KR20100049548A - 글리코사미노글리칸-길항 ｍｃｐ-1 돌연변이체 및 그것의 이용방법 - Google Patents

글리코사미노글리칸-길항 ｍｃｐ-1 돌연변이체 및 그것의 이용방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20100049548A
KR20100049548A KR1020107001235A KR20107001235A KR20100049548A KR 20100049548 A KR20100049548 A KR 20100049548A KR 1020107001235 A KR1020107001235 A KR 1020107001235A KR 20107001235 A KR20107001235 A KR 20107001235A KR 20100049548 A KR20100049548 A KR 20100049548A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mcp
protein
mutant protein
amino acid
group
Prior art date
Application number
KR1020107001235A
Other languages
English (en)
Inventor
안드레아스 쿤글
안나 마리아 피치니니
크리스티안 베버
Original Assignee
프로타핀 바이오테크놀로기 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프로타핀 바이오테크놀로기 아게 filed Critical 프로타핀 바이오테크놀로기 아게
Publication of KR20100049548A publication Critical patent/KR20100049548A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

본 발명은 야생형 MCP-1에 비하여 글리코사미노글리칸(GAG) 결합 친화도가 증가되고 GPCR 활성이 제거되거나 감소된 인간 단핵구 주화성 단백질 1(MCP-1)의 신규 돌연변이체 및 그것의 염증성 질환의 치료 용도에 관한 것이다.

