TW201920249A - 具有結合位點之t細胞調節多聚體多肽及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供T細胞調節多聚體多肽T細胞-MMP，其包含可經選擇以便對同源共免疫調節多肽(「Co-MOD」)及用於共價附接可充當抗原決定基之分子，諸如抗原決定基肽之位置展現降低之結合親和力的免疫調節多肽(「MOD」)。一旦附接該抗原決定基分子，所得T細胞-MMP-抗原決定基結合物便可用於藉由以抗原決定基選擇性/特異性方式向該T細胞遞送免疫調節肽，諸如對IL-2R展現降低之結合親和力的IL-2或IL-2變異體來調節T細胞之活性，且因此調節個體之免疫反應。

Description

具有結合位點之T細胞調節多聚體多肽及其使用方法
適應性免疫反應涉及藉由主要組織相容性複合體(MHC；在人類中亦稱為人類白血球抗原(HLA)複合體)嚙合T細胞表面上存在之T細胞受體(TCR)與抗原呈現細胞(APC)表面上非共價呈現之小肽抗原。此嚙合表示免疫系統之靶向機制且對於T細胞調節(活化或抑制)及效應功能而言為必需之分子相互作用。在抗原決定基特異性細胞靶向後，藉由嚙合APC上發現之共刺激蛋白與T細胞上之對應共刺激蛋白來活化所靶向之T細胞。需要兩個信號，亦即抗原決定基/TCR結合及APC共刺激蛋白與T細胞共刺激蛋白嚙合，來驅動T細胞特異性及活化或抑制。TCR對指定抗原決定基具有特異性；然而，共刺激蛋白不具抗原決定基特異性，而是一般表現於所有T細胞上或大T細胞子集上。
本發明提供T細胞調節多聚體多肽(「T細胞-MMP」或多個「T細胞-MMP」)，在一個實施例中，其包含MHC受體之一部分及至少一個免疫調節多肽(本文中亦稱為「MOD多肽」或簡稱為「MOD」)。T細胞-MMP中存在之MOD中之任一或多個均可為野生型或對其細胞(例如T細胞表面)結合搭配物/受體(通稱為「Co-MOD」)展現降低之結合親和力的變異體。T細胞-MMP包含至少一個包含靶抗原決定基之分子(例如肽或非肽，諸如醣)可共價結合以便呈現至攜帶T細胞受體之細胞的化學結合位點。包含用於連接抗原決定基之化學結合位點之T細胞-MMP可用於快速製備可調節對所呈現之抗原決定基具有特異性之T細胞的活性的T細胞-MMP-抗原決定基結合物且因此用於調節個體中涉及彼等T細胞之免疫反應。T細胞-MMP及其抗原決定基結合物可另外包含用於結合諸如化學治療劑之生物活性物質(有效負載)的位點以便與特定靶抗原決定基一起共遞送。因而，T細胞-MMP-抗原決定基結合物可被視為以抗原決定基特異性方式向細胞遞送免疫調節肽(例如IL-2、4-1BBL、FasL、TGFβ、CD70、CD80、CD86、OX40L、ICOS-L、ICAM、JAG1或其片段，或其經改變(突變)之變異體)及/或有效負載(例如化學治療劑)之手段。
在本文中所描述之實施例中，T細胞-MMP可包含有助於即使在不存在相關抗原決定基肽之情況下亦在細胞內轉運期間及/或在由表現該多聚體多肽之細胞分泌後使T細胞-MMP穩定的修飾。在本文中所描述之實施例中，T細胞-MMP可包括連接MHC-I α1 螺旋之羧基端與MHC-I α2-1 螺旋之胺基端的修飾。此類修飾包括引起連接彼等螺旋之所指示區域的二硫鍵聯之形成的半胱胺酸殘基插入。舉例而言，相對於形成該等螺旋之序列，在MHC-I之胺基酸84 (Y84C取代)及139 (A139C取代)或等效位置處插入半胱胺酸殘基可形成有助於使T細胞-MMP穩定之二硫鍵聯。參見例如Z. Hein等人，Journal of Cell Science (2014) 127, 2885-2897。
本申請案主張2017年9月7日申請之美國臨時專利申請案第62/555,559號、2017年12月21日申請之美國臨時專利申請案第62/609,082號及2018年1月9日申請之美國臨時專利申請案第62/615,402號之權益。
本申請案含有經由EFS-web以電子方式提交之序列表，該序列表呈紙質複本及電腦可讀形式(CRF)且由名為「2018-9-3_123640-8001.WO00 Sequence Listing (Final)_ST25.txt」之檔案組成，於2018年9月4日創建，大小為196,231位元組，且以引用之方式整體併入本文中。
定義
本文中可互換使用之術語「聚核苷酸」及「核酸」係指任何長度之多聚體形式之核苷酸(核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸)。因而，此術語包括但不限於單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜合體或者包含嘌呤及嘧啶鹼基或其他天然、經化學或生物化學修飾、非天然或經衍生化之核苷酸鹼基的聚合物。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，且係指任何長度之多聚體形式之胺基酸，其可包括編碼及非編碼胺基酸、經化學或生物化學修飾或衍生化之胺基酸，及具有經修飾之肽骨架的多肽。
聚核苷酸或多肽與另一聚核苷酸或多肽具有某一百分比「序列一致性」意謂當比對時該百分比之鹼基或胺基酸相同並且當比較兩個序列時處於相同的相對位置。可用眾多不同的方式測定序列一致性。為了測定序列一致性，可使用經全球資訊網在諸多網站，包括ncbi.nlm.nili.gov/BLAST、ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/、ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/及mafft.cbrc.jp/alignment/software/獲得之各種便利方法及電腦程式(例如BLAST、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFT等)對序列進行比對。參見例如Altschul等人(1990), J. Mol. Biol. 215:403-10。除非另外陳述，否則使用BLAST進行序列比對。
術語「胺基酸」縮寫為「aa」。除非另外陳述，否則天然存在之胺基酸意謂：L (Leu，白胺酸)、A (Ala，丙胺酸)、G (Gly，甘胺酸)、S (Ser，絲胺酸)、V (Val，纈胺酸)、F (Phe，苯丙胺酸)、Y (Tyr，酪胺酸)、H (His，組胺酸)、R (Arg，精胺酸)、N (Asn，天冬醯胺酸)、E (Glu，麩胺酸)、D (Asp，天冬胺酸)、C (Cys，半胱胺酸)、Q (Gln，麩醯胺酸)、I (Ile，異白胺酸)、M (Met，甲硫胺酸)、P (Pro，脯胺酸)、T (Thr，蘇胺酸)、K (Lys，離胺酸)及W (Trp，色胺酸)；均為L構型。硒代半胱胺酸與羥基脯胺酸皆為在意欲涵蓋其之任何情況下特定提及之天然存在之胺基酸。
非天然胺基酸為除以上所敍述之天然存在之胺基酸、硒代半胱胺酸及羥基脯胺酸以外的任何胺基酸。
如本文中所使用之「化學結合」意謂形成共價鍵。如本文中所使用之「化學結合位點」意謂多肽中可形成共價鍵之位置，包括與該多肽形成共價鍵時所需要或有幫助之任何環境要素(例如，周圍胺基酸序列)。因此，包含一組胺基酸(該組胺基酸指導酶修飾且最終指導該組內之胺基酸處的共價鍵形成)的位點亦可稱為化學結合位點。在一些情況下，如自上下文顯而易見，術語化學結合位點可用於指已發生共價鍵形成或化學修飾之位置。
術語「保守胺基酸取代」係指蛋白質中具有類似側鏈之胺基酸殘基的可互換性。舉例而言，具有脂族側鏈之胺基酸群組由甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸組成；具有脂族-羥基側鏈之胺基酸群組由絲胺酸及蘇胺酸組成；具有含醯胺側鏈之胺基酸群組由天冬醯胺酸及麩醯胺酸組成；具有芳族側鏈之胺基酸群組由苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸組成；具有鹼性側鏈之胺基酸群組由離胺酸、精胺酸及組胺酸組成；具有酸性側鏈之胺基酸群組由麩胺酸及天冬胺酸組成；且具有含硫側鏈之胺基酸群組由半胱胺酸及甲硫胺酸組成。例示性保守胺基酸取代群組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸-甘胺酸及天冬醯胺酸-麩醯胺酸。
如本文中所使用之術語「免疫學突觸」或「免疫突觸」一般係指適應性免疫反應之兩個相互作用之免疫細胞之間的天然界面，包括例如APC或靶T細胞與效應細胞(例如，淋巴細胞、效應T細胞、天然殺手細胞或其類似細胞)之間的界面。APC與T細胞之間的免疫學突觸一般由T細胞抗原受體與一或多個MHC分子之相互作用引發，例如，如Bromley等人，Ann Rev Immunol. 2001; 19:375-96中所描述，該文獻之揭示內容係以引用之方式整體併入本文中。
「T細胞」包括表現CD3之免疫細胞之所有類型，包括T輔助細胞(CD4+ 細胞)、細胞毒性T細胞(CD8+ 細胞)、T調控細胞(Treg)及NK-T細胞。
除非另外陳述，否則如本文中所使用，術語「第一主要組織相容性複合體(MHC)多肽」或「第一MHC多肽」以及術語「第二MHC多肽」、「MHC重鏈」及「MHC-H」係指I類MHC受體元件。
如本文中所使用之術語「MOD」(亦稱為共免疫調節或共刺激多肽)包括APC (例如樹突狀細胞、B細胞及其類似物)上之多肽或APC上之多肽之一部分，該多肽特異性地結合T細胞上之「Co-MOD」(亦稱為同源共免疫調節多肽或同源共刺激多肽)，從而提供連同由例如TCR/CD3複合體與肽所負載之MHC多肽結合所提供之第一信號一起介導T細胞反應之信號，包括但不限於增殖、活化、分化及其類似物。MOD包括但不限於CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、Fas配位體(FasL)、誘導性共刺激配位體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴細胞毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結合Toll配位體受體之促效劑或抗體及特異性地與B7-H3結合之配位體。MOD亦尤其涵蓋特異性地與T細胞上存在之Co MOD (諸如但不限於CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、LIGHT、NKG2C、B7-H3及特異性地結合至CD83之配位體)結合之抗體(或其抗原結合部分，諸如Fab)。
T細胞-MMP之「免疫調節結構域」(「MOD」)為T細胞-MMP之充當MOD之多肽。
如本文中所使用之「異源」分別意謂並非在天然核酸或蛋白質中發現之核苷酸或多肽。
如本文中所使用之「重組」意謂特定核酸(DNA或RNA)為對獲得與天然系統中發現之內源核酸不同的具有結構性編碼或非編碼序列之構築體的選殖、限制、聚合酶鏈反應(PCR)及/或連接步驟進行各種組合的產物。可由cDNA片段或由一系列合成寡核苷酸來組裝編碼多肽之DNA序列，以提供能夠由細胞或無細胞轉錄及轉譯系統中所含有之重組轉錄單元加以表現之合成核酸。
術語「重組表現載體」及「DNA構築體」在本文中可互換用於指包含載體及至少一個插入物之DNA分子。通常出於表現及/或增殖插入物之目的或為了構築其他重組核苷酸序列而產生重組表現載體。插入物可能或可能未可操作地連接至啟動子序列，且可能或可能未可操作地連接至DNA調控序列。
如本文中所使用，術語「親和力」係指兩種試劑(例如，抗體及抗原)之可逆結合的平衡常數且表示為解離常數(KD )。親和力可比抗體對無關胺基酸序列之親和力高出至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1,000倍或更多倍。抗體對靶蛋白質之親和力可為例如約100奈莫耳(nM)至約0.1 nM、約100 nM至約1皮莫耳(pM)或約100 nM至約1飛莫耳(fM)或更高。如本文中所使用，術語「親合力」係指兩種或更多種劑之複合體在稀釋之後對解離之抗性。就抗體及/或抗原結合片段而言，術語「免疫反應性」及「優先結合」在本文中可互換使用。
如本文中所使用之「結合」(例如，參考諸如包含一或多個MOD之T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之分子與一或多個多肽(例如，T細胞上之T細胞受體及同源共免疫調節多肽(Co-MOD)之結合)係指分子之間的非共價相互作用。非共價結合係指兩個分子之間由於例如靜電相互作用、疏水性相互作用、離子相互作用及/或氫鍵相互作用，包括諸如鹽橋及水橋之相互作用而直接締合。非共價結合相互作用一般以小於10-6 M、小於10-7 M、小於10-8 M、小於10-9 M、小於10-10 M、小於10-11 M或小於10-12 M之解離常數(KD )為特徵。「親和力」係指非共價結合之強度，增加之結合親和力與較低之KD 相關。「特異性結合」一般係指例如配位體分子與其結合位點或「受體」之間以至少約10-7 M或更大(例如低於5×10-7 M、低於10-8 M、低於5×10-8 M、低於10-9 M、低於10-10 M、低於10-11 M或低於10-12 M及更大之親和力，或者處於10-7 至10-9 或10-9 至10-12 之範圍內)之親和力結合。「非特異性結合」一般係指配位體與除其指定結合位點或「受體」以外之某物典型地以低於約10-7 M之親和力結合(例如，以低於約10-6 M、低於約10-5 M、低於約10-4 M之親和力結合)。然而，在一些情況下，例如，TCR與肽/MHC複合體之間的結合，「特異性結合」可處於1 μM至100 μM或100 μM至1 mM之範圍內。如本文中所使用之「共價結合」意謂兩個不同的分子之間形成一或多個共價化學鍵。
術語「處理」及其類似術語在本文中一般用於意謂獲得所要藥理學及/或生理學效應。該效應就完全或部分預防疾病或其症狀而言可為預防性的，及/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不利效應而言可為治療性的。如本文中所使用之「處理」涵蓋對哺乳動物之疾病或症狀之任何處理，且包括：(a)預防可能易患該疾病或症狀但尚未診斷為患有該疾病或症狀之個體出現該疾病或症狀；(b)抑制該疾病或症狀，亦即，阻遏其發展；及/或(c)減輕該疾病，亦即，使該疾病消退。治療劑可在疾病或損傷發作之前、期間及/或之後投與。尤其關注持續性疾病之處理，其中該處理穩定或減輕患者之不良臨床症狀。理想地，在受影響之組織的功能完全喪失之前進行此種處理。理想地，將在疾病之有症狀階段期間且在一些情況下在疾病之有症狀階段之後投與標的療法。
術語「個人」、「個體」、「宿主」及「患者」在本文中可互換使用，並且係指需要診斷、處理或治療的任何哺乳動物個體。哺乳動物包括例如人類、非人類靈長類動物、囓齒動物(例如大鼠；小鼠)、兔類動物(例如兔)、有蹄類動物(例如牛、綿羊、豬、馬、山羊及其類似動物)等。
在進一步描述本發明之前，應理解本發明不限於所描述之特定實施例，因而固然可變化。亦應理解，本文中所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，而不意欲具有限制性，此係因為本發明之範疇將僅受所附申請專利範圍限制。
在提供值之範圍時，應理解，除非上下文另外清楚指出，否則該範圍包括介於該範圍之上限與下限之間的各居中值(達至下限之十分之一)，且該所陳述範圍中之任何其他所陳述值或居中值均涵蓋在本發明內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於該等較小範圍內，且亦涵蓋在本發明內，受所陳述之範圍內的任何明確排除之界限限制。在範圍包括上限及下限時，排除彼等界限中之任一者或兩者的範圍亦包括在本發明中。
除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之熟習此項技術者通常所理解之含義相同的含義。儘管與本文中所描述者類似或等效之任何方法及材料亦可用於實踐或檢驗本發明，但現描述較佳方法及材料。本文中所提及之所有出版物均以引用之方式併入本文中，以便結合所引用之出版物來揭示並描述該等方法及/或材料。
必須指出，除非上下文另外清楚地指出，否則如本文中及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」及「該」包括複數參考物。因而，舉例而言，提及「多聚體T細胞調節多肽」包括複數個此類多肽，且提及「該免疫調節多肽」或「該MOD」包括提及熟習此項技術者已知的一或多個免疫調節多肽及其等效物，以此類推。此外應指出，可撰寫申請專利範圍以排除任何可選要素。因而，此陳述意欲充當結合申請專利範圍要素之敍述來使用諸如「僅僅」、「僅」及其類似術語之排他性術語或使用「負」限制的前提基礎。
應瞭解，獨立的實施例之內容中出於清楚性之目的而描述的某些本發明特徵亦可組合提供於單一實施例中。相反，單個實施例之內容中出於簡便性之目的而描述的各種本發明特徵亦可單獨或以任何適合之子組合形式提供。關於本發明之實施例之所有組合均明確由本發明涵蓋且揭示於本文中，就如同逐一地且明確地揭示各個及每個組合。另外，其各種實施例及要素之所有子組合亦明確由本發明涵蓋且揭示於本文中，就如同在本文中逐一地且明確地揭示各個及每個此種子組合。
本文中所論述之出版物僅由於其在本申請案之申請日期之前揭示而得以提供。在本文中不應被視為承認本發明由於先前發明而無權先於此種出版物。此外，所提供之公開日期可能與實際公開日期不同，由此可能需要獨立地加以證實。
I. 具有供抗原決定基結合用之化學結合位點的T細胞調節多聚體多肽(T細胞-MMP)
本發明提供可用於調節T細胞之活性的T細胞-MMP及其抗原決定基結合物，以及其製備方法及在調節個體之免疫反應方面的用途。T細胞-MMP可包含對其Co-MOD展現降低之結合親和力的一或多個獨立選擇之野生型及/或變異MOD多肽以及用於偶聯抗原決定基及有效負載之化學結合位點。本發明中包括包含兩種類型多肽(第一多肽及第二多肽)之異源二聚體T細胞-MMP，其中彼等多肽中之至少一者包含用於附接(例如，共價附接)諸如化學治療劑及/或可結合TCR之物質(例如，抗原決定基肽及無效力肽)之有效負載的化學結合位點。本發明中亦包括已與抗原決定基及/或有效負載(例如，化學治療劑)化學結合之T細胞-MMP。視T細胞-MMP中所存在之MOD之類型而定，當T細胞-MMP上存在TCR特異性抗原決定基時，T細胞可藉由進行活化來作出反應，包括例如純系擴增(例如，當諸如IL-2、4-1BBL及/或CD80之活化MOD併入T細胞-MMP中時)。替代地，當諸如CD86及/或PD-L1之MOD併入T細胞-MMP中時，T細胞可進行下調T細胞活性(例如阻斷自體免疫反應)之抑制。因為MOD對任何抗原決定基均不具特異性，故可藉由將對其Co-MOD具有降低之親和力的變異MOD併入T細胞-MMP中以使T細胞-MMP與T細胞之結合受MHC-抗原決定基-TCR相互作用強烈影響或甚至受其控制而使T細胞之活化或抑制偏向抗原決定基特異性相互作用。
在本文中所描述之實施例中，T細胞-MMP-抗原決定基結合物充當替代APC，且模擬適應性免疫反應。T細胞-MMP-抗原決定基結合物藉由嚙合T細胞表面上存在之TCR與T細胞-MMP-抗原決定基結合物複合體中呈現之共價結合之抗原決定基而達成此舉。此嚙合提供能夠達成抗原決定基特異性細胞靶向之T細胞-MMP-抗原決定基結合物。在本文中所描述之實施例中，T細胞-MMP-抗原決定基結合物亦具有至少一個嚙合T細胞上之對應共刺激蛋白(Co-MOD)的MOD。兩個信號，亦即抗原決定基/MHC與TCR結合及MOD與Co-MOD結合，隨後驅動所要T細胞特異性及抑制或活化/增殖。
具有化學結合位點之T細胞-MMP得以用作可插入不同的抗原決定基及/或有效負載以製備供用於治療應用、診斷應用及研究應用之物質的平台。此類包含化學結合位點之T細胞-MMP允許快速製備診斷劑及治療劑，因為其允許含抗原決定基之物質(例如肽)快速插入T細胞-MMP中且測試攜帶對該抗原決定基具有特異性之TCR的T細胞的活化或抑制。
在一實施例中，可利用此類T細胞-MMP之化學結合位點將諸如化學治療劑或酶之有效負載附接至T細胞-MMP。在不存在添加之抗原決定基時，所得複合體可以類似於抗體之方式用於遞送有效負載，尤其當T細胞-MMP由於併入Fc支架而形成多聚體(例如二聚體或更高級結構)時。由於缺乏抗原決定基，T細胞-MMP-有效負載結合物之MOD將藉由其結合特異性及該複合體對不同細胞之親合力來指定將會接受有效負載之細胞。
在T細胞-MMP中併入刺激T細胞增殖之變異MOD及抗原決定基的實施例中，T細胞與至少一種濃度之T細胞-MMP接觸在具有對該抗原決定基具特異性之TCR的T細胞的活化方面與同相同濃度之不具有對該抗原決定基具特異性之TCR的T細胞-MMP接觸的T細胞相比誘導至少兩倍(例如至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、75倍或100倍)差異(如藉由T細胞增殖或ZAP-70活性所量測，參見例如Wang等人，Cold Spring Harbor perspectives in biology 2.5 (2010): a002279 )。
在T細胞-MMP中併入抑制T細胞活化之變異MOD及抗原決定基的實施例中，T細胞與至少一種濃度之T細胞-MMP接觸防止T細胞以抗原決定基特異性方式活化(如藉由T細胞增殖所量測)。
已併入抗原決定基之T細胞-MMP之特異性將視該抗原決定基及MOD對結合之相對貢獻而定。在MOD控制結合相互作用時，對該抗原決定基具特異性之T細胞之T細胞-MMP的特異性相對於T細胞-MMP複合體將有所降低，其中該抗原決定基藉由比MOD對總體結合能貢獻更多來控制結合相互作用。抗原決定基對抗原決定基特異性TCR貢獻愈大，T細胞-MMP對該T細胞類型之特異性將愈大。在抗原決定基對其TCR具有強親和力時，使用對其Co-MOD具有降低之親和力的變異MOD將有利於T細胞-MMP-抗原決定基結合物之抗原決定基選擇性相互作用，且亦有助於選擇性地遞送可與T細胞-MMP-抗原決定基結合物結合之任何有效負載。
除可用作併入抗原決定基及製備抗原決定基特異性T細胞-MMP之結構以外，描述為缺乏抗原決定基或含有無效肽之T細胞-MMP亦可用於向攜帶T細胞-MMP中所存在之MOD及/或變異MOD之受體的靶細胞遞送有效負載。
在一實施例中，缺乏抗原決定基(或含有無效肽)之攜帶對T細胞活化及/或增殖具抑制性之MOD的T細胞-MMP可用作含有T細胞-MMP中存在之MOD或變異MOD之一或多個受體的T細胞模擬劑。此類刺激性T細胞-MMP可用於同時向與其結合之T細胞遞送有效負載(例如化學結合之化學治療劑)。
在一實施例中，缺乏抗原決定基(或含有無效肽)之攜帶對T細胞活化及/或增殖具抑制性之MOD的T細胞-MMP可單獨或與諸如環孢黴素之其他免疫抑制劑聯合用作免疫抑制劑以抑制免疫反應(例如預防移植物對抗宿主或宿主對抗移植物排斥反應)。此類抑制性T細胞-MMP可用於同時向與其結合之T細胞遞送有效負載(例如化學結合之化學治療劑)。
本發明提供可用於調節T細胞之活性且因此用於調節個體之免疫反應的T細胞-MMP。T細胞-MMP包含對Co-MOD展現降低之結合親和力的MOD。
I.A. T 細胞 -MMP
本文中所描述之T細胞-MMP構架在第一多肽鏈或第二多肽鏈上包含至少一個化學結合位點。
在一實施例中，本發明提供包含異源二聚體之T細胞-MMP，其包含：a)第一多肽，該第一多肽包含第一MHC多肽；b)第二多肽，該第二多肽包含第二MHC多肽；c)第一多肽或第二多肽中之至少一者包含化學結合位點；及d)至少一個MOD，其中該第一多肽及/或該第二多肽包含至少一個MOD (例如一個、兩個、三個或更多個)。視情況，該第一多肽或該第二多肽包含Ig Fc多肽或非Ig支架。獨立選擇之MOD中之一或多個可為對Co-MOD展現與相應野生型MOD對Co-MOD之親和力相比有所降低之親和力的變異MOD。本發明亦提供T細胞-MMP，其中抗原決定基(例如攜帶抗原決定基之肽)共價結合(直接地或間接地)至化學結合位點從而形成T細胞-MMP-抗原決定基結合物。在此類實施例中，本發明之T細胞-MMP抗原決定基結合物中存在之抗原決定基(例如抗原決定基肽)可以至少100 μM (例如至少10 μM、至少1 μM、至少100 nM、至少10 nM或至少1 nM)之親和力結合至T細胞上之T細胞受體(TCR)。T細胞-MMP抗原決定基結合物可以比T細胞-MMP抗原決定基結合物結合第二T細胞之親和力高出至少25%的親和力結合至第一T細胞，其中第一T細胞在其表面上表現Co-MOD及以至少100 μM之親和力結合抗原決定基之TCR，且其中第二T細胞在其表面上表現Co-MOD但不在其表面上表現以至少100 μM (例如，至少10 μM、至少1 μM、至少100 nM、至少10 nM或至少1 nM)之親和力結合抗原決定基之TCR。
在一實施例中，本發明提供異源二聚T細胞-MMP (其可形成異源二聚體之更高級多聚體、二聚體、三聚體等)，其包含：
a) 第一多肽，該第一多肽包含i)第一MHC多肽；
b) 第二多肽，該第二多肽自N末端至C末端依序包含：i)第二MHC多肽及ii)可選免疫球蛋白(Ig) Fc多肽支架或非Ig多肽支架；
c) 一或多個附接於該第一多肽或處於其內部之第一多肽化學結合位點及/或一或多個附接於該第二多肽或處於其內部之第二多肽化學結合位點；及
d) 一或多個免疫調節多肽(MOD)，其中該一或多個MOD中之至少一個係
A) 處於該第一多肽之C末端(參見例如圖5或圖6中之A)；
B) 處於該第二多肽之N末端(參見例如圖5或圖6中之B)；
C) 處於該第二多肽之C末端(參見例如圖5或圖6中之C)；或
D) 處於該第一多肽之C末端及處於該第二多肽之N末端(參見例如圖5或圖6中之D)；
其中該一或多個MOD中之每一個為獨立選擇之野生型或變異MOD。
此類T細胞-MMP構架充當抗原決定基(例如多肽抗原決定基)可經由鍵聯共價附接至與第一MHC多肽及第二MHC多肽中之至少一者結合的第一化學結合位點或第二化學結合位點之一從而形成T細胞-MMP-抗原決定基結合物的平台。由此允許將不同的抗原決定基輕易引入該構架中以便在T細胞-MMP之情況下呈現至T細胞上之T細胞受體(TCR)。有效負載(例如化學治療劑)可藉由共價附接至第一化學結合位點或第二化學結合位點之一(例如，未用於附接抗原決定基之位點)而類似地附接至T細胞-MMP。
在採用可多聚之免疫球蛋白(Ig) Fc多肽或非Ig多肽支架時，T細胞-MMP可多聚。複合體可呈二聚體(參見例如圖7)、三聚體、四聚體或五聚體之形式。包含T細胞-MMP多聚體之組合物亦可包含單體，且因此可包含單體、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或其任何組合(例如單體與二聚體之混合物)。
在一實施例中，MOD為視情況包含抗原決定基之T細胞-MMP中所呈現之獨立選擇之野生型MOD或變異MOD。在一實施例中，MOD為能夠刺激抗原決定基特異性T細胞活化/增殖之一或多個MOD或變異MOD (例如IL-2、4-1BBL及/或CD80)。在另一實施例中，MOD為能夠抑制T細胞活化/增殖之一或多個MOD或變異MOD (例如FAS-L 及 /或PD-L1)。當與攜帶適合之抗原決定基的T細胞-MMP結合使用時，此類活化或抑制性MOD能夠進行抗原決定基特異性T細胞作用，尤其在該等MOD為變異MOD且MHC-抗原決定基-TCR相互作用之強足以控制T細胞-MMP與T細胞之相互作用時。
I.A.1 T 細胞 -MMP 中之第一化學結合位點及第二化學結合位點之位置
在進行併入抗原決定基(例如含抗原決定基之肽)及/或有效負載之化學結合反應之前，本文中所描述之T細胞-MMP包含至少一個化學結合位點。在T細胞-MMP包含多於一個化學結合位點時，可能存在處於第一多肽上之兩個或更多個結合位點(第一多肽化學結合位點)、處於第二多肽上之兩個或更多個結合位點(第二多肽化學結合位點)，或至少一個第一多肽化學結合位點及至少一個第二多肽化學結合位點。在T細胞-MMP分子中存在多於一個化學結合位點之各情況下，該等位點係獨立地選擇且可採用相同或不同的化學性質、胺基酸序列或用於結合之化學基團。第一多肽化學結合位點(指示為CC-1)及第二多肽化學結合位點(指示為CC-1)之位置的一些實例示於圖5至圖7中。
在諸多實施例中，T細胞-MMP之第一多肽包含：在其N末端及C末端上無連接子之第一MHC多肽；在其N末端上攜帶連接子之第一MHC多肽；在其C末端上攜帶連接子之第一MHC多肽；或在其N末端及C末端上攜帶連接子之第一MHC多肽。該一或多個第一多肽化學結合位點中之至少一個：a)當第一MHC多肽在其N末端及C末端上無連接子時附接於該第一MHC多肽序列(例如處於N末端或C末端)或處於其內部；b)在第一MHC多肽在其N末端及C末端上包含連接子時附接於該第一MHC多肽序列或處於其內部；c)附接於該第一MHC多肽N末端上之連接子序列或處於其內部；及/或d)附接於該第一MHC多肽C末端上之連接子序列或處於其內部。T細胞-MMP之額外第一多肽化學結合位點可存在於(附接於或處於內部)第一多肽(例如，充當化學結合位點之多於一個酶修飾序列)，包括第一MHC多肽上之任何位置或處於與其附接之任何連接子中。在此類實施例中，第一MHC多肽可包含如以下所描述之β2M多肽序列。
在諸多實施例中，T細胞-MMP之第二多肽包含：在其N末端及C末端上無連接子之第二MHC多肽；在其N末端上攜帶連接子之第二MHC多肽；在其C末端上攜帶連接子之第二MHC多肽；或在其N末端及C末端上攜帶連接子之第二MHC多肽。該一或多個第二多肽化學結合位點中之至少一個：a)當第二MHC多肽在其N末端及C末端上無連接子時附接於該第二MHC多肽序列(例如處於N末端或C末端)或處於其內部；b)在第二MHC多肽在其N末端及C末端上包含連接子時附接於該第二MHC多肽序列或處於其內部；c)附接於該第二MHC多肽N末端上之連接子序列或處於其內部；及/或d)附接於該第二MHC多肽C末端上之連接子序列或處於其內部。另外，當第二多肽含有免疫球蛋白(Fc)多肽胺基酸序列或非Ig多肽支架以及與其附接之額外連接子時，該第二多肽化學結合位點可附接於該第二MHC多肽、該免疫球蛋白多肽、該多肽支架或所附接之連接子或者處於其內部。T細胞-MMP之額外第二多肽化學結合位點可存在於(附接於或處於內部)第二多肽(例如，充當化學結合位點之多於一個酶修飾序列)，包括第二MHC多肽上之任何位置或處於與其附接之任何連接子中。在此類實施例中，第二MHC多肽可包含如以下所描述之MHC重鏈(MHC-H)多肽序列。
在一實施例中，第一MHC多肽及第二MHC多肽可選擇為I類MHC多肽，其中該第一MHC多肽包含β2M多肽序列且該第二多肽包含MHC重鏈序列，其中該第一多肽或第二多肽上存在至少一個化學結合位點。在一實施例中，T細胞-MMP中之一或多個第一化學結合位點中之至少一個可附接於β2M多肽抑或與其N末端或C末端附接之連接子(包括處於N末端或C末端)或者處於其內部。在一實施例中，T細胞-MMP中之一或多個第二多肽化學結合位點中之至少一個可附接於以下各物(包括處於N末端或C末端)或處於其內部：MHC-H多肽；與該MHC-H多肽之N末端或C末端附接之連接子；或當存在時附接於免疫球蛋白(Fc)多肽(或非Ig多肽支架)或與其附接之連接子或者處於其內部。在此類I類MHC多肽構築體之另一實施例中，第一多肽及第二多肽二者皆包含至少一個化學結合位點。
在T細胞-MMP包含β2M多肽序列時，該序列可與圖4中所示之胺基酸序列之一具有至少85%胺基酸序列一致性(例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%一致性)。該β2M多肽可包含與圖4中所示之胺基酸序列之一部分具有一致性的具有至少20、30、40、50、80、100或110個連續胺基酸之胺基酸序列。化學結合序列可附接於該β2M多肽(例如處於N末端及/或C末端或與其附接之連接子處)或處於該β2M多肽內。
在T細胞-MMP包含MHC-H多肽時，其可為HLA-A、HLA-B或HLA-C重鏈。在一實施例中，該MHC-H多肽可包含與圖3A至圖3D之一中所示之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列一致性(例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%一致性)的胺基酸序列。I類MHC重鏈多肽可包含與圖3A至圖3D中所示之胺基酸序列之一部分具有一致性的具有至少20、30、40、50、80、100、150、200、250、300或330個連續胺基酸之胺基酸序列。化學結合序列可附接於MHC-H多肽(例如處於N末端及/或C末端或與其附接之連接子處)或處於其內部。
T細胞-MMP之第二多肽可包含Ig Fc多肽序列，該多肽序列可充當提供結構且能夠與T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物)多聚且另外提供潛在化學結合位置之分子支架的一部分。在一些實施例中，該Ig Fc多肽為IgG1 Fc多肽、IgG2 Fc多肽、IgG3 Fc多肽、IgG4 Fc多肽、IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。在此類實施例中，該Ig Fc多肽可包含與圖2A至圖2D之一中所描繪之胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、98%或99%或甚至100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。Ig Fc多肽可包含與圖2中之胺基酸序列之一部分具有一致性的具有至少20、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200或220個連續胺基酸之序列。在第二多肽包含IgG1 Fc多肽之實施例中，該多肽亦可包含一或多個選自N297A、L234A、L235A、L234F、L235E及P331S之胺基酸取代。在一個此類實施例中，該IgG1 Fc多肽包含單獨或與第二多肽化學結合位點組合之L234A及L235A取代。化學結合位點可位於/附接於N末端及/或C末端或與其附接之連接子或處於Ig Fc多肽內。
I.A.2 T 細胞 -MMP 之化學結合位點
T細胞-MMP之第一多肽化學結合位點及第二多肽化學結合位點可為可在用試劑及/或催化劑(諸如允許與該等T細胞-MMP多肽中之一者抑或兩者形成共價鍵聯之酶)處理後經修飾之任何適合之位點。在一實施例中，T細胞-MMP之第一多肽或第二多肽中已引入僅一個化學結合位點。在另一實施例中，選擇各第一多肽化學結合位點及第二多肽化學結合位點，使得個別多肽上僅存在一種類型之結合位點(不同的結合位點)，從而允許不同的分子選擇性地結合至該等多肽中之每一者。在其他實施例中，諸如在T細胞-MMP中併入抗原決定基分子及一或多個有效負載分子兩者時，可將第一多肽化學結合及/或第二多肽化學結合之多於一個複本引入該T細胞-MMP中。舉例而言，T細胞-MMP可具有一個第一多肽化學結合位點(例如用於結合抗原決定基)及多個第二多肽化學結合位點(用於遞送有效負載分子)。
在諸多實施例中，第一化學結合位點及第二化學結合位點可獨立地選自：
a) 附接於第一多肽或第二多肽或者處於其內部之充當酶修飾序列之肽序列(例如硫酸酯酶、分選酶及/或轉麩醯胺酸酶序列)；
b) 附接於第一多肽或第二多肽或者處於其內部之非天然胺基酸及/或硒代半胱胺酸；
c) 經工程改造之胺基酸化學結合位點；
d) 附接於第一多肽或第二多肽之醣或寡醣部分；及
e) 附接於第一多肽或第二多肽或者處於其內部之IgG核苷酸結合位點。
I.A.2.1 硫酸酯酶基元
在選擇酶修飾作為提供化學結合位點之手段的彼等實施例中，該一或多個第一化學結合位點及第二化學結合位點中之至少一者可包含硫酸酯酶基元。硫酸酯酶基元之長度通常為5或6個胺基酸，且描述於例如美國專利第9,540,438號及美國專利公開案第2017/0166639 Al號中，諸案係以引用之方式併入。該基元之插入引起形成有時稱為醛標籤化或具有醛標籤之蛋白質或多肽。該基元可受甲醯基甘胺酸產生酶(「FGE」)作用而將該基元中之半胱胺酸或絲胺酸轉化成甲醯基甘胺酸殘基(「fGly」，但有時表示為「FGly」)，此為可用於選擇性(例如位點特異性)化學結合反應之含醛胺基酸。因此，如本文中所使用，「醛標籤」或「醛標籤化」多肽係指包含未轉化之硫酸酯酶基元的胺基酸序列，以及包含硫酸酯酶基元之胺基酸序列，其中該基元之半胱胺酸或絲胺酸殘基已藉由FGE之作用而轉化成fGly。另外，在胺基酸序列之情況下提供硫酸酯酶基元時，應理解為揭示含有未轉化之基元的胺基酸序列(例如多肽)以及其含fGly之對應物兩者。一旦併入多肽(例如T細胞-MMP之多肽)中，fGly殘基便可與包含多種反應基團(包括但不限於硫半卡肼、胺氧基、醯肼及肼基)之分子(例如抗原決定基肽)反應，以便經由該fGly殘基形成具有介於該肽與該分子之間的共價鍵的結合物(例如T細胞-MMP抗原決定基結合物)。
在諸多實施例中，硫酸酯酶基元之長度為至少5或6個胺基酸殘基，但可為例如5至16 (例如6-16、5-14、6-14、5-12、6-12、5-10、6-10、5-8或6-8)個胺基酸。硫酸酯酶基元可受限於少於16、14、12、10或8個胺基酸殘基之長度。
在一實施例中，硫酸酯酶基元含有式(I)中所示之序列：
X1Z1X2Z2X3Z3 (I) (SEQ ID NO:45)，其中
Z1為半胱胺酸或絲胺酸；
Z2為脯胺酸或丙胺酸殘基(其亦可由「P/A」表示)；
Z3為鹼性胺基酸(精胺酸、離胺酸或組胺酸，通常為離胺酸)或脂族胺基酸(丙胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸或脯胺酸，通常為A、G、L、V或I)；
X1存在或不存在，且當存在時可為任何胺基酸，但通常為脂族胺基酸、含硫胺基酸或極性不帶電胺基酸(例如，不為芳族胺基酸或帶電胺基酸)，通常為L、M、V、S或T，更通常為L、M、S或V，限制條件為當該硫酸酯酶基元處於靶多肽之N末端時，X1存在；且
X2及X3可獨立地為任何胺基酸，但通常為脂族胺基酸、極性不帶電胺基酸或含硫胺基酸(例如，不為芳族胺基酸或帶電胺基酸)，通常為S、T、A、V、G或C，更通常為S、T、A、V或G。
因此，在一個實施例中，可使用具有式I之硫酸酯酶基元來製備含FGly之多肽，其中：
Z1為半胱胺酸或絲胺酸；
Z2為脯胺酸或丙胺酸殘基；
Z3為脂族胺基酸或鹼性胺基酸；
X1存在或不存在，且當存在時為任何胺基酸，限制條件為當硫酸酯酶基元處於多肽之N末端時，X1存在；且
X2及X3各自獨立地為任何胺基酸，其中該序列處於Ig恆定區之溶劑可及環區域內或附近，且其中該序列並非處於Ig重鏈之C末端。
在醛標籤存在於除靶多肽N末端以外之位置時，硫酸酯酶基元之X1可由併入靶多肽之序列之胺基酸提供。因此，在一些實施例中，在該基元存在於除靶多肽N末端以外之位置時，該硫酸酯酶基元可具有下式：
(C/S)X2(P/A)X3Z3，式(II) (SEQ ID NO:46)，其中：X1不存在；X2、X3及Z3如以上所定義。
在製備含硫酸酯酶基元之肽以便藉由真核生物FGE，例如藉由在真核生物細胞或使用真核生物FGE之無細胞系統中對該肽進行表現及轉化而轉化成含fGly之肽時，可能適宜採用順應於由真核生物FGE轉化之硫酸酯酶基元。一般而言，順應於由真核生物FGE轉化之硫酸酯酶基元含有分別處於以上式(I) (例如X1CX2PX3Z3，SEQ ID NO:47)中及CX2PX3Z3 SEQ ID NO:48 (由以上式(II)涵蓋)中之Z1及Z2處的半胱胺酸及脯胺酸。可藉由「SUMF1型」FGE對攜帶彼等基元之肽進行修飾。
在FGE為真核生物FGE之實施例中，硫酸酯酶基元可包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：
X1CX2PX3R或CX2PX3R (SEQ ID NO:47及48，其中Z3為R，且X1存在或不存在)；
X1CX2PX3K或CX2PX3K (SEQ ID NO:47及48，其中Z3為K，且X1存在或不存在)；
X1CX2PX3H或CX2PX3H (SEQ ID NO:47及48，其中Z3為H，且X1存在或不存在)；
X1CX2PX3L或CX2PX3L (SEQ ID NO:47及48，其中Z3為L，且X1存在或不存在)；其中X1、X2及X3如以上所定義。
在一實施例中，硫酸酯酶基元包含以下序列：X1C(X2)P(X3)Z3 (參見SEQ ID NO:47)，其中：
X1存在或不存在，且當存在時為任何胺基酸，限制條件為當硫酸酯酶基元處於多肽N末端時，X1存在；且
X2及X3為獨立選擇之絲胺酸、蘇胺酸、丙胺酸或甘胺酸殘基。
順應於由原核生物FGE轉化之具有式(I)及式(II)之硫酸酯酶基元通常含有處於Z1處之半胱胺酸或絲胺酸及處於Z2處之脯胺酸，其分別可藉由「SUMP I型」FGE或「AtsB型」FGE加以修飾。易由原核生物FGE轉化之具有式(I)或式(II)之其他硫酸酯酶基元含有處於Z1處之半胱胺酸或絲胺酸及處於Z2處之脯胺酸或丙胺酸(其中每一者經獨立地選擇)，該序列之其餘胺基酸如針對式(I)及式(II)所描述；且易藉由例如來自產氣夾膜梭菌(Clostridium perfringens ) (半胱胺酸型酶)、克留氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae ) (絲胺酸型酶)之FGE或結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )之FGE進行修飾。
硫酸酯酶基元可併入T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物)之第一多肽或第二多肽上的任何所要位置。硫酸酯酶基元可用於不僅併入抗原決定基(例如抗原決定基呈現肽)，而且併入有效負載(例如，在與藥物及診斷分子形成結合物時)。在一實施例中，可在T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物)之第一多肽或第二多肽中之任何元件，包括第一MHC多肽及第二MHC多肽(例如MHC-H及β2M多肽)、支架或Ig Fc及接合彼等元件之連接子的末端處或附近添加硫酸酯酶基元。在諸多實施例中，硫酸酯酶基元可併入β2M I類MHC重鏈及/或Fc Ig多肽中。在一實施例中，硫酸酯酶基元可併入接近或處於第一MHC多肽(例如β2M多肽)之胺基末端處的第一多肽或與其附接之連接子中。在一實施例中，在第一多肽包含β2M多肽序列時，硫酸酯酶基元X1(C/S)X2PX3Z3 (SEQ ID NO:45，其中Z1為C或S且Z2為P)可併入在β2M序列之N末端處或附近，從而允許例如抗原決定基直接或經由連接子進行化學結合。舉例而言，如圖4中所示之β2-微球蛋白之成熟序列起始於20個胺基酸之前導序列，且該成熟多肽起始於起始序列IQ(R/K)TP(K/Q)IQVYS... (SEQ ID NO:151-155之胺基酸殘基21-31)且延續至β2M多肽之其餘部分。因此，連接至β2M之N末端區域中之胺基酸(存在或不存在連接子)的硫酸酯酶基元可顯示為例如：
或如人類β2M前導序列MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:151之胺基酸1-20)及可選連接子(例如連接子肽)所示
(SEQ ID NO:151之胺基酸1-20)-連接子-(SEQ ID NO:45或47)-(β2M序列)
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-X1Z1X2Z2X3Z3IQRTP (K/Q)IQVYS...；
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-X1Z1X2Z2X3Z3-連接子-IQRTP(K/Q)IQVYS...；
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-X1Z1X2Z2X3RTP (K/Q)IQVYS...；
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-X1CX2PX3IQRTP (K/Q)IQVYS...；
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-X1CX2PX3Z3-連接子-IQRTP(K/Q)IQVYS...；或
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-X1CX2PX3RTP (K/Q)IQVYS...；
其中該等連接子當存在時可包含獨立選擇之胺基酸序列(例如1至50個胺基酸，諸如聚甘胺酸、聚丙胺酸、聚絲胺酸及聚Gly，諸如AAAGG (SEQ ID NO:75)或(GGGGS)n ，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO:76))。所顯示之連接子可能存在或不存在，並且當顯示兩個時，其可能相同或不同。
在一實施例中，硫酸酯酶基元併入或附接於(例如經由肽連接子) T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物)之第一多肽或第二多肽中，該第一多肽或第二多肽具有與圖4中所示之序列具有至少85% (例如至少90%、95%、98%或99%，或甚至100%)胺基酸序列一致性之β2M多肽序列(例如，圖4中所示之全長序列中之任一者，或成熟β2M多肽中任一者之起始於胺基酸21且終止於其C末端之序列)。出於此實施例之目的，在不考慮所添加之硫酸酯酶基元及所存在之任何連接子序列的情況下確定β2M多肽相對於圖4中之β2M多肽之相應部分的序列一致性。
在一實施例中，硫酸酯酶基元併入或附接於(例如在N末端、C末端或N末端與C末端兩處經由一或多個獨立選擇之肽連接子)具有第一多肽或第二多肽之T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物)，該第一多肽或第二多肽具有與圖4中所示之序列相比具有1至15 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)個胺基酸缺失、插入及/或變化之β2M多肽序列(例如，圖4中所示之全長序列中之任一者，或成熟β2M多肽中任一者之起始於胺基酸21且終止於其C末端之序列)，其中在不考慮所添加之A2-5 或G2-5 基元及所存在之任何連接子序列的情況下評定胺基酸缺失、插入及/或變化。出於此實施例之目的，在硫酸酯酶基元之胺基酸及所存在之任何連接子序列的情況下確定β2M多肽中相對於圖4中之β2M多肽之相應部分的胺基酸缺失、插入及/或變化。在一個此類實施例中，硫酸酯酶基元(例如，具有以上所描述之式X1Z1X2Z2X3Z3、(C/S)X2(P/A) X3Z3、X1CX2PX3R或X1CX2PX3L)可置換及/或插入在成熟β2M序列(諸如圖4中所示之彼等)之胺基末端15個胺基酸中之任一者之間。
在另一實施例中，式(I) SEQ ID NO:45或式(II) SEQ ID NO:46之硫酸酯酶基元可併入或附接於(例如經由肽連接子) Ig Fc區作為第二多肽化學結合位點。在一實施例中，在添加硫酸酯酶基元序列之前將硫酸酯酶基元併入相對於圖2中所示之序列之相應部分具有至少85% (例如至少90%、95%、98%或99%，或甚至100%)胺基酸序列一致性的序列中。在一個此類實施例中，硫酸酯酶基元可用作直接或經由肽連接子或化學連接子間接地結合例如抗原決定基及/或有效負載之位點。
在另一實施例中，SEQ ID NO:45 (式(I))或SEQ ID NO:46 (式II)之硫酸酯酶基元可併入MHC-H多肽序列中作為化學結合位點。在一實施例中，在添加硫酸酯酶基元序列之前將硫酸酯酶基元併入相對於圖3中所示之序列之相應部分具有至少85% (例如，至少90%、95%、98%或99%，或甚至100%)胺基酸序列一致性的MHC-H序列。在一個此類實施例中，硫酸酯酶基元可用作直接或經由肽連接子或化學連接子間接地結合例如抗原決定基及/或有效負載之位點。
在另一實施例中，SEQ ID NO:45 (式(I))或SEQ ID NO:46 (式II)之硫酸酯酶基元之一或多個複本可併入IgFc區中作為一或多個第二多肽化學結合位點。在一個此類實施例中，其可用作直接或經由肽連接子或化學連接子間接地結合例如抗原決定基及/或有效負載之位點。
如以上所指示，醛標籤之硫酸酯酶基元之長度為至少5或6個胺基酸殘基，但可為例如5至16個胺基酸。該基元可在N末端及C末端之一或兩者處含有額外殘基，使得醛標籤包括硫酸酯酶基元及「輔助基元」兩者。在一實施例中，硫酸酯酶基元包括C末端輔助基元(亦即，在該基元之Z3位置後)，且可包括選自由以下組成之群的胺基酸序列之連續殘基中之1、2、3、4、5、6或所有7個：AALLTGR (SEQ ID NO:49)、SQLLTGR (SEQ ID NO:50)、AAFMTGR (SEQ ID NO:51)、AAFLTGR (SEQ ID NO:52)及GSLFTGR (SEQ ID NO:53)；已描述許多其他輔助基元。醛標籤之硫酸酯酶基元之FGE介導之轉化並不需要輔助基元胺基酸殘基，且因而其僅視情況存在且可自本文中所描述之醛標籤中明確排除。
美國專利第9,540,438號論述硫酸酯酶基元併入各種免疫球蛋白序列，包括Fc區多肽中，且其關於硫酸酯酶基元以及Fc多肽及其他多肽之修飾的教示內容係以引用之方式併入本文中。該專利因其關於FGE酶之指導及其在形成fGly殘基方面之用途以及與將諸如抗原決定基及有效負載之分子偶聯至fGly殘基相關之化學反應而亦以引用之方式併入。
硫酸酯酶基元之併入可藉由在編碼T細胞-MMP之第一多肽及/或第二多肽之核酸中的預定位置處併入編碼該基元之核酸序列來達成。如以下所論述，核酸序列可受轉錄調控序列(啟動子)控制且設有指導其表現之調控元件。所表現之蛋白質可在表現及部分或完全純化之後用一或多種FGE加以處理。替代地，在表現識別硫酸酯酶基元之FGE的細胞中表現核酸引起該基元之半胱胺酸或絲胺酸轉化成fGly，有時稱為側氧基丙胺酸。在存在兩個或更多個不同的硫酸酯酶基元(例如，第一硫酸酯酶基元及第二硫酸酯酶基元)時，亦可能在細胞表現期間對各基元或在細胞表現及部分或完全純化之後對各基元進行轉化。使用具有不同的基元選擇性的兩種或更多種FGE酶及由該等FGE中之每一種優先轉化之基元，亦可能相繼在細胞表現期間轉化至少一個硫酸酯酶基元及在部分或完全純化之後轉化至少一個硫酸酯酶基元，或者在表現之後將硫酸酯酶基元單獨轉化成fGly殘基。如以下所論述，單獨轉化不同的硫酸酯酶基元並且以順序方式將其化學偶聯至抗原決定基及/或有效負載之能力允許使用硫酸酯酶偶聯在不同基元之位置上併入不同的抗原決定基或有效負載。
宿主細胞在產生具有未轉化之硫酸酯酶基元的多肽時或在細胞表現適用於轉化含fGly之多肽序列的FGE時包括原核生物及真核生物之宿主細胞。非限制性實例包括大腸桿菌(Escherichia coli )菌株、芽胞桿菌屬(Bacillus spp. ) (例如枯草芽胞桿菌(B. subtilis )及其類似物)、酵母或真菌(例如釀酒酵母(S. cerevisiae )、畢赤酵母菌屬(Pichia spp. )及其類似物)。其他宿主細胞，包括來源於諸如昆蟲及脊椎動物、尤其是哺乳動物之高級生物體之宿主細胞的實例包括但不限於CHO細胞、HEK細胞及其類似物(例如，美國典型菌種保藏中心(ATCC)第CCL-2號)、CHO細胞(例如ATCC第CRL9618號及第CRL9096號)、CHO DG44細胞、CHO-Kl細胞(ATCC CCL-61)、293細胞(例如，ATCC第CRL-1573號)、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例如，ATCC第CRL-1658號)、Hnh-7細胞、BHK細胞(例如，ATCC第CCLlO號)、PC12細胞(ATCC第CRL1721號)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC第CRL1651號)、RAT1細胞、小鼠L細胞(ATCC第CCLI.3號)、人類胚胎腎(HEK)細胞(ATCC第CRL1573號)、HLHepG2細胞及其類似物。
可採用多種FGE將硫酸酯酶基元中之半胱胺酸或絲胺酸轉化(氧化)成fGly。如本文中所使用，術語甲醯基甘胺酸產生酶或FGE係指促進硫酸酯酶基元之半胱胺酸或絲胺酸轉化成fGly之fGly產生酶。如美國專利第9,540,438號中所論述，該文獻通常將術語甲醯基甘胺酸產生酶用於將該基元之半胱胺酸轉化成fGly之彼等酶，而將硫酸酯酶基元中之絲胺酸轉化成fGly之酶則稱為Ats-B樣蛋白。
FGE可分為兩個類別，好氧性及厭氧性。好氧性酶，包括真核生物酶(例如人類酶)，將半胱胺酸殘基轉化成fGly，其中半胱胺酸一般在式X1CX2PX3Z3 (SEQ ID NO:47)之硫酸酯酶基元之情況下。真核生物FGE屬於「SUMF1型」且在人類中係由SUMF1基因編碼。厭氧性酶屬於最通常來自原核生物來源(例如，產氣莢膜梭菌、克留氏肺炎桿菌或結核分枝桿菌)之AtsB型，且看似能夠使用與好氧形式不同之機制將其硫酸酯酶基元中之半胱胺酸或絲胺酸轉化成fGly。
促進絲胺酸或半胱胺酸轉化成fGly之能力視酶及硫酸酯酶基元而定。由於FGE轉化絲胺酸及半胱胺酸之能力存在差異，故有可能不同的硫酸酯酶基元可用作不同的化學結合位點。舉例而言，有可能向T細胞-MMP中併入編碼順應於由真核生物好氧性SUMF1型FGE轉化之含半胱胺酸之位點及順應於由AtsB型FGE轉化之含絲胺酸之位點兩者的序列。在表現SumF1型FGE之真核生物細胞中表現之後，半胱胺酸基元將攜帶可與抗原決定基或有效負載進行第一化學結合之fGly殘基。在第一化學結合後，將在無細胞系統中用AtsB型絲胺酸型酶處理T細胞-MMP結合物，且由含絲胺酸之基元產生之fGly隨後可與同第一化學結合中所使用之分子相同或不同的分子進行化學結合。
鑒於上述內容，本發明提供包含併入如以上所論述之第一多肽鏈或第二多肽鏈之序列中的一或多個fGly殘基的T細胞-MMP。舉例而言，fGly殘基可處於序列X1(fGly)X2Z2X3Z3之情況下，其中：fGly為甲醯基甘胺酸殘基；且Z2、Z3、X1、X2及X3如以上式(I)中所定義。
在化學結合之後，在序列X1(fGly')X2Z2X3Z3之情況下，T細胞-MMP包含併入第一多肽鏈或第二多肽鏈之序列中的一或多個fGly'殘基，其中該fGly'殘基為已進行化學反應且現具有共價附接部分(例如抗原決定基或有效負載)之甲醯基甘胺酸。
眾多化學反應及市售試劑可用於將分子(例如抗原決定基或有效負載)結合至fGly殘基，包括但不限於使用硫半卡肼、胺氧基、醯肼或肼基、欲偶聯於含fGly之化學結合位點處之分子的衍生物。舉例而言，抗原決定基(例如，抗原決定基肽)及/或攜帶硫半卡肼、胺氧基、醯肼、肼基或肼基官能基(例如，直接或經由諸如PEG之連接子附接至肽之胺基酸)之有效負載可與T細胞-MMP之含fGly之第一多肽或第二多肽反應以形成共價連接之抗原決定基。類似地，可使用例如生物素醯肼作為連接劑來併入有效負載，諸如藥物及治療劑。
在一實施例中，對肽(例如，含抗原決定基之肽)進行修飾以併入與併入T細胞-MMP之第一多肽及/或第二多肽中之fGly殘基反應的含親核試劑之部分(例如，胺氧基或醯肼部分)。該反應形成T細胞-MMP及肽(例如，抗原決定基或有效負載)共價連接(例如，藉由腙或肟鍵聯)之結合物。(參見例如美國專利第9,238,878號及第7,351,797號；Interchem,Aminooxy & Aldehyde PEO/PEG reagents for Biorthogonal Conjugation and Labeling Featuring Oxime Formation (已更新), 可在http://www.interchim.fr/ft/J/JV2290.pdf獲得(2017年9月2日可存取)。
在一實施例中，使抗原決定基(例如，肽抗原決定基)及/或攜帶硫半卡肼、胺氧基、醯肼或肼基之有效負載與T細胞-MMP之含fGly之第一多肽及/或第二多肽反應。該反應引起T細胞-MMP與抗原決定基及/或有效負載之間形成共價鍵。如美國專利第9,540,438號及美國專利公開案第2017/0166639 Al號中所論述，所得結合物可含有下式之結構(經修飾之胺基酸殘基)：
，
其中：
J1為共價結合之部分；
各L1為獨立地選自以下之二價部分：伸烷基、經取代之伸烷基、伸烯基、經取代之伸烯基、伸炔基、經取代之伸炔基、伸芳基、經取代之伸芳基、伸環烷基、經取代之伸環烷基、伸雜芳基、經取代之伸雜芳基、伸雜環基、經取代之伸雜環基、醯基、醯胺基、醯氧基、伸脲烷基、硫代酯、磺醯基、磺醯胺、磺醯基酯、-O-、-S-、-NH-及經取代之胺；且
n 為選自零至40之數目(例如1-5、5-10、10-20、20-30或30-40)。
在一實施例中，可對抗原決定基及/或有效負載進行修飾以包括共價結合之肼基，包括攜帶環狀取代基(例如吲哚)之肼基，從而允許其共價附接至攜帶fGly胺基酸殘基之T細胞-MMP。在一個實施例中，該肼基化合物為式(III)化合物：
(III)，
其中，出於式(III)之目的：
R'''可為將與含fGly之多肽結合之相關有效負載或抗原決定基；
R'及R''可各自獨立地為任何所要取代基，包括但不限於氫、烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、烷氧基、經取代之烷氧基、胺基、經取代之胺基、羧基、羧基酯、醯基、醯氧基、醯基胺基、胺基醯基、烷基醯胺、經取代之烷基醯胺、磺醯基、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、環烷基、經取代之環烷基、雜環基及經取代之雜環基；
