JP2023552895A - Ｃｄ７０をターゲティングする細胞ベースの治療剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するよう操作されたナチュラルキラー(ＮＫ)細胞であって、ＣＡＲがＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分を含むものである、ＮＫ細胞ならびに操作されたＮＫ細胞を含む組成物、操作されたＮＫ細胞を産生する方法および新生物疾患の処置のためなど操作されたＮＫ細胞の治療適用を提供する。

Description

分野
本発明は、医薬分野に広く適用可能であり、より具体的には新生物疾患を処置する方法に有用な免疫細胞ベースの治療剤に関する。

背景
腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)関連分子であり、ＣＤ２７リガンド(ＣＤ２７Ｌ)とも称されるＣＤ７０(分化抗原群７０)タンパク質は、通常の状況下であれば活性化ＴおよびＢ細胞ならびに成熟樹状細胞で一過性にだけ発現される。しかしながら、ある種の固形および血液悪性腫瘍の悪性細胞でＣＤ７０の構成的発現が記載されている。その受容体、ＣＤ２７を介する悪性細胞上のＣＤ７０発現は、とりわけＴ細胞アポトーシス誘導、Ｔ細胞疲弊および抑制性制御Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)の増量により、免疫系の回避を促進し得る。ＣＤ７０が、健常リンパ球での短い一過性ＣＤ７０発現と対照的に、ＴおよびＢ細胞リンパ腫などの高度活性化リンパ球で発現されていることから、抗ＣＤ７０抗体はＣＤ７０陽性悪性腫瘍の可能性のある治療として提案されている。

さらに最近、本発明者らは癌関連線維芽細胞(ＣＡＦ)上のＣＤ７０の発現を特徴づけた(Jacobs et al. Oncoimmunology. 2018, vol. 7(7), e1440167)。ＣＡＦは腫瘍微小環境(ＴＭＥ)の優勢成分であり、腫瘍の増殖性および侵襲性行動ならびに免疫回避に役割を有することが提唱されている。著者らは、結腸直腸癌(ＣＲＣ)検体のステージ(Ｔ１～Ｔ４)に伴いＣＤ７０陽性ＣＡＦ数が増え(ここでの図２参照)、ＣＤ７０発現がＣＲＣ患者の全生存および無進行生存の顕著な負の予測因子として作用すると報告した。

ＷＯ２０１６／０９３８７８は抗ＣＤ７０キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)に関する。ＷＯ２０１９／２１３６１０は、免疫チェックポイント遮断を備えたＣＡＲを発現するよう操作されたナチュラルキラー(ＮＫ)細胞に関する。

概要
本発明は、少なくとも一部、ＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分を含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するよう操作されたナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を使用する、癌関連線維芽細胞(ＣＡＦ)などのＣＤ７０陽性癌細胞および／またはＣＤ７０陽性腫瘍微小環境細胞への標的化の実行可能性および治療有用性に焦点を絞った、本発明者らの革新的洞察および実験的評価に基づく。

ある態様において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するよう操作されたナチュラルキラー(ＮＫ)細胞であって、ＣＡＲがＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分を含むものである、ＮＫ細胞を提供する。

さらなる態様は、操作されたＮＫ細胞および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。

他の態様は、発現可能な形式でＣＡＲをコードする核酸をＮＫ細胞の出発集団に導入することを含む、操作されたＮＫ細胞を産生する方法を提供する。所望によりおよび有利に、その後該核酸を含み、ＣＡＲの発現が可能となるＮＫ細胞を選択および／または増やすことができる。

ある態様は、治療に使用するための操作されたＮＫ細胞または医薬組成物を提供する。さらなる態様は、新生物疾患を処置する方法に使用するための操作されたＮＫ細胞または医薬組成物を提供する。関連態様は、処置を必要とする対象、特に新生物疾患を有する対象を処置する方法であって、対象に治療有効量の操作されたＮＫ細胞または医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。

本発明は、故に、ＣＡＦなどの癌性および／または腫瘍微小環境(ＴＭＥ)細胞を含み得るＣＤ７０陽性細胞を効率的に除去する能力を有する、ＣＤ７０に対する抗原特異性を有する特別に設計されたキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を用いる改善された免疫細胞ベースの治療剤に関する。腫瘍がＣＤ７０陽性癌性細胞を含んでいてもいなくても、ＣＤ７０陽性ＴＭＥ細胞の根絶は、特にＣＤ７０陽性ＣＡＦなどの後者の細胞は、腫瘍微小環境の免疫抑制性特徴に大きな役割を果たしている可能性があり、その根絶は、故に、腫瘍を、患者自身の免疫系または他の(免疫)治療剤の作用によるなどの排除により感受性とし得るため、相当な治療利益があり得る。

本発明のこれらのおよびさらなる態様および好ましい実施態様を次のセクションおよび添付する特許請求の範囲に記載する。添付する特許請求の範囲の主たる事項は、これにより、本明細書に具体的に包含される。

本発明のある実施態様による免疫細胞ベースの薬剤により誘発される治療効果の根底にあるまたは寄与すると考えらえる分子機構を説明する。キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するよう操作されたナチュラルキラー細胞であって(１)、ここで、ＣＡＲがＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分を含み(２)、ＣＤ７０分子に特異的に結合し(３)、癌関連線維芽細胞(ＣＡＦ)(４)(上部パネル)または腫瘍における癌性細胞(５)(下部パネル)の表面に露出され、それによりこれらＣＤ７０陽性細胞および腫瘍の排除を駆動または促進する。

Jacobs et al. (上掲)により報告された、正常(Ｎ)、腺腫(Ａ)、上皮内癌(Ｔｉｓ)およびＴ１～Ｔ４結腸直腸癌(ＣＲＣ)検体における線維芽細胞上のＣＤ７０発現を定量する(％ＣＤ７０陽性線維芽細胞として示す、ｙ軸)グラフを再現したものであり、－(＜１％)、＋(１～１０％)、＋＋(１１～５０％)、＋＋＋(＞５０％のＣＡＦがＣＤ７０発現)と等級付けする。

(Ａ、Ｂ)ＣＡＲ ｍＲＮＡ非存在下(ＭＯＣＫ)、ＩＬ－１５サイトカインカセットを伴うＣＡＲ ｍＲＮＡ(ＣＤ２７－ＣＡＲ)およびＩＬ－１５サイトカインカセットを伴わないＣＡＲ ｍＲＮＡ(ＣＤ２７－ＣＡＲ ｗ／ｏ ＩＬ－１５)でエレクトロポレーション２４時間後のＮＫ－９２細胞上のＣＤ２７発現の代表的ヒストグラムのオーバーレイを示す。エレクトロポレーションプロトコールのさらなる最適化および改善により、ヒストグラムは、ＣＡＲの発現増加を示して、より右寄りとなる(Ｂ)。

ＣＤ７０ターゲティングＣＡＲ－ＮＫ－９２細胞の特徴づけを示す。(Ａ～Ｂ)ＣＡＲ ｍＲＮＡ非存在下(ＭＯＣＫ)、ＩＬ－１５サイトカインカセットを伴わない(ＣＤ２７－ＣＡＲ)およびＩＬ－１５サイトカインカセットを伴う(ＩＬ－１５を伴うＣＤ２７－ＣＡＲ)ＣＡＲ ｍＲＮＡでエレクトロポレーション２４時間後のＮＫ－９２細胞上のＣＤ２７発現のパーセンテージオーバートーン(Ａ)およびデルタ平均蛍光強度(△ＭＦＩ)(Ｂ)を示すグラフを示す。(Ｃ)ＭＯＣＫ、ＣＤ２７－ＣＡＲおよびＩＬ－１５を伴うＣＤ２７－ＣＡＲでエレクトロポレーション後のＮＫ－９２細胞の上清に産生されるＩＬ－１５濃度。点線はアッセイの検出限界を示す。実験を少なくともトリプリケートで実施した。エラーバーは標準偏差を示す。＊Ｐ≦０.０５、△ＭＦＩ＝特異的ＣＤ２７ ｍＡｂ染色 －アイソタイプ対照。

ＣＤ７０^＋標的細胞株に対するＣＤ７０ターゲティングＣＡＲ－ＮＫ－９２ｓのインビトロ細胞毒性能を示す。ＣＡＲ ｍＲＮＡ非存在下(ＭＯＣＫ)、ＩＬ－１５サイトカインカセットを伴わない(ＣＤ２７－ＣＡＲ)およびＩＬ－１５サイトカインカセットを伴う(ＩＬ－１５を伴うＣＤ２７－ＣＡＲ)ＣＡＲ ｍＲＮＡでエレクトロポレーションしたＮＫ－９２細胞と、エレクトロポレーション２４時間後、種々のＣＤ７０^＋標的細胞株(Ｒａｊｉ、ＰＡＮＣ－１、ＬＩＭ２０９９およびＲＬＴ－ＰＳＣ)の、共培養４時間後の細胞死パーセンテージを示すグラフを示す。標的細胞死のパーセンテージは、フローサイトメトリーでAnnexin V⁺および／または７－ＡＡＤ^＋細胞として同定する。実験を少なくともトリプリケートで実施した。エラーバーは標準偏差を示す。＊Ｐ≦０.０５。

ＣＡＲ特異的死滅を示す、ＣＡＲの抗原認識ドメインの遮断を示す。ＣＤ７０^＋Ｒａｊｉ標的細胞株単独(Ｒａｊｉベースライン)またはＣＡＲ ｍＲＮＡ非存在下(ＭＯＣＫ)、ＩＬ－１５サイトカインカセットを伴わない(ＣＤ２７－ＣＡＲ)およびＩＬ－１５サイトカインカセットを伴う(ＩＬ－１５を伴うＣＤ２７－ＣＡＲ)ＣＡＲ ｍＲＮＡでエレクトロポレーションしたＮＫ－９２細胞と、エレクトロポレーション２４時間後、共培養４時間後の生存可能細胞のパーセンテージを示すグラフを示す。エフェクター細胞を、種々の濃度(１０μg／mL、５０μg／mLまたは１００μg／mL)の中和抗ＣＤ２７モノクローナル抗体またはＩｇＧ１アイソタイプ対照と共培養中一夜インキュベートした。生存可能標的細胞のパーセンテージはフローサイトメトリーでAnnexin V^-および７－ＡＡＤ^－細胞として同定する。実験を少なくともトリプリケートで実施した。エラーバーは標準偏差を示す。＊Ｐ≦０.０５。

ＣＤ７０ターゲティングＣＡＲ－ＮＫ－９２ｓのＩＬ－１５またはＩＬ－２１での刺激は細胞毒性能を改善することを示す。グラフは、種々のＣＤ７０^＋標的細胞株(Ｒａｊｉ、ＰＡＮＣ－１、ＬＩＭ２０９９およびＲＬＴ－ＰＳＣ)の、ＣＡＲ ｍＲＮＡ非存在下(ＭＯＣＫ)、ＩＬ－１５サイトカインカセットを伴わない(ＣＤ２７－ＣＡＲ)およびＩＬ－１５サイトカインカセットを伴う(ＩＬ－１５を伴うＣＤ２７－ＣＡＲ)ＣＡＲ ｍＲＮＡでエレクトロポレーションしたＮＫ－９２細胞と、エレクトロポレーション２４時間後、共培養４時間後の生存可能細胞のパーセンテージを示す。ＣＤ２７－ＣＡＲ ＮＫ－９２細胞を、エフェクター用量５０(ＥＤ５０)の外因性ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１サイトカインで一夜刺激した。生存可能標的細胞のパーセンテージはフローサイトメトリーでＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ^－および７－ＡＡＤ^－細胞として同定する。ベースライン条件は、エフェクター細胞非存在下のＣＤ７０^＋標的細胞の生存能を示す。実験を少なくともトリプリケートで実施した。エラーバーは標準偏差を示す。＊Ｐ≦０.０５。

実施態様の記載
ここで使用する単数表現は、文脈から明らかに他の解釈が必要でない限り、単数および複数対象を含む。

ここで使用する用語「含む」、「含み」および「含んで」は、「包含する」、「包含して」または「含有する」、「含有して」と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、付加的な、非記載メンバー、要素または方法工程を除外しない。本用語はまた「からなる」および「本質的にからなる」を含み、これらは特許用語で十分に確立された意味を有する。

終点による数値範囲の記載は、各範囲内に組み込まれる全数値および分数ならびに記載する終点を含む。これは、数値範囲が表現「～」または表現「...と...の間」または他の表現により導入されるかにかかわらず、適用される。

パラメータ、量、期間などのような測定可能な値をいうとき、ここで使用される用語「約」または「おおよそ」は、特定した値のおよびそこからの変動、例えば、特定した値のおよびそこからの±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、なおさらに好ましくは±０.１％以下の変動を、そのような変動が開示する本発明の実施に適切である限り、包含することを意味する。修飾語句「約」または「おおよそ」が言及される値はそれ自体また具体的にかつ好ましくは開示されると理解すべきである。

一群のメンバーの１以上のメンバーまたは少なくとも１個のメンバーなどの、用語「１以上」または「少なくとも１個」はそれ自体明確であり、さらなる例示の手段として、本用語は、とりわけ該メンバーの何れか一つまたは、例えば、該メンバーの任意の≧３、≧４、≧５、≧６または≧７など、該メンバーの何れか２以上および該メンバー全てまでを包含する。他の例において、「１以上」または「少なくとも１個」は１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上を意味し得る。

ここでの発明の背景の記載は、本発明の状況の説明を含む。これは、記載する資料のいずれも、本願の請求項のいずれかの優先日当時、何れかの国で、公開された、知られていたまたは技術常識の一部であることを認めると解釈してはならない。

本明細書をとおして、種々の刊行物、特許および特許公報が、特定できる引用符によって言及されている。本明細書に引用する全文献は、引用により全体として本明細書に組み込む。特に、ここで具体的に言及するそのような文献の教示またはセクションを、引用により組み込む。

他に断らない限り、技術的および科学的用語を含む、本発明の開示に使用される全用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。さらなるガイダンスの手段によって、用語定義は、本発明の教示の良好な認識のために包含される。具体的用語が本発明の特定の態様または本発明の特定の実施態様と関連して定義されるとき、そのような含意または意味は、他に断らない限り、本明細書をとおして、すなわち本発明の他の態様または実施態様の他の状況においても適用されることが意図される。

次の文章で、種々の本発明の態様または実施態様をより詳細に定義する。そのように定義された各態様または実施態様を、反することが明らかに示されない限り、任意の他の態様または実施態様と組み合わせ売る。特に、好ましいまたは有利として示される何れかの特性を、好ましいまたは有利として示される任意の１以上の他の特性と組み合わせ得る。

本明細書をとおして「１つの実施態様」、「ある実施態様」の言及は、該実施態様に関連して記載される特定の特性、構造または特徴が、本発明の少なくとも１個の実施態様に包含されることを意味する。故に、本明細書の種々の場所で見られる用語「１つの実施態様において」または「ある実施態様において」は、必ずしも全て同じ実施態様を言及しないが、その可能性もある。さらに、特定の特性、構造または特徴を、当業者には明らかなとおり、１以上の実施態様において、任意の適当な方法で組み合わせ得る。さらに、ここに記載するある実施態様は、他の実施態様に含まれる一部の特性を含み、他は含まないが、種々の実施態様の特性の組み合わせは本発明の範囲内であることを意図し、当業者には理解されるとおり、異なる実施態様を形成する。例えば、添付する特許請求の範囲において、請求する実施態様のいずれも、任意の組み合わせで使用し得る。

本発明のある代表的実施態様を説明する実験セクションで裏付けられるとおり、本発明者らは、ＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分を含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するよう操作されたナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を使用する癌関連線維芽細胞(ＣＡＦ)などのＣＤ７０陽性癌細胞および／またはＣＤ７０陽性腫瘍微小環境細胞のターゲティングの実行可能性および治療有用性を証明した。ＣＤ７０陽性癌細胞および／またはＣＡＦの効率的根絶は、増殖性疾患の処置の価値ある治療手段を提供する。

本発明は、故に、概要セクションに示す態様を含み、特にＣＡＲを発現するよう操作されたＮＫ細胞であって、ここで、ＣＡＲはＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分を含む、ＮＫ細胞；ならびにそのように操作されたＮＫ細胞を含む医薬組成物、操作されたＮＫ細胞を産生する方法および、特に癌などの新生物疾患の処置のために操作されたＮＫ細胞または医薬組成物を用いる、治療用途および方法に関する。

用語「キメラ抗原受容体」あるいは「ＣＡＲ」は、免疫エフェクター細胞により発現されたとき、細胞に標的細胞表面上の標的抗原に対する特異性および細胞内シグナル伝達を付与する、組み換えポリペプチドまたは一連のポリペプチドをいう。ある実施態様において、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激分子および／または共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「細胞内活性化ドメイン」とも称する)を含む。用語「シグナル伝達ドメイン」は、第二メッセンジャーの産生によりまたはそのようなメッセンジャーに応答することによるエフェクターとして機能することにより、規定されたシグナル伝達経路を介する細胞活性を制御するために、細胞内で情報伝達することにより作用する、タンパク質の機能的部分をいう。典型的に、ＣＡＲは、例えば抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが同じポリペプチド鎖内に含まれるように、キメラ融合タンパク質を含み得る。別の実施態様において、ＣＡＲは、例えば抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＡＲを形成するためにヘテロ二量体化するよう作られている、別のポリペプチド鎖に提供され得るように、互いに隣接していない一連のポリペプチドにより形成され得る。実例として、抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインは、各々、二量体化分子の存在により、該ドメインを含むポリペプチドを互いに結合できる、二量体化スイッチを備えて提供され得る。

