JP4524816B2 - Ｉｌ−６レセプター・ｉｌ−６直結融合蛋白質 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リンカー配列を介さずに直結されたインターロイキン−６レセプター（以下ＩＬ−６Ｒと略す）・インターロイキン−６（以下ＩＬ−６と略す）融合蛋白質、該融合蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された宿主、該宿主を培養する方法、該宿主の培養物から該融合蛋白質を精製する方法、該融合蛋白質を含むことを特徴とする新規な造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅剤、及び該融合蛋白質を主成分として含む新規な血小板増多剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＬ−６タイプのサイトカインに属するＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ ｆａｃｔｏｒ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ−Ｍ、Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｎ−１は、いずれも、少なくとも１つはシグナル伝達蛋白質ｇｐ１３０を含むレセプター複合体を介してシグナルを伝えることが知られている。ＩＬ−６を例にとると、ＩＬ−６はＩＬ−６Ｒに結合し、その結果生じたＩＬ−６・ＩＬ−６Ｒ複合体がｇｐ１３０に結合する。
【０００３】
造血系はＩＬ−６が重要な役割を示す生体防御系のひとつである。造血系の細胞におけるＩＬ−６Ｒの発現様式はヒトとマウスでは異なる。メチルセルロース培地上で顆粒球・マクロファージコロニー、赤芽球コロニー、巨核球コロニー、及び混合コロニーを形成することができるヒトの未分化な造血前駆細胞は、十分な数のＩＬ−６Ｒを発現していない（Ｔａｊｉｍａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４、１９９６年参照）。したがって、ヒトの未分化な造血前駆細胞はＩＬ−６にはほとんど反応しないが、ＩＬ−６・ＩＬ−６Ｒ複合体には強く反応する。一方、マウスの未分化な造血前駆細胞は十分な数のＩＬ−６Ｒを発現している。さらに、中畑と本発明者らはヒトの巨核球の前駆細胞は十分な数のＩＬ−６Ｒを発現していなことを発見した（平成９年特許願第３２５８４７号）。これらの知見は、ＩＬ−６をマウスに投与すると血小板数の有意な増多が観察されるが、ＩＬ−６をヒトに投与すると効果が限定されることと合致する。
【０００４】
ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６Ｒの結合定数は５ｘ１０-9Ｍであることが報告されている（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０８巻、６７３頁、１９９０年参照）。これは２００ｎｇ／ｍｌ（１ｘ１０-8Ｍ）のＩＬ−６（分子量２万）と５００ｎｇ／ｍｌ（１ｘ１０-8Ｍ）の可溶性ＩＬ−６Ｒ（分子量５万）を混合すると、半数の分子が単体で存在することを意味する。実際、ＩＬ−６Ｒを発現していない細胞に十分に作用させるには１０００ｎｇ／ｍｌ以上の可溶性ＩＬ−６Ｒを必要とする。
【０００５】
遺伝子工学を用いると、天然ではそれぞれ別の蛋白質として存在する２種類の蛋白質を１本のポリペプチド鎖から成る融合蛋白質として発現させることができる。互いに結合する性質をもつ２種類の蛋白質を融合蛋白質として発現させた場合、該２種類の蛋白質が融合された状態でそれぞれ本来の構造（生理活性を発現しうる構造）をとり得れば両者の結合は強固となり、解離は融合されていない場合に比較して起こりにくくなることが考えられる。
【０００６】
融合蛋白質において２種類の蛋白質が本来の構造をとるためには、２種類の蛋白質間に立体障害が起こらないことが必要である。更には、融合させた本来の構造を有する２種類の蛋白質が互いに結合できる程度の自由度を有していることも必要である。このため従来は、主にグリシン残基やセリン残基のような自由度の高いアミノ酸残基を５〜２０個つないでリンカーとし、リンカーを介して蛋白質を融合するのは普通である。このような、融合される蛋白質には含まれていない、本来無関係のリンカーを介して間接的に融合することで、２種類の蛋白質間に立体障害を生じさせず、かつ、互いに結合可能となる程度の自由度を与えることができる。
【０００７】
例えば、互いに結合する性質をもつ抗体のＨ鎖のＶ領域とＬ鎖のＶ領域を融合蛋白質として発現させる場合は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（Ｇはグリシン残基、Ｓはセリン残基）がリンカー配列として報告されている（Ｈｏｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、５８７９頁、１９８８年参照）。
【０００８】
互いに結合する性質をもつＩＬ−６ＲとＩＬ−６についても、最近になってリンカーを介して両者を結合した融合蛋白質（図１（ａ）はイラスト図）が報告されている。一つはＩＬ−６Ｒの３２３番目のアラニン残基のＣ末端側に配列番号６０で示される、ＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥというＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒには含まれていない、本来無関係なリンカーを結合し、更にそのＣ末端にＩＬ−６を結合した融合蛋白質である（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１５、１４２頁、１９９７年参照）。２番目は、ＩＬ−６Ｒの３５６番目のバリン残基のＣ末端にＥＦＭ（Ｅはグルタミン酸残基、Ｆはフェニルアラニン残基、Ｍはメチオニン残基）というリンカーを結合し、さらにそのＣ末端側にＩＬ−６が結合した融合蛋白質である（Ｃｈｅｂａｔｈら、Ｅｕｒ．ＣｙｔｏｋｉｎｅＮｅｔｗ．、８、３５９頁、１９９７年参照）。また本出願人らも、ＩＬ−６Ｒの３４４番目のロイシン残基のＣ末端にＳＳＥＬＶ（Ｌはロイシン残基、Ｖはバリン酸残基）というリンカーを結合し、更にそのＣ末端側にＩＬ−６が結合した融合蛋白質を発明している（平成１０年特許願第２９２１号）。
【０００９】
ところで、一般的に、異種蛋白質を遺伝子組換えで作製する場合、宿主が天然に発現するプロテアーゼの作用により発現された異種蛋白質が切断されることが指摘されている。従って、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質においても、宿主中で発現された後に宿主のプロテアーゼによる切断作用を受ける可能性がある。特にピキア・パストリス種の酵母は多種のプロテアーゼを発現することが知られているが、前述した報告ではこの点について述べられていない。仮に宿主が発現するプロテアーゼの切断作用によってＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質が切断されているのであれば、かかる切断作用に抵抗性のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を提供することにより、従来に比較してより多量のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をピキア・パストリス種の酵母や他の宿主の培養液から取得することが可能となる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
融合蛋白質は２種類の蛋白質の結合状態を強固に維持することが可能と考えられるため、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６のように、これら２種類の蛋白質が結合した状態でＩＬ−６のシグナル伝達系を形成する蛋白質を医薬品としてヒト等の体内に投与する場合に特に有効と考えられる。
【００１１】
融合蛋白質を体内に持続的に投与する医薬品として開発する場合、リンカーは結合される蛋白質には含まれていない、これら蛋白質とは無関係の配列であり、しかも独自の立体構造をとるために上記免疫反応が惹起される可能性が高いことが課題となる。従って、一般的にリンカーはできるだけ短い配列であることが好ましく、更には全くリンカーが存在しないことが最も好ましい。
【００１２】
しかし、前述したように融合蛋白質には、２種類の蛋白質間に立体障害等が起こらないこと、及び、融合された本来の構造を有する２種類の蛋白質が互いに結合できる程度の自由度を有していることが必要である。例えばリンカーを使用せずにＩＬ−６ＲとＩＬ−６を直接融合させる場合、両者の立体障害を起こさず、かつ両者が互いに結合できる程度の自由度を有し得るようにするためには、融合させる蛋白質の順序、Ｎ末端側蛋白質のどのアミノ酸残基にどのＣ末端側アミノ酸残基を結合するか等、決定しなければならない事項が数多くある。
【００１３】
ＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質については、前記した３種類のリンカーを用いた例しか報告されておらず、リンカーを介して両者が結合したものしか知られていない。図１（ａ）はリンカーを介して両者が結合した融合蛋白質のイラスト図である。一方、リンカーを介することなく両者が結合されたものについては報告されていない。
【００１４】
そこで本発明は、図１（ｂ）に示したような、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６がリンカーを介することなく直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質等を提供することを目的とするものである。また本発明は、宿主、特にピキア・パストリス種の酵母が発現するプロテアーゼの切断作用に対して抵抗性を有するＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質、及び該融合蛋白質をコードする遺伝子を提供することをも目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らはＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質について鋭意検討した結果、リンカーを介することなくＮ末端側にＩＬ−６Ｒが、Ｃ末端側にＩＬ−６が配置された融合蛋白質を完成するに至った。即ち本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ残基の一つが直接に結合していることを特徴とするＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質である。また本発明者らは、ＩＬ−６のＮ末端３７番目のリジン残基のＣ末端側がプロテアーゼの切断作用を受けることを見いだし、一次構造中のプロテアーゼ切断部位に変異が挿入され、プロテアーゼに対する抵抗性を有することを特徴とするプロテアーゼ抵抗性のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質、中でも、ＩＬ−６ＲのＣ末端側に、Ｎ末端２８番目のアラニン残基から３７番目のリジン残基までの１０アミノ酸残基が欠失したＩＬ−６が結合した、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質と、これをコードする遺伝子を完成するに至った。
【００１６】
また本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子である。
【００１７】
更に本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）種の酵母である。
【００１８】
更に本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス種の酵母を培養し、当該培養物からＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を分泌型蛋白質として採取することを特徴とするＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の製造法である。
【００１９】
更に本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス種の酵母をメタノールを含まず天然物由来の炭素源を含む培地で培養し、途中でメタノールを添加して培養することを特徴とするＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の製造法である。
【００２０】
更に本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を含有する溶液を、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの３種類のクロマトグラフィーにかけ、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を採取することを特徴とするＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の製造法である。
【００２１】
更に本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を含むことを特徴とする造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅剤である。
【００２２】
そして本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を主成分として含む血小板増多剤である。以下本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明の融合蛋白質は、そのＮ末端側にＩＬ−６Ｒが位置し、Ｃ末端側にＩＬ−６が位置し、両蛋白質の間がリンカーを介することなく直接結合されていることを特徴とするものである。前記したように、プロテアーゼに対する抵抗性付与のみを目的とする場合は、両蛋白質の間はポリペプチドリンカーを介して結合しても良いが、投与の際の抗原性低減等をも考慮するのであれば、ポリペプチドリンカーを介することなく直接結合されていることが好ましい。リンカーを用いる場合には、例えば公知のリンカー配列（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１５、１４２頁、１９９７年；Ｃｈｅｂａｔｈら、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．、８、３５９頁、１９９７年）を使用したり、ＩＬ−６Ｒの３４４番目のロイシン残基のＣ末端にセリン残基−セリン残基−グルタミン酸残基−ロイシン残基−バリン酸残基というリンカーを結合し、更にそのＣ末端側にＩＬ−６を結合させることが例示できる。本発明のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を構成するＩＬ−６Ｒは、全長４６８アミノ酸残基で構成される膜蛋白質で、シグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞内領域から成る（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１、８２５頁、１９８８年参照）。ヒトＩＬ−６Ｒの場合、シグナル領域はＮ末端１番目のメチオニン残基付近から１９番目のアラニン残基付近まで、細胞外領域は２０番目のロイシン残基付近から３５８番目のアスパラギン酸残基付近まで、膜貫通領域は３５９番目のセリン残基付近から３８６番目のロイシン残基付近まで、細胞内領域はおよそ３８７番目のアルギニン残基付近から４６８番目のアルギニン残基付近までと考えられている。細胞外領域はイムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域に分けられ、イムノグロブリン様領域は２０番目のロイシン残基付近から１１１番目のアスパラギン酸残基付近まで、サイトカインレセプター領域は１１２番目のバリン残基付近から３２３番目のアラニン残基付近までと考えられている。
【００２４】
ＩＬ−６Ｒにおいて、ＩＬ−６との結合に必須なのはサイトカインレセプター領域であり、イムノグロブリン様領域は不要であることが知られている。なおサイトカインレセプター領域は、７つのβシートから構成されるバレル（樽）様の構造体が短い２個つながった構造体である（Ｙａｗａｔａら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１２、１７０５頁、１９９３年参照）。
【００２５】
本発明では、全長のＩＬ−６Ｒはもちろんのこと、その細胞外領域全体又はサイトカインレセプター領域のいずれか、即ち部分的ＩＬ−６Ｒを用いることもできる。ＩＬ−６と結合してそのシグナル伝達系を構成するのはサイトカインレセプター領域であり、細胞外領域は該領域を含む領域だからである。
【００２６】
本発明者らの知見によれば、具体的にはＩＬ−６ＲのＮ末端として、Ｎ末端２０番目のロイシン残基、Ｎ末端１１２番目のバリン残基、及びＮ末端１１６番目のグルタミン酸残基が例示できる。
【００２７】
また本発明者らの知見によれば、具体的にはＩＬ−６ＲのＣ末端として、Ｎ末端３２３番目のアラニン残基から３６１番目のセリン残基までの３９個のアミノ酸残基のうちのいずれか一つ、特に好ましくは３２３番目のアラニン残基、３３３番目のアラニン残基、３３４番目のロイシン残基、３３５番目のトレオニン残基、３３８番目のリジン残基、及び３４３番目のイソロイシン残基の６個のアミノ酸残基のいずれか一つを用いることが例示できる。この部分的ＩＬ−６ＲのＣ末端側に、ＩＬ−６のＮ末端とを結合させるのである。なおＩＬ−６ＲのＮ末端は、融合蛋白質のシグナル伝達における作用効果を勘案して適宜削除することができる。
【００２８】
ＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質を構成するＩＬ−６は、４つのαヘリックスから構成される全長２１２アミノ酸残基の分泌型蛋白質で（Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４，７３１巻、１９８６年参照）。ＩＬ−６が活性を示すためには、これら４つのαヘリックス全てが必要であることが知られている。従って、本発明で使用するＩＬ−６としては、４つのαヘリックスすべてを有するものであれば、特に制限はない。即ち、全長のＩＬ−６はもちろんのこと、例えばＮ末端やＣ末端の一部アミノ酸残基が削除された部分的ＩＬ−６であってもよい。より具体的には、分泌型ＩＬ−６の構造として知られているＮ末端２８番目のアラニン残基又は２９番目のプロリン残基から２１２番目のメチオニン残基までのＩＬ−６を例示することができる。またその他にも、ＩＬ−６の発現例（例えばＹａｓｕｋａｗａら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．、１２，４１９頁、１９９０年）やＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の発現例（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５，１４２頁、１９９７年）を参照にして、部分的ＩＬ−６としていかなる配列のものを使用するか決定することができる。
【００２９】
一次構造中のプロテアーゼ切断部位に変異が挿入され、プロテアーゼに対する抵抗性が付与された本発明の融合蛋白質では、プロテアーゼの切断部位が種類毎に異なるため、その一次構造において、どの部分に変異を導入する、即ちどの部分を欠失させ、どの部分に本来存在しないアミノ酸残基を付加し、或いはどの部分のアミノ酸残基を置換してプロテアーゼによる切断作用を受け難くするか、を適宜決定する。置換による変異の導入では、置換により蛋白質分子が本来の立体構造をとらないようにすることにより、プロテアーゼの切断作用を受けない、或いは受け難くする。この場合、目的とするアミノ酸残基を分子サイズの小さいアミノ酸残基であるグリシンやセリンに置換することが好ましい置換として例示できる。欠失による変異の導入では、目的とするアミノ酸残基を削除することでプロテアーゼが切断作用部位を認識できないようにしたり、蛋白質分子が本来の立体構造をとらないようにすることにより、プロテアーゼの切断作用を受けない、或いは受け難いようにする。
【００３０】
変異の導入は、遺伝子工学的にＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子に対して行う等すれば良い。また前記アミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の置換のいずれを行っても良いが、操作が比較的容易であり、しかも本来存在しないアミノ酸残基の置換による抗原性の変化等の影響が小さいと考えられることから、プロテアーゼの切断部位近傍の連続する１以上のアミノ酸残基を削除して欠失させることが特に好ましい。
【００３１】
より具体的な選択の基準は、本願発明のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を遺伝子工学的に製造する際に使用する宿主細胞が分泌するプロテアーゼに対する抵抗性を付与することである。即ち、後の実施例に示したように、遺伝子工学的に製造しようとするＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を選定した宿主細胞で発現させ、通常の液体クロマトグラフィーを用いる方法等で部分的に精製する過程でプロテアーゼによる分解産物と思われるピークを採取したり、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いる方法でプロテアーゼによる分解産物と思われるバンドを採取し、N末端のアミノ酸配列を解析することにより、前記選定した宿主細胞が分泌するプロテアーゼによりＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質のいずれの部分が切断作用を受けているかを知ることができる。
【００３２】
以上のようにしてＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の一次構造におけるプロテアーゼ切断部位を検出したならば、当該切断部位付近のアミノ酸残基を欠失等してプロテアーゼの切断作用を受けない、或いは受け難くすることにより、プロテアーゼに対する抵抗性を有するＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を得ることが可能になる。
【００３３】
前記以外に例えば、医薬品等のようにプロテアーゼ存在下でＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の生物活性を長時間持続させる目的でも、本願発明のプロテアーゼ抵抗性ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は有効である。このようなＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を製造するためには、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質が生物活性を発揮すべき環境に共存するプロテアーゼを取得し、該プロテアーゼにより変異導入前のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質においてどの部位が切断作用を受けるかを検出し、当該部分に前記のように変異させれば良い。
【００３４】
前記のようにして変異を導入したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質については、変異導入後、生物活性を維持していることを確認することが好ましい。この目的のためには、変異を導入したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を調製し、その生物活性を、例えば後の実施例に示したようなＢＡＦ１３０細胞株を用いる確認に供することが例示できる。この確認により変異を導入したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質に生物活性が認められなかった場合には、別の変異を導入して同様の確認を行う操作を繰り返し行えば良い。
【００３５】
引き続き、変異を導入したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質については、プロテアーゼ抵抗性であることを確認することが好ましい。この目的のためには、変異を導入したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を一定時間プロテアーゼと共存させたものをＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングを組み合わせた解析に供する等すれば良い。この結果プロテアーゼに対する抵抗性が認められなかった場合には、別の変異を導入して同様の確認を行う操作を繰り返し行えば良い。なお、宿主細胞が分泌するプロテアーゼに対する抵抗性を付与したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質においては、該宿主細胞を用いてこれを調製した後、細胞培養液について前述のような確認操作を行えば良い。
【００３６】
本発明のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、これをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換え操作を行うことにより容易に作製することができる。ＩＬ−６Ｒ又はＩＬ−６をコードする遺伝子は既に単離されており、その塩基配列もよく知られている。従って、本発明の融合蛋白質を作製する際には、融合蛋白質を構成するＩＬ−６ＲとＩＬ−６のアミノ酸配列から必要な遺伝子配列を調製し、これを制限酵素を用いて結合させておけば良い。またここで、天然の遺伝子配列を用いる以外にコドンの縮合を勘案し、任意のコドンを同一のアミノ酸残基をコードするが塩基配列の異なるものに置換するなどしても良い。遺伝子組換えにより宿主に蛋白質を発現させる場合、特定のコドンを使うと発現率や翻訳率が向上することがあるからである。
