JP5064212B2 - インターロイキン−1受容体アンタゴニスト、組成物、及び治療方法 - Google Patents
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Description
サイトカインは、生物学的に活性なホルモン様タンパク質(インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、成長因子)を示す総称であり、受容体のスーパーファミリーによってその効果を介在する。サイトカイン及びその受容体は強力な制御ネットワークを構成しており、それによって細胞はシグナルを送り、細胞増殖及び分化、細胞死及び生存を調整する。サイトカインは、具体的に、非常に強力な生物活性を有する低分子量ペプチドであり得る。それらの作用メカニズムは、通常、オートクリン及びパラクリンであり、最終的に遺伝子発現を調節することによって作用する。
本発明は、これらの必要性及び他の必要性を満たすことを求めている。
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したがって、本発明は、非競合的な、効率的且つ選択的細胞外IL−1受容体アンタゴニストに関するものであり、先行技術のIL−1受容体アンタゴニストの1以上の欠点を克服する。
1つの態様では、本発明の化合物は、IL−1Rの生物活性を阻害し、受容体を介したシグナル伝達を妨げることによってサイトカイン活性を阻害するペプチド及びペプチド模倣薬である。したがって、IL−1介在イベントの阻害は、例えば、いくつかある炎症性疾患並びにIL−1機能に関連した疾患及び病態の中で、関節リウマチ及び炎症性大腸炎などのさまざまな慢性及び急性の炎症性疾患の予防又は治療に有益な抗炎症性反応をもたらす。
関連する態様では、本発明のアンタゴニストは有利に簡便に合成される。
(1) 色素上皮由来因子。PEDFは網膜の色素上皮細胞によって合成される、網膜の抗血管新生因子である。また、酸化ストレス及びグルタミン酸の外毒性から神経細胞を保護する。したがって、本発明のアゴニストは、網膜及び腫瘍増殖(例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、及びがん;Barnstableら、2004)における異常な血管新生の症例に治療可能性を有するであろう。
(2) IL−4受容体:IL−4は、単球によるIL−1、IL−6、TNF−αのような炎症性分子の産生、及びT細胞によるTNF−αの産生を炎症部位で阻害できる抗炎症性サイトカインである。IL−4は、結腸癌及び乳癌の増殖も阻害する。関節リウマチでは、軟骨細胞に対する保護作用及び炎症性メディエーターの産生阻害によって、抗炎症性サイトカインとしても作用する(Schuerweghら)。
(3) IL−10サイトカインファミリー:このファミリーは全て炎症部位に対して有益な効果を有し、その抗炎症作用は創傷治癒、炎症性大腸炎、及び乾癬の症例において記載されている。IL−10は、IL−2、TNF−α、及びIFN−γのような炎症性因子の産生をTh1細胞において低下させる。IL−10は、腫瘍部位においてマクロファージの浸潤を阻害することにより腫瘍増殖を低下させる(Liら、2004;Asadullahら、2004)。
X−aa1−aa2−aa3−aa4−aa5 式I
式中、X、aa1、aa2、aa3−aa4、及びaa5は、独立して選択され、
Xは、A1P2R3Y4、A1A2R3Y4、A1P2A3Y4、A1P2R3A4、P2R3Y4、R3Y4、Z3Y4、R3F4、及びY4から選択され、式中、A、P、R、Y、及びFは対応のアミノ酸を表し、数はA1P2R3Y4配列中のアミノ酸の位置を表し、Zはシトルリンである;
A1は、アラニン、ロイシン、バリン、メチオニン、及びφから成る群より選択され、φは、限定されるものではないが、ノルロイシン、イソロイシン、tert−ロイシン、シクロヘキシルアラニン、アリルグリシンなどの疎水性側鎖を有するα−アミノ酸を定義する;
P2は、プロリン、アラニン、アミノイソ酪酸(Aib)、N−メチル−L−アラニン(MeAla)、トランス−4−ヒドロキシプロリン、ジエチルチアゾリジン カルボン酸(Dtc)、及びΩから成る群より選択され、Ωは構造制約を生ずるアミノ酸を定義する(Hanessian,Sら、1997;Halabら、2000;Cluzeau及びLubell、2004;Feng及びLubell、2001);その非限定的な例には、アゼチジン−2−カルボン酸、ピペコリン酸、イソニペコチン酸、4−(アミノメチル)安息香酸、2−アミノ安息香酸、ニペコチン酸が含まれる;
R3は、ヒスチジン、リジン、アラニン、オルニチン、シトルリン、2−ピリジルアラニン、3−ピリジルアラニン、4−ピリジルアラニン、及び限定されるものではないが4−アミジノフェニルアセチル、4−アミジノフェニルプロピオニル、4−アミジノフェニルグリシル、4−アミジノフェニルメチルグリシル、4−グアニジノフェニルアセチル、4−グアニジノフェニルプロピオニル、4−グアニジノフェニルグリシル、4−グアニジノフェニルメチルグリシルなどのアルギニン代用物から成る群より選択される(Masic及びKikelj、2001;Feng及びLubell、2001);
Y4は、残基なし、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、及びΣから成る群より選択され、Σは疎水性側鎖Σ又は芳香族側鎖を有するα−アミノ酸を定義し、例には、限定されるものではないが、ノルロイシン、イソロイシン、tert−ロイシン、シクロヘキシルアラニン、アリルグリシン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、ヒスチジン、チロシンが含まれる;
aa1は、スレオニン、セリン、バリン、及びηから成る群より選択され、ηは中性親水性アミノ酸を定義し、例には、限定されるものではないが、ヒドロキシバリン、Dettwiler及びLubell、2004に記載のようなβ,β−ジアルキルセリン、ホモセリン、アロスレオニン、ヒドロキシプロリンが含まれる;
aa2は、イソロイシン、ロイシン、バリン、プロリン、メチオニン、ピペコリン酸、アゼチジン−2−カルボン酸、ヒドロキシプロリン チアゾリジン−a−カルボン酸、及びφから成る群より選択され、φは疎水性側鎖を有するα−アミノ酸を定義する(上記を参照されたい);
