CN115023444A - 新型il2激动剂及其使用方法 - Google Patents

新型il2激动剂及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115023444A
CN115023444A CN202080088389.3A CN202080088389A CN115023444A CN 115023444 A CN115023444 A CN 115023444A CN 202080088389 A CN202080088389 A CN 202080088389A CN 115023444 A CN115023444 A CN 115023444A
Authority
CN
China
Prior art keywords
agonist
domain
mage
antigen
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080088389.3A
Other languages
English (en)
Inventor
J.吴
T.张
M.d.P.莫利纳-波特拉
E.史密斯
C-Y.林
T.米格尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of CN115023444A publication Critical patent/CN115023444A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/50—Colon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/55—Lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464436—Cytokines
    • A61K39/46444—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/084—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本公开涉及具有改善的治疗特性的IL2激动剂。

Description

新型IL2激动剂及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年12月20日提交的美国临时申请第62/951,831号的优先权权益，该临时申请的内容以整体引用的方式并入本文。
2.序列表
本申请含有序列表，该序列表已经按ASCII格式以电子方式递交，并因而在此以整体引用的方式并入。所述ASCII副本创建于2020年12月18日，命名为RGN-006C-WO_SL，且大小为162,034字节。
3.发明背景
白介素2(IL-2或IL2)是主要由CD4+辅助T细胞产生的多能细胞因子。其刺激T细胞的增殖和分化、诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的生成以及外周血液淋巴细胞分化成细胞毒性细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、促使T细胞表达细胞因子和细胞溶解分子、促进B细胞的增殖和分化以及B细胞合成免疫球蛋白，并刺激自然杀伤(NK)细胞的生成、增殖和激活(参见Waldmann,2009,Nat Rev Immunol 6:595-601和Malek,2008,Annu Rev Immunol26:453-79)。
IL2有三种不同的受体：高亲和力受体，中亲和力受体和低亲和力受体。高亲和力受体具有三个亚基：白介素2受体α(IL-2Rα；CD25)、白介素2受体β(IL-2Rβ；CD122)，以及白介素2受体γ(IL-2Rγ；CD132；共享γ链)。低亲和力受体是IL-2Rα，其为55kD的多肽(p55)，在T细胞激活后出现且先前被称为Tac(用于T细胞激活)抗原。IL-2Rα以约10-8M的KD结合IL2。IL2与仅表达IL-2Rα的细胞的结合不会导致任何可检测的生物学应答。
中亲和力受体由IL-2Rβ和IL-2Rγ组成。IL-2Rβ是I型细胞因子受体家族的成员，其特征在于两个半胱氨酸/WSXWS基序(SEQ ID NO:1)。IL-2Rγ是64kD的多肽，也被称为共享γ链，因为其由多种细胞因子受体(包括白介素-4和白介素-7的受体)所共有。中亲和力受体还介导白介素15(IL-15或IL15)信号传导。
静息的免疫细胞被认为仅表达中亲和力受体。在抗原受体介导的免疫细胞(例如静息T细胞)激活后，IL-2Rα得到迅速地表达。一旦IL-2Rα结合IL2，其随后相继接合IL-2Rβ和IL-2Rγ。通过STAT5和IL2介导的生长刺激，尤其是破坏受病毒感染的细胞和肿瘤细胞的效应T细胞的生长刺激，IL-2Rαβγ复合体与IL2结合会导致信号转导。
除了其对效应T细胞的刺激作用外，IL2还在T细胞中介导激活诱导的细胞死亡(AICD)(Lenardo等人,1991,Nature 353:858-61)。AICD是完全激活的T细胞经历程序性细胞死亡的过程，不仅导致对已建立的正常自身抗原的耐受性，而且导致对持久性抗原(如肿瘤抗原)的耐受性。
IL2也参与外周CD4+CD25+调节性T(Treg)细胞的维持(参见例如Fontenot等人,2005,Nature Immunol 6:1142-51)，Treg细胞也被称为抑制性T细胞。它们抑制效应T细胞破坏其(自身)靶标，通过抑制T细胞辅助和激活的细胞间接触，或通过释放免疫抑制性细胞因子如IL-10或TGFβ。已证实，Treg细胞的耗竭会增强IL2诱导的抗肿瘤免疫力(Imai等人,2007,Cancer Sci 98:416-23)。
由于IL2的多效性作用，其并非抑制肿瘤生长的最佳选项。IL2作为抗肿瘤药剂的用途已经由伴随肿瘤反应所需的剂量的严重毒性所限制。
Figure BDA0003700122800000021
(购自PrometheusLaboratories,San Diego,加利福尼亚)是重组形式的IL2，经批准用于治疗转移性黑色素瘤和转移性肾癌，但其副作用非常严重，因此仅建议在有重症监护的医院环境中使用。接受高剂量IL2治疗的患者经常会遭受严重的心血管、肺、肾、肝、胃肠、神经学、皮肤、血液学和全身性不良事件，需要加强监测和住院管理。IL2疗法的主要副作用是血管渗漏综合征(VLS)，其导致组织液在肺和肝中积聚，从而导致肺水肿和肝损伤。除了停用IL2外，没有其他可用于VLS的治疗方法。已经在患者中测试了低剂量IL2方案以避免VLS，然而代价为治疗效果欠佳。已经证实IL2诱导的肺水肿是因为IL2直接结合至表达低至中水平的功能性高亲和力IL2受体的肺内皮细胞所引起的(Krieg等人,2010,Proc Nat Acad Sci USA107:11906-11)。
为了降低IL2癌症疗法的毒性，已经生成了多种IL2变体。主要的方法是生成允许IL2结合至中亲和力受体但不利于IL2与CD25缔合(因此称为偏好CD122的)的IL2分子。这种方法的原理有两个方面。首先，CD25在Treg细胞上显著表达，过量的CD25在此可以充当槽(sink)，从而将IL2带离效应T细胞。其次，介导VLS的内皮细胞表达CD25。理论上，减少结合至CD25(IL-2Rα)可以将IL2信号重定向至效应T细胞，进而提升抗肿瘤功效，并降低VLS，从而降低毒性。得到偏好CD122的IL2制剂的策略包括，例如定向CD122的IL2复合体(其中抗IL2单克隆抗体覆盖了CD25结合位点)、在CD25结合位点具有突变的IL2突变蛋白(mutein)、以及在CD25结合位点处带有聚乙二醇(PEG)基团的IL2。Onur和Arenas-Ramirez,2019,Swiss Med Wkly 149:w14697。
尽管普遍接受开发用于癌症疗法的定向CD122的IL2疗法的领域，但出人意料地发现，此类分子具有较差的癌症疗法治疗指数，并且需要较高的毒性剂量才能产生适度的抗癌作用。
因此，本领域需要具有改善的治疗功效和安全性的新型IL2疗法。
4.发明概述
本公开源自有关影响抗肿瘤功效的IL2分子的活性的许多发现。如本文所示，即使在导致明显毒性的高剂量下，定向CD122的IL2分子出人意料地仅具有适度的抗肿瘤功效。这可以由许多其他发现来解释。首先，发明人发现，尽管定向CD122的IL2分子被设计成相对于Treg细胞优先扩增NK和CD8+T细胞，但其主要在血液和脾脏中如此，在肿瘤中的程度要小得多，相比之下，野生型IL2优先在肿瘤中扩增CD8+T细胞但在外周组织中不如此。另外，由偏好CD122的IL2分子所扩增的CD8+T细胞大多是CD44+CD62L+中央记忆样T细胞且缺乏对肿瘤细胞的特异性，而野生型IL-2可扩增CD44+CD62L-效应CD8+T细胞。因此，相对于野生型IL2来说，这些分子的抗肿瘤功效降低了。此外，发明人已经发现，肿瘤Treg细胞对IL2的反应性低于血液Treg细胞和脾脏Treg细胞。因而，可以通过将此类非CD122定向形式的IL2引导至肿瘤(在肿瘤中，Treg对IL2的反应性较低且IL2优先扩增CD8+T细胞)来减轻IL2癌症疗法的非CD122定向形式的不利影响。
此外，本发明人发现，具有不同程度受体衰减的多种IL2分子的治疗指数可以通过如下方式改善：适当平衡IL2激动剂定位于感兴趣的位点或细胞类型(例如，一般的肿瘤环境或特异性的肿瘤反应性T细胞)的能力并调节IL2组分在感兴趣的位点和/或直到它到达感兴趣的位点或细胞类型的水平活性。
基于前述发现，发明人已经开发出IL2分子(在本文中称为IL2激动剂)，据信其比目前正在开发用于治疗癌症的定向CD122的IL2分子更为有效。本公开的IL2激动剂不定向至CD122，并且在一些情况下，具有减少或最少的CD122结合。本公开的IL2激动剂具有IL2部分和(1)任选的肿瘤靶向部分，和/或(2)任选的多聚化(例如二聚化)部分，和/或(3)任选的稳定化部分。肿瘤靶向部分(例如抗体的抗原结合结构域“(ABD”))可以例如结合至存在于肿瘤表面(例如，肿瘤相关抗原)、肿瘤微环境和/或肿瘤反应性淋巴细胞上的靶分子。
可用于本公开的IL2激动剂的IL2部分描述于第6.3节中。
可用于本公开的IL2激动剂的靶向部分描述于第6.4节中。
可用于本公开的IL2激动剂的多聚化部分描述于第6.5节中。
可用于本公开的IL2激动剂的稳定化部分描述于第6.6节中。
本公开的IL2激动剂的各种示例性构型描述于下文具体实施方案1至166、199至258和267至322中。可用于连接本公开的IL2激动剂的不同组分的接头描述于第6.7节中。
本公开进一步提供编码本公开的IL2激动剂的核酸。编码IL2激动剂的核酸可以是单个核酸(例如，编码IL2激动剂的所有多肽链的载体)或多个核酸(例如，两个或更多个编码IL2激动剂的不同多肽链的载体)。本公开进一步提供经工程改造以表达本公开的核酸和IL2激动剂的宿主细胞和细胞系。本公开进一步提供产生本公开的IL2激动剂的方法。示例性的核酸、宿主细胞、和细胞系、以及产生IL2激动剂的方法描述于下文第6.8节和具体实施方案167至169、259至261和323至325中。
本公开进一步提供包含本公开的IL2激动剂的药物组合物。示例性的药物组合物描述于下文第6.9节和具体实施方案170、262和326中。
本文还提供使用本公开的IL2激动剂和药物组合物，例如用于治疗癌症和免疫病症的方法。示例性方法描述于第6.10节中。本公开的IL2激动剂可用于组合疗法中，例如作为CART疗法的辅助。示例性组合疗法公开于6.11中。本公开的治疗方法的具体实施方案描述于下文具体实施方案171至198、263至266和327至346中。
5.附图说明
图1示出了IL2和IL15信号传导通路，其具有独特的受体亚基，但是具有共同的β/γ受体亚基。
图2A-2D示出了抗原经由I类MHC复合体(图2A)和II类MHC复合体(图2B)通过抗原呈递细胞呈递给T细胞，以及T细胞受体复合体通过MHC-肽复合体的激活(图2C-2D)。
图3A-3B显示了由两个不同物种的含IL-2Rα的IL2突变蛋白形成的不同结构之间的平衡。
图4A-4C显示了IL2M1针对人PBMC的活性。IL2M1针对IL-2Rα+Treg具有降低的活性(图4A)，但其针对IL-2Rα-CD8+T细胞(图4B)和NK细胞(图4C)保持了完全活性。
图5A-5D显示了IL2M1在体内相对于Treg(图5A)选择性扩增NK细胞(图5B)和CD8+T细胞(图5C-5D)，而IL2M0(在图中称为IL2-Fc)优先扩增Treg(图5A-5D)。
图6A-6B显示了用IL2突变蛋白及/或抗PD1抗体处理的小鼠的平均肿瘤体积(mm3+SD)(图6A)和Kaplan-Meier生存曲线(图6B)。
图7A-7C.5显示了IL2M0(在图中称为IL2-Fc)以剂量依赖的方式诱导抗肿瘤应答。
图8A-8C显示了IL2M1的适度抗肿瘤功效(图8A，8B)和伴随的明显毒性(图8C)。
图9A-9C.4显示了IL15M1的适度抗肿瘤功效(图9A)和伴随的明显毒性(图9B)，以及由IL15M1诱导的外周免疫细胞谱(图9C.1-9C.4)。
图10A.1-10R显示了IL2M0(在图中称为IL2-Fc)和IL2M1对肿瘤内淋巴细胞和外周淋巴细胞增殖的活性。
图11A-11B显示了脾脏浸润性Treg和CD8+T细胞与肿瘤浸润性Treg和CD8+T细胞的差异性IL2反应性。
图12A-12D显示，IL2M2和IL2M3在人PBMC的多个淋巴细胞群中展现出减弱的活性(图12A至图12C)以及降低的体内毒性(图12D)。图12A至图12C的结果是用IL2M2和IL2M3蛋白获得的，而图12D的结果是基于通过流体动力学DNA递送(“HDD”“)来体内施用编码IL2M2和IL2M3的核酸。
图13A-13C显示，IL2M2在多个同基因小鼠肿瘤模型中作为单一药剂展示出抗肿瘤功效。IL2M2经由流体动力学DNA递送(HDD)(图13A和13B)或作为经纯化蛋白质递送(图13C)。
图14A-14C显示了IL2M4和IL2M5对人PBMC的不同淋巴细胞群的活性。
图15A-15D显示了IL2M5的抗肿瘤功效。
图16A-16B显示了IL2M2(图16A)相对于IL2M3(图16B)的SEC-MALS研究的结果，其中IL2M2主要由高阶寡聚物组成，IL2M3主要作为Fc同二聚体存在，据信是IL2结构域相对于Fc结构域的取向和/或连接这些结构域的接头的长度所致。
图17显示了抗PD1和T1-IL2M3对HEK293-mPD1细胞的FACS结合结果。
图18A-18E.2显示了T1-IL2M3的抗肿瘤功效优于抗PD1和非靶向IL2M3的组合(图18A-18B.4)，且T1-IL2M3扩增PD1+的效应CD8+T细胞，同时与非靶向的IL2M3相比导致Treg的较少扩增(图18C.1-18E.2)。
图19显示了如下示意图：(a)IL-2由IL-2Rαβγ复合体结合，导致通过STAT5的信号转导和强烈的细胞激活(图左侧)，(b)抗PD1-IL2突变蛋白3融合物以低水平结合至不存在细胞表面表达的PD-1的淋巴细胞和内皮细胞上的IL-2Rαβγ复合体，导致那些细胞的低活化或不活化(图中两条虚线之间的中间部分)，和(c)抗PD1-IL2突变蛋白3融合物结合至细胞表面表达PD-1的肿瘤特异性T细胞上的IL-2Rαβγ复合体，导致持续的信号传导和T细胞激活。
图20A-20D显示了抗mPD1-IL2突变蛋白3融合物在鼠类同基因肿瘤模型中的抗肿瘤功效：肺(图20A)；皮肤(图20B)；乳房(图20C)；和结肠(图20D)。
图21A-21B显示了抗LAG3-IL2突变蛋白3融合物的抗肿瘤功效(图21A)和抗LAG3-IL2突变蛋白3融合物与抗mPD1抗体组合的抗肿瘤功效(图21B)。
图22A.1-22B显示了单链肽-MHC靶向的IL2突变蛋白的同二聚体和异二聚体实施方案(图22A.1-22A.2)，并且研究结果证明单链肽-MHC靶向的IL2突变蛋白融合物允许选择性刺激抗原特异性小鼠CD8+T细胞(图22B)。
图23A-23B显示了单链肽-MHC靶向的IL2突变蛋白对不表达抗原特异性TCR的非CD8+T细胞的活性。不同的突变蛋白显示出难以区分的活性。
图24显示了CMV抗原特异性人CD8+T细胞受到具有肽-MHC靶向部分的单链IL2突变蛋白的选择性刺激。
图25A-25C显示了嵌合抗原受体(CAR)的示意图，该CAR包含识别本文中称为T3的肽-MHC靶向部分的VL-VH scFv、人CD8a铰链和跨膜(TM)结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3z信号传导结构域、和用于追踪经CAR转导的T细胞的P2A：eGFP序列(图25A)，以及在扩增之后活CAR-T细胞的频率和组成(图25B-25C)。
图26A-26B示出了具有肽-MHC靶向部分的二价靶向IL2突变蛋白T2-IL2M6和T3-IL2M6(图26A)以及单价靶向IL2突变蛋白T7-IL2M7和T8-IL2M7(图26B)的结构。
图27A-27B显示了表达CAR的CD4+(图27A)和CD8+(图27B)T细胞通过图26A与图26B中所示肽-MHC靶向IL2突变蛋白的STAT5刺激。
图28A.1-28C显示了CAR-T通过具有由CAR的scFV识别的靶向部分的单价IL2突变蛋白的选择性富集。图28A.1-28A.16显示了如通过流式细胞术所测定的，在应答负载有HLA-A2的单价单链肽的扩增期间，CAR-T细胞被富集的频率。所有生物制剂维持在3.3×10-10M的浓度。图28B.1-28B.4显示，在应答负载有融合至经减弱IL(2m)的HLA-A2的单价单链肽(空心圆形)的扩增期间，CAR阳性/CAR阴性比率选择性地增加。重组IL2(Aldesleukin)产生最大数量的总T细胞，但相对于负载有融合至经减弱IL2(2m)的HLA-A2的单链肽，CAR-T富集程度较小。图28C显示，使用负载有融合至经减弱IL2(2m)的HLA-A2单链肽(空心圆形)来扩增CAR-T，产生最大数量的活CAR-T。
图29显示了在免疫活性(C57BL/6J)小鼠和免疫缺陷(NOD.Scid.IL2Rgnull)小鼠中，单价和二价靶向的经减弱的IL2突变蛋白的体内PK评估结果。相对于融合至Fc的hIL2(IL2-Fc)，二价和单价突变蛋白都显示出延迟的清除。小鼠注射各种生物制剂，并在给药后2、24、48和72小时收集血液样品。通过蛋白质印迹法研究了血浆中Fc融合蛋白的药物动力学。感兴趣的蛋白质由黑框表示。
6.发明详述
6.1定义
约、近似：在整个说明书中，在数字前使用术语“约”“近似”或类似用语来表示该数字不一定是准确的(例如，考虑到分数、测量精准度及/或精确度的偏差、时间等)。应理解，当X是数字时，“约X”或“近似X”的公开也是“X”的公开。因此，例如其中一个序列与另一个序列具有“约X％序列一致性”的实施方案的公开也是其中该序列与另一个序列具有“X％序列一致性”的实施方案的公开。
和、或：除非另有说明，否则“或”连接词应按其正确的含义作为布尔逻辑运算符来使用，涵盖择一选定特征(A或B，其中A的选择与B互斥)，以及联合选定特征(A或B，同时选择了A和B)。在文中的某些地方，术语“和/或”用于相同目的，不应解释为暗示“或”是指互斥的选择。
抗原结合结构域或ABD：如本文所用，术语“抗原结合结构域”或“ABD”是指能够与靶分子特异性、非共价且可逆结合的靶向部分的部分。
缔合的(associated)：在IL2激动剂或其组分(例如，靶向部分如抗体)的上下文中，术语“缔合的”是指两个或更多个多肽链之间的功能性关系。特别地，术语“缔合的”是指两个或更多个多肽彼此缔合，例如通过分子相互作用非共价缔合或通过一个或多个二硫键或化学交互键联共价缔合，从而产生功能性IL2激动剂。可以存在于本公开的IL2激动剂中的缔合的实例包括(但不限于)Fc区中同二聚化Fc结构域或异二聚化Fc结构域之间的缔合、Fab或scFv中VH和VL区之间的缔合、Fab中CH1与CL之间的缔合、以及结构域经取代的Fab中CH3和CH3之间的缔合。
二价：如本文提及IL2激动剂中的IL2部分和/或靶向部分时所用，术语“二价”是指分别具有两个IL2部分和/或靶向部分的IL2激动剂。通常，对IL2部分和/或靶向部分为二价的IL2激动剂是二聚体(同二聚体或异二聚体)。
癌症：术语“癌症”是指由异常细胞不受控制(且通常迅速)的生长表征的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例，且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、肾上腺癌、自主神经节癌、胆道癌、骨癌、子宫内膜癌、眼癌、输卵管癌、生殖道癌、大肠癌、脑膜癌、食道癌、腹膜癌、垂体癌、阴茎癌、胎盘癌、胸膜癌、唾液腺癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、上呼吸消化道癌、泌尿道癌、阴道癌、外阴癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
互补决定区或CDR：如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。大体上，每个重链可变区有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、HCDR-H3)，而每个轻链可变区有三个CDR(CDR1-L1、CDR-L2、CDR-L3)。可用于识别CDR边界的示例性惯例包括，例如Kabat定义、Chothia定义、ABM定义和IMGT定义。参见，例如Kabat,1991,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(Kabat编号方案)；Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.273:927-948(Chothia编号方案)；Martin等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(ABM编号方案)；与Lefranc等人,2003,Dev.Comp.Immunol.27:55-77(IMGT编号方案)。公用数据库也可用于鉴定抗体内的CDR序列。
EC50：术语“EC50”是指分子(如IL2激动剂)的半最大有效浓度，该浓度在指定的暴露时间后引起基线和最大值之间一半的反应。EC50本质上代表抗体或IL2激动剂在可观察到其最大作用的50％的浓度。在某些实施方案中，EC50值等于在如第7.1.2节中所述测定中，提供半最大STAT5激活的IL2激动剂的浓度。
表位：表位或抗原决定簇是由如本文所述的抗体或其他抗原结合部分所识别的抗原(例如靶分子)的一部分。表位可以是线性的或构象的。
Fab：在本公开的靶向部分的上下文中，术语“Fab”是指一对多肽链，第一多肽链包含在第一恒定结构域(本文称为C1)N端的抗体的可变重链(VH)结构域，而第二多肽链包含在第二恒定结构域(本文称为C2)N端能够与第一恒定结构域配对的抗体的可变轻链(VL)结构域。在天然抗体中，VH在重链的第一恒定结构域(CH1)的N端，而VL在轻链的恒定结构域(CL)的N端。本公开的Fab可以根据天然取向来排列，或者可以包括有助于VH和VL正确配对的结构域取代或交换。例如，可以用CH3-结构域对来取代Fab中的CH1和CL结构域对，以促进异二聚体分子中经修饰的Fab链正确配对。也可以反转CH1和CL，使得CH1连接到VL，而CL连接到VH，这种构型通常称为Crossmab。
Fc结构域和Fc区：术语“Fc结构域”是指重链的一部分，其与另一条重链的相应部分配对。术语“Fc区”是指通过两个重链Fc结构域缔合形成的基于抗体的结合分子的区域。Fc区内的两个Fc结构域可能相同或彼此不同。在天然抗体中，Fc结构域通常是相同的，但是一个或两个Fc结构域可以受到有利地修饰例如经由杵臼(knob-in-hole)相互作用而允许异二聚化。
宿主细胞：如本文所用，术语“宿主细胞”是指已经引入本公开的核酸的细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可互换使用。应理解，这些术语是指特定的受试者细胞以及此细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响，某些修饰可能会在后代中发生，因此这样的后代实际上可能与亲代细胞不同，但仍包括在本文所用术语的范畴内。典型的宿主细胞是真核宿主细胞，诸如哺乳动物宿主细胞。示例性真核宿主细胞包括酵母和哺乳动物细胞，例如脊椎动物细胞，如小鼠、大鼠、猴或人细胞系，例如HKB11细胞、PER.C6细胞、HEK细胞或CHO细胞。
IL2突变蛋白(mutein)：是具有IL2活性的变体IL2分子。该变体可以是IL2融合蛋白(例如，融合至IL-2Rα的IL2)和/或突变IL2(例如，相较于野生型IL2具有一个或更多个氨基酸取代)。与野生型IL2相比，IL2突变蛋白可以具有改变的功能(例如受体结合、亲和力、细胞因子活性)和/或改变的药物动力学。尽管在本公开的IL2激动剂的上下文中，术语“IL2突变蛋白”有时是指IL2分子的非靶向组分(和缔合的接头部分)，并应理解，除非上下文另有说明，否则术语“IL2突变蛋白”涵盖具有或不具有靶向部分以及具有或不具有多聚化部分的IL2分子。
主要组织相容性复合体和MHC：这些术语是指天然存在的MHC分子，MHC分子的单独链(例如MHC I类α(重)链、β2微球蛋白、MHC II类α链和MHC II类β链)，MHC分子的此类链的单独亚基(例如MHC I类α链的α1、α2和/或α3亚基、MHC II类α链的α1-α2亚基，MHC II类β链的β1-β2亚基)及其部分(例如肽结合部分，例如肽结合沟)、突变体和各种衍生物(包括融合蛋白)，其中这样的部分、突变体和衍生物保留展示由T细胞受体(TCR)(例如抗原特异性TCR)识别的抗原肽的能力。MHC I类分子包含肽结合沟，其由重链的α1和α2结构域所形成，可容纳约8-10个氨基酸的肽。尽管两类MHC均结合肽内约9个氨基酸(例如，5至17个氨基酸)的核心，但MHC II类肽结合沟(II类MHCα多肽的α1结构域与II类MHCβ多肽的β1结构域缔合)的开放端性质允许更宽范围的肽长度。结合MHC II类的肽的长度通常在13至17个氨基酸之间变化，但更短或更长的长度并不罕见。因而，肽可能在MHC II类肽结合沟内移动，从而改变了在任何给定时间直接位于沟内的9-mer。本文使用了特定MHC变体的常规鉴定。该术语涵盖“人白血球抗原”或“HLA”。
单价：如本文提到IL2激动剂的IL2部分和/或靶向部分时所用，术语“单价”表示仅分别具有单个IL2部分和/或靶向部分的IL2激动剂。通常，对于IL2部分和/或靶向部分为单价的IL2激动剂是单体或异二聚体。
可操作地连接：如本文所用，术语“可操作地连接”是指多肽链的两个或更多个区域之间的功能性关系，其中两个或更多个区域相连接以产生功能性多肽或两个或更多个核酸序列，例如产生两个多肽组分的框内融合或将调节序列连接至编码序列。
肽-MHC复合体、pMHC复合体、沟中肽：(ⅰ)MHC结构域(例如人MHC分子或其部分(例如其肽-结合沟，以及例如其细胞外部分)、(ii)抗原肽，和任选地(ⅲ)β2微球蛋白结构域(例如人β2微球蛋白或其部分)，其中该MHC结构域、抗原肽和任选的β2微球蛋白结构域以允许特异性结合至T细胞受体的方式复合。在一些实施方案中，pMHC复合体包含至少人HLA I类/人β2微球蛋白分子和/或人HLA II类分子的细胞外结构域。
单链Fv或scFv：如本文所用，术语“单链Fv”或“scFv”指包含抗体的VH结构域和VL结构域的多肽链，其中这些结构域存在于单个多肽链中。
特异性(或选择性)结合：如本文所用，术语“特异性(或选择性)结合”表示靶向部分(例如抗体或其抗原结合结构域“(ABD”))与靶分子形成复合体，该复合体在生理条件下是相对稳定的。特异性结合可以表征为Kd为约5×10-2M或更小(例如小于5×10-2M、小于10- 2M、小于5×10-3M、小于10-3M、小于5x10-4M、小于10-4M、小于5x10-5M、小于10-5M、小于5x10-6M、小于10-6M、小于5x10-7M、小于10-7M、小于5x10-8M、小于10-8M、小于5x10-9M、小于10-9M或小于10-10M)。用于确定抗体或抗体片段(例如IL2激动剂或组分靶向部分)对靶分子的结合亲和力的方法是本领域众所周知的，且包括例如平衡透析、表面等离子共振(例如Biacore测定)、荧光激活细胞分选(FACS)结合测定等。然而，包含特异性地结合来自一个物种的靶分子的靶向部分或其ABD的本公开的IL2激动剂可能与来自一个或更多个其他物种的靶分子具有交叉反应性。
受试者：术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬虫动物。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
靶分子：如本文所用，术语“靶分子”是指在细胞表面上或细胞外基质中表达的任何生物分子(例如蛋白质、碳水化合物、脂质或其组合)，其可由本公开的IL2激动剂中的靶向部分特异性结合。
靶向部分：如本文所用，术语“靶向部分”是指可以结合至本公开的IL2激动剂所定位之处(例如在肿瘤细胞上或在肿瘤微环境中的淋巴细胞上)的细胞表面或细胞外基质分子的任何分子或其结合部分(例如免疫球蛋白或抗原结合片段)。除了将IL2激动剂定位到特定位点之外，靶向部分还可以具有功能活性。例如，作为抗PD1抗体或其抗原结合部分的靶向部分也可以通过抑制PD1信号传导由IL2突变蛋白展现出抗肿瘤活性或增强抗肿瘤活性。
处理、疗法、治疗：如本文所用，术语“处理”、“疗法”和“治疗”是指施用本公开的一个或多个IL2激动剂而导致的增生性疾病的进展、严重性和/或持续时间的减少或改善，或增生性病症的一种或多种症状(优选地一种或多种可辨别的症状)的改善。在具体实施方案中，术语“处理”、“疗法”和“治疗”是指改善增生性病症的至少一种可测量物理参数，如肿瘤的生长，该参数不必然由患者所察觉。在其他实施方案中，术语“处理”、“疗法”和“治疗”是指在物理上通过例如稳定可辨别的症状、生理上通过例如稳定物理参数、或两者来抑制增生性病症的进展。在其他实施方案中，术语“处理”、“疗法”和“治疗”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。
肿瘤：术语“肿瘤”在本文中与术语“癌症”可互换使用，例如这两个术语均涵盖实体瘤和液体肿瘤，例如弥漫性或循环性肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括癌前以及恶性癌症和肿瘤。
肿瘤相关抗原：术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”是指整体或作为片段(例如MHC/肽)在癌细胞表面上表达的分子(通常是蛋白质、碳水化合物、脂质或其某种组合)，并且可用于使药理学药剂优先靶向癌细胞。在一些实施方案中，TAA是由正常细胞和癌细胞表达的标志物，例如谱系标志物，例如在B细胞上的CD19。在一些实施方案中，TAA是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比过表达1倍、过表达2倍、过表达3倍或更多。在一些实施方案中，TAA是在癌细胞中不适当地合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比，含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，TAA将整体或作为片段(例如MHC/肽)单独表达在癌细胞的细胞表面上，而不在正常细胞的表面上合成或表达。因此，术语“TAA”涵盖对癌细胞具有特异性的抗原，有时在本领域中称为肿瘤特异性抗原(“TSA”)。
通用轻链：如本文所用，在靶向部分的上下文中，术语“通用轻链”是指能够与靶向部分的重链区配对，并且还能够与其他重链区配对的轻链多肽。通用轻链也被称为“共享轻链”。
VH：术语“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括scFv或Fab的重链。
VL：术语“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括scFv或Fab的轻链。
6.2IL2激动剂
本公开提供了IL2激动剂，其包含IL2部分、任选的多聚化部分和任选的靶向部分。
本公开的IL2激动剂可以是单体或多聚体，例如二聚体(同二聚体或异二聚体)或高阶复合体。为方便起见，同二聚体(或相同多肽的更高阶多聚体)的IL2激动剂由其组成单体描述；但是，在合适的细胞系中重组表达组成单体后，可以产生同二聚体(或更高阶多聚体)分子。
在不同实施方案中，IL2激动剂是(a)IL2部分为单价或二价的和/或(b)靶向部分(若有的话)为单价或二价的。
相对于野生型IL2，本公开的IL2激动剂和/或本公开的IL2激动剂中的IL2突变蛋白通常不是CD122定向的，例如它们在IL2部分中不具有使它们相较于IL-2Rα优先结合至IL-2Rβ的氨基酸取代或其他修饰(例如，聚乙二醇化)。但是，在某些实施方案中，本公开的IL2激动剂可以是CD122定向的，例如其中IL2激动剂是pMHC-靶向的(例如，如第6.4.3节中所述)和/或与自身免疫疾病的CAR Treg疗法组合使用，例如第6.11.1节和第6.11.1.4节中所述。在一些实施方案中，此类IL2激动剂可以具有对IL-2Rα的结合亲和力至多1000倍的降低，而对IL-2Rβ的结合亲和力至多50倍的降低。
本公开的IL2激动剂和/或本公开的IL2激动剂中的IL2突变蛋白可以是CD25定向的，例如相较于野生型IL2，它们在IL2部分中具有一个或多个使它们相较于IL-2Rβ优先结合至IL-2Rα的氨基酸取代或其他修饰。
因此，本公开的IL2激动剂和/或本公开的IL2激动剂中的IL2突变蛋白可具有导致IL-2Rβ和/或IL-2Rα结合亲和力降低的氨基酸修饰。
总的来说，本公开的IL2激动剂和/或本公开的IL2激动剂中的IL2突变蛋白可以具有对中和/或高亲和力IL2受体正常或减弱的结合(即亲和力降低)(例如，至多10倍、至多50倍、至多100倍、至多200倍、至多500倍、至多1000倍、至多5000倍)。在一些实施方案中，结合受到减弱，但是相对高亲和力IL2受体对中亲和力IL2受体的优先选择类似于野生型IL2。
通过测量高亲和力受体(IL-2Rαβγ)表达细胞和中亲和力受体(IL-2Rβγ)表达细胞的结合亲和力差异，并将比率与野生型IL2的对应比率相比较，可以评估一种受体相对另一种受体的优先结合。
在某些实施方案中，本公开的IL2激动剂在IL2部分中具有一个或多个减少与IL-2Rβ的结合的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，相较于野生型人IL2，IL2部分可以具有对人IL-2Rβ至多100倍至1000倍减弱的结合。
对IL-2Rβ具有减弱的结合的IL2部分可以保留其对IL-2Rα的亲和力，或对IL-2Rα具有减弱的结合。例如，在一些实施方案中，相较于野生型人IL2，IL2部分可以具有对人IL2-Rα至多50倍、至多100倍、至多500倍、至多1000倍或至多5000倍减弱的结合。
可以通过表面等离子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人.,2000,Glyco J 17:323-329)测定对IL-2Rα(中亲和力受体)和IL-2Rβ(高亲和力受体)的结合亲和力。
在第6.2节中描述了适用于本公开的IL2激动剂的示例性IL2部分。
IL2激动剂可以是包含IL2部分和多聚化部分和/或靶向部分的融合蛋白。示例性多聚化部分描述于第6.5节中并且包括赋予IL2激动剂同二聚化或异二聚化能力的Fc结构域。游离IL2具有非常差的药物动力学(血清半衰期<10分钟)，并且在不受理论束缚的情况下，据信纳入多聚化结构域(如Fc结构域)可改善IL2激动剂的血清稳定性和药物动力学特性。因此，Fc结构域可以是双重用途结构域，赋予如第6.6节中所述的稳定化部分以稳定特性。
有时为了方便起见，IL2部分和任选的多聚化和/或稳定化部分在本文中称为IL2突变蛋白，但是术语“突变蛋白”也涵盖具有靶向部分的分子。示例性靶向部分描述于第6.4节中，并且包括结合至肿瘤相关抗原、结合至肿瘤微环境抗原、或结合至肿瘤淋巴细胞、以及识别肿瘤淋巴细胞的肽-MHC复合体的抗原结合结构域(例如scFv或Fab)。
此外，IL2部分、多聚化部分和靶向部分中的每个本身可以是融合蛋白。例如，IL2部分可以包含IL2或IL2变体结构域和IL-2Rα结构域。
在不同实施方案中，IL2激动剂不包含(a)IL2以外的细胞因子；(b)抗IL2抗体或抗体片段；(c)抗DNA抗体或抗体片段；(b)非结合抗体可变结构域；上述两者、三者或全部四者的任何组合。
IL2激动剂可以包括一个或多个连接分子的不同组分(例如融合蛋白中存在的不同结构域)的接头序列。示例性接头描述于第6.7节中。在某些方面，本公开的IL2激动剂在施用于受试者(例如患有癌症的患者或具有肿瘤的小鼠)后，增加肿瘤内CD8+T细胞与Treg细胞比率。
以下是本公开IL2突变蛋白和激动剂的一些示例性取向，以N端至C端的方向：
(1)取向1：IL2部分-任选的接头-多聚化部分和/或稳定化部分。
(2)取向2：多聚化部分和/或稳定化部分-任选的接头-IL2部分。
(3)取向3：靶向部分-任选的接头-多聚化部分和/或稳定化部分-任选的接头-IL2部分。
(4)取向4：包含两条多肽A和B的异二聚体：
·多肽A：IL2部分-任选的接头-多聚化部分；和
·多肽B：靶向部分-任选的接头-多聚化部分。
在本公开的IL2激动剂中，当靶向部分是抗体的抗原结合结构域“(ABD”)时，每个IL2分子可以由两条多肽链组成，一条多肽链带有重链可变区而另一条多肽链带有轻链可变区。因此，在取向3和取向4中，靶向部分本身可以在不同的多肽链上包含重链可变结构域和轻链可变结构域。例如，关于取向4IL2激动剂，多肽B可以由两条多肽链B-1和B-2组成。多肽链B-1可含有靶向部分的重链可变结构域-任选的接头-多聚化部分，而多肽链B-2可包含靶向部分的轻链可变结构域。多肽A-多肽B异二聚体可如第6.5.1.2节中所述通过Fc异二聚化变体配对来缔合。
或者，可以使用scFv，其中重链和轻链可变区在单个多肽中彼此融合。
取向1IL2激动剂的示例性实施方案从N端至C端的方向包含：
a)IL2部分，其包含：
i)IL2或IL2变体(例如IL2 N88D)结构域，其在C125处具有或不具有减少聚集的取代(例如C125S或C125A或C125)；
ii)接头(例如如第6.7节中所述)；和
iii)IL-2Rα的IL2结合部分；
b)接头(例如如第6.7节中所述)；和
c)Fc结构域(例如IgG1或IgG4，具有或不具有如第6.5.1节及其小节中所述减少糖基化和/或效应功能的取代)。
在第7节中被称为IL2M0和IL2M2的IL2激动剂是取向1IL2激动剂的特定实施方案。
取向2IL2激动剂的示例性实施方案从N端至C端的方向包含：
a)Fc结构域(例如IgG1或IgG4，具有或不具有如第6.5.1节及其小节中所述减少糖基化和/或效应功能的取代)；
b)接头(例如如第6.7节中所述)；和
c)IL2或IL2变体(例如IL2 N88D)结构域，其在C125处具有或不具有减少聚集的取代(例如C125S或C125A或C125V)。
被称为IL2M4和IL2M5的IL2激动剂是这些取向2IL2激动剂的特定实施方案。
取向2IL2激动剂的另一个示例性实施方案从N端至C端的方向包含：
a)Fc结构域(例如IgG1或IgG4，具有或不具有如第6.5.1节及其小节中所述减少糖基化和/或效应功能的取代)；
b)接头(例如如第6.7节中所述)；和
c)IL2部分，包含：
i)IL2或IL2变体(例如IL2 N88D)结构域，其在C125处具有或不具有减少聚集的取代(例如C125S或C125A或C125V)；
ii)接头(例如如第6.7节中所述)；和
iii)IL-2Rα的IL2结合部分。
在第7节中被称为IL2M3的IL2激动剂是该取向2IL2激动剂的特定实施方案。
取向3IL2激动剂的示例性实施方案从N端至C端的方向包含：
a)scFv或Fab的重链可变区(在单独多肽上与对应轻链可变区缔合)(例如如第6.4.2节及其小节中所述)；
b)接头(例如如第6.7节中所述)；
c)Fc结构域(例如IgG1或IgG4，具有或不具有如第6.5.1节及其小节中所述减少糖基化和/或效应功能的取代)；
d)接头(例如如第6.7节中所述)；和
e)IL2部分，其包含：
i)IL2或IL2变体(例如IL2 N88D)结构域，其在C125处具有或不具有减少聚集的取代(例如C125S、C125A或C125V)；
ii)接头(例如如第6.7节中所述)；和
iii)IL-2Rα的IL2结合部分(例如如第6.3节中所述)。
在第7节中被称为IL2M3的IL2激动剂的T1靶向变化形式是该取向3IL2激动剂的特定实施方案。
取向3IL2激动剂的另一个示例性实施方案从N端至C端的方向包含：
a)肽-MHC复合体(如第6.4.3节中所述)，其包含；
i)MHC肽：
ii)接头(例如如第6.7节及其小节，例如第6.7.1节中所述)；
iii)任选的β2-微球蛋白(β2m)；
iv)任选的接头(例如如第6.7节及其小节，例如第6.7.1节中所述)；和
v)MHC；
b)任选的接头(例如如第6.7节中所述)；
c)Fc结构域(例如IgG1或IgG4，具有或不具有如第6.5.1节及其小节中所述减少糖基化和/或效应功能的取代)；
d)接头(例如如第6.7节中所述)；
e)IL2部分，其包含：
i)IL2或IL2变体(例如IL2 N88D)结构域，其在C125处具有或不具有减少聚集的取代(例如C125S、C125A或C125V)；
ii)接头(例如如第6.7节中所述)；和
iii)IL-2Rα的IL2结合部分(例如如第6.3节中所述)。
在第7节中被称为IL2M3的IL2激动剂的T2和T3靶向变化形式是该取向3IL2激动剂的特定实施方案。
在示例性实施方案中，取向4IL2激动剂包含两条多肽A和B，其从N端至C端的方向包含：
在某些方面，取向4IL2激动剂包含两条多肽A和B，其从N端至C端的方向包含：
多肽A：
a)靶向部分，例如肽-MHC复合体(例如如第6.4.3节中所述)、Fab结构域(例如如第6.4.2.2节中所述)(例如多肽A上的Fab的重链与包含Fab的轻链的第三多肽(多肽C)缔合)、或scFv结构域(例如如第6.4.2.1节中所述)；
b)任选的接头(例如如第6.7节中所述)；和
c)第一Fc结构域。
多肽B：
d)IL2部分，其包含IL2或IL2变体结构域(例如具有取代H16A、F42A取代的IL2结构域，也被称为IL2(2m))，在C125处具有或不具有减少聚集的取代(例如C125S、C125A或C125V)；
e)任选的接头(例如如第6.7节中所述)；和
f)第二Fc结构域，其与第一Fc结构域不同但可与第一Fc结构域异二聚化(例如如第6.5.1.2节中所述)。
在一些实施方案中，IL2激动剂是对靶向部分为单价的且对IL2部分为单价的异二聚体。
该取向4IL2激动剂的特定实施方案包含：
多肽A：
a)肽-MHC复合体(例如如第6.4.3节中所述)，其包含：
i)MHC肽；
ii)接头(例如如第6.7节中所述)；
iii)任选的β2-微球蛋白(β2m)；
iv)任选的接头(例如如第6.7节中所述)；和
v)MHC；
b)任选的接头(例如如第6.7节中所述)；和
c)第一Fc结构域。
多肽B：
d)IL部分，其包含IL2或IL2变体(例如IL2 H16A、F42A，也被称为IL2(2m))结构域，在C125处具有或不具有会减少聚集的取代(例如C125S、C125A或C125V)；
e)任选的接头(例如如第6.7节中所述)；和
f)第二Fc结构域，其与第一Fc结构域不同但可与第一Fc结构域异二聚化(例如如第6.5.1.2节中所述)。
第一Fc结构域和第二Fc结构域可以是例如IgG1或IgG4 Fc结构域，其具有或不具有如第6.5.1节及其小节中所述减少糖基化和/或效应功能的取代。
在图22A.2中示出了示例性取向4IL2激动剂。
举例而言，在上述示例性取向3和取向4激动剂中，据信在肽-MHC复合体中纳入β2微球蛋白会稳定人细胞表面MHC I分子并有利于其负载外源性肽。参见例如Shields等人,1998,J Biol Chem.273(43):28010-8；Obermann等人,2007,Immunology 122(1):90-7。
在某些方面，IL2激动剂包含IL2突变蛋白以及例如在N端的任选的靶向部分和任选的接头，IL2突变蛋白具有IL2M0、IL2M1、IL2M2、IL2M3、IL2M4、IL2M5、IL2M6或IL2M7的构型。在一些实施方案中，IL2激动剂包含IL2突变蛋白以及例如在N端的任选的靶向部分和任选的接头，IL2突变部分具有IL2M0、IL2M1、IL2M2、IL2M3、IL2M4、IL2M5，IL2M6或IL2M7的氨基酸序列。
本公开的IL2激动剂通常具有改善的治疗指数。在某些方面，可以将治疗指数测量为IL2激动剂作为整体或其如第7节中所例举的非靶向组分(例如，包含IL2部分和多聚化部分的分子，为方便起见，在本文中称为“IL2突变蛋白”或“IL2M”组分)在荷瘤小鼠中引起毒性(例如，体重减轻)的剂量相对最小有效抗肿瘤剂量的比率。第7节中的数据显示以下治疗指数：
Figure BDA0003700122800000191
Figure BDA0003700122800000201
在某些方面，本公开的IL2激动剂或其IL2M组分的治疗指数大于1，且优选地大于2，且甚至更优选地大于10。在特定实施方案中，治疗指数为约10、约20、约100或约200。
本公开的IL2激动剂的组分的更多详细内容呈现于下文。
6.3IL2部分
本公开的IL2拮抗剂的IL2部分包含野生型或变体IL2结构域，其任选地通过接头(例如如第6.7节中所述)任选地融合至IL-2Rα的IL2结合结构域。当存在时，IL-2Rα的IL2结合结构域可以在野生型或变体IL2结构域的N端或C端。
在真核细胞中，人IL2被合成为具有153个氨基酸的前体多肽，从中移除20个氨基酸而产生成熟的分泌型IL2(Taniguchi等人,1983,Nature302(5906):305-10)。成熟的人IL2具有以下氨基酸序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:2)
本公开的IL2部分通常不是CD122定向的，例如它们在IL2结构域中不具有使它们相较于IL-2Rα优先结合至IL-2Rβ的氨基酸取代。
本公开的IL2部分可以是CD25定向的，例如它们在IL2结构域中具有一个或多个使它们相较于IL-2Rβ优先结合至IL-2Rα的氨基酸取代。
在某些实施方案中，本公开的IL2激动剂在IL2部分中具有一个或多个减少结合至IL-2Rβ的氨基酸取代。举例而言，在一些实施方案中，相较于野生型人IL2，IL2部分对人IL-2Rβ的结合可以具有至多50倍(并且在一些实施方案中至多100倍)至1,000倍减弱的结合。
对IL-2Rβ具有减少的结合的IL2部分可以保留其对IL-2Rα的亲和力，或对IL-2Rα具有减少的结合。例如，在一些实施方案中，相较于野生型人IL2，IL2部分对人IL2-Rα的可以具有至多50倍减弱的结合。可用IL2变体的其他特征可包括诱导带有IL-2Rα的CD8+T细胞在肿瘤中增殖的能力、带有IL-2Rα的CD8+T细胞在肿瘤中引发IL2信号传导的能力、以及改善的治疗指数。
在一个实施方案中，IL2部分包含一个或多个降低对IL-2Rβ的亲和力且保留对IL2-Rα的亲和力的氨基酸取代。示例性氨基酸取代是N88D。其他降低或消除IL2对IL-2Rβ的亲和力的氨基酸取代是D20T、N88R、N88D或Q126D(参见例如美国专利公开第US 2007/0036752号)。
在一个实施方案中，IL2部分包含一个或多个降低对IL2-Rα的亲和力，并保留对IL-2Rβ的亲和力或降低对IL-2Rβ的亲和力至较低程度的氨基酸取代，从而产生CD122定向的IL2部分。此类IL2部分特别可用于引入具有肽-MHC靶向部分的IL2激动剂和/或用作CARTreg疗法的辅助疗法，如第6.11.1.4节中所述。示例性CD122定向的IL2部分是同时包含H16A和F42A取代的那些，如IL2M6和IL2M7中所例举的。因此，在一些实施方案中，IL2部分包含具有H16A和F42A取代的人IL2的氨基酸序列，如下所示：
SAPTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:124)
在某些实施方案中，IL2部分包含在对应于人IL2的残基3的位置处消除IL2的O-糖基化位点的氨基酸取代。在T3处的示例性氨基酸取代是T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K和T3P。在特定实施方案中，取代是T3A。
IL2部分优选地基本上是全长IL2分子，例如人IL2分子。在某些实施方案中，IL2部分是人IL-2分子。
如美国专利第4,518,584号中所述，C125可以由S、V或A取代以减少蛋白质聚集。
如其中所述，还可以删除IL2的N端丙氨酸残基，产生des-A1 IL2。
此外，如美国专利第5,206,344号中所述，IL2部分可包括用中性氨基酸(如丙氨酸)取代甲硫氨酸104。
因此，除了其他改变IL2与其受体的结合的变异以外，本公开的IL2部分可具有选自以下的氨基酸缺失和/或取代：des-A1 M104A IL2、des-A1 M104A C125S IL2、M104AIL2、M104A C125A IL2、des-A1 M104A C125A IL2或M104A C125S IL2。这些和其他突变体可以见于美国专利第5,116,943号和Weiger等人,1989,Eur J Biochem 180:295-300中。
在不同方面，前述IL2部分中的任一项包含与成熟人IL2具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、约至少93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
本公开的IL2部分可进一步包括IL-2Rα的IL2结合结构域(为方便起见，称为“IL2-Rα结构域”)，例如IL-2Rα的细胞外结构域，其如第6.7节中所述任选地经由接头融合在IL2的C端或N端。成熟人IL-2Rα细胞外结构域的序列(对应于人IL-Rα的氨基酸22-272)为：
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu
Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys
Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr
Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln Val Ala Val Ala Gly
Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr Trp
Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile(SEQ ID NO:3)
人IL-2Rα细胞外结构域的IL2结合部分的序列(包含两个“寿司(sushi)”结构域，其对应于人IL-2Rα的氨基酸22-186)为：
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
Leu Ile Cys Thr Gly(SEQ ID NO:4)
替代性人IL-2Rα细胞外结构域的IL2结合部分的序列(其对应于人IL-2Rα的氨基酸22-240)为：
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu
Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys
Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr
Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln(SEQ ID NO:5)
IL-2Rα细胞外结构域的IL2-Rα结构域或IL2结合部分优选地包含与上述序列中的任一项(即IL-2Rα的氨基酸22-186、IL-2Rα的氨基酸22-240、或IL-2Rα的氨基酸22-272、或其任何IL2结合部分中的任一项)具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
在某些方面，IL2-Rα结构域或IL2结合部分可包含或组成为与人IL-2Rα的IL2结合部分具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的氨基酸序列，任选地其中结合部分具有人IL2-Rα的细胞外结构域的(a)至少160个氨基酸、至少161个氨基酸、至少162个氨基酸、至少164个氨基酸或至少165个氨基酸，和/或(b)至多251个、至多240个、至多230个、至多220个、至多210个、至多200个、至多190个、至多180个或至多170个氨基酸的氨基酸序列。在特定实施方案中，人IL-2Rα的部分由前一句中的(a)和(b)中的任一项所限定，例如来自人IL-2Rα的至少160个和至多180个氨基酸、来自人IL-2Rα的至少162个和至多200个氨基酸、来自人IL-2Rα的至少160个和至多220个氨基酸、来自人IL-2Rα的至少164个和至多190个氨基酸，依此类推。
在一些实施方案中，IL2-Rα结构域或IL2结合部分包含或组成为与氨基酸22-186具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的氨基酸序列，在IL2-Rα的氨基酸残基186的C端具有或不具有额外至多5个氨基酸、至多10个氨基酸、至多15个氨基酸、至多20个氨基酸、至多30个氨基酸或至多40个氨基酸。
如图3A至3B中所例示，在具有N端Fc结构域的情况下，IL2融合至IL-2Rα的IL2结合部分的C端，导致IL2激动剂不形成更高阶结构，这不同于在N至C的方向上包含IL2-IL-2Rα细胞外结构域-Fc的IL2激动剂。因此，本公开含IL-2Rα的IL2突变蛋白优选地在IL-2的N端具有IL-2Rα细胞外结构域。具有这个取向的示例性突变蛋白是IL2M3。
在某些实施方案中，与天然IL-2Rα的细胞外结构域相比，IL2-Rα结构域或IL-2Rα细胞外结构域具有少至少一个的O-糖基化和/或N-糖基化，例如通过在以下一处或多处的取代：氨基酸N49、氨基酸N68、氨基酸T74、氨基酸T85、氨基酸T197、氨基酸T203、氨基酸T208、和氨基酸T216。在一些实施方案中，一个或多个取代是从天冬酰胺到选自以下的氨基酸：丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，一或多个取代是从苏氨酸到选自以下的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、麸酰氨酸、麸氨酸、甘氨酸、组氨酸、异白氨酸、白氨酸、离氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸，酪氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，一个或多个取代在以下位置处：氨基酸S50(例如S50P)、氨基酸S51(例如S51R、S51N、S51D、S51C、S51Q、S51E、S51G、S51H、S51I、S51L、S51K、S51M、S51F、S51P、S51W、S51Y或S51V)、氨基酸T69(例如T69P)、氨基酸T70(例如T70R、T70N、T70D、T70C、T70Q、T70E、T70G、T70H、T70I、T70L、T70K、T70M、T70F、T70P、T70W、T70Y或T70V)、氨基酸C192(例如C192R、C192N、C192D、C192Q、C192E、C192G、C192H、C192I、C192L、C192K、C192M、C192F、C192P、C192W、C192Y或C192V)或其任何组合。
6.4靶向部分
在本公开的IL2激动剂中并入靶向部分允许将高浓度的IL2递送至肿瘤微环境或肿瘤反应性淋巴细胞(包括CART淋巴细胞)，同时减少全身性暴露，从而导致比使用野生型IL2获得的更少的副作用。
合适的靶向部分形式描述于第6.4.2节中。靶向部分优选地是抗原结合部分，例如抗体或抗体的抗原结合部分，例如scFv(如第6.4.2.1节中所述)，或Fab(如第6.4.2.2节中所述)。
抗体和抗原结合部分通常结合至特定抗原决定簇，并且能够将IL2激动剂引导至靶位点，例如引导至带有抗原决定簇的特定类型肿瘤细胞或肿瘤基质。由本公开的靶向部分所识别的示例性靶分子描述于第6.4.1节中。
在其他实施方案中，靶向部分是如第6.4.3节中所述的肽-MHC复合体，例如由肿瘤淋巴细胞识别的肽-MHC复合体。
在一些实施方案中，靶向部分呈Fc融合蛋白的形式，例如在实施例中称为T7和T8的结构中所例举的。靶向部分多肽的Fc部分可用于与包含IL2部分的单独多肽链中的Fc结构域多聚化。
6.4.1靶分子
由本公开IL2激动剂的靶向部分识别的靶分子通常存在于例如激活T细胞的表面上、肿瘤细胞的表面上、病毒感染的细胞的表面上、在其他患病细胞的表面上、游离在血清中、在细胞外基质(ECM)中或存在于靶位点的免疫细胞(例如肿瘤反应性淋巴细胞)中。在外源性施用免疫细胞(例如表达嵌合抗原受体(“CAR”)的T细胞)时，靶向部分可以识别嵌合抗原受体(CAR)或在CAR T细胞表面上存在的另一分子。在不同实施方案中，CAR包含特异性识别TAA或pMHC复合体的CDR或VH和VL序列(例如以scFv的形式)。
