CN108350032A - 调节γC-细胞因子活性 - Google Patents

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Abstract

实施方案涉及γc‑家族细胞因子的肽拮抗剂，所述γc‑家族细胞因子与重要的人类疾病(诸如白血病、自身免疫性疾病、胶原病、糖尿病、皮肤病、退行性神经疾病和移植物抗宿主病(GvHD))相关。因此，γc‑细胞因子活性的抑制剂是有价值的治疗剂和美容剂以及研究工具。传统的抑制γc‑细胞因子活性的方法涉及针对每个单独的γc‑细胞因子家族成员/受体亚基产生中和抗体。然而，成功受到限制，并且通常多个γc‑细胞因子家族成员合作引起疾病状态。针对每个因子产生的中和抗体的组合使用是不切实际的，并且造成不利免疫反应的风险增加。本发明实施方案通过利用基于共有γc‑亚基结合位点的肽拮抗剂来抑制γc‑细胞因子活性克服了这些缺点。此类方法允许在拮抗剂设计中具有灵活性。在若干实施方案中，肽展现出同时‑阻断(Simul‑Block)活性，从而抑制多个γc‑细胞因子家族成员的活性。

Description

调节γC-细胞因子活性
优先权和相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年10月9日提交的美国临时申请第62/239,761号的权益，其在此通过引用整体并入。
电子格式的序列表
通过EFS-Web将本申请与作为ASCII文本文件的序列表一起提交。序列表是作为名为BION006WOSEQLIST.txt的文件提供的，被创建并最后保存于2016年10月6日，其大小为5,981字节。根据35U.S.C.§1.52(e)，序列表电子格式中的信息通过引用整体并入本文。
领域
一些实施方案涉及γc-家族细胞因子的肽拮抗剂，所述γc-家族细胞因子是主要由上皮细胞、基质细胞和免疫细胞产生并控制各种淋巴细胞的正常和病理激活的一组哺乳动物细胞因子。一些实施方案还涉及此类肽用于治疗某些人类疾病的治疗性用途。本实施方案还涉及此类肽的药用化妆品应用。公开描述了该肽的目标疾病、药用化妆品应用以及施用、生产和商业化的方法。
背景
细胞因子是介导各种细胞功能(诸如生长、功能性分化及促进或预防程序性细胞死亡(凋亡性细胞死亡))的不同组的可溶性因子。与激素不同，细胞因子不是由特化的腺体组织产生的，但是可以由各种各样的细胞类型(诸如上皮细胞、基质细胞或免疫细胞)产生。
γc-家族细胞因子是主要由上皮细胞、基质细胞和免疫细胞产生并控制各种淋巴细胞的正常和病理激活的一组哺乳动物细胞因子。这些细胞因子对于T细胞在胸腺中的早期发育以及它们在外周的稳态是至关重要的。
概述
在一些实施方案中，提供了复合肽。在一些实施方案中，复合肽包含至少两个白细胞介素(IL)蛋白γc-盒D-螺旋区的氨基酸序列，其中复合肽包含氨基酸序列P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，权利要求1所述的复合肽，其中复合肽抑制选自以下的两种或更多种γc-细胞因子的活性：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21。在一些实施方案中，复合肽抑制至少IL-15和IL-21的活性。
在一些实施方案中，复合肽还包含信号肽。在一些实施方案中，将复合肽在复合肽的N末端、C末端或侧链残基处进一步与一个或更多个另外的部分缀合。在复合肽的一些实施方案中，一个或更多个另外的部分选自：牛血清白蛋白(BSA)、白蛋白、钥孔戚血蓝蛋白(Keyhold Limpet Hemocyanin，KLH)、IgG的Fc区、用作支架的生物蛋白、针对细胞特异性抗原的抗体、受体、配体、金属离子和聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，复合肽由与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，复合肽由与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，提供了药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的肽缀合物或其衍生物，和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或它们的组合，其中肽缀合物或其衍生物调节选自以下的两种或更多种γc-细胞因子的活性：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，其中肽缀合物包含氨基酸序列P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)。
在药物组合物的一些实施方案中，肽缀合物或其衍生物抑制选自以下的两种或更多种γc-细胞因子的活性：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21。
在药物组合物的一些实施方案中，肽缀合物或其衍生物还包含位于其N末端、C末端或侧链残基处的另外的缀合物。在药物组合物的一些实施方案中，肽缀合物或其衍生物还包含信号肽。
在一些实施方案中，药物组合物还包含稳定肽缀合物或其衍生物的结构并提高其生物活性的蛋白质，其中蛋白质选自：牛血清白蛋白(BSA)、白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)的Fc区、用作支架的生物蛋白、聚乙二醇(PEG)及它们的衍生物。
在药物组合物的一些实施方案中，其衍生物包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列共有至少90％同一性的肽序列。在药物组合物的一些实施方案中，其衍生物包含与SEQ IDNO:3的氨基酸序列共有至少95％同一性的肽序列。
在一些实施方案中，提供了用于阻断经由两种或更多种γc-细胞因子家族成员的信号转导的方法。在一些实施方案中，该方法包括将细胞与本文提供的复合肽和/或药物组合物接触。
在一些实施方案中，提供了抑制γc-细胞因子结合γc-亚基的方法。在一些实施方案中，该方法包括将细胞的γc-亚基与本文提供的复合肽和/或药物组合物接触。
在一些实施方案中，提供了治疗γc-细胞因子介导的疾病的方法。在一些实施方案中，该方法包括向有需要的对象施用本文提供的复合肽和/或药物组合物，其中γc-细胞因子介导的疾病选自：CD4白血病、CD8白血病、LGL白血病、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征(syndrome)、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、乳糜泻病、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、类风湿性关节炎、糖尿病、银屑病、多发性硬化症、葡萄膜炎(uvietis)、眼部炎症和移植物抗宿主病(GvHD)。
在一些实施方案中，提供了治疗HTLV-1相关的脊髓病(HAM)/热带痉挛性下肢轻瘫(TSP)相关的疾病的方法。在一些实施方案中，该方法包括向有需要的对象施用本文提供的复合肽和/或药物组合物，其中HAM/TSP相关的疾病选自：成人T细胞白血病(ATL)、HTLV相关的脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫(HAM/TSP)和其他与HTLV相关的非肿瘤炎症性疾病(诸如葡萄膜炎(HU)、关节病、肺病、皮炎、外分泌病(exocrinopathy)和肌炎)。
在一些实施方案中，提供了治疗炎症性呼吸疾病的方法。在一些实施方案中，该方法包括向有需要的对象施用本文提供的复合肽和/或药物组合物，其中炎症性呼吸疾病选自：哮喘、鼻窦炎、枯草热、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、急性和慢性中耳炎以及肺纤维化。
在一些实施方案中，提供了治疗美容病的方法。在一些实施方案中，该方法包括向有需要的对象施用本文提供的复合肽和/或药物组合物，其中美容病选自：痤疮、脱发、晒斑、指甲保养和外表衰老。
在一些实施方案中，提供了用于治疗患者中的病况的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的肽缀合物或其衍生物，和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或它们的组合，其中肽缀合物或其衍生物调节选自以下的两种或更多种γc-细胞因子的活性：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，其中肽缀合物包含氨基酸序列P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)。
在药物组合物的一些实施方案中，其衍生物包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列共有至少90％同一性的肽序列。在药物组合物的一些实施方案中，其衍生物包含与SEQ IDNO:3的氨基酸序列共有至少95％同一性的肽序列。
在一些实施方案中，提供药物组合物以用于治疗γc-细胞因子介导的疾病，其中γc-细胞因子介导的疾病选自：CD4白血病、CD8白血病、LGL白血病、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、韦格纳肉芽肿病、乳糜泻病、桥本氏甲状腺炎、类风湿性关节炎、糖尿病、银屑病、多发性硬化症、葡萄膜炎、眼部炎症和移植物抗宿主病(GvHD)。
在一些实施方案中，提供了药物组合物以用于治疗HTLV-1相关的脊髓病(HAM)/热带痉挛性下肢轻瘫(TSP)相关的疾病，其中HAM/TSP相关的疾病选自：成人T细胞白血病(ATL)、HTLV相关的脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫(HAM/TSP)和其他与HTLV相关的非肿瘤炎症性疾病(诸如葡萄膜炎(HU)、关节病、肺病、皮炎、外分泌病和肌炎)。
在一些实施方案中，提供了药物组合物以用于治疗炎症性呼吸疾病，其中炎症性呼吸疾病选自：哮喘、鼻窦炎、枯草热、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、急性和慢性中耳炎以及肺纤维化。
在一些实施方案中，提供了药物组合物以用于治疗美容病，其中美容病选自：痤疮、脱发、晒斑、指甲保养和衰老的外观。
在一些实施方案中，提供了用于治疗患者中的病况的试剂盒。在试剂盒的一些实施方案中，该病况是γc-细胞因子介导的疾病、HTLV-1相关的脊髓病(HAM)/热带痉挛性下肢轻瘫(TSP)相关的疾病、炎症性呼吸疾病、美容病或它们的组合，该试剂盒包含本文提供的药物组合物。
在试剂盒的一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的肽缀合物或其衍生物，和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或它们的组合，其中肽缀合物或其衍生物调节选自以下的两种或更多种γc-细胞因子的活性：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，其中肽缀合物包含氨基酸序列P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)。
在试剂盒的一些实施方案中，其衍生物包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列共有至少90％同一性的肽序列。在试剂盒的一些实施方案中，其衍生物包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列共有至少95％同一性的肽序列。
在试剂盒的一些实施方案中，该病况是以下中的一种或更多种：CD4白血病、CD8白血病、LGL白血病、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征(Sjoegren’s syndrome)、韦格纳肉芽肿病、乳糜泻病、桥本氏甲状腺炎、类风湿性关节炎、糖尿病、银屑病、多发性硬化症、葡萄膜炎、眼部炎症、移植物抗宿主病(GvHD)、成人T细胞白血病(ATL)、HTLV相关的脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫(HAM/TSP)和其他与HTLV相关的非肿瘤炎症性疾病(诸如葡萄膜炎(HU)、关节病、肺病、皮炎、外分泌病、肌炎)、哮喘、鼻窦炎、枯草热、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、急性和慢性中耳炎以及肺纤维化、痤疮、脱发、晒斑、指甲保养或外表衰老。
附图简述
图1A显示人类γc-细胞因子家族成员的D-螺旋区的比对。
图1B描绘在γc-细胞因子的D-螺旋区附近产生共有序列的γc-盒(SEQ ID NO:10)基序和IL-2/IL-15盒(SEQ ID NO:11)基序。
图2描绘氨基酸生物化学性质的图解表示。
图3A显示在PT-18增殖测定中BNZ-γ对IL-15和IL-9活性的抑制。
图3B显示在IL-2或IL-15和0、0.1、1或10uM BNZ-γ的存在下生长的CTTL2细胞的增殖测定。
图3C显示BNZ-γ对IL-15介导的STAT5的酪氨酸磷酸化的抑制。
图4A显示使用HAM/TSP外周血的离体T细胞增殖测定。通过添加BNZ-γ抑制T细胞增殖。
图4B显示在向培养物中添加BNZ-γ之后在使用HAM/TSP外周血的离体T细胞增殖测定中的CD4+CD25+细胞群减少。
图4C显示在向培养物中添加BNZ-γ之后在使用HAM/TSP外周血的离体T细胞增殖测定中的CD4+Ki67细胞群减少。
图4D显示在向培养物中添加BNZ-γ之后在使用HAM/TSP外周血的离体T细胞增殖测定中通过Guava染色的活细胞百分比未受影响。
图5显示SEQ ID NO:3的序列与不同人类γc-细胞因子家族成员的D-螺旋区的比对。阴影区代表与SEQ ID NO:3的序列中它们相应的氨基酸相同的人类γc-细胞因子家族成员的氨基酸序列。
详述
综述
目前已经鉴定出超过100种细胞因子，并且其被认为是借助来自原始基因库的基因复制而发展的(参见Bazan,J.F.1990,Immunol.Today 11:350-354)。为了支持这一观点，对于一组细胞因子在它们的多亚基受体系统中共享组分是很常见的。在T细胞中最证据充分的共享细胞因子亚基是常见的γ亚基(γc-亚基)。
γc-亚基被6种已知的细胞因子(白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-15(IL-15)和白细胞介素-21(IL-21)，统称为“γc-细胞因子”或“γc-家族细胞因子”)共有，并在转导所有这些细胞因子的细胞激活信号中起着不可或缺的作用。此外，对于每种γc-细胞因子，存在一种或两种私有细胞因子特异性受体亚基，其当与γc-亚基复合时，产生完全功能的受体。(参见Rochman等人,2009,Nat Rev Immunol.9:480-90.)
