JP2023085460A - 抗cd19キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 - Google Patents
抗cd19キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023085460A JP2023085460A JP2023061386A JP2023061386A JP2023085460A JP 2023085460 A JP2023085460 A JP 2023085460A JP 2023061386 A JP2023061386 A JP 2023061386A JP 2023061386 A JP2023061386 A JP 2023061386A JP 2023085460 A JP2023085460 A JP 2023085460A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- seq
- car
- cell
- domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 144
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 69
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 83
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 title abstract description 329
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims abstract description 141
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims abstract description 141
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 83
- 108010005327 CD19-specific chimeric antigen receptor Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 claims abstract description 51
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims abstract description 51
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 229940125814 BTK kinase inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 711
- XYFPWWZEPKGCCK-GOSISDBHSA-N ibrutinib Chemical compound C1=2C(N)=NC=NC=2N([C@H]2CN(CCC2)C(=O)C=C)N=C1C(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 XYFPWWZEPKGCCK-GOSISDBHSA-N 0.000 claims description 197
- 239000002177 L01XE27 - Ibrutinib Substances 0.000 claims description 196
- 229960001507 ibrutinib Drugs 0.000 claims description 196
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 176
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 134
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 132
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 127
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 127
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 123
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 116
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 claims description 116
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 110
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 claims description 84
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 74
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 72
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 claims description 70
- 229940124291 BTK inhibitor Drugs 0.000 claims description 60
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 53
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 52
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 43
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 41
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 40
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 40
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 37
- 229940124302 mTOR inhibitor Drugs 0.000 claims description 37
- 239000003628 mammalian target of rapamycin inhibitor Substances 0.000 claims description 37
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 36
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 35
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 33
- HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N Everolimus Chemical compound C1C[C@@H](OCCO)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N 0.000 claims description 26
- 229960005167 everolimus Drugs 0.000 claims description 26
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 25
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 23
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 23
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 23
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims description 22
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 22
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 21
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 21
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 21
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims description 20
- -1 aleucine A Chemical compound 0.000 claims description 19
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 19
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 18
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 18
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 18
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims description 18
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims description 17
- 108010029445 Agammaglobulinaemia Tyrosine Kinase Proteins 0.000 claims description 17
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 17
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 17
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 17
- 102100029823 Tyrosine-protein kinase BTK Human genes 0.000 claims description 17
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 17
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 claims description 16
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 16
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 16
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims description 15
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 15
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims description 15
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 claims description 14
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 14
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 14
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 13
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 13
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical group C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 claims description 13
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 12
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 12
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 claims description 12
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 11
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 11
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 claims description 10
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 claims description 10
- ZTUJNJAKTLHBEX-UHFFFAOYSA-N 6-cyclopropyl-8-fluoro-2-[2-(hydroxymethyl)-3-[1-methyl-5-[[5-(4-methylpiperazin-1-yl)pyridin-2-yl]amino]-6-oxopyridin-3-yl]phenyl]isoquinolin-1-one Chemical compound C1CN(C)CCN1C(C=N1)=CC=C1NC1=CC(C=2C(=C(C=CC=2)N2C(C3=C(F)C=C(C=C3C=C2)C2CC2)=O)CO)=CN(C)C1=O ZTUJNJAKTLHBEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 102100024263 CD160 antigen Human genes 0.000 claims description 9
- 101000761938 Homo sapiens CD160 antigen Proteins 0.000 claims description 9
- 238000009093 first-line therapy Methods 0.000 claims description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 9
- IJMHHZDBRUGXNO-UHFFFAOYSA-N n-[3-(8-anilinoimidazo[1,2-a]pyrazin-6-yl)phenyl]-4-tert-butylbenzamide Chemical compound C1=CC(C(C)(C)C)=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC(C=2N=C(NC=3C=CC=CC=3)C3=NC=CN3C=2)=C1 IJMHHZDBRUGXNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- LZMJNVRJMFMYQS-UHFFFAOYSA-N poseltinib Chemical compound C1CN(C)CCN1C(C=C1)=CC=C1NC1=NC(OC=2C=C(NC(=O)C=C)C=CC=2)=C(OC=C2)C2=N1 LZMJNVRJMFMYQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- VVLHQJDAUIPZFH-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[5-fluoro-4-[3-(prop-2-enoylamino)anilino]pyrimidin-2-yl]amino]phenoxy]-n-methylpyridine-2-carboxamide Chemical compound C1=NC(C(=O)NC)=CC(OC=2C=CC(NC=3N=C(NC=4C=C(NC(=O)C=C)C=CC=4)C(F)=CN=3)=CC=2)=C1 VVLHQJDAUIPZFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- SEJLPXCPMNSRAM-GOSISDBHSA-N 6-amino-9-[(3r)-1-but-2-ynoylpyrrolidin-3-yl]-7-(4-phenoxyphenyl)purin-8-one Chemical compound C1N(C(=O)C#CC)CC[C@H]1N1C(=O)N(C=2C=CC(OC=3C=CC=CC=3)=CC=2)C2=C(N)N=CN=C21 SEJLPXCPMNSRAM-GOSISDBHSA-N 0.000 claims description 8
- UVSVTDVJQAJIFG-VURMDHGXSA-N LFM-A13 Chemical compound C\C(O)=C(/C#N)C(=O)NC1=CC(Br)=CC=C1Br UVSVTDVJQAJIFG-VURMDHGXSA-N 0.000 claims description 8
- ABSXPNGWJFAPRT-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid;n-[3-[[5-fluoro-2-[4-(2-methoxyethoxy)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]prop-2-enamide Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1.C1=CC(OCCOC)=CC=C1NC1=NC=C(F)C(NC=2C=C(NC(=O)C=C)C=CC=2)=N1 ABSXPNGWJFAPRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- CDOOFZZILLRUQH-GDLZYMKVSA-N n-[3-[6-[4-[(2r)-1,4-dimethyl-3-oxopiperazin-2-yl]anilino]-4-methyl-5-oxopyrazin-2-yl]-2-methylphenyl]-4,5,6,7-tetrahydro-1-benzothiophene-2-carboxamide Chemical group CN1CCN(C)C(=O)[C@H]1C(C=C1)=CC=C1NC1=NC(C=2C(=C(NC(=O)C=3SC=4CCCCC=4C=3)C=CC=2)C)=CN(C)C1=O CDOOFZZILLRUQH-GDLZYMKVSA-N 0.000 claims description 8
- AHJRHEGDXFFMBM-UHFFFAOYSA-N palbociclib Chemical compound N1=C2N(C3CCCC3)C(=O)C(C(=O)C)=C(C)C2=CN=C1NC(N=C1)=CC=C1N1CCNCC1 AHJRHEGDXFFMBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 claims description 7
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 claims description 7
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims description 7
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims description 7
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 claims description 7
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 claims description 7
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 7
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 claims description 6
- 208000025324 B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 6
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 6
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 claims description 6
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 6
- BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N alvocidib Chemical compound O[C@@H]1CN(C)CC[C@@H]1C1=C(O)C=C(O)C2=C1OC(C=1C(=CC=CC=1)Cl)=CC2=O BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 6
- 201000007924 marginal zone B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 6
- 208000021937 marginal zone lymphoma Diseases 0.000 claims description 6
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 claims description 6
- XDLYKKIQACFMJG-UHFFFAOYSA-N 2-amino-8-[4-(2-hydroxyethoxy)cyclohexyl]-6-(6-methoxypyridin-3-yl)-4-methylpyrido[2,3-d]pyrimidin-7-one Chemical compound C1=NC(OC)=CC=C1C(C1=O)=CC2=C(C)N=C(N)N=C2N1C1CCC(OCCO)CC1 XDLYKKIQACFMJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims description 5
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001138062 Homo sapiens Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 claims description 5
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 claims description 5
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100020943 Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 claims description 5
- 208000029052 T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 claims description 5
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 claims description 5
- KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N crizotinib Chemical compound O([C@H](C)C=1C(=C(F)C=CC=1Cl)Cl)C(C(=NC=1)N)=CC=1C(=C1)C=NN1C1CCNCC1 KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N 0.000 claims description 5
- IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N fluquinconazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1N1C(=O)C2=CC(F)=CC=C2N=C1N1C=NC=N1 IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 5
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 claims description 5
- 229960004390 palbociclib Drugs 0.000 claims description 5
- YABJJWZLRMPFSI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-5-[[2-[5-(trifluoromethyl)-1H-imidazol-2-yl]-4-pyridinyl]oxy]-N-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-2-benzimidazolamine Chemical compound N=1C2=CC(OC=3C=C(N=CC=3)C=3NC(=CN=3)C(F)(F)F)=CC=C2N(C)C=1NC1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 YABJJWZLRMPFSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HHFBDROWDBDFBR-UHFFFAOYSA-N 4-[[9-chloro-7-(2,6-difluorophenyl)-5H-pyrimido[5,4-d][2]benzazepin-2-yl]amino]benzoic acid Chemical compound C1=CC(C(=O)O)=CC=C1NC1=NC=C(CN=C(C=2C3=CC=C(Cl)C=2)C=2C(=CC=CC=2F)F)C3=N1 HHFBDROWDBDFBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- KVLFRAWTRWDEDF-IRXDYDNUSA-N AZD-8055 Chemical compound C1=C(CO)C(OC)=CC=C1C1=CC=C(C(=NC(=N2)N3[C@H](COCC3)C)N3[C@H](COCC3)C)C2=N1 KVLFRAWTRWDEDF-IRXDYDNUSA-N 0.000 claims description 4
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 claims description 4
- OUSFTKFNBAZUKL-UHFFFAOYSA-N N-(5-{[(5-tert-butyl-1,3-oxazol-2-yl)methyl]sulfanyl}-1,3-thiazol-2-yl)piperidine-4-carboxamide Chemical compound O1C(C(C)(C)C)=CN=C1CSC(S1)=CN=C1NC(=O)C1CCNCC1 OUSFTKFNBAZUKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 229950010817 alvocidib Drugs 0.000 claims description 4
- 229960005061 crizotinib Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims description 4
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 claims description 4
- MMNNTJYFHUDSKL-UHFFFAOYSA-N methyl n-[6-[2-(5-chloro-2-methylphenyl)-1-hydroxy-3-oxoisoindol-1-yl]-1h-benzimidazol-2-yl]carbamate Chemical compound C=1C=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=CC=1C(C1=CC=CC=C1C1=O)(O)N1C1=CC(Cl)=CC=C1C MMNNTJYFHUDSKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 claims description 4
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 claims description 4
- SVNJBEMPMKWDCO-KCHLEUMXSA-N (2s)-2-[[(2s)-3-carboxy-2-[[2-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-2-[[4-oxo-4-[[4-(4-oxo-8-phenylchromen-2-yl)morpholin-4-ium-4-yl]methoxy]butanoyl]amino]pentanoyl]amino]acetyl]amino]propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoate Chemical compound C=1C(=O)C2=CC=CC(C=3C=CC=CC=3)=C2OC=1[N+]1(COC(=O)CCC(=O)N[C@@H](CCCNC(=N)N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O)CCOCC1 SVNJBEMPMKWDCO-KCHLEUMXSA-N 0.000 claims description 3
- PIMQWRZWLQKKBJ-SFHVURJKSA-N 2-[(2S)-1-[3-ethyl-7-[(1-oxido-3-pyridin-1-iumyl)methylamino]-5-pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl]-2-piperidinyl]ethanol Chemical compound C=1C(N2[C@@H](CCCC2)CCO)=NC2=C(CC)C=NN2C=1NCC1=CC=C[N+]([O-])=C1 PIMQWRZWLQKKBJ-SFHVURJKSA-N 0.000 claims description 3
- RHXHGRAEPCAFML-UHFFFAOYSA-N 7-cyclopentyl-n,n-dimethyl-2-[(5-piperazin-1-ylpyridin-2-yl)amino]pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-6-carboxamide Chemical compound N1=C2N(C3CCCC3)C(C(=O)N(C)C)=CC2=CN=C1NC(N=C1)=CC=C1N1CCNCC1 RHXHGRAEPCAFML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 208000036170 B-Cell Marginal Zone Lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000032568 B-cell prolymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 208000016778 CD4+/CD56+ hematodermic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- GEWLYFZWVLXQME-UHFFFAOYSA-N Cercosporamide Natural products CC12C(=O)C(C(=O)C)=C(O)C=C1OC1=C2C(O)=CC(O)=C1C(N)=O GEWLYFZWVLXQME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 206010061850 Extranodal marginal zone B-cell lymphoma (MALT type) Diseases 0.000 claims description 3
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 3
- 208000019758 Hypergammaglobulinemia Diseases 0.000 claims description 3
- 201000003791 MALT lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000035416 Prolymphocytic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 3
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 claims description 3
- CBPNZQVSJQDFBE-FUXHJELOSA-N Temsirolimus Chemical compound C1C[C@@H](OC(=O)C(C)(CO)CO)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 CBPNZQVSJQDFBE-FUXHJELOSA-N 0.000 claims description 3
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 claims description 3
- GEWLYFZWVLXQME-MRXNPFEDSA-N cercosporamide Chemical compound O=C([C@]12C)C(C(=O)C)=C(O)C=C1OC1=C2C(O)=CC(O)=C1C(N)=O GEWLYFZWVLXQME-MRXNPFEDSA-N 0.000 claims description 3
- JROFGZPOBKIAEW-HAQNSBGRSA-N chembl3120215 Chemical compound N1C=2C(OC)=CC=CC=2C=C1C(=C1C(N)=NC=NN11)N=C1[C@H]1CC[C@H](C(O)=O)CC1 JROFGZPOBKIAEW-HAQNSBGRSA-N 0.000 claims description 3
- 229950009859 dinaciclib Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 claims description 3
- PWDYHMBTPGXCSN-VCBMUGGBSA-N n,n'-bis[3,5-bis[(e)-n-(diaminomethylideneamino)-c-methylcarbonimidoyl]phenyl]decanediamide Chemical compound NC(N)=N/N=C(\C)C1=CC(C(=N/N=C(N)N)/C)=CC(NC(=O)CCCCCCCCC(=O)NC=2C=C(C=C(C=2)C(\C)=N\N=C(N)N)C(\C)=N\N=C(N)N)=C1 PWDYHMBTPGXCSN-VCBMUGGBSA-N 0.000 claims description 3
- RBOKLZGCVRXGEP-XTQSDGFTSA-N n-[[5-[(3e)-3-(4,6-difluorobenzimidazol-2-ylidene)-1,2-dihydroindazol-5-yl]-4-methylpyridin-3-yl]methyl]ethanamine Chemical compound CCNCC1=CN=CC(C=2C=C3C(=C/4N=C5C(F)=CC(F)=CC5=N\4)/NNC3=CC=2)=C1C RBOKLZGCVRXGEP-XTQSDGFTSA-N 0.000 claims description 3
- 208000007525 plasmablastic lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 210000005134 plasmacytoid dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 229950003687 ribociclib Drugs 0.000 claims description 3
- 229950011005 semapimod Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000235 temsirolimus Drugs 0.000 claims description 3
- QFJCIRLUMZQUOT-UHFFFAOYSA-N temsirolimus Natural products C1CC(O)C(OC)CC1CC(C)C1OC(=O)C2CCCCN2C(=O)C(=O)C(O)(O2)C(C)CCC2CC(OC)C(C)=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C(OC)C(O)C(C)=CC(C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims description 3
- BUROJSBIWGDYCN-GAUTUEMISA-N AP 23573 Chemical compound C1C[C@@H](OP(C)(C)=O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 BUROJSBIWGDYCN-GAUTUEMISA-N 0.000 claims description 2
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 claims description 2
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 claims description 2
- 101000777628 Homo sapiens Leukocyte antigen CD37 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002146 L01XE16 - Crizotinib Substances 0.000 claims description 2
- 102100031586 Leukocyte antigen CD37 Human genes 0.000 claims description 2
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims description 2
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 2
- UQPMANVRZYYQMD-UHFFFAOYSA-N N3-(4-fluorophenyl)-2H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidine-3,4-diamine Chemical compound C=12C(N)=NC=NC2=NNC=1NC1=CC=C(F)C=C1 UQPMANVRZYYQMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 claims description 2
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 claims description 2
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 claims description 2
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 229960001302 ridaforolimus Drugs 0.000 claims description 2
- OOVTUOCTLAERQD-OJMBIDBESA-N 2-(2-chlorophenyl)-5,7-dihydroxy-8-[(2r,3s)-2-(hydroxymethyl)-1-methylpyrrolidin-3-yl]chromen-4-one;hydrochloride Chemical compound Cl.OC[C@@H]1N(C)CC[C@H]1C1=C(O)C=C(O)C2=C1OC(C=1C(=CC=CC=1)Cl)=CC2=O OOVTUOCTLAERQD-OJMBIDBESA-N 0.000 claims 1
- RGHYDLZMTYDBDT-UHFFFAOYSA-N 2-amino-8-ethyl-4-methyl-6-(1H-pyrazol-5-yl)-7-pyrido[2,3-d]pyrimidinone Chemical compound O=C1N(CC)C2=NC(N)=NC(C)=C2C=C1C=1C=CNN=1 RGHYDLZMTYDBDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WJRRGYBTGDJBFX-UHFFFAOYSA-N 4-(2-methyl-3-propan-2-yl-4-imidazolyl)-N-(4-methylsulfonylphenyl)-2-pyrimidinamine Chemical compound CC(C)N1C(C)=NC=C1C1=CC=NC(NC=2C=CC(=CC=2)S(C)(=O)=O)=N1 WJRRGYBTGDJBFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 208000017726 ALK-positive large B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 102100026882 Alpha-synuclein Human genes 0.000 claims 1
- 206010002412 Angiocentric lymphomas Diseases 0.000 claims 1
- 206010003921 B-cell unclassifiable lymphomas Diseases 0.000 claims 1
- UDFAXHFPCDXHHH-UHFFFAOYSA-N C1=NC2=NN=CC2=C(N)N1NC1=CC=C(F)C=C1 Chemical compound C1=NC2=NN=CC2=C(N)N1NC1=CC=C(F)C=C1 UDFAXHFPCDXHHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 claims 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 claims 1
- 201000000439 HCL-V Diseases 0.000 claims 1
- 208000010956 Hairy cell leukemia variant Diseases 0.000 claims 1
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 claims 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 claims 1
- 241001502974 Human gammaherpesvirus 8 Species 0.000 claims 1
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 claims 1
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 claims 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 claims 1
- 206010065857 Primary Effusion Lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 206010036711 Primary mediastinal large B-cell lymphomas Diseases 0.000 claims 1
- 102100023345 Tyrosine-protein kinase ITK/TSK Human genes 0.000 claims 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 claims 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 claims 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 claims 1
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- 201000006569 extramedullary plasmacytoma Diseases 0.000 claims 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 claims 1
- 208000025750 heavy chain disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims 1
- 208000026876 intravascular large B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 208000006116 lymphomatoid granulomatosis Diseases 0.000 claims 1
- 201000007919 lymphoplasmacytic lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 claims 1
- 208000015325 multicentric Castleman disease Diseases 0.000 claims 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims 1
- 201000006576 solitary osseous plasmacytoma Diseases 0.000 claims 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 claims 1
- 206010062113 splenic marginal zone lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 68
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 64
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 60
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 59
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 59
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 54
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 54
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 52
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 43
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 41
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 39
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 38
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 37
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 33
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 32
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 31
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 31
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 28
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 28
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 28
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 27
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 23
- VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein succinimidyl ester Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 21
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 20
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 20
- 101001103039 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Proteins 0.000 description 20
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 20
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 20
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 20
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 20
- 101001103036 Homo sapiens Nuclear receptor ROR-alpha Proteins 0.000 description 19
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 19
- 102100039615 Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Human genes 0.000 description 19
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 19
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 18
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 18
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 18
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 description 17
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 17
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 17
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 17
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 15
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 15
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 15
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 15
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 14
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 14
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 13
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 13
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 13
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 12
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 12
- 102100025278 Coxsackievirus and adenovirus receptor Human genes 0.000 description 11
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 11
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 10
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 8
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 8
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 8
- 229940083347 Cyclin-dependent kinase 4 inhibitor Drugs 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 7
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 7
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 6
- 108010013238 70-kDa Ribosomal Protein S6 Kinases Proteins 0.000 description 6
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 6
- 101100383038 Homo sapiens CD19 gene Proteins 0.000 description 6
- 101001043809 Homo sapiens Interleukin-7 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 6
- 102100021593 Interleukin-7 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 6
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 230000003259 immunoinhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 6
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 6
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 5
- 208000006994 Precancerous Conditions Diseases 0.000 description 5
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 5
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 5
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 5
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 4
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 4
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 4
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 4
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 4
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 4
- 102100029215 Signaling lymphocytic activation molecule Human genes 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- HJSSPYJVWLTYHG-UHFFFAOYSA-N XL765 Chemical compound COC1=CC(OC)=CC(NC=2C(=NC3=CC=CC=C3N=2)NS(=O)(=O)C=2C=CC(NC(=O)C=3C=C(OC)C(C)=CC=3)=CC=2)=C1 HJSSPYJVWLTYHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- DWZAEMINVBZMHQ-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[4-(dimethylamino)piperidine-1-carbonyl]phenyl]-3-[4-(4,6-dimorpholin-4-yl-1,3,5-triazin-2-yl)phenyl]urea Chemical compound C1CC(N(C)C)CCN1C(=O)C(C=C1)=CC=C1NC(=O)NC1=CC=C(C=2N=C(N=C(N=2)N2CCOCC2)N2CCOCC2)C=C1 DWZAEMINVBZMHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QLUYMIVVAYRECT-OCCSQVGLSA-N 2-(2-chlorophenyl)-5,7-dihydroxy-8-[(2r,3s)-2-(hydroxymethyl)-1-methylpyrrolidin-3-yl]chromen-4-one Chemical compound OC[C@@H]1N(C)CC[C@H]1C1=C(O)C=C(O)C2=C1OC(C=1C(=CC=CC=1)Cl)=CC2=O QLUYMIVVAYRECT-OCCSQVGLSA-N 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 102000011107 Diacylglycerol Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108010062677 Diacylglycerol Kinase Proteins 0.000 description 3
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 3
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 description 3
- 101000971538 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily F member 1 Proteins 0.000 description 3
- 101100495232 Homo sapiens MS4A1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000633786 Homo sapiens SLAM family member 6 Proteins 0.000 description 3
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 description 3
- 102100032816 Integrin alpha-6 Human genes 0.000 description 3
- 102100021458 Killer cell lectin-like receptor subfamily F member 1 Human genes 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 3
- 208000009052 Precursor T-Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 102100029197 SLAM family member 6 Human genes 0.000 description 3
- 108010074687 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Proteins 0.000 description 3
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000011301 standard therapy Methods 0.000 description 3
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 108010078373 tisagenlecleucel Proteins 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- OVPNQJVDAFNBDN-UHFFFAOYSA-N 4-(2,6-dichlorobenzamido)-N-(piperidin-4-yl)-pyrazole-3-carboxamide Chemical compound ClC1=CC=CC(Cl)=C1C(=O)NC1=CNN=C1C(=O)NC1CCNCC1 OVPNQJVDAFNBDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QYBGBLQCOOISAR-UHFFFAOYSA-N 5-(8-methyl-2-morpholin-4-yl-9-propan-2-ylpurin-6-yl)pyrimidin-2-amine Chemical compound N1=C2N(C(C)C)C(C)=NC2=C(C=2C=NC(N)=NC=2)N=C1N1CCOCC1 QYBGBLQCOOISAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 2
- 108091012583 BCL2 Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 2
- 101100228196 Caenorhabditis elegans gly-4 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 108010021468 Fc gamma receptor IIA Proteins 0.000 description 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 102000050627 Glucocorticoid-Induced TNFR-Related Human genes 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 102100029360 Hematopoietic cell signal transducer Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000990188 Homo sapiens Hematopoietic cell signal transducer Proteins 0.000 description 2
- 101001078158 Homo sapiens Integrin alpha-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000994365 Homo sapiens Integrin alpha-6 Proteins 0.000 description 2
- 101001035237 Homo sapiens Integrin alpha-D Proteins 0.000 description 2
- 101001046687 Homo sapiens Integrin alpha-E Proteins 0.000 description 2
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 101001043807 Homo sapiens Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 101000971533 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 2
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101000589305 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000633784 Homo sapiens SLAM family member 7 Proteins 0.000 description 2
- 101000633780 Homo sapiens Signaling lymphocytic activation molecule Proteins 0.000 description 2
- 101000809875 Homo sapiens TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 101000795169 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Proteins 0.000 description 2
- 102000017182 Ikaros Transcription Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010013958 Ikaros Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100039904 Integrin alpha-D Human genes 0.000 description 2
- 102100022341 Integrin alpha-E Human genes 0.000 description 2
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 2
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 2
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102100021457 Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Human genes 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 102000008135 Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010035196 Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000009308 Mechanistic Target of Rapamycin Complex 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010034057 Mechanistic Target of Rapamycin Complex 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 108010004217 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010004222 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100032870 Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100032851 Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100032852 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100038082 Natural killer cell receptor 2B4 Human genes 0.000 description 2
- 102100037589 OX-2 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000012823 PI3K/mTOR inhibitor Substances 0.000 description 2
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 description 2
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 2
- 206010070308 Refractory cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- 102100029198 SLAM family member 7 Human genes 0.000 description 2
- 102100027744 Semaphorin-4D Human genes 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 102100038717 TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Human genes 0.000 description 2
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100029690 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Human genes 0.000 description 2
- 101710187882 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 2
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JOGKUKXHTYWRGZ-UHFFFAOYSA-N dactolisib Chemical compound O=C1N(C)C2=CN=C3C=CC(C=4C=C5C=CC=CC5=NC=4)=CC3=C2N1C1=CC=C(C(C)(C)C#N)C=C1 JOGKUKXHTYWRGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950006418 dactolisib Drugs 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000044389 human CD22 Human genes 0.000 description 2
- 102000052622 human IL7 Human genes 0.000 description 2
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- CGBJSGAELGCMKE-UHFFFAOYSA-N omipalisib Chemical compound COC1=NC=C(C=2C=C3C(C=4C=NN=CC=4)=CC=NC3=CC=2)C=C1NS(=O)(=O)C1=CC=C(F)C=C1F CGBJSGAELGCMKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 208000016691 refractory malignant neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- BTIHMVBBUGXLCJ-OAHLLOKOSA-N seliciclib Chemical compound C=12N=CN(C(C)C)C2=NC(N[C@@H](CO)CC)=NC=1NCC1=CC=CC=C1 BTIHMVBBUGXLCJ-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOVVNQKCSKSHKT-HNNXBMFYSA-N (2s)-1-[4-[[2-(2-aminopyrimidin-5-yl)-7-methyl-4-morpholin-4-ylthieno[3,2-d]pyrimidin-6-yl]methyl]piperazin-1-yl]-2-hydroxypropan-1-one Chemical compound C1CN(C(=O)[C@@H](O)C)CCN1CC1=C(C)C2=NC(C=3C=NC(N)=NC=3)=NC(N3CCOCC3)=C2S1 YOVVNQKCSKSHKT-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical group C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- DBXGGXLBTWZXBB-MRXNPFEDSA-N 2-(6-fluorobenzimidazol-1-yl)-9-[(4r)-8-fluoro-3,4-dihydro-2h-chromen-4-yl]-7h-purin-8-one Chemical compound C1COC2=C(F)C=CC=C2[C@@H]1N(C1=N2)C(=O)NC1=CN=C2N1C=NC2=CC=C(F)C=C21 DBXGGXLBTWZXBB-MRXNPFEDSA-N 0.000 description 1
- ZGAMKIIQEUPLIP-UHFFFAOYSA-N 4-(4-methylsulfonylphenyl)pyrimidin-2-amine Chemical compound C1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1C1=CC=NC(N)=N1 ZGAMKIIQEUPLIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 description 1
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025321 B-lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- YUXMAKUNSXIEKN-BTJKTKAUSA-N BGT226 Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O.C1=NC(OC)=CC=C1C1=CC=C(N=CC2=C3N(C=4C=C(C(N5CCNCC5)=CC=4)C(F)(F)F)C(=O)N2C)C3=C1 YUXMAKUNSXIEKN-BTJKTKAUSA-N 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010056102 CD100 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010017009 CD11b Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062802 CD66 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100027217 CD82 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101710139831 CD82 antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940124297 CDK 4/6 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 102100024533 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 102100027816 Cytotoxic and regulatory T-cell molecule Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101000585551 Equus caballus Pregnancy-associated glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- AIWWPESIWODBCF-UHFFFAOYSA-N FC1=CC=C(NN2C=NC=3C(=C2)C=NN3)C=C1 Chemical class FC1=CC=C(NN2C=NC=3C(=C2)C=NN3)C=C1 AIWWPESIWODBCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000002090 Fibronectin type III Human genes 0.000 description 1
- 108050009401 Fibronectin type III Proteins 0.000 description 1
- 102100022086 GRB2-related adapter protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 101000900690 Homo sapiens GRB2-related adapter protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001046683 Homo sapiens Integrin alpha-L Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101001046668 Homo sapiens Integrin alpha-X Proteins 0.000 description 1
- 101001015037 Homo sapiens Integrin beta-7 Proteins 0.000 description 1
- 101001047640 Homo sapiens Linker for activation of T-cells family member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001090688 Homo sapiens Lymphocyte cytosolic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000873418 Homo sapiens P-selectin glycoprotein ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001124867 Homo sapiens Peroxiredoxin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000692259 Homo sapiens Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000702132 Homo sapiens Protein spinster homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000633778 Homo sapiens SLAM family member 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000596234 Homo sapiens T-cell surface protein tactile Proteins 0.000 description 1
- 101000648507 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Proteins 0.000 description 1
- 101000679857 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 description 1
- 108010041100 Integrin alpha6 Proteins 0.000 description 1
- 108010030465 Integrin alpha6beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102100033016 Integrin beta-7 Human genes 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010038498 Interleukin-7 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010782 Interleukin-7 Receptors Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024032 Linker for activation of T-cells family member 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 1
- 102100034709 Lymphocyte cytosolic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 206010025280 Lymphocytosis Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 1
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 101100236305 Mus musculus Ly9 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000027581 NK cell receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008877 NK cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710141230 Natural killer cell receptor 2B4 Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102100034925 P-selectin glycoprotein ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100026066 Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 208000007541 Preleukemia Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005161 RNA Caps Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 108010034782 Ribosomal Protein S6 Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000009738 Ribosomal Protein S6 Kinases Human genes 0.000 description 1
- 102100029216 SLAM family member 5 Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008115 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100035268 T-cell surface protein tactile Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102100030742 Transforming growth factor beta-1 proprotein Human genes 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 1
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 1
- 102100022156 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 101001038499 Yarrowia lipolytica (strain CLIB 122 / E 150) Lysine acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 229940125528 allosteric inhibitor Drugs 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- XDLYKKIQACFMJG-WKILWMFISA-N chembl1234354 Chemical compound C1=NC(OC)=CC=C1C(C1=O)=CC2=C(C)N=C(N)N=C2N1[C@@H]1CC[C@@H](OCCO)CC1 XDLYKKIQACFMJG-WKILWMFISA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000018805 childhood acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000024207 chronic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108010072917 class-I restricted T cell-associated molecule Proteins 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003983 crown ethers Chemical class 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000002022 differential scanning fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 229950008209 gedatolisib Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010033706 glycylserine Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000049583 human ROR1 Human genes 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001400 myeloablative effect Effects 0.000 description 1
- 125000001419 myristoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 208000037916 non-allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 208000017426 precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 125000000246 pyrimidin-2-yl group Chemical group [H]C1=NC(*)=NC([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 102220191892 rs199825512 Human genes 0.000 description 1
- 102220058139 rs372082751 Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000649 small cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- IRFHMTUHTBSEBK-QGZVFWFLSA-N tert-butyl n-[(2s)-2-(2,5-difluorophenyl)-3-quinolin-3-ylpropyl]carbamate Chemical compound C1([C@H](CC=2C=C3C=CC=CC3=NC=2)CNC(=O)OC(C)(C)C)=CC(F)=CC=C1F IRFHMTUHTBSEBK-QGZVFWFLSA-N 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000004222 uncontrolled growth Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/53—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with three nitrogens as the only ring hetero atoms, e.g. chlorazanil, melamine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/001112—CD19 or B4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4636—Immune checkpoint inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/464412—CD19 or B4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】キメラ抗原受容体(CAR)分子に結合するCARを発現する、免疫エフェクター細胞を使用する、癌のような障害を処置する組成物を提供する。【解決手段】血液癌を有する哺乳動物の処置において使用するための、CD19と結合するCAR分子を発現する細胞(CAR19発現細胞)の集団を含む組成物であって、哺乳動物は、先にブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)阻害剤を受けている、組成物である。【選択図】図60
Description
本出願は、米国出願61/976,396号(2014年4月7出願)、米国出願62/007,309号(2014年6月3日出願)、米国出願62/036,493号(2014年8月12日出願)、米国出願62/076,238号(2014年11月6日出願)、米国出願62/087,888号(2014年12月5日出願)および米国出願62/097,278号(2014年12月29日出願)に基づく優先権を主張し、これらの内容を、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
配列表
本出願は配列表を含み、これはASCII形式で電子的に提供しており、ここに、その全体を包含させる。2015年4月6日に作成した該ASCIIコピーは名称N2067-7051WO_SL.txtであり、サイズ252,236バイトである。
本出願は配列表を含み、これはASCII形式で電子的に提供しており、ここに、その全体を包含させる。2015年4月6日に作成した該ASCIIコピーは名称N2067-7051WO_SL.txtであり、サイズ252,236バイトである。
発明の分野
本発明は、一般に、表面抗原分類19タンパク質(CD19)の発現と関係する疾患を処置するための、例えば、キナーゼ阻害剤および/またはサイトカインのような他の薬剤と、例えば組み合わせて、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように操作したT細胞の使用に関する。
本発明は、一般に、表面抗原分類19タンパク質(CD19)の発現と関係する疾患を処置するための、例えば、キナーゼ阻害剤および/またはサイトカインのような他の薬剤と、例えば組み合わせて、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように操作したT細胞の使用に関する。
発明の背景
B細胞悪性腫瘍を有する多くの患者は、標準的治療では不治である。さらに、伝統的処置選択肢は、しばしば重篤な副作用を有する。癌免疫療法が試みられているが、いくつかの障害が、臨床的有効性の達成を、極めて困難な目標としている。数百ものいわゆる腫瘍抗原が同定されているが、これらは一般に自己由来であり、ゆえに、免疫原性が乏しい。さらに、腫瘍は、自身を免疫攻撃の開始および伝播に適さないようにするいくつかの機構を使用する。
B細胞悪性腫瘍を有する多くの患者は、標準的治療では不治である。さらに、伝統的処置選択肢は、しばしば重篤な副作用を有する。癌免疫療法が試みられているが、いくつかの障害が、臨床的有効性の達成を、極めて困難な目標としている。数百ものいわゆる腫瘍抗原が同定されているが、これらは一般に自己由来であり、ゆえに、免疫原性が乏しい。さらに、腫瘍は、自身を免疫攻撃の開始および伝播に適さないようにするいくつかの機構を使用する。
T細胞をB細胞悪性腫瘍のような癌細胞上の適当な細胞表面分子に再指向させることに依存するキメラ抗原受容体(CAR)修飾自己T細胞(CART)治療を使用する最近の開発は、免疫系の力をB細胞悪性腫瘍および他の癌の処置に利用する有望な結果を示す(例えば、Sadelain et al., Cancer Discovery 3:388-398 (2013)参照)。マウス由来CART19(すなわち、“CTL019”)の臨床結果は、CLLならびに小児ALLを有する患者における完全寛解の確立に見込みを示している(例えば、Kalos et al., Sci Transl Med 3:95ra73 (2011), Porter et al., NEJM 365:725-733 (2011), Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013))。遺伝子修飾したT細胞上のキメラ抗原受容体が標的細胞を認識し破壊する能力以外に、治療的T細胞治療の成功には、時間をかけて増殖し、持続する能力を有することおよび逃亡白血病細胞をさらにモニターすることが必要である。T細胞の可変性の品質は、アネルギー、抑制または疲弊のいずれの結果であれ、CAR形質転換T細胞の性能に影響するが、当業者は、現時点で限られた管理しか有しない。有効とするために、CARで形質転換した患者のT細胞が存続し、CARの抗原に応答して増殖する能力を維持する必要がある。マウスscFvを含むCART19を用いて、ALL患者T細胞はこれを実施できることが示された(例えば、Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)参照)。
発明の要約
本発明は、少なくとも一部、キメラ抗原受容体(CAR)分子(例えば、B細胞抗原、例えば、表面抗原分類19タンパク質(CD19)(例えば、OMIM Acc. No. 107265、Swiss Prot. Acc No. P15391)に結合するCARを発現する、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)を使用する、癌(例えば、血液癌または他のB細胞悪性腫瘍)のような障害を処置する組成物および方法に関する。組成物は、B細胞ターゲティングCARを発現する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)を、キナーゼ阻害剤(例えば、CDK4/6阻害剤、BTK阻害剤、mTOR阻害剤、MNK阻害剤、デュアルPI3K/mTOR阻害剤またはこれらの組み合わせの1以上)と組み合わせて含み、方法はその投与を含む。ある態様において、組み合わせは、いずれかの単独治療と比較して、臨床的有効性を維持するかまたは良好である。本発明は、さらに、B細胞抗原、例えば、CD19の発現と関係する障害(例えば、癌、例えば、血液癌)を処置するための、キナーゼ阻害剤(例えば、サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)阻害剤、mTOR阻害剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)阻害剤、デュアルホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)/mTOR阻害剤またはこれらの組み合わせから選択される1以上のキナーゼ阻害剤)と組み合わせた、B細胞抗原、例えば、CD19と結合するCAR分子を発現するように操作した細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)の使用に関する。
本発明は、少なくとも一部、キメラ抗原受容体(CAR)分子(例えば、B細胞抗原、例えば、表面抗原分類19タンパク質(CD19)(例えば、OMIM Acc. No. 107265、Swiss Prot. Acc No. P15391)に結合するCARを発現する、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)を使用する、癌(例えば、血液癌または他のB細胞悪性腫瘍)のような障害を処置する組成物および方法に関する。組成物は、B細胞ターゲティングCARを発現する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)を、キナーゼ阻害剤(例えば、CDK4/6阻害剤、BTK阻害剤、mTOR阻害剤、MNK阻害剤、デュアルPI3K/mTOR阻害剤またはこれらの組み合わせの1以上)と組み合わせて含み、方法はその投与を含む。ある態様において、組み合わせは、いずれかの単独治療と比較して、臨床的有効性を維持するかまたは良好である。本発明は、さらに、B細胞抗原、例えば、CD19の発現と関係する障害(例えば、癌、例えば、血液癌)を処置するための、キナーゼ阻害剤(例えば、サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)阻害剤、mTOR阻害剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)阻害剤、デュアルホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)/mTOR阻害剤またはこれらの組み合わせから選択される1以上のキナーゼ阻害剤)と組み合わせた、B細胞抗原、例えば、CD19と結合するCAR分子を発現するように操作した細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)の使用に関する。
従って、ある面において、本発明は、B細胞抗原、例えば、CD19の発現と関係する疾患を有する対象、例えば、哺乳動物を処置する方法に関する。方法は、哺乳動物に、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤と組み合わせて、B細胞抗原と結合するCAR分子を発現する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)の有効量を投与することを含む。ある態様において、CAR分子はCD19に結合し、例えば、CAR分子はここに記載するCD19に結合する。他の態様において、CAR分子は、CD20、CD22またはROR1の1以上と結合する。
ある態様において、B細胞抗原の発現(例えば、CD19、CD20、CD22またはROR1の1以上の発現)と関係する疾患は、癌、悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態のような増殖性疾患またはB細胞抗原、例えば、CD19、CD20、CD22またはROR1の1以上の発現と関係する非癌関連疾患である。ある態様において、疾患は固形または液性腫瘍である。ある態様において、癌は膵臓癌である。ある態様において、疾患は血液癌である。ある態様において、血液癌は白血病である。ある態様において、癌は、B細胞急性リンパ系白血病(BALL)、T細胞急性リンパ系白血病(TALL)、小リンパ球性白血病(SLL)、急性リンパ系白血病(ALL)を含むが、これらに限定されない1以上の急性白血病;慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)を含むが、これらに限定されない1以上の慢性白血病からなる群から選択される。さらなる血液癌または血液学的状態は、マントル細胞リンパ腫(MCL)、B細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含むが、これらに限定されない。ある態様において、B細胞抗原(例えば、例えば、CD19、CD20、CD22またはROR1の1以上)発現と関係する疾患は、骨髄球性血液細胞の産生不全(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の雑多なコレクションである“前白血病状態”である。ある態様において、B細胞抗原(例えば、CD19、CD20、CD22またはROR1の1以上)発現と関係する疾患は、B細胞抗原(例えば、CD19、CD20、CD22またはROR1の1以上)を発現する非定型および/または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。ここに記載するB細胞抗原(例えば、CD19、CD20、CD22またはROR1の1以上)発現と関係する疾患のあらゆる組み合わせを、ここに記載する方法および組成物により処置できる。
ある態様において、B細胞抗原(例えば、CD19、CD20、CD22またはROR1の1以上)の発現と関係する疾患は、リンパ腫、例えば、MCL、ホジキンリンパ腫またはDLBCLである。ある態様において、B細胞抗原(例えば、CD19、CD20、CD22またはROR1の1以上)の発現と関係する疾患は、白血病、例えば、SLL、CLLおよび/またはALLである。ある態様において、B細胞抗原の発現と関係する疾患は多発性骨髄腫、例えば、フローサイトメトリーおよびRT-PCRの両者により検出して、例えば、CD19陰性である、例えば、新生物形質細胞の大多数(99.95%)がCD19陰性表現型を有する多発性骨髄腫である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、CDK4阻害剤、例えば、ここに記載するCDK4阻害剤、例えば、6-アセチル-8-シクロペンチル-5-メチル-2-(5-ピペラジン-1-イル-ピリジン-2-イルアミノ)-8H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-オン、ヒドロクロライド(パルボシクリブまたはPD0332991とも呼ぶ)のような、例えば、CD4/6阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、BTK阻害剤、例えば、イブルチニブのような、例えば、ここに記載するBTK阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、mTOR阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、OSI-027のような、例えば、ここに記載するmTOR阻害剤である。mTOR阻害剤は、例えば、mTORC1阻害剤および/またはmTORC2阻害剤、例えば、ここに記載するmTORC1阻害剤および/またはmTORC2阻害剤であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、MNK阻害剤、例えば、4-アミノ-5-(4-フルオロアニリノ)-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジンのような、例えば、ここに記載するMNK阻害剤である。MNK阻害剤は、例えば、MNK1a、MNK1b、MNK2aおよび/またはMNK2b阻害剤であり得る。ある態様において、阻害剤はデュアルPI3K/mTOR阻害剤、例えば、PF-04695102であり得る。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンA;フラボピリドールまたはHMR-1275、2-(2-クロロフェニル)-5,7-ジヒドロキシ-8-[(3S,4R)-3-ヒドロキシ-1-メチル-4-ピペリジニル]-4-クロメノン;クリゾチニブ(PF-02341066);2-(2-クロロフェニル)-5,7-ジヒドロキシ-8-[(2R,3S)-2-(ヒドロキシメチル)-1-メチル-3-ピロリジニル]-4H-1-ベンゾピラン-4-オン、ヒドロクロライド(P276-00);1-メチル-5-[[2-[5-(トリフルオロメチル)-1H-イミダゾール-2-イル]-4-ピリジニル]オキシ]-N-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-ベンズイミダゾール-2-アミン(RAF265);インジスラム(E7070);ロスコビチン(CYC202);パルボシクリブ(PD0332991);ディナシクリブ(SCH727965);N-[5-[[(5-tert-ブチルオキサゾール-2-イル)メチル]チオ]チアゾール-2-イル]ピペリジン-4-カルボキサミド(BMS387032);4-[[9-クロロ-7-(2,6-ジフルオロフェニル)-5H-ピリミド[5,4-d][2]ベンズアゼピン-2-イル]アミノ]-安息香酸(MLN8054);5-[3-(4,6-ジフルオロ-1H-ベンズイミダゾール-2-イル)-1H-インダゾール-5-イル]-N-エチル-4-メチル-3-ピリジンメタンアミン(AG-024322);4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)-1H-ピラゾール-3-カルボン酸N-(ピペリジン-4-イル)アミド(AT7519);4-[2-メチル-1-(1-メチルエチル)-1H-イミダゾール-5-イル]-N-[4-(メチルスルホニル)フェニル]-2-ピリミジンアミン(AZD5438);XL281(BMS908662);およびリボシクリブからなる群から選択されるCDK4阻害剤である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はDK4阻害剤、例えば、パルボシクリブ(PD0332991)であり、パルボシクリブを、1日約50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例えば、75mg、100mgまたは125mg)の用量で一定期間、例えば、28日サイクルの14~21日連日または21日サイクルの7~12日連日投与する。ある態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれ以上のサイクルのパルボシクリブを投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(PCI-32765);GDC-0834;RN-486;CGI-560;CGI-1764;HM-71224;CC-292;ONO-4059;CNX-774;およびLFM-A13から選択されるBTK阻害剤である。好ましい態様において、BTK阻害剤はインターロイキン-2誘導性キナーゼ(ITK)のキナーゼ活性を低減または阻害せず、GDC-0834;RN-486;CGI-560;CGI-1764;HM-71224;CC-292;ONO-4059;CNX-774;およびLFM-A13から選択される。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はBTK阻害剤、例えば、イブルチニブ(PCI-32765)であり、イブルチニブを、1日約250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例えば、250mg、420mgまたは560mg)の用量で一定期間、例えば、21日サイクルで連日または28日サイクルで連日投与する。ある態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれ以上のサイクルのイブルチニブを投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス;リダフォロリムス(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2-[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R、23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-ジヒドロキシ-19,30-ジメトキシ-15,17,21,23、29,35-ヘキサメチル-2,3,10,14,20-ペンタオキソ-11,36-ジオキサ-4-アザトリシクロ[30.3.1.04,9]ヘキサトリアコンタ-16,24,26,28-テトラエン-12-イル]プロピル]-2-メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート(AP23573およびMK8669としても知られる);エベロリムス(RAD001);ラパマイシン(AY22989);セマピモド;(5-{2,4-ビス[(3S)-3-メチルモルホリン-4-イル]ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル}-2-メトキシフェニル)メタノール(AZD8055);2-アミノ-8-[trans-4-(2-ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]-6-(6-メトキシ-3-ピリジニル)-4-メチル-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PF04691502);およびN2-[1,4-ジオキソ-4-[[4-(4-オキソ-8-フェニル-4H-1-ベンゾピラン-2-イル)モルホリニウム-4-イル]メトキシ]ブチル]-L-アルギニルグリシル-L-α-アスパルチルL-セリン-、分子内塩(SF1126);およびXL765から選択されるmTOR阻害剤である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、1日約3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例えば、6mg)の用量で一定期間、例えば、21日サイクルで連日または28日サイクルで連日投与する。ある態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれ以上のサイクルのラパマイシンを投与する。ある態様において、キナーゼ阻害剤はmTOR阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを1日約2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例えば、10mg)の用量で一定期間、例えば、28日サイクルで連日投与する。ある態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれ以上のサイクルのエベロリムスを投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はCGP052088;4-アミノ-3-(p-フルオロフェニルアミノ)-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(CGP57380);セルコスポラミド;ETC-1780445-2;および4-アミノ-5-(4-フルオロアニリノ)-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジンから選択されるMNK阻害剤である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、2-アミノ-8-[trans-4-(2-ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]-6-(6-メトキシ-3-ピリジニル)-4-メチル-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PF-04691502);N-[4-[[4-(ジメチルアミノ)-1-ピペリジニル]カルボニル]フェニル]-N’-[4-(4,6-ジ-4-モルホリニル-1,3,5-トリアジン-2-イル)フェニル]尿素(PF-05212384、PKI-587);2-メチル-2-{4-[3-メチル-2-オキソ-8-(キノリン-3-イル)-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]フェニル}プロパンニトリル(BEZ-235);アピトリシブ(GDC-0980、RG7422);2,4-ジフルオロ-N-{2-(メチルオキシ)-5-[4-(4-ピリダジニル)-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(GSK2126458);8-(6-メトキシピリジン-3-イル)-3-メチル-1-(4-(ピペラジン-1-イル)-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-2(3H)-オンマレイン酸(NVP-BGT226);3-[4-(4-モルホリニルピリド[3’,2’:4,5]フロ[3,2-d]ピリミジン-2-イル]フェノール(PI-103);5-(9-イソプロピル-8-メチル-2-モルホリノ-9H-プリン-6-イル)ピリミジン-2-アミン(VS-5584、SB2343);およびN-[2-[(3,5-ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン-3-イル]-4-[(4-メチル-3-メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(XL765)から選択されるデュアルホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)およびmTOR阻害剤である。
ある態様において、細胞は、抗CD19結合ドメイン(例えば、CD19に特異的に結合するマウスまたはヒト化抗体または抗体フラグメント)、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび/または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含むCAR分子を発現する。ある態様において、CARは、ここに記載する抗CD19結合ドメイン(例えば、ここに記載するCD19に特異的に結合するマウスまたはヒト化抗体または抗体フラグメント)、ここに記載する膜貫通ドメインおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび/または一次シグナル伝達ドメインを含むここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む抗体または抗体フラグメントを含む。
ある態様において、CAR分子は、CD19(例えば、野生型または変異体ヒトCD19)と結合できる。ある態様において、CAR分子は、ここに記載する抗CD19結合ドメインの軽鎖相補性決定領域1(LC CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LC CDR2)および軽鎖相補性決定領域3(LC CDR3)の1以上(例えば、全3)およびここに記載する抗CD19結合ドメインの重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)および重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)の1以上(例えば、全3)を含む抗CD19結合ドメイン、例えば、LC CDRの1以上、例えば、全3およびHC CDRの1以上、例えば、全3を含む抗CD19結合ドメインを含む。ある態様において、抗CD19結合ドメインはここに記載する抗CD19結合ドメインの重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)および重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)の1以上(例えば、全3)を含み、例えば、抗CD19結合ドメインは、各々、ここに記載するHC CDR1、HC CDR2およびHC CDR3を含む2可変重鎖領域を有する。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、ここに記載するマウス軽鎖可変領域(例えば、表7)および/またはここに記載するマウス重鎖可変領域(例えば、表7)を含む。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、表7のアミノ酸配列のマウス軽鎖およびマウス重鎖を含むscFvである。ある態様において、抗CD19結合ドメイン(例えば、scFv)は、表7に提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1、2または3修飾(例えば、置換)を有するが、30、20または10修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表7のアミノ酸配列と95~99%同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域;および/または表7に提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1、2または3修飾(例えば、置換)を有するが、30、20または10修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表7のアミノ酸配列と95~99%同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、配列番号59の配列またはそれと95~99%同一性を有する配列を含む。ある態様において、抗CD19結合ドメインはscFvであり、ここに、例えば、表7に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、ここに、例えば、表7に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーを介して連結している。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、(Gly4-Ser)nリンカー(ここで、nは1、2、3、4、5または6、好ましくは3または4である)(配列番号53)を含む。scFvの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい:軽鎖可変領域-リンカー-重鎖可変領域または重鎖可変領域-リンカー-軽鎖可変領域。
ある態様において、CAR分子は、ここに記載するヒト化抗CD19結合ドメインの軽鎖相補性決定領域1(LC CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LC CDR2)および軽鎖相補性決定領域3(LC CDR3)の1以上(例えば、全3)およびここに記載するヒト化抗CD19結合ドメインの重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)および重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)の1以上(例えば、全3)を含むヒト化抗CD19結合ドメイン、例えば、ヒト化LC CDRの1以上、例えば、全3およびHC CDRの1以上、例えば、全3を含む抗CD19結合ドメインを含む。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインは、少なくともHC CDR2を含む。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインは、ここに記載するヒト化抗CD19結合ドメインの重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)および重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)の1以上(例えば、全3)を含み、例えば、ヒト化抗CD19結合ドメインは、各々、ここに記載するHC CDR1、HC CDR2およびHC CDR3を含む2可変重鎖領域を有する。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインは、少なくともHC CDR2を含む。ある態様において、軽鎖可変領域はVK3_L25生殖系列配列の1、2、3または全4フレームワーク領域を含む。ある態様において、軽鎖可変領域は、修飾(例えば、置換、例えば、配列番号58のマウス軽鎖可変領域における対応する位置に見られる1以上のアミノ酸の置換、例えば、71位および87位の1箇所以上の置換)を含む。ある態様において、重鎖可変領域は、VH4_4-59生殖系列配列の1、2、3または全4フレームワーク領域を含む。ある態様において、重鎖可変領域は、修飾(例えば、置換、例えば、配列番号58のマウス重鎖可変領域における対応する位置に見られる1以上のアミノ酸の置換、例えば、71位、73位および78位の1箇所以上の置換)を含む。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインは、ここに記載する軽鎖可変領域(例えば、表3)および/またはここに記載する重鎖可変領域(例えば、表3)を含む。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインは、表3のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むscFvである。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメイン(例えば、scFv)は、表3に提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1、2または3修飾(例えば、置換)を有するが、30、20または10修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表3のアミノ酸配列と95~99%同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域;および/または表3に提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1、2または3修飾(例えば、置換)を有するが、30、20または10修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表3のアミノ酸配列と95~99%同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群から選択される配列またはそれと95~99%同一性を有する配列を含む。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインはscFvであり、ここに、例えば、表3に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、ここに、例えば、表3に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーを介して連結している。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインは、(Gly4-Ser)nリンカー(ここで、nは1、2、3、4、5または6、好ましくは3または4である)(配列番号53)を含む。scFvの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい:軽鎖可変領域-リンカー-重鎖可変領域または重鎖可変領域-リンカー-軽鎖可変領域。
ある態様において、CAR分子は、T細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137およびCD154からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号15の配列を含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号15のアミノ酸配列の少なくとも1、2または3修飾(例えば、置換)を有するが、20、10または5修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または配列番号15のアミノ酸配列と95~99%同一性を有する配列を含む。
ある態様において、抗CD19結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジ領域により膜貫通ドメインに接続される。ある態様において、コードされるヒンジ領域は、配列番号14または配列番号45またはそれと95~99%同一性を有する配列を含む。
ある態様において、CAR分子は、さらに共刺激ドメイン、例えば、ここに記載する共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)および4-1BB(CD137)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号16の配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号51の配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号16または配列番号51のアミノ酸配列の少なくとも1、2または3修飾(例えば、置換)を有するが、20、10または5修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または配列番号16または配列番号51のアミノ酸配列と95~99%同一性を有する配列を含む。
ある態様において、CAR分子は、さらに、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは4-1BBの機能的シグナル伝達ドメインおよび/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号16の配列および/または配列番号17の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号16の配列および/または配列番号43の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD27の機能的シグナル伝達ドメインおよび/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号51の配列および/または配列番号17の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号51の配列および/または配列番号43の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号16または配列番号51のアミノ酸配列および/または配列番号17または配列番号43のアミノ酸配列の少なくとも1、2または3修飾(例えば、置換)を有するが、20、10または5修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または配列番号16または配列番号51のアミノ酸配列および/または配列番号17または配列番号43のアミノ酸配列と95~99%同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号16または配列番号51の配列と配列番号17の配列または配列番号43を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレームに、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される。
ある態様において、CAR分子は、さらに、リーダー配列、例えば、ここに記載するリーダー配列を含む。ある態様において、リーダー配列は、配列番号13のアミノ酸配列または配列番号13のアミノ酸配列と95~99%同一性を有する配列を含む。
ある態様において、CAR分子は、リーダー配列、例えば、ここに記載するリーダー配列、例えば、配列番号13を有するまたはそれと95~99%同一性を有するリーダー配列;ここに記載する抗CD19結合ドメイン、例えば、ここに記載するLC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、HC CDR1、HC CDR2およびHC CDR3を含む抗CD19結合ドメイン、例えば、表7に記載するマウス抗CD19結合ドメイン、表3に記載するヒト化抗CD19結合ドメインまたはそれと95~99%同一性を有する配列;ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジ領域、例えば、配列番号14を有するまたはそれと95~99%同一性を有するヒンジ領域;膜貫通ドメイン、例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン、例えば、配列番号15の配列を有するまたはそれと95~99%同一性を有する配列を有する膜貫通ドメイン;細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび/または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、ここに記載する共刺激ドメイン、例えば、配列番号16または配列番号51の配列を有するまたはそれと95~99%同一性を有する4-1BB共刺激ドメインおよび/または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン、例えば、配列番号17または配列番号43の配列を有するまたはそれと95~99%同一性を有するCD3ゼータ刺激ドメインを含む。
ある態様において、CAR分子は、配列番号58、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41または配列番号42のアミノ酸配列または配列番号58、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41または配列番号42のアミノ酸配列の少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20または30修飾(例えば、置換)を有するが、60、50または40修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または配列番号58、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41または配列番号42のアミノ酸配列と85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む(例えば、からなる)。
ある態様において、CAR分子を発現する細胞は、CAR分子を発現する核酸配列を含むベクターを含む。ある態様において、ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。ある態様において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。ある態様において、ベクターはさらにプロモーターを含む。ある態様において、プロモーターは、EF-1プロモーターである。ある態様において、EF-1プロモーターは、配列番号100の配列を含む。ある態様において、ベクターは、インビトロ転写ベクター、例えば、ここに記載する核酸分子のRNAを転写するベクターである。ある態様において、インビトロベクターにおける核酸配列は、さらにポリ(A)テイル、例えば、約150アデノシン塩基(配列番号104)を含む、例えば、ここに記載するポリAテイルである。ある態様において、インビトロベクターにおける核酸配列は、さらに3’UTR、例えば、ヒトベータ-グロブリン由来の3’UTRの少なくとも1反復を含む、例えば、ここに記載する3’ UTRを含む。ある態様において、インビトロベクターにおける核酸配列は、さらにプロモーター、例えば、T2プロモーターを含む。
