CN116615258A - 用于体内产生car表达细胞的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本披露的方面总体上涉及生物材料用于体内产生CAR表达细胞的用途。在一些实施例中，这些生物材料包含细胞募集组合物、病毒载体、和/或细胞活化剂中的一种或多种。

Description

用于体内产生CAR表达细胞的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年8月21日提交的美国临时申请63/068,876以及于2021年2月26日提交的美国临时申请63/154,609的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包括序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交并且通过引用以其全文特此并入。所述ASCII副本创建于2021年8月20日，名称为N2067-7176WO_SL.txt并且大小为987,095字节。

技术领域

本披露的方面总体上涉及生物材料用于体内产生CAR表达细胞的用途。在一些实施例中，生物材料包含在组合物中，该组合物进一步包含细胞募集组合物、病毒载体、和/或细胞活化剂中的一种或多种。

背景技术

T细胞过继转移方案在许多治疗应用(例如癌症)中示出潜力，最近已批准CAR T细胞疗法用于B细胞恶性肿瘤的治疗。目前的CAR-T细胞制造方法是离体进行的：从受试者中提取细胞，将这些细胞工程改造以表达嵌合抗原受体(CAR)，然后将它们重新引入受试者体内以治疗疾病、障碍或病症，如癌症。在本领域中仍然需要有效制造CAR表达细胞，包括但不限于允许位点特异性递送和/或体内产生的那些。

发明内容

在一些方面，本披露的特征在于包含生物材料和细胞募集因子的第一组合物；以及包含病毒载体的第二组合物。在一些方面，本披露的特征在于包含生物材料和分子(例如，VEGF-C、IL-2、IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、GM-CSF、CXCL12、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、或CXCL11)的第一组合物；以及包含病毒载体的第二组合物。

在一些方面，本披露的特征在于包含生物材料和细胞募集因子的第一组合物，其中该生物材料包含水凝胶，例如晶胶，例如海藻酸盐晶胶，并且其中该细胞募集因子包含根据SEQ ID NO:741的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:741的位置26处的氨基酸不是半胱氨酸(C)，任选地其中SEQ ID NO:741的位置26处的氨基酸是丙氨酸(A)。

在一些方面，本披露的特征在于第二组合物，该第二组合物包含介孔二氧化硅颗粒；病毒载体；和细胞活化剂。

在一些方面，本披露的特征在于体内转导受试者的细胞或治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法。该方法包括：向受试者的某个部位(例如，高皮下间隙或与真皮相邻的皮下间隙)施用生物材料和细胞募集因子，以及向该受试者施用包含转基因的病毒载体或核酸；从而用转基因转导该受试者的细胞。在一些方面，本披露的特征在于体内转导受试者的细胞或治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法。该方法包括：向受试者的某个部位(例如，高皮下间隙或与真皮相邻的皮下间隙)施用生物材料和分子(例如，VEGF-C、IL-2、IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、GM-CSF、CXCL12、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、或CXCL11)，以及向该受试者施用包含转基因的病毒载体或核酸；从而用转基因转导该受试者的细胞。

在一些实施例中，生物材料和细胞募集因子包含在第一组合物中，并且病毒载体或核酸包含在第二组合物中。在一些实施例中，生物材料和分子(例如，VEGF-C、IL-2、IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、GM-CSF、CXCL12、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、或CXCL11)包含在第一组合物中，并且病毒载体或核酸包含在第二组合物中。

在一些方面，本披露的特征在于体内转导受试者的细胞或治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法，该方法包括：向该受试者的部位施用包含转基因的病毒载体或核酸，其中该受试者先前已经被以足以诱导淋巴管生成和/或募集T细胞到该受试者的该部位的量施用生物材料和细胞募集因子；从而转导这些细胞。在一些方面，本披露的特征在于体内转导受试者的细胞或治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法，该方法包括：向该受试者的部位施用包含转基因的病毒载体或核酸，其中该受试者先前已经被以足以诱导淋巴管生成和/或募集T细胞到该受试者的该部位的量施用生物材料和分子(例如，VEGF-C、IL-2、IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、GM-CSF、CXCL12、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、或CXCL11)；从而转导这些细胞。

在本文的任何方面，例如，上述组合物和方法，可以应用本文的任何实施例(例如，下文)。

在一些实施例中，生物材料包含(i)包含水凝胶；(ii)包含晶胶；(iii)包含明胶、透明质酸、胶原蛋白、海藻酸盐、层粘连蛋白、壳聚糖、丝纤蛋白、琼脂糖、聚(乙二醇)、聚乙烯醇、和/或羟乙基甲基丙烯酸酯；(iv)包含海藻酸盐水凝胶，任选地其中该海藻酸盐水凝胶进一步包含降冰片烯和/或四嗪，任选地其中该降冰片烯和/或四嗪共价地与该海藻酸盐缔合，例如，与其化学连接，或非共价地与其缔合，例如，吸附在其上；和/或(v)包含直径为约10μm至约300μm之间，例如，约50μm至约300μm之间的孔，或无孔；和/或(vi)是化学交联的。在一些实施例中，包含生物材料的第一组合物进一步包含锂皂石(laponite)，任选地其中该锂皂石以约0.15mg/mL至约0.35mg/mL，例如，约0.25mg/mL的浓度存在。在一些实施例中，生物材料进一步包含锂皂石，任选地其中该锂皂石以约0.15mg/mL至约0.35mg/mL，例如，约0.25mg/mL的浓度存在。

在一些实施例中，细胞募集因子：(i)非共价地与生物材料缔合，例如，吸附在其上；或(ii)共价地与生物材料缔合，例如，与其缀合。在一些实施例中，细胞募集因子：(i)诱导淋巴管生成；(ii)诱导淋巴内皮细胞的生长；和/或(ii)募集免疫细胞，任选地其中这些免疫细胞包含T细胞和/或NK细胞。

在一些实施例中，淋巴管生成的诱导：(i)包括淋巴内皮细胞(LEC)(例如，CD45-CD31+PDPN+细胞)水平的增加，任选地其中当通过测定法，例如，流式细胞术测定，例如，如实例H或I中所述测量时，与参考水平(例如，在注射多种组合物或第一组合物之前受试者的部位的LEC水平)相比，LEC水平增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、或200％；和/或(ii)当通过测定法，例如，流式细胞术测定，例如，如实例H或I中所述测量时，每毫克的组织产生至少50个LEC(例如，至少75、100、125、150、200、225、或250个LEC)。

在一些实施例中，细胞募集因子募集T细胞，任选地其中这些T细胞包含初始T细胞(例如，CD45RA+CD62L+T细胞或CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+T细胞)。在一些实施例中，T细胞的募集包括T细胞水平的增加，任选地其中当通过测定法，例如，流式细胞术测定，例如，如实例H或I中所述测量时，与参考水平(例如，在注射多种组合物或第一组合物之前受试者的部位的T细胞水平)相比，T细胞水平增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、或300％。

在一些实施例中，细胞募集因子选自VEGF-C、IL-2、IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、GM-CSF、CXCL12、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、或CXCL11。在一些实施例中，细胞募集因子包含VEGF-C或其功能性变体；IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))或其功能性变体；IL-7或其功能性变体；或其组合。

在一些实施例中，细胞募集因子包含VEGF-C，任选地其中该VEGF-C：(i)包含成熟VEGF-C肽，任选地次要或主要成熟形式或其突变变体；(ii)是单体或二聚体；和/或(iii)以有效量，任选地，以小于或约1mg、小于或约10mg、大于或约10μg、大于或约1μg、约1μg与1mg之间、约10μg与1mg之间、约1μg与10mg之间、或约10μg与10mg之间的量存在。

在一些实施例中，VEGF-C包含：(i)表18中提供的序列中的任一个的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列，任选地其中该序列包含或不包含接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)和/或his标签；和/或(ii)根据SEQ ID NO:725进行编号的C137A的氨基酸取代。

在一些实施例中，细胞募集因子包含：(i)根据SEQ ID NO:741的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:741的位置26处的氨基酸不是半胱氨酸(C)，任选地其中SEQ ID NO:741的位置26处的氨基酸是丙氨酸(A)；(ii)根据SEQ ID NO:743的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的序列氨基酸序列；(iii)根据SEQ ID NO:740的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列；(iv)根据SEQ ID NO:736的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列；(v)接头，例如，其中该接头具有Gly-Ser的序列，其中任选地该接头在SEQ ID NO:743或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的序列的C末端；(vi)根据SEQ IDNO:735的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列；(vii)根据SEQ ID NO:734的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列；和/或(viii)根据SEQ ID NO:733的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，本文所述组合物中的任一个，例如第一组合物中的任一个进一步包含IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))或其功能性变体。在一些实施例中，本文所述组合物中的任一个，例如第一组合物中的任一个进一步包含IL-7或其功能性变体。在一些实施例中，本文所述组合物中的任一个，例如第一组合物中的任一个进一步包含IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))或其功能性变体，以及IL-7或其功能性变体。

在一些实施例中，本文所述方法中的任一种进一步包括施用IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))或其功能性变体。在一些实施例中，本文所述方法中的任一种进一步包括施用IL-7或其功能性变体。在一些实施例中，本文所述方法中的任一种进一步包括施用IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))或其功能性变体，以及IL-7或其功能性变体。

在一些实施例中，第二组合物进一步包含颗粒。在一些实施例中，颗粒是介孔颗粒、二氧化硅颗粒和/或介孔二氧化硅颗粒，任选地其中该介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒。在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒包含表面修饰，任选地其中该表面修饰包含：(a)-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐，任选地使用C1至C20烷基或(O(CH2 CH2)1-25接头；(b)伯胺、仲胺、叔胺或季胺；和/或(c)如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量，具有约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da、或约10,000Da的平均分子量的聚乙烯亚胺。在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒(i)是三甲基铵官能化的介孔二氧化硅颗粒，例如，N,N,N-三甲基丙-1-铵官能化的介孔二氧化硅颗粒；(iii)包含多个孔，任选地其中这些孔直径为2-50nm之间；和/或(iv)包含至少约100m2/g的表面积。

在一些实施例中，(i)病毒载体非共价地，例如，静电地，或共价地与介孔二氧化硅颗粒缔合；和/或(ii)细胞活化剂非共价地或共价地与介孔二氧化硅颗粒缔合。在一些实施例中，病毒载体包含：(i)慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、或疱疹病毒；和/或(ii)含有重组多核苷酸的表达载体，该重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。在一些实施例中，核苷酸序列编码：嵌合抗原受体(CAR)、工程改造的TCR、细胞因子、趋化因子、shRNA、或经工程改造以靶向肿瘤抗原的多肽。

在一些实施例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPVE6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。

在一些实施例中，病毒载体编码CAR，该CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和信号传导结构域，其中：(i)该抗原结合结构域结合抗原，该抗原选自由以下组成的组：CD19、CD123、CD22、CD20、EGFRvIII、BCMA、间皮素、CD33、CLL-1、及其任何组合；(ii)该跨膜结构域包含CD8铰链；(iii)该共刺激信号传导区域选自4-1BB或CD28共刺激信号传导结构域；和/或(iv)该信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域。

在一些实施例中，第二组合物进一步包含细胞活化剂。在一些实施例中，细胞活化剂包含刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂。在一些实施例中，细胞活化剂包含多特异性结合分子，该多特异性结合分子包含：(A)抗CD3结合结构域，以及(B)共刺激分子结合结构域(例如，抗CD2结合结构域或抗CD28结合结构域)。

在一些实施例中，抗CD3结合结构域(例如，抗CD3 scFv)位于共刺激分子结合结构域的N末端，例如，抗CD2 Fab或抗CD28 Fab；或抗CD3结合结构域(例如，抗CD3 scFv)位于共刺激分子结合结构域的C末端，例如，抗CD2 Fab或抗CD28 Fab，任选地其中：Fc区位于抗CD3结合结构域和共刺激分子结合结构域之间；或多特异性结合分子包含CH2，且抗CD3结合结构域位于CH2的N末端。

在本文所述的第二组合物和方法的一些实施例中，多特异性结合分子包含：(i)从N末端至C末端包含以下的第一多肽：抗CD3结合结构域的VH、抗CD3结合结构域的VL、共刺激分子结合结构域的VH、CH1、CH2、和CH3；和(ii)从N末端至C末端包含以下的第二多肽：共刺激分子结合结构域的VL、和CL。在一些实施例中，多特异性结合分子包含：(i)从N末端至C末端包含以下的第一多肽：共刺激分子结合结构域的VH、CH1、CH2、CH3、抗CD3结合结构域的VH、和抗CD3结合结构域的VL；和(ii)从N末端至C末端包含以下的第二多肽：共刺激分子结合结构域的VL、和CL。在一些实施例中，多特异性结合分子包含：(i)从N末端至C末端包含以下的第一多肽：共刺激分子结合结构域的VH、CH1、抗CD3结合结构域的VH、抗CD3结合结构域的VL、CH2、和CH3；和(ii)从N末端至C末端包含以下的第二多肽：共刺激分子结合结构域的VL、和CL。在一些实施例中，抗CD3结合结构域包含scFv，并且共刺激分子结合结构域是Fab片段的一部分。

在一些实施例中，细胞活化剂包含表20中提供的任何重链的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和/或表20中提供的任何轻链的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，细胞活化剂与颗粒，例如，介孔二氧化硅颗粒缀合，或吸附在其上。

在一些实施例中，多特异性结合分子包含Fc区，该Fc区包含：(i)L234A、L235A、S267K、和P329A突变(LALASKPA)，其根据Eu编号系统进行编号；(ii)L234A、L235A、和P329G突变(LALAPG)，其根据Eu编号系统进行编号；(iii)G237A、D265A、P329A、和S267K突变(GADAPASK)，其根据Eu编号系统进行编号；(iv)L234A、L235A、和G237A突变(LALAGA)，其根据Eu编号系统进行编号；(v)D265A、P329A、和S267K突变(DAPASK)，其根据Eu编号系统进行编号；(vi)G237A、D265A、和P329A突变(GADAPA)，其根据Eu编号系统进行编号；(vii)L234A、L235A、和P329A突变(LALAPA)，其根据Eu编号系统进行编号；或(viii)表20中Fc区中的任一个的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，多特异性结合分子包含：(i)重链，该重链包含SEQ ID NO:726、1416、893、1417、或895中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和/或(ii)轻链，该轻链包含SEQ ID NO:728、730、892、或894中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多特异性结合分子包含：(i)含有SEQ ID NO:726的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:728的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链；(ii)含有SEQ ID NO:726的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:730的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链；(iii)含有SEQ ID NO:1416的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:728的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链；(iv)含有SEQ ID NO:1416的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:730的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链；(v)含有SEQ ID NO:893的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:892的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链；(vi)含有SEQ ID NO:1417的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:892的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链；或(vii)含有SEQ ID NO:895的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:894的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链。

在一些实施例中，第二组合物进一步包含颗粒的第一群体和颗粒的第二群体，例如，介孔二氧化硅颗粒的第一群体和介孔二氧化硅颗粒的第二群体，其中该第一群体包含病毒载体，并且该第二群体包含细胞活化剂，例如，其中该病毒载体非共价地与该第一群体的颗粒缔合，并且该细胞活化剂非共价地与该第二群体的颗粒缔合。

在一些实施例中，组合物，例如第一或第二组合物适合于注射使用。

在一些实施例中，本文所述的组合物，例如第一或第二组合物进一步包含Tet2抑制剂和/或ZBTB32抑制剂。在一些实施例中，Tet2抑制剂包含：(1)靶向编码Tet2的基因或其相应调控元件中的一个或多个位点的基因编辑系统；(2)抑制Tet2表达的核酸(例如，siRNA或shRNA)；(3)蛋白质(例如，显性负性，例如，无催化活性的)Tet2、或Tet2的结合配偶体(例如，Tet2的显性负性结合配偶体)；(4)抑制Tet2的表达和/或功能的小分子；(5)编码(1)-(3)中任一项的核酸；或(6)(1)-(5)的任何组合。在一些实施例中，ZBTB32基因或其一种或多种组分；(2)编码基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；或(3)(1)和(2)的组合。在实施例中，ZBTB32抑制剂包含：(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分。在实施例中，ZBTB32抑制剂包含(2)编码基因编辑系统的一种或多种组分的核酸。在实施例中，ZBTB32抑制剂包含(1)和(2)的组合。

在一些实施例中，本文所述的方法进一步包括向受试者施用：(i)Tet2抑制剂，任选地其中该Tet2抑制剂包含：(1)靶向编码Tet2的基因或其相应调控元件中的一个或多个位点的基因编辑系统；(2)抑制Tet2表达的核酸(例如，siRNA或shRNA)；(3)蛋白质(例如，显性负性，例如，无催化活性的)Tet2、或Tet2的结合配偶体(例如，Tet2的显性负性结合配偶体)；(4)抑制Tet2的表达和/或功能的小分子；(5)编码(1)-(3)中任一项的核酸；或(6)(1)-(5)的任何组合；和/或(ii)ZBTB32抑制剂，任选地其中该ZBTB32抑制剂包含：(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分；(2)编码基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；或(3)(1)和(2)的组合。在实施例中，ZBTB32抑制剂包含：(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分。在实施例中，ZBTB32抑制剂包含(2)编码基因编辑系统的一种或多种组分的核酸。在实施例中，ZBTB32抑制剂包含(1)和(2)的组合。

在一些实施例中，在施用第二组合物之前施用第一组合物，任选地其中：(i)在施用该第二组合物之前约1-4周，例如约2周施用该第一组合物；或(ii)在施用该第二组合物之前至少两周施用该第一组合物。

在一些实施例中，本文所述方法中的任一种进一步包括评估，例如测量来自受试者的样品(例如，来自或接近施用部位的样品)中的淋巴管生成，其中在施用第一组合物之后和/或施用第二组合物之前测量淋巴管生成，任选地，其中测量淋巴管生成包括获取该样品中淋巴内皮细胞(LEC)(例如，CD45-CD31+PDPN+细胞)的水平和/或活性的值。

在一些实施例中，本文所述方法中的任一种进一步包括评估，例如测量来自受试者的样品(例如，来自或接近施用部位的样品)中的T细胞的募集，其中在施用第一组合物之后和/或施用第二组合物之前测量T细胞的募集，任选地，其中测量T细胞的募集包括获取该样品中淋巴内皮细胞(LEC)(例如，初始T细胞，例如CD45RA+CD62L+T细胞和/或CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+T细胞)的水平和/或活性的值。

在一些实施例中，受试者患有或已经被诊断出患有疾病、障碍或病症；和/或该受试者是人。

在一些实施例中，疾病、障碍或病症包含：(i)癌症；(ii)血液癌症，任选地其中该血液癌症包含白血病或淋巴瘤；(iii)选自以下的血液癌症：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增殖性肿瘤、滤泡性淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症、脾脏边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变异、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链疾病、浆细胞性骨髓瘤、骨单发性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、淋巴结边缘区淋巴瘤、小儿淋巴结边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯尔曼病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或无法分类的淋巴瘤；(iv)实体癌；(v)选自以下的实体癌：间皮瘤、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、食管腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、肾癌(renal cancer)、肝癌、脑癌、胸腺瘤、肉瘤、恶性上皮肿瘤(carcinoma)、子宫癌、肾脏癌(kidney cancer)、胃肠癌、尿路上皮癌、咽癌、头颈癌、直肠癌、食道癌或膀胱癌，或其转移癌中的一种或多种；或(iv)自身免疫性疾病、炎性疾病、或移植。在一些实施例中，疾病、障碍或病症是自身免疫性疾病、炎性疾病、或移植，并且表达的CAR与B细胞抗原，例如CD19、CD20、CD22、CD123、FcRn5、FcRn2、BCMA、CS-1和CD138结合。

在一些实施例中，疾病、障碍或病症包含实体瘤。在一些实施例中，当用使用本文所述方法制造的表达CAR的细胞治疗实体瘤时，该细胞表达两种CAR，第一CAR与B细胞抗原结合，而第二CAR与实体瘤抗原结合。在一些实施例中，当用使用本文所述方法制造的表达CAR的细胞治疗实体瘤时，该细胞表达多特异性CAR，该多特异性CAR包含与B细胞抗原结合的第一结合结构域和与实体瘤抗原结合的第二结合结构域。不希望受理论束缚，在此类细胞中表达与B细胞抗原结合的CAR可有助于改善表达CAR的细胞的增殖和/或存活。B细胞抗原(例如，正常B细胞上的CD19)可以改善此类表达CAR的细胞的增殖和/或存活，即使在肿瘤抗原水平较低时(例如，当肿瘤细胞的数量较少时，或在使用本文所述方法制造的表达CAR的细胞遇到实体瘤细胞之前)。

在一些实施例中，疾病、障碍或病症包含骨髓肿瘤。在一些实施例中，当用使用本文所述方法制造的表达CAR的细胞治疗骨髓肿瘤时，该细胞表达两种CAR，第一CAR与B细胞抗原结合，而第二CAR与骨髓肿瘤抗原结合。在一些实施例中，当用使用本文所述方法制造的表达CAR的细胞治疗骨髓肿瘤时，该细胞表达多特异性CAR，该多特异性CAR包含与B细胞抗原结合的第一结合结构域和与骨髓肿瘤抗原结合的第二结合结构域。不希望受理论束缚，在此类细胞中表达与B细胞抗原结合的CAR可有助于改善表达CAR的细胞的增殖和/或存活。B细胞抗原(例如，正常B细胞上的CD19)可以改善此类表达CAR的细胞的增殖和/或存活，即使在肿瘤抗原水平较低时(例如，当肿瘤细胞的数量较少时，或在使用本文所述方法制造的表达CAR的细胞遇到骨髓肿瘤细胞之前)。

在本文所述的方法或第二组合物的一些实施例中，病毒载体或核酸编码：

(i)与B细胞抗原(例如，CD19)结合的第一CAR和与(a)实体瘤抗原(例如，EGFRvIII)、(b)骨髓肿瘤抗原、或(c)非B细胞系的血液肿瘤的抗原结合的第二CAR；或

(2)CAR，该CAR包含与B细胞抗原(例如，CD19)结合的第一结合结构域和与(a)实体瘤抗原(例如，EGFRvIII)、(b)骨髓肿瘤抗原、或(c)非B细胞系的血液肿瘤的抗原结合的第二结合结构域。

在一些实施例中，B细胞抗原是CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD34、CD37、CD38、CD40、CD53、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD123、CD135、CD138、CD179、CD269、Flt3、ROR1、BCMA、FcRn5、FcRn2、CS-1、CXCR4、5、7、IL-7/3R、IL7/4/3R、或IL4R。在一些实施例中，B细胞抗原是CD19、CD20、CD22、CD123、FcRn5、FcRn2、BCMA、CS-1或CD138。

在一些实施例中，实体瘤抗原是EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn Ag、PSMA、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如，ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、邻乙酰基GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4、或MHC上呈递的这些抗原的任一个的肽。

在一些实施例中，本文还考虑了包含本文所述第一组合物和本文所述第二组合物的试剂盒。

在一些方面，本披露的特征在于治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法，该方法包括：向受试者中已被诱导发生淋巴管生成的部位施用包含转基因的病毒载体或核酸，从而转导细胞。

在一些方面，本披露的特征在于使受试者准备好接受编码嵌合抗原受体(CAR)的病毒载体的方法，该方法包括向该受试者施用生物材料和细胞募集因子，从而使该受试者准备好接受编码该CAR的病毒载体。在一些方面，本披露的特征在于使受试者准备好接受编码嵌合抗原受体(CAR)的病毒载体的方法，该方法包括向该受试者施用生物材料和分子(例如，VEGF-C、IL-2、IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、GM-CSF、CXCL12,、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、或CXCL11)，从而使该受试者准备好接受编码该CAR的病毒载体。

在一些实施例中，准备包括诱导淋巴管生成和/或募集T细胞(例如，例如CD45RA+CD62L+T细胞和/或CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+T细胞)。在一些实施例中，该方法进一步包含施用编码CAR的病毒载体，任选地其中该病毒载体与颗粒(例如，包含或不包含细胞活化剂的介孔二氧化硅颗粒)缀合。

本文还考虑了组合物，该组合物包含含有细胞募集因子的生物材料；介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；以及，任选地细胞活化剂。本文还考虑了组合物，该组合物包含生物材料和细胞募集因子；介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；以及，任选地细胞活化剂。

在一些实施例中，生物材料包含水凝胶，任选地晶胶。在一些实施例中，晶胶包含明胶、透明质酸、胶原蛋白、海藻酸盐、层粘连蛋白、壳聚糖、丝纤蛋白、琼脂糖、聚(乙二醇)、聚乙烯醇、和/或羟乙基甲基丙烯酸酯。在一些实施例中，包含晶胶的组合物进一步包含锂皂石。在一些实施例中，晶胶包含直径为约10至300μm之间，任选地约50至300μm之间的孔。在一些实施例中，晶胶是化学交联的。

在一些实施例中，细胞募集因子选择性地募集免疫细胞，任选地T-细胞和/或NK-细胞。在一些实施例中，细胞募集因子选自由以下组成的组：CCL19、CXCL9、CXCL10、XCL1、IL-2、IL-7、CCL21、GM-CSF、CCL17、CCL22、CCL20、CCL27、IL-15、淋巴毒素α、淋巴毒素β、VEGF-C、FLT3L、G-CSF、PDGF、S100A8/A9、CSF-1、CXCL8、CCL20、CCL17、CCR5、CCR6、CCL2、VEGF、血管生成素-2、PGE2、LTB4、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、CXCL11、和/或CXCL12。在一些实施例中，VEGF-C选自由未成熟VEGF-C肽或成熟VEGF-C肽组成的组。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是次要成熟形式或主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是野生型次要成熟形式或野生型主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是经修饰的次要成熟形式或经修饰的主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是包含半胱氨酸137处突变(例如，C137A)的经修饰的次要成熟形式，或包含半胱氨酸137处突变(例如，C137A)的经修饰的主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是包含C137A突变的经修饰的次要成熟形式或包含C137A突变的经修饰的主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽以二聚体或单体形式存在。在一些实施例中，VEGF-C是在每个单体中进一步包含C137A突变的主要成熟形式的二聚体。在一些实施例中，VEGF-C是在每个单体中进一步包含C137A突变的次要成熟形式的二聚体。在一些实施例中，VEGF-C选自表18中提供的序列，任选地，其中his标签不包括在该序列中。在一些实施例中，VEGF-C以有效量，任选地，以小于或约1mg、小于或约10mg、大于或约10μg、大于或约1μg、约1μg与1mg之间、约10μg与1mg之间、约1μg与10mg之间、或约10μg与10mg之间的量存在。

