JP6649254B2 - ＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαスシドメインに基づくモジュロカイン - Google Patents

Description

本国際特許出願は、２０１３年８月８日に出願された欧州特許出願第ＥＰ１３００３９６３．９号の優先権を主張し、その出願は参照により本明細書に組み入れられる。

発明の分野
本発明は、本明細書においてモジュロカイン（modulokine）と呼ばれる新たな「イムノサイトカイン」、及び、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を活性化することによる特に癌の処置のための医薬品としてのその使用に関する。

背景
脊椎動物免疫系は、腫瘍に対する最適な免疫応答を達成するために複数の分子性及び細胞性相互作用を必要とする。

現在、宿主の抗腫瘍免疫は主にＴＩＬによって影響を受ける（Galon et al., Science, vol.313, p:1960-1964, 2006）。事実、多くの一連のエビデンスは、ＴＩＬが腫瘍細胞による抑制性調節を受けることを示している。

前記ＴＩＬを「再活性化」するために、複数の戦略及び標的が構想された。これらの戦略は、ｉ）ダウンレギュレーションシグナルを防ぐことによって免疫活性化を促進するための、ＴＩＬ免疫抑制受容体（例えばＣＴＬ−Ａ４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２、ＡＤＯＲＡ２Ａ、又は抑制性ＫＩＲ）の阻害；又はｉｉ）Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の活性化を促進するための、ＴＩＬ共刺激受容体（例えばＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０又はグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ））の刺激のいずれかに基づく。

前記療法がすでにいくつかの有望な結果をもたらしていたとしても、これらの戦略の効力は限られているように思われる。大体の場合、コホートの僅か数％しか回復したＴＩＬ応答を示さない。

増強された効力を得るために、今回、これらの戦略を他の薬物又はモジュレーターと組み合わせることを構想する。

したがって、本発明者らは抗ＰＤ１抗体を用いるこれらの戦略を、特許出願の国際公開公報第２００７／０４６００６号に開示されているモジュレーターと組み合わせることを試みた。

結果は、この組合せが、腎細胞癌（ＲＣＣ）患者から単離されたＴＩＬの有意な割合を回復することができなかった（すなわち約２０％）ことを示した。

発明の要約
今回、本発明者らはまた、同じモジュレーターを同じ抗体と融合させた別の組合せを試みて、これにより本発明者らが「モジュロカイン」と呼ぶ新たな種類のイムノサイトカインが得られた。驚くべきことに、以前の組合せと比較して、この組合せは強力なＴＩＬ再活性化をもたらし、その再活性化は大半のＴＩＬ（すなわち約８０％）に観察された。

この強力な相乗作用は、新たな療法の構想を可能とする。

結果として、本発明は、
Ａ）コンジュゲート、及び
Ｂ）該コンジュゲートに共有原子価によって直接的に又は間接的に連結された免疫調節抗体又はその断片を含む、イムノサイトカインに関し、
該コンジュゲートは、
（ｉ）インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（ｉｉ）ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド
を含む。

第二の態様では、本発明は、上記のイムノサイトカインをコードする核酸に関する。

第三の態様では、本発明は、上記の核酸を含むベクターを提供する。

第四の態様では、本発明は、以前に記載されたポリヌクレオチド又はベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞に関する。本発明はまた、本発明に記載のイムノサイトカインを発現する遺伝子操作された宿主細胞を産生する方法に関し、該方法は、（ｉ）インビトロ又はエクスビボで上記の核酸又はベクターを宿主細胞に導入する工程、（ｉｉ）インビトロ又はエクスビボで得られた遺伝子操作された組換え宿主細胞を培養する工程、及び（ｉｉｉ）場合により、該イムノサイトカインを発現及び／又は分泌する細胞を選択する工程を含む。

好ましい実施態様では、遺伝子操作された前記宿主細胞は、動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞である。

第五の態様では、本発明は、最終的に薬学的に許容される担体を伴う、上記のイムノサイトカイン、それをコードする核酸、又は該核酸を含む核酸ベクターを含む医薬組成物を提供する。

好ましい実施態様では、前記組成物はさらに治療剤を含み、これは好ましくは抗癌剤である。

第六の態様では、本発明は、被験者における癌を処置するための前記のような医薬組成物に関する。

第七の態様では、本発明は、被験者における癌を処置するために同時に、別々に、又は順次使用するための組合せ調製物としての、
（ｉ）上記のイムノサイトカイン、それをコードする核酸配列、又はこのような核酸配列を含むベクター、及び
（ｉｉ）治療剤、好ましくは抗癌剤
を含有する製品に関する。

第八の態様では、本発明は、被験者に前記の医薬組成物を投与する工程を含む、該被験者における癌を処置するための方法に関する。

最終の態様では、本発明は、それを必要とする被験者に
（ｉ）上記のイムノサイトカイン、それをコードする核酸配列、又はこのような核酸配列を含むベクター、及び
（ｉｉ）治療剤、好ましくは抗癌剤
の治療有効量を同時に、別々に、又は順次投与する工程を含む、癌を処置するための方法に関する。

図１は、患者Ａ（Ａ）及び患者Ｂ（Ｂ）に由来するＴＩＬにおけるＰＤ−１、Ｔｉｍ−３及びＩＬ−１５Ｒαの発現を示す。 図２は、抗ＰＤ１抗体（ＨＢＡＴ）によって、ＲＬＩによって、ＲＬＩとＨＢＡＴの組合せ（ＲＬＩ＋ＨＢＡＴ）によって、又は本発明のモジュロカイン（ＨＢＡＴ−ＲＬＩ）によって誘導された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の再活性化を示す。

詳細な説明
「イムノサイトカイン」という用語は、サイトカイン又はその誘導体に共有原子価によって直接的に又は間接的に連結された抗体又はその断片を含む分子を指す。該抗体と該サイトカインとはリンカーペプチドによって連結されていてもよい。

本発明のイムノサイトカインのコンジュゲート
「インターロイキン１５」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、これはＩＬ−２に類似した構造を有するサイトカインを指す（Grabsteinet al., Science, vol.264(5161), p:965-968, 1994）。このサイトカインはまたＩＬ−１５、ＩＬ１５、又はＭＧＣ９７２１としても知られる。このサイトカインとＩＬ−２は多くの生物学的活性を共有し、それらは共通のヘマトポエチン受容体サブユニットに結合することが判明した。したがって、それらは同じ受容体に対して競合し得、互いの活性を負に調節している。ＩＬ−１５はＴ細胞及びナチュラル―キラー細胞の活性化及び増殖を調節し、ＣＤ８＋メモリー細胞の数は、このサイトカインとＩＬ−２との間の平衡によって制御されることが示されることが確立されている。ＩＬ−１５の活性は、実施例に開示されているように、ｋｉｔ２２５細胞株に対するその増殖誘導を決定することによって測定され得る（HORI et al., Blood, vol.70(4), p:1069-72, 1987）。

前記のＩＬ−１５又はその誘導体は、ｋｉｔ２２５細胞株の増殖誘導に対するヒトインターロイキン−１５の活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％を有する。

前記インターロイキン１５は、哺乳動物インターロイキン１５、好ましくは霊長類インターロイキン１５、より好ましくはヒトインターロイキン１５である。

哺乳動物インターロイキン１５は当業者によって簡単に同定され得る。一例として、イノシシ（Sus scrofa）（アクセッションナンバーＡＢＦ８２２５０）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）（アクセッションナンバーＮＰ＿０３７２６１）、ハツカネズミ（Mus musculus）（アクセッションナンバーＮＰ＿０３２３８３）、ウシ（Bos Taurus）（アクセッションナンバーＮＰ＿７７６５１５）、カイウサギ（Oryctolagus cuniculus）（アクセッションナンバーＮＰ＿００１０７５６８５）、ヒツジ（Ovies aries）（アクセッションナンバーＮＰ＿００１００９７３４）、イエネコ（Felis catus）（アクセッションナンバーＮＰ＿００１００９２０７）、カニクイザル（Macaca fascicularis）（アクセッションナンバーＢＡＡ１９１４９）、ヒト（Homo sapiens）（アクセッションナンバーＮＰ＿０００５７６）、アカゲザル（Macaca Mulatta）（アクセッションナンバーＮＰ＿００１０３８１９６）、モルモット（Cavia porcellus）（アクセッションナンバーＮＰ＿００１１６６３００）、又はミドリザル（Chlorocebus sabaeus）（アクセッションナンバーＡＣＩ２８９）由来のインターロイキン１５を挙げることができる。

本明細書において使用される「哺乳動物インターロイキン１５」という用語は、配列番号１の共通配列を指す。

霊長類インターロイキン１５は当業者によって簡単に同定され得る。一例として、イノシシ（アクセッションナンバーＡＢＦ８２２５０）、カイウサギ（アクセッションナンバーＮＰ＿００１０７５６８５）、カニクイザル（アクセッションナンバーＢＡＡ１９１４９）、ヒト（アクセッションナンバーＮＰ＿０００５７６）、アカゲザル（アクセッションナンバーＮＰ＿００１０３８１９６）、又はミドリザル（アクセッションナンバーＡＣＩ２８９）由来のインターロイキン１５を挙げることができる。

本明細書において使用される「霊長類インターロイキン１５」という用語は、配列番号２の共通配列を指す。

ヒトインターロイキン１５は当業者によって簡単に同定され得、これは配列番号３のアミノ酸配列を指す。

本明細書において使用される「インターロイキン１５誘導体」という用語は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群より選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも９２．５％（すなわち約１０個のアミノ酸の置換に相当する）、好ましくは少なくとも９６％（すなわち約５個のアミノ酸の置換に相当する）、より好ましくは少なくとも９８．５％（すなわち約２個のアミノ酸の置換に相当する）又は少なくとも９９％（すなわち約１個のアミノ酸の置換に相当する）の同一率を有するアミノ酸配列を指す。このような誘導体は当業者によってその個人の知識及び本特許出願の教義の観点から簡単に同定され得る。このような誘導体の一例として、国際特許出願第ＰＣＴ国際公開公報第２００９／１３５０３１号に記載のものを挙げることができる。また、天然アミノ酸は化学的に修飾されたアミノ酸によって置換されていてもよいことが理解されるだろう。典型的には、このような化学的に修飾されたアミノ酸はポリペプチドの半減期を延長する。

本明細書において使用される２つのアミノ酸配列間の「同一率」は、該配列の最善のアラインメントを用いて得られた、比較しようとする２つの配列間の同一のアミノ酸の比率を意味し、この比率は純粋に統計学的であり、これらの２つの配列間の差異はアミノ酸配列全体に無作為に広がる。本明細書において使用される「最善のアラインメント」又は「最適なアラインメント」は、決定された同一率（以下参照）が最も高いアラインメントを意味する。２つのアミノ酸配列間の配列比較は通常、最善のアラインメントに従って事前にアラインさせておいたこれらの配列を比較することによって実現され；この比較は比較セグメント上で実現され、これにより、類似性を有する局所領域を同定及び比較する。比較を行なうための最善の配列アラインメントは、手作業の方法の他に、Smith及びWaterman（Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981）によって開発された局所相同性アルゴリズムを使用することによって、Neddleman及びWunsch（J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970）によって開発された全体的相同性アルゴリズムを使用することによって、Pearson及びLipman（Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988）によって開発された類似性の方法を使用することによって、このようなアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.、マジソン、ＷＩ、米国）を使用したコンピューターソフトウェアを使用することによって、ＭＵＳＣＬＥマルチプルアラインメントアルゴリズム（Edgar, Robert C., NucleicAcids Research, vol. 32, p:1792, 2004）を使用することによって、又はＣＬＵＳＴＡＬ（Goujonet al., Nucleic acids research, vol.38, W695-9, 2010）を使用することによって実現することができる。最善の局所アラインメントを得るために、好ましくはＢＬＡＳＴソフトウェアとＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用することができる。２つのアミノ酸配列間の同一率は、最適にアラインさせたこれらの２つの配列を比較することによって決定され、該アミノ酸配列は、これらの２つの配列間の最適なアラインメントを得るために基準配列に対して付加又は欠失を包含することができる。同一率は、これらの２つの配列間の同一位置の数を決定し、この数を、比較した位置の総数で割り、得られた結果に１００を乗じることによって計算され、これによりこれらの２つの配列間の同一率が得られる。