γc-家族细胞因子是主要由上皮细胞、基质细胞和免疫细胞产生并控制各种淋巴细胞的正常和病理激活的一组哺乳动物细胞因子。这些细胞因子对于T细胞在胸腺中的早期发育以及它们在外周的稳态是至关重要的。例如，在不存在γc-亚基的情况下，T细胞、B细胞和NK细胞不会在小鼠中发育。(参见Sugamura等人,1996,Annu.Rev.Immunol.14:179-205)。
γc-细胞因子是构成免疫系统的淋巴细胞(特别是T细胞、B细胞和NK细胞)发育的重要参与者。此外，γc-细胞因子已经参与各种人类疾病。因此，抑制γc-细胞因子活性的因子将为阐明淋巴细胞亚群的发育机制以及治疗免疫病症和γc-细胞因子介导的疾病提供有用的工具。
已知小鼠中编码γc-亚基的基因的种系缺失或人类中γc-亚基的突变通过破坏NK细胞、T细胞和B细胞的正常外观或功能而引起严重的联合免疫缺陷(SCID)。在证明来自这些小鼠和人类患者的淋巴细胞对γc-细胞因子的应答的研究中表明了γc-亚基在γc-细胞因子(IL-2、-4、-7、-9、-15、-21)的信号转导中的重要性(综述于Sugamura等人,1995Adv.Immunol.59:225-277中)。这表明γc-亚基与γc-细胞因子之间的相互作用的破坏将有效地阻断由γc-细胞因子家族成员进行的细胞内信号转导事件。因此，预期根据本发明实施方案的拮抗剂肽有效地阻断患有由γc-细胞因子家族成员误调节介导的疾病的人类中的致病性变化。
作为用于调节单独的γc-细胞因子活性的抗体介导的方法的替代方法，申请人已经设计出新型低分子量化合物，其在本文中被称为“同时-阻断(Simul-Block)”，其抑制多种γc-细胞因子的活性。这些低分子量化合物(包括化学品和肽两者)比抗体的免疫原性低。这些性质将同时-阻断区分为用于在临床干预中介导γc-细胞因子活性的更有效策略。
与γc-细胞因子相关的病理
最近的研究表明，γc-细胞因子的表达调节异常和功能障碍可能导致各种各样的人类免疫疾病和造血疾病。
IL-2
尽管历史上IL-2被认为是原型T细胞生长因子，但是缺乏IL-2表达的敲除小鼠的产生揭示了IL-2对于体内常规T细胞的生长或发育不是关键的。然而，IL-2的过表达导致T细胞亚群的优先扩增；调节性T细胞(T-reg)。(参见Antony等人,2006,J.Immunol.176:5255-66.)T-reg抑制其他细胞的免疫应答，并因此起到维持外周耐受的作用(综述于Sakaguchi等人,2008,Cell 133:775-87)。外周耐受性的衰弱被认为会引起人类中的自身免疫性疾病。
因此，T-reg的免疫抑制功能被认为可以预防自身免疫性疾病的发展(参见Sakaguchi等人,2008,Cell 133:775-87)。T-reg也已经参与癌症，其中已经将实体瘤和血液恶性肿瘤与升高数量的T-reg相关联(参见De Rezende等人,2010,Arch.Immunol.Ther.Exp.58:179-190)。
IL-4
IL-4是参与T辅助细胞分化为Th2(T-辅助2型)亚群的非冗余细胞因子，其促进不成熟B细胞分化为产生IgE的浆细胞。在过敏性哮喘中IgE水平是升高的。因此，IL-4参与过敏性哮喘的发展。可以将靶向IL-4的抗体用于治疗或甚至预防过敏性哮喘的发作。(参见LeBuanec等人,2007,Vaccine 25:7206-16.)
IL-7
IL-7对于B细胞发育和T细胞在胸腺中的早期发育是必要的。在小鼠中，IL-7的异常表达引起T细胞相关的白血病。(参见Fisher等人,1993,Leukemia 2:S66-68.)然而，在人类中，IL-7的误调节似乎不会引起T细胞-相关的白血病。在人类中，单独或与另一种γc-细胞因子家族成员IL-15组合的IL-7的上调已经参与大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病。
IL-9
与其他γc-细胞因子家族成员相比，IL-9的作用仍然相当不明确。耗尽IL-9基因的小鼠看起来正常，并且在淋巴和造血隔室中不缺少任何细胞亚群。然而，最近的研究揭示IL-9在Th17(白细胞介素-17诱导的T-辅助)细胞产生中的体内作用(参见Littman等人,2010,Cell 140(6):845-58；和Nowak等人,2009,J.Exp.Med.206:1653-60)。
IL-15
IL-15关键参与NK细胞、NK-T细胞、上皮内淋巴细胞(IEL)的一些亚群、γδ-T细胞和记忆-表型CD8T-细胞的发育(参见Waldmann,2007,J.Clin.Immunol.27:1-18；和Tagaya等人,1996,EMBO J.15:4928-39.)小鼠中IL-15的过表达导致NK-T细胞的发育和CD8细胞类型T细胞白血病(参见Fehniger等人,2001,J.Exp.Med.193:219-31；Sato等人，2011Blood，印刷中)。这些实验诱导的白血病看起来与人类中的LGL(大颗粒淋巴细胞)白血病类似，因为在两种情况下白血病细胞表达CD8抗原。
还怀疑IL-15-介导的自分泌机制可能参与CD4T淋巴细胞的白血病转化。(参见Azimi等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.95:2452-7；Azimi等人,1999,J.Immunol.163:4064-72；Azimi等人,2000,AIDS Res.Hum.Retroviruses 16:1717-22；和Azimi等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.98:14559-64)。例如，引起人类中的成人T细胞白血病的CD4-向性HTLV-I通过IL-15和IL-15Rα的产生诱导病毒-转化的T细胞的自分泌生长(Azimi等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.95:2452-7)。
除白血病转化外，最近的研究暗示IL-15在乳糜泻病(CD)(自身免疫性疾病)的病理发展中。已知IL-15通过诱导细胞溶解酶(即颗粒酶和穿孔素)以及干扰素-γ的表达来刺激NK细胞、CD8细胞和肠上皮内淋巴细胞(IEL)细胞分化成淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。乳糜泻病(在本文中表示为CD)是免疫介导的肠病，其由表达特定HLA-DQ等位基因的个体食用含麸质食物而触发。
这种疾病在西方人群中的发病率为1％。目前对CD的唯一治疗是从患者饮食中彻底除去麸质。CD的病理主要由肠粘膜的广泛性损伤引起，所述肠粘膜的广泛性损伤是由已经浸润到肠道固有层的激活的CD8T细胞引起的。这些CD8T细胞似乎通过涉及IL-15的机制被激活。最近的一篇出版物在小鼠中证明由肠上皮细胞异位过表达IL-15导致肠病的发展，所述肠病与CD患者中的病变非常类似。IL-15活性的中和显著地减少了病理变化。因此，阻断IL-15激活CD8T细胞的干预似乎在使CD应付常规无麸质饮食中提供了替代策略。
IL-21
IL-21是γc-家族中最近发现的成员。与其他家族成员不同，IL-21似乎不具有有效的生长促进作用。相反，IL-21被认为比用作控制细胞增殖的因子更多地用作分化因子(参见Tagaya等人,2010,J.Leuk.Biol.87:13-15)。
用于治疗γc-细胞因子介导的病症的当前策略
由于γc-细胞因子被认为参与许多人类疾病，因此已经提出了几种通过抑制γc-细胞因子家族活性来治疗涉及γc-细胞因子的疾病的方法。这些方法包括使用细胞因子特异性单克隆抗体来中和体内靶向的细胞因子活性；使用靶向私有细胞因子特异性受体亚基(除了共有γc-亚基之外的亚基)的单克隆抗体来选择性抑制细胞因子活性；和使用阻断下游细胞内细胞因子信号转导途径的化学抑制剂。
尽管细胞因子特异性抗体通常是设计治疗剂的首选，但是共有受体组分的细胞因子显示出重叠功能(参见Paul,W.E.,1989,Cell 57:521-24)，并且超过一种细胞因子可以合作以引起疾病(参见下述的实例)。因此，涉及中和单一细胞因子的方法在治疗涉及细胞因子的人类疾病中可能不是有效的。
也已经提出了用于设计通过识别共有受体组分的抗体来抑制多种细胞因子功能的治疗剂的策略。然而，细胞因子受体系统的多亚基性质和单一细胞因子的功能性受体可以采取不同构型的事实使得该方法变得困难。
例如，功能性IL-15受体可以是IL-15Rβ/γc或IL-15Rα/β/γc。(参见Dubois等人,2002,Immunity 17:537-47.)针对IL-15Rβ受体的抗体(TMβ1)是一种有效的IL-15功能抑制剂，但只有当IL-15Rα分子不存在于受体复合物中时才是如此。(参见Tanaka等人,1991,J.Immunol.147:2222–28.)因此，无论是针对共有的还是私有的亚基产生的单克隆抗受体抗体的有效性，都可以是背景依赖性的并且在体内是不可预测的。
虽然临床使用针对与疾病的发病机理相关的生物活性因子或受体的单克隆抗体是惯例，但是很少有成功结果的证明。此外，确立临床适用的单克隆抗体治疗是漫长且艰难的过程，成功产生中和抗体主要是运气。例如，由于γc-亚基在通过γc-家族细胞因子介导的信号转导中至关重要，已经进行了许多尝试来产生针对γc-亚基的多克隆和单克隆抗体，并且存在许多识别小鼠和人类中的γc-亚基的商业抗体。然而，奇怪的是，这些抗γc-亚基抗体中没有一个阻断γc-细胞因子的功能。
单克隆抗体的治疗用途的另一个问题是单克隆抗体通常通过用人类蛋白免疫啮齿类动物而产生，因此所产生的抗体是外源蛋白质，并因此具有高度免疫原性。为了避免这个问题，单克隆抗体的氨基酸序列被分子修饰以便抗体分子被识别为人类免疫球蛋白(被称为人源化的过程)，但是这个过程需要时间和费用。
靶向JAK3，作为用于抑制多种γc-细胞因子的现存的替代实例
γc-亚基与γc-细胞因子之间的相互作用导致被称为Janus激酶3(Jak3)的细胞内的蛋白质酪氨酸激酶的激活。反过来，Jak3磷酸化多种信号转导分子(包括STAT5和PI3激酶)。γc-亚基和Jak3的相互作用非常有特异性。事实上，没有其他受体分子募集Jak3进行信号转导。(参见O’Shea,2004,Ann.Rheum.Dis.63:(增刊II):ii67-7.)因此，可以通过阻止Jak3激酶的活性来实现对通过γc-亚基的细胞因子信号转导的抑制。因此，靶向Jak3的激酶活性的多种化学抑制剂已经被引入市场。(参见Pesu等人,2008,Immunol.Rev.223:132-142.)一个此类实例是CP690,550。
这些蛋白质激酶抑制剂的主要缺点是对Jak3激酶缺乏特异性。这些药物截断ATP(三磷酸腺苷)分子结合Jak3激酶(许多蛋白质激酶的常见生物化学反应)，并因此倾向于阻断与Jak3激酶无关的多种细胞内蛋白质激酶的作用，所述多种细胞内蛋白质激酶的作用是在各种组织中正常细胞的健康状况非常需要的。因此，需要更多特异性的通过γc-亚基的信号转导的抑制剂。