用語ＣＡＲは、ここで意図されるような受容体を意味するために適切な、便利なおよび十分確立された態様を構成するが、それとは別にこの用語を使用せずに、このような受容体を、例えば、ＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分および細胞内活性化ドメインを含むポリペプチドまたは一連のポリペプチドということができ、ここで、細胞外ドメインの標的細胞表面上のＣＤ７０への結合は、細胞内活性化ドメインを介して細胞内シグナルを誘発、誘導または引き起こす。

別のＣＡＲ構築物は、典型的に連続した複数世代に属するとして特徴づけられ得る。第一世代において、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体複合体(ＣＤ３ζ)または免疫グロブリンＦｃ受容体のγサブユニット(ＦｃＲγ)と関連したゼータ鎖を含むまたはそれから本質的になる。第二世代ＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメインは、さらに、細胞内共刺激ドメイン、すなわち、ＣＤ２８、４－１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＤＡＰ１０、ＩＣＯＳまたはＯＸ４０(ＣＤ１３４)などの少なくとも１個の共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含み、第三世代ＣＡＲは、２以上のこのような共刺激エンドドメインの組み合わせを含む。

ある実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分、膜貫通ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分、膜貫通ドメインならびに共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分、膜貫通ドメインならびに１以上の共刺激分子由来の２個の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分、膜貫通ドメインならびに１以上の共刺激分子由来の少なくとも２個の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。

ある実施態様において、ＣＡＲの細胞内部分は少なくとも１個の細胞内活性化ドメインを含む。ある実施態様において、少なくとも１個の細胞内活性化ドメインはＣＤ３ζ活性化ドメイン、ＦｃＲγ活性化ドメインおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある好ましい実施態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞内活性化ドメインがＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインを含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるように、ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＡＲの細胞内部分は少なくとも１個の細胞内共刺激ドメインを含む。ある実施態様において、少なくとも１個の細胞内共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＤＡＰ１０共刺激ドメイン、ＯＸ４０共刺激ドメイン、ＩＣＯＳ共刺激ドメインおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある好ましい実施態様において、ＣＡＲは４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインおよび所望により１以上の付加的共刺激ドメインを含む。ある好ましい実施態様において、ＣＡＲは４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインを含み、他の共刺激ドメインを含まない。

記載するとおり、ＣＡＲはＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分を含む。分化抗原群２７(ＣＤ２７)分子または略してＣＤ２７もしくはＣＤ２７抗原は、ＣＤ２７Ｌ受容体または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー７(ＴＮＦＲＳＦ７タンパク質)としても知られ、２９kDa１回膜貫通Ｉ型膜糖タンパク質である。ヒトＣＤ２７前駆体は、米国国立生物工学情報センター(ＮＣＢＩ)ジェンバンク(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)Gene ID no. 939の下、注釈を付されている。ヒト野生型ＣＤ２７アミノ酸配列は、ここで下に再現するNP_001233.2配列である、ジェンバンクアクセッション番号NP_001233.2またはSwissprot/Uniprot(http://www.uniprot.org/)アクセッション番号P26842-1の下に注釈を付されているものであり得る(エントリーバージョン１９５、２０２０年１０月７日、配列バージョン２、２００９年１１月２４日)(上記データベースエントリーにおいて注釈を付されているＣＤ２７分子のシグナルまたはリーダー配列、Ｎ末端細胞外ドメイン、膜貫通または膜内ドメインおよびＣ末端細胞内ドメインを、連続してかつそれぞれ、標準、太字および斜体で示す)。

ここで意図されるＣＤ２７は、特にヒトＣＤ２７に関する。ＣＤ２７タンパク質に関連して、ここで使用する修飾語句「ヒト」は、特にＣＤ２７タンパク質のアミノ酸配列をいう。例えば、ヒトで見られるＣＤ２７タンパク質としてのアミノ酸配列を有するＣＤ２７タンパク質を、技術的手段、例えば、組み換え発現、無細胞翻訳または非生物学的ペプチド合成によっても得ることができる。ＣＤ２７タンパク質などのある天然タンパク質のアミノ酸配列が、種内の正常な遺伝的多様性(アレル変異、多型)および／または転写後または翻訳後修飾の差異により、同じ種の異なる個体間または個体内で異なり得ることを、当業者は理解する。天然タンパク質のあらゆるこのようなバリアントまたはアイソフォームは、タンパク質の言及または指定により包含される。

ジェンバンクアクセッション番号NP_001233.2下に注釈を付されているヒトＣＤ２７タンパク質の細胞外ドメインを下に再現する。
ATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIR(配列番号３)

ある実施態様において、ＣＤ２７の細胞外ドメインは、配列番号３と少なくとも８０％同一、例えば配列番号３と少なくとも８５％同一、好ましくは配列番号３と少なくとも９０％同一、例えば配列番号３と少なくとも９５％同一、より好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または配列番号３と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるポリペプチドをいう。特に好ましい実施態様において、ＣＤ２７の細胞外ドメインは、配列番号３に示すアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。

アミノ酸配列に関する用語「配列同一性」は、Ｎ末端からＣ末端に読んだアミノ酸配列の間の、％として表す、全体的配列同一性(すなわち、比較で引用されるアミノ酸配列の完全または全アミノ酸配列を含む)の程度をいう；そして核酸配列に関しては、５’末端から３’末端に読んだ核酸配列間の、％として表す、全体的配列同一性(すなわち、比較で引用されるアミノ酸配列の完全または全核酸配列を含む)の程度をいう(所望により、相補的配列を比較で使用してよい)。配列同一性は、それ自体既知の配列アラインメントの実施および配列同一性決定のための適当なアルゴリズムを使用して、実施し得る。例であるが、非限定的アルゴリズムは、例えば公開されたデフォルト設定または他の適当な設定(例えば、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムについて：ギャップ開始ペナルティ＝５、ギャップ延長ペナルティ＝２、ミスマッチペナルティ＝－２、マッチリワード＝１、ギャップｘ＿ドロップオフ＝５０、期待値＝１０.０、ワードサイズ＝２８；またはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムについて：マトリクス＝Blosum62(Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89:10915-10919)、ギャップ開始ペナルティ＝１１、ギャップ延長ペナルティ＝１、期待値＝１０.０、ワードサイズ＝３など)を使用する、Altschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10)により最初に記載されたBasic Local Alignment Search Tool(ＢＬＡＳＴ)に基づくもの、例えば、Tatusova and Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)により記載された「Blast 2 sequences」アルゴリズムを含む。

特定のアミノ酸配列とクエリアミノ酸配列の間のパーセント同一性を決定するための例示的手順は、適当なアルゴリズムパラメータを使用する、Blast 2 sequences(Bl2seq)アルゴリズム、ウェブ・アプリケーションとして入手可能(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=blasttab)またはＮＣＢＩウェブサイト(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/)の独立型実行可能プログラム(BLAST version 2.11.0+)を使用する、各々、Ｎ末端からＣ末端に読む２アミノ酸配列のアラインを必然的に含む。適当なアルゴリズムパラメータの例は：マトリクス＝Blosum62、ギャップ開始ペナルティ＝１１、ギャップ延長ペナルティ＝１、期待値＝１０.０、ワードサイズ＝３)を含む。２個の比較した配列が同一性を共有するならば、アウトプットは、アラインされた配列の同一性の領域を提示する。２個の比較した配列が同一性を共有しないならば、アウトプットはアラインされた配列を提示しない。アラインされたら、マッチ数は、両配列に同一アミノ酸残基が存在する位置数の計数により決定される。パーセント同一性は、マッチ数をクエリ配列長で除し、続いて得られた値に１００を乗ずることにより決定される。パーセント同一性値は、最も近い１／１０で四捨五入してもよいが、必ずしもそうではない。例えば、７８.１１、７８.１２、７８.１３および７８.１４を７８.１に切り下げてよく、一方７８.１５、７８.１６、７８.１７、７８.１８および７８.１９を７８.２に切り上げてよい。Bl2seqによりアウトプットされるアラインメントの各セグメントについての詳細画像は、すでに便利に同一性パーセンテージを含むことはさらに留意すべきである。

アミノ酸配列がある他のアミノ酸配列と異なる、変化しているまたは相違するとき － 例えば、前者のアミノ酸配列が後者のアミノ酸配列とある程度またはパーセンテージの配列同一性を示すといえるときまたは前者のアミノ酸配列が後者のアミノ酸配列とある数のアミノ酸が異なるといえるとき － このような配列多様性は、１以上のアミノ酸付加(例えば、一アミノ酸または２以上の隣接アミノ酸のストレッチがアミノ酸配列の一か所にまたはアミノ酸配列の２か所以上に各々独立して付加され得る)、欠失(例えば、一アミノ酸または２以上の隣接アミノ酸のストレッチがアミノ酸配列の一か所またはアミノ酸配列の２か所以上で各々独立して欠失され得る)および／または置換(例えば、一アミノ酸または２以上の隣接アミノ酸のストレッチがアミノ酸配列の一か所またはアミノ酸配列の２か所以上で各々独立して１アミノ酸または２以上の隣接アミノ酸のストレッチで置換され得る)により構成され得る。

好ましくは、１以上のアミノ酸置換、特に１以上の一アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であり得る。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸の類似の特徴を有する他のものへの置換である。保存的アミノ酸置換は、次の群内の置換を含む：バリン、アラニンおよびグリシン；ロイシン、バリンおよびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システインおよびスレオニン；リシンおよびアルギニン；およびフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。極性中性アミノ酸はグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。正荷電(すなわち、塩基性)アミノ酸はアルギニン、リシンおよびヒスチジンを含む。負荷電(すなわち、酸性)アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。上記極性、塩基性または酸性群のあるメンバーの、同じ群の他のメンバーによる任意の置換は、保存的置換と考えられ得る。対照的に、非保存的置換は、あるアミノ酸の類似しない特徴を有する他のものへの置換である。

本明細書は、例えば、ＣＤ２７の細胞外ドメインまたは細胞内活性化ドメインなどのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得るある分子を述べる。用語「タンパク質」は、一般に１以上のポリペプチド鎖を含む高分子を包含する。用語「ポリペプチド」は、一般にペプチド結合により連結されたアミノ酸残基の直線状ポリマー鎖を包含する。「ペプチド結合」、「ペプチド連結」または「アミド結合」は、あるアミノ酸のカルボキシル基が他のアミノ酸のアミノ基と反応し、それにより水分子が遊離されるとき、２アミノ酸間で形成される共有結合である。特にタンパク質が単一ポリペプチド鎖からのみなり得るとき、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は相互交換可能に使用され得て、このようなタンパク質をいう。これら用語は、ポリペプチド鎖の何らかの最小長により限定されない。５０以下(≦５０)のアミノ酸、例えば≦４５、≦４０、≦３５、≦３０、≦２５、≦２０、≦１５、≦１０または≦５アミノ酸から本質的になるまたはそれからなるポリペプチド鎖は、一般に「ペプチド」と称される。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの文脈において、「配列」は、配列内で互いに隣接する残基が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの一次構造で隣接する、アミノ末端からカルボキシル末端方向での鎖におけるアミノ酸の順番である。本用語は、天然、組み換え、半合成または合成により産生されたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを包含し得る。故に、例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは天然に存在するかまたは単離することができ、例えば、細胞または組織により天然または内因性に酸性または発現され、所望によりそこから単離される；またはタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、組み換えであってよく、すなわち、組み換えＤＮＡ技術により産生されおよび／または、部分的にまたは全体に、化学的にまたは生化学的に合成され得る。限定しないが、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、適当な宿主または宿主細胞発現系により組み換えにより産生され、所望によりそこから単離されるか(例えば、適当な細菌、酵母、真菌、植物または動物宿主または宿主細胞発現系)または無細胞翻訳または無細胞転写および翻訳により組み換えにより産生されるかまたは非生物学的ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成により産生され得る。本用語はまた、限定しないが、グルコシル化、脂質化、アセチル化、アミド化、リン酸化、スルホン化、メチル化、ペグ化(典型的にＮ末端または１以上のＬｙｓ残基の側鎖へのポリエチレングリコールの共有的結合)、ユビキチン化、スモ化、システイン化、グルタチオン化、メチオニンスルホキシドまたはメチオニンスルホンへのメチオニンの酸化、シグナルペプチド除去、Ｎ末端Ｍｅｔ除去、酵素前駆体またはホルモン前駆体の活性形態への変換などの、ポリペプチド鎖の１以上の同時発現または発現後型修飾を担持する、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドも包含する。このような同時発現または発現後型修飾は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現する宿主細胞によりインビボで導入され得る(同時翻訳または翻訳後タンパク質修飾機構は宿主細胞に天然であり得るおよび／または宿主細胞１以上の(付加的)同時翻訳または翻訳後タンパク質修飾官能性を含むよう遺伝子操作されていてよい)または単離タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの化学的(例えば、ペグ化)および／または生化学的(例えば、酵素)修飾によりインビトロで導入され得る。

用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸と類似の方法で機能する限り、天然に存在するアミノ酸、天然でコードされるアミノ酸、天然でコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を含み、全て、構造によりＤ－およびＬ－立体異性体形態が可能であるならば、そのような立体異性体である。アミノ酸は、ここでは、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨されるその名称、一般に知られる三文字記号または一文字記号により記載する。「天然でコードされるアミノ酸」は、２０の一般的アミノ酸またはピロリシン、ピロリン－カルボキシ－リシンまたはセレノシステインの一つであるアミノ酸をいう。２０の一般的アミノ酸は、アラニン(ＡまたはＡｌａ)、システイン(ＣまたはＣｙｓ)、アスパラギン酸(ＤまたはＡｓｐ)、グルタミン酸(ＥまたはＧｌｕ)、フェニルアラニン(ＦまたはＰｈｅ)、グリシン(ＧまたはＧｌｙ)、ヒスチジン(ＨまたはＨｉｓ)、イソロイシン(ＩまたはＩｌｅ)、リシン(ＫまたはＬｙｓ)、ロイシン(ＬまたはＬｅｕ)、メチオニン(ＭまたはＭｅｔ)、アスパラギン(ＮまたはＡｓｎ)、プロリン(ＰまたはＰｒｏ)、グルタミン(ＱまたはＧｌｎ)、アルギニン(ＲまたはＡｒｇ)、セリン(ＳまたはＳｅｒ)、スレオニン(ＴまたはＴｈｒ)、バリン(ＶまたはＶａｌ)、トリプトファン(ＷまたはＴｒｐ)およびチロシン(ＹまたはＴｙｒ)である。「天然でコードされないアミノ酸」は、２０の一般的アミノ酸またはピロリシン、ピロリン－カルボキシ－リシンまたはセレノシステインの一つではないアミノ酸をいう。本用語は、限定しないが、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－スレオニンおよびＯ－ホスホチロシンにより例示される、限定しないが、天然でコードされるアミノ酸の修飾(例えば翻訳後修飾)により生ずるが、それ自体翻訳複合体により成長中のポリペプチド鎖に天然に組み込まれない、アミノ酸を含む。天然でコードされない、非天然または修飾アミノ酸のさらなる例は、２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、ベータ－アラニン、ベータ－アミノプロピオン酸、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、ピペリジン酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－アミノピメリン酸、２,４－ジアミノ酪酸、デスモシン、２,２’－ジアミノピメリン酸、２,３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ホモセリン、ホモシステイン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、６－Ｎ－メチルリシン、Ｎ－メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシンまたはオルニチンを含む。１以上の個々の原子が異なる原子、同じ原子の同位体または異なる官能基に置き換えられているアミノ酸アナログもまた含まれる。Ellman et al. Methods Enzymol. 1991, vol. 202, 301-36に記載される非天然アミノ酸およびアミノ酸アナログも含まれる。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドへの非天然アミノ酸の取り込みは、いくつかの種々の方法において有利であり得る。例えば、Ｄ－アミノ酸含有タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、Ｌ－アミノ酸含有カウンターパートと比較して、インビトロまたはインビボで安定性増加を示す。より具体的に、Ｄ－アミノ酸含有タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは内因性ペプチダーゼおよびプロテアーゼにより抵抗性であり、それによりインビボでの分子のバイオアベイラビリティの改善および寿命延長が提供され得る。

ある実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７の細胞外ドメインのＣＤ７０結合部分またはフラグメントを含み得る。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの「フラグメント」または「部分」なる用語は、一般に完全長タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのＮ末端および／またはＣ末端が欠失または切断された形態を包含する。本用語は、限定しないが、完全長タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの切断形態の発現またはインビボまたはインビトロでの完全長タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの物理的、化学的または酵素的タンパク質分解などのあらゆる機構により生ずるフラグメントを包含する。限定しないが、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのフラグメントは、完全長タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの隣接アミノ酸配列の少なくとも約５０％(アミノ酸の数で)、例えば、少なくとも約６０％または少なくとも約７０％または少なくとも約８０％または少なくとも約９０％または少なくとも約９１％または少なくとも約９２％または少なくとも約９３％または少なくとも約９４％または少なくとも約９５％または少なくとも約９６％または少なくとも約９７％または少なくとも約９８％または少なくとも約９９％を意味し得る。例えば、配列番号３に示す実例の１７２アミノ酸長ＣＤ２７細胞外ドメインのフラグメントまたは部分は、配列番号３の少なくとも約９０または少なくとも約１００または少なくとも約１１０または少なくとも約１２０または少なくとも約１３０または少なくとも約１４０または少なくとも約１５０または少なくとも約１６０または少なくとも約１７０連続アミノ酸の配列を含み得る。

本来、ＣＤ２７は、細胞上に発現されるＣＤ７０分子の同族受容体である。従って、ここに教示されるＣＡＲに含まれるＣＤ２７の細胞外ドメインは、生理学的におよび治療的に関連する設定で、細胞表面上のＣＤ７０タンパク質と特異的に結合する内在的能力を有する。本明細書をとおして使用する用語「特異的に結合」は、薬剤が１以上の所望の分子または検体に、無作為または無関係である他の分子を実質的に排除して、所望により構造的に関連する他の分子を実質的に排除して、結合することを意味する。言いかえれば、タンパク質および／または高分子の複合体混合物中の標的分子を優先的に認識するとき、薬剤は標的分子に特異的に結合すると言える。

