CN101790537A - 拮抗糖胺聚糖的mcp-1突变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

人单核细胞趋化因子蛋白1(MCP-1)的新突变体，以及它们用于炎性疾病的治疗性治疗的用途，所述新突变体与野生型MCP-1相比，具有增加的糖胺聚糖(GAG)结合亲和力和敲除或降低的GPCR活性。

Description

拮抗糖胺聚糖的MCP-1突变体及其用途
本发明涉及人单核细胞趋化因子蛋白1(MCP-1)的新突变体，以及它们用于炎性疾病的治疗性治疗的用途，所述新突变体与野生型MCP-1相比，具有增加的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)结合亲和力和敲除或降低的GPCR活性。
所有趋化因子，除了淋巴细胞趋化蛋白(lymphotactin)和CX3C趋化因子(fraktaline)/神经趋化因子(neurotactin)(分别是C和CX3C趋化因子亚家族的成员)外，在保守位置都具有4个半胱氨酸，分别基于N端两个半胱氨酸之间氨基酸的存在与否，可以将其分到CXC或α-趋化因子和CC或β-趋化因子亚家族。趋化因子是小的分泌蛋白，作为细胞间的信使协调特定类型的白细胞活化，从血管腔迁移入组织(Baggiolini M.，J.Int.Med.250，91-104(2001))。该事件由趋化因子与靶细胞表面的7次跨膜G蛋白偶联受体(GPCRs)的相互作用介导。这类相互作用在体内流动条件下发生。因此，需要建立局部浓度梯度，这通过趋化因子与细胞表面糖胺聚糖(G-protein-coupled receptors，GAGs)的相互作用来保证。趋化因子具有两个与其受体相互作用的主要位点，一个在N端结构域(起触发结构域的作用)，另一个位于第二个半胱氨酸后的暴露环内(起对接结构域(docking domain)的作用)(Gupta S.K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，92，(17)，7799-7803(1995))。趋化因子的GAG结合位点包括空间上分离的碱性氨基酸的簇(Ali S.et al.，Biochem.J.358，737-745(2001))。一些趋化因子，诸如RANTES，在40s环中具有BBXB模体(motif)作为主要GAG结合位点；IL-8通过C端α-螺旋和邻近N环中的Lys 20与GAGs相互作用。其他趋化因子，诸如MCP-1，显示在包括受体结合和GAG结合位点的残基之间存在显著重叠(Lau E.K.etal.，J.Biol.Chem.，279(21)，22294-22305(2004))。
就细胞因子的趋化因子-β家族来说，单核细胞趋化因子蛋白-1(MCP-1)是在各种以富集单核细胞的炎性成分为特征的疾病中发现的单核细胞和淋巴细胞特异性趋化因子和活化剂，所述疾病诸如动脉粥样硬化(Nelken N.A.et al.，J.Clin.Invest.88，1121-1127(1991)；Yla-Herttuala，S.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 88，5252-5256(1991)，类风湿性关节炎(Koch A.E.et al.，J.Clin.Invest.90，772-779(1992)；Hosaka S.et al.，Clin.Exp.Immunol.97(3)，451-457(1994)，Robinson E.et al.，Clin.Exp.Immunol.101(3)，398-407(1995))，炎症性肠病(MacDermott R.P.et al.，J.Clin.Immunol.19，266-272(1999))和充血性心力衰竭(Aukrust P.，et al.，Circulation 97，1136-1143(1998)，Hohensinner P.J.etal.，FEBS Letters 580，3532-3538(2006))。重要的是，不含MCP-1或其受体CCR2的敲除小鼠，无法将单核细胞和T细胞募集到炎性病变处(Grewal I.S.et al.，J.Immunol.159(1)，401-408(1997)，Boring L.et al.，J.Biol.Chem.271(13)，7551-7558(1996)，Kuziel W.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(22)，12053-8(1997)，Lu B.，et al.，J.Exp.Med.187(4)，601-8(1998))；此外，在数种动物模型中利用MCP-1中和抗体或其他生物拮抗剂的治疗可以减轻炎症(Lukacs N.W.et al.，J.Immunol.，158(9)，4398-4404(1997)，Flory C.M.et al.，1.Lab.Invest.69(4)，396-404(1993)，Gong J.H.，et al.，J.Exp.Med.186(1)，131-7(1997)，Zisman D.A.et al.，J.Clin.Invest.99(12)，2832-6(1997))。最后，与WTMCP-1品系相比，LDL-受体/MCP-1-缺陷和apoB-转基因/MCP-1-缺陷小鼠在其整个主动脉显示显著更少的脂沉积和巨噬细胞积聚(Alcami A.et al.，J.Immunol.160(2)，624-33(1998)，Gosling J.et al.，J.Clin.Invest.103(6)，773-8(1999))。