aa3は、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、ヒスチジン、ホモセリン、β−ロイシン、β−フェニルアラニン、α−アミノアジピン酸、及びΨから成る群より選択され、Ψは疎水性側鎖、芳香族アミン、脂肪族アミン、及び1級アリールアルキルアミンを有する3−アミノ−5−フェニルペンタン酸−α−アミノ酸を定義し、例には、限定されるものではないが、ベンジルアミン、フェニルエチルアミン、2,2−ジフェニルエチルアミン、4−フェニル−ベンジルアミンが含まれる;
aa4は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びΛから選択され、Λは中性脂肪族アミノ酸を定義し、例には、限定されるものではないが、ノルロイシン、イソロイシン、tert−ロイシン、シクロヘキシアラニン、アリルグリシン;限定されるものではないがメチルアミン、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、シクロヘキシルアミンなどの炭素数1〜10の脂肪族アミン;限定されるものではないがアニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、及びフェニルエチルアミンなどの芳香族アミン又はアリールアルキルアミンが含まれる。
更に他の特定の態様では、本発明は、以下の一般式のうちの1つによって特徴付けられる配列を含む、IL−1Rの生物活性に拮抗するペプチド又はその誘導体に関する:
G1−X−aa1−aa2−aa3−aa4−aa5− 式II
−X−aa1−aa2−aa3−aa4−aa5−G2 式III
G1−X−aa1−aa2−aa3−aa4−aa5−G2 式IV
式中:
G1はペプチドのアミノ末端に付着し、残基なし、水素、炭素数1〜8の直鎖又は分岐鎖アルキル基、アシル基(RCO)(アセチル、メチル、エチルなど)、プロピアノイル、ブタノイル、イソプロピアノイル、イソブタノイル、又は3級アミン(ジアルキルアミノ基又はモノアルキルアミノ基)から成る群より選択される;
G2はペプチドのカルボキシ末端に付着し、残基なし、水素、NH2、炭素数1〜10の脂肪族アミン(限定されるものではないが、メチルアミンなど)、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、シクロヘキシルアミン、芳香族アミン、又はアリールアルキルアミン(限定されるものではないが、アニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、フェニルエチルアミンなど)、及び/又は3級アミン(ジアルキルアミノ基又はモノアルキルアミノ基)から成る群より選択される。
R1−aa1−aa2−aa3−aa4−aa5−aa6−aa7−R2
式中、R1、aa1、aa2、aa3、aa4、aa5、aa6、aa7、及びR2は独立して選択される。
定義
他に定義されない限り、本明細書において用いた科学用語及び技術用語並びに命名は、本発明が関連する分野において通常の技術を有する者に一般に理解されるのと同一の意味を有する。分子生物用語の一般に理解される定義は、例えば、『微生物学及び分子生物学辞典』、第2版(Singletonら、1994、John Wiley&Sons、ニューヨーク、ニューヨーク州)、『Harper Collinsの生物学事典』(Hale&Marham、1991、Harper Perennial、ニューヨーク、ニューヨーク州)、Riegerら、『遺伝学用語解説:古典と分子』、第5版、Springer−Verlag、ニューヨーク、1991;Albertsら、『細胞の分子生物学』、第4版、Garland science、ニューヨーク、2002;並びにLewin、『遺伝子 VII』、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、2000に見出すことができる。一般に、細胞培養、感染、分子生物法のなどの手順は、当該技術分野において一般に用いられている方法である。そのような標準技術は、例えば、Sambrookら(2000、『分子クローニング−実験室マニュアル』、第3版、コールドスプリングハーバー研究所);及びAusubelら(1994、『分子生物学の最新プロトコール』、John Wiley&Sons、ニューヨーク)などの参考書に見出すことができる。
上記のように、本明細書において、20の天然L−アミノ酸及びそれらの略語は慣例的用法にしたがう。本明細書で用いたポリペプチド表記法では、標準的用法及び慣例にしたがい、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシ末端方向である。本明細書において、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、非常の多数のアミノ酸又はイミノ酸(又はそれらの同等物)をペプチド結合によって含む高分子を表し、ポリペプチドは翻訳後修飾を含んでいても欠失していてもよい。したがって、ペプチドという用語には、改変がIL−1受容体活性の調整能を変化させない限り、IL−1受容体D−アミノ酸アンタゴニストペプチド及びペプチドの他の改変型が含まれる。本発明の全てのアンタゴニストペプチドは、IL−1受容体活性の調整能を共有する。改変の非限定的な例には、N末端アセチル化、グリコシル化、及びビオチン化が含まれる。本発明によるペプチドの具体的な改変型を以下に更に記載する。
本明細書において「被験者」又は「患者」という用語は、治療、観察、又は実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを表す。
本明細書において「治療的に又は医薬的に有効な量」とは、所望の効果を誘導するのに十分な本発明の組成物の量を表す。そのような結果は、疾患の徴候、症状、若しくは原因の緩和又は軽減、あるいは標的生理系の他の所望の変化であり得る。例えば、炎症性疾患の場合(例えば関節炎及び炎症性大腸炎)、典型的な結果は炎症反応及び免疫反応の低下を包含するであろう。