ＣＡＲがＣＤ２７の細胞外ドメインのＣＤ７０結合部分またはフラグメントを含むとき、このようなＣＤ２７部分がＣＤ７０タンパク質に結合する能力は、ＣＤ２７細胞外ドメインのＣＤ７０結合部分を含むＣＡＲ発現細胞が、完全長ＣＤ２７細胞外ドメインを含むその他は同一のＣＡＲを発現する細胞により達成される治療効果と有意に類似するまたは同等である治療効果を示すように、ＣＤ７０に結合する完全長ＣＤ２７細胞外ドメインの能力と有意に類似するまたは同等である。

典型的に、標的結合タンパク質(例えばＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合フラグメント)は、同族標的タンパク質(例えばＣＤ７０)に１×１０^－５～１×１０^－１２モル／リットル(Ｍ)以下および好ましくは１×１０^－７～１×１０^－１２Ｍ以下およびより好ましくは１×１０^－８～１×１０^－１２Ｍ以下およびさらにより好ましくは１×１０^－９～１×１０^－１２Ｍ以下、例えば１×１０^－９～１×１０^－１０Ｍまたは１×１０^－１０～１×１０^－１１Ｍの解離定数(ＫＤ)で結合し得て、ここで、ＫＤ＝[ＴＢＰ][ＴＧ]／[ＴＢＰ－ＴＧ]であり、ＴＢＰは標的結合タンパク質であり、ＴＰは標的タンパク質であり、ＴＢＰ－ＴＧはこれら２個の複合体である。１０^－４Ｍを超えるＫＤ値は、典型的に非特異的結合の指標として考えられる。故に、ある実施態様において、ＣＤ２７細胞外ドメインのＣＤ７０結合部分は、１０^－４Ｍ以下、好ましくは１０^－５Ｍ以下、より好ましくは１０^－６Ｍ以下、さらにより好ましくは１０^－７Ｍ以下、なおさらに好ましくは１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－９Ｍ以下、１０^－１０Ｍ以下または１０^－１１Ｍ以下のＫＤでＣＤ７０に結合し得る。ある実施態様において、ＣＤ２７細胞外ドメインのＣＤ７０結合部分は、その他は実質的に同一の条件下の完全長ＣＤ２７細胞外ドメインのＣＤ７０への結合を典型的に表すＫＤより最大で２桁高い、好ましくは最大で１桁高い、より好ましくは同じ桁または１桁以上低いＫＤでＣＤ７０と結合し得る。標的結合タンパク質の標的への特異的結合は、例えば、スキャッチャードプロット分析および／または放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、酵素免疫アッセイ(ＥＩＡ)およびサンドイッチ競合アッセイおよびそれ自体当分野で知られるそれらの種々のバリアントなどの競合的結合アッセイを含む、それ自体知られる任意の適当な方法で決定し得る。

ある実施態様において、本発明の治療状況におけるＣＤ２７細胞外ドメインのある部分またはフラグメントの適合性は、実施例に説明するようなインビトロ細胞死実験により評価し得る。例えば、その他は実質的に同一の条件下、ＣＤ７０陽性細胞死において、ＣＤ２７細胞外ドメインのある部分を含むＣＡＲを発現するＮＫ細胞が、完全長ＣＤ２７細胞外ドメインを含むその他は同一のＣＡＲを発現するＮＫ細胞の１０％の効率を示すとき、ＣＤ２７細胞外ドメインの該部分は、ここで意図されるＣＤ７０結合と考えられ得る。好ましくは、ＣＤ２７細胞外ドメインのＣＤ７０結合部分を含むＣＡＲを発現するＮＫ細胞の死滅効率は、完全長ＣＤ２７細胞外ドメインを含むＣＡＲを発現するＮＫ細胞の死滅効率の少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％または少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％または少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％であり得るかまたは実質的に同等または高い可能性がある。

ある実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７の膜内ドメインをさらに含み得る。ジェンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００１２３３.２の下に注釈を付されたヒトＣＤ２７タンパク質の膜内または膜貫通ドメインを下に再現する。
ILVIFSGMFLVFTLAGALFLH(配列番号４)

ある実施態様において、ＣＤ２７の膜内ドメインは、配列番号４と少なくとも８０％同一、例えば配列番号４と少なくとも８５％同一、好ましくは配列番号４と少なくとも９０％同一、例えば配列番号４と少なくとも９５％同一、より好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または配列番号４と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるポリペプチドをいう。特に好ましい実施態様において、ＣＤ２７の膜内ドメインは、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。

ジェンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００１２３３.２下に注釈を付されたヒトＣＤ２７タンパク質の細胞外および膜内ドメインからなるポリペプチドは下に再現するとおりである。
ATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLH(配列番号１０)

ある実施態様において、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメインは、配列番号１０と少なくとも８０％同一、例えば配列番号１０と少なくとも８５％同一、好ましくは配列番号１０と少なくとも９０％同一、例えば配列番号１０と少なくとも９５％同一、より好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または配列番号１０と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるポリペプチドをいう。特に好ましい実施態様において、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメインは、配列番号１０に示すアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。

ある他の実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７以外の膜貫通タンパク質、好ましくは1回膜貫通Ｉ型膜貫通タンパク質由来の膜内ドメインを含み得る。例としておよび限定しないが、当分野における多くのＣＡＲ構築物は、ＣＤ８α膜貫通ドメインを、所望によりＣＤ８αヒンジドメインと共に使用し、これはまた本ＣＡＲ分子に採用され得る。さらに他の実施態様において、ＣＡＲは、例えば、高疎水性およびアルファ－ヘリクス一次構造などの、このタイプの膜貫通ドメインへの適用が知られる生物物理学的基準に基づき走査された、天然に存在しないまたは合成膜内ドメインを含み得る。

ある実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７の細胞内ドメインの全てまたは一部を欠く。ジェンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００１２３３.２下に注釈を付されたヒトＣＤ２７タンパク質の細胞内または細胞質ドメインを下に再現する。
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(配列番号５)

好ましい実施態様において、ＣＡＲはＣＤ２７の細胞内ドメイン全てを欠く、すなわち、ＣＡＲは、配列番号５に示すアミノ酸配列の全てを欠くなど、ＣＤ２７の細胞内ドメイン全体を欠く。他の実施態様において、ＣＡＲは、完全長ＣＤ２７細胞内ドメインの少なくとも１、例えば少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも４０の隣接または非隣接アミノ酸を欠く修飾ＣＤ２７細胞内ドメインを含み得る。具体的実施態様において、ＣＤ２７細胞内ドメインは、該ドメインによる正常ＣＤ２７シグナル伝達が不可能となるようになど修飾され得る。このような修飾は、ＣＤ２７細胞内ドメインの１以上のアミノ酸の欠失および／または置換などの任意のアミノ酸配列変更を含み得る。

故に、ある実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメインおよび細胞内活性化ドメインを含む、それから本質的になるまたはそれからなる。他の実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメイン、細胞内活性化ドメインおよび細胞内共刺激ドメインを含む、それから本質的になるまたはそれからなる。さらなる実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメイン、細胞内活性化ドメインおよび正確に２個など２以上の細胞内共刺激ドメインを含む、それから本質的になるまたはそれからなる。ある実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインおよび細胞内共刺激ドメインを含む、それから本質的になるまたはそれからなる。ある実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインおよび正確に２個など２以上の細胞内共刺激ドメインを含む、それから本質的になるまたはそれからなる。特に好ましい実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインおよび４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインを含む、それから本質的になるまたはそれからなる。

ヒトＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインのある特定の例を下に再現する。
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号６)

ある実施態様において、ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインは、配列番号６と少なくとも８０％同一、例えば配列番号６と少なくとも８５％同一、好ましくは配列番号６と少なくとも９０％同一、例えば配列番号６と少なくとも９５％同一、より好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または配列番号６と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるポリペプチドをいう。特に好ましい実施態様において、ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインは、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。

ヒト４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインのある特定の例を下に再現する。
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(配列番号７)

ある実施態様において、４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインは、配列番号７と少なくとも８０％同一、例えば配列番号７と少なくとも８５％同一、好ましくは配列番号７と少なくとも９０％同一、例えば配列番号７と少なくとも９５％同一、より好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または配列番号７と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるポリペプチドをいう。特に好ましい実施態様において、４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインは、配列番号７に示すアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。

ある特に好ましい実施態様において、ＣＡＲは、下記配列番号１に示すアミノ酸を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるものであり、ここで、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメインは標準文字、４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインは斜体およびＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインは下線を引く。

ある実施態様において、ＣＡＲは、配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一、例えば特に好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。

ある実施態様において、ＣＡＲは、(ｉ)ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメイン、(ii)４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインおよび(iii)ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインを含む、本質的にそれからなるまたはそれからなり、ここで、該ドメイン(ｉ)～(iii)は、各々独立して、配列番号１の(ｉ)アミノ酸位置１～１９３、(ii)アミノ酸位置１９４～２３５および(iii)２３６～３４８と、少なくとも８０％同一性、好ましくは少なくとも８５％同一性、より好ましくは少なくとも９０％同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一性、例えば特に好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％同一性を示す。

ここに記載するＣＡＲ分子が膜貫通タンパク質であり、タンパク質の細胞膜局在化を達成するために、発現時、適当なシグナルまたはリーダー配列を含めることが典型的に必要であることを当業者は認識する。このようなシグナル配列は、典型的に短(３～６０アミノ酸長)Ｎ末端配置ペプチド鎖であり、所望によりおよび有利に、成熟タンパク質を産生するなどのために、タンパク質が輸送された後、シグナルペプチダーゼにより切断または処理され除かれる。シグナル配列は当分野で広く知られ、ここに教示されるＣＡＲの発現に適用され得る。ある実施態様において、シグナル配列は、ＣＤ２７以外のタンパク質に由来し得る。ある好ましい実施態様において、シグナル配列は、ＣＤ２７に由来し得る。ジェンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００１２３３.２の下に注釈を付されたヒトＣＤ２７タンパク質の天然シグナル配列を下に再現する。
MARPHPWWLCVLGTLVGLS(配列番号８)

ある実施態様において、ＣＡＲ分子に含まれるシグナル配列は、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。ある実施態様において、このようなシグナル配列は、上に個別化したＣＡＲ分子の何れかのＮ末端に融合し得る。

故に、例示として、ある特に好ましい実施態様において、ＣＡＲの前駆体形態は、下の配列番号９に示すアミノ酸を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるものであり、ここで、シグナル配列は太字、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメインは標準文字、４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインは斜体およびＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインは下線を引く。

本発明の態様はまた本明細書に記載するＣＡＲ分子の何れかに関する。本発明のさらなる態様は、ここに記載するＣＡＲ分子をコードする核酸に関する。「コードする」は、核酸配列またはその一部が、問題の生物の遺伝コードにより、特定のアミノ酸配列、例えば、１以上の所望のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列または鋳型－転写産物(例えば、ＲＮＡまたはＲＮＡアナログ)関係で他の核酸配列に対応することを意味する。

ここで使用する用語「核酸」は、典型的に本質的にヌクレオシド単位からなるあらゆる長さのポリマー(好ましくは直鎖ポリマー)をいう。ヌクレオシド単位は、一般にヘテロ環式塩基および糖基を含む。ヘテロ環式塩基は、とりわけ、天然に存在する核酸に広く存在するアデニン(Ａ)、グアニン(Ｇ)、シトシン(Ｃ)、チミン(Ｔ)およびウラシル(Ｕ)などのプリンおよびピリミジン塩基、他の天然に存在する塩基(例えば、キサンチン、イノシン、ヒポキサンチン)、ならびに化学的にまたは生化学的に修飾された(例えば、メチル化)、非天然または誘導体化塩基を含む。修飾核酸塩基の例は、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含む、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリンを含むが、これらに限定されない。特に、５－メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を増加することが示されている。糖基は、とりわけペントース(ペントフラノース)基、例えば、好ましくは天然に存在する核酸に一般的なリボースおよび／または２－デオキシリボースまたはアラビノース、２－デオキシアラビノース、トレオースまたはヘキソース糖基、ならびに修飾または置換糖基(例えば、限定しないが、２’－Ｏ－アルキル化、例えば、２’－Ｏ－メチル化または２’－Ｏ－エチル化糖、例えばリボース；２’－Ｏ－アルキルオキシアルキル化、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル化糖、例えばリボース；または２’－Ｏ,４’－Ｃ－アルキレン結合、例えば、２’－Ｏ,４’－Ｃ－メチレン結合または２’－Ｏ,４’－Ｃ－エチレン結合糖、例えばリボース；２’－フルオロ－アラビノースなど)を含み得る。ヌクレオシド単位は、とりわけ天然に存在する核酸に一般的なホスホジエステル結合およびさらに修飾ホスフェート－またはホスホネートベースの結合、例えばホスホロチオエート、アルキルホスホロチオエート、例えばメチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、例えばメチルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、例えばアルキルホスホトリエステル、ホスロアミデート、ホスホロピペラジデート、ホスホロモルホリデート、架橋ホスロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート；およびさらにシロキサン、カーボネート、スルファメート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、例えば３’－Ｎ－カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、３’－チオアセタールおよびスルホンヌクレオシド間結合を含む、多数の既知ヌクレオシド間結合の何れかにより互いに結合され得る。好ましくは、ヌクレオシド間結合は、修飾ホスフェートベースの結合、例えばより好ましくはホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合またはそれらの組み合わせを含むホスフェートベースの結合であり得る。用語「核酸」はまたポリマーを含む任意の他の核酸塩基、例えば、限定しないが、ペプチド核酸(ＰＮＡ)、リン酸基を有するペプチド核酸(ＰＨＯＮＡ)、ロックド核酸(ＬＮＡ)、モルホリノホスホロジアミデート主鎖核酸(ＰＭＯ)、シクロヘキセン核酸(ＣｅＮＡ)、トリシクロ－ＤＮＡ(ｔｃＤＮＡ)およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを有する主鎖セクションを有する核酸を含む、核酸模倣体も包含する(例えば、Kurreck 2003 (Eur J Biochem 270: 1628-1644)参照)。ここで使用する「アルキル」は、特に低級炭化水素部分、例えば、Ｃ_１－Ｃ_４直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和炭化水素、例えばメチル、エチル、エテニル、プロピル、１－プロペニル、２－プロペニルおよびイソプロピルを包含する。

ここで意図する核酸は、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシドまたはそれらの混合物を含み得る。修飾ヌクレオシドは、修飾ヘテロ環式塩基、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合またはそれらの組み合わせを含み得る。用語「核酸」は、さらに好ましくは、特にｈｎＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、増幅産物、オリゴヌクレオチドおよび合成(例えば、化学合成)ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子を包含する。核酸は、天然に存在する、例えば、天然物に存在するまたは天然物から単離された、組み換え、すなわち、組み換えＤＮＡ技術により産生されたおよび／または部分的にまたは全体に、化学的にまたは生化学的に合成されたものであり得る。「核酸」は、二本鎖、部分的二本鎖または一本鎖。一本鎖であるとき、核酸はセンス鎖でもアンチセンス鎖でもよい。さらに、核酸は、環状でも直線状でもよい。

ある実施態様において、特に配列番号１０に示すものなどのＣＤ２７の細胞外および膜内ドメインは、配列番号１１
GCTACACCAGCTCCTAAGAGCTGCCCCGAGAGACACTATTGGGCCCAGGGCAAGCTGTGCTGCCAGATGTGTGAACCTGGCACCTTCCTGGTCAAGGACTGCGACCAGCACAGAAAGGCCGCTCAGTGCGATCCTTGTATCCCCGGCGTGTCCTTCTCTCCCGACCACCACACAAGACCTCACTGCGAGAGCTGCAGACACTGCAATTCTGGACTGCTCGTGCGGAACTGCACCATCACAGCCAATGCCGAGTGCGCCTGCAGAAATGGCTGGCAGTGCCGGGACAAAGAATGTACCGAGTGCGACCCTCTGCCTAATCCTAGCCTGACCGCCAGAAGCAGCCAGGCTTTGTCTCCTCATCCTCAGCCTACACATCTGCCCTACGTGTCCGAGATGCTGGAAGCCAGAACAGCCGGCCATATGCAGACCCTGGCCGACTTTAGACAGCTGCCCGCCAGAACACTGAGCACCCATTGGCCTCCACAGAGAAGCCTGTGCAGCAGCGACTTCATCCGGATCCTCGTGATCTTCAGCGGCATGTTCCTGGTGTTCACACTGGCTGGCGCCCTGTTTCTGCAT(配列番号１１)
に示す核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされ得て、所望により、ここで、配列番号１１の任意のコドンは、各々独立して同じアミノ酸をコードする他のコドンに置き換えられてよく、好ましくはここで、核酸配列は、当分野で知られるコドン最適化原理に従い、ヒト細胞におけるなどの所望の種の細胞における発現についてそれによりコドン最適化され、例えば、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメインが、配列番号１１と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、それから本質的になるまたはそれからなる核酸によりコードされるようなものである。

ある実施態様において、特に配列番号６に示すものなどのヒトＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインは、配列番号１２
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG(配列番号１２)
に示す核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされ得て、所望により、ここで、配列番号１２の任意のコドンは、各々独立して同じアミノ酸をコードする他のコドンに置き換えられてよく、好ましくはここで、核酸配列は、当分野で知られるコドン最適化原理に従い、ヒト細胞におけるなどの所望の種の細胞における発現についてそれによりコドン最適化され、例えば、ヒトＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインが配列番号１２に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされるようなものである。