在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面经修饰的。在一些实施例中，在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐，任选地使用C₁至C₂₀烷基或(-O(CH2-CH₂-)_1-25接头。在一些实施例中，在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在一些实施例中，在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是聚乙烯亚胺，其平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da，如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量。在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒包含直径2nm-50nm的孔。在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒的表面积是至少约100m²/g。在一些实施例中，组合物适合于注射使用。在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒的形式。

在一些实施例中，将病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中，将病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中，病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或慢病毒。在一些实施例中，所述病毒载体包含表达载体，所述表达载体包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。在一些实施例中，所述核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)、工程改造的TCR、一种或多种细胞因子、一种或多种趋化因子、用于阻断抑制性分子的shRNA，或其中所述核苷酸序列包含用于诱导蛋白质表达的mRNA。在一些实施例中，核苷酸序列编码经工程改造以靶向肿瘤抗原的多肽。在一些实施例中，多肽靶向选自下组的肿瘤抗原，该组由以下组成：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。在一些实施例中，蛋白质是CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和信号传导结构域。在一些实施例中，信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导区域选自41BB(即，CD137)、CD27、ICOS、和/或CD28。

在一些实施例中，细胞活化剂缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体上。在一些实施例中，细胞活化剂是T细胞刺激化合物、针对CAR抗原结合结构域的抗独特型抗体、和/或肿瘤抗原。在一些实施例中，T细胞刺激化合物是IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、来自共享抗原(例如TRP2、gp100、肿瘤细胞裂解物、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、和/或MAGE A3 TCR)的肽。在一些实施例中，细胞活化剂包含CD3/TCR复合物和/或刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂，任选地，其中该细胞活化剂是包含刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂的多特异性结合分子。在一些实施例中，细胞活化选自表20中提供的序列。在一些实施例中，细胞活化剂缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体上或缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体的表面上的脂质包膜上。在一些实施例中，组合物还包含细胞因子。在一些实施例中，细胞因子缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一或第二群体上。在一些实施例中，细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段，或其组合。

本文还考虑了体内转导细胞的方法，该方法包括向受试者施用包含细胞募集因子的生物材料；介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；以及，任选地细胞活化剂。在一些实施例中，同时或顺序地施用这些组分。在一些实施例中，首先施用包含细胞募集因子的生物材料。在一些实施例中，同时地，并且任选地在生物材料之后，施用介孔二氧化硅棒的第一群体、病毒载体、以及任选地细胞活化剂。

本文还考虑了体内转导细胞的方法，该方法包括向受试者施用生物材料和细胞募集因子；介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；以及，任选地细胞活化剂。在一些实施例中，同时或顺序地施用这些组分。在一些实施例中，首先施用生物材料和细胞募集因子。在一些实施例中，同时地，并且任选地在生物材料和细胞募集因子之后，施用介孔二氧化硅棒的第一群体、病毒载体、以及任选地细胞活化剂。

本文还考虑了体内转导细胞的方法，该方法包括向受试者施用生物材料和分子(例如，VEGF-C、IL-2、IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、GM-CSF、CXCL12、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、或CXCL11)；介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；以及，任选地细胞活化剂。在一些实施例中，同时或顺序地施用这些组分。在一些实施例中，首先施用生物材料和分子。在一些实施例中，同时地，并且任选地在生物材料和分子之后，施用介孔二氧化硅棒的第一群体、病毒载体、以及任选地细胞活化剂。

在一些实施例中，生物材料包含水凝胶，任选地晶胶。在一些实施例中，晶胶包含明胶、透明质酸、胶原蛋白、海藻酸盐、层粘连蛋白、壳聚糖、丝纤蛋白、琼脂糖、聚(乙二醇)、聚乙烯醇、和/或羟乙基甲基丙烯酸酯。在一些实施例中，包含晶胶的组合物进一步包含锂皂石。在一些实施例中，晶胶包含直径为约10至300μm之间，任选地约50至300μm之间的孔。在一些实施例中，晶胶是化学交联的。

在一些实施例中，细胞募集因子选择性地募集免疫细胞，任选地T-细胞和/或NK-细胞。在一些实施例中，细胞募集因子选自由以下组成的组：CCL19、CXCL9、CXCL10、XCL1、IL-2、IL-7、CCL21、GM-CSF、CCL17、CCL22、CCL20、CCL27、IL-15、淋巴毒素α、淋巴毒素β、VEGF-C、FLT3L、G-CSF、PDGF、S100A8/A9、CSF-1、CXCL8、CCL20、CCL17、CCR5、CCR6、CCL2、VEGF、血管生成素-2、PGE2、LTB4、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、CXCL11、和/或CXCL12。在一些实施例中，VEGF-C选自由未成熟VEGF-C肽或成熟VEGF-C肽组成的组。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是次要成熟形式或主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是野生型次要成熟形式或野生型主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是经修饰的次要成熟形式或经修饰的主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是包含半胱氨酸137处突变(例如，C137A)的经修饰的次要成熟形式，或包含半胱氨酸137处突变(例如，C137A)的经修饰的主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是包含C137A突变的经修饰的次要成熟形式或包含C137A突变的经修饰的主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽以二聚体或单体形式存在。在一些实施例中，VEGF-C是在每个单体中进一步包含C137A突变的主要成熟形式的二聚体。在一些实施例中，VEGF-C是在每个单体中进一步包含C137A突变的次要成熟形式的二聚体。在一些实施例中，VEGF-C选自表18，任选地，其中his标签不包括在该序列中。在一些实施例中，VEGF-C以有效量，任选地，以小于或约1mg、小于或约10mg、大于或约10μg、大于或约1μg、约1μg与1mg之间、约10μg与1mg之间、约1μg与10mg之间、或约10μg与10mg之间的量存在。

在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面经修饰的。在一些实施例中，在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐，任选地使用C₁至C₂₀烷基或(-O(CH2-CH₂-)_1-25接头。在一些实施例中，在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在一些实施例中，在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是聚乙烯亚胺，其平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da，如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量。在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒包含直径2nm-50nm的孔。在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒的表面积是至少约100m²/g。在一些实施例中，组合物适合于注射使用。在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒的形式。

在一些实施例中，将病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中，将病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中，病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或慢病毒。在一些实施例中，所述病毒载体包含表达载体，所述表达载体包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。在一些实施例中，所述核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)、工程改造的TCR、一种或多种细胞因子、一种或多种趋化因子、用于阻断抑制性分子的shRNA，或其中所述核苷酸序列包含用于诱导蛋白质表达的mRNA。在一些实施例中，核苷酸序列编码经工程改造以靶向肿瘤抗原的多肽。在一些实施例中，多肽靶向选自下组的肿瘤抗原，该组由以下组成：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。在一些实施例中，蛋白质是CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和信号传导结构域。在一些实施例中，信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导区域选自41BB(即，CD137)、CD27、ICOS、和/或CD28。

在一些实施例中，细胞活化剂缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体上。在一些实施例中，细胞活化剂是T细胞刺激化合物、针对CAR抗原结合结构域的抗独特型抗体、和/或肿瘤抗原。在一些实施例中，T细胞刺激化合物是IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、来自共享抗原(例如TRP2、gp100、肿瘤细胞裂解物、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、和/或MAGE A3 TCR)的肽。在一些实施例中，细胞活化剂包含CD3/TCR复合物和/或刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂，任选地，其中该细胞活化剂是包含刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂的多特异性结合分子。在一些实施例中，细胞活化选自表20中提供的序列。在一些实施例中，细胞活化剂缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体上或缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体的表面上的脂质包膜上。在一些实施例中，组合物还包含细胞因子。在一些实施例中，细胞因子缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一或第二群体上。在一些实施例中，细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段，或其组合。

本文还考虑了治疗患有疾病、障碍或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用包含细胞募集因子的生物材料；介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；以及，任选地细胞活化剂。在一些实施例中，同时或顺序地施用这些组分。在一些实施例中，首先施用包含细胞募集因子的生物材料。在一些实施例中，同时地，并且任选地在生物材料之后，施用介孔二氧化硅棒的第一群体、病毒载体、以及任选地细胞活化剂。

本文还考虑了治疗患有疾病、障碍或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用生物材料和细胞募集因子；介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；以及，任选地细胞活化剂。在一些实施例中，同时或顺序地施用这些组分。在一些实施例中，首先施用生物材料和细胞募集因子。在一些实施例中，同时地，并且任选地在生物材料和细胞募集因子之后，施用介孔二氧化硅棒的第一群体、病毒载体、以及任选地细胞活化剂。

本文还考虑了治疗患有疾病、障碍或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用生物材料和分子(例如，VEGF-C、IL-2、IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、GM-CSF、CXCL12、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、或CXCL11)；介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；以及，任选地细胞活化剂。在一些实施例中，同时或顺序地施用这些组分。在一些实施例中，首先施用生物材料和分子。在一些实施例中，同时地，并且任选地在生物材料和分子之后，施用介孔二氧化硅棒的第一群体、病毒载体、以及任选地细胞活化剂。

在一些实施例中，受试者患有癌症。在一些实施例中，受试者患有表达选自下组的一种或多种肿瘤抗原的癌症，该组由以下组成：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、HPVE7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。

在一些实施例中，生物材料包含水凝胶，任选地晶胶。在一些实施例中，晶胶包含明胶、透明质酸、胶原蛋白、海藻酸盐、层粘连蛋白、壳聚糖、丝纤蛋白、琼脂糖、聚(乙二醇)、聚乙烯醇、和/或羟乙基甲基丙烯酸酯。在一些实施例中，包含晶胶的组合物进一步包含锂皂石。在一些实施例中，晶胶包含直径为约10至300μm之间，任选地约50至300μm之间的孔。在一些实施例中，晶胶是化学交联的。

在一些实施例中，细胞募集因子选择性地募集免疫细胞，任选地T-细胞和/或NK-细胞。在一些实施例中，细胞募集因子选自由以下组成的组：CCL19、CXCL9、CXCL10、XCL1、IL-2、IL-7、CCL21、GM-CSF、CCL17、CCL22、CCL20、CCL27、IL-15、淋巴毒素α、淋巴毒素β、VEGF-C、FLT3L、G-CSF、PDGF、S100A8/A9、CSF-1、CXCL8、CCL20、CCL17、CCR5、CCR6、CCL2、VEGF、血管生成素-2、PGE2、LTB4、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、CXCL11、和/或CXCL12。在一些实施例中，VEGF-C选自由未成熟VEGF-C前肽或成熟VEGF-C肽组成的组。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是次要成熟形式或主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是野生型次要成熟形式或野生型主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是经修饰的次要成熟形式或经修饰的主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是包含半胱氨酸137处突变(例如，C137A)的经修饰的次要成熟形式，或包含半胱氨酸137处突变(例如，C137A)的经修饰的主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是包含C137A突变的经修饰的次要成熟形式或包含C137A突变的经修饰的主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽以二聚体或单体形式存在。在一些实施例中，VEGF-C是在每个单体中进一步包含C137A突变的主要成熟形式的二聚体。在一些实施例中，VEGF-C是在每个单体中进一步包含C137A突变的次要成熟形式的二聚体。在一些实施例中，VEGF-C选自表18，任选地，其中his标签不包括在该序列中。在一些实施例中，VEGF-C以有效量，任选地，以小于或约1mg、小于或约10mg、大于或约10μg、大于或约1μg、约1μg与1mg之间、约10μg与1mg之间、约1μg与10mg之间、或约10μg与10mg之间的量存在。

在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒的第一群体是表面经修饰的。在一些实施例中，在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐，任选地使用C₁至C₂₀烷基或(-O(CH2-CH₂-)_1-25接头。在一些实施例中，在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在一些实施例中，在介孔二氧化硅颗粒的第一群体上的表面修饰是聚乙烯亚胺，其平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da，如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量。在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒包含直径2nm-50nm的孔。在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒的表面积是至少约100m²/g。在一些实施例中，组合物适合于注射使用。在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒的形式。

在一些实施例中，将病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中，将病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的第一群体。在一些实施例中，病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或慢病毒。在一些实施例中，所述病毒载体包含表达载体，所述表达载体包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。在一些实施例中，所述核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)、工程改造的TCR、一种或多种细胞因子、一种或多种趋化因子、用于阻断抑制性分子的shRNA，或其中所述核苷酸序列包含用于诱导蛋白质表达的mRNA。在一些实施例中，核苷酸序列编码经工程改造以靶向肿瘤抗原的多肽。在一些实施例中，多肽靶向选自下组的肿瘤抗原，该组由以下组成：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。在一些实施例中，蛋白质是CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和信号传导结构域。在一些实施例中，信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导区域选自41BB(即，CD137)、CD27、ICOS、和/或CD28。

在一些实施例中，细胞活化剂缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体上。在一些实施例中，细胞活化剂是T细胞刺激化合物、针对CAR抗原结合结构域的抗独特型抗体、和/或肿瘤抗原。在一些实施例中，T细胞刺激化合物是IL-2、IL-15、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、来自共享抗原(例如TRP2、gp100、肿瘤细胞裂解物、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、和/或MAGE A3 TCR)的肽。在一些实施例中，细胞活化剂包含CD3/TCR复合物和/或刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂，任选地，其中该细胞活化剂是包含刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂的多特异性结合分子。在一些实施例中，细胞活化选自表20中提供的序列。在一些实施例中，细胞活化剂缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体上或缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体的表面上的脂质包膜上。在一些实施例中，组合物还包含细胞因子。在一些实施例中，细胞因子缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一或第二群体上。在一些实施例中，细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂、其模拟物、其变体、其功能片段，或其组合。

本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明这些具体实施例的许多等效形式。这种等同物旨在由以下列举的实施例涵盖。

列举的实施例

1.一种组合物，所述组合物包含：

(a)含有细胞募集因子的生物材料；

(b)介孔二氧化硅颗粒的第一群体；

(c)病毒载体；以及

(d)任选地，细胞活化剂。

2.如实施例1所述的组合物，其中所述生物材料包含水凝胶，任选地晶胶。

3.如实施例2所述的组合物，其中所述晶胶：

(a)包含明胶、透明质酸、胶原蛋白、海藻酸盐、层粘连蛋白、壳聚糖、丝纤蛋白、琼脂糖、聚(乙二醇)、聚乙烯醇、和/或羟乙基甲基丙烯酸酯，任选地，其中所述晶胶进一步包含锂皂石；

(b)包含直径为约10至300μm之间，任选地约50至300μm之间的孔；和/或

(c)是化学交联的。

4.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述细胞募集因子选自由以下组成的组：CCL19、CXCL9、CXCL10、XCL1、IL-2、IL-7、CCL21、GM-CSF、CCL17、CCL22、CCL20、CCL27、IL-15、淋巴毒素α、淋巴毒素β、VEGF-C、FLT3L、G-CSF、PDGF、S100A8/A9、CSF-1、CXCL8、CCL20、CCL17、CCR5、CCR6、CCL2、VEGF、血管生成素-2、PGE2、LTB4、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、CXCL11、和/或CXCL12。

5.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述细胞募集因子选择性地募集免疫细胞，任选地T-细胞和/或NK-细胞。

6.如实施例5所述的组合物，其中所述细胞募集因子选自由以下组成的组：

(a)用于募集T-细胞的IL-2、IL-7、CCL21、IL-15、GM-CSF、和/或VEGF-C；和/或

(b)用于募集NK-细胞的CXCL12、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、和/或CXCL11。

7.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述细胞募集因子是VEGF-C，任选地呈单体或二聚体形式。

8.如实施例7所述的组合物，其中所述VEGF-C是成熟VEGF-C肽，任选地次要或主要成熟形式或其各自的突变变体。

9.如实施例8所述的组合物，其中所述成熟VEGF-C肽包含C137A突变。

10.如实施例7至9中任一项所述的组合物，其中所述VEGF-C包含表18中提供的序列，任选地，其中his标签不包括在所述序列中。

11.如实施例10所述的组合物，其中所述VEGF-C包含表18中提供的序列中的一个或多个的二聚体，任选地，其中his标签不包括在该序列中。

12.如实施例7至10中任一项所述的组合物，其中所述VEGF-C以有效量，任选地，以小于或约1mg、小于或约10mg、大于或约10μg、大于或约1μg、约1μg与1mg之间、约10μg与1mg之间、约1μg与10mg之间、或约10μg与10mg之间的量存在。

13.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。

14.如实施例13所述的组合物，其中所述病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体。

15.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中对介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体进行表面修饰。

16.如实施例15所述的组合物，其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐，任选地使用C₁至C₂₀烷基或(-O(CH2-CH₂-)_1-25接头。

17.如实施例15所述的组合物，其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。

18.如实施例15所述的组合物，其中在介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上的表面修饰是聚乙烯亚胺，如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量，所述聚乙烯亚胺的平均分子量是约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da。

19.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、或慢病毒。

20.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述病毒载体包含表达载体，所述表达载体包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。

21.如实施例20所述的组合物，其中所述核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)、工程改造的TCR、一种或多种细胞因子、一种或多种趋化因子、用于阻断抑制性分子的shRNA，或其中所述核苷酸序列包含用于诱导蛋白质表达的mRNA。

22.如实施例21所述的组合物，其中所述核苷酸序列编码经工程改造以靶向肿瘤抗原的多肽。

23.如实施例22所述的组合物，其中所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。

24.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述载体编码CAR，所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和信号传导结构域。

25.如实施例24所述的组合物，其中：

(a)所述抗原结合结构域结合抗原，所述抗原选自CD19、CD123、CD22、CD20、EGFRvIII、BCMA、间皮素、CD33、CLL-1、及其任何组合；

(b)所述跨膜结构域包含CD8铰链；

(c)所述共刺激信号传导区域选自4-1BB或CD28共刺激信号传导结构域；和/或

(d)所述信号传导区域包含CD3ζ信号传导结构域。

26.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述细胞活化剂是T细胞刺激化合物、针对CAR抗原结合结构域的抗独特型抗体、或肿瘤抗原。

27.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述细胞活化剂：

(a)包含CD3/TCR复合物和/或刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂；

(b)是多特异性结合分子，所述多特异性结合分子包含刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂；和/或

(c)包含表20中提供的序列和/或根据图37以一种或多种格式提供的序列。

28.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述细胞活化剂缀合或吸附至介孔二氧化硅颗粒的所述第一群体上、介孔二氧化硅颗粒的第二群体上，或介孔二氧化硅颗粒的所述第二群体的表面上的脂质包膜上。

29.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒。

30.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述介孔二氧化硅颗粒包含直径2-50nm的孔。

31.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述介孔二氧化硅颗粒的表面积是至少约100m²/g。

32.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述组合物适合于注射使用。

33.一种体内转导细胞的方法，所述方法包括施用如实施例1至32中任一项所述的组合物，每个组分同时或顺序施用。

34.一种治疗疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括施用如实施例1至32中任一项所述的组合物，每个组分同时或顺序施用。

35.如实施例34所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是癌症。

附图说明

图1显示介孔二氧化硅颗粒上的一系列表面修饰。

图2显示将病毒包膜蛋白(VSV-G)假型慢病毒吸附到MSR上后，MSR表面上的VSV-G染色的结果。对照MSR显示在上图，并且病毒孵育的棒显示在下图。

图3是MSR上的病毒吸附和T细胞转导的示意图。

图4提供与游离慢病毒或结合MSR的慢病毒孵育的T细胞的GFP表达结果。如图所示，从40μg/ml的起始浓度开始稀释病毒包被的MSR。“1x慢病毒”条件等同于用MSR条件孵育的病毒数量。“2x慢病毒”条件等同于用于包被MSR条件的数量的两倍。

图5提供MSR表面上配体呈递的总体策略的示意图。将脂质体与MSR一起孵育以形成支撑的脂质双层。可以使用链霉亲和素-生物素相互作用将配体偶联至MSR-脂质双层。

图6示出用POPC脂质体包被的MSR的图片，所述POPC脂质体含有1mol％PE-羧基荧光素。亮场(左)、荧光(中)、和重叠(右)图像被示出。

图7描述EGFRvIII CAR结合肽的肽序列(LEEKKGNYVVTDH(SEQ ID NO:756))。

图8说明通过肽固定在MSR上，EGFRvIII CART的细胞因子产生。结果提供与对照条件相比，由呈递EGFRvIII CAR结合肽的、脂质包被的MSR(脂质包被中有1％ PE-生物素)刺激的EGFRvIII CART的干扰素-γ和白细胞介素2的产生。

图9说明通过肽固定在MSR上，EGFRvIII CART的增殖。将0.01％PE-生物素的脂质包被的MSR组合物用于肽固定，并且孔中的MSR浓度为30μg/ml。在指示条件下培养的第7天进行细胞计数。

图10A和10B说明通过肽固定在MSR上，EGFRvIII CART的增殖和最终细胞组合物。起始MSR浓度为50μg/ml，并且从所述起始浓度开始的MSR的稀释度如轴所示。图10A示出了在培养期结束时，在所示材料情况下的CD4和CD8 T细胞的百分比。图10B描述在3天的培养期内，使用具有不同量的EGFRvIII CAR结合肽的MSR(在MSR表面上带有或不带有抗CD28)，对稀释CFSE的CD8+和CD4+CAR T细胞的FACS分析。

图11A和11B说明通过BCMA蛋白固定在MSR上，BCMA CART的增殖和最终细胞组合物。起始MSR浓度为50μg/ml，并且从所述起始浓度开始的MSR的稀释度如轴所示。图11A示出了在培养期结束时，在所示材料情况下的CD4和CD8 T细胞的百分比。图11B证明了在3天的培养期内，使用具有不同量的EGFRvIII CAR结合肽的MSR(在MSR表面上带有或不带有抗CD28)，对稀释CFSE的CD8+和CD4+CAR T细胞的FACS分析。

图12显示根据一些实施例的使用MSR同时刺激和转导未刺激的人T细胞的示意图。创建两个MSR群体–1)呈递激动性CD3/CD28抗体来用于刺激T细胞的MSR，2)带正电的PEI-MSR，其已与慢病毒结合来促进向T细胞的病毒递送。可以将两种类型的MSR以不同的比例混合在一起，以调整刺激和T细胞所暴露的病毒的数量。

图13说明暴露于刺激性(固定抗CD3/CD28抗体的MSR)和与病毒一起孵育的PEI-MSR的T细胞的转导效率。T细胞与不同数量的刺激棒一起孵育(刺激1.00代表70μg/mlMSR)，并以不同感染复数(MOI)(与PEI-MSR结合或呈游离病毒形式)暴露于GFP-慢病毒。在病毒条件下，MSR的最高浓度为22μg/ml。

图14说明暴露于刺激性(固定抗CD3/CD28抗体的)MSR和与病毒一起孵育的PEI-MSR的T细胞的转导效率。图示出在各种病毒总量下，作为刺激性MSR浓度的函数的转导效率。刺激性MSR条件1.0的MSR浓度为70μg/ml。PEI MSR条件1中的MSR浓度为22μg/ml。在培养开始后3天对转导进行评估。

图15提供比较病毒递送策略的转导效率的结果。在“PEI”和“游离”条件下，用“高”水平的与MSR(MSR浓度为70μg/ml)结合的CD3/CD28抗体刺激T细胞，并分别给予与PEI-MSR相关的或在介质中游离递送的病毒(病毒浓度1.0含有22μg/ml MSR，MOI约6.7)。在“PEI+CD3/CD28”中，病毒和CD3/CD28激动性抗体与PEI-MSR(浓度1.0为22μg/ml MSR)结合。在培养开始后3天对转导进行评估。

图16提供比较各种递送策略在PBMC群体中的转导的结果。将如图15所示的条件添加到PBMC。对在每种细胞类型中的转导的细胞的比例进行定量。在培养开始后3天对转导进行评估。

图17提供在各种病毒递送策略情况下在PBMC中的不同转导分数。上图提供了在图15的条件下PBMC群体中存在的总细胞组成。下图提供在使用图15的条件进行病毒递送后存在的转导的细胞级分的组成。在培养开始后3天对转导进行评估。

图18提供了本文披露的用作癌症治疗剂的组合物的非限制性示例性示意图，其中(A)描述了递送诱导已存在的皮肤淋巴毛细血管的淋巴管生成的生长因子VEGF-C；(B)描述了生成的淋巴内皮细胞分泌趋化因子(如CCL21)，这些趋化因子吸引免疫细胞(主要是初始T细胞)从血液循环进入凝胶顶部的真皮；(C)描述了培养T细胞的淋巴内皮细胞-不受理论束缚，申请人认为这种培养可以产生高比例的干细胞记忆表型，反过来，一旦转导，其可能是更有效的细胞；在T细胞被募集到这个引发位点之后，(D)描述了编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒与介孔二氧化硅棒组合递送以防止全身性扩散-不受理论束缚，申请人认为病毒的局部定位可能有利于局部募集的T细胞的转导，并且这种激活可以进一步改善转导，防止泄漏以及不需要的细胞的转导；(E)和(F)描述了转导和培养的细胞通过皮肤淋巴管、淋巴结和胸导管返回到体循环中-不受理论束缚，申请人认为这种细胞会在对肿瘤抗原的应答中进一步扩增。