「1つの(a)」という語の使用は、特許請求の範囲及び/又は明細書において「含む(comprising)」という用語とともに用いる場合、「1」を意味することができるが、「1以上」、「少なくとも1つ」、及び「1以上」の意味とも一致する。
特許請求の範囲における「又は」という用語は、本明細書の開示は代替物のみ及び「及び/又は」を表す定義を支持しているが、代替物のみを表すことが明確に示されていないか、又は代替物が互いに排他的でない場合は、「及び/又は」を意味するために用いられる。
本明細書において、「精製された」という用語は、それが元々含有されていた組成物の成分から分離されている化合物を表す。したがって、例えば、「精製されたペプチド」又は「ペプチドの精製された組成物」は、天然に見られないレベルまで精製されている。「実質的に純粋な」粗化合物は、他の成分の大部分を喪失した化合物である(例えば混入物質の30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100%が存在しない)。逆に、「粗製」という用語は、それが存在したオリジナル組成物の成分から分離されていない化合物を意味する。簡潔にするために、単位(例えば66、67...81、82、...91、92%....)を具体的に列挙しないが、それでも本発明の範囲内であるとみなされる。
本明細書において考察される態様は、本発明の方法又は組成物に関して実施でき、逆もまた同様であることが意図される。更に、本発明の組成物及びキットは、本発明の方法を達成するために使用できる。
このように本発明を一般的に記載する上で、具体的態様を説明するためにのみ示す添付の図面を参照する。
本発明の1つの目的は、IL−1受容体アクセサリータンパク質の生体機能を阻害可能なペプチド及びペプチド模倣化合物のファミリーについて記載することである、したがって、非常に多くの病的状態に有用であろう。
I. 本発明のペプチドを同定するためのアッセイ
II. ペプチドの調製
III. ペプチド誘導体とペプチド模倣薬
IV. ペプチド模倣薬を同定するためのアッセイ
V. 医薬組成物。
候補化合物のIL−1受容体活性の阻害能を試験するための方法を本明細書に提示する。本発明はさほど限定されないことが理解されるであろう。実際、本発明の非競合的細胞外アゴニスト又はアンタゴニストを同定するために、当該技術分野に周知の他のアッセイを用いることができる。
in vitroアッセイ
1つの態様では、IL−1受容体の細胞増殖調整能の活性化能又は阻害能に関し、3H−チミジン取り込み法で候補ペプチドを試験する。更に他の態様では、IL−1受容体の細胞増殖調整能の活性化能又は阻害能に関し、例えば(Bakerら、1995;Cheviron、Grillonら、1996);(Elliottら、1999;Huら、1999)に記載のアッセイを用いて候補ペプチドを試験する。
上記アッセイは、更に開発するための有望なリード化合物を検出するための初期又は1次スクリーニングとして用いることができる:リードペプチドは、追加の、異なるスクリーニングで更に評価されるであろう。したがって、本発明は、これらの受容体を発現する哺乳動物細胞株又は他のアッセイを利用したさまざまなアッセイを包含し得る2次IL−1Rスクリーニングも包含する。
本発明のペプチド又はペプチド誘導体は、合成技術(例えば排他的固相合成、部分的固相合成、フラグメント縮合、古典的液相合成)及び組換え技術を含めた、当該技術分野に熟練した者に公知のペプチド合成法によって得られる。例えば、ペプチド又はペプチド誘導体は、手短にはC末端アミノ酸のカルボキシル基を樹脂(例えばベンズヒドリルアミン樹脂、クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂)にカップリングさせ、続いてN−α保護アミノ酸を加えることから成る固相ペプチド合成によって得ることができる。保護基は当該技術分野に公知の如何なる基でもよい。個々の新たなアミノ酸を伸びている鎖に加える前に、鎖に加えた前のアミノ酸の保護基を除去する。そのような固相合成は、例えば、Merrifield、1964、J.Am.Chem.Soc.85:2149;Valeら;1981、Science、213:1394−1397によって、そして米国特許第4,305,872号及び第4,316,891号、Bodonskyら、1966、Chem.Ind.(ロンドン)、38:1597;Pietta及びMarshall、1970、Chem.Comm.650に記載されている。アミノ酸の適切な樹脂へのカップリングも当該技術分野に周知であり、米国特許第4,244,946号に記載されている。(Houver−Weyl、『有機化学法』、Vol.E22a、「ペプチドとペプチド模倣薬の合成」、Murray Goodman、編集長、Thieme、Stuttgart、ニューヨーク、2002に概説されている)。
天然アミノ酸のみから成るペプチドに加えて、ペプチド模倣薬又はペプチドアナログも本発明に包含される。ペプチドアナログは医薬産業において、鋳型ペプチドと類似した特性を有する非ペプチド薬として一般に用いられている。非ペプチド化合物の類型は、「ペプチド模倣体」又はペプチド模倣薬と呼ばれている(Fauchere,J.1986、Adv.Drug Res.15:29;Evansら、1987、J.Med.Chem.30:1229)。治療的に有用なペプチドと構造的に関連したペプチド模倣体は、同等の若しくは増強された治療効果又は予防効果を生ずるために用いることができる。一般に、ペプチド模倣薬は、天然受容体結合ポリペプチドのようなパラダイムポリペプチドと構造的に類似する(即ち、生物活性又は薬理活性を有するポリペプチド)が、当該技術分野に周知の方法で場合により−CH2NH−、−CH2S−、−CH2−CH2−、−CH=CH−(シス及びトランス)、−CH2SO−、−CH(OH)CH2−、−COCH2−などのような結合によって置換された1以上のペプチド結合を有する(Spatola A.F.、ペプチド骨格修飾、Vega Data、March 1983、1(3):267;Spatolaら、Life Sci.、1986、38:1243−1249;Hudson D.ら、Int.J.Pept.Res.1979、14:177−185;Weinstein.B.、1983、『アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の化学と生化学』、Weinstein監修、Marcel Dekker、ニューヨーク)。そのようなペプチド模倣体は、天然ポリペプチドよりも、経済的生産向上、化学的安定性の増加、薬理特性(例えば、半減期、吸収、効能、効率など)の増大、抗原性の減少などを含めた顕著な利点を有するかもしれない。