ある実施態様において、特に配列番号７に示すものなどのヒト４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインは、配列番号１３
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG(配列番号１３)
に示す核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされ得て、所望により、ここで、配列番号１３の任意のコドンは、各々独立して同じアミノ酸をコードする他のコドンに置き換えられてよく、好ましくはここで、核酸配列は、当分野で知られるコドン最適化原理に従い、ヒト細胞におけるなどの所望の種の細胞における発現についてそれによりコドン最適化され、例えば、ヒト４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインが配列番号１３に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされるようなものである。

ある実施態様において、特に配列番号９に示すものなどのここに教示されるＣＡＲの前駆体形態は、配列番号１４
ATGGCCAGACCTCATCCTTGGTGGCTGTGTGTGCTGGGCACACTCGTTGGCCTGTCTGCTACACCAGCTCCTAAGAGCTGCCCCGAGAGACACTATTGGGCCCAGGGCAAGCTGTGCTGCCAGATGTGTGAACCTGGCACCTTCCTGGTCAAGGACTGCGACCAGCACAGAAAGGCCGCTCAGTGCGATCCTTGTATCCCCGGCGTGTCCTTCTCTCCCGACCACCACACAAGACCTCACTGCGAGAGCTGCAGACACTGCAATTCTGGACTGCTCGTGCGGAACTGCACCATCACAGCCAATGCCGAGTGCGCCTGCAGAAATGGCTGGCAGTGCCGGGACAAAGAATGTACCGAGTGCGACCCTCTGCCTAATCCTAGCCTGACCGCCAGAAGCAGCCAGGCTTTGTCTCCTCATCCTCAGCCTACACATCTGCCCTACGTGTCCGAGATGCTGGAAGCCAGAACAGCCGGCCATATGCAGACCCTGGCCGACTTTAGACAGCTGCCCGCCAGAACACTGAGCACCCATTGGCCTCCACAGAGAAGCCTGTGCAGCAGCGACTTCATCCGGATCCTCGTGATCTTCAGCGGCATGTTCCTGGTGTTCACACTGGCTGGCGCCCTGTTTCTGCATAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG(配列番号１４)
に示す核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされ得て、所望により、ここで、配列番号１４の任意のコドンは、各々独立して同じアミノ酸をコードする他のコドンに置き換えられてよく、好ましくはここで、核酸配列は、当分野で知られるコドン最適化原理に従い、ヒト細胞におけるなどの所望の種の細胞における発現についてそれによりコドン最適化され、例えば、ＣＡＲが配列番号１４に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされるようなものである。

核酸に含まれる遺伝情報により駆動される、宿主細胞などの適当な系におけるＣＡＲタンパク質の産生のためであるＣＡＲをコードする核酸を発現させるために、核酸を、当分野で一般的であるとおり、発現カセットまたはベクターの成分として挿入されるかまた他の方法で作製されたなどの発現可能形式で提供し得る。従って、本発明の態様はまた発現可能形式のここに開示するＣＡＲ分子をコードする核酸にも関する。ある実施態様は、ＣＡＲコード化核酸を含む発現カセットまたは発現ベクターに関する。

用語「発現カセット」は、目的の１以上のタンパク質のコード配列が発現のために挿入され得る核酸分子、典型的にＤＮＡを包含し、ここで、該核酸分子は、コード配列に操作可能に連結し、発現を制御する１以上の核酸配列(制御配列)を含み、その非限定的例は、プロモーター配列および転写ターミネーターを含む。「操作可能な結合」は、制御配列および発現させようとする配列が、該発現を可能とするような方法で接続される、結合である。例えば、プロモーターおよび目的のタンパク質のコード配列などの、例えば、配列は、該配列間の結合の性質が(１)フレームシフトの導入をもたらす、(２)プロモーターがコード配列の転写を指示する能力を妨害する、(３)コード配列がプロモーター配列から転写される能力を妨害するものではない限り、操作可能に連結といってよい。故に、「操作可能に連結」は、プロモーターなどの発現制御配列が目的の配列の転写／発現を効率的に制御するように、遺伝構築物に組み込まれ得る。発現に必要な転写および翻訳制御配列または要素の厳密な性質は発現環境毎に異なり得るが、典型的に転写制御配列はプロモーター、所望によりエンハンサーおよび転写ターミネーターを含む。

「プロモーター」の言及はその最も広い意味と解釈すべきであり、正確な転写開始および、適用可能であれば、遺伝子発現の正確な空間および／または時間的制御または、例えば、内部または外部(例えば、外因的)刺激に対する、その応答に必要な転写制御配列を含む。より具体的に、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する、核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子の領域を表し得る。プロモーターは、好ましくは、しかし必ずしもそうではないが、転写を制御する配列の上流、すなわち、５’に位置する。典型的に、原核生物において、プロモーター領域はプロモーターそれ自体およびＲＮＡに転写されたときタンパク質合成開始のシグナルを伝達する配列(例えば、シャイン・ダルガノ配列)の両方を含む。プロモーター配列はまた、遺伝子クラスターにおける遺伝子の転写レベルを増強するためにタンパク質と結合できるＤＮＡの１以上の領域(すなわちトランス作用因子)である、「エンハンサー領域」も含み得る。エンハンサーは、典型的にコード領域の５’末端であるが、プロモーター配列から離されてよく、例えば、遺伝子のイントロン領域内または遺伝子のコード領域に対して３’であってよい。

ある実施態様において、プロモーターは構成的でも誘導型でもよい。構成的プロモーターは、発現が標準培養条件下で一定であるプロモーターと理解される。誘導型プロモーターは、１以上の誘導因子に応答性であるプロモーターである。例えば、誘導型プロモーターは化学的制御(例えば、転写活性がアルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属または他の小分子などの化学的誘導剤の存在または非存在により制御されるプロモーター)または物理的制御(例えば、転写活性が光または高温もしくは低温などの物理的誘導因子の存在または非存在により制御されるプロモーター)であり得る。誘導型プロモーターはまた化学的または物理的因子により直接制御される、１以上の転写因子により間接的に制御もされ得る。プロモーターの非限定的例は、Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターおよびＥＦ１αプロモーターを含む。

用語「ターミネーター」または「転写ターミネーター」は、一般に転写停止のシグナルを伝達する転写単位末端の配列要素をいう。例えば、ターミネーターは、通常目的のポリペプチドをコードするコード配列の下流、すなわち、３’に位置する。例えば、組み換え核酸が２以上のコード配列を含むとき、例えば、連続して整列したおよび一体となって多シストロン性転写単位を形成する、転写ターミネーターが、有利に最も下流のコード配列に対して位置する。

ここで使用する用語「発現ベクター」または「ベクター」は、核酸フラグメントが挿入され、クローン化、すなわち、増殖され得る、核酸分子、典型的にＤＮＡをいう。故に、ベクターは、典型的に１以上の特有の制限部位を含み、クローン化配列が再生可能であるように、規定した細胞または媒体生物で自律的再現できる。ベクターはまた好ましくは、ベクターを含むレシピエント細胞の選択を可能とする、例えば、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーも含み得る。ベクターは、適切に、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、バクテリオファージ由来ベクター、ＰＡＣ、ＢＡＣ、直鎖核酸、例えば、直鎖ＤＮＡ、トランスポゾン、ウイルスベクターなどを含み得るが、これらに限定されない(例えば、Sambrook et al., 1989; Ausubel 1992参照)。ウイルスベクターは、とりわけレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター、例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶに基づくベクターを含み得る。発現ベクターは、一般に所望の発現系、例えば、インビトロ、細胞、臓器および／または生物で導入された核酸またはオープンリーディングフレームの発現を可能にするおよび／または発現に作用するよう構成される。例えば、発現ベクターは有利に適当な制御配列を含み得る。

特定のベクターの選択に重要な因子は、とりわけ、ベクターを含むレシピエント細胞の認識が容易であり、ベクターを含まないレシピエント細胞から選別され得るレシピエント細胞の選択；特定のレシピエント細胞で所望のベクターのコピー数；レシピエント細胞においてベクターが染色体に統合されるかまたは染色体外のままであるかの何れが所望であるか；および異なる種のレシピエント細胞間でベクターを「シャトル」できるのが所望であるか否かを含む。

発現ベクターは自律的または統合的であり得る。核酸を、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミドまたはウイルス粒子などの発現ベクターの形で細胞に導入得る。組み換え核酸は染色体外に留まり得るかまたは細胞染色体ＤＮＡに統合され得る。発現ベクターは、所望の核酸で形質転換された細胞の検出および／または選択を可能にするために、選択条件下で細胞生存能に必要なタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子(例えば、ウラシル生合成に必要な酵素であるＵＲＡ３またはロイシン生合成に必要な酵素であるＬＥＵ２またはトリプトファン生合成に必要な酵素であるＴＲＰ１)を含み得る。発現ベクターはまた自律的再現配列(ＡＲＳ)も含み得る。ＡＲＳは、セントロメア(ＣＥＮ)および再現起点(ＯＲＩ)を含み得る。例えば、ＡＲＳは、ＡＲＳ１８またはＡＲＳ６８であり得る。

統合的ベクターは、一般に少なくとも第一挿入可能ＤＮＡフラグメント、選択可能マーカー遺伝子および第二挿入可能ＤＮＡフラグメントの連続して配置された配列を含む。第一および第二挿入可能ＤＮＡフラグメントは各々約２００(例えば、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００または約１０００またはそれ以上)ヌクレオチド長であり、形質転換すべき細胞種のゲノムＤＮＡの一部と相同であるヌクレオチド配列を含む。発現のための目的の核酸を含むヌクレオチド配列を、第一および第二挿入可能ＤＮＡフラグメントの間、マーカー遺伝子の前後何れかでこのベクターに挿入する。統合的ベクターは、目的のヌクレオチド配列の細胞ゲノムへの組込みを促進するため、形質転換前に直線化し得る。

目的の細胞へのベクターの導入前、ベクターをエシェリヒア・コリ(大腸菌)などの細菌細胞で増殖(例えば、増幅)させ得る。ベクターＤＮＡを、細菌環境からのベクターＤＮＡの精製をもたらす当分野で知られる方法の何れかにより細菌細胞から単離し得る。精製ベクターＤＮＡを、プラスミドＤＮＡ調製物に、大腸菌タンパク質が、これらのタンパク質が哺乳動物細胞に毒性であり得るため、存在しないことを確実にするため、フェノール、クロロホルムおよびエーテルで徹底的に抽出する。

ある実施態様において、発現可能な形式でＣＡＲをコードする核酸は、ＤＮＡ分子が哺乳動物細胞、特にヒトＮＫ細胞などのヒト細胞などの動物細胞に導入されたとき、ＣＡＲタンパク質の発現(細胞性翻訳機構によるＤＮＡ ＣＡＲコード配列の対応するＣＡＲメッセンジャーＲＮＡ分子への転写および後者のタンパク質への翻訳)を駆動するように構成されたＤＮＡ分子であり得る。ある実施態様において、発現可能な形式でＣＡＲをコードする核酸は、ＣＡＲタンパク質のコード配列を含む発現カセットまたは発現ベクターであり得る。ある実施態様において、これは、ＣＡＲタンパク質のＤＮＡコード配列を含むＤＮＡ発現カセットまたは発現ベクターが重要であり得る。ある他の実施態様において、発現可能な形式でＣＡＲをコードする核酸は、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子が哺乳動物細胞、特にヒトＮＫ細胞などのヒト細胞などの動物細胞に導入されたとき、ＣＡＲタンパク質の発現(細胞性翻訳機構によるＲＮＡ分子に含まれるコード配列のタンパク質への翻訳)を駆動するように構成されたｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子であり得る。このようなｍＲＮＡは、ＣＡＲコード配列を含む発現カセットまたはベクターからのインビトロ転写などの当分野で利用可能な任意の適当な手段により産生され得る。

核酸を動物細胞に導入する種々の周知方法が存在し、そのいずれもここで使用する。最も単純には、核酸を標的細胞に直接注入し得る。他の方法は、レシピエント細胞と核酸含有細菌プロトプラストの融合、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、塩化リチウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、カチオン性脂質もしくはリポソームなどの組成物の使用または受容体介在エンドサイトーシス、微粒子銃(「遺伝子銃」方法)、ウイルスベクター(すなわちレンチウイルス、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)、アデノウイルス、レトロウイルスまたはアンチウイルス由来)での感染、エレクトロポレーションなどの方法などを含む。核酸分子の標的細胞への送達に適する他の技術または方法は、ポリ(乳酸－コ－グリコール酸)ポリマーマイクロスフェアからのＮＡ分子の連続的送達または保護(安定化)ＮＡ分子の産物を送達するマイクロポンプへの直接注入を含む。他の可能性は、植込み型薬物放出生分解性マイクロスフェアの使用である。また想起されるのは、種々のタイプのリポソーム(免疫リポソーム、ペグ化(免疫)リポソーム)、カチオン性脂質およびポリマー、ナノ粒子またはデンドリマー、ポリ(乳酸－コ－グリコール酸)ポリマーマイクロスフェア、植込み型薬物放出生分解性マイクロスフェアなどへのＮＡの封入；およびＮＡとヌクレアーゼ阻害剤アウリントリカルボン酸などの保護剤の共注入である。種々の上記送達モードまたは方法の組み合わせを使用し得ることも明らかである。

上記説明およびガイダンスに加えて、目的のタンパク質を「発現するよう操作された細胞」なる用語は、特に、目的のタンパク質をコードする外因的核酸が利用可能な技術的手段により導入または挿入されている細胞などの目的のタンパク質をコードする核酸を含むように人為的に改変または操作された細胞を意味する。

既に記載したとおり、本発明は、特にここに記載するＣＡＲタンパク質を発現するようなナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の遺伝子操作を企図する。ＮＫ細胞により産生されるＣＡＲタンパク質の量であるＣＡＲの発現レベルは、典型的に、下限で、発現レベルが、ＣＤ７０陽性標的細胞上で特に細胞毒性作用(例えば、ＣＤ７０陽性標的細胞の損傷または死滅)などの作用を誘発するなどＮＫ細胞内で意味のある強度の細胞内シグナル産生と結びついた標的細胞上のＣＤ７０に特異性を有する細胞とするのに十分であるとの優先性または必要性、そして、上限で、外因的ＣＡＲタンパク質の過剰な過発現によるＮＫ細胞の生存能または機能性の減少を回避するとの優先性または必要性により決定され得る、許容される範囲内で変わり得る。このような量的考察は、当業者により適用され得る。

修飾語句「単離」は、ここで意図するＮＫ細胞と関連して明確に記載されている必要はないが、本発明が体外でのＮＫ細胞の操作に関連するため、そのように操作されたＮＫ細胞のインビトロまたはエクスビボおよびその後の治療用途を含むのが便利であり得る。特定の成分を参照する用語「単離」は、一般に、そのような成分がその天然環境の１以上の他の成分から離されて存在する － 例えば、離されているまたは離されて調製および／または維持されている － ことを意味する。より具体的に、細胞または細胞集団に関連してここで使用する用語「単離」は、このような細胞または細胞集団が動物またはヒト身体の一部ではない、例えば、細胞はインビトロまたはエクスビボで培養、選別または保管され得ることを意味する。

天然ＮＫ細胞は、表現型および機能両者の点でリンパ球の明白な集団である。ＮＫ細胞は、大顆粒状リンパ球形態を有し、特徴的ＮＫ細胞表面受容体を発現し、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)再配列およびＴ細胞、Ｂ細胞、単球および／またはマクロファージ細胞表面マーカー両者を欠く。細胞は、標的細胞をアポトーシスにより死滅させる、小細胞質顆粒のタンパク質(パーフォリンおよびグランザイム)により死滅する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩ様分子およびＭＨＣと無関係の分子と結合する多数の阻害性および活性化受容体を介して、潜在的「標的」細胞と健常細胞を区別する機構を有する。阻害性ＮＫ細胞受容体は、ＨＬＡ－Ｅ(ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ)；ＨＬＡ－Ｃ(グループ１または２)、ＫＩＲ２ＤＬ；ＫＩＲ３ＤＬ(ＨＬＡ－Ｂ Ｂｗ４)およびＨＬＡ－Ａ３またはＡ４＋ペプチドを含む。活性化ＮＫ細胞受容体は、ＨＬＡ－Ｅ(ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ)；ＫＩＲ２ＤＳ(ＨＬＡ－Ｃ)およびＫＩＲ３ＤＳ(ＨＬＡ－Ｂｗ４)を含む。他の受容体は、ＮＫ細胞受容体タンパク質－１およびＩｇＧＦｃ部分に対する低親和性受容体(ＦｃｙＲIII；ＣＤ１６)を含む。「活性化」および「阻害性」表面受容体は、天然ＮＫ細胞の細胞毒性活性を制御する。

ＮＫ細胞は、ＣＤ３発現の非存在と共に、ヒトにおいてＣＤ１６、ＣＤ５６およびＣＤ８などの特異的表面マーカーにより検出され得る。

ある実施態様において、ＮＫ細胞はヒト対象などの対象から単離され得る。ある実施態様において、ＮＫ細胞は対象の臍帯血または末梢血から単離され得る。ある実施態様において、ＮＫ細胞は造血幹細胞または誘導多能性幹(ｉＰＳ)細胞からインビトロで分化され得る。ある実施態様において、ＮＫ細胞はヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、非刺激白血球除去産物(ＰＢＳＣ)、ヒト胚幹細胞(ｈＥＳＣ)、誘導多能性幹細胞(ｉＰＳＣ)、骨髄または臍帯血に由来し得る。このような源からＮＫ細胞を単離するまたは導く方法は当分野で周知である。具体的実施態様において、ＮＫ細胞は臍帯血(ＣＢ)、末梢血(ＰＢ)、骨髄または幹細胞から単離され得る。具体的実施態様において、ＮＫ細胞は貯蔵ＣＢから単離され得る。ＣＢは、２、３、４、５、６、７、８、１０、２０またはそれ以上の単位から貯蔵され得る。