示例性靶分子是成纤维细胞活化蛋白(FAP)、腱生蛋白C(Tenascin C)的A1结构域(TNC A1)、腱生蛋白C的A2结构域(TNC A2)、纤连蛋白的额外结构域B(EDB)、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、肿瘤抗原的MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)，MAGE-Xp3(MAGE-B3)，MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、肿瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙黏蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉蛋白(APC)、胞衬蛋白(fodrin)、连接蛋白37、Ig个体基因型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物(例如人乳头瘤病毒蛋白)、肿瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、c-erbB-2、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR缔合的异多聚体)、CD22(B细胞受体)、CD23(低亲和力IgE受体)、CD30(细胞因子受体)、CD33(骨髓细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、IL-6R-(IL6受体)、CD20、MCSP、PDGFβR(β-血小板衍生的生长因子受体)、ErbB2、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、二唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮黏蛋白、gp36、TAG-72、神经胶质瘤相关抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、LAGA-1a、p53、前列腺素(prostein)、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白(ephrin)B2、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤连蛋白的额外结构域A (EDA)和额外结构域B(EDB)以及腱生蛋白C的A1结构域(TnC A1)。
病毒抗原的非限制性实例包括EBV抗原(例如Epstein-Barr病毒LMP-1)、丙型肝炎病毒抗原(例如丙型肝炎病毒E2糖蛋白)、HIV抗原(例如HIV gp160和HIV gp120)；CMV抗原；HPV特异性抗原或流感病毒抗原(例如流感病毒血球凝集素)。
ECM抗原的非限制性实例包括黏结蛋白聚糖(syndecan)、乙酰肝素酶、整合素、骨桥蛋白、link、钙黏蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白型EGF、凝集素、纤连蛋白、notch、腱生蛋白、胶原蛋白和基质蛋白。
其他靶分子是肿瘤或病毒淋巴细胞的细胞表面分子，例如T细胞共刺激蛋白，如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3。
在特定实施方案中，靶分子是检查点抑制剂，例如CTLA-4、PD1、PDL1、PDL2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2。在特定实施方案中，靶分子是PD1。在其他实施方案中，靶分子是LAG3。
6.4.2.靶向部分形式
在某些方面，靶向部分可以是保留与抗原决定簇的特异性结合的任何类型的抗体或其片段。在一个实施方案中，抗原结合部分是全长抗体。在一个实施方案中，抗原结合部分是免疫球蛋白分子，特别是IgG类免疫球蛋白分子，更特别是IgG1或IgG4免疫球蛋白分子。抗体片段包括但不限于VH(或VH)片段、VL(或VL)片段、Fab片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、微型抗体、二价抗体(diabody)、三价抗体(triabody)和四价抗体(tetrabody)。
6.4.2.1.scFv
单链Fv或“scFv”抗体片段在单条多肽链中包含抗体的VH结构域和VL结构域，能够表达为单链多肽，并保留它们衍生而来的完整抗体的特异性。通常，scFv多肽还包含在VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能形成靶结合的预期结构。适用于连接scFv的VH链和VL链的接头的实例是第6.4.3节中所鉴别的接头。
除非另有说明，否则如本文所用，scFv可具有呈任何顺序的VL可变区和VH可变区，例如相对于多肽的N端和C端末端，scFv可包含VL-接头-VH或可包含VH-接头-VL。
scFv可包含来自任何合适物种的VH序列和VL序列，如鼠类、人或人源化的VH序列和VL序列。
为了产生编码scFv的核酸，将编码VH和VL的DNA片段与编码接头的另一片段可操作地连接，该另一片段例如编码第6.4.3节中所述的任何接头(通常是含有氨基酸甘氨酸和丝氨酸的重复序列，如氨基酸序列
Figure BDA0003700122800000282
Figure BDA0003700122800000283
(SEQ ID NO:6))，使得VH序列和VL序列可以表达为连续的单链蛋白，其中VL区和VH区由柔性接头所连接(参见例如Bird等人,1988,Science242:423-426；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等人,1990,Nature 348:552-554)。
6.4.2.2.Fab
Fab结构域传统上是通过使用酶(如木瓜蛋白酶)对免疫球蛋白分子进行蛋白水解切割而产生。在本公开的IL2激动剂中，Fab结构域通常作为IL2激动剂的一部分重组表达。
Fab结构域可包含来自任何合适物种的恒定结构域和可变区序列，因此可以是鼠类的、嵌合的、人的或人源化的。
Fab结构域通常包含连接至VH结构域的CH1结构域，其与连接至VL结构域的CL结构域配对。在野生型免疫球蛋白中，VH结构域与VL结构域配对以构成Fv区，而CH1结构域与CL结构域配对以进一步稳定结合模块。两个恒定结构域之间的二硫键可以进一步稳定Fab结构域。
对于本公开的IL2激动剂，特别是当轻链不是共享或通用的轻链时，使用Fab异二聚化策略以允许属于相同ABD的Fab结构域正确缔合，并使属于不同ABD的Fab结构域的异常配对降至最低是有利的。例如，可以使用下表1中所示的Fab异二聚化策略：
Figure BDA0003700122800000281
Figure BDA0003700122800000291
因此，在某些实施方案中，Fab的两条多肽之间正确缔合是通过Fab的VL结构域和VH结构域彼此交换或CH1结构域和CL结构域彼此交换而促进的，例如如WO 2009/080251中所述。
通过在Fab的CH1结构域中引入一个或多个氨基酸修饰以及在Fab的CL结构域中引入一个或多个氨基酸修饰，和/或在VH结构域中引入一个或多个氨基酸修饰以及在VL结构域中引入一个或多个氨基酸修饰也可以促进正确的Fab配对。经过修饰的氨基酸通常是VH：VL和CH1：CL界面的一部分，使得Fab组分优先彼此配对，而不是与其他Fab的组分配对。
在一个实施方案中，一个或多个氨基酸修饰限于如由残基的Kabat编号所指示的可变结构域(VH、VL)和恒定结构域(CH1、CL)的保守框架残基。Almagro,2008,Frontiers InBioscience 13:1619-1633根据Kabat、Chothia和IMGT编号方案提供了框架残基的定义。
在一个实施方案中，在VH结构域和CH1结构域和/或VL结构域和CL结构域中所引入的修饰彼此互补。重链和轻链界面处的互补性可以基于空间和疏水性接触、静电/电荷相互作用或各种相互作用的组合来实现。蛋白质表面之间的互补性(有关于锁钥适配、杵入臼、突起和空腔、供体和受体等)广泛描述于文献中，全都暗示了两个相互作用表面之间结构和化学匹配的性质。
在一个实施方案中，一个或多个被引入的修饰在Fab组分的界面上引入了新的氢键。在一个实施方案中，一个或多个被引入的修饰在Fab组分的界面上引入了新的盐桥。示例性取代描述于WO 2014/150973和WO 2014/082179中，其内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，Fab结构域在CH1结构域中包含192E取代，并在CL结构域中包含114A和137K取代，其在CH1结构域和CL结构域之间引入了盐桥(参见例如Golay等人,2016,J Immunol 196:3199-211)。
在一些实施方案中，Fab结构域在CH1结构域中包含143Q和188V取代，而在CL结构域中包含113T和176V取代，其用于在CH1结构域和CL结构域之间交换疏水性和极性的接触区域(参见例如Golay等人,2016,J Immunol 196:3199-211)。
在一些实施方案中，Fab结构域可在VH、CH1、VL、CL结构域中的一些或全部中包含修饰，以引入促进Fab结构域正确组装的正交Fab界面(Lewis等人,2014 NatureBiotechnology 32:191-198)。在一个实施方案中，在VH结构域中引入39K、62E修饰，在CH1结构域中引入H172A、F174G修饰，在VL结构域中引入1R、38D、(36F)修饰，并且在CL结构域中引入L135Y、S176W修饰。在另一个实施方案中，在VH结构域中引入39Y修饰，并且在VL结构域中引入38R修饰。
可以对Fab结构域进行修改以用工程化的二硫键取代天然CH1：CL二硫键，从而提高Fab组分配对的效率。例如，可通过在CH1结构域中引入126C并在CL结构域中引入121C来引入工程化的二硫键(参见例如Mazor等人,2015,MAbs 7:377-89)。
也可以通过用促进正确组装的替代结构域取代CH1结构域和CL结构域来修饰Fab结构域。例如，Wu等人,2015,MAbs 7:364-76描述了用T细胞受体的恒定结构域取代CH1结构域，并用T细胞受体的b结构域取代CL结构域，并通过在VL结构域中引入38D修饰且在VH结构域中引入39K修饰而借助VL结构域和VH结构域之间的额外电荷-电荷相互作用使这些结构域取代物配对。
代替或除了使用Fab异二聚化策略来促进正确的VH-VL配对外，共享轻链(也被称为通用轻链)的VL可用于本公开的IL2激动剂的每个Fab VL区。在不同实施方案中，与采用原始同源VL相比，采用如本文所述的共享轻链减少了不合适种类的IL2激动剂的数量。在不同实施方案中，IL2激动剂的VL结构域是从包含共享轻链的单特异性抗体鉴定而来。在不同实施方案中，IL2激动剂的VH区包含人重链可变基因片段，其在小鼠B细胞中体内重排，而该小鼠B细胞先前已被工程改造以表达有限的人轻链谱或单个人轻链(与人重链同源)，并对暴露于感兴趣的抗原产生应答，产生含有与可能的人VL中的一种或两种中的一种同源的多个人VH的抗体谱，其中该抗体谱对感兴趣的抗原具有特异性。共享轻链是衍生自重排的人Vκ1-39Jκ5序列或重排的人Vκ3-20Jκ1序列的那些，并包括体细胞突变(例如亲和力成熟)的形式。参见例如美国专利第10,412,940号。
6.4.3.MHC-肽融合物
本公开的IL2激动剂的靶向部分可以是肽-MHC复合体(“pMHC复合体”)，例如与MHCI类结构域复合的肽或与MHC II类结构域复合的肽，任选地具有β2微球蛋白结构域。
天然存在的MHC由人6号染色体上的基因簇编码。MHC包括但不限于HLA特异性，如A(例如A1-A74)、B(例如B1-B77)、C(例如C1-C11)、D(例如D1-D26)、DR(例如DR1-DR8)、DQ(例如DQ1-DQ9)和DP(例如DP1-DP6)。HLA特异性包括A1、A2、A3、AII、A23、A24、A28、A30、A33、B7、B8、B35、B44、B53、B60、B62、DR1、DR2、DR3、DR4、DR7、DR8和DR11。
天然存在的MHC I类分子结合衍生自蛋白水解降解蛋白的肽。因此，所获得的小肽被转运到内质网中，在那里它们与新生的MHC I类分子缔合，然后通过高尔基体，并展示在细胞表面上以供细胞毒性T淋巴细胞识别，如图3A中所示。
天然存在的MHC I类分子由与β2微球蛋白缔合的α(重)链组成。重链由亚基α1-α3组成。β2微球蛋白和重链的α3亚基缔合。在某些实施方案中，β2微球蛋白和α3亚基通过共价结合而缔合。在某些实施方案中，β2微球蛋白和α3亚基非共价缔合。重链的α1和α2亚基折叠形成沟，用于待展示且由TCR所识别的肽(例如抗原决定簇)。
I类分子通常与长度为约8-9个氨基酸(例如7-11个氨基酸)的肽缔合(例如结合)。所有人具有三种至六种不同的I类分子，其可各自结合许多不同类型的肽。在一个特定实施方案中，I类MHC多肽为选自以下的人I类MHC多肽：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F以及HLA-G。
在一些实施方案中，靶向部分包含不具有跨膜结构域的MHC I类α重链细胞外结构域(人α1、α2和/或α3结构域)。在一些实施方案中，I类α重链多肽是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-K或HLA-L。在一些实施方案中，HLA-A序列可以是HLA-A*0201序列。
pMHC复合体中的肽可具有能够与MHC I类分子缔合(例如由其所呈递)的肽的氨基酸序列。在某些实施方案中，该序列可包含6至20个连续的氨基酸。在某些实施方案中，肽序列可以是蛋白质片段的序列，其中该蛋白质是由细胞蛋白(例如与癌症或癌症新抗原相关蛋白)衍生而来的(例如细胞蛋白的一部分)，且其中该肽可结合至MHC I类重链。
在一些实施方案中，pMHC复合体靶向部分包含(i)抗原肽；(ii)I类MHC多肽或其片段、突变体或衍生物(例如细胞外结构域)，和任选的(iii)β2微球蛋白多肽或其片段、突变体或衍生物。例如，pMHC复合体从N端至C端可包含(i)抗原肽，(ii)β2M序列，和(iii)I类α(重)链序列。或者，pMHC复合体从N端至C端可包含(i)抗原肽，(ii)I类α(重)链序列，和(iii)β2M序列。
在一个特定实施方案中，抗原肽和MHC序列和/或MHC序列和β2M结构域经由肽接头彼此连接，例如如第6.7节中所述。在一些实施方案中，单链pMHC复合体可在肽片段和β2微球蛋白片段之间包含第一柔性接头。例如，接头可从肽的羧基端延伸并将其连接至β2微球蛋白片段的氨基端。在一些实施方案中，构建接头以允许肽折叠到结合沟中，从而产生功能性pMHC复合体。在一些实施方案中，接头可以包含至少3个氨基酸，至多约15个氨基酸(例如20个氨基酸)。pMHC接头可以包含插入β2微球蛋白和MHC I重链片段之间的第二柔性接头。例如，接头可从β2微球蛋白片段的羧基端延伸并将其连接至MHC I重链片段的氨基端。在某些实施方案中，β2微球蛋白和MHC I重链可以折叠到结合沟中，产生可以促进T细胞扩增的分子。
当β2M存在时，pMHC复合体可以在β2M和MHC I类α重链结构域中包括突变，使得可以在它们之间形成二硫键。可以被半胱氨酸取代以允许两个结构域之间形成二硫键的示例性氨基酸对鉴定于下表2中或描述于PCT公开WO 2015/195531(通过整体引用并入本文)中：
Figure BDA0003700122800000321
Figure BDA0003700122800000331
在进一步的实施方案中，单链pMHC复合体可包含经由二硫桥(即两个半胱氨酸之间的二硫键)共价连接至MHC I类α(重)链的肽。参见例如美国专利第8,992,937号和第8,895,020号，其各自均通过整体引用并入。在某些实施方案中，二硫键包含位于从肽的羧基端延伸的接头内的第一半胱氨酸，以及位于MHC I类重链(例如对抗原肽具有非共价结合位点的MHC I类α(重)链其)内的第二半胱氨酸。在某些实施方案中，第二半胱氨酸可以是MHCI类α(重)链中的突变(添加或取代)。优选地，pMHC复合体可以包含一条连续的多肽链以及二硫桥。或者，pMHC复合体可包含两条连续的多肽链，其经由二硫桥作为唯一的共价键而连接。在一些实施方案中，连接序列还可包含除半胱氨酸外的至少一个氨基酸，包括一个或多个甘氨酸、一个或多个丙氨酸，和/或一个或多个丝氨酸。在一些实施方案中，单链分子从N端至C端包含MHC I类肽(例如抗原肽)、包含第一半胱氨酸的第一接头、β2-微球蛋白序列、第二接头、以及包含第二半胱氨酸的MHC I类重链序列，其中第一半胱氨酸和第二半胱氨酸包含二硫桥。在一些实施方案中，第二半胱氨酸选自T80C、Y84C和N86C的MHC I类重链氨基酸的取代(Y84C是指成熟蛋白质中位置108处的突变，其中成熟蛋白质缺少信号序列。或者，当蛋白质仍包括24位的信号序列时，该位置称为Y108C)。
在某些实施方案中，如果pMHC复合体在肽的C端和β2微球蛋白之间延伸的Gly-Ser接头中包含第一半胱氨酸，则二硫桥可以在pMHC复合体的第I类沟中连接肽，且第二半胱氨酸位于近端重链位置。
当存在时，β2微球蛋白序列可包含全长(人或非人)β2微球蛋白序列。在某些实施方案中，β2微球蛋白序列缺乏前导肽序列。因此，β2微球蛋白序列可包含约99个氨基酸。示例性人β2微球蛋白序列是Genbank登录号AF072097.1。
作为基于I类MHC的pMHC复合体的替代物，本公开的IL2激动剂可包括基于II类MHC的pMHC复合体作为靶向部分。基于II类MHC的pMHC复合体通常包括I类MHC多肽或其片段、突变体或衍生物。在一个特定实施方案中，MHC包含II类MHC分子的α和β多肽或其片段、突变体或衍生物。在一个特定实施方案中，α和β多肽通过肽接头连接。在一个特定实施方案中，MHC包含选自HLA-DP、HLA-DR、HLA-DQ，HLA-DM和HLA-DO的人II类MHC分子的α和β多肽。
MHC II类分子通常由两条多肽链α和β组成。该链可以来自DP、DQ或DR基因群。有大约40种已知的不同的人MHC II类分子。它们具有相同的基本结构，但分子结构会有所不同。MHC II类分子结合长度为13-18个氨基酸的肽。
在一些实施方案中，pMHC复合体包含一个或多个MHC II类α链或其细胞外部分。在一些实施方案中，II类α链是HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA或HLA-DRA。
在其他实施方案中，pMHC复合体包含一个或多个MHC II类β链或其细胞外部分。在一些实施方案中，II类β链是HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB或HLA-DRB。
pMHC复合体中的肽可以是能够以某种方式与MHC蛋白结合的肽，使得pMHC复合体可以例如以特定方式结合至TCR。
实例包括通过水解产生的肽，且最典型地是合成产生的肽，包括随机生成的肽、专门设计的肽、以及其中至少一些氨基酸位置在多个肽之间保守且其余位置随机的肽。
在自然界中，通过水解产生的肽在抗原结合至MHC蛋白之前经历水解。I类MHC通常呈递衍生自在细胞质中主动合成的蛋白质的肽。相比之下，II类MHC通常呈递衍生自进入细胞内吞途径的外源性蛋白或在ER中合成的蛋白质的肽。细胞内运输允许肽与MHC蛋白缔合。
肽结合至MHC肽结合沟可以控制MHC和/或由TCR识别的肽氨基酸残基，或由如本文公开的经遗传修饰的动物产生的pMHC结合蛋白的空间排列。这种空间控制一部分归因于在肽和MHC蛋白之间形成的氢键。基于肽如何结合至不同MHC的知识，可以确定在不同肽之间变化的主要MHC锚定氨基酸和表面暴露的氨基酸。在一些实施方案中，MHC结合肽的长度为5至40个氨基酸残基，例如6至30个氨基酸残基、例如8至20个氨基酸残基、例如9至11个氨基酸残基，包括长度在5至40个氨基酸之间以整数递增(即5、6、7、8、9…40)的任何大小的肽。尽管天然MHC II类结合肽约在9-40个氨基酸之间变化，但在几乎所有情况下，该肽均可被截短成9-11个氨基酸核心，而不会丧失MHC结合活性或T细胞识别作用。
本公开的pMHC复合体中的肽通常是感染性病原体(例如细菌、病毒或寄生生物)、过敏原和肿瘤相关蛋白的至少一部分，例如抗原决定簇。优选地，pMHC复合体包含癌细胞的抗原决定簇。癌细胞的示例性抗原决定簇包括LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBVCore(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPV E7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYES1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(Survivin)(96-014)、酪氨酸酶(369-377、371D)、和WT1(126-134)。示例性HPV E7(11-19)肽序列是YMLDLQPET(SEQ ID NO:7)，即国际专利公开WO 2019/005897的SEQ ID NO:537。示例性HPV E7(82-90)肽序列是LLMGTLGIV(SEQ ID NO:8)，国际专利公开WO 2019/005897的SEQ ID NO:538。国际专利公开WO 2019/005897的内容通过整体引用并入本文。
适合并入本公开的pMHC靶向部分的癌细胞的其他抗原决定簇是下表3中列出的癌症新抗原及其对应的HLA等位基因。新抗原相对于野生型等位基因含有突变，或导致癌细胞中新开放读框的表达，如Fritsch等人,2014,Cancer Immunol Res 2:522-529的表1中所示，其通过整体引用并入本文。
Figure BDA0003700122800000361
6.5多聚化部分
6.5.1 Fc结构域
本公开的IL2激动剂可包括衍生自任何合适物种的Fc区。在一个实施方案中，Fc区衍生自人Fc结构域。在优选实施方案中，IL2结构域融合至IgG Fc分子。
IL2结构域可以融合至IgG Fc区的N端或C端。如实施例中所示，融合至IgG Fc区的C端比融合至IgG Fc区的N端可以更大程度地维持IL2结构域的活性。
本公开的一个实施方案涉及二聚体，其包含通过将IL2结构域融合至抗体的Fc区而产生的两条Fc融合多肽。例如，可以通过以下方式来制备二聚体：将编码融合蛋白的基因融合物插入适当的表达载体中，在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达基因融合物，并使表达的融合蛋白像如抗体分子般组装，随后Fc部分之间形成链间键以产生二聚体。
Fc结构域可衍生自任何合适类型的抗体，包括IgA(包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亚类IgG1、IgG2，IgG3和IgG4)以及IgM。在一个实施方案中，Fc结构域衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个实施方案中，Fc结构域衍生自IgG1。在一个实施方案中，Fc结构域衍生自IgG4。
Fc区内的两个Fc结构域可以彼此相同或不同。在天然抗体中，Fc结构域通常是相同的，但是出于产生多特异性结合分子(例如本公开的IL2激动剂)的目的，Fc结构域可以有利地不同以允许异二聚化，如下文第6.5.1.2节中所述。
在天然抗体中，IgA、IgD和IgG的重链Fc结构域由两个重链恒定结构域(CH2和CH3)组成，而IgE和IgM的重链Fc结构域由三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4)组成。这些结构域二聚化以产生Fc区。
在本公开的IL2激动剂中，Fc区和/或其中的Fc结构域可包含来自一种或多种不同类型的抗体(例如一种、两种或三种不同类型)的重链恒定结构域。
在一个实施方案中，Fc区包含衍生自IgG1的CH2和CH3结构域。
在一个实施方案中，Fc区包含衍生自IgG2的CH2和CH3结构域。
在一个实施方案中，Fc区包含衍生自IgG3的CH2和CH3结构域。
在一个实施方案中，Fc区包含衍生自IgG4的CH2和CH3结构域。
在一个实施方案中，Fc区包含来自IgM的CH4结构域。IgM CH4结构域通常位于CH3结构域的C端。
在一个实施方案中，Fc区包含衍生自IgG的CH2和CH3结构域，以及衍生自IgM的CH4结构域。
应理解，用于产生本公开的IL2激动剂的Fc区的重链恒定结构域可包括上述天然存在的恒定结构域的变体。与野生型恒定结构域相比，此类变体可包含一个或多个氨基酸变异。在一个实例中，本公开的Fc区包含至少一个恒定结构域，其与野生型恒定结构域的序列不同。应理解，变体恒定结构域可以比野生型恒定结构域更长或更短。优选地，变体恒定结构域与野生型恒定结构域至少60％一致或相似。在另一个实例中，变体恒定结构域至少70％一致或相似。在另一个实例中，变体恒定结构域至少80％一致或相似。在另一个实例中，变体恒定结构域至少90％一致或相似。在另一个实例中，变体恒定结构域至少95％一致或相似。
IgM和IgA在人中以常见的H2L2抗体单元的共价多聚体形式天然存在。IgM并入J链时以五聚体形式出现，或缺少J链时以六聚体形式出现。IgA以单体和二聚体形式存在。IgM和IgA的重链具有延伸到C端恒定结构域的18个氨基酸，称为尾部(tailpiece)。尾部包括在聚合物的重链之间形成二硫键的半胱氨酸残基，并且据信其在聚合作用中具有重要作用。尾部还含有糖基化位点。在某些实施方案中，本公开的IL2激动剂不包含尾部。
并入本公开的IL2激动剂中的Fc结构域可包含一种或多种改变蛋白质的功能特性的修饰，功能特性例如为结合至如FcRn的Fc受体或白血球受体、结合至补体、经修饰的二硫键结构或经改变的糖基化模式。改变效应功能的示例性Fc修饰描述于第6.5.1.1节中。
还可以改变Fc结构域以包括改善不对称IL2激动剂的可制造性的修饰，例如通过允许异二聚化，其为不相同的Fc结构域相较于相同的Fc结构域的优先配对。异二聚化允许产生IL2激动剂，其中不同的多肽组分通过含有在序列上不同的Fc结构域的Fc区而彼此连接。第6.5.1.2中节举例说明了异二聚化策略的实例。
应理解，上文提及的任何修饰可以以任何合适的方式组合以获得所需的功能性质，和/或与其他修饰组合以改变IL2激动剂的性质。
6.5.1.1具有改变的效应功能的Fc结构域
在一些实施方案中，Fc结构域包含减少与Fc受体的结合和/或效应功能的一个或多个氨基酸取代。
在特定实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，Fc受体是活化的Fc受体。在特定实施方案中，Fc受体是活化的人Fcγ受体，更具体地为人FcγRIIIA，FCγRI或FcγRIIa，最具体地为人FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应功能选自以下中的一种或多种：补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和细胞因子分泌。在一个特定实施方案中，效应功能是ADCC。
在一个实施方案中，Fc区在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329(根据KabatEU索引编号)的位置处包含氨基酸取代。在一个更特定的实施方案中，Fc区在选自L234、L235和P329(根据Kabat EU索引编号)的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，Fc区包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个这样的实施方案中，Fc区是Igd Fc区，特别是人Igd Fc区。在一个实施方案中，Fc区在位置P329处包含氨基酸取代。在一个更特定的实施方案中，氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施方案中，Fc区在位置P329处包含氨基酸取代，并且在选自E233、L234、L235、N297和P331(根据Kabat EU索引编号)的位置处包含另一个氨基酸取代。在更特定的实施方案中，另一个氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施方案中，Fc区在位置P329、L234和L235(根据Kabat EU索引编号)处包含氨基酸取代。在更特定的实施方案中，Fc区包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”，“PGLALA”或“LALAPG”)。
通常，在Fc区的两个Fc结构域的每一个中存在相同的一个或多个氨基酸取代。因此，在特定的实施方案中，Fc区的每个Fc结构域包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)，即在Fc区中的第一Fc结构域和第二Fc结构域的每一个中，位置234处的亮氨酸残基由丙氨酸残基取代(L234A)，位置235处的亮氨酸残基由丙氨酸残基取代(L235A)，且位置329处的脯氨酸残基由甘氨酸残基取代(P329G)(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。
通常，在Fc区的两个Fc结构域的每一个中存在相同的一个或多个氨基酸取代。因此，在特定的实施方案中，Fc区的每个Fc结构域包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)，即在Fc区中的第一Fc结构域和第二Fc结构域的每一个中，位置234处的亮氨酸残基由丙氨酸残基取代(L234A)，位置235处的亮氨酸残基由丙氨酸残基取代(L235A)，且位置329处的脯氨酸残基由甘氨酸残基取代(P329G)(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一些实施方案中，IgG1 Fc结构域是包含D265A、N297A突变(EU编号)以降低效应功能的变体IgG1。
在另一个实施方案中，Fc结构域是具有降低的对Fc受体的结合的IgG4Fc结构域。具有降低的对Fc受体的结合的示例性IgG4 Fc结构域可包含选自下表4的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域仅包括以下所示序列的粗体部分：
Figure BDA0003700122800000401
Figure BDA0003700122800000411
Figure BDA0003700122800000421
Figure BDA0003700122800000431
在特定的实施方案中，具有降低的效应功能的IgG4包含WO2014/121087的SEQ IDNO:31的氨基酸序列的粗体部分，在本文中有时称为IgG4或hIgG4。
对于异二聚体Fc区，可以并入上述变体IgG4 Fc序列的组合，例如包含WO2014/121087的SEQ ID NO:30(或其粗体部分)和WO2014/121087的SEQ ID NO:37(或其粗体部分)的组合的Fc区，或包含WO2014/121087的SEQ ID NO:31(或其粗体部分)和WO2014/121087的SEQ ID NO:38(或其粗体部分)的组合的Fc区。
6.5.1.2 Fc异二聚化变体
与天然免疫球蛋白不同，某些IL2激动剂需要两个可操作地连接至不同的N端区域的Fc结构域(例如一个Fc结构域连接至Fab，而另一个Fc结构域连接至IL2部分)之间的二聚化。形成Fc结构域的两个Fc区的不充分的异二聚化可能是增加预期异二聚体分子产量的障碍，并且代表了纯化的挑战。可以使用本领域中可用的多种方法来增强可能存在于本公开的IL2激动剂中的Fc结构域的二聚化，例如，如EP 1870459A1；美国专利第5,582,996号；美国专利第5,731,168号；美国专利第5,910,573号；美国专利第5,932,448号；美国专利第6,833,441号；美国专利第7,183,076号；美国专利申请公开第2006204493A1号；和PCT公开第WO 2009/089004A1号中所公开。
本公开提供了包含Fc异二聚体(即包含异质的、不同的Fc结构域的Fc区)的IL2激动剂。通常，Fc异二聚体中的各个Fc结构域包含抗体的CH3结构域。如前节中所述，CH3结构域衍生自任何同种型、类型或亚类抗体的恒定区，并且优选地是IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)类的恒定区。
两个不同重链在CH3结构域处的异二聚化产生期望的IL2激动剂，而相同重链的同二聚化将降低期望的IL2激动剂的产率。因此，在优选实施方案中，缔合而形成本公开的IL2激动剂的多肽将含有相对于未修饰的Fc结构域，具有有利于异二聚体缔合的修饰的CH3结构域。
在特定的实施方案中，所述促进Fc异二聚体形成的修饰是所谓的“杵入臼(knob-into-hole)”或“臼内杵(knob-in-hole)”修饰，其在Fc结构域的一个中包含“杵”修饰，并在另一个Fc结构域中包含“臼”修饰。杵入臼技术描述于例如美国专利第5,731,168号；US 7,695,936；Ridgway等人,1996,Prot Eng 9:617-621，以及Carter,2001,Immunol Meth 248:7-15中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)，并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得可以将该突起置入空腔中而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。使用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代第一多肽的界面的小氨基酸侧链来构建突起。使用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代较大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与突起大小相同或相似的互补空腔。
因此，在一些实施方案中，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基由具有较大侧链体积的氨基酸残基所取代，从而在其第一亚基的CH3结构域内产生突起，该突起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，而Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基由具有较小侧链体积的氨基酸残基所取代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，其内可定位第一亚基的CH3结构域内的突起。优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。示例性的取代是Y470T。
在特定的此类实施方案中，在第一Fc结构域中，位置366处的苏氨酸残基由色氨酸残基所取代(T366W)，而在Fc结构域中，位置407处的酪氨酸残基由缬氨酸残基所取代(Y407V)，且任选地位置366处的苏氨酸残基由丝氨酸残基所取代(T366S)，而位置368处的亮氨酸残基由丙氨酸残基所取代(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。在进一步的实施方案中，额外在第一Fc结构域中，位置354处的丝氨酸残基由半胱氨酸残基所取代(S354C)，或位置356处的谷氨酸残基由半胱氨酸残基所取代(E356C)(特别是在位置354处的丝氨酸残基由半胱氨酸残基所取代)，且额外在第二Fc结构域中，位置349处的酪氨酸残基由半胱氨酸残基所取代(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。在特定的实施方案中，第一Fc结构域包含氨基酸取代S354C和T366W，而第二Fc结构域包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一些实施方案中，静电控制(例如如在Gunasekaran等人,2010,J Biol Chem285(25):19637-46中所述)可用于促进Fc区的第一Fc结构域和第二Fc结构域缔合。
作为替代方案或除了使用经修饰以促进异二聚化的Fc结构域之外，可以修饰Fc结构域以允许能够选择Fc异二聚体的纯化策略。在一个这样的实施方案中，一个多肽包含经修饰的Fc结构域，该经修饰的Fc结构域消除了其与蛋白A的结合，从而使得能够获得产生异二聚体蛋白的纯化方法。参见，例如美国专利第8,586,713号。因此，IL2激动剂包含第一CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸，且相较于缺少该氨基酸差异的对应IL2激动剂，其中至少一个氨基酸差异降低了IL2激动剂对蛋白A的结合。在一个实施方案中，第一CH3结构域结合蛋白A，而第二CH3结构域含有减少或消除蛋白A结合的突变/修饰，如H95R修饰(依据IMGT外显子编号；依据EU编号为H435R)。第二CH3可进一步包含Y96F修饰(依据IMGT；依据EU为Y436F)。这类修饰在本文中称为“星(star)”突变。
在一些实施方案中，Fc可含有一个或多个突变(例如杵和臼突变)以促进异二聚化，以及星突变以促进纯化。
6.6稳定化部分
本公开的IL2激动剂可包含稳定化部分，该稳定化部分可以在体内延长分子的血清半衰期。血清半衰期通常分为α期和β期。通过添加适当的稳定化部分，可以显著改善任一个或两个时期。例如，相对于不含有该稳定化部分的对应IL2激动剂，稳定化部分可使IL2激动剂的血清半衰期增加超过5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、400％、600％、800％、1000％或更多。出于本公开的目的，血清半衰期可以指在人或其他哺乳动物(例如小鼠或非人灵长类动物)中的半衰期。
野生型IL2的血清半衰期少于10分钟。本公开的IL2激动剂优选地在人和/或小鼠中的血清半衰期为至少约2小时、至少约4小时，至少约6小时或至少约8小时。在一些实施方案中，本公开的IL2激动剂的血清半衰期为至少10小时、至少12小时、至少15小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时或至少72小时。
稳定化部分包括聚氧化烯部分(例如聚乙二醇)、糖(例如唾液酸)和耐受良好的蛋白质部分(例如Fc及其片段和变体、转铁蛋白或血清白蛋白)。
可用于本公开的IL2激动剂中的其他稳定化部分包括在Kontermann等人,2011,Current Opinion in Biotechnology 22:868-76中描述的那些。此类稳定化部分包括但不限于人血清白蛋白融合物、人血清白蛋白缀合物、人血清白蛋白结合剂(例如AdnectinPKE、AlbudAb、ABD)、XTEN融合物、PAS融合物(即基于三个氨基酸：脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的重组PEG模拟物)、碳水化合物缀合物(例如羟乙基淀粉(HES))、糖基化、聚唾液酸缀合物和脂肪酸缀合物。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了IL2激动剂，其包含为聚合糖的稳定化部分。
血清白蛋白还可以通过具有与白蛋白非共价相互作用能力的模块参与半衰期延长。因此，本公开的IL2激动剂可包括白蛋白结合蛋白作为稳定化部分。白蛋白结合蛋白可以缀合或遗传融合至本公开的IL2激动剂的一个或多个其他组分。从某些细菌已知具有白蛋白结合活性的蛋白质。例如，链球菌蛋白G含有几个由约50个氨基酸残基(6kDa)组成的小白蛋白结合结构域。血清白蛋白结合蛋白的其他实例如描述于美国公开第2007/0178082号和第2007/0269422号中的那些。白蛋白结合结构域与蛋白质的融合导致半衰期大大延长(参见Kontermann等人,2011,Current Opinion in Biotechnology 22:868-76)。
在其他实施方案中，稳定化部分是人血清白蛋白。在其他实施方案中，稳定化部分是转铁蛋白。
在一些实施方案中，稳定化部分是Fc结构域，例如在第6.5.1节及其小节中描述的任一种Fc结构域，通过引用并入于此。在第6.5.1节中描述的Fc结构域通常能够二聚化。然而，出于稳定化的目的，Fc结构域可以是具有降低的自我缔合能力的可溶性单体Fc结构域。参见例如Helm等人,1996,J.Biol.Chem.271:7494-7500与Ying等人,2012,J BiolChem.287(23):19399–19408。可溶性单体Fc结构域的实例包含在对应于CH3中的T366和/或Y407的位置处的氨基酸取代，如在美国专利公开第2019/0367611号中所述。如第6.5.1节及其小节中所述，单体Fc结构域可以是任何Ig亚型，并且可包括减少效应功能的其他取代。
在其他实施方案中，稳定化部分是聚乙二醇部分或另一种聚合物，如以下第6.6.1节中所述。
稳定化部分可以经由接头连接至本公开的IL2激动剂的一个或多个其他组分，例如如以下第6.7节中所述。
6.6.1.聚乙二醇
在一些实施方案中，IL2激动剂包含聚乙二醇(PEG)或另一种亲水性聚合物作为稳定化部分，例如乙二醇/丙二醇、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。
PEG是已知的水溶性聚合物，其是可商购的或根据本领域中熟知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备的(Sandler和Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,纽约,Vol.3,pages 138-161)。术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子，而不考虑大小或在PEG末端处的修饰，并且可以由下式表示：X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH，其中n为20至2300，X为H或末端修饰，例如C1-4烷基。PEG可以含有结合反应所需的其他化学基团，该化学基团来自分子的化学合成；或作为间隔物以实现分子各部分的最佳距离。另外，这种PEG可以由连接在一起的一个或多个PEG侧链组成。具有超过一个PEG链的PEG称为多臂或支链PEG。支链PEG描述于例如欧洲申请第473084A号和美国专利第5,932,462号。
一个或多个PEG分子可以连接在IL2激动剂上的不同位置，且这样的连接可以通过与胺、硫醇或其他合适的反应基团反应来实现。胺部分可以是例如存在于IL2激动剂(或其组分)N端的一级胺，或存在于氨基酸(如赖氨酸或精氨酸)中的胺基团。在一些实施方案中，PEG部分连接在IL激动剂的以下位置处：a)N端；b)N端和最N端的α螺旋之间；c)位于IL2的表面结合至IL2-Rβ的环；d)C端和最C端的α螺旋之间；e)连接两个α螺旋的环；和/或f)C端。
可通过定点PEG化来实现PEG化，其中将合适的反应基团引入蛋白质中以产生优先发生PEG化的位点。在一些实施方案中，IL2激动剂经修饰而在预期位置处引入半胱氨酸残基，以允许在半胱氨酸上进行定点PEG化。可将突变引入本公开的IL2激动剂的编码序列中以产生半胱氨酸残基。例如，这可以通过将一个或多个氨基酸残基突变成半胱氨酸来实现。用于突变成半胱氨酸残基的优选氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和其他亲水性残基。优选地，突变成半胱氨酸的残基是表面暴露的残基。基于一级序列或三维结构，用于预测残基的表面可及性的算法在本领域中是众所周知的。IL2的三维结构描述于例如Wang等人,2005,Science 310(5751):1159-63，并且可用于鉴定能突变成半胱氨酸的表面暴露残基。尽管在一些实施方案中(例如在预期偏向结合至受体的情况下)设计了用半胱氨酸取代氨基酸和随后聚乙二醇化，以减少与一个或多个受体例如IL2-Rα或IL2-Rβ的结合，但可以对突变进行选择以避免破坏IL2与其一个或多个受体之间的相互作用。半胱氨酸残基的PEG化可以使用例如PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺或PEG-邻二硫吡啶进行。
PEG通常用适合于偶联至多肽上的预期位点的合适激活基团激活。PEG化方法是本领域中所熟知的，并进一步描述于Zalipsky等人,“Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides"在Polyethylene GlycolChemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris,Plenus Press,纽约(1992)，和Zalipsky,1995,Advanced Drug Reviews 16:157-182中。
PEG部分的分子量可以广泛变化并且可以是支链或直链的。通常，PEG的重量平均分子量为约100道尔顿至约150,000道尔顿。PEG的示例性重量平均分子量包括约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿和约80,000道尔顿。在某些实施方案中，PEG的分子量是40,000道尔顿。也可以使用具有任何前述总分子量的PEG的支链形式。在一些实施方案中，PEG具有两个支链。在其他实施方案中，PEG具有四个支链。在另一个实施方案中，PEG是双-PEG(NOF Corporation，DE-200MA)，其中两个含IL2的多肽链被缀合。
本领域中已知的常规分离和纯化技术可用于纯化PEG化的IL2激动剂，如尺寸排阻(例如凝胶过滤)和离子交换层析。也可以使用SDS-PAGE分离产物。可以被分离的产物包括单PEG化、二PEG化、三PEG化、聚PEG化和非PEG化IL2激动剂，以及游离PEG。可以通过在洗脱峰周围合并较宽的级分以增加组合物中单PEG的百分比来控制单PEG缀合物百分比。约90％的单PEG缀合物代表了产率和活性的良好平衡。
在一些实施方案中，PEG化IL2激动剂优选将保留至少约25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％与未修饰的IL2激动剂有关的生物活性。在一些实施方案中，生物活性是指其结合至高或中亲和力IL2受体的能力，如由KD、kon或koff所评估的。
6.7接头
在某些方面，本公开提供了IL2激动剂，其中IL2激动剂的两个或更多个组分通过肽接头彼此连接。作为实例而非限制，接头可用于连接(a)IL2部分和多聚化部分；(b)IL2部分和靶向部分；(c)靶向部分和多聚化部分(例如Fab结构域和Fc结构域)；(d)IL2部分内的不同结构域(例如IL2结构域和IL-Rα结构域)；或(e)靶向部分内的不同结构域(例如肽-MHC复合体的不同组分或scFv中的VH结构域和VL结构域)。
肽接头的长度范围可以是2个氨基酸至60个或更多个氨基酸，且在某些方面，肽接头的长度范围是3个氨基酸至50个氨基酸、4个至30个氨基酸、5个至25个氨基酸、10个至25个氨基酸、10个氨基酸至60个氨基酸、12个氨基酸至20个氨基酸、20个氨基酸至50个氨基酸，或25个氨基酸至35个氨基酸。
在特定方面，肽接头的长度为至少5个氨基酸、至少6个氨基酸或至少7个氨基酸，且长度任选地为至多30个氨基酸、至多40个氨基酸、至多50个氨基酸或至多60个氨基酸。
在前述的一些实施方案中，接头的长度范围是5个氨基酸至50个氨基酸，例如长度范围是5至50、5至45、5至40、5至35、5至30、5至25或5至20个氨基酸。在前述的其他实施方案中，接头的长度范围为6个氨基酸至50个氨基酸，例如长度范围为6至50、6至45、6至40、6至35、6至30、6至25或6至20个氨基酸。在前述的其他实施方案中，接头的长度范围为7个氨基酸至50个氨基酸，例如长度范围为7至50、7至45、7至40、7至35、7至30、7至25或7至20个氨基酸。
带电荷的接头(例如带电荷的亲水性接头)和/或柔性接头是特别优选的。
可用于本公开IL2激动剂的柔性接头的实例包括由Chen等人,2013,Adv DrugDeliv Rev.65(10):1357-1369与Klein等人,2014,Protein Engineering,Design&Selection 27(10):325-330所描述的那些。特别有用的柔性接头是或包含重复的甘氨酸和丝氨酸，例如GnS(SEQ ID NO:55)或SGn(SEQ ID NO:56)的单体或多聚体，其中n是1至10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，接头是或包含重复的G4S的单体或多聚体，例如(GGGGS)n(SEQ ID NO:57)。
聚甘氨酸接头可合适地用于本公开的IL2激动剂中。在一些实施方案中，肽接头包含两个连续的甘氨酸(2Gly)、三个连续的甘氨酸(3Gly)、四个连续的甘氨酸(4Gly)(SEQ IDNO:58)、五个连续的甘氨酸(5Gly)(SEQ ID NO:59)、六个连续的甘氨酸(6Gly)(SEQ ID NO:60)、七个连续的甘氨酸(7Gly)(SEQ ID NO:61)、八个连续的甘氨酸(8Gly)(SEQ ID NO:62)或九个连续的甘氨酸(9Gly)(SEQ ID NO:63)。
6.7.1pMHC接头
对于pMHC复合体，合适的接头的范围可以从1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。除上述接头外，pMHC接头还包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GGGS)n(SEQ ID NO:65)，其中n是至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域中已知的其他柔性接头。可以使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物；Gly和Ser都相对非结构的，因此可以作为组分之间的中性系链。可以使用甘氨酸聚合物；甘氨酸甚至比丙氨酸更能进入phi-psi空间，并且相较于具有更长侧链的残基限制更少(参见Scheraga,1992,Rev.Computational Chem.11173-142，通过整体引用并入本发明)。示例性接头可包含氨基酸序列，包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:66)、GGSGG(SEQ ID NO:67)、GSGSG(SEQ ID NO:68)、GSGGG(SEQ ID NO:69)、GGGSG(SEQ ID NO:70)、GSSSG(SEQ ID NO:71)、GCGASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:72)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:73)、GGGASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:74)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:6)、GGGASGGGGS(SEQ ID NO:75)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:76)、GCGGS(SEQID NO:77)等。在一些实施方案中，接头多肽包括可与存在于pMHC复合体另一部分中的半胱氨酸残基形成二硫键的半胱氨酸残基。在某些实施方案中，接头包含氨基酸序列GCGGS(SEQID NO:77)。用半胱氨酸取代G4S接头(SEQ ID NO:57)中的甘氨酸可导致二硫键的形成，例如在HLA.A2中具有相应半胱氨酸取代的MHC靶向部分使MHC复合体内的MHC稳定化。
6.7.2铰链序列
在其他实施方案中，本公开的IL2激动剂包含为铰链区的接头。特别地，当IL2激动剂含有基于免疫球蛋白的靶向部分时，铰链可用于将靶向部分(例如Fab结构域)连接至多聚化结构域(例如Fc结构域)。铰链区可以是天然的或经修饰的铰链区。铰链区通常存在于Fc区的N端。除非上下文另有规定，否则术语“铰链区”是指天然的或非天然存在的铰链序列，其在单个或单体多肽链的情况下是单体铰链结构域，并且在二聚体多肽的情况下(例如，通过两个Fc结构域的缔合形成的同二聚体或异二聚体IL2激动剂)可以在分开的多肽链上包含两个缔合的铰链序列。
天然铰链区是通常在天然存在的抗体的Fab和Fc结构域之间存在的铰链区。修饰的铰链区是长度和/或组成与天然铰链区不同的任何铰链。此类铰链可以包括来自其他物种的铰链区，如人、小鼠、大鼠、兔、鲨鱼、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼或山羊铰链区。其他修饰的铰链区可包含衍生自与重链Fc区不同类别或亚类的抗体的完整铰链区。或者，修饰的铰链区可包含天然铰链或重复单元的一部分，其中重复中的每个单元均衍生自天然铰链区。在另一替代方案中，可以通过将一个或多个半胱氨酸或其他残基转化为中性残基(例如丝氨酸或丙氨酸)，或通过将合适位置处的残基转化为半胱氨酸残基来改变天然铰链区。通过此种方式，可以增加或减少铰链区中的半胱氨酸残基数目。其他修饰的铰链区可以是完全合成的，并且可以设计成具有如长度、半胱氨酸组成和柔性的期望特性。
例如，在美国专利第5,677,425号、WO 99/15549、WO 2005/003170、WO 2005/003169、WO 2005/003170、WO 98/25971和WO 2005/003171中已经描述了许多修饰的铰链区，且这些文件通过引用并入本文。
在一个实施方案中，本公开的IL2激动剂包含Fc区，其中一个或两个Fc结构域在其N端处具有完整的铰链区。
在不同实施方案中，铰链区内的位置233-236可以是G、G、G和未占据；G、G、未占据和未占据；G、未占据、未占据和未占据；或全部未占据，其中位置依据EU编号进行编号。
在一些实施方案中，本公开的IL2激动剂包含修饰的铰链区，其相对于相同同种型(例如人IgG1或人IgG4)的野生型铰链区降低了对Fcγ受体的结合亲和力。
在一个实施方案中，本公开的IL2激动剂包含Fc区，其中每个Fc结构域在其N端具有完整的铰链区，其中每个Fc结构域和铰链区均衍生自IgG4，且每个铰链区包含修饰的序列CPPC(SEQ ID NO:78)。与含有序列CPPC(SEQ ID NO:78)的IgG1相比，人IgG4的核心铰链区含有序列CPSC(SEQ ID NO:79)。lgG4序列中存在的丝氨酸残基导致该区中的柔性增加，并因此导致一部分分子在同一蛋白质链内形成二硫键(链内二硫键)，而不是与IgG分子中的另一条重链桥接形成链间二硫键(Angel等人,1993,Mol Immunol 30(1):105-108)。将丝氨酸残基变成脯氨酸以提供与lgG1相同的核心序列，可在lgG4铰链区中完全形成链间二硫键，从而减少纯化产物的异质性。这个经改变的同种型称为IgG4P。
6.7.2.1嵌合铰链序列
铰链区可以是嵌合铰链区。
例如，嵌合铰链可包含衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”序列，其与衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列组合。
在特定实施方案中，嵌合铰链区包含氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ IDNO:80)(先前公开为WO2014/121087的SEQ ID NO:8，其通过整体引用并入本文)或ESKYGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO:81)(先前公开为WO2014/121087的SEQ ID NO:9)。此类嵌合铰链序列可适当地连接至IgG4 CH2区(例如通过引入IgG4 Fc结构域中例如人或鼠类Fc结构域中，其可在CH2和/或CH3结构域中受到进一步修饰以减少效应功能，例如如6.5.1.1节中所述)。
6.7.2.2.效应功能减少的铰链序列
在进一步的实施方案中，铰链区可以被修饰以减少效应功能，例如如WO2016161010A2中所述，其通过整体引用并入本文。在各种实施方案中，修饰的铰链区的位置233-236是G、G、G和未占据；G、G、未占据和未占据；G、未占据、未占据和未占据；或全部未占据，其中位置依据EU编号进行编号(如WO2016161010A2的图1中所示)。这些片段可以表示为GGG-、GG--、G---或----，其中“-”表示未占据的位置。