图19A-19C展示了各种VEGF-C蛋白质变体的特征。图19A提供了天然和修饰的VEGF-C的示意图。通常在细胞内发现未成熟VEGF-C(#1)，其具有N末端和C末端前肽序列。一旦释放，VEGF-C蛋白就会进行蛋白水解切割，并以二聚体或单体形式作为次要或主要成熟形式(#2、#7)存在于细胞外间隙中。通过在序列中插入C137A突变，将主要(#9)和次要成熟(#8)形式的稳定的二聚体进行工程改造。次要成熟形式和主要成熟形式之间的主要区别是在次要成熟形式N末端存在额外的短前肽序列。不受理论束缚，申请人认为额外的短前肽似乎可以促进HEK293T和CHO MaKo细胞中二聚体的形成以及蛋白质的表达。图19B描述了在非还原(NR)和还原条件(R)下进行电泳的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，其装载有纯化的VEGF-C变体。图19C显示了具有相应VEGF-C变体的孔的详细信息，已经用星号表示出二聚体(**)和单体(*)的存在。具有全长前肽(#1)的未成熟VEGF-C作为二聚体产生，其中包含一些杂质(孔2和3)；去除前肽后会产生两种主要成熟VEGF-C形式(#2)，一种非共价二聚体形式(孔5、6)和一种单体形式(孔8、9)；在#2中添加突变C137A导致产生共价二聚体(孔21、22)和单体形式(孔24、25)。短的N末端前肽附着在蛋白质上，以产生非共价二聚体(孔11、12)或单体形式(孔15、16)的次要成熟VEGF-C形式(#7)。不受理论束缚，申请人已经确定，对#7VEGF-C的C137A突变导致仅产生VEGF-C二聚体(孔18、19)，这可能适合大规模生产。第1、4、7、10、13、14、17、20、23和26行示出分子量标志物，单位为kDa。

图20A-20C显示了用各种VEGF-C变体进行HDLEC芽生测定(sprouting assay)的结果。二聚体VEGF-C形式似乎表现出良好的体外活性。图20A描述了对人真皮淋巴管内皮细胞(HDLEC)进行体外芽生测定的实验设置，以测试VEGF-C变体的生物活性。孵育后，图20B通过WT-8测定评估细胞的增殖，图20C通过鬼笔环肽染色对管形成进行成像。管形成图像显示，主要和次要成熟形式(#2、7、8、9)比未成熟形式(#1)更能刺激HDLEC的芽生。不受理论束缚，据信二聚体形式(#2D、7D、8D、9D)优异的芽生活性使它们优选于单体形式(#2M、7M、9M)。

图21A-21D显示了海藻酸盐晶胶配制品中VEGF-C的释放速率，以及其可以在小鼠皮下注射的概念证明。图21A提供了海藻酸盐晶胶制造的非限制性的示例性示意图。将海藻酸盐液体预聚物与锂皂石和目的蛋白混合，然后冷冻，并且在注射前再次解冻以产生多孔基质。图21B显示了不同类型的海藻酸盐凝胶：海藻酸盐纳米多孔(凝胶化发生在晶胶化之前，所以没有形成孔)、海藻酸盐晶胶(冷冻和晶胶化之后，多孔)、以及具有0.25％锂皂石的海藻酸盐晶胶，在体外对VEGF-C释放的调节。0.25％锂皂石海藻酸盐晶胶在体外显示出VEGF-C蛋白的受控和持久的释放。图21C显示了根据装载有10μg或50μg VEGF-C的0.25％或0.5％锂皂石海藻酸盐晶胶，VEGF-C体外释放谱的调节。总VEGF-C的30％从凝胶中释放，并根据受控释放谱，选择0.25％锂皂石海藻酸盐晶胶进行体内工作。图21D是描述用16G针头在小鼠皮下注射的晶胶的图像。

图22A-22C描述了VEGF-C在初始小鼠皮肤中诱导体内淋巴血管生成。不受理论束缚，次要成熟共价二聚体VEGF-C似乎具有优异的功效。图22A描述了体内实验设置，图22B显示了代表性的点状图，这些点状图显示了在晶胶移植14天后进行皮肤消化后，通过流式细胞术对淋巴内皮细胞(CD45-、CD31+、PDPN+)的染色来评估体内淋巴管生成。在图22C中，小鼠皮肤的淋巴管生成在染色后量化为淋巴内皮细胞计数/mg。共价二聚体(#8、#9)显示出高的体内淋巴管生成。因此，#8用于进一步的实验。PDPN：平足蛋白(podoplanin)。

图23A-23E，皮肤淋巴管对通过海藻酸盐晶胶递送的10μg VEGF-C(#7变体，SEQ IDNO:734)有应答，并且淋巴管生成在晶胶植入后14天达到峰值，这与C57/BL6小鼠初始皮肤的免疫浸润峰值相一致。图23A描述了装载到海藻酸盐晶胶中的VEGF-C(1、10、20、50μg)的体内剂量应答和淋巴管生成诱导(表示为总淋巴内皮细胞(LEC)计数/mg组织，上图)以及在递送10μg VEGF-C后淋巴管生成的时间过程(下图)。这些结果表明，10μg的VEGF-C诱导体内高淋巴管生成，并且在皮下晶胶递送后14天观察到了淋巴管生成的峰值。图23B：凝胶植入14天后，C57/BL6小鼠皮肤消化后分离的LEC(CD45-CD31+PDPN+)和血液内皮细胞(BEC，CD45-CD31+PDPN-)染色的代表性图。图23C：内皮细胞定量为总细胞计数/mg组织。图23D：以CD4+T细胞和CD8+T细胞的总细胞数/mg组织表示的定量。LEC计数与T细胞浸润相关，尤其是初始表型(CD62L+、CD44-)。柱形图包括针对VEGF-C和对照条件合并的5个独立实验，VEGF-Cn＝30，对照n＝18，初始n＝3，以平均值+SEM表示，Mann-Whitney非参数t检验，****，P<0.0001；**，p<0.01。图23E显示了在VEGF-C海藻酸盐晶胶注射后的几天里，每mg的组织中指定的细胞类型(LEC、CD4 T细胞、或CD8 T细胞)的定量。

图24A-24C证实，在CHO MaKo细胞中产生的VEGF-C#8具有功能性。在图24A中，HDLEC体外芽生测定显示CHO细胞(8CHO)中产生的VEGF-C蛋白#8的活性与HEK293T细胞中产生的#8的活性相当。在图24B中，通过在晶胶递送后14天皮肤消化后对LEC进行染色，也在体内证实了相当的生物活性。图24C显示了注射了空白晶胶或装载了#8HEK或#8CHO VEGF-C的晶胶的小鼠的淋巴管生成量化为总LEC计数/mg组织。BEC(CD45-CD31+PDPN-)不受VEGF-C#8递送的影响，而淋巴管生成的峰值对应于晶胶递送后第14天CD4和CD8 T细胞(CD45+)在晶胶顶部的皮肤中的免疫浸润峰值。n>9。柱形图表示为平均值+SEM，CHO相比于对照、HEK相比于对照或CHO相比于HEK之间的Mann-Whitney非参数t检验，****，p<0.0001；**，p<0.01

图25A-25C证明，VEGF-C还诱导免疫力低下的NSG小鼠中的淋巴管生成，并且小鼠LEC有效地募集人外周血单核细胞(PBMC)。图25A提供了在VEGF-C(变体#8，具有C137A突变的次要成熟形式，SEQ ID NO:736)或空白晶胶递送后14天，NSG、C57/BL6小鼠皮肤LEC和BEC染色的代表性流式细胞术图。图25B展示了NSG小鼠中的凝胶递送的实验设置以及随后的人PBMC静脉注射(在第10天)。在凝胶植入后第17天，对小鼠进行安乐死，并分析其皮肤淋巴管生成和免疫浸润情况。图25C显示了以LEC、总T细胞(CD45+CD3+)CD8(CD3+CD8+)和CD4(CD3+CD4+)T细胞亚群以及B细胞(CD45+CD19+)的总计数/mg表示的定量。这些数据表明，T细胞是NSG小鼠中募集的PBMC的主要细胞类型。

图26A-26B提供了VEGF-C在小鼠皮肤中递送的示意图，在注射与结合介孔二氧化硅颗粒(MSP)的起始物(STARTERS)(例如，均质化的结合MSR的起始物)组合的与MSP(例如，均质化介孔二氧化硅棒(MSR))结合的病毒颗粒(图26A)或与结合MSP的起始物(例如，均质化的结合MSR的起始物)组合的游离病毒(图26B)后，产生待培养和转导的T细胞的二级引发位点。

图27A-27B提供了MSP，特别是均质化的MSR，装载编码CD 19CAR的慢病毒的能力的表征。根据基于细胞的转导测定确定的功能效价，将三甲基铵MSR与表达GFP的慢病毒以不同量共同孵育。对三个级分中的病毒的量进行表征-病毒装载液(添加到MSR的初始输入)、结合MSR的病毒(孵育和洗涤后保持与MSR结合的量)以及未结合的病毒(MSR和病毒共孵育后仍在溶液中的量)。将MSR和病毒在冰上共孵育30分钟，去除上清液(未结合的病毒)，并且在评估结合MSR的病毒之前，将MSR洗涤两次。还分析了每种条件下未接触过的病毒装载液。在图27A中，结果显示输入的病毒装载液中的大部分病毒在吸附和洗涤后被保留在结合MSR的病毒级分中。吸附在MSR上的病毒的量随着病毒装载液中病毒的量的增加而增加。图27A显示了结合MSR的病毒相对于病毒装载液的计算分数在吸附和洗涤后在MSR上具有很强的装载和保留效率。

图28提供了病毒在MSP上，特别是均质的MSR上的保留的表征。将慢病毒和MSR在冰上共孵育30分钟，并且将MSR洗涤两次。然后将MSR在含有10％ FCS的R10培养基或OpTmizer无血清培养基中培养，并将输入的病毒储备液也在培养基中培养。在孵育开始后的指定时间除去上清液，并分析总病毒含量。结果表明，MSR在前18小时内只释放了输入病毒的一部分。

图29A-29C显示了使用与编码CD19 CAR(CAR19)的病毒结合的MSP，特别是均质化MSR，CAR-T细胞的功能性产生。CART由游离慢病毒(无CAR)或与三甲基铵MSR(CAR-MSR)结合的慢病毒产生。指出了在CAR-MSR条件下，用于无CAR转导的MOI和用于吸附在MSR上的总病毒的MOI。选择这些MOI来生产在两种条件之间具有相似转导效率的CART。在吸附步骤后洗涤MSR，因此在MSR条件下，T细胞的转导中的病毒总量可能会以低于指示的MOI发生。将4.3e6 TU/病毒/1mg的MSR用于MSR和病毒的共孵育，然后洗涤，并且用T细胞铺板。将T细胞用构建体4(表20、图38A-38B)和指定的病毒制剂处理1天，随后洗涤，并且再培养3天。图29A显示了转导后第4天测量的CAR+百分比。在转导后第4天，将细胞与Nalm6-Luc细胞一起用于杀伤测定，并且在相对于总细胞和CAR+细胞归一化后，以指定的效应子:靶标(E:T比率；T细胞)共孵育。结果表明，图29B的特异性杀伤活性和图29C的干扰素-γ释放在共孵育24小时期间在CAR-MSR和无CAR之间是相当的，表明与传统的游离病毒转导相比，用MSR的配制品转导在体外产生同等功能的CART。

图30A-30B表明，通过均质化减小MSR的尺寸，改善了MSR的可注射性。使用珠混合器将MSR均化，以减小其尺寸并改善可注射性。在图30A中，在MSR的长度上观察到尺寸减小，这就允许通过直径较小的针头注射到皮内间隙。在图30A中，标准的三甲基铵MSR或均质化的MSR与慢病毒吸附在一起，并建立该复合物的稀释系列，并用于与编码GFP的慢病毒转染T细胞。MSR的均质化并没有实质性地改变体外转导性能。

图31A-31B描述了含有相邻晶胶和MSP，特别是均质化的MSR的皮肤的苏木精和曙红(H&E)染色切片。皮下注射空白海藻酸盐晶胶，并且7天后用胰岛素注射器(对于MSR-病毒组)或汉密尔顿(Hamilton)注射器(对于游离病毒)在凝胶顶部的皮内间隙中注射游离或与MSR结合的病毒颗粒(4e6 TU)。病毒递送后72h，对小鼠实施安乐死，并收获组织(皮肤和引流淋巴结)用于免疫组织化学分析。为了促进VEGF-C向淋巴毛细血管的递送，将晶胶植入到膜肌肉顶部的高皮下间隙。图31A描述了H&E染色切片，显示了皮下晶胶在皮下组织中的膜肌表面的位置。MSP，特别是均质化的MSR，表现为轻度嗜酸性颗粒材料，与位于植入晶胶附近真皮-皮下交界处的单核细胞混合(图31A和图31B为特写图)。

图32A-32B显示了CAR mRNA在皮肤切片上的原位杂交。用于检测CAR mRNA转录物的原位杂交显示，在注射结合MSR的病毒的小鼠中，与注射MSP(特别是均质化的MSR)对应的区域内出现了稳健的信号(图32A)，同时在渗透凝胶的细胞以及游离病毒条件下与之相邻的细胞中检测到扩散信号(图32B)。不受理论束缚，申请人认为这些数据支持这样的观点，即MSP，特别是均质化的MSR，可能维持病毒在真皮中的定位，在真皮处T细胞浸润皮肤。

图33A-33B显示，与游离病毒组相比，注射了MSP-病毒，特别是均质化的MSR-病毒的小鼠在引流淋巴结中具有较少的CAR mRNA转录阳性细胞。CAR mRNA在引流淋巴结(dLN)的切片上的原位杂交。原位杂交在注射了结合MSR的病毒的小鼠dLN内只检测到一个CARmRNA转录阳性细胞(图33A)，而注射了游离病毒的小鼠在被膜下淋巴窦中显示出少许CARmRNA转录阳性细胞，与病毒或细胞从晶胶移植部位的的局部引流一致(图33B)。

图34A-34C显示了体内CD19+CART细胞的产生和脾中B细胞耗减。图34A提供了体内CART制造的实验设置时间轴。在第0天，将装载有VEGF-C的海藻酸盐晶胶皮下注射到NSG小鼠中。在第10天(我们知道达到淋巴管生成峰值之前的3天)，将PBMC静脉注射到小鼠体内，并且7天后(第17天)将MSP-病毒(特别是均质化的MSR-病毒)、游离病毒或作为对照的PBS，与MSP-起始物(特别是均质化的MSR-起始物)一起注射到各组中，以便可能促进T细胞的激活并且有利于T细胞转导。在第35天，对小鼠实施安乐死，并收集脾和血液，以确定编码CD19CAR的病毒体内递送是否能诱发由VEGF-C诱导的淋巴管生成所募集的T细胞的转导。图34B提供了免疫群体的代表性流式细胞术(FACS)图，显示用游离病毒或MSP-病毒，特别是均质化的MSR-病毒治疗的小鼠的脾中的B细胞耗减和T细胞转导(CD19 CAR+细胞)。图34C是所有组中小鼠脾中B细胞耗减和CAR-T细胞的定量。

图35显示组合物对非T细胞的最小转导。提供了用游离病毒或MSP-病毒(特别是均质化的MSR-病毒或)PBS对照治疗的小鼠的脾中的人CD11b+单核细胞、小鼠单核细胞(在NSG小鼠中无功能)以及基质细胞的代表性流式细胞术(FACS)图。很少有人单核细胞显示CD19CAR的阳性染色。

图36A-36B显示B细胞耗减与CAR-T细胞在脾和血液中的扩增相关。在图36A中，绘制了脾中的CART细胞(总计数/mg组织)相比于B细胞(总计数/mg组织)的图，并且在图36B中，绘制了CART细胞(血液，表示为总细胞计数/μl)相比于B细胞耗减(脾，表示为总细胞计数/mg组织)的图。

图37A-37C提供了双特异性抗体的示例性方案，包括单个双特异性抗体方案(图37A)、多聚双特异性抗体方案(图37B)、和图解(图37C)。

图38.在植入部位募集T细胞。图38显示了在病毒递送后18天，接受晶胶-VEGF-C植入物加MSP-病毒和MSP-起始物的小鼠皮肤上CD3的IHC分析的实验设置(上)和代表性图像(下)。

图39.凝胶周围单核细胞中的CAR ISH信号。图39显示了在病毒递送后18天，接受晶胶-VEGF-C植入物加MSP-病毒和MSP-起始物的小鼠皮肤中细胞的CAR ISH分析(CD19 CARRNA)的代表性图像。

图40.局部体内产生的CAR-T细胞迁移到脾并与B细胞耗减相关。图40显示了在病毒递送后18天，接受晶胶-VEGF-C植入物加MSP-病毒和MSP-起始物的小鼠脾中细胞的CARISH分析的代表性图像。

图41A-41B.体内CAR-T细胞的产生与植入部位和脾中B细胞杀伤相关。在病毒递送后18天，在接受晶胶-VEGF-C植入物加MSP-病毒和MSP-起始物的小鼠的植入部位处(图41A，荧光图像上分图和明视野图像下分图)以及脾(图41B)中荧光标记的CD19+B细胞和CD3+T细胞的代表性图像。

图42A-42B.NSG小鼠中循环的人T细胞随时间变化的分析。图42A显示了实验设计和分组。图42B是显示植入小鼠随时间变化的流式细胞术分析的一组图。流式细胞术数据表示为平均值±SEM。

图43A-43B.循环中的B细胞耗减与CART细胞扩增相关。经植入的小鼠的循环中的CART细胞(图43A)和B细胞(图43B)随时间推移的流式细胞术分析。流式细胞术数据表示为平均值±SEM(在图43A和43B中)或每个小鼠的单独曲线(图43B)。

图44A-44B.CART细胞扩增与循环和脾中的B细胞耗减密切相关。用不同条件处理的小鼠的血液(图44A)和脾(图44B)中的B细胞数量和T细胞数量的相关性。细胞数量代表在流式细胞术分析中确定的细胞计数/mg组织或计数/μl血液。

图45A-45B.病毒递送后18天，脾中CART细胞扩增和相应B细胞耗减的定量。经治疗的小鼠的脾中CART(图45A)和B细胞(图45B)计数/mg组织的定量。流式细胞术数据表示为平均值±SEM。

图46A-46D.病毒递送后18天，CART细胞扩增与皮肤中淋巴管生成以及局部B细胞耗减相关。经治疗的小鼠的脾中CART(图46A)和B细胞(图46B)计数/mg组织的定量。流式细胞术数据表示为平均值±SEM。皮肤中B细胞数量和CART细胞数量(图46C)以及CART细胞数量和淋巴内皮细胞(LEC)数量(图46D)的相关性图。在相关性图中，细胞数量以计数/mg组织表示。

图47.GFP转基因表达作为MSP剂量的函数。

图48A-48B描述了包含CD3抗原结合结构域的17种不同的多特异性构建体的示意图，该CD3抗原结合结构域包含衍生自抗CD3抗体的重链和轻链，并且在除对照构建体11、14和17以外的所有结构中，CD28或CD2抗原结合结构域如所指出的，包含分别衍生自抗CD28或CD2抗体的重链和轻链。不受理论束缚，应了解的是，这些构建体中的任何一个或多个都可以作为本文所披露的细胞激活剂使用。

构建体1包含融合到抗CD2 Fab的抗CD3 scFv，该抗CD2 Fab进一步融合到Fc区。构建体1包含第一链和第二链。第一链从N末端至C末端包含抗CD2 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3 VL、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD2 VH、CH1、CH2、和CH3。构建体2包含融合到抗CD28Fab的抗CD3 scFv，该抗CD28 Fab进一步融合到Fc区。构建体2包含第一链和第二链。第一链从N末端至C末端包含抗CD28 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3 VL、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD28 VH、CH1、CH2、和CH3。

构建体3包含融合到Fc区的抗CD2 Fab，该Fc区进一步融合到抗CD3 scFv。构建体3包含第一链和第二链。第一链从N末端至C末端包含抗CD2 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD2 VH、CH1、CH2、CH3、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ IDNO:29)、抗CD3 VL。构建体4包含融合到Fc区的抗CD28Fab，该Fc区进一步融合到抗CD3scFv。构建体4包含第一链和第二链。第一链从N末端至C末端包含抗CD28 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD28 VH、CH1、CH2、CH3、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3 VL。

构建体5包含融合到抗CD3 scFv的抗CD2 Fab，该抗CD3 scFv进一步融合到Fc区。构建体5包含第一链和第二链。第一链从N末端至C末端包含抗CD2 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD2 VH、CH1、(G4S)2接头(SEQ ID NO:767)、抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ IDNO:29)、抗CD3 VL、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、CH2、和CH3。构建体6包含融合到抗CD3scFv的抗CD28 Fab，该抗CD3 scFv进一步融合到Fc区。构建体6包含第一链和第二链。第一链从N末端至C末端包含抗CD28 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD28VH、CH1、(G4S)2接头(SEQ ID NO:767)、抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3 VL、(G4S)4接头(SEQID NO:29)、CH2、和CH3。

构建体7包含融合到Fc区的抗CD3 scFv，该Fc区进一步融合到抗CD2 Fab。构建体7包含第一链和第二链。第一链从N末端至C末端包含抗CD2 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3 VL、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、CH2、CH3、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD2 VH、和CH1。构建体8包含融合到Fc区的抗CD3scFv，该Fc区进一步融合到抗CD28Fab。构建体8包含第一链和第二链。第一链从N末端至C末端包含抗CD28 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3 VL、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、CH2、CH3、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD28VH、和CH1。

构建体9包含融合到第一Fc区的抗CD2 Fab和融合到第二Fc区的抗CD3 scFv。构建体9包含第一链、第二链、和第三链。第一链从N末端至C末端包含抗CD2 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD2VH、CH1、CH2、和CH3。第三链从N末端至C末端包含抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3 VL、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、CH2、和CH3。构建体10包含融合到第一Fc区的抗CD28 Fab和融合到第二Fc区的抗CD3 scFv。构建体10包含第一链、第二链、和第三链。第一链从N末端至C末端包含抗CD28 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD28 VH、CH1、CH2、和CH3。第三链从N末端至C末端包含抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3 VL、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、CH2、和CH3。

构建体11包含融合到Fc区的抗CD3 scFv。构建体11包含第一链和第二链。第一链从N末端至C末端包含CH2和CH3。第二链从N末端至C末端包含抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ IDNO:29)、抗CD3 VL、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、CH2、和CH3。

构建体12包含融合到第一Fc区的抗CD2 Fab和融合到第二Fc区的抗CD3 scFv。构建体12包含第一链、第二链、和第三链。第一链从N末端至C末端包含抗CD2 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD2 VH、CH1、CH2、和CH3。第三链从N末端至C末端包含抗CD3VH、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3 VL、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、CH2、CH3、(G4S)3接头(SEQ ID NO:30)、和Matrilin1。构建体13包含融合到第一Fc区的抗CD28 Fab和融合到第二Fc区的抗CD3 scFv。构建体13包含第一链、第二链、和第三链。第一链从N末端至C末端包含抗CD28 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD28 VH、CH1、CH2、和CH3。第三链从N末端至C末端包含抗CD3VH、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3 VL、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、CH2、CH3、(G4S)3接头(SEQ ID NO:30)、和Matrilin1。

构建体14包含融合到Fc区的抗CD3 scFv。构建体14包含第一链和第二链。第一链从N末端至C末端包含CH2和CH3。第二链从N末端至C末端包含抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ IDNO:29)、抗CD3 VL、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、CH2、CH3、(G4S)3接头(SEQ ID NO:30)、和Matrilin1。

构建体15包含融合到第一Fc区的抗CD2 Fab和融合到第二Fc区的抗CD3 scFv。构建体15包含第一链、第二链、和第三链。第一链从N末端至C末端包含抗CD2 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD2 VH、CH1、CH2、和CH3。第三链从N末端至C末端包含抗CD3VH、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3 VL、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、CH2、CH3、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、和软骨寡聚基质蛋白卷曲螺旋结构域(COMPcc)。构建体16包含融合到第一Fc区的抗CD28 Fab和融合到第二Fc区的抗CD3 scFv。构建体16包含第一链、第二链、和第三链。第一链从N末端至C末端包含抗CD28 VL和CL。第二链从N末端至C末端包含抗CD28 VH、CH1、CH2、和CH3。第三链从N末端至C末端包含抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、抗CD3VL、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、CH2、CH3、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、和COMPcc。

构建体17包含融合到Fc区的抗CD3 scFv。构建体17包含第一链和第二链。第一链从N末端至C末端包含CH2和CH3。第二链从N末端至C末端包含抗CD3 VH、(G4S)4接头(SEQ IDNO:29)、抗CD3 VL、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、CH2、CH3、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、和COMPcc。

表20中提供了构建体1至构建体17的示例性序列。另外序列(例如，本文披露的抗CD3结合物、本文披露的抗CD28结合物、本文披露的抗CD2结合物或本文披露的Fc区)可用于产生构建体1至构建体17。

图49A-49B显示了第二代起始物分子的结合信息(图49A)和构型(图49B)。“F5抗CD3(2)”是指具有基于抗CD3(2)的抗CD3结合物的F5构建体。

图50A-50B显示了第三代起始物分子的结合物信息(图50A)和构型(图50B)。

图51A显示了实例J中测试的起始物分子的构型。图51B和51C显示了由MSP-慢病毒-起始物混合物介导的T细胞活化和转导。MSP-慢病毒-起始物混合物的每个稀释液中起始物分子的浓度显示在x轴上。两批MSP产生的配制品在体外产生了类似的T细胞激活(图51B)和转导(图51C)效率。与起始物分子(图51B-C中的“无MSP”)的可溶性递送相比，递送与MSP结合的起始物分子(图51B-C中的“批次1”和“批次2”)增强了激活和转导。图51B中的第1天和图51C中的第4天是指T细胞培养开始(即，当细胞和MSP-起始物-病毒最初混合在一起时)后的时间。

