MX2007014474A

MX2007014474A - Composiciones y metodos para inmunomodulacion en un organismo.

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Publication number: MX2007014474A
Application number: MX2007014474A
Authority: MX
Inventors: Leo Lefrancois; Thomas A Stoklasek
Original assignee: Univ Connecticut
Priority date: 2005-05-17
Filing date: 2006-05-17
Publication date: 2008-02-07
Also published as: EP1899364B1; JP5918817B2; PT1899364T; JP5236461B2; US9371368B2; US8124084B2; JP2015007086A; NZ563263A; EP3263581B1; US20200291091A1; US20150093357A1; JP2008545397A; US20180298079A1; US20120177598A1; CA2608474C; EP1899364A2; US20150139945A1; US9932387B2; EP1899364A4; PL1899364T3

Abstract

La presente invencion se relaciona a un polipeptido terapeutico y metodos para su creacion y uso para modular una respuesta inmune en un organismo hospedero en necesidad del mismo. En particular, la invencion se relaciona a la administracion en un organismo en necesidad del mismo, de una cantidad efectiva de un complejo de polipeptido pre-acoplado que comprende una porcion de polipeptido de linfocina, por ejemplo IL-15 (SEQ ID NO:5, 6), IL-2 (SEQ ID NO:10, 12) o combinaciones de ambos, y una porcion de polipeptido de receptor de interleucina, por ejemplo IL-15Ra (SEQ ID NO:7, 8), IL-2Ra (SEQ ID NO:9, 11) o combinaciones de ambos, para aumentar el sistema inmune en, por ejemplo, cancer, SCID, SIDA o vacunacion; o inhibir el sistema inmune en, por ejemplo, artritis reumatoide o Lupus. El complejo terapeutico de la invencion sorprendentemente demuestra vida media incrementada y eficacia in vivo.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA INMUNOMODULACION EN UN ORGANISMO I 1 Campo de la Invención i I La presente invención se relaciona a una compdsición de polipéptido terapéutica y métodos de admir?istracion a un organismo en necesidad de la misma para modular la función inmune. En particular la invención se relaciona a la administración de una cantidad efectiva de un complejo de proteína terapéutico que comprende una porción de polipéptido de linfocina, y una porción de receptor de linfócina que demuestra vida media in vivo y eficacia mejoradas cuando se administra a un organismo. Antecedentes Los linfocitos son un tipo de glóbulos blancos involucrados en la regulación del sistema inmune. Hay dos categorías amplias de linfocitos, específicamente células T y células B. Las células T son responsables para la inmunidad medifda por células mientras que las células B son responsables para la inmunidad humoral (relacionada con anticuerpos) . Las células T son nombradas de tal manera debido a que estos linfocitos maduran en el timo y las células B maduran en la médula ósea. Los linfocitos son mucho más comunes en el sistema linfático, e incluyen células B, células T, células T exterminadoras y células exterminadoras naturales. Las células B hacen anticuerpos que enlazan a patógenos para permitir su destrucción. Las células T CD4+ (ayudantes) coordinan la respuesta inmune (ellas son lo que llega a ser defectuoso en una infección HIV) . Las células T CDd+ (citotóxicas) y células Exterminadoras Naturales (NK) son i capaces de exterminar células del cuerpo que son infectadas por un virus o exhiben una secuencia antigénica. Las células exterminadoras naturales son linfocitos granqlares grandes CD56 (+) CD3 (-) que constituyen un componente clave de la respuesta inmune innata humana. Además de su potente actividad citolítica, las células NK expresan un hospedero de citoquinas y quimioquinas inmunorreguladoras gue desempeñan una función crucial en la evacuación del patógeno. Además, las interacciones entre NK y otras células inmunes están implicadas en activar la respuesta inmune adaptlativa, o específica de antígeno. Las interacciones entre las células inmunes e inflamatorias son mediadas en gran parte por las proteínas de citoqiuina, por ejemplo, las linfocinas tales como inteileucinas (IL), que son capaces de promover el crecimiento celular, diferenciación y activación funcional.

Actualmente, por lo menos veintitrés interleucinas y sus diversas variantes de empalme se han descrito. Algunas de esta^ citoquinas median los efectos biológicos distintos pero muchas tienen actividades sobrepuestas. El entendimiento de la estructura y función de la interleucina ha conducido a nuevOs e importantes discernimientos en la biología fundamental de inmunidad e inflamación. Por ejemplo, la Inte?tleucina-2 (IL-2) e IL-15 son dos citoquinas distintas con propiedades parcialmente sobrepuestas que están implicadas en el desarrollo, homeostasis y función de células T y qelulas NK. IL-2, anteriormente referida como factor de crecimiento de células T, es una potente linfocina inmurioreguladora que se produce por células T activadas con antígeno. Esta se produce por los linfocitos T maduros en la estimulación pero también constitutivamente por ciertas líne4s de células de linfoma de célula T. IL-2 es útil en el estudio de la naturaleza molecular de la diferenciación de célula T, y debido a que aumenta la actividad de la célula exterrainadora natural, ésta puede ser útil en modular la respuesta inmune a cánceres, infecciones virales o bacterianas. También, IL-2 puede actuar como una hormona de crecimiento para ambos de los linfocitos B y T y estimula la expansión clonal y maduración de estos linfocitos. IL-2 enlaza a su complejo de receptor (R) comprendido de IL-2R alfa ("IL-2Ra"), IL-2R beta ("IL-2Rb") y cadenas gamma ("gC"), y ejerce su efecto por la vía de segundos mensajeros, principalmente tirosina qumasas, que finalmente estimulan la expresión del gen. La eterotrimerización de las cadenas de receptor conduce al enlace de alta afinidad para IL-2. La importancia funci nal de IL-2Ra en sistemas de células hematopoyéticas es bien conocida. Sin embargo, la función potencial que IL-2Ra dese jpeña en la tumorigénesis es todavía no puesta en claro i completamente. La expresión IL-2Ra se ha encontrado en muchos tipos¡ de cánceres, incluyendo leucemia, linfoma, pulmón, seno,i cabeza y cuello y próstata. También, la alta expresión de II),-2Ra en tumores se correlaciona con una pobre prognosis para ,el paciente. IL-15 es un miembro de la familia de agrupamiento de cuatro alfa-hélices de linfocinas y su mRNA puede ser detedtado en una amplia variedad de tejidos de tanto linajes no hématopoyéticos como hematopoyéticos pero no es producida por las células T. IL-15 es difícil de detectar al nivel de prot ína in vivo quizá debido a la vida media de la proteína corta y el control hermético transcripcional y traduccional .

IL-líj es una proteína soluble hecha por muchas células en el i cuerdo que desempeña una función importante en el desarrollo del Sistema inmune. IL-15 se descubrió simultáneamente en una línea de células de leucemia de célula T de adulto y una línea de células epiteliales de riñon de simio como una protéína de 14kDa-16kDa capaz de estimular la línea de células de linfocito de células T citotóxica (CTLL) y la proliferación de células T de sangre periférica, y de inducir I las Células mononucleares de sangre periférica a que exhiban función efectora.

IL-15 desempeña una función multifacética en el desarrollo y control del sistema inmune. Más específicamente, IL-15J influencia, la función, desarrollo, supervivencia y proliferación de células T CD8+, células NK, células T exterminadoras, células B, linfocitos intraepiteliales intestinales (IEL) y células que presentan antígeno (APC). Se i ha demostrado que ambos ratones transgénicos IL-15-/-, y IL- 15Ra-/- carecen de poblaciones de células NK periféricas y células T exterminadoras, ciertos subconjuntos IEL, y la mayoría de células T CD8+ de fenotipo de memoria. Además, mientras que las células T CD8+ de memoria específicas de antígeno pueden desarrollarse en respuesta a patógenos en amboá tipos de ratones bloqueados, la acumulación de células T CD8+ de memoria resultante se somete a la erosión dramática a través del tiempo. Sugiriendo una función crucial para IL-15 eiji mediar la proliferación y supervivencia de las células TCD8-)1 de memoria a largo plazo. El receptor de IL-15 (R) consiste de tres polipéptidos, el IL-15R alfa ("IL-15Ra") específico del tipo, el IL-2/IL-15Rbeta ("IL-2Rb"), y la cadena gama común ("gC", que es compartida por receptores de citoquina múltiples) . La alta afinidad de la cadena IL-15Ra (K4 « 1011 M) se cree que forma un complejo heterotrimérico con el IL-2Rb compartido y la gC . Similar a IL-15, IL-15Ra se cree que es expresada por una amplia variedad de tipos de células pero no necesariamente en conjunción con IL-2Rb y gC . Aunque la IL-15Ra,¡ la IL-2Rb y las cadenas gC se cree que se asocian con un receptor neterotp .me.ri.co, si. esta es l.,a forma fisicjlógicamente relevante del receptor IL-15 permanece como una rfiateria de especulación. Por ejemplo, la cadena IL-15Ra no sel coprecipita con la IL-2Rb/gC en la presencia de IL-15.

, Por otra parte, distinto a la cadena IL-2Ra, la cadenja IL-15Ra aparentemente media la transducción de señal.

I IL-15ÍRa es una proteína de 58-60 kDa que comparte similitudes I estructurales a la proteína IL-2Ra. Los genes IL-15Ra e IL-2Ra ambién comparten organización de intrón-exón similar y está? estrechamente enlazados sobre el cromosoma humano 10pl4-pl5. IL-15Ra humana comparte aproximadamente 45% de homología de aminoácidos (aa) con la forma de ratón del receptor. Ocho isoformas de mRNA de IL-15Ra se han identificado resultando de eventos de empalme alternativos que (Involucran diferentes exones. La exclusión del exón 2 (?Excn2) da por resultado una isoforma IL-15Ra que no enlaza IL-l-¡. El cDNA de ?Exón3 de IL-15Ra humano codifica una proteína de 267 aminoácidos (aa) que contiene una secuencia de s^ñal de 30 aa , una región extracelular de 175 aa que contdjene un sitio de glicosilación N-enlazado, un dominio de transmembrana de 21 aa y un extremo citoplásmico y 41 aa . i La señalización de IL-15 pudo ocurrir a través del compljejo heterotrimérico de IL-15Ra, IL-2Rb y gC; a través del complejo heterodimerico de IL-2Rb y gC; o a través de una subun¡?dad IL-15Rx de 60-65 kDa novedosa encontrada sobre células cebadas. (Anderson, D.M. y colaboradores 1995, J Biol . Chem . 270:29862-29869; Waldemann, T. A. y Y. Tagaya, 1999, Ann. Rev. Immunol , 17:19-49; Dubois, S. y colaboradores 1999, J. Biol . Chem . 274:26978 - 26984). Recientemente, el enlaqe de IL-15 a IL-15Ra se ha reportado que antagoniza la apoptosis mediada por TNF-alfa en fibroblastos al competir con TNFRI para el enlace de TRAF2 (Bulfone-Paus, S. y colaboradores, 1999, FASEB 13 : 1575-1585) . Dado los efectos conocidos de IL-15 sobre el sist ma inmune, un numero de grupos han propuesto la dirección a IL-15, para manipular el sistema inmune para el beneficio de los hospederos. Mientras que la administración de I^_-15 se ha empleado para reforzar respuestas inmunes o aumerltar la reconstitución del sistema inmune, el bloqueo de la actividad de IL-15 puede inhibir las respuestas auto^nmunes . Por ejemplo, la administración de una proteína IL-l^-Fc mutante que bloquea la actividad de IL-15 o una forma soluble de la IL-15Ra tiene potencial terapéutico en un modelo de artritis de ratón y supervivencia de alom erto. A la inversa, IL-15 (proteína o vector de expresión de DNA) administrada como un adyuvante durante la vacunación o infección aumenta la inmunidad de la célula TCD8+, y el tratamiento con IL-15 puede aumentar la protección de los ratones de dosis letales de Mycoba cteri um tuberculosis y Esch pchia coli . Ademas, la terapia con IL-15 estimula la inmunidad anti-HIV e incrementa la supervivencia de los lmfocitos CD4+ y CD8+ de los pacientes infectados con HIV ín vitrd. IL-15 también puede acelerar la reconstitución inmune i después del transplante de medula osea. Varios grupos han encontrado que la terapia con IL-15, en conjunción con la quimioterapia, agonistas de receptor similares a Toll, o transferencia adoptiva de células T CD8+ reactivas con tumor, pued dar por resultado supervivencia incrementada o regrfsion del tumor completo en modelos de tumor de ratón en contraste a cada terapia sola. Asi,' la manipulación de la acti?idad de IL-15 tiene potencial como una modalidad terapéutica en un numero de situaciones clínicas. IL-15 esta siendo utilizada actualmente en muchos estudios en los cuales es deseable el aumento de la respuesta inmune. Estos incluyen incrementar la eficacia de vacunas contra tumores e infecciones asi como aumentar la habilidad del cuerpo para remover canceres en la ausencia de la vacunación evidente Ademas, IL-15 puede ayudar en regenerar al sistema inmune después del transplante de medula osea o en SIDA. Sin embargo, la vida media de IL-15 m vivo es muy corta (minutos a 1 hora o asi sucesivamente) y esta es una razop para la pobre eficacia. Actualmente la única manera de obtener cualquier efecto de la actividad de IL-15 es mediante la utilización de dosis grandes, e IL-15 sola no siempre es efectjiva. Las investigaciones han intentado incrementar la vida media de IL-15 utilizando modificaciones moleculares pero íestas han sido generalmente inefectivas. Por ejemplo, la PEGilacion (una técnica para incrementar la vida media de la proteína) de IL-15 incrementa la vida media pero destruye la mayoría de la actividad de la citoquma, de hecho, PEG-IL-15 es ur antagonista de la actividad de IL-15. Por lo tanto, existe una necesidad no satisfecha para ' proporcionar una forma terapéutica adecuada de IL-15 que demuestre una vida media mas larga, y una eficacia mas grande de dbsis inferiores cuando se administra a un organismo en necesidad de la misma para propósitos de modular o aumentar la inmunidad. Tal forma terapéutica permitiría la administración de menos citoquina mientras que simultáneamente proporcionaría el aumento del sistema inmune i de los hospederos mas alia de los efectos de IL-15 sola. I Los estudios de los inventores mostraron que la IL-15Ra actúa para "transpresentar" IL-15 a las células opuestas que expresan el complejo IL-2/15Rb/gC sin un requerimiento paral la expresión de IL-15Ra. Ademas, m vi tro, IL-15 enlajada a una quimera comprendida de una porción soluble de la !?L-15Ra covalentemente enlazada a una región Fc de antifcuerpo (IL-15Ra-Fc) (R&D Systems, Inc., Mmneapolis, MN) , sustenta la supervivencia de las células T CD8 de memoria IL-15Ra-/-, en contraste a cualquier componente solo. 1 Generalmente se percibe por aquellos en la técnica pertinente que la porción soluble de la IL-15Ra es un ?nh?t(?dor de la acción de IL-15. De hecho, la investigación publicada ha demostrado que IL-15Ra puede inhibir la actividad de IL-15 m vi tro e m vivo . Actualmente, ninguno ha icjleado todavía un sistema en el cual IL-15 e IL-15Ra sean pre-a¡copladas antes de la administración como un tratamiento m vajvo. Breve Descripción de la Invención La presente invención se relaciona generalmente a una composición de polipéptido terapéutica y métodos para su i administración a un individuo en necesidad de la misma. La presqnte invención proporciona ácidos nucleicos y polipeptidos codificados de esta manera, asi como composiciones relacionadas que incluyen vectores de ácido nucl ico que contiene los ácidos nucleicos de la invención, líneas de células que contienen los ácidos nucleicos de la invención, y anticuerpos (por ejemplo, policlonales, monodlonales, quiméricos, etc ) que enlazan al polipéptido terapéutico de la invención. La presente invención también se relaqiona a métodos para generar un agente terapéutico que comprende por lo menos una lmfocina o porción de la misma, en u complejo preacoplado o por lo menos un receptor de linfqcina o porción del mismo. Se observó de manera sorprendente e inesperada que la combinación preacoplada de la invención demuestra una vida media más larga ín vivo, y eficacia terapéutica más grande que la observada con la administración de IL-15 sola. 1 La invención ademas abarca moléculas de ácido I nucleico que tienen por lo menos 25% de homología a las I secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NOS: 1-4 y 13-16. Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que i los polimorfismos de secuencia de DNA que conducen a cambios i en las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos NOVX pueden existir dentro de una población (por ejemplo, la población humana). Tal polimorfismo genético en los genes i NOVX i puede existir entre individuos dentro de una población debido a la variación alélica natural. Como se utiliza en la presente, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de acido nucleico que comprenden una estructura I de l ctura abierta (ORF) que codifica una interleucina y/o pol?pépt?do de receptor de interleucina, de preferencia un vertebrado. Tales variaciones alélicas naturales pueden I típicamente dar por resultado variación de 1-5% en la secuencia de nucleótidos. Cualquiera y todas de tales variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos resultantes en los polipéptidos SEQ ID NOS: 5-12, que son el resultado de variación alelica natural y que no alteran la actividad funcional de los polipéptidos, se proponen para estar1 dentro del alcance de la invención. I En un aspecto, la invención se relaciona a ácidos nucleicos y moléculas de polmucleótido que codifican una linfccina o porciones de la misma. Además, la invención se relaciona a ácidos nucleicos y moléculas de polmucleótido que codifican un receptor de linfocina o porciones de la misma . Este aspecto de la invención contempla el uso de polir ucleotidos que codifican sustanclalmente la proteína de longitud completa, polipeptidos de tipo silvestre o mutantes; segm ntos discretos, dominios, subdominios, fragmentos, mutaciones de supresión o inserción; quimeras; e isoformas y variantes de empalme. Este aspecto de la invención también incluye ácidos nucleicos que comprenden un segmento que codifica por lo menos una linfocina o porción de la misma, i contigua con un segmento que codifica por lo menos un i receptor de linfocina o porciones del mismo dentro de una sola estructura de lectura (ORF) . En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos de la invención comprenden por lo menos un segmento de polinucleotido adicional correspondiente a las secuencias reguladoras de transcripción (por ejemplo, promotores, promotores inducibles, realizadores y los similares); secuencias de proteina de fusión (por ejemplo, His-tag, GST, GFP, porciones Fc de anticuerpo, resistencia a antibiótico, peptidos de señal y los similares) ; y/o secuencias enlazadoras dispuestas en el extremo 5' , extremo 3' d en una localización dentro de las secuencias de codificación de polipéptido; y/o combinaciones de los mismos. En cualquiera de las modalidades descritas en la presente, los polinucleótidos de la invención también pueden ser dispuestos en un vector viral adecuado, plásmido bacteriano o cromosoma artificial adecuado para la clonación y/o expresión en fna célula eucariótica o extracto celular, célula procariótica o extracto celular, y/o combinaciones de los mismos . I En ciertos aspectos, la presente invención se relaciona a una composición terapéutica que comprende un polipéptido de interleucina, por ejemplo IL-2 (SEQ ID NO: 10 y 12) , o IL-15 (SEQ ID NO: 5 y 6) , incluyendo porciones y combinaciones de las mismas, en un complejo de proteína preaqoplado con un polipéptido receptor de interleucina, por ejemplo IL-2Ra (SEQ ID NO: 9 y 11), o IL-15Ra (SEQ ID NO: 7 y 8), incluyendo porciones y combinaciones de las mismas. En ciertas modalidades, la invención se relaciona a una composición de polipéptido terapéutica que comprende un polipéptido que tiene por lo menos 40% de homología a la SEQ ID NOS: 5, 6, 10, 12, porciones o combinaciones de las mismas, en un complejo pre-acoplado con un polipéptido que tiene; por lo menos 40% de homología a la SEQ ID NOS: 7, 8/ 9, 11, porciones o combinaciones de las mismas. En ciertas de otras modalidades, la invención se relaciona a composición de polipjéptido terapéutica que comprende un polipéptido que tiene por lo menos 80% de homología a la SEQ ID NOS: 5, 6, , 12, porciones o combinaciones de las mismas, en un complejo preacoplado con un polipéptido que tiene por lo menos; 80% de homología a la SEQ ID NOS: 7, 8, 9, 11, porciones o combinaciones de las mismas. I En otro aspecto, la invención se relaciona al uso de pblipéptidos quiméricos en el complejo de polipéptido de i la invención. En ciertas modalidades, la invención comprende I polipéptidos quiméricos que comprende una o más interleucinas, receptor de interleucina, porciones y combinaciones de las mismas. En otra modalidad, la invención comprende polipéptidos quiméricos que comprende por lo menos un pjolipéptido de receptor de interleucina, o porción del mismf, por ejemplo, la porción soluble de un receptor de ínterleucma y/o el dominio de enlace de ligando, covaj.entemente enlazado y contiguo con la porción Fc de un anticuerpo. Las moléculas quiméricas de la invención pueden ser sintetizadas recombinantemente al expresar un poliñucleótido que contiene los elementos deseados dentro de una pRF individual en cualquier número de combinaciones, que será reconocidos por uno de habilidad ordinaria en la i técnica. Otros polipeptidos quiméricos, por ejemplo, un polipéptido IL-15Ra ( lMet-9 He) -K- ( 129Pro-205Thr) -enlazador-Fc ftumano , son comercia lmente disponibles de R& D Systems (Minrjeapolis, MN) . En otro aspecto las moléculas de polinucleótido qu?mér?cas están contenidas en un vector de ácido nucleico, tal tomo por ejemplo una construcción de DNA de plasmido o I viral, para la subclonacion, expresión, purificación u otra manipulación genética de rutina adecuadas para el uso en células u organismos eucarioticos o procarióticos. Además, las ¡moléculas de polmucleotido quiméricas opcionalmente i pueden contener secuencias de codificación o de no codificación adicionales, insertadas por la manipulación genética entre regiones que codifican para porciones de linffcina o receptor de linfocina. En una modalidad, el acido nucl ico que codifica la interleucina o porción de la misma, está dispuesto en un enlace en tándem como porción de receptor de interleucina . En todavía modalidades adicionales, una secuencia enlazadora se inserta entre el codon Terminal del primer acido nucleico y el primer codón del segundo acido nucleico. Estos enlazadores pueden ser de cualquier longitud i y tijpo adecuado, y se pueden utilizar, por ejemplo, para reducir las restricciones esféricas sobre el plegamiento de polipeptido, introducción a un sitio de segmentación de protfeasa o nucleasa, proporcionar un sitio conveniente para la modificación química, conjugación u otro elemento funcional . En modalidades preferidas, la proteína candidata es una proteína humana. En otras modalidades, la proteína candidata es una proteína eucariótica, por ejemplo, una proteína mamífera, o una proteína de ratón. En otro aspecto, la Invención se relaciona a una célula u organismo transgénico que contiene un transgen que codifica una interleucma, un receptor de mterleucina o porción de los mismcjis y/o un polipéptido de nterleucma quimérica/receptor de írjterleucina . En otro aspecto, la invención se relaciona a i uno ¡o más líneas celulares genéticamente alteradas que contienen las construcciones de polinucleótidos de la invección, tal como, por ejemplo, mediante la incorporación en el DNA genómico de la célula, retención episomalmente o como I parte de un cromosoma artificial. En un aspecto relafionado, la presente invención se relaciona a la í expr sión por una célula hospedera modificada de un ácido nuclfico que codifica componentes individuales o el complejo I de ¡polipéptido completo de la invención. En algunas modalidades, el transgen codifica una proteína que es normalmente exógena a la célula transgénica. En algunas modalidades, el transgen codifica una proteína humana. En algunas modalidades, el transgen se enlaza a un promotor hete^rologo. En otras modalidades, el transgen se enlaza a su promotor nativo. En otro aspecto, la invención se relaciona a anticuerpos, por ejemplo, policlonales, monoclonales o guimépcos, que reconocen y enlazan a epítopes discretos del complejo de polipéptido de la invención o componentes del mismo¡. En ciertos aspectos, la invención se relaciona a la administración de anticuerpos específicos a los componentes del Complejo de la invención, el complejo de la invención, a otras linfocmas, otros receptores de linfocina o combinaciones de los mismos. En una modalidad, la invención comprjende una interleucina , por ejemplo IL-2, IL-7, o IL-15, i preaaoplada a un anticuerpo específico para la mterleucina .