ここに開示する組成物および方法のある態様において、CAR分子を発現する細胞(ここでは“CAR発現細胞”とも呼ぶ)は、ここに記載する細胞または細胞の集団、例えば、ヒト免疫エフェクター細胞または細胞の集団(例えば、ヒトT細胞またはヒトNK細胞、例えば、ここに記載するヒトT細胞またはここに記載するヒトNK細胞)である。ある態様において、ヒトT細胞はCD8+ T細胞である。ある態様において、細胞は自己T細胞である。ある態様において、細胞は同種T細胞である。ある態様において、細胞はT細胞であり、T細胞はジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)欠損である。ある態様において、細胞はT細胞であり、T細胞はイカロス欠損である。ある態様において、細胞はT細胞であり、T細胞はDGKおよびイカロスの両者が欠損している。用語“細胞”を引用してここに開示する組成物および方法は、1以上の細胞、例えば、細胞の集団を含む組成物および方法を包含すると解釈すべきである。
他の態様において、例えば、ここに記載するような、CAR分子を発現する細胞は、さらに他の薬剤、例えば、CAR発現細胞の活性を増強する薬剤を発現できる。
ある態様において、方法は、さらに、ここに記載するような、CAR分子を発現する細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、CAR発現細胞の活性を増強する薬剤と組み合わせて投与することを含む。ある態様において、薬剤はサイトカイン、例えば、IL-7、IL-15、IL-21またはこれらの組み合わせである。ある態様において、方法は、IL-7を対象に投与することを含む。サイトカインは、CAR発現細胞の投与と組み合わせて、例えば、同時にまたはすぐ後に送達できる。あるいは、サイトカインは、CAR発現細胞の投与後長期間後、例えば、CAR発現細胞に対する対象の応答の評価後送達できる。
他の態様において、CAR発現細胞の活性を増強する薬剤は、免疫阻害分子を阻害する薬剤であり得る。免疫阻害分子の例は、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4およびTGFRベータを含む。ある態様において、免疫阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを伝達する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、免疫阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4またはTGFRベータのような阻害分子またはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである第二ポリペプチド(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するような、例えば、41BB、CD27またはCD28)および/または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)を含む。ある態様において、薬剤は、PD1またはそのフラグメント(例えば、PD1の細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインの第二ポリペプチド(例えば、ここに記載するCD28シグナル伝達ドメインおよび/またはここに記載するCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。
ある態様において、リンパ球注入、例えば同種リンパ球注入が癌の処置に使用され、ここで、リンパ球注入は、ここに記載するような、B細胞抗原(例えば、CD19)に結合する少なくとも1CAR発現細胞(ここではCD19 CAR発現細胞とも呼ぶ)を含む。ある態様において、自己リンパ球注入が癌の処置に使用され、ここで、自己リンパ球注入は少なくとも1つのCD19発現細胞を含む。
ある態様において、CD19 CAR発現細胞、例えば、T細胞を、先に幹細胞移植、例えば、自己幹細胞移植を受けている対象に投与する。
ある態様において、CD19 CAR発現細胞、例えば、T細胞を、先にメルファランを投与されている対象に投与する。
ある態様において、CAR分子、例えば、ここに記載するCAR分子を発現する細胞を、CAR分子を発現する細胞の投与と関係する1以上の副作用を軽減する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤を、キナーゼ阻害剤の投与と関係する1以上の副作用を軽減する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、CAR分子、例えば、ここに記載するCAR分子を発現する細胞およびキナーゼ阻害剤を、CD19と関係する疾患を処置するさらなる薬剤、例えば、ここに記載するさらなる薬剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、CAR分子、例えば、ここに記載するCAR分子を発現する細胞を、ここに記載する用量および/または投薬スケジュールで投与する。
ある態様において、CAR分子を、例えば、インビトロ転写を使用してT細胞に導入し、対象(例えば、ヒト)はCAR分子を含む細胞の最初の投与およびCAR分子を含む細胞の1以上のその後の投与を受け、ここで、1以上のその後の投与は、先の投与の後15日、例えば、14日、13日、12日、11日、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日または2日以内に行う。ある態様において、CAR分子を含む細胞の1以上の投与を、1週間あたりに対象に行い、例えば、1週間あたりCAR分子を含む細胞を2回、3回または4回投与する。ある態様において、対象(例えば、ヒト対象)は1週間あたりCAR分子を含む細胞の1以上の投与(例えば、1週間あたり2回、3回または4回投与)(ここではサイクルともいう)、続いて1週間CAR分子を含む細胞を休薬し、次いでCAR分子を含む細胞の1以上のさらなる投与(例えば、CAR分子を含む細胞の1週間あたり1以上の投与)を対象に行う。他の態様において、対象(例えば、ヒト対象)はCAR分子を含む細胞を1サイクルを超えて受け、各サイクルの間の間隔は10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日または3日未満である。ある態様において、CAR分子を含む細胞を、隔日で週に3回投与する。ある態様において、CAR分子を含む細胞を、少なくとも2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間またはそれ以上投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤とCAR分子、例えば、ここに記載するCAR分子を発現する細胞の組み合わせを、疾患、例えば、癌、例えば、ここに記載する癌のための第一選択処置として投与する。他の態様において、キナーゼ阻害剤とCAR分子、例えば、ここに記載するCAR分子を発現する細胞の組み合わせを、疾患、例えば、癌、例えば、ここに記載する癌のための第二、第三、第四選択処置として投与する。
ある態様において、ここに記載する細胞(例えば、細胞の集団)を対象に投与する。
ある態様において、方法は細胞の集団の投与を含み、その大多数がここに記載するCAR分子を含む。ある態様において、CAR発現細胞の集団は、異なるCARを発現する細胞の混合物を含む。例えば、ある態様において、CAR発現細胞の集団は、ここに記載する抗CD19結合ドメインを有するCARを発現する第一細胞および異なる抗CD19結合ドメイン、例えば、第一細胞により発現されるCARにおける抗CD19結合ドメインと異なるここに記載する抗CD19結合ドメインを有するCARを発現する第二細胞を含み得る。他の例として、CAR発現細胞の集団は、例えば、ここに記載するような、抗CD19結合ドメインを含むCARを発現する第一細胞およびCD19以外の標的(例えば、CD123またはメソセリン)に対する抗原結合ドメインを含むCARを発現する第二細胞を含み得る。ある態様において、CAR発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARを発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むCARを発現する第二細胞を含む。
ある態様において、方法は細胞の集団の投与を含み、ここで、集団における少なくとも1個の細胞は、ここに記載する抗CD19ドメインおよびCAR発現細胞の活性を増強する薬剤を有するCARを発現し、例えば、第二細胞は、CAR発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する。例えば、ある態様において、薬剤は、免疫阻害分子を阻害する薬剤であり得る。免疫阻害分子の例は、PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4およびTGFRベータを含む。ある態様において、免疫阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを伝達する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4またはTGFRベータのような阻害分子またはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである第二ポリペプチド(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するような、例えば、41BB、CD27またはCD28)および/または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)を含む。ある態様において、薬剤は、PD1またはそのフラグメント(例えば、PD1の細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインの第二ポリペプチド(例えば、ここに記載するCD28シグナル伝達ドメインおよび/またはここに記載するCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。
他の面において、本発明は、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)と組み合わせて、医薬として使用するためのここに記載するCAR分子を発現する細胞に関する。他の面において、本発明は、ここに記載するCAR分子を発現する細胞と組み合わせて、医薬として使用するためのここに記載するキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)に関する。
他の面において、本発明は、B細胞抗原(例えば、CD19)を発現する疾患の処置において、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)と組み合わせて使用するためのここに記載するCAR分子を発現する細胞に関する。他の面において、本発明は、B細胞抗原(例えば、CD19)を発現する疾患の処置において、ここに記載するCAR分子を発現する細胞と組み合わせて使用する、ここに記載するキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)に関する。疾患は、例えば、血液癌のような癌であり得る。癌は、例えば、リンパ腫、CLL、MCL、ALL、DLBCL、多発性骨髄腫または他のここに記載する癌であり得る。
他の面において、本発明は、サイトカイン、例えば、ここに記載するようなIL-7、IL-15および/またはIL-21と組み合わせて、医薬として使用するためのここに記載するCAR分子を発現する細胞に関する。他の面において、本発明は、ここに記載するCAR分子を発現する細胞と組み合わせて、医薬として使用するための、ここに記載するサイトカインに関する。
他の面において、本発明は、CD19を発現する疾患の処置において、サイトカイン、例えば、ここに記載するようなIL-7、IL-15および/またはIL-21と組み合わせて使用するここに記載するCAR分子を発現する細胞に関する。他の面において、本発明は、CD19を発現する疾患の処置において、ここに記載するCAR分子を発現する細胞と組み合わせて使用するここに記載するサイトカインに関する。
他の面において、本発明は、哺乳動物にCAR分子、例えば、ここに記載するCAR分子を発現する細胞(例えば、複数細胞)の有効量を投与することを含む、ホジキンリンパ腫を有する哺乳動物を処置する方法に関する。
ある態様において、CAR分子、例えば、ここに記載するCAR分子を発現する細胞を、CAR分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、CAR分子、例えば、ここに記載するCAR分子を発現する細胞を、CAR分子を発現する細胞の投与と関係する1以上の副作用を軽減する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、CAR分子、例えば、ここに記載するCAR分子を発現する細胞を、ホジキンリンパ腫を処置する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、CAR分子、例えば、ここに記載するCAR分子を発現する細胞を、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤、例えば、ここに記載するmTOR阻害剤と組み合わせて投与する。理論はともかく、低い、免疫増強用量(例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能を改善するのには十分である用量)での処置はPD-1陽性T細胞減少またはPD-1陰性細胞増加を伴うと考えられる。PD-1陰性T細胞ではなく、PD-1陽性T細胞が、PD-1リガンド、例えば、PD-L1またはPD-L2を発現する細胞との結合により使い尽くされ得る。
ある態様において、この手法を使用して、対象におけるここに記載するCAR細胞の性能を最適化できる。理論はともかく、ある態様において、内在性、非修飾免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞の性能が改善されると考えられる。理論はともかく、ある態様において、CD19 CAR発現細胞の性能が改善されると考えられる。他の態様において、CARを発現するように操作されているまたは操作される細胞、例えば、T細胞が、エクスビボでPD1陰性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞の数を増加させる量またはPD1陰性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞/PD1陽性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞の比を増加させる量のmTOR阻害剤との接触により処理される。
ある態様において、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、RAD001または触媒的阻害剤の投与を、ここに記載するCAR発現細胞、例えば、T細胞の投与前に開始する。ある態様において、mTOR阻害剤はRAD001またはラパマイシンである。ある態様において、CAR細胞を、PD1陰性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞のレベルまたはPD1陰性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞/PD1陽性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞の比が、少なくとも一過性に、増加するように、mTOR阻害剤の投与後十分な時間をおいてまたは十分な量を投与した後に投与する。
ある態様において、CARを発現するように操作する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)を、対象におけるまたは対象から採取したPD1陰性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞のレベルまたはPD1陰性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞/PD1陽性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞の比が、少なくとも一過性に、増加するように、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤の投与後十分な時間をおいてまたは十分な量を投与した後に採取する。
ある態様において、ここに記載する方法のいずれも、さらに、例えば、ここに記載するCAR分子、例えば、CD19と結合するCAR分子を発現する1以上の細胞の投与前に、対象にリンパ球枯渇を実施することを含む。リンパ球枯渇は、例えば、メルファラン、シトキサン、シクロホスファミドおよびフルダラビンの1以上の投与を含む。
ある態様において、投与されるCAR発現細胞は、調節可能なCAR(RCAR)、例えば、ここに記載するRCARを含む。RCARは、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー、CD19に結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合メンバーおよび第二スイッチドメイン;および膜貫通ドメインを含み得る。方法は、さらに、例えば、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインの二量体化を誘発する十分量で、二量体化分子を投与することを含み得る。
ある態様において、CAR発現細胞およびキナーゼ阻害剤を、例えば、第一選択の治療として同時にまたは実質的に同時に投与する。ある態様において、方法は、BTK阻害剤(例えば、イブルチニブ)とCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)の組み合わせを、対象に第一選択治療として投与する。
他の態様において、CAR発現細胞およびキナーゼ阻害剤を逐次的に投与する。例えば、キナーゼ阻害剤をCAR発現細胞の前に投与するかまたはCAR発現細胞をキナーゼ阻害剤の前に投与する。
ある態様において、CD19の発現と関係する疾患は血液癌(例えば、CLL、MCLまたはALLのようなここに記載する血液癌)であり、対象は、血液癌に対する1以上の治療、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤に対する部分応答者、非応答者または再発者であるかまたはそう診断される。ある態様において、対象は、BTK変異を有するかまたはそれを有する認定される。変異は、例えば、点変異、挿入または欠失であり得る。変異は、例えば、BTK阻害剤の結合部位、例えば、ATP結合ポケットまたはその近辺の変異であり得る。変異は、BTK阻害剤に対する応答の減少(例えば、耐性)に寄与し得る。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、方法はBTK阻害剤(例えば、イブルチニブ)を対象に投与し、BTK阻害剤の量を減らし(例えば、投与を止め)、そして続いてCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を対象に投与することを含む。
ある態様において、方法はBTK阻害剤(例えば、イブルチニブ)を対象に投与し、続いてBTK阻害剤とCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)の組み合わせを対象に投与することを含む。
ある態様において、方法はBTK阻害剤(例えば、イブルチニブ)を対象に投与し、BTK阻害剤の量を減らし(例えば、投与を中止または中断し)、続いてCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)と第二BTK阻害剤(例えば、第一BTK阻害剤以外、例えば、イブルチニブ以外のBTK阻害剤)の組み合わせを対象に投与することを含む。ある態様において、第二BTK阻害剤は、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774またはLFM-A13またはこれらの組み合わせから選択される1以上である。
ある態様において、B細胞抗原の発現と関係する疾患(例えば、CD19)は血液癌(例えば、ここに記載する血液癌、例えば、CLL、MCLまたはALL)であり方法は、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)または両者に対する対象の耐性発生を遅延させるか耐性を低減させる。ある態様において、CD19の発現と関係する疾患は血液癌(例えば、ここに記載する血液癌、例えば、CLL、MCLまたはALL)であり、ここで、方法は血液癌の寛解を延長するかまたは再発を遅延させる。例えば、キナーゼ阻害剤またはCAR発現細胞の単剤療法で処置されたときの疾患の予測される経過と比較して、寛解を延長でき、再発を遅延でき、耐性発現を遅延させまたは耐性を低減させ得る。
前記方法のいずれかにおいて使用できる代表的処置レジメンは、次の1以上を含む。
ある態様において、キナーゼ阻害剤およびCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を、第一選択の治療として対象、例えば、哺乳動物に投与する。
他の態様において、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を、キナーゼ阻害剤の投与後に対象、例えば、哺乳動物に投与する。
他の態様において、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を、キナーゼ阻害剤の投与中止後に投与する。
他の態様において、キナーゼ阻害剤の投与をCAR19発現細胞の投与前に開始し、CAR19発現細胞を、継続しているキナーゼ阻害剤の投与と組み合わせて投与する。
ある態様において、対象に、例えば、第一選択治療として、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)を投与する。予定した期間の投与後(例えば、1ヶ月または2ヶ月であるが、2週間、3週間、1ヶ月、1.5ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、12ヶ月、15ヶ月または18ヶ月でもよい)、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を、対象に単独でまたはキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。ある態様において、処置に対する対象の応答を、予定した間隔で、例えば、キナーゼ阻害剤および/またはCAR発現細胞での処置前または処置中に評価する。評価により対象が完全応答者であることが示されたら、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を投与しない。評価により対象がキナーゼ阻害剤に対して部分応答者であるかまたは応答して疾患安定であることが示されたら、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を、例えば、ここに記載のように、キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。評価により対象が非応答者または再発者であることが示されたら、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を、キナーゼ阻害剤または第二キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載する第二キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。
他の態様において、対象、例えば、哺乳動物はBTK阻害剤(例えば、イブルチニブ)に対する完全または部分応答者またはCAR19発現細胞に対する完全または部分応答者であるか、そうであると認定される。
ある態様において、対象がキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)に対して完全応答者である(またはそうであると認定される)とき、完全応答の期間、対象にCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を投与しない。他の態様において、対象がキナーゼ阻害剤に対して完全応答者(例えば、イブルチニブに対して完全応答者)である(またはそうであると認定される)とき、完全応答の期間、対象にCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を投与する。ある態様において、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)後、対象は、応答の延長または再発の遅延を経験する(例えば、CAR治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
ある態様において、対象がキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)に対して部分応答者である(またはそうであると認定される)とき、部分応答の期間、対象にCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を投与しない。他の態様において、対象がキナーゼ阻害剤に対して部分応答者である(またはそうであると認定される)とき、部分応答の期間、対象にCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)(単独でまたはBTK阻害剤と組み合わせて)を投与する。ある態様において、CAR治療後、対象は、完全応答および/または応答延長または再発遅延を経験する(例えば、CAR治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
ある態様において、対象がキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)での処置後疾患安定である(または安定であると認定される)とき、疾患が安定な期間、対象にCAR治療を投与しない。他の態様において、対象がキナーゼ阻害剤での処置後疾患安定である(または安定であると認定される)とき、疾患が安定な期間、対象にCAR治療を投与する。ある態様において、CAR治療後、対象は、部分応答、完全応答および/または応答延長または再発遅延を経験する(例えば、CAR治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
ある態様において、対象がキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)での処置後疾患が進行している(または進行していると認定される)とき、疾患が進行している期間、対象にCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を投与しない。他の態様において、対象がキナーゼ阻害剤での処置後疾患が進行している(または進行していると認定される)とき、疾患が進行している期間、対象にCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を投与する。ある態様において、CAR治療後、対象は疾患安定、部分応答、完全応答および/または応答延長または再発遅延を経験する(例えば、CAR治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
他の態様において、哺乳動物がイブルチニブに対して非応答者または再発者であるかまたはそうであると認定されるとき、CAR発現細胞を第二キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与し、ここで、第二キナーゼ阻害剤はイブルチニブ以外である。第二キナーゼ阻害剤は、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774またはLFM-A13またはこれらの組み合わせから選択される1以上であり得る。
他の態様において、対象、例えば、哺乳動物はキナーゼ阻害剤に対する部分応答者であり(またはそうであると認定され)、該対象は、部分応答の期間、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を、単独でまたはBTK阻害剤と組み合わせて投与される。
他の態様において、対象、例えば、哺乳動物は、イブルチニブでの処置後疾患が進行するまたは安定である非応答者であり(またはそうであると認定され)、該対象は、疾患が進行しているまたは安定である期間、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を第二BTK阻害剤と組み合わせて投与され、ここで、第二キナーゼ阻害剤はイブルチニブ以外である。
他の面において、B細胞抗原(例えば、CD19)の発現と関係する疾患を有する対象、例えば、哺乳動物を処置する方法が提供される。方法は、対象にここに記載するキナーゼ阻害剤(例えば、ここに記載するBTKキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブ)およびCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)の有効量を組み合わせて(例えば同時に(または実質的に同時に)または逐次的に)投与することを含む。
ある態様において、キナーゼ阻害剤およびCAR発現細胞(例えば、CAR19細胞)を、例えば、第一選択の治療として、組み合わせて投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤を、最初に、例えば、単剤療法または第一選択の治療として投与し;キナーゼ阻害剤の量を減らした(例えば、投与中止または中断)後、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を対象に投与する。
他の態様において、キナーゼ阻害剤を、最初に、例えば、単剤療法または第一選択の治療として投与し;続いてキナーゼ阻害剤とCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)の組み合わせを対象に投与する。
他の態様において、キナーゼ阻害剤を、最初に、例えば、単剤療法または第一選択の治療として投与し;キナーゼ阻害剤の量を減らした(例えば、投与中止または中断)後、第二キナーゼ阻害剤とCAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)の組み合わせを対象に投与する。
ある態様において、処置に対する対象の応答を、予定した間隔で、例えば、キナーゼ阻害剤および/またはCAR発現細胞での処置前または処置中に評価する。評価により対象が完全応答者であることが示されたら、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を投与しない。評価により対象がキナーゼ阻害剤に対して部分応答者であるかまたは応答して疾患安定であることが示されたら、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を、例えば、ここに記載のように、キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。評価により対象が非応答者または再発者であることが示されたら、CAR発現細胞(例えば、CAR19発現細胞)を、キナーゼ阻害剤または第二キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載する第二キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、B細胞抗原(例えば、CD19)の発現と関係する疾患は、血液癌、白血病、リンパ腫、MCL、CLL、ALL、ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はイブルチニブ、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774またはLFM-A13から選択されるBTK阻害剤;パルボシクリブ、アロイシンA、フラボピリドール、2-(2-クロロフェニル)-5,7-ジヒドロキシ-8-[(3S,4R)-3-ヒドロキシ-1-メチル-4-ピペリジニル]-4-クロメノンから選択されるCDK4阻害剤;クリゾチニブ(PF-02341066、P276-00、RAF265、インジスラムロスコビチン、ジナシクリブ、BMS387032、MLN8054、AG-024322、AT7519、AZD5438、BMS908662;またはリボシクリブ;ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、セマピモド、AZD8055、PF04691502、SF1126、XL765またはOSI-027のようなラパマイシンアナログから選択されるmTOR阻害剤;またはCGP052088、CGP57380、セルコスポラミドまたはETC-1780445-2または4-アミノ-5-(4-フルオロアニリノ)-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジンから選択されるMNK阻害剤である。
ある面において、本発明は、ホジキンリンパ腫を有する対象、例えば、哺乳動物を処置するかまたは抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。方法は、対象に、CD19と結合するCAR分子を発現する細胞の有効量を、単独でまたは第二治療と組み合わせて投与することを含む。
他の面において、本発明は、多発性骨髄腫(例えば、CD19陽性多発性骨髄腫またはCD19陰性骨髄腫)を有する対象、例えば、哺乳動物を処置するかまたは抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。ある態様において、多発性骨髄腫は、例えば、フローサイトメトリーおよびRT-PCRの両者により検出して、例えば、CD19陰性である、例えば、新生物形質細胞の大多数(99.95%)がCD19陰性表現型を有する。は、対象にCD19と結合するCAR分子を発現する細胞の有効量を、単独でまたは第二治療(例えば、多発性骨髄腫に対する標準治療)と組み合わせて投与することを含む。方法は、さらにここに記載するキナーゼ阻害剤の投与を含み得る。
ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫に関連する方法のある態様において、CAR分子は、例えば、ここに記載するような、ヒト化CAR分子である。ある態様において、CAR分子はここに記載するCAR分子である。例えば、ある態様において、CAR分子は、配列番号5のLC CDR1、配列番号26のLC CDR2および配列番号27のLC CDR3;配列番号19のHC CDR1、配列番号20~23のいずれかのLC CDR2および配列番号24のHC CDR3の1以上(例えば、2、3、4、5または全て)を含む抗CD19結合ドメインを含む。
ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫に関する方法のある態様において、CAR分子(例えば、CART19またはCTL019)を単剤療法として投与する。ある態様において、方法は、さらにキナーゼ阻害剤、例えば、BTK阻害剤(例えばイブルチニブ)、CDK4阻害剤、mTOR阻害剤またはMNK阻害剤を投与することを含む。
多発性骨髄腫に関する方法のある態様において、CAR分子(例えば、CART19またはCTL019)を、多発性骨髄腫に対する標準治療、例えば、骨髄破壊的化学療法および/または移植自己幹細胞レスキュー(例えば、メルファラン投与(例えば、高用量メルファラン)後)と組み合わせて投与する。
他の面において、本発明は、B細胞抗原(例えば、CD19、CD20、CD22またはROR1の1以上)と結合するCAR分子を発現する細胞および1以上のキナーゼ阻害剤を含む組成物に関し、ここで、キナーゼ阻害剤はブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)阻害剤、mTOR阻害剤またはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)阻害剤から選択される。CAR発現細胞および1以上のキナーゼ阻害剤は、単一剤形でまたは2以上の剤形で存在できる
ある態様において、ここに開示する組成物は医薬として使用するためである。
ある態様において、ここに開示する組成物を、B細胞抗原(例えば、CD19)の発現と関係する疾患の処置に使用する。
CAR発現細胞を産生するための方法および組成物
本発明はまた、ある面において、CAR(例えば、ここに記載するCAR)を発現するように操作され得る免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)の集団を製造する方法も提供し、該方法は、免疫エフェクター細胞の集団を提供し;そして、免疫エフェクター細胞とキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)を、キナーゼ阻害剤の標的(例えば、BTKおよび/またはITK)の阻害に十分な条件下で接触させることを含む。方法は、さらに、免疫エフェクター細胞とCAR分子をコードする核酸を接触させる、例えば、形質導入することを含む。
本発明はまた、ある面において、CAR(例えば、ここに記載するCAR)を発現するように操作され得る免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)の集団を製造する方法も提供し、該方法は、免疫エフェクター細胞の集団を提供し;そして、免疫エフェクター細胞とキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)を、キナーゼ阻害剤の標的(例えば、BTKおよび/またはITK)の阻害に十分な条件下で接触させることを含む。方法は、さらに、免疫エフェクター細胞とCAR分子をコードする核酸を接触させる、例えば、形質導入することを含む。
ある面において、本発明は、CAR発現細胞(例えば、CAR発現免疫エフェクター細胞または細胞の集団)を産生する方法であって、細胞または細胞の集団とキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤を接触させ;そして、CAR分子をコードする核酸を細胞または細胞の集団に、CAR分子が発現されるような条件下で導入する(例えば、形質導入する)ことを含む。
CAR発現細胞を産生する方法のある態様において、核酸によりコードされるCAR分子はCD19と結合するCAR分子である。ある態様において、方法は、さらに、1以上の細胞を、細胞または少なくとも細胞の亜集団がCAR分子を発現することを可能にする条件下で培養することを含む。ある態様において、細胞はT細胞またはNK細胞であるかまたは細胞の集団はT細胞、NK細胞または両者を含む。ある態様において、方法は、1以上の細胞とキナーゼ阻害剤を接触させ(例えば、10~20分、20~30分、30~40分、40~60分または60~120分)、続いてキナーゼ阻害剤のほとんどまたは全てを1以上の細胞から除去することを含む。ある態様において、キナーゼ阻害剤を、1以上の細胞を回収後にまたは1以上の細胞の刺激前に添加する。ある態様において、キナーゼ阻害剤はBTK阻害剤、CDK4阻害剤、mTOR阻害剤またはMNK阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤はイブルチニブである。ある態様において、細胞の集団はまた癌細胞、例えば、白血病またはリンパ腫細胞も含む。癌細胞は、例えば、CLL細胞、MCL細胞またはALL細胞であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、癌細胞における標的(例えば、BTK)を阻害する、例えば、その活性を少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%低下させる。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、免疫エフェクター細胞の標的(例えば、ITK)を阻害する、例えば、その活性を少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%低下させる。
ある面において、本発明はまたキナーゼ阻害剤(例えば、BTK阻害剤)およびCAR分子またはCAR分子をコードする核酸を含む反応混合物も提供する。ある態様において、反応混合物は、さらに免疫エフェクター細胞の集団を含む。
ある態様において、免疫エフェクター細胞の1以上はCAR分子を発現するかまたはCAR分子をコードする核酸を含む。ある態様において、キナーゼ阻害剤はBTK阻害剤、CDK4阻害剤、mTOR阻害剤またはMNK阻害剤から選択される。ある態様において、BTK阻害剤はイブルチニブ、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774またはLFM-A13から選択される。ある態様において、反応混合物は、癌細胞、例えば、血液癌細胞を含む。癌細胞は、例えば、免疫エフェクター細胞が対象から回収されたとき、対象から回収された細胞であり得る。
ある面において、本発明は免疫エフェクター細胞の集団およびCAR分子またはCAR分子をコードする核酸を含む反応混合物を提供し、ここで、免疫エフェクター細胞は、共有結合的に不活性化されたITKを含む。ある態様において、ITKの少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%が、共有結合的に不活性化される。ある態様において、反応混合物は、さらに癌細胞を含む。ある態様において、癌細胞は、共有結合的に不活性化されたBTKを含む。ある態様において、BTKの少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%が、共有結合的に不活性化される。ある態様において、BTKまたはITKは、そのATP結合ドメインにまたはその近辺にイブルチニブのような小分子への共有結合を形成する。ある態様において、BTKは、そのシステイン-481にまたはその近辺にイブルチニブのような小分子への共有結合を形成する。
ある態様において、ここに記載するような反応混合物は、さらに緩衝液または他の試薬、例えば、PBS含有溶液を含む。ある態様において、反応混合物は、さらに、細胞の集団を活性化および/または拡張する薬剤、例えば、CD3/TCR複合体関連シグナルおよび/または細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを刺激する薬剤を含む。ある態様において、薬剤は、抗CD3抗体またはそのフラグメントおよび/または抗CD28抗体またはそのフラグメントとコンジュゲートしたビーズである。ある態様において、反応混合物は、さらに、血清(例えば、胎仔ウシまたはヒト血清)、インターロイキン-2(IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβおよびTNF-αまたは細胞の増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および/または生存能のための1以上の因子を含む。ある態様において、反応混合物は、さらにIL-15および/またはIL-7を含む。ある態様において、反応混合物における複数の細胞の集団は、CARコード化配列、例えば、ここに記載するような、例えば、CD19 CARコード化配列を含む、核酸分子、例えば、ここに記載する核酸分子を含む。ある態様において、反応混合物における複数の細胞の集団は、CAR、例えば、ここに記載するCAR、例えば、ここに記載するCD19 CARをコードする核酸配列を含むベクターを含む。ある態様において、ベクターは、ここに記載するベクター、例えば、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択されるベクターである。ある態様において、反応混合物は、例えば、糖類、オリゴ糖類、多糖およびポリオール(例えば、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、グルコースおよびデキストラン)、塩およびクラウンエーテルのような、凍結保護物質または安定剤をさらに含む。ある態様において、凍結保護物質はデキストランである。
ある態様において、ここに開示する製造方法は、さらに、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニットをコードする核酸、例えば、hTERTを接触させることを含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はDNAであり得る。
ある態様において、ここに開示する製造方法は、さらに、2%hAB血清を含む血清中で免疫エフェクター細胞の集団を培養することを含む。
見出し、小見出しまたは番号もしくは文字が付された要素、例えば、(a)、(b)、(i)などは、単に読みやすさのために提示したものである。本明細書における見出しまたは番号もしくは文字が付された要素の使用は、これらの工程または要素がアルファベット順で行われること、またはこれらの工程または要素が互いに必ず分離されていることを必要とするものではない。
ここに記載する全ての刊行物、特許出願、特許および他の引用文献は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
本発明の他の特質、目的および利点は、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかである。
詳細な記載
定義
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
定義
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
単数表現は、1または1超(すなわち、少なくとも1)を意味する。例として、単数表現の“要素”は1の要素または1を超える要素を意味する。
用語“約”は、量、時間などのような測定可能な値に言及するとき、特定した値からの±20%またはある場合±10%またはある場合±5%またはある場合±1%またはある場合±0.1%の逸脱を、このような変動が開示した当該方法の実行に適するならば、包含することを意味する。
用語“キメラ抗原受容体”または代替的に“CAR”は、免疫エフェクター細胞にあるとき、標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性および細胞内シグナル産生を細胞に提供する、一連の、一般に最も単純な態様で2ポリペプチドをいう。ある態様において、CARは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび下に定義する刺激分子および/または共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは“細胞内シグナル伝達ドメイン”とも呼ぶ)を含む。ある面において、一連のポリペプチドは互いに隣接し、例えば、同じポリペプチド鎖にある(例えば、キメラ融合タンパク質を含む)。ある態様において、一連のポリペプチドは互いに隣接しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。ある態様において、一連のポリペプチドは、二量体化分子の存在により、ポリペプチドを互いに連結できる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結できる、二量体化スイッチを含む。ある面において、刺激分子は、T細胞受容体複合体と関係するゼータ鎖である。ある面において、細胞質シグナル伝達ドメインは、さらに、下に定義する少なくとも1つの共刺激分子由来の1種以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。ある面において、共刺激分子は、ここに記載する共刺激分子、例えば、4-1BB(すなわち、CD137)、CD27および/またはCD28から選択される。ある面において、CARは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、CARは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。ある面において、CARは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび1以上の共刺激分子由来の2つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。ある面において、CARは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも1以上の共刺激分子由来の2つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質である。ある面において、CARはCAR融合タンパク質のアミノ末端(N-ter)に任意のリーダー配列を含む。ある面において、CARは、さらに、細胞外抗原結合ドメインのN末端にリーダー配列を含み、ここで、リーダー配列は、所望により細胞プロセシングおよびCARの細胞膜への局在化の間に、抗原結合ドメイン(例えば、scFv)から開裂される。
用語“シグナル伝達ドメイン”は、第二メッセンジャーを産生することによりまたはこのようなメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することにより、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を制御するために、細胞の中で情報を伝達することにより作用する、タンパク質の機能的部分をいう。
ここで使用する用語“CD19”は、白血病前駆体細胞で検出可能な抗原決定基である表面抗原分類19タンパク質をいう。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列が、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースで見られ得る。例えば、ヒトCD19のアミノ酸配列は、UniProt/Swiss-Prot Accession No. P15391として見ることができ、ヒトCD19をコードするヌクレオチド配列はAccession No. NM_001178098に見ることができる。ここで使用する“CD19”は、完全長野生型CD19の変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含む、タンパク質を含む。CD19は、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病および非ホジキンリンパ腫を含む、大部分のB細胞系譜癌に発現される。CD19を発現する他の細胞は、下の“CD19の発現と関係する疾患”の定義に提供する。これはまた、B細胞前駆細胞の初期マーカーである。例えば、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)参照。ある面において、CARTの抗原結合部分は、CD19タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある面において、CD19タンパク質は、癌細胞に発現される。
ここで使用する用語“CD20”は、B細胞で検出可能であることが知られる抗原決定基をいう。ヒトCD20はまた膜貫通4-ドメイン、サブファミリーA、メンバー1(MS4A1)とも呼ばれる。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースで入手できる。例えば、ヒトCD20のアミノ酸配列はAccession Nos. NP_690605.1およびNP_068769.2に見ることができ、ヒトCD20のトランスクリプトバリアント1および3をコードするヌクレオチド配列は、それぞれAccession No. NM_152866.2およびNM_021950.3で入手できることができる。ある面において、CARの抗原結合部分は、CD20タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある面において、CD20タンパク質は、癌細胞に発現される。
ここで使用する用語“CD22”は、白血病前駆体細胞で検出可能であることが知られる抗原決定基をいう。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースで入手できる。例えば、アイソフォーム1~5 ヒトCD22のアミノ酸配列はそれぞれAccession Nos. NP 001762.2、NP 001172028.1、NP 001172029.1、NP 001172030.1およびNP 001265346.1で入手でき、ヒトCD22のバリアント1~5をコードするヌクレオチド配列は、それぞれAccession No. NM 001771.3、NM 001185099.1、NM 001185100.1、NM 001185101.1およびNM 001278417.1で入手できる。ある面において、CARの抗原結合部分は、CD22タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある面において、CD22タンパク質は、癌細胞に発現される。
ここで使用する用語“ROR1”は、白血病前駆体細胞で検出可能であることが知られる抗原決定基をいう。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトROR1のアイソフォーム1および2前駆体のアミノ酸配列はそれぞれAccession Nos. NP_005003.2およびNP_001077061.1で入手でき、それらをコードするmRNA配列は、それぞれAccession Nos. NM_005012.3およびNM_001083592.1で入手できる。ある面において、CARの抗原結合部分は、ROR1タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある面において、ROR1タンパク質は、癌細胞に発現される。
ここで使用する用語“抗体”は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列をいう。抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでも、多鎖でも一本鎖でも、または完全免疫グロブリンであってもよく、天然源由来でも組み換え源由来でもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
用語“抗体フラグメント”は、抗原のエピトープと(例えば、結合、立体障害、安定化/不安定化、空間分布により)特異的に相互作用する能力を保持する、抗体の少なくとも一部をいう。抗体フラグメントの例は、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvフラグメント、scFv抗体フラグメント、ジスルフィド架橋Fv(sdFv)、VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント、直鎖状抗体、sdAb(VLまたはVHのいずれか)のような単一ドメイン抗体、ラクダ類VHHドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメントのような抗体フラグメントから形成される多特異的抗体および単離されたCDRまたは抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントはまた単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、二重特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ、v-NARおよびビス-scFvにも取り込まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005参照)。抗原結合フラグメントはまたフィブロネクチンIII型(Fn3)のようなポリペプチドに基づくスキャフォールドにも移植できる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許6,703,199号参照)。
用語“scFv”は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも一つの抗体フラグメントおよび重鎖の可変領域を含む少なくとも一つの抗体フラグメントを含む融合タンパク質をいい、ここで、軽鎖および重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短可動性ポリペプチドリンカーにより、隣接して連結し、一本鎖ポリペプチドとして発現されることが可能であり、ここで、scFvは、それが由来する完全抗体の特異性を保持する。特定しない限り、ここで使用するscFvは、VLおよびVH可変領域を、例えば、ポリペプチドのN末端およびC末端に関していずれの配向で有してもよく、scFvはVL-リンカー-VHを含み得るかまたはVH-リンカー-VLを含み得る。
抗体またはその抗体フラグメントを含む本発明のCARの部分は、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(sdAb)、一本鎖抗体(scFv)、ヒト化抗体または二特異性抗体を含む、隣接ポリペプチド鎖の一部として発現される、多様な形態で存在できる(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある面において、本発明のCAR組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、CARは、scFvを含む抗体フラグメントを含む。あるCDRの厳密なアミノ酸配列境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(“Kabat”番号付けスキーム)、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (“Chothia”番号付けスキーム)またはこれらの組み合わせに記載のものを含む、周知のスキームをいくつでも使用して決定できる。
ここで使用する用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントをいう。用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、抗体および抗体フラグメントを包含する。ある態様において、抗体分子は、多特異的抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、複数の中の第一の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第一エピトープに対する結合特異性を有し、複数の中の第二の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第二エピトープに対する結合特異性を有する。ある態様において、多特異的抗体分子は、二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、2つを超えない抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。
本発明のCARの抗体または抗体そのフラグメントを含む部分は、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(sdAb)、一本鎖抗体(scFv)、ヒト化抗体または二特異性抗体を含む、隣接ポリペプチド鎖の一部として発現される、多様な形態で存在できる(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある面において、本発明のCAR組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、CARはscFvを含む抗体フラグメントを含む。
用語“抗体重鎖”は、天然に存在する立体構造で抗体分子に存在する2タイプのポリペプチド鎖の大きいほうをいい、通常抗体が属するクラスを決定する。
用語“抗体軽鎖”は、天然に存在する立体構造で抗体分子に存在する2タイプのポリペプチド鎖の小さいほうをいう。カッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖は、2つの主用な抗体軽鎖アイソタイプをいう。
用語“組み換え抗体”は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系により発現された抗体のような、組み換えDNAテクノロジーを使用して産生される抗体をいう。本用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成により産生され、そのDNA分子が抗体を特定する抗体タンパク質またはアミノ酸配列を発現し、ここで、DNAまたはアミノ酸配列が、当分野で利用可能であり、周知の組み換えDNAまたはアミノ酸配列テクノロジーを使用して産生されている、抗体も意味すると解釈すべきである。
用語“抗原”または“Ag”は、免疫応答を惹起する分子をいう。この免疫応答は、抗体産生または特異的免疫学的コンピテント細胞の活性化または両者に関与し得る。当業者は、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含むあらゆる巨大分子が抗原として作用し得ることを理解する。さらに、抗原は組み換えまたはゲノムDNAに由来し得る。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むあらゆるDNAが、それゆえに、ここで使用される用語“抗原”を、コードする。さらに、当業者は、抗原が必ずしも遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解する。本発明は、1を超える遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これらに限定されない、これらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするように種々の組み合わせで配置されることが容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が全く“遺伝子”によってコードされる必要がないことを理解する。抗原が、合成により産生でき、または生物学的サンプルに由来でき、またはポリペプチド以外の巨大分子であり得ることは直ちに明らかである。このような生物学的サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または他の生物学的成分を伴う液体を含み得るが、これらに限定されない。
用語“抗癌効果”は、例えば、腫瘍体積減少、癌細胞数減少、転移数減少、平均余命延長、癌細胞増殖減少、癌細胞生存減少または癌状態と関係する種々の生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない、種々の手段により示され得る生物学的効果をいう。“抗癌効果”はまた、癌の発生の予防におけるペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても本来示すことができる。用語“抗腫瘍効果”は、例えば、腫瘍体積減少、腫瘍細胞数減少、腫瘍細胞増殖減少または腫瘍細胞生存減少を含むが、これらに限定されない、種々の手段により示され得る生物学的効果をいう。
用語“自己”は、後に再導入される個体と同じ個体由来のあらゆる物質をいう。
用語“同種”は、物質を導入するのと同じ種の異なる動物由来のあらゆる物質をいう。2つ以上の個体は、一箇所以上の座位における遺伝子が同一ではない場合、互いに同種という。ある面において、同じ種の個体からの同種物質は、抗原的に相互作用するために遺伝的に十分に異なり得る。
用語“異種”は、異なる種の動物由来の移植片をいう。
用語“癌”は、異常細胞の無制御な増殖により特徴付けられる疾患をいう。癌細胞は、局所的にまたは血流およびリンパ系により体内の他の部分に拡散し得る。多様な癌の例は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などを含むが、これらに限定されない。用語“腫瘍”および“癌”はここでは相互交換可能に使用し、例えば、両方の用語は固形および液性の、例えば、汎発性または循環性の、腫瘍を含む。ここで使用する用語“癌”または“腫瘍”は前悪性ならびに悪性癌および腫瘍を含む。
用語“CD19の発現と関係する疾患”は、CD19の発現と関係する疾患またはCD19を発現するまたは任意の時点で発現された細胞と関係する状態を含み、例えば、癌または悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態のような増殖性疾患;またはCD19を発現する細胞と関係する非癌関連徴候を含む。疑いを避けるために、CD19の発現と関係する疾患は、例えば、CD19発現が、例えば、CD19を標的とする分子、例えば、CD19 CARでの処置により、下方制御されているために、現在CD19を発現しないが、かつてCD19を発現していた細胞と関係する状態を含み得る。ある面において、CD19の発現と関係する癌は、血液癌である。ある面において、血液癌は白血病またはリンパ腫である。ある面において、CD19の発現と関係する癌は、例えば、例えば、B細胞急性リンパ系白血病(BALL)、T細胞急性リンパ系白血病(TALL)、急性リンパ系白血病(ALL)を含むが、これらに限定されない1以上の急性白血病;例えば、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ系白血病(CLL)を含み、これらに限定されない1以上の慢性白血病を含み、これらに限定されない癌および悪性腫瘍を含む。CD19の発現と関係するさらなる癌または血液学的状態は、例えば、B細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞-または大細胞-濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫(MCL)、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症および骨髄球性血液細胞の産生不全(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の多様な集合である“前白血病状態”などを含むが、これらに限定されない。さらにCD19の発現と関係する疾患は、例えば、CD19の発現と関係する非定型および/または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。CD19の発現と関係する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患、(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするmRNAを発現するまたは任意の時点で発現した。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は腫瘍抗原タンパク質(例えば、野生型または変異体)を産生し、腫瘍抗原タンパク質は正常レベルまたは低レベルで存在し得る。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、ある時点で腫瘍抗原タンパク質を検出可能なレベル産生し、続いて実質的に検出可能な腫瘍抗原タンパク質を産生しない。
用語“B細胞抗原の発現と関係する疾患”は、CD19、CD20、CD22またはROR1の1以上の発現と関係する疾患またはCD19、CD20、CD22またはROR1の1以上を発現するまたは任意の時点で発現した細胞と関係する状態を含むが、これらに限定されず、例えば、癌または悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態のような増殖性疾患;またはCD19、CD20、CD22またはROR1の1以上を発現する細胞と関係する非癌関連徴候を含む。疑いを避けるために、B細胞抗原の発現と関係する疾患は、例えば、抗原発現が、例えば、B細胞抗原を標的とする分子、例えば、B細胞ターゲティングCARでの処置により、下方制御されているために、現在B細胞抗原を発現しないが、かつて該抗原を発現していた細胞と関係する状態を含み得る。用語“B細胞抗原の発現と関係する疾患”は、ここに記載するような、CD19の発現と関係する疾患を含む。
用語“保存的配列修飾”は、アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特徴に顕著に影響しないかまたは変えない、アミノ酸修飾をいう。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾を、本発明の抗体または抗体フラグメントに、部位特異的変異誘発およびPCR介在変異誘発のような、当分野で知られる標準法により導入できる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それゆえに、本発明のCAR内の1個以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置き換えることができ、改変したCARを、ここに記載する機能的アッセイを使用して試験できる。
用語“刺激”は、刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体またはCAR)のその同族リガンド(またはCARの場合腫瘍抗原)への結合により誘導される一次応答をいい、それにより、TCR/CD3複合体によるシグナル伝達またはCARの適切なNK受容体またはシグナル伝達ドメインを介するシグナル伝達のような、しかしこれに限定されないシグナル伝達事象に介在する。刺激は、ある分子の発現の改変に介在できる。
用語“刺激分子”は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともある面について、刺激性の方法で免疫細胞の活性化を制御する細胞質シグナル伝達配列を提供する、免疫細胞(例えば、T細胞、NK細胞、B細胞)により発現される分子をいう。ある面において、シグナルは、例えば、TCR/CD3複合体と、ペプチドと共に充填されたMHC分子の結合により開始され、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されないT細胞応答への介在に至る、一次シグナルである。刺激性の方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列(“一次シグナル伝達ドメイン”とも呼ぶ)は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含む。本発明において特に有用であるITAM含有細胞質シグナル伝達配列の例は、CD3ゼータ、共通FcRガンマ(FCER1G)、FcガンマRIIa、FcRベータ(FcイプシロンR1b)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD79a、CD79b、DAP10およびDAP12由来のものを含むが、これらに限定されない。本発明の具体的なCARにおいて、本発明の任意の1以上のCARにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、CD3ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の具体的なCARにおいて、CD3ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号17として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。本発明の具体的なCARにおいて、CD3ゼータの一次シグナル伝達配列は配列番号43に提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。
用語“抗原提示細胞”または“APC”は、表面上に主要組織適合複合体(MHC)と複合体化した外来性抗原を表示する、アクセサリー細胞(例えば、B細胞、樹状細胞など)のような免疫系細胞をいう。T細胞は、T細胞受容体(TCR)を使用してこれらの複合体を認識する。APCは、抗原を処理し、T細胞に提示させる。
“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、ここで使用する用語として、分子の細胞内部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、CAR含有細胞、例えば、CART細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを産生する。例えば、CART細胞における、免疫エフェクター機能の例は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解性活性およびヘルパー活性を含む。
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。代表的一次細胞内シグナル伝達ドメインは、一次刺激または抗原依存的刺激を担う分子由来のものを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激細胞内ドメインを含み得る。代表的共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナルまたは抗原非依存的刺激を担う分子由来のものを含む。例えば、CARTの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインはT細胞受容体の細胞質配列を含んでよく、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは共受容体または共刺激分子からの細胞質配列を含んでよい。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ITAM含有一次細胞質シグナル伝達配列の例は、CD3ゼータ、共通FcRガンマ(FCER1G)、FcガンマRIIa、FcRベータ(FcイプシロンR1b)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD79a、CD79b、DAP10およびDAP12由来のものを含むが、これらに限定されない。
用語“ゼータ”または代替的に“ゼータ鎖”、“CD3ゼータ”または“TCRゼータ”は、GenBan Acc. No. BAG36664.1として提供されるタンパク質として規定されるかまたは非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基であり、“ゼータ刺激ドメイン”または代替的に“CD3ゼータ刺激ドメイン”または“TCR-ゼータ刺激ドメイン”は、T細胞活性化に必要な初期シグナルの機能的伝達に十分である、ゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基またはその機能的誘導体として定義される。ある面において、ゼータの細胞質ドメインは、GenBank Acc. No. BAG36664.1の残基52~164またはその機能的オルソログである非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基を含む。ある面において、“ゼータ刺激ドメイン”または“CD3ゼータ刺激ドメイン”は配列番号17として提供される配列である。ある面において、“ゼータ刺激ドメイン”または“CD3ゼータ刺激ドメイン”は配列番号43として提供される配列である。
用語“共刺激分子”は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、増殖のような、しかし、これに限定されないT細胞による共刺激応答に介在する、T細胞上の同族結合パートナーをいう。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子は、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体、ならびにOX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)および4-1BB(CD137)を含むが、これらに限定されない。このような共刺激分子のさらなる例は、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL2Rベータ、IL2Rガンマ、IL7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19aおよびCD83と特異的に結合するリガンドを含む。
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、次のタンパク質ファミリーにより表すことができる:TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(SLAMタンパク質)および活性化NK細胞受容体。このような分子の例は、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3およびCD83と特異的に結合するリガンドなどを含む。
細胞内シグナル伝達ドメインは、由来する分子またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の全細胞内部分または全天然細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
用語“4-1BB”は、GenBank Acc. No. AAA62478.2として提供されるアミノ酸配列を有するTNFRスーパーファミリーのメンバーまたは非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基であり、“4-1BB共刺激ドメイン”は、GenBank accno. AAA62478.2のアミノ酸残基214~255として規定されるかまたは非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。ある面において、“4-1BB共刺激ドメイン”は、配列番号16として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。
“免疫エフェクター細胞”は、該用語がここで使用される限り、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞をいう。免疫エフェクター細胞の例は、T細胞、例えば、アルファ/ベータT細胞およびガンマ/デルタT細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、肥満細胞および骨髄由来貪食細胞を含む。
ここで使用されている用語、“免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答”は、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、例えば、免疫エフェクター細胞の機能または応答をいう。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の死滅を促進するまたは成長または増殖を阻止する、T細胞またはNK細胞の特性をいう。T細胞の場合、一次刺激および共刺激は免疫エフェクター機能または応答の例である。
用語“コードする”は、特定のヌクレオチド配列(例えば、rRNA、tRNAおよびmRNA)または特定のアミノ酸配列およびそれに由来する生物学的特性を有する、生物学的過程における他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として働くための、遺伝子、cDNAまたはmRNAのようなポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性をいう。それゆえに、遺伝子、cDNAまたはRNAは、該遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生するならば、タンパク質をコードする。遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として使用される、ヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖および非コード鎖の両者を、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードするということができる。
特に断らない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いに縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全ヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列なる用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、あるバージョンでイントロンを含み得る限り、イントロンも含み得る。
用語“有効量”または“治療有効量”はここでは相互交換可能に使用し、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、ここに記載する化合物、製剤、物質または組成物の量をいう。
用語“内在性”は、生物、細胞、組織または系の内部由来または内部で産生されるあらゆる物質をいう。
用語“外来性”は、生物、細胞、組織または系に導入されたまたはその外で産生されたあらゆる物質をいう。
用語“発現”は、プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および/または翻訳をいう。
用語“導入ベクター”は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用できる、組成物をいう。多数のベクターが当分野で知られ、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含む。それゆえに、用語“導入ベクター”は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。本用語は、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどのような、核酸の細胞への伝達を促進する、非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むとも解釈すべきである。ウイルス導入ベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
用語“発現ベクター”は、発現すべきヌクレオチド配列と操作可能に連結した発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含む、ベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用領域を含み、他の発現のための要素は、宿主細胞によりまたはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターは、組み換えポリヌクレオチドを取り込む、コスミド、プラスミド(例えば、ネイキッドまたはリポソームに含まれた)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含む、当分野で知られる全てのものを含む。
用語“レンチウイルス”は、レトロウイルス科ファミリーの属をいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染可能な点で、レトロウイルスの中で独特であり、それらは相当量の遺伝情報を、宿主細胞のDNAに送達でき、それゆえに、それらは、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の一つである。HIV、SIVおよびFIVは、全てレンチウイルスの例である。
用語“レンチウイルスベクター”は、特にMilone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)に提供されるような、自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部由来のベクターである。臨床施設で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例は、例えば、Oxford BioMedicaのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達テクノロジー、LentigenのLENTIMAXTMベクター系などを含むが、これらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られている。
用語“相同”または“同一性”は、2重合体分子間、例えば、2DNA分子または2RNA分子のような、2核酸分子間または2ポリペプチド分子間の、サブユニット配列同一性をいう。2分子の両者における該サブユニット位置が、同じ単量体サブユニットにより占拠されているとき;例えば、2DNA分子におけるある位置がアデニンにより占拠されているならば、それらは、その位置で相同である。2配列間の相同性は、整合または相同位置の数の一次関数である;例えば、2配列における位置の半分(例えば、10サブユニット長のポリマーにおける5位置)が相同であるならば、2配列は、50%相同であり、位置の90%(例えば、10中9)が整合しているかまたは相同であるならば、2配列は、90%相同である。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の“ヒト化”形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えばFv、Fab、Fab’、F(ab’)2または抗体の他の抗原結合部分配列)である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体およびその抗体フラグメントは、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のCDRからの残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体フラグメント)である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体/抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも移入したCDRもしくはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体または抗体フラグメントの性能をさらに精密かつ最適化するために行う。一般に、ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、全てのまたは実質的に全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域の全てまたは相当な部分がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1および一般に2の、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、一般にヒト免疫グロブリンのものも含み得る。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照のこと。
用語“完全ヒト”は、全分子がヒト起源のものである抗体または免疫グロブリンのヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる抗体または抗体フラグメントのような、免疫グロブリンをいう。
用語“単離された”は、天然状態から変えられたまたは取り出されたものを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは“単離”されていないが、その天然状態で共存する物質から一部または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは“単離”されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製形態で存在でき、または、例えば、宿主細胞のような、非天然環境で存在できる。
本発明の状況において、一般的に生じる核酸塩基について、次の略語を使用する。“A”はアデノシンを、“C”はシトシンを、“G”はグアノシンを、“T”はチミジンを、“U”はウリジンを、それぞれ意味する。
用語“操作可能に連結”または“転写制御”は、制御配列と異種核酸配列の、後者の発現をもたらす機能的結合をいう。例えば、第一核酸配列が第二核酸配列と機能的に関係して配置されているとき、第一核酸配列は、第二核酸配列と操作可能に連結している。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響するならば、該コード配列と操作可能に連結している。操作可能に連結したDNA配列は互いに隣接していてよく、2タンパク質コード領域を連結するために必要ならば、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の“非経腸”投与なる用語は、例えば、皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)または胸骨内、腫瘍内注射または点滴法を含む。
用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖形態いずれかのデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)およびそれらのポリマーをいう。特に限定しない限り、本用語は、対照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知アナログを含む核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列はまたその保存的に修飾された変異体(例えば、縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、SNPおよび相補性配列ならびに明確に記載された配列も包含することを含意する。具体的に、縮重コドン置換は、1以上の選択した(または全ての)コドンの第三の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列の産生により達成され得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
用語“ペプチド”、“ポリペプチド”、および“タンパク質”は相互交換可能に使用し、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基を含む化合物をいう。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2アミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列に含まれ得るアミノ酸の数に上限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに連結した2以上のアミノ酸を含む、あらゆるペプチドまたはタンパク質をいう。ここで使用する用語は、当分野で、一般に、例えば、ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短鎖および多くのタイプが存在する当分野で一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両者を含む。“ポリペプチド”は、中でも、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチドまたはこれらの組み合わせを含む。
用語“プロモーター”は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写の開始に必要な、細胞の合成機構により認識されるかまたは合成機構に導入されるDNA配列をいう。
用語“プロモーター/制御配列”は、プロモーター/制御配列に操作可能に連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列をいう。いくつかの例において、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の例において、この配列はまたエンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要な他の制御要素も含み得る。プロモーター/制御配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的方法で発現させるものであり得る。
用語“構成的”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定化するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、細胞の大部分のまたは全ての生理学的条件下で、細胞に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列をいう。
用語“誘導性”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定化するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的に細胞にプロモーターに対応するインデューサーが存在するときのみ、細胞に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列をいう。
用語“組織特異的”プロモーターは、遺伝子をコードするまたはそれにより特定化されるポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときのみ、細胞に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列をいう。
scFvの文脈で使用する用語“可動性ポリペプチドリンカー”または“リンカー”は、可変重鎖および可変軽鎖領域を連結するために、単独でまたは組み合わせで使用される、グリシンおよび/またはセリン残基のようなアミノ酸からなるペプチドリンカーをいう。ある態様において、可動性ポリペプチドリンカーはGly/Serリンカーであり、アミノ酸配列(Gly-Gly-Gly-Ser)n(ここで、nは1以上の正の整数である)を含む。例えば、n=1、n=2、n=3。n=4、n=5およびn=6、n=7、n=8、n=9およびn=10(配列番号105)。ある態様において、可動性ポリペプチドリンカーは、(Gly4 Ser)4(配列番号106)または(Gly4 Ser)3(配列番号107)を含むが、これらに限定されない。他の態様において、リンカーは(Gly2Ser)、(GlySer)または(Gly3Ser)(配列番号108)の複数反復を含む。また本発明の範囲内に含まれるのは、引用により本明細書に包含させるWO2012/138475号に記載するリンカーである。
ここで使用する5’キャップ(RNAキャップ、RNA 7-メチルグアノシンキャップまたはRNA m7Gキャップとも呼ぶ)は、転写開始直後に、真核メッセンジャーRNAの“前面”または5’末端に付加されている、修飾グアニンヌクレオチドである。5’キャップは、第一転写ヌクレオチドに連結した末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびRNaseからの保護に重要である。キャップ付加は、転写と共役し、一方が他方に影響するように、共転写的に生じる。転写開始直後、合成されているmRNAの5’末端は、RNAポリメラーゼと関係するキャップ合成複合体により結合される。この酵素複合体は、mRNAキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多工程生化学反応として進行する。キャッピング部分を修飾して、安定性または翻訳効率のようなmRNAの機能を調節し得る。
ここで使用する“インビトロ転写RNA”は、インビトロで合成されているRNA、好ましくはmRNAをいう。一般に、インビトロ転写RNAはインビトロ転写ベクターから産生される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写RNAの産生に使用する鋳型を含む。
ここで使用する“ポリ(A)”は、ポリアデニル化によりmRNAに結合した一連のアデノシンである。一過性発現用構築物の好ましい態様において、ポリAは50~5000(配列番号109)、好ましくは64超、より好ましくは100超、最も好ましくは300または400超である。ポリ(A)配列は、局在化、安定性または翻訳効率のようなmRNAの機能を調節するために、化学的または酵素的に修飾され得る。
ここで使用する“ポリアデニル化”は、ポリアデニリル部分またはその修飾変異体の、メッセンジャーRNA分子への共有結合をいう。真核生物において、大部分のメッセンジャーRNA(mRNA)分子は、3’末端でポリアデニル化される。3’ポリ(A)テイルは、酵素、ポリアデニル化ポリメラーゼの作用により、プレmRNAに付加されるアデニンヌクレオチドの長い配列(しばしば数百)である。高等真核生物において、ポリ(A)テイルは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に付加される。ポリ(A)テイルおよびそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からmRNAを保護することを助ける。ポリアデニル化はまた転写終結、核からのmRNAの搬出および翻訳に重要である。ポリアデニル化は、DNAからRNAへの転写直後に核で生じるが、さらにまた細胞質で後に生じ得る。転写が終結した後、mRNA鎖を、RNAポリメラーゼと結合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用により開裂する。開裂部位は、通常開裂部位近くの塩基配列AAUAAAの存在により特徴付けられる。mRNAが開裂された後、アデノシン残基が、開裂部位の遊離3’末端に付加される。
ここで使用する“一過性”は、非統合導入遺伝子の数時間、数日または数週の期間の発現をいい、ここで、該発現の期間は、遺伝子がゲノムに統合されているかまたは宿主細胞における安定なプラスミドレプリコンに含まれている場合の発現の期間より短い。
用語“シグナル伝達経路”は、細胞のある部分から細胞の他の部分へのシグナル伝達に役割を有する、多様なシグナル伝達分子間の生化学的関係をいう。用語“細胞表面受容体”は、シグナルを受け、細胞膜を通過してシグナルを伝達できる分子および分子の複合体を含む。
用語“対象”は、免疫応答が惹起できる生存生物(例えば、哺乳動物、ヒト)を含むことを意図する。
用語“実質的に精製された”細胞は、他の細胞型が本質的にない細胞をいう。実質的に精製された細胞はまた天然に存在する状態では通常関係している、他の細胞型から離されている細胞をいう。いくつかの例において、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の同種集団をいう。他の例において、この用語は、単に、天然状態では天然に関係している細胞から離されている細胞をいう。ある面において、細胞はインビトロで培養される。他の面において、細胞はインビトロで培養されない。
ここで使用する用語“治療”は処置を意味する。治療効果は、疾患状態の軽減、抑制、寛解または根絶により得られる。
ここで使用する用語“予防”は、疾患または疾患状態の予防的または保護的処置を意味する。
本発明の文脈において、“腫瘍抗原”または“過増殖性障害抗原”または“過増殖性障害と関係する抗原”は、特異的過増殖性障害に共通する抗原をいう。ある面において、本発明の過増殖性障害抗原は、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌および乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などのような腺癌を含むが、これらに限定されない癌に由来する。
用語“トランスフェクト”または“形質転換”または“形質導入”は、外来性核酸が宿主細胞に伝達または導入される過程をいう。“トランスフェクト”または“形質転換”または“形質導入”細胞は、外来性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入されているものである。細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。
用語“特異的に結合”は、サンプルに存在する結合パートナー(例えば、刺激腫瘍抗原)タンパク質を認識し、結合する抗体またはリガンドをいうが、この抗体またはリガンドは、サンプル内の他の分子を実質的に認識または結合しない。
“調節可能なキメラ抗原受容体(RCAR)”は、該用語がここで使用される限り、RCARX細胞にあるとき、RCARX細胞に、RCARX細胞の免疫エフェクター特性を最適化できる標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性および調節可能な細胞内シグナル産生または増殖を提供する一連の、一般に最も単純な態様で2ポリペプチドをいう。RCARX細胞は、少なくとも一部、抗原結合ドメインにより結合される抗原を含む標的細胞への特異性を提供するために、抗原結合ドメインに頼る。ある態様において、RCARは、二量体化分子の存在下、細胞内シグナル伝達ドメインを抗原結合ドメインに連結できる、二量体化スイッチを含む。
“膜アンカー”または“膜繋留ドメイン”は、該用語がここで使用される限り、細胞外または細胞内ドメインを原形質膜に繋留するのに十分なポリペプチドまたは部分、例えば、ミリストイル基をいう。
用語“スイッチドメイン”は、該用語がここで使用される限り、例えば、RCARをいうとき、二量体化分子の存在下、他のスイッチドメインと結合するもの、一般にポリペプチドベースのものをいう。結合は、第一スイッチドメインに連結した、例えば、融合した第一のものと、第二スイッチドメインに連結した、例えば、融合した第二のものの機能的カップリングをもたらす。第一および第二スイッチドメインは、集合的に二量体化スイッチと呼ぶ。ある態様において、第一および第二スイッチドメインは、互いに同じである、例えば、同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと呼ぶ。ある態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに異なり、例えば、異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にヘテロ二量体化スイッチと呼ぶ。ある態様において、スイッチは細胞内である。ある態様において、スイッチは細胞外である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのもの、例えば、FKBPまたはFRBベースのものであり、二量体化分子は小分子、例えば、ラパログである。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのもの、例えば、mycペプチドと結合するscFvであり、二量体化分子はポリペプチド、そのフラグメントまたはポリペプチドの多量体、例えば、1以上のmyc scFvsと結合するmycリガンドまたはmycリガンドの多量体である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのもの、例えば、myc受容体であり、二量体化分子は抗体またはそのフラグメント、例えば、myc抗体である。
ここで使用する用語“二量体化分子”は、例えば、RCARに言及するとき、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインの結合を促進する分子をいう。ある態様において、二量体化分子は対象内に天然で存在せず、または顕著な二量体化をもたらす濃度で存在しない。ある態様において、二量体化分子は、小分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、RAD001である。
用語“生物学的に同等”は、対照化合物(例えば、RAD001)の対照用量または対照量により産生される効果と同等な効果を産生するのに必要な対照化合物(例えば、RAD001)以外の薬剤の量をいう。ある態様において、効果は、例えば、P70 S6キナーゼ阻害により測定して、例えば、インビボまたはインビトロアッセイにおいて評価して、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Boulayアッセイにより測定してまたはウェスタンブロットによるリン酸化S6レベルの測定により測定して、mTOR阻害のレベルである。ある態様において、効果は、セルソーティングにより測定して、PD-1陽性/PD-1陰性T細胞の比の変更である。ある態様において、mTOR阻害剤の生物学的に同等な量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのP70 S6キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある態様において、mTOR阻害剤の生物学的に同等な量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのPD-1陽性/PD-1陰性T細胞の比の変更を達成する量または用量である。
用語“低い、免疫増強用量”は、mTOR阻害剤、例えば、アロステリックmTOR阻害剤、例えば、RAD001またはラパマイシンまたは触媒的mTOR阻害剤と組み合わせて使用するとき、例えば、P70 S6キナーゼ活性の阻害により測定して、mTOR活性を、一部、しかし、完全にではなく、阻害するmTOR阻害剤の用量をいう。例えば、P70 S6キナーゼの阻害によりmTOR活性を評価する方法はここに記載する。用量は、完全免疫抑制を生じるには不十分であるが、免疫応答の増強に十分な用量である。ある態様において、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤は、PD-1陽性T細胞数の減少および/またはPD-1陰性T細胞数の増加またはPD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞比の増加をもたらす。ある態様において、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤は、ナイーブT細胞数の増加をもたらす。ある態様において、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤は、次の1以上をもたらす:
例えば、記憶T細胞、例えば、記憶T細胞前駆体における、次のマーカーの1以上の発現の増加:CD62L高、CD127高、CD27+およびBCL2;
例えば、記憶T細胞、例えば、記憶T細胞前駆体における、KLRG1発現の減少;および
記憶T細胞前駆体数、例えば、次の特徴の任意の1つまたは組み合わせを有する細胞数の増加:CD62L高増加、CD127高増加、CD27+増加、KLRG1減少およびBCL2増加;
ここで、上記変化は、例えば、未処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
例えば、記憶T細胞、例えば、記憶T細胞前駆体における、次のマーカーの1以上の発現の増加:CD62L高、CD127高、CD27+およびBCL2;
例えば、記憶T細胞、例えば、記憶T細胞前駆体における、KLRG1発現の減少;および
記憶T細胞前駆体数、例えば、次の特徴の任意の1つまたは組み合わせを有する細胞数の増加:CD62L高増加、CD127高増加、CD27+増加、KLRG1減少およびBCL2増加;
ここで、上記変化は、例えば、未処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
ここで使用する“難治性”は、処置に応答しない疾患、例えば、癌をいう。ある態様において、難治性癌は、処置前または開始時に処置に耐性であり得る。他の態様において、難治性癌は、処置中に難治性になり始め得る。
ここで使用する“完全応答者”は、処置に対する完全応答、例えば、完全寛解を示す、疾患、例えば、癌を有する対象をいう。完全応答は、例えば、ここに記載するCheson基準を使用して、同定し得る。
ここで使用する“部分応答者”は、処置に対して部分応答、例えば、部分寛解を示す、疾患、例えば、癌を有する対象をいう。部分応答は、例えば、Cheson基準を使用して、同定し得る。
ここで使用する“非応答者”は、処置に対して応答を示さない疾患、例えば、癌を有する対象をいい、例えば、患者は、疾患が安定であるかまたは疾患進行を示す。非応答者は、例えば、ここに記載するCheson基準を使用して、同定し得る。
ここで使用する用語“再発”は、応答性の最初の期間(例えば、完全応答または部分応答)後の、疾患(例えば、癌)の再出現をいう。応答性の最初の期間は、ある閾値以下、例えば、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%または1%以下への癌細胞レベルの低下を含み得る。再出現は、ある閾値以上、例えば、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%または1%以上の癌細胞レベルの上昇を含み得る。再発は、例えば、ここに記載するCheson基準を使用して、同定し得る。
範囲:本明細書をとおして、本発明の多様な面を範囲の形式で示すことができる。範囲の形式での記載は単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する確固たる制限として解釈すべきではないと理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲ならびに該範囲内の個々の数値が具体的に開示されていると解釈すべきである。例えば、1~6のような範囲の記載は、1~3、1~4、1~5、2~4、2~6、3~6などのような部分範囲ならびに該範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3および6が具体的に開示されていると解釈すべきである。他の例として、95~99%同一性のような範囲は、95%、96%、97%、98%または99%同一性と同一性を有する何かを含み、96~99%、96~98%、96~97%、97~99%、97~98%および98~99%同一性のような部分範囲を含む。これは、範囲の広さに関わらず、適用される。
概要
キメラ抗原受容体(CAR)(例えば、CD19のようなB細胞マーカーを標的とするCAR)を発現する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)を使用する、癌のような疾患(例えば、血液癌または他のB細胞悪性腫瘍)の処置に使用するための組成物および方法をここに提供する。方法は、とりわけ、ここに記載するB細胞ターゲティングCARを発現する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)を、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤のような他の薬剤と組み合わせて投与することを含む。
キメラ抗原受容体(CAR)(例えば、CD19のようなB細胞マーカーを標的とするCAR)を発現する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)を使用する、癌のような疾患(例えば、血液癌または他のB細胞悪性腫瘍)の処置に使用するための組成物および方法をここに提供する。方法は、とりわけ、ここに記載するB細胞ターゲティングCARを発現する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)を、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤のような他の薬剤と組み合わせて投与することを含む。
本発明は、少なくとも一部、CAR治療(例えば、B細胞ターゲティングCAR治療)とキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤の組み合わせの高い有効性を支持する実験を提供する。キナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤とCAR治療の組み合わせは、キナーゼ阻害剤単剤療法またはCAR発現細胞単剤療法または両者に対して組み合わせ治療の有効性を増加できる。これらの有利な効果は、例えば、有効性を維持しながら、キナーゼ阻害剤またはCAR発現細胞または両者を低用量とすることを可能とする。ここでの結果は、広範な癌、例えば、血液癌および他のB細胞悪性腫瘍に適用可能である。例えば、イブルチニブは、大部分のリンパ腫で上昇しているBTKを阻害する。CAR19を発現する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)は、大部分のB細胞悪性腫瘍で発現されるCD19表面発現を有する癌を標的とする。CAR19の代わりにまたはそれと組み合わせて、あらゆる他のB細胞ターゲティングCAR(例えば、CD20、CD22またはROR1の1以上をターゲティングするCAR)を、ここに記載する組み合わせ治療で使用できる。それゆえに、CAR治療(例えば、CD19 CAR、CD20 CAR、CD22 CARまたはROR1 CAR治療の1以上)とBTK阻害剤(例えば、イブルチニブ)の組み合わせは、リンパ腫(例えば、ホジキンリンパ腫)、MCL、CLL、DLBCLおよび多発性骨髄腫を含む、B細胞の過増殖が関与する広範な癌の処置に適する。
本発明によって、イブルチニブは、腫瘍塊を減らし、新生物B細胞を末梢血に移動させ得る(例えば、ここでの実施例8参照)。理論に拘束されるものではないが、MCLのようなあるリンパ腫は、リンパ節における増殖中心の癌性細胞の塊を特徴とする。CAR発現免疫エフェクター細胞は、高密度に充填された塊への浸透が困難であることがある。それゆえに、イブルチニブのようなBTK阻害剤は、腫瘍塊を減らし、新生物B細胞を末梢血に移動させ、リンパ腫細胞を、CAR発現細胞により攻撃されやすくする。
これに代えてまたはこれと組み合わせて、イブルチニブのようなBTK阻害剤は、またCAR発現細胞に影響する。本発明は、イブルチニブ処置が循環CART19細胞レベルを増加させることを示す(例えば、実施例8に示すデータ参照)。理論に拘束されるものではないが、循環CART19細胞レベルの増加は、例えば、増殖の増加、T細胞表現型の改変または他の因子の結果であり得る。例えば、イブルチニブは、BTKに相同性を有するキナーゼであるITKを阻害できる。ITKはT細胞に発現され、その阻害はT細胞表現型を変え得る。イブルチニブのようなキナーゼ阻害剤での処置は、T細胞表現型をTh2表現型からTh1表現型に代え、そうしてT細胞増殖能を増加させ得る。対象のBTK阻害剤での前処置または共投与は、対象におけるT細胞増殖能を増加し、そうして、循環CAR発現細胞レベルを増加させ得る。さらに、BTK阻害剤、例えば、イブルチニブで前処置した対象は、CAR製造のためのそのアフェレシスにおける高い増殖能を備えたT細胞集団を有し得る。
ある面において、本発明は、B細胞抗原(例えば、CD19、CD20、CD22またはROR1の1以上タンパク質から選択される)に特異的に結合するように操作された抗体または抗体フラグメントを含む、多数のキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。ある面において、本発明は、CARを発現するように操作した細胞(例えば、T細胞)を提供し、ここで、CAR T細胞(“CART”)は抗癌特性を示す。ある面において、細胞はCARで形質転換され、CARは細胞表面上に発現される。ある態様において、細胞(例えば、T細胞)CARをコードするウイルスベクターで形質導入される。ある態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。ある態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。あるこのような態様において、細胞は、CARを安定に発現し得る。他の態様において、細胞(例えば、T細胞)は、CARをコードする核酸、例えば、mRNA、cDNA、DNAでトランスフェクトされる。あるこのような態様において、細胞は、CARを一過性に発現し得る。
ある面において、CARの抗CD19タンパク質結合部分はscFv抗体フラグメントである。ある面において、このような抗体フラグメントは、同等な結合親和性を保持している点で機能的であり、例えば、それらは、由来したIgG抗体と同等の親和性で同じ抗原に結合する。ある面において、このような抗体フラグメントは、当業者に理解されるように、免疫応答の活性化、標的抗原から起こるシグナル伝達の阻害、キナーゼ活性の阻害などを含むが、これらに限定されない生物学的応答を提供する点で、機能的である。ある面において、CARの抗CD19抗原結合ドメインは、由来したscFvのマウス配列と比較して、ヒト化されているscFv抗体フラグメントでる。ある面において、親マウスscFv配列は、PCT公報WO2012/079000号(引用により本明細書に包含させる)に提供され、ここに配列番号59として提供されるCAR19構築物である。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、WO2012/079000号に記載され、配列番号59に提供されるscFvである。
ある面において、本発明の抗体は、キメラ抗原受容体(CAR)に取り込まれる。ある面において、CARは、PCT公報WO2012/079000号に配列番号12として提供され、ここに配列番号58として提供されるポリペプチド配列を含み、ここで、scFvドメインは、配列番号1~12から選択される1以上の配列により置換されている。ある面において、配列番号1~12のscFvドメインは、ヒトCD19に特異的に結合するマウス起源のscFvフラグメントである、配列番号59のscFvドメインのヒト化バリアントである。このマウスscFvのヒト化は、マウス特異的残基が、CART19処置、例えば、CAR19構築物を形質導入したT細胞での処置を受けている患者でヒト抗マウス抗原(HAMA)応答を誘発し得る、臨床の現場で望ましいことがある。
ある面において、本発明のCARの抗CD19結合ドメイン部分、例えば、ヒト化scFv部分は、配列が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている、導入遺伝子によりコードされる。ある面において、本発明のCAR構築物全体が、配列全体が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている、導入遺伝子によりコードされる。コドン最適化は、コードDNAにおける同義コドン(すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン)の出現頻度が、異なる種で偏っているとの発見をいう。このようなコドン縮重は、多様なヌクレオチド配列により同一ポリペプチドがコードされることを可能とする。多様なコドン最適化法が当分野で知られ、例えば、少なくとも米国特許5,786,464号および6,114,148号に開示される方法を含む。
ある面において、ヒト化CAR19は、配列番号1に提供されるscFv部分を含む。ある面において、ヒト化CAR19は、配列番号2に提供されるscFv部分を含む。ある面において、ヒト化CAR19は、配列番号3に提供されるscFv部分を含む。ある面において、ヒト化CAR19は、配列番号4に提供されるscFv部分を含む。ある面において、ヒト化CAR19は、配列番号5に提供されるscFv部分を含む。ある面において、ヒト化CAR19は、配列番号6に提供されるscFv部分を含む。ある面において、ヒト化CAR19は、配列番号7に提供されるscFv部分を含む。ある面において、ヒト化CAR19は、配列番号8に提供されるscFv部分を含む。ある面において、ヒト化CAR19は、配列番号9に提供されるscFv部分を含む。ある面において、ヒト化CAR19は、配列番号10に提供されるscFv部分を含む。ある面において、ヒト化CAR19は、配列番号11に提供されるscFv部分を含む。ある面において、ヒト化CAR19は、配列番号12に提供されるscFv部分を含む。
ある面において、本発明のCARは、特異的抗体の抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達分子を合わせる。例えば、ある面において、細胞内シグナル伝達分子は、CD3ゼータ鎖、4-1BBおよびCD28シグナル伝達モジュールおよびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ある面において、CD19 CARは、配列番号31~42の1種以上に提供される配列から選択されるCARを含む。ある面において、CD19 CARは、配列番号31に提供される配列を含む。ある面において、CD19 CARは、配列番号32に提供される配列を含む。ある面において、CD19 CARは、配列番号33に提供される配列を含む。ある面において、CD19 CARは、配列番号34に提供される配列を含む。ある面において、CD19 CARは、配列番号35に提供される配列を含む。ある面において、CD19 CARは、配列番号36に提供される配列を含む。ある面において、CD19 CARは、配列番号37に提供される配列を含む。ある面において、CD19 CARは、配列番号38に提供される配列を含む。ある面において、CD19 CARは、配列番号39に提供される配列を含む。ある面において、CD19 CARは、配列番号40に提供される配列を含む。ある面において、CD19 CARは、配列番号41に提供される配列を含む。ある面において、CD19 CARは、配列番号42に提供される配列を含む。
さらに、本発明は、CD19 CAR組成物および数ある疾患の中で、癌またはCD19を発現する細胞または組織が関与するあらゆる悪性腫瘍または自己免疫性疾患を処置するための、医薬または方法におけるそれらの利用を提供する。
ある面において、本発明のCARをCD19発現正常細胞の根絶に使用でき、それにより細胞移植前の細胞コンディショニング治療としての使用が適用可能である。ある面において、CD19発現正常細胞は、CD19発現正常幹細胞であり、細胞移植は幹細胞移植である。
ある面において、本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように操作した細胞(例えば、T細胞)を提供し、ここで、CAR発現細胞、例えば、CAR T細胞(“CART”)は抗癌特性を示す。好ましい抗原はCD19である。ある面において、CARの抗原結合ドメインは、部分的にヒト化された抗CD19抗体フラグメントを含む。ある面において、CARの抗原結合ドメインは、scFvを含む部分的にヒト化された抗CD19抗体フラグメントを含む。従って、本発明は、ヒト化抗CD19結合ドメインを含み、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞またはNK細胞に設計されたCD19-CARおよび養子治療のためのその使用方法を提供する。
ある面において、CD19-CARは、CD137(4-1BB)シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD3ゼータシグナルドメインおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの細胞内ドメインを含む。ある面において、CD19-CARは、CD137(4-1BB)またはCD28以外の1以上の共刺激分子からの少なくとも一つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
キメラ抗原受容体(CAR)
本発明は、CARをコードする配列を含む組み換えDNA構築物を包含し、ここで、CARB細胞抗原(例えば、CD19、例えば、ヒトCD19)に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含み、ここで、抗体フラグメントの配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しており、同じリーディングフレーム内にある。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび/または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインの少なくとも一部を含む、CARの部分をいう。ある態様において、抗原結合ドメインは、ここに記載するマウス抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメントである。
本発明は、CARをコードする配列を含む組み換えDNA構築物を包含し、ここで、CARB細胞抗原(例えば、CD19、例えば、ヒトCD19)に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含み、ここで、抗体フラグメントの配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しており、同じリーディングフレーム内にある。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび/または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインの少なくとも一部を含む、CARの部分をいう。ある態様において、抗原結合ドメインは、ここに記載するマウス抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメントである。
具体的な面において、本発明のCAR構築物は、配列番号1~12からなる群から選択されるscFvドメインまたは配列番号59のscFVドメインを含み、ここで、scFvの前に配列番号13に提供するような任意のリーダー配列および後ろに配列番号14または配列番号45または配列番号47または配列番号49に提供するような任意のヒンジ配列、配列番号15に提供するような膜貫通領域、配列番号16または配列番号51を含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび配列番号17または配列番号43を含むCD3ゼータ配列があってよく、ここで、ドメインは、連続しており、同じリーディングフレーム内にあり、単一融合タンパク質を形成する。配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号59からなる群から選択されるscFvフラグメントの各々のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も本発明に包含される。配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号59からなる群から選択されるscFvフラグメントの各々のポリペプチドおよび配列番号13~17のドメインの各々をコードするヌクレオチド配列と、コードされた本発明のCD19CAR融合タンパク質も本発明に包含される。ある面において、代表的CD19CAR構築物は、任意のリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメインおよび細胞内刺激ドメインを含む。ある面において、代表的CD19CAR構築物は任意のリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメインおよび細胞内刺激ドメインを含む。本発明のヒト化scFvドメインを含む特異的CD19 CAR構築物は、配列番号31~42として提供され、または配列番号59として提供されるマウスscFvドメインである。
完全長CAR配列も、表7および表3に示すように、配列番号31~42および58としてここに提供する。
代表的リーダー配列は配列番号13として提供する。代表的ヒンジ/スペーサー配列は配列番号14または配列番号45または配列番号47または配列番号49として提供する。代表的膜貫通ドメイン配列は配列番号15として提供する。4-1BBタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの代表的配列は配列番号16として提供する。CD27の細胞内シグナル伝達ドメインの代表的配列は配列番号51として提供する。代表的CD3ゼータドメイン配列は配列番号17または配列番号43として提供する。
ある面において、本発明は、CARをコードする核酸分子を含む組み換え核酸構築物を包含し、ここで、核酸分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しており、同じリーディングフレーム内にある、例えば、ここに記載の、抗CD19結合ドメインをコードする核酸配列を含む。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号1~12および58から選択される1以上である。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号61~72および59の1以上に提供される配列のヌクレオチド残基64~813によりコードされる。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号61のヌクレオチド残基64~813によりコードされる。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号62のヌクレオチド残基64~813によりコードされる。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号63のヌクレオチド残基64~813によりコードされる。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号64のヌクレオチド残基64~813によりコードされる。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号65のヌクレオチド残基64~813によりコードされる。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号66のヌクレオチド残基64~813によりコードされる。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号67のヌクレオチド残基64~813によりコードされる。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号68のヌクレオチド残基64~813によりコードされる。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号69のヌクレオチド残基64~813によりコードされる。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号70のヌクレオチド残基64~813によりコードされる。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号71のヌクレオチド残基64~813によりコードされる。ある面において、抗CD19結合ドメインは、配列番号72のヌクレオチド残基64~813によりコードされる。
ある面において、本発明は、CARをコードする導入遺伝子を含む組み換え核酸構築物を包含し、ここで、核酸分子は、配列番号61~72から選択される1以上の抗CD19結合ドメインをコードする核酸配列を含み、ここで、配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しており、同じリーディングフレーム内にある。CARにおいて使用できる代表的細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、CD3ゼータ、CD28、4-1BBなどの1以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない。ある例において、CARは、CD3ゼータ、CD28、4-1BBなどの任意の組み合わせを含み得る。ある面において、本発明のCAR構築物の核酸配列は、配列番号85~96から選択される1以上である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号85である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号86である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号87である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号88である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号89である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号90である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号91である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号92である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号93である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号94である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号95である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号96である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号97である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号98である。ある面において、CAR構築物の核酸配列は、配列番号99である。
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用する、例えば該遺伝子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニング、それを含むことが知られるベクターからの遺伝子の誘導またはそれを含む細胞および組織からの直接の単離のような、当分野で知られる組み換え法を使用して得ることができる。あるいは、目的の核酸を、クローン化ではなく、合成により産生できる。
本発明は、細胞に直接形質導入できる、CARを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含む。
本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトできるRNA構築物も含む。トランスフェクションに使用するためのmRNAを産生する方法は、特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(IVT)、続くポリA付加を含み、一般に50~2000塩基長の、3’および5’非翻訳配列(“UTR”)、5’キャップおよび/または配列内リボソーム進入部位(IRES)、発現させる遺伝子およびポリAテイルを含む構築物を産生する(配列番号118)。このように産生したRNAは、異なる種の細胞を効率的にトランスフェクトする。ある態様において、鋳型は、CARの配列を含む。ある態様において、RNA CARベクターを、エレクトロポレーションによりT細胞に形質導入する。
抗原結合ドメイン