因为已经鉴定出第一批趋化因子及其受体，完全了解它们在正常和患病生理状态中的作用的兴趣变得越来越强烈。对新抗炎药物(不同于现有药物的作用方式)的稳定需要支持开发新的基于蛋白的GAG拮抗剂以及它们在炎性条件下的用途。
因为在过去几年已经仔细研究了MCP-1与CCR2和GAGs相互作用的分子基础，将趋化因子靶向改造为MCP-1生物作用的有效拮抗剂是可行的。
为了这个目的，已经制备了数种重组MCP-1变体，其与它们的野生型对应物竞争糖胺聚糖结合，并显示对白细胞活化作用的减弱或敲除。
因此，本发明的主题是在炎性或变应性(allergic)进程中通过利用基于MCP-1的突变蛋白拮抗GAG相互作用，抑制白细胞(更具体地是抑制单核细胞和T细胞)迁移。
本发明基于，通过修饰野生型GAG结合区或通过将新的GAG结合区导入MCP1蛋白、并同时敲除或降低其GPCR活性，尤其是趋化因子的CCR2活性，而将更高的GAG结合亲和力引入人MCP-1。这已经通过突变MCP-1蛋白成功实现，其中MCP-1蛋白的区域通过结构保守方法进行改造，方法是，导入碱性和/或供电子氨基酸或用碱性和/或供电子氨基酸取代天然氨基酸，以及可选的还通过添加、缺失和/或取代氨基酸，和，可选的，向突变MCP-1蛋白中添加N端甲硫氨酸(M)来改造所述MCP-1蛋白的N端区域，导致趋化活性的部分或完全丧失。本发明的MCP-1突变体对于标准GAGs(肝素或硫酸乙酰肝素(heparan sulfate))特别显示Kd最少增加五倍，而在标准单核细胞的细胞培养物中显示对于诱导钙释放的缺陷或降低。
之前没有公开或提示过GAG结合亲和力增加并且GPCR活性降低的MCP-1突变蛋白。US2003/0162737描述了具有N端缺失并且在MCP-1蛋白的所选22和24位具有氨基酸N或L的MCP-1分子，但这些突变蛋白没有显示本发明MCP-1蛋白的有益特征。这也未被Steitz S等人公开(FEBSLetters，40(1998)，pp.158-164)，其只改造了MCP-1蛋白的13和18位。Paavola C等(J.Biol.Chem.，1998，273，pp.33157-33165)只描述了参与受体结合活性的MCP-1突变体，但的确包括一些改造以降低突变MCP-1蛋白的GAG结合亲和力。
此外，本发明提供编码本发明突变MCP-1蛋白的分离的多核酸分子，含有编码突变MCP-1蛋白的分离的DNA分子的载体，和用所述载体转染的重组细胞。
还可以将本发明的突变MCP-1蛋白配制为药物组合物，所述药物组合物包括突变的MCP-1蛋白或编码MCP-1突变蛋白的多核酸分子，含有编码MCP-1突变蛋白的分离的DNA分子的载体，和药学上可接受的载体。
所述MCP-1突变蛋白或编码其的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体还可以用于抑制或遏制相应野生型蛋白的生物活性。
本发明的MCP-1突变蛋白，编码其的多核酸或包含所述多核苷酸的载体也可以用于制备治疗慢性或急性炎性疾病或变应性疾病的药物的方法。优选的，所述疾病选自类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，葡萄膜炎(uveitis)，炎症性肠病(inflammatory bowel disease)，心肌梗死(myocardialinfarction)，充血性心力衰竭(congested heart failure)或局部缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury)。
附图：
图1：MCP-1突变体的序列，相对于野生型趋化因子的突变用下划线标出。
图2：因硫酸乙酰肝素结合所致wtMCP-1(图2a)和Met-MCP-1 Y13AS21K Q23R(图2b)的结构变化，通过far-UV CD光谱法显示。
图3：WT MCP-1(实心方块)，Met-MCP-1 Y13A S21K(实心三角形)和Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R(空心环)结合未分级(unfractionated)HS的Scatchard曲线分析和平衡解离常数(Kd值)。
图4：THP-1细胞中通过20nM wtMCP-1和MCP-1突变体(每种20nM)诱导的钙流入分析。显示由于添加趋化因子诱导的钙动员引起的495nm处荧光发射变化：wtMCP-1(A)，Met-MCP-1 Y13A S21K(B)，Met-MCP-1 Y13AS21K Q23R(C)和Met-MCP-1Y13A S21K Q23R V47K(D)。
图5：10nM浓度的wtMCP-1和MCP-1突变体诱导的THP-1细胞的趋化性(误差线表示3次独立实验的SEM)。1wtMCP-1，2Met-MCP-1，3Met-MCP-1Y13A S21K，4Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R，5 Met-MCP-1Y13A S21K Q23R V47K。
图6：Met-MCP-1Y13AS21KQ23R(用化合物编号PA05-008表示)对单核细胞粘附/流出的剂量依赖性抑制，在小鼠来自体内的(ex vivo)颈动脉损伤模型中检测。
图7：在自身免疫性葡萄膜炎的大鼠模型中，Met-MCP-1Y13AS21KQ23R治疗后临床和组织学分数的提高。