I En otras modalidades, los métodos de la invención incluyen un método para tratar una enfermedad en un individuo que comprenden administrar una cantidad efectiva de un complejo preaqoplado que comprende una interleucina y un anticuerpo espeaífico para interleucina a un individuo en necesidad de la miisrna. En otro aspecto, la presente invención se relaciona a métodos para producir un terapéutico inmunomodulador que compriende un complejo preacoplado de por lo menos un polipjéptido de lmfocina o porción del mismo, y por lo menos un pcjilipéptido receptor de linfocina o porción del mismo. En ciertas modalidades, la invención incluye métodos para crear el cqmplejo de la invención m vi tro que comprende expresar o sintetizar polipéptidos componentes, aislar los polipéptidos, purificar y/o concentrar los polipéptidos, y formar el complejo. En este aspecto, la invención se relaciona a la creacjion del complejo de polipeptido preacoplado de la invención a partir de polipeptidos aislados de una célula hospedera o extracto celular en el cual cada componente de polipéptido del complejo es expresado de dos ácidos nucleicos I discrfetos o como una sola estructura de lectura abierta que comprende una quimera que comprende la interleucina y el receptor de mterleucina enlazado, en la estructura, en tánd m. La purificación se puede realizar por medios crom4tográficos conocidos para uno de habilidad ordinaria en la t cnica y pueden incluir, por ejemplo, la purificación por afinidad, exclusión de tamaño, intercambio iónico, hidrOxiapatita, HPLC y los similares. En otro aspecto, la invención se relaciona a métodos para inducir, aumentar o inhibir la actividad celular inmune y la proliferación que comprende administrar una cantidad efectiva de un complejo de polipéptido preacoplado a un íhdividuo en necesidad del mismo, en donde el complejo de polipeptido preacoplado comprende por lo menos una linfocma o porción de la misma y por lo menos un receptor de linfocina o porción del mismo. En un aspecto relacionado a la invención, el complejo puede ser utilizado para aumentar una inmunidad o respuesta inmune del organismo hospedero al antigeno, tal como por ejemplo una bacteria, un virus, una proteina, un peptido, un acido nucleico y los similares. Todos los objetivos presentes de la invención contemplan el uso de polipéptidos IL-15, IL-2, IL-15Ra, o IL-2Ra, porciones y combinaciones de los mismos. En todavía otro aspecto, la invención incluye métodos para tratar un organismo, que comprende administrar a un organismo un vector que codifica una O más de SEQ ID NO: 1-4, y 13-16. En otro aspecto, la invención se relaciona a un comp]|e o de polipéptido preacoplado útil para incrementar la proliferación y supervivencia de células T de memoria, células B y células NK. Tal como, la administración del terapéutico de la presente invención también puede ser utilizada para aumentar la inmunidad pre-existente (por ejemplo, individuos previamente vacunados) sin la necesidad por ¡un reforzador de vacuna actual. En ciertos aspectos el terapéuticos de la invención se administran, por ejemplo, para el aumento de vacunación, para aumentar la inmunidad en paci ntes SCID o con SIDA, y para el tratamiento de canceres. En todavía otros aspectos, el complejo de polipéptido preacoplado de la invención es útil para inhibir una respuesta inmune del organismo hospedero en casos donde ésta es perjudicial para el organismo. Por ejemplo, el complejo de la invención se puede utilizar para inhibir una inmunidad o respuesta inmune del organismo hospedero al antígeno, por ejemplo un auto-antígeno, como se observa en individuos que sufren de enfermedades autoinmunes y condiciones similares a artritis reumatoide o Lupus. En ciertas modalidades de este aspecto de la invención el i complejo de polipeptido preacoplado comprende polipéptidos de linfocina y de receptor de linfocina o porciones de los mismos, que son incapaces de activar las células inmunes o i estimular su proliferación. Por ejemplo, los componentes de polipeptido del complejo pueden contener mutaciones, suprqsiones, inserciones o modificaciones químicas que inhiben la señalización por la vía de las rutas de IL-2 o IL- 15. En cualquiera de los aspectos descritos en lo anterior, el complejo de polipeptido preacoplado puede ser administrado en cualquier forma farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, liquido, polvo, pildora, fórmula de liberación controlada, etc ) , por la vía de cualquier ruta (por ejemplo, ruta intravenosa, oral, parenteral, subdermica, tópica, anal, nasal, etc ) , y opcionalmente con cualquiera de los excipientes farmacéuticamente aceptables, portadores y/o en combinación con otros ingredientes activos, (por ejemplo, NASAIDS, Inmunosupresores, Antihistaminicos, Antioncogénicos, Antibióticos, sulfonamidas, etc ) . Lo precedente se da a manera de ejemplo no limitativo, y la formulación particular puede variar en cualquier numero de maneras, que son expresamente incorporadas en la presente, dependiendo sobre una multitud de factores que serán reconocibles por uno de habilidad ordinaria en la técnica.

En todavía otro aspecto, la presente invención se relacliona a un equipo que comprende un contenedor adecuado, el cqmplejo de polipéptido preacoplado de la invención o los compojnentes del mismo en una forma farmacéuticamente aceptable dispuesta en el mismo, e instrucciones para su uso. En otro aspecto, la invención actual se relaciona a la producción de librerías que contienen ácidos nucleicos I mutac|os y modificados para el uso en los métodos descritos, y i ácidcjs nucleicos identificados en los mismos. i I En otro aspecto, la invención se relaciona a un i método para detectar la presencia de un complejo de polipéptido de lmfocina-receptor de linfocina en una muestra. En el método, una muestra se pone en contacto con un compuesto o anticuerpo que selectivamente enlaza bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el polipéptido. El complejo se detecta, si está presente, para identificar de esta manera el complejo de polipéptido dentro de la muestra. También incluido en la invención está un método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico quimérica de linfocina-receptor de linfocma en una muestra al poner en contacto la muestra con una sonda o cebador de ácido nucleico de linfocina o un receptor de lmffcina, y al detectar si la sonda o cebador de ácido nucleico se enlazo a una molécula de ácido nucleico quimérica de linfocina-receptor de lmfocina de la muestra.

Características ventajosas y funcionalidades adicionales asociadas con los sistemas, métodos y procesos de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción detallada que sigue. Las publicaciones y otros materiales utilizados en la presente para poner en claro el antecedente de la invención, y en casos particulares, para proporcionar detalles adicionales con respecto a la práctica, son incorporados por referencia, y por conveniencia son listajdos en la bibliografía adjunta. i Descripción de los Dibujos Figura 1. La co-administración de IL-15 + IL-15Ra-Fc preacopladas aumenta la respuesta proliferativa de células T CD8+ a la IL-15 exógena. En el día 1 los ratones recibieron aproximadamente lxlO7 lmfocitos enriquecidos con CD8, marcados con CFSE congenióos í.v. y se trataron í.p. en el día 0 con PBS; IL-15 (aproximadamente 2.5 µg) ; o IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 µg) con IL-15 (2.5 µg) . Los esplenocitos CD8+ se analizaron en el día 4 mediante la citometría de flujo para la fluorescencia de CFSE y la expresión de CD45.1 (paneles superior); o células CD45.1 + CD8+ se analizaron para fluorescencia de CFSE y la expresión CD44 (paneles medios); paneles del fondo: en el día 1 los ratones recibieron esplenocitos enriquecidos con células T CD8+ marc^das con CFSE que contienen aproximadamente 6.5xl05 de células T CD8+ de memoria específicas de tetrámero + OVA y se trataron en el día 0 con PBS IL-15 (aproximadamente 2.5 µg) o IL-15iRa-Fc (aproximadamente 15 µg) con IL-15 (aproximadamente 2.5 µg) . Los esplenocitos de tetrámero + donadores se analizaron mediante citometría de flujo en el día 4 para la fluorescencia de CFSE. El tratamiento con IL-15Ra-Fc solo no tuvo efecto sobre la proliferación (datos no mostrados). Los datos son representativos de 3 experimentos similares con 3 ratorjes por grupo. Figura 2. Las células NK son altamente responsivas a IL-15+IL-15Ra-Fc preacopladas . En el día-1, los ratones recibieron aproximadamente 1.5xl07 linfocitos marcados con CFSE congenióos i.v. y en el día 0 se trataron con PBS, IL-15 (aproximadamente 2.5 µg) , o IL-15 (aproximadamente 2.5µg) + IL-lSRa-Fc (aproximadamente 15 µg) i.v. Las células del bazo se analizaron mediante citometría de flujo en el día 4. Las muestras se confinaron sobre el indicado en la población donadora. Los datos son representativos de 2 experimentos con 3 ratones por grupo. Figura 3. Las células T CD8+ se dividen rápidamente en respuesta al tratamiento con IL-15+IL-15Ra-Fc preacopladas. En el día 1 los ratones recibieron aproximadamente 1x10! linfocitos enriquecidos con CD8, marcados con CFSE, congenióos i.v. se trataron con PBS o IL-15 (aproximadamente 2.5 µg) + IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 µg) en el día 0. Los linfpcitos de la sangre periférica se analizaron mediante citomletría de flujo en los días 1-4. Las muestras se confinaron sobre células T CD8+ donadoras vivas. Los datos son representativos de 2 experimentos con por lo menos 3 i ratones por grupo. El tratamiento con PBS no tuvo efecto de la división celular (datos no mostrados) . Figura 4. La coadministración de IL-15Ra-Fc con IL-15 grandemente aumenta la potencia de IL-15. (a) en el día-1 los ratones recibieron aproximadamente 1.5xl06 linfocitos enriquecidos con CD8, marcados con CFSE, congenióos, í.v. y en el día 0 recibieron ya sea PBS (no mostrado) y IL-15 (aproximadamente 5 µg) o dosis variables de IL-15 con IL-15Ra-fFc (aproximadamente 2.5 µg + 15 µg, aproximadamente 0.5 I µg + 13 µg, aproximadamente 0.1 µg + 0.6 µg, o aproximadamente 0.02 µg + 0.12 µg) í.p. (b) En el día 1 cada ratón recibió aproximadamente 4.5xl06 lmfocitos enriquecidos con CD8 marcados con CFSE, congenióos, í.v. en el día 0 recibieron ya sea PBS (no mostrado), IL-15 (aproximadamente 0.5 µg)+ IL-15Ra^Fc (aproximadamente 3 µg) , o dosis variables de IL-15 (aproximadamente 12.5 µg, 25 µg, o 37.5 µg) í.p. Los esplénocitos CD8+ se analizaron en el día 4 para la dilución de C^SE mediante citometría de flujo. Figura 5. La actividad de IL-15+IL-15Ra-Fc formados en c mple o requiere IL-2Ra pero no la expresión IL-15Ra por las células respondientes, (a) En el día-1 los ratones IL-ISRa4-/- recibieron linfocitos IL-15Ra-/- enriquecidos con CD8, marcados con CFSE, congenióos, í.v. y en el día 0 se i trataron con PBS, IL-15 (aproximadamente 2.5 µg) o IL-15 (aproximadamente 2.5 µg) t lL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 µg) í.p. En el día 4 esplenocitos donadores CD8+ se analizaron para la fluorescencia de CFSE y la expresión de CD44 y CD122. (b) EJn el d?a-1 los ratones normales recibieron esplenocitos de tipo silvestre o IL-2/IL-15Ra-/- marcados con CFSE, congejnicos, í.v. y en e L día 0 se trataron con ya sea PBS o IL-15 (aproximadamente 2 5 µg) + IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 µd) í.p. de esplenocitos donadores CD8+ se analizaron para la diflucion de CFSE en el día 4 mediante citometpa de flujo. Figura 6. La proliferación inducida por IL-15+IL- 15Ra-Fc preacoplados de células CD8+T requiere la expresión MHC de clase I, pero no requiere IL-7 o DC . (a) En el d?a-1 los fatones B6 y beta2m-/- recibieron una mezcla de células T CD8+ marcadas con CFSE B6 normales y OT-I-RAG-/- naive y en el djLa 0 se trataron con ya sea PBS o IL-15 (aproximadamente 2.5 µg) + IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 µg) . (b) En el día-1 los ratones IL-7+/- o IL-7-/- recibieron linfocitos enriquecidos con CD8 marcados con CFSE, congenióos. En el día i 0 los ratones recibieron IL-15 (aproximadamente 2.5 µg)+IL-ldRa^Fc (aproximadamente 15 µg) í.p. (c) En el d?a-1 las quimeras producidas con medula osea B6 o CDllc-DTR recibieron esplénocitos í.v y en el día 0 se trataron con ya sea PBS o IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 µg)+IL-15 (aproximadamente 2.5 µg) | . p . Todos los ratones se trataron con DT en los días 0, 1 y X En todos los casos los esplenocitos CD8+ donadores se analizaron para dilución de CFSE en el día 4. Figura 7. Células T CD8+ Naive adquieren el fenotipo efectjor y funcionan en respuesta al tratamiento con IL-15+IL- 15Ra-JFc preacoplado. En el día-1 los ratones recibieron una I mezcla de células OT-I-RAG-/- naive y de memoria (a) o solamente células OT-I-RAG-/- naive (b-d) , y se trataron con I ya s a PBS o rmIL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 µg) con IL-15 (aproximadamente 2.5 g) en el día 0. Cuatro días después los espl^nocitos se examinaron para (a) intensidad CFSE, (b) porcentaje de expresión OT-I y CD44 donadora, (c) En el día-1 los ratones recibieron aproximadamente 7xl05 células OT-I- RAG- - naive y en el día 0 se trataron con PBS, IL-15 (aproximadamente 2.5 µg) , IL-15 (aproximadamente 2.5 µg)+IL- 15Ra-f-Fc (aproximadamente 15 µg) , o aproximadamente lxlO5 pfu VSV-QVA. En el día 4 los esplenocitos se incubaron m vitro con (¡_ sin péptido SIINFEKL durante aproximadamente 5 horas y la producción de IFN-a se analizó mediante el manchado intrácelular, (d) En el día-1 los ratones recibieron aproximadamente 2xl06 células OT-I-RAG-/- naive y se trataron con PBS o IL-15 (aproximadamente 2.5 µg) +IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 µg) í.p o aproximadamente IxIO5 pfu de VSV-OVA í.v. En el día 4 de post-tratamiento cada ratón recibió una mezcla de esplenocitos pulsados no de péptido marcados con CFSE (aproximadamente 0.25 µM) y esplenocitos pulsaldos con péptido SIINFEKL marcados con CFSE (aprcximadamente 2.5 µM) . Cuatro horas después los esplenocitos se analizaron para la presencia de las poblaciones objetivo marcadas con CFSE. Figura 8. El tratamiento con IL-15+IL-15Ra-Fc I preacopladas genera células de memoria de las células T CD8+r|aive. En el día uno, los ratones B6 recibieron i aproximadamente 6xlOd células OT-I-RAG-/- naive marcadas con CFSE y en el día 0 se trataron con i.p. con PBS o IL-15 (aproximadamente 2.5 g) + IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 µg) . 44 ías después los esplenocitos se analizaron para el porcentaje de células T CD8+ OT-I (panales superiores) y la expresión de OT-I del CD44 y CD122 (paneles medios y al i fondo) . i Figura 9. Ejemplo de una proteína de fusión IL- 15+LJj-15Ra-Fc de la Invención - versión de ratón de la prot^ína de fusión. En este ejemplo, la construcción general inclµye un péptido de señal IL-2 para la expresión aumentada y de! procesamiento, el gen IL-15 o porción del mismo, una región enlazadora variable para promover la libertad estérica y el plegamiento de la proteína (puede ser de cualquier longitud o secuencia deseada) la porción soluble o extracelular del gen IL-15Ra y la porción Fc de un IgG humano. Los genes o porciones de los mismos de los homólogos humanos pueden ser sustituidos sobre una manera similar. De manera similar, los genes IL-2 y IL-2Ra o porciones de los mismois pueden ser sustituidos en una construcción quimérica, I que también incluye combinaciones con genes IL-15 o IL-15Ra o porciones de los mismos. Figura 10. La proteína de fusión IL-15+IL-15Ra induqe proliferación de células TCD8 + y células NK. Los linfqcitos marcados con CFSE se transfirieron de ratones normales que luego se trataron con -10 µg de la proteína de fusión IL-15+IL-15Ra . Cuatro días después, células del bazo se aislaron y se analizaron mediante citometría de flujo. Figura 11. Carga de Cáncer de Hígado reducido por el Complejo de Proteína IL-15+IL-15Ra en Ratones.

Aproximadamente lxlO5 células de melanoma B6-F1 se inyectaron intráesplénicamente (que dirige los tumores al hígado) . En los días 1 y 7 días después los ratones se trataron con PBS i (control), 2.5 µg de IL-15 o 2.5 µg de complejo IL-15+IL- 15Ra. Catorce días después de la inoculación los tumores se contaron en el hígado y los bazos se pesaron. Figura 12. La formación en complejo de IL-15 a IL- 15Ra : grandemente aumenta la vida media y la biodisponibilidad in vi vo . (A) 2.5 µg de IL-15 humana sola o preformada en complejo a IL-15Ra se administró en ratones mediante inyección intraperitoneal. En los tiempos indicados, el suero se obtuvo y se probó mediante ELISA para la presencia de IL-15. La IL-15 total presente se calculó de una curva de concentración estándar. (B) La vida media se calculo de la porcíón lineal de la curva de decaimiento en A . Descripción Detallada de la Invención En los ejemplos de las composiciones y métodos de modalidades preferidas, se presenta la generación útil y ventajosa de polipéptidos terapéuticos. En una modalidad prefejpda, la invención se relaciona a un complejo de pol?pépt?do terapéutico que comprende una lmfocina o porciones de la misma, y un receptor de linfocina o porciones de la misma. El termino "receptor de linfocina" o "receptor de interleucina" se refiere a los receptores de transmembrana para una linfocina o interleucina respectiva, y en algunas modalidades puede comprender un anticuerpo capaz de enlazar la 1 nfocina o interleucina . En este contexto, el anticuerpo funciona efectivamente como el "receptor" para el polipéptido de lmfocma o mterleucina . Sin que sea restringido por alguna teoría particular, los inventores plantean como hipótesis que la actividad del terapéutico de la invención resulta de un procfso llamado "trans-presentación" en el cual la porción de receptor del complejo de polipéptido funciona para presentar la porción de molécula de señalización a su(s) receptor (es) respectivo ( s ) sobre la superficie de la célula objetivo. Por ejep?lo, la evidencia experimental indica que IL-15Ra trans-presenta IL-15 a las células T y otras células m vivo a travels de las cadenas beta y gamma del receptor IL-15. La i teoría es soportada por los resultados m vivo en ratones que muestran IL-15 sola que tienen poca actividad pero el complejo IL-15+IL-15Ra pre-acoplado tiene actividad sustancial sobre la proliferación de células T de memoria de índucjción (una de las marcas de referencia de la actividad IL-lq) como se muestra en la Figura 1, y reduce la carga de tumoif de la Tabla 1. Al pre-acoplar IL-15 a la cadena IL-15Ra la actividad biológica de IL-15 se aumentó grandemente en ratones (Figuras 1-8, y 10-12). A menos que se indique claramente lo contrario, las siguientes definiciones suplementan las definiciones de términos conocidos en la técnica. El termino "acido nucleico" se refiere a deoximbonucleotidos, ácidos deoxirpbonucléicos, riboijucleótidos y ácidos ribonucleicos y formas poliméricas de los mismos, e incluye formas de ya sea una sola o doble hebra. También, a menos que se limite expresamente, el término "acido nucleico" incluye análogos conocidos de nucleótidos naturales, por ejemplo, ácidos nucleicos de péptldo ("PNAs"), que tiene propiedades de enlace similares como el ácido nucleico de referencia. Ademas, en cualquiera de las modalidades preferidas, una secuencia de nucleótido de ácido nucleico particular incluye variaciones conservativas (por ejemplo, sustituciones de codón degeneradas, ver enseguida ) secuencias complementarias, así como las secuelncias explícitamente indicada. Una sustitución de codón I degenerada es una en la cual la tercera posición de uno o más codones seleccionados es sustituida con cualquier nucleótido que cjla por resultado el mismo aminoácido. El término ácido nucleico es genérico a los términos "gen", "DNA", "cDNA", "oligonucleótido", "RNA", "mRNA", "nucleótido", "polrnucleótido" , y los similares. ' Como se utiliza en la presente, el término "olicjonucleótido" se refiere a una serie de residuos de nucleótidos enlazados. Una secuencia de oligonucleótido corta puede estar basada sobre o diseñada de, una secuencia genór?ica o de cDNA y se utiliza para amplificar, confirmar o revelar la presencia de un DNA o RNA idéntico, similar o complementario en una célula o tejido particular. Los I ol?g{>nucleót?dos comprenden una secuencia de ácido nucleico i que tiene aproximadamente 10 nt, 50 nt, o 100 nt en longitud, de preferencia aproximadamente 15 nt a 30 nt en longitud. En una modalidad de la invención, un oligonucleótido gue comprende una molécula de ácido nucleico menor que 100 nt en longitud además comprendería por lo menos 6 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NOS: 1-4 o 13-16. Los oligonucleótidos puedfn ser químicamente sintetizados y también pueden ser utilizados como sondas.

Un acido nucleico "recombmante" es cualquier ácidoj nucleico producido por un proceso m vi tro o artificial (que significa que no ocurre naturalmente) o mediante recoi?binación de dos o mas ácidos nucleicos. El termino "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de ácido nucleico asociado con la expresión de un RNA o proteína dada. Así, los genes incluyen regiones que codifican RNAs expresadas (que típicamente incluyen secuencias de codificación de pol?pépt?do) y, frecuentemente, las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Los genes se pueden obtener de una variedad de fuentes, incluyendo la clonación de una fuenfe de ínteres o la sintetizacion de la información de secu ncia conocida o predicha, y puede incluir secuencias disecadas para tener parámetros específicamente deseados. En otra modalidad, una molécula de acido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NOs: 1-4, y 13-16. Como se utiliza en la presente, el termino "complementario" se refiere al emparejamiento de bases de Watson-Crick o Hoogsteen entre unidades de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico, y el término "enlace" significa la interacción física o química entre dos polipeptidos o compuestos o polipéptidos o compuestos asociados o combinación de los mismos. El enlace incluye interacciones iónicas, no iónicas, de van der Waals, interacciones hidrofóbicas y los similares. Una interacción físicja puede ser ya sea directa o indirecta. Las interacciones indirectas pueden ser a través o debido a los efectos de otro polipéptido o compuesto. El enlace directo se refiejre a interacciones que no toman lugar a través de, o debido a, el efecto de otro polipéptido o compuesto, sino en cambio están sin otros intermediarios químicos sustanciales. Los "fragmentos" proporcionados en la presente se definen como ; secuencias de por lo menos 6 ácidos nucleicos (contiguos) o por lo menos 4 aminoácidos (contiguos), una longitud suficiente para permitir la hibridación específica en él caso de ácido nucleico o para el reconocimiento específico de un epítope de casos de aminoácidos, y son en la mayoría alguna porción menor que una secuencia de longitud completa. Los fragmentos pueden ser de igual de cualquier porción contigua de una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de elección. Un clon de longitud completa se identifica por contener un codón de inicio de traducción ATG y un' codón de detención en la estructura. Cualquier secuencia de nucleótidos de NOVX divulgada que carece de un codón de inicio ATG por lo tanto codifica un fragmento C-terminal trunpado del polipéptido respectivo, y requiere que el cDNA de longitud completa correspondiente se extienda en la dirección 5' de la secuencia divulgada. Cualquier secuencia de nucleótido divulgada que carece de un codón de detención en la estructura de manera similar codifica un fragmento N-terminal truncado del polipéptido respectivo, y requiere que el cE()NA de longitud completa correspondiente se extienda en la dirección 3' de la secuencia divulgada. El término "célula hospedera" incluye una célula que podría ser utilizada para llevar un ácido nucleico heterjólogo, o expresar un péptido o proteína codificada por un ácido nucleico heterólogo. Una célula hospedera puede contener genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no i ecombmante) de la célula, genes encontrados en la forma nativa de la célula donde los genes son modificados y remfroducidos en la célula por medios artificiales, o un ácido nucleico endógeno a la célula que se ha modificado artificialmente sin remover el ácido nucleico de la célula.