ある面において、本発明のCARは、別に抗原結合ドメインと呼ばれる標的特異的結合要素を含む。部分の選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドのタイプおよび数による。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態と関係する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択し得る。そうして、本発明のCARにおける抗原結合ドメインのためのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例は、ウイルス、細菌および寄生虫感染、自己免疫疾患および癌細胞と関係するものを含む。
ある面において、本発明のCARは、別に抗原結合ドメインと呼ばれる標的特異的結合要素を含む。部分の選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドのタイプおよび数による。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態と関係する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択し得る。そうして、本発明のCARにおける抗原結合ドメインのためのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例は、ウイルス、細菌および寄生虫感染、自己免疫疾患および癌細胞と関係するものを含む。
ある面において、CAR介在T細胞応答は、所望の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを、CARに設計することにより、目的の抗原に方向付けできる。
ある面において、CARの抗原結合ドメインを含む部分は、CD19を標的とする抗原結合ドメインを含む。ある面において、抗原結合ドメインはヒトCD19を標的とする。ある面において、CARの抗原結合ドメインは、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)に記載されているFMC63 scFvフラグメントと同じまたは類似する結合特異性を有する。ある態様において、CARの抗原結合ドメインは、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)に記載のscFvフラグメントを含む。
抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体および重鎖可変ドメイン(VH)、軽鎖可変ドメイン(VL)およびラクダ類由来ナノボディの可変ドメイン(VHH)のような単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されないその機能的フラグメントを含むが、これらに限定されない抗原に結合するあらゆるドメインおよび組み換えフィブロネクチンドメインなどのような抗原結合ドメインとして機能することが知られる代替スキャフォールドであり得る。
ある態様において、CAR分子は、ここに記載する抗CD19結合ドメインの軽鎖相補性決定領域1(LC CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LC CDR2)および軽鎖相補性決定領域3(LC CDR3)の1以上(例えば、全3)およびここに記載する抗CD19結合ドメインの重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)および重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)の1以上(例えば、全3)を含む抗CD19結合ドメイン、例えば、LC CDRの1以上、例えば、全3およびHC CDRの1以上、例えば、全3を含む抗CD19結合ドメインを含む。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、ここに記載する抗CD19結合ドメインの重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)および重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)の1以上 (例えば、全3)を含み、例えば、抗CD19結合ドメインは、各々、ここに記載するHC CDR1、HC CDR2およびHC CDR3を含む2可変重鎖領域を有する。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、ここに記載するマウス軽鎖可変領域(例えば、表7)および/またはここに記載するマウス重鎖可変領域(例えば、表7)を含む。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、表7のアミノ酸配列のマウス軽鎖およびマウス重鎖を含むscFvである。ある態様において、抗CD19結合ドメイン(例えば、scFv)は、表7に提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1、2または3修飾(例えば、置換)を有するが、30、20または10修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表7のアミノ酸配列と95~99%同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域;および/または表7に提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1、2または3修飾(例えば、置換)を有するが、30、20または10修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表7のアミノ酸配列と95~99%同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、配列番号59の配列またはそれと95~99%同一性を有する配列を含む。ある態様において、抗CD19結合ドメインはscFvであり、ここに、例えば、表7に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、ここに、例えば、表7に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーを介して結合する。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、(Gly4-Ser)nリンカー(ここで、nは1、2、3、4、5または6、好ましくは3または4である)(配列番号53)を含む。scFvの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい:軽鎖可変領域-リンカー-重鎖可変領域または重鎖可変領域-リンカー-軽鎖可変領域。
いくつかの例において、抗原結合ドメインが、CARが最終的に使用されるのと同じ種由来であることが有利である。例えば、ヒトにおける使用のために、CARの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインについてヒトまたはヒト化残基を有することが有利であり得る。
それゆえに、ある面において、抗原結合ドメインはヒト化抗体または抗体フラグメントを含む。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインは、ここに記載するマウスまたはヒト化抗CD19結合ドメインの軽鎖相補性決定領域1(LC CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LC CDR2)および軽鎖相補性決定領域3(LC CDR3)の1以上 (例えば、全3)および/またはここに記載するマウスまたはヒト化抗CD19結合ドメインの重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)および重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)の1以上(例えば、全3)、例えば、ヒト化LC CDRの1以上、例えば、全3およびHC CDRの1以上、例えば、全3を含む抗CD19結合ドメインを含む。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインcはここに記載するマウスまたはヒト化抗CD19結合ドメインの重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)および重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)の1以上 (例えば、全3)を含み、例えば、ヒト化抗CD19結合ドメインは、各々、ここに記載するHC CDR1、HC CDR2およびHC CDR3を含む2可変重鎖領域を有する。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインは、ここに記載するヒト化軽鎖可変領域(例えば、表3)および/またはここに記載するヒト化重鎖可変領域(例えば、表3)を含む。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインは、ここに記載するヒト化重鎖可変領域(例えば、表3)、例えば、少なくとも2のここに記載するヒト化重鎖可変領域(例えば、表3)を含む。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、表3のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むscFvである。ある態様において、抗CD19結合ドメイン(例えば、scFv)は、表3に提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1、2または3修飾(例えば、置換)を有するが、30、20または10修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表3のアミノ酸配列と95~99%同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域;および/または表3に提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1、2または3修飾(例えば、置換)を有するが、30、20または10修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表3のアミノ酸配列と95~99%同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群から選択される配列またはそれと95~99%同一性を有する配列を含む。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインをコードする核酸配列は、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号70、配列番号71および配列番号72またはそれと95~99%同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインはscFvであり、ここに、例えば、表3に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、ここに、例えば、表3に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーを介して結合する。ある態様において、ヒト化抗CD19結合ドメインは、(Gly4-Ser)nリンカー(ここで、nは1、2、3、4、5または6、好ましくは3または4である)(配列番号53)を含む。scFvの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい:軽鎖可変領域-リンカー-重鎖可変領域または重鎖可変領域-リンカー-軽鎖可変領域。
ある面において、抗原結合ドメイン部分は、配列番号1~12から選択される1以上の配列を含む。ある面において、ヒト化CARは、配列番号31~42から選択される1以上の配列から選択される。ある面において、非ヒト抗体は、抗体の特定の配列または領域が、ヒトで天然に産生される抗体またはそのフラグメントとの類似性を高めるように修飾されている、ヒト化されている。
ヒト化抗体は、CDR移植(例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる欧州特許番号EP239,400号;国際公開WO91/09967号;および米国特許5,225,539号、5,530,101号および5,585,089号参照)、ベニアリングまたはリサーフェシング(例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる欧州特許EP592,106号およびEP519,596号;Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814;およびRoguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973参照)、鎖シャッフリング(例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる米国特許5,565,332号参照)および例えば、各々、引用によりその全体を本明細書に包含させる米国特許出願公開US2005/0042664号、米国特許出願公開US2005/0048617号、米国特許6,407,213号、米国特許5,766,886号、国際公開WO9317105号、Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)およびPedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)に開示された技術を含むが、これらに限定されない、当分野で知られる多様な技術を使用して産生できる。しばしば、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基を、抗原結合を変える、例えば、改善するために、CDRドナー抗体からの対応する残基と置き換える。これらのフレームワーク置換は、当分野で周知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基の相互作用のモデリングおよび特定の位置の異常フレームワーク残基を同定するための配列比較により、道程される(例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させるQueen et al.、米国特許5,585,089号;およびRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323参照)。
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒトである起源由来の1以上のアミノ酸残基をその中に残す。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば“移入”残基と呼ばれ、これは、一般に“移入”可変ドメインから取られる。ここに提供するように、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒト免疫グロブリン分子およびフレームワーク領域からの1以上のCDRを含み、ここで、フレームワークを構成するアミノ酸残基は、完全にまたは大部分ヒト生殖系列に由来する。抗体または抗体フラグメントのヒト化のための複数の技術が当分野で周知であり、齧歯類CDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列に変えて、すなわち、CDR移植(内容を、引用によりその全体を本明細書に包含させる、EP239,400号;PCT公報WO91/09967号;および米国特許4,816,567号;6,331,415号;5,225,539号;5,530,101号;5,585,089号;6,548,640号)により、Winterら(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))に従い実質的に実施できる。このようなヒト化抗体および抗体フラグメントにおいて、実質的に完全未満のヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列で置換されている。ヒト化抗体は、しばしば、あるCDR残基および恐らくあるフレームワーク(FR)残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基で置換されている、ヒト抗体である。抗体および抗体フラグメントのヒト化はまたベニアリングまたはリサーフェシング(EP592,106号;EP519,596号;Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994);およびRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994))または鎖シャッフリング(米国特許5,565,332号)により達成でき、これらの内容を、その全体を引用により本明細書に包含させる。
ヒト化抗体を製造するための、ヒト可変ドメイン、軽および重両者の選択は、抗原性を減少するためである。いわゆる“最良適合”法により、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知ヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、齧歯類のものに最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(FR)として認める(内容を引用によりその全体を本明細書に包含させる、Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987))。他の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、数種の異なるヒト化抗体のために使用し得る(例えば、内容を、引用することによりその全体を本明細書に包含させるNicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)参照)。ある態様において、重鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、全4フレームワーク領域はVH4_4-59生殖系列配列由来である。ある態様において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列(例えば、配列番号59)のアミノ酸から、1、2、3、4または5修飾、例えば、置換を含み得る。ある態様において、フレームワーク領域、例えば、軽鎖可変領域の全4フレームワーク領域はVK3_1.25生殖系列配列由来である。ある態様において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列(例えば、配列番号59)のアミノ酸から、1、2、3、4または5修飾、例えば、置換を含み得る。
ある面において、抗体フラグメントを含む本発明のCAR組成物の部分を、標的抗原への高親和性および他の都合よい生物学的特性を残して、ヒト化する。本発明のある面によって、ヒト化抗体および抗体フラグメントを、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用する、親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析の過程により製造する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に馴染み深い。選択した候補免疫グロブリン配列の可能性の高い立体配座構造を模式化し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンが標的抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このように、標的抗原への親和性増加のような、所望の抗体または抗体フラグメント特性が達成されるように、レシピエントおよび移入配列からFR残基を選択し、組み合わせできる。一般に、CDR残基は、直接的におよび最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、元の抗体と類似の抗原性特異性、例えば、本発明において、ヒトCD19と結合する能力を維持し得る。ある態様において、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、ヒトCD19への結合の親和性および/または特異性が改善され得る。
ある面において、抗CD19結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的特質または特性により特徴付けられる。例えば、ある面において、本発明のCAR組成物の抗原結合ドメインを含む部分は、ヒトCD19と特異的に結合する。ある面において、抗原結合ドメインは、ヒトCD19に対してNicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)に記載のFMC63 scFvと同じまたは類似する結合特異性を有する。ある面において、本発明は、抗体または抗体フラグメントを含む抗原結合ドメインに関し、ここで、抗体結合ドメインはCD19タンパク質またはそのフラグメントと特異的に結合し、ここで、抗体または抗体フラグメントは、配列番号1~12または配列番号59のアミノ酸配列を含む可変軽鎖および/または可変重鎖を含む。ある面において、抗原結合ドメインは、配列番号1~12または配列番号59から選択されるscFvのアミノ酸配列を含む。ある面において、scFvは、リーダー配列に隣接しており、同じリーディングフレーム内にある。ある面において、リーダー配列は、配列番号13として提供するポリペプチド配列である。
ある面において、抗CD19結合ドメインは、フラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント(scFv)である。ある面において、抗CD19結合ドメインは、Fv、Fab、(Fab’)2または二官能的(例えば二特異性)ハイブリッド抗体である(例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987))。ある面において、本発明の抗体およびそのフラグメントは、野生型のまたは増強された親和性で、CD19タンパク質と結合する。
ある例において、scFvを、当分野で知られる方法に従い製造できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426 and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。ScFv分子を、最適化された長さおよび/またはアミノ酸組成を有する、可動性ポリペプチドリンカーを使用して、VH領域とVL領域を一緒に連結することにより製造できる(例えば、Ser-Glyリンカー)。リンカー長は、scFvの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短ポリペプチドリンカー(例えば、5~10アミノ酸)を用いるならば、鎖内折りたたみは阻止される。鎖間折りたたみも、2可変領域を一緒にして機能的エピトープ結合部位を形成させるために必要である。リンカー配向およびサイズの例について、例えば、引用により本明細書に包含させる、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開2005/0100543号、2005/0175606号、2007/0014794号およびPCT公開WO2006/020258号およびWO2007/024715号参照。
scFvは、VL領域とVH領域の間に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。ある態様において、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。他の態様において、リンカー配列は、(Gly4Ser)n(ここで、nは1以上の正の整数である)(配列番号18)のようなグリシンおよびセリン反復のセットを含む。ある態様において、リンカーは(Gly4Ser)4(配列番号106)または(Gly4Ser)3(配列番号107)であり得る。リンカー長の変動は、活性試験で優れた有効性を生じるか、活性を保持するかまたは増強させ得る。
ある態様において、抗原結合ドメイン(または他の部分またはCAR全体)のアミノ酸配列を修飾でき、例えば、ここに記載するアミノ酸配列を、例えば、保存的置換により修飾できる。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で規定されており、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。
2以上の核酸またはポリペプチド配列における同一性パーセントは、同じである2以上の配列をいう。2配列は、次の配列比較アルゴリズムの一つまたは手動アラインメントおよび目視を使用して測定して、比較ウィンドウまたは指定領域を通して最大対応のために比較および整列したとき、2配列が、同じである特定したパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有するならば、“実質的に同一”である(すなわち、特定した領域、または、特定していないとき、配列全体にわたり、60%同一、所望により70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%,81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一)。所望により、同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド(または10アミノ酸)長またはそれ以上の領域、好ましくは100~500または1000またはそれ以上のヌクレオチド(または20、50、200またはそれ以上のアミノ酸)長の領域に存在する。
配列比較のために、一般に一方の配列が対照配列として働き、それに対して、試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用したとき、試験配列および対照配列をコンピューターに入力し、必要であれば、部分配列調和を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用でき、または代替パラメータを指定できる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、対照配列に対する試験配列の配列同一パーセントを計算する。比較のための配列のアラインメント法は、当分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局地的相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピューター制御履行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)または手動アラインメントおよび目視検査により(例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology参照)、実施できる。
配列同一性パーセントおよび配列類似性の決定に適するアルゴリズムの二つの例はBLASTアルゴリズムおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これはそれぞれAltschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402;およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationから公的に利用可能である。
2アミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれているE. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17のアルゴリズムを使用して、PAM120加重残基表、ギャップ長ペナルティ12およびギャップペナルティ4を使用しても決定できる。さらに、2アミノ酸配列間の同一性パーセントは、GCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comから利用可能)におけるGAPプログラムに取り込まれているNeedleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453アルゴリズムを使用して、Blossom 62マトリクスまたはPAM250マトリクスおよびギャップ加重16、14、12、10、8、6または4および長さ加重1、2、3、4、5または6を使用しても決定できる。
ある面において、本発明は、機能的に等価な分子を産生する、出発抗体またはフラグメント(例えば、scFv)アミノ酸配列の修飾を意図する。例えば、CARに含まれる抗CD19結合ドメインのVHまたはVL、例えば、scFvを、抗CD19結合ドメイン、例えば、出発VHまたはVLフレームワーク領域のscFvと少なくとも約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%,81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性を保持するように修飾できる。本発明は、機能的に等価な分子を産生するための、CAR構築物全体の修飾、例えば、CAR構築物の種々のドメインの1以上のアミノ酸配列の修飾を意図する。CAR構築物は、出発CAR構築物と少なくとも約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%,81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性を維持するように修飾できる。
二特異性CAR
ある態様において、多特異的抗体分子は、二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、2を超えない抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。ある態様において、第一および第二エピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質(または多量体タンパク質のサブユニット)にある。ある態様において、第一および第二エピトープは重複する。ある態様において、第一および第二エピトープは重複しない。ある態様において、第一および第二エピトープは異なる抗原、例えば、異なるタンパク質(または多量体タンパク質の異なるサブユニット)にある。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列および第二エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある態様において、二重特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体および第二エピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。ある態様において、二重特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントを含む。ある態様において、二重特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有するscFvまたはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有するscFvまたはそのフラグメントを含む。
ある態様において、多特異的抗体分子は、二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、2を超えない抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。ある態様において、第一および第二エピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質(または多量体タンパク質のサブユニット)にある。ある態様において、第一および第二エピトープは重複する。ある態様において、第一および第二エピトープは重複しない。ある態様において、第一および第二エピトープは異なる抗原、例えば、異なるタンパク質(または多量体タンパク質の異なるサブユニット)にある。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列および第二エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある態様において、二重特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体および第二エピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。ある態様において、二重特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントを含む。ある態様において、二重特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有するscFvまたはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有するscFvまたはそのフラグメントを含む。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、多様な態様において、CARは、CARの細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する1以上のさらなるアミノ酸、例えば、膜貫通ドメインが由来したタンパク質の細胞外領域と結合する1以上のアミノ酸(細胞外領域の例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10から最大15アミノ酸)および/または膜貫通型タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と結合する1以上のさらなるアミノ酸(例えば、細胞内領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10から最大15アミノ酸)を含むことができる。ある面において、膜貫通ドメインは、CARの他のドメインと結合しているもの、例えば、ある態様において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメインまたはヒンジドメインが由来したのと同じタンパク質に由来し得る。他の面において、膜貫通ドメインは、CARの他のいずれかのドメインが由来するのと同じタンパク質に由来しない。ある例において、膜貫通ドメインは、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するため、このようなドメインの同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を避けるため、選択できまたはアミノ酸置換により修飾できる。ある面において、膜貫通ドメイン膜貫通ドメインは、CAR発現細胞の細胞表面上の他のCARとホモ二量体化できる。異なる面において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じCAR発現細胞に存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するために、修飾または置換され得る。
膜貫通ドメインに関して、多様な態様において、CARは、CARの細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する1以上のさらなるアミノ酸、例えば、膜貫通ドメインが由来したタンパク質の細胞外領域と結合する1以上のアミノ酸(細胞外領域の例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10から最大15アミノ酸)および/または膜貫通型タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と結合する1以上のさらなるアミノ酸(例えば、細胞内領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10から最大15アミノ酸)を含むことができる。ある面において、膜貫通ドメインは、CARの他のドメインと結合しているもの、例えば、ある態様において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメインまたはヒンジドメインが由来したのと同じタンパク質に由来し得る。他の面において、膜貫通ドメインは、CARの他のいずれかのドメインが由来するのと同じタンパク質に由来しない。ある例において、膜貫通ドメインは、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するため、このようなドメインの同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を避けるため、選択できまたはアミノ酸置換により修飾できる。ある面において、膜貫通ドメイン膜貫通ドメインは、CAR発現細胞の細胞表面上の他のCARとホモ二量体化できる。異なる面において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じCAR発現細胞に存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するために、修飾または置換され得る。
膜貫通ドメインは、天然由来でも、組み換え供給源由来でもよい。供給源が天然であるとき、ドメインは、あらゆる膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。ある面において、膜貫通ドメインは、CARが標的に結合するときは、細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明で特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、T細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154の少なくとも膜貫通領域を含み得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、例えば、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rベータ、IL2Rガンマ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2Cの少なくとも膜貫通領域を含み得る。
ある例において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質からのヒンジを介して、CARの細胞外領域、例えば、CARの抗原結合ドメインに結合され得る。例えば、ある態様において、ヒンジは、ヒトIg(免疫グロブリン)ヒンジ、例えば、IgG4ヒンジ、IgDヒンジ)、GSリンカー(例えば、GSここに記載するリンカー)、KIR2DS2ヒンジまたはCD8aヒンジであり得る。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号14のアミノ酸配列を含む(例えば、からなる)。ある面において、膜貫通ドメインは、配列番号15のアミノ酸配列を含む(例えば、からなる)。
一つの面において、ヒンジまたはスペーサーは、IgG4ヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列
のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、
のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、IgDヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列
のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、
のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
ある面において、膜貫通ドメインは組み換えであってよく、この場合、主としてロイシンおよびバリンのような疎水性残基を含む。一つの面においてフェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組が、組み換え膜貫通ドメインの各端に見られ得る。
所望により、2~10アミノ酸長の短オリゴまたはポリペプチドリンカーが、CARの膜貫通ドメインと細胞質領域の間の結合を形成し得る。グリシン-セリンダブレットは、特に適当なリンカーを提供する。例えば、一つの面において、リンカーは、
のアミノ酸配列を含む。ある態様において、リンカーは、
のヌクレオチド配列によりコードされる。
ある面において、ヒンジまたはスペーサーはKIR2DS2ヒンジを含む。
細胞質ドメイン
CARの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、CARが導入される免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくともの一つの活性化を一般に担う。用語“エフェクター機能”は、細胞の専門化された機能をいう。T細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解性活性またはヘルパー活性であり得る。用語“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化された機能の実施を指示する、タンパク質の部分をいう。通常細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分を使用する点において、このような切断された部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全鎖の変わりに使用し得る。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、このように、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断された部分を含むことを意味する。
CARの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、CARが導入される免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくともの一つの活性化を一般に担う。用語“エフェクター機能”は、細胞の専門化された機能をいう。T細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解性活性またはヘルパー活性であり得る。用語“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化された機能の実施を指示する、タンパク質の部分をいう。通常細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分を使用する点において、このような切断された部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全鎖の変わりに使用し得る。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、このように、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断された部分を含むことを意味する。
本発明のCARで使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体結合後にシグナル伝達の開始のために協力して働くT細胞受容体(TCR)および共受容体の細胞質配列、ならびに同じ機能的能力を有するこれらの配列のあらゆる誘導体または変異体およびあらゆる組み換え配列を含む。
TCRのみを介して産生されたシグナルがT細胞の完全活性化に不十分であり、二次的および/または共刺激シグナルも必要であることが知られる。それゆえに、T細胞活性化は、TCR(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)を介する抗原依存性一次活性化を開始するものおよび二次的または共刺激シグナル(二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン)を提供するために抗原非依存的様式で作用するものの、2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列により介在されるということができる。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激方向または阻害方向のいずれかで、TCR複合体の一次活性化を制御する。刺激様式で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明で特に有用な一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むITAMの例は、CD3ゼータ、共通FcRガンマ(FCER1G)、FcガンマRIIa、FcRベータ(FcイプシロンR1b)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD79a、CD79b、DAP10およびDAP12のものを含む。ある態様において、本発明のCARは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、CD3ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、天然のITAMドメインと比較して活性が改変(例えば、増加または低下)された修飾ITAMドメイン、例えば、変異ITAMドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ITAM含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および/または切断したITAM含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、1、2、3、4またはそれ以上のITAMモチーフを含む。
本発明において特に有用な一次細胞内シグナル伝達ドメイン含有分子のさらなる例は、DAP10、DAP12およびCD32のものを含む。
CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータシグナル伝達ドメインを単独で含んでも、それを本発明の文脈においてのCARに有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせてもよい。例えば、CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、CARの共刺激分子の細胞内ドメインを含む部分をいう。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例は、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3およびCD83と特異的に結合するリガンドなどを含む。例えば、CD27共刺激は、インビトロでヒトCART細胞の増殖、エフェクター機能および生存を増強し、インビボでヒトT細胞持続および抗腫瘍活性を増強することが示されている(Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706)。このような共刺激分子のさらなる例は、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL2Rベータ、IL2Rガンマ、IL7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、NKG2D、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/CbpおよびCD19aを含む。
本発明のCARの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、無作為にまたは特定の順番で互いに連結され得る。所望により、例えば、2~10アミノ酸(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10アミノ酸)長の、短オリゴまたはポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列間の結合を形成し得る。ある態様において、グリシン-セリンダブレットを適当なリンカーとして使用できる。ある態様において、単アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを適当なリンカーとして使用できる。
一つの面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、2以上の、例えば、2、3、4、5またはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、2以上の、例えば、2、3、4、5またはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば、ここに記載するリンカー分子により離される。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、2の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、リンカー分子はグリシン残基である。ある態様において、リンカーはアラニン残基である。
一つの面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータのシグナル伝達ドメインおよびCD28のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一つの面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータのシグナル伝達ドメインおよび4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一つの面において、4-1BBのシグナル伝達ドメインは、配列番号16のシグナル伝達ドメインである。一つの面において、CD3ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号17のシグナル伝達ドメインである。
一つの面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータのシグナル伝達ドメインおよびCD27のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一つの面において、CD27のシグナル伝達ドメインは、
のアミノ酸配列を含む。一つの面において、CD27のシグナル伝達ドメインは、
の核酸配列によりコードされる。
ある面において、ここに記載するCAR発現細胞は、さらに、第二CAR、例えば、同じ標的(CD19)へのまたは異なる標的(例えば、CD123またはメソセリン)への異なる抗原結合ドメインを含む、例えば、第二CARを含み得る。ある態様において、ある態様において、CAR発現細胞が2以上の異なるCARを含むとき、異なるCARの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第一および第二CARを発現する細胞は、第一CARの抗原結合ドメインを、例えば、フラグメント、例えば、scFvとして有してよく、これは、第二CARの抗原結合ドメイン、例えば、VHHである第二CARの抗原結合ドメインと結合を形成しない。
他の面において、ここに記載するCAR発現細胞他の薬剤、例えば、CAR発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現できる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、PD1は、ある態様において、CAR発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下させ得る。阻害分子の例は、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4およびTGFRベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4またはTGFRベータまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)のような阻害分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するように、例えば、41BB、CD27またはCD28を含む)および/または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)である第二ポリペプチドを含む。ある態様において、薬剤は、PD1またはそのフラグメントの第一ポリペプチド(例えば、PD1の細胞外ドメインの少なくとも一部)およびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するCD28シグナル伝達ドメインおよび/またはここに記載するCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。PD1は、CD28、CTLA-4、ICOSおよびBTLAも含む受容体のCD28ファミリーの阻害メンバーである。PD-1は、活性化B細胞、T細胞および骨髄球性細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。PD1、PD-L1およびPD-L2に対する2リガンドが、PD1への結合によりT細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1は、ヒト癌で豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、PD1とPD-L1の局所相互作用の阻害により逆転され得る。
ある態様において、阻害分子、例えば、プログラム細胞死1(PD1)の細胞外ドメイン(ECD)を含む薬剤は、41BBおよびCD3ゼータのような膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに融合できる(ここではPD1 CARとも呼ぶ)。ある態様において、PD1 CARは、ここに記載するCD19 CARと組み合わせて使用したとき、T細胞の持続を改善する。ある態様において、CARは、配列番号121おいて下線で示すPD1の細胞外ドメインを含む、PD1 CARである。ある態様において、PD1 CARは、配列番号121のアミノ酸配列を含む。
ある態様において、薬剤は、PD1 CAR、例えば、ここに記載するPD1 CARをコードする核酸配列を含む。ある態様において、PD1 CARのための核酸配列を下に示し、PD1 ECDは、下の配列番号120で下線を引いている。
他の面において、本発明は、CAR発現細胞の集団、例えば、CART細胞を提供する。ある態様において、CAR発現細胞の集団は、異なるCARを発現する細胞の混合物を含む。例えば、ある態様において、CAR発現細胞の集団は、ここに記載する抗CD19結合ドメインを有するCARを発現する第一細胞および異なる抗CD19結合ドメイン、例えば、第一細胞により発現されるCARにおける抗CD19結合ドメインと異なるここに記載する抗CD19結合ドメインを有するCARを発現する第二細胞を含み得る。他の例として、CAR発現細胞の集団は、例えば、ここに記載するような、抗CD19結合ドメインを含むCARを発現する第一細胞およびCD19以外(例えば、CD123)を標的とする抗原結合ドメインを含むCARを発現する第二細胞を含み得る。ある態様において、CAR発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARを発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むCARを発現する第二細胞を含む。
他の面において、本発明は、細胞の集団を提供し、ここで、集団における少なくとも1細胞がここに記載する抗CD19結合ドメインを有するCARを発現し、第二細胞が他の薬剤、例えば、CAR発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子は、例えば、ある態様において、CAR発現細胞が免疫エフェクター応答を開始するのを阻害できる。阻害分子の例は、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4またはTGFRベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを伝達する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4またはTGFRベータのような阻害分子またはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである第二ポリペプチド(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するような、例えば、41BB、CD27またはCD28)および/または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)を含む。ある態様において、薬剤は、PD1またはそのフラグメント(例えば、PD1の細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインの第二ポリペプチド(例えば、ここに記載するCD28シグナル伝達ドメインおよび/またはここに記載するCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。
調節可能なキメラ抗原受容体
ある態様において、CAR活性が制御できる調節可能なCAR(RCAR)が、CAR治療の安全性および有効性を最適化するために望まれる。CAR活性を制御できる多くの方法がある。例えば、二量体化ドメインに融合したカスパーゼを使用する、例えば、誘導性アポトーシス(例えば、Di Stasa et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683参照)を、本発明のCAR治療における安全スイッチとして使用できる。ある態様において、本発明のCARを発現する細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)は、さらに誘導性アポトーシススイッチを含むことができ、ここで、ヒトカスパーゼ(例えば、カスパーゼ9)または修飾バージョンがヒトFKBタンパク質の修飾体に融合し、これは条件付二量体化を可能とする。ラパログ(例えば、AP1903、AP20187)のような小分子存在下、誘導性カスパーゼ(例えば、カスパーゼ9)は活性化されて、本発明のCARを発現する細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)の急速なアポトーシスおよび死に至る。カスパーゼベースの誘導性アポトーシススイッチ(またはこのようなスイッチの1以上の面)の例は、例えば、全て、引用により本明細書に包含させるUS2004040047号;US20110286980号;US20140255360号;WO1997031899号;WO2014151960号;WO2014164348号;WO2014197638号;WO2014197638号に記載されている。
ある態様において、CAR活性が制御できる調節可能なCAR(RCAR)が、CAR治療の安全性および有効性を最適化するために望まれる。CAR活性を制御できる多くの方法がある。例えば、二量体化ドメインに融合したカスパーゼを使用する、例えば、誘導性アポトーシス(例えば、Di Stasa et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683参照)を、本発明のCAR治療における安全スイッチとして使用できる。ある態様において、本発明のCARを発現する細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)は、さらに誘導性アポトーシススイッチを含むことができ、ここで、ヒトカスパーゼ(例えば、カスパーゼ9)または修飾バージョンがヒトFKBタンパク質の修飾体に融合し、これは条件付二量体化を可能とする。ラパログ(例えば、AP1903、AP20187)のような小分子存在下、誘導性カスパーゼ(例えば、カスパーゼ9)は活性化されて、本発明のCARを発現する細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)の急速なアポトーシスおよび死に至る。カスパーゼベースの誘導性アポトーシススイッチ(またはこのようなスイッチの1以上の面)の例は、例えば、全て、引用により本明細書に包含させるUS2004040047号;US20110286980号;US20140255360号;WO1997031899号;WO2014151960号;WO2014164348号;WO2014197638号;WO2014197638号に記載されている。
ある面において、RCARは、ここに記載する標準的CARの成分、例えば、抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが別々のポリペプチドまたはメンバーに配置されている、一般に最も単純な態様において2つの、一連のポリペプチドを含む。ある態様において、一連のポリペプチドは、二量体化分子の存在下、ポリペプチドを互いに連結できる、例えば、抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結できる、二量体化スイッチを含む。ある態様において、本発明のCARは、引用により本明細書に包含する、例えば、WO2014127261号に記載のもののような、二量体化スイッチを利用する。
ある面において、RCARは、1)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー;2)ここに記載するような、例えば、ここに記載するCD19を標的とする抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバーの2つのポリペプチドまたはメンバーを含む。所望により、RCARは、ここに記載する膜貫通ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達メンバー上、抗原結合メンバー上または両者の上に配置できる。(特に断らない限り、RCARのメンバーまたは要素がここに記載されているとき、順番は示されるとおりであってよいが、他の順番も同様に含まれる。換言すると、ある態様において、順番は本文に記載したとおりであるが、他の態様において、順番は異なり得る。例えば、膜貫通領域の一方の要素の順番は例と異なってよく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに対するスイッチドメインの位置は、異なる、例えば、逆でよい)。
ある態様において、第一および第二スイッチドメインは、細胞内または細胞外二量体化スイッチを形成できる。ある態様において、二量体化スイッチは、例えば、第一および第二スイッチドメインが同じであるときホモ二量体化スイッチであってよく、または、例えば、第一および第二スイッチドメインが互いに異なるとき、ヘテロ二量体化スイッチであってよい。
ある態様において、RCARは、“多スイッチ”を含み得る。多スイッチはヘテロ二量体化スイッチドメインまたはホモ二量体化スイッチドメインを含み得る。多スイッチは、複数の、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10のスイッチドメインを、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーおよび第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーと独立して含む。ある態様において、第一メンバーは、複数の第一スイッチドメイン、例えば、FKBPベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは、複数の第二スイッチドメイン、例えば、FRBベースのスイッチドメインを含んでよい。ある態様において、第一メンバーは、第一および第二スイッチドメイン、例えば、FKBPベースのスイッチドメインおよびFRBベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは、第一および第二スイッチドメイン、例えば、FKBPベースのスイッチドメインおよびFRBベースのスイッチドメインを含み得る。
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、1以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび1以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様において、抗原結合メンバーは、1以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、1以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、2または3の、例えば、41BB、CD28、CD27、ICOSおよびOX40から選択される、ここに記載する共刺激シグナル伝達ドメインを含み、ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインがない。ある態様において、抗原結合メンバーは、細胞外から細胞内方向で、次の共刺激シグナル伝達ドメインを含む:41BB-CD27;41BB-CD27;CD27-41BB;41BB-CD28;CD28-41BB;OX40-CD28;CD28-OX40;CD28-41BB;または41BB-CD28。このような態様において、細胞内結合メンバーは、CD3ゼータドメインを含む。このような態様の一つにおいて、RCARは、(1)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび2共刺激ドメインおよび第一スイッチドメインを含む抗原結合メンバー;および(2)膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインおよび少なくとも1つの一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様は、抗原結合メンバーがCAR細胞の表面に繋留されていない、RCARを提供する。これは、細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞を、該細胞を抗原結合メンバーをコードする配列で形質転換することなく、1以上の抗原結合ドメインと好都合に対形成させる。このような態様において、RCARは、1)第一スイッチドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー;および2)抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーは膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインを含まず、そして、所望により、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、RCARは、さらに、3)抗原結合ドメインが結合するのと異なる抗原に結合する第二抗原結合ドメイン、例えば、第二抗原結合ドメイン;および第二スイッチドメインを含む第二抗原結合メンバーを含み得る。
抗原結合メンバーが二特異性活性化および標的化能を含むRCARも提供される。この態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、2、3、4または5の抗原結合ドメイン、例えば、scFvを含んでよく、ここで、各抗原結合ドメインは、標的抗原、例えば異なる抗原または同じ抗原、例えば、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープに結合する。ある態様において、複数の抗原結合ドメインは直列であり、所望により、リンカーまたはヒンジ領域が抗原結合ドメインの各々の間に配置される。適当なリンカーおよびヒンジ領域はここに記載する。
ある態様は、増殖のスイッチングを可能にする配置を有するRCARを提供する。この態様において、RCARは、1)所望により、膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメイン;例えば、41BB、CD28、CD27、ICOSおよびOX40から選択される1以上の共刺激シグナル伝達ドメインおよびスイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー;および2)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、CD3ゼータドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーは、スイッチドメインを含まないかまたは細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化するスイッチドメインを含まない。ある態様において、抗原結合メンバーは共刺激シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ホモ二量体化スイッチからのスイッチドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインを含み、RCARは、ヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含む。このような態様において、第二細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバーと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、二量体化スイッチは細胞内である。ある態様において、二量体化スイッチは細胞外である。
ここに記載するRCAR配置のいずれにおいても、第一および第二スイッチドメインは、ここに記載するFKBP-FRBベースのスイッチを含む。
ここに記載するRCARを含む細胞もここで提供される。RCARを発現するように操作したあらゆる細胞を、RCARX細胞として使用できる。ある態様において、RCARX細胞はT細胞であり、RCART細胞と呼ぶ。ある態様において、RCARX細胞はNK細胞であり、RCARN細胞と呼ぶ。
RCARコード化配列を含む核酸およびベクターもここで提供される。RCARの種々の要素をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、同じプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。ある態様において、(i)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、同じ核酸、例えば、ベクター上に存在できる。対応するタンパク質の産生は、例えば、別のプロモーターの使用によりまたはバイシストロニック転写産物(これは、単一翻訳産物の開裂によりまたは2つの別々のタンパク質産物の翻訳により、2タンパク質の産生をもたらし得る)の使用により達成できる。ある態様において、開裂可能ペプチドをコードする配列、例えば、P2AまたはF2A配列を(i)と(ii)の間に配置する。ある態様において、IRESをコードする配列、例えば、EMCVまたはEV71 IRESを(i)と(ii)の間に配置する。これらの態様において、(i)および(ii)は単一RNAとして転写される。ある態様において、(i)および(ii)が別のmRNAとして転写されるように、第一プロモーターは(i)に操作可能に連結し、第二プロモーターは(ii)に操作可能に連結する。
あるいは、RCARの種々の要素をコードする配列を、異なる核酸分子、例えば、異なるプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。例えば、(i)抗原結合メンバーをコードする配列は第一核酸、例えば、第一ベクター上に存在でき、そして(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は第二核酸、例えば、第二ベクター上に存在できる。
二量体化スイッチ
二量体化スイッチは、非共有結合でも共有結合でもよい。非共有結合二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有結合相互作用を促進する。共有結合二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有結合相互作用を促進する。
二量体化スイッチは、非共有結合でも共有結合でもよい。非共有結合二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有結合相互作用を促進する。共有結合二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有結合相互作用を促進する。
ある態様において、RCARは、FKBP/FRAPまたはFKBP/FRBベースの二量体化スイッチを含む。FKBP12(FKBPまたはFK506結合タンパク質)は、天然産物免疫抑制剤、ラパマイシンの初期細胞内標的として働く、豊富な細胞質タンパク質である。ラパマイシンはFKBPおよび大型PI3KホモログFRAP(RAFT、mTOR)に結合する。FRBは、FKBP-ラパマイシン複合体の結合に十分な、FRAPの93アミノ酸部分である(Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51)。
ある態様において、FKBP/FRAP、例えば、FKBP/FRBベースのスイッチは、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログとして使用できる。
FKBPのアミノ酸配列は次のとおりである。
FKBPのアミノ酸配列は次のとおりである。
ある態様において、FKBPスイッチドメインは、ラパマイシンまたはラパログの存在下、FRBまたはそのフラグメントもしくはアナログと結合する能力を有するFKBPのフラグメント、例えば、次の配列番号37の下線部分を含み得る。
“FKBP/FRAP、例えば、FKBP/FRBベースのスイッチ”は、その用語をここで使用する限り、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、RAD001の存在下、FRBまたはそのフラグメントもしくはアナログと結合する能力を有し、配列番号122または123のFKBP配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するかまたは30、25、20、15、10、5、4、3、2または1のアミノ酸残基を超えて異ならない、FKBPそのフラグメントもしくはアナログを含む第一スイッチドメイン;およびラパマイシンまたはラパログの存在下、FRBまたはそのフラグメントもしくはアナログと結合する能力を有し、配列番号124のFRB配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するかまたは30、25、20、15、10、5、4、3、2または1のアミノ酸残基を超えて異ならない、FRBそのフラグメントもしくはアナログを含む、第二スイッチドメインを含む、二量体化スイッチをいう。ある態様において、ここに記載するRCARは、配列番号122(または配列番号123)に開示するアミノ酸残基を含む1つのスイッチドメインおよび配列番号124に開示するアミノ酸残基を含む1つのスイッチドメインを含む。
ある態様において、FKBP/FRB二量体化スイッチは、FRBベースのスイッチドメイン、例えば、修飾FRBスイッチドメイン、FKBPベースのスイッチドメインと、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、RAD001の複合体形成が変えられた、例えば、増強された、修飾FRBスイッチドメインを含む。ある態様において、修飾FRBスイッチドメインは、野生型アミノ酸が、その他の天然に存在するアミノ酸に変異している、アミノ酸位置L2031、E2032、S2035、R2036、F2039、G2040、T2098、W2101、D2102、Y2105およびF2108での変異から選択される、1以上の、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の変異を含む。ある態様において、変異体FRBは、E2032に変異を含み、ここで、E2032はフェニルアラニン(E2032F)、メチオニン(E2032M)、アルギニン(E2032R)、バリン(E2032V)、チロシン(E2032Y)、イソロイシン(E2032I)、例えば、配列番号125またはロイシン(E2032L)、例えば、配列番号126に変異されている。ある態様において、変異体FRBは、T2098に変異を含み、ここで、T2098はフェニルアラニン(T2098F)またはロイシン(T2098L)、例えば、配列番号127に変異されている。ある態様において、変異体FRBは、E2032およびT2098に変異を含み、ここで、E2032は任意のアミノ酸に変異され、T2098は任意のアミノ酸に変異され、例えば、配列番号128である。ある態様において、変異体FRBは、E2032IおよびT2098L変異を含み、例えば、配列番号129である。ある態様において、変異体FRBはE2032LおよびT2098L変異を含み、例えば、配列番号130である。
他の適当な二量体化スイッチは、GyrB-GyrBベースの二量体化スイッチ、ジベレリンベースの二量体化スイッチ、タグ/バインダー二量体化スイッチおよびハロタグ/snapタグ二量体化スイッチを含む。ここに提供する指針に従い、このようなスイッチおよび関連する二量体化分子は、当業者に明らかである。
二量体化分子
スイッチドメイン間の結合は二量体化分子により促進される。二量体化分子存在下、スイッチドメイン間の相互作用または結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば融合したポリペプチドと第二スイッチドメインに結合、例えば融合したポリペプチド間のシグナル伝達を可能にする。非律速レベルの二量体化分子の存在下、シグナル伝達は、例えば、ここに記載する系で測定して、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍増加する。
スイッチドメイン間の結合は二量体化分子により促進される。二量体化分子存在下、スイッチドメイン間の相互作用または結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば融合したポリペプチドと第二スイッチドメインに結合、例えば融合したポリペプチド間のシグナル伝達を可能にする。非律速レベルの二量体化分子の存在下、シグナル伝達は、例えば、ここに記載する系で測定して、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍増加する。
ラパマイシンおよびラパマイシンアナログ(ラパログと呼ぶこともある)、例えば、RAD001を、ここに記載するFKBP/FRBベースの二量体化スイッチにおける二量体化分子として使用できる。ある態様において、二量体化分子は、ラパマイシン(シロリムス)、RAD001(エベロリムス)、ゾタロリムス、テムシロリムス、AP-23573(リダフォロリムス)、バイオリムスおよびAP21967から選択できる。FKBP/FRBベースの二量体化スイッチと使用するのに適するさらなるラパマイシンアナログは、さらに“組み合わせ治療”なる表題の部分または表題“代表的mTOR阻害剤”の部分に記載する。
分裂CAR
ある態様において、CAR発現細胞は、分裂CARを使用する。分裂CAR手法は、公開WO2014/055442号およびWO2014/055657号にさらに詳細に記載される。簡潔には、分裂CAR系は第一抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン(例えば、41BB)を有する第一CARを発現する細胞を含み、細胞はまた第二抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3ゼータ)を有する第二CARを発現する。細胞が第一抗原と遭遇したとき、共刺激ドメインは活性化され、細胞が増殖する。細胞が第二抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインは活性化され、細胞死滅活性が開始する。それゆえに、CAR発現細胞は、両抗原の存在下でのみ完全活性化される。
ある態様において、CAR発現細胞は、分裂CARを使用する。分裂CAR手法は、公開WO2014/055442号およびWO2014/055657号にさらに詳細に記載される。簡潔には、分裂CAR系は第一抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン(例えば、41BB)を有する第一CARを発現する細胞を含み、細胞はまた第二抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3ゼータ)を有する第二CARを発現する。細胞が第一抗原と遭遇したとき、共刺激ドメインは活性化され、細胞が増殖する。細胞が第二抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインは活性化され、細胞死滅活性が開始する。それゆえに、CAR発現細胞は、両抗原の存在下でのみ完全活性化される。
RNAトランスフェクション
インビトロ転写RNA CARを産生する方法がここに開示される。本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトできるRNA構築物をコードするCARも含む。トランスフェクションに使用するためのmRNAを産生する方法は、一般に50~2000塩基長(配列番号118)の、3’および5’非翻訳配列(“UTR”)、5’キャップおよび/または配列内リボソーム進入部位(IRES)、発現させるべき核酸およびポリAテイルを含む構築物を産生するための特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(IVT)、続くポリA付加を含む。このように産生されたRNAは、異なる種の細胞を効率的にトランスフェクトできる。一つの面において、鋳型はCARのための配列を含む。
インビトロ転写RNA CARを産生する方法がここに開示される。本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトできるRNA構築物をコードするCARも含む。トランスフェクションに使用するためのmRNAを産生する方法は、一般に50~2000塩基長(配列番号118)の、3’および5’非翻訳配列(“UTR”)、5’キャップおよび/または配列内リボソーム進入部位(IRES)、発現させるべき核酸およびポリAテイルを含む構築物を産生するための特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(IVT)、続くポリA付加を含む。このように産生されたRNAは、異なる種の細胞を効率的にトランスフェクトできる。一つの面において、鋳型はCARのための配列を含む。
ある面において、抗CD19 CARは、メッセンジャーRNA(mRNA)によりコードされる。一つの面において、抗CD19 CARをコードするmRNAを、CAR発現細胞、例えば、CART細胞またはCAR NK細胞の産生のために免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞またはNK細胞に導入する。
ある態様において、インビトロ転写RNA CARを、一過性トランスフェクションの形で細胞に導入できる。RNAを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により産生した鋳型を使用してインビトロ転写により産生する。任意の供給源からの目的のDNAを、適切なプライマーおよびRNAポリメラーゼを使用して、PCRによりインビトロmRNA合成のための鋳型に直接変換できる。DNAの供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列またはDNAのあらゆる他の適切な供給源であり得る。インビトロ転写のための所望の鋳型は、本発明のCARである。例えば、RNA CARのための鋳型は、抗腫瘍抗体の一本鎖可変ドメイン;ヒンジ領域、膜貫通ドメイン(例えば、CD8aの膜貫通ドメイン);および例えば、CD3ゼータのシグナル伝達ドメインおよび4-1BBのシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域を含む細胞外領域を含む。
ある態様において、PCRに使用するDNAは、オープンリーディングフレームを含む。DNAは、生物のゲノムからの天然に存在するDNA配列由来であり得る。ある態様において、核酸は、5’および/または3’非翻訳領域(UTR)の一部または全てを含み得る。核酸はエクソンおよびイントロンを含み得る。ある態様において、PCRに使用するDNAはヒト核酸配列である。他の態様において、PCRに使用するDNAは5’UTRおよび3’UTRを含むヒト核酸配列である。DNAは、あるいは天然に存在する生物で通常発現されない人工DNA配列であり得る。代表的人工DNA配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームをコードするために一緒にライゲートされた遺伝子の部分を含むものである。一緒にライゲートされたDNAの部分は、単一生物由来でも、1種を超える生物由来でもよい。
PCRを使用して、トランスフェクションに使用するmRNAのインビトロ転写のための鋳型を産生する。PCRを実施する方法は、当分野で周知である。PCRにおいて使用するためのプライマーは、PCRで鋳型として使用するDNAの領域に実質的に相補的である領域を有するように設計する。ここで使用する“実質的に相補的”は、プライマー配列における塩基の大部分または全てが相補的であるかまたは1以上の塩基が非相補的またはミスマッチである、ヌクレオチド配列をいう。実質的に相補的な配列は、PCRに使用するアニーリング条件下、意図するDNA標的とアニールまたはハイブリダイズできる。プライマーは、DNA鋳型の任意の部分と実質的に相補的であるように設計できる。例えば、プライマーは、5’UTRおよび3’UTRを含む、細胞において通常転写される(オープンリーディングフレーム)核酸の部分を増幅するように設計できる。プライマーはまた目的の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにも設計できる。ある態様において、プライマーは、5’UTRおよび3’UTRの全てまたは一部を含む、ヒトcDNAのコード領域を増幅するように設計される。PCRに有用なプライマーは、当分野で周知である合成方法により産生できる。“順方向プライマー”は、増幅すべきDNA配列の上流にある、DNA鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“上流”は、コード鎖に対して増幅すべきDNA配列に対する5’位置をいう。“逆方向プライマー”は、増幅すべきDNA配列の下流である、二本鎖DNA鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“下流”は、コード鎖に対して増幅すべきDNA配列に対する3’位置をいう。
PCRのために有用なあらゆるDNAポリメラーゼを、ここに開示する方法に使用できる。試薬およびポリメラーゼは、多数の業者から入手可能である。
安定性および/または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用し得る。RNAは、好ましくは5’および3’ UTRを有する。ある態様において、5’ UTRは1~3000ヌクレオチド長である。コード領域に付加すべき5’および3’ UTR配列の長さは、UTRの異なる領域にアニールするPCRのためのプライマーの設計を含む、がこれに限定されない、異なる方法毎に変わり得る。この方法を使用して、当業者は、転写RNAのトランスフェクト後の最適翻訳効率を達成するのに必要な5’および3’ UTR長を修飾できる。
5’および3’ UTRは、天然に存在する、目的の核酸のための内因性5’および3’ UTRであり得る。あるいは、目的の核酸に内在性ではないUTR配列を、順方向および逆方向プライマーへのUTR配列の取り込みまたは鋳型のその他の修飾により付加できる。目的の核酸に内在性ではないUTR配列の使用は、RNAの安定性および/または翻訳効率の修飾のために有用であり得る。例えば、3’ UTR配列におけるAUリッチ要素がmRNAの安定性を低下させ得ることが知られる。それゆえに、3’ UTRを、当分野で周知である、UTRの特性に基づく転写RNAの安定性の増加のために選択または設計できる。
ある態様において、5’ UTRは、内在性核酸のコザック配列を含み得る。あるいは、目的の核酸に内在性ではない5’ UTRを上記のようにPCRで付加するとき、コンセンサスコザック配列を、5’ UTR配列の付加により再設計できる。コザック配列は、あるRNA転写物の翻訳効率を高め得るが、効率的翻訳を可能とするために全RNAで必要であるとは考えられない。多くのmRNAについてのコザック配列の必要性は当分野で知られる。他の態様において、5’ UTRは、RNAゲノムが細胞において安定であるRNAウイルスの5’ UTRであり得る。他の態様において、種々のヌクレオチドアナログを、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するように3’または5’ UTRで使用できる。
遺伝子クローニングの必要性なしにDNA鋳型からRNAの合成を可能とするために、転写のプロモーターを、転写される配列の上流でDNA鋳型に結合しなければならない。RNAポリメラーゼのためのプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの5’末端に添加したとき、RNAポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流でPCR産物に取り込まれるようになる。ある好ましい態様において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載するような、T7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、T3およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。T7、T3およびSP6プロモーターのためのコンセンサスヌクレオチド配列は、当分野で知られる。
好ましい態様において、mRNAは、リボソーム結合、翻訳開始および細胞における安定性を決定する、5’末端および3’ポリ(A)テイルの両者にキャップを有する。環状DNA鋳型、例えば、プラスミドDNAにおいて、RNAポリメラーゼは、真核細胞での発現に不適な長い鎖状産物を産生する。3’ UTRの末端で直線化したプラスミドDNAの転写は、転写後にポリアデニル化されても真核トランスフェクトに有効ではない、通常サイズのmRNAをもたらす。
直鎖状DNA鋳型において、ファージT7 RNAポリメラーゼは、転写物の3’末端を、鋳型の最後の塩基を越えて伸長できる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13 :6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270: 1485-65 (2003))。
DNA鋳型へのポリA/Tストレッチの組込みの従来の方法は分子クローニングである。しかしながら、プラスミドDNAへのポリA/T配列の統合はプラスミドを不安定にする可能性があり、これが、細菌細胞から得たプラスミドDNA鋳型がしばしば欠失および他の異常により高度に汚染されているかの理由である。これは、クローニング法を面倒で時間がかかるものとするだけでなく、しばしば信頼できないものとする。これは、クローニングなしでポリA/T 3’ストレッチを伴うDNA鋳型の構築を可能とする方法が非常に望まれるかの理由である。
ポリA/Tストレッチは、分子クローニングによりDNA鋳型(例えば、プラスミド)に統合できる。あるいは、転写性DNA鋳型のポリA/Tセグメントを、100Tテイル(配列番号110)(サイズは50~5000T(配列番号111)であり得る)のようなポリTテイルを含む逆方向プライマーを使用してPCR中にまたは、DNAライゲーションまたはインビトロ組換えを含むが、これらに限定されないその他の方法により、PCR後に産生できる。ポリ(A)テイルはまたRNAに安定性を与え、その分解を減らす。一般に、ポリ(A)テイルの長さは、転写RNAの安定性と正に相関する。ある態様において、ポリ(A)テイルは100~5000アデノシンである(配列番号112)。
RNAのポリ(A)テイルは、大腸菌ポリAポリメラーゼ(E-PAP)のようなポリ(A)ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後にさらに伸長できる。ある態様において、ポリ(A)テイルの長さの100ヌクレオチドから300~400ヌクレオチド(配列番号113)への延長は、RNAの翻訳効率の約2倍増加をもたらす。さらに、3’末端への異なる化学基の結合は、mRNA安定性を増加できる。このような結合は、修飾/人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含み得る。例えば、ATPアナログを、ポリ(A)ポリメラーゼを使用して、ポリ(A)テイルに統合できる。ATPアナログは、さらに、RNAの安定性を増加できる。
5’キャップもまたRNA分子に安定性を提供する。好ましい態様において、ここに開示の方法により産生したRNAは5’キャップを含む。5’キャップは当分野で知られ、ここに記載する技術を使用して提供される(Cougot, et al, Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al, RNA, 7: 1468-95 (2001); Elango, et al, Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
ここに開示の方法により産生されたRNAはまた配列内リボソーム進入部位(IRES)配列も含み得る。IRES配列は、mRNAへのキャップ非依存的リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促進する、あらゆるウイルス配列、染色体配列または人工的に設計した配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤および界面活性剤のような、細胞透過性および生存能を促進する因子を含むことができる、細胞エレクトロポレーションに適するあらゆる溶質が含まれ得る。
RNAを、多数の異なる方法、例えば、エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II(Biorad, Denver, Colo.)、Multiporator(Eppendort, Hamburg Germany)、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在トランスフェクト、ポリマー封入、ペプチド介在トランスフェクトまたは“遺伝子銃”のような微粒子銃粒子送達系を含むが、これらに限定されない、商業的に入手可能な方法のいずれかを使用して、標的細胞に統合できる(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)。
非ウイルス性送達法
ある面において、非ウイルス性の方法を使用して、ここに記載するCARをコードする核酸を細胞または組織または対象に送達できる。
ある面において、非ウイルス性の方法を使用して、ここに記載するCARをコードする核酸を細胞または組織または対象に送達できる。
ある態様において、非ウイルス性の方法は、トランスポゾン(転位因子とも呼ばれる)の使用を含む。ある態様において、トランスポゾンは、ゲノムにおけるある場所にそれ自体挿入できる一片のDNA、例えば、自己複製し、そのコピーをゲノムに挿入できる一片のDNAまたは長い核酸から切り出され、ゲノムの他の場所に挿入され得る一片のDNAである。例えば、トランスポゾンは、転位のための遺伝子に隣接した逆方向反復からなるDNA配列である。
トランスポゾンを使用する核酸送達の代表的方法は、Sleeping Beauty トランスポゾン系(SBTS)およびpiggyBac(PB)トランスポゾン系を含む。例えば、全てを引用により本明細書に包含させる、Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; and Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83参照。
SBTSは、1)導入遺伝子を含むトランスポゾンおよび2)トランスポサーゼ酵素の供給源の2成分を含む。トランスポサーゼは、担体プラスミド(または他のドナーDNA)からのトランスポゾンを、宿主細胞染色体/ゲノムのような標的DNAに転置できる。例えば、トランスポサーゼは担体プラスミド/ドナーDNAに結合し、トランスポゾン(導入遺伝子を含む)をプラスミドから切り出し、それを宿主細胞のゲノムに導入する。例えば、Aronovich et al. supra参照。
代表的トランスポゾンは、pT2ベースのトランスポゾンを含む。例えば、全てを引用により本明細書に包含させる、Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47;およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971参照。代表的トランスポサーゼは、Tc1/marinerタイプトランスポサーゼ、例えば、SB10トランスポサーゼまたはSB11トランスポサーゼ(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現され得る、高活性トランスポサーゼ)を含む。例えば、全てを引用により本明細書に包含させる、Aronovich et al.; Kebriaei et al.;およびGrabundzija et al.参照。
SBTSの使用は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するCARをコードする核酸の効率的組込みおよび発現を可能にする。例えば、SBTSのようなトランスポゾン系を使用する、ここに記載するCARを安定に発現する細胞、例えば、T細胞またはNK細胞を産生する方法をここに提供する。
ここに記載する方法によって、ある態様において、SBTS要素を含む1以上の核酸、例えば、プラスミドを、細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)に送達する。例えば、核酸は、核酸(例えば、プラスミドDNA)送達の標準法、例えば、ここに記載する方法、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクションまたはリポフェクションにより送達される。ある態様において、核酸は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するCARをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。ある態様において、核酸は、導入遺伝子(例えば、ここに記載するCARをコードする核酸)を含むトランスポゾンならびにトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。他の態様において、2核酸を伴う系、例えば、第一プラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第二プラスミドがトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、例えば、デュアル-プラスミド系を提供する。例えば、第一および第二核酸は、宿主細胞に共送達される。
ある態様において、ここに記載するCARを発現する細胞、例えば、T細胞またはNK細胞は、SBTSを使用する遺伝子挿入と、ヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Cas系または操作メガヌクレアーゼ再設計ホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用する遺伝子エディティングの組み合わせを使用することにより、産生される。
ある態様において、非ウイルス性の送達法の使用は、細胞、例えば、T細胞またはNK細胞の再プログラムおよび対象への細胞の直接注入を可能にする。非ウイルスベクターの利点は、容易性および比較的低コストでの患者集団に見合う十分量の産生、貯蔵中の安定性および免疫原性欠如を含むが、これらに限定されない。
CARをコードする核酸構築物
本発明はまた、1以上のここに記載するCAR構築物をコードする核酸分子を提供する。一つの面において、核酸分子は、メッセンジャーRNA転写物として提供される。一つの面において、核酸分子はDNA構築物として提供される。
本発明はまた、1以上のここに記載するCAR構築物をコードする核酸分子を提供する。一つの面において、核酸分子は、メッセンジャーRNA転写物として提供される。一つの面において、核酸分子はDNA構築物として提供される。
従って、ある面において、本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離された核酸分子に関し、ここで、CARは、抗CD19結合ドメイン(例えば、ヒト化抗CD19結合ドメイン)、膜貫通ドメインおよび刺激ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインおよび/または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、ここに記載する抗CD19結合ドメイン、例えば、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号59からなる群から選択される配列またはそれと95~99%同一性を有する配列を含む抗CD19結合ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、T細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137およびCD154からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号15の配列を含むまたはそれと95~99%同一性を有する配列である。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジにより膜貫通ドメインに接続する。ある態様において、ヒンジ領域は、配列番号14または配列番号45または配列番号47または配列番号49またはそれと95~99%同一性を有する配列を含む。ある態様において、単離された核酸分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)および4-1BB(CD137)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号16の配列またはそれと95~99%同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、4-1BBの機能的シグナル伝達ドメインおよびCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号16または配列番号51の配列またはそれと95~99%同一性を有する配列および配列番号17の配列または配列番号43またはそれと95~99%同一性を有する配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレームに、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される。
他の面において、本発明は、配列番号13のリーダー配列、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号59からなる群から選択される配列(またはそれと95~99%同一性を有する配列)を有するscFvドメイン、配列番号14または配列番号45または配列番号47または配列番号49(またはそれと95~99%同一性を有する配列)のヒンジ領域、配列番号15の配列(またはそれと95~99%同一性を有する配列)を有する膜貫通ドメイン、配列番号16の配列を有する4-1BB共刺激ドメインまたは配列番号51の配列(またはそれと95~99%同一性を有する配列)を有するCD27共刺激ドメインおよび配列番号17または配列番号43の配列(またはそれと95~99%同一性を有する配列)を有するCD3ゼータ刺激ドメインを含む、単離されたCARをコードする核酸分子構築物に関する。
他の面において、本発明は、核酸分子によりコードされる、単離されたポリペプチド分子に関する。ある態様において、単離されたポリペプチド分子は、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号59からなる群から選択される配列またはそれと95~99%同一性を有する配列を含む。
他の面において、本発明は、抗CD19結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)分子によりコードされる核酸分子に関し、該抗CD19結合ドメインは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号59からなる群から選択される配列またはそれと95~99%同一性を有する配列を含む。
ある態様において、コードされるCAR分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)および4-1BB(CD137)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。ある態様において、共刺激ドメインは配列番号16の配列を含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、T細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137およびCD154からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号15の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、4-1BBの機能的シグナル伝達ドメインおよびゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号16の配列および配列番号17の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレームに、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、抗CD19結合ドメインは、ヒンジ領域により膜貫通ドメインに連結される。ある態様において、ヒンジ領域は配列番号14を含む。ある態様において、ヒンジ領域は配列番号45または配列番号47または配列番号49を含む。
他の面において、本発明は、配列番号13のリーダー配列、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号59からなる群から選択される配列またはそれと95~99%同一性を有する配列を有するscFvドメイン、配列番号14または配列番号45または配列番号47または配列番号49のヒンジ領域、配列番号15の配列を有する膜貫通ドメイン、配列番号16の配列を有する4-1BB共刺激ドメインまたは配列番号51の配列を有するCD27共刺激ドメインおよび配列番号17または配列番号43の配列を有するCD3ゼータ刺激ドメインを含む、コードされるCAR分子に関する。ある態様において、コードされるCAR分子は、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42および配列番号59からなる群から選択される配列またはそれと95~99%同一性を有する配列を含む。
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用する、例えば核酸分子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニング、それを含むことが知られるベクターからの核酸分子の導出またはそれを含む細胞および組織から直接の単離のような、当分野で知られる組み換え方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を、クローン化ではなくむしろ合成的に製造できる。
本発明はまた本発明のDNAが導入されている、ベクターも提供する。レンチウイルスのようなレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期の安定な組込みおよび娘細胞へのその伝播を可能にするため、長期遺伝子移入の達成に適当なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような非増殖細胞に形質導入できるため、マウス白血病ウイルスのようなオンコレトロウイルス由来のベクターを超えるさらなる利点を有する。それらはまた低免疫原性のさらなる利点も有する。レトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであり得る。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル(ψ)、プライマー結合部位(PBS)、1以上(例えば、2)の末端反復配列(LTR)および目的の導入遺伝子、例えば、CARをコードする遺伝子を含み得る。ガンマレトロウイルスベクターは、gag、polおよびenvのようなウイルス構造的遺伝子を欠き得る。代表的ガンマレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス(MLV)、脾フォーカス形成ウイルス(SFFV)および骨髄増殖性肉腫ウイルス(MPSV)およびそれ由来のベクターを含む。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713に記載される。
他の態様において、所望の本発明のCARをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(A5/35)である。他の態様において、CARをコードする核酸の発現は、sleeping beautyのようなトランスポゾン、crisper、CAS9および亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用して達成できる。June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716参照。引用により、これを本明細書に包含させる。
概要において、天然または合成CARをコードする核酸の発現は、一般にCARポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに操作可能に連結させ、該構築物を発現ベクターに取り込むことにより、達成される。ベクターは、真核生物での複製および組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。
本発明の発現構築物はまた、標準遺伝子送達プロトコールを使用する核酸免疫化および遺伝子治療のためにも使用できる。遺伝子送達のための方法は当分野で知られる。例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる、米国特許5,399,346号、5,580,859号、5,589,466号参照。他の態様において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
核酸を、多数のタイプのベクターにクローン化できる。例えば、核酸を、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターおよびシークエンシングベクターを含む。
さらに、発現ベクターを、ウイルスベクターの形で細胞に提供してよい。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYおよび他のウイルス学および分子生物学手引き書に記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも1つの生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位および1以上の選択可能マーカーを含む(例えば、WO01/96584号;WO01/29058号;および米国特許6,326,193号)。
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞のトランスフェクトのために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子を、当分野で知られる技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に充填できる。次いで、組み換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボで対象の細胞に送達できる。多数のレトロウイルス系が、当分野で知られる。ある態様において、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが、当分野で知られる。ある態様において、レンチウイルスベクターを使用する。
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーが、転写開始の頻度を制御する。一般に、これらは、開始部位の領域30~110bp上流に位置するが、多数のプロモーターが、開始部位の下流に同様に機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の間隙はしばしば可動性であり、そうして、要素が互いに倒置したときまたは入れ替わったときに、プロモーター機能が保持される。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターにおいて、プロモーター要素間の間隙は、活性が低下し始める前に50bp離れるまで増加し得る。プロモーターによって、個々の要素が、転写を活性化するために協調的にまたは独立して機能できる。代表的プロモーターは、CMV IE遺伝子、EF-1α、ユビキチンCまたはホスホグリセロキナーゼ(PGK)プロモーターを含む。
哺乳動物T細胞においてCAR導入遺伝子の発現が可能なプロモーターの例は、EF1aプロモーターである。天然のEF1aプロモーターは、アミノアシルtRNAのリボソームへの酵素送達を担う伸長因子-1複合体のアルファサブユニットの発現である。EF1aプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された導入遺伝子からのCAR発現の駆動に有効であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17 (8): 1453-1464 (2009)参照。一つの面において、EF1aプロモーターは、配列番号100として提供する配列を含む。
プロモーターの他の例は、最初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それと操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる強い構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)末端反復配列(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子-1αプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターを含むが、これらに限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列も使用し得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に制限されるべきではない。誘導性プロモーターも、本発明の一部として意図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、その発現が望まれるとき、オンにでき、または発現が望まれないとき、その発現をオフにできる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
ベクターはまた、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(例えば、ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子から)、エピソーム複製および原核生物における複製を可能にする要素(例えばSV40起源およびColE1または当分野で知られるその他)および/または選択を可能にする要素(例えば、アンピシリン耐性遺伝子および/またはゼオシンマーカー)も含み得る。
CARポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入すべき発現ベクターはまた、ウイルスベクターによるトランスフェクトまたは感染が求められる細胞の集団からの、発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子または両者も含み得る。他の面において、選択可能マーカーは、DNAの別々の断片上で実施でき、共トランスフェクション過程において使用し得る。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子の両者は、宿主細胞における発現を可能とするために適切な制御性配列が隣接し得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、neoのような抗生物質耐性遺伝子などを含む。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞の同定および制御性配列の機能性の評価のために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しないかまたはそれにより発現されず、発現がある容易に検出可能な特性により、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする、遺伝子をいう。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入された後適当な時点でアッセイする。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適当な発現系は周知であり、既知技術を使用して製造しても、商業的に得てもよい。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小5’フランキング領域を伴う構築物を、プロモーターとして同定する。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤の評価のために使用し得る。
細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は当分野で知られる。発現ベクターの状況において、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に、当分野の任意の方法により容易に導入できる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段により、宿主細胞に移入される。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび/または外来性核酸を含む細胞を産生する方法は、当分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY参照。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入に好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、DNAおよびRNAベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となってきている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許5,350,674号および5,585,362号参照。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系のようなコロイド分散体系を含む。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用するための代表的コロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化ナノ粒子または他の適当なサブミクロンサイズの送達系を用いるポリヌクレオチドの送達のような、最新式の核酸の標的化送達の他の方法が利用可能である。
非ウイルス送達系を利用する場合、代表的送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入のために意図される(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)。他の面において、核酸は、脂質と結合され得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部への被包、リポソームの脂質二重層内への分散、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者と結合する連結分子を介するリポソームへの結合、リポソームへの封入、リポソームとの複合体化、脂質含有溶液への分散、脂質との混合、脂質との組み合わせ、脂質中の懸濁液としての包含、ミセル内への包含または複合体化または他の方法で脂質と結合する。脂質、脂質/DNAまたは脂質/発現ベクター結合組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造において、ミセルとしてまたは“崩壊”構造を有して存在し得る。それらはまた単に溶液に分散され、恐らく、サイズまたは形が均一ではない凝集体を形成し得る。脂質は、天然に存在するまたは合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に生じる脂肪滴ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのような長鎖脂肪族炭化水素を含む化合物群およびその誘導体を含む。
使用するのに適する脂質は、業者から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(“DMPC”)は、Sigma, St. Louis, MOから得ることができ、リン酸ジセチル(“DCP”)はK & K Laboratories(Plainview, NY)から得ることができ、コレステロール(“Choi”)はCalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(“DMPG”)および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL)から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール内の脂質の原液を、約-20℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりも容易に揮発するために、唯一の溶媒として使用する。“リポソーム”は、封入された脂質二重層または凝集体の産生により形成される、多様な単および多重層脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を備えた小胞構造を有するとして特徴付けできる。多重層リポソームは、水性媒体により分離される複数脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたときに、自然に形成される。脂質要素は、閉構造の形成前に自己再構成し、水を封入し、脂質二重層間に溶質を溶解する(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、通常の小胞構造と異なる構造を溶液中で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造と仮定してよく、または脂質分子の不均一性の凝集体として存在する。また考慮されるのは、リポフェクタミン-核酸複合体である。
外来性核酸を宿主細胞に導入するまたはそうでなければ細胞を本発明の阻害剤に曝す方法に関係なく、宿主細胞における組み換えDNA配列の存在を確認するために、多様なアッセイを行い得る。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、RT-PCRおよびPCRのような当業者に周知の“分子生物学的”アッセイ、例えば、免疫学的手段(ELISAおよびウェスタンブロット)によりまたは本発明の範囲内に入る薬剤を同定するためのここに記載するアッセイにより、特定のペプチドの存在または不在を検出するような“生化学的”アッセイを含む。
本発明は、さらにCARコード化核酸分子を含むベクターを提供する。一つの面において、CARベクターは、細胞、例えば、T細胞に直接形質導入できる。一つの面において、ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば、1以上のプラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重分染色体)、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含むが、これらに限定されない、ベクターである。一つの面において、ベクターは、哺乳動物T細胞におけるCAR構築物の発現が可能である。一つの面において、哺乳動物T細胞はヒトT細胞である。
細胞の供給源
増殖および遺伝子修飾または他の修飾前に、細胞、例えば、T細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞の供給を対象から得ることができる。用語“対象”は、免疫応答が惹起され得る、生存生物(例えば、哺乳動物)を含むと意図される。対象の例は、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそのトランスジェニック種を含む。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、多くの供給源から得られる。
増殖および遺伝子修飾または他の修飾前に、細胞、例えば、T細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞の供給を対象から得ることができる。用語“対象”は、免疫応答が惹起され得る、生存生物(例えば、哺乳動物)を含むと意図される。対象の例は、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそのトランスジェニック種を含む。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、多くの供給源から得られる。
本開示のある面において、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞は、FicollTM分離のような、当業者に知られる任意の数の技術を使用して、対象から採取された血液のユニットから得ることができる。ある好ましい面において、個体の循環血からの細胞を、アフェレシスにより得る。アフェレシス産物は、一般に、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含む、リンパ球を含む。ある面において、アフェレシスにより収集した細胞を、血漿フラクションを除去するために、および、所望により、続く処理段階のために、細胞を適切な緩衝液または媒体に加え、洗浄してよい。ある態様において、細胞をリン酸緩衝化食塩水(PBS)で洗浄する。別の態様において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてよくまたは全てではないにしても多くの二価カチオンを欠いてよい。
カルシウム非存在下の初期活性化段階は、活性化を増大させ得る。当業者には容易に認識されるように、洗浄工程は、製造者の指示に従い、半自動化“フロースルー”遠心(例えば、Cobe 2991 cell processor、Baxter CytoMateまたはHaemonetics Cell Saver 5)を使用するような、当業者に知られる方法により達成し得る。洗浄後、細胞を、例えば、無Ca、無MgPBS、PlasmaLyte Aまたは緩衝剤を用いるまたは用いない他の食塩水溶液のような、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁できる。あるいは、アフェレシスサンプルの望ましくない要素を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁してよい。
ある面において、赤血球を溶解し、例えば、PERCOLLTM勾配を介する遠心または対向流遠心溶出法により単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球からT細胞を単離する。
ここに記載する方法は、例えば、ここに記載する、例えば、負の選択手法を使用する、T制御細胞枯渇集団、CD25+枯渇細胞である、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞の特異的亜集団の、例えば、セレクションである。好ましくは、T制御枯渇細胞の集団は、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%未満のCD25+細胞を含む。
ある態様において、T制御細胞、例えば、CD25+ T細胞を、抗CD25抗体またはそのフラグメントまたはCD25結合リガンド、IL-2を使用して集団から除去する。ある態様において、抗CD25抗体またはそのフラグメントまたはCD25結合リガンドを基質、例えば、ビーズに結合するかまたは他に基質、例えば、ビーズに被覆させる。ある態様において、抗CD25抗体またはそのフラグメントを、ここに記載するように基質に結合する。
ある態様において、T制御性細胞、例えば、CD25+ T細胞を、MiltenyiTMからのCD25枯渇剤を使用して集団から除去する。ある態様において、細胞対CD25枯渇剤の比は1e7細胞対20μLまたは1e7細胞対15μLまたは1e7細胞対10μLまたは1e7細胞対5μLまたは1e7細胞対2.5μLまたは1e7細胞対1.25μLである。ある態様において、例えば、T制御性細胞、例えば、CD25+枯渇のために、5億細胞/mlを使用する。さらなる面において、6億、7億、8億または9億細胞/mlの細胞濃度を使用する。
ある態様において、枯渇する免疫エフェクター細胞の集団は、約6×109 CD25+ T細胞を含む。他の面において、枯渇する免疫エフェクター細胞の集団は、約1×109~1×1010およびその間の任意の整数値のCD25+ T細胞を含む。ある態様において、得られた集団T制御枯渇細胞は、2×109 T制御細胞、例えば、CD25+細胞またはそれ未満(例えば、1×109、5×108、1×108、5×107、1×107またはそれ未満のCD25+細胞)を有する。
ある態様において、T制御細胞、例えば、CD25+細胞を、例えば、チュービング162-01のような、枯渇チュービングを備えたCliniMAC系を使用して、集団から除去する。ある態様において、CliniMAC系を、例えば、DEPLETION2.1のような、枯渇設定で使用する。
特定の理論に拘束されないが、アフェレシス前またはCAR発現細胞産物の製造中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少(例えば、望まない免疫細胞、例えば、Treg細胞の数の減少)は、対象が再発するリスクを減らし得る。例えば、Treg細胞を枯渇する方法は当分野で知られる。Treg細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗GITR抗体(ここに記載する抗GITR抗体)、CD25枯渇およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
ある態様において、製造法は、CAR発現細胞製造前のTreg細胞の数の減少(例えば、枯渇)を含む。例えば、製造法は、例えば、サンプル、例えば、アフェレシスサンプルと抗GITR抗体および/または抗CD25抗体(またはそのフラグメントまたはCD25結合リガンド)を接触させ、CAR発現細胞(例えば、T細胞、NK細胞)産物の製造前にTreg細胞を枯渇させることを含む。
ある態様において、対象は、CAR発現細胞産物製造のための細胞採取前にTreg細胞を減らす1以上の治療で前処置されており、それにより対象がCAR発現細胞処置中に再発するリスクを低減する。ある態様において、Treg細胞を低減する方法は、対象へのシクロホスファミド、抗GITR抗体、CD25枯渇またはこれらの組み合わせの1以上の投与を含むが、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗GITR抗体、CD25枯渇またはこれらの組み合わせの1以上の投与は、CAR発現細胞産物注入前、間または後に行い得る。
ある態様において、対象は、CAR発現細胞産物製造のための細胞の採取前にシクロホスファミドで前処置され、それにより対象がCAR発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。ある態様において、対象は、CAR発現細胞産物製造のための細胞の採取前に抗GITR抗体で前処置され、それにより対象がCAR発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。
ある態様において、除去すべき細胞の集団は、制御性T細胞または腫瘍細胞ではなく、CART細胞の増殖および/または機能に他に負に影響する細胞、例えばCD14、CD11b、CD33、CD15または潜在的免疫抑制性細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。ある態様において、このような細胞は、制御性T細胞および/または腫瘍細胞と同時にまたは該枯渇後にまたは他の順番で除去することが意図される。
