산란 게이팅을 이용하여 FACS 분석을 수행하여 살아있는 세포를 측정하였고, 한편 CFSE 염색 및 CD3-양성성을 이용하여 CD3-음성, 비표지된 종양 세포로부터 CD70-특이적 또는 비-형질도입된 T 세포를 구별하였다.
이종이식 모델 및 생물발광 영상
모든 동물 실험은 Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee에 의해 승인된 프로토콜 하에 수행하였다. 생체내 CD70-특이적 T 세포의 항종양 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 2마리의 SCID 마우스 모델 및 IVIS 생체내 영상 시스템(Caliper Life Sciences)을 사용하였다(Ahmed et al., 2007). 8 내지 10주령 SCID 마우스(IcrTac:ICR-Prkdcscid; Taconic)를 거의 치사량에 가깝게 조사하였고(2.5Gy), 2일 후에, Matrigel(BD Biosciences)에 현탁된, 향상된 GFP(eGFP)-반딧불이 루시페라제(eGFP-FFLuc) 융합 유전자를 발현하는 5×105의 Daudi 세포를 IP 주사하였다. 종양 성장을 모니터링하기 위해, 이소플루란-마취된 동물에 D-루시페린(150mg/kg)을 IP 주사하였고, 생물발광 영상을 수득하였고, 10분 후에 Living Image 소프트웨어 버젼 4.0(Caliper Life Sciences)을 이용하여 분석하였다. 목적한 불변 영역이 종양 영역보다 더 도출되었고, 스테라디안당 평방 센티미터당 초당 총 광자(p/s/㎠/sr)로서 측정된 신호의 강도를 수득하였다. 10일 후, 종양 신호가 지속적으로 증가하는 경우, 마우스를 CD70-특이적 또는 비형질도입된 T 세포로 치료하였다. 3회의 1×107개의 T 세포의 IP 주사를 10일, 11일, 및 17일째에 제공하였고, 이어서 1500U의 rhIL-2(R&D Systems) 또한 IP 제공하였다. 각 T-세포 주사 전에 그리고 그 후 매주 3회 마우스를 영상화하였다. 본 발명자들은 Raji SCID 이종이식체를 사용하여 전신성 비-호지킨 림프종 모델에서의 CD70-특이적 T 세포의 항종양 활성을 평가하였다(Brentjens et al., 2003; Cheadle et al., 2008; Tammana et al., 2010). 간략하게, 거의 치사량에 가깝게 조사된(2.5Gy) SCID 마우스에게 2×105의 Raji.FFluc 세포를 IV 주사하였고, 이는 4일 후에 1×107의 CD70-특이적 또는 비형질도입된 T 세포의 IV 투여에 의해 치료되었다. 본 발명자들은 1500U의 rhIL-2를 이용하여 3용량의 T 세포를 제공하였다(4, 5, 및 11일째). 본 발명자들은 생물발광 영상화를 이용하여 전이성 종양을 정량하였다. 생존 분석을 위해, 걸을 때 하나의 또는 둘 다의 다리를 끄는 것으로 정의되는 뒷다리 마비의 첫 징후시에 마우스를 안락사시켰다.
통계학적 분석
CD70-특이적 및 비형질도입된 T 세포 사이의 IFN-γ 및 IL-2 분비의 비교는 윌콕슨 부호-순위 시험(Wilcoxon signed-rank test)을 이용하여 수행하였다. 종양 체적 데이터는 로그 변형되었고, 개시 T-세포 주사로부터 치료-후 측정까지의 변화를 계산하였다. 쌍별 비교(pairwise comparison)를 사용하여 2개의 T 세포 그룹 사이의 광 강도에 있어서의 임의의 통계학적으로 현저한 차이를 확인하였다. 0.05 미만의 p-값을 통계학적으로 현저한 것으로 여겼다. 생존 곡선은 카플란-마이어 방법을 이용하여 구성하였고, 칭량된 장-범위 시험을 이용하여 비교하였다.