Description

글리코사미노글리칸-길항 ＭＣＰ-1 돌연변이체 및 그것의 이용방법{GLYCOSAMINOGLYCAN-ANTAGONISING MCP-1 MUTANTS AND METHODS OF USING SAME}
본 발명은 야생형 MCP-1에 비하여 글리코사미노글리칸(GAG) 결합 친화도가 증가되고 GPCR 활성이 제거되거나 감소된 인간 단핵구 주화성 단백질 1(MCP-1)의 신규 돌연변이체 및 그것의 염증성 질환 치료 용도에 관한 것이다.
C 및 CX3C 케모카인 아과의 일원인 림포탁틴 및 프랙토카인/뉴로탁틴을 제외한 모든 케모카인은 각각 보존 위치에 4개의 시스테인을 갖고, N-말단 내의 2개의 시스테인 사이의 아미노산 존재 여부에 기초하여 각각 CXC 또는 α-케모카인 아과 CC 또는 β-케모카인 아과로 나뉠 수 있다. 케모카인은 세포간 메신저로서 기능하여 특정 형태의 백혈구의 활성 및 혈관의 내강에서 조직으로의 이동을 조율하는 작은 분비 단백질이다(Baggiolini M., J. Int. Med. 250, 91-104(2001)). 이러한 경우는 표적 세포의 표면 상의 7개의 막관통 G-단백질-결합 수용체(GPCR)와 케모카인의 상호 작용에 의해 매개된다. 이러한 상호 작용은 유동 상태 하 인 비보에서 발생한다. 따라서, 국소 농도 구배의 성립이 요구되고, 세포 표면 글리코사미노글리칸(GAG)과 케모카인의 상호 작용에 의해 보장된다. 케모카인은 그 수용체와 상호 작용하는 트리거링 도메인으로서 기능하는 N-말단 도메인에 하나, 그리고 도킹 도메인으로서 기능하는 제 2 시스테인 뒤에 노출된 루프 내에 다른 하나인 2개의 주요 부위를 갖는다(Gupta S.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92, (17), 7799-7803(1995)). 케모카인의 GAG 결합 부위는 공간 개별적인 염기성 아미노산의 클러스터를 포함한다(Ali S. et al., Biochem. J. 358, 737-745(2001)). RANTES 등의 일부 케모카인은 주요 GAG 결합 부위로서 40개의 루프에 BBXB 모티브를 갖고; IL-8은 프록시멀 N-루프에서 C-말단 α-헬릭스 및 Lys 20을 통해서 GAG와 상호 작용을 한다. MCP-1 등의 다른 케모카인은 수용체 결합 및 GAG 결합 부위를 포함하는 잔기 사이에서 현저한 오버랩을 나타낸다(Lau E.K. et al., J. Biol. Chem., 279(21), 22294-22305(2004)).
케모카인-β과의 사이토카인의 경우에 있어서, 단핵구 주화성 단백질-1(MCP-1)은 죽상 동맥 경화증(Nelken N.A. et al., J. Clin. Invest. 88, 1121-1127(1991); Yla-Herttuala, S., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 5252-5256(1991)), 류마티스 관절염(Koch A.E. et al., J. Clin. Invest. 90, 772-779(1992); Hosaka S. et al., Clin. Exp. Immunol. 97(3), 451-457(1994), Robinson E. et al., Clin. Exp. Immunol. 101(3), 398-407(1995)), 염증성 장질환(MacDermott R.P. et al., J. Clin. Immunol. 19, 266-272(1999)) 및 울혈성 심부전(Aukrust P. et al., Circulation 97, 1136-1143(1998), Hohensinner P.J. et al., FEBS Letters 580, 3532-3538(2006))과 같은 백혈구 풍부 염증성 요소를 특징으로 하는 각종 질환에서 발견되는 단핵구 및 림프구 특이적 주화성 인자 및 활성화 인자이다. 결정적으로, MCP-1 또는 그 수용체 CCR2가 결손된 특정 유전자 제거 마우스는 염증성 병소에 단핵구 및 T 세포를 보충할 수 없고(Grewal I.S. et al., J. Immunol. 159(1), 401-408(1997), Boring L. et al., J. Biol. Chem. 271(13), 7551-7558(1996), Kuziel W.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(22), 12053-8(1997), Lu B. et al., J. Exp. Med. 187(4), 601-8(1998)); 또한, MCP-1 중화 항체 또는 다른 생물학적 길항제로의 치료는 일부 동물 모델에서 염증을 감소시킬 수 있다(Lukacs N.W. et al., J. Immunol., 158(9), 4398-4404(1997), Flory C.M. et al., 1. Lab. Invest. 69(4), 396-404(1993), Gong J.H. et al., J. Exp. Med. 186(1), 131-7(1997), Zisman D.A. et al., J. Clin. Invest. 99(12), 2832-6(1997)). 마지막으로, LDL-수용체/MCP-1-결손체 및 apoB-형질전환체/MCP-1-결손체 마우스는 WT MCP-1 계통에 비하여 그들의 대동맥을 통한 지방 축적 및 마크로파지 축적이 현저하게 낮게 나타낸다(Alcami A. et al., J. Immunol. 160(2), 624-33(1998), Gosling J. et al., J. Clin. Invest. 103(6), 773-8(1999)).
제 1 케모카인 및 그 수용체가 동정된 이래로 정상 및 질병 생리에서의 그들의 역할을 정확하게 이해하는 것에 대한 관심이 점점 더 커지고 있다. 기존 항염증약의 작용 방식과는 다른 작용 방식의 신규 항염증약에 대한 끊임없는 요구는 신규 단백질계 GAG-길항제 및 염증군에서의 그 사용의 개발을 지지한다.
최근 몇년간 MCP-1의 CCR2 및 GAG와의 상호 작용을 분자에 기초하여 매우 상세하게 연구하여 MCP-1의 생물학적 작용의 효과적 길항제가 되도록 하는 케모카인의 표적 조작이 실현 가능하다.
이러한 목적으로, 글리코사미노글리칸 결합을 위한 그들의 야생형 카운터파트와 경쟁하고 백혈구의 활성이 감소되거나 제거된 것을 나타내는 각종 재조합형 MCP-1 변이체를 생성시켰다.
따라서, 본 발명에서의 하나의 목적은 염증성 또는 알레르기성 프로세스의 경우에 있어서 MCP-1계 돌연변이 단백질과의 GAG 상호 작용을 길항시킴으로써 백혈구, 보다 구체적으로는 단핵구 및 T 세포의 이동을 억제시키는 것이다.
본 발명은 야생형 GAG 결합 영역을 수식하거나 또는 새로운 GAG 결합 영역을 MCP-1 단백질에 도입함으로써 인간 MCP-1로의 GAG 결합 친화도를 보다 높게 조작하고, 동시에 그 GPCR 활성, 구체적으로는 케모카인의 CCR2 활성을 제거하거나 감소시키는 것에 기초한다. 이것은 MCP-1 단백질의 영역이 염기성 및/또는 전자 공여성 아미노산을 도입하거나 천연 아미노산을 염기성 및/또는 전자 공여성 아미노산으로 대체하고, 선택적으로 아미노산을 첨가, 제거 및/또는 대체함으로써 상기 MCP-1 단백질의 N-말단 영역을 수식하고, 선택적으로 돌연변이 MCP-1 단백질에 N-말단 메티오닌(M)을 첨가함으로써 구조 보존 방식으로 MCP-1 단백질의 영역이 수식됨으로써 주화능이 일부 또는 전부 제거된 돌연변이 MCP-1 단백질을 성공적으로 얻었다. 상기 본 발명의 MCP-1 돌연변이체는 특히 표준 GAG에 대하여 최소 5배 향상된 Kd를 나타낼 수 있고(헤파린 또는 헤파란술페이트), 그들은 표준 단핵구 세포 배양에서 칼슘 방출 유발을 부족하게 하거나 감소시킨다.
증가된 GAG 결합 친화도와 감소된 GPCR 활성을 나타내는 MCP-1 돌연변이 단백질은 이전에 공개되거나 나타나지 않았다. US 2003/0162737에는 N-말단이 삭제되고 또한 MCP-1 단백질의 선택된 22 및 24의 위치가 아미노산 N 또는 L로 대체된 MCP-1 분자가 기재되어 있지만, 이들 돌연변이 단백질은 본 발명의 MCP-1 단백질의 유리한 특성을 나타내지 않는다. 또한, 이것은 MCP-1 단백질의 13 및 18 위치만을 수식한 Steitz S. et al(FEBS Letters, 40(1998), pp. 158-164)에 의해 공개된 것이 아니다. Paavola C. et al.(J. Biol. Chem., 1998, 273, pp. 33157-33165)는 수용체 결합활성에는 관련이 있지만, 돌연변이 MCP-1 단백질의 GAG 결합 친화도를 감소시키는 수식을 포함하지 않는 MCP-1 돌연변이체만을 기재한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 돌연변이 MCP-1 단백질을 코딩하는 분리된 폴리핵산 분자, 및 돌연변이 MCP-1 단백질을 코딩하는 분리된 DNA 분자를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 트랜스펙트된 재조합 세포를 제공한다.
본 발명에 따른 돌연변이 MCP-1 단백질은 돌연변이 MCP-1 단백질 또는 MCP-1 돌연변이 단백질을 코딩하는 폴리핵산 분자, MCP-1 돌연변이 단백질을 코딩하는 분리된 DNA 분자를 함유하는 벡터, 및 약제학적으로 허용되는 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물로서도 제조될 수 있다.
또한, 상기 MCP-1 돌연변이 단백질 또는 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터는 각각의 야생형 단백질의 생물학적 활성을 저해 또는 억제하기 위해서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 MCP-1 돌연변이 단백질, 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터는 만성 또는 급성 염증성 질환 또는 알레르기 상태를 치료하기 위한 약제를 제조하는 방법에서 사용될 수도 있다. 바람직하게는 상기 질환은 류마티스 관절염, 포도막염, 염증성 장질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전 또는 허혈 재관류 손상을 포함하는 군에서 선택된다.
도 1은 MCP-1 돌연변이체의 서열을 나타내고, 야생형 케모카인에 대한 돌연변이체는 밑줄 그었다.
도 2는 원자외선 CD 분광법으로 나타내어진 바와 같은 헤파란술페이트 결합에 따른 wtMCP-1(도 2a) 및 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R(도 2b)의 구조적 변화를 나타낸다.
도 3은 비분획 HS에 결합하는 WT MCP-1(채워진 사각형), Met-MCP-1 Y13A S21K(채워진 삼각형) 및 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R(채워지지 않은 원형)의 스캐차드 플롯 분석 및 평형 해리 상수(Kd값)를 나타낸다.
도 4는 THP-1 세포 상에 20nM wtMCP-1 및 MCP-1 돌연변이체(각각 20nM)에 의해 유발된 칼슘 인플럭스 분석을 나타낸다. 케모카인의 첨가에 의해 유발된 칼슘 동원으로 인하여 495nm에서의 형광 방출의 변화가 나타내어진다: wtMCP-1(A), Met-MCP-1 Y13A S21K(B), Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R(C) 및 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R V47K(D).
도 5는 10nM의 농도에서 wtMCP-1 및 MCP-1 돌연변이체에 의해 유발된 THP-1 세포의 주화성을 나타낸다(오차 막대는 3개의 독립 실험의 SEM을 나타냄). 1 wtMCP-1, 2 Met-MCP-1, 3 Met-MCP-1 Y13A S21K, 4 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R, 5 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R V47K.
도 6은 뮤린의 엑스 비보 경동맥 손상 모델에서 측정된 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R(화합물 코드 PA05-008로 기재됨)에 의해서 단핵구 부착/배출의 용량 의존 저해를 나타낸다.
도 7은 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R로 치료한 후 자가면역 포도막염의 래트 모델에서의 임상학적 및 조직학적 점수의 향상을 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 뮤린의 심근 경색증 모델에서의 허혈 재관류 손상에 대한 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R(PA008로 나타냄)의 효과를 나타낸다.
도 9는 MCP-1 Y13A S21K V47K, MCP-1 Y13A S21K Q23R, MCP-1 Y13A S21K Q23R V47K의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