位置236在典型人IgG2中未被占据，但是在其他典型的人IgG同种型中被占据。在所有四种人同种型中，位置233-235被G以外的残基所占据(如WO2016161010A2的图1中所示)。
位置233-236内的铰链修饰可与被P占据的位置228组合。位置228在人IgG1和IgG2中天然被P占据，但在人IgG4中被S占据，且在人IgG3中被R占据。IgG4抗体中的S228P突变在稳定IgG4抗体和减少外源性抗体与内源性抗体之间重链轻链对的交换方面是有利的。优选地，位置226-229分别被C、P、P和C所占据。
示例性的铰链区具有残基226-236，有时称为中(或核心)下铰链，其被命名为GGG-(233-236)、GG--(233-236)、G---(233-236)与无G(233-236)的修饰的铰链序列所占据。任选地，铰链结构域氨基酸序列包含CPPCPAPGGG-GPSVF(SEQ ID NO:82)(先前公开为WO2016161010A2的SEQ ID NO:1)、CPPCPAPGG--GPSVF(SEQ ID NO:83)(先前公开为WO2016161010A2的SEQ ID NO:2)、CPPCPAPG---GPSVF(SEQ ID NO:84)(先前公开为WO2016161010A2的SEQ ID NO:3)或CPPCPAP----GPSVF(SEQ ID NO:85)(先前公开为WO2016161010A2的SEQ ID NO:4)。
可以将上述修饰的铰链区并入重链恒定区，该重链恒定区通常包括CH2和CH3结构域，且其可以具有侧接指定区域的额外铰链片段(例如上铰链)。尽管可以是不同同种型的混合物，但是存在的此类额外恒定区片段通常是相同同种型，优选地为人同种型。此类额外的人恒定区片段的同种型优选地是人IgG4，但也可以是人IgG1、IgG2、或IgG3或其中结构域为不同同种型的混合物。人IgG1、IgG2和IgG4的示例性序列显示于WO2016161010A2的图2-4中。
在特定实施方案中，修饰的铰链序列可以连接至IgG4 CH2区(例如，通过引入IgG4Fc结构域中，IgG4 Fc结构域为例如可以在CH2和/或CH3结构域中进一步修饰以减少效应功能的人或鼠类Fc结构域，例如如第6.5.1.1节中所述)。
6.8核酸和宿主细胞
在另一个方面，本公开提供了编码本公开的IL2激动剂的核酸。在一些实施方案中，IL2激动剂由单个核酸编码。在其他实施方案中，例如在异二聚体分子或包含由超过一个多肽链构成的靶向部分的分子的情况下，IL2激动剂可以由多个(例如两个、三个、四个或更多个)核酸编码。
单个核酸可编码包含单条多肽链的IL2激动剂、包含两条或更多条多肽链的IL2激动剂，或包含超过两条多肽链的IL2激动剂的一部分(例如，单个核酸可编码包含三条、四条或更多条多肽链的IL2激动剂的两条多肽链，或包含四条或更多条多肽链的IL2激动剂的三条多肽链)。对于表达的单独控制，编码两条或更多条多肽链的开放阅读框可以受到单独转录调节元件(例如启动子和/或增强子)的控制。编码两条或更多条多肽的开放阅读框也可以受到相同的转录调节元件的控制，并由内部核糖体进入位点(IRES)序列隔开，从而允许翻译成单独的多肽。
在一些实施方案中，包含两条或更多条多肽链的IL2激动剂由两个或更多个核酸编码。编码IL2激动剂的核酸的数目可以等于或小于IL2激动剂中的多肽链数目(例如，当超过一条多肽链由单个核酸所编码时)。
本发明的核酸可以是DNA或RNA(例如mRNA)。
在另一个方面，本公开提供了含有本公开的核酸的宿主细胞和载体。核酸可以存在于相同宿主细胞或独立宿主细胞中的单个载体或独立载体中，如下文更详细地描述。
6.8.1载体
本公开提供了载体，其包含编码本文所述的IL2激动剂或IL2激动剂组分的核苷酸序列，例如半抗体的一条或两条多肽链。载体包括但不限于病毒、质体、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。
可以采用许多载体系统。例如，一类载体利用衍生自动物病毒(如例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(Rous肉瘤病毒，MMTV或MOMLV)或SV40病毒)的DNA元件。另一类载体利用衍生自RNA病毒(诸如Semliki森林病毒、东方马脑炎病毒和黄病毒)的RNA元件。
另外，可以通过引入允许选择转染的宿主细胞的一个或多个标志物来选择已将DNA稳定整合到其染色体中的细胞。标志物可以提供例如对营养缺陷宿主的原始营养型、杀生物剂抗性(例如抗生素)、或对重金属(如铜)的抗性等。可选择标志物基因可以直接连接至待表达的DNA序列，或通过共转化引入细胞中。mRNA的最佳合成可能还需要额外元件。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
一旦已经准备好含有构建体的表达载体或DNA序列用于表达，就可以将表达载体转染或引入合适的宿主细胞中。可以采用各种技术来实现这一点，例如原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。用于培养所得的转染细胞和回收表达的多肽的方法与条件是本领域技术人员所知的，并且可以基于本说明书根据所使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞来改变或优化。
6.8.2细胞
本公开还提供了包含本公开的核酸的宿主细胞。
在一个实施方案中，宿主细胞经遗传改造成包含一个或多个本文所述的核酸。
在一个实施方案中，通过使用表达盒对宿主细胞进行遗传改造。短语“表达盒”是指核苷酸序列，其能够影响与此类序列兼容的宿主中的基因的表达。此类盒可以包括启动子、具有或不具有内含子的开放阅读框以及终止信号。也可以使用影响表达所必需或有帮助的其他因子，如例如诱导型启动子。
本公开还提供了包含本文所述载体的宿主细胞。
细胞可以是但不限于真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人细胞。合适的真核细胞包括但不限于Vero细胞、HeLa细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞和MDCKII细胞。合适的昆虫细胞包括但不限于Sf9细胞。
6.9药物组合物
6.9.1包含IL2激动剂多肽的药物组合物
本公开的IL2激动剂可以是包含IL2激动剂和一种或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂的组合物形式。可以将组合物制备用于特定用途，如用于兽医用途或人的药学用途。组合物的形式(例如干燥粉末、液体制剂等)与所使用的赋形剂、稀释剂和/或载剂将取决于IL2激动剂的预期用途和治疗用途、施用模式。
对于治疗用途，组合物可以作为包括药学上可接受载剂的无菌药物组合物的一部分来提供。此组合物可以是任何合适的形式(取决于将其施用于患者的预期方法)。药物组合物可以通过各种途径(如经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌肉内、肿瘤内、鞘内、外敷或局部性)施用于患者。在任何给定情况下，最合适的施用途径将取决于特定抗体、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，药物组合物将静脉内或皮下施用。
药物组合物可以方便地以单位剂量形式存在，每个剂量含有预定量的本公开的IL2激动剂。单位剂量中所包括的IL2激动剂的量将取决于待治疗的疾病以及本领域中周知的其他因素。此类单位剂量可以是含有适于单次施用的量的IL2激动剂的冻干粉末形式，或者是液体的形式。干燥粉末单位剂量形式可以与注射器、适量稀释剂和/或其他用于施用的组分一起包装在试剂盒中。液体形式的单位剂量可以方便地以预填充有适于单次施用的IL2激动剂的注射器形式提供。
药物组合物也可以以含有适于多次施用的IL2激动剂的量的整批形式提供。
可通过将具有预期纯度的IL2激动剂与本领域中通常使用的任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(在本文中统称为“载剂”)(即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型去污剂、抗氧化剂和其他各种添加剂)混合来制备药物组合物，作为冻干制剂或水溶液储存。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th edition(Osol,ed.1980)。此类添加剂在所使用的剂量和浓度下对接受者应无毒。
缓冲剂有助于将pH维持在近似生理条件的范围内。它们可以以多种浓度存在，但通常以约2mM至约50mM的浓度存在。和本公开一起使用的合适缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，如柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐缓冲剂(例如葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可以使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐如Tris。
可以添加防腐剂以阻止微生物生长，并且可以以约0.2％-1％(w/v)范围的量添加。适用于本公开的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、苯扎卤化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六甲铵、和对羟基苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可以添加有时称为“稳定剂”的等渗剂以确保本公开的液体组合物的等渗性，并且包括多元糖醇，例如三元或更高级的糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指广泛种类的赋形剂，其功能范围可以从填充剂到溶解治疗剂的添加剂或有助于防止变性或黏附于容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上面列举)；氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环醇(如肌醇)；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个残基或更少的肽)；蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮单糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；双糖，如乳糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖；和三糖苷，如棉子糖；和多糖，如葡聚糖。稳定剂可以以占每重量份IL2激动剂的0.5至10wt％的量存在。
可以添加非离子型表面活性剂或去污剂(也称为“润湿剂”)以帮助糖蛋白溶解并保护糖蛋白免于搅动引起的聚集，其还允许制剂暴露于剪切表面应力，而不会引起蛋白质变性。合适的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、帕洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)和普朗尼克多元醇。非离子型表面活性剂可以以约0.05mg/mL至约1.0mg/mL的范围存在，例如约0.07mg/mL至约0.2mg/mL。
额外的各种赋形剂包括填充剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和助溶剂。
6.9.2用于递送编码IL2激动剂的核酸的药物组合物
本公开的IL2激动剂可以通过任何可用于基因疗法的方法递送，例如作为mRNA或通过在合适的启动子控制下的编码IL2激动剂的病毒载体来递送。
示例性基因疗法载体包括基于腺病毒或AAV的治疗剂。用于本文方法、用途或组合物中的基于腺病毒或基于AAV的治疗剂的非限制性实例包括但不限于：rAd-p53，其为编码野生型人肿瘤抑制蛋白p53的重组腺病毒载体p53，例如用于治疗癌症(也称为
Figure BDA0003700122800000581
Qi等人,2006,Modern Oncology,14:1295-1297)；Ad5_d11520，其为缺少E1B基因以使宿主p53失活的腺病毒(也称为H101或ONYX-015；参见例如Russell等人,2012,Nature Biotechnology 30:658-670)；AD5-D24-GM-CSF，含有细胞因子GM-CSF的腺病毒，例如用于治疗癌症(Cerullo等人,2010,Cancer Res.70:4297)；rAd-HSVtk，具有HSV胸苷激酶基因的复制缺陷型腺病毒，例如用于癌症治疗(开发为
Figure BDA0003700122800000582
Ark Therapeutics，参见例如美国专利第6,579,855号；由Advantagene开发为ProstAtakTM；国际PCT申请第WO2005/049094号)；rAd-TNFα，复制缺陷型腺病毒载体，在化学放射诱导型EGR-1启动子控制下表达人肿瘤坏死因子α(TNFα)，例如用于癌症治疗(TNFeradeTM、GenVec；Rasmussen等人,2002,Cancer Gene Ther.9:951-7)；Ad-IFNβ，腺病毒血清型5载体，其中E1和E3基因已删除，在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子引导下表达人干扰素β基因，例如用于治疗癌症(BG00001和H5.110CMVhIFN-β，Biogen；Sterman等人,2010,Mol.Ther.18:852-860)。
可以将核酸分子(例如mRNA)或病毒配制成药物组合物中的唯一药学活性成分，或者可以与针对待治疗特定疾病的其他活性剂组合。任选地，其他药剂、药物、载剂、佐剂、稀释剂可包括在本文提供的组合物中。例如，润湿剂、乳化剂和润滑剂中的任何一种或多种，如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂，调味剂和芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、螯合剂与惰性气体也可以存在于组合物中。可以包括在组合物中的示例性其他药剂和赋形剂包括，例如水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠；油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚；以及金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸和磷酸。
当用作过继细胞转移疗法(例如第6.11.1节中所述的表达CAR的细胞疗法)的辅助疗法时，细胞疗法如表达CAR的细胞可以工程化以表达本公开的IL-2激动剂。IL2激动剂可以靶向特定基因座，例如内源性IL2基因座；或在活化或功能异常的淋巴细胞中有活性的另一基因座，例如PD-1基因座；或插入非特异性基因座。靶向特定基因座可以通过基因编辑来实现，例如使用锌指蛋白、CRISPR/Cas9系统等。
6.10治疗适应症和治疗方法
本公开的IL2激动剂可用于治疗其中宿主免疫系统的刺激是有益的疾病状态，特别是期望增强细胞免疫应答的病症。这些病症可以包括宿主免疫应答不足或有缺陷的疾病状态。可以施用本公开的IL2激动剂的疾病状态包含例如其中细胞免疫应答是特异性免疫的关键机制的肿瘤或感染。可以采用本公开的IL2激动剂的特定疾病状态包括癌症，例如肾细胞癌或黑色素瘤；免疫缺陷，特别是在HIV阳性患者、免疫抑制患者、慢性感染等中。本公开的IL2激动剂可以以本身施用或以任何合适的药物组合物形式施用。
在一个方面，提供了用作药物的本公开的IL2激动剂。在其他方面，提供了用于治疗疾病的本公开的IL2激动剂。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法中的本公开IL2激动剂。在一个实施方案中，本公开提供了如本文所述的IL2激动剂，其用于治疗有需要的受试者的疾病。在某些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有疾病的受试者的方法中的IL2激动剂，该方法包括向个体施用治疗有效量的IL2激动剂。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增生性病症。在优选实施方案中，疾病是癌症。在某些实施方案中，如果待治疗的疾病是癌症，则该方法进一步包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗剂，例如抗癌剂。在进一步的实施方案中，本公开提供了用于刺激免疫系统的IL2激动剂。在某些实施方案中，本公开提供了用于在刺激受试者的免疫系统的方法中使用的IL2激动剂，该方法包括向个体施用有效量的IL2激动剂以刺激免疫系统。根据以上任一实施方案，“个体”是哺乳动物，优选地是人。根据以上任一实施方案，“刺激免疫系统”可以包括免疫功能的普遍增加、T细胞功能增加、B细胞功能增加、淋巴细胞功能恢复、IL-2受体表达增加、T细胞反应性增加、自然杀伤细胞活性或淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞活性增加等中的任意一个或多个。
在另一个方面，本公开提供了本公开的IL2激动剂在制造或制备用于治疗有需要的受试者的疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗疾病的方法中，该方法包括向患有该疾病的受试者施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增生性病症。在优选实施方案中，疾病是癌症。在一个这样的实施方案中，如果待治疗的疾病是癌症，则该方法进一步包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗剂，例如抗癌剂。在进一步的实施方案中，该药物用于刺激免疫系统。在进一步的实施方案中，该药物用于刺激受试者的免疫系统的方法中，该方法包括向个体施用有效量的药物以刺激免疫系统。根据以上任一实施方案，“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。根据以上任一实施方案，“刺激免疫系统”可以包括免疫功能普遍增加、T细胞功能增加、B细胞功能增加、淋巴细胞功能恢复、IL-2受体表达增加、T细胞反应性增加、自然杀伤细胞活性或淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞活性增加等中的任意一个或多个。
在又一方面，本公开提供用于治疗受试者的疾病的方法，该方法包括向所述个体施用治疗有效量的本公开的IL2激动剂。在一个实施方案中，向所述个体施用包含药学上可接受形式的本公开的IL2激动剂的组合物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增生性病症。在优选实施方案中，疾病是癌症。在某些实施方案中，如果待治疗的疾病是癌症，则该方法进一步包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗剂，例如抗癌剂。在又一个方面，本公开提供用于刺激受试者免疫系统的方法，该方法包括向个体施用有效量的IL2激动剂以刺激免疫系统。根据以上任一实施方案，“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。根据以上任一实施方案，“刺激免疫系统”可以包括免疫功能普遍增加、T细胞功能增加、B细胞功能增加、淋巴细胞功能恢复、IL-2受体表达增加、T细胞反应性增加、自然杀伤细胞活性或淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞活性增加等中的任意一个或多个。
在某些实施方案中，待治疗的疾病是增生性病症，优选地为癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。可以使用本公开的IL2激动剂治疗的其他细胞增生性病症包括但不限于位于以下部位的肿瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝脏、胰脏、腹膜、内分泌腺(肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头颈、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部区域和泌尿生殖系统。还包括癌前病症或损伤和癌症转移。在某些实施方案中，癌症选自肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。类似地，本公开的IL2激动剂也可以治疗其他细胞增生性病症。此类细胞增生性病症的实例包括但不限于：高γ球蛋白血症、淋巴增生性病症、副蛋白血症、紫癜、结节病、Sezary综合征、Waldenstron巨球蛋白血症、戈谢病、组织细胞增生症以及除肿瘤形成以外的位于上面列出的器官系统中的任何其他细胞增生性疾病。在另一个实施方案中，疾病与自身免疫、移植排斥、创伤后免疫应答和感染性疾病(例如HIV)有关。更具体地说，IL2激动剂可用于消除与免疫细胞介导的病症相关的细胞，病症包括淋巴瘤、自身免疫、移植排斥、移植物抗宿主病、局部缺血和中风。技术人员容易理解到，在许多情况下，IL2激动剂可能无法提供治愈，而只能提供部分益处。在一些实施方案中，具有某些益处的生理变化也被认为是在治疗上有益的。因此，在一些实施方案中，提供生理变化的IL2激动剂的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物，更具体地是人。
为了预防或治疗疾病，本公开的IL2激动剂的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他额外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、施用途径、患者的体重、特定IL2激动剂、疾病的严重程度和病程、抗体施用以用于预防还是治疗目的、先前或并行的治疗干预、患者的临床病史和对IL2激动剂的应答，以及主治医师的判断。无论如何，负责施用的从业者将确定组合物中活性成分的浓度和对个别受试者的合适剂量。本文考虑了各种给药时间表，包括但不限于在不同时间点内的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
未缀合的IL2的单次施用范围可为约50,000IU/kg至约1,000,000IU/kg或更多，更通常为约600,000IU/kg的IL2。这可以一天重复数次(例如2-3次)、数天(例如连续3-5天)，然后在休息一段时间(例如大约7-14天)后重复一次或多次。因此，治疗有效量可以仅包含单次施用或在一段时间内多次施用(例如，在约10-20天的期间内给予20-30次单独施用，每次约600,000IU/kg的IL2)。
类似地，将IL2激动剂一次或在一系列治疗内适当地施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)的IL2激动剂可以是施用于患者的初始候选剂量，无论是通过一次或多次单独施用，还是通过连续输注。取决于上述因素，一个典型的日剂量范围可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更久的重复施用，取决于病症，治疗通常持续至出现预期的疾病症状抑制。IL2激动剂的一个示例性剂量范围为约0.005mg/kg至约10mg/kg。在其他非限制性实例中，剂量还可以包含每次施用约1μg/kg/体重、约5μg/kg/体重、约10μg/kg/体重、约50μg/kg/体重、约100μg/kg/体重、约200μg/kg/体重、约350μg/kg/体重、约500μg/kg/体重、约1mg/kg/体重、约5mg/kg/体重、约10mg/kg/体重、约50mg/kg/体重、约100mg/kg/体重、约200mg/kg/体重、约350mg/kg/体重、约500mg/kg/体重，至约1000mg/kg/体重或更多，以及可在其中得出的任何范围。在从本文列出的数字衍生的范围的非限制性实例中，基于上述数字，可施用范围为约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg体重等。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任何组合)。此剂量可以例如每周或每三周间歇地施用(例如，使得患者接受约两个至约二十个，或例如约六个剂量的IL2激动剂)。一开始可以施用较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定很容易监测此疗法的进展。
本公开的IL2激动剂通常以有效达到预期目的的量使用。为了用于治疗或预防疾病病症，本公开的IL2激动剂或其药物组合物以治疗有效量施用或应用。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。
对于全身性施用，可以最初从体外测定(如细胞培养测定)来预估治疗有效剂量。然后可以在动物模型中制定剂量，以达到包括细胞培养中所确定的EC50在内的循环浓度范围。此信息可用于更准确地确定在人体内有用的剂量。
也可以使用本领域中周知的技术，根据体内数据(例如动物模型)来预估初始剂量。本领域技术人员可以根据动物数据来优化对人的施用。
可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的IL2激动剂的血浆水平。通过注射施用的惯常患者剂量为约0.1至50mg/kg/天，典型地为约0.5至1mg/kg/天。治疗有效血浆水平可以通过每天多次施用来达到。血浆水平可以例如通过ELISA HPLC来测量。
在局部施用或选择性摄取的情况下，IL2激动剂的有效局部浓度可能与血浆浓度不相关。本领域技术人员将能够优化治疗有效局部剂量而不需要过度实验。
本文所述的IL2激动剂的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不会引起实质毒性。IL2激动剂的毒性和治疗功效可以通过在细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定(参见例如实施例7和8)。细胞培养测定和动物研究可用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体有效治疗的剂量)。毒性和治疗功效的剂量比是治疗指数，可以表示为比率LD50/ED50。优选展现出高治疗指数的IL2激动剂。在一个实施方案中，根据本公开的IL2激动剂展现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于制定适用于人的一系列剂量。剂量优选地位于包括几乎没有毒性或无毒性的ED50的循环浓度范围内。取决于多种因素(例如所采用的剂量类型、所利用的施用途径、受试者的病症等)，剂量可以在该范围内变化。个体临床医师可以根据患者的病症选择确切的制剂、施用途径和剂量(参见，例如Fingl等人,1975,In:The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1,p.1，通过整体引用并入本文)。
用本公开的IL2激动剂治疗的患者的主治医师将知道由于毒性、器官功能障碍等而如何以及何时终止、中断或调整施用。相反，如果临床反应不充分(排除毒性)，主治医师也将知道调整治疗到更高的水平。在治疗所关注的病症时，施用剂量的大小将随待治疗病症的严重程度、施用途径等而改变。病症的严重程度可以例如通过标准预后评估方法来部分评估。此外，剂量以及可能的给药频率也将根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。
由于较低的毒性，本公开的IL2激动剂可以比野生型IL2具有更高的最大治疗剂量，但是因为半衰期延长，含有稳定化部分的IL2激动剂通常以比野生型IL2更低的剂量来施用。
6.11组合疗法
根据本公开的IL2激动剂可以与一种或多种其他药剂组合施用于疗法中。例如，本公开的IL2激动剂可以与至少一种额外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”涵盖为治疗需要这种疗法的受试者的症状或疾病而施用的任何药剂。此类额外的治疗剂可包含适合于待治疗的特定适应症的任何活性成分，优选地是那些具有不会彼此不利影响的互补活性的活性成分。在某些实施方案中，额外的治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞黏附抑制剂、细胞毒剂、细胞凋亡激活剂或增加细胞对凋亡诱导剂敏感性的药剂。在特定实施方案中，额外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓朴异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷基化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡的激活剂、或抗血管生成剂。
此类其他药剂适当地以对于预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所使用的IL2激动剂的量、病症或治疗的类型以及上面讨论的其他因素。IL2激动剂通常以与本文所述相同的剂量和施用路径来使用，或约本文所述剂量的1％至99％，或经验/临床上确定合适的任何剂量和任何途径。
上文提到的此种组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂纳入相同或单独的组合物中)以及单独施用，在这种情况下，本公开的IL2激动剂可以在施用额外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后施用。本公开的IL2激动剂也可以与放射疗法组合使用。
6.11.1使用IL2激动剂疗法和免疫疗法的组合疗法
本公开的IL2激动剂可有利地与表达嵌合抗原受体(“CAR”)的细胞(例如表达CAR的T细胞(“CAR-T”))(例如用于治疗癌症或自身免疫疾病的CAR-T)组合使用。在一些实施方案中，CAR-T细胞由IL2激动剂中的靶向部分所识别。靶向部分可以识别CART细胞上的T细胞受体或另一细胞表面分子。在一些实施方案中，IL2激动剂中的靶向部分能够结合至CAR的细胞外结构域，例如抗原结合结构域。
也可以对接受CAR和IL2激动剂疗法的受试者施用调理或淋巴清除疗法，例如环磷酰胺和氟达拉滨的方案。此疗法通常在向受试者施用表达CAR的细胞之前的数天内进行。例如，环磷酰胺可以在输注表达CAR的细胞之前(输注日为零)，例如在第-8天和第-7天时施用持续两天，而氟达拉滨可以从第-6天至第-2天施用于受试者连续五天。在一个实施方案中，向受试者施用60mg/kg的环磷酰胺。在一个实施方案中，向受试者施用25mg/m2的氟达拉滨。在一个实施方案中，在第-1天(即向受试者输注表达CAR的细胞之前的一天)没有治疗。
表达CAR的细胞可以以104至109个细胞/kg体重，优选地以105至106个细胞/kg体重的范围的量施用，包括这些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以按这些剂量多次施用。在一些实施方案中，以1×106至1×1011个细胞或1×107至1×108个细胞的剂量来施用表达CAR的细胞。
表达CAR的细胞可以在施用于人受试者之前由抗CD3和/或抗CD28抗体连同IL2扩增来激活。
表达CAR的细胞(例如T细胞)优选地对于受试者是自体的，但是也可以是同种异体来源的。
在一个实施方案中，从施用表达CAR的细胞群之日开始，连续四天通过推注向人受试者施用IL2激动剂。
在一个实施方案中，从施用表达CAR的细胞群之日开始，至少连续五天通过推注向人受试者施用IL2激动剂。
IL2激动剂可以施用更长的时期，例如持续一周、两周、一个月或更久。给药频率可以(例如)在表达CAR的细胞耗竭后降低。例如，IL2激动剂可以最初每天施用，然后将给药频率降低至每周一次。
IL2疗法的起始可以在施用表达CAR的细胞的同一天，或之后的一天、二天、三天、四天、五天、六天或一周后开始。
在一个实施方案中，细胞群包含从受试者获得的经工程改造以重组表达CAR的T细胞。
在一个实施方案中，在向受试者施用细胞群后，IL2激动剂血浆水平维持一到两周。
在一个实施方案中，在向受试者施用细胞群后，IL2激动剂血浆水平维持持一个月。
6.11.1.1CAR组分
典型的CAR包括含有抗原结合结构域(例如抗体的抗原结合结构域)的细胞外区域，该细胞外区域连接至细胞内信号传导模块，该细胞内信号传导块包括在抗原结合后诱导T细胞激活的CD3信号传导结构域(例如T细胞受体的CD3ζ信号传导区域)。如第6.4.2.1节中所述，抗原结合结构域可以是scFv的形式。
抗原结合结构域通常经由接头(例如如第6.7节中所述的接头)、任选的间隔区(例如如第6.11.1.1.1节中所述)、任选的铰链(例如如第6.11.1.1.2节中所述)、跨膜结构域(例如如第6.11.1.1.3节中所述)和细胞内信号传导模块(例如如第6.11.1.1.4节所述)连接至信号传导结构域。
6.11.1.1.1.间隔结构域
在特定的实施方案中，CAR的抗原结合结构域(随后是任选的接头)后接一个或多个“间隔结构域”，其指使抗原结合结构域远离效应细胞表面从而实现正确的细胞/细胞接触、抗原结合和激活的区域(Patel等人,1999,Gene Therapy 6:412-419)。间隔结构域可以衍生自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。在某些实施方案中，间隔结构域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如CH2和CH3。间隔结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
在一个实施方案中，间隔结构域包含IgG1或IgG4的CH2和CH3结构域。
6.11.1.1.2.铰链结构域
CAR的抗原结合结构域通常后接一个或多个“铰链结构域”(任选的接头和/或间隔区的下游)，其在使抗原结合结构域远离效应细胞表面从而实现正确的细胞/细胞接触、抗原结合和激活中发挥重要作用。CAR通常在结合结构域和跨膜结构域(TM)之间包含一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以衍生自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
“改变的铰链区”是指(a)具有至多30％的氨基酸变化(例如至多25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸取代或缺失)的天然存在的铰链区，(b)长度为至少10个氨基酸(例如至少12、13、14或15个氨基酸)的天然存在的铰链区的一部分，其具有至多30％的氨基酸变化(例如至多25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸取代或缺失)，或(c)天然存在的铰链区的一部分，其包含核心铰链区(长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、13、14或15个氨基酸)。在某些实施方案中，天然存在的免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基可以由一个或多个其他氨基酸残基(例如一个或多个丝氨酸残基)取代。改变的免疫球蛋白铰链区可替代地或另外地具有野生型免疫球蛋白铰链区的脯氨酸残基被另一氨基酸残基(例如丝氨酸残基)取代。
适用于本文所述CAR中的其他说明性铰链结构域包括衍生自1型膜蛋白质(如CD8α、CD4、CD28和CD7)的细胞外区域的铰链区，其可以是来自这些分子的野生型铰链区或可被改变。在另一个实施方案中，铰链结构域包含CD8α铰链区。
6.11.1.1.3.跨膜(TM)结构域
“跨膜结构域”是CAR的部分，其融合细胞外结合部分和细胞内信号传导结构域并将CAR锚定至免疫效应细胞的质膜。如本文所用，术语“跨膜结构域”是指在细胞膜，优选真核细胞膜(例如哺乳动物细胞膜)中热力学稳定的任何多肽结构。
TM结构域可以衍生自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。TM结构域可以衍生自(例如包含至少以下的跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD152、CD 154或PD1。在特定实施方案中，TM结构域是合成的，并且主要包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。
在某些实施方案中，CAR包含CD3ζ跨膜结构域(例如，包含氨基酸序列LCYLLDGILFIYGVILTALFL(SEQ ID NO:86)或LDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVK(SEQ ID NO:87)的跨膜结构域)、CD28跨膜结构域(例如，包含氨基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:88)的跨膜结构域)或CD8α跨膜结构域(例如，包含氨基酸序列KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLR PEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:89)的跨膜结构域)。
TM可以后接短接头，优选地长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，其连接TM结构域和CAR的细胞内信号传导结构域。基于甘氨酸-丝氨酸的接头(例如，根据第6.7节的接头)提供了特别合适的接头。
6.11.1.1.4.细胞内信号传导结构域
CAR通常包含细胞内信号传导结构域域。“细胞内信号传导结构域”是指CAR的一部分，其参与将有效抗原结合的信息转导至免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能，例如激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括释放细胞毒性因子到与CAR结合的靶细胞，或由结合至细胞外CAR结构域的抗原引起的其他细胞反应。
术语“效应功能”是指免疫效应细胞的特定功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性包括细胞因子的分泌。因而术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应功能信号并引导细胞执行特定功能的蛋白质的一部分。尽管通常可以使用完整的细胞内信号传导结构域，但在许多情况下并不需要使用完整结构域。对于使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度，只要截短部分转导效应功能信号，它就可以取代完整结构域。术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，还需要次级或共刺激信号。因此，可以说T细胞激活是由两类不同的细胞内信号传导结构域所介导：通过TCR(例如TCR/CD3复合体)启动抗原依赖性初级激活的初级信号传导结构域，和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供次级或共刺激信号的共刺激信号传导结构域。在优选实施方案中，本文考虑的CAR包含细胞内信号传导结构域，其包含一个或多个“共刺激信号传导结构域”和“初级信号传导结构域”。
初级信号传导结构域以刺激性或抑制性方式调节TCR复合体的初级活化。以刺激方式起作用的初级信号传导结构域可包含信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
在本公开的方法中特别有用的含有ITAM的初级信号传导结构域的说明性实例包括衍生自TCRζ、FC-Rγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在特别优选的实施方案中，CAR包含CD3ζ初级信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。细胞内的初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以以任何顺序串联连接到跨膜结构域的羧基端。
本文考虑的CAR包含一个或多个共刺激信号传导结构域，以增强表达CAR受体的T细胞的功效和扩增。如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体以外的细胞表面分子，其在结合至抗原后提供T淋巴细胞有效激活和功能所需的次级信号。此类共刺激分子的说明性实例包括CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70。
在一些实施方案中，CD3信号传导区连接至CD28、4-1BB(也称为CD137)、CD70或OX40(也称为CD134)或其组合的共刺激胞内域，或具有两个串联的CD3ζ信号传导结构域。这些胞内域在抗原呈递细胞(APC)识别TCR期间允许强烈的T细胞激活，从而改善细胞因子的产生和CAR-T细胞的增殖。
在另一个实施方案中，CAR包含CD28和CD137共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
在又另一个实施方案中，CAR包含CD28和CD134共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，CAR包含CD137和CD134共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
示例性CD3ζ信号传导区可包含以下氨基酸序列之一：
LDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ IDNO:90)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR(SEQ ID NO:91)
示例性CD28信号传导区可包含以下氨基酸序列之一：
KIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPP RDFAAYRS(SEQ ID NO:92)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:93)
KIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:94)
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:88)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:93)
示例性CD137(41BB)信号传导区可包含以下氨基酸序列：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:95)
6.11.1.1.5.标签
在一些实施方案中，CAR包含用于识别CAR的标签，例如V5表位标签，其衍生自猿猴病毒5(SV5)的副粘病毒的P和V蛋白上存在的小表位(Pk)。V5标签通常以全部14个氨基酸(GKPIPNPLLGLDST)(SEQ ID NO:96)来使用，但其也以较短的9个氨基酸序列(IPNPLLGLD)(SEQ ID NO:97)来使用。
6.11.1.1.6.信号肽
在一些实施方案中，CAR包含信号肽。信号肽促进细胞表面的CAR表达。信号肽包括天然存在的蛋白质或合成的信号肽、非天然存在的信号肽，其与本文所述的CAR中的使用兼容，对本领域技术人员而言将是显而易见的。在一些实施方案中，信号肽位于CAR的抗原结合部分的N端。CAR在细胞(例如T细胞)中表达和加工后，信号肽被切割，因此通常在成熟分子中不存在。
6.11.1.2.CART细胞的制备
对于CART细胞的离体生成，可以在将编码CAR的核酸引入细胞(例如通过病毒转导)之前和/或之后扩增PBMC、外周血淋巴细胞或从中富集的T细胞。
可用于生成CART细胞的T细胞可通过裂解红细胞并清除单核细胞而从外周血淋巴细胞中分离，例如通过经由PERCOLLTM梯度的离心或通过逆流离心淘析。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)缀合的珠子(如
Figure BDA0003700122800000701
M-450CD3/CD28 T)共同孵育足以阳性选择期望T细胞的时间段来分离T细胞。在一个实施方案中，该时间段是大约30分钟。在进一步的实施方案中，时间段的范围是从30分钟到36小时或更长，以及其间的所有整数值。在进一步的实施方案中，时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在又另一个较佳实施方案中，时间段是10至24小时。在一个优选实施方案中，孵育时间段是24小时。对于从白血病患者中分离T细胞，使用更长的孵育时间段(例如24小时)可以提高细胞产率。在与其他细胞类型相比T细胞很少的任何情况下，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞，例如从肿瘤组织或免疫低下的个体中分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。此外，使用更长的孵育时间可以提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠子结合的时间和/或通过增加或降低珠子与T细胞的比率，可以在培养开始时或在过程期间的任何其他时间点优先选择支持或反对的T细胞亚群。另外，通过增加或减少珠子或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养开始时或在其他预期时间点优先选择支持或反对的T细胞亚群。本领域技术人员会认知到，在本公开的上下文中也可以使用多轮选择。在某些实施方案中，可能预期执行选择程序并在激活和扩增过程中使用“未被选择的”细胞。“未被选择的”细胞也可以进行更多轮的选择。
通过阴性选择来富集T细胞群可以用针对阴性选择细胞特有的表面标志物的抗体组合来实现。一种方法是通过阴性磁性免疫黏附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该方法使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。也可以通过抗C25缀合珠或其他类似的选择方法来清除T reg细胞。
在某些实施方案中，例如用于涉及如第6.11.1.4节中所述自身免疫疾病治疗的应用，可能期望富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62L高、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。Treg也可以通过FoxP3的重组表达来诱导。
无论是在对T细胞进行遗传修饰以表达期望CAR之前还是之后，T细胞通常可以使用本领域已知的方法激活和扩增，例如，如美国专利第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；或第7,175,843号中所述。
通常，通过与连接有刺激CD3/TCR复合体相关信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触，扩增可用于本公开的方法的T细胞。特别地，可以通过以下方式刺激T细胞群：与抗CD3抗体或其抗原结合片段，或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或与结合钙离子载体的蛋白激酶C激活剂(例如苔癣虫素)接触。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群与抗CD3抗体和任选的抗CD28抗体(例如在抗CD3和抗CD28珠子上)接触。
在施用于人受试者之前，表达CAR的细胞也可以用IL12进行调理(参见例如Emtage等人,2003,J.Immunother.16(2):97-106，通过引用并入本发明)。
6.11.1.3.癌症免疫疗法
相应地，本发明提供了在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，包含向受试者施用有效量的本公开的IL2激动剂并施用至表达CAR的细胞(例如表达CAR的T细胞(或“CART细胞”)。用于癌症治疗的特别有用的T细胞亚型是具有强烈的CAR介导的细胞毒性的T细胞(例如CD3+CD8+T细胞)，其可以如上文6.11.1.2中所述进行制备。
关于癌症的治疗，CAR的细胞外结构域可靶向肿瘤相关抗原，例如如第6.4.1节中所述。在某些实施方案中，肿瘤相关抗原是CD20、EGFR、FITC、CD19、CD22、CD33、PSMA、GD2、EGFR变体、ROR1、c-Met、HER2、CEA、间皮素、GM2、CD7、CD10、CD30、CD34、CD38、CD41、CD44、CD74、CD123、CD133、CD171、MUC16、MUC1、CS1(CD319)、IL-13Ra2、BCMA、Lewis Y、IgGκ链、叶酸受体-α、PSCA或EpCAM。在特定的实施方案中：
οCAR被设计以靶向CD22，以治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤。
οCAR被设计以靶向间皮素，以治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等。
οCAR被设计以靶向CD33/IL3Ra，以治疗急性骨髓性白血病等。
οCAR被设计以靶向c-Met，以治疗三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌等。
οCAR被设计以靶向PSMA，以治疗前列腺癌等。
οCAR被设计以靶向糖脂F77，以治疗前列腺癌等。
οCAR被设计以靶向EGFRvIII，以治疗胶质母细胞瘤等。
οCAR被设计以靶向GD-2，以治疗成神经细胞瘤、黑色素瘤等。
οCAR被设计以靶向NY-ESO-1TCR，以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑色素瘤等。
οCAR被设计以靶向MAGE A3 TCR，以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑色素瘤等。
特别可用于CAR-IL2激动剂组合疗法的是包含靶向部分的IL2激动剂，该靶向部分识别存在于表达CAR的淋巴细胞表面上的细胞表面抗原。
当与CAR疗法组合施用的IL2激动剂具有肽-MHC靶向部分时，表达CAR的细胞优选地是其TCR识别肽-MHC复合体的CD4+或CD8+细胞。例如，表达CAR的细胞可以是T淋巴细胞，其TCR特异性结合IL2激动剂上存在的pMHC复合体，从而导致表达CAR的细胞的功能激活和存活。
在一些实施方案中，CAR本身包含靶向IL2激动剂中的pMHC复合体(例如在第6.4.3节中描述的任何pMHC融合物)的抗原结合结构域(例如scFv结构域)。靶向具有HPV肽(例如对应于HPV16E7多肽的氨基酸残基11-19或82-90的肽)的pMHC复合体的示例性CAR公开于美国专利第10,806,780B2号中，其通过整体引用并入本文。在一些实施方案中，CAR包含选自以下任一对的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)氨基酸序列对：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/202、218/226、234/242、250/258、266/274、282/290、298/306、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、458/466、474/482、490/498、506/514和522/530，在美国专利第10,806,780B2号的每种情况下，其中每个通过引用并入本文。在特定实施方案中，VH-VL对包含美国专利第10,806,780B2号的SEQ IDNO.2和10、美国专利第10,806,780B2号的SEQ ID NO.34和42、美国专利第10,806,780B2号的SEQ ID NO.82和90、美国专利第10,806,780B2号的SEQ ID NO.194和202、或美国专利第10,806,780B2号的SEQ ID NO.506和514，其中每个通过引用并入本文。CAR-IL2激动剂和靶向具有HPV肽的pMHC的CAR的组合疗法可用于治疗HPV阳性癌症，例如鳞状细胞癌，例如子宫颈癌、头颈部小细胞癌、肛门生殖器癌和口咽癌。
6.11.1.4.自身免疫疾病的免疫疗法
嵌合抗原受体(CAR)T细胞已成为血液癌的有力治疗选项。通过使用修饰T细胞以有效靶向疾病的相同想法，科学家经由编码嵌合抗原受体(CAR)的病毒载体的转染，以预定的抗原特异性有效地工程改造了T细胞。以非MHC限制的方式工程改造的CAR修饰的T细胞具有广泛应用的优势，特别是在移植和自身免疫中。
可以如上6.11.1.2中所述制备表达CAR的Treg细胞。
特别可用于CAR-IL2激动剂组合疗法的是包含靶向部分的IL2激动剂，该靶向部分识别存在于表达CAR的淋巴细胞表面上的细胞表面抗原，例如从自身免疫靶细胞克隆而来的pMHC。
为了用于治疗自体免疫疾病，CAR的细胞外结构域优选地对与自身免疫应答相关的靶抗原或配体具有特异性。此类修饰引起炎症部位处重定向Treg的激活，以抑制促炎性效应型免疫应答。CAR Treg疗法所靶向的自身免疫疾病的实例为多发性硬化症、炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病、牛皮癣、I型糖尿病、干燥病、重症肌无力(MG)、桥本氏甲状腺炎；格雷夫斯病和葡萄膜炎。
在特定实施方案中，将Treg工程改造以表达靶向特定于以下疾病的抗原或配体的CAR：
ο炎性肠病(IBD)，其中抗原或配体在患病的结肠或回肠中表达；
ο类风湿性关节炎，其中抗原或配体是在关节中存在的胶原蛋白或抗原的表位；
οI型糖尿病或自身免疫胰岛炎，其中抗原或配体是胰腺β细胞抗原；
ο多发性硬化症，其中抗原或配体是例如髓磷脂碱性蛋白(MBP)抗原或MOG-1或MOG2-2、或神经元抗原；
ο自身免疫甲状腺炎，其中抗原或配体是甲状腺抗原；
ο自身免疫胃炎，其中抗原或配体是胃抗原；
ο自身免疫葡萄膜炎或葡萄膜视网膜炎，其中抗原或配体是S抗原或另一种葡萄膜或视网膜抗原；
ο自身免疫睾丸炎，其中抗原或配体是睾丸抗原；
ο自身免疫卵巢炎，其中抗原或配体是卵巢抗原；
ο牛皮癣，其中抗原或配体是角质细胞抗原或另一种存在于真皮或表皮中的抗原；
ο白癜风，其中抗原或配体是黑色素细胞抗原，例如黑色素或酪氨酸酶；
ο自身免疫前列腺炎，其中抗原或配体是前列腺抗原；
ο任何非期望的免疫反应，其中抗原或配体是在非期望反应的位点处存在的激活抗原或T效应细胞上表达的其他抗原；
ο组织排斥反应，其中抗原或配体是对移植组织具有特异性的MHC；和
ο炎性病症，其中抗原或配体是在参与炎症的造血谱系的非淋巴样细胞上表达的抗原或配体。
在一个实施方案中，可以工程改造T细胞以表达嵌合自体抗原受体(CAAR)T细胞，以特异性消除负责自身免疫疾病的B细胞。因此，除非上下文另有规定，否则提及表达CAR的T细胞包括提及表达CAAR的细胞。
7.实施例
7.1.材料与方法
7.1.1.IL2和IL15激动剂的产生
产生编码描述于下表5A和5B中(或含有其中所述的模块)、具有或不具有靶向部分(以T命名标识)的IL2和IL15突变蛋白(视情况以IL2M_或IL15M_命名标识)的构建体，以及Fc对照。通过瞬时转染(Thermo Fisher Scientific)在Expi293FTM细胞中表达构建体。使用具有HiTrap Protein G HP柱(GE Healthcare)的ProteinMaker系统(ProteinBioSolutions,Gaithersburg,MD)纯化Expi293F上清液中的蛋白质。在单步洗脱后，中和突变蛋白，透析至含5％甘油的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的最终缓冲液中，等分分装并保存在-80℃下。
Figure BDA0003700122800000761
Figure BDA0003700122800000771
Figure BDA0003700122800000781
Figure BDA0003700122800000791
Figure BDA0003700122800000801
Figure BDA0003700122800000811