Q10 、Q20 、Q30 及Q40 可為CR11 、NR12 、N、O或S；
其中Q10 、Q20 、Q30 及Q40 之一視情況存在，且R11 及R12 可為任何所要取代基(例如烷基)。參見美國專利公開案第2015/0352225號。
在其他實施例中，經修飾之抗原決定基及有效負載(例如，藥物及/或診斷劑)之肼基具有由式(IV)、式(V)、式(Va)、式(VI)或式(VIa)提供之結構。參見美國專利第9,310,374號，該專利因其關於肼基化合物之製備及在生物結合物(包括涉及肽及多肽之結合物)之形成中之用途的教示內容而以引用之方式併入。
其中，出於此部分中所敍述之式(IV)、式(V)、式(Va)、式(VI)或式(VIa)之目的：
Q2 及Q3 中之一者為-(CH2 ) n NR3 NHR2 ，且另一者為Y4 ；
n 為0或1；
R2 及R3 係各自獨立地選自氫、烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、烷氧基、經取代之烷氧基、胺基、經取代之胺基、羧基、羧基酯、醯基、醯氧基、醯基胺基、胺基醯基、烷基醯胺、經取代之烷基醯胺、磺醯基、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、環烷基、經取代之環烷基、雜環基及經取代之雜環基；
X1 、X2 、X3 及X4 係各自獨立地選自C、N、O及S；
Y1 、Y2 、Y3 及Y4 係各自獨立地選自氫、鹵素、烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、烷氧基、經取代之烷氧基、胺基、經取代之胺基、羧基、羧基酯、醯基、醯氧基、醯基胺基、胺基醯基、烷基醯胺、經取代之烷基醯胺、磺醯基、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、環烷基、經取代之環烷基、雜環基及經取代之雜環基；
L為可選連接子；且
W1 係選自抗原決定基(例如，抗原決定基多肽)、藥物、診斷劑或其他有效負載。
屬於彼等結構內之肼基吲哚與醛官能化肽之例示性反應示意性地示於圖8中。
在一實施例中，Q2 為-(CH2)n NR3 NHR2 且Q3 為Y4 。在一實施例中，Q3 為-(CH2)n NR3 NHR2 且Q2 為Y4 。在一實施例中，n為1。在一實施例中，R2 及R3 係各自獨立地選自烷基及經取代之烷基。在一些實施例中，R2 及R3 各自為甲基。在一實施例中，X1 、X2 、X3 及X4 各自為C。在一實施例中，Y1 、Y2 、Y3 及Y4 各自為H。
在一實施例中，L存在且包括選自以下之基團：烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、烷氧基、經取代之烷氧基、胺基、經取代之胺基、羧基、羧基酯、醯基胺基、烷基醯胺、經取代之烷基醯胺、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、環烷基、經取代之環烷基、雜環基及經取代之雜環基。在一些實施例中，L存在且包括聚合物。在一些實施例中，該聚合物為聚乙二醇。
出於式(IV)、式(V)、式(Va)、式(VI)或式(VIa)之目的：
1. 「烷基」係指具有1至10個碳原子且較佳1至6個碳原子之單價飽和脂族烴基。此術語包括例如直鏈及分支鏈烴基，諸如甲基(CH3 -)、乙基(CH3 CH2 -)、正丙基(CH3 CH2 CH2 -)、異丙基((CH3 )2 CH-)、正丁基(CH3 CH2 CH2 CH2 -)、異丁基((CH3 )2 CHCH2 -)、第二丁基((CH3 )(CH3 CH2 )CH-)、第三丁基((CH3 )3 C-)、正戊基(CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 -)及新戊基((CH3 )3 CCH2 -)。
2. 術語「經取代之烷基」係指如本文中所定義之烷基，其中烷基鏈中之一或多個碳原子已視情況經諸如-O-、-N-、-S-、-S(O)n - (其中n為0至2)或-NR- (其中R為氫或烷基)之雜原子置換且具有1至5個選自由以下組成之群的取代基：烷氧基、經取代之烷氧基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、醯基、醯基胺基、醯氧基、胺基、胺基醯基、胺基醯基氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、側氧基、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳基氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜環氧基、硫醇、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2 -烷基、-SO2 -芳基、-SO2 -雜芳基及-NRa Rb ，其中Ra 及Rb 可相同或不同且選自氫、視情況經取代之烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基及雜環。
3. 「伸烷基」係指較佳具有1至6個且更佳1至3個碳原子之二價脂族烴基，其為直鏈或分支鏈且其視情況間雜一或多個選自-O-、-NR10 -、-NR10 C(O)-、-C(O)NR10 -及其類似基團之基團。此術語包括例如亞甲基(-CH2 -)、伸乙基(-CH2 CH2 -)、伸正丙基(-CH2 CH2 CH2 -)、伸異丙基(-CH2 CH(CH3 )-)、(-C(CH3 )2 CH2 CH2 -)、(-C(CH3 )2 CH2 C(O)-)、(-C(CH3 )2 CH2 C(O)NH-)、(-CH(CH3 )CH2 -)及其類似基團。
4. R10 為H或烷基(例如，H、-CH3 、-CH2 CH3 或-CH2 CH2 CH3 )。
5. 「經取代之伸烷基」係指有1至3個氫經如針對以下「經取代」之定義中之碳所描述之取代基置換的伸烷基。
6. 術語「烷烴」係指如本文中所定義之烷基及伸烷基。
7. 術語「烷基胺基烷基」、「烷基胺基烯基」及「烷基胺基炔基」係指基團R'NHR''-，其中R'為如本文中所定義之烷基且R''為如本文中所定義之伸烷基、伸烯基或伸炔基。
8. 術語「烷芳基」或「芳烷基」係指基團-伸烷基-芳基及-經取代之伸烷基-芳基，其中伸烷基、經取代之伸烷基及芳基如本文中所定義。
9. 「烷氧基」係指基團-O-烷基，其中烷基如本文中所定義。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、第三丁氧基、第二丁氧基、正戊氧基及其類似基團。術語「烷氧基」亦係指基團烯基-O-、環烷基-O-、環烯基-O-及炔基-O-，其中烯基、環烷基、環烯基及炔基如本文中所定義。
10. 術語「經取代之烷氧基」係指基團經取代之烷基O-、經取代之烯基-O-、經取代之環烷基-O-、經取代之環烯基-O-及經取代之炔基-O-，其中經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之環烷基、經取代之環烯基及經取代之炔基如本文中所定義。
11. 術語「烷氧基胺基」係指基團-NH-烷氧基，其中烷氧基如本文中所定義。
12. 術語「鹵基烷氧基」係指基團烷基-O-，其中該烷基上之一或多個氫原子已經鹵基取代，且舉例而言，包括諸如三氟甲氧基及其類似基團之基團。
13. 術語「鹵烷基」係指如以上所描述之經取代之烷基，其中該烷基上之一或多個氫原子已經鹵基取代。此類基團之實例包括但不限於氟烷基，諸如三氟甲基、二氟甲基、三氟乙基及其類似基團。
14. 術語「烷基烷氧基」係指基團-伸烷基-O-烷基、伸烷基-O-經取代之烷基、經取代之伸烷基-O-烷基及經取代之伸烷基-O-經取代之烷基，其中烷基、經取代之烷基、伸烷基及經取代之伸烷基如本文中所定義。
15. 術語「烷基硫代烷氧基」係指基團-伸烷基-S-烷基、伸烷基-S-經取代之烷基、經取代之伸烷基-S-烷基及經取代之伸烷基-S-經取代之烷基，其中烷基、經取代之烷基、伸烷基及經取代之伸烷基如本文中所定義。
16. 「烯基」係指具有2至6個碳原子且較佳2至4個碳原子並且具有至少1個且較佳1至2個雙鍵不飽和位點之直鏈或分支鏈烴基。此術語包括例如聯乙烯基、烯丙基及丁-3-烯-1-基。此術語內包括順式及反式異構體或此等異構體之混合物。
17. 術語「經取代之烯基」係指具有1至5個取代基或1至3個取代基之如本文中所定義之烯基，該等取代基係選自烷氧基、經取代之烷氧基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、醯基、醯基胺基、醯氧基、胺基、經取代之胺基、胺基醯基、胺基醯氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、側氧基、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜環氧基、硫醇、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-經取代之烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2 -烷基、-SO2 -經取代之烷基、-SO2 -芳基及-SO2 -雜芳基。
18. 「炔基」係指具有2至6個碳原子且較佳2至3個碳原子並且具有至少1個且較佳1至2個三鍵不飽和位點之直鏈或分支鏈單價烴基。此類炔基之實例包括乙炔基(-C≡CH)及炔丙基(-CH2 C≡CH)。
19. 術語「經取代之炔基」係指具有1至5個取代基或1至3個取代基之如本文中所定義之炔基，該等取代基係選自烷氧基、經取代之烷氧基、環烷基、經取代之環烷基、環炔基、經取代之環炔基、醯基、醯基胺基、醯氧基、胺基、經取代之胺基、胺基醯基、胺基醯氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、側氧基、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜環氧基、硫醇、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-經取代之烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2 -烷基、-SO2 -經取代之烷基、-SO2 -芳基及-SO2 -雜芳基。
20. 「炔氧基」係指基團-O-炔基，其中炔基如本文中所定義。炔氧基包括例如乙炔氧基、丙炔氧基及其類似基團。
21. 「醯基」係指基團H-C(O)-、烷基-C(O)-、經取代之烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、經取代之烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、經取代之炔基-C(O)-、環烷基-C(O)-、經取代之環烷基-C(O)-、環烯基-C(O)-、經取代之環烯基-C(O)-、芳基-C(O)-、經取代之芳基-C(O)-、雜芳基-C(O)-、經取代之雜芳基-C(O)-、雜環基-C(O)-及經取代之雜環基-C(O)-，其中烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、雜環及經取代之雜環如本文中所定義。舉例而言，醯基包括「乙醯基」基團CH3 C(O)-。
22. 「醯基胺基」係指基團-NR20 C(O)烷基、-NR20 C(O)經取代之烷基、NR20 C(O)環烷基、-NR20 C(O)經取代之環烷基、-NR20 C(O)環烯基、-NR20 C(O)經取代之環烯基、-NR20 C(O)烯基、-NR20 C(O)經取代之烯基、-NR20 C(O)炔基、-NR20 C(O)經取代之炔基、-NR20 C(O)芳基、-NR20 C(O)經取代之芳基、-NR20 C(O)雜芳基、-NR20 C(O)經取代之雜芳基、-NR20 C(O)雜環及-NR20 C(O)經取代之雜環，其中R20 為氫或烷基且其中烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、雜環及經取代之雜環如本文中所定義。
23. 「胺基羰基」或術語「胺基醯基」係指基團-C(O)NR21 R22 ，其中R21 及R22 係獨立地選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、芳基、經取代之芳基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、雜芳基、經取代之雜芳基、雜環及經取代之雜環，且其中R21 及R22 視情況用與其結合之氮接合在一起而形成雜環基或經取代之雜環基，且其中烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、雜環及經取代之雜環如本文中所定義。
24. 「胺基羰基胺基」係指基團-NR21 C(O)NR22 R23 ，其中R21 、R22 及R23 係獨立地選自氫、烷基、芳基或環烷基，或其中兩個R基團接合以形成雜環基。
25. 術語「烷氧基羰基胺基」係指基團-NRC(O)OR，其中各R獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、芳基、雜芳基或雜環基，其中烷基、經取代之烷基、芳基、雜芳基及雜環基如本文中所定義。
26. 術語「醯氧基」係指基團烷基-C(O)O-、經取代之烷基-C(O)O-、環烷基-C(O)O-、經取代之環烷基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、雜芳基-C(O)O-及雜環基-C(O)O-，其中烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基、芳基、雜芳基及雜環基如本文中所定義。
27. 「胺基磺醯基」係指基團-SO2 NR21 R22 ，其中R21 及R22 係獨立地選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、芳基、經取代之芳基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、雜芳基、經取代之雜芳基、雜環及經取代之雜環，且其中R21 及R22 視情況用與其結合之氮接合在一起而形成雜環基或經取代之雜環基，且烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、雜環及經取代之雜環如本文中所定義。
28. 「磺醯基胺基」係指基團-NR21 SO2 R22 ，其中R21 及R22 係獨立地選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、芳基、經取代之芳基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、雜芳基、經取代之雜芳基、雜環及經取代之雜環，且其中R21 及R22 視情況用與其結合之原子接合在一起而形成雜環基或經取代之雜環基，且其中烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、雜環及經取代之雜環如本文中所定義。
29. 「芳基」或「Ar」係指具有單一環之具有6至18個碳原子之單價芳族碳環基團(諸如存在於苯基中時)或具有多個縮合環之環系統(此類芳族環系統之實例包括萘基、蒽基及茚烷基)，該等縮合環可能為或可能不為芳族的，限制條件為附接點係經由芳族環之原子。此術語包括例如苯基及萘基。除非另外受芳基取代基之定義約束，否則此類芳基可視情況經取代以形成具有1至5個取代基或1至3個取代基之「經取代之芳基」，該等取代基係選自醯氧基、羥基、硫醇、醯基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、經取代之烷基、經取代之烷氧基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、胺基、經取代之胺基、胺基醯基、醯基胺基、烷芳基、芳基、芳氧基、疊氮基、羧基、羧基烷基、氰基、鹵素、硝基、雜芳基、雜芳氧基、雜環基、雜環氧基、胺基醯氧基、氧基醯基胺基、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、-SO-烷基、-SO-經取代之烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2 -烷基、-SO2 -經取代之烷基、-SO2 -芳基、-SO2 -雜芳基及三鹵基甲基。
30. 「芳氧基」係指基團-O-芳基，其中芳基如本文中所定義，包括例如苯氧基、萘氧基及其類似基團，包括亦如本文中所定義之視情況經取代之芳基。
31. 「胺基」係指基團-NH2 。
32. 術語「經取代之胺基」係指基團-NRR，其中各R獨立地選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基、烯基、經取代之烯基、環烯基、經取代之環烯基、炔基、經取代之炔基、芳基、雜芳基及雜環基，其限制條件為至少一個R不為氫。
33. 術語「疊氮基」係指基團-N3 。
34. 「羧酸基」、「羧基」或「羧酸」係指-CO2 H或其鹽。
35. 「羧酸基酯」、「羧基酯」或者術語「羧基烷基」或「羧酸烷基」係指基團-C(O)O-烷基、-C(O)O-經取代之烷基、-C(O)O-烯基、-C(O)O-經取代之烯基、-C(O)O-炔基、-C(O)O-經取代之炔基、-C(O)O-芳基、-C(O)O-經取代之芳基、-C(O)O-環烷基、-C(O)O-經取代之環烷基、-C(O)O-環烯基、-C(O)O-經取代之環烯基、-C(O)O-雜芳基、-C(O)O-經取代之雜芳基、-C(O)O-雜環及-C(O)O-經取代之雜環，其中烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、雜環及經取代之雜環如本文中所定義。
36. 「(羧酸基酯)氧基」或「碳酸酯」係指基團-O-C(O)O-烷基、-O-C(O)O-經取代之烷基、-O-C(O)O-烯基、-O-C(O)O-經取代之烯基、-O-C(O)O-炔基、-O-C(O)O-經取代之炔基、-O-C(O)O-芳基、-O-C(O)O-經取代之芳基、-O-C(O)O-環烷基、-O-C(O)O-經取代之環烷基、-O-C(O)O-環烯基、-O-C(O)O-經取代之環烯基、-O-C(O)O-雜芳基、-O-C(O)O-經取代之雜芳基、-O-C(O)O-雜環及-O-C(O)O-經取代之雜環，其中烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、雜環及經取代之雜環如本文中所定義。
37. 「氰基」或「腈」係指基團-CN。
38. 「環烷基」係指具有單一環狀環或多個環狀環之3至10個碳原子之環狀烷基，包括稠合系統、橋連系統及螺旋系統。適合之環烷基之實例包括例如金剛烷基、環丙基、環丁基、環戊基、環辛基及其類似基團。此類環烷基包括例如諸如環丙基、環丁基、環戊基、環辛基及其類似基團之單環結構或諸如金剛烷基及其類似基團之多環結構。
39. 術語「經取代之環烷基」係指具有1至5個取代基或1至3個取代基之環烷基，該等取代基係選自烷基、經取代之烷基、烷氧基、經取代之烷氧基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、醯基、醯基胺基、醯氧基、胺基、經取代之胺基、胺基醯基、胺基醯氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、側氧基、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜環氧基、硫醇、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-經取代之烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2 -烷基、-SO2 -經取代之烷基、-SO2 -芳基及-SO2 -雜芳基。
40. 「環烯基」係指具有單一環或多個環並且具有至少一個雙鍵且較佳1至2個雙鍵之3至10個碳原子之非芳族環狀烷基。
41. 術語「經取代之環烯基」係指具有1至5個取代基或1至3個取代基之環烯基，該等取代基係選自烷氧基、經取代之烷氧基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、醯基、醯基胺基、醯氧基、胺基、經取代之胺基、胺基醯基、胺基醯氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、酮基、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜環氧基、硫醇、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-經取代之烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2 -烷基、-SO2 -經取代之烷基、-SO2 -芳基及-SO2 -雜芳基。
42. 「環炔基」係指具有單一環或多個環且具有至少一個三鍵之5至10個碳原子之非芳族環烷基。
43. 「環烷氧基」係指-O-環烷基。
44. 「環烯氧基」係指-O-環烯基。
45. 「鹵基」或「鹵素」係指氟基、氯基、溴基及碘基。
46. 「羥基」係指-OH基團。
47. 「雜芳基」係指在環內具有1至15個碳原子，諸如1至10個碳原子及1至10個選自由氧、氮及硫組成之群的雜原子的芳族基團。此類雜芳基可在環系統中具有單一環(諸如吡啶基、咪唑基或呋喃基)或多個縮合環(舉例而言，如在諸如吲哚嗪基、喹啉基、苯并呋喃、苯并咪唑基或苯并噻吩基之基團中)，其中該環系統內之至少一個環為芳族的，限制條件為附接點係經由芳族環之原子。在某些實施例中，雜芳基之氮及/或硫環原子視情況經氧化以提供N-氧化物(N-＞O)、亞磺醯基或磺醯基部分。此術語包括例如吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基及呋喃基。除非另外受雜芳基取代基之定義約束，否則此種雜芳基可視情況經取代而形成具有1至5個取代基或1至3個取代基之「經取代之雜芳基」，該等取代基係選自醯氧基、羥基、硫醇、醯基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、經取代之烷基、經取代之烷氧基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、胺基、經取代之胺基、胺基醯基、醯基胺基、烷芳基、芳基、芳氧基、疊氮基、羧基、羧基烷基、氰基、鹵素、硝基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環基、雜環氧基、胺基醯氧基、氧基醯基胺基、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、-SO-烷基、-SO-經取代之烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2 -烷基、-SO2 -經取代之烷基、-SO2 -芳基及-SO2 -雜芳基，以及三鹵基甲基。
48. 術語「雜芳烷基」係指基團-伸烷基-雜芳基，其中伸烷基及雜芳基如本文中所定義。此術語包括例如吡啶基甲基、吡啶基乙基、吲哚基甲基及其類似基團。
49. 「雜芳氧基」係指-O-雜芳基。
50. 「雜環」、「雜環狀」、「雜環烷基」及「雜環基」係指具有單個環或多個縮合環，包括稠合環系統、橋連環系統及螺旋環系統且具有3至20個環原子，包括1至10個雜原子之飽和或不飽和基團。此等環原子係選自由以下組成之群：氮、硫或氧，其中在稠合環系統中，該等環中之一或多個可為環烷基、芳基或雜芳基，限制條件為附接點係經由非芳族環。在某些實施例中，雜環狀基團之氮及/或硫原子視情況經氧化以提供N-氧化物、-S(O)-或-SO2 -部分。
51. 雜環及雜芳基之實例包括但不限於氮雜環丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吲哚嗪、異吲哚、吲哚、二氫吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、異噻唑、吩嗪、異噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑啶、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、酞醯亞胺、1,2,3,4-四氫異喹啉、4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑啶、噻吩、苯并[b]噻吩、嗎啉基、硫代嗎啉基(亦稱為噻嗎啉基)、1,1-二側氧基硫代嗎啉基、哌啶基、吡咯啶、四氫呋喃基及其類似基團。
52. 除非另外受雜環狀基團取代基之定義約束，否則此種雜環狀基團可視情況經1至5個取代基或1至3個取代基取代，該等取代基係選自烷氧基、經取代之烷氧基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、醯基、醯基胺基、醯氧基、胺基、經取代之胺基、胺基醯基、胺基醯氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、側氧基、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜環氧基、硫醇、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-經取代之烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2 -烷基、-SO2 -經取代之烷基、-SO2 -芳基、-SO2 -雜芳基及稠合之雜環。
53. 「雜環氧基」係指基團-O-雜環基。
54. 術語「雜環硫基」係指基團雜環-S-。
55. 術語「伸雜環基」係指由如本文中所定義之雜環形成之二價基團。
56. 術語「羥基胺基」係指基團-NHOH。
57. 「硝基」係指基團-NO2 。
58. 「側氧基」係指原子(=O)。
59. 「磺醯基」係指基團SO2 -烷基、SO2 -經取代之烷基、SO2 -烯基、SO2 -經取代之烯基、SO2 -環烷基、SO2 -經取代之環烷基、SO2 -環烯基、SO2 -經取代之環烯基、SO2 -芳基、SO2 -經取代之芳基、SO2 -雜芳基、SO2 -經取代之雜芳基、SO2 -雜環及SO2 -經取代之雜環，其中烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、雜環及經取代之雜環如本文中所定義。磺醯基包括例如甲基-SO2 -、苯基-SO2 -及4-甲基苯基-SO2 -。
60. 「磺醯氧基」係指基團-OSO2 -烷基、OSO2 -經取代之烷基、OSO2 -烯基、OSO2 -經取代之烯基、OSO2 -環烷基、OSO2 -經取代之環烷基、OSO2 -環烯基、OSO2 -經取代之環烯基、OSO2 -芳基、OSO2 -經取代之芳基、OSO2 -雜芳基、OSO2 -經取代之雜芳基、OSO2 -雜環及OSO2 -經取代之雜環，其中烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、雜環及經取代之雜環如本文中所定義。
61. 術語「胺基羰氧基」係指基團-OC(O)NRR，其中各R獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、芳基、雜芳基或雜環，其中烷基、經取代之烷基、芳基、雜芳基及雜環如本文中所定義。
62. 「硫醇」係指基團-SH。
63. 「硫代側氧基」或術語「硫酮基」係指原子(=S)。
64. 「烷硫基」或術語「硫代烷氧基」係指基團-S-烷基，其中烷基如本文中所定義。在某些實施例中，硫可氧化成-S(O)-。亞碸可呈一或多種立體異構體之形式存在。
65. 術語「經取代之硫代烷氧基」係指基團-S-經取代之烷基。
66. 術語「硫代芳氧基」係指基團芳基-S-，其中芳基如本文中所定義，包括亦如本文中所定義之視情況經取代之芳基。
67. 術語「硫代雜芳氧基」係指基團雜芳基-S-，其中雜芳基如本文中所定義，包括亦如本文中所定義之視情況經取代之芳基。
68. 術語「硫代雜環氧基」係指基團雜環基-S-，其中雜環基如本文中所定義，包括亦如本文中所定義之視情況經取代之雜環基。
69. 除本文中之揭示內容以外，術語「經取代」當用於修飾指定基團時亦可意謂指定基團之一或多個氫原子各自彼此獨立地經相同或不同的如以下所定義之取代基置換。
70. 除非另外規定，否則除關於本文中之個別術語所揭示之基團以外，用於取代指定基團中飽和碳原子上之一或多個氫(可用=O、=NR70 、=N-OR70 、=N2 或=S置換單一碳上之任兩個氫)的取代基為-R60 、鹵基、=O、-OR70 、-SR70 、-NR80 R80 、三鹵基甲基、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2 、=N2 、-N3 、-SO2 R70 、-SO2 O- M+ 、-SO2 R70 、-OSO2 R70 、-OSO2 O- M+ 、-OSO2 OR70 、-P(O)(O- )2 (M+ )2 、-P(O)(OR70 )O- M+ 、-P(O)(OR70 )2 、-C(O)R70 、-C(S)R70 、-C(NR70 )R70 、-C(O)O- M+ 、-C(O)OR70 、-C(S)OR70 、-C(O)NR80 R80 、-C(NR70 )NR80 R80 、-OC(O)R70 、-OC(S)R70 、-OC(O)O- M+ 、-OC(O)OR70 、-OC(S)OR70 、-NR70 C(O)R70 、-NR70 C(S)R70 、-NR70 CO2 - M+ 、-NR70 CO2 R70 、-NR70 C(S)OR70 、-NR70 C(O)NR80 R80 、-NR70 C(NR70 )R70 及-NR70 C(NR70 )NR80 R80 ，其中R60 係選自由以下組成之群：視情況經取代之烷基、環烷基、雜烷基、雜環烷基烷基、環烷基烷基、芳基、芳基烷基、雜芳基及雜芳基烷基；各R70 獨立地為氫或R60 ；各R80 獨立地為R70 ，或替代地，兩個R80 與其所鍵結之氮原子一起形成5員、6員或7員雜環烷基，該雜環烷基可視情況包括選自由O、N及S組成之群的1至4個相同或不同的額外雜原子，其中N可具有-H或C1 -C3 烷基取代；且各M+ 為具有淨單一正電荷之相對離子。各M+ 可獨立地為例如鹼金屬離子，諸如K+ 、Na+ 、Li+ ；銨離子，諸如+ N(R60 )4 ；或鹼土金屬離子，諸如[Ca2+ ]0.5 、[Mg2+ ]0.5 或[Ba2+ ]0.5 (「0.5 」意謂此類二價鹼土金屬離子之相對離子中一個可為本發明化合物之電離形式且另一個為典型相對離子，諸如氯離子，或兩個經離子化之本文中所揭示之化合物可充當此類二價鹼土金屬離子之相對離子，或經雙離子化之本發明化合物可充當此類二價鹼土金屬離子之相對離子)。作為特定實例，-NR80 R80 意欲包括-NH2 、-NH-烷基、N-吡咯啶基、N-哌嗪基、4N-甲基-哌嗪-1-基及N-嗎啉基。
71. 除非另外規定，否則除本文中之揭示內容以外，「經取代之」烯烴、炔烴、芳基及雜芳基中之不飽和碳原子上之氫的取代基為-R60 、鹵基、-O- M+ 、-OR70 、-SR70 、-S- M+ 、-NR80 R80 、三鹵基甲基、-CF3 、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2 、-N3 、-SO2 R70 、-SO3 - M+ 、-SO3 R70 、-OSO2 R70 、-OSO3 - M+ 、-OSO3 R70 、-PO3 - 2(M+ )2 、-P(O)(OR70 )O- M+ 、-P(O)(OR70 )2 、-C(O)R70 、-C(S)R70 、-C(NR70 )R70 、-CO2 - M+ 、-CO2 R70 、-C(S)OR70 、-C(O)NR80 R80 、-C(NR70 )NR80 R80 、-OC(O)R70 、-OC(S)R70 、-OCO2 - M+ 、-OCO2 R70 、-OC(S)OR70 、-NR70 C(O)R70 、-NR70 C(S)R70 、-NR70 CO2 - M+ 、-NR70 CO2 R70 、-NR70 C(S)OR70 、-NR70 C(O)NR80 R80 、-NR70 C(NR70 )R70 及-NR70 C(NR70 )NR80 R80 ，其中R60 、R70 、R80 及M+ 如先前所定義，限制條件為在經取代之烯烴或炔烴之情況下，取代基不為-O- M+ 、-OR70 、-SR70 或-S- M+ 。
72. 除非另外規定，否則除關於本文中之個別術語所揭示之基團以外，「經取代之」雜烷基及環雜烷基中之氮原子上之氫的取代基為-R60 、-O- M+ 、-OR70 、-SR70 、-S- M+ 、-NR80 R80 、三鹵基甲基、-CF3 、-CN、-NO、-NO2 、-S(O)2 R70 、-S(O)2 O- M+ 、-S(O)2 R70 、-OS(O)2 R70 、-OS(O)2 O- M+ 、-OS(O)2 R70 、-P(O)(O- )2 (M+ )2 、-P(O)(OR70 )O- M+ 、-P(O)(OR70 )(OR70 )、-C(O)R70 、-C(S)R70 、-C(NR70 )R70 、-C(O)OR70 、-C(S)OR70 、-C(O)NR80 R80 、-C(NR70 )NR80 R80 、-OC(O)R70 、-OC(S)R70 、-OC(O)OR70 、-OC(S)OR70 、-NR70 C(O)R70 、-NR70 C(S)R70 、-NR70 C(O)OR70 、-NR70 C(S)OR70 、-NR70 C(O)NR80 R80 、-NR70 C(NR70 )R70 及-NR70 C(NR70 )NR80 R80 ，其中R60 、R70 、R80 及M+ 如先前所定義。
在一實施例中，抗原決定基(例如肽抗原決定基)及/或將與含fGly之多肽結合之有效負載具有式(III)、式(IV)、式(V)、式(Va)、式(VI)或式(VIa)之形式。在一些實施例中，抗原決定基共價結合於式(III)、式(IV)、式(V)、式(Va)、式(VI)或式(VIa)之化合物中。在一個此類實施例中，抗原決定基為包含抗原決定基(例如病毒或癌症抗原決定基)之胺基酸序列的肽。在一實施例中，肽抗原決定基具有約4個胺基酸至約20個胺基酸(例如，4個胺基酸、5個胺基酸、6個胺基酸、7個胺基酸、8個胺基酸、9個胺基酸、10個胺基酸、11個胺基酸、12個胺基酸、13個胺基酸、14個胺基酸、15個胺基酸、16個胺基酸、17個胺基酸、18個胺基酸、19個胺基酸或20個胺基酸)之長度。
本發明提供製備T細胞-MMP-抗原決定基結合物及/或T細胞-MMP-有效負載結合物之方法，該方法包括：
a) 將編碼包括絲胺酸或半胱胺酸之硫酸酯酶基元(例如，式(I)或式(II)之硫酸酯酶基元，諸如以上所論述之X1CX2PX3Z3 (SEQ ID NO:47)、CX1PX2Z3 (SEQ ID NO:48))的序列併入編碼T細胞-MMP之第一多肽及/或第二多肽的核酸中；
b) 在細胞中表現含有該硫酸酯酶基元之第一多肽及/或第二多肽，該細胞
i) 表現FGE並且將該硫酸酯酶基元之絲胺酸或半胱胺酸轉化成fGly；及部分或完全純化單獨或呈T細胞-MMP形式之含fGly之第一多肽及/或第二多肽；或
ii) 不表現將該硫酸酯酶基元之絲胺酸或半胱胺酸轉化成fGly之FGE；純化或部分純化含fGly殘基之T細胞-MMP；以及使經純化或部分純化之T細胞-MMP與將該硫酸酯酶基元之絲胺酸或半胱胺酸轉化成fGly殘基之FGE接觸；及
c) 使單獨或作為T細胞-MMP之一部分的含fGly之第一多肽及/或第二多肽與已用可在fGly之醛與抗原決定基及/或有效負載之間形成共價鍵之基團進行官能化的抗原決定基及/或有效負載接觸；
從而形成T細胞-MMP-抗原決定基結合物及/或T細胞-MMP有效負載結合物。
在此類方法中，抗原決定基(含抗原決定基之分子)及/或有效負載可藉由選擇性地與醛基反應之任何適合之官能基進行官能化。此類基團可例如選自由以下組成之群：硫半卡肼、胺氧基、醯肼及肼基。在諸多實施例中，抗原決定基及或有效負載為式(III)、式(IV)、式(V)、式(Va)、式(VI)或式(VIa)之肼基化合物之一部分。在一個此類實施例中，將硫酸酯酶基元併入包含β2M胺基酸序列之T細胞-MMP第一多肽中的β2M序列或與其附接之連接子內(例如，在N末端之10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個胺基酸內。在一實施例中，將硫酸酯酶基元併入包含與圖4中所示之β2M序列具有至少85% (例如，至少90%、95%、98%或99%，或甚至100%)序列一致性之β2M胺基酸序列的第一多肽或第二多肽中(例如，其中在不包括硫酸酯酶基元序列之情況下或在添加硫酸酯酶基元序列之前計算一致性)。舉例而言，可將硫酸酯酶基元置於信號序列與成熟肽序列之間或成熟肽之N末端處，且可藉由肽連接子將該基元與β2M序列隔開。
在製備T細胞-MMP-抗原決定基結合物及/或T細胞-MMP有效負載結合物之方法的其他實施例中，可將SEQ ID NO:45 (式(I))或SEQ ID NO:46之硫酸酯酶基元併入第二多肽之IgFC區中作為第二多肽化學結合位點。在一實施例中，可將硫酸酯酶基元併入在添加硫酸酯酶基元序列之前與圖2中所示之序列具有至少85% (例如，至少90%、95%、98%或99%，或甚至100%)胺基酸序列一致性的序列中。
在製備T細胞-MMP-抗原決定基結合物及/或T細胞-MMP有效負載結合物之方法的另一實施例中，可將SEQ ID NO:45 (式(I))或SEQ ID NO:46之硫酸酯酶基元併入I類MHC重鏈多肽中作為化學結合位點。
在製備T細胞-MMP-抗原決定基結合物及/或T細胞-MMP有效負載結合物之方法的一實施例中，將硫酸酯酶基元併入與圖3中所示之序列具有至少85% (例如，至少90%、95%、98%或99%，或甚至100%)胺基酸序列一致性的序列中(例如，其中在不包括硫酸酯酶基元序列之情況下或在添加硫酸酯酶基元序列之前計算一致性)。在一個此類實施例中，硫酸酯酶基元可用作直接或經由肽連接子或化學連接子間接地結合例如抗原決定基及/或有效負載之位點。
I.A.2.2 分選酶 A 酶位點
可藉由在T細胞-MMP之第一多肽及/或第二多肽之N末端及/或C末端併入供分選酶A結合用之位點而將抗原決定基(例如，包含抗原決定基之序列的肽)及有效負載附接於彼等位置。
分選酶A識別C末端五肽序列LP(X5)TG/A (SEQ ID NO 54，其中X5為任何單一胺基酸，且G/A為甘胺酸或丙胺酸)，並且在該序列內之蘇胺酸與結合搭配物之N末端中的甘胺酸或丙胺酸之間產生醯胺鍵。有利的是，可將識別序列併入任一結合搭配物中，從而允許第一多肽或第二多肽之胺基末端抑或羧基末端充當化學結合位點。此外，LP(X5)TG/A序列不需要任何非天然胺基酸，從而允許表現至T細胞-MMP得以在不同的細胞類型中在多種條件下進行。分選酶A酶連接之潛在不利之處在於其採用亦可促進麩醯胺酸側鏈偶聯至烷基一級胺，諸如離胺酸之細菌轉麩醯胺酸酶(mTG)。細菌mTG看似不能夠修飾天然IgG1中之麩醯胺酸殘基，但在採用時可能引起多肽序列之二次修飾。
為了將抗原決定基或有效負載附接至T細胞-MMP之第一多肽或第二多肽之羧基末端，將LP(X5)TG/A工程改造至所要肽之羧基末端部分中。將甘胺酸或丙胺酸曝露段(例如，當使用來自金黃色葡萄球菌之分選酶A時，(G)3-5 (SEQ ID NO:55及56)；或當使用來自釀膿鏈球菌之分選酶A時，(A)3-5 (SEQ ID NO:57及58))工程改造至包含抗原決定基之肽(或與其附接之連接子)、肽有效負載(或與其附接之連接子)或者共價附接至非肽抗原決定基或有效負載之肽的N末端。
為了將抗原決定基或有效負載附接至T細胞-MMP之第一多肽或第二多肽之胺基末端，對甘胺酸曝露段(例如，(G)2 、 3 、 4 或 5 )或丙胺酸曝露段(例如，(A)2 、 3 、 4 或 5 )進行工程改造以出現在所要多肽之N末端，並且將LP(X5)TG/A工程改造至包含抗原決定基之肽(或與其附接之連接子)、肽有效負載(或與其附接之連接子)或者共價附接至非肽抗原決定基或有效負載之肽的羧基末端部分中。
組合分選酶A與經胺基及羧基工程改造之肽引起LP(X5)TG/A序列中之Thr與Gly/Ala殘基之間裂解，從而形成具有經羧基標記之肽的硫酯中間物。藉由N末端經修飾之多肽進行親核性侵襲引起形成以下形式之共價偶聯複合體：羧基經修飾之多肽-LP(X5)T*G/A-胺基經修飾之多肽，其中「*」表示LP(X5)TG/A基元之蘇胺酸與N末端經修飾之肽之甘胺酸或丙胺酸之間形成的鍵。鑒於上述內容，本發明設想含有T細胞-MMP之組合物及其用途，該T細胞-MMP具有：
處於第一多肽及/或第二多肽之羧基末端的至少一個LP(X5)TG/A胺基酸序列(例如，用於與在其N末端處經寡甘胺酸或寡丙胺酸修飾之抗原決定基肽偶聯)；
處於第一多肽及/或第二多肽之胺基末端的至少一個寡甘胺酸(例如，(G)2 、 3 、 4 或 5 ) (例如，用於與在其N末端處經LP(X5)TG/A胺基酸序列修飾之抗原決定基肽偶聯)；
處於第一多肽及/或第二多肽之胺基末端的至少一個寡丙胺酸(例如，(A)2 、 3 、 4 或 5 ) (例如，用於與在其N末端處經LP(X5)TG/A胺基酸序列修飾之抗原決定基肽偶聯)；
處於第一多肽及/或第二多肽中之至少一個LP(X5)TA (例如，LPETA，SEQ ID NO:54，其中X5為E且末端位置為A)胺基酸序列(例如，用於與在其N末端處經寡甘胺酸或寡丙胺酸修飾之抗原決定基肽偶聯)；及/或
處於第一多肽及/或第二多肽中之至少一個LP(X5)TG (例如，LPETG，SEQ ID NO:54，其中X5為E且末端位置為G)胺基酸序列(例如，用於與在其N末端處經寡甘胺酸或寡丙胺酸修飾之抗原決定基肽偶聯)。
作為LP(X5)TG/A之替代，LPETGG (SEQ ID NO:59)肽可用於金黃色葡萄球菌分選酶A偶聯，或LPETAA (SEQ ID NO:60)可用於釀膿鏈球菌分選酶A偶聯。結合反應仍在蘇胺酸與胺基末端寡甘胺酸或寡丙胺酸肽之間進行，從而產生羧基經修飾之多肽-LP(X5)T*G/A-胺基經修飾之多肽，其中「*」表示蘇胺酸與N末端經修飾之肽的甘胺酸或丙胺酸之間形成的鍵。
在T細胞-MMP之第一多肽包含β2M多肽之一個實施例中，第一多肽含有處於該多肽之N末端或處於附接至該第一多肽之多肽連接子(例如，該連接子與該第一多肽共轉譯且處於其N末端)之N末端的寡甘胺酸(例如，(G)2 、 3 、 4 或 5 )或寡丙胺酸(例如，(A)2 、 3 、 4 或 5 )。寡甘胺酸或寡丙胺酸可用作分選酶A化學結合位點以便藉由使其與包含在其羧基末端區域中攜帶LP(X5)TG/A之多肽的抗原決定基結合而將抗原決定基分子引入T細胞-MMP中。舉例而言，如圖4中所示之β2M序列起始於20個胺基酸之前導序列，且成熟多肽起始於起始序列IQRTP(K/Q)IQVYS並且延續至多肽之其餘部分。SEQ ID NO:54、59及69之分選酶基元可併入其中，例如，如下：
A2-5 或 G2-5 -連接子-IQ(R/K)TP(K/Q)IQVYS...；
A2-5 或 G2-5 -連接子-Q(R/K)TP(K/Q)IQVYS...；或
A2-5 或G2-5 -連接子-(R/K)TP(K/Q)IQVYS...，
(對於A2-5 或 G2-5 ，參見SEQ ID NO:55至58，且對於β2M序列，參見SEQ ID NO:151-155及圖4)；
或如以下所示具有人類前導序列MSRSVALAVLALLSLSGLEA (參見SEQ ID NO:151及圖4)
MSRSVALAVLALLSLSGLEA (A2-5 或G2-5 )-連接子-IQ(R/K)TP (K/Q)IQVYS...；
MSRSVALAVLALLSLSGLEA (A2-5 或G2-5 )-連接子-Q(R/K)TP (K/Q)IQVYS...；
或
MSRSVALAVLALLSLSGLEA (A2-5 或G2-5 )-連接子-(R/K)TP (K/Q)IQVYS...，
其中該等連接子當存在時可包含獨立選擇之胺基酸序列(例如1至50個胺基酸，諸如聚甘胺酸、聚丙胺酸、聚絲胺酸及聚Gly，諸如AAAGG (SEQ ID NO:75)或(GGGGS)n ，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO:76))或化學基團(例如聚氧化乙烯、聚乙二醇等)。連接子可能存在或不存在，並且當顯示兩個時，其可能相同或不同。
在藉由於基於細胞之系統中表現來製備於其N末端處攜帶寡甘胺酸之多肽且表現細胞未移除或未完全移除前導序列及/或連接子之任一部分時，可將凝血酶裂解位點(Leu-Val-Pro-Arg-Gly，SEQ ID NO:61)插入在甘胺酸之前。在凝血酶於Arg與Gly殘基之間裂解時，確保在裂解後將甘胺酸曝露於蛋白質分子上以便用寡甘胺酸加以標記並且結合，限制條件為多肽中不存在其他凝血酶位點。
在一實施例中，將A2-5 或G2-5 基元併入包含與圖4中所示之序列(例如，圖4中所示之整個序列，或起始於胺基酸21且終止於其C末端之成熟多肽序列)具有至少85% (例如，至少90%、95%、98%或99%，或甚至100%)胺基酸序列一致性之序列的多肽中，其中在不考慮所添加之A2-5 或G2-5 基元及所存在之任何連接子序列的情況下對序列一致性進行評定。
在一實施例中，將A2-5 或G2-5 基元併入包含與圖4中所示之序列(例如，圖4中所示之全長序列中之任一者，或起始於胺基酸21且終止於其C末端之成熟多肽序列中之任一者)相比具有1至15 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)個胺基酸缺失、插入及/或變化之β2M序列的多肽中，其中在不考慮所添加之A2-5 或G2-5 基元及所存在之任何連接子序列的情況下評定胺基酸缺失、插入及/或變化。在一個此類實施例中，A2-5 或G2-5 基元可置換及/或插入在成熟β2M序列(諸如圖4中所示之彼等序列)之胺基末端15 (例如，1-5、5-10或10-15)個胺基酸中之任一個之間。
I.A.2.3 轉麩醯胺酸酶酶位點
轉麩醯胺酸酶(mTG)促進麩醯胺酸殘基側鏈上之醯胺基與一級胺供體(例如，一級烷基胺，諸如多肽中之離胺酸殘基側鏈上所發現者)之間形成共價鍵。可採用轉麩醯胺酸酶使抗原決定基及有效負載直接或經由包含游離一級胺之連接子間接地與T細胞-MMP結合。因而，T細胞-MMP之第一多肽及/或第二多肽中所存在之麩醯胺酸殘基在藉由諸如茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense )轉麩醯胺酸酶之酶對其加以評定時可視為化學結合位點。該酶(EC 2.3.2.13)為促進麩醯胺酸之γ-醯基轉移至離胺酸之ε-胺基的穩定非鈣依賴性酶。然而，序列中出現之麩醯胺酸殘基對於酶修飾而言未必始終可及。受限之可及性可能為有利的，因為其限制可發生修飾之位置數。舉例而言，細菌mTG一般不能夠修飾天然IgG1中之麩醯胺酸殘基；然而，Schibli及同事(Jeger, S.等人，Angew Chem (Int Engl). 2010;49:99957以及Dennler P等人，Bioconjug Chem. 2014;25(3):569-78)發現N297處之去糖基化IgG1致使麩醯胺酸殘基Q295可及且允許酶連接從而產生抗體藥物結合物。此外，藉由產生N297至Q297 IgG1突變體，其引入兩個位點供藉由轉麩醯胺酸酶進行酶促標記。
在T細胞-MMP之第一多肽及/或第二多肽不含可用作化學結合位點之麩醯胺酸(例如，其對於轉麩醯胺酸酶不可及或未處於所要位置上)時，可將可充當轉麩醯胺酸酶受質之麩醯胺酸殘基或包含可及麩醯胺酸之序列(有時稱為「麩醯胺酸標籤」或「Q標籤」)併入該多肽中。所添加之麩醯胺酸或Q標籤可充當第一多肽化學結合位點或第二多肽化學結合位點。美國專利公開案2017/0043033 A1描述麩醯胺酸殘基及Q標籤之併入及轉麩醯胺酸酶用於修飾多肽之用途，並且因彼等教示內容而併入本文中。
麩醯胺酸殘基及Q標籤之併入可用合成肽之化學手段或藉由對編碼多肽之核酸進行修飾且在細胞或無細胞系統中表現經修飾之核酸來實現。
在第一多肽化學結合位點為麩醯胺酸或Q標籤之實施例中，麩醯胺酸或Q標籤可處於針對以上所描述之第一多肽化學結合位點或第二多肽化學結合位點所指示之任何位置。
在一實施例中，所添加之麩醯胺酸殘基或Q標籤附接於第一MHC多肽序列或與第一MHC多肽附接之連接子(若存在) (例如，處於N末端或C末端)或處於其內部。額外第一多肽化學結合位點可存在於(附接於或處於內部) T細胞-MMP之第一多肽上之任何位置。在一個此類實施例中，T細胞-MMP之第一MHC多肽為β2M多肽，且所添加之麩醯胺酸或Q標籤併入圖4中所提供之成熟β2M多肽序列N末端之20、15或10個胺基酸(不包括20鹼基對信號序列) (或與圖4中之成熟β2M多肽具有至少85%、90%、95%、98%、99%或甚至100%序列一致性的肽)內。在另一實施例中，麩醯胺酸或Q標籤存在於與圖4中所提供之成熟β2M多肽之一的N末端附接的多肽連接子中。
在一實施例中，所添加之麩醯胺酸殘基或Q標籤附接至T細胞-MMP之第二多肽之序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部，例如，第二MHC多肽(例如，MHC-H肽)或者直接或間接地附接至第二MHC多肽之Fc、支架肽或連接子(若存在)的末端或內部。額外第二多肽化學結合位點可存在於(附接於或處於內部) T細胞-MMP之第二多肽上之任何位置。在一個實施例中，第二MHC多肽為MHC-H多肽，第二多肽包含Fc多肽，且所添加之麩醯胺酸或Q標籤併入MHC-H或Fc多肽序列內。在另一實施例中，麩醯胺酸或Q標籤存在於MHC-H與Fc多肽之間的多肽連接子內或與Fc多肽羧基末端附接之連接子內。
在諸多實施例中，含麩醯胺酸之標籤包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：LQG、LLQGG (SEQ ID NO:62)、LLQG (SEQ ID NO:63)、LSLSQG (SEQ ID NO:64)及LLQLQG (SEQ ID NO:65) (可利用眾多其他胺基酸序列)。
含有或已經修飾而含有一級胺基團之有效負載及抗原決定基可作為胺供體用於在麩醯胺酸殘基(例如，Q標籤中之麩醯胺酸殘基)與抗原決定基或有效負載之間形成共價鍵之轉麩醯胺酸酶催化反應中。
在抗原決定基或有效負載不包含允許其充當胺供體之適合一級胺時，該抗原決定基或有效負載可經化學修飾以併入胺基(例如，經修飾以藉由鍵聯至離胺酸、胺基己酸、屍胺等而併入一級胺)。在抗原決定基或有效負載包含肽且需要一級胺來充當胺供體時，可將一級胺與轉麩醯胺酸酶可作用於其之含離胺酸或其他胺之化合物併入肽中。可提供一級胺基團且可併入α胺基酸鏈中或其末端之含其他胺之化合物包括但不限於升離胺酸、2,7-二胺基庚酸、胺基庚酸。替代地，抗原決定基或有效負載可附接於包含適合胺基之肽或非肽連接子。適合非肽連接子之實例包括烷基連接子及PEG (聚乙二醇)連接子。
轉麩醯胺酸酶可獲自多種來源，且包括來自以下之酶：哺乳動物肝臟(例如，天竺鼠肝臟)；真菌(例如，卵菌類(Oomycetes )、放線菌類(Actinomycetes )、酵母菌屬(Saccharomyces )、念珠菌屬(Candida )、隱球菌屬(Cryptococcus )、紅麴菌屬(Monascus )或黑黴菌屬(Rhizopus )轉麩醯胺酸酶)；變形黏液菌屬(myxomycetes ) (例如，多頭絨泡菌(Physarum polycephalum )轉麩醯胺酸酶)；及/或細菌(例如，茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobarensis )、灰肉色鏈輪絲菌(Streptoverticillium griseocarneum )、拉達卡鏈輪絲菌(Streptoverticillium ladakanum )、茂原鏈黴菌(Streptomyces mobarensis )、綠色鏈黴菌(Streptomyces viridis )、拉達卡鏈黴菌(Streptomyces ladakanum )、生暗灰鏈黴菌(Streptomyces caniferus )、扁平鏈黴菌(Streptomyces platensis )、吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopius )、紡錘鏈黴菌(Streptomyces netropsis )、弗氏鏈黴菌(Streptomyces fradiae )、玫瑰輪絲鏈黴菌(Streptomyces roseovertivillatus )、肉桂鏈黴菌(Streptomyces cinnamaoneous )、灰肉色鏈黴菌(Streptomyces griseocarneum )、淡紫灰鏈黴菌(Streptomyces lavendulae )、淺青紫鏈黴菌(Streptomyces lividans )、利迪鏈黴菌(Streptomyces lydicus )、茂原鏈黴菌(S .mobarensis )、鹽屋鏈黴菌(Streptomyces sioyansis )、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura sp .)、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans )、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )、產胺棒狀桿菌(Coryneba cterium ammoniagenes )、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium gluta micum )、梭菌屬(Clostridium )、腸桿菌屬(Enterobacter sp .)、微球菌屬(Micrococcus ))。在一些實施例中，轉麩醯胺酸酶為不需要鈣來誘導酶構形變化且允許酶活性之非鈣依賴性轉麩醯胺酸酶。
如以上關於其他第一多肽化學結合位點及第二多肽化學結合位點所論述，麩醯胺酸或Q標籤可併入T細胞-MMP之第一多肽或第二多肽上的任何所要位置。在一實施例中，可在T細胞-MMP之第一多肽或第二多肽中之任何元件，包括第一MHC多肽及第二MHC多肽(例如，MHC-H多肽及β2M多肽)、支架或Ig Fc及接合彼等元件之連接子的末端處或附近添加麩醯胺酸或Q標籤。
在T細胞-MMP之第一多肽包含β2M多肽序列之一個實施例中，第一多肽含有處於該多肽之N末端或處於與該第一多肽附接之多肽連接子(例如，該連接子附接至該第一多肽之N末端)之N末端的麩醯胺酸或Q標籤。麩醯胺酸或Q標籤可用作化學結合位點以便藉由利用轉麩醯胺酸酶使抗原決定基分子與可用作醯胺供體之攜帶一級胺之抗原決定基或與包含一級胺之連接子結合的抗原決定基結合而將其引入T細胞-MMP中。舉例而言，如圖4中所示之β2M序列起始於20個胺基酸之前導序列，且成熟多肽起始於起始序列IQRTP(K/Q)IQVYS並且延續至多肽之其餘部分。可由以上所示之其他Q標籤代表及替代之具有胺基酸序列LLQG (SEQ ID NO:63)之Q標籤可併入β2M之N末端，如以下所示：
Q-標籤-連接子-IQRTP(K/Q)IQVYS...；
LLQG -連接子-IQRTP(K/Q)IQVYS...；
LLQG -連接子-QRTP(K/Q)IQVYS......；或
LLQG -連接子-RTP(K/Q)IQVYS...；
(關於β2M序列，參見SEQ ID NO:151-155)
或如以下所示具有人類前導序列MSRSVALAVLALLSLSGLEA (參見SEQ ID NO:151及圖4)，
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-Q標籤-連接子-IQRTP(K/Q)IQVYS...；
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-LLQG-連接子-IQRTP(K/Q)IQVYS...；
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-LLQG-連接子-QRTP(K/Q)IQVYS...；或
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-LLQG-連接子-RTP(K/Q)IQVYS....