Una ¡célula hospedera puede ser eucariótica o procariótica.

I Por ejemplo, células de bacterias se puede utilizar para llevar o clonar secuencias de ácido nucleico y expresar polipéptidos . Las condiciones de crecimiento general necesarias para el cultivo de bacterias se puede encontrar en textos tales como BERGEY' S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, Vol. 1, N. R. Krieg, ed., Williams y Wilkms, Baltimore/London (1984). Una "célula hospedera" también puede ser µna en la cual los genes o promotores endógenos o ambos se han modificado para producir uno o más de los componentes 3- de polipéptido del complejo de la invención. "Derivados" son secuencias de ácido nucleico o secuelncias de aminoácidos formadas de los compuestos nativos ya sfa directamente, por modificación, o por sustitución parcial. "Análogos" son secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos que tienen una estructura similar a, ptero no idéntica a, el compuesto nativo, por ejemplo, ellos, difieren en este aspecto a ciertos componentes o caderjas laterales. Los análogos pueden ser sintéticos o derivados de un origen evolucionario diferente y pueden tener una actividad metabólica similar u opuesta comparada con el tipo silvestre. Los homólogos son secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácido de un gen particular que son derivados de diferentes especies. Los derivados y análogos pueden ser de longitud completa o diferente a la longitud completa. Los derivados o análogos de los ácido nucleicos o proteínas de la invención incluyen, pero no están limitados a, moléculas que comprenden regiones que son sustancialmente homologas a los ácidos nucleicos o proteínas de la invención, en varias modalidades, por lo menos aproximadamente 30%, 45%, 70%, 80%, o 95% de identidad (con una identidad preferida de 80-95%) sobre una secufncia de ácido nucleico o aminoácido de tamaño idéntico o cuando se compara a una secuencia alineada en la cual la alinfación se hace con un programa de homología en computadora conocido en la técnica, o cuyo ácido nucleico de codificación es capaz de hibridar el complemento de una secuencia que codifica las proteínas de la invención bajo condiciones severas, moderadamente severas o de baja severidad. Ver, por ejemplo Ausubel, y colaboradores, CURRENT PROTQCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N. Y .- , 1993. Los derivados de ácido nucleico y modificaciones incluyen aquellos obtenidos por el reemplazo de gen, mutación específica del sitio, supresión, inserción, recombinación, reparación, entremezclamiento, digestión de endonucleasa, PCR, subclonación y técnicas relacionadas. "Homólogos" pueden ser que ocurran naturalmente, o creados por síntesis artificial de uno o más ácidos nucleicos que tienen secuencias relacionadas, o por modificación de uno o m&s ácidos nucleicos para producir ácidos nucleicos relacionados. Los ácidos nucleicos son homólogos cuando se derivan, naturalmente o artificialmente, de una secuencia de I ancestro común (por ejemplo, ortólogos o parálogos) . Si la homología entre dos ácidos nucleicos no es expresamente descrita, la homología puede ser inferida por una comparación de ácido nucleico entre dos o más secuencias. Si las secuencias demuestran algún grado de similitud de secuencia, por e emP °' mayor que aproximadamente 30% en el nivel de la estructura de aminoácidos primaria, se concluye que ellos comparten un ancestro común. El grado de similitud variará y factojres importantes incluyen por ejemplo, el grado de similitud total, el grado de similitud dentro de regiones especificas de la secuencia de codificación, la similitud de secuencia de no codificación, y la actividad del polipéptido. Para i propósitos de la presente invención, los genes son homólogos si las secuencias de ácido nucleico son sufiqientemente similares para permitir la recombinación. i Los términos "homología" o "identidad" en el contexto de dos o más ácido nucleicos o secuencias de polirjéptido, se refieren a dos o más secuencias o i subsécuencias que son las mismas o similares, y tiene un i porcentaje específico de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos cuando se comparan y se alinean para correspondencia máxima, como es medido utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencia tal como BLAST, Clusttal W, u otros algoritmos disponibles para personas de habilidad o por inspección visual. Para comparación de secuencia y determinación de homología, típicamente una secufncia actúa como una secuencia de referencia a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un i algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de pruefa y de referencia se introduce en una computadora, se i disecan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secu ncia. El algoritmo de comparación de secuencia luego calcula el por ciento de identidad de secuencia para la(s) secuencia (s ) de prueba con relación a la secuencia de referencia, basado sobre los parámetros del programa designado. Otras determinaciones de homología incluyen la hibridación de ácidos nucleicos bajo condiciones severas. La frase "hibridación" se refiere al enlace, duplexión o hibridación de una molécula solamente una secuencia de nucleotido particular bajo condiciones severas, incluyendo cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, celular total) de DNA o RNA. El término "pre-acoplado" como se utiliza en la presente, se refiere a una situación donde los componentes de polipéptido individuales se combinan para formar el complejo activo antes de la activación o enlace al sitio objetivo, por ejemplo, como una célula inmune. Este incluye la situación don e los componentes de complejo de polipéptido individual se sintetizan o se expresan recombinantemente y subsecuentemente se aislan y se combinan para formar un complejo, ín Vi tro, antes de la administración en un organismo; la situación donde un polipéptido quimérico o de fusión (es decir, cada componente de proteína discreta del complejo está contenido en una cadena de polipéptido individual) se sintetiza o expresa recombinantemente como un complejo intacto; y/o la situación donde los componentes de complejo de polipéptido individuales se administran simultáneamente en un individuo, por ejemplo, intravenosamente, en forma compleja m si tu o m vivo. "Mutaciones conservativas" de una secuencia de acida nucleico se refiere a aquellos nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idéntjicas, o donde el nucleotido no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Esto está basado sobre el hecho de que el código genético es "degenerado", es decir, un numero de ácidos nucleicos distintos codifican para el mismo aminoácido. Por ejemplo, los codones GTT, GTA, GTC, y GTG todos codifican el aminoácido valina. Asi, en cada posición donde una valma es especificada por un codon, el codon puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin altefar el polipeptido codificado. Tales variaciones de ácido nuclfico son "mutaciones silenciosas", que son una especie de "mutación conservativa". A menos que se describa de otra manera cada secuencia de nucleotidos descrita en la presente que codifica un aminoácido también incluye cada variación silenciosa posible. Uno de habilidad ordinaria reconocerá que cada codon en un acido nucleico (excepto ATG, que es ordinariamente el único codon para metionina) se puede modijficar para producir una molécula funcionalmente idéntica por técnicas estándares. Por consiguiente, en cada caso donde la mutagenesis se utiliza cada "mutación silenciosa" de un I ácido1 nucleico, que codifica un aminoácido, es implícitamente inclu|?da . Además, uno de habilidad ordinaria reconocerá que I las ' "mutaciones conservativas" también incluyen la sustitución, supresión o adición de ácidos nucleicos que I alterjan, adicionan o suprimen un solo aminoácido o un número i pequeño de aminoácidos en una secuencia de cod ficación donde | las ¡alteraciones de ácido nucleico dan por resultado la sustitución de un aminoácido químicamente similar. Los i aminoácidos que pueden servir como sustituciones conservativas entre sí incluyen lo siguiente: Básico: i Argirima (R), Lisma (K), Histidina (H) ; Acídico: Acido aspártico (D), ácido glutamico (E) , Asparagina (N), Glutamina (Q) ; hidrofílico: Glicina (G) , Alanina (A), Valina (V), Leucina (L) , Isoleucina (I); Hidrofóbico: Fenilalamna (F), Tiro^ina (Y), Triptofano (W) ; que contiene Azufre: Metionina (M) , Cisteína (C) . Además, secuencias que difieren por variaciones conservativas son generalmente homologas. Una "subsecuencia" se refiere a una secuencia de ácidf nucleico o aminoácidos que comprende una parte de una secuencia más larga de acido nucleico o aminoácidos (por ejemplo, polipéptido) respectivamente. Un "operon" de ácido nucleico incluye un gen que está situado en una relación funcional con otras secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, un promotor, un aumentador, I señales de terminación u otro gen si incrementa la transcripción de la secuencia de codificación. "Mutagénesis" como se utiliza en la presente incluye tales técnicas conocidas en el arte como mutagénesis de PCR, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis dirigida al sito, mutagénesis aleatoria, mutagjénesis de PCR propensa de error, etc., y la recortjbinación de secuencia reiterativa mediante cualquiera de las tjécnicas descritas en la presente. ' Las descripciones de las técnicas biológicas moleculares útiles para la práctica de la invención incluyen mutagénesis, PCR, clonación y los similares incluyen Berger y Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, METHODS IN ENZYMOLOGY, volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook y colaboradores, MOLECULAR CLONING--A LABORATORY MANUAL (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Labo atory, Cold Spring Harbor, New York, 1989, y CURRENT PROT?COLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. M. Ausubel y colaboradores, eds., Current Protocols, una empresa asociada entrf Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc.; Berger, Sambrook, y Ausubel, así como Mullís y colaboradores, patente norteamericana No. 4,683,202 (1987); PCR ¡PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS y APPLICATIONS (Innis y colaboradores, eds), Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (Oct. 1, 1990) C&EN 36-47; Lueng, y colaboradores, A method for random mutagenesis of a definted DNA segment using a modified polymerase chain reaction. Techni que : J Methods Cel l Molec Biol 1(1):11-15 (1989?), que son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos. Métodos ejemplares de la pfesente invención incluyen la realización de mutagénesis de secuencia, recombinación, o ambas y la clasificación o seledción de genes individuales. Como se utiliza en la presente, los términos "linfocina", "interleucina", "IL-15" o "IL-2" se utilizan para ' referirse colectivamente a todas las formas de las secuencias de polinucleótido de polipéptido correspondientes que incluyen, por ejemplo, las secuencias de longitud completa, segmentos, dominios o porciones discretas, sustituciones, mutantes de inserción y de sustitución, quimeras con las mismas u otras linfocinas, isoformas, i variantes de empalme y cualquiera de las combinaciones de los mismfs . Como se utiliza en la presente, los términos "IL-15Ra", o "IL-2Ra" se utilizan para referirse colectivamente a todas las formas de las secuencias de polinucleótido o polipéptido correspondientes que incluyen, por ejemplo la secuencia de longitud completa, segmentos, dominios o I porciones discretas, sustituciones, mutantes de inserción y de sjupresión, quimeras con los mismos u otros receptores de lmfocma, isoformas, variantes de empalme y cualquiera de las cpmbinaciones de los mismos. Moléculas de Acido Nucleico En algunas modalidades, la invención comprende I ácidds nucleicos o moléculas de polmucleótido que codifica una linfocma o porciones de la misma, y ácidos nucleicos y molécjulas de polinucleotido que codifica un receptor de linfqcina o porciones del mismo. En cualquiera de las modalidades de acido nucleico, la invención contempla el uso de p?lmucleotidos que codifican sustanclalmente la protema de longitud completa, polipeptido de tipo silvestre o mutantes; segmentos discretos, dominios, subdominios, fragitientos, mutaciones de supresión e inserción; quime'ras; e isoffrmas y variantes de empalme. En ciertas de las moda idades preferidas, la invención comprende ácidos nucleicos que comprenden un segmento de polmucleótido que codifica por lo menos una lmfocma o porción de la misma, contigua con un segmento de polmucleotido que codifica por lo menos un receptor de lmfocina o porción del mismo dentro de ?na lectura de estructura abierta individual ORF (es decir, codon de inicio a codon de detención) . En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos de la invención comprende por lo menos un segmento de polinucleótido adicional que comprende secuencias reguladoras de transcripción (por ejemplo, promotores, promotores inducibles, aumentadores y los ¡similares) ; secuencias de proteína de fusión (por ejempilo, His-tag, GST, GFP, porciones Fc de anticuerpo, resistencia a antibiótico, péptidos de señal y los similares; y/o secuencias enlazadoras dispuestas en el extremo 5' , extremo 3' o en una localización dentro de las secuencias de codificación del polipéptido; y/o combinaciones de los mismos. En cualquiera de las modalidades descritas en la presfnte, el polinucleótido de la invención también puede ser dispqesto en un vector viral adecuado, plásmido bacteriano o cromcjsoma artificial adecuado para la clonación y/o expresión en na célula eucariótico o extracto celular, célula procariótica o extracto celular, y/o combinaciones de los mismos . Muchas técnicas para la clonación, subclonación y transferencia de ácidos nucleicos recombinantes en un vector de plásmido o una célula hospedera o ambos, y técnicas para clasiificación de librería y selección, son conocidos en la técnica, y cada uno de estos formatos y/o técnicas es generalmente aplicable a la presente invención. Por ejemplo, los textos que divulgan técnicas generales para manipular ácidfs nucleicos de uso en esta invención incluyen "Current Protfcols in Molecular Biology" (Ausubel y colaboradores eds.; 1994)); Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning, A Labofatory Manual" (2nd ed. 1989) ; y Kriegler, "Gene Transfer y Expression: A Laboratory Manual" (1990), los contenidos y enseñanzas relevantes de los cuales son incorporados en la presepte por referencia. Otro aspecto de la invención pertenece a vectores, t de preferencia vectores de expresión, que contiene un ácido nucleico que codifica SEQ ID NOs: 5-12, o derivados, fragmentos homólogos de los mismos. Como se utiliza en la presente, el termino "vector" se refiere a una molécula de ácidq nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico a la cual se ha "operablemente enlazado". Un tipo de vector es un "pláámido", que se refiere a un circuito de DNA de doble hebra circular en el cual pueden ser ligados segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de DNA adicionales pueden ser ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de la replicación autónoma en una célula hospedera en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episomales) . Otro$ vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episómales) se integran en el genoma de una célula hospedera en una introducción en la célula hospedera, y de esta manera se replican junto con el genoma del hospedero. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales son operativamente enlazados. Tales vectores son referidos en la presente como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de DNA recombinantes están frecuentemente en la formal de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se puede utilizar intercambiablemente como el i plásm'ido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embar¡go, la invención se propone para incluir tales de otras forma|s de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus adenoasociados) que sirven para funciones equivalentes . ' Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célu a hospedera, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células hospederas para ser utilizadas para expresión, que es i operativamente enlazado a la secuencia de ácido nucleico que es expresada. Dentro de un vector de expresión recombinante, "operativamente enlazado" se propone para dar a entender que i la s cuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la(s) secuencia (s) reguladora (s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sist ma de transcripción/traducción in vi tro o en una célula hospedera cuando el vector se introduce en la célula hospedera) .

¡ El término "secuencia reguladora" se propone para incluir promotores, aumentadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, en Goeddjel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, 'Academic Press, San Diego, Calif. (1990) . Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospederas y aquellos que dirigen la expresión de la Secuencia de nucleótidos solamente en cierta células hospederas (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido) . Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de t^les factores como la elección de la célula hospedera a ser transformada, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células hospederas para de esta manera producir proteínas o péptidos, que incluyen proteínas o péptjLdos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como es descrito en la presente. Los vectores de expresión recofnbinante de la invención se pueden diseñar para la expresión de proteínas en células procarióticas o eucaírióticas . Por ejemplo, las proteínas se pueden expresar en células bacterianas tales como Escherichia coli, células de insecto (usando vectores -de expresión de baculovirus), células de levadura o células mamíferas. Las células hospejderas adecuadas se discuten adicionalmente en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Académic Press, San Diego, Calif (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras del promotor T7 y T7 polimerasa. La expresión de proteínas en procariotas es más frecuentemente llevado a cabo en Escherichia coli con vectores que contienen promotores constitutivos inducibles que dirigen la expresión de proteínas ya sea de fusión o de no fusión. Los vectores de fusión adicionan un número de aminoácidos a una proteína codificada en el mismo, usualmente al amino Terminal de la proteína recombinante. Tales vectores de fµsión típicamente sirven para tres propósitos: (i) para incrementar la expresión de la proteína recombinante; (ii) para incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y (iii) para ayudar en la purificación de la proteína recombinante al actuar como un ligando en la purificación por afinidad. Frecuentemente, en vectores de expresión de fusión, un sitio de segmentación proteolítica se introduce en la unión de la porción de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante de la porción de fusión subsecuente a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de I reconocimiento cognadas, incluyen el Factor Xa, trombina y i enterdquinasa . Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson, 1988.

Gene 167: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5' (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan gluttiona S-transjferasa (GST) , proteína de enlace de maltosa E, o proteína A, respectivamente, la proteína recombinante objetjivo . Ejemplos de vectores de expresión de E. coli de no fusión inducibles, adecuados incluyen pTrc (A rann y colaboradores, (1988) Gene 69:301-315) y pET lid (Studier y colaboradores, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89) . Una estrategia para maximizar la expresión de proteína recombinante en E. coli es expresar la proteína en una ¡bacteria hospedera con una capacidad deteriorada para segmentar proteolíticamente la proteína recombinante. Ver, por ejemplo, Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128. Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucl ico del ácido nucleico a ser insertada en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido son aquellos preferencialmente utilizados en E. coli ¡ver, por ejemplo, Wada, y colaboradores, 1992. Nucí Acídsi Res. 20: 2111-2118) . Cada alteración de secuencia de ácido nucleico de la invención se puede llevar a cabo mediapte técnicas de síntesis de DNA estándares. En otra i modalidad, el vector de expresión es un vector de expresión de lavadura. Ejemplos de vectores para la expresión en la I levadura Sa ccharomyces cepvisae incluye pYepSec (Baldan, y colaboradores, 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kur an y Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz y colaboradores, 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corpo'ration, San Diego, Calif.), y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.). Alternativamente, los polipeptidos pueden ser expresados en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de mseqto cultivadas (por ejemplo, células SF9) incluyen la serie pAc (Smith, y colaboradores, 1983. Mol. Cell. Biol. 3:2136-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989. Virology 170:31-39) En todavía otra modalidad, un acido nucleico de la invención se expresa en células mamiferas utilizando un vectqr de expresión mamífero. Ejemplos de vectores de expresión mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329:800) y pMT2PC (Kaufmnan, y colaboradores, 1987. EMBO J. 6:87-195). Cuando se utilizan células mamiferas, las funciones del control del vector de expresión frecuentemente son ¡proporcionadas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente utilizados son derivados de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus 40 de simif. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procarióticas y eucarióticas ver, por ejemplo, Capítulos 16 y 17 de Sambrook, y colaboradores, MOLECULAR CLONlNG: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbfr, N.Y., 1989. En otra modalidad, el vector de expresión mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferencialmente en un tipo de célula particular (por ejemplo, elementos reguladores específicos de tejido se utilizan para expresar el .ácido nucleico. Los elementos reguladores específicos de' tejido son conocidos en la técnica. Ejemplos no limitativos de promotores específicos de teji?io adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert, y colaboradores, 1987. Genes Dev. 1:268-277) promotores específicos linfoides (Caíame y Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore, 1989. EMBO J. 8:729-733) e im unoglobulinas (Banerji, y colaboradores, 1983. Cell 33:729-740; Queen y Baltimore, 1983. Cell 33:741-748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle, 1989. Proc.

I Nati.- Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund, y colaboradores, 1985. Science 230:912- 916) ,¡ y promotores específicos de glándula mamaria (por ejemplo, promotor de suero de leche; patente norteamericana No. 4,873,316 y publicación de solicitud Europea No. 264,166). Los promotores desarrolladamente regulados también está? comprendidos, por ejemplo, los promotores hox de murino (Kes?jel y Gruss, 1990. Science 249:374-379) y el promotor alfa-ifetoproteína (Campes y Tilghman, 1989. Genes Dev. 3:537- ¡ 546) .| En una modalidad de la presente invención, los segmentos de ácido nucleico de partida primero se recombinan mediante cualquiera de los formatos referidos en la presente para , generar una librería de ácidos nucleicos recombinantes. La librería puede variar en tamaño, por ejemplo, variando de aproximadamente 10 a aproximadamente 109 miembros. En general, los segmentos de ácido nucleico iniciales, y las librerías recombinantes de ácidos nucleicos generados incluyen secuencias de codificación de longitud completa (es decii, estructura de lectura abierta (ORF) , que incluye el codórt de inicio, secuencia de codificación y codón de detención) y cualquiera de las secuencias reguladoras esenciales, por ejemplo, un promotor y secuencia de poliádenilación, requerida para la expresión. Sin embargo, en el caso de que el ácido nucleico recombinante no contenga estos elementos, los ácidos nucleicos recombinantes en la librería pueden ser insertados en un vector que incluye las i secuencias perdidas antes de la clasificación y selección de ! clones recombinantes. Las secuencias de ácido nucleico recombinantes se pued n combinar en un formato in vi vo que da por resultado una librería de segmentos recombinantes capaces de expresión.

Alternativamente, la recombinación se puede realizar in Vi trO, y la librería recombinante se introduce en el tipo de célula deseada antes de la etapa de clasificación y selección. En algunas modalidades de la invención, la librería de ácido nucleico recombinante se amplifica en un primfr hospedero, y luego se recupera de ese hospedero y se introduce a un segundo hospedero para razón de expresión, selección o clasificación o cualquier otro parámetro desefble. La manera mediante la cual el ácido nucleico recombinante se introduce en la célula hospedera depende de las características de captación de ácido nucleico del tipo de célula (por ejemplo, que tiene receptores virales, que son capaces de conjugación, que son naturalmente competentes y/o que requieren pistola de DNA o electropulso) . Después de la introducción de la librería de genes de DNA recombinantes, las ¡células se pueden propagar para permitir que ocurra la exprfsión de genes. En cualquiera de las modalidades, los ácidos nuclficos que codifican la linfocina o receptor de linfocina I se pueden presentar como: uno o más DNAs desnudos; uno o más ácidos nucleicos dispuestos en un vector de expresión apropiado y mantenidos episomalmente; uno o más ácidos nucleicos incorporados en el genoma de la célula hospedera; una yersión modificada de un gen endógeno que codifica los componentes del complejo; uno o más ácidos nucleicos en i combinación con uno o más secuencias de ácido nucleico reguiadoras; o combinaciones de las mismas. En una modalidad, los ¡genes de interleucina y/o receptor de interleucina endógeno de célula hospedera se modifica utilizando técnicas i de recombinación homologa tal que la célula es una combinación del polipéptido 'de interleucina, un polipéptido de receptor de interleucina soluble y polipéptidos de I compiejo de interleucina/receptor de interleucina, que pueden ser aislados y purificados -utilizando técnicas estándares. En cualquiera de las modalidades, un ácido nucleico que codifica el componente linfocina comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NOs:l, 2, 14, 15, porciones y combinaciones de las mismas. Además, cualquiera de las modalidades, un ácido nucleico que codifica componente receptor de linfocina comprende un miembro seleccionado del grupcj) que consiste de SEQ ID NOs:3, 4, 13, 16, porciones y i combinaciones de las mismas. El ácido nucleico que codifica la linfocina, porción de receptor de linfocina y/o quimera de linfpcina/receptor de linfocina opcionalmente puede comprender un péptido enlazador o componente de proteína de fusicjm, por ejemplo, His-Tag, FLAG-Tag, GFP, GST, una porción i de 'anticuerpo, un péptido de señal y los similares, en el extremo 5' , el extremo 3' o en cualquier localización dentro de lá ORF. En una modalidad preferida, el ácido nucleico de la invención comprende un polinucleótido que codifica la porción soluble (es decir, la extracelular) de un receptor de linffcina. En una modalidad particularmente preferida, la invención comprende un ácido nucleico contiguo que codifica un péptido de señal, una linfocma, un péptido enlazador, y la porción soluble de un receptor de lmfocina, y la porción Fc de un anticuerpo. Cualquiera de las modalidades descritas en la presente, se puede lograr utilizando procedimientos biológicos moleculares y genéticos estándares bien conocidos para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. En cualquiera de las modalidades un cDNA que codifica la estructura de lectura abierta de la SEQ ID NOs: 1-4, y 13-16 o porciones de las mismas se pueden incorporar en plásmidos de expresión bacteriana disponibles tales como pGEM (Promega) o vectores pBluescript (Stratagene) o vectores de expresión eucarióticas tal como el sistema baculovirus, pCEP, vectores pcDNA o uno de estos derivados. En ciertas modalidades, la invención comprende una secuencia de polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de la SEQ ID NOs:5-12 o porciones de las mismas.