因此非常需要用于治疗涉及γc-细胞因子的疾病的替代策略。
γc-盒的发现
γc-细胞因子的C-末端(D-螺旋)含有用于与多单元细胞因子受体的常见γc-亚基相互作用的推荐位点。(Bernard等人,2004J.Biol.Chem.279:24313-21.)在小鼠和人类中鉴定的所有γc-细胞因子的氨基酸的生物化学性质的比较揭示了氨基酸的化学性质(例如疏水性、亲水性、碱性/酸性性质)，如果不相同的话，则在跨越γc-细胞因子家族成员的D-螺旋中的许多位置处是保守的。
相反，与γc-细胞因子IL-4相关但不结合γc-亚基的IL-13的序列在D-螺旋区没有展现出与γc-细胞因子显著的同源性，这表明在D-螺旋区中的序列同源性与结合γc-亚基相关。如图1A所示，人类中γc-细胞因子家族成员的D-螺旋区的氨基酸序列的比对揭示了在这些细胞因子中的中等序列同源性的基序，其在本文中被称为“γc-盒”。
γc-盒(SEQ ID NO:10)包含19个氨基酸，其中在19个位置中，位置4、5和13分别完全保守为苯丙氨酸、亮氨酸和谷氨酰胺。在γc-盒的位置6、7和11处观察到较少的保守性，其中氨基酸是共有物理化学性质的两个或三个相关氨基酸中的一个：位置6可以被极性氨基酸谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺占据；非极性氨基酸丝氨酸或精氨酸可以占据位置7；并且位置11被非极性脂肪族氨基酸亮氨酸或异亮氨酸占据。位置9和位置16可以被非极性氨基酸异亮氨酸或极性氨基酸赖氨酸占据。参见图1B。在γc-细胞因子亚家族中的位置9和位置16处观察到γc-盒的氨基酸组成的一些差异。跨物种的γc-细胞因子的比较表明异亮氨酸通常存在于IL-2/15亚家族的位置9和位置16处，而其他γc-家族成员在这些位置处通常具有赖氨酸。不希望被特定理论束缚，异亮氨酸和赖氨酸在生物化学上是不同的，并因此可以在IL-2/15亚家族和其他γc-细胞因子之间赋予特定的构象差异。
γc-细胞因子之间的γc-盒基序的保守性得到了以下发现的支持：位于D-螺旋区中的谷氨酰胺(Gln,Q)残基对于γc-细胞因子与γc-亚基的结合至关重要。(Bernard等人,2004J.Biol.Chem.279:24313-21.)
γc-细胞因子活性的肽抑制剂
可以通过破坏γc-细胞因子与γc-亚基之间的相互作用(例如通过引入可以与γc-亚基相互作用而不刺激通过多亚基细胞因子受体的信号转导的竞争性抑制剂)阻断γc-家族细胞因子的活性。不受特定理论的束缚，参与γc-家族细胞因子与γc-亚基结合的保守γc-盒基序呈现可被用于设计γc-细胞因子信号转导的肽抑制剂的核心碱基氨基酸序列。
核心γc-盒氨基酸序列包含：D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q(SEQ ID NO:2)(其中X表示任何氨基酸)。本文描述的至少一些实施方案涉及可以抑制一种或更多种γc-细胞因子的活性的核心γc-盒氨基酸序列的定制肽衍生物。定制肽衍生物包括任何肽，其部分氨基酸序列显示出与核心γc-盒氨基酸序列具有大约50％、50-60％、60-70％、70-80％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或99.8％的同一性。定制肽衍生物还包括任何肽，其中此肽衍生物的部分氨基酸序列包含具有与核心γc-盒的氨基酸类似的物理化学性质的氨基酸。例如，具有类似物理化学性质的氨基酸将包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸，它们是芳香族氨基酸。图2显示了具有类似物理化学性质的氨基酸的图解表示，其可以取代包含核心γc-盒的氨基酸。核心γc-盒的肽衍生物的长度可以是11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50或超过50个氨基酸。在一些实施方案中，可以将定制肽衍生物与现存生物蛋白质/肽的N-末端、C-末端和/或侧链残基缀合。
基于结合γc-亚基的细胞因子中保守的γc-盒基序的鉴定，申请人已经设计出新型的19-mer定制衍生肽，其是组合了人类IL-2和IL-15γc-盒的氨基酸序列的人工复合肽。本文称为BNZ-γ的19-mer肽由以下氨基酸序列组成：I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(SEQ ID NO:1)，其中由粗体字符所示的氨基酸在IL-2和IL-15之间是保守的，并且带下划线的氨基酸代表其中氨基酸的物理化学性质是保守的位置。
申请人发现19-mer BNZ-γ抑制IL-15和IL-9诱导的细胞增殖，但不抑制IL-3或IL-4诱导的细胞增殖。参见图3A和实施例2。申请人进一步证明BNZ-γ抑制IL-15介导的细胞内细胞因子信号转导分子STAT-5的磷酸化。参见图3C和实施例5。这些结果证明保守的γc-盒基序的定制肽衍生物可以抑制多种γc-细胞因子的活性。
若干实施方案涉及19-mer BNZ-γ氨基酸序列：I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(SEQ ID NO:1)的定制衍生肽，，其可以抑制一种或更多种γc-细胞因子的活性。19-mer BNZ-γ氨基酸序列的定制肽衍生物包括任何肽，其部分氨基酸序列显示出与氨基酸序列：I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(SEQ ID NO:1)具有大约50％、50-60％、60-70％、70-80％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或99.8％的同一性。定制肽衍生物还包括任何肽，其中此肽衍生物的部分氨基酸序列包含具有与序列：I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(SEQ ID NO:1)的氨基酸类似的物理化学性质的氨基酸。在若干实施方案中，定制衍生肽的氨基酸残基保留了与BNZ-γ的氨基酸残基类似的物理化学性质，但是对6个γc-细胞因子家族成员展现出与原始19-mer肽不同的生物抑制特异性。BNZ-γ的肽衍生物的长度可以是19、20、21、22、24、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50或超过50个氨基酸。在一些实施方案中，可以将定制肽衍生物与现存生物蛋白质/肽的N-末端、C-末端和/或侧链残基缀合。
若干实施方案涉及IL-15、IL-2、IL-21、IL-4、IL-9或IL-7的γc-盒基序的定制肽衍生物，其描绘于图1A中。其他实施方案涉及组合了人类IL-15、IL-2、IL-21、IL-4、IL-9和IL-7γc-盒基序中的两种或更多种的氨基酸序列的人工复合肽的定制衍生肽。若干实施方案涉及IL-15、IL-2、IL-21、IL-4、IL-9或IL-7的γc-盒基序的定制肽衍生物，所述定制肽衍生物具有显示出与IL-15、IL-2、IL-21、IL-4、IL-9或IL-7的γc-盒基序的氨基酸序列具有大约50％、50-60％、60-70％、70-80％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或99.8％的同一性的部分氨基酸序列。IL-15、IL-2、IL-21、IL-4、IL-9或IL-7的γc-盒基序的定制肽衍生物还包括任何肽，其中此肽衍生物的部分氨基酸序列包含具有与IL-15、IL-2、IL-21、IL-4、IL-9或IL-7的γc-盒基序的序列的氨基酸类似的物理化学性质的氨基酸。
若干实施方案涉及将抑制γc-细胞因子的一个、全部或选择性成员的功能的定制肽衍生物。在一些实施方案中，定制肽衍生物选择性地靶向单独的γc-细胞因子家族成员。例如，定制肽衍生物可以选择性地抑制IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15或IL-21的功能。在其他实施方案中，定制肽衍生物可以抑制2个或更多个γc-细胞因子家族成员。
例如，本发明实施方案的定制肽衍生物可以选择性地抑制以下组合的功能：IL-2与IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21中的一种或更多种的组合；IL-4与IL-7、IL-9、IL-15和IL-21中的一种或更多种的组合；IL-7与IL-9、IL-15和IL-21中的一种或更多种的组合；IL-9与IL-2、IL-4、IL-7、IL-15和IL-21中的一种或更多种的组合；IL-15与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-21中的一种或更多种的组合；或IL-21与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15中的一种或更多种的组合。在其他实施方案中，定制肽衍生物可以全面靶向所有γc-细胞因子家族成员。
不希望被特定理论束缚，定制肽衍生物可以通过减少γc-细胞因子与γc-亚基的结合(例如作为竞争性抑制剂)来抑制γc-细胞因子的全部或选择性成员的功能。可以将此类定制肽衍生物用于不同的应用，包括作为临床药物。
若干实施方案涉及将调节(包括增强或降低)γc-细胞因子中的一个、两个或更多个选择性成员的功能的定制肽衍生物。在一些实施方案中，定制肽衍生物选择性地靶向单独的γc-细胞因子家族成员。例如，定制肽衍生物可选择性地增强或抑制IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15或IL-21的功能。在其他实施方案中，定制肽衍生物可增强或抑制两个或更多个γc-细胞因子家族成员。在某些实施方案中，定制肽衍生物可以包含P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)，其可以增强或抑制γc-细胞因子中的一种、两种或更多种的活性。在某些实施方案中，定制肽衍生物可以包含P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)，其可以抑制至少IL-15和IL-21的活性。
在一些实施方案中，定制肽衍生物可以包括任何肽，其部分的氨基酸序列显示出与氨基酸序列：P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)具有大约50％、50-60％、60-70％、70-80％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或99.8％的同一性。定制肽衍生物还包括任何肽，其中此肽衍生物的部分氨基酸序列包含具有与序列：P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)的氨基酸类似的物理化学性质的氨基酸。