其中該等連接子當存在時可包含獨立選擇之胺基酸序列(例如1至50個胺基酸，諸如聚甘胺酸、聚丙胺酸、聚絲胺酸及聚Gly，諸如AAAGG (SEQ ID NO:75)或(GGGGS)n ，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO:76))或化學基團(例如聚氧化乙烯、聚乙二醇等)。連接子可能存在或不存在，並且當顯示兩個時，其可能相同或不同。
在一實施例中，將Q標籤基元併入包含與圖4中所示之序列(例如，圖4中所示之全長序列中之任一者，或起始於胺基酸21且終止於其C末端之成熟β2M多肽中之任一者的序列)具有至少85% (例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%)胺基酸序列一致性之β2M序列的多肽中，其中在不考慮所添加之Q標籤基元及所存在之任何連接子序列的情況下對一致性進行評定。
在一實施例中，將Q標籤基元併入與圖4中所示之序列(例如，圖4中所示之整個序列，或起始於胺基酸21且終止於其C末端之成熟多肽序列)相比具有1至15 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)個胺基酸缺失、插入及/或變化之序列中，在不考慮所添加之Q標籤基元及所存在之任何連接子序列的情況下對變化進行評定。在一個此類實施例中，Q標籤基元可置換及/或插入在成熟β2M序列(諸如圖4中所示之彼等序列)之胺基末端15 (例如，1-5、5-10或10-15)個胺基酸中之任一個之間。
替代地，可對T細胞-MMP中出現之MHC-H鏈序列中出現的麩醯胺酸殘基中之任一個、兩個或三個周圍的序列進行修飾以匹配Q標籤之序列，並且用作供添加抗原決定基或有效負載用的化學結合位點。
在另一實施例中，麩醯胺酸或Q標籤可併入IgFc區中作為第二多肽化學結合位點。在一個此類實施例中，其可用作直接或經由攜帶一級胺之肽連接子或化學連接子間接地結合例如抗原決定基及/或有效負載之位點。
I.A.2.4 作為化學結合位點之硒代半胱胺酸及非天然胺基酸
一種在T細胞-MMP之第一多肽及/或第二多肽中提供位點特異性化學結合位點之策略採用插入具有與該多肽中所存在之其他胺基酸不同的反應性的胺基酸。此類胺基酸包括但不限於非天然胺基酸、乙醯基苯丙胺酸(對乙醯基-L-苯丙胺酸，pAcPhe)、對疊氮基苯丙胺酸及丙炔基酪胺酸，以及天然存在之胺基酸硒代半胱胺酸(Sec)。
Thanos等人在美國專利公開案第20140051836 A1號中論述一些其他非天然胺基酸，包括O-甲基-L-酪胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcβ-絲胺酸、L-多巴胺、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、L-磷酸絲胺酸、膦醯基絲胺酸、膦醯基酪胺酸、對碘苯丙胺酸、對溴苯丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸及對炔丙氧基苯丙胺酸。其他非天然胺基酸包括反應性基團，包括胺基、羧基、乙醯基、肼基、醯肼基、半卡肼基、氫硫基、疊氮基及炔基。參見例如美國專利公開案第20140046030 A1號。
除了在實驗室中直接合成多肽以外，亦已開發兩種利用終止密碼子之方法以利用轉錄-轉譯系統將非天然胺基酸併入蛋白質及多肽中。第一種藉由使乳白密碼子UGA與Sec插入序列配對來併入硒代半胱胺酸(Sec)。第二種一般藉由使用琥珀終止密碼子、赭石終止密碼子或乳白終止密碼子將非天然胺基酸併入多肽中。亦已報導使用其他類型密碼子諸如獨特密碼子、罕見密碼子、非天然密碼子、五鹼基密碼子及四鹼基密碼子以及使用無意義及框移阻遏。參見例如美國專利公開案第20140046030 A1號及Rodriguez等人，PNAS 103(23)8650-8655(2006)。舉例而言，可在活體內或無細胞轉錄-轉譯系統中使用tRNA/胺醯基tRNA合成酶配對將非天然胺基酸乙醯基苯丙胺酸併入琥珀密碼子處。
硒代半胱胺酸及非天然胺基酸二者之併入需要將必需終止密碼子工程改造至T細胞-MMP之第一多肽及/或第二多肽之核酸編碼序列中的所要位置，此後使用該編碼序列在活體內或無細胞轉錄-轉譯系統中表現T細胞-MMP之第一多肽鏈或第二多肽鏈。
活體內系統一般依賴於經工程改造之細胞株將充當生物正交化學結合位點之非天然胺基酸併入多肽及蛋白質中。參見例如標題為「In vivo incorporation of unnatural amino acids」之國際公開申請案第2002/085923號。活體內非天然胺基酸併入依賴於與宿主細胞中之所有內源tRNA及合成酶正交的tRNA及胺醯基tRNA合成酶(aaRS)配對。在細胞培養或醱酵期間將所選非天然胺基酸補充至培養基，使得細胞滲透性及穩定性成為重要考慮因素。
具有帶電tRNA之各種無細胞合成系統亦可用於併入非天然胺基酸。此類系統包括以下文獻中所描述之彼等系統：美國公開專利申請案第20160115487A1號；Gubens等人，RNA . 2010 Aug; 16(8): 1660-1672；Kim, D. M.及Swartz, J. R.Biotechnol. Bioeng . 66:180-8 (1999)；Kim, D. M.及Swartz, J. R.Biotechnol. Prog . 16:385-90 (2000)；Kim, D. M.及Swartz, J. R. Biotechnol. Bioeng . 74:309-16 (2001)；Swartz等人，Methods Mol. Biol. 267:169-82 (2004)；Kim, D. M.及Swartz, J. R.Biotechnol. Bioeng . 85:122-29 (2004)；Jewett, M. C.及Swartz, J. R.,Biotechnol. Bioeng . 86:19-26 (2004)；Yin, G.及Swartz, J. R.,Biotechnol. Bioeng . 86:188-95 (2004)；Jewett, M. C.及Swartz, J. R.,Biotechnol. Bioeng . 87:465-72 (2004)；Voloshin, A. M.及Swartz, J. R.,Biotechnol. Bioeng . 91:516-21 (2005)。
一旦併入T細胞-MMP之第一多肽或第二多肽中，便使與所併入之硒代半胱胺酸或非天然胺基酸具有反應性之攜帶抗原決定基及/或有效負載之基團與T細胞-MMP在適合之條件下接觸以形成共價鍵。舉例而言，pAcPhe之酮基與烷氧基胺且經由肟偶聯反應，且可直接結合至含烷氧基胺之抗原決定基及/或有效負載，或者經由含烷氧基胺之連接子間接地結合至抗原決定基及有效負載。硒代半胱胺酸與例如一級烷基碘化物(例如，可用作連接子之碘乙醯胺)、馬來醯亞胺及甲碸苯基噁二唑基團反應。因此，攜帶彼等基團或與攜帶彼等基團之連接子結合的抗原決定基及/或有效負載可共價結合至攜帶硒代半胱胺酸之多肽鏈。
如以上關於其他第一多肽化學結合位點及第二多肽化學結合位點所論述，硒代半胱胺酸及/或非天然胺基酸可併入T細胞-MMP之第一多肽或第二多肽中之任何所要位置。在一實施例中，可在T細胞-MMP之第一多肽或第二多肽中之任何元件，包括第一MHC多肽及第二MHC多肽(例如，MHC-H多肽及β2M多肽)、支架或Ig Fc及接合彼等元件之連接子的末端處或附近添加硒代半胱胺酸及/或非天然胺基酸。在諸多實施例中，硒代半胱胺酸及/或非天然胺基酸可併入β2M、I類MHC重鏈及/或Fc Ig多肽中。在一實施例中，硒代半胱胺酸及/或非天然胺基酸可併入第一MHC多肽(例如，β2M多肽)之胺基末端處或附近之第一多肽或與其附接之連接子中。舉例而言，在第一多肽包含β2M序列時，硒代半胱胺酸及/或非天然胺基酸可併入β2M序列之N末端處或附近，從而允許例如抗原決定基直接或經由連接子進行化學結合。舉例而言，如圖4中所示之β2M序列起始於20個胺基酸之前導序列，且成熟多肽起始於起始序列IQRTP(K/Q)IQVYS並且延續至多肽之其餘部分。硒代半胱胺酸及/或非天然胺基酸(以「ψ」表示)可併入其中，例如，如下：
ψ IQRTP(K/Q)IQVYS...； ψ -連接子-IQRTP(K/Q)IQVYS...；
ψ -連接子-QRTP(K/Q)IQVYS...；或 ψ -連接子-RTP(K/Q) IQVYS...；
或如下所示具有人類前導序列MSRSVALAVLALLSLSGLEA(關於β2M序列，參見SEQ ID NO:151-155及圖4)，
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子- ψ IQRTP(K/Q)IQVYS...；
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子- ψ -連接子-IQRTP (K/Q)IQVYS...；
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子- ψ -連接子-QRTP (K/Q)IQVYS...；或
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子- ψ -連接子-RTP (K/Q)IQVYS...，
其中該等連接子當存在時可包含獨立選擇之胺基酸序列(例如1至50個胺基酸，諸如聚甘胺酸、聚丙胺酸、聚絲胺酸及聚Gly，諸如AAAGG (SEQ ID NO:75)或(GGGGS)n ，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 (SEQ ID NO:76))或化學基團(例如聚氧化乙烯、聚乙二醇等)。連接子可能存在或不存在，並且當顯示兩個時，其可能相同或不同。
在一實施例中，將硒代半胱胺酸及/或非天然胺基酸併入包含與圖4中所示之β2M序列(例如，圖4中所示之全長序列中之任一者，或起始於胺基酸21且終止於其C末端之成熟β2M多肽中之任一者的序列)具有至少85% (例如，至少90%、95%、98%或99%，或甚至100%)胺基酸序列一致性之β2M序列的多肽中，其中在不考慮所添加之硒代半胱胺酸及/或非天然胺基酸及所存在之任何連接子序列的情況下對序列一致性進行評定。
在一實施例中，將硒代半胱胺酸及/或非天然胺基酸併入包含與圖4中所示之β2M序列(例如，圖4中所示之全長序列中之任一者，或起始於胺基酸21且終止於其C末端之成熟β2M多肽中之任一者的序列)相比具有1至15 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)個胺基酸缺失、插入及/或變化之β2M序列的多肽中，在不考慮硒代半胱胺酸及/或非天然胺基酸之胺基酸及所存在之任何連接子序列的情況下對變化進行評定。在一個此類實施例中，硒代半胱胺酸及/或非天然胺基酸可置換及/或插入在成熟β2M序列(諸如圖4中所示之彼等)之胺基末端15個胺基酸中之任一者之間。
在其他實施例中，硒代半胱胺酸及/或非天然胺基酸可併入包含MHC - H鏈或IgFC多肽序列(包括與其附接之連接子)之多肽中作為化學結合位點。在一個此類實施例中，其可用作例如直接或經由肽連接子或化學連接子間接地結合與T細胞-MMP結合之抗原決定基及/或有效負載之位點。
I.A.2.5 經工程改造之胺基酸化學結合位點
天然存在之胺基酸之側鏈中或多肽末端處所存在之多種官能基(例如，-SH、-NH3 、-OH、-COOH及其類似基團)中之任一者均可用作化學結合位點。此包括分別容易藉由包括N-羥基琥珀醯亞胺及馬來醯亞胺官能基之試劑加以修飾之離胺酸及半胱胺酸側鏈。利用此類胺基酸殘基之主要不利之處在於產物之潛在變異性及異質性。舉例而言，IgG具有超過80個離胺酸，其中超過20個處於溶劑可及位點。參見例如McComb及Owen AAPS J. 117(2): 339-351。半胱胺酸傾向於不太廣泛分佈；其傾向於嚙合於二硫鍵中並且可能不可及且不位於對置放化學結合位點而言合乎需要處。因此，可能對第一多肽及或第二多肽進行工程改造以在所要位置併入非天然存在之胺基酸，以便對T細胞-MMP第一多肽及/或第二多肽進行選擇性修飾。工程改造可呈直接化學合成多肽(例如，藉由偶聯經適當阻斷之胺基酸)及/或藉由對編碼該多肽之核酸之序列進行修飾且在細胞或無細胞系統中對其進行表現的形式。因此，本說明書包括並提供藉由轉錄/轉譯來製備T細胞-MMP之第一多肽及/或第二多肽之全部或一部分並且向第一多肽及/或第二多肽之經轉譯部分之C末端或N末端接合攜帶非天然或天然(包括硒代半胱胺酸)胺基酸以用作化學結合位點(例如，對於抗原決定基或肽)之經工程改造之多肽。經工程改造之肽可藉由任何適合之方法，包括使用如針對抗原決定基肽所描述之分選酶來接合，且可包括連接子肽序列。在一實施例中，經工程改造之肽可包含2、3、4或5個丙胺酸或甘胺酸之序列，該序列可充當分選酶結合及/或作為連接子序列之一部分。
在一個實施例中，T細胞-MMP之第一多肽或第二多肽含有至少一個天然存在之胺基酸以用作化學結合位點而工程改造至如圖4中所示之β2M序列、如圖2中所示之IgFC序列或如圖3中所示之I類MHC重鏈多肽中。在一實施例中，將至少一個用作化學結合位點之天然存在之胺基酸工程改造至與如圖4中所示之β2M序列、如圖2中所示之IgFC序列或如圖3中所示之I類MHC重鏈多肽具有至少85% (例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%)胺基酸序列一致性的多肽中。在一實施例中，將至少一個用作化學結合位點之天然存在之胺基酸工程改造至包含以下各項之T細胞-MMP第一多肽或第二多肽中：與如圖4中所示之成熟β2M序列之至少胺基末端10、20、30、40、50、60或70個胺基酸具有至少90% (例如，至少93%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%)胺基酸序列一致性的β2M胺基酸序列中；如圖2中所示之IgFC序列；或如圖3中所示之I類MHC重鏈多肽。在另一實施例中，將至少一個用作化學結合位點之天然存在之胺基酸工程改造至包含與如圖4中所示之β2M序列、如圖2中所示之IgFC序列或如圖3中所示之I類MHC重鏈序列具有100%胺基酸序列一致性的至少30、40、50、60、70、80、90或100個胺基酸之連續序列的多肽中。在以上所提及之將天然存在之胺基酸工程改造至多肽中之實施例中之任一者中，胺基酸可選自由以下組成之群：精胺酸、離胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、天冬胺酸及天冬醯胺酸。在另一此類實施例中，胺基酸係選自由以下組成之群：離胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及麩醯胺酸。在另一此類實施例中，胺基酸係選自由以下組成之群：離胺酸、麩醯胺酸及半胱胺酸。在一實施例中，胺基酸為半胱胺酸。在一實施例中，胺基酸為離胺酸；在另一實施例中，胺基酸為麩醯胺酸。
此項技術中已知的任何方法均可用於將有效負載或抗原決定基偶聯至工程改造至T細胞-MMP之第一多肽或第二多肽中之胺基酸。舉例而言，可利用馬來醯亞胺偶聯至巰基，可利用N-羥基琥珀醯亞胺偶聯至胺基，可使用酸酐或醯氯偶聯至醇或胺，且可使用脫水劑將醇或胺偶聯至羧酸基。因此，使用此類化學反應，抗原決定基或有效負載可直接或經由連接子(例如，同雙官能交聯劑或異雙官能交聯劑)間接地偶聯至第一多肽及/或第二多肽上之位置。舉例而言，包括馬來醯亞胺胺基酸之抗原決定基肽(或含肽之有效負載)可結合至天然存在或工程改造至T細胞-MMP中之化學結合位點(例如，半胱胺酸殘基)之巰基。使用狄耳士-阿德爾/逆狄耳士-阿德爾保護流程，有可能使用固相肽合成技術直接將馬來醯亞胺胺基酸併入肽(例如，抗原決定基肽)中。參見例如Koehler, Kenneth Christopher, 「Development and Implementation of Clickable Amino Acids」 (2012).Chemical & Biological Engineering Graduate Theses & Dissertations . 31. https://scholar.colorado.edu/ chbe_gradetds/31。因此，在一個實施例中，抗原決定基肽包含偶聯至T細胞-MMP之結合袋中所存在之半胱胺酸的馬來醯亞胺胺基酸。亦可使用可將馬來醯亞胺附接至肽之交聯劑(例如，異雙官能N-羥基琥珀醯亞胺-馬來醯亞胺交聯劑，其可將馬來醯亞胺附接至例如肽離胺酸上之胺基)將馬來醯亞胺附加至抗原決定基肽。在一實施例中，具有至少一(例如，1或2)個馬來醯亞胺胺基酸之抗原決定基肽結合至在選自位置7、84、5、59、116、139、167、168、170及/或171之任一或多(例如，1或2)個胺基酸位置具有半胱胺酸殘基(例如Y7C、Y59C、Y84C、Y116C、A139C、W167C、L168C、R170C及Y171C取代)之MHC重鏈，其中編號如圖3D中。在一實施例中，具有至少一(例如，1或2)個馬來醯亞胺胺基酸之抗原決定基肽結合至在選自位置7、84、116之任一或多(例如，1或2)個胺基酸位置具有半胱胺酸殘基(例如Y7C、Y84C、Y116C取代)之MHC重鏈，其中編號如圖3D中。在一實施例中，具有至少一(例如，1或2)個馬來醯亞胺胺基酸之抗原決定基肽結合至在選自位置84、116之任一或多(例如，1或2)個胺基酸位置具有半胱胺酸殘基(例如Y84C、Y116C取代)之MHC重鏈，其中編號如圖3D中。
可同時採用成對硫氫基來產生T細胞-MMP之化學結合物。在此類實施例中，具有二硫鍵或具有工程改造至彼此鄰近之位置上之兩個半胱胺酸(或硒代半胱胺酸)的T細胞-MMP可藉由使用雙硫醇連接子而用作化學結合位點。Godwin及同事所描述之雙硫醇連接子避免與藉由在其位置上形成橋連基團來還原二硫鍵相關的不穩定性，且同時允許併入另一分子，該分子可為抗原決定基或有效負載。參見例如Badescu G等人，Bioconjug Chem. 2014;25(6):1124-36，標題為Bridging disulfides for stable and defined antibody drug conjugates ，描述併入親水性連接子(例如，PEG (聚乙二醇)連接子)之雙碸試劑的用途。
在T細胞-MMP包含二硫鍵時，可藉由一般用化學計算量或接近化學計算量之二硫醇還原劑(例如二硫蘇糖醇)將該鍵還原且允許連接子與兩個半胱胺酸殘基反應而使用雙硫醇連接子併入抗原決定基或有效負載。在存在多個二硫鍵時，使用化學計算量或接近化學計算量之還原劑可允許在一個位點進行選擇性修飾。參見例如Brocchini等人，Adv. Drug. Delivery Rev. (2008) 60: 3-12。在T細胞-MMP之第一多肽及/或第二多肽不包含成對半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸(例如，硒代半胱胺酸及半胱胺酸)時，可將其工程改造至多肽中(藉由引入半胱胺酸或硒代半胱胺酸之一或兩者)以提供可與雙硫醇連接子相互作用之成對殘基。半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸應位於雙硫醇連接子可將其橋接處(例如，處於兩個半胱胺酸可形成二硫鍵之位置)。可採用半胱胺酸與硒代半胱胺酸之任何組合(亦即，兩個半胱胺酸、兩個硒代半胱胺酸，或硒代半胱胺酸與半胱胺酸)。半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸可皆存在於T細胞-MMP之第一多肽及/或第二多肽上。替代地，半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸可存在於第一多肽上，且用於雙硫醇連接子反應之其對應物存在於T細胞-MMP之第二多肽上。
在一實施例中，在添加成對半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸之前將成對半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸併入包含與圖4中所示之序列具有至少85% (例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%)胺基酸序列一致性的β2M序列的T細胞-MMP第一多肽或第二多肽中，或併入與彼等序列之一附接的肽連接子中。在一個此類實施例中，可利用成對半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸作為雙硫醇連接子偶聯位點以用於直接或者經由肽連接子或化學連接子間接地結合例如抗原決定基及/或有效負載。在一個實施例中，成對半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸位於T細胞-MMP第一多肽胺基末端之10、20、30、40或50個胺基酸內。
在另一實施例中，將成對半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸併入已併入第二多肽中之IgFC序列中以提供化學結合位點。在一實施例中，在添加成對半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸之前將成對半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸併入包含與圖2中所示之序列具有至少85% (例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%)胺基酸序列一致性的IgFC序列的多肽中，或併入與彼等序列之一附接的肽連接子中。在一個此類實施例中，可利用成對半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸作為雙硫醇連接子偶聯位點以用於直接或者經由肽連接子或化學連接子間接地結合例如抗原決定基及/或有效負載。
在另一實施例中，將成對半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸併入包含I類MHC重鏈多肽序列之多肽中作為化學結合位點。在一實施例中，在添加成對半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸之前將成對半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸併入包含與圖3中所示之序列具有至少85% (例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%)胺基酸序列一致性的序列的多肽中，或併入與彼等序列之一附接的肽連接子中。在一個此類實施例中，可利用成對半胱胺酸及/或硒代半胱胺酸作為雙硫醇連接子偶聯位點以用於直接或者經由肽連接子或化學連接子間接地結合例如抗原決定基及/或有效負載。
可同時採用成對硫氫基來產生T細胞-MMP之化學結合物。在此類實施例中，具有二硫鍵或具有工程改造至彼此鄰近之位置上之兩個半胱胺酸(或硒代半胱胺酸)的T細胞-MMP可藉由使用雙硫醇連接子而用作化學結合位點。
I.A.2.6 其他化學結合位點
醣化學結合位點
許多藉由細胞表現製備之蛋白質含有添加之醣(例如，添加至哺乳動物細胞中所表現之抗體的類型的寡醣)。因此，在藉由細胞表現來製備T細胞-MMP之第一多肽及/或第二多肽時，醣可存在且可用作二醇結合反應中之位點選擇性化學結合位點。McCombs及Owen, AAPS Journal, (2015) 17(2): 339-351及其中所引用之參考文獻描述醣殘基用於分子與抗體之二醇結合的用途。
亦可藉由使用改變醣之化學物質(例如，過碘酸，其引入醛基)或藉由可併入化學反應性醣或醣類似物以供用作化學結合位點之酶(例如，海藻糖基轉移酶)的作用而在擬體內進行醣殘基之添加及修飾。
在一實施例中，併入具有已知糖基化位點之IgFc支架可用於引入位點特異性化學結合位點。
本發明包括並提供具有醣作為化學結合(二醇結合)位點之T細胞-MMP及其抗原決定基結合物。本發明亦包括並提供此類分子在與抗原決定基及與其他分子(諸如藥物及診斷劑)形成結合物方面之用途及彼等分子在醫學處理及診斷方法中之用途。
核苷酸結合位點
核苷酸結合位點藉由使用可共價連接至該結合位點之UV反應性部分而提供位點特異性官能化。Bilgicer等人，Bioconjug Chem. 2014;25(7):1198-202報導可在核苷酸結合位點處共價連接至IgG之吲哚-3-丁酸(IBA)部分的用途。藉由併入形成核苷酸結合位點所需之序列，具有經適當修飾之抗原決定基及/或攜帶反應性核苷酸之其他分子(例如，藥物或診斷劑)之T細胞-MMP的化學結合物可用於製備T細胞-MMP-抗原決定基結合物。
本發明包括並提供具有核苷酸結合位點作為化學結合位點之T細胞-MMP。本發明亦包括並提供此類分子在與抗原決定基及與其他分子(諸如藥物及診斷劑)形成結合物方面之用途及彼等分子在醫學處理及診斷方法中之用途。
I.A.2.7 T 細胞 -MMP 、抗原決定基及 MOD 之結合及性質
本發明提供T細胞-MMP-抗原決定基結合物。在一個實施例中，本發明提供一種T細胞-MMP抗原決定基結合物，其包含：a)第一多肽；及b)第二多肽，其中該多聚體多肽之第一多肽及第二多肽包含抗原決定基；第一主要組織相容性複合體(MHC)多肽；第二MHC多肽；及視情況免疫球蛋白(Ig) Fc多肽或非Ig支架。在另一實施例中，本發明亦提供T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其包含：a)第一多肽，該第一多肽自N末端至C末端依序包含：i)抗原決定基；ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽自N末端至C末端依序包含：i)第二MHC多肽；及ii)視情況Ig Fc多肽或非Ig支架。除以上所敍述之彼等組分以外，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之第一多肽及第二多肽中之至少一者包含一或多(至少一)個MOD。該一或多個MOD位於：A)該第一多肽之C末端；B)該第二多肽之N末端；C)該第二多肽之C末端；及/或D)該第一多肽之C末端及該第二多肽之N末端。在一實施例中，該一或多個MOD中之至少一個(例如，至少兩個或至少三個)為對Co-MOD展現與相應野生型MOD對該Co-MOD之親和力相比有所降低之親和力的變異MOD。
在一實施例中，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基以至少100 μM(例如，至少10 μM、至少1 μM、至少100 nM、至少10 nM或至少1 nM)之親和力結合T細胞上之T細胞受體(TCR)。在一實施例中，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物以比T細胞-MMP-抗原決定基結合物結合第二T細胞之親和力高出至少25%的親和力結合至第一T細胞，其中該第一T細胞在其表面上表現Co-MOD及以至少100 μM之親和力結合抗原決定基之TCR，且其中該第二T細胞在其表面上表現該Co-MOD但不在其表面上表現以至少100 μM (例如，至少10 μM、至少1 μM、至少100 nM、至少10 nM或至少1 nM)之親和力結合抗原決定基之TCR。
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基以約10-4 M至約5×10-4 M、約5×10-4 M至約10-5 M、約10-5 M至5×10-5 M、約5×10-5 M至10-6 M、約10-6 M至約5×10-6 M、約5×10-6 M至約10-7 M、約10-7 M至約10-8 M或約10-8 M至10-9 M之親和力結合至T细胞上之TCR。以另一方式表述，在一些情況下，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基以約0.1 μM至約0.5 μM、約0.5 μM至約1 μM、約1 μM至約5 μM、約5 μM至約10 μM、約10 μM至約25 μM、約25 μM至約50 μM、約50 μM至約75 μM或約75 μM至約100 μM之親和力結合至T細胞上之TCR。
在一實施例中，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之變異MOD以比相應野生型MOD對該Co-MOD之親和力低至少10%、低至少15%、低至少20%、低至少25%、低至少30%、低至少35%、低至少40%、低至少45%、低至少50%、低至少55%、低至少60%、低至少65%、低至少70%、低至少75%、低至少80%、低至少85%、低至少90%、低至少95%或低至少95%的親和力結合至其Co-MOD。
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之變異MOD對Co-MOD具有1 nM至100 nM或100 nM至100 μM之結合親和力。舉例而言，在一些情況下，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之變異MOD對Co-MOD具有約1 nM至約5 nM、約5 nM至約10 nM、約10 nM至約50 nM、約50 nM至約100 nM、約100 nM至150 nM、約150 nM至約200 nM、約200 nM至約250 nM、約250 nM至約300 nM、約300 nM至約350 nM、約350 nM至約400 nM、約400 nM至約500 nM、約500 nM至約600 nM、約600 nM至約700 nM、約700 nM至約800 nM、約800 nM至約900 nM、約900 nM至約1 μM、至約1 μM至約5 μM、約5 μM至約10 μM、約10 μM至約15 μM、約15 μM至約20 μM、約20 μM至約25 μM、約25 μM至約50 μM、約50 μM至約75 μM或約75 μM至約100 μM之結合親和力。在一些情況下，本發明之T細胞-MMP中所存在之變異MOD對Co-MOD具有約1 nM至約5 nM、約5 nM至約10 nM、約10 nM至約50 nM、約50 nM至約100 nM之結合親和力。
MOD對其Co-MOD之降低之親和力與抗原決定基對TCR之親和力的組合提供本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之增強之選擇性，同時仍允許MOD之活性。舉例而言，相較於結合至呈現以下各項之第二T細胞：i)對除T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基以外的抗原決定基具有特異性的TCR；及ii)結合至T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之MOD的Co-MOD，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物選擇性地結合至呈現以下兩者之第一T細胞：i)對T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基具有特異性的TCR；及ii)結合至T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之MOD的Co-MOD。舉例而言，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物以比其結合第二T細胞之親和力高出至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少200% (2倍)、至少250% (2.5倍)、至少500% (5倍)、至少1,000% (10倍)、至少1,500% (15倍)、至少2,000% (20倍)、至少2,500% (25倍)、至少5,000% (50倍)、至少10,000% (100倍)或超過100倍的親和力結合至第一T細胞。
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP抗原決定基結合物在投與有需要之個體時誘導抗原決定基特異性T細胞反應及抗原決定基非特異性T細胞反應。本發明之T細胞-MMP抗原決定基結合物在投與有需要之個體時藉由調節呈現以下兩者之第一T細胞的活性而誘導抗原決定基特異性T細胞反應：i)對T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基具有特異性的TCR；及ii)結合至T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之MOD的Co-MOD。T細胞-MMP抗原決定基結合物亦藉由調節呈現以下各項之第二T細胞的活性而誘導抗原決定基非特異性T細胞反應：i)對除T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基以外的抗原決定基具有特異性的TCR；及ii)結合至T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之MOD的Co-MOD。抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1或至少100:1。抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為約2:1至約5:1、約5:1至約10:1、約10:1至約15:1、約15:1至約20:1、約20:1至約25:1、約25:1至約50:1或約50:1至約100:1，或超過100:1。「調節」T細胞之「活性」可包括以下一或多項：i)活化細胞毒性(例如CD8+ ) T細胞；ii)誘導細胞毒性(例如CD8+ ) T細胞之細胞毒性活性；iii)誘導細胞毒性(例如CD8+ ) T細胞之細胞毒素(例如，穿孔素；顆粒酶；顆粒溶素)之產生及釋放；iv)抑制自體反應性T細胞之活性；及其類似操作。
MOD對其Co-MOD之降低之親和力與抗原決定基對TCR之親和力的組合提供本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之增強之選擇性。因而，舉例而言，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物相較於其結合至呈現以下之第二T細胞之親合力：i)對除T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基以外的抗原決定基具有特異性的TCR；及ii)結合至T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之MOD的Co-MOD，以較高親合力結合至呈現以下兩者之第一T細胞：i)對T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基具有特異性之TCR；及ii)結合至T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之MOD的Co-MOD。
I.A.2.8 測定結合親和力
可藉由生物層干涉術(BLI)使用經純化之MOD及經純化之Co-MOD來測定MOD與其Co-MOD之間的結合親和力。可藉由BLI使用經純化之T細胞-MMP-抗原決定基結合物及Co-MOD來測定T細胞-MMP-抗原決定基結合物與其Co-MOD之間的結合親和力。BLI方法對熟習此項技術者為熟知的。參見例如Lad等人 (2015)J. Biomol. Screen . 20(4):498-507；以及Shah及Duncan (2014)J. Vis. Exp. 18:e51383。可使用以下程序測定本發明中所描述之Co-MOD與MOD之間或Co-MOD與T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物)之間的特異性結合親和力及相對結合親和力。
可使用Octet RED 96 (Pal FortéBio)儀器或類似儀器如下進行BLI分析。舉例而言，為了測定Co-MOD對T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物) (例如，本發明之具有變異MOD之T細胞-MMP抗原決定基結合物；或包含野生型MOD之對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物)之結合親和力，將T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物)固定至不溶性載體(「生物感測器」)上。經固定之T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物)為「標靶」。可藉由將捕獲抗體固定至不溶性載體上來實現固定，其中該捕獲抗體固定該T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物)。舉例而言，在T細胞-MMP包含IgFc多肽時，可藉由將抗Fc (例如，抗人類IgG Fc)抗體固定至不溶性載體上並且使T細胞-MMP抗原決定基結合物與將結合至並且固定其之經固定抗Fc抗體接觸來實現固定。將Co-MOD以若干不同的濃度施加至經固定之T細胞-MMP (或其經固定之抗原決定基結合物)，並且記錄儀器之反應。在包含25 mM HEPES pH 6.8、5%聚(乙二醇) 6000、50 mM KCl、0.1%牛血清白蛋白及0.02% Tween 20非離子清潔劑之液體介質中進行分析。在30℃下進行Co-MOD與經固定之T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物)之結合。作為結合親和力之陽性對照，可使用抗I類MHC單株抗體。舉例而言，可使用抗I類HLA單株抗體W6/32 (美國典型菌種保藏中心第HB-95號；Parham等人，(1979)J. Immunol . 123:342)，其具有7 nM之KD 。可使用抗I類MHC單株抗體之連續稀釋來產生標準曲線。Co-MOD或抗I類MHC mAb為「分析物」。BLI分析自兩個表面反射之白光的干涉圖案：i)經固定之多肽(「標靶」)；及ii)內部參考層。與生物感測器尖端結合之分子(「分析物」；例如，Co-MOD；抗HLA抗體)的數目變化引起干涉圖案位移；可即時量測此干涉圖案位移。描述標靶/分析物相互作用之親和力的兩個動力學術語為締合常數(k a )及解離常數(k d )。此兩個術語之比率(k d /k a )得到親和力常數KD 。亦可用固定於生物感測器上之經純化之野生型或其變異MOD來進行分析，其中以若干不同的濃度施加Co-MOD以測定MOD與其Co-MOD之間的結合參數。
測定Co-MOD (例如，IL-2R)與野生型MOD (例如，IL-2)及變異MOD (例如，如本文中所揭示之IL-2變異體)或者含有野生型MOD或變異MOD之T細胞MMP (或其抗原決定基結合物)的結合親和力因而允許確定野生型分子及變異分子之相對結合親和力。亦即，可確定變異MOD對其受體(其Co-MOD)之結合親和力與野生型MOD對同一Co-MOD之結合親和力相比是否有所降低，並且若有所降低，即為相對於野生型Co-MOD之結合親和力的降低百分比。
在多孔平板中進行BLI分析。為了進行該分析，定義平板佈局，定義分析步驟，且在Octet Data Acquisition軟體中給生物感測器賦值。使生物感測器組合件水化。使經水化之生物感測器組合件及分析板在Octet儀器上平衡10分鐘。一旦獲取資料，便將所獲取之資料加載至Octet Data Analysis軟體中。在處理窗口中藉由規定參考扣除、y軸比對、步驟間修正及Savitzky-Golay過濾之方法來處理資料。在分析窗口中藉由規定欲分析之步驟(締合及解離)、選擇曲線擬合模型(1:1)、擬合方法(全域)及相關窗口(以秒計)來分析資料。評估擬合品質。各資料跡線(分析物濃度)之KD 值若在3倍範圍內則可取平均值。KD 誤差值應在親和力常數值之一個數量級內；R2 值應在0.95以上。參見例如Abdiche等人(2008)J. Anal. Biochem. 377:209。
除非本文中另外陳述，否則使用如以上所描述之BLI來測定本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物對Co-MOD之親和力或對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物(其中對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含野生型MOD)對Co-MOD之親和力。同樣，可使用如以上所描述之BLI來測定MOD及其Co-MOD多肽之親和力。
在一些情況下，當藉由BLI (如以上所描述)加以量測時，i)對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物(其中該對照包含野生型MOD)對Co-MOD之結合親和力與ii)包含野生型MOD之變異體的本發明T細胞-MMP-抗原決定基結合物對Co-MOD之結合親和力的比率為至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102 :1、至少5×102 :1、至少103 :1、至少5×103 :1、至少104 :1、至少105 :1或至少106 :1。在一些情況下，當藉由BLI加以量測時，i)對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物(其中該對照包含野生型MOD)對Co-MOD之結合親和力與ii)包含野生型MOD之變異體的本發明T細胞-MMP-抗原決定基結合物對Co-MOD之結合親和力的比率處於1.5:1至106 :1，例如1.5:1至10:1、10:1至50:1、50:1至102 :1、102 :1至103 :1、103 :1至104 :1、104 :1至105 :1或105 :1至106 :1之範圍內。
作為一個實例，在對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含野生型IL-2多肽時，且在本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含變異IL-2多肽(相對於野生型IL-2多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為MOD時，當藉由BLI加以量測時，i)本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之結合親和力與ii)對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物對IL-2受體(亦即，Co-MOD)之結合親和力的比率為至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102 :1、至少5×102 :1、至少103 :1、至少5×103 :1、至少104 :1、至少105 :1或至少106 :1。在一些情況下，在對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含野生型IL-2多肽時，且在本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含變異IL-2多肽(相對於野生型IL-2多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為MOD時，當藉由BLI加以量測時，i)本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之結合親和力與ii)對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物對IL-2受體(亦即，Co-MOD)之結合親和力的比率處於1.5:1至106 :1，例如1.5:1至10:1、10:1至50:1、50:1至102 :1、102 :1至103 :1、103 :1至104 :1、104 :1至105 :1或105 :1至106 :1之範圍內。
作為另一實例，在對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含野生型PD-L1多肽時，且在本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含變異PD-L1多肽(相對於野生型PD-L1多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為MOD時，當藉由BLI加以量測時，i)本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之結合親和力與ii)對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物對PD-1 (亦即，Co-MOD)之結合親和力的比率為至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102 :1、至少5×102 :1、至少103 :1、至少5×103 :1、至少104 :1、至少105 :1或至少106 :1。
作為另一實例，在對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含野生型CD80多肽時，且在本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含變異CD80多肽(相對於野生型CD80多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為MOD時，當藉由BLI加以量測時，i)本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之結合親和力與ii)對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物對CTLA4 (亦即，Co-MOD)之結合親和力的比率為至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102 :1、至少5×102 :1、至少103 :1、至少5×103 :1、至少104 :1、至少105 :1或至少106 :1。
作為另一實例，在對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含野生型CD80多肽時，且在本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含變異CD80多肽(相對於野生型CD80多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為MOD時，當藉由BLI加以量測時，i)本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之結合親和力與ii)對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物對CD28 (亦即，Co-MOD)之結合親和力的比率為至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102 :1、至少5×102 :1、至少103 :1、至少5×103 :1、至少104 :1、至少105 :1或至少106 :1。
作為另一實例，在對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含野生型4-1BBL多肽時，且在本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含變異4-1BBL多肽(相對於野生型4-1BBL多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為MOD時，當藉由BLI加以量測時，i)本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之結合親和力與ii)對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物對4-1BB (亦即，Co-MOD)之結合親和力的比率為至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102 :1、至少5×102 :1、至少103 :1、至少5×103 :1、至少104 :1、至少105 :1或至少106 :1。
作為另一實例，在對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含野生型CD86多肽時，且在本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含變異CD86多肽(相對於野生型CD86多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為MOD時，當藉由BLI加以量測時，i)本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之結合親和力與ii)對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物對CD28 (亦即，Co-MOD)之結合親和力的比率為至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102 :1、至少5×102 :1、至少103 :1、至少5×103 :1、至少104 :1、至少105 :1或至少106 :1。
可用以下方式量測本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物對靶T細胞之結合親和力：A)使本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物與在其表面上表現以下各物之靶T細胞接觸：i)結合親本野生型MOD之Co-MOD；及ii)結合抗原決定基之T細胞受體，其中該T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含抗原決定基標籤或螢光標記物，以使該T細胞-MMP-抗原決定基結合物結合至靶T細胞；B)若T細胞-MMP抗原決定基結合物未經標記，則使靶T細胞結合之T細胞-MMP-抗原決定基結合物與結合該抗原決定基標籤之經螢光標記之結合劑(例如，經螢光標記之抗體)接觸，從而產生T細胞-MMP-抗原決定基結合物/靶T細胞/結合劑複合體；C)使用流式細胞術來量測T細胞-MMP-抗原決定基結合物/靶T細胞/結合劑複合體之平均螢光強度(MFI)。抗原決定基標籤可為例如FLAG標籤、血球凝集素標籤、c-myc標籤、聚(組胺酸)標籤等。在T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員之濃度範圍內量測之MFI提供親和力之量度。在T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員之濃度範圍內量測之MFI提供T細胞-MMP-抗原決定基結合物之半最大有效濃度(EC50 )。在一些情況下，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物對靶T細胞之EC50 處於nM範圍內；且該T細胞-MMP-抗原決定基結合物對對照T細胞(其中對照T細胞在其表面上表現：i)結合親本野生型MOD之Co-MOD；及ii)不結合至T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基的T細胞受體)之EC50 處於μM範圍內。在一些情況下，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物對對照T細胞之EC50 與該T細胞-MMP-抗原決定基結合物對靶T細胞之EC50 的比率為至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102 :1、至少5×102 :1、至少103 :1、至少5×103 :1、至少104 :1、至少105 :1或至少106 :1。本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物對對照T細胞之EC50 與該T細胞-MMP-抗原決定基結合物對靶T細胞之EC50 的比率為T細胞-MMP-抗原決定基結合物之選擇性的表現。
在一些情況下，當如前一段中所描述進行量測時，相較於T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員與包含以下各物之對照T細胞的結合：i)結合親本野生型MOD之Co-MOD；及ii)結合至除T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員中所存在之抗原決定基以外的抗原決定基的T細胞受體，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物對靶T細胞展現選擇性結合。
二聚之多聚 T 細胞調節多肽
本發明之T細胞-MMP，包括具有與其化學結合之抗原決定基的彼等T細胞-MMP，可二聚；亦即，本發明提供一種包含本發明之多聚T細胞-MMP之二聚體的多聚體多肽。因而，本發明提供一種多聚體T細胞-MMP，其包含：A)第一異源二聚體，該第一異源二聚體包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)肽抗原決定基；及ii)第一主要組織相容性複合體(MHC)多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含第二MHC多肽，其中該第一異源二聚體包含一或多個MOD；及B)第二異源二聚體，該第二異源二聚體包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)肽抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含第二MHC多肽，其中該第二異源二聚體包含一或多個MOD，且其中該第一異源二聚體及該第二異源二聚體彼此共價連接。在一些情況下，該兩個多聚體T細胞-MMP在胺基酸序列方面彼此相同。在一些情況下，該第一異源二聚體及該第二異源二聚體經由該第一異源二聚體之第二多肽之C末端區域及該第二異源二聚體之第二多肽之C末端區域彼此共價連接。在一些情況下，該第一異源二聚體及該第二異源二聚體經由該第一異源二聚體之第二多肽之C末端胺基酸及該第二異源二聚體之第二多肽之C末端區域彼此共價連接；舉例而言，在一些情況下，該第一異源二聚體之第二多肽之C末端胺基酸及該第二異源二聚體之第二多肽之C末端區域直接或經由連接子彼此連接。該連接子可為肽連接子。該肽連接子可具有1個胺基酸至200個胺基酸之長度(例如，1個胺基酸(aa)至5 aa、5 aa至10 aa、10 aa至25 aa、25 aa至50 aa、50 aa至100 aa、100 aa至150 aa或150 aa至200 aa)。在一些情況下，該第一異源二聚體之肽抗原決定基及該第二異源二聚體之肽抗原決定基包含相同的胺基酸序列。在一些情況下，該第一異源二聚體及該第二異源二聚體之第一MHC多肽為I類MHC β2M，且該第一異源二聚體及該第二異源二聚體之第二MHC多肽為I類MHC重鏈。在一些情況下，該第一異源二聚體之MOD及該第二異源二聚體之MOD包含相同的胺基酸序列。在一些情況下，該第一異源二聚體之MOD及該第二異源二聚體之MOD為與相應親本野生型MOD相比包含1至10個胺基酸取代之變異MOD，其中1至10個胺基酸取代引起變異MOD對Co-MOD之結合親和力降低。在一些情況下，該第一異源二聚體之MOD及該第二異源二聚體之MOD係選自由以下各項組成之群：IL-2、4-1BBL、PD-L1、CD70、CD80、CD86、ICOS-L、OX-40L、FasL、JAG1(CD339)、TGFβ、ICAM及其變異MOD (例如，與相應親本野生型MOD相比具有1至10個胺基酸取代之變異MOD)。以下描述適合MHC多肽、MOD及肽抗原決定基之實例。
除二聚體以外，本發明之T細胞-MMP及T細胞-MMP抗原決定基結合物可形成高級複合體，包括三聚體、四聚體或五聚體。包含T細胞-MMP多聚體之組合物亦可包含低級複合體，諸如單體，且因此可包含單體、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或其任何組合(例如，單體與二聚體之混合物)。
I.B. T 細胞 -MMP 之 MHC 多肽
如以上所指出，T細胞-MMP及T細胞-MMP-抗原決定基結合物包括MHC多肽。出於本發明之目的，術語「主要組織相容性複合體(MHC)多肽」意欲包括不同物種之I類MHC多肽，包括人類MHC (亦稱為人類白血球抗原(HLA))多肽、囓齒動物(例如，小鼠、大鼠等) MHC多肽及其他哺乳動物物種(例如，兔類動物、非人類靈長類動物、犬科動物、貓科動物、有蹄類動物(例如，馬、牛、綿羊、山羊等)及其類似物種之MHC多肽。術語「MHC多肽」意欲包括I類MHC多肽(例如，β-2微球蛋白及I類MHC重鏈及/或其部分)。
如以上所指出，本文中所描述之T細胞-MMP及T細胞-MMP-抗原決定基結合物之第一MHC多肽及第二MHC多肽為I類MHC多肽(例如，在一些情況下，該第一MHC多肽為I類MHC β2M (β2M)多肽，且該第二MHC多肽為I類MHC重鏈(H鏈) (「MHC-H」))。在一實施例中，T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物)中之β2M及MHC-H鏈序列具有人類起源。除非另外明確陳述，否則本文中所描述之T細胞-MMP不意欲包括I類MHC分子之膜錨定域(跨膜區)，或該分子中足以將所得T細胞-MMP或其肽錨定至表現其之細胞(例如，真核生物細胞，諸如哺乳動物細胞)的部分。
在T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之人類MHC多肽為人類MHC多肽時，其亦可稱為「人類白血球抗原」(「HLA」)多肽。在一些情況下，T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之MHC多肽為I類HLA多肽，例如β2M多肽或I類HLA重鏈多肽。可包括在T細胞-MMP或其抗原決定基結合物中之I類HLA重鏈多肽包括HLA-A重鏈多肽、HLA-B重鏈多肽、HLA-C重鏈多肽、HLA-E重鏈多肽、HLA-F重鏈多肽及HLA-G重鏈多肽或包含與圖3A、圖3B、圖3C及/或圖3D中所描繪之人類HLA重鏈多肽中任一者之胺基酸序列之胺基酸25-365具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之序列的多肽(例如，其可包含1-30、1-5、5-10、10-15或15-20、20-25或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。作為一個實例，多聚體多肽之I類MHC重鏈多肽可包含與圖3A中所描繪之人類HLA-A重鏈多肽中任一者之胺基酸序列之胺基酸25-365具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
I.B.1 I 類 MHC 重鏈
HLA-A(HLA-A*01:01:01:01)
在一實施例中，T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之I類MHC重鏈多肽包含HLA-A*01:01:01:01 (圖3D中之HLA-A (SEQ ID NO:140))之胺基酸序列，或與該序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15或15-20、20-25或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。在一實施例中，在T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A重鏈多肽與圖3D中標記為HLA-A之序列具有低於100%一致性時，其可能在位置84、139及/或236中之一或多個處包含選自以下之突變：位置84處酪胺酸至丙胺酸(Y84A)；位置84處酪胺酸至半胱胺酸(Y84C)；位置139處丙胺酸至半胱胺酸(A139C)；及位置236處丙胺酸至半胱胺酸取代(A236C)。Y84A取代打開MHC結合袋之一端，允許連接子(若存在)「穿」過袋狀結構之該端，並且允許抗原決定基大小存在更大程度之變化(例如，攜帶抗原決定基序列之較長肽)以便裝配至袋狀結構中並且由T細胞-MMP呈現。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A重鏈多肽包含Y84A及A236C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A重鏈多肽包含Y84C及A139C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A重鏈多肽包含Y84C、A139C及A236C突變。
HLA-A*0201
在一實施例中，T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之I類MHC重鏈多肽包含圖3D中所提供之HLA-A*0201 (SEQ ID NO:143)之胺基酸序列，或與該序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15或15-20、20-25或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。在一實施例中，在T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*0201 重鏈多肽與圖3D中標記為HLA-A*0201 之序列具有低於100%一致性時，其可能在位置84、139及/或236中之一或多個處包含選自以下之突變：位置84處酪胺酸至丙胺酸(Y84A)；位置84處酪胺酸至半胱胺酸(Y84C)；位置139處丙胺酸至半胱胺酸(A139C)；及位置236處丙胺酸至半胱胺酸取代(A236C)。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*0201 重鏈多肽包含Y84A及A236C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*0201 重鏈多肽包含Y84C及A139C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*0201 重鏈多肽包含Y84C、A139C及A236C突變。