上記のように、本発明の方法で同定されたペプチドの骨格配置とファーマコフォアの呈示(ペプチド模倣薬)を複製するように作製された非ペプチジル化合物は、代謝安定性が高く、効能が高く、作用期間が長く、そしてバイオアベイラビリティがよいという特質を有することが多い。
本発明は、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬との相互作用を介したIL−1受容体活性の阻害方法に関するものである。動物の数多くの経路及び病態におけるIL−1及び/又はIL−1R/IL1RacP受容体機能の重要性に鑑みると、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬は、IL−1反応(例えばIL−1過剰発現又はIL−1R/IL1−RacPを介した異常なシグナル伝達)に関連した病態又は疾患の治療に有用である。
シリカ フローコンディショナーの例には、コロイド状二酸化ケイ素、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、及びガーゴムが含まれる。他の最も好適なシリカ フローコンディショナーは二酸化ケイ素から成る。
本発明の化合物及び方法の有効性の1例を、同定したペプチドAPI−101(配列番号1:APRYTVELA)を用いて得た結果によって表す。
他の実験では、コブタ軟膜血管で血管運動性試験を行い、IL−1βの血管拡張作用に対するAPI−101(配列番号1)の具体的効果を更に評価した。
要約すれば、これらの結果は、IL−1R/IL−1Racp受容体を標的にすることで、API−101(配列番号1)はIL−1の生体反応の阻害に有効であったことを示している。
API−101(配列番号1)アンタゴニストの顕著な効果を実証するために、API−101と誘導体に関する構造機能関係データを提供するための実験を行い、活性に関して最も重要な領域を同定した。したがって、アラニンスキャン変異をAPI−101(配列番号1)について行った(ペプチド配列に関しては図17を参照されたい)。当然ながら、アラニンの代わりに他のアミノ酸を用いてスキャン実験を行うこともできたであろう。
実施した変異に応じた結果の表の概要を図17に示す。
変異ペプチドの効率及び阻害活性をIL−1誘導性PGE2合成の阻害を測定することによって決定した(上記実施例1の実験プロトコールを参照されたい)。API−101.1(配列番号2)のみが親ペプチドAPI−101(配列番号1)と比較して内皮細胞及び軟骨細胞においてわずかに効率が上昇していた。一方、API−101.5(配列番号6)、−101.6(配列番号7)、及び−101.7(配列番号8)は両細胞種においてほとんど全ての活性を失っていた。このことは、標的としたVELA領域がペプチドの活性に重要であることを示唆している。図5は、このシリーズの最も有効なペプチドについてグラフ表示したものである。全てのペプチドは10-6Mの濃度で試験した。
API−101のアラニンスキャンペプチドについても血管運動性試験を行った(実施例1の実験プロトコールを参照されたい)。図6は、API−101(配列番号1)、−101.1、−101.3、及び−101.6(それぞれ配列番号2、4、及び7)はいずれもIL−1β(75ng/ml)で誘導される血管拡張を逆転させ、そしてAPI−101.1(配列番号2)はAPI−101よりもわずかに阻害活性が上昇し、血管拡張を70%止めたことを示している。
活性を更に改善し、その活性に重要なAPI−101内の領域について得たアラニンスキャンの結論を評価するために、ペプチドのN末端アミノ酸を徐々に切断した。図7は、新たなペプチドの配列、及びAPI−101について採用した最適化の一般的パターンを示す
In vitro特性
IL−1βはヒト線維芽細胞の増殖を誘導する。3H−チミジン取り込みプロトコール(実施例1のプロトコールを参照されたい)を用いて、IL−1β誘導性WI−38(ヒト肺線維芽細胞)増殖に関し短鎖型ペプチドをアッセイした。
API−101の最新誘導体の細胞障害性も2つの細胞種:WI−38及び脳微小血管内皮細胞について測定した。先に記載された通りに細胞生存率をアッセイした(Beauchampら、2001;Braultら、2003)。内皮細胞及び線維芽細胞をさまざまな濃度のペプチドとともに37℃で24時間インキュベーションした。MTT(3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド)のPBS溶液を終濃度50μg/mlで増殖培地に加えた。細胞をMTTとともに37℃で2時間インキュベーションした。次に増殖培地を吸引し、イソプロパノール:1N HCl 24:1の溶液200μlを各ウェルに加えて細胞を溶解させた。生存細胞はMTT産物(ミトコンドリアを介して)をホルマザンと呼ばれる測定可能比色(青色)産物に変換する。ホルマザン産生(及び細胞生存率)を、溶解物100μlの光学密度を600nmで測定することによって決定した。
生体外特性
IL−1誘導性血管拡張に対するAPI−101.10(配列番号10)の効果を評価するため(in vitroで最高活性を示したペプチド)、血管運動性実験も行った(プロトコールについては実施例1を参照されたい)。API−101.10(配列番号10)は10.8nMで最高のIC50を示し、API−101(182nM)よりも100倍強力であった(図18)。ペプチド101.9(配列番号9)、101.11(配列番号11)、及び101.12(配列番号12)は、API−101(配列番号1)よりも良好なIC50を示した(図18及び図10)。図10のペプチドの濃度範囲は10-10M〜10-5Mであった。したがって、生体外実験では、API−101.11(配列番号11)及びAPI−101.12(配列番号12)が親ペプチドと比較して顕著に改善された阻害活性を示した。
IL−1R/IL−1RacPペプチドアンタゴニストの全身作用