在若干实施方案中，定制衍生肽的氨基酸残基保留与P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)的氨基酸残基类似的物理化学性质，但是对6个γc-细胞因子家族成员(即IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15或IL-21)展现出与P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)的原始肽不同的生物抑制特异性。P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)的序列的肽衍生物的长度可以是19、20、21、22、24、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50或超过50个氨基酸。
在一些实施方案中，可以将定制肽衍生物与现存生物蛋白质/肽的N-末端、C-末端和/或侧链残基缀合。在一些实施方案中，可以通过复合肽的N-末端、C-末端或侧链将SEQID NO:3的复合肽与其他部分缀合。其他部分可以包括稳定复合肽的蛋白质或肽，或包括但不限于以下的其他部分：牛血清白蛋白(BSA)、白蛋白、钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、IgG的Fc区、用作支架的生物蛋白、针对细胞特异性抗原的抗体、受体、配体、金属离子和聚乙二醇(PEG)。
术语"寡肽"、"多肽"、"肽"和"蛋白质"当是指根据本发明实施方案提供的定制肽衍生物时可以被互换使用，并且可以被用于指定一系列任何长度的氨基酸残基。根据本发明实施方案的肽还可以含有非天然氨基酸。可以通过肽键或经由化学键将接头元件连接至本发明实施方案的肽。本发明实施方案的肽可以是线性的或环状的，并且可以包括(D)以及(L)氨基酸。
本发明实施方案的肽还可以含有一个或更多个稀有的氨基酸(诸如4-羟基脯氨酸或羟基赖氨酸)、有机酸或酰胺和/或常见氨基酸的衍生物(诸如具有C-末端羧酸根被酯化(例如，苄基酯、甲基酯或乙基酯)或被酰胺化和/或具有N-末端氨基基团修饰(例如乙酰化或烷氧基羰基氨基)，具有或不具有任何广泛种类的侧链修饰和/或取代(例如，甲基化、苄基化、叔丁基化、甲苯磺酰化、烷氧基羰基氨基等)的氨基酸)。
除了常见氨基酸以外可能存在的残基包括但不限于：青霉胺、四亚甲基半胱氨酸、五亚甲基半胱氨酸、巯基丙酸、五亚甲基巯基丙酸、2-巯基苯、2-巯基苯胺、2-巯基脯氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、氨基己二酸、间氨基甲基苯甲酸和二氨基丙酸。
可以通过本领域技术人员已知的各种方法产生和获得本发明实施方案的肽。例如，可以通过基于编码本发明实施方案的肽的核苷酸序列的基因工程，或者借助肽固相合成等的化学合成产生肽，或者以它们组合的方式产生并获得肽。
本领域技术人员可以基于本公开的保守γc-盒基序和如图2中所述的氨基酸的生物化学性质的知识合成定制肽衍生物。一些实施方案还涉及包含编码本发明的肽的核苷酸序列的多核苷酸。"核苷酸序列"、"多核苷酸"或"核酸"可以被互换使用，并且被理解为意指双链DNA、单链DNA或所述DNA的转录产物(例如RNA分子)。可以将多核苷酸施用于细胞或对象并由细胞或对象表达多核苷酸，而不是施用肽本身。若干实施方案还涉及包含编码本发明的肽的多核苷酸序列的基因构建体。基因构建体还可以包含另外的调节元件(诸如启动子和增强子)以及任选地可选择标记。
治疗γc-细胞因子介导的疾病的方法
若干实施方案涉及γc-拮抗剂肽在治疗γc-细胞因子介导的疾病中的用途。使用根据本发明实施方案的定制肽衍生物允许设计治疗剂(肽的定制设计)的灵活性，并且能够实现更全面的结果，所述结果不能通过使用抗细胞因子或抗细胞因子受体抗体的常规策略实现。
本文所描述的是阻断γc-家族细胞因子作用的新方法。此类操作可以产生有效的临床干预方法，以治疗与γc-细胞因子的调节异常或功能障碍相关的疾病方法。可以通过破坏γc-细胞因子与γc-亚基之间的相互作用治疗的疾病的实例包括自身免疫性疾病诸如系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、韦格纳肉芽肿病、乳糜泻病、桥本氏或自身免疫性甲状腺炎；胶原病，其包括类风湿性关节炎、炎症性肠病、糖尿病、皮肤自身免疫性疾病诸如银屑病；退行性神经疾病，诸如多发性硬化症、葡萄膜炎或眼部炎症以及交感性眼炎、移植物抗宿主病(GvHD)和重症肌无力。
在一些实施方案中，可以将本文所述的γc-拮抗剂肽用于治疗1-人类T细胞嗜淋巴细胞I型和II型(HTLV-I和HTLV-II)相关的疾病，其包括成人T细胞白血病(ATL)、HTLV相关的脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫(HAM/TSP)，和其他与HTLV相关的非肿瘤炎症性疾病(诸如葡萄膜炎(HU)、关节病、肺病、皮炎、外分泌病和肌炎)。在一些实施方案中，可以将本文所述的γc-拮抗剂肽用于治疗其他病毒性疾病(诸如流行性感冒、AIDS、HBV和疱疹)或寄生虫病。
在若干实施方案中，可以在移植各种器官之前、期间和之后将γc-拮抗剂肽作为免疫抑制剂施用。
在一些实施方案中，可以将本文所述的γc-拮抗剂肽用于治疗免疫介导的疾病诸如哮喘和其他炎症性呼吸疾病，诸如但不限于鼻窦炎、枯草热、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、急性和慢性中耳炎、肺纤维化。在一些实施方案中，可以施用γc-拮抗剂肽以治疗或预防由于暴露于过敏原、化学剂或其他急性呼吸疾病的常见病因而引起的过敏反应。在一些实施方案中，可以施用γc-拮抗剂肽以治疗或预防由病毒、细菌、化学试剂和生化试剂引起的炎症性应答。
在若干实施方案中，可以施用γc-拮抗剂肽以治疗一些类型的恶性肿瘤，诸如LGL-白血病、难治性乳糜泻病中的上皮内淋巴瘤和白血病、NK白血病/淋巴瘤和NK-T白血病/淋巴瘤。
在一些实施方案中，可以将根据本文所述的实施方案的定制肽衍生物用于美容目的(诸如治疗痤疮、脱发、晒斑和指甲保养),由于它们的抗炎症性质被包括在软膏中作为抗衰老组分。
若干实施方案涉及将抑制γc-细胞因子的全部或选择性成员的功能的治疗性拮抗剂肽。在一些实施方案中，治疗性拮抗剂肽选择性地抑制单独的γc-细胞因子家族成员(定制肽)。在其他实施方案中，治疗性拮抗剂肽可以全面抑制所有γc-细胞因子家族成员(同时-阻断)。在一些实施方案中，治疗性拮抗剂肽选择性地抑制γc-细胞因子的亚群。不希望受特定理论束缚，肽拮抗剂可以通过减少γc-细胞因子与γc-亚基的结合(例如作为竞争性抑制剂)来抑制γc-细胞因子的全部或选择性成员的功能。
在实验小鼠模型中，γc-细胞因子家族的若干成员IL-2、IL-7和IL-15而不是IL-4已被涉及参与移植物抗宿主病(GvHD)。(Miyagawa等人,2008J.Immunol.181:1109-19.)一个实施方案涉及选择性抑制IL-2、IL-7和IL-15活性的治疗性拮抗剂肽用于治疗人类中GvHD从而允许移植的组织或骨髓细胞的存活的用途。其他实施方案涉及选择性抑制IL-2和IL-7、IL-2和IL-15、或IL-7和IL-15的组合的治疗性拮抗剂肽治疗GvHD的用途。其他实施方案涉及选择性抑制IL-2、IL-7或IL-15的治疗性拮抗剂肽的组合的用途。
一些实施方案涉及选择性抑制IL-2功能的治疗性拮抗剂肽用于治疗其中T-reg已被涉及起作用的自身免疫性病症的用途。在一些实施方案中，肽介导的T-reg的抑制可以增强人类中的天生的抗癌免疫力，从而提供了抗癌治疗的新手段。
若干实施方案涉及选择性抑制IL-4的治疗性拮抗剂肽治疗哮喘的用途。
一些实施方案涉及选择性抑制IL-7的治疗性拮抗剂肽单独地或与选择性抑制γc-细胞因子家族成员IL-15的治疗性拮抗剂肽组合作为LGL白血病的治疗剂的用途。在一些实施方案中，可以将选择性抑制IL-7和IL-15两者活性的治疗性拮抗剂肽用于治疗LGL白血病。若干实施方案涉及BNZ-γ治疗LGL白血病的用途。在一些实施方案中，将选择性地单独IL-15的特异性γc-拮抗剂肽或选择性地IL-15和IL-7的特异性γc-拮抗剂肽用作CD4/CD8T淋巴细胞相关的白血病(包括由HTLV I引起的)的治疗剂。
若干实施方案涉及选择性抑制单独的IL-9或IL-9与其他γc-细胞因子家族成员组合的活性的γc-拮抗剂肽作为涉及Th17细胞异常发育的人类疾病的治疗剂的用途。
若干实施方案涉及选择性抑制IL-15活性的治疗性拮抗剂肽作为治疗CD的治疗剂的用途。最近的一篇出版物表明，除IL-15之外，IL-21可能在CD发病机理中发挥作用。(参见Bodd等人,2010,Mucosal Immunol.3:594-601.)这表明通过常规抗细胞因子或细胞因子受体抗体的CD的最佳治疗将受益于识别属于IL-15和IL-21系统的组分的至少两种抗体的组合。在一些实施方案中，将选择性抑制IL-15和IL-21两者活性的定制衍生拮抗剂肽用作治疗CD的治疗剂。
除了具有治疗应用外，γc-拮抗剂肽，还具有在消费品中的应用。若干实施方案涉及γc-拮抗剂肽在皮肤护理产品(诸如抗衰老、抗炎症、抗痤疮和其他相关应用)中的用途。一些实施方案涉及γc-拮抗剂肽在头发产品中作为抗脱发成分来治疗由自身免疫性病症引起的脱发的用途。
另一实施方案涉及开发化学化合物(非肽、非蛋白质)，其具有类似于19-mer氨基酸序列I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(SEQ ID NO:1)的空间结构并且可以适合γc-亚基的口袋中以在结构上阻碍γc-细胞因子接近γc-亚基进行结合。一些实施方案涉及结构类似的化学化合物作为γc-细胞因子活性的抑制剂的用途。进一步改善与现存生物肽/蛋白质结构类似的合成化合物的开发的此类分子模拟策略描述于Orzaez等人,2009Chem.Med.Chem.4:146-160中。另一实施方案涉及施用具有与19-mer氨基酸序列I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(SEQ ID NO:1)类似的3D结构的化学化合物(非肽、非蛋白质)以治疗γc-细胞因子介导的疾病。
