KR20230058427A - Car 발현 세포의 생체내 생성을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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요엘 멜레스
레지스 세브
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Abstract

본 개시의 양태는 일반적으로 CAR 발현 세포의 생체내 생성을 위한 생체물질의 용도에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 생체물질은 세포 동원 조성물, 바이러스 벡터 및/또는 세포 활성화제 중 하나 이상을 포함한다.

Description

CAR 발현 세포의 생체내 생성을 위한 조성물 및 방법
관련 출원
본 출원은 2020년 8월 21일에 출원된 미국 가출원 63/068,876 및 2021년 2월 26일에 출원된 미국 가출원 63/154,609에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출되었고 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2021년 8월 20일에 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 N2067-7176WO_SL.txt이고 크기는 987,095 바이트이다.
기술분야
본 개시의 양태는 일반적으로 CAR 발현 세포의 생체내 생성을 위한 생체물질의 용도에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 생체물질은 세포 동원 조성물, 바이러스 벡터 및/또는 세포 활성화제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 조성물에 포함된다.
T 세포 차용 전달 프로토콜은 암과 같은 여러 치료학적 적용에서 잠재력을 나타내며, 최근에는 CAR T 세포 치료법이 B 세포 악성종양의 치료를 위해 승인된 바 있다. CAR-T 세포 제조의 현재 방법론은 생체외에서 수행되고: 대상체로부터 세포를 추출하고, 이를 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작한 다음, 암과 같은 질환, 장애 또는 질병의 치료를 위해 대상체에 다시 도입한다. 부위 특이적 전달 및/또는 생체내 생산을 허용하는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는, CAR 발현 세포의 효율적인 제조에 대한 당분야의 요구가 남아있다.
일부 양태에서, 본 개시의 특징은 생체물질 및 세포 동원 인자를 포함하는 제1 조성물; 및 바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물이다. 일부 양태에서, 본 개시의 특징은 생체물질 및 분자(예를 들어, VEGF-C, IL-2, IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), GM-CSF, CXCL12, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10 또는 CXCL11)를 포함하는 제1 조성물; 및 바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물이다.
일부 양태에서, 본 개시는 생체물질 및 세포 동원 인자를 포함하는 제1 조성물을 특징으로 하며, 생체물질은 하이드로겔, 예를 들어 크리오겔, 예를 들어 알기네이트 크리오겔을 포함하고, 세포 동원 인자는 SEQ ID NO: 741에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 단 SEQ ID NO: 741의 위치 26에 있는 아미노산은 시스테인(C)이 아니며, 선택적으로 SEQ ID NO: 741의 위치 26에 있는 아미노산은 알라닌(A)이다.
일부 양태에서, 본 개시는 메조다공성 실리카 입자; 바이러스 벡터; 및 세포 활성화제를 포함하는 제2 조성물을 특징으로 한다.
일부 양태에서, 본 개시는 생체내에서 대상체의 세포를 형질도입하거나 대상체에서 질환, 장애 또는 질병을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 대상체의 부위(예를 들어, 높은 피하 공간 또는 진피에 인접한 피하 공간)에 생체물질 및 세포 동원 인자를 투여하는 단계, 및 트랜스유전자를 포함하는 바이러스 벡터 또는 핵산을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고; 그에 의해 대상체의 세포를 트랜스유전자로 형질도입한다. 일부 양태에서, 본 개시는 생체내에서 대상체의 세포를 형질도입하거나 대상체에서 질환, 장애 또는 질병을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 생체물질 및 분자(예를 들어, VEGF-C, IL-2, IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), GM-CSF, CXCL12, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10 또는 CXCL11)를 대상체의 부위(예를 들어, 높은 피하 공간 또는 진피에 인접한 피하 공간)에 투여하는 단계, 및 트랜스유전자를 포함하는 바이러스 벡터 또는 핵산을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고; 그에 의해 대상체의 세포를 트랜스유전자로 형질도입한다.
일부 구현예에서, 생체물질 및 세포 동원 인자는 제1 조성물에 포함되고, 바이러스 벡터 또는 핵산은 제2 조성물에 포함된다. 일부 구현예에서, 생체물질 및 분자(예를 들어, VEGF-C, IL-2, IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), GM-CSF, CXCL12, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10 또는 CXCL11)는 제1 조성물에 포함되고, 바이러스 벡터 또는 핵산은 제2 조성물에 포함된다.
일부 양태에서, 본 개시는 생체내에서 대상체의 세포를 형질도입하거나 대상체에서 질환, 장애 또는 질병을 치료하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 트랜스유전자를 포함하는 바이러스 벡터 또는 핵산을 대상체의 부위에 투여하는 단계를 포함하고; 그에 의해 세포를 형질도입하고, 대상체는 림프관신생 및/또는 대상체의 부위로의 T 세포의 동원을 유도하기에 충분한 양으로 생체물질 및 세포 동원 인자를 이전에 투여받은 적이 있다. 일부 양태에서, 본 개시는 생체내에서 대상체의 세포를 형질도입하거나 대상체에서 질환, 장애 또는 질병을 치료하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 트랜스유전자를 포함하는 바이러스 벡터 또는 핵산을 대상체의 부위에 투여하는 단계를 포함하고; 그에 의해 세포를 형질도입하고, 대상체는 림프관신생 및/또는 대상체의 부위로의 T 세포의 동원을 유도하기에 충분한 양으로 생체물질 및 분자(예를 들어, VEGF-C, IL-2, IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), GM-CSF, CXCL12, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10 또는 CXCL11)를 이전에 투여받은 적이 있다.
본원의 양태 중 임의의 것, 예를 들어 상기 조성물 및 방법에서, 본원(예를 들어, 하기)의 구현예 중 임의의 것이 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, 생체물질은 (i) 하이드로겔을 포함하고/하거나; (ii) 크리오겔을 포함하고/하거나; (iii) 젤라틴, 히알루론산, 콜라겐, 알기네이트, 라미닌, 키토산, 실크 피브로인, 아가로스, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리비닐 알코올 및/또는 하이드록시에틸 메틸아크릴레이트를 포함하고/하거나; (iv) 알기네이트 하이드로겔을 포함하고/하거나(선택적으로 여기서 알기네이트 하이드로겔은 노르보르넨 및/또는 테트라진을 추가로 포함하고/하거나, 선택적으로 노르보르넨 및/또는 테트라진은 알기네이트와 공유적으로 회합(예를 들어 이에 화학적으로 연결)되거나 이와 비공유적으로 회합(예를 들어 이에 흡착)됨); (v) 지름이 약 10 μm 내지 약 300 μm, 예를 들어 약 50 μm 내지 약 300 μm인 기공을 포함하거나 기공을 전혀 포함하지 않고/않거나; (vi) 화학적으로 가교된다. 일부 구현예에서, 생체물질을 포함하는 제1 조성물은 라포나이트를 추가로 포함하며, 선택적으로 라포나이트는 약 0.15 mg/mL 내지 약 0.35 mg/mL, 예를 들어 약 0.25 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 생체물질은 라포나이트를 추가로 포함하며, 선택적으로 라포나이트는 약 0.15 mg/mL 내지 약 0.35 mg/mL, 예를 들어 약 0.25 mg/mL의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 (i) 생체물질과 비공유적으로 회합(예를 들어 이에 흡착)되거나; (ii) 생체물질과 공유적으로 회합(예를 들어 이에 접합)된다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 (i) 림프관신생을 유도하고/하거나; (ii) 림프 내피 세포의 성장을 유도하고/하거나; (ii) 면역 세포를 동원하며, 선택적으로 면역 세포는 T-세포 및/또는 NK-세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 림프관신생의 유도는 (i) 림프 내피 세포(LEC)(예를 들어, CD45-CD31+PDPN+ 세포) 수준의 증가를 포함하고, 선택적으로 LEC 수준은 검정, 예를 들어 유세포측정 검정에 의해, 예를 들어 실시예 H 또는 I에 기재된 바와 같이 측정될 때 참조 수준(예를 들어, 복수의 조성물 또는 제1 조성물의 주사 전 대상체의 부위에서의 LEC 수준)과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 2 00% 증가되고/되거나; (ii) 검정, 예를 들어 유세포측정 검정에 의해, 예를 들어 실시예 H 또는 I에 기재된 바와 같이 측정될 때 조직 1 밀리그램당 적어도 50개 LEC(예를 들어, 적어도 75, 100, 125, 150, 200, 225 또는 250개 LEC)를 생성한다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 T 세포를 동원하고, 선택적으로 T 세포는 나이브 T 세포(예를 들어, CD45RA+CD62L+ T 세포 또는 CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+ T 세포)를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포의 동원은 T 세포 수준의 증가를 포함하고, 선택적으로 T 세포 수준은 검정, 예를 들어 유세포측정 검정에 의해, 예를 들어 실시예 H 또는 I에 기재된 바와 같이 측정될 때 참조 수준(예를 들어, 복수의 조성물 또는 제1 조성물의 주사 전 대상체의 부위에서의 T 세포 수준)과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 또는 300% 증가된다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 VEGF-C, IL-2, IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), GM-CSF, CXCL12, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10 또는 CXCL11로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 VEGF-C 또는 이의 기능적 변이체; IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 또는 이의 기능적 변이체; IL-7 또는 이의 기능적 변이체; 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 VEGF-C를 포함하고, 선택적으로 VEGF-C는 (i) 성숙 VEGF-C 펩티드, 선택적으로 이의 마이너 또는 메이저 성숙 형태 또는 돌연변이된 변이체를 포함하고/하거나; (ii) 단량체 또는 이량체이고/이거나; (iii) 유효량, 선택적으로 약 1 mg 이하, 약 10 mg 이하, 약 10 μg 이상, 약 1 μg 이상, 약 1 μg 내지 1 mg, 약 10 μg 내지 1 mg, 약 1 μg 내지 10 mg, 또는 약 10 μg 내지 10 mg의 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, VEGF-C는 (i) 표 18에 제공된 서열 중 임의의 하나의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열로서, 선택적으로 링커(예를 들어, 글리신-세린 링커) 및/또는 his 태그를 포함하거나 포함하지 않는, 서열; 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 725에 따라 넘버링된 C137A의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 (i) SEQ ID NO: 741에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(단 SEQ ID NO: 741의 위치 26에 있는 아미노산은 시스테인(C)이 아니고, 선택적으로 SEQ ID NO: 741의 위치 26에 있는 아미노산은 알라닌(A)임); (ii) SEQ ID NO: 743에 따른 아미노산 서열 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열 아미노산 서열; (iii) SEQ ID NO: 740에 따른 아미노산 서열 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; (iv) SEQ ID NO: 736에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; (v) 링커(예를 들어, 여기서 링커는 Gly-Ser의 서열을 갖고, 선택적으로 링커는 SEQ ID NO: 743의 C-말단 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열임); (vi) SEQ ID NO: 735에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; (vii) SEQ ID NO: 734에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및/또는 (viii) SEQ ID NO: 733에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 중 임의의 것, 예를 들어 제1 조성물 중 임의의 것은 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 또는 이의 기능적 변이체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 중 임의의 것, 예를 들어 제1 조성물 중 임의의 것은 IL-7 또는 이의 기능적 변이체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 중 임의의 것, 예를 들어 제1 조성물 중 임의의 것은 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 또는 이의 기능적 변이체 및 IL-7 또는 이의 기능적 변이체를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것은 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 또는 이의 기능적 변이체의 투여를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것은 IL-7 또는 이의 기능적 변이체의 투여를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것은 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 및 이의 기능적 변이체 또는 IL-7 또는 이의 기능적 변이체의 투여를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 조성물은 입자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 입자는 메조다공성 입자, 실리카 입자 및/또는 메조다공성 실리카 입자이고, 선택적으로 메조다공성 실리카 입자는 메조다공성 실리카 막대이다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 표면 변형을 포함하며, 선택적으로 표면 변형은 (a) 선택적으로 C1 내지 C20 알킬 또는 ( O(CH2 CH2 )1-25 링커를 사용하는, -OH(하이드록실), 아민, 카복실산, 포스포네이트, 할라이드, 아지드, 알킨, 에폭시드, 설프하이드릴, 폴리에틸렌이민, 소수성 모이어티 또는 이의 염; (b) 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민; 및/또는 (c) 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정된 평균 분자량이 약 1000 내지 20,000 Da, 약 1,200 내지 15,000 Da, 약 1,500 내지 12,000 Da, 약 2,000 Da, 약 3,000 Da, 약 4,000 Da, 약 5,000 Da, 약 6,000 Da, 약 7,000 Da, 약 8,000 Da, 약 9,000 Da 또는 약 10,000 Da인 폴리에틸렌이민을 포함한다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 (i) 트리메틸암모늄 기능화 메조다공성 실리카 입자, 예를 들어 N,N,N-트리메틸프로판-1-암모늄 기능화 메조다공성 실리카 입자이고/이거나; (iii) 복수의 기공을 포함하며, 선택적으로 기공의 지름은 2 내지 50 nm이고/이거나; (iv) 적어도 약 100 m2/g의 표면적을 포함한다.
일부 구현예에서, (i) 바이러스 벡터는 메조다공성 실리카 입자와 비공유적으로, 예를 들어 정전기적으로 또는 공유적으로 회합되고/되거나; (ii) 세포 활성화제는 메조다공성 실리카 입자와 비공유적으로 또는 공유적으로 회합된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 (i) 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 헤르페스 바이러스; 및/또는 (ii) 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 TCR, 사이토카인, 케모카인, shRNA, 또는 종양 항원을 표적화하도록 조작된 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, 엽산 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 파단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 신호전달 영역 및 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 인코딩하며, (i) 항원 결합 도메인은 CD19, CD123, CD22, CD20, EGFRvIII, BCMA, 메소텔린, CD33, CLL-1, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 결합하고/하거나; (ii) 막관통 도메인은 CD8 힌지를 포함하고/하거나; (iii) 공동자극 신호전달 영역은 4-1BB 또는 CD28 공동자극 신호전달 도메인으로부터 선택되고/되거나; (iv) 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 조성물은 세포 활성화제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 (A) 항-CD3 결합 도메인, 및 (B) 공동자극 분자 결합 도메인(예를 들어, 항-CD2 결합 도메인 또는 항-CD28 결합 도메인)을 포함하는 다중특이적 결합 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab 또는 항-CD28 Fab의 N-말단에 위치하거나; 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab 또는 항-CD28 Fab의 C-말단에 위치하고, 선택적으로, Fc 영역은 항-CD3 결합 도메인과 공동자극 분자 결합 도메인 사이에 위치하거나; 다중특이적 결합 분자는 CH2를 포함하고, 항-CD3 결합 도메인은 CH2의 N-말단에 위치한다.
본원의 제2 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 (i) N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 결합 도메인의 VH, 항-CD3 결합 도메인의 VL, 공동자극 분자 결합 도메인의 VH, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (ii) N-말단에서 C-말단으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 (i) N-말단에서 C-말단으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, CH3, 항-CD3 결합 도메인의 VH, 및 항-CD3 결합 도메인의 VL을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (ii) N-말단에서 C-말단으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 (i) N-말단에서 C-말단으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VH, CH1, 항-CD3 결합 도메인의 VH, 항-CD3 결합 도메인의 VL, CH2 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (ii) N-말단에서 C-말단으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 scFv를 포함하고 공동자극 분자 결합 도메인은 Fab 단편의 일부이다.
일부 구현예에서, 세포 활성화제는 표 20에 제공된 임의의 중쇄의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및/또는 표 20에 제공된 임의의 경쇄의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 입자, 예를 들어 메조다공성 실리카 입자에 접합되거나 흡착된다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 (i) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A, L235A, S267K 및 P329A 돌연변이(LALASKPA); (ii) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A, L235A 및 P329G 돌연변이(LALAPG); (iii) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 G237A, D265A, P329A 및 S267K 돌연변이(GADAPASK); (iv) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A, L235A 및 G237A 돌연변이(LALAGA); (v) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 D265A, P329A 및 S267K 돌연변이(DAPASK); (vi) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 G237A, D265A 및 P329A 돌연변이(GADAPA); (vii) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A, L235A 및 P329A 돌연변이(LALAPA); 또는 (viii) 표 20의 Fc 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 (i) SEQ ID NO: 726, 1416, 893, 1417 또는 895 중 임의의 것의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 728, 730, 892, 또는 894 중 임의의 것의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 (i) SEQ ID NO: 726의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 728의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; (ii) SEQ ID NO: 726의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 730의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; (iii) SEQ ID NO: 1416의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 728의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; (iv) SEQ ID NO: 1416의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 730의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; (v) SEQ ID NO: 893의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 892의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; (vi) SEQ ID NO: 1417의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 892의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는 (vii) SEQ ID NO: 895의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 894의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 조성물은 입자의 제1 집단 및 입자의 제2 집단, 예를 들어 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 및 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단을 추가로 포함하고, 제1 집단은 바이러스 벡터를 포함하고 제2 집단은 세포 활성화제를 포함하며, 예를 들어 바이러스 벡터는 제1 집단의 입자와 비공유적으로 회합되고, 세포 활성화제는 제2 집단의 입자와 비공유적으로 회합된다.
일부 구현예에서, 조성물, 예를 들어, 제1 또는 제2 조성물은 주사 용도에 적합하다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물, 예를 들어 제1 또는 제2 조성물은 Tet2 억제제 및/또는 ZBTB32 억제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, Tet2 억제제는 (1) Tet2를 인코딩하는 유전자 내의 하나 이상의 부위, 또는 그 상응하는 조절 요소를 표적화하는 유전자 편집 시스템; (2) Tet2의 발현을 억제하는 핵산(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); (3) 단백질(예를 들어, 우성 음성, 예를 들어 촉매 불활성) Tet2, 또는 Tet2의 결합 파트너(예를 들어, Tet2의 우성 음성 결합 파트너); (4) Tet2의 발현 및/또는 기능을 억제하는 소분자; (5) (1) 내지 (3) 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산; 또는 (6) (1) 내지 (5)의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, ZBTB32 유전자 또는 이의 하나 이상의 성분; (2) 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 핵산; 또는 (3) (1) 및 (2)의 조합. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (1) ZBTB32 유전자 또는 이의 하나 이상의 성분을 표적화하는 유전자 편집 시스템을 포함한다. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (2) 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (1) 및 (2)의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 (i) Tet2 억제제로서, 선택적으로, (1) Tet2를 인코딩하는 유전자 내의 하나 이상의 부위, 또는 그 상응하는 조절 요소를 표적화하는 유전자 편집 시스템; (2) Tet2의 발현을 억제하는 핵산(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); (3) 단백질(예를 들어, 우성 음성, 예를 들어 촉매 불활성) Tet2, 또는 Tet2의 결합 파트너(예를 들어, Tet2의 우성 음성 결합 파트너); (4) Tet2의 발현 및/또는 기능을 억제하는 소분자; (5) (1) 내지 (3) 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산; 또는 (6) (1) 내지 (5)의 임의의 조합을 포함하는, Tet2 억제제; 및/또는 (ii) ZBTB32 억제제로서, 선택적으로 (1) ZBTB32 유전자 또는 이의 하나 이상의 성분을 표적화하는 유전자 편집 시스템; (2) 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 핵산; 또는 (3) (1) 및 (2)의 조합을 포함하는, ZBTB32 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (1) ZBTB32 유전자 또는 이의 하나 이상의 성분을 표적화하는 유전자 편집 시스템을 포함한다. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (2) 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (1) 및 (2)의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 조성물은 제2 조성물의 투여 전에 투여되며, 선택적으로, (i) 제1 조성물은 제2 조성물의 투여 약 1 내지 4주 전, 예를 들어 약 2주 전에 투여되거나; (ii) 제1 조성물은 적어도 제2 조성물의 투여 2주 전에 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것은 대상체로부터의 샘플(예를 들어, 투여 부위로부터의 또는 그 근처의 샘플)에서 림프관신생을 평가하는, 예를 들어 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 림프관신생은 제1 조성물의 투여 후 및/또는 제2 조성물의 투여 전에 측정되고, 선택적으로 림프관신생을 측정하는 단계는 샘플에서 림프 내피 세포(LEC)(예를 들어, CD45-CD31+PDPN+ 세포)의 수준 및/또는 활성에 대한 값을 획득하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것은 대상체로부터의 샘플(예를 들어, 투여 부위로부터의 또는 그 근처의 샘플)에서 T 세포의 동원을 평가하는, 예를 들어 측정하는 단계를 추가로 포함하고, T 세포의 동원은 제1 조성물의 투여 후 및/또는 제2 조성물의 투여 전에 측정되고, 선택적으로 T 세포의 동원을 측정하는 단계는 샘플에서 T 세포(예를 들어, 나이브 T 세포, 예를 들어 CD45RA+CD62L+ T 세포 및/또는 CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+ T 세포)의 수준 및/또는 활성에 대한 값을 획득하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 질병을 갖거나, 갖는 것으로 진단받았고/받았거나; 대상체는 인간이다.
일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 질병은 (i) 암; (ii) 선택적으로 백혈병 또는 림프종을 포함하는 혈액암; (iii) 만성 림프구성 백혈병(CLL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 다발성 골수종, 급성 림프성 백혈병(ALL), 호지킨 림프종, B-세포 급성 림프성 백혈병(BALL), T-세포 급성 림프성 백혈병(TALL), 소 림프구성 백혈병(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 모세포성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종(DLBCL), 만성 염증과 관련된 DLBCL, 만성 골수성 백혈병, 골수증식성 신생물, 여포성 림프종, 소아 여포성 림프종, 털세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 질병, MALT 림프종(점막 관련 림프 조직의 외연 변연부 림프종), 변연부 림프종, 골수이형성증, 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 비장 변연부 림프종, 비장 림프종/백혈병, 비장 미만성 적색 속질 소 B-세포 림프종, 털세포 백혈병-변이형, 림프형질세포성 림프종, 중쇄병, 형질 세포 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 골수외 형질세포종, 결절성 변연부 림프종, 소아 결절성 변연부 림프종, 원발성 피부 소포 중심 림프종, 림프종모양 육아종증, 원발성 종격동(가슴샘) 대 B-세포 림프종, 혈관내 대 B-세포 림프종, ALK+ 대 B-세포 림프종, HHV8-관련 다심성 캐슬만병에서 발생하는 대 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, B-세포 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 또는 미분류 림프종으로부터 선택된 혈액암; (iv) 고형암; (v) 중피종, 악성 흉막 중피종, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 편평 세포 폐암, 대세포 폐암, 췌장암, 췌관 샘암종, 식도 샘암종, 유방암, 교모세포종, 난소암, 결장직장암, 전립샘암, 자궁경부암, 피부암, 흑색종, 신암, 간암, 뇌암, 가슴샘종, 육종, 암종, 자궁암, 신장암, 위장암, 요로상피암, 인두암, 두경부암, 직장암, 식도암, 또는 방광암 중 하나 이상, 또는 이의 전이로부터 선택된 고형암; 또는 (iv) 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 이식을 포함한다. 일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 질병은 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 이식이고 발현된 CAR은 B 세포 항원, 예를 들어 CD 19, CD20, CD22, CD123, FcRn5, FcRn2, BCMA, CS-1 및 CD138에 결합한다.
일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 질병은 고형 종양을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 CAR-발현 세포로 고형 종양을 치료할 때, 세포는 2개의 CAR을 발현하고, 제1 CAR은 B 세포 항원에 결합하고 제2 CAR은 고형 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 CAR-발현 세포로 고형 종양을 치료할 때, 세포는 B 세포 항원에 결합하는 제1 결합 도메인 및 고형 종양 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 CAR을 발현한다. 이론에 구애됨이 없이, 이러한 세포에서 B 세포 항원에 결합하는 CAR을 발현하는 것은 CAR-발현 세포의 증식 및/또는 생존을 개선하는 데 도움이 될 수 있다. B 세포 항원(예를 들어, 정상 B 세포 상의 CD19)은 종양 항원의 수준이 낮을 때에도(예를 들어, 종양 세포의 수가 적을 때 또는 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 CAR-발현 세포가 고형 종양 세포와 접촉하기 전에) 이러한 CAR-발현 세포의 증식 및/또는 생존을 개선할 수 있다.
일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 질병은 골수성 종양을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 CAR-발현 세포로 골수성 종양을 치료할 때, 세포는 2개의 CAR을 발현하고, 제1 CAR은 B 세포 항원에 결합하고 제2 CAR은 골수성 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 CAR-발현 세포로 골수성 종양을 치료할 때, 세포는 B 세포 항원에 결합하는 제1 결합 도메인 및 골수성 종양 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 CAR을 발현한다. 이론에 구애됨이 없이, 이러한 세포에서 B 세포 항원에 결합하는 CAR을 발현하는 것은 CAR-발현 세포의 증식 및/또는 생존을 개선하는 데 도움이 될 수 있다. B 세포 항원(예를 들어, 정상 B 세포 상의 CD19)은 종양 항원의 수준이 낮을 때에도(예를 들어, 종양 세포의 수가 적을 때 또는 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 CAR-발현 세포가 골수성 종양 세포와 접촉하기 전에) 이러한 CAR-발현 세포의 증식 및/또는 생존을 개선하는 데 도움이 될 수 있다.
본원에 기재된 방법 또는 제2 조성물의 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 또는 핵산은
(i) B 세포 항원(예를 들어, CD19)에 결합하는 제1 CAR 및 (a) 고형 종양 항원(예를 들어, EGFRvIII), (b) 골수성 종양 항원, 또는 (c) B-세포 계통이 아닌 혈액 종양의 항원에 결합하는 제2 CAR; 또는
(2) B 세포 항원(예를 들어, CD19)에 결합하는 제1 결합 도메인 및 (a) 고형 종양 항원(예를 들어, EGFRvIII), (b) 골수성 종양 항원 또는 (c) B-세포 계통이 아닌 혈액 종양의 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 CAR을 인코딩한다.
일부 구현예에서, B 세포 항원은 CD5, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27, CD30, CD34, CD37, CD38, CD40, CD53, CD69, CD72, CD73, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD123, CD135, CD138, CD179, CD269, Flt3, ROR1, BCMA, FcRn5, FcRn2, CS-1, CXCR4, 5, 7, IL-7/3R, IL7/4/3R, 또는 IL4R이다. 일부 구현예에서, B 세포 항원은 CD19, CD20, CD22, CD123, FcRn5, FcRn2, BCMA, CS-1 또는 CD138이다.
일부 구현예에서, 고형 종양 항원은 EGFRvIII, 메소텔린, GD2, Tn Ag, PSMA, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, 레구만, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, 엽산 수용체 알파, ERBB(예를 들어, ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, 에프린 B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, 레구마인, HPV E6 또는 E7, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, 폴리시알산, Fos-관련 항원, 호중구 엘라스타제, TRP-2, CYP1B1, 정자 단백질 17, 베타 인간 융모 생식선자극호르몬, AFP, 티로글로불린, PLAC1, 글로보H, RAGE1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, 장 카복실 에스터라제, mut hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4, 또는 MHC 상에 제시된 이들 항원 중 임의의 것의 펩티드이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 제1 조성물 및 본원에 기재된 제2 조성물을 포함하는 키트가 또한 본원에서 고려된다.
일부 양태에서, 본 개시는 대상체에서 질환, 장애 또는 질병을 치료하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 트랜스유전자를 포함하는 바이러스 벡터 또는 핵산을 부위에서 림프관신생을 겪도록 유도된 대상체의 부위에 투여하는 단계를 포함하고, 그에 의해 세포를 형질도입한다.
일부 양태에서, 본 개시는 대상체에 생체물질 및 세포 동원 인자를 투여하여, 대상체가 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 바이러스 벡터를 제공받도록 준비시키는 단계를 포함하는, CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 제공받도록 대상체를 준비시키는 방법을 특징으로 한다. 일부 양태에서, 본 개시는 대상체에 생체물질 및 분자(예를 들어, VEGF-C, IL-2, IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), GM-CSF, CXCL12, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10 또는 CXCL11)를 투여하여, 대상체가 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 바이러스 벡터를 제공받도록 준비시키는 단계를 포함하는, CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 제공받도록 대상체를 준비시키는 방법을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 준비시키는 단계는 림프관신생의 유도 및/또는 T 세포(예를 들어, 예를 들어, CD45RA+CD62L+ T 세포 및/또는 CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+ T 세포)의 동원을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 선택적으로 바이러스 벡터는 입자(예를 들어, 세포 활성화제를 포함하거나 포함하지 않는 메조다공성 실리카 입자)에 접합된다.
또한 세포 동원 인자를 포함하는 생체물질; 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제를 포함하는 조성물이 본원에서 고려된다. 또한 생체물질 및 세포 동원 인자; 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제를 포함하는 조성물이 본원에서 고려된다.
일부 구현예에서, 생체물질은 하이드로겔, 선택적으로 크리오겔을 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 젤라틴, 히알루론산, 콜라겐, 알기네이트, 라미닌, 키토산, 실크 피브로인, 아가로스, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리비닐 알코올 및/또는 하이드록시에틸 메틸아크릴레이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔을 포함하는 조성물은 라포나이트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 지름이 약 10 내지 300 μm, 선택적으로 약 50 내지 300 μm인 기공을 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 화학적으로 가교된다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 선택적으로 면역 세포, 선택적으로 T-세포 및/또는 NK-세포를 동원한다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 CCL19, CXCL9, CXCL10, XCL1, IL-2, IL-7, CCL21, GM-CSF, CCL17, CCL22, CCL20, CCL27, IL-15, 림프독소 알파, 림프독소 베타, VEGF-C, FLT3L, G-CSF, PDGF, S100A8/A9, CSF-1, CXCL8, CCL20, CCL17, CCR5, CCR6, CCL2, VEGF, 안지오포이에틴-2, PGE2, LTB4, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CXCL12로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 미성숙 VEGF-C 펩티드 또는 성숙 VEGF-C 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 마이너 성숙 형태 또는 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 야생형 마이너 성숙 형태 또는 야생형 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 변형된 마이너 성숙 형태 또는 변형된 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 시스테인 137에서의 돌연변이(예를 들어, C137A)를 포함하는 변형된 마이너 성숙 형태 또는 시스테인 137에서의 돌연변이(예를 들어, C137A)를 포함하는 변형된 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 C137A 돌연변이를 포함하는 변형된 마이너 성숙 형태 또는 C137A 돌연변이를 포함하는 변형된 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 이량체 또는 단량체로 존재한다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 각각의 단량체에 C137A 돌연변이를 추가로 포함하는 메이저 성숙 형태의 이량체이다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 각각의 단량체에 C137A 돌연변이를 추가로 포함하는 마이너 성숙 형태의 이량체이다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 표 18에 제공된 서열로부터 선택되며, 선택적으로 his 태그는 서열에 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 유효량, 선택적으로 약 1 mg 이하, 약 10 mg 이하, 약 10 μg 이상, 약 1 μg 이상, 약 1 μg 내지 1 mg, 약 10 μg 내지 1 mg, 약 1 μg 내지 10 mg, 또는 약 10 μg 내지 10 mg의 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단은 표면 변형된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 상의 표면 변형은 선택적으로 C1 내지 C20 알킬 또는 (-O(CH2-CH2-)1-25 링커를 사용하는, -OH(하이드록실), 아민, 카복실산, 포스포네이트, 할라이드, 아지드, 알킨, 에폭시드, 설프하이드릴, 폴리에틸렌이민, 소수성 모이어티 또는 이의 염이다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 상의 표면 변형은 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민이다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 상의 표면 변형은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정된 평균 분자량이 약 1000 내지 20,000 Da, 약 1,200 내지 15,000 Da, 약 1,500 내지 12,000 Da, 약 2,000 Da, 약 3,000 Da, 약 4,000 Da, 약 5,000 Da, 약 6,000 Da, 약 7,000 Da, 약 8,000 Da, 약 9,000 Da 또는 약 10,000 Da인 폴리에틸렌이민이다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 지름이 2 내지 50 nm인 기공을 포함한다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 적어도 약 100 m2/g의 표면적을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 주사 용도에 적합하다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 메조다공성 실리카 막대의 형태이다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단에 접합된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단에 정전기적으로 또는 공유적으로 접합된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 렌티바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 TCR, 하나 이상의 사이토카인, 하나 이상의 케모카인, 억제 분자를 차단하기 위한 shRNA를 인코딩하거나, 뉴클레오티드 서열은 단백질의 발현을 유도하기 위한 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 종양 항원을 표적화하도록 조작된 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, 엽산 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 파단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 종양 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 신호전달 영역 및 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 영역은 41BB(즉, CD137), CD27, ICOS, 및/또는 CD28로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 세포 활성화제는 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 또는 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단에 접합되거나 흡수된다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 T 세포 자극 화합물, CAR 항원 결합 도메인에 대한 항-개별특이형 항체, 및/또는 종양 항원이다. 일부 구현예에서, T-세포 자극 화합물은 IL-2, IL-15, 항-CD2 mAb, 항-CD3 mAb, 항-CD28 mAb, 신생항원 펩티드, 공유 항원으로부터의 펩티드, 예컨대 TRP2, gp100, 종양 세포 용해물, CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR 및/또는 MAGE A3 TCR이다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 CD3/TCR 복합체 및/또는 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하고, 선택적으로 세포 활성화제는 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하는 다중특이적 결합 분자이다. 일부 구현예에서, 세포 활성화는 표 20에 제공된 서열로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단 또는 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단 표면 상의 지질 외피에 접합된다. 일부 구현예에서, 조성물은 사이토카인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 메조다공성 실리카 입자의 제1 또는 제2 집단에 접합되거나 흡착된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, 또는 전환 성장 인자 베타(TGF-β), 또는 이의 효능제, 이의 모방체, 이의 변이체, 이의 기능적 단편, 또는 이의 조합이다.
또한 세포 동원 인자를 포함하는 생체물질; 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 생체내에서 세포를 형질도입하는 방법이 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, 성분은 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자를 포함하는 생체물질이 먼저 투여된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 막대의 제1 집단, 바이러스 벡터, 및 선택적으로 세포 활성화제는 동시에 그리고 선택적으로 생체물질 이후에 투여된다.
또한 생체물질 및 세포 동원 인자; 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 생체내에서 세포를 형질도입하는 방법이 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, 성분은 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서는, 생체물질 및 세포 동원 인자가 먼저 투여된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 막대의 제1 집단, 바이러스 벡터, 및 선택적으로 세포 활성화제는 동시에 그리고 선택적으로 생체물질 및 세포 동원 인자 이후에 투여된다.
또한 생체물질 및 분자(예를 들어, VEGF-C, IL-2, IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), GM-CSF, CXCL12, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10 또는 CXCL11); 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 생체내에서 세포를 형질도입하는 방법이 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, 성분은 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서는, 생체물질 및 분자가 먼저 투여된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 막대의 제1 집단, 바이러스 벡터, 및 선택적으로 세포 활성화제는 동시에 그리고 선택적으로 생체물질 및 분자 이후에 투여된다.
일부 구현예에서, 생체물질은 하이드로겔, 선택적으로 크리오겔을 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 젤라틴, 히알루론산, 콜라겐, 알기네이트, 라미닌, 키토산, 실크 피브로인, 아가로스, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리비닐 알코올 및/또는 하이드록시에틸 메틸아크릴레이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔을 포함하는 조성물은 라포나이트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 지름이 약 10 내지 300 μm, 선택적으로 약 50 내지 300 μm인 기공을 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 화학적으로 가교된다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 선택적으로 면역 세포, 선택적으로 T-세포 및/또는 NK-세포를 동원한다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 CCL19, CXCL9, CXCL10, XCL1, IL-2, IL-7, CCL21, GM-CSF, CCL17, CCL22, CCL20, CCL27, IL-15, 림프독소 알파, 림프독소 베타, VEGF-C, FLT3L, G-CSF, PDGF, S100A8/A9, CSF-1, CXCL8, CCL20, CCL17, CCR5, CCR6, CCL2, VEGF, 안지오포이에틴-2, PGE2, LTB4, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CXCL12로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 미성숙 VEGF-C 펩티드 또는 성숙 VEGF-C 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 마이너 성숙 형태 또는 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 야생형 마이너 성숙 형태 또는 야생형 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 변형된 마이너 성숙 형태 또는 변형된 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 시스테인 137에서의 돌연변이(예를 들어, C137A)를 포함하는 변형된 마이너 성숙 형태 또는 시스테인 137에서의 돌연변이(예를 들어, C137A)를 포함하는 변형된 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 C137A 돌연변이를 포함하는 변형된 마이너 성숙 형태 또는 C137A 돌연변이를 포함하는 변형된 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 이량체 또는 단량체로 존재한다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 각각의 단량체에 C137A 돌연변이를 추가로 포함하는 메이저 성숙 형태의 이량체이다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 각각의 단량체에 C137A 돌연변이를 추가로 포함하는 마이너 성숙 형태의 이량체이다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 표 18로부터 선택되며, 선택적으로 his 태그는 서열에 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 유효량, 선택적으로 약 1 mg 이하, 약 10 mg 이하, 약 10 μg 이상, 약 1 μg 이상, 약 1 μg 내지 1 mg, 약 10 μg 내지 1 mg, 약 1 μg 내지 10 mg, 또는 약 10 μg 내지 10 mg의 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단은 표면 변형된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 상의 표면 변형은 선택적으로 C1 내지 C20 알킬 또는 (-O(CH2-CH2-)1-25 링커를 사용하는, -OH(하이드록실), 아민, 카복실산, 포스포네이트, 할라이드, 아지드, 알킨, 에폭시드, 설프하이드릴, 폴리에틸렌이민, 소수성 모이어티 또는 이의 염이다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 상의 표면 변형은 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민이다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 상의 표면 변형은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정된 평균 분자량이 약 1000 내지 20,000 Da, 약 1,200 내지 15,000 Da, 약 1,500 내지 12,000 Da, 약 2,000 Da, 약 3,000 Da, 약 4,000 Da, 약 5,000 Da, 약 6,000 Da, 약 7,000 Da, 약 8,000 Da, 약 9,000 Da 또는 약 10,000 Da인 폴리에틸렌이민이다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 지름이 2 내지 50 nm인 기공을 포함한다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 적어도 약 100 m2/g의 표면적을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 주사 용도에 적합하다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 메조다공성 실리카 막대의 형태이다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단에 접합된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단에 정전기적으로 또는 공유적으로 접합된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 렌티바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 TCR, 하나 이상의 사이토카인, 하나 이상의 케모카인, 억제 분자를 차단하기 위한 shRNA를 인코딩하거나, 뉴클레오티드 서열은 단백질의 발현을 유도하기 위한 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 종양 항원을 표적화하도록 조작된 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, 엽산 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 파단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 종양 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 신호전달 영역 및 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 영역은 41BB(즉, CD137), CD27, ICOS, 및/또는 CD28로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 세포 활성화제는 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 또는 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단에 접합되거나 흡수된다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 T 세포 자극 화합물, CAR 항원 결합 도메인에 대한 항-개별특이형 항체, 및/또는 종양 항원이다. 일부 구현예에서, T-세포 자극 화합물은 IL-2, IL-15, 항-CD2 mAb, 항-CD3 mAb, 항-CD28 mAb, 신생항원 펩티드, 공유 항원으로부터의 펩티드, 예컨대 TRP2, gp100, 종양 세포 용해물, CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR 및/또는 MAGE A3 TCR이다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 CD3/TCR 복합체 및/또는 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하고, 선택적으로 세포 활성화제는 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하는 다중특이적 결합 분자이다. 일부 구현예에서, 세포 활성화는 표 20에 제공된 서열로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단 또는 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단 표면 상의 지질 외피에 접합된다. 일부 구현예에서, 조성물은 사이토카인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 메조다공성 실리카 입자의 제1 또는 제2 집단에 접합되거나 흡착된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, 또는 전환 성장 인자 베타(TGF-β), 또는 이의 효능제, 이의 모방체, 이의 변이체, 이의 기능적 단편, 또는 이의 조합이다.
또한 세포 동원 인자를 포함하는 생체물질; 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애 또는 질병을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, 성분은 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자를 포함하는 생체물질이 먼저 투여된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 막대의 제1 집단, 바이러스 벡터, 및 선택적으로 세포 활성화제는 동시에 그리고 선택적으로 생체물질 이후에 투여된다.
또한 생체물질 및 세포 동원 인자; 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애 또는 질병을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, 성분은 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서는, 생체물질 및 세포 동원 인자가 먼저 투여된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 막대의 제1 집단, 바이러스 벡터, 및 선택적으로 세포 활성화제는 동시에 그리고 선택적으로 생체물질 및 세포 동원 인자 이후에 투여된다.
또한 생체물질 및 분자(예를 들어, VEGF-C, IL-2, IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), GM-CSF, CXCL12, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10 또는 CXCL11); 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애 또는 질병을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, 성분은 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서는, 생체물질 및 분자가 먼저 투여된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 막대의 제1 집단, 바이러스 벡터, 및 선택적으로 세포 활성화제는 동시에 그리고 선택적으로 생체물질 및 분자 이후에 투여된다.
일부 구현예에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, 엽산 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 파단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 종양 항원을 발현하는 암을 갖는다.
일부 구현예에서, 생체물질은 하이드로겔, 선택적으로 크리오겔을 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 젤라틴, 히알루론산, 콜라겐, 알기네이트, 라미닌, 키토산, 실크 피브로인, 아가로스, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리비닐 알코올 및/또는 하이드록시에틸 메틸아크릴레이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔을 포함하는 조성물은 라포나이트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 지름이 약 10 내지 300 μm, 선택적으로 약 50 내지 300 μm인 기공을 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 화학적으로 가교된다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 선택적으로 면역 세포, 선택적으로 T-세포 및/또는 NK-세포를 동원한다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 CCL19, CXCL9, CXCL10, XCL1, IL-2, IL-7, CCL21, GM-CSF, CCL17, CCL22, CCL20, CCL27, IL-15, 림프독소 알파, 림프독소 베타, VEGF-C, FLT3L, G-CSF, PDGF, S100A8/A9, CSF-1, CXCL8, CCL20, CCL17, CCR5, CCR6, CCL2, VEGF, 안지오포이에틴-2, PGE2, LTB4, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CXCL12로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 미성숙 VEGF-C 프로펩티드 또는 성숙 VEGF-C 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 마이너 성숙 형태 또는 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 야생형 마이너 성숙 형태 또는 야생형 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 변형된 마이너 성숙 형태 또는 변형된 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 시스테인 137에서의 돌연변이(예를 들어, C137A)를 포함하는 변형된 마이너 성숙 형태 또는 시스테인 137에서의 돌연변이(예를 들어, C137A)를 포함하는 변형된 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 C137A 돌연변이를 포함하는 변형된 마이너 성숙 형태 또는 C137A 돌연변이를 포함하는 변형된 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 이량체 또는 단량체로 존재한다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 각각의 단량체에 C137A 돌연변이를 추가로 포함하는 메이저 성숙 형태의 이량체이다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 각각의 단량체에 C137A 돌연변이를 추가로 포함하는 마이너 성숙 형태의 이량체이다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 표 18로부터 선택되며, 선택적으로 his 태그는 서열에 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 유효량, 선택적으로 약 1 mg 이하, 약 10 mg 이하, 약 10 μg 이상, 약 1 μg 이상, 약 1 μg 내지 1 mg, 약 10 μg 내지 1 mg, 약 1 μg 내지 10 mg, 또는 약 10 μg 내지 10 mg의 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단은 표면 변형된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 상의 표면 변형은 선택적으로 C1 내지 C20 알킬 또는 (-O(CH2-CH2-)1-25 링커를 사용하는, -OH(하이드록실), 아민, 카복실산, 포스포네이트, 할라이드, 아지드, 알킨, 에폭시드, 설프하이드릴, 폴리에틸렌이민, 소수성 모이어티 또는 이의 염이다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 상의 표면 변형은 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민이다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 상의 표면 변형은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정된 평균 분자량이 약 1000 내지 20,000 Da, 약 1,200 내지 15,000 Da, 약 1,500 내지 12,000 Da, 약 2,000 Da, 약 3,000 Da, 약 4,000 Da, 약 5,000 Da, 약 6,000 Da, 약 7,000 Da, 약 8,000 Da, 약 9,000 Da 또는 약 10,000 Da인 폴리에틸렌이민이다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 지름이 2 내지 50 nm인 기공을 포함한다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 적어도 약 100 m2/g의 표면적을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 주사 용도에 적합하다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 메조다공성 실리카 막대의 형태이다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단에 접합된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단에 정전기적으로 또는 공유적으로 접합된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 렌티바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 TCR, 하나 이상의 사이토카인, 하나 이상의 케모카인, 억제 분자를 차단하기 위한 shRNA를 인코딩하거나, 뉴클레오티드 서열은 단백질의 발현을 유도하기 위한 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 종양 항원을 표적화하도록 조작된 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, 엽산 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 파단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 종양 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 신호전달 영역 및 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 영역은 41BB(즉, CD137), CD27, ICOS, 및/또는 CD28로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 세포 활성화제는 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 또는 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단에 접합되거나 흡수된다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 T 세포 자극 화합물, CAR 항원 결합 도메인에 대한 항-개별특이형 항체, 및/또는 종양 항원이다. 일부 구현예에서, T-세포 자극 화합물은 IL-2, IL-15, 항-CD2 mAb, 항-CD3 mAb, 항-CD28 mAb, 신생항원 펩티드, 공유 항원으로부터의 펩티드, 예컨대 TRP2, gp100, 종양 세포 용해물, CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR 및/또는 MAGE A3 TCR이다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 CD3/TCR 복합체 및/또는 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하고, 선택적으로 세포 활성화제는 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하는 다중특이적 결합 분자이다. 일부 구현예에서, 세포 활성화는 표 20에 제공된 서열로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단 또는 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단 표면 상의 지질 외피에 접합된다. 일부 구현예에서, 조성물은 사이토카인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 메조다공성 실리카 입자의 제1 또는 제2 집단에 접합되거나 흡착된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, 또는 전환 성장 인자 베타(TGF-β), 또는 이의 효능제, 이의 모방체, 이의 변이체, 이의 기능적 단편, 또는 이의 조합이다.
당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 발명의 특정 구현예에 대한 다수의 균등부를 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등부는 하기 열거된 구현예에 포괄되는 것으로 의도된다.
열거된 구현예
1. (a) 세포 동원 인자를 포함하는 생체물질;
(b) 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단;
(c) 바이러스 벡터; 및
(d) 선택적으로 세포 활성화제를 포함하는 조성물.
2. 구현예 1에 있어서, 생체물질이 하이드로겔, 선택적으로 크리오겔을 포함하는, 조성물.
3. 구현예 2에 있어서, 크리오겔이,
(a) 젤라틴, 히알루론산, 콜라겐, 알기네이트, 라미닌, 키토산, 실크 피브로인, 아가로스, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리비닐 알코올 및/또는 하이드록시에틸 메틸아크릴레이트를 포함하며, 선택적으로 크리오겔은 라포나이트를 추가로 포함하고/하거나;
(b) 지름이 약 10 내지 300 μm, 선택적으로 약 50 내지 300 μm인 기공을 포함하고/하거나;
(c) 화학적으로 가교되는, 조성물.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 세포 동원 인자가 CCL19, CXCL9, CXCL10, XCL1, IL-2, IL-7, CCL21, GM-CSF, CCL17, CCL22, CCL20, CCL27, IL-15, 림프독소 알파, 림프독소 베타, VEGF-C, FLT3L, G-CSF, PDGF, S100A8/A9, CSF-1, CXCL8, CCL20, CCL17, CCR5, CCR6, CCL2, VEGF, 안지오포이에틴-2, PGE2, LTB4, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CXCL12로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 세포 동원 인자가 선택적으로 면역 세포, 선택적으로 T-세포 및/또는 NK-세포를 동원하는, 조성물.
6. 구현예 5에 있어서, 세포 동원 인자가,
(a) T-세포의 동원을 위한 IL-2, IL-7, CCL21, IL-15, GM-CSF 및/또는 VEGF-C; 및/또는
(b) NK 세포의 동원을 위한 CXCL12, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10 및/또는 CXCL11로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 세포 동원 인자가 선택적으로 단량체 또는 이량체로서의 VEGF-C인, 조성물.
8. 구현예 7에 있어서, VEGF-C가 성숙 VEGF-C 펩티드, 선택적으로 각각 이의 마이너 또는 메이저 성숙 형태 또는 돌연변이된 변이체인, 조성물.
9. 구현예 8에 있어서, 성숙 VEGF-C 펩티드가 C137A 돌연변이를 포함하는, 조성물.
10. 구현예 7 내지 9 중 어느 하나에 있어서, VEGF-C가 표 18에 제공된 서열을 포함하고, 선택적으로 his 태그가 서열에 포함되지 않는, 조성물.
11. 구현예 10에 있어서, VEGF-C가 표 18에 제공된 서열 중 하나 이상의 이량체를 포함하고, 선택적으로 his 태그가 서열에 포함되지 않는, 조성물.
12. 구현예 7 내지 10 중 어느 하나에 있어서, VEGF-C가 유효량, 선택적으로 약 1 mg 이하, 약 10 mg 이하, 약 10 μg 이상, 약 1 μg 이상, 약 1 μg 내지 1 mg, 약 10 μg 내지 1 mg, 약 1 μg 내지 10 mg, 또는 약 10 μg 내지 10 mg의 양으로 존재하는, 조성물.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터가 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단에 접합된, 조성물.
14. 구현예 13에 있어서, 바이러스 벡터가 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단에 정전기적으로 또는 공유적으로 접합된, 조성물.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단이 표면 변형되는, 조성물.
16. 구현예 15에 있어서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 상의 표면 변형은 선택적으로 C1 내지 C20 알킬 또는 (-O(CH2-CH2-)1-25 링커를 사용하는, -OH(하이드록실), 아민, 카복실산, 포스포네이트, 할라이드, 아지드, 알킨, 에폭시드, 설프하이드릴, 폴리에틸렌이민, 소수성 모이어티 또는 이의 염인, 조성물.
17. 구현예 15에 있어서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 상의 표면 변형이 1 차, 2차, 3차 또는 4차 아민인, 조성물.
18. 구현예 15에 있어서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 상의 표면 변형은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정된 평균 분자량이 약 1000 내지 20,000 Da, 약 1,200 내지 15,000 Da, 약 1,500 내지 12,000 Da, 약 2,000 Da, 약 3,000 Da, 약 4,000 Da, 약 5,000 Da, 약 6,000 Da, 약 7,000 Da, 약 8,000 Da, 약 9,000 Da 또는 약 10,000 Da인 폴리에틸렌이민인, 조성물.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 렌티바이러스인, 조성물.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터가 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 조성물.
21. 구현예 20에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 TCR, 하나 이상의 사이토카인, 하나 이상의 케모카인, 억제 분자를 차단하기 위한 shRNA를 인코딩하거나, 뉴클레오티드 서열이 단백질의 발현을 유도하기 위한 mRNA를 포함하는, 조성물.
22. 구현예 21에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 종양 항원을 표적화하도록 조작된 폴리펩티드를 인코딩하는, 조성물.
23. 구현예 22에 있어서, 종양 항원이 TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, 엽산 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 파단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
24. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 벡터가 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 신호전달 영역 및 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 인코딩하는, 조성물.
25. 구현예 24에 있어서,
(a) 항원 결합 도메인이 CD19, CD123, CD22, CD20, EGFRvIII, BCMA, 메소텔린, CD33, CLL-1 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 항원에 결합하고/하거나;
(b) 막관통 도메인이 CD8 힌지를 포함하고/하거나;
(c) 공동자극 신호전달 영역이 4-1BB 또는 CD28 공동자극 신호전달 도메인으로부터 선택되고/되거나;
(d) 신호전달 영역이 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는, 조성물.
26. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 세포 활성화제가 T 세포 자극 화합물, CAR 항원 결합 도메인에 대한 항-개별특이형 항체, 또는 종양 항원인, 조성물.
27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 세포 활성화제가,
(a) CD3/TCR 복합체 및/또는 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하고/하거나;
(b) CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하는 다중특이적 결합 분자이고/이거나;
(c) 표 20에 제공된 서열 및/또는 도 37에 따른 하나 이상의 포맷으로 제공된 서열을 포함하는, 조성물.
28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 세포 활성화제가 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단, 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단, 또는 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단의 표면 상 지질 외피에 접합되거나 흡착된, 조성물.
29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 메조다공성 실리카 입자가 메조다공성 실리카 막대인, 조성물.
30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 메조다공성 실리카 입자가 지름이 2 내지 50 nm인 기공을 포함하는, 조성물.
31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 메조다공성 실리카 입자가 적어도 약 100 m2/g의 표면적을 갖는, 조성물.
32. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 주사 용도에 적합한 조성물.
33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 생체내에서 세포를 형질도입하는 방법으로서, 각각의 성분이 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
34. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애 또는 질병을 치료하는 방법으로서, 각각의 성분이 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
35. 구현예 34에 있어서, 질환, 장애 또는 질병이 암인, 방법.
도 1은 메조다공성 실리카 입자 상의 일련의 표면 변형을 나타낸다.
도 2는 바이러스 외피 단백질(VSV-G) 위형(pseudotyped) 렌티바이러스를 MSR에 흡착시킨 후 MSR 표면에서의 VSV-G에 대한 염색 결과를 나타낸다. 대조군 MSR은 상단 패널에 제시하고, 바이러스 인큐베이션된 막대는 하단 패널에 제시한다.
도 3은 MSR에 대한 바이러스 흡착 및 T 세포의 형질도입의 개략도이다.
도 4는 유리 렌티바이러스 또는 MSR-결합 렌티바이러스와 인큐베이션된 T 세포에 의한 GFP 발현의 결과를 제공한다. 40 μg/ml의 시작 농도로부터의 바이러스-코팅 MSR의 희석도는 표시된 바와 같다. "1x 렌티" 조건은 MSR 조건으로 인큐베이션된 바이러스의 양에 해당한다. "2x 렌티" 조건은 MSR 조건을 코팅하기 위해 사용된 양의 2배에 해당한다.
도 5는 MSR 표면의 리간드 제시를 위한 전체 전략의 개략도를 제공한다. 리포좀은 MSR과 함께 인큐베이션되어 지지된 지질 이중층을 형성한다. 리간드는 스트렙타비딘-비오틴 상호작용을 사용하여 MSR-지질 이중층에 커플링될 수 있다.
도 6은 1 mol%의 PE-카복시플루오레신을 함유하는 POPC 리포좀으로 코팅된 MSR의 사진을 나타낸다. 명시야(왼쪽), 형광(중간) 및 중첩(오른쪽) 이미지를 나타낸다.
도 7은 EGFRvIII CAR-결합 펩티드(LEEKKGNYVVTDH(SEQ ID NO: 756))의 펩티드 서열을 도시한다.
도 8은 MSR 상의 펩티드 고정화에 의한 EGFRvIII CART의 사이토카인 생산을 예시한다. 결과는 대조군 조건 대조군 조건과 비교하여 EGFRvIII-CAR 결합 펩티드를 제시하는 지질-코팅 MSR(지질 코팅 내 1% PE-비오틴)에 의해 자극된 EGFRvIII CART의 인터페론-감마 및 인터루킨-2 생산을 제공한다.
도 9는 MSR 상의 펩티드 고정화에 의한 EGFRvIII CART의 증식을 예시한다. 0.01% PE-비오틴의 지질-코팅 MSR 조성물이 펩티드 고정화를 위해 사용되었고, MSR 농도는 웰 내에서 30 μg/ml이었다. 표시된 조건 하에 배양 제7일에 세포 계수를 수행하였다.
도 10a 및 도 10b는 MSR 상의 펩티드 고정화에 의한 EGFRvIII CART의 증식 및 최종 세포 조성을 예시한다. 시작 MSR 농도는 50 μg/ml이었고, 이 시작 농도로부터의 MSR의 희석도는 축에 표시된 것과 같다. 도 10a는 표시된 물질을 사용한 배양 기간 종료 시의 CD4 및 CD8 T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 10b는 MSR 표면 상에 항-CD28을 갖거나 갖지 않는 다양한 양의 EGFRvIII CAR-결합 펩티드를 갖는 MSR을 사용하여 3일 배양 기간 동안 CFSE를 희석하는 CD8+ 및 CD4+ CAR T 세포의 FACS 분석을 도시한다.
도 11a 및 도 11b는 MSR 상의 BCMA 단백질 고정화에 의한 BCMA CART의 증식 및 최종 세포 조성을 예시한다. 시작 MSR 농도는 50 μg/ml이었고, 이 시작 농도로부터의 MSR의 희석도는 축에 표시된 것과 같다. 도 11a는 표시된 물질을 사용한 배양 기간 종료 시의 CD4 및 CD8 T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 11b는 MSR 표면 상에 항-CD28을 갖거나 갖지 않는 다양한 양의 EGFRvIII CAR-결합 펩티드를 갖는 MSR을 사용하여 3일 배양 기간 동안 CFSE를 희석하는 CD8+ 및 CD4+ CAR T 세포의 FACS 분석을 실증한다.
도 12는 일부 구현예에 따라 MSR을 사용하여 자극되지 않은 인간 T 세포의 동시 자극 및 형질도입의 개략도를 제시한다. MSR의 하기 두 집단이 생성된다: 1) T 세포를 자극하기 위한 효능적 CD3/CD28 항체를 제시하는 MSR, 2) T 세포로의 바이러스 전달을 용이하게 하기 위한, 렌티바이러스와 결합된 양으로 하전된 PEI-MSR. 두 가지 유형의 MSR을 상이한 비로 함께 혼합하여 T 세포가 노출되는 자극 및 바이러스의 양을 조정할 수 있다.
도 13은 바이러스와 인큐베이션된 자극(항-CD3/CD28 항체-고정화 MSR) 및 PEI-MSR에 노출된 T 세포의 형질도입 효율을 예시한다. T 세포는 상이한 양의 자극 막대(자극 1.00은 70 μg/ml의 MSR을 나타냄)와 인큐베이션되고, PEI-MSR에 결합되거나 유리 바이러스 형태의 상이한 감염 다중도(MOI)를 갖는 GFP-렌티바이러스에 노출되었다. 바이러스 조건에서 MSR의 최고 농도는 22 μg/ml이었다.
도 14는 바이러스와 인큐베이션된 자극(항-CD3/CD28 항체-고정화) MSR 및 PEI-MSR에 노출된 T 세포의 형질도입 효율을 예시한다. 그래프는 다양한 총량의 바이러스에서 자극성 MSR 농도의 함수로서 형질도입 효율을 나타낸다. 자극 MSR 조건 1.0의 MSR 농도는 70 μg/ml이다. PEI MSR 조건 1에서 MSR의 농도는 22 μg/ml이다. 형질도입은 배양 개시 3일 후 평가되었다.
도 15는 형질도입 효율을 위한 바이러스 전달 전략의 비교 결과를 제공한다. "PEI" 및 "유리" 조건에서, T 세포가 MSR에 결합된(MSR 농도 70 μg/ml) "높은" 수준의 CD3/CD28 항체로 자극되었고, 각각 PEI-MSR과 회합된 바이러스 또는 배지 중 자유롭게 전달되는 바이러스가 제공되었다(바이러스 농도 1.0은 22 μg/ml의 MSR을 함유함, MOI 약 6.7). "PEI+CD3/CD28"에서, 바이러스 및 CD3/CD28 효능적 항체는 PEI-MSR에 결합되었다(농도 1.0은 22 μg/ml MSR임). 형질도입은 배양 개시 3일 후 평가되었다.
도 16은 PBMC 집단에서 형질도입을 위한 다양한 전달 전략의 비교 결과를 제공한다. 도 15에서와 같은 조건이 PBMC에 추가되었다. 각 세포 유형에서 형질도입된 세포의 비율이 정량되었다. 형질도입은 배양 개시 3일 후 평가되었다.
도 17은 다양한 바이러스 전달 전략을 갖는 PBMC에서의 상이한 형질도입 분획을 제공한다. 상단 패널은 도 15의 조건 하에 PBMC 집단에 존재하는 총 세포 조성을 제공한다. 하단 패널은 도 15의 조건을 사용한 바이러스 전달 후 존재하는 형질도입된 세포 분획의 조성을 제공한다. 형질도입은 배양 개시 3일 후 평가되었다.
도 18은 암 치료제로서 사용하기 위한 본원에 개시된 조성물의 비제한적인 예시적 개략도를 제공하며, (a)는 기존 피부 림프 모세관의 림프관신생을 유도하는 성장 인자 VEGF-C의 전달을 도시하고; (b)는 생성된 림프 내피 세포가 면역 세포(주로 나이브 T 세포)를 혈액 순환에서 겔 상단의 진피로 유인하는 케모카인(예를 들어, CCL21)을 분비하는 것을 도시하고; (c)는 T 세포가 이 프라이밍 부위로 동원된 후, T 세포를 교육하는 림프 내피 세포를 도시하며, 이론에 구애되지 않고, 본 출원인은 이러한 교육이 높은 비율의 줄기 세포 기억 표현형을 생성할 수 있으며, 이는 다시 형질도입되면 더 강력한 세포가 될 수 있다고 여긴다; (d)는 전신 확산을 방지하기 위해 메조다공성 실리카 막대와 조합되어 전달되는 하나 이상의 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 렌티바이러스를 도시하며, 이론에 구애되지 않고, 본 출원인은 바이러스의 국소 배치가 국소적으로 동원된 T 세포의 형질도입을 선호할 수 있으며 활성화가 형질도입을 추가로 개선하고 누출 및 원하지 않는 세포의 형질도입을 방지할 수 있다고 여긴다; (e) 및 (f)는 피부 림프, 림프절 및 흉관을 통해 전신 순환계로 되돌아가는 형질도입되고 교육된 세포를 도시하며, 이론에 구애되지 않고, 본 출원인은 이러한 세포가 종양 항원에 반응하여 더 증대할 것이라고 여긴다.
도 19a 내지 도 19c는 다양한 VEGF-C 단백질 변이체의 특징을 제시한다. 도 19a는 천연 및 변형된 VEGF-C 둘 모두의 개략도를 제공한다. 미성숙 VEGF-C(#1)는 일반적으로 N-말단 및 C-말단 프로펩티드 서열과 함께 세포내에서 발견된다. 일단 방출되면, VEGF-C 단백질은 단백분해 절단을 겪고 이량체 또는 단량체 형태의 마이너 또는 메이저 성숙 형태(#2, #7)로서 세포외 공간에 존재한다. 메이저(#9) 및 마이너 성숙(#8) 형태의 안정화된 이량체는 C137A 돌연변이를 서열에 삽입하여 조작되었다. 마이너 성숙 형태와 메이저 성숙 형태 사이의 주요 차이점은 마이너 성숙 형태 N-말단에 추가의 짧은 프로펩티드 서열이 존재한다는 것이다. 이론에 구애되지 않고, 본 출원인은 추가의 짧은 프로펩티드가 HEK293T 및 CHO MaKo 세포 둘 모두에서 이량체 형성뿐만 아니라 단백질 발현을 촉진하는 것으로 나타난다고 여긴다. 도 19b는 정제된 VEGF-C 변이체가 로딩된 비-환원(NR) 및 환원 조건(R) 하에서 전기영동된 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 도시한다. 상응하는 VEGF-C 변이체를 갖는 웰의 상세사항을 도 19c에 나타내며 이량체(**) 및 단량체(*)의 존재는 별표로 표시되었다. 전장 프로펩티드를 갖는 미성숙 VEGF-C(#1)는 일부 불순물(웰 2 및 3) 중에서 이량체로서 생산되며; 프로펩티드의 제거는 2개의 메이저 성숙 VEGF-C 형태(#2), 하나의 비공유 이량체 형태(웰 5, 6) 및 단량체 형태(웰 8, 9)의 생산을 야기하고; #2에 돌연변이 C137A를 부가하면 공유 이량체(웰 21, 22) 및 단량체 형태(웰 24, 25)의 생산을 야기한다. 짧은 N-말단 프로펩티드는 비공유 이량체(웰 11, 12) 또는 단량체 형태(웰 15, 16)로 마이너 성숙 VEGF-C 형태(#7)를 생성하기 위해 단백질에 부착된 상태로 남는다. 이론에 구애되지 않고, 본 출원인은 #7 VEGF-C에 대한 C137A 돌연변이가 대규모 생산에 적합할 수 있는 VEGF-C 이량체만의 생산(웰 18, 19)을 야기한다고 결정하였다. 행 1, 4, 7, 10, 13, 14, 17, 20, 23 및 26은 kDa 단위의 분자량 마커를 나타낸다.