본 발명에서 구체화된 모든 치수는 실시예만을 위한 것으로 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 도면에 나타내어진 비율로 할 필요는 없다.
GAG 결합 영역에서의 염기성 및/또는 전자 공여성 아미노산의 상대량을 증가시킴으로써 증가된 GAG 결합 친화도를 도입함으로써(WO 05/054285에도 기재됨, 본 명세서 전체에 참조로서 도입됨) 천연 GAG 결합 단백질과 경합체로서 작용하는 수식 단백질로 할 수 있는 것을 알 수 있다. 이것은 특히 인터류킨-8에 있어서 나타내어져 있다. 적어도 2개의 염기성 및/또는 전자 공여성 아미노산의 선택적 도입에 의한 GAG 결합 영역 및 그들의 수식의 특정 위치는 MCP-1 단백질에 관해서 공개되어 있지 않다.
또한, MCP-1의 아미노 말단은 그 GPC 수용체 CCR2를 통한 케모카인 신호에 필수적인 것으로 밝혀졌다. MCP-1계 CCR2 길항체를 조작하기 위해서, 그외의 것은 GAG 결합을 완전하게 제거하고 CCR2 결합 인택트를 남기는 방식으로 MCP-1을 조작했다(WO 03084993A1). 이들 방법에 의해서, 호중구 상의 CCR2 수용체를 차단함으로써 MCP-1 매개 신호를 차단하고, GAG쇄를 통한 내피 상의 부착을 방지하도록 의도되었다. 따라서, 내피 상의 GAG쇄를 차단함으로써(GAG 결합 친화도를 높게 조작함으로써) 이러한 접근을 돌리고, MCP-1의 CCR2 결합을 제거하는 것은 명백하지 않았다.
이제, 본 발명은 야생형 MCP-1 단백질에 비하여 GAG 결합 친화도가 증가되고 GPCR 활성이 감소된 신규 MCP-1 돌연변이 단백질을 제공하고, 여기에서 MCP-1 단백질의 영역은 적어도 1개의 염기성 및/또는 전자 공여성 아미노산을 삽입하거나 바람직하게는 천연 GAG 결합 부위 또는 천연 GAG 결합 부위의 구조 부근 내의 적어도 2개의 아미노산을 적어도 2개의 염기성 및/또는 전자 공여성 아미노산으로 대체함으로써 구조 보존 방식으로 수식된다.
특정 실시형태에 따르면, 수식 MCP-1 단백질은 상기 MCP-1 단백질의 N-말단 영역의 첫번째 1~10 아미노산 중 적어도 1개의 아미노산을 적어도 1개의 아미노산 잔기로 첨가, 삭제 및/또는 대체함으로써 더 수식하는 것을 더 포함한다.
상기 염기성 또는 전자 공여성 아미노산으로 대체된 천연 아미노산이 염기성 아미노산이면, 치환하는 아미노산은 천연 아미노산 잔기에 비하여 보다 염기성인 아미노산이거나 또는 구조적 가요성을 보다 더 또는 덜 포함해야 한다. 본 발명에 따른 구조적 가요성은 GAG 리간드 결합의 결과로서 유도 적합의 조정 정도로 정의된다.
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 염기성 및/또는 전자 공여성 아미노산으로 대체된 천연 아미노산은 비염기성 아미노산이다.
본 발명의 명세서에 사용된 정의에 따르면, MCP-1 돌연변이 단백질은 단핵구 또는 T 세포 주화성 및 Ca 방출과 같이 여전히 케모카인 활성을 나타내는 그것의 임의의 부분 또는 단편도 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 정의된 상기 용어 "부근"은 GAG 결합 부위의 입체배좌 주변에 위치하지만 GAG 결합 부위에 위치하지 않은 아미노산 잔기를 포함한다. 입체배좌 주변은 단백질의 아미노산 서열 중 GAG 결합 아미노산 잔기에 인접하게 위치한 아미노산 잔기 또는 단백질의 3차원 구조 또는 폴딩으로 인한 입체배좌적으로 인접한 아미노산 중 어느 하나로서 정의될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 용어 "인접한"은 수식되는 각각의 아미노산 잔기의 컷오프 반경이 20nm 이하, 바람직하게는 15nm, 바람직하게는 10nm, 바람직하게는 5nm 이내인 것으로서 정의된다.
그 생물학적 기능을 행할 수 있게 하기 위해서, 단백질은 수소 결합, 이온 상호 작용, 반데르발스의 힘 및 소수성 패킹 등의 다수의 비공유 상호 작용에 의해 결정되는 1개, 또는 그 이상의 특이적 공간적 입체배좌로 폴딩된다. 3차원 구조는 X선 결정법 또는 NMR 분광법과 같은 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다.
천연 GAG 결합 부위의 동정은 돌연변이 실험에 의해 측정할 수 있다. 단백질의 GAG 결합 부위는 단백질의 표면에 위치한 염기성 잔기를 특징으로 한다. 이들 영역이 GAG 결합 부위인지의 여부를 시험하기 위해서, 이들 염기성 아미노산 잔기를 돌연변이화시킬 수 있고, 헤파린 결합 친화도의 감소를 측정할 수 있다. 이것은 기술 분야에 공지된 임의의 친화도 측정 기술에 의해 행할 수 있다.
염기성 또는 전자 공여성 아미노산의 삽입 또는 치환에 의해 합리적으로 고안된 돌연변이 생성을 행하여 GAG 결합 부위의 크기를 증가시키고 GAG 결합 친화도를 증가시킬 수 있도록 외부 아미노산을 천연 GAG 결합 부위의 부근에 도입시킬 수 있다.
또한, GAG 결합 부위 또는 상기 부위의 부근은 US 6107565에 상세하게 기재되어 있는 하기 방법에 의해 검출할 수 있다:
(a) 단백질 및 상기 단백질에 결합된 GAG 리간드 분자, 예를 들면 헤파린술페이트(HS), 헤파린, 케라틴술페이트, 콘드로이틴술페이트, 더마탄술페이트 및 히알루론산 등을 포함하는 착체를 제공하는 단계;
(b) 상기 착체를 상기 GAG 리간드 분자가 결합된 단백질의 영역의 단백질 분절을 상기 GAG 리간드 분자가 차단하는 단백질을 분절시킬 수 있는 프로테아제, 예를 들면 트립신과 같은 분절 시약과 접촉시켜 상기 단백질을 상기 결합된 GAG 리간드 분자로 차단되지 않은 영역에서 분절시키는 단계; 및
(c) 분절 펩티드를 분리 및 검출하는 단계로서, 상기 단백질의 영역에서의 분절이 발생하지 않은 것은 상기 GAG 리간드 분자가 상기 영역에 결합된 것을 나타내고, 예를 들면, LC-MS, nanoHPLC-MS/MS 또는 질량 분광법에 의해서 검출할 수 있는 분절 펩티드를 분리 및 검출하는 단계를 포함하는 방법.
GAG 결합 부위를 도입 또는 개선하기 위한 프로토콜은 예를 들면, WO 05/054285에 일부 기재되어 있고, 하기와 같을 수 있다.
- GAG 결합에 관련된 단백질의 영역을 동정한다.
- 임의의 위치에 적어도 1개의 염기성 또는 전자 공여성 아미노산, 바람직하게는 Arg, Lys, His, Asp 및 Gln 잔기를 도입(대체 또는 삽입)하거나 또는 GAG 결합에 간섭하는 적어도 2개의 아미노산을 삭제함으로써 새로운 GAG 결합 부위를 고안한다.
- 실리카 중에 얻어진 돌연변이 단백질의 입체배좌 안정성을 확인한다.
- 야생형 단백질 cDNA을 제공한다(대안: cDNA를 구입함).
- 이것을 PCR-보조 돌연변이 생성을 위한 템플릿으로서 사용하여 상술한 변화를 아미노산 서열에 도입한다.
- 돌연변이 유전자를 적절한 발현 시스템(생물학적으로 요구되는 번역 후 수식에 의존적인 원핵 또는 진핵)에 서브클로닝한다.
- 인비트로에서의 돌연변이 단백질의 발현, 정제 및 특징화.
GAG 결합 친화도의 증가 기준: Kd GAG(돌연변이)≤10μM
- 원자외선 CD 분광법 또는 1-D NMR 분광법에 의해 구조적 보존을 확인한다.
30% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만인 야생형 MCP-1 구조로부터의 원자외선 CD 분광법으로 측정된 수식 구조의 편차는 본 발명에 따른 구조 보존 수식으로서 정의된다.
다른 실시형태에 따르면, 구조 보존 수식은 MCP-1 단백질의 N-말단 내에 위치되지 않는다.
wtMCP-1의 GAG 결합 도메인에 관련된 열쇠 잔기는 S21, Q23 및/또는 V47이다. 본 발명에 따르면, MCP-1 돌연변이 단백질은 21, 23 및/또는 47 위치에서 적어도 2개의 아미노산 잔기 내에서 적어도 2개의 아미노산 수식을 함유해도 좋다.
상기 수식은 예를 들면, 적어도 2개의 염기성 또는 전자 공여성 아미노산의 치환 또는 대체일 수 있다. 전자 공여성 아미노산은 전자 또는 수소 원자를 공여하는 아미노산이다(Droenstedt 정의). 구체적으로는 이들 아미노산은 N 또는 Q일 수 있다. 염기성 아미노산은 R, K 및 H로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 아미노산 18 위치의 R은 K로 수식될 수 있고, 및/또는 K19 위치는 R로 변경될 수 있으며, 및/또는 P8은 임의의 아미노산 치환기에 의해 수식되어 수식된 MCP-1의 수용체 결합을 적어도 일부 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 MCP-1 돌연변이 단백질은 13 위치의 Y가 임의의 아미노산 잔기, 바람직하게는 A로 더 치환되는 것을 특징으로 한다.
또한, Y13 및 R18은 신호 전달에 대단히 중요한 잔기인 것으로 나타내어졌고, 이들 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체함으로써 주화성을 유발할 수 없는 단백질을 생성한다. 삭제 및 치환 MCP-1 이형체 모두에 기록된 2차원 1H-15N HSQC 스펙트럼에 의해 이들 돌연변이는 미스폴딩 단백질을 생성하지 않는다는 것을 알 수 있었다(Chad D. Paavola et al., J. Biol. Chem., 273(50), 33157-33165(1998)).
또한, N-말단 메티오닌은 THP-1 세포 상의 CCR2에 대한 MCP-1의 결합 친화도를 감소시켜(Hemmerich S. et al., Biochemistry 38(40), 13013-13025(1999)) [Met]-MCP-1의 주화능은 야생형보다 약 300배 낮다(Jarnagin K. et al., Biochemistry 38, 16167-16177(1999)). 이것은 주화성을 유발하지는 않지만 수용체에 대한 친화도가 높게 결합하는 강력한 수용체 길항체 [Met]-RANTES와 대조적이다.
따라서, 본 발명의 다른 실시형태에 따르면 MCP-1 돌연변이 단백질은 헤파린에 대한 겉보기 친화도가 증가되는 것으로 보이는 N-말단 메티오닌을 유지하는 N-말단 Met. MCP-1 변이체를 함유해도 좋다(Lau E.K. et al., J. Biol. Chem. 279(21), 22294-22305(2004)).
본 발명에 따르면, 수식될 수 있는 야생형 MCP-1 영역의 N-말단 영역은 첫번째 1~10 N-말단 아미노산을 포함한다. 또한, 본 발명의 MCP-1 돌연변이 단백질은 삭제된 N-말단 아미노산 잔기 2~8을 가질 수 있다. 잔기 2~8의 삭제([1+9-76]hMCP-1)는 주화성을 유발할 수 없는 단백질을 생성한다.
구체적으로는 MCP-1 돌연변이 단백질은 Met-MCP-1 Y13A S21K V47K, Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R 및 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R V47K의 군에서 선택될 수 있다.
GPCR 활성을 제거하고, 동시에 가능한 한 수식의 수를 최소화하는 GAG에 대한 친화도를 향상시키기 위해서, 생물 정보학적 및 생물 구조학적 수단을 사용하여 부위 특이적 MCP-1 돌연변이체를 고안했다. 이것은 wtMCP-1의 구조가 알려져 있기 때문에 돌연변이체가 합리적으로 고안되었다는 것을 의미한다. 이것은 GAG 결합 친화도를 높이기 위해서, GAG 결합에 직접적으로 관련되어 있지 않고 구조적으로 덜 중요하며, K 또는 R 등의 염기성 아미노산 부근에서 용매에 노출된 아미노산을 대체함으로써 보다 많은 GAG 결합 부위가 기존의 GAG 결합 도메인에 도입된다는 것을 의미한다. 그렇게 함으로써, MCP-1의 특정 GAG 상호 작용 부위, 즉 케모카인의 전체 폴드뿐만 아니라 GAG 리간드와의 수소 결합 및 반데르발스 접촉을 책임지고 있는 아미노산도 보호하여 MCP-1의 표면에 함유된 단백질-단백질 상호 작용에 의존하는 케모카인 네트워크에 침투하는 케모카인의 능력을 보호하는데 특별히 주의를 끌었다.
수식된 MCP-1 분자의 아미노산 서열은 하기 일반식으로 기재될 수 있다.
(M)nQ(PDAINA(Z1))mVTCC(X1)NFTN(Z2)(Z3)I(X2)V(X3)RLASYRRITSSKCPKEAVIFKTI(X4) AKEICADPKQ KWVQDSMDHL DKQTQTPKT
여기에서, Z1은 P 및 A, G, L의 군에서 선택되고, 바람직하게는 A이며,
여기에서, Z2는 R 및 K의 군에서 선택되고,
여기에서, Z3은 K 및 R의 군에서 선택되며,
여기에서, X1은 Y 및 A로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 A이며,
여기에서, X2는 S, R, K, H, N 및 Q로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 K이며,
여기에서, X3은 R, K, H, N 및 Q로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 R이며,
여기에서, X4는 V, R, K, H, N 및 Q로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 K이며,
여기에서 n 및/또는 m은 0 또는 1 중 어느 하나이고, 여기에서 X2, X3 또는 X4 위치 중 적어도 2개가 변형된다.