图8：小鼠心肌梗塞模型中，Met-MCP-1Y13AS21KQ23R(标示为PA008)对局部缺血再灌注损伤的效果。
图9：MCP-1Y13AS21KV47K，MCP-1Y13AS21KQ23R，MCP-1Y13AS21KQ23RV47K的核苷酸序列。
本文中规定的所有尺寸只是为了举例，而不是用来限制的。此外，上述附图中显示的大小不是必需按照比例来的。
已经证明通过增加GAG结合区中碱性和/或供电子氨基酸的相对量可以增加GAG结合亲和力(还描述于WO 05/054285，在此完整引入作为参考)，这产生了可以作为天然GAG结合蛋白的竞争者的改造蛋白。这尤其适用于白细胞介素-8。但对于MCP-1蛋白来说，没有公开GAG结合区的具体位点和它们通过选择性导入至少两个碱性和/或供电子氨基酸进行的改造。
此外，发现MCP-1的氨基端对经由其GPC受体CCR2进行的趋化因子信号转导是非常重要的。为了构建基于MCP-1的拮抗剂，其他人以完全敲除MCP-1结合和保留CCR2结合完整的方式改造MCP-1(WO03084993A1)。利用这些方法，旨在通过封闭中性粒细胞上的CCR2受体来阻断MCP-1介导信号转导和预防经由GAG链对内皮进行吸附。通过封闭内皮上的GAG链(通过构建更高的GAG结合亲和力实现)来转变这种方法以及敲除MCP-1的CCR2结合不是显而易见的。
本发明现在提供一种新的MCP1突变蛋白，其与野生型MCP1蛋白相比，具有增加的GAG结合亲和力和降低的GPCR活性，其中，通过插入至少一个碱性和/或供电子氨基酸或用至少两个碱性和/或供电子氨基酸取代优选的位于天然GAG结合位点内或天然GAG结合位点结构邻近区域内的至少两个氨基酸，以结构保守方式改造MCP-1蛋白的区域。
根据具体的实施方案，改造的MCP-1蛋白还包括，通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失和/或取代，对所述MCP-1蛋白N端区的前1到10个氨基酸中至少一个氨基酸进一步改造。
如果被所述碱性或供电子氨基酸取代的天然氨基酸是碱性氨基酸，则取代的氨基酸必须是碱性更强的氨基酸，或包含比天然氨基酸残基更高或更低的结构柔性。本发明的结构柔性被定义为，对GAG配体结合所致契合(fit)的适应程度。
根据本发明的一个具体实施方案，被碱性和/或供电子氨基酸取代的天然氨基酸是非碱性氨基酸。
根据本申请使用的定义，MCP-1突变蛋白还可以包括其仍然显示趋化因子活性(例如单核细胞或T细胞趋化性和Ca释放)的任意部分或片段。
本发明定义的术语“邻近(vicinity)”包括位于GAG结合位点的构象附近区域内但不位于GAG结合位点上的氨基酸残基。构象邻近区域可以被定义为在蛋白的氨基酸序列中接近GAG结合氨基酸残基的氨基酸残基，或由于蛋白的三维结构或折叠在构像上接近的氨基酸。
本发明的术语“接近(adjacent)”被定义为位于待改造的相应氨基酸残基的不超过20nm，优选的15nm，优选的10nm，优选的5nm的截止半径(cut-off radius)内。
蛋白为了能够发挥生物功能，通过多种非共价相互作用(诸如氢键键合，离子相互作用，范德华力和疏水性堆积)驱动，而折叠成一种或多种特异的空间构象。三维结构可以通过已知的方法诸如X射线结晶或NMR光谱法来确定。
天然GAG结合位点的鉴定可以通过诱变实验来确定。蛋白GAG结合位点的特征在于位于蛋白表面的碱性残基。为了验证这些区域是否限定GAG结合位点，可以将这些碱性氨基酸残基进行诱变，然后检测肝素结合亲和力的降低。这可以通过本领域已知的的任意亲和力测量技术来进行。
可以进行合理设计的诱变(插入或取代碱性或供电子氨基酸)以便在天然GAG结合位点附近导入外源氨基酸，这可以导致GAG结合位点大小的增加和GAG结合亲和力的增加。
GAG结合位点或所述位点的邻近区域还可以利用US 6107565详细描述的方法确定，包括：
(a)提供一种复合物，其包括所述蛋白和与所述蛋白结合的GAG配体分子，例如硫酸乙酰肝素(HS)，肝素，硫酸角蛋白，硫酸软骨素，硫酸皮肤素和透明质酸等等；
(b)将所述复合物与能够裂解该蛋白的裂解剂诸如蛋白酶(如胰蛋白酶)接触，其中所述GAG配体分子在结合GAG配体分子的蛋白区域阻断蛋白裂解，因此所述蛋白在未被所述结合的GAG配体分子封闭的区域被裂解；和
(c)分离并检测所述裂解的肽，其中蛋白区域中未发生裂解事件提示所述GAG配体分子与该区域结合。检测可以通过例如LC-MS，nanoHPLC-MS/MS或质谱法进行。
用于导入或改进GAG结合位点的方案是，例如，部分描述于WO05/054285的方案，可以是如下所述：
-鉴定参与GAG结合的蛋白区域
-设计新的GAG结合位点，这通过在任意位置导入(取代或插入)至少一个碱性或供电子氨基酸，优选的Arg，Lys，His，Asp和Gln残基，或通过去除至少两个干扰GAG结合的氨基酸来实现
-在计算机上(in silica)检查所获突变蛋白的构象稳定性
-提供野生型蛋白cDNA(可选的：购买cDNA)
-使用所述cDNA作为模板用于PCR辅助诱变以便将上述变化导入氨基酸序列
-将突变基因亚克隆入合适的表达系统(原核或真核的，取决于生物学上所需的翻译后修饰)
-在体外(in vitro)表达、纯化和表征突变蛋白
GAG结合亲和力增加的标准：Kd GAG(突变体)＜10uM。
-通过far-UV CD光谱法或1-D NMR光谱法检测结构保守性。
根据本发明，通过far-UV CD光谱法检测，所述改造的结构与野生型MCP-1结构的偏离低于30％，优选的低于20％，优选的低于10％被定义为结构保守性改造。
根据另一实施方案，结构保守性改造不位于MCP1蛋白的N端内。