誘導体を頚部又は直接胃に注射することによって天然リガンドの生理作用をin vivoで逆転できるかどうか評価するため(消化管を介したペプチドの安定性を証明するため)、API−101誘導体のAPI−101.10(配列番号10)(及びその他)を試験した。スプラーグ・ドーリーラット(300g)をイソフルラン(2.5〜4%)で麻酔した。天然リガンド(IL−1β)又はビヒクル(生理食塩水)を頚静脈から注射した(5μg/kg)。その後のPGE2測定のために、各注射の前及び10分後に頚動脈から採血した。頚静脈又は直接胃にペプチドを投与した(IC50値に基づいた用量、及び細胞外空間と同等な分布量)(静脈内(iv)で用いた5回用量)。動脈圧及び心拍数を持続的にモニターし(Gould)、一方、日常的な解析で体温及び血液ガス(Radiometer)を先に記載された通りに測定した(Liら、1997;Hardyら、1999;Najarianら、2000)。実験は3回繰り返した。
1. API−101.10(配列番号10):IL−1βの注射後(5μg/kg)に頚部注射によって投与した場合、10-8Mの濃度で低血圧を95%防いだ(即ち、IL−1誘導性低血圧を和らげた)。API−101.9(配列番号9)のような他の誘導体も、このIL−1βの生体作用を防いだが、生理食塩水対照(図11A)よりも顕著に良好であったものの、ペプチドAPI−101.10(配列番号10)、101.101(配列番号13)、又はペプチド模倣薬101.109、101.111、及び11.112(図20)よりも効果が小さかった。これは、ペプチドが動物においてIL−1βの効果を逆転させることによってin vivoで血圧上昇効果を有することを明確に立証している。
2. 10-5Mの濃度で胃に直接投与した場合、ペプチドはIL−1βによる低血圧を60%減少させた。この結果は、101.10(配列番号10)ペプチドの腸内投与がIL−1β誘導性低血圧の主要な効果を依然として維持し(図12A)、したがって消化管に沿って効果及び安定性を維持できることを立証した。
本発明のIL−1R受容体アンタゴニストが低血圧をin vivoで防止できる場合、PGE2の合成も予防できるはずである。したがって、上記実験に用いたラット血清のPGE2を測定した(例えば動脈圧変動測定)。短鎖型API−101誘導体ペプチドを用いて得た結果の例を以下に記載する。
最適化の最終ラウンドから、API−101.10(配列番号10)を最高のペプチド誘導体として同定した。したがって、API−101をN端から9〜7アミノ酸切断することにより、in vitro、ex vivo、及びin vivo効果を傷つけることなく、効能を改善させることができるであろう。
IBDはヒト集団において罹患率の高い胃腸管の慢性炎症である。ペプチドAPI−101.10(配列番号10)が、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)で誘発したIBD動物モデルにおいて、更に他の炎症プロセスを防げるかどうかを実証するために本実験を行った。TNBSは、急性腸炎及びクローン病に典型的な好中球及びマクロファージの経壁浸潤、亀裂潰瘍形成、並びに粘膜下線維症を特徴とするIL−12介在TH−1反応を引き起こす(Bouma及びStrober、2003)。
結腸炎症は、雄性スプラーグ・ドーリーラット(175〜200g)にハプテンであるトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を直腸内/結腸投与することによって誘導した(Bouma、Nature Rev、2003;Morris、Gastroenterology、1989)。イソフルランで動物を麻酔し、TNBSを50%エタノール(容量/容量)に溶解した。120mg/ml(TNBS)をポリエチレンチューブ(PE50)を用いて結腸に投与した(ラットあたり合計量0.25ml)。肛門から8cmのところにカニューレを挿入し、溶液の排出を防ぐためにTNBS投与後少なくとも15分間適当な位置に維持した。TNBS投与前2時間に、API−101誘導体API−101.10(配列番号10、1.1mg/kg)又は0.9%生理食塩水を尾静脈から静脈内投与した(合計量0.3ml)。次に、プライム腹腔内alzetポンプを用いてAPI−101.10(2.2mg/kg、さまざまなペプチドのt1/2=2〜3時間に基づいて血圧実験に用いた6回用量)又は0.9%生理食塩水を持続注入した。第3群(対照)にはTNBSを注射しなかった。TNBS投与後6日目に、CO2吸入によってラットを屠殺した。第7日目までに自然な組織再生が始まり、これは試験ペプチド又はペプチド誘導体の治療効果を覆い隠すことができるため、第6日目を終点として選択した。結腸を取り出し、巨視的に(癒着、潰瘍形成、変色、及び出血)及び組織学的に(好中球浸潤、上皮傷害、陰窩変形、及び潰瘍形成)調べた(Anthonyら、1995;Padolら、2000;Dieleman,LAら、1997;Torres MIら、1999)。1群あたり2匹の動物を試験した。
炎症性大腸炎のTNBSモデルは、(例えばヒトにおける)クローン病の炎症特性及び組織傷害を再現する。図14A及び図14Bに示すように、TNBSを注射した動物の結腸は、形態的に腸壁の肥厚、浮腫、及び変色を呈示し、顕著な炎症を示した。API−101.10(配列番号10)で前処理した動物の結腸の巨視的特徴は対照動物のものと(図14C)似ていた。組織学的特徴は、上皮層及び陰窩への好中球浸潤(図16Bを参照されたい)、上皮層傷害、並びに陰窩の喪失(図16B)から成っていた。動物をAPI−101.10(配列番号10)で前処理することにより、TNBSで誘発された結腸損傷が妨げられた。図16では、API−101.10(配列番号10)で処理した結腸における陰窩の組織化と完全性は、たとえ依然として炎症が存在しても保存されることが理解できるであろう(巨視的解析実験と比較して、API−101.10の用量の半分を用いた)。図16Bに示す上皮層の傷は、API−101.10(配列番号10)処理動物において完全に妨げられる(図16C)。したがって、本発明のIL−1Rアンタゴニストは炎症性大腸炎動物モデルにおいても非常に有効である。