본 발명의 다른 실시형태는 상술한 바와 같은 본 발명의 단백질을 코딩하는 분리된 폴리핵산 분자이다.
구체적으로는 SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8 또는 SEQ ID No. 9의 뉴클레오타이드 서열 또는 적어도 그들 중 일부를 포함하는 분리된 폴리핵산 분자도 포함된다.
상기 폴리핵산은 DNA 또는 RNA여도 좋다. 이로써, 본 발명의 MCP-1 돌연변이 단백질에 이르게 하는 수식은 DNA 또는 RNA 레벨로 행해진다. 이러한 본 발명의 분리된 폴리핵산 분자는 유전자 치료뿐만 아니라 진단법에도 그리고 본 발명의 MCP-1 돌연변이 단백질의 대량 제조에도 적합하다.
또한, 상기 분리된 폴리핵산 분자는 엄격한 조건 하에 상기 정의된 본 발명의 폴리핵산 분자에 혼성화된다. 혼성화 조건에 따르면, 완벽하게 일치시키거나 또는 비일치 염기를 포함시킴으로써 2개의 DNA 또는 RNA 분자 사이에 상보적 듀플렉스를 형성한다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, N.Y. 1989 참조). 약 50개의 뉴클레오타이드보다 길이가 긴 프로브는 25~30%까지의 비일치 염기를 이룰 수도 있다. 보다 적은 프로브가 보다 적은 비일치를 이룰 것이다. 표적 및 프로브의 비일치 염기쌍을 함유하는 듀플렉스를 형성하는 경향은 그 자체가 혼성화 버퍼 중의 염 또는 포름아미드의 농도, 혼성화 온도 및 혼성화 후 세정 조건 등의 요인의 기능인 혼성화 조건의 엄격성에 의해 제어된다. 혼성 듀플렉스의 형성시 발생하는 공지의 원칙을 적용함으로써, 당업자에 의해 각종 혼성화 버퍼, 온도 및 세정 조건 중에서 선택함으로써 소망의 엄격성을 갖는 조건이 이루어질 수 있다. 따라서, 조건은 완벽한 일치 또는 부분 일치 혼성 듀플렉스 중 어느 하나의 검출을 허용하도록 선택될 수 있다. 듀플렉스의 융점(Tm)은 적절한 혼성화 조건을 선택하는데 유용하다. 일반적으로 200개의 뉴클레오타이드의 길이를 초과하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 대한 엄격한 혼성화 조건은 소망의 듀플렉스의 융점 이하인 15~25℃의 온도에서 혼성화하는 것을 포함한다. 긴 프로브보다 덜 안정한 듀플렉스를 형성하는 30개의 뉴클레오타이드를 초과하는 올리고뉴클레오타이드 프로브에 관해서는 일반적으로 Tm 이하인 5~10℃에서 혼성화시킴으로써 엄중한 혼성화가 이루어진다. 핵산 듀플렉스의 Tm은 핵산에 함유된 G+C 백분율에 기초하고, 쇄 길이를 고려하는 Tm=81.5-16.6(log[NA+]+0.41(% G+C)-(600/N)(여기에서, N=쇄 길이) 등의 식을 사용하여 산출될 수 있다.
다른 실시형태는 상기에 정의된 바와 같이, 본 발명에 따른 분리된 DNA 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 단백질의 효율적인 표현뿐만 아니라 효율적인 감염에 필요한 모든 조절 요소를 포함한다. 이러한 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있고, 임의의 적합한 벡터를 이러한 목적으로 선택할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 상술한 바와 같이 본 발명의 벡터가 트랜스펙트된 재조합 세포에 관한 것이다. 세포의 트랜스펙트 및 재조합 세포의 배양은 당업에 알려진 바와 같이 행해질 수 있다. 이러한 재조합 세포뿐만 아니라 그들로부터 유래된 임의의 세포도 벡터를 포함한다. 이로써, 연속적으로 또는 벡터에 따른 활성에 따라서 MCP-1 돌연변이 단백질을 발현하는 세포주가 제공된다.
본 발명의 다른 실시형태는 상기에 정의된 바와 같이 본 발명에 따른 MCP-1 돌연변이 단백질, 폴리핵산 또는 벡터, 및 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 물론, 상기 약제학적 조성물은 염, 버퍼, 에멀젼, 착색제 등의 약제학적 조성물에 일반적으로 존재하는 부가적 물질을 더 포함해도 좋다.
본 발명의 다른 실시형태는 각각의 야생형 단백질의 생물학적 활성을 인 비보 또는 인비트로 중 어느 하나에서 저해 또는 억제하기 위한 방법에 있어서 상기에 정의된 바와 같이 본 발명에 따른 MCP-1 단백질, 폴리 핵산 또는 벡터의 용도에 관한 것이다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 MCP-1 돌연변이 단백질은 길항제로서 작용하여 공지의 재조합 단백질에 의해 발생하는 부작용이 본 발명의 MCP-1 돌연변이 단백질에 의해서는 발생하지 않을 것이다. 이러한 경우, 이것은 특별하게 염증 반응에 관련된 생물학적 활성일 것이다.
따라서, 상기 정의된 바와 같이 본 발명의 MCP-1 단백질, 폴리핵산 또는 벡터의 다른 용도는 염증 상태의 치료를 위한 약제의 제조방법에서의 용도이다. 특히, 그것은 부작용이 없는 길항제로서 작용할 것이고, 특히 만성 또는 급성 중 어느 하나의 염증성 질환 또는 상태의 치료에 적합할 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 실시형태는 본 발명에 따른 MCP-1 돌연변이 단백질, 본 발명에 따른 분리된 폴리핵산 분자 또는 벡터 또는 본 발명에 따른 약제학적 조제를 환자에게 투여하는 염증성 질환 또는 알레르기 상태의 치료 방법이기도 하다.
보다 구체적으로는 염증성 질환 또는 알레르기 상태는 천식, 알레르기성 비염, COPD, 과민성 폐질환, 과민성 폐렴, 간질성 폐질환(예를 들면, 특발성 폐섬유화증, 또는 자가면역 질환에 관련됨), 아나필락시스 또는 과민성 반응, 약물 알레르기 및 곤충의 자상 알레르기 등의 호흡기 알레르기성 질환; 크론병 및 궤양성 대장염 등의 염증성 장질환; 척추염, 경피증; 피부염, 습진, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 두드러기 등의 건선 및 염증성 피부 질환; 혈관염; 관절염(예를 들면, 류마티스 관절염, 만성 지속 관절염, 건선성 관절염 및 변형성 관절염) 등의 염증성 요소를 포함하는 병인을 갖는 자가면역 질환 및 염증 상태 및 류마티스 질환 관련 골손실, 염증성 통증, 과민증(기도 과민증 및 피부 과민증 모두 포함) 및 알레르기를 포함하는 류마티스 질환이다. 특정 자가면역 질환은 자가면역 혈액 장애(예를 들면, 용혈성 빈혈, 재생 불량성 빈혈, 순적혈구 빈혈 및 원인 불명의 혈소판 감소증 포함), 전신 홍반성 낭창, 다발 연골염, 웨그너 육아종증, 피부근염, 만성 활동성 간염, 중증 근무력증, 건선, 스티븐-존슨 증후군, 자가면역 염증성 장질환(예를 들면, 궤양성 대장염, 크론병 및 과민성 대장 증후군 포함), 자가면역 갑상선염, 베체트병, 내분비성 안 질환, 그레이브스병, 유육종증, 다발성 경화증, 원발성 담즙 간경변, 소아 당뇨(제 1 형 당뇨병), 포도막염(선척적 및 후천적), 건성 각결막염 및 춘계 각결막염, 간질성 폐 섬유화증, 및 사구체신염(신증후군 동반 및 비동반, 예를 들면, 특발성 신증후군 또는 미세 변화 신증후군); 동종 이식편 거부 반응 또는 이종 이식편 거부 반응 또는 이식편 대 숙주병을 포함하는 이식편 거부 반응(예를 들면, 심장, 폐, 심장-폐 조합, 간, 신장, 이자, 피부, 또는 각막 이식을 포함하는 이식시), 및 장기 이식 관련 동맥 경화증; 죽상 동맥 경화증; 피부 또는 장기의 백혈구 침윤이 있는 종양; 신생 내막 증식뿐만 아니라 혈관 간섭에서 초래되는 협착증 또는 재협착증을 포함하는 혈관, 특히 동맥, 예를 들면 관상 동맥의 협착증 또는 재협착증; 및 허혈 재관류 손상, 혈액 종양, 사이토카인 유도 독성(예를 들면, 패혈성 쇼크 또는 내독 쇼크), 다발성 근염, 피부근염, 및 유육종증을 포함하는 육아종증 질환을 포함하는 염증성 반응과 관련된 다른 질환 또는 상태를 포함한다.
바람직하게는 상기 염증성 질환은 류마티스 관절염, 포도막염, 염증성 장질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전증 또는 허혈 재관류 손상을 포함하는 군에서 선택된다.
하기 실시예는 본 발명의 범위를 한정하지 않고 보다 상세하게 본 발명을 설명한다.
실시예
본 발명에서 사용된 동물 모델뿐만 아니라 경동맥 손상 모델은 Prof. Christian Weber(Universitatsklinikum Aachen)의 실험실에서 행해졌다.
<GAG 결합에 따른 MCP-1 돌연변이체의 구조 분석>
원자외선 CD 분광법에 의한 MCP-1 돌연변이체의 제 2 차 구조 요소의 분석은 알파/베타/턴스의 전체 비가 단백질 고안 동안에 보존되었다는 것을 나타냈다. 또한, 단백질 언폴딩 연구는 특히 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R이 야생형 단백질에 비하여 이들 단백질 변이체와 유사한 안정성을 나타내는 매우 유사한 언폴딩 전이 파라미터를 나타냈다는 것을 나타냈다. 또한, wtMCP-1에서 발견된 HS 결합에 의해서 유발된 작은 제 2 차 구조 변화는 MCP-1 돌연변이체에서 재생성되었다(예를 들면, 도 1의 wtMCP-1 및 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R). 그러나, 온도 유도 언폴딩 연구에 의해 측정된 2종의 단백질 모두의 안정성은 HS의 존재하에 현저하게 향상되었다. 이것은 다른 케모카인과는 대조적으로 HS는 그들의 제 2 차 구조보다 강하게 MCP-1의 변이체의 폴드에 영향을 준다는 것을 의미한다. 이것은 GAG 결합에 따른 구조 유도를 겪은 GAG의 부재시 MCP-1의 일부 연장되고 일부 비구조화된 형태로 인하여 보다 컴팩트한 폴드가 되어 안정성이 보다 큰 것이어도 좋다.
<GAG 결합 친화도의 증가>
Biacore 3000 시스템을 사용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해서 증가된 GAG 결합 친화도를 측정했다. 확보된 프로토콜(28)에 따라서 스트렙트아비딘이 코팅된 CM4 센서칩 상에 비오틴화 HS의 고정을 행했다. 실제 결합 상호 작용은 0.01%(v/v) P20 계면활성제(BIAcore AB)를 함유하는 PBS pH 7.4 중 25℃에서 기록되었다. 60㎕/분의 유속에서의 다른 단백질 농도의 주입 2.5분에 이어 버퍼에서의 해리 기간 5분 및 완전한 재생을 위한 1M NaCl의 펄스가 이어졌다. 각각의 센소그램의 플래토에 따른 HS 표면에 결합한 단백질의 최대 반응 신호는 스캐차드 플롯 분석 및 평형 해리 상수(Kd값)의 산출에 사용했다. 도 3에 wtMCP-1 및 2개의 돌연변이의 스캐차드 플롯을 나타낸다. wtMCP-1은 1.26μM의 Kd값을 부여했고, Met-MCP-1 Y13A S21K는 676nM을 생산했고, Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R은 152nM를 부여했다. 이것은 후자 돌연변이체에 있어서 >8의 요인에 의해 HS에 대한 친화도가 향상되었다는 것을 의미한다. Met-MCP-1 Y13A S21K V47K 돌연변이체는 천연 HS 리간드에 대한 친화도에 있어서 어떠한 향상도 나타내지 않았다.
<GPCR 활성의 제거>
우성-음성 MCP-1을 얻기 위해서, 향상된 GAG 결합 친화도 이외에 MCP-1의 GPCR 활성도 제거했다. 이것은 13 위치에서의 티로신 잔기를 알라닌 잔기로 대체하고, N-말단 메티오닌 잔기를 유지함으로써 이루어졌다. 이것은 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R 변이체의 경우에 Ca 인플러스 및 Thp-1 주화성의 완전한 부재(도 4 및 도 5)로 예시되는 바와 같이, MCP-1 관련 CCR2 활성을 완전하게 제거하게 했다. 표적 단핵구 세포 상의 고친화도 GPC 수용체를 활성화시키는 이러한 변이체의 불능은 증가된 GAG 결합 친화도와 조합으로 인 비보 MCP-1 활성의 잠재적 저해제가 되는 것이 기대된다.
<세포 이동의 저해>
단핵구 이동에 대한 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R의 효과는 엑스 비보 모델에서 조사되었다. 이러한 목적으로, 아폴리포단백질 E-결손체(Apoe)-/-마우스는 동맥경화성 식이 1주 후 와이어로 유도된 내피 제거 손상을 행했다(1). 24시간 후에 (1)에 상술된 바와 같이 경동맥을 엑스 비보 관류를 위해 분리했다. 경동맥을 5㎕/분에서 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R로 1, 5 또는 10㎍/ml의 농도로 30분 동안 미리 관류했다. Mono Mac 6 세포(1'106/ml)는 칼세인-AM으로 라벨링하고, 2회 세정하고, 경동맥을 통해 관류했다. 손상된 혈관벽의 부착성 상호 작용은 스트로보스코픽 표면 형광 조명(Drelloscop 250, Drello) 및 Olympus BX51 현미경을 사용하여 관류 10분 후에 기록했다. 이러한 방법에 의해서, Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R에 의한 단핵구 부착의 농도 의존성 저해를 관찰했다(도 6 참조).
<자가면역 포도막염의 저해/향상>