ここに記載する方法は、1を超える選択工程、例えば、1を超超える枯渇工程を含み得る。負の選択によるT細胞集団の富化は、例えば、負に選択される細胞に独特な表面マーカーに対する抗体の組み合わせにより、達成できる。一つの方法は、負に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負の磁性免疫粘着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および/または選択である。例えば、負の選択によりCD4+細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DRおよびCD8に対する抗体を含み得る。
ここに記載する方法は、さらに、集団から腫瘍抗原、例えば、CD25を含まない腫瘍抗原、例えば、CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14またはCD11bを発現する細胞を除去し、それにより、CAR、例えば、ここに記載するCARの発現に適するT制御枯渇、例えば、CD25+枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供することを含む。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、T制御、例えば、CD25+細胞と同時に除去される。例えば、抗CD25抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを、細胞の除去に使用できる同じ基質、例えば、ビーズに結合してよく、または抗CD25抗体またはそのフラグメントまたは抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを別々のビーズに結合でき、それらの混合物は、細胞の除去に使用できる。他の態様において、T制御細胞、例えば、CD25+細胞の除去および腫瘍抗原発現細胞の除去は連続的であり、例えば、いずれの順番でも生じ得る。
チェックポイント阻害剤、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えば、PD1+細胞、LAG3+細胞およびTIM3+細胞の1以上を集団から除去し、それにより、T制御枯渇、例えば、CD25+枯渇細胞およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、PD1+、LAG3+および/またはTIM3+枯渇細胞の集団を提供する方法も提供する。代表的チェックポイント阻害剤は、B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLAおよびLAIR1を含む。ある態様において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、T制御、例えば、CD25+細胞と同時に除去される。例えば、抗CD25抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを、細胞または抗CD25抗体またはそのフラグメントの除去に使用できるのと同じビーズに使用でき、そして、抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の態様において、T制御細胞、例えば、CD25+細胞の除去およびチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は連続的であり、例えば、いずれの順番でも生じ得る。
ここに記載する方法は、正の選択工程を含み得る。例えば、T細胞は、所望のT細胞の正の選択に十分な時間、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tのような抗CD3/抗CD28(例えば、3x28)結合ビーズとインキュベーションすることにより単離できる。ある態様において、時間は約30分である。さらなる態様において、時間は30分~36時間またはそれより長い範囲およびその間の任意の整数値である。さらなる態様において、時間は少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間または6時間である。さらに他の態様において、時間は10~24時間、例えば、24時間である。腫瘍組織または免疫無防備状態個体から腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)を単離するような、他の細胞型と比較してT細胞が少ないあらゆる状況において、T細胞を単離するために長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、CD8+ T細胞の捕獲効率を高め得る。そうして、T細胞がCD3/CD28 ビーズと結合できる時間を単に短くまたは長くするおよび/またはビーズ対T細胞の比を増加または減少することにより(さらにここに記載するとおり)、T細胞の亜集団は、培養開始時または工程中の他の時点で優先的に選択または抑制される。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗CD3および/または抗CD28抗体の比を増加または減少させることにより、T細胞の亜集団は、培養開始時または工程中の他の時点で優先的に選択または抑制される。
ある態様において、IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、グランザイムBおよびパーフォリンまたは他の適切な分子、例えば、他のサイトカインの1以上を発現するT細胞集団を選択できる。細胞発現をスクリーニングする方法は、例えば、PCT公開番号WO2013/126712号に記載の方法により決定できる。
正のまたは負の選択により細胞の所望の集団を単離するために、細胞の濃度および表面(例えば、ビーズのような粒子)は変わり得る。ある面において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞を一緒に混合する体積を顕著に低下させる(例えば、細胞濃度を増加させる)ことが望まれ得る。例えば、ある面において、100億細胞/ml、90億/ml、80億/ml、70億/ml、60億/mlまたは50億/mlの濃度が使用される。ある面において、10億細胞/mlの濃度が使用される。さらにある面において、7500万、8000万、8500万、9000万、9500万または1億細胞/mlの細胞濃度が使用される。さらなる面において、1億2500万または1億5千万細胞/mlの濃度が使用され得る。
高濃度の使用は、細胞収量、細胞活性化および細胞増殖を増加させ得る。さらに、高細胞濃度の使用は、CD28陰性T細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞または多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(例えば、白血病血液、腫瘍組織など)からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有し得て、得ることが望まれる。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常弱いCD28発現を有するCD8+ T細胞のより効率的な選択を可能にする。
関連する面において、低濃度の細胞の使用が望まれることがある。T細胞と表面(例えば、ビーズのような粒子)の混合物を顕著に希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が最小化される。これは、粒子に結合させる所望の抗原を高い量で発現する細胞のために選択される。例えば、CD4よりも効率的に捕獲される。ある面において、使用する細胞の濃度は5×106/mlである。他の面において、使用する濃度は約1×105/ml~1×106/mlおよびその間の任意の整数値であり得る。
他の面において、細胞を、2~10℃または室温で、種々の時間、種々の速度で、回転子上でインキュベートし得る。
刺激のためのT細胞を、洗浄工程後も凍結できる。理論に拘束されないが、凍結と続く解凍工程は、細胞集団における顆粒球およびある程度の単球の除去により、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除く洗浄工程後、細胞を凍結溶液に懸濁し得る。多くの凍結溶液およびパラメータが当分野で知られ、この状況において有用であるが、一つの方法は、20%DMSOおよび8%ヒト血清アルブミンを含むPBSまたは10%デキストラン40および5%デキストロース、20%ヒト血清アルブミンおよび7.5%DMSOまたは31.25%Plasmalyte-A、31.25%デキストロース5%、0.45%NaCl、10%デキストラン40および5%デキストロース、20%ヒト血清アルブミンおよび7.5%DMSOを含む培養培地または例えば、HespanおよびPlasmaLyte Aを含む他の適当な細胞凍結媒体の使用を含み、次いで、細胞を、-80℃で1°/分の速度で凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの気相中に保存する。制御凍結の他の方法ならびに即時に-20℃または液体窒素中の未制御凍結を使用し得る。
ある面において、本発明の方法を使用する活性化前に、ここに記載するように凍結保存細胞を解凍し、洗浄し、1時間、室温で休息させる。
本発明の状況においてまた意図されるのは、ここに記載する増殖させた細胞が必要となる前の時点での、対象からの血液サンプルまたはアフェレシス産物の採取である。したがって、ここに記載するような免疫エフェクター細胞治療により利益を得るいくつもの疾患または状態の免疫エフェクター細胞治療における後の使用のために、増殖させるべき細胞の供給源を、必要な任意の時点で採取し、T細胞のような所望の細胞を単離し、凍結しておくことができる。ある面において、血液サンプルまたはアフェレシスは、一般に健常対象から採取される。ある面において、血液サンプルまたはアフェレシスは、疾患を発症するリスクがあるが、まだ疾患を発症していない健常対象から採取され、目的の細胞は、その後の使用のために単離および凍結される。ある面において、T細胞を、増殖し、凍結し、後の時点で使用し得る。ある面において、サンプルを、ここに記載する特定の疾患の診断直後に、しかし、何らかの処置前に患者から採取する。さらなる面において、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびFK506のような免疫抑制剤、キャンパス、抗CD3抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228および照射のような抗体または他の免疫除去因子のような因子での処置を含むが、これらに限定されない、多くの関連する処置法の前に、対象からの血液サンプルまたはアフェレシスから単離する。
本発明のさらなる面において、T細胞を、対象に機能的T細胞を残す処置後、直接患者から得る。これについて、ある癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、患者が通常該処置から回復するであろう期間のすぐ後、得られるT細胞の品質は、エクスビボで増殖する能力について、最適であるかまたは改善されている可能性がある。同様に、ここに記載する方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、増強された移植生着およびインビボ増殖のために好ましい状態であり得る。そうして、この回復相間の、T細胞、樹状細胞または造血細胞系譜の他の細胞を含む血液細胞の採取が、本発明の状況において意図される。さらに、ある面において、可動化(例えば、GM-CSFでの可動化)および条件づけレジメンを使用して、特に、治療後規定された時間枠の間、特定の細胞型の再増殖、再循環、再分化および/または増殖が支持される状態を作ることができる。細胞型の説明的例は、T細胞、B細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞を含む。
ある態様において、CAR分子、例えば、ここに記載するCAR分子を発現する免疫エフェクター細胞を、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤を受けている対象から得る。ある態様において、CARを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞の集団を、対象におけるまたは対象から採取したPD1陰性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞のレベルまたはPD1陰性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞/PD1陽性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞の比が、少なくとも一過性に、増加しているように、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤の投与から十分な時間経過後または十分な用量の投与後に、採取する。
他の態様において、CARを発現するように操作したまたは操作する免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞の集団を、PD1陰性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞の数を増加させるかまたはPD1陰性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞/PD1陽性免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞の比を増加させる量のmTOR阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処置できる。
ある態様において、T細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)欠損である。DGK欠損細胞は、DGK RNAもしくはタンパク質を発現しない、またはDGK活性が低下もしくは阻止されている細胞を含む。DGK欠損細胞は、遺伝学的方法で、例えば、DGK発現を低下または阻止するための、RNA干渉剤、例えば、siRNA、shRNA、miRNAの投与により産生できる。あるいは、DGK欠損細胞は、ここに記載するDGK阻害剤での処理により産生できる。
ある態様において、T細胞集団はイカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスRNAもしくはタンパク質を発現しないまたはイカロス活性が低下もしくは阻止されている細胞を含み、イカロス欠損細胞は、遺伝学的方法で、例えば、イカロス発現を低下または阻止するための、RNA干渉剤、例えば、siRNA、shRNA、miRNAの投与により産生できる。あるいは、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えば、レナリドマイドでの処理により産生できる。
ある態様において、T細胞集団はDGK欠損およびイカロス欠損であり、例えば、DGKおよびイカロスを発現しないかまたはDGKおよびイカロス活性が低下または阻止されている。このようなDGKおよびイカロス欠損細胞は、ここに記載する方法のいずれかにより産生できる。
ある態様において、NK細胞は、対象から得られる。他の態様において、NK細胞はNK細胞株、例えば、NK-92細胞株(Conkwest)である。
同種CAR
ここに記載する態様において、免疫エフェクター細胞は同種免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞またはNK細胞であり得る。例えば、細胞は、同種T細胞、例えば、機能的T細胞受容体(TCR)および/またはヒト白血球抗原(HLA)、例えば、HLAクラスIおよび/またはHLAクラスIIの発現を欠く同種T細胞であり得る。
ここに記載する態様において、免疫エフェクター細胞は同種免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞またはNK細胞であり得る。例えば、細胞は、同種T細胞、例えば、機能的T細胞受容体(TCR)および/またはヒト白血球抗原(HLA)、例えば、HLAクラスIおよび/またはHLAクラスIIの発現を欠く同種T細胞であり得る。
機能的TCRを欠くT細胞は、例えば、その表面に機能的TCRを何も発現しないように操作されるか、機能的TCRを含む1以上のサブユニットを発現しないように操作されるかまたはその表面にごくわずかな機能的TCRしか産生しないように操作され得る。あるいは、T細胞は、例えば、TCRのサブユニットの1以上の変異型または切断型の発現により、実質的に障害されたTCRを発現できる。用語“実質的に障害されたTCR”は、このTCRが、宿主に有害免疫反応を誘発しないことを意味する。
ここに記載するT細胞は、例えば、その表面に機能的HLAを発現しないように操作できる。例えば、ここに記載するT細胞は、細胞表面発現HLA、例えば、HLAクラスIおよび/またはHLAクラスIIが下方制御されるように操作される。
ある態様において、T細胞は、機能的TCRおよび機能的HLA、例えば、HLAクラスIおよび/またはHLAクラスIIを欠き得る。
機能的TCRおよび/またはHLAの発現を欠く修飾T細胞は、TCRまたはHLAの1以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む、あらゆる適当な手段により得ることができる。例えば、T細胞は、siRNA、shRNA、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ZFN)を使用する、TCRおよび/またはHLAのノックダウンを含み得る。
ある態様において、同種細胞は、例えばここに記載するいずれかの方法により、阻害分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞である。例えば、細胞は、例えば、CAR発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下させ得る、阻害分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞である。阻害分子の例は、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4およびTGFRベータを含む。例えば、DNA、RNAまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害分子の阻害は、CAR発現細胞性能を最適化できる。いくつかの態様において、例えば、ここに記載する、阻害核酸、例えば、阻害核酸、例えば、dsRNA、例えば、siRNAまたはshRNA、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(palindromic repeat)(CRISPR)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ZFN)を使用できる。
TCRまたはHLAを阻害するためのsiRNAおよびshRNA
ある態様において、TCR発現および/またはHLA発現を、T細胞におけるTCRおよび/またはHLAをコードする核酸を標的とするsiRNAまたはshRNAを使用して阻害できる。
ある態様において、TCR発現および/またはHLA発現を、T細胞におけるTCRおよび/またはHLAをコードする核酸を標的とするsiRNAまたはshRNAを使用して阻害できる。
T細胞におけるsiRNAおよびshRNAの発現は、例えば、レンチウイルス発現系のような、任意の慣用発現系を使用して達成できる。
TCRの成分の発現を下方制御する代表的shRNAは、例えば、米国公開公報2012/0321667号に記載されている。HLAクラスIおよび/またはHLAクラスII遺伝子の発現を下方制御する代表的siRNAおよびshRNAは、例えば、米国公開公報2007/0036773号に記載されている。
TCRまたはHLAを阻害するためのCRISPR
ここで使用する“CRISPR”または“TCRおよび/またはHLAに対するCRISPR”または“TCRおよび/またはHLAを阻害するためのCRISPR”は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのセットまたはこのようなセットの反復を含む系をいう。ここで使用する“Cas”は、CRISPR関連タンパク質をいう。“CRISPR/Cas”系は、TCRおよび/またはHLA遺伝子の発現抑制または変異に使用できるCRISPRおよびCas由来の系である。
ここで使用する“CRISPR”または“TCRおよび/またはHLAに対するCRISPR”または“TCRおよび/またはHLAを阻害するためのCRISPR”は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのセットまたはこのようなセットの反復を含む系をいう。ここで使用する“Cas”は、CRISPR関連タンパク質をいう。“CRISPR/Cas”系は、TCRおよび/またはHLA遺伝子の発現抑制または変異に使用できるCRISPRおよびCas由来の系である。
天然に存在するCRISPR/Cas系は、配列決定された真正細菌ゲノムの約40%および配列決定された古細菌の90%で見られる。Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8:172。この系は、プラスミドおよびファージのような外来性遺伝成分に対する抵抗性を付与し、獲得免疫の一形態を提供する、原核生物免疫系の一タイプである。Barrangou et al. (2007) Science 315:1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322:1843-1845。
CRISPR/Cas系は、マウスまたは霊長類のような真核生物における遺伝子編集(特異的遺伝子のサイレンシング、促進または変更)に使用するために修飾されている。Wiedenheft et al. (2012) Nature 482:331-8。これは、真核細胞に、特別に設計されたCRISPRおよび1以上の適切なCasを含むプラスミドを導入することにより達成される。
CRISPR座位と呼ばれることもあるCRISPR配列は、交互の反復およびスペーサーを含む。天然に存在するCRISPRにおいて、スペーサーは、通常プラスミドまたはファージ配列のような細菌に外来性の配列を含み、TCRおよび/またはHLA CRISPR/Cas系において、スペーサーはTCRまたはHLA遺伝子配列に由来する。
CRISPR座位からのRNAは、構成的に発現され、Casタンパク質により小RNAに加工される。これらは、反復配列が隣接したスペーサーを含む。RNAは、他のCasタンパク質が、RNAまたはDNAレベルで外来性遺伝成分を発現抑制するよう導く。Horvath et al. (2010) Science 327:167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1:7。スペーサーは、それゆえに、siRNAと類似して、RNA分子の鋳型として働く。Pennisi (2013) Science 341:833-836。
これらが多くの異なるタイプの細菌で天然に存在するため、CRISPRの正確な配置ならびにCas遺伝子およびその産物の構造、機能および数は種毎にいくぶん異なる。Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663;およびStern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340。例えば、Cse(Casサブタイプ、大腸菌)タンパク質(例えば、CasA)は機能的複合体であるCascadeを形成し、これは、CRISPR RNA転写物を、Cascadeを保持するスペーサー反復単位に加工する。Brouns et al. (2008) Science 321:960-964。他の原核生物において、Cas6はCRISPR転写物を処理する。大腸菌におけるCRISPRベースのファージ不活性化はCascadeおよびCas3を必要とするが、Cas1またはCas2は必要としない。パイロコッカス・フリオサスおよび他の原核生物におけるCmr(Cas RAMPモジュール)タンパク質は、小CRISPR RNAと機能的複合体を形成し、これは相補的標的RNAを認識し、切断する。より単純なCRISPR系はタンパク質Cas9に依存し、これは、二重らせんの各鎖それぞれに対する2の活性切断部位を有するヌクレアーゼである。Cas9と修飾CRISPR座位RNAの組み合わせは、遺伝子編集のための系において使用できる。Pennisi (2013) Science 341:833-836。
CRISPR/Cas系は、それゆえに、TCRおよび/またはHLA遺伝子の編集(塩基対の付加または除去)または未成熟終止の導入に使用でき、こうしてTCRおよび/またはHLAの発現を減少させる。CRISPR/Cas系は、あるいはRNA干渉のように使用でき、可逆性様式でTCRおよび/またはHLA遺伝子を遮断する。哺乳動物細胞において、例えば、RNAは、Casタンパク質をTCRおよび/またはHLプロモーターに誘導し、RNAポリメラーゼを立体的に遮断できる。
当分野で知られるテクノロジー、例えば、米国公開20140068797号およびCong (2013) Science 339: 819-823に記載のものを使用して、TCRおよび/またはHLAを阻害する人工CRISPR/Cas系を産生できる。例えば、Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576、米国特許8,871,445号;8,865,406号;8,795,965号;8,771,945号;および8,697,359号に記載されるもののような、TCRおよび/またはHLAを阻害する当分野で知られる他の人工CRISPR/Cas系も産生できる。
TCRおよび/またはHLAを阻害するためのTALEN
“TALEN”または“HLAおよび/またはTCRに対するTALEN”または“HLAおよび/またはTCRを阻害するためのTALEN”は、HLA遺伝子および/またはTCR遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼをいう。
“TALEN”または“HLAおよび/またはTCRに対するTALEN”または“HLAおよび/またはTCRを阻害するためのTALEN”は、HLA遺伝子および/またはTCR遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼをいう。
TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインのDNA切断ドメインへの融合により人為的に産生される。転写アクティベーター様効果(TALE)は、HLA遺伝子またはTCR遺伝子の一部を含む任意の所望のDNA配列と結合するよう操作できる。操作したTALEとDNA切断ドメインを合わせることにより、HLAまたはTCR配列を含む、任意の所望のDNA配列に特異的な制限酵素が産生できる。次いで、これらを細胞に導入でき、ここで、それらをゲノム編集のために使用できる。Boch (2011) Nature Biotech. 29:135-6;およびBoch et al. (2009) Science 326:1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326:3501。
TALEは、キサントモナス細菌により分泌されるタンパク質である。DNA結合ドメインは、反復した、12番目および13番目のアミノ酸以外、高度に保存された33~34アミノ酸配列を含む。これらの2箇所は高度に可変であり、特定のヌクレオチド認識と強い相関を示す。こうして、これらを所望のDNA配列と結合するように操作できる。
TALENを産生するために、TALEタンパク質を、野生型または変異FokIエンドヌクレアーゼであるヌクレアーゼ(N)と融合させる。FokIの数変異がTALENにおけるその使用のために行われており、これらは、例えば、切断特異性または活性を改善する。Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793;およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96。
FokIドメインは二量体として機能し、正確な配向および間隔を有する標的ゲノム内の部位のための独特のDNA結合ドメインを有する2の構築物を必要とする。TALE DNA結合ドメインとFokI切断ドメインの間のアミノ酸残基数および2の個々のTALEN結合部位間の塩基数の両者が、高レベルの活性を達成するための重要なパラメータであると考えられる。Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29:143-8。
HLAまたはTCR TALENは、二本鎖切断(DSB)を産生するために細胞内で使用できる。修復機構が、非相同末端連結により切断を不適切に修復するならば、切断部位に変異を導入できる。例えば、不適当な修復は、フレームシフト変異を導入し得る。あるいは、外来DNAを、TALENと共に細胞に導入でき、外来DNAの配列および染色体配列によって、この過程を、HLA遺伝子またはTCR遺伝子における欠損を矯正するかまたはwt HLA遺伝子またはTCR遺伝子へこのような欠損を導入し、そうしてHLAまたはTCRの発現を減少させるのに使用できる。
HLAまたはTCRにおける配列に特異的なTALENを、モジュラー成分を使用する多様なスキームを含む、当分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29:149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6:e19509。
HLAおよび/またはTCRを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
“ZFN”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”または“HLAおよび/またはTCRに対するZFN”または“HLAおよび/またはTCRを阻害するためのZFN”は、HLA遺伝子および/またはTCR遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである亜鉛フィンガーヌクレアーゼである。
“ZFN”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”または“HLAおよび/またはTCRに対するZFN”または“HLAおよび/またはTCRを阻害するためのZFN”は、HLA遺伝子および/またはTCR遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである亜鉛フィンガーヌクレアーゼである。
TALENと同様、ZFNは、DNA結合ドメインに融合したFokIヌクレアーゼドメイン(またはその誘導体)を含む。ZFNの場合、DNA結合ドメインは、1以上の亜鉛フィンガーを含む。Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782;およびKim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160。
亜鉛フィンガーは、1以上の亜鉛イオンにより安定化された小タンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Cys2His2を含み、約3bp配列を認識できる。既知特異性の多様な亜鉛フィンガーを組み合わせて、約6bp、9bp、12bp、15bpまたは18bp配列を認識する多フィンガーポリペプチドを産生できる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッド系、細菌ワンハイブリッドおよびツーハイブリッド系および哺乳動物細胞を含む、特異的配列を認識する亜鉛フィンガー(およびこれらの組み合わせ)を産生する多様な選択およびモジュラー組立技術が入手可能である。
TALENと同様、ZFNは、DNAを切断するために二量体化しなければならない。それゆえに、非パリンドロームDNA部位を標的とするためにZFNの対が必要である。2の個々のZFNは、適切な間隔のそれらのヌクレアーゼにより、DNAの逆鎖に結合するはずである。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10570-5。
またTALENと同様、ZFNはDNAに二本鎖切断を作ることができ、これは、不適切に修復されたならばフレームシフト変異を作り、細胞におけるHLAおよび/またはTCRの発現および量を減少させる。ZFNはまたHLA遺伝子またはTCR遺伝子を変異するための相同組換えと共に使用できる。
HLAおよび/またはTCRにおける配列に特異的なZFNは、当分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。例えば、Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96;米国特許公開2011/0158957号;および米国特許公開2012/0060230号参照。
テロメラーゼ発現
何らかの特定の理論に拘束されないが、ある態様において、治療的T細胞は、T細胞における短縮されたテロメアのために、患者における残留性が短く、したがって、テロメラーゼ遺伝子を用いるトランスフェクションは、T細胞のテロメアを延長し、患者におけるT細胞の残留性を改善し得る。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)参照。それゆえに、ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞、異所性にテロメラーゼサブユニットを、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、TERT、例えば、hTERT発現する。ある面において、本開示は、細胞とテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、TERT、例えば、hTERTをコードする核酸を接触させることを含む、CAR発現細胞を産生する方法を提供する。細胞を、CARをコードする構築物と接触させる前に、同時にまたは後に核酸と接触させ得る。
何らかの特定の理論に拘束されないが、ある態様において、治療的T細胞は、T細胞における短縮されたテロメアのために、患者における残留性が短く、したがって、テロメラーゼ遺伝子を用いるトランスフェクションは、T細胞のテロメアを延長し、患者におけるT細胞の残留性を改善し得る。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)参照。それゆえに、ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞、異所性にテロメラーゼサブユニットを、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、TERT、例えば、hTERT発現する。ある面において、本開示は、細胞とテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、TERT、例えば、hTERTをコードする核酸を接触させることを含む、CAR発現細胞を産生する方法を提供する。細胞を、CARをコードする構築物と接触させる前に、同時にまたは後に核酸と接触させ得る。
一つの面において、本開示は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、T細胞またはNK細胞)を製造する方法に関する。ある態様において、本方法は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、T細胞またはNK細胞)を提供し、免疫エフェクター細胞の集団とCARをコードする核酸を接触させ、そして、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、hTERTをコードする核酸を、CARおよびテロメラーゼ発現を可能とする条件下に接触させることを含む。
ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はDNAである。ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、テロメラーゼサブユニットの発現を駆動できるプロモーターを含む。
ある態様において、hTERTは、GenBank Protein ID AAC51724.1のアミノ酸配列を有し(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)、次のとおりである。
ある態様において、hTERTは、配列番号131の配列と配列少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一の配列を有する。ある態様において、hTERTは、配列番号131の配列を有する。ある態様において、hTERTは、N末端、C末端または両方に欠失(例えば、5、10、15、20または30アミノ酸を超えない)を含む。ある態様において、hTERTは、N末端、C末端または両方にトランスジェニックアミノ酸配列(例えば、5、10、15、20または30アミノ酸を超えない)を含む。
ある態様において、hTERTは、GenBank Accession No. AF018167の核酸配列によりコードされる(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)。
ある態様において、hTERTは、配列番号64の配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96、97%、98%または99%同一である配列を有する核酸によりコードされる。ある態様において、hTERTは、配列番号64の核酸によりコードされる。
免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)の活性化および増殖
T細胞のような免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許6,352,694号;6,534,055号;6,905,680号;6,692,964号;5,858,358号;6,887,466号;6,905,681号;7,144,575号;7,067,318号;7,172,869号;7,232,566号;7,175,843号;5,883,223号;6,905,874号;6,797,514号;6,867,041号;および米国特許出願公開20060121005号に記載する方法を使用して、一般的に活性化および増殖できる。
T細胞のような免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許6,352,694号;6,534,055号;6,905,680号;6,692,964号;5,858,358号;6,887,466号;6,905,681号;7,144,575号;7,067,318号;7,172,869号;7,232,566号;7,175,843号;5,883,223号;6,905,874号;6,797,514号;6,867,041号;および米国特許出願公開20060121005号に記載する方法を使用して、一般的に活性化および増殖できる。
造血幹および前駆細胞のエクスビボ増殖は、引用により本明細書に包含させる米国特許5,199,942号に記載され、本発明の細胞に適用できる。他の適当な方法は当分野で知られ、それゆえに本発明は、細胞のエクスビボ増殖なんらかの特定の方法に限定されない。簡潔には、T細胞のエクスビボ培養および増殖は、(1)哺乳動物の採取した末梢血または骨髄外植片からCD34+造血幹および前駆細胞を採取し;そして(2)このような細胞をエクスビボで増殖することを含む。米国特許5,199,942号に記載の細胞増殖因子に加えて、flt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドのような他の因子を細胞の培養および増殖に使用し得る。
一般に、免疫エフェクター細胞、例えば、T制御性細胞枯渇細胞の集団、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する薬剤が結合した表面と、T細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを接触させることにより増殖させ得る。特に、T細胞集団は、表面上に固定化した抗CD3抗体またはその抗原結合フラグメントまたは抗CD2抗体と接触させるかまたはカルシウムイオノフォアと共にタンパク質キナーゼCアクティベーター(例えば、ブリオスタチン)と接触させることによるような、ここに記載するように刺激させ得る。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドを使用する。例えば、T細胞の集団を、T細胞の増殖を刺激するのに適当な条件下、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させ得る。CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞の増殖を刺激するために、抗CD3抗体および抗CD28抗体を使用できる。抗CD28抗体の例は9.3、B-T3を含み、XR-CD28(Diaclone, Besancon, France)を、当分野で一般に知られる他の方法と同様にに使用できる(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
ある面において、T細胞のための一次刺激性シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールにより提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は溶液中でも、表面に結合していてもよい。表面に結合しているとき、薬剤は同じ表面に結合していても(すなわち、“cis”形式)、別の表面に結合していても(すなわち、“trans”形式)よい。あるいは、一方の薬剤が表面に結合し、他方の薬剤が溶液にあってもよい。ある面において、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は溶液中にあるかまたは表面に結合する。ある面において、両薬剤は溶液中にある。ある面において、薬剤は可溶性形態であり、そうして、Fc受容体または抗体または薬剤と結合する他の結合剤を発現する細胞のような、表面に架橋する。これについて、例えば、本発明におけるT細胞の活性化および増殖における使用が意図される人工抗原提示細胞(aAPC)に関する米国特許出願公開20040101519号および20060034810号を参照のこと。
ある面において、二剤をビーズに、同じビーズ上に、すなわち、“cis”で、または異なるビーズに、すなわち、“trans”で固定化する。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は抗CD3抗体またはその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は抗CD28抗体またはその抗原結合フラグメントであり、両剤を、等価な分子量で同じビーズに共固定化する。ある面において、CD4+ T細胞増殖およびT細胞増殖のために、ビーズに結合した各抗体の1:1比が使用される。本発明のある面において、1:1比を使用して観察される増殖と比較して、T細胞増殖が増加するように、ビーズに結合した抗CD3:CD28抗体比を使用する。ある特定の面において、1:1比を使用して観察される増殖と比較して、約1~約3倍の増加が観察される。ある面において、ビーズに結合したCD3:CD28抗体の比は100:1~1:100の範囲およびその間の任意の整数値である。ある面において、抗CD3抗体より多い抗CD28抗体が粒子に結合し、すなわち、CD3:CD28の比は1未満である。ある面において、ビーズに結合した抗CD28抗体:抗CD3抗体の比は2:1より大きい。ある特定の面において、ビーズに結合した1:100 CD3:CD28比の抗体が使用される。ある面において、ビーズに結合した1:75 CD3:CD28比の抗体が使用される。さらなる面において、ビーズに結合した1:50 CD3:CD28比の抗体が使用される。ある面において、ビーズに結合した1:30 CD3:CD28比の抗体が使用される。ある好ましい面において、ビーズに結合した1:10 CD3:CD28比の抗体が使用される。ある面において、ビーズに結合した1:3 CD3:CD28比の抗体が使用される。さらにある面において、ビーズに結合した3:1 CD3:CD28比の抗体が使用される。
1:500~500:1およびその間の任意の整数値の粒子対細胞の比を、T細胞または他の標的細胞の刺激に使用し得る。当業者には容易に認識できるとおり、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径に依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは少ない数の細胞しか結合できず、一方大きなビーズはたくさん結合できる。ある面において、粒子対細胞比は、1:100~100:1およびその間の任意の整数値の範囲であり、さらなる面において、比は1:9~9:1およびその間の任意の整数値を含み、これをまたT細胞の刺激に使用できる。T細胞刺激をもたらす抗CD3および抗CD28結合粒子対T細胞比は上記のとおり変わり得るが、しかしながらある好ましい値は、1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1および15:1を含み、一つの好ましい比は、少なくとも1:1粒子対T細胞である。ある面において、1:1またはそれ未満の粒子対細胞比が使用される。ある特定の面において、好ましい粒子:細胞比は1:5である。さらなる面において、粒子対細胞比は、刺激の日により異なり得る。例えば、ある面において、粒子対細胞比は、第一日目は1:1~10:1であり、その後10日目まで連日または隔日でさらなる粒子を細胞に添加し、最終比は1:1~1:10である(添加日の細胞数に基づく)。ある特定の面において、粒子対細胞比は、刺激第一日目は1:1であり、刺激の3日目および5日目に1:5に調節する。ある面において、第一日の最終比1:1および刺激の3日目および5日目の1:5を基に、連日または隔日で粒子を添加する。ある面において、粒子対細胞比は、刺激の第一日目は2:1であり、刺激の3日目および5日目に1:10に調節する。ある面において、第一日の最終比1:1および刺激の3日目および5日目の1:10を基に、連日または隔日で粒子を添加する。多様な他の比が本発明で使用するのに適し得ることは当業者には認識される。特に、比は、粒子径および細胞サイズおよびタイプにより変わる。ある面において、使用するための最も典型的比は、第一日目の1:1、2:1および3:1付近である。
さらなる面において、T細胞のような細胞を薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズおよび細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。別の面において、培養前に、薬剤被覆ビーズおよび細胞を分離せず、一緒に培養する。さらなる面において、ビーズおよび細胞を、磁力のような力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘導する。
例として、細胞表面タンパク質を、抗CD3および抗CD28が結合した常磁性ビーズ(3x28ビーズ)とT細胞を接触させることにより、ライゲートし得る。一つの面において、細胞(例えば、104~109 T細胞)およびビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 T常磁性ビーズを1:1比)を、緩衝液、例えばPBS(カルシウムおよびマグネシウムのような二価カチオン不含)中で合わせる。再び、任意の細胞濃度を使用し得ることは当業者には容易に認識され得る。例えば、標的細胞は、サンプル中に極めて稀であり、サンプルの0.01%しか含まれないかまたはサンプル全体(すなわち、100%)が目的の標的細胞で構成され得る。したがって、あらゆる細胞数が本発明の文脈と一体となる。ある面において、細胞と粒子の最大接触を確実にするために、粒子および細胞を混合する体積を顕著に減少させる(すなわち、細胞の濃度を高める)ことが望ましいことがある。例えば、一つの面において、約100億細胞/ml、90億/ml、80億/ml、70億/ml、60億/ml、50億/mlまたは20億細胞/mlの濃度を使用する。一つの面において、1億細胞/ml超を使用する。さらなる面において、1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万または5000万細胞/mlの細胞濃度を使用する。さらなる面において、7500万、8000万、8500万、9000万、9500万または1億細胞/mlの細胞濃度を使用する。さらなる面において、1億2500万または1億5000万細胞/mlをの濃度使用できる。高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化および細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用はCD28陰性T細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞の集団は、治療的価値を有し得て、得ることが望まれる。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常CD28発現が弱いCD8+ T細胞のより効率的な選択を可能にする。
ある態様において、CAR、例えば、ここに記載するCARをコードする核酸が形質導入された細胞は、例えば、ここに記載する方法により増幅される。ある態様において、細胞は、複数時間(例えば、約2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、15時間、18時間、21時間)~約14日までの期間(例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日または14日)の培養により増殖される。ある態様において、細胞は4~9日の期間増殖される。ある態様において、細胞は8日またはそれ未満の期間、例えば、7日、6日または5日増殖される。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するCD19 CAR細胞は、5日の培養で増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件下で9日培養により増殖された同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、種々のT細胞機能、例えば増殖、標的細胞死滅、サイトカイン産生、活性化、遊走またはこれらの組み合わせにより規定される。ある態様において、5日増殖された細胞、例えば、ここに記載するCD19 CAR細胞は、同じ培養条件下で9日培養により増殖された細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも1倍、2倍、3倍または4倍増加がある。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するCD19 CARを発現する細胞は5日の培養で増殖され、同じ培養条件下で9日培養により増殖された細胞と比較して、得られた細胞は、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、IFN-γおよび/またはGM-CSFレベルを有する。ある態様において、5日増殖された細胞、例えば、ここに記載するCD19 CAR細胞は、同じ培養条件下で9日培養により増殖された細胞と比較して、炎症誘発性サイトカイン産生は、例えば、IFN-γおよび/またはGM-CSFレベルで、pg/mlにおいて少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍またはそれ以上の増加がある。
T細胞の培養時間が60日またはそれ以上であり得るように、数サイクルの刺激も望まれ得る。T細胞培養のための適切な条件は、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン-2(IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβおよびTNF-αまたは当業者に知られる細胞の増殖用のその他の添加剤を含む、増殖および生存能のために必要な因子を含み得る、適切な媒体(例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 15(Lonza))を含む。細胞の増殖のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネートならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、無血清または適切な量の血清(または血漿)が添加されたまたは規定されたセットのホルモンおよび/またはT細胞の増殖および拡大に十分な量のサイトカインが添加された、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加されたRPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15およびX-Vivo 20、Optimizerを含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは実験的培養においてのみ包含され、対象に注入すべき細胞の培養には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、37℃)および雰囲気(例えば、空気+5%CO2)で維持される。
ある態様において、細胞は、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、14日の増殖期間にわたり、細胞の少なくとも200倍(例えば、200倍、250倍、300倍、350倍)増加をもたらす1以上のインターロイキンを含む、適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で増殖させる。ある態様において、細胞は、IL-15および/またはIL-7(例えば、IL-15およびIL-7)の存在下増殖させる。
複数の態様において、ここに記載する方法、例えば、CAR発現細胞製造法は、T制御性細胞、例えば、CD25+ T細胞を、例えば、抗CD25抗体またはそのフラグメントまたはCD25結合リガンド、IL-2を使用して、細胞集団から除去することを含む。細胞集団からT制御性細胞、例えば、CD25+ T細胞を除去する方法は、ここに記載される。複数の態様において、方法、例えば、製造法は、さらに細胞集団(例えば、CD25+ T細胞のようなT制御性細胞が枯渇されている細胞集団;または抗CD25抗体、そのフラグメントまたはCD25結合リガンドと前に接触された細胞集団)とIL-15および/またはIL-7の接触を含む。例えば、細胞集団(例えば、抗CD25抗体、そのフラグメントまたはCD25結合リガンドと先に接触されている)を、IL-15および/またはIL-7の存在下で増殖させる。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、インターロイキン-15(IL-15)ポリペプチド、インターロイキン-15受容体アルファ(IL-15Ra)ポリペプチドまたはIL-15ポリペプチドとIL-15Raポリペプチドの組み合わせ、例えば、hetIL-15を含む組成物を、CAR発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで接触させる。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、CAR発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、IL-15ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、CAR発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、IL-15ポリペプチドおよびIL-15 Raポリペプチドの両者の組合せを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、CAR発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、hetIL-15を含む組成物と接触させる。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、エクスビボ増殖中、hetIL-15を含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、エクスビボ増殖中、IL-15ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、エクスビボ増殖中、IL-15ポリペプチドおよびIL-15Raポリペプチドの両者を含む組成物と接触させる。ある態様において、接触は、リンパ球亜集団、例えば、CD8+ T細胞の生存および増殖をもたらす。
種々の刺激時間に曝されているT細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーT細胞集団(TC、CD8+)より大きいヘルパーT細胞集団(TH、CD4+)を有する。CD3およびCD28受容体での刺激によるT細胞のエクスビボ増殖は、約8~9日目前まで主にTH細胞からなるT細胞の集団を産生するが、約8~9日目後、T細胞の集団は、徐々に大きくなるTC細胞の集団を含む。したがって、処置の目的によって、対象に、主にTH細胞を含むT細胞集団を注入することは有利であり得る。同様に、TC細胞の抗原特異的サブセットが単離されているならば、このサブセットを大きな程度まで増殖させることが有利であり得る。
さらに、CD4およびCD8マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖過程の経過中に、顕著に、しかし大部分、再現性よく変化する。そうして、このような再現性は、特異的な目的のために活性化T細胞産物をあつらえる能力を可能とする。
他の態様において、ここに開示する製造方法は、さらに免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニットをコードする核酸、例えば、hTERTを接触させることを含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はDNAであり得る。
ある態様において、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)を、CAR細胞製造過程中に添加する。ここでの非限定的理論に従い、キナーゼ阻害剤は、産生される細胞の集団の品質を改善できる。例えば、CAR発現細胞は、しばしば、癌患者自身の血漿アフェレシスサンプルから産生され、これは、癌細胞を含み、キナーゼ阻害剤がこれらの癌細胞(例えば、CLLまたはMCLのようなBTK発現癌)におけるシグナル伝達を変えることができ、例えば、増殖を減少させまたはアポトーシスのレベルを増加する。他の例として、キナーゼ阻害剤は、CAR発現細胞(またはCAR発現前の免疫エフェクター細胞)におけるシグナル伝達を、例えば、T細胞におけるITKの阻害により変え得る。キナーゼ阻害剤は、T細胞のバランスをTH2細胞からTH1細胞側にシフトさせ得る。
キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)を、標的、例えば、BTKを阻害するのに十分なレベルで反応混合物に添加できる。ある態様において、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)を、約0.1~0.2μM、0.2~0.5μM、0.5~1μM、1~2μM、2~5μMまたは5~10μMの濃度で添加する。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、共有結合性阻害剤(例えばイブルチニブ)であり、非特異的毒性を避けながら標的を非可逆的に阻害するために短パルスが十分である。結果として、キナーゼ阻害剤を、例えば、10~20分、20~30分、30~40分、40~60分または60~120分添加し得る。キナーゼ阻害剤をまた、例えば、キナーゼ阻害剤が非共有結合性作用機序を有するならば、長い時間添加もし得る。それゆえに、キナーゼ阻害剤を、例えば、2~4時間、4~6時間、6~8時間、8~12時間、12~18時間または18~24時間または1~2日、2~3日、3~4日、4~6日、6~8日、8~10日または細胞が培養されている全期間添加し得る。キナーゼ阻害剤を、製造過程の種々の時点で、例えば、細胞回収後、ビーズで刺激前、ビーズで刺激後、形質導入前、形質導入後または患者への細胞の投与前に添加し得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)を、細胞回収後または例えば、ビーズで刺激前に添加する。この文脈での前および後は、例えば、約1分、5分、15分、30分、45分または60分前または後または1時間、2時間、3時間、4時間、5時間または6時間前または後をいう。
CD19 CARが構築されたら、適切なインビトロおよび動物モデルにおける抗原刺激後にT細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下でのT細胞増殖の持続および抗癌活性のような、しかしこれらに限定されない分子の活性を評価するために、種々のアッセイが使用され得る。CD19 CARの効果を評価するためのアッセイは、下にさらに詳細に記載する。
初代T細胞におけるCAR発現のウェスタンブロット分析を、単量体および二量体の存在を検出するために使用できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔には、CARを発現するT細胞(CD4+およびCD8+ T細胞の1:1混合物)をインビトロで10日超増殖させ、続いて溶解および還元条件下のSDS-PAGEを行う。完全長TCR-ζ細胞質ドメインおよび内因性TCR-ζ鎖を含むCARを、TCR-ζ鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより検出する。同じT細胞サブセットを、共有結合性二量体形成の評価を可能とするために非還元条件下のSDS-PAGE分析に使用する。
抗原刺激後のCAR+ T細胞のインビトロ増殖を、フローサイトメトリーにより測定できる。例えば、CD4+およびCD8+ T細胞の混合物をαCD3/αCD28ビーズで刺激し、続いて分析すべきプロモーターの制御下に、GFPを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。代表的プロモーターは、CMV IE遺伝子、EF-1α、ユビキチンCまたはホスホグリセロキナーゼ(PGK)プロモーターを含む。GFP蛍光を、CD4+および/またはCD8+ T細胞サブセットの培養6日目に、フローサイトメトリーにより評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。あるいは、CD4+とCD8+ T細胞の混合物を、0日目にαCD3/αCD28被覆磁気ビーズで刺激し、2Aリボソームスキッピング配列を使用するCARとeGFPを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、1日目にCARを形質導入する。培養物を、洗浄後、CD19+ K562細胞(K562-CD19)、野生型K562細胞(K562野生型)またはHCD32および4-1BBLを発現するK562細胞で、抗CD3および抗CD28抗体(K562-BBL-3/28)の存在下刺激する。外来性IL-2を、100IU/mlを隔日で培養物に添加する。GFP+ T細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより数える。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。
再刺激非存在下の持続するCAR+ T細胞増殖も測定できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、平均T細胞体積(fl)を、0日目のαCD3/αCD28被覆磁気ビーズでの刺激および1日目の記載するCARの形質導入後、培養8日目にCoulter Multisizer III粒子カウンター、Nexcelom Cellometer VisionまたはMillipore Scepterを使用して測定する。
動物モデルも、CART活性の測定に使用できる。例えば、免疫欠損マウスにおける初代ヒトプレB ALLを処置するための、ヒトCD19特異的CAR+ T細胞を使用する異種移植モデルを使用できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔には、ALL確立後、マウスを処置群に無作為化する。。異なる数のαCD19-ζおよびαCD19-BB-ζを操作されたT細胞を、1:1比でB-ALLを担持するNOD-SCID-γ-/-マウスに共注射する。マウスからの脾臓DNAにおけるαCD19-ζおよびαCD19-BB-ζベクターコピー数を、T細胞注射後、種々の時点で評価する。動物を、1週間間隔で白血病について評価する。末梢血CD19+ B-ALL芽細胞数を、αCD19-ζ CAR+ T細胞または偽形質導入T細胞を注射されたマウスにおいて計測する。ログランク検定を使用して、群の生存曲線を比較する。さらに、NOD-SCID-γ-/-マウスへのT細胞注射4週間後の絶対的末梢血CD4+およびCD8+ T細胞数も分析する。マウスに、白血病性細胞を注射し、3週間後、eGFPに連結したCARをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターによりCARを発現するように操作されたT細胞を注射する。T細胞を、注入GFP+ T細胞の45~50%に、注射前に偽形質導入細胞と混合することにより標準化し、フローサイトメトリーにより確認する。動物を、1週間間隔で白血病について評価する。CAR+ T細胞群の生存曲線を、ログランク検定を使用して比較する。
用量依存的CAR処置応答を評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。例えば、21日目にCAR T細胞、等しい数の偽形質導入T細胞で処置したまたはT細胞処置なしの、マウスにおいて白血病が確立した後35~70日後に後、末梢血を得る。各群からのマウスを、末梢血CD19+ ALL芽細胞数の決定のために無作為に採血し、35日目および49日目に殺す。残りの動物を57日目および70日目に評価する。
細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、先に、例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)に記載されている。簡潔には、CAR介在増殖の評価を、洗浄したT細胞と、CD19(K19)またはCD32およびCD137(KT32-BBL)を発現するK562細胞と、最終T細胞:K562比2:1で混合することによりマイクロタイタープレートにおいて実施する。K562細胞を、使用前にガンマ線で照射する。抗CD3(クローンOKT3)および抗CD28(クローン9.3)モノクローナル抗体を、これらのシグナルがエクスビボでの長期CD8+ T細胞増殖を支持するため、刺激T細胞増殖について陽性対照として役立つKT32-BBL細胞の培養物に添加する。T細胞を、製造者により記載のとおり、CountBrightTM蛍光ビーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)およびフローサイトメトリーを使用して、培養において数える。CAR+ T細胞を、eGFP-2A連結CAR発現レンチウイルスベクターで操作されたT細胞を使用するGFP発現により同定する。GFPを発現しないCAR+ T細胞について、CAR+ T細胞を、ビオチニル化組み換えCD19タンパク質および二次アビジン-PEコンジュゲートにより検出する。T細胞のCD4+およびCD8+発現も、特異的モノクローナル抗体(BD Biosciences)を使用して同時に検出する。サイトカイン測定を、製造業者の指示に従いヒトTH1/TH2サイトカイン細胞数測定ビーズアレイキット(BD Biosciences, San Diego, CA)を使用して再刺激24時間後に回収した上清で実施する。蛍光を、FACScaliburフローサイトメーターを使用して評価し、データを製造業者の指示に従い分析する。
細胞毒性を、標準的51Cr放出アッセイにより評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、標的細胞(K562株および初代プロB-ALL細胞)に、51Cr(NaCrO4として、New England Nuclear, Boston, MA)を、37℃で2時間、頻繁に撹拌しながら充填し、完全RPMIで2回洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターT細胞を、ウェル中で完全RPMI中、標的細胞と種々のエフェクター細胞:標的細胞(E:T)比で混合する。さらなる培地のみ(自発的放出、SR)またはtriton-X 100洗剤1%溶液(全放出、TR)を含むウェルも調製する。37℃で4時間のインキュベーション後、各ウェルから上清を回収する。放出された51Crを、次いでガンマ粒子カウンター(Packard Instrument Co., Waltham, MA)を使用して測定する。各条件を少なくとも3回行い、溶解のパーセントを式:溶解%=(ER-SR)/(TR-SR)(式中、ERは各実験条件で放出された平均51Crを示す)を使用して計算する。
造影テクノロジーを使用して、腫瘍担持動物モデルにおけるCARの特異的輸送および増殖を評価できる。このようなアッセイは、例えば、Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)に記載されている。簡潔には、NOD/SCID/γc-/-(NSG)マウスに、Nalm-6細胞をIV注射し、7日後CAR構築物でエレクトロポレーション4時間後T細胞を注射する。T細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルス構築物で安定にトランスフェクトされ、マウスをバイオルミネセンスについて造影する。あるいは、Nalm-6異種移植モデルにおけるCAR+ T細胞の単回注射の治療有効性および特異性を、次のように測定できる。NSGマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように形質導入したNalm-6を注射し、続いて7日後にCD19 CARで電気穿孔したT細胞を1回尾静脈注射する。動物を、注射後種々の時点で造影する。例えば、5日目(処置2日前)および8日目(CAR+ PBL後24時間)に、代表的マウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度ヒートマップを作成できる。
ここでの実施例の部分に記載するものならびに当分野で知られるものを含む他のアッセイも、本発明のCD19 CAR構築物の評価に使用できる。
キナーゼ阻害剤
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、CDK4阻害剤、例えば、ここに記載するCDK4阻害剤、例えば、6-アセチル-8-シクロペンチル-5-メチル-2-(5-ピペラジン-1-イル-ピリジン-2-イルアミノ)-8H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-オン、ヒドロクロライド(パルボシクリブまたはPD0332991とも呼ぶ)のような、例えば、CDK4/6阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、BTK阻害剤、例えば、例えば、イブルチニブのような、ここに記載するBTK阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、mTOR阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、OSI-027のような、例えば、ここに記載するmTOR阻害剤である。mTOR阻害剤は、例えば、mTORC1阻害剤および/またはmTORC2阻害剤、例えば、ここに記載するmTORC1阻害剤および/またはmTORC2阻害剤であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、MNK阻害剤、例えば、4-アミノ-5-(4-フルオロアニリノ)-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジンのような、例えば、ここに記載するMNK阻害剤である。MNK阻害剤は、例えば、MNK1a、MNK1b、MNK2aおよび/またはMNK2b阻害剤であり得る。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、CDK4阻害剤、例えば、ここに記載するCDK4阻害剤、例えば、6-アセチル-8-シクロペンチル-5-メチル-2-(5-ピペラジン-1-イル-ピリジン-2-イルアミノ)-8H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-オン、ヒドロクロライド(パルボシクリブまたはPD0332991とも呼ぶ)のような、例えば、CDK4/6阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、BTK阻害剤、例えば、例えば、イブルチニブのような、ここに記載するBTK阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、mTOR阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、OSI-027のような、例えば、ここに記載するmTOR阻害剤である。mTOR阻害剤は、例えば、mTORC1阻害剤および/またはmTORC2阻害剤、例えば、ここに記載するmTORC1阻害剤および/またはmTORC2阻害剤であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、MNK阻害剤、例えば、4-アミノ-5-(4-フルオロアニリノ)-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジンのような、例えば、ここに記載するMNK阻害剤である。MNK阻害剤は、例えば、MNK1a、MNK1b、MNK2aおよび/またはMNK2b阻害剤であり得る。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンA;フラボピリドールまたはHMR-1275、2-(2-クロロフェニル)-5,7-ジヒドロキシ-8-[(3S,4R)-3-ヒドロキシ-1-メチル-4-ピペリジニル]-4-クロメノン;クリゾチニブ(PF-02341066;2-(2-クロロフェニル)-5,7-ジヒドロキシ-8-[(2R,3S)-2-(ヒドロキシメチル)-1-メチル-3-ピロリジニル]-4H-1-ベンゾピラン-4-オン、ヒドロクロライド(P276-00);1-メチル-5-[[2-[5-(トリフルオロメチル)-1H-イミダゾール-2-イル]-4-ピリジニル]オキシ]-N-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-ベンズイミダゾール-2-アミン(RAF265);インジスラム(E7070);ロスコビチン(CYC202);パルボシクリブ(PD0332991);ディナシクリブ(SCH727965);N-[5-[[(5-tert-ブチルオキサゾール-2-イル)メチル]チオ]チアゾール-2-イル]ピペリジン-4-カルボキサミド(BMS387032);4-[[9-クロロ-7-(2,6-ジフルオロフェニル)-5H-ピリミド[5,4-d][2]ベンズアゼピン-2-イル]アミノ]-安息香酸(MLN8054);5-[3-(4,6-ジフルオロ-1H-ベンズイミダゾール-2-イル)-1H-インダゾール-5-イル]-N-エチル-4-メチル-3-ピリジンメタンアミン(AG-024322);4-(2,6-ジクロロベンゾイルアミノ)-1H-ピラゾール-3-カルボン酸N-(ピペリジン-4-イル)アミド(AT7519);4-[2-メチル-1-(1-メチルエチル)-1H-イミダゾール-5-イル]-N-[4-(メチルスルホニル)フェニル]-2-ピリミジンアミン(AZD5438);およびXL281(BMS908662)から選択されるCDK4阻害剤である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はDK4阻害剤、例えば、パルボシクリブ(PD0332991)であり、パルボシクリブを、1日約50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例えば、75mg、100mgまたは125mg)の用量で一定期間、例えば、28日サイクルの14~21日連日または21日サイクルの7~12日連日投与する。ある態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれ以上のサイクルのパルボシクリブを投与する。
代表的CDK4/6阻害剤はLEE011(別名リボシクリブ)であり、その構造式を下に示す。
理論に縛られないが、ここに記載するCAR発現細胞とCDK4/6阻害剤(例えば、LEE011または他のここに記載するCDK4/6阻害剤)の投与は、例えば、CDK4/6阻害剤と比較して、高い応答性、例えば、高い寛解率および/または低い再発率を達成できると考えられる。
理論に拘束されないが、ある態様において、CDK4/6阻害剤は、癌細胞、例えば、MCL細胞におけるサイクリンD1活性を低下させるよう働く。ある癌細胞は、転座によるサイクリンD1レベル上昇を特徴とする。CDK4は、サイクリンDと複合体化して、細胞周期進行を促進する。従って、ある態様において、CK4/6阻害剤の投与は、癌細胞増殖を減らす。例えば、Marzec et al., “Mantle cell lymphoma cells express predominantly cyclin D1a isoform and are highly sensitive to selective inhibition of CDK4 kinase activity.” Blood. 2006 Sep 1;108(5):1744-50. Epub 2006 May 11参照。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(PCI-32765);GDC-0834;RN-486;CGI-560;CGI-1764;HM-71224;CC-292;ONO-4059;CNX-774;およびLFM-A13から選択されるBTK阻害剤である。ある態様において、BTK阻害剤はインターロイキン-2誘導性キナーゼ(ITK)のキナーゼ活性を低減または阻害せず、GDC-0834;RN-486;CGI-560;CGI-1764;HM-71224;CC-292;ONO-4059;CNX-774;およびLFM-A13から選択される。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はBTK阻害剤、例えば、イブルチニブ(PCI-32765)であり、イブルチニブを、1日約250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例えば、250mg、420mgまたは560mg)の用量で一定期間、例えば、21日サイクルで連日または28日サイクルで連日投与する。ある態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれ以上のサイクルのイブルチニブを投与する。
ある態様において、BTK阻害剤(例えば、イブルチニブ)を、CLL、マントル細胞リンパ腫(MCL)または小リンパ球性リンパ腫(SLL)を有する対象に投与する。例えば、BTK阻害剤を投与する対象は、染色体17の短腕における欠失(del(17p)、例えば、白血病性細胞において)を有する。他の例において、BTK阻害剤を投与する対象はdel(17p)を有しない。ある態様において、BTK阻害剤を投与する対象は、再発したCLLまたはSLLを有し、例えば、対象は、先に癌治療を投与されている(例えば、前に、1、2、3または4癌治療を前に投与されている)。ある態様において、BTK阻害剤を投与する対象は難治性CLLまたはSLLを有する。他の態様において、BTK阻害剤を投与する対象は濾胞性リンパ腫、例えば、再発または難治性濾胞性リンパ腫を有する。
イブルチニブ(1-[(3R)-3-[4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル]ピペリジン-1-イル]プロプ-2-エン-1-オン)の構造を、下に示す。
約400nMを超える濃度のイブルチニブは、臨床的に適切ではない。Advani et al.(J Clin Oncol 2012;31:88)による研究において、イブルチニブの平均ピーク血清濃度は約130ng/mlであり、これは295nMに等しい(イブルチニブの分子量440.5に基づく)。それゆえに、1μM濃度のイブルチニブでT細胞への効果を示すデータは、インビボで臨床的に適切な濃度を相当超える。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス;リダフォロリムス(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2-[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R、23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-ジヒドロキシ-19,30-ジメトキシ-15,17,21,23、29,35-ヘキサメチル-2,3,10,14,20-ペンタオキソ-11,36-ジオキサ-4-アザトリシクロ[30.3.1.04,9]ヘキサトリアコンタ-16,24,26,28-テトラエン-12-イル]プロピル]-2-メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィナート、別名AP23573およびMK8669;エベロリムス(RAD001);ラパマイシン(AY22989);セマピモド;(5-{2,4-ビス[(3S)-3-メチルモルホリン-4-イル]ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル}-2-メトキシフェニル)メタノール(AZD8055);2-アミノ-8-[trans-4-(2-ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]-6-(6-メトキシ-3-ピリジニル)-4-メチル-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PF04691502);およびN2-[1,4-ジオキソ-4-[[4-(4-オキソ-8-フェニル-4H-1-ベンゾピラン-2-イル)モルホリニウム-4-イル]メトキシ]ブチル]-L-アルギニルグリシル-L-α-アスパルチルL-セリン-、分子内塩(SF1126);およびXL765から選択されるmTOR阻害剤である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、1日約3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例えば、6mg)の用量で一定期間、例えば、21日サイクルで連日または28日サイクルで連日投与する。ある態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれ以上のサイクルのラパマイシンを投与する。ある態様において、キナーゼ阻害剤はmTOR阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを1日約2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例えば、10mg)の用量で一定期間、例えば、28日サイクルで連日投与する。ある態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれ以上のサイクルのエベロリムスを投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はCGP052088;4-アミノ-3-(p-フルオロフェニルアミノ)-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(CGP57380);セルコスポラミド;ETC-1780445-2;および4-アミノ-5-(4-フルオロアニリノ)-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジンから選択されるMNK阻害剤である。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象に、ホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)阻害剤(例えば、ここに記載するPI3K阻害剤、例えば、イデラリシブまたはドゥベリシブ)および/またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、対象にイデラリシブおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、対象にドゥベリシブおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。イデラリシブ(別名GS-1101またはCAL-101; Gilead)は、PI3Kのデルタアイソフォームを遮断する小分子である。イデラリシブ(5-フルオロ-3-フェニル-2-[(1S)-1-(7H-プリン-6-イルアミノ)プロピル]-4(3H)-キナゾリノン)の構造を下に示す。
ドゥベリシブは、PI3K-δ,γを遮断する小分子である。ドゥベリシブ(8-クロロ-2-フェニル-3-[(1S)-1-(9H-プリン-6-イルアミノ)エチル]-1(2H)-イソキノリノン)の構造を下に示す。
ある態様において、対象はCLLを有する。ある態様において、対象は再発したCLLを有し、例えば、対象は、先に癌治療剤を投与されている(例えば、先に抗CD20抗体を投与されているまたは先にイブルチニブを投与されている)。例えば、対象は、例えば、白血病性細胞において染色体17の短腕の欠損(del(17p))を有する。他の例において、対象はdel(17p)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(IgVH)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(IgVH)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、対象は、染色体11の長腕の欠損(del(11q))を有する。他の態様において、対象は、del(11q)を有しない。ある態様において、イデラリシブを、約100~400mg(例えばmg、100~125mg、125~150mg、150~175mg、175~200mg、200~225mg、225~250mg、250~275mg、275~300mg、325~350mg、350~375mgまたは375~400mg)の用量で、例えば、BIDで投与する。ある態様において、ドゥベリシブを、約15~100mg(例えば、約15~25mg、25~50mg、50~75mgまたは75~100mg)の用量で、例えば、1日2回投与する。ある態様において、リツキシマブを、約350~550mg/m2(例えば、350~375mg/m2、375~400mg/m2、400~425mg/m2、425~450mg/m2、450~475mg/m2または475~500mg/m2)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、2-アミノ-8-[trans-4-(2-ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]-6-(6-メトキシ-3-ピリジニル)-4-メチル-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PF-04691502);N-[4-[[4-(ジメチルアミノ)-1-ピペリジニル]カルボニル]フェニル]-N’-[4-(4,6-ジ-4-モルホリニル-1,3,5-トリアジン-2-イル)フェニル]尿素(PF-05212384、PKI-587);2-メチル-2-{4-[3-メチル-2-オキソ-8-(キノリン-3-イル)-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]フェニル}プロパンニトリル(BEZ-235);アピトリシブ(GDC-0980、RG7422);2,4-ジフルオロ-N-{2-(メチルオキシ)-5-[4-(4-ピリダジニル)-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(GSK2126458);8-(6-メトキシピリジン-3-イル)-3-メチル-1-(4-(ピペラジン-1-イル)-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-2(3H)-オンマレイン酸(NVP-BGT226);3-[4-(4-モルホリニルピリド[3’,2’:4,5]フロ[3,2-d]ピリミジン-2-イル]フェノール(PI-103);5-(9-イソプロピル-8-メチル-2-モルホリノ-9H-プリン-6-イル)ピリミジン-2-アミン(VS-5584、SB2343);およびN-[2-[(3,5-ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン-3-イル]-4-[(4-メチル-3-メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(XL765)から選択されるデュアルホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)およびmTOR阻害剤である。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象に、未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)阻害剤と組み合わせて投与する。代表的ALKキナーゼ阻害剤は、クリゾチニブ(Pfizer)、セリチニブ(Novartis)、アレクチニブ(中外)、ブリガチニブ(別名AP26113; Ariad)、エントレクチニブ(Ignyta)、PF-06463922(Pfizer)、TSR-011(Tesaro)(例えば、治験番号NCT02048488参照)、CEP-37440(Teva)およびX-396(Xcovery)を含むが、これらに限定されない。ある態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌、例えば、肺癌を有する。
クリゾチニブの化学名は、3-[(1R)-1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロフェニル)エトキシ]-5-(1-ピペリジン-4-イルピラゾール-4-イル)ピリジン-2-アミンである。セリチニブの化学名は、5-クロロ-N2-[2-イソプロポキシ-5-メチル-4-(4-ピペリジニル)フェニル]-N4-[2-(イソプロピルスルホニル)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミンである。アレクチニブの化学名は、9-エチル-6,6-ジメチル-8-(4-モルホリノピペリジン-1-イル)-11-オキソ-6,11-ジヒドロ-5H-ベンゾ[b]カルバゾール-3-カルボニトリルである。ブリガチニブの化学名は、5-クロロ-N2-{4-[4-(ジメチルアミノ)-1-ピペリジニル]-2-メトキシフェニル}-N4-[2-(ジメチルホスホリル)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミンである。エントレクチニブの化学名は、N-(5-(3,5-ジフルオロベンジル)-1H-インダゾール-3-イル)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)-2-((テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アミノ)ベンズアミドである。PF-06463922の化学名は、(10R)-7-アミノ-12-フルオロ-2,10,16-トリメチル-15-オキソ-10,15,16,17-テトラヒドロ-2H-8,4-(メテノ)ピラゾロ[4,3-h][2,5,11]-ベンズオキサジアザシクロテトラデシン-3-カルボニトリルである。CEP-37440の化学的構造は、(S)-2-((5-クロロ-2-((6-(4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル)-1-メトキシ-6,7,8,9-テトラヒドロ-5H-ベンゾ[7]アヌレン-2-イル)アミノ)ピリミジン-4-イル)アミノ)-N-メチルベンズアミドである。X-396の化学名は、(R)-6-アミノ-5-(1-(2,6-ジクロロ-3-フルオロフェニル)エトキシ)-N-(4-(4-メチルピペラジン-1-カルボニル)フェニル)ピリダジン-3-カルボキサミドである。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象に、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)阻害剤と共に投与する。IDOは、アミノ酸、L-トリプトファンのキヌレニンへの分解を触媒する酵素である。多くの癌、例えば、前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸部、胃、卵巣、頭部および肺の癌がIDOを過発現する。pDC、マクロファージおよび樹状細胞(DC)はIDOを発現できる。理論に縛られないが、L-トリプトファン(例えば、IDOによる触媒)の減少が、T細胞アネルギーおよびアポトーシスの誘導により免疫抑制性環境をもたらすと考えられる。それゆえに、理論に縛られないが、IDO阻害剤は、例えば、CAR発現免疫細胞の抑制または死滅を減少させることにより、ここに記載するCAR発現細胞の有効性を高め得る。ある態様において、対象は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸部、胃、卵巣、頭部または肺の癌を有する。IDOの代表的阻害剤は、1-メチル-トリプトファン、インドキシモド(NewLink Genetics)(例えば、治験番号NCT01191216; NCT01792050参照)およびINCB024360(Incyte Corp.)(例えば、治験番号NCT01604889; NCT01685255参照)を含むが、これらに限定されない
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象に、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)のモジュレーターと組み合わせて投与する。MDSCは、多くの固形腫瘍の周辺および腫瘍部位に蓄積される。これらの細胞はT細胞応答を抑制し、それによりCAR発現細胞治療の有効性を邪魔する。理論に縛られないが、MDSCモジュレーターの投与は、ここに記載するCAR発現細胞の有効性を増強すると考えられる。ある態様において、対象は固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、神経膠芽腫を有する。MDSCの代表的モジュレーターは、MCS110およびBLZ945を含むが、これらに限定されない。MCS110は、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)に対するモノクローナル抗体(mAb)である。例えば、治験番号NCT00757757参照。BLZ945は、コロニー刺激因子1受容体(CSF1R)の小分子阻害剤である。例えば、Pyonteck et al. Nat. Med. 19 (2013):1264-72参照。BLZ945の構造を下に示す。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象に、インターロイキン-15(IL-15)ポリペプチド、インターロイキン-15受容体アルファ(IL-15Ra)ポリペプチドまたはIL-15ポリペプチドおよびIL-15Raポリペプチド両者の組み合わせ、例えば、hetIL-15(Admune Therapeutics, LLC)と組み合わせて投与する。hetIL-15は、IL-15およびIL-15Raのヘテロ二量体非共有結合性複合体である。hetIL-15は、例えば、本明細書に引用により包含させる米国8,124,084号、米国2012/0177598号、米国2009/0082299号、米国2012/0141413および米国2011/0081311号に記載される。ある態様において、het-IL-15を皮下に投与する。ある態様において、対象は癌、例えば、固形癌、例えば、黒色腫または結腸癌を有する。ある態様において、対象は転移癌を有する。
治療適用
CD19関連疾患および/または障害
ある面において、本発明は、CD19発現と関係する疾患を処置する方法を提供する。ある面において、本発明は、腫瘍の一部がCD19に陰性であり、腫瘍の一部がCD19に陽性である、疾患を処置するための方法を提供する。例えば、本発明のCARは、CD19の発現上昇と関係する疾患のための処置を受けている対象の処置に有用であり、ここで、CD19のレベル上昇について処置を受けている対象は、CD19のレベル上昇と関係する疾患を示す。
CD19関連疾患および/または障害
ある面において、本発明は、CD19発現と関係する疾患を処置する方法を提供する。ある面において、本発明は、腫瘍の一部がCD19に陰性であり、腫瘍の一部がCD19に陽性である、疾患を処置するための方法を提供する。例えば、本発明のCARは、CD19の発現上昇と関係する疾患のための処置を受けている対象の処置に有用であり、ここで、CD19のレベル上昇について処置を受けている対象は、CD19のレベル上昇と関係する疾患を示す。
ここに記載する治療は、例えば、イブルチニブのようなキナーゼ阻害剤に応答する対象(例えば、部分応答または完全応答)または応答しない対象(例えば、非応答者または再発者)の処置に使用できる。理論に拘束されないが、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)で処置を受けている患者の多くが、処置に対する応答が低下し得る(例えば、処置に対する部分応答者または非応答者または処置中の再発)。よって、ここに開示するCAR治療のキナーゼ阻害剤と組み合わせた投与は、有利な効果をもたらし得る。
これらの対象のための代表的治療的レジメンを下に記載する。
ある場合、対象がナーゼ阻害剤(例えばイブルチニブのようなBTK阻害剤)に対する非応答者または再発者であるとき、キナーゼ阻害剤を中止し、CAR治療を投与する。他の場合、対象がキナーゼ阻害剤(例えばイブルチニブのようなBTK阻害剤)に応答しないとき、キナーゼ阻害剤治療を継続し、CAR治療をレジメンに追加する。この使用は、例えば、CAR治療が、イブルチニブ耐性細胞における単剤療法として有効であることを示す、ここでの実施例8における実験により、支持される。理論に拘束されないが、キナーゼ阻害剤治療継続は、例えば、血流におけるCAR発現細胞の数の増加により、CAR治療の有効性を改善できる(ここでの実施例8参照)。
理論に縛られないが、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)に非応答者または再発者である対象は、少なくとも2つの理由により非応答であり得る:対象は、薬物標的に標的阻害を阻止する変異(例えば、BTK、例えば、C481S変異)を有し得るかまたは標的が適切に阻害されても、増殖を駆動できる他の経路への変更を有し得る(例えば、構成的BTK非依存的細胞シグナル伝達を生じる、PLCγにおける活性化変異のような、PLCγにおける変異)。処置を、非応答性の理由により変えることができる。例えば、最初の状況で(ある態様において)、対象が、キナーゼ阻害剤が標的を阻害することを妨げる変異を有する(または有すると同定される)ならば、第二キナーゼ阻害剤(例えば、同じ標的を指向)を、キナーゼ阻害剤と置き換え得る(または組み合わせて投与)。より具体的に、ある態様において、患者が、イブルチニブがBTKを阻害することを阻止する変異を有する(または有すると同定される)とき、第二BTK阻害剤、例えば、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774またはLFM-A13のような、ここに記載するBTK阻害剤を、イブルチニブと置き換え得る。理論に拘束されないが、第二キナーゼ阻害剤は、変異により妨害されない標的の領域に作用し得て、それゆえに対象は、第二キナーゼ阻害剤に対して感受性である。他の態様において、元のキナーゼ阻害剤(例えばイブルチニブのようなBTK阻害剤)を維持する。ここでの非限定的理論によると、元のキナーゼ阻害剤は、例えば、TH1表現型促進、増殖促進または他の点で細胞のレベルまたは活性の増加に、CAR発現細胞に有益な活性を有し得る。
上記のように、ある場合、対象は、標的が適切に阻害されても、増殖を駆動できる他の経路への変更(例えば、変異)を有し得るために、非応答である。従って、対象がキナーゼ阻害剤の活性を無効とする経路における変更を有する(または有すると同定される)とき、キナーゼ阻害剤治療を維持できる。理論に拘束されないが、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)活性は、キナーゼ阻害剤単独が増殖遅延に有効でない場合でも、癌細胞における有用な生物学的変化を促進できる。例えば、キナーゼ阻害剤は、癌細胞をリンパ節外に移動させるのに十分である可能性があり、CAR治療に対してより攻撃されやすくする。
次にキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)に応答である対象について、種々の治療的レジメンをここに記載する。ある態様において、対象がキナーゼ阻害剤に対して完全応答者である(またはそうであると同定される)とき、対象に、完全応答の期間CAR治療を投与しない。他の態様において、対象がキナーゼ阻害剤に対して完全応答者である(またはそうであると同定される)とき、対象に、完全応答の期間CAR治療を投与する。ある態様において、CAR治療後、対象は、応答の延長または再発の遅延を経験する(例えば、CAR治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。例えば、イブルチニブ単剤療法で処置したMCLは、約17.5ヶ月の中央応答期間を有する。
ある態様において、対象がキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)に対して部分応答者である(またはそうであるとして同定される)とき、対象に、部分応答の期間CAR治療を投与しない。他の態様において、対象がキナーゼ阻害剤に対して部分応答者である(またはそうであるとして同定される)とき、対象に、部分応答の期間CAR治療を投与する。ある態様において、CAR治療後、対象は、完全応答および/または応答延長または再発遅延を経験する(例えば、CAR治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
ある態様において、対象が、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)での処置開始後に疾患安定である(またはそうであると同定される)とき、疾患が安定な期間、対象にCAR治療を投与しない。他の態様において、対象が、キナーゼ阻害剤での処置開始後に疾患安定である(またはそうであると同定される)とき、疾患が安定な期間、対象にCAR治療を投与する。ある態様において、CAR治療後、対象は、部分応答、完全応答および/または応答延長または再発遅延を経験する(例えば、CAR治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
ある態様において、対象が、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)での処置開始後疾患が進行した(またはそうであると同定される)とき、対象に、疾患進行期間中、CAR治療を投与しない。他の態様において、対象が、キナーゼ阻害剤での処置開始後疾患が進行した(またはそうであると同定される)とき、対象に、疾患進行期間中、CAR治療を投与する。ある態様において、CAR治療後、対象は疾患安定、部分応答、完全応答および/または応答延長または再発遅延を経験する(例えば、CAR治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
それゆえに、ある患者にどの処置コースが適するか決定するために、処置前または処置中に1以上の疾患評価肯定を実施できる。例えば、対象は、第一選択治療としてキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)を投与され得る。次いで、一定期間(例えば、1ヶ月または2ヶ月であるが、また2週間、3週間、1ヶ月、1.5ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、12ヶ月、15ヶ月または18ヶ月)後、患者の応答を評価できる。評価により対象が完全応答者であることが示されたら、ある態様において、CAR治療を、例えば、上記のように、投与しない。評価により対象が部分応答者であるかまたは疾患が安定であると示されたら、ある態様において、CAR治療を、例えば、上記のように、キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。評価により対象が非応答者または再発者であることが示されたら、ある態様において、CAR治療を、例えば、上記のように、キナーゼ阻害剤または第二キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、CAR発現細胞を製造しながら、例えば、患者自身のT細胞が、CARおよび/または他の因子を発現するように操作されながら、疾患を制御する。
患者の応答者状態または再発者状態を分類するための臨床標準が当分野で知られる。例として、悪性リンパ腫について、標準化された応答基準がCheson et al, J Clin Oncol 17:1244 (1999)およびCheson et al., “Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma”, J Clin Oncol 25:579-586 (2007)(両者とも、その全体を引用により本明細書に包含させる)に記載されている。従って、ある態様において、対象を、Cheson基準または修飾Cheson基準に従って完全応答者、部分応答者、疾患安定、非応答者または再発者と分類できる。他の血液系腫瘍を分類するための基準は当分野で知られる。
Cheson 2007の表2における基準によると、完全応答者は、疾患の証拠が全て消失する;部分応答者は、測定可能な疾患の退行があり、新規部位がない;疾患が安定した患者は、CR/PRまたはPDの達成に失敗する;そして、疾患が再発したまたは疾患が進行した患者は、何らかの新規病変または先に関与した部位の最下点からの50%以上の増加を有する。評価は、疾患がFDG貪欲であるか、PET陽性であるか陰性であるか、小結節が存在するか、例えば、肝臓または脾臓で触知できるかおよび骨髄が無傷であるかまたは関与を示すかの決定を含み得る。
CAR治療およびキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)を、例えば、同時にまたは逐次的に投与できる。ある態様において、CAR治療を、キナーゼ阻害剤治療開始と実質的に同じときに開始する。ある態様において、CAR治療を、キナーゼ阻害剤治療開始の前に開始する。ある態様において、CAR治療を、キナーゼ阻害剤治療開始の後に開始する。例えば、CAR治療を、キナーゼ阻害剤治療開始、例えば、少なくとも1週間、2週間、3週間または4週間または1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、12ヶ月、15ヶ月、18ヶ月または24ヶ月後に開始できる。ある態様において、CAR治療を、患者の体内に生理学的に適切なレベルのキナーゼ阻害剤が存在している間に開始する。
組み合わせで投与するとき、CAR治療およびキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)または両者を、各薬剤を、例えば、単剤療法として、個々に使用する量または用量より高い、低いまたは同じ量または用量で投与できる。ある態様において、CAR治療、キナーゼ阻害剤または両者の投与する量または用量は、例えば、単剤療法として、各々の薬剤を個々に使用する量または用量より、低い(例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%)。他の態様において、所望の効果(例えば、癌の処置)をもたらすCAR治療、キナーゼ阻害剤または両者の量または用量は、同じ治療的効果の達成に必要な、例えば、単剤療法として、各々の薬剤を個々に使用する量または用量より低い(例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%低い)。
組み合わせて投与するとき、CAR治療およびキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)または両者を、例えば、単剤療法として、各々の薬剤を個々に使用する期間より長い、短いまたは同じ期間投与できる。ある態様において、CAR治療、キナーゼ阻害剤または両者の投与期間は、例えば、単剤療法として、各々の薬剤を個々に使用する期間より短い(例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%)。他の態様において、所望の効果(例えば、癌の処置)をもたらすCAR治療、キナーゼ阻害剤または両者の投与期間は、同じ治療的効果を達成するのに必要な、例えば、単剤療法として、各々の薬剤を個々に使用する期間より短い(例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%短い)。ある態様において、患者に、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤)を短縮コースで投与する。例えば、キナーゼ阻害剤の短縮コースは、計約0~2ヶ月、2~4ヶ月、4~6ヶ月、6~8ヶ月、8~10ヶ月、10~12ヶ月、12~15ヶ月、15~18ヶ月、18~21ヶ月または21~24ヶ月継続し得るか、またはCAR治療投与後約0~2ヶ月、2~4ヶ月、4~6ヶ月、6~8ヶ月、8~10ヶ月、10~12ヶ月、12~15ヶ月、15~18ヶ月、18~21ヶ月または21~24ヶ月継続し得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤の短縮コースは、再発前に終了する。ある態様において、キナーゼ阻害剤を、短縮コースの間、常用(例えば、単剤療法)レベルで使用する。
ある態様において、CAR発現細胞の単一用量は、約5×108 CD19 CART細胞を含む。CAR発現細胞の用量は、また約5×106、1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109または5×109細胞、例えば、CD19 CAR細胞、例えば、CD19 CART細胞も含み得る。
ある面において、本発明は、哺乳動物細胞、例えば、T細胞における発現のためのプロモーターと操作可能に連結したCD19 CARを含むベクターに関する。ある面において、本発明は、CD19発現腫瘍の処置に使用するための、CD19 CARを発現する組み換え細胞、例えば、T細胞を提供し、ここで、CD19 CARを発現する組み換えT細胞を、CD19 CARTと名付ける。ある面において、ここに記載するCD19 CARTは、腫瘍細胞と、その表面に発現している少なくとも一つのCD19 CARを、CARTが腫瘍細胞を標的とし、腫瘍の増殖が阻止されるように、接触させることができる。
ある面において、本発明は、腫瘍細胞とCD19 CAR発現細胞、例えば、ここに記載するCD19 CART細胞を、CARTが抗原に応答して活性化され、癌細胞を標的とし、腫瘍の増殖が阻止されるように、接触させることを含む、CD19発現腫瘍細胞の増殖を阻止する方法に関する。CD19 CAR発現細胞、例えば、T細胞を、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。
ここで使用する“組み合わせて”投与するは2(またはそれ以上)の異なる処置を、対象が障害を有する過程の間に対象に送達することを意味し、例えば、2以上の処置を、対象が障害と診断された後にかつ障害が治癒または撲滅される前にまたは処置が他の理由で中止される前に送達される。ある態様において、投与期間の重複があるように、一方の処置の送達は、第二の処置の送達開始時にまだ行われている。これは、ここでは“同時の”または“一緒の送達”ということがある。他の態様において、一方の処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終わる。いずれかの場合のある態様において、処置は、組み合わせ投与のためにより有効である。例えば、第二処置はより有効である、例えば、等しい効果が少ない第二処置で見られるまたは第二処置が、第二処置を第一処置非存在下で投与したときに見られるよりも大きな程度で症状を軽減するかまたは第一処置で同様な状況が見られる。ある態様において、送達は、障害と関係する症状または他のパラメータの減少が、他方の処置の非存在下で一方の処置の送達で観察されるされるより大きい。2処置の効果は一部相加的、完全相加的または相加的より大きいものであり得る。送達は、送達した第一処置の効果が、第二剤の送達時になお検出可能であるようなものであり得る。ある態様において、CAR発現細胞をここに記載する用量および/または投薬スケジュールで投与し、キナーゼ阻害剤またはCAR発現細胞の活性を増強する薬剤をここに記載する用量および/または投薬スケジュールで投与する。
本発明は、T細胞がキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子修飾され、CAR T細胞がそれを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞治療を含む。注入された細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を殺すことができる。抗体治療と異なり、CAR修飾T細胞は、インビボで複製でき、持続した腫瘍制御に至り得る長期持続をもたらす。多様な面において、患者に投与されたT細胞またはその子孫は、患者で、患者にT細胞投与後少なくとも4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、13ヶ月、14ヶ月、15ヶ月、16ヶ月、17ヶ月、18ヶ月、19ヶ月、20ヶ月、21ヶ月、22ヶ月、23ヶ月、2年、3年、4年または5年持続する。
本発明はまた、T細胞が、キメラ抗原受容体(CAR)を一過性に発現するように、例えば、インビトロ転写RNAにより修飾し、CAR T細胞を、それを必要とするレシピエントに注入する、ある種の細胞治療を含む。注入した細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を殺すことができる。それゆえに、多様な面において、患者に投与したT細胞は、患者にT細胞投与後、1ヶ月、例えば、3週間、2週間、1週間未満持続する。
何らかの特定の理論に拘束されないが、CAR修飾T細胞により惹起される抗腫瘍免疫応答は、能動的または受動的免疫応答であり得るかまたはあるいは直接的対間接的免疫応答によるものであり得る。一つの面において、CAR形質導入T細胞は、CD19を発現するヒト癌細胞に応答して特定の炎症誘発性サイトカイン分泌および強力な細胞溶解性活性を示し、可可溶性CD19阻害に抵抗性とし、バイスタンダー死滅に介在し、確立されたヒト腫瘍の退縮に介在する。例えば、CD19発現腫瘍の不均一な場内の低抗原腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性癌細胞に対して先に反応しているCD19再指向T細胞による間接的破壊に感受性であり得る。
一つの面において、本発明の完全ヒトCAR修飾T細胞は、哺乳動物におけるエクスビボ免疫化および/またはインビボ治療のための1種のワクチンである。一つの面において、哺乳動物はヒトである。
ある態様において、エクスビボ免疫化に関し、哺乳動物に細胞を投与する前に、インビトロで次のi)細胞の増殖、ii)CARをコードする核酸の細胞への導入またはiii)細胞の凍結保存の少なくとも1つが起こる。
エクスビボ手順は当分野で周知であり、下により完全に考察する。簡潔には、細胞を哺乳動物(例えば、ヒト)から単離し、ここに開示するCARを発現するベクターで遺伝子修飾する(すなわち、インビトロでの形質導入またはトランスフェクト)。CAR修飾細胞を、治療利益を提供するために哺乳動物レシピエントに投与できる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、CAR修飾細胞はレシピエントに対して自己であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに対して同種、同系または異種であり得る。エクスビボ免疫化の観点での細胞ベースのワクチンの使用に加えて、患者における抗原に対する免疫応答を惹起させるインビボ免疫化のための組成物および方法もここに記載する方法に包含される。
一般に、ここに記載のように活性化および増殖された細胞は、免疫無防備状態である個体で生じる疾患の処置および予防に利用し得る。特に、ここに記載するCAR発現細胞を、CD19の発現と関係する疾患、障害および状態の処置に使用する。ある面において、細胞を、CD19の発現と関係する疾患、障害および状態を発症するリスクのある患者の処置に使用する。それゆえに、本発明は、処置を必要とする対象に、ここに記載するCAR発現細胞の有効量を、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む、CD19の発現と関係する疾患、障害および状態を処置または予防する方法を提供する。
本発明はまた、CD19発現細胞集団の増殖を阻止するまたは減少させる方法も提供し、該方法は、CD19発現細胞を含む細胞の集団とCD19発現細胞と結合するここに記載する抗CD19 CAR発現細胞を接触させ、CD19発現細胞の集団とキナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤を接触させることを含む。具体的な面において、本発明は、CD19を発現する癌細胞の集団の増殖を阻止するまたは減少させる方法を提供し、該方法は、CD19発現癌細胞集団とCD19発現細胞と結合するここに記載する抗CD19 CAR発現細胞を接触させ、CD19発現細胞とキナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤を接触させることを含む。ある面において、本発明は、CD19を発現する癌細胞の集団の増殖を阻止するまたは減少させる方法を禎子油し、該方法は、CD19発現癌細胞集団とCD19発現細胞と結合するここに記載する抗CD19 CAR発現細胞を接触させ、CD19発現細胞とキナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤を接触させることを含む。ある面において、ここに記載する抗CD19 CAR発現細胞およびキナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤の組み合わせは、血液癌またはCD19発現細胞と関係する他の癌を有する対象または動物モデルにおいて、陰性対照と比較して、細胞および/または癌細胞の数量、数、量またはパーセンテージを少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも65%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%または少なくとも99%現象させる。ある面において、対象はヒトである。
本発明はまたCD19発現と関係する疾患細胞(例えば、CD19を発現する血液癌または非定型癌)を予防、処置および/または管理する方法を提供し、該方法は、処置を必要とする対象にCD19発現細胞に結合する抗CD19 CAR発現細胞を投与し、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤を投与することを含む。ある面において、対象はヒトである。CD19発現細胞と関係する障害の非限定的例は、自己免疫性障害(例えば狼瘡)、炎症性障害(例えばアレルギーおよび喘息)および癌(例えばCD19を発現する血液癌または非定型癌)を含む。
本発明はまたCD19発現と関係する疾患細胞を予防、処置および/または管理する方法も提供し、該方法は、処置を必要とする対象にCD19発現細胞と結合する本発明の抗CD19 CART細胞を投与することを含む。ある面において、対象はヒトである。
本発明は、CD19発現細胞と関係する癌の再発を予防する方法を提供し、該方法は、処置を必要とする対象にCD19発現細胞と結合する本発明の抗CD19発現細胞(例えば抗CD19 CART細胞)を投与することを含む。ある面において、方法は、処置を必要とする対象に、CD19発現細胞と結合するここに記載の抗CD19発現細胞(例えば抗CD19 CART細胞)の有効量を、他の治療剤の有効量と組み合わせて投与することを含む。
ある面において、本発明は、対象における癌を処置する方法に関する。方法は、対象にB細胞ターゲティングCARを発現する細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)、例えば、ここに記載のT細胞またはNK細胞を、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤と組み合わせて、癌が対象において処置されるように投与することを含む。ここに記載する方法により処置可能な癌の例は、B細胞抗原、例えば、CD19の発現と関係する癌である。ある態様において、疾患は固形または液性腫瘍である。ある態様において、疾患は血液癌である。ある態様において、血液癌は白血病である。ある態様において、血液癌は、例えば、WHO分類によると、成熟B細胞新生物である。ある態様において、血液癌は、CD19+ Bリンパ球由来悪性腫瘍である。ある態様において、癌は、B細胞急性リンパ系白血病(BALL)、T細胞急性リンパ系白血病(TALL)、小リンパ球性白血病(SLL)、急性リンパ系白血病(ALL)を含むが、これらに限定されない1以上の急性白血病;慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)を含むが、これらに限定されない1以上の慢性白血病;マントル細胞リンパ腫(MCL)、B細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大B細胞リンパ腫(DLBCL)(例えば、T細胞/組織球富大B細胞リンパ腫、CNSの原発性DLCBL、高齢者の皮膚原発DLBCL足型またはEBV+ DLBCL)、慢性炎症と関係するDLBCL、濾胞性リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫(粘膜関連リンパ組織型節外性辺縁帯リンパ腫)、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、脾臓辺縁帯リンパ腫、脾臓リンパ腫/白血病(例えば、分類不可能)、脾臓汎発性赤色髄小B細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病異型、リンパ形質細胞性リンパ腫、重鎖疾患(例えば、アルファ重鎖疾患、ガンマ重鎖疾患またはミュー重鎖疾患)、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外形質細胞腫、結節性辺縁帯リンパ腫、小児結節性辺縁帯リンパ腫、皮膚原発濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、縦隔原発(胸腺)大B細胞リンパ腫、血管内大B細胞リンパ腫、ALK+ 大B細胞リンパ腫、HHV8関連多中心性キャッスルマン病で生じる大B細胞リンパ腫、原発浸出リンパ腫、B細胞リンパ腫、分類不可能(例えば、DLBCLとバーキットリンパ腫の中間またはDLBCLと古典的ホジキンリンパ腫の中間の特性を有する)および骨髄球性血液細胞の産生不全(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の多様なコレクションである“前白血病状態”およびB細胞抗原(例えば、CD19)を発現する非定型および/または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されないB細胞抗原(例えば、CD19)発現と関係する疾患を含むが、これらに限定されないさらなる血液癌または血液学的状態;およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
ある態様において、癌はホジキンリンパ腫であり、患者は、CAR発現細胞で、例えば、単剤療法としてまたは他の1以上の治療と組み合わせて処置される。ある態様において、ホジキンリンパ腫は、ステージI、II、IIIまたはIVである。さらなる治療は、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤のようなキナーゼ阻害剤を含み得る。さらなる治療は、ホジキンリンパ腫の処置を含み得る。さらなる治療は、例えば、放射線療法、MOPP(マスタージェン、オンコビン、プレドニゾンおよびプロカルバジン)、ABVD(アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン)、Stanford V(化学療法および放射線処置を用いるレジメン)またはBEACOPP(ブレオマイシン、エトポシド、アドリアマイシン、シクロホスファミド、オンコビン、プロカルバジン、プレドニゾン)を含み得る。ある態様において、対象は、予め放射線療法、MOPP、Stanford VまたはBEACOPPの1以上で処置されているかまたはこれに耐性であるもしくは難治性である。
B細胞抗原、例えば、CD19、CD20、CD22またはROR1の1以上の発現と関係する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。
ある態様において、ここに記載する組み合わせで処置できる癌は多発性骨髄腫である。多発性骨髄腫は、骨髄への形質細胞クローンの蓄積を特徴とする血液の癌である。多発性骨髄腫の現在の治療は、サリドマイドのアナログであるレナリドマイドでの処置を含むが、これに限定されない。レナリドマイドは、抗腫瘍活性、血管形成阻害および免疫調節を含む活性を有する。ある態様において、例えば、ここに記載するような、CD19 CARを骨髄腫細胞を標的とするために使用し得る。ある態様において、ここに記載する組み合わせを、1以上のさらなる治療、例えば、レナリドマイド処置と組み合わせて使用し得る。
ここに記載するCAR発現細胞を、単独でまたは希釈剤および/またはIL-2または他のサイトカインまたは細胞集団のような他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与し得る。
ある態様において、白血球枯渇化学療法を、CAR細胞、例えば、ここに記載するCAR発現細胞の投与(例えば、注入)前に、同時にまたは後に対象に投与する。例として、白血球枯渇化学療法を、CAR細胞投与前に対象に投与する。例えば、白血球枯渇化学療法は、CAR細胞注入の1~4日(例えば、1日、2日、3日または4日)前に終わる。ある態様において、CAR細胞の複数用量を、例えば、ここに記載のように投与する。例えば、単一用量は、約5×108 CAR細胞を含む。ある態様において、白血球枯渇化学療法を、ここに記載するCAR発現細胞の投与(例えば、注入)前に、同時にまたは後に対象に投与する。
血液癌
血液癌状態は、血液、骨髄およびリンパ系に影響する白血病、リンパ腫および悪性リンパ増殖性状態のようなタイプの癌である。
血液癌状態は、血液、骨髄およびリンパ系に影響する白血病、リンパ腫および悪性リンパ増殖性状態のようなタイプの癌である。
白血病は急性白血病および慢性白血病に分類できる。急性白血病はさらに急性骨髄性白血病(AML)および急性リンパ性白血病(ALL)として分類され得る。慢性白血病は慢性骨髄性白血病(CML)および慢性リンパ系白血病(CLL)を含む。他の関連する状態は、骨髄球性血液細胞の産生不良(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の多様なコレクションであり、AMLに癌化するリスクがある、骨髄異形成症候群(MDS、以前は“前白血病状態”として知られた)である。
リンパ腫は、リンパ球から生じる血液細胞腫瘍の群である。代表的リンパ腫は非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む。
組み合わせ治療
ここに記載するCAR発現細胞(例えば、およびここに記載するキナーゼ阻害剤)の組み合わせを、他の既知薬剤および治療と組み合わせて使用し得る。
ここに記載するCAR発現細胞(例えば、およびここに記載するキナーゼ阻害剤)の組み合わせを、他の既知薬剤および治療と組み合わせて使用し得る。
ここに記載するCAR発現細胞、キナーゼ阻害剤および/または少なくとも1つのさらなる治療剤を同時に、同じまたは別の組成物でまたは逐次的に投与できる。逐次投与について、ここに記載するCAR発現細胞をまず投与し、さらなる薬剤を次に投与するかまたは投与の順番を逆にできる。
CAR治療および/または他の治療剤、方法またはモダリティーを、活動性障害の期間または寛解または低活動性疾患の期間に投与できる。CAR治療を、他の処置の処置前、処置と同時、処置後または障害の寛解中に投与できる。
組み合わせて投与するとき、CAR治療およびさらなる薬剤(例えば、キナーゼ阻害剤および/または第三薬剤)または全てを、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または投与より高い、低いまたは同じ量または用量で投与できる。ある態様において、CAR治療、さらなる薬剤(例えば、キナーゼ阻害剤および/または第三薬剤)または全ての投与される量または用量は、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または用量より低い(例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%)。他の態様において、所望の効果(例えば、癌の処置)を生じるCAR治療、さらなる薬剤(例えば、キナーゼ阻害剤および/または第三薬剤)または全ての投与される量または用量は、同じ治療効果を達成するのに必要な、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または用量より低い(例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%低い)。
さらなる面において、ここに記載するCAR発現細胞(例えば、およびキナーゼ阻害剤)の組合せを、手術、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびFK506のような免疫抑制剤、抗体またはCAMPATH、抗CD3抗体または他の抗体治療のような他の免疫除去剤、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカインおよび照射、Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971に記載されるようなペプチドワクチンと組み合わせる処置レジメンにおいて使用し得る。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞(例えばおよびここに記載するキナーゼ阻害剤)の組み合わせを、他の化学療法剤と組み合わせて使用できる。代表的化学療法剤は、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン(例えば、リポソームドキソルビシン))、ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン)、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド)、免疫細胞抗体(例えば、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ)、代謝拮抗剤(例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビン)を含む)、TNFRグルココルチコイド誘発TNFR関連タンパク質(GITR)アゴニスト、プロテアソーム阻害剤(例えば、アクラシノマイシンA、グリオトキシンまたはボルテゾミブ)、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体(例えば、レナリドマイド)のような免疫調節剤を含む。
組み合わせ治療における使用に考慮される一般的化学療法剤は、アナストロゾール(アリミデックス(登録商標))、ビカルタミド(カソデックス(登録商標))、硫酸ブレオマイシン(ブレノキサン(登録商標))、ブスルファン(マイレラン(登録商標))、ブスルファン注(ブスルフェクス(登録商標))、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、N4-ペントキシカルボニル-5-デオキシ-5-フルオロシチジン、カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))、カルムスチン(BiCNU(登録商標))、クロラムブシル(リューケラン(登録商標))、シスプラチン(プラチノール(登録商標))、クラドリビン(ロイスタチン(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)またはNeosar(登録商標))、シタラビン、シトシンアラビノシド(Cytosar-U(登録商標))、シタラビンリポソーム注射(DepoCyt(登録商標))、ダカルバジン(DTIC-Dome(登録商標))、ダクチノマイシン(アクチノマイシンD、Cosmegan)、塩酸ダウノルビシン(Cerubidine(登録商標))、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射(DaunoXome(登録商標))、デキサメサゾン、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、塩酸ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)、ルベックス(登録商標))、エトポシド(ベプシド(登録商標))、リン酸フルダラビン(フルダラ(登録商標))、5-フルオロウラシル(アドルシル(登録商標)、エフデックス(登録商標))、フルタミド(Eulexin(登録商標))、テザシチビン、ゲムシタビン(ジフルオロデオキシシチジン)、ヒドロキシ尿素(ハイドレア(登録商標))、イダルビシン(イダマイシン(登録商標))、イホスファミド(IFEX(登録商標))、イリノテカン(Camptosar(登録商標))、L-アスパラギナーゼ(ELSPAR(登録商標))、ロイコボリンカルシウム、メルファラン(アルケラン(登録商標))、6-メルカプトプリン(ピュリネソール(登録商標))、メトトレキサート(Folex(登録商標))、ミトキサントロン(ノバントロン(登録商標))、マイロターグ、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、phoenix(イットリウム90/MX-DTPA)、ペントスタチン、ポリフェプロザン20とカルムスチンインプラント(グリアデル(登録商標))、クエン酸タモキシフェン(Nolvadex(登録商標))、テニポシド(Vumon(登録商標))、6-チオグアニン、チオテパ、チラパザミン(Tirazone(登録商標))、注射用塩酸トポテカン(ハイカムチン(登録商標))、ビンブラスチン(Velban(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