Figure BDA0003700122800000821
Figure BDA0003700122800000831
Figure BDA0003700122800000841
Figure BDA0003700122800000851
Figure BDA0003700122800000861
7.1.2.人PBMC上的pSTAT5的细胞内染色
将低温保存的人PBMC解冻并在无IL-2的培养基中静置过夜。第二天，将细胞用不同IL-2变体的连续稀释液处理，然后用BD CytofixTM固定缓冲液在37℃下固定12分钟。然后在冰上用预冷的BD PhosflowTMPerm Buffer III透化细胞20分钟。接着将细胞用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤两次，然后用含有Alexa
Figure BDA0003700122800000872
647缀合的抗STAT5 pY694(BDBiosciences)的染色混合物在室温下于黑暗中孵育45分钟。为了鉴定PBMC中的不同淋巴细胞群，染色混合物中还包括以下抗体组：BUV496-抗CD8、BUV395-抗CD4、BV421-抗-NKp46、BV711-抗-CD56、BV786-抗-CD3、
Figure BDA0003700122800000871
488-抗FoxP3、PE-抗CD25(BDBiosciences)。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，然后在BD LSRFortessaTMX-20流式细胞仪上采集数据。使用FlowJo v10分析原始数据。
7.1.3.尺寸排阻色谱和多角度光散射
尺寸排阻超效液相色谱(SEC)与多角度光散射(MALS)结合用于评估不同突变蛋白的寡聚状态。在Waters Acquity UPLC H-Class系统上进行SEC分析。将10μg的各个蛋白质样品注入由Acquity BEH SEC柱(
Figure BDA0003700122800000873
1.7μm，4.6x150 mm)组成的双柱串联设置。流速设定为0.3ml/min。移动相缓冲液含有10mM磷酸钠，500mM NaCl，pH 7.0。使用Wyatt OptilabT-Rex和Wyatt-uDawn Treos LS检测器在280nm处监测UV吸光值、光散射和折射率变化。
7.1.4.FACS结合测定
为了分析抗体-IL2突变蛋白对细胞表面上的靶抗原的结合，收集稳定表达抗原靶标的HEK293细胞并将其重悬于FACS缓冲液(PBS+2％FBS)中。对于每次结合测定，将50,000-100,000个细胞与连续稀释的IL-2突变蛋白在FACS缓冲液中于4℃下共同孵育30分钟。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并且与1：500稀释的APC-F(ab)'2抗小鼠IgG Fcγ片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories)于4℃下共同孵育30分钟。在孵育结束时，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并在BD FACSCelestaTM流式细胞仪上进行分析。
7.1.5.肿瘤接种、处理和测量
将总计3x105个MC38细胞皮下注射(s.c.)到6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠(JacksonLaboratory)的腹侧。当肿瘤大小达到80-100mm3时将小鼠随机分组，并用不同的IL-2/IL-15激动剂进行腹膜内处理。每隔一天或每半周重复四次以上的处理。使用数字卡尺每半周测量肿瘤一次，并将肿瘤大小计算为长度x宽度2/2。在记录存活率的肿瘤研究中，将失去存活定义为死亡或当肿瘤在任何维度上达到20mm或总体积达到2250mm3。
7.1.6.肿瘤、脾脏和血液的FACS分析
使用温和的MACSTM解离器(Miltenyi Biotec.)收取肿瘤并进行处理以生成单细胞悬浮液。计数细胞，然后用稀释于BD Horizon Brilliant Buffer中的荧光标记的抗体混合物染色。
在用IL2突变蛋白处理后，从荷瘤或非荷瘤小鼠收集脾脏和血液。将脾脏压碎通过70μm
Figure BDA0003700122800000881
细胞过滤器以生成单细胞悬浮液。然后用ACK裂解缓冲液(Lonza)处理脾脏和血液，以裂解红细胞(RBC)。RBC裂解后，计数淋巴细胞并用稀释于BD HorizonBrilliant Buffer中的抗体混合物染色。在BD LSRFortessaTMX-20流式细胞仪上分析所有染色的样品。使用FlowJo v10处理原始数据。
7.1.7.抗原特异性T细胞和嵌合抗原受体(CAR)T细胞
从OT-I TCR转基因小鼠(Jackson Laboratory)的脾脏中分离卵白蛋白(257-264)特异性小鼠OT-I T细胞。CMV pp65(495-503)特异性人T细胞从CMV+供体的PBMC扩增而来，并从ASTARTE Biologics(Cat.#1049)获得。在用慢病毒以MOI＝5转导之前，通过用CD3/CD28微珠加上100U/ml重组人IL2刺激CD3+T细胞来生成CAR T细胞。然后在将培养基更换为缺少IL2的CTS补充OpTmizerTM培养基(Gibco)之前，用CD3/CD28微珠加上100U/ml重组人IL2扩增转导的细胞17天。在37℃和5％CO2下过夜培养后，如第7.1.2节中所述进行pSTAT5测定。
7.2.实施例1：IL-2Rα减弱的IL2突变蛋白的体外活性
为了测试IL2 M1在不同免疫细胞群中触发IL2受体信号传导的能力，在37℃下用浓度递增的IL2M0或IL2M1刺激4×105个人PBMC 20分钟。作为IL2受体介导的信号传导的标志，如第7.1.2节中所述，通过流式细胞术测量免疫细胞亚群中的细胞内STAT5磷酸化程度。图4A-4C显示了门控的Treg(图4A)、CD8+T细胞(图4B)和NK细胞(图4C)中的STAT5活性。相较于IL2M0，IL2 M1对缺乏可检测的IL-2Rα表达的CD8+T细胞和NK细胞维持同等活性。然而，IL2M1对IL-2Rα+Treg的活性比IL2-Fc对IL-2Rα+Treg的活性低好几个数量级。因此，IL2M1在体外失去了相较于其他效应细胞群的对Treg的优先活性。
7.3.实例施2：IL-2Rα减弱的IL2突变蛋白在对免疫细胞群的体内活性
C57BL/6J小鼠每天接受腹膜内注射PBS、15μg IL2M0或IL2M1持续连续六天。最后一次注射后一天，收取脾脏进行流式细胞术分析。在图5A-5C中分别显示了经处理小鼠脾脏中的Treg、NK细胞和CD8+T细胞的数量。定量了TCRβ+T细胞内CD8+和CD4+T细胞的相对频率(图5D)。
尽管IL2M0(IL2-Fc)在体内优先扩增Treg，但是在IL2M1(偏好CD122的人IL2-Fc融合物)中这样的Treg选择性被消除。相反，IL2M1以对Treg群最小的影响诱导NK和CD8+T细胞的特异性扩增。因此，IL2M1可通过选择性扩增效应细胞群来重塑外周淋巴细胞区。
7.4.实施例3：IL2和IL-2Rα减弱的IL2突变蛋白作为单一疗法以及与抗PD1组合的抗肿瘤活性
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接种3x105个MC38肿瘤细胞，并在第8天当平均肿瘤大小达到100mm3时进行随机分组。然后用同种型(10mg/kg)、IL2M0(0.75mg/kg)+同种型(10mg/kg)、IL2M1(0.75mg/kg)+同种型(10mg/kg)、抗mPD1(10mg/kg)、IL2M0(0.75mg/kg)+抗mPD1(10mg/kg)或IL2M1(0.75mg/kg)+抗mPD1(10mg/kg)每隔一天(对于IL2M0和IL2M1)或每半周(对于同种型和抗mPD1)腹膜内处理小鼠总计五次注射。图6显示了各个处理组中的平均肿瘤体积(mm3+SD)(图6A)和Kaplan-Meier存活曲线(图6B)。将失去存活定义为死亡或当肿瘤在任何维度达到20mm或总体积达到2250mm3。
作为单一疗法，IL2M0(IL2-Fc)显著抑制已形成的肿瘤的进展。将其与抗PD1组合进一步以协同的方式促进肿瘤消退和无肿瘤存活的持久性。出乎意料的是，尽管CD122偏好的IL2M1具有特异性扩增NK和CD8+T细胞的能力，但即使在存在抗PD1的情况下，其也展现出很少的抗肿瘤作用。
7.5.实施例4：IL2M0的给药研究
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接种3x105个MC38肿瘤细胞，并在第8天当平均肿瘤大小达到90mm3时进行随机分组。然后用指定剂量的IL2M0每隔一天腹膜内处理小鼠总计五次注射。图7显示了平均肿瘤体积(mm3+SD)(图7A)，Kaplan-Meier存活曲线(图7B)以及个体肿瘤生长曲线(7C.1-7C.5)。将失去存活定义为死亡或当肿瘤在任何维度达到20mm或总体积达到2250mm3。
这项研究显示，IL2M0的抗肿瘤功效高度仰赖于所注射的剂量，最高剂量最为有效。从5μg/剂开始观察到效用，并且增加剂量至10μg和20μg/剂导致更好的肿瘤控制和存活益处。
7.6.实施例5：IL2M1相较于IL2M0的抗肿瘤活性与毒性
在两项不同的研究中，C57BL/6J小鼠在第0天皮下接种3x105个MC38肿瘤细胞，并在第8天当平均肿瘤大小达到90mm3时进行随机分组(研究#1)，或在第7天当平均肿瘤大小达到70mm3时进行随机分组(研究#2)。然后每隔一天用指定剂量的IL2M0或IL2 M1腹膜内处理小鼠总计五次注射。显示了各个处理组的平均肿瘤体积(mm3+SD)(图8A-8B，分别显示研究#1和研究#2的结果)和体重变化百分比(图8C，来自研究#2)。箭头指示处理日。
IL2M1在直到40μg/剂时仍然对控制肿瘤进展无效，而10μg/剂的IL2M0导致了肿瘤生长的显著延迟(图8A)。当以75或100μg/剂给予IL2M1时，观察到适度的功效(图8B)。然而，在这些剂量下，其引起严重的毒性，包括明显的体重减轻(图8C)、机能减退和死亡率增加。高剂量IL2M1组中所观察到的功效是由抗肿瘤免疫力还是由宿主小鼠的疾病引起的肿瘤营养不良所致，尚待确定。
尽管在控制肿瘤生长方面不如10μg/剂的IL2M0有效，但100μg/剂的IL2M1确实诱导外周NK和CD8+T细胞大规模扩增，同时对Treg的影响远小于由10μg/剂的IL2M0所诱导的影响。但是，外周效应细胞群的这种大规模扩增并未转化为更有效的抗肿瘤应答。
7.7.实施例6：IL15突变蛋白的抗肿瘤活性和毒性
IL15与IL2共享相同的β/γ受体亚基，但它不结合至IL2-Rα。IL15通常表达为骨髓细胞表面上的IL15/IL15Rα复合体的一部分，然后被呈递以激活周围的淋巴细胞(图1)。包含IL15-IL15Rα融合物的IL15M1，据信通过IL15Rα模拟IL15的反式呈递并特异地接合IL-2Rβ/γ，因而引发与IL2-Rα减弱的IL2突变蛋白(例如IL2M1)类似的信号传导。
测试了IL15M1的抗肿瘤活性和毒性。C57BL/6J小鼠在第0天皮下接种3x105个MC38肿瘤细胞，并在第7天当平均肿瘤大小达到70mm3时进行随机分组。然后每隔一天用指定剂量的IL2M0和IL15M1腹膜内处理小鼠总计五次注射。图9显示了各个处理组中的平均肿瘤体积(mm3+SD)(图9A)和体重变化百分比(图9B)。箭头指示处理日。如第7.1.6节中所述，在第11天收集指定组的血液并通过流式细胞仪进行分析。量化所指示的淋巴细胞群的计数(图9C.1-9C.4)。
在IL15M1处理后观察到适度但剂量依赖性的抗肿瘤功效(图9A)。然而，类似于IL2M1，IL15M1处理在荷瘤小鼠中引起了大约同时发生的剂量依赖性毒性(图9B)。IL15M1还在这些荷瘤小鼠的血液中诱导了外周淋巴细胞的急剧扩增，该外周淋巴细胞主要是NK和CD8+T细胞，而不是Treg(图9C.1-9C.4)。连同IL2M1的实施例，这些结果表明，选择性刺激IL-2Rβ/γ受体，无论是通过具有消除的IL-2Rα结合的变体IL2或者IL15突变蛋白，具有次佳的治疗指数-相对于毒性来说有限的功效。这也表明，由IL2M1和IL15M1所扩增的外周NK和CD8+T细胞在控制肿瘤生长方面是低效的。
7.8.实施例7：IL2Rα减弱的IL2突变蛋白对瘤内淋巴细胞的活性
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接种3x105个MC38肿瘤细胞，并在第7天当平均肿瘤大小达到100mm3时进行随机分组。然后每隔一天用PBS、抗mPD1(10mg/kg)、IL2M0(0.75mg/kg)+抗mPD1(10mg/kg)、或IL2M1(0.75mg/kg)+抗mPD1(10mg/kg)腹膜内处理小鼠。在总计三次剂量后，于第12天收取肿瘤以分离并分析肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。图10A.1至10A.5显示了各个处理组的总CD45+TIL的密度tSNE图。在图10A.1至10A.5中高亮显示的簇1-4在总TIL内的百分比定量结果显示于图10B中。与针对不同淋巴细胞群的定义标志物的表达重叠的总TIL的tSNE图显示于图10C.1至10C.7中。这些结果显示，IL2M0比IL2M1在肿瘤中更明显地诱导CD8+T细胞扩增。
进一步从总TIL中门控TCRβ+T细胞。每次处理后，肿瘤中的CD8+T细胞内的Ki67+IL-2Rα+细胞的代表性FACS图和频率定量分别显示于图10D和图10E中。肿瘤中的Ki67+IL-2Rα+CD8+T细胞的密度定量结果显示于图10F中。肿瘤中的CD4+T细胞内的FoxP3+IL-2Rα+Treg的代表性FACS图和频率定量显示于图10G和图10H中。肿瘤中的FoxP3+IL-2Rα+CD4+Treg的密度定量结果显示于图10I中。这些结果显示，相对于肿瘤中的Treg，IL2M0增加了增殖性IL-2Rα+CD8+T细胞。
在CD8+TIL中评估IL-2Rα和PD1的表达。总CD45+TIL的tSNE图与这些标志物的表达重叠，结果显示于图10J-10L中。表达图谱显示了共表达IL-2Rα和PD1的肿瘤浸润性CD8+T细胞的亚群。这些结果显示，IL-2Rα和PD1在肿瘤中的一些肿瘤内CD8+T细胞上共表达。考虑到这两种蛋白质在其激活后在抗原特异性CD8+T细胞上的动态表达，它们的共表达可能会在本文未捕获的时间点在更为广泛的CD8+T细胞群中发生(Kalia等人,2010,Immunity 32(1):91-103)。
如第7.1.6节中所述，从同一只荷瘤小鼠中收取血液和脾脏进行流式细胞术分析。脾脏中NK细胞和Treg的频率定量结果显示于图10M和图10N中。血液中NK细胞和Treg的频率定量结果显示于图10P和图10Q中。脾脏中TCRβ+T细胞内的CD8+和CD4+T细胞的相对频率定量结果显示于图10O中而在血液中的结果显示于图10R中。这些结果显示，在脾脏和血液中，相对于Treg，IL2M1特异性扩增NK和CD8+T细胞，而IL2M0优先扩增Treg。
在外周中和在肿瘤中，由IL2M0和IL2M1所诱导的免疫细胞图谱完全不同：在血液和脾脏中，IL2M0优先扩增Treg，而IL2M1导致NK和CD8+T细胞的选择性扩增。在肿瘤中，IL2M0扩增CD8+T细胞但不扩增Treg，而IL2M1仅略微增加NK细胞。这些观察结果可以解释为何由IL-2Rα减弱的IL2突变蛋白或IL15变体所诱导的外周NK和CD8+T细胞的大量扩增没有转化成良好的抗肿瘤应答，因为此扩增并不会扩展到肿瘤微环境。这也解释了为何在外周中扩增抑制性Treg的IL2M0可以诱导有效的抗肿瘤免疫力。在在肿瘤中被抗原激活时，肿瘤特异性T细胞上调其IL-2Rα，使其对IL2M0治疗更加敏感。总之，这些结果表明，保留接合IL-2Rα的能力对于IL2相关分子的抗肿瘤功效是必须的。
7.9.实施例8：肿瘤Treg对IL2刺激的反应性低于脾脏Treg
如第7.1.6节中所述，从负载MC38肿瘤的C57BL/6J小鼠中收取肿瘤和脾脏以分离淋巴细胞。将经消化的肿瘤细胞进一步用CD45 MicroBead进行
Figure BDA0003700122800000921
Cell Separation以富集TIL和。在37℃下用浓度渐增的重组人IL2体外刺激4x105个TIL或2x106个脾脏细胞20分钟。图11显示了如通过FACS根据第7.1.2节的测定所确定的门控的Treg(图11A)和CD8+T细胞(图11B)内经历STAT5磷酸化的细胞百分比。
重组人IL2对来自肿瘤和脾脏的Treg表现出相似的EC50。然而，尽管IL2能够在几乎所有脾脏Treg中诱导STAT5磷酸化，但只有一部分肿瘤Treg在IL-2刺激后表现出STAT5磷酸化。相反地，来自肿瘤的CD8+T细胞以比来自脾脏的CD8+T细胞更低的EC50对IL-2处理产生应答。该结果表明，肿瘤Treg对IL2刺激的反应性低于外周Treg，而肿瘤浸润性CD8+T细胞对IL2刺激可能比其脾脏对应物更加敏感。该结果还揭示了肿瘤Treg区中的潜在异质性。
7.10.实例施9：IL2M2和IL2M3对淋巴细胞群的活性
用浓度渐增的IL2M0、IL2M2和IL2M3刺激人PBMC。如第7.1.2节中所述，通过FACS测定细胞内STAT5磷酸化水平，结果显示于图12A(门控的Treg)、图12B(CD8+T细胞)与图12C(NK细胞)中。
IL2M2和IL2M3对不同的淋巴细胞群表现出彼此相似的活性。相较于IL2M0，IL2M2和IL2M3对所有测试的细胞类型均显示出降低的活性。整体而言，IL2M2和IL2M3对所有IL2受体均减弱，同时仍然保持对IL-2Rα+细胞的选择性。
C57BL/6J小鼠在第0天以流体动力学的方式注射5μg编码IL2M0、IL2M1、IL2M2或IL2M3的质粒DNA。蛋白质由肝细胞持续表达和分泌，以维持稳定的血清浓度。各处理组在质粒注射之后的体重变化百分比显示于图12D中。与IL2M0和IL2M1相反，IL2M2和ILM3注射未导致可检测到的体重减轻，暗示着明显降低的毒性。
7.11.实施例10：IL2M2单一疗法在同基因小鼠模型中的抗肿瘤活性
Balbc/J小鼠在第0天皮下接种Colon 26或4T1肿瘤细胞，并在第10或11天当平均肿瘤大小达到80mm3时进行随机分组。随机分组后，立即向小鼠以流体动力学的方式注射指定剂量的编码在人泛素C启动子控制下的人Fc或IL2M2的质粒DNA。蛋白质持续表达并由肝细胞分泌，以维持稳定的血清浓度。测量各治疗组中的平均肿瘤体积。Colon 26和4T1的结果(以mm3+SD表示)显示于图13A和图13B中。箭头指示流体动力学注射日。
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接种MC38肿瘤细胞，并在第7天当平均肿瘤大小达到80mm3时进行随机分组。小鼠接着每隔三天用PBS对照、IL2M0(15μg)或IL2M2(50μg)腹膜内处理总计四次注射。测量各处理组的平均肿瘤体积，结果(以mm3+SD表示)显示于图13C中。
无论是通过流体动力学递送DNA还是蛋白质注射，IL2M2处理都抑制了多个同基因肿瘤模型中的肿瘤进展(图13)。尽管对多个淋巴细胞群的效力比IL2M0低约100倍(图12A-C)，但约高3倍剂量的IL2M2能够达到与IL2M0相当的抗肿瘤功效。
7.12.实施例11：IL2M4和IL2M5对淋巴细胞群的活性
用浓度渐增的IL2M4(Fc-IL2融合蛋白)或IL2M5刺激人PBMC。如第7.1.2节中所述，通过FACS测量细胞内的STAT5磷酸化水平。门控的Treg(图14A)、CD8+T细胞(图14B)和NK细胞(图14C)的结果显示于图14中。
相较于IL2M4，IL2M5对所有测试的细胞类型显示出降低的活性。然而，减弱的程度在不同淋巴细胞群中不同，其中IL-2Rα-NK和CD8+T细胞比IL-2Rα+Treg受到更大的影响。整体而言，IL2M5总体上减弱但增加了对IL-2Rα+细胞的选择性。
7.13.实施例12：IL2M5单一疗法的抗肿瘤功效
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接种MC38肿瘤细胞，并在第7天当平均肿瘤大小达到80mm3时进行随机分组。小鼠接着每隔三天用PBS、IL2M4(15μg)或IL2M5(100μg)处理总共四次注射。测量平均肿瘤体积。各处理组的结果(以mm3+SD表示)显示于图15A中，而针对个体肿瘤的结果显示于图15B至15D。
鉴于IL2M5与IL2M4相比高度减弱，因此在肿瘤研究中以更高剂量来使用IL2M5。尽管IL2M5对多个淋巴细胞群比IL2M4的效力低＞100倍(图14A-C)，但是高约6倍剂量的IL2M5比IL2M4实现了更为有效的肿瘤控制。在用100μg/剂IL2M5处理的五只小鼠中，有三只小鼠观察到完全的肿瘤消退和无肿瘤存活。
7.14.实施例13：含IL-2Rα的突变蛋白的寡聚状态
尺寸排阻超效液相色谱(SEC)与多角度光散射(MALS)结合用于评估IL2M2和IL2M3的寡聚状态。IL2M2含有多种高分子量物质，其中主要的物质
Figure BDA0003700122800000941
展现出与二聚体的二聚体一致的摩尔质量(图16A)。相反地，IL2M3不易寡聚化。其主要以二聚体
Figure BDA0003700122800000942
的形式存在，还有两种较少的高分子量物质(图16B)。箭头指示每个主要群的测定分子量和相对百分比。不同结构之间的平衡在图3A和3B中说明(分别针对IL2M2和IL2M3)。
7.15.实施例14：T1-IL2M3保留对细胞表面PD1的结合
如第7.1.4节中所述，通过FACS评估含有抗PD1靶向部分的T1-IL2M3的结合。如图17中所示，T1-IL2M3和亲本抗mPD1抗体显现出相当的与在其表面稳定表达小鼠PD1的人HEK293细胞的结合，这表明通过将抗体融合至IL2M3，对靶标结合的影响最小。
7.16.实施例15：T1-IL2M3显示出比抗PD1和IL2M3的组合更优异的抗肿瘤功效
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接种3x105个MC38肿瘤细胞，并在第7天当平均肿瘤大小达到100mm3时进行随机分组。然后每半周用同种型(1mg/kg)、抗mPD1(1mg/kg)、同种型-IL2M3(0.5mg/kg)+抗mPD1(0.33mg/kg)、同种型-IL2M3(1.5mg/kg)+抗mPD1(1mg/kg)、T1-IL2M3(0.5mg/kg)+同种型(0.33mg/kg)、或T1-IL2M3(1.5mg/kg)+同种型(1mg/kg)腹膜内处理总计五次注射。
测量了平均肿瘤体积。各处理组的结果(以mm3+SD表示)显示于图18A中，针对个体肿瘤的结果显示于图18B.1至18B.4中。
虽然同种型-IL2M3+抗PD1不能赋予肿瘤控制，但T1-IL2M3+同种型在两个测试剂量下均显示出巨大的功效，更多的小鼠在更高剂量下经历了完全的肿瘤消退。以0.5mg/kg剂量的T1-IL2M3递送的IL2M3部分的量非常低，相当于5.7μg/剂的IL2M3。该结果揭示了T1-IL2M3相对于抗PD1和IL2M3的组合的更优异的抗肿瘤功效。这也表明靶向PD1大大降低了实现有效肿瘤控制所需的IL2M3的量。
在第15天从荷瘤小鼠收集血液，并通过FACS分析。CD8+T细胞内的CD44高CD62L低细胞和PD1+细胞的频率，以及CD4+T细胞内的FoxP3+IL-2Rα+Treg的频率分别显示于图18C.1-18D.2和图18E.1-18E.2中。
相较于非靶向的同种型-IL2M3，T1-IL2M3诱导了CD44高CD62L低和PD1+的激活效应记忆CD8+T细胞的特异性扩增。同时，T1-IL2M3比同种型-IL2M3引起更少的非期望的Treg增殖。该结果证明，T1-IL2M3融合物能够将IL2M3重定向至表达PD1的抗原激活的CD8+T细胞。激活的T细胞上调PD1，从而导致T细胞抑制。除了在这些细胞中阻断PD1信号传导外，T1-IL2M3还可以通过刺激IL2信号传导而特异性地重新激活并扩增这些细胞。图19显示了针对T1-IL2M3作用所提出的作用机理的示意图。
7.17.实施例16：在多个鼠类同基因肿瘤模型中，抗mPD1-IL2突变蛋白3融合物显示出相对于同种型-IL2突变蛋白3和亲本抗PD1抗体的组合的更优异的抗肿瘤功效
在两种不同小鼠品系(C57BL/6J和BALB/cJ)的肺癌、皮肤癌、乳腺癌和结肠癌(分别使用LLC1、B16F10、4T1和Colon-26肿瘤细胞)的鼠类同基因肿瘤模型中评估T1 IL2M3(抗mPD1-IL2突变蛋白3)的治疗功效。
C57BL/6J小鼠(a)在第0天皮下接种2x105个LLC1肿瘤细胞，并在第7天当平均肿瘤大小达到90mm3时进行随机分组，或(b)在第0天皮下接种3x105个B16F10肿瘤细胞，并在第7天当平均肿瘤大小达到80mm3时进行随机分组。然后每半周用同种型(1mg/kg)、同种型-IL2突变蛋白3(1.5mg/kg)+抗mPD1(1mg/kg)、或抗mPD1-IL2突变蛋白3(1.5mg/kg)+同种型(1mg/kg)腹膜内处理小鼠总计四或五次注射。
将BALB/cJ小鼠(a)在第0天皮下接种5x105个4T1肿瘤细胞，并在第8天当平均肿瘤大小达到60mm3时进行随机分组，或(b)在第0天皮下接种1x106个Colon-26肿瘤细胞，并在第12天当肿瘤平均大小达到100mm3时进行随机分组。然后每半周用同种型(1mg/kg)、同种型-IL2突变蛋白3(0.5mg/kg)+抗mPD1(0.33mg/kg)、或抗mPD1-IL2突变蛋白3(0.5mg/kg)+同种型(0.33mg/kg)腹膜内处理小鼠总计五次注射。
各处理组中的平均肿瘤体积(mm3+SEM)显示于图20A-20D中。箭头表示处理日。
在所有研究的模型中，抗mPD1-IL 2突变蛋白3展现出比同种型-IL2突变蛋白3和抗mPD1的组合更好的抗肿瘤活性。在Colon-26模型中，抗mPD1-IL2突变蛋白3处理导致大多数经处理小鼠中的肿瘤完全消退(图20D)。在已显示出对一般免疫疗法有抗性的其他模型(LLC1、B16F10、4T1)中((Mosely等人,2016,Cancer Immunol Res 5(1):29-41)，抗mPD1-IL2突变蛋白3能够延迟已形成的肿瘤的进展(图20A-20C)。
7.18.实施例17：抗mLAG3-IL2突变蛋白3融合物展现出比抗LAG3+同种型IL2突变蛋白3的组合更好的抗肿瘤功效
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接种MC38肿瘤细胞，并在第10天当平均肿瘤大小达到50mm3时进行随机分组。然后每半周用同种型(1mg/kg)、抗-mLAG3(1mg/kg)、同种型-IL2突变蛋白3(0.5mg/kg)+抗-mLAG3(0.33mg/kg)、同种型-IL2突变蛋白3(1.5mg/kg)+抗-mLAG3(1mg/kg)、T6-IL2M3(抗-mLAG3-IL2突变蛋白3)(0.5mg/kg)+同种型(0.33mg/kg)、或T6-IL2M3(抗-mLAG3-IL2突变蛋白3)(1.5mg/kg)+同种型(1mg/kg)腹膜内处理小鼠总计五次注射。
分别地，C57BL/6J小鼠在第0天皮下接种MC38肿瘤细胞，并在第9天当平均肿瘤大小达到80mm3时进行随机分组。然后每半周用同种型(0.33mg/kg)、同种型IL2突变蛋白3(0.5mg/kg)+抗-mLAG3(0.33mg/kg)+抗-mPD1(0.33mg/kg)、抗-mLAG3-IL2突变蛋白3(0.5mg/kg)+同种型(0.33mg/kg)、抗mLAG3-IL2突变蛋白3(0.5mg/kg)+抗-mPD1(0.33mg/kg)、或抗-mLAG3-IL2突变蛋白3(0.5mg/kg)+抗mPD1(5mg/kg)腹膜内处理小鼠总共四次注射。
各处理组的平均肿瘤体积(mm3+SEM)显示于图21A-21B中。箭头指示处理日。
通过0.5mg/kg剂量同种型-IL2突变蛋白3或抗mLAG3-IL2突变蛋白3递送的IL2M3部分的摩尔量等同于5.7μg/kg剂量的IL2M2或IL2M3。尽管同种型-IL2突变蛋白3+抗-mLAG3在所研究的剂量下不能赋予肿瘤控制，但抗-mLAG3-IL2突变蛋白3+同种型显示出以剂量依赖的方式加强抗肿瘤功效(图21A)。该结果提供了另一个实例，即靶向肿瘤反应性T细胞可以通过减少实现有效肿瘤控制所需的IL2M3的量来提高IL2M3的抗肿瘤功效。
单独的抗mLAG3-IL2M3赋予了肿瘤生长的部分控制，而其与抗mPD1的组合则导致了大大增强的功效，更多的小鼠实现了完全的肿瘤消退(图21B)。该结果表明，将由非竞争性靶向肿瘤反应性T细胞的抗体所靶向的IL2突变蛋白3与PD1阻断相组合可导致更强大的抗肿瘤免疫力。
7.19.实施例18：肽MHC-IL2突变蛋白融合物允许选择性刺激抗原特异性小鼠CD8T细胞
在37℃下，将来自OT-I TCR转基因小鼠(得自Jackson Laboratory)或对照C57BL/6J小鼠的总计1.5×106个脾脏细胞用浓度渐增的T4-IL2M6或T5-IL2M6刺激20分钟。如第7.1.2节中所述，通过流式细胞术评估门控的CD8+T细胞中的细胞内STAT5磷酸化。
结果显示于图22B中。相较于靶向针对不相关抗原的TCR的T5-IL2M6，T4-IL2M6在诱导T4特异性CD8+OT-I T细胞中的STAT5磷酸化方面显示出高两个数量级的效力，但对来自对照小鼠的非特异性CD8+T细胞则没有显示出不同。
测量了来自同一只小鼠的脾脏细胞的门控的传统CD4+T细胞和Treg的细胞内STAT5磷酸化水平。
结果显示于图23A-23B中。观察到T4-IL2M6和T5-IL2M6对两种细胞类型的活性相当。与CD8+T细胞不同，来自同一只OT-1小鼠的传统CD4+T细胞和Treg不表达T4特异性OT-ITCR。因此，T4-IL2M6对这些细胞的选择性被消除。
7.20.实施例19：pMHC-IL2突变蛋白融合物允许选择性刺激抗原特异性人CD8+T细胞
在37℃下，用浓度渐增的T2-IL2M6或T3-IL2M6刺激1.5×104个CMV pp65特异性人CD8+T细胞20分钟。如第7.1.2节中所述，通过流式细胞术评估细胞内STAT5磷酸化水平。
结果显示于图24中。相较于靶向针对HPV 16E7抗原的TCR的T3-IL2M6，T2-IL2M6在诱导这些CMV pp65特异性T细胞的STAT5磷酸化方面显示出高几个数量级的功效。
7.21.实施例20：通过靶向肽-MHC的IL2突变蛋白的选择性CAR-T扩增
7.21.1.CAR构建体的结构
使用单一抗体17363N的VL和VH序列来构建含有识别T3的VL-VH scFv(包含负载有HPV16 E711-19肽的HLA-A2)、huCD8跨膜结构域、CD137(4-1BB)共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域(如图25A所示)的嵌合抗原受体。作为CAR阴性对照，使用来自同一供体的未转导的T细胞。将此CAR克隆到具有EF1a启动子的pLVX慢病毒载体中，该载体在用于追踪经CAR转导的细胞的eGFP序列上游含有P2A序列。产生VSV假型慢病毒，用于随后以5的感染倍数(MOI)进行转导。用CAR构建体转导的细胞的示例性FACS图谱显示于图25B-25C中。
7.21.2.CAR T细胞的生成和扩增
将来自HLA-A2纯合供体的CD3+T细胞解冻，然后以1.5x106/mL的密度用
Figure BDA0003700122800000981
Human T-Expander CD3/CD28微珠加阿地白介素(100IU/mL)刺激24小时。随后，通过磁性分离移除CD3/CD28微珠，然后用CAR构建体通过在2440rpm下离心90分钟转导激活的T细胞。作为CAR阴性对照，使用了来自同一供体的未转导的T细胞。然后向已转导和未转导的细胞补充
Figure BDA0003700122800000991
Human T-Expander CD3/CD28微珠(每1个T细胞1个珠子)，并在补充CTS的OpTmizerTM培养基中扩增19天。细胞密度维持在1-1.5×106/mL之间，且每48小时向培养物添加阿地白介素并维持在100IU/mL。扩增结束时，移除微珠，并低温保存细胞。
测试图26A和26B中所示的各种肽-MHC靶向的IL2突变蛋白的活性，其含有减弱的IL2(H16A、F42A)(也称为IL2(2m)：T7-IL2M7(对IL2是单价的且具有HPV肽-MHC复合体)、T8-IL2M7((对IL2是单价的且具有CMV肽-MHC复合体)、T3-IL2M6(对IL2是二价的且具有HPV肽-MHC复合体)、T2-IL2M6(对IL2是单价的且具有CMV肽-MHC复合体)。将CAR-T细胞解冻并在完全RPMI培养基中洗涤两次，然后将解冻的细胞在无阿地白介素的完全RPMI培养基中以2.8x106/mL静置过夜。静置过夜后，如第7.1.2节所述通过流式细胞术评估这些CAR T细胞中门控的CD4+或CD8+群的细胞内STAT5磷酸化水平。
7.21.3.结果
结果显示于图27A(CD4+T细胞)和27B(CD8+T细胞)中。通过门控经工程改造以表达靶向CAR和HPV16 E711-19肽-HLA-A2复合体的CD4+和CD8+CAR-T细胞，相对于T8-IL2M7和T2-IL2M6(靶向CMV pp65495-503-特异性T细胞)，IL2突变蛋白T7-IL2M7和T3-IL2M6(两者均具有HPV16 E711-19肽-HLA-A2靶向部分)在诱导STAT5磷酸化方面显示出高几个数量级的功效。
7.22.实施例21：通过肽-MHC靶向的IL2突变蛋白的选择性CAR-T扩增
7.22.1.CAR T细胞的生成和扩增
将来自HLA-A2纯合供体的CD3+T细胞解冻，然后用
Figure BDA0003700122800000993
Human T-Expander CD3/CD28微珠加3.3x10-10M重组阿地白介素刺激48小时。随后，通过磁性分离移除CD3/CD28微珠，然后用图27A中所示的CAR构建体通过在2440rpm下旋转离心90分钟转导激活的T细胞。对于CAR阴性对照，使用来自同一供体的未转导的T细胞。然后将已转导和未转导的细胞用
Figure BDA0003700122800000992
Human T-Expander CD3/CD28微珠在补充有CTS的OpTmizerTM培养基中扩增4天，以1：1的比例添加T细胞以及3.3x10-10 M的阿地白介素。接着收集激活的T细胞，在OpTmizerTM培养基中洗涤两次，并通过磁性分离移除CD3/CD28微珠，然后在37℃下将T细胞在缺少阿地白介素的补充有CTS的OpTmizerTM培养基中静置过夜。将静置的已转导和未转导的T细胞重悬，并在
Figure BDA0003700122800001001
humanT-Expander CD3/CD28微珠(每1个T细胞1个珠子)存在下，在补充有CTS的OpTmizerTM培养基中以1x106/mL进行培养。然后用浓度为3.3x 10-10M的对应生物制剂刺激各个培养物。各T细胞扩增培养物每48小时补充生物制剂，并维持在1-1.5x106/mL的密度17天。在扩增的第3、9、17天，计数T细胞数量，并收集细胞的等分试样以定量活eGFP阳性(CAR+)与eGFP阴性(非CAR)T细胞的比率变化。经各种生物制剂扩增的未转导的T细胞用于确定每个时间点的CAR-T扩增的eGFP信号。
7.22.2.CAR-T细胞的表征
在CAR-T细胞扩增期间的几个时间点，收集细胞的等分试样以通过流式细胞术来定量活eGFP+(CAR+)细胞。为了鉴别不同T细胞群和IL2Rα的表达，使用下列抗体的组合：BUV395抗-CD4(BD Biosciences)、BUV737抗-CD4(BD Biosciences)、PE-CY7抗-CD8(Biolegend)、APC-Cy7抗-CD8(Biolegend)、BV605抗-CD25(BD Biosciences)。为了表征记忆T细胞亚群与表型，使用BV421抗-CCR7(Biolegend)、PE-CF594抗-CD45RO(BDBiosciences)、PerCP-Cy5.5抗-CD45RO(BD Biosciences)、BUV395抗-PD1(BDBiosciences)，和PE-CF594抗-CD57(BD Biosciences)。使用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(ThermoFisher)或AQUA活力染料(ThermoFisher)评估活力。所有样品均在BDFortessaTMX-20或Biorad Ze5流式细胞仪上采集。使用FlowJo v10处理原始数据。
7.22.3.结果与讨论
为了检查与给定靶向部分的递增价数(valency)相对应的减弱的IL-2价数介导选择性CAR-T扩增的潜力，研究了响应于一系列经改造生物制剂的选择性CAR-T扩增。在单价形式中，将1个拷贝的减弱的IL2与1个拷贝的靶向部分组合。在二价形式中，将两个拷贝的减弱的IL-2与两个拷贝的的靶向部分组合。为了控制非选择性扩增，使用了不被CAR-T细胞识别的靶向部分(装载了CMV pp65495-503肽的scHLA-A2)。所测试的生物制剂的结构在图26A和26B中说明。
结果显示于图28中。如图28A.1-28A.16中所示，在转导的T细胞响应于scMHC-肽靶向的IL2突变蛋白而扩增之前(表示为第0天)，活CAR-T(eGFP阳性)细胞的频率为38％。在扩增的第3天，各培养物中的活CAR-T细胞的频率增加至大约43％，二价T3-IL2M6构建体除外(CAR的频率降低到36％)。在第9天，观察到响应于单价T7-IL2M7的最大程度的选择性CAR-T富集，其中活CAR-T细胞的百分比已增加到75％。值得注意的是，即使该生物制剂不结合CARscFv，也观察到响应于单价T8-IL2M7的不太明显的CAR-T百分比的增加。尽管由于使用匹配的供体PBMC(根据供货商)的抗原召回反应的缺乏，这种扩增不太可能是由先前存在的针对巨细胞病毒肽(pp65495-503)的T细胞库引起的，但这种可能性无法完全排除。在扩增的第9天和第17天之间，响应于单价T7-IL2M7和T8-IL2M7的CAR百分比维持相似。观察到响应于IL2(阿地白介素)和二价T3-IL2M6时，CAR-T频率略有增加，而响应于二价T2-IL2M6时，未观察到进一步的变化。
为了评估生物制剂同时结合CAR的scFv并递送减弱的IL2信号以介导CAR-T的选择性扩增的潜力，绘制活T细胞的总数量相对于CAR-T细胞(EGFP阳性)与非CAR-T细胞(EGFP阴性)的比例的图。如图28B.1-28B.4中所示，随着eGFP阳性/eGFP阴性比例从0.73增加到3.12，在第3天和第9天之间发生响应于T7-IL2M7(空心圆形)的CAR-T的选择性富集。此外，T细胞的数量增加超过一倍。在第17天，在培养终止时，观察到响应于阿地白介素(黑色方形)的总T细胞的最大扩增数量，其次是单价T7-IL2M7(空心圆形)；然而，在用T7-IL2M7扩增的培养物中，CAR阳性与CAR阴性T细胞的比例最大，这表明发生了CAR-T的选择性靶向扩增。如图28C中所示，针对每种扩增条件的活CAR-T细胞的绝对数目相对于培养时间作图。尽管IL-2(阿地白介素)产生最大数量的总T细胞(图28B.4)，但由于选择性CAR-T扩增，单价T7-IL2M7产生了最大数量的活CAR-T细胞(图28C)。响应于单价T8-IL2M7而发生的CAR-T扩增最小，这证实了靶向部分的重要性。值得注意的是，响应于二价T3-IL2M6的CAR-T扩增很低，这可能表明CAR-T细胞的过度活化导致细胞死亡。或者，二价T3-IL2M6可能交联单独的CAR-T细胞，从而产生CAR-T自相残杀。这些研究显示，单价形式的结构在介导选择性CAR-T扩增方面是更优的。
7.23.实施例22：肽-MHC靶向的IL2突变蛋白的体内药物动力学评估
7.23.1.方法
为了评估指定的IL2突变蛋白在血浆中的药物动力学，免疫活性C57BL/6J和免疫缺陷NSG(NOD-scid IL2Rgnull)小鼠腹膜内注射单一剂量的12μg各蛋白质。给药后2、24、48和72小时收集血液样品，然后在10,000RPM下离心10分钟以分离血浆。通过SDS-PAGE然后使用抗人IgG Fc的免疫印迹法来分析1μl的各血浆样品。将2ng的各纯化蛋白质(加入1μl天然血浆中)加载到同一凝胶上，以帮助评估血浆样品中每种蛋白质的绝对水平。
7.23.2.结果
结果显示于图29中。相较于IL2M0(在图29中称为IL2-Fc)，图26A合26B中所示的靶向IL2突变蛋白显示了亲合力依赖方式的PK改善。另外，与IL2-Fc相比，二价和单价构建体均显示出循环中的延迟清除，其中单价构建体(T7-IL2M7和T8-IL2M7)持续时间最长。该结果表明，IL2减弱可以以亲合力依赖的方式显著降低其受体介导的清除，并因此增加了靶向的减弱IL2突变蛋白到达靶细胞的机会。尽管在循环中更持久的存在，但二价T2-IL2M6仍显示出比单独的靶向部分(T2-Fc)更快的从血液中清除，这表明T2-IL2M6的清除主要由IL2M6驱动。
8.具体实施方案，参考文献的引用
尽管已经示出并描述了各个具体实施方案，但是应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范畴的情况下进行各种改变。本公开通过以下所述的编号实施方案来例示说明。
在以下编号实施方案的优选方面以及随后的权利要求中，IL2结构域、IL2受体、Fc结构域、MHC结构域、β2M及其变体优选地包含人IL2、人IL2受体、人Fc结构域、人MHC结构域、人β2M及其变体的氨基酸序列，例如与此类人序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的序列同一性的变体。
1.IL2激动剂，其包含：
(a)包含IL2结构域的IL2部分；
(b)任选的多聚化部分；
(c)任选的靶向部分；和
(d)任选的稳定化部分。
2.如实施方案1的IL2激动剂，其包含具有以下构型的IL2突变蛋白：
(a)IL2M0；
(b)IL2M1；
(c)IL2M2；
(d)IL2M3；
(e)IL2M4；
(f)IL2M5；
(g)IL2M6；或
(h)IL2M7。
3.如实施方案1或实施方案2的IL2激动剂，其中该IL2部分为偏好IL2-Rα的IL2突变蛋白。
4.如实施方案1至3中任一项的IL2激动剂，其中相较于野生型IL2，该IL2部分和/或IL2激动剂与人IL2-Rβ的结合减弱50倍至1000倍。
5.如实施方案1至4中任一项的IL2激动剂，其中相较于野生型IL2，该IL2部分和/或IL2激动剂与人IL2-Rα的结合减弱至多100倍、至多500倍、至多1000倍、或至多5000倍。
6.如实施方案1至5中任一项的IL2激动剂，其中IL2激动剂对高亲和力IL2受体的结合亲和力相对于IL2激动剂对中亲和力IL2受体的结合亲和力的比率等于或大于野生型IL2的对应比率。
7.如实施方案1至6中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分和/或IL2激动剂对高亲和力IL2受体的EC50比对中亲和力IL2受体的EC50低100倍至10,000倍。
8.如实施方案1的IL2激动剂，其中该IL2部分为偏好IL2-Rβ的IL2突变蛋白。
9.如实施方案1或实施方案8的IL2激动剂，其中相较于野生型IL2，该IL2部分和/或IL2激动剂对人IL2-Rα的结合减弱(a)50倍至1000倍或(b)50倍至5000倍。
10.如实施方案1、8和9中任一项的IL2激动剂，其中相较于野生型IL2，该IL2部分和/或IL2激动剂对IL2-Rβ的结合减弱至多50倍。
11.如实施方案1和8至10中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分和/或IL2激动剂对中亲和力IL2受体的结合亲和力相对于IL2部分和/或IL2激动剂对高亲和力IL2受体的结合亲和力的比率等于或大于野生型IL2的对应比率。
12.如实施方案1和7至11中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分和/或IL2激动剂对高亲和力IL2受体的EC50比对中亲和力IL2受体的EC50低10倍至100倍。
13.如实施方案1至12中任一项的IL2激动剂，其中相较于野生型IL2，该IL2部分和/或IL激动剂对高亲和力IL2受体的结合亲和力减弱。
14.如实施方案13的IL2激动剂，其中结合亲和力减弱至多1,000倍或至多5000倍，或其中结合亲和力减弱：
(a)10倍至1000倍；
(b)50倍至5000倍；
(c)至多10倍；
(d)至多50倍；
(e)至多100倍；或
(f)至多200倍。
15.如实施方案1至14中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分和/或IL2激动剂对肿瘤反应性淋巴细胞的细胞因子活性比对外周淋巴细胞的细胞因子活性更高。
16.如实施方案15的IL2激动剂，其中该IL2部分和/或IL2激动剂对肿瘤反应性淋巴细胞的细胞因子活性比对外周淋巴细胞的细胞因子活性高至少5倍或至少10倍。
17.如实施方案1至16中任一项的IL2激动剂，其具有至少1的治疗指数。
18.如实施方案17的IL2激动剂，其具有至少2的治疗指数。
19.如实施方案17的IL2激动剂，其具有至少5的治疗指数。
20.如实施方案17的IL2激动剂，其具有至少10的治疗指数。
21.如实施方案17的IL2激动剂，其具有至少50的治疗指数。
22.如实施方案17至21中任一项的IL2激动剂，其具有至多500的治疗指数。
23.如实施方案17至21中任一项的IL2激动剂，其具有至多250的治疗指数。
24.如实施方案1至23中任一项的IL2激动剂，其具有约2的治疗指数。
25.如实施方案1至23中任一项的IL2激动剂，其具有约10的治疗指数。
26.如实施方案1至23中任一项的IL2激动剂，其具有约20的治疗指数。
27.如实施方案1至23中任一项的IL2激动剂，其具有约50的治疗指数。
28.如实施方案1至23中任一项的IL2激动剂，其具有约100的治疗指数。
29.如实施方案1至23中任一项的IL2激动剂，其具有约200的治疗指数。
30.如实施方案1至29中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分和/或IL2激动剂未聚乙二醇化。
31.如实施方案1至30中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分和/或IL2激动剂不包含IL2以外的细胞因子。
32.如实施方案1至31中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分和/或IL2激动剂不含有抗IL2抗体或抗体片段。
33.如实施方案1至32中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分和/或IL2激动剂不含有抗DNA抗体或抗体片段。
34.如实施方案1至33中任一项的IL2激动剂，其中相较于人IL2，该IL2结构域在位置D20处不包含取代。
35.如实施方案1至34中任一项的IL2激动剂，其中相较于人IL2，该IL2结构域在位置Q126处不包含取代。
36.如实施方案1至35中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分和/或IL2激动剂不含有非结合可变结构域。
37.如实施方案1至36中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分包含IL2结构域，该IL2结构域包含与成熟的人IL2具有至少约90％的序列同一性的氨基酸序列。
38.如实施方案1至36中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分包含IL2结构域，该IL2结构域包含与成熟的人IL2具有至少约93％的序列同一性的氨基酸序列。
39.如实施方案1至36中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分包含IL2结构域，该IL2结构域包含与成熟的人IL2具有至少约96％的序列同一性的氨基酸序列。
40.如实施方案1至39中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分包含IL2变体，该IL2变体具有氨基酸取代C125S、C125A或C125V。
41.如实施方案1至40中任一项的IL2激动剂，其中该IL2结构域包含IL2序列，该IL2序列具有一个或多个取代以减少O连接的糖基化。
42.如实施方案41的IL2激动剂，其中该IL2结构域在对应于人IL2的残基3的位置处具有取代。
43.如实施方案42的IL2激动剂，其中该氨基酸取代为T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、或T3K。
44.如实施方案1至43中任一项的IL2激动剂，其中该IL2结构域在对应于人IL2的甲硫氨酸104的位置处具有使用中性氨基酸的取代。
45.如实施方案44的IL2激动剂，其中该中性氨基酸为丙氨酸。
46.如实施方案1至45中任一项的IL2激动剂，其中该IL2结构域为全长人IL2结构域。
47.如实施方案1至45中任一项的IL2激动剂，其中相较于全长的成熟人IL2，该IL2结构域具有N端丙氨酸缺失。
48.如实施方案1至47中任一项的IL2激动剂，其中该IL2结构域包含在位置N88处具有氨基酸取代的IL2变体。
49.如实施方案48的IL2激动剂，其中该氨基酸取代为N88D。
50.如实施方案1至47中任一项的IL2激动剂，其中该IL2结构域包含在位置H16和F42处具有氨基酸取代的IL2变体。
51.如实施方案50的IL2激动剂，其中该氨基酸取代为H16A和F42A。
52.如实施方案1至51中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分包含IL-2Rα结构域，该IL-2Rα结构域包含融合至IL2结构域的IL-2Rα的IL2结合部分。
53.如实施方案52的IL2激动剂，其中该IL-2Rα结构域或IL-2Rα的IL2结合部分为IL-2Rα的细胞外结构域或其IL2结合部分。
54.如实施方案52或实施方案53的IL2激动剂，其中该IL-2Rα结构域或IL2结合部分包含或组成为与人IL-2Rα的IL2结合部分具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，任选地其中所述结合部分具有：
(a)人IL-2Rα的至少160个氨基酸、至少161个氨基酸、至少162个氨基酸、至少164个氨基酸或至少165个氨基酸；和/或
(b)人IL-2Rα的细胞外结构域的至多251个、至多240个、至多230个、至多220个、至多210个、至多200个、至多190个、至多180个或至多170个氨基酸。
55.如实施方案52至54中任一项的IL2激动剂，其中该IL-2Rα结构域或IL2结合部分具有与IL-2Rα的氨基酸22-186、IL-2Rα的氨基酸22-240和/或与IL-2Rα的氨基酸22-272有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99或100％的序列同一性的氨基酸序列。
56.如实施方案52至55中任一项的IL2激动剂，其中该IL-2Rα结构域或IL2结合部分包含或组成为与人IL-2Rα的氨基酸22-186具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99或100％的序列同一性的氨基酸序列，在氨基酸残基186的C端具有或不具有额外的至多5个氨基酸、至多10个氨基酸、至多15个氨基酸、至多20个氨基酸、至多30个氨基酸、或至多40个氨基酸。
57.如实施方案52至56中任一项的IL2激动剂，其中该IL-2Rα结构域在IL2结构域的N端。
58.如实施方案52至56中任一项的IL2激动剂，其中该IL-2Rα结构域在IL2结构域的C端。
59.如实施方案52至58中任一项的IL2激动剂，其中该IL2结构域与IL-2Rα结构域经由接头连接。
60.如实施方案59的IL2激动剂，其中该接头为甘氨酸-丝氨酸接头，或包含甘氨酸-丝氨酸接头。
61.如实施方案60的IL2激动剂，其中该接头包含氨基酸序列G4S(SEQ ID NO:57)。
62.如实施方案60的IL2激动剂，其中该接头为氨基酸序列G4S(SEQ ID NO:57)的多聚体或包含氨基酸序列G4S(SEQ ID NO:57)的多聚体。
63.如实施方案62的IL2激动剂，其中该多聚体包含2、3、4、5或6个重复的氨基酸序列G4S(SEQ ID NO:57)。
64.如实施方案1至63中任一项的IL2激动剂，其包含多聚化部分和/或稳定化部分。
65.如实施方案64的IL2激动剂，其中该多聚化部分和/或该稳定化部分是Fc结构域或包含Fc结构域。
66.如实施方案65的IL2激动剂，其中该Fc结构域为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。
67.如实施方案65或实施方案66的IL2激动剂，其中该Fc结构域具有减少的效应功能。
68.如实施方案67的IL2激动剂，其中该Fc结构域包含WO2014/121087的SEQ IDNO:31的氨基酸序列或其部分，例如如表4和/或第6.5.1.1节中所示。
69.如实施方案1至68中任一项的IL2激动剂，其包含稳定化部分。
70.如实施方案69的IL2激动剂，其中该稳定化部分是人血清白蛋白、人血清白蛋白结合剂、XTEN、PAS、碳水化合物、聚唾液酸、亲水性聚合物、脂肪酸、或Fc结构域。
71.如实施方案70的IL2激动剂，其中该稳定化部分为人血清白蛋白结合剂。
72.如实施方案71的IL2激动剂，其中该人血清白蛋白结合剂为Adnectin PKE、AlbudAb或白蛋白结合结构域。
73.如实施方案72的IL2激动剂，其中该稳定化部分是Fc结构域。
74.如实施方案73的IL2激动剂，其中该Fc结构域是单体Fc结构域。
75.如实施方案73或实施方案74的IL2激动剂，其中Fc结构域具有减少的效应功能。
76.如实施方案70的IL2激动剂，其中该稳定化部分是亲水性聚合物。
77.如实施方案76的IL2激动剂，其中该亲水性聚合物为PEG。
78.如实施方案77的IL2激动剂，其中PEG的分子量范围为约7.5kDa至约80kDa。
79.如实施方案78的IL2激动剂，其中PEG的分子量范围为约30kDa至约60kDa，任选地其中分子量为约50kDa。
80.如实施方案76至79中任一项的IL2激动剂，其中该亲水性分子连接至IL2的IL-2Rβ结合表面。
81.如实施方案1至80中任一项的IL2激动剂，其为二聚体。
82.如实施方案81的IL2激动剂，其为同二聚体。
83.如实施方案81的IL2激动剂，其为异二聚体。
84.如实施方案1至80中任一项的IL2激动剂，其为单体。
85.如实施方案1至84中任一项的IL2激动剂，其对IL2部分为单价的。
86.如实施方案1至85中任一项的IL2激动剂，其对IL2部分为二价的。
87.如实施方案1至86中任一项的IL2激动剂，其为取向1IL2激动剂或包含取向1IL2激动剂。
88.如实施方案1至87中任一项的IL2激动剂，其包含：
(a)IL2部分，其包含：
(i)IL2或IL2变体(例如IL2 N88D)结构域，其在C125处具有或不具有减少聚集的取代(例如C125S或C125A或C125V)；
(ii)接头(例如如第6.7节中所述)，例如包含10个或更多个氨基酸和/或包含或组成为(G4S)n(SEQ ID NO:57)的接头，任选地其中n≥2，例如其中N为3、4、5或更大；和
(iii)IL-2Rα的IL2结合部分；
(b)接头(例如如第6.7节中所述)，例如包含或组成为(G4S)n(SEQ ID NO:57)的接头，任选地其中n≥1，例如其中N为1、2、3、4、5或更大；和
(c)Fc结构域(例如IgG1或IgG4，具有或不具有如第6.5.1节及其小节中所述减少糖基化和/或效应功能的取代)。
89.如实施方案1至86中任一项的IL2激动剂，其为取向2IL2激动剂或包含取向2IL2激动剂。
90.如实施方案1至89中任一项的IL2激动剂，其包含：
(a)Fc结构域(例如IgG1或IgG4，具有或不具有如第6.5.1节及其小节中所述减少糖基化和/或效应功能的取代)；
(b)接头(例如如第6.7节中所述)，例如包含或组成为(G4S)n(SEQ ID NO:57)的接头，任选地其中n≥1，例如其中N为1、2、3、4、5或更大；和
(c)IL2或IL2变体(例如IL2 N88D)结构域，其在C125处具有或不具有减少聚集的取代(例如C125S或C125A或C125V)。
91.如实施方案1至89中任一项的IL2激动剂，其包含：
(a)Fc结构域(例如IgG1或IgG4，具有或不具有如第6.5.1节及其小节中所述减少糖基化和/或效应功能的取代)；
(b)接头(例如如第6.7节中所述)，例如包含或组成为(G4S)n(SEQ ID NO:57)的接头，任选地其中n≥1，例如其中N为1、2、3、4、5或更大；和
(c)IL2部分，其包含：
(i)IL2或IL2变体(例如IL2 N88D)结构域，其在C125处具有或不具有减少聚集的取代(例如C125S或C125A或C125V)；