若干实施方案涉及施用氨基酸序列I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(SEQ ID NO:1)的肽以治疗γc-细胞因子介导的疾病。另一实施方案涉及施用氨基酸序列I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(SEQ ID NO:1)的衍生肽以治疗γc-细胞因子介导的疾病，其中衍生肽的氨基酸序列具有与氨基酸序列I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(SEQ ID NO:1)的肽类似的物理化学性质但是具有不同的生物活性。另一实施方案涉及将与现存生物蛋白质/肽的N-末端和C-末端或侧链残基缀合的氨基酸序列I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(SEQ ID NO:1)的肽施用至患者体内以治疗γc-细胞因子介导的疾病。
若干实施方案涉及将针对由氨基酸序列I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(SEQ ID NO:1)组成的肽产生的多克隆抗体和单克隆抗体施用至患者体内作为免疫原以治疗γc-细胞因子介导的疾病。另一实施方案涉及将针对氨基酸序列I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(SEQ ID NO:1)的衍生肽产生的多克隆抗体和单克隆抗体施用至患者体内作为免疫原以治疗γc-细胞因子介导的疾病，其中衍生肽的氨基酸序列具有与氨基酸序列I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(SEQ ID NO:1)的肽类似的物理化学性质但是具有不同的生物活性。
γc-拮抗剂肽的施用
本发明实施方案还包含γc-拮抗剂肽用于制造治疗疾病的药物的用途。本发明实施方案还包含药物组合物，其包括γc-拮抗剂肽与药学上可接受的载体的组合。药物组合物可以包括药学上可接受的载体和无毒治疗有效量的γc-拮抗剂肽或本发明实施方案的其他组合物。
本发明实施方案提供使用包含在适合的稀释剂或载体中的有效量的γc-细胞因子的拮抗剂的药物组合物的方法。可以根据用于制备药学上有用的组合物的已知方法配制本发明实施方案的γc-拮抗剂。可以将γc-拮抗剂作为唯一的活性物质或与其他已知的活性物质一起，与药学上适合的稀释剂(例如，磷酸盐、醋酸盐、Tris-HCl)、防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯类)、乳化化合物、增溶剂、佐剂和/或载体(诸如牛血清白蛋白)一起混入掺混物中。
适合的载体及其制剂描述于Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版.1980Mack Publishing CO。此外，此类组合物可以含有与聚乙二醇(PEG)、金属离子复合、或掺入聚合物(诸如聚乙酸、聚乙醇酸、水凝胶等)中或掺入脂质体、微乳液、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或球芽中的γc-拮抗剂。此类组合物将影响γc-拮抗剂的物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。可以将γc-拮抗剂缀合至针对细胞特异性抗原的抗体、受体、配体，或偶联至针对组织特异性受体的配体。
可以根据诸如疾病类型、对象状况和/或要靶向的部位的因素适当选择施用本发明实施方案的γc-拮抗剂的方法。可以局部、口服、肠胃外、经直肠或通过吸入施用γc-拮抗剂。术语“肠胃外的”包括皮下注射、静脉内、肌肉内、腹膜内、脑池内注射或输注技术。这些组合物通常包括单独或与有效量的任何其他活性物质组合的有效量的γc-拮抗剂。
可以根据诸如疾病类型、对象状况和/或要靶向的部位的因素适当选择本发明实施方案的药物组合物中含有的肽的量、药物组合物的剂型、施用频率等。包含在组合物中的此类剂量和所需的药物浓度可能受许多参数影响，所述参数包括预期用途、患者体重和年龄以及施用途径。将首先使用动物研究进行试验性研究，并且将根据领域接受的做法进行对人类施用的缩放。
在一实施方案中，向对象施用已经用编码至少一种γc-拮抗剂肽的多核苷酸遗传修饰的宿主细胞以治疗增殖病症和/或减少恶性细胞的生长。由宿主细胞表达多核苷酸，从而在对象体内产生肽。优选地，宿主细胞对于对象是同种异体的或自体的。
在另一方面，可以将γc-拮抗剂肽与其他疗法(例如抑制癌细胞增殖和生长的疗法)组合使用。短语"组合疗法"包括施用γc-拮抗剂肽和另外的治疗剂，作为旨在从这些治疗剂的共同作用提供有益效果的特定治疗方案的一部分。通常在限定的时间段内(通常是数分钟、数小时、数天或数周，取决于所选择的组合)进行这些治疗剂的组合施用。
组合疗法旨在包括以顺序方式施用这些治疗剂(即其中在不同的时间施用每种治疗剂)，以及以基本上同时的方式施用这些治疗剂或至少两种治疗剂。可以例如通过向对象施用具有固定比率的每种治疗剂的单个胶囊或者以多个用于每种治疗剂的单个胶囊实现基本上同时的施用。可以通过适当的途径实现每种治疗剂的有顺序或基本上同时施用，所述适当的途径包括但不限于口服途径、静脉内途径、肌肉内途径以及通过粘膜组织的直接吸收。可以通过相同的途径或通过不同的途径施用这些治疗剂。其中施用治疗剂的顺序并不是非常关键。
组合疗法还可以包括施用如上所述的治疗剂与其他生物活性成分(诸如但不限于第二治疗剂和不同的治疗剂)以及非药物疗法(诸如但不限于手术或放射治疗)的另外组合。在组合疗法还包括放射治疗的情况下，可以在任何适合的时间进行放射治疗，只要实现来自治疗剂和放射治疗的组合的共同作用的有益效果即可。例如，在适当的情况下，当将放射治疗暂时从治疗剂的施用中去除可能几天甚至几周时，仍然可以获得有益效果。
在某些实施方案中，可以将γc-拮抗剂肽与选自以下的至少一种抗增殖剂组合施用：化疗剂、抗代谢物、和抗生瘤剂、和抗有丝分裂剂、和抗病毒剂、和抗肿瘤剂、免疫治疗剂和放射治疗剂。
在某些实施方案中，可以将γc-拮抗剂肽与选自以下的至少一种抗炎症剂组合施用：类固醇、皮质类固醇和非类固醇抗炎症药物。
还提供了用于进行本文提供的任何方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以包括根据本文提供的任何实施方案的一种或更多种γc-拮抗剂。在一些实施方案中，试剂盒可以包括说明书。说明书可以呈书面形式或统计图表形式，或者可以在记录的媒介()上，包括录音磁带、音频CD、录像磁带、DVD、CD-ROM等。试剂盒可以包含包装。
定义
如本文所用，术语“患者”是指治疗性治疗的接受者并且包括动物界内的所有生物体。在优选的实施方案中，动物是在哺乳动物的家族内，诸如人类、牛科动物、绵羊类动物、猪科动物、猫科动物、水牛、犬科动物、山羊、马科动物、驴、鹿和灵长类动物。最优选的动物是人类。
如本文所用，术语“治疗(treat)”或其任何变型(例如，治疗(treatment,treating)等)是指被诊断患有以下生物病况的患者的任何治疗：诸如CD4-、CD8-和LGL-白血病、自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、韦格纳肉芽肿病、乳糜泻病、桥本氏甲状腺炎、胶原病、类风湿性关节炎、炎症性肠病、糖尿病、银屑病、退行性神经疾病、多发性硬化症、葡萄膜炎、眼部炎症、移植物抗宿主病(GvHD)、重症肌无力、1-人类T细胞嗜淋巴细胞I型和II型(HTLV-I和HTLV-II)相关的疾病、成人T细胞白血病(ATL)、HTLV相关的脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫(HAM/TSP)、葡萄膜炎(HU)、关节病、肺病、皮炎、外分泌病、肌炎、流行性感冒、AIDS、HBV、疱疹、哮喘、鼻窦炎、枯草热、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、急性和慢性中耳炎、肺纤维化、NK白血病/淋巴瘤和NK-T白血病/淋巴瘤。
如本文所用，术语治疗包括：(i)预防或延迟在尚未表现出与生物病况相关的症状的处于风险中的患者中的与目标生物病况相关的症状的呈现；(ii)改善被诊断患有生物病况的患者中的与目标生物病况相关的症状；(iii)预防、延迟或改善处于风险中的患者或被诊断患有生物病况的患者中与与目标生物病况相关的并发症、病况或疾病相关的症状的呈现；(iv)减缓、延迟或停止生物病况的进展；和/或(v)预防、延迟、减缓、停止或改善炎症的细胞事件。
如本文所用的术语“症状”是指患者患有特定病况或疾病的常见的病征或适应症。
如本文所用的术语“有效量”是指引起期望的生物应答所必需的量。根据本发明实施方案，γc-拮抗剂的有效量是在至少一种生物因子中提供可观察的效果以用于治疗生物病况所必需的量。
“重组DNA技术”或“重组”是指使用从已经用克隆或合成的DNA序列转化或转染的微生物(例如细菌、酵母)、无脊椎动物(昆虫)、哺乳动物细胞或生物体(例如转基因动物或植物)产生特定多肽使异源肽的生物合成成为可能的技术和方法。只有用哺乳动物细胞表达系统才能实现天然的糖基化模式。原核表达系统缺乏将糖基化添加到合成蛋白质的能力。酵母和昆虫细胞提供可能与天然模式不同的独特糖基化模式。
“核苷酸序列”是指呈单独片段形式或作为更大的DNA构建体的组分的多核苷酸，其来源于以基本上纯的形式分离至少一次的DNA或RNA，不含污染的内源性物质并且其数量或浓度使得能够通过标准分子生物学方法(如概述于分子生物学中的实验室指南)鉴定、操作并回收其组分核苷酸序列。
“重组表达载体”是指包含含有以下的集合的转录单元的质粒：(1)在基因表达中具有调节作用的基因元件(a genetic clement or elements)，其包括启动子和增强子，(2)编码根据本发明实施方案的多肽的结构或编码序列，以及(3)适当的转录和翻译起始序列，以及如果需要，终止序列。意在用于酵母和哺乳动物系统中的结构元件优选包括使得能够通过酵母或哺乳动物宿主细胞细胞外分泌已翻译的多肽的信号序列。
“重组微生物表达系统”是指适合的热点微生物(例如，细菌(诸如大肠杆菌(E.coli))或酵母菌(诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)))的基本上同源的单一培养物，所述热点微生物已将重组转录单元稳定整合到染色体DNA中或携带重组转录单元作为残余质粒的组分。通常，构成重组微生物表达系统的宿主细胞是单一祖先转化细胞的后代。一旦诱导与待表达的结构核苷酸序列连接的调节元件，重组微生物表达系统将表达异源多肽。
如本文所用，章节标题仅用于组织目的且不应被解释为以任何方式限制所描述的主题。出于任何目的，在本申请中引用的所有文献和类似材料(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和互联网网页)均明确地通过引用整体并入。当在并入的参考文献中的术语的定义似乎不同于本教导中提供的定义时，本教导中提供的定义将控制术语。应理解，在本教导中讨论的温度、浓度、时间等之前存在暗示的“约”，使得轻微且非实质性的偏差在本文的教导的范围内。