HLA-A*1101
在一實施例中，T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之I類MHC重鏈多肽包含圖3D中所提供之HLA-A*1101 (SEQ ID NO:148)之胺基酸序列，或與該序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15或15-20、20-25或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。在一實施例中，在T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*1101 重鏈多肽與圖3D中標記為HLA-A*1101 之序列具有低於100%一致性時，其可能在位置84、139及/或236中之一或多個處包含選自以下之突變：位置84處酪胺酸至丙胺酸(Y84A)；位置84處酪胺酸至半胱胺酸(Y84C)；位置139處丙胺酸至半胱胺酸(A139C)；及位置236處丙胺酸至半胱胺酸取代(A236C)。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*1101 重鏈多肽包含Y84A及A236C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*1101 重鏈多肽包含Y84C及A139C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*1101 重鏈多肽包含Y84C、A139C及A236C突變。
HLA-A*2402
在一實施例中，T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之I類MHC重鏈多肽包含圖3D中所提供之HLA-A*2402 (SEQ ID NO:149)之胺基酸序列，或與該序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15或15-20、20-25或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。在一實施例中，在T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*2402 重鏈多肽與圖3D中標記為HLA-A*2402 之序列具有低於100%一致性時，其可能在位置84、139及/或236中之一或多個處包含選自以下之突變：位置84處酪胺酸至丙胺酸(Y84A)；位置84處酪胺酸至半胱胺酸(Y84C)；位置139處丙胺酸至半胱胺酸(A139C)；及位置236處丙胺酸至半胱胺酸取代(A236C)。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*2402 重鏈多肽包含Y84A及A236C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*2402 重鏈多肽包含Y84C及A139C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*2402 重鏈多肽包含Y84C、A139C及A236C突變。
HLA-A*3303
在一實施例中，T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之I類MHC重鏈多肽包含圖3D中所提供之HLA-A*3303 (SEQ ID NO:150)之胺基酸序列，或與該序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15或15-20、20-25或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。在一實施例中，在T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*3303 重鏈多肽與圖3D中標記為HLA-A*3303 之序列具有低於100%一致性時，其可能在位置84、139及/或236中之一或多個處包含選自以下之突變：位置84處酪胺酸至丙胺酸(Y84A)；位置84處酪胺酸至半胱胺酸(Y84C)；位置139處丙胺酸至半胱胺酸(A139C)；及位置236處丙胺酸至半胱胺酸取代(A236C)。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*3303 重鏈多肽包含Y84A及A236C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*3303 重鏈多肽包含Y84C及A139C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-A*3303 重鏈多肽包含Y84C、A139C及A236C突變。
HLA-B
在一實施例中，T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之I類MHC重鏈多肽包含HLA-B (SEQ ID NO:141) (圖3D中之HLA-B)之胺基酸序列，或與該序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15或15-20、20-25或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。在一實施例中，在T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-B重鏈多肽與圖3D中標記為HLA-B之序列具有低於100%一致性時，其可能在位置84、139及/或236中之一或多個處包含選自以下之突變：位置84處酪胺酸至丙胺酸(Y84A)；位置84處酪胺酸至半胱胺酸(Y84C)；位置139處丙胺酸至半胱胺酸(A139C)；及位置236處丙胺酸至半胱胺酸取代(A236C)。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-B重鏈多肽包含Y84A及A236C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-B重鏈多肽包含Y84C及A139C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-B重鏈多肽包含Y84C、A139C及A236C突變。
HLA-C
在一實施例中，T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之I類MHC重鏈多肽包含HLA-C (SEQ ID NO:142) (圖3D中之HLA-C)之胺基酸序列，或與該序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15或15-20、20-25或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。在一實施例中，在T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-C重鏈多肽與圖3D中標記為HLA-C之序列具有低於100%一致性時，其可能在位置84、139及/或236中之一或多個處包含選自以下之突變：位置84處酪胺酸至丙胺酸(Y84A)；位置84處酪胺酸至半胱胺酸(Y84C)；位置139處丙胺酸至半胱胺酸(A139C)；及位置236處丙胺酸至半胱胺酸取代(A236C)。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-C重鏈多肽包含Y84A及A236C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-C重鏈多肽包含Y84C及A139C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA-C重鏈多肽包含Y84C、A139C及A236C突變。
小鼠 H2K
在一實施例中，T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之I類MHC重鏈多肽包含小鼠H2K (SEQ ID NO:144) (圖3D中之小鼠H2K)之胺基酸序列，或與該序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15或15-20、20-25或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。在一實施例中，在T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之小鼠H2K重鏈多肽與圖3D中標記為小鼠H2K之序列具有低於100%一致性時，其可能在位置84、139及/或236中之一或多個處包含選自以下之突變：位置84處酪胺酸至丙胺酸(Y84A)；位置84處酪胺酸至半胱胺酸(Y84C)；位置139處丙胺酸至半胱胺酸(A139C)；及位置236處丙胺酸至半胱胺酸取代(A236C)。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之小鼠H2K重鏈多肽包含Y84A及A236C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之小鼠H2K重鏈多肽包含Y84C及A139C突變。在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之小鼠H2K重鏈多肽包含Y84C、A139C及A236C突變。
位置 116 及 167 處之取代
任何I類MHC重鏈序列(包括上文針對以下各項所揭示之彼等I類MHC重鏈序列：HLA-A (HLA-A*01:01:01:01)；HLA-A*0201；HLA-A*1101；HLA-A*2402；HLA-A*3303；HLA-B；HLA-C；及小鼠H2K)均可進一步包含處於位置116處之半胱胺酸取代(Y116C，從而提供硫醇以用於錨定抗原決定基肽，諸如藉由與馬來醯亞胺肽反應)及/或位置167處之丙胺酸(W167A)或半胱胺酸(W167C)之一。如同打開MHC-H結合袋之一端的取代(例如，位置84處或其等效物，諸如Y84A)，位置167處之丙胺酸或甘胺酸取代或其等效物(例如，W167A取代)打開MHC結合袋之另一端，從而產生可由T細胞-MMP抗原決定基結合物呈現之允許更大程度變化(例如，更長之長度)抗原決定基肽之溝槽。位置84及167處之取代或其等效物(例如，Y84A與W167A或W167G之組合)可組合用於修飾MHC-H鏈之結合袋。在位置167處置放半胱胺酸(例如，W167C突變)或其等效物提供硫醇殘基以用於錨定抗原決定基肽)。位置116及167處之半胱胺酸取代可分別用於錨定抗原決定基(例如，抗原決定基肽)或組合用於錨定兩個位置(例如，含抗原決定基之肽的諸端)上之抗原決定基。位置116及/或167處之突變可與以上所描述之位置84、139及/或236處之任一或多個突變組合。
取代之組合
當胺基酸84及139皆為半胱胺酸時，其可形成鏈內二硫鍵，從而即使在未負載抗原決定基肽時亦可使1類MHC蛋白穩定且允許轉譯及由真核生物細胞分泌。當位置84為C殘基時，其亦可與同β2M多肽N末端附接之連接子形成鏈內二硫鍵(例如，抗原決定基-GCGGS(G4 S)n (SEQ ID NO:133)-成熟β2M多肽，參見SEQ IDNO:151至155)。當胺基酸236為半胱胺酸時，其可與在胺基酸12處包含R12C取代之變異β2M多肽之該位置上之半胱胺酸形成鏈間二硫鍵。可併入T細胞-MMP或其抗原決定基結合物中之1類MHC重鏈序列修飾之一些可能組合示於下表中。該表中所提供之殘基84、139及236處之取代的任何組合均可與該表中所提供之位置116及167處之取代的任何組合進行組合。
可併入T細胞-MMP或其抗原決定基結合物中之1類MHC重鏈序列修飾之一些組合
⁑該序列一致性範圍為併入T細胞-MMP中之MHC-H多肽序列相對於圖3D中所列出之序列的序列一致性的容許範圍。
I.B.2 I 類 MHC β 2- 微球蛋白及與 MHC-H 多肽之組合
多聚體多肽之β2M多肽可為人類β2M多肽、非人類靈長類動物β2M多肽、鼠類β2M多肽及其類似物。在一些情況下，β2M多肽包含與圖4中所描繪之β2M胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在一些情況下，β2M多肽包含與圖4中所描繪之β2M胺基酸序列之胺基酸21至119具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
在一些情況下，MHC多肽相對於參考MHC多肽包含單一胺基酸取代(其中參考MHC多肽可為野生型MHC多肽)，其中該單一胺基酸取代以半胱胺酸(Cys)殘基取代胺基酸。此類半胱胺酸殘基當存在於T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之第一多肽之MHC多肽中時可與第二多肽鏈中所存在之半胱胺酸殘基形成二硫鍵。
在一些情況下，多聚體多肽之第一多肽中之第一MHC多肽及/或多聚體多肽之第二多肽中之第二MHC多肽包括以半胱胺酸取代胺基酸之胺基酸取代，其中第一MHC多肽中之經取代之半胱胺酸與第二MHC多肽中之半胱胺酸形成二硫鍵，其中第一MHC多肽中之半胱胺酸與第二MHC多肽中之經取代之半胱胺酸形成二硫鍵，或其中第一MHC多肽中之經取代之半胱胺酸與第二MHC多肽中之經取代之半胱胺酸形成二硫鍵。
舉例而言，在一些情況下，HLA β2M及I類HLA重鏈中之以下殘基配對之一經半胱胺酸取代(其中殘基編號為成熟多肽之彼等殘基編號)：1) β2M殘基12、I類HLA重鏈殘基236；2) β2M殘基12、I類HLA重鏈殘基237；3) β2M殘基8、I類HLA重鏈殘基234；4) β2M殘基10、I類HLA重鏈殘基235；5) β2M殘基24、I類HLA重鏈殘基236；6) β2M殘基28、I類HLA重鏈殘基232；7) β2M殘基98、I類HLA重鏈殘基192；8) β2M殘基99、I類HLA重鏈殘基234；9) β2M殘基3、I類HLA重鏈殘基120；10) β2M殘基31、I類HLA重鏈殘基96；11) β2M殘基53、I類HLA重鏈殘基35；12) β2M殘基60、I類HLA重鏈殘基96；13) β2M殘基60、I類HLA重鏈殘基122；14) β2M殘基63、I類HLA重鏈殘基27；15) β2M殘基Arg3、I類HLA重鏈殘基Gly120；16) β2M殘基His31、I類HLA重鏈殘基Gln96；17) β2M殘基Asp53、I類HLA重鏈殘基Arg35；18) β2M殘基Trp60、I類HLA重鏈殘基Gln96；19) β2M殘基Trp60、I類HLA重鏈殘基Asp122；20) β2M殘基Tyr63、I類HLA重鏈殘基Tyr27；21) β2M殘基Lys6、I類HLA重鏈殘基Glu232；22) β2M殘基Gln8、I類HLA重鏈殘基Arg234；23) β2M殘基Tyr10、I類HLA重鏈殘基Pro235；24) β2M殘基Ser11、I類HLA重鏈殘基Gln242；25) β2M殘基Asn24、I類HLA重鏈殘基Ala236；26) β2M殘基Ser28、I類HLA重鏈殘基Glu232；27) β2M殘基Asp98、I類HLA重鏈殘基His192；及28) β2M殘基Met99、I類HLA重鏈殘基Arg234。I類MHC/HLA重鏈之胺基酸編號參考無信號肽之成熟I類MHC/HLA重鏈。舉例而言，在圖3A中所描繪之包括信號肽之胺基酸序列中，Gly120為Gly144；Gln96為Gln120；等等。在一些情況下，β2M多肽包含R12C取代，且I類HLA重鏈包含A236C取代；在此類情況下，二硫鍵形成在β2M多肽之Cys-12與I類HLA重鏈之Cys-236之間。舉例而言，在一些情況下，成熟HLA-A胺基酸序列之殘基236 (亦即，圖3A中所描繪之胺基酸序列之殘基260)經Cys取代。在一些情況下，成熟HLA-B胺基酸序列之殘基236 (亦即，圖3B中所描繪之胺基酸序列之殘基260)經Cys取代。在一些情況下，成熟HLA-C胺基酸序列之殘基236 (亦即，圖3C中所描繪之胺基酸序列之殘基260)經Cys取代。在一些情況下，圖4中所描繪之胺基酸序列之殘基32 (對應於成熟β2M之Arg-12)經Cys取代。
各別地，或除β2M及I類HLA重鏈多肽中可用於在T細胞-MMP之第一多肽與第二多肽之間形成二硫鏈間二硫鍵之成對半胱胺酸殘基(如上文所論述)以外，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之HLA重鏈可經半胱胺酸取代以便在取代至α1螺旋之羧基端部分中的半胱胺酸與α2-1螺旋之胺基端部分中的半胱胺酸之間形成鏈內二硫鍵。此類二硫鍵使T細胞-MMP穩定且允許其在不存在已結合之抗原決定基肽(或無效肽)之情況下進行細胞加工及自真核生物細胞分泌。在一個實施例中，α1螺旋之羧基端部分自I類MHC重鏈之約胺基酸位置79至約胺基酸位置89，且α2-1螺旋之胺基端部分自約胺基酸位置134至胺基酸位置144 (胺基酸位置係基於無其前導序列之重鏈序列而確定(參見例如圖3D)。在一個此類實施例中，二硫鍵介於位於I類MHC重鏈之位置83、84或85處之半胱胺酸與位於位置138、139或140中之任一者處的半胱胺酸之間。舉例而言，可由併入I類MHC重鏈中胺基酸83處之半胱胺酸及位於位置138、139或140中任一者處之胺基酸處的半胱胺酸形成二硫鍵。替代地，可在插入位置84處之半胱胺酸與插入位置138、139或140中任一者處之半胱胺酸之間或在插入位置85處之半胱胺酸與插入位置138、139或140中任一者處之半胱胺酸之間形成二硫鍵。在一實施例中，1類MHC重鏈鏈內二硫鍵介於取代至重鏈序列中位置84與139處之半胱胺酸之間(例如，該重鏈序列可為圖3D中所示之重鏈序列之一)。如以上所指出，I類MHC鏈內二硫鍵(包括介於84與139處之半胱胺酸之間的二硫鍵)中之任一者可與鏈內二硫鍵(包括介於1類MHC重鏈位置236與如例如圖4中所示之成熟β2M多肽序列(缺乏其前導序列)之位置12之間的鍵)組合。
在另一實施例中，可在T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之MHC-H序列中介於取代至圖3D中所提供之序列之胺基酸位置79與89之間的區域中的半胱胺酸與取代至胺基酸位置134與144之間的區域中的半胱胺酸之間形成鏈內二硫鍵。在此類實施例中，I類MHC重鏈序列可在形成介於α1螺旋之羧基端部分與α2-1螺旋之胺基端部分之間的二硫鍵的半胱胺酸前後具有1至5個胺基酸之插入、缺失及/或取代。任何插入之胺基酸均可選自天然存在之胺基酸或除脯胺酸及丙胺酸以外之天然存在之胺基酸。
在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之β2M多肽包含NP_004039.1、NP_001009066.1、NP_001040602.1、NP_776318.l或NP_033865.2 (SEQ ID NO 151至155)中任一者之成熟β2M多肽序列(胺基酸21-119)。
在一些情況下，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之I類HLA重鏈多肽包含圖3D中所示之HLA-A、HLA-B或HLA-C序列中之任一者。重鏈序列中之任一者均可在位置84及139處進一步包含可用於鏈內二硫鍵之半胱胺酸取代。
在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之β2M多肽包含圖4中之序列中之任一者的成熟β2M多肽序列(胺基酸21-119)，該多肽序列進一步包含R12C取代。
在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物包含：第一肽，該第一肽包含具有R12C取代之成熟β2M多肽序列(例如，圖4中之序列中之任一者的胺基酸21-119)；及第二多肽，該第二多肽包含在位置236處攜帶半胱胺酸的圖3D中之HLA-A、HLA-B或HLA-C重鏈序列中之任一者。在此類實施例中，鏈內二硫鍵可形成在位置12與236處之半胱胺酸之間。另外，該等重鏈序列中之任一者均可在位置84及139處進一步包含可用於鏈內二硫鍵之半胱胺酸取代。
在一些情況下，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之I類HLA重鏈多肽包含HLA-A*0201之胺基酸序列(圖3D)。在一些情況下，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之I類HLA重鏈多肽包含具有A236C取代之HLA-A*0201之胺基酸序列(圖3D)。在一些情況下，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之I類HLA重鏈多肽包含具有Y84A及A236C取代之HLA-A*0201之胺基酸序列(圖3D)。
在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物包含：第一肽，該第一肽包含具有R12C取代之NP_004039.1之胺基酸殘基21-119 (參見圖4)；及第二多肽，該第二多肽包含圖3D中之HLA-A0201(HLA-A2)序列。在一個此類實施例中，HLA-A0201序列具有A236C取代。在另一此類實施例中，HLA-A0201序列具有Y84C及A139C取代。在另一此類實施例中，HLA-A0201序列具有Y84C、A139C及A236C取代。如所指示，具有Y84C及A139C取代之MHC-H序列可用於穩定鏈內二硫鍵，且位置236處之半胱胺酸可鍵結至成熟β2M多肽之位置12處之半胱胺酸。
在一實施例中，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物包含有包含具有R12C取代之NP_004039.1之胺基酸殘基21-119 (參見圖4)的第一多肽；且第二多肽I類HLA重鏈多肽包含胺基酸序列
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDL(胺基酸聚簇1){C}( 胺基酸聚簇2)AGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAY DGKDYIALKEDLRSW(胺基酸聚簇3){C} (胺基酸聚簇4)HKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:156)；或者，
該第一多肽包含序列
IQRTPKIQVY SCHPAENGKS NFLNCYVSGF HPSDIEVDLLKNGERIEKVE HSDLSFSKDW SFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVNHVTLSQP KIVKWDRDM (SEQ ID NO:157，且該第二多肽包含胺基酸序列，
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDL(胺基酸聚簇1){C}( 胺基酸聚簇2)AGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAY DGKDYIALKEDLRSW(胺基酸聚簇3){C} (胺基酸聚簇4))HKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTEL(胺基酸聚簇5)(C)(胺基酸聚簇6)QKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQH EGLPKPLTLRWEP (SEQ ID NO:158)；
其中指示為{C}之半胱胺酸殘基在α1螺旋與α2-1螺旋之間形成二硫鍵，且該等(C)殘基與位置12處之β2M多肽半胱胺酸形成二硫鍵。
胺基酸聚簇1、胺基酸聚簇2、胺基酸聚簇3、胺基酸聚簇4、胺基酸聚簇5及胺基酸聚簇6在每次出現時為且獨立地選擇為1-5個胺基酸殘基，其中該等胺基酸殘基係i)獨立地選自任何天然存在之(病原性)胺基酸或ii)除脯胺酸或甘胺酸以外之任何天然存在之胺基酸。
在一實施例中：
胺基酸聚簇1可為胺基酸序列GTLRG或者有該序列一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，L置換為I、V、A或F)；
胺基酸聚簇2可為胺基酸序列YNQSE或者該序列有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，N置換為Q，Q置換為N，及/或E置換為D)；
胺基酸聚簇3可為胺基酸序列TAADM或者該序列有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，T置換為S，A置換為G，D置換為E，及/或M置換為L、V或I)；
胺基酸聚簇4可為胺基酸序列AQTTK或者該序列有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，A置換為G，Q置換為N，或T置換為S，及或K置換為R或Q)；
胺基酸聚簇5可為胺基酸序列VETRP或者該序列有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，V置換為I或L，E置換為D，T置換為S，及/或R置換為K)；及/或
胺基酸聚簇6可為胺基酸序列GDGTF或者該序列有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，D置換為E，T置換為S，或F置換為L、W或Y)。
在一些情況下，該β2M多肽包含胺基酸序列：IQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (SEQ ID NO:157)。
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP之第一多肽及第二多肽經由以下與彼此二硫鍵連接：i)連接第一多肽鏈中之肽抗原決定基及β2M多肽之連接子中所存在的Cys殘基(例如，其中該抗原決定基置放於該連接子及該β2M序列之N末端)；及ii)第二多肽鏈中之I類MHC重鏈中所存在之Cys殘基。在一些情況下，I類MHC重鏈中所存在之Cys殘基為作為Y84C取代引入之Cys。在一些情況下，連接第一多肽鏈中之肽抗原決定基及β2M多肽之連接子為GCGGS(G4 S)n，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8或9 (SEQ ID NO:133) (例如，抗原決定基-GCGGS(G4 S)n-成熟β2M多肽)。舉例而言，在一些情況下，該連接子包含胺基酸序列GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:78)。作為另一實例，該連接子包含胺基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:79)。此類二硫鍵連接之第一多肽及第二多肽之實例示意性地描繪於圖6E至圖6H中。
I.C. 支架多肽
T細胞-MMP及T細胞-MMP-抗原決定基結合物可包含Fc多肽，或可包含另一適合之支架多肽。
適合之支架多肽包括基於抗體之支架多肽及非基於抗體之支架。非基於抗體之支架包括例如白蛋白、XTEN (延伸重組)多肽、轉鐵蛋白、Fc受體多肽、彈性蛋白樣多肽(參見例如Hassouneh等人(2012)Methods Enzymol. 502:215；例如，包含五肽重複單元(Val-Pro-Gly-X-Gly；SEQ ID NO:159)之多肽，其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸)、白蛋白結合多肽、蠶絲樣多肽(參見例如Valluzzi等人(2002)Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 357:165)、蠶絲-彈性蛋白樣多肽(SELP；參見例如Megeed等人(2002)Adv Drug Deliv Rev . 54:1075)及其類似物。適合之XTEN多肽包括例如以下文獻中所揭示之彼等XTEN多肽：WO 2009/023270、WO 2010/091122、WO 2007/103515、US 2010/0189682及US 2009/0092582；亦參見Schellenberger等人(2009)Nat Biotechnol . 27:1186)。適合之白蛋白多肽包括例如人血清白蛋白。
在一些情況下，適合之支架多肽將為半衰期延長多肽。因而，在一些情況下，適合之支架多肽使多聚體多肽之活體內半衰期(例如，血清半衰期)與缺乏該支架多肽之對照多聚體多肽相比有所增加。舉例而言，在一些情況下，支架多肽使多聚體多肽之活體內半衰期與缺乏該支架多肽之對照多聚體多肽相比增加至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約50%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約100倍或超過100倍。舉例而言，在一些情況下，Fc多肽使多聚體多肽之活體內半衰期(血清半衰期)與缺乏該Fc多肽之對照多聚體多肽相比增加至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約50%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約100倍或超過100倍。
I.D. Fc 多肽
在一些情況下，T細胞-MMP (或其相應T細胞-MMP-抗原決定基結合物)之第一多肽鏈及/或第二多肽鏈包含處於多肽內或附接(例如，處於末端或由連接子附接)於多肽之可經修飾以包括一或多個化學結合位點之Fc多肽。T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之Fc多肽可例如來自IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，其可含有人類多肽序列、人類化多肽序列、合成重鏈恆定區之Fc區多肽或一致重鏈恆定區。在諸多實施例中，該Fc多肽可來自於人類IgG1 Fc、人類IgG2 Fc、人類IgG3 Fc、人類IgG4 Fc、人類IgA Fc、人類IgD Fc、人類IgE Fc、人類IgM Fc等。除非另外陳述，否則T細胞-MMP及其抗原決定基結合物中所使用之Fc多肽不包含跨膜錨定域或其足以將T細胞-MMP或其抗原決定基結合物錨定至細胞膜之部分。在一些情況下，Fc多肽包含與圖2A至圖2G中所描繪之Fc區之胺基酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在一些情況下，Fc區包含與圖2A中所描繪之人類IgG1 Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在一些情況下，Fc區包含與圖2A中所描繪之人類IgG1 Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列；且包含N77取代；例如，Fc多肽包含N77A取代。在一些情況下，Fc多肽包含與圖2A中所描繪之人類IgG2 Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列；例如，Fc多肽包含與圖2A中所描繪之人類IgG2 Fc多肽之胺基酸99-325具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在一些情況下，Fc多肽包含與圖2A中所描繪之人類IgG3 Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列；例如，Fc多肽包含與圖2A中所描繪之人類IgG3 Fc多肽之胺基酸19-246具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在一些情況下，Fc多肽包含與圖2B中所描繪之人類IgM Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列；例如，Fc多肽包含與圖2B中所描繪之人類IgM Fc多肽之胺基酸1-276具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在一些情況下，Fc多肽包含與圖2C中所描繪之人類IgA Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列；例如，Fc多肽包含與圖2C中所描繪之人類IgA Fc多肽之胺基酸1-234具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
在一些情況下，多聚體多肽中所存在之Fc多肽包含圖2A中所描繪之胺基酸序列(人類IgG1 Fc)。在一些情況下，多聚體多肽中所存在之Fc多肽包含圖2A中所描繪之胺基酸序列(人類IgG1 Fc)，但用除天冬醯胺酸以外之胺基酸取代N297。在一些情況下，多聚體多肽中所存在之Fc多肽包含圖2C中所描繪之胺基酸序列(包含N297A取代之人類IgG1 Fc)。在一些情況下，多聚體多肽中所存在之Fc多肽包含圖2A中所描繪之胺基酸序列(人類IgG1 Fc)，但用除白胺酸以外之胺基酸取代L234。在一些情況下，多聚體多肽中所存在之Fc多肽包含圖2A中所描繪之胺基酸序列(人類IgG1 Fc)，但用除白胺酸以外之胺基酸取代L235。
在一些情況下，多聚體多肽中所存在之Fc多肽包含圖2E中所描繪之胺基酸序列。在一些情況下，多聚體多肽中所存在之Fc多肽包含圖2F中所描繪之胺基酸序列。在一些情況下，多聚體多肽中所存在之Fc多肽包含圖2G中所描繪之胺基酸序列(包含L234A取代及L235A取代之人類IgG1 Fc)。在一些情況下，多聚體多肽中所存在之Fc多肽包含圖2A中所描繪之胺基酸序列(人類IgG1 Fc)，但用除脯胺酸以外之胺基酸取代P331；在一些情況下，該取代為P331S取代。在一些情況下，多聚體多肽中所存在之Fc多肽包含圖2A中所描繪之胺基酸序列(人類IgG1 Fc)，但用除白胺酸以外之胺基酸在L234及L235處進行取代。在一些情況下，多聚體多肽中所存在之Fc多肽包含圖2A中所描繪之胺基酸序列(人類IgG1 Fc)，但用除白胺酸以外之胺基酸在L234及L235處進行取代，且用除脯胺酸以外之胺基酸取代P331。在一些情況下，多聚體多肽中所存在之Fc多肽包含圖2B中所描繪之胺基酸序列(包含L234F、L235E及P331S取代之人類IgG1 Fc)。在一些情況下，多聚體多肽中所存在之Fc多肽為包含L234A及L235A取代之IgG1 Fc多肽。
I.E. 連接子
T細胞-MMP (及其T細胞-MMP-抗原決定基結合物)可包括插入例如以下任一或多者之間的一或多個獨立選擇之連接子肽：i) MHC多肽及Ig Fc多肽，其中此類連接子在本文中稱為「L1連接子」；ii) MHC多肽及MOD，其中此類連接子在本文中稱為「L2連接子」；iii)第一MOD及第二MOD，其中此類連接子在本文中稱為「L3連接子」(例如，介於第一變異4-1BBL多肽與第二變異4-1BBL多肽之間；或介於第二變異4-1BBL多肽與第三變異4-1BBL多肽之間)；iv)結合位點或肽抗原(結合之「抗原決定基」肽)及I類MHC多肽(例如，β2M)；v) I類MHC多肽及二聚多肽(例如，二聚配對之第一成員或第二成員)；及vi)二聚多肽(例如，二聚配對之第一成員或第二成員)及IgFc多肽。
適合之連接子(亦稱為「間隔子」)可容易地選擇，且可具有眾多適合長度中之任一種，諸如1個胺基酸至25個胺基酸、3個胺基酸至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸，包括4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸或7個胺基酸至8個胺基酸。在諸多實施例中，適合之連接子的長度可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個胺基酸。在一些情況下，連接子具有25個胺基酸至50個胺基酸之長度，例如25至30、30至35、35至40、40至45或45至50個胺基酸之長度。
例示性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n 、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n 、(GSGGS)n (SEQ ID NO:66)及(GGGS)n (SEQ ID NO:67)，其中n為至少一之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物及此項技術中已知的其他可撓性連接子。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物皆可使用；Gly及Ser兩者相對未經結構化，且因此可充當介於諸多組分之間的中性繫鏈。甘胺酸聚合物可觸及甚至顯著多於丙胺酸之φ-ψ空間，且所受約束比具有較長側鏈之殘基少得多(參見Scheraga,Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992))。例示性連接子亦可包含諸多胺基酸序列，包括但不限於GGSG (SEQ ID NO:68)、GGSGG (SEQ ID NO:69)、GSGSG (SEQ ID NO:70)、GSGGG (SEQ ID NO:71)、GGGSG (SEQ ID NO:72)、GSSSG (SEQ ID NO:73)及其類似胺基酸序列。例示性連接子可包括例如Gly(Ser4 )n (SEQ ID NO:74)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一個實施例中，連接子包含胺基酸序列AAAGG (SEQ ID NO:75)。
在一些情況下，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO:76)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些情況下，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之第一多肽中所存在之連接子多肽包括可與抗原決定基或者T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之第二多肽中所存在之半胱胺酸殘基形成二硫鍵的半胱胺酸殘基。在一些情況下，舉例而言，連接子包含胺基酸序列GCGGS(G4 S)n (其中n為1、2、3、4、5、6、7、8或9) (SEQ ID NO:133)、G C GASGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:77)、序列G C GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:78)或序列G C GGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:79)。
連接子，包括以上所描述之多肽連接子，可存在於與T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物)之第一多肽或第二多肽偶聯之有效負載之間。除以上所敍述之多肽連接子以外，用於將有效負載或抗原決定基(例如肽)附接至第一多肽及/或第二多肽之連接子可為非肽。此類非肽連接子包括包含例如聚乙二醇(PEG)之聚合物。亦可利用其他連接子，包括由與雙官能交聯劑(諸如以下所敍述之彼等雙官能交聯劑)偶聯而產生之彼等連接子。
I.F. 抗原決定基
本文中所描述之化學結合位點及化學反應允許將肽(抗原決定基呈現肽)及非肽抗原決定基併入T細胞-MMP中。除多肽抗原決定基以外，抗原決定基可包括例如醣肽。
在一實施例中，多聚體多肽中所存在之抗原決定基可具有約4個胺基酸至約25個胺基酸之長度，例如該抗原決定基可具有4個胺基酸(aa)至10 aa、10 aa至15 aa、15 aa至20 aa或20 aa至25 aa之長度。舉例而言，T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基可具有4個胺基酸(aa)、5 aa、6 aa、7、aa、8 aa、9 aa、10 aa、11 aa、12 aa、13 aa、14 aa、15 aa、16 aa、17 aa、18 aa、19 aa、20 aa、21 aa、22 aa、23 aa、24 aa或25 aa之長度。在一些情況下，多聚體多肽中所存在之抗原決定基具有5個胺基酸至10個胺基酸，例如5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa或10 aa之長度。
在一實施例中，T細胞特異性地結合多聚體多肽中所存在之抗原決定基，亦即，抗原決定基特異性T細胞特異性地結合該抗原決定基。抗原決定基特異性T細胞結合具有參考胺基酸序列之抗原決定基，但實質上不結合與參考胺基酸序列不同的抗原決定基。舉例而言，抗原決定基特異性T細胞結合具有參考胺基酸序列之抗原決定基，且結合與參考胺基酸序列不同的抗原決定基，若果真如此，則親和力低於10-6 M、低於10-5 M或低於10-4 M。抗原決定基特異性T細胞可以至少10-7 M、至少10-8 M、至少10-9 M或至少10-10 M之親和力結合其具有特異性之抗原決定基。
適合之肽/多肽抗原決定基包括但不限於癌症相關抗原中所存在之抗原決定基。癌症相關抗原在此項技術中為已知的；參見例如Cheever等人(2009)Clin. Cancer Res. 15:5323。癌症相關抗原包括但不限於α葉酸受體；碳酸酐酶IX (CAIX)；CD19；CD20；CD22；CD30；CD33；CD44v7/8；癌胚抗原(CEA)；上皮醣蛋白-2 (EGP-2)；上皮醣蛋白-40 (EGP-40)；葉酸結合蛋白(FBP)；胎兒乙醯膽鹼受體；神經節苷脂抗原GD2；Her2/neu；IL-13R-a2；κ輕鏈；LeY；L1細胞黏附分子；黑素瘤相關抗原(MAGE)；MAGE-A1；間皮素；MUC1；NKG2D配位體；癌胚抗原(h5T4)；前列腺幹細胞抗原(PSCA)；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；腫瘤相關醣蛋白-72 (TAG-72)；血管內皮生長因子受體-2 (VEGF-R2) (參見例如Vigneron等人(2013)Cancer Immunity 13:15；及Vigneron (2015)BioMed Res. Int’l 論文編號948501)；及表皮生長因子受體(EGFR) vIII多肽(參見例如Wong等人(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2965；及Miao等人(2014)PLoSOne 9:e94281)。在一些情況下，抗原決定基為人類乳頭狀瘤病毒E7抗原之抗原決定基；(參見例如Ramos等人(2013)J. Immunother . 36:66)。
在一些情況下，適合之肽抗原決定基為以下各物之約4個胺基酸至約20個胺基酸(例如，4個胺基酸(aa)、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10 aa、11 aa、12 aa、13 aa、14 aa、15 aa、16 aa、17 aa、18 aa、19 aa或20 aa)之長度的肽片段：MUC1多肽、人類乳頭狀瘤病毒(HPV) E6多肽、LMP2多肽、HPV E7多肽、表皮生長因子受體(EGFR) vIII多肽、HER-2/neu多肽、黑素瘤抗原家族A3 (MAGE A3)多肽、p53多肽、突變p53多肽、NY-ESO-1多肽、葉酸水解酶(前列腺特異性膜抗原；PSMA)多肽、癌胚抗原(CEA)多肽、T細胞識別之黑素瘤抗原(melanA/MART1)多肽、Ras多肽、gp100多肽、蛋白酶3 (PR1)多肽、bcr-abl多肽、酪胺酸酶多肽、存活素多肽、前列腺特異性抗原(PSA)多肽、hTERT多肽、肉瘤易位斷裂點多肽、滑膜肉瘤X (SSX)斷裂點多肽、EphA2多肽、酸性磷酸酶、前列腺(PAP)多肽、黑素瘤細胞凋亡抑制劑(ML-IAP)多肽、α-胎蛋白(AFP)多肽、上皮細胞黏附分子(EpCAM)多肽、ERG (TMPRSS2 ETS融合物)多肽、NA17多肽、配對框-3 (PAX3)多肽、退行性淋巴瘤激酶(ALK)多肽、雄激素受體多肽、週期素B1多肽、N-myc原癌基因(MYCN)多肽、Ras同系物基因家族成員C (RhoC)多肽、酪胺酸酶相關蛋白-2 (TRP-2)多肽、間皮素多肽、前列腺幹細胞抗原(PSCA)多肽、黑素瘤相關抗原-1 (MAGE A1)多肽、細胞色素P450 1B1 (CYP1B1)多肽、胎盤特異性蛋白1 (PLAC1)多肽、BORIS多肽(亦稱為CCCTC結合因子或CTCF)、ETV6-AML多肽、乳癌抗原NY-BR-1多肽(亦稱為含錨蛋白重複結構域之蛋白30A)、G蛋白信號傳導調節劑(RGS5)多肽、T細胞識別之鱗狀細胞癌抗原(SART3)多肽、碳酸酐酶IX多肽、配對框-5 (PAX5)多肽、OY-TES1 (睾丸抗原；亦稱為精子頂體蛋白結合蛋白)多肽、精液蛋白17多肽、淋巴細胞特異性蛋白-酪胺酸激酶(LCK)多肽、高分子量黑素瘤相關抗原(HMW-MAA)、A-激酶錨定蛋白-4 (AKAP-4)、滑膜肉瘤X斷裂點2 (SSX2)多肽、X抗原家族成員1 (XAGE1)多肽、B7同系物3 (B7H3；亦稱為CD276)多肽、豆莢蛋白多肽(LGMN1；亦稱為天冬醯胺醯內肽酶)、具有Ig及EGF之酪胺酸激酶同源性結構域-2 (Tie-2；亦稱為血管生成素-1受體)多肽、P抗原家族成員4 (PAGE4)多肽、血管內皮生長因子受體2 (VEGF2)多肽、MAD-CT-1多肽、纖維母細胞活化蛋白(FAP)多肽、血小板衍生生長因子受體β (PDGFβ)多肽、MAD-CT-2多肽、Fos相關抗原-1 (FOSL)多肽或威爾姆斯瘤-1 (WT-1)多肽。
癌症相關抗原之胺基酸序列在此項技術中為已知的；參見例如MUC1 (GenBank CAA56734)；LMP2 (GenBank CAA47024)；HPV E6 (GenBank AAD33252)；HPV E7 (GenBank AHG99480)；EGFRvIII (GenBank NP_001333870)；HER-2/neu (GenBank AAI67147)；MAGE-A3 (GenBank AAH11744)；p53 (GenBank BAC16799)；NY-ESO-1 (GenBank CAA05908)；PSMA (GenBank AAH25672)；CEA (GenBank AAA51967)；melan/MART1 (GenBank NP_005502)；Ras (GenBank NP_001123914)；gp100 (GenBank AAC60634)；bcr-abl (GenBank AAB60388)；酪胺酸酶(GenBank AAB60319)；存活蛋白(GenBank AAC51660)；PSA (GenBank CAD54617)；hTERT (GenBank BAC11010)；SSX (GenBank NP_001265620)；Eph2A (GenBank NP_004422)；PAP (GenBank AAH16344)；ML-IAP (GenBank AAH14475)；AFP (GenBank NP_001125)；EpCAM (GenBank NP_002345)；ERG (TMPRSS2 ETS融合物) (GenBank ACA81385)；PAX3 (GenBank AAI01301)；ALK (GenBank NP_004295)；雄性素受體(GenBank NP_000035)；週期素B1 (GenBank CAO99273)；MYCN (GenBank NP_001280157)；RhoC (GenBank AAH52808)；TRP-2 (GenBank AAC60627)；間皮素(GenBank AAH09272)；PSCA (GenBank AAH65183)；MAGE A1 (GenBank NP_004979)；CYP1B1 (GenBank AAM50512)；PLAC1 (GenBank AAG22596)；BORIS (GenBank NP_001255969)；ETV6 (GenBank NP_001978)；NY-BR1 (GenBank NP_443723)；SART3 (GenBank NP_055521)；碳酸酐酶IX (GenBank EAW58359)；PAX5 (GenBank NP_057953)；OY-TES1 (GenBank NP_115878)；精液蛋白17 (GenBank AAK20878)；LCK (GenBank NP_001036236)；HMW-MAA (GenBank NP_001888)；AKAP-4 (GenBank NP_003877)；SSX2 (GenBank CAA60111)；XAGE1 (GenBank NP_001091073；XP_001125834；XP_001125856；及XP_001125872)；B7H3 (GenBank NP_001019907；XP_947368；XP_950958；XP_950960；XP_950962；XP_950963；XP_950965；及XP_950967)；LGMN1 (GenBank NP_001008530)；TIE-2 (GenBank NP_000450)；PAGE4 (GenBank NP_001305806)；VEGFR2 (GenBank NP_002244)；MAD-CT-1 (GenBank NP_005893 NP_056215)；FAP (GenBank NP_004451)；PDGFβ (GenBank NP_002600)；MAD-CT-2 GenBank NP_001138574)；FOSL (GenBank NP_005429)；及WT-1 (GenBank NP_000369)。此等多肽亦論述於例如以下文獻中：Cheever等人(2009)Clin. Cancer Res. 15:5323，及其中引用之參考文獻；Wagner等人(2003)J. Cell. Sci. 116:1653；Matsui等人(1990)Oncogene 5:249；Zhang等人(1996)Nature 383:168。
在一些情況下，該抗原決定基為諸如病毒、支原體(例如肺炎黴漿菌)或細菌致病原之感染性致病原之抗原決定基。在抗原決定基為病毒抗原決定基之一些情況下，該抗原決定基來自於核心蛋白、早期蛋白、晚期蛋白、DNA或RNA聚合酶或者外殼蛋白。舉例而言，在一些情況下，病毒抗原決定基為來自乳頭狀瘤病毒(例如，人類乳頭狀瘤病毒)、肝炎病毒(例如，A型肝炎病毒或B型肝炎病毒(HBV))之肽抗原決定基。在另一實施例中，抗原決定基來自於巨細胞病毒(「CMV」)。
在抗原決定基為HPV病毒之實施例中，其來源於人類乳頭狀瘤早期蛋白。在一個此類實施例中，抗原決定基來自於HPV E6多肽、HPV E7多肽、HPV 16早期蛋白7 (HPV16E7)胺基酸82-90 (HPV16E7/82-90，LLMGTLGIV；SEQ ID NO:80)。在一實施例中，抗原決定基為HPV16E7胺基酸86-93 (TLGIVCPI；SEQ ID NO:81)。在一實施例中，抗原決定基為HPV16E7胺基酸11-20 (YMLDLQPETT；SEQ ID NO:82)。在一實施例中，抗原決定基為HPV16E7胺基酸11-19 (YMLDLQPET；SEQ ID NO:83)。關於其他適合之HPV抗原決定基，參見例如Ressing等人((1995)J. Immunol. 154:5934)。
在一些情況下，該抗原決定基為B型肝炎病毒(HBV)抗原決定基。眾多HBV抗原決定基為此項技術中已知的。參見例如Desmond等人(2008)Antiviral Therapy 13:161；Lumley等人(2016)Wellcome Open Res. 1:9；及Kefalakes等人(2015)Hepatology 62:47。適於包括在本發明之T細胞-MMP抗原決定基結合物中之HBV肽可為來自多種HBV基因型，包括HBV基因型A、HBV基因型B、HBV基因型C或HBV基因型D中之任一種的HBV肽。適於包括在本發明之T細胞多聚體多肽中之HBV肽可為來自多種HBV子基因型中之任一種的HBV肽。適於包括在本發明之T細胞多聚體多肽中之HBV肽可以至少10-7 M、至少10-8 M、至少5×10-9 M、至少10-9 M、至少5×10-10 M或至少10-10 M之親和力結合至MHC複合體；且當與MHC複合體複合時被TCR結合。
適於包括在本發明之T細胞多聚體多肽中之HBV肽可具有約4個胺基酸至約25個胺基酸之長度，例如，該抗原決定基可具有4 aa至10 aa、9 aa至15 aa、10 aa至15 aa、15 aa至20 aa或20 aa至25 aa之長度。舉例而言，適於包括在本發明之T細胞多聚體多肽中之HBV肽可具有4 aa、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10 aa、11 aa、12 aa、13 aa、14 aa、15 aa、16 aa、17 aa、18 aa、19 aa、20 aa、21 aa、22 aa、23 aa、24 aa或25 aa之長度。
在一些情況下，適於包括在本發明之T細胞多聚體多肽中之HBV肽為I類MHC侷限性HBV肽(例如，其侷限於特定I類HLA對偶基因)。舉例而言，在一些情況下，適於包括在本發明之T細胞多聚體多肽中之HBV肽侷限於HLA-A，例如HLA-A2、HLA-A11 (HLA-A*1101)、HLA-A*2402或HLA-A3303 (參見例如圖3)。作為另一實例，在一些情況下，適於包括在本發明之T細胞-MMP抗原決定基結合物中之HBV肽侷限於HLA-B。作為另一實例，在一些情況下，適於包括在本發明之T細胞-MMP抗原決定基結合物中之HBV肽侷限於HLA-C。
適於包括在本文中所描述之T細胞-MMP抗原決定基結合物中之HBV肽為：HBV外膜肽；HBV前核心/核心肽；聚合酶肽及HBV X-蛋白肽。一些HBV抗原決定基為此項技術中已知的。參見例如Desmond等人(2008)Antiviral Therapy 13:161；Lumley等人(2016)Wellcome Open Res. 1:9；及Kefalakes等人(2015)Hepatology 62:47。適於包括在本發明之T細胞-MMP抗原決定基結合物中之HBV肽可以至少10-7 M、至少10-8 M、至少5×10-9 M、至少10-9 M、至少5×10-10 M或至少10-10 M之親和力結合至I類MHC複合體；且當與MHC複合體複合時被TCR結合。本文中所提供之HBV抗原決定基之表闡述可形成併入T細胞-MMP-抗原決定基結合物中之抗原決定基肽之全部或一部分之含HBV抗原決定基之肽序列的非限制性實施例。
HBV 抗原決定基之表


I.G. 免疫調節多肽 (MOD)
適合之MOD多肽可併入T細胞-MMP中作為對Co-MOD展現降低之親和力的結構域。該等MOD多肽相對於野生型免疫調節結構域可具有1個胺基酸(aa)至10 aa差異。舉例而言，在一些情況下，本發明之T細胞-MMP中所存在之變異MOD多肽相對於相應野生型MOD可在胺基酸序列方面相差例如1 aa、2 aa、3 aa、4 aa、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10 aa、11 aa、12 aa、13 aa、14 aa、15 aa、16 aa、17 aa、18 aa、19 aa或20 aa (例如，1aa至5 aa、5 aa至10 aa或10 aa至20 aa)。舉例而言，在一些情況下，本發明之T細胞-MMP中所存在之變異MOD多肽與相應參考(例如野生型) MOD相比可具有及/或包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20 (例如，1至5、2至5、3至5、5至10或10至20)個胺基酸取代。在一些情況下，T細胞-MMP中所存在之變異MOD多肽與相應參考(例如，野生型) MOD相比包括單一胺基酸取代。在一些情況下，T細胞-MMP中所存在之變異MOD包括相對於相應野生型參考(例如，野生型MOD)包括：1至2個胺基酸取代；1至3個胺基酸取代；1至4個胺基酸取代；1至5個胺基酸取代；1至6個胺基酸取代；1至7個胺基酸取代；1至8個胺基酸取代；1至9個胺基酸取代；1至10個胺基酸取代；1至11個胺基酸取代；1至12個胺基酸取代；1至13個胺基酸取代；1至14個胺基酸取代；1至15個胺基酸取代；1至16個胺基酸取代；1至17個胺基酸取代；1至18個胺基酸取代；1至19個胺基酸取代；或1至20個胺基酸取代。
如以上所論述，適於作為結構域(MOD多肽)包括在本發明之T細胞-MMP (及/或其抗原決定基結合物)中之變異MOD包括對Co-MOD展現與相應野生型MOD對該Co-MOD之親和力相比有所降低之親和力的彼等變異MOD。可藉由例如突變誘發，諸如掃描突變誘發(例如丙胺酸、絲胺酸或甘胺酸掃描突變誘發)來鑑定適合之變異MOD。
MOD與Co-MOD之例示性配對包括但不限於下表中所列出之項目(a)至(r)：
MOD 與 Co-MOD 之例示性配對
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP中所存在之變異MOD對Co-MOD具有100 nM至100 μM之結合親和力。舉例而言，在一些情況下，本發明之T細胞-MMP (或其抗原決定基結合物)中所存在之變異MOD多肽對Co-MOD具有約100 nM至約150 nM、約100 nM至約500 nM、約150 nM至約200 nM、約200 nM至約250 nM、約250 nM至約300 nM、約300 nM至約350 nM、約350 nM至約400 nM、約400 nM至約500 nM、約500 nM至約600 nM、約500 nM至約1 μM、約600 nM至約700 nM、約700 nM至約800 nM、約800 nM至約900 nM、約900 nM至約1 μM、約1 μM至約5 μM、約1 μM至約25 μM、約5 μM至約10 μM、約10 μM至約15 μM、約15 μM至約20 μM、約20 μM至約25 μM、約25 μM至約50 μM、約25 μM至約100 μM、約50 μM至約75 μM或約75 μM至約100 μM之結合親和力(例如，T細胞-MMP或其抗原決定基結合物包含對Co-MOD具有結合親和力之變異MOD)。
I.G.1 野生型及變異 PD-L1 MOD
作為一個非限制性實例，在一些情況下，本發明之T細胞-MMP中所存在之變異MOD多肽為變異PD-L1多肽。野生型PD-L1結合PD1。
野生型人類PD-L1多肽可包含以下胺基酸序列：MRIFAVFIFM TYWHLLNAFT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKICLT LSPST (SEQ ID NO:13)。
野生型人類PD-L1胞外域可包含以下胺基酸序列：FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKI (SEQ ID NO:14)。
野生型PD-1多肽(NCBI登錄號NP_005009.2，胺基酸21-288)可包含以下胺基酸序列：PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL (SEQ ID NO:15)。
在一些情況下，可用作MOD多肽之變異PD-L1多肽對其Co-MOD PD-1 (例如，包含SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列的PD-1多肽)展現與包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列的PD-L1多肽之結合親和力相比有所降低之結合親和力。舉例而言，在一實施例中，本發明之變異PD-L1多肽以比包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列的PD-L1多肽的結合親和力低至少10%、低至少15%、低至少20%、低至少25%、低至少30%、低至少35%、低至少40%、低至少45%、低至少50%、低至少55%、低至少60%、低至少65%、低至少70%、低至少75%、低至少80%、低至少85%、低至少90%、低至少95%或低95%以上之結合親和力結合PD-1 (例如，包含SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列的PD-1多肽)。
在一實施例中，變異PD-L1多肽對PD-1具有1 nM至1 μM之結合親和力。在一些情況下，本發明之變異PD-L1多肽對PD-1具有100 nM至100 μM之結合親和力。作為另一實例，在一些情況下，變異PD-L1多肽對PD1 (例如，包含SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列的PD1多肽)具有約100 nM至約150 nM、約150 nM至約200 nM、約200 nM至約250 nM、約250 nM至約300 nM、約300 nM至約350 nM、約350 nM至約400 nM、約400 nM至約500 nM、約500 nM至約600 nM、約600 nM至約700 nM、約700 nM至約800 nM、約800 nM至約900 nM、約900 nM至約1 μM、約1 μM至約5 μM、約5 μM至約10 μM、約10 μM至約15 μM、約15 μM至約20 μM、約20 μM至約25 μM、約25 μM至約50 μM、約50 μM至約75 μM或約75 μM至約100 μM之結合親和力。