(ii)接头(例如如第6.7节中所述)，例如包含10个或更多个氨基酸和/或包含或组成为(G4S)n(SEQ ID NO:57)的接头，任选地其中n≥2，例如其中N为3、4、5或更大；和
(iii)IL2Rα的IL2结合部分。
92.如实施方案1至86中任一项的IL2激动剂，其为取向3IL2激动剂或包含取向3IL2激动剂。
93.如实施方案1至92中任一项的IL2激动剂，其包含：
(a)scFv或Fab的重链可变区(在单独的多肽上与对应轻链可变区缔合)(例如如第6.4.2节及其小节中所述)；
(b)接头(例如如第6.7节中所述)，例如包含或组成为(G4S)n(SEQ ID NO:57)的接头，任选地其中n≥1，例如其中N为1、2、3、4、5或更大；
(c)Fc结构域((例如IgG1或IgG4，具有或不具有如第6.5.1节及其小节中所述减少糖基化和/或效应功能的取代)；
(d)接头(例如如第6.7节中所述)，例如包含或组成为(G4S)n(SEQ ID NO:57)的接头，任选地其中n≥1，例如其中N为1、2、3、4、5或更大；和
(e)IL2部分，其包含：
(i)IL2或IL2变体(例如IL2 N88D)结构域，其在C125处具有或不具有减少聚集的取代(例如C125S、C125A或C125V)；
(ii)接头(例如如第6.7节中所述)，例如包含10个或更多个氨基酸和/或包含或组成为(G4S)n(SEQ ID NO:57)的接头，任选地其中n≥2，例如其中N为3、4、5或更大；和
(iii)IL-2Rα的IL2结合部分(例如如第6.3节中所述)。
94.如实施方案1至92中任一项的IL2激动剂，其包含：
(a)肽-MHC复合体(例如如第6.4.3节中所述)，其包含：
(i)MHC肽：
(ii)接头(例如如在第6.7节或其小节，例如第6.7.1节中所述)；
(iii)任选的β2-微球蛋白(β2m)结构域；
(iv)任选的接头(例如如第6.7节及其小节，例如第6.7.1节中所述)；和
(v)MHC；
(b)任选的接头(例如如第6.7节中所述)，例如包含或组成为(G4S)n(SEQ ID NO:57)的接头，任选地其中n≥1，例如其中N为1、2、3、4、5或更大；
(c)Fc结构域(例如IgG1或IgG4，具有或不具有如第6.5.1节及其小节中所述减少糖基化和/或效应功能的取代)；
(d)接头(例如如第6.7节中所述)，例如包含或组成为(G4S)n(SEQ ID NO:57)的接头，任选地其中n≥1，例如其中N为1、2、3、4、5或更大；
(e)IL2部分，其包含：
(i)IL2或IL2变体(例如IL2 N88D)结构域，其在C125处具有或不具有减少聚集的取代(例如C125S、C125A或C125V)；
(ii)接头(例如如第6.7节中所述)，例如包含10个或更多个氨基酸和/或包含或组成为(G4S)n(SEQ ID NO:57)的接头，任选地其中n≥2，例如其中N为3、4、5或更大；和
(iii)IL-2Rα的IL2结合部分(例如如第6.3节中所述)。
95.如实施方案1至86中任一项的IL2激动剂，其为取向4IL2激动剂或包含取向4IL2激动剂。
96.如实施方案1至86和95中任一项的IL2激动剂，其包含：
(a)第一多肽，其包含：
(i)靶向部分，例如肽-MHC复合体(例如如第6.4.3节中所述)、Fab结构域(例如如第6.4.2.2节中所述)(例如与包含Fab轻链的第三多肽缔合的Fab重链)或scFv结构域(例如如第6.4.2.1节中所述)；
(ii)任选的接头(例如如第6.7节中所述)；和
(iii)第一Fc结构域；和
(b)第二多肽，其包含：
(i)IL部分，其包含IL2或IL2变体结构域(例如，如第6.3节所述(例如具有取代H16A、F42A的IL2结构域，也称为IL2(2m))，其在C125处具有或不具有减少聚集的取代(例如C125S、C125A或C125V))；
(ii)任选的接头(例如如第6.7节中所述)；和
(iii)第二Fc结构域，其可与第一Fc结构域二聚化(例如异二聚化)(例如如第6.5.1.2节中所述)。
97.如实施方案1至86、95和96中任一项的IL2激动剂，其包含：
(a)第一多肽，其包含：
(i)肽-MHC复合体(例如如第6.4.3节中所述)，其包含：
(1)MHC肽；
(2)接头(例如如第6.7节或其小节中所述，例如第6.7.1节)；
(3)任选的β2-微球蛋白(β2m)结构域；
(4)任选的接头(例如如第6.7节或其小节中所述，例如第6.7.1节)；和
(5)MHC；
(ii)任选的接头(例如如第6.7节中所述)；和
(iii)第一Fc结构域。
(b)第二多肽，其包含：
(i)IL2部分，其包含IL2或IL2变体(例如IL2 H16A、F42A)结构域，其在C125处具有或不具有减少聚集的取代(例如C125S、C125A或C125V)；
(ii)任选的接头(例如如第6.7节中所述)；和
(iii)第二Fc结构域，其与第一Fc结构域不同但可与第一Fc结构域异二聚化(例如如第6.5.1.2节中所述)。
98.如实施方案1、87和88中任一项的IL2激动剂，其(a)具有或包含具有IL2M0的构型的氨基酸序列，或(b)包含IL2M0的氨基酸序列。
99.如实施方案1、87和88中任一项的IL2激动剂，其(a)具有或包含具有IL2M2的构型(例如IL2部分-任选的接头-IL2Rα-任选的接头-Fc结构域)的氨基酸序列，或(b)包含IL2M2的氨基酸序列。
100.如实施方案1和91至94中任一项的IL2激动剂，其(a)具有或包含具有IL2M3的构型(例如IL2Rα-任选的接头-IL2部分-任选的接头-Fc结构域)的氨基酸序列，或(b)包含IL2M3的氨基酸序列。
101.如实施方案1、89和90中任一项的IL2激动剂，其(a)具有或包含具有IL2M4的构型(例如Fc结构域-任选的接头-IL2部分)的氨基酸序列，或(b)包含IL2M4的氨基酸序列。
102.如实施方案1、89和90中任一项的IL2激动剂，其(a)具有或包含具有IL2M5的构型(例如Fc结构域-任选的接头-IL2部分)的氨基酸序列，或(b)包含IL2M5的氨基酸序列。
103.如实施方案1和95至97中任一项的IL2激动剂，其(a)具有或包含具有IL2M6的构型(例如Fc结构域-任选的接头-IL2部分)的氨基酸序列，或(b)包含IL2M6的氨基酸序列。
104.如实施方案1和95至97中任一项的IL2激动剂，其(a)具有含IL2M7的构型(例如IL2部分-任选的接头-Fc结构域)的氨基酸序列，或(b)包含IL2M7的氨基酸序列，在各个情况下任选地与包含靶向部分-任选的接头-Fc结构域的多肽链(例如包含T7或T8的序列或构型的多肽链)缔合。
105.一种IL2激动剂，其包含：
(a)IL2部分，其包含IL2结构域和IL2-Rα的IL2结合部分；和
(b)Fc结构域。
106.如实施方案105的IL2激动剂，其中该IL2-Rα的IL2结合部分在IL2结构域的N端。
107.如实施方案105的IL2激动剂，其中该IL2-Rα的IL2结合部分在IL2结构域的C端。
108.如实施方案105至107中任一项的IL2激动剂，其中该Fc结构域在IL2部分的N端。
109.如实施方案105至107中任一项的IL2激动剂，其中该Fc结构域在IL2部分的C端。
110.如实施方案105至109中任一项的IL2激动剂，其中该IL2结构域和IL2-Rα的IL2结合部分经由接头连接，任选地其中该接头包含10个或更多个、或15个或更多个氨基酸。
111.如实施方案110的IL2激动剂，其中该接头为G4S(SEQ ID NO:57)或其多聚体，或包含G4S(SEQ ID NO:57)或其多聚体。
112.如实施方案111的IL2激动剂，其中该接头包含单个G4S(SEQ ID NO:57)。
113.如实施方案111的IL2激动剂，其中该接头包含两个、三个、四个或五个重复的G4S(SEQ ID NO:57)。
114.如实施方案105至113中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分和Fc结构域经由接头连接，任选地其中该接头包含5个或更多个、或10个或更多个氨基酸。
115.如实施方案114的IL2激动剂，其中该接头为G4S(SEQ ID NO:57)或其多聚体，或包含G4S(SEQ ID NO:57)或其多聚体。
116.如实施方案115的IL2激动剂，其中该接头包含单个G4S(SEQ ID NO:57)。
117.如实施方案115的IL2激动剂，其中该接头包含两个、三个、四个或五个重复的G4S(SEQ ID NO:57)。
118.如实施方案105的IL2激动剂，其(a)具有或包含具有IL2M2的构型(例如IL2部分-任选的接头-IL2Rα-任选的接头-Fc结构域)的氨基酸序列，或(b)包含IL2M2的氨基酸序列。
119.如实施方案105的IL2激动剂，其(a)具有或包含具有IL2M3的构型(例如IL2α部分-任选的接头-IL2R-任选的接头-Fc结构域)的氨基酸序列，或(b)包含IL2M3的氨基酸序列。
120.如实施方案1至119中任一项的IL2激动剂，其包含靶向部分。
121.如实施方案120的IL2激动剂，其中该靶向部分：
(a)结合至肿瘤相关抗原；
(b)结合至肿瘤微环境抗原；
(c)结合至肿瘤反应性淋巴细胞的细胞表面分子；
(d)结合至检查点抑制剂；
(e)结合至肽-MHC复合体；
(f)是肽-MHC复合体；或
(g)结合至与自身免疫反应相关或由自身免疫反应靶向的抗原。
122.如实施方案121的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至肿瘤相关抗原。
123.如实施方案122的IL2激动剂，其中该肿瘤相关抗原为成纤维细胞活化蛋白(FAP)、腱生蛋白C的A1结构域(TNC A1)、腱生蛋白C的A2结构域(TNC A2)、纤连蛋白的额外结构域B(EDB)、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)或其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、肿瘤抗原的MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、肿瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、甲胎蛋白、E-钙黏蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig个体基因型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物(例如人乳头瘤病毒蛋白)、肿瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、c-erbB-2、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR相关的异多聚体)、CD22(B细胞受体)、CD23(低结合亲和力IgE受体)、CD30(细胞因子受体)、CD33(骨髓细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、IL-6R-(IL6受体)、CD20、MCSP、PDGFβR(β-血小板衍生的生长因子受体)、ErbB2、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、二唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮黏蛋白、gp36、TAG-72、神经胶质瘤相关抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、LAGA-1a、p53、前列腺素、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤连蛋白的额外结构域A(EDA)或额外结构域B(EDB)、或腱生蛋白C的A1结构域(TnC A1)。
124.如实施方案121或实施方案122的IL2激动剂，其中该肿瘤相关抗原为病毒抗原。
125.如实施方案124的IL2激动剂，其中该病毒抗原为Epstein-Barr病毒LMP-1、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、HIV gp160或HIV gp120、HPV E6、HPV E7，CMV早期膜抗原(EMA)或CMV晚期膜抗原(LMA)。
126.如实施方案121的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至肿瘤微环境抗原。
127.如实施方案126的IL2激动剂，其中该肿瘤微环境抗原为细胞外基质蛋白。
128.如实施方案127的IL2激动剂，其中该细胞外基质蛋白为黏结蛋白聚糖、乙酰肝素酶、整合素、骨桥蛋白、link、钙黏蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白型EGF、凝集素、纤连蛋白、notch、腱生蛋白、胶原蛋白和基质蛋白。
129.如实施方案121的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至肿瘤淋巴细胞的细胞表面分子。
130.如实施方案129的IL2激动剂，其中该细胞表面分子为CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、LAG3、TIM3或B7-H3。
131.如实施方案130的IL2激动剂，其中该细胞表面分子为PD1。
132.如实施方案131的IL2激动剂，其中该靶向部分为抗PD1抗体或其抗原结合片段。
133.如实施方案132的IL2激动剂，其中该抗PD1抗体或其抗原结合片段抑制PD1信号传导。
134.如实施方案132的IL2激动剂，其中该抗PD1抗体或其抗原结合片段不抑制PD1信号传导。
135.如实施方案130的IL2激动剂，其中该细胞表面分子为LAG3。
136.如实施方案121的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至检查点抑制剂。
137.如实施方案136的IL2激动剂，其中该检查点抑制剂为CTLA-4、PD1、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、VISTA、PSGL1、或CHK2。
138.如实施方案137的IL2激动剂，其中该检查点抑制剂为PD1。
139.如实施方案138的IL2激动剂，其中靶向部分为抗PD1抗体或其抗原结合片段。
140.如实施方案139的IL2激动剂，其中该抗PD1抗体或其抗原结合片段抑制PD1信号传导。
141.如实施方案139的IL2激动剂，其中该抗PD1抗体或其抗原结合片段不抑制PD1信号传导。
142.如实施方案137的IL2激动剂，其中该检查点抑制剂为LAG3。
143.如实施方案138的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至MHC-肽复合体。
144.如实施方案143的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体中的肽包含肿瘤新抗原。
145.如实施方案144的IL2激动剂，其中该肿瘤新抗原为LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPV E7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪氨酸酶(369-377、371D)、或WT1(126-134)。
146.如实施方案143至145中任一项的IL2激动剂，其中该靶向部分包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段具有包含下列的互补决定区(“CDR”)；
(a)CDR-H1，其具有选自国际专利公开第WO 2019005897 A1号的SEQ ID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、396、412、428、444、460、476、492、508和524中任一项的氨基酸序列，该国际专利公开通过引用并入本文；
(b)CDR-H2，其具有选自国际专利公开第WO 2019005897 A1号的SEQ ID NO:6、22、38、54、70、86、102、1 18、134、150、166、182、198、214、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、414、430、446、462、478、494、510、和526中任一项的氨基酸序列，该国际专利公开通过引用并入本文；
(c)CDR-H3，其具有选自国际专利公开第WO 2019005897 A1号的SEQ ID NO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384、400、416、432、448、464、480、496、512、和528中任一项的氨基酸序列，该国际专利公开通过引用并入本文；
(d)CDR-L1，其具有选自国际专利公开第WO 2019005897 A1号的SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、204、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、388、404、420、436、452、468、484、500、516、和532中任一项的氨基酸序列，该国际专利公开通过引用并入本文；
(e)CDR-L2，其具有选自国际专利公开第WO 2019005897 A1号的SEQ ID NO:14、30、46、62、78、94、1 10、126、142、158、174、190、206、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、390、406、422、438、454、470、486、502、518、和534中任一项的氨基酸序列，该国际专利公开通过引用并入本文；和
(f)CDR-L3，其具有选自国际专利公开第WO 2019005897 A1号的SEQ ID NO:16、32、48、64、80、96、1 12、128、144、160、176、192、208、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、392、408、424、440、456、472、488、504、520、和536中任一项的氨基酸序列，该国际专利公开通过引用并入本文。
147.如实施方案146的IL2激动剂，其中该抗体或抗原结合片段具有选自以下任一项的VH-VL氨基酸序列：国际专利公开第WO 2019005897 A1号的SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/202、218/226、234/242、250/258、266/274、282/290、298/306、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、458/466、474/482、490/498、506/514、和522/530，该国际专利公开通过引用并入本文。
148.如实施方案147的IL2激动剂，其中该抗体或抗原结合片段具有选自以下任一项的VH-VL氨基酸序列：国际专利公开第WO 2019005897 A1号的SEQ ID NO:2/10、34/42、82/90、194/202、282/290、和506/514，该国际专利公开通过引用并入本文。
149.如实施方案121的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至与自身免疫反应相关或由自身免疫反应靶向的抗原。
150.如实施方案149的IL2激动剂，其中该肽衍生自麦醇溶蛋白(gliadin)、GAD65、IA-2、胰岛素B链、乙酸格拉替雷(glatiramer acetate，GA)、乙酰胆碱受体(AChR)、p205、胰岛素、促甲状腺素、酪氨酸酶、TRP I或髓磷脂抗原。
151.如实施方案150的IL2激动剂，其中该肽衍生自IL-4R、IL-6R或DLL4。
152.如实施方案121至151中任一项的IL2激动剂，其中该靶向部分为抗体或其抗原结合片段。
153.如实施方案152的IL2激动剂，其中该靶向部分为Fab。
154.如实施方案152的IL2激动剂，其中该靶向部分为scFv。
155.如实施方案121的IL2激动剂，其中该靶向部分为肽-MHC复合体。
156.如实施方案155的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体结合至肿瘤淋巴细胞的T细胞受体。
157.如实施方案155或实施方案156的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体中的肽包含肿瘤新抗原。
158.如实施方案157的IL2激动剂，其中该肿瘤新抗原为LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPV E7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪氨酸酶(369-377、371D)、或WT1(126-134)。
159.如实施方案155的IL2激动剂，其中肽-MHC复合体中的肽包含病毒抗原。
160.如实施方案159的IL2激动剂，其中该病毒抗原为CMVpp65或HPV16E7。
161.如实施方案155至160中任一项的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体进一步包含β2微球蛋白或其片段。
162.如实施方案161的IL2激动剂，其中该肽MHC复合体包含I型MHC结构域。
163.如实施方案162的IL2激动剂，其中该肽MHC复合体从N端至C端方向包含MHC肽、接头、β2微球蛋白结构域、接头、和I型MHC结构域。
164.如实施方案163的IL2激动剂，其中连接MHC肽与β2微球蛋白结构域的接头包含氨基酸序列GCGGS(SEQ ID NO:77)。
165.如实施方案155至160中任一项的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体不包含β2微球蛋白或其片段。
166.如实施方案165的IL2激动剂，其中该肽MHC复合体包含II型MHC结构域。
167.一种核酸或多种核酸，其编码实施方案1至166中任一项的IL2激动剂。
168.宿主细胞，其经工程改造以表达如实施方案1至166中任一项的IL2激动剂或实施方案167的核酸。
169.产生如实施方案1至166中任一项的IL2激动剂的方法，其包括培养如实施方案168的宿主细胞并回收由其表达的IL2激动剂。
170.药物组合物，其包含如实施方案1至166中任一项的IL2激动剂和赋形剂。
171.治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用如实施方案1至166中任一项的IL2激动剂或如实施方案170的药物组合物。
172.治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用：
(a)嵌合抗原受体(“CAR”)T细胞(“CART细胞”)；和
(b)IL2激动剂，其包含结合至CART细胞的T细胞受体或CART细胞上的另一个细胞表面分子的靶向部分，任选地其中该靶向部分能够结合至CAR的细胞外结构域。
173.如实施方案172的方法，其中该IL2激动剂对IL2部分和/或靶向部分为单价的。
174.如实施方案172或实施方案173的方法，其中该IL2激动剂是如实施方案1至166中任一项的IL2激动剂，优选地是如实施方案94至97、121和155至166中任一项的IL2激动剂。
175.如实施方案172至174中任一项的方法，其中该CART细胞未被工程改造以表达变体IL2-Rβ受体。
176.如实施方案172至174中任一项的方法，其中该CART细胞未被工程改造以表达任何变体IL2受体。
177.如实施方案172至176中任一项的方法，其中该IL2激动剂在施用该CART细胞的一周内施用于受试者。
178.如实施方案177的方法，其中该IL2激动剂在施用该CART细胞的同一天施用于受试者。
179.如实施方案172至178中任一项的方法，其包括向受试者施用IL2激动剂至少两周的时间段。
180.如实施方案179的方法，其中该IL2激动剂通过连续输注来给药。
181.如实施方案179的方法，其中该IL2激动剂通过每日施用来给药，持续至少两周的时间段的至少一部分。
182.如实施方案179的方法，其中该IL2激动剂根据分次给药方案来给药，该分次给药方案包括：
(a)在至少两周的时间段的初始部分中以第一给药频率来施用IL2激动剂；和
(b)在至少两周的时间段的后续部分中以第二给药频率来施用IL2激动剂。
183.如实施方案182的方法，其中该第一给药频率为每天。
184.如实施方案182或实施方案183的方法，其中该第二给药频率少于第一给药频率。
185.如实施方案184的方法，其中该第二给药频率为每周。
186.如实施方案182至185中任一项的方法，其中在CART细胞耗竭的同时或之后，该受试者从第一给药频率过渡到第二给药频率。
187.如实施方案171至186中任一项的方法，其进一步包括向受试者施用抗PD1抗体。
188.如实施方案187的方法，其中该抗PD1抗体为MDX-1106(纳武单抗(nivolumab))、MK-3475(派姆单抗(pembrolizumab))、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810、或BGB-108。
189.如实施方案172至188中任一项的方法，其中该CAR经设计以靶向第6.11.1.3节中所鉴定靶标中的任一种。
190.如实施方案172至189中任一项的方法，其中该CAR根据第6.11.1.1节及其小节来配置。
191.如实施方案172至190中任一项的方法，其中该靶向部分包含由CAR的抗原结合结构域所识别的pMHC。
192.治疗自身免疫疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用：
(a)嵌合抗原受体(“CAR”)T细胞(“CART细胞”)；和
(b)IL2激动剂，其包含结合至CART细胞上存在的细胞表面抗原的靶向部分，任选地其中该靶向部分能够结合至CAR的细胞外结构域。
193.如实施方案192的方法，其中该IL2激动剂对IL2部分和/或靶向部分为单价的。
194.如实施方案192或实施方案193的方法，其中该IL2激动剂为如实施方案1至166中任一项的IL2激动剂，优选地如实施方案94至97、121和155至166中任一项的IL2激动剂。
195.如实施方案192至194中任一项的方法，其中该靶向部分包含克隆自自身免疫靶细胞和/或由CAR的抗原结合结构域所识别的pMHC。
196.如实施方案192至195中任一项的方法，其中该CART细胞为Treg细胞。
197.如实施方案192至196中任一项的方法，其中该CAR经设计以靶向第6.11.1.4节中所鉴定靶标中的任一种。
198.如实施方案192至197中任一项的方法，其中该CAR根据第6.11.1.1节及其小节来配置。
199.IL2激动剂，其包含：
(a)Fc结构域；和
(b)在Fc结构域的C端的IL2部分，其中该IL2部分包含IL2结构域和IL2-Rα结构域，任选地其中该IL2激动剂具有实施方案1至36中任一项的IL2激动剂的一种或多种特性。
200.如实施方案199的IL2激动剂，其中该IL2结构域在IL2-Rα结构域的N端。
201.如实施方案199的IL2激动剂，其中该IL2结构域在IL2-Rα结构域的C端。
202.如实施方案199至201中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分包含IL2结构域，该IL2结构域包含具有以下的氨基酸序列：
(a)与成熟的人IL2具有至少约90％或至少约95％的序列同一性；
(b)相较于成熟的人IL2，具有N端丙氨酸缺失；
(c)IL2变体，相较于野生型IL2，其在位置N88处具有氨基酸取代，任选地其中氨基酸取代为N88D；
(d)相较于野生型IL2，具有氨基酸取代C125S、C125A或C125V；或
(e)(a)、(b)、(c)和/或(d)的任何组合。
203.如实施方案199至202中任一项的IL2激动剂，其中该IL2-Rα结构域包含或组成为与人IL2-Rα的IL2结合部分具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，任选地其中所述结合部分具有：
(a)人IL2-Rα的至少160个氨基酸、至少161个氨基酸、至少162个氨基酸、至少164个氨基酸或至少165个氨基酸；和/或
(b)人IL2-Rα的细胞外结构域的至多251个、至多240个、至多230个、至多220个、至多210个、至多200个、至多190个、至多180个或至多170个氨基酸。
204.如实施方案199至203中任一项的IL2激动剂，其中该IL2结构域和该IL2-Rα结构域经由接头(“IL2部分接头”)连接。
205.如实施方案204的IL2激动剂，其中该IL2部分接头的长度为至少10个或至少15个氨基酸。
206.如实施方案204或实施方案205的IL2激动剂，其中该IL2部分接头为甘氨酸-丝氨酸接头或包含甘氨酸-丝氨酸接头。
207.如实施方案204至206中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分接头包含氨基酸序列G4S(SEQ ID NO:57)。
208.如实施方案207的IL2激动剂，其中该IL2部分接头为氨基酸序列G4S(SEQ IDNO:57)的多聚体或包含氨基酸序列G4S(SEQ ID NO:57)的多聚体。
209.如实施方案208的IL2激动剂，其中该多聚体包含2、3、4、5、6或更多个重复的氨基酸序列G4S(SEQ ID NO:57)。
210.如实施方案199至209中任一项的IL2激动剂，其中该Fc结构域和该IL2结构域经由接头(“Fc-IL2接头”)连接。
211.如实施方案210的IL2激动剂，其中该Fc-IL2接头的长度为至少5个或至少10个氨基酸。
212.如实施方案210或实施方案211的IL2激动剂，其中该Fc-IL2接头为甘氨酸-丝氨酸接头或包含甘氨酸-丝氨酸接头。
213.如实施方案210至212中任一项的IL2激动剂，其中该Fc-IL2接头包含氨基酸序列G4S(SEQ ID NO:57)。
214.如实施方案207的IL2激动剂，其中该Fc-IL2接头为氨基酸序列G4S(SEQ IDNO:57)的多聚体或包含氨基酸序列G4S(SEQ ID NO:57)的多聚体。
215.如实施方案208的IL2激动剂，其中该多聚体包含2、3、4、5、6或更多个重复的氨基酸序列G4S(SEQ ID NO:57)。
216.如实施方案199至215中任一项的IL2激动剂，其中该Fc结构域为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。
217.如实施方案216的IL2激动剂，其中该Fc结构域具有减少的效应功能。
218.如实施方案199至217中任一项的IL2激动剂，其为二聚体。
219.如实施方案218的IL2激动剂，其为同二聚体。
220.如实施方案218的IL2激动剂，其为异二聚体。
221.如实施方案199至220中任一项的IL2激动剂，其对IL2部分为二价的。
222.如实施方案199至221中任一项的IL2激动剂，其包含靶向部分。
223.如实施方案222的IL2激动剂，其中该靶向部分在Fc结构域的N端。
224.如实施方案22或实施方案223的IL2激动剂，其中该靶向部分：
(a)结合至肿瘤相关抗原；
(b)结合至肿瘤微环境抗原；
(c)结合至肿瘤反应性淋巴细胞的细胞表面分子；
(d)结合至检查点抑制剂；
(e)结合至肽-MHC复合体；
(f)是肽-MHC复合体；或
(g)结合至与自身免疫反应相关或由自身免疫反应所靶向的抗原。
225.如实施方案224的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至肿瘤相关抗原。
226.如实施方案225的IL2激动剂，其中该肿瘤相关抗原为成纤维细胞活化蛋白(FAP)、腱生蛋白C的A1结构域(TNC A1)、腱生蛋白C的A2结构域(TNC A2)、纤连蛋白的额外结构域B(EDB)、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)或其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、肿瘤抗原的MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、肿瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、甲胎蛋白、E-钙黏蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig个体基因型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物(例如人乳头瘤病毒蛋白)、肿瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、c-erbB-2、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR相关的异多聚体)、CD22(B细胞受体)、CD23(低结合亲和力IgE受体)、CD30(细胞因子受体)、CD33(骨髓细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、IL-6R-(IL6受体)、CD20、MCSP、PDGFβR(β-血小板衍生的生长因子受体)、ErbB2、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、二唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮黏蛋白、gp36、TAG-72、神经胶质瘤相关抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、LAGA-1a、p53、前列腺素、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤连蛋白的额外结构域A(EDA)或额外结构域B(EDB)、或腱生蛋白C的A1结构域(TnC A1)。
227.如实施方案224或实施方案225的IL2激动剂，其中该肿瘤相关抗原为病毒抗原。
228.如实施方案227的IL2激动剂，其中该病毒抗原为Epstein-Barr病毒LMP-1、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、HIV gp160或HIV gp120、HPV E6、HPV E7、CMV早期膜抗原(EMA)或CMV晚期膜抗原(LMA)。
229.如实施方案224的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至肿瘤微环境抗原。
230.如实施方案229的IL2激动剂，其中该肿瘤微环境抗原为细胞外基质蛋白。
231.如实施方案230的IL2激动剂，其中该细胞外基质蛋白为黏结蛋白聚糖、乙酰肝素酶、整合素、骨桥蛋白、link、钙黏蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白型EGF、凝集素、纤连蛋白、notch、腱生蛋白、胶原蛋白和基质蛋白。
232.如实施方案224的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至肿瘤淋巴细胞的细胞表面分子。
233.如实施方案232的IL2激动剂，其中该细胞表面分子为CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、LAG3、TIM3或B7-H3。
234.如实施方案233的IL2激动剂，其中该细胞表面分子为PD1。
235.如实施方案234的IL2激动剂，其中该靶向部分为抗PD1抗体或其抗原结合片段。
236.如实施方案233的IL2激动剂，其中该细胞表面分子为LAG3。
237.如实施方案224的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至检查点抑制剂。
238.如实施方案237的IL2激动剂，其中该检查点抑制剂为CTLA-4、PD1、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、VISTA、PSGL1、或CHK2。
239.如实施方案238的IL2激动剂，其中该检查点抑制剂为PD1。
240.如实施方案238的IL2激动剂，其中该检查点抑制剂为LAG3。
241.如实施方案239的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至MHC-肽复合体。
242.如实施方案241的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体中的肽包含肿瘤新抗原。
243.如实施方案242的IL2激动剂，其中该肿瘤新抗原为LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPV E7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪氨酸酶(369-377、371D)、或WT1(126-134)。
244.如实施方案224至243中任一项的IL2激动剂，其中该靶向部分为抗体或其抗原结合片段。
245.如实施方案244的IL2激动剂，其中该靶向部分为Fab。
246.如实施方案244的IL2激动剂，其中该靶向部分为scFv。
247.如实施方案224的IL2激动剂，其中该靶向部分为肽-MHC复合体。
248.如实施方案247的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体结合至肿瘤淋巴细胞的T细胞受体。
249.如实施方案247或实施方案248的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体中的肽包含肿瘤新抗原。
250.如实施方案249的IL2激动剂，其中该肿瘤新抗原为LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPV E7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪氨酸酶(369-377、371D)、或WT1(126-134)。
251.如实施方案247的IL2激动剂，其中肽-MHC复合体中的肽包含病毒抗原。
252.如实施方案251的IL2激动剂，其中该病毒抗原为CMVpp65或HPV16E7。
253.如实施方案247至252中任一项的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体进一步包含β2微球蛋白或其片段。
254.如实施方案253的IL2激动剂，其中该肽MHC复合体包含I型MHC结构域。
255.如实施方案254的IL2激动剂，其中该肽MHC复合体从N端至C端的方向包含MHC肽、接头、β2微球蛋白结构域、接头、和I型MHC结构域。
256.如实施方案255的IL2激动剂，其中连接MHC肽与β2微球蛋白结构域的接头包含氨基酸序列GCGGS。
257.如实施方案247至252中任一项的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体不包含β2微球蛋白或其片段。
258.如实施方案257的IL2激动剂，其中该肽MHC复合体包含II型MHC结构域。
259.一种核酸或多种核酸，其编码实施方案199至258中任一项的IL2激动剂。
260.宿主细胞，其经工程改造以表达如实施方案199至258中任一项的IL2激动剂或实施方案259的核酸。
261.产生如实施方案199至258中任一项的IL2激动剂的方法，其包括培养如实施方案260的宿主细胞并回收由其表达的IL2激动剂。
262.药物组合物，其包含如实施方案199至258中任一项的IL2激动剂和赋形剂。
263.治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用如实施方案199至258中任一项的IL2激动剂或如实施方案262的药物组合物。
264.治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用：
(a)嵌合抗原受体(“CAR”)T细胞(“CART细胞”)；和
(b)如实施方案199至224中任一项的IL2激动剂，其包含结合至CART细胞的T细胞受体或CART细胞上的另一个细胞表面分子的靶向部分，任选地其中该靶向部分能够结合至CAR的细胞外结构域，任选地其中该CAR：
(i)其中该CAR经设计以靶向第6.11.1.4节中所鉴定靶标中的任一种；和/或
(ii)其中该CAR根据第6.11.1.1节及其小节来配置。
265.如实施方案263或实施方案264的方法，其进一步包括向受试者施用抗PD1抗体。
266.如实施方案265的方法，其中该抗PD1抗体为MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810、或BGB-108。
267.IL2激动剂，其包含：
(a)第一多肽链，其包含：
(i)靶向部分，例如能够结合至嵌合抗原受体(CAR)T细胞上的细胞表面分子的靶向部分，任选地其中该靶向部分能够结合至CAR的细胞外结构域；和
(ii)第一Fc结构域，其在靶向部分的C端；和
(b)第二多肽链，其包含：
(i)IL2部分；和
(ii)第二Fc结构域，其在IL2部分的N端或C端，任选地其中该IL2激动剂具有实施方案1至36中任一项的IL2激动剂的一种或多种特性。
268.如实施方案267的IL2激动剂，其为二聚体。
269.如实施方案268的IL2激动剂，其为同二聚体。
270.如实施方案269的IL2激动剂，其对靶向部分和IL2部分为二价的。
271.如实施方案270的IL2激动剂，其具有如图22A.1中所示的构型。
272.如实施方案270或实施方案271的IL2激动剂，其包含：
(a)第一多肽链，其包含：
(i)能够结合至嵌合抗原受体的第一靶向部分；
(ii)任选的接头；
(iii)第一Fc结构域，其在靶向部分的C端；
(iv)任选的接头；和
(v)第一IL2部分，其在第一Fc结构域的C端；
(b)第二多肽链，其包含：
(i)能够结合至嵌合抗原受体的第二靶向部分；
(ii)任选的接头；
(iii)第二Fc结构域，其在靶向部分的C端；
(iv)任选的接头；和
(v)第二IL2部分，其在第一Fc结构域的C端。
273.如实施方案268的IL2激动剂，其为异二聚体。
274.如实施方案273的IL2激动剂，其对靶向部分和IL2部分为单价的。
275.如实施方案274的IL2激动剂，其具有图22A.2中所示的构型。
276.如实施方案274或实施方案274的IL2激动剂，其包含：
(a)第一多肽链，其包含：
(i)能够结合至嵌合抗原受体的靶向部分；
(ii)任选的接头；和
(iii)第一Fc结构域，其在靶向部分的C端；和
(b)第二多肽链，其包含：
(i)IL2部分；
(ii)任选的接头；和
(iii)第二Fc结构域，其在IL2部分的C端。
277.如实施方案267至276中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分和/或IL2激动剂具有减弱的对人IL2-Rβ的结合。
278.如实施方案267至277中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分和/或IL2激动剂具有减弱的对人IL2-Rα的结合。
279.如实施方案267至278中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分和/或IL2激动剂具有：
(a)相较于野生型IL2，对人IL2-Rβ减弱50倍至1000倍的结合；和/或
(b)较于野生型人IL2，对人IL2-Rα减弱至多100倍的结合。
280.如实施方案267至279中任一项的IL2激动剂，其中相较于野生型IL2，该IL2部分和/或IL2激动剂对高亲和力IL2受体的结合亲和力减弱。
281.如实施方案280的IL2激动剂，其中该结合亲和力减弱10倍至1,000倍。
282.如实施方案267至281中任一项的IL2激动剂，其中该IL2部分包含IL2结构域，该IL2结构域包含具有以下的氨基酸序列：
(a)与成熟的人IL2具有至少约90％或至少约95％的序列同一性；
(b)相较于成熟的人IL2，具有N端丙氨酸缺失；
(c)相较于野生型IL2，具有氨基酸取代C125S、C125A或C125V；
(d)相较于野生型IL2，具有氨基酸取代H16A和/或F42A；或
(e)(a)、(b)、(c)和/或(d)的任何组合。
283.如实施方案267至282中任一项的IL2激动剂，其缺少IL2-Rα的IL2结合部分。
284.如实施方案267至283中任一项的IL2激动剂，其中该Fc结构域为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。
285.如实施方案284的IL2激动剂，其中该Fc结构域具有减少的效应功能。
286.如实施方案1至285中任一项的IL2激动剂，其中该靶向部分为肽-MHC复合体。
287.如实施方案286的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体结合至肿瘤淋巴细胞的T细胞受体。
288.如实施方案286或实施方案287的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体中的肽包含肿瘤新抗原。
289.如实施方案288的IL2激动剂，其中该肿瘤新抗原为LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPVE7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪氨酸酶(369-377、371D)、或WT1(126-134)。
290.如实施方案286或实施方案287的IL2激动剂，其中肽-MHC复合体中的肽包含病毒抗原。
291.如实施方案290的IL2激动剂，其中该病毒抗原为CMVpp65或HPV16E7。
292.如实施方案286至291中任一项的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体进一步包含β2微球蛋白或其片段。
293.如实施方案292的IL2激动剂，其中该肽MHC复合体包含I型MHC结构域。
294.如实施方案293的IL2激动剂，其中该肽MHC复合体从N端至C端的方向包含MHC肽、接头、β2微球蛋白结构域、接头、和I型MHC结构域。
295.如实施方案294的IL2激动剂，其中连接MHC肽与β2微球蛋白结构域的接头包含氨基酸序列GCGGS(SEQ ID NO:77)。
296.如实施方案286至291中任一项的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体不包含β2微球蛋白或其片段。
297.如实施方案296的IL2激动剂，其中该肽MHC复合体包含II型MHC结构域。
298.如实施方案267至285中任一项的IL2激动剂，其中该靶向部分为抗体或其抗原结合片段。
299.如实施方案298的IL2激动剂，其中该靶向部分为Fab且其中该IL2激动剂包含第三多肽链，该第三多肽链包含Fab的轻链。
300.如实施方案298的IL2激动剂，其中该靶向部分为scFv。
301.如实施方案267至285和298至300中任一项的IL2激动剂，其中该靶向部分：
(a)结合至肿瘤相关抗原；
(b)结合至肿瘤微环境抗原；
(c)结合至肿瘤反应性淋巴细胞的细胞表面分子；
(d)结合至检查点抑制剂；
(e)结合至肽-MHC复合体；
(f)结合至与自身免疫反应相关或由自身免疫反应靶向的抗原。
302.如实施方案301的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至肿瘤相关抗原。
303.如实施方案302的IL2激动剂，其中该肿瘤相关抗原为成纤维细胞活化蛋白(FAP)、腱生蛋白C的A1结构域(TNC A1)、腱生蛋白C的A2结构域(TNC A2)、纤连蛋白的额外结构域B(EDB)、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)或其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、肿瘤抗原的MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、肿瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、甲胎蛋白、E-钙黏蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig个体基因型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物(例如人乳头瘤病毒蛋白)、肿瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、c-erbB-2、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR相关的异多聚体)、CD22(B细胞受体)、CD23(低结合亲和力IgE受体)、CD30(细胞因子受体)、CD33(骨髓细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、IL-6R-(IL6受体)、CD20、MCSP、PDGFβR(β-血小板衍生的生长因子受体)、ErbB2、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、二唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮黏蛋白、gp36、TAG-72、神经胶质瘤相关抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、LAGA-1a、p53、前列腺素、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤连蛋白的额外结构域A(EDA)或额外结构域B(EDB)、或腱生蛋白C的A1结构域(TnC A1)。
304.如实施方案301或实施方案302的IL2激动剂，其中该肿瘤相关抗原为病毒抗原。
305.如实施方案304的IL2激动剂，其中该病毒抗原为Epstein-Barr病毒LMP-1、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、HIV gp160或HIV gp120、HPV E6、HPV E7、CMV早期膜抗原(EMA)或CMV晚期膜抗原(LMA)。
306.如实施方案301的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至肿瘤微环境抗原。
307.如实施方案306的IL2激动剂，其中该肿瘤微环境抗原为细胞外基质蛋白。
308.如实施方案307的IL2激动剂，其中该细胞外基质蛋白为黏结蛋白聚糖、乙酰肝素酶、整合素、骨桥蛋白、link、钙黏蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白型EGF、凝集素、纤连蛋白、notch、腱生蛋白、胶原蛋白和基质蛋白。
309.如实施方案301的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至肿瘤淋巴细胞的细胞表面分子。
310.如实施方案309的IL2激动剂，其中该细胞表面分子为CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、LAG3、TIM3、或B7-H3。
311.如实施方案310的IL2激动剂，其中该细胞表面分子为PD1。
312.如实施方案310的IL2激动剂，其中该细胞表面分子为LAG3。
313.如实施方案301的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至检查点抑制剂。
314.如实施方案313的IL2激动剂，其中该检查点抑制剂为CTLA-4、PD1、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、VISTA、PSGL1、或CHK2。
315.如实施方案314的IL2激动剂，其中该检查点抑制剂为PD1。
316.如实施方案314的IL2激动剂，其中该检查点抑制剂为LAG3。
317.如实施方案301的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至MHC-肽复合体。
318.如实施方案317的IL2激动剂，其中该肽-MHC复合体中的肽包含肿瘤新抗原。
319.如实施方案318的IL2激动剂，其中该肿瘤新抗原为LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPVE7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪氨酸酶(369-377、371D)、或WT1(126-134)。
320.如实施方案301的IL2激动剂，其中该靶向部分结合至与自身免疫反应相关或由自身免疫反应靶向的抗原。
321.如实施方案320的IL2激动剂，其中该肽衍生自麦醇溶蛋白、GAD65、IA-2、胰岛素B链、乙酸格拉替雷(GA)、乙酰胆碱受体(AChR)、p205、胰岛素、促甲状腺素、酪氨酸酶、TRPI或髓磷脂抗原。
322.如实施方案321的IL2激动剂，其中该肽衍生自IL-4R、IL-6R或DLL4。
323.一种核酸或多种核酸，其编码实施方案267至322中任一项的IL2激动剂。
324.宿主细胞，其经工程改造以表达如实施方案267至322中任一项的IL2激动剂或实施方案323的核酸。
325.产生如实施方案267至322中任一项的IL2激动剂的方法，其包括培养如实施方案324的宿主细胞并回收由其表达的IL2激动剂。
326.药物组合物，其包含如实施方案267至322中任一项的IL2激动剂和赋形剂。
327.治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用如实施方案267至322中任一项的IL2激动剂或如实施方案326的药物组合物。
328.治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用：
(a)嵌合抗原受体(“CAR”)T细胞(“CART细胞”)；和
(b)如实施方案267至322中任一项的IL2激动剂，其靶向部分结合至嵌合抗原受体(CAR)T细胞的细胞表面分子，任选地其中该靶向部分能够结合至CAR的细胞外结构域，任选地其中该CAR：
(i)经设计以靶向第6.11.1.4节中所鉴定靶标中的任一种；和/或
(ii)根据第6.11.1.1节及其小节来配置。
329.如实施方案328的方法，其中该靶向部分包含由CAR的抗原结合结构域所识别的pMHC。
330.如实施方案328或实施方案329的方法，其中该CART细胞未经工程改造以表达变体IL2-Rβ受体。
331.如实施方案328至330中任一项的方法，其中该CART细胞未经工程改造以表达任何变体IL2受体。
332.如实施方案328至331中任一项的方法，其中该IL2激动剂在施用该CART细胞的一周内施用于受试者。
333.如实施方案332的方法，其中该IL2激动剂在施用该CART细胞的同一天施用于受试者。
334.如实施方案328至333中任一项的方法，其包括向受试者施用IL2激动剂至少两周的时间段。
335.如实施方案334的方法，其中该IL2激动剂通过连续输注来给药。
336.如实施方案334的方法，其中该IL2激动剂通过每日施用来给药，持续至少两周的时间段的至少一部分。
337.实施方案334的方法，其中该IL2激动剂根据分次给药方案来给药，该分次给药方案包含：
(a)在至少两周的时间段的初始部分中以第一给药频率来施用IL2激动剂；和
(b)在至少两周的时间段的后续部分中以第二给药频率来施用IL2激动剂。
338.如实施方案337的方法，其中该第一给药频率为每天。
339.如实施方案337或实施方案338的方法，其中该第二给药频率少于第一给药频率。
340.如实施方案339的方法，其中该第二给药频率为每周。
341.如实施方案337至340中任一项的方法，其中在CART细胞耗竭的同时或之后，该受试者从第一给药频率过渡到第二给药频率。