代表的アルキル化剤は、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア類およびトリアゼン):ウラシルマスタード(アミノウラシルマスタード(登録商標)、Chlorethaminacil(登録商標)、Demethyldopan(登録商標)、Desmethyldopan(登録商標)、Haemanthamine(登録商標)、Nordopan(登録商標)、Uracil nitrogen mustard(登録商標)、Uracillost(登録商標)、Uracilmostaza(登録商標)、Uramustin(登録商標)、ウラムスチン(登録商標))、クロルメチン(Mustargen(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)、Neosar(登録商標)、Clafen(登録商標)、エンドキサン(登録商標)、プロシトックス(登録商標)、RevimmuneTM)、イホスファミド(プロシトックス(登録商標))、メルファラン(アルケラン(登録商標))、クロラムブシル(リューケラン(登録商標))、ピポブロマン(Amedel(登録商標)、Vercyte(登録商標))、トリエチレンメラミン(Hemel(登録商標)、Hexalen(登録商標)、Hexastat(登録商標))、トリエチレンチオホスホロアミン、テモゾロミド(テモダール(登録商標))、チオテパ(テモダール(登録商標))、ブスルファン(Busilvex(登録商標)、マイレラン(登録商標))、カルムスチン(BiCNU(登録商標))、ロムスチン(CeeNU(登録商標))、ストレプトゾシン(ザノサー(登録商標))およびダカルバジン(DTIC-Dome(登録商標))を含むが、これらに限定されない。さらなる代表的アルキル化剤は、オキサリプラチン(エロキサチン(登録商標));テモゾロミド(テモダール(登録商標)およびTemodal(登録商標));ダクチノマイシン(別名アクチノマイシン-D、Cosmegen(登録商標));メルファラン(別名L-PAM、L-サルコリシンおよびフェニルアラニンマスタード、アルケラン(登録商標));アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(HMM)、Hexalen(登録商標));カルムスチン(BiCNU(登録商標));ベンダムスチン(Treanda(登録商標));ブスルファン(ブスルフェクス(登録商標)およびマイレラン(登録商標));カルボプラチン(パラプラチン(登録商標));ロムスチン(別名CCNU、CeeNU(登録商標));シスプラチン(別名CDDP、プラチノール(登録商標)およびプラチノール(登録商標)-AQ);クロラムブシル(リューケラン(登録商標));シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)およびNeosar(登録商標));ダカルバジン(別名DTIC、DICおよびイミダゾールカルボキサミド、DTIC-Dome(登録商標));アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(HMM)、Hexalen(登録商標));イホスファミド(Ifex(登録商標));Prednumustine;プロカルバジン(Matulane(登録商標));メクロレタミン(別名窒素マスタード、ムスチンおよび塩酸メクロロエタミン、Mustargen(登録商標));ストレプトゾシン(ザノサー(登録商標));チオテパ(別名チオホスホアミド、TESPAおよびTSPA、テモダール(登録商標));シクロホスファミド(エンドキサン(登録商標)、シトキサン(登録商標)、Neosar(登録商標)、プロシトックス(登録商標)、Revimmune(登録商標));およびベンダムスチンHCl(Treanda(登録商標))を含むが、これらに限定されない。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象にフルダラビン、シクロホスファミドおよび/またはリツキシマブと組み合わせて投与し得る。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、対象にフルダラビン、シクロホスファミドおよびリツキシマブ(FCR)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象はCLLを有する。例えば、対象は、例えば、白血病性細胞において染色体17の短腕の欠損(del(17p))を有する。他の例において、対象はdel(17p)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(IgVH)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(IgVH)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、フルダラビンを、約10~50mg/m2(例えば、約10~15mg/m2、15~20mg/m2、20~25mg/m2、25~30mg/m2、30~35mg/m2、35~40mg/m2、40~45mg/m2または45~50mg/m2)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、シクロホスファミドを、約200~300mg/m2(例えば、約200~225mg/m2、225~250mg/m2、250~275mg/m2または275~300mg/m2)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、リツキシマブを、約400~600mg/m2(例えば、400~450mg/m2、450~500mg/m2、500~550mg/m2または550~600mg/m2)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象に、ベンダムスチンおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、対象はCLLを有する。例えば、対象は、例えば、白血病性細胞において染色体17の短腕の欠損(del(17p))を有する。他の例において、対象はdel(17p)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(IgVH)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(IgVH)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、ベンダムスチンを、約70~110mg/m2(例えば、70~80mg/m2、80~90mg/m2、90~100mg/m2または100~110mg/m2)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、リツキシマブを、約400~600mg/m2(例えば、400~450mg/m2、450~500mg/m2、500~550mg/m2または550~600mg/m2)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象にリツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよび/またはコルチコステロイド(例えば、プレドニゾン)と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、対象にリツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン(R-CHOP)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、汎発性大B細胞リンパ腫(DLBCL)を有する。ある態様において、対象は、大きくない限定病期DLBCL(例えば、7cm未満のサイズ/直径を有する腫瘍を含む)を有する。ある態様において、対象を、R-CHOPと組み合わせた放射線で処置する。例えば、対象に、R-CHOP(例えば、1~6サイクル、例えば、1サイクル、2サイクル、3サイクル、4サイクル、5サイクルまたは6サイクルのR-CHOP)、続いて放射線を投与する。ある場合、対象に、放射線後にR-CHOP(例えば、1~6サイクル、例えば、1サイクル、2サイクル、3サイクル、4サイクル、5サイクルまたは6サイクルのR-CHOP)を投与する。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象にエトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよび/またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、対象にエトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびリツキシマブ(EPOCH-R)と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、対象に用量調節EPOCH-R(DA-EPOCH-R)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、B細胞リンパ腫、例えば、Myc再構成侵襲性B細胞リンパ腫を有する。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象にリツキシマブおよび/またはレナリドマイドと組み合わせて投与する。レナリドマイド((RS)-3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-2H-イソインドール-2-イル)ピペリジン-2,6-ジオン)は免疫調節剤である。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、対象にリツキシマブおよびレナリドマイドと組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、濾胞性リンパ腫(FL)またはマントル細胞リンパ腫(MCL)を有する。ある態様において、対象はFLを有し、先に癌治療剤での処置を受けていない。ある態様において、レナリドマイドを、約10~20mg(例えば、10~15mgまたは15~20mg)の用量で、例えば、連日投与する。ある態様において、リツキシマブを、約350~550mg/m2(例えば、350~375mg/m2、375~400mg/m2、400~425mg/m2、425~450mg/m2、450~475mg/m2または475~500mg/m2)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
代表的免疫調節剤は、例えば、アフツズマブ(Roche(登録商標)から入手可能);ペグフィルグラスチム(ニューラスタ(登録商標));レナリドマイド(CC-5013、レブリミド(登録商標));サリドマイド(サロミド(登録商標))、ポマリドミド、actimid(CC4047);およびIRX-2(インターロイキン1、インターロイキン2およびインターフェロンγを含むヒトサイトカイン混合物、CAS 951209-71-5、IRX Therapeuticsから入手可能)を含む。
代表的アントラサイクリンは、例えば、ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)およびルベックス(登録商標));ブレオマイシン(lenoxane(登録商標));ダウノルビシン(塩酸ダウノルビシン、ダウノマイシンおよび塩酸ルビドマイシン、Cerubidine(登録商標));ダウノルビシンリポソーム(クエン酸ダウノルビシンリポソーム、DaunoXome(登録商標));ミトキサントロン(DHAD、ノバントロン(登録商標));エピルビシン(EllenceTM);イダルビシン(イダマイシン(登録商標)、イダマイシンPFS(登録商標));マイトマイシンC(ムタマイシン(登録商標));ゲルダナマイシン;ハービマイシン;ラビドマイシン;およびデスアセチルラビドマイシンを含む。
代表的ビンカアルカロイドは、例えば、酒石酸ビノレルビン(ナベルビン(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビンデシン(Eldisine(登録商標)));ビンブラスチン(別名硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびVLB、Alkaban-AQ(登録商標)およびVelban(登録商標));およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
代表的プロテオソーム阻害剤は、ボルテゾミブ(ベルケイド(登録商標));カーフィルゾミブ(PX-171-007、(S)-4-メチル-N-((S)-1-(((S)-4-メチル-1-((R)-2-メチルオキシラン-2-イル)-1-オキソペンタン-2-イル)アミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)-2-((S)-2-(2-モルホリノアセトアミド)-4-フェニルブタンアミド)-ペンタンアミド);マリゾミブ(NPI-0052);イキサゾミブクエン酸エステル(MLN-9708);デランゾミブ(CEP-18770);およびO-メチル-N-[(2-メチル-5-チアゾリル)カルボニル]-L-セリル-O-メチル-N-[(1S)-2-[(2R)-2-メチル-2-オキシラニル]-2-オキソ-1-(フェニルメチル)エチル]-L-セリンアミド(ONX-0912)を含む。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象にブレンツキシマブと組み合わせて投与する。ブレンツキシマブは、抗CD30抗体およびモノメチルオーリスタチンEの抗体-薬物コンジュゲートである。ある態様において、対象は、ホジキンリンパ腫(HL)、例えば、再発したまたは難治性HLを有する。ある態様において、対象は、CD30+ HLを含む。ある態様において、対象は、自己幹細胞移植(ASCT)を受けている。ある態様において、対象は、ASCTを受けていない。ある態様において、ブレンツキシマブを、約1~3mg/kg(例えば、約1~1.5mg/kg、1.5~2mg/kg、2~2.5mg/kgまたは2.5~3mg/kg)の用量で、例えば、静脈内に、例えば、3週間毎に投与する。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象にブレンツキシマブおよびダカルバジンと組み合わせてまたはブレンツキシマブおよびベンダムスチンと組み合わせて投与する。ダカルバジンは、化学名5-(3,3-ジメチル-1-トリアゼニル)イミダゾール-4-カルボキサミドを有するアルキル化剤である。ベンダムスチンは、化学名4-[5-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-1-メチルベンズイミダゾール-2-イル]ブタン酸を有するアルキル化剤である。ある態様において、対象は、ホジキンリンパ腫(HL)を有する。ある態様において、対象は、先に癌治療剤での処置を受けていない。ある態様において、対象は少なくとも60歳、例えば、60歳、65歳、70歳、75歳、80歳、85歳またはそれ以上である。ある態様において、ダカルバジンを、約300~450mg/m2(例えば、約300~325mg/m2、325~350mg/m2、350~375mg/m2、375~400mg/m2、400~425mg/m2または425~450mg/m2)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、ベンダムスチンを、約75~125mg/m2(例えば、75~100mg/m2または100~125mg/m2、例えば、約90mg/m2)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、ブレンツキシマブを、約1~3mg/kg(例えば、約1~1.5mg/kg、1.5~2mg/kg、2~2.5mg/kgまたは2.5~3mg/kg)の用量で、例えば、静脈内に、例えば、3週間毎に投与する。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、対象にCD20阻害剤、例えば、抗CD20抗体(例えば、抗CD20単-または二重特異的抗体)またはそのフラグメントと組み合わせて投与する。代表的抗CD20抗体は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)、オカラツズマブおよびPro131921(Genentech)を含むが、これらに限定されない。例えば、Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43参照。
ある態様において、抗CD20抗体は、リツキシマブを含む。リツキシマブは、例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdfに記載のように、CD20に結合し、CD20発現細胞の細胞溶解を引き起こすキメラマウス/ヒトモノクローナル抗体IgG1カッパである。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、対象にリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、CLLまたはSLLを有する。
ある態様において、リツキシマブを、静脈内に、例えば、静脈内点滴として投与する。例えば、各注入は、約500~2000mg(例えば、約500~550、550~600、600~650、650~700、700~750、750~800mg、800~850mg、850~900mg、900~950mg、950~1000mg、1000~1100mg、1100~1200mg、1200~1300mg、1300~1400mg、1400~1500mg、1500~1600mg、1600~1700mg、1700~1800mg、1800~1900mgまたは1900~2000mg)のリツキシマブを提供する。ある態様において、リツキシマブを、150mg/m2~750mg/m2、例えば、約150~175mg/m2、175~200mg/m2、200~225mg/m2、225~250mg/m2、250~300mg/m2、300~325mg/m2、325~350mg/m2、350~375mg/m2、375~400mg/m2、400~425mg/m2、425~450mg/m2、450~475mg/m2、475~500mg/m2、500~525mg/m2、525~550mg/m2、550~575mg/m2、575~600mg/m2、600~625mg/m2、625~650mg/m2、650~675mg/m2または675~700mg/m2の用量で投与し、ここで、m2は対象の体表面積を示す。ある態様において、リツキシマブを、少なくとも4日、例えば、4日、7日、14日、21日、28日、35日またはそれ以上の投薬間隔を開けて投与する。例えば、リツキシマブを、少なくとも0.5週間、例えば、0.5週間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間またはそれ以上の投薬間隔を開けて投与する。ある態様において、リツキシマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、一定期間、例えば、少なくとも2週間、例えば、少なくとも2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、13週間、14週間、15週間、16週間、17週間、18週間、19週間、20週間またはそれ以上投与する。例えば、リツキシマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、処置サイクルあたり合計少なくとも4回投与で投与する(例えば、処置サイクルあたり少なくとも4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回またはそれ以上投与)。
ある態様において、抗CD20抗体は、オファツムマブを含む。オファツムマブは、分子量約149kDaの抗CD20 IgG1κヒトモノクローナル抗体である。例えば、オファツムマブは、トランスジェニックマウスおよびハイブリドーマテクノロジーを使用して産生し、組み換えマウス細胞株(NS0)で発現され、精製される。例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf;および治験番号NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352およびNCT01397591参照。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、対象にオファツムマブと組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、CLLまたはSLLを有する。
ある態様において、オファツムマブを静脈内点滴として投与する。例えば、各注入は、約150~3000mg(例えば、約150~200mg、200~250mg、250~300mg、300~350mg、350~400mg、400~450mg、450~500mg、500~550mg、550~600mg、600~650mg、650~700mg、700~750mg、750~800mg、800~850mg、850~900mg、900~950mg、950~1000mg、1000~1200mg、1200~1400mg、1400~1600mg、1600~1800mg、1800~2000mg、2000~2200mg、2200~2400mg、2400~2600mg、2600~2800mgまたは2800~3000mg)のオファツムマブを提供する。ある態様において、オファツムマブを約300mgの出発用量で開始し、続いて2000mgで、例えば、約11回投与、例えば、24週間投与する。ある態様において、オファツムマブを、少なくとも4日、例えば、4日、7日、14日、21日、28日、35日またはそれ以上の投薬間隔を開けて投与する。例えば、オファツムマブを、少なくとも1週間、例えば、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、24週間、26週間、28週間、20週間、22週間、24週間、26週間、28週間、30週間またはそれ以上の投薬間隔で投与する。ある態様において、オファツムマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、一定期間、例えば、少なくとも1週間、例えば、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、13週間、14週間、15週間、16週間、17週間、18週間、19週間、20週間、22週間、24週間、26週間、28週間、30週間、40週間、50週間、60週間またはそれ以上または1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月またはそれ以上または1年、2年、3年、4年、5年またはそれ以上投与する。例えば、オファツムマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、処置サイクルあたり合計少なくとも2回投与で投与する(例えば、処置サイクルあたり少なくとも2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、18回、20回またはそれ以上投与)。
ある場合、抗CD20抗体はオクレリズマブを含む。オクレリズマブは、例えば、治験番号NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570およびKappos et al. Lancet. 19.378 (2011):1779-87に記載される、ヒト化抗CD20モノクローナル抗体である。
ある場合、抗CD20抗体はベルツズマブを含む。ベルツズマブはCD20に対するヒト化モノクローナル抗体である。例えば、治験番号NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581およびGoldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55参照。
ある場合、抗CD20抗体はGA101を含む。GA101(別名オビヌツズマブまたはRO5072759)は、ヒト化および糖操作された抗CD20モノクローナル抗体である。例えば、Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96; 治験番号NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422およびNCT01414205;およびwww.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf参照。
ある場合、抗CD20抗体はAME-133vを含む。AME-133v(別名LY2469298またはオカラツズマブ)は、リツキシマブと比較して、FcγRIIIa受容体に対する親和性が増加され、抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性が増強されたCD20に対するヒト化IgG1モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25;およびForero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403参照。
ある場合、抗CD20抗体は、PRO131921を含む。PRO131921は、リツキシマブと比較して、FcγRIIIaへの結合が良好であり、ADCCが増強されるように操作されたヒト化抗CD20モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25;およびCasulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46;および治験番号NCT00452127参照。
ある場合、抗CD20抗体はTRU-015を含む。TRU-015は、CD20に対する抗体のドメイン由来の抗CD20融合タンパク質である。TRU-015はモノクローナル抗体より小さいが、Fc介在エフェクター機能を維持する。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25参照。TRU-015は、ヒトIgG1ヒンジ、CH2およびCH3ドメインと連結した抗CD20一本鎖可変フラグメント(scFv)を含むが、CH1およびCLドメインを欠く。
ある態様において、抗CD20ここに記載する抗体は、ここに記載する治療剤、例えば、化学療法剤(例えば、シトキサン、フルダラビン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、デメチル化剤、ペプチドワクチン、抗腫瘍抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗微小管または抗有糸分裂剤)、抗アレルギー剤、抗悪心剤(または鎮吐剤)、鎮痛剤または細胞保護剤とコンジュゲートしているかまたは他に結合している。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、対象にB細胞リンパ腫2(BCL-2)阻害剤(例えば、ベネトクラックス、別名ABT-199またはGDC-0199)および/またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、対象にベネトクラックスおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ベネトクラックスは、抗アポトーシスタンパク質、BCL-2を阻害する小分子である。ベネトクラックス(4-(4-{[2-(4-クロロフェニル)-4,4-ジメチルシクロヘキシ-1-エン-1-イル]メチル}ピペラジン-1-イル)-N-({3-ニトロ-4-[(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルメチル)アミノ]フェニル}スルホニル)-2-(1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-5-イルオキシ)ベンズアミド)の構造を下に示す。
ある態様において、対象はCLLを有する。ある態様において、対象は、再発したCLLを有し、例えば、対象は、先に癌治療剤を投与されている。ある態様において、ベネトクラックスを、約15~600mg(例えば、15~20mg、20~50mg、50~75mg、75~100mg、100~200mg、200~300mg、300~400mg、400~500mgまたは500~600mg)の用量で、例えば、連日投与する。ある態様において、リツキシマブを、約350~550mg/m2(例えば、350~375mg/m2、375~400mg/m2、400~425mg/m2、425~450mg/m2、450~475mg/m2または475~500mg/m2)の用量で、静脈内に、例えば、月1回投与する。
ある態様において、ここに記載するCARを発現する細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象にTreg細胞集団を減少させる分子と組み合わせて投与する。Treg細胞の数を減らす(例えば、枯渇させる)方法は当分野で知られ、例えば、CD25枯渇、シクロホスファミド投与、GITR機能調節を含む。理論に拘束されないが、アフェレシス前またはここに記載するCAR発現細胞の投与に対象におけるTreg細胞の数を減らすことは、腫瘍微小環境における望まない免疫細胞(例えば、Treg)の数を減らし、対象の再発リスクを減らすと考えられる。ある態様において、ここに記載するCARを発現する細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象に、制御性T細胞(Treg)を枯渇させるGITRアゴニストおよび/またはGITR抗体のようなGITRを標的とするおよび/またはGITR機能を調節する分子と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するCARを発現する細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、対象にシクロホスファミドと組み合わせて投与する。ある態様において、GITR結合分子および/またはGITR機能を調節する分子(例えば、GITRアゴニストおよび/またはTreg枯渇GITR抗体)を、CAR発現細胞の投与前に投与する。例えば、ある態様において、GITRアゴニストを、細胞のアフェレシス前に投与できる。ある態様において、シクロホスファミドを、対象にCAR発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレシス前に投与する。ある態様において、シクロホスファミドおよび抗GITR抗体を、対象にCAR発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレシス前に投与する。ある態様において、対象は癌(例えば、固形癌またはALLまたはCLLのような血液癌)を有する。ある態様において、対象はCLLを有する。ある態様において、対象はALLを有する。ある態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌を有する。
代表的GITRアゴニストは、例えば、米国特許6,111,090号、欧州特許090505B1号、米国特許8,586,023号、PCT公開WO2010/003118号および2011/090754号に記載のGITR融合タンパク質または例えば、米国特許7,025,962号、欧州特許1947183B1号、米国特許7,812,135号、米国特許8,388,967号、米国特許8,591,886号、欧州特許EP1866339号、PCT公開WO2011/028683号、PCT公開WO2013/039954号、PCT公開WO2005/007190号、PCT公開WO2007/133822号、PCT公開WO2005/055808号、PCT公開WO99/40196号、PCT公開WO2001/03720号、PCT公開WO99/20758号、PCT公開WO2006/083289号、PCT公開WO2005/115451号、米国特許7,618,632号およびPCT公開WO2011/051726号に記載の抗GITR抗体のような、例えば、GITR融合タンパク質および抗GITR抗体(例えば、二価抗GITR抗体)を含む。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞とここに記載するキナーゼ阻害剤の組み合わせを、対象にGITRアゴニスト、例えば、ここに記載するGITRアゴニストと組み合わせて投与する。ある態様において、GITRアゴニストを、CAR発現細胞の前に投与する。例えば、ある態様において、GITRアゴニストを、細胞のアフェレシス前に投与できる。ある態様において、対象はCLLを有する。
カルシウム依存的ホスファターゼカルシニューリンを阻害する(シクロスポリンおよびFK506)または増殖因子誘発シグナル伝達に重要であるp70S6キナーゼを阻害する薬物(ラパマイシン)(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)も使用できる。さらなる面において、本発明の細胞組成物を、患者に骨髄移植、フルダラビンのような化学療法剤、体外照射療法(XRT)、シクロホスファミドおよび/またはOKT3またはCAMPATHのような抗体を使用するT細胞除去療法と組み合わせて(例えば、前に、同時にまたは後に)投与し得る。一つの面において、本発明の細胞組成物を、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなB細胞除去療法後に投与する。例えば、ある態様において、対象を、高用量化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付す。ある態様において、移植後、対象は、本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。さらなる態様において、増殖細胞を手術の前または後に投与する。
ある態様において、対象は、CAR発現細胞の投与と関係する副作用を軽減または改善する薬剤を投与され得る。CAR発現細胞の投与と関係する副作用は、CRSおよびマクロファージ活性化症候群(MAS)とも呼ぶ血球貪食性リンパ組織球症(HLH)を含むが、これらに限定されない。CRSの症状は、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などを含む。従って、ここに記載する方法は、ここに記載するCAR発現細胞の対象への投与およびさらにCAR発現細胞の処置に起因する可溶性因子のレベル上昇を管理する薬剤の投与を含み得る。ある態様において、対象で上昇する可溶性因子は、IFN-γ、TNFα、IL-2受容体およびIL-6の1以上である。それゆえに、この副作用を処置するために投与する薬剤は、これらの可溶性因子の1以上を中和する薬剤であり得る。このような薬剤の例は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)、TNFαの阻害剤およびIL-6の阻害剤を含むが、これらに限定されない。TNFα阻害剤の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールおよびゴリムマブのような、抗TNFα抗体分子である。TNFα阻害剤の他の例は、エタネルセプトのような融合タンパク質である。小分子TNFαの阻害剤は、キサンチン誘導体(例えばペントキシフィリン)およびブプロピオンを含むが、これらに限定されない。IL-6阻害剤の例は、トシリズマブ(toc)、サリルマブ、エルシリモマブ、CNTO328、ALD518/BMS-945429、CNTO136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301およびFM101のような抗IL-6抗体分子または抗IL-6受容体抗体分子である。ある態様において、抗IL-6受容体抗体分子は、トシリズマブである。IL-1Rベースの阻害剤の例は、アナキンラである。
ある態様において、対象に、CAR発現細胞の活性を増強する薬剤を投与できる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、プログラム死1(PD1)は、ある態様において、CAR発現細胞が免疫エフェクター応答を開始させる能力を低下できる。阻害分子の例は、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4およびTGFRベータを含む。阻害分子の、例えば、DNA、RNAまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害は、CAR発現細胞性能を最適化できる。ある態様において、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、dsRNA、例えば、siRNAまたはshRNA、群生性等間隔短回文反復配列(CRISPR)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ZFN)は、CAR発現細胞における阻害分子の発現阻害に使用できる。ある態様において、阻害剤はshRNAである。ある態様において、阻害分子はCAR発現細胞内で阻害される。これらの態様において、阻害分子の発現を阻害するdsRNA分子は、CARの要素、例えば、全ての要素をコードする核酸と連結する。ある態様において、阻害性シグナルの阻害剤は、例えば、阻害分子と結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、薬剤は、PD1、PD-L1、PD-L2またはCTLA4と結合する抗体または抗体フラグメント(例えば、イピリムマブ(MDX-010およびMDX-101とも呼ばれ、ヤーボイ(登録商標)として市販;Bristol-Myers Squibb;トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なIgG2モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、CP-675,206として知られる))である。ある態様において、薬剤は、TIM3と結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、薬剤は、LAG3と結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、薬剤は、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)と結合する抗体または抗体フラグメントである。
PD1は、CD28、CTLA-4、ICOSおよびBTLAも含む、受容体のCD28ファミリーの阻害メンバーである。PD-1は活性化B細胞、T細胞および骨髄球性細胞上に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。PD1に対する2個のリガンド、PD-L1およびPD-L2は、PD1への結合によりT細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1はヒト癌で豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、PD1とPD-L1の局所相互作用の阻害により反転させ得る。PD1、PD-L1およびPD-L2の抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤が知られ、ここに記載するCD19 CARと組み合わせて使用し得る。例えば、ニボルマブ(BMS-936558またはMDX1106とも呼ばれる;Bristol-Myers Squibb)は、PD1と特異的に遮断する完全ヒトIgG4モノクローナル抗体である。PD1と特異的に結合するニボルマブ(クローン5C4)および他のヒトモノクローナル抗体が、US8,008,449号およびWO2006/121168号に開示される。ピディリズマブ(CT-011;Cure Tech)は、PD1と結合するヒト化IgG1kモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗PD1モノクローナル抗体は、WO2009/101611号に開示される。ペンブロリズマブ(以前はランブロリズマブとして知られ、Keytruda、MK03475とも称される;Merck)は、PD1に結合するヒト化IgG4モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブおよび他のヒト化抗PD1抗体は、US8,354,509号およびWO2009/114335号に開示される。MEDI4736(Medimmune)は、PDL1に結合し、リガンドとPD1の反応を阻害するヒトモノクローナル抗体である。MDPL3280A(Genentech/Roche)は、PD-L1に結合するヒトFc最適化IgG1モノクローナル抗体である。MDPL3280AおよびPD-L1に対する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許7,943,743号および米国公開20120039906号に開示されている。他の抗PD-L1結合剤は、YW243.55.S70(WO2010/077634号における配列番号20および21に示す重鎖および軽鎖可変領域)およびMDX-1105(BMS-936559とも呼ばれ、例えば、WO2007/005874号に開示の抗PD-L1結合剤)である。AMP-224(B7-DCIg;Amplimmune;例えば、WO2010/027827号およびWO2011/066342号に開示)は、PD1とB7-H1の相互作用を遮断するPD-L2 Fc融合可溶性受容体である。他の抗PD1抗体は、AMP514(Amplimmune)、数ある中で、例えば、US8,609,089号、US2010028330号および/またはUS20120114649号に開示の抗PD1抗体を含む。
TIM-3(T細胞免疫グロブリン-3)も、特にIFN-g分泌CD4+ Tヘルパー1およびCD8+ T細胞毒性1細胞において、T細胞機能を負に制御し、T細胞疲弊に重要な役割を有する。TIM3とそのリガンド、例えば、ガレクチン-9(Gal9)、ホスファチジルセリン(PS)およびHMGB1の相互作用の阻害は免疫応答を高め得る。TIM3およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で利用可能であり、ここに記載するCD19 CARと組み合わせて使用し得る。例えば、TIM3を標的とする抗体、抗体フラグメント、小分子またはペプチド阻害剤は、そのリガンドとの相互作用を阻害するためにTIM3のIgVドメインに結合する。TIM3を阻害する抗体およびペプチドは、WO2013/006490号およびUS20100247521号に開示されている。他の抗TIM3抗体は、RMT3-23のヒト化バージョン(Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551に開示)およびクローン8B.2C12(Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541に開示)を含む。TIM3およびPD-1を阻害する二特異性抗体はUS20130156774号に開示されている。
他の態様において、CAR発現細胞の活性を増強する薬剤は、CEACAM阻害剤(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5阻害剤)である。ある態様において、CEACAMの阻害剤は、抗CEACAM抗体分子である。代表的抗CEACAM-1抗体は、WO2010/125571号、WO2013/082366号、WO2014/059251およびWO2014/022332号に開示され、例えば、モノクローナル抗体34B1、26H7および5F4;または例えば、US2004/0047858号、US7,132,255号およびWO99/052552号に開示のようなその組み換え形態である。他の態様において、抗CEACAM抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)に記載のようにCEACAM-5と結合するかまたは例えば、WO2013/054331号およびUS2014/0271618号に記載のようにCEACAM-1およびCEACAM-5と交差反応する。
理論に拘束されないが、CEACAM-1およびCEACAM-5のような癌胎児性抗原細胞接着分子(CEACAM)は、少なくとも一部、抗腫瘍免疫応答の阻害に介在すると考えられる(例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529参照)。例えば、CEACAM-1は、TIM-3のヘテロ親和性リガンドとして、そしてTIM-3介在T細胞耐容性および疲弊に役割を有するとして記載されている(例えば、WO2014/022332号;Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848三種)。ある態様において、CEACAM-1およびTIM-3の共遮断が、異種移植結腸直腸癌モデルにおいて抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている(例えば、WO2014/022332号;Huang, et al. (2014), supra参照)。他の態様において、CEACAM-1およびPD-1の共遮断は、例えば、WO2014/059251号に記載されるようにT細胞耐容性を減少させる。それゆえに、CEACAM阻害剤を、ここに記載する他の免疫調節剤(例えば、抗PD-1および/または抗TIM-3阻害剤)と使用して、癌、例えば、黒色腫、肺癌(例えば、NSCLC)、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌およびここに記載の他の癌に対する免疫応答を増強させ得る。
LAG-3(リンパ球活性化遺伝子-3またはCD223)は、CD8+ T細胞疲弊に役割を有することが示されている、活性化T細胞およびB細胞に発現される細胞表面分子である。LAG-3およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で入手可能であり、ここに記載するCD19 CARと組み合わせて使用し得る。例えば、BMS-986016(Bristol-Myers Squib)は、LAG3を標的とするモノクローナル抗体である。IMP701(Immutep)は、アンタゴニストLAG-3抗体であり、IMP731(ImmutepおよびGlaxoSmithKline)は枯渇性LAG-3抗体である。他のLAG-3阻害剤は、LAG3の可溶性部分とMHCクラスII分子のIgの組み換え融合タンパク質であり、抗原提示細胞(APC)を活性化するIMP321(Immutep)である。他の抗体は、例えば、WO2010/019570号に開示されている。
ある態様において、CAR治療およびキナーゼ阻害剤を、toll様受容体(TLR)アゴニストと組み合わせて投与する。TLRアゴニストは、TLR9アゴニストであり得る。ある態様において、TLRアゴニストは、オリゴデオキシヌクレオチド、例えば、CG富化オリゴデオキシヌクレオチド、例えば、非メチル化CG富化オリゴデオキシヌクレオチドである。例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させるSagiv-Barfi et al., “Ibrutinib enhances the antitumor immune response induced by intratumoral injection of a TLR9 ligand in syngeneic mouse lymphoma model.” Blood. 2015 Feb 6. pii: blood-2014-08-593137参照。ある態様において、TLRアゴニストを、CAR発現NK細胞と組み合わせて投与する。理論に拘束されないが、TLRアゴニストは、CAR発現NK細胞のようなNK細胞の活性化を促進し得る。ある態様において、TLRアゴニストを注射、例えば、腫瘍内注射により投与する。
ある態様において、CAR発現細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第一ドメインおよび第二ドメインを含む融合タンパク質であってよく、ここで、第一ドメインは阻害分子またはそのフラグメントであり、第二ドメインは陽性シグナルと関係するポリペプチド、例えば、ここに記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。ある態様において、陽性シグナルと結合するポリペプチドは、CD28、CD27、ICOSの共刺激ドメイン、例えば、CD28、CD27および/またはICOSの細胞内シグナル伝達ドメインおよび/または例えば、ここに記載する、例えば、CD3ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、融合タンパク質は、CARを発現するのと同じ細胞により発現される。他の態様において、融合タンパク質は、抗CD19 CARを発現しない細胞、例えば、T細胞により発現される。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞の活性を増強する薬剤はmiR-17-92である。
ある態様において、ここに記載するCARの活性を増強する薬剤はサイトカインである。サイトカインは、T細胞増殖、分化、生存および恒常性に関連する重要な機能を有する。ここに記載するCAR発現細胞を受ける対象に投与できるサイトカインは、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18およびIL-21またはこれらの組み合わせを含む。好ましい態様において、投与するサイトカインはIL-7、IL-15またはIL-21またはこれらの組み合わせである。サイトカインを、1日1回または1日1回以上、例えば、1日2回、1日3回または1日4回投与できる。サイトカインを、1日以上投与でき、例えば、サイトカインを2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間または4週間投与する。例えば、サイトカインを1日1回、7日間投与する。
ある態様において、サイトカインをCAR発現細胞と組み合わせて投与する。サイトカインを、CAR発現細胞と同時にまたは一緒に投与でき、例えば、同じ日に投与する。サイトカインをCAR発現T細胞と同じ医薬組成物に製剤しても、別の医薬組成物に製剤してもよい。あるいは、サイトカインを、CART発現細胞の投与後間もなく、例えば、CAR発現細胞投与1日、2日、3日、4日、5日、6日または7日後に投与してよい。サイトカインを1日を超える投薬レジメンで投与する態様において、サイトカイン投薬レジメンの1日目はCAR発現T細胞の投与と同じ日でよく、またはサイトカイン投薬レジメンの1日目は、CAR発現T細胞の投与1日、2日、3日、4日、5日、6日または7日後であってよい。ある態様において、1日目に、CAR発現細胞を対象に投与し、2日目に、サイトカインを1日1回、翌7日間投与する。好ましい態様において、CAR発現細胞と組み合わせて投与するサイトカインはIL-7、IL-15および/またはIL-21である。
他の態様において、サイトカインを、CAR発現細胞の投与から十分な期間後、例えば、CAR発現細胞の投与から少なくとも2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、10週間、12週間、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月または1年またはそれ以上の後に投与する。ある態様において、サイトカインを、CAR発現細胞に対する対象の応答の評価後に投与する。例えば、対象にここに記載する用量およびレジメンに従い、CAR発現細胞を投与する。CART治療に対する対象の応答を、腫瘍増殖阻止、循環腫瘍細胞減少または腫瘍退縮を含む、ここに記載する方法のいずれかを使用して、CAR発現細胞の投与2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、10週間、12週間、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月または1年またはそれ以上後に評価する。CART治療に対して十分な応答を示さない対象にサイトカインを投与し得る。CART治療に対して応答が最適以下である対象へのサイトカインの投与は、CART有効性または抗腫瘍活性を改善する。好ましい態様において、CAR発現細胞の投与後に投与するサイトカインはIL-7である。
低用量のmTOR阻害剤との組み合わせ
ある態様において、CAR分子を発現する細胞、例えば、ここに記載するCAR分子は、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤と組み合わせて投与される。
ある態様において、CAR分子を発現する細胞、例えば、ここに記載するCAR分子は、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤と組み合わせて投与される。
ある態様において、mTOR阻害剤の用量は、少なくとも5%、しかし90%を超えない、少なくとも10%、しかし90%を超えない、少なくとも15%、しかし90%を超えない、少なくとも20%、しかし90%を超えない、少なくとも30%、しかし90%を超えない、少なくとも40%、しかし90%を超えない、少なくとも50%、しかし90%を超えない、少なくとも60%、しかし90%を超えないまたは少なくとも70%、しかし90%を超えないmTOR阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、mTOR阻害剤の用量は、少なくとも5%、しかし80%を超えない、少なくとも10%、しかし80%を超えない、少なくとも15%、しかし80%を超えない、少なくとも20%、しかし80%を超えない、少なくとも30%、しかし80%を超えない、少なくとも40%、しかし80%を超えない、少なくとも50%、しかし80%を超えないまたは少なくとも60%、しかし80%を超えないmTOR阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、mTOR阻害剤の用量は、少なくとも5%、しかし70%を超えない、少なくとも10%、しかし70%を超えない、少なくとも15%、しかし70%を超えない、少なくとも20%、しかし70%を超えない、少なくとも30%、しかし70%を超えない、少なくとも40%、しかし70%を超えないまたは少なくとも50%、しかし70%を超えないmTOR阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、mTOR阻害剤の用量は、少なくとも5%、しかし60%を超えない、少なくとも10%、しかし60%を超えない、少なくとも15%、しかし60%を超えない、少なくとも20%、しかし60%を超えない、少なくとも30%、しかし60%を超えないまたは少なくとも40%、しかし60%を超えないmTOR阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、mTOR阻害剤の用量は、少なくとも5%、しかし50%を超えない、少なくとも10%、しかし50%を超えない、少なくとも15%、しかし50%を超えない、少なくとも20%、しかし50%を超えない、少なくとも30%、しかし50%を超えないまたは少なくとも40%、しかし50%を超えないmTOR阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、mTOR阻害剤の用量は、少なくとも5%、しかし40%を超えない、少なくとも10%、しかし40%を超えない、少なくとも15%、しかし40%を超えない、少なくとも20%、しかし40%を超えない、少なくとも30%、しかし40%を超えないまたは少なくとも35%、しかし40%を超えないmTOR阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、mTOR阻害剤の用量は、少なくとも5%、しかし30%を超えない、少なくとも10%、しかし30%を超えない、少なくとも15%、しかし30%を超えない、少なくとも20%、しかし30%を超えないまたは少なくとも25%、しかし30%を超えないmTOR阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、mTOR阻害剤の用量は、少なくとも1%、2%、3%、4%または5%、しかし20%を超えない、少なくとも1%、2%、3%、4%または5%、しかし30%を超えない、少なくとも1%、2%、3%、4%または5%、しかし35%を超えない、少なくとも1%、2%、3%、4%または5%、しかし40%を超えないまたは少なくとも1%、2%、3%、4%または5%、しかし45%を超えないmTOR阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、mTOR阻害剤の用量は、少なくとも1%、2%、3%、4%または5%、しかし90%を超えないmTOR阻害と関係するまたは提供するものである。
ここに記載するように、mTOR阻害の程度は、P70 S6キナーゼ阻害の程度として表すことができ、例えば、mTOR阻害の程度を、例えば、P70 S6キナーゼ基質のリン酸化の減少による、P70 S6キナーゼ活性のレベルの減少により決定できる。mTOR阻害レベルは、ここに記載する方法により、例えばBoulayアッセイまたはウェスタンブロットによるリン酸化S6レベルの測定により評価できる。
代表的MTOR阻害剤
ここで使用する用語“mTOR阻害剤”は、細胞におけるmTORキナーゼを阻害する化合物またはリガンドまたはその薬学的に許容される塩をいう。ある態様において、mTOR阻害剤はアロステリック阻害剤である。ある態様において、mTOR阻害剤は触媒的阻害剤である。
ここで使用する用語“mTOR阻害剤”は、細胞におけるmTORキナーゼを阻害する化合物またはリガンドまたはその薬学的に許容される塩をいう。ある態様において、mTOR阻害剤はアロステリック阻害剤である。ある態様において、mTOR阻害剤は触媒的阻害剤である。
アロステリックmTOR阻害剤は、中性三環式化合物ラパマイシン(シロリムス)、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体(ラパログとも呼ぶ)およびmTOR活性を阻害する他のマクロライド化合物を含む、ラパマイシンに構造的および機能的類似性を有する化合物であるラパマイシン関連化合物を含む。
例えば、McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433;米国特許3,929,992号参照。ラパマイシンについて多様な番号付けスキームが提唱されている。混乱を避けるために、特定のラパマイシン類似体をここで名づけるとき、式Aの番号付けスキームを使用したラパマイシンを参照して名付ける。
本発明において有用なラパマイシン類似体は、例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル環におけるヒドロキシル基がOR1(ここで、R1はヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルである)で置換されているO置換類似体であり、例えばその内容を引用して本明細書に包含させるUS5,665,772号およびWO94/09010号に記載された、エベロリムスとしても知られるRAD001である。他の適当なラパマイシン類似体は、26位または28位が置換されているものを含む。ラパマイシン類似体は、上記類似体のエピマーであってよく、特に、例えば、その内容を引用して本明細書に包含させるUS6,015,815号、WO95/14023号およびWO99/15530号に記載のとおり、40位、28位または26位が置換され、所望によりさらに水素化されていてよい類似体のエピマー、例えばゾタロリムスとして知られるABT578またはその内容を引用して本明細書に包含させるUS7,091,213号、WO98/02441号およびWO01/14387号に記載のラパマイシン類似体、例えばリダフォロリムスとしても知られるAP23573を含む。
US5,665,772号の本発明における使用に適当なラパマイシン類似体の例は、40-O-ベンジル-ラパマイシン、40-O-(4’-ヒドロキシメチル)ベンジル-ラパマイシン、40-O-[4’-(1,2-ジヒドロキシエチル)]ベンジル-ラパマイシン、40-O-アリル-ラパマイシン、40-O-[3’-(2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4(S)-イル)-プロプ-2’-エン-1’-イル]-ラパマイシン、(2’E,4’S)-40-O-(4’,5’-ジヒドロキシペント-2’-エン-1’-イル)-ラパマイシン、40-O-(2-ヒドロキシ)エトキシカルボニルメチル-ラパマイシン、40-O-(2-ヒドロキシ)エチル-ラパマイシン、40-O-(3-ヒドロキシ)プロピル-ラパマイシン、40-O-(6-ヒドロキシ)ヘキシル-ラパマイシン、40-O-[2-(2-ヒドロキシ)エトキシ]エチル-ラパマイシン、40-O-[(3S)-2,2-ジメチルジオキソラン-3-イル]メチル-ラパマイシン、40-O-[(2S)-2,3-ジヒドロキシプロプ-1-イル]-ラパマイシン、40-O-(2-アセトキシ)エチル-ラパマイシン、40-O-(2-ニコチノイルオキシ)エチル-ラパマイシン、40-O-[2-(N-モルホリノ)アセトキシ]エチル-ラパマイシン、40-O-(2-N-イミダゾリルアセトキシ)エチル-ラパマイシン、40-O-[2-(N-メチル-N’-ピペラジニル)アセトキシ]エチル-ラパマイシン、39-O-デスメチル-39,40-O,O-エチレン-ラパマイシン、(26R)-26-ジヒドロ-40-O-(2-ヒドロキシ)エチル-ラパマイシン、40-O-(2-アミノエチル)-ラパマイシン、40-O-(2-アセトアミノエチル)-ラパマイシン、40-O-(2-ニコチンアミドエチル)-ラパマイシン、40-O-(2-(N-メチル-イミダゾ-2’-イルカルベトキサミド)エチル)-ラパマイシン、40-O-(2-エトキシカルボニルアミノエチル)-ラパマイシン、40-O-(2-トリルスルホンアミドエチル)-ラパマイシンおよび40-O-[2-(4’,5’-ジカルボエトキシ-1’,2’,3’-トリアゾール-1’-イル)-エチル]-ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、ラパマイシンのシクロヘキシル環におけるヒドロキシル基および/または28位のヒドロキシ基がヒドロキシエステル基で置換されている類似体を含み、例えば、USRE44,768号に記載されているラパマイシン類似体、例えばテムシロリムスが知られる。
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、16位のメトキシ基が他の置換基、好ましくは(所望によりヒドロキシ置換)アルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジルまたはクロロベンジルで置換されているおよび/または39位のメトキシ基が、39番炭素と共に欠失しており、ラパマイシンのシクロヘキシル環が39位のメトキシ基を欠くシクロペンチル環となるものを含み、例えば、引用によりその内容を本明細書に包含させるWO95/16691号およびWO96/41807号に記載されている。ラパマイシンの40位のヒドロキシがアルキル化されるおよび/または32-カルボニルが還元されるように、類似体をさらに修飾できる。
WO95/16691号からのラパマイシン類似体は、16-デメトキシ-16-(ペント-2-イニル)オキシ-ラパマイシン、16-デメトキシ-16-(ブト-2-イニル)オキシ-ラパマイシン、16-デメトキシ-16-(プロパルギル)オキシ-ラパマイシン、16-デメトキシ-16-(4-ヒドロキシ-ブト-2-イニル)オキシ-ラパマイシン、16-デメトキシ-16-ベンジルオキシ-40-O-(2-ヒドロキシエチル)-ラパマイシン、16-デメトキシ-16-ベンジルオキシ-ラパマイシン、16-デメトキシ-16-オルト-メトキシベンジル-ラパマイシン、16-デメトキシ-40-O-(2-メトキシエチル)-16-ペント-2-イニル)オキシ-ラパマイシン、39-デメトキシ-40-デスオキシ-39-ホルミル-42-ノル-ラパマイシン、39-デメトキシ-40-デスオキシ-39-ヒドロキシメチル-42-ノル-ラパマイシン、39-デメトキシ-40-デスオキシ-39-カルボキシ-42-ノル-ラパマイシン、39-デメトキシ-40-デスオキシ-39-(4-メチル-ピペラジン-1-イル)カルボニル-42-ノル-ラパマイシン、39-デメトキシ-40-デスオキシ-39-(モルホリン-4-イル)カルボニル-42-ノル-ラパマイシン、39-デメトキシ-40-デスオキシ-39-[N-メチル、N-(2-ピリジン-2-イル-エチル)]カルバモイル-42-ノル-ラパマイシンおよび39-デメトキシ-40-デスオキシ-39-(p-トルエンスルホニルヒドラゾノメチル)-42-ノル-ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
WO96/41807号からのラパマイシン類似体は、32-デオキソ-ラパマイシン、16-O-ペント-2-イニル-32-デオキソ-ラパマイシン、16-O-ペント-2-イニル-32-デオキソ-40-O-(2-ヒドロキシ-エチル)-ラパマイシン、16-O-ペント-2-イニル-32-(S)-ジヒドロ-40-O-(2-ヒドロキシエチル)-ラパマイシン、32(S)-ジヒドロ-40-O-(2-メトキシ)エチル-ラパマイシンおよび32(S)-ジヒドロ-40-O-(2-ヒドロキシエチル)-ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
他の適当なラパマイシン類似体は、引用によりその内容を本明細書に包含させる、US2005/0101624号に記載されたウミロリムスである。
エベロリムス(アフィニトール(登録商標))としても知られるRAD001は化学名(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-ジヒドロキシ-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-ヒドロキシエトキシ)-3-メトキシシクロヘキシル]-1-メチルエチル}-19,30-ジメトキシ-15,17,21,23,29,35-ヘキサメチル-11,36-ジオキサ-4-アザ-トリシクロ[30.3.1.04,9]ヘキサトリアコンタ-16,24,26,28-テトラエン-2,3,10,14,20-ペタオンを有する。
アロステリックmTOR阻害剤のさらなる例は、シロリムス(ラパマイシン、AY-22989)、40-[3-ヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)-2-メチルプロパノエート]-ラパマイシン(テムシロリムスまたはCCI-779とも呼ばれる)およびリダフォロリムス(AP-23573/MK-8669)を含む。アロステリックmTORの他の例は、ゾタロリムス(ABT578)およびウミロリムスを含む。
これとは別にまたはこれに加えて、触媒的、ATP競合的mTOR阻害剤が、mTORキナーゼドメインを直接標的とし、mTORC1およびmTORC2の両者を標的とすることが知られている。これらはまた、4EBP1-T37/46リン酸化およびキャップ依存性翻訳のようなラパマイシン耐性mTORC1アウトプットを調節するため、ラパマイシンのようなアロステリックmTOR阻害剤よりも有効なmTORC1阻害剤でもある。
触媒的阻害剤は、BEZ235または2-メチル-2-[4-(3-メチル-2-オキソ-8-キノリン-3-イル-2,3-ジヒドロ-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)-フェニル]-プロピオニトリルまたはモノトシル酸塩形態;BEZ235の合成はWO2006/122806号に記載される;化学名{5-[2,4-ビス-((S)-3-メチル-モルホリン-4-イル)-ピリド[2,3d]ピリミジン-7-イル]-2-メトキシ-フェニル}-メタノールを有するCCG168(AZD-8055としても知られ、Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298);3-[2,4-ビス[(3S)-3-メチルモルホリン-4-イル]ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル]-N-メチルベンズアミド(WO09104019号);3-(2-アミノベンゾ[d]オキサゾール-5-イル)-1-イソプロピル-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(WO10051043およびWO2013023184);N-(3-(N-(3-((3,5-ジメトキシフェニル)アミノ)キノキサリン-2-イル)スルファモイル)フェニル)-3-メトキシ-4-メチルベンズアミド(WO07044729号およびWO12006552号);化学名1-[4-[4-(ジメチルアミノ)ピペリジン-1-カルボニル]フェニル]-3-[4-(4,6-ジモルホリノ-1,3,5-トリアジン-2-イル)フェニル]尿素を有するPKI-587(Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645);化学名2,4-ジフルオロ-N-{2-メトキシ-5-[4-(4-ピリダジニル)-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドを有するGSK-2126458(ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43);5-(9-イソプロピル-8-メチル-2-モルホリノ-9H-プリン-6-イル)ピリミジン-2-アミン(WO10114484号);(E)-N-(8-(6-アミノ-5-(トリフルオロメチル)ピリジン-3-イル)-1-(6-(2-シアノプロパン-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-メチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-2(3H)-イリデン)シアナミド(WO12007926号)を含む。
触媒的mTOR阻害剤のさらなる例は、8-(6-メトキシ-ピリジン-3-イル)-3-メチル-1-(4-ピペラジン-1-イル-3-トリフルオロメチル-フェニル)-1,3-ジヒドロ-イミダゾ[4,5-c]キノリン-2-オン(WO2006/122806号)およびKu-0063794(Garcia-Martinez JM, et al., Biochem J., 2009, 421(1), 29-42)を含む。Ku-0063794は、ラパマイシンの哺乳動物標的(mTOR)の特異的阻害剤である。WYE-354は、触媒的mTOR阻害剤の他の例である(Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240)。
本発明に有用なmTOR阻害剤はまた前記のいずれかのプロドラッグ、誘導体、薬学的に許容される塩または類似体を含む。
RAD001のようなmTOR阻害剤は、ここに記載する特定の投与量に基づき、当分野で十分確立された方法を利用して送達用に製剤し得る。特に、US特許6,004,973号(引用により本明細書に包含させる)は、ここに記載のmTOR阻害剤に有用な製剤の例を提供する。
mTOR阻害の評価
mTORはキナーゼP70 S6をリン酸化し、それによりP70 S6キナーゼを活性化し、その基質をリン酸化させる。mTOR阻害の程度は、P70 S6キナーゼ阻害の程度により表すことができ、例えば、mTOR阻害の程度は、例えば、P70 S6キナーゼ基質のリン酸化の減少による、P70 S6キナーゼ活性レベルの減少により決定できる。阻害剤の非存在下、例えば、阻害剤投与前と、阻害剤存在下または阻害剤投与後のP70 S6キナーゼ活性(P70 S6キナーゼが基質をリン酸化する能力)を測定することにより、mTOR阻害のレベルを決定できる。P70 S6キナーゼ阻害レベルは、mTOR阻害のレベルを示す。それゆえに、P70 S6キナーゼが40%阻害されたら、P70 S6キナーゼ活性で測定して、mTOR活性は40%阻害される。ここでいう阻害の程度またはレベルは、投与間隔の間の平均阻害レベルである。例えば、阻害剤を週に1回与えるとき、阻害レベルは、その間隔の間の、すなわち1週間の平均阻害レベルを示す。
mTORはキナーゼP70 S6をリン酸化し、それによりP70 S6キナーゼを活性化し、その基質をリン酸化させる。mTOR阻害の程度は、P70 S6キナーゼ阻害の程度により表すことができ、例えば、mTOR阻害の程度は、例えば、P70 S6キナーゼ基質のリン酸化の減少による、P70 S6キナーゼ活性レベルの減少により決定できる。阻害剤の非存在下、例えば、阻害剤投与前と、阻害剤存在下または阻害剤投与後のP70 S6キナーゼ活性(P70 S6キナーゼが基質をリン酸化する能力)を測定することにより、mTOR阻害のレベルを決定できる。P70 S6キナーゼ阻害レベルは、mTOR阻害のレベルを示す。それゆえに、P70 S6キナーゼが40%阻害されたら、P70 S6キナーゼ活性で測定して、mTOR活性は40%阻害される。ここでいう阻害の程度またはレベルは、投与間隔の間の平均阻害レベルである。例えば、阻害剤を週に1回与えるとき、阻害レベルは、その間隔の間の、すなわち1週間の平均阻害レベルを示す。
引用により本明細書に包含させるBoulay et al., Cancer Res, 2004, 64:252-61は、mTOR阻害のレベルの評価に使用できるアッセイを教示する(ここではBoulayアッセイと称す)。ある態様において、アッセイは、mTOR阻害剤、例えば、RAD001の投与前後の生物学的サンプルからのP70 S6キナーゼ活性の測定に頼る。サンプルを、mTOR阻害剤での処置後、予め選択した時間、例えば、処置の24時間、48時間および72時間後に採り得る。例えば、皮膚または末梢血単核細胞(PBMC)からの生物学的サンプルを使用できる。総タンパク質抽出物をサンプルから調製する。P70 S6キナーゼを特異的に認識する抗体を使用した免疫沈降により、タンパク質抽出物からP70 S6キナーゼを単離する。単離したP70 S6キナーゼの活性を、インビトロキナーゼアッセイで測定する。単離したキナーゼを40Sリボソームサブユニット基質(P70 S6キナーゼの内在性基質である)およびガンマ-32Pと、該基質のリン酸化を可能とする条件下でインキュベートできる。次いで、反応混合物をSDS-PAGEゲルで分割し、32PシグナルをPhosphorImagerを使用して解析する。40Sリボソームサブユニットのサイズに対応する32Pシグナルが、リン酸化された基質およびP70 S6キナーゼの活性を示す。キナーゼ活性の増加または減少を、リン酸化基質の32Pシグナルの面積および強度を定量し(例えば、ImageQuant, Molecular Dynamicsを使用)、任意単位値を定量化シグナルに割り当て、投与後の値と投与前の値または対照値を比較することにより、計算できる。例えば、キナーゼ活性阻害パーセントを次の式で計算できる:1-(投与後に得た値/投与前に得た値)×100。上記のとおり、阻害の程度またはレベルは、ここでは、投与の合間の阻害の平均レベルをいう。
キナーゼ活性、例えば、P70 S6キナーゼ活性を評価する方法もまた、引用により本明細書に包含させるUS7,727,950号に提供されている。
mTOR阻害のレベルはまた、PD1陰性細胞対PD1陽性T細胞の比の変化によっても評価できる。末梢血からのT細胞を、当分野で知られる方法によりPD1陰性または陽性と同定できる。
低用量mTOR阻害剤
ここに記載する方法は、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤、例えば、RAD001のようなラパログを含むアロステリックmTOR阻害剤の複数用量を使用する。対照的に、mTOR経路を完全にまたはほぼ完全に阻害するレベルの阻害剤は免疫抑制性であり、例えば、臓器移植片拒絶の予防に使用される。さらに、mTORを完全に阻害する高用量のラパログも腫瘍細胞増殖を阻止し、多様な癌の処置に使用されている(例えば、Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvadori M. World J Transplant. 2012 Oct 24;2(5):74-83; Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition. Finn RS. Liver Cancer. 2012 Nov;1(3-4):247-256; Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornella H, Villanueva A. Liver Cancer. 2012 Sep;1(2):83-93; Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013 Sep 20.; Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2013 Oct 2参照)。
ここに記載する方法は、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤、例えば、RAD001のようなラパログを含むアロステリックmTOR阻害剤の複数用量を使用する。対照的に、mTOR経路を完全にまたはほぼ完全に阻害するレベルの阻害剤は免疫抑制性であり、例えば、臓器移植片拒絶の予防に使用される。さらに、mTORを完全に阻害する高用量のラパログも腫瘍細胞増殖を阻止し、多様な癌の処置に使用されている(例えば、Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvadori M. World J Transplant. 2012 Oct 24;2(5):74-83; Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition. Finn RS. Liver Cancer. 2012 Nov;1(3-4):247-256; Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornella H, Villanueva A. Liver Cancer. 2012 Sep;1(2):83-93; Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013 Sep 20.; Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2013 Oct 2参照)。
本発明は、少なくとも一部、現在臨床の現場で使用されるよりはるかに低用量のmTOR阻害剤が、対象における免疫応答の増加に優れた効果を有し、PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞比を増加させるという驚くべき発見に基づく。mTOR活性を一部しか阻害しない低用量のmTOR阻害剤が、ヒト対象における免疫応答を効率的に改善し、PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞比を増加できることは、驚きであった。
これとは別にまたはこれに加えて、何らかの理論に拘束されないが、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤は、例えば、非処置対象と比較して、ナイーブT細胞数を、例えば、少なくとも一過性に増加できると考えられる。これとは別にまたはこれに加えて、再び理論に拘束されないが、十分な時間または十分な投薬後のmTOR阻害剤での処置は、次の一個以上をもたらすと考えられる:
例えば、記憶T細胞、例えば、記憶T細胞前駆体における、次のマーカーCD62L高、CD127高、CD27+およびBCL2の1個以上の発現の増加;
例えば、記憶T細胞、例えば、記憶T細胞前駆体における、KLRG1の発現の減少;および
記憶T細胞前駆体、例えば、次のCD62L高増加、CD127高増加、CD27+増加、KLRG1減少およびBCL2増加の特性の任意の1個または組み合わせを有する細胞の数の増加;
そして、ここで、上記のいずれかの変化は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる(Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)。記憶T細胞前駆体は、分化プログラムにおける初期にある記憶T細胞である。例えば、記憶T細胞は、次の1個以上の特性を有する:CD62L高増加、CD127高増加、CD27+増加、KLRG1減少および/またはBCL2増加。
例えば、記憶T細胞、例えば、記憶T細胞前駆体における、次のマーカーCD62L高、CD127高、CD27+およびBCL2の1個以上の発現の増加;
例えば、記憶T細胞、例えば、記憶T細胞前駆体における、KLRG1の発現の減少;および
記憶T細胞前駆体、例えば、次のCD62L高増加、CD127高増加、CD27+増加、KLRG1減少およびBCL2増加の特性の任意の1個または組み合わせを有する細胞の数の増加;
そして、ここで、上記のいずれかの変化は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる(Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)。記憶T細胞前駆体は、分化プログラムにおける初期にある記憶T細胞である。例えば、記憶T細胞は、次の1個以上の特性を有する:CD62L高増加、CD127高増加、CD27+増加、KLRG1減少および/またはBCL2増加。
ある態様において、本発明は、選択した投与レジメン、例えば、1日1回または週に1回で投与したとき、完全なまたは顕著な免疫抑制には結びつかないが、免疫応答の増強に結びつくmTOR阻害のレベルと関係する、mTOR阻害剤、例えば、アロステリックmTOR阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはRAD001または触媒的mTOR阻害剤の組成物または投薬形態に関する。
mTOR阻害剤、例えば、アロステリックmTOR阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはRAD001または触媒的mTOR阻害剤は、徐放製剤で投与できる。ここに記載する組成物または単位投与形態のいずれも徐放製剤で提供できる。ある態様において、徐放製剤は、即時放出製剤より低いバイオアベイラビリティを有する。例えば、いくつかの態様において、即時放出製剤に類する治療効果を達成するために、徐放製剤は、即時放出製剤に提供される約2~約5倍、約2.5~約3.5倍または約3倍量の阻害剤を有する。
ある態様において、単位投薬形態あたり0.1~20mg、0.5~10mg、2.5~7.5mg、3~6mgまたは約5mgを有する、一般に週1回投与に使用される、例えば、RAD001の、即時放出形態が提供される。週1回投与のために、これらの即時放出製剤は、それぞれ、0.3~60mg、1.5~30mg、7.5~22.5mg、9~18mgまたは約15mgのmTOR阻害剤、例えば、アロステリックmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001を有する徐放形態に対応する。ある態様において、両方の形態を週1回投与する。
ある態様において、一般に1日1回投与に使用するための、単位剤形あたり0.005~1.5mg、0.01~1.5mg、0.1~1.5mg、0.2~1.5mg、0.3~1.5mg、0.4~1.5mg、0.5~1.5mg、0.6~1.5mg、0.7~1.5mg、0.8~1.5mg、1.0~1.5mg、0.3~0.6mgまたは約0.5mgを有する、例えば、RAD001の、即時放出形態が提供される。1日1回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、0.015~4.5mg、0.03~4.5mg、0.3~4.5mg、0.6~4.5mg、0.9~4.5mg、1.2~4.5mg、1.5~4.5mg、1.8~4.5mg、2.1~4.5mg、2.4~4.5mg、3.0~4.5mg、0.9~1.8mgまたは約1.5mgのmTOR阻害剤、例えば、アロステリックmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001を含む徐放性形態に対応する。1週間に1回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、0.1~30mg、0.2~30mg、2~30mg、4~30mg、6~30mg、8~30mg、10~30mg、1.2~30mg、14~30mg、16~30mg、20~30mg、6~12mgまたは約10mgのmTOR阻害剤、例えば、アロステリックmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001を含む徐放性形態に対応する。
ある態様において、一般に1日1回投与に使用するための、単位剤形あたり0.01~1.0mgを有する、例えば、RAD001の即時放出形態が提供される。1日1回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、0.03~3mgのmTOR阻害剤、例えば、アロステリックmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001を含む徐放性形態に対応する。1週間に1回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、0.2~20mgのmTOR阻害剤、例えば、アロステリックmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001を含む徐放性形態に対応する。
ある態様において、一般に1週間に1回投与に使用するための、単位剤形あたり0.5~5.0mgを有する、例えば、RAD001の即時放出形態が提供される。1週間に1回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、1.5~15mgのmTOR阻害剤、例えば、アロステリックmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001を含む徐放性形態に対応する。
上記のように、mTOR経路の一つの標的はP70 S6キナーゼである。それゆえに、ここに記載する方法および組成物において有用なmTOR阻害剤の用量は、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Boulayアッセイにより測定して、mTOR阻害剤非存在下のP70 S6キナーゼの活性に対して、P70 S6キナーゼ活性の80%未満の阻害を達成するのに十分なものである。さらなる面において、本発明は、mTOR阻害剤非存在下のP70 S6キナーゼ活性に対して、P70 S6キナーゼ活性の38%未満の阻害を達成するのに十分なmTOR阻害剤の量を提供する。
ある面において、本発明の方法および組成物において有用なmTOR阻害剤の用量は、例えば、ヒト対象に投与したとき、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Boulayアッセイにより測定して、P70 S6キナーゼ活性の90±5%(すなわち、85~95%)、89±5%、88±5%、87±5%、86±5%、85±5%、84±5%、83±5%、82±5%、81±5%、80±5%、79±5%、78±5%、77±5%、76±5%、75±5%、74±5%、73±5%、72±5%、71±5%、70±5%、69±5%、68±5%、67±5%、66±5%、65±5%、64±5%、63±5%、62±5%、61±5%、60±5%、59±5%、58±5%、57±5%、56±5%、55±5%、54±5%、54±5%、53±5%、52±5%、51±5%、50±5%、49±5%、48±5%、47±5%、46±5%、45±5%、44±5%、43±5%、42±5%、41±5%、40±5%、39±5%、38±5%、37±5%、36±5%、35±5%、34±5%、33±5%、32±5%、31±5%、30±5%、29±5%、28±5%、27±5%、26±5%、25±5%、24±5%、23±5%、22±5%、21±5%、20±5%、19±5%、18±5%、17±5%、16±5%、15±5%、14±5%、13±5%、12±5%、11±5%または10±5%阻害を達成するのに十分である。
対象におけるP70 S6キナーゼ活性は、例えば、米国特許7,727,950号に記載する方法による、ホスホP70 S6Kレベルおよび/またはホスホP70 S6レベルの免疫ブロット解析またはインビトロキナーゼ活性アッセイのような、当分野で知られる方法を使用して測定し得る。
mTOR阻害剤の用量と関連してここで使用する用語“約”は、mTOR阻害剤の用量の最大±10%ばらつきをいうが、記載した用量の周辺のばらつきを含まなくてよい。
ある態様において、本発明は、対象に、目標トラフレベル内の投与量で、mTOR阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、RAD001を投与することを含む、方法を提供する。ある態様において、トラフレベルは、臓器移植および癌患者で使用される投与レジメンに関係するトラフレベルより顕著に低い。ある態様において、mTOR阻害剤、例えば、RAD001またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌効果を生じるトラフレベルの1/2、1/4、1/10または1/20未満であるトラフレベルを生じるように投与する。ある態様において、mTOR阻害剤、例えば、RAD001またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌適応症における使用についてFDAが承認した添付文書に従い提供されるトラフレベルの1/2、1/4、1/10または1/20未満であるトラフレベルを生じるように投与する。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象に、mTOR阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、RAD001を、0.1~10ng/ml、0.1~0.5ng/ml、0.1~3ng/ml、0.1~2ng/mlまたは0.1~1ng/mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にmTOR阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、RAD001を、0.2~10ng/ml、0.2~5ng/ml、0.2~3ng/ml、0.2~2ng/mlまたは0.2~1ng/mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にmTOR阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、RAD001を、0.3~10ng/ml、0.3~5ng/ml、0.3~3ng/ml、0.3~2ng/mlまたは0.3~1ng/mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にmTOR阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、RAD001を、0.4~10ng/ml、0.4~5ng/ml、0.4~3ng/ml、0.4~2ng/mlまたは0.4~1ng/mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にmTOR阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、RAD001を、0.5~10ng/ml、0.5~5ng/ml、0.5~3ng/ml、0.5~2ng/mlまたは0.5~1ng/mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にmTOR阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、RAD001を、1~10ng/ml、1~5ng/ml、1~3ng/mlまたは1~2ng/mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
ここで使用する用語“トラフレベル”は、次の投与直前の血漿中の薬物濃度または2回の投与の間の最少薬物濃度をいう。
ある態様において、目標トラフレベルのRAD001は約0.1~4.9ng/mlの範囲である。ある態様において、目標トラフレベルは3ng/ml以下、例えば、0.3ng/ml以下~3ng/mlである。ある態様において、目標トラフレベルは3ng/ml以下、例えば、0.3ng/ml以下~1ng/mlである。
さらなる面において、本発明は、RAD001の特定した目標トラフレベルと生物学的同等である目標トラフレベルと関係する量で、RAD001以外のmTOR阻害剤を使用できる。ある態様において、RAD001以外のmTOR阻害剤の目標トラフレベルは、ここに記載するRAD001のトラフレベルと同じレベルのmTOR阻害(例えば、ここに記載する方法で測定して、例えば、P70 S6の阻害)を示すレベルである。
医薬組成物:mTOR阻害剤
ある面において、本発明は、ここに記載するCAR細胞と組み合わせて使用するために製剤された、mTOR阻害剤、例えば、ここに記載するmTOR阻害剤を含む医薬組成物に関する。
ある面において、本発明は、ここに記載するCAR細胞と組み合わせて使用するために製剤された、mTOR阻害剤、例えば、ここに記載するmTOR阻害剤を含む医薬組成物に関する。
ある態様において、mTOR阻害剤は、例えば、ここに記載する、さらなる薬剤と組み合わせて投与するために製剤される。
一般に、本発明の化合物は、単独でまたは1種以上の治療剤と組み合わせて、当分野で知られる通常のかつ許容される方法のいずれかにより、上記の治療有効量で投与される。
医薬製剤は、慣用の溶解および混合法を使用して製造できる。例えば、原体物質(例えば、mTOR阻害剤または該化合物の安定化形態(例えば、シクロデキストリン誘導体または他の既知複合化薬物との複合体))を、ここに記載する添加物の1種以上の存在下、適当な溶媒に溶解させる。mTOR阻害剤は、一般に薬物の投与量を容易に制御可能とし、患者に洗練され、取り扱いが容易な製品を与えるような、医薬投与形態に製剤される。
本発明の化合物は、医薬組成物として、任意の慣用の経路で、特に経腸的に、例えば、錠剤またはカプセル剤の形で、例えば、経口でまたは、例えば、注射溶液剤または懸濁液剤の形で、非経腸的に、例えば、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤またはクリーム剤の形で、局所的にまたは経鼻または坐薬形態で投与できる。ここに記載するようにmTOR阻害剤を他の薬剤と組み合わせて(同時にまたは別々に)投与するとき、ある面において、両方の成分を同じ経路で(例えば、非経腸的に)投与する。あるいは、他の薬剤を、mTOR阻害剤と異なる経路で投与し得る。例えば、mTOR阻害剤を経口で投与してよく、他の薬剤を非経腸的に投与してよい。
徐放
ここに開示するmTOR阻害剤、例えば、アロステリックmTOR阻害剤または触媒的mTOR阻害剤は、製品安定性要求を満たすおよび/または平均血漿ピーク濃度減少、薬物吸収の程度および血漿ピーク濃度の患者間および患者内ばらつき減少、Cmax/Cmin比減少および/または食効減少のような即時放出(IR)錠剤より都合よい薬物動態特性を有する、ここに開示するmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001を含む経口固体投与形態の形の医薬製剤として提供できる。提供された医薬製剤は、より厳密な用量調節を可能にするおよび/または有害事象の頻度を減少させ、ここに開示するmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001での患者のより安全な処置を提供することができる。
ここに開示するmTOR阻害剤、例えば、アロステリックmTOR阻害剤または触媒的mTOR阻害剤は、製品安定性要求を満たすおよび/または平均血漿ピーク濃度減少、薬物吸収の程度および血漿ピーク濃度の患者間および患者内ばらつき減少、Cmax/Cmin比減少および/または食効減少のような即時放出(IR)錠剤より都合よい薬物動態特性を有する、ここに開示するmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001を含む経口固体投与形態の形の医薬製剤として提供できる。提供された医薬製剤は、より厳密な用量調節を可能にするおよび/または有害事象の頻度を減少させ、ここに開示するmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001での患者のより安全な処置を提供することができる。
ある態様において、本発明は、多粒子系であり、機能的層およびコーティングを有し得る、ここに開示するmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001の安定な持続放出製剤を提供する。
ここで使用する用語“持続放出、多粒子製剤”は、長時間にわたり、例えば少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間または6時間にわたり、ここに開示するmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001の放出を可能とする製剤である。持続放出製剤は、活性成分を摂取後長時間にわたり利用可能とするような方法で製剤された、例えば、ここに記載する、特別の添加物からなるマトリクスおよびコーティングを含み得る。
用語“持続放出”は用語“徐放”(SR)または“延長放出”と交換可能に使用する。用語“持続放出”は、錠剤およびカプセル剤についての欧州薬局方(第7版)モノグラフおよびUSPの医薬投与形態についての一般的な章<1151>の定義に従う、活性薬物物質を、経口投与直後ではなく、長時間にわたり放出する医薬製剤をいう。ここで使用する用語“即時放出”(IR)は、Guidance for Industry: “Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms” (FDA CDER, 1997)の定義に従い、60分以内に活性薬物物質の85%を放出する医薬製剤である。ある態様において、用語“即時放出”は、例えば、ここに記載する溶解アッセイで測定して、エベロリムスの錠剤からの30分以内の放出を意味する。
ここに開示するmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001の安定な持続放出製剤は、ここに記載する溶解アッセイのような当分野で知られるアッセイを使用してインビトロ放出プロファイルにより特徴づけできる。37℃でドデシル硫酸ナトリウム0.2%を含む900mLリン酸緩衝液pH6.8で魅した溶解容器で、それぞれUSP試験モノグラフ711および欧州薬局方試験モノグラフ2.9.3.に従い、USPに従い、パドル法で、75rpmで溶解を行う。
ある態様において、ここに開示するmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001の安定な持続放出製剤は、インビトロ放出アッセイで、次の放出仕様に従いmTOR阻害剤を放出する。
0.5時間:<45%または<40、例えば、<30%
1時間:20~80%、例えば、30~60%
2時間:>50%または>70%、例えば、>75%
3時間:>60%または>65%、例えば、>85%、例えば、>90%。
0.5時間:<45%または<40、例えば、<30%
1時間:20~80%、例えば、30~60%
2時間:>50%または>70%、例えば、>75%
3時間:>60%または>65%、例えば、>85%、例えば、>90%。
ある態様において、ここに開示するmTOR阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはRAD001の安定な持続放出製剤は、インビトロ溶解アッセイで、45分、60分、75分、90分、105分または120分より速くmTOR阻害剤の50%を放出しない。
バイオポリマー送達法
ある態様において、ここに開示する1以上のCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントにより対象に投与または送達し得る。バイオポリマー足場は、ここに記載するCAR発現細胞の送達、増殖および/または分散を支持または増強できる。バイオポリマー足場は、天然に存在するまたは合成であり得る生体適合性(例えば、実質的に炎症性または免疫応答を誘発しない)および/または生分解性ポリマーを含む。
ある態様において、ここに開示する1以上のCAR発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなBTK阻害剤と組み合わせて、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントにより対象に投与または送達し得る。バイオポリマー足場は、ここに記載するCAR発現細胞の送達、増殖および/または分散を支持または増強できる。バイオポリマー足場は、天然に存在するまたは合成であり得る生体適合性(例えば、実質的に炎症性または免疫応答を誘発しない)および/または生分解性ポリマーを含む。
適当なバイオポリマーの例は、寒天、アガロース、アルギン酸、アルギン酸/リン酸カルシウムセメント(CPC)、ベータ-ガラクトシダーゼ(β-GAL)、(1,2,3,4,6-ペンタアセチルa-D-ガラクトース)、セルロース、キチン、キトサン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ヒアルロン酸コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ポリ(3-ヒドロキシブチレート-コ-3-ヒドロキシ-ヘキサノエート)(PHBHHx)、ポリ(ラクチド)、ポリ(カプロラクトン)(PCL)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLG)、ポリエチレンオキシド(PEO)、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)、ポリプロピレンオキシド(PPO)、ポリビニルアルコール)(PVA)、絹、大豆タンパク質および大豆タンパク質単離体の、単独でまたは任意の他のポリマー組成物との、あらゆる濃度およびあらゆる比での混合物を含むが、これらに限定されない。バイオポリマーは、接着または遊走促進分子、例えば、リンパ球のコラーゲン受容体に結合するコラーゲン模倣ペプチドおよび/または送達する細胞の送達、増殖または機能、例えば、抗癌活性を増強する刺激分子で増強または修飾され得る。バイオポリマースキャフォルドは、注射可能な、例えば、ゲルまたは半固体または固体組成物であり得る。
ある態様において、ここに記載するCAR発現細胞を、対象への送達前にバイオポリマー足場上に播種する。ある態様において、バイオポリマー足場は、例えば、足場のバイオポリマーに取り込まれたまたはコンジュゲートされた、さらにここに記載する1種以上のさらなる治療剤(例えば、他のCAR発現細胞、抗体または小分子)またはCAR発現細胞の活性を増強する薬剤を含む。ある態様において、バイオポリマー足場を、例えば、腫瘍内に注射するかまたは腫瘍にまたは抗腫瘍効果に介在するのに十分に腫瘍に近位に外科的にインプラントする。バイオポリマー組成物およびその送達のための方法さらなる例は、Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101;およびWO2014/110591号に記載される。
医薬組成物および処置
本発明の医薬組成物は、ここに記載のように、CAR発現細胞、例えば、複数のCAR発現細胞を、1個以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのような緩衝液;グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物;タンパク質;グリシンのようなポリペプチドまたはアミノ酸;抗酸化剤;EDTAまたはグルタチオンのようなキレート剤;アジュバント(例えば、アルミニウムヒドロキシド);および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、一つの面において静脈内投与用に製剤される。
本発明の医薬組成物は、ここに記載のように、CAR発現細胞、例えば、複数のCAR発現細胞を、1個以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのような緩衝液;グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物;タンパク質;グリシンのようなポリペプチドまたはアミノ酸;抗酸化剤;EDTAまたはグルタチオンのようなキレート剤;アジュバント(例えば、アルミニウムヒドロキシド);および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、一つの面において静脈内投与用に製剤される。
本発明の医薬組成物を、処置する(または予防する)疾患に適する方法で投与し得る。投与の量および頻度は、患者の状態および患者の疾患のタイプおよび重症度のような因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定され得る。
ある態様において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能レンチウイルス(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留抗CD3/抗CD28被覆ビーズ、マウス抗体、貯留ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地要素、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群から選択される汚染物が実質的にない、例えば、検出可能なレベルで存在しない。ある態様において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス、カンジダ・アルビカンス、エシェリキア・コリ、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ナイセリア・メニンギティディス、シュードモナス・エルジノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびストレプトコッカス・ピオゲネスA群からなる群から選択される少なくとも1個である。
“免疫学的有効量”、“抗腫瘍有効量”、“腫瘍阻害有効量”または“治療量”が示されるとき、投与すべき本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度および患者(対象)の状態における、個々の差異を考慮しながら、医師により決定され得る。ここに記載するT細胞を含む医薬組成物を、104~109細胞/kg体重、ある場合105~106細胞/kg体重(これらの範囲内の全ての整数を含む)の用量で投与し得ると一般に述べ得る。T細胞組成物はまたこれらの用量で複数回投与し得る。細胞を、免疫療法において一般的に知られる点滴技術を使用して、投与できる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照)。特定の患者のための最適用量および処置レジメは、疾患の徴候について患者をモニタリングし、それに応じて処置を調節することにより、医学分野の当業者により容易に決定され得る。
ある面において、活性化T細胞を対象に投与し、その後再び採血し(またはアフェレシスを実施し)、本発明に従いそこからT細胞を活性化し、これらの活性化され、増殖されたT細胞を患者に再注入することが望まれ得る。この方法を数週間毎に複数回実施できる。ある面において、T細胞を、10cc~400ccの採血した血液から活性化できる。ある面において、T細胞は、20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90ccまたは100ccの採血した血液から活性化できる。
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、注入、植え込みまたは移植を含む、任意の簡便な方法で実施し得る。ここに記載の組成物を、患者に経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内、髄内、筋肉内に、静脈内(i.v.)注射によりまたは腹腔内に投与し得る。ある態様において、組成物を、患者に皮内または皮下注射により投与する。ある態様において、本発明のT細胞組成物を、皮内または皮下注射により患者に投与する。ある面において、本発明のT細胞組成物を、i.v.注射により投与する。T細胞の組成物を、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射し得る。
特定の代表的面において、対象を白血球除去法に付し、目的の細胞、例えば、T細胞を選択および/または単離するために、白血球を採取し、エクスビボで富化または枯渇させ得る。これらのT細胞単離体を、当分野で知られる方法により増殖させ、1個以上の本発明のCARおよびETP構築物が導入され、それにより、本発明のETP-CAR T細胞、例えば、RNA ETP-CAR T細胞が産生され得るように処置する。処置を必要とする対象は、その後、高用量化学療法と、続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付され得る。ある面において、移植の後または同時に、対象は、増殖させた本発明のETP-CAR T細胞、例えば、RNA ETP-CAR T細胞の注入を受ける。さらなる面において、増殖させた細胞を手術前または後に投与する。
患者に投与すべき上記処置の用量は、処置する状態および処置の受け手の正確な性質により変わる。ヒト投与のための用量のスケーリングは、当分野で認められた慣例に従い実施できる。例えば、キャンパスの用量は、一般に成人患者に1~約100mgの範囲であり、通常、1~30日間連日投与する。好ましい1日用量は1~10mg/日であるが、ある場合最大40mg/日までの高用量を使用し得る(米国特許6,120,766号に記載)。
ある態様において、CARを、例えば、インビトロ転写を使用してT細胞に導入し、対象(例えば、ヒト)は、本発明のCAR T細胞の初期投与および本発明のCAR T細胞の1以上の続く投与を受け、ここで、1以上のその後の投与は、先の投与の後15日、例えば、14日、13日、12日、11日、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日または2日以内に行う。ある態様において、本発明のCAR T細胞の1回を超える投与を、1週間あたりに対象(例えば、ヒト)に投与し、例えば、本発明のCAR T細胞の2、3または4投与を1週間あたりに行う。ある態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、1週間あたりにCAR T細胞の1回を超える投与を受け(例えば、1週間あたり2、3または4投与)(ここではサイクルとも称す)、その後1週間CAR T細胞投与をせず、その後、CAR T細胞の1回を超えるさらなる投与(例えば、1週間あたりCAR T細胞の1回を超える投与)を対象に投与する。他の態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、CAR T細胞を1サイクルを超えて受け、各サイクルの間の時間は10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日または3日未満である。ある態様において、CAR T細胞を、1週間3回、隔日で投与する。ある態様において、本発明のCAR T細胞を、少なくとも2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間またはそれ以上投与する。
ある面において、CAR発現細胞を、レンチウイルスのようなレンチウイルスウイルスベクターを使用して産生する。細胞、例えば、このような方法で産生したCARTは、安定なCAR発現を有する。
ある面において、CAR発現細胞、例えば、CARTを、ガンマレトロウイルスベクター、例えば、ここに記載するガンマレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターを使用して産生する。これらのベクターを使用して産生したCARTは、安定なCAR発現を有する。
ある面において、CARTは、形質導入4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日後CARベクターを一過性に発現する。CARの一過性発現は、RNA CARベクター送達によりもたらされ得る。ある面において、CAR RNAを、エレクトロポレーションによりT細胞に形質導入する。
一過性に発現するCAR T細胞(特にマウスscFv担持CART)を使用して処置している患者で生じる可能性のある問題は、複数処置後のアナフィラキシーである。
理論に拘束されないが、このようなアナフィラキシー応答は、液性抗CAR応答を発症する患者、すなわち、抗IgEアイソタイプを有する抗CAR抗体で起こると考えられる。抗原への暴露に、10~14日の中断があるとき、患者の抗体産生細胞がIgGアイソタイプ(アナフィラキシーを生じない)からIgEアイソタイプへのクラススイッチを受けると考えられる。
患者が一過性CAR治療(例えばRNA形質導入により産生されるもの)のコースの間に抗CAR抗体応答を生じる高リスクにあるならば、CART注入中断は、10~14日を超えて持続してはならない。
本発明を、次の実験的実施例を引用してさらに詳細に記載する。これらの実施例は、説明のみを目的として提示するものであり、特に断らない限り限定を意図しない。そうして、本発明は、決して次の実施例に限定されると解釈されてはならず、むしろ、ここに提示する教示の結果として明らかとなる任意かつあらゆる変形を含むと解釈されるべきである。
さらに記載せずとも、当業者は、先の記載および次の説明的実施例を使用して、本発明の化合物を製造し、かつ利用し、請求する方法を実施できると考える。次の作業実施例は、特異的に本発明の多様な面を指摘するものであり、本開示の残りをどのような方法であれ限定すると解釈してはならない。
実施例1:マウス抗CD19抗体のヒト化
CD19抗体分子は、例えば、その全体を引用により本明細書に包含させるWO2014/153270に記載する抗体分子(例えば、ヒト化抗CD19抗体分子)であり得る。マウスCD19抗体のヒト化は、マウス特異的残基がCART19処置、すなわち、CAR19構築物を形質導入したT細胞での処置を受けている患者においてヒト-抗マウス抗原(HAMA)応答を誘発し得る臨床の現場で望まれる。ハイブリドーマ由来マウスCD19抗体のVHおよびVL配列を、公開文献から抽出した(Nicholson et al, 1997, supra)。ヒト化を、マウスCD19抗体からのCDR領域を、ヒト生殖系列アクセプターフレームワークVH4_4-59およびVK3_L25(vBASEデータベース)に移植することにより達成した。CDR領域に加えて、CDR領域の構造的完全性を支持すると考えられる5フレームワーク残基、すなわちVH #71、#73、#78およびVL #71、#87が、マウス配列から維持された。さらに、ヒトJ要素JH4およびJK2を、それぞれ重鎖および軽鎖に使用した。ヒト化抗体の得られたアミノ酸配列を、それぞれFMC63_VL_hzおよびFMC63_VH_hz1と命名し、下の表1にも示す。残基番号付けは、Kabat(Kabat E.A. et al, 1991, supra)に従う。CDR定義について、KabatならびにChothia(Chothia et al, 1987 supra)を使用した。mマウスCD19由来残基を太字/斜体で示す。囲んだ位置#60/61/62は、HCDR2とも呼ばれるCDR H2における潜在的翻訳後修飾(PTM)部位である。
CD19抗体分子は、例えば、その全体を引用により本明細書に包含させるWO2014/153270に記載する抗体分子(例えば、ヒト化抗CD19抗体分子)であり得る。マウスCD19抗体のヒト化は、マウス特異的残基がCART19処置、すなわち、CAR19構築物を形質導入したT細胞での処置を受けている患者においてヒト-抗マウス抗原(HAMA)応答を誘発し得る臨床の現場で望まれる。ハイブリドーマ由来マウスCD19抗体のVHおよびVL配列を、公開文献から抽出した(Nicholson et al, 1997, supra)。ヒト化を、マウスCD19抗体からのCDR領域を、ヒト生殖系列アクセプターフレームワークVH4_4-59およびVK3_L25(vBASEデータベース)に移植することにより達成した。CDR領域に加えて、CDR領域の構造的完全性を支持すると考えられる5フレームワーク残基、すなわちVH #71、#73、#78およびVL #71、#87が、マウス配列から維持された。さらに、ヒトJ要素JH4およびJK2を、それぞれ重鎖および軽鎖に使用した。ヒト化抗体の得られたアミノ酸配列を、それぞれFMC63_VL_hzおよびFMC63_VH_hz1と命名し、下の表1にも示す。残基番号付けは、Kabat(Kabat E.A. et al, 1991, supra)に従う。CDR定義について、KabatならびにChothia(Chothia et al, 1987 supra)を使用した。mマウスCD19由来残基を太字/斜体で示す。囲んだ位置#60/61/62は、HCDR2とも呼ばれるCDR H2における潜在的翻訳後修飾(PTM)部位である。
これらのヒト化CD19 IgGを使用して、発現を試験するための可溶性scFvおよび完全CART CD19構築のためのscFvを産生した(下記実施例参照)。ヒト化において、CDRH2領域における62位が、マウスCDRH2に存在するアラニンよりセリン残基が優先されるのは興味深い。マウス配列は翻訳後修飾(PTM)を欠き、CDRH2における60位/61位/62位にそれぞれアスパラギン-セリン-アラニンを有する。これは、ヒト化の過程中の潜在的PTMモチーフ(CDRH2における四角で示す)を産生する。ヒト化過程中に産生されたPTM部位が実際に“真の”PTM部位であるかまたは単なる理論上のものかを試験した。アミノ酸モチーフアスパラギンと続くセリン(NS)が翻訳後脱アミド化に恐らく感受性であろうと仮説立てられたが、容易に明らかとなるようなものではなかった。また、アスパラギンと続くプロリン以外の任意のアミノ酸およびその後のセリン(NxS、x≠P)が翻訳後N-グリコシル化に恐らく感受性であろうと仮説立てられた。この仮説を試験するために、60位のアスパラギン(グリコシル化部位であると知られる)をセリンまたはグルタミンに置き換え、それぞれFMC63_VH_hz2(N60S)およびFMC63_VH_hz2(N60Q)と命名した2種のIgGバリアントを産生した。これらの構築物を、潜在的翻訳後修飾部位(PTM)を除き、保持された活性を試験するために産生した(下記実施例2参照)。
クローニング:
マウスおよびヒト化VLドメインおよびVHドメインをコードするDNA配列を得て、構築物のコドンを、ホモ・サピエンスからの細胞における発現のために最適化した。
VLドメインおよびVHドメインをコードする配列を、クローニングベクターから哺乳動物細胞における分泌に適する発現ベクターにサブクローンした。重鎖および軽鎖を個々の発現ベクターにクローン化して、共トランスフェクションを可能とした。発現ベクターの要素はプロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー-プロモーター)、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソーム複製および原核生物での複製を可能とする要素(例えばSV40起源およびColE1または当分野で知られるその他)および選択を可能とする要素(アンピシリン耐性遺伝子およびゼオシンマーカー)を含む。
マウスおよびヒト化VLドメインおよびVHドメインをコードするDNA配列を得て、構築物のコドンを、ホモ・サピエンスからの細胞における発現のために最適化した。
VLドメインおよびVHドメインをコードする配列を、クローニングベクターから哺乳動物細胞における分泌に適する発現ベクターにサブクローンした。重鎖および軽鎖を個々の発現ベクターにクローン化して、共トランスフェクションを可能とした。発現ベクターの要素はプロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー-プロモーター)、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソーム複製および原核生物での複製を可能とする要素(例えばSV40起源およびColE1または当分野で知られるその他)および選択を可能とする要素(アンピシリン耐性遺伝子およびゼオシンマーカー)を含む。
発現:
キメラおよびヒト化IgG候補を、HEK293F哺乳動物細胞で1ml規模で発現させた。浄化した上清をFACS結合試験に使用した。より厳密には、HEK293F細胞を、Pen/Strepを添加したFreeStyle培地で5E5細胞/mlに希釈し、1mlを24ウェル丸底深ウェルプレートに移した。0.5μgの軽鎖および0.5μgの重鎖哺乳動物発現プラスミドを、同じ培地で4μlのFuGENE HD(Roche REF 04709705001)と共に希釈した。15分、RTでインキュベーション後、DNA/Fugene混合物を細胞に滴下し、5%CO2インキュベーターに250rpm、37℃で5日置いた。上清を、遠心により細胞から分離した。IgG含量を測定するために、200μL量を96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れた。全サンプルおよび標品を、Protein A Dipを使用してデュプリケートで測定し、バイオセンサー(Fortebio Cat No 18-5010)で読んだ。プレートをOctet装置(ForteBio)に入れ、恒温チャンバーで27℃で平衡化させた。データをOctet User Software version 3.0を使用して自動的に処理し、IgG標準曲線との比較により濃度を決定した。
キメラおよびヒト化IgG候補を、HEK293F哺乳動物細胞で1ml規模で発現させた。浄化した上清をFACS結合試験に使用した。より厳密には、HEK293F細胞を、Pen/Strepを添加したFreeStyle培地で5E5細胞/mlに希釈し、1mlを24ウェル丸底深ウェルプレートに移した。0.5μgの軽鎖および0.5μgの重鎖哺乳動物発現プラスミドを、同じ培地で4μlのFuGENE HD(Roche REF 04709705001)と共に希釈した。15分、RTでインキュベーション後、DNA/Fugene混合物を細胞に滴下し、5%CO2インキュベーターに250rpm、37℃で5日置いた。上清を、遠心により細胞から分離した。IgG含量を測定するために、200μL量を96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れた。全サンプルおよび標品を、Protein A Dipを使用してデュプリケートで測定し、バイオセンサー(Fortebio Cat No 18-5010)で読んだ。プレートをOctet装置(ForteBio)に入れ、恒温チャンバーで27℃で平衡化させた。データをOctet User Software version 3.0を使用して自動的に処理し、IgG標準曲線との比較により濃度を決定した。
FACSによる結合分析:
ヒト化およびキメラ抗体を、細胞株300.19-hsCD19FLを使用してフローサイトメトリー結合アッセイで評価した。この細胞株は、マウスプレB細胞株300.19を完全長ヒトCD19コード化配列および天然プロモーターならびにゼオシン耐性遺伝子をコードするベクター(hCD19 FL/pEF4-myc-His A)でトランスフェクトすることにより産生した。簡潔にいうと、300.19細胞を直線化プラスミドで電気穿孔し、次いで高レベルのhsCD19を発現する細胞をAPC結合抗ヒトCD19 Ab(BD 555415からのクローンHIB19)を使用して同定し、続いてFACS Ariaフローサイトメーターを使用してソートした。ソートしたhsCD19+細胞培養し、高レベルのhsCD19を安定に発現することを確認した。
ヒト化およびキメラ抗体を、細胞株300.19-hsCD19FLを使用してフローサイトメトリー結合アッセイで評価した。この細胞株は、マウスプレB細胞株300.19を完全長ヒトCD19コード化配列および天然プロモーターならびにゼオシン耐性遺伝子をコードするベクター(hCD19 FL/pEF4-myc-His A)でトランスフェクトすることにより産生した。簡潔にいうと、300.19細胞を直線化プラスミドで電気穿孔し、次いで高レベルのhsCD19を発現する細胞をAPC結合抗ヒトCD19 Ab(BD 555415からのクローンHIB19)を使用して同定し、続いてFACS Ariaフローサイトメーターを使用してソートした。ソートしたhsCD19+細胞培養し、高レベルのhsCD19を安定に発現することを確認した。
結合アッセイを、発現されたIgGを含む無血清培養培地で直接実施できた。全ての評価したIgGを、同じ濃度に標準化し(85nM)、その後3倍連続希釈で1.4pMまで希釈した。次いで、96ウェルプレートで、5×105細胞/ウェル量を、希釈IgGと共に30分、4℃でインキュベートした。細胞をFACS緩衝液(PBS中0.5%BSA)で2回洗浄し、FACS緩衝液で1:1000に希釈した検出抗体、APC結合ヤギ抗hu IgG、Fcフラグメント特異的(Dianova #109-136-098)を添加した。細胞をさらに30分、4℃でインキュベートし、FACS緩衝液で2回洗浄し、FACS Calibur(BD Bioscience)を使用してアッセイした。結合曲線プロッティング(蛍光強度の中央値対IgG濃度)およびEC50決定を、非線形回帰分析、シグモイド用量応答(可変勾配)でGraphPad PrismTM 3.0ソフトウェアを用いて実施した。
FACS分析は、全ての評価したIgGに対する見かけの結合が広範に変わり、いくつかの構築物は、IgG対scFvとして、EC50の5~10倍シフトを示す。EC50値に基づき、キメラ対照と比較して、2倍までの結合親和性を有するリード候補を選択した。
実施例2:ヒト化CD19 IgG抗体由来抗CD19可溶性scFvフラグメントの特徴づけ
可溶性scFvフラグメントを、実施例1に記載するヒト化CD19 IgGから、標準的分子生物学手法を使用して産生した。これらの可溶性scFvを、scFvの安定性、細胞表面発現および結合特性を試験する特徴づけ試験に使用した。さらに、ヒト化過程で導入された潜在的PTMの影響を試験する実験も実施した。
可溶性scFvフラグメントを、実施例1に記載するヒト化CD19 IgGから、標準的分子生物学手法を使用して産生した。これらの可溶性scFvを、scFvの安定性、細胞表面発現および結合特性を試験する特徴づけ試験に使用した。さらに、ヒト化過程で導入された潜在的PTMの影響を試験する実験も実施した。
scFv発現および精製
各scFv構築物のトランスフェクションのために、約3e8 293F細胞を、トランスフェクション試薬としてPEIを3:1比(PEI:DNA)で使用して、100μgのプラスミドでトランスフェクトした。細胞を、シェーカーフラスコ中、100ml EXPi293発現培地(Invitrogen)で37℃、125rpm、8%CO2で増殖させた。培養物を6日後に採取し、タンパク質精製に使用した。
293F細胞を、3500gで20分遠沈させることにより採取した。上清を採取し、VacuCap90 PF Filter Unit(w/0.8/0.2μm Super Membrane、PALL)で濾過した。約400μlのNi-NTAアガロースビーズ(Qiagen)を上清に添加した。混合物を、4時間、4℃で回転させ、インキュベートした。精製カラムに載せ、20mMヒスチジン含有洗浄緩衝液で洗浄した。タンパク質を、300mMヒスチジン含有500μl 溶出緩衝液で溶出した。サンプルを、4℃で一夜、PBS緩衝液に対して透析した。タンパク質サンプルを、nanodrop 2000cを使用して定量した。
各scFv構築物のトランスフェクションのために、約3e8 293F細胞を、トランスフェクション試薬としてPEIを3:1比(PEI:DNA)で使用して、100μgのプラスミドでトランスフェクトした。細胞を、シェーカーフラスコ中、100ml EXPi293発現培地(Invitrogen)で37℃、125rpm、8%CO2で増殖させた。培養物を6日後に採取し、タンパク質精製に使用した。
293F細胞を、3500gで20分遠沈させることにより採取した。上清を採取し、VacuCap90 PF Filter Unit(w/0.8/0.2μm Super Membrane、PALL)で濾過した。約400μlのNi-NTAアガロースビーズ(Qiagen)を上清に添加した。混合物を、4時間、4℃で回転させ、インキュベートした。精製カラムに載せ、20mMヒスチジン含有洗浄緩衝液で洗浄した。タンパク質を、300mMヒスチジン含有500μl 溶出緩衝液で溶出した。サンプルを、4℃で一夜、PBS緩衝液に対して透析した。タンパク質サンプルを、nanodrop 2000cを使用して定量した。
scFv立体構造およびコロイド安定性分析
scFvの熱安定性をDSFにより決定した:1:1000の最終希釈の10~20μlのタンパク質サンプルと色素Sypro Orange(Invitrogen Cat#S6650)を、総体積25μlでPBS中で混合し、BioRad CF×1000(25℃で2分、次いで0.5℃増分で30秒、25~95℃)で流した。
分析的SEC実験のために、20μl PBS中約15~20μgのscFvタンパク質サンプルを、TSKgel Super SW2000に、Agilent 1100シリーズ上、0.3ml/分流速で注入した。
scFvの熱安定性をDSFにより決定した:1:1000の最終希釈の10~20μlのタンパク質サンプルと色素Sypro Orange(Invitrogen Cat#S6650)を、総体積25μlでPBS中で混合し、BioRad CF×1000(25℃で2分、次いで0.5℃増分で30秒、25~95℃)で流した。
分析的SEC実験のために、20μl PBS中約15~20μgのscFvタンパク質サンプルを、TSKgel Super SW2000に、Agilent 1100シリーズ上、0.3ml/分流速で注入した。
FACS結合によるEC50
マウス細胞株300.CD19を、0.5mg/ml ゼオシン含有RPMI 1640で増殖させた。約5e5細胞/ウェルを、BD Falcon 96ウェルプレートに移した。細胞を、900rpm(Sorval Legend XT centrifuge)で3分遠沈した。上清を除いた。抗CD19 scFvタンパク質サンプルを、5%FBS含有DPBSで希釈した。サンプルをウェルに添加し、ウェルを細胞と混合し、1時間インキュベートした。細胞を、5%FBS含有DPBSで2回洗浄した。細胞を、高ポリHis PE(R&D)と1時間インキュベートし、2回洗浄して、FACS分析した(BD BiosciencesのLSRII)。
マウス細胞株300.CD19を、0.5mg/ml ゼオシン含有RPMI 1640で増殖させた。約5e5細胞/ウェルを、BD Falcon 96ウェルプレートに移した。細胞を、900rpm(Sorval Legend XT centrifuge)で3分遠沈した。上清を除いた。抗CD19 scFvタンパク質サンプルを、5%FBS含有DPBSで希釈した。サンプルをウェルに添加し、ウェルを細胞と混合し、1時間インキュベートした。細胞を、5%FBS含有DPBSで2回洗浄した。細胞を、高ポリHis PE(R&D)と1時間インキュベートし、2回洗浄して、FACS分析した(BD BiosciencesのLSRII)。
Proteonによる動態分析
動態を、Bio-Rad Proteonを使用して決定した。GLCセンサーチップ上への標準アミンカップリングを使用して、固定化を実施した。scFvサンプルを、酢酸pH4.5で0.03mg/mLに希釈し、流速30μL/分で300秒チップに適用した。CD19リガンドをPBS-Tweenで連続希釈し、解離時間480秒を用いて流速50μL/分で120秒で注入した。チップ表面を、グリシンpH2.5で再生した。1:1 ラングミュアモデルを使用してデータをフィットさせた。
動態を、Bio-Rad Proteonを使用して決定した。GLCセンサーチップ上への標準アミンカップリングを使用して、固定化を実施した。scFvサンプルを、酢酸pH4.5で0.03mg/mLに希釈し、流速30μL/分で300秒チップに適用した。CD19リガンドをPBS-Tweenで連続希釈し、解離時間480秒を用いて流速50μL/分で120秒で注入した。チップ表面を、グリシンpH2.5で再生した。1:1 ラングミュアモデルを使用してデータをフィットさせた。
CART19構築物の表面発現およびFACSによる染色
種々の抗hCD19 CARTで一過性にトランスフェクトしたHEK293F懸濁細胞を、トランスフェクション2日後に採取した。約1e6細胞をV型96ウェルプレート(Greiner Bio-One, Germany)の各ウェルに入れ、0.2ml FACS緩衝液(4%ウシ血清アルブミン(BSA)含有1×PBS(BSA fraction V, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)で3回洗浄した。細胞を、0.2mlのFCAS緩衝液に、0.2μgのビオチニル化タンパク質L(GenScript, Piscataway, NJ)または100nMのhCD19(AA 1-291)-hIgG1 Fc(NIBRIにより産生)と共に再懸濁し、4℃で30分インキュベートした。細胞を0.2mlのFACS緩衝液で3回洗浄し、タンパク質L含有サンプルについては1μl Streptavidin Alexa Fluor 488(Life Technologies, Grand Island, NY)と0.2mlのFACS緩衝液中またはhCD19-hIgG1 Fc含有サンプルについては2μlのPE抗ヒトFcγ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)と0.2mlのFACS緩衝液中、30分、4℃で暗所でインキュベートした。0.2mlのFACS緩衝液で3回洗浄後、細胞を、FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences, San Jose, CA)を使用してLSRII(BD Biosciences, San Jose, CA)機で分析した。免疫蛍光染色を、生存細胞の相対対数蛍光として分析し、Alexa Fluor 488陽性またはPE陽性細胞のパーセンテージを測定した。