실시예 2
CD70-특이적 T 세포의 생성
본 발명자들은 T-세포 수용체 ζ 쇄의 신호전달 도메인에 융합된 CD70 수용체, CD27(CD70-CAR)을 암호화하는 SFG 레트로바이러스 벡터를 작제하였다. 최대 나이브(naive) 및 메모리 T 세포가 낮은 수준의 CD27을 내인성으로 발현하므로, IRES-tCD19 발현 카세트도 레트로바이러스 벡터에 포함되어 형질도입된 세포의 명백한 검출을 가능하게 하였다(도 1a). CD27 및 tCD19는 tCD19가 CD70-CAR 발현에 적합한 마커임을 나타내는 직선상 공동-발현 패턴을 나타내었다(도 1b). CD3/CD28 활성화된 T 세포는 CD70-CAR-IRES-tCD19를 암호화하는 RD114-슈도타입 레트로바이러스 입자를 이용하여 형질도입되었고, 형질도입 10 내지 14일 후에 tCD19의 발현을 FACS 분석에 의해 측정하였다. 45%(+/-6; n=5) T 세포의 평균은 tCD19를 발현하였고, CD4- 및 CD8-양성 세포 둘 다는 형질도입되었다(도 1c 및 도 1d).
실시예 3
CD70
-특이적 T 세포는 면역자극성
사이토킨을
분비하고
CD70
-양성 종양 세포에 노출 후에 증식한다
형질전환 T 세포에 의해 CD70의 인식을 검출하기 위해, 본 발명자들은 초기에 CD70-음성 K562 세포 및 CD70-형질전환 K562 세포를 사용하였다(도 2). 3명의 공여자의 CD70-특이적 T 세포 및 비형질도입된 T 세포를 K562 또는 K562.70으로 자극하였고, 48시간 후에 본 발명자들은 IFN-γ 및 IL-2 방출을 측정하였다(도 3a 및 도 3b). CD70-특이적 T 세포는 비-형질도입된 T 세포와 비교하여 K562.CD70에 대해 노출 후 현저한 양의 IFN-γ(p=0.03) 및 IL-2(p=0.02)를 제조하였다. 또한, CD70-음성 K562 세포는 CD70-특이적 T 세포를 활성화하지 않았고, 이는 사이토킨 제조가 표적 세포 상의 CD70의 발현 및 T 세포 상의 CD70-CAR의 존재 둘 다를 요구한다는 것을 나타낸다. 본 발명자들이 이들 배양액 조합 각각에서의 T-세포 증식을 비교하였을 때 유사한 결과가 나타났다(도 3c).
본 발명자들은, CD70 발현이 본래 존재하지만 다양한 수준으로 존재하는 종양 세포를 사용함으로써 상기 발견을 확인하였다. 이들은 비-호지킨 림프종(Daudi, SNK6, SNT16), 호지킨 림프종(L1236), 백혈병(CCL-120) 및 다발성 골수종(U266; 도 2)을 나타내는 CD70-양성 종양 세포주의 패널을 사용하였다. CD70-특이적 T 세포는 비-형질도입된 T 세포보다 현저하게 많은 IFN-γ(p<0.0001) 및 IL-2(p<0.0001)를 분비하였다(도 3a 및 도 3b). T-세포 증식은 표적 세포 상의 CD70의 발현에 의존하였고, CD70dim 종양 세포(Daudi)는 CD70bright 종양 세포보다 적은 T-세포 증식을 유도하였다. 또한, 본 발명자들은 SNT16 세포로의 자극 후에 비형질도입된 T 세포의 증식을 관찰하였고, 본 발명자들은 CD70-특이적 T 세포의 IL-2 제조를 유도하는 능력에 의해 판단되는 바와 같이 SNT16 세포에 의한 IL-2 분비의 낮은 수준 및 공동-자극하는 이들의 강한 능력에 기여하였다(도 1b). CD70의 발현은 건강한 공여자 유래의 말초혈 B 및 T 세포 상에서 낮은 정도 내지 부재였다(도 2). 따라서, 본 발명자들은 초기 B 또는 T 세포와의 공동배양 후에 CD70-특이적 T 세포의 IFN-γ 또는 IL-2 제조를 검출할 수 없었다. CD70-특이적 T 세포가 B 또는 T 세포에 의해 자극되지 않음을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 IFN-γ ELISPOT 검사를 사용하였고, 이는 초기 B 또는 T 세포와의 공동배양 후에 CD70-특이적 T 세포의 활성화를 나타내지 않았다(도 8a).
