TW202136316A - 新穎之il2促效劑及其使用方法(一) - Google Patents

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家曦 吳
彤 張
波特拉 瑪麗亞 莫利納
艾瑞克 史密斯
家楊 林
湯瑪斯 米格赫
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美商再生元醫藥公司
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Abstract

本發明揭露內容是有關於治療概況獲得增進的IL2促效劑。

Description

新穎之IL2促效劑及其使用方法(一)
本發明揭露內容是有關於治療概況獲得增進的IL2促效劑。
1.        相關申請案的交叉引用
本申請案請求於2019年12月20日提申之美國臨時申請案第62/951,831號的優先權權益，該件臨時申請案的內容以全文引用的方式併入本文。 2.        序列表
本申請案含有序列表，該序列表已經按ASCII格式以電子方式遞交，並因而在此以全文引用的方式併入。該份ASCII副本創建於2020年12月17日，命名為RGN-006A-TW_SL，且大小為159,462位元組。 3.        背景
介白素2(IL-2或IL2)是一種主要由CD4+ 輔助T細胞產生的多能細胞激素。它刺激T細胞的增生和分化、誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的生成以及周邊血液淋巴細胞分化成細胞毒性細胞和受淋巴激素活化的殺手(LAK)細胞、促使T細胞表現細胞激素和細胞溶解分子、促進B細胞的增生和分化以及B細胞合成免疫球蛋白，並刺激自然殺手(NK)細胞的生成，增生和活化(參見Waldmann, 2009, Nat Rev Immunol 6:595-601與Malek, 2008, Annu Rev Immunol 26:453-79)。
IL2有三種不同的受體：高親和力受體，中等親和力受體和低親和力受體。高親和力受體具有三個次單位：介白素2受體α(IL-2Rα；CD25)、介白素2受體β(IL-2Rβ；CD122)，以及介白素2受體γ(IL-2Rγ；CD132；共用γ鏈)。低親和力受體是IL-2Rα，其為一個55 kD的多肽(p55)，在T細胞活化後出現且原先被稱為Tac(有關T活化)抗原。IL-2Rα以約10-8 M的KD 結合IL2。IL2結合至僅表現IL-2Rα的細胞不會導致任何可偵測到的生物反應。
中等親和力受體是由IL-2Rβ和IL-2Rγ組成。IL-2Rβ是第I型細胞激素受體家族的一員，特徵在於兩個半胱胺酸/WSXWS模體(SEQ ID NO:1)。IL-2Rγ是一個64 kD的多肽，也被稱為共用γ鏈，因為它是由一些細胞激素受體所共有，包括介白素-4和介白素-7的受體。中等親和力受體還媒介了介白素15(IL-15或IL15)信號傳導。
靜止的免疫細胞被認為只會表現中等親和力受體。在抗原受體媒介的免疫細胞(例如靜止T細胞)活化後，IL-2Rα迅速地被表現。一旦IL-2Rα結合IL2，它接著相繼接合IL-2Rβ和IL-2Rγ。IL-2Rαβγ複合體與IL2結合會導致信號轉導穿過STAT5和IL2媒介的生長刺激，尤其是破壞受病毒感染的細胞和腫瘤細胞之效應子T細胞的生長刺激。
除了對效應子T細胞的刺激作用外，IL2還在T細胞中媒介活化誘導的細胞死亡(AICD)(Lenardoet al. , 1991, Nature 353:858-61)。AICD是一個過程，透過這個過程，受到完全活化的T細胞經歷計畫性細胞死亡，不僅對已生成的正常自體抗原不具耐受性，對持久性抗原(諸如腫瘤抗原)也不具耐受性。
IL2也參與周邊CD4+ CD25+ 調節性T(Treg )細胞的維持(參見例如Fontenotet al. , 2005, Nature Immunol 6:1142-51)，這也被稱為抑制性T細胞。它們抑制效應子T細胞破壞其(自體)目標，無論是透過細胞-細胞接觸藉由抑制T細胞輔助與活化，或是透過免疫抑制性細胞激素(諸如IL-10或TGFβ)釋放。已證實，Treg 細胞的耗竭會提高IL2誘導的抗腫瘤免疫力(Imaiet al. , 2007, Cancer Sci 98:416-23)。
由於IL2的多效作用，它並不是抑制腫瘤生長的最佳選項。IL2使用作為抗腫瘤藥劑已經因為嚴重的毒性而受到限制，這個毒性伴隨著腫瘤反應所需的劑量。Proleukin®(由Prometheus Laboratories, San Diego, Calif.販售)是一種重組形式的IL2，經核准用於治療轉移性黑色素瘤和轉移性腎癌，但其副作用非常嚴重，因此僅建議使用在有重症照護的醫院環境。接受高劑量IL2治療的患者經常會遭受到嚴重的心血管、肺臟、腎臟、肝臟、胃腸、神經學、皮膚，血液學和全身性不良事件，需要加強監測和住院管理。IL2療法的主要副作用是血管滲漏症候群(VLS)，導致組織間隙液在肺臟和肝臟中積聚，從而造成肺水腫和肝臟損傷。除了停用IL2外，沒有其他可用於VLS的治療方法。已經在患者中測試了低劑量IL2方案以避免VLS，然而代價為治療效果欠佳。已經證實IL2誘導的肺水腫是因為IL2直接結合至肺臟內皮細胞所引起的，肺臟內皮細胞表現低至中等程度的功能性高親和力IL2受體(Krieget al. , 2010, Proc Nat Acad Sci USA 107:11906-11)。
為了降低IL2癌症療法的毒性，已經生產出多種IL2變體。主要的方法是生成IL2分子，該分子允許IL2結合至中等親和力受體，但不利於IL2與CD25締合(因此稱為偏好CD122的(CD122-biased))。這種方法的原理有兩個方面。首先，CD25在Treg 細胞上顯著表現，過量的CD25在此可以充當槽(sink)，從而將IL2帶離效應子T細胞。其次，媒介VLS的內皮細胞表現CD25。理論上，減少結合至CD25(IL-2Rα)可以將IL2信號重定向至效應子T細胞，從而增進抗腫瘤效力，並降低VLS，從而降低毒性。得到偏好CD122的IL2調配物的策略包括，例如定向CD122的IL2複合體(其中抗IL2單株抗體隱匿了CD25結合位點)、在CD25結合位點具有突變的IL2突變蛋白，以及在CD25結合位點處帶有聚乙二醇(PEG)基團的IL2。Onur and Arenas-Ramirez, 2019, Swiss Med Wkly 149:w14697。
儘管在開發用於癌症療法之CD122定向IL2療法的領域中已被廣為接受，但出乎意料發現到，這樣的分子就癌症療法來說治療指數欠佳，並且需要較高的毒性劑量才能產生適度的抗癌作用。
因此，本技藝中需要治療效力和安全性概況獲得改善的新穎IL2療法。
4.        摘要
本發明源自有關影響抗腫瘤功效之IL2分子的活性的許多發現。如本文中所示，即使在導致明顯毒性的高劑量下，定向CD122的IL2分子意外地僅具有適度的抗腫瘤功效。這可以由許多其他發現來解釋。首先，發明人發現，儘管定向CD122的IL2分子被設計成相對於Treg細胞偏好擴增NK和CD8+ T細胞，它們主要在血液和脾臟中這樣，但在腫瘤中的程度要小得多，相反地，野生型IL2偏好在腫瘤中擴增CD8+ T細胞，但在周邊並不會。另外，透過偏好CD122的IL2分子所擴增之CD8+ T細胞大多是CD44+ CD62L+ 中央記憶樣T細胞且缺乏對腫瘤細胞的特異性，而野生型IL-2可擴增CD44+ CD62L- 效應子CD8+ T細胞。因此，相對於野生型IL2來說，這些分子的抗腫瘤功效被降低了。此外，發明人已經發現到，腫瘤Treg細胞對IL2的反應性不如血液和脾臟Treg細胞。因而，可以藉由將這種非CD122定向形式的IL2引導至腫瘤來減輕非CD122定向形式的IL2之癌症治療的不利影響，其中Treg對IL2的反應較小，且IL2偏好擴增CD8+ T細胞。
基於前述發現，發明人已經開發出IL2分子(在本文中稱為IL2促效劑)，咸信其比目前正在開發用於治療癌症之定向CD122的IL2分子更為有效。本發明的IL2促效劑不定向至CD122，並且在一些情況下，具有減少或最少的CD122結合。本發明的IL2促效劑具有一個IL2部分和(1)視情況選用的腫瘤靶向部分，及/或(2)視情況選用的多聚化(例如二聚化)部分及/或(3)視情況選用的穩定化部分。腫瘤靶向部分(例如抗體的抗原結合結構域(「ABD」))可以例如結合至存在於腫瘤表面上，腫瘤微環境及/或腫瘤反應性淋巴細胞上的目標分子(例如，腫瘤相關抗原)。
可用於本發明之IL2促效劑的IL2部分描述於第6.3節中。
可用於本發明之IL2促效劑的靶向部分描述於第6.4節中。
可用於本發明之IL2促效劑的多聚化部分描述於第6.5節中。
可用於本發明之IL2促效劑的穩定化部分描述於第6.6節中。
本發明之IL2促效劑的各種例示性構形描述於下文特定具體例1至166，199至258和267至322中。
可用於連接本發明之IL2促效劑的不同組分的連接子描述於第6.7節中。
本發明進一步提供編碼本發明之IL2促效劑的核酸。編碼IL2促效劑的核酸可以是單個核酸(例如，編碼IL2促效劑之所有多肽鏈的載體)或複數個核酸(例如，兩個或更多個編碼IL2促效劑之不同多肽鏈的載體)。本發明進一步提供被工程改造成表現本發明之核酸和IL2促效劑的宿主細胞和細胞株。本發明進一步提供生產本發明之IL2促效劑的方法。例示性的核酸、宿主細胞，和細胞系，以及生產IL2促效劑的方法描述於下文第6.8節和特定具體例167至169，259至261和323至325中。
本發明進一步提供包含本發明之IL2促效劑的醫藥組成物。例示性的藥物組成物描述於下文第6.9節和特定具體例170，262和326中。
本文還提供使用本發明之IL2促效劑和醫藥組成物，例如用於治療癌症和免疫病症的方法。例示性方法描述於第6.10節中。本發明之IL2促效劑可用於組合療法中，例如作為CART療法的輔助。例示性組合療法描述於6.11中。本發明之治療方法的特定具體例描述於下文特定具體例171至198，263至266和327至346中。
6.        定義 6.1  定義
約、近似：於通篇說明書中，在數字前使用術語「約」」「近似」或類似用語來表示該數字不一定是準確的(例如，考慮到分數，測量精準度及/或精確度的偏差，時間等)。應理解，揭示其中X是數字的「大約X」或「近似X」也揭示了「X」。因此，例如揭示其中一個序列與另一個序列具有「約X%序列一致性」的具體例也揭示其中該序列與另一個序列具有「X%序列一致性」的具體例。
及、或：除非另有說明，否則「或」連接詞應按其正確的含義作為布林邏輯運算子來使用，含括在擇一中選定特徵(A或B，其中選定A是與B互斥的)，並且特徵選定同時存在(A或B，同時選擇了A和B)。在文中的某些地方，術語「及/或」用於相同目的，不應解釋為暗示「或」是指互斥的選擇。
抗原結合結構域或ABD：如本文所用，術語「抗原結合結構域」或「ABD」是指靶向部分能夠與目標分子特異性，非共價且可逆結合的部分。
締合的(associated)：在IL2促效劑或其組分的上下文中，術語「締合的」(例如，靶向部分，諸如抗體)是指兩個或更多個多肽鏈之間的功能性關係。特別地，術語「締合的」是指兩個或更多個多肽彼此締合，例如經由分子交互作用非共價締合或透過一或多個二硫鍵或化學交互鍵聯非共價締合，從而產生功能性IL2促效劑。可能存在於本發明IL2促效劑中之締合的實例包括(但不限於) Fc區中同二聚或異二聚Fc結構域之間的締合，Fab或scFv中VH和VL區之間的締合、Fab中CH1與CL之間的締合，以及域經置換Fab中CH3和CH3之間的締合。
二價：如本文所用，術語「二價」是指IL2促效劑中的IL2部分及/或靶向部分，表示分別具有兩個IL2部分及/或靶向部分的IL2促效劑。通常，對IL2部分及/或靶向部分為二價的IL2促效劑是二聚體(同二聚體或異二聚體)。
癌症：術語「癌症」是指特徵在於異常細胞不受控制(且通常迅速)生長的疾病。癌細胞可以局部擴散，也可以透過血流和淋巴系統擴散到身體的其他部位。本文描述了各種癌症的實例，且包括但不限於乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、腎上腺癌、自律神經神經節癌、膽道癌、骨癌、子宮內膜癌、眼癌、輸卵管癌、生殖道癌、大腸癌、腦膜癌、食道癌、腹膜癌、垂體癌、陰莖癌、胎盤癌、胸膜癌、唾液腺癌、小腸癌、胃癌、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、上呼吸消化道癌、泌尿道癌、陰道癌、外陰癌、淋巴瘤、白血病，肺癌與類似者。
互補決定區或CDR：如本文所用，術語「互補決定區」或「CDR」是指抗體可變區內賦予抗原特異性和結合親和力的胺基酸序列。大體上，每個重鏈可變區有三個CDR(CDR-H1、CDR-H2、HCDR-H3)，而每個輕鏈可變區有三個CDR(CDR1-L1、CDR-L2、CDR-L3)。可用於識別CDR邊界的例示性慣例包括，例如Kabat定義、Chothia定義，ABM定義和IMGT定義。參見，例如Kabat, 1991, “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” National Institutes of Health, Bethesda, Md. (Kabat編號方案)；Al-Lazikaniet al. , 1997, J. Mol. Biol. 273:927-948 (Chothia編號方案)；Martinet al. , 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (ABM編號方案)；與Lefrancet al. , 2003, Dev. Comp. Immunol. 27:55-77 (IMGT編號方案)。公用數據庫也可用於鑑定抗體內的CDR序列。
EC50：術語「EC50」是指分子(諸如IL2促效劑)的半最大有效濃度，該濃度在指定的暴露時間後引起基線和最大值之間的一半反應。EC50本質上代表抗體或IL2促效劑在可觀察到其最大作用之50%的濃度。在某些具體例中，EC50值等於在如第7.1.2節中所述分析中，提供半最大STAT5活化的IL2促效劑濃度。
表位：表位或抗原決定位(antigenic determinant)是被如本文所述之抗體或其他抗原結合部分所辨識的抗原(例如目標分子)的一部分。表位可以是線性的或構形性的。
Fab：在本發明的靶向部分上下文中，術語「Fab」是指一對多肽鏈，第一個多肽鏈在第一恆定結構域(本文稱為C1)N端之抗體的可變重(VH)結構域，而第二個多肽鏈在第二恆定結構域(本文稱為C2)N端包含能夠與第一恆定結構域配對之抗體的可變輕(VL)結構域。在天然抗體中，VH在重鏈的第一恆定結構域(CH1)的N端，而VL在輕鏈的恆定結構域(CL)的N端。可以根據天然位向來排列本發明的Fab，或者可以包括有助於VH和VL正確配對的結構域置換或交換。例如，可以用CH3-結構域對來取代Fab中的CH1和CL結構域對，以促進異二聚體分子中經修飾Fab鏈正確配對。也可以反轉CH1和CL，以便CH1附接到VL，而CL附接到VH，這種構形通常稱為Crossmab。
Fc結構域和Fc區：術語「Fc結構域」是指重鏈的一部分，其與另一條重鏈的相應部分配對。術語「Fc區」是指藉由兩個重鏈Fc結構域締合形成的基於抗體的結合分子的區域。Fc區內的兩個Fc結構域可能相同或彼此不同。在天然抗體中，Fc結構域通常是相同的，但是一個或兩個Fc結構域可以受到有利地修飾而允許異二聚化，例如經由杵入臼交互作用(knob-in-hole interaction)。
宿主細胞：如本文所用，術語「宿主細胞」是指本發明的核酸已被引入其中的細胞。術語「宿主細胞」和「重組宿主細胞」在本文可交替使用。應理解，這些術語是指特定的主體細胞以及此一細胞的後代或潛在後代。由於突變或環境影響，某些修飾可能會在後代中發生，因此這樣的後代實際上可能與親代細胞不同，但仍包含在本文所用術語的範疇內。典型的宿主細胞是真核宿主細胞，諸如哺乳動物宿主細胞。例示性真核宿主細胞包括酵母和哺乳動物細胞，例如脊椎動物細胞，諸如小鼠、大鼠，猴或人類細胞株，例如HKB11細胞、PER.C6細胞，HEK細胞或CHO細胞。
IL2突變蛋白：是一種具有IL2活性的變體IL2分子。該變體可以是IL2融合蛋白(例如，融合至IL-2Rα的IL2)及/或突變體IL2，例如相較於野生型IL2帶有一個或更多個胺基酸置換。與野生型IL2相比，IL2突變蛋白可以具有經改變的功能(例如受體結合、親和力，細胞激素活性)及/或經改變的藥物動力學。儘管在本發明IL2促效劑的上下文中，術語「IL2突變蛋白」有時是指IL2分子(和相締合的連接子部分)的非靶向組分，並應理解，除非上下文另有指明，否則術語「IL2突變蛋白」含括具有或不具有靶向部分且具有或不具有多聚化部分的IL2分子。
主要組織相容性複合體和MHC：這些術語是指天然存在的MHC分子，MHC分子的個別鏈(例如第I類MHC α(重)鏈、β2微球蛋白、第II類MHC α鏈和第II類MHC β鏈)，MHC分子的此等鏈的個別次單位(例如α1，α2及/或第I類MHC α鏈、第II類MHC α鏈 α1-α2次單位，第II類MHC β鏈的β1-β2次單位)以及其部分(例如肽結合部分，例如肽結合溝)，突變體及各種衍生物(包括融合蛋白)，其中這樣的部分，突變體和衍生物保有展示抗原肽供T細胞受體(TCR)(例如抗原特異性TCR)辨識的能力。第I類MHC分子包括肽結合溝，其由重鏈的α1和α2結構域所形成，可容納約8-10個胺基酸的肽。儘管兩類MHC均結合肽內約9個胺基酸的核心(例如，5至17個胺基酸)，但第II類MHC肽結合槽(第II類MHC α多肽的α1結構域與第II類MHC β多肽的β1結構域締合)的開放端性質允許更寬範圍的肽長度。結合肽的第II類MHC的長度通常在13至17個胺基酸之間變化，儘管更短或更長的長度並不罕見。因而，肽可能在第II類MHC肽結合溝內移動，從而改變了在任何給定時間是哪9員直接在溝內。本文使用了特定MHC變體的常規鑑定。該術語含括「人類白血球抗原」或「HLA」。
單價：如提到IL2促效劑之IL2部分及/或靶向部分時所用，術語「單價」表示僅分別具有單個IL2部分及/或靶向部分的IL2促效劑。通常，對於IL2部分及/或靶向部分為單價的IL2促效劑是單體或異二聚體。
可操作地連接：術語「可操作地連接」如本文所用是指其中兩個或更多個區域相連結之多肽鏈的兩個或更多個區域之間的功能性關係，以便產生功能性多肽，或兩個或更多個核酸序列為，例如產生兩個多肽組分的框內融合或將調節序列連接至編碼序列。
肽-MHC複合體、pMHC複合體、溝中肽：一種(ⅰ)MHC結構域(例如人類MHC分子或其部分(例如其肽-結合溝，以及例如其細胞外部分)、(ⅱ)抗原肽，和視情況(ⅲ)β2微球蛋白結構域(例如人類β2微球蛋白或其部分)，其中該MHC結構域，抗原肽和視情況β2微球蛋白結構域以一種允許特異性結合至T細胞受體的方式複合。在一些具體例中，pMHC複合體包含至少人類第I類HLA/人類β2微球蛋白分子及/或人類第II類HLA分子的細胞外結構域。
單鏈Fv或scFv：如本文所用，術語「單鏈Fv」或「scFv」係指包含抗體的VH結構域和VL結構域的多肽鏈，其中這些結構域存在於單個多肽鏈中。
特異性地(或選擇性地)結合：如本文所用，術語「特異性地(或選擇性地)結合」表示靶向部分(例如抗體或其抗原結合結構域(「ABD」))與目標分子形成複合體，該複合體在生理條件下是相對穩定的。特異性結合的特徵可在於Kd 為約5×10-2 M或更小(例如小於5×10-2 M、小於10-2 M、小於5×10-3 M、小於10-3 M、小於5x10-4 M、小於10-4 M、小於5x10-5 M、小於10-5 M、小於5x10-6 M、小於10-6 M、小於5x10-7 M、小於10-7 M、小於5x10-8 M、小於10-8 M、小於5x10-9 M、小於10-9 M或小於10-10 M)。用於確定抗體或抗體片段(例如IL2促效劑或組分靶向部分)對目標分子的結合親和力的方法是本技藝中眾所周知的，且包括例如平衡透析、表面電漿共振(例如Biacore分析)、螢光活化細胞分選(FACS)結合分析與類似方法。然而，包含特異性地結合來自一個物種的目標分子的靶向部分或其ABD的本發明IL2促效劑可能與來自一個或更多個其他物種的目標分子具有交叉反應性。
個體：術語「個體(subject)」包括人類和非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人類靈長類動物、綿羊、狗、牛、雞，兩棲動物和爬蟲動物。除非有說明，否則術語「患者」或「個體」在本文中可交替使用。
目標分子：如本文所用的術語「目標分子」是指表現於細胞表面上或細胞外基質中的任何生物分子(例如蛋白質、碳水化合物，脂質或其組合)，其可被本發明IL2促效劑中的靶向部分特異性地結合的。
靶向部分：如本文所用的術語「靶向部分」是指可以結合至本發明IL2促效劑所定位之處的細胞表面或胞外基質分子的任何分子或其結合部分(例如免疫球蛋白或抗原結合片段)，例如在腫瘤細胞上或在腫瘤微環境中的淋巴細胞上。除了將IL2促效劑定位到特定位點之外，靶向部分還可以具有功能活性。例如，作為抗PD1抗體或其抗原結合部分的靶向部分也可以藉由抑制PD1信號傳導由IL2突變蛋白展現出抗腫瘤活性或提高抗腫瘤活性。
治療(treat、treatment、treating)：如本文所用，術語「治療(treat，treatment及treating)」是指因為投與本發明的一或多個IL2促效劑而減少或改善增生性疾病的進展，嚴重性及/或持續時間，或改善增生性病症的一或多種症狀(較佳地一或多種可辨別的症狀)。在特定具體例中，術語「治療」是指改善增生性病症的至少一種可測量物理參數，諸如腫瘤的生長，這不必然由患者所察覺。在其他具體例中，術語「治療」是指在物理上例如藉由穩定可辨別的症狀、生理上例如藉由穩定物理參數或兩者來抑制增生性病症的進展。在其他具體例中，術語「治療」是指減少或穩定腫瘤大小或癌細胞計數。
腫瘤：術語「腫瘤」在本文中與術語「癌症」可交替使用，例如這兩個術語均含括固體和液體，例如瀰漫性或循環性腫瘤。如本文所用，術語「癌症」或「腫瘤」包括癌前以及惡性癌症與腫瘤。
腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen)：術語「腫瘤相關抗原」或「TAA」是指整體或作為一個片段(例如MHC/肽)表現在癌細胞表面上的分子(通常是蛋白質、碳水化合物，脂質或其某種組合)，並且可用於使藥理學藥劑優先靶向癌細胞。在一些具體例中，TAA是由正常細胞和癌細胞表現的標記，例如譜系標記，例如在B細胞上的CD19。在一些具體例中，TAA是與正常細胞相比在癌細胞中過度表現的細胞表面分子，例如，與正常細胞相比過度表現1倍、過度表現2倍、過度表現3倍或更多。在一些具體例中，TAA是在癌細胞中不適當地合成的細胞表面分子，例如，與正常細胞上表現的分子相比，含有缺失，添加或突變的分子。在一些具體例中，TAA將整體或作為一個片段(例如MHC/肽)專門表現在癌細胞的細胞表面上，而不在正常細胞的表面上合成或表現。因此，術語「TAA」含括對癌細胞具有特異性的抗原，在本技藝中有時稱為腫瘤特異性抗原(「TSA」)。
通用輕鏈：在靶向部分的上下文中，如本文使用的術語「通用輕鏈」是指能夠與靶向部分的重鏈區配對，並且還能夠與其他重鏈區配對的輕鏈多肽。通用區域也被稱為「共用輕鏈」。
VH：術語「VH」是指抗體的免疫球蛋白重鏈的可變區，包括scFv或Fab的重鏈。
VL：術語「VL」是指免疫球蛋白輕鏈的可變區，包括scFv或Fab的輕鏈。 6.2  IL2促效劑
本發明提供了IL2促效劑，其包含IL2部分、視情況選用的多聚化部分及視情況選用的靶向部分。
本發明的IL2促效劑可以是單體或多聚體，例如二聚體(同二聚體或異二聚體)或高階複合體。為方便起見，同二聚體(或同一多肽的高階多聚體)的IL2促效劑由其組成單體描述；但是，在合適的細胞株中重組表現組成單體後，可以產生同二聚體(或更高階多聚體)分子。
在不同具體例中，IL2促效劑是(a)IL2部分為單價或二價，及/或(b)靶向部分(若有的話)為單價或二價。
本發明的IL2促效劑通常不是定向CD122的，例如相對於野生型IL2，它們在IL2部分中不具有使它們相較於IL-2Rα更為偏好結合至IL-2Rβ的胺基酸置換或其他修飾(聚乙二醇化)。但是，在某些具體例中，本發明的IL2促效劑可以是定向CD122的，例如其中IL2促效劑是pMHC-靶向的(例如，如第6.4.3節中所述)及/或與自體免疫疾病的CAR Treg療法組合使用，例如第6.11.1節和第6.11.1.4節中所述。在一些具體例中，此等IL2促效劑對IL-2Rα的結合親和力減少至多1000倍，而對IL-2Rβ的結合親和力減少至多20倍。
本發明的IL2促效劑可以是定向CD25的，例如相較於野生型IL2，它們在IL2部分中具有一或多個使它們相較於IL-2Rβ更為偏好結合至IL-2Rα的胺基酸置換或其他修飾。
因此，本發明的IL2促效劑可具有造成IL-2Rβ及/或IL-2Rα結合親和力降低的胺基酸修飾。
總的來說，本發明的IL2促效劑對中等及/或高親和力IL2受體的結合正常或減弱(即親和力降低)(例如，達至多10倍、達至多50倍、達至多100倍，200倍)。在一些具體例中，結合受到減弱，但是對中等親和力相對高親和力IL2受體的偏好性類似於野生型IL2。
藉由測量對高親和力受體(IL-2Rαβγ)表現細胞和中等親和力受體(IL-2Rβγ)表現細胞的結合親和力差異，並將比率與野生型IL2的對應比率相比較，可以評估一種受體相對另一種受體的偏好結合。
在某些具體例中，本發明的IL2促效劑在IL2部分中具有一或多個減少結合至IL-2Rβ的胺基酸置換。例如，在一些具體例中，相較於野生型人類IL2，IL2部分對人類IL-2Rβ的親和力可減弱至多100倍至1000倍。
對IL-2Rβ的結合降低之IL2部分可以保留其對IL-2Rα的親和力，或對IL-2Rα的結合降低。例如，在一些具體例中，與野生型人類IL2相比，IL2部分對人類IL2-Rα的親和力減弱至多50倍。
可藉由表面電漿共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析) (Liljebladet al. , 2000, Glyco J 17:323-329)分析對IL-2Rα(中等親和力受體)和IL-2Rβ(高親和力受體)的結合親和力。
在第6.2節中描述了適用於本發明IL2促效劑的例示性IL2部分。
IL2促效劑可以是包含IL2部分和多聚化部分及/或靶向部分的融合蛋白。例示性多聚化部分描述於第6.5節中並且包括賦予IL2促效劑同二聚化或異二聚化能力的Fc結構域。游離IL2的藥物動力學非常差(血清半衰期＜10分鐘)，並且在不受理論束縛的情況下，咸信納入多聚化結構域(諸如Fc結構域)可改善IL2促效劑的血清穩定性和藥物動力學概況。因此，Fc結構域可以是一種雙重用途結構域，賦予穩定部分的穩定特性，如第6.6節中所述。
有時為了方便起見，IL2部分和視情況選用的多聚化及/或穩定化部分在本文中被稱為IL2突變蛋白，儘管術語「突變蛋白」也含括具有靶向部分的分子。例示性靶向部分描述於第6.4節中，並且包括結合至腫瘤相關抗原、結合至腫瘤微環境抗原或結合至腫瘤淋巴細胞，以及辨識腫瘤淋巴細胞之肽-MHC複合體的抗原結合結構域(例如scFv或Fab)。
此外，IL2部分，多聚化部分及靶向部分中的每一者本身可以是融合蛋白。例如，IL2部分可以包含IL2或IL2變體結構域和IL-2Rα結構域。
在不同具體例中，IL2促效劑不包含(a)IL2以外的細胞激素；(b)抗IL2抗體或抗體片段；(c)抗DNA抗體或抗體片段；(b)非結合抗體可變結構域；上述兩者，三者或全部四者的任何組合。
IL2促效劑可包括一或多個連接分子之不同組分(例如融合蛋白中存在的不同結構域)的連接子序列。例示性連接子描述於第6.7節中。
在某些態樣中，本發明的IL2促效劑在投與給個體(例如帶有癌症的患者或帶有腫瘤的小鼠)後，增加腫瘤內CD8+ T細胞對Treg細胞比率。
以下是本發明IL2突變蛋白和促效劑的一些例示性位向，在N端至C端位向上：
(1)位向1：IL2部分-視情況選用的連接子-多聚化部分及/或穩定化部分。
(2)位向2：多聚化部分及/或穩定化部分-視情況選用的連接子-IL2部分。
(3)位向3：靶向部分-視情況選用的連接子-多聚化部分及/或穩定化部分-視情況選用的連接子-IL2部分。
(4)位向4：包含兩條多肽A和B的異二聚體： ◎多肽A：IL2部分-視情況選用的連接子-多聚化部分；和 ◎多肽B：靶向部分-視情況選用的連接子-多聚化部分。
在本發明的IL2促效劑中，當靶向部分是抗體的抗原結合結構域(「ABD」)時，每個IL2分子可以由兩條多肽鏈組成，一條多肽鏈帶有重鏈可變區而另一條多肽鏈帶有輕鏈可變區。因此，在位向3和位向4中，靶向部分本身可以在個別多肽鏈上包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域。例如，關於位向4 IL2促效劑，多肽B可以由兩條多肽鏈B-1和B-2組成。多肽鏈B-1可含有靶向部分的重鏈可變結構域-視情況選用的連接子-多聚化部分，而多肽鏈B-2可包含靶向部分的輕鏈可變結構域。多肽A-多肽B異二聚體可如第6.5.1.2節中所述透過Fc異二聚化變體配對來締合。
或者，可以使用scFv，其中重鏈和輕鏈可變區在單個多肽中彼此融合。
位向1 IL2促效劑的例示性具體例在N端至C端位向上包含： a)    IL2部分，包含： i)                IL2或IL2變體(例如IL2 N88D)結構域，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S或C125A或C125)； ii)              連接子(例如如第6.7節中所述)；與 iii)            IL-2Rα的IL2結合部分； b)    連接子(例如如第6.7節中所述)；以及 c)    Fc結構域(例如IgG1或IgG4，帶有或不帶有如第6.5.1節及其小節中所述減少醣基化及/或效應子功能的置換)。
在第7節中被稱為IL2M0和IL2M2的IL2促效劑是位向1 IL2促效劑的特定具體例。
位向2 IL2促效劑的例示性具體例在N端至C端位向上包含： a)    Fc結構域(例如IgG1或IgG4，帶有或不帶有如第6.5.1節及其小節中所述減少醣基化及/或效應子功能的置換)； b)    連接子(例如如第6.7節中所述)；以及 c)    IL2或IL2變體(例如IL2 N88D)結構域，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S或C125A或C125V)。
被稱為IL2M4和IL2M5的IL2促效劑是這些位向2 IL2促效劑的特定具體例。
位向2 IL2促效劑的另一個例示性具體例在N端至C端位向上包含： a)    Fc結構域(例如IgG1或IgG4，帶有或不帶有如第6.5.1節及其小節中所述減少醣基化及/或效應子功能的置換)； b)    連接子(例如如第6.7節中所述)；以及 c)    IL2部分，包含： i)                IL2或IL2變體(例如IL2 N88D)結構域，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S或C125A或C125V)； ii)              連接子(例如如第6.7節中所述)；與 iii)            IL-2Rα的IL2結合部分。
在第7節中被稱為IL2M3的IL2促效劑是這個位向2 IL2促效劑的特定具體例。
位向3 IL2促效劑的一個例示性具體例在N端至C端位向上包含： a)    scFv或Fab的重鏈可變區(在個別多肽上與對應輕鏈可變區締合)(例如如第6.4.2節及其小節中所述)； b)    連接子(例如如第6.7節中所述)； c)    Fc結構域(例如IgG1或IgG4，帶有或不帶有如第6.5.1節及其小節中所述減少醣基化及/或效應子功能的置換)； d)    連接子(例如如第6.7節中所述)；以及 e)    IL2部分，包含： i)                IL2或IL2變體(例如IL2 N88D)結構域，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S，C125A或C125V)； ii)              連接子(例如如第6.7節中所述)；與 iii)            IL-2Rα的IL2結合部分(例如如第6.3節中所述)。
在第7節中被稱為IL2M3的IL2促效劑的T1靶向變化形式是這個位向3 IL2促效劑的特定具體例。
位向3 IL2促效劑的另一個例示性具體例在N端至C端位向上包含： a)    肽-MHC複合體(如第6.4.3節中所述)，包含； i)                MHC肽： ii)              連接子(例如如第6.7節及其小節，例如第6.7.1節中所述)； iii)            視情況選用的β2-微球蛋白(β2m)； iv)            視情況選用的連接子(例如如第6.7節及其小節，例如第6.7.1節中所述)；與 v)              MHC； b)    視情況選用的連接子(例如如第6.7節中所述)； c)    Fc結構域(例如IgG1或IgG4，帶有或不帶有如第6.5.1節及其小節中所述減少醣基化及/或效應子功能的置換)； d)    連接子(例如如第6.7節中所述)； e)    IL2部分，包含： i)                IL2或IL2變體(例如IL2 N88D)結構域，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S，C125A或C125V)； ii)              連接子(例如如第6.7節中所述)；與 iii)            IL-2Rα的IL2結合部分(例如如第6.3節中所述)。
在第7節中被稱為IL2M3的IL2促效劑的T2和T3靶向變化形式是這個位向3 IL2促效劑的特定具體例。
在一個例示性具體例中，位向4 IL2促效劑包含兩條多肽，A和B，其在N端至C端的方向上包含：
在某些態樣中，位向4 IL2促效劑包括兩條多肽，A和B，其在N端至C端方向上包含： 多肽A： a)    靶向部分，例如肽-MHC複合體(例如如第6.4.3節中所述)，Fab結構域(例如如第6.4.2.2節中所述)(例如多肽A上與第三多肽(多肽C)締合之Fab的重鏈，包含Fab的輕鏈)，或scFv結構域(例如如第6.4.2.1節中所述)； b)    視情況選用的連接子(例如如第6.7節中所述)；與 c)    第一Fc結構域。 多肽B： d)    IL2部分，包含IL2或IL2變體結構域(例如帶有置換H16A，F42A的IL2結構域，被稱為IL2(2m))，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S，C125A或C125V)； e)    視情況選用的連接子(例如如第6.7節中所述)；與 f)     第二Fc結構域，與第一Fc結構域不同但可與第一Fc結構域異二聚化(例如如第6.5.1.2節中所述)。
在一些態樣中，IL2促效劑對靶向部分為單價而對IL2部分為單價的異二聚體。
這個位向4 IL2促效劑的一個特定具體例包含： 多肽A： a)    肽-MHC複合體(例如如第6.4.3節中所述)，包含： i)                MHC肽； ii)              連接子(例如如第6.7節中所述)； iii)            視情況選用的β2-微球蛋白(β2m)； iv)            視情況選用的連接子(例如如第6.7節中所述)；與 v)              MHC； b)    視情況選用的連接子(例如如第6.7節中所述)；及 c)    第一Fc結構域。 多肽B： d)    IL部分，包含IL2或IL2變體(例如L2 H16A、F42A，也被稱為IL2(2m))結構域，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S，C125A或C125V)； e)    視情況選用的連接子(例如如第6.7節中所述)；與 f)     第二Fc結構域，與第一Fc結構域不同但可與第一Fc結構域異二聚化(例如如第6.5.1.2節中所述)。
第一Fc結構域和第二Fc結構域可以是例如IgG1或IgG4 Fc結構域，帶有或不帶有如第6.5.1節及其小節中所述減少醣基化及/或效應子功能的置換。
在圖22A.2中示出例示性位向4 IL2促效劑。
舉例來說，在上述例示性位向3和位向4促效劑中，於肽-MHC複合體中納入β2微球蛋白被認為會穩定人類細胞表面MHC I分子並促使其裝上外源性肽。參見例如Shieldset al. , 1998, J Biol Chem. 273(43):28010-8；Obermannet al. , 2007, Immunology 122(1):90-7。
在某些態樣中，IL2促效劑包含IL2突變蛋白，其具有IL2M0、IL2M1、IL2M2、IL2M3、IL2M4、IL2M5，IL2M6或IL2M7的構形，例如在N端處帶有視情況選用的靶向部分和視情況選用的連接子。在一些具體例中，IL2促效劑包含IL2突變蛋白，其具有IL2M0、IL2M1、IL2M2、IL2M3、IL2M4、IL2M5，IL2M6或IL2M7的胺基酸序列，例如在N端處帶有視情況選用的靶向部分和視情況選用的連接子。
本發明的IL2促效劑通常具有改善的治療指數。在某些態樣中，如第7節中所例舉，可以將治療指數測量為IL2促效劑作為整體或其非靶向組分(例如，包含IL2部分和多聚化部分的分子，為方便起見，在本文中被稱「IL2突變蛋白」或「IL2M」組分)在帶有腫瘤的小鼠體內造成毒性(例如，體重減輕)的劑量相對最小有效抗腫瘤劑量的比率。第7節中的數據顯示以下治療指數：
IL2M0 IL2M1 IL15M1
有效劑量 ＞ 5 μg ＞ 75 μg ＞20 μg
毒性劑量 ＞ 30 μg ＞ 40 μg ＞10 μg
治療指數 6 0.53 0.5
在某些態樣中，本發明IL2促效劑或其IL2M組分的治療指數大於1，且較佳大於2，且甚至更佳大於10。在特定具體例中，治療指數為約10、約20，約100或約200。
本發明IL2促效劑的組分的更多詳細內容呈現於下文。 6.3  IL2部分
本發明IL2拮抗劑的IL2部分包含野生型或變體IL2結構域，其視情況融合至IL-2Rα的IL2結合結構域，視情況經由連接子(例如如第6.7節中所述)。若存在的話，則IL-2Rα的IL2結合結構域可以在野生型或變體IL2結構域的N-端或C-端。
在真核細胞中，人類IL2被合成為具有153個胺基酸的前體多肽，從中移除20個胺基酸而產生成熟的分泌型IL2(Taniguchiet al., 1983, Nature 302(5906):305-10)。成熟的人類IL2具有以下胺基酸序列： APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMC EYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO:2)
本發明的IL2部分通常不是定向CD122的，例如它們在IL2結構域中不具有使它們偏好結合至IL-2Rβ(相較於IL-2Rα)的胺基酸置換。
本發明的IL2部分可以是定向CD25的，例如它們在IL2結構域中具有一或多個使它們偏好結合至IL-2Rα(相較於IL-2Rβ)的胺基酸置換。
在某些具體例中，本發明的IL2促效劑在IL2部分中具有一或多個減少結合至IL-2Rβ的胺基酸置換。舉例而言，在一些具體例中，相較於野生型人類IL2，IL2部分對人類IL-2Rβ的結合可以減弱至多50倍(並且在一些具體例中至多100倍)至1,000倍。
對IL-2Rβ的結合減少的IL2部分可以保有其對IL-2Rα的親和力，或對IL-2Rα的結合減少。例如，在一些具體例中，相較於野生型人類IL2，IL2部分對人類IL2-Rα的結合可以減弱至多50倍。
可用IL2變體的其他特徵可包括誘導帶有IL-2Rα之CD8+ T細胞在腫瘤中增生的能力、帶有IL-2Rα之CD8+ T細胞在腫瘤中引發IL2信號傳導的能力，以及改善治療指數。
在一個具體例中，IL2部分包含一或多個降低對IL-2Rβ的親和力且保留對IL2-Rα的親和力的胺基酸置換。例示性胺基酸置換是N88D。降低或消除IL2對IL-2Rβ之親和力的其他胺基酸置換是D20T、N88R，N88D或Q126D (參見例如美國專利公開案第US 2007/0036752號)。
在一個具體例中，IL2部分包含一或多個降低對IL2-Rα的親和力，並保留對IL-2Rβ的親和力或對IL-2Rβ的親和力降低至較低程度的胺基酸置換，從而產生定向CD122的IL2部分。此類IL2部分特別可用於併入帶有肽-MHC靶向部分的IL2促效劑及/或用作CAR Treg療法的輔助療法，如第6.11.1.4節中所述。例示性定向CD122的IL2部分是那些同時包含H16A和F42A置換者，如IL2M6和IL2M7中所例舉的。因此，在一些具體例中，IL2部分包含具有H16A和F42A置換的人類IL2的胺基酸序列，如下所示： SAPTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO:124)
在某些具體例中，IL2部分包含一個胺基酸置換，該胺基酸置換在對應於人類IL2的殘基3的位置處消除IL2的O-醣基化位點。在T3處的例示性胺基酸置換是T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R，T3K和T3P。在一個特定具體例中，置換是T3A。