好ましくは、インターロイキン１５誘導体は、ＩＬ−１５アゴニスト又はＩＬ−１５スーパーアゴニストである。当業者は、ＩＬ−１５アゴニスト又はＩＬ−１５スーパーアゴニストを簡単に同定することができる。ＩＬ−１５アゴニスト又はＩＬ−１５スーパーアゴニストの一例として、国際特許出願の国際公開公報第２００５／０８５２８２号又はZHU et al.（J. Immunol., vol.183(6), p:3598-607, 2009）に開示されたものを挙げることができる。

さらに好ましくは、前記ＩＬ−１５アゴニスト又はＩＬ−１５スーパーアゴニストは、Ｌ４５Ｄ、Ｌ４５Ｅ、Ｓ５１Ｄ、Ｌ５２Ｄ、Ｎ７２Ｄ、Ｎ７２Ｅ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｓ、Ｎ７２Ｙ及びＮ７２Ｐ（ヒトＩＬ−１５の配列、すなわち配列番号３に関して）を含む／からなる群より選択される。

本明細書において使用される「ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、これは、ＩＬ−１５Ｒαのシグナルペプチドの後の最初のシステイン残基（Ｃ１）で始まり、該シグナルペプチド後の第四のシステイン残基（Ｃ４）で終わるドメインを指す。ＩＬ−１５Ｒαの細胞外領域の部分に対応する該スシドメインは、ＩＬ−１５へのその結合のために必要である（WEI et al., J. Immunol., vol.167(1), p:277-282, 2001）。

前記のＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体は、ヒトインターロイキン−１５に対するＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの結合活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％を有する。該結合活性は、WEI et al.（前記、2001）に開示された方法によって簡単に決定され得る。

前記のＩＬ−１５Ｒαのスシドメインは、哺乳動物ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン、好ましくは霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン、より好ましくはヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメインである。

哺乳動物ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインは、当業者によって簡単に同定され得る。一例として、ドブネズミ（アクセッションナンバーＸＰ＿００２７２８５５５）、ハツカネズミ（アクセッションナンバーＥＤＬ０８０２６）、ウシ（アクセッションナンバーＸＰ＿００２６９２１１３）、カイウサギ（アクセッションナンバーＸＰ＿００２７２３２９８）、カニクイザル（アクセッションナンバーＡＣＩ４２７８５）、ブタオザル（Macaca nemestrina）（アクセッションナンバーＡＣＩ４２７８３）、ヒト（アクセッションナンバーＱ１３２６１．１）、アカゲザル（アクセッションナンバーＮＰ＿００１１６６３１５）、スマトラオランウータン（Pongo abelii）（アクセッションナンバーＸＰ＿００２８２０５４１）、シロユリマンガベイ（Cercocebus torquatus）（アクセッションナンバーＡＣＩ４２７８４）、コモンマーモセット（Callithrix jacchus）（アクセッションナンバーＸＰ＿００２７５００７３）、又はモルモット（アクセッションナンバーＮＰ＿００１１６６３１４）由来のＩＬ−１５Ｒαのスシドメインを挙げることができる。

本明細書において使用される「哺乳動物ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン」という用語は配列番号４の共通配列を指す。

好ましくは、哺乳動物ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドは配列番号５の共通配列を指す。

霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインは当業者によって簡単に同定され得る。一例として、カイウサギ、カニクイザル、ブタオザル、ヒト、アカゲザル、スマトラオランウータン、シロユリマンガベイ、又はコモンマーモセット由来のＩＬ−１５Ｒαのスシドメインを挙げることができる。

本明細書において使用される「霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン」という用語は配列番号６の共通配列を指す。

好ましくは、霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドは配列番号７の共通配列を指す。

ヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメインは当業者によって簡単に同定され得、これは配列番号８のアミノ酸配列を指す。

好ましくは、ヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドは配列番号９を指す。

本明細書において使用される「ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの誘導体」という用語は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群より選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも９２％（すなわち約５個のアミノ酸の置換に相当する）、好ましくは少なくとも９６％（すなわち約２個のアミノ酸の置換に相当する）、より好ましくは少なくとも９８％（すなわち約１個のアミノ酸の置換に相当する）の同一率を有するアミノ酸配列を指す。このような誘導体は、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの４つのシステイン残基を含み、これは当業者によって当業者の一般的な知識及び本特許出願の教義の観点から簡単に同定され得る。また、天然アミノ酸は、化学的に修飾されたアミノ酸によって置換されていてもよいことが理解されるだろう。典型的には、このような化学的に修飾されたアミノ酸は、ポリペプチドの半減期を延長させることができる。

好ましい実施態様によれば、コンジュゲートは（ｉｉ）ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

ＩＬ−１５Ｒαヒンジドメインは、スシドメインの後の最初のアミノ残基に始まり、最初もグリコシル化可能な部位の前の最後のアミノ酸残基で終わる、アミノ酸配列として定義される。ヒトＩＬ−１５Ｒαでは、ヒンジ領域のアミノ酸配列は、このＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの後で、該スシドメインに対してＣ末端に位置する１４個のアミノ酸からなり、すなわち、該ＩＬ−１５Ｒαヒンジ領域は、該（Ｃ４）システイン残基の後の最初のアミノ酸で始まり、（標準的な「Ｎ末端からＣ末端への」方向で数えて）１４番目のアミノ酸で終わる。

ＩＬ−１５Ｒαの前記のスシドメイン及びヒンジドメインは、哺乳動物ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン、好ましくは霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン、より好ましくはヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインである。

哺乳動物ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインのアミノ酸配列は当業者によって簡単に同定され得る。本明細書において使用される「哺乳動物ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン」という用語は配列番号１０の共通配列を指す。

霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインのアミノ酸配列は当業者によって簡単に同定され得る。本明細書において使用される「霊長類ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン」という用語は配列番号１１の共通配列を指す。

ヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインのアミノ酸配列は当業者によって簡単に同定され得る。本明細書において使用される「ヒトＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメイン」という用語は配列番号１２の共通配列を指す。

本明細書において使用される「ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン及びヒンジドメインの誘導体」は、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも９３％（すなわち約５個のアミノ酸の置換に相当する）、好ましくは少なくとも９７％（すなわち約２個のアミノ酸の置換に相当する）、より好ましくは少なくとも９８％（すなわち約１個のアミノ酸の置換に相当する）の同一率を有するアミノ酸配列を指す。このような誘導体はＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの４つのシステイン残基を含み、これは当業者によって当業者の一般的な知識及び本特許出願の教義の観点から簡単に同定され得る。また、天然アミノ酸は、化学的に修飾されたアミノ酸によって置換されていてもよいことが理解されるだろう。典型的には、このような化学的に修飾されたアミノ酸は、ポリペプチドの半減期を延長させることができる。

コンジュゲートの両方のポリペプチドｉ）とｉｉ）は、米国特許第８，１２４，０８４ Ｂ２号に開示された複合体におけるように非共有結合的に連結されていてもよい。該コンジュゲート又は複合体は、適切な量のポリペプチドｉ）を準備し、適切な量のポリペプチドｉｉ）を準備し、両方のポリペプチドを適切なｐＨ及びイオン条件下で複合体（すなわちコンジュゲート）の形成を可能とするに十分な時間をかけて混合し、場合により該複合体を濃縮又は精製することによって簡単に得ることができる。複合体（すなわちコンジュゲート）のポリペプチドは、例えば、標準的な方法に従ってペプチド合成装置を使用して；細胞又は細胞抽出物中で各ポリペプチドを別々に発現させ、その後、該ポリペプチドを単離及び精製することによって形成され得る。場合により、本発明の治療用ポリペプチド複合体は、同じ細胞又は細胞抽出物中で両方のポリペプチドｉ）及びｉｉ）を発現させ、その後、例えばリンホカイン部分、リンホカイン受容体部分、又は複合体に対する抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技術を使用して該複合体を単離及び精製することによって形成され得る。

コンジュゲートの両方のポリペプチドｉ）とｉｉ）はまた、二官能基タンパク質カップリング剤を使用して又は融合タンパク質において共有結合されていてもよい。

二官能基タンパク質カップリング剤、例えばそれらを使用する方法は当業者には周知であり、これには、例えば、Ｎ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能基誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビスー（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えばトリレン−２，６−ジイソシアナート）、及びビスフッ素活性化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）が挙げられる。

「融合タンパク質」という用語は、別々のタンパク質を元来コードしていた２つ以上の遺伝子の接続を通して作られたタンパク質を指す。それはまたキメラタンパク質としても知られる。この融合遺伝子の翻訳により、元来の各々のタンパク質に由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドが得られる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究又は治療薬に使用するための組換えＤＮＡ技術によって人工的に作られる。組換え融合タンパク質は、融合遺伝子の遺伝子操作を通して作られたタンパク質である。これは典型的には、第一タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列から終止コドンを除去し、その後、ライゲーション又はオーバーラップエクステンションＰＣＲを通して第二タンパク質のｃＤＮＡ配列をインフレームで付加することを含む。そのＤＮＡ配列は、その後、細胞によって単一のタンパク質として発現されるだろう。該タンパク質は、両方の元来のタンパク質の完全な配列、又はそのいずれかの一部のみを含むように操作されていてもよい。

好ましい実施態様では、コンジュゲートは融合タンパク質である。

インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列は、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列に対してＣ末端にあってもＮ末端にあってもよい。好ましくは、インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列は、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列に対してＣ末端の位置にある。

インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列とＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列とは、第一「リンカー」アミノ酸配列によって隔てられていてもよい。前記の第一「リンカー」アミノ酸配列は、融合タンパク質が適切な二次構造及び三次構造を確実に形成するに十分な長さであり得る。

第一リンカーアミノ酸配列の長さは、融合タンパク質の生物学的活性に有意に影響を及ぼすことなく変更され得る。典型的には、第一リンカーアミノ酸配列は、少なくとも１つであるがしかし３０個未満のアミノ酸、例えば２〜３０アミノ酸のリンカー、好ましくは１０〜３０アミノ酸、より好ましくは１５〜３０アミノ酸、さらにより好ましくは１５〜２５アミノ酸、最も好ましくは１８〜２２アミノ酸を含む。

好ましいリンカーアミノ酸配列は、コンジュゲートが適切なコンフォメーション（すなわち、ＩＬ−１５Ｒβ／γシグナル伝達経路を通して適切なシグナル伝達活性を可能とするコンフォメーション）をとることを可能とするものである。