342.如实施方案328至341中任一项的方法，其进一步包括向受试者施用抗PD1抗体。
343.如实施方案342的方法，其中该抗PD1抗体为MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810、或BGB-108。
344.治疗自身免疫疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用：
(a)嵌合抗原受体(“CAR”)T细胞(“CART细胞”)；和
(b)如实施方案267至322中任一项的IL2激动剂，其靶向部分结合至嵌合抗原受体(CAR)T细胞上的细胞表面分子，任选地其中该靶向部分能够结合至CAR的细胞外结构域，任选地其中该CAR：
(i)经设计以靶向第6.11.1.4节中所鉴定靶标中的任一种；和/或
(ii)根据第6.11.1.1节及其小节来配置。
345.如实施方案344的方法，其中该靶向部分包含克隆自自身免疫靶细胞的pMHC。
346.如实施方案344或实施方案345的方法，其中该CART细胞为Treg细胞。
在本申请案引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件，出于所有目的通过整体引用并入本发明，如在每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件中单独指出出于所有目的通过引用方式并入。如果并入本发明的一个或多个参考文献的教导与本公开内容之间存在不一致的情况，则以本说明书的教导为准。
序列表
<110> 再生元制药公司
<120> 新型IL2激动剂及其使用方法
<130> RGN-006C-WO
<140>
<141>
<150> 62/951,831
<151> 2019-12-20
<160> 124
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /说明="未知的描述: I型细胞因子受体基序序列"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<400> 1
Trp Ser Xaa Trp Ser
1 5
<210> 2
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 3
<211> 251
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
1 5 10 15
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
35 40 45
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
50 55 60
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
65 70 75 80
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
85 90 95
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
100 105 110
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
115 120 125
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
130 135 140
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
145 150 155 160
Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu
165 170 175
Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys
180 185 190
Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr
195 200 205
Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln Val Ala Val Ala Gly
210 215 220
Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr Trp
225 230 235 240
Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
245 250
<210> 4
<211> 165
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
1 5 10 15
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
35 40 45
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
50 55 60
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
65 70 75 80
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
85 90 95
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
100 105 110
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
115 120 125
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
130 135 140
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
145 150 155 160
Leu Ile Cys Thr Gly
165
<210> 5
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
1 5 10 15
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
35 40 45
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
50 55 60
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
65 70 75 80
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
85 90 95
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
100 105 110
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
115 120 125
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
130 135 140
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
145 150 155 160
Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu
165 170 175
Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys
180 185 190
Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr
195 200 205
Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
210 215
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 7
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 8
Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val
1 5
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 9
Arg Pro His Ala Ile Arg Arg Pro Leu Ala Leu
1 5 10
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 10
Phe Leu Asp Glu Phe Met Glu Gly Val
1 5
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 11
Leu Thr Asp Asp Arg Leu Phe Thr Cys Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 12
Val Val Met Ser Trp Ala Pro Pro Val
1 5
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 13
Leu Leu Leu Asp Asp Leu Leu Val Ser Ile
1 5 10
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 14
Lys Thr Leu Thr Ser Val Phe Gln Lys
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 15
Glu Ala Phe Ile Gln Pro Ile Thr Arg
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 16
Arg Pro His Val Pro Glu Ser Ala Phe
1 5
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 17
Ser Leu Ala Asp Glu Ala Glu Val Tyr Leu
1 5 10
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 18
Lys Leu Tyr Glu Glu Pro Leu Leu Lys
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 19
Lys Ile Phe Ser Glu Val Thr Leu Lys
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 20
Glu Thr Val Ser Glu Gln Ser Asn Val
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 21
Val Leu His Asp Asp Leu Leu Glu Ala
1 5
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 22
Gly Ile Val Glu Gly Leu Ile Thr Thr Val
1 5 10
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 23
Asp Tyr Leu Gln Tyr Val Leu Gln Ile
1 5
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 24
Ser Leu Phe Glu Gly Ile Asp Ile Tyr Thr
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 25
Phe Ile Ala Ser Asn Gly Val Lys Leu Val
1 5 10
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 26
Cys Ile Leu Gly Lys Leu Phe Thr Lys
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 27
Gln Thr Ala Cys Glu Val Leu Asp Tyr
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 28
Ile Leu Asn Ala Met Ile Ala Lys Ile
1 5
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 29
Lys Glu Phe Glu Asp Asp Ile Ile Asn Trp
1 5 10
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 30
Tyr Thr Asp Phe His Cys Gln Tyr Val
1 5
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 31
Glu Glu Lys Arg Gly Ser Leu His Val Trp
1 5 10
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 32
Ser Glu Leu Phe Arg Ser Gly Leu Asp Ser Tyr
1 5 10
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 33
Ala Glu Pro Ile Asp Ile Gln Thr Trp
1 5
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 34
Thr Leu Asp Trp Leu Leu Gln Thr Pro Lys
1 5 10
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 35
Gly Leu Phe Gly Asp Ile Tyr Leu Ala Ile
1 5 10
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 36
Ile Leu Asp Lys Val Leu Val His Leu
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 37
Ser Tyr Leu Asp Ser Gly Ile His Phe
1 5
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 38
Lys Ile Leu Asp Ala Val Val Ala Gln Lys
1 5 10
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 39
Lys Glu Leu Glu Gly Ile Leu Leu Leu
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 40
Lys Ile Asn Lys Asn Pro Lys Tyr Lys
1 5
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 41
Phe Leu Glu Gly Asn Glu Val Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 42
Ala Gln Gln Ile Thr Lys Thr Glu Val
1 5
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 43
Ala Cys Asp Pro His Ser Gly His Phe Val
1 5 10
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 44
Ala Val Cys Pro Trp Thr Trp Leu Arg
1 5
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 45
Met Glu Ile Phe Ile Glu Val Phe Ser His Phe
1 5 10
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 46
Arg Val Trp Asp Leu Pro Gly Val Leu Lys
1 5 10
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 47
Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 48
Thr Pro Asn Gln Arg Gln Asn Val Cys
1 5
<210> 49
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 49
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
100 105 110
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
225 230
<210> 50
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 50
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
130 135 140
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 51
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 51
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 52
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 52
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 53
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 53
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 54
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 54
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(9)
<223> /说明="氨基酸1-9的每一个可以独立存在或不存在"
<400> 55
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(10)
<223> /说明="氨基酸2-10的每一个可以独立存在或不存在"
<400> 56
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 57
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 58
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 58
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 61
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 62
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 63
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 64
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 65
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 65
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 66
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 66
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 67
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 68
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 68
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 69
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 70
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 71
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 71
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 72
Gly Cys Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 73
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 74
Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 75
Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 76
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 76
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 77
Gly Cys Gly Gly Ser
1 5
<210> 78
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 78
Cys Pro Pro Cys
1
<210> 79
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Cys Pro Ser Cys
1
<210> 80
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 80
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala
20
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 81
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 82
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 83
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10
<210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 84
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 85
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10
<210> 86
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 86
Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ala Leu Phe Leu
20
<210> 87
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 87
Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr
1 5 10 15
Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys
20 25
<210> 88
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 88
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 89
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 89
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
35 40 45
<210> 90
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 90
Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr
1 5 10 15
Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
35 40 45
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
50 55 60
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
65 70 75 80
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
85 90 95
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
100 105 110
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
115 120 125
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
130 135
<210> 91
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 91
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 92
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 92
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
1 5 10 15
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
20 25 30
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
35 40 45
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
50 55 60
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
65 70 75 80
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
85 90 95
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
100 105
<210> 93
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 93
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 94
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 94
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
1 5 10 15
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
20 25 30
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35 40
<210> 95
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 95
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 96
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<400> 97
Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp
1 5
<210> 98
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 98
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
130 135 140
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
145 150 155 160
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
165 170 175
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
180 185 190
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
195 200 205
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
210 215 220
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
225 230 235 240
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
245 250 255
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
260 265 270
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
275 280 285
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
290 295 300
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
305 310 315 320
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
325 330 335
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
340 345 350
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
355 360 365
<210> 99
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 99
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
130 135 140
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
145 150 155 160
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
165 170 175
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
180 185 190
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
195 200 205
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
210 215 220
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
225 230 235 240
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
245 250 255
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
260 265 270
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
275 280 285
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
290 295 300
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
305 310 315 320
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
325 330 335
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
340 345 350
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
355 360 365
<210> 100
<211> 550
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 100
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro
145 150 155 160
Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly
165 170 175
Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser
180 185 190
Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp
195 200 205
Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys
210 215 220
Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu
225 230 235 240
Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His
245 250 255
Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr
260 265 270
His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr
275 280 285
Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His
290 295 300
Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
325 330 335
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
340 345 350
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
355 360 365
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
370 375 380
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
385 390 395 400
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
405 410 415
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
420 425 430
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
435 440 445
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
450 455 460
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
465 470 475 480
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
485 490 495
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
500 505 510
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
515 520 525
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
530 535 540
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
545 550
<210> 101
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 101
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala
245 250 255
Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu
260 265 270
Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu
275 280 285
Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys
290 295 300
Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro
305 310 315 320
Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln
325 330 335
Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro
340 345 350
Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln
355 360 365
Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly
370 375 380
Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr
385 390 395 400
Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
405 410 415
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
420 425 430
Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
435 440 445
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
450 455 460
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
465 470 475 480
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
485 490 495
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
500 505 510
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
515 520 525
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
530 535 540
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser
545 550 555 560
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
565
<210> 102
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 102
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys
225 230 235 240
Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu
245 250 255
Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr
260 265 270
Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln
275 280 285
Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala
290 295 300
Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile
305 310 315 320
Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys
325 330 335
Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp
340 345 350
Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
355 360
<210> 103
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 103
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys
225 230 235 240
Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu
245 250 255
Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr
260 265 270
Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln
275 280 285
Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala
290 295 300
Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asp Ile
305 310 315 320
Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys
325 330 335
Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp
340 345 350
Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
355 360
<210> 104
<211> 376
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 104
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
245 250 255
Leu Glu Ala Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr
275 280 285
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
290 295 300
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
305 310 315 320
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
325 330 335
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
340 345 350
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
355 360 365
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
370 375
<210> 105
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 105
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
130 135 140
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
145 150 155 160
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
165 170 175
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
180 185 190
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
195 200 205
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
210 215 220
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
225 230 235 240
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
245 250 255
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
260 265 270
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
275 280 285
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
290 295 300
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
305 310 315 320
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
325 330 335
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
340 345 350
Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 106
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 106
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro
130 135 140
Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu
145 150 155 160
Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala
165 170 175
Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val
180 185 190
Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu
195 200 205
Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr
225 230 235 240
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
245 250 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260 265 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
275 280 285
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290 295 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305 310 315 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325 330 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
340 345 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355 360 365
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370 375 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405 410 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435 440 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
450 455 460
<210> 107
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 107
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp
245 250 255
Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys
260 265 270
Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys
275 280 285
Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu
290 295 300
Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro
305 310 315 320
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu
355 360 365
Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu
370 375 380
Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His
385 390 395 400
Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser
405 410 415
Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu
420 425 430
Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln
435 440 445
Met Phe Ile Asn Thr Ser
450
<210> 108
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 108
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg
145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190
Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg
195 200 205
Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu
210 215 220
Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg
225 230 235 240
Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr
245 250 255
His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp
260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His
275 280 285
Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala
325 330 335
Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr
340 345 350
Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr
355 360 365
Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr
385 390 395 400
Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg
405 410 415
Trp Glu Pro
<210> 109
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 109
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg
145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190
Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg
195 200 205
Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu
210 215 220
Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg
225 230 235 240
Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr
245 250 255
His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp
260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His