IL2部分較佳基本上是全長IL2分子，例如人類IL2分子。在某些具體例中，IL2部分是人類IL-2分子。
如美國專利第4,518,584號中所述，C125可以被S，V或A置換以減少蛋白質聚集。
如其中所述，還可以刪除IL2的N-端丙胺酸殘基，產生des-A1 IL2。
此外，如美國專利第5,206,344號中所述，IL2部分可包括用中性胺基酸(諸如丙胺酸)置換甲硫胺酸104。
因此，除了其他改變IL2結合至其受體的變異以外，本發明的IL2部分可具有選自以下的胺基酸缺失及/或置換：des-A1 M104A IL2、des-A1 M104A C125S IL2、M104A IL2、M104A C125A IL2，des-A1 M104A C125A IL2或M104A C125S IL2。這些和其他突變體可以在美國專利第5,116,943號和Weiger et al., 1989, Eur J Biochem 180:295-300中找到。
在不同態樣中，前述IL2部分中任一者包含與成熟人類IL2具有至少約90%、至少約91%、至少約92%、約至少93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
本發明的IL2部分可進一步包括IL-2Rα的IL2結合結構域(為方便起見，被稱為「IL2-Rα結構域」)，例如IL-2Rα的細胞外結構域，如第6.7節中所述視情況經由一個連接子融合在IL2的C端或N端處。成熟人類IL-2Rα細胞外結構域的序列(對應於人類IL-Rα的胺基酸22-272)為： Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile (SEQ ID NO:3)
人類IL-2Rα細胞外結構域的IL2結合部分的序列(包含兩個「壽司(sushi)」結構域，其對應於人類IL-2Rα的胺基酸22-186)是： Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly (SEQ ID NO:4)
替代性人類IL-2Rα細胞外結構域的IL2結合部分的序列(其對應於人類IL-2Rα的胺基酸22-240)為： Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln (SEQ ID NO:5)
IL-2Rα細胞外結構域的IL2-Rα結構域或IL2結合部分較佳與上述序列中任一者(即IL-2Rα的胺基酸22-186、IL-2Rα的胺基酸22-240，或IL-2Rα的胺基酸22-272或其任何IL2結合部分中任一者)具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99%或100%的序列一致性的胺基酸序列。
在某些態樣中，IL2-Rα結構域或IL2結合部分可包含與人類IL-2Rα的IL2結合部分具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99%或100%序列一致性的胺基酸序列或由其組成，視情況其中結合部分具有人類IL2-Rα之細胞外結構域的(a)至少160個胺基酸、至少161個胺基酸、至少162個胺基酸，至少164個胺基酸或至少165個胺基酸，及/或(b)至多251個、至多240、至多230、至多220、至多210、至多200、至多190，至多180或至多170個胺基酸的胺基酸序列。在特定具體例中，人類IL-2Rα的部分受到前一句中的(a)和(b)中的任一者界定，例如來自人類IL-2Rα的至少160個和至多180個胺基酸、來自人類IL-2Rα的至少162個和至多200個胺基酸、來自人類IL-2Rα的至少160個和至多220個胺基酸，來自人類IL-2Rα的至少164個和至多190個胺基酸，依此類推。
在一些具體例中，IL2-Rα結構域或IL2結合部分包含與胺基酸22-186具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99%或100%序列一致性的胺基酸序列或由其組成，在IL2-Rα之胺基酸殘基186的C端帶有或不帶有額外至多5個胺基酸、至多10個胺基酸、至多15個胺基酸、至多20個胺基酸，至多30個胺基酸或至多40個胺基酸。
如圖3A至3B中所例示，在有一個N端Fc結構域的情況下，IL2融合至IL-2Rα的IL2結合部分的C端，導致IL2促效劑不形成更高階結構，IL2促效劑在N至C方向上包含IL2-IL-2Rα細胞外結構域-Fc。因此，本發明含IL-2Rα的IL2突變蛋白較佳在IL-2的N端處具有IL-2Rα細胞外結構域。具有這個位向的例示性突變蛋白是IL2M3。
在某些具體例中，與天然IL-2Rα的細胞外結構域相比，IL2-Rα結構域或IL-2Rα細胞外結構域具有少了至少一個的O-醣基化及/或N-醣基化，例如因為在以下一或多者處的置換：胺基酸N49、胺基酸N68、胺基酸T74、胺基酸T85、胺基酸T197、胺基酸T203、胺基酸T208，和胺基酸T216。在一些具體例中，一或多個置換是從天冬醯胺酸到選自由以下組成之群的胺基酸：丙胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、精胺酸、天冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸，酪胺酸和纈胺酸。在一些具體例中，一或多個置換是從蘇胺酸到選自由以下組成之群的胺基酸：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、色胺酸，酪胺酸和纈胺酸。在一些具體例中，一或多個取代是在胺基酸S50(例如S50P)、胺基酸S51(例如S51R、S51N、S51D、S51C、S51Q、S51E、S51G、S51H、S51I、S51L、S51K、S51M、S51F、S51P、S51W、S51Y，或S51V)、胺基酸T69(例如T69P)、胺基酸T70(例如T70R、T70N、T70D、T70C、T70Q、T70E、T70G、T70H、T70I、T70L、T70K、T70M、T70F、T70P、T70W、T70Y或T70V)、胺基酸C192(例如C192R、C192N、C192D、C192Q、C192E、C192G、C192H、C192I、C192L、C192K、C192M、C192F、C192P、C192W，C192Y或C192V)或其任何組合。 6.4.        靶向部分
在本發明的IL2促效劑中併入靶向部分允許將高濃度的IL2遞送至腫瘤微環境或腫瘤反應性淋巴細胞(包括CART淋巴細胞)，同時減少了全身性暴露，使得副作用比野生型IL2所得到者更少。
合適的靶向部分形式描述於第6.4.2節中。靶向部分較佳是抗原結合部分，例如抗體或抗體的抗原結合部分，例如scFv(如第6.4.2.1節中所述)，或Fab(如第6.4.2.2節中所述)。
抗體和抗原結合部分通常結合至特定抗原決定位，並且能夠將IL2促效劑引導至目標部位，例如靶向至帶有抗原決定位的特定類型腫瘤細胞或腫瘤基質。受到本發明靶向部分所辨識的例示性目標分子描述於第6.4.1節中。
在其他具體例中，靶向部分是如第6.4.3節中所述的肽-MHC複合體，例如受到腫瘤淋巴細胞所辨識的肽-MHC複合體。
在一些具體例中，靶向部分呈Fc融合蛋白的形式，例如在實例中稱為T7和T8的結構中所例舉的。靶向部分多肽的Fc部分可用於與包含IL2部分的個別多肽鏈中的Fc結構域多聚化。 6.4.1     目標分子
受到本發明IL2促效劑的靶向部分所辨識的目標分子通常發現於例如經活化T細胞的表面上、腫瘤細胞的表面上、遭病毒感染的細胞的表面上、在其他罹病細胞的表面上、游離在血清中，在細胞外基質(ECM)中或存在於目標部位的免疫細胞(例如腫瘤反應性淋巴細胞)中。在外源性地投與免疫細胞(例如表現嵌合抗原受體(「CAR」)的T細胞)時，靶向部分可以辨識嵌合抗原受體(CAR)或在CAR T細胞表面上所發現的另一個分子。在不同具體例中，CAR包含特異性辨識TAA或pMHC複合體的CDR或VH和VL序列(例如呈scFv的形式)。
例示性目標分子是纖維母細胞活化蛋白(FAP)、肌腱蛋白C(Tenascin C)的A1結構域(TNC A1)、肌腱蛋白C的A2結構域(TNC A2)，纖維連接蛋白的額外結構域B(EDB)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脫胺酶結合蛋白(ADAbp)、親環蛋白b、結腸直腸相關抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特異性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、T細胞受體/CD3-ζ鏈、腫瘤抗原的MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2 (MAGE-B2)，MAGE-Xp3 (MAGE-B3)，MAGE-Xp4 (MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、腫瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪胺酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-鈣黏蛋白、α-連環蛋白、β-連環蛋白和γ-連環蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性結腸息肉蛋白(APC)、胞襯蛋白(fodrin)、連接蛋白37、Ig個體基因型、p15、gp75、GM2和GD2神經節苷脂、病毒產物(例如人類乳頭瘤病毒蛋白)、腫瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、EBV編碼的核抗原(EBNA)-1、腦糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2 (HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、c-erbB-2、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T細胞表面抗原)、CD3(與TCR締合的異多聚體)、CD22(B細胞受體)、CD23 (低結合親和力IgE受體)、CD30(細胞激素受體)、CD33(骨髓細胞表面抗原)、CD40(腫瘤壞死因子受體)、IL-6R-(IL6受體)、CD20、MCSP、PDGFβR(β-血小板衍生的生長因子受體)、ErbB2上皮細胞黏附分子(EpCAM)、EGFR變體III(EGFRvIII)、CD19、雙唾液酸神經節苷脂GD2、導管上皮黏蛋白、gp36、TAG-72、神經膠質瘤相關抗原、β-人類絨毛膜促性腺激素、α胎蛋白(AFP)、凝集素反應性AFP、甲狀腺球蛋白、MN-CA IX、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2(AS)、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特異性抗原(PSA)、PAP、LAGA-1a、p53、前列腺相關蛋白(prostein)、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、嗜中性球彈性蛋白酶、蝶素(ephrin) B2、胰島素生長因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受體、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘤基質抗原、纖維連接蛋白的額外結構域A(EDA)和額外結構域B(EDB)以及肌腱蛋白C的A1結構域(TnC A1)。
病毒抗原的非限制性實例包括EBV抗原(例如艾-巴二氏病毒LMP-1)、C型肝炎病毒抗原(例如C型肝炎病毒E2糖蛋白)、HIV抗原(例如HIV gp160和HIV gp120)；CMV抗原；HPV特異性抗原或流感病毒抗原(例如流感病毒血球凝集素)。
ECM抗原的非限制性實例包括聯合蛋白聚醣(syndecan)、肝素酶、整合素、骨橋蛋白、link、鈣黏蛋白、層連結蛋白、層連結蛋白型EGF、凝集素、纖維連接蛋白、notch、肌腱蛋白，膠原蛋白和基質蛋白。
其他目標分子是腫瘤或病毒淋巴細胞的細胞表面分子，例如T細胞共刺激蛋白，諸如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT，NKG2C和B7-H3。
在特定具體例中，目標分子是檢查點抑制劑，例如CTLA-4、PD1、PDL1、PDL2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2。在特定具體例中，目標分子是PD1。在其他具體例中，目標分子是LAG3。 6.4.2.    靶向部分形式
在某些態樣中，靶向部分可以是保有特異性結合至抗原決定位的任何類型抗體或其片段。在一個具體例中，抗原結合部分是全長抗體。在一個具體例中，抗原結合部分是免疫球蛋白分子，特別是IgG類免疫球蛋白分子，更特別是IgG1 或IgG4 免疫球蛋白分子。抗體片段包括，但不限於VH(或VH )片段、VL(或VL )片段、Fab片段、F(ab')2 片段、scFv片段、Fv片段、微型抗體、雙功能抗體，三功能抗體和四功能抗體。 6.4.2.1. scFv
單鏈Fv或「scFv」抗體片段在單條多肽鏈中包含抗體的VH結構域和VL結構域，能夠表現為單鏈多肽，並保有它們衍生而來之完整抗體的特異性。通常，scFv多肽還包含在VH結構域和VL結構域之間的多肽連接子，其使得scFv能形成目標結合的期望結構。適用於連接scFv的VH鏈和VL鏈的連接子的實例是第6.4.3節中所鑑別的連接子。
除非另有說明，否則如本文所用，scFv可具有呈任何順序的VL可變區和VH可變區，例如相對於多肽的N-端和C-端末端，scFv可包含VL-連接子-VH或可包含VH-連接子-VL。
scFv可包含來自任何合適物種的VH序列和VL序列，諸如鼠類，人類或人類化的VH序列和VL序列。
為了創造出編碼scFv的核酸，將編碼VH和VL的DNA片段與編碼一個連接子的另一個片段可操作地連接，該另一個片段例如編碼第6.4.3節中所述的任何連接子(通常是一個含有胺基酸甘胺酸和絲胺酸的重複序列，諸如胺基酸序列(Gly4〜Ser)3 (SEQ ID NO:6))，使得VH序列和VL序列可以表現呈一條連續的單鏈蛋白，其中VL區和VH區是由一個撓性連接子所連接(參見例如Birdet al. , 1988, Science 242:423-426；Hustonet al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCaffertyet al. , 1990, Nature 348:552-554)。 6.4.2.2. Fab
Fab結構域傳統上是透過使用酶(諸如木瓜蛋白酶)對免疫球蛋白分子進行蛋白水解切割而產生。在本發明的IL2促效劑中，Fab結構域通常作為IL2促效劑的一部分被重組表現。
Fab結構域可包含來自任何合適物種的恆定結構域和可變區序列，因此可以是鼠類、嵌合，人類或人類化的。
Fab結構域通常包含附接至VH結構域的CH1結構域，其與附接至VL結構域的CL結構域配對。在野生型免疫球蛋白中，VH結構域與VL結構域配對以構成Fv區，而CH1結構域與CL結構域配對以進一步穩定結合模塊。兩個恆定結構域之間的二硫鍵可以進一步穩定Fab結構域。
關於本發明的IL2促效劑，特別是當輕鏈不是共用或通用的輕鏈時，使用Fab異二聚化策略以允許屬於相同ABD的Fab結構域正確締合，並使異常屬於不同ABD的Fab結構域配對降至最低是有利的。例如，可以使用下表1中所示的Fab異二聚化策略：
表1 Fab 異二聚化策略
策略 VH CH1 VL CL 參考文獻
CrossMabC H1-CL WT CL結構域 WT CH1 結構域 Schaeferet al. , 2011, Cancer Cell 2011; 20:472-86; PMID:22014573.
正交Fab VHVRD1C H1CRD2 – VLVRD1Cλ CRD2 39K、 62E H172A、 F174G 1R、38D、 (36F) L135Y、 S176W Lewiset al. , 2014, Nat Biotechnol 32:191-8
正交Fab VHVRD2C H1wt – VLVRD2Cλ wt 39Y WT 38R WT Lewiset al. , 2014, Nat Biotechnol 32:191-8
TCR CαCβ 39K TCR Cα 38D TCR Cβ Wuet al. , 2015, MAbs 7:364-76
CR3 WT T192E WT N137K、 S114A Golayat al. , 2016, J Immunol 196:3199-211.
MUT4 WT L143Q、 S188V WT V133T、 S176V Golayat al. , 2016, J Immunol 196:3199-211.
DuetMab WT F126C WT S121C Mazoret al. , 2015, MAbs 7:377-89; Mazoret al. , 2015, MAbs 7:461-669.
結構域交換 WT CH3 +杵 或臼突變 WT CH3 + 臼 或杵突變 Wozniak-Knoppet al. , 2018, PLoSONE13(4):e0195442
因此，在某些具體例中，Fab的兩條多肽之間正確締合是透過Fab的VL結構域和VH結構域彼此交換或CH1結構域和CL結構域彼此交換而獲得增進，例如如WO 2009/080251中所述。
透過在CH1結構域中引入一或多個胺基酸修飾，以及在Fab的CL結構域中引入一或多個胺基酸修飾，及/或在VH結構域中引入一或多個胺基酸修飾和在VL結構域中引入一或多個胺基酸修飾也可以增進正確的Fab配對。經過修飾的胺基酸通常是VH：VL和CH1：CL界面的一部分，使得Fab組分偏好彼此配對，而不是與其他Fab的組分配對。
在一個具體例中，一或多個胺基酸修飾限於如由Kabat殘基編號所指示的可變結構域(VH、VL)和恆定結構域(CH1、CL)的保守框架殘基。Almagro, 2008, Frontiers In Bioscience 13:1619-1633根據Kabat，Chothia和IMGT編號方案提供了框架殘基的定義。
在一個具體例中，在VH結構域和CH1結構域及/或VL結構域和CL結構域中所引入的修飾彼此互補。重鏈和輕鏈界面處的互補性可以基於空間和疏水性接觸，靜電/電荷交互作用或各種交互作用的組合來實現。蛋白質表面之間的互補性(有關於鎖與鍵配合、杵入臼、隆起和腔、供體和受體等)廣泛描述於文獻中，全都暗示了兩個交互作用表面之間結構和化學匹配的性質。
在一個具體例中，一或多個被引入的修飾在Fab組分的界面上引入了新的氫鍵。在一個具體例中，一或多個被引入的修飾在Fab組分的界面上引入了新的鹽橋。例示性置換描述於WO 2014/150973和WO 2014/082179中，其內容以引用的方式併入本文。
在一些具體例中，Fab結構域在CH1結構域中包含192E置換，並在CL結構域中包含114A和137K置換，其在CH1結構域和CL結構域之間引入了鹽橋(參見例如Golayet al. , 2016, J Immunol 196:3199-211)。
在一些具體例中，Fab結構域在CH1結構域中包含143Q和188V置換，而在CL結構域中包含113T和176V置換，其用於在CH1結構域和CL結構域之間交換疏水性和極性的接觸區域(參見例如Golayet al. , 2016, J Immunol 196:3199-211)。
在一些具體例中，Fab結構域可在一些或全部的VH、CH1、VL、CL結構域中包含修飾，以引入促進Fab結構域正確組裝的正交Fab界面(Lewiset al. , 2014 Nature Biotechnology 32:191-198)。在一個具體例中，在VH結構域中引入39K、62E修飾，在CH1結構域中引入H172A、F174G修飾，在VL結構域中引入1R、38D、(36F)修飾，並且在CL結構域中引入L135Y，S176W修飾。在另一個具體例中，在VH結構域中引入了39Y修飾，並且在VL結構域中引入了38R修飾。
Fab結構域也可以被修飾成用工程化的二硫鍵取代天然CH1：CL二硫鍵，從而提高Fab組分配對的效率。例如，可藉由在CH1結構域中引入126C並在CL結構域中引入121C來引入經工程化的二硫鍵(參見例如Mazoret al. , 2015, MAbs 7:377-89)。
也可以透過用促進正確組裝的替代結構域取代CH1結構域和CL結構域來修飾Fab結構域。例如，Wuet al. , 2015, MAbs 7:364-76描述了用T細胞受體的恆定結構域置換CH1結構域，並用T細胞受體的b結構域置換CL結構域，並將這些結構域取代與藉由在VL結構域中引入38D修飾且在VH結構域中引入39K修飾而在VL結構域和VH結構域之間的額外電荷-電荷交互作用配對。
代替或除了使用Fab異二聚化策略來促使正確的VH-VL配對外，共用輕鏈(也被稱為通用輕鏈)的VL可用於本發明IL2促效劑的每個Fab VL區。在不同具體例中，與採用原始同源VL相比，採用如本文所述的共用輕鏈減少了不當種類的IL2促效劑的數量。在不同具體例中，IL2促效劑的VL結構域是從包含共用輕鏈的單特異性抗體鑑定而來。在不同具體例中，IL2促效劑的VH區包含人類重鏈可變基因區段，其在小鼠B細胞內於活體內重排，而該等小鼠B細胞先前已被工程改造成表現有限的人類輕鏈譜，或單個人類輕鏈(與人類重鏈同源)，並對暴露於感興趣的抗原有反應，產生含有與兩種可能人類VL中的一者或一個同源的複數個人類VH的抗體譜，其中該抗體譜對感興趣抗原具有特異性。共用輕鏈來自那些衍生自重排的人類Vκ1-39Jκ5序列或重排的人類Vκ3-20Jκ1序列者，並包括體細胞突變(例如經親和力成熟)的形式。參見例如美國專利第10,412,940號。 6.4.3.    MHC-肽融合物
本發明IL2促效劑的靶向部分可以是肽-MHC複合體(「pMHC複合體」)，例如與第I類MHC結構域複合的肽或與第II類MHC結構域複合的肽，視情況具有β2微球蛋白結構域。
天然存在的MHC由人類6號染色體上的一個基因簇編碼。MHC包括但不限於HLA特異性，諸如A(例如A1-A74)、B(例如B1-B77)、C(例如C1-C11)、D(例如D1-D26)、DR(例如DR1-DR8)，DQ(例如DQ1-DQ9)和DP(例如DP1-DP6)。HLA特異性包括A1、A2、A3、AII、A23、A24、A28、A30、A33、B7、B8、B35、B44、B53、B60、B62、DR1、DR2、DR3、DR4、DR7，DR8和DR11。
天然存在的第I類MHC分子結合衍生自經蛋白水解降解蛋白而來的肽。因此，所獲得的小肽被轉運到內質網中，在那裡它們與新生的第I類MHC分子結合，然後被安排通過高基氏體，並展示在細胞表面上以供細胞毒性T淋巴細胞辨識，如圖3A中所示。
天然存在的第I類MHC分子由與β2微球蛋白締合的α(重)鏈組成。重鏈由次單位α1-α3組成。β2微球蛋白蛋白質和重鏈的α3次單位締合。在某些具體例中，β2微球蛋白和α3次單位透過共價結合而締合。在某些具體例中，β2微球蛋白和α3次單位非共價締合。重鏈的α1和α2次單位折疊形成溝，用於要被展示且由TCR所辨識的肽(例如抗原決定位)。
第I類分子通常與長度為約8-9個胺基酸(例如7-11個胺基酸)的肽締合(例如結合)。所有人類具有三個與六個之間的不同第I類分子，其可各自結合一些不同類型的肽。在一個特定具體例中，第I類MHC多肽為人類第I類MHC多肽，選自由以下組成之群：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E，HLA-F以及HLA-G。
在一些具體例中，靶向部分包含不具有跨膜結構域的第I類MHC α重鏈細胞外結構域(人類α1，α2及/或α3結構域)。在一些具體例中，第I類α重鏈多肽是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G，HLA-K或HLA-L。在一些具體例中，HLA-A序列可以是HLA-A*0201序列。
pMHC複合體中的肽可具有可與第I類MHC分子締合(例如由其所呈現)的肽的胺基酸序列。在某些具體例中，序列可包含6至20個連續胺基酸。在某些具體例中，肽序列可以是蛋白質片段的序列，其中該蛋白質是一種衍生自(例如)與諸如例如癌症或癌症新抗原有關之蛋白質(例如細胞蛋白的一部分)衍生而來，且其中該肽可結合至第I類MHC重鏈。
在一些具體例中，pMHC複合體靶向部分包含(i)抗原性肽；(ii)第I類MHC多肽或其片段，突變體或衍生物(例如細胞外結構域)，和視情況(iii)β2微球蛋白多肽或其片段，突變體或衍生物。舉例來說，pMHC複合體從N端至C端可包含(i)抗原性肽、(ii)β2M序列，和(iii)第I類α(重)鏈序列。或者，pMHC複合體從N端至C端可包含(i)抗原性肽、(ii)第I類α(重)鏈序列，和(iii)β2M序列。
在一個特定具體例中，抗原性肽和MHC序列及/或MHC序列和β2M結構域經由一個肽連接子彼此連接，例如如第6.7節中所述。在一些具體例中，單鏈pMHC複合體可在肽區段和β2微球蛋白區段之間包含第一撓性連接子。例如，連接子可從肽的羧基端延伸並將其連接至β2微球蛋白區段的胺基端。在一些具體例中，連接子被結構設計成允許肽折疊到結合溝中，從而產生功能性pMHC複合體。在一些具體例中，這個連接子可以包含至少3個胺基酸，至多約15個胺基酸(例如20個胺基酸)。pMHC連接子可以包含被插入在β2微球蛋白和MHC I重鏈區段之間的第二撓性連接子。例如，連接子可從β2微球蛋白區段的羧基端延伸並將其連接至MHC I重鏈區段的胺基端。在某些具體例中，β2微球蛋白和MHC I重鏈可以折疊到結合溝中，產生可以促進T細胞擴增的分子。
當β2M存在時，pMHC複合體可以在β2M中和在第I類MHC α重鏈結構域中包括突變，使得二硫鍵可以在它們之間形成。可以經半胱胺酸置換以允許兩個結構域之間進行二硫鍵鍵結的例示性胺基酸對鑑別在下表2中或描述於PCT公開案WO 2015/195531(以全文引用的方式併入本文)中：
表 2
β2M 結構域 MHC 結構域
12 236
12 237
8 234
10 235
24 236
28 232
98 192
99 234
3 120
31 96
53 35
60 96
60 122
63 27
R3 G120
H31 Q96
D53 R35
W60 Q96
W60 D122
Y63 Y27
K6 E232
Q8 R234
Y10 P235
S11 Q242
N24 A236
S28 E232
D98 H192
M99 R234
R12 G237
在進一步的具體例中，單鏈pMHC複合體可包含經由二硫橋(即兩個半胱胺酸之間的二硫鍵)共價附接至第I類MHCα(重)鏈的肽。參見例如美國專利第8,992,937號和第8,895,020號，其各自均以全文引用的方式併入。在某些具體例中，二硫鍵包括位於從肽的羧基端延伸之連接子內的第一半胱胺酸，以及位於第I類MHC重(例如第I類MHC α (重鏈)，其對抗原肽具有非共價結合位點)內的第二半胱胺酸。在某些具體例中，第二半胱胺酸可以是第I類MHC α (重)鏈中的突變(添加或置換)。較佳地，pMHC複合體可以包含一條連續多肽鏈以及二硫橋。或者，pMHC複合體可包含兩條連續多肽鏈，其經由二硫橋作為唯一的共價鍵連而附接。在一些具體例中，除半胱胺酸外，連接序列還可包含至少一個胺基酸，包括一或多個甘胺酸、一或多個丙胺酸，及/或一或多個絲胺酸。在一些具體例中，單鏈分子從N端至C端包含第I類MHC肽(例如抗原性肽)、包含第一半胱胺酸的連接子、β2-微球蛋白序列、第二連接子，以及包含第二半胱胺酸的第I類MHC重鏈序列，其中第一半胱胺酸和第二半胱胺酸包含二硫橋。在一些具體例中，第二半胱胺酸是選自由T80C，Y84C和N86C組成之群的第I類MHC重鏈胺基酸的置換(Y84C是指成熟蛋白質中位置108處的突變，其中成熟蛋白質缺少訊號序列。或者，當蛋白質仍包括24員信號序列時，該位置稱為Y108C)。
在某些具體例中，如果pMHC複合體在延伸於該肽的C端和β2微球蛋白之間的Gly-Ser連接子中包含第一半胱胺酸，則二硫橋可以在pMHC複合體的第I類溝中連接肽，且第二半胱胺酸位於近端重鏈位置。
若存在的話，β2微球蛋白序列可包含全長(人類或非人類)β2微球蛋白序列。在某些具體例中，β2微球蛋白序列缺乏前導肽序列。這樣一來，β2微球蛋白序列可包含約99個胺基酸。例示性人類β2微球蛋白序列是Genbank登錄號AF072097.1。
作為基於第I類MHC的pMHC複合體的替代物，本發明IL2促效劑可包括基於第II類MHC的pMHC複合體作為靶向部分。基於第II類MHC的pMHC複合體通常包括第I類MHC多肽或其片段，突變體或衍生物。在一個特定具體例中，MHC包含第II類MHC分子的α和β多肽或其片段，突變體或衍生物。在一個特定具體例中，α和β多肽藉由一個肽連接子連接。在一個特定具體例中，MHC包含選自由HLA-DP、HLA-DR、HLA-DQ，HLA-DM和HLA-DO組成之群的人類第II類MHC分子的α和β多肽。
第II類MHC分子通常由兩條多肽鏈α和β組成。該等鏈可能來自DP，DQ或DR基因群。有大約40種已知的不同人類第II類MHC分子。它們都具有相同的基本結構，但分子結構會有所不同。第II類MHC分子結合長度為13-18個胺基酸的肽。
在一些具體例中，pMHC複合體包含一或多條第II類MHC α鏈或其細胞外部分。在一些具體例中，第II類α鏈是HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA，HLA-DQA或HLA-DRA。
在其他具體例中，pMHC複合體包含一或多個第II類MHC β鏈或其細胞外部分。在一些具體例中，第II類β鏈是HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB，HLA-DQB或HLA-DRB。
pMHC複合體中的肽可以是能夠以某種方式與MHC蛋白結合的肽，使得pMHC複合體可以例如以特定方式結合至TCR。
實例包括藉由水解產生的肽，且最常是合成產生的肽，包括隨機生成的肽、專門設計的肽，以及其中一些肽中的至少一些胺基酸位置保守且其餘位置是隨機的肽。
在自然界中，藉由水解產生的肽在抗原結合至MHC蛋白之前經歷水解。第I類MHC通常呈遞衍生自在細胞質中被主動合成的蛋白質的肽。相比之下，第II類MHC通常呈遞衍生自進入細胞內吞途徑的外源性蛋白，或者ER中被合成的蛋白質的肽。細胞內運輸允許肽與MHC蛋白締合。
肽結合至MHC肽結合溝可以控制MHC空間排列及/或受到TCR辨識的肽胺基酸殘基，或由如本文揭示經遺傳修飾的動物產生的pMHC結合蛋白。這種空間控制一部分歸因於在肽和MHC蛋白之間形成的氫鍵。基於肽如何結合至不同MHC的知識，可以確定在不同肽之間變化的主要MHC錨定胺基酸與表面暴露的胺基酸。在一些具體例中，MHC結合肽的長度為5至40個胺基酸殘基，例如6至30個胺基酸殘基、例如8至20個胺基酸殘基、例如9至11個胺基酸殘基，包括長度在5至40個胺基酸之間的任何大小的肽，以整數遞增(即5、6、7、8、9…40)。儘管天然結合第II類MHC的肽大約在9-40個胺基酸之間變化，但在幾乎所有情況下，該肽均可被截短成9-11個胺基酸核心，而不會喪失MHC結合活性或T細胞辨識作用。
本發明pMHC複合體中的肽通常是傳染原蛋白(例如細菌，病毒或寄生生物)，過敏原和腫瘤相關蛋白的至少一部分，例如抗原決定位。較佳地，pMHC複合體包含癌細胞的抗原決定位。癌細胞的例示性抗原決定位包括LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBVCore(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPV E7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYES1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(Survivin)(96-014)、酪胺酸酶(369-377、371D)，與WT1(126-134)。例示性HPV E7(11-19)肽序列是國際專利公開案WO 2019/005897的YMLDLQPET(SEQ ID NO:7)，SEQ ID NO:537。例示性HPV E7 (82-90)肽序列是國際專利公開案WO 2019/005897的LLMGTLGIV(SEQ ID NO:8)，SEQ ID NO:538。國際專利公開案WO 2019/005897的內容以全文引用的方式併入本文。
適合併入本發明pMHC靶向部分的癌細胞的其他抗原決定位是下面表3中列出的癌症新抗原及其對應HLA對偶基因。新抗原相對於野生型對偶基因含有突變，或是因為癌細胞中表現新開放讀框的結果，如Fritschet al. , 2014, Cancer Immunol Res 2:522-529的表1中所示，並以全文引用的方式併入本文。
表3
基因 HLA 對偶基因 新抗原 SEQ ID NO:
ECGF-1 B 07:02 RPHAIRRPLAL 9
ME-1 A 02:01 FLDEFMEGV 10
PLEKHM2 A 01:01 LTDDRLFTCY 11
FNDC3B A 02:01 VVMSWAPPV 12
PRDX5 A 02:01 LLLDDLLVSI 13
MATN2 A 11:01 KTLTSVFQK 14
DDX21 A 68:01 EAFIQPITR 15
RBAF B 07:02 RPHVPESAF 16
GAS7 A 02:01 SLADEAEVYL 17
ATR A 03:01 KLYEEPLLK 18
SIRT2 A 03:01 KIFSEVTLK 19
EF2 A 68:02 ETVSEQSNV 20
KIAA0223 A 02:01 VLHDDLLEA 21
GAPDH A 02:01 GIVEGLITTV 22
BCL2A1 A 24:02 DYLQYVLQI 23
HSP70 A 02:01 SLFEGIDIYT 24
ACTININ A 02:01 FIASNGVKLV 25
CDK12 A 11:01 CILGKLFTK 26
KIAA1440 A 01:01 QTACEVLDY 27
HAUS3 A 02:01 ILNAMIAKI 28
BCL2A1 B 44:03 KEFEDDIINW 29
PPP1R3B A 01:01 YTDFHCQYV 30
HB-1 B 44:03 EEKRGSLHVW 31
MUM-2 B 44:02 SELFRSGLDSY 32
KIAA0205 B 44:03 AEPIDIQTW 33
GPNMB A 03:01 TLDWLLQTPK 34
CSNK1A1 A 02:01 GLFGDIYLAI 35
CLPP A 02:01 ILDKVLVHL 36
CTNNB1 A 24:02 SYLDSGIHF 37
SNRP116 A 03:01 KILDAVVAQK 38
OS9 B 44:03 KELEGILLL 39
MYH2 A 03:01 KINKNPKYK 40
MART-2 A 01:01 FLEGNEVGKTY 41
NFYC B 52:01 AQQITKTEV 42
CDK4 A 02:01 ACDPHSGHFV 43
pARF14-ORF3 A 11:01 AVCPWTWLR 44
HMSD-n B 44:03 MEIFIEVFSHF 45
PANE-1 A 03:01 RVWDLPGVLK 46
MUM1 B 44:02 EEKLIVVLF 47
P2x5 B 07:02 TPNQRQNVC 48
6.5.        多聚化部分 6.5.1.  Fc結構域
本發明IL2促效劑可包括衍生自任何合適物種的Fc區。在一個具體例中，Fc區衍生自人類Fc結構域。在較佳具體例中，IL2結構域融合至IgG Fc分子。
IL2結構域可以融合至IgG Fc區的N端或C端。如實例中所示，融合至IgG Fc區的C端比融合至IgG Fc區的N端可以更大程度地維持IL2結構域活性。
本發明的一個具體例涉及一種二聚體，其包含藉由將IL2結構域融合至抗體的Fc區而創造出來的兩條Fc融合多肽。例如，可以藉由將編碼融合蛋白的基因融合物插入適當的表現載體中、在用重組表現載體轉形的宿主細胞中表現基因融合物，並使表現的融合蛋白像抗體一樣組裝來製造二聚體，在之後於Fc部分之間形成鏈間鍵以產生二聚體。
Fc結構域可衍生自任何合適類型的抗體，包括IgA(包括亞類IgA1和IgA2)、IgD、IgE，IgG(包括亞類IgG1、IgG2，IgG3和IgG4)以及IgM。在一個具體例中，Fc結構域衍生自IgG1、IgG2，IgG3或IgG4。在一個具體例中，Fc結構域衍生自IgG1。在一個具體例中，Fc結構域衍生自IgG4。
Fc區內的兩個Fc結構域可以彼此相同或不同。在天然抗體中，Fc結構域通常是相同的，但是出於生產多特異性結合分子(例如本發明的IL2促效劑)之目的，Fc結構域可以有利地不同以允許異二聚化，如下文第6.5.1.2節中所述。
在天然抗體中，IgA，IgD和IgG的重鏈Fc結構域由兩個重鏈恆定結構域(CH2和CH3)組成，而IgE和IgM的重鏈Fc結構域由三個重鏈恆定結構域(CH2，CH3和CH4)組成。這些二聚化以產生Fc區。
在本發明的IL2促效劑中，Fc區及/或其中的Fc結構域可包含一或多種不同類型抗體(例如一種，兩種或三種不同類型)的重鏈恆定結構域。
在一個具體例中，Fc區包含衍生自IgG1的CH2和CH3結構域。
在一個具體例中，Fc區包含衍生自IgG2的CH2和CH3結構域。
在一個具體例中，Fc區包含衍生自IgG3的CH2和CH3結構域。
在一個具體例中，Fc區包含衍生自IgG4的CH2和CH3結構域。
在一個具體例中，Fc區包含來自IgM的CH4結構域。IgM CH4結構域通常位於CH3結構域的C端處。
在一個具體例中，Fc區包含衍生自IgG的CH2和CH3結構域，以及衍生自IgM的CH4結構域。
應理解，用於產生本發明IL2促效劑之Fc區的重鏈恆定結構域可包括上述天然存在恆定結構域的變體。與野生型恆定結構域相比，此類變體可包含一或多個胺基酸變異。在一個實例中，本發明的Fc區包含至少一個恆定結構域，其與野生型恆定結構域的序列不同。應當理解，變體恆定結構域可以比野生型恆定結構域更長或更短。較佳地，變體恆定結構域與野生型恆定結構域至少60%一致或相似。在另一個實例中，變體恆定結構域是至少70%一致或相似。在另一個實例中，變體恆定結構域是至少80%一致或相似。在另一個實例中，變體恆定結構域是至少90%一致或相似。在另一個實例中，變體恆定結構域是至少95%一致或相似。
IgM和IgA在人類中以常見H2L2抗體單元的共價多聚體形式天然存在。IgM併入J鏈時以五聚體形式出現，或缺少J鏈時會以六聚體形式出現。IgA以單體和二聚體形式存在。IgM和IgA的重鏈具有18個胺基酸延伸到C端恆定結構域，稱為尾部(tailpiece)。尾部包括半胱胺酸殘基，該半胱胺酸殘基在聚合物中的重鏈之間形成二硫鍵，並且據信在聚合作用中具有重要作用。尾部還包含一個醣基化位點。在某些具體例中，本發明的IL2促效劑不包含尾部。
併入至本發明IL2促效劑中的Fc結構域可包含一或多種修飾，該修飾改變蛋白質的功能性質，例如結合至諸如FcRn的Fc受體或白血球受體、結合至補體、經修飾的二硫鍵結構或經改變的醣基化模式。改變效應子功能的例示性Fc修飾描述於第6.5.1.1節中。
還可以改變Fc結構域以納入增進不對稱IL2促效劑的可製造性的修飾，例如藉由允許異二聚化，其是非同一Fc結構域比同一Fc結構域更偏好配對。異二聚化允許生產IL2促效劑，其中不同的多肽組分藉由含有在序列上不同之Fc結構域的Fc區彼此連接。第6.5.1.2中節舉例說明了異二聚化策略。
將意識到，上文提及的任何修飾可以按任何合適的方式組合以獲得所需的功能性質，及/或與其他修飾組合以改變IL2促效劑的性質。 6.5.1.1.      具有效應子功能經改變的Fc結構域
在一些具體例中，Fc結構域包含減少結合至Fc受體及/或減少效應子功能的一或多個胺基酸置換。
在特定實施例中，Fc受體是Fcγ受體。在一個具體例中，Fc受體是人類Fc受體。在一個具體例中，Fc受體是活化的Fc受體。在一個特定具體例中，Fc受體是活化的人類Fcγ受體，更具體地人類FcγRIIIA，FCγRI或FcγRIIa，最具體地人類FcγRIIIa。在一個具體例中，效應子功能選自由補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)和細胞激素分泌組成之群的一或多者。在一個特定具體例中，效應子功能是ADCC。
在一個具體例中，Fc區在選自由E233、L234、L235、N297，P331和P329(根據Kabat EU索引來編號)組成之群的位置處包含胺基酸置換。在一個更特定的具體例中，Fc區在選自由L234，L235和P329(根據Kabat EU索引來編號)組成之群的位置處包含胺基酸置換。在一些具體例中，Fc區包含胺基酸置換L234A和L235A(根據Kabat EU索引來編號)。在一個這樣的具體例中，Fc區是Igd Fc區，特別是人類Igd Fc區。在一個具體例中，Fc區在位置P329處包含胺基酸置換。在一個更特定的具體例中，胺基酸置換是P329A或P329G，特別是P329G(根據Kabat EU索引來編號)。在一個具體例中，Fc區在位置P329處包含胺基酸置換，並且在選自E233、L234、L235，N297和P331(根據Kabat EU索引來編號)的位置處包含又一個胺基酸置換。在一個更特定的具體例中，又一個胺基酸置換是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A，N297D或P331S。在特定具體例中，Fc區在位置P329，L234和L235(根據Kabat EU索引來編號)處包含胺基酸置換。在更特定的具體例中，Fc區包含胺基酸突變L234A、L235A和P329G(「P329G LALA」，「PGLALA」或「LALAPG」)。