【００３７】
本発明の融合蛋白質を遺伝子組換えで作製する場合に使用する宿主に特別の制限はなく、従来の報告を参考にしつつ、通常の遺伝子組換え操作で使用されている大腸菌やＣＨＯ細胞等に代表される動物細胞を使用することができる（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１０８，６７３頁、１９９０年参照）。中でも、本実施例に示したピキア・パストリス種の酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、メタノールを唯一の炭素源として生育できる酵母で、ＣＨＯ細胞等のような動物細胞と比較して安価に培養できることから特に好ましい宿主として例示できる。
【００３８】
ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を遺伝子工学的に製造する際に好適な宿主細胞であるピキア・パストリス種の酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が分泌するプロテアーゼに抵抗性であるＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質として、ＩＬ−６Ｒと少なくともN末端２８番目のアラニン残基からＮ末端３７番目のリジン残基までが欠失したＩＬ−６との融合蛋白質を例示することができる。プロテアーゼ抵抗性を有するＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を調製し、これを組み込んで発現ベクターを調製し、宿主細胞を形質転換すれば、形質転換宿主細胞を培養することにより本願発明のプロテアーゼ抵抗性を有するＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を大量に製造することができる。前述のように宿主細胞が分泌するプロテアーゼに対する抵抗性を付与したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質では、宿主細胞で発現された後に該プロテアーゼにより切断されない、或いは切断され難いため、抵抗性を有していないＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質に比較して、より大量の蛋白質を得ることが可能となる。
【００３９】
前述した、本発明の融合蛋白質を遺伝子組換えで作製するための遺伝子は、宿主に導入する（形質転換する）際には、発現ベクターの中に組み込んで使用する。発現ベクターは当該遺伝子の他に、発現制御遺伝子や形質転換された宿主の選択のための指標となる遺伝子等を組み込むが、かかる遺伝子は使用する宿主との関係で適宜選択して使用すれば良い。例えばピキア・パストリス種の酵母を宿主として使用するのであれば、その染色体ＤＮＡ中にＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を導入するためのアルコールオキシダーゼ遺伝子の上流配列と下流配列、選択の指標となるヒスチジン合成遺伝子そして発現制御のためのアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター配列等が、大腸菌を宿主として使用するのであれば選択の指標となるアンピシリン耐性遺伝子や発現制御のためのＬａｃプロモーター／オペレーター配列等が例示できる。なお、市販の発現ベクター（例えばｐＰＩＣ９、ピキア・パストリス種の酵母用の発現ベクター、インビトロジェン社製）に本発明の遺伝子を導入して使用することもできる。
【００４０】
本発明において、好ましくピキア・パストリス種の酵母をＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換して融合蛋白質を作製する場合は、発現ベクター中に、融合蛋白質のシグナルペプチドとしてＩＬ−６Ｒ本来のシグナルペプチドやα因子のシグナルぺプチドを組み込むことが好ましく、特に高発現を実現できることからα因子のシグナルぺプチドを用いることが好ましい。
【００４１】
前述の形質転換された宿主を適当な条件下で培養し、発現ベクター中の発現制御遺伝子との関係で必要に応じて融合蛋白質の発現を誘導すれば融合蛋白質を作製することができる。本発明において、好ましくピキア・パストリス種の酵母を宿主とする場合は、ジャーファーメンターを用いる方法が例示できる。より具体的には、１００ｍＬの培地が仕込まれた５００ｍＬ容量の振とうフラスコに、あらかじめ作製しておいたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を発現するピキア・パストリス種の酵母の２０％グリセロール凍結菌株を接種し、２８〜３０℃で２０時間振とう培養する。次に６〜９Ｌの培地が仕込まれた１６Ｌ容量のジャーファーメンターに上記培養液１００ｍＬを接種し、２８〜３０℃にて通気撹拌培養を開始する。培養中の酵母の状態をモニタリングするために、ＯＤ６００、ｐＨ、溶存酸素濃度、撹拌速度、温度をモニタリングしてかつ制御することが好ましい。培地は天然物由来の炭素源を含むものであれば特に種別は問わないが、具体的組成は実施例を参考にすればよい。また、該培養を実施するためのジャーファーメンターとしては市販の装置を使用することができる。培養開始後、培養液中のグリセロールが枯渇した段階でメタノールを添加すればよい。グリセロールの枯渇は溶存酸素をモニタリングすることにより知ることができる。メタノールの添加は枯渇後５時間以内に行うことが望ましい。メタノールの添加量は多すぎると酵母に毒性を示すが、少なすぎるとアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター配列が十分に機能しないことを勘案すると、０．５％以上５％以下（質量／容量）が好ましい。
【００４２】
培養により作製された融合蛋白質は、適当な方法で培地等から取得することが可能である。宿主として大腸菌を用いた場合は、発現された融合蛋白質は大腸菌内に不溶性塊として蓄積されることから、菌体を破砕後、適当な条件下でリフォールディングや精製操作を行えばよい。好ましくピキア・パストリス種の酵母を宿主として用いた場合には、その培養上清から融合蛋白質を精製して取得することが可能である。精製原料は融合蛋白質を含む溶液であれば特に制限はなく、例えば融合蛋白質を含むピキア・パストリス種の酵母の培養液を例示することができる。該溶液はそのまま用いてもよく、またはそれらを緩衝液あるいは純水により希釈したり、限外ろ過膜あるいは硫酸アンモニウム等により濃縮した後に用いてもよい。精製操作としては、液体クロマトグラフィー操作を例示することができる。好ましくはイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの３種類のクロマトグラフィーの組み合わせを例示することができる。
【００４３】
ピキア・パストリス種の酵母の培養上清は容量が大きいため、最初にイオン交換クロマトグラフィーにかけることが好ましい。イオン交換クロマトグラフィーは陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーに分かれるが、除蛋白質効率を考慮するして適宜選択することができる。前者の例としては陽イオン交換基としてＳＰを、後者の例としては陰イオン交換基としてＤＥＡＥを例示することができる。ここで流速を毎分１００ｍｌ以上に上げられることと、１μｍ以下のフィルターを通していないサンプルを添加することができることを勘案すると、後の実施例に示すように、陽イオンクロマトグラフィーとしては吸着流動床Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＳＰ Ｃ−５０カラム（アマシャムファルマシア社製）を好ましく例示することができる。上記方法により得た融合蛋白質を含む画分は、次に疎水性クロマトグラフィーにかけ、さらに融合蛋白質の純度がより高い画分を得ることができる。この画分は、後の実施例に示すように、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーで濃縮することにより、ゲルろ過クロマトグラフィーを効率よく行うことができる。
【００４４】
本発明者らは、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の幹細胞増幅効果について鋭意検討した結果、後の実施例に示すように、該融合蛋白質と幹細胞因子（ＳＣＦ）存在下でＣＤ３４陽性細胞をメチルセルロースプレート上で培養すると、従来報告されているＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、及びＳＣＦ存在下で培養したときよりも、著しくコロニー形成能が高くなることを発見した。本発明はこれらの新たに見出されたＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質が有する造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅に基づきなされたものであり、該融合蛋白質を主成分として含む造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅剤又は造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅法である。
【００４５】
本発明の造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅剤は、本発明の融合蛋白質単独でも若干の効果を示すので実用価値はあるが、ＳＣＦ、ＦＬＫ２リガンド等のチロシンキナーゼを刺激するサイトカイン類のうちいずれかひとつを、特に好ましくはＳＣＦを添加すると効果は顕著なものとなる。更にインターロイキン−３（ＩＬ−３）や血小板増殖因子（ＴＰＯ）等を加えてもよい。造血幹細胞は臍帯血、末梢血、又は骨髄からＣＤ３４選択により、造血幹細胞を含む画分として得ることができる。本発明の融合蛋白質は他のサイトカインを入れた個々の容器を含むキットとして提供することもできるし、または単一の容器の中の混合物として提供することもできる。造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅は、例えばプラスチックバッグのような容器の中で、造血幹細胞を含む画分を、本発明の融合蛋白質と例えばＳＣＦを添加した無血清培地で３７℃で１〜３週間培養すればよい。増幅された造血幹細胞を患者に戻す場合は、現行の末梢血幹細胞移植と同じ方法を採用すればよい。
【００４６】
本発明者らは、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の血小板増多効果について鋭意検討した結果、後の実施例に示すように、該融合蛋白質をマウスに投与すると血小板が有意に増多することと、該融合蛋白質を予め制癌剤を投与したマウスに投与すると血小板回復が有意に早くなることを発見した。本発明はこれらの新たに見出されたＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質が有する血小板の増多あるいは回復に基づきなされたものであり、該融合蛋白質を主成分として含む血小板増多剤又は血小板増多方法である。本発明の血小板増多剤は、好ましくは非経口投与により、例えば静脈内投与、筋肉内投与、経皮投与等により投与することが好ましい。投与量は、血小板の不足症状を示す疾患の種類、患者の状態等により適宜選択されるが、一般に１〜５００μｇ／ｋｇ／日の範囲であり、血小板の増多の様子により継続的に投与すれば良い。本発明の血小板増多剤は、常用の賦形剤、例えば生理食塩水、ブドウ糖液、マンニトール、メチルセルロース、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等の賦活剤と混合して製剤化することができる。また本発明の血小板増多剤は凍結乾燥品とすることも可能であり、凍結乾燥した場合には使用直前に生理食塩水、ブドウ糖液、リンゲル液等の等張液により再溶解すれば良い。
【００４７】
【発明の実施の形態】
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１ 中間体プラスミドの作製
各種リンカーをコードするオリゴヌクレオチドを挿入することにより、各種リンカーを介して融合されたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を作製可能とすべく、中間体プラスミドｐＢＳ６Ｒ６ＳとｐＢＳ６Ｒ６Ｌを以下の方法で作製した。
【００４９】
まず、クローニングベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（東洋紡（株）製）を制限酵素ＫｐｎＩで切断し、クレノウフラグメントで処理した後、ライゲーション反応を行ってＫｐｎＩサイトが消失したプラスミドｐＢＳを作製した。
【００５０】
次に、プライマーｐ６ＲＡＢ２０Ｌ（配列番号４５）とプライマーｐ６ＲＦ３２０Ｓ（配列番号４６）を用いてＩＬ−６Ｒ遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、ＸｈｏＩで切断した。これを、予めＸｈｏＩとＥｃｏＲＶで切断したｐＢＳに挿入することにより、プラスミドｐＢＳ６Ｒを得た。
【００５１】
次に、プライマーｐＩＬ６Ｂ２（配列番号４７）とプライマーｐＩＬ６Ｆ（配列番号４８）により、ＩＬ−６遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、Ｂｇｌ ＩＩとＮｏｔＩで切断した。これを、予めＢｇｌ ＩＩとＮｏｔＩで切断したプラスミドｐＢＳ６Ｒに挿入することにより、ｐＢＳ６Ｒ６Ｓを得た。得られたｐＢＳ６Ｒ６Ｓの構造を図２に示す。
【００５２】
次に、オリゴマー３２０Ｓ３３３Ａｂ（配列番号４９）と３２０Ｓ３３３Ａｆ（配列番号５０）を通常の方法でアニールさせた。これを、予めＢｇｌ ＩＩとＫｐｎ Ｉで切断したプラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｓに挿入することにより、ｐＢＳ６Ｒ６Ｌを得た。得られたｐＢＳ６Ｒ６Ｌの構造を図４に示す。
【００５３】
実施例２ 発現プラスミドの作製
予めＢｇｌ ＩＩとＫｐｎＩで切断したｐＢＳ６Ｒ６Ｓに、下記のようにそれぞれ２種類のオリゴヌクレオチドをアニールしたアニール配列１〜５をそれぞれ挿入し、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子をインサートにもつプラスミド５種類を作製した。
【００５４】
アニール配列１（３２３ＡＧ４ＳＡ）；センス側は配列番号１のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号２のオリゴヌクレオチド。
【００５５】
アニール配列２（３２３ＡＧ４Ｓ２Ａ）；センス側は配列番号３のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号４のオリゴヌクレオチド。
【００５６】
アニール配列３（３３４ＬＰＡ）；センス側は配列番号５のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側；配列番号６のオリゴヌクレオチド。
【００５７】
アニール配列４（３３３ＡΔＡ）；センス側は配列番号７のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側；配列番号８のオリゴヌクレオチド。
【００５８】
アニール配列５（３２３ＡΔＡ）；センス側は配列番号９のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側；配列番号１０のオリゴヌクレオチド。
【００５９】
なお、アニール配列１（３２３ＡＧ４ＳＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３２３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧＳというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列２（３２３ＡＧ４Ｓ２Ａ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３２３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列３はＩＬ−６ＲのＮ末端３３４番目のロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＰというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列４（３３３ＡΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、そしてアニール配列５（３２３ＡΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３２３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものである。
【００６０】
次に、予めＥｃｏ４７ ＩＩＩとＫｐｎＩで切断したｐＢＳ６Ｒ６Ｌに、下記のようにそれぞれ２種類のオリゴヌクレオチドをアニールしたアニール配列６〜２２をそれぞれ挿入し、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子をインサートにもつプラスミド１７を作製した。
【００６１】
アニール配列６（３３３ＡＧ４ＳＡ）；センス側は配列番号１１のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側；配列番号１２のオリゴヌクレオチド。
【００６２】
アニール配列７（３３３ＡＧ４Ｓ２Ａ）；センス側は配列番号１３のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号１４のオリゴヌクレオチド。
【００６３】
アニール配列８（３４３ＩＧ４Ｓ２Ａ）；センス側は配列番号１５のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号１６のオリゴヌクレオチド。
【００６４】
アニール配列９（３３３ＡＧ４Ｓ３Ａ）；センス側は配列番号１７のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号１８のオリゴヌクレオチド。
【００６５】
アニール配列１０（３３３ＡＧ２Ａ）；センス側は配列番号１９のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号２０のオリゴヌクレオチド。
【００６６】
アニール配列１１（３３３ＡＧ４Ａ）；センス側は配列番号２１のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号２２のオリゴヌクレオチド。
【００６７】
アニール配列１２（３４３ＩＧ２Ａ）；センス側は配列番号２３のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号２４のオリゴヌクレオチド。
【００６８】
アニール配列１３（３４３ＩＧ４Ａ）；1センス側は配列番号２５のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号２６のオリゴヌクレオチド。
【００６９】
アニール配列１４（３６１ＳΔＡ）；センス側は配列番号２７のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号２８のオリゴヌクレオチド。
【００７０】
アニール配列１５（３５８ＤΔＡ）；センス側は配列番号２９のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号３０のオリゴヌクレオチド。
【００７１】
アニール配列１６（３５２ＴΔＡ）；センス側は配列番号３１のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号３２のオリゴヌクレオチド。
【００７２】
アニール配列１７（３４６ＲΔＡ）；センス側は配列番号３３のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号３４のオリゴヌクレオチド。
【００７３】
アニール配列１８（３４３ＩΔＡ）；センス側は配列番号３５のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号３６のオリゴヌクレオチド。
【００７４】
アニール配列１９（３３８ＫΔＡ）；センス側は配列番号３７のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号３８のオリゴヌクレオチド。
【００７５】
アニール配列２０（３３５ＴΔＡ）；センス側は配列番号３９のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号４０のオリゴヌクレオチド。
【００７６】
アニール配列２１（３４３ＩΔＰ）；センス側は配列番号４１のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号４２のオリゴヌクレオチド。
【００７７】
アニール配列２２（３３８ＫΔＰ）；センス側は配列番号４３のオリゴヌクレオチド、 アンチセンス側は配列番号４４のオリゴヌクレオチド。
【００７８】
なお、アニール配列６（３３３ＡＧ４ＳＡ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧＳというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列７（３３３ＡＧ４Ｓ２Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列８（３４３ＩＧ４Ｓ２Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３４３番目のイソロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列９（３３３ＡＧ４Ｓ３Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１０（３３３ＡＧ２Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１１（３３３ＡＧ４Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１２（３４３ＩＧ２Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３４３番目のイソロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１３（３４３ＩＧ４Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３４３番目のイソロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１４（３６１ＳΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３６１番目のセリンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１５（３５８ＤΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３５８番目のアスパラギン酸とＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１６（３５２ＴΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３５２番目のトレオニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１７（３４６ＲΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３４６番目のアルギニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１８（３４３ＩΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３４３番目のイソロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１９（３３８ＫΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３８番目のリジンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列２０（３３５ＴΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３５番目のトレオニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列２１（３４３ＩΔＰ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３４３番目のイソロイシンとＩＬ−６のＮ末端２９番目のプロリンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、そしてアニール配列２２（３３８ＫΔＰ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３８番目のリジンとＩＬ−６のＮ末端２９番目のプロリンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものである。
【００７９】
ｐＢＳ６Ｒ６Ｌ自体がＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子をインサートにもつが、該遺伝子により発現する融合蛋白質（３３４ＬΔＶ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３４番目のロイシンとＩＬ−６のＮ末端３０番目のバリンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質である。
【００８０】