最も適切な第一リンカーアミノ酸配列は、（１）可動性の伸展したコンフォメーションをとり、（２）融合タンパク質の機能的ドメインと相互作用する可能性のある規則正しい二次構造を発生する傾向を示さず、（３）機能的タンパク質ドメインとの相互作用を促進する可能性のある疎水性特徴又は荷電特徴を最小限有するだろう。

好ましくは、第一リンカーアミノ酸配列は、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＧｌｎ（Ｑ）を含む群より選択された、最も好ましくはＧｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）及びＳｅｒ（Ｓ）を含む群から選択された中性に近いアミノ酸を含む。

リンカー配列の例は、米国特許第５，０７３，６２７号及び第５，１０８，９１０号に記載されている。

本発明にとってより特に適している例示的な可動性リンカーとしては、配列番号１３（SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ）、配列番号１４（SGGSGGGGSGGGSGGGGSGG）、又は配列番号１５（SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ）の配列によってコードされるものが挙げられる。

好ましくは、該コンジュゲートは配列番号１８又は配列番号１９の配列を有する。

本発明のイムノサイトカインの抗体
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された、２本の同一な重鎖（Ｈ）（完全長の場合には約５０〜７０kDa）と２本の同一な軽鎖（Ｌ）（完全長の場合には約２５kDa）という４本のポリペプチド鎖を含む四量体に相当する免疫グロブリン分子を指す。軽鎖は、κ（カッパ）及びλ（ラムダ）として分類される。重鎖は、γ（ガンマ）、μ（ミュー）、α（アルファ）、δ（デルタ）、又はε（イプシロン）として分類され、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。各々の重鎖は、Ｎ末端の重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲと略称される）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＡについては３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）から構成され；ＩｇＭ及びＩｇＥについては４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）から構成される。各々の軽鎖は、Ｎ末端の軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲと略称される）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、すなわちＣＬから構成される。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域の介在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域にさらに細分され得る。各々のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序に並んだ、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、周知の慣習による。特定の抗原に対する抗体の機能的結合能力は、軽鎖／重鎖の各対の可変領域に依存し、これは主にＣＤＲによって決定される。

本明細書において使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体それ自体を指す。モノクローナル抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体、及び／又はヒト化抗体であり得る。

有利には、抗体という用語は、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を指す。好ましくは、抗体という用語は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２、より好ましくはＩｇＧ２ａを指す。

「キメラ抗体」は、マウス免疫グロブリンの可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域から構成される抗体を意味する。この改変は、ヒト抗体の定常領域を、マウス定常領域で単に置換することからなり、その結果、医薬用途に許容可能なほど十分に低い免疫原性を有し得るヒト／マウスキメラが得られる。このようなキメラ抗体を産生するための多くの方法がすでに報告されており、したがって当業者の一般的な知識の一部を形成する（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号参照）。

「ヒト化抗体」は、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体の配列を改変することによって、ヒト抗体生殖系列に由来するアミノ酸で一部又は完全に構成される抗体を意味する。抗体の可変領域及び最終的にはＣＤＲのこのヒト化は、当技術分野において現在までに周知である技術によって行なわれる。一例として、英国特許出願第ＧＢ２１８８６３８Ａ号及び米国特許第５，５８５，０８９号は、置換された抗体の唯一の部分が相補性決定領域、すなわち「ＣＤＲ」である、組換え抗体を産生するプロセスを開示する。ＣＤＲ移植技術を使用して、マウスＣＤＲとヒト可変領域フレームワーク領域及び定常領域からなる抗体を作製した（例えば、Riechmann et al., Nature , vol.332, p: 323-327, 1988参照）。これらの抗体は、Ｆｃ依存的エフェクター機能に必要であるヒト定常領域を保持するが、抗体に対する免疫応答を誘起する可能性ははるかに低いようである。一例として、非ヒトＣＤＲを実質的にインタクトとしたまま、又はＣＤＲをヒトゲノム由来の配列と置換さえする一方で、可変領域のフレームワーク領域を対応するヒトフレームワーク領域によって置換する。免疫系がヒト免疫系に相当するように改変された遺伝子的に改変されたマウスにおいて完全なヒト抗体が産生される。上記のように、一本鎖形態を示す断片などの抗体の免疫学的に特異的な断片を使用することは、本発明の方法に使用するのに十分である。

ヒト化抗体はここでも、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体を指し、存在する全ての定常領域は、ヒト免疫グロブリン定常領域に対して実質的に同一であり、すなわち少なくとも８５又は９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である。したがって、おそらくＣＤＲを除くヒト化抗体の全ての部分が、１つ以上の天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分に対して実質的に同一である。例えば、ヒト化免疫グロブリンは典型的には、キメラマウス可変領域／ヒト定常領域の抗体を包含しない。一例として、ヒト化免疫グロブリンの設計は、以下のように行なわれ得る：アミノ酸が以下の範疇に該当する場合、使用しようとするヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリン）のフレームワークアミノ酸を、ＣＤＲを与える非ヒト免疫グロブリン（ドナー免疫グロブリン）由来のフレームワークアミノ酸によって置換する：（ａ）アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸が、その位置においてヒト免疫グロブリンにとって異常であり、ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸がその位置においてヒト免疫グロブリンにとって典型的なものである場合；（ｂ）アミノ酸の位置がＣＤＲの１つのすぐ近くである場合；又は（ｃ）フレームワークアミノ酸の任意の側鎖の原子が、３次元免疫グロブリンモデルにおけるＣＤＲアミノ酸の任意の原子から約５〜６Å（中心間）以内にある場合（Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p:2869, 1991）。アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中の各アミノ酸及びドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸が、その位置においてヒト免疫グロブリンにとって異常である場合、このようなアミノ酸を、その位置においてヒト免疫グロブリンにとって典型的であるアミノ酸によって置換する。

本明細書において使用される「抗体断片」という用語は、その抗体対応物と同じ抗原と反応することのできる抗体断片を指す。このような断片は当業者によって簡単に同定され得、これは一例として、本発明によって包含される、Ｆ_ａｂ断片（例えばパパインによる消化による）、Ｆ_ａｂ’断片（例えばペプシンによる消化及び部分的な還元による）、Ｆ（_ａｂ’）_２断片（例えばペプシンによる消化による）、Ｆ_ａｃｂ断片（例えばプラスミンによる消化による）、Ｆ_ｄ断片（例えばペプシンによる消化、部分的還元、及び再凝集による）、及びまたｓｃＦ_ｖ断片（一本鎖Ｆｖ；例えば分子生物学的技術による）を含む。

このような断片は、当技術分野において公知及び／又は本明細書に記載のような、酵素的切断、合成技術、又は組換え技術によって作製され得る。また、１つ以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して、様々な切断短縮形の抗体が作製され得る。例えば、重鎖のＣＨ_１ドメイン及び／又はヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むような、Ｆ（_ａｂ’）_２重鎖部分をコードする組合せ遺伝子を設計することができる。抗体の様々な部分を従来の技術によって化学的に互いに接続させても、又は、遺伝子操作技術を使用して連続タンパク質として調製してもよい。

好ましくは、該抗体断片はｓｃＦｖ断片である。

本明細書において使用される「免疫調節抗体」という用語は、
１）ＣＴＬ−Ａ４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２、ＡＤＯＲＡ２Ａ又は抑制性ＫＩＲなどの免疫抑制受容体又はそのリガンドに結合することによってこの受容体を阻害し、よって、ダウンレギュレーションシグナルを防ぐことによって免疫活性化を促進することによって；又は
２）ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４又はＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ）などの共刺激受容体を刺激し、よってＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の活性化を促進することによって
のいずれかによって作用する抗体を指す。

第一の好ましい実施態様では、免疫調節抗体は、免疫抑制受容体を阻害する。免疫抑制受容体を阻害する免疫調節抗体の一例として、ＣＴＬ−Ａ４、抑制性ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２、ＡＤＯＲＡ２Ａ、及びＰＤ−１のアンタゴニスト、さらに好ましくは抗ＰＤ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体から選択されたＰＤ−１アンタゴニストを挙げることができる。

ＣＴＬ−Ａ４（細胞障害性リンパ球関連抗原、ＣＤ１５２とも称される）が１９８７年に発見された（Brunet et al., Nature, vol.328, p:267-270, 1987）。ＣＴＬ−Ａ４の役割は主にＴ細胞活性化を阻害することであり、これは、大量のリンパ球増殖に苦しむＣＴＬ−Ａ４欠損マウスにおいて示された（Chambers et al., Immunity, vol.7, p:8855-8959, 1997）。現在、ＣＴＬ−Ａ４の遮断は、インビトロ（Walunas et al., Immunity, vol.1, p:405-413, 1994）及びインビボ（Kearney, J. Immunol, vol.155, p:1032-1036, 1995）においてＴ細胞応答を増強し、また抗腫瘍免疫を高める（Leach, Science, vol.271, p:1734-1736, 1996）ことが示された。ＣＴＬ−Ａ４アンタゴニストに対応する抗体の一例として、国際公開公報第０１／１４４２４号に開示されたイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０及び１０Ｄ１とも呼ばれる、メダレックス社から入手可能であり、そしてブリストールマイヤーズスクイブ社によってヤーボイ（商標）として市販されている）、国際公開公報第００／３７５０４号に開示されたチシリムマブ（１１．２．１及びＣＰ−６７５，２０６としても知られる）、及びまた国際特許出願の国際公開公報第９８／４２７５２号、国際公開公報第０１／１４４２４号、国際公開公報第２００４／０３５６０７号、及び国際公開公報第２０１２／１２０１２５号、欧州特許第１２１２４２２号及び欧州特許第１２６２１９３号、米国特許第５，８１１，０９７号、米国特許第５，８５５，８８７号、米国特許第５，９７７，３１８号、米国特許第６，０５１，２２７号、米国特許第６，２０７，１５６号、米国特許第６，６８２，７３６号、米国特許第６，９８４，７２０号、米国特許第７，１０９，００３号及び米国特許第７，１３２，２８１号に開示されたＣＴＬ−Ａ４抗体を挙げることができ、これらの出願は参照により本明細書に組み入れられる。