图52A和52B显示了由MSP-慢病毒-起始物混合物介导的T细胞激活和转导。将编码GFP的慢病毒和起始物分子装载到全尺寸(“MSP”)或尺寸减小的MSP上，其中使用MSP的珠均质化(“珠均质化”)或超声处理(“超声化”)实现尺寸减小。MSP-慢病毒-起始物混合物的每个稀释液中慢病毒与T细胞(MOI)的比率显示在x轴上。MSP的尺寸减小不会对T细胞激活(图52A)和转导(图52B)的体外效力产生负面影响。珠均质化和超声处理均产生了与全尺寸MSP相当的结果。

图53A和53B显示了体内研究的设计。图53C是可注射物2注射后第18天小鼠血液中CD19 CAR-T扩增与B细胞耗减的相关性图。图53D显示了表达荧光素酶的NALM6肿瘤植入NSG小鼠4天，然后用剂量为3e5的过继转移的CAR+T细胞治疗的生物发光测量值，这些细胞来自经历体内CART产生过程的最初小鼠群组。图像来自过继转移后13天。将小鼠用使用游离病毒(“游离的病毒”)或MSP递送的病毒(“MSP病毒”)制造的3e5 CAR-T的剂量治疗。还显示了对照组，其中将肿瘤用来自无CART的供体小鼠的转移的PBMC(“PBMC对照”)治疗，或者其中肿瘤未经治疗(“NALM6”)。标记为“a”的小鼠接受来自游离病毒组的1.5e5 CAR+细胞。标记为“b”的小鼠接受来自游离病毒组的2.3e5 CAR+细胞。图53E、53F、和53G是显示在晶胶部位皮内注射可注射物2后13天，循环中总T细胞的CART％(图53E)、循环中CART的数量(图53F)和循环的CD3+T细胞的数量(图53G)的图。图53H、53I、和53J是选择用于循环淋巴细胞过继转移到NALM6激发的小鼠中的小鼠的图，其显示在可注射物2的皮内注射后18天，循环的T细胞的量(图53H)、循环的CART细胞的量(图53I)和循环中总T细胞的CART％(图53J)。图53K和53L显示了对用于过继转移的小鼠和参加研究的其余小鼠的血液进行组合流式细胞术分析的结果，其显示了在可注射物2的皮内注射后18或19天，循环的T细胞的量(图53K)和循环中的CART细胞的量(图53L)。

图54A、54B、54C、和54D是显示体外释放数据的图。图54A显示了H2a水凝胶(200kDa[HA-N3]-24％；9％交联)和H4a水凝胶(700kDa[HA-N3]-16％；18％交联)的数据。图54B显示了H4a水凝胶(700kDa[HA-N₃]-16％；18％交联；无锂皂石)、H5a水凝胶(700kDa[HA-N₃]-16％；18％交联；0.25mg/ml锂皂石)、和H6a水凝胶(700kDa[HA-N₃]-16％；18％交联；1mg/ml锂皂石)的数据。图54C显示了H5a水凝胶(原位；0.25mg/ml锂皂石)和H5b水凝胶(颗粒；0.25mg/ml锂皂石)的数据。图54D显示了H6a水凝胶(原位；1mg/ml锂皂石)和H6b水凝胶(颗粒；1mg/ml锂皂石)的数据。

图55A和55B是显示第7天的体内PD应答的图。

具体实施方式

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

术语“一个/种(a/an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)所述冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。

当指可测量的值如量、时距等时，术语“约”意在涵盖与规定值±20％或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下±1％、或在一些情况下±0.1％的变化，因为此类变化适于执行所披露的方法。

如本文所用的，术语“细胞募集因子”是指能够募集细胞，例如免疫细胞的药剂。此类募集因子的非限制性实例包括IL-2、IL-7、CCL21、IL 5、GM-CSF、CCL19、CXCL9、CXCL10、XCL1、淋巴毒素α、淋巴毒素β、和VEGF-C。已知这些因子可以募集免疫细胞，如T细胞。募集特定细胞类型的细胞募集因子的另外的非限制性实例包括皮肤归巢趋化因子，例如但不限于CCL17、CCL22、CCL20、和CCL27；骨髓细胞化学引诱剂，例如但不限于FLT3L、G-CSF、PDGF、S100A8/A9、CSF-1、CXCL8、CCL20、CCL17、CCR5、CCR6、CCL2、VEGF、血管生成素-2、CXCL12、PGE2、和LTB4；以及NK特异性募集因子，例如但不限于CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、CXCL11、和CXCL12

如本文所用的，术语“细胞活化剂”是指能够激活细胞以执行给定功能的药剂-例如，对于T细胞，内源性或工程改造的受体(例如，CAR)的接合或细胞表面标志物激活T细胞以增殖，并且在某些情况下分泌适当的细胞因子。

术语“嵌合抗原受体”或者“CAR”是指重组多肽构建体，所述重组多肽构建体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自如下定义的刺激分子的功能性信号传导结构域的胞质信号传导结构域(本文还称为“细胞内信号传导结构域”)。在一些实施例中，CAR多肽构建体中的结构域在同一多肽链中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些实施例中，例如，如在如本文所述的RCAR中所提供，CAR多肽构建体中的结构域彼此不连续，例如在不同的多肽链中。

在一些方面，胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如CD3-ζ的初级信号传导结构域)。在一些方面，胞质信号传导结构域还包含源自如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一些方面，共刺激分子选自41BB(即，CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含源自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含源自共刺激分子的功能信号传导结构域和源自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)|跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含源自一种或多种共刺激分子的两个功能信号传导结构域和源自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)|跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含源自一种或多种共刺激分子的至少两个功能信号传导结构域和源自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基-末端(N-ter)的任选的前导序列。在一些方面，CAR还包含在细胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间从抗原识别结构域(例如，scFv)切割。

包含靶向特定肿瘤标志物X的抗原结合结构域(例如，scFv(单结构域抗体)或TCR(例如，TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域))的CAR(其中X可以是如本文所述的肿瘤标志物)也称为XCAR。例如，包含靶向BCMA的抗原结合结构域的CAR被称为BCMA CAR。CAR可以在任何细胞中表达，例如，如本文所述的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。

术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，其通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过响应于此类信使而用作效应子，经由定义的信号传导途径调控细胞活性起作用。

如本文所用，术语“抗体”是指源自与抗原特异性地结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。

术语“抗体片段”是指抗体的至少一部分，所述部分保留与抗原表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、由抗体片段(如包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体、和分离的CDR、或抗体的其他表位结合片段。抗原结合片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、细胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和bis-scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136，2005)。还可以将抗原结合片段移植到基于多肽如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。

包含抗体或其抗体片段的本发明CAR部分可以按多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，所述连续多肽链包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人,1999:Using Antibodies:ALaboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Harlow等人,1989:Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一些方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一个方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),"Sequences of Proteins of Immunological Interest"[具有免疫学重要性的蛋白序列]，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(“卡巴特”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“乔西亚”编号方案)、或其组合。

如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一些实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。

术语“双特异性抗体(双特异性抗体/双特异性抗体)”是指在单个分子内组合两种抗体的抗原结合位点的分子。因此，双特异性抗体能够同时或依次结合两种不同的抗原。用于制备双特异性抗体的方法是本领域熟知的。用于组合两种抗体的各种形式也是本领域已知的。如本领域技术人员已知的，本发明的双特异性抗体的形式包括但不限于双抗体、单链双抗体、Fab二聚化(Fab-Fab)、Fab-scFv和串联抗体。

术语“抗体重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，并且通常决定抗体所属的类别。

术语“抗体轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。κ(kappa)和λ(lambda)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如像由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。所述术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子和表达抗体蛋白的DNA分子或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已经使用本领域可得和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。

术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。免疫应答可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的活化或两者。技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”(当所述术语在本文中使用时)。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所希望的免疫应答的多肽。另外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成或可以源自生物样品，或者可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。

所述术语“多特异性结合分子”是指特异性结合至至少两个抗原并包含两个或更多个抗原结合结构域的分子。所述抗原结合结构域可以各自独立地是抗体片段(例如，scFv、Fab、纳米抗体)、配体、或非抗体衍生的结合物(例如，纤连蛋白、Fynomer、DARPin)。

在多特异性结合分子、抗体(例如，双特异性抗体)或抗体片段的上下文中，如本文所用的术语“一价”其中是指对于多特异性结合分子、抗体(例如，双特异性抗体)、或抗体片段的每个抗原存在单一抗原结合结构域的多特异性结合分子、抗体(例如，双特异性抗体)、或抗体片段。

在多特异性结合分子、抗体(例如，双特异性抗体)或抗体片段的上下文中，如本文所用的术语“二价”是指对于多特异性结合分子、抗体(例如，双特异性抗体)、或抗体片段结合的每个抗原存在两个抗原结合结构域的多特异性结合分子、抗体(例如，双特异性抗体)、或抗体片段。

术语“多聚体”是指多个分子(例如但不限于抗体(例如双特异性抗体))的聚集体，任选地彼此缀合。

术语“抗癌作用”是指可以通过各种手段显现的生物学作用，包括但不限于例如肿瘤体积减少、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命延长、癌细胞增生减少、癌细胞存活率降低、或改善与癌症相关的各种生理症状。“抗癌作用”还可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防癌症发生的能力来显现。术语“抗肿瘤作用”是指可以通过各种手段显现的生物学作用，包括但不限于例如肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增生减少、或肿瘤细胞存活率降低。

术语“自体的”是指源自与后来将其重新引入个体中的同一个体的任何材料。

术语“同种异体的”是指源自与引入材料的个体相同的物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时，称两个或更多个个体彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料可以在遗传上充分不同以抗原性地相互作用。

术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。

术语“癌症”是指特征在于异常细胞不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例，并且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语包括实体和液体，例如弥散或循环肿瘤。如本文所用，所述术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。

如本文所述，“缀合至”意指通过本文所述的任何方式，任选地共价地或非共价地和/或直接或通过接头进行关联或附接。

“源自”(当所述术语在本文中使用时)表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不暗示或包括对源自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在源自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，这样使得其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它没有暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或强加突变，以到达细胞内信号传导结构域。

短语“与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的疾病”包括但不限于与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的疾病或与表达如本文描述的肿瘤抗原的细胞相关的病症，包括例如增生性疾病(如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或与表达如本文描述的肿瘤抗原的细胞相关的非癌症相关适应症。在一些方面，与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的癌症是血液癌症。在一些方面，与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的癌症是实体癌。与本文描述的肿瘤抗原的表达相关的其他疾病包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的增生性疾病。与如本文描述的肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮)、炎性病症(过敏症和哮喘)和移植。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。

术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体(或在CAR情况下的肿瘤抗原)的结合诱导的初级应答，从而介导信号转导事件，如但不限于，通过TCR/CD3复合物的信号转导或通过适当的NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达。

术语“刺激分子”是指由免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供以针对免疫细胞信号传导通路的至少一些方面的刺激方式调节免疫细胞激活的一个或多个细胞质信号传导序列。在一些方面，信号是初级信号，所述初级信号通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合而启动，并且导致了介导T细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中特别有用的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。在本发明的特定CAR中，本发明的任何一种或多种CAR中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是提供为SEQ ID NO:18的序列，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等)的等同残基。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是提供为SEQ IDNO:20的序列，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。

术语“Fc沉默型”是指经修饰的Fc结构域以与效应细胞具有最小相互作用。沉默的效应子功能可以通过在抗体的Fc区中进行突变而获得并已经在本领域中进行了描述，例如，但不限于LALA和N297A(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.[当前生物技术观点]卷20(6):685-691)；和D265A(Baudino等人,2008,J.Immunol.[免疫学杂志]181:6664-69)还参见Heusser等人,WO 2012065950。Fc沉默突变的实例包括在IgG1 Fc氨基酸序列中包含L234A和L235A突变的LALA突变体、DAPA(D265A、P329A)(参见，例如US 6,737,056)、N297A、DANAPA(D265A、N297A和P329A)和/或LALADANAPS(L234A、L235A、D265A、N297A和P331S)，其根据Eu编号系统进行编号。另外，沉默突变的非限制性示例性实施例包括LALAGA(L234A、L235A、和G237A)、LALASKPA(L234A、L235A、S267K、和P329A)、DAPASK(D265A、P329A、和S267K)、GADAPA(G237A、D265A、和P329A)、GADAPASK(G237A、D265A、P329A、和S267K)、LALAPG(L234A、L235A、和P329G)、以及LALAPA(L234A、L235A、和P329A)，其根据Eu编号系统进行编号。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)，如描述于Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学目的蛋白质序列]，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health[公共卫生服务，美国国立卫生研究院]，贝塞斯达，马里兰州(1991)中。

术语“CD3/TCR复合物”是指T细胞表面上包含TCR的复合物，该TCR包括TCRα和TCRβ链；CD3包括一个CD3γ链、一个CD3δ链、和两个CD3ε链；和ζ结构域。UniProt登录号P01848(TCRα，恒定结构域)、P01850(TCRβ，恒定结构域1)、A0A5B9(TCRβ，恒定结构域2)、P09693(CD3γ)、P04234(CD3δ)、P07766(CD3ε)提供了这些链的示例性人序列，除了负责细胞内信号传导的ζ链，其在如下文进一步详细讨论。进一步相关的登录号包括A0A075B662(鼠TCRα，恒定结构域)、A0A0A6YWV4和/或A0A075B5J3(鼠TCRβ，恒定结构域1)、A0A075B5J4(鼠TCRβ，恒定结构域2)、P11942(鼠CD3γ)、P04235(鼠CD3δ)、P22646(鼠CD3ε)。

术语“CD28”是指T细胞特异性糖蛋白CD28，也称为Tp44以及其所有替代性名称，其用作共刺激分子。UniProt登录号P10747提供了示例性人CD28氨基酸序列(还参见HGNC：1653，Entrez基因：940，Ensembl：ENSG00000178562，和OMIM：186760)。进一步相关的CD28序列包括UniProt登录号P21041(鼠CD28)。

术语“ICOS”是指可诱导T细胞共刺激分子，也称为AILIM、CVID1、CD278以及其所有替代性名称，其用作共刺激分子。UniProt登录号Q9Y6W8提供了示例性人ICOS氨基酸序列(还参见HGNC：5351，Entrez基因：29851，Ensembl：ENSG00000163600，和OMIM：604558)。进一步相关的ICOS序列包括UniProt登录号Q9WVS0(鼠ICOS)。

术语“CD27”是指T细胞活化抗原CD27、肿瘤坏死因子受体超家族成员7、T14、T细胞活化抗原S152、Tp55以及其所有替代性名称，其用作共刺激分子。UniProt登录号P26842提供了示例性人CD27氨基酸序列(还参见HGNC：11922，Entrez基因：939，Ensembl：ENSG00000139193，和OMIM：186711)。进一步相关的CD27序列包括UniProt登录号P41272(鼠CD27)。

术语“CD25”是指IL-2亚基α、TAC抗原、p55、胰岛素依赖型糖尿病10、IMD21、P55、TCGFR以及其所有替代性名称，其用作生长因子受体。UniProt登录号P01589提供了示例性人CD25氨基酸序列(还参见HGNC：6008，Entrez基因：3559，Ensembl：ENSG00000134460，和OMIM：147730)。进一步相关的CD25序列包括UniProt登录号P01590(鼠CD25)。

术语“4-1BB”是指CD137或肿瘤坏死因子受体超家族成员9以及其所有替代性名称，其用作共刺激分子。UniProt登录号Q07011提供了示例性人4-1BB氨基酸序列(还参见HGNC：11924，Entrez基因：3604，Ensembl：ENSG00000049249，和OMIM：602250)。进一步相关的4-1BB序列包括UniProt登录号P20334(鼠4-1BB)。

术语“IL6RA”是指IL-6受体亚基α或CD126以及其所有替代性名称，其用作生长因子受体。UniProt登录号P08887提供了示例性人IL6RA氨基酸序列(还参见HGNC：6019，Entrez基因：3570，Ensembl：ENSG00000160712，和OMIM：147880进一步相关的IL6RA序列包括UniProt登录号P22272(鼠IL6RA)。

术语“IL6RB”是指IL-6受体亚基β或CD130以及其所有替代性名称，其用作生长因子受体。UniProt登录号P40189提供了示例性人IL6RB氨基酸序列。进一步相关的IL6RB序列包括UniProt登录号Q00560(鼠IL6RB)。

术语“CD2”是指T细胞表面抗原T11/Leu-5/CD2，淋巴细胞功能抗原2、T11、或红细胞/rosette/LFA-3受体以及其所有替代性名称，其用作生长因子受体。UniProt登录号P06729提供了示例性人CD2氨基酸序列(还参见HGNC：1639，Entrez基因：914，Ensembl：ENSG00000116824，和OMIM：186990)。进一步相关的CD2序列包括UniProt登录号P08920(鼠CD2)。

术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫系统细胞如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)，所述免疫系统细胞在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。

如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生信号，所述信号促进含有CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能。免疫效应子功能的实例，例如在CART细胞中，包括细胞溶解活性和辅助活性(包括分泌细胞因子)。

在一些实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包含源自负责初级刺激、或抗原依赖性模拟的分子的那些。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包含源自负责共刺激信号、或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的胞质序列。

初级细胞内信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于源自以下的那些：CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。

术语“ζ”或者“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”是指CD247。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人CD3ζ氨基酸序列。“ζ刺激结构域”或者“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”是指CD3-ζ或其变体的刺激结构域(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1或其变体的残基52至164(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是SEQ ID NO:9或10提供的序列或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。可替代地或另外地，术语“ζ”或可替代地“ζ链”、“CD3-ζ”(或“CD3ζ、CD3ζ或CD3z)或“TCR-ζ”被定义为以GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等的等效残基，并且“ζ刺激结构域”或可替代地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”被定义为来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能衍生物，其足以在功能上传递T细胞活化所必需的初始信号。在一些方面，ζ的细胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164或是其功能性直向同源物的来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。在一些方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是提供为SEQ ID NO:18的序列。在一些方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是提供为SEQ ID NO:20的序列。

术语“共刺激分子”是指T细胞上与共刺激配体特异性结合、从而介导T细胞的共刺激应答(如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其有助于高效的免疫应答。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、以及4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、和特异性地结合CD83的配体。

共刺激细胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。共刺激分子可以在以下蛋白质家族中表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)和活化型NK细胞受体。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3、以及与CD83特异性地结合的配体等。

细胞内信号传导结构域可以包含衍生它的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能片段或衍生物。

当所述术语在本文中使用时，“免疫效应细胞”是指参与免疫应答(例如促进免疫效应子应答)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和骨髓来源的吞噬细胞。

当所述术语在本文中使用时，“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指例如免疫效应细胞的增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答是指T细胞或NK细胞的促进靶细胞的杀伤或抑制生长或增生的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的实例。

术语“编码(encoding或encode)”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则所述基因、cDNA或RNA编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或者所述基因或cDNA的其他产物。

除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包含内含子，其程度为编码所述蛋白质的核苷酸序列可以在某些形式中含有一个或多个内含子。

术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文描述的化合物、配制品、材料或组合物的有效于实现特定的生物学结果的量。

术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何材料。

术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何材料。

术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

如本文所用的术语“缓释剂”是指在比具有可比性的立即释放配制品更长的时间内释放给定组合物(例如，病毒载体(例如，慢病毒载体)和/或细胞活化剂)的药剂。在一些实施例中，缓释剂被配制用于通过注射施用。

术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可用于向细胞内部递送所述分离的核酸的物质组合物。许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。所述术语还应当解释为还包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒，“病毒载体”)。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法中的一种。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒的实例。

术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如下提供的自灭活慢病毒载体：Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453–1464(2009)。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自牛津生物医药公司(OxfordBioMedica)的基因递送技术、来自Lentigen公司的LENTIMAX^TM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可得的并且是本领域技术人员已知的。

术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在所述位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有所希望的特异性、亲和力、和能力的小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应非人残基置换。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有如下项：至少一个(典型地两个)可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，且FR区的所有或显著一部分是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关进一步的细节，参见Jones等人，Nature[自然]，321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature[自然]，332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学新见],2:593-596,1992。

“完全人”是指如下免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子是人起源或由与抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。

术语“分离的”意指从天然状态改变的或去除的。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如像宿主细胞)中。

术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列和异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子与所述编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一阅读框中。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则所述术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98(1994))。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指短链，例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体；并且还是指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，所述蛋白质存在有很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。

术语“启动子”是指启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。

术语“启动子/调控序列”是指表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，所述序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，所述序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。

术语“组成型启动子”是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。

术语“诱导型启动子”是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。

术语“组织特异性”启动子是指当与编码或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。

术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指在癌细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其可用于优先将药理学药剂靶向癌细胞。在一些实施例中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标志，例如谱系标志，例如B细胞上的CD19。在一些实施例中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比，1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多。在一些实施例中，肿瘤抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施例中，肿瘤抗原将仅在癌细胞的细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施例中，本发明的CAR包括包含结合MHC呈递的肽的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR。通常，源自内源性蛋白质的肽填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并且被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表用于免疫疗法的独特类别的细胞表面靶标。已经描述了在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的上下文中靶向源自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见，例如，Sastry等人,J Virol.[病毒学杂志]2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood[血液],2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol[免疫学杂志]2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,Gene Ther[基因疗法]20018(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med[科学转化医学]2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther[癌基因疗法]201219(2):84-100)。例如，可以从筛选文库(如人scFv噬菌体展示文库)鉴定TCR样抗体。

术语“支持肿瘤的抗原”或“支持癌症的抗原”可互换地指在细胞表面上表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，所述细胞本身不是癌性的、但例如通过促进其生长或存活、例如对免疫细胞的抗性而支持癌细胞。这种类型的示例性细胞包括基质细胞和骨髓源性的抑制细胞(MDSC)。支持肿瘤的抗原本身不需要在支持肿瘤细胞中发挥作用，只要所述抗原存在于支持癌细胞的细胞上。

如本文所用，“体外转录的RNA”是指已在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。

如本文所用，“聚(A)”是通过聚腺苷酸化与mRNA附接的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施例中，聚A为50个至5000个之间(SEQ ID NO:34)、优选大于64个、更优选大于100个、最优选大于300个或400个。聚(A)序列可以被化学修饰或酶促修饰以调节mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。

如本文结合表达、例如CAR分子的表达所使用，“瞬时”是指非整合转基因的持续数小时、数天或数周的表达，其中表达的时间段小于如果整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内的基因的表达的时间段。

如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善增生性障碍的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善增生性障碍的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)，这由施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂，如本发明的CAR)引起。在具体的实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指改善增生性障碍的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长，这不一定是患者可辨别的。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指通过例如稳定可辨别的症状来物理地，或通过例如稳定物理参数来生理地，或通过两者，抑制增生性障碍的进展。在其他实施例中，所述术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。

术语“信号转导途径”是指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些信号转导分子在信号从细胞的部分传递至细胞的另一部分中发挥作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并且传递信号跨过细胞膜的分子以及分子复合物。

术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物、人)。

术语“基本上纯化的”细胞是指本质上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下正常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群体是指同质的细胞群体。在其他情况下，所述术语仅指已经与其天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些方面，在体外培养细胞。在其他方面，不在体外培养细胞。

如本文所用的术语“治疗剂”意指治疗。通过减少、抑制、缓解或根除疾病症态来获得治疗效果。

如本文所用的术语“预防”意指对疾病或疾病症态的预防或保护性治疗。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主体细胞及其子代。

术语“特异性地结合”是指识别样本中存在的结合配偶体(例如，肿瘤抗原)蛋白并与其结合的抗体或配体，但所述抗体或配体基本上不识别或结合样本中的其他分子。

如本文所用的“难治性”是指对治疗无应答的疾病，例如癌症。在实施例中，难治性癌症可以在治疗开始之前或治疗开始时对治疗具有抗性。在其他实施例中，难治性癌症可能在治疗期间变得有抗性。难治性癌症也称为抗性癌症。

如本文所用的“复发”是指疾病(例如，癌症)或疾病的体征和症状(如改善期之后，例如在疗法(例如癌症疗法)的先前治疗后的癌症)的回返。

当所述术语在本文中结合例如基因编辑使用时，“系统”是指一起用于产生所希望的功能的一组分子，例如一种或多种分子。

当所述术语在本文中使用时，“基因编辑系统”是指指导和影响由所述系统靶向的基因组DNA位点处或附近的一种或多种核酸的改变(例如缺失)的系统，例如一种或多种分子。基因编辑系统是本领域中已知的，并且在下文更全面地描述。

“显性负性”基因产物或蛋白质是干扰基因产物或蛋白质的功能的基因产物或蛋白质。受影响的基因产物可能与显性负性蛋白质相同或不同。显性负性基因产物可以具有多种形式，包括截短、具有点突变的全长蛋白质或其片段、或全长野生型或突变型蛋白质或其片段与其他蛋白质的融合物。所观察到的抑制水平可以非常低。例如，与过程中涉及的一种或多种功能性蛋白质相比，可能需要大量过量的显性负性蛋白质以观察作用。在正常生物测定条件下可能难以观察到作用。

术语“比例”是指群体中特定分子与分子总数的比率。在一个示例性实施例中，具有特定表型的T细胞(例如，T_SCM细胞)的比例是指群体中具有所述表型的T细胞的数量相对于T细胞的总数的比率。在一个示例性实施例中，具有特定表型的T细胞(例如，CD45RA+CD62L+细胞)的比例是指群体中具有所述表型的T细胞的数量相对于T细胞的总数的比率。应当理解，可以在指示的情况下针对某些细胞亚群测量此类比例。例如，可以针对CD4+T细胞的总数测量CD4+T_SCM细胞的比例。

如本文所用的术语“免疫效应细胞群体”是指包含至少两种、例如两种或更多种、例如多于一种免疫效应细胞的组合物，并且不表示任何纯度水平或其他细胞类型的存在或不存在。在一个示例性实施例中，群体基本上不含其他细胞类型。在另一个示例性实施例中，群体包含至少两种指定细胞类型的细胞，或具有指定的功能或特性。

