TW202317623A - 基於il2之治療劑及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本揭露是有關一種融合蛋白及其使用方法，該融合蛋白包含特異地結合至人類PD-1的抗原結合部分以及IL2部分。

Description

基於IL2之治療劑及其使用方法

本揭露大體上是有關基於IL2之治療劑及其使用方法，且更具體地是有關包含IL2部分和特異地結合至人類PD-1的抗原結合部分之融合蛋白及其使用方法。

介白素2(IL-2或IL2)是一種主要由經活化T細胞所生產的多能細胞介素。它刺激T細胞的增生和分化、誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的生成以及周邊血液淋巴細胞分化成細胞毒性細胞和受淋巴激素活化的殺手(LAK)細胞、促使T細胞表現細胞介素和細胞溶解分子、促進B細胞的增生和分化以及B細胞合成免疫球蛋白，並刺激自然殺手(NK)細胞的生成，增生和活化(參見Waldmann, 2009, Nat Rev Immunol 6:595-601與Malek, 2008, Annu Rev Immunol 26:453-79)。IL2參與周邊CD4 ⁺CD25 ⁺調節性T(T _reg)細胞的維持(參見例如Fontenot et al., 2005, Nature Immunol 6:1142-51)，這也被稱為抑制性T細胞。它們抑制效應T細胞破壞其(自身)目標，無論是透過細胞-細胞接觸藉由抑制T細胞輔助與活化，或是透過免疫抑制性細胞介素(諸如IL-10或TGFβ)釋放。已證實，T _reg細胞的耗竭會提高IL2誘導的抗腫瘤免疫力(Imai et al., 2007, Cancer Sci 98:416-23)。

然而，由於IL2的多效作用，它並不是抑制腫瘤生長的最佳選項。使用IL2作為抗腫瘤藥劑已經因為腫瘤反應所需劑量所伴隨而來的嚴重毒性而受到限制。Proleukin® (由Prometheus Laboratories, San Diego, Calif.經銷)是一種重組形式的IL2，經核准用於治療轉移性黑色素瘤和轉移性腎癌，但其副作用非常嚴重，因此僅建議使用在有重症照護的醫院環境。IL2療法的主要副作用是血管滲漏症候群(VLS)，導致組織間隙液積聚在肺臟和肝臟中，從而造成肺水腫和肝臟損傷。除了停用IL2外，沒有其他可用於VLS的治療方法。已經證實IL2誘導的肺水腫是因為IL2直接結合至肺臟內皮細胞所引起的，肺臟內皮細胞表現低至中等程度的功能性高親和力IL2受體(Krieg et al., 2010, Proc Nat Acad Sci USA 107:11906-11)。儘管在開發用於癌症療法之經CD122定向IL2療法的領域中已被廣為接受，但出乎意料發現到，這樣的分子就癌症療法來說治療指數欠佳，並且需要較高的毒性劑量才能產生適度的抗癌作用。

因此，本技藝中迫切需要治療功效和安全性概況獲得改善的新穎IL2療法。

本揭露解決了上述需求中的一或多者。本揭露的融合蛋包含特異地結合至靶向腫瘤反應性T細胞之人類PD-1的抗原結合部分。抗原結合部分有助於選擇性地重建對腫瘤反應性T細胞的活性。融合蛋白進一步包含IL2部分，其中IL2部分包含與IL2Rα結合的IL2。在某些具體例中，融合蛋白包含未經修飾的IL2序列。在某些具體例中，融合蛋白保有接合內源性IL2Rα的能力。融合蛋白包含呈反式螯合構形(trans-sequestered conformation)的IL2部分。這保持了與經活化CD8+ T細胞的接合；然而，IL2部分的結合構形有助於掩蔽IL2並減弱其活性，從而導致全身性毒性降低。例如，與野生型IL2相比，本揭露融合蛋白並不會在小鼠體內誘導急性肺水腫(血管滲漏)。與單獨IL2或與PD-1抑制劑(例如抗PD-1抗體或其抗原結合片段)組合的IL2相比，本揭露融合蛋白提供的抗腫瘤功效提高且治療指數改善。

在一個態樣中，所揭示的技術是有關一種融合蛋白，其包括：(i)特異地結合至人類計畫性細胞死亡蛋白1(PD-1)的抗原結合部分和(ii)介白素2(IL2)部分。在一些具體例中，抗原結合部分包括特異地結合至人類PD-1的抗體或其抗原結合片段。在一些具體例中，結合至人類PD-1的抗體或其抗原結合片段是人類單株抗體。在一些具體例中，抗原結合部分包括三個重鏈互補決定區(HCDR) (HCDR1、HCDR2和HCDR3)及三個輕鏈CDR (LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中：HCDR1包括SEQ ID NO：43、4或24的胺基酸序列；HCDR2包括SEQ ID NO：45、6或26的胺基酸序列；HCDR3包括SEQ ID NO：47、8或28的胺基酸序列；LCDR1包括SEQ ID NO：12或32的胺基酸序列；LCDR2包括SEQ ID NO：14的胺基酸序列；而LCDR3包括SEQ ID NO：16或35的胺基酸序列。

在一些具體例中，抗原結合部分包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其包括以下對應胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：43、45、47、12、14和16；(ii)SEQ ID NO：4、6、8、12、14和16；或(iii)SEQ ID NO：24、26、28、32、14和35。在一些具體例中，抗原結合部分包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其包括SEQ ID NO：43、45、47、12、14和16的對應胺基酸序列。在一些具體例中，抗原結合部分包括重鏈可變區(HCVR)，其包括SEQ ID NO：41、2或22的胺基酸序列；以及輕鏈可變區(LCVR)，其包括SEQ ID NO：10或30的胺基酸序列。在一些具體例中，HCVR包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列而LCVR包括SEQ ID NO：10的胺基酸序列。在一些具體例中，HCVR包括SEQ ID NO：22的胺基酸序列而LCVR包括SEQ ID NO：30的胺基酸序列。在一些具體例中，HCVR包括SEQ ID NO：41的胺基酸序列而LCVR包括SEQ ID NO：10的胺基酸序列。在一些具體例中，抗原結合部分包括SEQ ID NO：55的重鏈恆定區以及SEQ ID NO：56的輕鏈恆定區。在一些具體例中，抗原結合部分包括重鏈和輕鏈，其中重鏈包括SEQ ID NO：61、57或59的胺基酸序列，而輕鏈包括SEQ ID NO：62、58或60的胺基酸序列。在一些具體例中，抗原結合部分包括SEQ ID NO：61/62、57/58或59/60的重鏈/輕鏈序列對。

在一些具體例中，抗原結合部分包括SEQ ID NO：61/62的重鏈/輕鏈序列對。在一些具體例中，IL2部分包括(i)IL2或其片段；及(ii)IL2受體α(IL2Rα)或其片段。在一些具體例中，IL2或其片段是人類IL2(hIL2)或其片段。在一些具體例中，IL2Rα或其片段是人類IL2Rα(hIL2Rα)或其片段。在一些具體例中，IL2或其片段包括SEQ ID NO：53的胺基酸序列。在一些具體例中，IL2Rα或其片段包括SEQ ID NO：51的胺基酸序列。在一些具體例中，IL2或其片段經由連接子連接至IL2Rα或其片段的C端。在一些具體例中，IL2部分經由連接子連接至抗原結合部分的重鏈恆定區的C端。在一些具體例中，連接子包括一或多個重複序列GGGGS(SEQ ID NO：67)的胺基酸序列。在一些具體例中，連接子包括SEQ ID NO：50或52的胺基酸序列。在一些具體例中，IL2部分包括SEQ ID NO：54的胺基酸序列。

在另一個態樣中，所揭示的技術是有關一種融合蛋白，其包括：(i)第一多肽，其包括特異地結合至人類PD-1的人類抗體的輕鏈可變區(LCVR)；以及(ii)第二多肽，其包括(a)特異地結合至人類PD-1的抗體的重鏈可變區(HCVR)和(b)IL2部分。在一些具體例中，HCVR包括三個重鏈互補決定區(HCDR) (HCDR1、HCDR2和HCDR3)而LCVR包括三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中：HCDR1包括SEQ ID NO：43、4或24的胺基酸序列；HCDR2包括SEQ ID NO：45、6或26的胺基酸序列；HCDR3包括SEQ ID NO：47、8或28的胺基酸序列；LCDR1包括SEQ ID NO：12或32的胺基酸序列；LCDR2包括SEQ ID NO：14的胺基酸序列；而LCDR3包括SEQ ID NO：16或35的胺基酸序列。在一些具體例中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包括(i)SEQ ID NO：43、45、47、12、14和16；(ii)SEQ ID NO：4、6、8、12、14和16；或(iii)SEQ ID NO：24、26、28、32、14和35的胺基酸序列。在一些具體例中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包括SEQ ID NO：43、45、47、12、14和16的胺基酸序列。

在一些具體例中，HCVR和LCVR包括(i)SEQ NO：41和10；(ii)SEQ ID NO：2和10；或(iii)SEQ ID NO：22和30的胺基酸序列。在一些具體例中，第一多肽包括連接至LCVR的輕鏈恆定區。在一些具體例中，輕鏈恆定區包括SEQ ID NO：56的胺基酸序列。在一些具體例中，第二多肽包括連接至HCVR的重鏈恆定區，且其中IL2部分連接至重鏈恆定區的C端。在一些具體例中，重鏈恆定區包括SEQ ID NO：55的胺基酸序列。在一些具體例中，第一多肽包括SEQ ID NO：62、58或60的輕鏈序列。在一些具體例中，第二多肽包括SEQ ID NO：61、57或59的重鏈序列。

在一些具體例中，融合蛋白包括SEQ ID NO：61/62、57/58或59/60的重鏈/輕鏈序列對。在一些具體例中，融合蛋白包括SEQ ID NO：61/62的重鏈/輕鏈序列對。在一些具體例中，IL2部分包括(i)IL2或其片段；以及(ii)IL2Rα或其片段。在一些具體例中，IL2部分經由連接子連接至重鏈恆定區的C端。在一些具體例中，IL2或其片段經由連接子連接至IL2Rα或其片段的C端。在一些具體例中，IL2或其片段是人類IL2(hIL2)或其片段。在一些具體例中，IL2Rα或其片段是人類IL2Rα(hIL2Rα)或其片段。在一些具體例中，IL2或其片段包括SEQ ID NO：53的胺基酸序列。在一些具體例中，IL2Rα或其片段包括SEQ ID NO：51的胺基酸序列。在一些具體例中，連接子包括一或多個重複序列GGGGS(SEQ ID NO：67)的胺基酸序列。在一些具體例中，連接子包括SEQ ID NO：50或52的胺基酸序列。在一些具體例中，IL2部分包括SEQ ID NO：54的胺基酸序列。在一些具體例中，第一多肽包括SEQ ID NO：62、58或60的胺基酸序列。

在一些具體例中，第二多肽包括SEQ ID NO：63、64或65的胺基酸序列。在一些具體例中，第一多肽包括SEQ ID NO：58的胺基酸序列而第二多肽包括SEQ ID NO：64的胺基酸序列。在一些具體例中，第一多肽包括SEQ ID NO：60的胺基酸序列，而第二多肽包括SEQ ID NO：63的胺基酸序列。在一些具體例中，第一多肽包括SEQ ID NO：62的胺基酸序列，而第二多肽包括SEQ ID NO：65的胺基酸序列。在一些具體例中，融合蛋白形成二聚融合蛋白。在一些具體例中，融合蛋白透過其各自的重鏈恆定區二聚化。

在一些具體例中，融合蛋白不與REGN2810、派姆單抗(pembrolizumab)或納武單抗(nivolumab)交叉競爭結合至PD-1。在一些具體例中，與IL2相比，融合蛋白在活化人類IL2Rα/β/γ和IL2Rβ/γ複合物方面展現出活性降低。在一些具體例中，與非靶向IL2Rα-IL2相比，融合蛋白在活化人類IL2Rα方面展現出活性增加。在一些具體例中，與野生型人類IL2相比，如藉由IFN-γ釋放程度所測量，融合蛋白在刺激T細胞方面展現出活性增加。在一些具體例中，融合蛋白展現出與IL2Rα、IL2Rβ和IL2Rγ的結合減弱。

在另一個態樣中，所揭示的技術是有關一或複數種核酸，包括編碼本文揭示的融合蛋白的多核苷酸序列。在另一個態樣中，所揭示的技術是有關包括本文所揭示的一或複數種核酸的載體。在另一個態樣中，所揭示的技術是有關一種宿主細胞，其包括本文所揭示的一或複數種核酸或載體。在一些具體例中，宿主細胞表現包括編碼本文揭示之融合蛋白的第一多肽的多核苷酸序列的第一載體，和包括編碼本文揭示之融合蛋白的第二多肽的多核苷酸序列的第二載體。

在另一個態樣中，所揭示的技術是有關一種產生本文所揭示之融合蛋白的方法，其包括在允許產生該融合蛋白或片段的條件下培養本文所揭示的宿主細胞，並回收由此產生的融合蛋白或其片段。

在另一個態樣中，所揭示的技術是有關一種包含本文所揭示之融合蛋白的醫藥組成物。在一些具體例中，該醫藥組成物進一步包括抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些具體例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段不與融合蛋白交叉競爭結合至PD-1。

在另一個態樣中，所揭示的技術是有關一種治療癌症的方法，其包括向有需要的個體投予治療有效量的本文所揭示之融合蛋白或醫藥組成物。在一些具體例中，該方法包括以0.005 mg/kg至10 mg/kg個體體重的量向個體投予融合蛋白。在一些具體例中，該方法進一步包括向個體投予第二治療劑或療法。

應當理解，本揭露不限於所述的特定方法和實驗條件，因為這樣的方法和條件可能會有所改變。還應理解，本文所使用的術語僅出於描述特定具體例為目的，而不希望具有限制性，且本揭露的範疇將僅受到隨附申請專利範圍所囿限。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本揭露所屬技藝中習於技藝者一般所理解的相同含義。儘管與本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料可以用於實施或測試本揭露，現將說明較佳方法和材料。除非另有說明，否則本文提及的所有出版物均以全文引用的方式併入本文。 融合蛋白

在一個態樣中，本揭露提供了一種融合蛋白，其包含：(i)特異地結合至人類PD-1的抗原結合部分，和(ii)IL2部分。與抗-hPD1抗體(諸如REGN2810)相比，所揭示的融合蛋白在刺激T細胞和抑制腫瘤生長方面出乎意料地有效。在某些具體例中，與抗PD-1靶向的IL2分子(例如REGN13233)相比，融合蛋白展現出的安全性概況更好。

所揭示的融合蛋白可以是單體或多聚體(multimer)，例如二聚體(同二聚體或異二聚體)或高級複合物。為簡單起見，同二聚體(或同一多肽的更高階多聚體)的融合蛋白的敘述是依據其組成單體；然而，在合適的細胞系中重組表現組分單體時，可以產生同二聚(或更高階的多聚體)分子。

在一些具體例中，抗原結合部分包含特異地結合至人類PD-1的抗體或其抗原結合片段。在一些具體例中，結合至人類PD-1的抗原結合部分是人類單株抗體。

如本文所用，術語「抗體」意指由藉著雙硫鍵相互連接的四條多肽鏈(兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈)組成的免疫球蛋白分子(即「完全抗體分子」)，以及其多聚體(例如IgM)或其抗原結合片段。每條重鏈由重鏈可變區(「HCVR」或「VH」)和重鏈恆定區(由結構域CH1、CH2和CH3組成)所組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(「LCVR」或「VL」)和輕鏈恆定區(CL)所組成。VH區和VL區可以進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，散佈著更保守的區域(稱為框架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在一些具體例中，抗體(或其抗原結合片段)的FR可能與人類生殖系序列相同，或者可能經天然或人工修飾。胺基酸共有序列可基於兩個或更多個CDR的並排分析來加以定義。如本文所用，術語「抗體」還包括完全抗體分子的抗原結合片段。

如本文所用，術語抗體的「抗原結合片段」、抗體的「抗原結合部分」與類似用語包括任何天然存在的、可酶促獲得的，合成的或經遺傳工程改造的多肽或糖蛋白，其特異地結合抗原而形成複合物。抗體的抗原結合片段可使用任何合適的標準技術(諸如蛋白水解消化或涉及操作和表現編碼抗體可變結構域和視情況選用之恆定結構域的DNA的重組遺傳工程技術)從例如完全抗體分子衍生而來。這種DNA是已知的及/或容易從例如商業來源、DNA庫(包括例如噬菌體-抗體庫)獲得，或者可以被合成。DNA可以化學方式或藉由分子生物學技術進行定序和操作，例如，將一或多個可變結構域及/或恆定結構域排列成合適的構形，或引入密碼子、產生半胱胺酸殘基、修飾、添加或刪除胺基酸等。

抗原結合片段的非限制性實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模擬抗體高變區(例如經分離的互補決定區(CDR)，例如CDR3肽)的胺基酸殘基組成的最小辨識單位或受限型FR3-CDR3-FR4肽。其他經工程改造的分子，諸如結構域特異性抗體、單域抗體、域缺失抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、微型抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、二價奈米抗體等)、小模塊免疫藥物(SMIP)和鯊魚可變IgNAR結構域也含括在如本文使用的用語「抗原結合片段」內。

抗體的抗原結合片段通常包含至少一個可變結構域。可變結構域可能具有任何大小或胺基酸組成，且通常將包含至少一個與一或多個框架序列相鄰或同框的CDR。在具有與V _L結構域締合的V _H結構域的抗原結合片段中，V _H和V _L結構域可按任何合適的排列彼此相對定位。例如，可變區可以是二聚體並含有V _H-V _H、V _H-V _L或V _L-V _L二聚體。或者，抗體的抗原結合片段可能含有單體V _H或V _L結構域。

在一些具體例中，抗體的抗原結合片段可能含有至少一個共價連接到至少一個恆定結構域的可變結構域。可以在本揭露抗體的抗原結合片段中發現到的可變和恆定結構域的非限制性例示性構形包括：(i)V _H-C _H1；(ii)V _H-C _H2；(iii)V _H-C _H3；(iv)V _H-C _H1-C _H2；(v)V _H-C _H1-C _H2-C _H3；(vi)V _H-C _H2-C _H3；(vii)V _H-C _L；(viii)V _L-C _H1；(ix)V _L-C _H2；(x)V _L-C _H3；(xi)V _L-C _H1-C _H2；(xii)V _L-C _H1-C _H2-C _H3；(xiii)V _L-C _H2-C _H3；及(xiv)V _L-C _L。在可變結構域和恆定結構域的任何構形中，包括上面列出的任何例示性構形，可變結構域和恆定結構域可以彼此直接連接或可以藉由完整或部分鉸鏈或連接子區加以連接。鉸鏈區可能由至少2個(例如5、10、15、20、40、60個或更多個)胺基酸組成，其導致單一條多肽分子中相鄰可變結構域及/或恆定結構域之間的撓性或半撓性鍵聯。此外，本揭露抗體的抗原結合片段可包含彼此非共價締合及/或具有一或多個單體V _H或V _L結構域(例如藉由雙硫鍵)的以上所列的任何可變結構域和恆定結構域構形的同二聚體或異二聚體(或其他多聚體)。

本文揭示之融合蛋白中所含的抗體或其抗原結合片段可以是人類抗體或其抗原結合片段。如本文所用，術語「人類抗體」是指具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區與恆定區的抗體。不過，本揭露融合蛋白中所含的人類抗體或其抗原結合片段可包括不是由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變引入的突變)，例如在CDR中，特別是CDR3中。然而，如本文所用，術語「人類抗體」並非意欲包括其中源自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)的生殖系的CDR序列已移植到人類框架序列上的抗體。

本文揭示之融合蛋白中所含的抗體可以是重組人類抗體。如本文所用，術語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、創造或分離的所有人類抗體，諸如使用被轉染到宿主細胞中的重組表現載體所表現的抗體(下文進一步說明)、分離自重組、組合人類抗體庫的抗體(下文進一步說明)、分離自動物(例如小鼠)的抗體(其為人類免疫球蛋白基因的轉基因(參見例如Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295))，或藉由任何其他方式(涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列)製備、表現、創造或分離的抗體。此類重組人類抗體具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。然而，在一些具體例中，對此類重組人類抗體進行活體外誘變(或者，當使用人類Ig序列的轉基因動物時，進行活體內體細胞誘變)，因此重組抗體V _H區和V _L區的胺基酸序列雖然是衍生自人類生殖系V _H和V _L序列並與之相關，但在活體內可能並非天然存在於人類抗體生殖系譜系中的序列。