在一些情況下，變異PD-L1多肽與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示之PD-L1胺基酸序列相比具有單一胺基酸取代。在一些情況下，變異PD-L1多肽與SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中所示之PD-L1胺基酸序列相比具有2至10個胺基酸取代。在一些情況下，變異PD-L1多肽與SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14中所示之PD-L1胺基酸序列相比具有2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。
適合之PD-L1變異體包括包含與以下胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的多肽：
FT VTVPKX LYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKI (SEQ ID NO:14)，其中X為除Asp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala。在一些情況下，X為Arg。
適合之PD-L1變異體包括包含與以下胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的多肽：
FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALX VYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKI (SEQ ID NO:14)，其中X為除Ile以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Asp。
適合之PD-L1變異體包括包含與以下胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的多肽：
FT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EX DLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPGNI LNVSIKI (SEQ ID NO:14)，其中X為除Glu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Arg。
SEQ ID NOI.G.2 野生型及變異 CD80 MOD
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP中所存在之變異MOD多肽為變異CD80多肽。野生型CD80結合CD28。
人類CD80之胞外域之野生型胺基酸序列可如下：
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)。
野生型CD28胺基酸序列可如下：MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLD SAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPP PYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLV TVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS (SEQ ID NO:17)。在本發明之T細胞-MMP包含變異CD80多肽之一些情況下，「Co-MOD」為包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的CD28多肽。
野生型CD28胺基酸序列可如下：MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSW KHLCPSPLFP GPSKPFWVLV VVGGVLACYS LLVTVAFIIF WVRSKRSRLL HSDYMNMTPR RPGPTRKHYQ PYAPPRDFAA YRS (SEQ ID NO:17)
野生型CD28胺基酸序列可如下：MLRLLLALNL FPSIQVTGKH LCPSPLFPGP SKPFWVLVVV GGVLACYSLL VTVAFIIFWV RSKRSRLLHS DYMNMTPRRP GPTRKHYQPY APPRDFAAYR S (SEQ ID NO:19)。
在一些情況下，變異CD80多肽對CD28展現與包含SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列的CD80多肽對CD28之結合親和力相比有所降低之結合親和力。舉例而言，在一些情況下，變異CD80多肽以比包含SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列的CD80多肽對CD28 (例如，包含SEQ ID NO:17、18或19之一中所示之胺基酸序列的CD28多肽)之結合親和力低至少10%、低至少15%、低至少20%、低至少25%、低至少30%、低至少35%、低至少40%、低至少45%、低至少50%、低至少55%、低至少60%、低至少65%、低至少70%、低至少75%、低至少80%、低至少85%、低至少90%、低至少95%或低95%以上之結合親和力結合CD28。
在一些情況下，變異CD80多肽對CD28具有100 nM至100 μM之結合親和力。作為另一實例，在一些情況下，本發明之變異CD80多肽對CD28 (例如，包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19中所示之胺基酸序列的CD28多肽)具有約100 nM至150 nM、約150 nM至約200 nM、約200 nM至約250 nM、約250 nM至約300 nM、約300 nM至約350 nM、約350 nM至約400 nM、約400 nM至約500 nM、約500 nM至約600 nM、約600 nM至約700 nM、約700 nM至約800 nM、約800 nM至約900 nM、約900 nM至約1 μM、約1 μM至約5 μM、約5 μM至約10 μM、約10 μM至約15 μM、約15 μM至約20 μM、約20 μM至約25 μM、約25 μM至約50 μM、約50 μM至約75 μM或約75 μM至約100 μM之結合親和力。
在一些情況下，變異CD80多肽與SEQ ID NO:16中所示之CD80胺基酸序列相比具有單一胺基酸取代。在一些情況下，變異CD80多肽與SEQ ID NO:16中所示之CD80胺基酸序列相比具有2至10個胺基酸取代。在一些情況下，變異CD80多肽與SEQ ID NO:16中所示之CD80胺基酸序列相比具有2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。
一些適合之CD80變異體包括包含與以下胺基酸序列中之任一者具有至少90% (少於20個取代)、至少95% (少於10個取代)、至少97% (少於6個取代)、至少98% (少於4個取代)、至少99% (少於2個取代)或至少99.5% (一個取代)胺基酸序列一致性之序列一致性的胺基酸序列的多肽：
VIHVTK EVKEVATLSC GH X VSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO16)，其中X為除Asn以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDIT X NLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Asn以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS X VILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Ile以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVL X YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Lys以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS X DPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS Q X PETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Asp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEE X A QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRI X WQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Tyr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYW X KEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK K X VLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Met以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KM X LTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Val以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MN X WPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Ile以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPE X KNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Tyr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIF X ITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Asp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA D X PTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTV X QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Ser以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；及
VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPT X SISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN (SEQ ID NO:16)，其中X為除Pro以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala。
I.G.3 野生型及變異 CD86 MOD
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP中所存在之變異MOD多肽為變異CD86多肽。野生型CD86結合CD28。
野生型人類CD86之完全胞外域之胺基酸序列可如下：APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYM N RTSF D SDS W TLRLHNLQIKDKGLYQCIIH H KKPTGMIRIHQMNSELSVL ANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:20)。
野生型人類CD86之IgV結構域之胺基酸序列可如下：APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYM N RTSF D SDS W TLRLHNLQIKDKGLYQCIIH H KKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:21)。
在一些情況下，變異CD86多肽對CD28展現與包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中所示之胺基酸序列的CD86多肽對CD28之結合親和力相比有所降低之結合親和力。舉例而言，在一些情況下，變異CD86多肽以比包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中所示之胺基酸序列的CD86多肽對CD28 (例如，包含SEQ ID NO:17、18或19之一中所示之胺基酸序列的CD28多肽)之結合親和力低至少10%、低至少15%、低至少20%、低至少25%、低至少30%、低至少35%、低至少40%、低至少45%、低至少50%、低至少55%、低至少60%、低至少65%、低至少70%、低至少75%、低至少80%、低至少85%、低至少90%、低至少95%或低95%以上之結合親和力結合CD28。
在一些情況下，變異CD86多肽對CD28具有100 nM至100 μM之結合親和力。作為另一實例，在一些情況下，本發明之變異CD86多肽對CD28 (例如，包含SEQ ID NO:17、18或19之一中所示之胺基酸序列的CD28多肽)具有約100 nM至150 nM、約150 nM至約200 nM、約200 nM至約250 nM、約250 nM至約300 nM、約300 nM至約350 nM、約350 nM至約400 nM、約400 nM至約500 nM、約500 nM至約600 nM、約600 nM至約700 nM、約700 nM至約800 nM、約800 nM至約900 nM、約900 nM至約1 μM、至約1 μM至約5 μM、約5 μM至約10 μM、約10 μM至約15 μM、約15 μM至約20 μM、約20 μM至約25 μM、約25 μM至約50 μM、約50 μM至約75 μM或約75 μM至約100 μM之結合親和力。
在一些情況下，變異CD86多肽與SEQ ID NO:20中所示之CD86胺基酸序列相比具有單一胺基酸取代。在一些情況下，變異CD86多肽與SEQ ID NO:20中所示之CD86胺基酸序列相比具有2至10個胺基酸取代。在一些情況下，變異CD86多肽與SEQ ID NO:20中所示之CD86胺基酸序列相比具有2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。
在一些情況下，變異CD86多肽與SEQ ID NO:21中所示之CD86胺基酸序列相比具有單一胺基酸取代。在一些情況下，變異CD86多肽與SEQ ID NO:21中所示之CD86胺基酸序列相比具有2至10個胺基酸取代。在一些情況下，變異CD86多肽與SEQ ID NO21中所示之CD86胺基酸序列相比具有2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。
適合之CD86變異體包括包含與以下胺基酸序列中之任一者具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的多肽：
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYM X RTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:20)，其中X為除Asn以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSF X SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:20)，其中X為除Asp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDS X TLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:20)，其中X為除Trp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIH X KKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:20)，其中X為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYM X RTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:20)，其中X為除Asn以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSF X SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:20)，其中X為除Asp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDS X TLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:20)，其中X為除Trp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIH X KKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:20)，其中X為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENL X LNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:20)，其中X為除Val以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENL X LNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:20)，其中X為除Val以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFW X DQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:20)，其中X為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFW X DQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:20)，其中X為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVV X WQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:20)，其中X為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVV X WQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:20)，其中X為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWT X RLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:20)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSFDSDSWT X RLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:20)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSK X MNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:20)，其中X為除Tyr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSK X MNRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:20)，其中X為除Tyr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYM X1 RTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIH X2 KKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:20)，其中X1 為除Asn以外之任何胺基酸，且第二X2 為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 及X2 皆為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYM X RTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIH X KKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:20)，其中X1 為除Asn以外之任何胺基酸，且X2 為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 及X2 皆為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSF X1 SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIH X2 KKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:20)，其中X1 為除Asp以外之任何胺基酸，且X2 為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 為Ala且X2 為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMNRTSF X1 SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIH X2 KKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:20)，其中X1 為除Asn以外之任何胺基酸，且X2 為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 及X2 皆為Ala；
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYM X1 RTSF X2 SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIH X3 KKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP (SEQ ID NO:20)，其中X1 為除Asn以外之任何胺基酸，X2 為除Asp以外之任何胺基酸，且X3 為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 為Ala，X2 為Ala，且X3 為Ala；及
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYM X1 RTSF X2 SDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIH X3 KKPTGMIRIHQMNSELSVL (SEQ ID NO:21)，其中X1 為除Asn以外之任何胺基酸，X2 為除Asp以外之任何胺基酸，且X3 為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 為Ala，X2 為Ala，且X3 為Ala。
I.G.4 野生型及變異 4-1BBL MOD
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP中所存在之變異MOD多肽為變異4-1BBL多肽。野生型4-1BBL結合至4-1BB (CD137)。
野生型4-1BBL胺基酸序列可如下：MEYASDASLD PEAPWPPAPR ARACRVLPWA LVAGLLLLLL LAAACAVFL A CPWAVSGARA SPGSAASPRL REGPELSPDD PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:22)。
在一些情況下，變異4-1BBL多肽為人類4-1BBL之腫瘤壞死因子(TNF)同源性結構域(THD)之變異體。
人類4-1BBL之THD之野生型胺基酸序列可例如為如下之SEQ ID NO:23-25之一：
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)；
D PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:24)；或
D PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPA (SEQ ID NO:25)。
野生型4-1BB胺基酸序列可如下：MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG CSCRFPEEEE GGCEL (SEQ ID NO:26)。在本發明之T細胞-MMP包含變異4-1BBL多肽之一些情況下，「Co-MOD」為包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列的4-1BB多肽。
在一些情況下，變異4-1BBL多肽對4-1BB展現與包含SEQ ID NO:22-25之一中所示之胺基酸序列的4-1BBL多肽的結合親和力相比有所降低之結合親和力。舉例而言，在一些情況下，本發明之變異4-1BBL多肽以當在相同條件下分析時比包含SEQ ID NO:22-25之一中所示之胺基酸序列的4-1BBL多肽對4-1BB多肽(例如，包含SEQ ID NO:26中所示之胺基酸序列的4-1BB多肽)之結合親和力低至少10%、低至少15%、低至少20%、低至少25%、低至少30%、低至少35%、低至少40%、低至少45%、低至少50%、低至少55%、低至少60%、低至少65%、低至少70%、低至少75%、低至少80%、低至少85%、低至少90%、低至少95%或低95%以上之結合親和力結合4-1BB。
在一些情況下，變異4-1BBL多肽對4-1BB具有100 nM至100 μM之結合親和力。作為另一實例，在一些情況下，變異4-1BBL多肽對4-1BB (例如，包含SEQ ID NO:26中所示之胺基酸序列的4-1BB多肽)具有約100 nM至150 nM、約150 nM至約200 nM、約200 nM至約250 nM、約250 nM至約300 nM、約300 nM至約350 nM、約350 nM至約400 nM、約400 nM至約500 nM、約500 nM至約600 nM、約600 nM至約700 nM、約700 nM至約800 nM、約800 nM至約900 nM、約900 nM至約1 μM、至約1 μM至約5 μM、約5 μM至約10 μM、約10 μM至約15 μM、約15 μM至約20 μM、約20 μM至約25 μM、約25 μM至約50 μM、約50 μM至約75 μM或約75 μM至約100 μM之結合親和力。
在一些情況下，變異4-1BBL多肽與SEQ ID NO:22-25之一中所示之4-1BBL胺基酸序列相比具有單一胺基酸取代。在一些情況下，變異4-1BBL多肽與SEQ ID NO:22-25之一中所示之4-1BBL胺基酸序列相比具有2至10個胺基酸取代。在一些情況下，變異4-1BBL多肽與SEQ ID NO:22-25之一中所示之4-1BBL胺基酸序列相比具有2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。
適合之4-1BBL變異體包括包含與以下胺基酸序列中之任一者具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的多肽：
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYX EDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Lys以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWX LTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQGX FAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Met以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MX AQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAX LVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQX VAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLX AQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Val以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAX NV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQX V LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Asn以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNX LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Val以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNVX LIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LX IDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLX DGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Ile以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIX GPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Asp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDX PLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gly以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGX LSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Pro以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPX SWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLX WY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Ser以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSX Y SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Trp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWX SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Tyr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWYX DPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Ser以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SX PGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Asp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDX GLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Pro以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPX LAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gly以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGX AGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAX VSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gly以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGX SL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Val以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVX L TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Ser以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSX TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSLX GGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Thr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TX GLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gly以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGX LSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gly以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGX SYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLX YKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Ser以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSX KEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Tyr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKX DT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Glu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEX T KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Asp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDX KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Thr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDTX ELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Lys以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KX LVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Glu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVX FQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFX QLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFX LELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQX ELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLX LR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Glu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLEX R RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELX RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Arg以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELRX VVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Arg以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RX VAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Val以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVX AGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Val以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAX EGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gly以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGX GSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Glu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEX SGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gly以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGX GS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Ser以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVX LPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Asp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDX PPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLX PASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Pro以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPAX S EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Ser以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASX EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Ser以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASSX ARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Glu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EAX NSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Arg以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARX SAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Asn以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNX AFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Ser以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAX GFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGX RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQX LGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Arg以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RX GVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLX VHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gly以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGX HLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Val以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVX LHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHX HTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLX TEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHX EA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Thr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTX A RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Glu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEAX ARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Arg以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RAX HAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Arg以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARX AWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAX QLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Trp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQX TQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Leu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLX Q GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Thr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTX GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQX ATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Gly以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GAX VLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Thr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；及
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIGGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATX LGLFRV TPEIPAGLPS PRSE (SEQ ID NO:23)，其中X為除Val以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala。
I.G.5 IL-2 變異體
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP中所存在之變異MOD多肽為變異IL-2多肽。野生型IL-2結合至IL-2受體(IL-2R)，亦即，包含IL-2Rα、IL-2Rβ及IL-2Rγ之異源三聚多肽。
野生型IL-2胺基酸序列可如下：APTSSSTKKT QLQL EH LLL D LQMILNGINN YKNPKLTRML T F KF Y MPKKA TELKHLQCLEEELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFC Q SIIS TLT (SEQ ID NO:27)。
野生型IL2結合至細胞表面上之IL2受體(IL2R)。在一些情況下，IL2受體為包含α鏈(IL-2Rα；亦稱為CD25)、β鏈(IL-2Rβ；亦稱為CD122)及γ鏈(IL-2Rγ；亦稱為CD132)之異源三聚多肽。人類IL-2Rα、IL2Rβ及IL-2Rγ之胺基酸序列可如下。
人類IL-2Rα：ELCDDDPPE IPHATFKAMA YKEGTMLNCE CKRGFRRIKS GSLYMLCTGN SSHSSWDNQC QCTSSATRNT TKQVTPQPEE QKERKTTEMQ SPMQPVDQAS LPGHCREPPP WENEATERIY HFVVGQMVYY QCVQGYRALH RGPAESVCKM THGKTRWTQP QLICTGEMET SQFPGEEKPQ ASPEGRPESE TSCLVTTTDF QIQTEMAATM ETSIFTTEYQ VAVAGCVFLL ISVLLLSGLT WQRRQRKSRR TI (SEQ ID NO:28)。
人類IL-2Rβ：VNG TSQFTCFYNS RANISCVWSQ DGALQDTSCQ VHAWPDRRRW NQTCELLPVS QASWACNLIL GAPDSQKLTT VDIVTLRVLC REGVRWRVMA IQDFKPFENL RLMAPISLQV VHVETHRCNI SWEISQASHY FERHLEFEAR TLSPGHTWEE APLLTLKQKQ EWICLETLTP DTQYEFQVRV KPLQGEFTTW SPWSQPLAFR TKPAALGKDT IPWLGHLLVG LSGAFGFIIL VYLLINCRNT GPWLKKVLKC NTPDPSKFFS QLSSEHGGDV QKWLSSPFPS SSFSPGGLAP EISPLEVLER DKVTQLLLQQ DKVPEPASLS SNHSLTSCFT NQGYFFFHLP DALEIEACQV YFTYDPYSEE DPDEGVAGAP TGSSPQPLQP LSGEDDAYCT FPSRDDLLLF SPSLLGGPSP PSTAPGGSGA GEERMPPSLQ ERVPRDWDPQ PLGPPTPGVP DLVDFQPPPE LVLREAGEEV PDAGPREGVS FPWSRPPGQG EFRALNARLP LNTDAYLSLQ ELQGQDPTHL V (SEQ ID NO:29)。
人類IL-2Rγ：LNTTILTP NGNEDTTADF FLTTMPTDSL SVSTLPLPEV QCFVFNVEYM NCTWNSSSEP QPTNLTLHYW YKNSDNDKVQ KCSHYLFSEE ITSGCQLQKK EIHLYQTFVV QLQDPREPRR QATQMLKLQN LVIPWAPENL TLHKLSESQL ELNWNNRFLN HCLEHLVQYR TDWDHSWTEQ SVDYRHKFSL PSVDGQKRYT FRVRSRFNPL CGSAQHWSEW SHPIHWGSNT SKENPFLFAL EAVVISVGSM GLIISLLCVY FWLERTMPRI PTLKNLEDLV TEYHGNFSAW SGVSKGLAES LQPDYSERLC LVSEIPPKGG ALGEGPGASP CNQHSPYWAP PCYTLKPET (SEQ ID NO:30)。
在本發明之T細胞-MMP包含變異IL-2多肽之一些情況下，「Co-MOD」為包含含有SEQ ID NO:28、29及30之胺基酸序列的多肽的IL-2R。
在一些情況下，變異IL-2多肽對IL-2R展現與包含SEQ ID NO:27中所示之胺基酸序列的IL-2多肽的結合親和力相比有所降低之結合親和力。舉例而言，在一些情況下，本發明之變異IL-2多肽以當在相同條件下分析時比包含SEQ ID NO:27中所示之胺基酸序列的IL-2多肽對IL-2R (例如，包含含有SEQ ID NO:28-30中所示之胺基酸序列的多肽的IL-2R)之結合親和力低至少10%、低至少15%、低至少20%、低至少25%、低至少30%、低至少35%、低至少40%、低至少45%、低至少50%、低至少55%、低至少60%、低至少65%、低至少70%、低至少75%、低至少80%、低至少85%、低至少90%、低至少95%或低95%以上之結合親和力結合IL-2R。
在一些情況下，變異IL-2多肽對IL-2R具有100 nM至100 μM之結合親和力。作為另一實例，在一些情況下，變異IL-2多肽對IL-2R (例如，包含含有SEQ ID NO:28-30中所示之胺基酸序列的多肽的IL-2R)具有約100 nM至150 nM、約150 nM至約200 nM、約200 nM至約250 nM、約250 nM至約300 nM、約300 nM至約350 nM、約350 nM至約400 nM、約400 nM至約500 nM、約500 nM至約600 nM、約600 nM至約700 nM、約700 nM至約800 nM、約800 nM至約900 nM、約900 nM至約1 μM、至約1 μM至約5 μM、約5 μM至約10 μM、約10 μM至約15 μM、約15 μM至約20 μM、約20 μM至約25 μM、約25 μM至約50 μM、約50 μM至約75 μM或約75 μM至約100 μM之結合親和力。
在一些情況下，變異IL-2多肽與SEQ ID NO:27中所示之IL-2胺基酸序列相比具有單一胺基酸取代。在一些情況下，變異IL-2多肽與SEQ ID NO:27中所示之IL-2胺基酸序列相比具有2至10個胺基酸取代。在一些情況下，變異IL-2多肽與SEQ ID NO:27中所示之IL-2胺基酸序列相比具有2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。
適合之IL-2變異MOD多肽包括包含與以下胺基酸序列中之任一者具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的多肽：
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML T X KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APTSSSTKKT QLQLEHLLL X LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X為除Asp以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APTSSSTKKT QLQL X HLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X為除Glu以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APTSSSTKKT QLQLE X LLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APTSSSTKKT QLQLE X LLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X為除His以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、Trp或Val；
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKF X MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X為除Tyr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFC X SIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X為Ala；
APTSSSTKKT QLQLE X1 LLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML T X2 KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X1 為除His以外之任何胺基酸，且其中X2 為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 為Ala。在一些情況下，X2 為Ala。在一些情況下，X1 為Ala且X2 為Ala；
APTSSSTKKT QLQLEHLLL X1 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X2 KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X1 為除Asp以外之任何胺基酸，且其中X2 為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 為Ala。在一些情況下，X2 為Ala。在一些情況下，X1 為Ala且X2 為Ala；
APTSSSTKKT QLQL X1 HLLL X2 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X3 KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(SEQ ID NO:27)，其中X1 為除Glu以外之任何胺基酸；其中X2 為除Asp以外之任何胺基酸；且其中X3 為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 為Ala。在一些情況下，X2 為Ala。在一些情況下，X3 為Ala。在一些情況下，X1 為Ala；X2 為Ala；且X3 為Ala；
APTSSSTKKT QLQLE X1 LLL X2 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X3 KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(SEQ ID NO:27)，其中X1 為除His以外之任何胺基酸；其中X2 為除Asp以外之任何胺基酸；且其中X3 為除Phe以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 為Ala。在一些情況下，X2 為Ala。在一些情況下，X3 為Ala。在一些情況下，X1 為Ala；X2 為Ala；且X3 為Ala；
APTSSSTKKT QLQLEHLLL X1 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X2 KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFC X3 SIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X1 為除Asp以外之任何胺基酸；其中X2 為除Phe以外之任何胺基酸；且其中X3 為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 為Ala。在一些情況下，X2 為Ala。在一些情況下，X3 為Ala。在一些情況下，X1 為Ala；X2 為Ala；且X3 為Ala；
APTSSSTKKT QLQLEHLLL X1 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X2 KF X3 MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X1 為除Asp以外之任何胺基酸；其中X2 為除Phe以外之任何胺基酸；且其中X3 為除Tyr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 為Ala。在一些情況下，X2 為Ala。在一些情況下，X3 為Ala。在一些情況下，X1 為Ala；X2 為Ala；且X3 為Ala；
APTSSSTKKT QLQLE X1 LLL X2 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X3 KF X4 MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X1 為除His以外之任何胺基酸；其中X2 為除Asp以外之任何胺基酸；其中X3 為除Phe以外之任何胺基酸；且其中X4 為除Tyr以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 為Ala。在一些情況下，X2 為Ala。在一些情況下，X3 為Ala。在一些情況下，X4 為Ala。在一些情況下，X1 為Ala；X2 為Ala；X3 為Ala；且X4 為Ala；
APTSSSTKKT QLQLEHLLL X1 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X2 KF X3 MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFC X4 SIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X1 為除Asp以外之任何胺基酸；其中X2 為除Phe以外之任何胺基酸；其中X3 為除Tyr以外之任何胺基酸；且其中X4 為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 為Ala。在一些情況下，X2 為Ala。在一些情況下，X3 為Ala。在一些情況下，X4 為Ala。在一些情況下，X1 為Ala；X2 為Ala；X3 為Ala；且X4 為Ala；