如本文所用的，术语“生物材料”是指为治疗目的而工程改造以与生物系统相互作用的物质。“水凝胶”是由聚合物链网络构成的物质，其可以水合以采用凝胶形式-通常是聚合物链之间交联的结果。“晶胶”是通过冷冻形成的水凝胶形式。在一些实施例中，通过使交联在部分冷冻状态下发生从而导致水凝胶网络来形成晶胶。

术语“T_SCM样细胞”、“初始T细胞(naive T Cell)”和“初始T细胞(T cell)”可互换使用，并且是指分化程度较低的T细胞状态，其特征在于CD45RA和CD62L的表面表达(例如，为CD45RA阳性和CD62L阳性(有时写为CD45RA+CD62L+))。一般来说，T细胞分化从大多数“初始”到大多数“耗竭”T_SCM样(例如，CD45RA+CD62L+细胞)>T_CM(例如，CD45RA-CD62L+细胞)>T_EM(例如，CD45RA-CD62L-细胞)>T_EFF进行。初始T细胞可以相对于更耗竭的T细胞表型被表征为，例如具有增加的自我更新、抗肿瘤功效、增殖和/或存活。在一个示例性实施例中，初始T细胞是指CD45RA+CD62L+T细胞。在另一个示例性实施例中，初始T细胞是指T_SCM细胞，例如CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+T细胞。

术语“T_SCM”是指具有干细胞记忆表型的T细胞，其特征在于它在它的细胞表面上表达CD45RA、CD62L、CCR7、CD27和CD95(例如，为CD45RA阳性、CD62L阳性、CCR7阳性、CD27阳性和CD95阳性(有时写为CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+))。T_SCM细胞是初始T细胞的一个实例。所述T细胞可以是CD4+和/或CD8+T细胞。

对于本文所述的特定蛋白(例如VEGF-C)，命名的蛋白包括该蛋白的任何天然存在形式、变体或同源物(例如，与天然蛋白相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些实施例中，与天然存在形式相比，变体或同源物跨整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，该蛋白是通过其NCBI序列参考鉴定的蛋白(例如，NP_005420.1)。在一些实施例中，该蛋白是通过其NCBI序列参考、同源物或其功能片段鉴定的蛋白。

如本文所用，术语“烷基”是指包含1至20个碳原子的完全饱和的支链或无支链(或直链或线性)烃部分。优选烷基包含1-6个碳原子且更优选1-4个碳原子。烷基的代表性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基。例如，术语“C_1-6烷基”是指具有一至六个碳原子的烃，并且术语“C_1-7烷基”是指具有一至七个碳原子的烃。

如本文所用，术语“卤代烷基”是指被一个或多个本文所定义的卤素基团取代的本文所定义的烷基。优选地，卤代烷基可以是单卤代烷基、二卤代烷基或多卤代烷基，包括全卤代烷基。单卤代烷基可以在烷基内具有一个碘、溴、氯或氟。二卤代烷基和多卤代烷基基团可以在烷基内具有两个或更多个相同的卤原子或不同的卤基基团的组合。优选地，多卤代烷基含有多达12或10、或8、或6、或4、或3、或2个卤基基团。卤代烷基的代表性实例是氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。全卤代烷基是指所有氢原子均被卤素原子替换的烷基。例如，术语“卤代-C_1-6烷基”是指具有一至六个碳原子并被一个或多个卤基基团取代的烃，并且术语“卤代-C_1-7烷基”是指具有一至七个碳原子并被一个或多个卤素基团取代的烃。

如本文所用，“盐”包括药学上可接受的酸加成盐，其可以采用无机酸和有机酸形成，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、胆茶碱(chlortheophyllonate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳糖酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。

可以衍生出盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以衍生出盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。可以用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。

可以衍生出盐的无机碱包括例如铵盐和来自元素周期表第I至XII列的金属。在某些实施例中，盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别合适的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。可以衍生出盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺；取代胺(包括天然存在的取代胺)；环胺；碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星、胆碱盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。

范围：贯穿本披露内容，能以范围形式呈现本发明的各个方面。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便以及简洁，不应该被理解为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及所述范围内的单独数值。例如，范围如从1至6的描述应当被认为是具有确切披露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及所述范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围如95％-99％同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且包括如96％-99％、96％-98％、96％-97％、97％-99％、97％-98％和98％-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。

术语“B细胞抗原(B cell antigen”或“B-Cell antigen)”可互换使用，并且是指在可以用与其结合的药剂靶向的B细胞表面上优先ID或特异性表达的分子(典型地是蛋白、碳水化合物或脂质)。与哺乳动物的其他非B细胞组织相比，特别感兴趣的B细胞抗原优先在B细胞上表达。B细胞抗原可以在一个具体的B细胞群体上表达，例如B细胞前体或成熟B细胞，或在多于一个具体B细胞群体上表达，例如前体B细胞和成熟B细胞两者。示例性B细胞表面标志物包括：CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD34、CD37、CD38、CD40、CD53、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD123、CD135、CD138、CD179、CD269、Flt3、ROR1、BCMA、FcRn5、FcRn2、CS-1、CXCR4、5、7、IL-7/3R、IL7/4/3R、和IL4R。在一些实施例中，B细胞抗原是：CD19、CD20、CD22、FcRn5、FcRn2、BCMA、CS-1或CD138。在实施例中，B细胞抗原是CD19。在实施例中，B细胞抗原是CD20。在实施例中，B细胞抗原是CD22。在实施例中，B细胞抗原是BCMA。在实施例中，B细胞抗原是FcRn5。在实施例中，B细胞抗原是FcRn2。在实施例中，B细胞抗原是CS-1。在实施例中，B细胞抗原是CD138。

术语“实体瘤抗原”或“实体瘤细胞抗原”是指在可以用与其结合的药剂靶向的实体瘤细胞表面上优先或特异性表达的分子(典型地是蛋白、碳水化合物或脂质)。与哺乳动物的其他非瘤组织相比，特别感兴趣的实体瘤抗原优先在实体瘤细胞上表达。实体瘤抗原可以在一个具体实体瘤细胞群体上表达，例如在间皮瘤肿瘤细胞上表达，或在多于一个具体实体瘤细胞群体上表达，例如在间皮瘤肿瘤细胞和卵巢癌细胞两者上表达。示例性实体瘤抗原包括：EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn Ag、PSMA、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、Legumain、HPVE6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4和MHC上呈递的这些抗原的任一个的肽。在一些实施例中，实体瘤抗原是CLDN6、间皮素或EGFRvIII。

术语“骨髓肿瘤抗原”或“骨髓肿瘤细胞抗原”是指在可以用与其结合的药剂靶向的骨髓肿瘤细胞表面上优先或特异性表达的分子(典型地是蛋白、碳水化合物或脂质)。与哺乳动物的其他非瘤组织相比，特别感兴趣的髓系肿瘤抗原优先在髓系肿瘤细胞上表达。髓系肿瘤抗原可以在一个具体髓系肿瘤细胞群体上表达，例如在急性骨髓性白血病(AML)肿瘤细胞上表达，或在多于一个具体髓系肿瘤细胞群体上表达。示例性髓系肿瘤抗原包括：CD33和CLL-1。

术语“非B细胞谱系的血液肿瘤的抗原”是指在造血或淋巴组织来源(B细胞来源除外)的肿瘤或癌症表面优先或特异性表达的分子(典型地是蛋白、碳水化合物或脂质)。这些包括髓系来源的肿瘤，例如，源自粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和/或肥大细胞来源的肿瘤，或它们的前体细胞群中的任一种，以及除B细胞来源外的淋巴细胞来源的肿瘤，例如，T细胞、NK细胞和/或浆细胞来源的肿瘤，或它们的前体细胞群中的任一种。

标题、小标题或编号或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素以字母顺序执行，或者步骤或元素必须彼此离散。

本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体并入。

根据说明书和附图并且如权利要求书，本发明的其他特征、目标和优点将是清楚的。

说明

本文考虑了包含生物材料和细胞募集因子的第一组合物和/或包含病毒载体的第二组合物，任选地具有颗粒，例如介孔二氧化硅颗粒(MSP)，和细胞活化剂，例如本文所述的多特异性结合分子。

本文还考虑了组合物，该组合物包含含有细胞募集因子的生物材料；介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；以及，任选地细胞活化剂，以及其使用方法。本文还考虑了组合物和包含细胞募集因子的生物材料；介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；以及，任选地细胞活化剂，以及其使用方法。

下文中描述了这些组合物的要素及其使用方法。不受理论束缚，申请人考虑组合物能够局部递送，例如在皮肤下，并且通过使用细胞募集因子，将细胞募集到所定义的递送部位并且能够被病毒载体转导。在载体编码CAR的实施例中，转导的细胞表达CAR，因此可用于靶向特定的抗原以治疗疾病、障碍或病症。

生物材料

在一些实施例中，生物材料包含水凝胶，任选地晶胶。在一些实施例中，晶胶包含明胶、透明质酸(HA)、胶原蛋白、海藻酸盐、层粘连蛋白、壳聚糖、丝纤蛋白、琼脂糖、聚(乙二醇)、聚乙烯醇、和/或羟乙基甲基丙烯酸酯。在一些实施例中，生物材料包含海藻酸盐水凝胶，例如，海藻酸盐晶胶。在一些实施例中，生物材料包含透明质酸水凝胶(HA水凝胶)。在一些实施例中，生物材料包含透明质酸晶胶。

在一些实施例中，海藻酸盐水凝胶(例如，海藻酸盐晶胶)进一步包含降冰片烯和/或四嗪。在一些实施例中，降冰片烯和/或四嗪共价地与海藻酸盐缔合，例如，与其化学连接。在一些实施例中，降冰片烯和/或四嗪非共价地与海藻酸盐缔合，例如，吸附在其上。

在一些实施例中，包含晶胶(例如，海藻酸盐晶胶)和细胞募集因子的组合物进一步包含锂皂石。在一些实施例中，包含水凝胶(例如，HA水凝胶)和细胞募集因子的组合物进一步包含锂皂石。不希望受理论束缚，在一些实施例中，使用锂皂石可以使细胞募集因子从组合物中缓慢和/或受控释放。在一些实施例中，锂皂石以以下浓度存在：约0.1至约0.5mg/mL，例如约0.1至0.4mg/mL、约0.1至0.35mg/mL、约0.1至0.3mg/mL、约0.1至0.25mg/mL、约0.1至0.15mg/mL、约0.15至0.5mg/mL、约0.15至0.4mg/mL、约0.15至0.35mg/mL、约0.15至0.3mg/mL、约0.15至0.25mg/mL、约1.5mg/mL至0.2mg/mL、约0.2至0.5mg/mL、约0.2至0.4mg/mL、约0.2至0.35mg/mL、约0.2至0.3mg/mL、约0.2至0.25mg/mL、约0.25至0.5mg/mL、约0.25至0.4mg/mL、约0.25至约0.35mg/mL、约0.25至0.3mg/mL、约0.3至0.5mg/mL、约0.3至0.4mg/mL、约0.35至0.5mg/mL、约0.35至0.4mg/mL、约0.4至0.5mg/mL、约0.1mg/mL、约0.15mg/mL、约0.2mg/mL、约0.25mg/mL、0.3mg/mL、约0.35mg/mL、或约0.5mg/mL。在一些实施例中，锂皂石以约0.25mg/mL的浓度存在。

在一些实施例中，晶胶包含直径为以下的孔：约10至300μm之间，例如，约10至20μm、约10至30μm、约10至40μm、约10至50μm、约10至100μm、约10至150μm、约10至200μm、约10至250μm、约20至30μm、约20至40μm、约20至50μm、约20至100μm、约20至150μm、约20至200μm、约20至250μm、约20至300μm、约50至300μm、约50至100μm、50至约150μm、50至约200μm、50至约250μm、100至约150μm、100至约200μm、100至约250μm、约100至300μm、约150至200μm、约150至250μm、约150至300μm、约200至250μm、约200至300μm、或约250至300μm之间。在一些实施例中，晶胶不包含孔。在一些实施例中，晶胶包含大小基本相同的孔。在一些实施例中，生物材料包含大小不同的孔。在一些实施例中，晶胶是化学交联的。

制造生物材料的方法是本领域熟知的。参见，例如，Koshy,S.T.,Zhang,D.,Grolman,J.M.,Stafford,A.G.,和Mooney,D.J.(2018).Injectable nanocompositecryogels for versatile protein drug delivery[用于多功能蛋白质药物递送的可注射的纳米复合晶胶].Acta biomaterialia[生物材料学报],65,36-43(描述海藻酸盐晶胶的制造)。另外地，生物材料及其组分可以商业购得，例如，Partek SLC(来自EMD密理博公司(EMD Millipore)的二氧化硅)或TruTag二氧化硅颗粒。

在一些实施例中，将晶胶(例如海藻酸盐晶胶)施用至高皮下间隙或与真皮相邻的皮下间隙。在一些实施例中，将水凝胶(例如HA水凝胶)施用至高皮下间隙或与真皮相邻的皮下间隙。

细胞募集因子

在一些实施例中，细胞募集因子将用于本文所述的组合物或方法中。

在一些实施例中，细胞募集因子诱导淋巴管生成。在一些实施例中，淋巴管生成的诱导包括增加淋巴内皮细胞(LEC)(例如，CD45-CD31+PDPN+细胞)的水平和/或激活。在一些实施例中，LEC(例如，CD45-CD31+PDPN+细胞)的水平增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、或200％。

在一些实施例中，细胞募集因子募集，例如选择性地募集免疫细胞，任选地T-细胞和/或NK-细胞。在一些实施例中，细胞募集因子直接募集细胞(例如，免疫细胞，例如T细胞)。在一些实施例中，细胞募集因子间接募集细胞(例如，免疫细胞，例如T细胞)。在一些实施例中，细胞募集因子诱导淋巴管生成，其反过来募集细胞，例如免疫细胞，例如T细胞。

在一些实施例中，细胞募集因子募集(例如，直接或间接)T细胞，例如初始T细胞(例如，CD45RA+CD62L+T细胞或CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+T细胞)。在一些实施例中，T细胞的募集包括增加T细胞的水平。在一些实施例中，T细胞的水平增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、250％、或300％。

在一些实施例中，细胞募集因子选自由以下组成的组：CCL19、CXCL9、CXCL10、XCL1、IL-2、IL-7、CCL21、GM-CSF、CCL17、CCL22、CCL20、CCL27、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、淋巴毒素α、淋巴毒素β、VEGF-C、FLT3L、G-CSF、PDGF、S100A8/A9、CSF-1、CXCL8、CCL20、CCL17、CCR5、CCR6、CCL2、VEGF、血管生成素-2、PGE2、LTB4、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、CXCL11、和/或CXCL12。在一些实施例中，细胞募集因子包含VEGF-C或其功能性变体。

不希望受理论束缚，在一些实施例中，从本文所述晶胶释放细胞募集因子(例如，VEGF-C或其变体)诱导预先存在的皮肤淋巴毛细血管的淋巴管生成、激活淋巴内皮细胞(LEC)(其反过来分泌趋化因子，例如CCL21)、将T细胞(例如，初始T细胞)募集到晶胶施用部位(例如凝胶顶部真皮部位)。在一些实施例中，通过本文所述的细胞募集因子诱导淋巴管生成并募集免疫细胞(例如T细胞)的时间包含约5至约28天，例如约5至21天、约5至15天、约5至14天、约5至10天、约7至约28天、约7至约21天、约7至15天、约7至14天、约7至10天、约10至28天、约10至21天、约10至15天、约10至14天、约14至28天、约14至21天、约15至28天、约15至21天、约21至28天、约7天、约10天、约14天、约15天、或约20天、约21天、约28天。在一些实施例中，通过本文所述的细胞募集因子诱导淋巴管生成并募集免疫细胞(例如T细胞)的时间包含14天(例如，两周)。在一些实施例中，通过本文所述的细胞募集因子诱导淋巴管生成并募集免疫细胞(例如T细胞)的时间包含21天(例如，三周)。在一些实施例中，通过本文所述的细胞募集因子诱导淋巴管生成并募集免疫细胞(例如T细胞)的时间包含28天(例如，四周或一个月)。

生产、配制和/或获得这些细胞募集因子的方法是本领域已知的。参见，例如，VM，Prota AE，Jeltsch M,等人determinants of growth factor binding andspecificity by VEGF receptor 2.[通过VEGF受体2的生长因子结合和特异性的决定因素]Proc Natl Acad Sci U S A.[美国国家科学院院刊]2010；107(6):2425-2430.doi:10.1073/pnas.0914318107；VM,Tvorogov D,Kisko K,等人Structural andmechanistic insights into VEGF receptor 3ligand binding and activation.[对VEGF受体3配体结合和激活的结构和机制的见解]Proc Natl Acad Sci U S A.[美国国家科学院院刊]2013；110(32):12960-12965.doi:10.1073/pnas.1301415110；Joyce Chiu,Jason W.H.Wong,Michael Gerometta,和Philip J.Hogg.Mechanism of Dimerization ofa Recombinant Mature Vascular Endothelial Growth Factor C[重组成熟的血管内皮生长因子C的二聚体化机制]Biochemistry[生物化学]2013 53(1),7-9.doi:10.1021/bi401518b；Broggi,M.A.S.,Schmaler,M.,Lagarde,N.，Rossi，S.W.Isolation of MurineLymph Node Stromal Cells.[小鼠淋巴结基质细胞的分离]J.Vis.Exp.[可视化实验杂志](90),e51803,doi:10.3791/51803(2014)；Fankhauser,M.,M.A.Broggi,L.Potin,N.Bordry,L.Jeanbart,A.W.Lund,E.Da Costa，S.Hauert，M.Rincon-Restrepo，和C.Tremblay.2017.Tumor lymphangiogenesis promotes T cell infiltration andpotentiates immunotherapy in melanoma.[肿瘤淋巴管生成促进T细胞浸润并增强黑色素瘤的免疫疗法]Science translational medicine.[科学转化医学]9:eaal4712；US2019/0099485 A1：“Lymphangiogenesis for therapeutic immunomodulation[用于治疗性免疫调节的淋巴管生成]”(2017)；以及Vokali,E.,S.Y.Shann,S.Hirosue,M.Rincon-Restrepo,F.V.Duraes,S.Scherer,P.Corthésy-Henrioud,W.W.Kilarski,A.Mondino,和D.Zehn.2020.Lymphatic endothelial cells primeCD8+T cells into memorycells under steady-state conditions.[淋巴内皮细胞在稳态条件下将初始的CD8+T细胞培养成记忆细胞]Nature communications.[自然通讯]11:1-18。

在一些实施例中，VEGF-C选自由未成熟VEGF-C肽或成熟VEGF-C肽组成的组。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是次要成熟形式或主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是野生型次要成熟形式或野生型主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是经修饰的次要成熟形式或经修饰的主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是包含半胱氨酸137处突变(例如，C137A)的经修饰的次要成熟形式，或包含半胱氨酸137处突变(例如，C137A)的经修饰的主要成熟形式，其根据SEQ ID NO:725进行编号。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽是包含C137A突变的经修饰的次要成熟形式或包含C137A突变的经修饰的主要成熟形式。在一些实施例中，成熟VEGF-C肽以二聚体或单体形式存在。在一些实施例中，VEGF-C是在每个单体中进一步包含C137A突变的主要成熟形式的二聚体。在一些实施例中，VEGF-C是在每个单体中进一步包含C137A突变的次要成熟形式的二聚体。在一些实施例中，VEGF-C选自下表18中提供的序列。在一些实施例中，VEGF-C选自表18中提供的序列，或与其具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在一些实施例中，VEGF-C序列包含或不包含接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)和/或his标签。

在一些实施例中，VEGF-C包含SEQ ID NO:731、732、733、或734的氨基酸序列，或与其具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在一些实施例中，VEGF-C包含SEQ ID NO:741的氨基酸序列，或与其具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列，条件是位置26不是半胱氨酸(C)，例如，是丙氨酸(A)。在一些实施例中，VEGF-C包含SEQ ID NO:737或738的氨基酸序列，或与其具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。

在一些实施例中，VEGF-C包含SEQ ID NO:743的氨基酸序列，或与其具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在一些实施例中，VEGF-C进一步包含SEQ ID NO:740的氨基酸序列，或与其具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。

在一些实施例中，VEGF-C包含SEQ ID NO:736的氨基酸序列，或与其具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，VEGF-C包含SEQ ID NO:735的氨基酸序列，或与其具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。

表18-VEGF-C变体

以下序列对应于单体。当二聚体形成时，2个相同的序列通过半胱氨酸桥组装在一起。应注意，his标签用于实验目的，但并非在所有实施例中都是必需的。

在一些实施例中，VEGF-C以有效量，任选地，以小于或约1mg、小于或约10mg、大于或约10μg、大于或约1μg、约1μg与1mg之间、约10μg与1mg之间、约1μg与10mg之间、或约10μg与10mg之间的量存在。

在一些实施例中，细胞募集因子可以诱导(例如促进)免疫细胞(例如T细胞)的迁移。在一些实施例中，细胞募集因子可以增加免疫细胞(例如T细胞)群的扩增或增殖。在一些实施例中，细胞募集因子包含IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))或其功能性变体。不希望受理论束缚，据信细胞募集因子(例如IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)))或其变体，与晶胶组合使用诱导免疫细胞扩增或增殖，从而导致局部激活以及促进和增强免疫细胞(例如T细胞)向晶胶的迁移。

在一些实施例中，细胞募集因子增强免疫细胞(例如T细胞)的存活。在一些实施例中，细胞募集因子包含IL-7或其功能性变体。不希望受理论束缚，据信细胞募集因子(例如IL-7)或其功能性变体，与晶胶组合使用增强免疫细胞(例如T细胞)的存活和增殖。

在一些实施例中，一种、两种、三种、或更多种细胞募集因子将用于本文所述的组合物或方法中。在一些实施例中，细胞募集因子包含VEGF-C或其功能性变体；IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))或其功能性变体；IL-7或其功能性变体；或其组合。在一些实施例中，细胞募集因子包含VEGF-C或其功能性变体，以及IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))或其功能性变体。在一些实施例中，细胞募集因子包含VEGF-C或其功能性变体，以及IL-7或功能性变体。在一些实施例中，细胞募集因子包含VEGF-C或其功能性变体；IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))或其功能性变体；以及IL-7或其功能性变体。在一些实施例中，细胞募集因子包含IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))或其功能性变体；以及IL-7或其功能性变体。

用于促进T细胞功能的药剂

在一些实施例中，本文所述的组合物或方法利用促进免疫细胞(例如T细胞)功能的药剂。在一些实施例中，用于促进T细胞功能的药剂减少T细胞耗竭和/或防止T细胞功能障碍。

在一些实施例中，用于促进T细胞功能的药剂包含Tet2基因的抑制剂，例如，Tet2抑制剂。虽然不希望受理论束缚，但Tet基因的单个等位基因(例如，Tet1、Tet2或Tet3)的破坏会导致5-羟甲基胞嘧啶的总水平降低，这与增强增殖、调节效应细胞因子产生和脱粒有关，从而增加CAR T细胞的增殖和/或功能。在一些实施例中，Tet2抑制剂包含：(1)靶向编码Tet2的基因或其相应调控元件中的一个或多个位点的基因编辑系统；(2)抑制Tet2表达的核酸(例如，siRNA或shRNA)；(3)蛋白质(例如，显性负性，例如，无催化活性的)Tet2、或Tet2的结合配偶体(例如，Tet2的显性负性结合配偶体)；(4)抑制Tet2的表达和/或功能的小分子；(5)编码(1)-(3)中任一项的核酸；或(6)(1)-(5)的任何组合。在一些实施例中，用于促进T细胞功能的药剂包含如例如WO 2017/049166、WO 2018/175733、和WO 2019/210153(将其内容通过引用以其全文特此并入)中描述的Tet2抑制剂。

在一些实施例中，用于促进T细胞功能的药剂包含ZBTB32的抑制剂，例如，ZBTB32抑制剂。不希望受理论束缚，据信在一些实施例中，ZBTB32的抑制可以增强T细胞介导的抗肿瘤应答。在某些实施例中，ZBTB32的抑制增强了CART细胞活性，例如，细胞扩增、细胞因子产生、持久性、抗耗竭和体内抗肿瘤活性。在一些实施例中，ZBTB32抑制剂包含：(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分；(2)编码基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；或(3)(1)和(2)的组合。在实施例中，ZBTB32抑制剂包含：(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分。在实施例中，ZBTB32抑制剂包含(2)编码基因编辑系统的一种或多种组分的核酸。在实施例中，ZBTB32抑制剂包含(1)和(2)的组合。在一些实施例中，用于促进T细胞功能的药剂包含如PCT/US2021/037048(将其内容通过引用以其全文特此并入)中描述的ZBTB32抑制剂。

缓释剂

在一些实施例中，本文所述的组合物或方法利用缓释剂。在一些实施例中，缓释剂可用于提供病毒载体(例如慢病毒载体，例如编码CAR的慢病毒载体)、细胞活化剂或病毒载体和细胞活化剂两者的缓释。在一些实施例中，缓释剂被配制用于通过注射施用。在一些实施例中，缓释剂包含颗粒，例如二氧化硅颗粒，例如介孔二氧化硅颗粒。