在一些具體例中，抗體或其抗原結合片段特異地結合人類PD-1。術語「特異地結合」或類似用語表示抗體或其抗原結合片段與抗原形成在生理條件下相對穩定的複合物。確定抗體是否特異地結合至抗原的方法是本技藝中熟知的，並包括例如平衡透析、表面電漿共振與類似方法。例如，如本揭露上下文中使用，「特異地結合」人類PD-1的抗體包括以小於約500 nM、小於約300 nM、小於約200 nM、小於約100 nM、小於約90 nM、小於約80 nM、小於約70 nM、小於約60 nM、小於約50 nM、小於約40 nM、小於約30 nM、小於約20 nM、小於約10 nM、小於約5 nM、小於約4 nM、小於約3 nM、小於約2 nM、小於約1 nM或小於約0.5 nM的K _D結合PD-1或其部分的抗體，如在表面電漿共振分析中所測量的。然而，特異地結合人類PD-1的經分離抗體可能與其他抗原(諸如來自其他(非人類)物種的PD-1分子)具有交叉反應性。

在一些具體例中，抗體或其抗原結合片段包含三個重鏈互補決定區(HCDR) (HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中：HCDR1包含胺基SEQ ID NO：4、24或43的酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：6、26或45的胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：8、28或47的胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：12或32的胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列；而LCDR3包含SEQ ID NO：16或35的胺基酸序列。

在一些具體例中，抗體或其抗原結合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其包含(i)SEQ ID NO：4、6、8、12、14和16；(ii)SEQ ID NO：24、26、28、32、14和35；或(iii)SEQ ID NO：43、45、47、12、14和16的對應胺基酸序列。

在一些具體例中，抗體或其抗原結合片段包含分別包含有SEQ ID NO：43、45、47、12、14和16的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些具體例中，抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(HCVR)，其包含SEQ ID NO：2、22或41的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2、22或41具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；以及輕鏈可變區(LCVR)，其包含SEQ ID NO：10或30的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10或30具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，抗體或其抗原結合片段包含HCVR，其包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；以及LCVR，其包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，抗體或其抗原結合片段包含HCVR，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列或與SEQ ID NO：22具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；以及LCVR，其包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列或與SEQ ID NO：30具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，抗體或其抗原結合片段包含HCVR，其包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列或與SEQ ID NO：41具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；以及LCVR，其包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，融合蛋白進一步包含SEQ ID NO：55或與SEQ ID NO：55具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的重鏈恆定區；以及SEQ ID NO：56或與SEQ ID NO：56具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈恆定區。

在一些具體例中，融合蛋白包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：57、59或61的胺基酸序列或與SEQ ID NO：57、59或61具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；而輕鏈具有SEQ ID NO：58、60或62的胺基酸序列或與SEQ ID NO：58、60或62具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，融合蛋白包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列或與SEQ ID NO：57具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；而輕鏈包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列或與SEQ ID NO：58具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，融合蛋白包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：59的胺基酸序列或與SEQ ID NO：59具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；而輕鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列或與SEQ ID NO：61具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，融合蛋白包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列或與SEQ ID NO：61具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；而輕鏈包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列或與SEQ ID NO：62具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，融合蛋白包含SEQ ID NO：57/58、59/60或61/62的重鏈/輕鏈序列對。在一些具體例中，融合蛋白包含SEQ ID NO：61/62的重鏈/輕鏈胺基酸序列對。

在一些具體例中，IL2部分包含(i)IL2或其片段；以及(ii)IL2受體α(IL2Rα)或其片段。

在一些具體例中，IL2部分可包括野生型或變體IL2結構域，其融合至IL-2Rα的IL2結合結構域，視情況經由連接子。IL-2Rα的IL2結合結構域可能在野生型或變體IL2結構域的N端或C端。在一些具體例中，IL-2Rα的IL2結合結構域在野生型或變體IL2結構域的N端。

在一些具體例中，IL2部分包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列或與SEQ ID NO：54具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在真核細胞中，人類IL2被合成為具有153個胺基酸的前體多肽，從中移除20個胺基酸而產生成熟的分泌型IL2(Taniguchi et al.,1983, Nature 302(5906):305-10)。成熟的人類IL2具有以下胺基酸序列： APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW ITFCQSIISTLT (SEQ ID NO: 75)

在一些具體例中，IL2部分可以是定向IL2Rα的，例如它們在IL2結構域中具有一或多個使它們偏好結合至IL-2Rα(相較於IL-2Rβ)的胺基酸置換。在一些具體例中，IL2部分不是定向CD122的，例如它們在IL2結構域中不具有使它們偏好結合至IL-2Rβ(相較於IL-2Rα)的胺基酸置換。

在一些具體例中，本揭露的融合蛋白在IL2結構域中具有一或多個減少結合至IL-2Rβ的胺基酸置換。舉例而言，在一些具體例中，相較於野生型人類IL2，IL2部分對人類IL-2Rβ的結合可以減弱至多50倍(並且在一些具體例中至多100倍)至1,000倍。在一些具體例中，對IL-2Rβ的結合減少的IL2結構域可以保有其對IL-2Rα的親和力，或對IL-2Rα的結合減少。例如，在一些具體例中，相較於野生型人類IL2，IL2部分對人類IL2-Rα的結合可以減弱至多50倍。在一些具體例中，IL2結構域包含一或多個降低對IL-2Rβ的親和力且保留對IL2-Rα的親和力的胺基酸置換。例示性胺基酸置換是N88D。降低或消除IL2對IL-2Rβ之親和力的其他胺基酸置換是D20T、N88R，N88D或Q126D(參見例如美國專利公開案第US 2007/0036752號)。

在一些具體例中，IL2結構域包含一或多個降低對IL2-Rα的親和力，並保留對IL-2Rβ的親和力或對IL-2Rβ的親和力降低至較低程度的胺基酸置換，從而產生CD122定向的IL2部分。例示性CD122定向的IL2結構域是那些包含H16A和F42A二置換者。因此，在一些具體例中，IL2部分包含具有H16A和F42A置換的人類IL2的胺基酸序列。

在一些具體例中，IL2部分包含一個胺基酸置換，該胺基酸置換在對應於人類IL2的殘基3的位置處消除IL2的O-醣基化位點。在T3處的例示性胺基酸置換是T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R，T3K和T3P。在一個特定具體例中，置換是T3A。

在一些具體例中，IL2結構域可能在C125處包括置換。如美國專利第4,518,584號中所述，C125可以被S，V或A置換以減少蛋白質聚集。在一些具體例中，如美國專利第5,206,344號中所述，IL2結構域可包括用中性胺基酸(諸如丙胺酸)置換甲硫胺酸104。在一些具體例中，IL2結構域還可以刪除IL2的N-端丙胺酸殘基，產生des-A1 IL2。

在一些具體例中，除了其他改變IL2結合至其受體的變異以外，IL2結構域可具有選自以下的胺基酸缺失及/或置換：des-A1 M104A IL2、des-A1 M104A C125S IL2、M104A IL2、M104A C125A IL2，des-A1 M104A C125A IL2或M104A C125S IL2。這些和其他突變體可以在美國專利第5,116,943號和Weiger et al., 1989, Eur J Biochem 180:295-300中找到。

在一些具體例中，IL2結構域可包括與成熟人類IL2具有至少約90%、至少約91%、至少約92%、約至少93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99%或100%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，IL2或其片段包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列或與SEQ ID NO：53具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，IL2部分進一步包括IL-2Rα的IL2結合結構域(被稱為「IL2-Rα結構域」)，例如IL-2Rα的細胞外結構域，視情況經由連接子融合在IL2的C端或N端處。在一些具體例中，IL2Rα或其片段為人類IL2Rα(hIL2Rα)或其片段。在一些具體例中，IL-2Rα結構域可包括成熟人類IL-2Rα細胞外結構域(對應於人類IL-Rα的胺基酸22-272)。在一些具體例中，IL-2Rα結構域可包括人類IL-2Rα細胞外結構域的IL2結合部分(包含兩個「sushi」結構域，其對應於IL-2Rα的胺基酸22-186)。在一些具體例中，IL-2Rα結構域可包括替代性人類IL-2Rα細胞外結構域的IL2結合部分，其對應於人類IL-2Rα的胺基酸22-240。

在一些具體例中，IL-2Rα細胞外結構域的IL2-Rα結構域或IL2結合部分具有與上述序列中任一者(即IL-2Rα的胺基酸22-186、IL-2Rα的胺基酸22-240，或IL-2Rα的胺基酸22-272或其任何IL2結合部分中任一者)至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99%或100%的序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，IL2-Rα結構域或IL2結合部分可包含與人類IL-2Rα的IL2結合部分具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99%或100%序列同一性的胺基酸序列或由其組成，視情況其中結合部分具有人類IL2-Rα之細胞外結構域的(a)至少160個胺基酸、至少161個胺基酸、至少162個胺基酸，至少164個胺基酸或至少165個胺基酸，及/或(b)至多251個、至多240、至多230、至多220、至多210、至多200、至多190，至多180或至多170個胺基酸的胺基酸序列。在特定具體例中，人類IL-2Rα的部分被前一句(a)和(b)中的任一者結合，例如人類IL-2Rα的至少160個和至多180個胺基酸、人類IL-2Rα的至少162個和至多200個胺基酸、人類IL-2Rα的至少160個和至多220個胺基酸，人類IL-2Rα的至少164個和至多190個胺基酸，依此類推。

在一些具體例中，IL2-Rα結構域或IL2結合部分包含與胺基酸22-186具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，至少約99%或100%序列同一性的胺基酸序列或由其組成，在IL2-Rα之胺基酸殘基186的C端帶有或不帶有額外至多5個胺基酸、至多10個胺基酸、至多15個胺基酸、至多20個胺基酸，至多30個胺基酸或至多40個胺基酸。

在一些具體例中，與天然IL-2Rα的細胞外結構域相比，IL2-Rα結構域或IL-2Rα細胞外結構域具有少了至少一個的O-醣基化及/或N-醣基化，例如因為在以下一或多者處的置換：胺基酸N49、胺基酸N68、胺基酸T74、胺基酸T85、胺基酸T197、胺基酸T203、胺基酸T208，和胺基酸T216。在一些具體例中，一或多個置換是從天冬醯胺酸到選自以下的胺基酸：丙胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、精胺酸、天冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸，酪胺酸和纈胺酸。在一些具體例中，一或多個置換是從蘇胺酸到選自以下的胺基酸：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、色胺酸，酪胺酸和纈胺酸。在一些具體例中，一或多個取代是在胺基酸S50(例如S50P)、胺基酸S51(例如S51R、S51N、S51D、S51C、S51Q、S51E、S51G、S51H、S51I、S51L、S51K、S51M、S51F、S51P、S51W、S51Y，或S51V)、胺基酸T69(例如T69P)、胺基酸T70(例如T70R、T70N、T70D、T70C、T70Q、T70E、T70G、T70H、T70I、T70L、T70K、T70M、T70F、T70P、T70W、T70Y或T70V)、胺基酸C192(例如C192R、C192N、C192D、C192Q、C192E、C192G、C192H、C192I、C192L、C192K、C192M、C192F、C192P、C192W，C192Y或C192V)或其任何組合。

在一些具體例中，IL2Rα或其片段包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列或與SEQ ID NO：51具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

融合蛋白可包括連接分子之不同組分的一或多個連接子(例如肽連接子或非肽連接子)。在一些具體例中，融合蛋白的兩個或更多個組分藉由肽連接子彼此連接。作為實例而非限制，連接子可用於連接(a)IL2部分和抗原結合部分；(b)一個IL2部分內的不同結構域(例如IL2結構域和IL-Rα結構域)；或(c)抗原結合部分內的不同結構域(例如抗PD-1抗體的不同組分)。

肽連接子的長度範圍可以是2個胺基酸至60個或更多個胺基酸，且在一些具體例中，肽連接子的長度範圍是3個胺基酸至50個胺基酸、4個至30個胺基酸、5個至25個胺基酸、10個至25個胺基酸、10個胺基酸至60個胺基酸、12個胺基酸至20個胺基酸、20個胺基酸至50個胺基酸，或25個胺基酸至35個胺基酸。

在一些具體例中，肽連接子的長度為至少5個胺基酸、至少6個胺基酸或至少7個胺基酸，且長度視情況為至多30個胺基酸、至多40個胺基酸，至多50個胺基酸或至多60個胺基酸。在一些具體例中，連接子的長度範圍是5個胺基酸至50個胺基酸，例如長度範圍是5至50、5至45、5至40、5至35、5至30，5至25或5至20個胺基酸。在前述的其他具體例中，連接子的長度範圍為6個胺基酸至50個胺基酸，例如長度範圍為6至50、6至45、6至40、6至35、6至30，6至25或6至20個胺基酸。在前述的又其他具體例中，連接子的長度範圍為7個胺基酸至50個胺基酸，例如長度範圍為7至50、7至45、7至40、7至35、7至30，7至25或7至20個胺基酸。

在一些具體例中，連接子包含極性(例如絲胺酸(S))或帶電荷(例如離胺酸(K))殘基。在一些具體例中，連接子是撓性連接子，例如包含一或多個胺基酸(G)或絲胺酸(S)殘基。

可用於本揭露融合蛋白的撓性連接子的實例包括那些由Chen et al., 2013, Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369與Klein et al., 2014, Protein Engineering, Design & Selection 27(10): 325-330所描述者。特別有用的撓性連接子是或包含甘胺酸和絲胺酸的重複序列，例如GnS或SGn的單體或多聚體，其中n是1至10的整數，例如1、2、3、4、5、6、7、8，9或10。在一個具體例中，連接子是或包含G4S重複序列(GGGGS，SEQ ID NO：67)的單體或多聚體，例如(GGGGS)n。

聚甘胺酸連接子可合適地用於本揭露的融合蛋白中。在一些具體例中，肽連接子包含兩個連續甘胺酸(2Gly)、三個連續甘胺酸(3Gly)、四個連續甘胺酸(4Gly) (SEQ ID NO：68)、五個連續甘胺酸(5Gly) (SEQ ID NO：69)、六個連續甘胺酸(6Gly) (SEQ ID NO：70)、七個連續甘胺酸(7Gly) (SEQ ID NO：71)，八個連續甘胺酸(8Gly) (SEQ ID NO：72)或九個連續甘胺酸(9Gly) (SEQ ID NO：73)。

在一些具體例中，IL2部分經由連接子與抗原結合部分相連接。在一些具體例中，連接子包含一或多個重複序列GGGGS(SEQ ID NO：67)的胺基酸序列。在一些具體例中，連接子包含SEQ ID NO：50或52的胺基酸序列。在一些具體例中，IL2部分經由肽連接子連接至抗原結合部分的C端。在一些具體例中，連接子包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列。

在另一個態樣中，本揭露提供了一種融合蛋白，其包含：(i)第一多肽，其包含特異地結合至人類PD-1的人類抗體的輕鏈可變區(LCVR)；以及(ii)第二多肽，其包含(a)特異地結合至人類PD-1的抗體的重鏈可變區(HCVR)；與(b)IL2部分。

在一些具體例中，HCVR包含三個重鏈互補決定區(HCDR) (HCDR1、HCDR2和HCDR3)而LCVR包含三個輕鏈CDR (LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中：HCDR1包含SEQ ID NO：4、24或43的胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：6、26或45的胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：8、28或47的胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：12或32的胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列；而LCDR3包含SEQ ID NO：16或35的胺基酸序列。

在一些具體例中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含(i)SEQ ID NO：4、6、8、12、14和16；(ii)SEQ ID NO：24、26、28、32、14和35；或(iii)SEQ ID NO：43、45、47、12、14和16的對應胺基酸序列。

在一些具體例中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含SEQ ID NO：43、45、47、12、14和16的對應胺基酸序列。

在一些具體例中，HCVR包含SEQ ID NO：2、22或41的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：2、22或41具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，LCVR包含SEQ ID NO：10或30的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：10或30具有80%、85%、90%、95%、97 %、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，HCVR包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，而LCVR包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，HCVR包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列或與SEQ ID NO：22具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，而LCVR包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列或與SEQ ID NO：30具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，HCVR包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列或與SEQ ID NO：41具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，而LCVR包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，HCVR和LCVR包含(i)SEQ ID NO：2和10；(ii)SEQ ID NO：22和30；或(iii)SEQ ID NO：41和10的對應胺基酸序列。在一些具體例中，HCVR和LCVR包含SEQ ID NO：41和10的對應胺基酸序列。

在一些具體例中，第一多肽進一步包含連接至LCVR的輕鏈恆定區。在一些具體例中，輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：56的胺基酸序列或與SEQ ID NO：56具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，第二多肽進一步包含排列在HCVR和IL2部分之間的重鏈恆定區。在一些具體例中，重鏈恆定區包含SEQ ID NO：55的胺基酸序列或與SEQ ID NO：55具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，第一多肽包含SEQ ID NO：58、60或62的輕鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO：58、60或62具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈胺基酸序列。

在一些具體例中，第二多肽包含SEQ ID NO：57、59或61的重鏈胺基酸序列，或與SEQ ID NO：57、59或61具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈胺基酸序列。

在一些具體例中，融合蛋白包含SEQ ID NO：57/58、59/60或61/62的重鏈/輕鏈序列對。在一些具體例中，融合蛋白包含SEQ ID NO：61/62的重鏈/輕鏈胺基酸序列對。

在一些具體例中，IL2部分經由連接子連接至重鏈恆定區的C端。在一些具體例中，連接子包含一或多個重複序列GGGGS(SEQ ID NO：67)的胺基酸序列。在一些具體例中，連接子包含SEQ ID NO：50或52的胺基酸序列。在一個具體例中，連接子包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列。

在一些具體例中，IL2部分包含(i)IL2或其片段；以及(ii)IL2受體α(IL2Rα)或其片段。

在一些具體例中，IL2或其片段是人類IL2(hIL2)或其片段。在一些具體例中，IL2或其片段包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列或與SEQ ID NO：53具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，IL2Rα或其片段是人類IL2Rα(hIL2Rα)或其片段。在一些具體例中，IL2Rα或其片段包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：51具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，IL2部分包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：54具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，IL2或其片段經由連接子連接至IL2Rα或其片段的C端。在一個具體例中，連接子包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列。

在一些具體例中，第一多肽包含SEQ ID NO：58、60或62的胺基酸序列或與SEQ ID NO：58、60或62具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些具體例中，第二多肽包含SEQ ID NO：63、64或65的胺基酸序列或與SEQ ID NO：63、64或65具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，第一多肽包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列或與SEQ ID NO：58具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，而第二多肽包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列或與SEQ ID NO：64具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，第一多肽包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列或與SEQ ID NO：60具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，而第二多肽包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列或與SEQ ID NO：63具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些具體例中，第一多肽包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列或與SEQ ID NO：62具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，而第二多肽包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列或與SEQ ID NO：65具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在本揭露中還提供了由本文所述之融合蛋白形成的二聚融合蛋白。在一些具體例中，二聚融合蛋白是同二聚融合蛋白，其中每個組成單體包含本文所述的融合蛋白。在一些具體例中，每個組成單體由本文所述的融合蛋白組成。在一些具體例中，二聚融合蛋白的單體透過每個單體的重鏈恆定區二聚化。 生物活性

本揭露的融合蛋白展現出對IL2Rα、IL2Rβ和IL2Rγ的結合減弱。在一些具體例中，融合蛋白不與REGN2810、派姆單抗或納武單抗競爭。在一些具體例中，與IL2相比，融合蛋白在活化人類IL2Rα/β/γ三聚和IL2Rβ/γ二聚受體複合物方面展現出活性降低，且與非靶向IL2Rα-IL2構築體相比，融合蛋白在活化人類IL2Rα/β/γ三聚和IL2Rβ/γ二聚受體複合物方面展現出活性增加。在一些具體例中，與野生型人類IL2相比，如藉由IFN-γ釋放程度測量的，融合蛋白在刺激經抗原活化之T細胞方面展現出活性增加。在一些具體例中，與單獨IL2或和抗PD-1抗體組合相比，融合蛋白顯示出抗腫瘤功效提高。 核酸與宿主細胞

在另一個態樣中，本揭露提供了包含編碼本揭露融合蛋白之一或多個多核苷酸序列的核酸。在一些具體例中，融合蛋白被單個核酸編碼。在其他具體例中，例如在異二聚分子或包含由超過一條多肽鏈組成之抗PD-1抗體的分子的情況下，融合蛋白可以由複數個(例如兩個、三個，四個或更多個)核酸所編碼。