APTSSSTKKT QLQLE X1 LLL X2 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X3 KF X4 MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFC X5 SIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X1 為除His以外之任何胺基酸；其中X2 為除Asp以外之任何胺基酸；其中X3 為除Phe以外之任何胺基酸；其中X4 為除Tyr以外之任何胺基酸；且其中X5 為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 為Ala。在一些情況下，X2 為Ala。在一些情況下，X3 為Ala。在一些情況下，X4 為Ala。在一些情況下，X5 為Ala。在一些情況下，X1 為Ala；X2 為Ala；X3 為Ala；X4 為Ala；且X5 為Ala；及
APTSSSTKKT QLQLE X1 LLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML T X2 KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFC X3 SIIS TLT (SEQ ID NO:27)，其中X1 為除His以外之任何胺基酸；其中X2 為除Phe以外之任何胺基酸；且其中X3 為除Gln以外之任何胺基酸。在一些情況下，X1 為Ala。在一些情況下，X2 為Ala。在一些情況下，X3 為Ala。在一些情況下，X1 為Ala；X2 為Ala；且X3 為Ala。
在本文中所提供之野生型或變異IL-2序列中之任一者中，位置125處之半胱胺酸可經丙胺酸取代(C125A取代)。除了由該取代所提供之任何穩定性以外，亦可採用例如含抗原決定基之肽或有效負載結合至T細胞-MMP第一多肽或第二多肽中其他處之半胱胺酸殘基，從而避免與IL-2 MOD序列中之C125競爭。
I.H. 額外多肽
T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之多肽鏈可包括除以上所描述之彼等多肽以外的一或多個多肽。適合之額外多肽包括抗原決定基標籤及親和力結構域。一或多個額外多肽可作為由細胞或無細胞系統轉譯之多肽的一部分包括在多聚體多肽之多肽鏈的N末端、多聚體多肽之多肽鏈的C末端或在多聚體多肽之多肽鏈內部。
I.I. 抗原決定基標籤
適合之抗原決定基標籤包括但不限於血球凝集素(HA；例如，YPYDVPDYA (SEQ ID NO:31))；FLAG (例如，DYKDDDDK (SEQ ID NO32))；c-myc (例如，EQKLISEEDL；SEQ ID NO:33))及其類似物。
I.J. 親和力結構域
親和力結構域包括可與結合搭配物，例如，諸如固定於可用於鑑定或純化之固體載體上的結合搭配物相互作用的肽序列。編碼多個連續單一胺基酸，諸如組胺酸之DNA序列當與所表現之蛋白質融合時可用於藉由與樹脂管柱，諸如鎳SEPHAROSE®之高親和力結合對重組蛋白質進行一步式純化。例示性親和力結構域包括His5 (HHHHH) (SEQ ID NO34)、HisX6 (HHHHHH) (SEQ ID NO:35)、C-myc (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO33)、Flag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:32)、StrepTag (WSHPQFEK) (SEQ ID NO:36)、血球凝集素(例如，HA標籤(YPYDVPDYA) (SEQ ID NO:31))、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、硫氧還原蛋白、纖維素結合結構域、RYIRS (SEQ ID NO:37)、Phe-His-His-Thr (SEQ ID NO:38)、幾丁質結合結構域、S肽、T7肽、SH2結構域、C端RNA標籤、WEAAAREACCRECCARA (SEQ ID NO:39)、金屬結合結構域(例如，鋅結合結構域或鈣結合結構域，諸如來自鈣結合蛋白，例如鈣調蛋白、肌鈣蛋白C、鈣調磷酸酶B、肌蛋白輕鏈、恢復蛋白、S-調控蛋白、視錐蛋白、VILIP、神經鈣蛋白、海馬鈣蛋白、頻率蛋白(frequenin)、鈣牽蛋白、鈣蛋白酶大次單元、S100蛋白、小白蛋白、鈣結合蛋白D9K、鈣結合蛋白D28K及鈣網膜蛋白之彼等鈣結合結構域)、內含肽、生物素、鏈黴親和素、MyoD、Id、白胺酸拉鏈序列及麥芽糖結合蛋白。
I.K. 有效負載
多種有效負載可與T細胞-MMP及T細胞-MMP-抗原決定基結合物締合，從而可在第一化學結合位點或第二化學結合位點處併入超過一種類型之有效負載以及與T細胞-MMP(共價)結合之抗原決定基。另外，在T細胞-MMP分子或其抗原決定基結合物多聚時，有可能將經不同的有效負載標記之單體併入多聚體中。因此，有可能引入一或多個選自由以下組成之群的有效負載：治療劑、化學治療劑、診斷劑、標記物及其類似物。應瞭解，一些有效負載可屬於超過一個類別(例如，放射性標記物可用作診斷劑及治療劑以供用於選擇性地輻照特定組織或細胞類型)。
如以上所指出，T細胞-MMP多肽(例如，支架或Fc多肽)可經交聯試劑修飾以便將有效負載及/或抗原決定基結合至附接於T細胞-MMP之第一多肽或第二多肽或者處於其中之化學結合位點(例如，在諸如經工程改造之半胱胺酸或離胺酸之化學結合位點處)。此類交聯劑包括4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、磺基-SMCC、馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、磺基-MBS或碘基乙酸琥珀醯亞胺酯。使用過量之此類交聯劑引入有效負載可引起多個有效負載分子併入T細胞-MMP中。用於將有效負載引入T細胞-MMP及其抗原決定基結合物中之一些雙官能連接子包括可裂解連接子及非可裂解連接子。在一些情況下，有效負載連接子為蛋白酶可裂解連接子。適合之有效負載連接子包括例如肽(例如，2至10個胺基酸之長度；例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸之長度)、烷基鏈、聚(乙二醇)、二硫基、硫醚基、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基團。適合連接子之非限制性實例為：N-琥珀醯亞胺基-[(N-馬來醯亞胺基丙醯胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-馬來醯亞胺)；4-(2-吡啶基二硫)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDB)；辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)；戊二酸二琥珀醯亞胺酯(DGS)；二醯亞胺己二酸二甲酯(DMA)；4-(2-吡啶基二硫)2-磺基丁酸N-琥珀醯亞胺酯(磺基-SPDB)；4-(2-吡啶基二硫)戊酸N-琥珀醯亞胺酯(SPP)；4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸N-琥珀醯亞胺酯) (LC-SMCC)；κ-馬來醯亞胺基十一酸N-琥珀醯亞胺酯(KMUA)；γ-馬來醯亞胺丁酸N-琥珀醯亞胺酯(GMBS)；ε-馬來醯亞胺基己酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(EMCS)；間馬來醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)；N-(α-馬來醯亞胺基乙醯氧基)-琥珀醯亞胺酯(AMAS)；6-(β-馬來醯亞胺基丙醯胺)己酸琥珀醯亞胺酯(SMPH)；4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸N-琥珀醯亞胺酯(SMPB)；異氰酸N-(對馬來醯亞胺基苯基)酯(PMPI)；4-(2-吡啶基硫)戊酸N-琥珀醯亞胺酯(SPP)；(4-碘基-乙醯基胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SIAB)；6-馬來醯亞胺基己醯基(MC)；馬來醯亞胺基丙醯基(MP)；對胺基苯甲氧基羰基(PAB)；4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SMCC)；3-(2-吡啶基二硫)丙酸琥珀醯亞胺酯(SPDP)；PEG4-SPDP (聚乙二醇化長鏈SPDP交聯劑)；BS(PEG)5 (聚乙二醇化辛二酸雙(磺基琥珀醯亞胺基)酯)；BS(PEG)9 (聚乙二醇化辛二酸雙(磺基琥珀醯亞胺基)酯)；馬來醯亞胺-PEG6 -琥珀醯亞胺酯；馬來醯亞胺-PEG8 -琥珀醯亞胺酯；馬來醯亞胺-PEG12 -琥珀醯亞胺酯；PEG4 -SPDP (聚乙二醇化長鏈SPDP交聯劑)；PEG12 -SPDP (聚乙二醇化長鏈SPDP交聯劑)；4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧基-(6-醯胺基已酸N-琥珀醯亞胺酯)、SMCC之「長鏈」類似物(LC-SMCC)；3-馬來醯亞胺基丙酸N-琥珀醯亞胺酯(BMPS)；碘乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SIA)；溴乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SBA)；及3-(溴乙醯胺基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SBAP)。
控制反應之化學計算量可獲得某種選擇性修飾，其中不利用具有與分子中之所有其他基團正交之化學性質的經工程改造之位點。同與單一離胺酸或半胱胺酸殘基反應之試劑相比，呈現更大選擇性之試劑，諸如以上所論述之雙硫連接子，傾向於允許對位置及化學計算量進行更精確之控制。
在本發明之T細胞-MMP包含Fc多肽時，Fc多肽可包含直接或經由連接子間接地附接之一或多個共價附接之有效負載分子。舉例而言，在本發明之T細胞-MMP包含Fc多肽時，包含Fc多肽之多肽鏈可具有式(A)-(L)-(C)，其中(A)為包含Fc多肽之多肽鏈；其中(L)若存在則為連接子；且其中(C)為有效負載(例如，細胞毒性劑)。(L)若存在則連接(A)與(C)。在一些情況下，包含Fc多肽之多肽鏈可包含多於一個有效負載分子(例如，2、3、4、5或多於5個細胞毒性劑分子)。
在一實施例中，有效負載係選自由以下組成之群：生物活性劑或藥物、診斷劑或標記物、核苷酸或核苷類似物、核酸或合成核酸(例如，反義核酸、小干擾RNA、雙鏈(ds)DNA、單鏈(ss)DNA、ssRNA、dsRNA)、毒素、脂質體(例如，併入化學治療劑，諸如5-氟去氧尿苷)、奈米粒子(例如，攜帶核酸或其他分子之金或其他金屬、脂質、攜帶核酸或其他分子之粒子)及其組合。
在一實施例中，該有效負載係選自由以下組成之群：生物活性劑或藥物，該等生物活性劑或藥物係獨立地選自由以下組成之群：治療劑(例如，藥物或前藥)、化學治療劑、細胞毒性劑、抗生素、抗病毒劑、細胞週期同步劑、細胞表面受體之配位體、免疫調節劑(例如，免疫抑制劑，諸如環孢黴素)、促細胞凋亡劑、抗血管生成劑、細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白質或多肽、抗體或其抗原結合片段、酶、酶原、激素及其組合。
在一實施例中，該有效負載係選自由以下組成之群：生物活性劑或藥物，該等生物活性劑或藥物係獨立地選自由以下組成之群：治療診斷劑或標記物，該等治療診斷劑或標記物係獨立地選自由以下組成之群：光可偵測標記物(例如染料、螢光標記物、磷光標記物、發光標記物)、造影劑(例如含碘或鋇之材料)、放射性標記物、成像劑、順磁性標記物/成像劑(含釓之磁共振成像標記物)、超音標記物及其組合。
I.L. 治療劑及化學治療劑
T細胞-MMP之多肽鏈可包含有效負載，包括但不限於在化學結合位點處連接(例如，共價附接)於第一多肽鏈或第二多肽鏈之小分子藥物。有效負載與T細胞-MMP或其抗原決定基結合物之第一多肽鏈或第二多肽鏈之間的鍵聯可為直接或間接鍵聯。直接鍵聯可包括直接達至胺基酸側鏈之鍵聯。間接鍵聯可為經由連接子之鍵聯。藥物(例如，有效負載，諸如癌症化學治療劑)可經由硫醚鍵、醯胺鍵、胺基甲酸酯鍵、二硫鍵或醚鍵連接至本發明之T細胞-MMP之多肽鏈(例如，Fc多肽)。
適合之治療劑包括例如雷帕黴素(rapamycin)；類視黃醇，諸如全反式視黃酸(ATRA)；維生素D3；維生素D3類似物；及其類似物。如以上所指出，在一些情況下，藥物為細胞毒性劑。細胞毒性劑為此項技術中已知的。適合之細胞毒性劑可為引起細胞死亡或誘導細胞死亡或以某種方式降低細胞活力之任何化合物，且包括例如類美登素(maytansinoid)及類美登素類似物、苯并二氮呯、類紫杉醇、CC-1065及CC-1065類似物、倍癌黴素(duocarmycin)及倍癌黴素類似物、烯二炔(諸如卡奇黴素(calicheamicin))、尾海兔素(dolastatin)及尾海兔素類似物(包括奧瑞斯他汀(auristatins))、茅屋黴素(tomaymycin)衍生物、來普黴素(leptomycin)衍生物、胺甲蝶呤(methotrexate)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、道諾黴素(daunorubicin)、阿黴素(doxorubicin)、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C、氮芥苯丁酸及嗎啉基阿黴素。
舉例而言，在一些情況下，細胞毒性劑為抑制真核生物細胞中之微管形成的化合物。此類劑包括例如類美登素、苯并二氮呯、類紫杉醇、CC-1065、倍癌黴素、倍癌黴素類似物、卡奇黴素、尾海兔素、尾海兔素類似物、奧瑞斯他汀、茅屋黴素及來普黴素或上述任一者之前藥。類美登素化合物包括例如N(2')-脫乙醯基-N(2')-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(DM1)；N(2')-脫乙醯基-N(2')-(4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM3)；及N(2')-脫乙醯基-N2-(4-巰基-4-甲基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)。苯并二氮呯包括例如吲哚啉并苯并二氮呯及噁唑啉并苯并二氮呯。
細胞毒性劑包括紫杉醇；細胞分裂抑素B；短桿菌肽D；溴化乙錠；吐根鹼(emetine)；絲裂黴素(mitomycin)；伊妥普賽(etoposide)；替尼泊苷(tenoposide)；長春新鹼；長春花鹼；秋水仙鹼(colchicin)；阿黴素；道諾黴素；二羥基炭疽菌素二酮；美登素或其類似物或衍生物；奧瑞斯他汀或其功能肽類似物或衍生物；尾海兔素10或15或其類似物；伊立替康(irinotecan)或其類似物；米托蒽醌(mitoxantrone)；光神黴素(mithramycin)；放線菌素D；1-去氫睾酮；糖皮質素；普魯卡因(procaine)；丁卡因(tetracaine)；利多卡因(lidocaine)；普萘洛爾(propranolol)；嘌呤黴素(puromycin)；卡奇黴素或其類似物或衍生物；抗代謝物；6-巰基嘌呤；6-硫鳥嘌呤；阿糖胞苷；氟達拉濱(fludarabin)；5-氟尿嘧啶；達卡巴嗪(decarbazine)；羥基脲；天冬醯胺酶；吉西他濱(gemcitabine)；克拉屈濱(cladribine)；烷基化劑；鉑衍生物；倍癌黴素A；倍癌黴素SA；拉奇黴素(rachelmycin) (CC-1065)或其類似物或衍生物；抗生素；吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮呯(PDB)；白喉毒素；篦麻毒素；霍亂毒素；類志賀(Shiga)毒素；LT毒素；C3毒素；志賀毒素；百日咳毒素；破傷風毒素；大豆鮑曼-比爾克蛋白酶抑制劑(Bowman-Birk protease inhibitor)；假單胞菌外毒素；蘆苔素(alorin)；肥皂草素；蒴蓮根毒素；甘丙胺肽；相思子毒素A鏈；蒴蓮根毒素A鏈；α-帚麴菌素；油桐(Aleurites fordii )蛋白；石竹素蛋白；美國商陸(Phytolacca americana )蛋白；苦瓜抑制劑；麻瘋樹毒素；巴豆毒素；肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑；白樹毒素；米托黴素；侷限麴菌素；酚黴素；伊諾黴素毒素；核糖核酸酶(RNase)；去氧核糖核酸酶I (DNase I)；葡萄球菌腸毒素A；美洲商陸抗病毒蛋白；白喉毒素；及假單胞菌內毒素。
I.M. 診斷劑及標記物
T細胞-MMP之第一多肽鏈及/或第二多肽鏈可包含光可偵測標記物(例如，染料、螢光標記物、磷光標記物、發光標記物)、造影劑(例如，含碘或鋇之材料)、放射性標記物、成像劑、自旋標記物、福斯特共振能量轉移(FRET)型標記物、順磁標記物/成像劑(例如，含釓之磁共振成像標記物)、超聲標記物及其組合之一或多個有效負載分子。
在一些實施例中，結合物部分包含標記物，該標記物為放射性同位素或包括放射性同位素。放射性同位素或其他標記物之實例包括但不限於3 H、11 C、14 C、15 N、35 S、18 F、32 P、33 P、64 Cu、68 Ga、89 Zr、90 Y、99 Tc、123 I、124 I、125 I、131 I、111 ln、131 In、153 Sm、186 Re、188 Re、211 At、212 Bi及153 Pb。
II. 產生 T 細胞 -MMP 多肽之方法
本發明提供一種獲得T細胞-MMP及T細胞-MMP-抗原決定基結合物，包括包含一或多個對Co-MOD展現相較於相應親本野生型MOD對Co-MOD之親和力而言較低之親和力的變異MOD的彼等T細胞-MMP及T細胞-MMP-抗原決定基結合物的方法，該方法包括：
A) 藉由在細胞或無細胞系統中引入編碼T細胞-MMP之第一多肽及第二多肽之核酸來產生T細胞-MMP，其中各成員包含：
a) 第一多肽，該第一多肽包含：i)第一I類主要組織相容性複合體(MHC)多肽(例如，β2M多肽)；及
b) 第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽(例如，I類MHC重鏈多肽多肽)；及ii)視情況Ig Fc多肽或非Ig支架，
其中該第一多肽包含第一化學結合位點及/或該第二多肽包含第二化學結合位點，且該第一多肽或第二多肽中至少一者包含一或多個獨立選擇之MOD (例如，1、2、3或更多個野生型及/或變異MOD)；
使第一多肽與第二多肽接觸(若共表現於同一細胞或無細胞系統中，則該等多肽可在其轉譯時得以接觸)以形成T細胞-MMP；且
其中當該T細胞-MMP包含一或多個新生(例如，未活化)化學結合位點時，視情況活化該新生化學結合位點以產生具有第一化學結合位點及/或第二化學結合位點之T細胞-MMP (例如，若表現T細胞-MMP之細胞不表現甲醯甘胺酸產生酶，則使硫酸酯酶基元與甲醯甘胺酸產生酶反應)。
此時可終止該方法且藉由純化獲得T細胞-MMP；替代地，在需要T細胞-MMP抗原決定基結合物時，該方法可繼續進行以下步驟：
提供適合與第一化學結合位點及/或第二化學結合位點結合之抗原決定基(例如，抗原決定基肽) (例如，用於與硫酸酯酶基元之甲醯甘胺酸反應之經肼基或肼基吲哚修飾之肽)及使該抗原決定基與該T細胞-MMP接觸(例如，在適合之反應條件下)以產生T細胞-MMP抗原決定基結合物。
在需要T細胞-MMP含有有效負載(例如，小分子藥物、放射性標記物等)，該有效負載可與T細胞-MMP而不是如以上所描述之抗原決定基結合物反應。在需要T細胞-MMP抗原決定基結合物含有有效負載時，該有效負載可在抗原決定基與其化學反應位點接觸並反應之前或之後與化學結合位點反應。可藉由使用正交化學反應及/或控制結合反應中之化學計算量來控制抗原決定基及有效負載對不同的結合位點(例如，第一化學結合位點及第二化學結合位點)之選擇性。在諸多實施例中，連接子(例如，多肽或其他雙官能化學連接子)可用於將抗原決定基及/或有效負載附接至其結合位點。
本發明提供一種獲得包含一或多個對Co-MOD展現相較於相應親本野生型MOD對Co-MOD之親和力而言較低之親和力的變異MOD的T細胞-MMP抗原決定基結合物的方法，該方法包括：
A) 產生包括多個成員之T細胞-MMP抗原決定基結合物庫，其中各成員包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)抗原決定基；及ii)第一主要MHC多肽(例如，β2M多肽)；及b)第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽(例如，I類MHC重鏈多肽多肽)；及ii)視情況Ig Fc多肽或非Ig支架，其中各成員在第一多肽、第二多肽或第一多肽與第二多肽兩者上包含不同的變異MOD；
B) 測定該庫之各成員對Co-MOD之親和力；及
C) 選擇對Co-MOD展現降低之親和力的庫成員。
在一些情況下，藉由生物層干涉術(BLI)使用經純化之T細胞-MMP庫成員及Co-MOD來測定親和力。BLI方法對熟習此項技術者為熟知的。BLI分析如以上所描述。參見例如Lad等人(2015) J. Biomol. Screen. 20(4): 498-507；以及Shah及Duncan (2014)J. Vis. Exp. 18:e51383。
本發明提供一種獲得對T細胞展現選擇性結合之T細胞-MMP-抗原決定基結合物的方法，該方法包括：
A) 產生包含多個成員之T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫，其中各成員包含：
a) 第一多肽：該第一多肽包含i)第一MHC多肽；及
b) 第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽；及ii)視情況免疫球蛋白(Ig) Fc多肽或非Ig支架，
其中各成員在第一多肽、第二多肽或第一多肽與第二多肽兩者上包含不同的變異MOD，其中變異MOD相對於親本野生型MOD在胺基酸序列方面相差1個胺基酸至10個胺基酸，
其中T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員進一步包含抗原決定基標籤或螢光標記物)，且
其中第一多肽或第二多肽之一包含經化學結合位點，直接或經由連接子間接地共價結合至第一多肽及/或第二多肽之抗原決定基；
B) 使T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員與靶T細胞接觸，該靶T細胞在其表面上表現：i)結合親本野生型MOD之Co-MOD；及ii)結合抗原決定基之T細胞受體；
C) 其中當T細胞-MMP抗原決定基結合物包含抗原決定基標籤時，使靶T細胞所結合之T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員與結合至抗原決定基標籤之經螢光標記之結合劑接觸(此舉對於經螢光標記之T細胞-MMP抗原決定基結合物而言為非必需的)，從而產生庫成員/靶T細胞/結合劑複合體；
D) 使用流式細胞術量測T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員/靶T細胞/結合劑複合體之平均螢光強度(MFI)，其中在T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員之濃度範圍內量測之MFI提供親和力及表觀親合力之量度；及
E) 選擇與T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員與對照T細胞之結合相比選擇性地結合靶T細胞之T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員，其包含：i)結合親本野生型MOD之Co-MOD；及ii)結合至除T細胞-MMP庫成員中所存在之抗原決定基以外的抗原決定基的T細胞受體。在一些情況下，將鑑定為選擇性地結合至靶T細胞之T細胞-MMP庫成員自庫中分離。
在一些情況下，親本野生型MOD及Co-MOD配對係選自：IL-2與IL-2受體；4-1BBL與4-1BB；PD-L1與PD-1；FasL與Fas；TGFβ與TGFβ受體；CD80與CD28；CD86與CD28；OX40L與OX40；ICOS-L與ICOS；ICAM與LFA-1；JAG1與Notch；JAG1與CD46；CD70與CD27；CD80與CTLA4；及CD86與CTLA4。
本發明提供一種獲得包含一或多個對Co-MOD展現與相應親本野生型MOD對Co-MOD之親和力相比有所降低之親和力的變異MOD的T細胞-MMP-抗原決定基結合物的方法，該方法包括自包括多個成員之T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫中選擇對Co-MOD展現降低之親和力的成員，其中該多個成員包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)共價結合於化學結合位點之抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽；及ii)視情況Ig Fc多肽或非Ig支架，其中該庫之成員包含第一多肽、第二多肽或第一多肽與第二多肽兩者中所存在之多個變異MOD。在一些情況下，選擇步驟包括使用生物層干涉術測定T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員與Co-MOD之間的結合親和力。在一些情況下，T細胞-MMP-抗原決定基結合物如以上所描述。
在一些情況下，獲得包含一或多個對Co-MOD展現與相應親本野生型MOD對Co-MOD之親和力相比有所降低之親和力的變異MOD的T細胞-MMP-抗原決定基結合物的方法進一步包括：a)使所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員與靶T細胞接觸，該靶T細胞在其表面上表現：i)結合親本野生型MOD之Co-MOD；及ii)結合抗原決定基之T細胞受體，其中該T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員包含抗原決定基標籤，使得T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員結合至靶T細胞；b)使與靶T細胞結合之所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員與結合至抗原決定基標籤之經螢光標記之結合劑接觸，從而產生所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員/靶T細胞/結合劑複合體；及c)使用流式細胞術量測所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員/靶T細胞/結合劑複合體之平均螢光強度(MFI)，其中在所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員之濃度範圍內量測之MFI提供親和力及表觀親合力之量度。與T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員與對照T細胞之結合相比選擇性地結合靶T細胞且包含以下各物之所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員：i)結合親本野生型MOD之Co-MOD；及ii)結合至除T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員中所存在之抗原決定基以外的抗原決定基的T細胞受體，鑑定為選擇性地結合至靶T細胞。在一些情況下，結合劑為對抗原決定基標籤具特異性之抗體。在一些情況下，變異MOD與相應親本野生型MOD相比包含1至20個胺基酸取代(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代)。在一些情況下，T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含兩個變異MOD。在一些情況下，該兩個變異MOD包含相同的胺基酸序列。在一些情況下，第一多肽包含兩個變異MOD之一，且其中第二多肽包含該兩個變異MOD中之第二個。在一些情況下，該兩個變異MOD處於T細胞-MMP-抗原決定基結合物之同一多肽鏈上。在一些情況下，該兩個變異MOD處於T細胞-MMP-抗原決定基結合物之第一多肽上。在一些情況下，該兩個變異MOD處於T細胞-MMP-抗原決定基結合物之第二多肽上。
在一些情況下，獲得包含一或多個對Co-MOD展現與相應親本野生型MOD對Co-MOD之親和力相比有所降低之親和力的變異MOD的T細胞-MMP-抗原決定基結合物的方法進一步包括自該庫中分離所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員。在一些情況下，該方法進一步包括提供包含編碼用於製備所選庫成員之具有至少一個化學結合位點之T細胞-MMP之核苷酸序列的核酸。在一些情況下，該核酸存在於重組表現載體中。在一些情況下，該核苷酸序列可操作地連接至在真核生物細胞中具有功能性之轉錄控制元件。在一些情況下，該方法進一步包括將該核酸引入真核生物宿主細胞中，及在液體培養基中培養該細胞以便在該細胞中合成所編碼之具有至少一個化學結合位點之T細胞-MMP，自該細胞或自液體培養基中分離所合成之具有至少一個化學結合位點之T細胞-MMP，及使其與至少一個抗原決定基結合以形成所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物。在一些情況下，所選具有至少一個化學結合位點之T細胞-MMP包含Ig Fc多肽。在一些情況下，該方法進一步包括使藥物與Ig Fc多肽結合。在一些情況下，該藥物為選自類美登素、苯并二氮呯、類紫杉醇、CC-1065、倍癌黴素、倍癌黴素類似物、卡奇黴素、尾海兔素、尾海兔素類似物、奧瑞斯他汀、茅屋黴素及來普黴素或上述任一者之前藥的細胞毒性劑。在一些情況下，該藥物為類視黃醇。在一些情況下，親本野生型MOD及Co-MOD係選自：IL-2及IL-2受體；4-1BBL及4-1BB；PD-L1及PD-1；FasL及Fas；TGFβ及TGFβ受體；CD70及CD27；CD80及CD28；CD86及CD28；OX40L及OX40；FasL及Fas；ICOS-L及ICOS；ICAM及LFA-1；以及JAG1及Notch；JAG1及CD46；CD80及CTLA4；以及CD86及CTLA4。
本發明提供一種獲得包含一或多個對Co-MOD展現與相應親本野生型MOD對Co-MOD之親和力相比有所降低之親和力的變異MOD的T細胞-MMP-抗原決定基結合物的方法，該方法包括：A)提供包括多個成員之T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫，其中該多個成員包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)共價結合於化學結合位點處之抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽；及ii)視情況Ig Fc多肽或非Ig支架，其中該庫之成員包含第一多肽、第二多肽或第一多肽與第二多肽兩者中所存在之多個變異MOD；及B)自該庫中選擇對Co-MOD展現降低之親和力的成員。在一些情況下，選擇步驟包括使用生物層干涉術測定T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員與Co-MOD之間的結合親和力。在一些情況下，選擇步驟包括使用生物層干涉術測定T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員與Co-MOD之間的結合親和力。在一些情況下，T細胞-MMP-抗原決定基結合物如以上所描述。
在一些情況下，該方法進一步包括：a)使所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員與靶T細胞接觸，該靶T細胞在其表面上表現：i)結合親本野生型MOD之Co-MOD；及ii)結合至抗原決定基之T細胞受體，其中該T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員包含抗原決定基標籤，使得T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員結合至靶T細胞；b)使與靶T細胞結合之所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員與結合至抗原決定基標籤之經螢光標記之結合劑接觸，從而產生所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員/靶T細胞/結合劑複合體；及c)使用流式細胞術量測所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員/靶T細胞/結合劑複合體之平均螢光強度(MFI)，其中在所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員之濃度範圍內量測之MFI提供親和力及表觀親合力之量度。與T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員與對照T細胞之結合相比選擇性地結合靶T細胞且包含以下各物之所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員：i)結合親本野生型MOD之Co-MOD；及ii)結合至除T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員中所存在之抗原決定基以外的抗原決定基的T細胞受體，鑑定為選擇性地結合至靶T細胞。在一些情況下，結合劑為對抗原決定基標籤具特異性之抗體。在一些情況下，變異MOD與相應親本野生型MOD相比包含1至20個胺基酸取代(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代)。在一些情況下，T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含兩個變異MOD。在一些情況下，該兩個變異MOD包含相同的胺基酸序列。在一些情況下，第一多肽包含兩個變異MOD之一，且其中第二多肽包含該兩個變異MOD中之第二個。在一些情況下，該兩個變異MOD處於T細胞-MMP-抗原決定基結合物之同一多肽鏈上。在一些情況下，該兩個變異MOD處於T細胞-MMP-抗原決定基結合物之第一多肽上。在一些情況下，該兩個變異MOD處於T細胞-MMP-抗原決定基結合物之第二多肽上。
在一些情況下，該方法進一步包括自該庫中分離所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物庫成員。在一些情況下，該方法進一步包括提供包含編碼用於製備所選庫成員之具有至少一個化學結合位點之T細胞-MMP之核苷酸序列的核酸。在一些情況下，該核酸存在於重組表現載體中。在一些情況下，該核苷酸序列可操作地連接至在真核生物細胞中具有功能性之轉錄控制元件。在一些情況下，該方法進一步包括將該核酸引入真核生物宿主細胞中，及在液體培養基中培養該細胞以便在該細胞中合成所編碼之具有至少一個化學結合位點之T細胞-MMP，自該細胞或自液體培養基中分離所合成之具有至少一個化學結合位點之所選T細胞-MMP，及使其與至少一個抗原決定基結合以形成所選T細胞-MMP-抗原決定基結合物。在一些情況下，所選T細胞-MMP庫成員包含Ig Fc多肽。在一些情況下，該方法進一步包括使藥物與Ig Fc多肽結合。在一些情況下，該藥物為選自類美登素、苯并二氮呯、類紫杉醇、CC-1065、倍癌黴素、倍癌黴素類似物、卡奇黴素、尾海兔素、尾海兔素類似物、奧瑞斯他汀、茅屋黴素及來普黴素或上述任一者之前藥的細胞毒性劑。在一些情況下，該藥物為類視黃醇。在一些情況下，親本野生型MOD及同源MOD係選自：IL-2及IL-2受體；4-1BBL及4-1BB；PD-L1及PD-1；FasL及Fas；TGFβ及TGFβ受體；CD70及CD27；CD80及CD28；CD86及CD28；OX40L及OX40；FasL及Fas；ICOS-L及ICOS；ICAM及LFA-1；以及JAG1及Notch；JAG1及CD46；CD80及CTLA4；以及CD86及CTLA4。
III. 核酸
本發明提供一種包含編碼本發明之T細胞-MMP之核苷酸序列的核酸。本發明提供一種包含編碼本發明之T細胞-MMP之核苷酸序列的核酸，其包括可工程改造至T細胞-MMP之多肽中的化學結合位點。
本發明提供包含編碼本文中所描述之T細胞-MMP之核苷酸序列的核酸。在一些情況下，本發明之T細胞-MMP之個別多肽鏈係於獨立的核酸中編碼。在一些情況下，本發明之T細胞-MMP之所有多肽鏈均於單一核酸中編碼。在一些情況下，第一核酸包含編碼本發明之T細胞-MMP之第一多肽的核苷酸序列；且第二核酸包含編碼本發明之T細胞-MMP之第二多肽的核苷酸序列。在一些情況下，單一核酸包含編碼本發明之T細胞-MMP之第一多肽及本發明之T細胞-MMP之第二多肽的核苷酸序列。
III.A. 編碼多聚體多肽之個別多肽鏈的個別核酸
本發明提供包含編碼T細胞-MMP之核苷酸序列的核酸。如以上所指出，在一些情況下，T細胞-MMP之個別多肽鏈係於獨立的核酸中編碼。在一些情況下，編碼T細胞-MMP之獨立的多肽鏈之核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件，例如，啟動子，諸如在真核生物細胞中具有功能性之啟動子，其中該啟動子可為組成性啟動子或誘導性啟動子。
本發明提供第一核酸及第二核酸，其中該第一核酸包含編碼本發明之T細胞-MMP之第一多肽的核苷酸序列，其中該第一多肽自N末端至C末端依序包含：a)第一MHC多肽；及b) MOD (例如，如以上所描述之降低親和力變異MOD多肽)；且其中該第二核酸包含編碼T細胞-MMP之第二多肽的核苷酸序列，其中該第二多肽自N末端至C末端依序包含：a)第二MHC多肽；及b) Ig Fc多肽。適合之抗原決定基、MHC多肽、MOD及Ig Fc多肽如以上所描述。第一多肽及第二多肽中之至少一者包含化學結合位點(或可轉化成化學結合位點之新生位點)。在一些情況下，編碼第一多肽及第二多肽之核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件。在一些情況下，轉錄控制元件為在真核生物細胞中具有功能性之啟動子。在一些情況下，核酸存在於獨立的表現載體中。
本發明提供第一核酸及第二核酸，其中該第一核酸包含編碼T細胞-MMP之第一多肽的核苷酸序列，其中該第一多肽包含第一MHC多肽；且其中該第二核酸包含編碼T細胞-MMP之第二多肽的核苷酸序列，其中該第二多肽自N末端至C末端依序包含：a) MOD (例如，如以上所描述之降低親和力變異MOD多肽)；b)第二MHC多肽；及c) Ig Fc多肽。適合之MHC多肽、MOD及Ig Fc多肽如以上所描述。第一多肽及第二多肽中之至少一者包含化學結合位點。在一些情況下，編碼第一多肽及第二多肽之核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件。在一些情況下，轉錄控制元件為在真核生物細胞中具有功能性之啟動子。在一些情況下，核酸存在於獨立的表現載體中。
III.B. 編碼 T 細胞 -MMP 中所存在之兩個或更多個多肽之核酸
本發明提供一種包含編碼T細胞-MMP之至少第一多肽及第二多肽之核苷酸序列的核酸。在一些情況下，在本發明之T細胞-MMP包括第一多肽、第二多肽及第三多肽時，核酸包括編碼該第一多肽、第二多肽及第三多肽之核苷酸序列。在一些情況下，編碼T細胞-MMP之第一多肽及第二多肽之核苷酸序列包括插入編碼第一多肽之核苷酸序列與編碼第二多肽之核苷酸序列之間的蛋白水解可裂解連接子。在一些情況下，編碼T細胞-MMP之第一多肽及第二多肽之核苷酸序列包括插入編碼第一多肽之核苷酸序列與編碼第二多肽之核苷酸序列之間的內部核糖體進入位點(IRES)。在一些情況下，編碼T細胞-MMP之第一多肽及第二多肽之核苷酸序列包括插入編碼第一多肽之核苷酸序列與編碼第二多肽之核苷酸序列之間的核糖體跳躍信號(或順式作用水解酶元件，CHYSEL)。核酸之實例如以下所描述，其中蛋白水解可裂解連接子提供於編碼T細胞-MMP之第一多肽及第二多肽之核苷酸序列之間；在此等實施例中之任一者中，可使用IRES或核糖體跳躍信號來替代編碼蛋白水解可裂解連接子之核苷酸序列。
在一些情況下，如本文中所提供，第一核酸(例如，重組表現載體、mRNA、病毒RNA等)包含編碼T細胞-MMP之第一多肽鏈的核苷酸序列；且第二核酸(例如，重組表現載體、mRNA、病毒RNA等)包含編碼T細胞-MMP之第二多肽鏈的核苷酸序列。在一些情況下，編碼第一多肽之核苷酸序列及編碼第二多肽之第二核苷酸序列各自可操作地連接至轉錄控制元件，例如，啟動子，諸如在真核生物細胞中具有功能性之啟動子，其中該啟動子可為組成性啟動子或誘導性啟動子。
本發明提供包含編碼重組多肽之核苷酸序列的核酸，其中該重組多肽自N末端至C末端依序包含以下元件：a)第一MHC多肽；b) MOD (例如，如以上所描述之降低親和力變異體)；c)蛋白水解可裂解連接子；d)第二MHC多肽；及e)免疫球蛋白(Ig) Fc多肽；其中該等元件中之至少一者包含在細胞加工期間未被移除之化學結合位點。本發明提供包含編碼重組多肽之核苷酸序列的核酸，其中該重組多肽自N末端至C末端依序包含以下元件：a)第一前導肽；b)第一MHC多肽；c) MOD (例如，如以上所描述之降低親和力變異體)；d)蛋白水解可裂解連接子；e)第二前導肽；f)第二MHC多肽；及g) Ig Fc多肽；其中該等元件中之至少一者包含在細胞加工期間未被移除之化學結合位點。本發明提供包含編碼重組多肽之核苷酸序列的核酸，其中該重組多肽自N末端至C末端依序包含以下元件：a)第一MHC多肽；b)蛋白水解可裂解連接子；c) MOD (例如，如以上所描述之降低親和力變異體)；d)第二MHC多肽；及e) Ig Fc多肽；其中該等元件中之至少一者包含在細胞加工期間未被移除之化學結合位點。在一些情況下，第一前導肽及第二前導肽為β2M前導肽。在一些情況下，核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件。在一些情況下，轉錄控制元件為在真核生物細胞中具有功能性之啟動子。
適合之MHC多肽如以上所描述。在一些情況下，第一MHC多肽為β2-微球蛋白多肽；且第二MHC多肽為I類MHC重鏈多肽。在一些情況下，β2-微球蛋白多肽包含與圖4中所描繪之β2M胺基酸序列具有至少約85% (例如，至少約90%、95%、98%、99%或甚至100%)胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在一些情況下，I類MHC重鏈多肽為HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-K或HLA-L重鏈。在一些情況下，I類MHC重鏈多肽包含與圖3A至圖3D中之任一者中所描繪之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在此類實施例中，I類MHC重鏈多肽可能不包含跨膜錨定域(例如，該重鏈多肽包含圖3D中之序列)。
適合之Fc多肽如以上所描述。在一些情況下，Ig Fc多肽為IgG1 Fc多肽、IgG2 Fc多肽、IgG3 Fc多肽、IgG4 Fc多肽、IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。在一些情況下，Ig Fc多肽包含與圖2A至圖2G中所描繪之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
適合之免疫調節多肽(MOD)如以上所描述。
在一些情況下，該蛋白水解可裂解連接子以及任何其他蛋白水解可裂解連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：a) LEVLFQGP (SEQ ID NO40)；b) ENLYTQS (SEQ ID NO41)；c) DDDDK (SEQ ID NO:42)；d) LVPR (SEQ ID NO:43)；及e) GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:44)。
在一些情況下，提供附接至第一MHC多肽之包含第一Cys殘基之連接子，且第二MHC多肽包含胺基酸取代以提供第二(工程改造) Cys殘基，使得第一Cys殘基及第二Cys殘基在連接子與第二MHC多肽之間提供二硫鍵聯。在一些情況下，第一MHC多肽包含胺基酸取代以提供第一工程改造Cys殘基，且第二MHC多肽包含胺基酸取代以提供第二工程改造Cys殘基，使得第一Cys殘基及第二Cys殘基在第一MHC多肽與第二MHC多肽之間提供二硫鍵聯。如以上所論述，在提供二硫橋時，有可能使用硫醇反應劑或雙硫醇連接子來併入有效負載或抗原決定基。
III.C. 重組表現載體
本發明提供包含本發明之核酸的重組表現載體。在一些情況下，重組表現載體為非病毒載體。在一些實施例中，重組表現載體為病毒構築體，例如重組腺相關病毒構築體(參見例如美國專利第7,078,387號)、重組腺病毒構築體、重組慢病毒構築體、重組反轉錄病毒構築體、非整合病毒載體等。
適合之表現載體包括但不限於病毒載體(例如基於牛痘病毒之病毒載體；基於脊髓灰質炎病毒之病毒載體；基於腺病毒之病毒載體(參見例如Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994；Borras等人，Gene Ther 6:515 524, 1999；Li及Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995；Sakamoto等人，H Gene Ther 5:1088 1097, 1999；WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984及WO 95/00655)；基於腺相關病毒之病毒載體(參見例如Ali等人，Hum Gene Ther 9:81 86, 1998；Flannery等人，PNAS 94:6916 6921, 1997；Bennett等人，Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997；Jomary等人，Gene Ther 4:683 690, 1997；Rolling等人，Hum Gene Ther 10:641 648, 1999；Ali等人，Hum Mol Genet 5:591 594, 1996；Srivastava, WO 93/09239；Samulski等人，J. Vir. (1989) 63:3822-3828；Mendelson等人，Virol. (1988) 166:154-165；及Flotte等人，PNAS (1993) 90:10613-10617)；基於SV40之病毒載體；基於單純疱疹病毒之病毒載體；基於人類免疫缺乏病毒之病毒載體(參見例如Miyoshi等人，PNAS 94:10319 23, 1997；Takahashi等人，J Virol 73:7812 7816, 1999)；反轉錄病毒載體(例如鼠類白血病病毒、脾臟壞死病毒及來源於諸如勞氏肉瘤病毒、哈維氏肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人類免疫缺乏病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒及乳腺瘤病毒之反轉錄病毒的載體)；及其類似物。
眾多適合之表現載體對熟習此項技術者為已知的，且許多可得自市面。提供以下載體以例如用於真核生物宿主細胞：pXT1、pSG5 (Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG及pSVLSV40 (Pharmacia)。然而，可使用任何其他載體，只要其與宿主細胞相容即可。
視所利用之宿主/載體系統而定，眾多適合之轉錄及轉譯控制元件，包括組成性啟動子及誘導性啟動子、轉錄增強子元件、轉錄終止子等中之任一者均可用於表現載體(參見例如Bitter等人(1987) Methods in Enzymology, 153:516-544)。
在一些實施例中，編碼DNA靶向性RNA及/或定點修飾多肽之核苷酸序列可操作地連接至控制元件，例如轉錄控制元件，諸如啟動子。轉錄控制元件可在真核生物細胞(例如哺乳動物細胞)或原核生物細胞(例如細菌細胞或古細菌細胞)中具有功能性。在一些實施例中，編碼DNA靶向性RNA及/或定點修飾多肽之核苷酸序列可操作地連接至多個控制元件，從而允許在原核生物細胞及真核生物細胞中表現編碼DNA靶向性RNA及/或定點修飾多肽之核苷酸序列。
適合之真核生物啟動子(在真核生物細胞中具有功能性之啟動子)的非限制性實例包括來自巨細胞病毒(CMV)立即早期、單純疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期及晚期SV40、反轉錄病毒之長末端重複單元(LTR)及小鼠金屬硫蛋白-I之彼等啟動子。適當載體及啟動子之選擇完全在一般熟習此項技術者之能力範圍內。表現載體亦可含有用於轉譯起始之核糖體結合位點，及轉錄終止子。表現載體亦可包括適用於增強表現之序列。
IV. 宿主細胞
本發明提供一種經基因修飾之宿主細胞，其中該宿主細胞經本發明之核酸加以基因修飾。
適合之宿主細胞包括真核生物細胞，諸如酵母細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。在一些情況下，宿主細胞為哺乳動物細胞株之細胞。適合之哺乳動物細胞株包括人類細胞株、非人類靈長類動物細胞株、囓齒動物(例如小鼠、大鼠)細胞株及其類似物。適合之哺乳動物細胞株包括但不限於HeLa細胞(例如，美國典型菌種保藏中心(ATCC)編號CCL-2™)、CHO細胞(例如ATCC編號CRL-9618™、CCL-61™、CRL9096)、293細胞(例如，ATCC編號CRL-1573™)、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例如，ATCC編號CRL-1658)、Huh-7細胞、BHK細胞(例如，ATCC編號CCL-10™)、PC12細胞(ATCC編號CRL-1721™)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC編號CRL1651)、RAT1細胞、小鼠L細胞(ATCC編號CCLI.3)、人類胚胎腎(HEK)細胞(ATCC編號CRL1573)、HLHepG2細胞及其類似物。
在一些情況下，宿主細胞為已經基因修飾以使其不合成內源MHC β2M及/或使其不合成內源I類MHC重鏈(MHC-H)之哺乳動物細胞。除上述以外，上文論述用於包含硫酸酯酶基元之T細胞-MMP的表現甲醯甘胺酸產生酶(FGE)活性之宿主細胞，且適宜對此類細胞進行修飾以使其不表現內源MHC β2M及MHC-H蛋白中之至少一者，甚至兩者。
V. 組合物
本發明提供包含一或多種T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之組合物，包括醫藥組合物。本發明提供包含本發明之核酸或重組表現載體之組合物，包括醫藥組合物。
V.A. 包含 T 細胞 -MMP 之組合物
本發明之組合物可包含本發明之T細胞-MMP以及以下一或多者：鹽，例如NaCl、MgCl2 、KCl、MgSO4 等；緩衝液，例如Tris緩衝液、N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸) (HEPES)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸鈉鹽(MES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、N-參[羥甲基]甲基-3-胺基丙磺酸(TAPS)等；增溶劑；清潔劑，例如非離子洗滌劑，諸如Tween-20等；蛋白酶抑制劑；甘油；及其類似物。
該組合物可包含醫藥學上可接受之賦形劑，其中多種為此項技術中已知的且已知無需在本文中詳細論述。醫藥學上可接受之賦形劑已詳盡描述於多種出版物中，包括例如「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」, 第19版(1995)或最新版本, Mack Publishing Co；A. Gennaro (2000) 「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」, 第20版, Lippincott, Williams, & Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel等人編, 第7版, Lippincott, Williams, & Wilkins；及Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe等人編, 第3版, Amer. Pharmaceutical Assoc。
醫藥組合物可包含本發明之T細胞-MMP及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下，標的醫藥組合物將適合於投與個體，例如，將為無菌的。舉例而言，在一些實施例中，標的醫藥組合物將適合於投與人類個體，例如，其中該組合物為無菌的且不含可偵測之熱原質及/或其他毒素。
蛋白質組合物可包含其他組分，諸如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、鎂、碳酸鹽及其類似物。該等組合物在需要接近生理條件時可含有醫藥學上可接受之輔助物質，諸如pH值調節及緩衝劑、毒性調節劑及其類似物，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉、鹽酸鹽、硫酸鹽、溶劑合物(例如，混合離子鹽、水、有機物)、水合物(例如，水)及其類似物。
舉例而言，組合物可包括(例如，呈以下形式)水溶液、粉劑、顆粒、錠劑、丸劑、栓劑、膠囊、懸浮液、噴霧劑及其類似物。可根據以下所描述之各種投與途徑來調配組合物。
在本發明之T細胞-MMP作為可注射劑直接投與組織中(例如，經皮下、腹膜內、肌肉內及/或靜脈內)時，可將調配物提供為即用劑型、非水性形式(例如可復原型儲存穩定粉劑)或水性形式，諸如由醫藥學上可接受之載劑及賦形劑構成之液體。亦可提供含蛋白質之調配物以便在投與後增強標的蛋白質之血清半衰期。舉例而言，可將蛋白質提供於脂質體調配物中，製備為膠體，或用於延長血清半衰期之其他習知技術。多種方法可用於製備脂質體，如例如Szoka等人，1980Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467、美國專利第4,235,871號、第4,501,728號及第4,837,028號中所描述。該等製劑亦可呈控制釋放或緩慢釋放形式提供。
適用於非經腸投與之調配物的其他實例包括等滲無菌注射溶液、抗氧化劑、抑細菌劑及致使調配物與預定受體之血液等滲的溶質、懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。舉例而言，標的醫藥組合物可存在於容器，例如無菌容器，諸如注射器中。調配物可存在於單位劑量或多劑量密封容器中，諸如安瓿及小瓶，且可儲存在冷凍乾燥(凍乾)條件下，從而僅需要在臨使用前添加無菌液體賦形劑，例如注射用水。可由無菌粉劑、顆粒劑及錠劑來製備臨時注射溶液及懸浮液。
調配物中之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之濃度可廣泛變化(例如，以重量計低於約0.1%，通常為或至少為約2%至高達20%至50%或更高)，且通常將主要基於流體體積、黏度及基於患者之因素，根據所選特定投與模式及患者之需要加以選擇。
本發明提供一種包含本發明組合物，例如液體組合物之容器。容器可為例如注射器、安瓿及其類似物。在一些情況下，容器為無菌的。在一些情況下，容器及組合物兩者皆為無菌的。
本發明提供包含T細胞-MMP及/或其抗原決定基結合物之組合物，包括醫藥組合物。組合物可包含：a) T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物；及b)如以上針對T細胞-MMP及其抗原決定基結合物所描述之賦形劑。在一些情況下，賦形劑為醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些情況下，T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物存在於液體組合物中。因而，本發明提供包含本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之組合物(例如，液體組合物，包括醫藥組合物)。在一些情況下，本發明之組合物包含：a)本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物；及b)生理鹽水(例如，0.9%或約0.9% NaCl)。在一些情況下，組合物為無菌的。在一些情況下，組合物適合於投與人類個體，例如在組合物為無菌的且不含可偵測之熱原質及/或其他毒素時。因而，本發明提供一種組合物，其包含：a) T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物；及b)生理鹽水(例如，0.9%或約0.9% NaCl)，其中該組合物為無菌的且不含可偵測之熱原質及/或其他毒素。
VI. 包含核酸或重組表現載體之組合物
本發明提供包含本發明之核酸或重組表現載體之組合物，例如醫藥組合物。多種醫藥學上可接受之賦形劑為此項技術中已知的且無需在本文中詳細論述。醫藥學上可接受之賦形劑已詳盡描述於多種出版物中，包括例如A. Gennaro (2000) 「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」, 第20版, Lippincott, Williams, & Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel等人編, 第7版, Lippincott, Williams, & Wilkins；及Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe等人編, 第3版, Amer. Pharmaceutical Assoc。
本發明之組合物可包括：a)包含編碼T細胞-MMP之核苷酸序列的一或多種核酸或者一或多種重組表現載體；及b)以下各物中之一或多種：緩衝劑、表面活性劑、抗氧化劑、親水性聚合物、糊精、螯合劑、懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、抑菌劑、潤濕劑及防腐劑。適合之緩衝劑包括但不限於(例如) N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙磺酸(BES)、雙(2-羥乙基)胺基-參(羥甲基)甲烷(BIS-Tris)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N'3-丙磺酸(EPPS或HEPPS)、甘胺醯甘胺酸、N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N'-雙(2-乙烷-磺酸) (PIPES)、碳酸氫鈉、3-(N-參(羥甲基)-甲基-胺基)-2-羥基-丙磺酸) TAPSO、(N-參(羥甲基)甲基-2-胺基乙磺酸(TES)、N-參(羥甲基)甲基-甘胺酸(Tricine)、參(羥甲基)-胺基甲烷(Tris)等)。適合之鹽包括例如NaCl、MgCl2 、KCl、MgSO4 等。
本發明之醫藥調配物可包括約0.001%至約90% (w/w)之量的本發明之核酸或重組表現載體。以下在描述調配物時，「標的核酸或重組表現載體」應理解為包括本發明之核酸或重組表現載體。舉例而言，在一些實施例中，標的調配物包含本發明之核酸或重組表現載體。
標的核酸或重組表現載體可與其他化合物或化合物混合物混合、囊封、結合或以其他方式締合；此類化合物可包括例如脂質體或受體靶向性分子。標的核酸或重組表現載體可與一或多種有助於攝取、分佈及/或吸收之組分組合於調配物中。
標的核酸或重組表現載體組合物可調配成許多可能劑型中之任一種，諸如但不限於錠劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、液體糖漿、軟凝膠劑、栓劑及灌腸劑。標的核酸或重組表現載體組合物亦可調配為處於水性、非水性或混合性介質中之懸浮液。水性懸浮液可更含有增加懸浮液之黏度的物質，包括例如羧甲基纖維素鈉鹽、山梨糖醇及/或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
包含標的核酸或重組表現載體之調配物可為脂質體調配物。如本文中所使用，術語「脂質體」意謂由排列在一或多個球形雙層中之兩親脂質構成的囊泡。脂質體為具有由親脂性材料形成之膜及含有欲遞送之組合物之水性內部的單層或多層囊泡。陽離子脂質體為可與帶負電DNA分子相互作用以形式穩定複合體之帶正電脂質體。據信pH值敏感性脂質體或帶負電脂質體俘獲DNA而非與其複合。陽離子脂質體及非陽離子脂質體皆可用於遞送標的核酸或重組表現載體。
脂質體亦包括「空間穩定型」脂質體，如本文中所使用，該術語係指包含一或多種當併入脂質體中時引起循環壽命相對於缺乏此類特化脂質之脂質體有所增加之特化脂質的脂質體。空間穩定型脂質體之實例為脂質體之囊泡形成脂質部分之一部分包含一或多種醣脂或用一或多種親水性聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)部分加以衍生化的彼等脂質體。美國專利第6,287,860號中進一步描述脂質體及其用途，該專利係以引用之方式整體併入本文中。
本發明之調配物及組合物亦可包括表面活性劑。表面活性劑在藥物產品、調配物及乳液中之用途為此項技術中熟知的。美國專利第6,287,860號中進一步描述表面活性劑及其用途。