最後に、上記方法で作製したプラスミド２３種及びｐＢＳ６Ｒ６ＬをそれぞれＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断してＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を取得し、予めＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断したｐＰＩＣ９に挿入して２４種類の発現プラスミドを作製した。これら発現プラスミドの一例として、３３３ＡΔＡの発現プラスミドの構造を図６に示す。
【００８１】
実施例３ 形質転換体の作製
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株（インビトロジェン社）から、ＥａｓｙＣｏｍｐ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いてコンピテントセルを調製し、Ｂｇｌ ＩＩによって線状化した各発現プラスミドを導入した。形質転換菌は最小栄養培地で培養し、ヒスチジン要求性を失った形質転換菌を選別した。
【００８２】
次に、得られた形質転換体をＭＤプレート（１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ）、０．００００４％（Ｗ／Ｖ）ビオチン、２％（Ｗ／Ｖ）グルコース）とＭＭプレート（１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ、０．００００４％（Ｗ／Ｖ）ビオチン、０．５％（Ｖ／Ｖ）メタノール）にそれぞれ接種し、各形質転換体に対し、ｍｕｔ+であるかｍｕｔsであるかを調べた。
【００８３】
各誘導体ごとの、得られた形質転換体の数とｍｕｔs菌株の数を表１に示す。各発現プラスミドで形質転換された菌株ごとに、平均９．４個のｍｕｔs菌株（最低４種、最高１７種、合計２１６種）を取得した。
【００８４】
【表１】
【００８５】
実施例４ 形質転換体の培養
実施例３で取得されたｍｕｔs菌（合計２１６種）とＩＬ−６ＲのＮ末端３４４番目のロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＳＳＥＬＶというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するｍｕｔs菌（平成１０年特許願第２９２１号に記載）をそれぞれ試験管を用いて５％（Ｖ／Ｖ）のメタノールを含むＢＭＧＹ培地（１％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス、２％（Ｗ／Ｖ）ペプトン、１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ＢａｓｅＷｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ）、０．４ｍｇ／ｌビオチン、１００mMリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１％（Ｗ／Ｖ）グリセロール３ｍｌで、３０℃で１２０時間培養した。各培養液から１２０時間目の培養液をサンプリングし、遠心により上清を取得した。
【００８６】
実施例５ 生物活性の測定
実施例４により得られた培養上清中のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の生物活性を、ＢＡＦ１３０細胞を用いた生物活性評価法により測定した。ＢＡＦ１３０は、本来ヒトｇｐ１３０蛋白質を発現していないマウス細胞ＢＡＦ（Ｈａｔａｋｅｙａｍａら、Ｃｅｌｌ、６３、１５４頁、１９８９年参照）にヒトｇｐ１３０蛋白質をコードする遺伝子を導入して形質転換させ、当該蛋白質を発現させた細胞である。このため、生理活性を有するＩＬ−６Ｒ及びＩＬ−６共存下で増殖活性を示す。
【００８７】
ＢＡＦ１３０の懸濁液を、９６穴プレートに２ｘ１０4細胞／穴となるように添加し、２１６種類の培養上清をそれぞれ、１％、０．２５％、０．０６１％、０．０１５％に希釈して添加した。２日後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（和光純薬工業（株）製）を用いて、参照波長を６００ｎｍとしたときの４０５ｎｍの吸光度を得た。培養上清の代わりに、１μｇ／ｍｌのＩＬ−６を各種濃度に希釈して、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＩＬ−６Ｒとともに添加したときの吸光度と同じ濃度依存性を示す培養上清の活性を１ｕｎｉｔ／ｍｌと定義した。図７には、各融合蛋白質ごとに、同一の融合蛋白質発現ベクターで形質転換されたｍｕｔs菌４〜１７種類の培養上清の生物活性の平均値を示した。
【００８８】
図７から、リンカー配列をもたない融合蛋白質１２種類の全てに関し、同一の融合蛋白質発現ベクターで形質転換された、少なくとも一つ以上のｍｕｔs菌の培養上清中に活性が認められたことが分かる。これは、ＩＬ−６ＲのＮ末端３２３番目のアラニン残基から３６１番目のセリン残基までの３９個のアミノ酸残基のいずれか一つのアミノ酸残基のＣ末端にＩＬ−６のＮ末端のアミノ酸残基が結合している本発明のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質がＩＬ−６のシグナル伝達活性を有することを示す。
【００８９】
更に図７から、３２３番目のアラニン残基、３３３番目のアラニン残基、３３４番目のロイシン残基、３３５番目のトレオニン残基、３３８番目のリジン残基、又は３４３番目のイソロイシン残基のいずれかのＣ末端にＩＬ−６のＮ末端のアミノ酸残基が結合したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質である３２３ＡΔＡ、３３３ＡΔＡ、３３４ＬΔＶ、３３５ＴΔＡ 、３３８ＫΔＰ、３３８ＫΔＡ、３４３ＩΔＰ又は３４３ＩΔＡは、先に報告されているＩＬ−６ＲのＮ末端３４４番目のロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＳＳＥＬＶというリンカーを介して融合した融合蛋白質である３３４ＬＳＳＥＬＶＡ（平成１０年特許願第２９２１号に記載）よりも強い活性をもつことが示された。
【００９０】
更に図７から、３２３番目のアラニン残基、３３３番目のアラニン残基、３３４番目のロイシン残基、３３５番目のトレオニン残基、３３８番目のリジン残基、又は３４３番目のイソロイシン残基のいずれかのＣ末端にＩＬ−６のＮ末端のアミノ酸残基が結合したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質である３２３ＡΔＡ、３３３ＡΔＡ、３３４ＬΔＶ、３３５ＴΔＡ 、３３８ＫΔＰ、３３８ＫΔＡ、３４３ＩΔＰ又は３４３ＩΔＡは、グリシン残基やセリン残基のような自由度の高いアミノ酸残基が５から１５個つながったペプチドから成るリンカーを介して融合されたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質である３２３ＡＧ４ＳＡ、３３３ＡＧ４ＳＡ、３２３ＡＧ４Ｓ２Ａ、３３３ＡＧ４Ｓ２Ａ、３４３ＩＧ４Ｓ２Ａ、３３３ＡＧ４Ｓ３Ａや、アミノ酸残基が１から４個つながったペプチドから成るリンカーを介して融合されたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質である３３４ＬＰＡ、３３３ＡＧ２Ａ、３３３ＡＧ４Ａ、３４３ＩＧ２Ａ、３４３ＩＧ４Ａと比較して、ほぼ同等かやや低い程度の活性を有することが分かる。これにより、３２３番目のアラニン残基、３３３番目のアラニン残基、３３４番目のロイシン残基、３３５番目のトレオニン残基、３３８番目のリジン残基、３４３番目のイソロイシン残基の６個のアミノ酸残基のいずれか一つのアミノ酸残基のＣ末端にＩＬ−６のＮ末端のアミノ酸残基が結合した本発明のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質が、中でも特に好ましいことが分かる。
【００９１】
実施例６ 融合蛋白質を発現するｍｕｔs菌の大量培養
実施例３に記載の３３３ＡΔＡを発現するｍｕｔs菌１１株のうち、実施例４と５に記載の方法で最も発現量の高かった株であるＩＩＩ−１０８株を用いて、１６リットルジャーを用いた培養を行った。ＩＩＩ−１０８株のグリセロールストックを１００ｍｌのＢＭＧＹ（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ，Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ ２０ｇ／ｌ，Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ １．３４ｇ／ｌ，１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０，グリセロール １０ｇ／ｌ，ビオチン ０．４ｍｇ／ｌ）培地に接種し、Ｇ−２０振とう培養器（ＮＢＳ社製）にて３０℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間前培養を行った。この培養液全量を８ＬのＢＭＧＹ（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ，Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ ２０ｇ／ｌ，Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ １．３４ｇ／ｌ，１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ６．０，グリセロール １０ｇ／ｌ，ビオチン ０．４ｍｇ／ｌ）培地に接種し、１６リットルジャーＳＦ−１１６（ＮＢＳ社製）を用いて温度２８℃、攪拌速度３５０ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの条件で培養を行った。培養開始から１６時間後、メタノール２４０ｍｌ、Ｂａｃｔｏ ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ ５０ｇ／ｌ、及びＢａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ １００ｇ／ｌの混合液１．６リットルを添加し、融合蛋白質の発現誘導を開始した。図に本培養の培養経過を示す。
【００９２】
培養液中のメタノール濃度はガスクロマトグラフィーで測定した。培養液中のｐＨはｐＨメーターで測定した。培養液中のＯＤ６００（菌体密度の指標）は、培養液を生理食塩水で１００倍希釈し、分光光度計で測定した。培養液中の融合蛋白質の濃度は、抗ヒトＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体ＭＴ−１８（Ｈｉｒａｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻、２９００、１９８９年参照）を固相抗体に、抗ヒトＩＬ−６ポリクローナル抗体（ジェンザイム社製）を検出用抗体に、実施例７に示す方法で取得した融合蛋白質精製品を標準物質にそれぞれ用いたサンドイッチエンザイムイムノアッセーで測定した。また、融合蛋白質の生物活性は実施例５に示すＢＡＦ１３０細胞を用いた方法で測定した。
【００９３】
実施例７ 融合蛋白質の精製
実施例６で選ばれた培養液を遠心分離操作により菌体と上清に分離した。得られた上清（１１．６Ｌ）を蒸留水で、導電率がＮａＣｌ濃度換算で約５０ｍＭになるまで希釈した（６６．０５Ｌ）。次に酢酸を用いてｐＨを４．５に調製した。
【００９４】
２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した吸着流動床Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＳＰ Ｃ−５０カラム（５０ｍｍＩＤ×１００ｃｍ、ゲル量３００ｍｌ）（アマシャムファルマシア社製）に、上記希釈調製液をカラム下部から上方送液することにより添加した（線速毎時３００ｃｍ）。添加終了後、平衡化緩衝液をさらに上方送液することで洗浄した。次に送液方向を変え、カラム上部から溶出緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５））を送液して(線速毎時１５０ｃｍ）、溶出画分（Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ溶出フラクション、３００ｍＬ）を得た。なお、溶出画分の検出は２８０ｎｍによる吸光度を測定することにより行った。
【００９５】
Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ溶出フラクションに−２０℃に冷却した硫酸アンモニウムを２Ｍになるように溶解させ、２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラム（２１．５ｍｍＩＤ×１５ｃｍ）（東ソー製）に添加した（流速毎分５ｍｌ）。添加終了後、平衡化緩衝液をさらに送液し、吸着基と疎水性相互作用の弱い蛋白質を溶出させた。次いで、緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を徐々に下げ、０．４Ｍの硫酸アンモニウム濃度にて溶出される画分を融合蛋白質の溶出画分として集めた（Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ溶出フラクション、６７ｍｌ）。融合蛋白質の検出は実施例５に示すＢＡＦ１３０細胞の増殖活性を指標とした。
【００９６】
Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ溶出フラクションを、５％グリセロールを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ４．５)で透析し脱塩した。脱塩した溶液を同緩衝液で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷカラム（７．５ｍｍＩＤ×７．５ｃｍ）（東ソー製）に添加した（流速毎分２ｍｌ）。添加終了後、平衡化緩衝液をさらに送液し、吸着基と相互作用の弱い蛋白質を溶出させた。次いで、５００ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を送液し（毎分１ｍｌ）、融合蛋白質を高濃度に含む画分を得た（ＳＰ−５ＰＷ溶出フラクション、１０ｍｌ）。融合蛋白質の検出は２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって行った。
【００９７】
ＳＰ−５ＰＷ溶出フラクションを、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム（２１．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ）（東ソー製）に数回に分け添加し（毎分５ｍｌ）、２８０ｎｍにおける吸光度を測定し融合蛋白質を分取した。
【００９８】
実施例８ 融合蛋白質の活性測定
実施例５に記載の本発明の融合蛋白質３３３ＡΔＡを実施例７に記載した方法で精製したもの（以下ＦＰ６と略記）を用いて以下の実験を行った。
【００９９】
各種濃度のＦＰ６（０．６２５〜４０ｎｇ／ｍｌ）の生物活性を、実施例５に示すＢＡＦ１３０細胞を用いた生物活性評価法により測定した。図９から明らかなように、ＦＰ６は濃度依存性を示した。
【０１００】
また図には示さないが、１μｇ／ｍｌのＦＰ６を各種濃度（１〜１０２４倍）に希釈して得た濃度依存曲線と５μｇ／ｍｌのＩＬ−６を各種濃度（１〜１０２４倍）に希釈して得た濃度依存曲線がほぼ一致した。一方、実施例５に記載しているように、１μｇ／ｍｌのＩＬ−６を各種濃度に希釈して、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＩＬ−６Ｒとともに添加したときに得られる濃度依存曲線と同じ濃度依存曲線を示す培養上清の活性を１ｕｎｉｔ／ｍｌと定義した。従って、１μｇのＦＰ６は５ｕｎｉｔに相当することが示された。
【０１０１】
実施例９ 融合蛋白質のアミノ酸配列の分析
実施例５に記載の本発明の融合蛋白質３３３ＡΔＡを実施例７に記載した方法で精製したもの（以下ＦＰ６と略記）を用いて以下の実験を行った。
【０１０２】
ＦＰ６をＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷ ＲＰカラムで逆相クロマトグラフィーを行い、さらに精製した。溶出は２０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液から６０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液へのグラジエントでおこなった。得られた画分を減圧乾固したのち、２０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で再溶解して、プロテインシーケンサー４７７Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）に供して分析した。
【０１０３】
分析の結果、Ｎ末端からロイシン、アラニン、プロリン、アルギニンの順に検出され、遺伝子によりコードされるＮ末端の配列と矛盾していないことを確認した。
【０１０４】
実施例１０ 融合蛋白質の糖鎖部分の分子量の分析
実施例５に記載の本発明の融合蛋白質３３３ＡΔＡを実施例７に記載した方法で精製したもの（以下ＦＰ６と略記）を用いて以下の実験を行った。
【０１０５】
０．１ｍｇ／ｍｌのＦＰ６を含む１５０μｌの０．１％ＳＤＳ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を５分間煮沸し、水冷した後に、１０μｌを1ｕｎｉｔ／ｍｌのエンドグリコシダーゼＨ（シグマ社製）１μｌと混合し、２５℃で３０秒から３時間反応させた。反応は５００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を１０μｌを加えて停止させた。なお、５００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）１０μｌ、予め冷却したＦＰ６溶液１０μｌ、及びエンドグリコシダーゼＨ1μｌを順次混合したものを、エンドグリコシダーゼＨ反応時間０分間の試料とした。
【０１０６】
反応が停止した上記各溶液にブロモフェニルブルーで着色した７２％グリセロール、１０％２−メルカプトエタノールを３μｌ加えた。これをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後のゲル中の蛋白質はコマジーブリリアントブルーＲ２５０で染色して検出した。
【０１０７】
図１０から明らかなように、エンドグリコシダーゼＨ未反応のＦＰ６は７６〜９３ｋＤａの位置にひとつのバンドとして検出された。このことは、ＦＰ６の糖鎖部位の分子量は、１７ｋＤａの不均一性を有することを示す。また、エンドグリコシダーゼＨで完全消化されたＦＰ６は５７ｋＤａの位置に検出された。更に、図には示さないが、ＦＰ６をＳＤＳで変性後、１０倍量のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え、Ｎ−グリコシルダーゼＦを加えて１８時間反応させた場合にも、ＦＰ６は５７ｋＤａの位置に検出された。このことは、ＦＰ６のＮグリコシド結合で結合した糖鎖の分子量は１９〜３６ｋＤａであることを示す。
【０１０８】
実施例１１ 融合蛋白質の幹細胞増幅効果
実施例５に記載の本発明の融合蛋白質３３３ＡΔＡを実施例７に記載した方法で精製したもの（以下ＦＰ６と略記）を用いて以下の実験を行った。
【０１０９】
ヒト臍帯血２０ｍｌより特願平９−３２５８４７号に示す方法に従ってＣＤ３４陽性細胞を精製分離した。得られた細胞５００個、１．２％メチルセルロース（信越化学）、３０％ウシ胎児血清アルブミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）、１％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略する）（Ｓｉｇｍａ社）、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社）、ＳＣＦ（幹細胞因子）（１００ｎｇ／ｍｌ）、及び以下の４条件のいずれか（▲１▼ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−６Ｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ、▲２▼ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−６Ｒ（２００ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ、▲３▼ＦＰ６（３００ｎｇ／ｍｌ）、▲４▼ＦＰ６（６００ｎｇ／ｍｌ））をα−ＭＥＭ（Ｆｌｏｗ社）１ｍｌを３５ｍｍ浮遊培養用プラスチック培養皿（Ｎｕnｃ社）に分注し、３７℃、５％ＣＯ2,湿度１００％の条件で培養した。
【０１１０】
２週間後、倒立顕微鏡下の観察でコロニーの同定を行った。結果を図１１に示す。コロニーは顆粒球コロニー（Ｇ）、マクロファージコロニー（Ｍ）、顆粒球・マクロファージの混合コロニー（ＧＭ）、芽球コロニー（Ｂｌａｓｔ）、顆粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニー（Ｍｉｘ）、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）の６種類に分類した。
【０１１１】
図１１から明らかなように、既に報告されている条件である▲１▼と▲２▼では、既存の報告（Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、２５８９頁、１９９５年参照）とほぼ同等のコロニー形成能が観察された。一方、本発明の条件である▲３▼（ＦＰ６（３００ｎｇ／ｍｌ））では、同濃度のＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの組み合わせである▲２▼（ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−６Ｒ（２００ｎｇ／ｍｌ）を大きく上回るコロニー形成能が観察された。さらに、図には表されていないが、本発明の条件である▲３▼あるいは▲４▼により形成された混合コロニーのサイズは、既に報告されている条件である▲１▼と▲２▼のそれよりも、著しく大きいものであった。これらのことは、本発明の融合蛋白質は、既に報告されているＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの組み合わせよりも優れた造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅効果を有することを示す。
【０１１２】
実施例１２ 融合蛋白質のマウスに対する血小板増多効果
実施例５に記載の本発明の融合蛋白質３３３ＡΔＡを実施例７に記載した方法で精製したもの（以下ＦＰ６と略記）を用いて以下の実験を行った。
【０１１３】
Ｃ５７ＢＬ６マウス（雄性、８週齢）を１群５匹、全５群を用い、第１群をＦＰ６未投与群（対照群）として３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群、第２群を０．５μｇのＦＰ６を含む３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群、第３群を１μｇのＦＰ６を含む３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群、第４群を２μｇのＦＰ６を含む３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群、第５群を５μｇのＦＰ６を含む３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群とし、それぞれ１２時間置きに１日２回、５日間連続腹腔内に投与した。６日目に下行静脈より全採血し、血小板数を血球測定器ＣＣ−１８０Ａ（東亜医用電子株式会社製）で計数した。
【０１１４】
図１２から明らかなように、１μｇ以上のＦＰ６を投与した群（第３−５群）ではＦＰ６未投与群（第１群）に比べ、有意な血小板増多が観察された。一方、ＦＰ６（分子量約８４ｋＤａ）１μｇの２倍の分子数であるＩＬ−６（分子量約２１ｋＤａ）０．５μｇを同条件で投与した場合は有意な血小板増多が観察されなかったことが報告されている（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、Ｂｌｏｏｄ、７４、１２４１頁、１９８９年参照）。このことは、本発明の融合蛋白質は、ＩＬ−６よりも優れたｉｎ ｖｉｖｏでの血小板増多効果を有することを示す。
【０１１５】
実施例１３ 融合蛋白質の５ＦＵ投与マウスに対する血小板回復効果
実施例５に記載の本発明の融合蛋白質３３３ＡΔＡを実施例７に記載した方法で精製したもの（以下ＦＰ６と略記）を用いて以下の実験を行った。
【０１１６】
Ｃ５７ＢＬ６マウス（雄性、８週齢）を１群１５匹、全２群を用い、第１群をＦＰ６未投与群（対照群）として３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群、第２群を５μｇのＦＰ６を含む３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群とした。全群とも１５０ｍｇ／ｋｇの５ＦＵを尾静脈から投与し、上記薬剤を１２時間置きに１日２回、２日目から６日目まで５日間連続腹腔内に投与した。７日目にから９日目までの３日間連続で、各群５匹ずつのマウスの下行動脈より全採血し、血小板数を血球測定器ＣＣ−１８０Ａ（東亜医用電子株式会社製）で計数した。
【０１１７】
図１３から明らかなように、ＦＰ６を投与した群（第２群）ではＦＰ６未投与群（第１群）に比べ、８日目と９日目に有意な血小板回復が観察された。このことは、本発明の融合蛋白質は５ＦＵ投与による血小板産生機能の低下に対し、ｉｎ ｖｉｖｏでの回復効果を有することを示す。
【０１１８】
実施例１４ イムノグロブリン様領域欠失型融合蛋白質の発現