도 20a 내지 도 20c는 다양한 VEGF-C 변이체를 이용한 HDLEC 발아 검정의 결과를 나타낸다. 이량체 VEGF-C 형태는 우수한 시험관내 활성을 실증하는 것으로 나타났다. 도 20a는 VEGF-C 변이체의 생물학적 활성을 시험하기 위한 인간 진피 림프 내피 세포(HDLEC)에 대한 시험관내 발아 검정의 실험 설정을 도시한다. 인큐베이션 후 세포는 도 20b에서 WT-8 검정에 의해 증식에 대해 평가되었고 도 20c에서 팔로이딘 염색 후 관 형성에 대해 이미지화되었다. 관 형성 이미지는 메이저 및 마이너 성숙 형태(#2, 7, 8, 9)가 미성숙 형태(#1)보다 HDLEC의 발아를 더 잘 자극함을 나타낸다. 이론에 구애되지 않고, 이량체 형태(#2D, 7D, 8D, 9D)의 우수한 발아 활성이 이들을 단량체 형태(#2M, 7M, 9M)보다 바람직하게 만드는 것으로 여겨진다.
도 21a 내지 도 21d는 알기네이트 크리오겔 제형물로부터의 VEGF-C의 방출 속도뿐만 아니라 이것이 마우스에 피하 주사될 수 있다는 개념 증명을 나타낸다. 도 21a는 알기네이트 크리오겔 제조의 비제한적인 예시적 개략도를 제공한다. 알기네이트 액체 예비중합체는 라포나이트 및 관심 단백질과 혼합된 다음 냉동되고 주사 전에 다시 해동되어 다공성 매트릭스를 생성한다. 도 21b는 상이한 유형의 알기네이트 겔: 알기네이트 나노다공성(기공이 형성되지 않도록 동결겔화 전에 겔화가 발생함), 알기네이트 크리오겔(냉동 및 동결겔화 후, 다공성), 및 0.25% 라포나이트를 갖는 알기네이트 크리오겔에 의한 시험관내 VEGF-C 방출의 조절을 나타낸다. 0.25% 라포나이트 알기네이트 크리오겔은 시험관내 VEGF-C 단백질의 제어되고 오래 지속되는 방출을 나타낸다. 도 21c는 10 μg 또는 50 μg VEGF-C가 로딩된 0.25% 또는 0.5% 라포나이트 알기네이트 크리오겔로부터의 시험관내 VEGF-C 방출 프로파일의 조절을 나타낸다. 총 VEGF-C의 30%가 겔에서 방출되고 제어 방출 프로파일을 제공하며, 생체내 작업을 위해 0.25% 라포나이트 알기네이트 크리오겔이 선택되었다. 도 21d는 16G 바늘로 마우스에 피하 주사된 크리오겔을 도시하는 이미지이다.
도 22a 내지 도 22c는 나이브 마우스 피부에서 VEGF-C에 의한 생체내 림프관신생의 유도를 도시한다. 이론에 구애되지 않고, 마이너 성숙 공유 이량체 VEGF-C는 우수한 효능을 갖는 것으로 나타난다. 도 22a는 생체내 실험 설정을 도시하고 도 22b는 크리오겔 임플란트 14일 후 수행된 피부 분해 후 유세포측정에 의한 림프 내피 세포(CD45-, CD31+, PDPN+)의 염색에 의해 평가된 생체내 림프관신생을 나타내는 대표적 점 그래프를 나타낸다. 도 22c에서는, 림프 내피 세포수/mg으로서 염색 후 정량된 마우스 피부에서의 림프관신생. 공유 이량체(#8, #9)는 높은 생체내 림프관신생을 나타낸다. 따라서 #8이 추가 실험에 사용되었다. PDPN: 포도플라닌.
도 23a 내지 도 23e는 피부 림프가 알기네이트 크리오겔에 의해 전달된 10 μg VEGF-C(#7 변이체, SEQ ID NO: 734)에 반응하고 크리오겔 임플란트 14일 후 림프관신생이 최대가 되며, 이는 C57/BL6 마우스의 나이브 피부에서 최대 면역-침윤에 해당한다. 도 23a는 알기네이트 크리오겔(1, 10, 20, 50 μg)에 로딩된 VEGF-C의 생체내 용량 반응 및 림프관신생 유도(총 림프 내피 세포(LEC)수/mg 조직으로 표시됨, 상단 그래프) 및 10 μg VEGF-C 전달 후 림프관신생의 시간 경과(하단 그래프)를 도시한다. 이러한 결과는 10 μg의 VEGF-C가 높은 생체내 림프관신생을 유도하고 최대 림프관신생이 피하 크리오겔 전달 14일 후 관찰됨을 표시하였다. 도 23b 겔 임플란트 14일 후 C57/BL6 마우스의 피부 분해 후 단리된 LEC(CD45-CD31+PDPN+) 및 혈액 내피 세포(BEC, CD45-CD31+PDPN-) 염색의 대표적 그래프. 도 23c 총 세포수/mg 조직으로서의 내피 세포의 정량. 도 23d CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 총 세포수/mg 조직으로 표시된 정량. LEC수는 특히 나이브 표현형(CD62L+, CD44-)을 갖는, T 세포 침윤과 관련이 있다. 막대 그래프는 VEGF-C 및 대조군 조건, VEGF-C n=30, 대조군 n=18, 나이브 n=3에 대해 풀링된 5개의 독립적인 실험을 포함하고 평균+SEM, 만-휘트니 비모수 t-시험으로 표시된다. ****, p<0.0001; **, p<0.01. 도 23e는 VEGF-C 알기네이트 크리오겔 주사 후 수일에 걸쳐 조직 mg당 표시된 세포 유형(LEC, CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포)의 정량을 나타낸다.
도 24a 내지 도 24c는 CHO MaKo 세포에서 생산된 VEGF-C #8이 기능적임을 확인시켜준다. 도 24a에서, HDLEC 시험관내 발아 검정은 HEK293T 세포에서 생산된 #8과 비교하여 CHO 세포에서 생산된 VEGF-C 단백질 #8(8CHO)의 필적하는 활성을 나타낸다. 도 24b에서, 크리오겔 전달 14일 후의 피부 분해 후 LEC를 염색함으로써 필적하는 생체활성이 생체내에서도 확인되었다. 도 24c는 블랭크 크리오겔 또는 #8HEK 또는 #8CHO VEGF-C가 로딩된 크리오겔을 주사한 마우스에서 총 LEC수/mg 조직으로서의 림프관신생의 정량을 나타낸다. BEC(CD45-CD31+PDPN-)는 VEGF-C #8 전달에 의해 영향을 받지 않는 반면, 최대 림프관신생은 크리오겔 전달 후 제14일에 크리오겔 상단의 피부에서 CD4 및 CD8 T 세포(CD45+)의 최대 면역 침윤에 해당한다. n>9. 평균+SEM, CHO 대 대조군, HEK 대 대조군 또는 CHO 대 HEK 사이의 만-휘트니 비모수 t-시험으로 표시된 막대 그래프, ****, p<0.0001; **, p<0.01
도 25a 내지 도 25c는 VEGF-C가 또한 면역손상된 NSG 마우스에서 림프관신생을 유도하고 마우스 LEC가 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 효율적으로 동원함을 실증한다. 도 25a는 VEGF-C(변이체 #8, C137A 돌연변이를 갖는 마이너 성숙 형태, SEQ ID NO: 736) 또는 블랭크 크리오겔 전달 14일 후 NSG, C57/BL6 마우스에서 피부 LEC 및 BEC 염색의 대표적 유세포측정 그래프를 제공한다. 도 25b는 NSG 마우스에서의 겔 전달 및 후속 인간 PBMC의 정맥내 주사(제10일)의 실험 설정을 제시한다. 겔 임플란트 후 제17일에 마우스를 안락사시키고 림프관신생 및 피부의 면역 침윤에 대해 분석하였다. 도 25c는 LEC, 총 T 세포(CD45+ CD3+) CD8(CD3+ CD8+) 및 CD4(CD3+ CD4+) T 세포 하위세트뿐만 아니라 B 세포(CD45+CD19+)의 총 수/mg로 표시된 정량을 나타낸다. 이러한 데이터는 T 세포가 NSG 마우스에서 동원된 PBMC의 주요 세포 유형임을 실증한다.
도 26a 내지 도 26b는 MSP-결합 스타터(예를 들어, 균질화 MSR-결합 스타터)와 조합된, 메조다공성 실리카 입자(MSP), 예를 들어 균질화 메조다공성 실리카 막대(MSR)에 결합된 바이러스 입자(도 26a) 또는 MSP-결합 스타터(예를 들어, 균질화 MSR-결합 스타터)와 조합된 유리 바이러스(도 26b)의 주사 후 교육 및 형질도입될 T 세포에 대한 2차 프라이밍 부위를 생성하는 마우스 피부에서의 VEGF-C 전달의 개략도를 제공한다.
도 27a 내지 도 27b는 CD 19 CAR 인코딩 렌티바이러스를 이용한 MSP, 특히 균질화 MSR 로딩 용량의 특성규명을 제공한다. 트리메틸암모늄 MSR은 세포 기반 형질도입 검정에 의해 결정된 기능적 역가에 따라 다양한 양으로 GFP-발현 렌티바이러스와 공동-인큐베이션되었다. 3개 분획에서의 바이러스 양 - 바이러스 로딩 용액(MSR에 첨가된 초기 투입물), MSR-결합 바이러스(인큐베이션 및 세척 후 MSR에 결합된 남아 있는 양), 및 결합되지 않은 바이러스(MSR 및 바이러스의 공동-인큐베이션 및 세척 후 남아 있는 용액의 양)이 특성규명되었다. MSR 및 바이러스가 얼음 위에서 30분 동안 공동-인큐베이션되고, 상청액이 제거되고(결합되지 않은 바이러스) MSR-결합 바이러스를 평가하기 전에 MSR이 2회 세척되었다. 각각의 조건 그대로의 바이러스 로딩 용액도 분석하였다. 도 27a에서, 결과는 투입 바이러스 로딩 용액 내 대부분의 바이러스가 흡착 및 세척 후에 MSR-결합 바이러스 분획에 유지됨을 나타낸다. MSR에 흡착된 바이러스의 양은 바이러스 로딩 용액 내 바이러스 양에 따라 증가한다. 도 27a는 바이러스 로딩 용액에 비해 MSR-결합 바이러스의 계산된 분획이 MSR 상에 강력한 로딩 및 흡착 및 세척 후 보유 효율을 가짐을 나타낸다.
도 28은 MSP, 특히 균질화 MSR 상의 바이러스 보유의 특성규명을 제공한다. 렌티바이러스 및 MSR이 얼음 위에서 30분 동안 공동-인큐베이션되고 MSR이 두 번 세척되었다. 그런 다음 MSR이 10% FCS 또는 OpTmizer 무혈청 배지를 함유하는 R10 배지에서 배양되고 투입 바이러스 스톡도 배지에서 인큐베이션되었다. 인큐베이션 시작 후 표시된 시간에 상청액이 제거되고 총 바이러스 함량에 대해 분석되었다. 결과는 MSR이 처음 18시간 동안 투입 바이러스의 일부만 방출함을 표시한다.
도 29a 내지 도 29c는 CD19 CAR(CAR19) 인코딩 바이러스에 결합된 MSP, 특히 균질화 MSR을 사용한 CAR-T 세포의 기능적 생성을 나타낸다. CART는 유리 렌티바이러스(CAR-유리) 또는 트리메틸암모늄 MSR에 결합된 렌티바이러스(CAR-MSR)로 생성되었다. CAR-유리 형질도입에 사용된 MOI 및 CAR-MSR 조건에서 MSR에 대한 흡착에 사용된 총 바이러스의 MOI가 표시된다. 이러한 MOI는 두 조건 사이에서 유사한 형질도입 효율을 갖는 CART를 생산하도록 선택되었다. MSR은 흡착 단계 후에 세척되었으므로 MSR 조건에서 T 세포의 형질도입에서 바이러스의 총량은 표시된 것보다 낮은 MOI에서 발생할 수 있다. MSR 1 mg당 4.3e6 TU/바이러스가 세척 및 T 세포를 이용한 플레이팅 전에 MSR 및 바이러스의 공동-인큐베이션에 사용되었다. T 세포가 작제물 4(표 20, 도 38a 내지 도 38b) 및 지시된 바이러스 조제물로 1일 동안 처리된 후, 세척 및 추가 3일 동안 배양되었다. 도 29a는 형질도입 후 제4일에 측정된 CAR+%를 나타낸다. 세포는 형질도입 후 제4일에 Nalm6-Luc 세포를 사용한 사멸 검정에 사용되었고, 총 세포 및 CAR+ 세포에 대해 표준화 후 표시된 효과기:표적(E:T 비; T 세포)으로 공동-인큐베이션되었다. 결과는 도 29b 특이적 사멸 활성 및 도 29c 24시간 동안의 공동-인큐베이션 동안 인터페론-감마 방출이 CAR-MSR 및 CAR-유리 간 필적하였음을 표시하여, MSR을 사용한 제형화에 의한 형질도입이 종래의 유리 바이러스 형질도입과 비교하여 시험관내 동등하게 기능적인 CART를 생산함을 나타낸다.
도 30a 내지 도 30b는 균질화에 의한 크기 감소를 통해 MSR 주입성이 개선되었음을 실증한다. MSR은 이의 크기를 줄이고 주입성을 개선하기 위해 비드 믹서를 사용하여 균질화되었다. 도 30a에서, MSR 길이 측면에서 크기 감소가 나타났고, 이것은 더 작은 지름의 바늘을 통해 피내 공간으로의 주사를 허용하였다. 도 30a에서, 표준 트리메틸암모늄 MSR 또는 균질화 MSR이 렌티바이러스로 흡착되고 이 복합체의 일련의 희석액을 생성되어 GFP-인코딩 렌티바이러스로 T 세포를 형질도입하기 위해 사용되었다. MSR의 균질화는 시험관내 형질도입 성능을 실질적으로 변경하지 않았다.
도 31a 내지 도 31b는 인접한 크리오겔 및 MSP, 특히 균질화 MSR을 함유하는 피부의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 절편을 도시한다. 블랭크 알기네이트 크리오겔이 피하 주사되고 7일 후 유리 또는 MSR에 결합된 바이러스 입자(4e6 TU)가 인슐린 주사기(MSR-바이러스 군의 경우) 또는 해밀턴 주사기(유리 바이러스의 경우)로 겔 상단의 피내 공간에 주사되었다. 바이러스 전달 72시간 후, 마우스가 안락사되고, 면역조직화학 분석을 위해 조직(피부 및 배액 림프절)이 수확되었다. 림프 모세관으로 VEGF-C의 전달을 용이하게 하기 위해, 크리오겔이 지방층 근육 상단의 높은 피하 공간에 임플란트되었다. H&E 염색 절편을 도시하는 도 31a는 피하조직의 지방층 근육 표면에 있는 피하 크리오겔의 위치를 실증한다. MSP, 특히 균질화 MSR은 임플란트된 크리오겔에 인접한 진피-피하조직 접합부에 위치한 단핵 세포와 혼합된 약호산구성 과립 물질로 나타났다(도 31a 및 클로즈업을 위해 도 31b).
도 32a 내지 도 32b는 피부 절편 상의 CAR mRNA에 대한 원 위치 혼성화를 나타낸다. CAR mRNA 전사체를 검출하기 위한 원 위치 혼성화는 MSR-결합 바이러스가 주사된 마우스에서 주사된 MSP, 특히 균질화 MSR에 해당하는 영역 내에서 강력한 신호를 실증한 반면(도 32a), 유리 바이러스 조건에서는 겔에 침윤하는 세포뿐만 아니라 이에 인접한 세포에서 확산 신호를 검출하였다(도 32b). 이론에 구애되지 않고, 본 출원인은 이러한 데이터가 MSP, 특히 균질화 MSR이 T 세포가 피부에 침윤하는 진피에 편재된 바이러스를 유지할 수 있다는 개념을 뒷받침한다고 여긴다.
도 33a 내지 도 33b는 MSP-바이러스, 특히 균질화 MSR-바이러스가 주사된 마우스가 유리 바이러스 군에 비해 배액 림프절에서 더 적은 CAR mRNA 전사체 양성 세포를 가짐을 나타낸다. 배액 림프절(dLN) 절편에서 CAR mRNA에 대한 원 위치 혼성화. 원 위치 혼성화는 MSR-결합 바이러스가 주사된 마우스의 dLN 내에서 단 하나의 CAR mRNA 전사체 양성 세포를 검출한 반면(도 33a), 유리 바이러스가 주사된 마우스는 크리오겔 임플란트 부위로부터 바이러스 또는 세포의 국소 배액과 일치하게 국소 피막하동에서 CAR mRNA 전사체 양성 세포를 거의 나타내지 않았다(도 33b).
도 34a 내지 도 34c는 생체내 CD19+ CART 세포의 생성 및 비장에서의 B 세포 고갈을 나타낸다. 도 34a는 생체내 CART 제조의 실험 설정을 위한 타임라인을 제공한다. 제0일에 VEGF-C 로딩된 알기네이트 크리오겔이 NSG 마우스에 피하 주사되었다. 제10일(최대 림프관신생이 달성되는 것을 알기 3일 전)에 PBMC가 마우스에 정맥내 주사되고 7일 후(제17일) MSP-바이러스(특히 균질화 MSR-바이러스), 유리 바이러스 또는 대조군으로서 PBS가 T 세포 활성화를 촉진하고 T 세포 형질도입을 촉진할 수 있도록 MSP-스타터, 특히 균질화 MSR-스타터와 함께 각각의 군에 주사되었다. 제35일에 마우스가 안락사되고 비장, 혈액 및 캔이 수집되어 생체내 CD19 CAR 인코딩 바이러스 전달이 VEGF-C 유도 림프관신생에 의해 동원된 T 세포의 형질도입을 유발하는지 여부를 결정하였다. 도 34b는 유리 바이러스 또는 MSP-바이러스, 특히 균질화 MSR-바이러스로 처리된 마우스의 비장에서 B 세포 고갈 및 T 세포 형질도입(CD19 CAR+ 세포)을 나타내는 면역 집단의 대표적 유세포측정(FACS) 그래프를 제공한다. 도 34c는 모든 군의 마우스 비장에서 B 세포 고갈 및 CAR-T 세포의 정량이다.
도 35는 조성물에 의한 비-T 세포의 최소 형질도입을 실증한다. 유리 바이러스 또는 MSP-바이러스, 특히 균질화 MSR-바이러스 또는 PBS 대조군으로 처리된 마우스의 비장에서 인간 CD11b+ 단핵구, 마우스 단핵구(NSG 마우스에서 비기능적임)뿐만 아니라 기질 세포의 대표적 유세포측정(FACS) 그래프가 제공된다. CD 19 CAR에 대해 양성 염색을 나타낸 인간 단핵구 세포는 거의 없었다.
도 36a 내지 도 36b는 B 세포 고갈이 비장 및 혈액에서 CAR-T 세포 증대와 상관관계가 있음을 나타낸다. 도 36a에서, CART 세포(총 수/mg 조직)는 비장에서 B 세포(총 수/mg 조직) 대비 도시되고, 도 36b에서, CART 세포(혈액, 총 세포수/μl로 표시됨)는 B 세포 고갈(비장, 총 세포수/mg 조직으로 표시됨) 대비 도시된다.
도 37a 내지 도 37c는 단일 이중특이적 항체 도식(도 37a), 다량체 이중특이적 항체 도식(도 37b) 및 도면 범례(도 37c)를 포함하는 이중특이적 항체에 대한 예시적인 도식을 제공한다.
도 38. 임플란트 부위에서 T 세포가 동원된다. 도 38은 바이러스 전달 18일 후 크리오겔-VEGF-C 임플란트와 MSP-바이러스 및 MSP-스타터를 제공받은 마우스 피부에서 CD3의 IHC 분석의 실험 설정(위) 및 대표적 이미지(아래)를 나타낸다.
도 39. 겔을 둘러싼 단핵 세포의 CAR ISH 신호. 도 39는 바이러스 전달 18일 후 크리오겔-VEGF-C 임플란트와 MSP-바이러스 및 MSP-스타터를 제공받은 마우스 피부 세포의 CAR ISH 분석(CD19 CAR RNA)의 대표적 이미지를 나타낸다.
도 40. 국소적으로 생체내 생성된 CAR-T 세포는 비장으로 이동하고 B 세포 고갈과 관련이 있다. 도 40은 바이러스 전달 18일 후 크리오겔-VEGF-C 임플란트와 MSP-바이러스 및 MSP-스타터를 제공받은 마우스 비장 세포의 CAR ISH 분석의 대표적 이미지이다.
도 41a 내지 도 41b. 생체내 CAR-T 세포의 생성은 임플란트 부위 및 비장에서 사멸시키는 B 세포와 관련이 있다. 바이러스 전달 18일 후 크리오겔-VEGF-C 임플란트와 MSP-바이러스 및 MSP-스타터를 제공받은 마우스의 임플란트 부위(도 41a, 형광 이미지 상부 패널 및 명시야 이미지 하부 패널)뿐만 아니라 비장(도 41b)에서 형광 표지된 CD19+ B 세포 및 CD3+ T 세포의 대표적 이미지.
도 42a 내지 도 42b. 시간 경과에 따른 NSG 마우스의 순환 인간 T 세포의 분석. 도 42a는 실험 설계 및 군을 나타낸다. 도 42b는 임플란트된 마우스의 시간 경과에 따른 유세포측정 분석을 나타내는 일련의 그래프이다. 평균 ± SEM으로 표시되는 유세포측정 데이터.
도 43a 내지 도 43b. 순환에서 B 세포 고갈은 CART 세포 증대와 관련이 있다. 임플란트된 마우스의 순환에서 CART 세포(도 43a) 및 B 세포(도 43b)의 시간 경과에 따른 유세포측정 분석. 평균 ± SEM(도 43a 및 도 43b) 또는 각각의 마우스에 대한 개별 곡선(도 43b)으로 표시된 유세포측정 데이터.
도 44a 내지 도 44b. 순환 및 비장에서 B 세포 고갈과 CART 세포 증대의 강한 상관관계. 상이한 조건으로 처리된 마우스의 혈액(도 44a) 및 비장(도 44b)에서 B 세포수와 T 세포수의 상관관계. 세포수는 유세포측정 분석 동안 결정된 혈액에 대한 세포수/mg 조직 또는 수/μl를 나타낸다.
도 45a 내지 도 45b. 바이러스 전달 18일 후 비장에서 CART 세포 증대 및 상응하는 B 세포 고갈의 정량. 처리된 마우스의 비장에서 CART(도 45a) 및 B 세포(도 45b)수/mg 조직의 정량. 평균 ± SEM으로 표시되는 유세포측정 데이터.
도 46a 내지 도 46d. CART 세포 증대는 림프관신생뿐만 아니라 바이러스 전달 18일 후 피부의 국소 B 세포 고갈과 관련이 있다. 처리된 마우스의 비장에서 CART(도 46a) 및 B 세포(도 46b)수/mg 조직의 정량. 평균 ± SEM으로 표시되는 유세포측정 데이터. 피부에서 B 세포수 및 CART 세포수(도 46c)뿐만 아니라 CART 세포수 및 림프 내피 세포(LEC) 수(도 46d)의 상관관계 그래프. 상관 관계 그래프에서 세포수는 수/mg 조직으로 표시된다.
도 47. MSP 용량의 함수로서의 GFP 트랜스유전자 발현.
도 48a 내지 도 48b는 항-CD3 항체로부터 유도된 중쇄 및 경쇄를 포함하는 CD3 항원 결합 도메인 및 대조군 작제물 11, 14 및 17을 제외하고는 모두 각각 항-CD28 또는 CD2 항체로부터 유도된 중쇄 및 경쇄를 포함하는 CD28 또는 CD2 항원 결합 도메인을 주목된 바와 같이 포함하는 17개의 상이한 다중특이적 작제물의 도식을 도시한다. 이론에 구애되지 않고, 이들 작제물 중 임의의 하나 이상이 본원에 개시된 바와 같은 세포 활성화제로 사용될 수 있음이 이해된다.
작제물 1은 Fc 영역에 추가로 융합된, 항-CD2 Fab에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 작제물 1은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD2 VH, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 작제물 2는 Fc 영역에 추가로 융합된, 항-CD28 Fab에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 작제물 2는 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD28 VH, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다.
작제물 3은 항-CD3 scFv에 추가로 융합된, Fc 영역에 융합된 항-CD2 Fab를 포함한다. 작제물 3은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD2 VH, CH1, CH2, CH3, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL을 포함한다. 작제물 4는 항-CD3 scFv에 추가로 융합된, Fc 영역에 융합된 항-CD28 Fab를 포함한다. 작제물 4는 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD28 VH, CH1, CH2, CH3, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL을 포함한다.
작제물 5는 Fc 영역에 추가로 융합된, 항-CD3 scFv에 융합된 항-CD2 Fab를 포함한다. 작제물 5는 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD2 VH, CH1, (G4S)2 링커(SEQ ID NO: 767), 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), CH2, 및 CH3을 포함한다. 작제물 6은 Fc 영역에 추가로 융합된, 항-CD3 scFv에 융합된 항-CD28 Fab를 포함한다. 작제물 6은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD28 VH, CH1, (G4S)2 링커(SEQ ID NO: 767), 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), CH2, 및 CH3을 포함한다.
작제물 7은 항-CD2 Fab에 추가로 융합된, Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 작제물 7은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), CH2, CH3, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD2 VH, 및 CH1을 포함한다. 작제물 8은 항-CD28 Fab에 추가로 융합된, Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 작제물 8은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), CH2, CH3, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD28 VH, 및 CH1을 포함한다.
작제물 9는 제1 Fc 영역에 융합된 항-CD2 Fab 및 제2 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 작제물 9는 제1 쇄, 제2 쇄, 및 제3 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD2 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 제3 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), CH2, 및 CH3을 포함한다. 작제물 10은 제1 Fc 영역에 융합된 항-CD28 Fab 및 제2 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 작제물 10은 제1 쇄, 제2 쇄, 및 제3 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD28 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 제3 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), CH2, 및 CH3을 포함한다.
작제물 11은 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 작제물 11은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, CH2 및 CH3을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), CH2, 및 CH3을 포함한다.
작제물 12는 제1 Fc 영역에 융합된 항-CD2 Fab 및 제2 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 작제물 12는 제1 쇄, 제2 쇄, 및 제3 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD2 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 제3 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), CH2, CH3, (G4S)3 링커(SEQ ID NO: 30), 및 Matrilin1을 포함한다. 작제물 13은 제1 Fc 영역에 융합된 항-CD28 Fab 및 제2 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 작제물 13은 제1 쇄, 제2 쇄, 및 제3 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD28 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 제3 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), CH2, CH3, (G4S)3 링커(SEQ ID NO: 30), 및 Matrilin1을 포함한다.
작제물 14는 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 작제물 14는 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, CH2 및 CH3을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 VH, (G4S)4, 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), CH2, CH3, (G4S)3 링커(SEQ ID NO: 30), 및 Matrilin1을 포함한다.
작제물 15는 제1 Fc 영역에 융합된 항-CD2 Fab 및 제2 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 작제물 15는 제1 쇄, 제2 쇄, 및 제3 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD2 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 제3 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), CH2, CH3, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), 및 연골 올리고머 매트릭스 단백질의 코일드-코일 도메인(COMPcc)을 포함한다. 작제물 16은 제1 Fc 영역에 융합된 항-CD28 Fab 및 제2 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 작제물 16은 제1 쇄, 제2 쇄, 및 제3 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD28 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 제3 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), CH2, CH3, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), 및 COMPcc를 포함한다.
작제물 17은 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 작제물 17은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, CH2 및 CH3을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), CH2, CH3, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), 및 COMPcc를 포함한다.
작제물 1 내지 작제물 17의 예시적인 서열이 표 20에 제공된다. 추가 서열(예를 들어, 본원에 개시된 항-CD3 결합제, 본원에 개시된 항-CD28 결합제, 본원에 개시된 항-CD2 결합제, 또는 본원에 개시된 Fc 영역)이 작제물 1 내지 작제물 17을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
도 49a 내지 도 49b는 2세대 스타터 분자의 결합 정보(도 49a) 및 구성(도 49b)을 나타낸다. "F5 항-CD3(2)"는 항-CD3(2)에 기반한 항-CD3 결합제를 갖는 F5 작제물을 지칭한다.
도 50a 내지 도 50b는 3세대 스타터 분자의 결합제 정보(도 50a) 및 구성(도 50b)을 나타낸다.
도 51a는 실시예 J에서 시험된 스타터 분자의 구성을 나타낸다. 도 51b 및 도 51c는 MSP-렌티바이러스-스타터 혼합물에 의해 매개되는 T 세포 활성화 및 형질도입을 나타낸다. MSP-렌티바이러스-스타터 혼합물의 각각의 희석액에서 스타터 분자의 농도를 x축에 나타낸다. 두 MSP 배치 모두로부터 생성된 제형물은 시험관내 유사한 T 세포 활성화(도 51b) 및 형질도입(도 51c) 효율을 수득하였다. MSP에 결합된 스타터 분자(도 51b 내지 도 51c에서 "배치 1" 및 "배치 2")의 전달은 스타터 분자의 가용성 전달(도 51b 내지 도 51c에서 "MSP 없음")과 비교하여 활성화 및 형질도입을 향상시켰다. 도 51b의 제1일 및 도 51c의 제4일은 T 세포 배양 시작(즉, 세포 및 MSP-스타터-바이러스가 초기에 함께 혼합되었을 때) 후 시간을 지칭한다.
도 52a 및 도 52b는 MSP-렌티바이러스-스타터 혼합물에 의해 매개되는 T 세포 활성화 및 형질도입을 나타낸다. GFP-인코딩 렌티바이러스 및 스타터 분자는 전체 크기("MSP") 또는 크기-감소 MSP에 로딩되었으며, 크기 감소는 MSP의 비드 균질화("균질화 비드") 또는 초음파분쇄("초음파분쇄")를 사용하여 달성되었다. MSP-렌티바이러스-스타터 혼합물의 각각의 희석에서 렌티바이러스 대 T 세포의 비(MOI)를 x축에 나타낸다. MSP의 크기 감소는 T 세포 활성화(도 52a) 및 형질도입(도 52b)과 관련하여 시험관내 효능에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 비드 균질화 및 초음파분쇄 둘 모두는 전체-크기 MSP와 필적하는 결과를 수득했다.
도 53a 및 도 53b는 생체내 연구의 설계를 나타낸다. 도 53c는 주사제 2 주사 후 제18일의, 마우스의 혈액에서 CD19 CAR-T 증대와 B 세포 고갈 사이의 상관관계 그래프이다. 도 53d는 4일 동안 NSG 마우스에 이식된 후, 생체내 CART 생성 과정을 겪고 있는 마우스의 초기 코호트로부터 3e5 차용 전달된 CAR+ T 세포의 용량으로 처리된 루시퍼라제-발현 NALM6 종양의 생물발광 측정을 나타낸다. 이미지는 차용 전달 13일 후의 이미지이다. 마우스는 유리 바이러스("유리 바이러스") 또는 MSP-전달 바이러스("MSP 바이러스")를 사용하여 제조된 3e5 CAR-T의 용량으로 처리되었다. 또한 종양이 CART 없이 공여체 마우스로부터 전달된 PBMC로 처리된 대조군("PBMC 대조군") 또는 종양이 처리되지 않은 대조군("NALM6")을 나타낸다. "a"로 표지된 마우스는 유리 바이러스군으로부터 1.5e5 CAR+ 세포를 제공받았다. "b"로 표지된 마우스는 유리 바이러스군으로부터 2.3e5 CAR+ 세포를 제공받았다. 도 53e, 도 53f 및 도 53g는 크리오겔 부위에서 주사제 2의 피내 주사 13일 후 순환에서 총 T 세포의 CART%(도 53e), 순환에서 CART의 양(도 53f) 및 순환 CD3+ T 세포의 양(도 53g)을 나타내는 그래프이다. 도 53h, 도 53i 및 도 53j는 NALM6 시험감염(challenge)된 마우스로의 순환 림프구 차용 전달을 위해 선택된 마우스의 그래프로, 주사제 2의 피내 주사 18일 후 순환 T 세포의 양(도 53h), 순환 CART 세포의 양(도 53i) 및 순환에서 총 T 세포의 CART%(도 53j)를 나타낸다. 도 53k 및 도 53l은 차용 전달에 사용된 마우스 및 연구에 등록된 나머지 마우스로부터의 혈액의 조합 유세포측정 분석으로부터의 결과를 나타내며, 주사제 2의 피내 주사 18일 또는 19일 후 순환 T 세포의 양(도 53k) 및 순환 CART 세포의 양(도 53l)을 나타낸다.
도 54a, 도 54b, 도 54c 및 도 54d는 시험관내 방출 데이터를 나타내는 그래프이다. 도 54a는 H2a 하이드로 겔(200 kDa[HA-N3]-24%; 9% 가교됨) 및 H4a 하이드로겔(700 kDa[HA-N3]-16%; 18% 가교됨)에 대한 데이터를 나타낸다. 도 54b는 H4a 하이드로겔(700 kDa[HA-N3]-16%; 18% 가교됨; 라포나이트 없음), H5a 하이드로겔(700 kDa[HA-N3]-16%; 18% 가교됨; 0.25 mg/ml 라포나이트), 및 H6a 하이드로겔(700 kDa[HA-N3]-16%; 18% 가교됨; 1 mg/ml 라포나이트)에 대한 데이터를 나타낸다. 도 54c는 H5a 하이드로겔(원 위치; 0.25 mg/ml 라포나이트) 및 H5b 하이드로겔(입자; 0.25 mg/ml 라포나이트)에 대한 데이터를 나타낸다. 도 54d는 H6a 하이드로겔(원 위치; 1 mg/ml 라포나이트) 및 H6b 하이드로겔(입자; 1 mg/ml 라포나이트)에 대한 데이터를 나타낸다.
도 55a 및 도 55b는 제7일의 생체내 PD 반응을 나타내는 그래프이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
단수 명사는 하나 이상(예를 들어, 적어도 하나)의 해당 대상물을 나타낸다. 예를 들어, "요소"는 하나 이상의 요소를 의미한다.
측정 가능한 값, 예컨대 양, 시간적 지속기간 등을 지칭할 때, 용어 "약"은, 명시된 값으로부터 ±20%, 또는 일부 경우에 ±10%, 또는 일부 경우에 ±5%, 또는 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 편차를 포괄하는 의미이며, 이러한 편차는 개시된 방법의 수행에 적절하다.
본원에 사용된 용어 "세포 동원 인자"는 세포, 예를 들어 면역 세포를 동원할 수 있는 제제를 지칭한다. 이러한 동원 인자의 비제한적 예는 IL-2, IL-7, CCL21, IL 5, GM-CSF, CCL19, CXCL9, CXCL10, XCL1, 림프독소 알파, 림프독소 베타 및 VEGF-C를 포함한다. 이러한 요인은 T-세포와 같은 면역 세포를 동원하는 것으로 알려져 있다. 특정 세포 유형을 동원하는 세포 동원 인자의 추가의 비제한적인 예는 CCL17, CCL22, CCL20, 및 CCL27과 같지만 이에 제한되지 않는 피부 귀소 케모카인; FLT3L, G-CSF, PDGF, S100A8/A9, CSF-1, CXCL8, CCL20, CCL17, CCR5, CCR6, CCL2, VEGF, 안지오포이에틴-2, CXCL12, PGE2 및 LTB4와 같지만 이에 제한되지 않는 골수 세포 화학유인물질; 및 CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10, CXCL11 및 CXCL12와 같지만 이에 제한되지 않는 NK 특이적 동원 인자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "세포 활성화제"는 주어진 기능을 수행하기 위해 세포를 활성화할 수 있는 제제를 지칭한다 - 예를 들어, T-세포와 함께, 내인성 또는 조작된 수용체(예를 들어, CAR) 또는 세포 표면 마커의 수반은 증식을 위해 T-세포를 활성화하고 어떤 경우에는 적절한 사이토카인을 분비한다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"은 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 아래에서 정의되는 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인(본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 포함하는 재조합 폴리펩티드 작제물을 지칭한다. 일부 구현예에서, CAR 폴리펩티드 작제물 내의 도메인은 동일한 폴리펩티드쇄에 존재하며, 예를 들어 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 폴리펩티드 작제물 내의 도메인은 서로 인접하지 않고, 예를 들어 본원에 기재된 RCAR에 제공된 바와 같이, 예를 들어 상이한 폴리펩티드쇄에 존재한다.
일부 양태에서, 세포질 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인(예를 들어, CD3-제타의 일차 신호전달 도메인)을 포함한다. 일부 양태에서, 세포질 신호전달 도메인은 아래에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공동자극 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 공동자극 분자는 41BB(즉, CD137), CD27, ICOS 및/또는 CD28로부터 선택된다. 일부 양태에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막관통 도메인, 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막관통 도메인, 및 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 공동자극 분자(들)로부터 유래된 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 공동자극 분자(들)로부터 유래된 적어도 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노-말단(N-ter)에서 선택적인 리더 서열을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인의 N 말단에 리더 서열을 추가로 포함하고, 리더 서열은 세포 가공 및 CAR의 세포막으로의 편재 동안 항원 인식 도메인(예를 들어, scFv)으로부터 선택적으로 절단된다.
특정 종양 마커 X(X는 본원에 기재된 종양 마커일 수 있음)를 표적화하는, 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv, 단일 도메인 항체, 또는 TCR(예를 들어, TCR 알파 결합 도메인 또는 TCR 베타 결합 도메인))을 포함하는 CAR은 XCAR로도 지칭된다. 예를 들어, BCMA를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR은 BCMA CAR로 지칭된다. CAR은 임의의 세포, 예컨대, 본원에 기재된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포 또는 NK 세포)에서 발현될 수 있다.
용어 "신호전달 도메인"은 제2 메신저를 생성하거나 이러한 메신저에 반응하여 효과기로서 기능함으로써 규정된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위하여 세포 내에서 정보를 전파하여 작용하는 단백질의 기능적 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날, 다중쇄 또는 단일쇄, 또는 온전한 면역글로불린일 수 있고, 천연원으로부터 또는 재조합원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 면역글로불린 분자의 사량체일 수 있다.
용어 "항체 단편"은 항원의 에피토프와(예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 하나의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, 디설피드-연결 Fv(sdFv), VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대 sdAb(VL 또는 VH), 낙타과 VHH 도메인, 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체, 예컨대 힌지 영역에서 디설피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편 및 항체의 단리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR, 및 비스-scFv 내에 통합될 수 있다(예를 들어, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005 참고). 항원 결합 단편은 또한 피브로넥틴 III형(Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기반한 스캐폴드에 그래프팅될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기재하는 미국 특허 제6,703,199호 참고).
항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR의 부분은 다양한 형태로 존재할 수 있으며, 여기서 항원 결합 도메인은 예를 들어 단일 도메인 항체 단편(sdAb), 단일쇄 항체(scFv), 인간화 항체 또는 이중특이적 항체를 포함하는 인접 폴리펩티드쇄의 부분으로서 발현된다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). 일부 양태에서, 본 발명의 CAR 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가 양태에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD("카바트(Kabat)" 넘버링 체계), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948("초티아(Chothia)" 넘버링 체계)에 기재된 것들, 또는 이의 조합을 포함하여, 잘 알려진 다수의 체계 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 적어도 1개의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예를 들어 면역글로불린쇄 또는 이의 단편을 지칭한다. 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 항체 및 항체 단편을 포괄한다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자이고, 예를 들어 그것은 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하며, 복수의 서열 중 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고, 복수의 서열 중 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다.
용어 "이중특이적 항체" 및 "이중특이적 항체들"은 단일 분자 내에 2개 항체의 항원 결합 부위를 조합한 분자를 지칭한다. 따라서, 이중특이적 항체는 2개의 상이한 항원에 동시에 또는 순차적으로 결합할 수 있다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 2개의 항체를 조합하는 다양한 포맷 또한 당분야에 알려져 있다. 본 발명의 이중특이적 항체의 형태는 당업자에게 알려진 바와 같이, 디아바디, 단일쇄 디아바디, Fab 이량체화(Fab-Fab), Fab-scFv, 및 탠덤 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "항체 중쇄"는 자연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩티드쇄 중 더 큰 것을 지칭하며 일반적으로 항체가 속하는 클래스를 결정한다.
용어 "항체 경쇄"는 자연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩티드쇄 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.
용어 "재조합 항체"는, 예를 들어 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체와 같이 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체를 지칭한다. 이 용어는 또한 항체를 인코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고, DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 항체로서, DNA 또는 아미노산 서열은 당분야에서 이용 가능하고 잘 알려진 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된, 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이러한 면역 반응은 항체 생산, 또는 특정 면역 적격 세포의 활성화, 또는 둘 모두를 수반할 수 있다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 마크로분자가 항원으로서의 역할을 할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 따라서, 당업자는 면역 반응을 유도하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가, 본원에 사용된 용어 "항원"을 인코딩함을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 인코딩될 필요는 없음을 이해할 것이다. 본 발명은 1개 초과의 유전자의 부분적 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니고, 이들 뉴클레오티드 서열은 원하는 면역 반응을 유발하는 폴리펩티드를 인코딩하도록 다양한 조합으로 배열됨이 분명하다. 또한, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원은 합성될 수 있거나, 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 폴리펩티드 이외의 마크로분자일 수 있음이 분명하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "다중특이적 결합 분자"는 적어도 2개의 항원에 특이적으로 결합하고 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 도메인은 각각 독립적으로 항체 단편(예를 들어, scFv, Fab, 나노바디), 리간드, 또는 비항체 유래 결합제(예를 들어, 피브로넥틴, 파이노머(Fynomer), DARPin)일 수 있다.
다중특이적 결합 분자, 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 항체 단편과 관련하여 본원에 사용된 용어 "1가"는 다중특이적 결합 분자, 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 항체 단편이 결합하는 각각의 항원에 대해 단일 항원 결합 도메인이 존재하는 다중특이적 결합 분자, 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 항체 단편을 지칭한다.
다중특이적 결합 분자, 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 항체 단편과 관련하여 본원에 사용된 용어 "2가"는 다중특이적 결합 분자, 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 항체 단편이 결합하는 각각의 항원에 대해 2개의 항원 결합 도메인이 존재하는 다중특이적 결합 분자, 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "다량체"는 선택적으로 서로 접합된, 복수의 분자(비제한적인 예로서 항체(예를 들어, 이중특이적 항체))의 응집체를 지칭한다.
용어 "항암 효과"는 예를 들어 종양 부피의 감소, 암 세포수의 감소, 전이수의 감소, 기대 수명의 증가, 암 세포 증식의 감소, 암 세포 생존의 감소, 또는 암성 질병과 관련된 다양한 생리학적 증상의 완화를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항암 효과"는 먼저 암 발생의 예방에서의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해서도 나타날 수 있다. 용어 "항-종양 효과"는 예를 들어 종양 부피의 감소, 종양 세포수의 감소, 종양 세포 증식의 감소, 또는 종양 세포 생존의 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.
용어 "자가"는 이후에 개체에게 재도입될, 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "동종이계"는 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 하나 이상의 유전자좌에서의 유전자가 동일하지 않은 경우 둘 이상의 개체는 서로 동종이계라 한다. 일부 양태에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종이계 물질은 항원과 관련하여 상호작용하기에 유전적으로 충분히 다를 수 있다.
용어 "이종"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
용어 "암"은 이상 세포의 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암 세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 다양한 암의 예가 본원에 기재되어 있고, 유방암, 전립샘암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어 "종양" 및 "암"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어 이들 용어는 둘 모두 고형 및 액상, 예를 들어 미만성 또는 순환성 종양을 포괄한다. 본원에 사용된 용어 "암" 또는 "종양"은 악성뿐만 아니라 전악성 암 및 종양을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, "~에 접합된"은 선택적으로 공유적으로 또는 비공유적으로 및/또는 직접적으로 또는 링커를 통해 본원에 기재된 바와 같은 임의의 수단과 회합되거나 부착된 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "~로부터 유래된"은 제1 분자와 제2 분자 간 관계를 표시한다. 이는 일반적으로 제1 분자와 제2 분자 사이의 구조적 유사성을 지칭하며, 제2 분자로부터 유래되는 제1 분자에 대한 과정 또는 원천의 제한은 내포하지 않거나 포함하지 않는다. 예를 들어, CD3제타 분자로부터 유래되는 세포내 신호전달 도메인의 경우, 세포내 신호전달 도메인은 요구되는 기능, 즉, 적절한 조건 하에 신호를 생성하는 능력을 갖도록 하기에 충분한 CD3제타 구조를 보유한다. 이는 세포내 신호전달 도메인의 특정한 생산 방법에 대한 제한을 내포하지 않거나 포함하지 않으며, 예를 들어, 이는 세포내 신호전달 도메인을 제공하기 위하여 CD3제타 서열로 시작하여 원하지 않는 서열을 결실시키거나, 돌연변이를 부여하여, 세포내 신호전달 도메인에 도달해야 함을 의미하는 것이 아니다.
어구 "본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 질환"은, 예를 들어, 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양 또는 전암성 질병, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병을 포함하여 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 질환 또는 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 세포와 관련된 질병; 또는 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 세포와 관련된 암 무관 적응증을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 암은 혈액암이다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 암은 고형암이다. 본원에 기재된 종양 항원의 발현과 관련된 추가의 질환은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 비정형 및/또는 비-고전적 암, 악성종양, 전암성 질병 또는 증식성 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 암 무관 적응증은, 예를 들어 자가면역 질환(예를 들어, 루푸스), 염증성 장애(알러지 및 천식) 및 이식을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 종양 항원-발현 세포는 종양 항원을 인코딩하는 mRNA를 발현하거나 임의의 시점에 발현하였다. 일부 구현예에서, 종양 항원-발현 세포는 종양 항원 단백질(예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체)을 생산하고, 종양 항원 단백질은 정상 수준 또는 감소된 수준으로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 항원-발현 세포는 검출 가능한 수준의 종양 항원 단백질을 한 시점에 생산하였고, 이후에 실질적으로 검출 가능한 종양 항원 단백질을 생산하지 않았다.
용어 "자극"은 자극 분자(예를 들어, TCR/CD3 복합체 또는 CAR)가 그 인지체 리간드(또는 CAR의 경우에 종양 항원)와 결합하여 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달 또는 적절한 NK 수용체 또는 CAR의 신호전달 도메인을 통한 신호 전달과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 신호 전달 사건을 매개함으로써 유도되는 1차 반응을 지칭한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다.
용어 "자극 분자"는 면역 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 양태에 대한 자극 방식에서 면역 세포의 활성화를 조절하는 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, B 세포)에 의해 발현되는 분자를 지칭한다. 일부 양태에서, 신호는 예를 들어 펩티드가 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 개시되고, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 T 세포 반응의 매개를 야기하는 일차 신호이다. 자극 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호전달 서열("일차 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려져 있는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 본 발명에서 특히 유용한 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, 통상적인 FcR 감마(FCER1G), Fc 감마 RIIa, FcR 베타(Fc 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10, 및 DAP12로부터 유래된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 특정 CAR에서, 본 발명의 임의의 하나 이상의 CAR 내의 세포내 신호전달 도메인은 세포내 신호전달 서열, 예를 들어 CD3-제타의 일차 신호전달 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 CAR에서, CD3-제타의 일차 신호전달 서열은 SEQ ID NO: 18로서 제공된 서열, 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다. 본 발명의 특정 CAR에서, CD3-제타의 일차 신호전달 서열은 SEQ ID NO: 20으로서 제공된 서열, 또는 비 인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다.
용어 "Fc 침묵"은 효과기 세포와 최소의 상호작용을 갖도록 변형된 Fc 도메인을 지칭한다. 침묵화된 효과기 기능은 항체의 Fc 영역에서의 돌연변이에 의해 얻어질 수 있고, LALA 및 N297A(Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691) 및 D265A(Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69)와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 당분야에 기재되어 있으며 또한 문헌[Heusser et al., WO2012065950]을 참고한다. Fc 침묵화 돌연변이의 예는 IgG1 Fc 아미노산 서열에 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는 LALA 돌연변이체, DAPA(D265A, P329A)(예를 들어, US 6,737,056 참고), N297A, DANAPA(D265A, N297A 및 P329A), 및/또는 LALADANAPS(L234A, L235A, D265A, N297A 및 P331S)를 포함한다. 추가로, 침묵화 돌연변이의 비제한적 예시적 구현예는 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 LALAGA(L234A, L235A, 및 G237A), LALASKPA(L234A, L235A, S267K, 및 P329A), DAPASK(D265A, P329A, 및 S267K), GADAPA(G237A, D265A, 및 P329A), GADAPASK(G237A, D265A, P329A, 및 S267K), LALAPG(L234A, L235A, 및 P329G), 및 LALAPA(L234A, L235A, 및 P329A)를 포함한다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 기재된 바와 같은 Eu 인덱스로도 불리는 Eu 넘버링 시스템을 따른다.
용어 "CD3/TCR 복합체"는 TCR 알파쇄 및 TCR 베타쇄를 포함하는 TCR; 1개의 CD3 감마쇄, 1개의 CD3 델타쇄, 및 2개의 CD3 엡실론쇄를 포함하는 CD3; 및 제타 도메인을 포함하는 T-세포 표면 상의 복합체를 지칭한다. UniProt 수탁 번호 P01848(TCR 알파, 불변 도메인), P01850(TCR 베타, 불변 도메인 1), A0A5B9(TCR 베타, 불변 도메인 2), P09693(CD3 감마), P04234(CD3 델타), P07766(CD3 엡실론)은 세포내 신호전달을 담당하는, 이러한 쇄(제타쇄는 제외)에 대한 예시적인 인간 서열을 제공하며, 이는 아래에서 더 자세히 논의된다. 추가 관련 수탁 번호는 A0A075B662(쥣과 TCR 알파, 불변 도메인), A0A0A6YWV4 및/또는 A0A075B5J3(쥣과 TCR 베타, 불변 도메인 1), A0A075B5J4(쥣과 TCR 베타, 불변 도메인 2), P11942(쥣과 CD3 감마), P04235(쥣과 CD3 델타), P22646(쥣과 CD3 엡실론)을 포함한다.
용어 "CD28"은 공동자극 분자로서 기능하는 T-세포 특이적 당단백질 CD28(Tp44로도 지칭됨) 및 이의 모든 대안적 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁 번호 P10747은 예시적인 인간 CD28 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 1653, Entrez Gene: 940, Ensembl: ENSG00000178562, 및 OMIM: 186760 참고). 추가 관련 CD28 서열은 UniProt 수탁 번호 P21041(쥣과 CD28)을 포함한다.
용어 "ICOS"는 공동자극 분자로서 기능하는 유도성 T-세포 공동자극제(AILIM, CVID1, CD278로도 지칭됨)뿐만 아니라 이의 모든 대안적 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁 번호 Q9Y6W8은 예시적인 인간 ICOS 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 5351, Entrez Gene: 29851, Ensembl: ENSG00000163600, 및 OMIM: 604558 참고). 추가 관련 ICOS 서열은 UniProt 수탁 번호 Q9WVS0(쥣과 ICOS)을 포함한다.
용어 "CD27"은 공동자극 분자로서 기능하는 T-세포 활성화 항원 CD27, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 7, T14, T-세포 활성화 항원 S152, Tp55, 및 이의 대안적 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁 번호 P26842은 예시적인 인간 CD27 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 11922, Entrez Gene: 939, Ensembl: ENSG00000139193, 및 OMIM: 186711 참고). 추가 관련 CD27 서열은 UniProt 수탁 번호 P41272(쥣과 CD27)를 포함한다.
용어 "CD25"는 성장 인자 수용체로서 기능하는 IL-2 서브유닛 알파, TAC 항원, p55, 인슐린 의존적 진성 당뇨병 10, IMD21, P55, TCGFR, 및 이의 대안적 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁 번호 P01589은 예시적인 인간 CD25 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 6008, Entrez Gene: 3559, Ensembl: ENSG00000134460, 및 OMIM: 147730 참고). 추가 관련 CD25 서열은 UniProt 수탁 번호 P01590(쥣과 CD25)을 포함한다.
용어 "4-1BB"는 공동자극 분자로서 기능하는 CD137 또는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 9뿐만 아니라 이의 대안적 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁 번호 Q07011은 예시적인 인간 4-1BB 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 11924, Entrez Gene: 3604, Ensembl: ENSG00000049249, 및 OMIM: 602250 참고). 추가 관련 4-1BB 서열은 UniProt 수탁 번호 P20334(쥣과 4-1BB)를 포함한다.
용어 "IL6RA"는 성장 인자 수용체로서 기능하는 IL-6 수용체 서브유닛 알파 또는 CD126뿐만 아니라 이의 대안적 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁 번호 P08887은 예시적인 인간 IL6RA 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 6019, Entrez Gene: 3570, Ensembl: ENSG00000160712, 및 OMIM: 147880 참고) 추가 관련 IL6RA 서열은 UniProt 수탁 번호 P22272(쥣과 IL6RA)를 포함한다.
용어 "IL6RB"는 성장 인자 수용체로서 기능하는 IL-6 수용체 서브유닛 베타 또는 CD130뿐만 아니라 이의 대안적 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁 번호 P40189는 예시적인 인간 IL6RB 아미노산 서열을 제공한다. 추가 관련 IL6RB 서열은 UniProt 수탁 번호 Q00560(쥣과 IL6RB)을 포함한다.
용어 "CD2"는 성장 인자 수용체로서 기능하는 T-세포 항원 T11/Leu-5/CD2, 림프구 기능 항원 2, T11, 또는 적혈구/로제트/LFA-3 수용체뿐만 아니라 이의 대안적 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁 번호 P06729는 예시적인 인간 CD2 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 1639, Entrez Gene: 914, Ensembl: ENSG00000116824, 및 OMIM: 186990 참고). 추가 관련 CD2 서열은 UniProt 수탁 번호 P08920(쥣과 CD2)을 포함한다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 그 표면에 주조직 적합성 복합체(MHC)와 복합체화된 외래 항원을 표시하는 면역계 세포, 예컨대 보조 세포(예를 들어, B-세포, 수지상 세포 등)를 지칭한다. T-세포는 T-세포 수용체(TCR)를 사용하여 이러한 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 처리하여 T-세포에 제시한다.
본원에 사용된 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR 함유 세포, 예를 들어 CART 세포의 면역 효과기 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 예를 들어 CART 세포에서 면역 효과기 기능의 예는 사이토카인의 분비를 포함하여 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 1차 세포내 신호전달 도메인은 1차 자극, 또는 항원 의존적 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호, 또는 항원 독립적 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것들을 포함한다. 예를 들어 CART의 경우, 1차 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체의 세포질 서열을 포함할 수 있고, 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동수용체 또는 공동자극 분자로부터의 세포질 서열을 포함할 수 있다.
1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 일차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, 통상적인 FcR 감마(FCER1G), Fc 감마 RIIa, FcR 베타(Fc 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10, 및 DAP12로부터 유래된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타쇄", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 CD247을 지칭한다. Swiss-Prot 수탁 번호 P20963은 예시적인 인간 CD3 제타 아미노산 서열을 제공한다. "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 CD3-제타의 자극 도메인 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이, 단편, 삽입, 또는 결실을 갖는 분자)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 제타의 세포질 도메인은 GenBank 수탁 번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이, 단편, 삽입, 또는 결실을 갖는 분자)를 포함한다. 일부 구현예에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 SEQ ID NO: 9 또는 10으로 제공된 서열, 또는 이의 변이체(예컨대, 돌연변이, 예컨대, 점 돌연변이, 단편, 삽입, 또는 결실을 갖는 분자)이다. 대안적으로 또는 추가로, 용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타쇄", "CD3-제타"(또는 "CD3제타, CD3 제타 또는 CD3z) 또는 "TCR-제타"는 GenBanK 수탁 번호 BAG36664.1로서 제공된 단백질 또는 비 인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로서 정의되고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한 제타쇄의 세포질 도메인 또는 이의 기능적 유도체로부터의 아미노산 잔기로서 정의된다. 일부 양태에서, 제타의 세포질 도메인은 GenBank 수탁 번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164, 또는 이의 기능적 오르소로그인 비 인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 포함한다. 일부 양태에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 SEQ ID NO: 18로서 제공된 서열이다. 일부 양태에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 SEQ ID NO: 20으로서 제공된 서열이다.
용어 "공동자극 분자"는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여, 증식과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 T 세포에 의한 공동자극 반응을 매개하는 T 세포 상의 인지체 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극 분자는 효율적인 면역 반응에 기여하는 항원 수용체 이외의 세포 표면 분자 또는 이의 리간드이다. 공동자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체뿐만 아니라 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 및 4-1BB(CD137)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 공동자극 분자의 추가적인 예로는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공동자극 분자는 하기의 단백질 패밀리로 표시될 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질) 및 활성화 NK 세포 수용체. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.
세포내 신호전달 도메인은 그것이 유래된 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 천연 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "면역 효과기 세포"는 면역 반응, 예컨대 면역 효과기 반응의 촉진에 수반되는 세포를 지칭한다. 면역 효과기 세포의 예는 T 세포, 예컨대 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포, 및 골수-유래 식세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "면역 효과기 기능 또는 면역 효과기 반응"은 표적 세포의 면역 공격을 향상시키거나 촉진하는, 예를 들어 면역 효과기 세포의, 기능 또는 반응을 지칭한다. 예를 들어, 면역 효과기 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸, 또는 이의 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T 또는 NK 세포의 특성을 지칭한다. T 세포의 경우에, 일차 자극 및 공동자극은 면역 효과기 기능 또는 반응의 예이다.
용어 "인코딩하는" 또는 "인코딩하다"는 뉴클레오티드(예를 들어 rRNA, tRNA 및 mRNA)의 규정된 서열 또는 아미노산의 규정된 서열 및 그로부터 초래된 생물학적 특성을 갖는, 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 마크로분자의 합성을 위한 주형으로서의 역할을 하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA 내의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA 또는 RNA는 그러한 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물계에서 단백질을 생산하는 경우에 단백질을 인코딩한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에서 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비코딩 가닥 둘 모두는 그러한 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 인코딩하는 것으로서 지칭될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이란 어구는 또한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도까지 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 특정 생물학적 결과를 달성하는 데 유효한 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 제형물, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템의 내부로부터 유래되거나 내부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템의 외부로부터 도입되거나 외부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "발현"은 프로모터에 의해 구동되는 특정한 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "연장 방출제"는 주어진 조성물, 예를 들어, 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터) 및/또는 세포 활성화제를 필적하는 즉시 방출 제형물보다 긴 시기에 걸쳐 방출하는 제제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 연장 방출제는 주사에 의한 투여용으로 제형화된다.
용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부에 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 친양매성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 벡터가 당분야에 알려져 있다. 따라서, 용어 "전달 벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 예를 들어 폴리라이신 화합물, 리포좀 등과 같은 핵산의 세포 내로의 전달을 용이하게 하는 비 플라스미드 및 비 바이러스 화합물을 추가로 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 전달 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드(예를 들어 네이키드이거나 리포좀 내에 함유됨) 및 바이러스(예를 들어 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스, "바이러스 벡터")를 포함하는 당분야에 알려진 모든 것들을 포함한다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로바이러스과(Retroviridae family)의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하며; 유의한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있어, 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다.
용어 "렌티바이러스 벡터"는 특히, 문헌[Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]에 제공된 바와 같은 자가-불활성 렌티바이러스 벡터를 포함하는, 적어도 일부의 렌티바이러스 게놈으로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는, 예를 들어 Oxford BioMedica의 LENTIVECTOR® 유전자 전달 기술, Lentigen의 LENTIMAX™ 벡터 시스템 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 비임상 유형의 렌티바이러스 벡터도 이용 가능하고, 당업자에게 알려져 있을 것이다.
용어 "상동성" 또는 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 2개의 핵산 분자, 예컨대 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 두 분자 모두에서 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각에서 하나의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 이들은 그 위치에서 상동성이거나 동일하다. 두 서열 사이의 상동성은 매칭되거나 상동성인 위치의 수의 직접적인 함수이다; 예를 들어, 두 서열에서의 위치의 절반(예를 들어, 길이가 10개 서브유닛인 중합체에서 5개 위치)이 상동성일 경우, 두 서열은 50% 상동성이고; 위치의 90%(예를 들어, 10개 중 9개)가 매칭되거나 상동성일 경우, 두 서열은 90% 상동성이다.
비인간(예를 들어, 쥣과) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린쇄 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)이다. 대개, 인간화 항체 및 이의 항체 단편은 수신체의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여체 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수신체 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체/항체 단편은 수신체 항체에서도 발견되지 않고 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 추가로 개량하고 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 이의 항체 단편은 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, CDR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, FR 영역의 모두 또는 상당 부분은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체 또는 항체 단편은 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 추가 상세사항은 문헌[ones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992]을 참고한다.
"완전 인간"은 전체 분자가 인간 기원이거나 항체 또는 면역글로불린의 인간 형태와 동일한 아미노산 서열로 구성된 면역글로불린, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "단리된"은 천연 상태로부터 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 천연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 이의 천연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비천연 환경에 존재할 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된" 또는 "전사 제어"는 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 이는 후자의 발현을 초래한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적으로 관련되어 배치되는 경우, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 해당 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 서로 인접할 수 있고, 예를 들어 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 것이 필요한 경우, 동일한 해독틀 내에 존재한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 알려진 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 표시되지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명시적으로 표시된 서열뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어 축퇴 코돈 치환), 대립유전자, 오르소로그, SNP, 및 상보성 서열을 묵시적으로 포괄한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 이루어진 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하고, 단백질 또는 펩티드 서열에 포함될 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 존재하지 않는다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이 용어는 당분야에서 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 통상적으로 지칭되는 짧은 쇄, 및 많은 유형이 존재하는, 일반적으로 당분야에서 단백질로 지칭되는 더 긴 쇄 둘 모두를 지칭한다. "폴리펩티드"는 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 또는 이의 조합을 포함한다.
용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특정 전사를 개시하는 데 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다.
용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 생성물의 발현에 필요한 핵산 서열을 지칭한다. 일부 예에서, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 다른 예에서 이 서열은 또한 인핸서 서열, 및 유전자 생성물의 발현에 필요한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 것일 수 있다.