ある実施態様において、ＮＫ細胞の出発集団は、フィコール密度勾配遠心分離を使用する単核細胞の単離により得られ得る。細胞培養は、ＣＤ３、ＣＤ１４を発現するあらゆる細胞および／またはＣＤ１９細胞を枯渇させてよくおよびＣＤ５６＋／ＣＤ３細胞(ＮＫ細胞)のパーセンテージの決定のために特徴づけしてよい。

ある実施態様において、ＮＫ細胞は、投与される対象に対して自己でも同種でもよい。ある好ましい実施態様において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞が移植片対宿主病を促進することなく同種設定で適用できるため、投与される対象に対して同種であり得る。ある実施態様において、ＮＫ細胞は、投与される対象についてハプロタイプマッチであり得る。

ある実施態様において、ＮＫ細胞は、クローンＮＫ細胞株であり得る。ＮＫ細胞株は、典型的に当分野で知られるＮＫリンパ腫／白血病由来である。ＮＫ細胞株の非限定的例は、ＹＴＳ、ＮＫ９２(ＮＫ－９２)、ＮＫ３.３、ＮＫＬおよびＮＫ１０１細胞株を含む。ある好ましい実施態様において、ＮＫ細胞はＮＫ－９２細胞である。ＮＫ－９２細胞はよく特徴付けられており、しばしば前臨床的および臨床的設定で使用される。

一次ＮＫ細胞は患者から単離でき、健常ドナーから単離できまたは公的細胞コレクションから購入できる。例としておよび限定しないが、血液から単離した一次ヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞は、カタログ番号PCS-800-019の下、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, USAから入手可能であり、ＮＫ細胞株、特にＮＫ－９２細胞株は、カタログ番号ＣＲＬ－２４０７およびＣＲＬ－２４０８の下ＡＴＣＣから入手可能であり(後者はＣＲＬ－２４０７に由来し、インターロイキン－２非依存的である)ならびにカタログ番号# ACC 488の下German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)から入手可能である。

ある実施態様において、ＮＫ細胞をインビトロで培養し得る。ＮＫ細胞の培養、増殖および拡張およびエクスビボを含むインビトロでのその性質の修飾は、よく特徴付けられている。限定しないが、実施例部分は、適当な１以上の血清(例えば、ウシ胎児血清および／またはウマ血清)、抗生物質混合物、Ｌ－グルタミンおよびインターロイキン２(ＩＬ－２)を添加した標準α－ＭＥＭ培地でのＮＫ細胞の培養を示す。ＩＬ－２、１２、１５、１８および／または２１を含むサイトカインインターロイキンの使用、自己アクセサリー非ＮＫ細胞の共培養または増殖不活性化フィーダー細胞の付加などのＮＫ細胞を培養するさらなる方法は、例えばGranzin et al. (Front Immunol. 2017, 8:458)に記載される。

ある実施態様において、ここに意図するは、１以上の免疫刺激性サイトカイン、好ましくは１以上の免疫刺激性インターロイキン(ＩＬ)、特に１以上のヒトサイトカインまたはインターロイキンをさらに発現するよう操作され得る。適当なインターロイキンの例は、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２および／またはＩＬ－２１、特にヒトＩＬ－１５、ＩＬ－１２および／またはＩＬ－２１を含む。好ましくは、免疫刺激性インターロイキンはＩＬ－１５またはＩＬ－２１または両方である。好ましくは、免疫刺激性インターロイキンはヒトＩＬ－１５またはヒトＩＬ－２１または両方である。特に好ましくは、免疫刺激性インターロイキンはヒトＩＬ－１５である。ある実施態様において、ＣＡＲおよび任意的な１以上の免疫刺激性サイトカインの発現は各々独立して構成的または誘導型である。

ガイダンスの手段としておよび限定しないが、ヒトインターロイキン－１５アイソフォーム１プレプロタンパク質およびヒトインターロイキン－１５アイソフォーム２プレプロタンパク質は、それぞれジェンバンクアクセッション番号ＮＰ＿０００５７６.１およびＮＰ＿７５１９１５.１下に注釈を付されている。

ヒトＩＬ－１５アイソフォーム１プレタンパク質の一つの具体例を下に再現する。
MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(配列番号１５)。

ある実施態様において、ＩＬ－１５は、配列番号１５と少なくとも８０％同一、例えば配列番号１５と少なくとも８５％同一、好ましくは配列番号１５と少なくとも９０％同一、例えば配列番号１５と少なくとも９５％同一、より好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または配列番号１５と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるポリペプチドをいう。特に好ましい実施態様において、ＩＬ－１５は、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。

ある実施態様において、特に配列番号１５に示すものなどのヒトＩＬ－１５は、配列番号１６
ATGAGAATCAGCAAGCCCCACCTGAGATCCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTTCTGACAGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGTTTTTCTGCCGGCCTGCCTAAGACCGAGGCCAACTGGGTTAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACACTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCTAGCTGTAAAGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAAGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAAAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAATGTGACCGAGTCCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAATATCAAAGAGTTCCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGC(配列番号１６)
に示す核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされ得て、所望により、ここで、配列番号１６の任意のコドンは、各々独立して同じアミノ酸をコードする他のコドンに置き換えられてよく、好ましくはここで、核酸配列は、当分野で知られるコドン最適化原理に従い、ヒト細胞におけるなどの所望の種の細胞における発現についてそれによりコドン最適化され、例えば、ヒトＩＬ－１５が配列番号１６に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされるようなものである。

ガイダンスの手段としておよび限定しないが、ヒトインターロイキン－２１アイソフォーム１前駆体およびヒトＩＬ－２１アイソフォーム２前駆体は、ジェンバンクアクセッション番号ＮＰ＿０６８５７５.１およびＮＰ＿００１１９３９３５.１の下に注釈を付さｒている。

ヒトＩＬ－２１アイソフォーム１前駆体(ＮＰ＿０６８５７５.１)のある具体例を下に再現する。
MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(配列番号２３)。

ヒトＩＬ－２１アイソフォーム２前駆体(ＮＰ＿００１１９３９３５.１)のある具体例を下に再現する。
MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKVSTLSFI(配列番号２４)。

ある実施態様において、ＩＬ－２１は、配列番号２３または２４、好ましくは配列番号２３と少なくとも８０％同一；例えば配列番号２３または２４、好ましくは配列番号２３と少なくとも８５％同一；好ましくは配列番号２３または２４、好ましくは配列番号２３と少なくとも９０％同一；例えば配列番号２３または２４、好ましくは配列番号２３と少なくとも９５％同一；より好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または配列番号２３または２４、好ましくは配列番号２３と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるポリペプチドをいう。特に好ましい実施態様において、ＩＬ－２１は、配列番号２３または２４に示すアミノ酸配列、好ましくは配列番号２３を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。

ある実施態様において、特に配列番号２３または２４に示すものなどのヒトＩＬ－２１は、それぞれアクセッション番号ＮＭ＿０２１８０３.４またはＮＭ＿００１２０７００６.２下にジェンバンクに注釈を付されているまたは配列番号２５
ATGAGATCCAGTCCTGGCAACATGGAGAGGATTGTCATCTGTCTGATGGTCATCTTCTTGGGGACACTGGTCCACAAATCAAGCTCCCAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCC(配列番号２５)
に示す核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされ得て、所望により、ここで、ＮＭ＿０２１８０３.４、ＮＭ＿００１２０７００６.２または配列番号２５の任意のコドンは、各々独立して同じアミノ酸をコードする他のコドンに置き換えられてよく、好ましくはここで、核酸配列は、当分野で知られるコドン最適化原理に従い、ヒト細胞におけるなどの所望の種の細胞における発現についてそれによりコドン最適化され、ここで、ヒトＩＬ－２１は、ＮＭ＿０２１８０３.４、ＮＭ＿００１２０７００６.２または配列番号２５と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされるようなものである。

ガイダンスの手段としておよび限定しないが、ヒトインターロイキン－１２サブユニットアルファ(ＩＬ－１２Ａ)前駆体は、ジェンバンクアクセッション番号ＮＰ＿０００８７３.２(アイソフォーム１)、ＮＰ＿００１３４１５１１.１(アイソフォーム２)、ＮＰ＿００１３４１５１２.１(アイソフォーム３)およびＮＰ＿００１３８４９２１.１(アイソフォーム４)の下に注釈を付されている。ガイダンスの手段としておよび限定しないが、ヒトインターロイキン－１２サブユニットベータ(ＩＬ－１２Ｂ)前駆体は、ジェンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００２１７８の下に注釈を付されている。まとめて、ＩＬ－１２Ａ(ｐ３５)およびＩＬ－１２Ｂ(ｐ４０)は、ｐ７０と称されるヘテロ二量体活性サイトカインを形成する。

ヒトＩＬ－１２Ａ、すなわちアイソフォーム１前駆体(ＮＰ＿０００８７３.２)のある具体例を下に再現する。
MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(配列番号２６)。

ＣＡＲと共発現されるヒトＩＬ－１２Ａサブユニットのある具体例を下に再現する。
MCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(配列番号２７)。

ヒトＩＬ－１２Ｂ前駆体(ＮＰ＿００２１７８.２)のある具体例を下に再現する。
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNK眼YSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS(配列番号２８)。

ある実施態様において、ＩＬ－１２ＡおよびＩＬ－１２Ｂは、配列番号２６～２８と少なくとも８０％同一、例えば配列番号２６～２８と少なくとも８５％同一、好ましくは配列番号２６～２８と少なくとも９０％同一、例えば配列番号２６～２８と少なくとも９５％同一、より好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または配列番号２６～２８と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる各ポリペプチドをいう。特に好ましい実施態様において、ＩＬ－１２Ａは、配列番号２６または２７に示すアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。特に好ましい実施態様において、ＩＬ－１２Ｂは、配列番号２８に示すアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。

ある実施態様において、ヒトＩＬ－１２Ａ前駆体は、アクセッション番号ＮＭ＿０００８８２.３(アイソフォーム１)、ＮＭ＿００１３５４５８２.２(アイソフォーム２)、ＮＭ＿００１３５４５８３.２(アイソフォーム３)、ＮＭ＿００１３９７９９２.１(アイソフォーム４)下にジェンバンクに注釈を付されているまたは配列番号２９：
ATGTGTCCAGCGCGCAGCCTCCTCCTTGTGGCTACCCTGGTCCTCCTGGACCACCTCAGTTTGGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTTCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATGCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCC(配列番号２９)
に示す核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされ得て、所望により、ここで、ＮＭ＿０００８８２.３、ＮＭ＿００１３５４５８２.２、ＮＭ＿００１３５４５８３.２、ＮＭ＿００１３９７９９２.１または配列番号２９の任意のコドンは、各々独立して同じアミノ酸をコードする他のコドンに置き換えられてよく、好ましくはここで、核酸配列は、当分野で知られるコドン最適化原理に従い、ヒト細胞におけるなどの所望の種の細胞における発現についてそれによりコドン最適化され、ここで、ヒトＩＬ－１２ＡがＮＭ＿０００８８２.３、ＮＭ＿００１３５４５８２.２、ＮＭ＿００１３５４５８３.２、ＮＭ＿００１３９７９９２.１または配列番号２９と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされるようなものである。

ある実施態様において、ヒトＩＬ－１２Ｂ前駆体はアクセッション番号ＮＭ＿００２１８７.２の下ジェンバンクに注釈を付されているまたは配列番号３０：
ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGT(配列番号３０)
に示す核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされ得て、所望により、ここで、ＮＭ＿００２１８７.２または配列番号３０における任意のコドンは、各々独立して同じアミノ酸をコードする他のコドンに置き換えられてよく、好ましくはここで、核酸配列は、当分野で知られるコドン最適化原理に従い、ヒト細胞におけるなどの所望の種の細胞における発現についてそれによりコドン最適化され、ここで、ヒトＩＬ－１２ＢがＮＭ＿００２１８７.２または配列番号３０と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされるようなものである。

ある実施態様において、ＣＡＲおよび免疫刺激性サイトカイン、例えばＩＬ－１５、ＩＬ－１２および／またはＩＬ－２１、例えば特にＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１、例えばさらにより具体的にＩＬ－１５は２個の別のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)によりコードされ得る。ある実施態様において、２個の別のＯＲＦは同じポリヌクレオチドまたは２個の別のポリヌクレオチドに含まれ得る。ある実施態様において、２個の別のＯＲＦは単一転写単位または２個の別の転写単位に含まれ得る。ある実施態様において、２個の別のＯＲＦは単一ｍＲＮＡ分子または２個の別のｍＲＮＡ分子に含まれ得る。

ある実施態様において、ＣＡＲおよび免疫刺激性サイトカイン、例えばＩＬ－１５、ＩＬ－１２および／またはＩＬ－２１、例えば特にＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１、例えばさらにより具体的にＩＬ－１５は、ＣＡＲとサイトカインアミノ酸配列の間に配置されたリボソームスキッピングまたは自発的タンパク質分解に感受性のペプチド配列と共に、単一ＯＲＦにより含まれ得る。例として、２Ａ自己切断ペプチドをコードする配列を、ＣＡＲをコードする配列とサイトカインをコードする配列の間に挿入し得る。２Ａペプチドの例は、Ｔ２Ａ(EGRGSLLTCGDVEENPGP、配列番号１７)、Ｐ２Ａ(ATNFSLLKQAGDVEENPGP、配列番号１８)、Ｅ２Ａ(QCTNYALLKLAGDVESNPGP、配列番号１９)およびＦ２Ａ(VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP、配列番号２０)を含む。任意的なＧＳＧトリペプチドを、効率を上げるためにＮ末端に導入してよい。従って、ある実施態様において、ＣＡＲおよびサイトカインは、その間に挿入された２Ａペプチドを含むポリペプチドをコードする配列と同じＯＲＦ内でコードされる。

従って、例示として、ある特に好ましい実施態様において、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ１５前駆体は下の配列番号２１に示すアミノ酸を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるものであり、ここで、シグナル配列は太字、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメインは標準文字、４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインは斜体、ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインは下線を引き、ＧＳＧ－Ｐ２Ａ自己切断ペプチドは太字斜体およびＩＬ－１５は下線を引かれた太字である。

ある実施態様において、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ１５前駆体は、配列番号２１と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一、例えば特に好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。

ある実施態様において、特に配列番号２１に示すものなどのここに教示するＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ１５前駆体形態は、配列番号２２または３１
に示す核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされ得て、ここで、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ１５コード配列のＡＴＧ開始およびＴＡＡ停止コドンは太字、ＳｐｅＩ制限部位は下線を引き、ＧＣＣＡＣＣコザック配列は斜体およびＸｈｏＩ制限部位は二重下線を引き、ＩＬ－１５カセットに隣接するＥｃｏＲＩ制限部位は太字斜体であり(明らかに、他の制限部位は、実験の便宜上、含まれていても含まれていなくてもよい)、所望により、ここで、配列番号２２または３１の任意のコドンは、各々独立して同じアミノ酸をコードする他のコドンに置き換えられてよく、好ましくはここで、核酸配列は、当分野で知られるコドン最適化原理に従い、ヒト細胞におけるなどの所望の種の細胞における発現についてそれによりコドン最適化され、ここで、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ１５前駆体が配列番号２２または３１と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされるようなものである。

さらも、例示として、ある特に好ましい実施態様において、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ２１前駆体は下の配列番号３２に示すアミノ酸を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるものであり、ここで、シグナル配列は太字、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメインは標準文字、４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインは斜体、ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインは下線を引き、ＧＳＧ－Ｐ２Ａ自己切断ペプチドは太字斜体およびＩＬ－２１は下線を引かれた太字である。

ある実施態様において、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ２１前駆体は、配列番号３２と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一、例えば特に好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。

ある実施態様において、特に配列番号３２に示すものなどのここに教示するＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ２１前駆体形態は、配列番号３３
に示す核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされ得て、ここで、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ２１コード配列のＡＴＧ開始およびＴＡＡ停止コドンは太字、ＳｐｅＩ制限部位は下線を引き、ＧＣＣＡＣＣコザック配列は斜体およびＸｈｏＩ制限部位は二重下線を引き、ＩＬ－２１カセットに隣接するＥｃｏＲＩ制限部位は太字斜体であり(明らかに、他の制限部位は、実験の便宜上、含まれていても含まれていなくてもよい)、所望により、ここで、配列番号３３の任意のコドンは、各々独立して同じアミノ酸をコードする他のコドンに置き換えられてよく、好ましくはここで、核酸配列は、当分野で知られるコドン最適化原理に従い、ヒト細胞におけるなどの所望の種の細胞における発現についてそれによりコドン最適化され、ここで、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ２１前駆体が配列番号３３と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされるようなものである。

さらに、例示として、ある特に好ましい実施態様において、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ１２前駆体は下の配列番号３４に示すアミノ酸を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるものであり、ここで、シグナル配列は太字、ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメインは標準文字、４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインは斜体、ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインは下線を引き、ＧＳＧ－Ｐ２Ａ自己切断ペプチドは太字斜体およびＩＬ－１２Ａおよび１２Ｂ(この順番でかつＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドにより分離される)は下線を引かれた太字である。

ある実施態様において、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ１２前駆体は、配列番号３４と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一、例えば特に好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。