プログラム化細胞死１受容体はＰＤ−１（ＰＤＣＤ１又はＣＤ２７９とも称される）としても知られるが、これは約５５kDのＩ型膜糖タンパク質である。ＰＤ−１は、ナイーブＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞上で中程度に発現され、かつリンパ球、単球及び骨髄球系細胞上でＴ／Ｂ細胞受容体シグナル伝達によってアップレギュレートされる、ＣＤ２８共刺激遺伝子ファミリーの受容体である。ＰＤ−１は、広く発現されている、すなわち、ナイーブリンパ球上、活性化Ｂ細胞上及びＴ細胞上、単球上及び樹状細胞上に発現されているＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）と、その発現が限定されている、すなわち、活性化樹状細胞上、マクロファージ上及び単球上、及び血管内皮細胞上に限定されているＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）という、明確に異なる発現プロファイルを有する２つの公知のリガンドを有する。いくつかのマウス同系腫瘍モデルにおいて、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１のいずれかの遮断が腫瘍増殖を有意に阻害したか又は完全な退縮を誘導した。したがって、ＰＤ−１は、免疫調節及び末梢性免疫寛容の維持において重要な役割を果たすと認識されている。ＰＤ−１アンタゴニストに対応する抗体の一例として、国際公開公報第２００６／１２１１６８号に開示されたニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８又はＭＤＸ１１０６としても知られる；抗ＰＤ−１抗体、ブリストールマイヤーズスクイブ）、国際公開公報第２００９／１１４３３５号に開示されたＭｅｒｃｋ３７４５（ＭＫ−３４７５又はＳＣＨ−９００４７５としても知られる、抗ＰＤ−１抗体である）、国際公開公報第２００９／１０１６１１号に開示されたＣＴ−０１１（ｈＢＡＴ又はｈＢＡＴ−１としても知られる、抗ＰＤ−１抗体）、国際公開公報第２００８／１５６７１２号に開示されたランブロリズマブ、国際公開公報第２０１０／０２７４２３号、国際公開公報第２０１０／０２７８２７号、国際公開公報第２０１０／０２７８２８号、及び国際公開公報第２０１０／０９８７８８号に開示されたＡＭＰ５１４、並びにまた国際特許出願の国際公開公報第２００４／０５６８７５号、国際公開公報第２００６／０５６８７５、国際公開公報第２００８／０８３１７４号、国際公開公報第２０１０／０２９４３４号、国際公開公報第２０１０／０２９４３５号、国際公開公報第２０１０／０３６９５９号、国際公開公報第２０１０／０８９４１１号、国際公開公報第２０１１／１１０６０４号、国際公開公報第２０１２／１３５４０８号及び国際公開公報第２０１２／１４５４９３号に開示された抗体を挙げることができる。該ＰＤ−１アンタゴニストは、国際公開公報第２００７／００５８７４号に開示されたＭＤＸ−１１０５（ＢＭＳ−９３６５５９としても知られる、抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、又は国際公開公報第２０１０／０７７６３４号に開示されたＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（ＭＰＤＬ３２８０Ａ又はＲＧ７４４６としても知られる；抗ＰＤ−Ｌ１抗体）などの抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対応し得、これらの出願は参照により本明細書に組み入れられる。

キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と呼ばれる免疫系の重要な細胞上に見られる細胞表面タンパク質のファミリーである。それらは、全ての細胞型に発現されるＭＨＣクラスＩ分子と相互作用することによってこれらの細胞の殺滅機能を調節する。この相互作用により、それらは、その表面上に特徴的な低いレベルのクラスＩ ＭＨＣを有するウイルス感染細胞又は腫瘍細胞を検出することが可能となる。大半のＫＩＲは抑制性であり、このことは、該ＫＩＲによるＭＨＣの認識は、そのＮＫ細胞の細胞障害活性を抑制することを意味する。ほんの僅かな数のＫＩＲのみが細胞を活性化する能力を有する。

抑制性ＫＩＲは、そのＭＨＣクラスＩリガンドとの結合時にＮＫ細胞に抑制性シグナルを伝達する、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する長い細胞質尾部を有する。公知の抑制性ＫＩＲとしては、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ３を含む、ＫＩＲ２ＤＬ及びＫＩＲ３ＤＬサブファミリーのメンバーが挙げられる。抑制性ＫＩＲアンタゴニストに対応する抗体の一例として、国際公開公報第２００６／００３１７９号に開示された抗体１−７Ｆ９を挙げることができ、この出願は参照により本明細書に組み入れられる。

ＢＴＬＡ（Ｂリンパ球及びＴリンパ球のアテニュエーター）はＣＤ２７２としても知られるが、これはＴ細胞の活性化の最中に誘導され、Ｔｈ２細胞上ではなくＴｈ１細胞上に発現され続ける。ＢＴＬＡは、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）、ＴＲ２；ＡＴＡＲ；ＨＶＥＡ；ＣＤ２７０；ＬＩＧＨＴＲとしても知られる、腫瘍壊死因子（受容体）メンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）との相互作用を介してＴ細胞の抑制を示す。ＴＮＦＲＳＦ１４は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の侵入の細胞性メディエーターとして同定された。この受容体の細胞質側領域は、免疫応答を活性化するシグナル伝達経路を媒介し得るいくつかのＴＲＡＦファミリーメンバーと結合することが判明した。最後に、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ複合体はＴ細胞免疫応答を負に調節する。ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭアンタゴニストの一例として、国際公開公報第２００８／０７６５６０号、国際公開公報第２０１０／１０６０５１号及び国際公開公報第２０１１／０１４４３８号に開示された抗体を挙げることができる。

ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３、ＣＤ２２３としても知られる）は免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属し、４つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含有する。ＬＡＧ３アンタゴニストの一例として、国際公開公報第２０１０／０１９５７０号に開示された抗体を挙げることができる。

ＨＡＶＣＲ２（Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２、Ｔｉｍ−３、ＫＩＭ−３；ＴＩＭＤ３；Ｔｉｍ−３；及びＴＩＭＤ−３としても知られる）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＴｈ１特異的細胞表面タンパク質である。ＨＡＶＣＲ２はマクロファージ活性化を調節し、Ｔｈ１媒介性自己及び同種免疫応答を抑制し、よって免疫寛容を促進する。ＨＡＶＣＲ２アンタゴニストの一例として、国際公開公報第２０１３／００６４９０Ａ号に開示された抗体を挙げることができる。

ＡＤＯＲＡ２Ａ（アデノシンＡ_２Ａ受容体、Ａ２ａＲ、ＲＤＣ８；又はＡＤＯＲＡ２としても知られる）はグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属し、これはクラス及びサブタイプに細分される。このタンパク質は、心律動及び心循環、脳及び腎の血流、免疫機能、疼痛の調節、及び睡眠などの多くの生物学的機能において重要な役割を果たす。それは、炎症疾患及び神経変性疾患などの病態生理学的容態に関与している。

第二の好ましい実施態様では、免疫調節抗体は共刺激受容体を刺激する。

共刺激受容体を刺激する免疫調節抗体の一例として、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４及びＴＮＦＲＳＦ１８のアゴニストを挙げることができる。

ＣＤ４０は、ＡＰＣの活性化に必要とされる、ＡＰＣ上に見られるＴＮＦ受容体スーパーファミリーの一員である。この受容体は、Ｔ細胞依存性免疫グロブリンクラススイッチ及びメモリーＢ細胞の発達をはじめとする、様々な免疫応答及び炎症応答を媒介する上で必須であることが判明した。

ＣＤ４０アゴニストに対応する抗体の一例として、国際公開公報第０３／０４０１７０号、国際公開公報第２００５／０６３９８１号、国際公開公報第２００５／０６３２８９号及び国際公開公報第２０１２／０４１６３５号に開示された抗体を挙げることができ、これらの出願は参照により本明細書に組み入れられる。

ＣＤ１３７は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーの一員である。その代替名称は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、４−１ＢＢ、及びinduced by lymphocyte activation（ＩＬＡ）である。ＣＤ１３７は、活性化Ｔ細胞によって発現され得るが、ＣＤ４Ｔ細胞よりもＣＤ８Ｔ細胞の方が程度が大きい。さらに、ＣＤ１３７の発現は樹状細胞、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球、及び炎症部位の血管壁の細胞上に見られる。最も良く特徴付けられたＣＤ１３７の活動は、活性化Ｔ細胞に対するその共刺激活性である。ＣＤ１３７との架橋は、Ｔ細胞の増殖、ＩＬ−２の分泌、生存期間、及び細胞障害活性を増強する。さらに、それは免疫活性を増強させてマウスにおける腫瘍を根絶することができる。

ＣＤ１３７アゴニストに対応する抗体の一例として、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３としても知られる）、及び国際公開公報第０３／０４０１７０号、国際公開公報第２００４／０１０９４７号、国際公開公報第２００５／０３５５８４号、国際公開公報第２００６／１２６８３５号及び国際公開公報第２０１２／１４５１８３号に開示された抗体を挙げることができ、これらの出願は参照により本明細書に組み入れられる。

ＣＤ１３４はＯＸ４０としても知られるが、これはＴＮＦＲ受容体スーパーファミリーの一員である。ＯＸ４０は共刺激分子であり、ＯＸ４０のその発現はＴ細胞の完全な活性化に依存する。ＯＸ４０はＴ細胞上の受容体に結合し、Ｔ細胞が死滅するのを防ぎ、続いてサイトカインの産生を増加させる。ＯＸ４０は、生存期間を増強するその能力に因り、最初の数日間を超える免疫応答の維持及びそれ以降の記憶応答の維持に重要な役割を果たす。

ＣＤ１３４アゴニストに対応する抗体の一例として、国際公開公報第２００９／０７９３３５号、国際公開公報第２０１２／０２７３２８号、国際公開公報第２０１３／０３８１９１号、及び国際公開公報第２０１３／０２８２３１号に開示された抗体を挙げることができ、これらの出願は参照により本明細書に組み入れられる。

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）は活性化誘導性ＴＮＦＲファミリー受容体（ＡＩＴＲ）又はグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）としても知られるが、これは腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）スーパーファミリーの一員である。このタンパク質は、制御性Ｔ細胞の抑制活性の阻害、及エフェクターＴ細胞の生存期間の延長に関与することが示された、表面受容体分子である。

ＴＮＦＲＳＦ１８アゴニストに対応する抗体の一例として、国際公開公報第２００６／１０５０２１号及び国際公開公報第２０１１／０２８６８３号に開示された抗体を挙げることができる。

コンジュゲートと抗体又はその断片との両方は、二官能基タンパク質カップリング剤を使用して又は融合タンパク質において共有結合されていてもよい。

二官能基タンパク質カップリング剤の方法は当業者には周知であり、以前に開示されている。一例として、当業者は、TILL et al.（Proc. Natl. Acad. U.S.A., vol.86(6), p:1987-91, 1989）に開示された方法を使用することができる。

好ましい実施態様では、イムノサイトカインは融合タンパク質である。

別の好ましい実施態様では、イムノサイトカインは複合体、好ましくはポリペプチドｉ）とｉｉ）との間のコンジュゲートを含む複合体であり、ポリペプチドｉ）又はｉｉ）は抗体又はその断片に融合している。

ポリペプチドｉ）、ポリペプチドｉｉ）又はコンジュゲートは、抗体又はその断片のアミノ酸配列に対してＣ末端にあってもＮ末端にあってもよい。

好ましくは、コンジュゲートは融合タンパク質であり、コンジュゲートのアミノ酸配列は、抗体又はその断片のアミノ酸配列に対してＣ末端にあり、最も好ましくは抗体又はその断片の重鎖定常領域の少なくとも１つのアミノ酸配列に対してＣ末端の位置にある。

コンジュゲートのアミノ酸配列と抗体又はその断片のアミノ酸配列とは、第二の「リンカー」アミノ酸配列によって隔離されていても隔離されていなくてもよい。

特定の実施態様では、本発明のイムノサイトカインは融合タンパク質であり、コンジュゲートと抗体又はその断片はいずれのリンカーによっても隔離されていない。

第一リンカーアミノ酸配列に関して、前記の第二「リンカー」アミノ酸配列は、融合タンパク質が適切な二次構造及び三次構造を確実に形成するに十分な長さであり得る。

第一リンカーアミノ酸配列の長さは、融合タンパク質の生物学的活性に有意に影響を及ぼすことなく変更され得る。典型的には、第一リンカーアミノ酸配列は、少なくとも１つであるがしかし３０個未満のアミノ酸、例えば２〜３０アミノ酸のリンカー、好ましくは１０〜３０アミノ酸、より好ましくは１５〜３０アミノ酸、最も好ましくは１５〜２５アミノ酸を含む。