尽管已经在某些实施方案和实例的背景公开了本发明，但是本领域技术人员将会理解，本发明超出具体公开的实施方案扩展到本发明的其他替代实施方案和/或用途以及其明显的修改和等同物。此外，虽然已经详细显示和描述了本发明的若干变型，但是基于本公开，在本发明范围内的其他修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
还考虑到的是可以对实施方案的特定特征和方面进行各种组合或子组合，并且仍然落入本发明的范围内。应理解，所公开的实施方案的各种特征和方面可以彼此组合或替代以形成所公开的本发明的不同模式或实施方案。因此，旨在本文所公开的本发明的范围不受上述具体公开的实施方案的限制。
然而，应该理解的是，尽管指出了本发明的优选实施方案，但是仅当作说明给出这个详细描述，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
实施例
以下实施例为了说明的目的被呈现，并不应被解释为限制。
实施例1–用于评估γc-拮抗剂肽的抑制活性的方法
使用哺乳动物细胞试验测量它们对γc-细胞因子家族成员的增殖应答来测定根据本发明实施方案制备的任何定制衍生肽用于抑制一个γc-细胞因子家族成员的作用的能力。
对于六种γc-细胞因子中的每一种，指示细胞系：CTLL-2(可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得的鼠CD8T细胞系)，和PT-18(鼠肥大细胞系)及其亚克隆PT-18β被用人类IL-2Rβ基因转染以使细胞对IL-2和IL-15有应答(Tagaya等人,1996,EMBO J.15:4928-39)，并且被用于定量测定γc-细胞因子的生长促进活性(参见来自Wiley和Sons的免疫学中的实验室指南用于方法参考)。当通过比色WST-1测定法在一定浓度范围内测量时，指示细胞表现出半线性剂量依赖性应答(参见Clontech PT3946-1和相关的用户手册，通过引用并入本文，用于试剂和方法的详细描述)。
一旦确定了从指示细胞系产生50％和95％的最大应答的细胞因子的适当剂量，就将各种浓度(范围为1pM至10μM)的纯化或合成的定制衍生肽添加至含有细胞因子和指示细胞的每个孔中。将在450nm处光吸收的减少用作抑制细胞因子刺激的细胞增殖的指标。通常，通过细胞因子刺激细胞，使得含有指示细胞系和细胞因子的孔的吸光度是2.0至3.0，其通过添加抑制肽被降低到0.1至0.5的范围。
实施例2–BNZ-γ肽特异性抑制IL-9和IL-15的生长促进活性
使用如上所述的PT-18β细胞，测定了BNZ-γ肽特异性抑制选择的γc-细胞因子的生长-促进活性的能力(图3A)。将IL-3(支持PT-18β细胞生长的非γc-细胞因子)用作阴性对照。简而言之，在IL-3、IL-9、IL-15或IL-4(在培养中1nM的各细胞因子)存在的情况下，将PT-18β细胞与由HEK293T细胞产生的BNZ-γ肽的两种不同稀释液一起(用BNZ-γ表达构建体转染的HEK293T细胞的原始上清液的1:20或1:50的稀释液)或不与BNZ-γ肽一起孵育。
在引入BNZ-γ肽和细胞因子后2天，使用WST-1测定法测定细胞的生长应答。IL-3(非γc-细胞因子)的生长促进活性不受BNZ–γ抑制。相反，IL-15和IL-9的活性被BNZ-γ肽显著降低(p<0.01，Student T检验)。由另一种γc-细胞因子IL-4刺激的细胞增殖不受添加的BNZ-γ肽的影响。图3A显示了IL-3、IL-9、IL-15和IL-4的结果。
在类似的测定中，使用鼠细胞系CTTL2。在该测定中，将细胞与0.5nM的重组IL-2一起在RPMI 10％胎牛血清中培养。为了建立增殖测定，将细胞从细胞因子中洗涤3次。将细胞以96孔板的每孔1x10(5)个细胞接种，其中IL-2或IL-15的终浓度为50pM的。向每个孔中添加各种浓度的BNZ-γ肽(0.1、1和10ug/ml)。将细胞培养20小时，并且在最后4小时，向板中添加3H-胸苷。使用平板阅读器收集细胞。数据示于图3B中。
实施例3-用于通过测定作为细胞增殖标记物的3H-胸苷掺入来测量抑制γc-细胞 因子活性的方法
通过3H-胸苷掺入测定测量拮抗剂定制衍生肽对γc-细胞因子诱导的指示细胞群增殖的抑制。简而言之，在细胞因子存在下，将放射性标记的胸苷(1微Ci)给予经历增殖的20-50,000个细胞。通过使用常规收获机器(例如，来自Perkin-Elmer的Filtermate通用收获机)将细胞结合的放射性捕获到玻璃纤维滤器上，之后使用b-计数器(例如，1450Trilux微孔板闪烁计数器)测量放射性来测量掺入细胞的放射性。
实施例4-用于通过测定作为细胞增殖标记物的细胞追踪染料的掺入来测量抑制 γc-细胞因子活性的方法
在选定的γc-细胞因子存在的情况下或在选定的γc-细胞因子和选定的定制衍生肽存在的情况下孵育指示细胞。然后使用细胞追踪染料(例如来自Invitrogen的CMFDA、C2925)体外标记细胞群，，并且使用流式细胞仪(例如，Beckton-Dickinson FACScalibur)监测每个细胞分裂时的细胞的绿色荧光的衰变。通常，响应于γc-细胞因子刺激，对应于细胞已经经历的分裂次数的7～10个不同峰将出现在绿色荧光通道上。根据抑制程度，将细胞与选定的γc-细胞因子和拮抗剂定制衍生肽一起孵育，将峰数减少到仅1至3个。
实施例5–BNZ-γ及其衍生拮抗剂抑制细胞内信号转导
除了刺激细胞增殖之外，γc-细胞因子与它们受体的结合引起各种细胞内事件。(Rochman等人，2009Nat.Rev.Immunol.9:480-90，Pesu等人，2005Immunol.Rev.203:127-142.)。在细胞因子结合其受体后，立即将称为Jak3(Janus激酶3)的酪氨酸激酶募集至质膜处的受体。该激酶磷酸化多种蛋白质(包括γc-亚基、STAT5(信号转导子和转录激活子5)以及PI3(磷脂酰肌醇3)激酶的亚基)的酪氨酸残基。其中，STAT5的磷酸化在许多研究中已被涉及与γc-细胞因子引发的细胞增殖有关。(综述于Hennighausen和Robinson,2008GenesDev.22:711-21.中)。根据这些已公布的数据，检测了BNZ-γ肽是否抑制由IL-15刺激的PT-18β细胞中STAT5分子的酪氨酸磷酸化(结果示于图3C中)。
在存在或不存在BNZ-γ肽的情况下，通过IL-15刺激PT-18β细胞。根据如Tagaya等人，1996EMBO J.15:4928-39中所述的常规方法从细胞中提取细胞质蛋白。使用标准SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离提取的细胞质蛋白，并且通过抗磷酸-STAT5抗体(Cell Signaling Technology，目录号#9354，Danvers MA)使用免疫印迹法确认磷酸化状态(参见图3C，上图)。为了确认每条泳道表现出类似的总蛋白质负载，然后将膜剥离，并用抗STAT5抗体(Cell Signaling Technology，目录号#9358)重新探测(参见图3C，下图)。
这些结果表明在PT-18β细胞中STAT5(信号转导的标记物)的酪氨酸磷酸化由IL-15诱导并且STAT5的酪氨酸磷酸化被BNZ-γ肽显著减少。
实施例6–BNZ-γ衍生拮抗性肽的合理设计
基于核心序列D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q(SEQ ID NO:2)(其中X表示任何氨基酸)通过用如图2所指定具有相同的物理化学性质的氨基酸取代核心序列的限定氨基酸来制备衍生肽。
可替代地，可以基于不同的γc-细胞因子家族成员的D-螺旋区的序列比对制备定制肽或它们的衍生肽。例如，如图5所示，可以将γc-细胞因子家族(SEQ ID NO:4–SEQ IDNO:9)成员中保守的一个或更多个序列组合以形成诸如SEQ ID NO:3的肽。
实施例7-鉴定拮抗性定制衍生肽的抑制特异性的方法
通过测定定制衍生肽抑制细胞因子应答细胞系对6种γc-细胞因子中的每一种的增殖应答的能力来确定拮抗性定制衍生肽的γc-细胞因子抑制特异性。例如，使用小鼠细胞系CTLL-2来确定候选肽是否抑制IL-2和IL-15的功能。使用PT-18(β)细胞来确定候选肽是否抑制IL-4和IL-9的功能。使用PT-18(7α)细胞来确定候选肽是否抑制IL-7的功能，并且使用PT-18(21α)细胞来确定候选肽是否抑制IL-21的功能。PT-18(β)表示通过基因转染外源表达人类IL-2Rβ的PT-18细胞的亚克隆(参见Tagaya等人，1996)，PT-18(7α)表示通过基因转染表达人类IL-7Rα的亚克隆，以及PT-18(21Rα)细胞表达人类IL-21Rα。
另一替代方法是使用对一系列细胞因子有应答的其他细胞系。该细胞系的实例是人类NK细胞系NK92，其可以在ATCC(目录号CRL-2407)商购。该细胞系是IL-2依赖性细胞系，其对其他细胞因子(包括IL-9、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21)应答(Gong等人，1994Leukemia 8:652-658，Kingemann等人，1996,Biol Blood Marrow Transplant 2:68；75，Hodge DL等人，2002J.Immunol.168:9090-8)。
实施例8-γc-拮抗剂肽的制备
通过人工和自动化过程化学合成定制衍生γc-拮抗剂肽。
人工合成：采用经典的液相合成，其涉及将一个氨基酸的羧基基团或C-末端偶联至另一个的氨基基团或N-末端。可替代地，利用固相肽合成(SPPS)。
自动合成：许多商业公司提供一定成本的自动化肽合成。这些公司使用各种商业肽合成仪，包括由Applied Biosystems(ABI)提供的合成仪。定制衍生γc-拮抗剂肽是由自动化肽合成仪合成的。
实施例9-使用重组技术生物产生定制衍生的γc-拮抗剂肽
将定制衍生的γc-拮抗剂肽生物学合成为前肽，所述前肽由适当的标记肽、信号肽或来源于已知的人类蛋白质的肽组成，所述已知的人类蛋白质增强或稳定BNZ-γ肽或包含SEQ ID NO:3序列的肽或其衍生物的结构，并且改善它们的生物活性。如果需要，应设计进入肽的N-末端的适当酶切序列以从最终蛋白质中去除标签或肽的任何部分。
将在3’末端具有终止密码子的编码定制衍生肽的核苷酸序列插入商业载体中，所述商业载体具有来源于大肠杆菌的硫氧还蛋白的标签部分和被适当的蛋白水解酶(例如肠激酶)识别并消化的介于标签部分与编码定制衍生肽的核苷酸序列以及终止密码子之间的特定肽序列。适合的载体的一个实例是可从Invitrogen,CA获得的pThioHis质粒。可以使用其他表达载体。
实施例10-用于免疫目的和产生针对定制肽的抗体的定制肽和衍生物与载体蛋白 的缀合