通常，在Fc區的兩個Fc結構域的每一者中存在相同的一或多個胺基酸置換。因此，在一個特定的具體例中，Fc區的每個Fc結構域包含胺基酸置換L234A，L235A和P329G(Kabat EU索引編號)，也就是在Fc區中的第一Fc結構域和第二Fc結構域的每一者中，位置234處的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代(L234A)，位置235處的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代(L235A)，且位置329處的脯胺酸殘基被甘胺酸殘基取代(P329G)(根據Kabat EU索引來編號)。
在一個具體例中，Fc結構域是IgG1 Fc結構域，特別是人類IgG1 Fc結構域。
通常，在Fc區的兩個Fc結構域的每一者中存在相同的一或多個胺基酸置換。因此，在一個特定的具體例中，Fc區的每個Fc結構域包含胺基酸置換L234A，L235A和P329G(Kabat EU索引編號)，也就是在Fc區中的第一Fc結構域和第二Fc結構域的每一者中，位置234處的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代(L234A)，位置235處的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代(L235A)，且位置329處的脯胺酸殘基被甘胺酸殘基取代(P329G)(根據Kabat EU索引來編號)。
在一個具體例中，Fc結構域是IgG1 Fc結構域，特別是人類IgG1 Fc結構域。在一些具體例中，IgG1 Fc結構域是包含D265A，N297A突變(EU編號)以降低效應子功能的變體IgG1。
在另一個具體例中，Fc結構域是對Fc受體的結合減少的IgG4 Fc結構域。對Fc受體的結合減少之例示性IgG4 Fc結構域可包含選自下表4的胺基酸序列：在一些具體例中，Fc結構域僅包括以下所示序列的粗體部分：
表4
 
Fc 結構域 序列 SEQ ID NO:
WO2014/121087的SEQ ID NO:1 Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 49
WO2014/121087的SEQ ID NO:2 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 50
WO2014/121087的SEQ ID NO:30 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys ValGlu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 51
WO2014/121087的SEQ ID NO:31 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg ValGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 52
WO2014/121087的SEQ ID NO:37 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys ValGlu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 53
WO2014/121087的SEQ ID NO:38 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg ValGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 54
在一個特定的具體例中，具有效應子功能降低的IgG4包含WO2014/121087的SEQ ID NO:31的胺基酸序列的粗體部分，在本文中有時稱為IgG4或hIgG4。
對於異二聚體Fc區，可以併入上述變體IgG4 Fc序列的組合，例如包含WO2014/121087的SEQ ID NO:30(或其粗體部分)與WO2014/121087的SEQ ID NO:37(或其粗體部分)之組合的Fc區，或包含WO2014/121087的SEQ ID NO:31(或其粗體部分)與WO2014/121087的SEQ ID NO:38(或其粗體部分)之組合的Fc區。 6.5.1.2  Fc異二聚化變體
某些IL2促效劑需要兩個Fc結構域之間的二聚化，與天然免疫球蛋白不同，其可操作地連接至不同的N端區域，例如一個Fc結構域連接至Fab，而另一個Fc結構域連接至IL2部分。兩個Fc區的異二聚化不恰當而形成Fc結構域可能是增加所需異二聚體分子產量的障礙，並且代表了純化的挑戰。可以使用本技藝中可用的多種方法來提高可能存在於本發明IL2促效劑中之Fc結構域的二聚化，例如，如EP 1870459A1；美國專利第5,582,996號；美國專利第5,731,168號；美國專利第5,910,573號；美國專利第5,932,448號；美國專利第6,833,441號；美國專利第7,183,076號；美國專利申請公開案第2006204493A1號；及PCT公開案第WO 2009/089004A1號中所揭示。
本發明提供了包含Fc異二聚體的IL2促效劑，即包含異質，不同Fc結構域的Fc區。通常，Fc異二聚體中的各個Fc結構域包含抗體的CH3結構域。如前節中所述，CH3結構域衍生自任何同型，類型或亞類抗體的恆定區，並且較佳地是IgG (IgG1、IgG2，IgG3和IgG4)類的恆定區。
在CH3結構域處，兩個不同重鏈的異二聚化產生期望的IL2促效劑，而相同重鏈的同二聚化將降低所期望IL2促效劑的產率。因此，在一個較佳具體例中，締合而形成本發明IL2促效劑的多肽將含有相對於未經修飾Fc結構域，具有有利於異二聚體締合的修飾的CH3結構域。
在一個特定的具體例中，該促進Fc異二聚體形成的修飾是所謂的「杵入臼(knob-into-hole)」或「臼內杵(knob-in-hole)」修飾，其在Fc結構域的一者中包含「杵」修飾，並在另一個Fc結構域中包含「臼」修飾。杵入臼技術描述於例如美國專利第5,731,168號；US 7,695,936；Ridgwayet al. , 1996, Prot Eng 9:617-621，以及Carter, 2001, Immunol Meth 248:7-15中。通常，該方法涉及在第一多肽的界面處引入隆突(「杵」)，並在第二多肽的界面中引入相應的腔(「臼」)，使得可以將該隆突置入腔中而促進異二聚體形成並阻礙同二聚體形成。透過用較大的側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)取代第一多肽的界面的小胺基酸側鏈來構建隆突。透過用較小的胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)取代較大的胺基酸側鏈，在第二多肽的界面中創造出與隆突大小相同或相似的互補腔。
因此，在一些具體例中，於Fc結構域的第一次單位的CH3結構域中，胺基酸殘基被具有較大側鏈體積的胺基酸殘基所取代，從而在其第一次單位的CH3結構域內產生隆突，該隆突可定位在第二次單位的CH3結構域內的腔中，而於Fc結構域的第二次單位的CH3結構域中，胺基酸殘基被具有較小側鏈體積的胺基酸殘基所取代，從而在第二次單位的CH3結構域內產生腔，其內可定位第一次單位的CH3結構域內的隆突。較佳地，該具有較大側鏈體積的胺基酸殘基選自由精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)，酪胺酸(Y)和色胺酸(W)組成之群。較佳地，該具有較小側鏈體積的胺基酸殘基選自由丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)，和纈胺酸(V)組成之群。隆突和腔可以藉由改變編碼多肽的核酸來做出，例如藉由定點誘變或藉由肽合成。例示性的置換是Y470T。
在特定的此類具體例中，於第一個Fc結構域中，位置366處的蘇胺酸殘基被色胺酸殘基所取代(T366W)，而於Fc結構域中，位置407處的酪胺酸殘基被纈胺酸殘基所取代(Y407V)，且視情況位置366處的蘇胺酸殘基被絲胺酸殘基所取代(T366S)，而位置368處的白胺酸殘基被丙胺酸殘基所取代(L368A)(根據Kabat EU索引來編號)。在又一個具體例中，額外於第一Fc結構域中，位置354處的絲胺酸殘基被半胱胺酸殘基所取代(S354C)，或位置356處的麩胺酸殘基被半胱胺酸殘基取代(E356C)(特別是在位置354處的絲胺酸殘基被半胱胺酸殘基所取代)，且額外於第二Fc結構域中，位置349處的酪胺酸殘基被半胱胺酸殘基所取代(Y349C)(根據Kabat EU索引來編號)。在一個特定的具體例中，第一Fc結構域包含胺基酸置換S354C和T366W，而第二Fc結構域包含胺基酸置換Y349C、T366S，L368A和Y407V(根據Kabat EU索引來編號)。
在一些具體例中，靜電控制(例如如在Gunasekaranet al. , 2010, J Biol Chem 285(25): 19637-46中所述)可用於促進Fc區的第一Fc結構域和第二Fc結構域締合。
或者或另外，使用被修飾成促進異二聚化的Fc結構域，可以修飾Fc結構域以允許能夠選出Fc異二聚體的純化策略。在一個這樣的具體例中，一個多肽包含經修飾的Fc結構域，該經修飾的Fc結構域消除了其與蛋白A的結合，從而使得能夠產生異二聚體蛋白的純化方法。參見，例如美國專利第8,586,713號。這樣，IL2促效劑包含第一CH3結構域和第二Ig CH3結構域，其中第一和第二Ig CH3結構域彼此相差至少一個胺基酸，且相較於缺少該胺基酸差異的對應IL2促效劑，其中至少一個胺基酸差異降低了IL2促效劑對蛋白A的結合。在一個具體例中，第一CH3結構域結合蛋白A，而第二CH3結構域含有減少或消除蛋白A結合的突變/修飾，諸如H95R修飾(依據IMGT外顯子編號；依據EU編號為H435R)。第二CH3可進一步包含Y96F修飾(依據IMGT；依據EU為Y436F)。這類修飾在本文中稱為「星(star)」突變。
在一些具體例中，Fc可含有一或多個突變(例如杵和臼突變)以促進異二聚化，還有星突變以促進純化。 6.6.        穩定化部分
本發明IL2促效劑可包含穩定化部分，該穩定化部分可以在活體內延長分子的血清半衰期。血清半衰期通常分為α期和β期。透過添加適當的穩定化部分，可以顯著改善任一期或兩期。例如，相對於不含有該穩定化部分的對應IL2促效劑，穩定化部分可將IL2促效劑的血清半衰期增加達超過5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、400、600、800，1000%或更多。出於本發明之目的，血清半衰期可以指在人類或其他哺乳動物(例如小鼠或非人類靈長類動物)中的半衰期。
野生型IL2的血清半衰期少於10分鐘。本發明IL2促效劑較佳在人類及/或小鼠中的血清半衰期為至少約2小時、至少約4小時，至少約6小時或至少約8小時。在一些具體例中，本發明IL2促效劑的血清半衰期為至少10小時、至少12小時、至少15小時、至少18小時、至少24小時、至少36小時、至少48小時，至少60小時或至少72小時。
穩定化部分包括聚氧化烯部分(例如聚乙二醇)、糖(例如唾液酸)和耐受良好的蛋白質部分(例如Fc及其片段和變體，轉鐵蛋白或血清白蛋白)。
可用於本發明IL2促效劑中的其他穩定化部分包括在Kontermannet al. , 2011, Current Opinion in Biotechnology 22:868-76中描述的那些。這樣的穩定化部分包括，但不限於人類血清白蛋白融合物、人類血清白蛋白綴合物、人類血清白蛋白結合劑(例如Adnectin PKE、AlbudAb、ABD)、XTEN融合物、PAS融合物(即基於三個胺基酸脯胺酸，丙胺酸和絲胺酸的重組PEG模擬物)、碳水化合物綴合物(例如羥乙基澱粉(HES))、醣基化，聚唾液酸綴合物和脂肪酸綴合物。
因此，在一些具體例中，本發明提供了一種IL2促效劑，其包含為聚合糖的穩定化部分。
血清白蛋白還可以透過能夠與白蛋白非共價交互作用的模塊參與半衰期延長。因此，本發明IL2促效劑可包括白蛋白結合蛋白作為穩定化部分。白蛋白結合蛋白可以綴合或遺傳融合至本發明IL2促效劑的一或多個其他組分。從某些細菌已知具有白蛋白結合活性的蛋白質。例如，鏈球菌蛋白G含有幾個由約50個胺基酸殘基(6 kDa)組成的小白蛋白結合結構域。血清白蛋白結合蛋白的其他實例，諸如那些描述於美國公開案第2007/0178082號和第2007/0269422號中者。白蛋白結合結構域與蛋白質的融合導致半衰期大大延長(參見Kontermannet al. , 2011, Current Opinion in Biotechnology 22:868-76)。
在其他具體例中，穩定化部分是人類血清白蛋白。在其他具體例中，穩定化部分是運鐵蛋白。
在一些具體例中，穩定化部分是Fc結構域，例如在第6.5.1節及其小節中描述的任一種Fc結構域，以引用的方式併入本文。在第6.5.1節中描述的Fc結構域通常能夠二聚化。然而，出於穩定化之目的，Fc結構域可以是自我締合能力降低的可溶性單體Fc結構域。參見例如Helmet al. , 1996, J. Biol. Chem. 271: 7494-7500與Yinget al ., 2012, J Biol Chem. 287(23):19399–19408。可溶性單體Fc結構域的一個實例包含在CH3中對應於T366及/或Y407的位置中的胺基酸置換，如在美國專利公開案第2019/0367611號中所述。如第6.5.1節及其小節中所述，單體Fc結構域可以是任何Ig亞型，並且可包括減少效應子功能的其他置換。
在又其他具體例中，穩定化部分是聚乙二醇部分或另一種聚合物，如以下第6.6.1節中所述。
穩定化部分可以經由連接子連接至本發明IL2促效劑的一或多個其他組分，例如如以下第6.7節中所述。 6.6.1     .聚乙二醇
在一些具體例中，IL2促效劑包含聚乙二醇(PEG)或另一種親水性聚合物作為穩定化部分，例如乙二醇/丙二醇、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、聚葡萄糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚合物可以具有任何分子量，並且可以是分支或未分支的。
PEG是已知的水溶性聚合物，其是可商購的或根據本技藝中熟知的方法藉由乙二醇的開環聚合來製備(Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161)。術語「PEG」廣泛用於涵蓋任何聚乙二醇分子，而不考慮大小或在PEG末端處的修飾，並且可以由下式表示：X-O(CH2 CH2 O)n -1CH2 CH2 OH，其中n為20至2300，而X為H或末端修飾，例如C1-4 烷基。PEG可以含有更多結合反應所需的化學基團，這是分子化學合成的結果；或充當間隔子以實現分子各部分的最佳距離。另外，這種PEG可以由連接在一起的一或多個PEG側鏈組成。具有超過一個PEG鏈的PEG稱為多臂或分支PEG。分支PEG描述於例如歐洲申請案第473084A號和美國專利第5,932,462號。
一或多個PEG分子可以附接在IL2促效劑上的不同位置處，且這種附接可以藉由與胺，硫醇或其他合適的反應基團反應來實現。胺部分可以是例如在IL2促效劑(或其組分)N-端發處現的一級胺，或存在於胺基酸中的胺基團(諸如離胺酸或精胺酸)。在一些具體例中，PEG部分在a)N-端處；b)在N端和最N端的α螺旋之間；c)位於IL2的表面結合至IL2-Rβ的環；d)在C端和最C端的α螺旋之間；e)連接兩個阿爾法螺旋的環；及/或f)在C端處附接在IL促效劑上的位置處。
可藉由定點PEG化來實現PEG化，其中將合適的反應基團引入蛋白質中以創造出一個偏好發生PEG化的位點。在一些具體例中，IL2促效劑經修飾而在所需位置處引入半胱胺酸殘基，允許在半胱胺酸上進行定點PEG化。可將突變引入本發明IL2促效劑的編碼序列中以產生半胱胺酸殘基。例如，這可以透過將一或多個胺基酸殘基突變成半胱胺酸來實現。用於突變成半胱胺酸殘基的較佳胺基酸包括絲胺酸、蘇胺酸，丙胺酸和其他親水性殘基。較佳地，被突變成半胱胺酸的殘基是表面暴露的殘基。基於一級序列或三維結構，用於預測殘基的表面可及性的演算法在本技藝中是眾所周知的。IL2的三維結構描述於例如Wanget al. , 2005, Science 310(5751):1159-63，並且可用於鑑定能被突變成半胱胺酸的表面暴露殘基。可以選擇突變以避免破壞IL2與其一或多個受體之間的交互作用，儘管在一些具體例中(例如在需要偏好結合至受體的情況下)設計了用半胱胺酸置換胺基酸和隨後聚乙二醇化，以減少結合至一或多個受體，例如IL2-Rα或IL2-Rβ。半胱胺酸殘基的PEG化可以使用例如PEG-馬來醯亞胺、PEG-乙烯基碸，PEG-碘乙醯胺或PEG-鄰吡啶基二硫化物進行。
PEG通常用適合於偶合至多肽上所需位點的合適活化基團予以活化。PEG化方法是本技藝中所熟知的，並進一步描述於Zalipskyet al. , “Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992)，和Zalipsky, 1995, Advanced Drug Reviews 16: 157-182中。
PEG部分的分子量可以廣泛變化並且可以是支鏈或直鏈。通常，PEG的重量平均分子量為約100道耳頓至約150,000道耳頓。PEG的例示性重量平均分子量包括約20,000道耳頓、約40,000道耳頓，約60,000道耳頓和約80,000道耳頓。在某些具體例中，PEG的分子量是40,000道耳頓。也可以使用具有任何前述總分子量的PEG的支鏈形式。在一些具體例中，PEG具有兩個支鏈。在其他具體例中，PEG具有四個支鏈。在另一個具體例中，PEG是雙-PEG(NOF Corporation，DE-200MA)，其中兩個含IL2的多肽鏈被綴合。
本技藝中已知的常規分離和純化技術可用於純化PEG化的IL2促效劑，諸如尺寸排阻(例如凝膠過濾)和離子交換層析。也可以使用SDS-PAGE分離產物。可以被分離的產物包括單、二、三，聚PEG化和非PEG化IL2促效劑，以及游離PEG。可以透過在洗脫峰周圍合併較寬的溶離份以增加組成物中單PEG的百分比來控制單PEG綴合物百分比。約90%的單-PEG綴合物代表了產率和活性的良好平衡。
在一些具體例中，PEG化IL2促效劑較佳將保留至少約25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%，95%或100%與未經修飾IL2促效劑有關的生物活性。在一些具體例中，生物活性是指其結合至高或中等親和力IL2受體的能力，如由KD ，kon 或koff 所評估的。 6.7.        連接子
在某些態樣中，本發明提供了IL2促效劑，其中IL2促效劑的兩個或更多個組分藉由肽連接子彼此連接。作為實例而非限制，連接子可用於連接(a)IL2部分和多聚化部分；(b)IL2部分和靶向部分；(c)靶向部分和多聚化部分(例如Fab結構域和Fc結構域)；(d)一個IL2部分內的不同結構域(例如IL2結構域和IL-Rα結構域)；或(e)靶向部分內的不同結構域(例如肽-MHC複合體的不同組分或scFv中的VH結構域和VL結構域)。
肽連接子的長度範圍可以是2個胺基酸至60個或更多個胺基酸，且在某些態樣中，肽連接子的長度範圍是3個胺基酸至50個胺基酸、4個至30個胺基酸、5個至25個胺基酸、10個至25個胺基酸、10個胺基酸至60個胺基酸、12個胺基酸至20個胺基酸、20個胺基酸至50個胺基酸，或25個胺基酸至35個胺基酸。
在特定態樣中，肽連接子的長度為至少5個胺基酸、至少6個胺基酸或至少7個胺基酸，且長度視情況為至多30個胺基酸、至多40個胺基酸，至多50個胺基酸或至多60個胺基酸。
在前述的一些具體例中，連接子的長度範圍是5個胺基酸至50個胺基酸，例如長度範圍是5至50、5至45、5至40、5至35、5至30，5至25或5至20個胺基酸。在前述的其他具體例中，連接子的長度範圍為6個胺基酸至50個胺基酸，例如長度範圍為6至50、6至45、6至40、6至35、6至30，6至25或6至20個胺基酸。在前述的又其他具體例中，連接子的長度範圍為7個胺基酸至50個胺基酸，例如長度範圍為7至50、7至45、7至40、7至35、7至30，7至25或7至20個胺基酸。
帶電荷的(例如帶電荷的親水性連接子)及/或撓性連接子是特佳的。
可用於本發明IL2促效劑的撓性連接子的實例包括那些由Chenet al. , 2013, Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369與Kleinet al. , 2014, Protein Engineering, Design & Selection 27(10): 325-330所描述者。特別有用的撓性連接子是或包含重複的甘胺酸和絲胺酸，例如Gn S(SEQ ID NO:55)或SGn (SEQ ID NO:56)的單體或多聚體，其中n是1至10的整數，例如1、2、3、4、5、6、7、8，9或10。在一個具體例中，連接子是或包含重複G4 S的單體或多聚體，例如(GGGGS)n (SEQ ID NO:57)。
聚甘胺酸連接子可合適地用於本發明的IL2促效劑中。在一些具體例中，肽連接子包含兩個連續甘胺酸(2Gly)、三個連續甘胺酸(3Gly)、四個連續甘胺酸(4Gly)(SEQ ID NO:58)、五個連續甘胺酸(5Gly)(SEQ ID NO:59)、六個連續甘胺酸(6Gly)(SEQ ID NO:60)、七個連續甘胺酸(7Gly)(SEQ ID NO:61)，八個連續甘胺酸(8Gly)(SEQ ID NO:62)或九個連續甘胺酸(9Gly)(SEQ ID NO:63)。 6.7.1.  pMHC連接子
關於pMHC複合體，合適的連接子範圍可以從1個胺基酸(例如Gly)至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸、包括4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸，或7個胺基酸至8個胺基酸，且可以是1、2、3、4、5，6或7個胺基酸。除上述連接子外，pMHC連接子還包括甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括，例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GGGS)n(SEQ ID NO:65)，其中n是至少為一的整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物和本技藝中已知的其他撓性連接子。可以使用甘胺酸和甘胺酸-絲胺酸聚合物；Gly和Ser都相對無特定結構，因此可以充當組件之間的中性栓繫。可以使用甘胺酸聚合物；甘胺酸比丙胺酸更能接近phi-psi空間，並且比具有更長側鏈的殘基限制更少(參見Scheraga, 1992, Rev. Computational Chem. 1 1173-142，以其整體併入本文)。例示性連接子可包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG(SEQ ID NO:66)、GGSGG(SEQ ID NO:67)、GSGSG(SEQ ID NO:68)、GSGGG(SEQ ID NO:69)、GGGSG(SEQ ID NO:70)、GSSSG(SEQ ID NO:71)、GCGASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:72)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:73)、GGGASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:74)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:6)、GGGASGGGGS(SEQ ID NO:75)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:76)，GCGGS(SEQ ID NO:77)與類似序列。在一些具體例中，連接子多肽包括可與存在於pMHC複合體另一部分中的半胱胺酸殘基形成二硫鍵的半胱胺酸殘基。在某些具體例中，連接子包含胺基酸序列GCGGS(SEQ ID NO:77)。用半胱胺酸置換G4 S連接子(SEQ ID NO:57)中的甘胺酸可導致形成二硫鍵，例如在HLA.A2中具有相應半胱胺酸置換的MHC靶向部分，其使MHC在MHC複合體中穩定。 6.7.2.  鉸鏈序列
在其他具體例中，本發明IL2促效劑包含為鉸鏈區的連接子。特別地，當IL2促效劑含有基於免疫球蛋白的靶向部分時，鉸鏈可用於將靶向部分(例如Fab結構域)連接至多聚化結構域(例如Fc結構域)。鉸鏈區可以是天然的或經修飾的鉸鏈區。鉸鏈區通常位於Fc區的N端。除非上下文另外指出，否則術語「鉸鏈區」是指天然的或非天然的鉸鏈序列，其在單個或單體多肽鏈的情況下是單體鉸鏈結構域，並且在二聚體多肽的情況下(例如，透過兩個Fc結構域締合形成的同二聚體或異二聚體IL2促效劑)可以在個別多肽鏈上包含兩個締合的鉸鏈序列。
天然鉸鏈區是通常在天然抗體的Fab和Fc結構域之間發現的鉸鏈區。經修飾的鉸鏈區是長度及/或組成與天然鉸鏈區不同的任何鉸鏈。這樣的鉸鏈可以包括來自其他物種的鉸鏈區，諸如人類、小鼠、大鼠、兔、鯊魚、豬、倉鼠、駱駝，駝馬或山羊鉸鏈區。其他經修飾的鉸鏈區可包含衍生自與重鏈Fc區不同類別或亞類的抗體的完整鉸鏈區。或者，經修飾的鉸鏈區可包含天然鉸鏈或重複單元的一部分，其中重複中的每個單元均源自天然鉸鏈區。在另一替代方案中，可以透過將一或多個半胱胺酸或其他殘基轉化為中性殘基(例如絲胺酸或丙胺酸)，或透過將適當放置的殘基轉化為半胱胺酸殘基來改變天然鉸鏈區。透過這種方式，可以增加或減少鉸鏈區中的半胱胺酸殘基數目。其他經修飾的鉸鏈區可以是完全合成的，並且可以設計成具有所需的特性，諸如長度，半胱胺酸組成和撓性。
例如，在美國專利第5,677,425號、WO 99/15549、WO 2005/003170、WO 2005/003169、WO 2005/003170，WO 98/25971和WO 2005中已經描述了許多經修飾的鉸鏈區，且這些文件以引用的方式併入本文。
在一個具體例中，本發明IL2促效劑包含一個Fc區，其中一個或兩個Fc結構域在其N端處具有一個完整的鉸鏈區。
在不同具體例中，鉸鏈區內的位置233-236可以是G、G、G與未佔據；G、G、未佔據，與未佔據；G、未佔據、未佔據與未佔據；或全部未佔據，其中依據EU編號將位置進行編號。
在一些具體例中，本發明IL2促效劑包含經修飾的鉸鏈區，其相對於同一同型(例如人類IgG1或人類IgG4)的野生型鉸鏈區降低了對Fcγ受體的結合親和力。
在一個具體例中，本發明IL2促效劑包含一個Fc區，其中每個Fc結構域在其N端處具有一個完整的鉸鏈區，其中每個Fc結構域和鉸鏈區均衍生自IgG4，且每個鉸鏈區包含經修飾的序列CPPC(SEQ ID NO:78)。與含有序列CPPC(SEQ ID NO:78)的IgG1相比，人類IgG4的核心鉸鏈區含有序列CPSC(SEQ ID NO:79)。lgG4序列中存在的絲胺酸殘基導致該區中的撓性增加，並因此一部分分子在同一蛋白質鏈內形成二硫鍵(鏈內二硫)，而不是與IgG分子中的另一條重鏈橋接形成鏈間二硫。(Angelet al. , 1993, Mol Immunol 30(1):105-108)。將絲胺酸殘基變成脯胺酸以提供與lgG1相同的核心序列，可在lgG4鉸鏈區完全形成鏈間二硫，從而減少經純化產物中的異質性。這個經改變的同型稱為IgG4P。 6.7.2.1  嵌合鉸鏈序列
鉸鏈區可以是嵌合鉸鏈區。
例如，嵌合鉸鏈可包含衍生自人類IgG1，人類IgG2或人類IgG4鉸鏈區的「上鉸鏈」序列，與衍生自人類IgG1，人類IgG2或人類IgG4鉸鏈區的「下鉸鏈」序列組合。
在特定具體例中，嵌合鉸鏈區包含胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO:80)(先前揭示為WO2014/121087的SEQ ID NO:8，其以全文引用的方式併入本文)或ESKYGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO:81)(先前揭示為WO2014/121087的SEQ ID NO:9)。此類嵌合鉸鏈序列可適當地連接至IgG4 CH2區(例如透過併入IgG4 Fc結構域中，例如人類或鼠類Fc結構域，其可在CH2及/或CH3結構域中受到進一步修飾以減少效應子功能，例如如6.5.1.1節中所述)。 6.7.2.2. 效應子功能減少的鉸鏈序列
在進一步的具體例中，鉸鏈區可以被修飾成減少效應子功能，例如如WO2016161010A2中所述，其以全文用的方式併入本文。在各種具體例中，經修飾的鉸鏈區的位置233-236是G、G、G與未佔據；G、G、未佔據與未佔據；G、未佔據、未佔據與未佔據；或全部未佔據，其中依據EU編號對位置進行編號(如WO2016161010A2的圖1中所示)。這些區段可以表示為GGG-、GG--、G---或----，其中「-」表示未佔據的位置。
位置236在典型人類IgG2中未被佔據，但是在其他典型的人類IgG同型中被佔據。在所有四種人類同型中，位置233-235被G以外的殘基所佔據(如WO2016161010A2的圖1中所示)。
位置233-236內的鉸鏈修飾可與被P佔據的位置228組合。位置228在人類IgG1和IgG2中天然被P佔據，但在人類IgG4中被S佔據，且在人類IgG3中被R佔據。IgG4抗體中的S228P突變在穩定IgG4抗體與減少外源性抗體與內源性抗體之間重鏈輕鏈對的交換方面是有利的。較佳地，位置226-229分別被C、P、P和C所佔據。
例示性的鉸鏈區具有殘基226-236，有時稱為中間(或核心)和下鉸鏈，被命名為GGG-(233-236)、GG--(233-236)、G---(233-236)與無G(233-236)的經修飾鉸鏈序列所佔據。視情況，鉸鏈結構域胺基酸序列包含CPPCPAPGGG-GPSVF (SEQ ID NO:82)(先前揭示為WO2016161010A2的SEQ ID NO:1)、CPPCPAPGG--GPSVF(SEQ ID NO:83)(先前揭示為WO2016161010A2的SEQ ID NO:2)、CPPCPAPG---GPSVF(SEQ ID NO:84)(先前揭示為WO2016161010A2的SEQ ID NO:3)或CPPCPAP----GPSVF(SEQ ID NO:85)(先前揭示為WO2016161010A2的SEQ ID NO:4)。
可以將上述經修飾的鉸鏈區併入重鏈恆定區，該重鏈恆定區通常包括CH2和CH3結構域，且其可以具有側接指定區域的額外鉸鏈區段(例如上鉸鏈)。儘管可以是不同同型的混合物，但是存在的此類額外恆定區區段通常是相同同型，較佳為人類同型。這種額外的人類恆定區區段的同型較佳是人類IgG4，但也可以是其中結構域具有不同同型的人類IgG1，IgG2或IgG3或其混合物。人類IgG1，IgG2和IgG4的例示性序列顯示於WO2016161010A2的圖2-4中。
在特定具體例中，經修飾的鉸鏈序列可以連接至IgG4 CH2區(例如，藉由併入IgG4 Fc結構域中，IgG4 Fc結構域為例如可以在CH2及/或CH3結構域中進一步修飾以減少效應子功能的如人類或鼠類Fc結構域，例如如第6.5.1.1節中所述)。 6.8.        核酸與宿主細胞
在另一個態樣中，本發明提供了編碼本發明IL2促效劑的核酸。在一些具體例中，IL2促效劑被單個核酸編碼。在其他具體例中，例如在異二聚體分子或包含由超過一個多肽鏈組成之靶向部分的分子的情況下，IL2促效劑可以由複數個(例如兩個、三個，四個或更多個)核酸所編碼。
單個核酸可編碼包含單一條多肽鏈的IL2促效劑、包含兩條或更多條多肽鏈的IL2促效劑，或包含超過兩條多肽鏈的一部分IL2促效劑(例如，單個核酸可編碼包含三條，四條或更多條多肽鏈的IL2促效劑的兩條多肽鏈，或包含四條或更多條多肽鏈的IL2促效劑的三條多肽鏈)。關於個別的表現控制，編碼兩條或更多條多肽鏈的開放讀框可以受到個別轉錄調節元件(例如啟動子及/或增強子)所控制。編碼兩條或更多條多肽的開放讀框也可以受到相同的轉錄調節元件所控制，並被內部核醣體進入位點(IRES)序列隔開，從而允許轉譯成個別多肽。
在一些具體例中，包含兩條或更多條多肽鏈的IL2促效劑由兩個或更多個核酸編碼。編碼IL2促效劑的核酸的數目可以等於或小於IL2促效劑中的多肽鏈數目(例如，當超過一條多肽鏈是由單個核酸所編碼時)。
本發明的核酸可以是DNA或RNA(例如mRNA)。
在另一個態樣中，本發明提供了含有本發明核酸的宿主細胞和載體。核酸可以存在於相同宿主細胞或個別宿主細胞中的單個載體或個別載體中，如下文更詳細地描述。 6.8.1.  載體
本發明提供了載體，其包含編碼本文所述的IL2促效劑或IL2促效劑組分的核苷酸序列，例如一個半抗體的一條或兩條多肽鏈。載體包括但不限於病毒、質體、黏接質體，λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。
可以採用許多載體系統。舉例來說，一類載體利用衍生自動物病毒(諸如例如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、逆轉錄病毒(Rous肉瘤病毒，MMTV或MOMLV)或SV40病毒)的DNA元件。另一類載體利用了衍生自RNA病毒(諸如Semliki森林病毒、東部馬腦炎病毒和黃病毒)的RNA元件。
另外，可以透過引入允許選擇經轉染宿主細胞的一或多個標記來選擇已將DNA穩定併入其染色體中的細胞。標記可以提供例如針對營養缺陷宿主的原始營養型、殺生物劑抗性(例如抗生素)，或對重金屬(諸如銅)的抗性或類似者。可選擇標記基因可以直接連接至要表現的DNA序列，或藉由共轉形引入細胞中。mRNA的最佳合成可能還需要額外元件。這些元件可以包括剪接信號，還有轉錄啟動子，增強子和終止信號。
一旦已經準備好含有構建物的表現載體或DNA序列用於表現，就可以將表現載體轉染或引入合適的宿主細胞中。可以採用各種技術來實現這一點，諸如例如原生質體融合、磷酸鈣沉澱、電穿孔、逆轉錄病毒轉導、病毒轉染、基因槍，基於脂質的轉染或其他常規技術。用於培養所得經轉染細胞和回收經表現多肽的方法與條件是技藝中具有通常技術者熟知的，並且可以基於本說明根據所使用的特定表現載體和哺乳動物宿主細胞來改變或優化。 6.8.2.  細胞
本發明還提供了包含本發明核酸的宿主細胞。
在一個具體例中，宿主細胞經遺傳改造成包含一或多個本文所述的核酸。
在一個具體例中，藉由使用表現匣對宿主細胞進行遺傳改造。片語「表現匣」是指核苷酸序列，其能夠影響基因在與此類序列相容的宿主中的表現。這樣的匣可以包括啟動子、有或沒有內含子的開放讀框以及終止信號。也可以使用影響表現所必需或有助益的其他因子，諸如例如誘導型啟動子。
本發明還提供了包含本文所述載體的宿主細胞。
細胞可以是，但不限於真核細胞、細菌細胞，昆蟲細胞或人類細胞。合適的真核細胞包括，但不限於Vero細胞、HeLa細胞、COS細胞、CHO細胞、HEK293細胞，BHK細胞和MDCKII細胞。合適的昆蟲細胞包括但不限於Sf9細胞。 6.9.        醫藥組成物 6.9.1.  含有IL2促效劑多肽的醫藥組成物
本發明IL2促效劑可以是呈包含IL2促效劑和一或多種載劑，賦形劑及/或稀釋劑的組成物形式。可以將組成物調配成用於特定用途，諸如用於獸醫用途或人類的醫藥用途。組成物的形式(例如乾燥粉末，液體調配物等)與所使用的賦形劑，稀釋劑及/或載劑將取決於IL2促效劑的預期用途和，治療用途、投藥模式。
關於治療用途，組成物可以作為包括醫藥上可接受載劑的無菌醫藥組成物的一部分來提供。此組成物可以呈任何合適的形式(取決於將其投與給患者的期望方法)。醫藥組成物可以透過各種途徑(諸如經口、穿皮、皮下、鼻內、靜脈內、肌肉內、腫瘤內、鞘內，局部或局部性)被投與給患者。在任何給定情況下，最合適的投藥途徑將取決於特定抗體、個體，疾病的性質和嚴重程度以及個體的身體狀況。通常，醫藥組成物將靜脈內或皮下投與。
醫藥組成物可以方便地以單位劑型存在，每個劑量含有預定量的本發明IL2促效劑。單位劑量中所包括的IL2促效劑數量將取決於所治療的疾病以及本技藝中周知的其他因素。這樣的單位劑量可呈含有某量適於單次投藥的IL2促效劑的凍乾粉末形式，或者是呈液體的形式。乾燥粉末單位劑型可以與注射器，適量稀釋劑及/或其他用於投藥的組分一起被包裝在套組中。呈液體形式的單位劑量可以方便地呈預填充有某量適於單次投藥之IL2促效劑的注射器形式提供。
醫藥組成物也可以按含大量IL2促效劑的整批提供以適於多次投藥。
可藉由將具有所需純度的IL2促效劑與本技藝中通常使用的視情況選用的醫藥上可接受的載劑，賦形劑或穩定劑(在本文中全被稱為「載劑」) (即緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等滲劑、非離子型去污劑，抗氧化劑和其他各種添加劑)混合來製備醫藥組成物，以作為凍乾調配物或水溶液形式儲存。參見Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)。這樣的添加劑在所使用的劑量和濃度下對接受者應無毒。
緩衝劑有助於將pH維持在近似生理條件的範圍內。它們可以以多種濃度存在，但通常以約2 mM至約50 mM的濃度存在。和本發明一起使用的合適緩衝劑包括有機酸和無機酸及其鹽，諸如檸檬酸鹽緩衝劑(例如檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩衝劑(例如琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩衝劑(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩衝劑(例如富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸鹽緩衝劑(例如葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩衝劑(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩衝劑(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和醋酸鹽緩衝劑(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。另外，可以使用磷酸鹽緩衝劑，組胺酸緩衝劑和三甲胺鹽，例如Tris。
可以添加防腐劑以阻止微生物生長，並且可以約0.2%-1%(w/v)範圍之量添加。用於本發明的合適防腐劑包括苯酚、苯甲醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、苯扎鹵銨(例如氯化物，溴化物和碘化物)、氯化六甲銨和對羥基苯甲酸烷基酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚，環己醇和3-戊醇。可以添加有時被稱為「穩定劑」的等滲劑以確保本發明液體組成物的等滲性，並且包括多元糖醇，例如三元或更高級的糖醇，諸如甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、木糖醇，山梨糖醇和甘露糖醇。穩定劑是指廣泛種類的賦形劑，其範圍在功能上可以從增積劑到可增加治療劑溶解或有助於防止變性或黏附於容器壁的添加劑。典型的穩定劑可以是多元糖醇(上面列舉)；胺基酸，諸如精胺酸、離胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、L-白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，諸如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇，甘油與類似物，包括環醣醇(諸如肌醇)；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，諸如脲、穀胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(例如10個殘基或更少的肽)；蛋白質，諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮單醣，諸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；雙醣，諸如乳糖、麥芽糖，蔗糖和海藻糖；和三醣苷，諸如棉子糖；和多醣，諸如聚葡萄糖。穩定劑可以每wt IL2促效劑0.5至10 wt%範圍之量存在。