種々の抗hCD19 CARTで一過性にトランスフェクトしたHEK293F懸濁細胞を、トランスフェクション2日後に採取した。約1e6細胞をV型96ウェルプレート(Greiner Bio-One, Germany)の各ウェルに入れ、0.2ml FACS緩衝液(4%ウシ血清アルブミン(BSA)含有1×PBS(BSA fraction V, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)で3回洗浄した。細胞を、0.2mlのFCAS緩衝液に、0.2μgのビオチニル化タンパク質L(GenScript, Piscataway, NJ)または100nMのhCD19(AA 1-291)-hIgG1 Fc(NIBRIにより産生)と共に再懸濁し、4℃で30分インキュベートした。細胞を0.2mlのFACS緩衝液で3回洗浄し、タンパク質L含有サンプルについては1μl Streptavidin Alexa Fluor 488(Life Technologies, Grand Island, NY)と0.2mlのFACS緩衝液中またはhCD19-hIgG1 Fc含有サンプルについては2μlのPE抗ヒトFcγ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)と0.2mlのFACS緩衝液中、30分、4℃で暗所でインキュベートした。0.2mlのFACS緩衝液で3回洗浄後、細胞を、FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences, San Jose, CA)を使用してLSRII(BD Biosciences, San Jose, CA)機で分析した。免疫蛍光染色を、生存細胞の相対対数蛍光として分析し、Alexa Fluor 488陽性またはPE陽性細胞のパーセンテージを測定した。
ヒト化過程中に産生された潜在的PMTの分析
実施例1に記載するように、ヒト化中、CDRH2領域における62位が、マウスCDRH2に存在するアラニンよりセリン残基のほうが好ましいのは興味深かった。ヒト化過程中に産生されたPTM部位が実際に“真の”PTM部位であるかまたは単なる理論上のものかを試験した。60位のアスパラギン(グリコシル化部位であると知られる)をセリンまたはグルタミンに置き換え、それぞれFMC63_VH_hz2(N60S)およびFMC63_VH_hz2(N60Q)と命名した2種のIgGバリアントを産生した。これらの構築物を、潜在的翻訳後修飾部位(PTM)を除き、保持された活性を試験するために産生した。
実施例1に記載するように、ヒト化中、CDRH2領域における62位が、マウスCDRH2に存在するアラニンよりセリン残基のほうが好ましいのは興味深かった。ヒト化過程中に産生されたPTM部位が実際に“真の”PTM部位であるかまたは単なる理論上のものかを試験した。60位のアスパラギン(グリコシル化部位であると知られる)をセリンまたはグルタミンに置き換え、それぞれFMC63_VH_hz2(N60S)およびFMC63_VH_hz2(N60Q)と命名した2種のIgGバリアントを産生した。これらの構築物を、潜在的翻訳後修飾部位(PTM)を除き、保持された活性を試験するために産生した。
結果
抗CD19ヒト化scFvおよびマウスscFvは293F細胞で発現され、Hisタグにより精製された。全ヒト化scFvの発現および収率は、元のマウスscFvよりはるかに高かった(データは示していない)。
抗CD19ヒト化scFvおよびマウスscFvは293F細胞で発現され、Hisタグにより精製された。全ヒト化scFvの発現および収率は、元のマウスscFvよりはるかに高かった(データは示していない)。
同一性を確認し、完全性を評価するために、scFV構築物を、N-グリカナーゼF(PNGaseF)とのインキュベーションを行いまたは行わず、高速液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー(HPLC-MS)(図3参照)およびSDS-PAGE(データは示していない)の両者により分析した。PNGaseFは、コンセンサス配列N-X-S/T/C(ここで、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である)からのN連結グリカン構造除去に特異的な酵素である。簡潔にいうと、サンプルを水で0.1μg/μLに希釈し、未処理のまままたはPNGaseFと1:2(w/w)PNGaseF:scFV比で3時間、37℃でインキュベートした。
NovexのNuPAGE 4~12%Bis-Trisゲルを使用してSDS-PAGE分析を行う。約2μg scFVを各レーンに載せ、200V定圧で40分電気泳動を実施する。電気泳動後、ゲルをPhastGel Blue R 250染色(Amersham Pharmacia)を使用して染色し、10%酢酸、30%メタノールを使用して脱染する。
HPLC-MS分析を、Xevo-Tofマススペクトロメーターに連結されたWater's Acquity UPLC系で行う。約1μgの各サンプルを、60℃で流速0.5mL/分に設定したR 1/10 2.1×100mm 10μm POROSカラム(Applied Biosciences)に載せる。移動相は、0.1%ギ酸(A)および0.1%ギ酸、75%イソプロパノール、25%アセトニトリル(B)からなる。タンパク質を、12分で25%~90%Bの逆相勾配を用いてカラムから溶出する。源コーン電圧勾配20~50Vを用いて600~4000Daのm/z範囲でエレクトロスプレー陽性走査を使用して、獲得を行う。得られたスペクトルを、MaxEnt1を使用してデコンボリューションする。
グリコシル化部位を、ヒト化工程中に導入した。非PTMバリアント(VH:N60SまたはN60Q)は、このさらなる形態を用いなかった。構築物は、HC CDR2におけるN連結グリコシル化のコンセンサス部位を有する唯一であった。SDS-PAGE分析から、未処理サンプルは、二重項が観察される103101-WT(S/N)以外の全構築物について、その配列の凡その分子量と一致する単バンドとして移動した。この構築物は、H-CDR2におけるN連結グリコシル化のコンセンサス部位を有する唯一である。PNGaseFで処理したとき、二重項の高分子量バンドはもはや存在せず、該部位の部分的占有を示唆する。同様に、デコンボリューションしたマススペクトルから観察された分子量は、アミノ酸配列から予測されるものに一致する。しかしながら、他の構築物は、一つの主要な分子片を示したが、103101-WT(S/N)はまた配列から予測されるより1217ダルトン高い集団を有し、これはPNGaseF処理後はもはや存在しない。これは、質量に基づき、恐らく、オリゴマンノース5である、一つの優勢なN連結グリコフォームの存在と一致する。グリコシル化形態の存在を、図3に示すようにMS分析により確認した。
立体構造安定性を、示差走査蛍光定量法により測定した(DSF)。図4に示すように、マウスscFvのTmは57℃であり、ヒトバリアントは約70℃の高いTmを示した。ヒト化scFv全てのTmは、マウスscFvよりはるかに良好であり、全てのヒト化scFvがマウスscFvより安定であることを明らかに示す。この安定性は、恐らくCART19構築物に反映され、治療特性改善に至る可能性がある。
精製scFvの活性を、SPRベースの検出法を使用する、hCD19発現細胞への結合ならびにhCD19抗原への結合により測定した。マウス細胞株300を、scFvの結合の決定に使用した。hCD19に対するマウスscFvのEC50は約06~1.6nMであった。ヒト化バリアントは、低nMまたはnM以下のEC50範囲で、同じ範囲のEC50を示した。
実施例3:CD19 CAR構築物
最終CAR構築物において使用するScFvは、実施例1に記載のヒト化IgGに由来した。表2に示すように、VLドメインおよびVHドメインがscFv中で現れる順番を変え(すなわち、VL-VHまたはVH-VL配向)、各サブユニットが配列GGGGS(配列番号18)(例えば、(G4S)3(配列番号107)または(G4S)4(配列番号106))を含む“G4S”(配列番号18)サブユニットの3または4コピーが、可変ドメインを連結して、scFvドメイン全体を産生した。
最終CAR構築物において使用するScFvは、実施例1に記載のヒト化IgGに由来した。表2に示すように、VLドメインおよびVHドメインがscFv中で現れる順番を変え(すなわち、VL-VHまたはVH-VL配向)、各サブユニットが配列GGGGS(配列番号18)(例えば、(G4S)3(配列番号107)または(G4S)4(配列番号106))を含む“G4S”(配列番号18)サブユニットの3または4コピーが、可変ドメインを連結して、scFvドメイン全体を産生した。
ヒト化scFvフラグメント(配列番号1~12)の配列を下記表3に示す。完全CAR構築物を、配列番号1~12と、下記さらなる配列、配列番号13~17を使用して産生し、配列番号31~42を有する完全CAR構築物を産生した。
・ リーダー(アミノ酸配列)(配列番号13)
・ リーダー(核酸配列)(配列番号54)
・ CD8ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号14)
・ CD8ヒンジ(核酸配列)(配列番号55)
・ CD8膜貫通(アミノ酸配列)(配列番号15)
・膜貫通(核酸配列)(配列番号56)
・ 4-1BB細胞内ドメイン(アミノ酸配列)(配列番号16)
・ 4-1BB細胞内ドメイン(核酸配列)(配列番号60)
・ CD3ゼータドメイン(アミノ酸配列)(配列番号17)
・ CD3ゼータ(核酸配列)(配列番号101)
・ CD3ゼータドメイン(アミノ酸配列;NCBI Reference Sequence NM_000734.3)(配列番号43)
・ CD3ゼータ(核酸配列;NCBI Reference Sequence NM_000734.3)(配列番号44)
・ リーダー(アミノ酸配列)(配列番号13)
表6は、CD19構築物数字の名前を、scFvの軽鎖および重鎖の特異的配向、重鎖と軽鎖を離すリンカーユニット数(すなわち、(G4S)3(配列番号107)または(G4S)4(配列番号106))および重鎖CDR2における特徴的アミノ酸配列と相関させる検索表である。
CAR scFvフラグメントを、次いでレンチウイルスベクターにクローン化して、単一符号化フレーム内に完全長CAR構築物を産生し、発現のためにEF1アルファプロモーター(配列番号100)を使用した。
EF1アルファプロモーター
EF1アルファプロモーター
ヒト化CAR構築物の分析を、実施例4に記載するように実施した。
実施例4:CARTにおけるヒト化CD19構築物の分析
CARテクノロジーによるCD19ターゲティングの実施可能性を評価するために、抗CD19抗体の一本鎖可変フラグメントを、4種の立体配置でCD3ゼータ鎖および4-1BB共刺激分子を含むレンチウイルスCAR発現ベクターにクローン化し、CD19+標的に応答するCD19 CAR形質導入T細胞(“CART19”または“CART19 T細胞”)のエフェクターT細胞応答の量および品質に基づき、最適構築物を選択する。エフェクターT細胞応答は、細胞増殖、増殖、倍加、サイトカイン産生および標的細胞殺細胞または細胞溶解活性(脱顆粒)を含むが、これらに限定されない。
CARテクノロジーによるCD19ターゲティングの実施可能性を評価するために、抗CD19抗体の一本鎖可変フラグメントを、4種の立体配置でCD3ゼータ鎖および4-1BB共刺激分子を含むレンチウイルスCAR発現ベクターにクローン化し、CD19+標的に応答するCD19 CAR形質導入T細胞(“CART19”または“CART19 T細胞”)のエフェクターT細胞応答の量および品質に基づき、最適構築物を選択する。エフェクターT細胞応答は、細胞増殖、増殖、倍加、サイトカイン産生および標的細胞殺細胞または細胞溶解活性(脱顆粒)を含むが、これらに限定されない。
材料および方法
再指向ヒト化CART19 T細胞の産生
ヒト化CART19レンチウイルス導入ベクターを、VSVg偽型レンチウイルス粒子に包装されたゲノム物質を作るために使用した。レンチウイルス導入ベクターDNAを、VSVg、gag/polおよびrevの3つのパッケージング成分と、リポフェクタミン試薬と組み合わせて、それらを293T細胞にトランスフェクトするために混合する。24時間および48時間後、培地を回収し、濾過し、超遠心分離法により濃縮する。得られたウイルス調製物を-80℃で保存する。形質導入ユニットの数を、SupT1細胞のタイトレーションにより決定する。再指向CART19 T細胞を、新鮮ナイーブT細胞をCD3x28ビーズと24時間接触させ、次いで、所望のパーセンテージの形質導入T細胞を得るための適切な数の形質導入ユニットの添加により活性化させることにより産生する。これらの修飾T細胞は、休息状態となり、サイズが小さくなり始めるまで増殖可能であり、その時点で後の分析のために凍結保存する。細胞数およびサイズを、coulter multisizer IIIを使用して測定する。凍結保存前に、形質導入された(CART19を細胞表面に発現する)細胞のパーセンテージおよびその発現の相対的蛍光強度を、LSRIIでのフローサイトメトリー分析により決定する。ヒストグラムプロットから、CARの相対的発現レベルを、形質導入パーセンテージとその相対的蛍光強度の比較により試験できる。
再指向ヒト化CART19 T細胞の産生
ヒト化CART19レンチウイルス導入ベクターを、VSVg偽型レンチウイルス粒子に包装されたゲノム物質を作るために使用した。レンチウイルス導入ベクターDNAを、VSVg、gag/polおよびrevの3つのパッケージング成分と、リポフェクタミン試薬と組み合わせて、それらを293T細胞にトランスフェクトするために混合する。24時間および48時間後、培地を回収し、濾過し、超遠心分離法により濃縮する。得られたウイルス調製物を-80℃で保存する。形質導入ユニットの数を、SupT1細胞のタイトレーションにより決定する。再指向CART19 T細胞を、新鮮ナイーブT細胞をCD3x28ビーズと24時間接触させ、次いで、所望のパーセンテージの形質導入T細胞を得るための適切な数の形質導入ユニットの添加により活性化させることにより産生する。これらの修飾T細胞は、休息状態となり、サイズが小さくなり始めるまで増殖可能であり、その時点で後の分析のために凍結保存する。細胞数およびサイズを、coulter multisizer IIIを使用して測定する。凍結保存前に、形質導入された(CART19を細胞表面に発現する)細胞のパーセンテージおよびその発現の相対的蛍光強度を、LSRIIでのフローサイトメトリー分析により決定する。ヒストグラムプロットから、CARの相対的発現レベルを、形質導入パーセンテージとその相対的蛍光強度の比較により試験できる。
ヒト化CART19再指向T細胞の細胞溶解活性、増殖能およびサイトカイン分泌の評価
ヒト化CAR19 T細胞の殺し、増殖し、そしてサイトカインを分泌する機能的能力を評価するために、細胞を解凍し、一夜回復させる。ヒト化CART19に加えて、マウスCART19を比較目的で使用し、SS1-BBzをバックグラウンドCAR/T細胞効果のための非ターゲティング発現されるCARとして使用した。“対照”至適基準(GS)CART19を、アッセイ変動を比較するために全アッセイで使用した。GS CART19は、研究グレード(すなわち、臨床グレードではない)製造条件で産生される細胞であることは重要であり、増殖培養のためにIL-2の添加を含む。このことは、これらの細胞の全生存期間の生存能および機能性に影響する可能性があり、他の形質導入T細胞集団の研究グレード産生の直接比較として評価してはならない。T細胞殺細胞は、CD19を発現するまたは発現しない慢性骨髄性白血病細胞株であるK562またはCLL患者から単離されたB細胞であるPt14に対してであった。このフローベースの細胞毒性アッセイのために、標的細胞をCSFEで染色し、その存在を定量化する。標的細胞をCD19発現について染色して、類似の標的抗原レベルであることを確認した。CAR19 T細胞の細胞溶解性活性を、エフェクター:標的細胞比10:1、3:1、1:1、0.3:1および0:1のタイトレーションで測定し、ここで、エフェクターは、抗CD19キメラ受容体を発現するT細胞として定義された。アッセイを、適切な数のT細胞と、一定数の標的細胞の混合により開始した。16時間後、各混合物の全液相を除去し、洗浄した各ウェルを適当にあわせた。T細胞をCD2について染色し、全細胞を生存/死マーカー7AADで染色した。最終洗浄後、ペレット化細胞を、予定した数の計数ビーズと共に特定の体積で再懸濁した。細胞染色データをLSRIIフローサイトメトリーにより集め、ビーズを使用するFloJoソフトウェアで解析して、結果を定量化した。
ヒト化CAR19 T細胞の殺し、増殖し、そしてサイトカインを分泌する機能的能力を評価するために、細胞を解凍し、一夜回復させる。ヒト化CART19に加えて、マウスCART19を比較目的で使用し、SS1-BBzをバックグラウンドCAR/T細胞効果のための非ターゲティング発現されるCARとして使用した。“対照”至適基準(GS)CART19を、アッセイ変動を比較するために全アッセイで使用した。GS CART19は、研究グレード(すなわち、臨床グレードではない)製造条件で産生される細胞であることは重要であり、増殖培養のためにIL-2の添加を含む。このことは、これらの細胞の全生存期間の生存能および機能性に影響する可能性があり、他の形質導入T細胞集団の研究グレード産生の直接比較として評価してはならない。T細胞殺細胞は、CD19を発現するまたは発現しない慢性骨髄性白血病細胞株であるK562またはCLL患者から単離されたB細胞であるPt14に対してであった。このフローベースの細胞毒性アッセイのために、標的細胞をCSFEで染色し、その存在を定量化する。標的細胞をCD19発現について染色して、類似の標的抗原レベルであることを確認した。CAR19 T細胞の細胞溶解性活性を、エフェクター:標的細胞比10:1、3:1、1:1、0.3:1および0:1のタイトレーションで測定し、ここで、エフェクターは、抗CD19キメラ受容体を発現するT細胞として定義された。アッセイを、適切な数のT細胞と、一定数の標的細胞の混合により開始した。16時間後、各混合物の全液相を除去し、洗浄した各ウェルを適当にあわせた。T細胞をCD2について染色し、全細胞を生存/死マーカー7AADで染色した。最終洗浄後、ペレット化細胞を、予定した数の計数ビーズと共に特定の体積で再懸濁した。細胞染色データをLSRIIフローサイトメトリーにより集め、ビーズを使用するFloJoソフトウェアで解析して、結果を定量化した。
ヒト化CAR19 T細胞の細胞増殖およびサイトカイン産生を測定するために、細胞を解凍し、一夜回復させる。ヒト化CART19に加えて、マウスCART19を比較目的で使用し、SS1-BBzをバックグラウンドCAR/T細胞効果のための非ターゲティング発現されるCARとして使用した。“対照”至適基準(GS)CART19を、アッセイ変動を比較するために全アッセイで使用した。T細胞は、CD19を発現するまたは発現しない慢性骨髄性白血病細胞株であるK562またはCLL患者から単離されたB細胞であるPt14に対してであった。さらに、CD3x28ビーズを、T細胞が内在性免疫学的シグナルに応答する可能性を評価するために使用した。増殖を分析するために、T細胞をCSFEで染色した。増殖は、親マーキングの現在の2娘細胞への分離を反映する、CSFE染色の希釈である。アッセイは、1:1および1:0のエフェクター:標的比でのみ試験し、ここで、エフェクターは、抗CD19キメラ受容体を発現するT細胞として定義された。アッセイをデュプリケートで行い、細胞混合24時間後、培地の50%を、Luminex 10-plexパネルのヒトサイトカイン検出を使用するサイトカイン分析のために除去/置換する。5日後、T細胞をCAR発現について染色し、CD4またはCD8細胞として表現型決定し、7AADで生存/死について染色した。最終洗浄後、ペレット化細胞を、予定した数のBD計数ビーズと共に特定の体積で再懸濁した。細胞染色データをLSRIIフローサイトメトリーにより集め、ビーズを使用するFloJoソフトウェアで解析して、結果を定量化した。総細胞数を、特定の数のビーズに対して計数した細胞数をさらに計数すべきビーズの画分で乗じて決定した。
ヒト化CART19細胞が、現在成功しているマウスCART19と同様に機能する可能性を評価するために、インビトロで標的細胞を殺す能力、標的抗原に応答して増殖する能力および残留性の兆候を示す能力を評価すること計画した。ヒト化CART19レンチウイルス構築物の各々をSupT1細胞にパッケージングし、そこで力価測定することにより、形質導入を約50%と標準化するウイルスの量を決定できた。これは、細胞あたり、類似の平均組込み部位で開始する活性のより直接の比較を可能にする。
治療的CAR19 T細胞を、正常アフェレシスドナーからの血液から出発して産生し、そのナイーブT細胞を、T細胞、CD4+およびCD8+リンパ球の陰性選択により得る。これらの細胞を、37℃、5%CO2で10%RPMI中のCD3x28ビーズにより活性化する。
24時間後、T細胞をブラスティングし、標準化した量のウィルスを添加する。T細胞は対数増殖パターンで分裂をはじめ、これをmlあたりの細胞数および細胞サイズの測定によりモニターする。T細胞が休止を始めると、対数増殖が減弱し、細胞サイズが縮む。増殖速度減速および約300flに近づくT細胞サイズの組み合わせが、T細胞を凍結保存または再刺激する状態を決定する。
24時間後、T細胞をブラスティングし、標準化した量のウィルスを添加する。T細胞は対数増殖パターンで分裂をはじめ、これをmlあたりの細胞数および細胞サイズの測定によりモニターする。T細胞が休止を始めると、対数増殖が減弱し、細胞サイズが縮む。増殖速度減速および約300flに近づくT細胞サイズの組み合わせが、T細胞を凍結保存または再刺激する状態を決定する。
サイズにより見られるように、休止するT細胞に極めて類似する傾向がある。ヒト化CART細胞と現在のマウスCART19およびUTD集団の間のほぼ重なるパターンは、活性化後の正常T細胞増殖に対するヒト化CAR19に異常な効果がないことを示す。対照として、SS1-BBzを、望ましくない抗原非依存的CAR活性を定義するために使用する。総細胞数における増殖プロファイルは、個々の増殖における実際の数の差異が恐らく主に出発細胞数の差異によることを示す。出発T細胞数の標準化により、全てのCART19細胞について密集が見られる。さらに、抗原非依存的CAR活性化の望まない効果は、群から下にかつ離れる線により検出される。
これらのCAR19発現細胞の各々の表面発現レベルを決定した。形質導入について標準化した力価測定を行ったウイルスは、遺伝子導入効率、形質導入細胞パーセントと相関する、同等な発現レベルを示す。あるCARは、先のパッケージングから外挿された力価を有し、形質導入パーセントは低いにも関わらず、MFIも予想通り減少する。結果は、UTDおよびマウスCAR19 T細胞と比較したとき、ヒト化CAR19が、正常に増殖する細胞の能力に検出可能な陰性効果がないことを示す。
ヒト化CART19細胞が、細胞上に発現された細胞表面特異的エピトープを選択的に区別し、破壊する能力を分析する。野生型K562細胞はCD19を発現しないが、CD19を発現するように形質導入できる。これらの殺細胞曲線を比較して、エフェクター細胞の定量は、CD19を発現する細胞が破壊されることを示す。同じドナー由来であり、ヒト化CART19細胞または現在の臨床用マウスCART19細胞で修飾された再指向T細胞は、殺細胞力に差がないことを示す。殺細胞曲線は、患者14からのCD19+ CLL細胞をターゲティングするヒト化CART19細胞で極めて類似する殺細胞力を有することを示す。興味深いことに、全体的細胞溶解活性の減少が、特にGS CART19であり、これらの細胞が特異的阻害特性を有し得ることを示唆する。標的細胞上に発現されるCD19レベルが同様であることは、発現レベルが殺細胞能の差の原因ではないことを示す。
標的細胞と知った後にヒト化CART19細胞が増殖するために必要な特性が、対照CD3x28ビーズおよびCD19発現標的による刺激後に、全構築物で見られる。Pt14 CLL細胞のターゲティングは、3xまたは4x GGGGS結合(それぞれ配列番号107および106)を有するとき、軽鎖から重鎖配向を有するscFvでわずかに大きな増殖率を示すようであり、バイアスは見られない。増殖結果は、5日間で蓄積された総細胞数を反映し、ヒト化CART19、2146、2144、2136、2141および2137が、T細胞により増殖性のシグナルを駆動することを示す。印象としては、これがPt14 CLL細胞をターゲティングするヒト化CART19細胞で検出された。
まとめると、ヒト化CART19構築物は、抗原特異的標的に対する細胞溶解活性、増殖性応答およびサイトカイン分泌において、現在のマウスCART19と極めて類似する特性を示す。ヒト化CART19細胞(2146、2144、2136、2141および2137)が標的活性化により、より増殖性のシグナルをT細胞に駆動する可能性は、潜在的に治療応答を高めるためのこれらの新規構築物の追加の利点であるように見える。
結果
脱顆粒およびサイトカイン産生アッセイの両者を使用して、操作されたCART19 T細胞がCD19+細胞を特異的に標的とすることが示される。
本発明のヒト化CD19CAR構築物(別名“huCART19”)を形質導入したND317細胞を分析した。マウスCART19および非修飾(UTD)T細胞と比較して、CD3x28活性化およびヒト化CART19候補形質導入後の増殖の間、T細胞のサイズは極めて類似した。
脱顆粒およびサイトカイン産生アッセイの両者を使用して、操作されたCART19 T細胞がCD19+細胞を特異的に標的とすることが示される。
本発明のヒト化CD19CAR構築物(別名“huCART19”)を形質導入したND317細胞を分析した。マウスCART19および非修飾(UTD)T細胞と比較して、CD3x28活性化およびヒト化CART19候補形質導入後の増殖の間、T細胞のサイズは極めて類似した。
実験で、マウスCART19および非修飾(UTD)T細胞と比較して、CD3x28活性化および種々のヒト化CART19候補形質導入後の増殖の間に蓄積されるT細胞数にほとんど差は示されなかった。
ヒト化CART19の細胞表面発現は、マウスCART19と同等であり、発現レベルは極めて類似した。各ヒト化CART19形質導入T細胞の細胞表面発現染色パターンおよびこれらのプロファイルから計算された平均蛍光強度(MFI)をプロットするヒストグラムの重層は、形質導入された細胞のパーセンテージとよく相関する。
ヒト化CART19の細胞表面発現は、マウスCART19と同等であり、発現レベルは極めて類似した。各ヒト化CART19形質導入T細胞の細胞表面発現染色パターンおよびこれらのプロファイルから計算された平均蛍光強度(MFI)をプロットするヒストグラムの重層は、形質導入された細胞のパーセンテージとよく相関する。
さらに、ヒト化CART19は、CD19発現標的細胞のターゲティングにおいて類似の特異的細胞毒活性を有し、マウスCART19と同等である。CSFE標識K562cc(図1A。非発現CD19対照)、K562.CD19(図1B、CD19を発現するように形質導入したK562細胞)またはPt14(図1C、CLL患者からのB細胞)をターゲティングするエフェクターヒト化CART19細胞でのエフェクター対標的(E:T)比の用量設定を使用する16時間フローベースの殺細胞アッセイ。ヒト化CART19細胞全ての細胞溶解性活性は類似し、マウスCART19と同等である。異なる標的間の細胞溶解活性の差は類似し、同等であり、マウスCART19の活性がCART19のヒト化形態で保持されることを示す。
標的細胞と混合して6日後のCFSE有標ヒト化CART19細胞のヒストグラム重層は、その増殖能を示す(図5)。CAR19から送達される増殖性応答は、正の臨床応答を生じるために、標的細胞と接触し、破壊した後の必要な応答である。親細胞株から薄められる娘細胞の分裂の指標である、SS1-BBz CSFE染色の希釈は、ターゲティング非依存的機構で分裂を維持する非休止T細胞の結果である。
増殖する細胞集団全体の能力を、TCRと共刺激因子CD28の内在性結合を模倣するCD3x28ビーズで評価する。データは、各細胞集団が同等な増殖能を有することを示す。全ヒト化およびマウスCART19細胞は、CD19を発現するK562細胞との接触により、強く、そして同等に増殖する。ヒト化CART19細胞はまたCLL患者から得たB細胞に良好に応答するが、いくつかの応答はわずかに低いように見える。図2Aおよび2Bに示すように、ヒト化CART19細胞2136、2137、2140、2141、2144および2146は、CSFE染色の大きな希釈により示されるように、わずかにより強い増殖を有すると見ることができる。これらの構築物は、全て、軽から重への同じ可変鎖配向を有し、これが、最適な配向であることを示す。重鎖CDR2部位のアミノ酸変化の精査(表1)は、YSSSL、YQSSLおよびYNSSL(各々配列番号28、29および30)のバリエーションが、標的と接触した後の、より強い増殖を有するように見える構築物に現れることを明らかにする。さらに、これらの観察された構築物は、
3コピーのサブユニットを含むG4Sリンカー(3G4S)(配列番号107)および4コピーのサブユニットを含むG4Sリンカー(4G4S)(配列番号106)の両者を含み、リンカーサイズが機能に影響しなかったことを示す。
3コピーのサブユニットを含むG4Sリンカー(3G4S)(配列番号107)および4コピーのサブユニットを含むG4Sリンカー(4G4S)(配列番号106)の両者を含み、リンカーサイズが機能に影響しなかったことを示す。
上記増殖性拡大から、腫瘍接触5日後の総細胞数を決定する。細胞は、最初に播種したより数の減少を示し、活性化が生存維持に必要であることを示す。内在性活性化対照を分析し、6日後の総細胞数が類似することを示した。CD19を発現するK562細胞をターゲティングするヒト化CART19細胞は、2つのマウスCART19細胞とも高細胞数で終わり、2146が類似の値を有する他の構築物をわずかに超えた。総細胞数を、患者14からのB細胞(pt14)に曝した6日後にも分析し、興味深いことに先に選択した、全て、軽鎖から重鎖配向を有し、3アミノ酸変異YSSSL、YQSSLおよびYNSSL(それぞれ配列番号28、29および30)を有するヒト化CART19構築物2146、2144、2136、2141および2137が、マウスCART19より高い、高い総細胞数をもたらすことが示される。種々のヒト化抗CD19CARクローンの間のこの予測外の差異は、これらの構築物を形質導入したCART細胞の良好な臨床効果に反映され得る。
CD19を発現しない対照K562細胞に曝した後のヒト化CART19細胞から産生されるサイトカインの背景レベルを分析した。24時間上清を、luminex 30-plexパネルを使用して分析した。内在性免疫系のCD3x28ビーズでの刺激からの潜在的サイトカインプロファイルは、細胞集団の各々が、同等なサイトカインプロファイルを有することを示す。
ヒト化CART19およびマウスCART19が、同じ標的に応答したとき、類似レベルの類似サイトカインプロファイルを産生することもデータは示す。サイトカインプロファイルは、Pt14標的細胞をターゲティングしたとき、低かったが類似した。
ヒト化CART19およびマウスCART19が、同じ標的に応答したとき、類似レベルの類似サイトカインプロファイルを産生することもデータは示す。サイトカインプロファイルは、Pt14標的細胞をターゲティングしたとき、低かったが類似した。
実施例5:インビボALLモデルにおけるヒト化CD19 CAR T細胞処置
初代ヒトALL細胞を、インビトロで培養することなく免疫無防備状態マウスで増殖させ得る。これらのマウスを、臨床で見られるであろう、患者集団を表すモデルにおけるキメラ抗原受容体(CAR)T細胞の有効性の試験に使用する。ここで使用するモデル、HALLX5447は、CAR T細胞の有効性を試験する試験に使用する前に、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)マウスで2回継代した。
初代ヒトALL細胞を、インビトロで培養することなく免疫無防備状態マウスで増殖させ得る。これらのマウスを、臨床で見られるであろう、患者集団を表すモデルにおけるキメラ抗原受容体(CAR)T細胞の有効性の試験に使用する。ここで使用するモデル、HALLX5447は、CAR T細胞の有効性を試験する試験に使用する前に、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)マウスで2回継代した。
マウスCD19 CAR T細胞は、初代ヒトALLのNSGマウスモデルにおいて白血病細胞を標的とし、殺すことが先に示されている。CD19 scFv(一本鎖Fc可変フラグメント)は、ヒト化されており、本実施例は、ヒト化CD19 CAR(CAR 2)を発現するT細胞がインビボでALL腫瘍細胞を除去する能力を、マウスCD19 CAR T細胞と比較する。ここで、これらの細胞の有効性は、ヒトCD19+細胞の末梢血FACS分析でアッセイして、確立された初代ヒトALLを有するマウスにおいて直接比較されている。1.5×106初代ALL細胞を、静脈内にインプラント後、血中の2.5~4%CD19+ヒト細胞の疾患負荷が、腫瘍インプラント2週間後までに達成された。このCD19パーセンテージは、マウスの血中の総細胞のものである。CAR T細胞での処置前のマウスにおけるヒト細胞の100%が腫瘍細胞である。末梢血における2%を超えるCD19+ヒト細胞のパーセンテージは、このモデルにおける確立されたヒトALL疾患と考えられる。白血病担持マウスを、白血病がマウスで確立されたら、腫瘍インプラント約2~3週間後にCAR T細胞で処置した。各群のマウスを、5×106総ヒトT細胞で処置した。ドナーヒトT細胞のCAR発現レンチウイルスでの形質導入効率は、40~60%であった。T細胞での処置後、疾患進行のバイオマーカーとして血中のCD19+ヒト細胞のパーセンテージを分析するためにマウスから毎週採血した。
材料および方法:
初代ヒトALL細胞:初代細胞は、インプラント前にインビトロで培養しなかった。これらの細胞を、ALLの患者から回収し、確立および増殖のためにマウスに導入した。腫瘍細胞がマウスで増大した後、骨髄および脾細胞を回収し、再インプラントのために、別々のバッチで生存可能なように凍結した。細胞を、90%FBSおよび10%DMSO中、5×106細胞/ミリリットルの最小濃度で凍結させた。再インプラントのために、凍結ALL細胞を解凍し、ヒト化CD19 CAR T細胞およびマウスCD19 CAR T細胞の抗腫瘍有効性の比較に使用するマウスを産生するために、NSGマウスに静脈内注射した。
初代ヒトALL細胞:初代細胞は、インプラント前にインビトロで培養しなかった。これらの細胞を、ALLの患者から回収し、確立および増殖のためにマウスに導入した。腫瘍細胞がマウスで増大した後、骨髄および脾細胞を回収し、再インプラントのために、別々のバッチで生存可能なように凍結した。細胞を、90%FBSおよび10%DMSO中、5×106細胞/ミリリットルの最小濃度で凍結させた。再インプラントのために、凍結ALL細胞を解凍し、ヒト化CD19 CAR T細胞およびマウスCD19 CAR T細胞の抗腫瘍有効性の比較に使用するマウスを産生するために、NSGマウスに静脈内注射した。
マウス:6週齢NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)マウスを、Jackson Laboratory(stock number 005557)から受け取った。動物を、実験の少なくとも3日前からNovartis NIBRI動物施設に気候順化させた。動物を、Novartis ACUC規則およびガイドラインに従い取り扱った。
腫瘍インプラント:インビボで連続的に継代した初代ヒトALL細胞、モデルHALLX5447を、37℃水浴で解凍した。次いで細胞を15mlコニカルチューブに移し、冷無菌PBSで2回洗浄した。次いで、初代ALL細胞を計数し、15×106細胞/ミリリットルPBSの濃度で再懸濁させた。細胞を氷上に置き、直ぐ(1時間以内)にマウスにインプラントした。ALL細胞を、尾静脈から100μl体積で、計1.5×106細胞/マウスで注射した。
CAR T細胞投薬:マウスに、腫瘍インプラント16日後5×106 T細胞を投与した。細胞を37℃水浴で一部解凍し、細胞含有チューブへの1mlの冷無菌PBSの添加により完全に解凍した。解凍細胞を15mlファルコンチューブに移し、PBSで最終体積10mlに調節した。細胞を、各回1000rpmで10分で洗浄し、次いで血球計数器で計数した。次いでT細胞を、50×106細胞/ml冷PBSで最懸濁し、マウスに投薬するまで氷の上に維持した。マウスに、100μlのCAR T細胞を、5×106 T細胞/マウスの要領で、尾静脈から静脈内注射した。群あたり5マウスを、100μlのPBS単独(PBS)、未処置T細胞(偽)、マウスCD19 CAR T細胞(muCTL019)またはヒト化CD19 CAR T細胞(huCTL019)のいずれかで処置した。未処置T細胞、muCTL019 T細胞およびhuCTL019 T細胞は、全て、並行して同じヒトドナーから調製した。
動物モニタリング:マウスの健康状態を、週2回の体重測定を含み、連日モニターした。体重の変化パーセントを(BW現在-BW初期)/(BW初期)×100%として計算した。腫瘍負荷を、末梢血FACS分析により毎週モニターした。マウスを、尾静脈から、氷上に置いたEDTA被覆チューブに毎週採血した。10~20μlの血液を、氷上の96ウェルプレートにプレーティングした。赤血球を、ACK赤血球溶解緩衝液(Life Technologies, catalog number A10492-01)で溶解し、冷PBSで2回洗浄した。細胞を、ヒトおよびマウスFcブロック(Miltenyi Biotec, catalog numbers 130-059-901および130-092-575)のFcブロッキングミックスと30分インキュベートし、次いで、抗ヒトCD19抗体と30分インキュベートした。細胞を、2%パラホルムアルデヒド溶液で20分固定し、洗浄し、PBS+2%FBSに一夜保存し、その後BD CantoまたはFortessaで分析し、続いてFlowJo FACS分析ソフトウェアでさらに分析した。ヒトHALLX5447 ALL腫瘍担持NSGマウスの血中のヒトCD19+細胞のパーセントを決定するために、細胞を分析した。血中のCD19パーセンテージは、平均±平均値の標準誤差(SEM)として報告する。
パーセント処置/対照(T/C)値を、次の式を使用して計算した。
ΔT≧0ならば、%T/C=100×ΔT/ΔC;
ΔT<0ならば、%退縮=100×ΔT/T初期;
式中、T=試験最終日の薬物処置群の平均末梢血CD19パーセンテージ;T初期=投薬初日の薬物処置群の平均末梢血CD19パーセンテージ;ΔT=試験最終日の薬物処置群の平均末梢血CD19パーセンテージ-投薬初日の薬物処置群の平均末梢血CD19パーセンテージ;C=試験最終日の対照群の平均末梢血CD19パーセンテージ;およびΔC=試験最終日の対照群の平均末梢血CD19パーセンテージ-投薬初日の対照群の平均末梢血CD19パーセンテージ。
ΔT≧0ならば、%T/C=100×ΔT/ΔC;
ΔT<0ならば、%退縮=100×ΔT/T初期;
式中、T=試験最終日の薬物処置群の平均末梢血CD19パーセンテージ;T初期=投薬初日の薬物処置群の平均末梢血CD19パーセンテージ;ΔT=試験最終日の薬物処置群の平均末梢血CD19パーセンテージ-投薬初日の薬物処置群の平均末梢血CD19パーセンテージ;C=試験最終日の対照群の平均末梢血CD19パーセンテージ;およびΔC=試験最終日の対照群の平均末梢血CD19パーセンテージ-投薬初日の対照群の平均末梢血CD19パーセンテージ。
100%~42%の範囲のT/C値を、抗腫瘍活性がないまたは最小であると解釈した;≦42%および>10%のT/C値は、抗腫瘍活性または腫瘍増殖阻害を有すると解釈する。T/C値≦10%または退縮値≧-10%は、腫瘍静止と解釈する。退縮値<-10%は、退縮として報告する。
結果:
マウスおよびヒト化CD19 CAR T細胞の抗腫瘍活性を、ヒトALLの初代モデルで評価し、直接比較した。0日目の腫瘍インプラント後、マウスを数処置群に無作為化し、16日目に5×106 T細胞で静脈内処置した。ALL疾患負荷および動物健康を、動物がエンドポイントに達するまでモニターした。全群のマウスを、対照群における疾患負荷が、末梢血でヒトCD19+細胞が80%を超えたときである腫瘍インプラント65日後に殺した。
マウスおよびヒト化CD19 CAR T細胞の抗腫瘍活性を、ヒトALLの初代モデルで評価し、直接比較した。0日目の腫瘍インプラント後、マウスを数処置群に無作為化し、16日目に5×106 T細胞で静脈内処置した。ALL疾患負荷および動物健康を、動物がエンドポイントに達するまでモニターした。全群のマウスを、対照群における疾患負荷が、末梢血でヒトCD19+細胞が80%を超えたときである腫瘍インプラント65日後に殺した。
対照群と、マウスまたはヒト化CD19 CAR T細胞のいずれかで処置された群で疾患負荷に明らかな差が見られ、腫瘍インプラント24日後からP<0.01であり、65日目の試験最終日まで続いた。マウスおよびヒトCD19 CAR T細胞は、NSGマウスにおけるヒトHALLX5447 ALL腫瘍細胞増殖の制御に類似する能力を示した。両群とも、HALLX5447インプラント21日後に12~15%ヒトCD19+細胞のピーク末梢血疾患レベルを示した。腫瘍細胞インプラント42日後、ヒトCD19+細胞はhuCTL019で検出不可能であり、一方muCTL019群におけるヒトCD19+細胞のパーセンテージは約1%まで落ちた。マウスおよびヒト化CD19 CAR T細胞の両者とも、このモデルで初代ヒトALL細胞の増殖の制御に同等な能力をもたらした(P>0.05)。偽形質導入T細胞群の%T/C値は94.40%であり、偽形質導入T細胞が抗腫瘍活性を有しないことを示した。muCTL019群の退縮パーセントは-89.75%であり、huCTL019群は-90.46%であり、これらの処置のいずれもHALLX5447腫瘍モデルの退縮を起こすことができることを示す。これらのマウスにおける疾患負荷の指標としての末梢血ヒトCD19+細胞パーセンテージを図7に示す。T細胞を何も受けなかったPBS処置群は、静脈内にインプラントしたNSGマウスのベースライン初代ALL腫瘍増殖動態を示した。偽処置群は、CAR T細胞と同じインビトロ増殖過程を経た未処置T細胞を受けた。これらの細胞は、この腫瘍モデルにおけるT細胞の非特異的応答を示すためのT細胞対照として役立つ。PBS群および偽形質導入T細胞処置群の両者とも、試験中の腫瘍進行継続を示した。マウスおよびヒト化CD19 CAR T細胞のいずれも、5×106 T細胞注射1週間以内に疾患の進行を制御し、この65日試験の間中の持続した疾患制御の類似する能力を示す。
マウスおよびヒト化CD19 CAR形質導入T細胞の抗腫瘍活性を、初代ヒトALLモデルを担持するNSGマウス、HALLX5447における有効性試験において評価した。この試験は、マウスおよびヒト化CD19 CAR T細胞(muCTL019およびhuCTL019)の両者が、ヒトALLの初代モデルにおいて抗腫瘍応答を開始できることを示す。さらに、この応答は、末梢血疾患負荷によりアッセイして、muCTL019およびhuCTL019細胞で同じである。マウスおよびヒト化CD19 CAR T細胞のいずれも、T細胞を投与されたマウスで1週間以内に初代ALL増殖を制御する。処置後最初は、疾患負荷は増加を続け、その後実質的に検出不可能なレベルまで減少した。マウスまたはヒト化CAR T細胞いずれかの1処置が、対照処置マウスにおける65日疾患進行の間、持続した抗腫瘍応答をもたらした。ヒト化CD19 CAR T細胞は、マウスCD19 CAR T細胞で見られるのと類似した、有効な抗CD19腫瘍応答および対照ALL疾患負荷を開始する能力を有することが示された。
実施例6:多発性骨髄腫の処置に使用するためのCD19 CAR T細胞
化学療法、標的化治療および自己幹細胞移植の現在レジメンでも、骨髄腫は不治の疾患と考えられている。本実施例は、キメラ抗原受容体でCD19を指向する自己T細胞(レンチウイルス/CD19:4-1BB:CD3ゼータ;“CART19”またはCTL019としても既知)での多発性骨髄腫(MM)の処置を記載する。この実施例は、CD19指向CAR治療が、極めて低い(ほとんどの方法では検出不可能な)レベルのCD19を発現する、骨髄腫幹細胞および/または腫瘍細胞のターゲティングに基づき、深い、長期持続性寛解を確立する能力を有することを示す。
化学療法、標的化治療および自己幹細胞移植の現在レジメンでも、骨髄腫は不治の疾患と考えられている。本実施例は、キメラ抗原受容体でCD19を指向する自己T細胞(レンチウイルス/CD19:4-1BB:CD3ゼータ;“CART19”またはCTL019としても既知)での多発性骨髄腫(MM)の処置を記載する。この実施例は、CD19指向CAR治療が、極めて低い(ほとんどの方法では検出不可能な)レベルのCD19を発現する、骨髄腫幹細胞および/または腫瘍細胞のターゲティングに基づき、深い、長期持続性寛解を確立する能力を有することを示す。
侵襲性二次形質細胞白血病を有する患者の処置において、我々は、サルベージ自己幹細胞移植2日後に投与したCART19が、複数系統の化学療法で進行している患者における形質細胞白血病の急速な排除と、極めて良好な部分応答をもたらしたことを発見した。この患者は、処置前数ヶ月輸血に頼っており、処置2ヶ月後、彼女の血球数は回復し(正常範囲の血小板数および白血球数)、輸血の必要がなくなり、退院した。
骨髄腫細胞はCD19を天然で発現しないため、CART19処置がこの腫瘍で急速かつ顕著な腫瘍応答を誘発することは驚きであった。特定の理論に縛られないが、(1)骨髄腫細胞は、フローサイトメトリーにより伝統的にCD19発現が陰性であると考えられていたが、骨髄腫細胞が、発現がフローサイトメトリーまたは免疫組織化学ではなくRNAで検出可能であるような、極低レベルのCD19を発現し得ることを示すデータがある;および(2)多発性骨髄腫を生じ、化学療法に特に耐性である癌性幹細胞と考えられる、クローン形質B細胞をターゲティングする概念のために、CART19が骨髄腫の処置に使用できたと考えた。B細胞と骨髄腫腫瘍細胞の間にクローン関係があるが、伝統的骨髄腫治療は、B細胞ではなく、悪性形質細胞を目標とした。骨髄腫を処置するためのCART19は、それゆえに大部分の骨髄腫治療と異なる細胞集団を標的とする。
我々の1名の患者の経験において、患者は循環形質細胞を有し、CD19発現について彼女の腫瘍細胞を試験できた。彼女の腫瘍細胞の約1~2%がCD19抗原を発現した(図8)。それゆえに、CART19が、彼女の腫瘍細胞の極めて小さな集団に直接効果を有し、極めて有効な部分応答を有し得ると考えられたが、CD19+腫瘍細胞の極めて小さな集団のみのターゲティングに基づいては予測されなかった。
この場合、CART19を、高用量メルファラン後の移植自己幹細胞レスキュー後に投与した。これは骨髄腫の標準的治療であるが、治癒的ではない。さらに、この患者は、先にタンデム自己幹細胞移植を受け、移植後早期に(<6ヶ月)再発した。特定の理論に縛られることを望まないが、本実施例に記載するようなCART19細胞の使用は、サルベージ自己幹細胞移植と組み合わせたとき、骨髄腫処置の重複しない機構を有し得る。
難治性多発性骨髄腫を有する患者を、骨髄破壊的化学療法およびASCT後CTL019で処置した。検出可能なCTL019の喪失および正常CD19陽性B細胞の再構成にも関わらず、寛解は維持され、この応答が持続したCTL019活性を必要としなかったことを示す。さらに、この患者の応答は、新生物形質細胞の大部分(99.95%)がフローサイトメトリーおよびRT-PCRの両者でCD19陰性であったにも関わらず実現された。
この患者の優性新生物形質細胞集団における検出可能なCD19発現の不在は、CTL019の臨床的に意義のある標的が、この優性CD19陰性集団の外にあることを示唆した。多発性骨髄腫患者における新生物形質細胞は、遺伝的、免疫表現的および機能的不均一性を示す。特定の亜集団は、抗骨髄腫治療を通してクローンの生存を必要とし得る。ここに報告する患者において、例えば、形質細胞の小CD19発現サブセットは、相対的にメルファラン耐性であるが、CTL019に感受性であるはずである。この治験は、クローンの小サブセットの治療的ターゲティングが、従来の抗骨髄腫治療と組み合わせたとき、耐久性のある臨床的有用性に至り得ることを示唆する。
あるいは、この患者におけるCTL019の臨床的に意義のある標的は、新生物形質細胞集団の外にあり得る。例えば、CTL019は、相対的に小さいが、新生物形質細胞に至る幹細胞集団を標的とし得る。多発性骨髄腫は、それゆえに、Bリンパ球を標的とするCTL019のような治療が、直接形質細胞を標的とする治療の有用な補助剤であるように、単に最終分化した形質細胞ではなく、多数の後期B細胞系譜細胞型の疾患であり得る。
フェーズI治験で、さらに10名の多発性骨髄腫患者をCART19で処置する予定であり、少なくとも3名の患者が今日まで処置されている。
フェーズI治験で、さらに10名の多発性骨髄腫患者をCART19で処置する予定であり、少なくとも3名の患者が今日まで処置されている。
用量根拠およびリスク/ベネフィット
我々は、本プロトコールで、静脈内投与経路からの一律の投薬の使用を選択した。このプロトコールの主要目的は、多発性骨髄腫を有する患者へのCART-19細胞投与の安全性および実施可能性を試験することであった。予測された一次毒性は、(1)CARが悪性または正常B細胞上の代替CD 19抗原に遭遇したときの、サイトカイン放出;(2)リツキシマブ治療に類似する、正常B細胞の枯渇;(3)MMのために増殖/共刺激自己T細胞がASCTと組み合わされた特に以前に見られたような、移植片対宿主病に似たステロイド応答性皮膚および消化器症候群であった。理論的懸念は、CART-19 T細胞の形質転換または未制御の増殖が、高レベルのCD 19に応答して生じるか否かであった。CLL患者の他の治験と比較して、その治験で処置された難治性CLL患者における悪性B細胞の負荷より、MMにおけるクローン形質B細胞の負荷がはるかに低いと予測されるため、本適用におけるこの懸念はほとんどなかった。
我々は、本プロトコールで、静脈内投与経路からの一律の投薬の使用を選択した。このプロトコールの主要目的は、多発性骨髄腫を有する患者へのCART-19細胞投与の安全性および実施可能性を試験することであった。予測された一次毒性は、(1)CARが悪性または正常B細胞上の代替CD 19抗原に遭遇したときの、サイトカイン放出;(2)リツキシマブ治療に類似する、正常B細胞の枯渇;(3)MMのために増殖/共刺激自己T細胞がASCTと組み合わされた特に以前に見られたような、移植片対宿主病に似たステロイド応答性皮膚および消化器症候群であった。理論的懸念は、CART-19 T細胞の形質転換または未制御の増殖が、高レベルのCD 19に応答して生じるか否かであった。CLL患者の他の治験と比較して、その治験で処置された難治性CLL患者における悪性B細胞の負荷より、MMにおけるクローン形質B細胞の負荷がはるかに低いと予測されるため、本適用におけるこの懸念はほとんどなかった。
用量根拠
最初の3患者について、我々は、1.4×l07~l.l×l09 CART-19細胞の範囲の用量で臨床活性を観察した。この観察は、少なくとも最初の3名の患者処置において、明白な用量応答相関がないことを示す。完全応答は、2対数倍異なる用量が投与された患者で観察された。それゆえに、代謝される標準的薬物と異なり、CAR T細胞は、広い用量応答範囲を有し得る。CAR T細胞が、患者内で広範に増殖できることが最もありそうな理由である。我々は、それゆえに注入のためのl~5×108 CART-19細胞の用量範囲を設定した。救済使用基準で提供されるこの一患者治験において、この患者は最大5×l08 CART19細胞を受け、用量の下限はなかった。10名患者治験について、患者は、1~5×107 CART-19細胞を受ける予定である。
最初の3患者について、我々は、1.4×l07~l.l×l09 CART-19細胞の範囲の用量で臨床活性を観察した。この観察は、少なくとも最初の3名の患者処置において、明白な用量応答相関がないことを示す。完全応答は、2対数倍異なる用量が投与された患者で観察された。それゆえに、代謝される標準的薬物と異なり、CAR T細胞は、広い用量応答範囲を有し得る。CAR T細胞が、患者内で広範に増殖できることが最もありそうな理由である。我々は、それゆえに注入のためのl~5×108 CART-19細胞の用量範囲を設定した。救済使用基準で提供されるこの一患者治験において、この患者は最大5×l08 CART19細胞を受け、用量の下限はなかった。10名患者治験について、患者は、1~5×107 CART-19細胞を受ける予定である。
一般的設計
これは、救済使用基準で提供される一患者治験であり、CART-19を発現するように形質導入された自己T細胞の注入が安全であることを決定したフェーズI治験後に設計された。本治験の主要な目的は、最初のASCT後の初期再発後にサルベージASCTを受けている患者におけるCART-19 T細胞の安全性、耐容性および生着能の決定であった。プロトコールは、オープンラベルパイロット試験からなる。
これは、救済使用基準で提供される一患者治験であり、CART-19を発現するように形質導入された自己T細胞の注入が安全であることを決定したフェーズI治験後に設計された。本治験の主要な目的は、最初のASCT後の初期再発後にサルベージASCTを受けている患者におけるCART-19 T細胞の安全性、耐容性および生着能の決定であった。プロトコールは、オープンラベルパイロット試験からなる。
エントリー対象は、骨髄生検およびMMについての通例の臨床検査および画像評価を受ける。適格対象は、CART-19製造のための多数の末梢血単核細胞(PBMC)を得るための、定常状態アフェレシスを受ける。T細胞をPBMCから精製し、TCRζ/4-1BBレンチウイルスベクターで形質導入し、インビトロで増幅し、将来的投与のために凍結する。製造が成功したT細胞を有する患者の数と比較して、不適切なT細胞コレクション、増殖または製造を有する患者の数を記録し、産物製造の実施可能性は、この患者集団で問題であるとは予測されない。
対象は、一般にさらに2回のASCTを実施するために、最初のASCTの調製において実施した動員/コレクションから保存されたままになっている十分な末梢血幹細胞を有していた。そうでないものは、処置医の選択に従うレジメンにより、定常状態アフェレシスの前または後に二回目の動員/コレクションに付す。初期白血球除去約2週間後、対象は入院し、高用量メルファラン(-2日目)、続いて2日後に自己幹細胞(0日目)を受け、全対象は、12~14日後にCART-19細胞注入を受ける(+12~14日目)。10名までの患者を登録する。
全対象は、治験の4週間、一定間隔で安全性ならびにCART-19細胞の生着および残留性を評価するために血液検査をする。+42日目および+100日目に、対象は、骨髄形質細胞負荷およびCART-19細胞の骨髄への輸送を評価するための骨髄吸引/生検を受ける。公式の応答評価を、国際骨髄腫作業部会(IMWG)基準136に従い100日目に行い、TTPを多発性骨髄腫患者の日常的診療に従いモニターする。本治験で測定された主有効性転帰は、患者の初期ASCTのTTPと、本治験のASCT後のTTPの比較である。
本治験の主要評価項目がASCTを伴うCART-19細胞の注入の安全性および実施可能性であるため、本治験は、初期停止規則を用いる。簡潔にいうと、最初の5対象処置において重篤な、予測されない有害事象が2を超えないならば、次いで、本治験を目標登録数10に向けて、さらに5対象で行う。我々は、処置対象をCART-19注入40日後(すなわち、42日目の最初の公的応答評価まで)観察し、その後5対象が登録され、そのように観察されるまで、その後の対象を登録する。第二群の5患者の処置について、対象間で待機時間は必要ない。
集中的フォローアップの6ヶ月後、対象は、2年間、少なくとも年四回、病歴、身体検査および血液検査を評価する。この評価後、対象は、最大さらに13年間、毎年電話および問診によるフォローアップの繰り越し試験に入り、新規悪性腫瘍の発生のような、長期健康問題の診断のための評価をする。
初期治験エンドポイント
このパイロット治験は、最初のASCT後早期再発後のMMについてサルベージASCTを受けた患者における、CD19 TCRζ/4-lBBを形質導入した自己T細胞の安全性および実施可能性を試験するために設計する。
このパイロット治験は、最初のASCT後早期再発後のMMについてサルベージASCTを受けた患者における、CD19 TCRζ/4-lBBを形質導入した自己T細胞の安全性および実施可能性を試験するために設計する。
初期安全性および実施可能性エンドポイントは、次のものを含む。
NCJ CTC 2として定義される、治験薬関連有害事象の発生:注入時から24週目までのあらゆる時点での、治験薬処置との因果関係が、可能な、疑われる、または確実であるグレード3段階の徴候/症状、臨床検査毒性および臨床的事象。これは、注入毒性およびCART-19細胞と関係する可能性のあるあらゆる毒性を含み、次のものを含むが、これらに限定されない。
a. 発熱
b. 発疹
c. 好中球減少症、血小板減少症、貧血、骨髄形成不全
d. 肝機能不全
e. 肺浸潤または他の肺毒性
f. 消化管または皮膚に影響するGVHD様症候群。
NCJ CTC 2として定義される、治験薬関連有害事象の発生:注入時から24週目までのあらゆる時点での、治験薬処置との因果関係が、可能な、疑われる、または確実であるグレード3段階の徴候/症状、臨床検査毒性および臨床的事象。これは、注入毒性およびCART-19細胞と関係する可能性のあるあらゆる毒性を含み、次のものを含むが、これらに限定されない。
a. 発熱
b. 発疹
c. 好中球減少症、血小板減少症、貧血、骨髄形成不全
d. 肝機能不全
e. 肺浸潤または他の肺毒性
f. 消化管または皮膚に影響するGVHD様症候群。
患者アフェレシス産物からCART-19細胞を製造する実施可能性。ベクター遺伝子導入効率、T細胞純度、生存能、無菌性および腫瘍汚染についてリリース基準に満たない製造産物の数を決定する。
CART19での自己幹細胞移植後の応答の強度(depth)および期間を、標準的自己幹細胞移後に各患者が最初に達成した応答の強度および期間と比較する。
CART19での自己幹細胞移植後の応答の強度(depth)および期間を、標準的自己幹細胞移後に各患者が最初に達成した応答の強度および期間と比較する。
対象選択および除外
編入基準
対象は、MMについて先のASCTを受けていなければならず、幹細胞注入365日以内に進行していなければならない。計画されたタンデムASCT複合レジメンの一部として先に2回ののASCTを受けた対象は適格である。進行は、疾患進行のIMWG基準に従い定義され、または、初期ASCT後CRまたはsCRに達した患者について、CRからの再発の基準に従い定義される(Durie et al. Leukemia 2006;20(9):1467-1473)。注:患者が先のASCTから365日以内に登録されなければないとの条件はなく、患者は、本治験登録前に、先のASCT後の再発/進行後、実験的薬剤を含む他の薬剤で処置されていてよい。
対象は、インフォームドコンセント書面に署名しなければならない。
編入基準
対象は、MMについて先のASCTを受けていなければならず、幹細胞注入365日以内に進行していなければならない。計画されたタンデムASCT複合レジメンの一部として先に2回ののASCTを受けた対象は適格である。進行は、疾患進行のIMWG基準に従い定義され、または、初期ASCT後CRまたはsCRに達した患者について、CRからの再発の基準に従い定義される(Durie et al. Leukemia 2006;20(9):1467-1473)。注:患者が先のASCTから365日以内に登録されなければないとの条件はなく、患者は、本治験登録前に、先のASCT後の再発/進行後、実験的薬剤を含む他の薬剤で処置されていてよい。
対象は、インフォームドコンセント書面に署名しなければならない。
対象は、メルファラン注入の日の前12週間以内に検査して、次の基準により規定される、高用量メルファランを受けるのに十分な重要臓器機能を有さなければならない:a. 血清クレアチニン≦2.5または推定クレアチニンクリアランス≧30ml/分および透析依存ではない。b. SGOT≦正常上限の3倍および総ビリルビン≦2.0mg/dl(高ビリルビン血症がジルベール症候群に寄与している患者を除く)。c. 左心室駆出率(LVEF)≧45%またはLVEFが<45%であるならば、臨床的に有意な心血管機能障害がないことを確認する心臓病専門医による正式な評価。LVEF評価は、登録の前6週間以内に行わなければならない。d. 予測値の≧40%のFEV1、FVC、TLC、DLCO(肺体積およびヘモグロビン濃度の適切な調節後)の十分な肺機能。肺機能試験は、登録の6週間以内に行っていなければならない。
対象は、高い活動指標が単に骨痛によるものでない限り、ECOG活動指標0~2を有しなければならない。
対象は、高い活動指標が単に骨痛によるものでない限り、ECOG活動指標0~2を有しなければならない。
除外基準
対象は
何らかの活動性で未制御の感染。
活動性B型肝炎、C型肝炎またはHIV感染。
概説した参加を妨げる、何らかの未制御の医学的障害
を有してはならない。
対象は
何らかの活動性で未制御の感染。
活動性B型肝炎、C型肝炎またはHIV感染。
概説した参加を妨げる、何らかの未制御の医学的障害
を有してはならない。
処置レジメン
再発/進行性多発性骨髄腫の治療
患者は、登録前に、処置医の選択による再発/進行性多発性骨髄腫のための治療を受けていでもよい。治療は、登録後も続けてよい。
患者は、アフェレシス2週間前および高用量メルファランの前2週間全治療を中止しなければならない。アフェレシスと高用量メルファランの間に2週間以上経過すると予測なれるならば、患者は、処置医の裁量でアフェレシス後治療を再開してよい。
再発/進行性多発性骨髄腫の治療
患者は、登録前に、処置医の選択による再発/進行性多発性骨髄腫のための治療を受けていでもよい。治療は、登録後も続けてよい。
患者は、アフェレシス2週間前および高用量メルファランの前2週間全治療を中止しなければならない。アフェレシスと高用量メルファランの間に2週間以上経過すると予測なれるならば、患者は、処置医の裁量でアフェレシス後治療を再開してよい。
高用量メルファラン(-2日目)
患者は、-3日目または-2日目に入院し、処置プロトコール開始前に、腫瘍崩壊症候群についてのパラメータのモニタリングを含む、担当医による試験および日常的臨床検査を受ける。MMモニタリング臨床検査(SPEP、定量的免疫グロブリンおよび無血清軽鎖分析)のための血液を、これらの試験が、入院7日以内に行われていないならば、治療開始前に採血する。
高用量治療は、-2日目の約20分にわたる200mg/m2用量のメルファランの静脈内投与からなる。メルファランの用量は、>70歳の患者および処置医の裁量により200mg/m2に耐容性でないと想定される全年齢の患者について140mg/m2に減量される。全患者は、デキサメサゾンおよび標準抗生物質予防薬を含み得る、標準的制吐予防薬を投与される。
患者は、-3日目または-2日目に入院し、処置プロトコール開始前に、腫瘍崩壊症候群についてのパラメータのモニタリングを含む、担当医による試験および日常的臨床検査を受ける。MMモニタリング臨床検査(SPEP、定量的免疫グロブリンおよび無血清軽鎖分析)のための血液を、これらの試験が、入院7日以内に行われていないならば、治療開始前に採血する。
高用量治療は、-2日目の約20分にわたる200mg/m2用量のメルファランの静脈内投与からなる。メルファランの用量は、>70歳の患者および処置医の裁量により200mg/m2に耐容性でないと想定される全年齢の患者について140mg/m2に減量される。全患者は、デキサメサゾンおよび標準抗生物質予防薬を含み得る、標準的制吐予防薬を投与される。
幹細胞再注入(0日目)
幹細胞注入を0日目に、高用量メルファラン投与から少なくとも18時間後に行う。幹細胞を、標準的な施設の慣例に従う前投薬後に約20~60分にわたり静脈内点滴する。少なくとも2×106 CD34+前駆細胞/kg体重を点滴しなければならない。さらに、少なくとも1×106 CD34+前駆細胞/kg体重を、生着遅延または不生着の場合に注入すべきバックアップ幹細胞産物として用意しなければならない。G-CSFを、+5日目に開始してSQで投与し、用量は標準的な施設の慣例に従う。輸血その他の支援処置を、標準的施設ガイドラインに従い講ずる。
幹細胞注入を0日目に、高用量メルファラン投与から少なくとも18時間後に行う。幹細胞を、標準的な施設の慣例に従う前投薬後に約20~60分にわたり静脈内点滴する。少なくとも2×106 CD34+前駆細胞/kg体重を点滴しなければならない。さらに、少なくとも1×106 CD34+前駆細胞/kg体重を、生着遅延または不生着の場合に注入すべきバックアップ幹細胞産物として用意しなければならない。G-CSFを、+5日目に開始してSQで投与し、用量は標準的な施設の慣例に従う。輸血その他の支援処置を、標準的施設ガイドラインに従い講ずる。
CART19細胞注入(+12~14日目)
最大5×107 CART-19細胞からなる単一用量のCART-19形質導入T細胞を、投与する。CD19 TCRζ4-1BBベクターを形質導入した細胞の最小許容注入用量は1×107である。CART-19細胞の単一用量を、幹細胞注入後+12~14日目に、i.v.高速点滴により注入する。患者が、12~14日ウィンドウにおいてここに記載する編入基準のいずれかに合わないならば、CART-19注入を、基準そ満たすまで+12~14日目以降に遅らせてよい。
最大5×107 CART-19細胞からなる単一用量のCART-19形質導入T細胞を、投与する。CD19 TCRζ4-1BBベクターを形質導入した細胞の最小許容注入用量は1×107である。CART-19細胞の単一用量を、幹細胞注入後+12~14日目に、i.v.高速点滴により注入する。患者が、12~14日ウィンドウにおいてここに記載する編入基準のいずれかに合わないならば、CART-19注入を、基準そ満たすまで+12~14日目以降に遅らせてよい。
維持レナリドマイド
最初のASCT後に維持レナリドマイドを受け、耐容性である対象は、処置医の判断で禁忌がないと推定されれば、約+100日目にレナリドマイド維持治療を再開する。出発用量は、先行治験が特定の患者について別の出発用量を指示しない限り、1日10mgである。維持治療を、疾患進行または不耐容性となるまで続ける。
最初のASCT後に維持レナリドマイドを受け、耐容性である対象は、処置医の判断で禁忌がないと推定されれば、約+100日目にレナリドマイド維持治療を再開する。出発用量は、先行治験が特定の患者について別の出発用量を指示しない限り、1日10mgである。維持治療を、疾患進行または不耐容性となるまで続ける。
治験薬の調製および投与
CART-19 T細胞を、CVPFで調製し、注入細胞についてのFDAの使用承認基準(例えば、細胞用量、細胞純度、無菌性、ベクター/細胞の平均コピー数など)を満たすまで、CVPFから使用に供しない。使用が許可されたら、投与のために細胞をベッドサイドに搬送する。
CART-19 T細胞を、CVPFで調製し、注入細胞についてのFDAの使用承認基準(例えば、細胞用量、細胞純度、無菌性、ベクター/細胞の平均コピー数など)を満たすまで、CVPFから使用に供しない。使用が許可されたら、投与のために細胞をベッドサイドに搬送する。
細胞解凍。凍結細胞を、ドライアイスに入れて対象のベッドサイドまで搬送する。細胞を、36℃~38℃に維持した水浴を使用して、ベッドサイドで解凍する。細胞がすべて解凍されるまで、バッグを穏やかに揉む。容器中に、凍結した塊が残っていてはならない。CART-19細胞産物が損傷を受けたか、バッグが漏れているか、その他の点で傷ついたように見えるならば、注入せず、CVPFに戻さなければならない。
前投薬。T細胞注入後の副作用は、一過性の発熱、悪寒および/または悪心を含む;レビューのためにCruz et al.(Cytotherapy 2010;12(6):743-749)参照。CART-19細胞注入前に、対象にアセトアミノフェンおよび塩酸ジフェンヒドラミンを前投薬することが推奨される。これらの投薬は、必要に応じて6時間毎に繰り返し得る。患者のアセトアミノフェンで軽減されない発熱が続くならば、非ステロイド性抗炎症剤を処方し得る。ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロンまたはデキサメサゾンのような全身コルチコステロイドはT細胞に有害な作用を有し得るため、生命に係わる緊急事態以外、患者にはこれらを投与しないことが奨められる。
発熱。対象がCAR T細胞注入後敗血症または全身菌血症を発症する稀な事態において、適切な培養および医学的管理を開始しなければならない。CART-19 T細胞製剤の汚染が疑われるならば、CVPFにおける保存サンプルを使用して、製剤の無菌性を再試験し得る。
投与。注入を、Rhoadsにおける隔離病室で、免疫抑制患者に対する注意をしながら行う。形質導入T細胞を、3方向コックを備えた18ゲージラテックス・フリーY字型血液セットによる、約10mL~20ml/分の流速の高速静脈内注入により行う。注入時間は、注入する総体積および推奨注入速度に依存する。各注入バッグは、“本人使用専用”と記載するラベルが付されていなければならない。さらに、ラベルは、対象のイニシャル、生年月日および治験番号のような少なくとも2種の本人識別表記を付する。注入前に、2名が、それぞれ独立して、対象の面前で全てのこれらの情報を確認し、確認された情報が被験者と正確に一致するかを確認する。
救急医療機器(すなわち、救急用トロリー)は、対象がアレルギー性応答または重篤な低血圧クライシスまたは注入に対する何らかの他の反応を有する場合、注入中利用可能としておく。バイタルサイン(体温、呼吸数、心拍および血圧)を注入前後、続いて、少なくとも1時間、これらのサインが正常かつ安定するまで、15分毎に確認する。対象は、医師が安全と判断するまで、その場を離れないよう求められる。
包装
注入は、1~5×107 CA T19形質導入細胞の単一用量を含み、注入についての最小許容用量は1×107 CART-19細胞である。各包装品は、注入可能グレード材料(%v/v) 31.25%plasmalyte-A、31.25%デキストロース(5%)、0.45%NaCl、最大7.5%DMSO、1%デキストラン40および5%ヒト血清アルブミンを含む一定量(体積は用量による)の凍結保存用媒体を含む。
注入は、1~5×107 CA T19形質導入細胞の単一用量を含み、注入についての最小許容用量は1×107 CART-19細胞である。各包装品は、注入可能グレード材料(%v/v) 31.25%plasmalyte-A、31.25%デキストロース(5%)、0.45%NaCl、最大7.5%DMSO、1%デキストラン40および5%ヒト血清アルブミンを含む一定量(体積は用量による)の凍結保存用媒体を含む。
アフェレシス
大体積(12~15リットルまたは4~6血液量)アフェレシス法を、アフェレシス・センターで行う。PBMCを、本方法中にCART-19のために得る。一回白血球除去について、意図は、CART-19 T細胞の産生のための少なくとも5×109白血球を得ることである。FDA追跡要求および研究用のベースライン血液白血球を得て、凍結保存する。細胞産物は、約2~4週間後リリースの準備が整うと予測される。CD19およびCD20 B細胞決定を含む、フローサイトメトリーリンパ球サブセット定量を行う。ベースライン評価を、ヒト抗VSV-Gおよび抗マウス抗体(HAMA)について行う。対象が、先に現在のGood Manufacturing Practices at the Clinical Cell and Vaccine Production Facilityに従い預けられた十分なアフェレシスコレクションを有するならば、これらの細胞を、CART-19製造用細胞源として使用し得る。預けられたアフェレシス産物の使用は、対象がさらにアフェレシス採取を受ける費用、時間およびリスクを回避する。
大体積(12~15リットルまたは4~6血液量)アフェレシス法を、アフェレシス・センターで行う。PBMCを、本方法中にCART-19のために得る。一回白血球除去について、意図は、CART-19 T細胞の産生のための少なくとも5×109白血球を得ることである。FDA追跡要求および研究用のベースライン血液白血球を得て、凍結保存する。細胞産物は、約2~4週間後リリースの準備が整うと予測される。CD19およびCD20 B細胞決定を含む、フローサイトメトリーリンパ球サブセット定量を行う。ベースライン評価を、ヒト抗VSV-Gおよび抗マウス抗体(HAMA)について行う。対象が、先に現在のGood Manufacturing Practices at the Clinical Cell and Vaccine Production Facilityに従い預けられた十分なアフェレシスコレクションを有するならば、これらの細胞を、CART-19製造用細胞源として使用し得る。預けられたアフェレシス産物の使用は、対象がさらにアフェレシス採取を受ける費用、時間およびリスクを回避する。
細胞減少化学療法
白血球枯渇化学療法は、ここに記載するような高用量メルファランである。
白血球枯渇化学療法は、ここに記載するような高用量メルファランである。
CART-19注入
注入は、幹細胞再注入後+12~14日目に開始する。
+12~14日目に、最初の注入前、患者は、化学療法が、一部リンパ球減少症を誘発するために与えられるために、画分と共にCBCおよびCD3、CD4およびCD8計数の評価を有する。
最初の用量を、単一用量を使用して投与する。細胞を、患者のベッドサイドで解凍する。解凍細胞を、注入時間が約10~15分であるように、耐えられる限り高速注入速度で与える。混合を促進するために、細胞を、Y時型アダプターを使用して同時に投与する。対象に、ここに記載のように、注入および前投薬する。対象のバイタルサインを評価し、パルスオキシメトリを投薬前、注入終了時およびその後15分毎に1時間、かつこれらが安定および正常となるまで実施する。ベースラインCART-19レベル決定用血液サンプルを、最初の注入前の任意の時間および各注入20分~4時間後に得る(そしてTCSLに送る)。
高用量メルファランによる毒性を経験した患者は、これらの毒性が解消するまで注入スケジュールを遅らせる。T細胞注入遅延の正当な理由である具体的毒性は、1)肺:95%を超える飽和度を維持するための追加酸素の必要性または胸部x線での、進行性の放射線学的異常の存在;2)心臓:医学的管理で制御されない新らたな心臓不整脈;3)昇圧介助を必要とする低血圧、4)活動性感染:T細胞注入48時間以内の細菌、真菌またはウイルスについて血液培養陽性を含む。
注入は、幹細胞再注入後+12~14日目に開始する。
+12~14日目に、最初の注入前、患者は、化学療法が、一部リンパ球減少症を誘発するために与えられるために、画分と共にCBCおよびCD3、CD4およびCD8計数の評価を有する。
最初の用量を、単一用量を使用して投与する。細胞を、患者のベッドサイドで解凍する。解凍細胞を、注入時間が約10~15分であるように、耐えられる限り高速注入速度で与える。混合を促進するために、細胞を、Y時型アダプターを使用して同時に投与する。対象に、ここに記載のように、注入および前投薬する。対象のバイタルサインを評価し、パルスオキシメトリを投薬前、注入終了時およびその後15分毎に1時間、かつこれらが安定および正常となるまで実施する。ベースラインCART-19レベル決定用血液サンプルを、最初の注入前の任意の時間および各注入20分~4時間後に得る(そしてTCSLに送る)。
高用量メルファランによる毒性を経験した患者は、これらの毒性が解消するまで注入スケジュールを遅らせる。T細胞注入遅延の正当な理由である具体的毒性は、1)肺:95%を超える飽和度を維持するための追加酸素の必要性または胸部x線での、進行性の放射線学的異常の存在;2)心臓:医学的管理で制御されない新らたな心臓不整脈;3)昇圧介助を必要とする低血圧、4)活動性感染:T細胞注入48時間以内の細菌、真菌またはウイルスについて血液培養陽性を含む。
毒性の管理
未制御のT細胞増殖。同種または自己T細胞注入と関係する毒性は、薬理的免疫抑制のコースで管理されている。T体関連毒性は、全身性コルチコステロイドに応答することが報告されている。未制御のT細胞増殖が生じたら(CART-19細胞に関するグレード3または4毒性)、対象をコルチコステロイドで処置し得る。対象は、パルスメチルプレドニゾロン(q8時間×2日に分けた2mg/kg i.v.)、続く急速な漸減により処置し得る。
さらに、他のプロトコールで処置している対象の観察に基づき、マクロファージ活性化症候群(MAS)についていくぶん懸念があるが、CD 19+腫瘍負荷は、CLLを有する患者より、骨髄腫を有する患者ではるかに低いと予測される。この毒性の処置および処置のタイミングは、主治医および治験責任者の判断による。示唆される管理は、対象が、連続2日間続く101°Fを有する発熱を有し、感染の証拠がなければ(血液培養、CXRまたは他の起源の陰性)、トシリズマブ4mg/kgを考慮し得る。コルチコステロイドおよび抗TNF治療の追加は、医師の判断により考慮し得る。
未制御のT細胞増殖。同種または自己T細胞注入と関係する毒性は、薬理的免疫抑制のコースで管理されている。T体関連毒性は、全身性コルチコステロイドに応答することが報告されている。未制御のT細胞増殖が生じたら(CART-19細胞に関するグレード3または4毒性)、対象をコルチコステロイドで処置し得る。対象は、パルスメチルプレドニゾロン(q8時間×2日に分けた2mg/kg i.v.)、続く急速な漸減により処置し得る。
さらに、他のプロトコールで処置している対象の観察に基づき、マクロファージ活性化症候群(MAS)についていくぶん懸念があるが、CD 19+腫瘍負荷は、CLLを有する患者より、骨髄腫を有する患者ではるかに低いと予測される。この毒性の処置および処置のタイミングは、主治医および治験責任者の判断による。示唆される管理は、対象が、連続2日間続く101°Fを有する発熱を有し、感染の証拠がなければ(血液培養、CXRまたは他の起源の陰性)、トシリズマブ4mg/kgを考慮し得る。コルチコステロイドおよび抗TNF治療の追加は、医師の判断により考慮し得る。
B細胞枯渇。B細胞枯渇および低ガンマグロブリン血症が生じる可能性がある。これは、抗CD20指向治療に共通する。臨床的に有意な低ガンマグロブリン血症(すなわち全身感染)の場合には、対象に、リツキシマブで行われているように、正常レベルの血清免疫グロブリンレベルを回復するように、確立された臨床ガイドラインにより静脈内免疫グロブリン(IVIG)を与える。
一次移植不全。一次移植不全(すなわち、不生着)は、最初のASCTと比較して、2回目のASCTでより一般的であり得る。適格基準は、一次移植不全の場合には、処置医の裁量によりレスキュー再注入のために十分な幹細胞が利用可能でなければならないことを明記する。
結果
3名の処置難治性、進行型多発性骨髄腫患者が、現在、この進行中の治験においてCTL019で処置されている。これらの患者の2名の結果は、3ヶ月時点での一次有効性評価に基づき、両者がCTL019治療から実質的抗腫瘍効果を得ていることを示す。3番目の患者はまた3ヶ月時点に到達していない。2名の患者の結果を下により詳細に記載する。
3名の処置難治性、進行型多発性骨髄腫患者が、現在、この進行中の治験においてCTL019で処置されている。これらの患者の2名の結果は、3ヶ月時点での一次有効性評価に基づき、両者がCTL019治療から実質的抗腫瘍効果を得ていることを示す。3番目の患者はまた3ヶ月時点に到達していない。2名の患者の結果を下により詳細に記載する。
最初の骨髄腫患者は、彼女の+100日応答評価を完了し、彼女はCART19治療に対して極めて良好な応答を有した。次の試験を実施し、次の結果が得られた。
- SPEP/免疫固定法:陰性
- 尿免疫固定法:免疫固定法によりかすかな測定不可能なカッパ軽鎖バンド(38日目にも存在したため、新規ではない)
他の点では、患者は、次の厳しい完全寛解基準を満たす。
- 無血清軽鎖比:正常
- 骨髄生検:陰性
- IgA免疫表現型検査:IgAは検出限界未満
- SPEP/免疫固定法:陰性
- 尿免疫固定法:免疫固定法によりかすかな測定不可能なカッパ軽鎖バンド(38日目にも存在したため、新規ではない)
他の点では、患者は、次の厳しい完全寛解基準を満たす。
- 無血清軽鎖比:正常
- 骨髄生検:陰性
- IgA免疫表現型検査:IgAは検出限界未満
尿免疫固定法由来のかすかな測定不可能なカッパ軽鎖以外、患者は、“厳しい完全寛解”の全基準を満たした。3時点(-2日目、+38日目、+103日目)での形質細胞免疫表現型検査の概要を図39に示し、患者のIgAは検出限界未満であったことを示す。概要は、-2日目の重い骨髄腫負荷および+38日目および+103日目に何も検出可能でないことを示し、これは、患者を、フロー分析により“MRD陰性”として分類する。+103日目、概要は、正常な、ポリクローナル、CD19+形質細胞およびB細胞の回復を示す。患者は、疾患または治療の症状を有さず、健常人と同様の職務を果たしている。
二番目の患者の処置はまだ+100日時点に達していない。いずれにしても、この時点で、彼女の経過は良好であるが、CTL019注入の効果を決定するには早すぎる。
二番目の患者の処置はまだ+100日時点に達していない。いずれにしても、この時点で、彼女の経過は良好であるが、CTL019注入の効果を決定するには早すぎる。
実施例7:マントル細胞リンパ腫に対するキナーゼ阻害剤/CAR19 T細胞組み合わせ治療
養子T細胞治療は、リンパ系悪性腫瘍の処置にかなりの見込みを有する。CTL109を使用するB細胞特異的CD19抗原(CAR19 T細胞/CART19細胞)に対するキメラ抗原受容体(CAR)を形質導入した自己T細胞の養子移植を使用する、小リンパ球性リンパ腫/慢性リンパ性白血病(SLL/CLL)および急性リンパ性白血病(ALL)における有望な臨床応答が得られている。我々は、最近、CD19特異的CAR(CAR19 T細胞/CART19細胞)を使用するCD19陽性悪性腫瘍の処置のためのフェーズI治験に登録した化学療法抵抗性SLL/CLLを有する3患者の初期データを報告した。使用した手法は、CD137およびTcRz由来シグナル伝達ドメインを含む、CD19-ターゲティングCARを発現するためのレンチウイルスを使用する患者由来バルクT細胞の遺伝子修飾を含む。この試験のために、細胞を我々の抗CD3および-CD28ビーズ増殖法により増殖させ、細胞を、リンパ球枯渇後早期にサイトカイン支持を欠く条件で注入した(Kalos M, et al. (2011) Sci Transl Med. 3: 95ra73; and Porter DL, et al. (2011) N Engl J Med. 365: 725-733)。これらの初期結果は、非常に有望であった:(i)単一処置コース後、2/3患者は完全寛解を達成し、処置後+15ヶ月の現在無疾患であり、一方、T細胞注入の直後にコルチコステロイドで処置を受けた3番目の患者は、強い部分応答を示した。(ii)これらの患者において、我々は、養子T細胞治療ベースの戦略の最終的な有効性に必要であると考えられる要素、すなわち、強いインビボT細胞増殖、疾患根絶、T細胞収縮および長期機能的残留を再現できた。現在まで、10名のSLL/CLL患者が処置されており、2名が臨床的完全寛解および分子寛解を維持しており、5名が部分寛解を経験し、3名が測定可能な応答の欠如を示す。他の試験において、B細胞ALLを有する2名の患者が完全寛解を有し、1名がCD19発現を欠く白血病細胞で再発した。
養子T細胞治療は、リンパ系悪性腫瘍の処置にかなりの見込みを有する。CTL109を使用するB細胞特異的CD19抗原(CAR19 T細胞/CART19細胞)に対するキメラ抗原受容体(CAR)を形質導入した自己T細胞の養子移植を使用する、小リンパ球性リンパ腫/慢性リンパ性白血病(SLL/CLL)および急性リンパ性白血病(ALL)における有望な臨床応答が得られている。我々は、最近、CD19特異的CAR(CAR19 T細胞/CART19細胞)を使用するCD19陽性悪性腫瘍の処置のためのフェーズI治験に登録した化学療法抵抗性SLL/CLLを有する3患者の初期データを報告した。使用した手法は、CD137およびTcRz由来シグナル伝達ドメインを含む、CD19-ターゲティングCARを発現するためのレンチウイルスを使用する患者由来バルクT細胞の遺伝子修飾を含む。この試験のために、細胞を我々の抗CD3および-CD28ビーズ増殖法により増殖させ、細胞を、リンパ球枯渇後早期にサイトカイン支持を欠く条件で注入した(Kalos M, et al. (2011) Sci Transl Med. 3: 95ra73; and Porter DL, et al. (2011) N Engl J Med. 365: 725-733)。これらの初期結果は、非常に有望であった:(i)単一処置コース後、2/3患者は完全寛解を達成し、処置後+15ヶ月の現在無疾患であり、一方、T細胞注入の直後にコルチコステロイドで処置を受けた3番目の患者は、強い部分応答を示した。(ii)これらの患者において、我々は、養子T細胞治療ベースの戦略の最終的な有効性に必要であると考えられる要素、すなわち、強いインビボT細胞増殖、疾患根絶、T細胞収縮および長期機能的残留を再現できた。現在まで、10名のSLL/CLL患者が処置されており、2名が臨床的完全寛解および分子寛解を維持しており、5名が部分寛解を経験し、3名が測定可能な応答の欠如を示す。他の試験において、B細胞ALLを有する2名の患者が完全寛解を有し、1名がCD19発現を欠く白血病細胞で再発した。
大細胞転化の前および後の両者のマントル細胞リンパ腫(MCL)も、特に、MCL細胞に直接作用するようなキナーゼ阻害剤と組み合わせたとき、CART19ベースの養子治療により利益を受ける可能性がある。
キナーゼ阻害剤と組み合わせたCART19ベースの養子治療の組み合わせをさらに分析するために、ハイスループットスクリーニングを使用して、CART19細胞と組み合わせて、MCL病因に重要なキナーゼを標的とする数阻害剤CDK4/6、BTKおよびmTORを評価した。最も有望な組み合わせは、インビトロおよびインビボ、MCL異種移植マウスモデルの両者において非常に詳細に評価し、これは、最終的に、MCL患者における小分子キナーゼ阻害剤およびCART細胞免疫療法の組み合わせを評価するための、臨床的プロトコールの開発の指針となり得る。
本試験において、前臨床試験を、CART19細胞単独でまたは発現および活性がMCL細胞の生存および増殖に重要なキナーゼファミリーから選択されたタンパク質の小分子阻害剤と組み合わせて、MCLの種々のサブタイプにおけるこの手法の潜在的臨床効果を決定するためおよびMCL細胞を治療的標的とする能力を評価するために行う。
キナーゼ阻害剤と組み合わせたCART19ベースの養子治療の組み合わせをさらに分析するために、ハイスループットスクリーニングを使用して、CART19細胞と組み合わせて、MCL病因に重要なキナーゼを標的とする数阻害剤CDK4/6、BTKおよびmTORを評価した。最も有望な組み合わせは、インビトロおよびインビボ、MCL異種移植マウスモデルの両者において非常に詳細に評価し、これは、最終的に、MCL患者における小分子キナーゼ阻害剤およびCART細胞免疫療法の組み合わせを評価するための、臨床的プロトコールの開発の指針となり得る。
本試験において、前臨床試験を、CART19細胞単独でまたは発現および活性がMCL細胞の生存および増殖に重要なキナーゼファミリーから選択されたタンパク質の小分子阻害剤と組み合わせて、MCLの種々のサブタイプにおけるこの手法の潜在的臨床効果を決定するためおよびMCL細胞を治療的標的とする能力を評価するために行う。
研究計画
前臨床設定において、培養および初代型細胞の両者が、MCL細胞を治療的標的とする能力について、MCLにおける報告された病原関連性を有するキナーゼの阻害剤およびCART19細胞を使用して評価する。ハイスループットMTTアッセイを使用して、潜在的最適組み合わせ、薬剤適用の用量およびタイミングを決定するために、これらの薬剤の効果を検定する。最も有望な2~3組み合わせを、最初にインビトロおよび後にインビボでMCL異種移植モデルにおいて細胞機能、リン酸化ベースの細胞シグナル伝達および遺伝子発現に関して、詳細に評価する。
前臨床設定において、培養および初代型細胞の両者が、MCL細胞を治療的標的とする能力について、MCLにおける報告された病原関連性を有するキナーゼの阻害剤およびCART19細胞を使用して評価する。ハイスループットMTTアッセイを使用して、潜在的最適組み合わせ、薬剤適用の用量およびタイミングを決定するために、これらの薬剤の効果を検定する。最も有望な2~3組み合わせを、最初にインビトロおよび後にインビボでMCL異種移植モデルにおいて細胞機能、リン酸化ベースの細胞シグナル伝達および遺伝子発現に関して、詳細に評価する。
キナーゼ阻害剤/CART-19細胞の組み合わせがMCL細胞を効率的に標的とする能力を特徴づけするためのインビトロ試験
この目的において、インビトロでMCL細胞に対する小分子キナーゼ阻害剤の影響を試験するための、ならびにCART19細胞とMCL細胞の相互作用および阻害剤の該相互作用に対する影響を試験するための、上に挙げた詳細な機能的、表現型、生化学的および分子アッセイを試験する。
この目的を達成するためのベンチマークは、次のことを目的とする、包括的データセットの作成である。
i. CART19細胞が、培養および初代MCL細胞により活性化され、溶解することを記録する;
ii. 阻害剤対CART19細胞投与の用量、および、ある場合は、タイミングに関して適切に適用したとき、CART19細胞機能に負に作用することなく、選択したキナーゼ阻害剤が、互いの能力および/またはCART19細胞がMCL細胞を排除する能力を増強することを証明する;および
iii. NSGマウスで使用するインビボMCL異種移植実験において使用するためのBTK阻害剤のスケジュールおよび投薬のためのレジメンを確立する。
この目的において、インビトロでMCL細胞に対する小分子キナーゼ阻害剤の影響を試験するための、ならびにCART19細胞とMCL細胞の相互作用および阻害剤の該相互作用に対する影響を試験するための、上に挙げた詳細な機能的、表現型、生化学的および分子アッセイを試験する。
この目的を達成するためのベンチマークは、次のことを目的とする、包括的データセットの作成である。
i. CART19細胞が、培養および初代MCL細胞により活性化され、溶解することを記録する;
ii. 阻害剤対CART19細胞投与の用量、および、ある場合は、タイミングに関して適切に適用したとき、CART19細胞機能に負に作用することなく、選択したキナーゼ阻害剤が、互いの能力および/またはCART19細胞がMCL細胞を排除する能力を増強することを証明する;および
iii. NSGマウスで使用するインビボMCL異種移植実験において使用するためのBTK阻害剤のスケジュールおよび投薬のためのレジメンを確立する。
本試験の目的は、例えば、MCL病理生物学に重要なキナーゼであるCDK4、BTKおよびmTORをターゲティングする小分子阻害剤と、CART19細胞の最適治療的組み合わせの同定でなくても評価、CART19活性モニターおよびMCLに対する治療の機能的、生化学的および分子効果の特徴付けである。
これらの試験は、インビボで目的2を評価するための、CART19治療と組み合わせたBTK処置キナーゼ阻害剤のタイミングおよび用量のスケジュールの合理的スキームの確立であるべきである。
これらの試験は、インビボで目的2を評価するための、CART19治療と組み合わせたBTK処置キナーゼ阻害剤のタイミングおよび用量のスケジュールの合理的スキームの確立であるべきである。
単独およびBTK阻害剤と組み合わせた、濾胞性リンパ腫を標的とするCART19細胞の能力を評価するためのインビボ試験
この目的において、我々は、動物モデルにおいて、確立されたおよび初代MCL細胞の増殖に影響を与える選択した阻害剤/CART19細胞組み合わせの能力を試験する。
この目的を達成するためのベンチマークは、次のことを目的とする、包括的データセットの作成である。
i. 選択した阻害剤/CART19細胞組み合わせが、対照(単剤および偽剤処置動物)と比較して、MCL移植動物の生存を顕著に増加させることの証明;
ii. 将来の臨床試験の基礎として使用する、選択したキナーゼ阻害剤/CART19組み合わせのスケジュールおよび投薬についてのレジメンの確立。
この目的において、我々は、動物モデルにおいて、確立されたおよび初代MCL細胞の増殖に影響を与える選択した阻害剤/CART19細胞組み合わせの能力を試験する。
この目的を達成するためのベンチマークは、次のことを目的とする、包括的データセットの作成である。
i. 選択した阻害剤/CART19細胞組み合わせが、対照(単剤および偽剤処置動物)と比較して、MCL移植動物の生存を顕著に増加させることの証明;
ii. 将来の臨床試験の基礎として使用する、選択したキナーゼ阻害剤/CART19組み合わせのスケジュールおよび投薬についてのレジメンの確立。
本試験の目的は、同定したキナーゼ阻害剤/CART19+BTK阻害剤組み合わせについて、目的1で規定した処置および投与スケジュールの評価およびBTK処置が、培養および初代両者の、MCL細胞を異種移植したNSGマウスにおけるMCLを標的とするCART19と相乗作用するかの試験である。
次の細胞型、化合物、動物および実験法を、この提案した目的を達成するために使用する。
次の細胞型、化合物、動物および実験法を、この提案した目的を達成するために使用する。
MCL細胞:
4種のMCL細胞株(Jeko-1、Mino、SP-49およびSP-53)および15初代MCL(定型12および芽球様細胞3)からの生存できる状態で凍結したサンプル。細胞株は、自然に十分に増殖したが、初代細胞を、単独でならびにその生存能を改善するためにHS5骨髄間質細胞から回収した条件培地の存在下、培養した。
4種のMCL細胞株(Jeko-1、Mino、SP-49およびSP-53)および15初代MCL(定型12および芽球様細胞3)からの生存できる状態で凍結したサンプル。細胞株は、自然に十分に増殖したが、初代細胞を、単独でならびにその生存能を改善するためにHS5骨髄間質細胞から回収した条件培地の存在下、培養した。
CART19細胞:
CAR19を発現するように操作した初代ヒトT細胞を、レンチウイルス形質導入を使用しおよび確立されたプロトコールを使用して産生した(Kalos M, et al. (2011) Sci Transl Med. 3: 95ra73; およびPorter DL, et al. (2011) N Engl J Med. 365: 725-733)。1回形質導入事象後、T細胞は、一般に30%を超える頻度でCAR19を発現する。
我々の試験は、5SLL/CLL患者(50~100バイアル/患者、1×107細胞/バイアルが既に利用可能)からのCART 19集団を使用する。CART19細胞を、抗CAR19特異的イディオタイプ抗体(STM)を使用して同定する。CART19活性を、CD19+NALM-6、CD19陰性K562およびCD19形質導入K562細胞株を使用する、標準化された方法で、インビトロおよびインビボのNSGマウスにおいて両者で制御する。CART19細胞機能はMHC制限的ではないが、少なくとも5MCL患者からのCART19細胞も使用する。
CAR19を発現するように操作した初代ヒトT細胞を、レンチウイルス形質導入を使用しおよび確立されたプロトコールを使用して産生した(Kalos M, et al. (2011) Sci Transl Med. 3: 95ra73; およびPorter DL, et al. (2011) N Engl J Med. 365: 725-733)。1回形質導入事象後、T細胞は、一般に30%を超える頻度でCAR19を発現する。
我々の試験は、5SLL/CLL患者(50~100バイアル/患者、1×107細胞/バイアルが既に利用可能)からのCART 19集団を使用する。CART19細胞を、抗CAR19特異的イディオタイプ抗体(STM)を使用して同定する。CART19活性を、CD19+NALM-6、CD19陰性K562およびCD19形質導入K562細胞株を使用する、標準化された方法で、インビトロおよびインビボのNSGマウスにおいて両者で制御する。CART19細胞機能はMHC制限的ではないが、少なくとも5MCL患者からのCART19細胞も使用する。
キナーゼ阻害剤
次のキナーゼの阻害剤を試験する:CDK4/6(PD0332991)、BTK(PCI-32765)、mTORC1(ラパマイシン)、MNK(4-アミノ-5-(4-フルオロアニリノ)-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(Marzec M, et al. PLoS One 6:e24849);およびEli Lillyからの新規化合物(Gupta M, et al. (2012) Blood 119:476-487);mTOR(OSI-027)およびデュアルPI3K/mTOR(PF-04691502)。
化合物を、最初に、最適キナーゼ阻害を確実にする、患者の血清において達成される非毒性濃度を含む、予定された有効用量のスペクトルを評価する。
次のキナーゼの阻害剤を試験する:CDK4/6(PD0332991)、BTK(PCI-32765)、mTORC1(ラパマイシン)、MNK(4-アミノ-5-(4-フルオロアニリノ)-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(Marzec M, et al. PLoS One 6:e24849);およびEli Lillyからの新規化合物(Gupta M, et al. (2012) Blood 119:476-487);mTOR(OSI-027)およびデュアルPI3K/mTOR(PF-04691502)。
化合物を、最初に、最適キナーゼ阻害を確実にする、患者の血清において達成される非毒性濃度を含む、予定された有効用量のスペクトルを評価する。
動物:
インビボ実験を、Jackson Laboratory(Bar Harbor)から得た種畜を使用し、Stem Cell and Xenograft Coreで繁殖させた、入手可能なNOD-SCID-IL-2Rgcヌル(NSG)マウスを使用して行う。マウスを、HEPA濾過マイクロアイソレーターを使用して無菌状態で使用し、照射した餌および酸性化水を与える。
移植したマウスを、実験の間、抗生物質(ネオマイシンおよびポリミキシン)で処置する。6~8週齢動物の雄雌同数を、Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたプロトコールに従い使用する。
インビボ実験を、Jackson Laboratory(Bar Harbor)から得た種畜を使用し、Stem Cell and Xenograft Coreで繁殖させた、入手可能なNOD-SCID-IL-2Rgcヌル(NSG)マウスを使用して行う。マウスを、HEPA濾過マイクロアイソレーターを使用して無菌状態で使用し、照射した餌および酸性化水を与える。
移植したマウスを、実験の間、抗生物質(ネオマイシンおよびポリミキシン)で処置する。6~8週齢動物の雄雌同数を、Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたプロトコールに従い使用する。
我々は、先のT細胞養子移植試験において、特に、CART19細胞の差次的活性を評価するために、NSG動物を使用している(Witzig TE, et al. (2010) Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2010:265-270、MTTアッセイ)。ハイスループットMTTアッセイは、最初に、単独でまたは種々の組み合わせで適用したキナーゼ阻害剤に応答するMCL細胞増殖を評価するために実施する。このアッセイは、同時に細胞増殖速度および生存能の測定が可能であり、CART19細胞の存在下または非存在下の、小分子阻害剤の多数の可能性のある組み合わせの効率的な評価を可能にする。この分析の重要な面は、潜在的相乗、相加または拮抗効果に関する薬物効果の特徴付けである。さらに、CART19細胞に対する小分子阻害剤の効果を評価する。BTK阻害はB細胞特異的であるはずであるが、mTORおよびCDK4/6阻害はCART19細胞にも影響する。CART19細胞に対する潜在的効果を最小化するための薬物適用の適切なタイミングの確立は、これらの実験の目的の一つである。
この試験を行うために、MCL細胞を、96ウェルプレートに1×104細胞/ウェルで、トリプリケートで播種し、培地または種々の組み合わせのキナーゼ阻害剤および種々の濃度のCART-19細胞に曝す。48時間および74時間後、代謝的に活性な細胞の相対的数を、MTT減少比色アッセイ(Promega)の使用により決定する。
対照および種々の処置条件の平均値(±S.D.)の差の有意性をスチューデントt検定を使用して評価し、<0.05のP値を統計学的有意とする。
対照および種々の処置条件の平均値(±S.D.)の差の有意性をスチューデントt検定を使用して評価し、<0.05のP値を統計学的有意とする。
細胞増殖およびアポトーシスアッセイ:
最も有望な薬物組み合わせを、次に、MCL細胞増殖阻害の、細胞増殖抑制および細胞毒性の両者をそれぞれ決定するためのCFSE標識および末端dUTPニック末端標識(タネル)アッセイにおいて評価する。前者のアッセイにおいて、MCL細胞を、BTK阻害剤および/または未標識CART-19細胞のCFSE付加により標識する。48時間後、培養細胞を、MCLタイプ細胞のCFSE標識パターンについてFACSで分析する。タネルアッセイは、製造者のプロトコールに従い、BD BiosciencesのApoAlert DNA Fragmentation Assay Kitを使用して行う。
簡潔にいうと、MCL細胞を、阻害剤および/またはCART19細胞と48時間または72時間培養する。洗浄後、細胞を標識抗CD20抗体で染色し、透過処理し、洗浄し、TdT緩衝液中、1時間、37℃でインキュベートする。反応を停止させ、細胞を洗浄し、再懸濁し、CellQuest PROソフトウェアを使用するフローサイトメトリーにより分析する。
最も有望な薬物組み合わせを、次に、MCL細胞増殖阻害の、細胞増殖抑制および細胞毒性の両者をそれぞれ決定するためのCFSE標識および末端dUTPニック末端標識(タネル)アッセイにおいて評価する。前者のアッセイにおいて、MCL細胞を、BTK阻害剤および/または未標識CART-19細胞のCFSE付加により標識する。48時間後、培養細胞を、MCLタイプ細胞のCFSE標識パターンについてFACSで分析する。タネルアッセイは、製造者のプロトコールに従い、BD BiosciencesのApoAlert DNA Fragmentation Assay Kitを使用して行う。
簡潔にいうと、MCL細胞を、阻害剤および/またはCART19細胞と48時間または72時間培養する。洗浄後、細胞を標識抗CD20抗体で染色し、透過処理し、洗浄し、TdT緩衝液中、1時間、37℃でインキュベートする。反応を停止させ、細胞を洗浄し、再懸濁し、CellQuest PROソフトウェアを使用するフローサイトメトリーにより分析する。
CART19機能的アッセイ:
我々は、CD107脱顆粒、細胞内サイトカイン分泌(ICS)アッセイ、増殖細胞溶解アッセイおよび多重サイトカイン検出アッセイ(32)を使用して、MCL細胞株に対するCART19細胞のエフェクター活性を測定する。脱顆粒およびICSアッセイに関して、確立されたプロトコールにより、エフェクター(T細胞)および標的(腫瘍細胞)を、抗CD107抗体存在下、4時間、E:T比0.2:1で共培養し、続いて表面(CAR19、CD3、CD8、CD4)および細胞内サイトカインマーカーについて染色する。MCL細胞の細胞溶解を、フローサイトメトリーベースの細胞溶解アッセイを使用して評価する。増殖アッセイについて、エフェクター細胞を、CFSE(カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルカルボキシ-フルオレセイン-サクシニルエステラーゼ)と前充填し、標的細胞とE:T比0.2:1で混合し、37℃で4日共インキュベートし、表面マーカー(CAR19、CD3、CD8、CD4)について染色し、フローサイトメトリーによりCFSEの希釈について分析する。
我々は、CD107脱顆粒、細胞内サイトカイン分泌(ICS)アッセイ、増殖細胞溶解アッセイおよび多重サイトカイン検出アッセイ(32)を使用して、MCL細胞株に対するCART19細胞のエフェクター活性を測定する。脱顆粒およびICSアッセイに関して、確立されたプロトコールにより、エフェクター(T細胞)および標的(腫瘍細胞)を、抗CD107抗体存在下、4時間、E:T比0.2:1で共培養し、続いて表面(CAR19、CD3、CD8、CD4)および細胞内サイトカインマーカーについて染色する。MCL細胞の細胞溶解を、フローサイトメトリーベースの細胞溶解アッセイを使用して評価する。増殖アッセイについて、エフェクター細胞を、CFSE(カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルカルボキシ-フルオレセイン-サクシニルエステラーゼ)と前充填し、標的細胞とE:T比0.2:1で混合し、37℃で4日共インキュベートし、表面マーカー(CAR19、CD3、CD8、CD4)について染色し、フローサイトメトリーによりCFSEの希釈について分析する。
多重サイトカインアッセイ
我々は、(STM32)に記載のような、Luminexベースのビーズアッセイを使用して、MCL標的に対する応答においてCART19細胞によるサイトカインの産生を評価する。これらの分析のために、我々は、血清、血漿または組織培養上清におけるIL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12(p40/p70)、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、MIG、エオタキシン、RANTES、MCP-1、VEGF、G-CSF、EGF、FGF塩基性およびHGFを同時に測定するInvitrogen 30-plexキットを使用する。
我々は、(STM32)に記載のような、Luminexベースのビーズアッセイを使用して、MCL標的に対する応答においてCART19細胞によるサイトカインの産生を評価する。これらの分析のために、我々は、血清、血漿または組織培養上清におけるIL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12(p40/p70)、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、MIG、エオタキシン、RANTES、MCP-1、VEGF、G-CSF、EGF、FGF塩基性およびHGFを同時に測定するInvitrogen 30-plexキットを使用する。
CART19T細胞の多変数フローサイトメトリー分析:
我々は、University of Pennsylvania Abramson Cancer Center Flow Cytometry Coreから入手可能な、4レーザー(青色(488nM)、紫色(405nM)、緑色(532nM)および赤色(633nM)を備えた4色フローサイトメトリーおよびカスタムBD LSR IIを使用して、腫瘍細胞と共インキュベーション後のCART19細胞に対する機能的活性化および抑制と関係する表面マーカーの調節を試験した。全フローサイトメトリーデータを、FlowJoソフトウェア(TreeStar, San Carlos, CA)を使用して分析する)。これらの分析を、本質的に(STM42)に記載のように、死亡細胞および標的細胞(CD19+)を除外するためのダンプチャネルおよびCART19細胞(STM)を検出するためのCAR19イディオタイプ特異的試薬を使用する。我々は、CART19陽性および陰性細胞(CD3+/CD8+およびCD3+/CD4+)で、腫瘍細胞との共インキュベーション後、次のマーカーを、無傷、または必要に応じて透過処理した細胞で評価する。我々は、これらのマーカーの確立された多変数パネルを有する:
- 活性化/エフェクター機能:CD25、CD154、CD134、CD137、CD69、CD57、CD28、T-bet
- 阻害:CD152 (CTLA4)、PD1、LAG3、CD200
- 抑制(Treg) CD4+/CD25++/CD127-、Fox-P3+
同時に、CD19およびCD5染色により同定されたMCL細胞を、免疫抑制性タンパク質CD174(PD-L1)CD173(PD-L2)およびCD152の発現について試験する。
我々は、University of Pennsylvania Abramson Cancer Center Flow Cytometry Coreから入手可能な、4レーザー(青色(488nM)、紫色(405nM)、緑色(532nM)および赤色(633nM)を備えた4色フローサイトメトリーおよびカスタムBD LSR IIを使用して、腫瘍細胞と共インキュベーション後のCART19細胞に対する機能的活性化および抑制と関係する表面マーカーの調節を試験した。全フローサイトメトリーデータを、FlowJoソフトウェア(TreeStar, San Carlos, CA)を使用して分析する)。これらの分析を、本質的に(STM42)に記載のように、死亡細胞および標的細胞(CD19+)を除外するためのダンプチャネルおよびCART19細胞(STM)を検出するためのCAR19イディオタイプ特異的試薬を使用する。我々は、CART19陽性および陰性細胞(CD3+/CD8+およびCD3+/CD4+)で、腫瘍細胞との共インキュベーション後、次のマーカーを、無傷、または必要に応じて透過処理した細胞で評価する。我々は、これらのマーカーの確立された多変数パネルを有する:
- 活性化/エフェクター機能:CD25、CD154、CD134、CD137、CD69、CD57、CD28、T-bet
- 阻害:CD152 (CTLA4)、PD1、LAG3、CD200
- 抑制(Treg) CD4+/CD25++/CD127-、Fox-P3+
同時に、CD19およびCD5染色により同定されたMCL細胞を、免疫抑制性タンパク質CD174(PD-L1)CD173(PD-L2)およびCD152の発現について試験する。
細胞シグナル伝達に対する阻害剤の影響:
実験のこの部分は、選択した化合物にのみ焦点をあてる;上記機能的アッセイ(細胞増殖、増殖およびアポトーシス)で最も有効であることが判明したもの。効果を、各薬剤および選択した組み合わせについて別々に試験し、試験を、特定の化合物に合わせる。例えば、mTORC1とMNK阻害剤の組み合わせは、mTORC1シグナル伝達、特にeIF-4Eリン酸化を評価し、BTK阻害はPI3K-AKTおよびMEK-ERK経路およびRbリン酸化に対するCDK4/6阻害に焦点をあてる。これらの試験は、記載のようにホスホ特異的抗体を使用するウェスタンブロッティングにより行う(Marzec M, et al. (2006) Blood. 108:1744-1750; Marzec M, et al. (2008) Blood 111: 2181-2189; Zhang Q, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108: 11977-11982)。簡潔にいうと、MCL細胞を溶解し、タンパク質抽出物をローリー法(Bio-Rad)を使用してアッセイし、ポリアクリルアミドゲルに載せる。タンパク質リン酸化を試験するために、ブロットした膜をホスホ特異的抗体、例えばS6rp S235/236、eIF4E S209、4E-BP1 T37/46、4E-BP1 T70(Cell Signaling)に特異的なものとインキュベートし、mTORC1およびMNK活性およびその阻害を評価する。次に、膜を、適切な二次、ペルオキシダーゼ結合抗体とインキュベートする。ブロットを、AmershamのECL Plus Systemを使用して開発する。
実験のこの部分は、選択した化合物にのみ焦点をあてる;上記機能的アッセイ(細胞増殖、増殖およびアポトーシス)で最も有効であることが判明したもの。効果を、各薬剤および選択した組み合わせについて別々に試験し、試験を、特定の化合物に合わせる。例えば、mTORC1とMNK阻害剤の組み合わせは、mTORC1シグナル伝達、特にeIF-4Eリン酸化を評価し、BTK阻害はPI3K-AKTおよびMEK-ERK経路およびRbリン酸化に対するCDK4/6阻害に焦点をあてる。これらの試験は、記載のようにホスホ特異的抗体を使用するウェスタンブロッティングにより行う(Marzec M, et al. (2006) Blood. 108:1744-1750; Marzec M, et al. (2008) Blood 111: 2181-2189; Zhang Q, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108: 11977-11982)。簡潔にいうと、MCL細胞を溶解し、タンパク質抽出物をローリー法(Bio-Rad)を使用してアッセイし、ポリアクリルアミドゲルに載せる。タンパク質リン酸化を試験するために、ブロットした膜をホスホ特異的抗体、例えばS6rp S235/236、eIF4E S209、4E-BP1 T37/46、4E-BP1 T70(Cell Signaling)に特異的なものとインキュベートし、mTORC1およびMNK活性およびその阻害を評価する。次に、膜を、適切な二次、ペルオキシダーゼ結合抗体とインキュベートする。ブロットを、AmershamのECL Plus Systemを使用して開発する。
ゲノム規模遺伝子発現分析:
細胞シグナル伝達阻害は、一般に遺伝子転写の変化を生じる。選択した阻害剤またはMCLにおける遺伝子転写の数阻害剤の効果を決定するために、ゲノム規模遺伝子発現分析を、Marzec M, et al. (2008) Blood 111: 2181-2189; Zhang Q, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108: 11977-11982に記載のように行う。簡潔にいうと、細胞を、選択した阻害剤またはその希釈物で、0時間、4時間および8時間でトリプリケート培養で処理する。総RNAをmRNAを富化するためにさらに精製し、これを逆転写し、標識し、全既知遺伝子エクソンに対するAffimetrixマイクロチップへのハイブリダイゼーションにより試験する。マイクロアレイデータを、GeneSpringおよびMAS5アルゴリズムで実行されるようにRMAを使用し、標準化および要約する。得られたp値を、Benjamini-Hochbergステップアップ法による偽陽性率(FDR)を使用する多重試験について補正する。差次的発現試験を、SAMおよびPartekProを含む多様なツールを使用して達成する。出現する目的の遺伝子を、次いで、発現パターンに基づきクラスター化し(GeneSpringまたはSpotfire)、クラスターを、試験ツールとしてNIH-Davidを使用する、KEGG、Ingenuity Pathway AnalysisおよびGene Ontologyデータベースにおける機能的群および経路について分析する。データに基づき同定された遺伝子について、定量的RTPCRによる非依存性発現立体構造を、種々のタイプのMCL(標準対芽球様細胞およびSOX11陽性対SOX11陰性)の大きなサンプル(少なくとも20)で行う。
細胞シグナル伝達阻害は、一般に遺伝子転写の変化を生じる。選択した阻害剤またはMCLにおける遺伝子転写の数阻害剤の効果を決定するために、ゲノム規模遺伝子発現分析を、Marzec M, et al. (2008) Blood 111: 2181-2189; Zhang Q, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108: 11977-11982に記載のように行う。簡潔にいうと、細胞を、選択した阻害剤またはその希釈物で、0時間、4時間および8時間でトリプリケート培養で処理する。総RNAをmRNAを富化するためにさらに精製し、これを逆転写し、標識し、全既知遺伝子エクソンに対するAffimetrixマイクロチップへのハイブリダイゼーションにより試験する。マイクロアレイデータを、GeneSpringおよびMAS5アルゴリズムで実行されるようにRMAを使用し、標準化および要約する。得られたp値を、Benjamini-Hochbergステップアップ法による偽陽性率(FDR)を使用する多重試験について補正する。差次的発現試験を、SAMおよびPartekProを含む多様なツールを使用して達成する。出現する目的の遺伝子を、次いで、発現パターンに基づきクラスター化し(GeneSpringまたはSpotfire)、クラスターを、試験ツールとしてNIH-Davidを使用する、KEGG、Ingenuity Pathway AnalysisおよびGene Ontologyデータベースにおける機能的群および経路について分析する。データに基づき同定された遺伝子について、定量的RTPCRによる非依存性発現立体構造を、種々のタイプのMCL(標準対芽球様細胞およびSOX11陽性対SOX11陰性)の大きなサンプル(少なくとも20)で行う。
全エクソームDNA配列分析:
病因、および、可能な範囲で、ここで提案される組み合わせ治療に対する応答に関してMCL症例を良好に分類するために、エクソンDNAの配列を試験する。MCLおよび正常末梢血DNAサンプルの全エクソーム捕獲および次世代配列決定を、NimbleGen Sequence Capture 2.1M Human Exome ArrayおよびHiSeq 2000/1000 Illumina装置を使用して行う。
病因、および、可能な範囲で、ここで提案される組み合わせ治療に対する応答に関してMCL症例を良好に分類するために、エクソンDNAの配列を試験する。MCLおよび正常末梢血DNAサンプルの全エクソーム捕獲および次世代配列決定を、NimbleGen Sequence Capture 2.1M Human Exome ArrayおよびHiSeq 2000/1000 Illumina装置を使用して行う。
異種移植腫瘍における処置効果の評価
NSGマウスは、MCL腫瘍(両MCL細胞株:JekoおよびMino由来であり、初代細胞を、組織フラグメントまたはあまり好ましくないが、細胞懸濁液としてインプラント)を担持する。腫瘍を、小腫瘍フラグメントの皮下インプラントにより増殖させる。腫瘍が直径0.2~0.3cmに達したら、治療を開始する。キナーゼ阻害剤を、インビトロで予め選択した用量およびタイミングで胃管栄養により投与する(例えば、我々は、BTK阻害剤を、B細胞特異性およびCART19細胞に対するあらゆる阻害性効果の予測される欠失を考慮して、CART19細胞と同時に与える予定である)。CART-19細胞を、1×107/動物の用量で、腫瘍担持マウスの尾静脈に注射し、キナーゼ阻害剤を、胃管栄養により、インビトロで予め選択した用量およびタイミングで投与する。我々が、悪性細胞を再現性よく根絶するのに十分であり、同時に、異種移植片対宿主病を誘発しないのにとして確立した用量である。エフェクター細胞の違いと関係する差異を最小とするためにCART19細胞の大マスターストック(1×1010)を産生し、凍結する。これらの実験からの主要尺度は生存であり、これを、カプラン/マイヤー曲線を使用して評価する。二次尺度として、我々は、T細胞注入後の動物におけるCART19細胞の差次的増殖を評価する。これは、注入したT細胞産物が一定比のCART19陽性および陰性細胞からなるとの事実により可能である。これらの分析のために、動物を、毎週尾静脈から採血し(各回25マイクロリットル)、続いて赤血球溶解ならびにヒトCD3、CD4、CD8およびCART19についての染色を行う。CART19細胞の優先的増殖(CART19+/CART19-比の少なくとも2倍増加は、選択的MCL駆動CART19細胞増殖の証拠である)。処置結果を評価するために、インプラントした皮下腫瘍の体積を測定し、式:体積=0.4ab2(式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長径および短径である)のように決定する。マウスの処置群と未処置群の腫瘍体積差を、標準t検定を使用して統計的に分析する。マウスを、実験の終点(>30日)、または腫瘍が直径>1.2cmに達したらまたは動物が苦しんでいる何らかの証拠が示されたら、殺す。マウスの処置群と未処置群の腫瘍体積差を、標準t検定を使用して統計的に分析する。腫瘍ならびに内臓を採取し、処理し、組織学により分析し、選択した組織について、B細胞(CD20、CD79a、Pax-5、CD10、BCL-6)およびT細胞(CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、TIA-1)および増殖マーカーKi-67に対する一連の抗体を使用して免疫組織化学により分析する。
NSGマウスは、MCL腫瘍(両MCL細胞株:JekoおよびMino由来であり、初代細胞を、組織フラグメントまたはあまり好ましくないが、細胞懸濁液としてインプラント)を担持する。腫瘍を、小腫瘍フラグメントの皮下インプラントにより増殖させる。腫瘍が直径0.2~0.3cmに達したら、治療を開始する。キナーゼ阻害剤を、インビトロで予め選択した用量およびタイミングで胃管栄養により投与する(例えば、我々は、BTK阻害剤を、B細胞特異性およびCART19細胞に対するあらゆる阻害性効果の予測される欠失を考慮して、CART19細胞と同時に与える予定である)。CART-19細胞を、1×107/動物の用量で、腫瘍担持マウスの尾静脈に注射し、キナーゼ阻害剤を、胃管栄養により、インビトロで予め選択した用量およびタイミングで投与する。我々が、悪性細胞を再現性よく根絶するのに十分であり、同時に、異種移植片対宿主病を誘発しないのにとして確立した用量である。エフェクター細胞の違いと関係する差異を最小とするためにCART19細胞の大マスターストック(1×1010)を産生し、凍結する。これらの実験からの主要尺度は生存であり、これを、カプラン/マイヤー曲線を使用して評価する。二次尺度として、我々は、T細胞注入後の動物におけるCART19細胞の差次的増殖を評価する。これは、注入したT細胞産物が一定比のCART19陽性および陰性細胞からなるとの事実により可能である。これらの分析のために、動物を、毎週尾静脈から採血し(各回25マイクロリットル)、続いて赤血球溶解ならびにヒトCD3、CD4、CD8およびCART19についての染色を行う。CART19細胞の優先的増殖(CART19+/CART19-比の少なくとも2倍増加は、選択的MCL駆動CART19細胞増殖の証拠である)。処置結果を評価するために、インプラントした皮下腫瘍の体積を測定し、式:体積=0.4ab2(式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長径および短径である)のように決定する。マウスの処置群と未処置群の腫瘍体積差を、標準t検定を使用して統計的に分析する。マウスを、実験の終点(>30日)、または腫瘍が直径>1.2cmに達したらまたは動物が苦しんでいる何らかの証拠が示されたら、殺す。マウスの処置群と未処置群の腫瘍体積差を、標準t検定を使用して統計的に分析する。腫瘍ならびに内臓を採取し、処理し、組織学により分析し、選択した組織について、B細胞(CD20、CD79a、Pax-5、CD10、BCL-6)およびT細胞(CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、TIA-1)および増殖マーカーKi-67に対する一連の抗体を使用して免疫組織化学により分析する。
統計解析:
インビトロ機能的試験において、対照と種々の処置条件の平均値(±S.D.)の差異の有意性をスチューデントt検定を使用して評価し、<0.05のP値を、統計的有意とする。先の実験に基づき、実験的マウス群間の差は、大きいことが予測される。それゆえに、10匹のNSGマウスを各処置群で使用し、これは、予測される、処置平均および標準偏差の差異の比が少なくとも3と仮定して、両側2サンプル/-検定で第1種の過誤0.05レベルで少なくとも90%検出力を確実にする。データを平均±SEMとして示す。群間比較を、2サンプルt検定を使用して行う。p<0.05の値を有意とする。無腫瘍生存率試験について、10マウスの群を、生存比較のために使用し、各マウスの疾患状態(腫瘍対無腫瘍)および無腫瘍期間を記録する。カプラン・マイヤー生存曲線をプロットし、ログランク検定を行って、生存曲線を比較する。有意レベルを、0.05で制御する。
インビトロ機能的試験において、対照と種々の処置条件の平均値(±S.D.)の差異の有意性をスチューデントt検定を使用して評価し、<0.05のP値を、統計的有意とする。先の実験に基づき、実験的マウス群間の差は、大きいことが予測される。それゆえに、10匹のNSGマウスを各処置群で使用し、これは、予測される、処置平均および標準偏差の差異の比が少なくとも3と仮定して、両側2サンプル/-検定で第1種の過誤0.05レベルで少なくとも90%検出力を確実にする。データを平均±SEMとして示す。群間比較を、2サンプルt検定を使用して行う。p<0.05の値を有意とする。無腫瘍生存率試験について、10マウスの群を、生存比較のために使用し、各マウスの疾患状態(腫瘍対無腫瘍)および無腫瘍期間を記録する。カプラン・マイヤー生存曲線をプロットし、ログランク検定を行って、生存曲線を比較する。有意レベルを、0.05で制御する。
実施例8:マントル細胞リンパ腫に対するイブルチニブ/CAR19 T細胞組み合わせ治療
この実施例に記載する実験は、インビトロおよびインビボでのマントル細胞リンパ腫の処置のための、イブルチニブ処置と組み合わせたCART19活性を特徴とする。イブルチニブは、ある種の血液癌の処置にしばしば使用されるBTKの小分子阻害剤である。ここに記載するインビトロ実験は、増殖、サイトカイン産生、CD107a脱顆粒および細胞毒性の評価を含む。異種移植マウスモデルを、インビボでのCART19とイブルチニブ処置の有効性および最適用量の試験に使用した。イブルチニブは、MCLにおいて相当な活性を示すが、患者の約30%は応答せず、応答者の中でも、わずか21%~約1/3しか完全寛解を経験しない(Wang et al. NEJM 369.6(2013):507-16)。完全寛解の達成は、無増悪生存期間の改善と関係する。さらに、治療は、薬物耐性を生じ、中央応答期間17.5ヶ月である。いくつかの設定で、BTK結合部位または直ぐ下流の変異がイブルチニブ治療後に観察され、ますます頻繁になり始め得る、薬物耐性機構を強調する。例えば、Woyach et al. NEJM. 370.24(2014):2286-94参照。また、BTK機能の遮断は、B細胞受容体(BCR)シグナル伝達の阻害を生じ、直接細胞毒性ではない。例えば、Ponader et al. Blood. 119.5(2012):1182-89参照。細胞毒性の欠如および悪性クローンの根絶失敗は、選択圧下のクローン進化に感受性である。また、CLLについてイブルチニブで処置した患者における侵襲性疾患への形質転換増加の先の発見が、懸念される。例えば、Byrd et al. NEJM. 369.1(2013):32-42; and Parikh et al. Blood. 123.11(2014):1647-57参照。
この実施例に記載する実験は、インビトロおよびインビボでのマントル細胞リンパ腫の処置のための、イブルチニブ処置と組み合わせたCART19活性を特徴とする。イブルチニブは、ある種の血液癌の処置にしばしば使用されるBTKの小分子阻害剤である。ここに記載するインビトロ実験は、増殖、サイトカイン産生、CD107a脱顆粒および細胞毒性の評価を含む。異種移植マウスモデルを、インビボでのCART19とイブルチニブ処置の有効性および最適用量の試験に使用した。イブルチニブは、MCLにおいて相当な活性を示すが、患者の約30%は応答せず、応答者の中でも、わずか21%~約1/3しか完全寛解を経験しない(Wang et al. NEJM 369.6(2013):507-16)。完全寛解の達成は、無増悪生存期間の改善と関係する。さらに、治療は、薬物耐性を生じ、中央応答期間17.5ヶ月である。いくつかの設定で、BTK結合部位または直ぐ下流の変異がイブルチニブ治療後に観察され、ますます頻繁になり始め得る、薬物耐性機構を強調する。例えば、Woyach et al. NEJM. 370.24(2014):2286-94参照。また、BTK機能の遮断は、B細胞受容体(BCR)シグナル伝達の阻害を生じ、直接細胞毒性ではない。例えば、Ponader et al. Blood. 119.5(2012):1182-89参照。細胞毒性の欠如および悪性クローンの根絶失敗は、選択圧下のクローン進化に感受性である。また、CLLについてイブルチニブで処置した患者における侵襲性疾患への形質転換増加の先の発見が、懸念される。例えば、Byrd et al. NEJM. 369.1(2013):32-42; and Parikh et al. Blood. 123.11(2014):1647-57参照。
B細胞特異的CD19抗原(CTL019、CART19)に対するキメラ抗原受容体(CAR)を形質導入した自己T細胞の注入は、種々のB細胞新生物、最重要には急性リンパ芽球性白血病(ALL)を有する患者の対部分で劇的な臨床応答に至る。例えば、Maude et al. NEJM. 371.16(2014):1507-17; and Ruella et al. Expert Opin. Biol. Ther. (2015):1-6参照。リンパ節腫瘤または巨大腫瘤病変の存在は、T細胞浸潤低下と、その結果としての抗腫瘍活性低下に至り得る。巨大リンパ節腫脹は、イブルチニブに対する応答を妨害するように見えない。Wang et al. NEJM. 369.6(2013):507-16。また、イブルチニブは、腫瘍質量の減少および新生物B細胞の末梢血への移動に特に有効性を示す。
方法
細胞株および初代サンプル。MCL細胞株を、ATCC(Mino、Jeko-1、SP-49)から得て、MCL-RLを、MCL患者の進行性胸水から産生した。インビトロ実験のために、細胞株を、10%胎仔ウシ血清、ペニシリンおよびストレプトマイシン添加RPMI培地での培養により維持した。いくつかの実験のために、MCL-RLおよびJeko-1細胞を、クリックビートル緑色ルシフェラーゼ/eGFPで形質導入し、保存して>99%陽性集団を得た。急性白血病細胞株MOLM-14、K562またはNALM-6およびT-ALL細胞株JURKATを対照として使用した。これらの細胞株は、元々ATCCから得た。非特定化初代ヒトMCL骨髄(BM)および末梢血(PB)検体を、University of Pennsylvaniaの診療から得た。全機能的試験について、初代細胞を、実験の少なくとも12時間前に解凍し、37℃で休息させた。
細胞株および初代サンプル。MCL細胞株を、ATCC(Mino、Jeko-1、SP-49)から得て、MCL-RLを、MCL患者の進行性胸水から産生した。インビトロ実験のために、細胞株を、10%胎仔ウシ血清、ペニシリンおよびストレプトマイシン添加RPMI培地での培養により維持した。いくつかの実験のために、MCL-RLおよびJeko-1細胞を、クリックビートル緑色ルシフェラーゼ/eGFPで形質導入し、保存して>99%陽性集団を得た。急性白血病細胞株MOLM-14、K562またはNALM-6およびT-ALL細胞株JURKATを対照として使用した。これらの細胞株は、元々ATCCから得た。非特定化初代ヒトMCL骨髄(BM)および末梢血(PB)検体を、University of Pennsylvaniaの診療から得た。全機能的試験について、初代細胞を、実験の少なくとも12時間前に解凍し、37℃で休息させた。
CAR構築物およびCAR T細胞の産生。マウス抗CD19キメラ抗原受容体(CD8ヒンジ、41BB共刺激ドメインおよびCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含んだ)を、先に記載のように産生した。例えば、Milone et al. Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 17.8(2009):1453-64参照。CAR発現T細胞の産生を、先に記載のように行った。例えば、Gill et al. Blood. 123.15(2014):2343-54参照。正常ドナーCD4およびCD8 T細胞またはPB単核細胞(PBMC)を、Human Immunology Core of the University of Pennsylvaniaから得た。T細胞を、1×106/mlで、CD4:CD8比1:1で播種し、X-vivo 15培地(Lonza、04-418Q)、ヒト血清AB5%(Gemini、100-512)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco、15070063)およびGlutamax(Gibco、35050061)で、抗CD3/CD28 Dynabeads(Life Technologies、11161D)を培養1日目に添加し、6日目に除去して、増殖させた。T細胞を、2日目にレンチウイルスで形質導入した。T細胞を、8~15日の培養で増殖させ、中央細胞体積が300flを下回ったとき、回収した。T細胞を、次いで、将来の実験のためにFBS 10%DMSO中凍結保存した。全実験前、T細胞を解凍し、一夜、37℃で休息させた。
イブルチニブ。イブルチニブ(PCI-32765)を、粉末またはDMSO溶液としてMedKoo(#202171)またはSelleck Biochemicals(#S2680)から購入した。インビトロ実験のために、イブルチニブを10nM、100nMおよび1000nMの濃度に希釈した。インビボ実験のために、イブルチニブ粉末を10%HP-ベータ-シクロデキストリン溶液(1.6mg/ml)に溶解し、マウスに飲み水から投与した。
多変数フローサイトメトリー分析。抗ヒト抗体をBiolegend、eBioscienceまたはBecton Dickinsonから購入した。細胞は、インビトロ培養または動物から単離され、2%胎仔ウシ血清添加PBSで1回洗浄し、15分、室温で染色した。細胞数定量化のために、Countbright(Invitrogen)ビーズを、製造者の指示に従い使用した。全ての分析において、目的の集団を、前方散乱光対側方散乱光特性、続いて一重項ゲーティングに基づきゲーティングし、生存細胞をLive Dead Aqua(Invitrogen)を使用してゲーティングした。時間ゲーティングを品質管理のために含んだ。CAR19の表面発現を、先に記載のように検出した。例えば、Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73参照。フローサイトメトリーを、4レーザーFortessa-LSRサイトメーター(Becton-Dickinson)で行い、FlowJo×10.0.7r2(Tree Star)で分析した。
脱顆粒アッセイ。脱顆粒アッセイを、先に記載のように実施した。例えば、Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73参照。T細胞を、標的細胞と、1:5比で、T細胞培地中インキュベートした。抗CD107a-PECY7(Biolegend)、抗CD28(BD Biosciences)、抗CD49d(BD Biosciences)抗体およびモネンシン(BD Biosciences)を共培養に添加した。4時間後、細胞を回収し、CAR発現、CD3、CD8およびLive Dead aqua染色(Invitrogen)について染色した。細胞を固定し、透過処理し(Invitrogen Fix/Perm緩衝液)、多数のサイトカイン(IFN、TNFa、IL-2、GM-CSF、MIP1b)の検出のために細胞内染色を行った。
増殖アッセイ。T細胞を洗浄し、1×107/mlで100μlのPBSに再懸濁し、100μlのCFSE 2.5μM(Invitrogen)で5分、37℃で染色した。冷培地で反応停止させ、細胞を3回洗浄した。標的を100Gy線量で照射した。T細胞を、1:1比で、照射標的細胞と120時間インキュベートし、24時間で培地を添加した。細胞を回収し、CD3、CARおよびLive Dead aqua(Invitrogen)について染色し、Countbrightビーズ(Invitrogen)を添加して、絶対定量化のためのフローサイトメトリー分析をした。
細胞毒性アッセイ。ルシフェラーゼ/eGFP+NALM-6またはRL細胞を、先に記載のように細胞毒性アッセイに使用した。例えば、Gill et al. Blood. 123.15(2014):2343-54参照。標的を示した比のエフェクターT細胞と4時間または16時間インキュベートした。細胞死を、Xenogen IVIS-200 Spectrumカメラでの生物発光造影により計算した。
サイトカイン測定。エフェクターおよび標的細胞を、1:1比で、T細胞培地で24時間共インキュベートした。上清を回収し、製造者のプロトコール(Invitrogen)に従い、30-plex Luminexアレイ(Luminex Corp, FLEXMAP 3D)で分析した。例えば、Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73参照。