表面修饰的介孔二氧化硅颗粒

在一些实施例中，本文所述的组合物或方法利用介孔二氧化硅颗粒。介孔二氧化硅颗粒包含例如具有六边密排的、圆柱形的、均匀孔的多孔体。介孔二氧化硅颗粒可以通过使用表面活性剂的棒状胶束作为模板来合成，其是在酸性或碱性催化剂的存在下，通过将二氧化硅源(如烷氧基硅烷、硅酸钠溶液、水硅畲石、二氧化硅细颗粒)溶于水或乙醇中并进行水解而在水中形成。参见，例如，美国公开号2015-0072009和Hoffmann等人,AngewandteChemie International Edition[德国应用化学国际版],45,3216-3251,2006。已经将多种表面活性剂(例如阳离子、阴离子和非离子表面活性剂)作为表面活性剂研究，并且已知，大体上，阳离子表面活性剂的烷基三甲基铵盐导致具有最大比表面积和孔体积的介孔二氧化硅。参见美国公开号2013/0052117和Katiyar等人(Journal of Chromatography[色谱学报]1122(1-2):13-20)。

介孔二氧化硅颗粒可以以各种形式(例如微球、不规则颗粒、矩形棒、圆形纳米棒)提供。介孔二氧化硅颗粒可具有各种预定的形状，包括例如，球体形状、椭圆体形状、棒状形状、或弯曲的圆柱形状。在特定的实施例中，本文所述的组合物和方法使用介孔二氧化硅棒(MSR)。组装介孔二氧化硅以产生微棒的方法是本领域已知的。参见，Wang等人,Journal ofNanoparticle Research[纳米颗粒研究杂志],15:1501,2013。在一些实施例中，通过使正硅酸乙酯与由胶束棒制成的模板反应来合成介孔二氧化硅颗粒。结果是填充了规则排列的孔的介孔二氧化硅球体或棒的集合。然后可以通过用调节至适当pH的溶剂洗涤来除去模板。在此实例中，在去除表面活性剂模板之后，制备特征为均匀的有序的和连通的介孔隙的、具有例如约600m²/g至约1200m²/g、特别地约800m²/g至约1000m²/g、以及特别地约850m²/g至约950m²/g的比表面积的介孔二氧化硅颗粒。在另一实施例中，可以使用溶胶-凝胶法或喷雾干燥法合成介孔二氧化硅颗粒。正硅酸乙酯也与另外的聚合物单体(作为模板)一起使用。在又一个实施例中，可以将一个或多个四烷氧基硅烷和一个或多个(3-氰基丙基)三烷氧基硅烷共缩合以提供作为棒的介孔硅酸盐颗粒。参见美国公开号2013-0145488、2012-0264599和2012-0256336，其内容通过引用整体并入本文。

介孔二氧化硅颗粒(MSP)(例如，MSR)可以包含孔，所述孔可以是有序的或随机分布的，直径是2nm至100nm，或直径是2nm-50nm，例如直径2nm-5nm、10nm-20nm、10nm-30nm、10nm-40nm、20nm-30nm、30nm-50nm、30nm-40nm、40-50nm的孔。在一些实施例中，微棒包含直径是约5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm或更大的孔。孔径可以根据应用类型而改变。

在一些实施例中，MSR的长度在微米范围内，范围从约5μm至约500μm。在一示例中，MSR的长度是5μm-50μm，例如10μm-20μm、10μm-30μm、10μm-40μm、20μm-30μm、30μm-50μm、30μm-40μm、40μm-50μm。在一些实施例中，MSR包括50μm至250μm的长度，例如，约60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、120μm、150μm、180μm、200μm、225μm或更长。在一些实施例中，使用具有更高的纵横比的MSR，例如具有长度50μm至200μm、特别是长度80μm至120μm、尤其是长度约100μm或更长的棒。

在又一个实施例中，MSP(例如MSR)提供高表面积用于附接和/或结合至靶细胞例如T细胞。获得高表面积介孔硅酸盐的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号8,883,308和美国公开号2011-0253643，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施例中，高表面积归因于纳米颗粒的纤维形态，这使得可以在表面上获得高浓度的高度分散的且易于接近的部分。在某些实施例中，高表面积MSP(例如MSR)具有至少约100m²/g，至少150m²/g或至少300m²/g的表面积。在其他实施例中，高表面积MSP(例如，MSR)具有约100m²/g至约1000m²/g的表面积，包括例如其之间的所有值或子范围，例如50m²/g、100m²/g、200m²/g、300m²/g、400m²/g、600m²/g、800m²/g、100-500m²/g、100-300m²/g、500-800m²/g或500-1000m²/g。

在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒可包括表面修饰。如本文所用，“表面修饰”是指在MSP(例如，MSR)的表面上附接或附加官能团。在一些实施例中，官能团被吸附或被共价键合到孔衬里和/或纳米通道衬里的表面上或MSP(例如MSR)的表面上。如本文所用，“官能团”定义与MSR连接的化学部分。在一些实施例中，官能团是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐。在一些实施例中，可以将官能团(即-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐)与二氧化硅表面通过接头分开。在一些实施例中，官能团经由C₁至C₂₀烷基接头共价键合至MSP或MSR表面。在其他实施例中，官能团经由聚乙二醇接头共价键合至MSP或MSR表面。在特定的实施例中，聚乙二醇接头具有式(-O(CH₂-CH₂-)_1-25。在特定的实施例中，表面修饰是C₁至C₂₀烷基全卤代烷基或C₁至C₂₀烷基全氟代烷基。

表面修饰的一般结构如下：

其中L是接头，并且X是官能团。

在一些实施例中，L可以是C₁至C₂₀烷基基团或聚乙二醇基团，并且X可以是-OH(羟基)、伯胺、仲胺、叔胺或季胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、或疏水部分、或其盐。

如本文所用，具有膦酸酯的表面修饰(也称为膦酸酯修饰的纳米颗粒)具有至少一个膦酸(—P(O)(OH)₂)基团或次膦酸(—P(O)(OH)R，其中R是C₁至C₂₀烷基)。膦酸或次膦酸可以取决于pH值而带电或不带电。在生理pH下，膦酸和次膦酸带负电或是阴离子。例如，可以通过用带有膦酸酯的三烷基硅氧烷化合物或带有膦酸酯的三羟基甲硅烷基化合物(例如(三羟基甲硅烷基)丙基甲基膦酸酯)处理二氧化硅体表面来制备膦酸酯修饰。

在一些实施例中，用伯胺、仲胺、叔胺或季胺对介孔二氧化硅颗粒(例如，MSR)进行表面修饰。仲胺、叔胺和季胺可以被C₁至C₂₀烷基取代并且可以带电荷。在一些实施例中，胺基可以是盐形式。在一些实施例中，伯胺、仲胺、叔胺或季胺可通过接头与MSP表面分开。在特定的实施例中，介孔二氧化硅颗粒用聚乙烯亚胺修饰。在特定的实施例中，聚乙烯亚胺是支链的或非支链的。在可替代实施例中，如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量，聚乙烯亚胺基团具有约1000至100,000道尔顿(Da)的平均分子量。在一些实施例中，如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量，聚乙烯亚胺基团具有约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da、约10,000Da或约20,000Da的平均分子量。

各种示例性的表面修饰的介孔二氧化硅颗粒的结构在图1中示出。

如本文所述，本文所述的MSP(例如，MSR)通过本领域技术人员已知的方法制备。通常，可以通过以下方法制备具有表面修饰的MSP。

通常，能够与MSP(例如，MSR)的甲硅烷基氢氧化物表面反应的任何反应都可以用于共价修饰所述表面。例如，MSP(例如MSR)的表面可以用三烷氧基甲硅烷基化合物或三羟基甲硅烷基化合物处理。在一些实施例中，将介孔二氧化硅颗粒悬浮在合适的反应溶剂中。在一些实施例中，反应溶剂可以是水性溶剂或pH为0-14的缓冲液。可以使用水溶液与1种或多种有机溶剂(包括但不限于四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、甲苯、三乙胺、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、二氯甲烷、或二氯乙烷)的另外的共混物。在一些实施例中，使悬浮的介孔二氧化硅颗粒与具有如本文所述期望的官能团的三烷氧基甲硅烷基或三羟基甲硅烷基试剂反应。例如，可以通过用带有胺的三烷氧基硅烷化合物(例如氨基丙基三乙氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基-三甲氧基硅烷、或3-三甲氧基甲硅烷基丙基乙二胺)处理MSP来制备胺修饰。在某些实施例中，三烷氧基甲硅烷基是三甲氧基甲硅烷基或三乙氧基甲硅烷基。在可替代实施例中，三烷氧基甲硅烷基试剂是三烷氧基烷基胺。在一些实施例中，三烷氧基烷基胺包括伯胺、仲胺、叔胺或季胺。

在某些实施例中，三烷氧基甲硅烷基试剂包括聚乙烯亚胺基团。在特定的实施例中，聚乙烯亚胺是支链的或非支链的。在可替代实施例中，如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量，聚乙烯亚胺基团具有约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12，000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da或约10,000Da的平均分子量。在一些实施例中，三烷氧基甲硅烷基试剂包括C_1-20烷基叠氮化物基团。在某些实施例中，三烷氧基甲硅烷基试剂包括C_1-20烷基羧酸基团。在其他实施例中，三烷氧基甲硅烷基试剂包括C_1-20烷基基团。

例如，可以通过用带有巯基的三烷氧基硅烷化合物(例如3-巯基丙基三乙氧基硅烷)处理MSP来制备MSP(例如，MSR)上的巯基修饰。例如，可以通过用带有二硫化物的三烷氧基硅烷化合物处理纳米颗粒的表面、或者通过用2,2′-二硫代二吡啶或其他二硫化物处理巯基修饰的表面，来制备MSP(例如，MSR)上的二硫化物修饰。例如，可以通过用带有羧酸的三烷氧基硅烷化合物处理表面、或者通过用带有官能团(所述官能团可以被化学上转化为羧酸)的三烷氧基硅烷化合物处理MSP，来制备包括羧酸基团的MSP(例如，MSR)表面修饰。例如，MSP可以用3-氰基丙基三乙氧基硅烷处理，然后用硫酸水解。例如，可以通过用带有环氧化物的三烷氧基硅烷化合物(例如甘油氧基丙基三乙氧基硅烷)处理MSP来制备MSP(例如，MSR)表面修饰，所述MSP表面修饰包括环氧化物(将具有至少一种环氧化物)。

具有疏水部分的表面修饰将具有至少一个部分，所述部分旨在降低在水中的溶解度、或增加在有机溶剂中的溶解度。疏水部分的实例包括长链烷基(例如，C₈-C₂₀烷基)，脂肪酸酯(例如，C₁-C₂₂烷基酸酯)和具有C₆-C₁₀碳原子的芳族环。

在一些实施例中，MSP(例如，MSR)与三烷氧基甲硅烷基试剂的反应在环境温度或室温下进行。在其他实施例中，反应在升高的温度下进行。在进一步的实施例中，反应温度是约40℃至约120℃、约50℃至约100℃、约60℃至约80℃、约70℃至约80℃、或约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃、或约100℃。

病毒载体

在一些实施例中，本文所述的组合物可以包括缓释剂，例如如本文所述介孔二氧化硅颗粒和病毒载体。

病毒载体可以为任何病毒载体。病毒载体技术是本领域熟知的并且描述于例如Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press，NY[纽约冷泉港出版社])，以及其他病毒学和分子生物学手册中。举例来说，病毒载体可以是腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒或疱疹病毒。在一些实施例中，病毒载体是慢病毒载体或腺病毒载体。

衍生自逆转录病毒如慢病毒的运载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒运载体相对于衍生自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的运载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的另外优点。逆转录病毒运载体还可以是例如γ逆转录病毒运载体。γ逆转录病毒运载体可以包括例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如两个)长末端重复(LTR)序列、和感兴趣的转基因(例如编码CAR的基因)。γ逆转录病毒运载体可能缺少病毒结构基因(如gag、pol、和env)。示例性γ逆转录病毒运载体包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的运载体。其他γ逆转录病毒运载体描述于例如Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application[γ逆转录病毒载体：生物学/技术和应用]”Viruses.[病毒]2011年6月；3(6):677-713。

在另一个实施例中，包含编码本发明所希望CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施例中，可以使用转座子(如sleeping beauty)、CRISPR、CAS9、和锌指核酸酶来完成编码CAR的核酸的表达。见June等人2009Nature Reviews Immunology[自然免疫学综述]9.10:704-716，所述文献通过引用并入本文。

在一些实施例中，所述病毒载体包含表达载体，所述表达载体包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。在一些实施例中，核苷酸序列表达嵌合抗原受体(CAR)、工程改造的TCR、细胞因子、趋化因子、用于阻断抑制性分子的shRNA、或用于诱导蛋白质表达的mRNA。在一些实施例中，蛋白质是CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和信号传导结构域。在一些实施例中，信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。

在一些实施例中，病毒载体中的核苷酸序列表达经工程改造以靶向肿瘤抗原的肽。在一些实施例中，所述肽靶向选自下组的肿瘤抗原，该组由以下组成：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。在一些实施例中，所述肽是嵌合抗原受体(CAR)或工程改造的TCR。此类肽在下文标题为“嵌合抗原受体技术的一般说明”的部分中更详细地描述。

在一些实施例中，载体中的核苷酸序列表达经工程改造以靶向肿瘤抗原的蛋白质。在一些实施例中，所述肿瘤抗原选自以下中的一种或多种：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319、以及19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板来源的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，细胞表面相关的(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关的抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白；存活蛋白(surviving)；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖蛋白8)、T细胞1识别的黑色素瘤抗原(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白(Brother ofthe Regulator of Imprinted Sites))，T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；Legumain；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

本文所述的CAR可以包含与支持肿瘤的抗原(例如，如本文所述的支持肿瘤的抗原)结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段，TCR或TCR片段)。在一些实施例中，支持肿瘤的抗原是存在于基质细胞或骨髓源性遏制细胞(MDSC)上的抗原。基质细胞可以分泌生长因子以促进微环境中的细胞分裂。MDSC细胞可以抑制T细胞增殖和活化。不希望受理论束缚，在一些实施例中，表达CAR的细胞破坏支持肿瘤的细胞，从而间接地抑制肿瘤生长或存活。

在一些实施例中，所述基质细胞抗原选自以下的一种或多种：骨髓基质细胞抗原2(BST2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)和腱生蛋白。在一些实施例中，FAP特异性抗体是西罗珠单抗，与西罗珠单抗竞争结合、或具有与西罗珠单抗相同的CDR。在实施例中，MDSC抗原选自以下中的一种或多种：CD33、CD11b、C14、CD15和CD66b。因此，在一些实施例中，所述支持肿瘤的抗原选自以下中的一种或多种：骨髓基质细胞抗原2(BST2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)或腱生蛋白、CD33、CD11b、C14、CD15、以及CD66b。

在一些实施例中，编码的CAR分子的抗原结合结构域包含抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、骆驼科VHH结构域或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur。J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17，105(1987))。

在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人，(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区如何折叠和相互作用。事实上，如果采用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，以及PCT公开号WO 2006/020258和WO 2007/024715(将其通过引用并入本文)。

scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施例中，所述接头序列包含甘氨酸和丝氨酸重复序列组，如(Gly₄Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:22)。在一些实施例中，接头可以是(Gly₄Ser)₄(SEQ ID NO:29)或(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO:30)。接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。

在另一方面，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如单链TCR(scTCR)。用于制备此类TCR的方法是本领域中已知的。参见例如Willemsen RA等人,GeneTherapy[基因疗法]7:1369–1377(2000)；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]11:487–496(2004)；Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]19(4):365-74(2012)(将参考文献以其全文并入本文)。例如，scTCR可以工程改造为含有来自通过接头(例如柔性肽)连接的T细胞克隆的Vα和Vβ基因。此途径对于本身在细胞内的与癌症相关的靶标非常有用，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。

在某些实施例中，编码的抗原结合结构域具有10^-4M至10^-8M的结合亲和力KD。

在一些实施例中，编码的CAR分子包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域对靶抗原的结合亲和力KD为10^-4M至10^-8M，例如10^-5M至10^-7M，例如10^-6M或10^-7M。在一些实施例中，所述抗原结合结构域的结合亲和力比参考抗体(例如本文所述的抗体)的结合亲和力低至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍。在一些实施例中，编码的抗原结合结构域的结合亲和力比参考抗体(例如，所述抗原结合结构域所来源的抗体)的结合亲和力低至少5倍。在一些方面，此类抗体片段是功能性的，因为它们提供生物学应答，所述生物学应答可以包括但不限于免疫应答的活化、起源于其靶抗原的信号转导的抑制、激酶活性的抑制等，如熟练技术人员所理解的那样。

在一些方面，CAR的抗原结合结构域是scFv抗体片段，所述scFv抗体片段与它所来源的scFv的鼠序列相比是人源化的。

在一些方面，本发明的CAR的抗原结合结构域(例如，scFv)由核酸分子编码，所述核酸分子的序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一些方面，本发明的整个CAR构建体由核酸分子编码，所述核酸分子的整个序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。密码子优化是指如下发现：在编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)的出现频率在不同物种中有偏差。这种密码子简并性允许相同的多肽由各种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域中已知的，并且包括例如在至少美国专利号5,786,464和6,114,148中披露的方法。

在涉及被工程改造为表达例如，如本文所述的CAR分子的免疫效应细胞的一些实施例中，应理解改治疗方法可以还包括下文在关于嵌合抗原受体的章节中描述的任何步骤、方面或特征。

这些细胞优选地是免疫效应细胞。在一些实施例中，这些细胞是T细胞。在一些实施例中，这些细胞是NK细胞。在实施例中，本发明涉及本发明的细胞群体，例如本发明的免疫效应细胞群体。在实施例中，本发明的细胞群体包含所指示类型的细胞，并且可以包含其他类型(例如，被工程改造为表达例如，如本文描述的CAR分子的免疫效应细胞群体(例如T细胞)可以包含被工程改造为表达CAR分子的T细胞以及未被工程改造为表达CAR分子的T细胞(或其他细胞类型))。在实施例中，用于本发明的方法中的细胞群体基本上由所指示类型的细胞组成。在实施例中，本发明的细胞群体基本上不含其他细胞类型。在实施例中，本发明的细胞群体由所指示的细胞类型组成。

在任何前述方面和实施例中，细胞和/或细胞群体是或包含免疫效应细胞，例如免疫效应细胞群体包含T细胞或NK细胞，例如由T细胞或NK细胞组成。在实施例中，这些细胞是T细胞，例如CD8+T细胞、CD4+T细胞或它们的组合。在实施例中，这些细胞是NK细胞。

在实施例中，这些细胞是人细胞。在实施例中，这些细胞例如对于有待施用这些细胞的受试者是自体的。在实施例中，这些细胞例如对于有待施用这些细胞的受试者是同种异体的。

一般而言，在本文所述的方法中，本文所述的组合物将经由本领域中已知的任何常用和可接受的方式，以如上所述的治疗有效量单独地或与一种或多种治疗剂组合施用。在特定的实施例中，组合物通过注射施用。在又特定实施例中，对于体内施用，将组合物皮下施用给有需要的受试者。在其他实施例中，可以在所需的作用位点以植入物的形式施用组合物。作用位点可以由本领域技术人员根据受试者的需要确定。

CAR靶标

本文所述的是病毒载体以转导免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，这些免疫效应细胞被工程改造为含有一种或多种CAR，所述一种或多种CAR将免疫效应细胞引导至不希望的细胞(例如，癌细胞)。这通过CAR上的抗原结合结构域实现，所述抗原结合结构域对癌症相关抗原具有特异性。存在两类可以通过本发明的CAR靶向的癌症相关抗原(肿瘤抗原)：(1)在癌细胞表面上表达的癌症相关抗原；和(2)本身在细胞内的癌症相关抗原，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC(主要组织相容性复合物)呈递在癌细胞的表面上。

在一些实施例中，所述肿瘤抗原选自以下中的一种或多种：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319、以及19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板来源的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，细胞表面相关的(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关的抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白；存活蛋白(surviving)；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖蛋白8)、T细胞1识别的黑色素瘤抗原(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白(Brother of the Regulator of Imprinted Sites))，T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；Legumain；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

CD19

非限制性示例性肿瘤抗原是CD19。结合CD19的CAR是本领域已知的。例如，在WO2012/079000和WO 2014/153270中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD19 CAR，例如任何已知的CD19CAR的CD19抗原结合结构域。例如，LG-740；CD19 CAR描述于以下中：美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood[血液]122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood[血液]118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood[血液]116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood[血液]122(25):4129-39(2013)；以及16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT)[美国基因与细胞治疗学会(ASGCT)第16届年度会议](5月15-18日，盐湖城)2013,文摘10。

非限制性的示例性CD19 CAR包括本文所述的CD19 CAR、或描述于以下中的抗CD19CAR：Xu等人Blood[血液]123.24(2014):3750-9；Kochenderfer等人Blood[血液]，122.25(2013):4129-39；Cruz等人Blood[血液]122.17(2013):2965-73、NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961或NCT02456207，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。

在一些实施例中，所述CD19 CAR包含在WO 2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的融合多肽序列，其提供特异性结合至人CD19的鼠来源的scFv片段。

在一些实施例中，CD19 CAR包含在WO 2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的氨基酸序列。

在一些实施例中，CD19 CAR包含氨基酸序列：

diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:757)、或与其基本上同源的序列。

在一些实施例中，CD19 CAR包含氨基酸序列：

eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvss(SEQ ID NO:758)

在一些实施例中，CD19 CAR是人源化的CD19 CAR，其包含氨基酸序列：

eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadap

aykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:759)

在一些实施例中，CD19 CAR包含序列，例如披露于以下表1中的CDR、VH、VL、scFv、或全长-CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列。

表1.示例性抗CD19分子的氨基酸序列

BCMA

非限制性示例性肿瘤抗原是BCMA。结合BCMA的CAR是本领域已知的。例如，披露于WO 2016/014565或WO 2019/241426的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的BCMACAR，例如任何已知的BCMA CAR的BCMA抗原结合结构域。例如WO 2016/014565中披露的BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8,BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2或C13F12.1。

在一些实施例中，所述BCMA CAR包含披露于WO2016/014565中的BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8、BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2、或C13F12.1的一种或多种CDR、VH、VL、scFv、或全长序列、或基本上(例如，95％-99％)与其相同的序列。

在一些实施例中，BCMA CAR包含序列，例如披露于表2-14中的CDR、VH、VL、scFv、或全长-CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列。

表2.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列

表3.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR

表4.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR

表5.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的IMGT CDR

表6.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列

表7.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR

表8.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR

表9.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的IMGT CDR

表14.基于PI61的示例性抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列

表10.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列

表11.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR

表12.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR

表13.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的IMGT CDR

在一些实施例中，使用来自WO 2012/0163805(将其通过引用以其全文特此并入)的VH和VL序列产生BCMA CAR。在一些实施例中，可以使用来自WO 2019/241426(将其通过引用以其全文特此并入)的CDR、VH、VL、scFv或完整CAR序列产生BCMA CAR。

其他示例性靶标

另外的非限制性示例性肿瘤抗原包括CD20、CD22、EGFR、CD123和CLL-1。

结合CD20的CAR是本领域已知的。例如，在WO2018/067992或WO2016/164731(通过引用并入本文)中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD20 CAR，例如任何已知的CD20 CAR的CD20抗原结合结构域。示例性的结合CD20的序列或CD20 CAR序列披露于例如WO 2018/067992(通过引用并入本文)的表1-5。在一些实施例中，CD20 CAR包含在WO2018/067992或WO2016/164731(两者通过引用并入本文)中披露的CD20 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。在一些实施例中，CD20 CAR包含序列，例如披露于下表23中的CDR、VH、VL、scFv、或全长-CAR序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

表23.示例性抗CD20分子的氨基酸序列

结合CD22的CAR是本领域已知的。例如，在WO2018/067992或WO2016/164731中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD22 CAR，例如任何已知的CD22 CAR的CD22抗原结合结构域。

示例性CD22结合序列或CD22 CAR序列披露于例如WO 2016164731的表6A、6B、7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、10A、和10B以及WO 2018067992的表6-10中。在一些实施例中，CD22CAR序列包含WO 2018067992或WO 2016164731中披露的CD22 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。

在实施例中，CAR包含结合CD22的抗原结合结构域(CD22 CAR)。在一些实施例中，抗原结合结构域靶向人CD22。在一些实施例中，抗原结合结构域包括如本文所述的单链Fv序列。

人CD22 CAR的序列在如下提供。在一些实施例中，人CD22 CAR是CAR22-65。

人CD22 CAR scFv序列

EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL(SEQ ID NO:753)

人CD22 CAR重链可变区

EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:754)

人CD22 CAR轻链可变区

QSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL(SEQ ID NO 755)

在一些实施例中，CD22 CAR包含序列，例如披露于下表15-16和表24中的CDR、VH、VL、scFv、或全长-CAR序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

表15.CD22 CAR的重链可变结构域CDR(CAR22-65)

表16.CD22 CAR的轻链可变结构域CDR(CAR22-65)。所述表中的LC CDR序列在卡巴特或组合定义下具有相同的序列。

表24.示例性抗CD22分子的氨基酸序列

结合EGFR的CAR是本领域已知的。例如，在WO 2014/130657(通过引用并入本文)中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的EGFR CAR，例如任何已知的EGFR CAR的EGFR抗原结合结构域。示例性的EGFRvIII CAR可以包括WO 2014/130657(通过引用并入本文)例如WO 2014/130657的表2中披露的CDR、可变区、scFv或全长CAR序列。

结合CD123的CAR是本领域已知的。例如，在WO 2014/130635或WO 2016/028896中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD123 CAR，例如任何已知的CD123CAR的CD123抗原结合结构域。例如，WO 2014/130635中披露的CAR1至CAR8；或WO 2016/028896中披露的CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32。编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2014/130635和WO 2016/028896中指定。

结合CLL-1的CAR是本领域已知的。例如，在US2016/0051651A1(通过引用并入本文)中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CLL-1CAR，例如任何已知的CLL-1CAR的CLL-1抗原结合结构域。

在一些实施例中，CAR包含根据WO 2016/014535(通过引用并入本文)的表2的CLL-1CAR或抗原结合结构域。编码CLL-1CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/014535中指定。