실시예 4
CD70
-특이적 T 세포는
CD70
-양성 종양 세포를 사멸시키지만,
CD70
-음성 세포는 사멸시키지 않는다
이어서, 본 발명자들은 표준 4시간 51Cr-방출 검사 및 5 내지 7일 공동배양 검사 둘 다에서 CD70-특이적 T 세포에 의해 CD70-양성 표적의 사멸을 측정하였다. 4시간 51Cr-방출 검사에서, CD70-특이적 T 세포는 CD70-양성 표적 세포(K562.70, Daudi, U266, SNK6, SNK16)를 사멸시켰지만, CD70-음성 세포(K562)는 사멸시키지 않았다. 비형질도입된 T 세포는 CD70-특이성을 확인하는 사멸을 나타내지 않았다(도 4a 및 도 4b). 공동배양 검사를 위해, CD70-특이적 또는 비-형질도입된 T 세포를 CFSE로 표지하였고, 비표지된 종양 세포에 2:1의 비율로 가하였다. 5 내지 7일 후, 종양 세포를 CD3-/CFSE-음성 분획의 FACS 분석에 의해 열거하였다(도 4c). CD70-특이적 T 세포는 시험된 4개의 CD70-양성 주 모두(Daudi, U266, SNK6, SNK16)를 열거하였고, 한편 대조군 T 세포는 이들을 열거할 수 없었다(도 4d). 반면, CD3/CD28로 자극된 T 세포는 CD70-특이적 T 세포에 의해 사멸되지 않았고, MRC5 세포 상의 CD40 리간드를 이용하여 "초-생리학적으로" 활성화된 B-세포 파쇄물은 CD70-특이적 T-세포 사멸에 민감성이었다(도 8b).
실시예 5
CD27 공동자극은 CD70-특이적 자극 후의 T-세포 생존에 중요하다
23개의 아미노산의 역할을 측정하기 위해, CD27의 공동자극 도메인은 CD70-CAR의 엔도도메인 내에 위치시켰고(도 1a), 본 발명자들은 CD27 공동자극 도메인이 결실된 CD70-CAR(ΔCD70-CAR)을 생성하였다. 공동자극 도메인의 기능적 부재는, CD27 신호전달을 매개하는 주요 어댑터 단백질인 TRAF2에의 ΔCD70-CAR의 결합 불능에 의해 확인되었다(도 5a). T 세포는 CD70-CAR-I-dsRed 또는 ΔCD70-CAR-I-dsRed를 암호화하는 레트로바이러스 벡터를 이용하여 형질도입되었다(도 9a). 작제물들 둘 다의 형질도입 효율은 dsRed 발현에 의해 판단되는 바와 같이 유사하였고(65 내지 90%; 도 9b), 세포독성 검사에서는 CD70-CAR 및 ΔCD70-CAR 발현 T 세포가 동일한 효율로 CD70-양성 표적을 사멸시켰다(도 5b). T-세포 활성화에 대한 CD27 공동자극의 기여를 평가하기 위해, 본 발명자들은, 공동자극 분자가 없고 CD70을 발현하도록 유전적으로 변형된 자가 섬유모세포(Fib.CD70)의 이점을 취하였다. Fib.CD70으로의 T-세포 자극 후 3일째에 시작하여, ΔCD70-CAR T 세포와 비교하여 활성화된 CD70-CAR T 세포에 현저하게 보다 큰 "클럼프(clump)"가 존재하였다(도 5c). T-세포 증식(도 5d) 및 IFN-γ 또는 IL-2의 제조에 있어서 차이가 존재하지 않았지만, ΔCD70-CAR T 세포 생존능은 CD70-CAR T 세포와 비교하여 현저하게 감소되었다(도 5d; P<0.05). 다른 발명자들에 의해 보고된 바와 같이, Bcl-xl, 중요한 항-아폽토시스성 단백질이 CD27 신호전달에 의해 유도된다(van Oosterwijk et al., 2007). 이러한 발견과 일치하여, CD70-CAR T 세포는 ΔCD70-CAR T 세포와 비교하여 더욱 높은 수준의 Bcl-xl을 지속적으로 발현하였다(도 5e). 이들 결과는 CD70-CAR 내에 위치하는 CD27 공동자극 도메인이 공동자극 신호를 제공하여 향상된 T-세포 생존을 초래한다는 것을 나타낸다. 따라서, 후속적인 실험 모두에 대해서, 본 발명자들은 CD70-CAR T 세포(CD70-특이적 T 세포)를 사용하였다.