루이스 래트 양쪽 뒷다리에 결핵균주 H37RA(BD, Heidelberg, Germany)를 가지고 최종 농도 2.5mg/ml로 강화된 프로인트 완전 면역 보강제 중 15㎍ PDSAg(리티날 펩티드)를 함유하는 전체 용적 200㎕ 에멀젼을 주사했다. 0.5ml PBS에 용해된 100㎍ Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R 돌연변이체(또는 대조군으로서 PBS만)를 능동 면역 후 1일부터 19일까지 매일 가했다. 검안경으로 동물을 매일 검사함으로써 질환의 시간 경로를 측정했다. 포도막염은 설명된 바와 같이 임상학적으로 분류했고(Gong J.H. 및 Clark-Lewis I., J. Exp.Med. 181(2), 631-640(1995)), 모든 양안의 평균 임상 점수는 군 및 일 당으로 나타내어진다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R 돌연변이체는 질환의 진행에 현저한 효과를 가졌다. 포도막염은 최종적으로 맹안에 이르게 하는 T 세포 및 단핵구의 안구 축적을 특징으로 하므로, Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R의 치료 효과는 단핵구 및 호염기구를 주로 구성하는 CCR2-활성화 백혈구의 이동을 저해하는 것에 속할 수 있다.
<심근 경색증의 저해/향상>
일반적인 마취(100mg/kg 케타민 및 10mg/kg 크실라신, 근육 주사) 하에 C57/B6 마우스를 삽관하고, 인공 호흡기를 사용하여 산소 및 이소플루란 0.2%로 양압 환기를 유지했다. 심장은 좌측 개흉술을 통해 노출시키고, 2mm 실리콘 튜브를 거친 좌전측 하행 전동맥(LAD)의 봉합 폐쇄에 의해서 MI를 제조했다. 30분 후에 실리콘 튜브를 커팅함으로써 봉합을 개방하고, 관류를 다시 수립했다. 동시에 동일 처치 대조군 마우스에서의 봉합은 개방된 채로 두었다. 근육층 및 피부 절개는 실크 봉합으로 덮었다. 동물 실험은 지방 정부 당국에 의해 승인되었고, 독일 동물 보호법에 따랐다.
Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R을 PBS에 100㎍/ml로 용해시켰다. 허혈시(결찰 10분 후) 각각 100㎕의 근육 주사로 관류 2시간 후, 그리고 종말점까지 매일 마우스를 치료했다. 대조군 마우스는 비히클을 가지고 동일한 방법으로 치료했다.
표시된 시간점에서, 마우스를 마취하고, 일정 혈류압(100mmHg) 및 일정 심박을 확보하기 위한 전기 자극(600bpm) 하에 Langendorff 장치(Hugo Sachs Elektronik-Harvard Apparatus) 및 HSE Isoheart 소프트웨어를 사용하여 심장 기능을 분석했다. 관상 동맥 혈류, 향상된 혈압, 좌심실압의 증가(dP/dtmax) 및 감소(dP/dtmin)가 도부타민없이 또는 도부타민으로(1회 300μ몰) 측정되었다. 측정된 파라미터는 도 8(상부 패널)에 나타내어진다. 마지막으로, 심장을 10% 포르말린으로 팽창시켜 고정시키고, 5㎛ 연속 슬라이스로 커팅했다.
연속 영역(마우스당 10~12개, 400㎛ 마다, 승모판까지)을 Gomori의 1단계 트리크롬 염색으로 염색시켰다. 경색 영역은 Diskus 소프트웨어(Hilgers)를 사용하여 영역마다 측정하여, 전체 좌심실 용적으로부터의 백분율로 나타냈다(도 8 참조, 하부 패널).
SEQUENCE LISTING <110> Protaffin Biotechnologie AG <120> Glycosaminoglycan-antagonising MCP-1 mutants and methods of using same <130> R 52404 <150> US 60/953140 <151> 2007-07-31 <150> EP 07450166.9 <151> 2007-09-27 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr 1 5 10 15 Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala 35 40 45 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met 50 55 60 Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 2 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified MCP-1 protein <400> 2 Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe 1 5 10 15 Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile 20 25 30 Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val 35 40 45 Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser 50 55 60 Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 3 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified MCP-1 protein <400> 3 Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Ala Asn Phe 1 5 10 15 Thr Asn Arg Lys Ile Lys Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile 20 25 30 Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val 35 40 45 Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser 50 55 60 Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 4 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified MCP-1 protein <400> 4 Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Ala Asn Phe 1 5 10 15 Thr Asn Arg Lys Ile Lys Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile 20 25 30 Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Lys 35 40 45 Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser 50 55 60 Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 5 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified MCP-1 protein <400> 5 Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Ala Asn Phe 1 5 10 15 Thr Asn Arg Lys Ile Lys Val Arg Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile 20 25 30 Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val 35 40 45 Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser 50 55 60 Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 6 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified MCP-1 protein <400> 6 Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Ala Asn Phe 1 5 10 15 Thr Asn Arg Lys Ile Lys Val Arg Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile 20 25 30 Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Lys 35 40 45 Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser 50 55 60 Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 7 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence of modified MCP-1 protein Y13AS21KV47K <400> 7 atgcaaccgg acgctatcaa cgcaccggtt acttgttgtg cgaacttcac caaccgtaag 60 atcaaagttc agcgtctggc tagctaccgt cgtatcacga gctctaaatg cccgaaagaa 120 gctgttatct tcaaaaccat caaagctaaa gaaatctgcg cggatccgaa acagaaatgg 180 gttcaggact ctatcgacca cctggacaaa cagacccaga ccccgaagac ctga 234 <210> 8 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence of modified MCP-1 protein Y13AS21KQ23R <400> 8 atgcaaccgg acgctatcaa cgcaccggtt acttgttgtg cgaacttcac caaccgtaag 60 atcaaagttc gccgtctggc tagctaccgt cgtatcacga gctctaaatg cccgaaagaa 120 gctgttatct tcaaaaccat cgttgctaaa gaaatctgcg cggatccgaa acagaaatgg 180 gttcaggact ctatcgacca cctggacaaa cagacccaga ccccgaagac ctga 234 <210> 9 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence of modified MCP-1 protein Y13AS21KQ23RV47K <400> 9 atgcaaccgg acgctatcaa cgcaccggtt acttgttgtg cgaacttcac caaccgtaag 60 atcaaagttc gccgtctggc tagctaccgt cgtatcacga gctctaaatg cccgaaagaa 120 gctgttatct tcaaaaccat caaagctaaa gaaatctgcg cggatccgaa acagaaatgg 180 gttcaggact ctatcgacca cctggacaaa cagacccaga ccccgaagac ctga 234 <210> 10 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutated MCP-1 protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> M = M or no amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> PDAINAX = PDAINAX or no amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Pro, Ala, Gly or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is Tyr or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arg or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is Arg or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is Ser, Arg, Lys, His, Asn or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Arg, Lys, His, Asn or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa is Val, Arg, Lys, His, Asn or Gln <400> 10 Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Xaa Val Thr Cys Cys Xaa Asn Phe 1 5 10 15 Thr Asn Xaa Xaa Ile Xaa Val Xaa Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile 20 25 30 Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Xaa 35 40 45 Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser 50 55 60 Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75