第一リンカーアミノ酸配列に関して、最も適した第二リンカーアミノ酸配列は、（１）可動性の伸展したコンフォメーションをとり、（２）融合タンパク質の機能的ドメインと相互作用する可能性のある規則正しい二次構造を発生する傾向を示さず、（３）機能的タンパク質ドメインとの相互作用を促進する可能性のある疎水性特徴又は荷電特徴を最小限有するだろう。

好ましくは、第二リンカーアミノ酸配列は、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＧｌｎ（Ｑ）を含む群より選択された、最も好ましくはＧｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）及びＳｅｒ（Ｓ）を含む群から選択された中性に近いアミノ酸を含む。

本発明に適した第二リンカーアミノ酸配列の一例として、配列番号１６（SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG）又は配列番号１７（AAGGGSGGGSGGGGSGGGGSAA）を挙げることができる。

核酸、ベクター、及び組換え宿主細胞
第二の態様では、本発明は、上記のイムノサイトカイン、好ましくは融合タンパク質に対応するイムノサイトカインをコードする核酸に関する。

前記の核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡ、好ましくはＤＮＡに相当する。

好ましい実施態様によると、本発明のイムノサイトカインをコードする核酸は、原核細胞又は真核細胞内で、好ましくは真核細胞内で核酸の発現を指令する遺伝子発現配列に作動可能に連結されている。「遺伝子発現配列」は、それが作動可能に連結されているイムノサイトカイン核酸の効率的な転写及び翻訳を促進する、任意の調節ヌクレオチド配列、例えばプロモーター配列又はプロモーター−エンハンサー配列の組合せである。遺伝子発現配列は、例えば、哺乳動物又はウイルス性のプロモーター、例えば構成性又は誘導性プロモーターであり得る。

構成性哺乳動物プロモーターとしては、以下の遺伝子のためのプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチンプロモーター、筋クレアチンキナーゼプロモーター、ヒト伸張因子プロモーター、及び他の構成性プロモーター。真核細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、例えば、サルウイルス（例えばＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、モロニー白血病ウイルス及び他のレトロウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。他の構成性プロモーターも当業者に公知である。

本発明の遺伝子発現配列として有用であるプロモーターとしては誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。例えば、プロモーター中のメタロチオネインは、特定の金属イオンの存在下で誘導されて転写及び翻訳を促進する。他の誘導性プロモーターも当業者には公知である。

一般的に、遺伝子発現配列は、必要に応じて、それぞれ転写及び翻訳の開始に関与する５’非転写配列及び５’非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含む。特に、このような５’非転写配列は、作動可能なように接続された核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含む、プロモーター領域を含むであろう。遺伝子発現配列は場合により、要望通りのエンハンサー配列又は上流活性化配列を含む。本明細書において使用される、本発明のイムノサイトカインをコードする核酸配列と遺伝子発現配列は、それらが、本発明のイムノサイトカインコード配列の発現又は転写及び／又は翻訳が遺伝子発現配列の影響下又は制御下に置かれるように共有結合されている場合に「作動可能に連結されている」と言われる。

５’遺伝子発現配列中のプロモーターの誘導により本発明のイムノサイトカインの転写が起こる場合、及び２つのＤＮＡ配列間の連結の性質により（１）フレームシフト突然変異が導入されないか、（２）プロモーター領域が本発明のイムノサイトカインの転写を指令する能力が妨害されないか、（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質へと翻訳される能力が妨害されない場合、２つのＤＮＡ配列は作動可能に連結されていると言われる。したがって、遺伝子発現配列は、核酸配列の転写を起こすことができ、よって生じた転写物が所望のポリペプチドへと翻訳されるならば、遺伝子発現配列は、本発明のイムノサイトカインをコードする核酸配列に作動可能に連結されているだろう。

有利には、前記核酸配列はイントロンを含む。なぜならプレｍＲＮＡ分子はしばしば、組換え分子の産生収率を向上させることが実証されたからである。どのようなイントロン配列も主張され得るが、一例として、ZAGO et al.（Biotechnol. Appl. Biochem., vol.52(Pt 3), p:191-8, 2009）及びCAMPOS-DA-PAZ et al.（Mol. Biotechnol., vol.39(2), p:155-8, 2008）に開示されたものを挙げることができる。

本発明のイムノサイトカインをコードする核酸は、インビボで単独で又はベクターを伴い送達され得る。

第三の態様では、本発明は、上記の核酸を含むベクターに関する。

その最も広い意味において、「ベクター」は本発明のイムノサイトカインをコードする核酸の細胞への導入を促進することのできる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下で起こるであろう分解の程度と比較して、低減された分解度で核酸を細胞に輸送する。一般的には、本発明において有用なベクターとしては、イムノサイトカイン核酸配列の挿入又は組込みによって操作された、プラスミド、コスミド、ファージミド、エピソーム、人工染色体、ウイルス、ウイルス源又は細菌源から得られた他のビヒクルが挙げられるがこれらに限定されない。

プラスミドベクターが好ましい種類のベクターであり、当技術分野において十分に記載され、当業者には周知である。例えば、Sanbrook et al., 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい。プラスミドの非制限的な例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられ、他のプラスミドも当業者には周知である。さらに、プラスミドは制限酵素及びライゲーション反応を使用してＤＮＡの特定の断片を除去及び付加することによりカスタム設計され得る。

好ましくは、核酸ベクターは、細菌及び哺乳動物細胞の両方において活性である選択マーカーを含むことができる。

第四の態様では、本発明は、前記の核酸又はベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞に関する。

本明細書において使用される「遺伝子操作された宿主細胞」という用語は、前記の核酸又はベクターを用いて形質導入された、形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞に関する。

適切な宿主細胞の代表例として、細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、真菌細胞、例えば酵母、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、動物細胞、例えばＣＨＯ細胞又はＣＯＳ細胞、植物細胞などを挙げることができる。適切な宿主の選択は、本明細書の教義から当業者の範囲内であると考えられる。

好ましくは、遺伝子操作された宿主細胞は、動物細胞、最も好ましくはＣＨＯ−Ｓ細胞（INVITROGEN、製造番号11619-012）である。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、組換えタンパク質、抗体、ペプチボディ（peptibody）、及び受容体リガンドなどの生物製剤の製造のためにバイオ医薬品産業において頻繁に使用されている。ＣＨＯ細胞がしばしば使用される理由の１つは、これらの細胞が、生物製剤の生産のための十分な安全性追跡記録を有するためである。これは、十分に特徴付けられた細胞株であると考えられ、結果として、必要とされる安全性試験は、他の細胞型に必要とされるよりも、いくつかの点で（例えばレトロウイルスの安全性）あまり厳密ではないだろう。それにも関わらず、インターロイキン１５の産生は、特にこの細胞においても特に困難である。

宿主細胞への前記の核酸又はベクターの導入は、カルシウムリン酸トランスフェクション；ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、又は電気穿孔法などの当業者には周知の方法によって行なうことができる。

本発明はまた、本発明に記載のイムノサイトカインを発現する遺伝子操作された宿主細胞を産生する方法に関し、該方法は、（ｉ）インビトロ又はエクスビボで上記の核酸又はベクターを宿主細胞に導入する工程、（ｉｉ）インビトロ又はエクスビボで得られた遺伝子操作された組換え宿主細胞を培養する工程、及び（ｉｉｉ）場合により、該イムノサイトカインを発現及び／又は分泌する細胞を選択する工程を含む。このような組換え宿主細胞を、本発明のイムノサイトカインの産生のために使用することができる。

本発明のイムノサイトカインを含む医薬組成物
本発明のさらなる目的は、最終的に薬学的に許容される担体を伴う、上記のイムノサイトカイン、それをコードする核酸、又は該核酸を含むベクターを含む、医薬組成物に関する。

「薬学的に許容される」という表現は、ヒトに投与された場合に、生理学的に耐容性であり、かつ典型的にはアレルギー反応又は類似の望ましくない反応、例えば胃の不調、眩暈などを生じない、分子実体及び組成物を指す。好ましくは、本明細書において使用される「薬学的に許容される」という表現は、動物、より特定するとヒトにおける使用について、連邦若しくは州政府の規制機関によって承認見込みであるか、又は、米国薬局方若しくは他の一般的に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。

「担体」という用語は、化合物と一緒に投与される、溶媒、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このような薬学的担体は、無菌液体、例えば水及び油、例えば石油、動物、植物、又は合成起源の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであり得る。

医薬組成物は、「有効量」の本発明のイムノサイトカインを含み、有効量は癌細胞の増殖を阻害するのに十分な、好ましくは腫瘍の増殖の退縮を誘導するのに十分なものである。投与のために使用される用量は、様々なパラメーターの関数として、特に使用される投与形態、関連のある病態、又は代替的には所望の処置期間の関数として適応させることができる。必然的に、医薬組成物の剤形、投与経路、用量、及び処方計画は必然的に、処置しようとする容態、病気の重度、被験者の年齢、体重及び性別などに依存する。以下に提供される有効量の範囲は本発明を制限するものではなく、好ましい用量範囲を示すものである。しかし、好ましい用量は個々の被験者に応じて調整され得、過度の実験を行なうことなく、当業者によって理解されかつ決定可能である。

本発明のイムノサイトカインの顕著な効力の観点から、当業者は、被験者の処置のために非常に少量を使用することを計画することができる。非制限的な例として、本発明のイムノサイトカインを、５０mg/kgから５μg/kg（被験者）の用量で、好ましくは１０mg/kgから１００μg/kgの用量で、最も好ましくは２．５mg/kgから５００μg/kgの用量で注射によって投与することができる。

一例として、本発明の医薬組成物は、局所、経口、鼻腔内、眼内、静脈内、筋肉内、腫瘍内、又は皮下投与などのために製剤化され得る。好ましくは、医薬組成物は、注射しようとする製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、若しくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、あるいは、場合に応じて滅菌水又は生理的食塩水の添加により注射液の復元が可能となる乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。適切な薬学的担体は、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。

本発明のイムノサイトカイン、それをコードする核酸、又は核酸ベクターは、緩衝液又は水中に可溶化され得るか、あるいは、エマルション、マイクロエマルション、ヒドロゲル（例えばＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡトリブロックコポリマーに基づくヒドロゲル）、マイクロスフィア、ナノスフィア、マイクロ粒子、ナノ粒子（例えば乳酸・グリコール酸共重合体マイクロ粒子（例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）；乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ））；ポリグルタミン酸マイクロスフィア、ナノスフィア、マイクロ粒子又はナノ粒子）、リポソーム、又は他のガレヌス製剤に取り込まれ得る。全ての場合において、該製剤は無菌でなければならず、かつシリンジの扱い易さが許容可能な程度となるように流動性でなければならない。それは製造及び保存の条件下で安定でなければならず、また細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防腐されていなければならない。

遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中において調製することができる。

分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中、並びに油中において調製することもできる。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含有する。

本発明に記載のイムノサイトカインは、中性又は塩の形態の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、例えば塩酸又はリン酸などの無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成された酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含む。遊離カルボキシル基と共に形成された塩はまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から導かれ得る。