실시예 6
CD70-특이적 T 세포는 원발성 B- 및 T-세포 림프종을 인식하고 사멸시킨다
CD70-특이적 T 세포가 CD70-양성 림프종 세포주를 인식하고 사멸시킨다는 것을 나타내면서, 본 발명자들은 이어서 CD70 항원을 원발성 B- 및 T-세포 림프종에 대한 표적으로서 유효화하였다. 본 발명자들은 원발성 CD70-양성 B-세포 비-호지킨 림프종(MF1792, MF1731, MF888) 및 T-세포 급성 림프아구성 백혈병(T007) 세포를 건강한 공여자 유래의 CD70-특이적 T 세포와 24시간 동안 공동배양하였고, 상청의 IFN-γ를 측정하였다. 대조군 T 세포를 제외하고 CD70-특이적 T 세포는 CD70+ 악성 종양에 노출시 IFN-γ 분비를 생성하였다(도 6a). 공동배양 검사 5일 이내에, 대조군 T 세포를 제외하고 CD70-특이적 T 세포는 초기 CD70-양성 세포를 제거하였다(도 6b 및 도 6c). 따라서, CD70-특이적 T 세포는 CD70-특이적 방식으로 원발성 CD70-양성 악성 종양 세포를 인식하고 사멸시킨다.
실시예 7
CD70-특이적 T 세포의 투여 후 확립된 림프종의 생체내 퇴축
본 발명자들은 이종 SCID 마우스 모델에서 CD70-특이적 T 세포의 항종양 활성을 측정하였다. 본 발명자들은 5×105의 Daudi.FFluc 세포를 거의 치사량에 가깝게 조사된 SCID 마우스에 i.p. 주사하였고, 이어서 마우스의 일련의 생물발광 영상화에 의해 종양 성장을 확인하였다. 10일 후, 마우스는 1×107 CD70-특이적 T 세포의 3회 주사를 투여받았고, 1일째, 그리고 이어서 1주 간격으로 제공되었다(주사일 0, 1, 및 7; n=10). 제2 그룹의 종양을 지닌 마우스에 비-형질도입된 T 세포를 주사하였다. 비-형질도입된 T 세포로 치료된 마우스에서, 생물발광 영상화에 의해 판단시 종양은 지수적으로 성장하였다(도 7a). 대조적으로, T-세포 주사 7일 후의 CD70-특이적 및 비-형질도입된 T 세포 그룹 사이의 종양 부하에 있어서 현저한 차이가 존재하였다(p=0.002)(도 7b). 종양이 성장하는 마우스 9마리 중 8마리에서, CD70-특이적 T-세포 주사 후 광자 방출이 기준선으로 되돌아왔고, 이는 T-세포 전이 후 2주 초과 동안에 7마리 마우스에서 유지되었던 종양 퇴축을 나타낸다.
제2 생체내 연구에서, 본 발명자들은 전신성 림프종 모델을 이용하여 CD70-특이적 T 세포의 항종양 활성을 측정하였다. 본 발명자들은 거의 치사량에 가깝게 조사된 SCID 마우스에게 2×105 Raji.FFluc 세포를 IV 주사하였다. 4일 후, 본 발명자들은 이전 단락에서 기술한 동일한 치료 계획을 이용하여 마우스에게 1×107 CD70-특이적 또는 비형질도입된 T 세포의 3회 IV 주사를 제공하였다. 전신성 종양은 생물발광 영상화를 이용하여 열거되었다. 종양 세포 주사 후 3주 및 4주째에, CD70-특이적 T 세포보다 비형질도입된 T 세포를 투여받은 마우스에서의 종양 부하가 현저하게 높았다(각각 P= .012 및 P= .10)(도 7c). 이는 CD70-특이적 T 세포로 치료된 마우스에서의 전체 생존에서의 현저한 증가(P< .05)로 해석되었다(도 7d).
실시예 8
중증의 만성 활성
EBV
감염과 관련된 원발성
CD70
-양성 T-세포 림프종
세포는
CD70
-특이적 T 세포에 의해 사멸된다
중증의 만성 활성 엡스타인-바 바이러스 감염(CAEBV)은 잠복 EBV 감염의 드문 합병증이다. 이는 일본에서 우세하게 발생하지만, 몇몇의 경우는 서반구에서도 보고되어 왔다(Kimura et al., 2003; Cohen et al., 2008). CAEBV에서, 자연 사멸(NK), T 세포, 또는 드물게는 B 세포가 감염되고, 이는 환자가 혈구탐식 증후군 및 NK- 또는 T-세포 림프구증식성 질환(LPD) 등의 생명을 위협하는 합병증에 걸리기 쉽게 한다(Kimura et al., 2001; Ishihara et al., 1997). CAEBV-관련 LPD에 대한 유일한 치유 선택은 현재 줄기 세포 이식이다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 CAEBV의 세팅에서 공격성 T-세포 림프종을 발전시킨 환자를 보고한다.