Claims (20)

  1. 야생형 MCP-1 단백질에 비하여 GAG 결합 친화도가 증가되고 GPCR 활성이 감소된 MCP-1 돌연변이 단백질로서:
    상기 MCP-1 단백질은 1개 이상의 염기성 및/또는 전자 공여성 아미노산의 삽입 또는 2개 이상의 염기성 및/또는 전자 공여성 아미노산에 의한 2개 이상의 아미노산의 대체에 의해 구조 보존 방식으로 수식된 것을 특징으로 하는 MCP-1 돌연변이 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 야생형 MCP-1 단백질의 N-말단 영역의 첫번째 1~10 아미노산 중 1개 이상의 아미노산은 1개 이상의 아미노산의 첨가, 삭제 및/또는 대체에 의해 수식된 것을 특징으로 하는 MCP-1 돌연변이 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 염기성 및/또는 전자 공여성 아미노산에 의해 대체되는 아미노산은 비염기성 아미노산인 것을 특징으로 하는 MCP-1 돌연변이 단백질.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    구조 보존 방식으로의 수식은 원자외선 CD 분광법에 의해서 측정시 수식된 구조의 야생형 MCP-1 구조로부터의 편차가 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만인 것을 특징으로 하는 MCP-1 돌연변이 단백질.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염기성 아미노산은 R, K, H로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 MCP-1 돌연변이 단백질.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전자 공여성 아미노산은 N 또는 Q로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 MCP-1 돌연변이 단백질.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    21, 23 및/또는 47 위치의 2개 이상의 아미노산이 수식된 것을 특징으로 하는 MCP-1 돌연변이 단백질.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    13 위치의 Y는 A로 치환된 것을 특징으로 하는 MCP-1 돌연변이 단백질.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    N-말단 Met를 함유하는 것을 특징으로 하는 MCP-1 돌연변이 단백질.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 N-말단 아미노산 잔기 2~8은 삭제되는 것을 특징으로 하는 MCP-1 돌연변이 단백질.
  11. 일반식: (M)nQ(PDAINA(Z1))mVTCC(X1)NFTN (Z2)(Z3)I(X2)V(X3)RLASYRRITSSKCPKEAVIFKTI(X4) AKEICADPKQ KWVQDSMDHL DKQTQTPKT의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 MCP-1 돌연변이 단백질.
    [여기에서, Z1은 P 및 A, G, L의 군에서 선택되고, 바람직하게는 A이며,
    여기에서, Z2는 R 및 K의 군에서 선택되고,
    여기에서, Z3은 K 및 R의 군에서 선택되며,
    여기에서, X1은 Y 및 A로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 A이며,
    여기에서, X2는 S, R, K, H, N 및 Q로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 K이며,
    여기에서, X3은 R, K, H, N 및 Q로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 R이며,
    여기에서, X4는 V, R, K, H, N 및 Q로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 K이며,
    여기에서 n 및/또는 m은 0 또는 1 중 어느 하나이고, 여기에서 X2, X3 또는 X4 위치 중 2개 이상이 수식된다.]
  12. Met-MCP-1 Y13A S21K V47K, Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R 및 Met-MCP-1 Y13A S21K Q23R V47K의 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 MCP-1 돌연변이 단백질.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항에 기재된 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리 폴리핵산 분자.
  14. 적어도 그들의 일부에 SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8 또는 SEQ ID No. 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 폴리핵산 분자.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 기재된 분리 DNA 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  16. 제 15 항에 기재된 벡터로 트랜스펙트되는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  17. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 단백질, 또는 제 13 항 또는 제 14 항에 기재된 폴리핵산 분자, 또는 제 15 항에 기재된 벡터, 및 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  18. 각각의 야생형 단백질의 생물학적 활성을 인비트로에서 저해 또는 억제하는 방법에 있어서의 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 MCP-1 돌연변이 단백질, 제 13 항 또는 제 14 항에 기재된 폴리핵산 분자, 또는 제 15 항에 기재된 벡터의 용도.
  19. 만성 또는 급성 염증성 질환 또는 자가면역 상태를 치료하기 위한 약제의 제조방법에 있어서의 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 MCP-1 돌연변이 단백질, 제 13 항 또는 제 14 항에 기재된 폴리핵산 분자, 또는 제 15 항에 기재된 벡터의 용도.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 류마티스 관절염, 포도막염, 염증성 장질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전 또는 허혈 재관류 손상을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
KR1020107001235A 2007-07-31 2008-07-31 글리코사미노글리칸-길항 ｍｃｐ-1 돌연변이체 및 그것의 이용방법 KR20100049548A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95314007P 2007-07-31 2007-07-31
US60/953,140 2007-07-31
EP07450166.9 2007-09-27
EP07450166A EP2042516A1 (en) 2007-09-27 2007-09-27 Glycosaminoglycan-antagonising MCP-1 mutants and methods of using same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20100049548A true KR20100049548A (ko) 2010-05-12