担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒体であり得る。本発明のイムノサイトカインはまた、その生物学的利用能を高めるために、一例としてＰＥＧ化によって修飾されていてもよい。本発明のイムノサイトカインが核酸の形態を有する場合、担体は、ベクター、例えばウイルス（例えばＭＶＡ、ｒＡＡＶ、レンチウイルスなど）であってもよい。

適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいだろう。

注射用組成物の延長吸収は、該組成物に、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、ポリオール、並びに半減期を延長する共有結合及び非共有結合製剤を使用することによってもたらされ得る。

ペプチドの不安定性又は分解の原因には、加水分解及び変性をはじめとして数多くある。疎水性相互作用は、分子の集塊（すなわち凝集）を引き起こす場合がある。このような問題を低減又は防ぐために安定化剤を添加してもよい。

安定化剤としては、シクロデキストリン及びその誘導体が挙げられる（米国特許第５，７３０，９６９号参照）。最終製剤を安定化させるために、適切な保存剤、例えばスクロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、デキストラン、及びゼラチンも加えることができる。イオン性及び非イオン性界面活性剤、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクツロン酸、トレハロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、及びその混合物から選択された安定化剤を製剤に添加してもよい。アルキル金属塩又は塩化マグネシウムの添加は、ペプチドを安定化させ得る。該ペプチドを、デキストラン、コンドロイチン硫酸、デンプン、グリコーゲン、デキストリン、及びアルギン酸塩からなる群より選択されたサッカリドと接触させることによって、該ペプチドを安定化させ得る。添加することのできる他の糖としては、単糖類、二糖類、糖アルコール、及びその混合物（例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、キシリトール）が挙げられる。ポリオールはペプチドを安定化させ得、かつ水混和性又は水溶性である。適切なポリオールは、ポリヒドロキシアルコール、単糖類、及び二糖類、例えばマンニトール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチルグリコール、ビニルピロリドン、グルコース、フルクトース、アラビノ―ス、マンノース、マルトース、スクロース、及びそのポリマーであり得る。血清アルブミン、アミノ酸、ヘパリン、脂肪酸、及びリン脂質、界面活性剤、金属、ポリオール、還元剤、金属キレート剤、ポリビニルピロリドン、加水分解されたゼラチン、及び硫酸アンモニウムをはじめとする様々な賦形剤もペプチドを安定化させ得る。

サイトカイン療法の有望さは実際にこれらの新規サイトカインの同定からもたらされているが、さらにより根本的には、この分野は、補完的な免疫刺激能を有するいくつかのサイトカイン組合せの使用を通して達成され得る相乗的及び／又は新規な生物学的作用を確証的に実証する、絶え間なく増え続ける前臨床データから大いなる恩恵を受けている。ＲＬＩに基づくイムノサイトカインと可能性のある治療活性剤との組合せは、例えば、化学療法剤、血管新生抑制剤、又は免疫調節剤を含む。

好ましい実施態様では、本発明の組成物は、さらに他の治療活性剤、例えば化学療法剤、血管新生抑制剤、又は免疫調節剤を含み得る。

化学療法剤について、その治療効果は、一部には、免疫原性細胞死を誘導し、免疫抑制環境の平衡を保ち、原発性の大きな腫瘍を減量させその後に免疫攻撃を促進することによって、又は一過性のリンパ球減少症を誘導し続いて恒常的なリンパ球増殖を誘導することによってのいずれかによる、免疫応答に対する間接的な作用によって媒介され得ることが実証された。それらの多くは当業者には周知であり、本発明のイムノサイトカインと組み合わせ得る化学療法剤の一例として、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メトトレキサート、タキソール、タキソテア、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、イフォスファミド、ニトロソ尿素、白金複合体、例えばシスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルバジン、エトポシド、テニポシド、カンプトテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、タキサン、例えばドセタキセル及びパクリタキセル、ロイコボリン、レバミソール、イリノテカン、エストラムスチン、エトポシド、ナイトロジェンマスタード、ＢＣＮＵ、ニトロソ尿素、例えばカルムスチン及びロムスチン、ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン、イマチニブメシル酸塩、ヘキサメチルメラミン、トポテカン、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、チロホスチン、プロテアーゼ阻害剤、阻害剤ハービマイシンＡ、ゲニステイン、エルブスタチン、及びラベンダスチンＡを挙げることができる。

血管新生抑制剤については、それらは免疫系に対してオフターゲット効果を有し、その後、腫瘍免疫応答を促進し得ることが実証された。本発明のイムノサイトカインと組み合わせ得る血管新生抑制剤の一例として、そのチロシンキナーゼを介して血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）を標的化する薬物、例えばソラフェニブ、スニチニブ、及びパゾパニブ、又は哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、例えばテムシロリムス及びエベロリムスを挙げることができる。

本発明のイムノサイトカインと組み合わせ得る免疫調節剤については、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ１８、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮαなど）、ケモカイン／血管新生抑制性サイトカイン（ＩＰ１０、Ｍｉｇ、ＳＤＦ−１、ＲＡＮＴＥＳなど）、ＴＬＲアゴニスト、及び免疫調節抗体（抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＴＧＦβ抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体など）を挙げることができる。

治療法及び使用
さらなる態様では、本発明は、被験者における癌の処置のための前記のような医薬組成物、好ましくは、前記のイムノサイトカインを含む医薬組成物に関する。

本明細書において使用される「被験者」という用語は、哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、又は霊長類、最も好ましくはヒトを示す。

別の態様では、本発明は、被験者における癌を処置するために同時に、別々に、又は順次使用するための組合せ調製物としての、
（ｉ）上記のイムノサイトカイン、それをコードする核酸配列、又はこのような核酸配列を含むベクター、及び
（ｉｉ）治療剤、好ましくは抗癌剤
を含有する製品に関する。

さらに別の態様では、本発明は、前記の医薬組成物を被験者に投与する工程を含む、該被験者における癌を処置するための方法に関する。

最終の態様では、本発明は、それを必要とする被験者に
（ｉ）上記のイムノサイトカイン、それをコードする核酸配列、又はこのような核酸配列を含むベクター、及び
（ｉｉ）治療剤、好ましくは抗癌剤
の治療有効量を同時に、別々に、又は順次投与する工程を含む、癌を処置するための方法に関する。

本発明の状況において、本明細書において使用される「処置する」又は「処置」という用語は、このような用語を適用する疾患若しくは容態、又はこのような疾患若しくは容態の１つ以上の症状の進行を、元に戻す、軽減する、阻止する、又は該疾患若しくは容態を予防することを意味する。本明細書において使用される「癌を処置する」という表現は、癌細胞の増殖の抑制を意味する。好ましくは、このような処置により、腫瘍増殖の退縮、すなわち、測定可能な腫瘍のサイズの減少ももたらされる。最も好ましくは、このような処置により完全な腫瘍の退縮がもたらされる。

好ましくは、前記の癌は癌腫又は肺癌である。

最も好ましくは、「癌を処置する」という表現は、「腫瘍浸潤性リンパ球を活性化することによって癌を処置する」ことを意味する。

したがって、癌は、好ましくは血管付きの癌に相当する。

さらに好ましくは、前記癌は、アネルギー性のＴＩＬ集団を有する癌であり、前記癌は、進行癌、例えば腎細胞癌（ＲＣＣ）に相当する。

以下において、本発明は、アミノ酸配列、核酸配列、及び実施例を参照してより詳細に記載される。しかし、実施例の詳細によって本発明が制限されるものではない。むしろ、本発明は、本明細書の実施例に明確に記載されていないが当業者が過度な努力を行なうことなく発見した詳細を含む、あらゆる実施態様に関する。

実施例
１）ＲＬＩに基づくモジュロカイン
抗ＰＤ−１抗体（ｈＢＡＴ）ＲＬＩイムノサイトカインの構築
ＣＴ−０１１（ｈＢＡＴ又はｈＢＡＴ−１）の１つに対応する抗ＰＤ−１抗体軽鎖をコードする発現プラスミド。該抗体のキメラＩｇＧ重鎖配列が、２２アミノ酸のリンカー（配列番号１６）を用いて又は用いずに、３’末端においてＩＬ１５（配列番号３、９３位のアミノ酸はＫである）に融合されるように設計した。これらのヌクレオチド配列を合成し、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにGENEARTによってクローニングした。抗ＰＤ−１抗体の軽鎖及び重鎖の完全配列は、国際特許出願の国際公開公報第２００９／１０１６１１号に開示されている。

プラスミドＤＮＡの調製及びトランスフェクション試薬
４０kDaの鎖状ＰＥＩをPolyscienceから入手した。ＰＥＩを加熱しながら水中に溶解し、ＮａＯＨによって中和し、０．２２μmのフィルターを通した濾過によって滅菌することによって１mg/mLのストック溶液を調製した。ストック溶液を分注し、−２０℃で保存した。

トランスフェクション用のプラスミドＤＮＡを、製造業者のプロトコール（Macherey-Nagel）に従ってプラスミド精製キットを使用して、０．２２μmのフィルターを通した過により滅菌して精製した。

イムノサイトカインの産生及び精製
１−懸濁液中での一過性トランスフェクション
慣用的に維持されたＣＨＯ−Ｓ（Invitrogen）細胞を１×１０^６個の細胞/mLの密度でPowerCHO2培地（Lonza）中に播種し、５％ＣＯ_２を含む振盪インキュベーター（１００rpm）中３７℃で一晩培養した。トランスフェクションのために、その後、細胞をＣＤ−ＣＨＯ培地（Invitrogen）で２×１０^６個の細胞/mLまで希釈した。１５０mM ＮａＣｌを使用して培養容量の１０％中にトランスフェクション複合体を調製した。発現構築物ＤＮＡ（２．５mg/Lの培養容量、重鎖をコードするプラスミドと軽鎖をコードするプラスミドを１：２の比で使用して）をＮａＣｌ中に希釈されたＰＥＩ（１０mg/Lの最終培養容量）と混合し、室温で１０分間インキュベートし、その後、培養液に加えた。細胞を振盪インキュベーター（１３０rpm）中３７℃で５時間培養し、その後、PowerCHO2培地を用いて培養容量を倍加させた。上清をトランスフェクションから５日後に回収した。

２−接着細胞上での安定なトランスフェクション
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）を、１−グルタミン、１０％ＦＣＳ及びペニシリン（１００単位/ml）／ストレプトマイシン（１００μg/ml）の補充されたＤＭＥＭ中で増殖させ、製造業者によって推奨されるように、リポフェクタミン２０００試薬（Invitrogen）を使用して各ベクターを用いてトランスフェクトした。クローンを、それぞれ抗ＣＤ２０抗体アセチル化ＩＣＫ及び抗ＣＤ２０ ＩＣＫについて、ジェネテシンとハイグロマイシン（０．５mg/ml）又はブラストサイジンとハイグロマイシン（５μg/mL及び１００μg/mL）を含有する培地を用いた限界希釈によって選択した。各クローンの培養上清を、ＥＬＩＳＡによって二官能基タンパク質の産生についてアッセイした。ＩＣＫの産生について、選択されたクローンを、２５％ＤＭＥＭ培地及び７５％ＡＩＭ培地（Invitrogen）中で増殖させた。その後、細胞を１００％のＡＩＭ中に維持し、上清を回収し、２日間毎に１０日間交換した。