單個核酸可編碼包含單一條多肽鏈的融合蛋白、包含兩條或更多條多肽鏈的融合多肽，或包含超過兩條多肽鏈的一部分融合多肽(例如，單個核酸可編碼包含三條，四條或更多條多肽鏈的融合蛋白的兩條多肽鏈，或包含四條或更多條多肽鏈的融合蛋白的三條多肽鏈)。關於個別的表現控制，編碼兩條或更多條多肽鏈的開放讀框可以受到個別轉錄調節元件(例如啟動子及/或增強子)所控制。編碼兩條或更多條多肽的開放讀框也可以受到相同的轉錄調節元件所控制，並被內部核醣體進入位點(IRES)序列隔開，從而允許轉譯成不同多肽。

在一些具體例中，包含兩條或更多條多肽鏈的融合多肽是由兩個或更多個核酸編碼。編碼融合蛋白的核酸的數目可以等於或小於融合多肽中的多肽鏈數目(例如，當超過一條多肽鏈是由單個核酸所編碼時)。

本揭露的核酸可以是DNA或RNA(例如mRNA)。

在另一個態樣中，本揭露提供了含有本揭露核酸的宿主細胞和載體。核酸可能存在於相同宿主細胞或不同宿主細胞中的單個載體或不同載體中，如下文更詳細地描述。

在一些具體例中，宿主細胞表現包含編碼本文所述抗體的HCVR的多核苷酸序列的第一載體，以及包含編碼本文所述抗體的LCVR的多核苷酸序列的第二載體。

在一些具體例中，宿主細胞表現包含編碼本文所述融合蛋白的第一多肽的多核苷酸序列的第一載體，以及包含編碼本文所述融合蛋白的第二多肽的多核苷酸序列的第二載體。

本揭露提供了載體，其包含編碼本文所述的融合蛋白或融合蛋白組分(例如一個半抗體的一條或兩條多肽鏈)的核苷酸序列。載體包括但不限於病毒、質體、黏接質體，λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。

可以採用許多載體系統。舉例來說，一類載體利用衍生自動物病毒(諸如例如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、逆轉錄病毒(Rous肉瘤病毒，MMTV或MOMLV)或SV40病毒)的DNA元件。另一類載體利用了衍生自RNA病毒(諸如Semliki森林病毒、東部馬腦炎病毒和黃病毒)的RNA元件。

另外，可以透過引入允許篩選經轉染宿主細胞的一或多個標記來篩選已將DNA穩定併入其染色體中的細胞。標記可以提供例如針對營養缺陷宿主的原始營養型、殺生物劑抗性(例如抗生素)，或對重金屬(諸如銅)的抗性或類似者。可篩選標記基因可以直接連接至要表現的DNA序列，或藉由共轉形引入同一細胞中。mRNA的最佳合成可能還需要額外元件。這些元件可包括剪接信號，還有轉錄啟動子，增強子和終止信號。

一旦已經準備好含有構築體的表現載體或DNA序列用於表現，就可以將表現載體轉染或引入合適的宿主細胞中。可以採用各種技術來實現這一點，諸如例如原生質體融合、磷酸鈣沉澱、電穿孔、逆轉錄病毒轉導、病毒轉染、基因槍，基於脂質的轉染或其他常規技術。用於培養所得經轉染細胞和回收經表現多肽的方法與條件是習於技藝者熟知的，並且可能基於發明說明根據所採用的特定表現載體和哺乳動物宿主細胞來改變或優化。

本揭露還提供了包含本揭露核酸的宿主細胞。在一個具體例中，宿主細胞經遺傳改造成包含一或多個本文所述的核酸。在一個具體例中，藉由使用表現匣對宿主細胞進行遺傳改造。片語「表現匣」是指核苷酸序列，其能夠影響基因在與此類序列相容的宿主中的表現。這樣的匣可包括啟動子、有或沒有內含子的開放讀框以及終止信號。也可以使用影響表現所必需或有助益的其他因子，諸如例如誘導型啟動子。

本揭露還提供了包含本文所述載體的宿主細胞。

細胞可以是，但不限於真核細胞、細菌細胞，昆蟲細胞或人類細胞。合適的真核細胞包括，但不限於Vero細胞、HeLa細胞、COS細胞、CHO細胞、HEK293細胞，BHK細胞和MDCKII細胞。合適的昆蟲細胞包括但不限於Sf9細胞。 醫藥組成物

本文揭示的融合蛋白或二聚融合蛋白可能是呈包含融合蛋白(例如二聚融合蛋白)和一或多種載劑，賦形劑及/或稀釋劑的組成物形式。

可以將組成物調配成用於特定用途，諸如用於獸醫用途或人類的醫藥用途。組成物的形式(例如乾燥粉末，液體調配物等)與所使用的賦形劑，稀釋劑及/或載劑將取決於融合蛋白或二聚融合蛋白的預期用途和治療用途、投藥模式。

關於治療用途，組成物可作為包括醫藥上可接受載劑的無菌醫藥組成物的一部分來提供。此組成物可以呈任何合適的形式(取決於將其投予給患者的期望方法)。醫藥組成物可以透過各種途徑(諸如經口、穿皮、皮下、鼻內、靜脈內、肌肉內、腫瘤內、鞘內，局部或局部性)被投予給患者。在任何給定情況下，最合適的投藥途徑將取決於特定抗體、個體，疾病的性質和嚴重程度以及個體的身體狀況。在一些具體例中，醫藥組成物將靜脈內或皮下投予。

醫藥組成物可以方便地呈單位劑型存在，每劑劑型含有預定量的本揭露融合蛋白。單位劑量中所包括的融合蛋白數量將取決於所治療的疾病以及本技藝中周知的其他因素。這樣的單位劑量可呈含有某量適於單次投藥的融合蛋白的凍乾乾燥粉末形式，或者是呈液體的形式。乾燥粉末單位劑型可以與注射器，適量稀釋劑及/或其他用於投藥的組分一起被包裝在套組中。呈液體形式的單位劑量可以方便地呈預填充有某量適於單次投藥之融合蛋白之量的注射器形式提供。醫藥組成物也可以按含大量融合蛋白的整批提供以適於多次投藥。

可藉由將具有所需純度程度的融合蛋白與本技藝中通常採用的視情況選用的醫藥上可接受的載劑，賦形劑或穩定劑(在本文中全被稱為「載劑」) (即緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等滲劑、非離子型去污劑，抗氧化劑和其他各種添加劑)混合來製備醫藥組成物，以作為凍乾調配物或水溶液形式儲存(參見Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980))。這樣的添加劑在所採用的劑量和濃度下對接受者應無毒。 使用方法

本揭露的融合蛋白可用於治療其中刺激宿主的免疫系統有助益的疾病狀態，特別是在需要提高細胞免疫反應的病況。這些可能包括宿主免疫反應不足或有缺陷的疾病狀態。可以投予本揭露融合蛋白的疾病狀態包含例如腫瘤或感染，其中細胞免疫反應將是專一性免疫的關鍵機制。可以採用本揭露融合蛋白的特定疾病狀態包括癌症，例如腎細胞癌或黑色素瘤；免疫缺陷，特別是在HIV陽性患者；免疫抑制患者，慢性感染與類似者。本揭露融合蛋白可以本身或以任何合適的醫藥組成物形式投藥。

在一個態樣中，提供了用作藥劑的本揭露融合蛋白。在更多態樣中，提供了用於治療疾病的本揭露融合蛋白。在一些具體例中，提供了用於治療方法中的本揭露融合蛋白。在一個具體例中，本揭露提供如本文所述的融合蛋白，其用於在有需要的個體體內治療疾病。在一些具體例中，本揭露提供用於治療患有疾病之個體的方法中的融合蛋白，包含向個體投予治療有效量的融合蛋白。在一些具體例中，受治療的疾病是增生性病症。在一個較佳具體例中，疾病是癌症。

在一些具體例中，如果要治療的疾病是癌症，則該方法進一步包含向個體投予治療有效量的至少一種額外治療劑，例如抗癌劑。在更多具體例中，本揭露提供用於刺激免疫系統的融合蛋白。在某些具體例中，本揭露提供用於在刺激個體之免疫系統的方法中的融合蛋白，該方法包含向個體投予有效量的融合蛋白以刺激免疫系統。

根據本文的任何具體例，「刺激免疫系統」可以包括免疫功能普遍增加、T細胞功能增加、B細胞功能增加、淋巴細胞功能恢復、IL-2受體表現增加、T細胞反應性增加、自然殺手細胞活性或經淋巴激素活化的殺手(LAK)細胞活性增加及類似者中的任一或多者。

在又一個態樣中，本揭露提供了本揭露融合蛋白在製造或製備用於治療有需要之個體的疾病的藥劑中的用途。在一個具體例中，該藥劑用於治療疾病的方法中，該方法包含向患有該疾病的個體投予治療有效量的藥劑。在一些具體例中，要治療的疾病是增生性病症。在一些具體例中，疾病是癌症。在一個這樣的具體例中，如果要治療的疾病是癌症，則該方法進一步包含向個體投予治療有效量的至少一種額外治療劑，例如抗癌劑。在又一個具體例中，該藥劑用於刺激免疫系統。在又一個具體例中，該藥劑用於刺激個體之免疫系統的方法，包含向個體投予有效量的藥劑以刺激免疫系統。

在一些具體例中，要治療的疾病是增生性病症，較佳為癌症。癌症的非限制性實例包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌，骨癌和腎癌。可以使用本揭露融合蛋白治療的其他細胞增生性病症包括，但不限於位於以下的腫瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系統、肝臟、胰臟、腹膜、內分泌腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼部、頭頸部、神經系統(中樞和周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟，胸腔區域和泌尿生殖系統。還包括癌前病況或病變和癌症轉移。在一些具體例中，癌症選自由腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌組成之群。類似地，本揭露融合蛋白也可以治療其他細胞增生病症。此類細胞增生病症的實例包括但不限於位在下列器官系統中者：高γ球蛋白血症、淋巴增生病症、副蛋白血症、紫癜、結節病、Sezary症候群、瓦爾登倫氏巨球蛋白血症、高歇氏病，組織細胞增生症以及除贅瘤以外的其他任何細胞增生疾病。在另一個具體例中，該疾病與自體免疫、移植排斥、創傷後免疫反應和傳染性疾病(例如HIV)有關。更具體地說，融合蛋白可用於消除參與免疫細胞媒介之病症的細胞，包括淋巴瘤；自體免疫、移植排斥、移植物抗宿主病，局部缺血和中風。習於技藝者容易理解到，在許多情況下，融合蛋白可能無法提供治癒，而只能提供部分益處。在一些具體例中，具有某些益處的生理變化也被認為是在治療上有益的。因此，在一些具體例中，提供生理變化的融合蛋白的量被認為是「有效量」或「治療有效量」。需要治療的個體或患者或通常是哺乳動物，更具體地是人類。

本文含括了各種給藥時間表，包括但不限於在不同時間點的單次或多次投藥、推注投藥和脈衝輸注。

本揭露的融合蛋白通常以有效達到預期目的之量使用。為了用於治療或預防疾病病況，以治療有效量投予或施用本揭露的融合蛋白或其醫藥組成物。

一個典型的日劑量範圍可以從約1 μg/kg至100 mg/kg或更多。關於在數天或更久的重複投藥，取決於病況，通常持續治療直至出現所期望的疾病症狀抑制。融合蛋白的一個例示性劑量範圍為約0.005 mg/kg至約10 mg/kg。在其他非限制性實例中，劑量還可以包含每次投藥約1 μg/kg/體重、約5 μg/kg/體重、約10 μg/kg/體重、約50 μg/kg/體重、約100 μg/kg/體重、約200 μg/kg/體重、約350 μg/kg/體重、約500 μg/kg/體重、約1 mg/kg/體重、約5 mg/kg/體重、約10 mg/kg/體重、約50 mg/kg/體重，或約100 mg/kg/體重或更多，以及可在其中得出的任何範圍。在從本文列出的數字衍生而來的範圍的非限制性實例中，基於上述數字，可投予範圍為約5 mg/kg/體重至約50 mg/kg體重、約5 μg/kg體重至約100 mg/kg體重等。因此，可以向患者投予約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg的一或多個劑量(或其任何組合)。這樣的劑量可以例如每週或每三週間歇地投予(例如，使得患者接受約兩個至約二十個，或例如約六個劑量的融合蛋白)。一開始可以投予較高的負荷劑量，然後投予一或多個較低的劑量。然而，其他劑量方案可能是有用的。透過常規技術和分析很容易監測此療法的進展。

本文所述融合蛋白的治療有效劑量通常將提供治療益處而不會引起實質毒性。融合蛋白的毒性和治療功效可以藉由在細胞培養或實驗動物中的標準醫藥程序來測定。細胞培養分析和動物研究可用於確定LD50(對50%群體致死的劑量)和ED50(對50%群體有效治療的劑量)。毒性和治療效用之間的劑量比是治療指數，可以表示為比率LD50 _/ED50。展現出治療指數大的融合蛋白較佳。在一個具體例中，根據本揭露的融合蛋白展現出高治療指數。從細胞培養分析和動物研究獲得的數據可用於調配適用於人類的一系列劑量。劑量較佳在包括幾乎沒有毒性或無毒性的ED50的循環濃度範圍內。取決於多種因素(如所採用的劑型、所利用的投藥途徑，個體的病況與類似因素)，劑量可以在這個範圍內變化。(參見，例如Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1，以全文引用的方式併入本文)。

由於毒性較低，本揭露融合蛋白可以比野生型IL2具有更高的最大治療劑量。

根據本揭露的融合蛋白可以與一或多種其他藥劑或療法組合投予。例如，本揭露的融合蛋白可以與至少一種額外治療劑或療法共同投予。術語「治療劑」含括為治療需要這種治療的個體之症狀或疾病而投予的任何藥劑。此類額外治療劑可包含適合於待治療的特定適應症的任何活性成分，較佳是那些具有互補活性且不會彼此不利影響的活性成分。在一些具體例中，額外治療劑是免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑，細胞凋亡活化劑或增加細胞對凋亡誘導劑敏感性的藥劑。在一個特定具體例中，額外治療劑是抗癌劑，例如微管破壞劑、抗代謝物、拓樸異構酶抑制劑、DNA嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑，腫瘤細胞凋亡的活化劑或抗血管生成劑。

在某些具體例中，第二治療劑或療法選自：放射線、手術、化療劑、溶瘤病毒、癌症疫苗、PD-L1抑制劑、B7-H3抑制劑、B7-H4抑制劑、淋巴細胞活化基因3(LAG3)抑制劑、T細胞膜蛋白3(TIM3)抑制劑、半乳糖凝集素9(GAL9)抑制劑、T細胞活化的V結構域免疫球蛋白(Ig)抑制因子(VISTA)抑制劑、免疫球蛋白樣受體(KIR)抑制劑、B-淋巴細胞和T-淋巴細胞弱化子(BTLA)抑制劑、具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體(TIGIT)抑制劑、CTLA4抑制劑、CD38抑制劑、CD47抑制劑、CD28活化因子、4-1BB活化因子、GITR促效劑、CD40促效劑、OX40調節劑、吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑、血管內皮生長因子(VEGF)拮抗劑、血管生成素-2(Ang2)抑制劑、轉形生長因子β(TGFβ)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑，針對腫瘤特異性抗原的抗體、卡介苗、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子、細胞毒素、介白素6受體(IL-6R)抑制劑、介白素4受體(IL-4R)抑制劑、IL-10抑制劑、IL-7、IL-12，IL-21、IL-15、IL-18、第I型介白素、抗體藥物結合物、消炎藥，及其組合。

在某些具體例中，本揭露融合蛋白可以與抗PD-1抗體組合使用，其中該抗體不與融合蛋白交叉競爭結合至人類PD-1。

這樣的其他藥劑適當地以對於預期目的有效之量組合存在。此類其他藥劑的有效量取決於所使用的融合蛋白數量，病症或治療的類型以及上面討論的其他因素。融合蛋白通常以與本文所述相同的劑量和投藥途徑來使用，或約本文所述劑量的1%至99%或呈任何劑量，並且藉由經驗/臨床上確定合宜的任何途徑。

上文提到的這種組合療法包括組合投藥(其中兩種或更多種治療劑納入相同或不同組成物中)以及個別投藥，在這種情況下，本揭露融合蛋白可以在投予額外治療劑及/或佐劑之前，同時及/或之後投予。本揭露融合蛋白也可以與放射線療法及/或手術組合使用。 額外定義

為了協助理解根據本揭露的組成物和方法的詳細說明，提供了一些明確的定義(除了本文別處揭示的那些)以促進對本揭露的各個態樣的明確揭示。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本揭露所屬技藝中具有通常技藝者一般理解的相同含義。

如本文所用，術語「融合蛋白」或「融合多肽」表示包含以共價或非共價方式接合在一起的兩個或更多個多肽序列的蛋白質。例如，本揭露所含括的融合多肽可包括嵌合基因構築體的轉譯產物，該構築體將編碼第一多肽的核酸序列與編碼第二多肽的核酸序列接合以形成單個開放讀框。或者，融合蛋白可以由兩個或更多個基因構築體編碼，這些基因構築體位於可以在宿主細胞中共表現的不同載體上。換言之，「融合多肽」或「融合蛋白」是藉由肽鍵或經由若干個肽接合的兩個或更多個蛋白質的重組蛋白。在一些具體例中，融合蛋白還可包含兩個結構域之間的肽連接子。

如本文所用，術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可交替使用以指代任何長度的胺基酸聚合物。聚合物可以是直鏈或支鏈的，它可包含經修飾的胺基酸，且它可以被非胺基酸打斷。該術語還含括已經過修飾的胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、醣基化、脂化、乙醯化、磷酸化、聚乙二醇化或任何其他操作，諸如與標記組分的接合。如本文所用，術語「胺基酸」包括天然及/或非天然或合成胺基酸，包括甘胺酸和D或L光學異構體，以及胺基酸類似物和肽模擬物。

如本文所用，IL-2的「野生型」形式是IL-2的一種形式，除了野生型形式在突變型IL2多肽的每個胺基酸位置上具有野生型胺基酸外，它與突變型IL-2多肽相同。例如，如果IL-2突變體是全長IL-2(即IL-2未與任何其他分子融合或結合)，則該突變體的野生型形式是全長天然IL-2。如果IL-2突變體是IL-2和在IL-2下游編碼的另一個多肽(例如抗體鏈)之間的融合物，則此IL-2突變體的野生型形式是具有野生型胺基酸序列融合至同一下游多肽的IL2。此外，如果IL-2突變體是IL-2的截短形式(IL-2的非截短部分內的突變或經修飾序列)，則該IL-2突變體的野生型形式是類似具有野生型序列的截短IL-2。

如本文所揭示的融合蛋白可包括一或多個保守修飾。具有一或多個保守修飾的融合蛋白可保留所需的功能性質，其可以使用技藝中已知的功能分析進行測試。如本文所用，術語「保守序列修飾」是指明顯不影響或改變含有胺基酸序列的蛋白質的結合特徵的胺基酸修飾。此類保守修飾包括胺基酸置換、添加和缺失。可以透過本技藝中已知的標準技術引入修飾，諸如定點誘變和PCR媒介的誘變。保守胺基酸置換是其中胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基所取代。本技藝中已經定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基家族。這些家族包括以下胺基酸：具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)；酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)；不帶電荷的極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)；非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)；β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)；和芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。包括一或多個保守修飾。具有一或多個保守修飾的Cas蛋白可以保留所需的功能特性，這可以使用本技藝已知的功能分析進行測試。如本文所用，術語「保守序列修飾」是指明顯不影響或改變含有胺基酸序列的蛋白質的結合特徵的胺基酸修飾。此類保守修飾包括胺基酸置換、添加和缺失。可以透過本技藝中已知的標準技術引入修飾，諸如定點誘變和PCR媒介的誘變。保守胺基酸置換是其中胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基所取代。本技藝中已經定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基家族。這些家族包括以下胺基酸：具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)；酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)；不帶電荷的極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)；非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)；β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)；和芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。

如本文所用，兩個胺基酸序列之間的同源性百分率等同於兩個序列之間的同一性百分率。兩個序列之間的同一性百分率與序列共有相同位置數量相關(即%同源性 = 相同位置的#/位置的總# x 100)，要考慮到空位數量和每個空位的長度，需要引入這些空位以實現兩個序列的最佳比對。可以使用數學演算法完成序列的比較和兩個序列之間同一性百分率的確定，如下面的非限制性實例中所述。

可以使用E. Meyers and W. Miller的演算法(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))來確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分率，該演算法已併入ALIGN程式(2.0版)，使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分為12而空位罰分為4。此外，可以使用Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))演算法來確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分率，該演算法已併入GCG套裝軟體(可在www.gcg.com獲得)的GAP程式中，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，空位權重為16、14、12、10、8、6或4，而長度權重為1、2、3、4、5或6。