インビボ実験。Jackson Laboratoriesから元々得たNOD-SCID-γ鎖-/-(NSG)マウスを、Stem Cell and Xenograft Core of the University of Pennsylvaniaから購入した。全実験を、Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)により承認されたプロトコールに基づき行った。利用した異種移植モデルの概略をここに記載する。細胞(MCL細胞株またはT細胞)を、200μlのPBS中、記載する濃度でマウスの尾静脈に注射した。生物発光造影をXenogen IVIS-200 Spectrumカメラを使用して行い、LivingImageソフトウェアv. 4.3.1(Caliper LifeSciencies)で分析した。動物を、実験の最後またはIACUCプロトコールに従い予め特定されたエンドポイントを満たしたとき、殺した。
免疫組織化学。ホルマリン固定パラフィン包埋組織の免疫組織化学的(IHC)染色を、Bond Polymer Refine Detection Systemを使用するLeica Bond-III装置で実施した。CD3、CD4、CD8、Pax5およびサイクリンD1に対する抗体を未希釈で使用した。熱誘発エピトープ修復を、20分、ER2溶液(Leica Microsystems AR9640)で行った。画像を、Aperio ScanScopeTMを使用して、デジタルに獲得した。
統計解析。全統計を、ウィンドウズ用GraphPad Prism 6、version 6.04を使用して行った。
マントル細胞リンパ腫細胞株
既存の大部分のマントル細胞リンパ腫(MCL)株は、インビトロで固定化され、多世代増殖されており、それゆえに、B細胞受容体シグナル伝達への依存性を失っている。結果として、それらはイブルチニブに低感受性である。インビトロ実験を行い、MCL細胞株のイブルチニブ処置に対する感受性を決定した。これらの細胞株をまた使用して、本実施例でさらに記載する実験におけるイブルチニブ/CART19組み合わせ処置の有効性を評価した。MCL細胞を、多数回再発したMCLを有する患者の胸水から回収した。元の細胞(RLprimary)およびそれ由来の細胞株(RL)は、典型的MCL免疫表現型である芽球様細胞形態学を有し、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)による古典的t(11;14)転座に陽性であった(図52A、52B、52C)。
既存の大部分のマントル細胞リンパ腫(MCL)株は、インビトロで固定化され、多世代増殖されており、それゆえに、B細胞受容体シグナル伝達への依存性を失っている。結果として、それらはイブルチニブに低感受性である。インビトロ実験を行い、MCL細胞株のイブルチニブ処置に対する感受性を決定した。これらの細胞株をまた使用して、本実施例でさらに記載する実験におけるイブルチニブ/CART19組み合わせ処置の有効性を評価した。MCL細胞を、多数回再発したMCLを有する患者の胸水から回収した。元の細胞(RLprimary)およびそれ由来の細胞株(RL)は、典型的MCL免疫表現型である芽球様細胞形態学を有し、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)による古典的t(11;14)転座に陽性であった(図52A、52B、52C)。
RLおよびJEKO-1細胞を、種々の用量のイブルチニブ(0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μMおよび10μM)と培養し、イブルチニブに対する感受性を、生物発光(BLI)の減少の測定により決定した。図31Aに示すように、RL細胞は、用量依存的様式でイブルチニブ処置に感受性であった。しかしながら、JEKO-1細胞は、イブルチニブ処置に耐性であった(イブルチニブ用量の増加の関数として生物発光減少を示さなかった)。
RL、Jeko-1およびMino細胞のイブルチニブへの感受性も、MTTアッセイを使用してアッセイした。インビトロでのRLの漸増濃度のイブルチニブへの暴露は、増殖および下流メディエーターリン酸化の用量依存性阻害に至り、イブルチニブの標的上効果を示し、10nMのIC50であった。対照的に、確立されたMCL細胞株Jeko-1およびMinoは、イブルチニブに相対的に耐性であり、IC50結果は最大10μMであった(図52D)。インビボ実験のための生存可能モデルとしてRLを確認するために、免疫欠損NOD-SCID-γ鎖ノックアウト(NSG)マウスに、1×106ルシフェラーゼ発現RL細胞を移植した(図52E)。その腫瘍負荷および生存を評価した。静脈内注射後、MCLは全マウスで生着し、脾臓および肝臓に局在化し、続いて骨髄、血液およびリンパ節に散在した(図52F)。罹患脾臓および肝臓の組織学は、MCLの実質性浸潤と一致する(図52G)。
これらの結果は、これらの種々の細胞株が、従ってイブルチニブ感受性およびイブルチニブ耐性MCL両者のモデルとして使用できることを示した。
これらの結果は、これらの種々の細胞株が、従ってイブルチニブ感受性およびイブルチニブ耐性MCL両者のモデルとして使用できることを示した。
マントル細胞リンパ腫細胞は、CART19による殺細胞に感受性である
CART19の有効性を示すほとんどの前臨床研究は、イブルチニブに感受性ではないB-ALL細胞株を使用して行われている。さらに、今日まで最良の臨床応答が、B-ALLを有する患者で報告されており、一方で低悪性度B細胞悪性腫瘍を有する患者では応答が低いと報告されている。
このモデルにおいてMCLがCART19による殺細胞に感受性であることを示すために、健常ドナーT細胞を、臨床試験で使用している抗CD19 CAR構築物で形質導入した。例えば、Porter, NEJM 2011参照。一連のインビトロ実験を行い、イブルチニブ感受性細胞株RLおよびイブルチニブ耐性細胞株Jeko-1が、等価なCART-19脱顆粒、サイトカイン産生、殺細胞および増殖を生じることを示した(図53A、53B、53C、53D)。さらに、末梢血または骨髄を、白血病性期のMCLを有する2患者から得て、抗CD19 CARを有する自己T細胞の増殖および形質導入を可能とした。自己患者由来CART19細胞はMCLに反応性であったが、未処置T細胞は、その各々の自己MCLに未反応性であった(図53E、53F)。これらの結果は、MCLがCART19のエフェクター機能に感受性であることを示す。
CART19の有効性を示すほとんどの前臨床研究は、イブルチニブに感受性ではないB-ALL細胞株を使用して行われている。さらに、今日まで最良の臨床応答が、B-ALLを有する患者で報告されており、一方で低悪性度B細胞悪性腫瘍を有する患者では応答が低いと報告されている。
このモデルにおいてMCLがCART19による殺細胞に感受性であることを示すために、健常ドナーT細胞を、臨床試験で使用している抗CD19 CAR構築物で形質導入した。例えば、Porter, NEJM 2011参照。一連のインビトロ実験を行い、イブルチニブ感受性細胞株RLおよびイブルチニブ耐性細胞株Jeko-1が、等価なCART-19脱顆粒、サイトカイン産生、殺細胞および増殖を生じることを示した(図53A、53B、53C、53D)。さらに、末梢血または骨髄を、白血病性期のMCLを有する2患者から得て、抗CD19 CARを有する自己T細胞の増殖および形質導入を可能とした。自己患者由来CART19細胞はMCLに反応性であったが、未処置T細胞は、その各々の自己MCLに未反応性であった(図53E、53F)。これらの結果は、MCLがCART19のエフェクター機能に感受性であることを示す。
インビトロでのイブルチニブ/CART19処置の評価
T細胞に対するイブルチニブの効果は、Honigberg et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107(2010):13075-80に記載のように、短期活性アッセイに基づき以前軽視されていた。後に、T細胞キナーゼITKに対するイブルチニブの効果の分析が、Th2タイプ極性化阻害によるCD4 T細胞に対するイブルチニブの免疫調節性の役割を指示する報告した。Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49参照。数群のCART19で処置した患者のサイトカイン分析は、CART19治療がTh1(IL2、IFNγ、TNF)、Th2(IL-4、IL-5、IL-10)および他のサイトカインの両者と関係することを示す(例えば、Kalos et al. Science Translational Medicine 3.95(2011):95ra73参照)。本実施例において、CART19機能の効果を、患者で予測されるであろうイブルチニブ濃度の、それを超えるおよびそれ未満のイブルチニブで評価した(血清中平均ピーク濃度100~150ng/ml)。Advani et al. J. Clin. Oncol. 2013;31:88参照。
T細胞に対するイブルチニブの効果は、Honigberg et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107(2010):13075-80に記載のように、短期活性アッセイに基づき以前軽視されていた。後に、T細胞キナーゼITKに対するイブルチニブの効果の分析が、Th2タイプ極性化阻害によるCD4 T細胞に対するイブルチニブの免疫調節性の役割を指示する報告した。Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49参照。数群のCART19で処置した患者のサイトカイン分析は、CART19治療がTh1(IL2、IFNγ、TNF)、Th2(IL-4、IL-5、IL-10)および他のサイトカインの両者と関係することを示す(例えば、Kalos et al. Science Translational Medicine 3.95(2011):95ra73参照)。本実施例において、CART19機能の効果を、患者で予測されるであろうイブルチニブ濃度の、それを超えるおよびそれ未満のイブルチニブで評価した(血清中平均ピーク濃度100~150ng/ml)。Advani et al. J. Clin. Oncol. 2013;31:88参照。
CART19細胞は、ITKを含むことが判明した。イブルチニブ存在下のTCRを経るCART19細胞の非特異的刺激は、CD4+T細胞で先に報告されたような、リン酸化ITK(pITK-Y180)の減少に至った。Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49参照。対照的に、CARを経るCART19細胞の特異的刺激は、ITK活性化の減少に到らなかった(図54A)。この観察は、CART19機能が、イブルチニブへの暴露により不利に影響を受けていない可能性を示す。
さらに、イブルチニブ存在下のCART19細胞の短期および長期インビトロ機能を決定した。臨床的に意義のある濃度でのイブルチニブは、CART19細胞増殖、脱顆粒またはサイトカイン産生を障害しなかったが、生理濃度超では、非特異的毒性を表す可能性のあるCART19細胞機能阻害があった(図54B、54C、10B)。
さらに、イブルチニブ存在下のCART19細胞の短期および長期インビトロ機能を決定した。臨床的に意義のある濃度でのイブルチニブは、CART19細胞増殖、脱顆粒またはサイトカイン産生を障害しなかったが、生理濃度超では、非特異的毒性を表す可能性のあるCART19細胞機能阻害があった(図54B、54C、10B)。
特に、正常健常ドナーから単離されたPBMCを、上記のようにレンチウイルス抗CD19 CAR構築物で形質導入した。得られたCAR19発現T細胞(CART19)を培養し、継代して増殖および増大能を決定した。1:1比のCD4:CD8発現T細胞を、種々の濃度のイブルチニブ(10nM、100nMおよび1000nMイブルチニブ)存在下、または非存在下、培養した。イブルチニブを、各細胞継代で添加した。細胞数を、0日目、5日目、6日目、7日目、9日目および10日目に計数した(図9A)。細胞体積もモニターした(図9B)。
CFSE染色およびフローサイトメトリー分析も、イブルチニブ存在下、腫瘍細胞株MOLM14、JEKO-1およびRLでの刺激後のCART19細胞の増殖を評価するために使用した。MOLM14はAML細胞株であり、JEKO-1およびRLはマントル細胞リンパ腫細胞株である。具体的に、RL細胞は、再発MCL患者の胸水から得た新生物B細胞由来の新規MCL細胞株である。CART19細胞および腫瘍細胞を、1:1比で混合し、増殖を5日間評価した。増殖細胞パーセンテージを、図10Aの各ヒストグラムに示す。図10Bに示すような増殖の定量化は、高用量のイブルチニブが、MCL細胞株との共培養中、CART 19細胞増殖を阻害するはずであることを示す。
CFSE染色およびフローサイトメトリー分析も、イブルチニブ存在下、腫瘍細胞株MOLM14、JEKO-1およびRLでの刺激後のCART19細胞の増殖を評価するために使用した。MOLM14はAML細胞株であり、JEKO-1およびRLはマントル細胞リンパ腫細胞株である。具体的に、RL細胞は、再発MCL患者の胸水から得た新生物B細胞由来の新規MCL細胞株である。CART19細胞および腫瘍細胞を、1:1比で混合し、増殖を5日間評価した。増殖細胞パーセンテージを、図10Aの各ヒストグラムに示す。図10Bに示すような増殖の定量化は、高用量のイブルチニブが、MCL細胞株との共培養中、CART 19細胞増殖を阻害するはずであることを示す。
T細胞の脱顆粒は、細胞溶解性T細胞の活性化および抗原特異的細胞毒性を開始する能力を示す。CD107aは、T細胞刺激後に細胞表面上に一過性に発現されるT細胞脱顆粒の機能的マーカーである。フローサイトメトリー分析を使用して、腫瘍細胞株MOLM14、JEKO-1およびRLで刺激後のCD107a発現CART19 T細胞を定量化した。CD107a発現細胞は、図11Aに示す細胞プロファイルのQ2(四分円2)に存在した。図11Aのプロファイルから得た結果の定量化を図11Bに示す。これらの結果は、CART19細胞とMCL-RLまたはJEKO-1の共培養が、大量のCAR特異的CD107a脱顆粒を生じることを示す。
イブルチニブ存在下のCART19 T細胞によるサイトカイン産生も、種々の腫瘍細胞株で刺激後定量した。IL-2、TNF-αおよびIFN-γ産生をフローサイトメトリーにより評価した。サイトカイン産生細胞は、図12、図13および図14に示すプロファイルの四分円2に存在した。JEKO-1およびRLにより刺激されたCART19 T細胞は、サイトカイン発現増加を示した。また、漸増濃度のイブルチニブ処置は、CART19サイトカイン産生細胞のパーセンテージに影響しなかった。
イブルチニブ存在下のCART19 T細胞によるサイトカイン産生も、種々の腫瘍細胞株で刺激後定量した。IL-2、TNF-αおよびIFN-γ産生をフローサイトメトリーにより評価した。サイトカイン産生細胞は、図12、図13および図14に示すプロファイルの四分円2に存在した。JEKO-1およびRLにより刺激されたCART19 T細胞は、サイトカイン発現増加を示した。また、漸増濃度のイブルチニブ処置は、CART19サイトカイン産生細胞のパーセンテージに影響しなかった。
腫瘍細胞による刺激後、かつ種々の濃度のイブルチニブ存在下のCART19細胞からのサイトカイン分泌を、30-plex LUMINEXアッセイにより分析した。IL-2、IFN-γおよびTNF-αのようなTH1細胞により分泌されるサイトカインをアッセイした。IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-15、IL-17、MIP1a、GM-CSF、MIP-1b、CP-1、IL-1Ra、IL-7、IP-10、IL-1b、VEGF、G-CSF、EGF、HGF、IFNa、IL-12、RANTES、エオタキシン、IL-2R、MIGおよびIL-8を含むTH2細胞により文筆されるサイトカインをアッセイした。図15に示すように、TH1およびTH2サイトカインは、CART19 T細胞により分泌された。
また、2つの異なる方法を使用した実験は、イブルチニブ暴露およびイブルチニブ未暴露CART19細胞でTh1/Th2極性化の差がないことを示した(図54D)。
また、2つの異なる方法を使用した実験は、イブルチニブ暴露およびイブルチニブ未暴露CART19細胞でTh1/Th2極性化の差がないことを示した(図54D)。
CART19細胞によるMCL細胞死はイブルチニブ存在下で増強され、組み合わせからの少なくとも相加的効果を示唆した(図54E)。しかしながら、CART19細胞の内因性細胞毒性機能は、イブルチニブ存在下で増強されなかった(図54F)。
さらなる生物発光アッセイを行い、腫瘍細胞のCART19細胞による殺細胞を評価した。CART19細胞を、96ウェルプレートでデュプリケートで、1:1、1:0.5、1:0.25および1:0のように、種々の比でルシフェラーゼレポーターを担持する腫瘍細胞MOLM14、JEKO-1およびRLと播種した。24時間後、生物発光を検出し、定量した。結果は、MOLM14サンプルにおける生物発光がCART19細胞とのインキュベーション後減少しないことを示した。しかしながら、JEKO-1およびRL細胞について、生物発光はCART19細胞存在下で減少し、CART19細胞がJEKO-1およびRL細胞死に介在したことを示唆した(図16A、16B、16C、16D、16Eおよび16F)。イブルチニブで処置したとき生物発光はさらに減少し、イブルチニブとCART19の組み合わせが、CART19処置単独よりJEKO-1およびRL細胞死を増加させたことを示した。これらの結果と一致して、各処置後の総細胞の計算は、JEKO-1およびRL細胞のCART19処置が、細胞数の減少を起こし、CART19およびイブルチニブで処置したときさらに減少し(図17Bおよび17C)、組み合わせ治療がMCL細胞死に有効なだけでなく、MCL細胞株の効率的殺細胞をもたらすことを示した。
さらなる生物発光アッセイを行い、腫瘍細胞のCART19細胞による殺細胞を評価した。CART19細胞を、96ウェルプレートでデュプリケートで、1:1、1:0.5、1:0.25および1:0のように、種々の比でルシフェラーゼレポーターを担持する腫瘍細胞MOLM14、JEKO-1およびRLと播種した。24時間後、生物発光を検出し、定量した。結果は、MOLM14サンプルにおける生物発光がCART19細胞とのインキュベーション後減少しないことを示した。しかしながら、JEKO-1およびRL細胞について、生物発光はCART19細胞存在下で減少し、CART19細胞がJEKO-1およびRL細胞死に介在したことを示唆した(図16A、16B、16C、16D、16Eおよび16F)。イブルチニブで処置したとき生物発光はさらに減少し、イブルチニブとCART19の組み合わせが、CART19処置単独よりJEKO-1およびRL細胞死を増加させたことを示した。これらの結果と一致して、各処置後の総細胞の計算は、JEKO-1およびRL細胞のCART19処置が、細胞数の減少を起こし、CART19およびイブルチニブで処置したときさらに減少し(図17Bおよび17C)、組み合わせ治療がMCL細胞死に有効なだけでなく、MCL細胞株の効率的殺細胞をもたらすことを示した。
インビボでのイブルチニブ/CART19処置の評価
これらの実験において、マントル細胞リンパ腫のマウスモデルを使用して、インビボでのCART19およびイブルチニブ組み合わせ治療を評価した。
図20、55および5Aに示すような概略を本実施例において使用した。図20は、MCLのインビボマウスモデルにおける試験CART19/イブルチニブ組み合わせ治療の概略を示す。RL(MCL-3)、JEKO-1(MCL-4)およびNALM6(MCL-5)細胞株からの1×106細胞をNSGマウスに注射する(各実験20マウス)。生着させるための1週間後、処置を0日目に開始し、ここで、処置は0.5~1×106 CART19細胞(注射による)、25mg/kg/日イブルチニブ(強制経口投与)またはCART19+イブルチニブ処置である。7日目、14日目、21日目および28日目、生物発光を造影して、腫瘍サイズをモニターする。イブルチニブ処置を受けているマウスは、イブルチニブ処置を続ける。マウスの生存もモニターする。図55および56は、MCLのインビボマウスモデルにおける試験CART19/イブルチニブ組み合わせ治療のさらなる概略を示す。2×106 MCL-RL細胞をNSGマウスに注射する。生着させるための1週間後(生着を生物発光造影で確認)、処置を7日目(MCL-RL細胞注射後)に開始し、ここで、処置は媒体対照、CART19細胞(2×106細胞)および/またはイブルチニブ(125mg/kg/日)である。14日目、21日目、28日目および35日目(MCL-RL細胞注射後)、生物発光を造影して、腫瘍サイズをモニターする。
これらの実験において、マントル細胞リンパ腫のマウスモデルを使用して、インビボでのCART19およびイブルチニブ組み合わせ治療を評価した。
図20、55および5Aに示すような概略を本実施例において使用した。図20は、MCLのインビボマウスモデルにおける試験CART19/イブルチニブ組み合わせ治療の概略を示す。RL(MCL-3)、JEKO-1(MCL-4)およびNALM6(MCL-5)細胞株からの1×106細胞をNSGマウスに注射する(各実験20マウス)。生着させるための1週間後、処置を0日目に開始し、ここで、処置は0.5~1×106 CART19細胞(注射による)、25mg/kg/日イブルチニブ(強制経口投与)またはCART19+イブルチニブ処置である。7日目、14日目、21日目および28日目、生物発光を造影して、腫瘍サイズをモニターする。イブルチニブ処置を受けているマウスは、イブルチニブ処置を続ける。マウスの生存もモニターする。図55および56は、MCLのインビボマウスモデルにおける試験CART19/イブルチニブ組み合わせ治療のさらなる概略を示す。2×106 MCL-RL細胞をNSGマウスに注射する。生着させるための1週間後(生着を生物発光造影で確認)、処置を7日目(MCL-RL細胞注射後)に開始し、ここで、処置は媒体対照、CART19細胞(2×106細胞)および/またはイブルチニブ(125mg/kg/日)である。14日目、21日目、28日目および35日目(MCL-RL細胞注射後)、生物発光を造影して、腫瘍サイズをモニターする。
MCLのインビボマウスモデルにおけるイブルチニブ処置単独の効果を試験した。GFP/ルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトしたRL細胞を、免疫欠損NSGマウスに静脈内注射し、肝臓および脾臓への100%MCL生着と、最終的なリンパ節および骨髄への拡散に到った。マウスを、種々の用量のイブルチニブ、25mg/kg/日および250mg/kg/日で処置した。腫瘍増殖を表す平均生物発光を種々の時点で評価した。図32に示すように、RL由来腫瘍は、用量相関感受性を示した。RL細胞含有マウスにおけるイブルチニブ用量を力価測定するさらなる実験を行っており、図57に示す。用量が高くなると、毒性を増加させずに良好な抗腫瘍活性をもたらし、MCLのために臨床で使用される高用量のイブルチニブと一致する(Wang et al. NEJM 369.6(2013):507-16)。
CART19用量設定も行った。GFP-ルシフェラーゼレポーターを担持する2つのMCL細胞株、RL(MCL-1)およびJEKO-1(MCL-2)を、NSGマウスに0日目に注射した。CART19 T細胞を、7日目に種々の用量で、例えば0.5×e6細胞、1×e6細胞または2×e6細胞で注射した。マウスを、例えば、100日間モニターした。種々の時点で、マウスを腫瘍サイズ(例えば、生物発光造影)(図18Aおよび18Bおよび図19A)および全生存期間(例えば、カプラン・マイヤー生存曲線)(図18Cおよび図19B)についてモニターした。異なる用量のCART19細胞は用量依存的抗腫瘍有効性を示し、2×106 CART19細胞/マウスが最も有効な用量である(図19A)。
CART19用量設定も行った。GFP-ルシフェラーゼレポーターを担持する2つのMCL細胞株、RL(MCL-1)およびJEKO-1(MCL-2)を、NSGマウスに0日目に注射した。CART19 T細胞を、7日目に種々の用量で、例えば0.5×e6細胞、1×e6細胞または2×e6細胞で注射した。マウスを、例えば、100日間モニターした。種々の時点で、マウスを腫瘍サイズ(例えば、生物発光造影)(図18Aおよび18Bおよび図19A)および全生存期間(例えば、カプラン・マイヤー生存曲線)(図18Cおよび図19B)についてモニターした。異なる用量のCART19細胞は用量依存的抗腫瘍有効性を示し、2×106 CART19細胞/マウスが最も有効な用量である(図19A)。
これらの試験は、MCLに対する2治療の直接の比較を行う機会を提供する。図58に示すように、長期生存は、CART-19細胞で処置したマウスでのみ達成された。未処置T細胞+イブルチニブとイブルチニブ単独を比較したとき、抗腫瘍効果に差はなかった。それゆえに、続く実験の全てにおいて、対照群は媒体およびイブルチニブ単独であった(図59)。
図56に模式的に詳述するように、CART19のイブルチニブの添加も試験した。腫瘍負荷に対するイブルチニブの効果の評価は、初期時点での腫瘍増殖のわずかな遅延を示した。対照的に、CART19細胞治療は、数週間腫瘍負荷の明確な減少を生じた。CART19細胞単独を受けたマウスにおいて、この後低悪性度再発が40日目に開始し、一方CART19細胞ならびにイブルチニブで処置されたマウスは、80日目まで検出可能な疾患はなかった(図60)。実験の最後に回収した臓器の病理組織学は、全対照およびイブルチニブ処置マウスにおける疾患の残留性を示し、イブルチニブ処置で腫瘍壊死の病巣があった。CART19単独で処置したマウスの大部分が、CART19細胞の残留性に付随した長期で低悪性度再発を示したが、CART19-イブルチニブで処置したマウスは腫瘍の排除と関連臓器からのCART19の消失を示した(データは示していない)。
図56に模式的に詳述するように、CART19のイブルチニブの添加も試験した。腫瘍負荷に対するイブルチニブの効果の評価は、初期時点での腫瘍増殖のわずかな遅延を示した。対照的に、CART19細胞治療は、数週間腫瘍負荷の明確な減少を生じた。CART19細胞単独を受けたマウスにおいて、この後低悪性度再発が40日目に開始し、一方CART19細胞ならびにイブルチニブで処置されたマウスは、80日目まで検出可能な疾患はなかった(図60)。実験の最後に回収した臓器の病理組織学は、全対照およびイブルチニブ処置マウスにおける疾患の残留性を示し、イブルチニブ処置で腫瘍壊死の病巣があった。CART19単独で処置したマウスの大部分が、CART19細胞の残留性に付随した長期で低悪性度再発を示したが、CART19-イブルチニブで処置したマウスは腫瘍の排除と関連臓器からのCART19の消失を示した(データは示していない)。
CART19およびイブルチニブの組み合わせ効果の機構
ここでのインビトロ実験は、イブルチニブが短期CART19エフェクター機能を妨害もしなければ、明らかな増強もしないことを示した。インビボ試験は、イブルチニブ単剤療法が中度の抗腫瘍効果を有することを示した。結果は、イブルチニブがCART19細胞の抗腫瘍機能を有意に増強できたことを示した(図60)。それゆえに、この効果の機構を決定する実験を行った。
ITKの阻害はTh2極性化を阻害し、Th1表現型に歪めることが示されている(Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49)。CART19細胞およびイブルチニブで処置されたマウスにおいて、CART19細胞単剤療法と比較したとき、このアッセイを使用して、Th1細胞の増加は観察されなかった(図61A、61B)。しかしながら、マウスのイブルチニブへの暴露は、末梢CART19細胞を増加させた。処置群と対照群で増殖マーカーKi67に差はなく(図61C)、よって、このアッセイは増殖の差異を検出しなかった。同様に、抗アポトーシスマーカーBcl2またはアポトーシスマーカーホスファチジルセリンに差はなく、CART細胞数の差は、アポトーシスの機能障害と関係しないことが示唆された(図61D)。イブルチニブが患者における末梢リンパ球増加と関係しているため、イブルチニブ単独で処置したマウスにおいてこれがまた未ら得るか否かを決定する実験を行った。イブルチニブ開始1週間後、イブルチニブ処置マウスにおいて循環MCL細胞が増え、結節性/臓器MCL細胞が減った。興味深いことに、この増加は、急性白血病細胞株NALM-6を移植したNSGマウスでも観察されたように、イブルチニブ感受性および耐性インビボモデルの両者で観察された(データは示していない)。
ここでのインビトロ実験は、イブルチニブが短期CART19エフェクター機能を妨害もしなければ、明らかな増強もしないことを示した。インビボ試験は、イブルチニブ単剤療法が中度の抗腫瘍効果を有することを示した。結果は、イブルチニブがCART19細胞の抗腫瘍機能を有意に増強できたことを示した(図60)。それゆえに、この効果の機構を決定する実験を行った。
ITKの阻害はTh2極性化を阻害し、Th1表現型に歪めることが示されている(Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49)。CART19細胞およびイブルチニブで処置されたマウスにおいて、CART19細胞単剤療法と比較したとき、このアッセイを使用して、Th1細胞の増加は観察されなかった(図61A、61B)。しかしながら、マウスのイブルチニブへの暴露は、末梢CART19細胞を増加させた。処置群と対照群で増殖マーカーKi67に差はなく(図61C)、よって、このアッセイは増殖の差異を検出しなかった。同様に、抗アポトーシスマーカーBcl2またはアポトーシスマーカーホスファチジルセリンに差はなく、CART細胞数の差は、アポトーシスの機能障害と関係しないことが示唆された(図61D)。イブルチニブが患者における末梢リンパ球増加と関係しているため、イブルチニブ単独で処置したマウスにおいてこれがまた未ら得るか否かを決定する実験を行った。イブルチニブ開始1週間後、イブルチニブ処置マウスにおいて循環MCL細胞が増え、結節性/臓器MCL細胞が減った。興味深いことに、この増加は、急性白血病細胞株NALM-6を移植したNSGマウスでも観察されたように、イブルチニブ感受性および耐性インビボモデルの両者で観察された(データは示していない)。
インビボでのT細胞増殖におけるイブルチニブの役割を理解するために、我々は、NSGマウスにMCL-RL WT細胞を移植し、ルシフェラーゼ陽性T細胞で処置した。CTL019およびCTL019イブルチニブ処置マウスの両者は、UTDまたはUTDイブルチニブと比較して、強いT細胞増殖を示した(データは示していない)。次いで、我々は、インビボでの異なるT細胞サブセットの頻度を試験し、T細胞注入1週間後、PB T細胞で差は見られなかった(データは示していない)。CXCR4がヒトにおけるイブルチニブ駆動B細胞動員と関係しているため、我々は、CTL019またはCTL019イブルチニブで処置したマウスのPB T細胞におけるCXCR4発現をインビボで確認し、CXCR4レベルは、2群で類似した(データは示していない)。最後に、CART19およびCART19イブルチニブで処置したマウスのT細胞のPBの阻害性/共刺激受容体発現を分析した。TIM3、LAG3、CD137またはCTLA4の発現における差異は明確でなかったが、しかしながらPD-1発現減少傾向がCTL019およびイブルチニブと組み合わせたUTDで処置したマウスで示された。
結論
B細胞悪性腫瘍の治療は、BCRシグナル伝達の小分子阻害剤およびCD19指向T細胞ベースの治療を含む。再発MCLの状況において、BTK阻害剤イブルチニブは、現在FDAにより承認され、高い初期応答率を生み出している。不運なことに、これらの応答は一過性であり、CLLで使用されるより高い薬物用量を必要とする傾向にある。CART-19は、高リスクB-ALLを有する患者で耐久性の応答をもたらし、同様に他のB細胞悪性腫瘍に有効であり得る。予備的データは、成熟B細胞悪性腫瘍のCART-19への応答がB-ALLより低い可能性があることを示唆するが、この差異の機構はまだ確認されていない。この実施例は、MCLの処置におけるCART19へのイブルチニブの付加の影響を試験した。
イブルチニブに対する種々の感受性(10nM~10μM範囲のIC50)の異なるMCL細胞株を、インビトロ実験に使用した。これらの種々の細胞株を、イブルチニブ感受性およびイブルチニブ耐性MCLの両者の具現化のために使用した。最高用量以外の全てのイブルチニブで、CART19細胞機能は障害されず、完全T細胞増殖動態、腫瘍認識および殺細胞およびサイトカイン産生を備えた。さらに、結果は、イブルチニブ暴露によるTヘルパー極性化を明らかにしなかった。この知見は、Dubovksy et al. Blood 122.15(2013):2539-49により実施されたCD4のみの実験のモデルとは対照的に、CD4およびCD8細胞の混合培養の使用を含む、因子の組み合わせによるものであり得る。イブルチニブ感受性およびイブルチニブ耐性細胞株の両者とも、CART19細胞を強く活性化し、殺細胞、サイトカイン産生および増殖を誘発した。CART19とイブルチニブの組み合わせは、インビトロで少なくとも相加的腫瘍細胞死をもたらした。本実施例の結果は、各々を臨床的に意義のある投与量および投与スケジュール(CART19について単回用量、イブルチニブについて連続投与)で単剤療法として使用したとき、イブルチニブを超えるCART19の優位性を示す。
B細胞悪性腫瘍の治療は、BCRシグナル伝達の小分子阻害剤およびCD19指向T細胞ベースの治療を含む。再発MCLの状況において、BTK阻害剤イブルチニブは、現在FDAにより承認され、高い初期応答率を生み出している。不運なことに、これらの応答は一過性であり、CLLで使用されるより高い薬物用量を必要とする傾向にある。CART-19は、高リスクB-ALLを有する患者で耐久性の応答をもたらし、同様に他のB細胞悪性腫瘍に有効であり得る。予備的データは、成熟B細胞悪性腫瘍のCART-19への応答がB-ALLより低い可能性があることを示唆するが、この差異の機構はまだ確認されていない。この実施例は、MCLの処置におけるCART19へのイブルチニブの付加の影響を試験した。
イブルチニブに対する種々の感受性(10nM~10μM範囲のIC50)の異なるMCL細胞株を、インビトロ実験に使用した。これらの種々の細胞株を、イブルチニブ感受性およびイブルチニブ耐性MCLの両者の具現化のために使用した。最高用量以外の全てのイブルチニブで、CART19細胞機能は障害されず、完全T細胞増殖動態、腫瘍認識および殺細胞およびサイトカイン産生を備えた。さらに、結果は、イブルチニブ暴露によるTヘルパー極性化を明らかにしなかった。この知見は、Dubovksy et al. Blood 122.15(2013):2539-49により実施されたCD4のみの実験のモデルとは対照的に、CD4およびCD8細胞の混合培養の使用を含む、因子の組み合わせによるものであり得る。イブルチニブ感受性およびイブルチニブ耐性細胞株の両者とも、CART19細胞を強く活性化し、殺細胞、サイトカイン産生および増殖を誘発した。CART19とイブルチニブの組み合わせは、インビトロで少なくとも相加的腫瘍細胞死をもたらした。本実施例の結果は、各々を臨床的に意義のある投与量および投与スケジュール(CART19について単回用量、イブルチニブについて連続投与)で単剤療法として使用したとき、イブルチニブを超えるCART19の優位性を示す。
研究室で産生したMCL-RL細胞株を使用して、全身異種移植MCLモデルも本実施例において産生した。種々の用量の同種CAR19 T細胞でのこれらのマウスの処置は、用量依存的抗腫瘍効果を生じた。CART-19に対する類似の用量応答は、イブルチニブ耐性JEKO-1細胞株においても観察された。MCL-RLを、種々の用量(例えば、0mg/kg/日、25mg/kg/日および125mg/kg/日)のイブルチニブでインビボで処置し、それぞれ70日、81日および100日(p<0.001)の中央全生存期間となった。イブルチニブ125mg/kgとCART19の直接インビボ比較は、CART19処置マウスについて腫瘍制御の有意な改善を示した。また、MCL-RL移植マウスを、媒体、イブルチニブ、CART19またはCART19とイブルチニブの組み合わせ(iCART19)で処置した。臨床的に意義のある用量で、MCLのCART19での単剤療法は、イブルチニブでの単剤療法より優れ、イブルチニブとCART19の組み合わせは、抗腫瘍効果の増強に至った。特に、iCART19組み合わせは、インビボで、初期に高いCART19細胞循環レベル、続いて深い腫瘍応答をもたらし、再発は、イブルチニブをCART19に添加したとき、有意に遅延された。iCART19組み合わせは、腫瘍制御改善をもたらし、マウスの80%が完全寛解および長期無病生存期間に達した。機構的に、イブルチニブ処置マウスは、Th1/Th2または記憶表現型の変化無しで、循環CART19細胞数が高かった。それゆえに、ここでの結果は、イブルチニブが合理的な方法でCART19と組み合わせることができることを示し、これらの治療の各々の特性が他方の欠損を補い、そうして、増強された長期抗腫瘍効果にいたり得ることを示唆する。BCRシグナル伝達阻害と抗CD19指向T細胞治療を組み合わせた実験および結果は、B細胞悪性腫瘍のための非交差耐性治療の合理的組み合わせへの道を築く。
腫瘍応答および再発の動態は、イブルチニブがCTL019単独により達成される初期応答を深めるまたはCTL019細胞の長期免疫監視能の増強のいずれかに役立つことを示唆する。
腫瘍応答および再発の動態は、イブルチニブがCTL019単独により達成される初期応答を深めるまたはCTL019細胞の長期免疫監視能の増強のいずれかに役立つことを示唆する。
実施例9:慢性リンパ性白血病のためのイブルチニブ/CAR19 T細胞組み合わせ治療
イブルチニブは、慢性リンパ性白血病(CLL)の処置にも有用である。イブルチニブは、T細胞またはNK細胞に対する胞毒性効果は示されていない。しかしながら、CLL細胞において、イブルチニブは、プログラム細胞死を促進し、腫瘍細胞遊走および接着を阻害する。本実施例において、1)イブルチニブ治療を受けている患者からのCART19産生に対するイブルチニブの効果;および2)最適インビボ機能のためのCART19と組み合わせたイブルチニブでの最適処置タイミングを試験するために実験を行った。
イブルチニブは、慢性リンパ性白血病(CLL)の処置にも有用である。イブルチニブは、T細胞またはNK細胞に対する胞毒性効果は示されていない。しかしながら、CLL細胞において、イブルチニブは、プログラム細胞死を促進し、腫瘍細胞遊走および接着を阻害する。本実施例において、1)イブルチニブ治療を受けている患者からのCART19産生に対するイブルチニブの効果;および2)最適インビボ機能のためのCART19と組み合わせたイブルチニブでの最適処置タイミングを試験するために実験を行った。
CART19産生および機能に対するイブルチニブの効果
正常ドナーPBMCを、ここに、例えば実施例6に記載するようなアフェレシスを使用して得た。PBMCを5μMのイブルチニブと30分インキュベートするかまたは未処置のままにし(対照として)、細胞を2回洗浄した。次いで、細胞を、ここに、例えば、実施例4記載する方法を使用して、CAR19を含むレンチウイルス構築物で形質導入して、CART19 T細胞を産生した。FACS分析を実施して、未処置PBMCと比較して、イブルチニブ処置PBMCから産生されたCART19 T細胞の数を決定した。図21に示すように、形質導入イブルチニブ処置PBMCの15%がCAR19を発現し、形質導入未処置PBMCの12%がCAR19を発現した。これらの結果は、イブルチニブ処置がレンチウイルス遺伝子導入効率またはCART19 T細胞産生に影響しないことを示す。それゆえに、CART19 T細胞を、イブルチニブ処置を受けているCLL患者から産生できる。
さらにインビトロ分析を行って、CART19 T細胞増殖、CART19細胞毒性およびTH1:TH2サイトカイン産生比に対するイブルチニブの影響を決定した。
正常ドナーPBMCを、ここに、例えば実施例6に記載するようなアフェレシスを使用して得た。PBMCを5μMのイブルチニブと30分インキュベートするかまたは未処置のままにし(対照として)、細胞を2回洗浄した。次いで、細胞を、ここに、例えば、実施例4記載する方法を使用して、CAR19を含むレンチウイルス構築物で形質導入して、CART19 T細胞を産生した。FACS分析を実施して、未処置PBMCと比較して、イブルチニブ処置PBMCから産生されたCART19 T細胞の数を決定した。図21に示すように、形質導入イブルチニブ処置PBMCの15%がCAR19を発現し、形質導入未処置PBMCの12%がCAR19を発現した。これらの結果は、イブルチニブ処置がレンチウイルス遺伝子導入効率またはCART19 T細胞産生に影響しないことを示す。それゆえに、CART19 T細胞を、イブルチニブ処置を受けているCLL患者から産生できる。
さらにインビトロ分析を行って、CART19 T細胞増殖、CART19細胞毒性およびTH1:TH2サイトカイン産生比に対するイブルチニブの影響を決定した。
細胞増殖の測定のために、細胞を、実施例4に記載のように、増殖細胞の検出のためのCFSEで染色し、FACSで分析した。CART19 T細胞を種々の濃度のイブルチニブ(0.1μM、0.5μM、1μMおよび5μM)とインキュベートし、CD3/CD28ビーズで刺激するかまたは未刺激のままとした。図22において、各濃度のイブルチニブで未刺激対CD3/CD28刺激CART19 T細胞を比較するために、ヒストグラムを重層した。各濃度のイブルチニブについて、CD3/CD28刺激T細胞増殖が観察され、それによりイブルチニブ処置がCART19細胞増殖に影響しないことが示された。
CART19 T細胞の細胞毒性に対するイブルチニブの効果も、実施例4に記載の方法を使用して評価した。非形質導入およびCAR19形質導入T細胞を培地、DMSOまたは1μMイブルチニブで処置した。フローベースの殺細胞アッセイを、エフェクターCART19細胞(培地、DMSOまたはイブルチニブ処置)を用いるエフェクター対標的(E:T)比のタイトレートを使用して行い、CD19発現標的細胞に対する特異的細胞毒性活性を決定した。図23に示すように、イブルチニブで処置したCART19 T細胞は、CD19発現標的細胞に対して、対照(培地またはDMSOで処置したCART19 T細胞)と同じパーセンテージの特異的細胞毒性活性を示した。それゆえに、イブルチニブ処置はCART19細胞毒性に影響しない。
イブルチニブ処置は、ヒトCLL患者においてTH2活性化を制限でき、それゆえにT細胞におけるTH1選択圧を促進し、TH1/TH2サイトカインをゆがめ得る。イブルチニブまたはDMSO(対照)の存在下または非存在下のTH1およびTH2サイトカイン産生を測定するためのアッセイを行った。図24に示すように、イブルチニブは、CART 19細胞におけるTH1およびTH2サイトカインの歪みを促進しない。
イブルチニブ処置は、ヒトCLL患者においてTH2活性化を制限でき、それゆえにT細胞におけるTH1選択圧を促進し、TH1/TH2サイトカインをゆがめ得る。イブルチニブまたはDMSO(対照)の存在下または非存在下のTH1およびTH2サイトカイン産生を測定するためのアッセイを行った。図24に示すように、イブルチニブは、CART 19細胞におけるTH1およびTH2サイトカインの歪みを促進しない。
インビボでのイブルチニブ/CART19組み合わせ処置の有効性
CART19機能をインビボマウスモデルで評価した。Nalm/6細胞(ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株)をNSGマウスにインプラントし、マウスを少なくとも50日間連日モニターした。Nalm/6腫瘍モデルは、イブルチニブに非感受性である腫瘍を産生し、それゆえにインビボでのCART19機能および腫瘍体積減少/癌処置における有効性の分析が可能である。7日目から開始して、マウスにDMSO(対照)またはイブルチニブを強制経口投与により連日投与した。CART19を7日目もしくは9日目に投与するかまたはマウスを未処置のままとした(対照)。4日目、11日目、18日目、25日目および32日目に、マウスで循環しているNalm/6細胞数を、例えば、末梢血FACS分析により測定して、イブルチニブの存在下または非存在下、CART19がNalm/6細胞を除去する有効性を決定した。例えば、細胞を抗ヒトCD19抗体で染色して、腫瘍担持NSGマウスにおける血中のヒトCD19+(Nalm/6)細胞のパーセントを決定した。
CART19機能をインビボマウスモデルで評価した。Nalm/6細胞(ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株)をNSGマウスにインプラントし、マウスを少なくとも50日間連日モニターした。Nalm/6腫瘍モデルは、イブルチニブに非感受性である腫瘍を産生し、それゆえにインビボでのCART19機能および腫瘍体積減少/癌処置における有効性の分析が可能である。7日目から開始して、マウスにDMSO(対照)またはイブルチニブを強制経口投与により連日投与した。CART19を7日目もしくは9日目に投与するかまたはマウスを未処置のままとした(対照)。4日目、11日目、18日目、25日目および32日目に、マウスで循環しているNalm/6細胞数を、例えば、末梢血FACS分析により測定して、イブルチニブの存在下または非存在下、CART19がNalm/6細胞を除去する有効性を決定した。例えば、細胞を抗ヒトCD19抗体で染色して、腫瘍担持NSGマウスにおける血中のヒトCD19+(Nalm/6)細胞のパーセントを決定した。
図25Aに示すように、CART19注射を受けなかったマウスは、腫瘍Nalm/6細胞の増加を示した。しかしながら、DMSOの連日投与と組み合わせてCART19注射を受けたマウスは、Nalm/6細胞の除去(減少)の成功が示された。イブルチニブの連日投与と組み合わせてCART19注射を受けたマウスも、DMSO処置を受けたマウスと同じ動態および有効性でNalm/6細胞の除去の成功を示した。それゆえに、これらの結果は、イブルチニブ処置がこの腫瘍モデルからのNalm/6細胞の除去におけるCART19機能を障害しないことを示す。
マウスの健康状態を、Nalm/6細胞注射後少なくとも50日モニターした。図25Bのカプラン・マイヤー生存曲線は、未処置マウス(CART19 T細胞を受けなかった)およびDMSOまたはイブルチニブのいずれかを受けたマウスのいずれも、Nalm/6細胞注射後30日を越えて生存しなかったことを示す。しかしながら、DMSOまたはイブルチニブいずれかとのCART19 T細胞での処置は、マウスの生存を増加させた。それゆえに、これらの結果を図13Aからの腫瘍負荷結果と合わせて、イブルチニブ処置がインビボでNSG-Nalm/6腫瘍モデルからの腫瘍細胞の除去におけるCART19機能を障害しないことを示す。
CLL患者におけるイブルチニブ/CART19組み合わせ処置の最適タイミング
CLLのイブルチニブ処置中のCART19投与の最適な時を、1年間イブルチニブ処置を受けているCLL患者からのサンプルを使用して評価した。9名のCLL患者(患者111330026、患者111330030、患者111330039、患者111330056、患者111330073、患者111330074、患者111330081、患者111330086および患者111330111)からのPBMCサンプルを、イブルチニブ処置の種々のサイクルで単離し、CART19 T細胞の産生に使用した。PBMCサンプルをベースラインを確立するためにイブルチニブ処置前、その後イブルチニブ処置のサイクル2、1日目およびサイクル12、1日目に採取した。形質導入、増殖、細胞毒性およびサイトカイン産生のようなCART19製造のいくつかの異なるパラメータを評価した。他の評価は、記憶、阻害剤分子および疲弊の評価のようなエクスビボ免疫表現型検査を含み得る。
CLLのイブルチニブ処置中のCART19投与の最適な時を、1年間イブルチニブ処置を受けているCLL患者からのサンプルを使用して評価した。9名のCLL患者(患者111330026、患者111330030、患者111330039、患者111330056、患者111330073、患者111330074、患者111330081、患者111330086および患者111330111)からのPBMCサンプルを、イブルチニブ処置の種々のサイクルで単離し、CART19 T細胞の産生に使用した。PBMCサンプルをベースラインを確立するためにイブルチニブ処置前、その後イブルチニブ処置のサイクル2、1日目およびサイクル12、1日目に採取した。形質導入、増殖、細胞毒性およびサイトカイン産生のようなCART19製造のいくつかの異なるパラメータを評価した。他の評価は、記憶、阻害剤分子および疲弊の評価のようなエクスビボ免疫表現型検査を含み得る。
図26は、CAR形質導入後の他の8患者から得た結果の代表であった、患者111330030からのT細胞のCAR19形質導入からのフローサイトメトリー分析の結果を示す。PBMCを、患者から記載した時点(ベースライン、例えば、処置前;サイクル2、1日目;およびサイクル12、1日目)に採取し、例えば、実施例4に記載するような方法を使用して、CAR19含有レンチウイルスベクターで形質導入した。次いで、形質導入PBMCをアネキシン、CD3、CD4およびGAM(CAR検出のため)で染色し、次いでFACS分析により分析した。図14のグラフにおける四角で囲んだ領域は、GAM陽性であり、CART19 T細胞形質導入が成功した細胞のパーセンテージを示す。下の3つのグラフは、CAR19がベースラインで約23%の細胞、サイクル2、1日目で28%の細胞およびサイクル12、1日目で44%の細胞に形質導入が成功したことを示す。
次に、CART19細胞または非形質導入細胞(対照)の増殖速度(または集団倍加)を、12日間各時点(ベースライン、サイクル2、1日目およびサイクル12、1日目)で評価した。図27は、3名の患者、患者111330039(#39)、患者111330026(#26)および患者111330030(#30)の12日間にわたる集団倍加のグラフ表示を示す。これらの結果は、増殖速度に関して、サイクル2、1日目とサイクル12、1日目の間またはその時点で単離されたPBMCがCAR形質導入に好ましいことを示す。
CART19機能に影響するイブルチニブ処置の潜在的機構
CLL患者サンプルからのCART19機能に影響し得るイブルチニブ処置の種々の機構を評価した。
CD19発現(CD19+)細胞をFACS分析により評価した。イブルチニブ処置を受けているCLL患者からのPBMCを、ベースライン(イブルチニブ処置前)、サイクル2、1日目およびサイクル12、1日目に単離し、続いてCD19について染色した。FACS分析は、イブルチニブがCD19発現細胞の低下を引き起こすことを示した(図28A、図28Bおよび図28C)。それゆえに、これらの結果は、イブルチニブ処置がリンパ球増加を誘発することを示す。
CLL患者サンプルからのCART19機能に影響し得るイブルチニブ処置の種々の機構を評価した。
CD19発現(CD19+)細胞をFACS分析により評価した。イブルチニブ処置を受けているCLL患者からのPBMCを、ベースライン(イブルチニブ処置前)、サイクル2、1日目およびサイクル12、1日目に単離し、続いてCD19について染色した。FACS分析は、イブルチニブがCD19発現細胞の低下を引き起こすことを示した(図28A、図28Bおよび図28C)。それゆえに、これらの結果は、イブルチニブ処置がリンパ球増加を誘発することを示す。
イブルチニブ処置中の腫瘍細胞上の経時的なCD200発現を試験するためにさらなる分析を実施した。免疫抑制分子CD200は、初代B細胞CLL腫瘍細胞上で上方制御されている。CD200は、単球/マクロファージ細胞系譜の細胞およびTリンパ球上に発現されるその受容体、CD200Rに結合する。CD200とその受容体との相互作用は、マクロファージ細胞系譜に阻害性シグナルを伝達し、サイトカインプロファイルをTH1からTH2に変え、制御性T細胞の誘発に至る。患者111330030、111330026および111330039からのベースライン(スクリーン)、サイクル2、1日目およびサイクル12、1日目のサンプルをアネキシン、CD19(CD19発現腫瘍細胞についてソートするため)およびCD200について染色し、FACSで分析した。各時点での腫瘍細胞上のCD200発現を検出するヒストグラムを各患者で重層した(図29A、29Bおよび29C)。一般に、腫瘍細胞上のCD200発現は、イブルチニブ処置中、経時的に減少した。
イブルチニブ処置中のPD1発現T細胞頻度も評価した。患者からのサンプルを、ベースライン、サイクル2、1日目およびサイクル12、1日目に得て、アネキシン、CD3、CD8およびPD1について染色した。アネキシン陰性およびCD3陽性の細胞を、CD8およびPD1発現について分析した。CD8およびPD1を発現する細胞を、図30A、30Bおよび30Cにおいて枠で囲むことにより示す。ベースライン(図30A)、サイクル2、1日目(図30B)およびサイクル12、1日目(図30C)の細胞のFACSプロファイルの比較は、イブルチニブ処置がPD1発現細胞の頻度を経時的に減少させることを示す。
上記の実験から得たデータは、イブルチニブを受けているCLL患者へのCART19治療投与の最適時は、サイクル2とサイクル12の間またはサイクル12であることを示す。
上記の実験から得たデータは、イブルチニブを受けているCLL患者へのCART19治療投与の最適時は、サイクル2とサイクル12の間またはサイクル12であることを示す。
実施例10:ホジキンリンパ腫のためのCAR19 T細胞治療
CAR19 T細胞治療はホジキンリンパ腫(HL)の処置にも使用できる。ホジキンリンパ腫は、クローン胚中心B細胞由来の悪性ホジキンリード・シュテルンベルク(HRS)細胞の存在により特徴付けられる。HLに対するCAR19 T細胞治療の治療有効性を示す数因子が存在する。HL腫瘍のCD19染色は、腫瘍および腫瘍微小環境内のCD19発現(CD19+)細胞を示す(図33)。研究により、大部分のHL患者において、CD19を発現するクローンB細胞集団(CD20+CD27+ALDH+)がホジキンリンパ腫細胞株の産生および維持を担い、また血中にも循環することが示されている(Jones et al., Blood, 2009, 113(23):5920-5926)。このクローンB細胞集団はまた悪性HRS細胞を発生させるかまたはその産生に寄与することも示唆されている。それゆえに、CART19治療は、腫瘍形成または腫瘍細胞維持に寄与するこのB細胞集団を枯渇させる。他の研究は、B細胞枯渇が複数のマウスモデルで固形腫瘍増殖を遅延させることを示している(Kim et al., J Immunotherapy, 2008, 31(5):446-57)。HL腫瘍微小環境におけるB細胞枯渇がいくぶん抗腫瘍効果を生じるであろうとの考えの支持として、リツキサンのような現在の治療が、HLにおける腫瘍性B細胞のターゲティングおよび枯渇について臨床的に試験されている(Younes et al., Blood, 2012, 119(18):4123-8)。慢性炎症と関連する新規発癌も、B細胞依存性であることが示されている(de Visser, et al., Cancer Cell, 2005, 7(5):411-23)。これらの試験からの結果は、特にHL腫瘍微小環境における、B細胞集団のターゲティングが、疾患進行または腫瘍増殖の軽減または阻止により、HLの処置に有用であることを示す。
CAR19 T細胞治療はホジキンリンパ腫(HL)の処置にも使用できる。ホジキンリンパ腫は、クローン胚中心B細胞由来の悪性ホジキンリード・シュテルンベルク(HRS)細胞の存在により特徴付けられる。HLに対するCAR19 T細胞治療の治療有効性を示す数因子が存在する。HL腫瘍のCD19染色は、腫瘍および腫瘍微小環境内のCD19発現(CD19+)細胞を示す(図33)。研究により、大部分のHL患者において、CD19を発現するクローンB細胞集団(CD20+CD27+ALDH+)がホジキンリンパ腫細胞株の産生および維持を担い、また血中にも循環することが示されている(Jones et al., Blood, 2009, 113(23):5920-5926)。このクローンB細胞集団はまた悪性HRS細胞を発生させるかまたはその産生に寄与することも示唆されている。それゆえに、CART19治療は、腫瘍形成または腫瘍細胞維持に寄与するこのB細胞集団を枯渇させる。他の研究は、B細胞枯渇が複数のマウスモデルで固形腫瘍増殖を遅延させることを示している(Kim et al., J Immunotherapy, 2008, 31(5):446-57)。HL腫瘍微小環境におけるB細胞枯渇がいくぶん抗腫瘍効果を生じるであろうとの考えの支持として、リツキサンのような現在の治療が、HLにおける腫瘍性B細胞のターゲティングおよび枯渇について臨床的に試験されている(Younes et al., Blood, 2012, 119(18):4123-8)。慢性炎症と関連する新規発癌も、B細胞依存性であることが示されている(de Visser, et al., Cancer Cell, 2005, 7(5):411-23)。これらの試験からの結果は、特にHL腫瘍微小環境における、B細胞集団のターゲティングが、疾患進行または腫瘍増殖の軽減または阻止により、HLの処置に有用であることを示す。
さらに、正常CD19発現B細胞はまたHLにおける腫瘍微小環境に浸潤する。CLLおよびALLにおけるCART19治療での先の試験(例えば、実施例4および5に記載)は、CD19+標的へのCART19暴露がサイトカイン産生およびマクロファージ産生をもたらすことを示す。それゆえに、腫瘍促進性微小環境から抗腫瘍微小環境へのHL腫瘍微小環境の調節が、HLに存在する正常CD19+B細胞と相互作用するためのCART19の注入により達成できる。例えば、CD19発現標的へのCART19暴露は、細胞毒性T細胞の増殖、マクロファージの活性化ならびに白血球、マクロファージおよび抗原提示細胞のような腫瘍増殖を阻害する種々の機能を備えた他の免疫エフェクター細胞の動員により、抗腫瘍活性を促進する、サイトカイン、例えば、炎症性サイトカイン産生を起こす。標的CD19+B細胞が悪性でない可能性があるために(例えば、正常に循環しているB細胞)、遅延性よりむしろ一過性のCART19効果が、腫瘍微小環境調節のために好ましい可能性がある。
HL患者におけるCART19治療の治療有効性を試験するための試験を下記のように実施できる(図34)。試験はまたHL対象におけるCART19の安全性および耐容性ならびにHL腫瘍微小環境に対するCART19細胞の効果も評価する。
古典的HLを有する8患者を、本試験で処置する。患者はあらゆる年齢であるが、小児と成人患者について薬物送達の別々のプロトコールを確立できる。本試験における患者は、治癒的である可能性のある処置選択肢(例えば自己(ASCT)または同種幹細胞移植)がなくまたはこのような治癒的処置選択肢に適さない。例えば、患者は、サルベージ化学療法後PET+、ブレンツキシマブ処置後PET+または先のブレンツキシマブ暴露を伴うまたは伴わないASCT後PET+のいずれかであり得る。患者は、現在利用可能な治療で予後が限られている(数ヶ月から2年以下の予測生存)。そして最終的に、患者は、抗CD20抗体治療を受けない。例えば、患者がCART19の6回注入に不十分なT細胞数であるならば、実施可能性の欠如のために患者を除外する。
古典的HLを有する8患者を、本試験で処置する。患者はあらゆる年齢であるが、小児と成人患者について薬物送達の別々のプロトコールを確立できる。本試験における患者は、治癒的である可能性のある処置選択肢(例えば自己(ASCT)または同種幹細胞移植)がなくまたはこのような治癒的処置選択肢に適さない。例えば、患者は、サルベージ化学療法後PET+、ブレンツキシマブ処置後PET+または先のブレンツキシマブ暴露を伴うまたは伴わないASCT後PET+のいずれかであり得る。患者は、現在利用可能な治療で予後が限られている(数ヶ月から2年以下の予測生存)。そして最終的に、患者は、抗CD20抗体治療を受けない。例えば、患者がCART19の6回注入に不十分なT細胞数であるならば、実施可能性の欠如のために患者を除外する。
mRNA CAR19をインビトロ転写により産生する。CAR19 mRNAをドナーT細胞に電気穿孔し、得られた細胞を増殖し、CD3/CD28ビーズとのインキュベーションにより刺激する。1×108~5×108 RNA電気穿孔CAR19 T細胞を含む用量を、2週間、週に3回患者に送達する(例えば、0日目、2日目、4日目、7日目、9日目および11日目)。全体的応答率を、処置1ヶ月後の臨床、CTおよびPET走査により評価する。応答および生存を、最初のCART19注入(0日目)後、最初の6ヶ月は毎月、その後、2年まで3ヶ月毎にモニターする。モニタリング技術は、CART19処置前後の腫瘍またはリンパ節の生検(例えば、免疫組織化学的分析および/または遺伝子発現プロファイリングのためのRNA)およびPET走査を含む。例えば、HL腫瘍微小環境に対するCART19細胞の効果は、選択した患者からの処置前および処置約1週間後(または細胞表現型の改変を可能にするための処置後適切な時)の利用できるリンパ節生検で実施する遺伝子発現プロファイリングの結果の比較により分析する。CART19処置の安全性および耐容性を評価するために、サイトカイン放出症候群(CRS)およびマクロファージ活性化症候群(MAS)の頻度を含む、有害事象の頻度および重症度を報告する。
化学療法剤を、CART19処置と同時に投与し得る。CART19の初期投与は、白血球枯渇化学療法、例えば、シトキサンが前にあり得る。
化学療法剤を、CART19処置と同時に投与し得る。CART19の初期投与は、白血球枯渇化学療法、例えば、シトキサンが前にあり得る。
実施例11:CLL患者の非応答者サブセットは、免疫チェックポイント阻害剤分子の発現増加を示す
本試験において、34名のCLL患者から臨床的に産生したCART19細胞を、PD-1、LAG3およびTIM3のような免疫チェックポイント阻害剤分子の発現について試験した。CART19に対するこのコホートの応答は知られ、ゆえに、応答とバイオマーカー発現パターンの相関を評価できる。
CART治療に対する種々の応答のCLL患者から製造したCART19細胞をフローサイトメトリーにより分析して、CARおよび免疫チェックポイント阻害剤分子PD-1、LAG3およびTIM3の発現を決定した。CART19細胞は、健常ドナー(HD)(n=2);CART治療に応答した(CR)CLL患者(n=5);CART治療に部分応答した(PR)CLL患者(n=8);CART治療に応答しなかった(NR)CLL患者(n=21)由来であった。細胞を、当分野で知られるフローサイトメトリー分析の標準法に従い、CD3、CD4、CD8、CD27、CD45RO、CAR19分子および免疫チェックポイント分子PD-1、LAG3およびTIM3を特異的に認識する蛍光標識抗体で染色した。各マーカー、例えば、CD4+、CD8+などの発現をフローサイトメトリー分析ソフトウェアにより決定し、亜集団(例えば、CD4+T細胞、CD8+T細胞またはCAR19発現T細胞)を、免疫チェックポイント分子PD-1、LAG3およびTIM3の発現についてさらに分析した。
本試験において、34名のCLL患者から臨床的に産生したCART19細胞を、PD-1、LAG3およびTIM3のような免疫チェックポイント阻害剤分子の発現について試験した。CART19に対するこのコホートの応答は知られ、ゆえに、応答とバイオマーカー発現パターンの相関を評価できる。
CART治療に対する種々の応答のCLL患者から製造したCART19細胞をフローサイトメトリーにより分析して、CARおよび免疫チェックポイント阻害剤分子PD-1、LAG3およびTIM3の発現を決定した。CART19細胞は、健常ドナー(HD)(n=2);CART治療に応答した(CR)CLL患者(n=5);CART治療に部分応答した(PR)CLL患者(n=8);CART治療に応答しなかった(NR)CLL患者(n=21)由来であった。細胞を、当分野で知られるフローサイトメトリー分析の標準法に従い、CD3、CD4、CD8、CD27、CD45RO、CAR19分子および免疫チェックポイント分子PD-1、LAG3およびTIM3を特異的に認識する蛍光標識抗体で染色した。各マーカー、例えば、CD4+、CD8+などの発現をフローサイトメトリー分析ソフトウェアにより決定し、亜集団(例えば、CD4+T細胞、CD8+T細胞またはCAR19発現T細胞)を、免疫チェックポイント分子PD-1、LAG3およびTIM3の発現についてさらに分析した。
表面マーカー発現の決定に使用したフローサイトメトリープロファイル分析の例を図35Aおよび35Bに示す。CD4発現T細胞をフローサイトメトリーを使用して決定し、プロファイルのx軸がCAR19発現を示し(上部左(Q5)および下部左(Q8)四分円はCAR19陰性CD4+細胞を示し、上部右(Q6)および下部右(Q7)四分円はCAR19発現CD4+細胞を示す)、y軸がPD-1発現を示すように(下部左(Q8)および右(Q7)四分円はPD-1陰性CD4+細胞を示し、上部左(Q5)および右(Q6)四分円はPD-1発現CD4+細胞を示す)、CAR19およびPD-1発現についてさらに分析した。CART応答者からのCD4+集団において、総CD4+細胞の44.7%がPD-1を発現し、CAR19発現細胞の約22.3%がPD-1陽性であり、一方CAR19発現細胞の27.2%がPD-1陰性であった(図35A)。対照的に、非応答者からのCD4+集団において、総CAR19発現細胞の有意な減少があり(CRの49.5%と比較して約15.3%)、14.7%のCAR19発現細胞がPD-1陽性であり、わずか0.64%がPD-1陰性であった(図35B)。図35Aと図35Bのプロファイルの比較は、CART応答者(約44.7%)と比較して、非応答者からのCD4+細胞のはるかに高いパーセンテージがPD-1を発現する(約92.9%)ことを示す。
上記方法および分析を使用して、CD4+集団およびCD8+集団のPD-1発現(PD-1+)細胞のパーセンテージを、各応答群における各患者について決定した。CAR治療応答者(CR)と比較して、非応答者は、CD4+(図35C)およびCD8+(図35D)集団の両者におけるPD-1+細胞の大きなパーセンテージを有することが示され、平均PD-1パーセンテージ増加はCD4+およびCD8+集団の両者で統計学的有意であった。部分応答者(PR)は、CD4+(図35C)およびCD8+(図35D)集団の両者において、応答者(CR)より高いパーセンテージのPD-1+細胞を示した。
次に、CAR19発現CD4+集団およびCAR19発現CD8+集団のPD-1発現(PD-1+)細胞のパーセンテージを、各応答群における各患者について実施した。上記と類似した分析を実施し、CAR19発現についてCD4+およびCD8+細胞を分析し、CAR19発現細胞同定後、CAR19発現細胞の集団からPD-1発現を有する細胞のパーセンテージを決定するさらなる工程を伴った。総CD4+およびCD8+集団で観察されたのと類似の傾向が、CAR19発現CD4+およびCD8+集団で観察され、非応答者はCAR治療応答者(CR)と比較して、CD4+(図36A)およびCD8+(図36B)集団の両者においてPD-1+細胞の大きなパーセンテージを有することが示され、平均PD-1パーセンテージ増加はCD4+およびCD8+集団の両者で統計学的有意であった。部分応答者(PR)は、CD4+(図36A)およびCD8+(図36B)集団の両者において、応答者(CR)より高いパーセンテージのPD-1+細胞を示した。
CAR治療に対する種々の応答の患者からのPD-1、LAG3およびTIM3を発現する細胞の分布を決定するために、さらなる分析を実施した。CD4+集団におけるPD-1、LAG3およびTIM3発現の代表的細胞プロファイル分析を図37に示す。細胞集団を、まず、CD4+およびCD8+発現について分析した。CD4+集団(またはCD8+集団、示していない)を次いで、PD-1およびCAR19発現について分析した(図37、左プロファイル)。先に記載したように、非応答者(NR)は、CART応答者(CR)と比較して、総PD-1+であった細胞の有意に増加したパーセンテージを有した(CRについて44.7%PD-1陽性と比較して、NRについて約92.9%PD-1陽性)。さらに、非応答者において、CAR19発現細胞は、大部分PD-1陽性であった(14.7%PD-1陽性およびCAR+対0.64%PD-1陰性およびCAR+)。次いで、該集団をPD-1およびLAG3共発現について分析した(図37、中央プロファイル)。PD-1およびLAG3の両者を発現する細胞を上部右四分円(Q2)に示す。非応答者は、CART応答者と比較して、両免疫チェックポイント阻害剤、PD-1およびLAG3を発現する細胞のパーセンテージが有意に増加していた(67.3%対7.31%)。PD-1発現もTIM3発現と共に分析した。図37において、右プロファイルの四角は、PD-1およびTIM3の両者を発現する細胞を示す。PD-1およびLAG3で得られた結果に類似して、非応答者は、CART応答者と比較して、両免疫チェックポイント阻害剤、PD-1およびTIM3を発現する細胞パーセンテージが有意に高かった(83.3%対28.5%)。PD-1発現細胞(PD1+)、PD-1およびLAG3発現細胞(PD1+LAG3+)およびPD-1およびTIM3発現細胞(PD1+TIM3+)のパーセンテージは、上記のように、フローサイトメトリー分析を使用して、各応答群における各患者で試験した。非応答者は、CART応答者と比較して、PD1+LAG3+細胞(図38A)およびPD1+TIM3+細胞(図38B)の増加したパーセンテージを示し、これは両細胞集団で統計的に有意であった。部分応答者はまたCART応答者と比較して両細胞集団の増加したパーセンテージを示し、平均は非応答者と比較して減少していた。
これらの結果は、CAR治療に応答しない患者が、CAR治療に応答するまたは一部応答する患者と比較して、免疫チェックポイント阻害剤(例えば、PD-1、LAG3およびTIM3)の発現増加を示すことを示す。それゆえに、これらの結果は、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、PD-1、LAG3またはTIM3の発現を阻害または減少する薬剤が、免疫チェックポイント経路(例えば、が介在するPD-1、LAG3またはTIM3)を介する免疫抑制を防止するためにCAR治療を受けている患者に投与し、それによりCAR発現細胞の有効性を増加させるのに有用であり得ることを示す。
実施例12:高齢者における免疫老化に対するmTOR阻害の効果
加齢と最も明確に結びついている経路の一つは、mTOR経路である。mTOR阻害剤ラパマイシンがマウスで寿命を延長し、高齢マウスで多様な加齢関連状態を改善することが示されている(Harrison, DE et al. (2009) Nature 460:392-395; Wilkinson JE et al. (2012) Aging Cell 11:675-682;およびFlynn, JM et al. (2013) Aging Cell 12:851-862)。それゆえに、これらの知見は、mTOR阻害剤がヒトにおける加齢および加齢関連状態に有益な効果を有し得ることを示す。
加齢と最も明確に結びついている経路の一つは、mTOR経路である。mTOR阻害剤ラパマイシンがマウスで寿命を延長し、高齢マウスで多様な加齢関連状態を改善することが示されている(Harrison, DE et al. (2009) Nature 460:392-395; Wilkinson JE et al. (2012) Aging Cell 11:675-682;およびFlynn, JM et al. (2013) Aging Cell 12:851-862)。それゆえに、これらの知見は、mTOR阻害剤がヒトにおける加齢および加齢関連状態に有益な効果を有し得ることを示す。
短い臨床試験時間枠で試験できる年齢関連表現型は免疫老化である。免疫老化は、感染に対する感受性の増加およびインフルエンザワクチン接種を含むワクチン接種に対する応答の減少に至る、高齢者で生じる免疫機能の減少である。年齢による免疫機能の減少は、造血幹細胞(HSC)がナイーブリンパ球を産生する能力の減少および抗原刺激に対する応答が不完全な疲弊したPD-1陽性リンパ球数の増加を含む、免疫欠損の蓄積による(Boraschi, D et al. (2013) Sci. Transl. Med.5:185ps8; Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798;およびShimatani, K et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:15807-15812)。高齢マウスでの試験は、mTOR阻害剤ラパマイシンでの6週間の処置がHSC機能を若返らせ、ナイーブリンパ球産生増加、インフルエンザワクチン接種に対する応答改善および寿命延長に至ることを示した(Chen, C et al. (2009) Sci. Signal. 2:ra75)。
ヒト加齢関連表現型に対するmTOR阻害の効果をおよびmTOR阻害剤RAD001が免疫老化を軽減するかを評価するために、RAD001またはプラセボを投与された高齢志願者におけるインフルエンザワクチンに対する応答を評価した。ここに示す知見は、RAD001が、十分耐容性である用量で高齢志願者のインフルエンザワクチンに対する応答を増強したことを示唆する。RAD001はまた年齢とともに蓄積されるプログラム死(PD)-1陽性CD4およびCD8 Tリンパ球のパーセンテージも減少させた。これらの結果は、mTOR阻害が高齢志願者における免疫老化に有益な効果を有することを示す。
ここに記載するとおり、ラパマイシン類似体であるmTOR阻害剤RAD001での6週間処置は、高齢ヒト志願者におけるインフルエンザワクチン接種に対する応答を改善した。
ここに記載するとおり、ラパマイシン類似体であるmTOR阻害剤RAD001での6週間処置は、高齢ヒト志願者におけるインフルエンザワクチン接種に対する応答を改善した。
方法
治験集団
不安定な基礎疾患のない65歳以上の高齢志願者が、ニュージーランドおよびオーストラリアの9箇所で参加した。スクリーニング時の除外基準はヘモグロビン<9.0g/dL、白血球数<3,500/mm3、好中球数<2,000/mm3または血小板数<125,000/mm3、未管理の糖尿病、不安定虚血性心疾患、臨床的に顕著な基礎肺疾患、免疫不全の病歴または免疫抑制性治療歴、凝固障害の病歴または長期抗凝固を必要とする医学的状態、概算糸球体濾過速度<30ml/分、重度の未管理高コレステロール血症(>350mg/dL、9.1mmol/L)または高トリグリセリド血症(>500mg/dL、5.6mmol/L)の存在を含んだ。
治験集団
不安定な基礎疾患のない65歳以上の高齢志願者が、ニュージーランドおよびオーストラリアの9箇所で参加した。スクリーニング時の除外基準はヘモグロビン<9.0g/dL、白血球数<3,500/mm3、好中球数<2,000/mm3または血小板数<125,000/mm3、未管理の糖尿病、不安定虚血性心疾患、臨床的に顕著な基礎肺疾患、免疫不全の病歴または免疫抑制性治療歴、凝固障害の病歴または長期抗凝固を必要とする医学的状態、概算糸球体濾過速度<30ml/分、重度の未管理高コレステロール血症(>350mg/dL、9.1mmol/L)または高トリグリセリド血症(>500mg/dL、5.6mmol/L)の存在を含んだ。
処置アーム間のベースライン個体群統計は類似した(表7)。218名の参加対象中、211名が治験を終了した。7名は治験を中止した。5名は有害事象(AE)が原因であり、1名は同意の上中止し、1名はプロトコール違反の結果、治験から除外した。
*肥満度指数は、身長(m)の二乗で除した体重(kg)である
*肥満度指数は、身長(m)の二乗で除した体重(kg)である
治験設計および遂行
2011年12月から2012年4月まで、218名の高齢志願者が、無作為化、観察者盲検化、プラセボ対照試験に参加した。対象を、各処置アームにおけるRAD001対プラセボ比5:2で、検証された自動化無作為化系を使用して処置アームに無作為化した。処置アームは
RAD001 0.5mg連日またはプラセボ
RAD001 5mg毎週またはプラセボ
RAD001 20mg毎週またはプラセボ
であった。
2011年12月から2012年4月まで、218名の高齢志願者が、無作為化、観察者盲検化、プラセボ対照試験に参加した。対象を、各処置アームにおけるRAD001対プラセボ比5:2で、検証された自動化無作為化系を使用して処置アームに無作為化した。処置アームは
RAD001 0.5mg連日またはプラセボ
RAD001 5mg毎週またはプラセボ
RAD001 20mg毎週またはプラセボ
であった。
RAD001 0.5mg連日および20mg毎週コホートにおけるプラセボがこれらのコホートにおけるRAD001錠剤とわずかに異なったため、本治験は観察者盲検であった。対象を評価する治験担当者は治験薬物を見ておらず、それゆえに完全に盲検式であった。全コホートの処置期間は6週間であり、その間、対象は2週間毎に診療所での安全性評価を受けた。対象が4週間投与された後、RAD001定常レベルを投与前および投与1時間後に測定した。6週間コースの治験薬完了後、対象はRAD001が誘発した可能性のある免疫抑制から回復するために2週間休薬させ、その後株H1N1 A/California/07/2009、H3N2 A/Victoria/210/2009、B/Brisbane/60/2008を含む2012年季節性インフルエンザワクチンを接種した(Agrippal(登録商標), Novartis Vaccines and Diagnostics, Siena, Italy)。インフルエンザワクチン接種4週間後、対象から血清を採取し、インフルエンザ力価を測定した。3種のインフルエンザワクチン株ならびに2種の異種株(A/H1N1株A/New Jersy/8/76およびA/H3N2株A/Victoria/361/11)に対する抗体力価を、標準血球凝集阻害アッセイにより測定した(Kendal, AP et al. (1982) Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention B17-B35)。
A/H1N1/California/07/2009特異的IgGおよびIgMレベルを、先に記載のとおりインフルエンザワクチン接種前および4週間後に測定した(Spensieri, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14330-14335)。結果を蛍光強度として表した。
全ての対象にインフォームド・コンセント書類を渡した。治験は、Good Clinical Practiceの原則に従い、適切な倫理委員会および規制当局により承認された。
A/H1N1/California/07/2009特異的IgGおよびIgMレベルを、先に記載のとおりインフルエンザワクチン接種前および4週間後に測定した(Spensieri, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14330-14335)。結果を蛍光強度として表した。
全ての対象にインフォームド・コンセント書類を渡した。治験は、Good Clinical Practiceの原則に従い、適切な倫理委員会および規制当局により承認された。
安全性
有害事象評価ならびに血液学的および生化学的安全性評価のための採血は、来院日に実施した。有害事象情報は、対象が治験薬を受けている6週間の間、家で記載した日記からも集めた。全有害事象データを、インフォームド・コンセント時から最後の来院30日後まで集めた。事象は治験医により軽度、中程度または重度と分類された。
有害事象評価ならびに血液学的および生化学的安全性評価のための採血は、来院日に実施した。有害事象情報は、対象が治験薬を受けている6週間の間、家で記載した日記からも集めた。全有害事象データを、インフォームド・コンセント時から最後の来院30日後まで集めた。事象は治験医により軽度、中程度または重度と分類された。
統計解析
幾何平均力価比の一次解析を、無情報事前分布を用いる正規ベイズ回帰モデルを使用して行った。このモデルを、対数尺度で各抗体力価に適合させた。各モデルの主要評価項目は84日目測定値であった。63日目測定値をアウトカムベクターに包含させた。モデルを、先のステートメントと混ぜたSAS 9.2 procを使用してフィットさせた。マトリクス共分散構造は、非構造化(選択肢タイプ=UN)として考慮した。平らである事前分布を使用した。抗体陽転率の二次解析のために、ロジスティック回帰を使用した。
治療企図集団は、少なくとも1回の完全用量の治験薬を投与され、有効性データに影響する重大なプロトコール逸脱がない全対象と定義された。治験に参加した218名の対象中199名治験が治療企図集団であった。
幾何平均力価比の一次解析を、無情報事前分布を用いる正規ベイズ回帰モデルを使用して行った。このモデルを、対数尺度で各抗体力価に適合させた。各モデルの主要評価項目は84日目測定値であった。63日目測定値をアウトカムベクターに包含させた。モデルを、先のステートメントと混ぜたSAS 9.2 procを使用してフィットさせた。マトリクス共分散構造は、非構造化(選択肢タイプ=UN)として考慮した。平らである事前分布を使用した。抗体陽転率の二次解析のために、ロジスティック回帰を使用した。
治療企図集団は、少なくとも1回の完全用量の治験薬を投与され、有効性データに影響する重大なプロトコール逸脱がない全対象と定義された。治験に参加した218名の対象中199名治験が治療企図集団であった。
免疫表現型検査
末梢血単核細胞を、ベースライン、6週間の治験薬処置後および対象が6週間治験薬物から離れており、インフルエンザワクチン接種した4週間後である治験の最後の3時点に採血した全血から単離した。76個のPBMCサブセットを、先に記載されたように、Human Immune Monitoring Center at Stanford University, CA, USAで8色免疫表現型検査パネルを使用したフローサイトメトリーにより解析した(Maecker, HT et al. (2012) Nat Rev Immunol. 12:191-200)。76個のPBMCサブセットを、8色凍結乾燥免疫表現型検査パネルを使用するフローサイトメトリーにより解析した(BD Lyoplate、BD Biosciences, San Diego, CA)。生存能>80%および2×106細胞を超える収量のPBMCサンプルを解析に入れた。
末梢血単核細胞を、ベースライン、6週間の治験薬処置後および対象が6週間治験薬物から離れており、インフルエンザワクチン接種した4週間後である治験の最後の3時点に採血した全血から単離した。76個のPBMCサブセットを、先に記載されたように、Human Immune Monitoring Center at Stanford University, CA, USAで8色免疫表現型検査パネルを使用したフローサイトメトリーにより解析した(Maecker, HT et al. (2012) Nat Rev Immunol. 12:191-200)。76個のPBMCサブセットを、8色凍結乾燥免疫表現型検査パネルを使用するフローサイトメトリーにより解析した(BD Lyoplate、BD Biosciences, San Diego, CA)。生存能>80%および2×106細胞を超える収量のPBMCサンプルを解析に入れた。
ベースラインから治験薬処置6週目までおよびベースラインから治験の最後(12週目)までの免疫表現型の相対的変化を、各RAD001投薬コホートで計算した。スチューデントT検定を行い、ベースラインから2回の採血時点までの免疫表現型の相対的変化が、それぞれ、プラセボ効果について調整した後、各投与群内で0とは有意に異なるかを試験した。処置効果解析における欠損値補完は行わなかった。それゆえに、患者がベースラインで表現型データ欠損があるとき、この患者は、この表現型の解析を行わなかった。患者の6週目または12週目の表現型データが欠損しているとき、この患者は、影響する時点でのこの表現型の解析に貢献しなかった。
3投薬群下の76表現型の608試験を行い、プラセボ効果に対する処置効果を比較した。層別化偽発見率(FDR)管理方法論を、今なお相当に優れた検出力を提供する複数の試験と関係する偽陽性の発生を制御するために実施した。細胞型群を層別因子として取り、各層内のFDR(q値)計算をそれぞれ行った。全帰無仮説は、対応するq値≦0.1の0.05有意水準で棄却された。0.05有意水準および対応するq<0.1で棄却される複数試験調節戦略は、結果の10%未満が偽であることを確実にした。
第二の解析において、免疫表現型は、全3個のRAD001投薬群を合わせたプールした処置群とプラセボ群で変化する。どの免疫表現型変化が処置群とプラセボ群を区別するかを決定するために、各測定した表現型の患者内細胞数比を、ベースラインと治験薬処置6週目およびベースラインと治験終了時(12週目)で計算した。比を対数変換し、プールした処置およびプラセボ群の間の差異を検出するために、各時点の共分散の解析により分析した。76個の表現型の152試験を実施して、プラセボ効果に対するプールした処置効果を比較した。層別化偽発見率(FDR)管理方法論を、今なお相当に優れた検出力を提供する複数の試験と関係する偽陽性の発生を制御するために実施した(Benjamini, Y. et al. (1995) J. Roy. Statist. 57:289-300;およびSun, L. et al. (2006) Genet. Epidemiol. 30:519-530)。細胞型群を層別因子として取り、FDR(q値)計算を、それぞれ各層内で実施した。0.05有意水準およびq値20%未満での全帰無仮説は棄却された。これは、0.05未満のP値および各観察された有意な結果が複数試験によるものである20%未満の確率のみを棄却すると解釈できる。
結果
一般に、RAD001は、特に0.5mg連日および5mg毎週投与レジメンで良好な耐容性であった。治験中に死亡例はなかった。3名の対象は、RAD001と無関係であると評価された4つの重篤な有害事象(SAE)を経験した。4つのSAEは、先に6週間5mg毎週RAD001の6週のコースを完了していた正常血小板数の対象の左眼の網膜出血とその後の失明;プラセボ処置対象における重度の背部痛およびプラセボ処置対象における重度の胃腸炎であった。あらゆる処置群における発生率>2%の処置関連有害事象(AE)のリストを表8に提供する。最も一般的なRAD001関連AEは、大部分の症例で、軽度であった口腔内潰瘍であった。全体的に、RAD001を投与された対象と、プラセボ処置対照の重度のAE発生率は類似した。1個の重度のAEのみがRAD001と関連すると評価され、20mg毎週RAD001処置対象の口腔内潰瘍であった。
一般に、RAD001は、特に0.5mg連日および5mg毎週投与レジメンで良好な耐容性であった。治験中に死亡例はなかった。3名の対象は、RAD001と無関係であると評価された4つの重篤な有害事象(SAE)を経験した。4つのSAEは、先に6週間5mg毎週RAD001の6週のコースを完了していた正常血小板数の対象の左眼の網膜出血とその後の失明;プラセボ処置対象における重度の背部痛およびプラセボ処置対象における重度の胃腸炎であった。あらゆる処置群における発生率>2%の処置関連有害事象(AE)のリストを表8に提供する。最も一般的なRAD001関連AEは、大部分の症例で、軽度であった口腔内潰瘍であった。全体的に、RAD001を投与された対象と、プラセボ処置対照の重度のAE発生率は類似した。1個の重度のAEのみがRAD001と関連すると評価され、20mg毎週RAD001処置対象の口腔内潰瘍であった。
RAD001が高齢志願者における免疫機能を改善する能力を、2012年の季節性インフルエンザワクチンに対する血清学的応答を測定することにより評価した。3種のインフルエンザワクチン株の各々に対するベースラインおよびインフルエンザワクチン接種4週間後の血球凝集阻害(HI)幾何平均力価(GMT)を表9に示す。一次解析変数は、HI GMT比(ワクチン接種4週間後/ベースライン)であった。治験を、少なくとも3種のインフルエンザワクチン株中2種において、1)プラセボに対して相対的に≧1.2倍GMT;および2)80%以上が、1を超えるプラセボ補正GMT比である事後確率の存在を証明できるように強化した。このエンドポイントは、MF-59ワクチンアジュバントにより誘発されるインフルエンザGMT比の1.2倍増加がインフルエンザ疾病の減少と関連するために、選択した(Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect 133:687-693)。
ベースラインは、インフルエンザワクチン接種2週間前を示す
4週目はインフルエンザワクチン接種4週間後を示す
Nはコホートあたりの対象数である
GMTは幾何平均力価である
GMT比は、ワクチン接種4週目のGMT/ベースラインのGMTである
CV%は、変動係数を示す
4週目はインフルエンザワクチン接種4週間後を示す
Nはコホートあたりの対象数である
GMTは幾何平均力価である
GMT比は、ワクチン接種4週目のGMT/ベースラインのGMTである
CV%は、変動係数を示す
治療企図(ITT)集団において、高用量(20mg毎週)コホートではなく、低い、免疫増強用量RAD001(0.5mg連日または5mg毎週)コホートが、治験の主要評価項目に合った(図40A)。これは、低用量でRAD001の異なる免疫調節機構が存在し、高用量で、mTOR阻害の既知免疫抑制性効果が発揮されるようになる可能性を示す。さらに、本結果は、低い、免疫増強用量RAD001処置後の高齢者における免疫機能の改善傾向を示唆する。
サブグループ解析において、低ベースラインインフルエンザ力価(≦1:40)のサブセットの対象は、ITT集団より高い力価のRAD001関連増加を経験した(図40B)。これらのデータは、RAD001が、ベースラインで予防的(>1:40)力価を有さず、それゆえにインフルエンザ疾病の最高のリスクにある対象のインフルエンザワクチン応答の増強に特に有効であることを示す。
RAD001濃度対各インフルエンザワクチン株に対する力価増加の散布図は、逆暴露/応答相関を示す(図41)。S6キナーゼ(S6K)のmTOR介在リン酸化に基づくモデリングおよびシミュレーションは、20mg毎週投与レジメンがmTOR介在S6K活性をほぼ完全に阻止し、5mg毎週投与レジメンはS6K活性を50%を超えて阻止し、0.5mg連日投与レジメンは、S6Kリン酸化を投与の合間に約38%まで阻止することを予測する(Tanaka, C et al. (2008) J. Clin. Oncol 26:1596-1602)。それゆえに、低い、免疫増強用量RAD001での、部分的mTOR阻害、例えば、mTOR介在S6Kリン酸化阻害は、高齢者の免疫応答の増強における高用量RAD001でのほぼ完全なmTOR阻害よりも有効ではないにしても、有効であり得る。
インフルエンザワクチン接種4週間後の抗体陽転率も評価した。抗体陽転は、ワクチン接種前力価陰性(すなわち、HI力価<1:10)から、ワクチン接種後HI力価≧1:40への変化または非陰性(≧1:10)ワクチン接種前HI力価からの少なくとも4倍増加として定義された。治療企図集団、H3N2およびB株への抗体陽転率は、プラセボコホートと比較してRAD001で増加したが、該増加は統計的有意性には合わなかった(表10)。ベースラインインフルエンザ力価≦1:40の対象の亜集団において、RAD001処置はまたH3N2およびB株に対する抗体陽転率を増加させ、これらの結果は、0.5mg連日投薬コホートでB株に対して統計額的有意性に達した。これらのデータは、さらにRAD001が、高齢者におけるインフルエンザワクチン接種に対する血清学的応答を増強させたことを示す。
* RAD001とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に1と異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側p値<0.05)
* RAD001とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に1と異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側p値<0.05)
現在の季節性インフルエンザワクチンは、しばしば、以前に広まったウイルスのバリアントとして存在するインフルエンザ株の継続する出現に対して適切な保護を提供しない。しかしながら、mTOR阻害剤ラパマイシンの存在下でインフルエンザに対してワクチン接種したマウスは、プラセボと比較して、インフルエンザに対する広い血清学的応答を発達させた。広い血清学的応答は、ワクチンに含まれないインフルエンザの異種株での感染に対する保護を提供する、複数のサブタイプのインフルエンザにより発現される保存的エピトープに対する抗体を含んだ(Keating, R et al. (2013) Nat Immunology 14:2166-2178)。RAD001が高齢志願者におけるインフルエンザに対する血清学的応答を広幅化するかについて、インフルエンザワクチン(A/H1N1株A/New Jersey/8/76およびA/H3N2株A/Victoria/361/11)に含まれないインフルエンザの2種の異種株に対するHI力価を測定した。異種株に対するHI GMT比の増加は、プラセボコホートと比較してRAD001で高かった(図42)。さらに、異種株に対する抗体陽転率は、プラセボコホートと比較してRAD001で高かった。5mgおよび20mg毎週RAD001投薬コホートにおける抗体陽転率の増加は、H3N2異種株に対して統計的有意であった(表11)。プールしたRAD001コホートについてのH3N2抗体陽転率は39%であり、それに対しプラセボコホートは20%であった(p=0.007)。ここに示した結果は、mTOR阻害がインフルエンザワクチン接種に対する高齢志願者の血清学的応答を広幅化し、季節性インフルエンザワクチンに含まれないインフルエンザの異種株に対する抗体力価を高めることを示唆する。
ラパマイシンで処置したマウスにおけるインフルエンザの異種株に対する血清学的応答の広幅化は、B細胞におけるクラススイッチングの阻止および抗インフルエンザIgMレベルの増加と関係している(Keating, R. et al. (2013) Nat Immunol 14:2166-2178)。しかしながら、クラススイッチングの阻止は、ワクチン接種後抗インフルエンザIgMおよびIgGレベルがRAD001コホートとプラセボ処置コホート間で差がなかったため、RAD001で処置したヒトにおける広幅化された血清学的応答とは関係しない可能性がある(図43)。
* RAD001とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に1より異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側p値<0.05)
* RAD001とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に1より異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側p値<0.05)
RAD001が高齢志願者における免疫機能を増強する機構に取り組むため、免疫表現型検査を、ベースライン、治験薬処置6週間後およびインフルエンザワクチン接種4週間後(治験薬中止6週間後)に対象から得たPBMCサンプルで実施した。大部分のPBMCサブセットのパーセンテージはRAD001コホートとプラセボの間で差がなかったが、PD-1陽性CD4およびCD8細胞のパーセンテージは、プラセボコホートと比較してRAD001で低かった(図44)。PD-1陽性CD4およびCD8細胞は年齢とともに蓄積し、PD-1がT細胞受容体誘発T細胞増殖、サイトカイン産生および細胞溶解性機能を阻止するため、抗原刺激に対する不完全な応答を有する(Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798)。プラセボコホートにおいてPD-1陽性T細胞のパーセンテージの経時的増加があった。12週目(ワクチン接種4週間後)で、インフルエンザウイルスがPD-1陽性T細胞を増加させることが示されているため、この増加はインフルエンザワクチン接種によるものであり得る(Erikson, JJ et al. (2012) JCI 122:2967-2982)。しかしながら、全RAD001コホートでCD4 PD-1陽性T細胞のパーセンテージは6週目および12週目でベースラインから下がった(図44A)。CD8 PD-1陽性細胞のパーセンテージも、2つの低用量RAD001コホートで6週目および12週目の両者でベースラインから下がった(図44B)。PD-1陰性CD4 T細胞のパーセンテージを評価し、プラセボコホートと比較してRAD001コホートで増加した(図44C)。
RAD001コホートからの結果をプールし、ベースラインPD-1発現の差異について調整したより厳密な統計解析下、プラセボコホート(n=25)と比較して、プールしたRADコホート(n=84)で、6週目にPD-1陽性CD4 T細胞の30.2%の統計的に有意な減少があり、p=0.03(q=0.13)であった(図45A)。プラセボコホートと比較した、プールしたRADにおける12週目のPD-1陽性CD4 T細胞の減少は32.7%であり、p=0.05(q=0.19)である。図45Bは、プラセボコホート(n=25)と比較して、プールしたRAD001コホート(n=84)における6週目のPD-1陽性CD8 T細胞の統計的に有意な37.4%の減少を示し、p=0.008(q=0.07)である。プラセボコホートと比較した、プールしたRAD001の12週目のPD-1陽性CD8 T細胞減少は41.4%であり、p=0.066(q=0.21)である。それゆえに、図44および45の結果は、合わせて、PD-1陽性CD4およびCD8 T細胞のパーセンテージのRAD001関連減少が、免疫機能の増強に貢献している可能性を示唆する。
結論
結論として、ここに提供したデータは、mTOR阻害剤RAD001が、インフルエンザワクチン接種に対する応答で評価して、ヒト高齢者の免疫学的機能における年齢関連減少を軽減し、この改善が許容されるリスク対効果バランスで得られることを示す。高齢マウスでの試験において、mTOR阻害剤ラパマイシンでの6週間処置はインフルエンザワクチン接種に対する応答を増加しただけでなく、寿命も延長し、免疫老化の改善は、加齢関連表現型に対するより広範な効果のマーカーであり得ることを示唆する。
結論として、ここに提供したデータは、mTOR阻害剤RAD001が、インフルエンザワクチン接種に対する応答で評価して、ヒト高齢者の免疫学的機能における年齢関連減少を軽減し、この改善が許容されるリスク対効果バランスで得られることを示す。高齢マウスでの試験において、mTOR阻害剤ラパマイシンでの6週間処置はインフルエンザワクチン接種に対する応答を増加しただけでなく、寿命も延長し、免疫老化の改善は、加齢関連表現型に対するより広範な効果のマーカーであり得ることを示唆する。
RAD001投薬をワクチン接種2週間前に中断したため、RAD001の免疫増強効果は、薬物処置中止後も残留する適切な細胞集団における変化により介在され得る。ここに示した結果は、RAD001が、プラセボと比較して疲弊したPD-1陽性CD4およびCD8 T細胞のパーセンテージを減少させたことを示す。PD-1発現はTCRシグナル伝達により誘発され、慢性ウイルス感染を含む永続性抗原刺激の設定で高いままである。理論に縛られることを望まないが、RAD001が高齢志願者における慢性免疫活性化を減少し、それによりPD-1発現を減少させた可能性がある。RAD001はまたイムノフィリンシクロスポリンAについて報告されているように、PD-1発現を直接的にも阻害し得る(Oestreich, KJ et al. (2008) J Immunol. 181:4832-4839)。PD-1陽性T細胞のパーセンテージのRAD001誘発減少は、T細胞応答の品質を改善させる可能性がある。これは、mTOR阻害が、マウスおよび霊長類におけるワクチン接種に対する記憶CD8 T細胞応答の品質を改善したことを示す試験と先の一致する(Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)。高齢マウスにおいて、mTOR阻害はまた造血幹細胞の数を増加させ、ナイーブリンパ球の産生増加に至ることも示されている(Chen, C et al. (2009) Sci Signal 2:ra75)。本実施例においてRAD001対プラセボコホートでナイーブリンパ球のパーセンテージに有意な差は検出されなかったが、この可能性がある機構をさらに調査し得る。
RAD001がインフルエンザの異種株に対する血清学的応答を広幅化する機構をさらに調査し得る。ラパマイシンも、インフルエンザワクチン接種後B細胞におけるクラススイッチングを阻止することが示されている。その結果、抗インフルエンザ抗体の独特のレパートリーが産生され、それがインフルエンザワクチンに含まれないインフルエンザウイルスサブタイプでの致死的感染に対する株間保護を促進した(Keating, R et al. (2013) Nat Immunol. 14:2166-2178)。ここに記載した結果は、RAD001がインフルエンザワクチン接種2週間前にRAD001を中止した高齢対象におけるB細胞クラススイッチングを改変したことを示さなかった。基礎機構をさらに解明する必要があるが、ここに記載する異種インフルエンザ株に対する血清学的応答の増加は、インフルエンザの季節性ワクチンと地域社会で広まっている株があまり適合していない年のインフルエンザ疾病に対する保護の増強に寄与し得る。
インフルエンザ抗体力価に対するRAD001の効果は、高齢者のインフルエンザワクチン接種に対する応答の増加について承認されているMF59ワクチンアジュバントの効果と同等であった(Podda, A (2001) Vaccine 19:2673-2680)。それゆえに、インフルエンザワクチン接種に対する抗体応答のRAD001駆動増強は、高齢者におけるMF59アジュバント添加インフルエンザワクチンで証明される臨床的利益に翻訳され得る(Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect. 133:687-693)。しかしながら、RAD001はまた臓器移植患者の免疫応答の抑制にも使用される。これらの外見上逆説的な結果は、mTOR阻害剤の免疫調節効果が用量および/または抗原依存性であり得る可能性を惹起する(Ferrer, IR et al. (2010) J Immunol. 185:2004-2008)。逆RAD001暴露/ワクチン接種応答相関の傾向がここで見られた。完全なmTOR阻害は通常のシクロフィリン-ラパマイシン機構を介して免疫機能を抑制するが、部分的mTOR阻害は、少なくとも高齢者において、異なる加齢関連表現型阻害により免疫機能を増強する可能性がある。興味深いことに、mTOR活性は、高齢動物モデルにおける造血幹細胞を含む多様な組織で増加する(Chen C. et al. (2009) Sci Signal 2:ra75 and Barns, M. et al. (2014) Int J Biochem Cell Biol. 53:174-185)。それゆえに、mTOR活性の、若い組織で見られるレベルへの下落が、mTOR活性のより完全な抑制とは逆に、老化減少適応症に臨床的利益があり得る。
加齢関連適応症の処置におけるRAD001のようなmTOR阻害剤の安全性プロファイルは懸念されている。腫瘍学または臓器移植適応症で使用される用量でのRAD001の毒性は、多くの加齢関連適応症では許容されないであろう口内炎、下痢、悪心、血球減少、高脂血症および高血糖を含む。しかしながら、これらのAEは、血中のRAD001のトラフレベルに関係する。それゆえに、本治験で使用したRAD001投与レジメンは、トラフレベルを最少化するように選択した。0.5mg連日、5mg毎週および20mg毎週投薬コホートの平均RAD001トラフレベルは、それぞれ0.9ng/ml、0.3ng/ml(定量下限)未満および0.7ng/mlであった。これらのトラフレベルは、臓器移植および癌患者で使用される投与レジメンと関係するトラフレベルより顕著に低い。さらに、6週間の限られた処置コースが有害事象のリスクを減らした。これらの結果は、この治験で使用された投与レジメンが、高齢者のある状態については許容されるリスク対効果を有し得ることを示唆する。それにもかかわらず、ここに記載した試験の対象の相当数が、0.5mg連日ほど低い投薬でも口腔内潰瘍を発症した。それゆえに、低い、免疫増強用量RAD001の安全性プロファイルはさらなる治験を必要とする。現在利用可能なラパログよりも問題のない安全性プロファイルを有するmTOR阻害剤は、将来加齢関連状態における良好な治療選択肢を提供し得る。
実施例13:高齢者対象におけるワクチンに対する免疫応答の増強
免疫機能は高齢者で低下し、感染発生率増加およびワクチン接種に対する応答減少に至る。mTOR阻害がヒトにおいて抗加齢効果を有するかの決定の第一段階として、無作為化プラセボ対照治験を実施し、mTOR阻害剤RAD001が、高齢志願者におけるワクチン接種に対する応答により評価された免疫機能の加齢関連低下を反転させるかを決定した。全例で、適切な患者同意を得て、治験は国の保健機関により承認された。
免疫機能は高齢者で低下し、感染発生率増加およびワクチン接種に対する応答減少に至る。mTOR阻害がヒトにおいて抗加齢効果を有するかの決定の第一段階として、無作為化プラセボ対照治験を実施し、mTOR阻害剤RAD001が、高齢志願者におけるワクチン接種に対する応答により評価された免疫機能の加齢関連低下を反転させるかを決定した。全例で、適切な患者同意を得て、治験は国の保健機関により承認された。
RAD001の次の3投与レジメンを治験で使用した:
20mg毎週(トラフレベル:0.7ng/ml)
5mg毎週(トラフレベルは検出限界以下であった)
0.5mg連日(トラフレベル:0.9ng/ml)。
20mg毎週(トラフレベル:0.7ng/ml)
5mg毎週(トラフレベルは検出限界以下であった)
0.5mg連日(トラフレベル:0.9ng/ml)。
移植および腫瘍適応症で承認されているRAD001の用量より低いトラフレベルのために、これらの投与レジメンを選択した。トラフレベルは、体内の薬物の最低レベルである。10mg連日腫瘍学投与レジメンに付随するRAD001のトラフレベルは約20ng/mlである。0.75~1.5mg bid移植投与レジメンに付随するトラフレベルは約3ng/mlである。対照的に、我々の免疫化治験で使用した投与レジメンに付随するトラフレベルは3~20倍低かった。
RAD001関連AEがトラフレベルと関係するため、3投与レジメンは正常志願者に対する適切な安全性を有することが予測された。さらに、3用量は、一定範囲のmTOR阻害を与えることが予想された。P70 S6キナーゼ(P70 S6K)は、mTORによりリン酸化される下流標的である。P70 S6Kリン酸化のレベルは、mTOR活性の指標として働く。RAD001の前臨床試験および臨床試験で得たP70 S6Kリン酸化データのモデリングおよびシミュレーションに基づき、20mg毎週が丸一週間mTOR活性をほぼ完全に阻害すると予測され、一方5mg毎週および0.5mg連日はmTOR活性を一部阻害すると予測された。
65歳以上の高齢志願者を、3つのRAD001処置群(50対象/アーム)またはプラセボ(20対象/アーム)の一つに無作為化した。対象を治験薬物で6週間処置し、2週間休薬し、インフルエンザワクチン接種(Aggrippal, Novartis)および肺炎球菌ワクチン接種(Pneumovax 23, Merck)をした。インフルエンザワクチン接種に対する応答を、ワクチン接種4週間後、インフルエンザワクチンの3インフルエンザ株(H1N1、H3N2およびBインフルエンザサブタイプ)に対する血球凝集阻害アッセイによる幾何平均力価(GMTs)の測定により評価した。治験の主要評価項目は(1)安全性および耐容性および(2)ワクチン接種4週間後、プラセボと比較した、インフルエンザワクチン株の2/3のインフルエンザ力価の1.2倍増加であった。このエンドポイントは、インフルエンザ力価の1.2倍増加が、ワクチン接種後のインフルエンザ疾病の減少と関連し、それゆえに臨床的に適切であるために、選択した。5mg毎週および0.5mg 1日用量は十分耐容性であり、20mg毎週用量と異なり、GMT主要評価項目を満たした(図40A)。高齢志願者においてプラセボと比較して、RAD001がインフルエンザワクチン接種に対する応答を改善しただけでなく、肺炎球菌ワクチン接種に対する応答も改善した。肺炎球菌ワクチンは、23種の肺炎球菌血清型からの抗原を含む。血清型の7種に対する抗体力価を我々の対象で測定した。6/7血清型に対する抗体力価が、プラセボと比較して全3つのRADコホートで増加した。
合わせたインフルエンザおよび肺炎球菌力価データは、部分的(80~100%未満)mTOR阻害が、完全なmTOR阻害よりも免疫機能における加齢関連低下の反転により有効であることを示す。
実施例14:低用量mTOR阻害はエネルギーおよび運動を増やす
前臨床モデルにおいて、ラパログであるラパマイシンでのmTOR阻害は、老齢マウスにおける自発的身体活動性を増加させる(Wilkinson et al. Rapamycin slows aging in mice. (2012) Aging Cell; 11:675-82)。興味深いことに、実施例13に記載した0.5mg連日投薬コホートの対象も、投与1年後のアンケートで、プラセボと比較してエネルギーおよび運動能の増加を報告した(図46)。これらのデータは、ラパログでの部分的mTOR阻害が、単なる免疫機能を超えて加齢関連罹病率に対する効果を有し得ることを示唆する。
前臨床モデルにおいて、ラパログであるラパマイシンでのmTOR阻害は、老齢マウスにおける自発的身体活動性を増加させる(Wilkinson et al. Rapamycin slows aging in mice. (2012) Aging Cell; 11:675-82)。興味深いことに、実施例13に記載した0.5mg連日投薬コホートの対象も、投与1年後のアンケートで、プラセボと比較してエネルギーおよび運動能の増加を報告した(図46)。これらのデータは、ラパログでの部分的mTOR阻害が、単なる免疫機能を超えて加齢関連罹病率に対する効果を有し得ることを示唆する。
実施例15:RAD001でのP70 S6キナーゼ阻害
モデリングおよびシミュレーションを実施し、mTOR活性を部分的に阻害すると予測されるRAD001の連日および毎週用量範囲を予測した。上記のとおり、P70 S6KはmTORによりリン酸化され、P70 S6Kのノックアウトが寿命を増加するため加齢とより密接に結びついたmTORの下流標的である。それゆえにモデリングを、P70 S6K活性を一部阻害するRAD001の用量で行った。≧0.1mgおよび<20mgの範囲の毎週投薬がP70 S6K活性の部分的阻害を達成すると予測される(図47)。
モデリングおよびシミュレーションを実施し、mTOR活性を部分的に阻害すると予測されるRAD001の連日および毎週用量範囲を予測した。上記のとおり、P70 S6KはmTORによりリン酸化され、P70 S6Kのノックアウトが寿命を増加するため加齢とより密接に結びついたmTORの下流標的である。それゆえにモデリングを、P70 S6K活性を一部阻害するRAD001の用量で行った。≧0.1mgおよび<20mgの範囲の毎週投薬がP70 S6K活性の部分的阻害を達成すると予測される(図47)。
連日投薬について、30pM~4nMの濃度のRAD001が細胞株におけるP70 S6K活性を部分的に阻害する(表12)。これらの血清濃度は、≧0.005mg~<1.5mg連日のRAD001の用量で達成されると予測される。
結論
P70 S6Kを部分的にしか阻害しない用量のmTOR阻害剤を用いる、加齢関連罹患を処置するまたは一般に免疫応答を増強する方法が提供される。加齢適応症における低用量のRAD001での部分的mTOR阻害の有効性は予想外の発見である。≧0.1mg~<20mg毎週および≧0.005mg~<1.5mg連日のRAD001用量範囲が部分的mTOR阻害を達成し、それゆえに加齢関連罹患または免疫応答の増強に有効性を有することが期待される。
P70 S6Kを部分的にしか阻害しない用量のmTOR阻害剤を用いる、加齢関連罹患を処置するまたは一般に免疫応答を増強する方法が提供される。加齢適応症における低用量のRAD001での部分的mTOR阻害の有効性は予想外の発見である。≧0.1mg~<20mg毎週および≧0.005mg~<1.5mg連日のRAD001用量範囲が部分的mTOR阻害を達成し、それゆえに加齢関連罹患または免疫応答の増強に有効性を有することが期待される。
実施例16:外来性IL-7はCAR T細胞の機能を増強する
CAR T細胞の養子移入後、一部の患者は、最適以下のレベルの抗腫瘍活性をもたらし得る、CAR T細胞の限定的持続を経験する。この実施例において、外来性ヒトIL-7投与の効果を、CAR T細胞に対する初期最適以下応答が観察されているマウス異種移植モデルで評価する。
IL-7受容体CD127の発現を、まず異なる癌細胞株およびCAR発現細胞で評価した。2個のマントル細胞リンパ腫細胞株(RLおよびJeko-1)および1個のB-ALL細胞株(Nalm-6)を、CD127発現についてフローサイトメトリーで分析した。図48Aに示すように、試験した3癌細胞株試験中、RLはCD127の最高発現を有し、続いてJeko-1およびNalm-6であることが示された。CART19細胞をNSGマウスに注入し、CD127発現を、フローサイトメトリーにより循環CART19細胞において評価した。図48Bに示すように、CD127は全循環CART19細胞で均一に発現される。
CAR T細胞の養子移入後、一部の患者は、最適以下のレベルの抗腫瘍活性をもたらし得る、CAR T細胞の限定的持続を経験する。この実施例において、外来性ヒトIL-7投与の効果を、CAR T細胞に対する初期最適以下応答が観察されているマウス異種移植モデルで評価する。
IL-7受容体CD127の発現を、まず異なる癌細胞株およびCAR発現細胞で評価した。2個のマントル細胞リンパ腫細胞株(RLおよびJeko-1)および1個のB-ALL細胞株(Nalm-6)を、CD127発現についてフローサイトメトリーで分析した。図48Aに示すように、試験した3癌細胞株試験中、RLはCD127の最高発現を有し、続いてJeko-1およびNalm-6であることが示された。CART19細胞をNSGマウスに注入し、CD127発現を、フローサイトメトリーにより循環CART19細胞において評価した。図48Bに示すように、CD127は全循環CART19細胞で均一に発現される。
次に、CART19細胞の抗腫瘍活性に対する外来性IL-7処置の効果を、リンパ腫動物モデルにおいて評価した。NSGマウスに、ルシフェラーゼ発現マントル細胞株(RL luc)を0日目(D0)に移植し、続いて6日目にCART19細胞で処置した。NSGマウスを群に分け、ここで、第一群はCART19細胞を受けず、第二群は0.5×106 CART19細胞を受け、第三群は1×106 CART19細胞を受け、第4群は2×106 CART19細胞を受けた。腫瘍サイズを、80日を越えて移植腫瘍の平均バイオルミネセンスを測定することによりモニターした。2×106 CART19細胞を受けたマウスのみが、腫瘍に対する拒絶および腫瘍増殖阻止を示した(図49A)。0.5×106 CART19細胞または1×106 CART19細胞を受けた2群のマウスは、最適以下の抗腫瘍応答を示した。これらの2群のマウスを次いで無作為化し、3匹のマウス(0.5×106 CART19細胞を受けたマウス#3827および#3829および1×106 CART19細胞を受けたマウス#3815)は、85日目に開始して、週に3回200ng/マウスの用量で外来性組み換えヒトIL-7の腹腔内注射を受け、2匹のマウスは受けなかった。平均バイオルミネセンスで決定した、85~125日目に外来性IL-7を受けたマウスの腫瘍負荷を図49Bに示す。IL-7を受けた全マウスが、腫瘍負荷の1~3ログ減少の劇的応答を示した。元々高用量CART19細胞を受けたマウス(1×106 CART19細胞を受けたマウス#3815)は、より著明な応答を示した。IL-7処置を受けたマウスと対照で腫瘍負荷を比較したとき、IL-7処置前後で、腫瘍負荷における腫瘍減少は、IL-7処置を受けたマウスでのみ見られた(図49C)。
リンパ腫動物モデルにおけるIL-7処置後のT細胞動態も試験した。ヒトCART19細胞は、IL-7処置は血液で検出不可能であった。IL-7での処置により、処置マウスにおけるT細胞数の急速であるが、不定の増加があった(図50A)。IL-7を受けたマウスで観察されるT細胞増殖の程度はまた腫瘍応答と相関した。IL-7処置中のピーク増殖時に血液で最高数のT細胞が検出されたマウス(マウス#3815)は、腫瘍負荷の最も強い減少を有した(図49B参照)。さらに、ピーク増殖の時間は、ベースラインとして注射したT細胞用量と相関した。血液中のCD3発現細胞数/レベルも、IL-7処置前後に測定した。対照マウスにおいて、CD3発現細胞はほとんど検出されなかったが、IL-7処置マウスは、IL-7処置後CD3+細胞の有意な増加を示した(図50B)。
まとめると、この実施例の結果は、外来性IL-7処置がインビボでT細胞増殖および抗腫瘍活性を増加させることを示し、CAR治療後最適以下の結果の患者へのIL-7が、これらの患者における抗腫瘍応答を改善できることを示す。
均等物
ここに引用する全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体を引用により本明細書に包含させる。本発明は、具体的態様を引用して開示されているが、本発明の他の態様および変形が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく他の当業者により想到され得ることは明らかである。以下に記載する特許請求の範囲は、全てのこのような態様および等価な変形を含むと解釈されることを意図している。
ここに引用する全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体を引用により本明細書に包含させる。本発明は、具体的態様を引用して開示されているが、本発明の他の態様および変形が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく他の当業者により想到され得ることは明らかである。以下に記載する特許請求の範囲は、全てのこのような態様および等価な変形を含むと解釈されることを意図している。
B細胞特異的CD19抗原(CTL019、CART19)に対するキメラ抗原受容体(CAR)を形質導入した自己T細胞の注入は、種々のB細胞新生物、最重要には急性リンパ芽球性白血病(ALL)を有する患者の大部分で劇的な臨床応答に至る。例えば、Maude et al. NEJM. 371.16(2014):1507-17; and Ruella et al. Expert Opin. Biol. Ther. (2015):1-6参照。リンパ節腫瘤または巨大腫瘤病変の存在は、T細胞浸潤低下と、その結果としての抗腫瘍活性低下に至り得る。巨大リンパ節腫脹は、イブルチニブに対する応答を妨害するように見えない。Wang et al. NEJM. 369.6(2013):507-16。また、イブルチニブは、腫瘍質量の減少および新生物B細胞の末梢血への移動に特に有効性を示す。
Claims (75)
- CD19の発現と関係する疾患を有する哺乳動物の処置において、1以上のキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用するためのCD19と結合するCAR分子を発現する細胞(例えば、細胞の集団)(“CAR19発現細胞”)を含む組成物であって、ここで、キナーゼ阻害剤がブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)阻害剤、mTOR阻害剤またはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)阻害剤から選択される、組成物。
- 哺乳動物にブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)阻害剤、mTOR阻害剤またはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)阻害剤から選択される1以上のキナーゼ阻害剤と組み合わせて、CD19と結合するCAR分子を発現する細胞(例えば、細胞の集団)(CAR19発現細胞)の有効量を投与することを含む、CD19の発現と関係する疾患を有する哺乳動物を処置する方法。
- キナーゼ阻害剤およびCAR19発現細胞を第一選択の治療として哺乳動物に投与する、請求項1または2に記載の使用または方法。
- CAR19発現細胞を、哺乳動物にキナーゼ阻害剤の投与後に投与する、請求項1または2に記載の使用または方法。
- (i)CAR19発現細胞をキナーゼ阻害剤の投与の休止後に投与するか、または
(ii)キナーゼ阻害剤の投与をCAR19発現細胞の投与前に開始し、CAR19発現細胞を、継続しているキナーゼ阻害剤の投与と組み合わせて投与する、
請求項4に記載の使用または方法。 - 哺乳動物がBTK阻害剤(例えば、イブルチニブ)に対する完全または部分応答者またはCAR19発現細胞に対する完全または部分応答者であるまたはそうであると決定される、請求項1~4のいずれかに記載の使用または方法。
- BTK阻害剤がイブルチニブ、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774またはLFM-A13から選択される、請求項1~6のいずれかに記載の使用または方法。
- CDK4阻害剤がパルボシクリブ、アロイシンA、フラボピリドール、2-(2-クロロフェニル)-5,7-ジヒドロキシ-8-[(3S,4R)-3-ヒドロキシ-1-メチル-4-ピペリジニル]-4-クロメノン、クリゾチニブ(PF-02341066、P276-00、RAF265、インジスラムロスコビチン、ジナシクリブ、BMS 387032、MLN8054、AG-024322、AT7519、AZD5438、BMS908662またはリボシクリブから選択される、請求項1~6のいずれかに記載の使用または方法。
- mTOR阻害剤がラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、セマピモド、AZD8055、PF04691502、SF1126、XL765またはOSI-027のようなラパマイシンアナログから選択される、請求項1~6のいずれかに記載の使用または方法。
- MNK阻害剤がCGP052088、CGP57380、セルコスポラミド、ETC-1780445-2または4-アミノ-5-(4-フルオロアニリノ)-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジンから選択される、請求項1~6のいずれかに記載の使用または方法。
- キナーゼ阻害剤がイブルチニブであり、イブルチニブが約250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mgまたは600mg連日の用量を有する、請求項1~10のいずれかに記載の使用または方法。
- 細胞がCD19結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むCAR分子を発現する、請求項1~11のいずれかに記載の使用または方法。
- 細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項12に記載の使用または方法。
- CAR分子が抗CD19結合ドメインの軽鎖相補性決定領域1(LC CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LC CDR2)、軽鎖相補性決定領域3(LC CDR3)、重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)および重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)を含む抗CD19結合ドメインを含む、請求項12または13に記載の使用または方法。
- 抗CD19結合ドメインが表7のマウス軽鎖可変領域、表7のマウス重鎖可変領域または両者を含む、請求項12~14のいずれかに記載の使用または方法。
- 抗CD19結合ドメインが配列番号5のLC CDR1、配列番号26のLC CDR2および配列番号27のLC CDR3を含む、請求項12~15のいずれかに記載の使用または方法。
- 抗CD19結合ドメインが配列番号19のHC CDR1、配列番号20~23のいずれかのLC CDR2および配列番号24のHC CDR3を含む、請求項12~16のいずれかに記載の使用または方法。
- 抗CD19結合ドメインが配列番号59の配列またはそれと95~99%同一である配列を含む、請求項12~17のいずれかに記載の使用または方法。
- 抗CD19結合ドメインがヒト化抗CD19結合ドメインである、請求項12~14、16または17のいずれかに記載の使用または方法。
- ヒト化抗CD19結合ドメインが配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12またはそれと95~99%同一性を有する配列から選択される配列を含む、請求項19に記載の使用または方法。
- ヒト化抗CD19結合ドメインがリンカーを介して重鎖可変に結合する軽鎖可変領域を含むscFvである、例えば、リンカーが配列番号53の配列を含む、請求項19または20に記載の使用または方法。
- CAR分子がT細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137またはCD154から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項1~21のいずれかに記載の使用または方法。
- 膜貫通ドメインが配列番号15の配列を含む、請求項22に記載の使用または方法。
- 抗CD19結合ドメインがヒンジ領域により膜貫通ドメインに結合し、例えば、ここで、ヒンジ領域が配列番号14または配列番号45の配列を含む、請求項12に記載の使用または方法。
- CAR分子が共刺激ドメインを含み、例えば、共刺激ドメインがOX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)または4-1BB(CD137)から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含み、例えば、共刺激ドメインが配列番号16または配列番号51の配列を含む、請求項1~24のいずれかに記載の使用または方法。
- CAR分子が細胞内シグナル伝達ドメインを含み、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインが4-1BBの機能的シグナル伝達ドメイン、CD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメインまたは両者を含むかまたは細胞内シグナル伝達ドメインがCD27、CD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメインまたは両者の配列を含む、請求項1~25のいずれかに記載の使用または方法。
- 細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号16の配列、配列番号17の配列または両者を含み、細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号16の配列、配列番号43の配列または両者を含み、細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号51の配列、配列番号17の配列または両者を含むかまたは細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号51の配列、配列番号43の配列または両者を含む、請求項26に記載の使用または方法。
- CAR分子がさらにリーダー配列を含み、例えば、ここで、リーダー配列が配列番号13のアミノ酸配列を含む、請求項1~27のいずれかに記載の使用または方法。
- CAR分子が配列番号58、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41または配列番号42のアミノ酸配列を含む、請求項1~28のいずれかに記載の使用または方法。
- PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4またはTGFRベータから選択される免疫阻害分子を阻害する薬剤と組み合わせて使用する、請求項1~29のいずれかに記載の使用または方法。
- 組成物が1~5×108 CAR発現細胞を含む、請求項1~30のいずれかに記載の使用または方法。
- CD19の発現と関係する疾患が癌である、請求項1~31のいずれかに記載の使用または方法。
- CD19の発現と関係する疾患が血液癌、例えば、白血病またはリンパ腫から選択される血液癌である、請求項1~32のいずれかに記載の使用または方法。
- 癌が慢性リンパ性白血病(CLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、多発性骨髄腫、急性リンパ系白血病(ALL)、ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ系白血病(BALL)、T細胞急性リンパ系白血病(TALL)、小リンパ球性白血病(SLL)、B細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大B細胞リンパ腫(DLBCL)、慢性炎症と関係するDLBCL、濾胞性リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、MALTリンパ腫(粘膜関連リンパ組織型節外性辺縁帯リンパ腫)、辺縁帯リンパ腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、脾臓辺縁帯リンパ腫、脾臓リンパ腫/白血病、脾臓汎発性赤色髄小B細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病異型、リンパ形質細胞性リンパ腫、重鎖疾患、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外形質細胞腫、結節性辺縁帯リンパ腫、小児結節性辺縁帯リンパ腫、皮膚原発濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、縦隔原発(胸腺)大B細胞リンパ腫、血管内大B細胞リンパ腫、ALK+大B細胞リンパ腫、HHV8関連多中心性キャッスルマン病に生じる大B細胞リンパ腫、原発浸出リンパ腫、B細胞リンパ腫または分類不可能リンパ腫から選択される、請求項32に記載の使用または方法。
- 癌がMCL、CLL、ALL、ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫から選択される、請求項32に記載の使用または方法。
- サイトカインと組み合わせて使用する、請求項1~35のいずれかに記載の使用または方法。
- サイトカインがIL-7、IL-15またはIL-21である、請求項36に記載の使用または方法。
- CARが調節可能なCAR(RCAR)である、請求項1~37のいずれかに記載の使用または方法。
- RCARが
細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー、
CD19に結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合メンバーおよび第二スイッチドメイン;および
膜貫通ドメイン
を含む、請求項38に記載の使用または方法。 - 哺乳動物がBTK変異を有するまたはそれを有すると同定される、請求項1~39のいずれかに記載の使用または方法。
- CD19の発現と関係する疾患が血液癌であり、キナーゼ阻害剤に対する耐性、哺乳動物に対するCAR分子を発現する細胞または両者が遅延または減少する、請求項1~40のいずれかに記載の使用または方法。
- CD19の発現と関係する疾患が血液癌であり、血液癌の寛解が延長するまたは血液癌の再発が遅延する、請求項1~41のいずれかに記載の使用または方法。
- CAR19発現細胞を第二キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与し、ここで、哺乳動物がイブルチニブに対して非応答者または再発者であるかまたはそうであると同定されたとき、第二キナーゼ阻害剤がイブルチニブ以外である、請求項1または2に記載の使用または方法。
- 第二キナーゼ阻害剤がGDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774またはLFM-A13またはこれらの組み合わせから選択される1以上である、請求項43に記載の使用または方法。
- 哺乳動物がキナーゼ阻害剤に対する部分応答者であり(またはそうであると同定される)、哺乳動物にCAR19発現細胞を、単独でまたはBTK阻害剤と組み合わせて、部分応答の期間投与する、請求項1~44のいずれかに記載の使用または方法。
- 哺乳動物がイブルチニブでの処置後疾患が進行するまたは安定である非応答者であり(またはそうであると同定される)、哺乳動物にCAR19発現細胞を、単独でまたは第二BTK阻害剤と組み合わせて、疾患が進行しているまたは安定な期間の間投与し、ここで、第二キナーゼ阻害剤はイブルチニブ以外である、請求項1または2に記載の使用または方法。
- キナーゼ阻害剤がイブルチニブであり、イブルチニブが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれ以上のサイクルで投与するために製剤され、例えば、サイクル長が21日または28日である、請求項1~46のいずれかに記載の使用または方法。
- 少なくとも1つのCD19 CAR発現細胞でのリンパ球注入を実施することを含む、請求項1~47のいずれかに記載の使用または方法。
- 細胞およびキナーゼ阻害剤が同時投与のために製剤される、請求項1~48のいずれかに記載の使用または方法。
- 細胞およびキナーゼ阻害剤が逐次送達のために製剤される、請求項1~49のいずれかに記載の使用または方法。
- 哺乳動物がリンパ球枯渇を受けている、請求項1~50のいずれかに記載の使用または方法。
- リンパ球枯渇がメルファラン、シトキサン、シクロホスファミドおよびフルダラビンの1以上の投与を含む、請求項51に記載の使用または方法。
- 低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤を哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項1~52のいずれかに記載の使用または方法。
- mTOR阻害剤がエベロリムスまたはラパマイシンである、請求項53に記載の使用または方法。
- CAR発現細胞(例えば、CAR発現免疫エフェクター細胞)または細胞の集団を製造する方法であって、
細胞または細胞の集団とBTK阻害剤を接触させ、そして
CAR分子が発現されるような条件下で、CAR分子をコードする核酸を細胞または細胞の集団に導入する(例えば、形質導入する)
ことを含む、方法。 - CAR分子がCD19と結合するCAR分子である、請求項55に記載の方法。
- 細胞がT細胞またはNK細胞であるかまたは細胞の集団がT細胞、NK細胞または両者を含む、請求項55または56に記載の方法。
- 細胞または細胞の集団とBTK阻害剤を10~20分、20~30分、30~40分、40~60分または60~120分接触させ、続いてBTK阻害剤の大部分または全てを細胞または細胞の集団から除去する、請求項55~57のいずれかに記載の方法。
- BTK阻害剤を細胞または細胞の集団が回収された後にまたは細胞または細胞の集団を刺激する前に、請求項55~58のいずれかに記載の方法。
- BTK阻害剤がイブルチニブ、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774またはLFM-A13から選択される、請求項55~59のいずれかに記載の方法。
- 細胞の集団が癌細胞も含む、請求項55~60のいずれかに記載の方法。
- BTK阻害剤が癌細胞におけるBTKを阻害する、請求項61に記載の方法。
- T制御性細胞(例えば、CD25+細胞)を細胞の集団から枯渇させることをさらに含む、請求項55~62のいずれかに記載の方法。
- 免疫エフェクター細胞の集団、BTK阻害剤およびCAR分子またはCAR分子をコードする核酸を含む、反応混合物。
- 免疫エフェクター細胞の1以上がCAR分子を発現するかまたはCAR分子をコードする核酸を含む、請求項64に記載の反応混合物。
- BTK阻害剤がイブルチニブ、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774またはLFM-A13から選択される、請求項64に記載の反応混合物。
- さらに癌細胞を含む、請求項64に記載の反応混合物。
- 免疫エフェクター細胞の集団およびCAR分子またはCAR分子をコードする核酸を含む反応混合物であって、ここで、免疫エフェクター細胞が共有結合的に不活性化されたITKを含む、反応混合物。