将BNZ-γ和其他定制衍生物肽(诸如包含SEQ ID NO:3的序列的肽或其衍生物)用于免疫动物以获得多克隆抗体和单克隆抗体。通过使用戊二醛或间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯的常规方法将肽缀合至适当载体蛋白(例如，牛血清白蛋白、钥孔戚血蓝蛋白(KLH)等)的N-末端或C-末端。然后将缀合的肽连同适当的佐剂一起用于免疫动物(诸如兔、啮齿类动物或驴)。使用常规方法检测所得抗体的特异性。如果所得抗体与免疫原性肽反应，然后则根据实施例1-3中所述的细胞增殖测定测试它们抑制单独的γc-细胞因子活性的能力。由于衍生肽的复合性质，有可能产生同时识别两种不同细胞因子的单一抗体(由于这些肽的复合性质)。
实施例11-用于大规模产生定制衍生的γc-拮抗剂肽的方法
如其他地方所述，通过使用无细胞系统大规模产生重组蛋白。(参见Takai等人,2010Curr.Pharm.Biotechnol.11(3):272-8.)简而言之，将编码γc-拮抗剂肽和标签的cDNA亚克隆到适当的载体(参见Takai等人,2010Curr.Pharm.Biotechnol.11(3):272-8)，其经受体外转录，随后立即进行体外翻译以产生经标记的肽。然后使用识别经标记的表位的固定化抗体纯化前多肽，用蛋白水解酶处理前多肽并使用常规的18％的三甲基甘氨酸-SDS–PAGE(Invitrogen)和常规的考马斯染色测试洗脱液(其主要含有目标定制衍生肽)的纯度。如果该肽所需的纯度的不被满足(>98％)，则使混合物经受常规HPLC(高效液相色谱法)以进一步纯化。
实施例12–使用定制衍生的γc-拮抗剂肽阻断HAM/TSP中的细胞因子功能
HTLV-1相关的脊髓病(HAM)/热带痉挛性下肢轻瘫(TSP)是见于感染人类T嗜淋巴细胞病毒I型(HTLV-I)的一些人中的慢性进行性脊髓病。脊髓中淋巴细胞的浸润与对HTLV-I的免疫应答相关并导致某些细胞因子的释放。这些细胞因子中的一些也可能损害神经。
患有HAM/TSP的患者表现出升高的免疫系统状态，其类似于在自身免疫性疾病中观察到的状态(Oh等人2008Neurol Clin.26:781-785)。由HAM/TSP患者的T细胞在不存在外源添加的细胞因子的情况下在离体培养物中经历自发性增殖约一周的能力证明这种升高的状态。将HAM/TSP患者中的T细胞的自发性增殖至少部分归因于IL-2、IL-9和IL-15的自分泌/旁分泌循环。已显示添加针对IL-2或IL-15受体的阻断抗体可以抑制HAM/TSP离体培养系统中的自发性T细胞增殖。
这些观察结果连同来源于离体研究的其他数据已经提供了将两种单克隆抗体(抗IL-2受体α或抗Tac和抗IL-15受体β链)付诸临床用于治疗HAM/TSP的基本原理(Azimi等人，2001Proc.Natl.Acad.Sci.98:14559-64.,Azimi等人,1999J.Immunol 163:4064-72)。
根据本文所述的实施方案的抗细胞因子受体拮抗剂不仅作为用于治疗HAM/TSP的治疗性免疫调节剂是有价值的，而且由根据本发明实施方案的抗细胞因子受体拮抗剂调节HAM/TSP中的免疫应答用作使用根据本发明实施方案的抗细胞因子受体拮抗剂治疗其他自身免疫性疾病的概念验证。
为了证明根据本文所述的实施方案的定制衍生的γc-拮抗剂肽的功效，我们使用HAM/TSP离体培养系统测试了在自发性T细胞增殖测定中BNZ-γ肽阻断对HTLV-I的免疫应答的能力。在添加或不添加BNZ-γ的情况下，对HAM/TSP患者血液样品进行增殖测定。这些测定评估了BNZ-γ阻断在离体HAM/TSP患者血液培养物中存在的细胞因子(诸如IL-2和IL-15)功能和阻止这些样品中的自发性T细胞增殖的能力。
在离体自发性T细胞增殖测定中，将来自HAM/TSP患者的PBMC在RPMI-10％FCS中以96孔板的每孔1x10(6)个细胞培养。向每个孔中添加增加浓度的BNZ-γ肽。作为对照，以类似的方式使用不相关的肽。将细胞在37℃CO2培养箱中孵育3、4和6天。将1uCi量的3H-胸苷添加至细胞。另外孵育6小时后，收集细胞，测量它们的增殖速率。在图4A–图4D中显示了代表性HAM/TSP患者的数据。如图4A-图4D中所显示，BNZ-γ肽在约1ug/ml的浓度下抑制HAM/TSP培养物中T细胞的自发性增殖。
在该测定中另外测量了其他免疫标记物。使用病毒蛋白质四聚体在离体培养期间测量病毒特异性CD8细胞的百分比。在流式细胞术测定中监测CD4+CD25+细胞群(T细胞激活的标记物)以及Ki67染色(T细胞增殖的标记物)。
在类似的未来测定中可以使用其他形式的缀合BNZ-γ肽衍生物或包含SEQ IDNO:3的序列的定制肽及其衍生物。它们包括在化学合成后可以与肽缀合的白蛋白、BSA、PEG。其他生物形式的定制肽(诸如BNZ-γ肽缀合物或包含SEQ ID NO:3的序列的定制肽及其衍生物)可以包括融合至定制肽的已知蛋白质实体的区域(包括但不限于人类IgG的Fc区)。
实施例13-通过施用定制衍生的γc-拮抗剂肽治疗人类患者中的成人T细胞白血 病(ATL)的方法
鉴定患有成人T细胞白血病的人类患者。将如由医师确定的有效剂量的定制衍生的γc-拮抗剂肽(例如BNZ-γ、包含SEQ ID NO:3的序列的定制肽或它们的衍生物)施用给患者由医师确定的一段时间。如果患者进入缓解，则确定治疗是有效的。
实施例14-通过施用定制衍生的γc-拮抗剂肽治疗人类患者中的HAM/TSP的方法
鉴定患有HAM/TSP的人类患者。将如由医师确定的有效剂量的定制衍生的γc-拮抗剂肽(例如BNZ-γ、包含SEQ ID NO:3的序列的定制肽或它们的衍生物)施用给患者由医师确定的一段时间。如果患者的症状改善或如果疾病进展已经被停止或被减缓，则确定治疗是有效的。
实施例15–使用定制衍生的γc-拮抗剂肽阻断细胞因子功能
鉴定了患有需要减少至少IL-15和IL-21功能的人类患者。将如由医师确定的有效剂量的定制衍生的γc-拮抗剂肽(例如包含SEQ ID NO:3的序列的复合肽或其衍生物)施用给患者由医师确定的一段时间。如果患者的症状改善或如果疾病进展已经被停止或被减缓，则确定治疗是有效的。
实施例16-通过施用定制衍生的γc-拮抗剂肽治疗人类患者中的乳糜泻病的方法
鉴定患有乳糜泻病的人类患者。将如由医师确定的有效剂量的定制衍生的γc-拮抗剂肽(例如，包含SEQ ID NO:3的序列的复合肽或其衍生物)施用给患者一段由医师确定的时间。如果患者的症状改善或如果疾病进展已经被停止或被减缓，则确定治疗是有效的。
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<223> 合成的
<400> 9
Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp
1 5 10 15
Asn Lys Ile Leu
20
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
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<223> 合成的
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<222> (1)..(1)
<223> X = 任何氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> (2)..(2)
<223> X = 任何氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> (3)..(3)
<223> X = D或E
<220>
<221> SITE
<222> (6)..(6)
<223> X = E或Q或N或极性氨基酸
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<221> SITE
<222> (7)..(7)
<223> X = S或R或极性氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> (8)..(8)
<223> X = 非极性氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> (9)..(9)
<223> X = I或K或非极性氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> (10)..(10)
<223> X = 任何氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> (11)..(11)
<223> X = L或I或脂肪族氨基酸
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<222> (12)..(12)
<223> X = 非极性氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> (14)..(14)
<223> X = 带电荷的氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> (15)..(15)
<223> X = 任何氨基酸
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<221> SITE
<222> (16)..(16)
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<222> (17)..(17)
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<221> SITE
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<400> 10
Xaa Xaa Xaa Phe Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
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<221> SITE
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<223> 合成的
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<222> (1)..(1)
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<400> 11
Xaa Xaa Xaa Phe Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Ile
1 5 10 15
Xaa Thr Ser

Claims (32)