与wtMCP-1的GAG结合结构域相关的关键残基是S21，Q23和/或V47。根据本发明，MCP-1突变蛋白可以在第21，23和/或47位的至少两个氨基酸残基中包含至少两个氨基酸改造。
所述改造可以是，例如，用至少两个碱性或供电子氨基酸进行替换或取代。供电子氨基酸是提供电子或氢原子的那些氨基酸(Droenstedt定义)。具体来说，这些氨基酸可以是N或Q。碱性氨基酸可以选自R、K和H。
根据本发明进一步的实施方案，氨基酸位置18的R可以被改造为K，和/或K19位可以被改造为R，和/或P8可以通过任意氨基酸取代进行改造，以至少部分减少经改造的MCP-1的受体结合。
可选的，本发明MCP-1突变蛋白的特征在于13位的Y还被任意氨基酸残基取代，优选的被A取代。
Y13和R18被证明也是信号转导的关键残基，这些残基被其他氨基酸残基取代导致蛋白不能诱导趋化性。从缺失和取代MCP-1变体上记录的二维1H-15N HSQC谱显示，这些突变不产生错误折叠的蛋白(Chad D.Paavolaet al.，J.Biol.Chem.，273(50)，33157-33165(1998))。
此外，N端甲硫氨酸降低MCP-1对THP-1细胞上CCR2的结合亲和力(Hemmerich S.et al，Biochemistry 38(40)，13013-13025(1999))，这样的话[Met]-MCP-1的趋化效应比野生型低大约300倍(Jarnagin K.et al.，Biochemistry 38，16167-16177(1999))。这与有效受体拮抗剂[Met]-RANTES(不诱导趋化性但以高亲和力结合受体)相反。
因此，根据本发明的另一实施方案，MCP-1突变蛋白可以包含N端Met。保留N端甲硫氨酸的MCP-1变体看起来对肝素的表观亲和力增加(LauE.K.et al.，J.Biol.Chem.279(21)，22294-22305(2004))。
根据本发明，可以被改造的野生型MCP-1区N端区包括前1到10个N端氨基酸。本发明的MCP-1突变蛋白还可以缺失N端氨基酸残基2-8。残基2-8的截除([1+9-76]hMCP-1)产生无法诱导趋化性的蛋白。
具体来说，MCP-1突变蛋白可以选自Met-MCP-1 Y13A S21K V47K，Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R和Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R V47K。
为了敲除GPCR活性并同时提高对GAGs的亲和力，将改造的数目尽可能降到最低，使用生物信息学和生物结构学工具设计定点MCP突变体。这意味着，因为wtMCP-1的结构是已知的，所以突变体是合理设计的。这意味着为引入(knocking-in)更高的GAG结合亲和力，将更多的GAG结合位点导入已经存在的GAG结合结构域，通过取代以下氨基酸：不直接参与GAG结合的，结构上次要的，和因靠近碱性氨基酸诸如K或R而暴露于溶剂的。通过这样做，注意力集中于维持MCP-1的特异性GAG相互作用位点，即负责以下作用的那些氨基酸：与GAG配体的氢键键合和范德华接触，以及趋化因子的总体折叠以保留趋化因子穿透趋化因子网络的能力(其依赖于MCP-1表面包含的蛋白-蛋白相互作用)。
改造的MCP-1分子的氨基酸序列可以用下列通式来描述：
(M)nQ(PDAINA(Z1))mVTCC(X1)NFTN(Z2)(Z3)I(X2)V(X3)RLASYRRITSSKCP
KEAVIFKTI(X4)AKEICADPKQ KWVQDSMDHL DKQTQTPKT
其中Z1选自P和A，G，L，优选的是A，
其中Z2选自R和K，
其中Z3选自K和R，
其中X1选自Y和A，优选的是A，
其中X2选自S，R，K，H，N和Q，优选的是K，
其中X3选自R，K，H，N和Q，优选的是R，
其中X4选自V，R，K，H，N和Q，优选的是K，
和其中n和/或m可以是0或1，其中位置X2、X3或X4的至少两个被改造。
本发明的另一方面是编码上述本发明蛋白的分离的多核苷酸分子。
具体来说，还涉及包括核苷酸序列SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQID No.9或其至少一部分的分离的多核苷酸分子。
多核酸可以是DNA或RNA。因此导致产生本发明MCP-1突变蛋白的那些改造可以在DNA或RNA水平进行。本发明分离的多核酸分子适合于诊断方法以及基因治疗，和大规模产生本发明的MCP-1突变蛋白。
可选的，在严谨条件下所述分离的多核苷酸分子与上述限定的本发明多核苷酸分子杂交。取决于杂交条件，在两条DNA或RNA分子之间形成互补双链，通过完全匹配或还通过包括错配碱基(参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A laboratory manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)。长度大于约50个核苷酸的探针可以实现直至25到30％错配的碱基。更短的探针将实现更少的错配。通过杂交条件的严谨性控制靶和探针形成包含错配碱基对的双链的倾向，杂交条件自身是因素的函数，诸如杂交缓冲液中盐或甲酰胺的浓度，杂交温度和杂交后清洗条件。通过应用形成杂交双链中发生的公知原理，本领域技术人员通过从各种杂交缓冲液、温度和清洗条件中进行选择可以实现具有所需严谨性的条件。因此，可以选择条件以便检测完全匹配或部分匹配的杂交双链。双链的解链温度(Tm)可用于选择合适的杂交条件。对于长度超过200个核苷酸的多核苷酸分子的严谨杂交条件通常包括在比预期双链的解链温度低15-25℃的温度下进行杂交。对于超过30个核苷酸的寡核苷酸探针(形成比更长探针稳定性更低的双链)来说，通常通过在比Tm低5到10℃的温度下杂交实现严谨杂交。可以利用基于核酸包含的G+C百分比并考虑链长度的公式计算核酸双链的Tm，诸如以下公式