- さらに癌細胞を含む、請求項68に記載の反応混合物。
- 癌細胞が共有結合的に不活性化されたBTKを含む、請求項68に記載の反応混合物。
- CD19と結合するCAR分子を発現する細胞(“CAR19発現細胞”)および1以上のキナーゼ阻害剤を含む組成物であって、ここで、キナーゼ阻害剤がブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)阻害剤、mTOR阻害剤またはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)阻害剤から選択される、組成物。
- CAR19発現細胞および1以上のキナーゼ阻害剤が単一用量形態または2以上の用量形態で存在する、請求項71に記載の組成物。
- 医薬として使用するための、請求項71または72に記載の組成物。
- CD19の発現と関係する疾患の処置に使用するための、請求項71または72に記載の組成物。
- CAR19発現細胞がヒト免疫エフェクター細胞(例えば、ヒトT細胞またはヒトNK細胞)または細胞の集団である、請求項1~74のいずれかに記載の使用、方法または組成物。
Applications Claiming Priority (13)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461976396P | 2014-04-07 | 2014-04-07 | |
US61/976,396 | 2014-04-07 | ||
US201462007309P | 2014-06-03 | 2014-06-03 | |
US62/007,309 | 2014-06-03 | ||
US201462036493P | 2014-08-12 | 2014-08-12 | |
US62/036,493 | 2014-08-12 | ||
US201462076238P | 2014-11-06 | 2014-11-06 | |
US62/076,238 | 2014-11-06 | ||
US201462087888P | 2014-12-05 | 2014-12-05 | |
US62/087,888 | 2014-12-05 | ||
US201462097278P | 2014-12-29 | 2014-12-29 | |
US62/097,278 | 2014-12-29 | ||
JP2020041499A JP7258802B2 (ja) | 2014-04-07 | 2020-03-11 | 抗cd19キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020041499A Division JP7258802B2 (ja) | 2014-04-07 | 2020-03-11 | 抗cd19キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023085460A true JP2023085460A (ja) | 2023-06-20 |
Family
ID=53008859
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016561313A Active JP6765966B2 (ja) | 2014-04-07 | 2015-04-07 | 抗cd19キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 |
JP2020041499A Active JP7258802B2 (ja) | 2014-04-07 | 2020-03-11 | 抗cd19キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 |
JP2023061386A Pending JP2023085460A (ja) | 2014-04-07 | 2023-04-05 | 抗cd19キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016561313A Active JP6765966B2 (ja) | 2014-04-07 | 2015-04-07 | 抗cd19キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 |
JP2020041499A Active JP7258802B2 (ja) | 2014-04-07 | 2020-03-11 | 抗cd19キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10357514B2 (ja) |
EP (2) | EP3129470B1 (ja) |
JP (3) | JP6765966B2 (ja) |
KR (3) | KR102487608B1 (ja) |
CN (2) | CN107075482B (ja) |
AU (2) | AU2015244039B2 (ja) |
CA (1) | CA2940671A1 (ja) |
DK (1) | DK3129470T3 (ja) |
ES (1) | ES2876263T3 (ja) |
HR (1) | HRP20211055T1 (ja) |
HU (1) | HUE054588T2 (ja) |
IL (4) | IL280215B (ja) |
LT (1) | LT3129470T (ja) |
MX (2) | MX2016013239A (ja) |
MY (1) | MY191608A (ja) |
PL (1) | PL3129470T3 (ja) |
PT (1) | PT3129470T (ja) |
RU (1) | RU2718542C2 (ja) |
SG (2) | SG10202109752XA (ja) |
SI (1) | SI3129470T1 (ja) |
TW (1) | TWI753848B (ja) |
WO (1) | WO2015157252A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201605657B (ja) |
Families Citing this family (173)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9249423B2 (en) | 2007-02-02 | 2016-02-02 | Yale University | Method of de-differentiating and re-differentiating somatic cells using RNA |
US10155038B2 (en) | 2007-02-02 | 2018-12-18 | Yale University | Cells prepared by transient transfection and methods of use thereof |
US8415150B2 (en) * | 2009-02-24 | 2013-04-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods for treating progressive multifocal leukoencephalopathy (PML) |
US11844720B2 (en) | 2011-02-04 | 2023-12-19 | Seed Health, Inc. | Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis |
US10940169B2 (en) | 2015-11-30 | 2021-03-09 | Joseph E. Kovarik | Method for reducing the likelihood of developing cancer in an individual human being |
US11951139B2 (en) | 2015-11-30 | 2024-04-09 | Seed Health, Inc. | Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis |
US11951140B2 (en) | 2011-02-04 | 2024-04-09 | Seed Health, Inc. | Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease |
EP2958942B1 (en) | 2013-02-20 | 2020-06-03 | Novartis AG | Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells |
CN105358576B (zh) | 2013-02-20 | 2020-05-05 | 诺华股份有限公司 | 使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受体治疗癌症 |
US9745368B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-08-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy |
UY35468A (es) | 2013-03-16 | 2014-10-31 | Novartis Ag | Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19 |
CA2931684C (en) | 2013-12-19 | 2024-02-20 | Novartis Ag | Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof |
US11529379B2 (en) | 2013-12-20 | 2022-12-20 | Seed Health, Inc. | Method and system for reducing the likelihood of developing colorectal cancer in an individual human being |
US11213552B2 (en) | 2015-11-30 | 2022-01-04 | Joseph E. Kovarik | Method for treating an individual suffering from a chronic infectious disease and cancer |
US10287354B2 (en) | 2013-12-20 | 2019-05-14 | Novartis Ag | Regulatable chimeric antigen receptor |
US11980643B2 (en) | 2013-12-20 | 2024-05-14 | Seed Health, Inc. | Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection |
US11672835B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-06-13 | Seed Health, Inc. | Method for treating individuals having cancer and who are receiving cancer immunotherapy |
US11642382B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-05-09 | Seed Health, Inc. | Method for treating an individual suffering from bladder cancer |
US11839632B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-12-12 | Seed Health, Inc. | Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris |
US11026982B2 (en) | 2015-11-30 | 2021-06-08 | Joseph E. Kovarik | Method for reducing the likelihood of developing bladder or colorectal cancer in an individual human being |
US11826388B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-11-28 | Seed Health, Inc. | Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation |
US11833177B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-12-05 | Seed Health, Inc. | Probiotic to enhance an individual's skin microbiome |
US11969445B2 (en) | 2013-12-20 | 2024-04-30 | Seed Health, Inc. | Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH |
US11028143B2 (en) | 2014-01-21 | 2021-06-08 | Novartis Ag | Enhanced antigen presenting ability of RNA CAR T cells by co-introduction of costimulatory molecules |
KR102487608B1 (ko) | 2014-04-07 | 2023-01-12 | 노파르티스 아게 | 항-cd19 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 |
RU2020133435A (ru) | 2014-04-16 | 2020-12-01 | Юно Терепьютикс Гмбх | Способ инкубирования популяции клеток и реагент для мультимеризации |
US11542488B2 (en) | 2014-07-21 | 2023-01-03 | Novartis Ag | Sortase synthesized chimeric antigen receptors |
CN112481283A (zh) | 2014-07-21 | 2021-03-12 | 诺华股份有限公司 | 使用cd33嵌合抗原受体治疗癌症 |
KR102612313B1 (ko) | 2014-07-21 | 2023-12-12 | 노파르티스 아게 | 인간화 항-bcma 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 |
JP7084138B2 (ja) | 2014-08-19 | 2022-06-14 | ノバルティス アーゲー | 癌処置に使用するための抗cd123キメラ抗原受容体(car) |
CN114621969A (zh) | 2014-09-17 | 2022-06-14 | 诺华股份有限公司 | 用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞 |
AU2015330898B2 (en) | 2014-10-08 | 2022-03-10 | Novartis Ag | Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof |
WO2016064929A1 (en) | 2014-10-20 | 2016-04-28 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for dosing in adoptive cell therapy |
US20190054117A1 (en) * | 2014-12-19 | 2019-02-21 | Novartis Ag | Dimerization switches and uses thereof |
EP3240803B1 (en) | 2014-12-29 | 2021-11-24 | Novartis AG | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
WO2016115482A1 (en) | 2015-01-16 | 2016-07-21 | Novartis Pharma Ag | Phosphoglycerate kinase 1 (pgk) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor |
WO2016126608A1 (en) * | 2015-02-02 | 2016-08-11 | Novartis Ag | Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof |
ES2876974T3 (es) * | 2015-04-07 | 2021-11-15 | Novartis Ag | Combinación de terapia con receptor de antígeno quimérico y derivados de amino pirimidina |
CN114958764A (zh) | 2015-04-08 | 2022-08-30 | 诺华股份有限公司 | Cd20疗法、cd22疗法和与cd19嵌合抗原受体(car)表达细胞的联合疗法 |
EP4234685A3 (en) * | 2015-04-17 | 2023-09-06 | Novartis AG | Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells |
EP3294342A4 (en) | 2015-05-08 | 2018-11-07 | President and Fellows of Harvard College | Universal donor stem cells and related methods |
SG10201912978PA (en) | 2015-07-21 | 2020-02-27 | Novartis Ag | Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells |
US10906951B2 (en) | 2015-07-29 | 2021-02-02 | Onk Therapeutics Limited | Modified natural killer cells and natural killer cell lines having increased cytotoxicity |
EP3878951A1 (en) | 2015-07-29 | 2021-09-15 | ONK Therapeutics Limited | Modified natural killer cells and natural killer cell lines having increased cytotoxicity |
US11667691B2 (en) | 2015-08-07 | 2023-06-06 | Novartis Ag | Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins |
JP6905163B2 (ja) | 2015-09-03 | 2021-07-21 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | サイトカイン放出症候群を予測するバイオマーカー |
MA44909A (fr) * | 2015-09-15 | 2018-07-25 | Acerta Pharma Bv | Association thérapeutique d'un inhibiteur du cd19 et d'un inhibiteur de la btk |
JP6821688B2 (ja) * | 2015-10-09 | 2021-01-27 | ミルテニー・バイオテク・テクノロジー・インコーポレイテッドMiltenyi Biotec Technology, Inc. | キメラ抗原受容体および使用方法 |
IL300420B1 (en) | 2015-10-16 | 2024-05-01 | Univ Columbia | Preparations and methods for inhibiting antigens of a certain lineage |
WO2017070092A1 (en) | 2015-10-19 | 2017-04-27 | University Of Massachusetts | Anti-cancer and anti-inflammatory therapeutics and methods thereof |
WO2017068419A2 (en) | 2015-10-22 | 2017-04-27 | Juno Therapeutics Gmbh | Methods, kits, agents and apparatuses for transduction |
EA201891092A1 (ru) * | 2015-11-04 | 2018-10-31 | Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания | Способы и композиции для редактирования генов в гемопоэтических стволовых клетках |
MA44140A (fr) | 2015-12-22 | 2021-05-19 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Récepteur d'antigène chimérique (car) contre la mésothéline et anticorps contre l'inhibiteur de pd-l1 pour une utilisation combinée dans une thérapie anticancéreuse |
BR112018013074A2 (pt) | 2015-12-30 | 2018-12-11 | Novartis Ag | terapias de célula efetora imune com eficácia real-çada |
CA3016287A1 (en) * | 2016-03-04 | 2017-09-08 | Novartis Ag | Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore |
WO2017165683A1 (en) | 2016-03-23 | 2017-09-28 | Novartis Ag | Cell secreted minibodies and uses thereof |
WO2017165869A1 (en) * | 2016-03-25 | 2017-09-28 | Trovagene, Inc. | Evaluaton of transgenes of genetically modified cells in bodily fluids |
EP4261277A3 (en) * | 2016-04-08 | 2024-01-03 | Emory University | Methods of treating cancer and infectious diseases using cell based therapies |
WO2017180587A2 (en) | 2016-04-11 | 2017-10-19 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Regulated biocircuit systems |
US10188749B2 (en) | 2016-04-14 | 2019-01-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers |
PL3443096T3 (pl) | 2016-04-15 | 2023-06-19 | Novartis Ag | Kompozycje i sposoby do selektywnej ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych |
US20210177896A1 (en) | 2016-06-02 | 2021-06-17 | Novartis Ag | Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells |
JP2019517518A (ja) * | 2016-06-03 | 2019-06-24 | メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター | 早期治療選択肢としての養子細胞療法 |
IL299099A (en) * | 2016-06-27 | 2023-02-01 | Univ California | Combinations of cancer treatments |
EP3484455A2 (en) | 2016-07-15 | 2019-05-22 | Novartis AG | Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor |
CN118021943A (zh) * | 2016-07-28 | 2024-05-14 | 诺华股份有限公司 | 嵌合抗原受体和pd-1抑制剂的组合疗法 |
AR110676A1 (es) | 2016-10-07 | 2019-04-24 | Novartis Ag | Tratamiento del cáncer utilizando receptores de antígenos quiméricos |
EP3534938A2 (en) * | 2016-11-03 | 2019-09-11 | Juno Therapeutics, Inc. | Combination therapy of a t cell therapy and a btk inhibitor |
US10899768B2 (en) | 2016-11-22 | 2021-01-26 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Degradation of protein kinases by conjugation of protein kinase inhibitors with E3 ligase ligand and methods of use |
BR112019011065A2 (pt) | 2016-12-03 | 2019-10-01 | Juno Therapeutics Inc | métodos para determinação da dosagem de células t car |
MA46995A (fr) | 2016-12-03 | 2019-10-09 | Acerta Pharma Bv | Méthodes et compositions pour l'utilisation de lymphocytes t thérapeutiques en association avec des inhibiteurs de kinase |
MA46998A (fr) | 2016-12-05 | 2019-10-09 | Juno Therapeutics Inc | Production de cellules modifiées pour une thérapie cellulaire adoptive |
WO2018118494A2 (en) * | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Xiaotong Song | Use of car-modified human natural killer cells to treat cancer |
EP3565535A4 (en) | 2017-01-05 | 2020-12-30 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | SYSTEMS AND METHODS FOR IMPROVING THE EFFECTIVENESS OF A VACCINE |
US11578115B2 (en) | 2017-01-10 | 2023-02-14 | The General Hospital Corporation | Chimeric antigen receptors based on alternative signal 1 domains |
EP4043485A1 (en) | 2017-01-26 | 2022-08-17 | Novartis AG | Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy |
AU2018219226A1 (en) | 2017-02-07 | 2019-08-15 | Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) | Phospholipid ether (PLE) CAR T cell tumor targeting (CTCT) agents |
CN110582288A (zh) | 2017-02-28 | 2019-12-17 | 恩多塞特公司 | 用于car t细胞疗法的组合物和方法 |
WO2018160731A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Novartis Ag | Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy |
CN110461363B (zh) | 2017-03-16 | 2024-04-02 | 综合医院公司 | 靶向cd37的嵌合抗原受体 |
US20200085871A1 (en) * | 2017-03-17 | 2020-03-19 | University Of Tennessee Research Foundation | Methods of using cytotoxic t cells for treatment of autoimmune diseases |
AU2018237159A1 (en) | 2017-03-22 | 2019-09-05 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for immunooncology |
CA3054443A1 (en) * | 2017-04-01 | 2018-10-14 | Avm Biotechnology, Llc | Replacement of cytotoxic preconditioning before cellular immunotherapy |
JP2020512983A (ja) * | 2017-04-03 | 2020-04-30 | カイト ファーマ インコーポレイテッドKite Pharma, Inc | 最適化された多機能性t細胞を含むキメラ受容体t細胞を使用する治療 |
IL270250B1 (en) * | 2017-05-01 | 2024-02-01 | Juno Therapeutics Inc | A combination of cellular therapy and an immune modulatory compound |
US20200224161A1 (en) * | 2017-05-10 | 2020-07-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof |
CN111225675B (zh) | 2017-06-02 | 2024-05-03 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 使用过继细胞疗法治疗的制品和方法 |
US11766442B2 (en) | 2017-06-16 | 2023-09-26 | City Of Hope | T-cell lymphoma treatments |
US20200172628A1 (en) | 2017-06-22 | 2020-06-04 | Novartis Ag | Antibody molecules to cd73 and uses thereof |
AU2018290237A1 (en) | 2017-06-22 | 2020-01-16 | Novartis Ag | Antibody molecules to CD73 and uses thereof |
WO2018237325A1 (en) * | 2017-06-22 | 2018-12-27 | University Of Southern California | ANTICANCER POLYTHERAPY USING NATURAL CORRELATED ANTIGENIC RECEPTOR MANIPULATED CELLS AS CHEMOTHERAPEUTIC MEDICAMENT CARRIERS |
MX2020000595A (es) * | 2017-07-17 | 2020-09-10 | Janssen Biotech Inc | Regiones de unión al antígeno contra dominios de fibronectina tipo iii y métodos para su uso. |
BR112020001605A2 (pt) | 2017-08-09 | 2020-08-11 | Juno Therapeutics Inc | métodos para produzir composições de células geneticamente modificadas e composições relacionadas |
CN109423481A (zh) * | 2017-08-24 | 2019-03-05 | 上海恒润达生生物科技有限公司 | 一种cart细胞的放行检测方法 |
US10501539B2 (en) * | 2017-09-15 | 2019-12-10 | Lentigen Technology Inc. | Compositions and methods for treating cancer with anti-CD19 immunotherapy |
US10870703B2 (en) | 2017-10-02 | 2020-12-22 | Humanigen, Inc. | Methods of treating immunotherapy-related toxicity using a GM-CSF antagonist |
US10927168B2 (en) | 2017-10-02 | 2021-02-23 | Humanicen, Inc. | Method of reducing tumor relapse rate in immunotherapy by administration of lenzilumab |
US11130805B2 (en) | 2017-10-02 | 2021-09-28 | Humanigen, Inc. | Methods of treating CART-T cell therapy-induced neuroinflammation using a GM-CSF antagonist |
US10899831B2 (en) | 2017-10-02 | 2021-01-26 | Humanigen, Inc. | Method of reducing the level of non-GM-CSF cytokines/chemokines in immunotherapy-related toxicity |
JP2021501570A (ja) | 2017-10-18 | 2021-01-21 | ノバルティス アーゲー | 選択的タンパク質分解のための組成物及び方法 |
JP2021502330A (ja) * | 2017-10-20 | 2021-01-28 | フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター | Tigitおよび/またはcd112rを標的とするか、またはcd226過剰発現を含む、組成物および免疫治療の方法 |
BR112020007710A2 (pt) | 2017-10-25 | 2020-10-20 | Novartis Ag | métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico |
CA3078963A1 (en) * | 2017-10-25 | 2019-05-02 | Actinium Pharmaceuticals, Inc. | Anti-cd45-based conditioning methods and uses thereof in conjunction with gene-edited cell-based therapies |
WO2019089798A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Novartis Ag | Anti-car compositions and methods |
US11851679B2 (en) | 2017-11-01 | 2023-12-26 | Juno Therapeutics, Inc. | Method of assessing activity of recombinant antigen receptors |
WO2019089813A1 (en) * | 2017-11-01 | 2019-05-09 | Nantkwest, Inc. | Nk-92 cells to stimulate anti-cancer vaccine |
JP7447006B2 (ja) | 2017-11-01 | 2024-03-11 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | B細胞成熟抗原(bcma)に特異的なキメラ抗原受容体 |
MX2020004243A (es) | 2017-11-01 | 2020-09-25 | Juno Therapeutics Inc | Receptores de anticuerpos y de antigenos quimericos especificos para el antigeno de maduracion de celulas b. |
US11564946B2 (en) | 2017-11-01 | 2023-01-31 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods associated with tumor burden for assessing response to a cell therapy |
WO2019099483A1 (en) * | 2017-11-14 | 2019-05-23 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Il-36 secreting immunoresponsive cells and uses thereof |
KR20200088440A (ko) * | 2017-11-21 | 2020-07-22 | 노파르티스 아게 | 종양-연관 항원에 대한 삼중특이성 결합 분자 및 이의 용도 |
WO2019108900A1 (en) * | 2017-11-30 | 2019-06-06 | Novartis Ag | Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof |
JP7299169B2 (ja) * | 2017-12-01 | 2023-06-27 | イルミナ インコーポレイテッド | 体細胞突然変異のクローン性を決定するための方法及びシステム |
WO2019109053A1 (en) | 2017-12-01 | 2019-06-06 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for dosing and for modulation of genetically engineered cells |
WO2019113557A1 (en) * | 2017-12-08 | 2019-06-13 | Juno Therapeutics, Inc. | Process for producing a composition of engineered t cells |
JP2021509903A (ja) * | 2018-01-05 | 2021-04-08 | マックスサイト インコーポレーティッド | 癌の長期car処置 |
PL3737765T3 (pl) * | 2018-01-12 | 2022-04-11 | Curocell Inc. | Komórki układu odpornościowego wzmocnione z użyciem podwójnego shrna i kompozycja zawierająca te komórki |
US11779602B2 (en) | 2018-01-22 | 2023-10-10 | Endocyte, Inc. | Methods of use for CAR T cells |
US20200376035A1 (en) * | 2018-02-26 | 2020-12-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions comprising cart and a smac mimetic |
KR102495666B1 (ko) | 2018-03-14 | 2023-02-06 | 서피스 온콜로지, 인크. | Cd39에 결합하는 항체 및 이의 용도 |
CA3095093A1 (en) * | 2018-04-05 | 2019-10-10 | Novartis Ag | Trispecific binding molecules against cancers and uses thereof |
KR20210014638A (ko) * | 2018-05-01 | 2021-02-09 | 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 | 유전자 발현을 위한 나노입자 및 이의 용도 |
EP3801769A1 (en) | 2018-05-25 | 2021-04-14 | Novartis AG | Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies |
TW202015726A (zh) | 2018-05-30 | 2020-05-01 | 瑞士商諾華公司 | Entpd2抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法 |
WO2019232244A2 (en) | 2018-05-31 | 2019-12-05 | Novartis Ag | Antibody molecules to cd73 and uses thereof |
AU2019277271A1 (en) * | 2018-06-01 | 2020-12-03 | Monash University | Methods of activating cells via PTP 1B inhibition |
EP3806962A1 (en) | 2018-06-13 | 2021-04-21 | Novartis AG | Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof |
US20210268027A1 (en) * | 2018-06-22 | 2021-09-02 | The General Hospital Corporation | Chimeric antigen receptors targeting cd37 and cd19 |
CN108949695A (zh) * | 2018-08-14 | 2018-12-07 | 杭州荣泽生物科技有限公司 | 一种非病毒载体共表达il18的car-t细胞构建及其应用 |
US20210171909A1 (en) | 2018-08-31 | 2021-06-10 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor?expressing cells |
EP3844267A2 (en) | 2018-08-31 | 2021-07-07 | Novartis AG | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
KR20210105344A (ko) * | 2018-10-31 | 2021-08-26 | 휴머니건, 아이엔씨. | 암 치료용 물질 및 방법 |
EP3927371A1 (en) | 2019-02-22 | 2021-12-29 | Novartis AG | Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors |
AU2020229806A1 (en) | 2019-02-25 | 2021-07-29 | Novartis Ag | Mesoporous silica particles compositions for viral delivery |
EP3953455A1 (en) | 2019-04-12 | 2022-02-16 | Novartis AG | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
EP3959320A1 (en) | 2019-04-24 | 2022-03-02 | Novartis AG | Compositions and methods for selective protein degradation |
BR112021021787A2 (pt) * | 2019-04-30 | 2022-01-04 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Terapias de combinação |
CN110157680A (zh) * | 2019-05-08 | 2019-08-23 | 浙江大学 | 提高嵌合抗原受体t细胞疗效和作用持久性的细胞培养方法 |
CN110218702B (zh) * | 2019-06-14 | 2024-02-27 | 博生吉医药科技(苏州)有限公司 | 靶向cd138和cd19的免疫细胞组合及其应用 |
US20230227583A1 (en) | 2019-08-30 | 2023-07-20 | Yale University | Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells |
JP2022548881A (ja) | 2019-09-18 | 2022-11-22 | ノバルティス アーゲー | Entpd2抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法 |
EP4048780A4 (en) * | 2019-10-23 | 2024-03-13 | Council Queensland Inst Medical Res | ADOPTIVE IMMUNOTHERAPY |
KR20220098184A (ko) * | 2019-11-06 | 2022-07-11 | 카이트 파마 인코포레이티드 | 키메라 항원 수용체 t세포 요법 |
TW202134285A (zh) | 2019-11-26 | 2021-09-16 | 瑞士商諾華公司 | Cd19和cd22嵌合抗原受體及其用途 |
JP2023503163A (ja) | 2019-11-26 | 2023-01-26 | ノバルティス アーゲー | キメラ抗原受容体及びその使用 |
WO2021135178A1 (zh) * | 2019-12-30 | 2021-07-08 | 华夏英泰(北京)生物技术有限公司 | 一种增强型t细胞受体star及其应用 |
CA3165346A1 (en) | 2020-01-23 | 2021-07-29 | George Q. Daley | Stroma-free t cell differentiation from human pluripotent stem cells |
KR20220147109A (ko) | 2020-02-27 | 2022-11-02 | 노파르티스 아게 | 키메라 항원 수용체 발현 세포의 제조 방법 |
WO2021173985A2 (en) | 2020-02-27 | 2021-09-02 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
CN115484978A (zh) | 2020-03-05 | 2022-12-16 | 尼奥克斯医疗有限公司 | 使用免疫细胞治疗癌症的方法和组合物 |
KR20230012571A (ko) * | 2020-05-18 | 2023-01-26 | 크라제 메디컬 씨오 리미티드 | 면역 이펙터 세포를 이용한 종양 치료 |
WO2021250552A1 (en) | 2020-06-08 | 2021-12-16 | Janssen Biotech, Inc. | Cell-based assay for determining the in vitro tumor killing activity of chimeric antigen expressing immune cells |
CN115701999A (zh) * | 2020-07-09 | 2023-02-14 | 南京传奇生物科技有限公司 | 用白介素-36工程化γδT细胞用于免疫疗法 |
US20220031751A1 (en) | 2020-08-03 | 2022-02-03 | Kyverna Therapeutics, Inc. | Methods of producing t regulatory cells, methods of transducing t cells, and uses of the same |
KR20230058427A (ko) | 2020-08-21 | 2023-05-03 | 노파르티스 아게 | Car 발현 세포의 생체내 생성을 위한 조성물 및 방법 |
CN111944850B (zh) * | 2020-08-28 | 2023-03-31 | 澳门大学 | 表达抗cd22嵌合抗原受体和pd-l1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用 |
WO2022047424A1 (en) | 2020-08-31 | 2022-03-03 | Yale University | Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells |
CN113368262A (zh) * | 2020-09-03 | 2021-09-10 | 上海易慕峰生物科技有限公司 | 通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法 |
CN116390933A (zh) | 2020-11-06 | 2023-07-04 | 诺华股份有限公司 | 治疗b细胞恶性肿瘤的抗cd19剂和b细胞靶向剂组合疗法 |
EP4263600A1 (en) | 2020-12-18 | 2023-10-25 | Century Therapeutics, Inc. | Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity |
WO2022165419A1 (en) | 2021-02-01 | 2022-08-04 | Kyverna Therapeutics, Inc. | Methods for increasing t-cell function |
EP4330381A1 (en) | 2021-04-27 | 2024-03-06 | Novartis AG | Viral vector production system |
CN117693519A (zh) | 2021-05-25 | 2024-03-12 | 瓦克斯细胞生物 | 基于单体拟抗体的嵌合抗原受体和包含其的免疫细胞 |
AR126838A1 (es) | 2021-08-20 | 2023-11-22 | Novartis Ag | Métodos para preparar células que expresan receptores de antígeno quiméricos |
WO2023081715A1 (en) | 2021-11-03 | 2023-05-11 | Viracta Therapeutics, Inc. | Combination of car t-cell therapy with btk inhibitors and methods of use thereof |
AR128124A1 (es) | 2021-12-30 | 2024-03-27 | Tr1X Inc | Células t cd4⁺ que expresan il-10 y receptores de antígenos quiméricos y usos de estos |
WO2023225569A1 (en) | 2022-05-17 | 2023-11-23 | Umoja Biopharma, Inc. | Manufacturing viral particles |
WO2024026029A2 (en) * | 2022-07-27 | 2024-02-01 | Trustees Of Tufts College | Lipid nanoparticles for immunotherapy |
WO2024081736A2 (en) | 2022-10-11 | 2024-04-18 | Yale University | Compositions and methods of using cell-penetrating antibodies |
WO2024089639A1 (en) | 2022-10-26 | 2024-05-02 | Novartis Ag | Lentiviral formulations |
WO2024098028A2 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Umoja Biopharma, Inc. | Lentiviral particles displaying fusion molecules and uses thereof |
WO2024097992A2 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Umoja Biopharma, Inc. | Particles displaying adhesion-molecule fusions |
CN116410336B (zh) * | 2023-06-02 | 2023-09-22 | 云南赛元生物技术有限公司 | 一种嵌合抗原受体的编码核苷酸、car-nk细胞及其构建方法和应用 |
Family Cites Families (267)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US44768A (en) | 1864-10-18 | Improvement in coftn-shellers | ||
FR901228A (fr) | 1943-01-16 | 1945-07-20 | Deutsche Edelstahlwerke Ag | Système d'aimant à entrefer annulaire |
ZA737247B (en) | 1972-09-29 | 1975-04-30 | Ayerst Mckenna & Harrison | Rapamycin and process of preparation |
EP0090505B1 (en) | 1982-03-03 | 1990-08-08 | Genentech, Inc. | Human antithrombin iii, dna sequences therefor, expression vehicles and cloning vectors containing such sequences and cell cultures transformed thereby, a process for expressing human antithrombin iii, and pharmaceutical compositions comprising it |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4882282A (en) | 1985-08-16 | 1989-11-21 | Immunex Corporation | DNA sequences encoding bovine interleukin-2 |
US6548640B1 (en) | 1986-03-27 | 2003-04-15 | Btg International Limited | Altered antibodies |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US5906936A (en) | 1988-05-04 | 1999-05-25 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Endowing lymphocytes with antibody specificity |
US6303121B1 (en) | 1992-07-30 | 2001-10-16 | Advanced Research And Technology | Method of using human receptor protein 4-1BB |
US6905680B2 (en) | 1988-11-23 | 2005-06-14 | Genetics Institute, Inc. | Methods of treating HIV infected subjects |
US6534055B1 (en) | 1988-11-23 | 2003-03-18 | Genetics Institute, Inc. | Methods for selectively stimulating proliferation of T cells |
US5858358A (en) | 1992-04-07 | 1999-01-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for selectively stimulating proliferation of T cells |
US6352694B1 (en) | 1994-06-03 | 2002-03-05 | Genetics Institute, Inc. | Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US5399346A (en) | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
US5585362A (en) | 1989-08-22 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Adenovirus vectors for gene therapy |
GB8928874D0 (en) | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
US6319494B1 (en) | 1990-12-14 | 2001-11-20 | Cell Genesys, Inc. | Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways |
CA2074825C (en) | 1990-12-14 | 2005-04-12 | Daniel J. Capon | Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways |
IE920716A1 (en) | 1991-03-07 | 1992-09-09 | Gen Hospital Corp | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras |
US6004811A (en) | 1991-03-07 | 1999-12-21 | The Massachussetts General Hospital | Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras |
US7049136B2 (en) | 1991-03-07 | 2006-05-23 | The General Hospital Corporation | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras |
EP0519596B1 (en) | 1991-05-17 | 2005-02-23 | Merck & Co. Inc. | A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains |
US5199942A (en) | 1991-06-07 | 1993-04-06 | Immunex Corporation | Method for improving autologous transplantation |
WO1992022653A1 (en) | 1991-06-14 | 1992-12-23 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
US5565332A (en) | 1991-09-23 | 1996-10-15 | Medical Research Council | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
GB9125768D0 (en) | 1991-12-04 | 1992-02-05 | Hale Geoffrey | Therapeutic method |
ATE249840T1 (de) | 1991-12-13 | 2003-10-15 | Xoma Corp | Verfahren und materialien zur herstellung von modifizierten variablen antikörperdomänen und ihre therapeutische verwendung |
GB9203459D0 (en) | 1992-02-19 | 1992-04-08 | Scotgen Ltd | Antibodies with germ-line variable regions |
IL104570A0 (en) | 1992-03-18 | 1993-05-13 | Yeda Res & Dev | Chimeric genes and cells transformed therewith |
US8211422B2 (en) | 1992-03-18 | 2012-07-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Chimeric receptor genes and cells transformed therewith |
US5350674A (en) | 1992-09-04 | 1994-09-27 | Becton, Dickinson And Company | Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof |
US5639641A (en) | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
GB9221220D0 (en) | 1992-10-09 | 1992-11-25 | Sandoz Ag | Organic componds |
US7211259B1 (en) | 1993-05-07 | 2007-05-01 | Immunex Corporation | 4-1BB polypeptides and DNA encoding 4-1BB polypeptides |
CA2172165C (en) | 1993-09-16 | 2003-12-02 | Byoung S. Kwon | Human receptor h4-1bb |
CA2175215C (en) | 1993-11-19 | 2008-06-03 | Yat Sun Or | Semisynthetic analogs of rapamycin (macrolides) being immunomodulators |
AU687491B2 (en) | 1993-12-17 | 1998-02-26 | Novartis Ag | Rapamycin derivatives useful as immunosuppressants |
US5362718A (en) | 1994-04-18 | 1994-11-08 | American Home Products Corporation | Rapamycin hydroxyesters |
PT758394E (pt) | 1994-05-02 | 2003-04-30 | Bernd Groner | Proteina bifuncional sua preparacao e utilizacao |
US7175843B2 (en) | 1994-06-03 | 2007-02-13 | Genetics Institute, Llc | Methods for selectively stimulating proliferation of T cells |
US5786464C1 (en) | 1994-09-19 | 2012-04-24 | Gen Hospital Corp | Overexpression of mammalian and viral proteins |
US5712149A (en) | 1995-02-03 | 1998-01-27 | Cell Genesys, Inc. | Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals |
US6103521A (en) | 1995-02-06 | 2000-08-15 | Cell Genesys, Inc. | Multispecific chimeric receptors |
NZ302513A (en) | 1995-02-24 | 1999-11-29 | Gen Hospital Corp | Chimeric receptors for redirecting cellular immunity |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
US6692964B1 (en) | 1995-05-04 | 2004-02-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for transfecting T cells |
US7067318B2 (en) | 1995-06-07 | 2006-06-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for transfecting T cells |
NZ311647A (en) | 1995-06-09 | 1999-11-29 | Novartis Ag | Rapamycin derivatives |
BE1009856A5 (fr) | 1995-07-14 | 1997-10-07 | Sandoz Sa | Composition pharmaceutique sous la forme d'une dispersion solide comprenant un macrolide et un vehicule. |
GB9526131D0 (en) | 1995-12-21 | 1996-02-21 | Celltech Therapeutics Ltd | Recombinant chimeric receptors |
EP0888303B1 (en) | 1996-02-28 | 2010-04-21 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc | Synthetic derivatives of rapamycin as multimerizing agents for chimeric proteins with immunophilin-derived domains |
US5874240A (en) | 1996-03-15 | 1999-02-23 | Human Genome Sciences, Inc. | Human 4-1BB receptor splicing variant |
WO1998002441A2 (en) | 1996-07-12 | 1998-01-22 | Ariad Pharmaceuticals, Inc. | Non immunosuppressive antifungal rapalogs |
DK0920505T3 (da) | 1996-08-16 | 2008-09-08 | Schering Corp | Pattedyrcelleoverfladeantigener og tilhörende reagenser |
US6111090A (en) | 1996-08-16 | 2000-08-29 | Schering Corporation | Mammalian cell surface antigens; related reagents |
US6114148C1 (en) | 1996-09-20 | 2012-05-01 | Gen Hospital Corp | High level expression of proteins |
AU744160B2 (en) | 1996-10-25 | 2002-02-14 | Cell Genesys, Inc. | Targeted cytolysis of cancer cells |
WO1998056915A2 (en) | 1997-06-12 | 1998-12-17 | Research Corporation Technologies, Inc. | Artificial antibody polypeptides |
US20030060444A1 (en) | 1997-06-25 | 2003-03-27 | Celltech Therapeutics, Ltd. | Cell activation process and reagents therefor |
GB9713473D0 (en) | 1997-06-25 | 1997-09-03 | Celltech Therapeutics Ltd | Biological products |
EP1017716A4 (en) * | 1997-09-19 | 2001-01-03 | Gen Hospital Corp | CAR RECEPTORS, MOLECULES AND RELATED METHODS |
US6015815A (en) | 1997-09-26 | 2000-01-18 | Abbott Laboratories | Tetrazole-containing rapamycin analogs with shortened half-lives |
TW557297B (en) | 1997-09-26 | 2003-10-11 | Abbott Lab | Rapamycin analogs having immunomodulatory activity, and pharmaceutical compositions containing same |
JP2001520039A (ja) | 1997-10-21 | 2001-10-30 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | ヒト腫瘍壊死因子レセプター様タンパク質、tr11,tr11sv1およびtr11sv2 |
DE69818106T2 (de) | 1997-10-28 | 2004-06-17 | The University Of British Columbia, Vancouver | Immunologische zusammensetzungen und verfahren zur transienten änderung des zentralnervensystem-myelins der saügetiere und förderung der nerven-regenerierung |
JP2002502607A (ja) | 1998-02-09 | 2002-01-29 | ジェネンテク・インコーポレイテッド | 新規な腫瘍壊死因子レセプター相同体及びそれをコードする核酸 |
US20040040047A1 (en) | 1998-03-30 | 2004-02-26 | Spencer David M. | Regulated apoptosis using chemically induced dimerization of apoptosis factors |
CA2328725A1 (en) | 1998-04-15 | 1999-10-21 | Brigham & Women's Hospital, Inc. | T cell inhibitory receptor compositions and uses thereof |
GB9809658D0 (en) | 1998-05-06 | 1998-07-01 | Celltech Therapeutics Ltd | Biological products |
EP1109921A4 (en) | 1998-09-04 | 2002-08-28 | Sloan Kettering Inst Cancer | FOR PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANE-ANTI-SPECIFIC FUSION RECEPTORS AND THEIR USE |
US6410319B1 (en) | 1998-10-20 | 2002-06-25 | City Of Hope | CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies |
US7052906B1 (en) | 1999-04-16 | 2006-05-30 | Celltech R & D Limited | Synthetic transmembrane components |
AU6085700A (en) | 1999-07-12 | 2001-01-30 | Genentech Inc. | Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization by tumor necrosis factor ligand/receptor homologs |
CA2386270A1 (en) | 1999-10-15 | 2001-04-26 | University Of Massachusetts | Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference |
GB9925848D0 (en) | 1999-11-01 | 1999-12-29 | Celltech Therapeutics Ltd | Biological products |
US6326193B1 (en) | 1999-11-05 | 2001-12-04 | Cambria Biosciences, Llc | Insect control agent |
WO2001034843A1 (en) | 1999-11-10 | 2001-05-17 | The Uab Research Foundation | Lentiviral vector transduction of hematopoietic stem cells |
US7572631B2 (en) | 2000-02-24 | 2009-08-11 | Invitrogen Corporation | Activation and expansion of T cells |
US6867041B2 (en) | 2000-02-24 | 2005-03-15 | Xcyte Therapies, Inc. | Simultaneous stimulation and concentration of cells |
CA2406864A1 (en) | 2000-02-24 | 2001-08-30 | Xcyte Therapies, Inc. | Simultaneous stimulation and concentration of cells |
US6797514B2 (en) | 2000-02-24 | 2004-09-28 | Xcyte Therapies, Inc. | Simultaneous stimulation and concentration of cells |
IL136511A0 (en) | 2000-06-01 | 2001-06-14 | Gavish Galilee Bio Appl Ltd | Genetically engineered mhc molecules |
AU2001275474A1 (en) | 2000-06-12 | 2001-12-24 | Akkadix Corporation | Materials and methods for the control of nematodes |
GB0025307D0 (en) | 2000-10-16 | 2000-11-29 | Celltech Chiroscience Ltd | Biological products |
US7446179B2 (en) | 2000-11-07 | 2008-11-04 | City Of Hope | CD19-specific chimeric T cell receptor |
CN1294148C (zh) | 2001-04-11 | 2007-01-10 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 环状单链三特异抗体 |
US7070995B2 (en) | 2001-04-11 | 2006-07-04 | City Of Hope | CE7-specific redirected immune cells |
AU2002256390B2 (en) | 2001-04-30 | 2007-08-30 | City Of Hope | Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers |
US7514537B2 (en) | 2001-04-30 | 2009-04-07 | City Of Hope | Chimeric immunoreceptor useful in treating human gliomas |
US20090257994A1 (en) | 2001-04-30 | 2009-10-15 | City Of Hope | Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers |
US20030148982A1 (en) | 2001-11-13 | 2003-08-07 | Brenner Malcolm K. | Bi-spcific chimeric T cells |
US7638326B2 (en) | 2002-01-03 | 2009-12-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform |
US7745140B2 (en) | 2002-01-03 | 2010-06-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool |
US7670781B2 (en) | 2002-01-03 | 2010-03-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Activation and expansion of T-cells using an agent that provides a primary activation signal and another agent that provides a co-stimulatory signal |
PL216224B1 (pl) | 2002-02-01 | 2014-03-31 | Ariad Pharmaceuticals | Pochodne rapamycyny zawierające fosfor, kompozycja je zawierająca oraz ich zastosowanie |
GB0208104D0 (en) | 2002-04-09 | 2002-05-22 | Univ Dundee | Method |
US7446190B2 (en) | 2002-05-28 | 2008-11-04 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors |
AU2003244817B2 (en) * | 2002-06-28 | 2010-08-26 | Domantis Limited | Antigen-binding immunoglobulin single variable domains and dual-specific constructs |
US20040047858A1 (en) | 2002-09-11 | 2004-03-11 | Blumberg Richard S. | Therapeutic anti-BGP(C-CAM1) antibodies and uses thereof |
ATE514713T1 (de) | 2002-12-23 | 2011-07-15 | Wyeth Llc | Antikörper gegen pd-1 und ihre verwendung |
US20050129671A1 (en) | 2003-03-11 | 2005-06-16 | City Of Hope | Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells |
US7402431B2 (en) | 2004-03-01 | 2008-07-22 | Immunovative Therapies, Ltd. | T-cell therapy formulation |
EP1631588A2 (en) | 2003-05-23 | 2006-03-08 | Wyeth | Gitr ligand and gitr ligand-related molecules and antibodies and uses thereof |
AU2004255216B2 (en) | 2003-07-01 | 2010-08-19 | Immunomedics, Inc. | Multivalent carriers of bi-specific antibodies |
US20050048054A1 (en) | 2003-07-11 | 2005-03-03 | Shino Hanabuchi | Lymphocytes; methods |
AU2004286198C1 (en) | 2003-08-18 | 2011-02-24 | Medimmune, Llc | Humanization of antibodies |
WO2005019429A2 (en) | 2003-08-22 | 2005-03-03 | Potentia Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity |
CA2537055A1 (en) | 2003-08-22 | 2005-04-21 | Medimmune, Inc. | Humanization of antibodies |
US20050113564A1 (en) | 2003-11-05 | 2005-05-26 | St. Jude Children's Research Hospital | Chimeric receptors with 4-1BB stimulatory signaling domain |
US7435596B2 (en) | 2004-11-04 | 2008-10-14 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Modified cell line and method for expansion of NK cell |
US7220755B2 (en) | 2003-11-12 | 2007-05-22 | Biosensors International Group, Ltd. | 42-O-alkoxyalkyl rapamycin derivatives and compositions comprising same |
WO2005055808A2 (en) | 2003-12-02 | 2005-06-23 | Genzyme Corporation | Compositions and methods to diagnose and treat lung cancer |
GB0409799D0 (en) | 2004-04-30 | 2004-06-09 | Isis Innovation | Method of generating improved immune response |
EP2295588B1 (en) | 2004-05-27 | 2018-03-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Novel artificial antigen presenting cells and uses thefor |
EP1765402A2 (en) | 2004-06-04 | 2007-03-28 | Duke University | Methods and compositions for enhancement of immunity by in vivo depletion of immunosuppressive cell activity |
EP1786918A4 (en) | 2004-07-17 | 2009-02-11 | Imclone Systems Inc | NEW BISPECIFIC ANTIBODY TETRAVALENT |
US7994298B2 (en) | 2004-09-24 | 2011-08-09 | Trustees Of Dartmouth College | Chimeric NK receptor and methods for treating cancer |
WO2006060878A1 (en) | 2004-12-10 | 2006-06-15 | Peter Maccallum Cancer Institute | Methods and compositions for adoptive immunotherapy |
WO2006105021A2 (en) | 2005-03-25 | 2006-10-05 | Tolerrx, Inc. | Gitr binding molecules and uses therefor |
DK2439273T3 (da) | 2005-05-09 | 2019-06-03 | Ono Pharmaceutical Co | Humane monoklonale antistoffer til programmeret død-1(pd-1) og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af anti-pd-1- antistoffer alene eller i kombination med andre immunterapeutika |
MX2007014474A (es) | 2005-05-17 | 2008-02-07 | Univ Connecticut | Composiciones y metodos para inmunomodulacion en un organismo. |
GB0510390D0 (en) | 2005-05-20 | 2005-06-29 | Novartis Ag | Organic compounds |
CA3201163A1 (en) | 2005-07-01 | 2007-01-11 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1) |
US20070036773A1 (en) | 2005-08-09 | 2007-02-15 | City Of Hope | Generation and application of universal T cells for B-ALL |
CN101370525B (zh) | 2005-08-19 | 2013-09-18 | Abbvie公司 | 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 |
EA019255B1 (ru) | 2005-10-07 | 2014-02-28 | Экселиксис, Инк. | Ингибиторы фосфатидилинозит-3-киназы и содержащие их фармацевтические композиции |
CN102796743B (zh) | 2006-01-13 | 2015-11-18 | 美国政府健康及人类服务部国立卫生研究院 | 用于在哺乳动物细胞中表达的密码子优化的IL-15和IL-15Rα基因 |
WO2007133822A1 (en) | 2006-01-19 | 2007-11-22 | Genzyme Corporation | Gitr antibodies for the treatment of cancer |
US20100105136A1 (en) | 2006-10-09 | 2010-04-29 | The General Hospital Corporation | Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors |
EP1916259A1 (en) | 2006-10-26 | 2008-04-30 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Anti-glycoprotein VI SCFV fragment for treatment of thrombosis |
US20080131415A1 (en) | 2006-11-30 | 2008-06-05 | Riddell Stanley R | Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells |
CA2584494A1 (en) | 2007-03-27 | 2008-09-27 | Jeffrey A. Medin | Vector encoding therapeutic polypeptide and safety elements to clear transduced cells |
ES2663323T3 (es) | 2007-03-30 | 2018-04-12 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Expresión constitutiva de ligandos coestimuladores en linfocitos T transferidos de manera adoptiva |
ES2616355T3 (es) | 2007-06-18 | 2017-06-12 | Merck Sharp & Dohme B.V. | Anticuerpos para el receptor humano de muerte programada PD-1 |
NZ616254A (en) | 2007-06-27 | 2015-04-24 | Us Sec Dep Of Health And Human Services | Complexes of il-15 and il-15ralpha and uses thereof |
AU2008275589B2 (en) | 2007-07-12 | 2013-11-21 | Gitr, Inc. | Combination therapies employing GITR binding molecules |
WO2009052623A1 (en) | 2007-10-26 | 2009-04-30 | Governing Council Of The University Of Toronto | Therapeutic and diagnostic methods using tim-3 |
WO2009091826A2 (en) | 2008-01-14 | 2009-07-23 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car) |
WO2009097140A1 (en) | 2008-01-30 | 2009-08-06 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Methods for off -the -shelf tumor immunotherapy using allogeneic t-cell precursors |
MX2010008786A (es) | 2008-02-11 | 2010-12-01 | Curetech Ltd | Anticuerpos monoclonales para tratamiento de tumores. |
EP2262504A1 (en) | 2008-02-21 | 2010-12-22 | AstraZeneca AB | Combination therapy 238 |
US8379824B2 (en) | 2008-03-06 | 2013-02-19 | At&T Intellectual Property I, Lp | Methods and apparatus to provide a network-based caller identification service in a voice over internet protocol network |
WO2009114335A2 (en) | 2008-03-12 | 2009-09-17 | Merck & Co., Inc. | Pd-1 binding proteins |
US20110177070A1 (en) | 2008-07-02 | 2011-07-21 | Emergent Product Development Seatlle, LLC | TGF-Beta Antagonist Multi-Target Binding Proteins |
AR072999A1 (es) | 2008-08-11 | 2010-10-06 | Medarex Inc | Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos |
PL2350129T3 (pl) | 2008-08-25 | 2015-12-31 | Amplimmune Inc | Kompozycje antagonistów PD-1 i sposoby stosowania |
EA201170375A1 (ru) | 2008-08-25 | 2012-03-30 | Эмплиммьюн, Инк. | Антагонисты pd-1 и способы их применения |
CA2735456C (en) | 2008-08-26 | 2021-11-16 | City Of Hope | Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells |
CN102149820B (zh) | 2008-09-12 | 2014-07-23 | 国立大学法人三重大学 | 能够表达外源gitr配体的细胞 |
US8476431B2 (en) | 2008-11-03 | 2013-07-02 | Itellikine LLC | Benzoxazole kinase inhibitors and methods of use |
HRP20240240T1 (hr) | 2008-12-09 | 2024-04-26 | F. Hoffmann - La Roche Ag | Protutijela anti-pd-l1 i njihova uporaba za poboljšanje funkcije t-stanice |
EP2389443B1 (en) | 2009-01-23 | 2018-11-14 | Roger Williams Hospital | Retroviral vectors encoding multiple highly homologous non-viral polypeptides and the use of same |
EP2391652A4 (en) | 2009-01-29 | 2013-01-02 | Abbott Lab | IL-1 BINDING PROTEINS |
JP5844159B2 (ja) | 2009-02-09 | 2016-01-13 | ユニヴェルシテ デクス−マルセイユUniversite D’Aix−Marseille | Pd−1抗体およびpd−l1抗体ならびにその使用 |
KR20110122859A (ko) | 2009-02-23 | 2011-11-11 | 그렌마크 파머수티칼스 에스. 아. | Cd19에 결합하는 인간화된 항체 및 그것의 용도 |
EP2414362B1 (en) | 2009-04-03 | 2014-06-11 | Verastem, Inc. | Pyrimidine substituted purine compounds as kinase (s) inhibitors |
RU2016134843A (ru) | 2009-04-30 | 2018-12-11 | Тел Хашомер Медикал Рисерч Инфрастракче Энд Сервисиз Лтд. | Антитела к ceacam1 и способы их использования |
NZ714757A (en) | 2009-08-14 | 2018-07-27 | Us Gov Health & Human Services | Use of il-15 to increase thymic output and to treat lymphopenia |
AU2010289677B2 (en) | 2009-09-03 | 2014-07-31 | Merck Sharp & Dohme Llc | Anti-GITR antibodies |
US8465743B2 (en) | 2009-10-01 | 2013-06-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer |
WO2011059836A2 (en) | 2009-10-29 | 2011-05-19 | Trustees Of Dartmouth College | T cell receptor-deficient t cell compositions |
GB0919054D0 (en) | 2009-10-30 | 2009-12-16 | Isis Innovation | Treatment of obesity |
EP4049674A1 (en) * | 2009-11-03 | 2022-08-31 | City of Hope | Truncated epidermal growth factor receptor (egfrt) for transduced t cell selection |
US8956828B2 (en) | 2009-11-10 | 2015-02-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases |
JP2013512251A (ja) | 2009-11-24 | 2013-04-11 | アンプリミューン、インコーポレーテッド | Pd−l1/pd−l2の同時阻害 |
CN102958942A (zh) | 2009-12-29 | 2013-03-06 | 新兴产品开发西雅图有限公司 | 异二聚体结合蛋白及其应用 |
US9133436B2 (en) | 2010-02-04 | 2015-09-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | ICOS critically regulates the expansion and function of inflammatory human Th17 cells |
US9089520B2 (en) | 2010-05-21 | 2015-07-28 | Baylor College Of Medicine | Methods for inducing selective apoptosis |
US9163087B2 (en) | 2010-06-18 | 2015-10-20 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Bi-specific antibodies against TIM-3 and PD-1 for immunotherapy in chronic immune conditions |
US9315585B2 (en) * | 2010-06-19 | 2016-04-19 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Anti-GD2 antibodies |
AR084469A1 (es) | 2010-07-09 | 2013-05-22 | Exelixis Inc | Combinaciones de inhibidores de quinasas para el tratamiento del cancer |
AR084706A1 (es) | 2010-07-16 | 2013-06-05 | Piramal Life Sciences Ltd | Derivados sustituidos de imidazoquinolinas como inhibidores de quinasa y proceso para su preparacion |
EP2596011B1 (en) | 2010-07-21 | 2018-10-03 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for modification of a hla locus |
WO2012050374A2 (en) * | 2010-10-13 | 2012-04-19 | Innocell, Inc. | Immunotherapy for solid tumors |
NZ723974A (en) | 2010-10-27 | 2017-03-31 | Baylor College Medicine | Chimeric cd27 receptors for redirecting t cells to cd70-positive malignancies |
MX347078B (es) | 2010-12-09 | 2017-04-10 | Univ Pennsylvania | Uso de celulas t modificadas por receptor de antigeno quimerico para tratar cancer. |
JP5897035B2 (ja) | 2010-12-14 | 2016-03-30 | ユニバーシティ オブ メリーランド,ボルチモア | 汎用の抗タグキメラ抗原受容体発現t細胞及びがんを治療する方法 |
US9402865B2 (en) | 2011-01-18 | 2016-08-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for treating cancer |
WO2012129514A1 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Method and compositions for cellular immunotherapy |
WO2012127464A2 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Gavish-Galilee Bio Applications Ltd | Constitutively activated t cells for use in adoptive cell therapy |
SG193956A1 (en) | 2011-04-01 | 2013-11-29 | Sloan Kettering Inst Cancer | T cell receptor-like antibodies specific for a wt1 peptide presented by hla-a2 |
IL285335B2 (en) | 2011-04-08 | 2023-12-01 | Us Health | Chimeric antigen receptors against epidermal growth factor receptor variant III and their use in cancer treatment |
NZ616405A (en) | 2011-04-08 | 2015-11-27 | Baylor College Medicine | Reversing the effects of the tumor microenvironment using chimeric cytokine receptors |
US20130071414A1 (en) | 2011-04-27 | 2013-03-21 | Gianpietro Dotti | Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies |
WO2013006490A2 (en) | 2011-07-01 | 2013-01-10 | Cellerant Therapeutics, Inc. | Antibodies that specifically bind to tim3 |
WO2013016352A1 (en) | 2011-07-25 | 2013-01-31 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of dux4 |
PE20141520A1 (es) | 2011-07-29 | 2014-11-17 | Univ Pennsylvania | Receptores coestimuladores de cambio |
EA027970B1 (ru) | 2011-08-11 | 2017-09-29 | ИНТЕЛЛАЙКИН, ЭлЭлСи | Полиморфы ингибитора киназы |
WO2013033626A2 (en) | 2011-08-31 | 2013-03-07 | Trustees Of Dartmouth College | Nkp30 receptor targeted therapeutics |
WO2013039954A1 (en) | 2011-09-14 | 2013-03-21 | Sanofi | Anti-gitr antibodies |
KR20140060541A (ko) | 2011-09-16 | 2014-05-20 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 암을 치료하기 위한 rna 조작된 t 세포 |
EP3692794A1 (en) | 2011-09-16 | 2020-08-12 | Baylor College of Medicine | Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells |
WO2013054320A1 (en) | 2011-10-11 | 2013-04-18 | Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. | Antibodies to carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule (ceacam) |
SG10201702913XA (en) * | 2011-10-19 | 2017-06-29 | Pharmacyclics Llc | Use of inhibitors of bruton's tyrosine kinase (btk) |
WO2013059593A1 (en) | 2011-10-20 | 2013-04-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-cd22 chimeric antigen receptors |
US20130131139A1 (en) * | 2011-11-17 | 2013-05-23 | Oregon Health & Science University | Ror1 as a gene target in acute lymphoblastic leukemia |
CA2892371C (en) | 2011-12-01 | 2021-01-19 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Anti-ceacam1 recombinant antibodies for cancer therapy |
KR20140127816A (ko) | 2012-02-22 | 2014-11-04 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 암의 치료에 유용한 t 세포의 지속성 집단을 생성시키기 위한 조성물 및 방법 |
AU2013222284A1 (en) | 2012-02-22 | 2014-08-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Use of the CD2 signaling domain in second-generation chimeric antigen receptors |
SG11201404769UA (en) | 2012-02-22 | 2014-11-27 | Univ Pennsylvania | Use of icos-based cars to enhance antitumor activity and car persistence |
ES2728782T3 (es) | 2012-05-25 | 2019-10-28 | Univ California | Métodos y composiciones para la modificación de ADN objetivo dirigida por ARN y para la modulación de la transcripción dirigida por ARN |
BR112015000657B1 (pt) | 2012-07-13 | 2023-12-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Uso de uma célula geneticamente modificada para expressar um car |
SI4019041T1 (sl) | 2012-07-13 | 2023-04-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Obladovanje toksičnosti za protitumorsko delovanje CARS |
WO2014011996A1 (en) | 2012-07-13 | 2014-01-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of assessing the suitability of transduced t cells for administration |
CN104507537A (zh) | 2012-07-13 | 2015-04-08 | 宾夕法尼亚大学董事会 | 用于调节car t细胞的组合物和方法 |
EP2872617A4 (en) | 2012-07-13 | 2015-12-09 | Univ Pennsylvania | EXTENSION OF EPITOPES IN RELATION TO T CAR LYMPHOCYTES |
EP3730512A1 (en) | 2012-07-13 | 2020-10-28 | The Trustees of the University of Pennsylvania | Enhancing activity of car t cells by co-introducing a bispecific antibody |
WO2014022332A1 (en) | 2012-07-31 | 2014-02-06 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Modulation of the immune response |
SG10201701339RA (en) | 2012-08-20 | 2017-03-30 | Seattle Children S Hospital Dba Seattle Children S Res Inst | Method and compositions for cellular immunotherapy |
WO2014039513A2 (en) | 2012-09-04 | 2014-03-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive t cell transfer |
AR092745A1 (es) | 2012-10-01 | 2015-04-29 | Univ Pennsylvania | Composiciones que comprenden un dominio de union anti-fap y metodos para hacer blanco en celulas estromales para el tratamiento del cancer |
WO2014055657A1 (en) | 2012-10-05 | 2014-04-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors |
CA2887528C (en) | 2012-10-12 | 2023-08-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Enhancement of the immune response |
AU2013359212B2 (en) | 2012-12-12 | 2017-01-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
EP4286404A3 (en) | 2012-12-12 | 2024-02-14 | The Broad Institute Inc. | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
US20160008399A1 (en) | 2013-01-14 | 2016-01-14 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods for delivery of immune cells to treat un-resectable or non-resected tumor cells and tumor relapse |
CN110423282B (zh) | 2013-02-15 | 2023-09-08 | 加利福尼亚大学董事会 | 嵌合抗原受体及其使用方法 |
EP2958942B1 (en) | 2013-02-20 | 2020-06-03 | Novartis AG | Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells |
CN105358576B (zh) | 2013-02-20 | 2020-05-05 | 诺华股份有限公司 | 使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受体治疗癌症 |
US9434935B2 (en) | 2013-03-10 | 2016-09-06 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Modified caspase polypeptides and uses thereof |
CN105209065B (zh) | 2013-03-14 | 2020-07-31 | 贝里坤制药股份有限公司 | 控制t细胞增殖的方法 |
US9657105B2 (en) * | 2013-03-15 | 2017-05-23 | City Of Hope | CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use |
US9745368B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-08-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy |
UY35468A (es) * | 2013-03-16 | 2014-10-31 | Novartis Ag | Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19 |
DK3004329T3 (da) | 2013-06-05 | 2020-05-18 | Bellicum Pharmaceuticals Inc | Fremgangsmåder til induktion af delvis apoptose under anvendelse af caspasepolypeptider |
JP6637415B2 (ja) * | 2013-10-15 | 2020-01-29 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | キメラ抗原受容体t細胞スイッチおよびその使用 |
US9512084B2 (en) | 2013-11-29 | 2016-12-06 | Novartis Ag | Amino pyrimidine derivatives |
SG10201800250XA (en) * | 2013-12-17 | 2018-02-27 | Genentech Inc | Anti-cd3 antibodies and methods of use |
CA2931684C (en) | 2013-12-19 | 2024-02-20 | Novartis Ag | Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof |
US10287354B2 (en) | 2013-12-20 | 2019-05-14 | Novartis Ag | Regulatable chimeric antigen receptor |
US11028143B2 (en) | 2014-01-21 | 2021-06-08 | Novartis Ag | Enhanced antigen presenting ability of RNA CAR T cells by co-introduction of costimulatory molecules |
US20170335281A1 (en) | 2014-03-15 | 2017-11-23 | Novartis Ag | Treatment of cancer using chimeric antigen receptor |
WO2015142661A1 (en) | 2014-03-15 | 2015-09-24 | Novartis Ag | Regulatable chimeric antigen receptor |
MX2016012021A (es) * | 2014-03-19 | 2017-04-13 | Infinity Pharmaceuticals Inc | Compuestos heterociclicos para utilizarlos en el tratamiento de trastornos mediados por pi3k-gamma. |
KR102487608B1 (ko) | 2014-04-07 | 2023-01-12 | 노파르티스 아게 | 항-cd19 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 |
US11542488B2 (en) | 2014-07-21 | 2023-01-03 | Novartis Ag | Sortase synthesized chimeric antigen receptors |
WO2016014530A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Novartis Ag | Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars |
KR102612313B1 (ko) | 2014-07-21 | 2023-12-12 | 노파르티스 아게 | 인간화 항-bcma 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 |
CN112481283A (zh) | 2014-07-21 | 2021-03-12 | 诺华股份有限公司 | 使用cd33嵌合抗原受体治疗癌症 |
WO2016014501A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Novartis Ag | Sortase molecules and uses thereof |
BR112017000939A2 (pt) | 2014-07-21 | 2017-11-14 | Novartis Ag | tratamento de câncer usando um receptor antigênico quimérico de cll-1 |
US20170274014A1 (en) | 2014-07-21 | 2017-09-28 | Jennifer Brogdon | Combinations of low, immune enhancing, doses of mtor inhibitors and cars |
ES2781175T3 (es) | 2014-07-31 | 2020-08-31 | Novartis Ag | Subconjunto optimizado de células T que contienen un receptor de antígeno quimérico |
US10851149B2 (en) | 2014-08-14 | 2020-12-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Treatment of cancer using GFR α-4 chimeric antigen receptor |
JP7084138B2 (ja) | 2014-08-19 | 2022-06-14 | ノバルティス アーゲー | 癌処置に使用するための抗cd123キメラ抗原受容体(car) |
CN114621969A (zh) | 2014-09-17 | 2022-06-14 | 诺华股份有限公司 | 用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞 |
AU2015330898B2 (en) | 2014-10-08 | 2022-03-10 | Novartis Ag | Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof |
WO2016061368A1 (en) | 2014-10-15 | 2016-04-21 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for treating b-lymphoid malignancies |
EP3240803B1 (en) | 2014-12-29 | 2021-11-24 | Novartis AG | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
WO2016115482A1 (en) | 2015-01-16 | 2016-07-21 | Novartis Pharma Ag | Phosphoglycerate kinase 1 (pgk) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor |
WO2016126608A1 (en) | 2015-02-02 | 2016-08-11 | Novartis Ag | Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof |
ES2876974T3 (es) | 2015-04-07 | 2021-11-15 | Novartis Ag | Combinación de terapia con receptor de antígeno quimérico y derivados de amino pirimidina |
CN114958764A (zh) | 2015-04-08 | 2022-08-30 | 诺华股份有限公司 | Cd20疗法、cd22疗法和与cd19嵌合抗原受体(car)表达细胞的联合疗法 |
EP4234685A3 (en) | 2015-04-17 | 2023-09-06 | Novartis AG | Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells |
EP3286211A1 (en) | 2015-04-23 | 2018-02-28 | Novartis AG | Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker |
SG10201912978PA (en) | 2015-07-21 | 2020-02-27 | Novartis Ag | Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells |
US11667691B2 (en) | 2015-08-07 | 2023-06-06 | Novartis Ag | Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins |
JP6905163B2 (ja) | 2015-09-03 | 2021-07-21 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | サイトカイン放出症候群を予測するバイオマーカー |
CA2999070A1 (en) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Novartis Ag | Car t cell therapies with enhanced efficacy |
AR110676A1 (es) | 2016-10-07 | 2019-04-24 | Novartis Ag | Tratamiento del cáncer utilizando receptores de antígenos quiméricos |
TW202134285A (zh) * | 2019-11-26 | 2021-09-16 | 瑞士商諾華公司 | Cd19和cd22嵌合抗原受體及其用途 |
JP2023503163A (ja) * | 2019-11-26 | 2023-01-26 | ノバルティス アーゲー | キメラ抗原受容体及びその使用 |
-
2015
- 2015-04-07 KR KR1020167027427A patent/KR102487608B1/ko active IP Right Grant
- 2015-04-07 IL IL280215A patent/IL280215B/en unknown
- 2015-04-07 TW TW104111176A patent/TWI753848B/zh active
- 2015-04-07 EP EP15719043.0A patent/EP3129470B1/en active Active
- 2015-04-07 AU AU2015244039A patent/AU2015244039B2/en active Active
- 2015-04-07 HU HUE15719043A patent/HUE054588T2/hu unknown
- 2015-04-07 EP EP21160203.2A patent/EP3888674B1/en active Active
- 2015-04-07 JP JP2016561313A patent/JP6765966B2/ja active Active
- 2015-04-07 CA CA2940671A patent/CA2940671A1/en active Pending
- 2015-04-07 MY MYPI2016702996A patent/MY191608A/en unknown
- 2015-04-07 SG SG10202109752X patent/SG10202109752XA/en unknown
- 2015-04-07 MX MX2016013239A patent/MX2016013239A/es unknown
- 2015-04-07 WO PCT/US2015/024671 patent/WO2015157252A1/en active Application Filing
- 2015-04-07 PL PL15719043T patent/PL3129470T3/pl unknown
- 2015-04-07 CN CN201580018102.9A patent/CN107075482B/zh active Active
- 2015-04-07 KR KR1020237000827A patent/KR102651707B1/ko active IP Right Grant
- 2015-04-07 PT PT157190430T patent/PT3129470T/pt unknown
- 2015-04-07 IL IL293603A patent/IL293603B2/en unknown
- 2015-04-07 CN CN202010128384.0A patent/CN111514283A/zh active Pending
- 2015-04-07 RU RU2016142896A patent/RU2718542C2/ru active
- 2015-04-07 IL IL307423A patent/IL307423A/en unknown
- 2015-04-07 ES ES15719043T patent/ES2876263T3/es active Active
- 2015-04-07 KR KR1020247009639A patent/KR20240042250A/ko active Search and Examination
- 2015-04-07 SG SG11201606909RA patent/SG11201606909RA/en unknown
- 2015-04-07 LT LTEP15719043.0T patent/LT3129470T/lt unknown
- 2015-04-07 SI SI201531647T patent/SI3129470T1/sl unknown
- 2015-04-07 DK DK15719043.0T patent/DK3129470T3/da active
- 2015-04-07 US US14/680,860 patent/US10357514B2/en active Active
-
2016
- 2016-08-10 IL IL247204A patent/IL247204B/en active IP Right Grant
- 2016-08-16 ZA ZA2016/05657A patent/ZA201605657B/en unknown
- 2016-10-07 MX MX2022010623A patent/MX2022010623A/es unknown
-
2019
- 2019-06-07 US US16/435,257 patent/US20190388471A1/en active Pending
-
2020
- 2020-03-11 JP JP2020041499A patent/JP7258802B2/ja active Active
-
2021
- 2021-07-02 HR HRP20211055TT patent/HRP20211055T1/hr unknown
-
2022
- 2022-01-18 AU AU2022200288A patent/AU2022200288A1/en active Pending
-
2023
- 2023-04-05 JP JP2023061386A patent/JP2023085460A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7258802B2 (ja) | 抗cd19キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 | |
TWI746437B (zh) | Cd20療法、cd22療法及與表現cd19嵌合抗原受體(car)之細胞的組合療法 | |
TWI719946B (zh) | 使用cd123嵌合抗原受體治療癌症 | |
AU2015292755B2 (en) | Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor | |
WO2016014535A1 (en) | Treatment of cancer using a cll-1 chimeric antigen receptor | |
RU2815417C2 (ru) | Лечение злокачественной опухоли с использованием химерного рецептора антигена против cd19 | |
BR112016022798B1 (pt) | Usos de células que expressam car19, método de produção de células que expressam car19, misturas reacionais, e composições e seus usos |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230405 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230405 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240402 |