Family

ID=38720368

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107001235A KR20100049548A (ko) 2007-07-31 2008-07-31 글리코사미노글리칸-길항 ｍｃｐ-1 돌연변이체 및 그것의 이용방법

Country Status (12)

Country Link
US (2) US8337825B2 (ko)
EP (2) EP2042516A1 (ko)
JP (1) JP2010534484A (ko)
KR (1) KR20100049548A (ko)
CN (1) CN101790537A (ko)
AU (1) AU2008282088B2 (ko)
BR (1) BRPI0815043A2 (ko)
CA (1) CA2693063A1 (ko)
EA (1) EA017113B1 (ko)
MX (1) MX2010001111A (ko)
NZ (1) NZ582877A (ko)
WO (1) WO2009015884A1 (ko)

Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0923051B1 (pt) 2008-12-19 2022-07-19 Centrexion Therapeutics Corporation Pirimidin-4-carboxamidas cíclicas como antagonistas do receptor de ccr2 para o tratamento de inflamação, asma e copd, seu uso, formulação e combinação farmacêutica que os compreende
EA201101131A1 (ru) * 2009-01-30 2012-01-30 Протаффин Биотехнологие Аг Новые мутанты мср-1, антагонизирующие гликозаминогликаны, и способы их применения
EA201200470A1 (ru) * 2009-09-11 2012-08-30 Протаффин Биотехнологие Аг Композиция для лечения опосредуемого cxcl8 воспаления легкого
US9324576B2 (en) 2010-05-27 2016-04-26 Applied Materials, Inc. Selective etch for silicon films
US10283321B2 (en) 2011-01-18 2019-05-07 Applied Materials, Inc. Semiconductor processing system and methods using capacitively coupled plasma
US8999856B2 (en) 2011-03-14 2015-04-07 Applied Materials, Inc. Methods for etch of sin films
US9064815B2 (en) 2011-03-14 2015-06-23 Applied Materials, Inc. Methods for etch of metal and metal-oxide films
US9267739B2 (en) 2012-07-18 2016-02-23 Applied Materials, Inc. Pedestal with multi-zone temperature control and multiple purge capabilities
US9373517B2 (en) 2012-08-02 2016-06-21 Applied Materials, Inc. Semiconductor processing with DC assisted RF power for improved control
US9132436B2 (en) 2012-09-21 2015-09-15 Applied Materials, Inc. Chemical control features in wafer process equipment
US10256079B2 (en) 2013-02-08 2019-04-09 Applied Materials, Inc. Semiconductor processing systems having multiple plasma configurations
US9362130B2 (en) 2013-03-01 2016-06-07 Applied Materials, Inc. Enhanced etching processes using remote plasma sources
US20140271097A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Applied Materials, Inc. Processing systems and methods for halide scavenging
US9773648B2 (en) 2013-08-30 2017-09-26 Applied Materials, Inc. Dual discharge modes operation for remote plasma
US9576809B2 (en) 2013-11-04 2017-02-21 Applied Materials, Inc. Etch suppression with germanium
US9520303B2 (en) 2013-11-12 2016-12-13 Applied Materials, Inc. Aluminum selective etch
US10047133B2 (en) 2014-01-22 2018-08-14 Antagonis Biotherapeutics Gmbh Glycosaminoglycan-antagonising fusion proteins and methods of using same
US9299537B2 (en) 2014-03-20 2016-03-29 Applied Materials, Inc. Radial waveguide systems and methods for post-match control of microwaves
US9903020B2 (en) 2014-03-31 2018-02-27 Applied Materials, Inc. Generation of compact alumina passivation layers on aluminum plasma equipment components
US9309598B2 (en) 2014-05-28 2016-04-12 Applied Materials, Inc. Oxide and metal removal
US9496167B2 (en) 2014-07-31 2016-11-15 Applied Materials, Inc. Integrated bit-line airgap formation and gate stack post clean
US9659753B2 (en) 2014-08-07 2017-05-23 Applied Materials, Inc. Grooved insulator to reduce leakage current
US9553102B2 (en) 2014-08-19 2017-01-24 Applied Materials, Inc. Tungsten separation
US9613822B2 (en) 2014-09-25 2017-04-04 Applied Materials, Inc. Oxide etch selectivity enhancement
US9355922B2 (en) 2014-10-14 2016-05-31 Applied Materials, Inc. Systems and methods for internal surface conditioning in plasma processing equipment
US9966240B2 (en) 2014-10-14 2018-05-08 Applied Materials, Inc. Systems and methods for internal surface conditioning assessment in plasma processing equipment
US11637002B2 (en) * 2014-11-26 2023-04-25 Applied Materials, Inc. Methods and systems to enhance process uniformity
US10224210B2 (en) 2014-12-09 2019-03-05 Applied Materials, Inc. Plasma processing system with direct outlet toroidal plasma source
US10573496B2 (en) 2014-12-09 2020-02-25 Applied Materials, Inc. Direct outlet toroidal plasma source
US11257693B2 (en) 2015-01-09 2022-02-22 Applied Materials, Inc. Methods and systems to improve pedestal temperature control
US20160225652A1 (en) 2015-02-03 2016-08-04 Applied Materials, Inc. Low temperature chuck for plasma processing systems
US9728437B2 (en) 2015-02-03 2017-08-08 Applied Materials, Inc. High temperature chuck for plasma processing systems
US9881805B2 (en) 2015-03-02 2018-01-30 Applied Materials, Inc. Silicon selective removal
US9691645B2 (en) 2015-08-06 2017-06-27 Applied Materials, Inc. Bolted wafer chuck thermal management systems and methods for wafer processing systems
US9741593B2 (en) 2015-08-06 2017-08-22 Applied Materials, Inc. Thermal management systems and methods for wafer processing systems
US9349605B1 (en) 2015-08-07 2016-05-24 Applied Materials, Inc. Oxide etch selectivity systems and methods
US10504700B2 (en) 2015-08-27 2019-12-10 Applied Materials, Inc. Plasma etching systems and methods with secondary plasma injection
US10504754B2 (en) 2016-05-19 2019-12-10 Applied Materials, Inc. Systems and methods for improved semiconductor etching and component protection
US10522371B2 (en) 2016-05-19 2019-12-31 Applied Materials, Inc. Systems and methods for improved semiconductor etching and component protection
US9865484B1 (en) 2016-06-29 2018-01-09 Applied Materials, Inc. Selective etch using material modification and RF pulsing
US10629473B2 (en) 2016-09-09 2020-04-21 Applied Materials, Inc. Footing removal for nitride spacer
US10062575B2 (en) 2016-09-09 2018-08-28 Applied Materials, Inc. Poly directional etch by oxidation
US9721789B1 (en) 2016-10-04 2017-08-01 Applied Materials, Inc. Saving ion-damaged spacers
US10546729B2 (en) 2016-10-04 2020-01-28 Applied Materials, Inc. Dual-channel showerhead with improved profile
US10062585B2 (en) 2016-10-04 2018-08-28 Applied Materials, Inc. Oxygen compatible plasma source
US9934942B1 (en) 2016-10-04 2018-04-03 Applied Materials, Inc. Chamber with flow-through source
US10062579B2 (en) 2016-10-07 2018-08-28 Applied Materials, Inc. Selective SiN lateral recess
US9947549B1 (en) 2016-10-10 2018-04-17 Applied Materials, Inc. Cobalt-containing material removal
US10163696B2 (en) 2016-11-11 2018-12-25 Applied Materials, Inc. Selective cobalt removal for bottom up gapfill
US9768034B1 (en) 2016-11-11 2017-09-19 Applied Materials, Inc. Removal methods for high aspect ratio structures
US10026621B2 (en) 2016-11-14 2018-07-17 Applied Materials, Inc. SiN spacer profile patterning
US10242908B2 (en) 2016-11-14 2019-03-26 Applied Materials, Inc. Airgap formation with damage-free copper
US10566206B2 (en) 2016-12-27 2020-02-18 Applied Materials, Inc. Systems and methods for anisotropic material breakthrough
US10431429B2 (en) 2017-02-03 2019-10-01 Applied Materials, Inc. Systems and methods for radial and azimuthal control of plasma uniformity
US10403507B2 (en) 2017-02-03 2019-09-03 Applied Materials, Inc. Shaped etch profile with oxidation
US10043684B1 (en) 2017-02-06 2018-08-07 Applied Materials, Inc. Self-limiting atomic thermal etching systems and methods
US10319739B2 (en) 2017-02-08 2019-06-11 Applied Materials, Inc. Accommodating imperfectly aligned memory holes
US10943834B2 (en) 2017-03-13 2021-03-09 Applied Materials, Inc. Replacement contact process
US10319649B2 (en) 2017-04-11 2019-06-11 Applied Materials, Inc. Optical emission spectroscopy (OES) for remote plasma monitoring
US11276559B2 (en) 2017-05-17 2022-03-15 Applied Materials, Inc. Semiconductor processing chamber for multiple precursor flow
US11276590B2 (en) 2017-05-17 2022-03-15 Applied Materials, Inc. Multi-zone semiconductor substrate supports
US10497579B2 (en) 2017-05-31 2019-12-03 Applied Materials, Inc. Water-free etching methods
US10049891B1 (en) 2017-05-31 2018-08-14 Applied Materials, Inc. Selective in situ cobalt residue removal
US10920320B2 (en) 2017-06-16 2021-02-16 Applied Materials, Inc. Plasma health determination in semiconductor substrate processing reactors
US10541246B2 (en) 2017-06-26 2020-01-21 Applied Materials, Inc. 3D flash memory cells which discourage cross-cell electrical tunneling
US10727080B2 (en) 2017-07-07 2020-07-28 Applied Materials, Inc. Tantalum-containing material removal
US10541184B2 (en) 2017-07-11 2020-01-21 Applied Materials, Inc. Optical emission spectroscopic techniques for monitoring etching
US10354889B2 (en) 2017-07-17 2019-07-16 Applied Materials, Inc. Non-halogen etching of silicon-containing materials
US10043674B1 (en) 2017-08-04 2018-08-07 Applied Materials, Inc. Germanium etching systems and methods
US10170336B1 (en) 2017-08-04 2019-01-01 Applied Materials, Inc. Methods for anisotropic control of selective silicon removal
US10297458B2 (en) 2017-08-07 2019-05-21 Applied Materials, Inc. Process window widening using coated parts in plasma etch processes
US10128086B1 (en) 2017-10-24 2018-11-13 Applied Materials, Inc. Silicon pretreatment for nitride removal
US10283324B1 (en) 2017-10-24 2019-05-07 Applied Materials, Inc. Oxygen treatment for nitride etching
US10256112B1 (en) 2017-12-08 2019-04-09 Applied Materials, Inc. Selective tungsten removal
US10903054B2 (en) 2017-12-19 2021-01-26 Applied Materials, Inc. Multi-zone gas distribution systems and methods
US11328909B2 (en) 2017-12-22 2022-05-10 Applied Materials, Inc. Chamber conditioning and removal processes
US10854426B2 (en) 2018-01-08 2020-12-01 Applied Materials, Inc. Metal recess for semiconductor structures
US10964512B2 (en) 2018-02-15 2021-03-30 Applied Materials, Inc. Semiconductor processing chamber multistage mixing apparatus and methods
US10679870B2 (en) 2018-02-15 2020-06-09 Applied Materials, Inc. Semiconductor processing chamber multistage mixing apparatus
TWI766433B (zh) 2018-02-28 2022-06-01 美商應用材料股份有限公司 形成氣隙的系統及方法
US10593560B2 (en) 2018-03-01 2020-03-17 Applied Materials, Inc. Magnetic induction plasma source for semiconductor processes and equipment
US10319600B1 (en) 2018-03-12 2019-06-11 Applied Materials, Inc. Thermal silicon etch
US10497573B2 (en) 2018-03-13 2019-12-03 Applied Materials, Inc. Selective atomic layer etching of semiconductor materials
US10573527B2 (en) 2018-04-06 2020-02-25 Applied Materials, Inc. Gas-phase selective etching systems and methods
US10490406B2 (en) 2018-04-10 2019-11-26 Appled Materials, Inc. Systems and methods for material breakthrough
US10699879B2 (en) 2018-04-17 2020-06-30 Applied Materials, Inc. Two piece electrode assembly with gap for plasma control
US10886137B2 (en) 2018-04-30 2021-01-05 Applied Materials, Inc. Selective nitride removal
US10755941B2 (en) 2018-07-06 2020-08-25 Applied Materials, Inc. Self-limiting selective etching systems and methods
US10872778B2 (en) 2018-07-06 2020-12-22 Applied Materials, Inc. Systems and methods utilizing solid-phase etchants
US10672642B2 (en) 2018-07-24 2020-06-02 Applied Materials, Inc. Systems and methods for pedestal configuration
US11049755B2 (en) 2018-09-14 2021-06-29 Applied Materials, Inc. Semiconductor substrate supports with embedded RF shield
US10892198B2 (en) 2018-09-14 2021-01-12 Applied Materials, Inc. Systems and methods for improved performance in semiconductor processing
US11062887B2 (en) 2018-09-17 2021-07-13 Applied Materials, Inc. High temperature RF heater pedestals
US11417534B2 (en) 2018-09-21 2022-08-16 Applied Materials, Inc. Selective material removal
US11682560B2 (en) 2018-10-11 2023-06-20 Applied Materials, Inc. Systems and methods for hafnium-containing film removal
US11121002B2 (en) 2018-10-24 2021-09-14 Applied Materials, Inc. Systems and methods for etching metals and metal derivatives
US11437242B2 (en) 2018-11-27 2022-09-06 Applied Materials, Inc. Selective removal of silicon-containing materials
US11721527B2 (en) 2019-01-07 2023-08-08 Applied Materials, Inc. Processing chamber mixing systems
US10920319B2 (en) 2019-01-11 2021-02-16 Applied Materials, Inc. Ceramic showerheads with conductive electrodes