ある実施態様において、特に配列番号３４に示すものなどのここに教示するＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ１２前駆体形態は、配列番号３５
に示す核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされ得て、ここで、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ１２Ａ－Ｐ２Ａ－ＩＬ１２Ｂコード配列のＡＴＧ開始およびＴＡＡ停止コドンは太字、ＳｐｅＩ制限部位は下線を引き、ＧＣＣＡＣＣコザック配列は斜体およびＸｈｏＩ制限部位は二重下線を引き、ＩＬ－１２カセットに隣接するＥｃｏＲＩ制限部位は太字斜体であり(明らかに、他の制限部位は、実験の便宜上、含まれていても含まれていなくてもよい)、所望により、ここで、配列番号３５の任意のコドンは、各々独立して同じアミノ酸をコードする他のコドンに置き換えられてよく、好ましくはここで、核酸配列は、当分野で知られるコドン最適化原理に従い、ヒト細胞におけるなどの所望の種の細胞における発現についてそれによりコドン最適化され、ここで、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＩＬ２１前駆体が配列番号３５と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる核酸によりコードされるようなものである。

さらなる本発明の態様は、発現可能形式でここに定義したＣＡＲをコードする核酸および所望により発現可能形式で１以上の免疫刺激性サイトカインをコードする核酸をＮＫ細胞の出発集団に導入することを含む、ここに教示するＮＫ細胞を産生する方法を提供する。

ある実施態様において、細胞に導入された核酸は、上記のとおり所望により単一ＯＲＦ内でＣＡＲおよび所望によりサイトカインをコードするｍＲＮＡが細胞の転写機構を使用して転写され得る、ＤＮＡ発現カセットまたはベクターであり得る。他の実施態様において、細胞に導入された核酸は、細胞のタンパク質翻訳機構により翻訳され得る、上記のとおり所望により単一ＯＲＦ内でＣＡＲおよび所望によりサイトカインをコードするｍＲＮＡであり得る。ある好ましい実施態様において、ｍＲＮＡなどの核酸を、ＮＫ細胞の出発集団にエレクトロポレーションにより導入し得る。

所望によりしかし必ずしもそうではないが、方法はさらに該１以上の核酸を含み、ＣＡＲおよび所望により１以上の免疫刺激性サイトカインを発現できるＮＫ細胞の選択および／または拡張を含み得る。トランスフェクトまたは形質導入細胞を選択する方法は当分野で日常的であり、ブラストサイジン、ジェネテシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する遺伝子などの確立された陽性選択マーカーを使用し得る。

ある特に好ましい実施態様において、方法は、ＮＫ細胞の、ＤＮＡ構築物またはｍＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子でのなどの一過性トランスフェクションを含み得る。ある実施態様において、一過性トランスフェクションは、トランスフェクト細胞のあらゆる選択を必要としない可能性がある。ある実施態様において、方法は、安定なトランスフェクトされたＮＫ細胞を含み得て、その場合操作された細胞の選択が望ましい。

さらなる態様は、ここに教示する操作されたＮＫ細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

ここに使用する用語「薬学的に許容される」は技術と一致し、医薬組成物の他の成分と適合性であり、かつそのレシピエントに有害ではないことを意味する。

ここで使用する「担体」または「添加物」は、任意かつ全ての溶媒、希釈剤、緩衝液ｓ(例えば、中性緩衝化食塩水またはリン酸緩衝化食塩水)、可溶化剤、コロイド、分散媒体、媒体、充填剤、キレート剤(例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン)、アミノ酸(例えば、グリシン)、タンパク質、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、風味剤、芳香剤、濃化剤、デポー効果を達成するための薬剤、コーティング、抗真菌剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤、張性制御剤、吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野で周知である。このような物質は非毒性であり、細胞の活性を妨害してはならない。

担体または添加物または他の物質の厳密な性質は投与経路による。例えば、組成物は、パイロジェンフリーであり、適当なｐＨ、等張性および安定性を有する非経腸的に許容される水溶液の形態であり得る。医薬製剤における一般的原理について、読者はCell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds., Cambridge University Press, 1996;およびHematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000を参照する。

液体医薬組成物は、一般に水または薬学的に許容される水溶液などの液体担体を含み得る。例えば、生理学的食塩水溶液、組織または細胞培養媒体、デキストロースまたは他の糖類溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれ得る。

組成物は１以上の細胞保護分子、細胞再生分子、増殖因子、抗アポトーシス因子または細胞における遺伝子発現を制御する因子を含み得る。このような物質は、細胞をその環境に非依存的とし得る。

このような医薬組成物は、細胞の生存能を確実とするさらなる成分を含み得る。例えば、組成物は、所望のｐＨ、より一般にはほぼ中性のｐＨを達成するための適当な緩衝液系(例えば、リン酸または炭酸緩衝液系)を含み得て、浸透ストレスを防止するために細胞の等張条件を確実にする十分な塩を含み得る。例えば、これらの目的で適当な溶液は、当分野で既知の、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)、塩化ナトリウム溶液、リンゲル注射液または乳酸リンゲル液注射液であり得る。さらに、組成物は、細胞の生存能を高め得る、担体タンパク質、例えば、アルブミン(例えば、ウシまたはヒトアルブミン)を含み得る。

さらに好適に薬学的に許容される担体または添加剤は当業者に周知であり、例えばコラーゲンまたはゼラチンなどのタンパク質、炭水化物、例えばデンプン、多糖、糖(デキストロース、グルコースおよびスクロース)、ナトリウムまたはカルシウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体、アルファ化デンプン、ペクチン寒天、カラゲナン、クレイ、親水性ゴム(アカシアゴム、グアーゴム、アラビアゴムおよびキサンタンゴム)、アルギン酸、アルギネート、ヒアルロン酸、ポリグリコール酸およびポリ乳酸、デキストラン、ペクチン、合成ポリマー、例えば水可溶性アクリル酸ポリマーまたはポリビニルピロリドン、プロテオグリカン、リン酸カルシウムなどから選択され得る。

ある実施態様において、上に定義する医薬細胞調製物を、液体組成物の形で投与し得る。ある実施態様において、細胞またはそれを含む医薬組成物を、全身に、局所に、ある臓器内に、臓器機能不全または病変部位にまたは組織病変部位に投与し得る。

好ましくは、医薬組成物は、治療有効量の所望の細胞を含み得る。用語「治療有効量」は、研究者、獣医師、医師または他の臨床医により探索されている、組織、系、動物またはヒトにおける生物学的または医薬応答を誘発できる、特に処置される疾患または状態の局所または全身症状または特性の１以上を予防または軽減できる量をいう。適切な治療有効量は、所望の細胞の性質、疾患状態および重症度ならびに対象の年齢、体格および状態を考慮して、有資格医により決定され得る。

また提供されるのは、本発明の細胞と１以上の上記付加的成分および１以上の上記医薬添加物の混合により該医薬組成物を産生する方法である。

ここに教示される細胞またはここに定義する医薬組成物を、対象に、例えば、注射により、例えば全身になど投与するための外科的装置またはデバイスを含む、そして、さらにここに教示される細胞またはここに定義する医薬組成物を含む、配置またはキット・オブ・パーツも開示される。

ある実施態様において、上に定義する医薬組成物を、液体組成物の形態で投与し得る。

投与すべき細胞の量は、処置する対象毎に変わる。ある実施態様において、投与すべき細胞の量は１０^２～１０^１０または１０^２～１０^９または１０^３～１０^１０または１０^３～１０^９または１０^４～１０^１０または１０^４～１０^９、例えば１０^４～１０^８または１０^５～１０^７であり、例えば、約１×１０^５、約５×１０^５、約１×１０^６、約５×１０^６、約１×１０^７、約５×１０^７、約１×１０^８、約５×１０^８、約１×１０^９、約５×１０^９または約１×１０^１０細胞をヒト対象に投与し得る。例えば、このような投与は、好適に、１日以上にわたり(例えば、１日、２日、３日、４日または５日またはそれ以上にわたり)投与される、１回以上に分けてよい(例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回またはそれ以上に分けてよい)。しかしながら、治療有効用量の厳密な決定は、体格、年齢、組織損傷を含む各患者の個々の因子に基づき、この開示および当分野の知識から当業者により容易に確認され得る。好適にではあるが、限定ではなく、投与すべき組成物において、細胞は約１０^４／ml～約１０^９／ml、好ましくは約１０^５／ml～約１０^８／ml、さらにより好ましくは約１×１０^６／ml～約１×１０^８／mlの濃度で存在し得る。

さらなる態様は、治療に使用するための、ここに教示される操作されたＮＫ細胞または医薬組成物を提供する。特に適用されるのは、新生物疾患を処置する方法に使用するためのここに教示される操作されたＮＫ細胞または医薬組成物である。特に適用されるのは、癌を処置する方法に使用するためのここに教示される操作されたＮＫ細胞または医薬組成物である。

「治療」または「処置」の言及は、治癒的および予防的両者の処置を広く包含し、本用語は特に疾患または障害などの病態の１以上の症状または測定可能なマーカーの軽減または測定可能な低減をいい得る。本用語は、一次処置ならびにネオアジュバント処置、アジュバント処置および補助療法を包含する。測定可能な低減は、測定可能なマーカーまたは症状の統計学的に有意な減少を含む。一般に、本用語は、治癒的処置および疾患の症状減少および／または進行遅延を意図する処置両方を包含する。本用語は、既に発症した病態の治療的処置ならびに予防的または防止的手段の両方を包含し、ここで、目的は、病態の発生の機会の予防または低減である。ある実施態様において、本用語は治療的処置に関し得る。ある他の実施態様において、本用語は予防的処置に関し得る。寛解期中の慢性病態の処置もまた、治療的処置を構成すると見なされ得る。本用語は本発明の構成で適当である限り、エクスビボまたはインビボ処置を含み得る。

用語「対象」、「個体」または「患者」は、本明細書をとおして相互交換可能に使用され、典型的におよび好ましくはヒトを意味するが、非ヒト動物、好ましくは温血動物、さらにより好ましくは非ヒト哺乳動物も包含し得る。両方の性別および全年齢分類を含むヒト対象が特に好ましい。他の実施態様において、対象は、疾患モデルとしての実験動物または代用動物である。本用語は、特定の年齢または性別を意味しない。故に、男性であれ、女性であれ、成人および新生児対象ならびに胎児がカバーされることが意図される。用語対象はさらにトランスジェニック非ヒト種を含むことが意図される。

ここで使用する用語「処置を必要とする対象」または類似のものは、ここに記載する疾患を有すると診断されたまたは有する対象および／または該疾患を予防すべき対象をいう。

用語「新生物疾患」は、一般に良性(周囲正常組織に浸潤しない、転移を形成しない)、前悪性(前癌性)または悪性(隣接組織に浸潤および転移を産生できる)であれ、新生物細胞成長および増殖により特徴づけられるあらゆる疾患または障害をいう。用語新生物疾患は、一般に全ての形質転換細胞および組織ならびに全ての癌性細胞および組織を含む。新生物疾患または障害は、異常細胞増殖、良性腫瘍、前悪性または前癌性病変、悪性腫瘍および癌を含むが、これらに限定されない。新生物疾患または障害の例は、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺(副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺)、眼、頭頚部、神経(中枢および末梢)、リンパ系、骨盤内、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭または尿生殖路におけるなどあらゆる組織または臓器に位置する良性、前悪性または悪性新生物である。

ここで使用する用語「腫瘍」または「腫瘍組織」は、過剰な細胞分裂に起因する組織の異常塊をいう。腫瘍または腫瘍組織は、異常な増殖性質を有し、有用な身体上の機能がない新生物細胞である腫瘍細胞を含む。腫瘍、腫瘍組織および腫瘍細胞は良性、前悪性または悪性であってよくまたは癌化の可能性が何らない病変を示し得る。腫瘍または腫瘍組織はまた腫瘍関連非腫瘍細胞、例えば、腫瘍または腫瘍組織に供給される血管を形成する血管細胞も含み得る。非腫瘍細胞は、腫瘍細胞により再成および進展が誘導、例えば、腫瘍または腫瘍組織における血管形成の誘導がされ得る。

ここで使用する用語「癌」は、制御が解除されたまたは制御されていない細胞増殖により特徴づけられる悪性新生物をいう。用語「癌」は、一次悪性細胞または腫瘍(例えば、細胞が対象の体の元の悪性腫瘍または腫瘍の部位以外の場所に遊走していないもの)および二次悪性細胞または腫瘍(例えば、元の腫瘍の部位と異なる二次的部位への悪性細胞または腫瘍細胞の転移、遊走に起因するもの)を含む。用語「転移性」または「転移」は、一般に癌のある一つの臓器または組織から他の非隣接臓器または組織への拡散をいう。他の非隣接臓器または組織における新生物疾患の出現は転移と称する。

癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病またはリンパ系悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない。このような癌のさらなる具体例は、扁平上皮細胞癌(例えば、上皮性扁平上皮細胞癌)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌および大細胞肺癌を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌を含む胃の癌または胃癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎臓の癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌ならびにＣＮＳ癌、黒色腫、頭頸部癌、骨癌、骨髄癌、十二指腸癌、食道癌、甲状腺癌または血液癌を含むが、これらに限定されない。

癌または悪性腫瘍の他の非限定的例は、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、成人(一次)肝細胞癌、成人(一次)肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン疾患、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人一次肝臓癌、成人軟組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂および尿道の癌、中枢神経系(一次)リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫、頸部癌、小児(一次)肝細胞癌、小児(一次)肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、神経膠芽腫、小児小脳星状細胞腫、小児脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン疾患、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視路神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体および小脳テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児一次肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟組織肉腫、小児視路および視床下部神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵臓島細胞癌、子宮内膜癌、上衣腫、上皮性癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、胆嚢癌、胃癌、消化器カルチノイド腫瘍、消化器腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性栄養芽細胞腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン疾患、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、島細胞癌、島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇および口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移潜在的一次扁平上皮頸部癌、転移一次扁平上皮頸部癌、転移扁平上皮頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在的一次転移扁平上皮頸部癌、口腔咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣上皮性癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、紫斑病、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、一次中枢神経系リンパ腫、一次肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞癌、腎盂および尿道癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮頸部癌、胃癌、小脳テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂および尿道の移行細胞癌、移行性腎盂および尿道癌、栄養芽細胞腫瘍、尿道および腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視路および視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症またはウィルムス腫瘍を含むが、これらに限定されない。

ある実施態様において、癌は血液学的悪性腫瘍である。ある実施態様において、癌はバーキットリンパ腫である。ある実施態様において、癌は固形悪性腫瘍(固形腫瘍)である。ある実施態様において、癌は結腸直腸癌または膵臓癌である。ある実施態様において、癌が血液学的悪性腫瘍であるとき、ＮＫ細胞は、必須ではないが、１以上の免疫刺激性サイトカインをさらに発現するよう操作してよい。ある実施態様において、癌が固形腫瘍であるとき、ＮＫ細胞は、必須ではないが、好ましくは１以上の免疫刺激性サイトカイン、例えば１以上の免疫刺激性インターロイキン、例えばＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１、例えば特に好ましくは少なくともＩＬ－１５またはＩＬ－１５のみをさらに発現するよう操作される。本発明者らは、ＮＫ細胞における免疫刺激性インターロイキンとＣＡＲの同時発現が、ＮＫ細胞が癌細胞およびＣＡＦなどの腫瘍環境の細胞を含む固形腫瘍の細胞を標的とする能力を大きく改善することを示した。

ある実施態様において、癌などの新生物疾患は、ＣＤ７０陽性癌性細胞を含む。ここに記載する腫瘍細胞または腫瘍微小環境の細胞などの細胞は、本明細書文脈において、１以上のマーカー、例えば１以上の遺伝子、ポリペプチドまたはタンパク質、例えばＣＤ７０の「発現を含む」または逆に「発現しない」ということができまたは１以上のマーカー、例えば１以上の遺伝子、ポリペプチドまたはタンパク質、例えばＣＤ７０について「陽性」(＋)または逆に「陰性」(－)として記載され得る。

このような用語は、細胞表現型を特徴づけるとき、当業者による決まり文句であり、よく理解されている。付加的ガイダンスの手段として、細胞があるマーカー、例えばある遺伝子、ポリペプチドまたはタンパク質、例えばＣＤ７０について陽性であるまたは発現するまたは発現を含むというとき、当業者は、細胞内または上のマーカーの検出または定量が可能な測定をするとき、該マーカー明確なシグナルの存在または証拠を結論とする。好適には、マーカーの明確なシグナルの存在または証拠は、ある細胞で得た測定結果と、陰性対照(例えば、マーカーを発現しないことが知られる細胞)および／または陽性対照(例えば、マーカーを発現することが知られる細胞)で実施した同じ測定の結果の比較に基づき、結論づける。マーカーの定量的評価が可能である測定方法であるならば、陽性細胞は、陰性対照細胞により産生されるマーカーについてのシグナルまたは陰性対照細胞集団により産生されるマーカーについての平均シグナルより少なくとも１.５倍高いマーカーについてのシグナルを産生し、例えば、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍高いまたはさらに高い。さらに、陽性細胞は、陰性対照細胞集団により産生されるマーカーについての平均シグナルより３.０標準偏差以上、例えば、３.５標準偏差以上、４.０標準偏差以上、４.５標準偏差以上または５.０標準偏差以上高いマーカーについてのシグナルを産生し得る。

あらゆる既存の、利用可能なまたは慣用の分離、検出および／または定量方法を使用して、対象からの生物学的サンプルにおけるＣＤ７０陽性細胞の存在または非存在(例えば、読出しは存在対非存在；または検出可能量対検出不可能量である)および／または品質(例えば、読出しは絶対または相対品質である)を測定できる。例として、標準免疫学的アッセイ方法を用いることができ、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、マスサイトメトリー、蛍光標識細胞分取(ＦＡＣＳ)、蛍光顕微鏡、微少流体系を使用する蛍光ベースの細胞選別、親和性クロマトグラフィーなどの免疫親和性吸着ベースの技術、磁気粒子分離、微少流体系を使用する磁気活性化細胞選別またはビーズベースの細胞選別、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)およびＥＬＩＳＰＯＴベースの技術、放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、ウェスタンブロットなどを含むが、これらに限定されない。このような技術に適する抗ＣＤ７０抗体は、多様な業者から市販されている。