在一個實施例中，包括各種滲透增強劑，以實現核酸之有效遞送。除輔助非親脂性藥物擴散越過細胞膜以外，滲透增強劑亦增強親脂性藥物之滲透性。滲透增強劑可分類為屬於五個大類之一，亦即，表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑及非螯合性非表面活性劑。美國專利第6,287,860號中進一步描述滲透增強劑及其用途，該專利係以引用之方式整體併入本文中。
用於經口投與之組合物及調配物包括粉劑或顆粒劑、微粒、奈米粒子、水或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、扁囊、錠劑或微型錠劑。可能需要增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。適合之經口調配物包括投與標的反義核酸連同一或多種滲透增強劑、表面活性劑及螯合劑之彼等經口調配物。適合之表面活性劑包括但不限於脂肪酸及/或其酯或鹽、膽汁酸及/或其鹽。美國專利第6,287,860號中進一步描述適合之膽汁酸/鹽及脂肪酸及其用途。滲透增強劑之組合，例如脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽之組合亦為適合的。例示性適合組合為月桂酸、羊脂酸及UDCA之鈉鹽。其他滲透增強劑包括但不限於聚氧化乙烯-9-月桂醚及聚氧化乙烯-20-鯨蠟醚。適合之滲透增強劑亦包括丙二醇、二甲亞碸、三乙醇胺、N,N-二甲基乙醯胺、N,N-二甲基甲醯胺、2-吡咯啶酮及其衍生物、四氫呋喃醇及AZONE™。
VII 調節 T 細胞活性之方法
T細胞-MMP及在一些情況下T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物上之MOD可攜帶有效負載。缺乏抗原決定基之T細胞-MMP可用於將有效負載遞送至由MOD定義之T細胞類別及/或作為刺激或抑制彼等類別之T細胞的手段。在其他情況下，在T細胞-MMP已結合至抗原決定基(亦即，其為T細胞-MMP-抗原決定基結合物)時，結合物與T細胞接觸引起抗原決定基特異性T細胞調節。在一些情況下，該接觸發生在活體內(例如，在哺乳動物中，諸如人類、大鼠、小鼠、狗、貓、豬、馬或靈長類動物)。在一些情況下，該接觸發生在活體外。在一些情況下，該接觸發生在擬體內。
本發明提供一種選擇性地調節抗原決定基特異性T細胞之活性的方法，該方法包括使T細胞與本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸，其中T細胞與本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸選擇性地調節抗原決定基特異性T細胞之活性。在一些情況下，該接觸發生在活體外。在一些情況下，該接觸發生在活體內。在一些情況下，該接觸發生在擬體內。
在一些情況下，例如，在靶T細胞為CD8+ T細胞時，T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含I類MHC多肽(例如，β2-微球蛋白及I類MHC重鏈)。
在本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物包括作為活化多肽之MOD時，T細胞與T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸使抗原決定基特異性T細胞活化。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞為對癌細胞上存在之抗原決定基具有特異性之T細胞，且抗原決定基特異性T細胞與T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸增加T細胞對癌細胞之細胞毒性活性。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞為對癌細胞上存在之抗原決定基具有特異性之T細胞，且抗原決定基特異性T細胞與T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸增加抗原決定基特異性T細胞之數目。
在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞為對病毒感染細胞上存在之抗原決定基具有特異性之T細胞，且抗原決定基特異性T細胞與T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸增加T細胞對病毒感染細胞之細胞毒性活性。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞為對病毒感染細胞上存在之抗原決定基具有特異性之T細胞，且抗原決定基特異性T細胞與T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸增加抗原決定基特異性T細胞之數目。
在本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物包括作為抑制多肽之MOD時，T細胞與多聚體接觸抑制抗原決定基特異性T細胞。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞為對自體抗原中所存在之抗原決定基具有特異性之自體反應性T細胞，且該接觸減少自體反應性T細胞之數目。
VIII 選擇性地遞送共刺激多肽 (MOD) 之方法
本發明提供一種將MOD或天然存在之MOD之降低親和力變異體(諸如本文中所揭示之變異體)遞送至所選T細胞或所選T細胞群體，例如以靶向對指定抗原決定基具有特異性之TCR的方式進行此舉之方法。本發明提供一種將MOD或本文中所揭示之天然存在之MOD之降低親和力變異體選擇性地遞送至攜帶對本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基具有特異性之TCR的靶T細胞的方法。該方法包括使T細胞群體與本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸。T細胞群體可為包含以下之混合群體：i)靶T細胞；及ii)對抗原決定基不具特異性之非靶T細胞(例如，對除抗原決定基特異性T細胞結合之抗原決定基以外的抗原決定基具有特異性之T細胞)。抗原決定基特異性T細胞對T細胞-MMP抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基呈現肽具有特異性，且結合至由T細胞-MMP抗原決定基結合物提供之肽HLA複合體或肽MHC複合體。因此，T細胞群體與T細胞-MMP抗原決定基結合物接觸將共刺激多肽(例如，如本文中所描述之野生型MOD或野生型MOD之降低親和力變異體)選擇性地遞送至對T細胞-MMP抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基具有特異性之T細胞。
因而，本發明提供一種將MOD (諸如IL-2)或本文中所揭示之天然存在之MOD之降低親和力變異體(諸如IL-2變異體)或兩者之組合選擇性地遞送至靶T細胞之方法，該方法包括使混合T細胞群體與本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸。混合T細胞群體包含靶T細胞及非靶T細胞。靶T細胞對T細胞-MMP-抗原決定基結合物內存在之抗原決定基具有特異性。混合T細胞群體與本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸將T細胞-MMP-抗原決定基結合物內所存在之MOD遞送至靶T細胞。
舉例而言，使本發明之T細胞-MMP抗原決定基結合物與包含以下之T細胞群體接觸：i)對T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基具有特異性之靶T細胞；及ii)非靶T細胞，例如，對除T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基以外的第二抗原決定基具有特異性之T細胞。接觸該群體引起T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之MOD (例如，天然存在之MOD (例如，天然存在之IL-2)或天然存在之MOD之降低親和力變異體(例如，本文中所揭示之IL-2變異體))選擇性遞送至靶T細胞。因而，例如，少於50%、少於40%、少於30%、少於25%、少於20%、少於15%、少於10%、少於5%或少於4%、3%、2%或1%之非靶T細胞結合T細胞-MMP抗原決定基結合物，且因此，共刺激多肽(例如，IL-2或IL-2變異體)未得以遞送至非靶T細胞。作為另一實例，接觸該群體引起T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之共刺激多肽(例如，天然存在之共刺激多肽(例如，天然存在之4-1BBL)或天然存在之共刺激多肽之降低親和力變異體(例如，本文中所揭示之4-1BBL變異體))選擇性遞送至靶T細胞。因而，例如，少於50%、少於40%、少於30%、少於25%、少於20%、少於15%、少於10%、少於5%或少於4%、3%、2%或1%之非靶T細胞結合T細胞-MMP抗原決定基結合物，且因此，共刺激多肽(例如，4-1BBL或4-1BBL變異體)未得以遞送至非靶T細胞。
在一些情況下，T細胞群體在活體外。在一些情況下，T細胞群體在活體外，且在活體外培養之情況下引發靶T細胞群體對本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之生物反應(例如，T細胞活化及/或擴增及/或表型分化)。舉例而言，混合T細胞群體可獲自個體，且可在活體外與T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸。此類接觸可包括T細胞群體單次或多次曝露於所定義之劑量及/或曝露時程。在一些情況下，該接觸引起選擇性地結合/活化及/或擴增T細胞群體內之靶T細胞，且引起產生經活化及/或擴增之靶T細胞之群體。舉例而言，混合T細胞群體可為外周血單核細胞(PBMC)。舉例而言，可藉由標準抽血及PBMC增濃技術來獲得患者之PBMC，隨後在標準淋巴球培養條件下曝露於0.1-1000 nM之本發明之多聚體多肽。在混合T細胞群體以所定義之劑量及時程曝露之前、期間及之後的時間點，可藉由特定肽-MHC多聚體及/或表型標記物及/或功能活性(例如，細胞因子ELISpot分析)來監測活體外培養物中靶T細胞之豐度。在一些情況下，在活體外達成抗原特異性細胞之最佳豐度及/或表型後，將經活化及/或擴增之靶T細胞之群體之全部或一部分投與個體(獲得混合T細胞群體之個體)。
在一些情況下，T細胞群體在活體外。舉例而言，混合T細胞群體可獲自個體，且可在活體外與本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸。此類接觸可包括在活體外細胞培養之情況下T細胞單次或多次曝露於所定義之劑量及/或曝露時程，可用於確定混合T細胞群體是否包括對T細胞-MMP-抗原決定基結合物所呈現之抗原決定基具有特異性之T細胞。對T細胞-MMP-抗原決定基結合物之抗原決定基具有特異性之T細胞之存在可藉由分析包含混合T細胞群體之樣品來確定，該T細胞群體包含對該抗原決定基不具特異性之T細胞(非靶T細胞)且可包含對該抗原決定基具有特異性之T細胞(靶T細胞)。可使用已知分析法來偵測靶T細胞之活化及/或增殖，從而提供可確定特定T細胞-MMP-抗原決定基結合物是否具有結合至個體中所存在之T細胞的抗原決定基且因而確定該T細胞-MMP -抗原決定基結合物是否具有作為用於該個體之治療組合物的潛在用途的擬體內分析。適用於偵測靶T細胞之活化及/或增殖的已知分析法包括例如T細胞表型及/或抗原特異性及/或增殖之流式細胞表徵。此類用於偵測抗原決定基特異性T細胞之存在的分析法，例如，伴隨診斷，可進一步包括額外的分析法(例如，效應細胞因子ELISpot分析)及/或適當的對照物(例如抗原特異性及抗原非特異性多聚體肽-HLA染色試劑)，以確定T細胞-MMP-抗原決定基結合物是否選擇性地結合/活化及/或擴增靶T細胞。因而，舉例而言，本發明提供一種在獲自個體之混合T細胞群體中偵測結合相關抗原決定基之靶T細胞之存在的方法，該方法包括：a)在活體外使混合T細胞群體與本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸，其中該T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含相關抗原決定基；及b)偵測T細胞響應於該接觸之活化及/或增殖，其中活化及/或增殖之T細胞指示存在靶T細胞。替代地及/或另外地，若使用T細胞-MMP-抗原決定基結合物獲得所要T細胞群體之活化及/或擴增(增殖)，則可將包含經活化/擴增之T細胞之T細胞群體之全部或一部分投回該個體作為療法。
在一些情況下，T細胞群體在個體之活體內。在此類情況下，本發明之將MOD (例如，IL-2或降低親和力IL-2；4-1BBL或降低親和力4-1BBL；PD-L1或降低親和力PD-L1；CD80或降低親和力CD80；或者CD86或降低親和力CD86)選擇性地遞送至抗原決定基特異性T細胞之方法包括向該個體投與T細胞-MMP-抗原決定基結合物。
向其選擇性地遞送MOD (例如，IL-2或降低親和力IL-2；4-1BBL或降低親和力4-1BBL；PD-L1或降低親和力PD-L1；CD80或降低親和力CD80；或者CD86或降低親和力CD86)之抗原決定基特異性T細胞在本文中亦稱為「靶T細胞」。在一些情況下，靶T細胞為調控T細胞(Treg)。在一些情況下，Treg抑制或阻抑自體反應性T細胞之活性。
在一些情況下，靶T細胞為細胞毒性T細胞。舉例而言，靶T細胞可為對癌症抗原決定基(例如，由癌細胞呈現之抗原決定基)具有特異性之細胞毒性T細胞。
XI. 治療方法
本發明提供一種選擇性地調節個體之抗原決定基特異性T細胞之活性(例如，治療個體)之方法，該方法包括向該個體投與一定量之本發明之T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物或者一或多種編碼T細胞-MMP之核酸，其在結合至抗原決定基之後對選擇性地調節個體之抗原決定基特異性T細胞之活性有效。亦提供本發明之T細胞-MMP抗原決定基結合物以供用於治療人類或動物體之方法中。在一些情況下，本發明之治療方法包括向有需要之個體投與一或多種包含編碼本發明之T細胞-MMP之核苷酸序列的重組表現載體。在一些情況下，本發明之治療方法包括向有需要之個體投與一或多種包含編碼本發明之T細胞-MMP之核苷酸序列的mRNA分子。在一些情況下，本發明之治療方法包括向有需要之個體投與本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物。可治療之病狀包括感染、癌症及自體免疫病症，其中一些之實例如以下所描述。
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP抗原決定基結合物在投與有需要之個體時誘導抗原決定基特異性T細胞反應及抗原決定基非特異性T細胞反應。換言之，在一些情況下，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物在投與有需要之個體時藉由調節呈現以下兩者之第一T細胞之活性而誘導抗原決定基特異性T細胞反應：i)對T細胞-MMP中所存在之抗原決定基具有特異性之TCR；及ii)結合至T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之MOD的Co-MOD；且藉由調節呈現以下之第二T細胞之活性而誘導抗原決定基非特異性T細胞反應：i)對除T細胞-MMP中所存在之抗原決定基以外的抗原決定基具有特異性之TCR；及ii)結合至T細胞-MMP中所存在之MOD的Co-MOD。抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1或至少100:1。抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為約2:1至約5:1、約5:1至約10:1、約10:1至約15:1、約15:1至約20:1、約20:1至約25:1、約25:1至約50:1、約50:1至約100:1，或超過100:1。「調節」T細胞之「活性」可包括以下一或多項：i)活化細胞毒性(例如CD8+ ) T細胞；ii)誘導細胞毒性(例如CD8+ ) T細胞之細胞毒性活性；iii)誘導細胞毒性(例如CD8+ ) T細胞之細胞毒素(例如，穿孔素；顆粒酶；顆粒溶素)之產生及釋放；iv)抑制自體反應性T細胞之活性；及其類似操作。
在諸多實施例中，諸如在患者總體上受免疫抑制時，可向患者投與一或多種攜帶獨立選擇之MOD (例如，野生型)或對其Co-MOD具有降低之親和力的變異MOD的T細胞-MMP，以模擬其總體免疫狀態/反應性(例如，如藉由其對疫苗抗原或感染作出反應之能力所量度)。在其他實施例中，諸如在患者總體上受免疫抑制時，可向患者投與一或多種攜帶獨立選擇之MOD (例如，野生型)或對其Co-MOD具有降低之親和力的變異MOD的T細胞-MMP與T細胞-MMP-抗原決定基結合物之組合，以模擬該患者之免疫反應。
在諸多實施例中，可向患者投與一或多種攜帶獨立選擇之MOD (例如，野生型)或對其Co-MOD具有降低之親和力的變異MOD的T細胞-MMP連同針對病原體之疫苗(例如，蛋白質或核酸疫苗)，以便模擬/增強產生針對病原體之免疫力。在另一實施例中，向患者投與一或多種攜帶針對病原體之抗原決定基的T細胞-MMP-抗原決定基結合物連同針對病原體之疫苗(例如，蛋白質或核酸疫苗)，以模擬產生針對病原體之免疫力。在此類情況下，T細胞-MMP-抗原決定基結合物可包含獨立選擇之MOD (例如，野生型)或對其Co-MOD具有降低之親和力的變異MOD。在投與T細胞-MMP連同疫苗(例如蛋白質或核酸)時，可將其與疫苗組合或處於在與疫苗投與相同或不同的時間投與之獨立調配物中共投與。
MOD對其Co-MOD之降低之親和力與抗原決定基對TCR之親和力的組合提供本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之增強之選擇性。因而，舉例而言，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物相較於其結合至呈現以下之第二T細胞的親合力：i)對除T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基以外的抗原決定基具有特異性的TCR；及ii)結合至T細胞-MMP抗原決定基結合物中所存在之MOD的Co-MOD，以較高親合力結合至呈現以下兩者之第一T細胞：i)對T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之抗原決定基具有特異性之TCR；及ii)結合至T細胞-MMP-抗原決定基結合物中所存在之MOD的Co-MOD。
本發明提供一種選擇性地調節個體之抗原決定基特異性T細胞之活性的方法，該方法包括向該個體投與有效量之本發明之T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該T細胞-MMP或其抗原決定基結合物選擇性地調節個體之抗原決定基特異性T細胞之活性。選擇性地調節抗原決定基特異性T細胞之活性可治療個體之疾病或病症。因而，本發明提供一種治療方法，其包括向有需要之個體投與有效量之T細胞-MMP或其抗原決定基結合物。
在一些情況下，該MOD為活化多肽，且該T細胞-MMP-抗原決定基結合物活化抗原決定基特異性T細胞。在一些情況下，該抗原決定基為癌症相關抗原決定基，且該T細胞-MMP-抗原決定基結合物增加對該癌症相關抗原決定基具有特異性之T細胞的活性。
本發明提供一種治療個體之癌症的方法，該方法包括向該個體投與有效量之本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含作為癌症抗原決定基之T細胞抗原決定基，且其中該T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含刺激性MOD。在一些情況下，T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使該個體之癌細胞數目降低的量。舉例而言，在一些情況下，本發明之T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使該個體之癌細胞數目與該個體在投與T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之前或者在不投與T細胞-MMP-抗原決定基結合物之情況下的癌細胞數目相比減少至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或減至不可偵測之水準的量。在另一情況下，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使該個體之至少一個實體腫瘤之體積與該腫瘤在投與T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之第一個劑量時之體積相比減小至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或減至不可偵測之水準的量。
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體(存在腫瘤之個體)時使該個體之癌細胞數目抑或至少一個腫瘤之體積降至不可偵測之水準的量。舉例而言，在一些情況下，本發明之T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使該個體之腫瘤質量與該個體在投與T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之前或者在不投與T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之情況下的總腫瘤質量相比減少至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或減至不可偵測之水準的量。在另一實施例中，本發明之T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體(存在腫瘤之個體)時使該個體之至少一個腫瘤之腫瘤體積減小的量。舉例而言，在一些情況下，本發明之多聚體多肽之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體(存在腫瘤之個體)時使腫瘤體積與該個體在投與T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之前或者在不投與T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之情況下的腫瘤體積相比減小至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或減至不可偵測之水準(體積)的量。在此類實施例中，可基於腫瘤密度及體積來計算質量。
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使該個體之存活時間增加的量。舉例而言，在一些情況下，本發明之T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使該個體之存活時間與該個體在不投與T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之情況下的預期存活時間相比增加至少1個月、至少2個月、至少3個月、3個月至6個月、6個月至1年、1年至2年、2年至5年、5年至10年或超過10年之量。
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體群體中之個體時使該群體之平均存活時間增加的量。舉例而言，在一些情況下，本發明之T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體群體中之個體時使接受T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之個體群體之存活時間與未接受T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之個體的存活時間相比增加至少1個月、至少2個月、至少3個月、3個月至6個月、6個月至1年、1年至2年、2年至5年、5年至10年或超過10年之量；其中該群體為年齡、性別、體重及疾病狀態(疾病及進展程度)相匹配之群體。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞為對病毒感染細胞上存在之抗原決定基具有特異性之T細胞，且抗原決定基特異性T細胞與T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸增加T細胞對病毒感染細胞之細胞毒性活性。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞為對病毒感染細胞上存在之抗原決定基具有特異性之T細胞，且抗原決定基特異性T細胞與T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸增加抗原決定基特異性T細胞之數目。因此，本發明提供一種治療個體之病毒感染的方法，該方法包括向該個體投與有效量之本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含作為病毒抗原決定基之T細胞抗原決定基，且其中該T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含刺激性MOD。在一些情況下，T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使該個體之病毒感染細胞數目減少的量。舉例而言，在一些情況下，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使該個體之病毒感染細胞數目與該個體在投與T細胞-MMP-抗原決定基結合物之前或在不投與T細胞-MMP-抗原決定基結合物之情況下的病毒感染細胞數目相比減少至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的量。在一些情況下，本發明之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使該個體之病毒感染細胞數目減少的量。
本發明亦提供一種治療個體之感染的方法，該方法包括向該個體投與有效量之本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含作為病原體相關抗原決定基之T細胞抗原決定基，且其中該T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含刺激性MOD。在一些情況下，T細胞-MMP之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使該個體之病原體數目減少的量。舉例而言，在一些情況下，本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使該個體之病原體數目與該個體在投與T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之前或者在不投與T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之情況下的病原體數目相比減少至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的量。在一些情況下，本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使該個體之病原體數目減至不可偵測之水準的量。病原體包括病毒、細菌、原生動物及其類似物。
在一些情況下，該MOD為抑制性多肽，且該T細胞-MMP-抗原決定基結合物抑制抗原決定基特異性T細胞之活性。在一些情況下，該抗原決定基為自體抗原決定基，且該T細胞-MMP-抗原決定基結合物選擇性地抑制對自體抗原決定基具有特異性之T細胞的活性。
本發明提供一種治療個體之自體免疫病症的方法，該方法包括向該個體投與有效量之T細胞-MMP (或者包含編碼該T細胞-MMP之核苷酸序列的一或多種核酸)及/或包含自體抗原決定基之T細胞-MMP抗原決定基結合物，其中該T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物包含抑制性MOD。在此類情況下，T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使自體反應性T細胞數目與該個體在投與T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之前及/或在不投與T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之情況下的自體反應性T細胞數目相比減少至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的量。在一些情況下，此類T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時使該個體之Th2細胞因子產生減少(例如，至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%)的量。在一些情況下，此類T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之「有效量」為當以一或多個劑量投與有需要之個體時改善該個體之與自體免疫疾病相關之一或多種症狀的量。
如以上所指出，在一些情況下，在進行標的治療方法時，將本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物作為多肽本身投與有需要之個體。在其他情況下，在進行標的治療方法時，向有需要之個體投與包含編碼本發明之T細胞-MMP之核苷酸序列的一或多種核酸。因而，在其他情況下，向有需要之個體投與一或多種本發明之核酸，例如，一或多種本發明之重組表現載體。
X. 調配物
適合之調配物如以上所描述，其中適合之調配物包括醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下，適合之調配物包含：a)本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物；及b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下，適合之調配物包含：a)包含編碼本發明之T細胞-MMP之核苷酸序列的核酸；及b)醫藥學上可接受之賦形劑；在一些情況下，該核酸為mRNA。在一些情況下，適合之調配物包含：a)包含編碼本發明之T細胞-MMP之第一多肽的核苷酸序列的第一核酸；b)包含編碼本發明之T細胞-MMP之第二多肽的核苷酸序列的第二核酸；及c)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下，適合之調配物包含：a)包含編碼本發明之T細胞-MMP之核苷酸序列的重組表現載體；及b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下，適合之調配物包含：a)包含編碼本發明之T細胞-MMP之第一多肽的核苷酸序列的第一重組表現載體；b)包含編碼本發明之T細胞-MMP之第二多肽的核苷酸序列的第二重組表現載體；及c)醫藥學上可接受之賦形劑。
適合之醫藥學上可接受之賦形劑如以上所描述。
X.A. 劑量
主治醫師或其他合格醫務人員可基於各種臨床因素來確定適合之劑量。如醫學領域中所熟知，任一患者之劑量均視許多因素而定，包括患者之體型、體表面積、年齡、欲投與之特定多肽或核酸、患者之性別、時間、投與途徑、總體健康狀況及並行投與之其他藥物。本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物可以介於每劑量1 ng/kg體重與20 mg/kg體重之間，例如介於0.1 mg/kg體重至10 mg/kg體重之間，例如介於0.5 mg/kg體重至5 mg/kg體重之間的量投與；然而，預想在此例示性範圍以下或以上之劑量，尤其在考慮上述因素之情況下。若方案為連續輸注，則其亦可處於每公斤體重每分鐘1 μg至10 mg之範圍內。本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物可以約1 mg/kg體重至50 mg/kg體重，例如約1 mg/kg體重至約5 mg/kg體重、約5 mg/kg體重至約10 mg/kg體重、約10 mg/kg體重至約15 mg/kg體重、約15 mg/kg體重至約20 mg/kg體重、約20 mg/kg體重至約25 mg/kg體重、約25 mg/kg體重至約30 mg/kg體重、約30 mg/kg體重至約35 mg/kg體重、約35 mg/kg體重至約40 mg/kg體重或約40 mg/kg體重至約50 mg/kg體重之量投與。
在一些情況下，本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之適合劑量為每公斤體重0.01 μg至100 g、每公斤體重0.1 μg至10 g、每公斤體重1 μg至1 g、每公斤體重10 μg至100 mg、每公斤體重100 μg至10 mg或每公斤體重100 μg至1 mg。熟習此項技術者可基於所投與之劑在體液或組織中之所量測滯留時間及濃度而容易地估計重複給藥速率。在成功治療後，可能需要患者進行維持療法以防止疾病狀態復發，其中以介於每公斤體重0.01 μg至100 g、每公斤體重0.1 μg至10 g、每公斤體重1 μg至1 g、每公斤體重10 μg至100 mg、每公斤體重100 μg至10 mg或每公斤體重100 μg至1 mg之範圍內的維持劑量投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物。
熟習此項技術者將容易瞭解，劑量水準可隨特定T細胞-MMP、症狀之嚴重程度及個體對副作用之易感性而變化。熟習此項技術者可藉由多種手段容易地確定指定化合物之較佳劑量。
在一些實施例中，投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體之多個劑量。本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體之投與頻率可視多種因素中之任一種，例如症狀嚴重程度等而變化。舉例而言，在一些實施例中，每月一次、每月兩次、每月三次、每隔一週(qow)、每週一次(qw)、每週兩次(biw)、每週三次(tiw)、每週四次、每週五次、每週六次、每隔一天(qod)、每天(qd)、每天兩次(qid)或每天三次(tid)投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體。
本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體之投與持續時間，例如，投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體之時段可視多種因素中之任一種，例如患者反應等而變化。舉例而言，本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體可在介於約一天至約一週、約兩週至約四週、約一個月至約兩個月、約兩個月至約四個月、約四個月至約六個月、約六個月至約八個月、約八個月至約1年、約1年至約2年或約2年至約4年或更久範圍內之時段內投與。
X.B. 投與途徑
使用適於藥物遞送之任何可利用方法及途徑，包括活體內及擬體內方法以及全身性及局部化投與途徑向個體投與活性劑(本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體)。
習知醫藥學上可接受之投與途徑包括腫瘤內、腫瘤周圍、肌肉內、淋巴內、氣管內、顱內、皮下、皮內、局部、靜脈內、動脈內、直腸、經鼻、經口以及其他經腸及非經腸投與途徑。投與途徑可在需要時加以組合或視T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物及/或所要效應加以調節。本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物或本發明之核酸或重組表現載體可呈單次劑量形式或呈多次劑量形式投與。
在一些實施例中，經靜脈內投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體。在一些實施例中，經肌肉內投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體。在一些實施例中，經淋巴內投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體。在一些實施例中，局部投與T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體。在一些實施例中，經腫瘤內投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體。在一些實施例中，經腫瘤周圍投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體。在一些實施例中，經顱內投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體。在一些實施例中，經皮下投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體。
在一些實施例中，經靜脈內投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物。在一些實施例中，經肌肉內投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物。在一些實施例中，局部投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物。在一些實施例中，經腫瘤內投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物。在一些實施例中，經腫瘤周圍投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物。在一些實施例中，經顱內投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物。在一些實施例中，經皮下投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物。在一些實施例中，經淋巴內投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物。在一些實施例中，經淋巴內投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物。
可使用適於遞送習知藥物之任何可利用習知方法及途徑，包括全身性或局部化途徑向宿主投與本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體。一般而言，設想用於本發明方法中之投與途徑包括但未必限於經腸、非經腸及吸入途徑。
除吸入投與以外之非經腸投與途徑包括但未必限於局部、經皮、皮下、肌肉內、眶內、囊內、脊柱內、胸骨內、腫瘤內、淋巴內、腫瘤周圍及靜脈內途徑，亦即，除經由消化道以外之任何投與途徑。可進行非經腸投與以實現本發明之T細胞-MMP及/或T細胞-MMP-抗原決定基結合物、本發明之核酸或本發明之重組表現載體之全身或局部遞送。在需要全身遞送時，投與典型地涉及醫藥製劑之侵襲性投與或全身吸收局部或經黏膜投與。
X.C. 適於治療之個體
適於用本發明方法進行治療之個體包括患有癌症之個體，包括已診斷為患有癌症之個體、已進行癌症治療但未能響應治療之個體及已進行癌症治療且起初對治療有反應但隨後對治療無反應之個體。適於用本發明方法進行治療之個體包括存在感染(例如，存在諸如細菌、病毒、原生動物等病原體之感染)之個體，包括已診斷為存在感染之個體及已進行感染治療但未能響應治療之個體。適於用本發明方法進行治療之個體包括存在細菌感染之個體，包括已診斷為存在細菌感染之個體及已進行細菌感染治療但未能響應治療之個體。適於用本發明方法進行治療之個體包括存在病毒感染之個體，包括已診斷為存在病毒感染之個體及已進行病毒感染治療但未能響應治療之個體。適於用本發明方法進行治療之個體包括患有自體免疫疾病之個體，包括已診斷為患有自體免疫疾病之個體及已進行自體免疫疾病治療但未能響應治療之個體。
在某些情況下，例如，在本發明之T細胞調節多聚體多肽包含HBV抗原決定基，適於治療之個體為已感染HBV之個體。在一些情況下，該個體存在急性HBV感染。在一些情況下，該個體存在急性HBV感染，且未患有肝癌。在一些情況下，該個體為HBV之無活性攜帶者。在一些情況下，該個體為HBV之無活性攜帶者，且未患有肝癌。在一些情況下，該個體存在慢性活性HBV。在一些情況下，該個體存在慢性活性HBV，且未患有肝癌。在一些情況下，該個體患有由於HBV感染所致之肝癌。
在某些情況下，例如，在本發明之T細胞調節多聚體多肽包含HBV抗原決定基時，適於治療之個體為已感染HBV之個體，其中該個體為亞洲人，例如，其中該個體具有HLA-A11、HLA-A24或HLA-A33對偶基因。在一些情況下，該個體存在急性HBV感染。在一些情況下，該個體存在急性HBV感染，且未患有肝癌，其中該個體為亞洲人，例如，其中該個體具有HLA-A11、HLA-A24或HLA-A33對偶基因。在一些情況下，該個體為HBV之無活性攜帶者，其中該個體為亞洲人，例如，其中該個體具有HLA-A11、HLA-A24或HLA-A33對偶基因。在一些情況下，該個體為HBV之無活性攜帶者，且未患有肝癌，其中該個體為亞洲人，例如，其中該個體具有HLA-A11、HLA-A24或HLA-A33對偶基因。在一些情況下，該個體存在慢性活性HBV，其中該個體為亞洲人，例如，其中該個體具有HLA-A11、HLA-A24或HLA-A33對偶基因。在一些情況下，該個體存在慢性活性HBV，且未患有肝癌，其中該個體為亞洲人，例如，其中該個體具有HLA-A11、HLA-A24或HLA-A33對偶基因。在一些情況下，該個體患有由於HBV感染所致之肝癌，其中該個體為亞洲人，例如，其中該個體具有HLA-A11、HLA-A24或HLA-A33對偶基因。
XI. 某些實施例
儘管已參考本發明之特定實施例描述本發明，但熟習此項技術者應理解，可進行各種變化且可在不背離本發明之精神及範疇的情況下取代等效方案。另外，可進行眾多修改以使特定情形、材料、物質組成、方法及/或一或多個方法步驟適於本發明之目標、精神及範疇。所有此種修改均意欲處於所附申請專利範圍之範疇內。
1. 一種T細胞-MMP (「T細胞-MMP」)，其包含：
a) 第一多肽，該第一多肽包含
i) 具有N末端及C末端之第一主要組織相容性複合體(MHC)多肽；
b) 第二多肽，該第二多肽自N末端至C末端依序包含
i) 第二MHC多肽；及
ii) 視情況，免疫球蛋白(Ig) Fc多肽或非Ig多肽支架；
c) 一或多個附接於該第一多肽(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部之第一多肽化學結合位點，及/或一或多個附接於該第二多肽(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部之第二多肽化學結合位點；及
d) 一或多個免疫調節多肽(MOD)，其中該一或多個MOD中之至少一個係
A) 處於該第一多肽之C末端；
B) 處於該第二多肽之N末端；
C) 處於該第二多肽之C末端；或
D) 處於該第一多肽之C末端及處於該第二多肽之N末端；
其中該一或多個MOD中之每一個為獨立選擇之野生型或變異MOD。
2. 如實施例1之T細胞-MMP，其中該第一多肽包含：
在其N末端及C末端上無連接子之第一MHC多肽；
在其N末端上攜帶連接子之第一MHC多肽；
在其C末端上攜帶連接子之第一MHC多肽；或
在其N末端及C末端上攜帶連接子之第一MHC多肽。
3. 如實施例1至2中任一者之T細胞-MMP，其中該一或多個第一多肽化學結合位點中之至少一個係：
a) 附接於該第一MHC多肽序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部，其中該第一MHC多肽在其N末端及C末端上無連接子；
b) 附接於該第一MHC多肽序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部，其中該第一MHC多肽在其N末端及C末端上包含連接子；
c) 附接於該第一MHC多肽N末端上之連接子序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部；及/或
d) 附接於該第一MHC多肽C末端上之連接子序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部。
4. 如實施例1至3中任一者之T細胞-MMP，其中該第一MHC多肽及該第二MHC多肽為I類MHC多肽，且該第一MHC多肽包含：
具有N末端及C末端而在其N末端及C末端上無連接子之β-2-微球蛋白(「β2M」)多肽；
在其N末端上攜帶連接子之β2M多肽；
在其C末端上攜帶連接子之β2M多肽；或
在其N末端及C末端上攜帶連接子之β2M多肽。
5. 如實施例4之T細胞-MMP，其中該一或多個第一多肽化學結合位點中之至少一個係：
a) 附接於該β2M多肽序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部，該β2M多肽在其N末端或C末端上無連接子；
b) 附接於該β2M多肽序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部，其中該β2M多肽在其N末端及C末端上包含連接子；
c) 附接於該β2M多肽N末端上之連接子序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部；及/或
d) 附接於該β2M多肽C末端上之連接子序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部。
6. 如實施例1至5中任一者之T細胞-MMP，其中該第二多肽包含：
在其N末端及C末端上無連接子之第二MHC多肽(包含例如I類MHC重鏈(「MHC-H」)多肽)；
在其N末端上攜帶連接子之第二MHC多肽；
在其C末端上攜帶連接子之第二MHC多肽；或
在其N末端及C末端上攜帶連接子之第二MHC多肽。
7. 如實施例6之T細胞-MMP，其中該第二多肽進一步包含免疫球蛋白(Ig) Fc多肽或非Ig多肽支架。
8. 如實施例7之T細胞-MMP，其中該第二多肽自N末端至C末端依序包含：
在其C末端上依序攜帶連接子及免疫球蛋白(Ig) Fc多肽或非Ig多肽支架之第二MHC多肽；或
在其N末端及/或C末端上依序攜帶連接子及免疫球蛋白(Ig) Fc多肽或非Ig多肽支架之第二MHC多肽。
9. 如實施例1至8中任一者之T細胞-MMP，其中該一或多個第二多肽化學結合位點中之至少一個係：
a) 附接於該第二MHC多肽序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部，其中該第二MHC多肽在其N末端及C末端上無連接子；
b) 附接於該第二MHC多肽序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部，其中該第二MHC多肽在其N末端及/或C末端上包含連接子；
c) 附接於該第二MHC多肽N末端上之連接子序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部；
d) 附接於該第二MHC多肽C末端上之連接子序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部；及/或
e) 當該第二MHC多肽後面有免疫球蛋白(Ig) Fc多肽或非Ig多肽支架時附接於免疫球蛋白(Ig) Fc多肽或非Ig多肽支架序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部。
10. 如實施例1至9中任一者之T細胞-MMP，其中該第二MHC多肽包含：具有N末端及C末端而在其N末端及C末端上無連接子之I類MHC重鏈(「MHC-H」)多肽；在其N末端上攜帶連接子之MHC-H多肽；在其C末端上攜帶連接子之MHC-H多肽；或在其N末端及C末端上攜帶連接子之MHC-H多肽。
11. 如實施例4-10中任一者之T細胞-MMP，其中該一或多個第一多肽化學結合位點中之至少一個係：
a) 附接於該β2M多肽序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部，該β2M多肽在其N末端或C末端上無連接子；
b) 附接於該β2M多肽序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部，其中該β2M多肽在其N末端及C末端上包含連接子；
c) 附接於該β2M多肽N末端上之連接子序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部；及/或
d) 附接於該β2M多肽C末端上之連接子序列(例如，處於N末端或C末端)或處於其內部。
12. 如實施例4-10中任一者之T細胞-MMP，其中該一或多個第一多肽化學結合位點中之至少一個置換及/或插入在缺乏信號序列之成熟β2M多肽序列(例如，圖4中所示之β2M多肽序列)之胺基末端15個胺基酸中之任一個之間。
13. 如實施例1至12中任一者之T細胞-MMP，其中該第二多肽包含Ig Fc多肽。
14. 如實施例13之T細胞-MMP，其中該Ig Fc多肽為IgG1 Fc多肽、IgG2 Fc多肽、IgG3 Fc多肽、IgG4 Fc多肽、IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。
15. 如實施例14之T細胞-MMP，其中該Ig Fc多肽包含與圖2A至圖2D之一中所描繪之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列一致性(例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%一致性)的胺基酸序列或圖2A至圖2D之一中對應於該Ig Fc多肽之序列的一部分(長度為至少約50、75、100、125或150個胺基酸)。
16. 如實施例15之T細胞-MMP，其中該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。
17. 如實施例16之T細胞-MMP，其中該IgG1 Fc多肽包含一或多個選自N297A、L234A、L235A、L234F、L235E及P331S之胺基酸取代。
18. 如實施例17之T細胞-MMP，其中該IgG1 Fc多肽包含L234A及L235A取代。
19. 如實施例1至18中任一者之T細胞-MMP，其中T細胞-MMP包含一或多個獨立選擇之野生型及/或變異MOD多肽；其中該一或多個變異MOD多肽中之至少一個對Co-MOD (其Co-MOD)展現與相應野生型MOD對該Co-MOD之親和力相比有所降低之親和力(例如，當藉由BLI (如以上所描述)加以量測時，對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物(其中該對照物包含野生型MOD)對Co-MOD之結合親和力與ii)包含野生型MOD變異體之本發明T細胞-MMP-抗原決定基結合物對Co-MOD之結合親和力的比率為至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102 :1、至少5×102 :1、至少103 :1、至少5×103 :1、至少104 :1、至少105 :1或至少106 :1)。
20. 如實施例19之T細胞-MMP，其中該變異MOD多肽相對於相應野生型免疫調節多肽包含1至10個胺基酸之取代、插入或缺失；或者包含與相應野生型MOD之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列一致性(例如至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%一致性)的胺基酸序列，或野生型MOD序列之一部分(例如，長度為野生型MOD之至少約50、75、100、125或150個連續胺基酸)。
21. 如實施例1至20中任一者之T細胞-MMP，其中該野生型免疫調節多肽係獨立地選自由以下組成之群：IL-2、4-1BBL、PD-L1、CD70、CD80、CD86、ICOS-L、OX-40L、FasL、JAG1、TGFβ、ICAM及PD-L2。
22. 如實施例1至21中任一者之T細胞-MMP，其中該第一MHC多肽為β2微球蛋白β2M多肽；且其中該第二MHC多肽為I類 MHC重鏈多肽。
23. 如實施例4至22中任一者之T細胞-MMP，其中該β2M多肽包含與圖4中所示之胺基酸序列之一具有至少85%胺基酸序列一致性(例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%一致性)的胺基酸序列，或圖4中之成熟序列β2M多肽之一部分(例如，長度為至少約60、70、80或90個胺基酸)。
24. 如實施例4至23中任一者之T細胞-MMP，其中該β2M多肽包含與圖4中所示之胺基酸序列之一的至少一部分具有一致性之具有至少20、30、40、50、60、70、80、90或99個連續胺基酸之序列(例如，與圖4中所示之缺乏其信號序列之成熟β2M多肽序列具有一致性的具有20-99、20-40、30-50、40-60、40-90、50-70、60-80、60-99、70-90或79-99個連續胺基酸之序列)、基本上由該序列組成或由該序列組成。
25. 如實施例10至24中任一者之T細胞-MMP，其中該I類MHC重鏈多肽為HLA-A、HLA-B或HLA-C重鏈(例如，圖3之HLA-A、HLA-B或HLA-C，包括HLA-A11、HLA-A24及HLA-A33)。
26. 如實施例25之T細胞-MMP，其中該I類MHC重鏈多肽序列包含與圖3A至圖3D之一中所示的胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列一致性(例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%一致性)的胺基酸序列，或圖3A至圖3D之一中對應於該I類MHC重鏈多肽之序列(例如，與圖3A至圖3D之一中所示之序列具有一致性之具有20-100、20-40、30-50、40-60、40-90、50-70、60-80、60-90、70-90、80-100、100-150、150-200、200-250或多於250個連續胺基酸之序列)之一部分，且視情況，限制條件為該I類MHC重鏈多肽不包含功能跨膜錨定域。
27. 如實施例26之T細胞-MMP，其中該I類MHC重鏈多肽包含與圖3A至圖3D中所示之胺基酸序列中之至少一者之一部分具有一致性的具有至少20、30、40、50、80、100、150、200或250個連續胺基酸之序列，限制條件為該I類MHC重鏈多肽不包含功能跨膜域。
28. 如實施例10至27中任一者之T細胞-MMP，其中該I類MHC重鏈多肽序列包含介於α1螺旋羧基端部分之半胱胺酸與α2-1螺旋胺基端部分中之半胱胺酸及/或胺基酸殘基2、7、84、5、59、116、139、167、168、170或171中之任一或多個(兩個、三個、四個等)處之半胱胺酸或半胱胺酸取代之間的二硫鍵。
29. 如實施例28之T細胞-MMP，其中該α1螺旋之羧基端部分自約胺基酸位置79至約胺基酸位置89，且該α2-1螺旋之胺基端部分自該I類 MHC重鏈之約胺基酸位置134至胺基酸位置144，其中該等胺基酸位置係基於無前導序列之重鏈序列(參見例如圖3D)來確定。
30. 如實施例28至29中任一者之T細胞-MMP，其中該二硫鍵係介於位於位置83、84或85處之半胱胺酸與位於位置138、139或140處之半胱胺酸之間(例如，自位置83至位置138、139或140，自位置84至位置138、139或140，或者自位置85至位置138、139或140)。
31. 如實施例28至30中任一者之T細胞-MMP，其中該二硫鍵係介於位於位置84處之半胱胺酸與位於位置139處之半胱胺酸之間。
32. 如實施例28之T細胞-MMP，其中該I類MHC重鏈序列可在形成介於該α1螺旋之羧基端部分與該α2-1螺旋之胺基端部分之間的二硫鍵的半胱胺酸前後具有1至5個胺基酸之插入、缺失及/或取代。
33. 如實施例32之T細胞-MMP，其中當存在取代及/或插入時，該等胺基酸可選自任何天然存在之胺基酸，或除甘胺酸及脯胺酸以外之任何天然存在之胺基酸。
34. 如實施例25至33中任一者之T細胞-MMP，其中位置1至79處之I類MHC重鏈多肽胺基酸序列與圖3D中所示之至少一個序列之相應部分具有至少85%胺基酸序列一致性(例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%一致性) (例如，該序列相對於圖3D中之序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸插入、缺失或取代)。
35. 如實施例25至34中任一者之T細胞-MMP，其中自位置89至134 (包括彼等位置在內)之I類MHC重鏈多肽胺基酸序列與圖3D中所示之至少一個序列之相應部分具有至少85%胺基酸序列一致性(例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%一致性) (例如，該序列相對於圖3D中之序列具有1、2、3、4、5或6個胺基酸插入、缺失或取代)。
36. 如實施例25至35中任一者之T細胞-MMP，其中自位置144至230 (包括彼等位置在內)之I類MHC重鏈多肽胺基酸序列與圖3D中所示之至少一個序列之相應部分具有至少85%胺基酸序列一致性(例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%一致性) (例如，該序列相對於圖3D中之序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個胺基酸插入、缺失或取代)。
37. 如實施例25至36中任一者之T細胞-MMP，其中自位置242至274 (包括彼等位置在內)之I類MHC重鏈多肽胺基酸序列與圖3D中所示之至少一個序列之相應部分具有至少85%胺基酸序列一致性(例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%一致性) (例如，該序列相對於圖3D中之序列具有1、2、3或4個胺基酸插入、缺失或取代)。
38. 如實施例1至37中任一者之T細胞-MMP，其中該第一多肽與該第二多肽非共價締合。
39. 如實施例1至37中任一者之T細胞-MMP，其中該第一多肽與該第二多肽彼此共價連接。
40. 如實施例39之T細胞-MMP，其中該共價鍵聯係經由二硫鍵進行。
41. 如實施例1至40中任一者之T細胞-MMP，其包含兩個或更多個、三個或更多個或者四個或更多個獨立選擇之MOD。
42. 如實施例41之T細胞-MMP，其包含介於該兩個或更多個(例如兩個、三個或四個)野生型或變異MOD中之任兩個或更多個、三個或更多個或者四個或更多個之間的肽連接子。
43. 如實施例1至42中任一者之T細胞-MMP，其中該第一多肽包含介於該第一MHC多肽與至少一個野生型或變異MOD之間的肽連接子。
44. 如實施例1至42中任一者之T細胞-MMP，其中該第二多肽包含介於該第二MHC多肽與至少一個野生型或變異MOD之間的肽連接子。
45. 如實施例2至44中任一者之T細胞-MMP，其中該連接子具有5個胺基酸至30個胺基酸(例如，5-10、10-20或20-30個胺基酸)之長度。
46. 如實施例45之T細胞-MMP，其中該連接子為式(AAAGG)n或(GGGGS)n之肽，其中n為1至8 (例如，1、2、3、4、5、6、7或8，或者處於選自1至4、3至6或4至8之範圍內)。
47. 如實施例1至46中任一者之T-細胞-MMP，其中該第一化學結合位點及該第二化學結合位點係獨立地選自：
a) 充當酶修飾序列之肽序列(例如，硫酸酯酶基元)；
b) 非天然胺基酸及/或硒代半胱胺酸；
c) 經工程改造之胺基酸化學結合位點；
d) 醣或寡醣部分；及/或
e) IgG核苷酸結合位點。
48. 如實施例1至47中任一者之T細胞-MMP，其中該一或多個第一化學結合位點及第二化學結合位點中之至少一個包含酶修飾序列。
49. 如實施例48之T細胞-MMP，其中該一或多個第一化學結合位點或第二化學結合位點中之至少一個為硫酸酯酶基元。
50. 如實施例49之T細胞-MMP，其中該硫酸酯酶基元包含序列X1Z1X2Z2X3Z3、X1(C/S) X2(P/A)X3Z3、X1CX2PX3Z3或CX2PX3R；其中
Z1為半胱胺酸或絲胺酸；
Z2為脯胺酸或丙胺酸殘基；
Z3為鹼性胺基酸(精胺酸、離胺酸或組胺酸，通常為離胺酸)或脂族胺基酸(丙胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸或脯胺酸，通常為A、G、L、V或I)；
X1存在或不存在，且當存在時可為任何胺基酸，但通常為脂族胺基酸、含硫胺基酸或極性不帶電胺基酸(亦即，不為芳族胺基酸或帶電胺基酸)，通常為L、M、V、S或T，更通常為L、M、S或V，限制條件為當該硫酸酯酶基元處於靶多肽之N末端時，X1存在；且
X2及X3可獨立地為任何胺基酸，但通常為脂族胺基酸、極性不帶電胺基酸或含硫胺基酸(亦即，不為芳族胺基酸或帶電胺基酸)，通常為S、T、A、V、G或C，更通常為S、T、A、V或G。
51. 如實施例50之T細胞-MMP，其在該第一多肽或該第二多肽之胺基酸序列中包含一或多個fGly胺基酸殘基。