另外或或者，本揭露的蛋白質序列可以進一步用作為「查詢序列」以針對公開數據庫執行檢索以例如鑑別相關序列。可以使用Altschul, et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10的XBLAST程式(2.0版)執行此類檢索。BLAST蛋白質檢索可以用XBLAST程式進行，分數=50，字長=3，以獲得與本揭露抗體分子同源的胺基酸序列。為了獲得用於比較目的之空位比對，可以按照Altschul et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402所述使用Gapped BLAST。當採用BLAST和Gapped BLAST程式時，可以使用對應程式(例如XBLAST和NBLAST)的內定參數(參見www.ncbi.nlm.nih.gov)。

如本文所用，當提及核酸或其片段時，術語「實質同一性」或「實質上相同」表示當與另一核酸(或其互補股)在有適當核苷酸插入或缺失的情況下進行最佳比對時，有至少約90%，且更佳至少約95%、96%、97%、98%或99%核苷酸鹼基中的核苷酸序列同一性，如藉由任何周知的序列同一性演算法測量的，諸如FASTA、BLAST或GAP，如下所述。在某些情況下，與參考核酸分子具有實質同一性的核酸分子可能編碼具有與參考核酸分子編碼的多肽相同或實質上相似的胺基酸序列的多肽。當應用於多肽時，術語「實質相似性」或「實質上相似」表示兩個肽序列在進行最佳比對時，諸如藉由程式GAP或BESTFIT使用內定空位權重，共有至少90%序列同一性，甚至更佳至少95%、98%或99%序列同一性。較佳地，不相同的殘基位置因保守胺基酸置換而有不同。「保守胺基酸取代」是其中一個胺基酸殘基被包括具有相似化學性質(例如電荷或疏水性)的側鏈(R基團)的另一個胺基酸殘基所置換。一般來說，保守胺基酸置換不會實質上改變蛋白質的功能性質。在兩個或多個胺基酸序列因保守置換而彼此不同的情況下，可向上調整相似性百分率或程度以校正置換的保守性質。用於進行這種調整的方式對於習於技藝者來說是眾所周知的。參見，例如Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331，其以引用的方式併入本文。

如本文所用，術語「重組」，如本文所用是指藉由本技藝中已知為重組DNA技術的技術或方法創造、表現、分離或獲得的本揭露蛋白質或其片段，包括例如DNA剪接和轉基因表現。該術語指在非人類哺乳動物(包括轉基因非人類哺乳動物，例如轉基因小鼠)或細胞(例如CHO細胞)表現系統中表現或從重組組合人類抗體庫中分離的融合蛋白。

如本文所用，在融合蛋白或其組分(例如，諸如抗體的靶向部分)的上下文中，術語「締合的」是指兩條或更多條多肽鏈之間的功能關係。特別地，術語「締合的」表示兩條或更多條多肽彼此締合，例如透過分子交互作用非共價地或透過一或多個二硫鍵或化學交聯鍵聯共價地締合，從而產生功能性融合蛋白。可能存在於本揭露融合蛋白中的締合的實例包括(但不限於)Fc區中的同二聚或異二聚Fc結構域的締合、Fab或scFv中VH和VL區之間的締合、Fab中CH1和CL之間的締合，以及結構域經取代Fab中CH3和CH3之間的締合。

如本文所用，如本文所用的關於融合蛋白中的IL2部分及/或靶向部分的術語「單價」分別表示僅具有單個IL2部分及/或靶向部分(例如抗PD-1抗體或其抗原結合部分)的融合蛋白。

如本文所用，如本文所用的關於融合蛋白中的IL2部分及/或靶向部分的術語「二價」表示分別具有兩個IL2部分及/或靶向部分(例如抗PD-1抗體或其抗原結合部分)的融合蛋白。通常，對於IL2部分及/或靶向部分是二價的融合蛋白是二聚體(同二聚體或異二聚體)。

如本文所用，術語「互補決定區」或「CDR」如本文所用是指抗體可變區內賦予抗原特異性和結合親和力的胺基酸序列。大體上，每個重鏈可變區有三個CDR(CDR-H1、CDR-H2、HCDR-H3)，而每個輕鏈可變區有三個CDR(CDR1-L1、CDR-L2、CDR-L3)。可用於識別CDR邊界的例示性慣例包括，例如Kabat定義、Chothia定義，ABM定義和IMGT定義。參見，例如Kabat, 1991, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」 National Institutes of Health, Bethesda, Md. (Kabat編號方案)；Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol. 273:927-948 (Chothia編號方案)；Martin et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (ABM編號方案)；與Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27:55-77 (IMGT編號方案)。公共數據庫也可用於鑑定抗體內的CDR序列。

如本文所用，術語「Fc結構域」是指重鏈的一部分，其與另一條重鏈的相應部分配對。術語「Fc區」是指藉由兩個重鏈Fc結構域締合所形成的基於抗體的結合分子的區域。Fc區內的兩個Fc結構域可能相同或彼此不同。在天然抗體中，Fc結構域通常是相同的，但是一個或兩個Fc結構域可能受到有利地修飾而允許異二聚化，例如經由突起-空隙交互作用(knob-in-hole interaction)。

如本文所用，術語「EC50」是指分子(諸如融合蛋白)的半最大有效濃度，該濃度在指定的暴露時間後引起基線和最大值之間的一半反應。EC50基本上代表抗體或融合蛋白在觀察到其最大作用之50%的濃度。在一些具體例中，EC50值等於在分析中提供半最大STAT5活化的融合蛋白濃度。

表位或抗原決定位(antigenic determinant)是被如本文所述之抗體或其他抗原結合部分所辨識的抗原(例如目標分子)的一部分。表位可以是線性的或構形性的。

如本文所用，術語「個體(subject)」包括人類和非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人類靈長類動物、綿羊、狗、牛、雞，兩棲動物和爬蟲動物。除非有註明，否則術語「患者」或「個體」在本文中可交替使用。

如本文所用，術語「目標分子」如本文所用是指表現於細胞表面上或細胞外基質中的任何生物分子(例如蛋白質、碳水化合物，脂質或其組合)，其可被本揭露融合蛋白中的靶向部分特異地結合。

如本文所用，術語「治療(treat，treatment及treating)」是指因為投予本揭露的一或多個融合蛋白而減少或改善增生性疾病的進展，嚴重程度及/或持續時間，或改善增生性病症的一或多種症狀(較佳地一或多種可辨別的症狀)。在特定具體例中，術語「治療」是指改善增生性病症的至少一種可測量物理參數，諸如腫瘤的生長，這不一定會被患者所察覺。在其他具體例中，術語「治療」是指在物理上藉由例如穩定可辨別的症狀、生理上藉由例如穩定物理參數或兩者來抑制增生性病症的進展。在其他具體例中，術語「治療」是指減少或穩定腫瘤大小或癌細胞計數。

如本文所用，術語「癌症」是指特徵在於異常細胞不受控制(且通常迅速)生長的疾病。癌細胞可以局部擴散，或透過血流和淋巴系統擴散到身體的其他部位。本文描述了各種癌症的實例，且包括但不限於乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、腎上腺癌、自律神經神經節癌、膽道癌、骨癌、子宮內膜癌、眼癌、輸卵管癌、生殖道癌、大腸癌、腦膜癌、食道癌、腹膜癌、垂體癌、陰莖癌、胎盤癌、胸膜癌、唾液腺癌、小腸癌、胃癌、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、上呼吸消化道癌、泌尿道癌、陰道癌、外陰癌、淋巴瘤、白血病，肺癌與類似者。

如本文所用，術語「腫瘤」在本文中與術語「癌症」可交替使用，例如這兩個術語均含括實體和液體，例如瀰漫性或循環性腫瘤。如本文所用，術語「癌症」或「腫瘤」包括癌前以及惡性癌症與腫瘤。

如本文所用，術語「宿主細胞」如本文所用是指本揭露的核酸已被引入其中的細胞。術語「宿主細胞」和「重組宿主細胞」在本文可交替使用。應理解，這些術語是指特定的主體細胞以及此一細胞的後代或潛在後代。由於突變或環境影響，某些修飾可能會在後代中發生，因此這樣的後代實際上可能與親代細胞不同，但仍包含在本文所用術語的範疇內。典型的宿主細胞是真核宿主細胞，諸如哺乳動物宿主細胞。

如本文所用，「表現」是指多核苷酸從DNA模板轉錄(諸如轉錄成mRNA或其他RNA轉錄本)的過程，及/或經轉錄的mRNA隨後被轉譯成肽、多肽或蛋白質的過程。轉錄本和編碼的多肽可以統稱為「基因產物」。如果多核苷酸是衍生自基因體DNA，則表現可能包括真核細胞中mRNA的剪接。

如本文所用，「經分離的」核酸分子或多核苷酸是指已從其天然環境中移除的核酸分子、DNA或RNA。例如，出於本揭露之目的，載體中所包含的編碼治療性多肽的重組多核苷酸被認為是經分離的。經分離的多核苷酸的更多實例包括維持在異源宿主細胞中的重組多核苷酸或在溶液中經純化的(部分或基本上)多核苷酸。經分離的多核苷酸包括包含在通常含有該多核苷酸分子的細胞中的多核苷酸分子，但該多核苷酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置的染色體位置。經分離的RNA分子包括本揭露活體內或活體外RNA轉錄本，以及正股和負股形式，與雙股形式。根據本揭露，經分離的多核苷酸或核酸進一步包括合成產生的此類分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括調節元件，諸如啟動子、核醣體結合位點或轉錄終止子。

如本文所用，如本文所用的術語「疾病」意欲與術語「病症」和「病況」(如在醫學病況中)大體上同義並且可交替使用，因為它們都反映了人類或動物身體或其一部分損害正常功能的異常狀況，通常表現為明顯的病兆和症狀，並導致人類或動物的生命持續時間或生活品質降低。

如本文所用，術語「組成物」或「醫藥組成物」是指至少一種可與本揭露揭示之融合蛋白的組分與其他組分(諸如載劑、穩定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑及/或賦形劑)的混合物。醫藥組成物有助於將本揭露的一或多種組分投予給生物體。

如本文所用，術語「醫藥上可接受的」是指諸如載劑或稀釋劑之類的材料，其不會消除組成物的生物活性或性質並且相對無毒，即該材料可以被投予給個體而不會引起不樂見的生物學效用或以有害方式與包含它的組合物的任何組分交互作用。

如本文所用，術語「醫藥上可接受的載劑」包括醫藥上可接受的鹽、醫藥上可接受的材料、組成物或載劑(諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或囊封材料)，其涉及將本揭露化合物(等)攜帶或運輸至個體體內或至個體以便其可以執行其預期功能。通常，此類化合物從一個器官或身體的一部分被攜帶或運輸至另一個器官或身體的一部分。就與調配物的其他成分相容的意義來說，每種鹽或載劑必須是「可接受的」，並且對個體無害。可用作醫藥上可接受的載劑的材料的一些實例包括：糖，諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、和乙酸纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂和栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇類，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯類，諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，諸如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；稀釋劑；造粒劑；潤滑劑；黏合劑；崩解劑；潤濕劑；乳化劑；著色劑；脫模劑；包衣劑；甜味劑；調味劑；香味劑；防腐劑；抗氧化劑；塑化劑；凝膠劑；增稠劑；硬化劑；定型劑；懸浮劑；表面活性劑；保濕劑；載劑；穩定劑；和其他在醫藥調配物中採用的無毒相容物質，或其任何組合。如本文所用，「醫藥上可接受的載劑」還包括與本揭露的一或多種組分的活性相容並且對個體來說生理學上可接受的任何和所有包衣、抗菌劑和抗真菌劑以及吸收延遲劑與類似者。補充性活性化合物也可以摻入組成物中。

如本文所用，術語「調節」意指生物狀態的任何變化，即增加、減少與類似者。

如本文所用，術語「增加(increased)」、「增加(increase)」或「提高(enhance)」或「活化」在本文中均用於大體上表示靜態顯著量的增加；為避免任何疑問，術語「增加」、「增加」或「提高」或「活化」是指與參考水平相比增加至少10%，例如增加至少約20%，或至少約30%，或至少約40%，或至少約50%，或至少約60%，或至少約70%，或至少約80%，或至少約90%，或與參考水平相比至多並包括增加100%或10-100%之間的任何增加，或與參考水平相比增加至少約2倍，或至少約3倍，或至少約4倍，或至少約5倍或至少約10倍，或增加2倍至10倍或更多。

如本文所用，單數形式「一(a、an)」或「該(the)」包括複數個指代對象，除非上下文另有明確說明。

如本文所用，除非另有註明，否則術語「包括」、「包含」、「含有」或「具有」及其變體意在含括其後列出的項目及其等效物以及額外請求標的。

如本文所用，重複使用片語「在一個具體例中」、「在各種具體例中」、「在一些具體例中」與類似者。這樣的片語不一定指相同的具體例，但除非上下文另有說明，否則它們可以指相同的具體例。

如本文所用，術語「及/或」或「/」表示與該術語相關聯的項目中的任何一者、項目的任何組合或所有項目。

如本文所用，詞語「基本上」不排除「完全」，例如「基本上不含」Y的組成物可能完全不含Y。必要時，可以從定義中省略詞語「基本上」。

如本文所用，當應用於一或多個感興趣值之時，術語「大約」或「約」是指與規定的參考值相似的值。在一些具體例中，術語「大約」或「約」是指範圍落在標準參考值的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少(大於或小於)之值，除非另有說明或從上下文中可以明顯看出(除非該數字超過可行值的100%)。除非本文另有說明，否則術語「約」意欲包括與所引用範圍相近的值(例如重量百分率)，其在單獨成分、組成物或具體例的功能性方面相當。

如本文所揭示，提供了多個值範圍。應當理解，除非上下文另有明確規定，否則每個介於該範圍的上限和下限之間的中間值到下限單位的十分之一也被具體揭示。本揭露含括在任何規定值或規定範圍內的中間值與該規定範圍內的任何其他規定或中間值之間的每個較小範圍。這些較小範圍的上限和下限可以獨立地納入或排除在該範圍內，且其中一者、均無或兩者限制都包括在較小範圍內的每個範圍也含括在本揭露內，但在規定的範圍內受任何明確排除的限制。在明確範圍包括一或兩個限制的情況下，排除那些被納入的一或兩個限制的範圍也含括在本揭露中。

如本文所用，術語「各」在用於指項目集合時，意欲要確定集合中的單獨項目，但不一定指集合中的每個項目。如果明確揭示或上下文清楚地另有指定，則可能會出現例外情況。

本文提供的任何和所有實例或例示性語言(例如「諸如」)的使用僅是希望在更為充分地闡明本揭露並且不對本揭露的範疇構成限制，除非另有聲明。說明書中的任何語言都不應被解釋為指示任何未請求保護的元件對於實施本揭露來說必不可少。

除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，否則本文所述的所有方法均按任何合適的順序執行。關於所提供的任何方法，該方法的步驟可以同時或依序發生。當該方法的步驟依序發生時，這些步驟可以按任何順序發生，除非另有註明。在方法包括步驟組合的情況下，除非本文另有註明，否則步驟的各個與每個組合或子組合都含括在本揭露的範疇內。

在此引用的每份出版物、專利申請案、專利案和其他參考文獻在不與本揭露不一致的範圍內以全文引用的方式併入。本文所揭示的出版物僅提供它們在本揭露的申請日期之前的揭示。本文中的任何內容均不應被解釋為承認本揭露無權因先前揭示內容而早於此出版物。此外，提供的公開日期可能與實際公開日期不同，這可能需要獨立確認。

應當理解，本文描述的實例和具體例僅用為說明目的，並且將據其向習於技藝者提出各種修改或變化，並且將被納入在本申請案的精神和範圍內以及隨附申請專利範圍的範疇內。 實例

提出以下實例是為了向那些習於技藝者提供如何製作和使用本揭露方法和組成物的完整揭示和說明，並不是想要限制發明人視為的發明範疇。同樣地，本揭露不限於本文所述的任何特定較佳具體例。實際上，在閱讀本份說明書後，那些習於技藝者可以清楚地了解具體例的修改和變化，並且可以在不脫離其精神和範疇的情況下做出修改和變化。已盡力確保所用數字(例如數量、溫度等)的準確性，但應考量到仍會有一些實驗誤差和偏差。除非另有說明，否則份是重量份、分子量是平均分子量、溫度是呈攝氏度、室溫是約25℃，而壓力為大氣壓或接近大氣壓。 實例1：生成針對PD-1的人類抗體

在包含編碼人類免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈可變區的DNA的VELOCIMMUNE®小鼠體內生成PD-1蛋白的人類抗體。於佐劑存在的情況下，用GenBank登錄號NP_005009.2的約胺基酸25-170範圍內的PD-1片段來免疫小鼠。藉由PD-1特異性免疫分析監控抗體免疫反應。當達到所期望的免疫反應時，收取脾細胞，並與小鼠骨髓瘤細胞融合以保有其活力且形成融合瘤細胞株。篩選並挑出融合瘤細胞株以鑑定產生PD-1特異性抗體的細胞株。

如美國專利第7,582,298號中所述，在不與骨髓瘤細胞融合的情況下，直接從抗原陽性小鼠B細胞分離出抗PD-1抗體，該件專利案特別以全文引用的方式併入本文。

使用這個方法，得到了數種完全人類抗PD-1抗體(即具有人類可變結構域和人類恆定結構域的抗體)。

如上文所揭示生成的例示性抗體被指定為mAb29512、mAb7798和mAb9048，其具有如表1和2中所鑑定的HCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCVR、LCDR1、LCDR2和LCDR3胺基酸序列與核酸序列。

使用技藝中已知的標準分子生物學技術，例示性抗PD-1抗體用於構築基於IL2的藥劑。表4揭示了藥劑的胺基酸序列。

根據這個實例的方法所生成的例示性蛋白質的生物學性質在下文闡述的實例中詳細說明。 實例2：重鏈與輕鏈可變區胺基酸序列及核苷酸序列

表1列出例示性抗PD-1抗體的重鏈和輕鏈可變區序列、CDR序列的胺基酸序列識別號。 表1：胺基酸識別號

	SEQ ID NO ：
抗體 ID	HCVR	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCVR	LCDR1	LCDR2	LCDR3
mAb29512	2	4	6	8	10	12	14	16
mAb7798	22	24	26	28	30	32	14	35
mAb9048	41	43	45	47	10	12	14	16

例示性抗PD-1抗體的對應核酸序列識別號列於表2中。 表2：核酸識別號

	SEQ ID NO ：
抗體 ID	HCVR	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCVR	LCDR1	LCDR2	LCDR3
mAb29512	1	3	5	7	9	11	13	15
mAb7798	21	23	25	27	29	31	33	34
mAb9048	40	42	44	46	9	11	13	15

抗體可能具有人類或小鼠Fc同型。如技藝中具有通常技術者將理解到的，具有特定Fc同型的抗體可以轉成具有不同Fc同型的抗體(例如具有小鼠IgG1 Fc的抗體可以轉成具有人類IgG1或人類IgG4的抗體等)，但在任何情況下，可變結構域(包括CDR) (由表1中顯示的數字識別號表示)將保持不變，而無論Fc結構域的性質如何，預期抗原的結合性質都相同或基本上相似。

在鉸鏈區含有絲胺酸到脯胺酸突變(S108P)之包含人類IgG4 Fc的mAb29512、mAb7798與mAb9048的例示性抗體分別指定為H4H29512、REGN2810和H4H9048。表3列出了這些抗體的全長重鏈和輕鏈序列的胺基酸序列識別號。 表3：抗PD-1抗體的重鏈(HC)與輕鏈(LC)序列

抗體 ID	抗體名稱	SEQ ID NO ：
HC	LC
DNA	PEP	DNA	PEP
mAb29512	H4H29512	17	18	19	20
mAb7798	REGN2810	36	37	38	39
mAb9048	H4H9048	48	49	19	20

REGN2810(也稱為西米普利單抗(cemiplimab)；LIBTAYO ^®)首次揭示於US 9,987,500中，此後經核准用於治療皮膚鱗狀細胞癌、基底細胞癌和非小細胞肺癌。

表4列出了抗PD-1-IL2Rα-IL2藥劑的胺基酸序列識別號。 表4：抗PD-1-IL2Rα-IL2的胺基酸識別號

	SEQ ID NO ：
ID	HCVR	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCVR	LCDR1	LCDR2	LCDR3	HC	LC	IL2 部分
REGN10595	2	4	6	8	10	12	14	16	57	58	54
REGN10486	22	24	26	28	30	32	14	35	59	60	54
REGN10597	41	43	45	47	10	12	14	16	61	62	54