Tm＝81.5-16.6(log[NA+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N＝链长。
另一方面涉及一种载体，包括如上确定的本发明分离的DNA分子。所述载体包括用于有效转染以及蛋白有效表达所需的所有调控元件。这类载体是本领域公知的，为了这个目的可以选择任意合适的载体。
本发明的另一方面涉及一种重组细胞，其被如上所述的本发明载体转染。细胞的转染和重组细胞的培养可以按照本领域公知的进行。这类重组细胞以及由此而来的任意后代细胞包括所述载体。因此，提供连续的或在活化时表达MCP-1突变蛋白(取决于载体)的细胞系。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，包括如上确定的本发明MCP-1突变蛋白、多核苷酸或载体，和药学上可接受的载体。理所当然，所述药物组合物还可以包括药物组合物中通常存在的其他物质，诸如盐，缓冲液，乳化剂，着色剂，等等。
本发明的另一方面涉及如上确定的本发明MCP-1蛋白、多核苷酸或载体在体内或体外用于抑制或遏制相应野生型蛋白的生物活性的方法中的用途。如上所述，本发明的MCP-1突变蛋白将起拮抗剂的作用，且本发明的MCP-1突变蛋白不会有已知的重组蛋白能引起的副作用中。在本例中，这特别是指涉及炎症反应的生物活性。
因此，如上确定的本发明MCP-1蛋白、多核苷酸或载体的进一步用途是用于产生治疗炎性疾病的药物的方法。具体来说，它将充当没有副作用的拮抗剂，尤其适用于治疗炎性疾病或病症，无论是慢性病还是急性病。因此，本发明的另一方面是治疗炎性疾病或变应性疾病的方法，其中给患者施用本发明的MCP-1突变蛋白、本发明的分离多核苷酸分子或载体或本发明的药物制剂。
更具体来说，所述炎性疾病或变应性疾病是呼吸道变应性疾病诸如哮喘，过敏性鼻炎，COPD，过敏性肺病，过敏性肺炎，间质肺病，(例如特发性肺纤维化，或与自身免疫病有关)，过敏反应或过敏症应答，药物变态反应和昆虫叮咬变态反应；炎性肠疾病，诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎；脊椎关节病，硬皮病；银屑病和炎性皮肤病诸如皮炎，湿疹，特应性皮炎，变应性接触性皮炎，荨麻疹；血管炎；具有病因的自身免疫病，包括炎性成分诸如关节炎(例如类风湿性关节炎，慢性进育性关节炎，牛皮癣关节炎和变形性关节炎)和风湿病，包括涉及骨丢失、炎性疼痛、过敏症(包括气道过敏症和皮肤过敏症)和变态反应的炎性疾病和风湿病。具体的自身免疫疾病包括自身免疫血液病症(包括例如溶血性贫血，再生障碍性贫血，纯红细胞贫血和自发性血小板减少)，系统性红斑狼疮，多软骨炎，Wegener肉芽肿病，皮肌炎，慢性活动型肝炎，重症肌无力，银屑病，Steven-Johnson综合征，自身免疫炎症性肠病(包括例如溃疡性结肠炎在内，克罗恩氏病和过敏性肠综合征)，自身免疫甲状腺炎，Behcet′s病，内分泌眼病，Graves病，结节病，多发性硬化，原发性胆汁性肝硬化，青少年糖尿病(I型糖尿病)，葡萄膜炎(前端和后端的)，干性角膜结膜炎和春季角膜结膜炎，间质肺部纤维化，和肾小球肾炎(患有和不患有肾病综合征，例如，包括自发性肾病综合征或微小病变肾病)；移植排斥(例如在移植中包括心脏，肺，组合的心-肺，肝，肾，胰腺，皮肤，或角膜的移植)包括同种异体移植排斥或异种移植排斥或移植-对-宿主疾病，和器官移植相关的动脉硬化；动脉粥样硬化；具有皮肤或器官白细胞浸润的癌症；血管的狭窄或再狭窄，尤其是动脉，冠状动脉，包括导致血管介入以及新生内膜增生的狭窄或再狭窄；和其他疾病或病症包括炎性应答，包括局部缺血再灌注损伤，血液恶性肿瘤，细胞因子诱导的毒性(例如脓毒性休克或内毒素性休克)，多肌炎，皮肌炎，和肉芽肿疾病包括结节病。
优选的，炎性疾病选自类风湿性关节炎，葡萄膜炎，炎症性肠病，心肌梗死，充血性心力衰竭或局部缺血再灌注损伤。
下列实施例更详细地描述本发明，而不是限制本发明的范围。
实施例
用于本发明的颈动脉损伤模型以及动物模型是在Christian Weber教授(
Figure GPA00001010789800111
Aachen)的实验室中进行的。
GAG结合的MCP-1突变体的结构分析
通过far-UV CD光谱法对MCP-1突变体二级结构元件的分析显示，在蛋白设计期间alpha/beta/转角的总比例是保守的。此外，蛋白解折叠研究显示，与野生型蛋白相比，尤其是Met-MCP-1Y13AS21KQ23R显示非常类似的解折叠转换参数，表明这些蛋白变体具有相似的稳定性。此外发现由HS结合wtMCP-1诱导的微小二级结构改变在MCP-1突变体中重现(通过图1中wtMCP-1和Met-MCP-1 Y13AS21KQ23R的比较得到例证)。但是，通过温度诱导的解折叠研究确认，存在HS的条件下这两种蛋白的稳定性均得到显著提高。这表明与其他趋化因子相反，HS对MCP-1变体折叠的影响要大于对它们二级结构的影响。这可能部分归因于无GAGs条件下MCP-1伸长的、部分无固定结构的形式，其通过GAG结合而经历结构诱导，导致更紧凑的折叠，从而导致更高的稳定性。
GAG结合亲和力的增加