本明細書をとおして使用する用語「サンプル」または「生物学的サンプル」は、対象から得た(単離、除去)あらゆる生物学的検体を含む。サンプルは、臓器組織(例えば、一次または転移腫瘍組織)、全血、血漿、血清、全血細胞、赤血球、白血球(例えば、末梢血単核細胞)、唾液、尿、便(糞便)、涙、汗、皮脂、乳頭吸引液、乳管内洗浄、腫瘍滲出液、滑膜液、脳脊髄液、リンパ、細針吸引、羊水、何らかのその他体液、滲出液または分泌液、細胞ライセート、細胞分泌産物、炎症液、精液および膣分泌物を含み得るが、これらに限定されない。好ましくは、サンプルは、対象からのサンプルの供給／除去／単離を可能とする、採血(‘液体生検’)、採尿、採便、組織(例えば、腫瘍組織)生検または細針吸引などの非侵襲性または最低限侵襲性の方法により得られ得る。ここで使用する用語「組織」は、臓器の細胞だけでなく、血液および上記の他の体液も含む、人体の全タイプの細胞を包含する。組織は健常でも病理学的変更の影響を受けていても、例えば、腫瘍組織でもよい。組織は生存対象からで有り得てまたは死体組織であり得る。特に有用なサンプルは、腫瘍細胞および／または腫瘍微小環境細胞を含むことが知られるまたは含むことが期待または予測されるまたはおそらく含むことが知られるまたはおそらく含むことが期待または予測されるものである。

任意の適当な重量または体積のサンプルを、分析用に対象から採り得る。限定しないが、液体サンプルは、１mL～２０mL、例えば、５mL、７.５mL、１０mL、１５mLまたは２０mLの体積を有し得る。固体サンプルは１ｇ～２０ｇ、例えば、５ｇ、７.５ｇ、１０ｇ、１５ｇまたは２０ｇの重量を有し得る。

ある実施態様において、癌などの新生物疾患は、ＣＤ７０陽性癌性細胞を１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または最大１００％含み、ＣＤ７０陽性癌性細胞のパーセンテージは、新生物疾患病変の代表的サンプルにおける全癌性細胞との比を表す。ある実施態様において、癌などの新生物疾患はＣＤ７０陽性癌性細胞を１０％以下、例えば８％以下、６％以下、４％以下、２％以下または最低０％含み、ＣＤ７０陽性癌性細胞のパーセンテージは、新生物疾患病変の代表的サンプルにおける全癌性細胞との比を表す。癌関連線維芽細胞(ＣＡＦ)などのＣＤ７０陽性腫瘍微小環境(ＴＭＥ)細胞を標的とする能力により、本発明の実施態様による操作されたＮＫ細胞はまた癌性細胞におけるＣＤ７０発現レベルが比較的低い癌にも治療上有効であり得る。

ある実施態様において、癌などの新生物疾患はＣＤ７０陽性癌関連線維芽細胞(ＣＡＦ)を含む。用語「癌関連線維芽細胞」、「ＣＡＦ」、「腫瘍関連線維芽細胞」、「発癌性関連線維芽細胞」または「活性化線維芽細胞」は、細胞外マトリクスのリモデリング開始またはサイトカイン分泌により、腫瘍原性特性を促進することが報告されている腫瘍微小環境内の細胞型である。ＣＡＦは、正常線維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、線維細胞または間葉性幹細胞に由来することが報告されている。現在の知識では、ＣＡＦは、血管形成を刺激するよう血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)および線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)などの増殖因子および他のケモカインを分泌することにより腫瘍増殖を支持し、それにより腫瘍増殖を刺激し得る。

ある実施態様において、癌などの新生物疾患はＣＤ７０陽性ＣＡＦを１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または最大１００％含み、ＣＤ７０陽性ＣＡＦのパーセンテージは、新生物疾患病変の代表的サンプルにおける全ＣＡＦとの比を表す。

ある実施態様において、癌などの新生物疾患はＣＤ７０陽性癌性細胞およびＣＤ７０陽性癌関連線維芽細胞(ＣＡＦ)を含む。

ある実施態様において、癌などの新生物疾患は、ＣＤ７０陽性癌性細胞を１０％未満、例えば８％以下、６％以下、４％以下、２％以下または最低０％(ＣＤ７０陽性癌性細胞のパーセンテージは、新生物疾患病変の代表的サンプルにおける全癌性細胞との比を表す)；およびＣＤ７０陽性ＣＡＦを１０％以上、例えば２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または最大１００％(ＣＤ７０陽性ＣＡＦのパーセンテージは、新生物疾患病変のＣＤ７０陽性ＣＡＦ代表的サンプルにおける全ＣＡＦとの比を表す)含む。

ある実施態様において、新生物疾患は結腸直腸癌(ＣＣ)、より具体的にある実施態様において、ＣＤ７０陽性ＣＡＦを含む結腸直腸癌である。本発明者らは、ＣＣをしばしば少ない数のＣＤ７０陽性癌性細胞を有する(例えば、１０％未満または５％未満)が、同時に比較的多い割合のＣＤ７０陽性ＣＡＦを有するとして特徴づけている。さらに、ＣＤ７０陽性ＣＡＦの％は、ＣＣのステージが進行すると増加すると考えられる。故に、好ましくは、ＣＣはステージＴ１、より好ましくはステージＴ２、さらにより好ましくはステージＴ３、最も好ましくはステージＴ４である。

ある実施態様において、結腸直腸癌はＣＤ７０陽性ＣＡＦを１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または最大１００％含み、ＣＤ７０陽性ＣＡＦのパーセンテージは、結腸直腸癌病変の代表的サンプルにおける全ＣＡＦとの比を表す。

ある実施態様において、ここに教示される操作されたＮＫ細胞を唯一の薬剤(活性医薬成分)としてまたは組み合わせが許容されない有害効果を引き起こさないとき１以上の他の薬剤と組み合わせて投与し得る。例えば、ＮＫ細胞を、例えば手術、放射線療法、化学療法、生物学的療法またはそれらの組み合わせなどの既知の１以上の抗癌治療と組み合わせ得る。ここで使用する用語「化学療法」は、広くおよび一般に化学物質または組成物を使用する処置を包含すると理解される。化学療法剤は、典型的に細胞毒性または細胞増殖抑制効果を示す。ある実施態様において、化学療法剤はアルキル化剤、細胞毒性化合物、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、テルペノイド、トポイソメラーゼ阻害剤またはそれらの組み合わせであり得る。ここで使用する用語「生物学的療法」は、広くおよび一般にウイルスまたは細胞などの生体分子または生物学的製剤などの生物学由来物質または組成物を使用する処置を包含すると理解される。ある実施態様において、生体分子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸または小分子(例えば一次代謝物、二次代謝物または天然産物)またはそれらの組み合わせであり得る。適当な生体分子の例は、インターロイキン、サイトカイン、抗サイトカイン、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、サイトカイン受容体、ワクチン、インターフェロン、酵素、治療抗体、抗体フラグメント、抗体様タンパク質足場またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。適当な生体分子の例は、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、ベバシズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、カツマキソマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エロツズマブ、ゲムツズマブ オゾガマイシン、^９０Ｙ－イブリツモマブチウキセタン、イダルシズマブ、インターフェロンＡ、イピリムマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、タソネルミン、^１３１Ｉ－トシツモマブ、トラスツズマブ、アド－トラスツズマブエタンシンおよびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。適当な腫瘍溶解性ウイルスの例は、タリモジンラヘルパレプベクを含むが、これに限定されない。抗癌治療のさらなるカテゴリーは、とりわけ、一般にに生物学的療法内に入ると考えられるホルモン療法(内分泌療法)、免疫療法および幹細胞療法を含む。適当なホルモン療法は、タモキシフェン；アロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾールおよびそれらの組み合わせ；黄体形成ホルモンブロッカー、例えばゴセレリン、ロイプロレリン、トリプトレリンおよびそれらの組み合わせ；抗アンドロゲン、例えばビカルタミド、シプロテロンアセテート、フルタミドおよびそれらの組み合わせ；性腺刺激ホルモン放出ホルモンブロッカー、例えばデガレリクス；プロゲステロン処置、例えばメドロキシプロゲステロンアセテート、メゲストロールおよびそれらの組み合わせ；およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。用語「免疫療法」は、広く対象の免疫系を調節するあらゆる処置を包含する。特に、本用語は、免疫応答、例えば液性免疫応答、細胞介在免疫応答または両方を調節するあらゆる処置を含む。免疫療法は、免疫細胞、例えばＴ細胞および／または樹状細胞が患者に移入される細胞ベースの免疫療法を含む。本用語はまた対象の免疫系を調節する物質または組成物、例えば化学的化合物および／または生体分子(例えば、抗体、抗原、インターロイキン、サイトカインまたはそれらの組み合わせ)の投与も含む。癌免疫療法の例は、腫瘍細胞により発現されるタンパク質に対するモノクローナル抗体、例えばＦｃ改変モノクローナル抗体、免疫チェックポイント阻害剤、予防的または治療的癌ワクチン、養子細胞療法およびそれらの組み合わせを用いる処置を含むが、これらに限定されない。阻害するために標的とする免疫チェックポイントの例は、ＰＤ－１(ＰＤ－１阻害剤の例はペムブロリズマブ、ニボルマブおよびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない)、ＣＴＬＡ－４(ＣＴＬＡ－４阻害剤の例はイピリムマブ、トレメリムマブおよびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない)、ＰＤ－Ｌ１(ＰＤ－Ｌ１阻害剤の例は、アテゾリズマブを含むが、これに限定されない)、ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、Ａ２ａＲ、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲｓ)、ＩＤＯおよびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。治療的抗癌ワクチン接種のための他のアプローチは、樹状細胞ワクチンを含む。本用語は、広く免疫反応が所望される抗原が負荷された樹状細胞を含むワクチンを包含する。養子細胞療法(ＡＣＴ)は、細胞、最も一般に免疫由来細胞、例えば特に細胞毒性Ｔ細胞(ＣＴＬ)を、免疫学的機能性および特徴の新規宿主への伝達を目的とした、同じ患者または新規レシピエント宿主への移入といい得る。可能であれば、自己細胞の使用により、レシピエントの組織拒絶および移植片対宿主病問題の最小化が促進される。種々の戦略は、例えば、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)の特異性の、例えば、選択ペプチド特異性を備えた新規ＴＣＲ αおよびβ鎖の導入による改変による遺伝子修飾Ｔ細胞の使用であり得る。あるいは、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を、選択標的、例えば悪性細胞に特異的な免疫応答性細胞、例えばＴ細胞を産生でき、多種多様な受容体キメラ構築物が記載されている。癌における幹細胞療法は、一般に放射線療法および／または化学療法により破壊した骨髄幹細胞を置き換えることを目的とし、自己、同系または同種幹細胞移植を含むが、これらに限定されない。幹細胞、特に造血幹細胞は、典型的に骨髄、末梢血または臍帯血液から得る。抗癌剤の投与経路、用量および処置レジメンの詳細は、例えば“Cancer Clinical Pharmacology” (2005) ed. By Jan H. M. Schellens, Howard L. McLeod and David R. Newell, Oxford University Pressに記載されるとおり、同分野で知られる。任意の組み合わせ治療の活性成分を混合してよくまたは物理的に分離してもよく、かつ同時にまたは任意の順序で逐次的に投与してよい。

本発明はまた下記記述に示す態様および実施態様も提供する：
記述１. キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するよう操作されたナチュラルキラー(ＮＫ)細胞であって、ＣＡＲがＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分を含むものである、ＮＫ細胞。

記述２. ＣＡＲがさらにＣＤ２７の膜内ドメインを含む、記述１のＮＫ細胞。

記述３. ＣＡＲがＣＤ２７の細胞内ドメインの全てまたは一部を欠く、記述１または２のＮＫ細胞。

記述４. ＣＡＲがＣＤ２７の細胞内ドメイン全てを欠く、記述１～３の何れかのＮＫ細胞。

記述５. ＣＡＲの細胞内部分が少なくとも１個の細胞内活性化ドメインを含む、記述１～４の何れかのＮＫ細胞。

記述６. 少なくとも１個の細胞内活性化ドメインがＣＤ３ζ活性化ドメイン、ＦｃＲγ活性化ドメインおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、記述５のＮＫ細胞。

記述７. ＣＡＲの細胞内部分が少なくとも１個の細胞内共刺激ドメインを含む、記述１～６の何れかのＮＫ細胞。

記述８. 少なくとも１個の細胞内共刺激ドメインがＣＤ２８共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＤＡＰ１０共刺激ドメイン、ＯＸ４０共刺激ドメイン、ＩＣＯＳ共刺激ドメインおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、記述７のＮＫ細胞。

記述９. ＣＡＲがＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインを含む、記述５～８の何れかのＮＫ細胞。

記述１０. ＣＡＲが４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインを含む、記述５～９の何れかのＮＫ細胞。

記述１１. ＣＡＲが：
ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインおよび４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインを含む；
ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインおよび４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインから本質的になる；または
ＣＤ２７の細胞外および膜内ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインおよび４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインからなる、
記述１～１０の何れかのＮＫ細胞。

記述１２. ＣＡＲが：
アミノ酸配列配列番号１と少なくとも８０％同一を含む；
アミノ酸配列配列番号１と少なくとも８０％同一から本質的になる；
アミノ酸配列配列番号１と少なくとも８０％同一からなる；
アミノ酸配列配列番号１と少なくとも８５％同一を含む；
アミノ酸配列配列番号１と少なくとも８５％同一から本質的になる；
アミノ酸配列配列番号１と少なくとも８５％同一からなる；
アミノ酸配列配列番号１と少なくとも９０％同一を含む；
アミノ酸配列配列番号１と少なくとも９０％同一から本質的になる；
アミノ酸配列配列番号１と少なくとも９０％同一からなる；
アミノ酸配列配列番号１と少なくとも９５％同一を含む；
アミノ酸配列配列番号１と少なくとも９５％同一から本質的になる；
アミノ酸配列配列番号１と少なくとも９５％同一からなる；
配列番号１と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む；
配列番号１と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列から本質的になる；
配列番号１と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列からなる；
配列番号１に示すアミノ酸配列を含む；
配列番号１に示すアミノ酸配列から本質的になる；または
配列番号１に示すアミノ酸配列からなる、
記述１～１１の何れかのＮＫ細胞。

記述１３. ＮＫ細胞が対象から単離されている、記述１～１２の何れかのＮＫ細胞。

記述１４. ＮＫ細胞が対象の臍帯血または末梢血から単離されている、記述１～１３の何れかのＮＫ細胞。

記述１５. ＮＫ細胞が所望によりインビトロで培養されている、記述１３または１４のＮＫ細胞。

記述１６. ＮＫ細胞がインビトロで造血幹細胞または誘導多能性幹(ｉＰＳ)細胞から分化されている、記述１～１３の何れかのＮＫ細胞。

記述１７. ＮＫ細胞がクローンＮＫ細胞株からである、記述１～１３の何れかのＮＫ細胞。

記述１８. ＮＫ細胞がＮＫ－９２細胞である、記述１～１３の何れかのＮＫ細胞。

記述１９. ＮＫ細胞が１以上の免疫刺激性サイトカインをさらに発現するよう操作されている、記述１～１８の何れかのＮＫ細胞。

記述２０. １以上の免疫刺激性サイトカインが１以上の免疫刺激性インターロイキン(ＩＬ)である、記述１９のＮＫ細胞。

記述２１. 免疫刺激性インターロイキンがＩＬ－１５、ＩＬ－１２および／またはＩＬ－２１、好ましくはヒトＩＬ－１５、ＩＬ－１２および／またはＩＬ－２１、より好ましくはＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１、さらにより好ましくはヒトＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１、なおさらに好ましくはＩＬ－１５、特に好ましくはヒトＩＬ－１５である、記述２０のＮＫ細胞。

記述２２. ＣＡＲおよび任意的な１以上の免疫刺激性サイトカインの発現が各々独立して構成的または誘導型である、記述１～２１の何れかのＮＫ細胞。

記述２３. ＮＫ細胞の出発集団に発現可能形式で記述１～２２の何れかのＣＡＲをコードする核酸をおよび所望により発現可能形式で１以上の免疫刺激性サイトカインをコードする核酸を導入することを含む、記述１～２２の何れかのＮＫ細胞を産生する方法。

記述２４. １以上の核酸がエレクトロポレーションによりＮＫ細胞の出発集団に導入される、記述２３の方法。

記述２５. １以上の核酸がｍＲＮＡである、記述２３または２４の方法。

記述２６. さらに該１以上の核酸を含み、ＣＡＲおよび所望により１以上の免疫刺激性サイトカインを発現できるＮＫ細胞の選択および／または拡張することを含む、記述２３～２５の何れかの方法。

記述２７. 記述１～２２の何れかのＮＫ細胞および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

記述２８. 治療に使用するための記述１～２２の何れかのＮＫ細胞または記述２７の医薬組成物。

記述２９. 新生物疾患を処置する方法に使用するための記述１～２２の何れかのＮＫ細胞または記述２７の医薬組成物。

記述３０. 癌を処置する方法に使用するための記述１～２２の何れかのＮＫ細胞または記述２７の医薬組成物。

記述３１. 対象に治療有効量の記述１～２２の何れかのＮＫ細胞または記述２７の医薬組成物を投与することを含む、処置を必要とする対象を処置する方法。

記述３２. 対象に治療有効量の記述１～２２の何れかのＮＫ細胞または記述２７の医薬組成物を投与することを含む、新生物疾患を有する対象を処置する方法。

記述３３. 対象に治療有効量の記述１～２２の何れかのＮＫ細胞または記述２７の医薬組成物を投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法。