IL2部分經由包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的連接子連接至重鏈恆定區(SEQ ID NO：55)的C端。關於REGN10595，重鏈(HC) SEQ ID NO : 57包括HCVR的胺基酸序列(SEQ ID NO：2)、重鏈恆定區的胺基酸序列(SEQ ID NO：55)、連接子的胺基酸序列(SEQ ID NO：50)和IL2部分的胺基酸序列(SEQ ID NO：54)。關於REGN10486，重鏈(HC) SEQ ID NO：59包括HCVR的胺基酸序列(SEQ ID NO：22)、重鏈恆定區的胺基酸序列(SEQ ID NO：55)、連接子的胺基酸序列(SEQ ID NO：50)和IL2部分的胺基酸序列(SEQ ID NO：54)。關於REGN10597，重鏈(HC) SEQ ID NO：61包括HCVR的胺基酸序列(SEQ ID NO：41)、重鏈恆定區的胺基酸序列(SEQ ID NO：55)、連接子的胺基酸序列(SEQ ID NO：50)和IL2部分的胺基酸序列(SEQ ID NO：54)。 用於以下實例的對照構築體：

在以下實例中納入下列對照構築體以供比較之用：「Comp 1」：根據WO 2008/156712 (Merck Sharp & Dohme)，具有抗體「MK-3475」的V _H/V _L序列的單株抗PD-1抗體；「Comp 2」：根據WO2006/121168 (Medarex, Inc/ER Squibb)，具有抗體「5C4」的V _H/V _L序列的單株抗PD-1抗體；和「REGN13233」：一種抗PD-1抗體，包含SEQ ID NO：41/10的VH/VL序列並連接至已消除CD25結合的IL2變體(IL2(3m)) (Klein et al., 2017, Oncoimmunology)。 實例3：抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體和親本二價抗PD1抗體的結合動力學

為了評估IL2RA-IL2融合構築體和親本二價抗PD1抗體的結合動力學，使用即時表面電漿共振生物感測器利用Biacore 3000或4000儀器來測定C端表現有myc-myc-六組胺酸標籤的人類PD-1(hPD-1.mmH，SEQ ID NO：66)與經純化的抗PD-1親本mAb和抗PD1-IL2RA-IL2融合構築體結合的平衡解離常數(K _D 值)。CM5 Biacore感測器表面藉由與單株小鼠抗人類Fc抗體(GE, #BR-1008-39)胺偶合予以衍生化。所有Biacore結合研究均在由0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v表面活性劑P20(HBS-EP運行緩衝液)組成的緩衝液中進行。將在HBS-EP運行緩衝液中製備的不同濃度的hPD-1.mmH (範圍從100 到3.7 nM，3倍稀釋或90 nM到3.33 nM，3倍稀釋)以30或50 µL/分鐘的流速注射到捕獲有抗PD-1抗體或抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體的表面上。監測抗體-藥劑締合歷時4或5分鐘，同時監測HBS-EP運行緩衝液中的解離歷時10分鐘。在每個循環結束時，使用12秒注射20mM磷酸使捕獲有抗PD-1 mAb或抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體的表面再生。所有結合動力學實驗均在25℃下進行。

使用Scrubber 2.0c曲線擬合軟體，藉由將即時感測圖擬合至1：1結合模型來確定動力學結合( k _a)和解離( k _d)速率常數。從動力學速率常數計算結合解離平衡常數( K _D)和解離半衰期(t½)為： K _D(M) =

，且t½ (min) =

表5中歸納了抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體和親本二價抗PD1抗體的結合動力學。 表5. 在25℃下，hPD-1.mmH與抗PD-1 mAb和PD1-IL2Rα-IL2融合構築體的結合動力學

REGN # / Ab PID #	mAb 捕獲 (RU)	90nM 或 100nM hPD-1.mmH 結合 (RU)	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)	t1/2 (min)
REGN10486	241.8 ± 6.4	46.9	1.07E+05	3.02E-04	2.83E-09	38.3
REGN2810	337.6 ± 3.9	88.7	9.88E+04	2.53E-04	2.56E-09	45.7
REGN10595	186.5 ± 1.5	44.7	1.04E+05	4.76E-04	4.59E-09	24.3
mAb29512	481.1 ± 1.3	123.8	1.38E+05	4.27E-04	3.10E-09	27.1
REGN10597	211.5 ± 2.6	41.8	1.48E+05	5.82E-04	3.92E-09	19.9
mAb9048	229.91	52.7	1.37E+05	1.23E-03	8.95E-09	9.4

實例4：抗PD-1 mAb和抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體的交叉競爭

為了評估抗PD-1 mAb和抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體的交叉競爭，使用即時無標籤生物層干涉術(BLI)分析，在Octet HTX生物感測器(ForteBio Corp.，Sartorius的一個部門)上測定抗PD1-IL2Rα-IL2和商業抗PD-1 mAb之間的結合競爭。整個實驗在25℃下於由0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v表面活性劑P20、0.1mg/mL BSA組成的緩衝液(Octet HBS-EP緩衝液)中與盤以1000 rpm的速度搖動來進行。為了評估兩種抗體是否能夠彼此競爭結合至其各自在hPD-1.mmH (SEQ ID NO：66)上的表位，首先透過將生物感測器浸入含有20µg/mL hPD-1.mmH溶液的孔中2分鐘，使約0.34nm的hPD-1.mmH被捕獲到經HIS1K抗體塗覆的Octet生物感測器(Fortebio Inc, # 18-5120)上。然後藉由浸入含有50 µg/mL mAb-1溶液的孔中歷時5分鐘，用第一抗PD-1抗體或抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體(之後稱為mAb-1)使捕獲有抗原的生物感測器飽和。接著將生物感測器浸入含有50 µg/mL第二抗PD-1抗體或抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體(之後稱為mAb-2)溶液的孔中歷時3分鐘。在實驗的每個步驟之間，所有生物感測器都在Octet HBS-EP緩衝液中進行清洗。實驗過程期間監測即時結合反應，記錄每一步驟結束時的結合反應(比較mAb-2和預先複合mAb-1的hPD-1.mmH的結合反應)，且使用50%抑制閾值來確定不同抗PD-1抗體的競爭/非競爭行為。

表6定義了抗體在兩個方向上競爭的關係，與結合順序無關。 表6. 抗PD-1 mAb與抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體結合至hPD-1.mmh的交叉競爭

使用 HIS1K Octet 生物感測器所捕獲的第一 mAb (mAb-1)	顯示與 mAb-1 競爭的 mAb-2 抗體
REGN10486	REGN2810
REGN2810	REGN10486
REGN10595	REGN10597
REGN10597	REGN10595

表6顯示REGN10486及其親本抗體REGN2810不與REGN10595或REGN10597交叉競爭結合至hPD-1。 實例5：抗PD1-IL2Rα-IL2構築體細胞株工程改造的活體外功能特徵鑑定

YT/報導細胞的工程改造：用信號轉導和轉錄活化因子5(STAT5)-螢光素酶報導構築體對人類T/NK細胞白血病YT細胞株進行電穿孔，並維持在Iscoves + 20% FBS + P/S/G + 200μg/mL潮黴素中。鑑定出對IL-2具有高反應性的單細胞殖株並重新命名為YT/Stat5-Luc cl.4。使用CRISPR-Cas9技術在該殖株中剔除IL2Rα(CD25)，並藉由流動式細胞測量術驗證所得細胞株YT/STAT5-Luc/IL2Rα KO。然後將人類IL2Rα穩定地重新引入YT/STAT5-Luc/IL2Rα KO細胞株(登錄號NP_000408.1的胺基酸M1-I272)，並藉由流動式細胞測量術驗證所得細胞株YT/STAT5-Luc/hIL2Rα且維持在Iscoves + 20% FBS + P/S/G + 200μg/mL潮黴素 + 15μg/mL殺稻瘟菌素中。YT/Stat5-Luc cl.4、YT/Stat5-Luc/IL2Rα KO和YT/Stat5-Luc/hIL2Rα細胞經工程改造以穩定表現人類PD1(登錄號NP_005009.2的胺基酸M1-L288，有一個2Q =＞ E突變)，並在補充有1mg/mL G418的培養基中挑選細胞。細胞藉由流動式細胞測量術進行驗證，並重新命名為YT/STAT5-Luc/hPD1、YT/STAT5-Luc/IL2Rα KO/hPD1和YT/STAT5-Luc/hIL2Rα/hPD1。

PD1報導細胞的工程改造：Jurkat E6-1細胞經工程改造以穩定表現活化蛋白1(AP1)螢光素酶報導構築體，並挑出抗生素抗性細胞且將其維持在RPMI + 10% FBS + P/S/G + 1 μg/mL嘌呤黴素中。由此產生的報導細胞庫經工程改造成表現人類PD1(登錄號NP_005009.2的胺基酸M1-L288，有一個2Q=＞E突變)，並藉由螢光活化細胞分選來分離高度表現PD-1的殖株細胞株且維持在RPMI + 10% FBS + P/S/G + 1 μg/mL嘌呤黴素中。生成的殖株被重新命名為Jurkat/AP1-Luc/hPD1 cl. 4E5。

HEK293/抗CD3/PD-L1細胞的工程改造：用編碼人類CD79a(hIga：登錄號NP_001774.1的M1-P226)、人類CD79b(hIgb：登錄號NP_000617.1的M1-E229)、抗CD3可變結構域(抗CD3 mIgE重鏈、抗CD3κ輕鏈；殖株2706N、IgE genbank# AAB59424.1、CemX-migis-Cyto/TM PIR# PIH1215)和人類PD-L1(登錄號NP_054862.1的胺基酸M1-T290)的慢病毒載體轉導HEK293，然後分選單細胞並維持在DMEM + 10% FBS + P/S/G + 500ug/mL G418 + 100ug/mL潮黴素 + 1ug/mL嘌呤黴素中。藉由流動式細胞測量術確認抗CD3和PD-L1表現，並將所得殖株重新命名為293/aCD3/hPD-L1 cl. A3。

Raji/CD80 KO/CD86 KO和Raji/CD80 KO/CD86 KO/PD-L1細胞的工程改造：在Raji細胞中使用CRISPR-Cas9技術消除CD80和CD86表現。對Raji/CD80 KO/CD86 KO細胞進行單細胞選殖，並將所得殖株(Raji/CD80 KO/CD86 KO cl.1D6)工程改造成表現人類PD-L1(登錄號NP_054862.1的胺基酸M1-T290)。藉由流動式細胞測量術驗證所得細胞株Raji/CD80 KO/CD86 KO/hPD-L1並維持在RPMI-1640 + 10% FBS + HEPES + NaPyr + P/S/G + 0.5ug/mL嘌呤黴素中。 PD1拮抗分析

將表現膜結合型抗hCD3ε和人類PD-L1的HEK293細胞與Jurkat/AP1-Luc/hPD-1報導T細胞一起培育。經由HEK293細胞上的抗CD3使CD3與報導細胞上的T細胞受體複合，導致轉錄因子AP1活化，其驅動螢光素酶報導基因表現。然而，報導T細胞中的螢光素酶表現可以透過抑制性受體PD-1與HEK293細胞上的PD-L1交互作用而受到壓抑，這可以藉由添加阻斷PD1/PD-L1軸的抗體予以克服。

補充有10% FBS和P/S/G的RPMI1640用作為分析培養基以製備細胞懸浮液和抗體稀釋液。篩選前一天，將經工程改造的Jurkat/AP1-Luc/hPD1報導細胞稀釋至3 x 10 ⁵個細胞/mL。在分析當天，將細胞離心下來，重新懸浮在分析培養基中，並以2.5 x 10 ⁴個293/aCD3/hPD-L1細胞/孔舖盤在96孔白色平底盤中。然後在11點滴定範圍(500nM至477 fM)內，將經連續稀釋(1：4)的非靶向IL2Rα-IL2[抗PSMA-IL2Rα-IL2(IL2Rα-IL2融合至不相關的(PSMA)抗體)]、抗PD1(REGN2810、H4H29512或H4H9048)、抗PD1-IL2Rα-IL2(REGN10486、REGN10595、REGN10597)或同型對照(同型對照1或同型對照2)添加到已鋪盤的細胞(plated cells)，其中第12點不含重組蛋白，接著添加2.5 x 10 ⁴個Jurkat/AP1-Luc/hPD1報導細胞/孔。將盤在37℃/5% CO ₂下培育5小時，然後將100 µL ONE-Glo™(Promega)試劑添加到孔中以溶解細胞並偵測螢光素酶活性。在多標籤讀盤儀Envision(PerkinElmer)上以相對光單位(RLU)測量發射的光。抗體的EC ₅₀值是使用GraphPad Prism ^TM軟體在12點劑量反應曲線內從四參數邏輯方程式確定。使用以下等式計算誘導倍數：

IL2報導分析

在本實驗中，經工程改造的YT報導細胞是經由重組IL2-Fc、非靶向IL2Rα-IL2或抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體受到刺激。功能性IL2受體由IL2R次單位(IL2Rα、IL2Rβ和IL2Rγ)的差異組裝所形成，其中IL2Rβ/IL2Rγ次單位的組裝包含低親和力受體，以及形成高親和力受體之含有所有三個次單位(IL2Rα/IL2Rβ/IL2Rγ)的受體。IL2R結合細胞介素會導致STAT5活化，其驅動螢光素酶在經工程改造細胞株中的產生。為了評估抗PD1-IL2Rα-IL2在低親和力(IL2Rβ/γ)或高親和力 (IL2Rα/β/γ)IL2受體存在下的相對效力，表現內源性IL2Rα的YT/STAT5-Luc報導細胞被工程改造成缺乏或過度表現IL2Rα。在報導細胞表現內源性PD1的同時，生成過度表現PD1的衍生物以供評估PD1表現程度對抗PD1-IL2Rα-IL2效力的影響。

補充有10% FBS和P/S/G的RPMI1640用作為分析培養基以製備細胞懸浮液和抗體稀釋液。在篩選前一天，以3 x 10 ⁵個細胞/mL稀釋過度表現或缺乏IL2Rα和內源性表現或過度表現PD1的經工程改造報導YT/Stat5-Luc細胞。在分析當天，將2.5 x 10 ⁴個報導細胞/孔鋪盤在96孔白色平底盤的新鮮分析培養基中，並與在11點滴定範圍(200nM至191 fM)內(且第12點不含重組蛋白)，經連續稀釋(1：4)的IL2-Fc(SEQ ID NO：74)、非靶向IL2Rα-IL2、REGN10486、REGN10595、REGN10597或同型對照一起培育。將盤在37℃/5% CO ₂下培育5小時，然後將100 µL ONE-Glo™(Promega)試劑添加到孔中以溶解細胞並偵測螢光素酶活性。在多標籤讀盤儀Envision(PerkinElmer)上以RLU測量發射的光。抗體的EC ₅₀值是使用GraphPad Prism ^TM軟體在12點劑量反應曲線內從四參數邏輯方程式確定。使用以下等式計算誘導倍數：

PD1競爭分析

在經由非靶向IL2Rα-IL2或抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體進行刺激之前，將抗PD1二價抗體或同型對照添加到經工程改造的YT報導細胞中。二價抗PD1與抗PD1-IL2Rα-IL2的競爭會削弱抗PD1-IL2Rα-IL2靶向並因此活化表現PD-1的STAT5-Luc報導細胞的能力。過度表現PD1的報導細胞用於使靶向效率達至最高，並允許最佳偵測抗PD1與抗PD1-IL2Rα-IL2的二價競爭。

補充有10% FBS和P/S/G的RPMI1640用作為分析培養基以製備細胞懸浮液和抗體稀釋液。在篩選前一天，以3 x 10 ⁵個細胞/mL稀釋剔除或過度表現IL2Rα的YT/Stat5-Luc/hPD1報導細胞。在分析當天，將2.5 x 10 ⁴個報導細胞/孔鋪盤在96孔白色平底盤的分析培養基中，並添加抗PD-1二價或同型對照抗體的滴定液(5點，1：10稀釋，範圍從500nM到0.05nM，其中第6點不含重組蛋白質)，接著添加非靶向IL2Rα-IL2、REGN10486、REGN10595或REGN10597的滴定液(62.5nM至59.6 fM，在11點稀釋範圍內1：4連續稀釋，其中第12點不含重組蛋白質)。將盤在37℃/5% CO ₂下培育4小時，然後將100 µL ONE-Glo™(Promega)試劑添加到孔中以溶解細胞並偵測螢光素酶活性。在多標籤讀盤儀Envision(PerkinElmer)上以RLU測量發射的光。抗體的EC ₅₀值是使用GraphPad Prism ^TM軟體在12點劑量反應曲線內從四參數邏輯方程式確定。使用以下等式計算誘導倍數：

初代T細胞刺激分析

初代T細胞是經由與經絲裂黴素處理的Raji/CD80 KO/CD86 KO細胞共培養4天而受到刺激。由於Raji細胞內源性表現CD20，因此添加了CD20xCD3雙特異性抗體來活化初代T細胞。在共培養期間添加了同型對照、IL2、抗PD1、非靶向IL2Rα-IL2抗體(REGN9904)或抗PD1-IL2Rα-IL2(REGN10486、REGN10595或REGN10597)的滴定液，以及並使用均質、免洗的AlphaLISA套組(Perkin Elmer)測量細胞培養上清液中的IFN-γ釋放來測定其對T細胞活性的影響。

遵循製造商推薦的方案，使用EasySep Direct Human PBMC Isolation套組(Stemcell)從健康捐贈者白血球濃厚液(leukopak)中分離人類周邊血液單核細胞(PBMC)。根據製造商的方案，使用EasySep Human T cell分離套組(Stemcell)從PBMC分離T細胞。細胞被離心下來，重新懸浮在刺激培養基(X-VIVO 15細胞培養基，補充有10% FBS、HEPES、NaPyr、NEAA和0.01 mM BME)中，並將1 x 10 ⁵個細胞/孔鋪盤到96孔圓底盤中。Raji/CD80 KO/CD86 KO和Raji/CD80 KO/CD86 KO/hPD-L1細胞用20 µg/mL絲裂黴素C，在濃度為10 x 10 ⁶個細胞/mL的初代刺激培養基中於37℃下處理1小時，以阻止細胞生長。然後用含有2% FBS的D-PBS洗滌細胞3次，每孔加入5×10 ⁴個細胞。隨後，加入0.5nM抗CD3x抗CD20雙特異性抗體，連同抗PD1、IL2、REGN2810 + IL2的組合、非靶向IL2Rα-IL2抗體、抗PD1-IL2Rα-IL2(REGN10486、REGN10595或REGN10597)或同型對照抗體(同型對照1或同型對照2)的滴定液，採用9點、1：6連續稀釋，範圍從500nM至0.3pM，其中第10個稀釋點僅含有固定0.5nM的雙特異性抗體。將盤在37℃/5% CO ₂下培育96小時。根據製造商的方案，使用具有已知IFN-γ濃度的樣品，利用AlphaLISA分析對細胞培養上清液中的IFN-γ進行量化，以推斷每個樣品孔中IFN-γ的pg/mL。在多標籤讀盤儀Envision(Perkin Elmer)上獲得測量結果。細胞介素的EC ₅₀值是使用GraphPad Prism ^TM軟體在10點劑量反應曲線內從四參數邏輯方程式確定，其中第10個稀釋點僅含有固定0.5 nM的雙特異性抗體。 結果歸納與結論 PD1拮抗分析：

使用基於AP1報導細胞的生物分析來評估抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體阻斷PD1/PD-L1媒介之TCR信號傳導抑制的能力。由於PD-L1活化PD1，293/aCD3/hPD-L1細胞與Jurkat/AP1-Luc/hPD1報導細胞一起培育會導致報導活性降低。評估二價抗PD1抗體或融合抗體的IL2Rα-IL2蛋白質阻斷PD1-PD-L1交互作用和拯救報導活性的能力。表7中歸納了經工程改造之報導細胞的EC ₅₀和誘導倍數值。

當用對照蛋白質(同型對照Ab1、同型對照Ab2或非靶向IL2Rα-IL2)處理報導細胞時，偵測到並無螢光素酶活性增加。相反地，將報導細胞與抗PD1抗體(REGN2810)或對應抗PD1-IL2Rα-IL2(REGN10486)一起培育會提高螢光素酶活性(分別為19.210倍和17.740倍)，並具有相似的效力(分別3.668E-09和5.351E-09)。另一方面，二價PD1抗體H4H29512和H4H9048並未提高螢光素酶活性，而對應抗PD1-IL2R-IL2蛋白(REGN10595和REGN10597)會誘導低螢光素酶活性(分別為2.725倍和3.038倍)，效力較弱(分別為1.266E-08和1.264E-08)。 IL-2報導分析：