结合CD33的CAR是本领域已知的。例如，在US 2016/0096892 A1和WO 2016/014576(通过引用并入本文)中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD33 CAR，例如任何已知的CD33 CAR的CD33抗原结合结构域。例如，WO 2016/014576中披露的CAR33-1至CAR33-9。

在一些实施例中，CAR包含根据WO 2016/014576(通过引用并入本文)的表2或9的CD33 CAR或抗原结合结构域。编码CD33 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VLCDR)在WO 2016/014576中指定。

结合间皮素的CAR是本领域已知的。例如，WO 2015090230和WO 2017112741(通过引用并入本文，例如WO 2017112741的表2、3、4和5)中披露的结合间皮素的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的间皮素CAR，例如任何已知的间皮素CAR的间皮素抗原结合结构域。

结合GFRα-4的CAR是本领域已知的。例如，在WO 2016/025880中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的GFRα-4CAR，例如任何已知的GFRα-4CAR的GFRα-4抗原结合结构域。编码GFRα-4CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/025880中指定。

抗原结合结构域结构

在一些实施例中，编码的CAR分子的抗原结合结构域包含抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、骆驼科VHH结构域或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur。J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17，105(1987))。在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区如何折叠和相互作用。事实上，如果采用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，以及PCT公开号WO 2006/020258和WO 2007/024715(将其通过引用并入本文)。

scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施例中，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复序列，如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:22)。在一些实施例中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:30)。接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。

在另一方面，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如单链TCR(scTCR)。用于制备此类TCR的方法是本领域中已知的。参见例如Willemsen RA等人,GeneTherapy[基因疗法]7:1369–1377(2000)；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]11:487–496(2004)；Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]19(4):365-74(2012)(将参考文献以其全文并入本文)。例如，scTCR可以工程改造为含有来自通过接头(例如柔性肽)连接的T细胞克隆的Vα和Vβ基因。此途径对于本身在细胞内的与癌症相关的靶标非常有用，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。

在某些实施例中，编码的抗原结合结构域具有10^-4M至10^-8M的结合亲和力KD。

在一些实施例中，编码的CAR分子包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域对靶抗原的结合亲和力KD为10^-4M至10^-8M，例如10^-5M至10^-7M，例如10^-6M或10^-7M。在一些实施例中，所述抗原结合结构域的结合亲和力比参考抗体(例如本文所述的抗体)的结合亲和力低至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍。在一些实施例中，编码的抗原结合结构域的结合亲和力比参考抗体(例如，所述抗原结合结构域所来源的抗体)的结合亲和力低至少5倍。在一些方面，此类抗体片段是功能性的，因为它们提供生物学应答，所述生物学应答可以包括但不限于免疫应答的活化、起源于其靶抗原的信号转导的抑制、激酶活性的抑制等，如熟练技术人员所理解的那样。

在一些方面，CAR的抗原结合结构域是scFv抗体片段，所述scFv抗体片段与它所来源的scFv的鼠序列相比是人源化的。

在一些方面，本文所述的CAR的抗原结合结构域(例如，scFv)由核酸分子编码，所述核酸分子的序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一些方面，本发明的整个CAR构建体由核酸分子编码，所述核酸分子的整个序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。密码子优化是指如下发现：在编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)的出现频率在不同物种中有偏差。这种密码子简并性允许相同的多肽由各种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域中已知的，并且包括例如在至少美国专利号5,786,464和6,114,148中披露的方法。

特异性抗原抗体对是本领域已知的。抗原抗体对及其组分的非限制性示例性实施例在本文以上标题为靶标的部分中及以下提供。

CD19

在一些实施例中，抗原结合结构域结合CD19并且具有与描述于Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中的FMC63 scFv片段相同或相似的结合特异性。在一些实施例中，抗原结合结构域结合CD19并且包括在Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中描述的scFv片段。

在一些实施例中，抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)结合CD19并且包含来自WO 2014/153270(通过引用并入本文)的表3的序列。WO 2014/153270还描述了测定多种CAR构建体的结合和功效的方法。

对于临床环境，鼠CD19抗体的人源化可以是所希望的，其中小鼠特异性残基在接受CART19治疗(即，用CAR19构建体转导的T细胞治疗)的患者中可以诱导人-抗-小鼠抗原(HAMA)应答。人源化CD19 CAR序列的产生、表征和功效描述于国际申请WO 2014/153270中，将所述文献通过引用以其全文并入本文，包括实例1-5(第115-159页)。

在一些实施例中，抗原结合结构域包含WO 2012/079000(通过引用并入本文)中提供的CAR19构建体的亲本小鼠scFv序列。在一些实施例中，抗原结合结构域结合CD19并且包含WO 2012/079000中描述的scFv。

BCMA

结合BCMA的示例性抗原结合结构域披露于WO 2012/0163805、WO 2017/021450、WO2017/011804、WO 2017/025038、WO 2016/090327、WO 2016/130598、WO 2016/210293、WO2016/090320、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/154055、WO 2015/166073、WO2015/188119、WO 2015/158671、US 9,243,058、US 8,920,776、US 9,273,141、US 7,083,785、US 9,034,324、US 2007/0049735、US 2015/0284467、US 2015/0051266、US 2015/0344844、US 2016/0131655、US 2016/0297884、US 2016/0297885、US 2017/0051308、US2017/0051252、US 2017/0051252、WO 2016/020332、WO 2016/087531、WO 2016/079177、WO2015/172800、WO 2017/008169、US 9,340,621、US 2013/0273055、US 2016/0176973、US2015/0368351、US 2017/0051068、US 2016/0368988、和US 2015/0232557中，将其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，其中披露的一个或多个BCMA抗原结合结构域的抗原结合结构域。

在一些实施例中，抗原结合结构域包含人抗体或结合BCMA的人抗体片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包含本文(例如，表2-14中)所述的人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，和/或本文(例如，表2-14中)所述的人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含本文(例如，表2、表6和表10中)所述的人VL和/或本文(例如，表2、表6和表10中)所述的人VH。在一些实施例中，抗原结合结构域是scFv，所述scFv包含表2、表6和表10的氨基酸序列的VL和VH。在一些实施例中，抗原结合结构域(例如，scFv)包含：VL，所述VL包含具有表2、表6和表10中提供的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，或与表2、6和10的氨基酸序列具有95％-99％的同一性的序列；和/或VH，所述VH包含具有表2、表6和表10中提供的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，或与表2、6和10的氨基酸序列具有95％-99％的同一性的序列。

在某些实施例中，本文所述的抗原结合结构域包括：

(1)选自以下中的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：

(i)SEQ ID NO:54的LC CDR1、SEQ ID NO:55的LC CDR2和SEQ ID NO:56的LCCDR3；和/或

(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：

(i)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:84的HCCDR3；(ii)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:46的HC CDR3；(iii)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:68的HC CDR3；或(iv)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:76的HC CDR3。

在某些实施例中，本文所述的抗原结合结构域包括：

(1)选自以下中的一者的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：

(i)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:131的LC CDR2和SEQ ID NO:132的LCCDR3；(ii)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:96的LC CDR2和SEQ ID NO:97的LC CDR3；(iii)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:114的LC CDR2和SEQ ID NO:115的LC CDR3；或(iv)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:114的LC CDR2和SEQ ID NO:97的LC CDR3；和/或

(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：

(i)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:130的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HCCDR3；(ii)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:87的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HC CDR3；或(iii)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:109的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HC CDR3。

在某些实施例中，本文所述的抗原结合结构域包括：

(1)选自以下中的一者的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：

(i)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:182的LC CDR2和SEQ ID NO:183的LCCDR3；(ii)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:148的LC CDR2和SEQ ID NO:149的LCCDR3；或(iii)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:170的LC CDR2和SEQ ID NO:171的LCCDR3；和/或

(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：

(i)SEQ ID NO:179的HC CDR1、SEQ ID NO:180的HC CDR2和SEQ ID NO:181的HCCDR3；(ii)SEQ ID NO:137的HC CDR1、SEQ ID NO:138的HC CDR2和SEQ ID NO:139的HCCDR3；或(iii)SEQ ID NO:160的HC CDR1、SEQ ID NO:161的HC CDR2和SEQ ID NO:162的HCCDR3。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、84、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、46、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:44、45、68、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、76、54、55和56的氨基酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、84、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、46、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:47、48、68、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、76、57、58和59的氨基酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、85、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、51、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:49、50、69、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、77、60、58和56的氨基酸序列。

其他示例性靶标

结合CD20的示例性抗原结合结构域描述于WO 2016/164731和WO 2018/067992(通过引用并入本文)中。在一些实施例中，其中披露的一个或多个CD20抗原结合结构域的抗原结合结构域。结合CD22的示例性抗原结合结构域描述于WO 2016/164731和WO 2018/067992(通过引用并入本文)中。

在一些实施例中，抗原结合结构域包含表15中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域还包含LC CDR1、LCCDR2、和LC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域包含表16中列出的LC CDR1、LC CDR2、和LCCDR3氨基酸序列。

在一些实施例中，抗原结合结构域包含表16中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个、两个或全部，以及表15中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个、两个或全部。

结合EGFRvIII的示例性抗原结合结构域描述于WO 2014/130657中。

结合CD123的示例性抗原结合结构域描述于WO 2014/130635和WO 2016/028896(通过引用并入本文)中。

在一些实施例中，抗原结合结构域包含来自WO 2014/130635(通过引用并入本文)的表1-2的序列。

在一些实施例中，抗原结合结构域包含来自WO 2016/028896(通过引用并入本文)的表2、6和9的序列。

结合CLL-1的示例性抗原结合结构域在WO 2016/014535(通过引用并入本文)中披露。

在一些实施例中，抗原结合结构域包含一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，这些重链CDR来自本文所述的抗体(例如描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275A1、或WO 2015/090230中的抗体)，和/或一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3，这些轻链CDR来自本文所述的抗体(例如描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗体)。在一些实施例中，所述抗原结合结构域包含上文列出抗体的重链可变区和/或可变轻链区。

在实施例中，抗原结合结构域是WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230(通过引用并入本文)中描述的抗原结合结构域。

可以使用表达CAR的细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4等等，描述于例如WO 2014/153270、WO 2014/130635、WO 2016/028896、WO 2014/130657、WO 2016/014576、WO 2015/090230、WO 2016/014565、WO 2016/014535、和WO 2016/025880(其各自通过引用以其全文并入本文)中。

在一些实施例中，本文所述的任何CAR(例如CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4中的任一个)的抗原结合结构域包含来自上文列出抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或来自上文列出抗原结合结构域的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一些实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。

在一些实施例中，所述抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)，和/或来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一些实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。

双特异性CAR

在某些实施例中，抗原结合结构域是双特异性或多特异性分子(例如，多特异性抗体分子)。在一些实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一些实施例中，第一和第二表位在相同抗原，例如，相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚单位)上。在一些实施例中，第一表位和第二表位重叠。在一些实施例中，第一表位和第二表位不重叠。在一些实施例中，第一表位和第二表位在不同的抗原，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一些实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一些实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一些实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一些实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。

在一些实施例中，抗体分子是多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体分子。此类分子包括双特异性融合蛋白，例如含有两个scFv(它们之间具有亲水性螺旋肽接头)和一个完全恒定区的表达构建体，如例如在US 5637481中所描述；具有连接的VL和VH链(它们进一步用肽间隔区连接至抗体铰链区和CH3区)的微型抗体构建体，其可以二聚化形成双特异性/多价分子，如例如在US 5837821所述；VH结构域(或家族成员中的VL结构域)的串，其通过肽键与C-末端的可交联基团连接，这些可交联基团进一步与VL结构域相关联以形成一系列FV(或scFv)，如例如在US 5864019中所述；以及具有经肽接头连接的VH和VL结构域两者的单链结合多肽通过非共价或化学交联组合成多价结构，以使用scFV或双体抗体类型形式形成例如同二价、异二价、三价和四价结构，如例如在US 5869620中所述。上述引用的申请的内容通过引用以其全文并入本文。

在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段(例如scFv)内，VH可以在VL的上游或下游。在一些实施例中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VL(VL1)上游布置有其VH(VH1)，并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VH(VH2)上游布置有其VL(VL2)，使得整个双特异性抗体分子具有布置VH1-VL1-VL2-VH2。在其他实施例中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VH(VH1)上游布置有其VL(VL1)，并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VL(VL2)上游布置有其VH(VH2)，使得整个双特异性抗体分子具有布置VL1-VH1-VH2-VL2。任选地，如果构建体被布置为VH1-VL1-VL2-VH2则接头设置在两个抗体或抗体片段(例如scFv)之间，例如VL1与VL2之间，如果构建体被布置为VL1-VH1-VH2-VL2则接头设置在VH1与VH2之间。接头可以是如本文所述的接头，例如(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，优选地是4(SEQ ID NO:691)。一般来说，两个scFv之间的接头应足够长以避免两个scFv的结构域之间的错配。任选地，接头设置在第一scFv的VL与VH之间。任选地，接头设置在第二scFv的VL与VH之间。在具有多个接头的构建体中，接头中的任何两个或更多个可以相同或不同。因此，在一些实施例中，双特异性CAR在如本文描述的布置中包含VL、VH、和任选一个或多个接头。

跨膜结构域

关于跨膜结构域，在各种实施例中，本文所述的嵌合分子(例如，CAR)可以被设计成包含附接至所述嵌合分子的细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如与跨膜来源的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如所述细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白来源的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如所述细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10多至15个氨基酸)。在一些方面，跨膜结构域与嵌合蛋白(例如，CAR)的其他结构域中的一个缔合，例如在一些实施例中，跨膜结构域可以来自信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域所来源的相同蛋白质。在另一个方面，跨膜结构域不源自嵌合蛋白(例如，CAR)的任何其他结构域所来源的相同蛋白质。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免此类域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一些方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一种CAR同源二聚化。在不同的方面，可以修饰或取代跨膜结构域的氨基酸序列，以便最小化与存在于相同表达CAR的细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。

跨膜结构域可以源自天然衍生或来自重组衍生。在来源是天然的情况下，所述结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。在一些方面，每当CAR结合靶标时，跨膜结构域能够将信号传导至一个或多个细胞内结构域。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以至少包括例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的一个或多个跨膜区。在一些实施例中，跨膜结构域可以至少包括以下中的一个或多个跨膜区：例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D或NKG2C。

在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白质的铰链)附接到CAR的细胞外区域(例如CAR的抗原结合结构域)。例如，在一些实施例中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链、IgD铰链)、GS接头(例如本文所述的GS接头)、KIR2DS2铰链或CD8a铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(例如由其组成)。在一些方面，跨膜结构域包含SEQ ID NO:12的跨膜结构域(例如由其组成)。

在一些实施例中，编码的跨膜结构域包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的CD8跨膜结构域的氨基酸序列，或与SEQID NO:12的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一些实施例中，编码的跨膜结构域包含SEQ ID NO:12的序列。

在其他实施例中，编码CAR的核酸分子包含CD8跨膜结构域的核苷酸序列，例如包含SEQ ID NO:13的序列，或其具有95％-99％同一性的序列。

在一些实施例中，编码的抗原结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一些实施例中，编码的铰链区包含CD8铰链的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:4；或IgG4绞链的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:6，或与SEQ ID NO:4或6具有95％-99％同一性的序列。在其他实施例中，编码铰链区的核酸序列包含分别对应于CD8铰链或IgG4铰链的SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:7的序列，或与SEQ ID NO:5或7具有95％-99％同一性的序列。

在一些方面，铰链或间隔区包含IgG4铰链。例如，在一些实例中，铰链或间隔区包含氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(SEQ ID NO:6)的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含由GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(SEQID NO:7)的核苷酸序列编码的铰链。

在一些方面，铰链或间隔区包含IgD铰链。例如，在一些实例中，铰链或间隔区包含氨基酸序列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(SEQ ID NO:8)的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含由AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQ ID NO:9)的核苷酸序列编码的铰链。

在一些方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，可以在重组跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。

任选地，长度在2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与胞质区域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别适合的接头。例如，在一些方面，接头包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。在一些实施例中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:11)的核苷酸序列编码。在一些实施例中，接头包含GGGGS的氨基酸序列(SEQ ID NO:877)。在一些实施例中，接头由SEQ ID NO:876的核苷酸序列编码。

在一些方面，铰链或间隔区包含KIR2DS2铰链。

信号传导结构域

在具有细胞内信号传导结构域的本发明实施例中，这种结构域可以含有例如初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域中的一个或多个。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含编码初级信号传导结构域的序列。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。

本发明的CAR的胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如，长度在2与10个氨基酸之间(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)可以形成细胞内信号传导序列之间的键联。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作适合的接头。在一些实施例中，单个氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸)可以用作适合的接头。

在一些方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域通过接头分子(例如本文描述的接头分子)分开。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施例中，接头是丙氨酸残基。

初级信号传导结构域

初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在CAR中，此类域用于相同目的。

含有在本发明中特别使用的初级细胞内信号传导结构域的ITAM的实例包括以下的那些：CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10、以及DAP12。在一些实施例中，本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ的初级信号传导结构域。

在一些实施例中，编码的初级信号传导结构域包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。编码的CD3ζ初级信号传导结构域可以包含具有SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一些实施例中，编码的初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列。在其他实施例中，编码初级信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的序列，或其具有95％-99％同一性的序列。

共刺激信号传导结构域

在一些实施例中，编码的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。例如，细胞内信号传导结构域可以包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，编码的共刺激信号传导结构域包含选自以下中的一种或多种的蛋白质的功能性信号传导结构域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性地结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、以及NKG2D。

在一些实施例中，编码的共刺激信号传导结构域包含具有SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一些实施例中，编码的共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列。在其他实施例中，编码共刺激信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的序列，或其具有95％-99％同一性的序列。

在其他实施例中，编码的细胞内结构域包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列，和SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列，其中包含细胞内信号传导结构域的序列在同一框架中表达并且表达为单个多肽链。

在一些实施例中，编码细胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的序列，或其具有95％-99％同一性的序列；以及SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的序列，或其具有95％-99％同一性的序列。

在一些实施例中，所述核酸分子进一步编码前导序列。在一些实施例中，前导序列包含SEQ ID NO:2的序列。

在一些方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一些方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一些方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:14的信号传导结构域。在一些方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:18的信号传导结构域。

在一些方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一些方面，CD27的信号传导结构域包含QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKP EPACSP(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在一些方面，CD27的信号传导结构域由AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:17)的核酸序列编码。

抑制性结构域

在一些实施例中，载体包含编码CAR(例如，本文描述的CAR)的核酸序列，和编码包含以下的抑制性分子的核酸序列：inhKIR胞质结构域；跨膜结构域，例如KIR跨膜结构域；和抑制剂胞质结构域，例如ITIM结构域，例如inhKIR ITIM结构域。在一些实施例中，抑制性分子是天然存在的inhKIR，或与天然存在的inhKIR共有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％同源性或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的序列。

在一些实施例中，编码抑制性分子的核酸序列包含：SLAM家族胞质结构域；跨膜结构域，例如SLAM家族跨膜结构域；和抑制剂胞质结构域，例如SLAM家族结构域，例如SLAM家族ITIM结构域。在一些实施例中，抑制性分子是天然存在的SLAM家族成员，或与天然存在的SLAM家族成员共有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％同源性或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的序列。

在一些实施例中，载体是体外转录的载体，例如转录本文描述的核酸分子的RNA的载体。在一些实施例中，载体中的核酸序列还包含聚(A)尾，例如聚A尾。在一些实施例中，载体中的核酸序列还包含3'UTR，例如本文描述的3'UTR，例如包含源自人β-球蛋白的3'UTR的至少一个重复。在一些实施例中，载体中的核酸序列还包含启动子，例如T2A启动子。

启动子

在一些实施例中，载体还包含启动子。在一些实施例中，所述启动子选自EF-1启动子、CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、泛素C启动子或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在一些实施例中，启动子是EF-1启动子。在一些实施例中，EF-1启动子包含SEQ ID NO:1的序列。

在本方面的一些方面，可以使用任何数量的本领域技术人员已知的技术(如Ficoll^TM分离)从自受试者收集的血液单位获得免疫效应细胞，例如T细胞。在一些方面，通过单采血液成分术获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分术产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞、和血小板。在一些方面，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分，并且任选地将细胞悬浮在缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代性实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。

表17：CAR的多种组分的序列(aa-氨基酸，na-编码相应蛋白质的核酸)

体外CAR-T制造

尽管本文考虑的方法涉及细胞的体内转导，但也认识到体外制备的挑战。

在一些实施例中，例如通过本文所述的方法对转导了本文所述的病毒载体的细胞进行扩增。在一些实施例中，使细胞在培养物中扩增数小时(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的一段时间。在一些实施例中，使细胞扩增4至9天的一段时间。在一些实施例中，使细胞扩增8天或更少(例如7、6或5天)的一段时间。在一些实施例中，使细胞在培养物中扩增5天，并且所得细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。效力可以例如通过各种T细胞功能来定义，例如增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、活化、迁移、或其组合。在一些实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞在抗原刺激后显示细胞倍增的至少一倍、两倍、三倍或四倍增加。在一些实施例中，使细胞在培养物中扩增5天，并且与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，所得细胞表现出更高的促炎性细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)。在一些实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞显示促炎性细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)的至少一倍、二倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍增加(pg/ml)。

在不存在钙的情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如通过根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver5)。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如像无Ca、无Mg的PBS、勃脈力A、或者含有或不含缓冲液的其他盐溶液。可替代地，可以除去单采血液成分术样品中不希望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。

应当认识到，本申请的体外方法可利用包含5％或更少(例如2％)的人AB血清的培养基条件，并使用已知的培养基条件和组合物，例如描述于以下的那些：Smith等人,“Exvivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novelXeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型无Xeno CTS免疫细胞血清替代物进行过继免疫治疗的人T细胞的离体扩增]”Clinical&Translational Immunology[临床和移植免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31。

在一些方面，通过例如通过PERCOLL^TM梯度离心或通过逆流离心淘洗来裂解红细胞和耗减单核细胞，从外周血淋巴细胞分离T细胞。分离的T细胞可进一步用于本文所述的方法。

本文所述的方法可以包括，例如使用例如(例如本文所述的)阴性选择技术选择免疫效应细胞(例如T细胞)的特定亚群，所述亚群是T调节性细胞耗减的群体，CD25+耗减的细胞。优选地，T调节性耗减的细胞群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。

在一些实施例中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体(IL-2)从群中去除调节性T细胞，例如CD25+T细胞。在一些实施例中，将抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体与底物(例如珠)缀合、或以其他方式包被在底物(例如珠)上。在一些实施例中，抗CD25抗体或其片段与本文所述的底物缀合。

在一些实施例中，使用来自Miltenyi^TM的CD25耗减药剂从所述群体除去T调节性细胞(例如CD25+T细胞)。在一些实施例中，细胞与CD25耗减药剂的比率是1x 10⁷个细胞比20μL、或1x 10⁷个细胞比15μL、或1x 10⁷个细胞比10μL、或1x 10⁷个细胞比5μL、或1x 10⁷个细胞比2.5μL、或1x 10⁷个细胞比1.25μL。在一些实施例中，例如对于T调节性细胞(例如CD25+)耗减，使用大于5亿个细胞/ml。在另外的方面，使用600、700、800、或900百万个细胞/ml的细胞浓度。

在一些实施例中，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约6x 10⁹个CD25+T细胞。在其他方面，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约1x 10⁹至1x 10¹⁰个CD25+T细胞，以及其间的任何整数值。在一些实施例中，所得群体T调节性耗减的细胞具有2x 10⁹个T调节性细胞(例如，CD25+细胞)或更少(例如，1x 10⁹个、5x 10⁸个、1x 10⁸个、5x 10⁷个、1x10⁷个或更少的CD25+细胞)。

在一些实施例中，使用具有耗减管组(例如像管162-01)的CliniMAC系统从所述群体除去T调节性细胞(例如CD25+细胞)。在一些实施例中，将CliniMAC系统在耗减设置(例如像DEPLETION2.1)上运行。

不希望受特定理论的束缚，在单采血液成分术之前或在制造表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如T_REG细胞)的数量)可以降低受试者复发的风险。例如，耗减T_REG细胞的方法是本领域已知的。减少T_REG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25耗减、及其组合。

在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前降低(例如，耗减)T_REG细胞的数量。例如，制造方法包括使样品(例如单采血液成分术样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如以在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前耗减T_REG细胞。

在一些实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用一种或多种减少T_REG细胞的疗法预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一些实施例中，减少T_REG细胞的方法包括但不限于向受试者施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间、或之后发生。

在一些实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用环磷酰胺预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一些实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用抗GITR抗体预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。

在一些实施例中，有待除去的细胞群体既不是调节性T细胞、或肿瘤细胞，也不是以其他方式对CART细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞(例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潜在免疫抑制细胞表达的其他标志的细胞)。在一些实施例中，设想将此类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞并行去除，或在所述耗减之后，或以另一种顺序去除。

本文所述的方法可以包括多于一个的选择步骤，例如多于一个的耗减步骤。可以例如用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群体。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。

本文所述的方法可以进一步包括从表达肿瘤抗原(例如不包含CD25的肿瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群体除去细胞，从而提供T调节性耗减的(例如CD25+耗减的)和肿瘤抗原耗减的细胞群体，所述细胞群体适于表达CAR(例如本文所述的CAR)。在一些实施例中，将表达肿瘤抗原的细胞与T调节性例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞、或抗CD25抗体或其片段、或抗肿瘤抗原抗体或其片段的同一底物(例如珠)，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节性细胞(例如CD25+细胞)的除去和表达肿瘤抗原的细胞的除去是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。

还提供了包括以下的方法：从表达检查点抑制剂(例如本文所述的检查点抑制剂)的群体除去细胞(例如PD1+细胞、LAG3+细胞、和TIM3+细胞中的一种或多种)，从而提供T调节性耗减的(例如CD25+耗减的)细胞和检查点抑制剂耗减的细胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗减的细胞)的群体。示例性检查点抑制剂包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。在一些实施例中，将表达检查点抑制剂的细胞与T调节性例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞、或抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段的同一珠，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节性细胞(例如CD25+细胞)的除去和表达检查点抑制剂的细胞的除去是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。