ＩＬ−６Ｒ誘導体１１２ＶＬ（ＩＬ−６ＲのＮ末端１１２番目のバリンからＮ末端３４４番目のロイシンまでの２３３アミノ酸）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１２ＶＬ、及びＩＬ−６Ｒ誘導体１１６ＥＬ（ＩＬ−６ＲのＮ末端１１６番目のグルタミン酸からＮ末端３４４番目のロイシンまでの２２９アミノ酸）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１６ＥＬを以下の方法で構築した。
【０１１９】
プライマーｐ６ＲＡＢ１１２Ｖ（配列番号５１）とプライマーｐ３４４Ｆ（配列番号５２）を用いてＩＬ−６Ｒ遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、ＸｈｏＩとＸｂａＩで切断した。これを予めＸｈｏＩとＡｖｒ ＩＩで切断したｐＰＩＣ９に挿入することにより、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＬを得た。
【０１２０】
次に、プライマーｐ６ＲＡＢ１１６Ｅ（配列番号５３）とプライマーｐ３４４Ｆ（配列番号５４）を用いてＩＬ−６Ｒ遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、ＸｈｏＩとＸｂａＩで切断した。これを予めＸｈｏＩとＡｖｒ ＩＩで切断したｐＰＩＣ９に挿入することにより、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＬを得た。
【０１２１】
次に、イムノグロブリン様領域欠失型融合蛋白質１１２ＶＡＡ（Ｎ末端がＩＬ−６ＲのＮ末端１１２番目のバリンで、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡ、及び該融合蛋白質１１６ＥＡＡ（Ｎ末端がＩＬ−６ＲのＮ末端１１６番目のグルタミン酸で、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡを以下の方法で構築した。
【０１２２】
ｐＰＩＣ９−１１２ＶＬをＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断して得られた断片を予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断した３３３ＡΔＡの発現プラスミドｐＰＩＣ９−３３３ＡΔＡに挿入し、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡを作製した。
【０１２３】
次に、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＬをＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断して得られた断片を予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断した３３３ＡΔＡの発現プラスミドｐＰＩＣ９−３３３ＡΔＡに挿入し、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡを作製した。
【０１２４】
ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡ、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡを用いて実施例３に示す方法で形質転換体を作製した結果、１１２ＶＡＡを発現するｍｕｔs菌９株と１１６ＥＡＡを発現するｍｕｔs菌１１株を樹立した。更に、これを実施例４に示す方法で培養し、実施例５に示す方法で上清中の生物活性を測定した。
【０１２５】
図１４から明らかなように、イムノグロブリン様領域欠失型融合蛋白質１１２ＶＡＡ及び１１６ＥＡＡは、イムノグロブリン様領域を有する融合蛋白質３３３ＡΔＡとほぼ同等の活性を有した。
【０１２６】
実施例１５ プロテアーゼ切断部位の決定
実施例７のようにして得られたＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ溶出フラクション１．９ｍｌに２％ＳＤＳ、６４％グリセロール、０．２５％ブロモフェノールブルーを０．１ｍｌ加えたのち煮沸した。これをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけたのち、１０％メタノール、１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１１）中でポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜にエレクトロブロッティングした。これをコマジ−ブリリアントブルー Ｇ−２５０で染色し検出した後、検出されたいくつかの蛋白質部分をそれぞれ裁断して回収し、プロテインシーケンサー４７７Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）にかけた。その結果、分子量１８ｋＤの蛋白質は、アスパラギン酸残基−バリン残基−アラニン残基−アラニン残基−プロリン残基−ヒスチジン残基という、融合蛋白質の一部であり、ＩＬ−６部分のＮ末端３７番目リジン残基と３８番目アスパラギン酸残基の間のペプチド結合がピキア酵母由来のプロテアーゼで切断されて生じたものであった。
【０１２７】
実施例１６ プロテアーゼ抵抗性融合蛋白質の発現（１）
実施例１のようにして得られたｐＢＳ６Ｒ６ＬからプライマーｐＫＮ６Ｂ３８Ｄ（配列番号５５）とプライマーｐＩＬ６Ｆ２（配列番号５６）を用いてＩＬ−６遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、ＮｒｕＩとＮｏｔＩで切断した。これを、予めＥｃｏ４７ＩＩＩとＮｏｔＩで切断したｐＢＳ６Ｒ６Ｌに挿入することにより、プラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｌ−３８Ｄを得た。
【０１２８】
ｐＢＳ６Ｒ６Ｌ−３８ＤをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断してＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を取得し、予めＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断したｐＰＩＣ９に挿入して、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質２０ＬＡＤをコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−２０ＬＡＤを作製した。
【０１２９】
プライマーｐ６ＲＡＢ１１２Ｖ（配列番号５７）とプライマーｐ３４４Ｆ（配列番号５８）を用いてＩＬ−６Ｒ遺伝子を増幅し、ＸｈｏＩとＸｂａＩで切断した。これを予めＸｈｏＩとＡｖｒＩＩで切断したｐＰＩＣ９に挿入することにより、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＬを得た。ｐＰＩＣ９−１１２ＶＬをＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断して得られた断片を予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断したｐＰＩＣ９−２０ＬＡＡに挿入し、イムノグロブリン様領域欠失型融合蛋白質１１２ＶＡＡ（Ｎ末端がＩＬ−６ＲのＮ末端１１２番目のバリンで、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した融合蛋白質）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡを作製した。
【０１３０】
次に、プライマーｐ６ＲＡＢ１１６Ｅ（配列番号５９）とプライマーｐ３４４Ｆ（配列番号５８）を用いてＩＬ−６Ｒ遺伝子を増幅し、ＸｈｏＩとＸｂａＩで切断した。これを予めＸｈｏＩとＡｖｒＩＩで切断したｐＰＩＣ９に挿入することにより、 ｐＰＩＣ９−１１６ＥＬを得た。ｐＰＩＣ９−１１６ＥＬをＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断して得られた断片を予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断したｐＰＩＣ９−２０ＬＡＡに挿入し、イムノグロブリン様領域欠失型融合蛋白質１１６ＥＡＡ（Ｎ末端がＩＬ−６ＲのＮ末端１１６番目のグルタミン酸で、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した融合蛋白質）発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡを作製した。
【０１３１】
更に、ｐＰＩＣ９−２０ＬＡＤをＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断してＩＬ−６Ｒをコードする遺伝子を取得し、予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断したｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡに挿入することにより、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質１１２ＶＡＤ（Ｎ末端がＩＬ−６ＲのＮ末端１１２番目のバリンで、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端３８番目のアスパラギン酸をリンカーを介さずに直接融合した融合蛋白質）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＤを、予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断したｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡに挿入することにより、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質１１６ＥＡＤ（Ｎ末端がＩＬ−６ＲのＮ末端１１６番目のグルタミン酸で、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端３８番目のアスパラギン酸をリンカーを介さずに直接融合した融合蛋白質）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＤをそれぞれ作製した。
【０１３２】
実施例１７ プロテアーゼ抵抗性融合蛋白質の発現（２）
実施例１６に記載の５種類の発現プラスミド（ｐＰＩＣ９−２０ＬＡＤ、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡ、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡ、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＤ、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＤ）を実施例３に記載の方法でそれぞれピキア酵母に導入した。その結果、ｐＰＩＣ９−２０ＬＡＤにより形質転換されたｍｕｔs株を１０株、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡにより形質転換されたｍｕｔs株を７株、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡにより形質転換されたｍｕｔs株を１０株、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＤにより形質転換されたｍｕｔs株を１株、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＤにより形質転換されたｍｕｔs株を６株を取得した。これを実施例４に記載の方法で培養して上清を取得し、実施例５に示す方法で生物活性を測定した結果、ｐＰＩＣ９−２０ＬＡＤにより形質転換されたｍｕｔs株では１０株中１０株、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡにより形質転換されたｍｕｔs株では７株中７株、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡにより形質転換されたｍｕｔs株では１０株中７株、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＤにより形質転換されたｍｕｔs株では１株中１株、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＤにより形質転換されたｍｕｔs株では６株中６株が生物活性を有していた。この結果は、ＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンから３７番目リジンまでを欠失させても生物活性は影響を受けないことを示すものである。
【０１３３】
実施例１８ プロテアーゼ抵抗性の評価
実施例３に記載の３３３ＡΔＡ（以下、２０ＬＡＡと記載する）、実施例１７に記載の本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質２０ＬＡＤ、融合蛋白質１１２ＶＡＡ、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質１１２ＶＡＤ、融合蛋白質１１６ＥＡＡ、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質１１６ＥＡＤをそれぞれ発現する形質転換株を下記の方法により培養した。試験管を用いてＢＭＧＹ培地（１％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス、２％（Ｗ／Ｖ）ペプトン、１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ、０．００００４％（Ｗ／Ｖ）ビオチン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１％（Ｗ／Ｖ）グリセロール）３ｍｌで、３０℃で４８時間培養した後、遠心して集菌し、菌体ペレットをＢＭＭＹ培地（１％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス、２％（Ｗ／Ｖ）ペプトン、１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ、０．００００４％（Ｗ／Ｖ）ビオチン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、０．５％（Ｖ／Ｖ）メタノール）２ｍｌに懸濁し、３０℃で２４時間培養した。各培養液から２４時間目の培養液をサンプリングして遠心し、培養上清を回収してＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写し、ウサギ抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体（ジェンザイム社製）を用いてウエスタンブロッティングを行った。結果を図１５に示す。
【０１３４】
図１５から明らかなように、２０ＬＡＡ、１１６ＥＡＡ、１１２ＶＡＡでは、それぞれのＩＬ−６領域のＮ末端３７番目のリジンのＣ末端で切断されて生じたと思われる分子量１８ｋＤのバンドが鮮明に検出されたが、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質２０ＬＡＤ、１１６ＥＡＤ、１１２ＶＡＤでは検出されないか、或いはほとんど検出されなかった。この結果から、ＩＬ−６のＮ末端２８番目から３７番目までの１０アミノ酸を失欠させる変異を導入したことにより、プロテアーゼ抵抗性を付与できたことが分かる。
【０１３５】
【発明の効果】
本発明で提供されるリンカー配列をもたないＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、従来報告されているリンカー配列を有するＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質に比べ、高い薬効と抗原性の著しい低下が期待される。このことは本融合蛋白質は造血領域における新規治療薬として大きな意義をもち、特に造血幹細胞のｅｘ
ｖｉｖｏ増幅剤や血小板増多剤としての開発が期待される。
【０１３６】
宿主細胞が分泌するプロテーゼに対する抵抗性を付与したものでは、遺伝子工学的に宿主細胞を形質転換して製造する工程で、該プロテアーゼによる切断を受ない等の理由により、従来のものに比較してより大量に製造することが可能となる。また前記プロテアーゼが共存した状態で精製工程に供しても切断されない等のために最終的には収量を増加することができ、しかもプロテアーゼを操作に先立って失活させるといった操作を省略することが可能であるため、精製操作を簡便化できるという効果もある。更には最終精製物中にプロテアーゼによって切断された分子が混じることがないため、より均一な精製品とすることも可能となる。
【０１３７】
上記効果に加えて、生物活性を発揮させようとする環境に共存が予想されるプロテアーゼに対する抵抗性を有するものでは、生物活性を持続して発揮するという効果を予想することができる。
【０１３８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、（ａ）リンカー配列を介してＩＬ−６ＲとＩＬ−６が融合したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質と（ｂ）リンカーを介さずにＩＬ−６ＲとＩＬ−６が直接融合した本発明のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質のイラストを示す図である。
【図２】図２は、実施例１で作製したプラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｓの構造を示す図である。ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉは転写開始部位を、ＩＬ−６はＩＬ−６遺伝子を、ＩＬ−６ＲはＩＬ−６Ｒ遺伝子をそれぞれ示す。
【図３】図３は、図２に示したプラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｓに、実施例２で示す方法でオリゴヌクレオチド２種をアニールさせたものを挿入する手順を示す図である。
【図４】図４は、実施例１で作製したプラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｌの構造を示す図である。ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉは転写開始部位を、ＩＬ−６はＩＬ−６遺伝子を、ＩＬ−６ＲはＩＬ−６Ｒ遺伝子をそれぞれ示す。
【図５】図５は、図４に示したプラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｌに、実施例２で示す方法でオリゴヌクレオチド２種をアニールさせたものを挿入する手順を示す図である。
【図６】図６は、実施例２で作製した誘導体３３３ＡΔＡの発現プラスミドの構造を示す図である。図中、ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉは転写開始部位を、ＨＩＳ４はヒスチジン合成遺伝子を、３'ＡＯＸＴＴはターミネーターを、ＩＬ−６はＩＬ−６遺伝子を、ＩＬ−６ＲはＩＬ−６レセプター遺伝子を、Ｓはシグナル配列をコードする遺伝子を、５'ＡＯＸ１はプロモーター配列を含むアルコールオキシダーゼ遺伝子の上流領域をそれぞれ示す。
【図７】図７は、各融合蛋白質の誘導体ごとに、（Ａ）ＩＬ−６Ｒ領域のＣ末端のアミノ酸残基の種類と番号、（Ｂ）リンカーのアミノ酸配列（「−」はリンカーがないことを示す。）、（Ｃ）ＩＬ−６領域のＮ末端のアミノ酸残基の種類と番号、（Ｄ）実施例４で得られた２１６種類の培養上清それぞれに対し、実施例５に示す方法で得られた生物活性値平均値をそれぞれ示した図である。
【図８】図８は、実施例６に示す方法で培養を行ったときの経時変化を示す図である。図中、ＭｅＯＨ ｃｏｎｃ．はメタノール濃度（単位は％（質量／容量））を、ＥＩＡはサンドイッチイムノアッセーを、Ｂｉｏ Ａｓｓａｙは生物活性をそれぞれ示す。
【図９】図９は、実施例８に示す方法でＦＰ６の生物活性を求めた図である。
【図１０】図１０は、実施例１０に示す方法でエンドグリコシダーゼＨで０〜１８０分処理したＦＰ６をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したときの結果を示す図である。図中、Ｈと示したレーンはエンドグリコシダーゼＨのみを、0から１８０の数字を付したレーンはそれぞれの数字の時間（分）だけエンドグリコシダーゼＨ処理されたＦＰ６を示す。図中の９７．４と６６．３の数値を付したバーは、分子量マーカー蛋白質（分子量が９７．４ｋＤａと６６．３ｋＤａ）がそれぞれ検出された位置である。
【図１１】図１１は、実施例１１に示す方法で、▲１▼ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−６Ｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ、▲２▼ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−６Ｒ（２００ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ、▲３▼ＦＰ６（３００ｎｇ／ｍｌ）、▲４▼ＦＰ６（６００ｎｇ／ｍｌ）の５００個のＣＤ３４陽性細胞に対するコロニー形成能を求めた図である。図中、Ｇは顆粒球コロニーを、Ｍはマクロファージコロニーを、ＧＭは顆粒球・マクロファージの混合コロニーを、Ｂｌａｓｔは芽球コロニーを、Ｍｉｘは顆粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニーを、ＢＦＵ−Ｅは赤芽球コロニーをそれぞれ示す。
【図１２】図１２は、実施例１２に示す方法でＣ５７ＢＬ６マウスに対し、ＦＰ６を投与しなかったとき（第１群）と投与したとき（第２−５群）の血小板数の平均値を示す図である。図中、星印は第１群のマウスの血小板数との有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図１３】図１３は、実施例１３に示す方法で予め５ＦＵを投与したＣ５７ＢＬ６マウスに対し、ＦＰ６を投与しなかったとき（第１群、黒塗りの四角）と投与したとき（第２群、白い四角）の７〜９日目の血小板数の平均値を示す図である。図中、星印は同日の第１群のマウスの血小板数との有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図１４】図１４は、実施例１４に示す方法で得られた（▲１▼）融合蛋白質１１２ＶＡＡを発現するｍｕｔs菌９株と（▲２▼）融合蛋白質１１６ＥＡＡを発現するｍｕｔs菌１１に対し、 実施例５に示す方法で得られた生物活性値平均値を、３３３ＡΔＡを発現するｍｕｔs菌１１株のうち最も発現量の高かった株であるＩＩＩ−１０８株に対する相対値（％）として、それぞれ示した図である。
【図１５】図１５は、（ａ）２０ＬＡＡ、（ｂ）２０ＬＡＤ、（ｃ）１１６ＥＡＡ、（ｄ）１１６ＥＡＤ、（ｅ）１１２ＶＡＡ、（ｆ）１１２ＶＡＤを含む培養上清を実施例８に示す方法でウエスタンブロットしたときの結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、リンカー配列を介さずに直結されたインターロイキン−６レセプター（以下ＩＬ−６Ｒと略す）・インターロイキン−６（以下ＩＬ−６と略す）融合蛋白質、該融合蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された宿主、該宿主を培養する方法、該宿主の培養物から該融合蛋白質を精製する方法、該融合蛋白質を含むことを特徴とする新規な造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅剤、及び該融合蛋白質を主成分として含む新規な血小板増多剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＬ−６タイプのサイトカインに属するＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ ｆａｃｔｏｒ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ−Ｍ、Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｎ−１は、いずれも、少なくとも１つはシグナル伝達蛋白質ｇｐ１３０を含むレセプター複合体を介してシグナルを伝えることが知られている。ＩＬ−６を例にとると、ＩＬ−６はＩＬ−６Ｒに結合し、その結果生じたＩＬ−６・ＩＬ−６Ｒ複合体がｇｐ１３０に結合する。
【０００３】
造血系はＩＬ−６が重要な役割を示す生体防御系のひとつである。造血系の細胞におけるＩＬ−６Ｒの発現様式はヒトとマウスでは異なる。メチルセルロース培地上で顆粒球・マクロファージコロニー、赤芽球コロニー、巨核球コロニー、及び混合コロニーを形成することができるヒトの未分化な造血前駆細胞は、十分な数のＩＬ−６Ｒを発現していない（Ｔａｊｉｍａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４、１９９６年参照）。したがって、ヒトの未分化な造血前駆細胞はＩＬ−６にはほとんど反応しないが、ＩＬ−６・ＩＬ−６Ｒ複合体には強く反応する。一方、マウスの未分化な造血前駆細胞は十分な数のＩＬ−６Ｒを発現している。さらに、中畑と本発明者らはヒトの巨核球の前駆細胞は十分な数のＩＬ−６Ｒを発現していなことを発見した（平成９年特許願第３２５８４７号）。これらの知見は、ＩＬ−６をマウスに投与すると血小板数の有意な増多が観察されるが、ＩＬ−６をヒトに投与すると効果が限定されることと合致する。
【０００４】
ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６Ｒの結合定数は５ｘ１０-9Ｍであることが報告されている（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０８巻、６７３頁、１９９０年参照）。これは２００ｎｇ／ｍｌ（１ｘ１０-8Ｍ）のＩＬ−６（分子量２万）と５００ｎｇ／ｍｌ（１ｘ１０-8Ｍ）の可溶性ＩＬ−６Ｒ（分子量５万）を混合すると、半数の分子が単体で存在することを意味する。実際、ＩＬ−６Ｒを発現していない細胞に十分に作用させるには１０００ｎｇ／ｍｌ以上の可溶性ＩＬ−６Ｒを必要とする。
【０００５】
遺伝子工学を用いると、天然ではそれぞれ別の蛋白質として存在する２種類の蛋白質を１本のポリペプチド鎖から成る融合蛋白質として発現させることができる。互いに結合する性質をもつ２種類の蛋白質を融合蛋白質として発現させた場合、該２種類の蛋白質が融合された状態でそれぞれ本来の構造（生理活性を発現しうる構造）をとり得れば両者の結合は強固となり、解離は融合されていない場合に比較して起こりにくくなることが考えられる。
【０００６】
融合蛋白質において２種類の蛋白質が本来の構造をとるためには、２種類の蛋白質間に立体障害が起こらないことが必要である。更には、融合させた本来の構造を有する２種類の蛋白質が互いに結合できる程度の自由度を有していることも必要である。このため従来は、主にグリシン残基やセリン残基のような自由度の高いアミノ酸残基を５〜２０個つないでリンカーとし、リンカーを介して蛋白質を融合するのは普通である。このような、融合される蛋白質には含まれていない、本来無関係のリンカーを介して間接的に融合することで、２種類の蛋白質間に立体障害を生じさせず、かつ、互いに結合可能となる程度の自由度を与えることができる。
【０００７】
例えば、互いに結合する性質をもつ抗体のＨ鎖のＶ領域とＬ鎖のＶ領域を融合蛋白質として発現させる場合は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（Ｇはグリシン残基、Ｓはセリン残基）がリンカー配列として報告されている（Ｈｏｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、５８７９頁、１９８８年参照）。
【０００８】
互いに結合する性質をもつＩＬ−６ＲとＩＬ−６についても、最近になってリンカーを介して両者を結合した融合蛋白質（図１（ａ）はイラスト図）が報告されている。一つはＩＬ−６Ｒの３２３番目のアラニン残基のＣ末端側に配列番号６０で示される、ＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥというＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒには含まれていない、本来無関係なリンカーを結合し、更にそのＣ末端にＩＬ−６を結合した融合蛋白質である（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１５、１４２頁、１９９７年参照）。２番目は、ＩＬ−６Ｒの３５６番目のバリン残基のＣ末端にＥＦＭ（Ｅはグルタミン酸残基、Ｆはフェニルアラニン残基、Ｍはメチオニン残基）というリンカーを結合し、さらにそのＣ末端側にＩＬ−６が結合した融合蛋白質である（Ｃｈｅｂａｔｈら、Ｅｕｒ．ＣｙｔｏｋｉｎｅＮｅｔｗ．、８、３５９頁、１９９７年参照）。また本出願人らも、ＩＬ−６Ｒの３４４番目のロイシン残基のＣ末端にＳＳＥＬＶ（Ｌはロイシン残基、Ｖはバリン酸残基）というリンカーを結合し、更にそのＣ末端側にＩＬ−６が結合した融合蛋白質を発明している（平成１０年特許願第２９２１号）。
【０００９】
ところで、一般的に、異種蛋白質を遺伝子組換えで作製する場合、宿主が天然に発現するプロテアーゼの作用により発現された異種蛋白質が切断されることが指摘されている。従って、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質においても、宿主中で発現された後に宿主のプロテアーゼによる切断作用を受ける可能性がある。特にピキア・パストリス種の酵母は多種のプロテアーゼを発現することが知られているが、前述した報告ではこの点について述べられていない。仮に宿主が発現するプロテアーゼの切断作用によってＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質が切断されているのであれば、かかる切断作用に抵抗性のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を提供することにより、従来に比較してより多量のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をピキア・パストリス種の酵母や他の宿主の培養液から取得することが可能となる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
融合蛋白質は２種類の蛋白質の結合状態を強固に維持することが可能と考えられるため、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６のように、これら２種類の蛋白質が結合した状態でＩＬ−６のシグナル伝達系を形成する蛋白質を医薬品としてヒト等の体内に投与する場合に特に有効と考えられる。
【００１１】
融合蛋白質を体内に持続的に投与する医薬品として開発する場合、リンカーは結合される蛋白質には含まれていない、これら蛋白質とは無関係の配列であり、しかも独自の立体構造をとるために上記免疫反応が惹起される可能性が高いことが課題となる。従って、一般的にリンカーはできるだけ短い配列であることが好ましく、更には全くリンカーが存在しないことが最も好ましい。
【００１２】
しかし、前述したように融合蛋白質には、２種類の蛋白質間に立体障害等が起こらないこと、及び、融合された本来の構造を有する２種類の蛋白質が互いに結合できる程度の自由度を有していることが必要である。例えばリンカーを使用せずにＩＬ−６ＲとＩＬ−６を直接融合させる場合、両者の立体障害を起こさず、かつ両者が互いに結合できる程度の自由度を有し得るようにするためには、融合させる蛋白質の順序、Ｎ末端側蛋白質のどのアミノ酸残基にどのＣ末端側アミノ酸残基を結合するか等、決定しなければならない事項が数多くある。
【００１３】
ＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合蛋白質については、前記した３種類のリンカーを用いた例しか報告されておらず、リンカーを介して両者が結合したものしか知られていない。図１（ａ）はリンカーを介して両者が結合した融合蛋白質のイラスト図である。一方、リンカーを介することなく両者が結合されたものについては報告されていない。
【００１４】
そこで本発明は、図１（ｂ）に示したような、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６がリンカーを介することなく直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質等を提供することを目的とするものである。また本発明は、宿主、特にピキア・パストリス種の酵母が発現するプロテアーゼの切断作用に対して抵抗性を有するＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質、及び該融合蛋白質をコードする遺伝子を提供することをも目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らはＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質について鋭意検討した結果、リンカーを介することなくＮ末端側にＩＬ−６Ｒが、Ｃ末端側にＩＬ−６が配置された融合蛋白質を完成するに至った。即ち本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ残基の一つが直接に結合していることを特徴とするＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質である。また本発明者らは、ＩＬ−６のＮ末端３７番目のリジン残基のＣ末端側がプロテアーゼの切断作用を受けることを見いだし、一次構造中のプロテアーゼ切断部位に変異が挿入され、プロテアーゼに対する抵抗性を有することを特徴とするプロテアーゼ抵抗性のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質、中でも、ＩＬ−６ＲのＣ末端側に、Ｎ末端２８番目のアラニン残基から３７番目のリジン残基までの１０アミノ酸残基が欠失したＩＬ−６が結合した、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質と、これをコードする遺伝子を完成するに至った。
【００１６】
また本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子である。
【００１７】
更に本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）種の酵母である。
【００１８】
更に本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス種の酵母を培養し、当該培養物からＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を分泌型蛋白質として採取することを特徴とするＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の製造法である。
【００１９】
更に本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス種の酵母をメタノールを含まず天然物由来の炭素源を含む培地で培養し、途中でメタノールを添加して培養することを特徴とするＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の製造法である。
【００２０】
更に本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を含有する溶液を、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの３種類のクロマトグラフィーにかけ、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を採取することを特徴とするＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の製造法である。
【００２１】
更に本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を含むことを特徴とする造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅剤である。
【００２２】
そして本発明は、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を主成分として含む血小板増多剤である。以下本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明の融合蛋白質は、そのＮ末端側にＩＬ−６Ｒが位置し、Ｃ末端側にＩＬ−６が位置し、両蛋白質の間がリンカーを介することなく直接結合されていることを特徴とするものである。前記したように、プロテアーゼに対する抵抗性付与のみを目的とする場合は、両蛋白質の間はポリペプチドリンカーを介して結合しても良いが、投与の際の抗原性低減等をも考慮するのであれば、ポリペプチドリンカーを介することなく直接結合されていることが好ましい。リンカーを用いる場合には、例えば公知のリンカー配列（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１５、１４２頁、１９９７年；Ｃｈｅｂａｔｈら、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．、８、３５９頁、１９９７年）を使用したり、ＩＬ−６Ｒの３４４番目のロイシン残基のＣ末端にセリン残基−セリン残基−グルタミン酸残基−ロイシン残基−バリン酸残基というリンカーを結合し、更にそのＣ末端側にＩＬ−６を結合させることが例示できる。本発明のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を構成するＩＬ−６Ｒは、全長４６８アミノ酸残基で構成される膜蛋白質で、シグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞内領域から成る（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１、８２５頁、１９８８年参照）。ヒトＩＬ−６Ｒの場合、シグナル領域はＮ末端１番目のメチオニン残基付近から１９番目のアラニン残基付近まで、細胞外領域は２０番目のロイシン残基付近から３５８番目のアスパラギン酸残基付近まで、膜貫通領域は３５９番目のセリン残基付近から３８６番目のロイシン残基付近まで、細胞内領域はおよそ３８７番目のアルギニン残基付近から４６８番目のアルギニン残基付近までと考えられている。細胞外領域はイムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域に分けられ、イムノグロブリン様領域は２０番目のロイシン残基付近から１１１番目のアスパラギン酸残基付近まで、サイトカインレセプター領域は１１２番目のバリン残基付近から３２３番目のアラニン残基付近までと考えられている。
【００２４】
ＩＬ−６Ｒにおいて、ＩＬ−６との結合に必須なのはサイトカインレセプター領域であり、イムノグロブリン様領域は不要であることが知られている。なおサイトカインレセプター領域は、７つのβシートから構成されるバレル（樽）様の構造体が短い２個つながった構造体である（Ｙａｗａｔａら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１２、１７０５頁、１９９３年参照）。
【００２５】
本発明では、全長のＩＬ−６Ｒはもちろんのこと、その細胞外領域全体又はサイトカインレセプター領域のいずれか、即ち部分的ＩＬ−６Ｒを用いることもできる。ＩＬ−６と結合してそのシグナル伝達系を構成するのはサイトカインレセプター領域であり、細胞外領域は該領域を含む領域だからである。
【００２６】
本発明者らの知見によれば、具体的にはＩＬ−６ＲのＮ末端として、Ｎ末端２０番目のロイシン残基、Ｎ末端１１２番目のバリン残基、及びＮ末端１１６番目のグルタミン酸残基が例示できる。
【００２７】
また本発明者らの知見によれば、具体的にはＩＬ−６ＲのＣ末端として、Ｎ末端３２３番目のアラニン残基から３６１番目のセリン残基までの３９個のアミノ酸残基のうちのいずれか一つ、特に好ましくは３２３番目のアラニン残基、３３３番目のアラニン残基、３３４番目のロイシン残基、３３５番目のトレオニン残基、３３８番目のリジン残基、及び３４３番目のイソロイシン残基の６個のアミノ酸残基のいずれか一つを用いることが例示できる。この部分的ＩＬ−６ＲのＣ末端側に、ＩＬ−６のＮ末端とを結合させるのである。なおＩＬ−６ＲのＮ末端は、融合蛋白質のシグナル伝達における作用効果を勘案して適宜削除することができる。
【００２８】
ＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質を構成するＩＬ−６は、４つのαヘリックスから構成される全長２１２アミノ酸残基の分泌型蛋白質で（Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４，７３１巻、１９８６年参照）。ＩＬ−６が活性を示すためには、これら４つのαヘリックス全てが必要であることが知られている。従って、本発明で使用するＩＬ−６としては、４つのαヘリックスすべてを有するものであれば、特に制限はない。即ち、全長のＩＬ−６はもちろんのこと、例えばＮ末端やＣ末端の一部アミノ酸残基が削除された部分的ＩＬ−６であってもよい。より具体的には、分泌型ＩＬ−６の構造として知られているＮ末端２８番目のアラニン残基又は２９番目のプロリン残基から２１２番目のメチオニン残基までのＩＬ−６を例示することができる。またその他にも、ＩＬ−６の発現例（例えばＹａｓｕｋａｗａら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．、１２，４１９頁、１９９０年）やＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の発現例（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５，１４２頁、１９９７年）を参照にして、部分的ＩＬ−６としていかなる配列のものを使用するか決定することができる。
【００２９】
一次構造中のプロテアーゼ切断部位に変異が挿入され、プロテアーゼに対する抵抗性が付与された本発明の融合蛋白質では、プロテアーゼの切断部位が種類毎に異なるため、その一次構造において、どの部分に変異を導入する、即ちどの部分を欠失させ、どの部分に本来存在しないアミノ酸残基を付加し、或いはどの部分のアミノ酸残基を置換してプロテアーゼによる切断作用を受け難くするか、を適宜決定する。置換による変異の導入では、置換により蛋白質分子が本来の立体構造をとらないようにすることにより、プロテアーゼの切断作用を受けない、或いは受け難くする。この場合、目的とするアミノ酸残基を分子サイズの小さいアミノ酸残基であるグリシンやセリンに置換することが好ましい置換として例示できる。欠失による変異の導入では、目的とするアミノ酸残基を削除することでプロテアーゼが切断作用部位を認識できないようにしたり、蛋白質分子が本来の立体構造をとらないようにすることにより、プロテアーゼの切断作用を受けない、或いは受け難いようにする。
【００３０】
変異の導入は、遺伝子工学的にＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子に対して行う等すれば良い。また前記アミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の置換のいずれを行っても良いが、操作が比較的容易であり、しかも本来存在しないアミノ酸残基の置換による抗原性の変化等の影響が小さいと考えられることから、プロテアーゼの切断部位近傍の連続する１以上のアミノ酸残基を削除して欠失させることが特に好ましい。
【００３１】
より具体的な選択の基準は、本願発明のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を遺伝子工学的に製造する際に使用する宿主細胞が分泌するプロテアーゼに対する抵抗性を付与することである。即ち、後の実施例に示したように、遺伝子工学的に製造しようとするＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を選定した宿主細胞で発現させ、通常の液体クロマトグラフィーを用いる方法等で部分的に精製する過程でプロテアーゼによる分解産物と思われるピークを採取したり、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いる方法でプロテアーゼによる分解産物と思われるバンドを採取し、N末端のアミノ酸配列を解析することにより、前記選定した宿主細胞が分泌するプロテアーゼによりＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質のいずれの部分が切断作用を受けているかを知ることができる。
【００３２】
以上のようにしてＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の一次構造におけるプロテアーゼ切断部位を検出したならば、当該切断部位付近のアミノ酸残基を欠失等してプロテアーゼの切断作用を受けない、或いは受け難くすることにより、プロテアーゼに対する抵抗性を有するＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を得ることが可能になる。
【００３３】
前記以外に例えば、医薬品等のようにプロテアーゼ存在下でＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の生物活性を長時間持続させる目的でも、本願発明のプロテアーゼ抵抗性ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は有効である。このようなＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を製造するためには、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質が生物活性を発揮すべき環境に共存するプロテアーゼを取得し、該プロテアーゼにより変異導入前のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質においてどの部位が切断作用を受けるかを検出し、当該部分に前記のように変異させれば良い。
【００３４】
前記のようにして変異を導入したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質については、変異導入後、生物活性を維持していることを確認することが好ましい。この目的のためには、変異を導入したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を調製し、その生物活性を、例えば後の実施例に示したようなＢＡＦ１３０細胞株を用いる確認に供することが例示できる。この確認により変異を導入したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質に生物活性が認められなかった場合には、別の変異を導入して同様の確認を行う操作を繰り返し行えば良い。
【００３５】
引き続き、変異を導入したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質については、プロテアーゼ抵抗性であることを確認することが好ましい。この目的のためには、変異を導入したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を一定時間プロテアーゼと共存させたものをＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングを組み合わせた解析に供する等すれば良い。この結果プロテアーゼに対する抵抗性が認められなかった場合には、別の変異を導入して同様の確認を行う操作を繰り返し行えば良い。なお、宿主細胞が分泌するプロテアーゼに対する抵抗性を付与したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質においては、該宿主細胞を用いてこれを調製した後、細胞培養液について前述のような確認操作を行えば良い。
【００３６】
本発明のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、これをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換え操作を行うことにより容易に作製することができる。ＩＬ−６Ｒ又はＩＬ−６をコードする遺伝子は既に単離されており、その塩基配列もよく知られている。従って、本発明の融合蛋白質を作製する際には、融合蛋白質を構成するＩＬ−６ＲとＩＬ−６のアミノ酸配列から必要な遺伝子配列を調製し、これを制限酵素を用いて結合させておけば良い。またここで、天然の遺伝子配列を用いる以外にコドンの縮合を勘案し、任意のコドンを同一のアミノ酸残基をコードするが塩基配列の異なるものに置換するなどしても良い。遺伝子組換えにより宿主に蛋白質を発現させる場合、特定のコドンを使うと発現率や翻訳率が向上することがあるからである。
【００３７】
本発明の融合蛋白質を遺伝子組換えで作製する場合に使用する宿主に特別の制限はなく、従来の報告を参考にしつつ、通常の遺伝子組換え操作で使用されている大腸菌やＣＨＯ細胞等に代表される動物細胞を使用することができる（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１０８，６７３頁、１９９０年参照）。中でも、本実施例に示したピキア・パストリス種の酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、メタノールを唯一の炭素源として生育できる酵母で、ＣＨＯ細胞等のような動物細胞と比較して安価に培養できることから特に好ましい宿主として例示できる。
【００３８】
ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を遺伝子工学的に製造する際に好適な宿主細胞であるピキア・パストリス種の酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が分泌するプロテアーゼに抵抗性であるＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質として、ＩＬ−６Ｒと少なくともN末端２８番目のアラニン残基からＮ末端３７番目のリジン残基までが欠失したＩＬ−６との融合蛋白質を例示することができる。プロテアーゼ抵抗性を有するＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を調製し、これを組み込んで発現ベクターを調製し、宿主細胞を形質転換すれば、形質転換宿主細胞を培養することにより本願発明のプロテアーゼ抵抗性を有するＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を大量に製造することができる。前述のように宿主細胞が分泌するプロテアーゼに対する抵抗性を付与したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質では、宿主細胞で発現された後に該プロテアーゼにより切断されない、或いは切断され難いため、抵抗性を有していないＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質に比較して、より大量の蛋白質を得ることが可能となる。
【００３９】