이제, 본 발명자들은 원발성 CAEBV-관련 T-세포 림프종 세포에서 CD70이 발현된다는 것 및 이들 세포가 CD70-특이적 T 세포에 의한 사멸에 민감성이라는 것을 입증하고, 이는 CAEBV-관련 T-세포 림프종에 대한 잠재적 면역치료학적 표적으로서 CD70을 확인한다.
실시예 9
본 발명의 특정 실시형태의 유의성
본 발명자들은, 몇몇의 혈액학적 악성 종양 및 암종에서 비정상적으로 발현되는 CD70이, 조작된 T 세포에 의해 표적화되어 CAR의 일부로서 CD27을 발현할 수 있다는 것을 나타낸다. CD70-특이적 CAR을 발현하는 T 세포는 CD70-양성 종양 세포주 및 원발성 종양 샘플을 시험관내에서 인식 및 사멸시켰고, 마우스 이종이식체에서 사람 CD70 종양을 제거하였다.
CD70은 많은 백혈병 및 림프종에 존재하지만, 계통-특이적 마커는 아니고, 생리학적으로, 단지 고도로 활성화된 T, B, 및 수지상 세포의 서브세트에서 일시적으로 발현된다. CD70 프로모터는 AP-1, AP-2, Spl, 및 NF-κB에 대한 전사 인자-결합 부위를 함유하고, 이는 메틸화에 민감성이지만; CD70 발현을 조절하는 정확한 신호전달 경로는 거의 설명되어 있지 않다(Lu et al., 2005). CD70은, CD70 발현을 조절하는데 기여할 수도 있는 경로인 구성적 NF-κB 활성화와 관련하여 유사하게 사람 T-림프영양성 바이러스 타입 1- 및 EBV-관련 악성 종양 및 호지킨 림프종에서 상향-조절된다(Nolte et al., 2009; Jost et al., 2007). 악성 종양 세포 상의 비정상적 CD70 발현의 역할은 이의 생리학적 기여보다 덜 설명되어 있지만, 이는 비-호지킨 림프종에 의한 면역 회피에 기여할 수 있다(Yang et al., 2007). 다른 발명자들은 CD70/CD27 공동자극 경로가 백혈병-특이적 T-세포 반응을 유도하는데 중요하다는 것을 발견하였다(Glouchkova et al., 2009).
대부분의 CAR의 엑소도메인은 MHC-비제한 방식으로 종양 세포를 인식 및 사멸시키는 항원-특이적 T 세포를 제조하기 위해 사용될 수 있는 변형된 단클론 항체-결합 부위로 이루어진다. 이들 단클론 항체 단편이 사람화되지 않는 경우, 이들은 사람 항-마우스 항체 및/또는 융합된 세포의 효과기 기능으로 약칭되는 내인성 T-세포 반응을 유도할 수 있다(Miotti et al., 1999; Kahlon et al., 2004; Jensen et al., 2010). 따라서, 생리학적으로 발생하는 수용체-리간드 상호작용의 이점을 취하는 것(Kahlon et al., 2004; Zhang et al., 2006)은 이러한 장애를 우회하고, 사람 대상체에서의 생체내 효과기 기능이 전이유전자에 대한 바람직하지 못한 면역 반응에 의해 방해되지 않는다는 것을 확보해야만 한다. 따라서, 본 발명자들은 천연적으로 발생하는 CD70 수용체 CD27에 CD3-ζ 쇄를 융합함으로써 CD70-특이적 CAR을 작제하였다.