使用STAT5-報導子分析來評估抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體誘導PD1靶向IL-2受體信號傳導的能力。將表現內源性IL2Rα、缺乏IL2Rα表現(KO細胞)或過度表現IL2Rα，以及表現內源性或過度表現PD1的YT/STAT5-Luc報導細胞與同型對照、IL2-Fc、非靶向IL2Rα-IL2或抗PD1-IL2Rα-IL2 (REGN10486、REGN10595或REGN10597)共培育，並評估STAT5報導活性。誘導倍數值和EC ₅₀分別歸納在表8和表9中。

與IL2相比，非靶向IL2Rα-IL2展現出對STAT5報導子活性的誘導降低，而與IL2Rα表現無關。與非靶向IL2Rα-IL2相比，PD1靶向分子表現出效力增加，而與IL2Rα表現無關。此外，當PD1在報導細胞上過度表現時，抗PD1-IL2Rα-IL2效力進一步增加到與IL2相似的效力。 PD-1競爭分析：

使用STAT5報導生物分析來評估PD1二價mAb干擾抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體的能力。過度表現IL2Rα或缺乏IL2Rα表現和過度表現PD1的YT/STAT5-Luc報導細胞與500nM同型對照或抗PD1二價mAb(REGN2810、Comp 1或Comp 2)一起培育，然後與非靶向IL2Rα-IL2或PD1靶向抗PD1-IL2Rα-IL2構築體(REGN10486、REGN10595或REGN10597)的滴定液一起培育。培育後，評估STAT5報導活性。抗PD1二價mAb與抗PD1-IL2Rα-IL2的競爭會導致抗PD1-IL2Rα-IL2對PD1的靶向喪失，從而導致報導活性降低。EC ₅₀值歸納在表10中。

在二價PD1 mAb不存在的情況下，PD1靶向IL2Rα-IL2 (REGN10486、REGN10595、REGN10597)與非靶向IL2Rα-IL2(REGN9904)相比具有更大的效力。雖然透過將報導細胞與PD1抗體(REGN2810、Comp 1或Comp 2)一起培育會大大降低REGN10486效力，但無論IL2Rα表現如何，對REGN10595和REGN10597效力的影響都是最小的。添加抗PD1(REGN2810、Comp 1或Comp 2)對非靶向IL2Rα-IL2的效力沒有影響。 初代T細胞刺激分析：

在測量IFN-γ細胞介素產生的功能性初代T細胞分析中評估抗PD1-IL2Rα-IL-2提高T細胞刺激的能力。與經絲裂黴素C處理的Raji/CD80 KO/CD86 KO或Raji/CD80 KO/CD86 KO/hPD-L1細胞一起培育的T細胞用固定量的0.5nM抗CD3x抗-CD20雙特異性抗體和同型對照、IL2、抗PD1二價抗體(REGN2810)單獨或與IL2組合、非靶向IL2Rα-IL2或抗PD1-IL2Rα-IL2(REGN10486、REGN10595或REGN10597)的滴定液處理。T細胞與Raji細胞共培育4天會導致可測量到IFN-γ釋放。在Raji/CD80 KO/CD86 KO細胞存在的情況下，用抗PD1-IL2Rα-IL2、IL2或IL2與REGN2810組合處理T細胞會導致相似程度的IFNγ釋放，而非靶向IL2Rα-IL2、同型對照抗體和REGN2810則導致較低程度的IFNγ釋放。在表現hPD-L1的Raji/CD80 KO/CD86 KO細胞存在的情況下，與不表現PD-L1的RAJI細胞相比，經同型對照處理的樣品中的整體IFNy釋放減少。與同型對照相比，用非靶向IL2Ra-IL2和REGN2810處理會導致IFNy釋放有類似的增加，而用IL2、REGN10597和REGN10595處理則導致更大的反應。就REGN10486或IL2與REGN2810的組合來說，觀察到了最大的反應。表11歸納了抗體劑量範圍內的EC ₅₀與最大干擾素釋放值。 表7. 藉由PD1拮抗分析所測定，抗PD1與抗PD1-IL2Rα-IL2構築體的EC ₅₀與誘導倍數值

	誘導倍數*	EC 50(M)
同型對照1	1.126	ND
同型對照2	1.202	ND
非靶向IL2Rα-IL2	1.076	ND
REGN2810	19.210	3.668E-09
REGN10486	17.740	5.351E-09
H4H29512	1.286	ND
REGN10595	2.725	1.266E-08
H4H9048	1.237	ND
REGN10597	3.038	1.264E-08

ND：未測定，因為未觀察到濃度依賴性反應。 *誘導倍數是相對於抗體不存在時的平均RLU，測試劑量範圍內的最高平均RLU值。 表8. 藉由IL2受體分析所測定，IL2-Fc、非靶向IL2Rα-IL2與抗PD1-IL2Rα-IL2構築體的誘導倍數

	同型對照	非靶向IL2Rα-IL2	IL2-Fc	REGN10486	REGN10595	REGN10597
YT/Stat5-Luc	1.072	3.206	4.955	3.426	3.254	3.295
YT/Stat5-Luc/IL2Rα KO	1.118	2.622	5.397	3.093	2.834	2.851
YT/Stat5-Luc/hIL2Rα	1.074	4.868	5.485	5.080	5.016	5.187
YT/Stat5-Luc/hPD1	1.082	4.521	7.967	5.605	6.638	6.393
YT/Stat5-Luc/IL2Rα KO/hPD1	1.061	2.586	3.870	3.347	3.612	3.538
YT/Stat5-Luc/hIL2Rα/ hPD1	1.000	2.770	3.060	2.714	3.013	2.879

*誘導倍數是相對於抗體不存在時的平均RLU，測試劑量範圍內的最高平均RLU值。 表9. 藉由IL2受體分析所測定，IL2-Fc、非靶向IL2Rα-IL2與抗PD1-IL2Rα-IL2構築體的EC ₅₀

	同型對照	非靶向IL2Rα-IL2	IL2-Fc	REGN10486	REGN10595	REGN10597
YT/Stat5-Luc	ND	NC	4.023E-10	NC	NC	NC
YT/Stat5-Luc/IL2Rα KO	ND	NC	1.327E-09	NC	NC	NC
YT/Stat5-Luc/hIL2Rα	ND	1.631E-09	2.415E-11	7.524E-10	8.87E-10	8.482E-10
YT/Stat5-Luc/hPD1	ND	NC	3.918E-10	1.702E-10	2.193E-10	1.749E-10
YT/Stat5-Luc/IL2Rα KO/hPD1	ND	NC	4.423E-10	1.948E-10	1.865E-10	1.913E-10
YT/Stat5-Luc/hIL2Rα/hPD1	ND	9.714E-10	2.316E-11	1.668E-11	5.777E-11	3.533E-11

NC：未計算，因為數據並未擬合4參數邏輯方程式。 ND：未測定，因為未觀察到濃度依賴性反應。 表10. 在抗PD1抗體或同型對照存在下，非靶向IL2Rα-IL2與抗PD1-IL2Rα-IL2構築體的EC ₅₀值

		-	同型對照	REGN2810	Comp 1	Comp 2
非靶向IL2Rα-IL2	YT/STAT5-Luc/IL2Rα KO/hPD1	NC	NC	NC	NC	NC
YT/STAT5-Luc/hIL2Rα/hPD1	7.033E-10	7.906E-10	6.506E-10	9.182E-10	9.376E-10
REG10486	YT/STAT5-Luc/IL2Rα KO/hPD1	9.388E-11	1.295E-10	NC	NC	NC
YT/STAT5-Luc/hIL2Rα/hPD1	1.499E-11	2.018E-11	5.860E-10	6.927E-10	4.531E-10
REGN10595	YT/STAT5-Luc/IL2Rα KO/hPD1	2.499E-10	3.623E-10	4.550E-10	3.480E-10	2.941E-10
YT/STAT5-Luc/hIL2Rα/hPD1	5.300E-11	6.223E-11	1.375E-10	1.335E-10	1.531E-10
REGN10597	YT/STAT5-Luc/IL2Rα KO/hPD1	1.285E-10	1.317E-10	2.216E-10	3.058E-10	2.807E-10
YT/STAT5-Luc/hIL2Rα/hPD1	5.448E-11	7.094E-11	1.172E-10	7.649E-11	8.046E-11

NC：未計算，因為數據並未擬合4參數邏輯方程式。 表11. 經IL2、抗PD1或抗PD1-IL2Rα-IL2構築體處理的初代T細胞的EC ₅₀與最大IFNγ釋放值

	最大IFNγ (pg/mL)	EC 50(M)
	Raji/ CD80 KO/ CD86 KO	Raji/ CD80 KO/ CD86 KO/ hPD-L1	Raji /CD80 KO/ CD86 KO	Raji/CD80 KO/ CD86 KO/ hPD-L1
同型對照1	1512	386	ND	ND
同型對照 2	1563	343	ND	ND
非靶向IL2Rα-IL2	1687	859	7.325E-09	NC
REGN10486	2306	1687	NC	1.457E-09
REGN10595	2108	1157	1.096E-09	2.047E-09
REGN10597	2484	1261	4.798E-10	1.839E-09
IL2	2544	1081	4.914E-10	2.660E-10
REGN2810	1172	858	ND	1.833E-09
IL2 + REGN2810	2500	1868	3.148E-10	2.016E-10

NC：未計算，因為數據並未擬合4參數邏輯方程式。 ND：未測定，因為未觀察到濃度依賴性反應。 實例6：在PD1xLAG3人源化小鼠體內的活體內抗腫瘤效力評估 研究#1：

在第0天將人類PD1 x LAG3嵌入小鼠(如Burova E. et al., Mol Cancer Ther 2019 (18) (11)2051-2062中所述)皮下接種3x10 ⁵個MC38腫瘤細胞，並在第7天當平均腫瘤大小達到95mm ³時進行隨機分組。然後小鼠每半週一次用同型對照Ab(0.33mg/kg)、同型-IL2Rα-IL2(0.5mg/kg) + 抗hPD1抗體(0.33mg/kg)或抗hPD1-IL2Rα-IL2(0.5mg/kg) + 同型對照Ab(0.33mg/kg)進行腹膜內治療，共計注射4次。繪製各治療組中的平均腫瘤體積(mm ³+ SEM) (圖1A)。腫瘤大小計算為v=ab^2/2，其中a表示最長腫瘤直徑，b是垂直腫瘤直徑。圖1A中的箭頭表示治療天數。

還繪製了各治療組的卡普蘭-邁爾(Kaplan-Meier)存活曲線(圖1B)。當腫瘤表現出嚴重潰瘍或當腫瘤在任何維度上達到20mm或總體積達到2250mm ³時，失去存活被定義為安樂死。 研究#2：

在第0天將人類PD1 x LAG3嵌入小鼠皮下接種3x10 ⁵個MC38腫瘤細胞，並在第7天當平均腫瘤大小達到105mm ³時進行隨機分組。然後小鼠每半週一次用同型(0.5mg/kg)或三種不同純系的抗hPD1-IL2Rα-IL2(0.5mg/kg)進行腹膜內治療，共計注射4次。顯示各治療組中的平均腫瘤體積(mm ³+ SEM) (圖1C)。腫瘤大小計算為v=ab^2/2，其中a表示最長腫瘤直徑，b是垂直腫瘤直徑。圖中的箭頭表示治療天數。

還繪製了各治療組中的卡普蘭-邁爾存活曲線(圖1D)。當腫瘤表現出嚴重潰瘍或當腫瘤在任何維度上達到20mm或總體積達到2250mm ³時，失去存活被定義為安樂死。 結果歸納和結論

在研究#1中，與抗-hPD1-IL2Rα-IL2的兩個單獨組分、同型-IL2Rα-IL2和等莫耳親本抗-hPD1阻斷抗體的組合進行比較，評估抗-hPD1-IL2Rα-IL2的抗腫瘤功效。

雖然同型-IL2Rα-IL2 + 抗hPD1在測試劑量下無法提供有效的腫瘤控制，但相同莫耳劑量的抗hPD1-IL2Rα-IL2 + 同型治療能夠使已確立的腫瘤消退，導致大多數受治療小鼠的長期無腫瘤存活(圖1A-B)。這個結果證實抗hPD1靶向IL2Rα-IL2的抗腫瘤功效優於非靶向IL2Rα-IL2和親本抗hPD1抗體的組合。

在研究#2中，比較三種不同純系的抗hPD1-IL2Rα-IL2的抗腫瘤活性。抗hPD1純系中有一個是強力阻斷劑，而另外兩個以最低限度地阻斷hPD1信號傳導。抗-hPD1-IL2Rα-IL2分子的所有三個純系都顯示出相當的強力抗腫瘤功效並導致相似的長期無腫瘤存活率(圖1C-D)。這個結果表明IL2Rα-IL2的抗hPD1靶向遞送主要負責抗hPD1-IL2Rα-IL2療法的強大抗腫瘤作用而不是其阻斷活性。它還表明了將抗hPD1-IL2Rα-IL2分子與非競爭性PD1阻斷試劑結合會進一步加強其治療功效的潛力。 實例7：抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體在溶液中結合重組單體IL2Rα、IL2Rβ或IL2Rγ蛋白的能力 人類IL2受體α結合

使用即時表面電漿共振生物感測器技術，利用Biacore S-200儀器來測定C端表現有六組胺酸標籤的人類IL2Rα(hIL2Rα.6H, R&D, Catalog # 10305-RL-050)與帶有C端IL2Rα-IL2融合物之經純化抗PD-1抗體的結合。為了製備hIgG捕獲表面，CM5 Biacore感測器表面藉由與單株抗人類Fab抗體的混合物(Cytiva, catalog # 28-9583-25)胺偶合予以衍生化。所有Biacore結合研究均在25℃下於由0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA和0.05% v/v表面活性劑P20組成的緩衝液(HBS-EP運行緩衝液)中進行。抗PD1-IL2Rα-IL2構築體與對照藉由以8 µL/min注射3 µg/mL溶液歷時1分鐘而被捕獲到這個抗hFab表面上。然後將在HBS-EP運行緩衝液中製備的1 µM hIL2Rα.6H溶液以50 µL/分鐘的流速注射到捕獲有抗體IL2融合物融合構築體的捕獲表面上。監測IL2融合抗體締合歷時1分鐘，然後是在HBS-EP運行緩衝液中的1分鐘解離期。在每次注射結束時測量結合反應並呈現於表12中。在每個循環結束時，使用30秒注射10mM甘胺酸pH 1.5使抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體捕獲表面再生。 人類IL2受體β/γ結合

使用即時表面電漿共振生物感測器技術，在Biacore S-200儀器上測定C端表現有myc-myc-六組胺酸標籤的人類IL2受體β(IL2Rβ) (hIL2Rβ.mmH, REGN9169)與C端表現有myc-myc-六組胺酸標籤的人類IL2受體γ(IL2Rγ) (hIL2Rγ.mmH, REGN1183)與抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體的結合。CM5 Biacore感測器表面藉由與單株抗人類Fab抗體的混合物(Cytiva, catalog # 28-9583-25)胺偶合予以衍生化。所有Biacore結合研究均在25℃下於由0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v表面活性劑P20組成的緩衝液(HBS-EP運行緩衝液)中進行。在相同緩衝液中製備所有IL2受體組分。抗PD1-IL2Rα-IL2構築體與對照藉由以8 µL/min注射3 µg/mL溶液歷時1分鐘而被捕獲到這個抗hFab表面上。

文獻(Liparoto, et al. Biochemistry. 2002)中有報導，IL2Rγ對IL2具有IL2Rβ或IL2Rα/β依賴性親和力。因此，添加IL2Rβ允許形成可偵測到的三元複合物。設計了一個依序結合實驗來探討在預結合IL2Rβ存在下的IL2Rγ結合。對於抗PD1-IL2Rα-IL2表面，以50 µl/min注射1 µM IL2Rβ.mmH 30秒，然後立即注射1 µM IL2Rβ.mmh和1 µM IL2Rγ.mmH的混合物溶液1分鐘。記錄每次注射結束時的結合信號。結果呈現於表13中。在每個循環結束時，使用pH 1.5的10mM甘胺酸注射30秒來再生抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體捕獲表面。

為了計算抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體的活性，首先根據捕獲的抗PD1-IL2-IL2Rα融合物的量、IL2受體交互作用的化學計量和交互作用蛋白質的分子量計算理論最大信號(TRmax)。然後抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體的活性接而表示為計算的TRmax百分率。此外，然後使用以下等式將TRmax結果的百分率相對於對照抗體(REGN1945和REGN8512)進行標準化：

結果、歸納及結論

與未減弱(僅IL2)的對照相比，抗PD1-IL2-IL2Rα融合構築體證實與hIL2Rα的結合大大降低。

與未減弱(僅IL2)的對照相比，抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體證實與hIL2Rβ結合的能力，其中結合信號部分降低。在結合的hIL2Rβ存在下，與未減弱的IL2對照構築體相比，觀察到hIL2Rγ的少量結合(marginal binding)。 表12. 抗PD1抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體與重組單體IL2Rα蛋白的結合

	IL2Ra
Ab 藥劑	mAb 捕獲 (RU)	1 µM hIL2Rα.6H 結合 (RU)	TRmax (RU)	% TRmax	% 經標準化的活性
REGN10486	275.7	0.9	58.5	1.5	1.3
REGN10595	152.1	2.1	32.0	6.6	6.6
REGN10597	206.7	0.6	43.6	1.4	1.2
REGN8512 (連接至IL2的Ab)	585.6	144.9	151.0	96.0	100.0
同型對照	422.3	0.3	133.3	0.2	0.0

表13：在預結合的IL2Rβ存在下，抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體與重組單體IL2Rβ或IL2Rγ結合的結合

	IL2Rβ	IL2Rγ After IL2Rβ
Ab 藥劑	mAb 捕獲 (RU)	1 µM hIL2Rβ.mmH 結合 (RU)	TRmax (RU)	% TRmax	經標準化的活性 %	1 µM hIL2Rγ.mmH 結合 (RU)	TRmax (RU)	% TRmax	% 經標準化的活性
REGN10486	355.1	13.3	111.5	12.0	46.4	0.8	125.7	0.6	5.5
REGN10595	324.1	15.6	101.7	15.3	61.6	2.2	114.7	1.9	12.6
REGN10597	304.3	16.8	95.5	17.6	71.9	1.4	107.7	1.3	9.3
REGN8512 (連接至IL2的Ab)	1474.0	110.3	462.6	23.8	100.0	90.0	521.7	17.3	100.0
同型對照	611.8	3.2	192.0	1.7	0.0	-0.7	216.5	-0.3	0.0

實例8：藉由FACS結合分析進行特徵鑑定之抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體和親本mAb的細胞結合

為了比較αhPD1-IL2Rα-IL2蛋白與其對應親本抗hPD1抗體的hPD1結合，用FACS洗滌液(PBS+2%FBS)洗滌表現內源性hPD1水平的YT/STAT5 luc/Cl4細胞兩次並以1x10^6個細胞/ml重新懸浮在FACS洗滌液中。然後將細胞(100μl/孔)鋪盤在96孔U底盤中。將細胞離心下來(1200 RPM，5分鐘)並重新懸浮於100 µl/孔的不同抗體稀釋液(以mAb純系ID列出)中。製備抗體滴定液，從20 µg/ml開始，使用FACS洗滌液稀釋6倍。將細胞與抗體在4℃下培育30分鐘。然後使用FACS洗滌液藉由洗滌細胞兩次去除未結合的抗體。然後將細胞重新懸浮於100μl/孔的APC-抗人類Fcγ二級抗體的1：200稀釋液中。將細胞在4℃下培育30分鐘。然後使用FACS洗滌液藉由洗滌細胞兩次去除未結合的抗體。然後將細胞重新懸浮在160μl/孔FACS洗滌液中，並使用BD FACSCanto ^TM流式細胞儀運行以測試結合。

抗-hPD1-IL2Rα-IL2蛋白及其對應抗-hPD1親本抗體與PD1+細胞的結合是相當的(圖2A、2B)。抗hPD1-IL2Rα-IL2蛋白結合的親和力證實比對應親本mAb略低(~2x)。 實例9：抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體的Fab交換和原生質譜(MS)分析

Fab交換和原生質譜(MS)分析用於確定PD-1-IL2Ra-IL2融合分子的構形。REGN10597、REGN8509、REGN2810和REGN475分別在45℃下用肽N-糖苷酶F(PNGase F；每10 µg蛋白質1 IUB毫單位)處理1小時，以完全去除每個重鏈恆定區的聚醣鏈。然後根據圖3A與下表14混合去醣基化的蛋白質樣品，且每種混合物在37℃下於2 mM DTT存在下培育30分鐘。然後在天然LC-MS平台(參見臨時專利案#10724)對經處理的蛋白質混合物進行與質譜聯用的天然脫鹽尺寸排阻層析(SEC-MS)分析。脫鹽SEC在BEH® SEC管柱(4.6 × 30 mm，200Å，1.7 µm)上使用150 mM乙酸銨(pH 6.8)等度流以0.2 mL/min的流速進行。在Thermo Q-Exactive UHMR質譜儀上進行質量測量。 表14. 用於Fab交換和原生MS分析的REGN10597、REGN8509、REGN2810、和REGN475混合