記述３４. 癌などの新生物疾患がＣＤ７０陽性癌性細胞を含む、記述２９または３０の使用のためのＮＫ細胞または医薬組成物または記述３２または３３の方法。

記述３５. 癌などの新生物疾患がＣＤ７０陽性癌性細胞を１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または最大１００％含み、ＣＤ７０陽性癌性細胞のパーセンテージが新生物疾患病変の代表的サンプルにおける全癌性細胞との比を表す、記述３４の使用のためのＮＫ細胞または医薬組成物または記述３４の方法。

記述３６. 癌などの新生物疾患がＣＤ７０陽性癌性細胞を１０％未満、例えば８％以下、６％以下、４％以下、２％以下または最低０％含み、ＣＤ７０陽性癌性細胞のパーセンテージが新生物疾患病変の代表的サンプルにおける全癌性細胞との比を表す、記述３４の使用のためのＮＫ細胞または医薬組成物または記述３４の方法。

記述３７. 癌などの新生物疾患がＣＤ７０陽性癌関連線維芽細胞(ＣＡＦ)を含む、記述２９、３０または３４～３６の何れかの使用のためのＮＫ細胞または医薬組成物または記述３２～３６の何れかの方法。

記述３８. 癌などの新生物疾患がＣＤ７０陽性ＣＡＦを１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または最大１００％含み、ＣＤ７０陽性ＣＡＦのパーセンテージが新生物疾患病変の代表的サンプルにおける全ＣＡＦとの比を表す、記述３７の使用のためのＮＫ細胞または医薬組成物または記述３７の方法。

記述３９. 癌などの新生物疾患がＣＤ７０陽性癌性細胞およびＣＤ７０陽性癌関連線維芽細胞(ＣＡＦ)を含む、記述２９または３０の使用のためのＮＫ細胞または医薬組成物または記述３２または３３の方法。

記述４０. 新生物疾患が：
ＣＤ７０陽性癌性細胞を１０％未満、例えば８％以下、６％以下、４％以下、２％以下または最低０％(ＣＤ７０陽性癌性細胞のパーセンテージが新生物疾患病変の代表的サンプルにおける全癌性細胞との比を表す)；およびＣＤ７０陽性ＣＡＦを１０％以上、例えば２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または最大１００％(ＣＤ７０陽性ＣＡＦのパーセンテージが新生物疾患病変ＣＤ７０陽性ＣＡＦの代表的サンプルにおける全ＣＡＦとの比を表す)、
記述３９の使用のためのＮＫ細胞または医薬組成物または記述３９の方法。

記述４１. 新生物疾患が結腸直腸癌である、記述２９、３０または３４～４０の何れかの使用のためのＮＫ細胞または医薬組成物または記述３２～４０の何れかの方法。

記述４２. 結腸直腸癌がＣＤ７０陽性ＣＡＦを含む、記述４１の使用のためのＮＫ細胞または医薬組成物または記述４１の方法。

記述４３. 結腸直腸癌がＣＤ７０陽性ＣＡＦを１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または最大１００％含み、ＣＤ７０陽性ＣＡＦのパーセンテージが結腸直腸癌病変の代表的サンプルにおける全ＣＡＦとの比を表す、記述４２の使用のためのＮＫ細胞または医薬組成物または記述４２の方法。

本発明をその具体的実施態様と関連して記載しているが、多くの改変、修飾および変動が上記に照らして当業者に明らかであることは自明である。従って、添付する請求項の精神および範囲に従う限り、次のとおり全てのこのような改変、修飾および変動が包含されることが意図される。

ここに開示される本発明の態様および実施態様は、さらに次の非限定的実施例により支持される。

細胞株：
ＮＫ－９２細胞株(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ, Leibniz Institute, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany, # ACC 488)から購入)を、１２.５％ウシ胎児血清(ＦＢＳ、Life Technologies, #10270106)、１２.５％ウマ血清(Life Technologies; #16050122)、１％ペニシリン／ストレプトマイシン(Ｐ／Ｓ、Life Technologies; #15140122)、２mM Ｌ－グルタミン(Life Technologies; #25030024)および１５０Ｕ／mL 組み換えインターロイキン－２(ＩＬ－２、ImmunoTools, #11340028)添加α－最小必須培地(α－ＭＥＭ、Life Technologies, #32561037)で培養した。細胞を懸濁増殖し、加湿インキュベーター中、３７℃で５％ＣＯ_２＋９５％空気中で指数関数的増殖を維持した。

種々のＣＤ７０^＋標的細胞株を使用した：バーキットリンパ腫細胞株(Ｒａｊｉ)、結腸直腸癌細胞株(ＬＩＭ２０９９)、膵管癌細胞株(ＰＡＮＣ－１)および膵臓癌関連線維芽細胞(ＣＡＦ)細胞株(ＲＬＴ－ＰＳＣ)。

Ｒａｊｉ細胞株(DSMZ, # ACC319から購入)およびＬＩＭ２０９９細胞株(Sigma-Aldrich, # CBA-0164から購入)を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓおよび２mM Ｌ－グルタミン添加ロズウェルパーク記念研究所(ＲＰＭＩ、Life Technologies, #52400025)培地で培養した。ＰＡＮＣ－１細胞株をＡＴＣＣ(# CRL-1469)から購入し、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓおよび２mM Ｌ－グルタミン添加ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ、Life Technologies, #10938025)で培養した。ＲＬＴ－ＰＳＣ細胞株(Prof. M. Loehr and R. Jesenofsky, University of Heidelberg, Mannheim, Germanyから恵与)を１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓおよび２mM Ｌ－グルタミン添加ＤＭＥＭ－Ｆ１２(Life Technologies, #11320074)で培養した。細胞を単層として増殖させ、加湿インキュベーター中、３７℃で５％ＣＯ_２＋９５％空気中で指数関数的増殖に維持した。

ＣＤ７０指向ＣＡＲ ｍＲＮＡの産生：
(１)ＣＤ２７受容体の細胞外および膜貫通部分、(２)４１ＢＢ共刺激ドメイン、(３)ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞活性化ドメインおよび(４)ＩＬ－１５サイトカインカセットを伴うＣＤ２７－ＣＡＲ構築物(配列番号２１に示し、かつ配列番号３１によりコードされる)を、Creative Biolabs(Shirley, NY, USA)のCellRapeutics^TM Chimeric Antigen Receptor Technologyプラットフォームを使用して、開発した。ＩＬ－１５を伴うおよび伴わない構築物を産生するために、ＩＬ－１５サイトカインカセットをＥｃｏＲＩ制限酵素(Life Technologies, #ER0271)で切断した。

ＣＤ２７－ＣＡＲ構築物含有プラスミド(ＩＬ－１５サイトカインカセットを伴うまたは伴わない)をエシェリヒア・コリ細菌で増幅させ、NucleoBond Xtra Midi Plus EFキット(Macherey Nagel; #740422.50)で精製し、適合性ＰｍｅＩ制限酵素(Life Technologies; #ER1342)を使用して、直線化した。ＣＤ２７－ＣＡＲメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)を、mMESSAGE mMACHINE^TM T7 Transcription Kit(Life Technologies, #AM1344)を使用して、１μg 直線化ＣＤ２７－ＣＡＲ ＤＮＡから出発して産生し、－８０℃でさらに使用するまで保管した。

ＣＤ７０指向ＣＡＲ－ＮＫ－９２細胞の開発：
エレクトロポレーション効率を最適化するために、ＮＫ－９２細胞を１５０Ｕ／mL ＩＬ－２で２４時間刺激し、その後エレクトロポレーションし、エレクトロポレーション直前OptiMEM^TM培地(Life Technologies, #11058021)で洗浄および再懸濁した。条件あたり５～２０×１０^６ ＮＫ－９２細胞を、次の設定：３００Ｖ、１２msおよびキュベット４の定時プロトコールを適用するGenePulser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を使用して２０μg ＣＡＲ ｍＲＮＡで２００μＬ OptiMEM培地中でエレクトロポレーションした。ｍＲＮＡ非存在下エレクトロポレーションしたＮＫ－９２細胞(ＭＯＣＫ)を陰性対照として使用した。エレクトロポレーション後、細胞を回復培地としてＩＬ－２不含α－ＭＥＭ培地に再懸濁した。

ＣＤ７０指向ＣＡＲ－ＮＫ－９２細胞の検証：
ＣＤ２７－ＣＡＲ発現(ＣＡＲ構築物の細胞外部分、ＣＤ２７の発現)を、CytoFLEXフローサイトメーター(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)で、エレクトロポレーション２４時間後モノクローナルＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ２７抗体(Cell Signaling Technology, Danvers, CA, USA；クローン0323; #55584S)および対応するＩｇＧ１アイソタイプ対照(Cell Signaling Technology；クローンMOPC-21; #63630)を使用して決定した。７－ＡＡＤ(BioLegend, #420403)蛍光挿入生存能色素染色を、生存細胞上のＣＤ２７発現の分析に使用した。ＭＯＣＫエレクトロポレーションしたＮＫ－９２細胞を陰性対照サンプルとして使用した。結果を図３および４に示す。

ＩＬ－１５サイトカインの産生および培養上清への分泌の検証を、マルチプレックス電気化学発光(Meso Scale Discovery Inc., Rockville, USA, #K151URK-1)を使用して実施した。

ＣＤ７０指向ＣＡＲ－ＮＫ－９２細胞のインビトロ細胞毒性能：
ＣＤ７０指向ＣＡＲ－ＮＫ－９２細胞のインビトロ殺傷能力を、種々のエフェクター条件(ＭＯＣＫ、ＣＤ２７－ＣＡＲおよびＩＬ－１５サイトカインカセットを伴うＣＤ２７－ＣＡＲ、エレクトロポレーション２４時間後)を、種々のＣＤ７０^＋標的細胞株：バーキットリンパ腫細胞株(Ｒａｊｉ)、結腸直腸癌および膵臓癌細胞株(それぞれＬＩＭ２０９９およびＰＡＮＣ－１)および膵臓ＣＡＦ細胞株(ＲＬＴ－ＰＳＣ)と、５：１エフェクター：標的比で、４時間、滅菌ＦＡＣＳチューブ中共培養することにより評価した。４時間の共培養後、標的細胞株の細胞死をCytoFLEXフローサイトメーターで、生存能挿入蛍光色素７－ＡＡＤおよびアポトーシス細胞死マーカーAnnexin V(BD Bioscience, #51-65875X)で染色することにより測定した。エフェクターと標的細胞を区別するために、後者を緑色蛍光色素PKH67(Sigma-Aldrich, #MIDI67-KT)で一過性に染色した。結果を図５に示す。

観察されたＣＤ７０－ＣＡＲ－ＮＫ－９２細胞による死滅がＣＡＲ特異的であるかを分析するために、細胞外抗原認識ドメイン、ＣＤ２７を、ＣＤ７０^＋Ｒａｊｉ細胞株との共培養中ブロックした。種々のエフェクター条件(ＭＯＣＫ、ＣＤ２７－ＣＡＲおよびＩＬ－１５サイトカインカセットを伴うＣＤ２７－ＣＡＲ)を、エレクトロポレーション６時間後、一夜、３つの異なる濃度(１０μg／mL、５０μg／mLおよび１００μg／mL)のモノクローナル中和抗ＣＤ２７抗体(R&D Systems; #MAB382)および対応するＩｇＧ１アイソタイプ対照(R&D Systems; #MAB002)とインキュベートした。これらのエフェクター細胞を、Ｒａｊｉ細胞株と、 エレクトロポレーション２４時間後、４時間、５：１エフェクター：標的比で滅菌ＦＡＣＳチューブで共培養した。中和抗体およびアイソタイプとインキュベートしたＲａｊｉ細胞を対照条件として使用した。標的細胞死の量の検出を先に説明したとおり、実施した。結果を図６に示す。

ＣＤ７０指向ＣＡＲ－ＮＫ－９２細胞およびさらなるサイトカインのインビトロ細胞毒性能：
ＣＤ７０指向ＣＡＲ－ＮＫ－９２細胞の細胞毒性能改善におけるＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１サイトカインの能力を決定した。ＩＬ－１５サイトカインカセットを伴わないＣＤ２７－ＣＡＲを、エレクトロポレーション６時間後、一夜、組み換えＩＬ－１２(R&D Systems、＃２１９－ＩＬ－００５、０.０５ng／mL)、組み換えＩＬ－１５(R&D Systems, #247-ILB-005、２.６０ng／mL)および組み換えＩＬ－２１(R&D Systems, #8879-ILB-010、８ng／mL)サイトカインのエフェクター用量５０(ＥＤ５０；R&D Systemsに提供)とインキュベートして、ＮＫ－９２細胞によりＣＡＲと共発現されたときの各サイトカインの効果を模倣またはエミュレートした。３エフェクター条件(ＭＯＣＫ、ＣＤ２７－ＣＡＲおよびＩＬ－１５サイトカインカセットを伴うＣＤ２７－ＣＡＲ)および刺激ＣＤ２７－ＣＡＲ－９２細胞を、エレクトロポレーション２４時間後、種々のＣＤ７０^＋標的細胞株(Ｒａｊｉ、ＬＩＭ２０９９、ＰＡＮＣ－１およびＲＬＴ－ＰＳＣ)と５：１エフェクター：標的比で、４時間、滅菌ＦＡＣＳチューブで一緒に共培養した。標的細胞死の量の検出を、先に説明したとおり、実施した。結果を図７に示す。

統計分析：
Prism 9.1.2ソフトウェア(GraphPad)をデータ比較、データグラフ表示および統計的計算のために使用した。クラスカル・ウォリス検定を、２を超える群間の平均比較のために使用した。マン・ホイットニーＵ検定を２群間の平均比較のために使用した。全統計解析を、最小で３つの独立した実験で実施した。ｐ値≦０.０５を統計的有意と判断した。

Claims (15)

1. キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するよう操作されたナチュラルキラー(ＮＫ)細胞であって、ＣＡＲがＣＤ２７の細胞外ドメインまたはそのＣＤ７０結合部分を含むものである、ＮＫ細胞。
2. ＣＡＲがさらにＣＤ２７の膜内ドメインを含むおよび／またはＣＤ２７の細胞内ドメインの全てまたは一部を欠く、好ましくはＣＤ２７の細胞内ドメイン全てを欠く、請求項１のＮＫ細胞。
3. ＣＡＲの細胞内部分が少なくとも１個のＣＤ３ζまたはＦｃＲγ細胞内活性化ドメインなどの細胞内活性化ドメインおよび所望によりおよび好ましくは少なくとも１個のＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０および／またはＩＣＯＳ細胞内共刺激ドメインなどの細胞内共刺激ドメインを含む、請求項１または２のＮＫ細胞。
4. ＣＡＲがＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインおよび／または４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインを含む、請求項３のＮＫ細胞。
5. ＣＡＲがＣＤ２７の細胞外および膜内ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内活性化ドメインおよび４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインを含む、それから本質的になるまたはそれからなる、請求項１～４の何れかのＮＫ細胞。
6. ＣＡＲが配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、特に好ましくは１００％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる、請求項１～５の何れかのＮＫ細胞。
7. ＮＫ細胞が対象の臍帯血または末梢血からなど対象から単離されており、所望によりインビトロで培養されている；またはＮＫ細胞がインビトロで造血幹細胞または誘導多能性幹(ｉＰＳ)細胞から分化されている；または好ましくはＮＫ細胞がクローンＮＫ細胞株からである、例えば、特に好ましくはＮＫ－９２細胞である、請求項１～６の何れかのＮＫ細胞。
8. ＮＫ細胞が１以上の免疫刺激性サイトカイン、例えば１以上の免疫刺激性インターロイキン(ＩＬ)、好ましくはＩＬ－１５、ＩＬ－１２および／またはＩＬ－２１、より好ましくはＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１、特に好ましくはヒトＩＬ－１５をさらに発現するよう操作されている、請求項１～７の何れかのＮＫ細胞。
9. ＣＡＲおよび任意的な１以上の免疫刺激性サイトカインの発現が各々独立して構成的または誘導型である、請求項１～８の何れかのＮＫ細胞。
10. ＮＫ細胞の出発集団に発現可能形式で請求項１～９の何れかのＣＡＲをコードする核酸をおよび所望により発現可能形式で１以上の免疫刺激性サイトカインをコードする核酸を、所望によりエレクトロポレーションによるなどで、導入し；そして所望により該１以上の核酸を含み、ＣＡＲおよび所望により１以上の免疫刺激性サイトカインを発現できるＮＫ細胞の選択および／または拡張を含む、請求項１～９の何れかのＮＫ細胞を産生する方法。
11. 請求項１～９の何れかのＮＫ細胞および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
12. 治療に使用するための請求項１～９の何れかのＮＫ細胞または請求項１１の医薬組成物。
13. 新生物疾患、特に癌を処置する方法に使用するための請求項１～９の何れかのＮＫ細胞または請求項１１の医薬組成物。
14. 新生物疾患がＣＤ７０陽性癌性細胞を含む、例えばＣＤ７０陽性癌性細胞および／またはＣＤ７０陽性癌関連線維芽細胞(ＣＡＦ)を１０％以上、例えばＣＤ７０陽性ＣＡＦを１０％以上含み、例えば、新生物疾患がＣＤ７０陽性癌性細胞を１０％未満およびＣＤ７０陽性ＣＡＦを１０％以上含む、請求項１３の使用のためのＮＫ細胞または医薬組成物。
15. 新生物疾患がＣＤ７０陽性ＣＡＦを含む結腸直腸癌である、請求項１２または１３の使用のためのＮＫ細胞または医薬組成物。