可以添加非離子型表面活性劑或去污劑(也稱為「潤濕劑」)以幫助醣蛋白溶解並保護醣蛋白免於攪動引起的聚集，允許調配物暴露於剪力表面加壓，而不會引起蛋白質變性。合適的非離子型表面活性劑包括聚山梨糖醇酯(20、80等)、帕洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)和普朗尼克多元醇。非離子型表面活性劑可以約0.05 mg/mL至約1.0 mg/mL的範圍存在，例如約0.07 mg/mL至約0.2 mg/mL。
額外各種賦形劑包括增積劑(例如澱粉)、螯合劑(例如EDTA)，抗氧化劑(例如抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E)和共溶劑。 6.9.2.  用於遞送IL2促效劑編碼核酸的醫藥組成物
本發明IL2促效劑可以藉由任何可用於基因療法的方法遞送，例如作為mRNA，或在合適的啟動子控制下透過編碼IL2促效劑的病毒載體來遞送。
例示性基因療法載體包括基於腺病毒或AAV的治療劑。用於本文方法，用途或組成物中之基於腺病毒或基於AAV的治療劑的非限制性實例包括，但不限於：rAd-p53，其為編碼野生型人類腫瘤抑制蛋白p53的重組腺病毒載體p53，例如用於治療癌症(也稱為Gendicine®、Genkaxin®，Qiet al. , 2006, Modern Oncology, 14:1295-1297)；Ad5_d11520，其是缺少E1B基因以使宿主p53不活化的腺病毒(也稱為H101或ONYX-015；參見例如Russellet al. , 2012, Nature Biotechnology 30:658-670)；AD5-D24-GM-CSF，一種含有細胞激素GM-CSF的腺病毒，例如用於治療癌症(Cerulloet al. , 2010, Cancer Res. 70:4297)；rAd-HSVtk，一種具有HSV胸苷激酶基因的複制缺陷型腺病毒，例如用於治療癌症(開發為Cerepro®，Ark Therapeutics，參見例如美國專利第6,579,855號；由Advantagene開發為ProstAtak™；國際PCT申請案第WO2005/049094號)；rAd-TNFα，複製缺陷型腺病毒載體，受到化學放射誘導型EGR-1啟動子控制下表現人類腫瘤壞死因子α(TNFα)，例如用於治療癌症(TNFerade™、GenVec；Rasmussenet al. , 2002, Cancer Gene Ther. 9:951-7)；Ad-IFNβ，腺病毒血清型5載體，E1和E3基因已自其中被刪除，在巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子指揮下表現人類干擾素β基因，例如用於治療癌症(BG00001與H5.110CMVhIFN-β，Biogen；Stermanet al. , 2010, Mol. Ther. 18:852-860)。
可以將核酸分子(例如mRNA)或病毒調配成醫藥組成物中的唯一醫藥活性成分，或者可以與針對待治療特定疾病的其他活性劑組合。視情況，其他藥劑、醫藥劑、載劑、佐劑，稀釋劑可包含在本文提供的組成物中。例如，潤濕劑，乳化劑和潤滑劑中的任何一或多者，諸如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、脫模劑、包衣劑、甜味劑，調味劑和加香劑、防腐劑、抗氧化劑，螯合劑與惰性氣體也可以存在於組成物中。可以包括在組成物中的例示性其他藥劑和賦形劑包括，例如水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉；油溶性抗氧化劑，諸如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基羥基大茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚；以及金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇，酒石酸和磷酸。
當用作第6.11.1節中所述的授受性細胞轉移療法(例如表現CAR的細胞療法)的輔助療法時，可以進行改造，使其表現本發明的IL-2促效劑。IL2促效劑可以靶向特定基因座，例如內源性IL2基因座；或在不活化或功能異常的淋巴細胞中有活性的另一個基因座，例如PD-1基因座；或插入非特異性基因座。靶向特定基因組可以透過基因編輯來實現，例如使用鋅指蛋白，CRISPR/Cas9系統與類似者。 6.10.    治療適應症與治療方法
本發明的IL2促效劑可用於治療其中刺激宿主的免疫系統有益的疾病狀態，特別是在需要提高細胞免疫反應的病況。這些可能包括宿主免疫反應不足或有缺陷的疾病狀態。可以投與本發明IL2促效劑的疾病狀態包含例如腫瘤或感染，其中細胞免疫反應將是特定免疫性的關鍵機制。可以採用本發明IL2促效劑的特定疾病狀態包括癌症，例如腎細胞癌或黑色素瘤；免疫缺陷，特別是在HIV陽性患者；免疫抑制患者，慢性感染與類似者中。本發明IL2促效劑可以本身或以任何合適的醫藥組成物形式投藥。
在一個態樣中，提供了用作藥劑的本發明IL2促效劑。在其他態樣中，提供了用於治療疾病的本發明IL2促效劑。在某些具體例中，提供了用於治療方法中的本發明IL2促效劑。在一個具體例中，本發明提供如本文所述的IL2促效劑，其用於在有需要的個體體內治療疾病。在某些具體例中，本發明提供用於治療患有疾病之個體的方法中的IL2促效劑，該方法包含向個體投與治療有效量的IL2促效劑。在某些具體例中，受治療的疾病是增生性病症。在一個較佳具體例中，疾病是癌症。在某些具體例中，如果要治療的疾病是癌症，則該方法進一步包含向個體投與治療有效量的至少一種額外治療劑，例如抗癌劑。在進一步的具體例中，本發明提供用於刺激免疫系統的IL2促效劑。在某些具體例中，本發明提供用於在刺激個體之免疫系統的方法中使用的IL2促效劑，該方法包含向個體投與有效量的IL2促效劑以刺激免疫系統。根據以上任一具體例，「個體」是哺乳動物，較佳是人類。根據以上任一具體例，「刺激免疫系統」可以包括免疫功能的普遍增加、T細胞功能增加、B細胞功能增加、淋巴細胞功能恢復、IL-2受體表現增加、T細胞反應性增加、天然殺手細胞活性或淋巴激素活化殺手(LAK)細胞活性增加以及類似者中任的一或多者。
在另一個態樣中，本發明提供了本發明IL2促效劑在製造或製備用於治療有需要之個體的疾病的藥劑中的用途。在一個具體例中，該藥劑用於治療疾病的方法中，該方法包含向患有該疾病的個體投與治療有效量的藥劑。在某些具體例中，要治療的疾病是增生性病症。在一個較佳具體例中，疾病是癌症。在一個這樣的具體例中，如果要治療的疾病是癌症，則該方法進一步包含向個體投與治療有效量的至少一種額外治療劑，例如抗癌劑。在又一個具體例中，該藥劑用於刺激免疫系統。在又一個具體例中，該藥劑用於刺激受個體之免疫系統的方法，該方法包含向個體投與有效量的藥劑以刺激免疫系統。根據以上任一具體例，「個體」可以是哺乳動物，較佳是人類。根據以上任一具體例，「刺激免疫系統」可以包括免疫功能普遍增加、T細胞功能增加、B細胞功能增加、淋巴細胞功能恢復、IL-2受體表現增加、T細胞反應性增加、自然殺手細胞活性或淋巴激素活化殺手(LAK)細胞活性增加及類似者中的任一或多者。
在又一個態樣中，本發明提供一種用於治療個體之疾病的方法，該方法包含向個體投與治療有效量的本發明IL2促效劑。在一個具體例中，向個體投與包含呈醫藥上可接受形式的本發明IL2促效劑的組成物。在某些具體例中，要治療的疾病是增生性病症。在一個較佳具體例中，疾病是癌症。在某些具體例中，包含若要治療的疾病是癌症，則該方法進一步向個體投與治療有效量的至少一種額外治療劑，例如抗癌劑。在又一個態樣中，本發明提供一種用於刺激個體之免疫系統的方法，該方法包含向個體投與有效量的IL2促效劑以刺激免疫系統。根據以上任一具體例，「個體」可以是哺乳動物，較佳是人類。根據以上任一具體例，「刺激免疫系統」可以包括免疫功能普遍增加、T細胞功能增加、B細胞功能增加、淋巴細胞功能恢復、IL-2受體表現增加、T細胞反應性增加、自然殺手細胞活性或淋巴激素活化殺手(LAK)細胞活性增加及類似者中的任一或多者。
在某些具體例中，要治療的疾病是增生性病症，較佳為癌症。癌症的非限制性實例包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌，骨癌和腎癌。可以使用本發明IL2促效劑治療的其他細胞增生性病症包括，但不限於位於以下的腫瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系統、肝臟、胰臟、腹膜、內分泌腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼部、頭頸部、神經系統(中樞和周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟，胸腔區域和泌尿生殖系統。還包括癌前病況或病變和癌症轉移。在某些具體例中，癌症選自由腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌組成之群。類似地，本發明IL2促效劑也可以治療其他細胞增生病症。此類細胞增生病症的實例包括但不限於位在下列器官系統中者：高γ球蛋白血症、淋巴增生病症、副蛋白血症、紫癜、結節病、Sezary症候群、瓦爾登倫氏巨球蛋白血症、高歇氏病，組織細胞增生症以及除贅生物以外的其他任何細胞增生疾病。在另一個具體例中，該疾病與自體免疫性、移植排斥、創傷後免疫反應和傳染性疾病(例如HIV)有關。更具體地說，IL2促效劑可用於消除與免疫細胞媒介之病症相關的細胞，包括淋巴瘤；自體免疫性、移植排斥、移植物抗宿主病，局部缺血和中風。習於技藝者容易理解到，在許多情況下，IL2促效劑可能無法提供治癒，而只能提供部分益處。在一些具體例中，具有某些益處的生理變化也被認為是在治療上有益的。因此，在一些具體例中，提供生理變化的IL2促效劑的量被認為是「有效量」或「治療有效量」。需要治療的個體(subject)，患者或個體(individual)通常是哺乳動物，更具體地是人類。
為了預防或治療疾病，本發明IL2促效劑的適當劑量(當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將取決於要治療的疾病類型、投藥路徑、患者的體重、特定IL2促效劑、疾病的嚴重程度和病程、抗體是用於預防還是治療目的、先前或並行的治療干預、患者的臨床病史和對IL2促效劑的反應，以及主治醫師的判斷。無論如何，負責給藥的從業者將確定組成物中活性成分的濃度和各別個體的合適劑量。本文考慮了各種給藥時間表，包括但不限於在不同時間點內的單次或多次投藥、推注投藥和脈衝輸注。
未綴合IL2的單次投藥範圍可為約50,000 IU/kg至約1,000,000 IU/kg或更多，更通常為約600,000 IU/kg的IL2。這可以一天重複數次(例如2-3次)、數天(例如連續3-5天)，然後在休息一段時間(例如大約7-14天)後重複一或多次。因此，治療有效量可以僅包含單次投藥或在一段時間內多次投藥(例如， 在約10-20天的期間內投與20-30次單獨投藥約600,000 IU/kg的IL2)。
類似地，將IL2促效劑一次或在一系列治療內適當地投與給患者。根據疾病的類型和嚴重程度，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如0.1 mg/kg至10 mg/kg) IL2促效劑可以是投與給患者的初始候選劑量，無論是藉由一或多次個別投藥，還是藉由連續輸注。取決於上述因素，一個典型的日劑量範圍可以從約1 μg/kg至100 mg/kg或更多。關於在數天或更久的重複投藥，取決於病況，通常持續治療直至出現所期望的疾病症狀抑制。IL2促效劑的一個例示性劑量範圍為約0.005 mg/kg至約10 mg/kg。在其他非限制性實例中，劑量還可以包含每次投藥約1 μg/kg/體重、約5 μg/kg/體重、約10 μg/kg/體重、約50 μg/kg/體重、約100 μg/kg/體重、約200 μg/kg/體重、約350 μg/kg/體重、約500 μg/kg/體重、約1 mg/kg/體重、約5 mg/kg/體重、約10 mg/kg/體重、約50 mg/kg/體重、約100 mg/kg/體重、約200 mg/kg/體重、約350 mg/kg/體重、500 mg/kg/體重，至約1000 mg/kg/體重或更多，以及可在其中得出的任何範圍。在從本文列出的數字衍生而來的範圍的非限制性實例中，基於上述數字，可投與範圍為約5 mg/kg/體重至約100 mg/kg/體重、約5 μg/kg/體重至約500 mg/kg體重等。因此，可以向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg的一或多種劑量(或其任何組合)。這樣的劑量可以例如每週或每三週間歇地投與(例如，使得患者接受約兩個至約二十個，或例如約六個劑量的IL2促效劑)。一開始可以投與較高的負荷劑量，然後投與一或多個較低的劑量。然而，其他劑量方案可能是有用的。透過常規技術和分析很容易監測此療法的進展。
本發明的IL2促效劑通常以有效達到預期目的之量使用。為了用於治療或預防疾病病況，以治療有效量投與或施用本發明的IL2促效劑或其醫藥組成物。確定治療有效量完全在那些習於技藝者的能力範圍內，尤其是根據本文提供的詳細揭示內容。
關於全身性投藥，可以最初從活體外分析(諸如細胞培養分析)來估計治療有效劑量。然後可以在動物模型中訂定劑量，以達到包括細胞培養中所確定的EC50 在內的循環濃度範圍。這樣的資訊可用於更準確地確定在人類體內有用的劑量。
也可以使用本技藝中周知的技術，根據活體內數據(例如動物模型)來估算初始劑量。技藝中具有通常技術者可以根據動物數據來優化對人類的投藥。
可以單獨調整劑量和間隔以提供足以維持治療效果的IL2促效劑的血漿含量。藉由注射投藥的慣常患者劑量為約0.1至50 mg/kg/天，典型地為約0.5至1 mg/kg/天。治療有效血漿含量可以藉由每天多次投藥來達到。血漿含量可以例如藉由ELISA HPLC來測量。
在局部投藥或選擇性攝取的情況下，IL2促效劑的有效局部濃度可能與血漿濃度不相關。習於技術者將能夠優化治療有效局部劑量而不需要過度實驗。
本文所述的IL2促效劑的治療有效劑量通常將提供治療益處而不會引起實質毒性。IL2促效劑的毒性和治療功效可以藉由在細胞培養或實驗動物中的標準醫藥程序來測定(參見例如實例7和8)。細胞培養分析和動物研究可用於確定LD50 (對50%群體致死的劑量)和ED50 (對50%群體有效治療的劑量)。毒性和治療效用之間的劑量比是治療指數，可以表示為比率LD50/ ED50 。展現出治療指數大的IL2促效劑較佳。在一個具體例中，根據本發明的IL2促效劑展現出高治療指數。從細胞培養分析和動物研究中獲得的數據可用於調配適用於人類的一系列劑量。劑量較佳在包括幾乎沒有毒性或無毒性的ED50 的循環濃度範圍內。取決於多種因素(如所採用的劑型、所利用的投藥途徑，個體的病況與類似因素)，劑量可以在這個範圍內變化。個別臨床醫師可以根據患者的病況選擇確切的調配物，投藥途徑和劑量。(參見，例如Finglet al. , 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1，以全文引用的方式併入本文)。
用本發明IL2促效劑治療的患者的主治醫師將知道由於毒性，器官功能障礙與類似因素而如何以及何時終止，中斷或調整投藥。相反，如果臨床反應不當(排除毒性)，主治醫師也知道將治療調整到更高的水平。在治療所關注的病症時，給藥劑量的大小將隨待治療病況的嚴重程度，投藥途徑與類似因素而改變。病況的嚴重程度可以一部分例如藉由標準預後評估方法來評估。此外，劑量以及可能的給藥頻率也將根據個別患者的年齡，體重和反應而變化。
由於毒性較低，本發明IL2促效劑可以比野生型IL2具有更高的最大治療劑量，儘管因為半衰期延長，含有穩定化部分的IL2促效劑通常含有比野生型IL2以更低的劑量來投藥。 6.11.    組合療法
根據本發明的IL2促效劑可以與一或多種其他藥劑組合用於療法中。例如，本發明的IL2促效劑可以與至少一種額外治療劑共同投與。術語「治療劑」涵蓋為治療需要這種治療的個體之症狀或疾病而投與的任何藥劑。此類額外治療劑可包含適合於待治療的特定適應症的任何活性成分，較佳是那些具有互補活性且不會彼此不利影響的活性成分。在某些具體例中，額外治療劑是免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑，細胞凋亡活化劑或增加細胞對凋亡誘導劑敏感性的藥劑。在一個特定具體例中，額外治療劑是抗癌劑，例如微管破壞劑、抗代謝物、拓樸異構酶抑制劑、DNA嵌入劑、烷基化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑，腫瘤細胞凋亡的活化劑或抗血管生成劑。
這樣的其他藥劑適當地以對於預期目的有效之量組合存在。此類其他藥劑的有效量取決於所使用的IL2促效劑數量，病症或治療的類型以及上面討論的其他因素。IL2促效劑通常以與本文所述相同的劑量和投藥路徑來使用，或約本文所述劑量的1%至99%或呈任何劑量，並且藉由經驗/臨床上確定合宜的任何路徑。
上文提到的這種組合療法包括組合投藥(其中兩種或更多種治療劑納入相同或個別組成物中)以及個別投藥，在這種情況下，本發明IL2促效劑可以在投與額外治療劑及/或佐劑之前，同時及/或之後投與。本發明IL2促效劑也可以與放射療法組合使用。 6.11.1.          使用IL2促效劑療法及免疫療法的組合療法
本發明IL2促效劑可有利地與表現嵌合抗原受體(「CAR」)的細胞(例如表現CAR的T細胞(「CAR-T」))(例如用於治療癌症或自體免疫疾病的CAR-T)組合使用。在一些具體例中，CAR-T細胞是被IL2促效劑中的靶向部分所辨識。靶向部分可以辨識CART細胞上的T細胞受體或另一種細胞表面分子。在一些具體例中，IL2促效劑中的靶向部分能夠結合至CAR的細胞外結構域，例如抗原結合結構域。
也可以對接受CAR和IL2促效劑療法的個體投與調理或淋巴清除療法，例如環磷醯胺和氟達拉賓的方案。這種治療通常在向個體投與表現CAR的細胞之前數天內進行。例如，環磷醯胺可以在輸注表現CAR的細胞之前(輸注日為零)(例如)，在第-8天與第-7天時投與持續兩天，而氟達拉賓在第-6天至第-2天投與給個體連續五天。在一個具體例中，向個體投與60 mg/kg的環磷醯胺。在一個具體例中，向個體投與25 mg/m2 的氟達拉賓。在一個具體例中，在第-1天(即向個體輸注表現CAR的細胞之前的一天)沒有治療。
表現CAR的細胞可以以104 至109 個細胞/kg體重之量投與，較佳地在105 至106 個細胞/kg體重的範圍內投與，包括那些範圍內的所有整數值。T細胞組成物也可以按這些劑量多次給藥。在一些具體例中，以1×106 至1×1011 個細胞或1×107 至1×108 個細胞的劑量來投與表現CAR的細胞。
表現CAR的細胞可以在投與給人類個體之前與IL2擴增合作用抗CD3及/或抗CD28抗體活化。
表現CAR的細胞(例如T細胞)較佳對於個體是自體的，但是也可以是同種異體來源的。
在一個具體例中，從投與表現CAR的細胞群的那一天開始，連續四天藉由快速輸注向人類個體投與IL2促效劑。
在一個具體例中，從投與表現CAR的細胞群的那一天開始，至少連續五天藉由快速輸注向人類個體投與IL2促效劑。
IL2促效劑可以投與更長的期間，例如持續一週、兩週，一個月或更久。給藥頻率可以(例如)在表現CAR的細胞耗竭後降低。舉例來說，IL2促效劑可以最初每天給藥，然後將給藥頻率降低至每週一次。
IL2療法的開始可以在投與表現CAR的細胞後的同一天，或一、二、三、四、五，六天或一週後開始。
在一個具體例中，細胞群包含從個體獲得之經工程改造成重組表現CAR的T細胞。
在一個具體例中，在向個體投與細胞群後，IL2促效劑血漿含量維持持續一到兩週。
在一個具體例中，在向個體投與細胞群後，IL2促效劑血漿含量維持持續一個月。 6.11.1.1.  CAR組分
典型的CAR包括細胞外區域，該細胞外區域包含連接至細胞內信號傳導嵌段的抗原結合結構域(例如抗體的抗原結合結構域)，該細胞內信號傳導塊包括在抗原結合後誘導T細胞活化的CD3信號傳導結構域(例如CD3ζ，T細胞受體的信號傳導區域)。如第6.4.2.1節中所述，抗原結合結構域可以呈scFv的形式。
抗原結合結構域通常經由連接子(例如如第6.7節中所述的連接子)、視情況選用的間隔子(例如如第6.11.1.1.1節中所述)、視情況選用的鉸鏈(例如如第6.11.1.1.2節中所述)、跨膜結構域(例如如第6.11.1.1.3節中所述)和細胞內信號傳導嵌段(例如如第6.11.1.1.4節所述)連接至信號結構域。 6.11.1.1.1.    間隔子結構域
在特定的具體例中，CAR的抗原結合結構域(隨後是視情況選用的連接子)接續著一或多個「間隔子結構域」，其指使抗原結合結構域從效應子細胞表面遠離而使細胞/細胞適當接觸，抗原結合和活化成為可能(Patelet al. , 1999, Gene Therapy 6:412-419)。間隔子結構域可以衍生自天然、合成，半合成或重組來源。在某些具體例中，間隔子結構域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限於一或多個重鏈恆定區，例如CH2和CH3。間隔子結構域可以包括天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區或改變的免疫球蛋白鉸鏈區的胺基酸序列。
在一個具體例中，間隔子結構域包含IgG1或IgG4的CH2和CH3結構域。 6.11.1.1.2.    鉸鏈結構域
CAR的抗原結合結構域通常接續著一或多個「鉸鏈結構域」(視情況選用的連接子及/或間隔子的下游)，其指使抗原結合結構域從效應子細胞表面遠離而使細胞/細胞適當接觸，抗原結合及活化成為可能。CAR通常在結合結構域和跨膜結構域(TM)之間包含一或多個鉸鏈結構域。鉸鏈結構域可以衍生自天然、合成，半合成或重組來源。鉸鏈結構域可以包括天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區或改變的免疫球蛋白鉸鏈區的胺基酸序列。
「改變的鉸鏈區」是指(a)具有至多30%胺基酸變化(例如至多25%、20%、15%，10%或5%的胺基酸置換或缺失)的天然存在鉸鏈區、(b)自然鏈區的一部分，其長度至少為10個胺基酸(例如至少12、13、14或15個胺基酸)，具有至多30%胺基酸改變(例如至多25%、20%、15%，10%或5%胺基酸置換或缺失)，或(c)天然鉸鏈區中的一部分，其包含核心鉸鏈區(長度可為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、13、14，或15個胺基酸)。在某些具體例中，天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區中的一或多個半胱胺酸殘基可以被一或多個其他胺基酸殘基(例如一或多個絲胺酸殘基)置換。改變的免疫球蛋白鉸鏈區可替代地或另外地具有被另一胺基酸殘基(例如絲胺酸殘基)置換的野生型免疫球蛋白鉸鏈區的脯胺酸殘基。
用於本文所述CAR中的其他說明性鉸鏈結構域包括衍生自第1型膜蛋白質(諸如CD8α、CD4，CD28和CD7)之細胞外區的鉸鏈區，其可以是從這些分子而來的野生型鉸鏈區或可能被改變。在另一個具體例中，鉸鏈結構域包含CD8α鉸鏈區。 6.11.1.1.3.    跨膜(TM)結構域
「跨膜結構域」是CAR的部分，其融合細胞外結合部分和細胞內信號傳導結構域並將CAR錨定至免疫效應子細胞的質膜。如本文所用，術語「跨膜結構域」是指在細胞膜，較佳真核細胞膜(例如哺乳動物細胞膜)中熱力學穩定的任何多肽結構。
TM結構域可以衍生自天然、合成，半合成或重組來源。TM結構域可以衍生自(例如包含至少以下的跨膜區)：T細胞受體的α，β或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD152，CD 154或PD1。在一個特定具體例中，TM結構域是合成的，並且主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸和纈胺酸。
在某些具體例中，CAR包含CD3ζ跨膜結構域(例如，包含胺基酸序列LCYLLDGILFIYGVILTALFL(SEQ ID NO:86)或LDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVK(SEQ ID NO:87)的跨膜結構域)、CD28跨膜結構域(例如，包含胺基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:88)的跨膜結構域)或CD8α跨膜結構域(例如，包含胺基酸序列KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLR PEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:89)的跨膜結構域)。
TM後面可以是短連接子，較佳長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸，連接TM結構域和CAR的細胞內信號傳導結構域。基於甘胺酸-絲胺酸的連接子(例如，根據第6.7節的連接子)提供了特別合適的連接子。 6.11.1.1.4.    細胞內信號傳導結構域
CAR通常包含細胞內信號傳導結構域域。「細胞內信號傳導結構域」是指CAR的一部分，其參與將有效抗原結合的信息轉導至免疫效應子細胞內部以引發效應子細胞功能(例如活化、細胞激素產生、增生和細胞毒性活性，包括釋放細胞毒性因子到與CAR結合的目標細胞)，或與抗原結合至細胞外CAR結構域引起的其他細胞反應。
術語「效應子功能」是指免疫效應子細胞的特化功能。例如，T細胞的效應子功能可以是細胞溶解活性或幫助或包括分泌細胞激素的活性。因而術語「細胞內信號傳導結構域」是指蛋白質的一部分，其轉導效應子功能信號並指導細胞執行特化功能。儘管通常可以使用完整的細胞內信號傳導結構域，但在許多情況下並不需要使用到完整結構域。在使用細胞內信號傳導結構域的截短部分的範圍內，只要截短部分轉導效應子功能信號，它就可以取代完整結構域。術語細胞內信號傳導結構域有意包括任何足以轉導效應子功能信號的細胞內信號傳導結構域的截短部分。
已知僅透過TCR產生的信號不足以完全活化T細胞，還需要二級或共刺激信號。因此，可以說T細胞活化是由兩類不同的細胞內信號傳導結構域所媒介：透過過TCR(例如TCR/CD3複合體)啟動抗原依賴性主要活化作用的一級信號傳導結構域，和以抗原非依賴性方式發揮作用以提供二級或共刺激信號的共刺激信號傳導結構域。在較佳具體例中，本文考慮的CAR包含細胞內信號傳導結構域，其包含一或多個「共刺激信號傳導結構域」和「一級信號傳導結構域」。
一級信號傳導結構域以刺激性或抑制性方式調節TCR複合體的主要活化。以刺激方式起作用的一級信號傳導結構域可含信號傳導模體，其被稱為基於免疫受體酪胺酸的活化模體或ITAM。
含有在本發明方法中特別有用的一級信號傳導結構域之ITAM的說明性實例包括那些衍生自TCRζ、FC-Rγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79A，CD79b和CD66d者。在尤佳的具體例中，CAR包含CD3ζ一級信號傳導結構域和一或多個共刺激信號傳導結構域。細胞內的一級信號傳導結構域和共刺激信號傳導結構域可以以任何順序串聯連接到跨膜域的羧基端。
本文考慮的CAR包含一或多個共刺激信號傳導結構域，以增強表現CAR受體之T細胞的功效和擴增。如本文所用，術語「共刺激信號傳導結構域」或「共刺激結構域」是指共刺激分子的細胞內信號傳導結構域。共刺激分子是抗原受體或Fc受體以外的細胞表面分子，其在結合至抗原後提供T淋巴細胞有效活化和功能所需的二級信號。此類共刺激分子的說明性實例包括CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM，和ZAP70。
在一些具體例中，CD3信號傳導區連接至CD28、4-1BB(也稱為CD137)，CD70或OX40(也稱為CD134)或其組合，或具有兩個串聯的CD3ζ信號傳導結構域的共刺激內結構域。這些內結構域在抗原呈遞細胞(APC)辨識TCR期間允許強大的T細胞活化，從而改善細胞激素的產生和CAR-T細胞的增生。
在另一個具體例中，CAR包含CD28和CD137共刺激信號傳導結構域和CD3ζ一級信號傳導結構域。
在又另一個具體例中，CAR包含CD28和CD134共刺激信號傳導結構域和CD3ζ一級信號傳導結構域。
在一個具體例中，CAR包含CD137和CD134共刺激信號傳導結構域和CD3ζ一級信號傳導結構域。
例示性CD3ζ信號傳導區可包含以下胺基酸序列中之一者： LDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:90) RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR(SEQ ID NO:91)
例示性CD28信號傳導區可包含以下胺基酸序列中之一者： KIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPP RDFAAYRS(SEQ ID NO:92) RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:93) KIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:94) FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:88) RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:93)
例示性CD137(41BB)信號傳導區可包含以下胺基酸序列： KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:95) 6.11.1.1.5.    標籤
在一些具體例中，CAR包含用於識別CAR的標籤，例如V5表位標籤是衍生自猿猴病毒5(SV5)副黏液病毒的P和V蛋白上存在的小表位(Pk)。V5標籤通常以全部14個胺基酸(GKPIPNPLLGLDST)(SEQ ID NO:96)來使用，儘管它也與較短的9個胺基酸序列(IPNPLLGLD)(SEQ ID NO:97)來使用。 6.11.1.1.6.    信號肽
在一些具體例中，CAR包含信號肽。信號肽促進細胞表面的CAR表現。與本文所述的CAR中使用相容的信號肽，包括天然存在的蛋白質或合成的信號肽、非天然存在的信號肽，對那些習於技藝者而言將是顯而易見的。在一些具體例中，信號肽位於CAR的抗原結合部分的N端。CAR在細胞(例如T細胞)中被表現和加工後，信號肽受到切割，因此通常在成熟分子中不存在。 6.11.1.2.  製備CART細胞
為了從富含CART細胞的PBMC，周邊血液淋巴細胞或T細胞離體產生CART細胞，可以在將編碼CAR的核酸引入細胞(例如藉由病毒轉導)之前及/或之後進行擴增。
可用於產生CART細胞的T細胞可藉由溶解紅血球並清除單核細胞而從周邊血液淋巴細胞分離出來，例如藉由透過PERCOLL™梯度離心或逆流離心淘析。可以透由陽性或陰性選擇技術進一步分離T細胞的特定亞群，諸如CD3+、CD28+ 、CD4+、CD8+，CD45RA+和CD45RO+ T細胞。例如，在一個具體例中，藉由與抗CD3/抗CD28(例如3x28)綴合的珠粒(諸如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一起培育歷時一段足以陽性分離所需T細胞的時間來分離T細胞。在一個具體例中，該時段是大約30分鐘。在又一個具體例中，時間段的範圍是從30分鐘到36小時或更長，以及其間的所有整數值。在又一個實施例中，時段是至少1、2、3、4、5或6小時。在又另一個較佳具體例中，時段是10至24小時。在一個較佳具體例中，培育時段是24小時。關於從白血病患者中分離T細胞，使用更長的培育時間(例如24小時)可以提高細胞產率。在與其他細胞類型相比，T細胞很少的任何情況下，可以使用更長的培育時間來分離T細胞，例如從腫瘤組織或免疫低下的個體中分離腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。此外，使用更長的培育時間可以提高捕獲CD8+ T細胞的效率。因此，透過簡單地縮短或延長時間，藉由增縮短或延長容許T細胞與CD3/CD28珠粒結合的時間及/或藉由增加或降低珠粒與T細胞的比率，可以優先選擇在培養時或在過程期間的任何其他時間點支持或反對的T細胞亞群。另外，藉由增加或減少珠粒或其他表面上抗CD3及/或抗CD28抗體的比率，可以優先選擇在培養開始時或在其他所需時間點針對或反對的T細胞亞群。習於技藝者會認知到，在本發明上下文中也可以使用多輪選擇。在某些具體例中，可能希望執行選擇程序並在活化和擴展過程中使用「未被選擇的」細胞。「未被選擇的」細胞也可以進行更多輪的選擇。
藉由陰性選擇來富集T細胞群可以用針對陰性選擇細胞特有的表面標記的抗體組合來完成。一種方法是經由陰性磁性免疫黏附或流式細胞術進行細胞分選及/或選擇，該方法使用針對存在於要陰性選擇的細胞上的細胞表面標記的單株抗體混合物。例如，為了藉由陰性選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16，HLA-DR和CD8的抗體。也可以藉由抗C25綴合珠粒或其他類似的選擇方法來清除T reg細胞。
在某些具體例中，例如用於涉及如第6.11.1.4節中所述治療自體免疫疾病的應用，可能需要富集或陽性選擇通常表現CD4+、CD25+、CD62Lhi 、GITR+ 和FoxP3+ 的調節性T細胞。Treg也可以透過重組表現FoxP3來誘導。
無論是在對T細胞進行遺傳修飾以表現所需CAR之前還是之後，T細胞通常可以使用本技藝已知的方法予以活化和擴增，例如，如美國專利第7,144,575號；第7,067,318號；第7,172,869號；第7,232,566號；或第7,175,843號中所述。
通常，藉由與附接有刺激CD3/TCR複合體相關信號的藥劑和刺激T細胞表面上的共刺激分子的配體的表面接觸，擴增可用於本發明方法的T細胞。特別地，可以藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段，或固定在表面上的抗CD2抗體接觸，或藉由與蛋白激酶C活化劑(例如苔癬蟲素)結合鈣離子載體接觸來刺激T細胞群。關於共刺激T細胞表面上的輔助分子，使用了結合輔助分子的配體。例如，可以在適於刺激T細胞增生的條件下，使T細胞群與抗CD3抗體和視情況選用的抗CD28抗體(例如在抗CD3和抗CD28珠粒上)接觸。
在投與人類個體表現CAR的細胞之前，也可以用IL12進行調理(參見例如Emtageet al. , 2003, J. Immunother. 16(2): 97-106，以引用的方式併入本文)。 6.11.1.3.  癌症免疫療法
因此，本發明提供了在有需要的人類個體中治療癌症的方法，包含向個體投與有效量的本發明IL2促效劑並投與至表現CAR的細胞(例如表現CAR的T細胞(或「CART細胞」)。用於治療癌症的特別有用的T細胞亞型是具有強大的CAR媒介細胞毒性的T細胞(例如CD3+CD8+ T細胞)，可以按照上文6.11.1.2中的所描述進行製備。
關於癌症的治療，CAR的胞外結構域可靶向腫瘤相關抗原，例如如第6.4.1節中所述。在某些具體例中，腫瘤相關抗原是CD20、EGFR、FITC、CD19、CD22、CD33、PSMA、GD2、EGFR變體、ROR1、c-Met、HER2、CEA、間皮素、GM2、CD7、CD10、CD30、CD34、CD38、CD41、CD44、CD74、CD123、CD133、CD171、MUC16、MUC1、CS1(CD319)、IL-13Ra2、BCMA、Lewis Y、IgGκ鏈、葉酸受體-α，PSCA或EpCAM。在特定的實施例中： 。      CAR被設計成靶向CD22，以治療瀰漫性大B細胞淋巴瘤。 。      CAR被設計成靶向間皮素，以治療間皮瘤、胰臟癌，卵巢癌與類似疾病。 。      CAR被設計為靶向CD33/IL3Ra，以治療急性骨髓性白血病與類似疾病。 。      CAR被設計成靶向c-Met，以治療三陰性乳癌，非小細胞肺癌與類似疾病。 。      CAR被設計成靶向PSMA，以治療前列腺癌與類似疾病。 。      CAR被設計成靶向醣脂F77，以治療前列腺癌與類似疾病。 。      CAR被設計成靶向EGFRvIII，以治療神經膠質母細胞瘤與類似疾病。 。      CAR被設計成靶向GD-2，以治療神經母細胞瘤，黑色素瘤與類似疾病。 。      CAR被設計成靶向NY-ESO-1 TCR，以治療骨髓瘤、肉瘤，黑色素瘤與類似疾病。 。      CAR被設計成靶向MAGE A3 TCR，以治療骨髓瘤、肉瘤，黑色素瘤與類似疾病。
特別有用於CAR-IL2促效劑組合療法的是IL2促效劑，其包含辨識存在於表現CAR的淋巴細胞表面上的細胞表面抗原的靶向部分。
若與CAR療法組合投與的IL2促效劑具有肽-MHC靶向部分時，則表現CAR的細胞較佳是其TCR辨識肽-MHC複合體的CD4+ 或CD8+ 細胞。例如，表現CAR的細胞可以是T淋巴細胞，其TCR特異性結合IL2促效劑上存在的pMHC複合體，從而導致表現CAR的細胞的功能活化和存活。
在一些具體例中，CAR本身包含靶向IL2促效劑中的pMHC複合體(例如在第6.4.3節中描述的任何pMHC融合物)的抗原結合結構域(例如scFv結構域)。靶向具有HPV肽(例如對應於HPV16E7多肽的胺基酸殘基11-19或82-90的肽)之pMHC複合體的例示性CAR揭示於美國專利第10,806,780 B2號中，其以全文引用的方式併入本文。在一些具體例中，CAR包含選自以下任一SEQ ID NO的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)胺基酸序列對：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/202、218/226、234/242、250/258、266/274、282/290、298/306、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、458/466、474/482、490/498、506/514，及522/530，在美國專利第10,806,780 B2號的每種情況下，其中各者以引用的方式併入本文。在特定具體例中，VH-VL對包含美國專利第10,806,780 B2號的SEQ ID NO. 2和10、美國專利第10,806,780 B2號的SEQ ID NO. 34和42、美國專利第10,806,780 B2號的SEQ ID NO. 82和90、美國專利第10,806,780 B2號的SEQ ID NO. 194和202，或美國專利第10,806,780 B2號的SEQ ID NO. 506和514，其中各者以引用的方式併入本文。CAR-IL2促效劑加上靶向具有HPV肽之pMHC的CAR的組合療法可用於治療HPV陽性癌症，例如鱗狀細胞癌，例如子宮頸癌、頭頸部小細胞癌，肛門生殖器癌和口咽癌。 6.11.1.4.  自體免疫疾病的免疫療法
嵌合抗原受體(CAR)T細胞已成為血癌的有力治療選項。藉由使用修飾T細胞以有效靶向疾病的相同想法，科學家經由轉染編碼嵌合抗原受體(CAR)的病毒載體，以預定的抗原特異性有效地工程改造了T細胞。以非MHC限制的方式改造的CAR經修飾T細胞具有廣泛應用的優勢，特別是在移植和自體免疫性中。
可以如上6.11.1.2中所述製備表現CAR的Treg細胞。
特別有用於CAR-IL2促效劑組合療法的是包含靶向部分的IL2促效劑，該靶向部分辨識存在於表現CAR的淋巴細胞表面上的細胞表面抗原，例如從自體免疫目標細胞選殖而來的pMHC。
為了用於治療自體免疫疾病，CAR的細胞外結構域較佳對與自體免疫反應相關的目標抗原或配體具特異性。這種修飾引起發炎部位處重定向的Treg活化，以抑制促發炎性效應子型免疫反應。CAR Treg 療法所靶向的自體免疫疾病的實例為多發性硬化症、發炎性腸病(IBD)、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、克羅恩病、牛皮癬、第I型糖尿病、休格倫氏病、重症肌無力(MG)，橋本甲狀腺炎；格雷夫斯病和葡萄膜炎。
在特定具體例中，將Tregs工程改造成表現靶向對以下抗原或配體具特異性的CAR： 。      發炎性腸病(IBD)，其中抗原或配體是在患病的結腸或迴腸中表現者； 。      類風濕性關節炎，其中抗原或配體是在關節中存在之膠原蛋白或抗原的表位； 。      第I型糖尿病或自體免疫胰島炎，其中抗原或配體是胰臟β細胞抗原； 。      多發性硬化症，其中抗原或配體是例如髓磷脂鹼性蛋白(MBP)抗原或MOG-1或MOG2-2，或神經元抗原； 。      自體免疫甲狀腺炎，其中的抗原或配體是甲狀腺抗原； 。      自體免疫胃炎，其中抗原或配體是胃抗原； 。      自體免疫葡萄膜炎或葡萄膜視網膜炎，其中抗原或配體是S抗原或另一種葡萄膜或視網膜抗原； 。      自體免疫睪丸炎，其中抗原或配體是睪丸抗原； 。      自體免疫卵巢炎，其中抗原或配體是卵巢抗原； 。      牛皮癬，其中抗原或配體是角質細胞抗原或另一種存在於真皮或表皮中的抗原； 。      白斑病，其中抗原或配體是黑色素細胞抗原，例如黑色素或酪胺酸酶； 。      自體免疫前列腺炎，其中抗原或配體是前列腺抗原； 。      任何不樂見的免疫反應，其中抗原或配體是活化抗原或在不樂見的反應部位處存在的T效應子細胞上表現的其他抗原； 。      組織排斥反應，其中抗原或配體是對移植組織具特異性的MHC；及 。      發炎性病況，其中抗原或配體是在參與發炎的造血譜系的非淋巴樣細胞上表現的抗原或配體。