３−上清の精製：
回収した上清を３０００rpmで４℃で２０分間遠心分離にかけ、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．８に平衡を保ち、０．２２μmのフィルターを通して濾過した。馴化培地を、製造業者の説明書に従ってプロテインＡカラム（ＧＥ）を使用してアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。精製されたタンパク質を５０kDaのアミコンユニット（ミリポア）を用いて濃縮した。この工程の最中に、溶出緩衝液をＰＢＳと交換した。精製されたタンパク質を最後にＥＬＩＳＡ及び２８０nmでの吸光度測定によってアッセイした。純度は電気泳動によって評価された。

４−ＥＬＩＳＡによる免疫グロブリン部分の検出
Maxisorp平底マイクロタイタープレート（NUNC）を、ＰＢＳ中で１．５μg/mLに希釈されたヤギ抗ヒト抗体 １００μL（UP892370, Interchim）を用いて４℃でコーティングした。その後、プレートを遮断緩衝液 ２００μL（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ＋０．１％ＴＷＥＥＮ２０）を用いて３７℃で１時間かけて遮断した。その後、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．１％ＴＷＥＥＮ２０）を用いて３回洗浄し、遮断緩衝液で希釈された試料を加え、３７℃で３０分間インキュベートした（１００μL）。３回洗浄した後、１：１００００に希釈されたペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたヤギ抗ヒトＩｇＧ１抗体（109-036-003, Jackson）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。ＴＭＢ基質（Interchim）を使用してタンパク質レベルを決定し、４５０nmでプレートを解読した。精製リツキシマブ（ロシュ）を使用してプレート上で標準曲線を作成した。

５−ＥＬＩＳＡによるサイトカイン部分の検出
Maxisorp平底マイクロタイタープレート（NUNC）を、炭酸緩衝液中で２μg/mLに希釈された抗ＩＬ１５抗体Ｂ−Ｅ２９ １００μL（Diaclone）を用いて４℃で１６時間かけてコーティングした。その後、プレートを遮断緩衝液 ２００μL（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）を用いて３７℃で１時間かけて遮断した。その後、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）を用いて３回洗浄した。ＴＢＳ＋０．０５％ＢＳＡ中で希釈された試料を加え、３７℃で１時間３０分かけてインキュベートした（１００μL）。３回洗浄した後、２００ng/mLに希釈されたビオチニル化抗ＩＬ１５抗体ＢＡＭ２４７（R&D system）を加え、３７℃で１時間３０分インキュベートした。プレートを３回洗浄し、１：１０００に希釈されたペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたストレプトアビジンを加えた。ＴＭＢ基質（Interchim）を使用してタンパク質レベルを決定し、４５０nmでプレートを解読した。ＩＬ−１５（Peprotech）を使用してプレート上で標準曲線を作成した。

ＴＩＬの表現型
腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）が、２人の腎細胞癌患者から得られた生検材料又は腎摘出組織から、ＤＮＡアーゼ及びコラゲナーゼによる消化後に得られた。これらのＴＩＬは殆ど、腫瘍進行を可能とするアネルギー性であった。

ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３及びＩＬ−１５Ｒαに関するこれらのＴＩＬの表現型を、免疫蛍光法によって決定した。

図１は、患者Ａ（図１Ａ）及び患者Ｂ（図１Ｂ）について得られた表現型を示す。

イムノサイトカインの結合活性
抗ＰＤ−１抗体 ＲＬＩモジュロカインの特異的結合をフローサイトメトリーによって評価した。モジュロカインがエフェクター細胞上のＩＬ−１５受容体に結合する能力を、Ｋｉｔ２２５で試験した。標的化細胞上にコーティングされたモジュロカインを、ＰＥにコンジュゲートさせたヤギ抗ヒトＩｇＧｍＡｂ（PN IM0550, Beckman Coulter）を用いて、又はＰＥ−ストレプトアビジン（Sigma-Aldrich）に結合させたビオチニル化マウス抗ＩＬ１５抗体（BAM247, R&D system）を用いて顕現させた。標的化細胞（１×１０^５個）を各ＩＣＫと共に４℃で１時間インキュベートし、洗浄し、その後、ＰＥ−コンジュゲートと共に４℃で１時間インキュベートした。洗浄した細胞を最後にFACScalibur（Becton Dickinson）で分析した。

結果は、モジュロカインがＩＬ−１５受容体に結合し、またＰＤ−１にも結合することを示した。

イムノサイトカインの増殖活性
得られたモジュロカインのインターロイキン−１５媒介性の増殖活性を試験し、ＲＬＩと比較した。ＩＣＫに対するＫｉｔ２２５細胞及び３２Ｄβ細胞の増殖応答を、[^３Ｈ]チミジンの取り込みによって測定した。細胞を培養培地中に３日間維持し、２回洗浄し、それぞれＫｉｔ２２５及び３２Ｄβについてサイトカインを含まない培地中で２４時間又は４時間かけて枯渇させた。その後、それらをマルチウェルプレートに１０^４個の細胞/ウェルで１００μl中に播種し、漸増濃度の試料の補充された培地中で４８時間培養した。ヒトｒＩＬ−１５及びＲＬＩを検量用試料として使用した。細胞に０．５μCi/ウェルの[^３Ｈ]チミジンを１６時間かけてパルス投与し、ガラス繊維フィルター上に収集し、細胞に関連した放射能を測定した。結果は、モジュロカインの増殖活性がＲＬＩの増殖活性と同等であったことを確認した。

ＲＬＩモジュロカインによる強力なＴＩＬの再活性化
腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）は、２５人の腎細胞癌患者から得られた生検材料又は腎摘出組織から、ＤＮＡアーゼ及びコラゲナーゼによる消化後に得られた。これらのＴＩＬは殆ど、腫瘍進行を可能とするアネルギー性であった。

２５人の患者のＴＩＬを、各患者について同じモル濃度のＲＬＩ、ＨＢＡＴ（ＣＴ０１１＝抗ＰＤ１抗体）、ＨＢＡＴ−ＲＬＩ（モジュロカイン）、又はＨＢＡＴとＲＬＩの組合せの非存在下又は存在下でインキュベートすることによって、該ＴＩＬの再活性化を試験した。ＲＬＩは患者１〜８については１μg/mlで使用され、患者９〜２５については３００ng/mlで使用された。

刺激から４８時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって上清中のＩＦＮγ濃度を測定することによって再活性化を決定した。

２０pg/ml未満のＩＦＮγを常に分泌していた刺激されなかったＴＩＬを除く、腎細胞癌患者から得られた２５個のＴＩＬの生データを表１に提示する。

組合せ

図２は、ＲＬＩ、ＨＢＡＴ、ＨＢＡＴ−ＲＬＩ及びＨＢＡＴ＋ＲＬＩを用いて活性化されたＴＬＩから産生されたＩＦＮγの平均値及び中央値を示す（^＊ｐ＜０．０５）。

結果は、抗ＰＤ−１抗体のみを用いるとＴＩＬの活性化は殆ど全く得られなかったことを示す。ＲＬＩ単独又は抗ＰＤ１抗体と組み合わせたＲＬＩを用いると幾分かのＴＩＬの活性化が得られた。今回、驚くべきことに、ＲＬＩ及びまたＲＬＩ＋ＨＢＡＴと比較して強力かつ全体的な活性化が、本発明のイムノサイトカインを用いて得られた（表１及び図２）。

これらの結果は新規な療法を構想することを可能とする。

ＣＴ２６細胞癌の実験腫瘍モデルにおけるモジュロカインの効力の評価
ＣＴ２６は、ｎ−ニトロソ―ｎ−メチルウレタン−（ｎｎｍｕ）により誘発されたマウス未分化大腸癌細胞株である。

ＢＡＬＢ／Ｃマウスは右側腹部に、ＣＴ２６腫瘍細胞（２×１０^５個／マウス）の皮下注射を受けるだろう。

９日目に、腫瘍が２０〜３０mm²に達した時、様々な群のマウスを、１６又は３２μg/マウスのモジュロカイン抗ＰＤ１抗体−ＲＬＩのみを用いて処置し、等モル濃度の抗ＰＤ１抗体のみ、ＲＬＩのみ（１００４−１４ｐ）、抗ＰＤ１抗体とＲＬＩの組合せ、又は対照群のＰＢＳと比較した。

モジュロカイン又はＲＬＩのみを９日目から１週間に２回４週間注射する。抗ＰＤ１抗体のみを９日目から注射し、その後、１週間に１回４週間注射する。組合せ群では、抗ＰＤ１抗体を９日目から注射し、その後、１週間に１回４週間注射し、ＲＬＩを１５日目から注射し、その後１週間に２回３週間注射する。腫瘍を１週間に３回キャリパーを用いて測定し、腫瘍面積を以下のように計算した：長さ×幅。腫瘍サイズが３００mm²に達した場合又は潰瘍化した場合にマウスを屠殺する。原発性腫瘍の増殖、生存期間、及び最終的には退縮を評価する。対照群は、対応する用量の抗体アイソタイプ又は関連性のないＲＬＩ−抗体コンジュゲート（抗ＨＥＲ２抗体−ＲＬＩ）を受けた。

ＢＡＬＢ／Ｃマウスは右側腹部に、ＣＴ２６腫瘍細胞（２×１０^５個／マウス）の皮下注射を受けた。９日目に腫瘍が２０〜３０mm²に達した時、マウスを、１６又は３２μg/マウスのモジュロカイン抗ＰＤ−Ｌ１抗体−ＲＬＩのみを用いて処置し、等モル濃度の抗ＰＤ−Ｌ１抗体のみ（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）、ＲＬＩのみ（１００４−１４ｐ）、抗ＰＤ−ＬＩ抗体（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）とＲＬＩの組合せ、又は対照群のＰＢＳと比較した。

モジュロカイン又はＲＬＩのみを、９日目から１週間に２回４週間注射する。抗ＰＤ１抗体のみを９日目から注射し、その後、１週間に１回４週間注射する。組合せ群では、抗ＰＤ１抗体を９日目から注射し、その後、１週間に１回４週間注射し、ＲＬＩを１５日目から注射し、その後、１週間に２回３週間注射する。腫瘍を１週間に３回キャリパーを用いて測定し、腫瘍面積を以下のように計算した：長さ×幅。腫瘍サイズが３００mm²に達した場合又は潰瘍化した場合にマウスを屠殺する。原発性腫瘍の増殖、生存期間、及び最終的には退縮を評価する。対照群は、対応する用量の抗体アイソタイプ又は関連性のないＲＬＩ−抗体コンジュゲート（抗ＨＥＲ２抗体−ＲＬＩ）を受けた。

肺ｔｃ−１実験腫瘍モデルにおけるモジュロカインの効力の評価
腫瘍細胞株ＴＣ−１を、Ｃ５７Ｂｌ/６マウスの原発性肺上皮細胞から得た。細胞を両種指向性レトロウイルスベクターｌｘｓｎ１６ｅ６ｅ７を用いて不死化させ、続いて、活性化ヒトｃ−ｈａ−ｒａｓ発癌遺伝子を発現しているｐｖｅｊｂプラスミドを用いて形質転換した。細胞はＨＰＶ−１６Ｅ７の発現について陽性である。

Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは右側腹部に、ＴＣ−１腫瘍細胞（１×１０^５個／マウス）の皮下注射を受けるだろう。９日目に腫瘍が２０〜５０mm²に達した時、様々な群のマウスを、１６又は３２μg/マウスのモジュロカイン抗ＰＤ１抗体−ＲＬＩのみを用いて処置し、等モル濃度の抗ＰＤ１抗体のみ、ＲＬＩのみ（１００４−１４ｐ）、抗ＰＤ１抗体とＲＬＩの組合せ、又は対照群のＰＢＳと比較する。モジュロカイン又はＲＬＩのみを９日目から１週間に２回４週間注射する。抗ＰＤ１抗体のみを９日目から注射し、その後、１週間に１回４週間注射する。組合せ群では、抗ＰＤ１抗体を９日目から注射し、その後、１週間に１回４週間注射し、ＲＬＩを１５日目から注射し、その後１週間に２回３週間注射する。腫瘍を１週間に３回キャリパーを用いて測定し、腫瘍面積を以下のように計算した：長さ×幅。腫瘍サイズが３００mm²に達した場合又は潰瘍化する場合にマウスを屠殺する。原発性腫瘍の増殖、生存期間、及び最終的には退縮を評価する。

転移性黒色腫Ｂ１６Ｆ１０実験腫瘍モデルにおけるモジュロカインの効力の評価
３×１０^４個のＢ１６Ｆ１０細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの腹側部に０日目に皮内注射することによってＢ１６Ｆ１０腫瘍を移植する。腫瘍細胞を生着させた後、４日目に療法を開始する。抗ＰＤ−Ｌ１抗体−ＲＬＩモジュロカインを１６又は３２μg/マウスで腹腔内注射し、等モル濃度の抗ＰＤ−Ｌ１抗体のみ（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）、ＲＬＩのみ（１００４−１４ｐ）、抗ＰＤ−ＬＩ抗体（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）とＲＬＩの組合せ、又は対照群のＰＢＳと比較する。

モジュロカイン、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ、ＲＬＩ、又は抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ＋ＲＬＩの組合せを、４日目から１週間に２回４週間注射する。腫瘍を１週間に３回キャリパーを用いて測定し、腫瘍面積を以下のように計算した：長さ×幅。腫瘍サイズが３００mm²に達した場合又は潰瘍化した場合にマウスを屠殺する。原発性腫瘍の増殖、生存期間、及び最終的には退縮を評価する。対照群は、対応する用量の抗体アイソタイプ又は関連性のないＲＬＩ−抗体コンジュゲート（抗ＨＥＲ２抗体−ＲＬＩ）を受けた。

進行膀胱癌ＭＢ４９実験腫瘍モデルにおけるモジュロカインの効力の評価
ＭＢ４９腫瘍細胞株は、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスの膀胱上皮を起源とする発癌物質により誘発された腫瘍から派生する。１０^６個のＭＢ４９膀胱癌細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背中の真皮上層に皮下注射した。腫瘍が約１５mm²のサイズで明瞭に見えるようになりかつ触診可能となる時に相当する腫瘍接種後の６日目に処置を開始する。抗ＰＤ−１抗体−ＲＬＩ及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体モジュロカインを１６又は３２μg/マウスで腹腔内注射し、等モル濃度の抗ＰＤ１抗体のみ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のみ（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）、ＲＬＩのみ（１００４−１４ｐ）、抗ＰＤＩ抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）とＲＬＩの組合せ、又は対照群のＰＢＳと比較する。

モジュロカイン、抗ＰＤ−１ｍＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）、ＲＬＩ、及び抗ＰＤ−１ｍＡｂ又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）＋ＲＬＩの組合せを、６日目から１週間に２回４週間注射する。腫瘍を１週間に３回キャリパーを用いて測定し、腫瘍面積を以下のように計算した：長さ×幅。腫瘍サイズが３００mm²に達した場合又は潰瘍化した場合にマウスを屠殺する。原発性腫瘍の増殖、生存期間、及び最終的には退縮を評価する。対照群は、対応する用量の抗体アイソタイプ又は関連性のないＲＬＩ−抗体コンジュゲート（抗ＨＥＲ２抗体−ＲＬＩ）を受けた。

乳癌４Ｔ１実験腫瘍モデルにおけるモジュロカインの効力の評価
ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺に、０日目に５×１０^４個の４Ｔ１乳癌細胞を接種した。腫瘍が約１５mm〜２０mm²のサイズで明瞭に見えるようになりかつ触診可能となる時に相当する腫瘍接種後の１０日目に処置を開始する。抗ＰＤ−１抗体−ＲＬＩ及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体モジュロカインを１６又は３２μg/マウスで腹腔内注射し、等モル濃度の抗ＰＤ１抗体のみ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のみ（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）、ＲＬＩのみ（１００４−１４ｐ）、抗ＰＤＩ抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）とＲＬＩの組合せ、又は対照群のＰＢＳと比較する。

モジュロカイン、抗ＰＤ−１ｍＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）、ＲＬＩ、及び抗ＰＤ−１ｍＡｂ又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）＋ＲＬＩの組合せを、１０日目から１週間に２回４週間注射する。対照群は、対応する用量の抗体アイソタイプ又は関連性のないＲＬＩ−抗体コンジュゲート（抗ＨＥＲ２抗体−ＲＬＩ）を受けた。腫瘍を１週間に３回キャリパーを用いて測定し、腫瘍面積を以下のように計算した：長さ×幅。マウスを２７日目に屠殺した。転移性肺結節を両眼顕微鏡下で計数する。

卵巣癌ＩＤ８実験腫瘍モデルにおけるモジュロカインの効力の評価
ＩＤ８−ＶＥＧＦ卵巣癌細胞株を、マウス卵巣上皮乳頭状漿液性腺癌細胞株から事前に発達させた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右腹側部に、５×１０^６個のＩＤ８腫瘍細胞を皮下移植した。腫瘍が約１５〜２０mm²のサイズで明瞭に見えるようになりかつ触診可能となる時に相当する腫瘍接種後の１０日目に処置を開始する。抗ＰＤ−１抗体−ＲＬＩ及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体モジュロカインを１６又は３２μg/マウスで腹腔内注射し、等モル濃度の抗ＰＤ１抗体のみ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のみ（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）、ＲＬＩのみ（１００４−１４ｐ）、抗ＰＤＩ抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）とＲＬＩの組合せ、又は対照群のＰＢＳと比較する。

モジュロカイン、抗ＰＤ−１ｍＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）、ＲＬＩ、及び抗ＰＤ−１ｍＡｂ又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）＋ＲＬＩの組合せを、１０日目から１週間に２回４週間注射する。対照群は、対応する用量の抗体アイソタイプ又は関連性のないＲＬＩ−抗体コンジュゲート（抗ＨＥＲ２抗体−ＲＬＩ）を受けた。腫瘍を１週間に３回キャリパーを用いて測定し、腫瘍面積を以下のように計算した：長さ×幅。腫瘍サイズが３００mm²に達した場合又は潰瘍化した場合にマウスを屠殺した。

前立腺癌ＲＭ−１実験腫瘍モデルにおけるモジュロカインの効力の評価
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに、２×１０^５個のＲＭ−１マウス前立腺癌細胞を皮下接種した。腫瘍が約１５〜２０mm²のサイズで明瞭に見えるようになりかつ触診可能となる時に相当する腫瘍接種後の３日目に処置を開始する。抗ＰＤ−１抗体−ＲＬＩ及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体モジュロカインを１６又は３２μg/マウスで腹腔内注射し、等モル濃度の抗ＰＤ１抗体のみ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のみ（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）、ＲＬＩのみ（１００４−１４ｐ）、抗ＰＤＩ抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）とＲＬＩの組合せ、又は対照群のＰＢＳと比較する。

モジュロカイン、抗ＰＤ−１ｍＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）、ＲＬＩ、及び抗ＰＤ−１ｍＡｂ又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン１０ Ｆ．９Ｇ２、Bio-XCell）＋ＲＬＩの組合せを、３日目から１週間に２回４週間注射する。対照群は、対応する用量の抗体アイソタイプ又は関連性のないＲＬＩ−抗体コンジュゲート（抗ＨＥＲ２抗体−ＲＬＩ）を受けた。腫瘍を１週間に３回キャリパーを用いて測定し、腫瘍面積を以下のように計算した：長さ×幅。腫瘍サイズが３００mm²に達した場合又は潰瘍化した場合にマウスを屠殺した。

Claims (15)

1. ａ）コンジュゲート、及び
   ｂ）該コンジュゲートに共有原子価によって直接的に又は間接的に連結されている免疫調節抗体か、該抗体対応物と同じ抗原と反応することのできる該抗体の断片か
   を含むイムノサイトカインであって、
   該コンジュゲートは、
   （ｉ）ｋｉｔ２２５細胞株の増殖誘導に対するヒトインターロイキン−１５の活性の少なくとも１０％を有する、インターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
   （ｉｉ）ヒトインターロイキン−１５に対するＩＬ−１５Ｒαのスシドメインの結合活性の少なくとも１０％を有する、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド
   を含み、
   前記免疫調節抗体が、免疫抑制受容体を阻害し、ＰＤ−１アンタゴニストから選択される、前記イムノサイトカイン。
2. 免疫抑制受容体を阻害する前記免疫調節抗体が、抗ＰＤ−１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体から選択される、請求項１のイムノサイトカイン。
3. 免疫抑制受容体を阻害する前記免疫調節抗体が、ニボルマブ、Ｍｅｒｃｋ３７４５又はＣＴ−０１１（ｈＢＡＴとしても知られる）、ランブロリズマブ、ＡＭＰ５１４、ＭＤＸ−１ １０５及びＹＷ２４３．５５．Ｓ７０から選択される、請求項２のイムノサイトカイン。
4. ａ）コンジュゲートのポリペプチドｉ）とｉｉ）が融合タンパク質において共有結合で連結されており；及び
   ｂ）該コンジュゲートと抗体又はその断片が、融合タンパク質において共有結合で連結されている、請求項１〜３のいずれか一項のイムノサイトカイン。
5. 前記インターロイキン１５が配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項のイムノサイトカイン。
6. ＩＬ−１５Ｒαのスシドメインが配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項のイムノサイトカイン。
7. ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ｉｉ）が配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項のイムノサイトカイン。
8. 前記コンジュゲートが、ＩＬ−１５Ｒαのスシドメイン又はその誘導体のアミノ酸配列に対してＣ末端位にインターロイキン１５又はその誘導体のアミノ酸配列を含み、該コンジュゲートのアミノ酸配列が前記抗体又はその断片のアミノ酸配列に対してＣ末端位にある、請求項７のイムノサイトカイン。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に定義されたイムノサイトカインをコードする核酸。
10. 請求項９に定義された核酸を含むベクター。
11. 請求項９の核酸又は請求項１０のベクターを用いて遺伝子工学操作された宿主細胞。
12. 該宿主細胞は、動物細胞である、請求項１１の宿主細胞。
13. 該宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項１１の宿主細胞。
14. 請求項１〜８のいずれか一項に定義されたイムノサイトカイン、請求項９の核酸、又は請求項１０のベクターを含み、薬学的に許容される担体と会合された、医薬組成物であって、被験者における癌の処置用である、医薬組成物。
15. 癌が、腎細胞癌（ＲＣＣ）を含む進行癌を処置するための、請求項１４の医薬組成物。