용어 "구성적" 프로모터는, 유전자 생성물을 인코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우에 유전자 생성물이 세포의 대부분의 또는 모든 생리학적 조건 하에 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "유도성" 프로모터는, 유전자 생성물을 인코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우에 실질적으로 프로모터에 상응하는 유도자가 세포에 존재할 때에만 유전자 생성물이 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "조직 특이적" 프로모터는, 유전자에 의해 인코딩되거나 특정되는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우에 실질적으로 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 유전자 생성물이 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "암 연관 항원" 또는 "종양 항원"은 상호교환적으로 전체적으로 또는 단편(예를 들어 MHC/펩티드)으로서 암 세포의 표면 상에서 발현되고, 약리학적 제제의 암 세포로의 우선적 표적화에 유용한 분자(전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 정상 세포 및 암 세포 둘 모두에 의해 발현되는 마커, 예를 들어 계통 마커, 예를 들어 B 세포 상의 CD19이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 정상 세포와 비교하여 암 세포에서 과발현, 예를 들어 정상 세포와 비교하여 1배 과발현, 2배 과발현, 3배 과발현, 또는 그 이상으로 과발현되는 세포 표면 분자이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 암 세포에서 부적절하게 합성된 세포 표면 분자, 예를 들어 정상 세포 상에서 발현되는 분자와 비교하여 결실, 부가, 또는 돌연변이를 함유하는 분자이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 암 세포의 세포 표면에서만 전체적으로 또는 단편(예를 들어, MHC/펩티드)으로서 발현될 것이고, 정상 세포의 표면에서는 합성되거나 발현되지 않을 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CAR은 MHC 제시 펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어 항체 또는 항체 단편)을 포함하는 CAR을 포함한다. 통상적으로, 내인성 단백질로부터 유래된 펩티드는 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자의 포켓을 채우고, CD8+ T 림프구 상의 T 세포 수용체(TCR)에 의해 인식된다. MHC 클래스 I 복합체는 모든 유핵 세포에 의해 구성적으로 발현된다. 암에서, 바이러스-특이적 및/또는 종양-특이적 펩티드/MHC 복합체는 면역치료법을 위한 고유한 클래스의 세포 표면 표적을 나타낸다. 인간 백혈구 항원(HLA)-A1 또는 HLA-A2와 관련하여 바이러스 또는 종양 항원으로부터 유래된 펩티드를 표적화하는 TCR-유사 항체가 기재된 바 있다(예를 들어 Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21) :1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100 참고). 예를 들어, TCR 유사 항체는 라이브러리, 예컨대, 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝으로부터 확인될 수 있다.
용어 "종양-지지 항원" 또는 "암-지지 항원"은 상호교환적으로, 그 자체가 암성은 아니지만, 예를 들어 암 세포의 성장 또는 생존, 예를 들어 면역 세포에 대한 저항성을 촉진함으로써 암 세포를 지지하는 세포의 표면에서 발현되는 분자(일반적으로 단백질, 탄수화물, 또는 지질)를 지칭한다. 이러한 유형의 예시적인 세포는 기질 세포 및 골수 유래 억제 세포(MDSC)를 포함한다. 종양-지지 항원은 암 세포를 지지하는 세포 상에 항원이 존재하는 한, 그 자체가 종양 세포를 지지하는 역할을 할 필요는 없다.
본원에서 사용된 "시험관내 전사 RNA"는 시험관내 합성된 RNA, 바람직하게는 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 시험관내 전사 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 생성된다. 시험관내 전사 벡터는 시험관내 전사 RNA를 생성하기 위해 사용되는 주형을 포함한다.
본원에 사용된 "폴리(A)"는 폴리아데닐화에 의해 mRNA에 부착된 일련의 아데노신이다. 일시적 발현을 위한 작제물의 바람직한 구현예에서, 폴리A는 50 내지 5000개(SEQ ID NO: 34), 바람직하게는 64개 초과, 더욱 바람직하게는 100개 초과, 가장 바람직하게는 300 또는 400개 초과이다. 폴리(A) 서열은 mRNA 기능성, 예컨대 편재, 안정성 또는 번역 효율을 조정하기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
발현, 예를 들어, CAR 분자의 발현과 관련하여 본원에서 사용되는 "일시적"은 수 시간, 수 일 또는 수 주의 기간 동안의 비통합 트랜스유전자의 발현을 지칭하고, 발현 기간은 게놈 내로 통합되거나 숙주 세포 내의 안정적인 플라스미드 레플리콘 내에 함유된 경우의 유전자의 발현을 위한 기간 미만이다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 하나 이상의 치료법(예를 들어 하나 이상의 치료제, 예컨대 본 발명의 CAR)의 투여로부터 초래되는 증식성 장애의 진행, 중증도 및/또는 지속기간의 감소 또는 완화, 또는 이의 하나 이상의 증상(바람직하게는, 하나 이상의 식별 가능한 증상)의 완화를 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 예를 들어 환자가 반드시 식별할 수 있는 것이 아닌, 증식성 장애의 적어도 하나의 측정 가능한 물리적 파라미터, 예컨대 종양의 성장의 완화를 지칭한다. 다른 구현예에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 예를 들어, 식별 가능한 증상의 안정화에 의해 물리적으로, 예를 들어 물리적 파라미터의 안정화에 의해 생리학적으로, 또는 둘 모두에 의한, 증식성 장애의 진행의 억제를 지칭한다. 다른 구현예에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 종양 크기 또는 암 세포수의 감소 또는 안정화를 지칭한다.
용어 "신호 전달 경로"는 신호를 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로 전달하는 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자들 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 어구 "세포 표면 수용체"는 신호를 수신하고 세포막을 가로질러 신호를 전달하는 것이 가능한 분자 및 분자의 복합체를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 유발될 수 있는 살아 있는 유기체(예를 들어, 포유류, 인간)를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "실질적으로 정제된" 세포는 다른 세포 유형이 본질적으로 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 이의 자연 발생 상태에서 보통 회합되어 있는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 다른 경우에, 이 용어는 단순히 그들의 천연 상태에서 천연적으로 회합되어 있는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 양태에서, 세포는 시험관내 배양된다. 다른 양태에서, 세포는 시험관내 배양되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "치료제"는 치료를 의미한다. 치료 효과는 질환 상태의 감소, 억제, 관해 또는 박멸에 의해 수득된다.
본원에 사용된 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 방지적 또는 보호적 처치를 의미한다.
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염된, 형질전환된 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 일차 대상체 세포 및 그 자손을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합한다"는 샘플 내에 존재하는 결합 파트너(예를 들어, 종양 항원) 단백질을 인식하고 이와 결합하지만 샘플 내의 다른 분자는 실질적으로 인식하지 않거나 결합하지 않는 항체 또는 리간드를 지칭한다.
본원에 사용된 "불응성"은 치료에 반응하지 않는 질환, 예를 들어 암을 지칭한다. 구현예에서, 불응성 암은 치료 전 또는 치료 시작 시에 치료에 저항성일 수 있다. 다른 구현예에서, 불응성 암은 치료하는 동안 저항성이 될 수 있다. 불응성 암은 저항성 암으로도 칭해진다.
본원에 사용된 "재발된"은 개선 기간 이후, 예를 들어 치료법, 예를 들어 암 치료법의 선행 치료 이후 질환(예를 들어 암) 또는 질환, 예컨대 암의 징후 및 증상의 복귀를 지칭한다.
예를 들어, 유전자 편집과 관련하여 본원에 사용된 용어 "시스템"은 원하는 기능을 생산하기 위해 함께 작용하는 분자의 집단, 예를 들어, 1개 이상의 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유전자 편집 시스템"은 상기 시스템에 의해 표적화된 게놈 DNA의 부위에서 또는 그 근처에서 하나 이상의 핵산의 변경, 예를 들어 결실을 유도하고 초래하는 시스템, 예를 들어 하나 이상의 분자를 지칭한다. 유전자 편집 시스템은 당분야에 알려져 있으며, 아래에서 더 상세하게 기재된다.
"우성 음성" 유전자 생성물 또는 단백질은 유전자 생성물 또는 단백질의 기능을 간섭하는 것이다. 영향을 받는 유전자 생성물은 우성 음성 단백질과 동일하거나 상이할 수 있다. 우성 음성 유전자 생성물은 절단, 점 돌연변이를 갖는 전장 단백질 또는 이의 단편, 또는 전장 야생형 또는 돌연변이체 단백질 또는 이의 단편과 다른 단백질의 융합체를 포함하는 많은 형태의 것일 수 있다. 관찰된 억제 수준은 매우 낮을 수 있다. 예를 들어, 이것은 효과를 보기 위하여 과정에 관여하는 기능적 단백질(들)과 비교하여 많은 과량의 우성 음성 단백질을 필요로 할 수 있다. 보통의 생물학적 검정 조건 하에서는 효과를 보는 것이 어려울 수 있다.
"비율"이라는 용어는 집단의 총 분자 수에 대한 특정 분자의 비를 지칭한다. 예시적인 구현예에서, 특정 표현형을 갖는 T 세포(예를 들어, TSCM 세포)의 비율은 집단의 T 세포의 총 수에 대한 해당 표현형을 갖는 T 세포의 수의 비를 지칭한다. 예시적인 구현예에서, 특정 표현형을 갖는 T 세포(예를 들어, CD45RA+CD62L+ 세포)의 비율은 집단의 T 세포의 총 수에 대한 해당 표현형을 갖는 T 세포의 수의 비를 지칭한다. 이러한 비율은 기소된 경우 세포의 특정 하위세트에 대해 측정될 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, CD4+ TSCM 세포의 비율은 CD4+ T 세포의 총 수에 대해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "면역 효과기 세포의 집단"은 적어도 2개, 예를 들어 2개 이상, 예를 들어 1개 초과의 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물을 지칭하고, 임의의 수준의 순도 또는 다른 세포 유형의 존재 또는 부재를 나타내지 않는다. 예시적인 구현예에서, 이 집단은 다른 세포 유형이 실질적으로 없다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 집단은 명시된 세포 유형의 또한 명시된 기능 또는 특성을 갖는 적어도 2개의 세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "생체물질"은 치료적 목적을 위해 생물학적 시스템과 상호작용하도록 조작된 물질을 지칭한다. "하이드로겔"은 - 전형적으로 중합체쇄 사이의 가교 결과 - 수화되어 겔 형태를 취할 수 있는 중합체쇄의 네트워크로 이루어진 물질이다. "크리오겔"은 냉동에 의해 형성된 하이드로겔의 한 형태이다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 가교가 부분적으로 냉동된 상태에서 일어나도록 하여 하이드로겔 네트워크를 생성함으로써 형성된다.
"TSCM-유사 세포" 및 "나이브 T 세포"라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, CD45RA 및 CD62L의 표면 발현을 특징으로 하는(예를 들어, CD45RA 양성 및 CD62L 양성인(때때로 CD45RA+CD62L+로 표기됨)), 덜 분화된 T 세포 상태를 지칭한다. 일반적으로, T 세포 분화는, 가장 "나이브"한 쪽에서 가장 "고갈된" 쪽으로, TSCM 유사(예를 들어, CD45RA+CD62L+ 세포) >TCM(예를 들어, CD45RA-CD62L+ 세포)>TEM(예를 들어, CD45RA-CD62L- 세포)>TEFF로 진행된다. 나이브 T 세포는 예를 들어, 더 고갈된 T 세포 표현형에 비해, 증가된 자가 재생, 항-종양 효능, 증식 및/또는 생존을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 나이브 T 세포는 CD45RA+CD62L+ T 세포를 지칭한다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 나이브 T 세포는 TSCM 세포, 예를 들어, CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+ T 세포를 지칭한다.
용어 "TSCM"은 줄기 세포 기억 표현형을 갖는 T 세포를 지칭하며, 세포 표면 상에서 CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 및 CD95를 발현하는(예를 들어, CD45RA 양성, CD62L 양성, CCR7 양성, CD27 양성 및 CD95 양성인(때때로 CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+로 표기됨)) 것을 특징으로 한다. TSCM 세포는 나이브 T 세포의 한 예이다. T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포일 수 있다.
본원에 기재된 특정 단백질(예를 들어, VEGF-C)의 경우 명명된 단백질은 단백질의 자연 발생 형태, 변이체 또는 상동체(예를 들어, 천연 단백질에 비해 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 이내) 중 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 형태에 비해 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50, 100, 150 또는 200개 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 단백질은 NCBI 서열 참조(예를 들어, NP_005420.1)에 의해 확인되는 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 그 NCBI 서열 참조, 이의 상동체 또는 기능적 단편에 의해 확인되는 단백질이다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자를 포함하는 완전 포화 분지형 또는 비분지형(또는 직쇄 또는 선형) 탄화수소 모이어티를 지칭한다. 바람직하게는 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 알킬의 대표적인 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 3-메틸헥실, 2,2-디메틸펜틸, 2,3-디메틸펜틸, n-헵틸을 포함한다. 예를 들어, 용어 "C1-6알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소를 지칭하고, 용어 "C1-7알킬"은 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "할로알킬"은 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 할로기로 치환된 본원에 정의된 바와 같은 알킬을 지칭한다. 바람직하게는, 할로알킬은 모노할로알킬, 디할로알킬 또는 폴리할로알킬일 수 있고 퍼할로알킬을 포함한다. 모노할로알킬은 알킬기 내에 하나의 요오도, 브로모, 클로로 또는 플루오로를 가질 수 있다. 디할로알킬기 및 폴리할로알킬기는 알킬 내에 둘 이상의 동일한 할로 원자 또는 상이한 할로기의 조합을 가질 수 있다. 바람직하게는, 폴리할로알킬은 12, 또는 10, 또는 8, 또는 6, 또는 4, 또는 3, 또는 2개까지의 할로기를 함유한다. 할로알킬의 대표적인 예는 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸, 펜타플루오로에틸, 헵타플루오로프로필, 디플루오로클로로메틸, 디클로로플루오로메틸, 디플루오로에틸, 디플루오로프로필, 디클로로에틸 및 디클로로프로필이다. 퍼할로알킬은 모든 수소 원자가 할로 원자로 치환된 알킬을 지칭한다. 예를 들어, 용어 "할로-C1-6알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖고, 하나 이상의 할로기로 치환된 탄화수소를 지칭하고, 용어 "할로-C1-7알킬"은 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖고 하나 이상의 할로기로 치환된 탄화수소를 지칭한다.
본원에 사용된 "염"은 무기 산 및 유기 산, 예를 들어, 아세테이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 베실레이트, 브로마이드/하이드로브로마이드, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 캄포르설포르메이트, 클로라이드/하이드로클로라이드, 클로르테오필로네이트, 시트레이트, 에탄디설포네이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 히푸레이트, 하이드로요오다이드/요오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우릴설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프토에이트, 나프실레이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥타데카노에이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 인산염/인산수소염/인산이수소염, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설포살리실레이트, 타르트레이트, 토실레이트 및 트리플루오로아세테이트 염으로 형성될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 산 부가 염을 포함한다.
염이 유도될 수 있는 무기 산은 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 염이 유도될 수 있는 유기 산은 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 톨루엔설폰산, 설포살리실산 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 염기 부가 염은 무기 염기 및 유기 염기로 형성될 수 있다.
염이 유도될 수 있는 무기 염기는, 예를 들어 암모늄 염 및 주기율표의 I 내지 XII열의 금속을 포함한다. 특정 구현예에서, 염은 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 은, 아연 및 구리로부터 유도되고, 특히 적합한 염으로는 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염이 포함된다.
염이 유도될 수 있는 유기 염기는, 예를 들어 1차, 2차, 및 3차 아민, 자연 발생 치환 아민을 포함하는 치환 아민, 환형 아민, 염기성 이온 교환 수지 등을 포함한다. 특정 유기 아민으로는 이소프로필아민, 벤자틴, 콜리네이트, 디에탄올아민, 디에틸아민, 라이신, 메글루민, 피페라진, 및 트로메타민을 포함한다.
범위: 본 개시에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양태는 범위 포맷으로 제시될 수 있다. 범위 포맷의 기재는 단지 편의와 간결함을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위범위와, 그 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위와, 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 또 다른 예로서, 95 내지 99% 동일성과 같은 범위는 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 것을 포함하고, 96 내지 99%, 96 내지 98%, 96 내지 97%, 97 내지 99%, 97~98%, 및 98 내지 99% 동일성과 같은 하위범위를 포함한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
용어 "B 세포 항원" 또는 "B-세포 항원"은 상호교환적으로 사용되며, 이에 결합하는 제제로 표적화될 수 있는 B 세포 표면 상에서 우선적으로 또는 특이적으로 발현되는 분자(전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)를 지칭한다. 특히 관심 B 세포 항원은 포유류의 다른 비-B 세포 조직과 비교하여 B 세포 상에서 우선적으로 발현된다. B 세포 항원은 하나의 특정 B 세포 집단, 예를 들어 B 세포 전구체 또는 성숙 B 세포, 또는 하나 초과의 특정 B 세포 집단, 예를 들어 전구체 B 세포 및 성숙 B 세포 둘 모두에서 발현될 수 있다. 예시적인 B 세포 표면 마커는 CD5, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27, CD30, CD34, CD37, CD38, CD40, CD53, CD69, CD72, CD73, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD123, CD135, CD138, CD179, CD269, Flt3, ROR1, BCMA, FcRn5, FcRn2, CS-1, CXCR4, 5, 7, IL-7/3R, IL7/4/3R, 및 IL4R을 포함한다. 일부 구현예에서, B-세포 항원은 CD19, CD20, CD22, FcRn5, FcRn2, BCMA, CS-1 또는 CD138이다. 구현예에서, B-세포 항원은 CD19이다. 구현예에서, B-세포 항원은 CD20이다. 구현예에서, B-세포 항원은 CD22이다. 구현예에서, B-세포 항원은 BCMA이다. 구현예에서, B-세포 항원은 FcRn5이다. 구현예에서, B-세포 항원은 FcRn2이다. 구현예에서, B-세포 항원은 CS-1이다. 구현예에서, B-세포 항원은 CD138이다.
용어 "고형 종양 항원" 또는 "고형 종양 세포 항원"은 이에 결합하는 제제로 표적화될 수 있는 고형 종양 세포의 표면 상에서 우선적으로 또는 특이적으로 발현되는 분자(전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)를 지칭한다. 특히 관심 고형 종양 항원은 포유류의 다른 비종양 조직과 비교하여 고형 종양 세포 상에서 우선적으로 발현된다. 고형 종양 항원은 하나의 특정 고형 종양 세포 집단, 예를 들어 중피종 종양 세포, 또는 하나 초과의 특정 고형 종양 세포 집단, 예를 들어 중피종 종양 세포 및 난소암 세포 둘 모두에서 발현될 수 있다. 예시적인 고형 종양 항원은 EGFRvIII, 메소텔린, GD2, Tn Ag, PSMA, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, 레구만, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, 엽산 수용체 알파, ERBB(예를 들어, ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, 에프린 B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, 레구마인, HPV E6 또는 E7, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, 폴리시알산, Fos-관련 항원, 호중구 엘라스타제, TRP-2, CYP1B1, 정자 단백질 17, 베타 인간 융모 생식선자극호르몬, AFP, 티로글로불린, PLAC1, 글로보H, RAGE1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, 장 카복실 에스터라제, mut hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4, 및 MHC 상에 제시된 이들 항원 중 임의의 것의 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 고형 종양 항원은 CLDN6, 메소텔린 또는 EGFRvIII이다.
용어 "골수성 종양 항원" 또는 "골수성 종양 세포 항원"은 이에 결합하는 제제로 표적화될 수 있는 골수성 종양 세포의 표면 상에서 우선적으로 또는 특이적으로 발현되는 분자(전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)를 지칭한다. 특히 관심 골수성 종양 항원은 포유류의 다른 비종양 조직과 비교하여 골수성 종양 세포 상에서 우선적으로 발현된다. 골수성 종양 항원은 하나의 특정 골수성 종양 세포 집단, 예를 들어 급성 골수성 백혈병(AML) 종양 세포, 또는 하나 초과의 특정 골수성 종양 세포 집단에서 발현될 수 있다. 예시적인 골수성 종양 항원은 CD33 및 CLL-1을 포함한다.
용어 "B-세포 계통이 아닌 혈액 종양의 항원"은 B-세포 기원이 아닌 조혈 또는 림프 조직 기원의 종양 또는 암의 표면 상에서 우선적으로 또는 특이적으로 발현되는 분자(전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)를 지칭한다. 이들은 골수 계통 기원의 종양, 예를 들어 과립구, 적혈구, 혈소판, 대식구 및/또는 비만 세포 기원 또는 이의 전구 세포 집단 중 임의의 것으로부터 유래된 종양 및 B-세포 기원 이외의 림프 기원, 예를 들어 T 세포, NK 세포 및/또는 형질 세포 기원, 또는 이의 전구체 세포 집단 중 임의의 것의 종양을 포함한다.
표제, 하위표제, 또는 번호나 문자로 된 요소, 예컨대 (a), (b), (i) 등은 단순히 이해의 편의를 위해 표시된 것이다. 본 문서에서 표제 또는 번호를 매기거나 문자를 붙인 요소의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳 순서로 수행될 것 또는 단계 또는 요소가 반드시 서로 개별적일 것을 요구하지 않는다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 이의 전체가 참조로 포함된다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 이러한 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.
설명
생체물질 및 세포 동원 인자를 포함하는 제1 조성물 및/또는 선택적으로 입자, 예를 들어 메조다공성 실리카 입자(MSP), 및 세포 활성화제, 예를 들어 본원에 기재된 다중특이적 결합 분자와 함께, 바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물이 본원에서 고려된다.
또한, 세포 동원 인자를 포함하는 생체물질; 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제를 포함하는 조성물, 및 이의 사용 방법이 본원에서 고려된다. 또한, 조성물 및 세포 동원 인자를 포함하는 생체물질; 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제, 및 이의 사용 방법이 본원에서 고려된다.
이들 조성물의 요소 및 이의 사용 방법은 본원에서 아래에 기재된다. 이론에 구애되지 않고, 본 출원인은 조성물이 국소적으로, 예를 들어 피부 아래에 전달될 수 있고 세포 동원 인자의 사용을 통해 세포가 규정된 전달 부위로 동원되고 바이러스 벡터에 의해 형질도입될 수 있다고 생각한다. 벡터가 CAR을 인코딩하는 구현예에서, 형질도입된 세포는 CAR을 발현하고, 따라서 질환, 장애 또는 질병을 치료하기 위해 특정 항원을 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
생체물질
일부 구현예에서, 생체물질은 하이드로겔, 선택적으로 크리오겔을 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 젤라틴, 히알루론산(HA), 콜라겐, 알기네이트, 라미닌, 키토산, 실크 피브로인, 아가로스, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리비닐 알코올 및/또는 하이드록시에틸 메틸아크릴레이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 생체물질은 알기네이트 하이드로겔, 예를 들어 알기네이트 크리오겔을 포함한다. 일부 구현예에서, 생체물질은 히알루론산 하이드로겔(HA 하이드로겔)을 포함한다. 일부 구현예에서, 생체물질은 히알루론산 크리오겔을 포함한다.
일부 구현예에서, 알기네이트 하이드로겔, 예를 들어 알기네이트 크리오겔은 노르보르넨 및/또는 테트라진을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 노르보르넨 및/또는 테트라진은 알기네이트와 공유적으로 회합(예를 들어 이에 화학적으로 연결)된다. 일부 구현예에서, 노르보르넨 및/또는 테트라진은 알기네이트와 비공유적으로 회합(예를 들어 이에 흡착)된다.
일부 구현예에서, 크리오겔, 예를 들어 알기네이트 크리오겔 및 세포 동원 인자를 포함하는 조성물은 라포나이트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하이드로겔, 예를 들어 HA 하이드로겔 및 세포 동원 인자를 포함하는 조성물은 라포나이트를 추가로 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, 일부 구현예에서, 라포나이트의 사용은 조성물로부터 세포 동원 인자의 느린 및/또는 제어된 방출을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 라포나이트는 약 0.1 내지 약 0.5 mg/mL, 예를 들어, 약 0.1 내지 0.4 mg/mL, 약 0.1 내지 0.35 mg/mL, 약 0.1 내지 0.3 mg/mL, 약 0.1 내지 0.25 mg/mL, 약 0.1 내지 0.15 mg/mL, 약 0.15 내지 0.5 mg/mL, 약 0.15 내지 0.4 mg/mL, 약 0.15 내지 0.35 mg/mL, 약 0.15 내지 0.3 mg/mL, 약 0.15 내지 0.25 mg/mL, 약 1.5 mg/mL 내지 0.2 mg/mL, 약 0.2 내지 0.5 mg/mL, 약 0.2 내지 0.4 mg/mL, 약 0.2 내지 0.35 mg/mL, 약 0.2 내지 0.3 mg/mL, 약 0.2 내지 0.25 mg/mL, 약 0.25 내지 0.5 mg/mL, 약 0.25 내지 0.4 mg/mL, 약 0.25 내지 약 0.35 mg/mL, 약 0.25 내지 0.3 mg/mL, 약 0.3 내지 0.5 mg/mL, 약 0.3 내지 0.4 mg/mL, 약 0.35 내지 0.5 mg/mL, 약 0.35 내지 0.4 mg/mL, 약 0.4 내지 0.5 mg/mL, 약 0.1 mg/mL, 약 0.15 mg/mL, 약 0.2 mg/mL, 약 0.25 mg/mL, 0.3 mg/mL, 약 0.35 mg/mL, 또는 약 0.5 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 라포나이트는 약 0.25 mg/mL의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, 크리오겔은 지름이 약 10 내지 300 μm, 예를 들어, 약 10 내지 20 μm, 약 10 내지 30 μm, 약 10 내지 40 μm, 약 10 내지 50 μm, 약 10 내지 100 μm, 약 10 내지 150 μm, 약 10 내지 200 μm, 약 10 내지 250 μm, 약 20 내지 30 μm, 약 20 내지 40 μm, 약 20 내지 50 μm, 약 20 내지 100 μm, 약 20 내지 150 μm, 약 20 내지 200 μm, 약 20 내지 250 μm, 약 20 내지 300 μm, 약 50 내지 300 μm, 약 50 내지 100 μm, 50 내지 약 150 μm, 50 내지 약 200 μm, 50 내지 약 250 μm, 100 내지 약 150 μm, 100 내지 약 200 μm, 100 내지 약 250 μm, 약 100 내지 300 μm, 약 150 내지 200 μm, 약 150 내지 250 μm, 약 150 내지 300 μm, 약 200 내지 250 μm, 약 200 내지 300 μm, 또는 약 250 내지 300 μm의 기공을 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 기공을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 실질적으로 동일한 크기의 기공을 포함한다. 일부 구현예에서, 생체물질은 상이한 크기의 기공을 포함한다. 일부 구현예에서, 크리오겔은 화학적으로 가교된다.
생체물질을 제조하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Koshy, S. T., Zhang, D., Grolman, J. M., Stafford, A. G., & Mooney, D. J. (2018). Injectable nanocomposite cryogels for versatile protein drug delivery. Acta biomaterialia, 65, 36-43(알기네이트 크리오겔의 제조를 기재함)]을 참고한다. 추가로, 생체물질 및 이의 성분, 예를 들어 Partek SLC(EMD Millipore의 실리카) 또는 TruTag 실리카 입자는 상업적으로 구입될 수 있다.
일부 구현예에서, 크리오겔, 예를 들어 알기네이트 크리오겔은 높은 피하 공간 또는 진피에 인접한 피하 공간에 투여된다. 일부 구현예에서, 하이드로겔, 예를 들어 HA 하이드로겔은 높은 피하 공간 또는 진피에 인접한 피하 공간에 투여된다.
세포 동원 인자
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 본원에 기재된 조성물 또는 방법에 사용된다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 림프관신생을 유도한다. 일부 구현예에서, 림프관신생의 유도는 림프 내피 세포(LEC)(예를 들어, CD45-CD31+PDPN+ 세포)의 수준 및/또는 활성화의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, LEC(예를 들어, CD45-CD31+PDPN+ 세포)의 수준은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 200% 증가된다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 면역 세포, 선택적으로 T-세포 및/또는 NK-세포를 동원, 예를 들어 선택적으로 동원한다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 세포(예를 들어, 면역 세포, 예를 들어 T 세포)를 직접적으로 동원한다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 세포(예를 들어, 면역 세포, 예를 들어 T 세포)를 간접적으로 동원한다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 림프관신생을 유도하고, 이는 다시 세포, 예를 들어 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 동원한다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 T 세포, 예를 들어 나이브 T 세포(예를 들어, CD45RA+CD62L+ T 세포 또는 CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+ T 세포)를 동원한다(예를 들어, 직접적으로 또는 간접적으로). 일부 구현예에서, T 세포의 동원은 T 세포 수준의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포의 수준은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 250%, 또는 300% 증가된다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 CCL19, CXCL9, CXCL10, XCL1, IL-2, IL-7, CCL21, GM-CSF, CCL17, CCL22, CCL20, CCL27, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), 림프독소 알파, 림프독소 베타, VEGF-C, FLT3L, G-CSF, PDGF, S100A8/A9, CSF-1, CXCL8, CCL20, CCL17, CCR5, CCR6, CCL2, VEGF, 안지오포이에틴-2, PGE2, LTB4, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10, CXCL11, 및/또는 CXCL12로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 VEGF-C 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
이론에 구애됨이 없이, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 크리오겔로부터의 세포 동원 인자, 예를 들어, VEGF-C 또는 이의 변이체의 방출은 기존 피부 림프 모세관의 림프관신생을 유도하고, 림프 내피 세포(LEC)를 활성화하며, 이는 다시 CCL21과 같은 케모카인을 분비하여 T 세포, 예를 들어 나이브 T 세포를 크리오겔 투여 부위, 예를 들어 겔 상단의 진피 부위로 동원한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포 동원 인자에 의해 림프관신생을 유도하고 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 동원하는 시간은 약 5 내지 약 28일, 예를 들어, 약 5 내지 21일, 약 5 내지 15일, 약 5 내지 14일, 약 5 내지 10일, 약 7 내지 약 28일, 약 7 내지 약 21일, 약 7 내지 15일, 약 7 내지 14일, 약 7 내지 10일, 약 10 내지 28일, 약 10 내지 21일, 약 10 내지 15일, 약 10 내지 14일, 약 14 내지 28일, 약 14 내지 21일, 약 15 내지 28일, 약 15 내지 21일, 약 21 내지 28일, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 15일, 또는 약 20일, 약 21일, 약 28일을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포 동원 인자에 의해 림프관신생을 유도하고 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 동원하는 시간은 14일(예를 들어, 2주)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포 동원 인자에 의해 림프관신생을 유도하고 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 동원하는 시간은 21일(예를 들어, 3주)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포 동원 인자에 의해 림프관신생을 유도하고 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 동원하는 시간은 28일(예를 들어, 4주 또는 1개월)을 포함한다.
이들 다양한 세포 동원 인자를 생산, 제형화 및/또는 획득하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[
Figure pct00001
VM, Prota AE, Jeltsch M, et al. Structural determinants of growth factor binding and specificity by VEGF receptor 2. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(6):2425-2430. doi:10.1073/pnas.0914318107;
Figure pct00002
VM, Tvorogov D, Kisko K, et al. Structural and mechanistic insights into VEGF receptor 3 ligand binding and activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(32):12960-12965. doi:10.1073/pnas.1301415110; Joyce Chiu, Jason W. H. Wong, Michael Gerometta, and Philip J. Hogg. Mechanism of Dimerization of a Recombinant Mature Vascular Endothelial Growth Factor C Biochemistry 2013 53 (1), 7-9. doi: 10.1021/bi401518b; Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014); Fankhauser, M., M.A. Broggi, L. Potin, N. Bordry, L. Jeanbart, A.W. Lund, E. Da Costa, S. Hauert, M. Rincon-Restrepo, and C. Tremblay. 2017. Tumor lymphangiogenesis promotes T cell infiltration and potentiates immunotherapy in melanoma. Science translational medicine. 9:eaal4712; US 2019 / 0099485 A1: "Lymphangiogenesis for therapeutic immunomodulation" (2017); and Vokali, E., S.Y. Shann, S. Hirosue, M. Rincon-Restrepo, F.V. Duraes, S. Scherer, P.
Figure pct00003
-Henrioud, W.W. Kilarski, A. Mondino, and D. Zehn. 2020. Lymphatic endothelial cells prime
Figure pct00004
CD8+ T cells into memory cells under steady-state conditions. Nature communications. 11:1-18]을 참고한다.
일부 구현예에서, VEGF-C는 미성숙 VEGF-C 펩티드 또는 성숙 VEGF-C 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 마이너 성숙 형태 또는 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 야생형 마이너 성숙 형태 또는 야생형 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 변형된 마이너 성숙 형태 또는 변형된 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 SEQ ID NO: 725에 따라 넘버링된, 시스테인 137에서의 돌연변이(예를 들어, C137A)를 포함하는 변형된 마이너 성숙 형태 또는 시스테인 137에서의 돌연변이(예를 들어, C137A)를 포함하는 변형된 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 C137A 돌연변이를 포함하는 변형된 마이너 성숙 형태 또는 C137A 돌연변이를 포함하는 변형된 메이저 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 성숙 VEGF-C 펩티드는 이량체 또는 단량체로 존재한다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 각각의 단량체에 C137A 돌연변이를 추가로 포함하는 메이저 성숙 형태의 이량체이다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 각각의 단량체에 C137A 돌연변이를 추가로 포함하는 마이너 성숙 형태의 이량체이다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 아래 표 18에 제공된 서열로부터 선택된다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 표 18에 제공된 서열 또는 이와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택된다. 일부 구현예에서, VEGF-C 서열은 링커(예를 들어, 글리신-세린 링커) 및/또는 his 태그를 포함하거나 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, VEGF-C는 SEQ ID NO: 731, 732, 733, 또는 734의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 SEQ ID NO: 741의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 단 위치 26은 시스테인(C)이 아니다, 예를 들어 알라닌(A)이다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 SEQ ID NO: 737 또는 738의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VEGF-C는 SEQ ID NO: 743의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 SEQ ID NO: 740의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, VEGF-C는 SEQ ID NO: 736의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VEGF-C는 SEQ ID NO: 735의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
[표 18]
VEGF-C 변이체
아래 서열은 단량체에 해당한다. 이량체가 형성되는 경우, 동일한 서열 중 2개가 시스테인 가교를 통해 함께 조립된다. his 태그는 실험 목적으로 사용되지만 모든 구현예에서 필요한 것은 아닐 수 있음이 주목된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
일부 구현예에서, VEGF-C는 유효량, 선택적으로 약 1 mg 이하, 약 10 mg 이하, 약 10 μg 이상, 약 1 μg 이상, 약 1 μg 내지 1 mg, 약 10 μg 내지 1 mg, 약 1 μg 내지 10 mg, 또는 약 10 μg 내지 10 mg의 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 면역 세포, 예를 들어 T 세포의 이동을 유도, 예를 들어 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 면역 세포, 예를 들어 T 세포 집단의 증대 또는 증식을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, 크리오겔과 조합된 세포 동원 인자, 예를 들어 IL-15(예를 들어 hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 또는 이의 변이체의 사용은 면역 세포 증대 또는 증식을 유도하여 면역 세포, 예를 들어 T 세포의 크리오겔로의 이동 촉진 및 향상뿐만 아니라 국소 활성화를 초래하는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 면역 세포, 예를 들어 T 세포의 생존을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 IL-7 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, 크리오겔과 조합된 세포 동원 인자, 예를 들어 IL-7 또는 이의 기능적 변이체의 사용은 면역 세포, 예를 들어 T 세포 생존 및 증식을 향상시키는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, 1개, 2개, 3개 이상의 세포 동원 인자가 본원에 기재된 조성물 또는 방법에서 사용된다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 VEGF-C 또는 이의 기능적 변이체; IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 또는 이의 기능적 변이체; IL-7 또는 이의 기능적 변이체; 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 VEGF-C 또는 이의 기능적 변이체 및 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 VEGF-C 또는 이의 기능적 변이체 및 IL-7 또는 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 VEGF-C 또는 이의 기능적 변이체; IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 또는 이의 기능적 변이체; 및 IL-7 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자는 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 또는 이의 기능적 변이체; 및 IL-7 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
T 세포 기능을 촉진하는 제제
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 또는 방법은 면역 세포, 예를 들어 T 세포 기능을 촉진하는 제제를 이용한다. 일부 구현예에서, T 세포 기능을 촉진하는 제제는 T 세포 고갈을 감소시키고/시키거나 T 세포 이상기능을 방지한다.
일부 구현예에서, T 세포 기능을 촉진하는 제제는 Tet2 유전자의 억제제, 예를 들어 Tet2 억제제를 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, Tet 유전자(예를 들어, Tet1, Tet2 또는 Tet3)의 단일 대립유전자의 파괴는 향상된 증식, 효과기 사이토카인 생산의 조절 및 탈과립화와 관련되어 5-하이드록시메틸시토신의 총 수준 감소를 야기하고, 이에 의해 CAR T 세포 증식 및/또는 기능을 증가시킨다. 일부 구현예에서, Tet2 억제제는 (1) Tet2를 인코딩하는 유전자 내의 하나 이상의 부위, 또는 그 상응하는 조절 요소를 표적화하는 유전자 편집 시스템; (2) Tet2의 발현을 억제하는 핵산(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); (3) 단백질(예를 들어, 우성 음성, 예를 들어 촉매 불활성) Tet2, 또는 Tet2의 결합 파트너(예를 들어, Tet2의 우성 음성 결합 파트너); (4) Tet2의 발현 및/또는 기능을 억제하는 소분자; (5) (1) 내지 (3) 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산; 또는 (6) (1) 내지 (5)의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 기능을 촉진하는 제제는 예를 들어 WO2017/049166, WO2018/175733, 및 WO2019/210153에 기재된 바와 같은 Tet2 억제제를 포함하며, 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, T 세포 기능을 촉진하는 제제는 ZBTB32의 억제제, 예를 들어 ZBTB32 억제제를 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, 일부 구현예에서 ZBTB32의 억제는 T 세포 매개 항-종양 반응을 강화할 수 있는 것으로 여겨진다. 특정 구현예에서, ZBTB32의 억제는 생체내 CART 세포 활성, 예를 들어 세포 증대, 사이토카인 생산, 지속성, 고갈에 대한 저항성, 및 항-종양 활성을 향상시킨다. 일부 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (1) ZBTB32 유전자 또는 이의 하나 이상의 성분을 표적화하는 유전자 편집 시스템; (2) 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 핵산; 또는 (3) (1) 및 (2)의 조합을 포함한다. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (1) ZBTB32 유전자 또는 이의 하나 이상의 성분을 표적화하는 유전자 편집 시스템을 포함한다. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (2) 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (1) 및 (2)의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 기능을 촉진하는 제제는 PCT/US2021/037048에 기재된 바와 같은 ZBTB32 억제제를 포함하며, 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함된다.
연장 방출제
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 또는 방법은 연장 방출제를 이용한다. 일부 구현예에서, 연장 방출제는 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 예를 들어 CAR을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터), 세포 활성화제, 또는 바이러스 벡터 및 세포 활성화제 둘 모두의 연장 방출을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 연장 방출제는 주사에 의한 투여용으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 연장 방출제는 입자, 예를 들어 실리카 입자, 예를 들어 메조다공성 실리카 입자를 포함한다.
표면 변형된 메조다공성 실리카 입자
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 또는 방법은 메조다공성 실리카 입자를 이용한다. 메조다공성 실리카 입자는 예를 들어, 육각형의 밀집된 실린더형의 균일한 기공을 갖는 다공체를 포함한다. 메조다공성 실리카 입자는 산 또는 염기 촉매의 존재 하에 알콕시실란, 규산나트륨 용액, 카네마이트, 실리카 마이크로입자 등의 실리카원을 물 또는 알코올에 용해 및 가수분해시켜 물 중에 형성된 계면활성제의 막대형 미셀을 주형으로 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 공개 제2015-0072009호 및 Hoffmann et al., Angewandte Chemie International Edition, 45, 3216-3251, 2006]을 참고한다. 양이온성, 음이온성, 및 비이온성 계면활성제와 같은 많은 종류의 계면활성제가 계면활성제로 조사되었으며, 일반적으로 양이온성 계면활성제의 알킬 트리메틸암모늄 염이 가장 큰 비표면적과 기공 부피를 갖는 메조다공성 실리카를 초래하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 공개 제2013/0052117호 및 Katiyar et al. (Journal of Chromatography 1122 (1-2): 13-20)]을 참고한다.
메조다공성 실리카 입자는 다양한 형태, 예를 들어 미소구체, 불규칙한 입자, 직사각형 막대, 둥근 나노막대로 제공될 수 있다. 메조다공성 실리카 입자는 예를 들어, 회전 타원체 형상, 타원체 형상, 막대형 형상, 또는 만곡된 원통형 형상을 포함한 다양한 소정의 형상을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 인용된 조성물 및 방법은 메조다공성 실리카 막대(MSR)를 사용한다. 마이크로막대(microrod)를 생성하기 위해 메조다공성 실리카를 조립하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 문헌[Wang et al , Journal of Nanoparticle Research, 15: 1501, 2013]을 참고한다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 테트라에틸 오르소실리케이트를 미셀 막대로 이루어진 주형과 반응시킴으로써 합성된다. 그 결과, 규칙적인 기공의 배열로 채워진 메조다공성 실리카 구체 또는 막대의 집합이 생성된다. 그런 다음, 적절한 pH까지 조정된 용매로 세척하여 주형을 제거할 수 있다. 이 예에서, 계면활성제 주형을 제거한 후, 메조다공성 실리카 입자는 균일하고, 규칙적이며, 연결된 메조다공성을 특징으로 하며, 예를 들어 약 600 m2/g 내지 약 1200 m2/g, 특히 약 800 m2/g 내지 약 1000 m2/g, 특히 약 850 m2/g 내지 약 950 m2/g의 비표면적으로 제조된다. 또 다른 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 졸-겔법 또는 분무 건조법을 사용하여 합성될 수 있다. 테트라에틸 오르소실리케이트는 또한 (주형으로서) 추가의 중합체 단량체와 함께 사용된다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 테트라알콕시-실란 및 하나 이상의 (3-시아노프로필)트리알콕시-실란은 공축합되어 메조다공성 실리케이트 입자를 막대로서 제공할 수 있다. 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함된, 미국 공개 제2013-0145488호, 제2012-0264599호 및 제2012-0256336호를 참고한다.
메조다공성 실리카 입자(MSP)(예를 들어, MSR)는 지름이 2 내지 100 nm 또는 지름이 2 내지 50 nm인 정렬되거나 무작위로 분포될 수 있는 기공, 예를 들어 2 내지 5 nm, 10 내지 20 nm, 10 내지 30 nm, 10 내지 40 nm, 20 내지 30 nm, 30 내지 50 nm, 30 내지 40 nm, 40 내지 50 nm의 기공을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 마이크로막대는 지름이 대략 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm, 11 nm, 12 nm 이상인 기공을 포함한다. 기공 크기는 적용 유형에 따라 변경될 수 있다.
일부 구현예에서, MSR의 길이는 약 5 μm 내지 약 500 μm 범위의 마이크로미터 범위이다. 일 예에서, MSR은 5 내지 50 μm, 예를 들어 10 내지 20 μm, 10 내지 30 μm, 10 내지 40 μm, 20 내지 30 μm, 30 내지 50 μm, 30 내지 40 μm, 40 내지 50 μm의 길이를 포함한다. 일부 구현예에서, MSR은 50 μm 내지 250 μm, 예를 들어, 약 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 100 μm, 120 μm, 150 μm, 180 μm, 200 μm, 225 μm 이상의 길이를 포함한다. 일부 구현예에서, 더 높은 종횡비를 갖는 MSR, 예를 들어 50 μm 내지 200 μm의 길이, 특히 80 μm 내지 120 μm의 길이, 특히 약 100 μm 이상의 길이를 포함하는 막대를 갖는 MSR이 사용된다.
또 다른 구현예에서, MSP(예를 들어, MSR)는 표적 세포, 예를 들어 T-세포에 대한 부착 및/또는 결합을 위한 높은 표면적을 제공한다. 고표면적 메조다공성 실리케이트를 얻는 방법은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 그 전체 내용가 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 제8,883,308호 및 미국 공개 제2011-0253643호를 참고한다. 일부 구현예에서, 높은 표면적은 나노입자의 섬유질 형태로 인한 것이며, 이는 표면 상에 고도로 분산되고 쉽게 접근 가능한 모이어티를 고농도로 수득하는 것을 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 고표면적 MSP(예를 들어, MSR)는 적어도 약 100 m2/g, 적어도 150 m2/g, 또는 적어도 300 m2/g의 표면적을 갖는다. 다른 구현예에서, 고표면적 MSP(예를 들어, MSR)는 예를 들어, 50 m2/g, 100 m2/g, 200 m2/g, 300 m2/g, 400 m2/g, 600 m2/g, 800 m2/g, 100 내지 500 m2/g, 100 내지 300 m2/g, 500 내지 800 m2/g 또는 500 내지 1000 m2/g 사이의 모든 값 또는 하위범위를 포함한, 약 100 m2/g 내지 약 1000 m2/g의 표면적을 갖는다.
일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 표면 변형을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "표면 변형"은 MSP(예를 들어, MSR)의 표면에 작용기를 부착 또는 첨부하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 작용기는 기공 및/또는 나노채널을 라이닝하는 표면 또는 MSP(예를 들어, MSR)의 표면 상에 흡착되거나 공유 결합된다. 본원에 사용된 바와 같이, "작용기"는 MSR에 연결된 화학적 모이어티를 정의한다. 일부 구현예에서, 작용기는 -OH(하이드록실), 아민, 카복실산, 포스포네이트, 할라이드, 아지드, 알킨, 에폭시드, 설프하이드릴, 디설피드, 폴리에틸렌이민, 소수성 모이어티, 또는 이의 염이다. 일부 구현예에서, 작용기(즉, -OH(하이드록실), 아민, 카복실산, 포스포네이트, 할라이드, 아지드, 알킨, 에폭시드, 설프하이드릴, 디설피드, 폴리에틸렌이민, 소수성 모이어티, 또는 이의 염)는 링커에 의해 실리카 표면으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 작용기는 C1 내지 C20 알킬 링커를 통해 MSP 또는 MSR 표면에 공유 결합된다. 다른 구현예에서, 작용기는 폴리에틸렌글리콜 링커를 통해 MSP 또는 MSR 표면에 공유 결합된다. 특정 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜 링커는 화학식 (-O(CH2-CH2-)1-25을 갖는다. 특정 구현예에서, 표면 변형은 C1 내지 C20 알킬 퍼할로알킬 또는 C1 내지 C20 알킬 퍼플루오로알킬이다.
표면 변형의 일반적인 구조는 하기와 같을 수 있다:
Figure pct00008
여기서, L은 링커이고, X는 작용기이다.
일부 구현예에서, L은 C1 내지 C20 알킬기 또는 폴리에틸렌 글리콜기일 수 있고, X는 -OH(하이드록실), 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민, 카복실산, 포스포네이트, 할라이드, 아지드, 알킨, 에폭시드, 설프하이드릴, 디설피드, 폴리에틸렌이민, 또는 소수성 모이어티, 또는 이의 염일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 포스포네이트를 갖는 표면 변형(포스포네이트-변형 나노입자로도 알려짐)은 적어도 하나의 포스폰산(-P(O)(OH)2)기 또는 포스핀산(-P(O)(OH)R, 여기서 R은 C1 내지 C20 알킬기임)을 갖는다. 포스폰산 또는 포스핀산은 pH에 따라 하전되거나 하전되지 않을 수 있다. 생리적 pH에서, 포스폰산과 포스핀산은 음으로 하전되거나, 음이온성이다. 포스포네이트 변형은 예를 들어, (트리하이드록실실릴)프로필 메틸포스포네이트와 같은 포스포네이트 함유 트리알킬실록산 화합물 또는 포스포네이트 함유 트리하이드록실실릴 화합물로 실리카 본체 표면을 처리함으로써 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자(예를 들어, MSR)는 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민으로 표면 변형된다. 2차, 3차 및 4차 아민은 C1 내지 C20의 알킬기로 치환될 수 있으며, 하전될 수 있다. 일부 구현예에서, 아민기는 염 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민은 링커에 의해 MSP 표면으로부터 분리될 수 있다. 특정 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 폴리에틸렌이민으로 변형된다. 특정 구현예에서, 폴리에틸렌이민은 분지형 또는 비분지형이다. 대안적인 구현예에서, 폴리에틸렌이민기는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정된, 약 1000 내지 100,000 달톤(Da) 범위의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리에틸렌이민기는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정된, 약 1,200 내지 15,000 Da, 약 1,500 내지 12,000 Da, 약 2,000 Da, 약 3,000 Da, 약 4,000 Da, 약 5,000 Da, 약 6,000 Da, 약 7,000 Da, 약 8,000 Da, 약 9,000 Da, 약 10,000 Da, 또는 약 20,000 Da의 평균 분자량을 갖는다.
다양한 예시적인 표면 변형된 메조다공성 실리카 입자의 구조를 도 1에 나타낸다.
본원에 언급된 MSP(예를 들어, MSR)는 본원에서 언급된 바와 같이 당업자에게 알려진 방법에 의해 제조된다. 일반적으로, 표면 변형된 MSP는 하기 방법으로 제조할 수 있다.
일반적으로, MSP(예를 들어, MSR)의 실릴 하이드록시드 표면과 반응할 수 있는 임의의 반응이 표면을 공유적으로 변형하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, MSP(예를 들어, MSR)의 표면은 트리알콕시실릴 화합물 또는 트리하이드록시실릴 화합물로 처리될 수 있다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자는 적합한 반응 용매에 현탁된다. 일부 구현예에서, 반응 용매는 pH 0 내지 14의 수성 용매 또는 완충액일 수 있다. 테트라하이드로푸란, 2-메틸 테트라하이드로푸란, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 트리에틸아민, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 디메틸설폭시드, 메탄올, 에탄올, 메틸렌 클로라이드, 또는 디클로로에탄을 포함하지만 이에 제한되지 않는 1종 이상의 유기 용매와 수용액의 추가 공동 혼합물이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 현탁된 메조다공성 실리카 입자를 본원에 기재된 바와 같은 원하는 작용기를 갖는 트리알콕시실릴 또는 트리하이드록시실릴 시약과 반응시킨다. 아민 변형은, 예를 들어, MSP를 아민 함유 트리알콕시실란 화합물, 예컨대 아미노프로필트리에톡시실란, 3-(2-아미노에틸아미노)프로필-트리메톡시실란, 또는 3-트리메톡시실릴프로필 에틸렌디아민으로 처리함으로써 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 트리알콕시실릴은 트리메톡시실릴 또는 트리에톡시실릴기이다. 대안적인 구현예에서, 트리알콕시실릴 시약은 트리알콕시 알킬아민이다. 일부 구현예에서, 트리알콕시 알킬아민은 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민을 포함한다.
특정 구현예에서, 트리알콕시실릴 시약은 폴리에틸렌이민기를 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리에틸렌이민은 분지형 또는 비분지형이다. 대안적인 구현예에서, 폴리에틸렌이민기는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정된, 약 1000 내지 20,000 Da, 약 1,200 내지 15,000 Da, 약 1,500 내지 12,000 Da, 약 2,000 Da, 약 3,000 Da, 약 4,000 Da, 약 5,000 Da, 약 6,000 Da, 약 7,000 Da, 약 8,000 Da, 약 9,000 Da, 또는 약 10,000 Da의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 트리알콕시실릴 시약은 C1-20 알킬아지드기를 포함한다. 특정 구현예에서, 트리알콕시실릴 시약은 C1-20 알킬카복실산기를 포함한다. 다른 구현예에서, 트리알콕시실릴 시약은 C1-20 알킬기를 포함한다.
MSP(예를 들어, MSR) 상의 설프하이드릴 변형은, 예를 들어, MSP를 3-메르캅토프로필트리에톡시실란과 같은 설프하이드릴 함유 트리알콕시실란 화합물로 처리함으로써 제조될 수 있다.
MSP(예를 들어, MSR) 상의 디설피드 변형은, 예를 들어, 나노입자의 표면을 디설피드 함유 트리알콕시실란 화합물로 처리함으로써, 또는 설프하이드릴 변형된 표면을 2,2'-디티오디피리딘 또는 다른 디설피드로 처리함으로써 제조될 수 있다.
카복실산기를 포함시키기 위한 MSP(예를 들어, MSR) 표면 변형은, 예를 들어, 표면을 카복실산 함유 트리알콕시실란 화합물로 처리함으로써, 또는 MSP를, 카복실산으로 화학적으로 전환될 수 있는 작용기를 함유하는 트리알콕시실란 화합물로 처리함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, MSP는 3-시아노프로필트리에톡시실란으로 처리된 후, 황산으로 가수분해될 수 있다.
에폭시드를 포함시키기 위한 MSP(예를 들어, MSR) 표면 변형은 적어도 하나의 에폭시드를 가질 것이며, 예를 들어, MSP를, 글리시독시프로필트리에톡시실란과 같은 에폭시드를 함유하는 트리알콕시실란 화합물로 처리함으로써 제조될 수 있다.
소수성 모이어티를 갖는 표면 변형은 물에 대한 용해도를 감소시키거나 유기 용매에 대한 용해도를 증가시키도록 의도된 적어도 하나의 모이어티를 가질 것이다. 소수성 모이어티의 예는 장쇄 알킬기(예를 들어, C8-C20 알킬기), 지방산 에스테르(예를 들어, C1-C22 알킬산 에스테르), 및 C6-C10 탄소 원자를 갖는 방향족 고리를 포함한다.
일부 구현예에서, MSP(예를 들어, MSR)와 트리알콕시실릴 시약의 반응은 상온 또는 실온에서 수행된다. 다른 구현예에서, 반응은 승온에서 수행된다. 추가 구현예에서, 반응 온도는 약 40℃ 내지 약 120℃, 약 50℃ 내지 약 100℃, 약 60℃ 내지 약 80℃, 약 70℃ 내지 약 80℃, 또는 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 약 80℃, 약 85℃, 약 90℃, 약 95℃, 또는 약 100℃이다.
바이러스 벡터
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 연장 방출제, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 메조다공성 실리카 입자 및 바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
바이러스 벡터는 임의의 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY], 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 예로서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스, 또는 헤르페스바이러스일 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터이다.
렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 딸세포에서의 트랜스유전자의 장기적이고 안정적인 통합 및 그 증식을 가능하게 하므로 장기적인 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 간세포와 같은 비증식성 세포의 형질도입을 가능하게 할 수 있다는 점에서 쥣과 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가적인 장점을 갖는다. 렌티바이러스 벡터는 또한 낮은 면역원성의 추가 장점을 갖는다. 레트로바이러스 벡터는 예를 들어 감마레트로바이러스 벡터일 수도 있다. 감마레트로바이러스 벡터는 예를 들어 프로모터, 패키징 신호(Ψ), 프라이머 결합 부위(PBS), 하나 이상(예를 들어 2개)의 장형 말단 반복(LTR), 및 관심 트랜스유전자, 예를 들어 CAR을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터에는 gag, pol, 및 env와 같은 바이러스 구조 유전자가 결여되어 있을 수 있다. 예시적인 감마레트로바이러스 벡터는 쥣과 백혈병 바이러스(MLV), 비장-병소 형성 바이러스(SFFV), 및 골수증식성 육종 바이러스(MPSV), 및 이로부터 유래된 벡터를 포함한다. 다른 감마레트로바이러스 벡터는, 예를 들어 문헌[Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713]에 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 목적하는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노바이러스 벡터(A5/35)이다. 또 다른 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산의 발현은 트랜스포존, 예컨대 슬리핑 뷰티(sleeping beauty), CRISPR, CAS9, 및 징크 핑거 뉴클레아제를 사용하여 달성할 수 있다. 문헌[June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716](본원에 참조로 포함됨)을 참고한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 TCR, 사이토카인, 케모카인, 억제 분자를 차단하기 위한 shRNA, 또는 단백질의 발현을 유도하기 위한 mRNA를 발현한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 신호전달 영역 및 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인이다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 뉴클레오티드 서열은 종양 항원을 표적화하도록 조작된 펩티드를 발현한다. 일부 구현예에서, 펩티드는 TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, 엽산 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 파단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 종양 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 펩티드는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 조작된 TCR이다. 이러한 펩티드는 아래의 키메라 항원 수용체 기술의 일반 설명이라는 표제의 섹션에 더 자세히 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 벡터의 뉴클레오티드 서열은 종양 항원을 표적화하도록 조작된 단백질을 발현한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1(CD2 하위세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24로도 지칭됨); C형 렉틴 유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII); 강글리오시드 G2(GD2); 강글리오시드 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙(BCMA); Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립샘 특이적 막 항원(PSMA); 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(ROR1); Fms 유사 티로신 키나제 3(FLT3); 종양 연관 당단백질 72(TAG72); CD38; CD44v6; 암배아 항원(CEA); 상피 세포 부착 분자(EPCAM); B7H3(CD276); KIT(CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파(IL-11Ra); 전립샘 줄기 세포 항원(PSCA); 프로테아제 세린 21(테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타); 단계 특이적 배아 항원-4(SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2(Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 연관(MUC1); 표피 성장 인자 수용체(EGFR); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제(PAP); 돌연변이된 신장 인자 2(ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP); 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체(IGF-I 수용체), 탄산 탈수효소 IX(CAIX); 프로테아좀(프로좀, 마크로파인(Macropain)) 서브유닛, 베타 유형, 9(LMP2); 당단백질 100(gp100); 절단점 클러스터 영역(BCR) 및 아벨슨(Abelson) 쥣과 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체 1(Ab1)로 구성된 종양유전자 융합 단백질(bcr-ab1); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자(sLe); 강글리오시드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5(TGS5); 고분자량 흑색종 연관 항원(HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2); 엽산 수용체 베타; 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7 관련(TEM7R); 클라우딘 6(CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); G 단백질-커플링 수용체 클래스 C군 5, 구성원 D(GPRC5D); 염색체 X 개방 해독틀 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이적 1(PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당류 부분(글로보H); 유선 분화 항원(NY-BR-1); 우로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3(ADRB3); 패넥신 3(PANX3); G 단백질-커플링 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TCR 감마 대안적 해독틀 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ESO-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종 연관 항원 1(MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전위-변이체 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; 종양 단백질 p53(p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빙; 텔로머라제; 전립샘 암종 종양 항원-1(PCTA-1 또는 갈렉틴 8); T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(멜란A 또는 MART1); 래트 육종(Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT); 육종 전위 파단점; 흑색종 아폽토시스 억제제(ML-IAP); ERG(막관통 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐 트랜스퍼라제 V(NA17); 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수구종증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래 상동체(MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C(RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2(TRP-2); 시토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC-결합 인자(징크 핑거 단백질) 유사(BORIS 또는 각인된 부위의 조절원(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)); T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원(SART3); 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32(OY-TES1); 림프구 특이적 단백질 티로신 키나제(LCK); A 키나제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종, X 절단점 2(SSX2); 진행성 당화 최종 생성물에 대한 수용체(RAGE-1); 신장 편재 1(RU1); 신장 편재 2(RU2); 레구마인; 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7); 장 카복실 에스테라아제; 돌연변이된 열 충격 단백질 70-2(mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2(LILRA2); CD300 분자 유사 패밀리 구성원 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF 유사 모듈 함유 뮤신 유사 호르몬 수용체 유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-3(GPC3); Fc 수용체 유사 5(FCRL5); 및 면역글로불린 람다 유사 폴리펩티드 1(IGLL1) 중 하나 이상으로부터 선택된다.
본원에 기재된 CAR은 종양 지지 항원(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 종양 지지 항원)에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편, TCR 또는 TCR 단편)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 지지 항원은 기질 세포 또는 골수 유래 억제 세포(MDSC) 상에 존재하는 항원이다. 기질 세포는 미세 환경에서 세포 분열을 촉진하도록 성장 인자를 분비할 수 있다. MDSC 세포는 T 세포의 증식 및 활성화를 억제할 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, 일부 구현예에서, CAR-발현 세포는 종양-지지 세포를 파괴함으로써 종양의 성장 또는 생존을 간접적으로 억제한다.
일부 구현예에서, 기질 세포 항원은 골수 기질 세포 항원 2(BST2), 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 및 테나신 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, FAP 특이적 항체는 시브로투주맙이거나, 시브로투주맙과의 결합에 대하여 경쟁하거나, 시브로투주맙과 동일한 CDR을 갖는다. 구현예에서, MDSC 항원은 CD33, CD11b, C14, CD15, 및 CD66b 중 하나 이상으로부터 선택된다. 따라서, 일부 구현예에서, 종양 지지 항원은 골수 기질 세포 항원 2(BST2), 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 또는 테나신, CD33, CD11b, C14, CD15, 및 CD66b 중 하나 이상으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 인코딩된 CAR 분자의 항원 결합 도메인은 항체, 항체 단편, scFv, Fv, Fab, (Fab')2, 단일 도메인 항체(SDAB), VH 또는 VL 도메인, 낙타과 VHH 도메인 또는 2기능적(예를 들어, 이중특이적) 하이브리드 항체를 포함한다(예를 들어, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)).
일부 경우에서, scFv는 당분야에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어 Bird et al., (1988) Science 242:423-426 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참고). scFv 분자는 가요성 폴리펩티드 링커를 사용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생산될 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 링커(예를 들어 Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv의 가변 영역이 폴딩하고 상호작용하는 방식에 크게 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 짧은 폴리펩티드 링커가 이용되는 경우(예를 들어, 5개 내지 10개의 아미노산), 사슬내 폴딩이 방지된다. 사슬간 폴딩은 또한 2개의 가변 영역을 함께 모아 기능적 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 필요하다. 링커 배향 및 크기의 예에 대해서는, 예를 들어 문헌[Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, 미국 특허 출원 공개 제2005/0100543호, 제2005/0175606호, 제2007/0014794호 및 국제 공개 제WO2006/020258호 및 제WO2007/024715호]를 참고하며, 본원에 참조로 포함된다.
scFv는 그의 VL 영역과 VH 영역 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열은 임의의 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 반복체의 세트, 예컨대 (Gly4Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다(SEQ ID NO: 22). 일부 구현예에서, 링커는 (Gly4Ser)4(SEQ ID NO: 29) 또는 (Gly4Ser)3(SEQ ID NO: 30)일 수 있다. 링커 길이의 변화는 활성을 유지하거나 향상시켜, 활성 연구에서 우수한 효능을 유도할 수 있다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체("TCR"), 또는 이의 단편, 예를 들어 단일쇄 TCR(scTCR)이다. 이러한 TCR을 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)](참고문헌 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)을 참고한다. 예를 들어, 링커(예를 들어, 가요성 펩티드)에 의해 연결된 T 세포 클론으로부터 Vα 및 Vβ 유전자를 함유하는 scTCR이 조작될 수 있다. 이러한 접근은 그 자체는 세포 내에 있으나 이러한 항원의 단편(펩티드)이 MHC에 의해 암 세포의 표면 상에 제시되는 암 관련 표적에 매우 유용하다.
특정 구현예에서, 인코딩된 항원 결합 도메인은 10-4 M 내지 10-8 M의 결합 친화도 KD를 갖는다.
일부 구현예에서, 인코딩된 CAR 분자는 표적 항원에 대해 10-4 M 내지 10-8 M, 예를 들어, 10-5 M 내지 10-7 M, 예를 들어, 10-6 M 또는 10-7 M의 결합 친화도 KD를 갖는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 참조 항체, 예를 들어 본원에 기재된 항체보다 적어도 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 또는 1,000배 적은 결합 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, 인코딩된 항원 결합 도메인은 참조 항체(예를 들어, 항원 결합 도메인이 유래되는 항체)보다 적어도 5배 적은 결합 친화도를 갖는다. 일부 양태에서, 이러한 항체 단편은 당업자에 의해 이해될 바와 같이 그들이 면역 반응의 활성화, 그의 표적 항원으로부터의 신호 전달 기원의 억제, 키나제 활성의 억제 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 생물학적 반응을 제공한다는 점에서 기능적이다.