在一個具體例中，可以改造T細胞以表現嵌合自體抗原受體(CAAR)T 細胞，以特異性消除負責自體免疫疾病的B細胞。因此，除非上下文另有指明，否則提到表現CAR的T細胞包括提及表現CAAR的細胞 7.        實例 7.1. 材料與方法 7.1.1.      生產IL2及IL15促效劑
編碼在以表5A和5B中所述(或含有所述模塊)的IL2和IL15突變蛋白的構建物(若適當的話，以IL2M_或IL15M_命名標識)，具有或不具有靶向部分(以T命名標識)，並產生Fc對照。藉由瞬時轉染(Thermo Fisher Scientific)在Expi293F™細胞中表現構建物。使用帶有HiTrap Protein G HP管柱(GE Healthcare)的ProteinMaker系統(Protein BioSolutions, Gaithersburg, MD)純化Expi293F上清液中的蛋白質。在單步溶離後，將突變蛋白中和，透析至含5%甘油的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)的最終緩衝液中，等分分裝並保存在-80℃下。
表 5A
分子/ 模塊 別名 說明 序列
IL2 IL2 重組人類IL2 (來源：BD Pharmingen™) APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO:2)
IL2M0 IL2突變 蛋白0 人類IL2 (WT)- GGGGS-Fc   Fc來自WO2014/121087的 SEQ ID NO:31，其為效應子 功能減少的IgG4 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:98)
IL2M1 IL2突變 蛋白1 偏好CD122的人類IL2 (F42A、 Y45A、L72G)- GGGGS-Fc   Fc來自WO2014/121087的 SEQ ID NO:31，其為效應子功能 減少的IgG4 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:99)
IL2M2 IL2突變 蛋白2 人類IL2-(GGGGS)4 -人類IL-2Ra- GGGGS-Fc   IL2在這個融合蛋白中與IL-2Rα 交互作用而形成不活化頭對尾 二聚體，其緩慢地解離成活性單體， 咸信群中的~99.5%呈不活化二聚體 形式。 Fc來自WO2014/121087的 SEQ ID NO:31，其為效應子功能 減少的IgG4 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:100)
IL2M3 IL2突變 蛋白3 Fc-(GGGGS)3-人類IL2-Rα- (GGGGS)5-人類IL2融合物   IL2在這個融合蛋白中與IL-2Rα 交互作用而形成不活化頭對尾 二聚體，其緩慢地解離成活性單體， 咸信群中的~99.5%呈不活化二聚體 形式。   Fc來自WO2014/121087的 SEQ ID NO:31，其為效應子功能 減少的IgG4 ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO:101)
IL2M4 IL2突變 蛋白4 Fc-GGGGS-人類IL2(C125A)   IL2(C125A)是IL2變體，其中 半胱胺酸125突變成丙胺酸以減少 聚集。IL2組分已知不展現 受體偏好。   Fc是人類IgG1，帶有N297G突變 以移除在這個位點處的醣基化。 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID NO:102)
IL2M5 IL2突變 蛋白5 Fc-GGGGS-人類IL2 (N88D、 C125A)融合物   N88D是天冬醯胺酸88變成 天冬胺酸的突變。帶有這個突變的 IL2變體對CD122的結合減少並因此 被認為是偏好CD25。   C125A是一個半胱胺酸125丙胺酸 的突變以減少聚集。   Fc是人類IgG1，帶有N297G突變 以移除在這個位點處的醣基化。 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT (SEQ ID NO:103)
IL2M6 IL2突變 蛋白6 Fc-(GGGGS)3 -hIL2(H16A、F42A)   (也被稱為Fc-(GGGGS)3 -hIL2(2m))   ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO:104)
IL2M7 IL2突變 蛋白7 hIL2(H16A、 F42A)-GGGGS-IgG4st_Fc_holestar   (也被稱為hIL2(2m)-GGGGS-IgG4st_Fc_ holestar)   Fc來自WO2014/121087的 SEQ ID NO:31，其為效應子功能 減少的IgG4，帶有額外的臼與 星突變 APTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:105)
IL15M1 IL15突變 蛋白1 人類IL15-(GGGGS)5-人類 IL15Ra-(GGGGS)4-Fc融合物   Fc來自WO2014/121087的 SEQ ID NO:31，其為效應子功能 減少的IgG4 NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:106)
IL15M2 IL15突變 蛋白2 Fc-(GGGGS)3 -人類IL15Ra- (GGGGS)4 -人類IL15融合物   Fc來自WO2014/121087的 SEQ ID NO:31，其為效應子功能 減少的IgG4 ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (SEQ ID NO:107)
T1 靶向部分1 抗-鼠類PD1抗體 T1包含T6，包含抗PD1抗體的Fab
T2 靶向部分2 CMVpp65(495-503)-GCGGS- (GGGGS)2 -hB2m-(GGGGS)4 - hHLA.A2肽-MHC靶向部分 NLVPMVATVGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:108)
T3 靶向部分3 HPV16E7(11-19)-GCGGS- (GGGGS)2 -hB2m-(GGGGS)4 - hHLA.A2肽-MHC靶向部分 YMLDLQPETGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:109)
T4 靶向部分4 OVA(257-264)-GCGGS- (GGGGS)2 -mB2m-(GGGGS)4 - mH2Kb肽-MHC靶向部分 SIINFEKLGCGGSGGGGSGGGGSIQKTPQIQVYSRHPPENGKPNILNCYVTQFHPPHIEIQMLKNGKKIPKVEMSDMSFSKDWSFYILAHTEFTPTETDTYACRVKHASMAEPKTVYWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGPHSLRYFVTAVSRPGLGEPRYMEVGYVDDTEFVRFDSDAENPRYEPRARWMEQEGPEYWERETQKAKGNEQSFRVDLRTLLGCYNQSKGGSHTIQVISGCEVGSDGRLLRGYQQYAYDGCDYIALNEDLKTWTAADMAALITKHKWEQAGEAERLRAYLEGTCVEWLRRYLKNGNATLLRTDSPKAHVTHHSRPEDKVTLRCWALGFYPADITLTWQLNGEELIQDMELVETRPAGDGTFQKWASVVVPLGKEQYYTCHVYHQGLPEPLTLRWEPPPSTVSNMA (SEQ ID NO:110)
T5 靶向部分5 MuLV p15E-GCGGS-(GGGGS)2 -mB2m- (GGGGS)4 -mH2Kb肽-MHC 靶向部分 KSPWFTTLGCGGSGGGGSGGGGSIQKTPQIQVYSRHPPENGKPNILNCYVTQFHPPHIEIQMLKNGKKIPKVEMSDMSFSKDWSFYILAHTEFTPTETDTYACRVKHASMAEPKTVYWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGPHSLRYFVTAVSRPGLGEPRYMEVGYVDDTEFVRFDSDAENPRYEPRARWMEQEGPEYWERETQKAKGNEQSFRVDLRTLLGCYNQSKGGSHTIQVISGCEVGSDGRLLRGYQQYAYDGCDYIALNEDLKTWTAADMAALITKHKWEQAGEAERLRAYLEGTCVEWLRRYLKNGNATLLRTDSPKAHVTHHSRPEDKVTLRCWALGFYPADITLTWQLNGEELIQDMELVETRPAGDGTFQKWASVVVPLGKEQYYTCHVYHQGLPEPLTLRWEPPPSTVSNMA (SEQ ID NO:111)
T6 靶向部分6 抗LAG3抗體 T6包含抗LAG3抗體的Fab
T7 靶向部分7 T3 (即HPV16E7(11-19)-GCGGS- (GGGGS)2 -hB2m-(GGGGS)4 - hHLA.A2)-(GGGGS)4 -Fc (杵) YMLDLQPETGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:112)
T8 靶向部分8 T2 (即CMVpp65(495-503)-GCGGS- (GGGGS)2 -hB2m-(GGGGS)4 - hHLA.A2)-(GGGGS)4 -Fc (杵) NLVPMVATVGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:113)
T9 靶向部分9 CMVpp65(495-503)-GCGGS- (GGGGS)2 -hB2m   (HLA-A*0201中的 CMVpp65(495-503))   NLVPMVATVGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (SEQ ID NO:114)  
T10 靶向部分10 HPV16E7(11-19)-GCGGS- (GGGGS)2-hB2m   (HLA-A*0201中的HPV16E7 (11-19)) YMLDLQPETGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (SEQ ID NO:115)
表 5B
分 子 別名 說明 序列
T1-IL2M3 抗-mPD1-IL2突變 蛋白3 IL2突變蛋白3加上 N-端抗- PD1抗體 IL2突變蛋白3經由(GGGGS)3連接子(SEQ ID NO:6)連接至抗PD1抗體重鏈的C端。
T2-IL2M3 CMVpp65_scpMHC- IL2突變蛋白3 CMVpp65(495-503)- GCGGS-(GGGGS)2 -hB2m- (GGGGS)4 -hHLA.A2- (GGGGS)4 -Fc-hIL2- Rα-hIL2   Fc來自WO2014/121087的 SEQ ID NO:31，其為效應 子功能減少的IgG4 NLVPMVATVGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:116)
T2-IL2M6 CMVpp65_scpMHC- IL2突變蛋白6 CMVpp65(495-503)-GCGGS- (GGGGS)2 -hB2m-(GGGGS)4 - hHLA.A2-(GGGGS)4 -Fc- (GGGGS)3 -hIL2(H16A、F42A)   (也稱為CMVpp65(495-503)- GCGGS-(GGGGS)2 -hB2m- (GGGGS)4 -hHLA.A2- (GGGGS)4 -Fc-(GGGGS)3 - hIL2(2m))   Fc來自WO2014/121087的 SEQ ID NO:31，其為效應 子功能減少的IgG4   NLVPMVATVGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO:117)
T3-IL2M3 HPV16E7_scpMHC- IL2突變蛋白3 HPV16E7(11-19)-GCGGS- (GGGGS)2 -hB2m-(GGGGS)4 - hHLA.A2-(GGGGS)4 -Fc-hIL- 2Rα-hIL2   Fc來自WO2014/121087的 SEQ ID NO:31，其為效應 子功能減少的IgG4 YMLDLQPETGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO:118)
T3-IL2M6 HPV16E7_scpMHC- IL2突變蛋白6 HPV16E7(11-19)-GCGGS- (GGGGS)2 -hB2m-(GGGGS)4 - hHLA.A2-(GGGGS)4 -Fc- (GGGGS)3 -hIL2(H16A、 F42A)   (也稱為HPV16E7(11-19)- GCGGS-(GGGGS)2 -hB2m- (GGGGS)4 -hHLA.A2- (GGGGS)4 -Fc-(GGGGS)3 - hIL2(2m))   Fc來自WO2014/121087的 SEQ ID NO:31，其為效應 子功能減少的IgG4   YMLDLQPETGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO:119)
T4-IL2M6 Ova_scpMHC-IL2 突變蛋白6 OVA(257-264)-GCGGS- (GGGGS)2 -mB2m-(GGGGS)4 - mH2Kb-(GGGGS)4 -Fc- (GGGGS)3 -hIL2(H16A、 F42A)   (也稱為OVA(257-264)- GCGGS-(GGGGS)2 -mB2m- (GGGGS)4 -mH2Kb-(GGGGS)4 - Fc-(GGGGS)3 -hIL2(2m))   Fc來自WO2014/121087的 SEQ ID NO:31，其為效應 子功能減少的IgG4 SIINFEKLGCGGSGGGGSGGGGSIQKTPQIQVYSRHPPENGKPNILNCYVTQFHPPHIEIQMLKNGKKIPKVEMSDMSFSKDWSFYILAHTEFTPTETDTYACRVKHASMAEPKTVYWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGPHSLRYFVTAVSRPGLGEPRYMEVGYVDDTEFVRFDSDAENPRYEPRARWMEQEGPEYWERETQKAKGNEQSFRVDLRTLLGCYNQSKGGSHTIQVISGCEVGSDGRLLRGYQQYAYDGCDYIALNEDLKTWTAADMAALITKHKWEQAGEAERLRAYLEGTCVEWLRRYLKNGNATLLRTDSPKAHVTHHSRPEDKVTLRCWALGFYPADITLTWQLNGEELIQDMELVETRPAGDGTFQKWASVVVPLGKEQYYTCHVYHQGLPEPLTLRWEPPPSTVSNMAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO:120)
T5-IL2M6 MuLV p15E_ scpMHC- IL2突變蛋白6 MuLV p15E-GCGGS- (GGGGS)2 -mB2m-(GGGGS)4 - mH2Kb-(GGGGS)4 -Fc- (GGGGS)3 -hIL2(H16A、F42A)   (也稱為MuLV p15E-GCGGS- (GGGGS)2 -mB2m-(GGGGS)4 - mH2Kb-(GGGGS)4 -Fc- (GGGGS)3 -hIL2(2m))   Fc來自WO2014/121087的 SEQ ID NO:31，其為效應 子功能減少的IgG4 KSPWFTTLGCGGSGGGGSGGGGSIQKTPQIQVYSRHPPENGKPNILNCYVTQFHPPHIEIQMLKNGKKIPKVEMSDMSFSKDWSFYILAHTEFTPTETDTYACRVKHASMAEPKTVYWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGPHSLRYFVTAVSRPGLGEPRYMEVGYVDDTEFVRFDSDAENPRYEPRARWMEQEGPEYWERETQKAKGNEQSFRVDLRTLLGCYNQSKGGSHTIQVISGCEVGSDGRLLRGYQQYAYDGCDYIALNEDLKTWTAADMAALITKHKWEQAGEAERLRAYLEGTCVEWLRRYLKNGNATLLRTDSPKAHVTHHSRPEDKVTLRCWALGFYPADITLTWQLNGEELIQDMELVETRPAGDGTFQKWASVVVPLGKEQYYTCHVYHQGLPEPLTLRWEPPPSTVSNMAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT  (SEQ ID NO:121)
T6-IL2M3 抗-mLAG3-IL2 突變蛋白3 IL2突變蛋白3加上N端 抗LAG3抗體 IL2突變蛋白3經由(GGGGS)3連接子(SEQ ID NO:6)連接至抗LA3抗體重鏈的C端。
7.1.2.    人類PBMC上的pSTAT5的細胞內染色
將低溫保存的人類PBMC解凍並在無IL-2的培養基中靜置過夜。次日，將細胞用不同IL-2變體的連續稀釋液處理，然後用BD Cytofix™固定緩衝液在37℃下固定12分鐘。然後在冰上用預冷的BD Phosflow™ Perm Buffer III滲透細胞20分鐘。接著將細胞用FACS緩衝液(PBS + 2% FBS)洗滌兩次，然後用含有Alexa Fluor® 647綴合抗STAT5 pY694(BD Biosciences)的染色混合物在室溫下於黑暗中培育45分鐘。為了鑑定PBMC中的不同淋巴細胞群，染色混合物中還包括以下抗體組：BUV496-抗CD8、BUV395-抗CD4、BV421-抗-NKp46、BV711-抗-CD56、BV786-抗-CD3、AlexaFluor® 488-抗FoxP3，PE-抗CD25(BD Biosciences)。用FACS緩衝液洗滌細胞兩次，然後在BD LSRFortessa™ X-20流式細胞儀上擷取數據。使用FlowJo v10分析原始數據。 7.1.3.    尺寸排阻層析以及多角度光散射
尺寸排阻超效液相層析(SEC)與多角度光散射(MALS)結合用於評估不同突變蛋白的寡聚狀態。在Waters Acquity UPLC H-Class系統上進行SEC分析。10 μg的各個蛋白質樣品被注入一個由Acquity BEH SEC管柱(200 Å，1.7 μm，4.6x150 mm)組成的雙管柱串聯設置。流速設定為0.3ml/min。移動相緩衝液含有10 mM磷酸鈉，500 mM NaCl，pH 7.0。使用Wyatt Optilab T-Rex和Wyatt-uDawn Treos LS偵測器在280 nm處監測UV吸光值，光散射和折射率變化。 7.1.4.    FACS結合分析
為了分析抗體-IL2突變蛋白對細胞表面上目標抗原的結合，收集穩定表現抗原目標的HEK293細胞並將其重新懸浮於FACS緩衝液(PBS + 2% FBS)中。關於每次結合分析，將50,000-100,000個細胞與連續稀釋的IL-2突變蛋白在FACS緩衝液中於4℃下一起培育30分鐘。然後將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，並且與1：500稀釋的APC-F(ab)'2抗小鼠IgG Fcγ片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories)於4℃下一起培育30分鐘。在培育結束時，將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，並在BD FACSCelestaTM 流式細胞儀上進行分析。 7.1.5.    腫瘤接種，治療及測量
將總計3x105 個MC38細胞皮下注射(s.c.)到6-8週大雌性C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratory)的腹側內。當腫瘤大小達到80-100mm3 時將小鼠隨機分組，並用不同的IL-2/IL-15促效劑腹膜內治療。每隔一天或每半週重複四次以上的治療。使用數字卡尺每半週測量腫瘤一次，並將腫瘤大小計算為長度x寬度2 /2。在記錄存活率的腫瘤研究中，失去存活定義為死亡或當腫瘤達到任何維度為20mm或總體積為2250mm3 時。 7.1.6.    腫瘤，脾臟及血液的FACS分析
使用溫和的MACSTM 解離器(Miltenyi Biotec.)收取腫瘤並進行處理以產生單細胞懸浮液。計數細胞，然後用稀釋在BD Horizon Brilliant Buffer中的經螢光標記抗體混合物染色。
在用IL2突變蛋白治療後，從荷瘤或非荷瘤小鼠收集脾臟和血液。將脾臟壓碎通過70 µm Corning®細胞過濾器以產生單細胞懸浮液。然後用ACK溶解緩衝液(Lonza)處理脾臟和血液，以溶解紅血球(RBC)。RBC溶解後，計數淋巴細胞並用稀釋在BD Horizon Brilliant Buffer中的抗體混合物染色。在BD LSRFortessa™ X-20流式細胞儀上分析所有經染色的樣品。使用FlowJo v10處理原始數據。 7.1.7.    抗原特異性T細胞以及嵌合抗原受體(CAR) T細胞
從OT-I TCR轉基因小鼠(Jackson Laboratory)的脾臟中分離出卵白蛋白(257-264)特異性小鼠OT-I T細胞。CMV pp65(495-503)特異性人類T細胞從CMV+供體的PBMC擴增而來，並從ASTARTE Biologics(Cat.＃1049)獲得。以MOI = 5用慢病毒轉導之前，藉由用CD3/CD28微珠粒加上100 U/ml重組人類IL2刺激CD3+ T細胞來產生CAR T細胞。然後在將培養基更換成缺少IL2的CTS補充OpTmizer™培養基(Gibco)之前，用CD3/CD28微珠粒加上100 U/ml重組人類IL2擴增經轉導的細胞歷時17天。在37℃和5% CO2 下培養隔夜後，如第7.1.2節中所述進行pSTAT5分析。 7.2. 實例1：IL-2Rα經減弱IL2突變蛋白在活體外的活性
為了測試IL2 M1在不同免疫細胞群中觸發IL2受體信號傳導的能力，在37℃下用濃度遞增的IL2M0或IL2M1刺激4×105 個人類PBMC歷時20分鐘。作為IL2受體媒介信號傳導的指標，如第7.1.2節中所述，藉由流式細胞術測量免疫細胞亞群中的細胞內STAT5磷酸化程度。圖4A-4C顯示圈選的Treg (圖4A)、CD8+ T細胞(圖4B)和NK細胞(圖4C)中的STAT5活性。相較於IL2M0，IL2 M1對缺乏可偵測到IL-2Rα表現的CD8+ T細胞和NK細胞維持等同活性。然而，其對IL-2Rα+Treg的活性比對IL2-Fc低了好幾個數量級。因此，IL2M1在活體外優先失去對Treg甚過對其他效應子細胞群。 7.3. 實例2：IL-2Rα經減弱IL2突變蛋白在活體內對免疫細胞群的活性
C57BL/6J小鼠每天接受腹膜內注射PBS，15 μg IL2M0或IL2M1持續連續六天。最後一次注射後一天，收取脾臟進行流式細胞術分析。在圖5A-5C中分別顯示受治療小鼠脾臟中的Treg，NK細胞和CD8+ T細胞數目。定量TCRβ+ T細胞內CD8+和CD4+ T細胞的相對頻率(圖5D)。
儘管IL2M0(IL2-Fc)在活體內偏好擴增Treg，但是在IL2M1(偏好CD122-的人類IL2-Fc融合物)中這樣的Treg-選擇性被消除。相反，IL2M1誘導NK和CD8+ T細胞的特異性擴增，同時對Treg群的影響最小。因此，IL2M1可透過選擇性擴增效應子細胞群來重塑周邊淋巴細胞區。 7.4.實例3：IL2與IL-2Rα經減弱IL2突變蛋白做為單一療法以及與抗PD1組合的抗腫瘤活性
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接種3x105 個MC38腫瘤細胞，並在第8天當平均腫瘤大小達到100mm3 時進行隨機分組。然後用同型(10mg/kg)、IL2M0 (0.75mg/kg)+同型(10mg/kg)、IL2M1(0.75mg/kg)+同型(10mg/kg)、抗mPD1(10mg/kg)，IL2M0(0.75mg/kg)+抗mPD1(10mg/kg)或IL2M1(0.75mg/kg)+抗mPD1(10mg/kg)每隔一天(用於IL2M0和IL2M1)或每半週(用於同型和抗mPD1)腹膜內治療小鼠總計五次注射。圖6顯示了各個治療組中的平均腫瘤體積(mm3 + SD)(圖6A)和卡普蘭-邁爾存活率曲線(圖6B)。失去存活定義為死亡或當腫瘤達到任何維度為20mm或總體積為2250mm3 時。
作為單一療法，IL2M0(IL2-Fc)顯著抑制已長成腫瘤的進展。將其與抗PD1組合進一步以協同的方式促進腫瘤消退和無腫瘤存活的持久性。出乎意料的是，儘管其具有特異性擴增NK和CD8+ T細胞的能力，但即使存在抗PD1，CD122偏好的IL2M1也展現出很少的抗腫瘤作用。 7.5.       實例4：IL2M0的給藥研究
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接種3x105 個MC38腫瘤細胞，並在第8天當平均腫瘤大小達到90mm3 時進行隨機分組。然後用指定劑量的IL2M0每隔一天腹膜內治療小鼠總計五次注射。圖7顯示了平均腫瘤體積(mm3 + SD)(圖7A)，卡普蘭-邁爾存活率曲線(圖7B)以及個別腫瘤生長曲線(7C.1-7C.5)。失去存活定義為死亡或當腫瘤達到任何維度為20mm或總體積為2250mm3 時。
這項研究顯示，IL2M0的抗腫瘤功效高度仰賴於所注射的劑量，最高劑量最為有效。從5 μg/劑量開始觀察到效用，並增加劑量至10μg和20μg/劑量導致腫瘤控制更好和存活益處。 7.6.       實例5：IL2M1相比於IL2M0的抗腫瘤活性與毒性
在兩項不同的研究中，C57BL/6J小鼠在第0天皮下接種3x105 個MC38腫瘤細胞，並在第8天當平均腫瘤大小達到90mm3 時進行隨機分組(研究＃1)，或在第7天當平均腫瘤大小達到70mm3 時進行隨機分組(研究＃2)。然後每隔一天用指定劑量的IL2M0或IL2 M1腹膜內治療小鼠總計五次注射。各個治療組的平均腫瘤體積(mm3 + SD)(圖8A-8B，分別顯示研究＃1和研究＃2的結果)和體重變化百分比(圖8C，來自研究＃2)。箭頭指示治療日。
IL2M1維持無效控制腫瘤進展至多40μg/劑量，而10μg/劑量IL2M0導致了腫瘤生長顯著延遲(圖8A)。當以75或100μg/劑量給予IL2M1時，觀察適度功效(圖8B)。然而，在這些劑量下，它引起嚴重的毒性，包括明顯的體重減輕(圖8C)，機能減退和死亡率增加。高劑量IL2M1組中所觀察到的功效是否是由宿主小鼠的疾病引起的抗腫瘤免疫性或腫瘤營養不良所致，尚待確定。
儘管在控制腫瘤生長方面不比10μg/劑量IL2M0有效，100μg/劑量的IL2M1確實誘導周邊NK和CD8+ T細胞大規模擴增，同時對Treg的影響比由10μg/劑量的IL2M0誘導者還不深遠。但是，周邊效應子細胞群的這種大規模擴增並未轉化為更有效的抗腫瘤反應。 7.7.       實例6：IL15突變蛋白的抗腫瘤活性及毒性
IL15與IL2共用相同的β/γ受體次單位，但它不結合至IL2-Rα。IL15通常被表現為骨髓細胞表面上的IL15/IL15Rα複合體的一部分，然後被呈遞以活化周圍的淋巴細胞(圖1)。IL15M1，其包含IL15-IL15Rα融合物，咸信藉由IL15Rα模擬反式呈遞IL15並特異地接合IL-2Rβ/γ，因而引發與IL2-Rα經減弱IL2突變蛋白(例如IL2M1)類似的信號傳導。
測試了IL15M1的抗腫瘤活性和毒性。C57BL/6J小鼠在第0天皮下接種3x105 M個MC38腫瘤細胞，並在第7天當平均腫瘤大小達到70mm3 時進行隨機分組。然後每隔一天用指定劑量的IL2M0和IL15M1腹膜內治療小鼠總計五次注射。圖9顯示了各個治療組中的平均腫瘤體積(mm3 + SD)(圖9A)和體重變化百分比(圖9B)。箭頭指示治療日。如第7.1.6節中所述，在第11天收集指定組別的血液並藉由流式細胞儀進行分析。量化所指定的淋巴細胞群的計數(圖9C.1-C.4)。
在IL15M1治療後觀察到適度但劑量依賴性的抗腫瘤功效(圖9A)。然而，類似於IL2M1，IL15M1治療在荷瘤小鼠中引起了大約同時發生的劑量依賴性毒性(圖9B)。IL15M1還在這些荷瘤小鼠的血液中誘導了周邊淋巴細胞的戲劇性擴增，主要是NK和CD8+ T細胞，而不是Treg(圖9C.1-C.4)。連同IL2M1的實例，這些結果表明，選擇性刺激IL-2Rβ/γ受體，無論是由一個具有IL-2Rα結合被消除的變體IL2或者IL15突變蛋白，具有次佳的治療指數-相對於毒性來說，功效有限。這也表明，受到IL2M1和IL15M1所擴增的周邊NK和CD8+ T細胞在控制腫瘤生長方面效率低下。 7.8.       實例7：IL2Rα減弱的IL2突變蛋白對瘤內淋巴細胞的活性
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接種3x105 個MC38腫瘤細胞，並在第7天當平均腫瘤大小達到100mm3 時進行隨機分組。然後每隔一天用PBS、抗mPD1(10mg/kg)、IL2M0(0.75mg/kg)+抗mPD1(10mg/kg)或IL2M1(0.75mg/kg)+抗mPD1(10mg/kg)腹膜內治療小鼠。在總計三劑後，於第12天收取腫瘤以分離並分析腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。圖10A.1至10A.5顯示了各個治療組的總CD45+ TIL的密度tSNE圖。在圖10A.1至10A.5中，強調簇1-4於總TIL內的百分比的定量結果顯示在圖10B中。與針對不同淋巴細胞群的定義標記的表現重疊之總TIL的tSNE圖顯示在圖10C.1至10C.7中。這些結果顯示，IL2M0而非IL2M1比IL2M1在腫瘤中更明顯地誘導CD8+ T細胞擴增。
進一步從總TIL中圈選出TCRβ+ T細胞。每次治療後，腫瘤中的CD8+ T細胞內的Ki67+ IL-2Rα+ 細胞的代表性FACS圖和頻率定量分別顯示於圖10D與圖10E中。腫瘤中Ki67+ IL-2Rα+ CD8+ T細胞密度的定量結果顯示於圖10F中。腫瘤中CD4+ T細胞內FoxP3+ IL-2Rα+ Treg的代表性FACS圖和頻率定量顯示於圖10G和圖10H中。腫瘤中FoxP3+ IL-2Rα+ CD4+ Treg密度定量結果顯示於圖10I中。這些結果證明，相對於腫瘤中的Treg，IL2M0而非IL2M1增加了增生性IL-2Rα+CD8+ T細胞。
在CD8+ TIL中評估IL-2Rα和PD1的表現。總CD45+ TIL的tSNE圖與這些標記的表現重疊，而結果顯示於圖10J-10L中。表現剖繪圖顯示共表現IL-2Rα和PD1的腫瘤浸潤性CD8+ T細胞亞群。這些結果證明，IL-2Rα和PD1在腫瘤中的一些腫瘤內CD8+ T細胞上共表現。基於這兩種蛋白質於其活化後在抗原特異性CD8+ T細胞上的強力表現，它們的共表現可能會在此處未捕獲的時間點在更為廣泛的CD8+ T細胞群中發生(Kaliaet al. , 2010, Immunity 32(1): 91-103)。
如第7.1.6節中所述，從同一隻荷瘤小鼠中收取的血液和脾臟進行流式細胞術分析。脾臟中NK細胞和Treg的頻率定量結果顯示於圖10M和圖10N中。血液中NK細胞和Treg的頻率定量結果顯示於圖10P和圖10Q中。脾臟中TCRβ+ T細胞內CD8+和CD4+ T細胞的相對頻率定量結果顯示於圖10O中而在血液中者顯示於10R中。這些結果證明，IL2M1相對於Treg特異性擴增NK和CD8+ T細胞，而IL2M0偏好擴增脾臟和血液中的Treg。
在周邊中相對在腫瘤中，受到IL2M0和IL2M1所誘導的免疫細胞概況完全不同：在血液和脾臟中，IL2M0偏好擴增Treg，而IL2M1導致NK和CD8+ T細胞選擇性擴增。在腫瘤中，IL2M0擴增CD8+ T細胞但不擴增Treg，而IL2M1僅增加NK細胞。這些觀察結果可以解釋為什麼受到IL-2Rα減弱的IL2突變蛋白或IL15變體所誘導的周邊NK和CD8+ T細胞的大量擴增不會轉化成良好的抗腫瘤反應，因為這樣的擴增並不會延續到腫瘤微環境。這也解釋了為什麼在周邊擴增抑制性Treg的IL2M0可以誘導有效的抗腫瘤免疫性。在腫瘤中被抗原活化時，腫瘤特異性T細胞上調它們的IL-2Rα，使得它們對IL2M0治療更加敏感。總之，這些結果表明，保有接合IL-2Rα的能力對於IL2相關分子的抗腫瘤功效是必須的。 7.9.        實例8：腫瘤Treg對IL2刺激的反應不如脾臟Treg
如第7.1.6節中所述，從帶有MC38腫瘤的C57BL/6J小鼠中收取腫瘤和脾臟以分離淋巴細胞。將經消化的腫瘤細胞進一步用CD45 MicroBead進行MACS® Cell Separation，以富集TIL和。在37℃下用濃度漸增的重組人類IL2在活體外刺激4x105 個TIL或2x106 個脾臟細胞歷時20分鐘。圖11顯示了如藉由FACS根據第7.1.2節的分析所測定，在圈選的Treg(圖11A)和CD8+ T細胞(圖11B)內歷經STAT5磷酸化的細胞百分比。
重組人類IL2對來自腫瘤和脾臟的Treg表現出相似的EC50。然而，儘管IL2能夠在幾乎所有脾臟Treg中誘導STAT5磷酸化，但只有一部分腫瘤Treg在IL-2刺激後表現出STAT5磷酸化。相反地，來自腫瘤的CD8+ T細胞對IL-2治療有反應，EC50比來自脾臟者還低。這個結果表明，腫瘤Treg對IL2刺激的反應性比周邊Treg低，而腫瘤浸潤性CD8+ T細胞對IL2刺激可能比其脾臟對應物更加敏感。它還揭示了腫瘤Treg區中的潛在異質性。 7.10.    實例9：IL2M2和IL2M3對淋巴細胞群的活性
用濃度漸增的IL2M0，IL2M2和IL2M3刺激人類PBMC。如第7.1.2節中所述，藉由FACS測定細胞內STAT5磷酸化程度，而結果顯示於圖12A(圈選的Treg)、圖12B(CD8+ T細胞)與圖12C(NK細胞)中。
IL2M2和IL2M3對不同的淋巴細胞群表現出彼此相似的活性。相較於IL2M0，它們對所有測試的細胞類型均顯示出活性降低。整體而言，它們對所有IL2受體均減弱，同時仍然保持著對IL-2Rα+細胞的選擇性。
C57BL/6J小鼠在第0天以流體動力學的方式注射5 μg編碼IL2M0、IL2M1，IL2M2或IL2M3的質體DNA。各處理組在質體注射之後的體重變化百分比顯示於圖12D中。與IL2M0和IL2M1相反，IL2M2和ILM3注射未導致可偵測到的體重減輕，暗示著毒性明顯降低。 7.11.    實例10：IL2M2單一療法在同基因小鼠模型中的抗腫瘤活性
Balbc/J小鼠在第0天皮下接種Colon 26或4T1腫瘤細胞，並在第10或11天當平均腫瘤大小達到80mm3 時進行隨機分組。隨機分組後，立即在人類泛素C啟動子控制下，向小鼠以流體動力學的方式注射指定劑量之編碼人類Fc或IL2M2的質體DNA。蛋白質持續表現並由肝細胞分泌，以維持穩定的血清濃度。測量各治療組中的平均腫瘤體積。Colon 26和4T1的結果(以mm3 + SD表示)顯示在圖13A和圖13B中。箭頭指示流體動力學注射之日。
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接種MC38腫瘤細胞，並在第7天當平均腫瘤大小達到80mm3 時進行隨機分組。小鼠接著每隔三天用PBS對照，IL2M0(15μg)或IL2M2(50μg)腹膜內治療總計四次注射。測量各治療組的平均腫瘤體積，而結果(以mm3 + SD表示)顯示在圖13C中。
不論是藉由流體動力學遞送DNA或蛋白質注射，IL2M2治療皆抑制了多個同基因腫瘤模型中的腫瘤進展(圖13)。儘管對多個淋巴細胞群的效力比IL2M0少了約100倍(圖12A-C)，但約高3倍劑量的IL2M2仍能夠達到與IL2M0相當的抗腫瘤功效。 7.12.    實例11：IL2M4及IL2M5對淋巴細胞群的活性
用濃度漸增的IL2M4或IL2M5刺激人類PBMC。如第7.1.2節中所述，藉由FACS測量細胞內STAT5磷酸化程度。圈選的Treg(圖14A)，CD8+ T細胞(圖14B)和NK細胞(圖14C)的結果顯示於圖14中。
相較於IL2M4，IL2M5對所有測試的細胞類型顯示出活性降低。然而，減弱的程度在不同淋巴細胞群中有別，其中IL-2Rα-NK和CD8+ T細胞比IL-2Rα+ Treg更為受到影響。整體而言，IL2M5大致減弱但增加了對IL-2Rα+細胞的選擇性。 7.13.    實例12：IL2M5單一療法的抗腫瘤功效
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接種MC38腫瘤細胞，並在第7天當平均腫瘤大小達到80mm3 時進行隨機分組。小鼠接著每隔三天用PBS，IL2M4(15μg)或IL2M5(100μg)治療總共四次注射。測量平均腫瘤體積。各治療組的結果(以mm3 + SD表示)顯示在圖15A中，而個別腫瘤顯示在圖15B至15D。
鑑於IL2M5與IL2M4相比高度減弱，因此在腫瘤研究中以更高劑量來使用。儘管對多個淋巴細胞群比IL2M4的效力低＞100X(圖14A-C)，但是約6倍高劑量的IL2M5比IL2M4實現了更為有效的腫瘤控制。在用100μg/劑量IL2M5治療的五隻小鼠中，有三隻小鼠觀察到完全腫瘤消退和無腫瘤存活。 7.14.    實例13：含IL-2Rα之突變蛋白的更高階結構
尺寸排阻超效液相層析(SEC)與多角度光散射(MALS)結合用於評估IL2M2和IL2M3的寡聚狀態。IL2M2含有多種高分子量物質，其中主要的物質(〜60%)展現出與二聚體的二聚體一致的莫耳質量(圖16A)。相反地，IL2M3不易寡聚話。它主要以二聚體(〜77%)的形式存在，還有兩個較小的高分子量物質(圖16B)。箭頭指示每個主要群的測定分子量和相對百分比。不同結構之間的平衡在圖3A和3B中說明(分別為IL2M2和IL2M3)。 7.15.    實例14：T1-IL2M3保有對細胞表面PD1的結合
如第7.1.4節中所述，藉由FACS評估含有抗PD1靶向部分的T1-IL2M3的結合。如圖17中所示，T1-IL2M3和親本抗mPD1抗體顯現出與在其表面穩定表現小鼠PD1之人類HEK293細胞相當的結合，這表明透過將抗體融合至IL2M3，對目標結合的影響最小。 7.16.    實例15：T1-IL2M3顯示出比抗PD1 & IL2M3之組合還要優異的抗腫瘤功效
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接種3x105 個MC38腫瘤細胞，並在第7天當平均腫瘤大小達到100mm3 時進行隨機分組。然後每半週用同型(1mg/kg)、抗mPD1(1mg/kg)、同型-IL2M3(0.5mg/kg)+抗mPD1(0.33mg/kg)，同型-IL2M3(1.5mg/kg) +抗mPD1(1mg/kg)、T1-IL2M3(0.5mg/kg)+同型(0.33mg/kg)，或T1-IL2M3(1.5mg/kg)+同型(1mg/kg)總計五次注射。
測量了平均腫瘤體積。各治療組的結果(以mm3 + SD表示)顯示在圖18A中，而個別腫瘤顯示於圖18B.1至18B.4中。
雖然同型-IL2M3 +抗PD1不能賦予腫瘤控制，但T1-IL2M3 +同型在兩個測試劑量下均顯示出巨大的功效，更多的小鼠在更高劑量下經歷了完全腫瘤消退。以0.5 mg/kg劑量T1-IL2M3遞送的IL2M3部分數量非常低，相當於6.3 μg/劑量的IL2M3。這個結果揭示了T1-IL2M3相對於抗PD1 & IL2M3的組合具有優異的抗腫瘤功效。這也表明靶向PD1大大降低了實現有效腫瘤控制所需的IL2M3數量。
在第15天從荷瘤小鼠中收集血液，並藉由FACS分析。在CD8+ T細胞內的CD44高 CD62L低 細胞和PD1+ 細胞的頻率，以及在CD4+ T細胞內的FoxP3+ IL-2Rα+ Treg的頻率分別顯示於圖18C.1-18D.2和圖18E.1-18E.2中。