前述した、本発明の融合蛋白質を遺伝子組換えで作製するための遺伝子は、宿主に導入する（形質転換する）際には、発現ベクターの中に組み込んで使用する。発現ベクターは当該遺伝子の他に、発現制御遺伝子や形質転換された宿主の選択のための指標となる遺伝子等を組み込むが、かかる遺伝子は使用する宿主との関係で適宜選択して使用すれば良い。例えばピキア・パストリス種の酵母を宿主として使用するのであれば、その染色体ＤＮＡ中にＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を導入するためのアルコールオキシダーゼ遺伝子の上流配列と下流配列、選択の指標となるヒスチジン合成遺伝子そして発現制御のためのアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター配列等が、大腸菌を宿主として使用するのであれば選択の指標となるアンピシリン耐性遺伝子や発現制御のためのＬａｃプロモーター／オペレーター配列等が例示できる。なお、市販の発現ベクター（例えばｐＰＩＣ９、ピキア・パストリス種の酵母用の発現ベクター、インビトロジェン社製）に本発明の遺伝子を導入して使用することもできる。
【００４０】
本発明において、好ましくピキア・パストリス種の酵母をＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換して融合蛋白質を作製する場合は、発現ベクター中に、融合蛋白質のシグナルペプチドとしてＩＬ−６Ｒ本来のシグナルペプチドやα因子のシグナルぺプチドを組み込むことが好ましく、特に高発現を実現できることからα因子のシグナルぺプチドを用いることが好ましい。
【００４１】
前述の形質転換された宿主を適当な条件下で培養し、発現ベクター中の発現制御遺伝子との関係で必要に応じて融合蛋白質の発現を誘導すれば融合蛋白質を作製することができる。本発明において、好ましくピキア・パストリス種の酵母を宿主とする場合は、ジャーファーメンターを用いる方法が例示できる。より具体的には、１００ｍＬの培地が仕込まれた５００ｍＬ容量の振とうフラスコに、あらかじめ作製しておいたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を発現するピキア・パストリス種の酵母の２０％グリセロール凍結菌株を接種し、２８〜３０℃で２０時間振とう培養する。次に６〜９Ｌの培地が仕込まれた１６Ｌ容量のジャーファーメンターに上記培養液１００ｍＬを接種し、２８〜３０℃にて通気撹拌培養を開始する。培養中の酵母の状態をモニタリングするために、ＯＤ６００、ｐＨ、溶存酸素濃度、撹拌速度、温度をモニタリングしてかつ制御することが好ましい。培地は天然物由来の炭素源を含むものであれば特に種別は問わないが、具体的組成は実施例を参考にすればよい。また、該培養を実施するためのジャーファーメンターとしては市販の装置を使用することができる。培養開始後、培養液中のグリセロールが枯渇した段階でメタノールを添加すればよい。グリセロールの枯渇は溶存酸素をモニタリングすることにより知ることができる。メタノールの添加は枯渇後５時間以内に行うことが望ましい。メタノールの添加量は多すぎると酵母に毒性を示すが、少なすぎるとアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター配列が十分に機能しないことを勘案すると、０．５％以上５％以下（質量／容量）が好ましい。
【００４２】
培養により作製された融合蛋白質は、適当な方法で培地等から取得することが可能である。宿主として大腸菌を用いた場合は、発現された融合蛋白質は大腸菌内に不溶性塊として蓄積されることから、菌体を破砕後、適当な条件下でリフォールディングや精製操作を行えばよい。好ましくピキア・パストリス種の酵母を宿主として用いた場合には、その培養上清から融合蛋白質を精製して取得することが可能である。精製原料は融合蛋白質を含む溶液であれば特に制限はなく、例えば融合蛋白質を含むピキア・パストリス種の酵母の培養液を例示することができる。該溶液はそのまま用いてもよく、またはそれらを緩衝液あるいは純水により希釈したり、限外ろ過膜あるいは硫酸アンモニウム等により濃縮した後に用いてもよい。精製操作としては、液体クロマトグラフィー操作を例示することができる。好ましくはイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの３種類のクロマトグラフィーの組み合わせを例示することができる。
【００４３】
ピキア・パストリス種の酵母の培養上清は容量が大きいため、最初にイオン交換クロマトグラフィーにかけることが好ましい。イオン交換クロマトグラフィーは陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーに分かれるが、除蛋白質効率を考慮するして適宜選択することができる。前者の例としては陽イオン交換基としてＳＰを、後者の例としては陰イオン交換基としてＤＥＡＥを例示することができる。ここで流速を毎分１００ｍｌ以上に上げられることと、１μｍ以下のフィルターを通していないサンプルを添加することができることを勘案すると、後の実施例に示すように、陽イオンクロマトグラフィーとしては吸着流動床Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＳＰ Ｃ−５０カラム（アマシャムファルマシア社製）を好ましく例示することができる。上記方法により得た融合蛋白質を含む画分は、次に疎水性クロマトグラフィーにかけ、さらに融合蛋白質の純度がより高い画分を得ることができる。この画分は、後の実施例に示すように、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーで濃縮することにより、ゲルろ過クロマトグラフィーを効率よく行うことができる。
【００４４】
本発明者らは、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の幹細胞増幅効果について鋭意検討した結果、後の実施例に示すように、該融合蛋白質と幹細胞因子（ＳＣＦ）存在下でＣＤ３４陽性細胞をメチルセルロースプレート上で培養すると、従来報告されているＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、及びＳＣＦ存在下で培養したときよりも、著しくコロニー形成能が高くなることを発見した。本発明はこれらの新たに見出されたＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質が有する造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅に基づきなされたものであり、該融合蛋白質を主成分として含む造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅剤又は造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅法である。
【００４５】
本発明の造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅剤は、本発明の融合蛋白質単独でも若干の効果を示すので実用価値はあるが、ＳＣＦ、ＦＬＫ２リガンド等のチロシンキナーゼを刺激するサイトカイン類のうちいずれかひとつを、特に好ましくはＳＣＦを添加すると効果は顕著なものとなる。更にインターロイキン−３（ＩＬ−３）や血小板増殖因子（ＴＰＯ）等を加えてもよい。造血幹細胞は臍帯血、末梢血、又は骨髄からＣＤ３４選択により、造血幹細胞を含む画分として得ることができる。本発明の融合蛋白質は他のサイトカインを入れた個々の容器を含むキットとして提供することもできるし、または単一の容器の中の混合物として提供することもできる。造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅は、例えばプラスチックバッグのような容器の中で、造血幹細胞を含む画分を、本発明の融合蛋白質と例えばＳＣＦを添加した無血清培地で３７℃で１〜３週間培養すればよい。増幅された造血幹細胞を患者に戻す場合は、現行の末梢血幹細胞移植と同じ方法を採用すればよい。
【００４６】
本発明者らは、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の血小板増多効果について鋭意検討した結果、後の実施例に示すように、該融合蛋白質をマウスに投与すると血小板が有意に増多することと、該融合蛋白質を予め制癌剤を投与したマウスに投与すると血小板回復が有意に早くなることを発見した。本発明はこれらの新たに見出されたＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つとＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合しているＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質が有する血小板の増多あるいは回復に基づきなされたものであり、該融合蛋白質を主成分として含む血小板増多剤又は血小板増多方法である。本発明の血小板増多剤は、好ましくは非経口投与により、例えば静脈内投与、筋肉内投与、経皮投与等により投与することが好ましい。投与量は、血小板の不足症状を示す疾患の種類、患者の状態等により適宜選択されるが、一般に１〜５００μｇ／ｋｇ／日の範囲であり、血小板の増多の様子により継続的に投与すれば良い。本発明の血小板増多剤は、常用の賦形剤、例えば生理食塩水、ブドウ糖液、マンニトール、メチルセルロース、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等の賦活剤と混合して製剤化することができる。また本発明の血小板増多剤は凍結乾燥品とすることも可能であり、凍結乾燥した場合には使用直前に生理食塩水、ブドウ糖液、リンゲル液等の等張液により再溶解すれば良い。
【００４７】
【発明の実施の形態】
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１ 中間体プラスミドの作製
各種リンカーをコードするオリゴヌクレオチドを挿入することにより、各種リンカーを介して融合されたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を作製可能とすべく、中間体プラスミドｐＢＳ６Ｒ６ＳとｐＢＳ６Ｒ６Ｌを以下の方法で作製した。
【００４９】
まず、クローニングベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（東洋紡（株）製）を制限酵素ＫｐｎＩで切断し、クレノウフラグメントで処理した後、ライゲーション反応を行ってＫｐｎＩサイトが消失したプラスミドｐＢＳを作製した。
【００５０】
次に、プライマーｐ６ＲＡＢ２０Ｌ（配列番号４５）とプライマーｐ６ＲＦ３２０Ｓ（配列番号４６）を用いてＩＬ−６Ｒ遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、ＸｈｏＩで切断した。これを、予めＸｈｏＩとＥｃｏＲＶで切断したｐＢＳに挿入することにより、プラスミドｐＢＳ６Ｒを得た。
【００５１】
次に、プライマーｐＩＬ６Ｂ２（配列番号４７）とプライマーｐＩＬ６Ｆ（配列番号４８）により、ＩＬ−６遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、Ｂｇｌ ＩＩとＮｏｔＩで切断した。これを、予めＢｇｌ ＩＩとＮｏｔＩで切断したプラスミドｐＢＳ６Ｒに挿入することにより、ｐＢＳ６Ｒ６Ｓを得た。得られたｐＢＳ６Ｒ６Ｓの構造を図２に示す。
【００５２】
次に、オリゴマー３２０Ｓ３３３Ａｂ（配列番号４９）と３２０Ｓ３３３Ａｆ（配列番号５０）を通常の方法でアニールさせた。これを、予めＢｇｌ ＩＩとＫｐｎ Ｉで切断したプラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｓに挿入することにより、ｐＢＳ６Ｒ６Ｌを得た。得られたｐＢＳ６Ｒ６Ｌの構造を図４に示す。
【００５３】
実施例２ 発現プラスミドの作製
予めＢｇｌ ＩＩとＫｐｎＩで切断したｐＢＳ６Ｒ６Ｓに、下記のようにそれぞれ２種類のオリゴヌクレオチドをアニールしたアニール配列１〜５をそれぞれ挿入し、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子をインサートにもつプラスミド５種類を作製した。
【００５４】
アニール配列１（３２３ＡＧ４ＳＡ）；センス側は配列番号１のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号２のオリゴヌクレオチド。
【００５５】
アニール配列２（３２３ＡＧ４Ｓ２Ａ）；センス側は配列番号３のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号４のオリゴヌクレオチド。
【００５６】
アニール配列３（３３４ＬＰＡ）；センス側は配列番号５のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側；配列番号６のオリゴヌクレオチド。
【００５７】
アニール配列４（３３３ＡΔＡ）；センス側は配列番号７のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側；配列番号８のオリゴヌクレオチド。
【００５８】
アニール配列５（３２３ＡΔＡ）；センス側は配列番号９のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側；配列番号１０のオリゴヌクレオチド。
【００５９】
なお、アニール配列１（３２３ＡＧ４ＳＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３２３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧＳというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列２（３２３ＡＧ４Ｓ２Ａ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３２３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列３はＩＬ−６ＲのＮ末端３３４番目のロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＰというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列４（３３３ＡΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、そしてアニール配列５（３２３ＡΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３２３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものである。
【００６０】
次に、予めＥｃｏ４７ ＩＩＩとＫｐｎＩで切断したｐＢＳ６Ｒ６Ｌに、下記のようにそれぞれ２種類のオリゴヌクレオチドをアニールしたアニール配列６〜２２をそれぞれ挿入し、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子をインサートにもつプラスミド１７を作製した。
【００６１】
アニール配列６（３３３ＡＧ４ＳＡ）；センス側は配列番号１１のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側；配列番号１２のオリゴヌクレオチド。
【００６２】
アニール配列７（３３３ＡＧ４Ｓ２Ａ）；センス側は配列番号１３のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号１４のオリゴヌクレオチド。
【００６３】
アニール配列８（３４３ＩＧ４Ｓ２Ａ）；センス側は配列番号１５のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号１６のオリゴヌクレオチド。
【００６４】
アニール配列９（３３３ＡＧ４Ｓ３Ａ）；センス側は配列番号１７のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号１８のオリゴヌクレオチド。
【００６５】
アニール配列１０（３３３ＡＧ２Ａ）；センス側は配列番号１９のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号２０のオリゴヌクレオチド。
【００６６】
アニール配列１１（３３３ＡＧ４Ａ）；センス側は配列番号２１のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号２２のオリゴヌクレオチド。
【００６７】
アニール配列１２（３４３ＩＧ２Ａ）；センス側は配列番号２３のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号２４のオリゴヌクレオチド。
【００６８】
アニール配列１３（３４３ＩＧ４Ａ）；1センス側は配列番号２５のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号２６のオリゴヌクレオチド。
【００６９】
アニール配列１４（３６１ＳΔＡ）；センス側は配列番号２７のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号２８のオリゴヌクレオチド。
【００７０】
アニール配列１５（３５８ＤΔＡ）；センス側は配列番号２９のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号３０のオリゴヌクレオチド。
【００７１】
アニール配列１６（３５２ＴΔＡ）；センス側は配列番号３１のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号３２のオリゴヌクレオチド。
【００７２】
アニール配列１７（３４６ＲΔＡ）；センス側は配列番号３３のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号３４のオリゴヌクレオチド。
【００７３】
アニール配列１８（３４３ＩΔＡ）；センス側は配列番号３５のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号３６のオリゴヌクレオチド。
【００７４】
アニール配列１９（３３８ＫΔＡ）；センス側は配列番号３７のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号３８のオリゴヌクレオチド。
【００７５】
アニール配列２０（３３５ＴΔＡ）；センス側は配列番号３９のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号４０のオリゴヌクレオチド。
【００７６】
アニール配列２１（３４３ＩΔＰ）；センス側は配列番号４１のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号４２のオリゴヌクレオチド。
【００７７】
アニール配列２２（３３８ＫΔＰ）；センス側は配列番号４３のオリゴヌクレオチド、 アンチセンス側は配列番号４４のオリゴヌクレオチド。
【００７８】
なお、アニール配列６（３３３ＡＧ４ＳＡ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧＳというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列７（３３３ＡＧ４Ｓ２Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列８（３４３ＩＧ４Ｓ２Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３４３番目のイソロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列９（３３３ＡＧ４Ｓ３Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１０（３３３ＡＧ２Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１１（３３３ＡＧ４Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１２（３４３ＩＧ２Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３４３番目のイソロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１３（３４３ＩＧ４Ａ）はＩＬ−６ＲのＮ末端３４３番目のイソロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＧＧＧＧというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１４（３６１ＳΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３６１番目のセリンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１５（３５８ＤΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３５８番目のアスパラギン酸とＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１６（３５２ＴΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３５２番目のトレオニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１７（３４６ＲΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３４６番目のアルギニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１８（３４３ＩΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３４３番目のイソロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列１９（３３８ＫΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３８番目のリジンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列２０（３３５ＴΔＡ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３５番目のトレオニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、アニール配列２１（３４３ＩΔＰ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３４３番目のイソロイシンとＩＬ−６のＮ末端２９番目のプロリンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものであり、そしてアニール配列２２（３３８ＫΔＰ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３８番目のリジンとＩＬ−６のＮ末端２９番目のプロリンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質を発現するためのものである。
【００７９】
ｐＢＳ６Ｒ６Ｌ自体がＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子をインサートにもつが、該遺伝子により発現する融合蛋白質（３３４ＬΔＶ）は、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３４番目のロイシンとＩＬ−６のＮ末端３０番目のバリンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質である。
【００８０】
最後に、上記方法で作製したプラスミド２３種及びｐＢＳ６Ｒ６ＬをそれぞれＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断してＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を取得し、予めＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断したｐＰＩＣ９に挿入して２４種類の発現プラスミドを作製した。これら発現プラスミドの一例として、３３３ＡΔＡの発現プラスミドの構造を図６に示す。
【００８１】
実施例３ 形質転換体の作製
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株（インビトロジェン社）から、ＥａｓｙＣｏｍｐ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いてコンピテントセルを調製し、Ｂｇｌ ＩＩによって線状化した各発現プラスミドを導入した。形質転換菌は最小栄養培地で培養し、ヒスチジン要求性を失った形質転換菌を選別した。
【００８２】
次に、得られた形質転換体をＭＤプレート（１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ）、０．００００４％（Ｗ／Ｖ）ビオチン、２％（Ｗ／Ｖ）グルコース）とＭＭプレート（１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ、０．００００４％（Ｗ／Ｖ）ビオチン、０．５％（Ｖ／Ｖ）メタノール）にそれぞれ接種し、各形質転換体に対し、ｍｕｔ+であるかｍｕｔsであるかを調べた。
【００８３】
各誘導体ごとの、得られた形質転換体の数とｍｕｔs菌株の数を表１に示す。各発現プラスミドで形質転換された菌株ごとに、平均９．４個のｍｕｔs菌株（最低４種、最高１７種、合計２１６種）を取得した。
【００８４】
【表１】
実施例４ 形質転換体の培養