Por ¡"secuencia de ácido nucleico aislada" se compone un i polinucleótido que no está inmediatamente contiguo con cualquiera de las secuencias de codificación con la cual está inmediatamente contiguo (uno sobre el extremo 5' y uno sobre el extremo 3' ) en el genoma que ocurre naturalmente de un organismo del cual se deriva. El término por lo tanto incluye, por ejemplo, un DNA recombinante que es incorporado i en ?n vector; en un plásmido o virus automáticamente replicante; o en el DNA genómico de una procariota o eucatiota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un cDNA) independiente de otras secuencias. Los nucleótidos pueden ser formas modificadas de DNA o RNA. Las modificaciones incluyen pero no están limitadas a sustituciones conocidas de una base que ocurre naturalmente, azúcar o internucleósido (cadena principal) enlace con una base modificada tal como 5-metilcit?sina, una azúcar modificada tal como 2' -metoxi y azúcares 2' -fluoro, y cadenas principales modificadas tales como fosforotioato y metilfosfonato. Un polinucleótido puede ser una molécula de DNA, una molécula de cDNA, molécula de DNA genómico o una molécula I de RNA. Un polinucleótido como DNA o RNA puede incluir una secuencia en donde T (timidita) también puede ser U (uradilo) . El polinucleótido puede ser complementario a la SEQ ID NOs: 1-4, y 13-16, en donde complementarios se refieren a capacidad para el emparejamiento preciso entre dos nucl^ótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una cierta posidión de un polinucleótido es capaz de formar un emparejamiento de Watson-Crick con un nucleótido en la misma posición en una hebra de DNA o RNA antiparalela, entonces el poliriucleótido y la molécula de DNA o RNA son complementarias entr4 sí en esa posición. El polinucleótido y la molécula de i I DNA f RNA son sustanclalmente complementarias entre si cuando i un nµmero suficiente de posiciones correspondientes de cada molécula son ocupados por nucleótidos que pueden hibridar entré sí con el fin de efectuar el proceso deseado. Como se utiliza en la presente, hibridación significa el enlace de hidrfgeno de Watson-Crick entre bases de nucleósido o de nuclOótido complementarios. I i Además, los polinucleótidos que codifican toda una porción de la SEQ ID NOs: 1-4, y 13-16 son incluidos. Tales polirjiucleótidos incluyen moléculas de DNA que ocurre naturalmente, sintéticas e intencionalmente manipuladas. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden ser sometidos a la i mutagénesis dirigida al sitio por técnicas conocidas en el arte1 de biología molecular. Existen 20 aminoácidos que ocurien naturalmente, muchos de los cuales son especificados por ifiás de un codón. Por lo tanto, se incluyen secuencias de nuclqótidos degenerados, los polinucleótidos también incluyen polinucleótidos que codifican para análogos de polipéptido; fragmentos o derivados de polipéptidos antigénicos que difieren de formas que ocurren naturalmente en términos de la identidad o localización de uno o más residuos de aminoácidos (análogos de supresión que contienen menos de todos los residuos especificados para el polipéptido, análogos de sustitución en donde uno o más residuos especificados son reemplazados por otros residuos y análogos de adición donde uno f más residuos de aminoácido se adiciona a una porción Terminal o media del polipéptido) y que comparten algunas o todas las propiedades de formas que ocurren naturalmente. Estas moléculas incluyen la incorporación de codones adecuados para la expresién mediante hospedero de un mamífero seleccionado. La provisiFn de sitios para la segmentación por enzir?as de endonucleasa de restricción; y la provisión de i secuencias de DNA iniciales, terminales o intermedias adicionales que facilitan la construcción de vectores fácilmente expresados. Los polinucleótidos incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos o proteínas de longitud completa que contienen sustituciones, inserciones o supresiones en la cadera principal de proteína. Los polipéptidos relacionados se alinean mediante grados asignativos de homología a varias supresiones, sustituciones y otras modificaciones. La homología se puede determinar junto con el polipeptido o poliijucleótido completo o junto con subconjuntos de residuos contiguos. El por ciento de identidad es el porcentaje de aminoácidos o nucleotidos que son idénticos cuando se i comparan con dos secuencias. El por ciento de similitud es el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que son químicamente similares cuando las dos secuencias se comparan. Los polijj»éptidos homólogos de preferencia son más grandes que o iguales a 25%, de preferencia mayor que o igual a 30°, más de preferencia mayor que o igual a 35% o mucho más de i preffrencia mayor que o igual a 40% idéntico. Los plasmidos divulgados en la presente son ya sea comercialmente disponibles, publicamente disponibles sobre una base no restringida, o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles mediante la aplicación de rutina de procedimientos publicados, bien conocidos. Muchos plásmidos y otroi vectores de clonación y expresión son bien conocidos y fácilmente disponibles, o aquellos de habilidad ordinaria en la técnica pueden fácilmente construir cualquier numero de otros plásmidos adecuados para el uso. Estos vectores se puedfn transformar en una célula hospedera adecuada para formar un sistema de vector de célula hospedera para la producción de un polipeptido que tiene la actividad biológica de un transportador celular. Los hospederos adecuados inclµyen microbios tales como bacterias, levadura, insecto u organismos mamíferos o líneas de célula. Ejemplos de bacterias adecuadas son __. col i y B . subtil i s . En un vector de levadura preferido es pRS426-Gal. Ejemplos de levaduras adecuadas son Sa ccharomyces y Pichia . Las • células anfibias adecuadas son células Xenopus. Los vectores adecuados para líneas de células de insectos incluyen vectores de baculovirus. Las células de rata o humana son células mamíferas preferidas. La transformación de una célula hospedera con DNA recombinante se puede llevar a cabo por técnicas convfncinales como son bien conocidas para aquellos expertos en la técnica. Por "transformación" se propone un cambio genético permanente o transiente inducido en una célula despµés de la incorporación de nuevo DNA (es decir, DNA exógeno a la célula) . Donde la célula es una célula mamífera, un Cambo genético permanente que aun se logra mediante la introducción del DNA del genoma de la célula. Por "célula transformada" ' o "célula hospedera" se propone una célula (por ejemplo, procariótica o eucariótica) en la cual (o en un ancestro de la cual) se ha introducido, por medio de técnicas de D A recombinantes como una molécula de DNA que codifica un polipéptido de la invención (es decir, un polipéptido INDY) , o fragmento del mismo. Donde el hospedero es procariótico, tal como E . coli,, células competentes que son capaces de captación de DNA se pueden preparar a partir de células recolectadas de la fase i de crecimiento exponencial y subsecuentemente tratadas por él método de CaCl2 mediante procedimientos bien conocidos en 1^ técnica. Alternativamente, se puede utilizar MgCl2 o RbCl. La transformación también se puede realizar después de formar un protoplasto de la célula hospedera o mediante electiroporación . ! Cuando el hospedero es una eucariota, tales métodos de tfansfección con DNA incluyen coprecipitados de fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales tal como micrFinyección, electroporación, inserción de un plásmido encajado en liposomas, o vectores de virus, así como otros conocidos en la técnica, pueden ser utilizados. Las células eucarióticas también se pueden cotransfectar con secuencias de D^IA que codifican un polipéptido de esta descripción, y una Segunda molécula de DNA foránea que codifica un fenotipo seleccionable, tal como el gen timidita quinasa de herpes simple. Otro método es usar un vector viral eucariótico, tal como ¡ el virus 40 de simio (SV40) o virus de papiloma bovino, para infectar transientemente o transformar células eucarióticas y expresar la proteína (Eucaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). De preferencia, un hospedero eucariFtico se utiliza como la célula hospedera como es descrito en la presente. La célula eucariótica puede ser una célula de levadura (por ejemplo, Sa ccnaromyces cerevi siae) o puede ser una célula mamífera, inciqyendo una célula humana. Los sistemas de célula mamíferas que utilizan virus recombmante o elementos virales para dirigir la expresión pueden ser diseñados. Por ejemplo, cuando se utilizan vectores de expresión de adenovirus, las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína foránea se pueden ligar a un Complejo de control de transcripción/traducción de adenqvirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia de guía tripartida. Este gen quimérico luego puede ser insertado en el genoma del adenovirus mediante recombinación ín Vitro o ín vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región El o E3) dará por resultado un virus recombmante que es viable y capaz de expresar los polipéptidos en hospederos infectados (por ejemplo, Logan & Shenk, Proc . Natl. Acad. Sci . U.S.A. 81:3655-3659, 1984). Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo de proteínas recombmantes, la expresión estable es preferida. Antes que utilizar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células hosp deras se pueden transformar con el cDNA que codifica un I prot^ína de fusión de mterleucina/receptor de interleucina controladas por elementos de control de expresión apropiada I (por ejemplo, promotor, aumentador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrarse establemente al plásmido y sus cromosomas y crecer para formar focos, que a su vez pueden ser clonados y expandidos en líneas celulares. Por ejemplo, después de la introducción del DNA foráneo, las células diseñadas se pueden dejar crecer durante 1 o 2 días en u? medio enriquecido, y luego se interrumpen a un medio selectivo. Un número de sistemas de selección pueden ser utilizados, incluyendo pero no limitado a la timidita quinasa de virus de herpes simple (Wigler y colaboradores, Cell 11: 233, 1977), fosforibosiltransferasa de hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Sci. U.S.A. 48:2026, 1962),, y fosforibosiltransferasa de adenina (Lowy y colaboradores, Cell 22:817, 1980) estos genes pueden ser empl ados . En otras modalidades, la invención pertenece a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos de interleucina, polipéptidos de receptor de interleucina, polipéptidos de anticuerpo y polipéptidos de interleucina/receptor de interleucina quiméricos o porciones biológicamente activas de las mismas. También incluidos en la invención están los fragmentos de ácido nucleico suficientes para1 el uso' como sondas de hibridación para identificar ácidos nucleicos que codifican interleucina/receptor de interleucina quiméricos y fragmentos para el uso como cebadores de PCR para la amplificación y/o mutación de molédulas de ácido nucleico de interleucina/receptor de interjleucina quiméricas. Como se utiliza en la presente, el térmijno "molécula de ácido nucleico" se propone para inclir moléculas de DNA (por ejemplo, cDNA o DNA genómico), molédulas de RNA (por ejemplo, mRNA), análogos del DNA o RNA generado utilizando análogos de nucleótidos y derivados, fragr?entos y homólogos de los mismos. La molécula de ácido nucleico puede ser de una sola hebra o de doble hebra, pero de preferencia está comprendida de DNA de doble hebra. J En todavía otra modalidad preferida, la invención inclµye un método para aislar un ácido nucleico de la inverfición que incluye uno o más de: (a) ácidos nucleicos de recoijibinación de por lo menos dos linfocinas o receptores de linffcina para crear una librería de ácidos nucleicos; (b) tranfformar los genes recombinantes en una célula competente; (c) clasificar las células'; (d) aislar el ácido nucleico deseado para ciclos adicionales de recombinación con otro ácidf nucleico. El método de esta invención también puede involucrar la construcción de ácidos nucleicos recombinante, vectores de plásmido, o ambos, y la expresiFn de genes en células hospederas transformadas. Las técnicas de clonación molecular requeridas para lograr estos objetivos son bien conocidas en la técnica.

Un ácido nucleico que codifica interleucina puede codificar un polipéptido de interleucina madura. Como se utiliza en la presente, una forma "madura" de un polipéptido o prFteína divulgada en la presente invención es el producto de un polipéptido que ocurre naturalmente, forma precursora, i preproteína o proproteína. El polipéptido que ocurre naturalmente, precursor o proproteína incluye, a manera de ejemplo no limitativo, el producto de gen de longitud completa codificado por el gen correspondiente. Alternativamente, se puede definir como el polipéptido, precursor o proproteína codificado por una ORF descrita en la presente. La forma "madura" del producto surge, a manera de ejemplo no limitativo, como un resultado de una o más etapas de procesamiento que ocurre naturalmente que pueden tomar lugar dentro de las células (célula hospedera) en la cual se origina el producto de gen. Ejemplos de tales etapas de procesamiento que conducen a una forma "madura" de un polipéptido a una proteína incluyen la segmentación del residuo de metionina N-terminal (Met) codificado por el codón de iniciación de una ORF o la segmentación proteolítica de un péptido de señal o secuencia de guía. Así una forma madura que ¡surge de un polipéptido o proteína precursora que tiene los ¡residuos l a n, donde el residuo 1 es la metionina N-terminal, tendría residuos 2 hasta n que permanecen después de la remoción de la metionina N-terminal. Alternativamente, una ¡forma madura que surge de un polipéptido o proteína precursora que tienen residuos de 1 a n , en la cual una secuencia de señal N-terminal del residuo 1 a residuo Met es segmentada, tendría unos residuos del residuo Met+1 al residuo n restante. Además como se utiliza en la presente, una forma "madura" de un polipéptido proteína puede surgir de una rfiodificación post traduccional diferente de un evento de segmentación proteolítica. Tales procesos adicionales, incluyen a manera de ejemplo no limitativo, glicosilación, miristoilación, oligomerización o fosforilación. En general, un polipéptido de proteína madura puede resultar de la operación de solamente uno de estos procesos, o una combinación de cualquiera de estos. Un ácido nucleico de la invencién puede ser amplificada utilizando cDNA, mRNA o alternativamente, DNA genómico como una plantilla con cebadores de oligonucleótido i apropiados de acuerdo con las técnicas de amplificación de PCR estándares. Además, los oligonucleótidos correspondientes a la, SEQ ID Nos: 1-4 y 13-16 y porciones y combinaciones de las mismas se pueden preparar por técnicas sintéticas estándares, por ejemplo, utilizando un sintetizador de DNA automatizado . Polipéptidos La presente invención está basada en el descubrimiento sorprendente e inesperado de que la eficacia I i terapéutica de interleucina se puede aumentar al preacoplar o formar el complejo de interleucina a un receptor de intenleucina o porción soluble del mismo. En ciertas modalidades, la invención incluye métodos para formar un complejo de polipeptido terapéutico de la invención. En una modalidad, el método comprende proporcionar una cantidad adecuada de por lo menos un polipéptido de lmfocina o porcjón del mismo, proporciona una cantidad adecuada de por lo menos un polipeptido de receptor de linfocina o porción del rismo, mezclar los polipeptidos de linfocina y receptor de Unfocma bajo condiciones de pH y iónicas adecuadas para una duración suficiente para permitir la formación del complejo y opcionalmente concentrar o purificar el complejo. Los polipéptidos del complejo se pueden formar, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptido de acuerdo con métodos estándares; al expresar cada polipéptido o componentes por separado en una célula o extracto de células y luego al aislar y purificar el polipeptido. Opcionalmente, el complejo de pflipéptido terapéutico de la invención se puede formar al expresar tanto componente de polipéptido del complejo de la invención en la misma célula o extracto de células, y luego al aislar y purificar los complejos, por ejemplo, utilizando técnicas cromatográficas, tal como la cromatografía de afinidad con anticuerpos de la porción de lmfocina, la porción de receptor de linfocina o al complejo. Además, la invención incluye la expresión de una proteína de quimera o de fusión que comprende una interleucina, en la estructura y contijguas con un receptor de interleucina o porción del mismo. La Figura 12 demuestra que el complejo de la invención da por resultado una composición terapéutica que exhibe vida media más larga in vivo con relación a la administración de IL-15 sola. Así, en una modalidad preferida, el complejo del polipéptido terapéutico de la invención, comprende por lo menos un polipéptido de linfocina o porción del mismo, pre-acoplado o formado en complejo con por lo menos un receptor de linfocina, en donde el complejo demuestra una vida media in vi vo y eficacia más grande que IL-15 sola. En otra modalidad, el complejo demuestra una vida media in vivo de mayor que aproximadamente una hora. En un aspedto de esta modalidad el complejo terapéutico de la invención se forma de polipéptidos recombinantes expresados en una célula bacteriana o eucariótica o a través del uso de pépti'dos químicamente sintetizados. En ciertas modalidades, el polipéptido de linfocina o porción del mismo es un miembro seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 5, 6, 10, 12 y ' combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades, el polipéptido receptor de linfocina o porción del mismo es un miembro seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 7, 8, 9, 11 y combinaciones de las mismas. En otra modalidad, el compiejo terapéutico de la invención demuestra eficacia incrementada cuando se administra a un organismo en necesidad del mismo, comparado con el suministro de linfocina, por ejemplo, IL-15 o IL-2, sola. ' En otra de las modalidades preferidas, la invención se felaciona a un método para crear un complejo de polipéptido terapéutico preacoplado que comprende por lo menos una interleucina, por ejemplo IL-15, IL-2, porciones o i combinaciones de las mismas, pre-acoplada o formada en complejo con por lo menos un receptor de interleucina, por ejemflo, IL-15Ra, IL-2Ra, porciones o combinaciones de las mismas, generadas al incubar el polipéptido de interleucina con ?un dominio de receptor de interleucina soluble o al expresar una molécula de ácido nucleico quimérica novedosa que comprende el segmento de polinucleótido de linfocina y el segmento de polinucleótido de receptor de linfocina. En una i modalidad preferida, la invención proporciona un método para preaCoplar una linfocina y un receptor de linfocina que i comprende proporcionar una porción de linfocina, y una porción de --receptor de linfocina, y combinar una cantidad adecuada de tiempo bajo condiciones reguladas en pH iónicas para! permitir la formación del complejo. En una modalidad particularmente preferida, el polipéptido de linfocina se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5, 6, porciones o combinación de las mismas, y el polipéptido i receptor de linfocina se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 7, 8, porciones o combinaciones de la misma. En una modalidad, la invención incluye el método para formar el complejo que comprende proporcionar los componentes del polipéptido aislados resuspendidos en una solución reguladora, por ejemplo PBS, mezclar los polipéptidos e incubar de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 60 minutos en aproximadamente 26°C a aproximadamente 40°C. En una modalidad adicional, el polipéptido receptor de linfocina comprende una quimera de una porción de enlace de linfocina de una porciFn Fc de anticuerpo. En una modalidad preferida, SEQ ID NO: 6 o porciones de la misma, y SEQ ID nO: 8-molécula quimérica Fc son ambas suspendidas en PBS, mezcladas e incubadas de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 40 minutos en aproximadamente 35°C a aproximadamente 39°C. En otra modalidad, se proporcionan polipéptidos sustancialmente puros homólogos a la SEQ ID Nos: 5-12. Un "polipéptido sustancialmente puro" es un .polipéptido de interleucina o de receptor de interleucina, o porción del mismp que está separado de los componentes que naturalmente lo acompañan. Típicamente, el polipéptido sustancialmente puro; cuando es por lo menos 60% en peso, libre de las proteínas y moléculas orgánicas que ocurren naturalmente con las cuales está naturalmente asociado. De preferencia, la preparación es por lo menos 75%, más de preferencia por lo menos; 90%, y mucho más de preferencia por lo menos 99% en peso, de polipéptidos de interleucina y/o de receptor de interleucina. Un polinucleótido sustancialmente puro puede ser fbtenido, por ejemplo, mediante la extracción desde una fuentje natural (por ejemplo, una célula eucariótica); mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido; o al sintetizar químicamente la proteína. La pureza se puede medir mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, mediante la cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o mediante el análisis de HPLC. Los aminoácidos esenciales para la función de los polipéptidos de interleucina y de receptor de interleucina se puedfn identificar de acuerdo con los procedimientos I conocidos en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida al sitiF y la mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085, 1989; Bass y colaboradores Proel Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-4502, 1991). En esta últiína técnica, las mutaciones de alanina individuales se introducen en diferentes residuos en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se aprueban para la actividad biológica (por ejemplo, enlace de ligando y transducción de señal) para identificar residuos de aminoácidos que son críticos a la actividad- de la molécula. Los sitios de interacción de proteína de ligando también se puede determinar mediante el análisis de la estructura de cristal como es determinado por tales técnicas como la resonancia magnética nuclear, cristalografía o etiquetación de fotoafmidad . (Ver, por ejemplo, de Vos y colaboradores, I Scierjce 255:306-312, 1992; Smith y colaboradores, J. Mol Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver y colaboradores, FEBS Lett. 309:59-64, 1992). Las identidades de aminoácidos esenciales también pueden ser inferida del análisis de homología con proteínas relacionadas. Múltiples sustituciones de aminoácido se pueden hacer y probar utilizando métodos conocidos de mutagénesis y clasificación, tales como aquellos divulgados por Reidhaar-Olso y Sauer (Science 241:53-57,1988; o Bowie y Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989). Brevemente, estos autores divulgan métodos para aleatorizar simultáneamente dos o m^s porciones en un polipeptido, seleccionar para el polipéptido funcional y luego secuenciar los polipéptidos mutagenizados y enfermedades respecto de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden ser utilizados incluyen la exhibición de fago (por ejemplo, Lowm n y colaboradores, Biochem. 30:10832-10837, 1991; Ladner y colaboradores, patente norteamericana No. 5,223,409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204) y la mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire y colaboradores, Gene 46:145, 1986; Ner y colaboradores, DNA 7:127, 1988). Los métodos de mutagénesis como ! son divulgados en lo anterior se pueden combinar con métodos de clasificación de alto rendimiento para detectar la actividad de proteínas mutagenizadas, acumuladas en células hospederas. Las moléculas de DNA mutagenizadas que codifican proteínas activas o porciones de las mismas (por ejemplo, fragmentos de enlace de ligando) se puede recuperar de las células hospederas y rápidamente secuenciadas utilizando eguipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida. Utilizando los métodos discutidos en lo anterior, uno de habilidad ordinaria en la técnica puede preparar una variedad de polipéptidos que son sustancialmente homólogos a la SEQ ID NO: 5-12 o variantes alélicas de las mismas y retienen las propiedades de los polipéptidos de tipo silvestre. Como se expresa y se reclama en la presente el lenguaje, "un polipéptido como se define por la SEQ ID NO: 5-12" incluye todas las variantes alélicas y especies ortólogas del polipéptido. El término "polipéptido" como se utiliza en la presente, incluye secuencias modificadas tales como glicqproteínas, y se propone específicamente para cubrir polipéptidos o proteínas que ocurren naturalmente, así como aquellos que son recombinantemente o sintéticamente sintetizados, que ocurre en por lo menos dos diferentes conformaciones en donde ambas conformaciones tienen la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácido pero tienen diferentes estructuras tridimensionales. "Fragmentos" son una porción de una proteína que ocurre naturalmente. Los fragmentos pueden tener la misma o sustancialmente la misma i secuencia de aminoácidos como la proteína que ocurre naturalmente . La descripción también comprende proteínas que son funcionalmente equivalentes al producto de gen de interleucina y de receptor de interleucina, como es estimado por cualquiera de un número de criterios, incluyendo pero no limitjados al efecto biológico resultante, por ejemplo, un cambio en el fenotipo tal como proliferacién de células inmunes, cambios en la expresión de gen, por ejemplo, biomárcadores específicos que confirman la activación de las rutas; de señalización de IL-15 y/o IL-2. Tales proteínas funcijonalmente equivalentes incluyen adiciones o supresiones de iresiduos de aminoácidos dentro de la secuencia de 1 aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos descritas, pero que dan por resultado un cambio silencioso o "mutación conservativa", para producir de esta manera un producto funcionalmente equivalente. En el caso de secuencias I de pjolipéptido que son menor que 100% idénticas a una secuencia de referencia, las posiciones no idénticas son de preferencia, pero no necesariamente, sustituciones conservativas para la secuencia de referencia. De pref rencia, las sustituciones de aminoácidos conservativas se hacen de uno o mas residuos de aminoácidos no esenciales, predichos. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una 4n la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares son definidas dentro de la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas i (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acídicas (por ejemplo, acido aspartico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, sepna, treonina, tirosma, cisterna), I cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanita, valina, leucina, ísoleucma, prolina, fenilalanina, metionina, tpptofano) , cadenas laterales beta-ramificada (por ejemplo, i treo?ma, valma, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ¡ ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidma) .

Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en la proteína es reemplazado por otro residuo de aminoácido de la misp? familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra modalidad, las mutaciones se pueden introducir aleatoriamente a lo largo de o todo o parte de la secuencia de codificación, tal como mediante la mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden ser clasificados para actividad biológica para identificar mutantes que retienen la actividad. Después de la mutagenesis, la proteína codificada puede ser expresada por cualquier tecnología recombinante conocida en la técnica y se puede determinar la actividad de la proteina. Los polinucleótidos también pueden ser diseñados para proporcionar secuencias adicionales, tal como, por ejemplo, la adición o secuencias de codificación para los aminoácidos C-terminales o N-terminales adicionados gue facilitarían la purificación mediante el atrapamiento de columnas o uso de anticuerpos. Tales etiquetas incluyen, por ejemplo, las etiquetas ricas en histidma que permite la purificación de polipeptidos sobre columnas de Níquel. Tales técnicas de modificación de gen y secuencias adicionales adecuadas son bien conocidas en las técnicas de biología molecular . i En otra modalidad, la invención se relaciona a un complejo de péptido que comprende un polipéptido que tiene por lo menos 30% de homología a un miembro seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5, 6, 10, 12, porciones y combinaciones de las mismas, con un polipéptido que tiene por lo menos 30% de homología a un miembro seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs:7, 8, 9, 11, porciones y combinaciones de las mismas. En otra modalidad, la invención se relaciona a un complejo de péptido que comprende un polipéptido que tiene por lo menos 80% de homología a un miembro seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5, 6, 10, 12, porciones y combinaciones de las mismas, con un polibéptido que tiene por lo menos 80% de homología a un I miembro seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 7, 8, 9? 11, porciones y combinaciones de las mismas. En otra modalidad, la invención comprende un miembro seleccionado del grupo gue consiste de SEQ ID NOs: 5, 6, 10, 12, porciones y combinaciones de las mismas, acopladas o formadas en complejo con ún miembro seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID i NOs : " , 8, 9, 11, porciones y combinaciones de las mismas. La proliferaciFn celular, por ejemplo, proliferación de célula inmune, disminución en la carga o formación de tumor o incremento en la resistencia de tumor, son parámetros que pueden ser utilizados para evaluar la i eficacia del complejo de la invención. Será entendido por un experto en la técnica que existen muchos métodos para evaluar la capacidad proliferativa de células que son novedosas para i el uso en los métodos de la invención. Por ejemplo, las células pueden ser etiquetadas in vitro (o in vivo) con BrdU i parai determinar el por ciento de células divisorias o evaluado utilizando un ensayo de formación de colonia, como es descrito en Li y colaboradores, (1997), supra. La célula adecuada para el análisis de capacidad proliferativa incluye céluias cultivadas en cultivo de tejidos, células aisladas de un animal que se trataron con un compuesto de prueba, células que son parte de un animal vivo, o células que son parte de una s¡ección de tejido obtenida de un animal. I En más de una modalidad de los métodos de ensayo anterior de la invención, puede ser deseable inmovilizar ya sea la interleucina, receptor de interleucina, o el complejo i de ínterleucina/receptor de mterleucina para facilitar la sepafación de las formas formadas en complejo de las no formadas en complejo de las proteínas. En una modalidad, una proteína de fusión de interleucina o de receptor de interleucma se puede proporcionar lo que adiciona un dominio que permite que una onda de las proteínas sean enlazadas a una fnatpz. Por ejemplo, las proteínas de fusión de GST o protfínas de fusión de objetivo de GST se pueden absorber sobre cuentas de glutationa sefarosa (Sigma Chemical, St. Louif, Mo.) o placas microtítulo derivadas de glutationa, y la pjiezcla de inter.leucina y receptor de interleucina se incuba bajo condiciones conducentes a formación de complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sal y pH) . Después de la incubación, las cuentas o cavidades de placa de micrftítulo se lavan para remover cualquiera de los componentes no enlazados, la matriz inmovilizada en el caso de cuentas, y la cantidad de complejo determinada ya sea directamente o indirectamente. Alternativamente, los complejos se pueden disasociar de la matriz, y la cantidad o actividad determinada utilizando técnicas estándares. Otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices también pueden ser utilizadas en la invención. Por ejemplo, cualquiera de las proteínas puede ser inmovilizada utilizando la conjugacién de biotina y estreptavidina. Las I moléqulas de proteína biotiniladas se pueden preparar a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida ) utilizando técnicas bien conocidas dentro del arte (por ejemplo, equipo i de Iiotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, 111.), e inmovilizadas en las cavidades de placas de 96 cavidades I recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, los anticuerpos reactivos con los polipéptidos de interleucina o de receptor de interleucina, pero | que no interfieren con el enlace, se pueden derivar a las Favidades de la placa, y los complejos de proteína atrapados en las cavidades mediante la conjugación de anticuerpo. Los métodos para detectar tales complejos además de aquellos descritos en lo anterior para los complejos inmovilizados por GST, incluyen inmunodetección de complejos utilizando anticuerpos, reactivos con los polipéptidos de intefleucina o de receptor de interleucina, así como ensayos enlajados a enzima que dependen de la detección de una actividad enzimática asociada con los polipéptidos de intefleucina o de receptor de interleucina. , Otra modalidad preferida se relaciona a métodos para , modular, inhibir o aumentar una respuesta inmune que comp?ende administrar una cantidad efectiva del complejo de polipjéptido terapéutico de la invención a un individuo. Otros I aspecjtos de este método incluyen la administración de una cantidad efectiva del complejo de polipéptido terapéutico en combinación con por lo menos un excipiente, adyuvante, agente biológicamente activo, farmacéuticamente aceptable, o una combinación de los mismos. En otra modalidad la invención proporciona un método para aumentar la inmunidad de un organismo en necesidad del mismo mediante la administración de un complejo o prf-acoplado de una linfocina y receptor de linfocina que demu stra una vida media in vivo sustancialmente más larga, y efic cia sustancialmente más grande que la linfocina sola. Además, esta modalidad también incluye un método para inducir la ptoliferacién homeostática de células inmunes responsivas de linfocina, por ejemplo, células T, células B, células NK o los similares. En ciertas de las modalidades preferidas, la presente modalidad incluye el uso de una molécula de receptor de linfocina que contiene un fragmento Fc de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, una construcción IL-15Ra-Fc es comercialmente disponible de R&D Systems (Minneapolis, MN) . Adicionalmente, será reconocido por uno de* habilidad ordinaria en la técnica que el dominio de receptor de linfocina del complejo de la invención opcionalmente puede tenerj el fragmento Fc de inmunoglobulina removido. En otra modalidad, la presente invención incluye un método para aplicar el complejo como un adyuvante para incrementar las respuestas inmunes a cáncer, infección o para aumerjtar la vacunación de cualquier clase. En un aspecto de esta ¡ modalidad el complejo de la invención se utiliza para aumentar la reconstitución del sistema inmune después del tran^plante de médula ósea, células madre o en casos de inmuriodeficiencia tal como SIDA. La presente invención I también incluye un método para usar el complejo de la I I invención para ayudar en el crecimiento de linfocitos in vi tr que luego pueden ser utilizados para la inmunoterapia adoptiva que comprende proporcionar un paciente; remover un volumen de sangre del paciente y aislar los linfocitos del pacifnte; tratar los linfocitos con una cantidad efectiva del complejo de la invención; y administrar los linfocitos trat dos nuevamente al paciente. En todavía • otras modalidades preferidas, la invención incluye un método para utilizar el complejo modificado para ser utilizado con antagonistas de la actividad de linfocina, por 'ejemplo, IL-15. Por ejemplo, a través de modificaciones de secuencia de una linfocina o receptor de linfocina, por ejemplo, IL-15 o IL-15Ra, el complejo combinado se. podría transformar como un inhibidor de la actividad de linfocina in vi vo . Tal molécula podría tener efectos terapéuticos potenciales en inhibir la autoinmunidad, rechazo de transplante o la enfermedad de injerto contra I hospqdero . En cualquiera de las modalidades preferidas, cualcjuiera de las formas recombinantes posibles de la molécula de complejo de linfocina/receptor de linfocina son contempladas. Por ejemplo, una molécula de polipéptido de i cadera individual producida de una construcción genética que contiene el gen linfocina, por ejemplo, IL-2, IL-15, porciones o combinaciones de las mismas, fusionadas al gen de receptor de linfocina, por ejemplo, IL-2Ra, IL-15Ra, porciones o combinaciones de las mismas y opcionalmente la porcién Fc de un anticuerpo. En ciertas modalidades la construcción genética puede además incluir una o más secuencias de ácido nucleico que codifica polipéptidos enla adores. Además de servir para aliviar las restricciones esféricas o conformacionales en el complejo, es concebible que la secuencia enlazadora podría impartir otras cualidades, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de nucleasa, una secuencia de reconocimiento de proteasa, un dominio t fotofreactivo, un dominio ,h.idrofóbico, dominio hidrofílico, un dominio activo, función enzimática, un sitio para la modificación o conjugación química, purificación o los similares. En modalidades adicionales, la invención propprciona moléculas quiméricas comprendidas de por lo menos un gen de linfocina y por lo menos un gen receptor de linfo|cina ligado en tándem tal que permitirá la expresión de formajs multiméricas del complejo, por ejemplo, dímeros, trímeros y los similares. Estas proteínas también pueden ser producidas en células eucarióticas o procariFticas . Proteínas Quiméricas y de Fusión Como es descrito supra, la invención también proporciona proteínas quiméricas o de fusión. Como se utiliza i en la presente, una "proteína quimérica" o "proteína de ! fusión" comprende un polipéptido operativamente enlazado a i otro polipéptido, por ejemplo, uno o más de los polipéptidos seleccionados de la SEQ ID NOs: 5-12, o porciones de las mismas. Mientras que los polipéptidos seleccionados de la SEQ ID Nfs:5-12 incluyen pplipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con por lo menos 30% de homología. Dentro de la protéína de fusión del polipéptido puede corresponder a toda una porción del polipéptido seleccionado de la SEQ ID NOs: 5-12. En una modalidad, la proteína de fusión comprende por lo menos una porción biológicamente activa de la proteína. En otra modalidad, la proteína de fusión comprende por lo menos dos porciones biológicamente activas de por lo menos una proteína seleccionada de la S.EQ ID NOs: 5-12. En todavía otra modalidad, la proteína de fusión comprende por lo menos tres porciones biológicamente activas de por lo menos una proteína seleccionada de la SEQ ID NOs: 5-12. Dentro de la proteína de fusióh, el término "operativamente enlazado" se propone para indicar que los polipéptidos discretos son fusionados en la estructura con otro del N-terminal o C-terminal. En más de una modalidad de los métodos de ensayo anteriores, puede ser deseable inmovilizar los polipéptidos quiméjricos de la invención para facilitar la separación de las óroteínas. En una modalidad, una proteína de fusión se puede, proporcionar la cual ayuda a un dominio que permite que las proteínas enlazadas a una matriz. Por ejemplo, las protejínas de fusión de glutationa-S-transferasa o conjugación de biotina y estreptavidina. En una modalidad, la proteína de fusión es una protejína de fusión GST 'en la cual las secuencias de polipléptido se fusionan en la C-terminal o N-terminal de las secuencias de GST (glutationa S-transferasa) . En otra i modalidad, la proteína de fusión contiene una secuencia de señal heteróloga • en su N-terminal . En ciertas células hospederas (por ejemplo células hospederas mamíferas) la expresión y/o secreción se pueden incrementar a través del uso de una secuencia de señal heteróloga. En todavía otra modalidad, la proteína de fusión es la proteína de fusión de inmurioglobulina en la cual los polipéptidos o el complejo de I polipféptido de la invención se fusiona a secuencias derivadas de uiji miembro de la familia de proteínas de inmunoglobulina. En uha modalidad, las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención se puede incorporar en composiciones farmacéuticas y administrada en un sujeto para modular la inter cción entre un ligando y una proteína sobre la superficie de una célula. Las proteínas de fusión de inmunjoglobulina se pueden utilizar para efectuar la biodi¡sponibilidad de un ligando cognado. La inhibición de la I interjacción de ligando puede ser útil terapéuticamente para tanto! el tratamiento de desórdenes proliferativos y diferenciativos, así como la modulación (por ejemplo, I promoción o inhibición) de la supervivencia de la célula. Por i otra parte, la proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención se puede utilizar como inmunógenos para producir anticuerpos en un sujeto, para purificar ligandos y en ensaybs de clasificación para identificar moléculas gue inhiben la interacción. ; Una proteína quimérica o de fusión de la invención se pjuede producir mediante técnicas de DNA recombinantes estándares. Por ejemplo, los fragmentos de DNA que codifican las , secuencias de polipéptido diferentes son ligadas conjuntamente en la estructura de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, al emplear las terminaciones de extremo despuntado o de extremo de etapa para ligación, digestión de enzima de restricción para proporcionar terminales apropiadas, relleno de extremo cohesivo como sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la I uniónl indeseable y ligación enzimatica. En otra modalidad, el gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales que | incluyen sintetizadores de DNA automatizadas. i I Alternativamente, la amplificación de PCR de los fragmentos de geh se pueden llevar a cabo utilizando cebadores fijadores que dan origen a colgamientos complementarios entre dos fragmentos de gen consecutivos que pueden ser consecuentemente recocidos y reamplificados para generar una secuencia de gen quimérico (ver, por ejemplo, Ausubel, y colaboradores, (eds ) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, i John Wiley & Sons, 1992) . Por otra parte, muchos vectores de i expresión son comercialmente disponibles que ya codifica una porción de fusión (por ejemplo un polipeptido GST) . Uno o más de SÉQ ID NOs: 1-4, y 13-16 se pueden clonar en tal vector de expresión tal que la porción de fusión se enlaza en la estructura de polipeptido deseado. Anticuerpos El termino "anticuerpo" como se utiliza en la presente se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de moléculas de ?nmu?¡oglobul?na (Ig), es decir, moléculas que contiene un sitió de enlace de antigeno específicamente enlaza (inmunorreacciona con) un antigeno, que comprende por lo menofe una, y de preferencia dos, regiones variables de cadena pesada (H) (abreviado en la presente como VH) , y por lo menos una y? de preferencia dos regiones variables de cadena ligera (L) (abreviada en la presente como VL) . Tales anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, policlonales, monocfLonales, quiméricos, de cadena individual, Fab, Fab' y fragmentos F(ab')2 y una librería de expresión Fab. Las regio¡nes VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas "regiones de deter¡minación de complementariedad" ("CDR") interdispersadas que son más conservadas, llamadas "regiones de FR) . El grado de la región de estructura y CDR's inido precisamente (ver, Kabat, E.A., y colaboradores, (1991) Sequences of Proteins of Immunological i Inteifest, Fifth Edition, U.S. Department of Health y Human Services, NIH Publication No. 91-3242, y Chothia, C. y colaboradores, (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, que son incorporadas en la presente por referencia) . Cada VH y VL está | compuesto de 'tres CDR's y cuatro FRs, arreglados del aminf Terminal a carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDRl; FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de humanos se relaciona a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA5 IgE y IgD, que difieren entre sí por ' la naturaleza de la cadena pesada presente en la molétula. Ciertas clases tienen subclases también, tal como IgGi; IgG2, y otras. Además, en humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda. La referencia en la, presente a anticuerpos incluye una referencia a todas de tales clases, subclases y tipos de especies de anticuerpos humanos . Los anticuerpos se pueden preparar del polipéptido intacto o fragmentos que contienen péptidos de interés como el agente inmunizante. Un fragmento de polipéptido antigénico I preferido es de 15-100 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NOs: 5-12. En una modalidad, el péptido se localiza en un dominlio no de transmembrana del polipéptido, por ejemplo, en un dbminio extracelular o intracelular. Un anticuerpo o fragr?ento de anticuerpo ejemplar enlaza un epítope que es acceslible de los medios extracelulares y que altera la funcionalidad de la proteína. En ciertas modalidades, la presente invencién comprende anticuerpos que reconocen y son específicos para uno o más epítopes de cualquiera de la SEQ ID N0s: 5-12, variantes, porciones y/o combinaciones de las mismas. En otras modalidades, los anticuerpos de la invención pueden ser específicos para el complejo de interleucina/receptor de interleucina mismo. En todavía otras modalidades un anticuerpo específico para una iterleucina puede funcionar como el "receptor de interleucina" - es decir, que funciona en un mecanismo de transpresentación similar a aquel observado con un complejo que involucra la porción soluble de los polipéptidos de receptor de interleucina, es decir, IL-15Ra y/o IL-2Ra. En modalidades alternativas los anticuerpos de la invención pueden dirigirse e interferir con la interacción de interleucina/receptor de interleucina para inhibir la señalización de interleucina . ! La preparación de anticuerpos policlonales es bien i conocida en la técnica de biología molecular; ver, por ejemplo, Production of Polyclonal Antisera m Immunochemical Processes (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992) y Colidan y colaboradores, Production of Polyclonal Antisera ín Rabbits, Rats, Mice y Hamsters ín Current Protocols ín Immurology, section 2.4.1 (1992). La preparación de antiquerpos monodlonales también es bien conocido en la i tecnijca; ver, por ejemplo, Harlow y colaboradores, Antirjodies: A Laboratory Manual, page 726 (Cold Spring Harbor Pub. ¡1988) . , Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener al myedtar ratones o conejos con una composición que comprende un antígeno, al verificar la presencia de la producción de anticuerpo al remover un muestra de suero, al remover el bazo i para obtener linfocitos B, fusionar los lmfocitos con i células de mieloma para producir hibridomas, clonar los h?bp,domas, seleccionar clones positivos que producen i antiauerpos al antigeno, y aislar los anticuerpos de los cultivos de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar de cultivos de hibridoma mediante técnicas bien ¡conocidas en el arte.

¡ En otras modalidades, el anticuerpo puede ser recombinantemente producido, por ejemplo, producido mediante la exhibición de fago o mediante métodos combinatorios. La exhibición de fago y métodos combinatorios se pueden utilizar para aislar anticuerpos recombinantes que enlazan a SEQ ID NOs: -12 o fragmentos de las mismas (como es descrito en, por ejemplo, Ladner y colaboradores, patente norteamericana No. 5,223¡,409; Kang y colaboradores, publicación Internacional No. i WO 92/18619; Dower y colaboradores, International Publication No. WO 91/17271; Winter y colaboradores, I International Publication WO 92/20791 ; Markland y colaboradores, International Publication No. WO 92/15679; Breitjling y colaboradores, International Publication WO 93/01J288; McCafferty y colaboradores, International Publication No. WO 9'2/01047; Garrard y colaboradores, Interjnational Publication No. WO 92/09690; Ladner y colaboradores, International Publication No. WO 90/02809; Fuchá y colaboradores, (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay I y colaboradores, (.1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse y colaboradores, (1989) Science 246:1275-1281; Griffths y i colaboradores, (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins y colaboradores, (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson y colaboradores^ (1991) Nature 352:624-628; Gram y colaboradores, (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad y colaboradores, (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom y colaboradores, (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas y colaboradores, (1991) PNAS 88:7978-7982). ¡ Los anticuerpos monoclonales humanos también se pueden generar utilizando ratones transgénicos que llevan los genes de inmunoglobulina humana antes que el sistema de ratór.. Los esplenocitos de estos ratones transgénicos i inmunizados con el antígeno de interés se utilizan para producir hibridomas que secretan mAbs humanos con afinidades específicas de epítopes de una proteína humana (ver, por ejemplo, Wood y colaboradores, solicitud internacional WO 91/00906, Kucherlapati y colaboradores, publicación de PCT WO 91/1Q741; Lonberg y colaboradores, solicitud internacional WO 92/03918; Kay y colaboradores, solicitud internacional 92/0^917; Lonberg, N. y colaboradores, 1994 Nature 368:856- 859; Green, L. L. y colaboradores, 1994 Nature Genet. 7:13-21; orrison, S. L. y colaboradores, 1994 Proc. Natl. Acad.

Sci. ¡USA 81:6851-6855; Bruggeman y colaboradores, 1993 Year i Immuriol 7 : 33-40 ;' Tuaillon y colaboradores, 1993 PNAS 90:3720- 3724; Bruggeman y colaboradores, 1991 Eur J Immunol 21:1323- ¡ Un anticuerpo terapéuticamente útil a los componentes del complejo de la invención o el complejo mismo I se puede derivar de un anticuerpo monoc-lonal "humanizado".

Los ¡anticuerpos monFclonales humanizados se producen al transferir regiones de determinación de complementariedad de ratón de cadenas variables pesada y ligera de la inmur oglobulma de ratón en un dominio de variable humano, luegq al sustituir los residuos humanos y las regiones de estructura de las contrapartes de mupno. El uso de comppnentes de anticuerpo derivados de anticuerpos monodlonales humanizados evita los problemas potenciales 1 asociados con inmunogenicidad de regiones constantes de murino. Las técnicas para producir anticuerpo monoclonales humanizados se pueden encontrar en Jones y colaboradores, Nature 321: 522, 1986 y Singer y colaboradores, J. Immunol . 150: 2844, 1993. Los anticuerpos también pueden ser derivados de fragmentos de anticuerpos humanos aislados de una librería de una inmunoglobulina combinatoria; ver, por ejemplo, Barbas y colaboradores, Methods: A Companion to Methods ín t Enzymology 2, 119, 1991. Además, los anticuerpos quiméricos se pueden obtener al empalmar los genes de una molécula de anticuerpo de ratón con especificidad de antígeno apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humana de especificidad b?olq>g?ca apropiada; ver, por ejemplo, Takeda y colaboradores, Nature 314: 544-546, 1985. Un anticuerpo guimérico es uno en el cual se derivan diferentes porciones de diferentes especies de animales. La tecnología anti-idiotipo se podría utilizar para producir anticuerpos monoclonales que imitan un epítope. Un antiduerpo monoclonal anti-idiotípico hecho a un primer anticuerpo monoclonal tendrá un dominio de enlace en la región intervariable que es la "imagen" del epítope enlazado i del , primer anticuerpo monoclonal. Alternativamente, las técnicas utilizadas para producir anticuerpos de cadena individual se puede utilizar para producir anticuerpos de caderja individual. Los anticuerpos de cadena individual se forman al enlazar los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv por la vía de un puente de aminoácido, que da por ¡resultado un polipeptido de cadena individual. Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopes específicos, por ejemplo, epítopes extracelulares, se pueden generar por técnicas bien conocidas en. el. arte. Tales fragmentos incluyen fragmentos Fab producidos mediante la digestión proteolítica, y los fragmentos Fab generados al reducir los puentes de disulfuro. Cuando se utiliza para inmunoterapia, los antiOuerpos monoclonales, fragmentos de los mismos, o ambos pueden ser no etiquetados o etiquetados con un agente terapéutico. Estos agentes se pueden acoplar directamente o indirectamente al anticuerpo monoclonal mediante técnicas bien conocidas en el arte, e incluyen tales agentes como fárm co, radioisótopos, lectinas y toxinas. Los' intervalos de dosificación para la administración de anticuerpos monoclonales son bastante grandes para producir el efecto deseado, y variarán con la edad, condición, peso, sexo, edad y el grado de la condición a sef tratada, y fácilmente pueden ser determinadas por un experjto en la técnica. Las dosificaciones pueden ser de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 2000 mg/kg. Los anticjuerpos monoclonales pueden ser administrados intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente y/o subcutáneamente. ¡ En ciertas modalidades de la invención, por lo menos! un epítope abarcado por el epítope antigénico es una i región de la SEQ ID NOs: 5-12 que está localizado sobre la I superficie de la proteína, por ejemplo una región hidrqfílica. Un análisis de. *hidrofobicidad de la secuencia de proteína indicará qué regiones de un polipéptido son particularmente hidrofílicas y, por lo tanto, son probables I de codificar los residuos de superficie útiles para dirigir i la producción de anticuerpo. En un medio para dirigir la producción de anticuerpo, gráficas de hidropatía que muestran regiones de hidrofilicidad e hidrofobicidad se pueden generar mediante cualquier método bien conocido en la técnica, ! incluyendo, por ejemplo, en |,os métodos de Kyte Doolittle o de Hppp Woods, ya sea con © sin transformación de Fourier. Ver, I por ejemplo, Hopp y Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci.

USA 8: 3824-3828; Kyte y Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: \ 105-142, cada una incorporada en la presente por referencia en sij totalidad. Los anticuerpos que son específicos para uno o más dominios dentro de una proteína antigénica, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos, también se proporcionan en la presente. Una proteína de la invención, o un derivado, fragmento, análogo, homólogo u ortólogo de la misma, se puede utilizar como un inmunógeno en la generación de anticuerpos que enlazan inmurioespecíticamente estos componentes de proteína. ¡ Anticuerpos Humanos- 1 Los anticuerpos completamente humanos esencialmente I se relacionan a moléculas de anticuerpo en las cuales la secuencia completa de tanto la cadena ligera como la cadena pesada incluyendo los CDRs, surgen de genes humanos. Tales anticuerpos son llamados "anticuerpos humanos", o "anticuerpos completamente humanos" en la presente. Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar mediante la técnica de trioma; la técnica de hibridroma de célula B humana (ver Kozbor, y colaboradores, 1983 Immunol Today 4:72) y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (ver Colé, y colaboradores, 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES y CÁNCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. ¡77-96). Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden utilizar en la práctica de la presente invención y se pueden prod cir al utilizar hibridomas humanos. (ver, Cote, y colaboradores, 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030) o al tiansformar células B humanas con el Virus Barr de Epstein in vitro (ver, Colé, y colaboradores, 1985 In: MONOCLONAL ANTIEÍODIES y CÁNCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

I Además, los anticuerpos humanos también se pueden producir utilizando técnicas adicionales, incluyendo librerías de exhibición de fago (Hoogenboom y Winter, J. Mol. BiolJ 227:381 (1991); Marks y colaboradores, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). De manera similar, los anticuerpos humanos se pueden hacer al introducir sitios de inmunoglobulina humarla en animales transgénicos, por ejemplo ratones en los i cuales los genes de inmunoglobulina endógenos han sido parcialmente o completamente inactivados. En la estimulación, la producción de anticuerpo humana se observa, estrechamente se asemeja a lo que se observa en humanos en todos los ¡ aspectos incluyendo el rearreglo de gen, ensamble y repertorio de anticuerpo. Este procedimiento es descrito, por I ejemblo, en las patentes norteamericanas Nos. 5,545,807; ,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en Mark$ y colaboradores, (Bio/Technology 10, 779-783 (1992)); Lonbérg y colaboradores, (Nature 368 856-859 (1994)); Morrison (Nature 368, 812-13 (1994)); Fishwild y colaboradores (Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)); Neub rger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996)); y Lonberg y Husz (Intern. Rev. Im unol . 13 65-93 (1995)). Los anticuerpos humanos adicionales se pueden producir utilizando animales no humanos transgénicos que son modificados para producir anticuerpos completamente humanos i anteg que los anticuerpos endógenos de animales en respuesta a la ¡ estimulación por un antígeno (Ver la publicación de PCT i WO94/Í02602 ) . Los genes endógenos que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera en el hospedero no humano se i han incapacitado, y sitios activos que codifican las inmu oglobulinas de cadena pesada y ligera humanas insertar el genoma del hospedero. Los genes humanos se incorporan, por ejemplo, utilizando cromosomas artificiales de levadura que contienen los segmentos de DNA humanos necesarios. Un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas luego se obtiene como progenie al reproducir cruzadamente animales transgénicos intermedios que contienen menor que el complemento completo de las modificaciones. Las modalidades i preferidas de tal animal no humano es un ratón y es llamado el Xbnomouse™ como es divulgado en las publicaciones de PCT i WO 96/33735 y WO 96/34096. Este animal produce células B que secretan inmunoglobulinas completamente humanas. Los anticuerpos pueden ser obtenidos directamente del animal después de la inmunización de un inmunógeno de interés, como, por ¡ejemplo una preparación de un anticuerpo policlonal, o alternativamente de células B inmortalizadas derivadas del animal, tales como hibrido as que producen anticuerpos monoclonales. 'Adicionalmente, los genes que codifican las inmuhoglobulinas con regiones variables humanas se pueden recuperar y expresar para obtener los anticuerpos direftamente, o se pueden modificar adicionalmente para obterjer análogos de anticuerpo tales como, por ejemplo, moléculas Fv de cadena individual. Fragmentos Fab y Anticuerpos de Cadena Individual De acuerdo con la invención, las técnicas se pueden adaptfar para la producción de anticuerpos de cadena individual específica sobre una proteína antigénica de la invertcién (ver por ejemplo, la patente norteamericana No. 4,946,778) . Además, los métodos se pueden adaptar para la construcción de librerías de expresión Fab (ver por ejemplo, Huse,! y colaboradores, 1989 Science 246: 1275-1281) para permitir la identificación rápida y efectiva de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para una protéína o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de la misma. Los fragmentos de anticuerpo que contienen idiotipos a un antígeno de proteí-na se puede producir por técnicas conocidas en el arte que incluyen, pero no limitado a: (i) un fragmento F(ab')2 producido mediante la digestión de pepsina de una molécula de anticuerpo; (ii)un fragmento Fab generado al reducir los puentes de disulfuro de un fragmento F(ab')2; (iii) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente de reducción y (iv) fragmentos Fv. ' Anticuerpos Biespecíficos i Los anticuerpos biespecíficos y monoclonales, de prefejrencia humanos o humanizados, anticuerpos que tienen I especificidad de enlace de por lo menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de enlace es- para una proteína antigénica de la invención. El i segundo objetivo de enlace -es cualquier otro antígeno, y ¡ ventajosamente es una proteína de superficie de célula o I receptor o subunidad de receptor. I Los métodos para hacer anticuerpos biespecíficos ¡ son Conocidas en la técnica. Tradicionalmente, la producción ¡ recoi?binante de anticuerpos biespecíficos está basada sobre la cf-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de ihmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferjentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305:5)37-539 (1983)). Debido a la clasificación aleatoria de i las ¡cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadrotas) produce una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpo, de la cual solamente una tien^ la estructura bioespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta es usualmente realizada por etapas de cromatografía por afinidad., Los procedimientos similares son divulgados en WO 93/08829,. publicada el 13 de Mayo de 1993, y en Traunecker y colaboradores, EMBO J. , 10:3655-3659 (1991). Los dominios variables de anticuerpo con espedificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de antiduerpos-antígenos) se pueden fusionar a las secuencias de domiriio constante de inmunoglobulina. La fusión de preferencia es con un dominio constante de cadena pesada a inmurioglobulina que tiene por lo menos parte de las regiones Se prefiere tener la primera regicjn constante de cadena pesada (CHl) que contiene el sitio necesjario para el enlace de cadena ligera presente en por lo menos' una de las fusiones. Los DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada , inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en los vectores de expresión separados, y se co-transfectan en un organismo hospedero adecuado. Para detalles adicionales de generación de anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo, Suresh y colaboradores, Methods in Enzymology, 121:210 (1986). De acuerdo con Otro procedimiento descrito en WO 96/21011, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo se puede diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímero que son recuperados del cultivo de célula recombinante. La interfase preferida comprende por lo menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, uno o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas desde la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) granee se crean sobre la interfase de la segunda molécula de anticuerpo a reemplazar las cadenas laterales de aminoácido grandes con unas pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto 'proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre los productos de extremo indeseados tales como homodímeros. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como , anticuerpos de longitud completa o fragmentos de antifuerpo (por ejemplo anticuerpo biespecífico F(ab')2). Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de fragmentos de anticuerpo se han descrito en la literatura. Por ejemplo, antifuerpos biespecíficos se pueden preparar utilizando el enlace químico. Brennan y- colaboradores, Science 229:81 (198p) describe un procedimiento donde los anticuerpos intaftos son segmentados proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la pres ncia del agente de formación de complejo de ditiol arsénico de sodio para estabilizar los ditioles vecinales y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los i f fragmentos Fab' generados luego se pueden convertir a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab' -TNB luego se reconvierte a Fab' -tiol mediante la redupción de mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Adicionalmente, los fragmentos Fab' se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby y colaboradores, J.

Exp. ' Med. 175:217-225 (1992) describe la producción de una moléfula de anticuerpo F(ab')2 y específica completamente humanizada. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. i coli I y se sometió al acoplamiento guímico dirigido in Vitro paral formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo I biespecífico así formado fue capaz de enlazar a células que sobrfexprésan los receptores ErbB2 y células T humanas normales, así como activar la actividad lítica de los linffcitos citotFxicos humanos contra objetivos de tumor de seno humano. Varias técnicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente del cultivo de célula recombinante también se han descrito. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando cremalleras de leucina. Kostelny y colaboradores, J. Immunol . 148 (¡5) :1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leuc[Lna de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dps anticuerpos diferentes mediante la fusijón de gen. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la fegión de articulación para formar monómeros y luego se reoxidaron para formar heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede ser utilizado para la producción de hetertodímero de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado mecanismo alternativo para hacer fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprende un dominio invariable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado cortf para permitir emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente los dominios VH y VL de un fragmento se hacen emparejar con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, para de esta manera formar dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv de cadena individual (sFv) también se ha i reportado. Ver, Gruber y colaboradores, J. Immunol. 152:5368 (1994) . Los anticuerpos con más de dos valencias son contemplados. Por ejemplo, los anticuerpos triespecíficos puedfn ser preparados. Tutt y colaboradores, J. Immunol . 147:60 (1991) . Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden enlafar a dos diferentes epítopes, por lo menos uno del cual se Origina el antígeno en la proteína de la invención. Alternativamente, un brazo anti-antigénico de una molécula de inmurJoglobulina se puede combinar con un brazo que enlaza una moléqula de activación sobre un linfocito tal como una molécula de receptor de célula T (por ejemplo CD2, CD3, CD28, o B7), o receptores Fc parra IgG (FcgammaR), tal como FcgartimaRI (CD654)m FcgammaRII (CD32) y FcgammaRIII (CD16) en cuanto a un enfoque de mecanismos de defensa celular a la célula que expresa el antígeno particular. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para dirigir agentes citotlóxicos a células que expresan un antígeno particular.

Estoq anticuerpos poseen un rastro de enlace de antígeno y un brazo que enlaza un agente citotóxico o un quemador de radionúclido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. , Anticuerpos Heteroconjugados i Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteifoconjugados están compuestos de los anticuerpos covalentemente unidos. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir las células del sistema inmune a células indeseadas (patente norteamericana No. 4,676,980), y para ¡ el tratamiento de la infección de HIV (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089) . Se contempla que los anticuerpos se pueden preparar in vitro utilizando métodos conocidos en la química de proteína sintética, incluyendo aquellos que involucran agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmuriotoxinas se pueden controlar utilizando una reacción de intercambio de disulfuro al formar un enlace de tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen y aquellos eamericana No.

La invención también pertenece a inmunoconjugados que ¡ comprenden un anticuerpo conjugado como un agente citottóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fangal, de plantas o de animales, o fragmentos de la misma) o un isótopo radioactivo (es decir, un radifconjugado) . Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se hacen utilizando una variedad de agentes de acopiamiento de proteína bifuncionales tales como propionato i de ¡N-succimidil-3- (2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano i (IT) ; derivados bifuncionales de imidoéteres (tal como adipimidato de dimetilo HCL) , esteres activos (tal como sube ato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tal como bis(p-azidpbenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazono (tal como' bis- (p-diazoniumbezoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tal como folien 2 , 6-diisocianato) y compuestos de fluorina bis-activa (tal como 1, 5-difluoro-1 , 4-dimitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina ricina se puede preparar como es descrito en Vitetta y colaboradores, Science, 238:1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilen j triarriinepentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radipnucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026. En otra modalidad, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" para la utilización en la predi.lección del tumor en donde el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la remoción del ¡conjugado no enlazado, de la circulación utilizando un agente de evacuación y luego la administración de un "ligando" que es a su vez conjugado a un agente citotóxico. : Inmunoliposomas Los anticuerpos divulgados en la presente también se pueden formular como inmunoliposomas. Las liposomas que contienen el anticuerpo se' preparan por métodos conocidos en la técnica, tal como descrito en Epstein . y colaboradores, Proci Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang y I colaboradores, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); y I pate tes norteamericanas. Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Los lipo?omas con tiempo de circulación aumentado se divulgan en la pftente norteamericana No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles se pueden gene ar mediante el método de evaporación de fase inversa con un fomposición de lípido que comprende fosfatidilcolina, coles¡terol y fosfatidiletanolamina PEG-derivado (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de Chem. 257:286- 288 i (1982) de intercambio de disulfuro. Un agente I qimióterapéutico (tal como Doxorubicina) es opcionalmente contenido dentro del liposoma. Ver Gabizon y colaboradores, J. Nacional Cáncer Inst., 81(19) :1484 (1989). Una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invencién se relaciona generalmente a la I cantidad necesaria para lograr un objetivo terapéutico. Como se mencionó en lo anterior, esta puede ser una interacción de i enlacpe entre el anticuerpo y su antígeno objetivo con que, en ciertos casos interfiere con el funcionamiento del objetivo, y eq otros casos, promueve una respuesta fisiológica. La cantidad requerida a ser administrada además dependerá de la i afinidad de enlace del. anticuerpo para su antígeno específico, y también dependerá de la proporción en la cual un anticuerpo administrado se agota del volumen libre de otro sujeto al cual se administra. Los intervalos comunes para la dosificación terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención, puede ser, a manera de ejemplo no limitativo, • de aproximadamente 0.1 mg/kg de peso1 del cuerpo a aproximadamente 50 mg/kg de peso del cuerpo. Las frecuencias de dosificación comunes pueden variar, por ejemplo, dos veces al día a una vez a la semana. , Los anticuerpos que específicamente enlazan a una i protéína de la invención, así como otras moléculas identificadas por los ensayos de clasificación divulgados en la presente, se pueden administrar para el tratamiento de variqs desórdenes en la forma de composiciones farmacéuticas. Los principios y consideraciones involucradas en la prepa'racién de tales composiciones, así como la guía de la seleqción de componentes son proporcionados, por ejemplo, en Remirtgton: The Science y Practice Of Pharmacy 19th ed.

(Alfonso R. Gennaro, y colaboradores, editors) Mack Pub. Co., Eastqn, Pa . : 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possíbilities, Limitations, y Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa . , 1994; y Peptide y Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York. Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidróximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato) , respectivamente, en • sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanopápsulas ) o en mácroemulsiones . Las formulaciones a ser utilizadas para la administración in vivo deben ser estéfües. Esto es fácilmente realizado por filtración a travéjs de membranas de administración estériles. | Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostfnida que incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrcfóbicos sólidos que contiene el anticuerpo, las matrices que están en la forma de artículos conformados, por ejemplo, ¡ pelídulas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (vinilalcohol) ) , poliljacturos (patente 'norteamericana No. 3,773,919), polímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctíco-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (micrjoesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) t ácido poli^D- (-) -3-hidroxibutírico . Mientras que los polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y el ácido láctico-ácido glicqlico permite la liberación de moléculas por durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por períodos de tiempjo más cortos. i i Ensayo de ELISA ¡ Un agente para detectar una proteína de analito es un a ticuerpo capaz de enlazar una proteína de analito, de preferencia un anticuerpo con una. etiqueta detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más de preferencia i monoclonales. Un anticuerpo intacto, o fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab)2) puede ser utilizado. El término "marcado" con respecto a la sonda o anticuerpo, se propone para abarcar la marcación directa de la sonda o anticuerpo al acoplar (es decir, enlazar físicamente) una sustancia deteCtable a la sonda o anticuerpo, así como la marcación indirecta de la sonda o anticuerpo mediante reactividad con otro agente que es directamente marcado. Ejemplos de marc ción indirecta incluye la detección del anticuerpo i primario utilizando un anticuerpo secundario fluorescentemente marcado y la marcación de extremo de una sonda de DNA con biotma tal que puede ser detectado con estrfptavidina fluorescentemente marcado. El término "muestra biológica" se propone para incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Incluido dentro de la utilización del término "muestra biológica", por lo tanto, está la sangre y una fracción o componente de sangre que incluye suero de sangre, plasma de sangre o linfa. Esto es, el método de detección de la invención se puede utilizar para detectar un mRNA de analito, proteína, o DNA genómico en una muestra biológica ín vitro así como ín vivo. Por ejemplo, las técnicas m Vitro para detección de un mRNA de analito incluyen las hibridaciones de Northern y las hibridaciones ín situ. Las técnicas ín vitro para la detección de una proteína de a?alito incluye los ensayos inmunosorbentes enlazados a enzima (ELISAs), manchado de Western, inmunoprecipitaciones e inmuhoflourescencia . Las técnicas in vitro para detección de un DNA genómico de analito incluye las hibridaciones de Southern. Los procedimientos para conducir inmunoensayos son descritos, por ejemplo en "ELISA: Theory y Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed. ) Human Presa, Totowa, NJ. , 1995; "Immunoassay" , E. Diamandis y T. Chrißtopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1996; y "Practice y Thory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, i Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Además, las in vivo para la detección de una proteína de analito incluye la introducción en un sujeto de un anticuerpo de proteína de anti-un analito marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado con un marcador radioactivo cuya I pres ncia y localización en un sujeto puede ser detectada mediante técnicas de formación de imagen estándares de intracavidad, . o transdérmicamente, solas o con células i efectoras. ' USOS ¡ TERAPÉUTICOS Y FORMULACIONES Los ácidos nucleicos y proteínas de la invención son I útiles en aplicaciones profilácticas y terapéuticas potenciales implicadas en una variedad de desórdenes que i incluyen, pero no limitados a: desórdenes metabólicos, diabptes-, obesidad, enfermedad infecciosa, anorexia, cáncer, desóbdenes neurodegenerativos, Enfermedad de Alzheimer, Desorden de Parkinson, desórdenes inmunes, desórdenes hematopoyéticos y las diversas dislipidemias, disturbios metafcólicos asociados con obesidad, el síndrome X metabólico y desórdenes de desecho asociados con enfermedades crónicas y varios cánceres, cardiomiopatía, ateroesclerosis, hipertensión, defectos del corazón congenióos, estenosis aórtica, defecto septal atrial (ASD) , defecto del canal atriOventricular (A-V) , ductur arteriosis, estenosis pulmonar, estenosis subaórtica, defecto septal ventricular (VSD) , enfermedad de válvula, esclerosis tuberus, escleroderma, lupus eritematoso, obesidad, transplante, adrerjioleucodistrofía, hiperplasia adrenal congénita, cáncer I de próstata, neoplasma; adenocarcinoma, linfoma, cáncer de úterf, fertilidad, leucemia, hemofilia, hipercoagulación, púrpiira trombocitopénica idiomática, inmunodeficiencia, I enfepmedad de injerto contra hospedera, SIDA, asma bronquial, artritis reumatoide y osteoartritis, enfermedad de Crohn; esclerosis múltiple, tratamiento de Osteodistrofia Hereditaria de Albright, y otras enfermedades, desórdenes y condiciones o los similares. Las preparaciones para la administración del complejo terapéutico de la invención incluyen soluciones acuosos o no acuosas estériles, suspensiones y emulsiones. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de olivo y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcoh'ólicas/acuosas , emulsiones o suspensiones, incluyendo solusión salina y medios regulados en pH . Los vehículos incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, vehículos intravenosos de Ringer lactados que incluyen renovadores de fluidos y de nutrientes, renovadores de electrolito y los similares. Se pueden ad?c?|onar conservadores y otros aditivos tales como por I ejemplo, agentes antimicrobianos, anti oxidantes, agentes quelantes y gases inertes y los similares. Las moléculas de acido nucleico, polipéptidos y anticuerpos (también referidos en la presente como "compuestos activos") de la invención, y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos, se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Tales composiciones típicamente comprenden la molécula de acido nucleico, proteina o anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" se propone para incluir cualquiera y todos los solventes, medio de dispersión, recubrimientos, agente antibactepanos y antifungales, agentes de retardo isotónico y de absorción y los similares, compatibles con la administración . Portadores adecuados con descritos en la reciente de Remmgton' s Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en el campo, que es incorporado en la presente por referencia. Ejemplos preferidos de tales portadores o diluyentes incluyen, pero no estari limitados a, agua, solución salina, solución de finger, soludión de dextrosa y albúmina de suero humano al 5%. Los liposlomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos I tambijén puede ser utilizado. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto hasta donde cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el us,o del mismo en las composiciones. Compuestos activos suplementarios también pueden ser incorporados en las compo ,siciones . I Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su ruta de administración de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intr^dérmica', subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación) , transdérmica (es decir, tópica) , transmucosal, intráperitoneal y rectal. 'Las soluciones o suspensiones I utilizadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un i rendimiento estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijados, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibjacterianos tal como alcohol bencílico o metilparabeno; antidxidantes tal como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tal como ácido etilendiaminotetraacético I (EDTA); soluciones reguladoras tales como acetatos, citratos o fofefatos y agentes para el ajuste de tonicidad tal como cloruro de 'sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidj>s o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido de sodicj). La preparación parenteral se puede alojar en ampolletas, jeringas desechables o frasquitos de dosis múltiples o hechos de vidrio o de plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde es i soluble en agua) o dispersiones o polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables' estériles. Para la administración intravenosa, portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, aguai bacteriostática, Cremophor™. (BASF, Parsippany, NJ. ) o solución salina regulada con fosfato (PBS) . En todos los casots, la composición debe , er estéril y debe ser 'fluida al gradp de que exista facilidad para la aplicación en jeringa. Esta¡ debe ser estable bajo las condiciones de manufactura y el almacenamiento debe ser conservado dentro de la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medios de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicero, propilenglicol y polietilenglicol líqui|do y los similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerida en el caso de i dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr por varios agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo, i parameños, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y los similares.. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como ( manitol, sorbito, cloruro de sodio y la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede originar o incluir en la composición un agente que I retafda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar el compuesto activo (por ejemplo, el complejo terapéutico de la invención) en la cantidad i requferida en un solvente apropiado con una o una combinación de ¡ingredientes enumerados en lo anterior, como sea requerido, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las ¡dispersiones se . preparan al incorporar en el compuesto activf en un vehículo estéril que contiene una dispersión básicp y el requerido de otros ingredientes de aquellos enumerados en lo anterior. En el caso de polvos estériles i para ¡la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y secado por congelación que producen polvo del ingrediente activo más i cualqjuier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada estérilmente de la misma. i Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Ellas pueden ser encerradas en cápsulas de gelatina o comprimidas en tabletas.