我们利用Biacore 3000系统通过表面等离子体共振(SPR)测定了GAG结合亲和力的增加。根据已经确定的方案(28)将生物素化的HS固定到包被链霉亲和素的CM4传感器芯片上。在25℃包含0.01％(v/v)P20表面活性剂(BIAcoreAB)的PBS pH 7.4中记录真正的结合相互作用。按照60μl/分钟的流速注射不同的蛋白浓度2.5分钟后是缓冲液中5分钟的解离期和1M NaCl的脉冲用于完全再生。蛋白结合HS表面的最大应答信号(对应于相应感应曲线的平台)用于Scatchard曲线分析和平衡解离常数(Kd值)的计算。图3显示wtMCP-1和两种突变体的Scatchard曲线。wtMCP-1的Kd值为1,26μM，Met-MCP-1Y13A S21K为676nM，和Met-MCP-1Y13A S21K Q23R为152nM。这意味着在后一种突变体中对于HS的亲和力已经增加＞8倍。Met-MCP-1 Y13AS21KV47K突变体在对天然HS配体的亲和力方面未显示任何提高。
GPCR活性的敲除
为了获得显性阴性MCP-1突变体，除了提高的GAG结合亲和力外，MCP-1的GPCR活性已经被敲除。这通过用丙氨酸残基取代13位的酪氨酸残基和保留N端甲硫氨酸残基来实现。这导致MCP-1相关CCR2活性的完全敲除，其得到如下例证：Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R突变体的Ca流入和Thp-1趋化性完全缺失(图4&5)。预期，由于这种突变体无法活化目标单核细胞上其高亲和力GPC受体，且由于其GAG结合亲和力增加，将导致其在体内成为MCP-1活性的有效抑制剂。
细胞迁移的抑制
在来自体内的(ex vivo)模型中研究Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R对单核细胞迁移的影响。为此目的，在喂食致动脉粥样化饲料1周后，载脂蛋白E-缺陷(Apoe)-/-小鼠经历导线诱导的内皮剥蚀损伤(1)。24小时后按照文献(1)分离颈动脉用于体外灌注。将浓度为1、5或10μg/ml的Met-MCP-1 Y13AS21K Q23R以5μl/分钟预灌注颈动脉30分钟。Mono Mac 6细胞(1-106/ml)用钙黄绿素(calcein)-AM标记，清洗两次，然后通过颈动脉进行灌注。在灌注10分钟后，利用频闪表面荧光光照法(Drelloscop 250，Drello)和OlympusBX51显微镜记录与受损血管壁的粘附相互作用。通过这种方法，观察到Met-MCP-1 Y13AS21KQ23R对单核细胞粘附的抑制是浓度依赖性的(参见图6)。
自身免疫性葡萄膜炎的抑制/改善
用总体积200μl的乳液免疫Lewis大鼠的两条后腿，所述乳液包含溶于弗氏完全佐剂的15μg PDSAg(视网膜肽)，还有终浓度2.5mg/ml的结核分枝杆菌株H37RA(BD，Heidelberg，Germany)起增强作用。在主动免疫后第1天直至第19天，腹腔内施用溶于0.5ml PBS的100μgMet-MCP-1Y13AS21KQ23R突变体(或仅用PBS作为对照)。利用检眼镜每天检查动物来确定疾病的时程。按照文献(Gong J.H.and Clark-Lewis I.，J.Exp.Med.181(2)，631-640(1995))对葡萄膜炎进行临床分级，显示每天每组所有眼睛的平均临床打分。从图7可以看出，Met-MCP-1 Y13AS21KQ23R突变体对疾病的进展具有显著影响。因为葡萄膜炎的特征在于T细胞和单核细胞的眼部积聚(最终导致失明)，Met-MCP-1 Y13AS21KQ23R的疗效可以被归定为其对CCR2活化的白细胞(其主要构成单核细胞和嗜碱性粒细胞)的迁移产生的抑制。
心肌梗死的抑制/改善
在全身麻醉(100mg/kg氯胺酮和10mg/kg赛拉嗪，腹腔内)条件下给C57/B6小鼠插管，通过啮齿动物呼吸器利用氧气和异氟烷0.2％维持正压通气。通过左侧开胸术暴露心脏，然后通过动脉左前降支(LAD)两毫米硅管的缝合闭塞产生MI。30分钟后通过切割硅管开放缝合处，重新建立再灌注。在假操作的(sham-operated)小鼠中，缝合处同时被保持开放状态。肌肉层和皮肤切口接近丝缝线。动物试验得到地方当局的批准，并遵守德国动物保护法。
将Met-MCP-1 Y13AS21KQ23R在PBS中溶为100μg/ml。在局部缺血期间(结扎后10分钟)，再灌注后2小时，和终点前每一天，每次小鼠接受腹腔内100μl的治疗。采用相同方式利用赋形剂治疗对照小鼠。
在指定时间点，麻醉小鼠，然后在保证恒定心率(600bpm)的恒定灌注压力(100mmHg)和电刺激条件下利用Langendorff装置(Hugo SachsElektronik-Harvard Apparatus)和HSE Isoheart软件分析心脏功能。在有或没有多巴酚丁胺(dobutamin，300μmol，丸剂形式(in bolus))的条件下检测冠脉血流量、产生的压力，左心室压的增加(dP/dtmax)和降低(dP/dtmin)。图8(上栏)显示测量到的参数。最后，心脏利用10％福尔马林固定膨胀，并切成5μm的连续切片。
利用Gomori′s一步法三色染料将连续切片(每只小鼠10-12个，间隔400μm，直至二尖瓣)染色。利用Diskus软件(Hilgers)确定每个切片上的梗死区域，将其表示为左心室总容积的百分比(参见图8，下栏)。
序列表
<110>普罗塔芬生物技术股份公司(Protaffin Biotechnologie AG)
 