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6632805B1 (en) * 1996-05-07 2003-10-14 Emory University Methods for using water-stabilized organosilanes
US6107565A (en) * 1998-11-17 2000-08-22 A&A Manufacturing Co., Inc. Covered energy transmission line carrier
US7309693B2 (en) * 2000-05-26 2007-12-18 Kensuke Egashira Preventives and remedies for pulmonary hypertension
EP1495050A1 (en) 2002-04-10 2005-01-12 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Novel antagonists of mcp proteins
AT412785B (de) * 2003-12-04 2005-07-25 Kungl Andreas J Dr Gag-bindungsproteine
US7754004B2 (en) * 2005-07-06 2010-07-13 Resource Development, L.L.C. Thickened surfactant-free cleansing and multifunctional liquid coating compositions containing nonreactive abrasive solid particles and an organosilane quaternary compound and methods of using

Also Published As

Publication number Publication date
CA2693063A1 (en) 2009-02-05
EA017113B1 (ru) 2012-09-28
WO2009015884A1 (en) 2009-02-05
US20130150303A1 (en) 2013-06-13
BRPI0815043A2 (pt) 2017-05-23
NZ582877A (en) 2012-05-25
MX2010001111A (es) 2010-03-03
US8337825B2 (en) 2012-12-25
EA201000265A1 (ru) 2010-06-30
JP2010534484A (ja) 2010-11-11
AU2008282088B2 (en) 2013-10-10
CN101790537A (zh) 2010-07-28
EP2188307A1 (en) 2010-05-26
US20100197583A1 (en) 2010-08-05
EP2042516A1 (en) 2009-04-01
AU2008282088A1 (en) 2009-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20100049548A (ko) 글리코사미노글리칸-길항 ｍｃｐ-1 돌연변이체 및 그것의 이용방법
EP1749836B1 (en) Recombinant vascular endothelial cell growth factor D (VEGF-D)
KR101188785B1 (ko) Ｇａｇ 결합 단백질
JP4902352B2 (ja) トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）との結合能を有するペプチド
US7425324B2 (en) Antagonists of MCP proteins
US7365171B2 (en) Chemokine-like factors (CKLFs) with chemotactic and hematopoietic stimulating activities
KR20100085041A (ko) Ｓｄｆ-1계 글리코스아미노글리칸 길항제 및 그 사용 방법
JP2012516143A (ja) グリコサミノグリカンを拮抗するｍｃｐ−１突然変異体およびその使用方法
JP2007099707A (ja) 神経分化抑制ペプチド及びその利用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application