275 280 285
Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala
325 330 335
Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr
340 345 350
Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr
355 360 365
Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr
385 390 395 400
Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg
405 410 415
Trp Glu Pro
<210> 110
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 110
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val
20 25 30
Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Cys
35 40 45
Tyr Val Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Lys
50 55 60
Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Ser
65 70 75 80
Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr
85 90 95
Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Ala Ser Met Ala Glu
100 105 110
Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro
130 135 140
His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu Gly
145 150 155 160
Glu Pro Arg Tyr Met Glu Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe Val
165 170 175
Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Tyr Glu Pro Arg Ala Arg
180 185 190
Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Arg Glu Thr Gln Lys
195 200 205
Ala Lys Gly Asn Glu Gln Ser Phe Arg Val Asp Leu Arg Thr Leu Leu
210 215 220
Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Ile Gln Val Ile
225 230 235 240
Ser Gly Cys Glu Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Gln
245 250 255
Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Cys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu
260 265 270
Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Leu Ile Thr Lys His Lys
275 280 285
Trp Glu Gln Ala Gly Glu Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly
290 295 300
Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Asn Ala Thr
305 310 315 320
Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr His His Ser Arg
325 330 335
Pro Glu Asp Lys Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro
340 345 350
Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Glu Leu Ile Gln
355 360 365
Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln
370 375 380
Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Tyr Tyr Thr
385 390 395 400
Cys His Val Tyr His Gln Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu Arg Trp
405 410 415
Glu Pro Pro Pro Ser Thr Val Ser Asn Met Ala
420 425
<210> 111
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 111
Lys Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val
20 25 30
Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Cys
35 40 45
Tyr Val Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Lys
50 55 60
Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Ser
65 70 75 80
Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr
85 90 95
Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Ala Ser Met Ala Glu
100 105 110
Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro
130 135 140
His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu Gly
145 150 155 160
Glu Pro Arg Tyr Met Glu Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe Val
165 170 175
Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Tyr Glu Pro Arg Ala Arg
180 185 190
Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Arg Glu Thr Gln Lys
195 200 205
Ala Lys Gly Asn Glu Gln Ser Phe Arg Val Asp Leu Arg Thr Leu Leu
210 215 220
Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Ile Gln Val Ile
225 230 235 240
Ser Gly Cys Glu Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Gln
245 250 255
Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Cys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu
260 265 270
Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Leu Ile Thr Lys His Lys
275 280 285
Trp Glu Gln Ala Gly Glu Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly
290 295 300
Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Asn Ala Thr
305 310 315 320
Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr His His Ser Arg
325 330 335
Pro Glu Asp Lys Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro
340 345 350
Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Glu Leu Ile Gln
355 360 365
Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln
370 375 380
Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Tyr Tyr Thr
385 390 395 400
Cys His Val Tyr His Gln Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu Arg Trp
405 410 415
Glu Pro Pro Pro Ser Thr Val Ser Asn Met Ala
420 425
<210> 112
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 112
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg
145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190
Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg
195 200 205
Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu
210 215 220
Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg
225 230 235 240
Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr
245 250 255
His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp
260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His
275 280 285
Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala
325 330 335
Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr
340 345 350
Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr
355 360 365
Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr
385 390 395 400
Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg
405 410 415
Trp Glu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
420 425 430
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
435 440 445
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
450 455 460
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
465 470 475 480
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
485 490 495
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
500 505 510
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
515 520 525
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
530 535 540
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
565 570 575
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
580 585 590
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
595 600 605
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
610 615 620
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
625 630 635 640
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
645 650 655
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
660 665
<210> 113
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 113
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg
145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190
Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg
195 200 205
Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu
210 215 220
Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg
225 230 235 240
Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr
245 250 255
His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp
260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His
275 280 285
Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala
325 330 335
Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr
340 345 350
Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr
355 360 365
Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr
385 390 395 400
Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg
405 410 415
Trp Glu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
420 425 430
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
435 440 445
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
450 455 460
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
465 470 475 480
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
485 490 495
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
500 505 510
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
515 520 525
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
530 535 540
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
565 570 575
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
580 585 590
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
595 600 605
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
610 615 620
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
625 630 635 640
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
645 650 655
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
660 665
<210> 114
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 114
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met
115 120
<210> 115
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 115
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met
115 120
<210> 116
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 116
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg
145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190
Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg
195 200 205
Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu
210 215 220
Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg
225 230 235 240
Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr
245 250 255
His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp
260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His
275 280 285
Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala
325 330 335
Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr
340 345 350
Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr
355 360 365
Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr
385 390 395 400
Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg
405 410 415
Trp Glu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
420 425 430
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
435 440 445
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
450 455 460
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
465 470 475 480
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
485 490 495
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
500 505 510
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
515 520 525
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
530 535 540
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
565 570 575
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
580 585 590
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
595 600 605
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
610 615 620
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
625 630 635 640
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
645 650 655
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
660 665
<210> 117
<211> 815
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 117
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg
145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190
Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg
195 200 205
Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu
210 215 220
Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg
225 230 235 240
Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr
245 250 255
His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp
260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His
275 280 285
Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala
325 330 335
Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr
340 345 350
Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr
355 360 365
Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr
385 390 395 400
Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg
405 410 415
Trp Glu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
420 425 430
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
435 440 445
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
450 455 460
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
465 470 475 480
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
485 490 495
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
500 505 510
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
515 520 525
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
530 535 540
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
565 570 575
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
580 585 590
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
595 600 605
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
610 615 620
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
625 630 635 640
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
645 650 655
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
660 665 670
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
675 680 685
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Ala Leu Leu Leu Asp Leu Gln
690 695 700
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg
705 710 715 720
Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
725 730 735
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
740 745 750
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
755 760 765
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
770 775 780
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
785 790 795 800
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
805 810 815
<210> 118
<211> 1005
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 118
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg
145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190
Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg
195 200 205
Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu
210 215 220
Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg
225 230 235 240
Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr
245 250 255
His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp
260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His
275 280 285
Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala
325 330 335
Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr
340 345 350
Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr
355 360 365
Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr
385 390 395 400
Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg
405 410 415
Trp Glu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
420 425 430
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
435 440 445
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
450 455 460
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
465 470 475 480
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
485 490 495
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
500 505 510
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
515 520 525
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
530 535 540
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
565 570 575
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
580 585 590
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
595 600 605
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
610 615 620
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
625 630 635 640
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
645 650 655
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
660 665 670
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp
675 680 685
Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu
690 695 700
Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys
705 710 715 720
Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser
725 730 735
Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr
740 745 750
Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr
755 760 765
Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly
770 775 780
His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile
785 790 795 800
Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly
805 810 815
Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr
820 825 830
His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Gly
835 840 845
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
850 855 860
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys
865 870 875 880
Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile
885 890 895
Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu
900 905 910
Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu
915 920 925
Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu
930 935 940
Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn
945 950 955 960
Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met
965 970 975
Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg
980 985 990
Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
995 1000 1005
<210> 119
<211> 815
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 119
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg
145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190
Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg
195 200 205
Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu
210 215 220
Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg
225 230 235 240
Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr
245 250 255
His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp
260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His
275 280 285
Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala
325 330 335
Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr
340 345 350
Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr
355 360 365
Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr
385 390 395 400
Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg
405 410 415
Trp Glu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
420 425 430
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
435 440 445
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
450 455 460
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
465 470 475 480
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
485 490 495
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
500 505 510
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
515 520 525
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
530 535 540
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
565 570 575
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
580 585 590
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
595 600 605
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
610 615 620
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
625 630 635 640
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
645 650 655
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
660 665 670
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
675 680 685
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Ala Leu Leu Leu Asp Leu Gln
690 695 700
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg
705 710 715 720
Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
725 730 735
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
740 745 750
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
755 760 765
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
770 775 780
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
785 790 795 800
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
805 810 815
<210> 120
<211> 823
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 120
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val
20 25 30
Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Cys
35 40 45
Tyr Val Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Lys
50 55 60
Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Ser
65 70 75 80
Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr
85 90 95
Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Ala Ser Met Ala Glu
100 105 110
Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro
130 135 140
His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu Gly
145 150 155 160
Glu Pro Arg Tyr Met Glu Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe Val
165 170 175
Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Tyr Glu Pro Arg Ala Arg
180 185 190
Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Arg Glu Thr Gln Lys
195 200 205
Ala Lys Gly Asn Glu Gln Ser Phe Arg Val Asp Leu Arg Thr Leu Leu
210 215 220
Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Ile Gln Val Ile
225 230 235 240
Ser Gly Cys Glu Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Gln
245 250 255
Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Cys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu
260 265 270
Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Leu Ile Thr Lys His Lys
275 280 285
Trp Glu Gln Ala Gly Glu Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly
290 295 300
Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Asn Ala Thr
305 310 315 320
Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr His His Ser Arg
325 330 335
Pro Glu Asp Lys Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro
340 345 350
Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Glu Leu Ile Gln
355 360 365
Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln
370 375 380
Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Tyr Tyr Thr
385 390 395 400
Cys His Val Tyr His Gln Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu Arg Trp
405 410 415
Glu Pro Pro Pro Ser Thr Val Ser Asn Met Ala Gly Gly Gly Gly Ser
420 425 430
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
435 440 445
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
450 455 460
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
465 470 475 480
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
485 490 495
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
500 505 510
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
515 520 525
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
530 535 540
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
545 550 555 560
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
565 570 575
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
580 585 590
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
595 600 605
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
610 615 620
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
625 630 635 640
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
645 650 655
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
660 665 670
Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
675 680 685
Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu
690 695 700
Glu Ala Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn
705 710 715 720
Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met
725 730 735
Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu
740 745 750
Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe
755 760 765
His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu
770 775 780
Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu
785 790 795 800
Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln
805 810 815
Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
820
<210> 121
<211> 823
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 121
Lys Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val
20 25 30
Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Cys
35 40 45
Tyr Val Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Lys
50 55 60
Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Ser
65 70 75 80
Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr
85 90 95
Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Ala Ser Met Ala Glu
100 105 110
Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro
130 135 140
His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu Gly
145 150 155 160
Glu Pro Arg Tyr Met Glu Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe Val
165 170 175
Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Tyr Glu Pro Arg Ala Arg
180 185 190
Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Arg Glu Thr Gln Lys
195 200 205
Ala Lys Gly Asn Glu Gln Ser Phe Arg Val Asp Leu Arg Thr Leu Leu
210 215 220
Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Ile Gln Val Ile
225 230 235 240
Ser Gly Cys Glu Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Gln
245 250 255
Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Cys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu
260 265 270
Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Leu Ile Thr Lys His Lys
275 280 285
Trp Glu Gln Ala Gly Glu Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly
290 295 300
Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Asn Ala Thr
305 310 315 320
Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr His His Ser Arg
325 330 335
Pro Glu Asp Lys Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro
340 345 350
Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Glu Leu Ile Gln
355 360 365
Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln
370 375 380
Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Tyr Tyr Thr
385 390 395 400
Cys His Val Tyr His Gln Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu Arg Trp
405 410 415
Glu Pro Pro Pro Ser Thr Val Ser Asn Met Ala Gly Gly Gly Gly Ser
420 425 430
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