Para i el propósito de administración terapéutica oral, el i compuesto activo se puede incorporar con excipientes y utilizar en la -forma de tabletas, trociscos, o cápsulas. Las compfsiciones orales también se pueden preparar utilizando un I portador fluido para el uso, como un lavado de cal, en donde el compuesto en el portador fluido se aplica oralmente y se digi re y se. exhala y se come. Los agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes pueden ser incluidos como" una parte de la composición. Las tablftas, pildoras,- cápsulas, trociscos y los similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza- similar; un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón , o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Steroftes; un agente de deslizamiento tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de' sabor naranja. Para administración oral, las composiciones farmajcéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatmizado, polivinilpirrolidona o ^ hidroxipropil metilcelulsoa) ; rellenadores (por ejemplo, lactosa, cellosa microcristalina o hidrqgeno fosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice) ; desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa o almidón glicolato de sodio) ; o agentes humectantes (por ejemplo, laurel sulfato de sodio) . Las tabletas pueden ser recubiertas por métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones o se pueden presentar como un producto seco para la reconstitución con agua u otro vehídulo adecuado desde el uso. Tales preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por .ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasab comestibles hidrogenadas); agentes emulsificantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, esteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (por i ejemplo, metil o propio-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico) . Las preparaciones también pueden contener sales I reguladoras, saborizantes, colorantes, y agentes edulcorantes como sea apropiado. , Las preparaciones para administración oral pueden ser formuladas adecuadamente para dar liberación controlada del ecompuesto activo. Para la administración bucal las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formujladas de manera convencional. Para administración por inhaljación, los compuestos para el uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en la formal de una presentación de rocío en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un i propélente adecuado, por \ ejemplo, diclorodifluorometano, ticlorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presµrizado la unidad de dosificación puede ser determinada al proporcionar una válvula para suministrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y , cartuchos de por ejemplo gelatina para ¡ el uso en un inhalador o soplador se pueden formular para contener una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Los compuestos puedejn ser formulados para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presfntar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en i ampolletas o en contenedores de dosis múltiples, con un conservador adicionado. Las composiciones pueden tomar tales formas como suspensiones, soluciones o emulsiones o vehículos aceitosos acuosos, y pueden contener agentes formulatorios tales como suspensión, estabilización y/o agentes dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede i estaf en forma de polvo para por la constitución con un vehípulo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógeno estéril, antes del uso. Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u i otros glicéricos. Ademas de las formulaciones previamente descritas, los compuestos también se pueden formular como una prep ración de depósito. Tales formulaciones de acción larga se pueden administrar por implantación (por ejemplo subcutáneamente o intramuscularmente) o por inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo como una sal escasamente soluble. Para administración por inhalación, los compuestos se suministran en la forma de un rocío en aerosol a partir de un Contenedor o surtidor presurizado que contiene un propálente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carb no o un nebulizador. La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para administración tranámucosal o transdérmica, los penetrantes apropiados a la barrera a ser permeada se utilizan en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e inclµyen, por ejemplo, para administración transmucosal, detergentes, sales biliares. y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal se puede realizar a través del i uso ¡de rocíos nasales o supositorios. Para administración transdéfmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles, o cremas como es generalmente conocido en la técnica. En una modalidad, los compuestos activos se prepairan con portadores que•. protegerán al compuesto contra la i eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada,, incluyendo implantes y sistemas de i suministro microencapsulado . Los polímeros biodegradables, biocompatibles pueden ser utilizados, tal como etileno- I acetato de vinilo, polianhídridos, ácidos poliglicólicos, colágfno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para ¡la preparación de tales formulaciones serán evidentes para ¡aquellos expertos en la técnica. Los materiales también pueden ser obtenidos comercialmente de Alza Corporation y Nova ' Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidas a células infectadas con antiquerpos monoclonales a antígenos virales) también se pueden utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables. Esto | se puede preparar de acuerdo con métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como es descrito en la patente norteamericana No. 4,522,811. Es especialmente ventajoso formular composiciones oralfs o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación como se utiliza en la presente refiere unidades físicamente discretas adecuadas como i dosificaciones unitarias para el sujeto a ser tratado; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención son dictadas por y directamente dependen de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a ser logrado, y las limitaciones inherentes en el arte de combinación de tal compuesto activo para los tratamientos de individuos. Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden insertar en vectores y utilizar como vectores de terapia génica. Los vectores de terapia génica se pueden suministrar a un sujeto mediante, por ejemplo, por inyección intravenosa, administración local (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,328,470) o mediante inyección estertotáctica (ver, por ejemplo, Chen, y colaboradores, 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vectqr de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la cual se incrusta el vehículo de suministro génico. Alternativamente, dond¿ el vector de Suministro génico completo se puede intrfducir intacto de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de suministro' génico. Las composiciones farmacéuticas pueden ser incluidas en un contenedor, paquete, o servidor junto con instrucciones para la administracién . Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a aquella cantidad de complejo terapéutico suficiente para dar por resultado la aminoración o retardo de los síntomas. La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cufLtivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, I para determinar la LD50 (la dosis letal para 50% de la i población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en ¡ 50% de la población) . La relación de dosis entre los efectos tóxicbs y terapéuticos es el índice terapéutico y puede ser expresado como la relación LD50/ED50. Los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos preferidos. Mientras que los compuestos que exhiben efectos secundarios tóxicos pueden ser ujtilizados, se debe tener cuidado para diseñar un sistema de suministro que dirige tales compuestos al sitio al tejido afect¡ado con el fin de minimizar daño potencial a las células no infectadas y de esta manera, reducir los efectos secundarios. Los datFs obtenidos de los ensayos de cultivo de células y estudios de animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosificación para el uso en humanos. La dosificación de tales compuestos depende de preferencia dentro de. .una gama de concentraciones en circulación que incluye la ED50 con poco o nada de toxicidad. La Oosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada en la ruta de ¡administración . utilizada. Para cualquier compuesto utilizado. en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente de ensayos de cultivo de células. Una dosis puede ser formulada i en modelos animales para lograr un intervalo de concentración de p¡lasma circulante que incluye el IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición semí máxima de los síntomas) como es determinado en el cultivo celular. Tal información puede ser utilizada para determinar más precisamente dosis útiles en humanos. Los niveles en el plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante la cromatografía líquida de alto desempeño. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional utilizando uno o más portadores o excipientes fisiológicamente aceptables. Así, los compuestos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables se pueden formular . para la administración mediante inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o la nariz) o administración oral, bucal, intravenosa, intraperitoneal, i parenteral o rectal. También se divulga de acuerdo con la presente invención un equipo o sistema que utiliza cualquiera de los métodos, estrategias de selección, materiales o componentes descritos en la presente. Los equipos ejemplares de acuerdo con ia presente descripción opcionalmente de manera adicional mclµirán instrucciones para realizar los métodos o ensayos, matefiales de empaquetamiento, uno o más contenedores que contienen un ensayo, ( un dispositivo o componentes del siste|ma, o los similares. En un aspecto adicional, la presente invención propqrciona equipos que engloba el complejo y los métodos de utilización divulgados en la presente. Los equipos de la inver.ción opcionalmente incluyen uno o más de lo siguiente: (1) polipéptido o componentes de ácido nucleico descritos en la presente, (2) instrucciones para practicar los métodos descritos en la presente y para operar el procedimiento de selección en la presente; (3) uno o más componentes de ensayo de detección; (4) un contenedor para contener los ácidos nucléicos o polipéptidos, .otros ácidos nucleicos, plantas tran&génicas, animales, células o los similares y (5) materiales de empaquetamiento. Organismos Transgénicos ( Una célula o animal transgénico utilizado en los métodos de la invención s pueden incluir un transgen que codifica, por ejemplo, un'a copia de un polipéptido quimérico i que Comprende una interleucma y receptor de interleucina. El i tranpgen puede codificar una proteína que es normalmente exógena a la célula o animal transgénico,' incluyendo una proteína humana. El transgen puede ser enlazado a un promotor hetetólogo o nativo. Esta descripción ademas se relaciona a un método i paral producir animales transgénicos. Las técnicas conocidas en e|l arte se pueden utilizar para introducir el transgen en animadles para producir la linea buscadora de animales. Tales técnijcas incluyen, pero no están limitadas a: microinyección pronuclear; transferencia de gen mediada por retrovirus en I línea¡s germinales (Van der Putten y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152, 1985; dirección del gen en células madre embrionicas (Thompson y colaboradores, Cell 56:31(3-321, 1989; eleclroporacion de embriones (Lo, Mol. Cell Biol. 3:1803-1814, 1983); y transferencia de gen mediada por esperma (Lavitrano, y colaboradores, Cell 57: 717-723, 1989; i etc. Para una revisión de tales técnicas ver Gordon, Intl. Re.v. Cytol. 115:171-229, 1989. Por consiguiente, la invención caracteriza un organismo transgenico que contiene un transgen que codifica un polipeptido de interleucina/receptor de interleucina quimérico. El organismo transgénico puede ser una Célula eurcapotica, por ejemplo, una célula de levadura, un insecto, por ejemplo, un gusano o una mosca, un pez, un reptil, una ave o un mamífero, por ejemplo, un roedor. El organismo transgenico puede ademas comprender una alteración genética, por , ejemplo, una? mutación puntual, inserción o deficiencia en un gen endógeno. Una célula hospedera de la invención, tal como una célula hospedera procariotica o eucariotica en cultivo, se puede utilizar para producir (es decir, expresar) los componentes del polipeptido . o complejo de la invención. Por consiguiente, la invención ademas proporciona métodos para producir proteína usando las células hospederas de la invención. En una modalidad, el método comprende cultivar la célula hospedera de la invención (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica la proteína) en un medio adecuado tal que se produce la prote|ína. En otra modalidad, el método además comprende aislar la proteína del medio en la célula hospedera. 1 Otro aspecto de la invencién pertenece a células hospederas en las cuales se ha introducido un vector de I expresión recombinante de la invención. Los términos "célula hospedera" y "célula hospedera recombinante" se utiliza intercambiablemente en la presente. Se entiende que tales términos • se refieren no solamente a la célula sujeto particular sino también a la progenie o progenie potencial de tal célula. Debido a' que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones subsecuentes debido a ya sea la mutación o influencias ambientales, tal progenie no puede ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero todavía son incluidos dentro del alcance del término como se utiliza en la presente. Una célula hospedera puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, una proteína se p?ede expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto, células de levadura o mamífera (tales como las células de ovario de hámster Chino) (CHO) o células COS). Otras células hospederas adecuadas son conocidas para aquellos expertos en la técnica. DNA de vector se puede introducir en las células procajrióticas o eucarióticas por la vía de técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se utiliza I en la presente, los términos "transformación" y "transfección" se proponen para referirse a una variedad de técnicas reconocidas en el arte para introducir ácido I nucleico foráneo (por ejemplo, DNA) en una célula hospedera, incluyendo la co-precipitación con fosfato de calcio o i cloruro de calcio, transfección mediada con DEAE-dextrano, lipofjección o electroporación. Los métodos adecuados para formar o transfectar células hospederas se pueden encontrar en 'Sambrook, y colaboradores, (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, I Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.

Y., 1989), y otros manuales de laboratorio. Para transfecciones estables de células mamíferas como es conocido que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de tran'sfección utilizada, solamente una pequeña fracción de célula puede integrar el DNA foráneo en su i genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ¡ ejemplo resistencia a antibióticos) generalmente se introduce en las células' hospederas junto con el gen de interés. Varios marcadores seleccionadles incluyen aquellos que ¡contienen resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se puede introducir en una célula hospedera sobre el mismo vector ya que codifica la proteína o se puede inducir como un vector por separado. Las células establemente transfectadas por el ácido nucleico introducido se piiede identificar mediante las selección de fármaco (por i ejemplo, células que han incorporado el gen marcador selescionable sobrevivirán, mientras que las otras células i mueren) . i Las células hospederas de la invención también se pueden utilizar para producir animales transgénicos no humarjos. Por ejemplo, en una modalidad, una célula hospedera de la invención es un oocito fertilizado o una célula madre embriónica én la cual se' . ha introducido las secuencias de codificación de proteína. Tales células hospederas luego se pueden utilizar para crear animales transgénicos no humanos en las cuales -_ la secuencia de polipéptido exógenas se han introducido en su genbma o animales recombinantes homólogos en lfs cuales se han alterado las secuencias de polipéptido exógénas. Tales animales son útiles para estudiar la función y/o actividad de proteínas y para identificar y/o evaluar moduladores de la actividad de proteína. Cómo se utiliza en la piesente, un "animal transgénico" es un animal no humano, de preferencia un mamífero, más de preferencia un roedor, tal co o una rata o ratón, en la cual uno o más de las células del nimal incluye un transgen. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas1, cabras, pollos, anfibios, etc. Un transgen es DNA exógéno que es integrado en el genoma de una célula de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece al genoma del animal maduro., Para de esta manera dirigir la expresión de un producto de gen codificado en uno o más tipos de células o tejidos de animal transgénico. Como se utiliza i en l)a presente, un "animal recombinante homólogo" es un animal no humano, de preferencia un mamífero, más de preferencia un ratón," en el cual un gen endógeno se ha alterado mediante recombinación homologa entre el gen endógeno y una- molécula de DNA exógena introducida en una i célula del animal, por ejemplo, una célula embriónica del i animal, antes del desarrollo. del animal. j ¡ Un 'ejemplo • de una modalidad preferida de la inve ción se proporciona enseguida. Como será entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica, las técnicas descritas por la presiente e incorporadas en la presente invención son generalmente aplicables y se pueden variar en cualquier número de maneras' sin apartarse del alcance general de ]¡a invención. El siguiente ejemplo se da a manera de ejemplo de las modalidades preferidas, y de ninguna manera se considera que es limitativo de la invención. Por ejemplo, las cantidades relativas de los ingredientes pueden variar para I logra'r diferentes efectos deseados, ingredientes adicionales se pueden adicionar, y/o ingredientes similares se pueden sustituir por uno o más de los ingredientes descritos. Ejemplo 1 La co-administración de IL- 15 e IL-15Ra induce la proliferación de células T de memoria CD8 y células NK in vivo .] Con el ,fin de determinar si la co-administración de IL-15 e IL-15Ra-Fc de ratón recombinante (rmIL-15Ra-Fc) podría mediar la actividad de IL-15 in vivo, los inventores utilizaron un modelo de transferencia adoptivo para calibrar el efecto de IL-15 sobre la proliferación de células T CD8+.

Células T CD8+ esplénicas enriquecidas marcadas con CD45.1 CFSE se transfirieron en ratones CD45.2 normales y rmIL-15Ra- i Fc ¡(aproximadamente 15 µg) . Cuatro días después del tratamiento con IL-15 sola, aproximadamente 11% de la población de células CD8+ donadoras se han dividido (Figura la, 'paneles superiores), -de acuerdo con los resultados I previos de los inventores. En contraste dramático, la co-admihistración de la misma cantidad IL-15 enlazada a rmlL-15Raj-Fc,dio por resultarlo la proliferación de aproximadamente 69% de las células T CD8+ donadoras (Figura 1). Además, mientras que la mayoría de células T CD8+ respondientes a IL-15 sOla se dividieron una vez, las células 'respondientes a 1 JJ tratajmiento de combinación se sometieron a 5-7 divisiones, dando! por resultado un incremento sustancial en los números de cflulas (datos no mostrados) . El volumen de las células divisorias expresaron altos niveles de CD44, sugiriendo que las Células respondientes fueron principalmente células T CD8+ de memoria o que CD44 se ha regulado hacia arriba (Figura la, paneles del fondo) . De manera importante, la administración de rmIL-15Ra-Fc sola indujo la proliferación de células T CD8+ (datos no mostrados) . De manera notable, la co-aqministración de una forma soluble de rmIL-15Ra con IL-15 también dio por resultado la proliferacién aumentada de células T CDdji- donadoras aunque un nivel intermedio a IL-15 solo e IL-15 combinado con rmIL-15Ra-Fc (datos no mostrados).

Con el fin de probar la acción de una terapia combinada sobre céluljas T CD8+ de memoria de bona-fide, • los inventores I transjfirieron adoptivamente células T de memoria CD8+ específicas de albúmina (OVA) marcada con CFSE que se ha generado mediante la infección con el virus de estomatitis vesicular reco' binante que ,expresa OVA (VSV-OVA) . Similar a los resultados anteriores, las células T CD8+ de memorias espedíficas de antígeno que -responden al tratamiento IL-15/IL-15Ra-Fc proliferaron a un grado mucho más grande que aquellas que se les proporcionó IL-15 sola (Figura Ib). Estudios pasados han implicado IL-15 como un inductor de célula B, célula NK y proliferación de célula T NK, pero no de la proliferación de célula T CD4+. Por lo tanto, los inventores examinaron la habilidad de IL-15 e IL-15 formado en complejo con receptor para inducir la I proliferación de otros tipos de células utilizando el sistema de tfansferencia adoptivo. Las células T CD4+ y las células B no proliferaron respuesta a aproximadamente 2.5 µg de IL-15, mientras que las células NK proliferaron muy poco (Figura 2). En contraste, la coadministración de rmIL-15Ra-Fc con IL-15 indujlo la proliferaciFn extensiva de las células NK mientras que ¡las células B no respondieron. La respuesta de las t células NK-T fue similar a aquellas de las células NK (datos °. no mostrados) . De manera interesante, aunque IL-15 no se cree que edie la proliferacién- de células T CD4+ de ratón, las i células T CD4 + ilustraron una respuesta intermedia al complejo administrado. Ejemplo 2 ¡ IL-15/IL-15Ra en complejo previamente aumenta la actividad IL-15 activa 'in vivo '. Los inventores enseguida examinaron la cinética temp na de la respuesta proliferativa a la coadministración de fmIL-15Ra-Fc con IL-15. • La dilución con CFSE fue insignificante un día después del tratamiento, pero por el día 2 aproximadamente 36% 'de la población de células T CD8+ * • '' donadoras se han dividido, con un número apreciable de células en la tercera y cuarta rondas de división (Figura 3).

Por ¡el día tres aproximadamente 59% de células T CD8+ donadoras se han dividido con muchas células en divisiones 5-6, mientras que aproximadamente 73% se han dividido por el día cuatro con algunas células en la séptima ronda de división. Estos resultados y otros mostraron que el efecto máxirro de una sola dosis de IL-15/rmIL-15Ra-Fc se logró por aproximadamente 4 días de post-tratamiento, seguido por las células T CD8+ donadoras que entran a una clasificación retraída de características de proliferación de las células T CD8+de memoria (datos no mostrados). i Con el fin de obtener una aproximación del aumento de actividad , obtenido por" el tratamiento combinado sobre aquel de IL-15 sola los inventores realizaron titulaciones de IL-1$ e IL-15/rmIL-15Ra-Fc utilizando el modelo de transferencia adoptivo. Las comparaciones se basaron en el grad de proliferaciFn de células T CD8+ donadoras como es estimado por la dilución de CFSE. Una dosis de aproximadamente 0.1 µg de IL-15 combinado con aproximadamente 0.6 µg de IL-15Ra-Fc indujo lun nivel de proliferación similar a aquel de aproximadamente 5 µg de IL-15 (Figura 4a) . Así, en este, tipo de experimento, la actividad de IL-15 se aumentó ~50 veces mediante la coádministración con rmIL-15Ra-Fc. Considerando este aumento sustancial, los inventores cuestionaron si IL-15 sdla podría lograr este nivel de actividad. Aun con la administración de aproximadamente 37.5 µg de IL-15, el nivel de proliferación obtenido con aproximadamente 0.5 µg de receptor formado en complejo con IL-15 no podría ser logrado (Figura 4b). Estos resultados sugirieron que la disponibilidad de IL-15Ra puede ser limitativa in vivo puesto que niveles de IL-15 incrementado no di[eron por resultado aumento adicional de la actividad. ¡ Ejemplo 3 IL-15/IL-15Ra en complejo opera por la vía de la tran?presenta'ción que requiere IL-15Rb 1 Los efectos de IL-15/IL-15Ra en complejo podrían ser ya sea mediados por efectos directos o indirectos sobre los tipos de células correspondientes. Si es directo, entonces se .podría esperar que las células objetivo serían ¡ requeridas para expresar componente (s) de IL-15R. Para probar esto; los inventores transfirieron células de CD8+ IL-15Ra-/-marcadas con ,.CFSE en hospedero IL-15Ra-/- y trataron los I ratohes con ya sea IL-15 o IL-15/IL-15Ra en complejo. IL-15 no pbdría ser transpresentadq en la ausencia de IL-15Ra, y no indujo proliferación (Figura 5a). Por otra parte las células T CD¡8+ donadoras de los ratones tratados con IL-15/rmIL-15Ra-Fc proliferaron extensivamente. Además, las células donadoras IL-l¡5Ra-/- que consistieron principalmente de células T CD8+ de fenotipo naive, progresivamente incrementaron su expresión de CD44 y CD 122 cFn división. Puesto que las células T respondientes' no requirieron IL-15Ra para responder a IL-15/IL-15Ra en complejo, los inventores examinaron la función de IL,-15Rb (CD122) en mediar este efecto. Con este fin, los inventores transfirieron células de CD8+ CD122 +/+ o CD122-/-marcadas con CFSE en ratones normales y analizaron las células donadoras para la dilución de CFSE 4 días después del tratamiento. Mientras que las células de control proliferaron vigorosamente en respuesta al tratamiento con IL-15/rmIL-15Ra-Fc, las células T CD8+ donadoras CD122-/- no proliferaron en respuesta a la coadministración (Figura 5b). Tomados conjuntamente, los resultados indicaron que IL-15/IL-15Ra-*Fc operó por la vía de la transpresentación directa a través de la interacdion con IL-15Rb probablemente en conjunción como gammaC, Ejemplo 4 Proliferación inducida por la presentación de IL-15 forz da requiere MHC clase I pero no células IL-7 o dendfíticas. ; Mientras que las células T naive requieren MHC clasei I y péptido °endógeno para su sobrevivencia, la supervivencia de proliferación de células T CD8+ de memoria i se cj:ee que es independiente de MHC clase I. La proliferación homoéstática de estos subconjuntos en hospederos vacíos exhibe requerimiento de MHC similares. Dados estos resultados, fue importante determinar el requerimiento de MHC para, la proliferación inducida por la coadmmistración de rmIL-15Ra-Fc con IL-15. Así, los inventores cotransfirieron células T CD8+ transgénicas TCR naive (OT-I) y enriquecieron células T CD8+ B6 (que contienen células de memoria) a ratones normales o deficientes de MHC clase I (b2-microglobulina-/-). De manera interesante, las células T CD8 OT-IRAG-/- naive proliferaron robustamente en respuestas al trat miento con el complejo en un hospedero suficiente de MHC clase I- En contraste, en hospederos MHC clase I-/-, la proliferación de células T naive no ocurrió (Figura 6a). De maneja similar, las células T CD8 B6 proliferaron en hospederos normales pero sorprendentemente la proliferación fue virtualmente ausente en los hospederos MHC clase I-/-. Estos datos indicaron que la inducción de proliferación por IL-15/IL-15Ra fue dependiente de MHC clase I para tanto las células T CD8+ naive y de. memoria. Puesto que la respuesta proliferativa inducida por la coadministración de rmIL-15Ra- Fc cf in IL-15 fue depend . :i.ente sobre la expresión del hospedero de MHC clase I los inventores desearon investigar otros criterios que también podrían desempeñar una función. Los inventores examinaron el involucramiento de IL-7, puesto que esta' citoquina es esencial para la proliferación homeostática de células T CD8 en hospederos inmunodeficientes . Las células T CÍ-8+ marcadas Con CFSE se transfirieron a ratones de control o IL-7-/- y se administró IL-15/rmIL-15Ra-Fc combinado. En la presencia o ausencia de IL-7 las células CD8+ proliferaron igualmente bien en respuesta a IL-15 con IL-15Ra-Fc (Figura 6b), indicando que IL-7 no fue involucrado en la proliferación mediada por IL-15 en el sistema de los inventores. Estudios previos ha resaltado el potencial de células dendríticas (DC) se midió a la actividad de IL-15 y la expresión de MHC por DC puede ser importante en la homeojstasis de células T. Para probar qué función DC desempeña en la respuesta proliferativa inducida por la coadministración de IL-15/IL-15Ra los inventores utilizaron un Sistema en el cual DC pueden ser condicionalmente agotajdas. Los ratones CDllc-DTR expresan el receptor de « toxina de difteria de. simio bajo el control de automotor CDllü, haciendo a las células CDllc+ susceptibles a DT, lo cual | remueve >95% de DC . Debido a la toxicidad de DT a los ratones CDllc-DTR intactos como un resultado de los efectos sobrq las células no hematopoyéticas, los inventores generaron quimeras utilizando médula ósea CDllc-DTR y hospederos B6 normales. Las células T CD8+ marcadas con CFSE luego se transfirieron a' las quimeras que se trataron con DT antea de la administración del complejo IL-15/IL-15Ra . De mane a interesante, los inventores no encontraron diferencia en l¡a proliferación de células T CD8+ entre el control tratado con DT o las quimeras CDllc-DTR (Figura 6c) . Así, I aunque MHC clase I fue esencial para la proliferación mediada por _JL-15, DC no fueron requeridas.

Ejemplo 5 Inmunoterapia con IL-15/IL-15Ra induce la acti ación de células T naive y la función efectora En experimentos previos los inventores notaron que las Células T CD8 policlonales bajas en CD44 así como las células T transgenicas TCR naive respondieron a IL-15 cuando i se coadministraron con IL-15Ra-Fc (Figuras 5 y 6) .

Considerando que bajo condiciones homeostáticas, las células T de memoria CD8 exhiben responsividad mucho más grande de I IL-l?j que las células T CD8+ naive, los inventores desearon i comparar directamente la responsividad de estos dos subcpn untos a IL-15/rmIL-15Ra-Fc en complejo. Para ser esto, i las délulas OT-I de memoria marcadas con CFSE y T CD8+ OT-I na?v<^ se transfirieron adoptivamente en los mismos hospederos ¡ C57B4J 6 congenióos y la proliferación se analizó 4 días despáés del tratamiento con IL-15/IL-15Ra-Fc . De manera I sorprendente las células T CD8 OT-I naive proliferaron casi i como ¡ las células T CD8+ OT-I de memoria (Figura 7a). Las células OT-I naive también se expandieron ~10 veces en respuesta al complejo como es comparado con los controles y CD4 i regulado hacia arriba (Figura 7b) . En vista de la proliferación robusta inducida en las células T' naive, fue de interés establecer si la función efectora fue I concfmitantemente "inducida. Para probar esta cuestión los inveftores transfirieron adoptivamente células T CD8+ OT-I / na?ve en hospedero C57BL/6 congenióos y, utilizando un ensayo de exterminación ín vivo, midieron la actividad lítica espedífica de antígeno 4 días después del tratamiento con IL-15/rmIL-15Ra-Fc o después de la infección con el virus de etomatitis vesicular recombinante que expresa ovalbúmina (VSV-;OVA) para comparación. De manera interesante, el tratamiento con IL-15/rmIL-15Ra-Fc dio por resultado la inducción de actividad lítica específica de antígeno robusta, i similar al nivel obtenido con la infección de virus (Figura I 7c) . ¡Además de la actividad lítica, la mayoría de las células T CD8+ OT-I naive activada por IL-15/IL-15Ra-Fc o la infefción de VSV-Ova produjo altos niveles de IFNg, después de lá reestimulaciFn in Vitro con péptido (Figura 7d) . Este resultado estuvo en contraste a la frecuencia insignificante de células OT-I que producen IFNg de control (PBS) y los ratones tratados con IL-15 (Figura 7d) . Así, la inducción de la función ef'ectora en las células T CD8+ naive mediante la coadministración de IL-15Ra-Fc con IL-15 estuvo en paralelo con la activación • obtenida por la infección. Ejemp(lo 6 ¡ El tratarrfiento de las células T na?ve con IL-15/IL- i 1 5R¿-Fc en, complejo genera células T CD8+ de memoria. Aunque las células T naive desarrolladas en células efectoras en respuesta' a IL-15 transpresentado, permaneció para' ser observado si este fue un efecto transiente o dio por I resultado el desarrollo de células T de memoria. Por lo tanto, los inventores analizaron el número y fenotipo de I célul¡as T OT-I44 días después de la transferencia de células T OT I na?ve y el tratamiento con IL-15/IL-15Ra-Fc . En este punto de tiempo, un porcentaje más alto de ~5 veces de células OT-I estuvo presente después de la administración de IL-15¡/IL-15Ra como es comparado con ratones no tratados (Figura 8, paneles superiores). Por otra parte, casi todas estas células expresaron altos niveles de CD44 y CD122 i (Figura 8, paneles medio y de fondo) . Así, aun en la ausencia de añtígeno el tratamiento con IL-15/IL-15Ra-Fc fue capaz de inducir el desarrollo de .células T CD8+ de memoria. ¡ Descubrimientos recientes sustentan el uso de IL- 15 cFmo un adyuvante para vacunación, inmunoterapia de tumor y la1 reconstitución del sistema immune en inmunodeficiencia.

En ^1 caso de tratamiento de cáncer, la inducción de I linffpenia estaba siendo empleada para aumentar la actividad funcional de linfocitos adoptivamente transferidos. Esta modalidad está basada en el descubrimiento de que la célula T CD8+1 que se someten a la proliferación homeostática inducida por linfopenia se diferencian en células efectoras con actividades líticas y productoras de citoquina. La i diferenciación de las células T CD8+ a células efectoras y de fenotipo de memoria también requiere de expresión de MHC clase I- Así, la proliferación y actividades funcionales inducidas por el complejo IL-15/IL-15Ra-Fc en hospederos intactos imito la proliferación homeostática activada por linfqpenia. Por otra parte, el nivel de proliferación obtenido mediante el tratamiento con el complejo no podría ser ogrado por altas dosis de IL-15 sola. Puesto que la misma célula que produce IL-15 también puede transpresentar la ditoquina, la disponibilidad de IL-15Ra puede ser limitada. Además, la vida media corta de IL-15 puede ser extendida cuando se forma en complejo con el receptor. Por lo tantf, el tratamiento con IL-15 sola es improbable que logre I el potencial terapéutico completo de la citoquina. La administración combinada de IL-15/IL-15Ra puede evitar estos problemas y proporciona la eficacia mejorada. El mecanismo de acción de IL-15/IL-15Ra en complejo fue de interés particular dado el paradigma actual que considera los requerimientos para la supervivencia de I ' * proliferaciFn homeostatica de la célula T naive y de memoria. Bajo condiciones normales, la supervivencia de ambas de las céluias T CD8+ naive y de memoria requiere IL-7, mientras que IL-1$ es esencial para la proliferación homeostática de céluias T CD8+ de memoria y células NK. En un ambiente lmffpénico, I.L-7 es requerido para la proliferación homeéstática de células T CD8+ y CD4+ naive .y desempeña una función, junto con IL-15, en mediar la proliferación home stática de células T de memoria CD8+. Así, fue inesperado que las células T CD8+ naive respondieron vigorosamente al complejo IL-15/IL-15Ra . Sin embargo se debe i observar que en ratones IL-15-/- la acumulación de células T CD8+ naive es disminuida por aproximadamente 50%, sugiriendo i que ya sea el desarrollo y/o supervivencia de células T CD8+ na?vej requiere IL-15. En cualquier caso, la proliferación de células T CD8+ na?ve inducida por IL-15/IL-15Ra enlazada al recepjtor fue IL-7 independiente y requirió la expresión de IL-15Ra. Este resultado indicó que las células T CD8+ na?ve expresaron niveles suficientes de IL-15Ra para responder a IL-l5/IL-15Ra pero no a IL-15 soluble sola. Además, las células T CD8+ naive adquirieron la función efectora y subsecuentemente se desarrollaron en células T CD8+ de memoria de larga vida después en altos niveles de CD44 y CD122. De manera interesante, la activación activada por IL- I 15/IL-lSRa de las células T CD8+ na?ve o de memoria requirió la expresión de MHC de clase. I. Mientras que la supervivencia de l^s células T CD8+ naive es independiente sobre MHC, la supervivencia de las células T de memoria CD8 se cree que es independiente de MHC. Así, un requerimiento- para MHC clase I en lá proliferación de células de memoria inducida por el receptor formado en complejo con IL-15 fue un-poco inesperado pero ¡sustenta una función para MHC en aspectos de la función de c lulas de memoria, como- se ha demostrado previamente. Los descubrimientos de los inventores ilustran el poder potencial de lL-15 en inducir la expansión de células T CD8+ y NK robusta y la diferenciación del efector en hospederos intactos. Como con cualquier adyuvante, será necesario determinar si tal activación puede aumentar la autoinmunidad. No obstante, este sistema puede proporcionar los medios para reforjzar la reconstitucién inmune e inmunodeficiencias u otro trans¡plante de médula ósea o de células madre. Por otra parte, mientras que la inmunoterapia adoptiva en el i trat miento de cáncer también puede ser aumentada por la I administración de IL-15/IL-15Ra, también es posible que el tratamiento con el complejo solo podría inducir la expansión suficiente de las células T específicas de antígeno endógenas, así como las células NK/NKT, para proporcionar algún nivel de protección. Estudios adicionales son necesarios para determinar el potencial para este complejo novedoso de inmunoterapia . Tabl 1. El tratamiento de° IL-15Ra/lL-15 combinado es una terapia antitumoral efectiva Te¡jido Dosis de Tratamiento . Tumor PBS IL-15 IL- 15Ra/lL-15 Hígacjlo 1x10- 2-,l;0;2- 0;3-l;3- 0 ; 0 ; 0 ; 0 ; 0 l;3-l 1;2-1;0 2x10- 2-l;4-l;2- ll-m;0; 1- 0 ; 0 ; 0 ; 0 ; 0 t La dosis indicada de melanoma B16-F1 se dio i ; intravenosamente, y uno y 10 días después los ratones se trataron intraperitonealmente con PBS, 2.5 µg de IL-15 o 2.5 µg de IL-15 + 15 µg de sIL-15Ra-Fc. .21 días después de la inoculación de tumor se estimó la carga de tumor. Tamafío de tumor: (s) ~ microscópico a 2mm; ;(m) ~ 2-5mm; (I) >5mm * Mufieron antes del análisis £ No hecho * Influye tumores en la cavidad del cuerpo incluyendo en el riñóni, páncreas, ganglios linfáticos y otros tejidos. §=sin tumorjes observados; + = 1 tumor pequeño; +++ = tumores múltiples medios a grandes; ++++ = masas de tumor grande. ' Métodos Ejemplares I Ratones. Ratones C57BL/6-Ly 5.1 se adquirieron de The ?ackson Laboratory (Bar Harbor, ME) . Ratones C57BL/6-Ly 5.2 se adquirieron de Charles River. Las líneas de ratones OT-I se propo.rcionó generosamente por el Dr . W. R. Heath (WEHI, Parkville, Australia) y el Dr . F. Carbone (Monash Medical School, Prahan, Victoria, Australia) y se mantuvieron como ' una línea C57BL/6-Ly5.2 sobre un antecedente RAG-/-. 22 ratones IL-15Ra-/- se proporcionaron generosamente por el Dr . Averil Ma (UCSF). Células del bazo de ratón IL-2Rb-/- se proporcionaron generosamente por el Dr.

Mich^el Farrar (UMINN) . Ratones transgénicos DTR fueron un i obsequio del Dr . D. Littman (Skirball Institute, NY, NY) . Los ratohes se retrocruzaron 10 veces a C57BL/6 en las instalaciones de UCONN Health C.enter. Los ratones DTR Tg+ se clasificaron mediante, PCR del DNA de extremo como es previamente descrito. Los ratones IL-7-/- se obtuvieron originalmente de DNAX Research Institute of Molecular y Cellular Biology (Palo Alto, CA) y se mantuvieron sobre un antecedente híbrido C57BL/6 x 129/Ola.

Tratamiento con IL-15. La molécula quimérica IL-15Ra-Fc de ratón recombinante se adquirió de R&D Systems, Inc. ¡ (Minneapolis, MN) . hIL-15 y rmIL-15Ra-Fc, ambos suspendidos en PBS, se mezclaron y se incubaron durante aproximadamente 30 min en aproximadamente 37 °C. Cada ratón, a menos¡ que se mencione específicamente, recibieron 2.5 µg de IL-15 y 15 µg de rmIL-15Ra-Fc en 200 ul.de PBS i.p. humano. 1 Una secuencia de DNA que codifica el dominio extrácelular de IL-15 Ra-E3 humano, que carece del exón 3 (Anderson, D. y colaboradores, 1995, J. Biol. Chem. 270:29862-29869) se fusionó al Fc etiquetado con 6X histidina de IgGl humana por la vía de un enlazador de polipéptido. La proteína quimérica se expresó en células Sf 21 utilizando sistemas de expresión de baculovirus. Masa molecular. El IL-15Ra Fc humana madura ° recombinanté es una proteína homodimérica enlazada a disulfuro. Basado en la secuenciación N-terminal, la proteína IL-15Ra humana recombinante tuvo lie 31 en el amino Terminal. El monómero IL-15Ra/Fc humano reducido tuvo una masa molecular calculada de aproximadamente 42.6, kDa. Como resultado de la glicosilación, el monómero recombinante migra como» una proteína de aproximadamente 60 -70 kf_a en SDS-PAGE ba o condiciones de reducción. Ratón. Una secuencia de DNA que codifica el péptido de señal de CD33 humano, unido con residuos de aminoácido 33 - 205 del dominio extrace(lular de ratón IL-15 Ra (Giri, J.G. y colaboradores, 1995, EMBO. 14:3654 - 3663) se fusionó a la región Fc de IgGl humana por la vía de un enlazador de polipéptido, la proteína quimérica se expresó en una línea de células de mieloma de ratón, NSO. Masa Molecular. La IL-15Ra-Fc de: ratón maduro recombinante es una proteína homodimérica i enlazada con disulfuro. Basado en la secuenciación N-termipal, la proteína IL-15Ra-Fc de ratón recombinante tuvo Gly 3¡3 en el amino Terminal. El monómero IL-15Ra-Fc de ratón reducido tuvo una masa molecular calculada de 44.9 kDa. Como resulltado de la glicosilaci'ón, la proteína recombinante migra como una proteína de aproximadamente 80 - 90 kDa en SDS-PAGE bajo condiciones de reducción. Además de la IL-15Ra-Fc de longitud completa, esta preparación también contiene una cantijdad pequeña (10%) de IL-15Ra y Fc libre generado por I segmentación proteolítica. IL-15Ra y Fc libre migra como protejínas de aproximadamente 42 kDa y 35 kDa, respectivamente, en SDS-PAGE bajo condiciones de reducción. Marcación con CFSE de células y transferencia adoptiva. Los linfocitos se aislaron del bazo y/o ganglios linfáticos periféricos (como es descrito en el aislamiento de poblajciones de linfocifcos) y se resuspendieron en HBSS (aproximadamente 1% HGPG) en lOxIO6 células/ml y luego se calentaron a 37°C. Las células se «incubaron durante aproximadamente 10 min con CFSE (0.01 mM; 'Molecular Probes, Eugene, OR) y la reacción se mezcló con HBSS con aproximadamente 1% HGPG y aproximadamente 5% FCS. Las células se la|varon dos veces con HBSS (aproximadamente 1% HGPG) . Las células marcadas con CFSE se resuspendieron (l-20xI06 células) in PBS y se inyectaron i.v. en ratones congenióos. Las células se aislaron en los tiempos indicados y se analizaron para la presencia de células donadoras utilizando el efetado de alelo CD45 y su expresión de marcadores de superficie y la intensidad de CFSE. Aislamiento de poblaciones de linfocito y análisis de inmunofluorescencia. Suspensiones de células individuales se ciearon HBSS (con aproximadamente 1% HGPG) al homogenizar bazos usando platinas de vidrio congeladas. Glóbulos rojos se Usaron y los esplenocitos se filtraron a través de Nitex. En los puntos de tiempo indicados, los linfocitos se aislaron y las células marcadas con CFSE donadoras se detectaron utilizando su estado *de alelo CD45 o células donadoras específicas de OVA se detectaron utilizando un tetrámero H-2 kb que contiene el péptido derivado de OVA SIINFEKL producido i como es descrito previamente. Para el manchado, los linfocitos se suspendieron en PBS/aproximadamente 0.2% BSA/^proximadamente 0.1% NaN3 (solución reguladora FACS) a una concentración de aproximadamente 3-15xl06/200 µl. Cuando se manchó para el tetrámero, las células se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora con APC de OVA-tetrámero más la dilución apropiada de PerCp anti-CD8.

Las células se lavaron con la solución reguladora FACS y se I mancharon con PE anti-CD44 en aproximadamente 4°C durante aproximadamente 20 min, se lavaron y luego se fijaron en PBS con aproximadamente 3% de paraformaldehído. Las intensidades I de fluorescencia relativa se midieron con FACScalibur (BD BiosCiences, San José, CA) . Los datos se analizaron utilizando el Software FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA) . Ensayo de citotoxicidad in vivo. Este ensayo se realizó esencialmente como es descrito previamente. Las células del bazo normales se marcaron a niveles de CFSE bajo (aproximadamente 0.25 um) o alto (aproximadamente 2.5 um) y las délulas CFSEhigh se incubaron con aproximadamente 1 µg/ml de péptido SIINFEKL durante aproximadamente 45 min en aproximadamente 37°C. Números iguales (lOxlO6) de cada pobl ción se mezclaron y se inyectaron i.v. en ratones ¡ transferidos con OT-I que fueron ya sea no tratados o que se trataron con IL-15/IL-15Ra o se infectaron con lxlO5 pfu de virus de estomatitis vesicular que expresa ovalbúmina de pollo cuatro días anteriormente. Cuatro horas después, las células del bazo se analizaron para la presencia de poblaciones CFSEhigh y CFSElow. Por ciento de lisis = [1 - (relación . no ' cebada/rela'ción cebada)] x 100. Relación = por ciento de CFSElow/por ciento de CFSEhigh. Detección intracelular de IFN-g. Los linfocitos se aislaron del bazo y se cultivaron durante aproximadamente 5 h con proximadamente 1 µg/ml de Golgistop (BD PharMingen) , con o cojn aproximadamente lµg/ml del péptido derivado de OVA SIINFEKL. Después del cultivo, las células se mancharon para las moléculas de superficie, luego se fijaron, y las i membranas celulares se permeabilizaron en solución de cito^ix/citoperma (BD PharMingen) y se mancharon con anti-IFN-fPE o IgGl PE de rata de control. Las células luego se lavaron y la intensidad de fluorescencia se midió sobre un FACS?alibur. ¡ Quimeras de médula ósea. Fémures y tibias se tomaron de ratones CDllc-DTR Tg+ o camadas sin Tg. La médula ósea (BM) se aspiró con una jeringa y se pasó a través de una malla de nylon de 70 um para generar una suspensión de célula individual. Glóbulos rojos (RBC) se lisaron y las células se resuspendieron en HBSS suplementado con HEPES, L-glutamine, penipilina, estreptomicina, sulfato de gentamicina (HBSS-HGPG¡) . Para remover las células T maduras de la BM, las célufas se incubaron con fluido de ascitis anti-Thyl (T24), se lavaron una vez en HBSS-HGPG luego se incubaron con complemento de conejo' Low-Tox-M (Cedarlane Laboratories, Ontario, Canadá) durante aproximadamente 45 min, en aproximadamente 37 °C. Los ratones B6 recipientes CD45.1 se irradiaron (aproximadamente 1,000 rad) antes de que aproximadamente 2-5xl06 células de médula ósea se transfirieran i.v. Los ratones se dejaron reposar 8 semanas antes¡ del uso. La toxina de difteria (Sigma, St Louis, MO) en PBS e administré i.p. a ratones en aproximadamente 4 g/g de peso ¡del cuerpo. Las quimeras recibieron DT un día antes del tratamiento con citoquina, una dosis justo antes del tratamiento con citoquina y una dosis final en el día tres de ¡ post-¡tratamiento con citoquina.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un complejo de polipéptido, caracterizado porque compr¡ende un polipéptido de interleucina o porción del mismo, y un1 polipéptido de receptor de interleucina o porción del mismF capaz de enlazar el polipéptido de interleucina, y en donde el componente de polipéptido de interleucina y el compfnente de polipéptido de receptor de interleucina están preacoplados .
2. El complejo de polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de interleucina o porcién del mismo tiene una estructura de aminFácidos primaria con por lo menos aproximadamente 40% de homología a un miembro seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5, 6, 10, 12, y combinaciones de las mismas.
3. El complejo de polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, _ caracterizado porque la porción de polipéptido de interleucina además comprende una secuencia de péptido de señal so'bre el amino terminal.
4. El complejo de polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el receptor de interleucina o porción del mismo comprende un anticuerpo específico para interleucina o un polipéptido con una estructura -de aminoácidos primaria con por lo menos 40% de homología de un miembro seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 11,' porciones y combinaciones de las mismas .
5. El complejo de polipeptido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el componente de receptor de interleucina ademas comprende una porción Fc de anticuerpo .
6. El complejo de polipeptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo pretiene una vida media ín vivo de por lo menos una
7. El complejo de polipeptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo comprende i un polipeptido de interleucina o porción del mismo y un i polipjeptido de receptor de interleucina o porción del mismo dentrfo de una sola cadena de polipeptido. i 8. Un acido nucleico que codifica el complejo de polipeptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un segmento polmucleótido con por ¡ lo menos 40% de homología a un acido nucleico i selepcionado del grupo que consiste de SEQ ID NO:l, 2, 14, i 15, porciones y combinaciones de las mismas, contiguo con un segmento de polmucleotido que tiene por lo menos 40% de homología a un acido nucleico seleccionado del grupo que I consiste de SEQ ID NO: 3, 4, 13, 16, porciones y combinaciones de l s mismas, en donde el polinucleotido de interleucina, y el pflinucleotido de receptor de ínterleucma son capaces de ser expresados como un solo polipéptido. 9. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque además comprende un segmento de polinucleótido que codifica una porción Fc de antipuerpo. 10. Una célula hospedera aislada, caracterizada porque contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9. 11. Un método para hacer un complejo de I polipéptido, caracterizado porque comprende las etapas de: proporcionar un polipéptido de interleucina o porción del mismo; proporcionar un polipéptido de receptor de interleucina o porción del mismo capaz de enlazar la interleucina; y combinar e incubar el polipéptido de interleucina y el polipéptido receptor de interleucina durante aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 120 minutos, en aproximadamente 26°C a aproximadamente ' 40°C, en una solución reguladora adecuada que tiene un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 8.5. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, ¡caracterizado porque el polipéptido de interleucina o porción del mismo tiene por lo menos 40% de homología a un miembro seleccionado del 'grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5, 6, 10, 12, y combinaciones de las mismas, y en donde el i polipeptido de receptor de interleucina o porción del mismo tiene por lo menos 40% de homología a un miembro seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 11, y combinaciones de las mismas. 13. Un método para incrementar la actividad de una célula inmune, caracterizado porque comprende tratar una célula inmune con una cantidad efectiva del complejo de polipéptido de la reivindicación 12. 14. Un método para modular la función inmune en un organismo, caracterizado porque comprende las etapas de: proporcionar el complejo de polipéptido de la reivindicación 12; y administrar una cantidad efectiva del complejo de polipéptido en una forma farmacéuticamente aceptable a un organismo en necesidad del mismo. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el complejo de polipéptido aumenta la función inmune en el organismo. 16. El método de conformidad con la reivindicación 14, Caracterizado porque el complejo de polipéptido inhibe la solución inmune en el organismo. 17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el complejo de polipéptido resultante exhibe una vida media in vivo de mayor que aproximadamente 1 hora. 18. El complejo de polipéptido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el complejo es contenido en un equipo que comprende un contenedor adecuado, el Complejo de polipéptido dispuesto en el mismo, e instrucciones para su uso. 19. El complejo de polipéptido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque una cantidad efectiva del complejo se administra a un organismo en necesidad del mismo a una dosis que es equivalente de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 90% de la dosis administrada utilizando interleucina sola. 20. Un método para modular la respuesta inmune en un organismo, caracterizado porque comprende la admihistración de una cantidad efectiva de un complejo de polipéptido pre-acoplado que comprende una porción de ¡ ' polipéptido de interleucina derivada de la SEQ ID NO: 6, y una porción de polipéptido de receptor de interleucina derivada de lia SEQ ID NO: 7, en donde la porción de polipéptido de recetor de interleucina derivada de la SEQ ID NO: 7 es capaz de enlazar la porción de polipéptido de interleucina derivada de lá SEQ ID NO: 6. REFERENCIAS Las siguientes referencias se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos . 1. Gifabstein, K. H . y colaboradores, Cloning of a T cell growth factor that interacts with the beta chain of the interleukin- i 2 receptor. Science 264, 965-968 (1994). 2. 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