CD70-양성 종양 세포를 이용한 CD70-특이적 T 세포의 자극은 IFN-γ 및 IL-2 둘 다의 분비를 초래하였다. ζ-신호전달 도메인만을 함유하는 CAR의 유발은 IFN-γ 제조를 초래하지만, IL-2는 일반적으로 항원-의존적 방식으로만 분비된다(Ahmed et al., 2007). CD70-양성 종양 세포를 이용한 CD70-특이적 T 세포의 공동배양은 CD70-특이적 T 세포에 의한 4000 내지 14000pg/mL의 IFN-γ의 제조를 초래하였고(Ahmed et al., 2009), 이는 T 세포를 발현하는 다른 CAR에 대해 보고된 범위 내이다. CAR T-세포 활성화가 표적 세포 상의 항원 밀도(Weijtens et al., 2000)뿐만 아니라 공동자극 분자의 존재(Zhao et al., 2009)에도 의존적이므로, IFN-γ 제조가 각각의 CD70-양성 종양 세포주간에 변한다는 것은 놀랍지 않다. 최저 수준의 IFN-γ 분비를 유도한 Daudi 세포는 FACS 분석에 의해 판단시 CD70 최저 발현을 가졌다. IFN-γ 제조 이외에, 본 발명자들은 종양 세포에의 노출 후 IL-2의 현저한(가변성이기도 함) 분비를 관찰하였다. 이들 차이는 종양 CD70 발현 수준에 비의존적이었고, 종래 공동자극 분자의 발현에 의존성이 아닌 것으로 나타났으며, 이는 본 발명자들이 CD80 및 CD86과 같은 전형적인 공동자극 분자를 발현하지 않는 K562.70 세포를 이용한 T-세포 자극 후에 IL-2 분비를 관찰하였기 때문이다. 그러나, 이들 세포는 NKG2D 리간드를 발현하고, 이는 사람 CD8-양성 T 세포 상에 발현된 NKG2D와 상호작용함으로써 공동자극 신호를 제공할 수 있다(Maasho et al., 2005). 또한, SNT16 및 SNK6 비-호지킨 림프종 세포는, EBV-양성, NK/T-세포 비-호지킨 림프종 세포 상의 부착 분자의 공지되어 있는 고발현과 일치하는 효과인 CD70-특이적 T 세포로부터 고수준의 IL-2 제조를 유도하였다(Kanno et al., 2008).
CD27 공동자극은 항아폽토시스성 단백질인 Bcl-xl의 상향-조절에 의해 T 세포에서의 활성화-유도된 세포 사멸을 부분적으로 예방한다(van Oosterwijk et al., 2007). 이러한 발견과 일치하여, 본 발명자들은 CD27 공동자극 도메인이 결실된 ΔCD70-CAR을 발현하는 T 세포가 전장 CD27을 갖는 CD70-CAR을 발현하는 T 세포보다 감소된 생존능 및 낮은 수준의 Bcl-xl 발현을 가졌음을 관찰하였다. 이들 데이터는 CD70-CAR T 세포가 또한 생체내에서 지연된 지속성을 나타낼 수 있음을 나타낸다. 흥미롭게도, 생체외-증식된 종양-침윤성 림프구의 생체내 효율성 데이터는 CD27의 발현이 항종양 활성과 상호관련되어 있음을 제안한다(Huang et al., 2006). 당해 분야 숙련가는 CD27 공동자극이 CAR-발현 T 세포의 지속성을 향상시키는지의 여부를 측정할 수 있다.
본 발명자들은 5 내지 7일 공동배양 검사에서 CD70-양성 종양 세포의 완전 사멸을 관찰하였지만(도 4c 및 도 4d), 본 발명자들은 표준 4시간 51Cr-방출 검사에서 보다 가변적인 수준의 종양 세포 사멸을 관찰하였다(도 4b). 이들 차이는 T-세포 비의존적일 확률이 높았고, 이는 종양 세포 분해(크로뮴 방출)의 동역학이, T 세포 자체의 효과기 기능에서의 차이보다는 퍼포린 또는 그랜자임 B와 같은 이들의 T 세포-유도된 세포독성 분자에 대한 고유한 감도에 의존하기 때문이다(Perelson et al., 1984).
본 발명의 실시형태에서, CD27-ζ CAR을 발현하는 CD70-특이적 T 세포는 림프종의 IP Daudi 및 IV Raji 모델 둘 다에서 현저한 생체내 항종양 활성을 나타냈다. IP Daudi 모델에서 관찰된 CD70-특이적 T 세포의 항종양 활성은 이전에 보고된 바와 같이 CD19-CAR을 발현하는 T 세포와 유사하였다(Tammana et al., 2010; Kowolik et al., 2006; Hoyos et al., 2010). 흥미롭게도, CD70-특이적 T 세포를 이용하여 관찰된 유지된 항종양 반응은 공동자극 도메인을 함유한 CAR을 발현하는 CD19-특이적 T 세포를 이용해서만 관찰되었다. 이는 구체적 실시형태에서, 본 발명자들이 이들의 시험관내 실험에서 나타낸 바와 같이 CD27-ζ CAR이 생체내 공동자극 신호를 제공한다는 것을 나타낸다(도 5). IV Raji 모델에서 종양 세포를 사멸시키기 위한 CD19-CAR에 대한 공동자극 도메인에 대한 요구는 논란이 많고 모순된다(Brentjens et al., 2003; Cheadle et al., 2008; Tammana et al., 2010). 이들 모순된 결과는 소정 양상에서 유전적으로 변형된 T 세포, 면역결핍 마우스의 스트레인, 및/또는 생체내 실험에 관해 사용된 특수 Raji 세포주 유도체의 생체외 제조의 차이에 의해 설명될 수 있다.