일부 양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 그것이 유래되는 scFv의 쥣과 서열과 비교하여 인간화된 scFv 항체 단편이다.
일부 양태에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 서열이 포유류 세포에서의 발현용으로 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 일부 양태에서, 본 발명의 전체 CAR 작제물은 전체 서열이 포유류 세포에서의 발현용으로 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 코돈 최적화는 코딩 DNA 내의 동의 코돈(즉, 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈)의 발생 빈도가 상이한 종에서 편향된다는 발견을 말한다. 이러한 코돈 축퇴성은 동일한 폴리펩티드가 다양한 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있도록 한다. 다양한 코돈 최적화 방법이 당분야에 알려져 있고, 예를 들어 적어도 미국 특허 제5,786,464호 및 제6,114,148호에 개시된 방법을 포함한다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, CAR 분자를 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 수반하는 구현예에서, 치료 방법은 아래의 키메라 항원 수용체에 관한 섹션에서 기재된 임의의 단계, 양태 또는 특징을 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
세포는 바람직하게는 면역 효과기 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 NK 세포이다. 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 세포 집단, 예를 들어, 본 발명의 면역 효과기 세포 집단에 관한 것이다. 구현예에서, 본 발명의 세포 집단은 표시된 유형의 세포를 포함하고, 다른 유형을 포함할 수 있다(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, CAR 분자를 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포의 집단은 CAR 분자를 발현하도록 조작된 T 세포뿐만 아니라 CAR 분자를 발현하도록 조작되지 않은 T 세포(또는 다른 세포 유형)를 포함할 수 있음). 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 세포 집단은 본질적으로 표시된 유형의 세포로 구성된다. 구현예에서, 본 발명의 세포 집단은 다른 세포 유형이 실질적으로 없다. 구현예에서, 본 발명의 세포 집단은 표시된 세포 유형으로 구성된다.
임의의 전술한 양태 및 구현예에서, 세포 및/또는 세포의 집단은 면역 효과기 세포이거나 이를 포함하고, 예를 들어 면역 효과기 세포의 집단은 T 세포 또는 NK 세포를 포함하고, 예를 들어, 이로 구성된다. 구현예에서 세포는 T 세포, 예를 들어 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 이의 조합이다. 구현예에서 세포는 NK 세포이다.
구현예에서 세포는 인간 세포이다. 구현예에서, 세포는 예를 들어 세포가 투여될 대상체에 대해 자가 세포이다. 구현예에서, 세포는 예를 들어 세포가 투여될 대상체에 대해 동종이계이다.
일반적으로, 본원에 기재된 방법에서, 본원에 기재된 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 조합되어 당분야에 알려진 임의의 통상적이고 허용 가능한 방식을 통해 전술한 바와 같이 치료 유효량으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 주사에 의해 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 생체내 투여를 위해, 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에 피하 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 원하는 작용 부위에 임플란트의 형태로 투여될 수 있다. 작용 부위는 대상체의 필요에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.
CAR 표적
면역 효과기 세포를 원하지 않는 세포(예를 들어, 암 세포)로 안내하는 하나 이상의 CAR을 함유하도록 조작된 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 형질도입하기 위한 바이러스 벡터가 본원에 기재되어 있다. 이는 암 관련 항원에 특이적인 CAR 상의 항원 결합 도메인을 통해 달성된다. 본 발명의 CAR이 표적화할 수 있는 두 클래스의 암 관련 항원(종양 항원): (1) 암 세포의 표면에서 발현되는 암 관련 항원; 및 (2) 그 자체는 세포 내에 있지만 이러한 항원의 단편(펩티드)이 MHC(주조직 적합성 복합체)에 의해 암 세포의 표면에서 제시되는 암 연관 항원이 있다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1(CD2 하위세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24로도 지칭됨); C형 렉틴 유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII); 강글리오시드 G2(GD2); 강글리오시드 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙(BCMA); Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립샘 특이적 막 항원(PSMA); 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(ROR1); Fms 유사 티로신 키나제 3(FLT3); 종양 연관 당단백질 72(TAG72); CD38; CD44v6; 암배아 항원(CEA); 상피 세포 부착 분자(EPCAM); B7H3(CD276); KIT(CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파(IL-11Ra); 전립샘 줄기 세포 항원(PSCA); 프로테아제 세린 21(테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타); 단계 특이적 배아 항원-4(SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2(Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 연관(MUC1); 표피 성장 인자 수용체(EGFR); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제(PAP); 돌연변이된 신장 인자 2(ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP); 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체(IGF-I 수용체), 탄산 탈수효소 IX(CAIX); 프로테아좀(프로좀, 마크로파인(Macropain)) 서브유닛, 베타 유형, 9(LMP2); 당단백질 100(gp100); 절단점 클러스터 영역(BCR) 및 아벨슨(Abelson) 쥣과 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체 1(Ab1)로 구성된 종양유전자 융합 단백질(bcr-ab1); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자(sLe); 강글리오시드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5(TGS5); 고분자량 흑색종 연관 항원(HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2); 엽산 수용체 베타; 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7 관련(TEM7R); 클라우딘 6(CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); G 단백질-커플링 수용체 클래스 C군 5, 구성원 D(GPRC5D); 염색체 X 개방 해독틀 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이적 1(PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당류 부분(글로보H); 유선 분화 항원(NY-BR-1); 우로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3(ADRB3); 패넥신 3(PANX3); G 단백질-커플링 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TCR 감마 대안적 해독틀 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ESO-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종 연관 항원 1(MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전위-변이체 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; 종양 단백질 p53(p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빙; 텔로머라제; 전립샘 암종 종양 항원-1(PCTA-1 또는 갈렉틴 8); T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(MelanA 또는 MART1); 래트 육종(Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT); 육종 전위 파단점; 흑색종 아폽토시스 억제제(ML-IAP); ERG(막관통 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐 트랜스퍼라제 V(NA17); 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수구종증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래 상동체(MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C(RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2(TRP-2); 시토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC-결합 인자(징크 핑거 단백질) 유사(BORIS 또는 각인된 부위의 조절원); T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원(SART3); 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32(OY-TES1); 림프구 특이적 단백질 티로신 키나제(LCK); A 키나제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종, X 절단점 2(SSX2); 진행성 당화 최종 생성물에 대한 수용체(RAGE-1); 신장 편재 1(RU1); 신장 편재 2(RU2); 레구마인; 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7); 장 카복실 에스테라아제; 돌연변이된 열 충격 단백질 70-2(mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2(LILRA2); CD300 분자 유사 패밀리 구성원 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF 유사 모듈 함유 뮤신 유사 호르몬 수용체 유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-3(GPC3); Fc 수용체 유사 5(FCRL5); 및 면역글로불린 람다 유사 폴리펩티드 1(IGLL1) 중 하나 이상으로부터 선택된다.
CD19
비제한적인 예시적 종양 항원은 CD19이다. CD19에 결합하는 CAR은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, WO2012/079000 및 WO2014/153270에 개시된 것들. 당분야에서의 임의의 알려진 CD19 CAR, 예를 들어, 임의의 알려진 CD19 CAR의 CD19 항원 결합 도메인이 본 개시에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, LG-740; CD19 CAR은 미국 특허 제8,399,645호; 미국 특허 제7,446,190호; 문헌[Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013); 및 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10]에 기재되었다.
비제한적인 예시적 CD19 CAR은 본원에 기재된 CD19 CAR 또는 문헌[Xu et al. Blood 123.24(2014):3750-9; Kochenderfer et al. Blood 122.25(2013):4129-39, Cruz et al. Blood 122.17(2013):2965-73, NCT00586391, NCT01087294, NCT02456350, NCT00840853, NCT02659943, NCT02650999, NCT02640209, NCT01747486, NCT02546739, NCT02656147, NCT02772198, NCT00709033, NCT02081937, NCT00924326, NCT02735083, NCT02794246, NCT02746952, NCT01593696, NCT02134262, NCT01853631, NCT02443831, NCT02277522, NCT02348216, NCT02614066, NCT02030834, NCT02624258, NCT02625480, NCT02030847, NCT02644655, NCT02349698, NCT02813837, NCT02050347, NCT01683279, NCT02529813, NCT02537977, NCT02799550, NCT02672501, NCT02819583, NCT02028455, NCT01840566, NCT01318317, NCT01864889, NCT02706405, NCT01475058, NCT01430390, NCT02146924, NCT02051257, NCT02431988, NCT01815749, NCT02153580, NCT01865617, NCT02208362, NCT02685670, NCT02535364, NCT02631044, NCT02728882, NCT02735291, NCT01860937, NCT02822326, NCT02737085, NCT02465983, NCT02132624, NCT02782351, NCT01493453, NCT02652910, NCT02247609, NCT01029366, NCT01626495, NCT02721407, NCT01044069, NCT00422383, NCT01680991, NCT02794961 또는 NCT02456207]에 기재된 항-CD19 CAR을 포함하며, 이들 각각 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, CD19 CAR은 WO2012/079000에 SEQ ID NO: 12로서 제공된 융합 폴리펩티드 서열을 포함하고, 이는 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 쥣과 기원의 scFv 단편을 제공한다.
일부 구현예에서, CD19 CAR은 WO2012/079000에 SEQ ID NO: 12로서 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CD19 CAR은 아미노산 서열:
Figure pct00009
또는 이와 실질적으로 상동성인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CD19 CAR은 아미노산 서열:
Figure pct00010
을 포함한다.
일부 구현예에서, CD19 CAR은 아미노산 서열:
Figure pct00011
을 포함하는 인간화 CD19 CAR이다.
일부 구현예에서, CD19 CAR은 아래 표 1에 개시된 서열, 예를 들어, CDR, VH, VL, scFv, 또는 전체 CAR 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[표 1]
예시적인 항-CD19 분자의 아미노산 서열
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
BCMA
비제한적인 예시적 종양 항원은 BCMA이다. BCMA에 결합하는 CAR은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, WO2016/014565 또는 WO2019/241426에 개시된 것들. 당분야에서의 임의의 알려진 BCMA CAR, 예를 들어 임의의 알려진 BCMA CAR의 BCMA 항원 결합 도메인이 본 개시에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, WO2016/014565에 개시된 BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, 또는 C13F12.1.
일부 구현예에서, BCMA CAR은 WO2016/014565에 개시된 BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, 또는 C13F12.1의 하나 이상의 CDR, VH, VL, scFv, 또는 전장 서열, 또는 이와 실질적으로(예를 들어, 95 내지 99%) 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, BCMA CAR은 표 2 내지 14에 개시된 서열, 예를 들어, CDR, VH, VL, scFv, 또는 전체 CAR 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[표 2]
예시적인 PALLAS-유래 항-BCMA 분자의 아미노산 및 핵산 서열
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
[표 3]
예시적인 PALLAS-유래 항-BCMA 분자의 카바트 CDR
Figure pct00028
[표 4]
예시적인 PALLAS-유래 항-BCMA 분자의 초티아 CDR
Figure pct00029
[표 5]
예시적인 PALLAS-유래 항-BCMA 분자의 IMGT CDR
Figure pct00030
[표 6]
예시적인 B 세포-유래 항-BCMA 분자의 아미노산 및 핵산 서열
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
[표 7]
예시적인 B 세포 유래 항-BCMA 분자의 카바트 CDR
Figure pct00042
[표 8]
예시적인 B 세포-유래 항-BCMA 분자의 초티아 CDR
Figure pct00043
[표 9]
예시적인 B 세포-유래 항-BCMA 분자의 IMGT CDR
Figure pct00044
[표 14]
PI61에 기반한 예시적인 항-BCMA 분자의 아미노산 및 핵산 서열
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
[표 10]
예시적인 하이브리도마-유래 항-BCMA 분자의 아미노산 및 핵산 서열
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
[표 11]
예시적인 하이브리도마-유래 항-BCMA 분자의 카바트 CDR
Figure pct00057
[표 12]
예시적인 하이브리도마-유래 항-BCMA 분자의 초티아 CDR
Figure pct00058
[표 13]
예시적인 하이브리도마-유래 항-BCMA 분자의 IMGT CDR
Figure pct00059
일부 구현예에서, BCMA CAR은 WO2012/0163805(그 내용 전체가 본원에 참조로 포함됨)로부터의 VH 및 VL 서열을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, BCMA CAR은 WO2019/241426(그 내용 전체가 본원에 참조로 포함됨)로부터의 CDR, VH, VL, scFv, 또는 전체 CAR 서열을 사용하여 생성될 수 있다.
다른 예시적인 표적
추가의 비제한적인 예시적 종양 항원은 CD20, CD22, EGFR, CD123, 및 CLL-1을 포함한다.
CD20에 결합하는 CAR은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 WO2018/067992 또는 WO2016/164731에 개시된 것들. 당분야에서의 임의의 알려진 CD20 CAR, 예를 들어, 임의의 알려진 CD20 CAR의 CD20 항원 결합 도메인이 본 개시에 따라 사용될 수 있다. 예시적인 CD20-결합 서열 또는 CD20 CAR 서열은 예를 들어, 참조로 포함되는, WO2018/067992의 표 1 내지 5에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, CD20 CAR은 WO2018/067992 또는 WO2016/164731(둘 모두 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 CD20 CAR의 CDR, 가변 영역, scFv, 또는 전장 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD20 CAR은 아래 표 23에 개시된 서열, 예를 들어, CDR, VH, VL, scFv, 또는 전체 CAR 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[표 23]
예시적인 항-CD20 분자의 아미노산 서열
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
CD22에 결합하는 CAR은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, WO2018/067992 또는 WO2016/164731에 개시된 것들. 당분야에서의 임의의 알려진 CD22 CAR, 예를 들어, 임의의 알려진 CD22 CAR의 CD22 항원 결합 도메인이 본 개시에 따라 사용될 수 있다.
예시적인 CD22-결합 서열 또는 CD22 CAR 서열은 예를 들어, WO2016164731의 표 6A, 6B, 7A, 7B, 7C, 8A, 8B, 9A, 9B, 10A, 및 10B, 및 WO2018067992의 표 6 내지 10에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, CD22 CAR 서열은 WO2018067992 또는 WO2016164731에 개시된 CD22 CAR의 CDR, 가변 영역, scFv, 또는 전장 서열을 포함한다.
구현예에서, CAR은 CD22에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다(CD22 CAR). 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 인간 CD22를 표적화한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 단일쇄 Fv 서열을 포함한다.
인간 CD22 CAR의 서열은 아래에 제공된다. 일부 구현예에서, 인간 CD22 CAR는 CAR22-65이다.
인간 CD22 CAR scFv 서열
Figure pct00081
인간 CD22 CAR 중쇄 가변 영역
Figure pct00082
인간 CD22 CAR 경쇄 가변 영역
Figure pct00083
일부 구현예에서, CD22 CAR은 아래 표 15 내지 16 및 표 24에 개시된 서열, 예를 들어, CDR, VH, VL, scFv, 또는 전체 CAR 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[표 15]
CD22 CAR의 중쇄 가변 도메인 CDR(CAR22-65)
Figure pct00084
[표 16]
CD22 CAR의 경쇄 가변 도메인 CDR(CAR22-65). 이 표에서 LC CDR 서열은 카바트 또는 조합 정의 하에 동일한 서열을 갖는다.
Figure pct00085
[표 24]
예시적인 항-CD22 분자의 아미노산 서열
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
EGFR에 결합하는 CAR은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 2014/130657에 개시된 것들. 당분야에서의 임의의 알려진 EGFR CAR, 예를 들어 임의의 알려진 EGFR CAR의 EGFR 항원 결합 도메인이 본 개시에 따라 사용될 수 있다. 예시적인 EGFRvIII CAR은 본원에 참조로 포함된 WO2014/130657, 예를 들어, WO2014/130657의 표 2에 개시된 CDR, 가변 영역, scFv, 또는 전장 CAR 서열을 포함할 수 있다.
CD123에 결합하는 CAR은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, WO2014/130635 또는 WO2016/028896에 개시된 것들. 당분야에서의 임의의 알려진 CD123 CAR, 예를 들어, 임의의 알려진 CD123 CAR의 CD123 항원 결합 도메인이 본 개시에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, WO2014/130635에 개시된 CAR1 내지 CAR8; 또는 WO2016/028896에 개시된 CAR123-1 내지 CAR123-4 및 hzCAR123-1 내지 hzCAR123-32. CD123 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어 카바트 또는 초티아에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 인코딩하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 WO 2014/130635 및 WO2016/028896에 명시되어 있다.
CLL-1에 결합하는 CAR은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 US2016/0051651A1에 개시된 것들. 당분야에서의 임의의 알려진 CLL-1 CAR, 예를 들어, 임의의 알려진 CLL-1 CAR의 CLL-1 항원 결합 도메인이 본 개시에 따라 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 본원에 참조로 포함되는, WO2016/014535의 표 2에 따른 CLL-1 CAR 또는 항원 결합 도메인을 포함한다. CLL-1 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어 카바트 또는 초티아에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 인코딩하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 WO2016/014535에 명시되어 있다.
CD33에 결합하는 CAR은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 US2016/0096892A1 또는 WO2016/014576에 개시된 것들. 당분야에서의 임의의 알려진 CD33 CAR, 예를 들어, 임의의 알려진 CD33 CAR의 CD33 항원 결합 도메인이 본 개시에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, WO2016/014576에 개시된 CAR33-1 내지 CAR33-9.
일부 구현예에서, CAR은 본원에 참조로 포함되는, WO2016/014576의 표 2 또는 9에 따른 CD33 CAR 또는 항원 결합 도메인을 포함한다. CD33 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어, 카바트 또는 초티아에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 인코딩하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 WO2016/014576에 명시되어 있다.
메소텔린에 결합하는 CAR은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 인간 메소텔린과 결합하는, 본원에 참조로 포함되는, WO2015090230 및 WO2017112741, 예를 들어, WO2017112741의 표 2, 3, 4, 및 5에 개시된 것들. 당분야에서의 임의의 알려진 메소텔린 CAR, 예를 들어 임의의 알려진 메소텔린 CAR의 메소텔린 항원 결합 도메인이 본 개시에 따라 사용될 수 있다.
GFR ALPHA-4에 결합하는 CAR은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, WO2016/025880에 개시된 것들. 당분야에서의 임의의 알려진 GFR ALPHA-4 CAR, 예를 들어 임의의 알려진 GFR ALPHA-4 CAR의 GFR ALPHA-4 항원 결합 도메인이 본 개시에 따라 사용될 수 있다. GFR ALPHA-4 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어 카바트 또는 초티아에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 인코딩하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 WO2016/025880에 명시되어 있다.
항원 결합 도메인 구조
일부 구현예에서, 인코딩된 CAR 분자의 항원 결합 도메인은 항체, 항체 단편, scFv, Fv, Fab, (Fab')2, 단일 도메인 항체(SDAB), VH 또는 VL 도메인, 낙타과 VHH 도메인 또는 2기능적(예를 들어, 이중특이적) 하이브리드 항체를 포함한다(예를 들어, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)).
일부 경우에서, scFv는 당분야에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어 Bird et al., (1988) Science 242:423-426 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참고). scFv 분자는 가요성 폴리펩티드 링커를 사용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생산될 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 링커(예를 들어 Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv의 가변 영역이 폴딩하고 상호작용하는 방식에 크게 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 짧은 폴리펩티드 링커가 이용되는 경우(예를 들어, 5개 내지 10개의 아미노산), 사슬내 폴딩이 방지된다. 사슬간 폴딩은 또한 2개의 가변 영역을 함께 모아 기능적 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 필요하다. 링커 배향 및 크기의 예에 대해서는, 예를 들어 문헌[Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, 미국 특허 출원 공개 제2005/0100543호, 제2005/0175606호, 제2007/0014794호 및 국제 공개 제WO2006/020258호 및 제WO2007/024715호]을 참고하며, 본원에 참조로 포함된다.
scFv는 그의 VL 영역과 VH 영역 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열은 임의의 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 반복 세트, 예컨대 (Gly4Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다(SEQ ID NO: 22). 일부 구현예에서, 링커는 (Gly4Ser)4(SEQ ID NO: 29) 또는 (Gly4Ser)3(SEQ ID NO: 30)일 수 있다. 링커 길이의 변화는 활성을 유지하거나 향상시켜, 활성 연구에서 우수한 효능을 유도할 수 있다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체("TCR"), 또는 이의 단편, 예를 들어 단일쇄 TCR(scTCR)이다. 이러한 TCR을 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)](참고문헌 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)을 참고한다. 예를 들어, 링커(예를 들어, 가요성 펩티드)에 의해 연결된 T 세포 클론으로부터 Vα 및 Vβ 유전자를 함유하는 scTCR이 조작될 수 있다. 이러한 접근은 그 자체는 세포 내에 있으나 이러한 항원의 단편(펩티드)이 MHC에 의해 암 세포의 표면 상에 제시되는 암 관련 표적에 매우 유용하다.
특정 구현예에서, 인코딩된 항원 결합 도메인은 10-4 M 내지 10-8 M의 결합 친화도 KD를 갖는다.
일부 구현예에서, 인코딩된 CAR 분자는 표적 항원에 대해 10-4 M 내지 10-8 M, 예를 들어, 10-5 M 내지 10-7 M, 예를 들어, 10-6 M 또는 10-7 M의 결합 친화도 KD를 갖는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 참조 항체, 예를 들어 본원에 기재된 항체보다 적어도 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 또는 1,000배 적은 결합 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, 인코딩된 항원 결합 도메인은 참조 항체(예를 들어, 항원 결합 도메인이 유래되는 항체)보다 적어도 5배 적은 결합 친화도를 갖는다. 일부 양태에서, 이러한 항체 단편은 당업자에 의해 이해될 바와 같이 그들이 면역 반응의 활성화, 그의 표적 항원으로부터의 신호 전달 기원의 억제, 키나제 활성의 억제 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 생물학적 반응을 제공한다는 점에서 기능적이다.
일부 양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 그것이 유래되는 scFv의 쥣과 서열과 비교하여 인간화된 scFv 항체 단편이다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 CAR의 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 서열이 포유류 세포에서의 발현용으로 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 일부 양태에서, 본 발명의 전체 CAR 작제물은 전체 서열이 포유류 세포에서의 발현용으로 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 코돈 최적화는 코딩 DNA 내의 동의 코돈(즉, 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈)의 발생 빈도가 상이한 종에서 편향된다는 발견을 말한다. 이러한 코돈 축퇴성은 동일한 폴리펩티드가 다양한 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있도록 한다. 다양한 코돈 최적화 방법이 당분야에 알려져 있고, 예를 들어 적어도 미국 특허 제5,786,464호 및 제6,114,148호에 개시된 방법을 포함한다.
구체적 항원 항체 쌍은 당분야에 알려져 있다. 항원 항체 쌍 및 이의 성분의 비제한적인 예시적 구현예는 본원에서 위의 표적이라는 표제의 섹션 및 아래에 제공된다.
CD19
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD19에 결합하고, 문헌[Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)]에 기재된 FMC63 scFv 단편과 동일하거나 유사한 결합 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD19에 결합하고, 문헌[Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)]에 기재된 scFv 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인(예를 들어, 인간화 항원 결합 도메인)은 CD19에 결합하고, 본원에 참조로 포함되는 WO2014/153270의 표 3으로부터의 서열을 포함한다. 또한, WO2014/153270에는 다양한 CAR 작제물의 결합 및 효능의 검정 방법이 기재되어 있다.
쥣과 CD19 항체의 인간화는 마우스-특이적 잔기가 CART19 처리, 즉 CAR19 작제물로 형질도입된 T 세포를 이용한 치료를 제공받은 환자에서 인간-항-마우스 항원(HAMA) 반응을 유도할 수 있는 임상 환경에 있어서 바람직하다. 인간화 CD19 CAR 서열의 생산, 특성규명, 및 효능은 실시예 1 내지 5(p. 115-159)를 포함하여 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 출원 WO2014/153270에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 (본원에 참조로 포함되는) WO2012/079000에 제공된 CAR19 작제물의 모 쥣과 scFv 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD19에 결합하고, WO2012/079000에 기재된 scFv를 포함한다.
BCMA
BCMA와 결합하는 예시적인 항원 결합 도메인은 이의 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO2012/0163805, WO 2017/021450, WO 2017/011804, WO 2017/025038, WO 2016/090327, WO 2016/130598, WO 2016/210293, WO 2016/090320, WO 2016/014789, WO 2016/094304, WO 2016/154055, WO 2015/166073, WO 2015/188119, WO 2015/158671, US 9,243,058, US 8,920,776, US 9,273,141, US 7,083,785, US 9,034,324, US 2007/0049735, US 2015/0284467, US 2015/0051266, US 2015/0344844, US 2016/0131655, US 2016/0297884, US 2016/0297885, US 2017/0051308, US 2017/0051252, US 2017/0051252, WO 2016/020332, WO 2016/087531, WO 2016/079177, WO 2015/172800, WO 2017/008169, US 9,340,621, US 2013/0273055, US 2016/0176973, US 2015/0368351, US 2017/0051068, US 2016/0368988, 및 US 2015/0232557에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, BCMA 항원 결합 도메인 중 하나 이상의 항원 결합 도메인이 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 BCMA와 결합하는 인간 항체 또는 인간 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 본원(예를 들어, 표 2 내지 14)에 기재된 인간 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상의(예를 들어, 모든 3개의) LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 및/또는 본원(예를 들어, 표 2 내지 14)에 기재된 인간 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상의(예를 들어, 모든 3개의) HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 본원(예를 들어, 표 2, 6, 및 10)에 기재된 인간 VL 및/또는 본원(예를 들어, 표 2, 6, 및 10)에 기재된 인간 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 2, 6, 및 10의 아미노산 서열의 VL 및 VH를 포함하는 scFv이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 표 2, 6, 및 10에 제공된 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열 또는 표 2, 6, 및 10의 아미노산 서열과 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL, 및/또는 표 2, 6, 및 10에 제공된 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열 또는 표 2, 6, 및 10의 아미노산 서열과 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 도메인은 다음을 포함한다:
(1) 다음으로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 경쇄(LC) CDR:
(i) SEQ ID NO: 54의 LC CDR1, SEQ ID NO: 55의 LC CDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 LC CDR3; 및/또는
(2) 다음 중 하나로부터의 1, 2, 또는 3개의 중쇄(HC) CDR:
(i) SEQ ID NO: 44의 HC CDR1, SEQ ID NO: 45의 HC CDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 HC CDR3; (ii) SEQ ID NO: 44의 HC CDR1, SEQ ID NO: 45의 HC CDR2, 및 SEQ ID NO: 46의 HC CDR3; (iii) SEQ ID NO: 44의 HC CDR1, SEQ ID NO: 45의 HC CDR2, 및 SEQ ID NO: 68의 HC CDR3; 또는 (iv) SEQ ID NO: 44의 HC CDR1, SEQ ID NO: 45의 HC CDR2, 및 SEQ ID NO: 76의 HC CDR3.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 도메인은 다음을 포함한다:
(1) 다음 중 하나로부터의 1, 2, 또는 3개의 경쇄(LC) CDR:
(i) SEQ ID NO: 95의 LC CDR1, SEQ ID NO: 131의 LC CDR2, 및 SEQ ID NO: 132의 LC CDR3; (ii) SEQ ID NO: 95의 LC CDR1, SEQ ID NO: 96의 LC CDR2, 및 SEQ ID NO: 97의 LC CDR3; (iii) SEQ ID NO: 95의 LC CDR1, SEQ ID NO: 114의 LC CDR2, 및 SEQ ID NO: 115의 LC CDR3; 또는 (iv) SEQ ID NO: 95의 LC CDR1, SEQ ID NO: 114의 LC CDR2, 및 SEQ ID NO: 97의 LC CDR3; 및/또는
(2) 다음 중 하나로부터의 1, 2, 또는 3개의 중쇄(HC) CDR:
(i) SEQ ID NO: 86의 HC CDR1, SEQ ID NO: 130의 HC CDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 HC CDR3; (ii) SEQ ID NO: 86의 HC CDR1, SEQ ID NO: 87의 HC CDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 HC CDR3; 또는 (iii) SEQ ID NO: 86의 HC CDR1, SEQ ID NO: 109의 HC CDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 HC CDR3.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 도메인은 다음을 포함한다:
(1) 다음 중 하나로부터의 1, 2, 또는 3개의 경쇄(LC) CDR:
(i) SEQ ID NO: 147의 LC CDR1, SEQ ID NO: 182의 LC CDR2, 및 SEQ ID NO: 183의 LC CDR3; (ii) SEQ ID NO: 147의 LC CDR1, SEQ ID NO: 148의 LC CDR2, 및 SEQ ID NO: 149의 LC CDR3; 또는 (iii) SEQ ID NO: 147의 LC CDR1, SEQ ID NO: 170의 LC CDR2, 및 SEQ ID NO: 171의 LC CDR3; 및/또는
(2) 다음 중 하나로부터의 1, 2, 또는 3개의 중쇄(HC) CDR:
(i) SEQ ID NO: 179의 HC CDR1, SEQ ID NO: 180의 HC CDR2, 및 SEQ ID NO: 181의 HC CDR3; (ii) SEQ ID NO: 137의 HC CDR1, SEQ ID NO: 138의 HC CDR2, 및 SEQ ID NO: 139의 HC CDR3; 또는 (iii) SEQ ID NO: 160의 HC CDR1, SEQ ID NO: 161의 HC CDR2, 및 SEQ ID NO: 162의 HC CDR3.
일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 44, 45, 84, 54, 55, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 44, 45, 46, 54, 55, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 44, 45, 68, 54, 55, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 44, 45, 76, 54, 55, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 47, 48, 84, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 47, 48, 46, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 47, 48, 68, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 47, 48, 76, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 49, 50, 85, 60, 58, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 49, 50, 51, 60, 58, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 49, 50, 69, 60, 58, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 49, 50, 77, 60, 58, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 예시적인 표적
CD20과 결합하는 예시적인 항원 결합 도메인은 본원에 참조로 포함되는 WO2016/164731 및 WO2018/067992에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CD20 항원 결합 도메인 중 하나 이상의 항원 결합 도메인.
CD22와 결합하는 예시적인 항원 결합 도메인은 본원에 참조로 포함되는 WO2016/164731 및 WO2018/067992에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 15에 열거된 임의의 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함한다. 구현예에서, 항원 결합 도메인은 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 추가로 포함한다. 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 16에 열거된 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 16에 열거된 임의의 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3 중 1, 2개 또는 모두, 및 표 15에 열거된 임의의 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3 중 1, 2개 또는 모두를 포함한다.
EGFRvIII과 결합하는 예시적인 항원 결합 도메인은 WO2014/130657에 기재되어 있다.
CD123과 결합하는 예시적인 항원 결합 도메인은 본원에 참조로 포함되는 WO 2014/130635 및 WO2016/028896에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 본원에 참조로 포함되는 WO2014/130635의 표 1 내지 2로부터의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 본원에 참조로 포함되는 WO2016/028896의 표 2, 6, 및 9로부터의 서열을 포함한다.
CLL-1과 결합하는 예시적인 항원 결합 도메인은 본원에 참조로 포함되는 WO2016/014535에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 항체(예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1 또는 WO2015/090230에 기재된 항체)로부터의 1, 2, 3개(예를 들어 3개 모두)의 중쇄 CDR, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3, 및/또는 본원에 기재된 항체(예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1, 또는 WO2015/090230에 기재된 항체)로부터의 1, 2, 3개(예를 들어 3개 모두)의 경쇄 CDR, LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 위에 열거된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
구현예에서, 항원 결합 도메인은 본원에 참조로 포함되는 WO2015/142675호, US-2015-0283178-A1호, US-2016-0046724-A1호, US2014/0322212A1호, US2016/0068601A1호, US2016/0051651A1호, US2016/0096892A1호, US2014/0322275A1호 또는 WO2015/090230호에 기재된 항원 결합 도메인이다.
CAR-발현 세포를 사용하여 표적화될 수 있는 예시적인 표적 항원은 다른 것들 중 특히, 예를 들어 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO2014/153270, WO 2014/130635, WO2016/028896, WO 2014/130657, WO2016/014576, WO 2015/090230, WO2016/014565, WO2016/014535 및 WO2016/025880에 기재된 바와 같은 CD19, CD123, EGFRvIII, CD33, 메소텔린, BCMA 및 GFR ALPHA-4를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CAR 중 임의의 것(예를 들어 CD19, CD123, EGFRvIII, CD33, 메소텔린, BCMA 및 GFR ALPHA-4 중 임의의 것)의 항원 결합 도메인은 위에 열거된 항체로부터의 1, 2, 3개(예를 들어 3개 모두)의 중쇄 CDR, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3, 및/또는 위에 열거된 항원 결합 도메인으로부터의 1, 2, 3개(예를 들어 3개 모두)의 경쇄 CDR, LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 상기 열거되거나 기재된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 상기 열거된 항체로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 중쇄 CDR, HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 및/또는 상기 열거된 항체로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 경쇄 CDR, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 상기 열거되거나 기재된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
이중특이적 CAR
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 이중특이적 또는 다중특이적 분자(예를 들어, 다중특이적 항체 분자)이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 일부 구현예에서 제1 및 제2 에피토프는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 단백질(또는 다량체 단백질의 서브유닛) 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩되지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 항원, 예를 들어 상이한 단백질(또는 다량체 단백질의 상이한 서브유닛) 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열 그리고 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 이의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 이의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 분자는 다중특이적(예를 들어 이중특이적 또는 삼중특이적) 항체 분자이다. 이러한 분자는 이중특이적 융합 단백질, 예를 들어, US5637481에 기재된 바와 같은, 2개의 scFv 사이에 친수성 나선형 펩티드 링커가 있는 2개의 scFv 및 전체 불변 영역을 함유하는 발현 작제물; 예를 들어, US5837821에 기재된 바와 같은, 이량체화되어 이중특이적/다가 분자를 형성할 수 있는, 항체 힌지 영역 및 CH3 영역에 펩티드 스페이서로 추가 연결된, 연결된 VL 및 VL 쇄가 있는 미니바디 작제물; 예를 들어, US5864019에 기재된 바와 같은, VL 도메인과 추가 회합되어 일련의 FV(또는 scFv)를 형성하는, C-말단에서 가교성 기와 펩티드 연결에 의해 연결된 VH 도메인(또는 패밀리 구성원의 VL 도메인)의 스트링; 및 예를 들어, US5869620에 기재된 바와 같은, 비공유적으로 또는 화학적 가교를 통해 다가 구조로 조합되어 scFV 또는 디아바디 유형의 포맷 둘 모두를 사용하여 예를 들어, 동종2가, 이종2가, 3가, 및 4가 구조를 형성하는, 펩티드 링커를 통해 연결된 VH 및 VL 도메인 둘 모두를 갖는 단일쇄 결합 폴리펩티드를 포함한다. 상기 참조된 출원의 내용은 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다.
이중특이적 항체 분자의 각각의 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv) 내에서, VH는 VL의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 상류 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)은 그 VH(VH1)가 그 VL(VL1)의 상류에 있게 배열되고, 하류 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)은 그 VL(VL2)이 그 VH(VH2)의 상류에 있게 배열되어, 전체 이중특이적 항체 분자가 배열 VH1-VL1-VL2-VH2를 갖도록 한다. 다른 구현예에서, 상류 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)은 그 VL(VL1)이 그 VH(VH1)의 상류에 있게 배열되고, 하류 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)은 그 VH(VH2)가 그 VL(VL2)의 상류에 있게 배열되어, 전체 이중특이적 항체 분자가 배열 VL1-VH1-VH2-VL2를 갖도록 한다. 선택적으로, 링커는 2개의 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv) 사이, 예를 들어 작제물이 VH1-VL1-VL2-VH2로 배열된 경우에 VL1과 VL2 사이, 또는 작제물이 VL1-VH1-VH2-VL2로 배열된 경우에 VH1과 VH2 사이에 배치된다. 링커는 본원에 기재된 바와 같은 링커, 예를 들어 (Gly4-Ser)n 링커일 수 있으며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6, 바람직하게는 4이다(SEQ ID NO: 691). 일반적으로, 2개의 scFv 사이의 링커는 2개의 scFv의 도메인 사이의 쌍형성오류를 피하기에 충분히 길어야 한다. 선택적으로, 링커는 제1 scFv의 VL과 VH 사이에 배치된다. 선택적으로, 링커는 제2 scFv의 VL과 VH 사이에 배치된다. 다수의 링커를 갖는 작제물에서, 링커 중 임의의 2개 이상은 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이중특이적 CAR은 VL, VH, 및 선택적으로 1개 이상의 링커를 본원에 기재된 바와 같은 배열로 포함한다.
막관통 도메인
막관통 도메인과 관련하여, 다양한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 분자(예를 들어, CAR)는 키메라 분자의 세포외 도메인에 부착된 막관통 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 막관통 도메인은 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 추가의 아미노산, 예를 들어 막관통 영역이 유래된 단백질의 세포외 영역과 관련된 하나 이상의 아미노산(예를 들어 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산) 및/또는 막관통 단백질이 유래된 단백질의 세포내 영역과 관련된 하나 이상의 추가의 아미노산(예를 들어 세포내 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 막관통 도메인은 키메라 단백질(예를 들어, CAR)의 다른 도메인 중 하나와 회합된 것이고, 예를 들어 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 신호전달 도메인, 공동자극 도메인 또는 힌지 도메인이 유래된 동일한 단백질로부터의 것일 수 있다. 또 다른 양태에서, 막관통 도메인은 키메라 단백질(예를 들어, CAR)의 임의의 다른 도메인이 유래된 동일한 단백질로부터 유래되지 않는다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 이러한 도메인이 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 결합하는 것을 피하기 위해, 예를 들어 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 선택되거나 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 막관통 도메인은 CAR-발현 세포의 세포 표면 상의 또 다른 CAR과의 동종이량체화가 가능하다. 상이한 양태에서, 막관통 도메인의 아미노산 서열은 동일한 CAR-발현 세포에 존재하는 고유 결합 파트너의 결합 도메인과의 상호작용을 최소화하기 위해 변형되거나 치환될 수 있다.
막관통 도메인은 천연 또는 재조합원으로부터 유래될 수 있다. 원천이 천연인 경우에, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 막관통 도메인은 CAR이 표적에 결합할 때마다 세포내 도메인(들)으로의 신호전달이 가능하다. 본 발명에서 특정 용도의 막관통 도메인은 적어도, 예를 들어 T-세포 수용체, CD28, CD27, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 알파쇄, 베타쇄 또는 제타쇄의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 적어도, 예컨대 KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CD11a, CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7Rα, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, 또는 NKG2C의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 막관통 도메인은 힌지, 예를 들어 인간 단백질로부터의 힌지를 통해 CAR의 세포외 영역, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 힌지는 인간 Ig(면역글로불린) 힌지(예를 들어 IgG4 힌지, IgD 힌지), GS 링커(예를 들어 본원에 기재된 GS 링커), KIR2DS2 힌지 또는 CD8a 힌지일 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다(예를 들어, 이로 구성됨). 일부 양태에서, 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 12의 막관통 도메인을 포함한다(예를 들어, SEQ ID NO: 12의 막관통 도메인으로 구성됨).
일부 구현예에서, 인코딩된 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의, 그러나 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 CD8 막관통 도메인의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인코딩된 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산 분자는 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 서열, 또는 이와 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, CD8 막관통 도메인의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인코딩된 항원 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 인코딩된 힌지 영역은 CD8 힌지의 아미노산 서열, 예를 들어, SEQ ID NO: 4; 또는 IgG4 힌지의 아미노산 서열, 예를 들어, SEQ ID NO: 6, 또는 SEQ ID NO: 4 또는 6과 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 힌지 영역을 인코딩하는 핵산 서열은 각각 CD8 힌지 또는 IgG4 힌지에 상응하는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7의 서열, 또는 SEQ ID NO: 5 또는 7과 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 힌지 또는 스페이서는 IgG4 힌지를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 아미노산 서열
Figure pct00098
의 힌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는
Figure pct00099
Figure pct00100
의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 힌지를 포함한다.
일부 양태에서, 힌지 또는 스페이서는 IgD 힌지를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 아미노산 서열
Figure pct00101
의 힌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는
Figure pct00102
의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 힌지를 포함한다.
일부 양태에서, 막관통 도메인은 재조합 도메인일 수 있고, 이 경우에 이는 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 주로 포함할 것이다. 일부 양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 재조합 막관통 도메인의 각각의 말단에서 발견될 수 있다.
선택적으로, 2 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 CAR의 막관통 도메인과 세포질 영역 사이에 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 특히 적합한 링커를 제공한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 링커는 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 10)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO: 11)의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 링커는 GGGGS(SEQ ID NO: 877)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 SEQ ID NO: 876의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.
일부 양태에서, 힌지 또는 스페이서는 KIR2DS2 힌지를 포함한다.
신호전달 도메인
세포내 신호전달 도메인을 갖는 본 발명의 구현예에서, 이러한 도메인은 예를 들어, 일차 신호전달 도메인 및/또는 공동자극 신호전달 도메인 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
본 발명의 CAR의 세포질 부분 내의 세포내 신호전달 도메인은 무작위 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 선택적으로, 예를 들어 2 내지 10개 아미노산(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산) 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커가 세포내 신호전달 도메인 사이의 연결을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 글리신-세린 이중체가 적합한 링커로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 아미노산, 예를 들어 알라닌, 글리신이 적합한 링커로서 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 공동자극 신호전달 도메인은 링커 분자, 예를 들어 본원에 기재된 링커 분자에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 분자는 글리신 잔기이다. 일부 구현예에서, 링커는 알라닌 잔기이다.
1차 신호전달 도메인
1차 신호전달 도메인은 TCR 복합체의 1차 활성화를 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려져 있는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. CAR에서 이러한 도메인은 동일한 목적에 사용된다.
본 발명에 특히 유용한 일차 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, 일반적인 FcR 감마(FCER1G), Fc 감마 RIIa, FcR 베타(Fc 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10 및 DAP12의 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CAR은 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3-제타의 일차 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 인코딩된 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 인코딩된 CD3 제타 일차 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을, 그러나 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인코딩된 일차 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 일차 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 21의 서열, 또는 이와 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
공동자극 신호전달 도메인
일부 구현예에서, 인코딩된 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, 세포내 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인코딩된 공동자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, 또는 NKG2D 중 하나 이상으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 인코딩된 공동자극 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을, 그러나 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인코딩된 공동자극 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 공동자극 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 17의 서열, 또는 이의 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 인코딩된 세포내 도메인은 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 16의 서열 및 SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하며, 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임에서 그리고 단일 폴리펩티드쇄로서 발현된다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 17의 서열, 또는 이와 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열, 및 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 21의 서열, 또는 이와 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 리더 서열을 추가로 인코딩한다. 일부 구현예에서, 리더 서열은 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일부 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일부 양태에서, 4-1BB의 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 14의 신호전달 도메인이다. 일부 양태에서, CD3-제타의 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 18의 신호전달 도메인이다.
일부 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD27의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일부 양태에서, CD27의 신호전달 도메인은
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO: 16)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, CD27의 신호전달 도메인은
Figure pct00103
의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
억제 도메인
일부 구현예에서, 벡터는 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 CAR을 인코딩하는 핵산 서열, 및 inhKIR 세포질 도메인; 막관통 도메인, 예를 들어 KIR 막관통 도메인; 및 억제제 세포질 도메인, 예를 들어 ITIM 도메인, 예를 들어 inhKIR ITIM 도메인을 포함하는 억제 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 억제 분자는 자연 발생 inhKIR, 또는 자연 발생 inhKIR과 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 또는 99%의 상동성을 공유하거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이하의 잔기가 상이한 서열이다.
일부 구현예에서, 억제 분자를 인코딩하는 핵산 서열은 SLAM 패밀리 세포질 도메인; 막관통 도메인, 예를 들어 SLAM 패밀리 막관통 도메인; 및 억제제 세포질 도메인, 예를 들어 SLAM 패밀리 도메인, 예를 들어 SLAM 패밀리 ITIM 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서 억제 분자는 자연 발생 SLAM 패밀리 구성원, 또는 자연 발생 SLAM 패밀리 구성원과 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 또는 99%의 상동성을 공유하거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이하의 잔기가 상이한 서열이다.
일부 구현예에서, 벡터는 시험관내 전사된 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 핵산 분자의 RNA를 전사하는 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터 내의 핵산 서열은 폴리(A) 테일, 예를 들어, 폴리 A 테일을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 내의 핵산 서열은 3'UTR, 예를 들어 인간 베타-글로불린으로부터 유래된 3'UTR의 적어도 하나의 반복을 포함하는, 예를 들어 본원에 기재된 3' UTR을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 내의 핵산 서열은 프로모터, 예를 들어 T2A 프로모터를 추가로 포함한다.
프로모터
일부 구현예에서, 벡터는 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF-1 프로모터, CMV IE 유전자 프로모터, EF-1α 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 또는 포스포글리세린산 키나제(PGK) 프로모터로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF-1 프로모터이다. 일부 구현예에서, EF-1 프로모터는 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포는 당업자에게 알려진 임의의 수의 기술, 예컨대 Ficoll™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 유닛으로부터 얻어질 수 있다. 일부 양태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출술에 의해 얻어진다. 분리반출술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구를 포함하는 림프구, 및 혈소판을 함유한다. 일부 양태에서, 분리반출술에 의해 수집된 세포는 세척되어, 혈장 분획을 제거하고, 선택적으로 후속 처리 단계를 위해 세포를 완충액 또는 배지에 현탁시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 대안적 구현예에서, 세척 용액에는 칼슘이 없고, 마그네슘이 없을 수 있거나, 모두는 아니지만 많은 2가 양이온이 없을 수 있다.
[표 17]
CAR의 다양한 성분의 서열(aa - 아미노산, na - 해당 단백질을 인코딩하는 핵산)
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
Figure pct00108
시험관내 CAR-T 제조
본원에서 고려되는 방법은 세포의 생체내 형질도입에 관한 것이지만, 시험관내 제조의 어려움 또한 인정된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터가 형질도입된 세포는, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 증대된다. 일부 구현예에서, 세포는 수 시간(예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21시간) 내지 약 14일(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일)의 기간 동안 배양 중에 증대된다. 일부 구현예에서, 세포는 4 내지 9일의 기간 동안 증대된다. 일부 구현예에서, 세포는 8일 이하, 예를 들어 7, 6, 또는 5일의 기간 동안 증대된다. 일부 구현예에서, 세포는 5일 동안 배양 중 증대되고, 생성된 세포는 동일한 배양 조건 하에서 9일 동안 배양 중 증대된 동일한 세포보다 더 강력하다. 효력은, 예를 들어 다양한 T 세포 기능, 예를 들어 증식, 표적 세포 사멸, 사이토카인 생산, 활성화, 이동, 또는 이의 조합에 의해 규정될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 5일 동안 증대되어 동일한 배양 조건 하에서 9일 동안 배양 중 증대된 동일한 세포에 비해 항원 자극 시 세포 배가의 적어도 1, 2, 3 또는 4배 증가를 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포는 5일 동안 배양 중 증대되고, 생성된 세포는 동일한 배양 조건 하에서 9일 동안 배양 중 증대된 동일한 세포에 비해 더 높은 염증성 사이토카인 생산, 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준을 나타낸다. 일부 구현예에서, 5일 동안 증대된 세포는 동일한 배양 조건 하에서 9일 동안 배양 중 증대된 동일한 세포에 비해 친염증성 사이토카인 생산(pg/ml), 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10배 이상의 증가를 나타낸다.
칼슘 부재 하의 초기 활성화 단계는 활성화 확대를 야기할 수 있다. 당업자가 용이하게 이해할 바와 같이, 세척 단계는 당업자에게 알려진 방법에 의해, 예컨대 반자동 "관류" 원심분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 제조업체의 지침에 따라 사용함으로써 달성될 수 있다. 세척 후, 세포는 다양한 생체적합성 완충액, 예를 들어 Ca-무함유, Mg-무함유 PBS, 플라스마라이트 A, 또는 완충액이 있거나 없는 다른 식염수 용액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 분리반출술 샘플의 원치않는 성분이 제거되고, 세포가 배양 배지에 직접 재현탁될 수 있다.
본 출원의 시험관내 방법은 5% 이하, 예를 들어 2%의 인간 AB 혈청을 포함하는 배양 배지 조건을 이용할 수 있고, 알려진 배양 배지 조건 및 조성, 예를 들어 문헌[Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31]에 기재된 것들을 이용할 수 있음이 인식된다.
일부 양태에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심분리 용출에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. 단리된 T 세포는 본원에 기재된 방법에서 추가로 사용될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 음성 선택 기술을 사용한, 예를 들어 T 조절 세포-고갈 집단, CD25+ 고갈 세포인 면역 효과기 세포의 특정 하위집단, 예를 들어 T 세포의 선택을 포함할 수 있다. 바람직하게는, T 조절 고갈 세포의 집단은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만의 CD25+ 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포는 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 CD25-결합 리간드, IL-2를 사용하여 집단으로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 항-CD25 항체, 또는 이의 단편, 또는 CD25-결합 리간드는 기질, 예를 들어 비드에 접합되거나, 기질, 예를 들어 비드에 코팅된다. 일부 구현예에서, 항-CD25 항체, 또는 이의 단편은 본원에 기재된 바와 같은 기질에 접합된다.
일부 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포는 Miltenyi™의 CD25 고갈 시약을 사용해 집단으로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 세포 대 CD25 고갈 시약의 비는 1 x 107개 세포 대 20 μL, 또는 1 x 107개 세포 대 15 μL, 또는 1 x 107개 세포 대 10 μL, 또는 1 x 107개 세포 대 5 μL, 또는 1 x 107개 세포 대 2.5 μL, 또는 1 x 107개 세포 대 1.25 μL이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 고갈을 위하여, 5억개 초과의 세포/ml가 사용된다. 추가의 양태에서, 6억, 7억, 8억 또는 9억개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다.
일부 구현예에서, 고갈될 면역 효과기 세포의 집단은 약 6 x 109개의 CD25+ T 세포를 포함한다. 다른 양태에서, 고갈될 면역 효과기 세포의 집단은 약 1 x 109 내지 1x 1010개의 CD25+ T 세포, 및 그 사이의 임의의 정수값을 포함한다. 일부 구현예에서, 생성된 T 조절 고갈 세포 집단은 2 x 109개 이하의 T 조절 세포, 예를 들어, CD25+ 세포(예를 들어, 1 x 109, 5 x 108, 1 x 108, 5 x 107, 1 x 107개 이하의 CD25+ 세포)를 갖는다.
일부 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포는 예를 들어 튜빙 162-01과 같은 고갈 튜빙 세트를 갖는 CliniMAC 시스템을 사용하여 집단으로부터 제거된다. 일부 구현예에서, CliniMAC 시스템은 DEPLETION2.1과 같은 고갈 환경에서 실행된다.
특정 이론에 구애됨이 없이, 성분채집 전에 또는 CAR-발현 세포 생성물의 제조 동안 대상체에서 면역 세포의 음성 조절인자의 수준을 감소시키면(예를 들어, 원치 않는 면역 세포, 예를 들어 TREG 세포의 수를 감소시키면), 대상체 재발 위험을 줄일 수 있다. 예를 들어, TREG 세포를 고갈시키는 방법은 당분야에 알려져 있다. TREG 세포를 감소시키는 방법은 사이클로포스파미드, 항-GITR 항체(본원에 기재된 항-GITR 항체), CD25-고갈, 및 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 CAR-발현 세포의 제조 전에 TREG 세포의 수를 감소(예를 들어, 고갈)시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 제조 방법은 샘플(예를 들어, 성분채집 샘플)을 항-GITR 항체 및/또는 항-CD25 항체(또는 이의 단편, 또는 CD25-결합 리간드)와 접촉시켜, 예를 들어 CAR-발현 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포) 생성물의 제조 전에 TREG 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 CAR-발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 TREG 세포를 감소시키는 하나 이상의 치료법으로 사전-처리되고, 이로 인해 CAR-발현 세포 처리에 대한 대상체 재발 위험이 감소된다. 일부 구현예에서, TREG 세포를 감소시키는 방법은 사이클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, 또는 이의 조합 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사이클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, 또는 이의 조합 중 하나 이상의 투여는 CAR-발현 세포 생성물의 주입 전, 동안, 또는 후에 일어날 수 있다.
일부 구현예에서, CAR-발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 사이클로포스파미드로 대상체를 사전-처리함으로써, CAR-발현 세포 치료에 대한 대상체 재발 위험이 줄어든다. 일부 구현예에서, CAR-발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 항-GITR 항체로 대상체를 사전-처리함으로써, CAR-발현 세포 치료에 대한 대상체 재발 위험이 줄어든다.
일부 구현예에서, 제거될 세포 집단은 조절 T 세포 또는 종양 세포 중 어느 것도 아니며, CART 세포의 증대 및/또는 기능에 달리 부정적인 영향을 미치는 세포, 예를 들어 CD14, CD11b, CD33, CD15, 또는 잠재적으로 면역 억제 세포에 의해 발현되는 다른 마커를 발현하는 세포이다. 일부 구현예에서, 이러한 세포는 조절 T 세포 및/또는 종양 세포와 동시에, 또는 상기 고갈 이후에, 또는 또 다른 순서로 제거되는 것이 고려된다.
본원에 기재된 방법은 1개 초과의 선택 단계, 예를 들어 1개 초과의 고갈 단계를 포함할 수 있다. 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은, 예를 들어 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 유도된 항체의 조합을 이용하여 달성될 수 있다. 하나의 방법은 음성 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 유도된 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 유세포측정 또는 음성 자기 면역부착을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어 음성 선발에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 종양 항원, 예를 들어 CD25를 포함하지 않는 종양 항원, 예를 들어 CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 또는 CD11b를 발현하는 세포를 집단으로부터 제거하여 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 CAR의 발현에 적합한 T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 및 종양 항원 고갈 세포 집단을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 항원 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어, 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 및 항-종양 항원 항체 또는 이의 단편은 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있는 동일한 기질, 예를 들어 비드에 부착될 수 있거나, 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 항-종양 항원 항체 또는 이의 단편은 개별 비드에 부착될 수 있고, 그 혼합물이 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포의 제거와 종양 항원 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 순서로든 발생할 수 있다.
또한, 체크포인트 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 체크포인트 억제제를 발현하는 세포, 예를 들어 PD1+ 세포, LAG3+ 세포, 및 TIM3+ 세포 중 하나 이상을 집단으로부터 제거하여, T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 세포 및 체크포인트 억제제 고갈 세포, 예를 들어 PD1+, LAG3+, 및/또는 TIM3+ 고갈 세포의 집단을 제공하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 예시적인 체크포인트 억제제는 B7-H1, B7-1, CD160, P1H, 2B4, PD1, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), LAG3, TIGIT, CTLA-4, BTLA, 및 LAIR1을 포함한다. 일부 구현예에서, 체크포인트 억제제 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 및 항-체크포인트 억제제 항체 또는 이의 단편은 동일한 비드에 부착될 수 있고, 이는 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있거나, 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 및 항-체크포인트 억제제 항체 또는 이의 단편은 개별 비드에 부착될 수 있으며, 그 혼합물은 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포의 제거 및 체크포인트 억제제 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 하나의 순서로 일어날 수 있다.
본원에 기재된 방법은 양성 선택 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어 T 세포는 항-CD3/항-CD28(예를 들어 3x28)-접합 비드, 예컨대 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와, 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 시기 동안 인큐베이션함으로써 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 시기는 약 30분이다. 추가 구현예에서, 시기는 30분 내지 36시간 이상 및 그 사이의 모든 정수값의 범위이다. 추가 구현예에서, 시기는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 또 다른 구현예에서, 시기는 10 내지 24시간, 예를 들어, 24시간이다. 다른 세포 유형에 비하여 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서, 예컨대 종양 조직으로부터 또는 면역손상 개체로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 단리하는 데 있어서, T 세포를 단리하기 위하여 보다 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 또한, 보다 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합할 수 있는 시간을 단순히 단축하거나 연장하고/하거나, (본원에 추가로 기재된 바와 같이) T 세포에 대한 비드의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단이 우선적으로 배양 개시 시점 또는 과정 중 다른 시점에 그에 대해 또는 그에 반해 선택될 수 있다. 추가로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단이 우선적으로 배양 개시 시점 또는 다른 원하는 시점에 그에 대해 또는 그에 반해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B 및 퍼포린, 또는 다른 적절한 분자, 예를 들어 다른 사이토카인 중 하나 이상을 발현하는 T 세포 집단이 선택될 수 있다. 세포 발현에 대한 스크리닝 방법은, 예를 들어 PCT 공개 제WO 2013/126712호에 기재된 방법에 의해 결정될 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의한 원하는 세포 집단의 단리를 위해, 세포의 농도 및 표면(예를 들어 입자, 예컨대 비드)은 달라질 수 있다. 일부 양태에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는(예를 들어 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 100억개 세포/ml, 90억개/ml, 80억개/ml, 70억개/ml, 60억개/ml 또는 50억개/ml의 농도가 사용된다. 일부 양태에서, 10억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가의 일부 양태에서 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 양태에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다.
높은 농도의 사용은 증가된 세포수율, 세포 활성화, 및 세포 증대를 초래할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도를 사용하면, 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(예를 들어, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)로부터, 또는 CD28-음성 T 세포와 같이 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 얻는 것이 요망될 것이다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용하면, 보통은 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포를 보다 효율적으로 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, 보다 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면(예를 들어 입자, 예컨대 비드)의 혼합물을 유의하게 희석시킴으로써, 입자와 세포 사이에 상호작용이 최소화된다. 이것은 입자에 결합되는 다량의 원하는 항원을 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어 CD4+ T 세포는 희석 농도에서 보다 높은 수준의 CD28을 발현하고 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 일부 양태에서, 사용되는 세포의 농도는 5 x 106개/ml이다. 다른 양태에서, 사용되는 농도는 약 1 x 105개/ml 내지 1 x 106개/ml, 및 그 사이의 임의의 정수값일 수 있다.
다른 양태에서, 세포는 2℃ 내지 10℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 길이의 시간 동안 회전기 상에서 인큐베이션될 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후에 냉동될 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, 냉동 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도까지의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포를 냉동 용액 중에 현탁시킬 수 있다. 많은 냉동 용액 및 파라미터가 당분야에 알려져 있고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 방법은 20%의 DMSO 및 8%의 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10%의 덱스트란 40 및 5%의 덱스트로스, 20%의 인간 혈청 알부민 및 7.5%의 DMSO, 또는 31.25%의 플라스마라이트-A, 31.25%의 덱스트로스 5%, 0.45%의 NaCl, 10%의 덱스트란 40 및 5%의 덱스트로스, 20%의 인간 혈청 알부민, 및 7.5%의 DMSO, 또는 예를 들어 헤스판 및 플라스마라이트 A를 함유하는 다른 적합한 세포 냉동 매질을 함유하는 배양 배지를 사용하는 것을 수반하고, 이어서, 세포를 1분당 1°의 속도로 -80℃까지 냉동시키고, 액체 질소 보관 탱크의 증기상에 보관한다. 다른 제어된 냉동 방법뿐만 아니라 -20℃에서의 또는 액체 질소에서의 제어되지 않는 즉각적인 냉동이 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 동결보존된 세포가 본원에 기재된 바와 같이 해동 및 세척되고, 1시간 동안 실온에서 휴지되도록 한 후, 본 발명의 방법을 사용하여 활성화시킨다.
또한, 본 발명과 관련하여 본원에 기재된 바와 같은 증대된 세포가 필요할 수 있기 전 시기에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 분리반출술 생성물을 수집하는 것이 고려된다. 이와 같이, 증대될 세포원이 필요한 임의의 시점에 수집될 수 있고, 원하는 세포, 예컨대 T 세포가 단리되고, 면역 효과기 세포 치료법으로부터 이익을 얻을 임의의 수의 질환 또는 질병, 예컨대 본원에 기재된 것에 대한 면역 효과기 세포 치료법에서 나중에 사용하기 위해 냉동될 수 있다. 일부 양태에서, 혈액 샘플 또는 분리반출술은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취된다. 일부 양태에서, 혈액 샘플 또는 분리반출술은 질환이 발생할 위험이 있지만 아직 질환이 발생하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취되고, 관심 세포가 단리되고, 나중의 사용을 위해 냉동된다. 일부 양태에서, T 세포가 증대되고, 냉동되고, 나중에 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후에, 그러나 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가 양태에서, 세포는 제제, 예컨대 나탈리주맙(natalizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 항바이러스제, 화학치료법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 및 방사선조사를 이용한 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 수의 관련 치료 방식 전에 대상체의 혈액 샘플로부터 또는 분리반출술로부터 단리된다.
본 발명의 추가의 양태에서, T 세포는 기능성 T 세포를 사용한 대상체의 치료 직후에 환자로부터 얻어진다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물을 사용한 치료 후, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복 중인 기간 동안 치료 직후에, 얻어진 T 세포의 품질은 생체외 증대되는 능력에 있어서 최적이거나 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 사용한 생체외 조작 후, 이들 세포는 향상된 생착 및 생체내 증대를 위해 바람직한 상태로 존재할 수 있다. 따라서, 이러한 회복상 동안 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 맥락에서 고려된다. 추가로, 일부 양태에서, 특히 치료법 후의 규정된 시간 윈도우 동안 특정 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생, 및/또는 증대가 선호되는 조건을 대상체에서 생성하기 위해 동원(예를 들어 GM-CSF를 사용한 동원) 및 컨디셔닝 치료법이 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, T 세포 집단은 디아글리세롤 키나제(DGK)-결핍이다. DGK-결핍 세포는 DGK RNA 또는 단백질을 발현하지 않거나 감소되거나 억제된 DGK 활성을 갖는 세포를 포함한다. DGK-결핍 세포는 유전적 접근에 의해, 예를 들어 RNA 간섭제, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 DGK 발현을 감소시키거나 방지함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, DGK-결핍 세포는 본원에 기재된 DGK 억제제를 이용한 처리에 의해 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 집단은 Ikaros-결핍이다. Ikaros-결핍 세포는 Ikaros RNA 또는 단백질을 발현하지 않는 세포, 또는 Ikaros 활성이 감소되거나 억제된 세포를 포함하며, Ikaros-결핍 세포는 유전적 접근에 의해, 예를 들어 RNA 간섭제, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 Ikaros 발현을 감소 또는 방지함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, Ikaros-결핍 세포는 Ikaros 억제제, 예를 들어 레날리도미드를 이용한 처리에 의해 생성될 수 있다.
구현예에서, T 세포 집단은 DGK-결핍 및 Ikaros-결핍 집단이며, 예를 들어 DGK 및 Ikaros를 발현하지 않거나, 감소되거나 억제된 DGK 및 Ikaros 활성을 갖는다. 이러한 DGK 및 Ikaros-결핍 세포는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, NK 세포는 대상체로부터 얻어진다. 또 다른 구현예에서, NK 세포는 NK 세포주, 예를 들어 NK-92 세포주(Conkwest)이다.
특정한 예시적인 양태에서, 대상체는 백혈구분리반출술을 거칠 수 있고, 백혈구가 수집, 농축, 또는 생체외 고갈되어 관심 세포, 예를 들어 T 세포를 선택하고/하거나 단리한다. 이러한 T 세포 단리물은 본원에 기재된 방법에 의해 증대될 수 있다. 이를 필요로 하는 대상체는 후속적으로 고용량 화학치료법에 이은 말초 혈액 줄기 세포 이식을 이용한 표준 치료를 거칠 수 있다. 일부 양태에서, 이식 후에 또는 동시에, 대상체는 본 발명의 방법에 의해 제조된 바와 같은 증대된 CAR T 세포의 주입을 제공받는다. 추가의 양태에서, 증대된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.