	組分	混合物比率 (莫耳比率)	最終蛋白質濃度
混合物1	REGN2810	REGN475	1:1	5 mg/mL
混合物2	REGN8509	REGN475	1:1	5 mg/mL
混合物3	REGN10597	REGN475	1:1	5 mg/mL

在鉸鏈區二硫鍵斷裂的情況下，IgG4分子經歷快速的Fab交換，其產物可以透過原生MS分析進行監測。使用兩種IgG4抗體的混合物(混合物1)或一種IgG4抗體 + 抗-hCD20-IL2的混合物(混合物2)的對照實驗展現出在部分還原條件下有Fab交換以及在FabRICATOR消化條件下有Fc交換(圖3B)。在部分還原或FabRICATOR消化條件下，PD1-IL2Rα-IL2 + IgG4分子的混合物(混合物3)分別未觀察到Fab或Fc交換產物，表明PD1-IL2Rα-IL2分子主要以不活化形式存在，其中IL2Rα和IL2之間的強烈鏈間交互作用會阻止Fab(或Fc)交換(圖3B)。總之，Fab交換和原生MS分析表明抗PD1-IL2Rα-IL2分子主要以反式螯合構形存在。 實例10：如藉由混合淋巴細胞反應(MLR)分析所評估，抗PD1-IL2Rα-IL2構築體提高人類初代T細胞活化的能力

使用混合淋巴細胞反應(MLR)分析來評估抗PD1-IL2Ra-IL2構築體提高人類初代T細胞活化的能力。同種異體捐贈者PBMC將刺激T細胞，導致它們增生並釋放細胞介素。添加重組IL-2可以進一步維持T細胞活化。因此，這個分析用於評估PD1靶向IL2Ra-IL2如何影響T細胞增生和IFNg釋放，其充作為T細胞活化的指標。 人類初代細胞的分離

使用EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit並遵循製造商推薦的方案，從獲自Precision for Medicine(捐贈者1)或Stem Cell Technologies(捐贈者2)的2名健康捐贈者周邊血液的白血球濃厚液分離人類PBMC。使用StemCell Technologies的EasySepTM Human CD3+T Cell Isolation Kit並遵循製造商推薦的說明書從PBMC分離來自捐贈者2的CD3+ T細胞。 分析程序：

將經分離的捐贈者2 CD3+ T細胞以1 x 10^6個細胞/ml的濃度重新懸浮於初代培養基(X Vivo 15培養基，補充有10% FBS、10mM HEPES、1mM丙酮酸鈉、1X非必需胺基酸和0.01 mM β-巰基乙醇)。捐贈者1 PBMC(10 x 10^6個細胞/ml)在37℃/5% CO ₂下用經稀釋於初代培養基中的50ug/mL絲裂黴素C處理1小時(以阻止細胞生長)。用初代培養基洗滌3次後，將PBMC重新懸浮並添加到捐贈者2 T細胞中，使T細胞與PBMC的最終比率為1：3 (1x10^6個T細胞 + 3x10^6個PBMC/ml)。將CD3+ T細胞/PBMC混合物培育6天後，遵循製造商的說明書使用Miltenyi CD3+ Microbeads重新分離T細胞。隨後，經分離的細胞在初代細胞培養基中靜置24小時。將100,000個T細胞添加到圓底微量滴定盤的孔中，並以300,000個細胞/孔將新鮮的經絲裂黴素C處理的捐贈者1 PBMC添加到孔中。以1：6在9點稀釋中滴定抗PD1-IL2Rα-IL2(REGN10597、REGN10595或REGN10486)、同型IL2Rα-IL2對照(REGN9903)、抗PD1(REGN2810)、重組IL2或匹配的IgG4和IgG4同型對照(分別為REGN1945和REGN7540)，範圍從1000nM 到0.595pM，最後第10個點不含抗體(由曲線上的最低點表示)。每個條件進行三重複。在37℃/5% CO ₂下培育72小時後，將微量滴定盤離心以沉澱細胞，並收集50 μl培養基上清液。從收集的上清液中，根據製造商的方案在人類IFNγ AlphaLISA (PerkinElmer)分析中測試5 µl。測量是在多標籤讀盤儀Envision (PerkinElmer)上進行擷取。將沉澱的細胞重新懸浮在含有3H-胸苷(1.25mCi/ml)的初代刺激培養基中，並在37℃/5% CO ₂下培育6小時。使用Filtermate Cell Harvester (PerkinElmer)處理盤並使用MicroBeta2 Microplate計數器(PerkinElmer)進行測量。將值記錄為計數/分鐘(CPM)。抗體的EC ₅₀值是使用GraphPad PrismTM軟體在10點劑量反應曲線內從四參數邏輯方程式確定。

在同種異體PBMC存在的情況下，用重組IL-2、抗PD-1-IL2Rα-IL2(REGN10597、REGN10595、REGN10486)或同型IL2Rα-IL2對照(REGN9903)的劑量滴定液處理的T細胞導致IFNγ釋放和增生有劑量依賴性增加(圖4A、4B和表15)。重組IL2導致最高的最大細胞介素釋放和最多的有效增生，其次是抗PD1-IL2Rα-IL2分子。與PD-1靶向相比，同型靶向IL2Rα-IL2對細胞介素釋放和增生展現出的效力降低。REGN2810僅導致IFNγ的輕微劑量依賴性增加，而匹配的IgG4和IgG4同型對照(分別為REGN1945和REGN7540)不影響細胞介素釋放或增生。 表15. IFNγ釋放和增生的最大值和EC ₅₀值

抗體	IFNγ釋放	增生
最大[pg/mL]	EC 50[M]	最大[CPM]	EC 50[M]
REGN10486	1709.7	4.44E-09	22558	1.3E-10
REGN10595	1395.2	1.27E-09	25376	6.1E-11
REGN10597	1534.0	9.53E-09	26602	1.8E-10
REGN9903	1268.0	1.53E-08	21951	4.88E-10
REGN2810	158.3	NC	4671	ND
REGN1945	2.4	ND	4342	ND
rhIL-2	5552.6	NC	20711	NC
REGN7540	6.2	ND	5702	ND

縮寫：ND：未測定，因為未觀察到濃度依賴性增加；NC：未計算，因為數據未擬合4參數邏輯方程式。 實例11：在基於Raji的初代T細胞刺激分析中，抗PD1-IL2Rα-IL2和同型對照-IL2Rα-IL2 + 抗PD1構築體的比較

使用基於Raji細胞的初代T細胞分析來評估抗PD1-IL2Rα-IL2構築體提高人類初代T細胞活化的能力。在CD3xCD20雙特異性抗體存在的情況下，藉由與CD80和CD86剔除且過度表現人類PD-L1的Raji細胞(Raji/CD80 KO/CD86 KO/hPD-L1)共培養來刺激T細胞，從而使得T細胞釋放細胞介素。添加重組IL-2可以進一步支持T細胞活化。因此，這個分析用於評估PD1靶向IL2Rα-IL2如何影響T細胞釋放IFNγ，其充當為T細胞活化的指標。 人類初代細胞的分離： 使用EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit並遵循製造商推薦的方案，從獲自Precision for Medicine的健康捐贈者周邊血液的白血球濃厚液分離人類PBMC。使用StemCell Technologies的EasySepTM Human CD3+T Cell Isolation Kit並遵循製造商推薦的說明書從PBMC分離CD3+ T細胞 基於Raji的T細胞分析程序：

T細胞被離心下來，重新懸浮於刺激培養基(X Vivo 15培養基，補充有10% FBS、10mM HEPES、1mM丙酮酸鈉、1X非必需胺基酸和0.01 mM β-巰基乙醇)且將1x10 ⁵個細胞/孔鋪盤在96孔圓底盤中。Raji/CD80 KO/CD86 KO/hPD-L1細胞(1x10 ⁷個細胞/ml)在37℃/5% CO ₂下用稀釋於刺激培養基中的20 mg/ml絲裂黴素C處理1小時，以阻止細胞生長。然後用含有2% FBS的D-PBS洗滌細胞3次，重新懸浮於刺激培養基中，且每孔加入5x10 ⁴個細胞。隨後，添加0.5nM抗CD3 x 抗CD20雙特異性抗體(REGN1979)，以及20nM固定同型對照(REGN1945)或抗PD1(REGN2810)。同型對照(REGN7540)、同型-IL2Rα-IL2抗體(REGN9903)、具有mAb9048之VR的抗PD1抗體(REGN15187)、抗PD1-IL2Rα-IL2(REGN10597)或等莫耳REGN9903 + REGN15187滴定液以9點、1：6連續稀釋的方式添加到孔中，範圍為每分子500nM至0.3pM，其中第10個稀釋點僅含有0.5nM固定的REGN1979和20nM REGN2810或REGN1945。每個條件進行二重複。將盤在37℃/5% CO ₂下培育96小時。根據製造商的方案，使用AlphaLISA分析對細胞培養上清液中的IFNγ進行量化。在多標籤讀盤儀Envision (Perkin Elmer)上擷取測量結果。細胞介素的EC ₅₀值是使用GraphPad Prism ^TM軟體在10點劑量反應曲線內從四參數邏輯方程式確定，其中第10個稀釋點僅含有0.5nM固定的REGN1979和20nM REGN2810或REGN1945。 結果歸納

在Raji/CD80 KO/CD86 KO/hPDL1存在的情況下，於REGN2810存在或不存在的情況下，用同型-IL2Rα-IL2(REGN9903)或抗PD1-IL2Rα-IL2 (REGN10597)的劑量滴定液處理的T細胞導致到IFNγ釋放有出乎意料的顯著劑量依賴性增加(表16和圖5A、5B)。抗PD1-IL2Rα-IL2分子導致最高的最大細胞介素釋放，其次是同型IL2Rα-IL2分子單獨或與抗PD1抗體REGN15187組合。匹配的IgG4和IgG4同型對照(分別為REGN1945和REGN7540)並未影響IFNγ釋放。 表16. IFNγ釋放的最大值

	最大IFNγ釋放[pg/mL]
	恆定 - 20nM REGN1945	恆定 - 20nM REGN2810
REGN7540	5.1	75.0
REGN9903	46.9	110.6
REGN15187	17.0	79.5
REGN9903 + REGN15187	47.6	140.0
REGN10597	133.0	258.5

實例12：抗-PD1-IL2Rα-IL2融合構築體的活體內抗腫瘤功效和安全性概況

在第一個實驗中，評估單一藥劑REGN10597的活體內抗腫瘤功效。在第0天將人類PD1 x LAG3嵌入小鼠(描述於Burova E. et al., 2019中)皮下接種3x10 ⁵個MC38腫瘤細胞，並在第7天當平均腫瘤大小達到105mm ³時進行隨機分組。每個隨機分組組別中的小鼠每半週腹膜內注射而接受特定劑量含量的指定分子，共計注射四次。繪製各治療組中的平均腫瘤體積(mm ³+ SD) (圖6A)。腫瘤大小計算為v=ab^2/2，其中a表示最長腫瘤直徑，b是垂直腫瘤直徑。圖中的箭頭表示治療天數。顯示各治療組中經歷完全腫瘤排斥的小鼠的個別腫瘤生長曲線和頻率(圖6B)。

呈0.5或1 mg/kg劑量含量的REGN10597單藥療法證實抗腫瘤活性優於1 mg/kg REGN9904和10 mg/kg REGN2810的組合，導致受治療小鼠的腫瘤完全消退頻率更高。用0.2 mg/kg REGN10597治療也觀察到中等的抗腫瘤功效(圖6A、6B)。

在第二個實驗中，將REGN10597的活體內活性和毒性概況與比較物REGN13233(一種抗PD1靶向IL2突變蛋白，消除了與IL2Ra的結合)進行比較。在第0天將人類PD1 x LAG3嵌入小鼠(描述於Burova E. et al., 2019中)皮下接種3x10 ⁵個MC38腫瘤細胞 ，並在第7天當平均腫瘤大小達到70mm ³時進行隨機分組。每個隨機分組組別中的小鼠每半週腹膜內注射而接受特定劑量含量的指定分子，共計注射四次。繪製各治療組中的平均腫瘤體積(mm ³+ SD) (圖6C)、卡普蘭-邁爾存活曲線(圖6D)，和體重變化百分率(平均值+SD) (圖6E)。圖6A中的箭頭表示治療天數。在(圖6D)中指示選定組別經歷完全腫瘤排斥的小鼠的頻率。在第13天，收集所有組別的血液並藉由流動式細胞測量儀進行分析。顯示了總白血球的計數(圖6F)。

REGN10597和REGN13233單藥療法均證實抗腫瘤功效優於REGN2810與其對應非靶向對照(REGN10597為REGN9904，REGN13233為REGN13234)的組合，並且在兩個組別的大多數受治療小鼠中都證實完全腫瘤消退(圖6C、6D)。

然而，與REGN10597不同(其在受治療小鼠中沒有引起明顯的體重變化)，相同劑量的REGN13233治療導致顯著的體重減輕，伴隨著循環淋巴細胞顯著增加(圖6E)。這個在毒性方面的差異可能歸因於REGN10597和REGN13233中有不同的IL-2部分，因為在經REGN13234治療的組別中觀察到相似的體重減輕和白血球計數增加(圖6E、6F)。藉由多參數流動式細胞測量術對白血球的進一步免疫表型分析顯示，REGN10597更選擇性地擴增PD-1 ⁺CD4和CD8 T細胞，而REGN13233不僅擴增了那些細胞，還大量擴增了CD44 ⁺CD62L ⁺CD8 T細胞群和NK細胞群。

這些結果表明，儘管REGN10597和比較物分子REGN13233均顯示出強大的抗腫瘤功效，但REGN10597具有更好的安全性概況，這可能是由於與REGN13233相比，REGN10597能夠在活體內更為選擇性地擴增PD1 ⁺T細胞，而REGN13233擴增更廣泛的CD8 ⁺T細胞群和NK細胞群。

在第三個實驗中，將REGN10597的活體內抗腫瘤功效與aPD1-IL2-IL2Rα的活體內抗腫瘤功效進行比較，aPD1-IL2-IL2Rα是一種含有與REGN10597相同部分的分子，但IL2和IL2Rα部分以相反的順序彼此融合。在第0天將人類PD1 x LAG3嵌入小鼠(描述於Burova E. et al., 2019中)皮下接種3x10 ⁵個MC38腫瘤細胞，並在第9天當平均腫瘤大小達到120mm ³時進行隨機分組。然後每個組別中的小鼠每週腹膜內注射而接受特定劑量含量的指定分子，共計注射兩次。(圖6G)。繪製各治療組中的平均腫瘤體積(mm ³+ SEM)。腫瘤大小計算為v=ab^2/2，其中a表示最長腫瘤直徑，b是垂直腫瘤直徑。圖中的箭頭表示治療天數(圖6H)。還顯示了各治療組的卡普蘭-邁爾存活曲線。當腫瘤表現出嚴重潰瘍或當腫瘤在任何維度上達到20mm或總體積達到2250mm ³時，失去存活被定義為安樂死。針對選定組別顯示了經歷完全腫瘤排斥的小鼠的頻率。

與在活體內展現出強大抗腫瘤活性的REGN10597不同，相同或更高劑量的aPD1-IL2-IL2Rα顯示最小的腫瘤生長控制。這個結果表明，REGN10597中IL2Rα-IL2融合物的正確順序對其活體內的有效抗腫瘤活性至關重要(圖6G、6H)。 實例13：Ab-IL2Ra-IL2融合分子與IL2受體的流動結合

功能性IL2受體由IL2R次單位(IL2Ra = CD25、IL2Rb = CD122和IL2Rg = CD132)的差異組裝所形成，導致在免疫細胞(PMID：16293754)上表現中等親和力IL受體(IL2Rb/IL2Rg)以及高親和力IL2受體(IL2Ra/IL2Rb/IL2Rg)。使用流動式細胞測量術評估IL2和IL2Ra-IL2嵌合抗體結合表現中等親和力IL2受體(IL2Rb/g，剔除IL2Ra)或高親和力受體(IL2Rb/g，且過度表現IL2Ra)的細胞的能力。

當YT細胞內源性表現人類PD1時，生成了過度表現PD-1的細胞(Over-Expressing PD-1 cells, PD1 OE) 。為了測試人類IL2和人類IL2Ra-IL2嵌合抗體(=一級抗體)與細胞的結合，對內源性表現所有三個IL2受體次單位的YT/STAT5-Luc/PD1 OE報導細胞進行了遺傳修飾，以展現透過剔除IL2Ra次單位(Knocking Out the IL2Ra subunit, CD25 KO)所得的中等親和力IL2受體或透過在細胞表面過度表現IL2Ra(Over-Expressing IL2Ra, CD25 OE)所得的高親和力受體。使用標記螢光的二級抗體藉由流動式細胞測量術偵測抗體與這些細胞的結合。簡而言之，將CD25 KO或CD25 OE的PD1 OE YT細胞重新懸浮於染色緩衝液(PBS中的2% FBS)中，將每孔3x10 ⁵個細胞接種到96孔盤中，並在冰上與以1：5連續稀釋的一級抗體[同型-IL2(REGN8512)或同型-IL2Ra-IL2(REGN9904)]一起培育30分鐘。最終抗體濃度範圍為768 fM至300 nM，包括標記為「僅二級」的無抗體對照。培育後，用冰冷的染色緩衝液洗滌樣品，然後在冰上與經AF647標記的抗人類IgG抗體一起培育30分鐘。去除未結合的二級抗體，樣品用冰冷的PBS洗滌一次、用活力染料予以染色、用冰冷的染色緩衝液洗滌一次、在室溫下固定30分鐘、在染色緩衝液中洗滌、重新懸浮於染色緩衝液中，並且在iQue Plus流動式細胞測量儀上進行分析以捕獲幾何平均螢光強度(gMFI)之前進行過濾。以下等式來計算僅對二級的最大倍數結合：

結果的歸納

表17歸納了結合至剔除或過度表現CD25之細胞的抗體-IL2或抗體-IL2Ra-IL2嵌合構築體的最大幾何MFI和誘導倍數值。在表現中等親和力IL2Rβ/γ受體(CD25 KO)或高親和力IL2Rα/β/γ受體(CD25 OE)的工程改造YT細胞觀察到同型IL2分子(REGN8512)與同型IL2Ra-IL2分子(REGN9904)有劑量依賴性結合(圖7A、7B；表17)。一如預期，兩個構築體對CD25 OE細胞的最大結合倍數更高。然而，與Ab-IL2相比，Ab-IL2Ra-IL2對表現IL2Rα/β/γ-和IL2Rβ/γ的細胞株的結合大大降低，表明因為融合蛋白中存在IL2Ra而「掩蔽」了IL-2。 表17：IL2流動結合分析-最大gMFI與誘導倍數值的歸納

	測試物	最大gMFI	誘導倍數*
CD25 KO /PD1 OE	同型-IL2 [REGN8512]	7.18E+04	31.2
同型-IL2Ra-IL2 [REGN9904]	3.99E+03	1.704
CD25 OE /PD1 OE	同型-IL2 [REGN8512]	3.33E+06	1341
同型-IL2Ra-IL2 [REG9904]	7.76E+04	33.11

*誘導倍數定義為相對於抗體不存在時的gMFI，測試劑量範圍內的最高gMFI值。 實例14：評估PD1-IL2R2-IL2分子效力的生物分析

功能性IL2受體由IL2R次單位(IL2Ra = CD25、IL2Rb = CD122和IL2Rg = CD132)的差異組裝所形成，導致在免疫細胞(PMID：16293754)上表現中等親和力IL受體(IL2Rβ/γ)以及高親和力IL2受體(IL2Rα/β/γ)。

為了評估IL2或IL2Ra-IL2或IL-2-IL2Ra嵌合抗體的生物活性，建立了基於細胞的報導分析，導致在IL2與經工程改造之YT/STAT5-Luc上的中等親和力或高親和力IL2受體結合後活化受到STAT5所驅動的螢光素酶表現。當YT細胞表現內源性人類PD1時，生成了過度表現PD-1的細胞(PD1 OE)。對內源性表現所有三個IL2受體次單位的YT/STAT5-Luc/PD1 OE報導細胞進行了遺傳修飾，以展現透過剔除IL2Ra次單位(CD25 KO)所得的中等親和力IL2受體或透過在細胞表面過度表現IL2Ra(CD25 OE)所得的高親和力受體。