CD70은 활성화 동안 면역 세포의 서브세트에 의해 생리학적으로 발현되므로, CAR T세포를 이용한 이러한 수용체의 표적화는 잠재적으로 세포 면역 반응을 손상시킬 수 있다. 그러나, CD70이 적은 비율의 활성화된 림프구 및 수지상 세포 상에서 일시적으로만 발현되므로 본 발명자들은 바람직하지 않은 것으로 생각한다. 또한, CD27-녹아웃 마우스(임의의 CD27/CD70 공동자극이 결여됨)는 이들의 면역계에서 보호성 1차 항원-특이적 T-세포 반응으로의 단지 미미한 변화를 갖지만, 병원체 노출 후 정상 마우스와 비교하여 보다 적은 메모리 T-세포 구획을 갖는다(Hendriks et al., 2000; Nolte et al., 2009). 이들 미미한 변화는 기존 메모리 집단의 재활성화가 감염에 대한 우세한 반응인 성인 사람 대상체에서의 주요 관련성인 것으로 생각되지 않는다. 연구에 있어서, CD70-특이적 T 세포는 말초혈 B 및 T 세포에 대해 반응성을 나타내지 않았다. 본 발명자들은 또한 활성화된 T 세포가 세포독성 검사에서 CD70-특이적 T 세포에 의해 사멸되지 않음을 나타냈다(도 8b). 대조적으로, B-세포 파쇄물은 CD70-특이적 T-세포 사멸에 민감하였지만, CD40 리간드를 이용한 활성화 후 및 동종 공급 세포가 CD70 발현을 유도한 후에만 적용되었다(도 8b). 이들 결과는 CD70-특이적 T 세포가 활성화된 B 세포를 사멸시키는 잠재성을 갖는다는 것을 나타내지만, 이러한 발견의 생리학적 관련성은, 지연된 CD70 발현을 초래하는 이러한 유형의 "초-생리학적" B-세포 활성화가 생체내에서 발생하지 않으므로 불확실한 것으로 남는다. 실제로, CD70은 CD40 단클론 항체 및 리포폴리사카라이드를 이용하여 시험관내 자극한 뮤린 B 세포의 표면 상에서 쉽게 발현되지만; 인플루엔자 바이러스로 시험(challenge)된 마우스는 사실상 폐에 침윤되고 림프절을 비우는 B 세포에 대한 CD70의 표면 발현을 나타내지 않는다는 것이 입증되었다(Tesselaar et al., 2003). 유사하게, CD70-발현 B 세포는 사람에서 거의 관찰되지 않고, 실험된 편도의 10% 미만의 한정된 수의 배아 중심 B 세포 상에서 그리고 2차 림프 기관 및 말초혈의 분산된 림프구 상에서 발견된다(Hintzen et al., 1994). CD70 단클론 항체의 안전성 및 내성을 평가하는 2상 1임상 연구에서 현재까지 부작용은 보고되지 않았다(MDX-1203, NCT00944905; SGN-75, NCT01015911).
요약하면, CD70-특이적 T 세포는 CD27-ζ을 암호화하는 CAR을 이용한 유전자 전이에 의해 쉽게 생성될 수 있고, 이들 세포는 사람 종양을 시험관내 및 생체내에서 사멸시킬 수 있다. CD70-재지정된 T 세포의 양자 전이는 B 또는 T 세포-유도된 혈액학적 악성 종양 및 기타 CD70-양성 고형 종양에 대한 매력적인 면역치료학적 접근법일 수 있다.
참조문헌
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 출판물은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 출판물은 각각 개별의 공보가 구체적으로 및 개별적으로 참조에 의해 인용되는 것으로 나타내어진 경우와 동일한 정도로 참조에 의해 본원에 인용된다.