<120>拮抗糖胺聚糖的MCP-1突变体及其用途
 
<130>R 52404
 
<150>US 60/953140
<151>2007-07-31
 
<150>EP 07450166.9
<151>2007-09-27
 
<160>10
 
<170>PatentIn version 3.5
 
<210>1
<211>76
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>1
 
Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr
1               5                   10                  15
Asn Arg Lys Ile Ser yal Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr
            20                  25                  30
Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala
        35                  40                  45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met
    50                  55                  60
Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr
65                  70                  75
 
<210>2
<211>77
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>修饰的MCP-1蛋白
 
<400>2
 
Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe
1               5                   10                  15
Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile
            20                  25                  30
Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val
        35                  40                  45
Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser
    50                  55                  60
Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr
65                  70                  75
 
<210>3
<211>77
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>修饰的MCP-1蛋白
 
<400>3
 
Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Ala Asn Phe
1               5                   10                  15
Thr Asn Arg Lys Ile Lys Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile
            20                  25                  30
Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val
        35                  40                  45
Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser
    50                  55                  60
Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr
65                  70                  75
 
<210>4
<211>77
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>修饰的MCP-1蛋白
 
<400>4
 
Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Ala Asn Phe
1               5                   10                  15
Thr Asn Arg Lys Ile Lys Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile
            20                  25                  30
Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Lys
        35                  40                  45
Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser
    50                  55                  60
Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr
65                  70                  75
 
<210>5
<211>77
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>修饰的MCP-1蛋白
 
<400>5
 
Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Ala Asn Phe
1               5                   10                  15
Thr Asn Arg Lys Ile Lys Val Arg Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile
            20                  25                  30
Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile yal
        35                  40                  45
Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser
    50                  55                  60
Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr
65                  70                  75
 
<210>6
<211>77
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>修饰的MCP-1蛋白
 
<400>6
 
Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Ala Asn Phe
1               5                   10                  15
Thr Asn Arg Lys Ile Lys Val Arg Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile
            20                  25                  30
Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Lys
        35                  40                  45
Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser
    50                  55                  60
Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr
65                  70                  75
 
<210>7
<211>234
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>修饰的MCP-1蛋白Y13AS21KV47K的核苷酸序列
 
<400>7
atgcaaccgg acgctatcaa cgcaccggtt acttgttgtg cgaacttcac caaccgtaag     60
atcaaagttc agcgtctggc tagctaccgt cgtatcacga gctctaaatg cccgaaagaa    120
gctgttatct tcaaaaccat caaagctaaa gaaatctgcg cggatccgaa acagaaatgg    180
gttcaggact ctatcgacca cctggacaaa cagacccaga ccccgaagac ctga          234
 
<210>8
<211>234
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>修饰的MCP-1蛋白Y13AS21KQ23R的核苷酸序列
 
<400>8
atgcaaccgg acgctatcaa cgcaccggtt acttgttgtg cgaacttcac caaccgtaag     60
atcaaagttc gccgtctggc tagctaccgt cgtatcacga gctctaaatg cccgaaagaa    120
gctgttatct tcaaaaccat cgttgctaaa gaaatctgcg cggatccgaa acagaaatgg    180
gttcaggact ctatcgacca cctggacaaa cagacccaga ccccgaagac ctga          234
 