本発明のアンタゴニストの効果及び効能を更に改善するために、ペプチド模倣薬をin vitroで合成し、スクリーニングした。1つの態様では、ペプチド模倣薬はAPI−101.10(配列番号10)又はAPI−101.107(配列番号19)に由来し、1次構造は:API−101.109はRY(HyVal)PELAであり(図20)、API−101.110はRY(I2aa)ELAである(図21)。ここで、HyValはβ−ヒドロキシバリンであり、I2aaはインドリジジン−2−オン アミノ酸(2−オキソ−3−アミノ−アザビシクロ[4.3.0]ノナン−9−カルボン酸である。これらのペプチド模倣薬もD−ペプチドである。
固体支持体の調製
ベンズヒドリルアミン樹脂塩酸塩(2g、Advanced Chemtech、ロット番号11988、100〜200メッシュ、添加1.2ミリモル/g)を、10ml/gの以下のそれぞれの試薬:5%DIEA/CH2Cl2;CH2Cl2;DMFで1分間×3回洗浄した。樹脂を、N−(Fmoc)アミノカプロン酸(1.27g、3.6ミリモル、150モル%)、TBTU(1.27g、3.96ミリモル、165モル%)、DIEA(690μL、3.96ミリモル、165モル%)、及びHOBt(535mg、3.96ミリモル、165モル%)のDMF(20ml、10ml/gの樹脂)溶液で処理し、カイザー試験が陰性になるまで1時間撹拌した。樹脂を10ml/gの以下の溶液で交互に洗浄した:DMF(3×1分)及びイソプロピルアルコール(3×1分)。次に樹脂をピペリジンのDMF液で処理し(20%v/v、20ml、1×2分、1×3分、1×10分)、続いて10ml/gのDMF(3×1分)とイソプロピルアルコール(3×1分)で交互に処理した。樹脂を、4−[(R,S)−α−1(9H−フルオレン−9−イル)−メトキシ−ホルムアミド]−2,4−ジメトキシベンジル]−フェノキシ酢酸(Knorrリンカー、1.94g、3.6ミリモル、150モル%)、TBTU(1.27g、3.96ミリモル、165モル%)、及びDIEA(690μL、3.96ミリモル、165モル%)のDMF(20ml)溶液で1時間撹拌した。樹脂を10ml/gの以下の溶液で連続的に洗浄した:DMF(3×2分)、イソプロピルアルコール(3×2分)、及びCH2Cl2(3×2分)。高真空下で樹脂を一晩乾燥させて3.66gの樹脂を得た。
ピペリジン(20g)とDMF(20g)を混合した。サンプルバイアル中の一定量のこの溶液に(20ml、18.08g)乾燥樹脂(20mg)を加え、アルゴン気流の通過によって懸濁液を穏やかに撹拌した。50分後、樹脂を安定させた。溶液のアリコート(1ml)をエタノールで50倍希釈し、吸光度を301nMにて測定した(N−(9−フルオレニル−メチル)ピペリジン UV λmax 267nM(ε17500)、290(5800)、及び301(7800)。2回の個別の測定(平均化)はA301=0.0785であった。下式:[c(ミリモル/g)=(OD×50×102)/7800]より、c=0.50ミリモル/gであった(Meienhoferら、1979)。
アミノ酸はAdvanced Chemtech(ルイビル、ケンタッキー州)から購入し、以下の誘導体として用いた:N−Fmoc−D−Ala−OH・H2O、N−Fmoc−D−Leu−OH、N−Fmoc−D−Glu(O−t−Bu)−OH、N−Fmoc−D−Pro−OH、N−Fmoc−D−Tyr(O−t−Bu)、N−Fmoc−D−Arg(Pmc)−OH。(R)−β−ヒドロキシ−N−(Fmoc)バリンを、(R)−β−ヒドロキシ−N−(Boc)バリンから(Dettwilerら、2003)、Boc基を除去し(1:1 TFA(トリフルオロ酢酸)/CH2Cl2)、含水アセトン中のFmoc−OSu及びNaHCO3で保護し(Capatsanisら、1983)、続いてクロマトグラフィによりシリカゲルに対して精製し(1:1:98 MeOH/HOAc/CHCl3)、含水アセトニトリルから凍結乾燥することによって調製した(収率78%)。(3R,6R,9R)−2−オキソ−3−[N−(Fmoc)アミノ]−1−アザビシクロ[4.3.0]−ノナン−9−カルボン酸を、(3R,6R,9R)−2−オキソ−3−アミノ−1−アザビシクロ[4.3.0]−ノナン−9−カルボン酸メチルから、含水アセトン中のFmoc−OSu及びNaHCO3でFmoc−保護し(Capatsanisら、1983)、続いてメチルエステルを選択的加水分解することによって(Pascalら、1998)調製した(D−グルタミン酸から順に調製(Lombartら、1996))。ペプチド合成を0.1ミリモルスケールで行い(200mg樹脂)、DMF中のピペリジンで脱保護し(10ml/g樹脂、20%v/v、1×2分、1×3分、1×10分)、続いてDMFで洗浄(10ml/g樹脂、5×1分)することによって実施した。TBTUのDMF(0.25M、2ml)溶液に溶解したFmoc保護アミノ酸(0.5ミリモル、500モル%)を樹脂に加えた。樹脂を撹拌後(5分)、DIEA(0.6ミリモル、600モル%)を加え、撹拌を1時間継続した。樹脂をDMFで洗浄し(10ml/g樹脂、5×1分)、カイザー試験でカップリング効率を測定した。カップリングのあいだ、樹脂を機械的なボルテックス装置で撹拌し、リンスし、配列を脱保護した。Alltech C18カラム(寸法250mm×4.6mm)で、アセトニトリル/水/TFA混合物を用いてRp−HPLC解析を行った。ここで、溶媒A=水/0.1%TFA、溶媒B=MeCN/0.1%TFAである(以下を参照されたい)。流速は0.5ml/分であり214nMで検出した。
樹脂を、TFA(82.5%)、チオアニソール(5%)、水(5%)、フェノール(5%)、及びトリエチルシラン(2.5%)を含有する20ml/gのカクテルで処理し、機械的なボルテックス装置で1時間室温にて撹拌することによって、樹脂(180mg)からの切断を、同時に起こる側鎖の脱保護とともに行った。その後、ろ過し、TFAでリンスし(2×1ml)、0℃でEt2O中に沈殿させてペプチドを得た。HCl溶液(1M)からの凍結乾燥によって粗製ペプチドを2塩酸塩として単離し、白色粉末(18mg)を得た。これは、A中5〜40%Bの溶離液を用いた20分にわたるrp−HPLC(RT=14.6分)により純度90%以上を示した。C39H64N11O11(MH+)に対するLRMSの計算値は862、実測値862であった。
樹脂を、TFA(82.5%)、チオアニソール(5%)、水(5%)、フェノール(5%)、及びトリエチルシラン(2.5%)を含有する20ml/gのカクテルで処理し、機械的なボルテックス装置で1時間室温にて撹拌することによって、樹脂(22mg)からの切断を、同時に起こる側鎖の脱保護とともに行った。その後、ろ過し、TFAでリンスし(2×1ml)、0℃でEt2O中に沈殿させてペプチドを得た。HCl溶液(1M)からの凍結乾燥によって粗製ペプチドを2塩酸塩として単離し、白色粉末(5.7mg)を得た。これは、A中5〜40%Bの溶離液を用いた20分にわたるrp−HPLC(RT=19.8分)により純度85%以上を示した。C38H60N11O10(MH+)に対するLRMSの計算値は830、実測値830であった。
ペプチド模倣薬のスクリーニングアッセイとして、内皮細胞におけるIL−1誘導性PGE2合成アッセイを用いた。ペプチド模倣化合物API−101.110(図21)の効能はIC50 0.2pMであり、これは、API−101.107(配列番号19)よりも10倍高く、後者の効果の2倍である。化合物API−101.109(図20)もPGE2の阻害(IC50)において効能が向上していた(図19)が、そのKDは有効な薬物であるには高すぎる。
これまではAPI−101.10(配列番号10)と呼んでいたリードペプチドTTI−101.10、TTI−101.107及びTTI−101.113(それぞれ101.107及び101.113;又はそれぞれAPI−101.107及びAPI−101.113ともいう)が実施例4に記載の動物IBDモデルの炎症特徴を防ぐことができるかどうかを検証するために更なる実験を行った。結腸炎症は、実施例4に記載のように、ハプテンであるトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)の直腸内/結腸投与によって誘発した。TNBS投与前2時間に、ペプチド、ペプチド模倣薬、又は0.9%生理食塩水を尾静脈から静脈内投与した(iv)(各種濃度、mg/kg/日)(合計量0.3ml)。持続注入の場合、API−101.10(又は他のペプチド若しくはペプチド模倣薬)(2.2mg/kg、さまざまなペプチドのt1/2=2〜3時間に基づいて血圧実験に用いた4回用量)又は0.9%生理食塩水をプライム腹腔内alzetポンプを用いて持続注入した。第3群(対照)にはTNBSを注射しなかった。間欠投与の場合、TNBS投与後15分に101.10(0.25〜1mg/kg)、101.107(0.2mg/kg)、101.113(0.05〜1mg/kg)を間欠腹腔内注射(ip)によって投与した。また、これらのIL−1Rアンタゴニストは1日2回(BID)投与した;レミケード(登録商標)(抗TNFα)(10mg/kg)及びデキサメサゾン(0.75mg/kg)を腹腔内投与したが、これらは1日1回(qd)のみである。101.10、101.113(1及び2.5mg/kg)、及び5−ASA(50mg/kg)をTNBS投与後1時間に直腸内投与(ir)した。5−ASAは1日1回で、他は1日2回である。最後に、101.10(1〜5mg/kg)も1日2回、強制経口投与した(po)。TNBS投与後48時間にCO2吸入によってラットを屠殺した。結腸を取り出し、巨視的に(癒着、潰瘍形成、変色、及び出血)及び組織学的に(好中球浸潤、上皮傷害、陰窩変形、及び潰瘍形成)評価した。処理により、1群あたり1〜7匹の動物を試験した。組織溶解物についてミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性を測定した。
前述のように、TNBS動物モデルは、クローン病の炎症特徴及び組織傷害を再現するため、ヒトの炎症性疾患の、より詳細には炎症性大腸炎(IBD)の有効なin vivoモデルである。表2に示すように、さまざまな用量で本発明のアンタゴニスト(例えばペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬)を腹腔内持続注射及び間欠注射することにより、潰瘍の形成、陰窩の喪失、及び上皮層傷害などの炎症による組織損傷を妨げた。
TTI−101.107(配列番号19及び図15;IC50 1.2pM)をリードペプチドとして用い、いくつかのアナログシリーズをデザインし、合成し、試験して、各残基の重要性を証明した。
表4からわかるように、末端D−アルギニンをアセチル化して化合物TTI−101.121(配列番号29)を生じた場合、ペプチドの活性は完全に消失した。一方、アルギニン残基をオルニチン又はリジンで置換することもでき、得られたペプチドはその活性を維持する(TTI−101.114、配列番号22;及びTTI−101.115、配列番号23)。したがって、アルギニンのグアニジン基は(オルニチンが有するように)、ペプチド活性に重要であると思われる。
リードペプチド(101.107 rytpela(配列番号19)、101.10 rytvela(配列番号10)、及び101.113 rytpel(配列番号21))に基づいて、他のアナログシリーズを作製し、ペプチドと誘導体の構造−活性関係(構造−機能関係)を更に試験した。
チロシンをロイシン及びアラニン残基にそれぞれ置換するためにアザ−アミノ酸残基を用いて、101.136〜101.140と101.141〜101.144のシリーズを調製した(図27及び28)。アザ−アミノ酸は酵素分解に対するペプチドの耐性を改善することができるため、特定のアナログにおける活性の維持はそのin vivo作用期間を延長させるための1つの手段を例示する。こうした最後の修飾により、化合物TTI−101.140の開発をもたらした。図29及び図30は、ペプチド模倣薬101.125、101.136〜101.144の構造と活性、特に活性が増加した模倣薬101−140の効能と効果を示す。
要約すると、本発明は、インターロイキン1のin vitro、ex vivo、及びin vivoの効果を無効にできる、IL−1R/IL−1RacP受容体の効率的且つ強力なアンタゴニストについて記載する。これらのペプチドは、さまざまな細胞種及びさまざまな生体効果(増殖及びPGE2合成)に対し、in vitroで有効であり、IL−1の軟膜血管に対する血管運動作用及び新鮮なサンプル組織のPGE2合成を無効にすることによってex vivoで有効であった。更に、これらのAPI−101誘導体は、全身投与及び胃に直接投与したときin vivoでも非常に有効であった。胃への送達によって得た最後の結果は、本発明のペプチドは経口投与したとき活性である可能性があることを示している。これは、強制経口投与したときに実際に証明された。より重要なのは、確立されたラット炎症性大腸炎(IBD)モデルにおいて、API−101.10が、ラットにTNBSを注射して誘発した結腸損傷を防ぐことができたことである。他の誘導体(101.100シリーズ)による結果に基づいて、これらのペプチド誘導体及びそのペプチド模倣薬は、ラットにTNBSを注射して誘発した結腸損傷を防ぐ役割によって証明されたように、強力な抗炎症剤であることが証明されている。
Claims (23)
- 長さ5〜25アミノ酸のペプチドであり、IL−1Rの生物活性を非競合的に拮抗するペプチドであって:
APRYTVELA(配列番号1)、AARYTVELA(配列番号2)、APAYTVELA(配列番号3)、APRATVELA(配列番号4)、APRYAVELA(配列番号5)、PRYTVELA(配列番号9)、RYTVELA(配列番号10)、YTVELA(配列番号11)、TVELA(配列番号12)、XYTVELA(X=シトルリン、配列番号13)、XYTVOLA(X=シトルリン、配列番号14)、RYTVOLA(配列番号15)、RFTVELA(配列番号16)、RYSVELA(配列番号17)、RYWELA(配列番号18)、RYTPELA(配列番号19)、RYTVEL(配列番号20)、RYTPEL(配列番号21)、KYTPELA(配列番号22)、XYTPELA(X=オルニチン、配列番号23)、RWTPELA(配列番号24)、RYTPDLA(配列番号25)、RYTPOLA(配列番号26)、RYTPEFA(配列番号27)、RYTPEMA(配列番号28)、RYTPEPA(配列番号30)、RYTPALA(配列番号31)、RFVPELA(配列番号33)、RWTPEL(配列番号34)、RYTPEV(配列番号35)、RFTPEL(配列番号36)(配列番号1〜5、9〜28、30、31、及び33〜36の配列はD−アミノ酸から成る);
RYTPELA又はRYTPEL(L−アミノ酸又はD−アミノ酸とL−アミノ酸との混合物から成る);及び
RYTPEL(配列番号39)(RはL−アミノ酸であり、YTPELはD−アミノ酸である)から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記ペプチド。 - アミノ酸配列が、RYTPEL(配列番号21)、RYTVOLA(配列番号15)、KYTPELA(配列番号22)、RYTPDLA(配列番号25)、及びRYTVELA(配列番号10)から成る群より選択される、請求項1に記載のペプチド。
- アミノ酸配列がRYTVELA(配列番号10)の配列である、請求項2に記載のペプチド。
- IL−1誘導性PGE2産生を阻害する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド。
- 長さ5〜16アミノ酸である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチド。
- 長さ5〜10アミノ酸である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチド。
- 長さ5〜9アミノ酸である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチド。
- プロテアーゼ及び/又はエクソペプチダーゼによる切断を容易に受けない、請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド。
- 血清安定性を高めるために化学的に修飾されており、当該修飾は(i)一端又は両端のペプチドのグリコシル化、(ii)N−末端アルキル基の付加、及び/又は(iii)C−末端アミド基若しくは置換アミド基の付加である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のペプチド。
- N−末端アセチル化、グリコシル化、又はビオチン化により化学的に修飾されている、請求項1〜8のいずれか1項に記載のペプチド。
- IL−1R/IL−1RacP活性に関与するシグナル伝達経路の異常に関連する動物の疾患又は病態の治療又は予防に使用される、請求項1〜10のいずれか1項に記載のペプチド。
- 疾患又は病態がIL−1関連疾患又は病態である、請求項11に記載のペプチド。
- 疾患又は病態が炎症性疾患又は病態である、請求項11又は12に記載のペプチド。
- 疾患が、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、変形性関節症、乾癬、及び敗血症から成る群より選択される、請求項13に記載のペプチド。
- 疾患が、アルツハイマー病、脳室周囲白質軟化症、髄膜炎、卒中、多発性硬化症、脳炎、及び自己免疫疾患から成る群より選択される、請求項11に記載のペプチド。
- 動物がヒトである、請求項11〜15のいずれか1項に記載のペプチド。
- 治療的に有効量の請求項1〜10のいずれか1項に記載のペプチドを、医薬的に許容可能な賦形剤とともに含む、医薬組成物。
- IL−1R/IL−1RacP活性に関与するシグナル伝達経路の異常に関連する動物の疾患又は病態を治療又は予防するための医薬を製造するための、請求項1〜10のいずれか1項に記載のペプチドの使用。
- 疾患又は病態がIL−1関連疾患又は病態である、請求項18に記載の使用。
- 疾患又は病態が炎症性疾患又は病態である、請求項18又は19に記載の使用。
- 疾患が、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、変形性関節症、乾癬、及び敗血症から成る群より選択される、請求項20に記載の使用。
- 疾患が、アルツハイマー病、脳室周囲白質軟化症、髄膜炎、卒中、多発性硬化症、脳炎、及び自己免疫疾患から成る群より選択される、請求項18に記載の使用。
- 動物がヒトである、請求項18〜22のいずれか1項に記載の使用。
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