추가의 발현된 제제
CAR 활성을 향상시키는 제제의 공동 발현
본원에서 고려되는 구현예에서, 추가 제제가 위의 본원에 기재된 벡터에서 인코딩될 수 있음이 인정된다. 따라서, 이러한 제제가 CAR-발현 세포와 관련하여 아래에서 기재된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 CAR 발현 면역 효과기 세포는 또 다른 제제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 향상시키는 제제를 추가로 발현할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제제는 억제 분자를 억제하는 제제일 수 있다. 억제 분자의 예는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 일부 구현예에서, 억제 분자를 억제하는 제제는 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된, 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 예를 들어 억제 분자, 예컨대 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타, 또는 이들 중 임의의 것의 단편의 제1 폴리펩티드, 및 본원에서 기재된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어 공동 자극 도메인(예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27, 또는 CD28) 및/또는 일차 신호전달 도메인(예를 들어 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)을 포함함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 PD-1 또는 이의 단편의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 CD28, CD27, OX40 또는 4-1BB 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
제2 CAR의 공동 발현
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 제2 CAR, 예를 들어 동일한 표적(예를 들어, CD19) 또는 상이한 표적(예를 들어, CD19 이외의 표적, 예를 들어 본원에 기재된 표적)에 대한 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 CAR을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 기재된 방법을 이용하여 제조된 CAR-발현 세포는 (i) BCMA에 결합하는 제1 CAR을 인코딩하는 제1 핵산 분자 및 (ii) CD19에 결합하는 제2 CAR을 인코딩하는 제2 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 CAR은 항-BCMA 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 항-BCMA 결합 도메인은 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 86, 87, 88, 95, 96, 및 97의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 CAR은 항-CD19 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 항-CD19 결합 도메인은 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함하는 VH, 및 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하고, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 SEQ ID NO: 760, 687, 762, 763, 764, 및 765의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, (i) 항-BCMA 결합 도메인의 VH 및 VL은 각각 SEQ ID NO: 93 및 102의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD19 결합 도메인의 VH 및 VL은 각각 SEQ ID NO: 250A 및 251A의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD19 결합 도메인은 SEQ ID NO: 758의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 CAR은 SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 CAR은 SEQ ID NO: 225의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 기재된 방법을 이용하여 제조된 CAR-발현 세포는 (i) CD22에 결합하는 제1 CAR을 인코딩하는 제1 핵산 분자 및 (ii) CD19에 결합하는 제2 CAR을 인코딩하는 제2 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, CD22 CAR은 CD22 항원 결합 도메인, 및 제1 막관통 도메인; 제1 공동자극 신호전달 도메인; 및/또는 제1 일차 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 CAR은 CD19 항원 결합 도메인, 및 제2 막관통 도메인; 제2 공동자극 신호전달 도메인; 및/또는 제2 일차 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인은 본원, 예를 들어, 표 15, 16, 30, 31, 또는 32에 기재된 CD22 결합 도메인의 하나 이상(예를 들어, 3개 모두)의 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3); 및/또는 본원, 예를 들어, 표 15, 16, 30, 31, 또는 32에 기재된 CD22 결합 도메인의 하나 이상(예를 들어, 3개 모두)의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3)을 포함한다. 한 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인은 본원, 예를 들어, 표 15, 16, 30, 31, 또는 32에 기재된 CD22 결합 도메인의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3; 및/또는 본원, 예를 들어, 표 15, 16, 30, 31, 또는 32에 기재된 CD22 결합 도메인의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 본원, 예를 들어, 표 1, 30, 31, 또는 32에 기재된 CD19 결합 도메인의 하나 이상(예를 들어, 3개 모두)의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3; 및/또는 본원, 예를 들어, 표 1, 30, 31, 및 32에 기재된 CD19 결합 도메인의 하나 이상(예를 들어, 3개 모두)의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 본원, 예를 들어, 표 1, 30, 31, 및 32에 기재된 CD19 결합 도메인의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3; 및/또는 본원, 예를 들어, 표 1, 30, 31, 및 32에 기재된 CD19 결합 도메인의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 본원, 예를 들어, 표 30 또는 32에 기재된 CD22 결합 도메인의 경쇄 가변(VL) 영역; 및/또는 본원, 예를 들어, 표 30 또는 32에 기재된 CD22 결합 도메인의 중쇄 가변(VH) 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인은 표 30 또는 32에 제공된 CD22 VL 영역 서열의 적어도 1, 2, 또는 3개의 변형(예를 들어, 치환)을, 그러나 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인은 표 30 또는 32에 제공된 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 임의의 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인은 표 30 또는 32에 제공된 CD22 VH 영역 서열의 적어도 1, 2, 또는 3개의 변형(예를 들어, 치환)을, 그러나 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인은 표 30 또는 32에 제공된 CD22 VH 영역 서열의 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 임의의 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 본원, 예를 들어, 표 1, 30, 또는 32에 기재된 CD19 결합 도메인의 VL 영역; 및/또는 본원, 예를 들어, 표 1, 30, 또는 32에 기재된 CD19 결합 도메인의 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 표 1, 30, 또는 32에 제공된 CD19 VL 영역 서열의 적어도 1, 2, 또는 3개의 변형(예를 들어, 치환)을, 그러나 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 표 1, 30, 또는 32에 제공된 CD19 VL 영역 서열의 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 임의의 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 표 1, 30, 또는 32에 제공된 CD19 VH 영역 서열의 적어도 1, 2, 또는 3개의 변형(예를 들어, 치환)을, 그러나 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 표 1, 30, 또는 32에 제공된 CD19 VH 영역 서열의 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 임의의 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, CD22 항원 결합은 표 30 또는 32에 제공된 CD22 scFv 서열의 적어도 1, 2, 또는 3개의 변형(예를 들어, 치환)을, 그러나 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, CD22 항원 결합은 표 30 또는 32에 제공된 CD22 scFv 서열의 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 임의의 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 표 1, 30, 또는 32에 제공된 CD19 scFv 서열의 적어도 1, 2, 또는 3개의 변형(예를 들어, 치환)을, 그러나 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 표 1, 30, 또는 32에 제공된 CD19 scFv 서열의 아미노산 서열 또는 임의의 상기 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 scFv를 포함한다.
일부 구현예에서, CD22 CAR 분자 및/또는 CD19 CAR 분자는 표 33에 제공된 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 임의의 것과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나; 표 33에 제공된 뉴클레오티드 서열 또는 상기 서열 중 임의의 것과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는, 추가 성분, 예를 들어 신호 펩티드, 힌지, 막관통 도메인, 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 제1 일차 신호전달 도메인, P2A 부위, 및/또는 링커를 포함한다.
CAR 분자, 예를 들어 본원에 개시된 (i) CD22에 결합하는 제1 CAR 및 (ii) CD19에 결합하는 제2 CAR을 포함하는 이중 CAR 분자의 예시적인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 표 30에 제공된다.
[표 30]
이중 및 탠덤 CD19-CD22 CAR 서열
Figure pct00109
Figure pct00110
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
Figure pct00122
본 개시의 이중 CAR(예를 들어, (i) CD22에 결합하는 제1 CAR 및 (ii) CD19에 결합하는 제2 CAR을 포함하는 이중 CAR 분자)의 CD22 및 CD19 CDR이 표 31에 제공된다.
[표 31]
CD22 및 CD19 CDR 서열
Figure pct00123
Figure pct00124
표 32는 본원에 개시된 이중 CAR 또는 탠덤 CAR, 예를 들어 (i) CD22에 결합하는 제1 CAR 및 (ii) CD19에 결합하는 제2 CAR을 포함하는 이중 CAR 또는 탠덤 CAR의 CD19 및 CD22 결합 도메인에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다.
[표 32]
CD19 및 CD22 결합 도메인
Figure pct00125
Figure pct00126
Figure pct00127
Figure pct00128
Figure pct00129
표 33은 CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 이중 CAR 분자(예를 들어, (i) CD22에 결합하는 제1 CAR 및 (ii) CD19에 결합하는 제2 CAR을 포함하는 이중 CAR 분자)에서 사용될 수 있는 추가의 CAR 성분, 예를 들어 신호 펩티드, 링커, 및 P2A 부위에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다.
[표 33]
추가 CAR 성분
Figure pct00130
Figure pct00131
Figure pct00132
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CAR 발현 면역 효과기 세포는 제2 CAR, 예를 들어 동일한 표적(예를 들어, 상기 기재된 표적) 또는 상이한 표적에 대한 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 CAR을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 CAR은 제1 CAR의 표적과 동일한 암 세포 유형에 대해 발현된 표적에 대한 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 발현 면역 효과기 세포는, 제1 항원을 표적화하고 공동자극 신호전달 도메인을 갖지만 일차 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 제2의 상이한 항원을 표적화하고 일차 신호전달 도메인을 갖지만 공동자극 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, 공동자극 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB, CD28, CD27 또는 OX-40을 제1 CAR에, 및 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타를 제2 CAR에 배치하면, CAR 활성을 두 표적 모두가 발현되는 세포로 제한할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR 발현 면역 효과기 세포는 예를 들어, 전술한 표적을 표적화하는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 제1 CAR에 의해 표적화되는 항원과 다른 항원(예를 들어, 제1 표적과 동일한 암 세포 유형에서 발현된 항원)을 표적화하고 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 일차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CAR 발현 면역 효과기 세포는 예를 들어, 전술한 표적을 표적화하는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 일차 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 제1 CAR에 의해 표적화되는 항원과 다른 항원(예를 들어, 제1 표적과 동일한 암 세포 유형에서 발현된 항원)을 표적화하고 항원에 대한 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 발현 면역 효과기 세포는 본원에 기재된 CAR, 예를 들어, 전술한 표적에 대한 CAR, 및 억제 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 억제 CAR은 암 세포에서는 발견되지 않지만, 정상 세포, 예를 들어 또한 표적을 발현하는 정상 세포에서 발견되는 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 억제 CAR은 억제 분자의 세포내 도메인, 막관통 도메인 및 항원 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어 억제 CAR의 세포내 도메인은 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, CEACAM(예를 들어 CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타의 세포내 도메인일 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 본원에 기재된 바와 같이, 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 CAR 및 PD1 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 CAR을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 전술한 억제 분자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포에서 제2 CAR은 억제 CAR이며, 억제 CAR은 억제 분자의 세포내 도메인, 막관통 도메인 및 항원 결합 도메인을 포함한다. 억제 분자는 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR 베타, CEACAM-1, CEACAM-3, 및 CEACAM-5 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 CAR 분자는 PD1의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
구현예에서, 세포의 제2 CAR 분자는 일차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, 세포의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능적 도메인을 포함하는 일차 신호전달 도메인 및 4-1BB의 기능적 도메인을 포함하는 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 CAR 분자의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하며, 제2 CAR 분자의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하지 않는다. 예를 들어, 제1 CAR 분자의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하며, 제2 CAR 분자의 항원 결합 도메인은 낙타과 VHH 도메인을 포함한다.
CAR의 입체형태
본원에서 고려되는 구현예에서, 하나 이상의 CAR의 입체형태는 본원에 전술된 벡터에 의해 조절될 수 있음이 인정된다. 따라서, 이러한 입체형태는 CAR-발현 세포와 관련하여 아래에서 기재된다.
분할 CAR
일부 구현예에서, CAR-발현 세포는 분할 CAR을 사용한다. 분할 CAR 접근은 공개 WO2014/055442 및 WO2014/055657에 보다 상세히 기재되어 있다. 간략하게, 분할 CAR 시스템은 제1 항원 결합 도메인 및 공동자극 도메인(예를 들어 41BB)을 갖는 제1 CAR을 발현하는 세포를 포함하고, 세포는 또한 제2 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인(예를 들어 CD3 제타)을 갖는 제2 CAR을 발현한다. 세포가 제1 항원과 접촉한 경우에, 공동자극 도메인이 활성화되고 세포는 증식한다. 세포가 제2 항원과 접촉한 경우에, 세포내 신호전달 도메인이 활성화되고 세포사멸 활성이 시작된다. 따라서, CAR-발현 세포는 두 항원 모두가 존재할 때만 완전히 활성화된다.
다중 CAR
일부 양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 제2 CAR, 예를 들어 동일한 표적 또는 상이한 표적(예를 들어 본원에 기재된 암 관련 항원 이외의 표적 또는 본원에 기재된 상이한 암 관련 항원)에 대한, 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 CAR을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 CAR은 암 관련 항원과 동일한 암 세포 유형에 의해 발현된 표적에 대한 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-발현 세포는, 제1 항원을 표적화하고 공동자극 신호전달 도메인을 갖지만 일차 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 제2의 상이한 항원을 표적화하고 일차 신호전달 도메인을 갖지만 공동자극 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, 공동자극 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB, CD28, CD27 또는 OX-40을 제1 CAR에, 및 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타를 제2 CAR에 배치하면, CAR 활성을 두 표적 모두가 발현되는 세포로 제한할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR 발현 세포는 본원에 기재된 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 공동 자극 도메인을 포함하는 제1 암 관련 항원 CAR, 및 상이한 표적 항원(예를 들어, 제1 표적 항원과 동일한 암 세포 유형 상에서 발현되는 항원)을 표적화하며, 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 일차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 또 다른 구현예에서, CAR 발현 세포는, 본원에 기재된 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 일차 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 제1 표적 항원 이외의 항원(예를 들어, 제1 표적 항원과 동일한 암 세포 유형에서 발현되는 항원)을 표적화하며, 항원에 대한 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다.
일부 구현예에서, 청구된 발명은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하며, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv이고, 다른 하나는 scFv가 아니다. 일부 구현예에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타과, 상어 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 나노바디를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 낙타과 VHH 도메인을 포함한다.
일단 본원에 기재된 방법이 수행되면 활성, 예를 들어, 항원 자극 후 T 세포를 증대시키는 능력, 재자극의 부재 하의 T 세포 증대를 지속시키는 능력, 및 적절한 시험관내 및 동물 모델에서의 항암 활성을 평가하기 위해 다양한 검정이 사용될 수 있다. 본 발명의 CAR의 효과를 평가하기 위한 검정은 당업자에게 알려져 있고, 아래에 개괄적으로 기재된다.
일차 T 세포에서의 CAR 발현의 웨스턴 블롯 분석은 단량체 및 이량체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참고한다. 아주 간략하게 요약하면, CAR을 발현하는 T 세포(CD4+ 및 CD8+ T 세포의 1:1 혼합물)를 10일 초과 동안 시험관내 증대시킨 후, 용해 및 환원 조건 하에 SDS-PAGE를 수행한다. 전장 TCR-ζ 세포질 도메인 및 내인성 TCR-ζ 쇄를 함유하는 CAR은 TCR-ζ 쇄에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된다. 공유 이량체 형성의 평가를 할 수 있는 비환원 조건 하의 SDS-PAGE 분석을 위해 동일한 T 세포 하위세트가 사용된다.
항원 자극 후 CAR+ T 세포의 시험관내 증대는 유세포측정으로 측정될 수 있다.
재자극의 부재 하에 지속되는 CAR+ T 세포 증대가 또한 측정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참고한다. 간략하게, 제0일에 αCD3/αCD28 코팅된 자기 비드를 이용한 자극 및 제1일에 표시된 CAR을 이용한 형질도입 후, Coulter Multisizer III 입자 계수기, Nexcelom Cellometer Vision, 또는 Millipore Scepter를 사용하여 배양 제8일에 평균 T 세포 부피(fl)를 측정한다.
CART 활성을 측정하기 위해 동물 모델이 사용될 수도 있다. 예를 들어 면역결핍 마우스에서 원발성 인간 전-B ALL을 치료하기 위해 본원에 기재된 인간 암 관련 항원-특이적 CAR+ T 세포를 사용하는 이종이식편 모델이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참고한다.
용량 의존적 CAR 처리 반응이 평가될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참고한다. 예를 들어, 제21일에 CAR T 세포, 동등한 수의 모의-형질도입 T 세포가 주사되거나 T 세포가 주사되지 않은 마우스에서 백혈병 발생 35 내지 70일 후 말초 혈액이 얻어진다. 각각의 군으로부터의 마우스가 본원에 기재된 바와 같은 말초 혈액 암 관련 항원+ ALL 모세포수의 결정을 위해 무작위로 채혈된 후, 제35일 및 제49일에 희생된다. 남아있는 동물은 제57일 및 제70일에 평가된다.
세포 증식 및 사이토카인 생산의 평가는 예를 들어 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]에서 이전에 기재된 바 있다.
세포독성은 표준 51Cr-방출 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참고한다.
종양-보유 동물 모델에서 CAR의 특이적 수송 및 증식을 평가하기 위해 이미징 기술이 사용될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어 문헌[Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)]에 기재되어 있다.
본원의 실시예 섹션에 기재된 것들뿐만 아니라 당분야에 알려진 것들을 포함하는 다른 검정도 본원에 기재된 CAR을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
항-CD28 항체 분자
일부 구현예에서, 항-CD28 항체, 예를 들어 본원에 기재된 다중특이적 결합 분자에서 사용될 항-CD28 항체는 표 19에 기재된 항-CD28(2) 유래의 적어도 하나의 항원 결합 영역, 예를 들어 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체 분자는 표 19에 기재된 항-CD28(2) 유래의 1개 또는 2개의 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 538, 539, 540, 530, 531, 및 532의 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 541, 539, 540, 530, 531, 및 532의 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 542, 543, 540, 533, 534, 및 535의 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 SEQ ID NO: 544, 545, 546, 536, 534, 및 532의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD28 항체 분자는 SEQ ID NO: 547 또는 548의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 547 또는 548과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체는 SEQ ID NO: 537의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체는 각각 SEQ ID NO: 547 및 537의 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 임의의 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체는 각각 SEQ ID NO: 548 및 537의 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 임의의 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함한다.
본원에 기재된 항-CD28 항체는 예를 들어 추가의 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 항-CD3 결합 도메인과 함께 다중특이적 결합 분자의 맥락에서 사용될 수 있음이 이해된다. 또한, 본원에 기재된 항-CD28 항체는 다른 맥락에서, 예를 들어 단일특이적 항체로서 사용될 수 있음이 이해된다.
세포 활성화제
일부 구현예에서, 세포 활성화제는 T 세포 자극 화합물, CAR 항원 결합 도메인에 대한 항-개별특이형 항체, 및/또는 종양 항원이다. 일부 구현예에서, T-세포 자극 화합물은 IL-2, IL-15, 항-CD2 mAb, 항-CD3 mAb, 항-CD28 mAb, 신생항원 펩티드, 공유 항원으로부터의 펩티드, 예컨대 TRP2, gp100, 종양 세포 용해물, CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR 및/또는 MAGE A3 TCR이다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 CD3/TCR 복합체 및/또는 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하고, 선택적으로 세포 활성화제는 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하는 다중특이적 결합 분자이다.
일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 CD3을 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, CD3을 자극하는 제제는 항-CD3 또는 항-TCR 항체 또는 이의 하나 이상의 CDR, VH, 중쇄, VL, 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 단편과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 CD3 또는 TCR 항원 결합 도메인 중 하나 이상을 포함한다.
항-CD3 항체 서열 및 이러한 항체를 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 항-CD3 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, 중쇄, 및 경쇄와 함께 표 19에 제공된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 각각 SEQ ID NO: 437 및 427의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 각각 SEQ ID NO: 456 및 445의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 SEQ ID NO: 457 및 446의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 각각 SEQ ID NO: 475 및 467의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 각각 SEQ ID NO: 476 및 468의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 각각 SEQ ID NO: 494 및 484의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함한다.
항-TCR 항체 서열 및 이러한 항체를 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 항-TCR 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, 중쇄 및 경쇄 서열과 함께 표 19에 제공된다.
일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제는 CD28, ICOS, CD27, CD25, 4-1BB, IL6RA, IL6RB, 또는 CD2를 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제는 항-CD28, 항-ICOS, 항-CD27, 항-CD25, 항-4-1BB, 항-IL6RA, 항-IL6RB, 또는 항-CD2 항체 또는 이의 하나 이상의 CDR, 중쇄, 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 단편과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 CD28, ICOS, CD27, CD25, 4-1BB, IL6RB, 및/또는 CD2 항원 결합 도메인 중 하나 이상을 포함한다.
항-CD28 항체 서열 및 이러한 항체를 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 항-CD28 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, VL, HC, 및 LC 서열과 함께 표 19에 제공된다.
항-ICOS 항체 서열 및 이러한 항체를 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 항-ICOS 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, VL, 및 LC 서열과 함께 표 19에 제공된다.
항-CD27 항체 서열 및 이러한 항체를 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 항-CD27 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, 및 VL 서열과 함께 표 19에 제공된다.
항-CD25 항체 서열 및 이러한 항체를 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 항-CD25 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, VL, HC, 및 LC 서열과 함께 표 19에 제공된다.
항-4-1BB 항체 서열 및 이러한 항체를 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 항-4-1BB 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, 및 VL 서열과 함께 표 19에 제공된다.
항-IL6RA 항체 서열 및 이러한 항체를 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있다. IL6RA 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, 및 VL 서열과 함께 표 19에 제공된다.
항-IL6RB 항체 서열 및 이러한 항체를 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있다. IL6RB 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, 및 VL 서열과 함께 표 19에 제공된다.
항-CD2 항체 서열 및 이러한 항체를 제조하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 항-CD2 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, VL, HC, 및 LC 서열과 함께 표 19에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 분자는 표 19에 개시된 CDR, VH, VL, HC 및/또는 LC, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[표 19]
표적 항원별 예시적인 항체, CDR, 중쇄 가변 영역(VH), 경쇄 가변 영역(VL), 중쇄(HC), 및 경쇄(LC) 서열
Figure pct00133
Figure pct00134
Figure pct00135
Figure pct00136
Figure pct00137
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
Figure pct00141
Figure pct00142
Figure pct00143
Figure pct00144
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
Figure pct00148
Figure pct00149
Figure pct00150
Figure pct00151
Figure pct00152
Figure pct00153
Figure pct00154
일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제, 및 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제는 다중특이적 결합 분자에 포함된다. 따라서, CD28, ICOS, CD27, CD25, 4-1BB, IL6RA, IL6RB, 및/또는 CD2 항원 결합 도메인 중 하나 이상 및 CD3 항원 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 분자와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하는 다중특이적 결합 분자가 본원에서 고려된다. 상기 주목된 바와 같은 이러한 결합 도메인의 비제한적인 예는 상기, 예를 들어 표 19 및 본원에 참조로 포함되는 간행물에 제공된다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 CD3 항원 결합 도메인 및 CD28 또는 CD2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3 항원 결합 도메인은 항-CD3 항체, 선택적으로, 표 19에 제공된 항-CD3(1), 항-CD3(2), 항-CD3(3), 또는 항-CD3(4), 또는 이의 하나 이상의 CDR, VH, 및/또는 VL을 포함하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, CD28 항원 결합 도메인은 항-CD28 항체, 선택적으로, 표 19에 제공된 항-CD28(1) 또는 항-CD28(2), 또는 이의 하나 이상의 CDR, VH, 중쇄, VL, 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, CD2 항원 결합 도메인은 항-CD2 항체, 선택적으로, 표 19에 제공된 항-CD2(1), 또는 이의 하나 이상의 CDR, VH, 중쇄, VL, 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다. 이러한 다중특이적 결합 분자에 포함될 수 있는 비제한적인 예시적 중쇄 및 경쇄 서열은 아래 표 20에 제공된다. 이의 비제한적인 예시적 조합이 작제물 내에서 언급된 중쇄 및/또는 경쇄의 분류에 기반하여 표 20에 제안되어 있다. 이러한 작제물 구조는 중쇄 및/또는 경쇄의 구성의 예를 제공하지만 이의 추가 조합 및 치환도 가능하다. 이들 작제물의 포맷 중 임의의 것의 비제한적 예는 도 37a 내지 도 37b, 도 48a 내지 도 48b, 도 49a 내지 도 49b 및 도 50a 내지 도 50b에 제공된다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 표 20에 개시된 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[표 20]
예시적인 Fc, 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 서열
Figure pct00155
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
Figure pct00160
Figure pct00161
Figure pct00162
Figure pct00163
Figure pct00164
Figure pct00165
Figure pct00166
Figure pct00167
Figure pct00168
Figure pct00169
Figure pct00170
Figure pct00171
Figure pct00172
Figure pct00173
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 이중특이적 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 도 37a 내지 도 37b, 도 48a 내지 도 48b, 도 49a 내지 도 49c, 및 도 50a 내지 도 50b에 제공된 도식 중 임의의 하나로 구성된다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 1가 또는 2가이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체의 Fc 영역은 침묵화된다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 복수의 이중특이적 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상은 1가이다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상은 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상의 Fc 영역은 침묵화된다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상은 함께 다량체로 접합된다. 일부 구현예에서, 다량체는 도 37b 및 도 48b에 제공된 다중특이적 도식 중 임의의 하나로 구성된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 결합 분자는 Fc 영역을 포함하고, 예를 들어 Fc 영역은 Fc 침묵 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 D265, N297 및 P329 중 하나 이상(예를 들어, 모두)에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 돌연변이 D265A, N297A 및 P329A(DANAPA)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 결합 분자는 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 제1 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인일 수 있고 제2 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인일 수 있거나, 제1 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인일 수 있고 제2 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 결합 도메인은 CD2, CD28, CD25, CD27, IL6Rb, ICOS, 또는 41BB에 결합한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 결합 도메인은 CD2, CD28, CD25, CD27, IL6Rb, ICOS, 또는 41BB를 활성화한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 결합 분자는 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 또는 감소된 ADCC, ADCP 또는 CDC 활성을 갖도록 돌연변이된 Fc 영역, 예를 들어 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 돌연변이 D265A, N297A 및 P329A(DANAPA)를 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 예를 들어 펩티드 링커를 통해 연결된, 제2 결합 도메인(예를 들어, Fab 단편)의 VH의 N-말단에 있다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, CH1, CH2, 및 CH3 중 하나 이상(예를 들어, 모두)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 하기 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VH, 제1 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29)), 제1 결합 도메인의 VL, 제2 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29)), 제2 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, 및 CH3. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 하기 서열을 포함한다: 제2 결합 도메인의 VL 및 CL. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 또는 감소된 ADCC, ADCP 또는 CDC 활성을 갖도록 돌연변이된 Fc 영역, 예를 들어 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 돌연변이 D265A, N297A 및 P329A(DANAPA)를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 단편은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD3 서열을 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD2 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD28 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 단편은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD2 또는 항-CD28 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 또는 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 또는 항-CD28 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD3 서열을 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 Fab를 포함한다. 이러한 다중특이적 결합 분자의 예는 도 37a의 좌측 상단 작제물; 도 48a의 작제물 1 또는 작제물 2; 및 표 20의 작제물 1 또는 작제물 2로 표시된다.
일부 구현예에서, 제1 결합 도메인(예를 들어, Fab 단편)은 제2 결합 도메인(예를 들어, scFv)의 N-말단에 있고, 예를 들어 Fc 영역은 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 또는 감소된 ADCC, ADCP 또는 CDC 활성을 갖도록 돌연변이되며, 예를 들어, Fc 영역은 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 돌연변이 D265A, N297A 및 P329A(DANAPA)를 포함한다. 일부 구현예에서 Fc 영역은 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 돌연변이 L234A, L235A, S267K, 및 P329A(LALASKPA)를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(LALAPG)를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 돌연변이 G237A, D265A, P329A 및 S267K(GADAPASK)를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, CH1, CH2, 및 CH3 중 하나 이상(예를 들어, 모두)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 하기 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, CH3, 제1 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29)), 제2 결합 도메인의 VH, 제2 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29)), 및 제2 결합 도메인의 VL. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 하기 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VL 및 CL. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD2 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD28 서열, 예를 들어 항-CD28(1) 또는 항-CD28(2)를 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD3 서열, 예를 들어 항-CD3(1), 항-CD3(2), 항-CD3(3), 또는 항-CD3(4)를 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD3 서열, 예를 들어 항-CD3(1), 항-CD3(2), 항-CD3(3), 또는 항-CD3(4)를 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD2 또는 항-CD28 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 또는 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 또는 항-CD28 scFv를 포함한다. 이러한 다중특이적 결합 분자의 예는 도 37a의 상단 행 왼쪽에서 두 번째 작제물; 도 48a의 작제물 3 또는 작제물 4; 및 표 20의 작제물 3 또는 작제물 4로 도시된다.
일부 구현예에서, 제1 결합 도메인(예를 들어, Fab 단편)은 예를 들어 펩티드 링커를 통해, 제2 결합 도메인(예를 들어, scFv)의 N-말단에 존재한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, CH1, CH2, 및 CH3 중 하나 이상(예를 들어, 모두)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 하기 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VH, CH1, 제1 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)2 링커(SEQ ID NO: 767)), 제2 결합 도메인의 VH, 제2 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29)), 제2 결합 도메인의 VL, 제3 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29)), CH2, 및 CH3. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 하기 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VL 및 CL. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 또는 감소된 ADCC, ADCP 또는 CDC 활성을 갖도록 돌연변이된 Fc 영역, 예를 들어 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 돌연변이 D265A, N297A 및 P329A(DANAPA)를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD2 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD28 서열, 예를 들어 항-CD28(1) 또는 항-CD28(2)를 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD25 결합 도메인(예를 들어, 항-CD25 Fab), 항-CD27 결합 도메인(예를 들어, 항-CD27 Fab), 항-IL6Rb 결합 도메인(예를 들어, 항-IL6Rb Fab), 항-ICOS 결합 도메인(예를 들어, 항-ICOS Fab), 또는 항-41BB 결합 도메인(예를 들어, 항-41BB Fab)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD3 서열, 예를 들어 항-CD3(1), 항-CD3(2), 항-CD3(3), 또는 항-CD3(4)를 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD3 서열, 예를 들어 항-CD3(1), 항-CD3(2), 항-CD3(3), 또는 항-CD3(4)를 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 결합 도메인(예를 들어, 항-CD2 scFv), 항-CD28 결합 도메인(예를 들어, 항-CD28 scFv), 항-CD25 결합 도메인(예를 들어, 항-CD25 scFv), 항-CD27 결합 도메인(예를 들어, 항-CD27 scFv), 항-IL6Rb 결합 도메인(예를 들어, 항-IL6Rb scFv), 항-ICOS 결합 도메인(예를 들어, 항-ICOS scFv), 또는 항-41BB 결합 도메인(예를 들어, 항-41BB scFv)을 포함한다. 이러한 다중특이적 결합 분자의 예는 도 37a의 상단 행 왼쪽에서 세 번째 작제물; 도 48a의 작제물 5 또는 작제물 6; 및 표 20의 작제물 5 또는 작제물 6으로 도시된다.
일부 구현예에서, 제1 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 제2 결합 도메인(예를 들어, Fab 단편)의 N-말단에 있고, 예를 들어 Fc 영역은 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 또는 감소된 ADCC, ADCP 또는 CDC 활성을 갖도록 돌연변이되며, 예를 들어, Fc 영역은 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 돌연변이 D265A, N297A 및 P329A(DANAPA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, CH2, CH3, 및 CH1 중 하나 이상(예를 들어, 모두)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 하기 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VH, 제1 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29)), 제1 결합 도메인의 VL, 제2 펩티드 링커(예를 들어, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768)), CH2, CH3, 제3 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29)), 제2 결합 도메인의 VH, 및 CH1. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 하기 서열을 포함한다: 제2 결합 도메인의 VL 및 CL. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD3 서열을 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD2 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD28 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD2 또는 항-CD28 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 또는 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 또는 항-CD28 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 19에 개시된 항-CD3 서열을 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 Fab를 포함한다. 이러한 다중특이적 결합 분자의 예는 도 37a의 상단 행 가장 오른쪽 작제물; 도 48a의 작제물 7 또는 작제물 8; 및 표 20의 작제물 7 또는 작제물 8로 도시된다.
일부 구현예에서, 제1 결합 도메인(예를 들어, Fab 단편)은 제1 Fc 영역의 N-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, 제1 CH1, 제1 CH2, 및 제1 CH3 중 하나 이상(예를 들어, 모두)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 예를 들어 제2 폴리펩티드쇄에서, 제2 Fc 영역의 N-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 제2 폴리펩티드쇄에서, 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, 제2 CH2 및 제2 CH3 중 하나 이상(예를 들어, 둘 모두)을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 제1 및 제2 Fc 영역이 노브-인투-홀(knob-into-hole) 돌연변이를 포함하는 것과 같은 이종이량체 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 영역은 제1 Fc 영역이 제1 Fc 영역의 또 다른 카피에 결합하는 것보다 강력하게 제2 Fc 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 제1 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 하기 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VH, 제1 CH1, 제1 CH2, 및 제1 CH3. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 제2 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 하기 서열을 포함한다: 제2 결합 도메인의 VH, 제1 펩티드 링커(예를 들어, (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768)), 제2 결합 도메인의 VL, 제2 CH2, 및 제2 CH3. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 제3 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로 하기 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VL 및 CL. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 제2 폴리펩티드는 예를 들어 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768), 또는 (G4S)3 링커(SEQ ID NO: 30))를 통해, 제2 CH3의 C-말단에, 동종다량체화 도메인, 예를 들어 Matrilin1 단백질 또는 연골 올리고머 기질 단백질의 코일드 코일 도메인(COMPcc)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 도 37b에 도시된 바와 같이, 2, 3, 4, 또는 5개 카피의 제1 결합 도메인 및 동일한 카피수의 제2 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 결합 도메인(예를 들어, 항-CD2 Fab)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 결합 도메인(예를 들어, 항-CD28 Fab)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv를 포함한다. 이러한 다중특이적 결합 분자의 예는 도 37a의 하단 행 가장 왼쪽 작제물; 도 37b의 작제물; 도 48b의 작제물 9, 작제물 10, 작제물 12, 작제물 13, 작제물 15, 및 작제물 16; 및 표 20의 작제물 9, 작제물 10, 작제물 12, 작제물 13, 작제물 15, 및 작제물 16으로 도시된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 결합 분자는 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 Fc 영역의 N-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 예를 들어 제1 및 제2 Fc 영역이 노브-인투-홀 돌연변이를 포함하는 것과 같은 이종이량체 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 영역은 제1 Fc 영역이 제1 Fc 영역의 또 다른 카피에 결합하는 것보다 강력하게 제2 Fc 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, CH2 및 CH3 중 하나 이상(예를 들어, 모두)을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 분자의 제2 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 하기 서열을 포함한다: 결합 도메인의 VH, 제1 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29)), 결합 도메인의 VL, 제2 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29) 또는 (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768)), CH2, 및 CH3. 일부 구현예에서, 결합 분자의 제2 폴리펩티드는 예를 들어 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커(SEQ ID NO: 29), (GS4)3 링커(SEQ ID NO: 878), 또는 (G4S) 링커(SEQ ID NO: 768))를 통해, 제2 CH3의 C-말단에, 동종다량체화 도메인, 예를 들어 Matrilin1 단백질 또는 연골 올리고머 기질 단백질의 코일드 코일 도메인(COMPcc)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 도 37b에 도시된 바와 같이, 2, 3, 4, 또는 5개 카피의 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 결합 도메인은 존재하지 않는다. 이러한 결합 분자의 예는 도 37a의 하단 행 가장 오른쪽 작제물; 도 48b의 작제물 11, 작제물 14, 및 작제물 17; 및 표 20의 작제물 11, 작제물 14, 및 작제물 17로 도시된다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 예를 들어 표 19의 항-CD28(2) 서열(또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함하는, 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어, 항-CD28 Fab, 및 예를 들어 표 19의 항-CD3(4) 서열(또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함하는, 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 Fc 영역을 포함하며, 여기서 항-CD28 Fab는 Fc 영역에 융합되고, 이는 항-CD3 scFv에 추가로 융합된다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A, L235A, S267K 및 P329A 돌연변이(LALASKPA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 726 또는 1416의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 726 또는 1416과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 728 또는 730의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 728 또는 730과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 726 또는 1416의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 726 또는 1416과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 728 또는 730의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 728 또는 730과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 726의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 728의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 726의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 730의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 1416의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 728의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 1416의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 730의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 예를 들어 표 19의 항-CD28(2) 서열(또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함하는, 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어, 항-CD28 Fab, 및 예를 들어 표 19의 항-CD3(2) 서열(또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함하는, 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 Fc 영역을 포함하며, 여기서 항-CD28 Fab는 Fc 영역에 융합되고, 이는 항-CD3 scFv에 추가로 융합된다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된, Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A, L235A, S267K 및 P329A 돌연변이(LALASKPA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 893 또는 1417의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 893 또는 1417과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 892의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 893의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 892의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 1417의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 892의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 예를 들어 표 19의 항-CD28(1) 서열(또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함하는, 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어, 항-CD28 Fab, 및 예를 들어 표 19의 항-CD3(4) 서열(또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함하는, 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 Fc 영역을 포함하며, 여기서 항-CD28 Fab는 Fc 영역에 융합되고, 이는 항-CD3 scFv에 추가로 융합된다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A, L235A, S267K 및 P329A 돌연변이(LALASKPA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 895의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 894의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 895의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 894의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본원의 많은 구현예에서 다중특이적 결합 분자가 예를 들어 디설피드 가교를 통해 서로 공유 연결된 2개 이상의 폴리펩티드쇄를 포함함이 이해된다. 그러나 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 2개 이상의 폴리펩티드쇄는 서로 비공유적으로 결합될 수 있다.
Fab 단편은 더 큰 단백질의 일부로서 존재할 수 있으며, 예를 들어 Fab 단편은 CH2 및 CH3과 융합되어 전장 항체의 일부가 될 수 있음이 또한 이해된다.
본원에 개시된 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하는 다중특이적 결합 분자가 본원에 개시된 세포 활성화제로 사용하기 위해 고려된다.
Fc 변이체
일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 야생형 Fc 영역, 예를 들어 야생형 인간 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 예를 들어 적어도 하나의 Fc 수용체에 대한 친화도의 감소나 제거를 초래하는 변이체, 예를 들어, Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 잔기의 부가, 치환, 또는 결실을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 표 20에 제공된 Fc 영역의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA), 보체 단백질 CIq, 및 단백질 A 및 G와 같은 다른 분자를 포함하는 다수의 수용체 또는 리간드와 상호작용한다. 이러한 상호작용은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC), 항체 의존적 세포 식세포작용(ADCP), 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 포함하는 다양한 효과기 기능 및 하류 신호전달 이벤트를 촉진한다. 이들 및 본원에 개시된 다른 침묵화 변형을 특징으로 하는 비제한적인 예시적인 Fc 영역이 상기 표 20에 제공된다.
일부 구현예에서, 변이체 Fc 영역을 포함하는 본원에 기재된 다중특이적 결합 분자는 Fc 수용체, 예를 들어 본원에 기재된 Fc 수용체에 대한 친화도가 감소(예를 들어, 제거)된다. 일부 구현예에서, 감소된 친화도는 야생형 Fc 영역을 갖는 다른 유사한 항체와 비교된다.
일부 구현예에서, 변이체 Fc 영역을 포함하는 본원에 기재된 다중특이적 결합 분자는 하기 특성: (1) 감소된 효과기 기능(예를 들어, 감소된 ADCC, ADCP, 및/또는 CDC); (2) 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 감소된 결합, 및/또는 (3) C1q 보체에 대한 감소된 결합 중 하나 이상을 갖는다. 일부 구현예에서, 특성 (1) 내지 (3) 중 임의의 하나 또는 모두의 감소는 야생형 Fc 영역을 갖는 다른 유사한 항체와 비교된다.
예시적인 Fc 영역 변이체는 표 34에 제공되고, 문헌[Saunders O, (2019) Frontiers in Immunology; vol 10, article 1296]에도 개시되어 있으며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 결합 분자는 표 34에 개시된 Fc 영역 변이체, 예를 들어 돌연변이의 임의의 하나 또는 모두, 또는 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 결합 분자의 Fc 영역은 침묵화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 결합 단백질의 Fc 영역은 LALA, DAPA, DANAPA, LALADANAPS, LALAGA, LALASKPA, DAPASK, GADAPA, GADAPASK, LALAPG 및 LALAPA로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 치환의 조합에 의해 침묵화된다(Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링됨).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 결합 분자는 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 IgG1 Fc 아미노산 서열에서 L234, 예를 들어, L234A 및/또는 L235, 예를 들어, L234A 돌연변이(LALA); Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 D265, 예를 들어 D265A 및/또는 P329, 예를 들어 P329A(DAPA); Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 N297, 예를 들어 N297A; EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 DANAPA(D265A, N297A 및 P329A); 및/또는 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234, 예를 들어 L234A, L235, 예를 들어 L235A, D265, 예를 들어 D265A, N297, 예를 들어 N297A 및 P331, 예를 들어 P331S(LALADANAPS)를 포함하는 돌연변이체의 임의의 하나 또는 모두, 또는 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 결합 분자는 야생형 인간 IgG1 Fc 영역의 인간 IgG1 Fc 변이체를 포함하고, Fc 변이체는 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234(예를 들어, L234A), L235(예를 들어, L235A), 및/또는 G237(예를 들어, G237A) 돌연변이(LALAGA); Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234(예를 들어, L234A), L235(예를 들어, L235A), S267(예를 들어, S267K), 및/또는 P329(예를 들어, P329A) 돌연변이(LALASKPA); Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 D265(예를 들어, D265A), P329(예를 들어, P329A), 및/또는 S267(예를 들어, S267K) 돌연변이(DAPASK); Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 G237(예를 들어, G237A), D265(예를 들어, D265A), 및/또는 P329(예를 들어, P329A) 돌연변이(GADAPA); Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 G237(예를 들어, G237A), D265(예를 들어, D265A), P329(예를 들어, P329A), 및/또는 S267(예를 들어, S267K) 돌연변이(GADAPASK); Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234(예를 들어, L234A), L235(예를 들어, L235A), 및/또는 P329(예를 들어, P329G) 돌연변이(LALAPG); 또는 L234(예를 들어, L234A), L235(예를 들어, L235A), 및/또는 P329(예를 들어, P329A) 돌연변이(LALAPA) 중 임의의 하나 또는 모두를 포함하며, 아미노산 잔기는 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중특이적 결합 단백질의 Fc 영역은 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 또는 감소된 ADCC, ADCP 또는 CDC 활성을 초래하는 돌연변이, 예를 들어 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 D265(예를 들어, D265A), N297(예를 들어, N297A), 및 P329(예를 들어, P329A) 돌연변이(DANAPA); Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234(예를 들어, L234A), L235(예를 들어, L235A) 및 G237(G237A) 돌연변이(LALAGA); Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234(L234A), L235(예를 들어, L235A), S267(예를 들어, S267K) 및 P329(예를 들어, P329A) 돌연변이(LALASKPA); Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 D265(예를 들어, D265A), P329(예를 들어, P329A), 및 S267(예를 들어, S267K) 돌연변이(DAPASK); Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 G237(예를 들어, G237A), D265(예를 들어, D265A) 및 P329(P329A) 돌연변이(GADAPA); Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 G237(예를 들어, G237A), D265(예를 들어, D265A), P329(예를 들어, P329A) 및 S267(예를 들어, S267K) 돌연변이(GADAPASK); Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234(예를 들어, L234A), L235(예를 들어, L235A) 및 P329(예를 들어, P329G) 돌연변이(LALAPG); 또는 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234(예를 들어, L234A), L235(예를 들어, L235A), 및 P329(예를 들어, P329A) 돌연변이(LALAPA)를 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
용어 "LALA," "DAPA," "DANAPA," "LALADANAPS," "LALAGA", "LALASKPA", "DAPASK", "GADAPA", "GADAPASK", "LALAPG", 및 "LALAPA"는 연속 아미노산 서열이 아닌 본원에 기재된 치환의 상이한 조합에 대한 약식 용어를 표시함이 이해된다.
[표 34]
예시적인 Fc 변형
Figure pct00174
메조다공성 실리카 입자, 바이러스 벡터 및 세포 활성화제의 조성물
또한 연장 방출제, 예를 들어 메조다공성 실리카 입자 집단 및 바이러스 벡터를 포함하는 조성물이 본원에 기재된다. 또한, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 및 바이러스 벡터를 포함하는 조성물이 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, MSP(예를 들어, MSR)는 기공 및/또는 나노채널을 라이닝하는 표면 또는 표면 상에 흡착되거나 공유 결합된 복수의 작용기를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 작용기는 -OH(하이드록실), 아민, 카복실산, 포스포네이트, 할라이드, 아지드, 알킨, 에폭시드, 설프하이드릴, 디설피드, 폴리에틸렌이민, 소수성 모이어티, 또는 이의 염이다. 일부 구현예에서, 작용기(즉, -OH(하이드록실), 아민, 카복실산, 포스포네이트, 할라이드, 아지드, 알킨, 에폭시드, 설프하이드릴, 디설피드, 폴리에틸렌이민, 소수성 모이어티, 또는 이의 염)는 MSP의 표면에 직접 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 작용기는 C1 내지 C20 알킬 링커를 통해 MSP(예를 들어, MSR) 표면에 공유 결합된다. 다른 구현예에서, 작용기는 폴리에틸렌글리콜 링커를 통해 MSP 표면에 공유 결합된다. 특정 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜 링커는 화학식 (-O(CH2-CH2-)1-25을 갖는다. 특정 구현예에서, 표면 변형은 C1 내지 C20 알킬 퍼할로알킬 또는 C1 내지 C20 알킬 퍼플루오로알킬이다.
일부 구현예에서, MSP(예를 들어, MSR)는 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민으로 표면 변형된다. 특정 구현예에서, 메조다공성 실리카 막대는 폴리에틸렌이민으로 변형된다. 특정 구현예에서, 폴리에틸렌이민은 분지형 또는 비분지형이다. 대안적인 구현예에서, 폴리에틸렌이민기는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정된, 약 1000 내지 20,000 달톤(Da) 범위의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리에틸렌이민기는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정된, 약 1,200 내지 15,000 Da, 약 1,500 내지 12,000 Da, 약 2,000 Da, 약 3,000 Da, 약 4,000 Da, 약 5,000 Da, 약 6,000 Da, 약 7,000 Da, 약 8,000 Da, 약 9,000 Da, 또는 약 10,000 Da의 평균 분자량을 갖는다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 메조다공성 실리카 입자에 접합된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 메조다공성 실리카 입자에 정전기적으로 또는 공유적으로 접합된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자와 바이러스 벡터 사이의 정전기적 접합은 반대로 표면 하전된 바이러스 벡터 및 메조다공성 실리카 입자로 인한 것이다. 예를 들어 이론에 구애되지 않고, 양으로 하전된 폴리에틸렌이민 또는 1차, 2차, 3차 또는 4차 암모늄기에 의해 표면 변형된 메조다공성 실리카 입자는 음으로 표면 하전된 바이러스 벡터에 접합될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 음으로 하전되고, 메조다공성 실리카 입자는 양으로 하전된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자와 바이러스 벡터 사이의 공유 접합은 링커를 통해 또는 링커 없이 당업자에게 알려진 방법에 의해 달성된다. 예를 들어, 제한 없이, 링커는 폴리에틸렌 글리콜, 알킬기, 중합체, 폴리아미드 연결 등일 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 제공되는 것은 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 림프구 세포의 집단의 제조에 사용하기 위해 제형화된, 본원에 기재된 바와 같은 메조다공성 실리카 입자를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, T 림프구 세포는 CAR로 형질도입된다. 일부 구현예에서, MSP는 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터에 접합된다. 일부 구현예에서, MSP는 세포 활성화제에 접합된다. 일부 구현예에서 세포 활성화제는 MSP에 흡수된다. 일부 구현예에서, 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 림프구 세포 집단의 제조에 사용하기 위한 MSP는 본원에 기재된 바와 같이 표면 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 메조다공성 실리카 입자, 바이러스 벡터, 및 선택적으로 세포 활성화제를 포함하는 주사제 조성물로서 사용하기에 적합하며, 바이러스 벡터는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 메조다공성 실리카 입자에 접합된다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 본원에 기재된 바와 같은 메조다공성 실리카 입자에 흡수되거나 접합된다. MSP(예를 들어, MSR) 표면에 대한 흡착은 일반적으로 표면에 부착된 분자로 이해된다.
이론에 구애됨이 없이, 일부 구현예에서, MSP-바이러스 조성물, 예를 들어 MSP 및 바이러스 벡터, 예를 들어 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 배액 림프절로의 바이러스 벡터 배액을 제한하여, MSP가 없는 다른 유사한 조성물과 비교하여 잠재적인 부위-외 형질도입을 감소시킨다.
본원에 기재된 메조다공성 실리카 입자의 조성물에서, MSP(예를 들어, MSR)는 0.01 내지 1000 μg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 대안적인 구현예에서, 본원에 기재된 조성물에서 MSP 또는 MSR의 농도는 0.1 내지 500 μg/ml, 0.5 내지 100 μg/ml, 1 내지 90 μg/ml, 1 내지 80 μg/ml, 1 내지 70 μg/ml, 1 내지 60 μg/ml, 1 내지 50 μg/ml, 또는 1 내지 40 μg/ml일 수 있다.
특정 구현예에서, MSP(예를 들어, MSR)는 약 1 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 30 μg/ml, 40 μg/ml, 50 μg/ml, 60 μg/ml, 70 μg/ml, 80 μg/ml, 90 μg/ml, 100 μg/ml, 110 μg/ml, 120 μg/ml, 130 μg/ml, 140 μg/ml, 또는 150 μg/ml의 농도로 존재할 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 조합되어 당분야에 알려진 임의의 통상적이고 허용 가능한 방식을 통해 전술한 같이 치료 유효량으로 투여될 수 있다.
주사제 조성물은 수성 등장성 현탁액일 수 있다. 조성물은 멸균될 수 있고/있거나 보존제, 안정화제, 수화제 또는 유화제, 용액 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충액과 같은 애주번트를 함유할 수 있다. 또한, 조성물은 치료적으로 유효한 다른 물질을 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 치료될(또는 방지될) 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양 및 빈도는 환자의 질병, 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 요인에 의해 결정될 것이지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 예를 들어 내독소, 미코플라즈마, 복제 적격 렌티바이러스(RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항-CD3/항-CD28 코팅 비드, 마우스 항체, 풀링된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 박테리아 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택된 오염물이 실질적으로 없으며, 예를 들어, 검출 가능한 수준으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 박테리아는 알칼리게네스 패칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 나이세리아 메닌지티데스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 및 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 군 A로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나이다.
적용을 위한 약학 조성물(또는 제형물)은 본원에 기재된 조성물을 투여하기 위해 사용되는 방법에 따라 다양한 방식으로 패키징될 수 있다. 일반적으로, 유통용 물품은 약학 제형물이 적절한 형태로 놓여있는 용기를 포함한다. 적합한 용기는 당업자에게 잘 알려져 있고, 병(플라스틱 및 유리), 사쉐, 앰풀, 플라스틱 백, 금속 실린더 등과 같은 물질을 포함한다. 용기는 또한, 패키지의 내용물에 무분별하게 접근하는 것을 방지하기 위하여 부정 조작 방지 조립물을 포함할 수 있다. 또한, 용기에는 용기의 내용물을 설명하는 라벨이 부착된다. 라벨은 또한 적절한 경고문을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 세포 활성화제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 T 세포 자극 화합물, CAR 항원 결합 도메인에 대한 항-개별특이형 항체, 및/또는 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단에 접합되거나 흡착된다. 추가적인 또는 대안적인 구현예에서, T 세포 자극 화합물 또는 종양 항원은 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단에 접합되거나 흡착된다. 추가 구현예에서, T-세포 자극 화합물 또는 종양 항원은 IL-2, IL-15, GM-CSF, 항-CD2 mAb, 항-CD3 mAb, 항-CD28 mAb, 신생항원 펩티드, TRP2와 같은 공유 항원으로부터의 펩티드, gp100, 종양 세포 용해물, CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR 및/또는 MAGE A3 TCR이다. 일부 구현예에서, 세포 활성화제는 CD3/TCR 복합체 및/또는 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하고, 선택적으로 세포 활성화제는 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하는 다중특이적 결합 분자이다.
세포 활성화제가 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단에 접합되는 구현예에서, T 세포 자극 화합물 또는 종양 항원은 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단의 표면 상의 지질 이중층에 접합될 수 있다. 메조다공성 실리카 입자 상에 지질 이중층을 제조하는 방법은 알려져 있다. 예를 들어, 국제 출원 공개 제WO 2018/013797호를 참고한다. 간략하게, 비오틴과 같은 미리 정의된 양의 표지를 함유하는 리포좀이 사용되어 MSP를 코팅한다. 그 후, 표지는 상보적 표지, 예를 들어 스트렙타비딘을 사용하여 T-세포 자극 화합물에 부착하기 위해 사용될 수 있다. 리포좀을 제조하기 위해 사용되는 지질은 당업자에게 알려져 있으며, 제한 없이 2개의 탄화수소쇄, 전형적으로 아실쇄, 및 극성 헤드기(head group)를 갖는 소포 형성 지질을 포함한다. 이 클래스에는 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티드산(PA), 포스파티딜이노시톨(PI) 및 스핑고미엘린(SM)과 같은 인지질이 포함되며, 2개의 탄화수소쇄는 전형적으로 약 14 내지 22개의 탄소 원자 길이이고, 다양한 불포화도를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질은 상대적으로 불포화된 인지질(탄화수소쇄에 1, 2 또는 3개의 이중 결합을 가짐)이다. 일부 구현예에서, 지질은 포스파티딜콜린이다. 포스파티딜콜린은 콜린을 헤드기로 통합하고 글리세로인산과 2개의 지방산을 조합한 인지질이다. 일부 구현예에서, 포스파티딜콜린은 팔미토일 포스파티딜콜린 또는 올레오일 포스파티딜콜린 또는 1-팔미토일,2-올레오일-포스파티딜콜린이다. 하나를 초과하는 유형의 지질이 리포좀 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 지질 및 비율의 선택은 원하는 정도의 유동성 또는 강성을 달성하고/하거나, 안정성을 제어하기 위해 다양할 수 있다. 하나를 초과하는 유형의 지질이 리포좀 조성물을 제조하기 위해 사용되는 경우, 안정적인 리포좀을 형성하기 위해 적합한 양의 상대적으로 불포화된 지질(예컨대, PC)이 사용되어야 한다. 일부 구현예에서, 제형물에 사용된 지질의 적어도 45 내지 50 mol%는 PC이다. 리포좀은 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 친수성 중합체로 유도체화된 지질을 포함할 수 있다. 적합한 친수성 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로필옥사졸린, 폴리하이드록시프로필메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리하이드록시프로필메타크릴레이트, 폴리하이드록시에틸아크릴레이트, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아스파르트아미드, 및 친수성 펩티드 서열을 포함한다. 친수성 중합체로 유도체화된 지질을 제조하는 방법은 알려져 있다(예를 들어, 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 제5,395,619호 참고).
일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 또는 제2 집단은 사이토카인을 추가로 포함한다. 사이토카인은 제한 없이 IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, 또는 전환 성장 인자 베타(TGF-β), 또는 이의 효능제, 이의 모방체, 이의 변이체, 이의 기능적 단편, 또는 이의 조합일 수 있다. 특정 구현예에서, 사이토카인은 메조다공성 실리카 입자의 제1 또는 제2 집단에 접합되거나 흡착된다. 구현예에서, 사이토카인이 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단에 흡착되는 경우, MSP(예를 들어, MSR)의 제2 집단은 전술한 바와 같이 지질 이중층에 의해 추가로 덮일 수 있다.
방법
본원에 개시된 양태는 세포 동원 인자를 포함하는 생체물질; 연장 방출제, 예를 들어 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 생체내에서 세포를 형질도입하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 성분은 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자를 포함하는 생체물질이 먼저 투여된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 막대의 제1 집단, 바이러스 벡터, 및 선택적으로 세포 활성화제는 동시에 그리고 선택적으로 생체물질 이후에 투여된다.
본원에 개시된 양태는 생체물질 및 세포 동원 인자; 연장 방출제, 예를 들어 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 생체내에서 세포를 형질도입하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 성분은 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서는, 생체물질 및 세포 동원 인자가 먼저 투여된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 막대의 제1 집단, 바이러스 벡터, 및 선택적으로 세포 활성화제는 동시에 그리고 선택적으로 생체물질 및 세포 동원 인자 이후에 투여된다.
일부 구현예에서, 방법은 T 림프구를 메조다공성 실리카 입자(예를 들어, MSR)의 제1 집단, 바이러스 벡터 및 선택적으로 세포 활성화제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 바이러스 벡터는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 방법은 집단에서 T 림프구의 비율 증가를 초래한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에서의 원하는 작용 부위로 바이러스 벡터를 전달하는 단계를 포함한다.
추가 양태는 세포 동원 인자를 포함하는 생체물질; 연장 방출제, 예를 들어 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애 또는 질병을 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 성분은 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 동원 인자를 포함하는 생체물질이 먼저 투여된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 막대의 제1 집단, 바이러스 벡터, 및 선택적으로 세포 활성화제는 동시에 그리고 선택적으로 생체물질 이후에 투여된다.
추가 양태는 생체물질 및 세포 동원 인자; 연장 방출제, 예를 들어 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단; 바이러스 벡터; 및 선택적으로 세포 활성화제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애 또는 질병을 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 성분은 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서는, 생체물질 및 세포 동원 인자가 먼저 투여된다. 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 막대의 제1 집단, 바이러스 벡터, 및 선택적으로 세포 활성화제는 동시에 그리고 선택적으로 생체물질 및 세포 동원 인자 이후에 투여된다.
일부 구현예에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, 엽산 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 파단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 종양 항원을 발현하는 암을 갖는다.
일부 구현예에서, 방법은 대상체에 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 및 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 바이러스 벡터는 종양 항원을 표적화하도록 조작된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
방법의 일부 구현예에서, 조성물은 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 또는 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단, 또는 MSP(예를 들어, MSR)의 두 집단 모두에 접합되거나 흡착된 T 세포 자극 화합물 또는 종양 항원을 추가로 포함한다. 대안적으로, 방법은 MSP(예를 들어, MSR)의 제1 집단의 투여와 조합되어, 예를 들어, 동시에 또는 직후에, 제2 연장 방출제, 예를 들어 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단을 투여하는 단계를 포함한다. 대안적으로, MSP(예를 들어, MSR)의 제2 집단은 MSP의 제1 집단의 투여 후 연장된 기간 후에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 연장 방출제는 MSP의 제1 집단을 포함하고 제2 방출 연장제는 MSP의 제2 집단을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 세포 활성화제를 투여하는 단계를 포함하고, 세포 활성화제는 메조다공성 실리카 입자의 제1 또는 제2 집단에 접합되거나 흡착된다.
일부 구현예에서, MSP(예를 들어, MSR)의 제2 집단은 MSP의 제1 집단의 투여와 동시에(예를 들어, 동일한 날에 투여됨), 또는 투여 직후(예를 들어, 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후 투여됨) 대상체에 투여된다. 다른 구현예에서, 사이토카인은 MSP의 제1 집단의 투여 후 연장된 시기(예를 들어, 예를 들어, 적어도 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주 이상) 후 대상체에 투여된다.
임의의 상기 언급된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 질병은 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양 또는 전암성 질병, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병으로부터 선택된 종양 항원, 예를 들어, 본원에 기재된 종양 항원과 관련되거나, 본원에 기재된 종양 항원의 발현과 관련된 암 무관 적응증이다. 일부 구현예에서, 질환은 본원에 기재된 암, 예를 들어 본원에 기재된 표적과 관련된 것으로 본원에 기재된 암이다. 일부 구현예에서, 질환은 혈액암이다. 일부 구현예에서, 혈액암은 백혈병이다. 일부 구현예에서, 암은 B-세포 급성 림프성 백혈병("BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병("TALL"), 급성 림프성 백혈병(ALL)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 급성 백혈병; 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 만성 백혈병; B 세포 전림프구성 백혈병, 모세포성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 털세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 질병, MALT 림프종, 맨틀 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 및 골수 혈액 세포의 비효과적인 생산(또는 이형성증)에 의해 통합된 혈액 질병의 다양한 집합인 "전백혈병"을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가 혈액암 또는 혈액 질병, 및 본 명세서에서 기재된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 비정형 및/또는 비-고전적 암, 악성종양, 전암성 질병 또는 증식성 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 명세서에 기재된 종양 항원의 발현과 관련된 질환; 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 종양 항원과 관련된 질환은 고형 종양이다.
구현예에서, 암은 결장암, 직장암, 신세포 암종, 간암, 비소세포 폐암종, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부 암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아기 고형 종양, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척추 축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 유표피암, 편평 세포 암, T-세포 림프종, 환경적으로 유발된 암, 상기 암들의 조합, 및 상기 암의 전이성 병변으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CAR-발현 세포로 치료될 수 있는 암은 다발성 골수종이다. 일반적으로, 골수종 세포는 본원에 기재된 암 관련 항원에 대하여 유세포측정에 의한 발현이 음성인 것으로 생각된다. 따라서, 일부 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 CD19 CAR은 골수종 세포를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 치료법의 car은 하나 이상의 추가 치료법, 예를 들어 레날리도미드 치료와 병용될 수 있다.
다양한 양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되고 환자에 투여된 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포), 또는 이의 자손은 환자에 대한 T 세포 또는 NK 세포의 투여 후 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 또는 5년 동안 환자에서 지속된다.
또한, 본 발명은 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)가 키메라 항원 수용체(CAR)를 일시적으로 발현하도록, 예를 들어 시험관내 또는 생체내 전사된 RNA에 의해, 변형되는 유형의 세포 치료법을 포함한다. 그 결과로 생성된 세포는 대상체 또는 환자에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양한 양태에서, 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 투여 후 1개월 미만, 예를 들어, 3주, 2주, 1주 동안 존재한다.
특정 이론에 구애됨이 없이, CAR 변형 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)에 의해 유발되는 항-종양 면역 반응은 능동 또는 수동 면역 반응일 수 있거나, 대안적으로 직접 대 간접 면역 반응으로 인한 것일 수 있다. 일부 양태에서, CAR 형질도입된 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 본원에 기재된 암 관련 항원을 발현하는 인간 암 세포에 반응하여 특이적 친염증성 사이토카인 분비 및 강력한 세포용해 활성을 나타내고, 본원에 기재된 가용성 암 관련 항원의 억제에 저항하고, 방관자 사멸을 매개하고, 확립된 인간 종양의 퇴행을 매개한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 암 관련 항원-발현 종양의 불균질 영역 내의, 항원이 더 적은 종양 세포는 인접한 항원-양성 암 세포에 대해 이전에 반응한, 본원에 기재된 바와 같은 암 관련 항원에 의해 재유도된 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)에 의해 간접 파괴되기 쉬울 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 완전 인간 CAR 변형 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 포유류에서의 생체외 면역화 및/또는 생체내 치료법을 위한 백신의 한 유형일 수 있다. 일부 양태에서, 포유류는 인간이다.