実施例３で取得されたｍｕｔs菌（合計２１６種）とＩＬ−６ＲのＮ末端３４４番目のロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＳＳＥＬＶというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するｍｕｔs菌（平成１０年特許願第２９２１号に記載）をそれぞれ試験管を用いて５％（Ｖ／Ｖ）のメタノールを含むＢＭＧＹ培地（１％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス、２％（Ｗ／Ｖ）ペプトン、１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ＢａｓｅＷｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ）、０．４ｍｇ／ｌビオチン、１００mMリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１％（Ｗ／Ｖ）グリセロール３ｍｌで、３０℃で１２０時間培養した。各培養液から１２０時間目の培養液をサンプリングし、遠心により上清を取得した。
【００８６】
実施例５ 生物活性の測定
実施例４により得られた培養上清中のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の生物活性を、ＢＡＦ１３０細胞を用いた生物活性評価法により測定した。ＢＡＦ１３０は、本来ヒトｇｐ１３０蛋白質を発現していないマウス細胞ＢＡＦ（Ｈａｔａｋｅｙａｍａら、Ｃｅｌｌ、６３、１５４頁、１９８９年参照）にヒトｇｐ１３０蛋白質をコードする遺伝子を導入して形質転換させ、当該蛋白質を発現させた細胞である。このため、生理活性を有するＩＬ−６Ｒ及びＩＬ−６共存下で増殖活性を示す。
【００８７】
ＢＡＦ１３０の懸濁液を、９６穴プレートに２ｘ１０4細胞／穴となるように添加し、２１６種類の培養上清をそれぞれ、１％、０．２５％、０．０６１％、０．０１５％に希釈して添加した。２日後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（和光純薬工業（株）製）を用いて、参照波長を６００ｎｍとしたときの４０５ｎｍの吸光度を得た。培養上清の代わりに、１μｇ／ｍｌのＩＬ−６を各種濃度に希釈して、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＩＬ−６Ｒとともに添加したときの吸光度と同じ濃度依存性を示す培養上清の活性を１ｕｎｉｔ／ｍｌと定義した。図７には、各融合蛋白質ごとに、同一の融合蛋白質発現ベクターで形質転換されたｍｕｔs菌４〜１７種類の培養上清の生物活性の平均値を示した。
【００８８】
図７から、リンカー配列をもたない融合蛋白質１２種類の全てに関し、同一の融合蛋白質発現ベクターで形質転換された、少なくとも一つ以上のｍｕｔs菌の培養上清中に活性が認められたことが分かる。これは、ＩＬ−６ＲのＮ末端３２３番目のアラニン残基から３６１番目のセリン残基までの３９個のアミノ酸残基のいずれか一つのアミノ酸残基のＣ末端にＩＬ−６のＮ末端のアミノ酸残基が結合している本発明のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質がＩＬ−６のシグナル伝達活性を有することを示す。
【００８９】
更に図７から、３２３番目のアラニン残基、３３３番目のアラニン残基、３３４番目のロイシン残基、３３５番目のトレオニン残基、３３８番目のリジン残基、又は３４３番目のイソロイシン残基のいずれかのＣ末端にＩＬ−６のＮ末端のアミノ酸残基が結合したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質である３２３ＡΔＡ、３３３ＡΔＡ、３３４ＬΔＶ、３３５ＴΔＡ 、３３８ＫΔＰ、３３８ＫΔＡ、３４３ＩΔＰ又は３４３ＩΔＡは、先に報告されているＩＬ−６ＲのＮ末端３４４番目のロイシンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをＳＳＥＬＶというリンカーを介して融合した融合蛋白質である３３４ＬＳＳＥＬＶＡ（平成１０年特許願第２９２１号に記載）よりも強い活性をもつことが示された。
【００９０】
更に図７から、３２３番目のアラニン残基、３３３番目のアラニン残基、３３４番目のロイシン残基、３３５番目のトレオニン残基、３３８番目のリジン残基、又は３４３番目のイソロイシン残基のいずれかのＣ末端にＩＬ−６のＮ末端のアミノ酸残基が結合したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質である３２３ＡΔＡ、３３３ＡΔＡ、３３４ＬΔＶ、３３５ＴΔＡ 、３３８ＫΔＰ、３３８ＫΔＡ、３４３ＩΔＰ又は３４３ＩΔＡは、グリシン残基やセリン残基のような自由度の高いアミノ酸残基が５から１５個つながったペプチドから成るリンカーを介して融合されたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質である３２３ＡＧ４ＳＡ、３３３ＡＧ４ＳＡ、３２３ＡＧ４Ｓ２Ａ、３３３ＡＧ４Ｓ２Ａ、３４３ＩＧ４Ｓ２Ａ、３３３ＡＧ４Ｓ３Ａや、アミノ酸残基が１から４個つながったペプチドから成るリンカーを介して融合されたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質である３３４ＬＰＡ、３３３ＡＧ２Ａ、３３３ＡＧ４Ａ、３４３ＩＧ２Ａ、３４３ＩＧ４Ａと比較して、ほぼ同等かやや低い程度の活性を有することが分かる。これにより、３２３番目のアラニン残基、３３３番目のアラニン残基、３３４番目のロイシン残基、３３５番目のトレオニン残基、３３８番目のリジン残基、３４３番目のイソロイシン残基の６個のアミノ酸残基のいずれか一つのアミノ酸残基のＣ末端にＩＬ−６のＮ末端のアミノ酸残基が結合した本発明のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質が、中でも特に好ましいことが分かる。
【００９１】
実施例６ 融合蛋白質を発現するｍｕｔs菌の大量培養
実施例３に記載の３３３ＡΔＡを発現するｍｕｔs菌１１株のうち、実施例４と５に記載の方法で最も発現量の高かった株であるＩＩＩ−１０８株を用いて、１６リットルジャーを用いた培養を行った。ＩＩＩ−１０８株のグリセロールストックを１００ｍｌのＢＭＧＹ（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ，Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ ２０ｇ／ｌ，Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ １．３４ｇ／ｌ，１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０，グリセロール １０ｇ／ｌ，ビオチン ０．４ｍｇ／ｌ）培地に接種し、Ｇ−２０振とう培養器（ＮＢＳ社製）にて３０℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間前培養を行った。この培養液全量を８ＬのＢＭＧＹ（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ，Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ ２０ｇ／ｌ，Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ １．３４ｇ／ｌ，１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ６．０，グリセロール １０ｇ／ｌ，ビオチン ０．４ｍｇ／ｌ）培地に接種し、１６リットルジャーＳＦ−１１６（ＮＢＳ社製）を用いて温度２８℃、攪拌速度３５０ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの条件で培養を行った。培養開始から１６時間後、メタノール２４０ｍｌ、Ｂａｃｔｏ ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ ５０ｇ／ｌ、及びＢａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ １００ｇ／ｌの混合液１．６リットルを添加し、融合蛋白質の発現誘導を開始した。図に本培養の培養経過を示す。
【００９２】
培養液中のメタノール濃度はガスクロマトグラフィーで測定した。培養液中のｐＨはｐＨメーターで測定した。培養液中のＯＤ６００（菌体密度の指標）は、培養液を生理食塩水で１００倍希釈し、分光光度計で測定した。培養液中の融合蛋白質の濃度は、抗ヒトＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体ＭＴ−１８（Ｈｉｒａｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻、２９００、１９８９年参照）を固相抗体に、抗ヒトＩＬ−６ポリクローナル抗体（ジェンザイム社製）を検出用抗体に、実施例７に示す方法で取得した融合蛋白質精製品を標準物質にそれぞれ用いたサンドイッチエンザイムイムノアッセーで測定した。また、融合蛋白質の生物活性は実施例５に示すＢＡＦ１３０細胞を用いた方法で測定した。
【００９３】
実施例７ 融合蛋白質の精製
実施例６で選ばれた培養液を遠心分離操作により菌体と上清に分離した。得られた上清（１１．６Ｌ）を蒸留水で、導電率がＮａＣｌ濃度換算で約５０ｍＭになるまで希釈した（６６．０５Ｌ）。次に酢酸を用いてｐＨを４．５に調製した。
【００９４】
２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した吸着流動床Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＳＰ Ｃ−５０カラム（５０ｍｍＩＤ×１００ｃｍ、ゲル量３００ｍｌ）（アマシャムファルマシア社製）に、上記希釈調製液をカラム下部から上方送液することにより添加した（線速毎時３００ｃｍ）。添加終了後、平衡化緩衝液をさらに上方送液することで洗浄した。次に送液方向を変え、カラム上部から溶出緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５））を送液して(線速毎時１５０ｃｍ）、溶出画分（Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ溶出フラクション、３００ｍＬ）を得た。なお、溶出画分の検出は２８０ｎｍによる吸光度を測定することにより行った。
【００９５】
Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ溶出フラクションに−２０℃に冷却した硫酸アンモニウムを２Ｍになるように溶解させ、２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラム（２１．５ｍｍＩＤ×１５ｃｍ）（東ソー製）に添加した（流速毎分５ｍｌ）。添加終了後、平衡化緩衝液をさらに送液し、吸着基と疎水性相互作用の弱い蛋白質を溶出させた。次いで、緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を徐々に下げ、０．４Ｍの硫酸アンモニウム濃度にて溶出される画分を融合蛋白質の溶出画分として集めた（Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ溶出フラクション、６７ｍｌ）。融合蛋白質の検出は実施例５に示すＢＡＦ１３０細胞の増殖活性を指標とした。
【００９６】
Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ溶出フラクションを、５％グリセロールを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ４．５)で透析し脱塩した。脱塩した溶液を同緩衝液で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷカラム（７．５ｍｍＩＤ×７．５ｃｍ）（東ソー製）に添加した（流速毎分２ｍｌ）。添加終了後、平衡化緩衝液をさらに送液し、吸着基と相互作用の弱い蛋白質を溶出させた。次いで、５００ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を送液し（毎分１ｍｌ）、融合蛋白質を高濃度に含む画分を得た（ＳＰ−５ＰＷ溶出フラクション、１０ｍｌ）。融合蛋白質の検出は２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって行った。
【００９７】
ＳＰ−５ＰＷ溶出フラクションを、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム（２１．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ）（東ソー製）に数回に分け添加し（毎分５ｍｌ）、２８０ｎｍにおける吸光度を測定し融合蛋白質を分取した。
【００９８】
実施例８ 融合蛋白質の活性測定
実施例５に記載の本発明の融合蛋白質３３３ＡΔＡを実施例７に記載した方法で精製したもの（以下ＦＰ６と略記）を用いて以下の実験を行った。
【００９９】
各種濃度のＦＰ６（０．６２５〜４０ｎｇ／ｍｌ）の生物活性を、実施例５に示すＢＡＦ１３０細胞を用いた生物活性評価法により測定した。図９から明らかなように、ＦＰ６は濃度依存性を示した。
【０１００】
また図には示さないが、１μｇ／ｍｌのＦＰ６を各種濃度（１〜１０２４倍）に希釈して得た濃度依存曲線と５μｇ／ｍｌのＩＬ−６を各種濃度（１〜１０２４倍）に希釈して得た濃度依存曲線がほぼ一致した。一方、実施例５に記載しているように、１μｇ／ｍｌのＩＬ−６を各種濃度に希釈して、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＩＬ−６Ｒとともに添加したときに得られる濃度依存曲線と同じ濃度依存曲線を示す培養上清の活性を１ｕｎｉｔ／ｍｌと定義した。従って、１μｇのＦＰ６は５ｕｎｉｔに相当することが示された。
【０１０１】
実施例９ 融合蛋白質のアミノ酸配列の分析
実施例５に記載の本発明の融合蛋白質３３３ＡΔＡを実施例７に記載した方法で精製したもの（以下ＦＰ６と略記）を用いて以下の実験を行った。
【０１０２】
ＦＰ６をＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷ ＲＰカラムで逆相クロマトグラフィーを行い、さらに精製した。溶出は２０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液から６０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液へのグラジエントでおこなった。得られた画分を減圧乾固したのち、２０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で再溶解して、プロテインシーケンサー４７７Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）に供して分析した。
【０１０３】
分析の結果、Ｎ末端からロイシン、アラニン、プロリン、アルギニンの順に検出され、遺伝子によりコードされるＮ末端の配列と矛盾していないことを確認した。
【０１０４】
実施例１０ 融合蛋白質の糖鎖部分の分子量の分析
実施例５に記載の本発明の融合蛋白質３３３ＡΔＡを実施例７に記載した方法で精製したもの（以下ＦＰ６と略記）を用いて以下の実験を行った。
【０１０５】
０．１ｍｇ／ｍｌのＦＰ６を含む１５０μｌの０．１％ＳＤＳ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を５分間煮沸し、水冷した後に、１０μｌを1ｕｎｉｔ／ｍｌのエンドグリコシダーゼＨ（シグマ社製）１μｌと混合し、２５℃で３０秒から３時間反応させた。反応は５００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を１０μｌを加えて停止させた。なお、５００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）１０μｌ、予め冷却したＦＰ６溶液１０μｌ、及びエンドグリコシダーゼＨ1μｌを順次混合したものを、エンドグリコシダーゼＨ反応時間０分間の試料とした。
【０１０６】
反応が停止した上記各溶液にブロモフェニルブルーで着色した７２％グリセロール、１０％２−メルカプトエタノールを３μｌ加えた。これをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後のゲル中の蛋白質はコマジーブリリアントブルーＲ２５０で染色して検出した。
【０１０７】
図１０から明らかなように、エンドグリコシダーゼＨ未反応のＦＰ６は７６〜９３ｋＤａの位置にひとつのバンドとして検出された。このことは、ＦＰ６の糖鎖部位の分子量は、１７ｋＤａの不均一性を有することを示す。また、エンドグリコシダーゼＨで完全消化されたＦＰ６は５７ｋＤａの位置に検出された。更に、図には示さないが、ＦＰ６をＳＤＳで変性後、１０倍量のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え、Ｎ−グリコシルダーゼＦを加えて１８時間反応させた場合にも、ＦＰ６は５７ｋＤａの位置に検出された。このことは、ＦＰ６のＮグリコシド結合で結合した糖鎖の分子量は１９〜３６ｋＤａであることを示す。
【０１０８】
実施例１１ 融合蛋白質の幹細胞増幅効果
実施例５に記載の本発明の融合蛋白質３３３ＡΔＡを実施例７に記載した方法で精製したもの（以下ＦＰ６と略記）を用いて以下の実験を行った。
【０１０９】
ヒト臍帯血２０ｍｌより特願平９−３２５８４７号に示す方法に従ってＣＤ３４陽性細胞を精製分離した。得られた細胞５００個、１．２％メチルセルロース（信越化学）、３０％ウシ胎児血清アルブミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）、１％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略する）（Ｓｉｇｍａ社）、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社）、ＳＣＦ（幹細胞因子）（１００ｎｇ／ｍｌ）、及び以下の４条件のいずれか（▲１▼ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−６Ｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ、▲２▼ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−６Ｒ（２００ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ、▲３▼ＦＰ６（３００ｎｇ／ｍｌ）、▲４▼ＦＰ６（６００ｎｇ／ｍｌ））をα−ＭＥＭ（Ｆｌｏｗ社）１ｍｌを３５ｍｍ浮遊培養用プラスチック培養皿（Ｎｕnｃ社）に分注し、３７℃、５％ＣＯ2,湿度１００％の条件で培養した。
【０１１０】
２週間後、倒立顕微鏡下の観察でコロニーの同定を行った。結果を図１１に示す。コロニーは顆粒球コロニー（Ｇ）、マクロファージコロニー（Ｍ）、顆粒球・マクロファージの混合コロニー（ＧＭ）、芽球コロニー（Ｂｌａｓｔ）、顆粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニー（Ｍｉｘ）、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）の６種類に分類した。
【０１１１】
図１１から明らかなように、既に報告されている条件である▲１▼と▲２▼では、既存の報告（Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、２５８９頁、１９９５年参照）とほぼ同等のコロニー形成能が観察された。一方、本発明の条件である▲３▼（ＦＰ６（３００ｎｇ／ｍｌ））では、同濃度のＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの組み合わせである▲２▼（ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−６Ｒ（２００ｎｇ／ｍｌ）を大きく上回るコロニー形成能が観察された。さらに、図には表されていないが、本発明の条件である▲３▼あるいは▲４▼により形成された混合コロニーのサイズは、既に報告されている条件である▲１▼と▲２▼のそれよりも、著しく大きいものであった。これらのことは、本発明の融合蛋白質は、既に報告されているＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの組み合わせよりも優れた造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅効果を有することを示す。
【０１１２】
実施例１２ 融合蛋白質のマウスに対する血小板増多効果
実施例５に記載の本発明の融合蛋白質３３３ＡΔＡを実施例７に記載した方法で精製したもの（以下ＦＰ６と略記）を用いて以下の実験を行った。
【０１１３】
Ｃ５７ＢＬ６マウス（雄性、８週齢）を１群５匹、全５群を用い、第１群をＦＰ６未投与群（対照群）として３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群、第２群を０．５μｇのＦＰ６を含む３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群、第３群を１μｇのＦＰ６を含む３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群、第４群を２μｇのＦＰ６を含む３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群、第５群を５μｇのＦＰ６を含む３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群とし、それぞれ１２時間置きに１日２回、５日間連続腹腔内に投与した。６日目に下行静脈より全採血し、血小板数を血球測定器ＣＣ−１８０Ａ（東亜医用電子株式会社製）で計数した。
【０１１４】
図１２から明らかなように、１μｇ以上のＦＰ６を投与した群（第３−５群）ではＦＰ６未投与群（第１群）に比べ、有意な血小板増多が観察された。一方、ＦＰ６（分子量約８４ｋＤａ）１μｇの２倍の分子数であるＩＬ−６（分子量約２１ｋＤａ）０．５μｇを同条件で投与した場合は有意な血小板増多が観察されなかったことが報告されている（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、Ｂｌｏｏｄ、７４、１２４１頁、１９８９年参照）。このことは、本発明の融合蛋白質は、ＩＬ−６よりも優れたｉｎ ｖｉｖｏでの血小板増多効果を有することを示す。
【０１１５】
実施例１３ 融合蛋白質の５ＦＵ投与マウスに対する血小板回復効果
実施例５に記載の本発明の融合蛋白質３３３ＡΔＡを実施例７に記載した方法で精製したもの（以下ＦＰ６と略記）を用いて以下の実験を行った。
【０１１６】
Ｃ５７ＢＬ６マウス（雄性、８週齢）を１群１５匹、全２群を用い、第１群をＦＰ６未投与群（対照群）として３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群、第２群を５μｇのＦＰ６を含む３００μｌのＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する群とした。全群とも１５０ｍｇ／ｋｇの５ＦＵを尾静脈から投与し、上記薬剤を１２時間置きに１日２回、２日目から６日目まで５日間連続腹腔内に投与した。７日目にから９日目までの３日間連続で、各群５匹ずつのマウスの下行動脈より全採血し、血小板数を血球測定器ＣＣ−１８０Ａ（東亜医用電子株式会社製）で計数した。
【０１１７】
図１３から明らかなように、ＦＰ６を投与した群（第２群）ではＦＰ６未投与群（第１群）に比べ、８日目と９日目に有意な血小板回復が観察された。このことは、本発明の融合蛋白質は５ＦＵ投与による血小板産生機能の低下に対し、ｉｎ ｖｉｖｏでの回復効果を有することを示す。
【０１１８】
実施例１４ イムノグロブリン様領域欠失型融合蛋白質の発現
ＩＬ−６Ｒ誘導体１１２ＶＬ（ＩＬ−６ＲのＮ末端１１２番目のバリンからＮ末端３４４番目のロイシンまでの２３３アミノ酸）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１２ＶＬ、及びＩＬ−６Ｒ誘導体１１６ＥＬ（ＩＬ−６ＲのＮ末端１１６番目のグルタミン酸からＮ末端３４４番目のロイシンまでの２２９アミノ酸）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１６ＥＬを以下の方法で構築した。
【０１１９】
プライマーｐ６ＲＡＢ１１２Ｖ（配列番号５１）とプライマーｐ３４４Ｆ（配列番号５２）を用いてＩＬ−６Ｒ遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、ＸｈｏＩとＸｂａＩで切断した。これを予めＸｈｏＩとＡｖｒ ＩＩで切断したｐＰＩＣ９に挿入することにより、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＬを得た。
【０１２０】
次に、プライマーｐ６ＲＡＢ１１６Ｅ（配列番号５３）とプライマーｐ３４４Ｆ（配列番号５４）を用いてＩＬ−６Ｒ遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、ＸｈｏＩとＸｂａＩで切断した。これを予めＸｈｏＩとＡｖｒ ＩＩで切断したｐＰＩＣ９に挿入することにより、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＬを得た。
【０１２１】
次に、イムノグロブリン様領域欠失型融合蛋白質１１２ＶＡＡ（Ｎ末端がＩＬ−６ＲのＮ末端１１２番目のバリンで、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡ、及び該融合蛋白質１１６ＥＡＡ（Ｎ末端がＩＬ−６ＲのＮ末端１１６番目のグルタミン酸で、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した本発明の融合蛋白質）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡを以下の方法で構築した。
【０１２２】
ｐＰＩＣ９−１１２ＶＬをＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断して得られた断片を予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断した３３３ＡΔＡの発現プラスミドｐＰＩＣ９−３３３ＡΔＡに挿入し、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡを作製した。