52. 如實施例1至51中任一者之T細胞-MMP，其中該一或多個第一化學結合位點或第二化學結合位點中之至少一個為包含位於該第一多肽及/或該第二多肽之C末端處的胺基酸序列LP(X5)TG、LP(X5)TG、LP(X5)TA、LP(X5)TGG、LP(X5)TAA、LPETGG或LPETAA的分選酶A酶位點，且其中X5為任何胺基酸。
53. 如實施例1至52中任一者之T細胞-MMP，其中該一或多個第一化學結合位點或第二化學結合位點中之至少一者為包含位於該第一多肽及/或該第二多肽之胺基末端處的至少一個寡甘胺酸(例如，(G)2 、 3 、 4 或 5 )及/或位於該第一多肽及/或該第二多肽之胺基末端處的至少一個寡丙胺酸(例如，(A)2 、 3 、 4 或 5 )的分選酶A酶位點。
54. 如實施例1至53中任一者之T細胞-MMP，其中該一或多個第一化學結合位點或第二化學結合位點中之至少一個為轉麩醯胺酸酶位點。
55. 如實施例54之T細胞-MMP，其中該一或多個轉麩醯胺酸酶位點中之至少一個係選自由以下組成之群：LQG、LLQGG、LLQG、LSLSQG、GGGLLQGG、GLLQG、LLQ、GSPLAQSHGG、GLLQGGG、GLLQGG、GLLQ、LLQLLQGA、LLQGA、LLQYQGA、LLQGSG、LLQYQG、LLQLLQG、SLLQG、LLQLQ、LLQLLQ、LLQGR、LLQGPP、LLQGPA、GGLLQGPP、GGLLQGA、LLQGPGK、LLQGPG、LLQGP、LLQP、LLQPGK、LLQAPGK、LLQGAPG、LLQGAP及LLQLQG。
56. 如實施例1至55中任一者之T細胞-MMP，其中該一或多個第一化學結合位點及第二化學結合位點中之至少一個包含硒代半胱胺酸或含一或多個獨立選擇之非天然胺基酸的胺基酸序列。
57. 如實施例56之T細胞-MMP，其中該一或多個非天然胺基酸中之至少一個係選自由以下組成之群：對乙醯基苯丙胺酸、對疊氮基苯丙胺酸及丙炔基酪胺酸。
58. 如實施例1至57中任一者之T細胞-MMP，其中該一或多個第一化學結合位點及第二化學結合位點中之至少一個包含經工程改造之胺基酸位點。
59. 如實施例1至57中任一者之T細胞-MMP，其中該一或多個第一化學結合位點及第二化學結合位點中之至少一個包含一或多個巰基或胺基(例如，胺基酸殘基2、7、84、5、59、116、139、167、168、170或171中之任一或多個(兩個、三個、四個等)處的半胱胺酸取代)。
60. 如實施例59之T細胞-MMP，其中該一或多個巰基或胺基中之至少一個由該第一多肽及或該第二多肽中存在離胺酸或半胱胺酸而產生。
61. 如實施例1至60中任一者之T細胞-MMP，其中該一或多個第一化學結合位點及第二化學結合位點中之至少一個包含獨立選擇之醣、單醣、二醣及/或寡醣。
62. 如實施例1至61中任一者之T細胞-MMP，其中該一或多個第一化學結合位點及第二化學結合位點中之至少一個包含一或多個IgG核苷酸抗體結合位點。
63. 如實施例1至62中任一者之T細胞-MMP，其進一步包含抗原決定基(例如，抗原決定基多肽)；其中該抗原決定基在第一多肽化學結合位點處或在第二多肽化學結合位點處直接或者經由間隔子或連接子間接地結合(共價附接)至該第一多肽或該第二多肽，從而形成T細胞-MMP-抗原決定基結合物。
64. 如實施例63之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該一或多個MOD中之至少一個為變異MOD。
65. 如實施例63至64中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基藉由連接子或間隔子間接地共價結合至該第一肽化學結合位點或第二肽化學結合位點。
66. 如實施例63至65中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基係經由選自肽或非肽聚合物之連接子結合。
67. 如實施例66之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該連接子為具有10個胺基酸至30個胺基酸(例如，10-20或20-30個胺基酸)之長度的肽，包括但不限於甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、GGSG)、(GGSGG)、(GSGSG)、(GSGGG)n、(GGGSG)n、(GSSSG)n及(GGGGS)n)、甘胺酸-丙胺酸聚合物諸如(AAAGG)n、丙胺酸-絲胺酸聚合物及含半胱胺酸之連接子諸如GCGGS(G4S)n、GCGASGGGGSGGGGS、GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS或GCGGSGGGGSGGGGS，其中n為至少一之整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。
68. 如67之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該連接子為式(AAAGG)n或(GGGGS)n之肽，其中n為1至8 (例如，1、2、3、4、5、6、7或8，或者處於選自1至4、3至6或4至8之範圍內)。
69. 如實施例63至68中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中：
(a) 該T細胞-MMP-抗原決定基結合物以比該T細胞-MMP結合第二T細胞之親和力高出至少25% (1.25倍)之親和力結合至第一T細胞；
其中該第一T細胞在其表面上表現Co-MOD及以至少10-7 M (例如，10-8 或10-9 M)之親和力結合該抗原決定基之TCR；且
其中該第二T細胞在其表面上表現該Co-MOD但不在其表面上表現以至少10-7 M之親和力(例如，低於10-7 M，諸如10-6 或10-5 M之親和力)結合該抗原決定基之TCR；或
(b) 其中該T細胞-MMP-抗原決定基結合物以比其結合該第二T細胞之親和力高出至少10% (例如，至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%)或至少2倍(例如，至少2.5倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超過100倍)之親和力結合至第一T細胞；
其中該第一T細胞呈現：i)對T細胞-MMP-抗原決定基結合物中存在之抗原決定基具有特異性之TCR；及ii)結合至T細胞-MMP-抗原決定基結合物中存在之MOD的Co-MOD；且
其中該第二T細胞呈現：i)對除T細胞-MMP-抗原決定基結合物中存在之抗原決定基以外的抗原決定基具有特異性之TCR；及ii)結合至T細胞-MMP-抗原決定基結合物中存在之MOD的Co-MOD。
70. 如實施例63至68中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其包含一或多個變異MOD，其中當藉由生物層干涉術加以量測時，該一或多個MOD對其Co-MOD展現與相應野生型MOD對該Co-MOD之親和力相比有所降低之親和力(例如，當藉由BLI (如以上所描述)加以量測時，對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物(其中該對照物包含野生型MOD)對Co-MOD之結合親和力與ii)本發明之包含野生型MOD之變異體的T細胞-MMP-抗原決定基結合物對該Co-MOD之結合親和力的比率為至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102 :1、至少5×102 :1、至少103 :1、至少5×103 :1、至少104 :1、至少105 :1或至少106 :1)。
71. 如實施例63至70中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基為癌症抗原決定基、病毒抗原決定基或自體抗原決定基。
72. 如實施例63至70中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基為選自HPV、CMV或HBV抗原決定基之病毒抗原決定基。
73. 如實施例63至72中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基為具有4個胺基酸(aa)、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10 aa、11 aa、12 aa、13 aa、14 aa、15 aa、16 aa、17 aa、18 aa、19 aa或20 aa長度之肽片段。
74. 如實施例63至72中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基結合於分選酶、硫酸酯酶或轉麩醯胺酸酶位點處。
75. 如實施例63至72中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基係經由非天然胺基酸或硒代半胱胺酸而得以結合。
76. 如實施例63至72中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基係經由經工程改造之胺基酸而得以結合。
77. 如實施例63至76中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其進一步包含一或多個獨立選擇之有效負載，該一或多個有效負載直接或者經由間隔子或連接子間接地共價結合至一或多個第一化學結合位點及/或第二化學結合位點，其中該間隔子或連接子視情況可裂解(例如，在哺乳動物細胞之核內體中)。
78. 如實施例77之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該有效負載包含一或多種獨立選擇之生物活性劑或藥物、診斷劑或標記物、核苷酸或核苷類似物、核酸或合成核酸、或毒素、脂質體(例如，併入藥物，諸如5-氟去氧尿苷)、奈米粒子或其組合。
79. 如實施例77之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其包含選自一或多種生物活性劑或藥物之有效負載，該一或多種生物活性劑或藥物係獨立地選自由以下組成之群：治療劑(例如，藥物或前藥)、化學治療劑、細胞毒性劑、抗生素、抗病毒劑、細胞週期同步劑、細胞表面受體配位體、免疫調節劑(例如，免疫抑制劑，諸如環孢黴素)、促細胞凋亡劑、抗血管生成劑、細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白質或多肽、抗體或其抗原結合片段、酶、酶原、激素或其組合。
80. 如實施例77之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其包含選自一或多種診斷劑或標記物之有效負載，該一或多種診斷劑或標記物係獨立地選自由以下組成之群：光可偵測標記物(例如染料、螢光標記物、磷光標記物、發光標記物)及放射性標記物、成像劑、造影劑、順磁性標記物、超音標記物及其組合。
81. 如實施例77之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其包含選自一或多種核苷酸或核苷、核苷類似物、核酸或合成核酸之有效負載，該一或多種核苷酸或核苷、核苷類似物、核酸或合成核酸係選自由以下組成之群：單鏈或雙鏈DNA、單鏈或雙鏈RNA、DNA/RNA雜合體、核糖酶、siRNA、反義RNA、cDNA、球形核酸及質體。
82. 如實施例77之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其包含選自一或多種脂質體及/或奈米粒子之有效負載，該一或多種脂質體及/或奈米粒子係獨立地選自由以下組成之群：微胞、金屬奈米粒子(例如，金奈米粒子)及非金屬奈米粒子，其中任一種或全部均可結合至核酸及或蛋白質。
83. 如實施例77之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該有效負載係經由具有1至20 (例如，1-2、2-4、5-10或10-20)個獨立選擇之α、β、δ、γ胺基酸或其組合之連接子而得以結合；或其中該連接子為式聚甘胺酸聚丙胺酸、隨機聚甘胺酸/丙胺酸共聚物或聚(GGGGS)n之肽，其中n為1、2、3、4、5、6、7或8。
84. 如實施例77之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該有效負載係藉由間隔子而得以附接至化學結合位點，其中該間隔子包含藉由單鍵或雙鍵、二硫鍵、碳-氧鍵、碳氮鍵或其組合而得以接合之兩個或更多個碳原子。
85. 如實施例77之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該有效負載係藉由間隔子而得以附接至化學結合位點，其中該間隔子由同官能(例如，同雙官能)交聯劑或異官能(例如，異雙官能)交聯劑之作用產生。
86. 如實施例77-85中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該有效負載係藉由連接子而得以結合，且可藉由在人類T細胞核內體內使該連接子或間隔子裂解或藉由用過量硫醇還原劑(例如，二硫蘇糖醇、DTT)加以還原而自T細胞-MMP中移除。
87. 一種組合物，其包含如實施例63-85中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物。
88. 一種組合物，其包含：
a) 如實施例63至87中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物；及
b) 醫藥學上可接受之賦形劑。
89. 一種調節個體之免疫反應的方法，該方法包括：對該個體投與有效量之如實施例63至87中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物。
90. 一種在活體外以抗原決定基選擇性或抗原決定基選擇性/特異性方式向靶T細胞(例如，調控T細胞或細胞毒性T細胞)或在活體內向個體遞送免疫調節多肽(MOD)之方法，該方法包括：
在活體外使如實施例63至86中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物與該T細胞接觸；或
向該個體投與如實施例63至86中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物或如實施例87至88中任一者之包含T細胞-MMP-抗原決定基結合物之組合物；
其中該靶T細胞對該T細胞-MMP-抗原決定基結合物中存在之抗原決定基具有特異性。
91. 如實施例90之方法，其中該MOD為選自IL-2、4-1BBL、PD-L1、CD70、CD80、CD86、ICOS-L、OX-40L、FasL、ICAM或PD-L2多肽之野生型或變異MOD。
92. 如實施例89至91中任一者之方法，其中該個體為人類。
93. 如實施例89至92中任一者之方法，其中該調節包括增加對癌細胞之細胞毒性T細胞反應。
94. 如實施例89至93中任一者之方法，其中該調節包括降低對自體抗原之T細胞反應。
95. 如實施例89至94中任一者之方法，其中該投與係經直腸、經鼻、經口以及其他經腸及/或非經腸投與途徑。
96. 如實施例89至95中任一者之方法，其中該投與係經腫瘤內、腫瘤周圍、肌肉內、氣管內、顱內、皮下、淋巴內、皮內、局部、靜脈內及/或動脈內進行。
97. 一或多種核酸，其包含編碼如實施例1至62中任一者之T細胞-MMP之第一多肽及第二多肽之核苷酸序列。
98. 如實施例97之一或多種核酸，其中該第一多肽係由第一核苷酸序列編碼，該第二多肽係由第二核苷酸序列編碼，且其中該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列存在於單一核酸(例如，質體)中。
99. 如實施例97至98中任一者之一或多種核酸，其中該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件。
100. 如實施例97之一或多種核酸，其中該第一多肽係由第一核酸(例如，第一質體)中存在之第一核苷酸序列編碼，且該第二多肽係由第二核酸(例如，第二質體)中存在之第二核苷酸序列編碼。
101. 如實施例98或100中任一者之一或多種核酸，其中該第一核苷酸序列可操作地連接至第一轉錄控制元件，且該第二核苷酸序列可操作地連接至第二轉錄控制元件。
102. 一種組合物，其包含：如實施例97-101中任一者之一或多種核酸。
103. 一種製造如實施例1至62中任一者之T細胞-MMP之方法，該方法包括：
a) 提供編碼該第一MHC多肽之核酸、編碼該第二MHC多肽之核酸及編碼一或多個獨立選擇之MOD的核酸，以及可選編碼免疫球蛋白(Ig) Fc多肽、非Ig多肽支架及/或一或多個獨立選擇之連接子中之任一或多個的核酸；
b) 以任何順序進行步驟i及步驟ii，彼等步驟包括：
i) 對所提供之核酸中之至少一者進行修飾以便將一或多個化學結合位點包括至除編碼該一或多個獨立選擇之MOD之核酸以外的所提供核酸之一中(工程改造至編碼序列中)；及
ii) 將所提供之核酸併入編碼該第一多肽之第一核酸及編碼該第二多肽之第二核酸中；
c) 表現由該第一核酸及該第二核酸編碼之多肽以獲得T細胞-MMP，從而獲得該第一多肽及該第二多肽。
104. 如實施例103之方法，其中該一或多個化學結合位點係獨立地選自充當酶修飾序列之肽序列、非天然胺基酸及/或硒代半胱胺酸、經工程改造之胺基酸化學結合位點、IgG核苷酸結合位點。
105. 如實施例104之方法，其中對所提供之核酸中之至少一者進行修飾包括對所提供之核酸中除編碼MOD之核酸以外的一或多者進行修飾，以便編碼為在野生型第一MHC多肽、第二MHC多肽、MOD之肽序列中或任何可選免疫球蛋白(Ig) Fc多肽、非Ig多肽支架或連接子中不存在的位置處包括天然存在之胺基酸的多肽序列。
106. 如實施例103至105中任一者之方法，其進一步包括：
a) 提供攜帶反應性基團之抗原決定基肽或與攜帶反應性基團之可選連接子結合的抗原決定基肽；
b) 在該反應性基團與化學結合位點之間形成共價鍵之條件下使該抗原決定基肽或與可選連接子結合之抗原決定基肽與如實施例103至105中任一者之T細胞-MMP接觸；
從而產生T細胞-MMP-抗原決定基結合物。
107. 如實施例106之方法，其中選擇性地在該反應性基團與該第一MHC多肽或附接至該第一MHC多肽之連接子中之化學結合位點之間形成共價鍵。
108. 如實施例107之方法，其中該第一MHC多肽包含有可選肽連接子附接至其N末端的β-2-微球蛋白(「β2M」)多肽。
109. 如108之方法，其中該β2M多肽處於該第一多肽之N末端。
110. 如實施例103至109中任一者之方法，其進一步包括使攜帶反應性基團之有效負載與T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物接觸以形成T細胞-MMP或T細胞-MMP-抗原決定基結合物之有效負載結合物。
111. 如實施例63至86中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基共價結合以產生T細胞-MMP-抗原決定基之化學結合位點不位於與以下序列具有100%胺基酸一致性之胺基酸序列中：
圖2A至圖2G中之Fc多肽序列；
圖3A至圖3D中之I類MHC重鏈多肽序列；或
圖4中之β-2微球蛋白多肽序列。
112. 如實施例63至86中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基共價結合以產生T細胞-MMP-抗原決定基之化學結合位點不位於與以下序列中任一者之任何部分具有100%胺基酸一致性的10、20、30、40或50個胺基酸長之序列中：
圖2A至圖2G中之Fc多肽序列；
圖3A至圖3D中之I類MHC重鏈多肽序列；或
圖4中之β-2微球蛋白多肽序列。
113. 如實施例63至86中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基共價結合以產生T細胞-MMP-抗原決定基之化學結合位點並非與以下序列中任一者之任何部分具有100%胺基酸一致性的5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60或70個胺基酸長之序列中出現的胺基酸：
圖2A至圖2G中之Fc多肽；
圖3A至圖3D中之I類MHC重鏈多肽；或
圖4中之β-2微球蛋白多肽序列。
114. 如實施例63至86中任一者之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基共價結合以產生T細胞-MMP-抗原決定基結合物之化學結合位點並非位於與以下序列中任一者之任何部分具有100%胺基酸一致性的10、20、30、40、50、60或70個胺基酸長之序列中的離胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或麩醯胺酸：
圖2A至圖2G中之Fc多肽序列；
圖3A至圖3D中之I類MHC重鏈多肽序列；或
圖4中之β-2微球蛋白多肽序列。
115. 一種多肽，其包含
具有N末端及C末端之成熟β2M多肽序列(缺乏其信號序列)；
可選連接子；及
處於該成熟β2M多肽序列內或經由可選連接子附接於該成熟β2M多肽的一或多個化學結合位點。
116. 如實施例115之多肽，其中該成熟β2M多肽具有與圖4中所提供之成熟β2M序列具有至少85% (例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%)胺基酸序列一致性的序列；其中在不考慮所添加之硫酸酯酶基元及所存在之任何可選連接子序列的情況下確定該β2M多肽與圖4中之相應序列之間的一致性。
117. 如實施例115至116中任一者之多肽，其中該β2M多肽序列包含與圖4中所示之胺基酸序列之一的至少一部分具有一致性的具有至少20、30、40、50、60、70、80、90或99個連續胺基酸之序列(例如，與圖4中所示之缺乏其信號序列之成熟β2M序列具有一致性的具有20-99、20-40、30-50、40-60、40-90、50-70、60-80、60-99、70-90或79-99個連續胺基酸之序列)、基本上由該序列組成或由該序列組成。
118. 如實施例115至117中任一者之多肽，其中該β2M多肽序列包含處於該成熟β2M多肽序列之胺基酸位置10、11、12、13或14中之一處、兩處或更多處的半胱胺酸。
119. 如實施例118之多肽，其中該β2M多肽序列之前12個胺基酸為IQRTPKIQVYSC。
120. 如實施例115至119中任一者之多肽，其中該硫酸酯酶基元包含序列X1Z1X2Z2X3Z3、X1(C/S) X2(P/A)X3Z3、X1CX2PX3Z3或CX2PX3R；其中
Z1為半胱胺酸或絲胺酸；
Z2為脯胺酸或丙胺酸殘基；
Z3為鹼性胺基酸(精胺酸、離胺酸或組胺酸，通常為離胺酸)或脂族胺基酸(丙胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸或脯胺酸，通常為A、G、L、V或I)；
X1存在或不存在，且當存在時可為任何胺基酸，但通常為脂族胺基酸、含硫胺基酸或極性不帶電胺基酸(亦即，不為芳族胺基酸或帶電胺基酸)，通常為L、M、V、S或T，更通常為L、M、S或V，限制條件為當該硫酸酯酶基元處於靶多肽之N末端時，X1存在；且
X2及X3可獨立地為任何胺基酸，但通常為脂族胺基酸、極性不帶電胺基酸或含硫胺基酸(亦即，不為芳族胺基酸或帶電胺基酸)，通常為S、T、A、V、G或C，更通常為S、T、A、V或G。
121. 如實施例115至120中任一者之多肽，其中該硫酸酯酶基元係直接或經由連接子間接地連接至該β2M多肽序列之N末端。
122. 如實施例115至121中任一者之多肽，其進一步包含信號序列或信號序列及連接子，其中該信號序列為該多肽之最胺基末端元件。
123. 如實施例115至122中任一者之多肽，其中該任一或多個連接子包含獨立選擇之多肽、基本上由該多肽組成或由該多肽組成。
124. 如實施例123之多肽，其中該等連接子中之任一或多個係獨立地選自式(AAAGG)n或(GGGGS)n之肽，其中n為1至8 (例如，1、2、3、4、5、6、7或8，或處於選自1至4、3至6或4至8之範圍內)。
125. 如實施例123之多肽，其中該多肽具有序列：
MSRSVALAVLALLSLSGLEALCTPSRGGGGSIQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
或序列
MSRSVALAVLALLSLSGLEAGGGGSLCTPSRGGGGSIQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM。
126. 如實施例115至125中任一者之多肽，其中該硫酸酯酶基元之絲胺酸或半胱胺酸已轉化成fGly (甲醯基甘胺酸)殘基。
127. 如實施例126之多肽，其進一步包含藉由與該fGly殘基之化學反應(例如，經硫半卡肼、胺氧基、醯肼或肼基修飾之抗原決定基多肽與該fGly之醛的反應)而得以共價結合至該多肽之抗原決定基。
128. 如實施例127之多肽，其中該抗原決定基包含肼基吲哚基以便與該fGly殘基之醛反應。
129. 如實施例127或128之多肽，其中該抗原決定基為多肽抗原決定基。
130. 一種組合物，其包含如實施例115至129中任一者之多肽。
131. 一種組合物，其包含如實施例127至129中任一者之多肽及醫藥學上可接受之載劑。
132. 一種多肽，其自N末端至C末端依序包含
成熟1類MHC重鏈多肽序列(缺乏其信號序列)；
可選連接子；及
免疫球蛋白(Ig) Fc多肽或非Ig多肽支架。
133. 如實施例132之多肽，其中該I類MHC重鏈多肽具有與圖3D中所提供之序列具有至少85% (例如，至少90%、95%、98%或99%一致性，或甚至100%)胺基酸序列一致性的序列；其中在不考慮該(Ig) Fc多肽及所存在之任何可選連接子的情況下確定該I類MHC重鏈多肽與圖3D中之相應序列之間的一致性。
134. 如實施例132至133中任一者之多肽，其中該I類MHC重鏈多肽包含與圖3D中所示之胺基酸序列之一的至少一部分具有一致性的具有至少20、30、40、50、60、70、80、90或100個連續胺基酸之序列(例如，與圖3D中所示之I類MHC重鏈多肽序列具有一致性的具有20-100、20-40、30-50、40-60、40-90、50-70、60-80、60-90、70-90或80-100個連續胺基酸之序列)、基本上由該序列組成或由該序列組成。
135. 如實施例134之多肽，其中該I類MHC重鏈多肽包含選自由以下組成之群的一個、兩個或三個序列：
i) 自約胺基酸位置79至約胺基酸位置89之序列；
ii) 自約胺基酸位置134至約胺基酸位置144之序列；及
iii) 圖3D中所示之I類MHC重鏈序列之自約胺基酸位置231至約胺基酸位置241之序列。
136. 如實施例135之多肽，其中該I類MHC重鏈多肽包含：
i) 自約胺基酸位置79至約胺基酸位置89之序列；及
ii) 自約胺基酸位置134至約胺基酸位置144之序列；
其中位置83、84或85之一已經半胱胺酸取代，從而與取代於位置138、139或140之一處的半胱胺酸形成鏈內二硫鍵。
137. 如實施例135至136中任一者之多肽，其中該多肽包含自I類MHC重鏈多肽序列之約胺基酸位置231至圖3D中所示之I類MHC重鏈序列之約胺基酸位置241，其中位置235、236或237之一已經半胱胺酸取代。
138. 如實施例132至137中任一者之多肽，其中該等連接子中之任一或多個係獨立地選自式(AAAGG)n或(GGGGS)n之肽，其中n為1至8 (例如，1、2、3、4、5、6、7或8，或處於1至4、3至6或4至8之範圍內)。
139. 如實施例137之多肽，其中該多肽具有以下序列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMCAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPCGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE AAAGGDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
140. 一種組合物，其包含如實施例132至139中任一者之多肽。
141. 一種組合物，其包含如實施例132至139中任一者之多肽及醫藥學上可接受之載劑。
XII. 實例
實例 1. 具有甲醯甘胺酸 (fGly) 化學結合位點之 T 細胞 -MMP 之製備。
此預示性實例提供具有第一多肽及第二多肽之T細胞-MMP之製備，該第一多肽含有fGly化學結合位點。第一多肽與第二多肽一起形成可結合抗原決定基之T細胞-MMP。
藉由將第一多肽及第二多肽之編碼序列組裝於包括用於驅動編碼第一多肽及第二多肽之mRNA分子之表現的組成性或誘導性啟動子元件以及聚腺苷酸化及終止密碼子之表現卡匣中來製備該等多肽。將表現卡匣組裝至單獨的載體(質體、病毒等)或單一載體中，以便由適合之細胞株(例如CHO、HEK、Vero、COS、酵母等)進行瞬時表現。或者，將所組裝之卡匣穩定整合至此類細胞中以用於第一多肽及第二多肽之組成性或誘導性表現。
以下所描述之T細胞-MMP多肽之第一多肽及第二多肽中所顯示之連接子為可選的。當存在時，該等連接子為胺基酸序列(例如1至50個胺基酸，諸如AAAGG (SEQ ID NO:75)或(GGGGS)n (SEQ ID NO:76)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在顯示多於一個連接子序列時，針對各位置所選擇之連接子序列可與針對出現連接子之任何其他位點所選擇之連接子序列相同或不同。
1A. 第一多肽
此實例之第一多肽自N末端至C末端包含a)前導序列、b)用於引入fGly化學偶合位點之硫酸酯酶基元、c)可選連接子及d) β2M多肽。在FGE作用後，第一肽允許該基元中之半胱胺酸轉化成甲醯甘胺酸(fGly)殘基。因此，mRNA編碼具有以下總體序列之第一多肽(在前導序列移除及用於產生fGly殘基之FGE作用之前顯示)：
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-X1Z1X2Z2X3Z3IQRTP(β2M之其餘部分，例如，根據圖4)；
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-X1Z1X2Z2X3Z3-連接子-IQRTP(β2M之其餘部分，例如，根據圖4)；
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-X1Z1X2Z2X3RTP(β2M之其餘部分，例如，根據圖4)；
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-X1CX2PX3IQRTP(β2M之其餘部分，例如，根據圖4)；
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-X1CX2PX3Z3-連接子-IQRTP(β2M之其餘部分，例如，根據圖4)；或
MSRSVALAVLALLSLSGLEA-連接子-X1CX2PX3RTP(K/Q)IQVYS... (β2M之其餘部分，例如，根據圖4)。
在以上提及之第一肽內，序列MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:167)充當信號序列且在多肽成熟期間在細胞加工過程中被移除。以上第I.A部分中描述硫酸酯酶基元之殘基(X1、Z1、X2、Z2、X3及Z3)。此種第一多肽之圖示於圖9第A部分中，其中硫酸酯酶基元(LCTPSR)顯示於G4 S (GGGGS) SEQ ID NO:76連接子內以強調連接子可置於該基元之前及/或之後。該圖亦指示β2M多肽中位置12處精胺酸變成半胱胺酸(R12C)之潛在胺基酸取代位置。該圖下方呈現包括前導序列之第一多肽之例示性肽序列。β2M多肽以粗體與斜體顯示，且硫酸酯酶序列(LCTPSR)以粗體顯示。
1B. 第二多肽
此實例之第二多肽自N末端至C末端包含a)前導序列、b) MOD多肽、c)可選連接子、d) 1類MHC重鏈多肽、e)可選連接子及f)免疫球蛋白Fc區。
mRNA編碼具有以下總體結構之第二多肽：信號序列-連接子-IL2多肽-連接子-IL2多肽-1類MHC重鏈多肽-連接子-免疫球蛋白重鏈Fc多肽，其中信號序列為人類IL2信號序列。此種第二多肽之圖示於圖9第B部分中，其中多肽含有信號序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168)、由具有四個G4 S (GGGGS) (SEQ ID NO:76)重複序列之連接子隔開之人類IL2 MOD之重複序列(以粗體顯示)。該多肽亦含有人類HLA-A多肽(以粗體及斜體顯示)及人類IgG1 Fc多肽。圖下指示潛在胺基酸取代位置，包括Y84C、A139C及A236C半胱胺酸取代位置。Y84C及A139C取代允許HLA α1螺旋羧基端附近之區域與HLA α2-1螺旋胺基末端周圍之區域之間形成穩定二硫鍵。由A236C取代產生之半胱胺酸可與例如第一多肽中之β2M多肽之位置12處的半胱胺酸形成鏈間二硫鍵。該圖下方呈現包括前導序列之第二多肽之例示性肽序列。
1C. 第一多肽第二多肽之表現及成熟
如以上所指出，藉由在適合之細胞株(例如真核生物或哺乳動物細胞株)中瞬時或穩定表現來製備第一多肽及第二多肽。細胞中之加工移除信號序列且當用於多肽表現之細胞亦表現能夠將硫酸酯酶基元之半胱胺酸或絲胺酸轉化成甲醯甘胺酸(fGly)殘基之FGE時形成fGly殘基。
可藉由細胞將T細胞-MMP加工為包括第一多肽及第二多肽及結合(非共價締合)抗原決定基或空多肽之複合體。在HLA重鏈多肽中介於α1螺旋羧基端處之區域與α2-1螺旋胺基末端處之區域之間處引入二硫鍵允許在不存在與第一多肽及第二多肽締合之抗原決定基多肽的情況下進行表現。另外，由於T細胞-MMP複合體不含膜錨定區，故該複合體得以呈可溶形式自表現細胞中釋放。
在已獲得所表現之T細胞-MMP之適合水準之後，收集含有所表現之T細胞-MMP之細胞培養基。在用於表現之細胞不具有FGE活性時，用能夠在硫酸酯酶基元處形成fGly殘基之FGE處理T細胞-MMP。使用例如層析法進行自培養基分離及濃縮T細胞-MMP，以產生在複合體之第一多肽之胺基末端處或附近具有fGly化學結合位點之經純化T細胞-MMP。所得T細胞-MMP具有圖5第B部分中所示之通用結構，其中第一多肽中之MHC-1為β2M多肽，第二多肽「MOD」為成對IL2多肽，MHC-2為HLA-A多肽，且Fc為IGg1重鏈恆定區。介於第一多肽與第二多肽之間的二硫鍵由因β2M多肽R12C及HLA-A A236C取代而來之半胱胺酸產生。
實例 2. T 細胞 -MMP- 抗原決定基結合物之製備
藉由在抗原決定基肽上形成能夠與T細胞-MMP中之fGly醛反應之基團使抗原決定基多肽與實例1中製備之fGly多肽結合。儘管可利用硫半卡肼、胺氧基、醯肼或肼基醛反應性基團，但藉由使用附接於吲哚之肼基來說明此實例，其中抗原決定基肽(圖8中之R)直接或間接地共價結合至吲哚環之氮。如圖8中所示，視肼基吲哚之特定結構而定，抗原決定基肽(R)與T細胞-MMP之含fGly多肽(圈出之多肽)接觸使得T細胞-MMP及抗原決定基藉由形成三環基團而共價連接，從而形成T細胞-MMP-抗原決定基結合物。結合物具有圖6中之實施例B之通用化結構，其中未顯示共價連接抗原決定基及β2M多肽之三環基團。
實例 3. 與 HBV 抗原決定基結合之 T 細胞 -MMP
可製造以產生T細胞-MMP複合體之T細胞-MMP構築體之非限制性實例包括圖10A至圖10D及圖11A至圖11E中所描繪之彼等。雖然藉由特定複合體加以例示，但來自圖10之肽與來自圖11之肽的任何組合均可用於形成可與抗原決定基肽結合以形成T細胞-MMP複合體之T細胞-MMP。圖10中所示之肽中之每一者含有構成人類IL-2序列、HLA-A重鏈序列及IgG支架之胺基酸。藉由如以上所描述在胺基酸89及139處併入半胱胺酸以形成穩定鏈內二硫鍵且在胺基酸236處併入半胱胺酸從而可與接下來描述之含β2M之多肽形成鏈間二硫鍵而使HLA-A序列穩定。在各情況下，圖11中所示之多肽含有在位置12處具有半胱胺酸取代以供鏈間二硫鍵形成用之β2M序列及側接有可選連接子之硫酸酯酶基元(SEQ ID NO:45)：(連接子)0-4 -X1Z1X2Z2X3Z3-(連接子)0-4 。可如以上(例如，如實例1及實例2中)所描述來選擇硫酸酯酶基元胺基酸以包括硫酸酯酶胺基酸序列，諸如LCTPSR。獨立地選擇硫酸酯酶基元胺基側及羧基側上之連接子，且當其存在時可為任何所要胺基酸序列，諸如1至4個GGGGS (SEQ ID NO:76)重複序列。舉例而言，在哺乳動物細胞中表現引起形成包含HLA-A重鏈之T細胞-MMP複合體及包含硫酸酯酶及β2M序列之肽。抗原決定基肽，諸如選自以下之HBV抗原決定基肽：LIMPARFYPK (SEQ ID NO:91)、AIMPARFYPK (SEQ ID NO:92)、YVNVNMGLK (SEQ ID NO:93)、FLPSDFFPSV (SEQ ID NO:84)、STLPETTVV (SEQ ID NO:90)或HBV抗原決定基表中所列出之其他HBV抗原決定基，可藉由在硫酸酯酶基元中形成甲醯甘胺酸，繼而使該甲醯基與經適當修飾之肽(例如在其羧基末端處或附近攜帶硫半卡肼、胺氧基、醯肼或肼基(諸如肼基吲哚)之肽)結合而與第一肽及第二肽複合體結合。
在T細胞-MMP之一個非限制性實例中，該複合體包含含有圖10A中命名為1775'之胺基酸序列的MHC重鏈；且該第二多肽為圖11A中命名為1783'之多肽。該多肽在一些情況下將不包括信號肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168))，且該含有β2M序列之多肽在一些情況下將不包括前導肽(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:167))。在一些情況下，抗原決定基肽不為圖11A中所描繪之LIMPARFYPK (SEQ ID NO:91)肽。
在T細胞-MMP之第二非限制性實例中，該複合體包含含有圖10B中命名為1777'之胺基酸序列的MHC重鏈；且該第二多肽為圖11A中命名為1783'之多肽。該多肽在一些情況下將不包括信號肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168))，且該含有β2M序列之多肽在一些情況下將不包括前導肽(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:167))。在一些情況下，抗原決定基肽不為圖11A中所描繪之LIMPARFYPK (SEQ ID NO:91)肽。
在T細胞-MMP之第三非限制性實例中，該複合體包含含有圖10C中命名為1779'之胺基酸序列的MHC重鏈；且該第二多肽為圖11A中命名為1783'之多肽。該多肽在一些情況下將不包括信號肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168))，且該含有β2M序列之多肽在一些情況下將不包括前導肽(MSRSVALAVLALLSLSGLEA SEQ ID NO:167))。在一些情況下，抗原決定基肽不為圖11A中所描繪之LIMPARFYPK (SEQ ID NO:91)肽。
在T細胞-MMP之第四非限制性實例中，該複合體包含含有圖10D中命名為1781'之胺基酸序列的MHC重鏈；且該第二多肽為圖11A中命名為1783'之多肽。該多肽在一些情況下將不包括信號肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168))，且該含有β2M序列之多肽在一些情況下將不包括前導肽(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:167))。在一些情況下，抗原決定基肽不為圖11A中所描繪之LIMPARFYPK (SEQ ID NO:91)肽。
在T細胞-MMP之第五非限制性實例中，該複合體包含含有圖10A中命名為1775'之胺基酸序列的MHC重鏈；且該第二多肽為圖11B中命名為1784'之多肽。該多肽在一些情況下將不包括信號肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168))，且該含有β2M序列之多肽在一些情況下將不包括前導肽(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:167))。在一些情況下，抗原決定基肽不為圖11B中所描繪之AIMPARFYPK (SEQ ID NO:92)肽。
在T細胞-MMP之第六非限制性實例中，該複合體包含含有圖10B中命名為1777'之胺基酸序列的MHC重鏈；且該第二多肽為圖11B中命名為1784'之多肽。該多肽在一些情況下將不包括信號肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168))，且該含有β2M序列之多肽在一些情況下將不包括前導肽(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:167))。在一些情況下，抗原決定基肽不為圖11B中所描繪之AIMPARFYPK (SEQ ID NO:92)肽。
在T細胞-MMP之第七非限制性實例中，該複合體包含含有圖10C中命名為1779'之胺基酸序列的MHC重鏈；且該第二多肽為圖11B中命名為1784'之多肽。該多肽在一些情況下將不包括信號肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168))，且該含有β2M序列之多肽在一些情況下將不包括前導肽(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:167))。在一些情況下，抗原決定基肽不為圖11B中所描繪之AIMPARFYPK (SEQ ID NO:92)肽。
在T細胞-MMP之第八非限制性實例中，該複合體包含含有圖10D中命名為1781'之胺基酸序列的MHC重鏈；且該第二多肽為圖11B中命名為1784'之多肽。該多肽在一些情況下將不包括信號肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168))，且該含有β2M序列之多肽在一些情況下將不包括前導肽(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:167))。在一些情況下，抗原決定基肽不為圖11B中所描繪之AIMPARFYPK (SEQ ID NO:92)肽。
在T細胞-MMP之第九非限制性實例中，該複合體包含含有圖10A中命名為1775'之胺基酸序列的MHC重鏈；且該第二多肽為圖11C中命名為1785'之多肽。該多肽在一些情況下將不包括信號肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168))，且該含有β2M序列之多肽在一些情況下將不包括前導肽(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:167))。在一些情況下，抗原決定基肽不為圖11C中所描繪之YVNVNMGLK (SEQ ID NO:93)肽。
在T細胞-MMP之第十非限制性實例中，該複合體包含含有圖10B中命名為1777'之胺基酸序列的MHC重鏈；且該第二多肽為圖11C中命名為1785'之多肽。該多肽在一些情況下將不包括信號肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168))，且該含有β2M序列之多肽在一些情況下將不包括前導肽(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:167))。在一些情況下，抗原決定基肽不為圖11C中所描繪之YVNVNMGLK (SEQ ID NO:93)肽。
在T細胞-MMP之第十一非限制性實例中，該複合體包含含有圖10C中命名為1779'之胺基酸序列的MHC重鏈；且該第二多肽為圖11C中命名為1785'之多肽。該多肽在一些情況下將不包括信號肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168))，且該含有β2M序列之多肽在一些情況下將不包括前導肽(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:167))。在一些情況下，抗原決定基肽不為圖11C中所描繪之YVNVNMGLK (SEQ ID NO:93)肽。
在T細胞-MMP之第十二非限制性實例中，該複合體包含含有圖10D中命名為1781'之胺基酸序列的MHC重鏈；且該第二多肽為圖11C中命名為1785'之多肽。該多肽在一些情況下將不包括信號肽(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168))，且該含有β2M序列之多肽在一些情況下將不包括前導肽(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:167))。在一些情況下，抗原決定基肽不為圖11C中所描繪之YVNVNMGLK (SEQ ID NO:93)肽。
實例 4. 與 CMV 抗原決定基結合之 T 細胞 -MMP
可一起表現依序包含信號肽(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (SEQ ID NO:167))、側接可選連接子之硫酸酯酶基元(SEq ID NO:45)及β2M序列(參見SEQ ID NO:151及圖4)之第一多肽：
MSRSVALAVLALLSLSGLEA(連接子)0 ‑ 4 X1Z1X2Z2X3Z3(連接子)0 ‑ 4 IQRTPKIQVYS C HPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM與依序含有信號序列(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:168))及人類IL-2 MOD、具有Y84C、A139C及A236C胺基酸取代之HLA-A11 (HLA A*1101)序列之第二多肽：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRG C YNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTCADM C AQITKRKWEAAHAAEQQRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRP C GDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEAAAGGDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。(SEQ ID NO:169)
可共表現其他1類MHC重鏈構築體(諸如圖10中之彼等構築體)作為以上所示之含HLA-A構築體之替代物。連接子及硫酸酯酶基元如以上例如實例1及實例2中所描述。
共表現產生具有可與多肽結合之硫酸酯酶基元之T細胞-MMP複合體。在硫酸酯酶基元為例如LCTPSR (轉化成醛之後為L(fGly)TPSR)且供結合之抗原決定基來自CMV (例如，NLVPMVATV (SEQ ID NO:170))時，轉化之後含有FGly殘基且結合至抗原決定基肽之c末端的第一多肽可呈現為：NLVPMVATV (連接子)0 ‑ 4 L (fGly) TPSR (連接子)0 ‑ 4 IQRTPKIQVYS C HPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLK NGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (β2M序列參見SEQ ID NO:151及圖4)。
已藉由細胞加工移除信號肽且未顯示介於半胱胺酸12與含HLA-A*1101之構築體之間的鍵聯。
圖 1 藉由本發明之攜帶經由化學偶合(以「CC」表示)至β-2微球蛋白(β2M)多肽序列而得以附接之抗原決定基之T細胞-MMP之實施例來描繪抗原決定基特異性T細胞相對於抗原決定基非特異性T細胞之優先活化。
圖 2A 至圖 2G 提供免疫球蛋白Fc多肽之胺基酸序列(SEQ ID NO. 1-12)。
圖 3A 、圖 3B 及圖 3C 提供人類白血球抗原(HLA) I類重鏈多肽之胺基酸序列。信號序列(胺基酸1-24)加粗且加下劃線。圖3A項目3A.1為HLA-A α鏈(HLA-A*01:01:01:01) (NCBI登錄號NP_001229687.1)，SEQ ID NO:134；項目3A.2來自於HLA-A*1101 SEQ ID NO:135；項目3A.3來自於HLA-A*2402 SEQ ID NO:136；且項目3A.4來自於HLA-A*3303 SEQ ID NO:137。
圖 3D 顯示十一個無前導序列且無跨膜域區域之成熟I類MHC重鏈肽序列之比對。所比對之序列包括人類HLA-A，SEQ ID NO:140 (亦參見SEQ ID NO:134)；HLA-B，SEQ ID NO:141 (參見SEQ ID NO:138)；HLA-C，SEQ ID NO:142 (參見SEQ ID NO:139)；HLA-A*0201，SEQ ID NO:143；小鼠H2K蛋白序列，SEQ ID NO:144；HLA-A之三個變異體(var.2、var. 2C及var.2CP，SEQ ID NO:145-147)；3個人類HLA-A變異體(HLA-A*1101 (HLA-A11)，SEQ ID NO:148；HLA-A*2402 (HLA-A24)，SEQ ID NO:149；及HLA-A*3303 (HLA-A33)，SEQ ID NO:150))。HLA-A*0201為HLA-A之變異體。標記為HLA-A(var. 2)者為HLA-A之Y84A及A236C變異體。標記為HLA-A(var. 2C)之第七個HLA-A序列顯示在位置84、139及236處經C殘基取代之HLA-A，且第8個序列在前一序列之C末端添加一個額外脯胺酸。第9個至第11個序列分別來自於HLA-A11 (HLA-A*1101)、HLA-A24 (HLA-A*2402)及HLA-A33 (HLA-A*3303)，該等序列在某些亞洲人群中盛行。比對指示可插入半胱胺酸殘基來替代該位置處之胺基酸以形成二硫鍵從而在不存在結合之抗原決定基肽的情況下使MHC-β2M複合體穩定的位置(成熟蛋白質之84及139)。比對亦顯示(成熟多肽之)可由半胱胺酸殘基加以置換，從而可與β2M形成鏈內二硫鍵之位置236 (例如在成熟多肽之胺基酸12處)。箭頭呈現於彼等位置中之每一者的上方並且將殘基加粗。殘基84、139及236兩側之方框顯示彼六組五個殘基之任一側上可藉由獨立地選自(i)任何天然存在之胺基酸或(ii)除脯胺酸或甘胺酸以外之任何天然存在之胺基酸的1至5個胺基酸加以置換之諸組五個胺基酸，表示為胺基酸聚簇1、胺基酸聚簇2、胺基酸聚簇3、胺基酸聚簇4、胺基酸聚簇5及胺基酸聚簇6 (該圖中分別顯示為aac 1至aac 6)。
圖 4 提供來自智人(NP_004039.1；SEQ ID NO:151)、黑猩猩(NP_001009066.1；SEQ ID NO:152)、恆河猴(NP_001040602.1；SEQ ID NO:153)、歐洲牛(NP_776318.1；SEQ ID NO:154)及小家鼠(NP_033865.2；SEQ ID NO:155)之β2M前驅物(亦即，包括前導序列)的多胺基酸序列比對。加下劃線之胺基酸1-20為信號肽(有時稱為前導序列)。
圖 5 提供四個T細胞-MMP實施例，標記為A 至D 。在各情況下，T細胞-MMP包含：第一多肽，其具有N末端及C末端且包含第一主要組織相容性複合體(MHC)多肽(MHC-1)；及第二多肽，其具有N末端及C末端及第二MHC多肽(MHC-2)，且視情況包含免疫球蛋白(Fc)多肽或非Ig多肽支架。在所示實施例中顯示第一多肽及第二多肽由二硫鍵連接；然而，T細胞-MMP不需要第一多肽與第二多肽之間存在二硫鍵聯或任何其他共價鍵聯。T細胞-MMP亦可包含由虛線(---)指示之獨立選擇之連接子序列。T細胞-MMP之第一多肽、第二多肽或第一多肽與第二多肽兩者包含至少一個化學結合位點。藉由箭頭顯示第一多肽化學結合位點(CC-1)及第二多肽化學結合位點(CC-2)之一些潛在位置。藉由處於斑點方框中之「MOD」來顯示一或多個獨立選擇之MOD的位置(例如，包含利用介於MOD之間的可選胺基酸連接子連接於序列中之一個、兩個、三個或更多個MOD之序列)。MOD可含有本發明中之其他部分以MOD*表示之變異MOD。在A 中，MOD位於第一多肽之C末端；在B 中，MOD位於第二多肽之N末端；在C 中，MOD位於第二多肽之C末端；且在D 中，可能相同或不同之MOD位於第一多肽之C末端及第二多肽之N末端。
圖 6 提供T細胞-MMP抗原決定基結合物之八個實施例，標記為A 至H ，與圖5中之實施例並行。如同圖5中，第一多肽具有N末端及C末端與第一MHC多肽，提供為包含β-2-微球蛋白多肽(β2M能夠與I類MHC重鏈(MHC-H)相互作用並且將抗原決定基呈現至T細胞受體。第二多肽具有N末端及C末端、MHC-H多肽且視情況包含免疫球蛋白(Fc)多肽或非Ig多肽支架。在A 至D 中顯示接合T細胞-MMP抗原決定基結合物之第一多肽與第二多肽之可選二硫鍵連接β2M肽序列與MHC-H肽序列，且不需要由虛線(---)指示之獨立選擇之可選連接子序列。在E 至H 中，重複A 至D 中之複合體，然而顯示接合第一多肽與第二多肽之二硫鍵接合MHC-H肽序列與間雜在抗原決定基與β2M肽序列之間的連接子序列(例如，自MHC-H鏈序列之位置84處之Cys殘基(參見圖3)至間雜之連接子的鍵)。T細胞-MMP之第一多肽、第二多肽或第一多肽與第二多肽兩者亦可包含除用於結合抗原決定基之位點以外的一或多個化學結合位點。藉由箭頭顯示此類CC-1及CC-2之潛在位置。一或多個免疫調節多肽(MOD或變異MOD)如圖5中所描繪。
圖 7 提供由T細胞-MMP形成之兩種二聚體的實例。標記為「A」之二聚體為圖6中標記為「A」之T細胞-MMP中之兩個發生二聚的結果。標記為「B」之二聚體為圖6中標記為「B」之T細胞-MMP中之兩個發生二聚的結果。所示實施例包括介於多肽之間的一或多個二硫鍵，其中每一個均為可選的。另外，僅顯示Fc區或所附接之可選連接子中之CC-2位點之子集。
圖 8 顯示根據美國專利第9,310,374號改適之肼基吲哚與含醛多肽反應之示意圖。
圖 9 在A 部分中顯示T細胞-MMP之圖，其中第一多肽具有硫酸酯酶基元作為藉由FGE酶之作用產生化學結合位點(fGly殘基)之位置。在B 中，圖 9 顯示T細胞-MMP之第二多肽具有串聯IL-2 MOD附接於人類I類MHC HLA-A重鏈多肽之胺基端，繼之以人類IgG1 Fc多肽。
圖 10A 至圖 10D 顯示自N末端至C末端具有以下劃線及粗體方式顯示之人類IL-2信號序列之一系列HLA A*1101重鏈構築體。信號(前導)序列繼之以MOD，後者指示為人類IL-2或「可選肽連接子-免疫調節多肽-可選肽連接子」。在未規定MOD時，其可為任何所要MOD。該序列之其餘部分為具有三個半胱胺酸取代(Y84C；A139C；A236C)之HLA A*1101 H鏈序列；連接子；及具有兩個胺基酸取代(L234A；L235A)之hIgG1 Fc。星號指示序列終止。
圖 11A 至圖 11E 顯示包含人類β2M多肽序列之一系列構築體。該等構築體自N末端至C末端包含：前導序列MSRSVALAVLALLSLSGLEA (加粗且加下劃線)；可選連接子及硫酸酯酶位點及如實例1及實例2中所描述之另一獨立選擇之連接子，亦即(連接子)0-4 X1Z1X2Z2X3Z3(連接子)0-4 ；以及具有R12C胺基酸修飾之人類β2M序列(IQRTPKIQVYS C HPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNG ERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM)。在哺乳動物細胞中與含I類MHC重鏈之多肽，諸如圖10中之肽共表現後，為了產生T細胞-MMP，對硫酸酯酶序列進行酶促修飾以含有甲醯基甘胺酸殘基。隨後可藉由使T細胞-MMP之甲醯基甘胺酸與已經修飾而在例如其羧基末端處攜帶肼基(例如肼基吲哚基)之HBV肽(例如，如圖11A至圖11E中所示)反應來製備T細胞-MMP結合物。

Claims (19)

  1. 一種T細胞調節多聚體多肽(「T細胞-MMP」)，其包含： a) 第一多肽，該第一多肽包含 i) 具有N末端及C末端之第一主要組織相容性複合體(MHC)多肽； b) 第二多肽，該第二多肽自N末端至C末端依序包含 i) 第二MHC多肽；及 ii) 視情況，免疫球蛋白(Ig) Fc多肽或非Ig多肽支架； c) 一或多個附接於該第一多肽或處於該第一多肽內之第一多肽化學結合位點及/或一或多個附接於該第二多肽或處於該第二多肽內之第二多肽化學結合位點；及 d) 一或多個免疫調節多肽(MOD)，其中該一或多個MOD中之至少一個係 A) 處於該第一多肽之C末端； B) 處於該第二多肽之N末端； C) 處於該第二多肽之C末端；或 D) 處於該第一多肽之C末端及處於該第二多肽之N末端； 其中該一或多個MOD中之每一個為獨立選擇之野生型或變異MOD。
  2. 如請求項1之T細胞-MMP，其中該第一MHC多肽及該第二MHC多肽為I類MHC多肽，且該第一MHC多肽包含： 具有N末端及C末端而在其N末端及C末端上無連接子之β-2-微球蛋白(「β2M」)多肽； 在其N末端上攜帶連接子之β2M多肽； 在其C末端上攜帶連接子之β2M多肽；或 在其N末端及C末端上攜帶連接子之β2M多肽。
  3. 如請求項2之T細胞-MMP，其中該第二多肽包含： 在其N末端及C末端上無連接子之第二MHC多肽(包含例如I類MHC重鏈(「MHC-H」)多肽)； 在其N末端上攜帶連接子之第二MHC多肽； 在其C末端上攜帶連接子之第二MHC多肽；或 在其N末端及C末端上攜帶連接子之第二MHC多肽。
  4. 如請求項3之T細胞-MMP，其中該第二多肽進一步包含免疫球蛋白(Ig) Fc多肽或非Ig多肽支架。
  5. 如請求項3之T細胞-MMP，其中該T細胞-MMP包含一或多個獨立選擇之野生型及/或變異MOD多肽。
  6. 如請求項3之T細胞-MMP，其中該T細胞-MMP包含一或多個獨立選擇之野生型及/或變異MOD多肽；其中該一或多個變異MOD多肽中之至少一個對Co-MOD (其Co-MOD)展現與相應野生型MOD對該Co-MOD之親和力相比有所降低之親和力；且其中當藉由生物層干涉術(「BLI」)加以量測時，i)對照T細胞-MMP-抗原決定基結合物(其中該對照包含野生型MOD)對Co-MOD之結合親和力與ii)本發明之包含野生型MOD之變異體的T細胞-MMP-抗原決定基結合物對該Co-MOD之結合親和力的比率為至少1.5:1或處於1.5:1至106 :1之範圍內。
  7. 如請求項6之T細胞-MMP，其中該等野生型MOD多肽係獨立地選自由以下組成之群：IL-2、4-1BBL、PD-L1、CD70、CD80、CD86、ICOS-L、OX-40L、FasL、JAG1、TGFβ、ICAM及PD-L2，且該等變異MOD多肽為其變異體。
  8. 如請求項1至7中任一項之T細胞-MMP，其中該第一化學結合位點及該第二化學結合位點係獨立地選自： a) 充當酶修飾序列(例如，硫酸酯酶基元)之肽序列； b) 非天然胺基酸及/或硒代半胱胺酸； c) 經工程改造之胺基酸化學結合位點； d) 醣或寡醣部分；及/或 e) IgG核苷酸結合位點。
  9. 如請求項8之T細胞-MMP，其中該一或多個第一化學結合位點及第二化學結合位點中之至少一個包含酶修飾序列。
  10. 如請求項9之T細胞-MMP，其中該一或多個第一化學結合位點或第二化學結合位點中之至少一個為硫酸酯酶基元。
  11. 如請求項10之T細胞-MMP，其中該硫酸酯酶基元包含序列X1Z1X2Z2X3Z3、X1(C/S) X2(P/A)X3Z3、X1CX2PX3Z3或CX2PX3R；其中 Z1為半胱胺酸或絲胺酸； Z2為脯胺酸或丙胺酸殘基； Z3為鹼性胺基酸； X1存在或不存在，且當存在時可為任何胺基酸，但通常為脂族胺基酸、含硫胺基酸或極性不帶電胺基酸，限制條件為當該硫酸酯酶基元處於該多肽之N末端時，X1存在；且 X2及X3可獨立地為任何胺基酸，但通常為脂族胺基酸、極性不帶電胺基酸或含硫胺基酸。
  12. 如請求項11之T細胞-MMP，其包含fGly胺基酸殘基作為該第一化學結合位點或該第二化學結合位點。
  13. 一種T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其包含：如請求項8之T細胞-MMP，且進一步包含抗原決定基；其中該抗原決定基在第一多肽化學結合位點或在第二多肽化學結合位點直接或經由間隔基或連接子間接結合至該第一多肽或該第二多肽。
  14. 如請求項13之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基經由間隔基或連接子結合至該第一多肽或該第二多肽。
  15. 如請求項13之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基為癌症抗原決定基、病毒抗原決定基或自體抗原決定基。
  16. 如請求項15之T細胞-MMP-抗原決定基結合物，其中該抗原決定基為選自HPV抗原決定基、CMV抗原決定基或HBV抗原決定基之病毒抗原決定基。
  17. 一種組合物，其包含： a) 如請求項15之T細胞-MMP-抗原決定基結合物；及 b) 醫藥學上可接受之賦形劑。
  18. 一種如請求項15之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之用途，其係用於製造供向有需要之個體投與有效量之該T細胞-MMP-抗原決定基結合物用的藥物。
  19. 一種如請求項15之T細胞-MMP-抗原決定基結合物之用途，其係用於製造供用於在活體外以抗原決定基選擇性或抗原決定基選擇性/特異性方式向靶T細胞或在活體內向個體遞送免疫調節多肽(MOD)之方法中的藥物，該方法包括： 在活體外使該藥物與該T細胞接觸，或 向該個體投與該藥物； 其中該靶T細胞對該T細胞-MMP-抗原決定基結合物中存在之抗原決定基具有特異性。
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