435 440 445
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
450 455 460
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
465 470 475 480
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
485 490 495
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
500 505 510
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
515 520 525
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
530 535 540
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
545 550 555 560
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
565 570 575
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
580 585 590
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
595 600 605
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
610 615 620
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
625 630 635 640
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
645 650 655
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
660 665 670
Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
675 680 685
Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu
690 695 700
Glu Ala Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn
705 710 715 720
Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met
725 730 735
Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu
740 745 750
Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe
755 760 765
His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu
770 775 780
Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu
785 790 795 800
Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln
805 810 815
Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
820
<210> 122
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成肽"
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(25)
<223> /说明="该序列可以包括2-5个'Gly Gly Gly Gly Ser'重复单元"
<400> 122
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 123
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(30)
<223> /说明="该序列可以包括2-6个'Gly Gly Gly Gly Ser'重复单元"
<400> 123
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 124
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /说明="人工序列描述：合成多肽"
<400> 124
Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro
35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
100 105 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser
115 120 125
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
130

Claims (68)

1.IL2激动剂，其包含：
(a)Fc结构域；和
(b)IL2部分，其在所述Fc结构域的C端，其中所述IL2部分包含IL2结构域和IL2-Rα结构域。
2.如权利要求1的IL2激动剂，其中所述IL2结构域在所述IL2-Rα结构域的N端。
3.如权利要求1的IL2激动剂，其中所述IL2结构域在所述IL2-Rα结构域的C端。
4.如权利要求1至3中任一项的IL2激动剂，其中所述IL2部分包含IL2结构域，所述IL2结构域包含具有以下的氨基酸序列：
(a)与成熟的人IL2具有至少约90％或至少约95％的序列同一性；
(b)相较于成熟的人IL2，具有N端丙氨酸缺失；
(c)IL2变体，其相较于野生型IL2，在位置N88处具有氨基酸取代，任选地其中所述氨基酸取代为N88D；
(d)相较于野生型IL2，具有氨基酸取代C125S、C125A或C125V；或
(e)(a)、(b)、(c)和/或(d)的任何组合。
5.如权利要求1至4中任一项的IL2激动剂，其中所述IL2-Rα结构域包含或组成为与人IL2-Rα的IL2结合部分具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，任选地其中所述结合部分具有：
(a)人IL2-Rα的至少160个氨基酸、至少161个氨基酸、至少162个氨基酸、至少164个氨基酸或至少165个氨基酸；和/或
(b)人IL2-Rα的细胞外结构域的至多251个、至多240个、至多230个、至多220个、至多210个、至多200个、至多190个、至多180个或至多170个氨基酸。
6.如权利要求1至5中任一项的IL2激动剂，其中所述IL2结构域和所述IL2-Rα结构域经由接头(“IL2部分接头”)连接。
7.如权利要求6的IL2激动剂，其中所述IL2部分接头的长度为至少10个或至少15个氨基酸。
8.如权利要求6或权利要求7的IL2激动剂，其中所述IL2部分接头为甘氨酸-丝氨酸接头或包含甘氨酸-丝氨酸接头。
9.如权利要求6至8中任一项的IL2激动剂，其中所述IL2部分接头包含氨基酸序列G4S(SEQ ID NO：57)。
10.如权利要求9的IL2激动剂，其中所述IL2部分接头为氨基酸序列G4S(SEQ ID NO：57)的多聚体或包含氨基酸序列G4S(SEQ ID NO：57)的多聚体。
11.如权利要求10的IL2激动剂，其中所述多聚体包含2、3、4、5、6或更多个重复的氨基酸序列G4S(SEQ ID NO：57)。
12.如权利要求1至11中任一项的IL2激动剂，其中所述Fc结构域和所述IL2部分经由接头(“Fc-IL2接头”)连接。
13.如权利要求12的IL2激动剂，其中所述Fc-IL2接头的长度为至少5个或至少10个氨基酸。
14.如权利要求12或权利要求13的IL2激动剂，其中所述Fc-IL2接头为甘氨酸-丝氨酸接头或包含甘氨酸-丝氨酸接头。
15.如权利要求12至14中任一项的IL2激动剂，其中所述Fc-IL2接头包含氨基酸序列G4S(SEQ ID NO：57)。
16.如权利要求9的IL2激动剂，其中所述Fc-IL2接头为氨基酸序列G4S(SEQ ID NO：57)的多聚体或包含氨基酸序列G4S(SEQ ID NO：57)的多聚体。
17.如权利要求10的IL2激动剂，其中所述多聚体包含2、3、4、5、6或更多个重复的氨基酸序列G4S(SEQ ID NO：57)。
18.如权利要求1至17中任一项的IL2激动剂，其中所述Fc结构域为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。
19.如权利要求18的IL2激动剂，其中所述Fc结构域具有减少的效应功能。
20.如权利要求1至19中任一项的IL2激动剂，其为二聚体。
21.如权利要求20的IL2激动剂，其为同二聚体。
22.如权利要求20的IL2激动剂，其为异二聚体。
23.如权利要求1至22中任一项的IL2激动剂，其对所述IL2部分为二价的。
24.如权利要求1至23中任一项的IL2激动剂，其包含靶向部分。
25.如权利要求24的IL2激动剂，其中所述靶向部分在所述Fc结构域的N端。
26.如权利要求24或权利要求25的IL2激动剂，其中所述靶向部分：
(a)结合至肿瘤相关抗原；
(b)结合至肿瘤微环境抗原；
(c)结合至肿瘤反应性淋巴细胞的细胞表面分子；
(d)结合至检查点抑制剂；
(e)结合至肽-MHC复合体；
(f)为肽-MHC复合体；或
(g)结合至与自身免疫反应相关或由自身免疫反应所靶向的抗原。
27.如权利要求26的IL2激动剂，其中所述靶向部分结合至肿瘤相关抗原。
28.如权利要求27的IL2激动剂，其中所述肿瘤相关抗原为成纤维细胞活化蛋白(FAP)、腱生蛋白C的A1结构域(TNC A1)、腱生蛋白C的A2结构域(TNC A2)、纤连蛋白的额外结构域B(EDB)、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)或其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、肿瘤抗原的MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、肿瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、甲胎蛋白、E-钙黏蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig个体基因型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物(例如人乳头瘤病毒蛋白)、肿瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、c-erbB-2、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR相关的异多聚体)、CD22(B细胞受体)、CD23(低结合亲和力IgE受体)、CD30(细胞因子受体)、CD33(骨髓细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、IL-6R-(IL6受体)、CD20、MCSP、PDGFβR(β-血小板衍生的生长因子受体)、ErbB2、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、二唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮黏蛋白、gp36、TAG-72、神经胶质瘤相关抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、LAGA-1a、p53、前列腺素、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤连蛋白的额外结构域A(EDA)或额外结构域B(EDB)、或腱生蛋白C的A1结构域(TnC A1)。
29.如权利要求26或权利要求27的IL2激动剂，其中所述肿瘤相关抗原为病毒抗原。
30.如权利要求29的IL2激动剂，其中所述病毒抗原为Epstein-Barr病毒LMP-1、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、HIV gp160或HIV gp120、HPV E6、HPV E7、CMV早期膜抗原(EMA)或CMV晚期膜抗原(LMA)。
31.如权利要求26的IL2激动剂，其中所述靶向部分结合至肿瘤微环境抗原。
32.如权利要求31的IL2激动剂，其中所述肿瘤微环境抗原为细胞外基质蛋白。
33.如权利要求32的IL2激动剂，其中所述细胞外基质蛋白为黏结蛋白聚糖、乙酰肝素酶、整合素、骨桥蛋白、link、钙黏蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白型EGF、凝集素、纤连蛋白、notch、腱生蛋白、胶原蛋白和基质蛋白。
34.如权利要求26的IL2激动剂，其中所述靶向部分结合至肿瘤淋巴细胞的细胞表面分子。
35.如权利要求34的IL2激动剂，其中所述细胞表面分子为CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、LAG3、TIM3、或B7-H3。
36.如权利要求35的IL2激动剂，其中所述细胞表面分子为PD1。
37.如权利要求36的IL2激动剂，其中所述靶向部分为抗PD1抗体或其抗原结合片段。
38.如权利要求35的IL2激动剂，其中所述细胞表面分子为LAG3。
39.如权利要求26的IL2激动剂，其中所述靶向部分结合至检查点抑制剂。
40.如权利要求39的IL2激动剂，其中所述检查点抑制剂为CTLA-4、PD1、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、VISTA、PSGL1、或CHK2。
41.如权利要求40的IL2激动剂，其中所述检查点抑制剂为PD1。
42.如权利要求40的IL2激动剂，其中所述检查点抑制剂为LAG3。
43.如权利要求41的IL2激动剂，其中所述靶向部分结合至MHC-肽复合体。
44.如权利要求43的IL2激动剂，其中所述肽-MHC复合体中的肽包含肿瘤新抗原。
45.如权利要求44的IL2激动剂，其中所述肿瘤新抗原为LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMVpp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPVE7(11-20)、HPVE7(11-19)、HPVE7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪氨酸酶(369-377、371D)、或WT1(126-134)。
46.如权利要求26至45中任一项的IL2激动剂，其中所述靶向部分为抗体或其抗原结合片段。
47.如权利要求46的IL2激动剂，其中所述靶向部分为Fab。
48.如权利要求46的IL2激动剂，其中所述靶向部分为scFv。
49.如权利要求26的IL2激动剂，其中所述靶向部分为肽-MHC复合体。
50.如权利要求49的IL2激动剂，其中所述肽-MHC复合体结合至肿瘤淋巴细胞的T细胞受体。
51.如权利要求49或权利要求50的IL2激动剂，其中所述肽-MHC复合体中的肽包含肿瘤新抗原。
52.如权利要求51的IL2激动剂，其中所述肿瘤新抗原为LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMVpp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPVE7(11-20)、HPVE7(11-19)、HPVE7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪氨酸酶(369-377、371D)、或WT1(126-134)。
53.如权利要求49的IL2激动剂，其中所述肽-MHC复合体中的肽包含病毒抗原。
54.如权利要求53的IL2激动剂，其中所述病毒抗原为CMVpp65或HPV16E7。
55.如权利要求49至54中任一项的IL2激动剂，其中所述肽-MHC复合体进一步包含β2微球蛋白或其片段。
56.如权利要求55的IL2激动剂，其中所述肽MHC复合体包含I型MHC结构域。
57.如权利要求56的IL2激动剂，其中所述肽MHC复合体从N端至C端的方向包含MHC肽、接头、β2微球蛋白结构域、接头、和I型MHC结构域。
58.如权利要求57的IL2激动剂，其中连接所述MHC肽与所述β2微球蛋白结构域的所述接头包含氨基酸序列GCGGS。
59.如权利要求49至54中任一项的IL2激动剂，其中所述肽-MHC复合体不包含β2微球蛋白或其片段。
60.如权利要求59的IL2激动剂，其中所述肽MHC复合体包含II型MHC结构域。
61.一种核酸或多种核酸，其编码如权利要求1至60中任一项的IL2激动剂。
62.宿主细胞，其经工程改造以表达如权利要求1至60中任一项的IL2激动剂或权利要求61的核酸。
63.产生如权利要求1至60中任一项的IL2激动剂的方法，其包括培养如权利要求62的宿主细胞并回收由其表达的IL2激动剂。
64.药物组合物，其包含如权利要求1至60中任一项的IL2激动剂和赋形剂。
65.治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求1至60中任一项的IL2激动剂或如权利要求64的药物组合物。
66.治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用：
(a)嵌合抗原受体(“CAR”)T细胞(“CART细胞”)；和
(b)如权利要求1至26中任一项的IL2激动剂，所述IL2激动剂包含结合至所述CART细胞的T细胞受体或所述CART细胞上的另外的细胞表面分子的靶向部分，任选地其中所述靶向部分能够结合至所述CAR的细胞外结构域。
67.如权利要求65或66的方法，其进一步包括向所述受试者施用抗PD1抗体。
68.如权利要求67的方法，其中所述抗PD1抗体为MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810、或BGB-108。
CN202080088389.3A 2019-12-20 2020-12-18 新型il2激动剂及其使用方法 Pending CN115023444A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962951831P 2019-12-20 2019-12-20
US62/951,831 2019-12-20
PCT/US2020/066086 WO2021127487A2 (en) 2019-12-20 2020-12-18 Novel il2 agonists and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115023444A true CN115023444A (zh) 2022-09-06

Family

ID=74186960

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080088389.3A Pending CN115023444A (zh) 2019-12-20 2020-12-18 新型il2激动剂及其使用方法

Country Status (12)

Country Link
US (7) US12091440B2 (zh)
EP (1) EP4077397A2 (zh)
JP (1) JP2023510115A (zh)
KR (1) KR20220116513A (zh)
CN (1) CN115023444A (zh)
AU (1) AU2020407233A1 (zh)
BR (1) BR112022012112A2 (zh)
CA (1) CA3164731A1 (zh)
IL (1) IL293978A (zh)
MX (1) MX2022007754A (zh)
TW (2) TW202136316A (zh)
WO (2) WO2021127495A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110996983A (zh) * 2017-06-26 2020-04-10 巴斯德研究所 清除hiv储库并降低病毒载量的治疗

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI3558339T1 (sl) 2016-12-22 2024-05-31 Cue Biopharma, Inc. Celico T modulirajoči multimerni polipeptidi in postopki njihove uporabe
WO2018129474A1 (en) 2017-01-09 2018-07-12 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
US20200010528A1 (en) 2017-03-15 2020-01-09 Cue Biopharma, Inc. Methods for modulating an immune response
JP2023510115A (ja) 2019-12-20 2023-03-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規ｉｌ２アゴニストおよびそれらの使用方法
EP4133085A1 (en) 2020-04-10 2023-02-15 CytomX Therapeutics, Inc. Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
KR20230009872A (ko) 2020-05-12 2023-01-17 큐 바이오파마, 인크. 다량체 t-세포 조절 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법
CN115916831A (zh) * 2020-06-30 2023-04-04 Gi 医诺微新 包含抗lag-3抗体和il-2的融合蛋白及其用途
EP4211149A4 (en) 2020-09-09 2024-10-09 Cue Biopharma Inc MHC CLASS II T-CELL MODULATING MULTIMER POLYPEPTIDES FOR THE TREATMENT OF TYPE 1 DIABETES MELLITUS (T1D) AND METHODS OF USE THEREOF
BR112023018735A2 (pt) 2021-03-16 2023-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Construtos de citocinas ativáveis mascarados e composições e métodos relacionados
KR20240035845A (ko) 2021-07-19 2024-03-18 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Il12 수용체 효능제 및 그의 사용 방법
WO2023201254A1 (en) * 2022-04-14 2023-10-19 Cue Biopharma, Inc. T-cell engaging polypeptides and methods of use thereof
US20230382969A1 (en) * 2022-05-27 2023-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interleukin-2 proproteins and uses thereof
WO2024136899A1 (en) * 2022-12-21 2024-06-27 Synthorx, Inc. Cancer therapy with il-2 conjugates and chimeric antigen receptor therapies
US20240270836A1 (en) 2023-01-13 2024-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il12 receptor agonists and methods of use thereof

Family Cites Families (134)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
DE69309472T2 (de) 1992-01-23 1997-10-23 Merck Patent Gmbh, 64293 Darmstadt Fusionsproteine von monomeren und dimeren von antikörperfragmenten
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6967092B1 (en) 1996-10-25 2005-11-22 Mc Kearn John P Multi-functional chimeric hematopoietic receptor agonists
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
GB9720054D0 (en) 1997-09-19 1997-11-19 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6955807B1 (en) 1998-05-15 2005-10-18 Bayer Pharmaceuticals Corporation IL-2 selective agonists and antagonists
GB9824437D0 (en) 1998-11-06 1999-01-06 Ylo Herttuala Seppo Gene therapy
US6348192B1 (en) 1999-05-11 2002-02-19 Bayer Corporation Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells
US6689353B1 (en) 2000-06-28 2004-02-10 Bayer Pharmaceuticals Corporation Stabilized interleukin 2
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
WO2003048334A2 (en) 2001-12-04 2003-06-12 Merck Patent Gmbh Immunocytokines with modulated selectivity
US8895020B2 (en) 2002-04-19 2014-11-25 Washington University Single chain trimers and uses therefor
ES2551682T3 (es) 2002-11-08 2015-11-23 Ablynx N.V. Anticuerpos de dominio simple dirigidos contra factor de necrosis tumoral-alfa y usos para los mismos
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
CA2527020A1 (en) 2003-07-01 2005-01-13 Celltech R & D Limited Modified antibody fab fragments
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2005007121A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides
WO2005049094A1 (en) 2003-11-13 2005-06-02 Advantagene, Inc. A mixed complementary viral vector for gene therapy
AU2005282700A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
AU2006207987B2 (en) 2005-01-27 2011-09-15 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Methods for treating renal cell carcinoma
EP1870459B1 (en) 2005-03-31 2016-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US9931413B2 (en) 2005-04-06 2018-04-03 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Tetrameric cytokines with improved biological activity
PL3263581T3 (pl) 2005-05-17 2021-05-04 University Of Connecticut Kompozycje i sposoby immunomodulacji w organizmie
US8518697B2 (en) 2006-04-04 2013-08-27 Washington University Single chain trimers and uses therefor
US20070269422A1 (en) 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
US8992937B2 (en) 2006-08-28 2015-03-31 Washington University Disulfide trap MHC class I molecules and uses therefor
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
GB0815216D0 (en) 2008-08-21 2008-09-24 Asterion Ltd Interleukin
CA2749539C (en) 2009-01-21 2022-07-19 Amgen Inc. Compositions and methods comprising interleukin-2 mutants for treating inflammatory and autoimmune diseases
KR101747103B1 (ko) 2009-06-26 2017-06-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
WO2011020783A2 (en) 2009-08-17 2011-02-24 Roche Glycart Ag Targeted immunoconjugates
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
WO2011123683A2 (en) 2010-04-02 2011-10-06 University Of Rochester Protease activated cytokines
CU23923B1 (es) 2010-11-12 2013-07-31 Ct De Inmunología Molecular Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
EP2655409A4 (en) 2010-12-22 2015-07-01 Univ Leland Stanford Junior SUPERAGONISTS AND ANTAGONISTS OF INTERLEUKIN-2
UA117294C2 (uk) 2011-02-10 2018-07-10 Рош Глікарт Аг Імунокон'югат
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
WO2013184938A2 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Alkermes. Inc. Fusion polypeptides comprising mucin-domain polypeptide linkers
SG10201800535XA (en) 2012-08-07 2018-02-27 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
BR112015012385A2 (pt) 2012-11-28 2019-08-27 Zymeworks Inc constructo de polipeptídeo de ligação de antígeno isolado, polinucleotídeo isolado ou conjunto de polinucleotídeos isolados, vetor ou conjunto de vetores, célula isolada, composição farmacêutica, uso do constructo, método para tratar um sujeito tendo uma doença ou distúrbio ou câncer ou doença vascular, método para inibir, reduzir ou bloquear um sinal dentro de uma célula, método para obter o constructo, método para preparar o constructo, meio de armazenamento legível por computador, método implementado por computador e método para produzir um constructo de polipeptídeo de ligação de antígeno bi-específico
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
US9580486B2 (en) 2013-03-14 2017-02-28 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
EP2970435B1 (en) 2013-03-15 2020-08-12 Eli Lilly and Company Methods for producing fabs and bi-specific antibodies
GB2527075A (en) 2014-03-17 2015-12-16 Daassist As Percutaneous system, devices and methods
HUE048076T2 (hu) 2014-06-18 2020-07-28 Albert Einstein College Of Medicine Syntac polipeptidek és alkalmazásaik
IL289475B2 (en) * 2014-07-21 2023-10-01 Delinia Inc Molecules that activate T cells are selectively regulated for the treatment of autoimmune diseases
MA40094B1 (fr) 2014-08-06 2022-05-31 Univ Miami Protéines de fusion de l'interleukine-2/récepteur alpha de l'interleukine-2 et procédés d'utilisation
WO2016025645A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and an immune checkpoint blocker
EP3233920B1 (en) 2014-12-19 2020-08-26 Alkermes, Inc. Single chain fc fusion proteins
CA2981312C (en) 2015-03-30 2023-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to fc gamma receptors
JP7299021B2 (ja) * 2015-09-11 2023-06-27 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 生体関連の直交性サイトカイン／受容体ペア
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
AU2017213659B2 (en) 2016-02-05 2024-04-18 Washington University Compositions and methods for targeted cytokine delivery
US11225520B2 (en) 2016-02-16 2022-01-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Immunotherapy compositions and methods
WO2017165464A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
CN115073581A (zh) 2016-05-04 2022-09-20 美国安进公司 用于扩增t调节性细胞的白细胞介素-2突变蛋白
EP3458485B1 (en) 2016-05-19 2021-12-29 The General Hospital Corporation Tethered interleukin-2 to its receptor il-2rbeta, a platform to enhance natural killer and regulatory t cell activity
WO2017220990A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 antibodies
MX2019001185A (es) 2016-07-29 2019-10-21 Juno Therapeutics Inc Polipeptidos inmunomoduladores y composiciones y metodos relacionados.
CN110167957A (zh) 2016-11-08 2019-08-23 德里尼亚公司 用于治疗自身免疫疾病的il-2变体
WO2018112854A1 (zh) 2016-12-22 2018-06-28 郑均思 一种植物纤维清洗剂
WO2018112852A1 (zh) 2016-12-22 2018-06-28 深圳配天智能技术研究院有限公司 基于梯形图编程语言的数控装置、数控系统及其调试方法
SI3558339T1 (sl) 2016-12-22 2024-05-31 Cue Biopharma, Inc. Celico T modulirajoči multimerni polipeptidi in postopki njihove uporabe
CN110234355B (zh) 2017-02-01 2021-11-09 浙江时迈药业有限公司 单体人IgG1 Fc和双特异性抗体
WO2018170288A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
US20200010528A1 (en) 2017-03-15 2020-01-09 Cue Biopharma, Inc. Methods for modulating an immune response
CN107082812B (zh) 2017-03-29 2018-11-13 上海科医联创生物科技有限公司 一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用
RS63663B1 (sr) 2017-04-03 2022-11-30 Hoffmann La Roche Imunokonjugati anti-pd-1 antitela sa mutantom il-2 ili sa il-15
WO2018184965A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates of il-2 with an anti-pd-1 and tim-3 bispecific antibody
CN111010866A (zh) 2017-05-24 2020-04-14 潘迪恩治疗公司 靶向免疫耐受性
US20210277085A1 (en) 2017-05-24 2021-09-09 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
EP3630162A1 (en) 2017-05-24 2020-04-08 Novartis AG Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use
CA3102086A1 (en) * 2017-06-06 2018-12-13 Relinia, Inc. Single-chain tnf receptor 2 agonist fusion proteins
CN111201035A (zh) 2017-06-19 2020-05-26 梅迪塞纳医疗股份有限公司 Il-2超激动剂、激动剂及其融合体的用途和方法
CN110914295B (zh) 2017-06-28 2024-08-09 里珍纳龙药品有限公司 抗人乳头瘤病毒(hpv)抗原结合蛋白及其使用方法
EP3648786A4 (en) 2017-07-03 2021-12-15 Torque Therapeutics, Inc. FUSION MOLECULES TARGETING IMMUNE REGULATORY CELLS AND THEIR USES
JP2020534352A (ja) 2017-09-07 2020-11-26 キュー バイオファーマ，インコーポレーテッド コンジュゲーション部位を有するｔ細胞調節多量体ポリペプチド及びその使用方法
AU2018372167B2 (en) 2017-11-21 2023-12-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Partial agonists of interleukin-2
SG11202003965VA (en) 2017-12-06 2020-06-29 Pandion Therapeutics Inc Il-2 muteins and uses thereof
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
JP2021505156A (ja) 2017-12-06 2021-02-18 パンディオン・オペレーションズ・インコーポレイテッド 標的化免疫寛容
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
MX2020006322A (es) 2017-12-19 2020-09-18 Xencor Inc Proteinas de fusion il-2 fc modificadas.
WO2019168791A2 (en) 2018-02-28 2019-09-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Single-chain il-2/antibody fusions that selectively activate regulatory t cells
JP7515412B2 (ja) 2018-03-09 2024-07-12 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッド 新規のサイトカインプロドラッグ
CA3094112A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Bristol-Myers Squibb Company Interleukin-2/interleukin-2 receptor alpha fusion proteins and methods of use
MX2020010910A (es) 2018-04-18 2021-02-09 Xencor Inc Proteinas de fusion heterodimericas dirigidas a pd-1 que contienen proteinas de fusion il-15 / il-15ra fc y dominios de union al antigeno pd-1 y usos de los mismos.
CU24554B1 (es) 2018-05-07 2021-11-04 Ct Inmunologia Molecular Proteínas de fusión compuestas por una muteína de interleucina 2 e interferón tipo 1
US20210130430A1 (en) 2018-05-14 2021-05-06 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof
AU2019271148B2 (en) 2018-05-14 2023-07-06 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
MX2020014290A (es) 2018-06-22 2021-08-05 Cugene Inc Farmacos bioactivables a base de citoquinas y métodos de usos de los mismos.
BR112020025287A2 (pt) 2018-06-25 2021-03-09 University Of Washington Projeto de novo de miméticos de interleucina potentes e seletivos
US20220275043A1 (en) * 2018-07-17 2022-09-01 Massachusetts Institute Of Technology Soluble multimeric immunoglobulin-scaffold based fusion proteins and uses thereof
JP7550745B2 (ja) 2018-07-24 2024-09-13 バイオエヌテック エスエー Ｉｌ２アゴニスト
US20220041713A1 (en) 2018-09-18 2022-02-10 Pandion Operations, Inc Targeted immunotolerance
JP2022501009A (ja) 2018-09-21 2022-01-06 イノベント バイオロジックス （スウツォウ） カンパニー，リミテッド 新規インターロイキン２およびその使用
EP3660039A1 (en) 2018-11-30 2020-06-03 Philogen S.p.A. Il2 immunoconjugates
WO2020070150A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Philogen S.P.A Il2 immunoconjugates
MA53862A (fr) 2018-10-12 2022-01-19 Xencor Inc Protéines de fusion fc d'il-15/il-15ralpha ciblant pd-1 et utilisations dans des polythérapies faisant intervenir celles-ci
EP3873923A4 (en) * 2018-10-31 2023-02-08 Delinia, Inc. MULTIVALENT REGULATORY T-CELL MODULATORS
JP2022514023A (ja) * 2018-12-19 2022-02-09 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 操作されたサイトカイン受容体対を使用して腫瘍浸潤リンパ球を拡大培養する方法及びその使用
WO2020132368A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides with conjugation sites and methods of use thereof
WO2020132136A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Cue Biopharma, Inc. Multimeric t-cell modulatory polypeptides and methods of use thereof
MX2021007479A (es) 2018-12-19 2021-09-23 Cue Biopharma Inc Polipeptidos multimericos moduladores de linfocitos t y metodos de uso de estos.
WO2020136060A1 (en) * 2018-12-28 2020-07-02 F. Hoffmann-La Roche Ag A peptide-mhc-i-antibody fusion protein for therapeutic use in a patient with amplified immune response
JP2022533702A (ja) 2019-05-20 2022-07-25 パンディオン・オペレーションズ・インコーポレイテッド ＭＡｄＣＡＭ標的化免疫寛容
CA3136992A1 (en) 2019-05-24 2020-12-03 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited Il-2 compositions and methods of use thereof
WO2020259536A1 (zh) 2019-06-24 2020-12-30 南京金斯瑞生物科技有限公司 单克隆抗体-细胞因子融合蛋白二聚体及其应用
CN114450297A (zh) 2019-07-12 2022-05-06 普罗维瓦疗法香港有限公司 Il-2组合物及其使用方法
CA3150978A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Cytimm Therapeutics, Inc. Modified interleukin 2 (il-2) polypeptides, conjugates and uses thereof
KR20220050168A (ko) 2019-08-19 2022-04-22 팬디온 오퍼레이션스, 인코포레이티드 Pd-1 작용제로 표적된 면역관용
WO2021055568A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited Il-2 compositions and methods of use thereof
KR20220115611A (ko) 2019-12-13 2022-08-17 큐진 인크. 사이토카인-기반 생체활성 약물 및 이의 사용 방법
JP2023510115A (ja) 2019-12-20 2023-03-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規ｉｌ２アゴニストおよびそれらの使用方法
WO2021168079A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a cd39 effector
EP4107189A4 (en) 2020-02-21 2024-07-03 Pandion Operations Inc TISSUE-TARGETED IMMUNOTOLERANCE WITH PD-1 AGONISTS OR IL-2 MUTEINS
JP2023532273A (ja) 2020-06-24 2023-07-27 メディシナ セラピューティクス インコーポレイテッド 二重特異性スーパーカイン及びその使用
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110996983A (zh) * 2017-06-26 2020-04-10 巴斯德研究所 清除hiv储库并降低病毒载量的治疗

Also Published As

Publication number Publication date
MX2022007754A (es) 2022-07-19
US20210188934A1 (en) 2021-06-24
US20220362395A1 (en) 2022-11-17
TW202136316A (zh) 2021-10-01
IL293978A (en) 2022-08-01
US20230053563A1 (en) 2023-02-23
WO2021127487A3 (en) 2021-07-22
US20230331800A1 (en) 2023-10-19
WO2021127487A2 (en) 2021-06-24
EP4077397A2 (en) 2022-10-26
WO2021127495A1 (en) 2021-06-24
CA3164731A1 (en) 2021-06-24
AU2020407233A1 (en) 2022-08-18
US20230312665A1 (en) 2023-10-05
BR112022012112A2 (pt) 2022-09-06
US11725034B2 (en) 2023-08-15
JP2023510115A (ja) 2023-03-13
US20210187027A1 (en) 2021-06-24
US20220220182A1 (en) 2022-07-14
KR20220116513A (ko) 2022-08-23
US12091440B2 (en) 2024-09-17
TW202136317A (zh) 2021-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11725034B2 (en) IL2 agonists and methods of use thereof
WO2014207064A1 (en) Bispecific molecules capable of specifically binding to both ctla-4 and cd40
US20230110958A1 (en) Il27 receptor agonists and methods of use thereof
US20230051304A1 (en) Il12 receptor agonists and methods of use thereof
US11673930B2 (en) IL10 agonists and methods of use thereof
CN118159555A (zh) Il12受体激动剂及其使用方法
WO2024151978A1 (en) Il12 receptor agonists and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination