JP2003500453A - 立体配座的に拘束された主鎖の環化インターロイキン−６アンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＩＬ−６の立体配座的に拘束された主鎖の環化アンタゴニストである新規なペプチドが開示される。ＩＬ−６アンタゴニストを合成する方法もまた開示される。さらに、ＩＬ−６アンタゴニストを含んでなる製薬学的組成物及びそのような組成物を使用する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、立体配座的に拘束された主鎖の環化ＩＬ−６アンタゴニスト及びそ
れらを含有する製薬学的組成物に関する。

【０００２】 発明の背景 インターロイキン−６（ＩＬ−６）はヘリックスサイトカインファミリーのメ
ンバーである。ＩＬ−６は、細菌（ＬＰＳ）及びウイルス感染、癌、並びに他の
サイトカイン（例えばＩＬ−１）を包含する様々な異なる刺激に応答してほとん
ど全ての細胞タイプにより生産される。ＩＬ−６は多面的因子であり、多数のプ
ロセスに関与し、従って多数の疾患と関連する（総説にはHirano T., Intern.
Ｒev. Immunol. 16:249, 1998を参照）。

【０００３】 ＩＬ−６の生物活性は、サイトカイン、ＩＬ−６、その受容体（ＩＬ−６Ｒ）
及び糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）として知られている膜貫通シグナルトラ
ンスデューサーの相互作用、並びに各タンパク質の２単位を含有する六量体複合
体の形成を必要とする。複合体形成の結果はｇｐ１３０の二量化であり、これは
単独でＩＬ−６様生物活性を得るために十分である（Fourcin, et al., J. Biol . Chem . 271:11756, 1996）。いくつかの他のサイトカインもまたシグナル伝達
のためにｇｐ１３０を用いる。これらには：インターロイキン−１１（ＩＬ−１
１）、毛様体神経栄養因子（ＣＴＮＦ）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、オンコス
タチンＭ（ＯＳＭ）が包含される。ＩＬ−６及び宿主防御 ＩＬ−６レベルは、細菌及びウイルス感染の間の初期に増える。ＩＬ−６は、
組織損傷及び感染に対する宿主生物体の防御に関与すると考えられる急性期タン
パク質の生産を誘導する。急性期反応は、感染及び損傷に対する全身性炎症反応
であると考えられる。

【０００４】 ＩＬ−６はまた、Ｂ細胞分化の誘導、骨髄前駆細胞の複製、及び細胞傷害性Ｔ
リンパ球の増大を包含するＴリンパ球の増大のようなその複数の増殖及び分化活
性により免疫系を増強する。ホメオスタシス、損傷及び移植におけるＩＬ−６： ＩＬ−６レベルはストレスの間に増加される。ウサギにおけるＩＬ−６は、体
温上昇の直接原因である。熱傷患者における高いＩＬ−６レベルは死亡率と相関
関係にある。高いＩＬ−６レベルは、外傷性事象及び同種移植片拒絶と関係があ
る。骨粗鬆症におけるＩＬ−６ エストロゲンは骨質量を保つことにおいて重要な役割を果たす。月経閉止後の
時期の女性において骨質量の大幅な低下が報告されている。閉経後骨粗鬆症にお
ける増加した骨吸収及び増加した破骨細胞活性はＩＬ−６と関連している。ＩＬ
−６の生産はこの時期に骨髄細胞において高められ、エストロゲンがＩＬ−６遺
伝子発現をダウンレギュレーションすることと相関関係にある。マウスにおいて
卵巣摘出により誘導されるエストロゲンの低下は破骨細胞発生を高め、そしてこ
の変化はＩＬ−６に対する抗体により防ぐことができる。ＩＬ−６ノックアウト
マウスモデル、抗ＩＬ−６抗体またはＩＬ−６アンチセンスでの処置を包含する
いくつかの実験は、高いレベルのＩＬ−６が破骨細胞の形成において重要な役割
を果たすことを示す。そのようなものとして、骨細胞におけるＩＬ−６活性の調
節異常は、病理学的疾患の発症を引き起こす。免疫疾患におけるＩＬ−６ 心臓粘液腫及び子宮頸癌における高いレベルのＩＬ−６は：抗−核因子、リウ
マチ因子、高められた免疫複合体、関節炎及び腎炎のような自己免疫適応症と関
係がある。

【０００５】 キャッスルマン病患者は熱、貧血症、高−γ−グロブリン血症及び急性期タン
パク質の増加を患う。リンパ節は多量のＩＬ−６を構成的に生産し、そして関与
するリンパ節の外科的除去の結果として血清ＩＬ−６レベルの減少及び劇的な臨
床改善が起こる。キャッスルマン病の全身症状発現は、抗−ＩＬ−６抗体での処
置により軽減できることが示されている。

【０００６】 滑膜組織への形質細胞浸潤、自己抗体生産及びポリクローナル高−γ−グロブ
リン血症のような、慢性関節リウマチの局所及び全身症状は、滑膜組織において
認められる増加したＩＬ−６生産により説明することができる。ＲＡ患者におい
て高められる少なくとも２つのメディエーター、ＰＧＥ２及びＩＬ−１は、ＩＬ
−６の合成を誘導することが既知である。正常より高いレベルのＩＬ−６が活性
ＳＬＥにかかっている患者の血清において検出されている。ＩＬ−６の増加した
血漿レベルが乾癬患者において認められた。エイズ： 高レベルのＩＬ−６はＨＩＶ感染と関係がある。ＨＩＶエンベロープ糖タンパ
ク質ｇｐ１２０及びｇｐ１６０は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＩＬ−６生産を誘導
する。ＩＬ−６はエイズ関連カポジ肉腫の増殖因子であることが示されている（
Murakamin-Mori, et al. Int. Immunol. 8:595, 1996）。ＩＬ−６受容体の可溶
性形態（ｓＩＬ−６Ｒａ）はエイズ関連カポジ肉腫（ＫＳ）細胞の強力な増殖因
子である。ｇｐ１３０の可溶性形態は、ｓＩＬ−６Ｒａにより誘導されるエイズ
−ＫＳ細胞増殖に拮抗する。さらに、高いＩＬ−６レベルはエイズにおける体重
低下と関係がある。増殖性疾患及び悪性疾患 ＩＬ−６の自己分泌役割がいくつかのタイプの癌において報告されており、こ
れらの中には腎細胞癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病
及び急性骨髄芽球性白血病がある。形質細胞腫及び骨髄腫細胞は増殖のためにＩ
Ｌ−６を必要とする。抗−ＩＬ−６抗体での原発性形質細胞白血病の処置は、処
置の間中患者の臨床状態を改善する。同様に、ＩＬ−６欠損マウスは形質細胞腫
誘導に完全に抵抗性である。

【０００７】 多発性骨髄腫は単一クローンに由来する形質細胞の悪性増殖である。これは多
数の臓器機能不全及び骨痛または骨折の症状、高カルシウム血症、腎機能不全、
感染に対する感受性、貧血症及び出血において現われる。この疾患は、典型的に
は、急性末期に進行する前に２〜５年にわたって慢性経過をたどる。

【０００８】 最近、多発性骨髄腫の抑制のための異なる治療方法が概説されている（Ogata
A., Leuk. Ｒes. 20:303, 1996）。多発性骨髄腫患者の大多数は、悪性疾患を制
御するために全身化学療法を、そして死亡率を最小限度に抑えるために対症支持
医療を必要とする。多発性骨髄腫にかかっている患者の結果は２〜３年の半数生
存期間で、依然として不十分である。明らかに、寛解の可能性を高めることがで
きるだけでなく、応答の期間を増して生存も高める作用因子の必要性がある。

【０００９】 最近、抗−ＩＬ−６抗体の注入が若い集団において試験され、骨髄腫細胞増殖
の完全な阻止及び血清ＩＬ−６生物活性の阻害をもたらした。しかしながら、単
一の抗−ＩＬ−６ ｍＡｂの投与は不十分であるようであった（Klein, et al., Blood 85:863, 1995）。

【００１０】 ＩＬ−６はまた、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の活性化にお
ける調節役割も有する。ＭＭＰは、基底膜成分を分解することができる酵素であ
る。そのようなものとしてＭＭＰは細胞外マトリックスリモデリング、腫瘍浸潤
及び転移における重要な酵素と呼ばれる。ＩＬ−６活性のインヒビター ＩＬ−６インヒビターは臨床価値を有することが一般に認められている。上記
のように、ＩＬ−６インヒビターが治療的に有用であり得る多数の臨床状況があ
る。これまでの参考文献において報告されたＩＬ−６に対するインヒビターを製
造する試みの大部分はタンパク質を使用した。一般に、タンパク質はそれらの免
疫原性の可能性、高コスト及び非経口投与の必要性のために、薬剤としてあまり
適当はではない。ＩＬ−６を阻害するためにタンパク質を使用する様々な試みを
以下に記述する。 モノクローナル抗体及び抗体フラグメント： 大部分の一般的な方法は、モノクロ−ナル抗体（ｍＡｂ）を用いることである
。ＩＬ−６の生物活性を阻害することができるいくつかのマウスｍＡｂが記述さ
れている。ＩＬ−６に対する抗体の使用の欠点は、ｍＡｂが循環中の免疫複合体
にＩＬ−６を閉じ込め（May et al., J. Immunol. 151, 3225, 1993）、それに
よりその半減期を２００倍増すことである（Lu et al., Blood 86, 3123, 1995
）。従って、免疫複合体はＩＬ−６の長期の持続性沈積物として働く。高レベル
の循環する免疫複合体の存在は、腎臓または関節の基底板におけるそれらの沈降
をもたらす可能性があり、これは腎不全または関節炎を引き起こす可能性がある
。

【００１１】 モノクローナル抗体でＩＬ−６を阻止する試みは、以下の疾患：エイズ関連症
候群及びリンパ腫（Emilie, et al., Blood 84:2472, 1994）、キャッスルマン
病、慢性関節リウマチ（Wijdenes et al., J. Interferon Ｒes. 14:297, 1994,
Yoshizaki et al. Springer Semin. Immunopathol., 20:247, 1998）、多発性
骨髄腫、形質細胞白血病（Klein et al., Blood 78:1198, 1991）及び内毒素毒
性に関して報告されている。大部分の場合において部分応答が認められたが、Ｉ
Ｌ−６の阻害のためのモノクローナル抗体の使用と関連する問題が、これまでそ
れらの日常的な臨床応用を妨げている。

【００１２】 モノクローナル抗体の臨床使用と関連する問題のいくつかは、抗体分子の大き
なサイズの結果である。ＩＬ−６生物活性を阻害することができる、抗体の超可
変ループ構造を利用するミニボディ（minibodies）が最近報告された（Martin e
t al., The EMBO J. 13, 5303, 1994）。ミニボディ分子へのＩＬ−６の結合は
、腎臓から分泌するために十分に小さい複合体を生じるはずであり、それにより
持続性ＩＬ−６沈積物を生じる危険を減らす。ミニボディ−ＩＬ−６−複合体は
免疫複合体として認識することができず、それにより腎臓及び関節炎の問題の可
能性を下げる。ミニボディはそれでもなお免疫原性である可能性があり、そして
それらを経口的に利用できると考えられない。これまで、ＩＬ−６に対する十分
に高い親和性を有するミニボディは得られていない。突然変異タンパク質： いくつかのＩＬ−６突然変異体が、ファージ展示系を用いて所望の活性に関し
て選択された。超活性突然変異体（Toniatti, et al., The EMBO J. 15:2726, 1
996）、並びにＩＬ−６Ｒの結合の能力を保持するがｇｐ１３０との相互作用の
能力を失い、従ってＩＬ−６生物活性の機能性アンタゴニストとして働く可能性
がある突然変異体（Savino et al., The EMBO J. 13, 5863, 1994; Sporeno, et
al., Blood 87:4510, 1996）が報告された。そのような突然変異体の臨床使用
における危険は、突然変異分子及び天然の分子の両方を認識するであろう抗体の
形成である。そのような抗体は、処置を止めたずっと後にＩＬ−６の生物活性を
妨げる可能性があり、それによりＩＬ−６の欠如と関連する危険に患者をさらす
。

【００１３】 米国特許第5,470,952号は、可溶性α特異性決定サイトカイン受容体成分及び
β受容体成分の細胞外ドメインを含んでなるヘテロ二量体タンパク質であるＣＴ
ＮＦ及びＩＬ−６アンタゴニストを開示している。詳細には、発明者等は、可溶
性ＩＬ−６Ｒα及びｇｐ１３０の細胞外ドメインを含んでなる、非機能性複合体
を形成するようにＩＬ−６に結合することができるＩＬ−６アンタゴニストを請
求している。サイトカイン−毒素コンジュゲート ＩＬ−６インヒビターのいくつかの用途には、多発性骨髄腫のようなＩＬ−６
依存性腫瘍の除去が含まれる。この目標は、ＩＬ−６−毒素コンジュゲートの使
用により達成することができる（Jean and Murphy, Prot. Eng. 4, 989, 1991）
。ＩＬ−６の受容体を有する悪性細胞は、コンジュゲートのＩＬ−６部分を介し
て毒素に結合し、そして毒素活性により除去される。ＩＬ−６受容体を同様に発
現する全ての非悪性細胞に対する毒性は、危険を伴う可能性がある。ＩＬ−６は
正常な体液性及び細胞性免疫応答の発生に必要とされるので、処置した患者が免
疫無防備状態であると予測することは可能である。 ＩＬ−６のペプチドアンタゴニスト Grube及びCochranはＩＬ−６受容体の調節ドメインを同定した（J. Biol. Che m. 269:20791, 1994）。この領域はＩＬ−６Ｒの膜外ドメインからであり、そし
てそれはＩＬ−６シグナル伝達の調節に関与している。ＩＬ−６Ｒの残基２４９
−２６４に対応する合成ペプチドは、リガンド結合に影響を与えずにＩＬ−６依
存性細胞有糸分裂誘発及びＩＬ−６により刺激される急性期反応を阻害する。

【００１４】 可能性があるリード化合物の探索において、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害す
るＩＬ−６Ｒに対するｍＡｂｓ（Novick, et al., Hybridoma 10, 137, 1991）
でヒトＩＬ−６Ｒのエピトープマッピングが実施された（Halimi et al., Eur. Cytokin, Netw . 6:135, 1995）。２個の抗体により認識された１０ｍｅｒの線状
ペプチドは、Grube及びCochran（同書中）により同定された同じ領域からである
。これら２つのグループにより同定されたペプチドを図１においてＩＬ−６Ｒ配
列の縁に示す（＊ Grube及びCochran、＊＊ Halimi et al.）。

【００１５】 国際ＰＣＴ出願WO 97/13781は、ＩＬ−６活性を阻害するＩＬ−６に由来する
これらの合成ペプチド及び類似体を開示している。請求されるペプチドはまた、
ＩＬ−６Ｒに特異的な１またはそれ以上のＭａｂにより認識される線状エピトー
プであることも特徴とする。ペプチド１１２２及び１１２３（（Halimi et al.
同書中）が合成され、そして約１００μＭのＩＤ₅₀でインビトロでＩＬ−６生物
活性を阻害することが認められた。

【００１６】 国際ＰＣＴ出願WO 95/13086及び米国特許5,420,109は、一般式：Ｘ１−Ｘ２−
Ｈｉｓ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−ＤＴｒｐ−Ｘ３を有するサイトカイン抑制因子であ
るペプチドを開示している。これらのペプチドは、様々なサイトカイン（ＴＮＦ
、ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８）の活性を同時に調節する非特異的因子であ
り、従って、特異的なＩＬ−６インヒビターではない。

【００１７】 国際ＰＣＴ出願WO 97/48728は、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒま
たはｇｐ１３０のいずれか）に由来し、そしてＩＬ−６アンタゴニストまたはア
ゴニスト活性を有する合成ペプチドを開示している。これらのペプチドは、ＩＬ
−６の受容体部位ともしくは標的細胞に細胞するＩＬ−６Ｒと相互作用し、また
は組み合わせると、両方の部位（ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ）と相互作用する。

【００１８】 米国特許第5,210,075号は、ＩＬ−６それ自体の配列の一部をもとにする（ｐ
５１−７０ Hirano et al. Nature 324:73, 1986）またはＩＬ−６受容体分子の
配列の４つの異なる部分をもとにする、様々な長さのＩＬ−６アンタゴニストペ
プチドを開示している。

【００１９】 これらのいずれも、本発明において記述するような環化されている立体配座的
に拘束されたＩＬ−６ペプチドアンタゴニストを開示していない。ＩＬ−６のペプチド模倣物及び主鎖の環化ペプチド類似体アンタゴニスト 天然のペプチド分子の欠点（低い代謝安定性、不十分な経口生物利用能、迅速
な肝臓及び腎臓排出、並びに選択性の欠如）を克服し、それにより改善された治
療特性を与える立体配座的に拘束されたペプチド類似体を製造することが最も有
益である。

【００２０】 ペプチドの立体配座的拘束の新規な概念の方法は、Gilon, et al., (Biopolym ers 31:745, 1991)により導入され、ペプチドの主鎖対主鎖の環化が提示された
。この方法の理論上の利点には、指定ペプチドの特定の受容体との相互作用に重
要であり得る側鎖を妨げずにペプチド主鎖の炭素または窒素を介して環化をもた
らすことができることが包含される。

【００２１】 Gilon, et alによるさらなる開示（WO 95/33765）は、主鎖の環化ペプチド類
似体の合成において必要とされる構成単位を製造する方法を提供した。最近、ソ
マトスタチン活性を有する主鎖の環化ペプチド類似体を製造するこれらの方法の
成功した使用もまた開示された（WO 98/04583及びWO 99/66508）ＩＬ−６類似体
を含む主鎖の環化類似体のライブラリーは国際出願WO 97/09344に開示されてい
る。この開示では、指定配列に由来する活性類似体の迅速な検出を与える立体配
座的に拘束された主鎖の環式ペプチドライブラリーに基づく「シクロスキャン（
Cycloscan）」と呼ばれる選択方法が記述されている。

【００２２】 背景となる技術分野のどこにも、ＩＬ−６阻害活性を有することが示された主
鎖の環化ペプチド類似体はない。

【００２３】 発明の要約 ＩＬ−６阻害活性を有する、αアミノ酸のα窒素に結合した架橋基を有する構
成単位を含むことを特徴とする、新規なペプチド類似体を提供することが本発明
の目的である。詳細には、これらの化合物は、少なくとも１つの構成単位を含む
５〜２０アミノ酸のペプチド配列を含んでなる主鎖の環化ＩＬ−６アンタゴニス
トであり、該構成単位はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィ
ドを含んでなる架橋基に結合したペプチド主鎖の1個の窒素原子を含有し、ここ
で、少なくとも１つの構成単位は第二の構成単位、配列のアミノ酸残基の側鎖ま
たはN末端アミノ酸残基よりなる群から選択される成分と環式構造を形成するよ
うに該架橋基を介して結合している。好ましくは、ペプチド配列は、ＩＬ−６阻
害活性を有する６〜１２アミノ酸を含む。

【００２４】 ＩＬ−６の生物活性は、３部からなる複合体の分子の各々、すなわち、ＩＬ−
６、ＩＬ−６Ｒ及びｇｐ１３０シグナルトランスデューサーが２つの他の相手と
相互作用することを必要とする。本発明の目的は、以下のような複合体における
相互作用のいずれか一つを阻害するペプチドにより達成される： ａ）ＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ相互作用またはＩＬ−６／ｇｐ１３０相互作用を妨げ
るＩＬ−６に由来するペプチド。 ｂ）ＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ相互作用またはＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０相互作用を妨
げるＩＬ−６Ｒに由来するペプチド。 ｃ）ＩＬ−６／ｇｐ１３０またはＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０相互作用を妨げるｇｐ
１３０に由来するペプチド。

【００２５】 本発明の一つの態様として、残基２４７−２７１にまたがるＩＬ−６Ｒのセグ
メントは、ＩＬ−６活性のインヒビターとして用いる立体配座的に拘束された主
鎖の環化ペプチド類似体の開発のために一般に最も好ましい態様である。

【００２６】 主鎖の環化ペプチド類似体のスクリーニングから、意外にも、好ましいペプチ
ド類似体は線状エピトープに比較して著しく高い阻害活性を有することが見出さ
れた。これらの主鎖の環化ペプチド類似体のあるものは残基２４９−２５８のＩ
Ｌ−６Ｒ阻害ドメインによく似ており、あるものはその受容体に結合するＩＬ−
６中の領域によく似ている。しかし、これらのドメインに由来する以前に記述さ
れたペプチドと異なり、これらの新規な主鎖の環化ペプチド類似体は 、高いレ
ベルのＩＬ−６と関連する病理学症状の処置のための製薬学的組成物における使
用にそれらをより適当にする独特な特徴を有する。

【００２７】 本発明によって、今回、より好ましい主鎖の環化類似体は、向上した活性及び
代謝安定性を有するＩＬ−６のデカペプチド及びノナペプチドアンタゴニストで
あることが開示される。さらなるより好ましい類似体は、それらの配列中にアミ
ノ酸の少なくとも１個のD−異性体を都合よく含むことができる。

【００２８】 好ましくは、本発明の主鎖の環化類似体は、ＩＬ−６Ｒ分子の配列に由来する
かまたはそれによく似ており、好ましくはＩＬ−６Ｒアミノ酸配列の残基２４７
−２７１に関する。さらなる好ましい類似体は、ＩＬ−６分子の配列に由来する
。

【００２９】 本発明の好ましい態様は、以下の式：

【００３０】

【化１０】

【００３１】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ²⁴⁹はＴｒｐ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｌｙｓ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｔｙｒま
たは（Ｄ）Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁰はＡｒｇであり； Ｒ²⁵¹は（Ｌ）もしくは（Ｄ）ＬｅｕまたはＬｙｓであり； Ｒ²⁵²は（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵³は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁴はＡｌａであり； Ｒ²⁵⁵は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−ＬｅｕであるかまたはＬｙｓであり； Ｒ²⁵⁶は存在しないかまたは（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵⁷は（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｔｙｒであり； Ｒ²⁵⁸はＡｌａであり；そして Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する。

【００３２】 本発明のより好ましい態様は、以下の式：

【００３３】

【化１１】

【００３４】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ²⁴⁹はＴｒｐ、（Ｄ）Ｌｙｓまたは（Ｄ）Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁰はＡｒｇであり； Ｒ²⁵¹はＬｙｓまたは（Ｄ）Ｌｅｕであり； Ｒ²⁵²は（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵³は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁴はＡｌａであり； Ｒ²⁵⁵は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−Ｌｅｕであり； Ｒ²⁵⁶は存在しないかまたはＡｒｇであり； Ｒ²⁵⁷は（Ｄ）Ｔｙｒであり； Ｒ²⁵⁸はＡｌａであり；そして Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する。

【００３５】 式において省略する慣例でないアミノ酸は以下に定義したとおりである。

【００３６】 ＩＬ−６受容体分子に由来する本発明の現在最も好ましい主鎖の環化ＩＬ−６
アンタゴニストは以下のとおりである： 本明細書においてＰＴＲ−５０４５と称するＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−（Ｄ）Ａ
ｒｇ−Ｐｈｅ−ＡｌａＣ３−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−（Ｄ）Ｔｙｒ−ＡｌａＮ３−ＮＨ ₂ 本明細書においてＰＴＲ−５０４１と称する（Ｄ）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｄ）Ｌｅ
ｕ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ｐｈｅ−ＡｌａＣ３−（Ｄ）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−（Ｄ）
Ｔｙｒ−ＡｌａＮ３−ＮＨ₂ 本明細書においてＰＴＲ−５０４３と称する（Ｄ）Ｐｈｅ−Ａｒｇ−（Ｄ）Ｌｅ
ｕ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ｐｈｅ−ＡｌａＣ３−Ｌｅｕ−（Ｄ）Ｔｙｒ−Ａｌａ
Ｎ３−ＮＨ₂ これらのペプチド類似体は、様々なインビトロバイオアッセイにおいてＩＬ−
６の細胞傷害性作用を阻害することが認められた。ＰＴＲ５０４５はまた、ＩＬ
−６により誘導される病状の予防においてインビボで有効であること及び代謝的
に機能性生物安定性であることも認められた。

【００３７】 本発明の別の態様によれば、さらなる好ましい類似体はＩＬ−６分子の配列に
由来する。本発明によれば、ループＡＢ及びへリックスＤにまたがるＩＬ−６分
子の領域は、現在、ＩＬ−６活性のインヒビターとして用いる立体配座的に拘束
された主鎖の環化ペプチド類似体の開発の最も好ましい態様である。

【００３８】 本発明によれば、今回、さらなるより好ましい主鎖の環化類似体は、向上した
活性及び代謝安定性を有するＩＬ−６のヘキサペプチドアンタゴニストであるこ
とが開示される。さらなるより好ましい類似体は、それらの配列中にアミノ酸の
少なくとも１個のＤ−異性体を都合よく含むことができる。

【００３９】 ＩＬ−６に由来するペプチドに関する本発明の好ましい態様は以下の式：

【００４０】

【化１２】

【００４１】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ¹は（Ｄ）Ｂｉｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（ＺＣＬ）またはＤａｂであり；
Ｒ²は（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＴｒｐであり； Ｒ³はＯｒｎ、４ＰｙｒＡｌａ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｄａｂ、（Ｄ）Ａｒｇ、
ＬｙｓまたはＤｐｒであり； Ｒ⁴はＬｙｓ、Ｌｙｓ（ＺＣＬ）、Ａｒｇ、Ａｒｇ（Ｍｔｒ）または（Ｄ）Ｇｌ
ｕであり； Ｒ⁵はＡｓｎ、Ｔｒｐまたは（Ｄ）Ａｌａであり； Ｒ⁶はＡｒｇ、（ｐ−ＮＯ₂）Ｐｈｅ、（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｔｒｐ、Ｇｌｎ
、ＡｂｕまたはＧｌｕであり；そして Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する。

【００４２】 ＩＬ−６に由来するペプチドに関する本発明の別の好ましい態様は以下の式：

【００４３】

【化１３】

【００４４】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ¹は（Ｄ）ＰｈｅまたはＬｙｓであり； Ｒ²は（Ｄ）Ｃｉｔ、Ｌｙｓまたは（Ｄ）Ｂｉｐであり； Ｒ³はＤｐｒ、４ＰｙｒＡｌａまたは（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ａｒｇであり；
Ｒ⁴はＨｏmＡｒｇ、ＯｒｎまたはＬｙｓであり； Ｒ⁵は（Ｄ）Ｇｌｎまたは（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｔｒｐであり； Ｒ⁶は（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｇｌｎまたは（ｐ−ＮＯ₂）Ｐｈｅであり；そし
て Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する。

【００４５】 ＩＬ−６分子に由来する本発明の現在最も好ましい主鎖の環化ＩＬ−６アンタ
ゴニストは以下のとおりである： ７０００３−２０と表示する（Ｄ）Ｂｉｐ−（Ｄ）ＬｙｓＣ３−Ｏｒｎ−Ｌｙｓ
−ＡｓｎＮ２−Ａｒｇ−ＮＨ₂； ７０００３−４１と表示する（Ｄ）Ｂｉｐ−（Ｄ）ＬｙｓＣ３−４ＰｙｒＡｌａ
−Ｏｒｎ−ＴｒｐＮ２−（ｐ−ＮＯ₂）Ｐｈｅ−ＮＨ₂； ７０００３−８８と表示する（Ｄ）Ｂｉｐ−（Ｄ）ＬｙｓＣ２−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
（ＺＣｌ）−（Ｄ）ＴｒｐＮ２−Ａｂｕ−ＮＨ₂； ７０００３−６１と表示するＧｌｎ−ＧｌｙＣ２−（Ｄ）Ｄａｂ−Ａｒｇ（ＭＴ
Ｒ）−ＴｒｐＮ２−Ｔｒｐ−ＮＨ₂； ７０００３−５７と表示するＬｙｓ（ＺＣＬ）−ＧｌｙＣ２−Ｄａｂ−（Ｄ）Ｇ
ｌｕ−（Ｄ）ＡｌａＮ３−（Ｄ）Ｔｒｐ−ＮＨ₂； ７０００３−９１と表示する（Ｄ）Ｂｉｐ−ＧｌｙＣ２−Ｄａｂ−（Ｄ）Ｇｌｕ
−（Ｄ）ＡｌａＮ３−Ａｂｕ−ＮＨ₂； ７０００３−２５と表示するＬｙｓ（ＺＣＬ）−ＡｌａＣ２−Ｄａｂ−（Ｄ）Ｇ
ｌｕ−（Ｄ）ＡｌａＮ３−（Ｄ）Ｔｒｐ−ＮＨ₂； ７０００３−３４と表示するＬｙｓ−ＴｒｐＣ２−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒ
ｐＮ３−Ｇｌｎ−ＮＨ₂； ７０００３−８３と表示するＤａｂ−ＴｒｐＣ２−Ｄｐｒ−Ａｒｇ（ＭＴＲ）−
（Ｄ）ＡｌａＮ３−Ｇｌｕ−ＮＨ₂； ７０００３−１７と表示する（Ｄ）ＰｈｅＣ２−（Ｄ）Ｃｉｔ−Ｄｐｒ−Ｈｏｍ
Ａｒｇ−（Ｄ）ＧｌｎＮ２−（Ｄ）Ｇｌｎ−ＮＨ₂； ７０００３−４０と表示するＬｙｓＣ３−Ｌｙｓ−４ＰｙｒＡｌａ−Ｏｒｎ−Ｔ
ｒｐＮ２−（ｐ−ＮＯ２）Ｐｈｅ−ＮＨ₂； ７０００３−３３と表示するＬｙｓＣ４−Ｌｙｓ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒ
ｐＮ３−Ｇｌｎ−ＮＨ₂； ７０００３−８１と表示する（Ｄ）ＰｈｅＣ２−（Ｄ）Ｂｉｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−（Ｄ）ＴｒｐＮ２−Ｇｌｎ−ＮＨ₂。

【００４６】 好ましくは、本発明の主鎖の環化ペプチド類似体は、Ｎ−主鎖対Ｎ−主鎖の環
式ペプチド類似体を形成するように相互に連結することができるような２個のＮ ^α −ω−機能化アミノ酸誘導体を含む。本発明のさらなる好ましい類似体は、Ｎ
−主鎖対Ｎ−主鎖並びに主鎖対側鎖またはあらゆる他のペプチド環化を包含する
２またはそれ以上の環化で構築することができる。

【００４７】 本発明の主鎖の環化類似体は、製薬学的組成物として、そして癌（多発性骨髄
腫／形質細胞種を包含する）、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、多発性硬化症
、ＳＬＥ及び糖尿病を包含する）、感染症（細菌及びウイルス感染、敗血症性シ
ョック）、炎症疾患（膵炎を包含する）、免疫不全疾患（エイズを包含する）、
血液学的疾患（例えば白血病、リンパ腫）、アレルギー疾患、臓器移植反応、キ
ャッスルマン病、レナートＴ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、心臓粘液腫、
メサンギウム増殖性糸球体腎炎、ポリクローナルＢ細胞活性化症状、異常な急性
期タンパク質生産症状を包含する疾患の処置の方法において用いることができる
。

【００４８】 薬理学的に有効な主鎖の環化ＩＬ−６アンタゴニスト及び製薬学的に許容しう
る担体または希釈剤を含んでなる製薬学的組成物は、本発明のＩＬ−６アンタゴ
ニストの有効量を含んでなる製薬学的組成物での処置を必要とする哺乳動物の処
置方法と同様に、本発明の別の態様を表す。本発明の組成物を用いる処置方法は
、そのような組成物を用いる癌（多発性骨髄腫／形質細胞種を包含する）、自己
免疫疾患（慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ＳＬＥ及び糖尿病を包含する）、
感染症（細菌及びウイルス感染、敗血症性ショック）、炎症疾患（膵炎を包含す
る）、免疫不全疾患（エイズを包含する）、血液学的疾患（例えば形質細胞悪液
質、白血病、リンパ腫）、アレルギー疾患、臓器移植反応、キャッスルマン病、
レナートＴ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、心臓粘液腫、メサンギウム増殖
性糸球体腎炎、ポリクローナルＢ細胞活性化症状、異常な急性期タンパク質生産
症状及び骨粗鬆症の治療に有用である。本発明の製薬学的組成物は、その配列中
にアミノ酸の少なくとも１個のＤ−異性体を含む少なくとも１つの主鎖の環化ペ
プチド類似体を都合よく含んでなる。これらの製薬学的組成物は、局所的または
全身的を包含するあらゆる適当な投与経路により投与することができる。好まし
い投与形態には、静脈及び筋肉注射のような非経口経路並びに鼻または経口接種
によるのが包含されるがこれらに限定されるものではない。

【００４９】 発明の詳細な記述 定義： 本明細書に記述する化合物は不斉中心を有することができる。全てのキラル、
ジアステレオマー及びラセミ形態は本発明に包含される。オレフィン等の多数の
幾何異性体もまた本明細書に記述する化合物において存在することができ、全て
のそのような安定な異性体は本発明において意図される。

【００５０】 「安定な化合物」または「安定な構造」は、本明細書において反応混合物から
有用な程度の純度までの単離及び有効な治療薬への調合に耐えるために十分に強
い化合物を意味する。

【００５１】 本明細書及び請求項において用いる場合、「治療的に有効な量」という語句は
、炎症、癌、内分泌疾患及び胃腸疾患のような、しかしそれらに限定されるもの
ではない、本明細書に記述する適応症に対する所望の結果を得るために宿主に投
与する新規な主鎖の環式ペプチド類似体またはそれらを含んでなる組成物の量を
意味する。

【００５２】 「置換された」という用語は、本明細書において用いる場合、指定成分上のい
ずれか１つまたはそれ以上の水素原子が示した基からの選択で置換されているこ
とを意味し、ただし、指定元素の基準原子価を上回らず、置換は安定な化合物を
もたらす。

【００５３】 本明細書のいずれかの成分またはいずれかの式においていずれかの変数（例え
ばＲ、Ｘ、Ｚ等）が1回より多く存在する場合、各存在に対するその定義は、あ
らゆる他の存在でのその定義から独立している。同様に、置換基及び／または変
数の組み合わせは、そのような組み合わせが安定な化合物をもたらす場合にのみ
許容される。

【００５４】 本明細書において用いる場合「ペプチド」は、ペプチド結合により連結された
アミノ酸の配列を示す。本発明のＩＬ−６ペプチドアンタゴニストは、４〜２４
アミノ酸基、好ましくは６〜１６基のアミノ酸の配列を含んでなり、各基はアミ
ノ及びカルボキシ末端を有することを特徴とする。

【００５５】 「構成単位」は、一般式５：

【００５６】

【化１４】

【００５７】 のＮ^α誘導化αアミノ酸を示し、ここで、Ｘはアルキレン、置換されたアルキレ
ン、アリーレン、シクロアルキレン及び置換されたシクロアルキレンよりなる群
から選択されるスペーサー基であり；Ｒ’は特定の保護基と場合により結合して
いてもよい、アミノ酸側鎖であり；そしてＧはアミン、チオール、アルコール、
カルボン酸及びエステル、並びに水素化アルキルよりなる群から選択される官能
基であり；これはペプチド配列中に含まれ、続いて該ペプチド配列中のアミノ酸
の側鎖の一つまたは別のω−機能化アミノ酸誘導体と官能基Ｇを介して選択的に
環化される。

【００５８】 構成単位を製造する方法論は、米国特許第5,883,293号並びに国際特許出願WO
95/33765及びWO 98/04573に記述されており、これらは両方ともこの方法論のさ
らなる詳細のためにそれらを引用することにより本明細書に明白に組み込まれる
。構成単位は、対応する改変されたアミノ酸の３文字コード、続いて反応性基の
タイプ（アミンはＮ、カルボキシルはＣ）及びスペースを置くメチレン基の数の
表示により省略される。例えば、ＧｌｙＣ２は、カルボキシル反応性基及び２個
の炭素メチレンスペーサーを有する改変されたＧｌｙ基を記述し、そしてＰｈｅ
Ｎ３は、アミノ反応性基及び３個の炭素メチレンスペーサーを有する改変された
フェニルアラニン基を示す。

【００５９】 本明細書において用いる場合、「主鎖の環式ペプチド」または「主鎖の環化ペ
プチド」は、別の構成単位または配列中の別のアミノ酸にペプチド主鎖のα窒素
を介して架橋を形成するように連結されている少なくとも一つの構成単位を含有
する線状ペプチドの類似体を表す。

【００６０】 本明細書において用いる場合、「ＰＴＲ」番号は、合成され、精製され、そし
て十分に特性化される（例えば、ＨＰＬＣ、ＭＳ、キャピラリー電気泳動により
、ペプチド含有量に関するアミノ酸分析及びアミノ酸比決定により）主鎖の環式
ペプチド類似体に付与する参照番号を表す。

【００６１】 本明細書及び請求項において用いる場合、より好ましい主鎖の環式ペプチド類
似体の式において、アミノ酸の後の上付き数字は、天然のＩＬ−６受容体または
ＩＬ−６分子におけるそれらの位置番号をさす。 略語： 本明細書において本発明並びにそれを製造及び使用する方法を記述するために
ある種の略語が用いられる。

【００６２】 例えば、ＡｃＯＨは酢酸をさし、Ａｄａはアダマンタンアセチルをさし、Ａｄ
ａｃはアダマンタンカルボニルをさし、Ａｌｌｏｃはアリルオキシカルボニルを
さし、エイズは後天性免疫不全症候群をさし、Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボ
ニル基をさし、ＢＯＰはベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメ
チルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩をさし、ＢＳＡはウシ血清ア
ルブミンをさし、Ｃｂｚはカルボベンジルオキシ基をさし、ＣＮＴＦは毛様体神
経栄養因子をさし、ＤＣＣはジシクロヘキシルカルボジイミドをさし、ＤＣＭは
ジクロロメタンをさし、Ｄｄｅは1−（４，４−ジメチル１２，６−ジオキソシ
クロヘキシ−1−イリデン−エチル）をさし、ＤＩＥＡはジイソプロピル−エチ
ルアミンをさし、ＤＭＦはジメチルホルムアミドをさし、ＤＰＰＡはジフェニル
ホスホリルアジドをさし、Ｄｔｃは５，５−ジメチルチアゾリジン−４−カルボ
ン酸をさし、ＥＤＴはエタンジチオールをさし、ＥＳＩ−ＭＳは電気スプレーイ
オン化質量分析法をさし、Ｆｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニル基をさし
、ＨＢＴＵは1−ヒドロキシベンズトリアゾリルテトラメチル−ウロニウムヘキ
サフルオロリン酸塩をさし、ＨＦはフッ化水素酸をさし、ＨＯＢＴは１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾールをさし、ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィーをさし
、ＩＬ−１はインターロイキン−１をさし、ＩＬ−６はインターロイキン−６を
さし、ＩＬ−６Ｒはインターロイキン−６受容体をさし、ＩＬ−１１はインター
ロイキン−１１をさし、ＫＳはカポジ肉腫をさし、ＬＣ−ＭＳは液体クロマトグ
ラフィー質量分析法をさし、ＬＩＦは白血球阻害因子をさし、ＬＩＦ−Ｒは白血
球阻害因子受容体をさし、ＬＰＳはリポ多糖をさし、ｍＡｂはモノクローナル抗
体をさし、ＭＭＰはマトリックスメタロプロテイナーゼをさし、ＭＰＳは複数平
行合成をさし、ＭＳは質量分析法をさし、ＮＭＭはＮ−メチルモルホリンをさし
、ＮＭＰは１−メチル−２−ピロリドノンをさし、ＯＳＭはオンコスタチンＭを
さし、ＰｙＢＯＰはベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジ
ノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩をさし、ＰｙＢｒＯＰはブロモ−トリ
ス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩をさし、ＲＡは慢性関節
リウマチをさし、ＲＰは逆相をさし、ＳＬＥは全身性エリテマトーデスをさし、
ＴＢＴＵは２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テ
トラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩をさし、ｔＢｕは第三級ブチル基
をさし、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸をさし、ＴＩＳはトリス−イソプロピル−シ
ランをさす。

【００６３】 本発明において使用するアミノ酸は、市販されているかまたは慣例的合成方法
により入手できるものである。ある種の残基はペプチド中への導入に特別な方法
を必要とする可能性があり、ペプチド配列への順次的、収束的及び発散的合成方
法のいずれかが本発明において有用である。天然のコードされるアミノ酸及びそ
れらの誘導体はＩＵＰＡＣ協定に従って３文字コードにより表される。示されな
い場合、Ｌ異性体を用いた。Ｄ異性体は残基の略語の前に「Ｄ」で示す。コード
されないアミノ酸のリスト：Ａｂｕは２−アミノ酪酸をさし、Ａｉｂは２−アミ
ノ−イソ酪酸をさし、β−Ａｌａはβ−アラニンをさし、Ｂｉｐはβ−（４−ビ
フェニル）−アラニンをさし、Ｃｉｔはシトルリンをさし、Ｄａｂはジアミノ酪
酸をさし、Ｄｐｒはジアミノプロピオン酸をさし、ＨｏｍＡｒｇはホモアルギニ
ンをさし、Ｈｃｙｓはホモシステインをさし、Ｌｙｓ（ＺＣｌ）は塩化ベンジル
で保護されたε−アミノ基を有するＬｙｓをさし、１Ｎａｌは１−ナフチルアラ
ニンをさし、２Ｎａｌは２−ナフチルアラニンをさし、Ｎｖａはノルバリンをさ
し、（ｐ−Ｃｌ）Ｐｈｅはパラクロロフェニルアラニンをさし、（ｐ−ＮＨ₂）
Ｐｈｅはパラアミノフェニルアラニンをさし、（ｐ−Ｆ）Ｐｈｅはパラフルオロ
フェニルアラニンをさし、（ｐ−ＮＯ₂）Ｐｈｅはパラニトロフェニルアラニン
をさし、４ＰｙｒＡｌａは４−ピリジルアラニンをさし、Ｔｈｉはチエニルアラ
ニンをさす。

【００６４】 先に記述したように、ＩＬ−６は免疫応答、急性期反応及び造血をもたらすこ
とにおいてきわめて重要な役割を果たす。しかしながら、ＩＬ−６調節の喪失ま
たはその過剰発現は、多数の病理学症状に関与する可能性があることが示されて
いる。詳細には、高いＩＬ−６レベルは、ＨＩＶを包含する、細菌、寄生生物及
びウイルス感染、並びに慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬及び
多発性硬化症のような慢性自己免疫疾患において検出される。さらに、ＩＬ−６
は、多発性骨髄腫、白血病、カポジ肉腫、腎細胞癌及び心臓粘液腫のような様々
な腫瘍の病理に関与している。特に、ＩＬ−６は、多発性骨髄腫腫瘍の増殖に必
要とされる主要なサイトカインとして認められており、そしておそらく多発性骨
髄腫患者におけるｎ腫瘍関連毒性にも関与している。

【００６５】 ＩＬ−６機能を阻害するペプチドは多数の哺乳動物疾患において広範囲の治療
有用性を有すると考えられる。本発明の主鎖の環化ＩＬ−６ペプチドアンタゴニ
ストの治療的使用は、様々なＩＬ−６関連疾患を処置することにおいて有益であ
ると考えられ、これらの多数は現在免疫調節薬または免疫抑制薬で処置されてい
る。

【００６６】 そのようなＩＬ−６関連疾患には： ａ）多発性骨髄腫／形質細胞腫 ｂ）自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ＳＬＥ及び糖尿病を包含
するがこれらに限定されるものではない） ｃ）感染症（細菌及びウイルス感染、敗血症性ショック） ｄ）炎症疾患 ｅ）エイズを包含する免疫不全疾患 ｆ）血液学疾患（例えば形質細胞悪液質、白血病、リンパ腫） ｇ）アレルギー疾患 ｈ）臓器移植反応 ｉ）キャッスルマン病 ｊ）レナートＴ細胞リンパ腫 ｋ）非ホジキンリンパ腫 ｌ）心臓粘液腫 ｍ）メサンギウム増殖性糸球体腎炎 ｎ）ポリクローナルＢ細胞活性化症状 ｏ）異常な急性期タンパク質生産症状 ｐ）骨粗鬆症 が包含される。

【００６７】 本発明の原理の例示として、阻害ペプチドの探索をＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０界
面に集中した。この後にＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ及びＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０界面
の研究を続けた。一つの現在好ましい態様によれば、探索は主として合理的設計
及び複数平行合成（ＭＰＳ）法を用いる無作為配列ライブラリースクリーニング
を含んでなる。

【００６８】 多発性骨髄腫の現在及び以前に示唆された治療より優れた主鎖の環式ペプチド
の利点は以下のとおりである： 提案するＩＬ−６インヒビターは、現在利用されている細胞傷害性薬剤と比較
した場合に非細胞傷害性である。ＩＬ−６アンタゴニストの作用は多発性骨髄腫
細胞及びわずかな一組のＩＬ−６依存性細胞に特異的であり、ここで、他の細胞
傷害性薬剤は非選択的であり、体の全タイプの分裂細胞を殺す。

【００６９】 提案するＩＬ−６アンタゴニストは、潜在的に免疫原性の抗体、抗体フラグメ
ント及びミニボディに比較した場合に、小さく、従って生来非免疫原性である。

【００７０】 提案するＩＬ−６アンタゴニストは、経口的に生物利用できるように改変する
ことができるはずである。タンパク質（抗体、フラグメントまたはミニボディ）
は経口的に利用できると考えられない。

【００７１】 ７４００を超える個々の主鎖の環化ペプチド類似体をＭＰＳ形態で合成し、Ｉ
Ｌ−６生物活性の阻害に関して少なくとも一つのタイプのバイオアッセイによ
り試験した。このスクリーニング段階で得られた最もよいペプチドは、約１μＭ
の概算ＩＣ₅₀を示した。これは、ＩＬ−６Ｒ分子に由来する線状ペプチドとして
利用できるペプチド類似体の１０〜１００倍の向上に相当する。ＭＰＳ合成から
活性により選択した約５０のペプチド類似体（ＰＴＲ）を大規模で合成し、精製
し、十分に特性化した。これらのＰＴＲを少なくとも一つのインビトロバイオア
ッセイにおいてＩＬ−６阻害活性に関して試験した。ＭＰＳ及びＰＴＲ形態の主
鎖の環化ペプチド類似体の上記の大量スクリーニングから、意外にも３ペプチド
が特に有効であると見出された。これらの主鎖の環化ペプチド類似体は、基２４
９−２５８のＩＬ−６Ｒ阻害ドメイン、及び受容体に結合するＩＬ−６中の領域
によく似ている。しかし、これらのドメインに由来する以前に記述されたペプチ
ドと異なり、これらの新規な主鎖の環化ペプチド類似体は、高いレベルのＩＬ−
６と関連する病理学症状の処置のための製薬学的組成物における使用にそれらを
より適当にする独特な特徴を有する。

【００７２】 今回、本発明の好ましい主鎖の環化ＩＬ−６アンタゴニストを記述する。

【００７３】 一つの態様は、以下の式：

【００７４】

【化１５】

【００７５】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ²⁴⁹はＴｒｐ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｌｙｓ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｔｙｒま
たは（Ｄ）Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁰はＡｒｇであり； Ｒ²⁵¹は（Ｌ）もしくは（Ｄ）ＬｅｕまたはＬｙｓであり； Ｒ²⁵²は（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵³は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁴はＡｌａであり； Ｒ²⁵⁵は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−ＬｅｕであるかまたはＬｙｓであり； Ｒ²⁵⁶は存在しないかまたは（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵⁷は（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｔｙｒであり； Ｒ²⁵⁸はＡｌａであり；そして Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する。

【００７６】 現在より好ましい態様は、以下の式：

【００７７】

【化１６】

【００７８】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ²⁴⁹はＴｒｐ、（Ｄ）Ｌｙｓまたは（Ｄ）Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁰はＡｒｇであり； Ｒ²⁵¹はＬｙｓまたは（Ｄ）Ｌｅｕであり； Ｒ²⁵²は（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵³は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁴はＡｌａであり； Ｒ²⁵⁵は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−Ｌｅｕであり； Ｒ²⁵⁶は存在しないかまたはＡｒｇであり； Ｒ²⁵⁷は（Ｄ）Ｔｙｒであり； Ｒ²⁵⁸はＡｌａであり；そして Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する。

【００７９】 この態様の最も好ましい化合物をＰＴＲ５０４５と称し、ここで、これらの基
は以下のとおりである： Ｒ²⁴⁹はＴｒｐであり； Ｒ²⁵⁰はＡｒｇであり； Ｒ²⁵¹はＬｙｓであり； Ｒ²⁵²は（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵³はＰｈｅであり； Ｒ²⁵⁴はＡｌａであり； Ｒ²⁵⁵はＬｅｕであり； Ｒ²⁵⁶はＡｒｇであり； Ｒ²⁵⁷は（Ｄ）Ｔｙｒであり； Ｒ²⁵⁸はＡｌａであり；そして Ｙ²はアミドである。

【００８０】 この態様の別の好ましい化合物をＰＴＲ５０４１と称し、ここで、これらの基
は以下のとおりである： Ｒ²⁴⁹は（Ｄ）Ｌｙｓであり； Ｒ²⁵⁰はＡｒｇであり； Ｒ²⁵¹は（Ｄ）Ｌｅｕであり； Ｒ²⁵²は（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵³は（Ｄ）Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁴はＡｌａであり； Ｒ²⁵⁵はＬｅｕであり； Ｒ²⁵⁶はＡｒｇであり； Ｒ²⁵⁷は（Ｄ）Ｔｙｒであり； Ｒ²⁵⁸はＡｌａであり；そして Ｙ²はアミドである。

【００８１】 この態様の別の好ましい化合物をＰＴＲ５０４３と称し、ここで、これらの基
は以下のとおりである： Ｒ²⁴⁹は（Ｄ）Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁰はＡｒｇであり； Ｒ²⁵¹は（Ｄ）Ｌｅｕであり； Ｒ²⁵²は（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵³は（Ｄ）Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁴はＡｌａであり； Ｒ²⁵⁵はＬｅｕであり； Ｒ²⁵⁶は存在せず； Ｒ²⁵⁷は（Ｄ）Ｔｙｒであり； Ｒ²⁵⁸はＡｌａであり；そして Ｙ²はアミドである。

【００８２】 ＩＬ−６に由来するペプチドに関する、本発明の別の好ましい態様は以下の式
：

【００８３】

【化１７】

【００８４】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ¹は（Ｄ）Ｂｉｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（ＺＣＬ）またはＤａｂであり；
Ｒ²は（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＴｒｐであり； Ｒ³はＯｒｎ、４ＰｙｒＡｌａ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｄａｂ、（Ｄ）Ａｒｇ、
ＬｙｓまたはＤｐｒであり； Ｒ⁴はＬｙｓ、Ｌｙｓ（ＺＣＬ）、Ａｒｇ、Ａｒｇ（Ｍｔｒ）または（Ｄ）Ｇｌ
ｕであり； Ｒ⁵はＡｓｎ、Ｔｒｐまたは（Ｄ）Ａｌａであり； Ｒ⁶はＡｒｇ、（ｐ−ＮＯ₂）Ｐｈｅ、（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｔｒｐ、Ｇｌｎ
、ＡｂｕまたはＧｌｕであり；そして Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する。

【００８５】 ＩＬ−６に由来するペプチドに関する、本発明の別の好ましい態様は以下の式
：

【００８６】

【化１８】

【００８７】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ¹は（Ｄ）ＰｈｅまたはＬｙｓであり； Ｒ²は（Ｄ）Ｃｉｔ、Ｌｙｓまたは（Ｄ）Ｂｉｐであり； Ｒ³はＤｐｒ、４ＰｙｒＡｌａまたは（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ａｒｇであり；
Ｒ⁴はＨｏｍＡｒｇ、ＯｒｎまたはＬｙｓであり； Ｒ⁵は（Ｄ）Ｇｌｎまたは（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｔｒｐであり； Ｒ⁶は（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｇｌｎまたは（ｐ−ＮＯ₂）Ｐｈｅであり；そし
て Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する。

【００８８】 本発明の最も好ましい主鎖の環化ＩＬ−６アンタゴニストを表１に記述する ：

【００８９】

【表１】

【００９０】 ここで、Ｘは−ＮＨ₂または−ＯＨであり、そして架橋基は２つの構成単位間
にまたがる。

【００９１】 本発明のより好ましい態様は、Ｎ−主鎖対Ｎ−主鎖の環式ペプチド類似体を形
成するように相互に連結することができる２個のＮ^α−ω−機能化アミノ酸誘導
体を含む。

【００９２】 主鎖の環化の最も顕著な利点は以下のとおりである： １）ペプチド配列の環化は、ペプチドの側鎖のいずれも妥協せずに得られ、それ
により生物学的認識及び機能にとって必須の官能基を犠牲にする可能性を減らす
。 ２）ペプチド立体配座の最適化は、架橋の長さ、方向及び結合タイプ（例えば、
アミド、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル等）並びに環における結合
の位置を交換させることにより得られる。 ３）既知の活性の線状ペプチドの環化に適用する場合、ペプチド及びそのコグネ
イト受容体の活性領域との相互作用を最小限度に抑えるように架橋を設計するこ
とができる。これは、認識及び機能を妨げる環化アームの可能性を減らし、また
放射性トレーサー、細胞傷害性薬剤、光捕獲物質のような標識またはあらゆる他
の所望の標識の結合のために適当な部位も生じる。

【００９３】 ペプチド類似体は、N−主鎖対Ｎ−主鎖並びに主鎖対側鎖またはあらゆる他の
ペプチド環化を包含する２またはそれ以上の環化で構築することができる。第二
の環化は、ペプチド配列中に少なくとも一つの追加の構成単位を導入してそれを
別の構成単位、アミノ酸側鎖またはペプチド末端のいずれかに連結することによ
り形成することができる。さらに、第二の環化は側鎖対側鎖（ジスルフィド結合
を包含する）または側鎖体末端の環化であることができる。

【００９４】 今回意外にも、合成してＩＬ−６活性の阻害に関してアッセイした個々の主鎖
の環化ペプチド類似体のスクリーニングにより同定された本発明の主鎖の環化Ｉ
Ｌ−６アンタゴニストが、以前に記述された線状ＩＬ−６阻害ペプチドより１０
−１００倍有効であることが見出された。

【００９５】 本発明の主鎖の環式ペプチドは、基２４９−２５８のＩＬ−６Ｒ阻害ドメイン
によく似ている新規な類似体である。主鎖の環式類似体のアミノ酸配列は、ＩＬ
−６Ｒの最も有効な阻害フラグメントとして同定されたもの（Grube and Cochra
n, 同書中）に基づく。さらなる類似体は、ＩＬ−６のその受容体への接触残基
を含んでなる、ＩＬ−６分子の連続していない領域に似ている。これらの類似体
は、約１０００ダルトンの分子量を有するというさらなる利点がある。

【００９６】 本発明の革新的な主鎖の環式類似体は、好ましくは、特定のアミノ酸改変を有
する５〜２０アミノ酸を含む。詳細には、各類似体の少なくとも1個のアミノ酸
は、アミノ酸のＤ−異性体である。

【００９７】 新規な主鎖の環式ペプチド類似体の特別な特徴は、体の最も攻撃的な酵素混合
物（例えば腎臓ホモジネート）の分解に対してインビトロで試験した場合のそれ
らの代謝安定性である。ＰＴＲ５０４５は、これらの条件下で２４時間までの間
安定である。ＩＬ−６Ｒに由来する以前に記述されたペプチド類似体及び天然の
タンパク質のフラグメントは代謝的に著しくより安定性が低い。主鎖の環式ペプチドの合成、精製及び特性化の一般的な方法 合成： 樹脂：０．２−０．７ｍｍｏｌ／ｇｒの充填で、１ｇのＲｉｎｋアミドまたはＴ
ｅｎｔａ−ゲル樹脂。 NMP中２０％ピペリジン７ｍLで行うＦｍｏｃ−脱保護。 １５分間を２回、続いて振盪しながら１０ｍｌ ＮＭＰで２分間を５回の洗浄。
カップリング： １. 通常のカップリング（単純アミノ酸へのカップリング）：７ｍｌ NMP中３当
量のアミノ酸、３当量のＰｙＢｒｏＰ及び６当量のＤＩＥＡを含有する溶液で。
振盪しながら０．５−２時間。カップリングをニンヒドリン試験によりモニター
し、ニンヒドリン溶液が黄色になるまで繰り返す。 ２. １０ｍｌ ＤＭＦ中５当量のＤＩＣ及び５当量のＨＯＢＴを含有する溶液で
のＨｉｓ及びＡｓｎのカップリング。 ３. Ｇｌｙ構成単位へのカップリング：７ｍｌ ＮＭＰ中３当量のアミノ酸、３
当量のＰｙＢｒｏＰ及び６当量のＤＩＥＡを含有する溶液で。振盪しながら１−
４時間を２回。 ４. Ｇｌｙではない構成単位へのカップリング：１５ｍｌ ジオキサンまたはＴ
ＨＦ中５当量のアミノ酸、１．５当量のトリホスゲン及び１３当量のコリジンを
含有する溶液で。振盪しながら５０℃で０．５−２時間を２回。

【００９８】 ５％酢酸及び２．５％ NMMを含有する３０ｍｌ ＤＣＭ中ペプチド当たり１．
５当量のＰｄ（ＰＰｈ₃）₄で行う構成単位のアリル及びＡｌｌｏｃ保護基の除去
。振盪しながら１−４時間。

【００９９】 ７ｍｌ NMP中３当量のＰｙＢＯＰ及び６当量のＤＩＥＡを含有する溶液で行う
環化。振盪しながら０．５−２時間。環化をニンヒドリン試験によりモニターし
、必要に応じて繰り返す。

【０１００】 スカベンジャー：１−１５％ Ｈ₂Ｏ，１−５％ ＴＩＳ及び１−５％ ＥＤＴを
補足した８２％−９５％ ＴＦＡを用いて行う切断。精製： 各々の主鎖の環式ペプチドの個々の精製方法は、他の粗成分から環式ペプチド
の最大単離を与えるように分析ＨＰＬＣで開発する。分析方法は、通常、固定相
としてＣ−１８ Ｖｙｄａｃカラム ２５０ｘ４．６ｍｍ及び０．１％ ＴＦＡ混
合物勾配を含有する水／ＡＣＮを用いて行う。

【０１０１】 分取方法は、２”Ｃ−１８ Ｖｙｄａｃ分取方法に分析分離方法を含むことに
より設計する。

【０１０２】 精製工程の間、環式ペプチドを含有するピークを半自動フラクションコレクタ
ーを用いて集める。集めた画分を純度チェックのために分析ＨＰＬＣに注入する
。純粋な画分を合わせ、凍結乾燥する。特性化： 合わせた純粋な凍結乾燥物質をＨＰＬＣ、ＭＳ及びキャピラリー電気泳動によ
り、そしてペプチド含有量に関するアミノ酸分析及びアミノ酸比決定により純度
に関して分析する。MPS形態の主鎖の環式ペプチドの合成、精製及び特性化並びにスクリーニングの
一般的な方法 慣例的なペプチド開発法としてＭＰＳ法を用いる。溶媒は通過できるが固相マ
トリックスはそうではないフィルターを備えた９６穴マイクロタイタープレート
において個々のペプチド、または少数のペプチドの群を合成する。全ての弁の同
時開閉ができる簡単で効率のよい弁装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅにより製造された
）を用いる。この系は、ある大きさより上の粒子を通過させない溶媒透過性膜を
各ウェルの底に備えつける方法を利用する。この方法により、ウェルに樹脂を置
き、溶媒中で反応を行い、そして真空にかけることにより全てのウェルから同時
に溶媒を除くことができる。標準的な９６穴形態で利用可能なこれらの特別なプ
レートにより、９６ペプチドの平行合成を同時にできる。この方法の合成規模は
ウェル当たり１−５μモルの範囲である。同様に標準的な９６穴形態で行うＣ１
８逆相カラムによる精製（SepPak精製）後に、ペプチドを通常１ｍｌの水に溶解
して１−５ｍMの理論粗濃度を得る（合成規模により決まる）。得られるペプチ
ドの化学品質のモニタリングをESI−MS分析により行う。異なる作業者により異
なる場合に調製されたいくつかのプレートの分析により、粗調製物中の所望のペ
プチド質量の存在により判断した場合に約８０％の一般的な成功率が示された。
ＭＰＳからのペプチドのさらなる分析をＬＣ−ＭＳにより実施する。この分析に
より、大規模で個々に合成したペプチドの粗調製物と同様の粗ペプチド品質が示
された。今回、自動ペプチド合成機を用いて異なる段階または完全な工程を自動
的に行う。ペプチドを１：４０（１２５μＭの理論粗濃度）またはそれより高い
希釈で生物活性に関して試験し、これは毒性作用の大部分を明らかに排除し、そ
してペプチドの慣例的生物学的試験を可能にした。MPS形態の合成の詳細な方法： ５μモルの容量には、０．５ｍｍｏｌ／ｇｒの置換を有する１０ｍｇの樹脂を
使用する。 Ｆｍｏｃ脱保護：各ウェルにＮＭＰ中２０％ピペリジンを１００μｌを加える。
反応物を１５分間振盪する。ＮＭＰを吸引により除く。 Ｆｍｏｃ脱保護後の洗浄：各ウェルに１５０μｌのＮＭＰを置き、続いて真空に
よる溶液の排除により樹脂を洗浄する。この工程を４回繰り返す。 ＰｙＢｒｏｐを用いるカップリング： ウェル容量：５μｍｏｌ ウェル当たりカップリング当たりのアミノ酸の量：２６μｍｏｌ NMP中のアミノ酸濃度：６５０ｍＭ 使用するアミノ酸容量：４０μｌ ＰｙＢｒｏP量：２６μｍｏｌ ＰｙＢｒｏP濃度：４０３ｍｇ／ｍｌ 使用するＰｙＢｒｏP容量：３０μｌ 加えるＤＩＥＡ：１０μｌ 全反応容量：８０μｌ アミノ酸を活性化前プレートに加え、次にＰｙＢｒｏPの新しい溶液をこのプ
レートに分配し、続いてＤＩＥＡを加える。このプレートからの溶液を反応プレ
ートに移し、1時間振盪する。このカップリングを２回繰り返す。 ムカヤマ（Mukayama）試薬を用いるカップリング： ６５０ｍMのアミノ酸溶液−４０μｌ １１１ｍｇ／ｍｌのムカヤマ試薬−６０μｌ ウェル当たり加えるコリジン−１５μｌ ＰｙＢｒｏｐでのカップリングと同じ方法。反応温度５０℃、反応時間：第一
のカップリング４時間、第二のカップリング１６時間。 アリルＡｌｌｏｃ脱保護：この工程は、５％ ＡｃＯＨ＋２．５％ ＮＭＭを含有
する２０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中１．５ｇのＰｄ（ＰＰｈ₃）₄の１８０μl溶液の添
加により、組み立てを完了した後に行う。 環化−この工程は、NMP＋DIEA中のＰｙＢｏＰの１００μｌ溶液の添加により行
う。 樹脂からのペプチドの切断及びＳｅｐＰａｋ精製：最後のＦｍｏｃ脱保護後に樹
脂を深いウェルのマイクロタイタープレートに移し、各ウェルに２．５％ ＴＩ
Ｓ、２．５％ Ｈ₂Ｏ、２．５％ ＥＤＴを含有する３００μｌのTFA溶液を加える
。ＴＦＡの除去は凍結乾燥により行う。切断後にペプチドをＳｅｐＰａｋにより
精製する。生物学的活性に関するＩＬ−６アンタゴニストのスクリーニング インビトロバイオアッセイ 可能性のあるＩＬ−６阻害ペプチドの生物活性に関するスクリーニングをイン
ビトロで実施した。ＩＬ−６の阻害は、マウスＴ１１６５及びＢ９またはヒトＴ
Ｆ１及びＸＧ１のようなＩＬ−６依存性細胞系の死をもたらす。あるいはまた、
ＩＬ−６の阻害は、細胞の持続する増殖をもたらすＡ３７５、Ｂ１６．Ｆ１０．
９及びＭ１細胞のＩＬ−６誘導分化をたどることによりモニターすることができ
る。ＣＥＳＳ細胞系によるＩｇＧ分泌を測定することもまた、ＩＬ−６阻害活性
をモニターするために用いることができる。異なるマウス及びヒト細胞系を用い
るＩＬ−６阻害の５タイプのインビトロバイオアッセイを阻害ペプチドのスクリ
ーニングのために異なる段階の探索において用いた。Ｂ９細胞を用いるバイオアッセイ Ｂ９（マウス骨髄腫）細胞は増殖にＩＬ−６を必要とする。ＩＬ−６の阻害は
細胞死をもたらす。アッセイ方法は、Halimi et al.（同書中）に記述されてい
るように実施した。Ｔ１１６５細胞を用いるバイオアッセイ Ｔ１１６５（マウス骨髄腫細胞）は増殖にＩＬ−６を必要とし、ＩＬ−６が省
かれるかまたは阻害される場合に死ぬ。アッセイの有効性は、ウサギＩＬ−６抗
血清を用いるＩＬ−６生物活性の阻害により示された。Ｂ１６．Ｆ１０．９黒色腫細胞を用いるバイオアッセイ Ｂ１６（マウス黒色腫）のＦ１０．９亜系統はｇｐ１３０を発現するがＩＬ−
６Ｒを発現しない。ヒトＩＬ−６及びヒトＩＬ−６ＲまたはＩＬ−６／ＩＬ−６
Ｒのキメラの添加は、細胞の増殖停止と関連する分化をもたらす。ＩＬ−６の阻
害は、持続する増殖をもたらす。このアッセイの終点は細胞死よりむしろ細胞増
殖であるので、このアッセイ系は、Ｂ９またはＴ１１６５細胞に対して認められ
る疑われる毒性作用とＩＬ−６活性の真の阻害を区別するために主として用いた
。

【０１０３】 Ｂ１６．Ｆ１０．９細胞アッセイは、（探索の異なる段階で）一次スクリーニ
ングアッセイであるＴ１１６５またはＴＦ１アッセイの確認アッセイとして慣例
的に用いた。

【０１０４】 ２つの方法を用いてこのアッセイにおける結果の評価が可能である。一つの方
法は、細胞増殖をモニターするために生体色素を使用する。第二の方法は、細胞
形態の視覚的観察及び以下の結果に基づくカットオフ点を定めることを含んでな
る： ＩＬ−６で処置していない細胞は、ほとんど全ての表面積を覆う単層を生じる
。ＩＬ−６での処置は増殖停止及び形態学的変化を引き起こし：処置していない
細胞のより広がった形状に比較した場合に細胞は非常に細く長くなる。ＩＬ−６
及び阻害ペプチドでの細胞の処置は、明らかに細胞増殖を完全に回復するが、細
胞形態を完全には回復しない。ＩＬ−６及び非阻害ペプチドでの細胞の処置は、
ＩＬ−６で処置した細胞に非常に類似しているようである細胞をもたらす。

【０１０５】 そのような結果に基づいて、アッセイの結果をＩＬ−６の作用のほとんど完全
な阻害を引き起こすペプチドの最終濃度として報告する。Ａ３７５細胞を用いるバイオアッセイ Ａ３７５はヒト黒色腫細胞である。ＩＬ−６は、 Ｂ１６Ｆ１０．９マウス黒
色腫細胞で認められる現象と同様の増殖停止と関連するＡ３７５細胞の分化を誘
導する。従って、ＩＬ−６の阻害は、容易に定量可能な細胞の持続する増殖をも
たらす。そのような場合、ペプチドの毒性は、偽陽性よりむしろ偽陰性として現
われる。この条件はスクリーニング工程中に好ましい。第二に、これらはヒト細
胞であるので、生物応答に関与する分子、すなわち、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び
ｇｐ１３０は全てヒト起源のものであり、従って、試験するペプチド生物活性の
確実性を保証する。Ａ３７５細胞の別の利点は、ｇｐ１３０シグナルトランスデ
ューサーを共有する他のサイトカイン、すなわち、白血病阻害因子（ＬＩＦ）及
びオンコスタチンＭ（OSM）によりそれらを誘導できることである。表２におい
て認めることができるように、ＬＩＦ単独では、それぞれの受容体（ＬＩＦ−Ｒ
）も加えられない限り、A３７５細胞に影響を及ぼさない。明らかに、我々が使
用するＡ３７５系統はＬＩＦ−Ｒを欠いている。ＯＳＭは単独で非常に有効であ
る。このアッセイ系を利用できることにより、全て単一の細胞系を用いる一続き
のアッセイにおいて、ファミリーの他のサイトカインに対する我々のＩＬ−６阻
害ペプチドの特異性を試験することができる。アッセイ作業は、Savino et al.
（同書中）に記述されている。

【０１０６】

【表２】

【０１０７】 ＩＬ−６の生物活性を阻害するために使用したウサギＩＬ−６抗血清を用いて
アッセイを実証した。粗ペプチド調製物並びに高濃度の精製ペプチドの試験は、
細胞に著しい毒性をもたらした。さらなる結果は、毒性が用量依存的であり、粗
ペプチド調製物の希釈を増すことでまたは低い濃度の精製ペプチドで減少するこ
とを示した。従って、このアッセイは、nM活性を有する類似体のスクリーニング
に使用できると予想される。これはまた、ＩＬ−６のみを阻害するペプチドとＩ
Ｌ−６及びさらなるｇｐ１３０使用サイトカインを阻害するペプチドを区別する
ためにｇｐ１３０関連サイトカインに関するペプチド選択性の立証のスクリーニ
ングに特に用いることもできる。ＴＦ１細胞を用いるバイオアッセイ ＴＦ細胞（ヒト赤白血病）は増殖にＩＬ−６を必要とし、従ってＩＬ−６生物
活性の阻害は、Ｔ１１６５細胞と同様に細胞死をもたらす。全ての関連分子の起
源はヒトである。

【０１０８】 これらの細胞は、（ｇｐ１３０シグナルトランスデューサーを用いずに）ＩＬ
−６に関係のないさらなるサイトカインにより誘導することができるので、毒性
（偽陽性結果）と関連する問題は、ＴＦ１に基づくアッセイでは克服できるはず
である。ＩＬ−６で、そしてさらなるサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦで細胞
を増殖するように誘導することが可能である。従って、ＩＬ−６生物活性の特異
的阻害は、ＩＬ−６により誘導される細胞においてのみ現われ、ＧＭ−ＣＳＦで
はそうではないと予想される。ＴＦ１細胞の使用及び示差的阻害概念の信頼性は
、ウサギＩＬ−６抗血清の使用により実証した。ＩＬ−６により誘導される増殖
のみが抗血清により阻害された。アッセイ方法は、Fourcin et al. （同書中）
に記述されている方法に基づく。アッセイの最後の生存細胞の量は、ＷＳＴ試薬
で細胞を染色すること並びにチミジンの取り込み（³Ｈ−Ｔ）を測定することに
より決定する。

【０１０９】 ＩＬ−６自体ではなく、ＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０に由来するペプチドを用
いるＩＬ−６の阻害は、ｇｐ１３０シグナル伝達系を同様に利用する他のサイト
カインの阻害をもたらすはずである。この点でペプチド類似体の特異性を試験す
るために、グループの他のサイトカインのいくつか（すなわち、ＩＬ−１１、Ｃ
ＮＴＦ、ＯＳＭ）の生物活性のバイオアッセイを行う。 インビトロ結合アッセイ 結合アッセイは、ＩＬ−６活性六量体の形成に対するペプチドの直接作用を測
定するものである。バイオアッセイと異なり、このアッセイの使用は、試験する
ペプチドの活性の様式を明らかに示すはずである。そのようなアッセイの簡単な
形態は以下のとおりである：ＩＬ−６、ＩＬ−６R及び可溶性ｇｐ１３０を試験
ペプチドと一緒に溶液中に混合する。推定の六量体の捕獲は抗−ｇｐ１３０抗体
により行い、そして結合した複合体の検出はＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒのいずれ
かに対する抗体により行う。ＩＬ−６／ＩＬ−６R相互作用におけるペプチドの
妨害を試験するために別個のアッセイを行う。

【０１１０】 ＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ複合体を市販されているサイトカイン及びgp１３０シグ
ナルトランスデューサーを利用することが既知である他のサイトカインの受容体
で置換することによりＩＬ−６生物活性複合体に対するペプチドの阻害特異性を
試験するために同様の形態のアッセイを用いる。 インビボアッセイ ＩＬ−６アンタゴニストの主要な臨床標的は多発性骨髄腫である。マウスＩＬ
−６依存性骨髄腫細胞系を接種したマウスにおいてインビボモデル系を行う。ヒ
ト多発性骨髄腫細胞を移植したヌードマウスも用いる。主鎖の環化ＩＬ−６アン
タゴニストの阻害作用を試験するために使用する他のインビボアッセイは：以下
の実施例において記述するようなＩＬ−６によりもたらされる急性期反応、ＩＬ
−６によりもたらされるアジュバント関節炎及びタウロコール酸により誘導され
る膵炎である。

【０１１１】 当業者は、以下の実施例が単に実例であり、本発明の原理の限定しない例示と
して使えること並びに以下の請求項により特定するような現在請求する本発明の
範囲内で多数の変形及び改変が可能であることを理解する。

【０１１２】 実施例 実施例１．ＰＴＲ５０４５ Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ
−ＡｌａＣ３−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−（Ｄ）Ｔｙｒ−ＡｌａＮ３−ＮＨ₂の詳細な合
成 焼結ガラス底を備え振盪機上に置いた反応容器において２グラムのＴｅｎｔａ
−ゲル樹脂（０．２２ｍｍｏｌ／ｇ）をNMP中で膨潤させた。全てのＦｍｏｃ保
護基をNMP中２０％ピペリジンとの反応（１０分を２回、各１０ｍｌ）、続いて
ＮＭＰ洗浄（２分を５回、各１５ｍｌ）により取り除いた。Ｆｍｏｃ除去は、２
９０ｎｍでの紫外線吸収測定によりモニターした。アミノ酸：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ
（ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−（Ｄ）Ａｒｇ（ｐｍｃ
）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｍｃ）−
ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨのカップリングは、NMP（１０ｍｌ）
中４ｅｑ（１．７６ｍｍｏｌ）のアミノ酸＋ＰｙＢｒｏｐ（４当量、１．７６ｍ
ｍｏｌ）＋ＤＩＥＡ（８当量、３．５２ｍｍｏｌ）で室温で１．５時間実施した
。反応の完了は、定性ニンヒドリン試験（カイザー試験）によりモニターした。
各カップリング後に、ペプチド−樹脂をＮＭＰで洗浄した（１５ｍｌ ＮＭＰで5
回、各２分）。ＡｌａＮ３構成単位へのＦｍｏｃ−（Ｄ）Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−
ＯＨのカップリングは、１０ｍｌ ＮＭＰ＋8ｅｑ ＤＩＥＡ中４ｅｑのアミノ酸
＋ＴＰＴＵ及びＴｏＰＰｙＵの混合物（４ｅｑ、１．７６ｍｍｏｌ）の使用、二
重カップリング：第一カップリング2時間、第二カップリング一晩により実施し
た。ＡｌａC３構成単位へのＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨのカップリングは、同じ方
法により実施した。カップリングの完了はＨＰＬＣによりモニターした。アリル
／Ａｌｏｃ保護基は、アルゴン下で、ＣＨ₂Ｃｌ₂中Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄及び酢酸５
％、モルホリン２．５％と室温で２時間の反応により取り除いた。ペプチド樹脂
をＣＨＣｌ₃（３回、５分、各３０ML）、続いてＮＭＰで洗浄した。環化は、Ｎ
ＭＰ中、ＰｙＢＯＰ ３当量、ＤＩＥＡ ６当量と室温で２時間実施した。最後の
Ｆｍｏｃ脱保護は、上記のようにＮＭＰ中２０％ピペリジンで実施した。ペプチ
ド樹脂をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄し、減圧下で乾燥させた。ペプチドをＴＦＡ ９４％
、水２．５％、ＥＤＴ ２．５％、ＴＩＳ １％と０℃で１５分間及び室温で２時
間アルゴン下での反応により樹脂から切断した。混合物を濾過し、樹脂を少容量
のＴＦＡで洗浄した。濾液を回転エバポレーター中に置き、全ての揮発性成分を
除いた。油状の生成物が得られた。これを３回エーテルで摩砕してエーテルをデ
カントした。白色の粉末が得られた。この粗生成物を乾燥させた。粗生成物の重
量は４００ｍｇであった。ＨＰＬＣによる精製後に分析HPLC及びキャピラリー電
気泳動により検出した場合に１００％の純度で単一のピークが得られた。１４８
９．７ダルトンの予想質量が質量分光分析法により検出された。

【０１１３】 実施例２：Ｂ１６．Ｆ１０．９黒色腫細胞増殖に対する主鎖の環式ペプチド類 似体の作用 ペプチドを２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６及び１２５ｎｇ／ｍｌのｓＩＬ−６Ｒ
の存在下でＢ１６．Ｆ１０．９黒色腫細胞に加えた。３日間のインキュベーショ
ン。ペプチド濃度は、１５００Daの平均分子量に対して計算した。コントロール
ペプチドの配列：ＰＴＲ５０４９：Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｐ
ｈｅ−ＡｌａＣ３−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＡｌａＮ３−ＮＨ₂ ＰＴＲ４０４
１：Ｌｙｓ−ＧｌｙＣ２−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＧｌｙＮ
３−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂。図２に記述する結果は、ＰＴＲ５０４５及びＰＴ
Ｒ５０４１が約２５０ｎＭの濃度でＩＬ−６活性を完全に妨げ、一方、ＰＴＲ５
０４９及びＰＴＲ４０４１は有効でないことを示す。

【０１１４】 実施例３：ＩＬ−６によりもたらされる急性期反応に対するＩＬ−６アンタゴ ニストのインビボ作用 本目的は、ＩＬ−６インヒビターの活性を試験するために、簡単な第一線イン
ビボモデルを確立することであった。テルペンチンモデルを、ＩＬ−６がこの炎
症反応において果たす主要な役割に基づいて選択した。

【０１１５】 全身及び局所炎症は、熱、体重の低下、低血糖症及び肝臓により生産されるい
くつかの血漿タンパク質の血清レベルの変化を包含する、急性期反応として知ら
れている、生物体における全身反応を引き出す。ＩＬ−６は、IL−1及びＴＮＦ
−αと一緒に、急性期反応の重要なメディエーターである（包括的な総説には、
Heinrich et. al., Biochemistry J. 1 265:621, 1990を参照）。テルペンチン
の注入により引き起こされる無菌性組織損傷は急性期反応を誘導すること、及び
ＩＬ−６がこの反応の必須のメディエーターであることが以前に示されている（
Rokita et. al., Cytokine 5:454, 1993）。

【０１１６】 この現象におけるＩＬ−６のこの役割を確かめるために、遺伝子ターゲッティ
ング（ノックアウト）により作製したＩＬ−６欠損マウスを使用した。方法及び結果 ＩＬ−６ノックアウト（−／−）及び対等な野生型（Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ；Ｃ
Ｂ）マウスを使用した。両方の後肢へのテルペンチン、０．１ｍｌの皮下注射に
より無菌性組織損傷を誘導した。ＩＬ−６は、ＥＬＩＳＡ（QuantikineM, R&D）
により血清において決定した。肝臓急性期タンパク質には、フィブリノーゲンを
カルシウム法によりクエン酸塩添加血漿において決定した。

【０１１７】 ＩＬ−６レベルは、正常なマウスではテルペンチン注射後に７倍上昇したが、
ＩＬ−６欠損マウスでは上昇しなかった（図３ａ）。フィブリノーゲンレベルは
、正常なマウスではテルペンチン注射後に３〜４倍上昇したが、ＩＬ−６欠損マ
ウスでは上昇しなかった（図３ｂ）。

【０１１８】 正常なマウスではテルペンチン注射後に体重の低下が起こったが、ＩＬ−６欠
損マウスでは起こらなかった（図３ｃ）。

【０１１９】 テルペンチン注射の６時間後にフィブリノーゲンレベルのいかなる変化も検出
されなかった。高いフィブリノーゲンレベルが注射後１２時間で認められ、注射
後24時間までに最大レベルに達する。 結論 我々の結果は、ＩＬ−６がテルペンチンに対する急性期反応の必須のメディエ
ーターであることを示唆する以前に公開された結果（Kozak et al., American J . Physiology 272:2 R621, 1997; Kopf et al., Nature 368:339-342, 1994）を
裏付ける。テルペンチンモデルは、抗−ＩＬ−６処置の薬理学的効能を決定する
ために第一線のインビボアッセイとして使うことができる。

【０１２０】 ＰＴＲ５０４５を関係のないコントロールペプチドＰＴＲ４０４１（Ｌｙｓ−
ＧｌｙＣ２−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＧｌｙＮ３−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−ＮＨ₂）と比較してこのモデルにおいて試験した。結果を以下の表３に
要約する。

【０１２１】

【表３】

【０１２２】 １０匹のマウスに１または１０ｍｇ／ｋｇの各ペプチド類似体を与えた。 ＰＴＲ５０４５は、急性炎症中に体重に対してＩＬ−６によりもたらされる影響
を約半分減らす。ＰＴＲ５０４５とコントロールペプチドの差は、１ｍｇ／ｋｇ
のみの用量を利用する場合にも有意である。

【０１２３】 実施例４：ＩＬ−６によりもたらされるアジュバント関節炎 本目的は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）インヒビターの活性を試験する
ために、慢性関節リウマチ（ＲＡ）のインビボモデルを確立することであった。
アジュバント関節炎モデルは、ヒトにおけるＲＡに臨床的及び病理学的類似性を
有するので、そしてＩＬ−６がこの炎症症状において果たす推定の役割に基づい
て選択した。

【０１２４】 慢性関節リウマチは、通常は対称配置の末梢関節を冒す、主に持続する炎症性
滑膜炎を特徴とする、慢性の多系自己免疫疾患である。ＩＬ−６は、増加したレ
ベルがＲＡ患者の血清及び滑液中に認められ、そしてこれらのレベルは炎症の臨
床パラメーターと相関していたので、ＲＡに関与している（Miltenburg et al.,
British J. Reumatology 30:186, 1991）。ラットにおけるアジュバント誘導関
節炎は、アジュバント関節炎動物がRA患者において認められる炎症性及び免疫学
的特徴を発症するのでヒトＲＡのモデルとして用いる。さらに、ＩＬ−６レベル
は関節炎ラットの血清において上昇しており、そしてこれらのレベルは炎症とそ
して症候群の進行と相関関係にある。方法及び結果 遺伝子的に感受性のルイスラットを用いた。油中に熱で殺したマイコバクテリ
ウム・ツベルクローシスを含有する（１０ｍｇ／ｍｌ）完全フロイントアジュバ
ント（ＣＦＡ）の1回の注射により関節炎を誘導する。動物に尾の基部で皮内に
注射した。関節炎は免疫後２週で発症し、端の小関節を冒した。次にラットを、
炎症を起こした関節の臨床評点及び組織病理学評価に供した。関節炎を誘導する
成功率は８５％より大きい。メスのラットはオスより感受性である。滑膜の炎症
、パンヌスの形成、軟骨及び骨の侵食は全て組織病理学的に認められ、臨床の重
さを裏付けた。

【０１２５】 デキサメタゾン処置は関節炎の臨床徴候を完全に終わらせ、それ故、このモデ
ルにおける陽性コントロールとして用いることができる。デキサメタゾン処置の
送達は、浸透ミニポンプを用いることによりうまく行い、これはまたペプチドの
連続投与にも用いることができた。結論 我々の結果は、このＲＡモデルの以前に公開された記述を裏付ける（Stanescu
et al., Arthritis and Rheumatism 30:779, 1987）。

【０１２６】 アジュバント関節炎モデルは、抗−ＩＬ−６処置の薬理学的活性を決定するた
めに疾患モデルとして使うことができる。試験は、疾患の発症時（１２日）での
臨床パラメーターの評点に基づく。

【０１２７】 実施例５：タウロコール酸により誘導される膵炎 本目的は、ＩＬ−６インヒビターの活性を試験するために急性膵炎のインビボ
モデルを確立することである。タウロコール酸により誘導される膵炎モデルは、
重い壊死させる急性膵炎に臨床的及び病理学的類似性を有する。

【０１２８】 急性膵炎は、その重い形態において、循環不全、代謝性アシドーシス、腹水、
高血糖症、高脂血症及び最終的には多系臓器不全のような明らかな全身症状発現
を有する。ＩＬ−６は、急性膵炎にかかっている患者においてC−反応性タ ン
パク質と比較した場合に高い血清レベルが疾患の重さまたは死亡率をより予示す
るので、急性膵炎に関与している（Leser et al., Gastroenterology 101:782:5
, 1991）。ラットにおいてタウロコール酸により誘導される膵炎は、膵炎動物が
膵炎患者において認められる生化学的及び病理学的特徴を発症するのでヒト膵炎
のモデルとして用いる。さらに、ＩＬ−６レベルは、膵炎ラットの血清において
上昇していた。方法及び結果 オスウィスターラットを用いた。３０G針で膵臓実質のいくつかの部位への０
．５ｍｌの１０％タウロコール酸ナトリウムの浸潤により膵炎を誘導した。進行
性の洗浄性作用が起こり、これはび慢性膵臓壊死及び高い死亡率をもたらした。
測定したパラメーターは、膵臓酵素アミラーゼ及びリパーゼの血清レベル、血清
ＩＬ−６及び死亡率であった。さらに、膵臓の組織病理学的評価を行った。擬似
コントロール群では死亡数なしに、膵炎動物では６０−８０％の死亡率が認めら
れた。タウロコール酸塩誘導後に、膵臓において激しい出血及び壊死が明白であ
った。

【０１２９】 腹膜腔の全体にわたる脂肪壊死及び著しい腸拡張が２４時間後に認められた。

【０１３０】 血清ＩＬ−６の著しい上昇が３時間で認められ、タウロコール酸塩注入から６
時間以内にそのピークに達した。

【０１３１】 血清アミラーゼの著しい上昇が膵炎誘導後２時間で認められた。結論 我々の結果は、ＩＬ−６が膵炎の動物モデルにおいて高められるという以前に
公開された結果を裏付ける。

【０１３２】 タウロコール酸塩により誘導される膵炎モデルは、抗−ＩＬ−６処置の薬理学
的活性を決定するために疾患モデルとして使うことができる。

【０１３３】 試験は、血清中の膵臓酵素のレベルを測定すること、死亡率及び組織病理学的
評点に基づく。

【０１３４】 実施例６：さらなる好ましい主鎖の環化ＩＬ−６アンタゴニストＰＴＲｓの合
成及びインビトロ活性 合成した追加のPTR類似体をそれらのそれぞれの化学的及び生物学的データと
一緒に表４に記載する。これらのペプチドの大部分は、活性ペプチドを見出す作
業の一部として研究の初期の間に合成した。Ｂ１６Ｆ１０．９細胞アッセイを用
いて認められた最もよいＩＣ₅₀は、ＰＴＲ−５００５では約１０μ／ｍｌ、そし
てＰＴＲ−５０３７では約２０μｇ／ｍｌである。これら２つのペプチドのうち
、ＰＴＲ−５００５のみがＴＦ１細胞に対して有効であるようである。

【０１３５】

【表４】

【０１３６】 ある好ましい類似体を表５及び表６に記述する。

【０１３７】

【表５】

【０１３８】 上記の方法に従って認められたペプチドの平均活性は、ＭＰＳ実験の結果から
概算した場合に１００μMを超えると概算される。

【０１３９】

【表６】

【０１４０】 ＢＴｙｒはＤＴｙｒ及びＬＴｙｒの混合物であり、従ってこれらのウェルは各
々２ペプチドを含有する。

【０１４１】 表６の結果は、両方のタイプのバイオアッセイの結果の全般的な一致を示す。
ＴＦ１細胞に対して陽性であった試験したペプチドの大部分は、Ｂ１６Ｆ１０．
９細胞に対しても陽性であった。

【０１４２】 得られた最もよいペプチド類似体は、１２μＭより低い理論粗濃度でＢ１６Ｆ
１０．９細胞に対するＩＬ−６の作用を阻害するようであり、１μＭに近いＩＣ ₅₀ 値を示唆した。いくぶん高いＩＣ₅₀値がＴＦ１アッセイにおいて認められる。

【０１４３】 実施例７：ＩＬ−６分子に由来するさらなる好ましい主鎖の環化類似体の設計
、合成、スクリーニング及び同定 ＩＬ−６の結晶構造及び特定の点突然変異とＩＬ−６生物学的活性を相関させ
る実験に基づいて、ＩＬ−６分子のループAB及びへリックスＤにおける重要な接
触点が決定された（Xu et al. J. Mol. Biol., 268:468, 1997及びSimpson et a
l. Protein Sci. 6:929, 1997及びそこに引用される参考文献）。 （国際特許出願ＰＣＴ ＩＬ／００／００２１８に開示されているような）実質
上のライブラリーから薬作用発生団含有分子を同定する方法を適用して、薬作用
発生団を含有し且つＩＬ−６タンパク質の対応する領域に似ている一組の分子を
得た。これらの分子を１０⁷の異なる主鎖の環式分子の無作為配列ライブラリー
の設計に用いた。これらのライブラリーの一例（ａｂ０３７３）の合成を以下の
スキームにおいて記述する：

【０１４４】

【表７】

【０１４５】 ここで：^a ＮＢＵはアミン反応性基を有する構成単位を表す。^b 各工程の２行目の数は、各スプリットアームにおいてカップリングした個々の
アミノ酸の数を表す。^c ＣＢＵはカルボキシル反応性基を有する構成単位を表す。

【０１４６】 ライブラリーを可溶性ＩＬ−６の結合に関してスクリーニングした。得られた
情報をＭＰＳ形態の主鎖の環式ペプチドの合成に用いた。生物学的活性の分析は
、ＴＦ１ヒト細胞系に対して行った。

【０１４７】 最初のＭＰＳプレートからの１８の主鎖の環式ペプチドは、１：１０希釈で４
５％より多い阻害を示す。使用したバイオアッセイの終点は細胞死であるので、
致死作用の特異性を調べること及び細胞死がＩＬ−６シグナリング経路の阻害の
ためであるかどうかを調べることが必要である。それ故、増殖因子として（ＩＬ
−６の代わりに）ＧＭ−ＣＳＦで同じ細胞を維持した場合に非特異的細胞死を誘
導する能力に関してペプチド類似体を分析した。そのような活性及び選択性アッ
セイのいくつかの結果を表７及び図４に要約する。類似体のあるものは非特異的
阻害を示すが（例えば表７及び図４のペプチド１、２及び５）、あるもの（すな
わち、ペプチド３４及び４１）はＩＬ−６経路に明らかに特異的であった。

【０１４８】

【表８】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＩＬ−６Rに由来する既知の活性ＩＬ−６阻害ペプチド及び非活性ペプチドを
示す概要図である。

【図２】 Ｂ１６．Ｆ１０．９黒色種細胞増殖に対する主鎖の環式ペプチド類似体の影響
を記述する。

【図３】 正常及びＩＬ−６ノックアウトマウスにおける、ＩＬ−６によりもたらされる
急性期反応：ａ）ＩＬ−６血清レベル、ｂ）フィブリノーゲン血漿レベル及びｃ
）体重の変化に対するＩＬ−６アンタゴニストのインビボでの影響を記述する。

【図４】 ＩＬ−６またはＧＭ−ＣＳＦで維持したＴＦ１細胞における、ＩＬ−６の主鎖
の環化ペプチドアンタゴニストの生物学的活性及び選択性を記述する図表である
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ Ａ６１Ｐ 31/04 31/04 31/12 31/12 33/00 33/00 35/00 35/00 37/00 37/00 37/02 37/02 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA07 BA01 BA09 BA16 BA17 BA18 BA26 BA27 BA28 DA59 NA14 ZA961 ZA971 ZB071 ZB151 ZB261 ZB331 ZB351 ZB371 ZC022 4H045 AA10 AA20 AA30 BA13 BA14 BA15 BA16 BA17 BA18 BA19 BA50 EA20 FA33 FA44 FA52

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１つの構成単位を含む５〜２０アミノ酸のペプ
   チド配列を含んでなり、該構成単位はアミド、チオエーテル、チオエステルまた
   はジスルフィドを含んでなる架橋基に結合したペプチド主鎖の1個の窒素原子を
   含有し、ここで、少なくとも１つの構成単位は環式構造を形成するように架橋基
   を介して結合している、ＩＬ−６アンタゴニスト活性を有する主鎖の環化ペプチ
   ド類似体。
2. 【請求項２】 ペプチド配列が６〜１２アミノ酸を含んでなる請求項１の
   主鎖の環化類似体。
3. 【請求項３】 ペプチド配列がアミノ酸の少なくとも１個のD−異性体を含
   む請求項１の主鎖の環化類似体。
4. 【請求項４】 ペプチド配列がアミノ酸の少なくとも２個のD−異性体を含
   む請求項１の主鎖の環化類似体。
5. 【請求項５】 線状ペプチド配列がＩＬ−６受容体に由来する請求項１の
   主鎖の環化類似体。
6. 【請求項６】 線状ペプチド配列がＩＬ−６分子に由来する請求項１の主
   鎖の環化類似体。
7. 【請求項７】 一般式１： 【化１】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ²⁴⁹はＴｒｐ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｌｙｓ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｔｙｒま
   たは（Ｄ）Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁰はＡｒｇであり； Ｒ²⁵¹は（Ｌ）もしくは（Ｄ）ＬｅｕまたはＬｙｓであり； Ｒ²⁵²は（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵³は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁴はＡｌａであり； Ｒ²⁵⁵は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−ＬｅｕであるかまたはＬｙｓであり； Ｒ²⁵⁶は存在しないかまたは（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵⁷は（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｔｙｒであり； Ｒ²⁵⁸はＡｌａであり；そして Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する請求項１の主鎖の環化類似体。
8. 【請求項８】 Ｒ²⁴⁹がＴｒｐ、（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｌｙｓまたは（
   Ｄ）Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁰がＡｒｇであり； Ｒ²⁵¹がＬｙｓまたは（Ｄ）Ｌｅｕであり； Ｒ²⁵²が（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵³が（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁴がＡｌａであり； Ｒ²⁵⁵が（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−Ｌｅｕであり； Ｒ²⁵⁶が存在しないかまたはＡｒｇであり； Ｒ²⁵⁷が（Ｄ）Ｔｙｒであり； Ｒ²⁵⁸がＡｌａであり；そして Ｙ²がアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである 請求項７の主鎖の環化類似体。
9. 【請求項９】 式： Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＡｌａＣ３−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
   −（Ｄ）Ｔｙｒ−ＡｌａＮ３−ＮＨ₂ を有する請求項８の主鎖の環化ＩＬ−６アンタゴニスト。
10. 【請求項１０】 式： （Ｄ）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｄ）Ｌｅｕ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ｐｈｅ−ＡｌａＣ
    ３−（Ｄ）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−（Ｄ）Ｔｙｒ−ＡｌａＮ３−ＮＨ₂ を有する請求項８の主鎖の環化ＩＬ−６アンタゴニスト。
11. 【請求項１１】 式： （Ｄ）Ｐｈｅ−Ａｒｇ−（Ｄ）Ｌｅｕ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ｐｈｅ−ＡｌａＣ
    ３−Ｌｅｕ−（Ｄ）Ｔｙｒ−ＡｌａＮ３−ＮＨ₂ を有する請求項８の主鎖の環化ＩＬ−６アンタゴニスト。
12. 【請求項１２】 一般式３： 【化２】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ¹は（Ｄ）Ｂｉｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（ＺＣＬ）またはＤａｂであり；
    Ｒ²は（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＴｒｐであり； Ｒ³はＯｒｎ、４ＰｙｒＡｌａ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｄａｂ、（Ｄ）Ａｒｇ、
    ＬｙｓまたはＤｐｒであり； Ｒ⁴はＬｙｓ、Ｌｙｓ（ＺＣＬ）、Ａｒｇ、Ａｒｇ（Ｍｔｒ）または（Ｄ）Ｇｌ
    ｕであり； Ｒ⁵はＡｓｎ、Ｔｒｐまたは（Ｄ）Ａｌａであり； Ｒ⁶はＡｒｇ、（ｐ−ＮＯ₂）Ｐｈｅ、（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｔｒｐ、Ｇｌｎ
    、ＡｂｕまたはＧｌｕであり；そして Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する請求項１の主鎖の環化類似体。
13. 【請求項１３】 一般式４： 【化３】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ¹は（Ｄ）ＰｈｅまたはＬｙｓであり； Ｒ²は（Ｄ）Ｃｉｔ、Ｌｙｓまたは（Ｄ）Ｂｉｐであり； Ｒ³はＤｐｒ、４ＰｙｒＡｌａまたは（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ａｒｇであり；
    Ｒ⁴はＨｏｍＡｒｇ、ＯｒｎまたはＬｙｓであり； Ｒ⁵は（Ｄ）Ｇｌｎまたは（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｔｒｐであり； Ｒ⁶は（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｇｌｎまたは（ｐ−ＮＯ₂）Ｐｈｅであり；そし
    て Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する請求項１の主鎖の環化類似体。
14. 【請求項１４】 少なくとも１つの構成単位を含む５〜２０アミノ酸のペ
    プチド配列を含んでなり、該構成単位はアミド、チオエーテル、チオエステルま
    たはジスルフィドを含んでなる架橋基に結合したペプチド主鎖の1個の窒素原子
    を含有し、ここで、少なくとも１つの構成単位は環式構造を形成するように架橋
    基を介して結合している、主鎖の環化ＩＬ−６アンタゴニストを製薬学的に許容
    しうる担体または希釈剤と一緒に含んでなる製薬学的組成物。
15. 【請求項１５】 ＩＬ−６アンタゴニストが一般式１： 【化４】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ²⁴⁹はＴｒｐ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｌｙｓ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｔｙｒま
    たは（Ｄ）Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁰はＡｒｇであり； Ｒ²⁵¹は（Ｌ）もしくは（Ｄ）ＬｅｕまたはＬｙｓであり； Ｒ²⁵²は（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵³は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁴はＡｌａであり； Ｒ²⁵⁵は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−ＬｅｕであるかまたはＬｙｓであり； Ｒ²⁵⁶は存在しないかまたは（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵⁷は（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｔｙｒであり； Ｒ²⁵⁸はＡｌａであり；そして Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する主鎖の環化ペプチド類似体である請求項１４の製薬学的組成物。
16. 【請求項１６】 ＩＬ−６アンタゴニストが式： Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＡｌａＣ３−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
    −（Ｄ）Ｔｙｒ−ＡｌａＮ３−ＮＨ₂ を有する主鎖の環化ペプチド類似体である請求項１５の製薬学的組成物。
17. 【請求項１７】 ＩＬ−６アンタゴニストが式： （Ｄ）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｄ）Ｌｅｕ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ｐｈｅ−ＡｌａＣ
    ３−（Ｄ）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−（Ｄ）Ｔｙｒ−ＡｌａＮ３−ＮＨ₂ を有する主鎖の環化ペプチド類似体である請求項１５の製薬学的組成物。
18. 【請求項１８】 ＩＬ−６アンタゴニストが式： （Ｄ）Ｐｈｅ−Ａｒｇ−（Ｄ）Ｌｅｕ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ｐｈｅ−ＡｌａＣ
    ３−Ｌｅｕ−（Ｄ）Ｔｙｒ−ＡｌａＮ３−ＮＨ₂ を有する主鎖の環化ペプチド類似体である請求項１５の製薬学的組成物。
19. 【請求項１９】 ＩＬ−６アンタゴニストが一般式３： 【化５】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ¹は（Ｄ）Ｂｉｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（ＺＣＬ）またはＤａｂであり；
    Ｒ²は（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＴｒｐであり； Ｒ³はＯｒｎ、４ＰｙｒＡｌａ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｄａｂ、（Ｄ）Ａｒｇ、
    ＬｙｓまたはＤｐｒであり； Ｒ⁴はＬｙｓ、Ｌｙｓ（ＺＣＬ）、Ａｒｇ、Ａｒｇ（Ｍｔｒ）または（Ｄ）Ｇｌ
    ｕであり； Ｒ⁵はＡｓｎ、Ｔｒｐまたは（Ｄ）Ａｌａであり； Ｒ⁶はＡｒｇ、（ｐ−ＮＯ₂）Ｐｈｅ、（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｔｒｐ、Ｇｌｎ
    、ＡｂｕまたはＧｌｕであり；そして Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する主鎖の環化ペプチド類似体である請求項１４の製薬学的組成物。
20. 【請求項２０】 ＩＬ−６アンタゴニストが一般式４： 【化６】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ¹は（Ｄ）ＰｈｅまたはＬｙｓであり； Ｒ²は（Ｄ）Ｃｉｔ、Ｌｙｓまたは（Ｄ）Ｂｉｐであり； Ｒ³はＤｐｒ、４ＰｙｒＡｌａまたは（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ａｒｇであり；
    Ｒ⁴はＨｏｍＡｒｇ、ＯｒｎまたはＬｙｓであり； Ｒ⁵は（Ｄ）Ｇｌｎまたは（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｔｒｐであり； Ｒ⁶は（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｇｌｎまたは（ｐ−ＮＯ₂）Ｐｈｅであり；そし
    て Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する主鎖の環化ペプチド類似体である請求項１４の製薬学的組成物。
21. 【請求項２１】 処置を必要とする哺乳動物に主鎖の環化ＩＬ−６アンタ
    ゴニストの治療的に有効な量を含んでなる製薬学的組成物を投与することを含ん
    でなる、腫瘍、細菌、寄生生物及びウイルス感染、慢性自己免疫疾患並びに骨粗
    鬆症よりなる群から選択される疾患を処置する方法。
22. 【請求項２２】 ＩＬ−６アンタゴニストが一般式１： 【化７】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ²⁴⁹はＴｒｐ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｌｙｓ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｔｙｒま
    たは（Ｄ）Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁰はＡｒｇであり； Ｒ²⁵¹は（Ｌ）もしくは（Ｄ）ＬｅｕまたはＬｙｓであり； Ｒ²⁵²は（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵³は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−Ｐｈｅであり； Ｒ²⁵⁴はＡｌａであり； Ｒ²⁵⁵は（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−ＬｅｕであるかまたはＬｙｓであり； Ｒ²⁵⁶は存在しないかまたは（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ａｒｇであり； Ｒ²⁵⁷は（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｔｙｒであり； Ｒ²⁵⁸はＡｌａであり；そして Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する主鎖の環化ペプチド類似体である請求項２１の方法。
23. 【請求項２３】 ＩＬ−６アンタゴニストが式： Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−（Ｄ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＡｌａＣ３−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
    −（Ｄ）Ｔｙｒ−ＡｌａＮ３−ＮＨ₂ を有する主鎖の環化ペプチド類似体である請求項２２の方法。
24. 【請求項２４】 ＩＬ−６アンタゴニストが式： （Ｄ）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｄ）Ｌｅｕ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ｐｈｅ−ＡｌａＣ
    ３−（Ｄ）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−（Ｄ）Ｔｙｒ−ＡｌａＮ３−ＮＨ₂ を有する主鎖の環化ペプチド類似体である請求項２２の方法。
25. 【請求項２５】 ＩＬ−６アンタゴニストが式： （Ｄ）Ｐｈｅ−Ａｒｇ−（Ｄ）Ｌｅｕ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ｐｈｅ−ＡｌａＣ
    ３−Ｌｅｕ−（Ｄ）Ｔｙｒ−ＡｌａＮ３−ＮＨ₂ を有する主鎖の環化ペプチド類似体である請求項２２の方法。
26. 【請求項２６】 ＩＬ−６アンタゴニストが一般式３： 【化８】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ¹は（Ｄ）Ｂｉｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（ＺＣＬ）またはＤａｂであり；
    Ｒ²は（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＴｒｐであり； Ｒ³はＯｒｎ、４ＰｙｒＡｌａ、（Ｌ）もしくは（Ｄ）Ｄａｂ、（Ｄ）Ａｒｇ、
    ＬｙｓまたはＤｐｒであり； Ｒ⁴はＬｙｓ、Ｌｙｓ（ＺＣＬ）、Ａｒｇ、Ａｒｇ（Ｍｔｒ）または（Ｄ）Ｇｌ
    ｕであり； Ｒ⁵はＡｓｎ、Ｔｒｐまたは（Ｄ）Ａｌａであり； Ｒ⁶はＡｒｇ、（ｐ−ＮＯ₂）Ｐｈｅ、（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｔｒｐ、Ｇｌｎ
    、ＡｂｕまたはＧｌｕであり；そして Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する主鎖の環化ペプチド類似体である請求項２１の方法。
27. 【請求項２７】 ＩＬ−６アンタゴニストが一般式４： 【化９】 式中、 ｍ及びｎは１〜５であり； Ｘは末端のカルボン酸、アミドまたはアルコール基を表し； Ｒ¹は（Ｄ）ＰｈｅまたはＬｙｓであり； Ｒ²は（Ｄ）Ｃｉｔ、Ｌｙｓまたは（Ｄ）Ｂｉｐであり； Ｒ³はＤｐｒ、４ＰｙｒＡｌａまたは（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ａｒｇであり；
    Ｒ⁴はＨｏｍＡｒｇ、ＯｒｎまたはＬｙｓであり； Ｒ⁵は（Ｄ）Ｇｌｎまたは（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｔｒｐであり； Ｒ⁶は（Ｌ）−もしくは（Ｄ）−Ｇｌｎまたは（ｐ−ＮＯ₂）Ｐｈｅであり；そし
    て Ｙ²はアミド、チオエーテル、チオエステルまたはジスルフィドである を有する主鎖の環化ペプチド類似体である請求項２１の方法。
28. 【請求項２８】 疾患が慢性関節リウマチ、多発性骨髄腫及び骨粗鬆症よ
    りなる群から選択される請求項２１の方法。