일부 양태에서 본 발명의 CAR-발현 세포는 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양, 또는 전암성 질병, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 관련된 질환은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 비정형 및/또는 비-고전적 암, 악성종양, 전암성 질병 또는 증식성 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 관련된 비-암 관련 적응증은, 예를 들어 자가면역 질환(예를 들어, 루푸스), 염증성 장애(알러지 및 천식) 및 이식을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서 본 발명의 CAR-발현 세포는 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 이식을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 자가면역 질환은 애디슨병, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신염, 항인지질 증후군(APS), 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환(AIED), 축삭 및 신경 신경병증(AMAN), 베체트병, 수포성 유천포창, 캐슬만병(CD), 셀리악병, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 만성 재발성 다발성 골수염(CRMO), 처그-스트라우스, 반흔성 유천포창/양성 점막 유천포창, 코간 증후군, 한랭 응집소 질환, 선천성 심장 차단, 콕사키 심근염, CREST 증후군, 크론병, 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병(시신경척수염), 원판상 루푸스, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산구성 식도염(EoE), 호산구성 근막염, 결절성 홍반, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 에반스 증후군, 섬유근육통, 섬유성 폐포염, 거대 세포 동맥염(측두 동맥염), 거대 세포 심근염, 사구체신염, 굿파스쳐 증후군, 다발혈관염을 동반한 육아종증, 그레이브스병, 길랭-바레 증후군, 하시모토 갑상샘염, 용혈성 빈혈, 헨노흐-쉔라인 자반병(HSP), 임신성 헤르페스 또는 임신성 유천포창(PG), 저감마글로불린혈증, IgA 신병증, IgG4 관련 경화성 질환, 봉입체 근염(IBM), 간질성 방광염(IC), 소아 관절염, 소아 당뇨병(1형 당뇨병), 소아 근염(JM), 가와사키병, 램버트-이튼 증후군, 백혈구 파괴성 혈관염, 편평태선, 경화태선, 태선성 결막염, 선형 IgA 질환(LAD), 루푸스, 만성 라임병, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염(MPA), 혼합 결합 조직 질환(MCTD), 무렌 궤양, 무하-하버만병, 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증, 근염, 기면증, 시신경척수염, 호중구감소증, 안반흔유천포창, 시신경염, 회문 류머티즘(PR), PANDAS(연쇄상구균과 관련된 소아 자가면역 신경정신병 장애), 신생물 부종양성 소뇌 변성(PCD), 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH), 패리 롬버그 증후군, 편평부염(말초 포도막염), 파소나지-터너 증후군, 천포창, 말초신경병증, 정맥주위 뇌척수염, 악성 빈혈(PA), POEMS 증후군(다발신경병증, 장기비대, 내분비병증, 모노클로날 감마병증, 피부 변화), 결절성 다발동맥염, 류마티스성 다발근염, 다발근염, 심근경색후 증후군, 심낭절개후 증후군, 원발성 담즙성 경변증, 원발성 경화 쓸개관염, 프로게스테론 피부염, 건선, 건선 관절염, 순수 적혈구 무형성증(PRCA), 괴저성 농피증, 레이노 현상, 반응성 관절염, 반사성 교감신경 위축증, 라이터 증후군, 재발성 다발연골염, 하지 불안 증후군(RLS), 후복막 섬유증, 류마티스열, 류마티스 관절염(RA), 유육종증, 슈미트 증후군, 공막염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 경직된 사람 증후군(SPS), 아급성 세균성 심내막염(SBE), 수삭 증후군, 교감신경 안염(SO), 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판감소성 자반증(TTP), 톨로사-헌트 증후군(THS), 횡단 척수염, 1형 당뇨병, 궤양성 결장염(UC), 미분화 결합 조직 질환(UCTD), 포도막염, 혈관염, 백반증 또는 베게너 육아종증(다발혈관염을 동반한 육아종증(GPA))을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, CAR은 B 세포 항원, 예를 들어 CD 19, CD20, CD22, CD123, FcRn5, FcRn2, BCMA, CS-1 및 CD138에 결합한다.
본 발명의 CAR-변형 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 단독으로, 또는 희석제 및/또는 다른 성분, 예컨대 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 조합되어 약학 조성물로서 투여될 수 있다.
혈액암
혈액암 질병은 백혈병, 림프종 및 혈액, 골수 및 림프에 영향을 미치는 악성 림프증식성 질병과 같은 유형의 암이다.
백혈병은 급성 백혈병 및 만성 백혈병으로 분류될 수 있다. 급성 백혈병은 급성 골수성 백혈병(AML) 및 급성 림프성 백혈병(ALL)으로 추가 분류될 수 있다. 만성 백혈병은 만성 골수성 백혈병(CML) 및 만성 림프성 백혈병(CLL)을 포함한다. 다른 관련 질병은 골수성 혈액 세포의 비효과적인 생산(또는 이형성증) 및 AML로의 변환 위험에 의해 통합된 다양한 혈액 질병의 집합인 골수이형성 증후군(MDS, 이전에 "전백혈병"으로 알려짐)을 포함한다.
림프종은 림프구에서 발생한 혈액 세포 종양의 한 군이다. 예시적인 림프종은 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종을 포함한다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 암 관련 항원의 증식을 억제하거나 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 암 관련 항원을 포함하는 세포 집단을 메조다공성 실리카 입자 및 바이러스 벡터를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, MSP는 본원에 기재된 바와 같이 표면 변형된다. 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 예시적인 뉴클레오티드 서열은 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 TCR, 사이토카인, 케모카인, 억제 분자를 차단하기 위한 shRNA, 또는 단백질의 발현을 유도하기 위한 mRNA를 발현한다. 일부 양태에서, 본 발명의 CAR 발현 T 세포 또는 NK 세포는 골수성 백혈병, 또는 본원에 기재된 바와 같은 암 관련 항원 발현 세포와 관련된 또 다른 암을 갖는 대상체 또는 이를 위한 동물 모델에서, 음성 대조군에 비해 세포 및/또는 암 세포의 수량, 수, 양 또는 백분율을 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 감소시킨다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다.
조합 치료법
본원에서 사용된 "조합되어" 투여된다는 것은 장애를 갖는 대상체가 고통을 겪는 동안 두 가지(이상)의 상이한 치료가 대상체에게 전달되는 것, 예를 들어 대상체가 장애를 갖고 있다고 진단받은 후 및 장애가 치유되거나 제거되거나 다른 이유로 치료가 중단되기 전에 두 개 이상의 치료가 전달됨을 의미한다. 일부 구현예에서, 하나의 치료의 전달은 제2 전달이 시작될 때 여전히 일어나고 있는 중이어서, 투여 측면에서 중첩이 존재한다. 이것은 때때로 본 명세서에서 "동시" 또는 "병행 전달"로 지칭된다. 다른 구현예에서, 하나의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 이전에 종료된다. 어느 하나의 경우의 일부 구현예에서, 치료는 조합 투여로 인해 더욱 효과적이다. 예를 들어 제2 치료가 보다 효과적이고, 예를 들어 더 적은 제2 치료에 의해 동등한 효과가 관찰되거나, 제1 치료의 부재 하에 제2 치료가 투여된 경우에 관찰되는 것보다 큰 정도로 제2 치료가 증상을 감소시키거나, 제1 치료에 의해 유사한 상황이 관찰된다. 일부 구현예에서, 전달은, 증상의 감소, 또는 장애와 관련된 다른 파라미터가 다른 치료의 부재 하에 전달된 하나의 치료에 의해 관찰되는 것보다 크도록 하는 것이다. 2가지의 치료의 효과는 부분적으로 부가적이거나, 완전히 부가적이거나, 부가적인 것보다 클 수 있다. 전달은, 제2 치료가 전달될 때 이미 전달된 제1 치료의 효과가 여전히 검출 가능하도록 하는 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 방법 또는 용도는 면역 효과기 세포의 효능을 증가시키는 제제, 예를 들어 본원에 기재된 제제와 조합되어 수행된다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 메조다공성 실리카 막대 조성물은 면역 효과기 세포의 효능을 증가시키는 제제, 예를 들어 단백질 포스파타제 억제제, 키나제 억제제, 사이토카인, 면역 억제 분자의 억제제; 또는 TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제와 조합되어 투여된다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 단백질 포스파타제 억제제는 SHP-1 억제제 및/또는 SHP-2 억제제이다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 다른 구현예에서, 키나제 억제제는 CDK4 억제제, CDK4/6 억제제(예를 들어, 팔보시클립), BTK 억제제(예를 들어, 이브루티닙 또는 RN-486), mTOR 억제제(예를 들어, 라파마이신 또는 에버롤리무스(RAD001)), MNK 억제제, 또는 이중 P13K/mTOR 억제제 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, BTK 억제제는 인터루킨-2-유도성 키나제(ITK)의 키나제 활성을 감소시키거나 억제하지 않는다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 다른 구현예에서, 면역 억제 분자를 억제하는 제제는 항체 또는 항체 단편, 억제 핵산, 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복부(CRISPR), 전사-활성화제 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 또는 억제 분자의 발현을 억제하는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)를 포함한다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 다른 구현예에서, TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제는 사이클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, 또는 이의 조합으로부터 선택된다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 면역 억제 분자는 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR 베타, CEACAM-1, CEACAM-3, 및 CEACAM-5로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 억제 분자를 억제하는 제제는 억제 분자 또는 이의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드를 포함하며, 제1 및 제2 폴리펩티드는 CAR 함유 면역 세포 상에서 발현되고, (i) 제1 폴리펩티드는 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR 베타, CEACAM-1, CEACAM-3, 및 CEACAM-5 또는 이의 단편을 포함하고/하거나; (ii) 제2 폴리펩티드는 일차 신호전달 도메인 및/또는 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능적 도메인을 포함하고/하거나, 공동자극 신호전달 도메인은 41BB, CD27 및 CD28로부터 선택된 단백질의 기능적 도메인을 포함한다.
다른 구현예에서, 사이토카인은 IL-7, IL-15, 또는 IL-21, 또는 이의 조합으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, CAR 분자 및 제2, 예를 들어, 본원에 개시된 조합 치료법 중 임의의 것(예를 들어, 면역 효과기 세포의 효능을 증가시키는 제제)을 포함하는 면역 효과기 세포는 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
다른 구현예에서, CAR 분자를 포함하는 면역 세포는 GITR을 표적화하고/하거나 GITR 기능을 조절하는 분자와 조합되어 투여된다. 일부 구현예에서, GITR을 표적화하고/하거나 GITR 기능을 조절하는 분자는 CAR-발현 세포 또는 세포 집단 전에, 또는 분리반출술 전에 투여된다.
일부 구현예에서, 림프구 주입, 예를 들어 동종이계 림프구 주입은 암의 치료에 사용되며, 림프구 주입은 본 발명의 적어도 하나의 CAR-발현 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 자가 림프구 주입은 암의 치료에 사용되며, 림프구 주입은 본원에 기재된 적어도 하나의 CAR-발현 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 T 세포이고, T 세포는 디아글리세롤 키나제(DGK) 결핍이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포이고, T 세포는 Ikaros 결핍이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포이고, T 세포는 DGK 및 Ikaros 결핍 둘 모두이다.
임의의 상기 언급된 방법 또는 용도의 구현예에서, 종양 항원의 발현과 관련된 질환을 치료하는 제제, 예를 들어 본원에 개시된 임의의 제2 또는 제3 치료법의 추가 투여가 있을 수 있다. 추가의 예시적인 조합은 하기 중 하나 이상을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 또 다른 제제, 예를 들어, 본원에 기재된 키나제 억제제 및/또는 체크포인트 억제제의 추가 투여가 있을 수 있다. 예를 들어, CAR-발현 세포의 활성을 향상시키는 제제의 추가 투여가 있을 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, CAR-발현 세포의 활성을 향상시키는 제제는 억제 분자(예를 들어, 면역 억제제 분자)를 억제하는 제제일 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다.
일부 구현예에서, 억제 분자를 억제하는 제제는 억제 핵산이며, dsRNA, siRNA, 또는 shRNA이다. 구현예에서, 억제 핵산은 CAR 분자의 성분을 인코딩하는 핵산에 연결된다. 예를 들어, 억제 분자는 CAR-발현 세포 상에서 발현될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 억제 분자를 억제하는 제제는, 예를 들어, 본원에 기재된 분자, 예를 들어, 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된, 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제 분자를 포함하는 제제이다. 일부 구현예에서, 제제는 예를 들어 억제 분자, 예컨대 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, CEACAM(예를 들어 CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타 또는 이들 중 임의의 것의 단편(예를 들어 이들 중 임의의 것의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어 공동자극 도메인(예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 일차 신호전달 도메인(예를 들어 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)을 포함함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 PD1 또는 그의 단편(예를 들어 PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CAR 발현 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포는 이전의 줄기 세포 이식, 예를 들어, 자가 줄기 세포 이식을 제공받은 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CAR 발현 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포는 이전 용량의 멜팔란을 제공받은 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 CAR 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 제제, 예를 들어 본원에 기재된 제제와 조합되어 투여된다.
일부 구현예에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 CAR 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 하나 이상의 부작용을 개선하는 제제, 예를 들어 본원에 기재된 제제와 조합되어 투여된다.
일부 구현예에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 본원에 기재된 암 관련 항원과 관련된 질환을 치료하는 제제, 예를 들어 본원에 기재된 제제와 조합되어 투여된다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 CAR 분자를 발현하는 세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 암을 치료하기 위해 치료를 필요로 하는 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, CAR 발현 세포를 포함하는 세포 집단은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 암을 치료하기 위해 치료를 필요로 하는 대상체에 투여된다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, CAR 분자는 다른 제제와 조합되어 투여된다. 일부 구현예에서, 제제는 키나제 억제제, 예를 들어, CDK4/6 억제제, BTK 억제제, mTOR 억제제, MNK 억제제, 또는 이중 PI3K/mTOR 억제제, 및 이의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 CDK4 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 CDK4 억제제, 예를 들어 CD4/6 억제제, 예컨대, 예를 들어 6-아세틸-8-사이클로펜틸-5-메틸-2-(5-피페라진-1-일-피리딘-2-일아미노)-8H-피리도[2,3-d]피리미딘-7-온, 하이드로클로라이드(팔보시클립 또는 PD0332991로도 지칭됨)이다. 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 BTK 억제제, 예컨대 예를 들어 이브루티닙이다. 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTOR 억제제, 예컨대 예를 들어 라파마이신, 라파마이신 유사체, OSI-027이다. mTOR 억제제는, 예를 들어 mTORC1 억제제 및/또는 mTORC2 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTORC1 억제제 및/또는 mTORC2 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 MNK 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 MNK 억제제, 예컨대 예를 들어 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘이다. MNK 억제제는, 예를 들어 MNK1a, MNK1b, MNK2a 및/또는 MNK2b 억제제일 수 있다. 이중 PI3K/mTOR 억제제는 예를 들어, PF-04695102일 수 있다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 알로이신 A; 플라보피리돌 또는 HMR-1275, 2-(2-클로로페닐)-5,7-디하이드록시-8-[(3S,4R)-3-하이드록시-1-메틸-4-피페리디닐]-4-크로메논; 크리조티닙(PF-02341066); 2-(2-클로로페닐)-5,7-디하이드록시-8-[(2R,3S)-2-(하이드록시메틸)-1-메틸-3-피롤리디닐]-4H-1-벤조피란-4-온, 하이드로클로라이드(P276-00); 1-메틸-5-[[2-[5-(트리플루오로메틸)-1H-이미다졸-2-일]-4-피리디닐]옥시]-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-1H-벤즈이미다졸-2-아민(RAF265); 인디술람(E7070); 로스코비틴(CYC202); 팔보시클립(PD0332991); 디나시클립(SCH727965); N-[5-[[(5-tert-부틸옥사졸-2-일)메틸]티오]티아졸-2-일]피페리딘-4-카복사미드(BMS 387032); 4-[[9-클로로-7-(2,6-디플루오로페닐)-5H-피리미도[5,4-d][2]벤즈아제핀-2-일]아미노]-벤조산(MLN8054); 5-[3-(4,6-디플루오로-1H-벤즈이미다졸-2-일)-1H-인다졸-5-일]-N-에틸-4-메틸-3-피리딘메탄아민(AG-024322); 4-(2,6-디클로로벤조일아미노)-1H-피라졸-3-카복실산 N-(피페리딘-4-일)아미드(AT7519); 4-[2-메틸-1-(-1-메틸에틸)-1H-이미다졸-5-일]-N-[4-(메틸설포닐)페닐]-2-피리미딘아민(AZD5438); 및 XL281(BMS908662)로부터 선택된 CDK4 억제제이다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 CDK4 억제제, 예를 들어 팔보시클립(PD0332991)이고, 팔보시클립은 일정 시기 동안 매일, 예를 들어 28일 주기의 14 내지 21일 동안 매일 또는 21일 주기의 7 내지 12일 동안 매일 약 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg(예를 들어 75 mg, 100 mg 또는 125 mg)의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 이상의 주기의 팔보시클립이 투여된다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 이브루티닙(PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된 BTK 억제제이다. 일부 구현예에서, BTK 억제제는 인터루킨-2-유도성 키나제(ITK)의 키나제 활성을 감소시키지 않거나 억제하지 않고, GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, 예를 들어 이브루티닙(PCI-32765)이고, 이브루티닙은 일정 시기 동안 매일, 예를 들어 21일 주기 동안 매일 또는 28일 주기 동안 매일 약 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg(예를 들어 250 mg, 420 mg 또는 560 mg)의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주기 이상의 이브루티닙이 투여된다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 ITK의 키나제 활성을 억제하지 않는 BTK 억제제, 예를 들어, RN-486이며, RN-486은 일정 시기 동안 매일, 예를 들어 28일 주기 동안 매일 약 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 210 mg, 220 mg, 230 mg, 240 mg, 250 mg(예를 들어, 150 mg, 200 mg 또는 250 mg)의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7주기 이상의 RN-486이 투여된다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 템시롤리무스; 리다포롤리무스 (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디하이드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리사이클로[30.3.1.04,9] 헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시사이클로헥실 디메틸포스피네이트(AP23573 및 MK8669로도 알려짐); 에버롤리무스(RAD001); 라파마이신(AY22989); 시마피모드; (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올(AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-하이드록시에톡시)사이클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온(PF04691502); 및 N 2-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파르틸L-세린-(SEQ ID NO: 692), 내염(SF1126); 및 XL765로부터 선택된 mTOR 억제제이다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신이고, 라파마이신은 일정 시기 동안 매일, 예를 들어 21일 주기 동안 매일, 또는 28일 주기 동안 매일 약 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg(예를 들어 6 mg)의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주기 이상의 라파마이신이 투여된다. 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 에버롤리무스이고, 에버롤리무스는 일정 시기 동안 매일, 예를 들어 28일 주기 동안 매일 약 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg(예를 들어 10 mg)의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주기 이상의 에버롤리무스가 투여된다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 CGP052088; 4-아미노-3-(p-플루오로페닐아미노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘(CGP57380); 세르코스포라미드; ETC-1780445-2; 및 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘으로부터 선택된 MNK 억제제이다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 키나제 억제제는 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-하이드록시에톡시)사이클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온(PF-04691502); N-[4-[[4-(디메틸아미노)-1-피페리디닐]카보닐]페닐]-N'-[4-(4,6-디-4-모르폴리닐-1,3,5-트리아진-2-일)페닐]우레아(PF-05212384, PKI-587); 2-메틸-2-{4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디하이드로-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐}프로판니트릴(BEZ-235); 아피톨리십(GDC-0980, RG7422); 2,4-디플루오로-N-{2-(메틸옥시)-5-[4-(4-피리다지닐)-6-퀴놀리닐]-3-피리디닐}벤젠설폰아미드(GSK2126458); 8-(6-메톡시피리딘-3-일)-3-메틸-1-(4-(피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2(3H)-온 말레산(NVP-BGT226); 3-[4-(4-모르폴리닐피리도[3',2':4,5]푸로[3,2-d]피리미딘-2-일]페놀(PI-103); 5-(9-이소프로필-8-메틸-2-모르폴리노-9H-푸린-6-일)피리미딘-2-아민(VS-5584, SB2343); 및 N-[2-[(3,5-디메톡시페닐)아미노]퀴녹살린-3-일]-4-[(4-메틸-3-메톡시페닐)카보닐]아미노페닐설폰아미드(XL765)로부터 선택된 이중 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K) 및 mTOR 억제제이다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 단백질 티로신 포스파타제 억제제, 예를 들어, 본원에 기재된 단백질 티로신 포스파타제 억제제의 추가 투여가 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 티로신 포스파타제 억제제는 SHP-1 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 SHP-1 억제제, 예컨대 나트륨 스티보글루코네이트이다. 일부 구현예에서, 단백질 티로신 포스파타제 억제제는 SHP-2 억제제이다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 구현예에서, 또 다른 제제의 추가 투여가 있을 수 있고, 제제는 사이토카인이다. 사이토카인은 예를 들어, IL-7, IL-15, IL-21, 또는 이의 조합일 수 있다. 또 다른 구현예에서, CAR 분자는 체크포인트 억제제, 예를 들어, 본원에 기재된 체크포인트 억제제와 조합되어 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타로부터 선택된 억제 분자를 억제한다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 다른 구현예에서, CAR 분자를 발현하는 세포와 관련된 하나 이상의 부작용을 완화하는 제제의 추가 투여가 있을 수 있다. CAR-발현 세포와 관련된 부작용은 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 식혈세포성 림프조직구증(HLH)으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 암 관련 항원 발현 세포와 관련된 질환(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 혈액암 또는 비정형 암)을 방지, 치료 및/또는 관리하는 방법으로서, 대상체에 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 및 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공하고, 바이러스 벡터는 종양 항원을 표적화하도록 조작된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다. 본원에 기재된 암 관련 항원 발현 세포와 관련된 장애의 비제한적인 예는 자가면역 장애(예컨대, 루푸스), 염증성 장애(예컨대, 알러지 및 천식) 및 암(예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 혈액암 또는 비정형 암)을 포함한다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 암 관련 항원 발현 세포와 관련된 질환을 방지, 치료 및/또는 관리하는 방법으로서, 대상체에 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 및 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공하고, 바이러스 벡터는 종양 항원을 표적화하도록 조작된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 암 관련 항원 발현 세포와 관련된 암의 재발을 방지하는 방법으로서, 대상체에 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 및 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 바이러스 벡터는 종양 항원을 표적화하도록 조작된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
"면역 유효량", "항-종양 유효량", "종양-억제 유효량", 또는 "치료량"이 표시되는 경우에, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은 환자(대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 질병의 개별 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다.
일부 양태에서, 활성화된 면역 효과기 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 대상체에 투여한 후, 후속적으로 혈액을 재채취하고(또는 분리반출술을 수행하고), 본 발명에 따라 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 활성화하고, 증대시키고, 환자에게 이들 활성화되고 증대된 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 재주입하는 것이 요망될 수 있다. 이러한 과정은 수 주마다 다회 실시될 수 있다. 일부 양태에서, 면역 효과기 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)는 10 cc 내지 400 cc의 혈액 채취물로부터 활성화될 수 있다. 일부 양태에서, 면역 효과기 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)는 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc 또는 100 cc의 혈액 채취물로부터 활성화된다.
본 발명의 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 임플란트 또는 이식에 의한 것을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 동맥통과, 피하, 피내, 종양내, 결절내, 수질내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로 환자에 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 MSP(예를 들어, MSR) 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 일부 양태에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 비경구 투여된다. 용어 T 세포 조성물의 "비경구" 투여는, 예를 들어 경막내, 경막외, 두개내, 피하(s.c), 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.), 또는 흉골내 주사, 종양내, 또는 주입 기술을 포함한다. 특정 구현예에서, T 세포 조성물은 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, MSP(예를 들어, MSR) 및 바이러스 벡터의 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위로 직접 주사될 수 있다.
실시예
실시예 A. 메조다공성 실리카 입자의 합성 및 후기능화(post-functionalization)
달리 언급되지 않는 한, 모든 시약은 상업적 공급처에서 얻었고 그대로 사용하였다.
1. 메조다공성 실리카 입자의 예시적인 합성
폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(프로필렌 글리콜)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) 평균 Mn 약 5,800(플루로닉(Pluronic) P-123, 80.0 g, 487 mmol; Sigma) 계면활성제를 실온에서 1.6 M의 HCl 3 L에 용해시키고, 5 L의 재킷형 플라스크에서 40℃까지 가열하고, 오버헤드 교반기를 통해 0 내지 600 rpm(그러나 가장 일반적으로는 300 rpm)의 속도로 기계적으로 교반하였다. 테트라에틸 오르소실리케이트(TEOS, 184 mL, 826 mmol; Sigma)를 5분 미만에 걸쳐 한 번에 첨가하고, 적어도 2시간, 그러나 가장 일반적으로는 20시간 동안 교반을 유지하면서 40℃에서 가열하였다. 생성된 슬러리를 실온까지 냉각하기 전에 열수 처리를 위해 6 내지 72시간(그러나 가장 일반적으로는 24시간) 동안 80 내지 130℃(가장 일반적으로는 100℃)까지 가열하였다. 슬러리를 부흐너 깔때기에서 여과하고, 탈이온수에 이어 에탄올로 세척하고, 실온에서 공기 건조하였다. 생성된 실리카 물질을 8시간에 걸쳐 실온으로부터 550℃까지의 느린 경사 온도를 이용하여 노에서 하소한 다음, 실온까지 냉각시키기 전에 550℃에서 추가 8시간 동안 유지하여 47 g의 메조다공성 실리카 입자를 얻었다.
교반 속도의 변화는 마이크로입자 종횡비의 변화를 가질 수 있다. 열수 온도 및 지속기간의 조건을 바꾸는 것은 메조다공성 물질에 대한 일반적인 기공 크기의 제어인자이다. 더 많은 정보에 대해서는, 문헌[J. Chem. Educ. 2017, 94, 9194] 및 여기서의 참고문헌을 참고한다.
최종 메조다공성 물질을 광학 현미경, Malvern Morphologi G3, 주사 전자 현미경(SEM), 열 중량 분석(TGA)으로 특성규명하였다.
2. 실리카 마이크로입자의 후-변형
실시예 2(a): 디에틸 에틸포스포네이트 기능화 마이크로입자
디에틸 에틸포스포네이트 기능화 실리카 마이크로입자를 일부 수정과 함께 문헌[New J. Chem., 2014, 38, 3853]에 보고된 변형된 방법으로 제조하였다. 디에틸포스파토에틸트리에톡시실란(4.15 mL, 13.03 mmol)을 300 mL의 톨루엔에 현탁된 2.0 g의 메조다공성 실리카 마이크로입자의 슬러리에 첨가하였다. 슬러리를 교반하고, 110℃에서 14시간 동안 환류시킨 후, 실온까지 냉각시키고 여과하였다. 입자를 탈이온수에 이어 에탄올로 세척한 다음, 100℃의 오븐에서 20시간 동안 건조하여 디에틸 에틸포스포네이트 기능화 입자를 수득하였다.
실시예 2(b): 에틸포스폰산 기능화 마이크로입자
에틸포스폰산 기능화 마이크로입자는 문헌[New J. Chem., 2014, 38, 3853]에 보고된 절차에 대한 변형된 방법으로 제조하였다. 트리메틸실릴클로로실란(1.388 mL, 10.86 mmol)을 150 mL의 톨루엔에 현탁된 2.0 g의 디에틸 에틸포스포네이트 기능화 마이크로입자의 슬러리에 첨가하고, 24시간 동안 110℃까지 가열하였다. 슬러리를 실온까지 냉각시킨 후 여과하고, 탈이온수 및 에탄올로 세척한 후, 100℃의 오븐에서 24시간 동안 건조하였다. 그 후, 메조다공성 실리카 입자를 100 mL의 12 M HCl에 현탁시키고, 18시간 동안 100℃까지 가열하였다. 슬러리를 실온까지 냉각시키고, 여과하고, 탈이온수 및 에탄올로 세척한 후, 100℃의 오븐에서 24시간 동안 건조하여 에틸포스폰산 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
실시예 2(c): 프로필아민 기능화 마이크로입자
프로필아민 기능화 마이크로입자는 문헌[Langmuir 2015, 31, 6457-6462]에 보고된 절차에 대한 변형된 방법으로 제조하였다. (3-아미노프로필)트리메톡시실란(3.05 ml, 19.54 mmol; APTMS, Sigma)을 시약 등급의 에탄올 150 mL 중 메조다공성 실리카 마이크로입자 3.0 g의 슬러리에 첨가하였다. 슬러리를 75℃에서 7시간 동안 환류시켰다. 실온까지 냉각시킨 후 슬러리를 여과하고, 입자를 탈이온수에 이어 에탄올로 세척한 다음, 100℃의 오븐에서 24시간 동안 건조하였다.
실시예 2(d): 비오틴 기능화 마이크로입자
(+)-비오틴 N-숙신이미딜 에스테르(246 mg, 0.720 mmol)를 10.0 mL의 pH 7.4 조정 PBS 완충액 중 1.0 g의 프로필아민 기능화 마이크로입자의 슬러리에 첨가하고 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 탈이온수 및 에탄올로 세척한 후, 100℃의 오븐에서 24시간 동안 건조하여 비오틴 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
실시예 2(e): 비오틴-PEG4 기능화 마이크로입자
PEG4-비오틴 N-하이드록시숙신이미드(106 mg, 0.180 mmol; ThermoFischer EZ-Link NHS-PEG4-비오틴)를 pH 7.4 조정된 PBS 완충액 2.5 mL 중 프로필아민-기능화 마이크로입자 0.25 g의 슬러리에 첨가하고, 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 탈이온수 및 에탄올로 세척한 후, 100℃의 오븐에서 24시간 동안 건조하여 비오틴-PEG4 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
실시예 2(f): 3(2-피리딜디티오)프로피온아미도)헥사노에이트 기능화 마이크로입자
숙신이미딜 6-(3(2-피리딜디티오)프로피온아미도)헥사노에이트(112 mg, 0.360 mmol; LC-SPDP, ThermoFischer)를 pH 7.4 조정 PBS 완충액 2.5 mL 중 프로필아민-기능화 마이크로입자 0.50 g의 슬러리에 첨가하고, 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 탈이온수 및 에탄올로 세척한 후, 100℃의 오븐에서 24시간 동안 건조하여 3(2-피리딜디티오)프로피온아미도)헥사노에이트 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
실시예 2(g): 4-옥소-4-(프로필아미노)부탄산 기능화 마이크로입자
무수 숙신산(4 g, 40.0 mmol)을 무수 DMF 중 프로필아민-기능화 마이크로입자 1.0 g의 슬러리에 첨가하고, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 탈이온수 및 에탄올로 세척한 후, 100℃의 오븐에서 24시간 동안 건조하여 4-옥소-4-(프로필아미노)부탄산 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
실시예 2(h): 프로필디에틸렌트리아민 기능화 마이크로입자
트리메톡시실릴프로필디에틸렌트리아민(1.678 mL, 6.51 mmol)을 1.0 g의 메조다공성 실리카 마이크로입자에 첨가하고, 150 mL의 시약 등급 에탄올에 현탁하였다. 슬러리를 75℃에서 7시간 동안 교반하였다. 실온까지 냉각한 후 슬러리를 여과하고, 입자를 탈이온수에 이어 에탄올로 세척한 다음, 100℃의 오븐에서 20시간 동안 건조하여, 프로필디에틸렌트리아민 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
실시예 2(i): 3-프로필디하이드로푸란-2,5-디온 기능화 마이크로입자(무수 숙신산)
3-(3-(트리에톡시실릴)프로필)디하이드로푸란-2,5-디온(4.94 mL, 17.37 mmol)을 300 mL의 톨루엔 중 3.0 g의 메조다공성 실리카 마이크로입자의 슬러리에 첨가하였다. 슬러리를 20시간 동안 110℃까지 가열한 후, 실온까지 냉각하고, 여과하고, 탈이온수 및 에탄올로 세척하였다. 기능화 마이크로입자를 100℃의 오븐에서 24시간 동안 건조하였다.
실시예 2(j): 분지형 폴리에틸렌이민 기능화 마이크로입자
폴리에틸렌이민(25.1 g, 47.0 mmol; 분지형, 평균 Mw 약 25,000, Sigma)을 600 mL의 무수 DMF에 용해시키고, 6.0 g의 3-프로필디하이드로푸란-2,5-디온 기능화 마이크로입자를 첨가하고, 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 입자를 탈이온수에 이어 에탄올로 세척한 다음, 100℃의 오븐에서 20시간 동안 건조하여, 분지형 폴리에틸렌이민 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
실시예 2(k): N,N,N-트리메틸프로판-1-암모늄 기능화 마이크로입자
트리메톡시실릴프로필트리메틸암모늄 클로라이드(3.61 mL, 6.51 mmol; 메탄올 중 50% 용액)를 150 mL 시약 에탄올 중 1.0 g의 메조다공성 실리카 마이크로입자의 슬러리에 첨가하고, 75℃까지 7시간 동안 가열하였다. 실온까지 냉각시킨 후 슬러리를 여과하고, 입자를 탈이온수에 이어 에탄올로 세척한 다음, 100℃의 오븐에서 20시간 동안 건조하여, N,N,N-트리메틸프로판-1-암모늄 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
다양한 비의 기능적 밀도에 영향을 미치기 위해 위의 절차를 다양한 비의 트리메톡시실릴프로필트리메틸암모늄 클로라이드 대 실리카 마이크로입자(마이크로입자 그램당 0.25 mmol의 트리메톡시실릴트리메틸암모늄 클로라이드)으로 반복하였다.
실시예 2(l): 옥틸 기능화 마이크로입자
트리에톡시(옥틸)실란(2.05 mL, 6.51 mmol)을 150 mL의 시약 에탄올 중 1.0 g의 메조다공성 실리카 마이크로입자의 슬러리에 첨가하고, 7시간 동안 75℃까지 가열하였다. 실온까지 냉각시킨 후 슬러리를 여과하고, 입자를 탈이온수에 이어 에탄올로 세척한 다음, 100℃의 오븐에서 20시간 동안 건조하여, 옥틸 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
실시예 2(m): 헥사데실 기능화 마이크로입자
헥사데실트리메톡시실란(2.54 mL, 6.51 mmol)을 150 mL의 시약 에탄올 중 1.0 g의 메조다공성 실리카 마이크로입자의 슬러리에 첨가하고, 7시간 동안 75℃까지 가열하였다. 실온까지 냉각한 후 슬러리를 여과하고, 입자를 탈이온수에 이어 에탄올로 세척한 다음, 100℃의 오븐에서 20시간 동안 건조하여, 헥사데실 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
실시예 2(n): 11-아지도운데실 기능화 마이크로입자
(11-아지도운데실)트리메톡시실란(1.0 g, 3.15 mmol)을 150 mL의 시약 에탄올 중 1.0 g의 메조다공성 실리카 마이크로입자의 슬러리에 첨가하고, 7시간 동안 75℃까지 가열하였다. 실온까지 냉각시킨 후 슬러리를 여과하고, 입자를 탈이온수에 이어 에탄올로 세척한 다음, 100℃의 오븐에서 20시간 동안 건조하여, 11-아지도운데실 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
실시예 2(o): 3-아지도프로필 기능화 마이크로입자
(3-아지도프로필)트리메톡시실란(1.0 g, 4.87 mmol)을 150 mL의 시약 에탄올 중 1.0 g의 메조다공성 실리카 마이크로입자의 슬러리에 첨가하고, 7시간 동안 75℃까지 가열하였다. 실온까지 냉각시킨 후 슬러리를 여과하고, 입자를 탈이온수에 이어 에탄올로 세척한 다음, 100℃의 오븐에서 20시간 동안 건조하여, 3-아지도프로필 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
실시예 2(p): 3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트리데카플루오로옥틸 기능화 마이크로입자
트리에톡시(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트리데카플루오로옥틸)실란(2.499 mL, 6.51 mmol)을 150 mL의 시약 에탄올 중 1.0 g의 메조다공성 실리카 마이크로입자의 슬러리에 첨가하고, 75℃까지 7시간 동안 가열하였다. 실온까지 냉각시킨 후 슬러리를 여과하고, 입자를 탈이온수에 이어 에탄올로 세척한 다음, 100℃의 오븐에서 20시간 동안 건조하여, 3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트리데카플루오로옥틸 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
실시예 B. 바이러스 결합에 대한 MSR 표면 변형 시험
MSP에 대한 렌티바이러스의 결합을 시험하기 위하여, 다양한 표면 화학을 사용하여 다양한 MSP를 제조하였다(도 1). 건조 MSR 배치를 빙냉 트리스-NaCl-EDTA 완충액 pH 7.5(NTE 완충액)에 10 mg/ml로 재현탁하였다. 렌티바이러스를 발현하는 녹색 형광 단백질(GFP)의 스톡 용액(FCT067, Kerafast)을 빙냉 NTE 완충액에 3x106/ml의 역가까지 희석하였다. MSR 현탁액 및 희석된 바이러스를 1:1 vol/vol의 비로 조합하고, 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 대조군 입자는 바이러스가 없는 NTE 완충액과 함께 1:1 vol/vol으로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 4℃에서 인산염 완충 식염수(PBS) 중 1%의 소 혈청 알부민(BSA)으로 1회, 이어서 4℃에서 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 샘플을 PBS 중 4.2%의 파라포름알데하이드로 고정하였다. 샘플을 바이러스 외피에 대한 항체(Kerafast의 항-VSV-G, 8G5F11; 1:50의 희석도)에 이어, Dylight-488로 표지된 항-마우스 IgG(Invitrogen)로 염색하였다. 샘플을 PBS로 2회 세척하고, GFP LED 라이트 큐브가 장착된 Evos 형광 현미경을 사용하여 이미지화하였다(도 2). 이미지화는 바이러스가 없는 MSR에 대한 염색 시약의 검출 가능한 결합을 나타내지 않았다. 바이러스-접합 막대는 다양한 수준의 정량적 결합을 나타내며, 트리메틸암모늄 및 아민 기능부는 최대 결합을 나타내었다.
실시예 C. MSR을 사용한 GFP 렌티바이러스를 이용한 T 세포 형질도입을 위한 시험관내 검정
T 세포의 바이러스 형질도입을 위한 MSR의 사용에 대한 도식적 표시를 도 3에 나타내었다. 나이브 인간 T 세포를 Dynabead T 세포 활성화제 비드로 3:1 비드:세포 비로 2일 동안 자극하였다. 자석을 사용하여 비드를 제거하고, 세포를 신선 배양 배지로 옮겼다. 바이러스-접합 MSR을 위에서 주목된 대로 제조하고, 세포 배양 배지에 80 μg/ml로 재현탁하였다. 이의 일련의 희석액을 도 3에 표시된 바와 같이 제조하였다. 이 현탁액을 5x105개/ml의 T 세포와 1:1로 조합하고, 4일 동안 인큐베이션하였다. GFP 발현은 배양 중 살아 있는 단일체 세포에서 평가하여 형질도입 효율을 평가하였다. 결과(도 4)는 MSR-접합 바이러스의 형질도입이 배양 배지에만 제공된 바이러스보다 높은 수준으로 발생했음을 표시한다. 트리메틸암모늄 기능화 MSR은 가장 높은 수준의 형질도입을 제공하였다.
실시예 D. CD3/CD28 효능적 항체, EGFRvIII 펩티드, 또는 BCMA 단백질을 제시하는 MSR과 T 세포의 상호작용;
표면-고정화 리간드가 있는 MSR은 문헌[Cheung, A. S., et al., Scaffolds that mimic antigen-presenting cells enable ex vivo expansion of primary T cells. Nature Biotechnology, 36(2), 160169]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 이 과정의 개략도를 도 5에 나타내었다.
간략하게, 1 mol%의 PE-비오틴과 POPC로 주로 이루어진 리포좀은 박막 재수화 방법 및 100 nm의 폴리카보네이트 막을 통한 압출을 사용하여 형성하였다. 하이드록실 기능화 MSR을 리포좀과 인큐베이션하여 MSR 표면에 지지된 지질 이중층을 형성할 수 있도록 하였다(도 6). MSR을 CD3 및 CD28 효능적 항체로 기능화하기 위하여, MSR을 PBS로 여러 차례 세척하고, 스트렙타비딘과 인큐베이션한 다음, 비오틴화 CD3 및 CD28 항체로 테더링하였다. EGFRvIII CAR-결합 펩티드의 MSR-고정화를 위하여, 비오틴화 EGFRvIII CAR-결합 펩티드를 사용하였다(도 7). BCMA CART 자극을 위하여, 재조합 BCMAFc 단백질을 비오틴-NHS를 사용하여 비오틴화하였고, MSR 표면에 유사하게 커플링하였다.
원하는 리간드와의 인큐베이션 후, MSR을 PBS로 여러 차례 세척하고, 다양한 농도로 배양 배지에 재현탁하고, T 세포와 인큐베이션하였다. T 세포 증식을 T 세포의 CFSE 표지화 및 유세포측정에 의한 염료 희석 평가를 사용하여 판독하였다. 사이토카인 생산을 다중 사이토카인 분석 방법(Mesoscale Delivery V-Plex)을 사용하여 평가하였다.
EGFRvIII CART는 MSR의 표면에 결합된 EGFRvIII CAR-결합 펩티드에 반응하여 인터페론 감마 및 IL-2를 생산한 반면, 용액 내 유리 EGFRvIII CAR-결합 펩티드, MSR에 제시된 비자극성 펩티드(OVA), 또는 아무것도 가미되지 않은 MSR은 CART로부터의 반응을 제공하지 않았다(도 8). 또 다른 실험에서, 세포 계수를 사용하여 다양한 자극에 반응하여 EGFRvIII CART의 증식을 모니터링하였다(도 9).
상이한 T 세포 하위세트의 표현형 증대를 추가로 분석하기 위하여, EGFRvIII CART의 증식을 유세포측정을 사용하여 평가하였다. CART를 CFSE로 염색하고 유세포측정에 의한 증식을 표시하는 염료 희석액을 모니터링하였다(도 10). MSR 표면에 존재하는 BCMAFc 단백질 항원으로 기능화된 MSR을 사용하여 유사한 실험을 수행하였다(도 11).
두 가지 유형의 MSR(자극 신호를 보유하는 MSR 및 렌티바이러스와 혼합된 MSR)을 사용하여 바이러스를 이용한 T 세포의 동시 자극 및 형질도입을 시험하기 위하여, 도 12에 나타낸 실험 도식을 사용하였다. MSR의 한 집단을 지질 이중층으로 코팅하고, 전술한 바와 같이 항-CD3/CD28 항체로 그래프팅하였다. MSR의 제2 집단은 렌티바이러스와 인큐베이션하였다. 도 13에 나타낸 결과는 T 세포가 항-CD3/CD28 효능적 항체로 자극되고 용액 중 유리 바이러스와 비교하여 PEI-MSR과 인큐베이션된 바이러스에 노출되었을 때 더 우수한 형질도입 수준을 표시하였다.
동일한 MSR 집단에 대한 두 신호 모두를 이용한 T 세포의 동시 자극 및 형질도입을 시험하기 위하여, T 세포를 (1) 항-CD3/CD28 효능적 항체-보유 지질-코팅 자극 MSR 및 배지 중 바이러스, (2) 항-CD3/CD28 효능적 항체-보유 지질-코팅 자극 MSR, 및 바이러스와 사전 인큐베이션된 PEI-MSR, 또는 (3) 항-CD3/CD28 효능적 항체가 흡착된 PEI MSR에 노출시킨 후, 바이러스와 인큐베이션하였다. 3일 배양 후, T 세포의 형질도입 효율을 평가하였다. 도 14는 다양한 양의 바이러스에서 상기 조건 (1) 및 (2)의 MSR에 대한 자극성 MSR 농도의 효과를 나타낸다. 도 14에 나타낸 바와 같이, PEI-MSR이 바이러스와 인큐베이션되는 조건 (2) 하에 전반적인 형질도입이 향상된다.
도 15는 조건 (1) 및 (2)가 최고 농도의 자극성 MSR에 있는 세 가지 조건을 모두 비교한다. 도 15에서 나타난 바와 같이, 자극 신호가 PEI-MSR에 결합된 조건 (3)이 가장 높은 상대 형질도입 효율을 생산한다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이용한 MSR-매개 형질도입을 연구하기 위해 동일한 제형물을 사용하였다. 도 16에서, 다양한 세포 집단의 형질도입을 바이러스 농도의 함수로서 조건 (1) 및 (2)에 대한 가장 높은 자극 수준에서 나타낸다. 도 17은 총 GFP+ 형질도입된 세포 분획, 및 조건 (1) 및 (2)에 대한 최고 수준의 자극에서 수집된 총 세포 집단에 존재하는 각 세포 집단의 비율을 나타낸다.
실시예 E. MSR 유도 T 세포 형질도입의 생체내 연구.
바이러스 벡터에 접합된 메조다공성 실리카 입자의 조성물을 마우스의 피부 아래에 주사한다. 대략 5 내지 7일 후, 항-마우스 CD19 CAR을 인코딩하는 바이러스가 흡착된 MSR을 이 부위에 주사한다. 항-CD19 CART가 생성되었다는 표시로서 마우스의 혈액에서 CD19+ B 세포의 고갈을 모니터링할 것이다. 이러한 CART의 존재는 혈액 및 골수에서 확인된다. 원치 않는 부위로의 바이러스의 누출을 평가하기 위하여 CAR 트랜스유전자에 대한 원 위치 혼성화를 사용하여, 주사 부위뿐만 아니라 배액 림프절, 비장 및 간의 상세한 조직학적 평가를 수행한다.
실시예 F. 메조다공성 실리카 마이크로입자 상으로의 약물 로딩
다양한 약물이 메조다공성 실리카 마이크로입자 상으로 로딩될 수 있다.
Figure pct00175
1. 실시예 1: 메조다공성 실리카 마이크로입자 상으로의 TLR7 효능제의 로딩.
클로로포름 중 이미퀴모드 용액을 2.0 mL의 클로로포름 중 100 mg의 실리카 마이크로입자의 슬러리에 첨가하고(메조다공성 실리카 입자 10 mg당 100 내지 500 μg의 이미퀴모드의 농도), 40℃에서 72시간 동안 500 rpm으로 진탕한다. MSP를 1000 rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 잔류 용액을 제거한다. MSP를 2.0 mL의 클로로포름으로 세척한 다음, 원심분리하고, 상청액을 제거한다. 에탄올을 이용한 세척 단계를 반복하여 과량의 흡수되지 않은 이미퀴모드를 제거한다. 최종 마이크로입자를 물에 슬러리화하고, 동결건조한다.
2. 실시예 2: 메조다공성 실리카 입자로부터의 시험관내 약물 방출.
10.0 mg의 약물-로딩 MSP(또는 300 μg의 약물-로딩 물질의 동등물)를 1.0 mL의 pH 7.4(0.0067 M) 인산염 완충액에 현탁하고, 37℃에 둔다. 샘플을 1시간, 3시간, 6시간, 24시간, 2일 및 5일에 수집한다; 이러한 샘플의 분석은 UPLC에 의해 수행하고, 표준 분석 곡선에 도시한다. 상청액을 제거하고, 각 시점에서 신선 완충액으로 교체한다.
전술한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 간주된다. 기탁된 구현예는 본 발명의 특정 양태만을 예시하도록 의도한 것이고, 기능적으로 동등한 임의의 작제물이 본 발명의 범위 내에 있기 때문에, 본 발명은 기탁된 작제물에 의해 범위가 제한되지 않는다. 본원의 물질의 기탁은 포함된 본원의 명세서가 최선의 방식을 포함하는 본 발명의 임의의 양태를 실시하도록 하기에 부적합하다는 인정을 구성하지 않으며, 청구항의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서도 안 된다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것 외에 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이고, 첨부된 청구항의 범위 내에 속할 것이다.
특정 문제 또는 상황에 본 발명의 교시를 적용하는 것은 본원에 포함된 교시에 비추어 당업자의 능력 내에 있을 것임을 이해해야 한다.
본 명세서의 각각의 모든 인용의 개시는 본원에 참조로 명시적으로 포함된다.
실시예 G. MSR 유도 CAR-T 생성의 생체내 연구
인간 T 세포 및 B 세포가 그래프팅된 마우스(인간 CD34+ 줄기 세포 인간화 마우스 또는 인간 말초 혈액 단핵 세포-주사 마우스)를 알려진 방법을 사용하여 확립한다. CAR19 렌티바이러스에 접합된 메조다공성 실리카 입자의 조성물을 마우스의 피부 아래에 주사하여 T 세포를 형질도입한다. MSR-CAR19 렌티바이러스 접합체로 처리된 마우스의 혈액에서 CAR19 발현 T 세포의 존재(항-CAR19 개별특이형 항체 염색 사용) 및 CD19+ B 세포의 고갈을 연속 혈액 수집 샘플에서 유세포측정을 사용하여 모니터링하고(제0일 주사 전 및 MSR-바이러스 주사 후 제1일에서 제21일 사이에 주 2회), 항-CD19 CART가 생성되었고 이의 표적을 사멸시키는 기능이 있음의 표시로서 MSR-GFP 렌티바이러스를 주사한 대조군 마우스와 비교한다. 인간 인터페론-감마 및 종양 괴사 인자 알파의 농도를, CD19 CAR T 세포 생성 및 활성화에 대한 제2 바이오마커와 동일한 혈액 샘플에서 결정한다. 원치 않는 부위로의 바이러스의 누출을 평가하고 이러한 부위로의 생성된 CAR19 T 세포의 수송을 연구하기 위하여 CAR 트랜스유전자에 대한 원 위치 혼성화를 사용하여, 주사 부위뿐만 아니라 림프절, 골수, 비장, 및 간의 상세한 조직학적 평가를 수행한다.
또 다른 실험에서, 인간 T 및 B 세포 함유 마우스에 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 CD19 발현 Nalm6 백혈병 종양을 정맥내 주사한다. 마우스 코호트는 T 세포를 형질도입하기 위하여 종양 주사 7일 전부터 7일 후까지 CAR19 또는 GFP 렌티바이러스에 접합된 메조다공성 실리카 입자 조성물의 단회 주사로 피부 하에 주사한다. 생성된 항-CD19 CART의 항-종양 효능을 연구하기 위하여 IVIS 이미지화에서 루시퍼라제 신호에 의해 Nalm6 종양 부담을 모니터링한다. MSR-CAR19 렌티바이러스 접합체로 처리된 마우스의 혈액에서 CAR19 발현 T 세포의 존재 및 CD19+ B 세포의 고갈을 연속 혈액 수집 샘플에서 모니터링하고(제0일 주사 전 및 MSR-바이러스 주사 후 제1일에서 제21일 사이에 주 2회), MSR-GFP 렌티바이러스를 주사한 대조군 마우스와 비교한다. 인간 인터페론-감마 및 종양 괴사 인자 알파의 농도를, CD19 CAR T 세포 생성 및 활성화에 대한 제2 바이오마커와 동일한 혈액 샘플에서 결정한다.
BCMA, CD20, CD22, CD123, EGFRvIII, CLL-1, 및 이의 (서로 및/또는 CD19와의) 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 다른 암/종양 표적에 대한 MSR-렌티바이러스 접합체를 사용하여 이러한 연구를 반복한다.
실시예 H: 접합된 바이러스 벡터 및 흡수된 세포 활성화제와 VEGF-C 및 MSR을 포함하는 크리오겔을 포함하는 조성물의 기능적 분석
실시예 1: VEGF-C의 생성
HEK 생산
GeneArt(Regensburg, Germany)에서 DNA를 합성하고, 제한효소-결찰 기반 클로닝 기술을 사용하여 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 단백질의 일시적 발현을 위해, 야생형 또는 조작된 변이체용 벡터를 폴리에틸렌이민(PEI; Cat# 24765 Polysciences, Inc.)을 사용하여 현탁-적응 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 이어서, 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하고 7일의 기간 동안 세포를 추가로 배양하여 작제물을 생산하여 배양 배지로 분비되도록 하였다.
이어서, 고정화 금속 이온 친화도 크로마토그래피(IMAC)를 사용하여 무세포 상청액으로부터 생산된 작제물을 정제하였다.
His-태그 단백질은 IMAC에 의해 포획하였다. 단백질이 용출되기 전에 수지를 세척하였다.
마지막으로, 용출된 분획을 크기 배제 크로마토그래피(응집체, 단량체 및 이량체의 분리를 허용함)를 사용하여 연마하였다. SDS-PAGE를 사용하여 정제 분석을 수행하고 분석적 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하여 응집 함량을 결정하였다.
[표 21]
HEK293T 세포주에서 VEGF-C 변이체의 생산 수율
Figure pct00176
CHO 생산
CHO MaKO 제조 발현 시스템을 사용하여 VEGF-C 변이체 8을 생산하였다. 표적 단백질을 인코딩하는 유전자를 플라스미드 발현 벡터에서 CMV 프로모터에 의해 구동되는 발현 카세트에 도입하였다. 벡터를 CHO MaKO 세포에 3개씩 형질감염시켰다. 각각의 형질감염에 대해, 0.5 μg의 플라스미드를 배지에서 생활성 세포로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 진탕 플라스크에서 낮은 농도의 엽산을 갖는 세포 배양 배지에 접종하였다. 세포는 가습 진탕 인큐베이터에서 성장시켰다. 형질감염 후 제3일에, 안정한 형질감염체에 대한 선택을 시작하였다. 세포는 선택 위기에 넣고 21일 내에 회수하였다. 그런 다음 선택된 안정한 풀의 바이알을 냉동하였다.
VEGF-C 변이체 8의 생산을 위해 유가식 접근을 사용하였다. 냉동된 세포의 바이알을 해동하였다. 해동으로부터의 회수 후, 세포를 진탕 플라스크의 생산 세포 배양 배지에 접종하였다. 배양물은 가습 진탕 인큐베이터에서 성장시켰다. 성장 온도는 배양 접종 후 제5일에 감소시켰다. 접종 후 제3일, 제4일, 제5일, 제6일, 제7일 및 제10일에 영양 용액을 첨가하였다. 접종 후 제11일에 배양물을 수확하였다. 세포를 원심분리 및 멸균 여과에 의해 세포 배양 배지로부터 분리하였다. 청정화된 세포 배양 상청액으로부터 표적 단백질을 정제하고 상기와 같이 특성규명하였다.
[표 22]
CHO MaKO 세포주에서 VEGF-C 변이체 8의 생산 수율
Figure pct00177
실시예 2: 크리오겔의 생성
알기네이트 접합은 이전에 기재된 프로토콜(Koshy et al. 2018)에 기반하여 제형화하였다.
노르보르넨 알기네이트(Alg-Nb)
Pronova UP MVG 알기네이트 1 g을 0.1 M 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 완충액 100 ml에 밤새 실온에서 계속 교반하면서 용해시켰다. 이어서 280 μl의 5-노르보르넨-2-메틸아민(노르보르넨)을 알기네이트 용액에 첨가하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 1464 mg 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 1085 mg을 각각 MES 완충액 20 ml에 용해시키고 알기네이트-노르보르넨 용액에 첨가하여 실온에서 24시간 동안 반응되게 하였다. 24시간 후, 용액을 각각의 농도에서 3시간 동안 순차적인 5 L 염조(7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0, 0, 0 g/L NaCl)에서 투석하였다. 그런 다음 용액을 두 번 여과하고(0.22 m 진공) 밤새 -80C에서 냉동하였다. 이어서 냉동된 용액을 5일 동안 동결건조하고 실험에 사용할 때까지 -20C에서 보관하였다.
테트라진 알기네이트(Alg-Tz)
Pronova UP MVG 알기네이트 1 g을 0.1 M 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 완충액에 밤새 실온에서 계속 교반하면서 용해시켰다. 이어서, 126 mg의 (4-(1,2,4,5- 테트라진-3-일)페닐 메탄아민 하이드로클로라이드(테트라진)를 알기네이트 용액에 첨가하였다. 1464 mg의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 1085 mg의 N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 각각 MES 완충액 20 ml에 용해시키고 알기네이트-테트라진 용액에 첨가하여 실온에서 24시간 동안 반응되게 하였다. 24시간 후 하이드록실아민 311 mg으로 30분 동안 용액을 켄칭하고 10분 동안 최대 RPM에서 원심분리하였다. 이어서 용액을 여과하고(0.22 uM 필터) 각각의 농도에서 3시간 동안 순차적인 5 L 염욕(7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0, 0, 0 g/L NaCl)에서 투석하였다. 그 후 용액을 2회 여과하고(0.22 uM 필터) -80C에서 밤새 냉동하였다. 이어서 냉동된 용액을 5일 동안 동결건조하고 실험에 사용할 때까지 -20C에서 보관하였다.
크리오겔 제형물(도 21a)
Alg-Tz 및 Alg-Nb를 Thermomixer(37C, 2000 rpm)로 1시간 동안 20 mg/ml로 DIH2O 중에 용해시켰다. 별도로, 라포나이트를 실온에서 일정하게 혼합하면서 DI-H2O에 5 mg/ml 농도로 1시간 동안 용해시켰다. 그런 다음 용액을 멸균 조건 하에 여과하였다(0.22 uM 필터). VEGF-C(3 mg/ml 스톡) 및 라포나이트(Laponite XLG)(5 mg/ml 스톡) 용액을 실온에서 1시간 동안 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 Alg-Tz 용액 및 Alg-Nb 용액을 1:1 비로 첨가하고 최종 농도 10 mg/ml(라포나이트의 최종 농도 0.25 mg/ml, 10 μg VEGF-C/겔)로 희석하였다. 50 ul의 혼합물을 PEEK 주형에 즉시 피펫팅하고 밤새 -20C에서 냉동하였다. 주사 전에 겔을 주형에서 실온에서 해동한 다음 16ga 주사기 바늘에 넣었다. 그런 다음 겔이 있는 바늘을 100 ul의 멸균 PBS가 있는 1 ml 주사기에 넣었다.
실시예 3: VEGF-C 방출 분석
알기네이트 크리오겔로부터의 시험관내 VEGF-C 방출 분석(도 21)
VEGF-C 크리오겔(10 μg 단백질 + 0.25 mg/ml 라포나이트)을 1 ml의 방출 완충액(PBS 중 1% BSA 용액)에서 37C에서 인큐베이션하였다. 방출 완충액은 실험에 걸쳐 다양한 시점에 완전히 제거하고 교체하였다. 방출 완충액의 샘플은 VEGF-C ELISA에서 사용하기 위해 해동할 때까지 -80C에서 보관하였다.
실시예 4: MSR 합성
폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(프로필렌 글리콜)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) 평균 Mn 약 5,800(Pluronic P-123, 80.0 g, 487 mmol; Sigma) 계면활성제를 실온에서 3 L의 1.6 M HCl에 용해시키고, 5 L 재킷형 플라스크에서 40C까지 가열하고 오버헤드 교반기를 통해 0 내지 600 rpm의 속도로 기계적으로 교반하였다. 테트라에틸 오르소실리케이트(TEOS, 184 mL, 826 mmol; Sigma)를 5분 미만에 걸쳐 한 번에 첨가하고 적어도 2시간 동안, 그러나 가장 일반적으로 20시간 동안 교반하면서 40C에서 가열하였다. 생성된 슬러리를 실온까지 냉각시키기 전에 열수 처리를 위해 6 내지 72시간 동안 80 내지 130C까지 가열하였다. 슬러리를 부흐너 깔때기에서 여과하고, 탈이온수에 이어 에탄올로 세척하고, 실온에서 공기 건조하였다. 생성된 실리카 물질을 8시간에 걸쳐 실온으로부터 550C까지의 느린 경사 온도를 이용하여 노에서 하소한 다음, 실온까지 냉각시키기 전에 550C에서 추가 8시간 동안 유지하여 47 g의 메조다공성 실리카 입자를 얻었다.
교반 속도의 변화는 마이크로입자 종횡비의 변화를 가질 수 있다. 열수 온도 및 지속기간의 조건을 바꾸는 것은 메조다공성 물질에 대한 일반적인 기공 크기의 제어인자이다.
최종 메조다공성 물질을 광학 현미경, Malvern Morphologi G3, 주사 전자 현미경(SEM), 열 중량 분석(TGA)으로 특성규명하였다.
N,N,N-트리메틸프로판-1-암모늄 기능화 마이크로입자
트리메톡시실릴프로필트리메틸암모늄 클로라이드(3.61 mL, 6.51 mmol; 메탄올 중 50% 용액)를 150 mL 시약 에탄올 중 1.0 g의 메조다공성 실리카 마이크로입자의 슬러리에 첨가하고, 75℃까지 7시간 동안 가열하였다. 실온까지 냉각한 후 슬러리를 여과하고 입자를 탈이온수에 이어 에탄올로 세척한 다음 100℃의 오븐에서 20시간 동안 건조하여 본원에서 "트리메틸암모늄 MSR"로 지칭되는 N,N,N-트리메틸프로판-1-암모늄 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
MSR 크기 감소
스톡 MSR 변이체는 합성 후 길이가 대략 100 내지 200 μm였다. 28.5ga 인슐린 주사기를 통한 주입성을 개선하기 위해 건조 MSR을 MP FastPrep-24 5G 비드 비팅 그라인더 및 용해 시스템에서 80초 동안 균질화하였다(도 30). 그런 다음 MSR을 오토클레이브하고 실험에 사용할 때까지 실온에서 보관하였다.
MSR로의 렌티바이러스 로딩 및 복합체의 특성규명
균질화 MSR 배치를 빙냉 트리스-NaCl-EDTA 완충액 pH 7.5(NTE 완충액)에 10 mg/ml로 재현탁하였다. 원하는 렌티바이러스 스톡을 로딩을 위해 원하는 총 형질도입 단위(TU) 양으로 빙냉 NTE 완충액에서 희석하였다. MSR 현탁액 및 희석된 바이러스를 1:1 vol/vol의 비로 조합하고, 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 기능적 시험관내 시험 또는 생체내 사용 전에 과량의 바이러스를 제거하기 위해 과량의 DPBS에서 적어도 두 번의 세척 단계를 수행하였다. 로딩 및 보유 연구(도 27 내지 도 28)를 위해, 2.5 mg/ml MSR 현탁액을 도면에 표시된 양의 바이러스를 함유하는 용액과 1:1로 혼합하고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. MSR에 결합되고 MSR에서 방출되는 로딩 용액의 바이러스 양은 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 정량하였다. 방출 연구를 위해 MSR-렌티바이러스 복합체를 배지에서 37C에서 인큐베이션하고 상청액을 qPCR 분석을 위해 표시된 시점에 수집하였다.
생체내 사용을 위한 바이러스 및 스타터를 이용한 MSR 로딩
작제물 2(표 20, 도 48a 내지 도 48b) 및 트리메틸암모늄 MSR을 공동-인큐베이션하여 세포 활성화제가 MSR 표면에 흡착되도록 하였다. 작제물 2를 8 mg/ml 트리메틸암모늄 MSR 현탁액 1에 첨가하고 4C에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 로딩된 MSR을 3회 세척하고 최종 농도 15 mg/ml MSR로 DPBS에 재현탁하였다.
CD19 CAR(CAR19로도 지칭됨) 인코딩 렌티바이러스를 함유하는 NTE 완충액을 10 mg/ml 트리메틸암모늄 MSR 현탁액과 혼합하고 4C에서 30분 동안 인큐베이션하였다. MSR을 2회 세척하고 최종 농도 15 mg/ml MSR로 DPBS에 재현탁하였다.
마지막으로 MSR을 위아래로 힘차게 피펫팅하고 인슐린 주사기에 다시 로딩한 다음 마우스에 즉시 피내 주사하였다.
실시예 5: 세포의 형질도입 및 기능 시험
시험관내 T 세포 형질도입
인간 T 세포는 Miltenyi Human Pan T 세포 단리 키트를 사용하여 류코팩(leukopak)으로부터 단리하고 사용하기 전까지 냉동하였다. 세포를 해동하고 포맷 4 작제물의 존재 하에 완전 OpTmizer 배지에 플레이팅 하였다(표 20, 도 48a 내지 도 48b). 유리 바이러스 또는 MSR-바이러스 복합체로서 CD19 CAR(CAR19로도 지칭됨) 인코딩 바이러스를 배양물에 첨가한 후, 하루 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 특성규명 및 기능 시험에 사용하기 전에 추가 3일 동안 플레이팅하였다(도 29 내지 도 30).