相較於非靶向同型-IL2M3，T1-IL2M3誘導的是CD44hi CD62Llo 和PD1+ 的經活化效應子記憶CD8+ T細胞的特異性擴增。同時，T1-IL2M3引起不樂見的Treg增生比同型-IL2M3還少。這個結果證明，T1-IL2M3融合物能夠將IL2M3重定向至表現PD1的經抗原活化的CD8+ T細胞。經活化的T細胞上調PD1，導致T細胞抑制。除了在這些細胞中阻斷PD1信號傳導外，T1-IL2M3還可以藉由刺激IL2信號傳導而特異性地重新活化並擴增這些細胞。圖19中顯示針對T1-IL2M3作用所提出的作用機理的示意圖。 7.17.    實例16：在數個鼠類同基因腫瘤模型中，抗mPD1-IL2突變蛋白3融合物顯示出相對於同型-IL2突變蛋白3和親本抗PD1抗體之組合更優異的抗腫瘤功效
在兩種不同小鼠品系(C57BL/6J和BALB/cJ)的肺癌、皮膚癌，乳癌和結腸癌的鼠類同基因腫瘤模型中(使用LLC1，B16F10、4T1和Colon-26腫瘤細胞)評估T1 IL2M3(抗mPD1-IL2突變蛋白3)的治療功效。
C57BL/6J小鼠(a)在第0天皮下接種2x105 個LLC1腫瘤細胞，並在第7天當平均腫瘤大小達到90mm3 時進行隨機分組，或(b)在第0天皮下接種3x105 個B16F10腫瘤細胞，並在第7天當平均腫瘤大小達到80mm3 時進行隨機分組。然後每半週用同型(1mg/kg)，同型-IL 2突變蛋白3(1.5mg/kg)+抗mPD1(1mg/kg)或抗mPD1-IL2突變蛋白3(1.5mg/kg)+同型(1mg/kg)腹膜內治療小鼠總計四或五次注射。
將BALB/cJ小鼠(a)在第0天皮下接種5x105 個4T1腫瘤細胞，並在第8天當平均腫瘤大小達到60mm3 時進行隨機分組，或(b)在第0天皮下接種1x106 個Colon-26腫瘤細胞，並在第12天當腫瘤平均大小達到100mm3 時進行隨機分組。然後每半週用同型(1mg/kg)、同型-IL2突變蛋白3(0.5mg/kg)+抗mPD1(0.33mg/kg)，或抗mPD1-IL2突變蛋白3(0.5mg/kg)+同型(0.33mg/kg)腹膜內治療小鼠總計五次注射。
各治療組中的平均腫瘤體積(mm3 + SEM)顯示在圖20A-20D中。箭頭表示治療日。
在所有研究的模型中，抗mPD1-IL 2突變蛋白3展現出比同型-IL2突變蛋白3和抗mPD1之組合更好的抗腫瘤活性。在Colon-26模型中，抗mPD1-IL2突變蛋白3治療導致受到治療的大多數小鼠的腫瘤完全消退(圖20D)。在其他模型(LLC1、B16F10、4T1)中，這些模型已顯示出對一般免疫療法有抗性(( Moselyet al. , 2016, Cancer Immunol Res 5(1):29-41)，抗mPD1-IL2突變蛋白3能夠延遲已長成腫瘤的進展(圖20A-20C)。 7.18.    實例17：抗mLAG3-IL2突變蛋白3融合物展現出比抗LAG3 +同型IL2突變蛋白3之組合更好的抗腫瘤功效
C57BL/6J小鼠在第0天皮下接種MC38腫瘤細胞，並在第10天當平均腫瘤大小達到50mm3 時進行隨機分組。然後每半週用同型(1mg/kg)、抗-mLAG3(1mg/kg)、同型-IL2突變蛋白3(0.5mg/kg)+抗-mLAG3(0.33mg/kg)、同型-IL2突變蛋白3(1.5mg/kg)+抗-mLAG3(1mg/kg)、T6-IL2M3(抗-mLAG3-IL2突變蛋白3)(0.5mg/kg)+同型(0.33mg/kg)，或T6-IL2M3(抗-mLAG3 -IL2突變蛋白3)(1.5mg/kg)+同型(1mg/kg)腹膜內治療小鼠總計五次注射。
個別地，C57BL/6J小鼠在第0天皮下接種MC38腫瘤細胞，並在第9天當平均腫瘤大小達到80mm3 時進行隨機分組。然後每半週用同型(0.33 mg/kg)、同型IL2突變蛋白3(0.5mg/kg)+抗-mLAG3(0.33mg/kg)+抗-mPD1(0.33mg/kg)、抗-mLAG3-IL2突變蛋白3(0.5mg/kg)+同型(0.33mg/kg)、抗mLAG3-IL2突變蛋白3(0.5mg/kg)+抗-mPD1(0.33mg/kg)，或抗-mLAG3-IL2突變蛋白3(0.5mg/kg)+抗mPD1(5mg/kg)腹膜內治療小鼠總共四次注射。
各治療組的平均腫瘤體積(mm3 + SEM)顯示在圖21A-21B中。箭頭指示治療日。
藉由0.5mg/kg同型-IL2突變蛋白3或抗mLAG3-IL2突變蛋白3的劑量被遞送之IL2M3部分莫耳量等同於一劑6.3 μg/kg的IL2M2或IL2M3。儘管同型-IL2突變蛋白3 +抗-mLAG3在所研究的劑量下不能賦予腫瘤控制，但抗-mLAG3-IL2突變蛋白3+同型顯示出以劑量依賴的方式加強抗腫瘤功效(圖21A)。這各結果提供了另一個實例，即靶向腫瘤反應性T細胞可以透過減少實現有效腫瘤控制所需的IL2M3數量來提高IL2M3的抗腫瘤功效。
雖然單獨抗mLAG3-IL2M3賦予了局部腫瘤生長控制，但是其與抗mPD1的組合大大增強功效，更多的小鼠實現了完全腫瘤消退(圖21B)。這個結果表明，將受到非競爭性靶向腫瘤反應性T細胞的抗體所靶向的IL2突變蛋白3與PD1阻斷組合可導致更強大的抗腫瘤免疫性。 7.19.    實例18：肽MHC-IL2突變蛋白融合物允許選擇性刺激抗原特異性小鼠CD8 T細胞
在37℃下，將從OT-I TCR轉基因小鼠(得自Jackson Laboratory)或對照C57BL/6J小鼠的總計1.5×106 個脾臟細胞用濃度漸增的T4-IL2M6或T5-IL2M6處理歷時20分鐘。如第7.1.2節中所述，藉由流式細胞術評估經圈選CD8+ T細胞中的細胞內STAT5磷酸化。
結果顯示在圖22B中。相較於靶向針對不相干抗原之TCR的T5-IL2M6，T4-IL2M6在T4特異性CD8+ OT-I T細胞中誘導STAT5磷酸化方面顯示出高兩個數量級的效力，但對來自對照小鼠的非特異性CD8+ T細胞則無。
測量了同一隻小鼠的脾臟細胞的經圈選傳統CD4+ T細胞和Treg的細胞內STAT5磷酸化程度。
結果顯示在圖23A-23B中。兩種細胞類型觀察到T4-IL2M6和T5-IL2M6的活性相當。與CD8+ T細胞不同，來自同一隻OT-1小鼠的傳統CD4+ T細胞和Treg不表現T4特異性OT-I TCR。因此，這些細胞上的T4-IL2M6選擇性被消除了。 7.20.    實例19：pMHC-IL2突變蛋白融合物允許選擇性刺激抗原特異性人類CD8+ T細胞
在37℃下，用濃度漸增的T2-IL2M6或T3-IL2M6刺激1.5×104 個CMV pp65特異性人類CD8+ T細胞歷時20分鐘。如第7.1.2節中所述，藉由流式細胞術評估細胞內STAT5磷酸化程度。
結果顯示在圖24中。相較於靶向針對HPV 16E7抗原的TCR的T3-IL2M6，T2-IL2M6在誘導這些CMV pp65特異性T細胞的STAT5磷酸化方面顯示出高幾個數量級的功效。 7.21.    實例20：藉由靶向肽-MHC的IL2突變蛋白的選擇性CAR-T擴增 7.21.1.     CAR構建物的結構
嵌合抗原受體(含有辨識T3的VL -VH scFv(包含裝有HPV16 E711-19 肽的HLA-A2)、huCD8跨膜結構域，CD137(4-1BB)共刺激結構域和CD3ζ信號傳導結構域(如圖25A中所說明))是使用單一抗體17363N的VL 和VH 序列來構建。作為CAR陰性對照，使用來自同一供體的未經轉導T細胞。將此CAR選殖到帶有EF1a啟動子的pLVX慢病毒載體中，該載體在eGFP序列(用以追踪經CAR轉導的細胞)上游含有一個P2A序列。產生VSV假型慢病毒，用於之後以5的感染倍數(MOI)進行轉導。用CAR構建物轉導的細胞的例示性FACS剖繪圖顯示在圖25B-25C中。 7.21.2.     CAR T細胞的產生及擴增
將來自HLA-A2同型合子供體的CD3+ T細胞解凍，然後以1.5x106/ mL的密度用Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28微珠粒加上Aldesleukin(100 IU/mL)刺激歷時24小時。隨後，藉由磁性分離移除CD3/CD28微珠粒，然後藉由在2440 rpm下離心90分鐘，用CAR構建體轉導經活化的T細胞。作為CAR陰性對照，使用了來自同一供體的未經轉導T細胞。然後已轉導和未轉導的細胞補充有Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28微珠粒(每1個T細胞1個珠粒)，並在補充CTS的OpTmizer™培養基中擴增歷時19天。細胞密度維持在1-1.5×106/ mL之間，且每48小時向培養物添加Aldesleukin並維持在100 IU/mL。擴增結束時，移除微珠粒，並低溫保存細胞。
測試圖26A和26B中所示的各種肽-MHC靶向的IL2突變蛋白的活性，其含有減弱的IL2(H16A、F42A)(也稱為IL2(2m)：T7-IL2M7 (對IL2是單價且具有HPV肽-MHC複合體)、T8-IL2M7((對IL2是單價且具有CMV肽-MHC複合體)、T3-IL2M6 (對IL2是二價且具有HPV肽-MHC複合體)、T2-IL2M6(對IL2是單價且具有CMV肽-MHC複合體)。將CAR-T細胞解凍並在完全RPMI培養基中洗滌兩次，然後將解凍的細胞在無Aldesleukin的完全RPMI培養基中以2.8x106/ mL靜置過夜。靜置過夜後，在這些CAR T細胞中，如第7.1.2節所述藉由流式細胞術評估經圈選CD4+或CD8+群的細胞內STAT5磷酸化程度。 7.21.3.     結果
結果顯示在圖27A (CD4+ T細胞)和27B (CD8+ T細胞)中。透過圈選出對被工程改造成表現靶向CAR與HPV16 E711-19 肽-HLA-A2複合體的CD4+和CD8+ CAR-T細胞，相對於T8-IL2M7和T2-IL2M6 (靶向CMV pp65495-503 -特異性T細胞)，IL2突變蛋白T7-IL2M7和T3-IL2M6 (兩者均具有HPV16 E711-19 肽-HLA-A2靶向部分)顯示出在誘導STAT5磷酸化方面高出幾個數量級的功效。 7.22.    實例21：藉由肽-MHC靶向的IL2突變蛋白的選擇性CAR-T擴增 7.22.1.     CAR T細胞的產生及擴增
將來自HLA-A2同型合子供體的CD3+ T細胞解凍，然後用Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28微珠粒加上3.3x10-10 M重組Aldesleukin刺激歷時48小時。隨後，藉由磁性分離移除CD3/CD28微珠粒，然後用圖27A中所示的CAR構建物藉由在2440 rpm旋轉離心歷時90分鐘轉導經活化的T細胞。關於CAR陰性對照，使用來自同一供體的未經轉導的T細胞。然後將已轉導和未轉導的細胞與Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28微珠粒在補充有CTS的OpTmizer™培養基中與以1：1的比例添加的T細胞，連同3.3x10-10 M Aldesleukin一起擴增。接著收集經活化的T細胞，在OpTmizer™培養基中洗滌兩次，並藉由磁性分離移除CD3/CD28微珠粒，然後於37℃下將T細胞在缺少Aldesleukin的補充有CTS的OpTmizer™培養基中靜置過夜。將靜置的已轉導和未轉導T細胞重新懸浮，並在Dynabeads® humanT-Expander CD3/CD28微珠粒(每1個T細胞1個珠粒)存在下，在補充有CTS的OpTmizer™培養基中以1x106/ mL進行培養。然後用濃度為3.3 x 10-10 M的對應生物製劑刺激各個培養物。各T細胞擴增培養物每48小時補充生物製劑，並維持在1-1.5x106/ mL的密度歷時17天。在擴增的第3、9、17天，計數T細胞數量，並收集等分的細胞以定量活eGFPPos (CAR+)與eGFPNeg (非CAR) T細胞的比率變化。使用各種生物製劑擴增的未轉導T細胞用於在每個時間點定義CAR-T擴增的eGFP信號。 7.22.2.     CAR-T細胞的特徵鑑定
在CAR-T細胞擴增期間的幾個時間點，收集細胞的等分試樣以藉由流式細胞術來定量活eGFP+ (CAR+)細胞。為了要識別不同T細胞群和IL2Rα的表現，使用下列抗體的組合：BUV395抗-CD4(BD Biosciences)、BUV737抗-CD4(BD Biosciences)、PE-CY7抗-CD8(Biolegend)、APC-Cy7抗-CD8(Biolegend)、BV605抗-CD25(BD Biosciences)。為了特徵鑑定記憶T細胞子群與表型，使用BV421抗-CCR7(Biolegend)、PE-CF594抗-CD45RO(BD Biosciences)、PerCP-Cy5.5抗-CD45RO(BD Biosciences)、BUV395抗-PD1(BD Biosciences)，及PE-CF594抗-CD57(BD Biosciences)。使用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(ThermoFisher)或AQUA成活力染料(ThermoFisher)評估成活力。所有樣品均在BDFortessa™ X-20或Biorad Ze5流式細胞儀上擷取。使用FlowJo v10處理原始數據。 7.22.3.     結果與討論
為了檢查經減弱IL-2價數與給定靶向部分的價數增加合作以媒介選擇性CAR-T擴增的潛力，研究對一系列經改造生物製劑作出反應的選擇性CAR-T擴增。在單價形式中，將1個副本的經減弱IL2與1個副本的靶向部分組合。在二價形式中，將兩個副本的經減弱IL-2與兩個副本的靶向部分組合。為了控制非選擇性擴增，利用了不被CAR-T細胞辨識的靶向部分(裝載了CMV pp65495-503 肽的scHLA-A2)。所測試的生物製劑的結構在圖26A和26B中說明。
結果顯示於圖28中。如圖28A.1-28A.16中所示，在經轉導T細胞對scMHC-肽靶向的IL2突變蛋白反應而擴增之前(表示為第0天)，活CAR-T (eGFPPos )細胞的頻率為38%。在擴增的第3天，各培養物中的活CAR-T細胞的頻率增加至大約43%，除了二價T3-IL2M6構建物以外(CAR的頻率降低到36%)。在第9天，對單價T7-IL2M7反應所觀察到最大程度的選擇性CAR-T富集，其中活CAR-T細胞的百分比已增加到75%。值得注意的是，即使該生物製劑不結合CAR scFv，也觀察到對單價T8-IL2M7反應，CAR-T百分比的增加不太明顯。儘管由於缺乏使用匹配的供體PBMC的抗原召回反應而導致的針對巨細胞病毒肽(pp65495-503 )的現有T細胞庫(由於供應商)，這種擴展不太可能引起，但這種可能性無法完全排除。在擴增的第9天和第17天之間，CAR對單價T7-IL2M7和T8-IL2M7反應的百分比維持相似。觀察到對IL2(Aldesleukin)和二價T3-IL2M6反應，CAR-T頻率略有增加，而對二價T2-IL2M6反應，未觀察到進一步的變化。
為了評估生物製劑同時結合至CAR之scFv並遞送減弱的IL2信號以便媒介CAR-T選擇性擴增的潛力，繪製活T細胞的總數量相對於CAR-T細胞(EGFPPos )對非CAR-T細胞(EGFPNeg)的比例之圖。如圖28B.1-B.4中所示，隨著eGFPPos /eGFPNeg 比例從0.73增加到3.12，在第3天和第9天之間對T7-IL2M7(空心圓形)反應，發生CAR-T的選擇性富集。此外，T細胞的數量倍增更甚。在第17天，在培養終止時，觀察到對Aldesleukin(黑色方形)反應有最大數量擴增的總T細胞，其次是單價T7-IL2M7 (空心圓形)；然而，在用T7-IL2M7擴增的培養物中，CARPos 與CARNeg T細胞的比例最大，表明發生了CAR-T的選擇性和靶向擴增。如圖28C中所示，針對每種擴增條件的活CAR-T細胞的絕對數目相對於培養時間來繪圖。儘管IL-2(Aldesleukin)產生最大數量的總T細胞(圖28B.4)，但由於選擇性CAR-T擴增，單價T7-IL2M7產生了最大數量的活CAR-T細胞(圖28C)。對單價T8-IL2M7反應發生的CAR-T擴增最小，證實了靶向部分的重要性。值得注意的是，對二價T3-IL2M6反應的CAR-T擴增很低，這可能表明CAR-T細胞的過度活化導致細胞死亡。或者，二價T3-IL2M6可能交聯個別的CAR-T細胞，從而產生CAR-T誤殺。這些研究證明，單價形式結構在媒介選擇性CAR-T擴展方面是優異的。 7.23.    實例22：肽-MHC靶向的IL2突變蛋白的活體內藥物動力學評估 7.23.1.     方法
為了評估指定的IL2突變蛋白在血漿中的藥物動力學，將免疫活性C57BL/6J和免疫缺陷NSG(NOD-scid IL2Rgnull)小鼠腹膜內注射單一劑量的12μg各個蛋白質。給藥後2、24、48和72小時收集血液樣品，然後在10,000 RPM下離心10分鐘以分離血漿。藉由SDS-PAGE然後使用抗人類IgG Fc的免疫墨點法來分析每個1μl血漿樣品。將2 ng的各個經純化蛋白質(摻入1µl未處理血漿中)加載到同一凝膠上，以輔助估計血漿樣品中每種蛋白質的絕對含量。 7.23.2.     結果
結果顯示於圖29中。相較於IL2M0 (在圖29中稱為IL2-Fc)，圖26A與26B中所示的靶向IL2突變蛋白以結合性依賴的方式證實PK有所改善。另外，與IL2-Fc相比，二價和單價構建物均顯示出延遲循環中的廓清，其中單價構建物(T7-IL2M7和T8-IL2M7)持續時間最長。這個結果表明，IL2減弱可以結合性依賴的方式顯著降低其受體媒介的廓清，並因此增加了靶向的減弱IL2突變蛋白到達目標細胞的機會。儘管在循環中存在更持久，但二價T2-IL2M6仍比單獨靶向部分(T2-Fc)更快地從血液中清除，這表明T2-IL2M6的廓清主要由IL2M6驅動。 8.      特定具體例，參考文獻的引用
儘管已經示出並說明了各種特定具體例，但是應當理解，可以在不脫離本發明的精神和範疇的情況下進行各種改變。本發明藉由以下闡述的編號具體例來例示說明。
在下面編號具體例的較佳態樣以及隨後的申請專利範圍中，IL2結構域、IL2受體、Fc結構域、MHC結構域、β2M，及其變體較佳包含人類IL2、人類IL2受體、人類Fc結構域、人類MHC結構域、人類β2M，和其變體的胺基酸序列，例如與此等人類序列具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99%或100%序列一致性的變體。 1.        一種IL2促效劑，包含： (a)  包含IL2結構域的IL2部分； (b) 視情況選用的多聚化部分； (c)  視情況選用的靶向部分；及 (d) 視情況選用的穩定化部分。 2.        如具體例1之IL2促效劑，其包含具有以下構形的IL2突變蛋白： (a)  IL2M0； (b) IL2M1； (c)  IL2M2； (d) IL2M3； (e)  IL2M4； (f)  IL2M5； (g) IL2M6；或 (h) IL2M7。 3.        如具體例1或具體例2之IL2促效劑，其中該IL2部分為偏好IL2-Rα的IL2突變蛋白。 4.        如具體例1至3中任一項之IL2促效劑，其中相較於野生型IL2，該IL2部分及/或IL2促效劑結合至人類IL2-Rβ減弱50倍至1000倍。 5.        如具體例1至4中任一項之IL2促效劑，其中相較於野生型IL2，該IL2部分及/或IL2促效劑結合至人類IL2-Rα減弱至多100倍。 6.        如具體例1至5中任一項之IL2促效劑，其中IL2促效劑對高親和力IL2受體的結合親和力相對於IL2促效劑對中等親和力IL2受體的結合親和力的比率等於或大於野生型IL2的對應比率。 7.        如具體例1至6中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分及/或IL2促效劑對高親和力IL2受體的EC50比對中等親和力IL2受體的EC50低100倍至10,000倍。 8.        如具體例1之IL2促效劑，其中該IL2部分為偏好IL2-Rβ的IL2突變蛋白。 9.        如具體例1或具體例8之IL2促效劑，其中相較於野生型IL2，該IL2部分及/或IL2促效劑對人類IL2-Rα的結合減弱50倍至1000倍。 10.    如具體例1，8及9中任一項之IL2促效劑，其中相較於野生型IL2，該IL2部分及/或IL2促效劑對IL2-Rβ的結合減弱至多50倍。 11.    如具體例1及8至10中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分及/或IL2促效劑對中等親和力IL2受體的結合親和力相對於IL2部分及/或IL2促效劑對高親和力IL2受體的結合親和力的比率等於或大於野生型IL2的對應比率。 12.    如具體例1及7至11中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分及/或IL2促效劑對高親和力IL2受體的EC50比對中等親和力IL2受體的EC50低10倍至100倍。 13.    如具體例1至12中任一項之IL2促效劑，其中相較於野生型IL2，該IL2部分及/或IL促效劑對高親和力IL2受體的結合親和力減弱。 14.    如具體例13之IL2促效劑，其中結合親和力減弱達10倍至1,000倍。 15.    如具體例1至14中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分及/或IL2促效劑對腫瘤反應性淋巴細胞的細胞激素活性比對周邊淋巴細胞更高。 16.    如具體例15之IL2促效劑，其中該IL2部分及/或IL2促效劑對腫瘤反應性淋巴細胞的細胞激素活性比對周邊淋巴細胞高至少5倍或至少10倍。 17.    如具體例1至16中任一項之IL2促效劑，其具有至少1的治療指數。 18.    如具體例17之IL2促效劑，其具有至少2的治療指數。 19.    如具體例17之IL2促效劑，其具有至少5的治療指數。 20.    如具體例17之IL2促效劑，其具有至少10的治療指數。 21.    如具體例17之IL2促效劑，其具有至少50的治療指數。 22.    如具體例17至21中任一項之IL2促效劑，其具有至多500的治療指數。 23.    如具體例17至21中任一項之IL2促效劑，其具有至多250的治療指數。 24.    如具體例1至23中任一項之IL2促效劑，其具有約2的治療指數。 25.    如具體例1至23中任一項之IL2促效劑，其具有約10的治療指數。 26.    如具體例1至23中任一項之IL2促效劑，其具有約20的治療指數。 27.    如具體例1至23中任一項之IL2促效劑，其具有約50的治療指數。 28.    如具體例1至23中任一項之IL2促效劑，其具有約100的治療指數。 29.    如具體例1至23中任一項之IL2促效劑，其具有約200的治療指數。 30.    如具體例1至29中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分及/或IL2促效劑未經聚乙二醇化。 31.    如具體例1至30中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分及/或IL2促效劑不包含IL2以外的細胞激素。 32.    如具體例1至31中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分及/或IL2促效劑不含有抗IL2抗體或抗體片段。 33.    如具體例1至32中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分及/或IL2促效劑不含有抗DNA抗體或抗體片段。 34.    如具體例1至33中任一項之IL2促效劑，其中相較於人類IL2，該IL2結構域在位置D20處不包含置換。 35.    如具體例1至34中任一項之IL2促效劑，其中相較於人類IL2，該IL2結構域在位置Q126處不包含置換。 36.    如具體例1至35中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分及/或IL2促效劑不含有非結合可變結構域。 37.    如具體例1至36中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分包含IL2結構域，該IL2結構域包含與成熟人類IL2具有至少約90%序列一致性的胺基酸序列。 38.    如具體例1至36中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分包含IL2結構域，該IL2結構域包含與成熟人類IL2具有至少約93%序列一致性的胺基酸序列。 39.    如具體例1至36中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分包含IL2結構域，該IL2結構域包含與成熟人類IL2具有至少約96%序列一致性的胺基酸序列。 40.    如具體例1至39中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分包含IL2變體，其具有胺基酸置換C125S，C125A或C125V。 41.    如具體例1至40中任一項之IL2促效劑，其中該IL2結構域包含IL2序列，該IL2序列具有一或多個置換以減少O連接型醣基化。 42.    如具體例41之IL2促效劑，其中該IL2結構域在對應於人類IL2的殘基3的位置處具有一個置換。 43.    如具體例42之IL2促效劑，其中該胺基酸置換為T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R，或T3K。 44.    如具體例1至43中任一項之IL2促效劑，其中該IL2結構域在對應於人類IL2的甲硫胺酸104的位置處具有一個使用中性胺基酸的置換。 45.    如具體例44之IL2促效劑，其中該中性胺基酸為丙胺酸。 46.    如具體例1至45中任一項之IL2促效劑，其中該IL2結構域為全長人類IL2結構域。 47.    如具體例1至45中任一項之IL2促效劑，其中相較於全長成熟人類IL2，該IL2結構域具有一個N端丙胺酸缺失。 48.    如具體例1至47中任一項之IL2促效劑，其中該IL2結構域包含一個在位置N88處具有胺基酸置換的IL2變體。 49.    如具體例48之IL2促效劑，其中該胺基酸置換為N88D。 50.    如具體例1至47中任一項之IL2促效劑，其中該IL2結構域包含在位置H16與F42處具有胺基酸置換的IL2變體。 51.    如具體例50之IL2促效劑，其中該胺基酸置換為H16A與F42A。 52.    如具體例1至51中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分包含IL-2Rα結構域，該IL-2Rα結構域包含融合至IL2結構域的IL-2Rα的IL2結合部分。 53.    如具體例52之IL2促效劑，其中該IL-2Rα結構域或IL-2Rα的IL2結合部分為IL-2Rα的細胞外結構域或其IL2結合部分。 54.    如具體例52或具體例53之IL2促效劑，其中該IL-2Rα結構域或IL2結合部分包含與人類IL-2Rα的IL2結合部分具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99%或100%序列一致性的胺基酸序列或由其組成，視情況其中該結合部分具有： (a)  人類IL-2Rα的至少160個胺基酸、至少161個胺基酸、至少162個胺基酸，至少164個胺基酸或至少165個胺基酸；及/或 (b) 人類IL-2Rα之細胞外結構域的至多251個、至多240個、至多230個、至多220個、至多210個、至多200個、至多190個，至多180個或至多170個胺基酸。 55.    如具體例52至54中任一項之IL2促效劑，其中該IL-2Rα結構域或IL2結合部分具有與IL-2Rα的胺基酸22-186，IL-2Rα的胺基酸22-240及/或與IL-2Rα的胺基酸22-272有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99或100%序列一致性的胺基酸序列。 56.    如具體例52至55中任一項之IL2促效劑，其中該IL-2Rα結構域或IL2結合部分具有與人類IL-2Rα的胺基酸22-186有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99或100%序列一致性的胺基酸序列，在胺基酸殘基186的C端有或沒有額外至多5個胺基酸、至多10個胺基酸、至多15個胺基酸、至多20個胺基酸、至多30個胺基酸，或至多40個胺基酸。 57.    如具體例52至56中任一項之IL2促效劑，其中該IL-2Rα結構域在IL2結構域的N端。 58.    如具體例52至56中任一項之IL2促效劑，其中該IL-2Rα結構域在IL2結構域的C端。 59.    如具體例52至58中任一項之IL2促效劑，其中該IL2結構域與IL-2Rα結構域經由一個連接子連接。 60.    如具體例59之IL2促效劑，其中該連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子，或包含甘胺酸-絲胺酸連接子。 61.    如具體例60之IL2促效劑，其中該連接子包含胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)。 62.    如具體例60之IL2促效劑，其中該連接子為胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)的多聚體或包含胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)的多聚體。 63.    如具體例62之IL2促效劑，其中該多聚體包含2、3、4、5或6個重複的胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)。 64.    如具體例1至63中任一項之IL2促效劑，其包含一個多聚化部分及/或一個穩定化部分。 65.    如具體例64之IL2促效劑，其中該多聚化部分及/或該穩定化部分是Fc結構域或包含Fc結構域。 66.    如具體例65之IL2促效劑，其中該Fc結構域為IgG1、IgG2，IgG3或IgG4 Fc結構域。 67.    如具體例65或具體例66之IL2促效劑，其中該Fc結構域的效應子功能減少。 68.    如具體例67之IL2促效劑，其中該Fc結構域包含WO2014/121087之SEQ ID NO:31的胺基酸序列或其一部分，例如如表4及/或第6.5.1.1節中所示者。 69.    如具體例1至68中任一項之IL2促效劑，其包含一個穩定化部分。 70.    如具體例69之IL2促效劑，其中該穩定化部分是人類血清白蛋白、人類血清白蛋白結合劑、XTEN、PAS、碳水化合物、聚唾液酸、親水性聚合物，脂肪酸，或Fc結構域。 71.    如具體例70之IL2促效劑，其中該穩定化部分為人類血清白蛋白結合劑。 72.    如具體例71之IL2促效劑，其中該人類血清白蛋白結合劑為Adnectin PKE，AlbudAb或白蛋白結合結構域。 73.    如具體例72之IL2促效劑，其中該穩定化部分是Fc結構域。 74.    如具體例73之IL2促效劑，其中該Fc結構域是單體Fc結構域。 75.    如具體例73或具體例74之IL2促效劑，其中Fc結構域的效應子功能減少。 76.    如具體例70之IL2促效劑，其中該穩定化部分是親水性聚合物。 77.    如具體例76之IL2促效劑，其中該親水性聚合物為PEG。 78.    如具體例77之IL2促效劑，其中PEG的分子量範圍為約7.5 kDa至約80 kDa。 79.    如具體例78之IL2促效劑，其中PEG的分子量範圍為約30 kDa至約60 kDa，視情況其中分子量為約50 kDa。 80.    如具體例76至79中任一項之IL2促效劑，其中該親水性分子附接至IL2的IL-2Rβ結合表面。 81.    如具體例1至80中任一項之IL2促效劑，其為二聚體。 82.    如具體例81之IL2促效劑，其為同二聚體。 83.    如具體例81之IL2促效劑，其為異二聚體。 84.    如具體例1至80中任一項之IL2促效劑，其為單體。 85.    如具體例1至84中任一項之IL2促效劑，其對IL2部分為單價。 86.    如具體例1至85中任一項之IL2促效劑，其對IL2部分為二價。 87.    如具體例1至86中任一項之IL2促效劑，其為位向1 IL2促效劑或包含位向1 IL2促效劑。 88.    如具體例1至87中任一項之IL2促效劑，其包含： (a)  IL2部分，包含： (i)             IL2或IL2變體(例如IL2 N88D)結構域，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S或C125A或C125V)； (ii)           連接子(例如如第6.7節中所述)，例如包含10個或更多個胺基酸及/或包含(G4 S)n(SEQ ID NO:57)或由其組成之連接子，視情況其中n ≥ 2，例如其中N為3、4，5或更大；及 (iii)         IL-2Rα的IL2結合部分； (b) 連接子(例如如第6.7節中所述)，例如包含(G4 S)n (SEQ ID NO:57)或由其組成之連接子，視情況其中n ≥ 1，例如其中N為1、2、3、4，5或更大；及 (c)  Fc結構域(例如IgG1或IgG4，帶有或不帶有如第6.5.1節及其小節中所述減少醣基化及/或效應子功能的置換)。 89.    如具體例1至86中任一項之IL2促效劑，其為位向2 IL2促效劑或包含位向2 IL2促效劑。 90.    如具體例1至89中任一項之IL2促效劑，其包含： (a)  Fc結構域(例如IgG1或IgG4，帶有或不帶有如第6.5.1節及其小節中所述減少醣基化及/或效應子功能的置換)； (b) 連接子(例如如第6.7節中所述)，例如包含(G4 S)n (SEQ ID NO:57)或由其組成之連接子，視情況其中n ≥ 1，例如其中N為1、2、3、4，5或更大；及 (c)  IL2或IL2變體(例如IL2 N88D)結構域，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S或C125A或C125V)。 91.    如具體例1至89中任一項之IL2促效劑，其包含： (a)  Fc結構域(例如IgG1或IgG4，帶有或不帶有如第6.5.1節及其小節中所述減少醣基化及/或效應子功能的置換)； (b) 連接子(例如如第6.7節中所述)，例如包含(G4 S)n (SEQ ID NO:57)或由其組成之連接子，視情況其中n ≥ 1，例如其中N為1、2、3、4，5或更大；及 (c)  IL2促效劑，包含： (iv)         IL2或IL2變體(例如IL2 N88D)結構域，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S或C125A或C125V)； (v)           連接子(例如如第6.7節中所述)，例如包含10個或更多個胺基酸及/或包含(G4 S)n(SEQ ID NO:57)或由其組成之連接子，視情況其中n ≥ 2，例如其中N為3、4，5或更大；及 (vi)         IL-2Rα的IL2結合部分。 92.    如具體例1至86中任一項之IL2促效劑，其為位向3 IL2促效劑或包含位向3 IL2促效劑。 93.    如具體例1至92中任一項之IL2促效劑，其包含： (a)  scFv或Fab的重鏈可變區(在個別多肽上與對應輕鏈可變區締合)(例如如第6.4.2節及其小節中所述)； (b) 連接子(例如如第6.7節中所述)，例如包含(G4 S)n (SEQ ID NO:57)或由其組成之連接子，視情況其中n ≥ 1，例如其中N為1、2、3、4，5或更大； (c)  Fc結構域((例如IgG1或IgG4，帶有或不帶有如第6.5.1節及其小節中所述減少醣基化及/或效應子功能的置換)； (d) 連接子(例如如第6.7節中所述)，例如包含(G4 S)n (SEQ ID NO:57)或由其組成之連接子，視情況其中n ≥ 1，例如其中N為1、2、3、4，5或更大；及 (e)  IL2部分，包含： (i)             IL2或IL2變體(例如IL2 N88D)結構域，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S，C125A或C125V)； (ii)           連接子(例如如第6.7節中所述)，例如包含10個或更多個胺基酸及/或包含(G4 S)n (SEQ ID NO:57)或由其組成之連接子，視情況其中n ≥ 2，例如其中N為3、4，5或更大；及 (iii)         IL-2Rα的IL2結合部分(例如如第6.3節中所述)。 94.    如具體例1至92中任一項之IL2促效劑，其包含： (a)  肽-MHC複合體(例如如第6.4.3節中所述)，包含： (i)             MHC肽： (ii)           連接子(例如如在第6.7節或其小節，例如第6.7.1節中所述)； (iii)         視情況選用的β2-微球蛋白(β2m)結構域； (iv)         視情況選用的連接子(例如如第6.7節及其小節，例如第6.7.1節中所述)；及 (v)           MHC； (b) 視情況選用的連接子(例如如第6.7節中所述)，例如包含(G4 S)n (SEQ ID NO:57)或由其組成之連接子，視情況其中n ≥ 1，例如其中N為1、2、3、4，5或更大； (c)  Fc結構域(例如IgG1或IgG4，帶有或不帶有如第6.5.1節及其小節中所述減少醣基化及/或效應子功能的置換)； (d) 連接子(例如如第6.7節中所述)，例如包含(G4 S)n (SEQ ID NO:57)或由其組成之連接子，視情況其中n ≥ 1，例如其中N為1、2、3、4，5或更大； (e)  IL2部分，包含： (i)             IL2或IL2變體(例如IL2 N88D)結構域，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S，C125A或C125V)； (ii)           連接子(例如如第6.7節中所述)，例如包含10個或更多個胺基酸及/或包含(G4 S)n (SEQ ID NO:57)或由其組成之連接子，視情況其中n ≥ 2，例如其中N為3、4，5或更大；及 (iii)         IL-2Rα的IL2結合部分(例如如第6.3節中所述)。 95.    如具體例1至86中任一項之IL2促效劑，其為位向4 IL2促效劑或包含位向4 IL2促效劑。 96.    如具體例1至86及95中任一項之IL2促效劑，其包含： (a)  第一多肽，包含： (i)             靶向部分，例如肽-MHC複合體(例如如第6.4.3節中所述)，Fab結構域(例如如第6.4.2.2節中所述)(例如與包含Fab輕鏈的第三多肽締合之Fab重鏈)或scFv結構域(例如如第6.4.2.1節中所述)； (ii)           視情況選用的連接子(例如如第6.7節中所述)；與 (iii)         第一Fc結構域；以及 (b) 第二多肽，包含： (i)             IL部分，包含IL2或IL2變體(例如帶有置換H16A，F42A的IL2結構域，被稱為IL2(2m))，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S，C125A或C125V))； (ii)           視情況選用的連接子(例如如第6.7節中所述)；與 (iii)         第二Fc結構域，與第一Fc結構域二聚化(例如異二聚化)(例如如第6.5.1.2節中所述)。 97.    如具體例1至86，95及96中任一項之IL2促效劑，其包含： (a)  第一多肽，包含： (i)             肽-MHC複合體(例如如第6.4.3節中所述)，包含： (1) MHC肽； (2) 連接子(例如如第6.7節或其小節中所述，例如第6.7.1節)； (3) 視情況選用的β2-微球蛋白(β2m)結構域； (4) 視情況選用的連接子(例如如第6.7節或其小節中所述，例如第6.7.1節)；與 (5) MHC； (ii)           視情況選用的連接子(例如如第6.7節中所述)；及 (iii)         第一Fc結構域。 (b) 第二多肽，包含： (i)             IL2部分，包含IL2或IL2變體(例如IL2 H16A、F42A)結構域，在C125處帶有或不帶有會減少聚集的置換(例如C125S、C125A或C125V)； (ii)           視情況選用的連接子(例如如第6.7節中所述)；與 (iii)         第二Fc結構域，與第一Fc結構域不同但可與第一Fc結構域異二聚化(例如如第6.5.1.2節中所述) 98.    如具體例1，87及88中任一項之IL2促效劑，其(a)具有或包含具有IL2M0構形的胺基酸序列，或(b)包含IL2M0的胺基酸序列。 99.    如具體例1，87及88中任一項之IL2促效劑，其(a)具有或包含具有IL2M2構形(例如IL2部分-視情況選用的連接子-IL2Rα-視情況選用的連接子-Fc結構域)的胺基酸序列，或(b)包含IL2M2的胺基酸序列。 100.    