특허
미국 특허 제4,690,915호
미국 특허 제6,410,319호
출판물
본 발명 및 이의 이점이 상세하게 기재되었지만, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에서 각종 변형, 치환 및 변경이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본 출원의 범위는 본 명세서에 기재된 프로세스, 기기, 제조, 물질의 조성, 수단, 방법, 및 단계의 특수 실시형태에 한정되도록 의도되는 것은 아니다. 당해 분야의 한 숙련가는 본 발명의 기재내용으로부터 본 발명에 따라 사용될 수 있는 본원에 기재된 상응하는 실시형태와 동일한 기능을 실질적으로 수행하거나 동일한 결과를 실질적으로 달성하는, 현존하거나 후에 개발될 프로세스, 기기, 제조, 물질의 조성, 수단, 방법, 또는 단계를 쉽게 이해할 것이다. 따라서, 첨부된 특허청구범위는 이들의 범위 내에 이러한 프로세스, 기기, 제조, 물질의 조성, 수단, 방법, 또는 단계를 포함하는 것으로 의도된다.
Claims (22)
- CD70 항원을 인식하고 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
- 제1항에 있어서, 상기 수용체가 T 세포 상에 존재하는, 키메라 항원 수용체.
- 제1항에 있어서, CD70 수용체를 포함하는 것으로 추가로 정의되는, 키메라 항원 수용체.
- 제1항에 있어서, 상기 CD70 수용체가 CD27인, 키메라 항원 수용체.
- 제1항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인이 T-세포 수용체 CD3-ζ 쇄인, 키메라 항원 수용체.
- CD70 항원을 갖는 세포를 표적화하는 방법으로서,
상기 CD70 항원을 갖는 세포에 대해 제1항의 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포를 제공하는 단계를 포함하는,
CD70 항원을 갖는 세포를 표적화하는 방법. - 제6항에 있어서, 상기 CD70 항원을 갖는 세포가 암 세포 또는 자가면역 질환과 관련된 세포인, CD70 항원을 갖는 세포를 표적화하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 암 세포가 혈액학적 악성 종양 세포인, CD70 항원을 갖는 세포를 표적화하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 암 세포가 림프종 세포, 백혈병 세포, 신세포 암종 세포, 골수종 세포, 또는 교모세포종 세포인, CD70 항원을 갖는 세포를 표적화하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 암 세포가 HTLV-1-관련된 악성 종양 세포 또는 EBV-관련된 악성 종양 세포인, CD70 항원을 갖는 세포를 표적화하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 암 세포가 고형 종양 세포인, CD70 항원을 갖는 세포를 표적화하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 고형 종양 세포가 신암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포, 폐암 세포, 비인두암 세포, 흉선암 세포, 신장암 세포, 췌장암 세포, 후두암 세포, 인두암 세포, 피부암 세포, 난소암 세포, 폐암 세포, 결장암 세포, 유방암 세포, 또는 뇌암 세포인, CD70 항원을 갖는 세포를 표적화하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 류마티스 관절염, 관절염, 염증, 자가면역 뇌염, 염증성 장 질환, 대장염, 또는 루푸스인, CD70 항원을 갖는 세포를 표적화하는 방법.
- 제6항에 있어서, 제1항의 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포가 T 세포인, CD70 항원을 갖는 세포를 표적화하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 T 세포가, 개체 유래이고, 상기 키메라 항원 수용체를 포함하도록 유전적으로 변형된, CD70 항원을 갖는 세포를 표적화하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 T 세포가, 개체 유래가 아니고, 상기 키메라 항원 수용체를 포함하도록 유전적으로 변형된, CD70 항원을 갖는 세포를 표적화하는 방법.
- 개체에서 CD70-양성 악성 종양 세포를 치료하는 방법으로서,
제1항의 키메라 항원 수용체를 포함하는 종양-특이적 T 세포를 이용하여 상기 CD70-양성 악성 종양 세포를 표적화하는 단계를 포함하는,
개체에서 CD70-양성 악성 종양 세포를 치료하는 방법. - 제17항에 있어서, T 세포를 변형시켜 제1항의 키메라 항원 수용체를 하버링(harbor)하는 단계를 추가로 포함하는, 개체에서 CD70-양성 악성 종양 세포를 치료하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 개체가 추가의 항암 치료요법을 받아왔거나, 받고 있거나, 받을 것인, 개체에서 CD70-양성 악성 종양 세포를 치료하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 추가의 항암 치료요법이 외과술, 방사선, 화학 치료요법, 면역 치료요법, 또는 호르몬 치료요법인, 개체에서 CD70-양성 악성 종양 세포를 치료하는 방법.
- 제1항의 키메라 수용체를 암호화하는 발현 작제물을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적합한 용기 내에 하우징시켜 포함하는, 암에 대해 개체를 치료하기 위한 키트.
- 제19항에 있어서,
T 세포를 추가로 포함하는, 키트.
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