CAR T 세포 특성규명 및 기능 시험( 도 29 )
CAR T 세포는 PE에 접합된 CD19 CAR 항-개별특이형 항체를 이용한 염색 및 유세포측정에 의한 분석에 의해 CAR 수용체의 발현에 대해 분석하였다. Nalm6(RRID: CVCL_0092)은 인간 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 세포주이다. 세포는 10% 태아 소 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 성장시켰고 둘 모두 현탁 성장시켰다. 세포를 루시퍼라제(Nalm6-Luc)를 발현하도록 변형하여, 공동 배양에서의 이의 존재가 루시퍼라제 신호에 의해 평가될 수 있도록 하였다. Nalm6-Luc 세포는 MSR-바이러스 복합체의 유리 바이러스를 사용하여 생산된 CD19-CART와 다양한 세포 비로 공동 배양하였다(도 29). 1일 공동 배양 종료 시 루시퍼라제 신호를 사용하여 CART에 의해 사멸된 투입 Nalm6의 백분율을 계산하였다. 공동 배양 종료 시 상청액의 인터페론-감마 수준을 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 정량하였다.
실시예 6: 결과 분석
튜브 검정( 도 20 )
인간 진피 림프 내피 세포(HDLEC)를 접종(p0) 실험을 위해 p4 또는 충분한 세포를 얻을 때까지 75% 융합성에서 계대하였다. 그런 다음 1 ml를 에펜도르프 튜브에 분취하고 600 μg의 VEGF-C 단백질로 처리하여 볼텍싱하였다. 각각의 처리를 6웰 플레이트의 가온 배지에 첨가하고 37C(5% CO2)에서 밤새 인큐베이션하였다. 이미징 분석을 위해 세포를 세척한 다음 3.7% 포르말린-0.05% Triton X-100 용액(고정 완충액)으로 고정한 다음 세척하고 0.1% Triton X-100 용액(투과화 완충액)으로 코팅하였다. PBS로 2회 세척한 후 세포를 1% BSA 용액 중 0.05% Triton X-100(차단 완충액)으로 코팅하였다. DAPI 및 팔로이딘 염색은 알려진 프로토콜에 따라 수행하였다. 염색 후 세포를 PBS로 2회 세척하고 이미지화하였다.
증식 검정( 도 20 )
WST-8 배지는 WST-8 용액을 MV 배지에 1:10으로 희석하여 제조하였다. 배양 배지를 제거하고 세포를 WST-8 배지에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배지를 각각의 웰로부터 3개씩 제거하고 96웰 플레이트에 첨가하였다. 분광광도계를 사용하여 450 nm에서 각각의 웰의 흡광도를 판독하였다.
생체내 실험 후 조직 처리
마우스로부터 조직을 수확하고, 칭량하고, 가위로 아주 미세한 단편으로 잘랐다. 그런 다음 샘플을 콜라게나제 4 및 DNAse 1을 함유하는 분해 배지에서 일정하게 교반하면서 효소적으로 분해하였다. 그런 다음 샘플을 위아래로 피펫팅하였다. 피펫팅 후, 콜라게나제 D 및 DNAse 1을 함유하는 분해 배지를 샘플에 첨가하였다. 샘플을 3주기 동안 위아래로 피펫팅하였다. EDTA를 첨가하고(5 mM) 세포를 70 μm 필터 및 40 uM 메쉬를 통해 여과하여 Fc 차단 완충액에 재현탁하였다. FACS 분석을 위해 세포를 세척하고 염색하였다.
H&E 및 ISH 염색( 도 32 내지 도 33 )
부검 시 피부/크리오겔 조직, 인접한 피부 및 배액 림프절을 수집하고 10% 중성 완충 포르말린에 침지 고정하고 파라핀 처리하였다. 절편은 조직학적 평가를 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. CAR 전사체뿐만 아니라 Hs-PPIB(양성 대조군 및 조직 품질 대조군) 및 DAPB(음성 대조군) 유전자를 검출하기 위한 원 위치 혼성화를 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 절편에서 수행하였다. 양성 PPIB 및 음성 DAPB 대조군 프로브 세트를 포함하여 각각 전처리를 최적화하고 mRNA 품질 및 특이성을 보장한다. 혼성화 방법은 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 발색원을 사용하는 알려진 프로토콜을 따랐다. 간략하게, 5 μm 두께의 조직 절편을 유리 슬라이드에 놓고 60 분 동안 소상한 후 혼성화에 사용하였다. 염색기를 사용하여 파라핀 제거 및 재수화 프로토콜을 수행하였다. 1X 복원 완충액(retrieval buffer)에서 오프라인 수동 전처리를 수행하였다. 최적화는 먼저 PPIB 및 DAPB 혼성화 신호를 평가한 다음 모든 슬라이드에 대해 동일한 조건을 사용하여 수행하였다. 전처리 후 슬라이드를 자동염색기로 옮겨 프로테아제 전처리; 혼성화 후 증폭; 그리고 HRP 및 헤마톡실린 카운터 염색을 이용한 검출을 포함하는 혼성화 절차를 완료하였다. 슬라이드는 슬라이드 스캐너 및 포착된 대표적 이미지를 사용하여 디지털화하였다.
추가 결과
10 μg의 상이한 VEGF-C 작제물을 함유하는 크리오겔(0.25 mg/ml 라포나이트)을 제0일에 마우스(N=5/군) 진피에 표면으로 주사하였다. 제14일에 마우스를 안락사시키고 피부/크리오겔(조합)을 분해 및 FACS 분석을 위해 절제하였다. LEC(CD31+, PDPN+)의 대표적 FACS 그래프는 FSC-A/SSC-A 및 CD45-에 사전 관문화한다(도 22).
도 23의 결과는 VEGF-C의 전달을 포함한다. 마우스에 앞서 언급된 바와 같이 합성된 VEGF-C(N=12) 또는 블랭크 크리오겔(N=10)을 주사하였다. 마우스의 피부/겔을 제7일, 제14일 및 제21일 시점에 수확하고, 분해하고, FACS를 위해 염색하였다. LEC는 CD45- CD31+ PDPN+에서 관문화하였다. BEC는 CD45- CD31+ PDPN-에서 관문화하였다. CD4 및 CD8 T 세포는 CD45+ CD11b- CD11c- Thy1+에서 관문화하였다.
도 25a에서 C57Bl6 마우스에 VEGF-C 크리오겔(N=5) 또는 블랭크 크리오겔(N=5)을 주사하고 제14일에 림프관신생을 평가하였다. 또한 NSG 마우스에 VEGF-C 크리오겔(N=5)을 주사하여 면역적격 마우스(C57Bl6) 및 면역손상 마우스(NSG) 사이의 LEG 증식을 비교하였다. 도 25b의 경우, NSG 마우스에 VEGF-C 크리오겔(N=5) 또는 블랭크 크리오겔(N=5)을 제0일에 주사하였다. 제10일에 모든 마우스에 측면 꼬리 정맥을 통해 PBMC를 주사하였다. PBMC 주사 7일 후 분해 및 FACS 분석을 위해 피부/겔 조직을 수집하였다. LEC는 인간 CD45- 마우스 CD11b- 마우스 CD31+ 마우스 PDPN+로부터 관문화하였다. CD4 및 CD8 T 세포는 인간 CD45+ 마우스 CD11b- 인간 CD3+로부터 관문화하였다. B 세포는 인간 CD45+ 마우스 CD11b- 인간 CD3- 인간 CD19+로부터 관문화하였다.
도 34에서, NSG 마우스(N=45)에 꼬리 정맥 주사를 통해 제0일에 VEGF-C 크리오겔을 주사하고 제10일에 PBMC를 주사하였다. 제17일에 마우스에 1) PBS(N=총 15개/종결점 FACS 분석을 위해 5개), 2) 작제물 2를 갖는 MSR(15 mg/ml MSR 동등물 10 μl 주사)에 이어서 유리 CD19 CAR 인코딩 렌티바이러스(스타터 주사 1시간 후 4.26e6 TU의 바이러스를 함유하는 10 μl 주사)(N=총 15개/종결점 FACS 분석을 위해 6개) 또는 3) 작제물 2를 갖는 MSR과 1:1로 혼합된 MSR 결합 CD19 CAR 인코딩 렌티바이러스(15 mg/ml MSR의 20 ul 단회 주사)(N=총 15개/종결점 FACS 분석을 위해 5개) 중 하나를 피내 주사하였다. 제14일에, 3 또는 4마리 마우스군의 마우스를 안락사시키고 피부/겔 영역에서 림프관신생을 분석한 반면, 제20일 및 제35일에 마우스를 안락사시키고 조직학적 분석을 위해 피부/겔 및 비장을 수집하여 국소 및 전신 형질도입된 세포를 확인하였다(N=3/군/시점). 순환 CD19 CAR+ 세포(D25, 30, 35)의 FACS 분석을 위해 마우스를 주기적으로 채혈하였다. 마지막으로, CART 증대 및 B 세포 고갈을 확인하기 위해 제35일에 피부/겔 및 비장의 FACS 분석을 위해 마우스를 안락사시켰다.
실시예 I: 생체내 CART 제조의 기능적 분석
개요
이 실시예는 림프관신생을 유도하고/하거나 T 세포, 예를 들어 나이브 T 세포를 유인하기 위해 세포 동원 인자의 편재된 전달을 수반하는 생체내 CART 제조 과정을 기재하며, 이는 후속적으로 활성화되고 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입되어 생체내 기능적 CART 세포를 생성할 수 있다(도 18). 일부 구현예에서, 대상체에 크리오겔을 통해 세포 동원 인자를(예를 들어, 국소적으로) 투여하며, 세포 동원 인자는 VEGF-C(예를 들어, 서방성 VEGF-C 단백질 크리오겔 제형물)이다. 이론에 구애됨이 없이, VEGF-C의 방출은 기존 피부 림프 모세관의 림프관신생을 유도하여 림프 내피 세포(LEC)를 활성화한다. 활성화된 LEC는 CCL21과 같은 케모카인을 분비하며, 이는 다시 면역 세포, 예를 들어 나이브 T 세포를 투여 부위, 예를 들어 겔 상단의 진피 부위로 동원한다. 일부 구현예에서, 7 내지 21일, 예를 들어 14일의 기간 후, 대상체에 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터 및 메조다공성 실리카 막대(MSR)에 의해 전달되는 세포 활성화제를 생체내 T 세포의 형질도입 및 CART 세포의 생성을 위해 투여한다(예를 들어, 국소적으로). 이론에 구애됨이 없이, 예를 들어 항-CD3/항-CD28(예를 들어, 이중특이적 항체)을 사용하는 간략한 CD3 및 CD28 활성화는 T 세포의 효율적인 형질도입을 촉진한다. 이론에 구애됨이 없이, 일부 구현예에서, 이러한 형질도입된 T 세포는 피부 림프관, 림프절 및 흉관을 통해 전신 순환으로 돌아갈 것이고 종양 항원에 반응하여 더 증대될 것이다.
실시예 1: VEGF-C 단백질 및 기능적 변이체의 생성 및 특성규명
이 실시예는 VEGF-C 및 이의 기능적 변이체를 포함하는 다양한 세포 동원 인자의 생성 및 특성규명을 기재한다. 이 실시예에 기재된 세포 동원 인자는 예를 들어 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터의 투여 전에 대상체의 부위에서 림프관신생을 촉진하기 위해 크리오겔에서 사용될 수 있다.
도 19a에 나타낸 바와 같이, VEGF-C는 천연 및 변형된 형태로 존재할 수 있다. 미성숙 VEGF-C(도 19a, #1)는 전형적으로 N-말단 및 C-말단 프로펩티드 서열과 함께 세포내에서 발견된다. 일단 방출되면, VEGF-C 단백질은 단백분해 절단을 겪고 이량체 또는 단량체인 메이저 또는 마이너 성숙 형태로서 세포외 공간에 존재한다(각각 도 19a, #2(SEQ ID NO: 731) 또는 #7(SEQ ID NO: 733)). VEGF-C의 메이저 성숙(도 19a, #9(SEQ ID NO: 737)) 및 마이너 성숙(도 19a, #8(SEQ ID NO: 735)) 형태의 안정화된 이량체는 서열로 C137A 돌연변이를 삽입하여 조작하였다. VEGF-C의 메이저 성숙 형태와 비교할 때, 마이너 성숙 형태는 마이너 성숙 형태의 N-말단에 추가의 짧은 프로펩티드 서열(TEETIKFAA(SEQ ID NO: 740))을 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, 일부 구현예에서, 이 추가의 짧은 프로펩티드는 HEK293T 및 CHO MaKo 세포 둘 모두에서 이량체 형성뿐만 아니라 단백질 발현을 늘린다.
VEGF-C 단백질 및 기능적 변이체의 HEK 생산
GeneArt(Regensburg, Germany)에서 DNA를 합성하고, 제한효소-결찰 기반 클로닝 기술을 사용하여 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 단백질의 일시적 발현을 위해, 야생형 또는 조작된 변이체용 벡터를 폴리에틸렌이민(PEI; Cat# 24765 Polysciences, Inc.)을 사용하여 현탁-적응 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 이어서, 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하고 7일의 기간 동안 세포를 추가로 배양하여 작제물을 생산하여 배양 배지로 분비되도록 하였다. 이어서, 고정화 금속 이온 친화도 크로마토그래피(IMAC)를 사용하여 무세포 상청액으로부터 생산된 작제물을 정제하였다. His-태그 단백질은 IMAC에 의해 포획하였다. 단백질이 용출되기 전에 수지를 세척하였다. 마지막으로 용출 분획을 크기 배제 크로마토그래피(응집체, 단량체 및 이량체의 분리 허용)를 사용하여 연마하였다. 환원 및 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE(도 19b 내지 도 19c)를 사용하여 정제 분석을 수행하고, 분석용 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하여 응집 함량을 결정하였다.
도 19b 내지 도 19c에 나타낸 바와 같이, 전장 프로펩티드(도 19a, #1(SEQ ID NO: 727))를 갖는 미성숙 VEGF-C가 이량체(웰 2 및 3)로서 생산되었고, 프로펩티드의 제거는 2개의 메이저 성숙 VEGF-C 형태(#2(SEQ ID NO: 731)), 하나의 비공유 이량체 형태(웰 5, 6) 및 단량체 형태(웰 8, 9)의 생산을 야기하였다. 짧은 N-말단 프로펩티드는 단백질에 부착된 채 남겨져 비공유 이량체(웰 11, 12) 또는 단량체 형태(웰 15, 16)의 마이너 성숙 야생형 VEGF-C 형태(#7(SEQ ID NO: 733))를 생성하였다. 돌연변이 C137A를 VEGF-C의 #2 메이저 성숙 형태에 부가하여 VEGF-C의 돌연변이(SEQ ID NO: 737)를 갖는 #9 메이저 성숙 형태를 생산함으로써 공유 이량체(웰 21, 22) 및 단량체 형태(웰 24, 25)의 생산을 야기하였다. C137A 돌연변이를 #7 마이너 성숙 VEGF-C 형태로 도입하여 VEGF-C의 돌연변이 형태(SEQ ID NO: 735)를 갖는 #8 마이너 성숙 형태를 생산함으로써 VEGF-C 이량체(웰스 18,19)의 검출 가능한 생산만 야기하였다. 이론에 구애됨이 없이, 일부 구현예에서, VEGF-C의 돌연변이 형태(SEQ ID NO: 736 또는 735)를 갖는 이 #8 마이너 성숙 형태는 대규모 생산에 적합할 수 있다.
HEK 세포를 사용한 전체 생산 수율을 계산하고 표 21에 요약하였다.
[표 21]
HEK293T 세포주에서 VEGF-C 변이체의 생산 수율
Figure pct00178
VEGF-C #8 마이너 성숙 변이체의 CHO 생산
이어서 MaKO 제조 발현 시스템을 사용하여 VEGF-C 변이체 #8(돌연변이를 갖는 마이너 성숙 형태, SEQ ID NO: 736 또는 735)을 생산하였다. 표적 단백질을 인코딩하는 유전자를 플라스미드 발현 벡터에서 CMV 프로모터에 의해 구동되는 발현 카세트에 도입하였다. 벡터를 CHO MaKO 세포에 3개씩 형질감염시켰다. 각각의 형질감염에 대해, 0.5 μg의 플라스미드를 배지에서 생활성 세포로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 진탕 플라스크에서 낮은 농도의 엽산을 갖는 세포 배양 배지에 접종하였다. 세포는 가습 진탕 인큐베이터에서 성장시켰다. 형질감염 후 제3일에, 안정한 형질감염체에 대한 선택을 시작하였다. 세포를 선택 위기에 넣고 21일 내에 회수하였다. 그런 다음 선택된 안정한 풀의 바이알을 냉동하였다.
VEGF-C 변이체 #8(돌연변이가 있는 마이너 성숙 형태, SEQ ID NO: 736 또는 735)의 생산을 위해, 유가식 접근을 사용하였다. 냉동된 세포의 바이알을 해동하였다. 해동으로부터의 회수 후, 세포를 진탕 플라스크의 생산 세포 배양 배지에 접종하였다. 배양물은 가습 진탕 인큐베이터에서 성장시켰다. 성장 온도는 배양 접종 후 제5일에 감소시켰다. 접종 후 제3일, 제4일, 제5일, 제6일, 제7일 및 제10일에 영양 용액을 첨가하였다. 접종 후 제11일에 배양물을 수확하였다. 세포를 원심분리 및 멸균 여과에 의해 세포 배양 배지로부터 분리하였다. 청정화된 세포 배양 상청액으로부터 표적 단백질을 정제하고 상기와 같이 특성규명하였다. VEGF-C 변이체 #8(돌연변이를 갖는 마이너 성숙 형태, SEQ ID NO: 736 또는 735)의 생산 수율을 표 22에 요약한다.
[표 22]
CHO MaKO 세포주에서 VEGF-C 변이체 8의 생산 수율
Figure pct00179
VEGF-C의 시험관내 활성 조사
VEGF-C 및 위에서 생산된 변이체 형태의 시험관내 생물학적 활성을 조사하였다. 발아 및 증식을 포함하는 인간 진피 림프 내피 세포(HDLEC)에 대한 VEGF-C의 영향(도 20a 내지 도 20c)을 측정하였다. 이 실시예에서 조사된 다양한 VEGF-C 변이체는 전장 프로펩티드를 갖는 미성숙 VEGF-C(#1); 단량체(2M) 또는 이량체(2D)로서의 메이저 성숙 형태 #2; 단량체(7M) 또는 이량체(7D)로서의 마이너 성숙 형태 #7; 단량체(9M) 또는 이량체(9D)로서의 돌연변이(C137A)를 갖는 메이저 성숙 형태 #9; 및 단량체(8M) 또는 이량체(8D)로서의 돌연변이(C137A)를 갖는 마이너 성숙 형태 #8을 포함한다.
VEGF-C 변이체의 생물학적 활성을 시험하기 위한 HDLEC에 대한 시험관내 발아 검정의 실험 설정의 개요를 도 20a에 나타낸다. HDLEC를 먼저 접종하고(p0) 실험을 위해 p4 또는 충분한 세포가 얻어질 때까지 75% 융합성에서 계대하였다. 그런 다음 약 1 mL의 HDLEC를 에펜도르프 튜브에 분취하고 600 μg의 VEGF-C 단백질로 처리하여 볼텍싱하였다. 각각의 처리를 6웰 플레이트의 가온 배지에 첨가하고 37C(5% CO2)에서 밤새 인큐베이션하였다. 이미징 분석을 위해 세포를 세척한 후 3.7% 포르말린-0.05% Triton X-100 용액(고정 완충액)으로 고정한 다음 세척하고 0.1% Triton X-100 용액(투과화 완충액)으로 코팅하였다. PBS로 2회 세척한 후, 세포를 1% BSA 용액(차단 완충액) 중 0.05% Triton X-100으로 코팅하였다. DAPI 및 팔로이딘 염색은 알려진 프로토콜에 따라 수행하였다. 팔로이딘 염색 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 튜브 형성에 대해 이미지화하였다.
증식을 측정하기 위해 WST-8 검정을 수행하였으며(도 20b), WST-8 용액을 MV 배지에 1:10으로 희석하여 WST-8 배지를 먼저 제조하였다. 배양 배지를 제거하고 세포를 WST-8 배지에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배지를 각각의 웰로부터 3개씩 제거하고 96웰 플레이트에 첨가하였다. 분광광도계를 사용하여 450 nm에서 각각의 웰의 흡광도를 판독하였다.
도 20b에 나타낸 바와 같이, 모든 VEGF-C 성숙 형태(야생형 또는 돌연변이체 메이저 및 마이너 성숙 형태)는 HDLEC의 유사한 수준의 증식을 야기하였고, 이는 전장 프로펩티드를 갖는 미성숙 VEGF-C(#1)와 인큐베이션된 HDLEC의 증식에 비해 개선되었다. 도 20c에 나타낸 바와 같이, 관 형성 이미지는 야생형(각각 #2 및 #7)이거나 C137A 돌연변이(각각 #9 및 #8)를 포함하는 메이저 및 마이너 성숙 형태가 미성숙 형태(#1)보다 HDLEC의 발아를 더 잘 자극함을 나타낸다. 또한, 다양한 VEGF-C 형태의 이량체 형태(D)는 우수한 시험관내 활성을 실증하는 것으로 나타났다(도 20b 내지 도 20c). 이론에 구애됨이 없이, 일부 구현예에서, 야생형(각각 #2D 및 #7D)이거나 C137A 돌연변이(각각 #9D 및 #8D)를 포함하는 메이저 및 마이너 성숙 형태의 이량체 형태는 단량체 형태와 비교하여 향상된 발아 활성을 포함한다.
실시예 2: VEGF-C를 함유하는 크리오겔의 생성 및 특성규명
VEGF-C 또는 기능적 변이체를 함유하는 크리오겔을 생성하고 조사하였다. VEGF-C의 느리고 보다 제어되는 방출을 초래하기 위해 라포나이트를 크리오겔 형성물에 첨가하였다.
크리오겔을 형성하기 위해, 이전에 기재된 프로토콜(Koshy et al., Acta Biomater. 2018 Jan;65:36-43)에 기반하여 알기네이트 접합체를 제형화하고 혼합하였다.
노르보르넨 알기네이트(Alg-Nb)
Pronova UP MVG 알기네이트 1 g을 0.1 M 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 완충액 100 ml에 밤새 실온에서 계속 교반하면서 용해시켰다. 이어서 280 μl의 5-노르보르넨-2-메틸아민(노르보르넨)을 알기네이트 용액에 첨가하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 1464 mg 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 1085 mg을 각각 MES 완충액 20 ml에 용해시키고 알기네이트-노르보르넨 용액에 첨가하여 실온에서 24시간 동안 반응되게 하였다. 24시간 후, 용액을 각각의 농도에서 3시간 동안 순차적인 5 L 염조(7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0, 0, 0 g/L NaCl)에서 투석하였다. 그런 다음 용액을 두 번 여과하고(0.22 m 진공) 밤새 -80℃에서 냉동하였다. 이어서 냉동된 용액을 5일 동안 동결건조하고 실험에 사용할 때까지 -20C에서 보관하였다.
테트라진 알기네이트(Alg-Tz)
Pronova UP MVG 알기네이트 1 g을 0.1 M 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 완충액에 밤새 실온에서 계속 교반하면서 용해시켰다. 이어서, 126 mg의 (4-(1,2,4,5- 테트라진-3-일)페닐 메탄아민 하이드로클로라이드(테트라진)를 알기네이트 용액에 첨가하였다. 1464 mg의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 1085 mg의 N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 각각 MES 완충액 20 ml에 용해시키고 알기네이트-테트라진 용액에 첨가하여 실온에서 24시간 동안 반응되게 하였다. 24시간 후 하이드록실아민 311 mg으로 30분 동안 용액을 켄칭하고 10분 동안 최대 RPM에서 원심분리하였다. 이어서 용액을 여과하고(0.22 uM 필터) 각각의 농도에서 3시간 동안 순차적인 5 L 염욕(7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0, 0, 0 g/L NaCl)에서 투석하였다. 그 후 용액을 2회 여과(0.22 uM 필터)하고 -80℃에서 밤새 냉동하였다. 이어서 냉동된 용액을 5일 동안 동결건조하고 실험에 사용할 때까지 -20C에서 보관하였다.
크리오겔 제형물
이어서 Alg-Tz 및 Alg-Nb를 Thermomixer(37C, 2000 rpm)로 1시간 동안 20 mg/ml로 DIH2O 중에 용해시켰다. 별도로, 라포나이트를 실온에서 일정하게 혼합하면서 DI-H2O에 5 mg/ml 농도로 1시간 동안 용해시켰다. 그런 다음 용액을 멸균 조건 하에 여과하였다(0.22 uM 필터).
그런 다음 라포나이트를 함유하지 않는 크리오겔의 경우, Alg-Tz 용액 및 Alg-Nb 용액을 원하는 양의 VEGF-C와 함께 1:1 비로 첨가하고 최종 농도 10 mg/ml(10 μg VEGF-C/겔)로 희석하였다.
라포나이트를 함유하는 크리오겔 제형물의 경우, VEGF-C(3 mg/ml 스톡) 및 라포나이트(Laponite XLG)(5 mg/ml 스톡)를 1시간 동안 실온에서 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 Alg-Tz 용액 및 Alg-Nb 용액을 1:1 비로 첨가하고 최종 농도 10 mg/ml(라포나이트의 최종 농도 0.25 mg/ml, 10 μg VEGF-C/겔)로 희석하였다. 라포나이트를 포함하거나 포함하지 않는 50 μl의 크리오겔 및 VEGF-C 혼합물을 PEEK 주형으로 즉시 피펫팅하고 밤새 -20℃에서 냉동하였다. 주사 전에 겔을 주형에서 실온에서 해동한 다음 16ga 주사기 바늘에 넣었다. 그런 다음 겔이 있는 바늘을 100 μl의 멸균 PBS가 있는 1 ml 주사기에 넣었다.
알기네이트 크리오겔로부터의 시험관내 VEGF-C 방출
라포나이트를 포함하는 알기네이트 크리오겔 형성물로부터의 VEGF-C의 방출률을 시험관내 조사하였다. 전술한 바와 같이, 알기네이트 액체 예비중합체는 라포나이트 및 VEGF-C와 혼합된 다음 주사 전에 다시 냉동 및 해동되어 다공성 매트릭스를 생성한다(도 21a).
먼저, 라포나이트를 포함하거나 포함하지 않는 알기네이트 크리오겔로부터 VEGF-C의 방출을 측정하였다. VEGF-C 방출 검정에 사용하기 위해 VEGF-C(10 μg 단백질)를 함유하는 상이한 유형의 알기네이트 겔: 알기네이트 나노다공성(동결겔화 없이 겔화가 일어나므로 거시적 규모의 기공이 형성되지 않음), 알기네이트 저온 겔(냉동 및 동결겔화 후, 다공성), 및 0.25% 라포나이트를 갖는 알기네이트 크리오겔을 형성하였다. 방출 검정을 수행하기 위해, VEGF-C 크리오겔(10 μg 단백질 ± 0.25 mg/ml 라포나이트)을 1 ml의 방출 완충액(PBS 중 1% BSA 용액)에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 방출 완충액를 완전히 제거하고 방출 완충액의 첨가 후 0시간에서 500시간 초과 범위의 실험에 걸쳐 다양한 시점에서 교체하였다. 수집된 방출 완충액 샘플은 VEGF-C ELISA에 사용하기 위해 해동할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 도 21b에 나타낸 바와 같이, 0.25% 라포나이트를 갖는 알기네이트 크리오겔은 시험관내 VEGF-C의 가장 잘 제어되고 가장 오래 지속되는 방출을 나타내었다.
다음으로, 10 μg 또는 50 μg VEGF-C가 로딩된 0.25% 라포나이트 알기네이트 크리오겔 또는 50 μg VEGF-C가 로딩된 0.5% 라포나이트 알기네이트 크리오겔로부터 시험관내 VEGF-C 방출의 조절을 측정하였다. 도 21c에 나타낸 바와 같이, 총 VEGF-C의 약 30%가 겔로부터 방출되었고 0.25% 라포나이트 알기네이트 크리오겔이 가장 잘 제어되는 방출 프로파일을 나타냈다.
크리오겔을 16G 바늘을 사용하여 마우스에 피하 주사하였다. 도 21d는 마우스 피부에 크리오겔의 성공적인 임플란트를 실증한다.
생체내 VEGF-C 크리오겔의 조사
크리오겔(0.25 mg/ml 라포나이트)을 통해 전달된 VEGF-C가 임플란트되어 림프관신생을 유도하고 T 세포를 동원하는 생체내 능력을 마우스에서 조사하였다. 이러한 일련의 실험은 C137A 돌연변이를 포함하는 것들을 포함하는 상이한 VEGF-C 변이체 및 상이한 방법에 의해 생산된 VEGF-C 변이체가 림프관신생을 유도하는 능력을 조사한다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 주사된 야생형 마우스 및 면역손상된 NSG 마우스에서 다양한 양의 VEGF-C 크리오겔의 림프관신생을 유도하고 T 세포를 동원하는 능력도 조사하였다.
먼저, 야생형인 메이저 및 마이너 성숙 형태의 이량체 형태(각각 #2 및 #7)와 C137A 돌연변이를 포함하는 메이저 및 마이너 성숙 형태(각각 #9 및 #8)를 포함하는 10 μg의 상이한 VEGF-C 형태를 함유하는 크리오겔(0.25 mg/ml 라포나이트)을 제0일에 마우스(N=5/군)의 진피에 표면으로 주사하였다. 제14일에 마우스를 안락사시키고 피부/크리오겔(조합)을 분해 및 FACS 분석을 위해 절제하였다(도 22a). 구체적으로, 마우스로부터 조직을 수확하고, 칭량하고, 가위로 아주 미세한 단편으로 잘랐다. 그런 다음 샘플을 콜라게나제 4 및 DNAse 1을 함유하는 분해 배지를 일정하게 교반하면서 효소적으로 분해하였다. 그런 다음 샘플을 위아래로 피펫팅하였다. 피펫팅 후, 콜라게나제 D 및 DNAse 1을 함유하는 분해 배지를 샘플에 첨가하였다. 샘플을 3주기 동안 위아래로 피펫팅하였다. EDTA를 첨가하고(5 mM) 세포를 70 μm 필터 및 40 μM 메쉬를 통해 여과하고 Fc 차단 완충액에 재현탁하였다. FACS 분석을 위해 세포를 세척하고 염색하였다.
크리오겔의 주사 후 제14일에 단리된 림프 내피 세포(LEC)(CD31+, PDPN+)의 대표적 FACS 그래프를 FSC-A/SSC-A 및 CD45-(도 22b)에 대해 사전 관문화하고, 생체내 림프관신생이 유도되었음을 나타낸다. 마우스 피부에서 림프관신생의 양은 도 22c에 나타낸 바와 같이 조직 mg당 LEC수로 정량하였다. C137A 돌연변이를 포함하는 메이저 및 마이너 성숙 형태의 공유 이량체(각각 #9 및 #8)는 야생형인 메이저 및 마이너 성숙 형태의 이량체(각각 #2 및 #7)에 비해 더 많은 양의 LEC를 생성하였고, 이에 따라 크리오겔 임플란트 후 더 높은 수준의 생체내 림프관신생을 야기하였다(도 22c).
또한, 전술한 바와 같이 CHO MaKo 세포에서 생산된 VEGF-C 변이체 #8(C137A 돌연변이를 갖는 마이너 성숙 형태)의 기능성을 생체내 조사하고 HEK 세포에서 생산된 동일한 돌연변이체 형태와 비교하였다. 두 #8 변이체 모두는 상이한 세포 유형에서 생산되었음에도 불구하고 시험관내 HDLEC 발아 검정에서 필적하는 활성을 나타내었다.
CHO MaKo 세포에서 생산된 VEGF-C 변이체 #8은 도 24b에 나타낸 바와 같이 VEGF-C를 포함하지 않는 블랭크 크리오겔 대조군과 비교하여 생체내 림프관신생을 유도할 수 있었다. 이어서 상이한 세포 유형에 의해 생산된 2개의 #8 변이체의 필적하는 생체활성을 또한 크리오겔 전달 14일 후의 피부 분해 후 LEC를 염색하여 생체내 확인하였다(도 24c). 림프관신생은 블랭크 크리오겔(VEGF-C 없음) 또는 HEK 세포에서 생산된 #8 VEGF-C 변이체(#8HEK)가 로딩된 크리오겔 또는 MaKo 세포에서 생산된 #8 VEGF-C 변이체(#8 CHO)가 주사된 마우스에서 총 LEC 수/mg 조직으로 정량하였다. 혈액 혈관 내피 세포(BEC)(CD45-CD31+PDPN-)는 생산된 세포 유형에 관계없이 #8 변이체 VEGF-C 전달에 의해 영향을 받지 않았다. 최대 림프관신생은 생산된 세포 유형에 관계없이 #8 변이체 VEGF-C 전달로 크리오겔 전달 후 제14일에 크리오겔 상단의 피부에서 상승된 LEC 수준 및 CD4 및 CD8 T 세포(CD45+)의 최대 면역 침윤에 해당함이 또한 관찰되었다.
또한 알기네이트 크리오겔에 의해 전달된 10 μg VEGF-C에 대한 피부 림프의 반응을 측정하였다. 마우스에 앞서 언급된 바와 같이 합성된 VEGF-C 알기네이트 크리오겔(N=12) 또는 블랭크 크리오겔(VEGF-C를 포함하지 않음)(N=10)을 주사하였다. 마우스로부터의 피부/겔을 전술한 바와 같이 시점 제7일, 제14일 및 제21일에 수확하고, 분해하고, FACS를 위해 염색하였다. LEC는 CD45- CD31+ PDPN+에서 관문화하였다. BEC는 CD45- CD31+ PDPN-에서 관문화하였다. CD4 및 CD8 T 세포는 CD45+ CD11b- CD11c- Thy1+에서 관문화하였다. 조직 mg당 세포수도 정량하였다.
도 23a는 알기네이트 크리오겔(1, 10, 20, 50 μg)에 로딩된 VEGF-C의 생체내 용량 반응 및 림프관신생 유도(총 림프 내피 세포(LEC) 수/mg 조직으로 표시함, 상부 그래프) 및 10 μg VEGF-C 전달 후 림프관신생의 시간 경과(하단 그래프)를 도시한다. 이러한 결과는 10 μg의 VEGF-C가 높은 생체내 림프관신생을 유도하고 최대 림프관신생이 피하 크리오겔 전달 14일 후 관찰됨을 표시하였다. 겔 임플란트 14일 후 C57/BL6 마우스의 피부 분해 후 단리된 LEC(CD45-CD31+PDPN+) 및 혈액 내피 세포(BEC, CD45-CD31+PDPN-) 염색의 대표적 그래프(도 23b) 및 총 세포수/mg 조직으로서의 내피 세포의 정량(도 23c)은 또한 10 μg의 VEGF-C가 VEGF-C를 포함하지 않는 블랭크 겔 대조군과 비교하여 높은 생체내 림프관신생을 유도함을 표시하였다. 또한 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 총 세포수/mg 조직으로 표시되는 정량은 T 세포 침윤이 10 μg의 VEGF-C 알기네이트 크리오겔 전달 후 또한 증가했으며 LEC수가 T 세포 침윤, 특히 나이브 표현형(CD62L+, CD44-)을 갖는 것들과 관련됨을 실증하였다. 도 23e에 나타낸 바와 같이, 피하 VEGF-C 알기네이트 크리오겔 전달 14일 후 최고 림프관신생이 관찰되었고, 최고 T 세포 침윤도 제14일에 관찰되었다.
VEGF-C의 면역손상 NSG 마우스에서 림프관신생을 유도하는 능력 및 마우스 LEC의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 효율적으로 동원하는 능력을 조사하였다. 도 25a에서, C57B6 마우스에 VEGF-C 크리오겔/0.25% 라포나이트(N=5) 또는 블랭크 크리오겔(N=5)을 주사하고 제14일에 림프관신생을 평가하였다. 또한 NSG 마우스에 VEGF-C 크리오겔(N=5)을 주사하여 면역적격 마우스(C57Bl6)와 면역손상 마우스(NSG) 사이의 LEG 증식을 비교하였다. VEGF-C 또는 블랭크 크리오겔 전달 14일 후 NSG, C57/BL6 마우스에서 피부 LEC 및 BEC 염색의 대표적 유세포측정 그래프는 증가된 LEC 및 따라서 NSG 및 C57B6 마우스에서 VEGF-C 크리오겔 전달 후 더 높은 생체내 림프관신생을 실증하였다(도 25a). 도 25b에서, NSG 마우스에 제0일에 VEGF-C 크리오겔(N=5) 또는 블랭크 크리오겔(N=5)을 주사하였다. 제10일에 모든 마우스에 측면 꼬리 정맥을 통해 PBMC를 주사하였다. PBMC 주사 7일 후 분해 및 FACS 분석을 위해 피부/겔 조직을 수집하였다. LEC는 인간 CD45- 마우스 CD11b- 마우스 CD31+ 마우스 PDPN+ 상에 관문화하였다. CD4 및 CD8 T 세포는 인간 CD45+ 마우스 CD11b- 인간 CD3+ 상에 관문화하였다. B 세포는 인간 CD45+ 마우스 CD11b- 인간 CD3- 인간 CD19+ 상에 관문화하였다. 이들 데이터는 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 B 세포가 블랭크 크리오겔 대조군(VEGF-C 없음)과 비교하여 VEGF-C 크리오겔을 투여한 NSG 마우스의 피부에서 모두 증가했고 T 세포가 NSG 마우스에서 동원된 PBMC의 주요 세포 유형이었음을 실증한다.
종합하면, 이들 데이터는 라포나이트를 포함하거나 포함하지 않는 VEGF-C를 포함하는 알기네이트 크리오겔이 국소적으로 림프관신생 및 생체내 크리오겔 투여 부위로의 T 세포 동원을 유도할 수 있었음을 표시한다.
실시예 3: CART 세포를 생성하기 위한 T 세포의 형질도입을 위한 MSR 합성
이 실시예는 메조다공성 실리카 막대(MSR)의 합성을 기재한다. MSR과 같은 메조다공성 실리카 입자(MSP)는 예를 들어 전술된 VEGF-C 크리오겔의 투여로 인해 림프관신생을 겪은 환자의 부위로 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터의 전달을 돕기 위해 사용될 수 있다.
MSR 합성은 먼저 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(프로필렌 글리콜)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) 평균 Mn 약 5,800(Pluronic P-123, 80.0 g, 487 mmol; Sigma) 계면활성제를 실온에서 3 L의 1.6 M HCl에 용해시킨 후, 5 L 재킷형 플라스크에서 40C까지 가열하고 오버헤드 교반기를 통해 0 내지 600 rpm의 속도로 기계적으로 교반하여 수행하였다. 테트라에틸 오르소실리케이트(TEOS, 184 mL, 826 mmol; Sigma)를 5분 미만에 걸쳐 한 번에 첨가하고 적어도 2시간 동안, 그러나 가장 일반적으로 20시간 동안 교반하면서 40C에서 가열하였다. 생성된 슬러리를 실온까지 냉각시키기 전에 열수 처리를 위해 6 내지 72시간 동안 80 내지 130C까지 가열하였다. 슬러리를 부흐너 깔때기에서 여과하고, 탈이온수에 이어 에탄올로 세척하고, 실온에서 공기 건조하였다. 생성된 실리카 물질을 8시간에 걸쳐 실온으로부터 550C까지의 느린 경사 온도를 이용하여 노에서 하소한 다음, 실온까지 냉각시키기 전에 550C에서 추가 8시간 동안 유지하여 47 g의 메조다공성 실리카 입자를 얻었다.
교반 속도의 변화는 마이크로입자 종횡비의 변화를 가질 수 있다. 열수 온도 및 지속기간의 조건을 바꾸는 것은 메조다공성 물질에 대한 일반적인 기공 크기의 제어인자이다.
최종 메조다공성 물질을 광학 현미경, Malvern Morphologi G3, 주사 전자 현미경(SEM), 열 중량 분석(TGA)으로 특성규명하였다.
N,N,N-트리메틸프로판-1-암모늄 기능화 마이크로입자
트리메톡시실릴프로필트리메틸암모늄 클로라이드(3.61 mL, 6.51 mmol; 메탄올 중 50% 용액)를 150 mL 시약 에탄올 중 1.0 g의 메조다공성 실리카 마이크로입자의 슬러리에 첨가하고, 75℃까지 7시간 동안 가열하였다. 실온까지 냉각한 후 슬러리를 여과하고 입자를 탈이온수에 이어 에탄올로 세척한 다음 100℃의 오븐에서 20시간 동안 건조하여 본원에서 "트리메틸암모늄 MSR"로 지칭되는 N,N,N-트리메틸프로판-1-암모늄 기능화 마이크로입자를 수득하였다.
MSR 크기 감소
스톡 MSR 변이체는 합성 후 길이가 대략 100 내지 200 μm였다. MSR은 이의 크기를 줄이고 주입성을 개선하기 위해 균질화하였다. 특히, 28.5ga 인슐린 주사기를 통한 주사성을 개선하기 위해, 건조 MSR을 MP FastPrep-24 5G 비드 비팅 그라인더 및 용해 시스템에서 80초 동안 균질화하였다(도 30a). 도 30a에서, MSR 길이 측면에서 크기 감소가 관찰되었으며, 이는 더 작은 지름의 바늘을 통해 피내 공간으로 주사할 수 있게 한다. 그런 다음 MSR을 오토클레이브하고 사용할 때까지 실온에서 보관하였다.
MSR로의 렌티바이러스 로딩 및 MSR + 바이러스 벡터의 특성규명
균질화 MSR 배치를 빙냉 트리스-NaCl-EDTA 완충액 pH 7.5(NTE 완충액)에 10 mg/ml로 재현탁하였다. 원하는 렌티바이러스 스톡(아래에 기재됨)을 로딩을 위해 원하는 총 형질도입 단위(TU) 양으로 빙냉 NTE 완충액에서 희석하였다. MSR 현탁액 및 희석된 바이러스를 1:1 vol/vol의 비로 조합하고, 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 기능적 시험관내 시험 또는 생체내 사용 전에 과량의 바이러스를 제거하기 위해 과량의 DPBS에서 적어도 두 번의 세척 단계를 수행하였다. 로딩 및 보유 연구(도 27 내지 도 28)를 위해, 2.5 mg/ml MSR 현탁액을 도면에 표시된 양의 바이러스를 함유하는 용액과 1:1로 혼합하고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 로딩 용액에서 MSR에 결합된 및 MSR로부터 방출된 바이러스 양을 상업적으로 이용 가능한 키트, 예를 들어 qRTPCR 기반 키트, 예를 들어 Lenti-X qRT-PCR 적정 키트를 사용하여 정량하였다. 방출 연구를 위해, MSR-렌티바이러스 복합체를 37℃에서 배지에서 인큐베이션하고, 상청액을 qPCR 분석을 위해 표시된 시점에 수집하였다.
먼저, GFP-인코딩 렌티바이러스를 가진 MSR의 로딩 용량을 측정하였다. 트리메틸암모늄 MSR은 세포 기반 형질도입 검정에 의해 결정된 기능적 역가에 따라 다양한 양으로 GFP-발현 렌티바이러스와 공동-인큐베이션하였다. 바이러스 로딩 용액(MSR에 첨가된 초기 투입물), MSR 결합 바이러스(인큐베이션 및 세척 후 MSR에 결합된 남아 있는 양) 및 결합되지 않은 바이러스(MSR 및 바이러스의 공동-인큐베이션 후 남아있는 용액)를 포함하는, 3개 분획에서 바이러스의 양을 특성규명하였다. MSR 및 바이러스를 얼음 위에서 30분 동안 공동-인큐베이션하고, 상청액을 제거하고(결합되지 않은 바이러스) MSR-결합 바이러스를 평가하기 전에 MSR을 2회 세척하였다. 각각의 조건 그대로의 바이러스 로딩 용액도 분석하였다. 도 27a에 나타낸 바와 같이, 투입 바이러스 로딩 용액 내의 대부분의 바이러스는 결합되지 않은 바이러스와 비교하여 흡착 및 세척 후에 MSR-결합 바이러스 분획에 보유되었다. MSR에 흡착된 바이러스의 양도 바이러스 로딩 용액의 바이러스 양에 따라 증가하였다. 바이러스 로딩 용액의 백분율 대 바이러스의 기능적 역가를 그래프로 나타낸 도 27b에 도시된 바와 같이, 바이러스 로딩 용액 대비 MSR-결합 바이러스의 계산된 분율은 흡착 및 세척 후 MSR에 대한 강력한 로딩 및 보유의 효율을 가졌다.
다음으로, MSR 상의 바이러스 보유를 특성규명하였다. 구체적으로, 렌티바이러스 및 MSR을 얼음 위에서 30분 동안 공동-인큐베이션하고, MSR을 2회 세척하였다. 그런 다음 MSR을 10% FCS 또는 OpTmizer 무혈청 배지를 함유하는 R10 배지에서 배양하고 투입 바이러스 스톡도 배지에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시작 후 표시된 시간에 상청액을 제거하고 총 바이러스 함량에 대해 분석하였다. 도 28에 실증된 바와 같이, 결과는 MSR이 결합되지 않은 바이러스 대조군(R10 배지의 바이러스 및 OpTmizer 배지의 바이러스)과 비교하여 처음 18시간에 걸쳐 투입 바이러스의 분획(R10 배지에서 MSR-바이러스 및 OpTmizer 배지에서 MSR-바이러스)만을 방출함을 표시하였다.
실시예 4: MSR 및 바이러스 벡터, 및 선택적으로 스타터를 사용한 T 세포의 형질도입 및 기능 시험
이 실시예는 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 사용하여 시험관내 T 세포의 형질도입을 설명한다. 이론에 구애됨이 없이, 바이러스 벡터를 MSR(벡터의 제어 방출을 촉진하기 위해) 및 선택적으로 또한 스타터 S(T 세포의 활성화를 촉진하기 위해)와 함께 투여하였다.
MSR + 바이러스 벡터 + 선택적으로 스타터를 이용한 시험관내 T 세포 형질도입
인간 T 세포는 Miltenyi Human Pan T 세포 단리 키트를 사용하여 류코팩(leukopak)으로부터 단리하고 사용하기 전까지 냉동하였다. 세포를 해동하고 스타터 작제물 4의 존재 하에 완전 OpTmizer 배지에 플레이팅하였다(표 20, 도 48a). 유리 바이러스 또는 MSR-바이러스 복합체로서 CD19 CAR(CAR19로도 지칭됨) 인코딩 바이러스를 배양물에 첨가한 후, 하루 동안 인큐베이션하였다. 특성규명 및 기능 시험에 사용하기 전에 세포를 세척하고 추가로 3일 동안 플레이팅하였다.
CAR T 세포 특성규명 및 기능 시험
CAR T 세포는 PE에 접합된 CD19 CAR 항-개별특이형 항체를 이용한 염색 및 유세포측정에 의한 분석에 의해 CAR 수용체의 발현에 대해 분석되었다.
CD19 CAR 발현을 측정하기 위해, 형질도입 후 제4일에 CAR+ 세포의 백분율을 정량하였다(도 29a). 시험관내 T 세포의 형질도입 효율은 CAR-MSR 또는 CAR-유리(결합되지 않은 바이러스)로 형질도입된 T 세포에서와 필적하였다(도 29a).
MSR 결합 바이러스 또는 결합되지 않은 바이러스로 형질도입된 CD19 CAR T 세포의 기능을 측정하기 위해 Nalm6-Luc 세포 특이 사멸 검정 및 인터페론-γ(IFN- γ) 방출 검정을 사용하였다. Nalm6(RRID: CVCL_0092)은 인간 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 세포주이다. 세포를 10% 태아 소 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 성장시키고 현탁액에서 성장시켰다. 세포를 루시퍼라제(Nalm6-Luc)를 발현하도록 변형하여, 공동 배양에서의 이의 존재가 루시퍼라제 신호에 의해 평가될 수 있도록 하였다. Nalm6-Luc 세포는 유리 바이러스 또는 MSR-바이러스 복합체를 사용하여 생산된 CD19-CART와 다양한 세포 비(효과기 대 표적 비율(E:T 비))로 공동 배양하였다(도 29b 내지 도 29c). 1일 공동 배양 종료 시 루시퍼라제 신호를 사용하여 CART에 의해 사멸된 투입 Nalm6의 백분율을 계산하였다. 공동 배양 종료 시 상청액의 IFN- γ 수준을 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 정량하였다.
이들 검정으로부터의 결과는 24시간 동안의 공동-인큐베이션 동안의 특이적 사멸 활성(도 29b) 및 IFN- γ 방출(도 29c)이 MSR-결합 바이러스(CAR-MSR)로 형질도입된 CART 세포와 유리 바이러스(CAR-유리)로 형질도입된 CART 세포 사이에 필적하여, MSR을 갖는 제형물에 의한 형질도입이 기존의 유리 바이러스 형질도입과 비교하여 시험관내 동등하게 기능적인 CART를 생산함을 나타냄을 표시한다.
다음으로, 균질화 후 MSR의 형질도입 효율을 평가하였다. MSR을 전술한 바와 같이 균질화하여 더 작은 지름의 바늘을 통한 주사를 허용하였다(도 30a). 도 30b에 나타낸 바와 같이, 표준 트리메틸암모늄 MSR 또는 균질화 MSR을 렌티바이러스로 흡착시키고 이 복합체의 일련의 희석액을 생성하여 GFP-인코딩 렌티바이러스로 T 세포를 형질도입하기 위해 사용하였다. MSR의 균질화는 시험관내 형질도입 성능을 실질적으로 변경하지 않았다.
크리오겔/ 라포나이트에 이어 생체내 MSR+ 바이러스 벡터의 투여
MSR-바이러스 복합체의 주사 후 마우스에 주사한 크리오겔의 편재 및 분포를 조사하기 위한 실험을 설계하였다. 블랭크 알기네이트 크리오겔을 피하 주사하고 7일 후 유리 또는 MSR에 결합된 바이러스 입자(4e6 TU)를 인슐린 주사기(MSR-바이러스 군의 경우) 또는 해밀턴 주사기(유리 바이러스의 경우)로 겔 상단의 피내 공간에 주사하였다. 바이러스 전달 72시간 후, 마우스를 안락사시키고, 면역조직화학 분석을 위해 조직(피부 및 배액 림프절)을 수확하였다. 부검 시 피부/크리오겔 조직, 인접한 피부 및 배액 림프절을 수집하고 10% 중성 완충 포르말린에 침지 고정하고 파라핀 처리하였다. 절편은 조직학적 평가를 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 슬라이드는 슬라이드 스캐너 및 포착된 대표적 이미지를 사용하여 디지털화하였다. 도 31a 내지 도 31b는 인접한 크리오겔 및 MSR을 함유하는 피부의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 절편을 도시한다.
도 31a에서, H&E 염색된 절편은 피하조직의 지방층 근육 표면의 피하 크리오겔의 위치를 실증하였다. MSR은 임플란트된 크리오겔에 인접한 진피-피하조직 접합부에 위치한 단핵 세포와 혼합된 약호산구성 과립 물질로 나타났다(클로즈 업 이미지에 대해 도 31b).
도 32a 내지 도 32b는 단리된 마우스 피부의 절편에서 CAR mRNA에 대한 원 위치 혼성화를 나타낸다. CAR 전사체뿐만 아니라 Hs-PPIB(양성 대조군 및 조직 품질 대조군) 및 DAPB(음성 대조군) 유전자를 검출하기 위한 원 위치 혼성화를 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 절편에서 수행하였다. 양성 PPIB 및 음성 DAPB 대조군 프로브 세트를 포함하여 각각 전처리를 최적화하고 mRNA 품질 및 특이성을 보장한다. 혼성화 방법은 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 발색원을 사용하는 알려진 프로토콜을 따랐다. 간략하게, 5 μm 두께의 조직 절편을 유리 슬라이드에 놓고 60 분 동안 소상한 후 혼성화에 사용하였다. 염색기를 사용하여 파라핀 제거 및 재수화 프로토콜을 수행하였다. 1X 복원 완충액에서 오프라인 수동 전처리를 수행하였다. 최적화는 먼저 PPIB 및 DAPB 혼성화 신호를 평가한 다음 모든 슬라이드에 대해 동일한 조건을 사용하여 수행하였다. 전처리 후 슬라이드를 자동염색기로 옮겨 프로테아제 전처리; 혼성화 후 증폭; 및 HRP 및 헤마톡실린 카운터 염색을 이용한 검출을 포함하는 혼성화 절차를 완료하였다. 슬라이드는 슬라이드 스캐너 및 포착된 대표적 이미지를 사용하여 디지털화하였다.
도 32a에 나타낸 바와 같이, CAR mRNA 전사체를 검출하기 위한 원 위치 혼성화는 MSR-결합 바이러스가 주사된 마우스에서 주사된 MSR에 상응하는 영역 내에서 강력한 신호를 실증하였다. 도 32b에 도시된 바와 같이, 원 위치 혼성화로 크리오겔에 침윤하는 세포뿐만 아니라 유리 바이러스 조건에서 이에 인접한 세포에서 확산 신호를 검출하였다. 이러한 데이터는 MSR이 T 세포가 피부에 침윤하는 진피에 편재된 바이러스를 유지할 수 있다는 개념을 뒷받침하는 것으로 나타낸다.
도 33a 내지 도 33b는 MSR-바이러스가 주사된 마우스가 유리 바이러스군과 비교하여 배액 림프절에서 더 적은 CAR mRNA 전사체 양성 세포를 가졌음을 나타낸다. CAR mRNA에 대한 원 위치 혼성화는 배액 림프절(dLN)의 절편에 대해 전술한 바와 같이 수행하였다. 이러한 원 위치 혼성화는 MSR-결합 바이러스가 주사된 마우스의 dLN 내에서 단 하나의 CAR mRNA 전사체 양성 세포를 검출한 반면(도 33a), 유리 바이러스가 주사된 마우스는 크리오겔 임플란트 부위로부터 바이러스 또는 세포의 국소 배액과 함께 피막하동에서 소수의 CAR mRNA 전사체 양성 세포를 나타내었다(도 35b). 이 연구는 MSP-바이러스 제형물이 배액 림프절로의 바이러스 배액을 제한함으로써 잠재적인 부위-외 형질도입을 감소시키고 안전성을 개선함을 실증하였다.
생체내 사용을 위한 바이러스 및 스타터를 이용한 MSR 로딩
스타터(구체적으로, 표 20, 도 37a에 나타낸 스타터 작제물 2) 및 트리메틸암모늄 MSR을 공동-인큐베이션하여 세포 활성화제가 MSR 표면에 흡착되도록 하였다. 스타터 작제물 2 단백질을 8 mg/ml 트리메틸암모늄 MSR 현탁액에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 로딩된 MSR을 3회 세척하고 최종 농도 15 mg/ml MSR로 DPBS에 재현탁하였다. CD19 CAR 인코딩 렌티바이러스를 함유하는 NTE 완충 용액을 10 mg/ml 트리메틸암모늄 MSR 현탁액과 혼합하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. MSR을 2회 세척하고 최종 농도 15 mg/ml MSR로 DPBS에 재현탁하였다. 마지막으로 MSR을 위아래로 힘차게 피펫팅하고 인슐린 주사기에 다시 로딩한 다음 마우스에 즉시 피내 주사하였다.
종합하면, 이러한 데이터는 스타터 S 작제물과 함께 MSR 결합 바이러스가 기능적 CART 세포를 생산하기 위해 T 세포를 효율적으로 형질도입할 수 있었음을 표시한다. 따라서, MSR-결합 스타터와 조합된 메조다공성 실리카 막대(MSR)에 결합된 바이러스 입자(도 26a), 또는 MSR-결합 스타터와 조합된 유리 바이러스(도 26b)의 주사 후 교육 및 형질도입될 T 세포에 대한 2차 프라이밍 부위를 생성하는 마우스 피부에서의 VEGF-C 전달이 본원에서 고려된다.
실시예 5: 생체내 CART 제조
생체내 마우스 모델에서 CD19 CAR 인코딩 렌티바이러스로 인간 T 세포의 바이러스 형질도입을 실증하기 위한 연구를 수행하였다. 구체적으로, VEGF-C 크리오겔(0.25 mg/ml 라포나이트)을 마우스에 투여하여 림프관신생 및 T 세포의 동원을 촉진하였다. 다음으로, CD19 CAR 인코딩 바이러스 벡터, MSR 및 스타터의 조합을 투여하여 림프관신생을 겪는 영역에서 T 세포를 활성화 및 형질도입하였다.
방법
마우스 연구 및 유세포측정 분석
NSG 마우스(N=45)에 꼬리 정맥 주사를 통해 제0일에 VEGF-C 크리오겔을 및 제10일에 PBMC를 주사하였다. 7일 후 제17일에 마우스에 1) PBS(N=총 15개/종결점 FACS 분석을 위해 5개), 2) 스타터 작제물 2를 갖는 MSR(전술한 바와 같이 생산된 15 mg/ml MSR 동등물의 10 μl 주사) 이어서 유리 CD19 CAR 인코딩 렌티바이러스(스타터 주사 1시간 후 4.26e6 TU 바이러스를 함유하는 10 μl 주사)(N=총 15개/종결점 FACS 분석을 위해 6개) 또는 3) 스타터 작제물 2를 갖는 MSR(15 mg/ml MSR의 20 μl 단회 주사)과 1:1로 혼합된 MSR 결합 CD19 CAR 인코딩 렌티바이러스(N=총 15개/종결점 FACS 분석을 위해 5개) 중 하나를 피내 주사하였다(도 34a). MSR-스타터는 T 세포 활성화 및 T 세포 형질도입을 촉진하기 위해 사용하였다. 제14일에, 군당 3 또는 4마리의 마우스를 안락사시키고 피부/크리오겔 주사 영역에서 림프관신생에 대해 분석하였다. 제35일에 마우스를 안락사시키고 비장 및 혈액을 수집하여 생체내 CD19 CAR 인코딩 바이러스 전달이 VEGF-C 유도 림프관신생에 의해 동원된 T 세포의 형질도입을 유발하는지 여부를 결정하고 국소 및 전신 형질도입된 세포(N=3/군/시점)를 확인하였다. 제25일, 제30일, 제35일에 순환 CD19 CAR+ 세포의 FACS 분석을 위해 마우스를 주기적으로 채혈하였다. 마지막으로, CART 증대 및 B 세포 고갈을 확인하기 위해 제35일에 피부/크리오겔 및 비장의 FACS 분석을 위해 마우스를 안락사시켰다. B 세포 고갈 및 CAR-T 세포도 모든 군의 마우스 비장에서 정량하였다.
CAR의 ISH 염색
CAR mRNA 전사체를 검출하기 위한 RNAscope 2.5 VS 프로브 CAR 3UTR(카탈로그 번호 438289)뿐만 아니라 2.5 VS 프로브 Hs-PPIB(양성 대조군 및 조직 품질 대조군(카탈로그 번호 313909)) 및 2.5 VS 프로브 DAPB(음성 대조군(카탈로그 #3120390)를 사용하는 원 위치 혼성화를 Advanced Cell Diagnostics(ACDBio)(Hayward, CA) 및 Ventana Medical Systems(Roche, Tuscon AZ)에서 공급한 시약 및 장비를 사용하여 블록에서 수행하였다. mRNA 품질 및 특이성을 보장하기 위해 양성 PPIB 및 음성 DAPB 대조군 프로브 세트를 포함하였다. 혼성화 방법은 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 발색원을 사용하여 ACDBio 및 Ventana 시스템에서 확립한 프로토콜을 따랐으며 연구 조직에 최적화하였다. 간략하게, 5 μm 절편을 60분 동안 60도에서 소성하고 혼성화를 위해 사용하였다. 파라핀제거 및 재수화 프로토콜은 하기 단계: 각각 3분 동안 자일렌 3회; 3분 동안 100% 알코올 2회; 공기 건조 5분으로 Sakura Tissue-Tek DR5 염색기를 사용하여 수행하였다. 98 내지 104℃에서 1X 복원 완충액에서 오프라인 수동 전처리를 15분 동안 수행하였다. 최적화는 먼저 PPIB 및 DAPB 혼성화 신호를 평가한 다음 모든 슬라이드에 대해 동일한 조건을 사용하여 수행하였다. 전처리 후 슬라이드를 Ventana Ultra 자동염색기로 옮겨 프로테아제 전처리; 2시간 동안 43℃에서 혼성화에 이은 증폭; 및 HRP 및 헤마톡실린 카운터 염색을 이용한 검출을 포함한 ISH 절차를 완료하였다.
T 세포에 대한 IHC 염색
파라핀제거 및 항원 복원 단계를 포함하는 CD3에 대한 면역조직화학 염색은 토끼 모노클로날 항체 클론 2GV6(Ventana 카탈로그 # 790-431)을 사용하여 표준 Ventana Discovery XT 시약(Ventana, Indianapolis, IN)을 사용하는 Ventana Discovery XT 자동 염색기에서 수행하였다. 슬라이드를 파라핀제거한 다음 표준 Ventana 복원 프로토콜(retrieval protocol)에 따라 Cell Conditioning 1(CC1/pH8) 용액으로 덮어 열 유도 항원 복원으로 제출하였다. 슬라이드를 1차 항체 또는 비면역 이소형-일치 음성 대조군과 인큐베이션하였다. Ventana Discovery OmniMap HRP 시약에 이어 Ventana Discovery ChromoMap 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)과 인큐베이션하여 가시화하였다. 카운터염색은 Ventana 헤마톡실린 및 Ventana Bluing 시약을 각각 4분 동안 사용하여 수행하였다. 슬라이드는 탈수, 청정화 및 합성 실장 배지와 함께 커버슬립 처리하였다.
IF 염색 프로토콜 - 생체내 CART 다중화를 위한 마우스 조직
제1일에 슬라이드를 세척한 다음 4℃에서 밤새 차단하였다. 제2일에 슬라이드를 AffiniPure Fab 단편 염소 항-마우스 IgG(H+L)와 인큐베이션한 다음 Alexa Fluor® 647-표지 항-CD19 항체와 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 제3일에 슬라이드를 세척한 다음 Alexa Fluor® 488-표지 항-CD3 제타 항체와 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 제4일에, 슬라이드를 세척하고, DAPI로 카운터염색한 후 다시 세척하였다. 슬라이드에 커버 글라스를 실장하고 이미지화 전에 적어도 24시간 동안 냉장고에 두었다.
결과
도 38에서 실증된 바와 같이, T 세포는 마우스 피부의 임플란트 부위 주변 및 겔 주변에서 효율적으로 동원되었다. CAR ISH 연구의 결과는 해당 영역의 일부 단핵 세포(표현형 유사 T 세포로부터)가 CAR을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입됨을 나타내었다(도 39). CAR RNA의 발현은 또한 일부 내피 세포(아마도 림프)에서 관찰되었다(도 39). 그러나 유세포측정으로 분석된 세포 표면의 CD19 CAR 단백질 발현은 소수의 인간 단핵구 세포를 제외하고는 거의 T 세포에서만 발현되는 것으로 확인되어, 유리 바이러스 및 MSR-바이러스에 의한 비-T 세포의 형질도입이 최소로 존재함을 표시하였다(도 35).