如具體例1及91至94中任一項之IL2促效劑，其(a)具有或包含具有IL2M3構形(例如IL2Rα-視情況選用的連接子-IL2部分-視情況選用的連接子-Fc結構域)的胺基酸序列，或(b)包含IL2M3的胺基酸序列。 101.    如具體例1，89及90中任一項之IL2促效劑，其(a)具有或包含具有IL2M4構形(例如Fc結構域-視情況選用的連接子-IL2部分)的胺基酸序列，或(b)包含IL2M4的胺基酸序列。 102.    如具體例1，89及90中任一項之IL2促效劑，其(a)具有或包含具有IL2M5構形(例如Fc結構域-視情況選用的連接子-IL2部分)的胺基酸序列，或(b)包含IL2M5的胺基酸序列。 103.    如具體例1及95至97中任一項之IL2促效劑，其(a)具有或包含具有IL2M6構形(例如Fc結構域-視情況選用的連接子-IL2部分)的胺基酸序列，或(b)包含IL2M6的胺基酸序列。 104.    如具體例1及95至97中任一項之IL2促效劑，其(a)具有含IL2M7構形(例如IL2部分-視情況選用的連接子-Fc結構域)的胺基酸序列，或(b)包含IL2M7的胺基酸序列，在各個情況下視情況與包含靶向部分-視情況選用的連接子-Fc結構域的多肽鏈(例如包含T7或T8之序列或構形的多肽鏈)締合。 105.    一種IL2促效劑，包含： (a)  IL2部分，包含IL2結構域及IL2-Rα的IL2結合部分；以及 (b) Fc結構域。 106.    如具體例105之IL2促效劑，其中該IL2-Rα的IL2結合部分在IL2結構域的N端。 107.    如具體例105之IL2促效劑，其中該IL2-Rα的IL2結合部分在IL2結構域的C端。 108.    如具體例105至107中任一項之IL2促效劑，其中該Fc結構域在IL2部分的N端。 109.    如具體例105至107中任一項之IL2促效劑，其中該Fc結構域在IL2部分的C端。 110.    如具體例105至109中任一項之IL2促效劑，其中該IL2結構域及IL2-Rα的IL2結合部分經由一個連接子而連接，視情況其中該連接子包含10個或更多個，或15個或更多個胺基酸。 111.    如具體例110之IL2促效劑，其中該連接子為G4 S(SEQ ID NO:57)或其多聚體，或包含G4 S(SEQ ID NO:57)或其多聚體。 112.    如具體例111之IL2促效劑，其中該連接子包含單個G4 S(SEQ ID NO:57)。 113.    如具體例111之IL2促效劑，其中該連接子包含兩個、三個，四個或五個重複的G4 S(SEQ ID NO:57)。 114.    如具體例105至113中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分及Fc結構域經由一個連接子而連接，視情況其中該連接子包含5個或更多個，或10個或更多個胺基酸。 115.    如具體例114之IL2促效劑，其中該連接子為G4 S(SEQ ID NO:57)或其多聚體，或包含G4 S(SEQ ID NO:57)或其多聚體。 116.    如具體例115之IL2促效劑，其中該連接子包含單個G4 S(SEQ ID NO:57)。 117.    如具體例115之IL2促效劑，其中該連接子包含兩個、三個，四個或五個重複的G4 S(SEQ ID NO:57)。 118.    如具體例105之IL2促效劑，其(a)具有或包含具有IL2M2構形(例如IL2部分-視情況選用的連接子-IL2Rα-視情況選用的連接子-Fc結構域)的胺基酸序列，或(b)包含IL2M2的胺基酸序列。 119.    如具體例105之IL2促效劑，其(a)具有或包含具有IL2M3構形(例如IL2α部分-視情況選用的連接子-IL2R-視情況選用的連接子-Fc結構域)的胺基酸序列，或(b)包含IL2M3的胺基酸序列。 120.    如具體例1至119中任一項之IL2促效劑，其包含靶向部分。 121.    如具體例120之IL2促效劑，其中該靶向部分： (a)  結合至腫瘤相關抗原； (b) 結合至腫瘤微環境抗原； (c)  結合至腫瘤反應性淋巴細胞的細胞表面分子； (d) 結合至檢查點抑制劑； (e)  結合至肽-MHC複合體； (f)  是肽-MHC複合體；或 (g) 結合至與自體免疫反應相關或受到自體免疫反應所靶向的抗原。 122.    如具體例121之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至腫瘤相關抗原。 123.    如具體例122之IL2促效劑，其中該腫瘤相關抗原為纖維母細胞活化蛋白(FAP)、肌腱蛋白C的A1結構域(TNC A1)、肌腱蛋白C的A2結構域(TNC A2)，纖維連接蛋白的額外結構域B(EDB)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV (DPPIV)、腺苷脫胺酶結合蛋白(ADAbp)、親環蛋白b、結腸直腸相關抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特異性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、T細胞受體/CD3-ζ鏈、腫瘤抗原的MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE -A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2 (MAGE-B2)、MAGE-Xp3 (MAGE-B3)、MAGE-Xp4 (MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、腫瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪胺酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-鈣黏蛋白、α-連環蛋白、β-連環蛋白和γ-連環蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性結腸息肉蛋白(APC)、胞襯蛋白、連接蛋白37、Ig個體基因型、p15、gp75、GM2和GD2神經節苷脂、病毒產物(例如人類乳頭瘤病毒蛋白)、腫瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、EBV編碼的核抗原(EBNA)-1、腦糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、c-erbB-2、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T細胞表面抗原)、CD3(與TCR相關的異多聚體)、CD22(B細胞受體)、CD23(低結合親和力IgE受體)、CD30(細胞激素受體)、CD33(骨髓細胞表面抗原)、CD40(腫瘤壞死因子受體)、IL-6R-(IL6受體)、CD20、MCSP、PDGFβR(β-血小板衍生的生長因子受體)、ErbB2上皮細胞黏附分子(EpCAM)、EGFR變體III(EGFRvIII)、CD19、雙唾液酸神經節苷脂GD2、導管上皮黏蛋白、gp36、TAG-72、神經膠質瘤相關抗原、β-人類絨毛膜促性腺激素、α胎蛋白(AFP)、凝集素反應性AFP、甲狀腺球蛋白、MN-CA IX、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2(AS)、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺酶特異性抗原(PSA)、PAP、LAGA-1a、p53、前列腺相關蛋白、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、嗜中性球彈性蛋白酶、蝶素B2、胰島素生長因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受體、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘤基質抗原、纖維連接蛋白的額外結構域A(EDA)或額外結構域B(EDB)，或肌腱蛋白C的A1結構域(TnC A1)。 124.    如具體例121或具體例122之IL2促效劑，其中該腫瘤相關抗原為病毒抗原。 125.    如具體例124之IL2促效劑，其中該病毒抗原為艾-巴二氏病毒LMP-1、C型肝炎病毒E2糖蛋白、HIV gp160或HIV gp120、HPV E6、HPV E7，CMV早期膜抗原(EMA)或CMV晚期膜抗原(LMA)。 126.    如具體例121之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至腫瘤微環境抗原。 127.    如具體例126之IL2促效劑，其中該腫瘤微環境抗原為細胞外基質蛋白。 128.    如具體例127之IL2促效劑，其中該細胞外基質蛋白為聯合蛋白聚醣、肝素酶、整合素、骨橋蛋白、link、鈣黏蛋白、層連結蛋白、層連結蛋白型EGF、凝集素、纖維連接蛋白、notch、肌腱蛋白，膠原蛋白和基質蛋白。 129.    如具體例121之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至腫瘤淋巴細胞的細胞表面分子。 130.    如具體例129之IL2促效劑，其中該細胞表面分子為CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、LAG3，TIM3或B7-H3。 131.    如具體例130之IL2促效劑，其中該細胞表面分子為PD1。 132.    如具體例131之IL2促效劑，其中該靶向部分為抗PD1抗體或其抗原結合片段。 133.    如具體例132之IL2促效劑，其中該抗PD1抗體或其抗原結合片段抑制PD1信號傳導。 134.    如具體例132之IL2促效劑，其中該抗PD1抗體或其抗原結合片段不抑制PD1信號傳導。 135.    如具體例130之IL2促效劑，其中該細胞表面分子為LAG3。 136.    如具體例121之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至檢查點抑制劑。 137.    如具體例136之IL2促效劑，其中該檢查點抑制劑為CTLA-4、PD1、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、VISTA、PSGL1，或CHK2。 138.    如具體例137之IL2促效劑，其中該檢查點抑制劑為PD1。 139.    如具體例138之IL2促效劑，其中靶向部分為抗PD1抗體或其抗原結合片段。 140.    如具體例139之IL2促效劑，其中該抗PD1抗體或其抗原結合片段抑制PD1信號傳導。 141.    如具體例139之IL2促效劑，其中該抗PD1抗體或其抗原結合片段不抑制PD1信號傳導。 142.    如具體例137之IL2促效劑，其中該檢查點抑制劑為LAG3。 143.    如具體例138之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至MHC-肽複合體。 144.    如具體例143之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體中的肽包含腫瘤新抗原。 145.    如具體例144之IL2促效劑，其中該腫瘤新抗原為LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPV E7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪胺酸酶(369-377、371D)，或WT1(126-134)。 146.    如具體例143至145中任一項之IL2促效劑，其中該靶向部分包含抗體或其抗原結合部分，該抗體或其抗原結合部分具有包含下列的互補決定區(「CDR」)； (a)  CDR-H1，具有選自國際專利公開案第WO 2019005897 A1號的SEQ ID NO: 4、20、36、52、68、84、100、1 16、132、148、164、180、196、212、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、396、412、428、444、460、476、492，508及524中任一者的胺基酸序列，該件國際專利公開案併入本文做為參考資料； (b) CDR-H2，具有選自國際專利公開案第WO 2019005897 A1號的SEQ ID NO: 6、22、38、54、70、86、102、1 18、134、150、166、182、198、214、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、414、430、446、462、478、494、510，及526中任一者的胺基酸序列，該件國際專利公開案併入本文做為參考資料； (c)  CDR-H3，具有選自國際專利公開案第WO 2019005897 A1號的SEQ ID NO: 8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384、400、416、432、448、464、480、496、512，及528中任一者的胺基酸序列，該件國際專利公開案併入本文做為參考資料； (d) CDR-L1，具有選自國際專利公開案第WO 2019005897 A1號的SEQ ID NO: 12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、204、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、388、404、420、436、452、468、484、500、516，及532中任一者的胺基酸序列，該件國際專利公開案併入本文做為參考資料； (e)  CDR-L2，具有選自國際專利公開案第WO 2019005897 A1號的SEQ ID NO: 14、30、46、62、78、94、1 10、126、142、158、174、190、206、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、390、406、422、438、454、470、486、502、518，及534中任一者的胺基酸序列，該件國際專利公開案併入本文做為參考資料；以及 (f)  CDR-L3，具有選自國際專利公開案第WO 2019005897 A1號的SEQ ID NO: 16、32、48、64、80、96、1 12、128、144、160、176、192、208、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、392、408、424、440、456、472、488、504、520，及536中任一者的胺基酸序列，該件國際專利公開案併入本文做為參考資料。 147.    如具體例146之IL2促效劑，其中該抗體或抗原結合片段具有選自以下任一者的VH-VL胺基酸序列：國際專利公開案第WO 2019005897 A1號的SEQ ID NO: 2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/202、218/226、234/242、250/258、266/274、282/290、298/306、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、458/466、474/482、490/498、506/514，以及522/530，該件國際專利公開案併入本文做為參考資料。 148.    如具體例147之IL2促效劑，其中該抗體或抗原結合片段具有選自以下任一者的VH-VL胺基酸序列：國際專利公開案第WO 2019005897 A1號的SEQ ID NO: 2/10、34/42、82/90、194/202、282/290，及506/514，該件國際專利公開案併入本文做為參考資料。 149.    如具體例121之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至與自體免疫反應有關或受到自體免疫反應靶向的抗原。 150.    如具體例149之IL2促效劑，其中該肽衍生自麥膠蛋白(gliadin)、GAD 65、IA-2、胰島素B鏈、醋酸格拉替雷(glatiramer acetate，GA)、乙醯膽鹼受體(AChR)、p205、胰島素、促甲狀腺素、酪胺酸酶，TRP I或髓磷脂抗原。 151.    如具體例150之IL2促效劑，其中該肽衍生自IL-4R，IL-6R或DLL4。 152.    如具體例121至151中任一項之IL2促效劑，其中該靶向部分為抗體或其抗原結合片段。 153.    如具體例152之IL2促效劑，其中該靶向部分為Fab。 154.    如具體例152之IL2促效劑，其中該靶向部分為scFv。 155.    如具體例121之IL2促效劑，其中該靶向部分為肽-MHC複合體。 156.    如具體例155之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體結合至腫瘤淋巴細胞的T細胞受體。 157.    如具體例155或具體例156之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體中的肽包含腫瘤新抗原。 158.    如具體例157之IL2促效劑，其中該腫瘤新抗原為LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPV E7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪胺酸酶(369-377、371D)，或WT1(126-134)。 159.    如具體例155之IL2促效劑，其中肽-MHC複合體中的肽包含病毒抗原。 160.    如具體例159之IL2促效劑，其中該病毒抗原為CMVpp65或HPV16E7。 161.    如具體例155至160中任一項之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體進一步包含β2微球蛋白或其片段。 162.    如具體例161之IL2促效劑，其中該肽MHC複合體包含第I型MHC結構域。 163.    如具體例162之IL2促效劑，其中該肽MHC複合體按N端至C端位向包含MHC肽、連接子、β2微球蛋白結構域、連接子，及第I型MHC結構域。 164.    如具體例163之IL2促效劑，其中連接該MHC肽與β2微球蛋白結構域的該連接子包含胺基酸序列GCGGS(SEQ ID NO:77)。 165.    如具體例155至160中任一項之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體不包含β2微球蛋白或其片段。 166.    如具體例165之IL2促效劑，其中該肽MHC複合體包含第II型MHC結構域。 167.    一種核酸或複數種核酸，其編碼具體例1至166中任一項之IL2促效劑。 168.    一種宿主細胞，其經工程改造成表現如具體例1至166中任一項之IL2促效劑或具體例167之核酸。 169.    一種生產如具體例1至166中任一項之IL2促效劑的方法，其包含培養如具體例168之宿主細胞並回收由此所表現的IL2促效劑。 170.    一種醫藥組成物，包含如具體例1至166中任一項之IL2促效劑及賦形劑。 171.    一種治療癌症的方法，包含向有需要的個體投與如具體例1至166中任一項之IL2促效劑或如具體例170之醫藥組成物。 172.    一種治療癌症的方法，包含向有需要的個體投與： (a)  嵌合抗原受體(「CAR」) T細胞(「CART細胞」)；以及 (b) IL2促效劑，包含結合至CART細胞之T細胞受體或CART細胞上另一個細胞表面分子的靶向部分，視情況其中該靶向部分能夠結合至CAR的細胞外結構域。 173.    如具體例172之方法，其中該IL2促效劑對IL2部分及/或靶向部分為單價。 174.    如具體例172或具體例173之方法，其中該IL2促效劑是如具體例1至166中任一項之IL2促效劑，較佳如具體例94至97，121及155至166中任一項之IL2促效劑。 175.    如具體例172至174中任一項之方法，其中該等CART細胞未被工程改造成表現變體IL2-Rβ受體。 176.    如具體例172至174中任一項之方法，其中該等CART細胞未被工程改造成任何變體IL2受體。 177.    如具體例172至176中任一項之方法，其中該IL2促效劑在投與該等CART細胞的一週內被投與給個體。 178.    如具體例177之方法，其中該IL2促效劑在投與該等CART細胞的同一天被投與給個體。 179.    如具體例172至178中任一項之方法，其包含給予個體IL2促效劑持續至少兩週的期間。 180.    如具體例179之方法，其中該IL2促效劑是藉由連續輸注來給藥。 181.    如具體例179之方法，其中該IL2促效劑是藉由每日投藥來給藥，持續至少兩週期間的一部分。 182.    如具體例179之方法，其中該IL2促效劑是依據分次給藥方案來給藥，該分次給藥方案包含： (a)  在至少兩週期間的初始部分中以第一給藥頻率來投與IL2促效劑；以及 (b) 在至少兩週期間的後續部分中以第二給藥頻率來投與IL2促效劑。 183.    如具體例182之方法，其中該第一給藥頻率為每天。 184.    如具體例182或具體例183之方法，其中該第二給藥頻率少於第一給藥頻率。 185.    如具體例184之方法，其中該第二給藥頻率為每週。 186.    如具體例182至185中任一項之方法，其中在CART細胞耗竭的同時或之後，該個體從第一給藥頻率過渡到第二給藥頻率。 187.    如具體例171至186中任一項之方法，其進一步包含向個體投與抗PD1抗體。 188.    如具體例187之方法，其中該抗PD1抗體為MDX-1106(納武單抗(nivolumab))、MK-3475(派姆單抗(pembrolizumab))、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810，或BGB-108。 189.    如具體例172至188中任一項之方法，其中該CAR被設計成靶向第6.11.1.3節中所識別目標中的任一者。 190.    如具體例172至189中任一項之方法，其中該CAR是如第6.11.1.1節及其小節來設計。 191.    如具體例172至190中任一項之方法，其中該靶向部分包含受到CAR之抗原結合結構域所辨識的pMHC。 192.    一種治療自體免疫疾病的方法，包含向有需要的個體投與： (a)  嵌合抗原受體(「CAR」) T細胞(「CART細胞」)；以及 (b) IL2促效劑，包含結合至CART細胞上存在之細胞表面抗原的靶向部分，視情況其中該靶向部分能夠結合至CAR的細胞外結構域。 193.    如具體例192之方法，其中該IL2促效劑對IL2部分及/或靶向部分為單價。 194.    如具體例192或具體例193之方法，其中該IL2促效劑為如具體例1至166中任一項之IL2促效劑，較佳如具體例94至97，121及155至166中任一項之IL2促效劑。 195.    如具體例192至194中任一項之方法，其中該靶向部分包含選殖自自體免疫目標細胞及/或被CAR之抗原結合結構域所辨識的pMHC。 196.    如具體例192至195中任一項之方法，其中該CART細胞為Treg細胞。 197.    如具體例192至196中任一項之方法，其中該CAR被設計成靶向第6.11.1.4節中所辯識目標中的任一者。 198.    如具體例192至197中任一項之方法，其中該CAR是如第6.11.1.1節及其小節來設計。 199.    一種IL2促效劑，包含： (a)  Fc結構域；及 (b) 在Fc結構之C端的IL2部分，其中該IL2部分包含IL2結構域及IL2-Rα結構域， 視情況其中該IL2促效劑具有具體例1至36中任一項之IL2促效劑的一或多種特性。 200.    如具體例199之IL2促效劑，其中該IL2結構域在IL2-Rα結構域的N端。 201.    如具體例199之IL2促效劑，其中該IL2結構域在IL2-Rα結構域的C端。 202.    如具體例199至201中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分包含IL2結構域，該IL2結構域包含具有以下的胺基酸序列： (a)  與成熟人類IL2具有至少約90%或至少約95%序列一致性； (b) 相較於成熟人類IL2，具有N端丙胺酸缺失； (c)  IL2變體，相較於野生型IL2，其在位置N88處具有胺基酸置換，視情況其中胺基酸置換為N88D； (d) 相較於野生型IL2，具有胺基酸置換C125S，C125A或C125V；或 (e)  (a)、(b)，(c)及/或(d)的任何組合。 203.    如具體例199至202中任一項之IL2促效劑，其中該IL2-Rα結構域包含與人類IL2-Rα之IL2結合部分具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99%或100%序列一致性的胺基酸序列或由其組成，視情況其中該結合部分具有： (a)  人類IL2-Rα的至少160個胺基酸、至少161個胺基酸、至少162個胺基酸，至少164個胺基酸或至少165個胺基酸；及/或 (b) 人類IL2-Rα之細胞外結構域的至多251個、至多240個、至多230個、至多220個、至多210個、至多200個、至多190個，至多180個或至多170個胺基酸。 204.    如具體例199至203中任一項之IL2促效劑，其中該IL2結構域及該IL2-Rα結構域經由一個連接子(「IL2部分連接子」)而連接。 205.    如具體例204之IL2促效劑，其中該IL2部分連接子的長度為至少10個或至少15個胺基酸。 206.    如具體例204或具體例205之IL2促效劑，其中該IL2部分連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子或包含甘胺酸-絲胺酸連接子。 207.    如具體例204至206中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分連接子包含胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)。 208.    如具體例207之IL2促效劑，其中該IL2部分連接子為胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)的多聚體或包含胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)的多聚體。 209.    如具體例208之IL2促效劑，其中該多聚體包含2、3、4、5，6或更多個重複的胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)。 210.    如具體例199至209中任一項之IL2促效劑，其中該Fc結構域及該IL2結構域經由一個連接子(「Fc-IL2連接子」)而連接。 211.    如具體例210之IL2促效劑，其中該Fc-IL2連接子的長度為至少5個或至少10個胺基酸。 212.    如具體例210或具體例211之IL2促效劑，其中該Fc-IL2連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子或包含甘胺酸-絲胺酸連接子。 213.    如具體例210至212中任一項之IL2促效劑，其中該Fc-IL2連接子包含胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)。 214.    如具體例207之IL2促效劑，其中該Fc-IL2連接子為胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)的多聚體或包含胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)的多聚體。 215.    如具體例208之IL2促效劑，其中該多聚體包含2、3、4、5，6或更多個重複的胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)。 216.    如具體例199至215中任一項之IL2促效劑，其中該Fc結構域為IgG1、IgG2，IgG3或IgG4 Fc結構域。 217.    如具體例216之IL2促效劑，其中該Fc結構域的效應子功能減少。 218.    如具體例199至217中任一項之IL2促效劑，其為二聚體。 219.    如具體例218之IL2促效劑，其為同二聚體。 220.    如具體例218之IL2促效劑，其為異二聚體。 221.    如具體例199至220中任一項之IL2促效劑，其對IL2部分為二價。 222.    如具體例199至221中任一項之IL2促效劑，其包含靶向部分。 223.    如具體例222之IL2促效劑，其中該靶向部分在Fc結構域的N端。 224.    如具體例22或具體例223之IL2促效劑，其中該靶向部分： (a)  結合至腫瘤相關抗原； (b) 結合至腫瘤微環境抗原； (c)  結合至腫瘤反應性淋巴細胞的細胞表面分子； (d) 結合至檢查點抑制劑； (e)  結合至肽-MHC複合體； (f)  是肽-MHC複合體；或 (g) 結合至與自體免疫反應相關或受到自體免疫反應所靶向的抗原。 225.    如具體例224之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至腫瘤相關抗原。 226.    如具體例225之IL2促效劑，其中該腫瘤相關抗原為纖維母細胞活化蛋白(FAP)、肌腱蛋白C的A1結構域(TNC A1)、肌腱蛋白C的A2結構域(TNC A2)，纖維連接蛋白的額外結構域B(EDB)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脫胺酶結合蛋白(ADAbp)、親環蛋白b、結腸直腸相關抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特異性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、T細胞受體/CD3-ζ鏈、腫瘤抗原的MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2 (MAGE-B2)，MAGE-Xp3 (MAGE-B3)，MAGE-Xp4 (MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、腫瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪胺酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-鈣黏蛋白、α-連環蛋白、β-連環蛋白和γ-連環蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性結腸息肉蛋白(APC)、胞襯蛋白、連接蛋白37、Ig個體基因型、p15、gp75、GM2和GD2神經節苷脂、病毒產物(例如人類乳頭瘤病毒蛋白)、腫瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、EBV編碼的核抗原(EBNA)-1、腦糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、c-erbB-2、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T細胞表面抗原)、CD3(與TCR相關的異多聚體)、CD22(B細胞受體)、CD23(低結合親和力IgE受體)、CD30(細胞激素受體)、CD33(骨髓細胞表面抗原)、CD40(腫瘤壞死因子受體)、IL-6R-(IL6受體)、CD20、MCSP、PDGFβR(β-血小板衍生的生長因子受體)、ErbB2上皮細胞黏附分子(EpCAM)、EGFR變體III(EGFRvIII)、CD19、雙唾液酸神經節苷脂GD2、導管上皮黏蛋白、gp36、TAG-72、神經膠質瘤相關抗原、β-人類絨毛膜促性腺激素、α胎蛋白(AFP)、凝集素反應性AFP、甲狀腺球蛋白、MN-CA IX、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2(AS)、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺酶特異性抗原(PSA)、PAP、LAGA-1a、p53、前列腺相關蛋白、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、嗜中性球彈性蛋白酶、蝶素B2、胰島素生長因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受體、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘤基質抗原、纖維連接蛋白的額外結構域A(EDA)或額外結構域B(EDB)，或肌腱蛋白C的A1結構域(TnC A1)。 227.    如具體例224或具體例225之IL2促效劑，其中該腫瘤相關抗原為病毒抗原。 228.    如具體例227之IL2促效劑，其中該病毒抗原為艾-巴二氏病毒LMP-1、C型肝炎病毒E2糖蛋白、HIV gp160或HIV gp120、HPV E6、HPV E7，CMV早期膜抗原(EMA)或CMV晚期膜抗原(LMA)。 229.    如具體例224之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至腫瘤微環境抗原。 230.    如具體例229之IL2促效劑，其中該腫瘤微環境抗原為細胞外基質蛋白。 231.    如具體例230之IL2促效劑，其中該細胞外基質蛋白為聯合蛋白聚醣、肝素酶、整合素、骨橋蛋白、link、鈣黏蛋白、層連結蛋白、層連結蛋白型EGF、凝集素、纖維連接蛋白、notch、肌腱蛋白，膠原蛋白和基質蛋白。 232.    如具體例224之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至腫瘤淋巴細胞的細胞表面分子。 233.    如具體例232之IL2促效劑，其中該細胞表面分子為CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、LAG3，TIM3或B7-H3。 234.    如具體例233之IL2促效劑，其中該細胞表面分子為PD1。 235.    如具體例234之IL2促效劑，其中該靶向部分為抗PD1抗體或其抗原結合片段。 236.    如具體例233之IL2促效劑，其中該細胞表面分子為LAG3。 237.    如具體例224之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至檢查點抑制劑。 238.    如具體例237之IL2促效劑，其中該檢查點抑制劑為CTLA-4、PD1、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、VISTA、PSGL1，或CHK2。 239.    如具體例238之IL2促效劑，其中該檢查點抑制劑為PD1。 240.    如具體例238之IL2促效劑，其中該檢查點抑制劑為LAG3。 241.    如具體例239之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至MHC-肽複合體。 242.    如具體例241之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體中的肽包含腫瘤新抗原。 243.    如具體例242之IL2促效劑，其中該腫瘤新抗原為LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPV E7 (11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪胺酸酶(369-377、371D)，或WT1(126-134)。 244.    如具體例224至243中任一項之IL2促效劑，其中該靶向部分為抗體或其抗原結合片段。 245.    如具體例244之IL2促效劑，其中該靶向部分為Fab。 246.    如具體例244之IL2促效劑，其中該靶向部分為scFv。 247.    如具體例224之IL2促效劑，其中該靶向部分為肽-MHC複合體。 248.    如具體例247之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體結合至腫瘤淋巴細胞的T細胞受體。 249.    如具體例247或具體例248之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體中的肽包含腫瘤新抗原。 250.    如具體例249之IL2促效劑，其中該腫瘤新抗原為LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPV E7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪胺酸酶(369-377、371D)，或WT1(126-134)。 251.    如具體例247之IL2促效劑，其中肽-MHC複合體中的肽包含病毒抗原。 252.    如具體例251之IL2促效劑，其中該病毒抗原為CMVpp65或HPV16E7。 253.    如具體例247至252中任一項之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體進一步包含β2微球蛋白或其片段。 254.    如具體例253之IL2促效劑，其中該肽MHC複合體包含第I型MHC結構域。 255.    如具體例254之IL2促效劑，其中該肽MHC複合體按N端至C端位向包含MHC肽、連接子、β2微球蛋白結構域、連接子，及第I型MHC結構域。 256.    如具體例255之IL2促效劑，其中連接該MHC肽與β2微球蛋白結構域的該連接子包含胺基酸序列GCGGS。 257.    如具體例247至252中任一項之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體不包含β2微球蛋白或其片段。 258.    如具體例257之IL2促效劑，其中該肽MHC複合體包含第II型MHC結構域。 259.    一種核酸或複數種核酸，其編碼具體例199至258中任一項之IL2促效劑。 260.    一種宿主細胞，其經工程改造成表現如具體例199至258中任一項之IL2促效劑或具體例259之核酸。 261.    一種生產如具體例199至258中任一項之IL2促效劑的方法，其包含培養如具體例260之宿主細胞並回收由此所表現的IL2促效劑。 262.    一種醫藥組成物，包含如具體例199至258中任一項之IL2促效劑及賦形劑。 263.    一種治療癌症的方法，包含向有需要的個體投與如具體例199至258中任一項之IL2促效劑或如具體例262之醫藥組成物。 264.    一種治療癌症的方法，包含向有需要的個體投與： (a)  嵌合抗原受體(「CAR」) T細胞(「CART細胞」)；以及 (b) 如具體例199至224中任一項之IL2促效劑，其包含結合至CART細胞之T細胞受體或CART細胞上另一個細胞表面分子的靶向部分，視情況其中該靶向部分能夠結合至CAR的細胞外結構域， 視情況其中該CAR： (i)      其中該CAR被設計成靶向第6.11.1.4節中所識別目標中的任一者；及/或 (ii)    其中該CAR是如第6.11.1.1節及其小節來設計。 265.    如具體例263或具體例264之方法，其進一步包含向個體投與抗PD1抗體。 266.    如具體例265之方法，其中該抗PD1抗體為MDX-1106(納武單抗)、MK-3475(派姆單抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810，或BGB-108。 267.    一種IL2促效劑，包含： (a)  第一多肽鏈，包含： (i)      靶向部分，例如能夠結合至嵌合抗原受體(CAR) T細胞上細胞表面分子的靶向部分，視情況其中該靶向部分能夠結合至CAR的細胞外結構域；及 (ii)    第一Fc結構域，在靶向部分的C端；以及 (b) 第二多肽鏈，包含： (i)      IL2部分；及 (ii)    第二Fc結構域，在IL2部分的N端或C端， 視情況其中該IL2促效劑具有具體例1至36中任一項之IL2促效劑的一或多種特性。 268.    如具體例267之IL2促效劑，其為二聚體。 