<210>9
<211>234
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>修饰的MCP-1蛋白Y13AS21KQ23RV47K的核苷酸序列
 
<400>9
atgcaaccgg acgctatcaa cgcaccggtt acttgttgtg cgaacttcac caaccgtaag     60
atcaaagttc gccgtctggc tagctaccgt cgtatcacga gctctaaatg cccgaaagaa    120
gctgttatct tcaaaaccat caaagctaaa gaaatctgcg cggatccgaa acagaaatgg    180
gttcaggact ctatcgacca cctggacaaa cagacccaga ccccgaagac ctga          234
 
<210>10
<211>77
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>突变的MCP-1蛋白
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>M＝M或无氨基酸残基
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(9)
<223>PDAINAX＝PDAINAX或无氨基酸残基
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa是Pro，Ala，Gly或Leu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>Xaa是Tyr或Ala
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>Xaa是Arg或Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa是Arg或Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa是Ser，Arg，Lys，His，Asn或Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>Xaa是Arg，Lys，His，Asn或Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(48)..(48)
<223>Xaa是Val，Arg，Lys，His，Asn或Gln
 
<400>10
 
Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Xaa Val Thr Cys Cys Xaa Asn Phe
1               5                   10                  15
Thr Asn Xaa Xaa Ile Xaa Val Xaa Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile
            20                  25                  30
Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Xaa
        35                  40                  45
Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser
    50                  55                  60
Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr
65                  70                  75

Claims (20)

1.MCP1突变蛋白，与野生型MCP-1蛋白相比，其GAG结合亲和力增加并且GPCR活性降低，其特征在于，对MCP-1蛋白，通过插入至少一个碱性和/或供电子氨基酸、或用至少两个碱性和/或供电子氨基酸取代至少两个氨基酸，以结构保守方式进行改造。
2.如权利要求1所述的MCP-1突变蛋白，其特征在于野生型MCP-1蛋白N端区前1到10个氨基酸中至少一个氨基酸通过添加、缺失和/或取代至少一个氨基酸而被改造。
3.如权利要求1或2中任意一项所述的MCP-1突变蛋白，其特征在于被碱性和/或供电子氨基酸取代的所述氨基酸是非碱性氨基酸。
4.如权利要求1到3中任意一项所述的MCP-1突变蛋白，其特征在于采用结构保守方式的改造，是通过far-UV CD光谱法检测，经改造的结构与野生型MCP 1结构的偏离低于30％，优选的低于20％。
5.如权利要求1到4中任意一项所述的MCP-1突变蛋白，其特征在于所述碱性氨基酸选自R，K，H。
6.如权利要求1到4中任意一项所述的MCP-1突变蛋白，其特征在于所述供电子氨基酸选自N或Q。
7.如权利要求1到6中任意一项所述的MCP-1突变蛋白，其特征在于第21，23和/或47位的至少两个氨基酸被改造。
8.如权利要求1到7中任意一项所述的MCP-1突变蛋白，其特征在于第13位的Y被A取代。
9.如权利要求1到8中任意一项所述的MCP-1突变蛋白，包含N端Met。
10.如权利要求1到9中任意一项所述的MCP-1突变蛋白，其中N端氨基酸残基2-8缺失。
11.MCP-1突变蛋白，其特征在于其包括下列通式的氨基酸序列：(M)nQ(PDAINA(Z1))mVTCC(X1)NFTN(Z2)(Z3)I(X2)V(X3)RLASYRRITSSKCPKEAVIFKTI(X4)AKEICADPKQ KWVQDSMDHL DKQTQTPKT
其中Z1选自P和A，G，L，优选的是A，
其中Z2选自R和K，
其中Z3选自K和R，
其中X1选自Y和A，优选的是A，
其中X2选自S，R，K，H，N和Q，优选的是K，
其中X3选自R，K，H，N和Q，优选的是R，
其中X4选自V，R，K，H，N和Q，优选的是K，
和其中n和/或m可以是0或1，其中位置X2、X3或X4中至少两个被改造。
12.MCP-1突变蛋白，其特征在于其选自Met-MCP-1Y13A S21K V47K，Met-MCP-1Y13A S21K Q23R和Met-MCP-1Y13A S21K Q23R V47K。
13.分离的多核酸分子，其特征在于其编码权利要求1到12中任意一项所述的蛋白。
14.分离的多核酸分子，包括核苷酸序列SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9或其至少一部分。
15.载体，其特征在于其包括权利要求13或14中任意一项所述的分离的DNA分子。
16.重组细胞，其特征在于其被权利要求15所述的载体转染。
17.药物组合物，其特征在于其包括权利要求1到12中任意一项所述的蛋白，或权利要求13或14所述的多核酸分子或权利要求15所述的载体，还包括药学上可接受的载体。
18.权利要求1到12中任意一项所述的MCP-1突变蛋白，权利要求13或14所述的多核酸分子或权利要求15所述的载体在体外抑制或遏制相应野生型蛋白的生物活性的方法中的用途。
19.权利要求1到12中任意一项所述的MCP-1突变蛋白，权利要求13或14所述的多核酸分子或权利要求15所述的载体在制备用于治疗慢性或急性炎性疾病或自身免疫疾病的药物中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于所述炎性疾病选自类风湿性关节炎，葡萄膜炎，炎症性肠病，心肌梗死，充血性心力衰竭或局部缺血再灌注损伤。
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