補充有10% FBS和P/S/G的RPMI1640用作為分析培養基以製備細胞懸浮液和抗體稀釋液。篩選前一天，以3 x 10 ⁵個細胞/mL稀釋經工程改造的YT/STAT5-Luc報導細胞(CD25 KO/PD1 OE和CD25 OE/PD1 OE)。在分析當天，將細胞離心下來，重新懸浮在分析培養基中，並以2.5 x 10 ⁴個報導細胞/孔鋪盤在96孔白色平底盤中，並與在11點滴定範圍(200nM至21 fM)內經連續稀釋(1：5) (圖1A、1B、1C、1D)或與在11點滴定範圍(250nM至238 fM)內經連續稀釋(1：4) (圖2A、2B)的同型-IL2Ra-IL2[REGN9903或REGN9904]、同型-IL2-IL2Ra、同型-IL2(3m)[REGN13234]、抗PD1(臂9048)-靶向-IL2Ra-IL2[REGN10597]、抗PD1(臂9048)-靶向-IL2-IL2Ra或抗PD1(臂9048)-靶向-IL2(3m)[REGN13233]一起培育，其中第12個點不含重組蛋白。將盤在37℃/5% CO ₂下培育4小時30分鐘(圖1A、1B、1C、1D)或4小時(圖2A、2B)，接著將100mL ONE-Glo™ (Promega)試劑添加到孔以溶解細胞並偵測螢光素酶活性。在多標籤讀盤儀Envision (PerkinElmer)上以RLU測量發射的光。抗體的EC ₅₀值是使用GraphPad Prism ^TM軟體在12點劑量反應曲線內從四參數邏輯方程式確定。使用以下等式計算誘導倍數：

結果的歸納

同型IL2Ra-IL2(REGN9903)、同型-IL2-IL2Ra、抗PD1靶向-IL2Ra-IL2(REGN10597)和抗PD1靶向-IL2-IL2Ra在報導細胞上不存在(圖8A)或存在(圖8A) IL2Ra表現的情況下均會導致受到STAT5驅動的報導子表現的劑量依賴性增加(表18)。與同型靶向分子相比，PD-1靶向分子展現出效力提高。與IL2Ra-IL2嵌合分子相比，IL2-IL2Ra嵌合分子展現出效力降低，無論報導細胞上存在或不存在IL2Ra表現。 表18：Ab-IL2Ra-IL2與Ab-IL2-IL2Ra的IL2報導分析比較 EC ₅₀值與誘導倍數的歸納

	EC50 (M)	最大誘導倍數*
	CD25 KO / PD1 OE	CD25 OE / PD1 OE	CD25 KO / PD1 OE	CD25 OE/ PD1 OE
同型-IL2Ra-IL2 [REGN9903]	NC	3.313E-10	4.37	7.00
aPD1(9048)-IL2Ra-IL2 [REGN10597]	5.781E-11	3.297E-11	5.72	7.36
同型-IL2-IL2Ra	NC	1.408E-09	1.25	7.78
aPD1(9048)-IL2-IL2Ra	2.052E-09	1.748E-10	4.42	7.77

NC：未計算，因為數據並未擬合4參數邏輯方程式。 *誘導倍數是相對於抗體不存在時的平均RLU，測試劑量範圍內的最高平均RLU值。

同型IL2Ra-IL2(REGN9903)、同型-IL2(3m) (REGN13234)、抗PD1靶向-IL2Ra-IL2(REGN10597)和抗PD1靶向-IL2(3m) (REGN13233)在報導細胞上不存在(圖9A)或存在(圖9A) IL2Ra表現的情況下均會導致受到STAT5驅動的報導子表現的劑量依賴性增加(表19)。PD1靶向分子在報導細胞上不存在IL2Ra表現(REGN13233：53pM，REGN10597：84pM)或在報導細胞上存在IL2Ra (REGN13233：46pM，REGN10597：37pM)的情況下展現出相似效力。在PD1靶向不存在的情況下，與IL2(3m)嵌合分子相比，IL2Ra-IL2嵌合分子所展現的效力降低。 表19：Ab-IL2Ra-IL2與Ab-IL2(3m)的IL2報導分析比較 EC ₅₀值與誘導倍數的歸納

	EC50 (M)	最大誘導倍數*
	CD25 KO/ PD1 OE	CD25 OE/ PD1 OE	CD25 KO/ PD1 OE	CD25 OE/ PD1 OE
同型-IL2(3m) [REGN13234]	1.743E-09	3.875E-10	4.25	4.49
同型-IL2Ra-IL2 [REGN9904]	NC	7.687E-10	3.24	4.57
aPD1(9048)-IL2(3m) [REGN13233]	5.317E-11	4.644E-11	4.24	4.62
aPD1(9048)-IL2Ra-IL2 [REGN10597]	8.383E-11	3.706E-11	4.36	5.10

NC：未計算，因為數據並未擬合4參數邏輯方程式。 *誘導倍數是相對於抗體不存在時的平均RLU，測試劑量範圍內的最高平均RLU值。

本揭露的範疇不受本文所述特定具體例所囿限。實際上，根據前面的描述和附圖，除了本文描述的那些之外，本揭露的各種修改對於那些習於技藝者來說將變得顯而易見。此類修改意欲落入隨附申請專利範圍的範疇內。

圖1A、1B、1C和1D是顯示如實例6中所述活體內研究結果的圖。圖1A和1B顯示經同型對照Ab、同型對照-hIL2Rα-IL2+抗PD-1、REGN10486+同型對照Ab治療的小鼠的腫瘤體積(mm ³) (圖1A)和存活百分率(圖1B)。圖1C和1D顯示經同型對照、REGN10486、REGN10595和REGN10597治療的小鼠的腫瘤體積(mm ³) (圖1C)和存活百分率(圖1D)。

圖2A和2B是一組圖，顯示比較抗α-hPD1抗體(「αhPD1」或「ahPD1」)親本抗體和PD1+細胞的結合(圖2A)與抗αhPD1抗體-IL2Rα-IL2融合構築體與PD1+細胞的結合(圖2B)之結果，如實例8中所述。

圖3A和3B顯示與指定抗體混合物相比，抗PD-1-IL2Ra-IL2+hIgG4抗體的混合物的實驗設計(圖3A)和所得原生質譜(圖3B)，如實例9中所述。

圖4A和4B是一組圖，顯示如實例10中所述T細胞回應於抗體或細胞介素滴定液而釋放IFNγ和增生。與T細胞混合的同種異體PBMC用重組IL2、抗-PD-1-IL2Rα-IL2(REGN10597、REGN10595和REGN10486)或同型-IL2Rα-IL2對照(REGN9903)的劑量滴定液處理，並評估IFNγ釋放(圖4A)和增生(圖4B)。

圖5A和5B是一組圖，顯示如實例11中所述於REGN2810不存在(圖5A)或存在(圖5B)的情況下T細胞回應於抗體或細胞介素滴定液的IFNγ釋放。RAJI/CD80 KO/CD86 KO/PDL1細胞與T細胞一起培育，並於REGN2810不存在(圖5A)或存在(圖5B)的情況下用固定劑量的抗CD3xCD20(REGN1979)和同型對照(REGN7540)、同型-IL2Rα-IL2抗體(REGN9903)、帶有mAb9048之可變區的抗PD1抗體(REGN15187)、抗PD1-IL2Rα-IL2(REGN10597)或REGN9903 + REGN15187的組合的劑量滴定液處理。測量IFNγ釋放。

圖6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G和6H是顯示抗PD1-IL2Rα-IL2融合構築體REGN10597在PD1xLAG3人源化小鼠體內的活體內活性評估的圖，如實例12中所述主要與以下比較：非靶向對照REGN9904和PD-1阻斷抗體REGN2810的組合(圖6A和6B)、比較物抗PD1靶向「非α」(3m)分子REGN13233(圖6C、6D、6E和6F)，和含有與REGN10597相同的所有組分但IL2和IL2Rα以相反順序彼此融合的構築體(圖6G和6H)。

圖7A和7B顯示實例13中所述的IL2結合分析的圖。將YT/STAT5-Luc/IL2Ra KO(圖7A)或YT/STAT5-Luc/IL2Ra OE(圖7B)與線性融合至IL2的抗體(REGN8512；有虛線的灰色空心圓圈)或線性融合至IL2Ra和IL2的抗體(REGN9904；有實線的黑色實心圓圈)滴定液一起培育。洗滌細胞，用二級AF647抗人類IgG染色、洗滌、固定，並在iQue Plus流式細胞儀上擷取。

圖8A和8B是顯示Ab-IL2Ra-IL2和Ab-IL2-IL2Ra的IL2報導分析比較的圖，如實例14中所述。YT/STAT5-Luc/IL2Ra KO/hPD1(圖8A)或YT/STAT5-Luc/hIL2Ra/hPD1(圖8B)與非靶向IL2Ra-IL2(帶有黑色虛線的黑色空心圓形符號，REGN9903)、非靶向IL2-IL2Ra(帶有灰色虛線的灰色方形空心符號)、抗-PD1-IL2Ra-IL2(帶有黑色實線的黑色實心圓形符號，REGN10597)，或抗-PD1-IL2-IL2Ra(帶有灰色實線的灰色方形實心符號)的滴定液一起培育。4小時又30分鐘後，藉由發光讀數評估STAT5活性。

圖9A和9B是顯示Ab-IL2Ra-IL2和Ab-IL2(3m)的IL2報導分析比較的圖，如實例14中所述。YT/STAT5-Luc/IL2Ra KO/hPD1(圖9A)或YT/STAT5-Luc/hIL2Ra/hPD1(圖9B)與非靶向IL2Ra-IL2(帶有黑色虛線的黑色空心圓形符號，REGN9904)、非靶向IL2(3m)(帶有灰色虛線的灰色菱形空心符號)、抗-PD1-IL2Ra-IL2(帶有黑色實線的黑色實心圓形符號，REGN10597)，或抗-PD1-IL2(3m) (帶有灰色實線的灰色菱形實線符號)的滴定液一起培育。4小時後，藉由發光讀數評估STAT5活性。

Claims (70)

1. 一種融合蛋白，其包含：(i)特異地結合至人類計畫性細胞死亡蛋白1(PD-1)的抗原結合部分，和(ii)介白素2(IL2)部分。
2. 如請求項1之融合蛋白，其中抗原結合部分包含特異地結合至人類PD-1的抗體或其抗原結合片段。
3. 如請求項2之融合蛋白，其中結合至人類PD-1的抗體或其抗原結合片段是人類單株抗體。
4. 如請求項1至3中任一項之融合蛋白，其中抗原結合部分包含三個重鏈互補決定區(HCDR) (HCDR1、HCDR2和HCDR3)及三個輕鏈CDR (LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中： HCDR1包含SEQ ID NO：43、4或24的胺基酸序列； HCDR2包含SEQ ID NO：45、6或26的胺基酸序列； HCDR3包含SEQ ID NO：47、8或28的胺基酸序列； LCDR1包含SEQ ID NO：12或32的胺基酸序列； LCDR2包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列；以及 LCDR3包含SEQ ID NO：16或35的胺基酸序列。
5. 如請求項4之融合蛋白，其中抗原結合部分包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其包含以下對應胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：43、45、47、12、14、和16；(ii)SEQ ID NO：4、6、8、12、14、和16；或(iii)SEQ ID NO：24、26、28、32、14、和35。
6. 如請求項4或5之融合蛋白，其中抗原結合部分包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其包含SEQ ID NO：43、45、47、12、14、和16的對應胺基酸序列。
7. 如請求項1至6中任一項之融合蛋白，其中抗原結合部分包括重鏈可變區(HCVR)，其包含SEQ ID NO：41、2、或22的胺基酸序列；以及輕鏈可變區(LCVR)，其包含SEQ ID NO：10或30的胺基酸序列。
8. 如請求項7之融合蛋白，其中HCVR包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列而LCVR包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列。
9. 如請求項7之融合蛋白，其中HCVR包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列而LCVR包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列。
10. 如請求項7之融合蛋白，其中HCVR包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列而LCVR包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列。
11. 如請求項1至10中任一項之融合蛋白，其中抗原結合部分包含SEQ ID NO：55的重鏈恆定區以及SEQ ID NO：56的輕鏈恆定區。
12. 如請求項1至11中任一項之融合蛋白，其中抗原結合部分包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：61、57、或59的胺基酸序列，而輕鏈包含SEQ ID NO：62、58、或60的胺基酸序列。
13. 如請求項1至12中任一項之融合蛋白，其中抗原結合部分包含SEQ ID NO：61/62、57/58或59/60的重鏈/輕鏈序列對。
14. 如請求項1至13中任一項之融合蛋白，其中抗原結合部分包含SEQ ID NO：61/62的重鏈/輕鏈序列對。
15. 如請求項1至14中任一項之融合蛋白，其中IL2部分包含(i)IL2或其片段；及(ii)IL2受體α(IL2Rα)或其片段。
16. 如請求項15之融合蛋白，其中IL2或其片段是人類IL2(hIL2)或其片段。
17. 如請求項16之融合蛋白，其中IL2Rα或其片段是人類IL2Rα(hIL2Rα)或其片段。
18. 如請求項15至17中任一項之融合蛋白，其中IL2或其片段包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列。
19. 如請求項15至17中任一項之融合蛋白，其中IL2Rα或其片段包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列。
20. 如請求項15至19中任一項之融合蛋白，其中IL2或其片段經由連接子連接至IL2Rα或其片段的C端。
21. 如請求項1至20中任一項之融合蛋白，其中IL2部分經由連接子連接至抗原結合部分的重鏈恆定區的C端。
22. 如請求項20或21之融合蛋白，其中連接子包含一或多個重複序列GGGGS(SEQ ID NO：67)的胺基酸序列。
23. 如請求項20至22中任一項之融合蛋白，其中連接子包含SEQ ID NO：50或52的胺基酸序列。
24. 如請求項1至23中任一項之融合蛋白，其中IL2部分包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列。
25. 一種融合蛋白，其包含：(i)第一多肽，其包含特異地結合至人類PD-1的人類抗體的輕鏈可變區(LCVR)；以及(ii)第二多肽，其包含(a)特異地結合至人類PD-1的抗體的重鏈可變區(HCVR)和(b)IL2部分。
26. 如請求項25之融合蛋白，其中HCVR包含三個重鏈互補決定區(HCDR) (HCDR1、HCDR2和HCDR3)而LCVR包含三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中： HCDR1包含SEQ ID NO：43、4或24的胺基酸序列； HCDR2包含SEQ ID NO：45、6或26的胺基酸序列； HCDR3包含SEQ ID NO：47、8或28的胺基酸序列； LCDR1包含SEQ ID NO：12或32的胺基酸序列； LCDR2包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列；以及 LCDR3包含SEQ ID NO：16或35的胺基酸序列。
27. 如請求項26之融合蛋白，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含(i)SEQ ID NO：43、45、47、12、14和16；(ii)SEQ ID NO：4、6、8、12、14和16；或(iii)SEQ ID NO：24、26、28、32、14和35的胺基酸序列。
28. 如請求項26或27之融合蛋白，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：43、45、47、12、14和16的胺基酸序列。
29. 如請求項25至28中任一項之融合蛋白，其中HCVR和LCVR包含(i)SEQ NO：41和10；(ii)SEQ ID NO：2和10；或(iii)SEQ ID NO：22和30的胺基酸序列。
30. 如請求項25至29中任一項之融合蛋白，其中第一多肽包含連接至LCVR的輕鏈恆定區。
31. 如請求項30之融合蛋白，其中輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：56的胺基酸序列。
32. 如請求項25至31中任一項之融合蛋白，其中第二多肽包含連接至HCVR的重鏈恆定區，且其中IL2部分連接至重鏈恆定區的C端。
33. 如請求項32之融合蛋白，其中重鏈恆定區包含SEQ ID NO：55的胺基酸序列。
34. 如請求項25至33中任一項之融合蛋白，其中第一多肽包含SEQ ID NO：62、58或60的輕鏈序列。
35. 如請求項25至34中任一項之融合蛋白，其中第二多肽包含SEQ ID NO：61、57或59的重鏈序列。
36. 如請求項25至35中任一項之融合蛋白，其包含SEQ ID NO：61/62、57/58或59/60的重鏈/輕鏈序列對。
37. 如請求項25至36中任一項之融合蛋白，其包含SEQ ID NO：61/62的重鏈/輕鏈序列對。
38. 如請求項25至37中任一項之融合蛋白，其中IL2部分包含(i)IL2或其片段；以及(ii)IL2Rα或其片段。
39. 如請求項25至38中任一項之融合蛋白，其中IL2部分經由連接子連接至重鏈恆定區的C端。
40. 如請求項38或39之融合蛋白，其中IL2或其片段經由連接子連接至IL2Rα或其片段的C端。
41. 如請求項38至40中任一項之融合蛋白，其中IL2或其片段是人類IL2(hIL2)或其片段。
42. 如請求項38至41中任一項之融合蛋白，其中IL2Rα或其片段是人類IL2Rα(hIL2Rα)或其片段。
43. 如請求項38至42中任一項之融合蛋白，其中IL2或其片段包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列。
44. 如請求項38至43中任一項之融合蛋白，其中IL2Rα或其片段包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列。
45. 如請求項40至44中任一項之融合蛋白，其中連接子包含一或多個重複序列GGGGS(SEQ ID NO：67)的胺基酸序列。
46. 如請求項45之融合蛋白，其中連接子包含SEQ ID NO：50或52的胺基酸序列。
47. 如請求項25至46中任一項之融合蛋白，其中IL2部分包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列。
48. 如請求項25至47中任一項之融合蛋白，其中第一多肽包含SEQ ID NO：62、58或60的胺基酸序列。
49. 如請求項25至48中任一項之融合蛋白，其中第二多肽包含SEQ ID NO：63、64或65的胺基酸序列。
50. 如請求項25至49中任一項之融合蛋白，其中第一多肽包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列而第二多肽包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列。
51. 如請求項25至49中任一項之融合蛋白，其中第一多肽包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列而第二多肽包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列。
52. 如請求項25至49中任一項之融合蛋白，其中第一多肽包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列而第二多肽包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列。
53. 如請求項1至52中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白形成二聚融合蛋白。
54. 如請求項1至53中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白透過其各自的重鏈恆定區二聚化。
55. 如請求項1至54中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白不與REGN2810、派姆單抗(pembrolizumab)、或納武單抗(nivolumab)交叉競爭結合至PD-1。
56. 如請求項1至55中任一項之融合蛋白，其中與IL2相比，融合蛋白在活化人類IL2Rα/β/γ和IL2Rβ/γ複合物方面展現出活性降低。
57. 如請求項1至56中任一項之融合蛋白，其中與非靶向IL2Rα-IL2相比，融合蛋白在活化人類IL2Rα方面展現出活性增加。
58. 如請求項1至57中任一項之融合蛋白，其中與野生型人類IL2相比，如藉由IFN-γ釋放程度所測量，融合蛋白在刺激T細胞方面展現出活性增加。
59. 如請求項1至58中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白展現出與IL2Rα、IL2Rβ和IL2Rγ的結合減弱。
60. 一或複數種核酸，其包含編碼如請求項1至59中任一項之融合蛋白的多核苷酸序列。
61. 一種載體，其包含如請求項60之核酸或複數種核酸。
62. 一種宿主細胞，其包含如請求項60之核酸或複數種核酸或如請求項61之載體。
63. 如請求項62之宿主細胞，其表現包含編碼如請求項25至59中任一項之融合蛋白的第一多肽的多核苷酸序列的第一載體，和包含編碼如請求項25至59中任一項之融合蛋白的第二多肽的多核苷酸序列的第二載體。
64. 一種產生如請求項1至59中任一項之融合蛋白的方法，其包含在允許產生融合蛋白或片段的條件下培養如請求項62或63之宿主細胞，並回收由此產生的融合蛋白或其片段。
65. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至59中任一項之融合蛋白。
66. 如請求項65之醫藥組成物，其進一步包含抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
67. 如請求項66之醫藥組成物，其中抗PD-1抗體或其抗原結合片段不與融合蛋白交叉競爭結合至PD-1。
68. 一種治療癌症的方法，其包含向有需要的個體投予治療有效量之如請求項1至59中任一項之融合蛋白或如請求項65至67中任一項之醫藥組成物。
69. 如請求項68之方法，其包含以0.005 mg/kg至10 mg/kg個體體重的量向個體投予融合蛋白。
70. 如請求項68或69之方法，其進一步包含向個體投予第二治療劑或療法。

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