269.    如具體例268之IL2促效劑，其為同二聚體。 270.    如具體例269之IL2促效劑，其對靶向部分及IL2部分為二價。 271.    如具體例270之IL2促效劑，其具有如圖22.A.1中所示的構形。 272.    如具體例270或具體例271之IL2促效劑，其包含： (a)  第一多肽鏈，包含： (i)      能夠結合至嵌合抗原受體的第一靶向部分； (ii)    視情況選用的連接子； (iii)  第一Fc結構域，在靶向部分的C端； (iv)  視情況選用的連接子；及 (v)    第一IL2部分，在第一Fc結構域的C端； (b) 第二多肽鏈，包含： (i)      能夠結合至嵌合抗原受體的第二靶向部分； (ii)    視情況選用的連接子； (iii)  第二Fc結構域，在靶向部分的C端； (iv)  視情況選用的連接子；及 (v)    第二IL2部分，在第一Fc結構域的C端。 273.    如具體例268之IL2促效劑，其為異二聚體。 274.    如具體例273之IL2促效劑，其對靶向部分及IL2部分為單價。 275.    如具體例274之IL2促效劑，其具有圖22.A.2中所示的構形。 276.    如具體例274或具體例274之IL2促效劑，其包含： (a)  第一多肽鏈，包含： (i)      能夠結合至嵌合抗原受體的靶向部分； (ii)    視情況選用的連接子；及 (iii)  第一Fc結構域，在靶向部分的C端；以及 (b) 第二多肽鏈，包含： (i)      IL2部分； (ii)    視情況選用的連接子；及 (iii)  第二Fc結構域，在IL2部分的C端。 277.    如具體例267至276中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分及/或IL2促效劑對人類IL2-Rβ的結合減弱。 278.    如具體例267至277中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分及/或IL2促效劑對人類IL2-Rα的結合減弱。 279.    如具體例267至278中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分及/或IL2促效劑具有： (a)  相較於野生型IL2，對人類IL2-Rβ的結合減弱50倍至1000倍；及/或 (b) 較於野生型人類IL2，對人類IL2-Rα的結合減弱至多100倍。 280.    如具體例267至279中任一項之IL2促效劑，其中相較於野生型IL2，該IL2部分及/或IL2促效劑對高親和力IL2受體的結合親和力減弱。 281.    如具體例280之IL2促效劑，其中該結合親和力減弱達10倍至1,000倍。 282.    如具體例267至281中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分包含IL2結構域，該IL2結構域包含具有以下的胺基酸序列： (a)  與成熟人類IL2具有至少約90%或至少約95%序列一致性； (b) 相較於成熟人類IL2，具有N端丙胺酸缺失； (c)  相較於野生型IL2，具有胺基酸置換C125S，C125A或C125V； (d) 相較於野生型IL2，具有胺基酸置換H16A及/或F42A；或 (e)  (a)、(b)，(c)及/或(d)的任何組合。 283.    如具體例267至282中任一項之IL2促效劑，其缺少IL2-Rα的IL2結合部分。 284.    如具體例267至283中任一項之IL2促效劑，其中該Fc結構域為IgG1、IgG2，IgG3或IgG4 Fc結構域。 285.    如具體例284之IL2促效劑，其中該Fc結構域的效應子功能減少。 286.    如具體例1至285中任一項之IL2促效劑，其中該靶向部分為肽-MHC複合體。 287.    如具體例286之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體結合至腫瘤淋巴細胞的T細胞受體。 288.    如具體例286或具體例287之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體中的肽包含腫瘤新抗原。 289.    如具體例288之IL2促效劑，其中該腫瘤新抗原為LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPVE7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪胺酸酶(369-377、371D)，或WT1(126-134)。 290.    如具體例286或具體例287之IL2促效劑，其中肽-MHC複合體中的肽包含病毒抗原。 291.    如具體例290之IL2促效劑，其中該病毒抗原為CMVpp65或HPV16E7。 292.    如具體例286至291中任一項之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體進一步包含β2微球蛋白或其片段。 293.    如具體例292之IL2促效劑，其中該肽MHC複合體包含第I型MHC結構域。 294.    如具體例293之IL2促效劑，其中該肽MHC複合體按N端至C端位向包含MHC肽、連接子、β2微球蛋白結構域、連接子，及第I型MHC結構域。 295.    如具體例294之IL2促效劑，其中連接該MHC肽與β2微球蛋白結構域的該連接子包含胺基酸序列GCGGS (SEQ ID NO:77)。 296.    如具體例286至291中任一項之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體不包含β2微球蛋白或其片段。 297.    如具體例296之IL2促效劑，其中該肽MHC複合體包含第II型MHC結構域。 298.    如具體例267至285中任一項之IL2促效劑，其中該靶向部分為抗體或其抗原結合片段。 299.    如具體例298之IL2促效劑，其中該靶向部分為Fab且其中該IL2促效劑包含第三多肽鏈，該第三多肽鏈包含Fab的輕鏈。 300.    如具體例298之IL2促效劑，其中該靶向部分為scFv。 301.    如具體例267至285及298至300中任一項之IL2促效劑，其中該靶向部分： (a)  結合至腫瘤相關抗原； (b) 結合至腫瘤微環境抗原； (c)  結合至腫瘤反應性淋巴細胞的細胞表面分子； (d) 結合至檢查點抑制劑； (e)  結合至肽-MHC複合體； (f)  結合至與自體免疫反應相關或受到自體免疫反應所靶向的抗原。 302.    如具體例301之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至腫瘤相關抗原。 303.    如具體例302之IL2促效劑，其中該腫瘤相關抗原為纖維母細胞活化蛋白(FAP)、肌腱蛋白C的A1結構域(TNC A1)、肌腱蛋白C的A2結構域(TNC A2)，纖維連接蛋白的額外結構域B(EDB)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脫胺酶結合蛋白(ADAbp)、親環蛋白b、結腸直腸相關抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特異性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、T細胞受體/CD3-ζ鏈、腫瘤抗原的MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)，MAGE-Xp3(MAGE-B3)，MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、腫瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪胺酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-鈣黏蛋白、α-連環蛋白、β-連環蛋白和γ-連環蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性結腸息肉蛋白(APC)、胞襯蛋白、連接蛋白37、Ig個體基因型、p15、gp75、GM2和GD2神經節苷脂、病毒產物(例如人類乳頭瘤病毒蛋白)、腫瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、EBV編碼的核抗原(EBNA)-1、腦糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、c-erbB-2、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T細胞表面抗原)、CD3(與TCR相關的異多聚體)、CD22(B細胞受體)、CD23(低結合親和力IgE受體)、CD30(細胞激素受體)、CD33(骨髓細胞表面抗原)、CD40(腫瘤壞死因子受體)、IL-6R-(IL6受體)、CD20、MCSP、PDGFβR(β-血小板衍生的生長因子受體)、ErbB2上皮細胞黏附分子(EpCAM)、EGFR變體III(EGFRvIII)、CD19、雙唾液酸神經節苷脂GD2、導管上皮黏蛋白、gp36、TAG-72、神經膠質瘤相關抗原、β-人類絨毛膜促性腺激素、α胎蛋白(AFP)、凝集素反應性AFP、甲狀腺球蛋白、MN-CA IX、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2(AS)、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺酶特異性抗原(PSA)、PAP、LAGA-1a、p53、前列腺相關蛋白、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、嗜中性球彈性蛋白酶、蝶素B2、胰島素生長因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受體、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘤基質抗原、纖維連接蛋白的額外結構域A(EDA)或額外結構域B(EDB)，或肌腱蛋白C的A1結構域(TnC A1)。 304.    如具體例301或具體例302之IL2促效劑，其中該腫瘤相關抗原為病毒抗原。 305.    如具體例304之IL2促效劑，其中該病毒抗原為艾-巴二氏病毒LMP-1、C型肝炎病毒E2糖蛋白、HIV gp160或HIV gp120、HPV E6、HPV E7，CMV早期膜抗原(EMA)或CMV晚期膜抗原(LMA)。 306.    如具體例301之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至腫瘤微環境抗原。 307.    如具體例306之IL2促效劑，其中該腫瘤微環境抗原為細胞外基質蛋白。 308.    如具體例307之IL2促效劑，其中該細胞外基質蛋白為聯合蛋白聚醣、肝素酶、整合素、骨橋蛋白、link、鈣黏蛋白、層連結蛋白、層連結蛋白型EGF、凝集素、纖維連接蛋白、notch、肌腱蛋白，膠原蛋白和基質蛋白。 309.    如具體例301之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至腫瘤淋巴細胞的細胞表面分子。 310.    如具體例309之IL2促效劑，其中該細胞表面分子為CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、LAG3、TIM3，或B7-H3。 311.    如具體例310之IL2促效劑，其中該細胞表面分子為PD1。 312.    如具體例310之IL2促效劑，其中該細胞表面分子為LAG3。 313.    如具體例301之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至檢查點抑制劑。 314.    如具體例313之IL2促效劑，其中該檢查點抑制劑為CTLA-4、PD1、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、VISTA、PSGL1，或CHK2。 315.    如具體例314之IL2促效劑，其中該檢查點抑制劑為PD1。 316.    如具體例314之IL2促效劑，其中該檢查點抑制劑為LAG3。 317.    如具體例301之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至MHC-肽複合體。 318.    如具體例317之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體中的肽包含腫瘤新抗原。 319.    如具體例318之IL2促效劑，其中該腫瘤新抗原為LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPVE7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪胺酸酶(369-377、371D)，或WT1(126-134)。 320.    如具體例301之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至與自體免疫反應有關或受到自體免疫反應靶向的抗原。 321.    如具體例320之IL2促效劑，其中該肽衍生自麥膠蛋白、GAD 65、IA-2、胰島素B鏈、醋酸格拉替雷(GA)、乙醯膽鹼受體(AChR)、p205、胰島素、促甲狀腺素、酪胺酸酶，TRP I或髓磷脂抗原。 322.    如具體例321之IL2促效劑，其中該肽衍生自IL-4R，IL-6R或DLL4。 323.    一種核酸或複數種核酸，其編碼具體例267至322中任一項之IL2促效劑。 324.    一種宿主細胞，其經工程改造成表現如具體例267至322中任一項之IL2促效劑或具體例323之核酸。 325.    一種生產如具體例267至322中任一項之IL2促效劑的方法，其包含培養如具體例324之宿主細胞並回收由此所表現的IL2促效劑。 326.    一種醫藥組成物，包含如具體例267至322中任一項之IL2促效劑及賦形劑。 327.    一種治療癌症的方法，包含向有需要的個體投與如具體例267至322中任一項之IL2促效劑或如具體例326之醫藥組成物。 328.    一種治療癌症的方法，包含向有需要的個體投與： (a)  嵌合抗原受體(「CAR」) T細胞(「CART細胞」)；以及 (b) 如具體例267至322中任一項之IL2促效劑，其靶向部分結合至嵌合抗原受體(CAR) T細胞之細胞表面分子，視情況其中該靶向部分能夠結合至CAR的細胞外結構域， 視情況其中該CAR： (i)      被設計成靶向第6.11.1.4節中所識別目標中的任一者；及/或 (ii)    如第6.11.1.1節及其小節來設計。 329.    如具體例328之方法，其中該靶向部分包含受到CAR之抗原結合結構域所辨識的pMHC。 330.    如具體例328或具體例329之方法，其中該等CART細胞未被工程改造成表現變體IL2-Rβ受體。 331.    如具體例328至330中任一項之方法，其中該等CART細胞未被工程改造成表現任何變體IL2受體。 332.    如具體例328至331中任一項之方法，其中該IL2促效劑在投與該等CART細胞的一週內被投與給個體。 333.    如具體例332之方法，其中該IL2促效劑在投與該等CART細胞的同一天被投與給個體。 334.    如具體例328至333中任一項之方法，其包含給予個體IL2促效劑持續至少兩週的期間。 335.    如具體例334之方法，其中該IL2促效劑是藉由連續輸注來給藥。 336.    如具體例334之方法，其中該IL2促效劑是藉由每日投藥來給藥，持續至少兩週期間的一部分。 337.    具體例334之方法，其中該IL2促效劑是依據分次給藥方案來給藥，該分次給藥方案包含： (a)  在至少兩週期間的初始部分中以第一給藥頻率來投與IL2促效劑；以及 (b) 在至少兩週期間的後續部分中以第二給藥頻率來投與IL2促效劑。 338.    如具體例337之方法，其中該第一給藥頻率為每天。 339.    如具體例337或具體例338之方法，其中該第二給藥頻率少於第一給藥頻率。 340.    如具體例339之方法，其中該第二給藥頻率為每週。 341.    如具體例337至340中任一項之方法，其中在CART細胞耗竭的同時或之後，該個體從第一給藥頻率過渡到第二給藥頻率。 342.    如具體例328至341中任一項之方法，其進一步包含向個體投與抗PD1抗體。 343.    如具體例342之方法，其中該抗PD1抗體為MDX-1106(納武單抗)、MK-3475(派姆單抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810，或BGB-108。 344.    一種治療自體免疫疾病的方法，包含向有需要的個體投與： (a)  嵌合抗原受體(「CAR」) T細胞(「CART細胞」)；以及 (b) 如具體例267至322中任一項之IL2促效劑，其靶向部分結合至嵌合抗原受體(CAR) T細胞上之細胞表面分子，視情況其中該靶向部分能夠結合至CAR的細胞外結構域， 視情況其中該CAR： (i)      被設計成靶向第6.11.1.4節中所識別目標中的任一者；及/或 (ii)    如第6.11.1.1節及其小節來設計。 345.    如具體例344之方法，其中該靶向部分包含選殖自自體免疫目標細胞的pMHC。 346.    如具體例344或具體例345之方法，其中該CART細胞為Treg細胞。
在本申請案中引用的所有出版物、專利，專利申請案和其他文件，出於所有目的以全文引用的方式併入本文，就像在每個個別出版物、專利，專利申請案或其他文件中單獨指出的那樣。出於所有目的以引用方式併入。如果併入本文的一或多個參考文獻的教示內容與本揭示內容之間存在不一致的情況，則預期為本說明書的教示內容。
5.        圖式的簡單說明
圖1示出IL2和IL15信號傳導途徑，其具有獨特的受體次單位，但是具有共同的β/γ受體次單位。
圖2A-2D示出抗原經由第I類MHC複合體(圖2A)與第II類MHC複合體(圖2B)被抗原呈遞細胞呈遞給T細胞，以及T細胞受體複合體受到MHC-肽複合體活化(圖2C-2D)。
圖3A-3B顯示由兩個不同物種的含IL-2Rα之IL2突變蛋白形成的不同結構之間的平衡。
圖4A-4C顯示IL2M1對人類PBMC的活性。IL2M1對IL-2Rα+ Treg的活性降低(圖4A)，它卻對IL-2Rα- CD8+ T細胞(圖4B)和NK細胞(圖4C)保持了完全活性。
圖5A-5D顯示IL2M1在活體內相對於Treg(圖5A)選擇性擴增NK(圖5B)和CD8+ T細胞(圖5C-5D)，IL2M0(在圖中稱為IL2-Fc)卻偏好擴展Treg(圖5A-5D)。
圖6A-6B顯示用IL2突變蛋白及/或抗PD1抗體治療的小鼠的平均腫瘤體積(mm3 + SD)(圖6A)和卡普蘭-邁爾存活曲線(Kaplan-Meier survival curves)(圖6B)。
圖7A-7C.5顯示IL2M0(在圖中被稱為IL2-Fc)以劑量依賴的方式誘導抗腫瘤反應。
圖8A-8C顯示IL2M1的適度抗腫瘤功效(圖8A，8B)和伴隨的明顯毒性(圖8C)。
圖9A-9C.4顯示IL15M1的適度抗腫瘤功效(圖9A)和伴隨的明顯毒性(圖9B)，以及由IL15M1誘導的周邊免疫細胞譜(圖9C.1-C.4)。
圖10A.1-10R顯示IL2M0(在圖中稱為IL2-Fc)和IL2M1對腫瘤內淋巴細胞和周邊淋巴細胞增生的活性。
圖11A-11B顯示脾臟和腫瘤浸潤性Treg與CD8+ T細胞的差異性IL2反應性。
圖12A至圖12D顯示，IL2M2和IL2M3在人類PBMC的多個淋巴細胞群中展現出活性減弱(圖12A至圖12C)以及活體內毒性降低(圖12D)。圖12A至圖12C的結果是用IL2M2和IL2M3蛋白獲得，而圖12D的結果是基於透過流體動力學DNA遞送(「HDD」)來活體內投與編碼IL2M2和IL2M3的核酸。
圖13A-13C顯示，IL2M2在多個同基因小鼠腫瘤模型中作為單一藥劑展示出抗腫瘤功效。IL2M2經由流體動力學DNA遞送(HDD)(圖9A和9B)或作為經純化蛋白質(圖9C)來遞送。
圖14A-14C顯示IL2M4和IL2M5對人類PBMC之不同淋巴細胞群的活性。
圖15A-15D顯示IL2M5的抗腫瘤功效。
圖16A-16B顯示IL2M2的SEC-MALS研究的結果(圖16A)，IL2M2主要由高階寡聚物組成，相對於IL2M3(圖16B)主要是以Fc同二聚體存在，咸信是IL2結構域相對於Fc結構域的位向及/或連接這些結構域之連接子的長度所致。
圖17顯示抗PD1和T1-IL2M3與HEK293-mPD1細胞的FACS結合結果。
圖18A-18E.2顯示T1-IL2M3的抗腫瘤功效優於抗PD1和非靶向IL2M3的組合(圖18A-18B.4)，且T1-IL2M3擴增PD1+的效應子CD8+ T細胞，與非靶向的IL2M3相比，Treg的擴增較少(圖18C.1-18E.2)。
圖19顯示(a)IL-2被IL-2Rαβγ複合體結合，導致透過STAT5信號轉導和強烈細胞活化的示意圖(圖左側)，(b)在沒有細胞表面表現PD-1的情況下，抗PD1-IL2突變蛋白3融合物以低程度結合至淋巴細胞與內皮細胞上的IL-2Rαβγ複合體，導致那些細胞的活化低或無活化(圖中兩個虛線之間的中間部分)，而(c)抗PD1-IL2突變蛋白3融合物結合至細胞表面表現PD-1的腫瘤特異性T細胞上的IL-2Rαβγ複合體，導致持續的信號傳導和T細胞活化。
圖20A-20D顯示抗mPD1-IL2突變蛋白3融合物在鼠類同基因腫瘤模型中的抗腫瘤功效：肺臟(圖20A)；皮膚(圖20B)；乳房(圖20C)；和結腸(圖20D)。
圖21A-21B顯示抗LAG3-IL2突變蛋白3融合物的抗腫瘤功效(圖21A)和抗LAG3-IL2突變蛋白3融合物與抗mPD1抗體組合的抗腫瘤功效(圖21B)。
圖22A.1-22B顯示單鏈肽-MHC-靶向的IL2突變蛋白的同二聚體和異二聚體具體例(圖22A.1-22A.2)，並且是來自證明單鏈肽-MHC-靶向的IL2突變蛋白融合物的研究結果，其允許選擇性刺激抗原特異性小鼠CD8+ T細胞(圖22B)。
圖23A-23B顯示單鏈肽-MHC靶向的IL2突變蛋白對不表現抗原特異性TCR的非CD8+ T細胞的活性。不同的突變蛋白顯示出難以區分的活性。
圖24顯示CMV抗原特異性人類CD8+ T細胞受到具有肽-MHC靶向部分的單鏈IL2突變蛋白的選擇性刺激。
圖25A-25C顯示，包含辨識本文中稱為T3的肽-MHC靶向部分的VL-VH scFv，人類CD8a鉸鏈和跨膜(TM)結構域、4-1BB共刺激結構域、CD3z信號傳導結構域，以及用於追踪經CAR轉導的T細胞的P2A：eGFP序列的嵌合抗原受體(CAR)的簡圖(圖25A)，以及在擴增之後活CAR-T細胞的頻率和組成(圖25B-25C)。
圖26A-26B示出皆具有肽-MHC靶向部分的二價靶向IL2突變蛋白T2-IL2M6和T3-IL2M6(圖26A)，與單價靶向IL2突變蛋白T7-IL2M7和T8-IL2M7 (圖26B)的結構。
圖27A-27B顯示表現CD4+(圖27A)和CD8+(圖27B)之CAR T細胞受到圖26A與圖26B中所示肽-MHC靶向IL2突變蛋白的STAT5刺激。
圖28A.1-28C顯示CAR-T受到單價IL2突變蛋白的選擇性富集，該單價IL2突變蛋白具有被CAR的scFV辨識的靶向部分。圖28A.1-28A.16顯示如藉由流式細胞術所測定，在擴增期間，對負載有HLA-A2之單價單鏈肽產生反應，CAR-T細胞被富集的頻率。所有生物製劑維持在3.3×10-10 M的濃度。圖28B.1-28B.4顯示，CARPos /CARNeg 比率在擴增期間選擇性地增加，這是對單價單鏈肽(負載有融合至經減弱IL(2m)的HLA-A2)產生反應(空心圓形)。重組IL2 (Aldesleukin)產生最大數量的總T細胞，但相對於負載有融合至經減弱IL2(2m)的HLA-A2之單鏈肽，CAR-T富集程度較小。圖28C顯示，使用單鏈肽(負載有融合至經減弱IL2(2m)之HLA-A2)(空心圓形)來擴增CAR-T，產生最大數量的活CAR-T。
圖29顯示在免疫活性(C57BL/6J)和免疫缺陷(NOD.Scid.IL2Rgnull)小鼠中，單價和二價靶向的經減弱IL2突變蛋白的活體內PK評估結果。相對於融合至Fc的hIL2(IL2-Fc)，二價和單價突變蛋白都顯示廓清延遲。小鼠注射各種生物製劑，並在給藥後2、24、48和72小時之時收集血液樣品。藉由西方墨點法研究了血漿中Fc融合蛋白的藥物動力學。黑框表示關注的蛋白質。
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Claims (68)

  1. 一種IL2促效劑，包含： (a)       Fc結構域；以及 (b)      IL2部分，在Fc結構域的C端，其中該IL2部分包含一個IL2結構域以及一個IL2-Rα結構域。
  2. 如請求項1之IL2促效劑，其中該IL2結構域在IL2-Rα結構域的N端。
  3. 如請求項1之IL2促效劑，其中該IL2結構域在IL2-Rα結構域的C端。
  4. 如請求項1至3中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分包含IL2結構域，該IL2結構域包含具有以下的胺基酸序列： (a)       與成熟人類IL2具有至少約90%或至少約95%序列一致性； (b)      相較於成熟人類IL2，具有N端丙胺酸缺失； (c)       IL2變體，相較於野生型IL2，在位置N88處具有一個胺基酸置換，其中視情況該胺基酸置換為N88D； (d)      相較於野生型IL2，具有胺基酸置換C125S，C125A或C125V；或 (e)       (a)，(b)，(c)及/或(d)的任何組合。
  5. 如請求項1至4中任一項之IL2促效劑，其中該IL2-Rα結構域包含與人類IL2-Rα的IL2結合部分具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99%或100%序列一致性的胺基酸序列或由其組成，視情況其中該結合部分具有： (a)       人類IL2-Rα的至少160個胺基酸、至少161個胺基酸、至少162個胺基酸，至少164個胺基酸或至少165個胺基酸；及/或 (b)      人類IL2-Rα之細胞外結構域的至多251個、至多240個、至多230個、至多220個、至多210個、至多200個、至多190個，至多180個或至多170個胺基酸。
  6. 如請求項1至5中任一項之IL2促效劑，其中該IL2結構域及該IL2-Rα結構域經由一個連接子(「IL2部分連接子」)而連接。
  7. 如請求項6之IL2促效劑，其中該IL2部分連接子的長度為至少10個或至少15個胺基酸。
  8. 如請求項6或請求項7之IL2促效劑，其中該IL2部分連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子或包含甘胺酸-絲胺酸連接子。
  9. 如請求項6至8中任一項之IL2促效劑，其中該IL2部分連接子包含胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)。
  10. 如請求項9之IL2促效劑，其中該IL2部分連接子為胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)的多聚體或包含胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)的多聚體。
  11. 如請求項10之IL2促效劑，其中該多聚體包含2、3、4、5，6或更多個重複的胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)。
  12. 如請求項1至11中任一項之IL2促效劑，其中該Fc結構域及該IL2部分經由一個連接子(「Fc-IL2連接子」)而連接。
  13. 如請求項12之IL2促效劑，其中該Fc-IL2連接子的長度為至少5個或至少10個胺基酸。
  14. 如請求項12或請求項13之IL2促效劑，其中該Fc-IL2連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子或包含甘胺酸-絲胺酸連接子。
  15. 如請求項12至14中任一項之IL2促效劑，其中該Fc-IL2連接子包含胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)。
  16. 如請求項9之IL2促效劑，其中該Fc-IL2連接子為胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)的多聚體或包含胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)的多聚體。
  17. 如請求項10之IL2促效劑，其中該多聚體包含2、3、4、5，6或更多個重複的胺基酸序列G4 S(SEQ ID NO:57)。
  18. 如請求項1至17中任一項之IL2促效劑，其中該Fc結構域為IgG1、IgG2，IgG3或IgG4 Fc結構域。
  19. 如請求項18之IL2促效劑，其中該Fc結構域的效應子功能減少。
  20. 如請求項1至19中任一項之IL2促效劑，其為二聚體。
  21. 如請求項20之IL2促效劑，其為同二聚體。
  22. 如請求項20之IL2促效劑，其為異二聚體。
  23. 如請求項1至22中任一項之IL2促效劑，其對IL2部分為二價。
  24. 如請求項1至23中任一項之IL2促效劑，其包含靶向部分。
  25. 如請求項24之IL2促效劑，其中該靶向部分在Fc結構域的N端。
  26. 如請求項24或請求項25之IL2促效劑，其中該靶向部分： (a)      結合至腫瘤相關抗原； (b)      結合至腫瘤微環境抗原； (c)      結合至腫瘤反應性淋巴細胞的細胞表面分子； (d)      結合至檢查點抑制劑； (e)      結合至肽-MHC複合體； (f)       為肽-MHC複合體；或 (g)      結合至與自體免疫反應相關或受到自體免疫反應所靶向的抗原。
  27. 如請求項26之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至腫瘤相關抗原。
  28. 如請求項27之IL2促效劑，其中該腫瘤相關抗原為纖維母細胞活化蛋白(FAP)、肌腱蛋白C的A1結構域(TNC A1)、肌腱蛋白C的A2結構域(TNC A2)，纖維連接蛋白的額外結構域B(EDB)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脫胺酶結合蛋白(ADAbp)、親環蛋白b、結腸直腸相關抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特異性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、T細胞受體/CD3-ζ鏈、腫瘤抗原的MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2) 、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、腫瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪胺酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-鈣黏蛋白、α-連環蛋白、β-連環蛋白和γ-連環蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性結腸息肉蛋白(APC)、胞襯蛋白、連接蛋白37、Ig個體基因型、p15、gp75、GM2和GD2神經節苷脂、病毒產物(例如人類乳頭瘤病毒蛋白)、腫瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、EBV編碼的核抗原(EBNA)-1、腦糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2 (HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、c-erbB-2、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T細胞表面抗原)、CD3(與TCR相關的異多聚體)、CD22(B細胞受體)、CD23(低結合親和力IgE受體)、CD30(細胞激素受體)、CD33(骨髓細胞表面抗原)、CD40(腫瘤壞死因子受體)、IL-6R-(IL6受體)、CD20、MCSP、PDGFβR (β-血小板衍生的生長因子受體)、ErbB2上皮細胞黏附分子(EpCAM)、EGFR變體III (EGFRvIII)、CD19、雙唾液酸神經節苷脂GD2、導管上皮黏蛋白、gp36、TAG-72、神經膠質瘤相關抗原、β-人類絨毛膜促性腺激素、α胎蛋白(AFP)、凝集素反應性AFP、甲狀腺球蛋白、MN-CA IX、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2(AS)、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺酶特異性抗原(PSA)、PAP、LAGA-1a、p53、前列腺相關蛋白、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、嗜中性球彈性蛋白酶、蝶素B2、胰島素生長因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受體、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘤基質抗原、纖維連接蛋白的額外結構域A(EDA)或額外結構域B(EDB)，或肌腱蛋白C的A1結構域(TnC A1)。
  29. 如請求項26或請求項27之IL2促效劑，其中該腫瘤相關抗原為病毒抗原。
  30. 如請求項29之IL2促效劑，其中該病毒抗原為艾-巴二氏病毒LMP-1、C型肝炎病毒E2糖蛋白、HIV gp160或HIV gp120、HPV E6、HPV E7，CMV早期膜抗原(EMA)或CMV晚期膜抗原(LMA)。
  31. 如請求項26之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至腫瘤微環境抗原。
  32. 如請求項31之IL2促效劑，其中該腫瘤微環境抗原為細胞外基質蛋白。
  33. 如請求項32之IL2促效劑，其中該細胞外基質蛋白為聯合蛋白聚醣、肝素酶、整合素、骨橋蛋白、link、鈣黏蛋白、層連結蛋白、層連結蛋白型EGF、凝集素、纖維連接蛋白、notch、肌腱蛋白，膠原蛋白和基質蛋白。
  34. 如請求項26之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至腫瘤淋巴細胞的細胞表面分子。
  35. 如請求項34之IL2促效劑，其中該細胞表面分子為CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、LAG3、TIM3，或B7-H3。
  36. 如請求項35之IL2促效劑，其中該細胞表面分子為PD1。
  37. 如請求項36之IL2促效劑，其中該靶向部分為抗PD1抗體或其抗原結合片段。
  38. 如請求項35之IL2促效劑，其中該細胞表面分子為LAG3。
  39. 如請求項26之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至檢查點抑制劑。
  40. 如請求項39之IL2促效劑，其中該檢查點抑制劑為CTLA-4、PD1、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、VISTA、PSGL1，或CHK2
  41. 如請求項40之IL2促效劑，其中該檢查點抑制劑為PD1。
  42. 如請求項40之IL2促效劑，其中該檢查點抑制劑為LAG3。
  43. 如請求項41之IL2促效劑，其中該靶向部分結合至MHC-肽複合體。
  44. 如請求項43之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體中的肽包含腫瘤新抗原。
  45. 如請求項44之IL2促效劑，其中該腫瘤新抗原為LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPV E7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪胺酸酶(369-377、371D)，或WT1(126-134)。
  46. 如請求項26至45中任一項之IL2促效劑，其中該靶向部分為抗體或其抗原結合片段。
  47. 如請求項46之IL2促效劑，其中該靶向部分為Fab。
  48. 如請求項46之IL2促效劑，其中該靶向部分為scFv。
  49. 如請求項26之IL2促效劑，其中該靶向部分為肽-MHC複合體。
  50. 如請求項49之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體結合至腫瘤淋巴細胞的T細胞受體。
  51. 如請求項49或請求項50之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體中的肽包含腫瘤新抗原。
  52. 如請求項51之IL2促效劑，其中該腫瘤新抗原為LCMV衍生的肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV Core(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、HPV E7(11-19)、HPV E7(82-90)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165、C165A)、NYESO1(157-165、C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、存活素(96-014)、酪胺酸酶(369-377、371D)，或WT1(126-134)。
  53. 如請求項49之IL2促效劑，其中肽-MHC複合體中的肽包含病毒抗原。
  54. 如請求項53之IL2促效劑，其中該病毒抗原為CMVpp65或HPV16E7。
  55. 如請求項49至54中任一項之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體進一步包含β2微球蛋白或其片段。
  56. 如請求項55之IL2促效劑，其中該肽MHC複合體包含第I型MHC結構域。
  57. 如請求項56之IL2促效劑，其中該肽MHC複合體按N端至C端位向包含MHC肽、連接子、β2微球蛋白結構域、連接子，及第I型MHC結構域。
  58. 如請求項57之IL2促效劑，其中連接該MHC肽與β2微球蛋白結構域的該連接子包含胺基酸序列GCGGS。
  59. 如請求項49至54中任一項之IL2促效劑，其中該肽-MHC複合體不包含β2微球蛋白或其片段。
  60. 如請求項59之IL2促效劑，其中該肽MHC複合體包含第II型MHC結構域。
  61. 一種核酸或複數種核酸，其編碼如請求項1至60中任一項之IL2促效劑。
  62. 一種宿主細胞，其經工程改造成表現如請求項1至60中任一項之IL2促效劑或請求項61之核酸。
  63. 一種生產如請求項1至60中任一項之IL2促效劑的方法，其包含培養如請求項62之宿主細胞並回收由此所表現的IL2促效劑。
  64. 一種醫藥組成物，包含如請求項1至60中任一項之IL2促效劑及賦形劑。
  65. 一種治療癌症的方法，包含向有需要的個體投與如請求項1至60中任一項之IL2促效劑或如請求項64之醫藥組成物。
  66. 一種治療癌症的方法，包含向有需要的個體投與： (a)       嵌合抗原受體(「CAR」) T細胞(「CART細胞」)；以及 (b)      如請求項1至26中任一項之IL2促效劑，包含結合至CART細胞之T細胞受體或CART細胞上另一個細胞表面分子的靶向部分，視情況其中該靶向部分能夠結合至CAR的細胞外結構域。
  67. 如請求項65或66之方法，其進一步包含向該個體投與抗PD1抗體。
  68. 如請求項67之方法，其中該抗PD1抗體為MDX-1106(納武單抗)、MK-3475(派姆單抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810，或BGB-108。
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