1.复合肽，其包含至少两个白细胞介素(IL)蛋白γc-盒D-螺旋区的氨基酸序列，其中所述复合肽包含氨基酸序列P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)。
2.如权利要求1所述的复合肽，其中所述复合肽抑制选自以下的两种或更多种γc-细胞因子的活性：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21。
3.如权利要求1和2所述的复合肽，其中所述复合肽抑制至少IL-15和IL-21的活性。
4.如权利要求1-3所述的复合肽，其还包含信号肽。
5.如权利要求1-4所述的复合肽，其中将所述复合肽在所述复合肽的N-末端、C-末端或侧链残基处进一步与一个或更多个另外的部分缀合。
6.如权利要求1-5所述的复合肽，其中所述一个或更多个另外的部分选自：牛血清白蛋白(BSA)、白蛋白、钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、IgG的Fc区、用作支架的生物蛋白、针对细胞特异性抗原的抗体、受体、配体、金属离子和聚乙二醇(PEG)。
7.如权利要求1-6所述的复合肽，其中所述复合肽由与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列组成。
8.如权利要求1-6所述的复合肽，其中所述复合肽由与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列组成。
9.药物组合物，其包含：
治疗有效量的肽缀合物或其衍生物；和
药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或它们的组合；
其中所述肽缀合物或其衍生物调节选自以下的两种或更多种γc-细胞因子的活性：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21；
其中所述肽缀合物包含氨基酸序列P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述肽缀合物或其衍生物抑制选自以下的两种或更多种γc-细胞因子的活性：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21。
11.如权利要求9和10所述的药物组合物，其中所述肽缀合物或其衍生物还包含位于其N-末端、C-末端或侧链残基处的另外的缀合物。
12.如权利要求9-11所述的药物组合物，其中所述肽缀合物或其衍生物还包含信号肽。
13.如权利要求9-12所述的药物组合物，其还包含稳定所述肽缀合物或其衍生物的结构并提高其生物活性的蛋白质，其中所述蛋白质选自：牛血清白蛋白(BSA)、白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)的Fc区、用作支架的生物蛋白、聚乙二醇(PEG)及它们的衍生物。
14.如权利要求9-13所述的药物组合物，其中所述其衍生物包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列共有至少90％同一性的肽序列。
15.如权利要求9-13所述的药物组合物，其中所述其衍生物包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列共有至少95％同一性的肽序列。
16.用于阻断经由两种或更多种γc-细胞因子家族成员的信号转导的方法，其包括将细胞与权利要求1-8所述的复合肽和/或权利要求9-15所述的药物组合物接触。
17.抑制γc-细胞因子结合γc-亚基的方法，其包括将细胞的γc-亚基与权利要求1-8所述的复合肽和/或权利要求9-15所述的药物组合物接触。
18.治疗γc-细胞因子介导的疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象施用权利要求1-8所述的复合肽和/或权利要求9-15所述的药物组合物，其中所述γc-细胞因子介导的疾病选自：CD4-白血病、CD8-白血病、LGL-白血病、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、韦格纳肉芽肿病、乳糜泻病、桥本氏甲状腺炎、类风湿性关节炎、糖尿病、银屑病、多发性硬化症、葡萄膜炎、眼部炎症和移植物抗宿主病(GvHD)。
19.治疗HTLV-1相关的脊髓病(HAM)/热带痉挛性下肢轻瘫(TSP)相关的疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象施用权利要求1-8所述的复合肽和/或权利要求9-15所述的药物组合物，其中所述HAM/TSP相关的疾病选自：成人T细胞白血病(ATL)、HTLV相关的脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫(HAM/TSP)和其他与HTLV相关的非肿瘤炎症性疾病诸如葡萄膜炎(HU)、关节病、肺病、皮炎、外分泌病和肌炎。
20.治疗炎症性呼吸疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象施用权利要求1-8所述的复合肽和/或权利要求9-15所述的药物组合物，其中所述炎症性呼吸疾病选自：哮喘、鼻窦炎、枯草热、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、急性和慢性中耳炎以及肺纤维化。
21.治疗美容病的方法，所述方法包括向有需要的对象施用权利要求1-8所述的复合肽和/或权利要求9-15所述的药物组合物，其中所述美容病选自：痤疮、脱发、晒斑、指甲保养和外表衰老。
22.用于治疗患者中的病况的药物组合物，所述药物组合物包含：
治疗有效量的肽缀合物或其衍生物；和
药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或它们的组合；
其中所述肽缀合物或其衍生物调节选自以下的两种或更多种γc-细胞因子的活性：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21；
其中所述肽缀合物包含氨基酸序列P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述其衍生物包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列共有至少90％同一性的肽序列。
24.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述其衍生物包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列共有至少95％同一性的肽序列。
25.权利要求22-24所述的药物组合物，其用于治疗γc-细胞因子介导的疾病，其中所述γc-细胞因子介导的疾病选自：CD4-白血病、CD8-白血病、LGL-白血病、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、韦格纳肉芽肿病、乳糜泻病、桥本氏甲状腺炎、类风湿性关节炎、糖尿病、银屑病、多发性硬化症、葡萄膜炎、眼部炎症和移植物抗宿主病(GvHD)。
26.权利要求22-24所述的药物组合物，其用于治疗HTLV-1相关的脊髓病(HAM)/热带痉挛性下肢轻瘫(TSP)相关的疾病，其中所述HAM/TSP相关的疾病选自：成人T细胞白血病(ATL)、HTLV相关的脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫(HAM/TSP)和其他与HTLV相关的非肿瘤炎症性疾病诸如葡萄膜炎(HU)、关节病、肺病、皮炎、外分泌病和肌炎。
27.权利要求22-24所述的药物组合物，其用于治疗炎症性呼吸疾病，其中所述炎症性呼吸疾病选自：哮喘、鼻窦炎、枯草热、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、急性和慢性中耳炎以及肺纤维化。
28.权利要求22-24所述的药物组合物，其用于治疗美容病，其中所述美容病选自：痤疮、脱发、晒斑、指甲保养和外表衰老。
29.用于治疗患者中的病况的试剂盒，其中所述病况是γc-细胞因子介导的疾病、HTLV-1相关的脊髓病(HAM)/热带痉挛性下肢轻瘫(TSP)相关的疾病、炎症性呼吸疾病、美容病或它们的组合，所述试剂盒包含权利要求9-15和/或权利要求22-28所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含：
治疗有效量的肽缀合物或其衍生物；和
药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或它们的组合；
其中所述肽缀合物或其衍生物调节选自以下的两种或更多种γc-细胞因子的活性：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21；
其中所述肽缀合物包含氨基酸序列P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(SEQ ID NO:3)。
30.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述其衍生物包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列共有至少90％同一性的肽序列。
31.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述其衍生物包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列共有至少95％同一性的肽序列。
32.如权利要求29-31所述的试剂盒，其中所述病况是以下中的一种或更多种：CD4白血病、CD8白血病、LGL白血病、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、韦格纳肉芽肿病、乳糜泻病、桥本氏甲状腺炎、类风湿性关节炎、糖尿病、银屑病、多发性硬化症、葡萄膜炎、眼部炎症、移植物抗宿主病(GvHD)、成人T细胞白血病(ATL)、HTLV相关的脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫(HAM/TSP)和其他与HTLV相关的非肿瘤炎症性疾病诸如葡萄膜炎(HU)、关节病、肺病、皮炎、外分泌病、肌炎，哮喘、鼻窦炎、枯草热、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、急性和慢性中耳炎以及肺纤维化、痤疮、脱发、晒斑、指甲保养或外表衰老。
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