【０１２３】
次に、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＬをＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断して得られた断片を予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断した３３３ＡΔＡの発現プラスミドｐＰＩＣ９−３３３ＡΔＡに挿入し、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡを作製した。
【０１２４】
ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡ、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡを用いて実施例３に示す方法で形質転換体を作製した結果、１１２ＶＡＡを発現するｍｕｔs菌９株と１１６ＥＡＡを発現するｍｕｔs菌１１株を樹立した。更に、これを実施例４に示す方法で培養し、実施例５に示す方法で上清中の生物活性を測定した。
【０１２５】
図１４から明らかなように、イムノグロブリン様領域欠失型融合蛋白質１１２ＶＡＡ及び１１６ＥＡＡは、イムノグロブリン様領域を有する融合蛋白質３３３ＡΔＡとほぼ同等の活性を有した。
【０１２６】
実施例１５ プロテアーゼ切断部位の決定
実施例７のようにして得られたＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ溶出フラクション１．９ｍｌに２％ＳＤＳ、６４％グリセロール、０．２５％ブロモフェノールブルーを０．１ｍｌ加えたのち煮沸した。これをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけたのち、１０％メタノール、１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１１）中でポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜にエレクトロブロッティングした。これをコマジ−ブリリアントブルー Ｇ−２５０で染色し検出した後、検出されたいくつかの蛋白質部分をそれぞれ裁断して回収し、プロテインシーケンサー４７７Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）にかけた。その結果、分子量１８ｋＤの蛋白質は、アスパラギン酸残基−バリン残基−アラニン残基−アラニン残基−プロリン残基−ヒスチジン残基という、融合蛋白質の一部であり、ＩＬ−６部分のＮ末端３７番目リジン残基と３８番目アスパラギン酸残基の間のペプチド結合がピキア酵母由来のプロテアーゼで切断されて生じたものであった。
【０１２７】
実施例１６ プロテアーゼ抵抗性融合蛋白質の発現（１）
実施例１のようにして得られたｐＢＳ６Ｒ６ＬからプライマーｐＫＮ６Ｂ３８Ｄ（配列番号５５）とプライマーｐＩＬ６Ｆ２（配列番号５６）を用いてＩＬ−６遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、ＮｒｕＩとＮｏｔＩで切断した。これを、予めＥｃｏ４７ＩＩＩとＮｏｔＩで切断したｐＢＳ６Ｒ６Ｌに挿入することにより、プラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｌ−３８Ｄを得た。
【０１２８】
ｐＢＳ６Ｒ６Ｌ−３８ＤをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断してＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を取得し、予めＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断したｐＰＩＣ９に挿入して、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質２０ＬＡＤをコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−２０ＬＡＤを作製した。
【０１２９】
プライマーｐ６ＲＡＢ１１２Ｖ（配列番号５７）とプライマーｐ３４４Ｆ（配列番号５８）を用いてＩＬ−６Ｒ遺伝子を増幅し、ＸｈｏＩとＸｂａＩで切断した。これを予めＸｈｏＩとＡｖｒＩＩで切断したｐＰＩＣ９に挿入することにより、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＬを得た。ｐＰＩＣ９−１１２ＶＬをＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断して得られた断片を予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断したｐＰＩＣ９−２０ＬＡＡに挿入し、イムノグロブリン様領域欠失型融合蛋白質１１２ＶＡＡ（Ｎ末端がＩＬ−６ＲのＮ末端１１２番目のバリンで、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した融合蛋白質）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡを作製した。
【０１３０】
次に、プライマーｐ６ＲＡＢ１１６Ｅ（配列番号５９）とプライマーｐ３４４Ｆ（配列番号５８）を用いてＩＬ−６Ｒ遺伝子を増幅し、ＸｈｏＩとＸｂａＩで切断した。これを予めＸｈｏＩとＡｖｒＩＩで切断したｐＰＩＣ９に挿入することにより、 ｐＰＩＣ９−１１６ＥＬを得た。ｐＰＩＣ９−１１６ＥＬをＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断して得られた断片を予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断したｐＰＩＣ９−２０ＬＡＡに挿入し、イムノグロブリン様領域欠失型融合蛋白質１１６ＥＡＡ（Ｎ末端がＩＬ−６ＲのＮ末端１１６番目のグルタミン酸で、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した融合蛋白質）発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡを作製した。
【０１３１】
更に、ｐＰＩＣ９−２０ＬＡＤをＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断してＩＬ−６Ｒをコードする遺伝子を取得し、予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断したｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡに挿入することにより、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質１１２ＶＡＤ（Ｎ末端がＩＬ−６ＲのＮ末端１１２番目のバリンで、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端３８番目のアスパラギン酸をリンカーを介さずに直接融合した融合蛋白質）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＤを、予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断したｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡに挿入することにより、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質１１６ＥＡＤ（Ｎ末端がＩＬ−６ＲのＮ末端１１６番目のグルタミン酸で、ＩＬ−６ＲのＮ末端３３３番目のアラニンとＩＬ−６のＮ末端３８番目のアスパラギン酸をリンカーを介さずに直接融合した融合蛋白質）をコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＤをそれぞれ作製した。
【０１３２】
実施例１７ プロテアーゼ抵抗性融合蛋白質の発現（２）
実施例１６に記載の５種類の発現プラスミド（ｐＰＩＣ９−２０ＬＡＤ、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡ、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡ、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＤ、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＤ）を実施例３に記載の方法でそれぞれピキア酵母に導入した。その結果、ｐＰＩＣ９−２０ＬＡＤにより形質転換されたｍｕｔs株を１０株、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡにより形質転換されたｍｕｔs株を７株、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡにより形質転換されたｍｕｔs株を１０株、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＤにより形質転換されたｍｕｔs株を１株、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＤにより形質転換されたｍｕｔs株を６株を取得した。これを実施例４に記載の方法で培養して上清を取得し、実施例５に示す方法で生物活性を測定した結果、ｐＰＩＣ９−２０ＬＡＤにより形質転換されたｍｕｔs株では１０株中１０株、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＡにより形質転換されたｍｕｔs株では７株中７株、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＡにより形質転換されたｍｕｔs株では１０株中７株、ｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＤにより形質転換されたｍｕｔs株では１株中１株、ｐＰＩＣ９−１１６ＥＡＤにより形質転換されたｍｕｔs株では６株中６株が生物活性を有していた。この結果は、ＩＬ−６のＮ末端２８番目のアラニンから３７番目リジンまでを欠失させても生物活性は影響を受けないことを示すものである。
【０１３３】
実施例１８ プロテアーゼ抵抗性の評価
実施例３に記載の３３３ＡΔＡ（以下、２０ＬＡＡと記載する）、実施例１７に記載の本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質２０ＬＡＤ、融合蛋白質１１２ＶＡＡ、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質１１２ＶＡＤ、融合蛋白質１１６ＥＡＡ、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質１１６ＥＡＤをそれぞれ発現する形質転換株を下記の方法により培養した。試験管を用いてＢＭＧＹ培地（１％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス、２％（Ｗ／Ｖ）ペプトン、１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ、０．００００４％（Ｗ／Ｖ）ビオチン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１％（Ｗ／Ｖ）グリセロール）３ｍｌで、３０℃で４８時間培養した後、遠心して集菌し、菌体ペレットをＢＭＭＹ培地（１％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス、２％（Ｗ／Ｖ）ペプトン、１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ ｗｏ ＡＡ、０．００００４％（Ｗ／Ｖ）ビオチン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、０．５％（Ｖ／Ｖ）メタノール）２ｍｌに懸濁し、３０℃で２４時間培養した。各培養液から２４時間目の培養液をサンプリングして遠心し、培養上清を回収してＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写し、ウサギ抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体（ジェンザイム社製）を用いてウエスタンブロッティングを行った。結果を図１５に示す。
【０１３４】
図１５から明らかなように、２０ＬＡＡ、１１６ＥＡＡ、１１２ＶＡＡでは、それぞれのＩＬ−６領域のＮ末端３７番目のリジンのＣ末端で切断されて生じたと思われる分子量１８ｋＤのバンドが鮮明に検出されたが、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質２０ＬＡＤ、１１６ＥＡＤ、１１２ＶＡＤでは検出されないか、或いはほとんど検出されなかった。この結果から、ＩＬ−６のＮ末端２８番目から３７番目までの１０アミノ酸を失欠させる変異を導入したことにより、プロテアーゼ抵抗性を付与できたことが分かる。
【０１３５】
【発明の効果】
本発明で提供されるリンカー配列をもたないＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、従来報告されているリンカー配列を有するＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質に比べ、高い薬効と抗原性の著しい低下が期待される。このことは本融合蛋白質は造血領域における新規治療薬として大きな意義をもち、特に造血幹細胞のｅｘ
ｖｉｖｏ増幅剤や血小板増多剤としての開発が期待される。
【０１３６】
宿主細胞が分泌するプロテーゼに対する抵抗性を付与したものでは、遺伝子工学的に宿主細胞を形質転換して製造する工程で、該プロテアーゼによる切断を受ない等の理由により、従来のものに比較してより大量に製造することが可能となる。また前記プロテアーゼが共存した状態で精製工程に供しても切断されない等のために最終的には収量を増加することができ、しかもプロテアーゼを操作に先立って失活させるといった操作を省略することが可能であるため、精製操作を簡便化できるという効果もある。更には最終精製物中にプロテアーゼによって切断された分子が混じることがないため、より均一な精製品とすることも可能となる。
【０１３７】
上記効果に加えて、生物活性を発揮させようとする環境に共存が予想されるプロテアーゼに対する抵抗性を有するものでは、生物活性を持続して発揮するという効果を予想することができる。
【０１３８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、（ａ）リンカー配列を介してＩＬ−６ＲとＩＬ−６が融合したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質と（ｂ）リンカーを介さずにＩＬ−６ＲとＩＬ−６が直接融合した本発明のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質のイラストを示す図である。
【図２】図２は、実施例１で作製したプラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｓの構造を示す図である。ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉは転写開始部位を、ＩＬ−６はＩＬ−６遺伝子を、ＩＬ−６ＲはＩＬ−６Ｒ遺伝子をそれぞれ示す。
【図３】図３は、図２に示したプラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｓに、実施例２で示す方法でオリゴヌクレオチド２種をアニールさせたものを挿入する手順を示す図である。
【図４】図４は、実施例１で作製したプラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｌの構造を示す図である。ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉは転写開始部位を、ＩＬ−６はＩＬ−６遺伝子を、ＩＬ−６ＲはＩＬ−６Ｒ遺伝子をそれぞれ示す。
【図５】図５は、図４に示したプラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｌに、実施例２で示す方法でオリゴヌクレオチド２種をアニールさせたものを挿入する手順を示す図である。
【図６】図６は、実施例２で作製した誘導体３３３ＡΔＡの発現プラスミドの構造を示す図である。図中、ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉは転写開始部位を、ＨＩＳ４はヒスチジン合成遺伝子を、３'ＡＯＸＴＴはターミネーターを、ＩＬ−６はＩＬ−６遺伝子を、ＩＬ−６ＲはＩＬ−６レセプター遺伝子を、Ｓはシグナル配列をコードする遺伝子を、５'ＡＯＸ１はプロモーター配列を含むアルコールオキシダーゼ遺伝子の上流領域をそれぞれ示す。
【図７】図７は、各融合蛋白質の誘導体ごとに、（Ａ）ＩＬ−６Ｒ領域のＣ末端のアミノ酸残基の種類と番号、（Ｂ）リンカーのアミノ酸配列（「−」はリンカーがないことを示す。）、（Ｃ）ＩＬ−６領域のＮ末端のアミノ酸残基の種類と番号、（Ｄ）実施例４で得られた２１６種類の培養上清それぞれに対し、実施例５に示す方法で得られた生物活性値平均値をそれぞれ示した図である。
【図８】図８は、実施例６に示す方法で培養を行ったときの経時変化を示す図である。図中、ＭｅＯＨ ｃｏｎｃ．はメタノール濃度（単位は％（質量／容量））を、ＥＩＡはサンドイッチイムノアッセーを、Ｂｉｏ Ａｓｓａｙは生物活性をそれぞれ示す。
【図９】図９は、実施例８に示す方法でＦＰ６の生物活性を求めた図である。
【図１０】図１０は、実施例１０に示す方法でエンドグリコシダーゼＨで０〜１８０分処理したＦＰ６をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したときの結果を示す図である。図中、Ｈと示したレーンはエンドグリコシダーゼＨのみを、0から１８０の数字を付したレーンはそれぞれの数字の時間（分）だけエンドグリコシダーゼＨ処理されたＦＰ６を示す。図中の９７．４と６６．３の数値を付したバーは、分子量マーカー蛋白質（分子量が９７．４ｋＤａと６６．３ｋＤａ）がそれぞれ検出された位置である。
【図１１】図１１は、実施例１１に示す方法で、▲１▼ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−６Ｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ、▲２▼ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−６Ｒ（２００ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ、▲３▼ＦＰ６（３００ｎｇ／ｍｌ）、▲４▼ＦＰ６（６００ｎｇ／ｍｌ）の５００個のＣＤ３４陽性細胞に対するコロニー形成能を求めた図である。図中、Ｇは顆粒球コロニーを、Ｍはマクロファージコロニーを、ＧＭは顆粒球・マクロファージの混合コロニーを、Ｂｌａｓｔは芽球コロニーを、Ｍｉｘは顆粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニーを、ＢＦＵ−Ｅは赤芽球コロニーをそれぞれ示す。
【図１２】図１２は、実施例１２に示す方法でＣ５７ＢＬ６マウスに対し、ＦＰ６を投与しなかったとき（第１群）と投与したとき（第２−５群）の血小板数の平均値を示す図である。図中、星印は第１群のマウスの血小板数との有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図１３】図１３は、実施例１３に示す方法で予め５ＦＵを投与したＣ５７ＢＬ６マウスに対し、ＦＰ６を投与しなかったとき（第１群、黒塗りの四角）と投与したとき（第２群、白い四角）の７〜９日目の血小板数の平均値を示す図である。図中、星印は同日の第１群のマウスの血小板数との有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図１４】図１４は、実施例１４に示す方法で得られた（▲１▼）融合蛋白質１１２ＶＡＡを発現するｍｕｔs菌９株と（▲２▼）融合蛋白質１１６ＥＡＡを発現するｍｕｔs菌１１に対し、 実施例５に示す方法で得られた生物活性値平均値を、３３３ＡΔＡを発現するｍｕｔs菌１１株のうち最も発現量の高かった株であるＩＩＩ−１０８株に対する相対値（％）として、それぞれ示した図である。
【図１５】図１５は、（ａ）２０ＬＡＡ、（ｂ）２０ＬＡＤ、（ｃ）１１６ＥＡＡ、（ｄ）１１６ＥＡＤ、（ｅ）１１２ＶＡＡ、（ｆ）１１２ＶＡＤを含む培養上清を実施例８に示す方法でウエスタンブロットしたときの結果を示す図である。
Claims (8)
- ＩＬ−６レセプターのＮ末端から３３３番目のアラニン残基にＩＬ−６のＮ末端から２８番目のアラニン残基が直接に結合していることを特徴とするＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質。
- ＩＬ−６レセプターのＮ末端から３３３番目のアラニン残基にＩＬ−６のＮ末端から２８番目のアラニン残基が直接に結合していることを特徴とするＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子。
- ＩＬ−６レセプターのＮ末端から３３３番目のアラニン残基にＩＬ−６のＮ末端から２８番目のアラニン残基が直接に結合していることを特徴とするＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）種の酵母。
- ＩＬ−６レセプターのＮ末端から３３３番目のアラニン残基にＩＬ−６のＮ末端から２８番目のアラニン残基が直接に結合していることを特徴とするＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）種の酵母を培養し、当該培養物からＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質を分泌型蛋白質として採取することを特徴とするＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質の製造法。
- ＩＬ−６レセプターのＮ末端から３３３番目のアラニン残基にＩＬ−６のＮ末端から２８番目のアラニン残基が直接に結合していることを特徴とするＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）種の酵母をメタノールを含まず天然物由来の炭素源を含む培地で培養し、途中でメタノールを添加して培養することを特徴とするＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質の製造法。
- ＩＬ−６レセプターのＮ末端から３３３番目のアラニン残基にＩＬ−６のＮ末端から２８番目のアラニン残基が直接に結合していることを特徴とするＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質を含有する溶液を、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの３種類のクロマトグラフィーにかけ、ＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質を採取することを特徴とするＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質の製造法。
- ＩＬ−６レセプターのＮ末端から３３３番目のアラニン残基にＩＬ−６のＮ末端から２８番目のアラニン残基が直接に結合していることを特徴とするＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質を含むことを特徴とする造血幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅剤。
- ＩＬ−６レセプターのＮ末端から３３３番目のアラニン残基にＩＬ−６のＮ末端から２８番目のアラニン残基が直接に結合していることを特徴とするＩＬ−６レセプター・ＩＬ−６融合蛋白質を主成分として含む血小板増多剤。
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| JPH08505055A (ja) * | 1992-12-24 | 1996-06-04 | コルバス・インターナショナル、インコーポレイテッド | 新規好中球抑制剤 |
| WO1997028273A1 (en) * | 1996-02-01 | 1997-08-07 | North American Vaccine, Inc. | Expression of group b neisseria meningitidis outer membrane (mb3) protein from yeast and vaccines |
-
1999
- 1999-07-02 JP JP18865099A patent/JP4524816B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08505055A (ja) * | 1992-12-24 | 1996-06-04 | コルバス・インターナショナル、インコーポレイテッド | 新規好中球抑制剤 |
| WO1997028273A1 (en) * | 1996-02-01 | 1997-08-07 | North American Vaccine, Inc. | Expression of group b neisseria meningitidis outer membrane (mb3) protein from yeast and vaccines |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001008690A (ja) | 2001-01-16 |
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