국소 생성된 CAR-T 세포는 비장으로 이동하였다(도 40). 도 34b에 나타낸 바와 같이, (a) 유리 바이러스 및 스타터 작제물 2와 결합된 MSR 또는 (b) 스타터 작제물 2를 갖는 MSR과 1:1 혼합된 MSR 결합 CD19 CAR 인코딩 렌티바이러스를 제공받은 마우스에서 CAR-T 세포뿐만 아니라 B 세포의 현저한 감소가 검출되었다. 비장에서 B 세포의 수는 비장(도 34c 및 도 36a) 및 혈액(도 36b)에서 CAR-T 세포(주로 CD8+임)의 수와 반비례 관계가 있어서, B 세포 고갈이 생체내 생성된 CD19 특이적 CAR-T 세포에 의해 유도됨을 뒷받침하였다. 도 41a 내지 도 41b에 나타낸 바와 같이, T 세포와 매우 근접한 B 세포는 세포 사멸을 표시하는 수축되고 건강하지 않은 모양을 가진 반면, 아직 CD19 특이적 T 세포와 접촉하지 않은 B 세포는 건강한 표현형(세포 표면에서만 CD19 염색을 갖는 둥글고 더 큰 세포)을 나타냈다. CD3 항체로 염색된 T 세포(점선 염색)는 CAR 프로브와의 공동 염색은 수행되지 않았으나 CART 세포일 수 있다.
이 연구는 기능적 CART 세포가 림프관신생 및 이후 MSR-결합 바이러스 또는 유리 바이러스 및 MSR-결합 스타터에 의해 형질도입되는 T 세포의 동원을 유도하기 위해 성장/세포 동원 인자, 예를 들어 VEGF-C를 함유하는 크리오겔의 국소 투여 후 생체내 생성될 수 있음을 실증한다.
실시예 6: 생체내 CART 제조 추가 연구 시험
이 실시예에서, 도 42a에 제시된 바와 같은 추가적인 연구를 생체내 CART 제조를 시험하기 위해 수행하였다. 방법은 실시예 5에 기재된 것과 유사하다. 간략하게, NSG 마우스에 제-24일에 VEGF-C 크리오겔(0.25 mg/ml 라포나이트) 및 제-14일에 인간 PBMC를 피하 주사하였다. 제0일에, 마우스에 1) 유리 바이러스 및 MSP와 스타터 작제물 2(유리 바이러스 군으로 지칭됨), 2) MSP와 바이러스 및 MSP와 스타터 작제물 2(MSP-바이러스 군으로 지칭됨), 또는 3) PBS 및 MSP와 스타터 작제물 2(PBS 군으로 지칭됨)를 피내 주사하였다. 네 번째 마우스군은 제-24일에 블랭크 크리오겔을, 및 제0일에 블랭크 MSP뿐만 아니라 유리 바이러스를 제공받았다(유리 바이러스 대조군으로 지칭됨). 처음 두 군(유리 바이러스군 및 MSP-바이러스군)은 전체 조합군 또는 전체 조합 치료를 제공받는 군으로 지칭한다. 바이러스 용량은 4e6 TU(실시예 5, 도 34a)에서 1.1e7 TU(실시예 6, 도 42a)까지 증가시켰다.
도 42b에 나타낸 바와 같이, 인간 CD45 순환 세포는 시간 경과에 따라 수가 증가하였다. 전체 조합 처리(실선 상자, 흰색 및 검은색 원)는 대조군 마우스(점선 상자, 회색 삼각형, 흰색 마름모꼴)와 비교하여 T 세포 증대, 특히 CD8+ T 세포를 추가로 늘렸다. 실시예 5에 기재된 연구(VEGF-C 주사 17일 후 및 PBMC 주사 7일 후 바이러스 주사)와 달리, 이 새로운 연구에서는 바이러스 주사를 VEGF-C 주사 24일 후 및 PBMC 주사 14일 후로 연기하였다. 이 변형은 CART 세포 생성의 일관성을 더 높였으며, 이는 이 후기 시점(제24일)에 VEGF-C 크리오겔 임플란트 주변의 T 세포 밀도가 더 높기 때문일 수 있다.
도 43a에 나타낸 바와 같이, 생체내 생성된 인간 CD3+ CAR+ T 세포, 특히 CD8 표현형의 CAR-T 세포는 대조군 마우스(점선 상자, 회색 삼각형, 흰색 마름모꼴)와 비교하여 전체 조합 처리로 처리된 마우스(실선 상자, 흰색 및 검은색 원)에서 시간 경과에 따라 추가 증가하였다. CAR-T 세포수의 증가에 상응하여, PBS 대조군과 비교하여 시간 경과에 따라 순환 중 B 세포의 감소가 관찰되었다(도 43b, 상부 패널). MSP-바이러스 및 유리-바이러스군은 유사하게 수행한 반면, 유리 바이러스 대조군(도 43b, 하단 패널)은 전체 조합 군과 동일한 정도는 아니지만 부분적인 B 세포 고갈을 나타내었다. 실제로, 유리 바이러스 대조군의 마우스에서 순환 CAR-T 세포수는 전체 조합군에서의 수만큼 높지 않았다.
실시예 5에 기재된 결과와 일치하게, 이 새로운 연구는 또한 혈액(도 44a) 및 비장(도 44b)에서 CAR-T 세포 증대와 B 세포 고갈 사이에 강한 상관관계를 나타내었다. 유리 바이러스 대조군은 순환에서 중간 수준의 B 세포 고갈을 나타내었지만(도 44a), 이 대조군 처리는 비장에서 효과적인 B 세포 고갈을 야기하지 않았다(도 44b). 특히 CD8 표현형으로부터의 CAR-T 세포의 존재는 처리된 마우스의 비장(도 45a 내지 도 45b) 및 피부(도 46a 내지 도 46c)에서 B 세포 고갈에 상응하였다. 피부에서, CART 세포 증대는 또한 림프 내피 세포(LEC)수에 의해 측정된 바와 같이 림프관신생과 상관관계가 있었다(도 46d).
요약하면, 이 연구는 본원에 기재된 생체내 CART 제조 방법이 그 증대가 B 세포 고갈과 관련이 있는, 기능적 CART를 생성하기 위해 사용될 수 있음을 실증한다.
실시예 7: MSP를 사용한 바이러스 및 스타터의 공동 전달.
이 예에서는 동일한 MSP를 사용하는 바이러스 및 스타터의 공동 전달을 검사한다. 간략하게, MSP는 GFP를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터 및 스타터 작제물 1과 동시에 공동-인큐베이션되었다(표 20, 도 48a). 공동-인큐베이션 및 세척 후, 바이러스 및 스타터-로딩 MSP를 96웰 편평 바닥 플레이트에서 T 세포와 인큐베이션하기 전에 연속 희석하였다. 도 47에 나타낸 바와 같이, MSP를 사용한 바이러스 및 스타터의 공동 전달은 1차 범 T 세포에서 성공적인 트랜스유전자 발현을 야기하였다.
실시예 8: 스타터 분자의 생성
이 실시예는 항-CD3 결합 도메인 및 공동자극 분자 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 분자의 생성을 기재한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 결합 도메인은 CD28, CD2, CD25, CD27, IL6Ra, IL6Rb, ICOS 또는 41BB에 결합한다. 이러한 분자는 스타터 분자로 지칭된다.
항-CD3 x 항-CD28 또는 항-CD3 x 항-CD2 이중특이적 항체 및 이의 다량체 접합체의 다양한 구성을 생성하였다. 이들 분자에 대한 도식을 도 48a 내지 도 48b에 제공한다(작제물 1 내지 17, F1 내지 F17로도 지칭됨; 1세대 스타터 분자). 작제물 1 내지 17의 서열 및 이의 결합 도메인을 표 19 및 표 20에 개시한다.
또한, 상이한 공동자극 분자(예를 들어, CD25, IL6Rb, CD27, 41BB, ICOS 또는 CD2)를 표적화하는 결합제를 시험하기 위해 2세대 스타터 분자를 생성하였다. 상이한 항-CD3 결합제(항-CD3(1) 또는 항-CD3(2)에 기반한 결합제)도 비교하였다. 모든 2세대 스타터 분자(도 49a)는 도 49b에 나타낸 구성을 갖는다. 2세대 스타터 분자의 상이한 결합제의 서열은 표 19에서 확인할 수 있다.
이론에 구애됨이 없이, FcR에 대한 스타터 분자의 결합을 감소시키는 것은 T 세포에 의한 FcR-발현 세포의 원치 않는 사멸을 감소시키거나 방지할 수 있다. 3세대 스타터 분자는 IgG1 Fc 영역에 D265A/N297A/P329A 치환(카바트에 따른 EU 넘버링)("DANAPA")을 도입하여 생성하였다. 또한, 상이한 항-CD3 결합제(항-CD3(1), 항-CD3(2) 또는 항-CD3(3)에 기반한 결합제) 및 상이한 항-CD28 결합제(항-CD28(1) 또는 항-CD28(2)에 기반한 결합제)도 비교하였다(도 50a). 모든 3세대 스타터 분자는 도 50b에 나타낸 구성을 갖는다. 3세대 스타터 분자의 서열 및 이의 결합 도메인은 표 19 및 표 20에서 찾을 수 있다.
스타터 분자는 CAR을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터를 이용한 T 세포 형질도입을 매개하는 것으로 나타났다.
스타터 S 활성을 검정하기 위한 예시적인 방법은 예를 들어 그 전체가 본원에 참조로 포함된 PCT/US2021/019889의 실시예 16 내지 19 및 22 내지 23에 개시된다.
실시예 J: 생체내 CART 제조에서 스타터 분자의 사용
이 실시예는 생체내 CART 제조에서 사용하기 위한 스타터 분자의 특성규명을 기재한다. 이 스타터 분자는 항-CD3 scFv에 융합된 항-CD28 항체를 포함하는 항-CD3/항-CD28 이중특이적 분자이다(도 51a). 이 스타터 분자는 SEQ ID NO: 726의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 728의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 이 스타터 분자의 Fc 영역은 Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A/L235A/S267K/P329A 돌연변이를 포함한다.
첫 번째 시험관내 연구에서 스타터 분자를 MSP를 통해 전달될 때 T 세포 활성화 및 형질도입을 매개하는 능력에 대해 시험하였다. 간략하게, 단리된 T 세포를 해동하고 96-웰 플레이트에 첨가하기 전에 100 단위/mL의 IL2와 함께 무혈청 T 세포 배지에서 1e6 세포/mL로 재현탁하였다. 각각의 MSP 배치 20 mg을 둘베코 PBS(Thermo: # 14190144)에 30 mg/mL로 재현탁하고 MSP(또는 동일한 부피의 DPBS) 1.5 mg을 에펜도르프 튜브에 첨가하였다. 동일한 에펜도르프 튜브에 스타터 2.1 μg을 첨가하였다. 렌티바이러스를 얼음 위에서 해동하고 DPBS로 1.4e8 TU/mL로 희석한 후 7e7 TU의 바이러스를 각각의 전술한 튜브에 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이팅된 T 세포에 투여하기 전에 T 세포 배지로 연속 희석하였다. 성분을 T 세포 활성화 전 3일 동안 T 세포와 공동 배양하고 유세포측정을 사용하여 형질도입을 평가하였다.
2개의 독립적으로 생산된 MSP 배치에 렌티바이러스 및 스타터 분자를 로딩한 후 T 세포와 시험관내 공동 배양하였다. MSP에 결합된 스타터 분자의 전달은 특히 더 희석된 조건에서, 분자의 가용성 전달과 비교하여 활성화 및 형질도입을 향상시켰다(도 51b 및 도 51c). MSP-바이러스-스타터 복합체를 3일 동안 T 세포와 공동 배양한 후, 활성화 판독으로서 CD25 발현을 검사하기 위해 유세포측정을 수행하고(도 51b), 형질도입을 측정하기 위해 GFP 발현을 분석하였다(도 51c). 데이터는 MSP 배치 중 하나와 형성된 복합체가 T 세포를 활성화하고 T 세포 형질도입을 매개할 수 있었음을 나타낸다. MSP를 사용한 활성화 및 형질도입이 종 모양의 반응을 나타난다는 것은 주목할 가치가 있다. 이론에 구애됨이 없이, T 세포 배양에서 고농도의 MSP는 T 세포 생활성에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며, 결과적으로 활성화 및 형질도입 효율을 저해할 수 있다.
두 번째 시험관내 연구에서는 초음파분쇄 또는 비드 균질화를 통한 MSP의 크기 감소가 MSP 성능에 영향을 미치는지 여부를 시험하였다. 단리된 T 세포를 해동하고 100 단위/mL의 IL-2를 갖는 무혈청 T 세포 배지에 1e6 세포/mL로 재현탁한 후 96-웰 플레이트에 첨가하였다. MSP 60 mg을 DPBS에 30 mg/mL로 재현탁하였다. MSP 용액의 일부를 비드 균질화에 의해 크기를 감소시켰다. 또한 30 mg의 MSP를 멸균수에 5 mg/mL로 재현탁한 다음 Q125 시스템(qSonica) 초음파분쇄 프로브를 사용하여 40%의 진폭에서 2분의 지속기간 동안 초음파분쇄하였다(초음파분쇄는 30초 휴지를 포함하여 15초 간격으로 수행됨). 초음파분쇄 후, MSP를 원심분리하여 물을 흡인하고 DPBS에서 30 mg/mL로 재현탁하였다. 전체 크기 또는 크기-감소 MSP 1.5 mg을 새 에펜도르프 튜브에 첨가하고 동일 부피의 DPBS를 별도의 에펜도르프 튜브에 가용성 바이러스 대조군으로 첨가하였다. 그런 다음 해동된 바이러스 8e7 TU를 첨가하기 전에 1.6 μg의 스타터 분자를 MSP 또는 DPBS에 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 T 세포 배지로 연속 희석하고 플레이팅된 T 세포에 첨가하였다. 성분을 T 세포 활성화 전 3일 동안 T 세포와 공동 배양하고 유세포측정을 사용하여 형질도입을 평가하였다.
GFP-인코딩 렌티바이러스 및 스타터 분자를 크기 감소가 비드 균질화 또는 MSP의 초음파분쇄를 사용하여 달성된 전체 크기 또는 크기-감소 MSP에 로딩하였다. MSP-바이러스-스타터 복합체는 CD25 발현(활성화) 및 GFP 발현(형질도입)에 대해 유세포측정 분석을 수행하기 전에 3일 동안 T 세포와 공동 배양하였다. MSP의 크기 감소는 T 세포 활성화(도 52a) 및 형질도입(도 52b)과 관련하여 시험관내 효능에 부정적인 영향을 미치지 않았고, 초음파분쇄된 MSP는 시험된 MSP 조건의 가장 큰 최대 형질도입 효율을 실증하였다.
다음으로, 생체내 CART 제조에서 스타터 분자의 사용을 검사하기 위해 생체내 연구(도 53a)를 수행하였다. 간략하게, VEGF-C 로딩된 크리오겔(도 53a에서 "주사제 1")을 제-16일에 주사한 후 제-14일에 20e6개 인간 PBMC를 주사하였다. 14일 후, MSP(도 53b에서 "주사제 2")에 공동-로딩된 CD19 CAR-인코딩 바이러스 및 스타터 분자의 상이한 조합을 크리오겔 위치 위에 피내 주사하였다. 주간 채혈 혈액에 대해 유세포측정을 수행하고 림프구 집단의 증대를 평가하였다. 제18일에 상당한 CAR-T 증대를 갖는 마우스를 안락사시키고 순환 림프구를 심장 천자를 통해 수확하고 CAR% 및 세포수를 분석하고, 군 내에서 풀링하고, 4일 전 1e6개 NALM6로 시험감염된 마우스에 차용 전달하였다. 주간 채혈 및 종양의 격주 발광 이미지화를 연구가 끝날 때까지 수행하였다. 이 연구의 목적은 1) 각각의 주사제의 단일 성분의 필요성을 밝히고 2) 생체내 제조된 CAR-T가 종양 부하를 제어하는 능력을 실증하는 것이었다.
도 53c에 나타낸 바와 같이, 생체내 제조된 CAR-T는 NALM6 종양 보유 마우스에 차용 전달되었을 때 이들 마우스에서 이의 표적 CD19 수용체를 인식하고 B 세포를 고갈시킬 수 있었다. 도 53d에 나타낸 바와 같이, CART가 없는 공여체 마우스로부터의 전달된 PBMC로 처리된 종양(도 53d에서 "PBMC 대조군")은 미처리된 NALM6 종양(도 53d에서 "NALM6")과 비교하여 필적하는 성장 동역학을 나타내었다. 유리 바이러스(도 53d에서 "유리 바이러스") 또는 MSP-전달 바이러스(도 53d에서 "MSP 바이러스")를 사용하여 제조된 3e5개 CAR-T 용량으로 처리된 마우스는 감소된 종양 부담을 나타내었다. 이러한 데이터는 생체내 생성된 CART가 생체내 강력한 항-종양 활성을 실증했음을 나타낸다.
또한 순환에서 생체내-생성 CART의 증대를 검사하였다. 크리오겔 부위에 주사제 2의 피내 주사 13일 후, VEGF-C 크리오겔, 바이러스(MSP-전달 또는 유리) 및 MSP-스타터의 조합으로 처리된 마우스는 총 순환 T 세포(도 53e)에서 유사한 CART 백분율, 및 혈중 CART 세포의 수/μl(도 53f)로 나타난 필적하는 CART를 나타내었다. 전체 치료 조합 없이 처리된 마우스는 더 낮은 수준의 CAR-T 수 및 CAR+ %를 나타냈다(도 53e 및 도 53f).
주사제 2의 피내 주사 18일 후, 유사한 양의 순환 T 세포(도 53h)에도 불구하고, MSP 상에 공동-로딩된 바이러스 및 스타터로 처리된 마우스는 유리 바이러스와 조합된 MSP-전달 스타터로 처리된 마우스와 비교하여 더 높은 CAR-T 수(도 53i) 및 CAR+%(도 53j)를 가졌다. 제-18일 데이터는 혈액 림프구의 풀링 후 CAR+ 세포수를 결정하여 Nalm6 종양을 보유하는 마우스에 투약된 세포수를 결정하기 위해 사용하였다.
도 53k 및 도 53l은 차용 전달에 사용된 마우스 및 연구에 등록된 나머지 마우스로부터의 혈액의 조합 유세포측정 분석 결과를 나타낸다. 군 간에 순환 T 세포수에 있어서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 53k). 주사제 1 및 주사제 2의 전체 조합은 순환에서 CART의 최고 절대수를 유도하였다(도 53l).
실시예 K: VEGF-C의 지속 방출을 위한 HA-하이드로겔의 사용
이 실시예는 주사 부위에서 림프관신생 및 T-세포 편재를 달성하기 위해 VEGF-C 단백질의 지속 방출을 위한 히알루론산(HA)-하이드로겔의 사용을 설명한다.
실시예 1: 히알루론산의 기능화
Figure pct00180
이 실시예는 하이드로겔을 형성하기 위해 가교 모이어티와 반응하는, 아지드 기능화 히알루론산의 합성을 기재한다.
히알루론산 중간체[HA-N 3 ]의 합성
히알루론산 나트륨염은 401.3 Da의 반복 단위 분자량을 갖는, 글루쿠론산 및 N-아세틸갈락토사민의 반복 이량체 단위로 구성되는 선형 중합체이다. 이 실시예에서 보고된 히알루론산의 몰수는 반복 단위의 몰수를 지칭하고 히알루론산과의 반응에 사용되는 시약의 당량은 히알루론산 반복 단위의 몰수와 대비되어 보고된다. 중합체의 평균 분자량은 중합체 가닥 당 반복 단위의 평균 수를 결정한다. 히알루론산 나트륨염은 공칭 평균 분자량이 700 kDa이고 배치마다 다를 수 있는 표지 HA700K-5로 공급업체 Lifecore Biomedical에서 구입하였다.
700 KD[HA-N 3 ]-16%의 합성
히알루론산, 나트륨염(공칭 평균 분자량 700 kD; 258.9 mg, 0.62 mmol; Lifecore Biomedical, LLC; 상품 번호 HA700K-5)의 용액을 37.5 mL의 MES 완충액(50 mM, pH 5.5)에 완전히 용해시켰다. 이 용액에 4-(4',6'-디메톡시-1',3',5'-트리아진-2'-일)-4-메틸모르폴린-4-윰 클로라이드(DMTMM, 298.1 mg, 1.077 mmol, 1.736 eq)를 첨가하고, 이어서 5분 후 11-아지도-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민(201 mg, 0.921 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 미정제 반응 혼합물을 투석막(MWCO 50 kDa)에 채우고, 투석 용액을 여러 번 교체하면서 0.25 M NaCl에 대해 1 내지 3일 동안 투석한 다음, 또한 투석 용액을 여러 번 교체하며 탈이온수에 대해 1 내지 3일 동안 투석하였다. 완료 시, 샘플을 투석 튜브에서 제거하고 급속 냉동하고 동결건조하여 700 kDa[HA-N 3 ]-16%를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 4.45 (bs, 1.71H), 4.0-3.1 (m, 16H), 1.95 (s, 3H).
DOSY-NMR. 1차원 확산 정렬 NMR 스펙트럼(DOSY)을 5 mm DCH 크리오프로브(cryoprobe)가 구비된 Bruker AVANCE III 400 MHz(1H-NMR용) 기기에서 하나의 스포일 구배 펄스 시퀀스를 갖는 자극 에코(stegp1s1d)를 사용하여 수집하였다. 확산 시간 및 확산 구배 시간은 각각 50 ms 및 4 ms로 설정하였다. 2개 스펙트럼을 2% 및 95%로 설정된 구배 강도(gpz6)로 수집하였다. 2개 스펙트럼의 비교는 용매 피크를 제외하고 차이를 나타내지 않았고, 이는 중합체에 소분자 불순물이 존재하지 않음을 나타낸다.
정제된 샘플의 원소 분석은 하기 원소 함량을 나타내었다 - C: 38.9%: H: 5.42%; N: 4.85%.
[HA-N 3 ]의 치환도는 반복 단위의 %로 정의되며 카복실레이트 모이어티가 반응을 거치게 하여 도시된 아미드를 얻었다. 원소 분석을 사용하여 치환도를 결정하였다. 정제된 샘플의 원소 분석에 의해 결정된 [%C/%N] 비를 하기 식에 입력하여 치환도를 제공하였다. 여기서 y = [(C%) / (N%)])이고, 따라서:
치환도 =
Figure pct00181
이다.
이 실시예에서, [HA-N 3 ]의 치환도(DS)는 16%였다.
16%의 아지드 링커로 기능화된, 이 700 kDa 히알루론산은 700 kDa[HA-N 3 ]-16%로 표지한다.
200 KD[HA-N 3 ]-24%의 합성
또 다른 양태에서, 히알루론산, 나트륨염(공칭 평균 분자량 200 kD)을 실시예 1에서 전술한 바와 같이 반응시켰다.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 4.45 (bs, 2H), 4.0-3.1 (m, 18H), 1.95 (s, 3H).
원소 분석: C: 39.94%: H: 5.53%; N: 5.73%.
나머지 실시예에서, X%의 아지드 링커로 기능화된 700 kDa 및 200 kDa 히알루론산은 각각 700 kDa[HA-N 3 ]-X% 및 200 kDa[HA-N 3 ]-X%로 표지한다.
[HA-N 3 ] 중간체는 또한 접선 유동 여과에 의해 정제할 수 있다. 반응 혼합물을 0.25 M NaCl 용액 25 mL로 희석하고 접선 유동 여과로 정제하였다. 400 mL의 0.25 M NaCl 용액에 이어 400 mL의 물로 용출하며, 30 kDa MWCO Vivaflow-50R Hydrosart 카트리지(Sartorius)를 사용하여 접선 유동 여과를 수행하였다. 제품을 급속 냉동하고 동결건조하여 최종 생성물을 얻었다.
실시예 2: 가교제(XL)의 합성
XL-1 합성
Figure pct00182
XL-1a. PEG(2000)-비스-3-((tert-부톡시카보닐)아미노)-2-메틸프로파노에이트
Figure pct00183
3-((tert-부톡시카보닐)아미노)프로판산(0.152 g, 0.75 mmol) 및 Mn 약 2 kDa PEG(0.5 g, 0.250 mmol)를 15 mL 디클로로메탄에 용해시켰다. 디메틸아미노피리딘(0.015 g, 0.125 mmol) 및 EDC·HCl(0.192 g, 1.003 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 미정제 생성물을 0 내지 15% 디클로로메탄: 메탄올 구배로 실리카 상의 플래쉬 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물 함유 분획을 조합하고 감압 건조하여 XL-1a를 제공하였다. 1H NMR
(400 MHz, 메탄올-d4) δ 4.23 (m, 4H), 3.63 (m, 170H), 3.22 (m, 4H) 2.66 (m, 2H), 1.43 (s, 18H), 1.13 (m, 6H).
XL-1b. PEG(2000)-비스-[메틸-3-아미노-2-메틸프로파노에이트], 비스-트리플루오로아세트산
Figure pct00184
XL-1a(260 mg, 0.108 mmol)를 디클로로메탄(3 mL)에 용해시켰다. 트리플루오로아세트산을 첨가하고(0.415 mL), 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제 생성물을 Et2O로 2회 분쇄한 다음, 진공 하에 건조하여 XL-1b를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d4) δ 4.45 (m, 2H), 4.22 (m, 2H), 3.59 (m, 177H), 3.12 (m, 4H), 2.87 (m, 2H), 1.22 (m, 6H).
XL-1. PEG(2000)-비스 3-(((((1R,8S,9s)-바이사이클로[6.1.0]논-4-인-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-2-메틸프로파노에이트
Figure pct00185
XL-1b(200 mg, 0.086 mmol)를 아세토니트릴(3 mL)에 용해시켰다. 트리에틸아민(0.599 mL, 4.30 mmol)에 이어서, ((1R,8S,9s)-바이사이클로[6.1.0]논-4-인-9-일)메틸 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 카보네이트(200 mg, 0.688 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 ELSD 트리거 분획 수집을 포함하는 분취용 역상 HPLC로 직접 정제하였다(아래 방법). 생성물 함유 분획을 풀링하고, 냉동하고 동결건조하여 XL-1을 제공하였다. 보관을 위해, XL-1을 아세토니트릴, DMSO, 또는 메탄올 용액으로 냉동고에서 유지하였다. 분석용 HPLC-CAD(아래 방법): 보유 시간 = 2.75분. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d4) δ 4.23 (m, 4H), 4.14 (m, 4H), 3.63 (m, 188H), 2.68 (m, 2H), 2.22 (m, 12H), 1.60 (m, 4H), 1.37 (m, 2H), 1.14 (m, 6H), 0.94 (m, 4H).
XL-2 합성
Figure pct00186
Mn 약 2 kDa PEG 디아민 하이드로클로라이드(JenKem Technology, 300 mg, 0.148 mmol)를 아세토니트릴(3 mL)에 용해시켰다. 트리에틸아민(0.413 mL, 2.96 mmol)에 이어서 ((1R,8S,9s)-바이사이클로[6.1.0]논-4-인-9-일)메틸 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 카보네이트(345 mg, 1.184 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 ELSD 트리거 분획 수집을 포함하는 분취용 역상 HPLC로 직접 정제하였다(아래 방법). 생성물 함유 분획을 풀링하고, 냉동하고 동결건조하여 XL-2를 제공하였다. 보관을 위해, XL-2를 아세토니트릴, DMSO, 또는 메탄올 용액으로서 냉동고에 유지하였다. 분석용 HPLC-CAD(아래 방법): 보유 시간 = 2.61분. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d4) δ 4.14 (m, 4H), 3.63 (br s, 186H), 3.54 (m, 4H), 2.22 15 (m, 12H), 1.61 (m, 4H), 1.38 (m, 2H), 0.94 (m, 4H).
분취용 HPLC 조건: Waters XBridge C18; 입자 크기: 5 μm; 칼럼 크기: 19 × 250 mm; 용출액/구배: 5% CH3CN/H2O/0.5분, 5 내지 95% CH3CN/H2O/12.5분, 95% CH3CN/H2O/3분; 유속: 30 mL/분; 컬럼 온도: 실온.
분석용 HPLC-CAD 조건: Waters ACQUITY UPLC BEH C18; 입자 크기: 1.7 μm; 칼럼 크기: 2.1 × 50 mm; 용출액/구배: 2% CH3CN/H2O/0.5분, 2 내지 98% CH3CN/H2O/5분(0.1% 포름산 함유 CH3CN 및 0.1% 포름산 함유 H2O); 유속: 1 mL/분; 컬럼 온도: 50℃.
실시예 3: 시험관내 및 생체내 연구를 위한 HA-하이드로겔 제형물의 제조
실시예 2에서 제조된 가교제 용액(50 mg/mL)을 감압 하에 건조하여 ACN(아세토니트릴)을 제거하였다. 동일한 양의 1X PBS를 건조 잔류물에 첨가하여 1X PBS 완충액에서 50 mg/mL 농도의 가교제를 얻었다. 이 신선 제조된 용액을 시험관내 및 생체내 연구를 위한 제형물의 제조에 사용하였다.
H1a. 원 위치 형성 HA-하이드로겔 합성
200 kDa[HA-N3]-24%(122.4 mg, 치환도 = 24%)를 7.26 mL 1X PBS 완충액 pH 7.4에(16.9 mg/mL, 칭량 농도로) 용해시키고 빛으로부터 보호하면서 실온에서 밤새 교반하였다. 비치환 카복실레이트 나트륨염 반복 이량체 단위의 분자량은 401.3 Da이다. 아지딜화된 반복 이량체 단위의 MW는 579.6 Da이다. 200 kDa[HA-N 3 ]-24%의 나트륨염 형태에 대한 이량체 단위의 평균 MW는 444.1 Da = ((401.3 × 0.76) + (579.6 × 0.24))이다. 나트륨염 이량체 단위의 평균 MW를 사용하면 반복 이량체 단위의 총 몰수는 276 μmol이고 아지딜화 반복 이량체 단위의 몰수는 66.2 μmol이다. 200 kDa HA-N3-24%(3.38 mg, 7.61 μmol) 200 μL를 원액으로부터 분취하고, 10.4 μl의 XL-2 가교제(0.52 mg, 0.221 μmol의 시약, 0.442 μmol의 반응성 기능부, 1X PBS에서 50 mg/mL)를 첨가하여 달성하였다. 이는 XL-2에 의한 200 kDa [HA-N 3 ]-24% 반복 단위의 6.7%의 예측 가교를 갖는 용액을 생성하였다((0.442 μmol[XL-2-반응성 기능부]/66.2 μmol[HA 단위) × 100 = 6.7%). 혼합물을 볼텍싱하고 50 μl 분취량의 혼합 용액을 에펜도르프 튜브에 신속하게 첨가하고 실온에서 밤새 보관하였다. 다음날 육안 검사는 H1a 겔의 형성을 나타내었다.
H2a 하이드로겔 합성
VEGF-C 단백질을 200 kDa[HA-N 3 ]-24% 용액과 혼합하고 전술한 바와 같이 가교제 XL-2로 겔화 반응을 수행하여 H2a 겔을 제조하였다.
H3a 하이드로겔 합성
VEGF-C 단백질을 200 kDa[HA-N 3 ]-24% 용액과 혼합하고 전술한 바와 같이 2X 양의 가교제 XL-1로 겔화 반응을 수행하여 H3a 겔을 제조하였다.
H4a 하이드로겔 합성
VEGF-C 단백질을 700 kDa[HA-N 3 ]-16% 용액과 혼합하고 상기한 바와 같이 2X 양의 가교제 XL-2로 겔화 반응을 수행하여 H4a 겔을 제조하였다.
H5a 하이드로겔 합성
VEGF-C 단백질을 700 kDa[HA-N 3 ]-16% 용액에 첨가하기 전에 라포나이트 XLG(BYK 첨가제)와 복합체화하였고 최종 겔에서 라포나이트 농도는 0.25 mg/mL이었다. 전술한 바와 같이 2X 양의 가교제 XL-2로 겔화 반응을 수행하여 H5a 겔을 제조하였다.
H6a 하이드로겔 합성
VEGF-C 단백질을 700 kDa[HA-N 3 ]-16% 용액에 첨가하기 전에 라포나이트 XLG(BYK 첨가제)와 복합체화하였고 최종 겔에서 라포나이트 농도는 1 mg/mL이었다. 전술한 바와 같이 2X 양의 가교제 XL-2로 겔화 반응을 수행하여 H6a 겔을 제조하였다.
H3b. HA 하이드로겔 입자 합성
전술한 바와 같이 제조된 200 μL의 H3a 겔을 100메쉬 스테인리스 강 스크린 디스크를 통해 1 mL 주사기로 밀어넣어 거친 겔 입자를 생성하였다. 100 μL의 1X PBS를 이 주사기에 첨가한 다음 볼텍싱하여 혼합하였다. 주사기를 실온에서 6시간 동안 유지하여 하이드로겔이 팽창되도록 하였다. 팽창한 굵은 겔 입자의 H3a를 200-메쉬 스테인레스 강 스크린 디스크를 통해 20회 밀어넣어 미세 겔 입자를 수득하여 H3b 생성물을 얻었다.
H5b 하이드로겔 합성
H5a 겔을 미세한 겔 입자로 압출하여 최종 H5b 생성물을 얻었다.
H6b 하이드로겔 합성
H6a 겔을 미세한 겔 입자로 압출하여 최종 H6b 생성물을 얻었다.
시험관내 방출 연구 설정
950 μl PBS-2% BSA 완충액을 하이드로겔의 50 μL 분취량에 첨가하고 300 rpm으로 진탕하여 37℃에서 인큐베이션하였다. 800 μl 분취량을 상이한 시점에서 채취하였고 그 시점들에서 겔은 제거하지 않았다. 연구 샘플을 동일한 양의 1X PBS-2% BSA 완충액으로 보충하여 연구 샘플의 부피를 동일하게 유지하였다. 이어서 방출 샘플을 VEGF-C 함량에 대해 ELISA로 분석하였다.
생체내 연구 설정
H3a 겔 제조를 위한 모든 성분을 혼합한 후, 튜브를 볼텍싱하고 신속하게 인슐린 주사기의 뒷면에 채웠다. 샘플을 플런저로 주사기 내부로 밀어넣고 형성된 임의의 기포를 제거하였다. 30 μL를 혼합 2 내지 3분 내에 마우스에 피내 주사하였다.
결과
VEGF-C의 지속 방출은 상이한 조성의 HA-하이드로겔을 사용하여 시험관내 달성하였다(도 54a 내지 도 54d). 700 kDa[HA-N 3 ]-16% 및 200 kDa[HA-N 3 ]-24%로 제조된 HA-하이드로겔에 대한 방출 곡선에서 차이가 관찰되지 않았다(도 54a). HA-하이드로겔 제형물로부터의 VEGF-C 방출은 라포나이트를 첨가하여 조정할 수 있다. 라포나이트를 함유하는 HA-하이드로겔 제형물은 라포나이트를 함유하지 않는 제형물과 비교하여 VEGF-C 단백질의 농도 의존적으로 더 느린 방출을 제공하였다(도 54b). 라포나이트를 함유하는 원 위치 형성 하이드로겔 및 HA-하이드로겔 입자는 VEGF-C 단백질에 대해 유사한 방출 프로파일을 제공하였다(도 54c 및 도 54d).
생체내 연구는 마우스에서 H1a 및 H3a 원 위치 형성 하이드로겔의 피내 주사로 수행하였다. VEGF-C 함유 제형물(H3a)은 대조군(H1a) 제형물과 비교하여 제7일 분석 후 림프 내피 세포(LEC) 및 T4 세포의 증가를 나타냈다(도 55a 및 도 55b).
균등부
본원에 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물의 개시는 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 발명은 특정 구현예와 관련하여 개시되었지만, 당분야의 다른 당업자가 본 발명의 진정한 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 본 발명의 추가 구현예 및 변형을 고안할 수 있을 것임이 분명하다. 첨부된 청구범위는 모든 이러한 구현예 및 동등한 변형을 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
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Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 31 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 31 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 32 <400> 32 000 <210> 33 <400> 33 000 <210> 34 <211> 5000 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> SITE <222> (1)..(5000) <223> /note="This sequence may encompass 50-5000 nucleotides" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 34 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 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<223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 189 Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 190 <400> 190 000 <210> 191 <400> 191 000 <210> 192 <400> 192 000 <210> 193 <400> 193 000 <210> 194 <400> 194 000 <210> 195 <400> 195 000 <210> 196 <400> 196 000 <210> 197 <400> 197 000 <210> 198 <400> 198 000 <210> 199 <400> 199 000 <210> 200 <400> 200 000 <210> 201 <400> 201 000 <210> 202 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 202 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 35 40 45 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 50 55 60 Ile Thr Leu Tyr Cys 65 <210> 203 <400> 203 000 <210> 204 <400> 204 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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu 465 470 475 480 Val Gln Pro Gly Asp Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe 485 490 495 Thr Phe Ser Lys Gln Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Lys Lys 500 505 510 Gly Leu Glu Trp Ile Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Met Tyr 515 520 525 Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 530 535 540 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 545 550 555 560 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Phe Trp Trp Asp Leu Asp Phe Asp His 565 570 575 Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 580 585 590 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 595 600 605 Ile Leu Val Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Gly 610 615 620 His Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Arg Ser Glu 625 630 635 640 Gly Thr Thr Tyr Phe Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 645 650 655 Gln Leu 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Claims (54)

  1. 생체물질 및 세포 동원 인자를 포함하는 제1 조성물; 및
    바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 포함하는, 복수의 조성물.
  2. 생체물질 및 세포 동원 인자를 포함하며,
    생체물질은 하이드로겔, 예를 들어 크리오겔(예를 들어, 알기네이트 크리오겔) 또는 히알루론산 하이드로겔(HA 하이드로겔)을 포함하고,
    세포 동원 인자는 SEQ ID NO: 741에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 단 SEQ ID NO: 741의 위치 26에 있는 아미노산은 시스테인(C)이 아니며, 선택적으로 SEQ ID NO: 741의 위치 26에 있는 아미노산은 알라닌(A)인, 제1 조성물.
  3. 생체내에서 대상체의 세포를 형질도입하거나 대상체에서 질환, 장애 또는 질병을 치료하는 방법으로서,
    대상체의 부위(예를 들어, 높은 피하 공간 또는 진피에 인접한 피하 공간)에 생체물질 및 세포 동원 인자를 투여하는 단계, 및
    트랜스유전자를 포함하는 바이러스 벡터 또는 핵산을 대상체에 투여하는 단계를 포함하며;
    그에 의해 대상체의 세포를 트랜스유전자로 형질도입하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 생체물질 및 세포 동원 인자가 제1 조성물에 포함되고, 바이러스 벡터 또는 핵산이 제2 조성물에 포함되는, 방법.
  5. 제1항, 제3항 또는 제4항에 있어서, 생체물질이
    (i) 하이드로겔을 포함하고/하거나;
    (ii) 크리오겔, 예를 들어 알기네이트 크리오겔을 포함하고/하거나;
    (iii) 히알루론산 하이드로겔(HA 하이드로겔)을 포함하고/하거나;
    (iv) 젤라틴, 히알루론산, 콜라겐, 알기네이트, 라미닌, 키토산, 실크 피브로인, 아가로스, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리비닐 알코올 및/또는 하이드록시에틸 메틸아크릴레이트를 포함하고/하거나;
    (v) 알기네이트 하이드로겔을 포함하고/하거나(선택적으로 여기서 알기네이트 하이드로겔은 노르보르넨 및/또는 테트라진을 추가로 포함하고, 선택적으로 노르보르넨 및/또는 테트라진은 알기네이트와 공유적으로 회합(예를 들어 이에 화학적으로 연결)되거나 비공유적으로 회합(예를 들어 이에 흡착)됨);
    (vi) 지름이 약 10 μm 내지 약 300 μm, 예를 들어 약 50 μm 내지 약 300 μm인 기공을 포함하거나 기공을 전혀 포함하지 않고/않거나;
    (vii) 화학적으로 가교되는, 복수의 조성물 또는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생체물질을 포함하는 제1 조성물이 라포나이트를 추가로 포함하거나; 생체물질이 라포나이트를 추가로 포함하는 제1 조성물 내에 포함되며; 선택적으로 라포나이트는 약 0.15 mg/mL 내지 약 0.35 mg/mL, 예를 들어 약 0.25 mg/mL의 농도로 존재하는, 복수의 조성물, 제1 조성물, 또는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 동원 인자가
    (i) 생체물질과 비공유적으로 회합(예를 들어 이에 흡착)되거나;
    (ii) 생체물질과 공유적으로 회합(예를 들어 이에 접합)되는, 복수의 조성물, 제1 조성물, 또는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 동원 인자가
    (i) 림프관신생을 유도하고/하거나;
    (ii) 림프 내피 세포의 성장을 유도하고/하거나;
    (ii) 면역 세포를 동원하며, 선택적으로 면역 세포는 T-세포 및/또는 NK-세포를 포함하는, 복수의 조성물, 제1 조성물, 또는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 림프관신생의 유도가
    (i) 림프 내피 세포(LEC)(예를 들어, CD45-CD31+PDPN+ 세포) 수준의 증가를 포함하고, 선택적으로 LEC 수준은 검정, 예를 들어 유세포측정 검정에 의해, 예를 들어 실시예 H 또는 I에 기재된 바와 같이 측정될 때 참조 수준(예를 들어, 복수의 조성물 또는 제1 조성물의 주사 전 대상체의 부위에서의 LEC 수준)과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 200% 증가되고/되거나;
    (ii) 검정, 예를 들어 유세포측정 검정에 의해, 예를 들어 실시예 H 또는 I에 기재된 바와 같이 측정될 때 조직 1 밀리그램당 적어도 50개 LEC(예를 들어, 적어도 75, 100, 125, 150, 200, 225 또는 250개 LEC)를 생성하는, 복수의 조성물, 제1 조성물, 또는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 동원 인자가 T 세포를 동원하고, 선택적으로 T 세포는 나이브 T 세포(예를 들어, CD45RA+CD62L+ T 세포 또는 CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+ T 세포)를 포함하는, 복수의 조성물, 제1 조성물, 또는 방법.
  11. 제10항에 있어서, T 세포의 동원이 T 세포 수준의 증가를 포함하고, 선택적으로 T 세포 수준은 검정, 예를 들어 유세포측정 검정에 의해, 예를 들어 실시예 H 또는 I에 기재된 바와 같이 측정될 때 참조 수준(예를 들어, 복수의 조성물 또는 제1 조성물의 주사 전 대상체의 부위에서의 T 세포 수준)과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 또는 300% 증가되는, 복수의 조성물, 제1 조성물 또는 방법.
  12. 제1항, 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 동원 인자가 VEGF-C, IL-2, IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), GM-CSF, CXCL12, CXC3L1, CCL19, CCL21, CXCL10 또는 CXCL11로부터 선택되는, 복수의 조성물 또는 방법.
  13. 제1항, 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 동원 인자가 VEGF-C를 포함하고, 선택적으로 VEGF-C는
    (i) 성숙 VEGF-C 펩티드, 선택적으로 이의 마이너 또는 메이저 성숙 형태 또는 돌연변이된 변이체를 포함하고/하거나;
    (ii) 단량체 또는 이량체이고/이거나;
    (iii) 유효량, 선택적으로 약 1 mg 이하, 약 10 mg 이하, 약 10 μg 이상, 약 1 μg 이상, 약 1 μg 내지 1 mg, 약 10 μg 내지 1 mg, 약 1 μg 내지 10 mg, 또는 약 10 μg 내지 10 mg의 양으로 존재하는, 복수의 조성물, 또는 방법.
  14. 제13항에 있어서, VEGF-C가
    (i) 표 18에 제공된 서열 중 임의의 하나의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열로서, 선택적으로 링커(예를 들어, 글리신-세린 링커) 및/또는 his 태그를 포함하거나 포함하지 않는, 서열; 및/또는
    (ii) SEQ ID NO: 725에 따라 넘버링된 C137A의 아미노산 치환을 포함하는, 복수의 조성물 또는 방법.
  15. 제1항, 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 동원 인자가
    (i) SEQ ID NO: 741에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(단 SEQ ID NO: 741의 위치 26에 있는 아미노산은 시스테인(C)이 아니고, 선택적으로 SEQ ID NO: 741의 위치 26에 있는 아미노산은 알라닌(A)임);
    (ii) SEQ ID NO: 743에 따른 아미노산 서열 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열 아미노산 서열;
    (iii) SEQ ID NO: 740에 따른 아미노산 서열 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (iv) SEQ ID NO: 736에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (v) 링커(예를 들어, 여기서 링커는 Gly-Ser의 서열을 갖고, 선택적으로 링커는 SEQ ID NO: 743의 C-말단 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열임);
    (vi) SEQ ID NO: 735에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (vii) SEQ ID NO: 734에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및/또는
    (viii) SEQ ID NO: 733에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 복수의 조성물, 또는 방법.
  16. 제1항, 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 동원 인자가 VEGF-C 또는 이의 기능적 변이체; IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 또는 이의 기능적 변이체; IL-7 또는 이의 기능적 변이체; 또는 이의 조합을 포함하는, 복수의 조성물, 또는 방법.
  17. 제1항, 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 조성물이 입자를 추가로 포함하는, 복수의 조성물 또는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 입자가 메조다공성 입자, 실리카 입자 및/또는 메조다공성 실리카 입자이고, 선택적으로 메조다공성 실리카 입자는 메조다공성 실리카 막대인, 복수의 조성물 또는 방법.
  19. 메조다공성 실리카 입자;
    바이러스 벡터; 및
    세포 활성화제를 포함하는, 조성물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 메조다공성 실리카 입자가
    (i) 표면 변형을 포함하고/하거나(선택적으로 여기서 표면 변형은
    (a) 선택적으로 C1 내지 C20 알킬 또는 (-O(CH2-CH2-)1-25 링커를 사용하는, -OH(하이드록실), 아민, 카복실산, 포스포네이트, 할라이드, 아지드, 알킨, 에폭시드, 설프하이드릴, 폴리에틸렌이민, 소수성 모이어티 또는 이의 염;
    (b) 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민; 및/또는
    (c) 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정된 평균 분자량이 약 1000 내지 20,000 Da, 약 1,200 내지 15,000 Da, 약 1,500 내지 12,000 Da, 약 2,000 Da, 약 3,000 Da, 약 4,000 Da, 약 5,000 Da, 약 6,000 Da, 약 7,000 Da, 약 8,000 Da, 약 9,000 Da 또는 약 10,000 Da인 폴리에틸렌이민을 포함함);
    (ii) 트리메틸암모늄 기능화 메조다공성 실리카 입자, 예를 들어 N,N,N-트리메틸프로판-1-암모늄 기능화 메조다공성 실리카 입자이고/이거나;
    (iii) 복수의 기공을 포함하며, 선택적으로 기공의 지름은 2 내지 50 nm이고/이거나;
    (iv) 적어도 약 100 m2/g의 표면적을 포함하는, 복수의 조성물, 방법, 또는 제2 조성물.
  21. 제1항, 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 바이러스 벡터가 메조다공성 실리카 입자와 비공유적으로, 예를 들어 정전기적으로 또는 공유적으로 회합되고/되거나;
    (ii) 세포 활성화제가 메조다공성 실리카 입자와 비공유적으로 또는 공유적으로 회합되는, 복수의 조성물, 제2 조성물, 또는 방법.
  22. 생체내에서 대상체의 세포를 형질도입하거나 대상체에서 질환, 장애 또는 질병을 치료하는 방법으로서,
    트랜스유전자를 포함하는 바이러스 벡터 또는 핵산을 대상체의 부위에 투여하는 단계를 포함하고; 그에 의해 세포를 형질도입하고,
    대상체는 림프관신생 및/또는 대상체의 부위로의 T 세포의 동원을 유도하기에 충분한 양으로 생체물질 및 세포 동원 인자를 이전에 투여받은 적이 있는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 바이러스 벡터가 입자, 예를 들어 메조다공성 실리카 입자와 비공유적으로, 예를 들어 정전기적으로, 또는 공유적으로 회합되는, 방법.
  24. 제1항, 제3항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가
    (i) 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 헤르페스 바이러스; 및/또는
    (ii) 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 복수의 조성물, 제2 조성물, 또는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 TCR, 사이토카인, 케모카인, shRNA, 또는 종양 항원을 표적화하도록 조작된 폴리펩티드를 인코딩하는, 복수의 조성물, 제2 조성물, 또는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 종양 항원이 TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, 엽산 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 파단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 복수의 조성물, 제2 조성물, 또는 방법.
  27. 제1항, 제3항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 신호전달 영역 및 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 인코딩하고,
    (i) 항원 결합 도메인은 CD19, CD123, CD22, CD20, EGFRvIII, BCMA, 메소텔린, CD33, CLL-1, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 결합하고/하거나;
    (ii) 막관통 도메인은 CD8 힌지를 포함하고/하거나;
    (iii) 공동자극 신호전달 영역은 4-1BB 또는 CD28 공동자극 신호전달 도메인으로부터 선택되고/되거나;
    (iv) 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는, 복수의 조성물, 제2 조성물, 또는 방법.
  28. 제1항, 제4항 내지 제18항, 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 조성물이 세포 활성화제를 추가로 포함하는, 복수의 조성물, 또는 방법.
  29. 제19항 내지 제21항, 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 활성화제가
    (a) CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 공동자극 분자 및/또는 성장 인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하고/하거나;
    (b) (i) 항-CD3 결합 도메인, 및 (ii) 공동자극 분자 결합 도메인(예를 들어, 항-CD2 결합 도메인 또는 항-CD28 결합 도메인)을 포함하는 다중특이적 결합 분자이고/이거나;
    (c) 표 20에 제공된 임의의 중쇄의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및/또는 표 20에 제공된 임의의 경쇄의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및/또는
    (d) 입자, 예를 들어 메조다공성 실리카 입자에 접합되거나 흡착되는, 복수의 조성물, 방법, 또는 제2 조성물.
  30. 제29항에 있어서,
    (i) 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv가 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab 또는 항-CD28 Fab의 N-말단에 위치하거나;
    (ii) 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv가 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab 또는 항-CD28 Fab의 C-말단에 위치하고, 선택적으로,
    Fc 영역은 항-CD3 결합 도메인과 공동자극 분자 결합 도메인 사이에 위치하거나;
    다중특이적 결합 분자가 CH2를 포함하고, 항-CD3 결합 도메인이 CH2의 N-말단에 위치하는, 복수의 조성물, 방법, 또는 제2 조성물.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 다중특이적 결합 분자가
    (i) N-말단에서 C-말단으로, 항-CD3 결합 도메인의 VH, 항-CD3 결합 도메인의 VL, 공동자극 분자 결합 도메인의 VH, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및
    (ii) N-말단에서 C-말단으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 조성물, 방법, 또는 제2 조성물.
  32. 제29항 또는 제30항에 있어서, 다중특이적 결합 분자가
    (i) N-말단에서 C-말단으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, CH3, 항-CD3 결합 도메인의 VH, 및 항-CD3 결합 도메인의 VL을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및
    (ii) N-말단에서 C-말단으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 조성물, 방법, 또는 제2 조성물.
  33. 제29항 또는 제30항에 있어서, 다중특이적 결합 분자가
    (i) N-말단에서 C-말단으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VH, CH1, 항-CD3 결합 도메인의 VH, 항-CD3 결합 도메인의 VL, CH2 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및
    (ii) N-말단에서 C-말단으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 조성물, 방법, 또는 제2 조성물.
  34. 제29항 또는 제30항에 있어서, 다중특이적 결합 분자가
    (i) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A, L235A, S267K 및 P329A 돌연변이(LALASKPA);
    (ii) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A, L235A 및 P329G 돌연변이(LALAPG);
    (iii) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 G237A, D265A, P329A 및 S267K 돌연변이(GADAPASK);
    (iv) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A, L235A 및 G237A 돌연변이(LALAGA);
    (v) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 D265A, P329A 및 S267K 돌연변이(DAPASK);
    (vi) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 G237A, D265A 및 P329A 돌연변이(GADAPA);
    (vii) Eu 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A, L235A 및 P329A 돌연변이(LALAPA); 또는
    (viii) 표 20의 Fc 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역을 포함하는, 복수의 조성물, 방법, 또는 제2 조성물.
  35. 제29항, 제30항 또는 제34항에 있어서, 다중특이적 결합 분자가
    (i) SEQ ID NO: 726, 893, 또는 895 중 임의의 것의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는
    (ii) SEQ ID NO: 728, 730, 892, 또는 894 중 임의의 것의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 복수의 조성물, 방법, 또는 제2 조성물.
  36. 제29항, 제30항, 제34항 또는 제35항에 있어서, 다중특이적 결합 분자가
    (i) SEQ ID NO: 726의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 728의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (ii) SEQ ID NO: 726의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 730의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (iii) SEQ ID NO: 1416의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 728의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (iv) SEQ ID NO: 1416의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 730의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (v) SEQ ID NO: 893의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 892의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (vi) SEQ ID NO: 1417의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 892의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    (vii) SEQ ID NO: 895의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 894의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 복수의 조성물, 방법, 또는 제2 조성물.
  37. 제1항, 제4항 내지 제18항, 제20항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 조성물이 입자의 제1 집단 및 입자의 제2 집단, 예를 들어 메조다공성 실리카 입자의 제1 집단 및 메조다공성 실리카 입자의 제2 집단을 추가로 포함하고, 제1 집단은 바이러스 벡터를 포함하고 제2 집단은 세포 활성화제를 포함하며, 예를 들어 바이러스 벡터는 제1 집단의 입자와 비공유적으로 회합되고, 세포 활성화제는 제2 집단의 입자와 비공유적으로 회합되는, 복수의 조성물, 또는 방법.
  38. 제1항, 제2항, 제5항 내지 제21항, 제24항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 조성물이 주사 용도에 적합한, 복수의 조성물, 제1 조성물, 또는 제2 조성물.
  39. 제1항, 제2항, 제5항 내지 제21항, 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) Tet2 억제제로서, 선택적으로, (1) Tet2를 인코딩하는 유전자 내의 하나 이상의 부위, 또는 그 상응하는 조절 요소를 표적화하는 유전자 편집 시스템; (2) Tet2의 발현을 억제하는 핵산(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); (3) 단백질(예를 들어, 우성 음성, 예를 들어 촉매 불활성) Tet2, 또는 Tet2의 결합 파트너(예를 들어, Tet2의 우성 음성 결합 파트너); (4) Tet2의 발현 및/또는 기능을 억제하는 소분자; (5) (1) 내지 (3) 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산; 또는 (6) (1) 내지 (5)의 임의의 조합을 포함하는, Tet2 억제제; 및/또는
    (ii) ZBTB32 억제제로서, 선택적으로, (1) ZBTB32 유전자 또는 이의 하나 이상의 성분을 표적화하는 유전자 편집 시스템; (2) 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 핵산; 또는 (3) (1) 및 (2)의 조합을 포함하는, ZBTB32 억제제를 추가로 포함하는, 복수의 조성물, 제1 조성물, 또는 제2 조성물. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (1) ZBTB32 유전자 또는 이의 하나 이상의 성분을 표적화하는 유전자 편집 시스템을 포함한다. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (2) 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (1) 및 (2)의 조합을 포함한다.
  40. 제3항 내지 제18항, 제20항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) Tet2 억제제로서, 선택적으로, (1) Tet2를 인코딩하는 유전자 내의 하나 이상의 부위, 또는 그 상응하는 조절 요소를 표적화하는 유전자 편집 시스템; (2) Tet2의 발현을 억제하는 핵산(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); (3) 단백질(예를 들어, 우성 음성, 예를 들어 촉매 불활성) Tet2, 또는 Tet2의 결합 파트너(예를 들어, Tet2의 우성 음성 결합 파트너); (4) Tet2의 발현 및/또는 기능을 억제하는 소분자; (5) (1) 내지 (3) 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산; 또는 (6) (1) 내지 (5)의 임의의 조합을 포함하는, Tet2 억제제; 및/또는
    (ii) ZBTB32 억제제로서, 선택적으로, (1) ZBTB32 유전자 또는 이의 하나 이상의 성분을 표적화하는 유전자 편집 시스템; (2) 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 핵산; 또는 (3) (1) 및 (2)의 조합을 포함하는, ZBTB32 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (1) ZBTB32 유전자 또는 이의 하나 이상의 성분을 표적화하는 유전자 편집 시스템을 포함한다. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (2) 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 한 구현예에서, ZBTB32 억제제는 (1) 및 (2)의 조합을 포함한다.
  41. 생체내에서 대상체의 세포를 형질도입하거나 대상체에서 질환, 장애 또는 질병을 치료하는 방법으로서, 제1항, 제5항 내지 제18항, 제20항, 제21항, 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항의 복수의 조성물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  42. 생체내에서 대상체의 세포를 형질도입하거나 대상체에서 질환, 장애 또는 질병을 치료하는 방법으로서, 제2항, 제6항 내지 제11항, 제38항, 제39항 중 어느 한 항의 제1 조성물 및 제19항 내지 제21항, 제24항 내지 제27항, 제29항 내지 제36항, 제38항 중 어느 한 항의 제2 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  43. 제3항 내지 제18항, 제20항, 제21항, 제24항 내지 제37항, 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물이 순차적으로 투여되는, 방법.
  44. 제3항 내지 제18항, 제20항, 제21항, 제24항 내지 제37항, 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 조성물이 제2 조성물의 투여 전에 투여되고, 선택적으로
    (i) 제1 조성물은 제2 조성물의 투여 약 1 내지 4주 전, 예를 들어 약 2주 전에 투여되거나;
    (ii) 제1 조성물은 적어도 제2 조성물의 투여 2주 전에 투여되는, 방법.
  45. 제3항 내지 제18항, 제20항, 제21항, 제24항 내지 제37항, 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터의 샘플(예를 들어, 투여 부위로부터의 또는 그 근처의 샘플)에서 림프관신생을 평가하는, 예를 들어 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 림프관신생은 제1 조성물의 투여 후 및/또는 제2 조성물의 투여 전에 측정되고,
    선택적으로 림프관신생을 측정하는 단계는 샘플에서 림프 내피 세포(LEC)(예를 들어, CD45-CD31+PDPN+ 세포)의 수준 및/또는 활성에 대한 값을 획득하는 것을 포함하는, 방법.
  46. 제3항 내지 제18항, 제20항, 제21항, 제24항 내지 제37항, 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터의 샘플(예를 들어, 투여 부위로부터의 또는 그 근처의 샘플)에서 T 세포의 동원을 평가하는, 예를 들어 측정하는 단계를 추가로 포함하고, T 세포의 동원은 제1 조성물의 투여 후 및/또는 제2 조성물의 투여 전에 측정되고,
    선택적으로 T 세포의 동원을 측정하는 단계는 샘플에서 T 세포(예를 들어, 나이브 T 세포, 예를 들어 CD45RA+CD62L+ T 세포 및/또는 CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+ T 세포)의 수준 및/또는 활성에 대한 값을 획득하는 것을 포함하는, 방법.
  47. 제1항, 제5항 내지 제18항, 제20항, 제21항, 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내에서 대상체의 세포를 형질도입하거나 대상체에서 질환, 장애 또는 질병을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 복수의 조성물.
  48. 제2항, 제6항 내지 제11항, 제38항, 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내에서 대상체의 세포를 형질도입하거나 대상체에서 질환, 장애 또는 질병을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 제19항 내지 제21항, 제24항 내지 제27항, 제29항 내지 제36항, 제38항 중 어느 한 항의 제2 조성물과 조합된 제1 조성물.
  49. 제19항 내지 제21항, 제24항 내지 제27항, 제29항 내지 제36항, 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내에서 대상체의 세포를 형질도입하거나 대상체에서 질환, 장애 또는 질병을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 제2항, 제6항 내지 제11항, 제38항, 제39항 중 어느 한 항의 제1 조성물과 조합된 제2 조성물.
  50. 제3항 내지 제18항, 제20항 내지 제37항, 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 대상체가 질환, 장애 또는 질병을 갖거나, 갖는 것으로 진단받았고/받았거나;
    (ii) 대상체가 인간인, 방법.
  51. 제3항 내지 제18항, 제20항 내지 제37항, 제40항 내지 제46항, 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 질환, 장애 또는 질병이
    (i) 암;
    (ii) 선택적으로 백혈병 또는 림프종을 포함하는 혈액암;
    (iii) 만성 림프구성 백혈병(CLL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 다발성 골수종, 급성 림프성 백혈병(ALL), 호지킨 림프종, B-세포 급성 림프성 백혈병(BALL), T-세포 급성 림프성 백혈병(TALL), 소 림프구성 백혈병(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 모세포성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종(DLBCL), 만성 염증과 관련된 DLBCL, 만성 골수성 백혈병, 골수증식성 신생물, 여포성 림프종, 소아 여포성 림프종, 털세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 질병, MALT 림프종(점막 관련 림프 조직의 외연 변연부 림프종), 변연부 림프종, 골수이형성증, 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 비장 변연부 림프종, 비장 림프종/백혈병, 비장 미만성 적색 속질 소 B-세포 림프종, 털세포 백혈병-변이형, 림프형질세포성 림프종, 중쇄병, 형질 세포 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 골수외 형질세포종, 결절성 변연부 림프종, 소아 결절성 변연부 림프종, 원발성 피부 소포 중심 림프종, 림프종모양 육아종증, 원발성 종격동(가슴샘) 대 B-세포 림프종, 혈관내 대 B-세포 림프종, ALK+ 대 B-세포 림프종, HHV8-관련 다심성 캐슬만병에서 발생하는 대 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, B-세포 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 또는 미분류 림프종으로부터 선택된 혈액암;
    (iv) 고형암; 또는
    (v) 중피종, 악성 흉막 중피종, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 편평 세포 폐암, 대세포 폐암, 췌장암, 췌관 샘암종, 식도 샘암종, 유방암, 교모세포종, 난소암, 결장직장암, 전립샘암, 자궁경부암, 피부암, 흑색종, 신암, 간암, 뇌암, 가슴샘종, 육종, 암종, 자궁암, 신장암, 위장암, 요로상피암, 인두암, 두경부암, 직장암, 식도암, 또는 방광암 중 하나 이상, 또는 이의 전이로부터 선택된 고형암;
    (vi) 선택적으로 바이러스 벡터 또는 핵산이 B 세포 항원, 예를 들어 CD 19, CD20, CD22, CD123, FcRn5, FcRn2, BCMA, CS-1 및 CD138에 결합하는 CAR을 인코딩하는 자가면역 질환을 포함하는, 방법.
  52. 제1항, 제5항 내지 제18항, 제20항, 제21항, 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항의 복수의 조성물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하는 키트.
  53. 제1항, 제3항 내지 제46항, 제50항, 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터 또는 핵산이
    (i) B 세포 항원에 결합하는 제1 CAR 및 (a) 고형 종양 항원, (b) 골수성 종양 항원, 또는 (c) B-세포 계통이 아닌 혈액 종양의 항원에 결합하는 제2 CAR; 또는
    (2) B 세포 항원에 결합하는 제1 결합 도메인 및 (a) 고형 종양 항원, (b) 골수성 종양 항원 또는 (c) B-세포 계통이 아닌 혈액 종양의 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 CAR을 인코딩하는, 복수의 조성물, 방법, 또는 제2 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 질환, 장애 또는 질병이 고형 종양인, 방법.
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