本文所述的方法可以包括阳性选择步骤。例如，可以通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)缀合的珠(如M-450CD3/CD28 T)孵育足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一些实施例中，所述时间段是约30分钟。在另外的实施例中，所述时间段的范围为从30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在另外的实施例中，所述时间段是至少1、2、3、4、5、或6小时。在又另一个实施例中，所述时间段是10至24小时，例如24小时。与其他细胞类型相比，在存在较少T细胞的任何情况下，如从肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+T细胞捕获的效率。因此，通过简单地缩短或延长使T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养起始时或在所述过程期间的其他时间点优先地选择或针对T细胞亚群。另外，通过增加或减少抗CD3和/或抗CD28抗体在珠或其他表面上的比率，可以在培养起始时或在其他希望的时间点优先地选择或针对T细胞亚群。在一些实施例中，可以选择表达以下中的一种或多种的T细胞群体：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B、和穿孔素、或其他适当的分子(例如其他细胞因子)。筛选细胞表达的方法可以通过例如PCT公开号WO 2013/126712中描述的方法来确定。

为了通过阳性或阴性选择分离希望的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如颗粒(如珠))的浓度。在一些方面，可能希望显著减小其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如在一些方面，使用100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml或50亿/ml的浓度。在一些方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一些方面，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用125或150百万个细胞/ml的浓度。

使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞活化、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病的血、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值，并且是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。

在一些实施例中，可能希望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒如珠)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量有待结合颗粒的所希望抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地捕获。在一些方面，所使用的细胞浓度是5x 10⁶/ml。在其他方面，所使用的浓度可以是从约1x 10⁵/ml至1x 10⁶/ml，以及其间的任何整数值。

在其他方面，可以将这些细胞在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或室温下孵育不同的时间长度。

用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和后续解冻步骤通过除去细胞群体中的粒细胞和一定程度的单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO的培养基，或含有31.25％勃脈力-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％ NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO的培养基，或含有例如Hespan和勃脈力-A的其他适合的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷冻。

在一些方面，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻和洗涤，并允许在使用本发明的方法活化之前在室温静置1小时。

在本发明的上下文中还考虑了在可能需要如本文描述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采血液成分术产物。因此，可以在任何必要的时间点收集有待扩增的细胞来源，并且可以分离和冷冻所希望的细胞(如T细胞)以便以后在免疫效应细胞疗法中用于任何数量将受益于免疫效应细胞疗法(如本文描述的那些)的疾病或病症。在一些方面，血液样品或单采血液成分术取自基本健康的受试者。在一些方面，血液样品或单采血液成分术取自基本健康的受试者，所述受试者处于发展疾病的风险中，但尚未患发展疾病，并且将目的细胞分离并冷冻供以后使用。在一些方面，T细胞可以扩增、冷冻，并在以后使用。在一些方面，在诊断如本文所述的特定疾病之后但在任何治疗之前不久从患者收集样本。在另外的方面，在任何数量的相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采血液成分术分离细胞，这些相关治疗模式包括但不限于用以下进行治疗：药剂(如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗、抗病毒剂)、化疗、放射、免疫遏制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)、和照射。

在本发明的另一个方面，在治疗后直接从患者获得T细胞使得受试者具有功能性T细胞。在这点上，已观察到在某些癌症治疗(特别是使用破坏免疫系统的药物的治疗)之后，在患者通常将从治疗恢复期间治疗后不久，所获得的T细胞的质量因其离体扩增的能力可能是最佳或改善的。同样地，在使用本文描述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选的状态以增强植入和体内扩增。因此，在本发明的上下文中，预期在所述恢复期期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在一些方面，动员(例如，用GM-CSF动员)和调整方案可以用于在受试者中产生病症，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的，尤其是在治疗后确定的时间窗口。说明性细胞类型包括免疫系统的T细胞、B细胞、树突细胞、和其他细胞。

在一些实施例中，T细胞群体是甘油二酯激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA、或蛋白质、或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。DGK缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以降低或预防DGK表达。可替代地，可以通过用本文所述的DGK抑制剂处理产生DGK缺陷型细胞。

在一些实施例中，T细胞群体是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA、或蛋白质、或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，Ikaros缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以减少或预防Ikaros表达。可替代地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺(lenalidomide))处理产生Ikaros缺陷型细胞。

在实施例中，T细胞群体是DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的，例如不表达DGK和Ikaros，或者具有降低或抑制的DGK和Ikaros活性。可以通过本文所述的任何方法产生此类DGK和Ikaros缺陷型细胞。在一些实施例中，从受试者获得NK细胞。在另一个实施例中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92细胞系(Conkwest公司)。在特定的示例性方面，受试者可以经历白细胞单采法，其中离体收集、富集、或耗减白细胞以选择和/或分离目的细胞(例如T细胞)。

这些T细胞分离物可以通过本文描述的方法扩增。有需要的受试者可以随后经历使用高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或与之同时，受试者接受通过本发明的方法制备的扩增的CAR T细胞的输注。在另外的方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。

另外的表达的药剂

增强CAR活性的药剂的共表达

在本文考虑的实施例中，应理解，其他药剂可以被编码在上文描述的载体中。因此，以下关于表达CAR的细胞描述这些药剂。

在另一个实施例中，本文描述的表达CAR的免疫效应细胞可以进一步表达另一种药剂，例如增强表达CAR的细胞的活性的药剂。例如，在一些实施例中，药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂。抑制性分子的实例包括例如，如本文描述的PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一些实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含第一多肽(例如抑制性分子)，所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文描述的细胞内信号传导结构域)相关联。在一些实施例中，药剂包含例如抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ、或这些中的任一者的片段)的第一多肽，和第二多肽，该第二多肽是本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文描述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文描述的CD3ζ信号传导结构域)。在一些实施例中，所述药剂包含PD-1的第一多肽或其片段，和本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，本文描述的CD28、CD27、OX40或4-IBB信号传导结构域和/或本文描述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。

第二CAR的共表达

在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞可以进一步包含第二CAR，例如包含不同的抗原结合结构域(例如，针对相同的靶标(例如，CD19)或不同的靶标(例如，除CD19以外的靶标，例如，本文所述的靶标))的第二CAR。

在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞，例如，使用本文所述的方法制造的表达CAR的细胞，包含(i)编码结合BCMA的第一CAR的第一核酸分子和(ii)编码结合CD19的第二个CAR的第二核酸分子。在一些实施例中，所述第一CAR包含抗BCMA结合结构域、第一跨膜结构域和第一细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，并且轻链可变区包含轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，其中所述HC CDR1、HCCDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:86、87、88、95、96和97的氨基酸序列。在一些实施例中，第二CAR包含抗CD19结合结构域、第二跨膜结构域和第二细胞内信号传导结构域，其中该抗CD19结合结构域包含VH和VL，该VH包含HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3，并且该VL包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中该HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:760、687、762、763、764、和765的氨基酸序列。在一些实施例中，(i)所述抗BCMA结合结构域的VH和VL分别包含SEQ ID NO:93和102的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD19结合结构域的VH和VL分别包含SEQ ID NO:250A和251A的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗BCMA结合结构域包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗CD19结合结构域包含SEQ ID NO:758的氨基酸序列。在一些实施例中，所述第一CAR包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列。在一些实施例中，所述第二CAR包含SEQID NO:225的氨基酸序列。

在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞，例如，使用本文所述的方法制造的表达CAR的细胞，包含(i)编码结合CD22的第一CAR的第一核酸分子和(ii)编码结合CD19的第二个CAR的第二核酸分子。在一些实施例中，CD22 CAR包含CD22抗原结合结构域和第一跨膜结构域；第一共刺激信号传导结构域；和/或第一初级信号传导结构域。在一些实施例中，所述CD19 CAR包含CD19抗原结合结构域和第二跨膜结构域；第二共刺激信号传导结构域；和/或第二初级信号传导结构域。

在一些实施例中，CD22抗原结合结构域包含本文所述的CD22结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，例如在表15、16、30、31、或32中；和/或本文(例如在表15、16、30、31或32中)所述的CD22结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施例中，CD22抗原结合结构域包含本文所述的CD22结合结构域的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，例如在表15、16、30、31或32中；和/或本文(例如在表15、16、30、31或32中)所述的CD22结合结构域的HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含：本文所述的CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)LC CDR1、LC CDR2、和LC CDR3，例如，表1、30、31、或32中的；和/或本文所述的CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)HC CDR1、HCCDR2、和HC CDR3，例如，表1、30、31、或32中的。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含本文所述的CD19结合结构域的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，例如，在表1、30、31、和32中；和/或本文(例如在表1、30、31、和32中)所述的CD19结合结构域的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3。

在一些实施例中，CD22抗原结合结构域(例如，scFv)包含本文所述的CD22结合结构域的轻链可变(VL)区，例如在表30或32中；和/或本文(例如在表30或32中)所述的CD22结合结构域的重链可变(VH)区。在一些实施例中，CD22抗原结合结构域包含VL区，所述VL区包含具有表30或32中提供的CD22 VL区序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。在一些实施例中，CD22抗原结合结构域包含含有表30或32中提供的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的VL区。在一些实施例中，CD22抗原结合结构域包含VH区，所述VH区包含具有表30或32中提供的CD22 VH区序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。在一些实施例中，CD22抗原结合结构域包含含有表30或32中提供的CD22 VH区序列的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的VH区。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域(例如，scFv)包含本文所述的CD19结合结构域的VL区，例如在表1、30、或32中；和/或本文(例如在表1、30、或32中)所述的CD19结合结构域的VH区。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含VL区，所述VL区包含具有表1、30、或32中提供的CD19 VL区序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含含有表1、30、或32中提供的CD19 VL区序列的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的VL区。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含VH区，所述VH区包含具有表1、30、或32中提供的CD19 VH区序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含含有表1、30、或32中提供的CD19VH区序列的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的VH区。

在一些实施例中，CD22抗原结合包含scFv，所述scFv包含具有表30或32中提供的CD22 scFv序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。在一些实施例中，CD22抗原结合包含含有表30或32中提供的CD22scFv序列的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的scFv。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含scFv，所述scFv包含具有表1、30、或32中提供的CD19 scFv序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含含有表1、30、或32中提供的CD19 scFv区序列的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的scFv。

在一些实施例中，CD22 CAR分子和/或CD19 CAR分子包含另外的组分，例如，包含表33中提供的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的信号肽、铰链、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和/或第一初级信号传导结构域、P2A位点、和/或接头；或由表33中提供的核苷酸序列，或与前述序列中任一者具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列编码的上述组分。

表30中提供了CAR分子的示例性核苷酸和氨基酸序列，所述CAR分子例如包含(i)结合CD22的第一CAR，和(ii)结合CD19的第二CAR的本文披露的双重CAR分子。

表30：双重和串联CD19-CD22 CAR序列

表31中提供了本披露的双重CAR的CD22和CD19 CDR(例如，包含(i)结合CD22的第一CAR，和(ii)结合CD19的第二CAR的双重CAR分子)。

表31：CD22和CD19 CDR序列

表32提供了本文披露的双重CAR或串联CAR的CD19和CD22结合结构域的核苷酸和氨基酸序列，例如，双重CAR或串联CAR，其包含(i)结合CD22的第一CAR和(ii)结合CD19的第二CAR。

表32：CD19和CD22结合结构域

表33提供了另外的CAR组分(例如，信号肽、接头和P2A位点)的核苷酸和氨基酸序列，其可用于CAR分子，例如本文所述的双重CAR分子(例如包含(i)结合CD22的第一CAR，和(ii)结合CD19的第二CAR的双重CAR分子)。

表33：另外的CAR组分

在一些实施例中，本文描述的表达CAR的免疫效应细胞可以还包含第二CAR，例如，包含例如针对相同靶标(例如，上述靶标)或不同靶标的不同抗原结合结构域的第二CAR。在一些实施例中，所述第二CAR包含针对在与第一CAR的靶标相同的癌细胞类型上表达的靶标的抗原结合结构域。在一些实施例中，表达CAR的免疫效应细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。虽然不希望受理论束缚，但是将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、CD27或OX-40)置于第一CAR上，并将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制于表达两种靶标的细胞。在一些实施例中，表达CAR的免疫效应细胞包含第一CAR，所述第一CAR包含靶向例如上述靶标的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；和第二CAR，所述第二CAR靶向除由所述第一CAR靶向的抗原以外的抗原(例如，在与第一靶标相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施例中，表达CAR的免疫效应细胞包含第一CAR，所述第一CAR包含靶向例如上述靶标的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和第二CAR，所述第二CAR靶向除由所述第一CAR靶向的抗原以外的抗原(例如，在与第一靶标相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对所述抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。

在一些实施例中，表达CAR的免疫效应细胞包含本文描述的CAR(例如，针对上述靶标的CAR)和抑制性CAR。在一些实施例中，抑制性CAR包含结合在正常细胞而非癌细胞(例如也表达所述靶标的正常细胞)上发现的抗原的抗原结合结构域。在一些实施例中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ的细胞内结构域。

在一些实施例中，免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)包含第一CAR，所述第一CAR包含结合至如本文描述的肿瘤抗原的抗原结合结构域；和第二CAR，所述第二CAR包含PD1细胞外结构域或其片段。

在一些实施例中，所述细胞还包含如上所述的抑制性分子。

在一些实施例中，所述细胞中的第二CAR是抑制性CAR，其中所述抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。抑制性分子可以选自以下中的一个或多个：PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ、CEACAM-1、CEACAM-3、和CEACAM-5。在一些实施例中，第二CAR分子包含PD1的细胞外结构域或其片段。

在实施例中，所述细胞中的第二CAR分子还包含细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或细胞内信号传导结构域。

在其他实施例中，所述细胞中的细胞内信号传导结构域包含含有CD3ζ的功能性结构域的初级信号传导结构域和含有4-1BB的功能性结构域的共刺激信号传导结构域。

在一些实施例中，第一CAR分子的抗原结合结构域包含scFv，并且第二CAR分子的抗原结合结构域不包含scFv。例如，第一CAR分子的抗原结合结构域包含scFv，并且第二CAR分子的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。

CAR的构象

在本文考虑的实施例中，应理解，一个或多个CAR的构象可以被本文以上描述的载体调节。因此，以下关于表达CAR的细胞描述这些构象。

分离的CAR

在一些实施例中，表达CAR的细胞使用分离的CAR。分离的CAR方法更详细地描述于公开WO2014/055442和WO2014/055657中。简言之，分离的CAR系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且所述细胞还表达具有第二抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)的第二CAR。当所述细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被活化，并且细胞增殖。当所述细胞遇到第二抗原时，细胞内信号传导结构域被活化并开始细胞杀伤活性。因此，所述表达CAR的细胞仅在两种抗原都存在下完全活化。

多重CAR

在一些方面，本文描述的表达CAR的细胞可以还包含第二CAR，例如包括不同抗原结合结构域的第二CAR，该抗原结合结构域例如针对相同靶标或不同靶标(例如，除本文描述的癌症相关抗原或本文描述的不同癌症相关抗原的靶标)。在一些实施例中，第二CAR包含针对在与癌症相关抗原相同的癌细胞类型上表达的靶标的抗原结合结构域。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。虽然不希望受理论束缚，但是将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、CD27或OX-40)置于第一CAR上，并将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制于表达两种靶标的细胞。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含第一癌症相关抗原CAR，所述第一癌症相关抗原CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；和第二CAR，所述第二CAR靶向不同靶抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR，所述第一CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和第二CAR，所述第二CAR靶向除第一靶抗原以外的抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对所述抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。

在一些实施例中，要求保护的本发明包括第一CAR和第二CAR，其中所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域不包含可变轻结构域和可变重结构域。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域是scFv，而另一者不是scFv。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含单个VH结构域，例如骆驼科、鲨鱼、或七鳃鳗单个VH结构域，或源自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。

一旦执行了本文所述的方法，各种测定可用于评估适当的体外和动物模型中的以下活性，例如抗原刺激后扩增T细胞的能力，在没有重新刺激的情况下维持T细胞扩增的能力以及抗癌活性。评估本发明的CAR的作用的测定是本领域技术人员已知的，并在下文中进行总体描述。

原代T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析可用于检测单体和二聚体的存在。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。非常简单地，表达CAR的T细胞(CD4⁺和CD8⁺T细胞的1:1混合物)在体外扩增超过10天，然后在还原条件下进行裂解和SDS-PAGE。使用针对TCR-ζ链的抗体通过蛋白质印迹来检测含有全长TCR-ζ胞质结构域和内源性TCR-ζ链的CAR。相同的T细胞亚群用于在非还原条件下的SDS-PAGE分析，以允许评估共价二聚体的形成。

可以通过流式细胞术测量抗原刺激后CAR⁺T细胞的体外扩增。

还可以测量在没有再刺激的情况下持续的CAR⁺T细胞扩增。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，以及在第1天用指示的CAR转导后，使用Coulter Multisizer III粒子计数器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter在培养的第8天测量平均T细胞体积(fl)。

动物模型也可用于测量CART活性。例如，可以使用异种移植模型，所述异种移植模型使用人本文描述的癌症相关抗原特异性CAR⁺T细胞来治疗免疫缺陷小鼠中的初级人前-BALL。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。

可以评估剂量依赖性CAR治疗应答。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。例如，在第21天用CAR T细胞、相同数量的模拟转导的T细胞、或无T细胞注射的小鼠中建立白血病之后35-70天获得外周血。将来自每组的小鼠随机放血以确定外周血如本文描述的癌症相关抗原⁺ALL胚细胞计数，并且然后在第35天和第49天处死。在第57天和第70天评价剩余的动物。

先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如在Milone等人，MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)中。

可通过标准51Cr释放测定来评估细胞毒性。参见例如，Milone等人，MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。

成像技术可用于评估荷肿瘤的动物模型中CAR的特定运输和增殖。例如，Barrett等人,Human Gene Therapy[人基因疗法]22:1575-1586(2011)中已经描述了此类测定。

其他测定，包括本文实例部分中描述的那些测定以及本领域中已知的那些测定也可以用于评价本文描述的CAR。

抗CD28抗体分子

在一些实施例中，抗CD28抗体，例如，本文所述的多特异性结合分子中使用的抗CD28抗体，包含来自表19中所述的抗CD28(2)的至少一个抗原结合区，例如可变区或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗CD28抗体分子包含来自表19中所述的抗CD28(2)的一个或两个可变区。在一些实施例中，抗CD28抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区(VH)包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、和HCDR3，该轻链可变区(VL)包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2、和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3分别包含SEQ ID NO:538、539、540、530、531、和532氨基酸序列；所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3分别包含SEQ ID NO:541、539、540、530、531和532的氨基酸序列；所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3分别包含SEQ ID NO:542、543、540、533、534和535的氨基酸序列；或所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3分别包含SEQ ID NO:544、545、546、536、534和532的氨基酸序列。

在一些实施例中，抗CD28抗体分子包含：含有SEQ ID NO:547或548的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:547或548具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的VH。在一些实施例中，抗CD28抗体包含：含有SEQ ID NO:537的氨基酸序列、或与其具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的VL。在一些实施例中，抗CD28抗体包含：分别含有SEQ ID NO:547或537的氨基酸序列、或与前述序列的任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的VH和VL。在一些实施例中，抗CD28抗体包含：分别含有SEQ ID NO:548或537的氨基酸序列、或与前述序列的任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的VH和VL。

应当理解，本文所述的抗CD28抗体可用于多特异性结合分子的上下文中，例如，具有另外的结合结构域，例如本文所述的抗CD3结合结构域。还应理解，本文所述的抗CD28抗体可用于其他上下文中，例如单特异性抗体。

细胞活化剂

在一些实施例中，细胞活化剂是T细胞刺激化合物、针对CAR抗原结合结构域的抗独特型抗体、和/或肿瘤抗原。在一些实施例中，T细胞刺激化合物是IL-2、IL-15、抗CD2mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、来自共享抗原(例如TRP2、gp100、肿瘤细胞裂解物、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、和/或MAGE A3 TCR)的肽。在一些实施例中，细胞活化剂包含CD3/TCR复合物和/或刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂，任选地，其中该细胞活化剂是包含刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂的多特异性结合分子。

在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂。在一些实施例中，刺激CD3的药剂包含CD3或TCR抗原结合结构域中的一个或多个，例如但不限于抗CD3或抗TCR抗体或包含其一个或多个CDR、重链、和/或轻链的抗体片段。

抗CD3抗体序列和制备这种抗体的方法是本领域已知的。抗CD3抗体序列，连同相关CDR、重链、和轻链序列的非限制性实例在表19中提供。在一些实施例中，所述抗CD3结合结构域包含VH和VL，所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:437和427的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗CD3结合结构域包含VH和VL，所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:456和445的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗CD3结合结构域包含VH和VL，所述VH和VL分别包含SEQ IDNO:457和446的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗CD3结合结构域包含VH和VL，所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:475和467的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗CD3结合结构域包含VH和VL，所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:476和468的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗CD3结合结构域包含VH和VL，所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:494和484的氨基酸序列。

抗TCR抗体序列和制备这种抗体的方法是本领域已知的。抗TCR抗体序列，连同相关CDR、重链、和轻链序列的非限制性实例在表19中提供。

在一些实施例中，刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、CD25、4-1BB、IL6RA、IL6RB、或CD2的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂包含CD28、ICOS、CD27、CD25、4-1BB、IL6RB、和/或CD2抗原结合结构域中的一个或多个，例如但不限于抗CD28、抗ICOS、抗CD27、抗CD25、抗4-1BB、抗IL6RA、抗IL6RB、或抗CD2抗体或包含其一个或多个CDR、重链、和/或轻链的抗体片段。

抗CD28抗体序列和制备这种抗体的方法是本领域已知的。抗CD28抗体序列的非限制性实例，连同相关CDR、VH、VL、HC和LC序列在表19中提供。

抗ICOS抗体序列和制备这种抗体的方法是本领域已知的。抗ICOS抗体序列的非限制性实例，连同相关CDR、VH、VL和LC序列在表19中提供。

抗CD27抗体序列和制备这种抗体的方法是本领域已知的。抗CD27抗体序列的非限制性实例，连同相关CDR、VH、和VL序列在表19中提供。

抗CD25抗体序列和制备这种抗体的方法是本领域已知的。抗CD25抗体序列的非限制性实例，连同相关CDR、VH、VL、HC和LC序列在表19中提供。

抗4-1BB抗体序列和制备这种抗体的方法是本领域已知的。抗4-IBB抗体序列的非限制性实例，连同相关CDR、VH、和VL序列在表19中提供。

抗IL6RA抗体序列和制备这种抗体的方法是本领域已知的。IL6RA抗体序列的非限制性实例，连同相关CDR、VH、和VL序列在表19中提供。

抗IL6RB抗体序列和制备这种抗体的方法是本领域已知的。IL6RB抗体序列的非限制性实例，连同相关CDR、VH、和VL序列在表19中提供。

抗CD2抗体序列和制备这种抗体的方法是本领域已知的。抗CD2抗体序列，连同相关CDR、VH、VL、HC和LC序列的非限制性实例在表19中提供。

在一些实施例中，本文所述的抗体分子包含表19中披露的CDR、VH、VL、HC、和/或LC，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

表19-示例性抗体、CDR、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、重链(HC)、和轻链(LC)、序列，通过靶抗原排序

在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂包含在多特异性结合分子。因此，还考虑了包含刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子和/或生长受体受体的药剂的多特异性结合分子，例如但不限于包含CD3抗原结合结构域和CD28、ICOS、CD27、CD25、4-1BB、IL6RA、IL6RB、和/或CD2抗原结合结构域中的一个或多个的多特异性结合分子。如上所述，上文提供了此类结合结构域的非限制性实例，例如在表19和通过引用并入本文的出版物中。

在一些实施例中，多特异性结合分子包含CD3抗原结合结构域和CD28或CD2抗原结合结构域。在一些实施例中，CD3抗原结合结构域是抗CD3抗体，任选地表19中提供的抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)、或抗CD3(4)，或包含一个或多个其CDR、VH、和/或VL的抗体片段。在一些实施例中，CD28抗原结合结构域是抗CD28抗体，任选地表19中提供的抗CD28(1)、或抗CD28(2)，或包含其一个或多个CDR、VH、重链、VL和/或轻链的抗体片段。在一些实施例中，CD2抗原结合结构域是抗CD2抗体，任选地表19中提供的抗CD2(1)，或包含其一个或多个CDR、VH、重链、VL和/或轻链的抗体片段。

在一些实施例中，多特异性结合分子包含一个或多个重链和/或轻链。下表20中提供了可包含在这些多特异性结合分子中的非限制性示例性重链和轻链序列。基于如在构建体中的所述重链和/或轻链的分类，在表20中提出了其非限制性示例性组合。该构建体组织提供了重链和/或轻链的构型的实例，但是其进一步的组合和排列也是可能的。图37A-B、48A-B、49A-B、和50A-B中提供了这些构建体的任何一种的形式的非限制性实例。

在一些实施例中，多特异性结合分子包含表20中披露的一个或多个重链和/或轻链序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列。

表20-示例性Fc、重链(HC)和轻链(LC)序列

在一些实施例中，多特异性结合分子包含双特异性抗体。在一些实施例中，双特异性抗体以图37A-37B、图48A-48B、图49A-49C、和图50A-50B中提供的方案中的任一种配置。在一些实施例中，所述双特异性抗体是单价或二价。在一些实施例中，所述双特异性抗体包含Fc区。在一些实施例中，双特异性抗体的Fc区是沉默的。

在一些实施例中，多特异性结合分子包含多个双特异性抗体。在一些实施例中，多个双特异性抗体中的一个或多个是一价的。在一些实施例中，多个双特异性抗体中的一个或多个包含Fc区。在一些实施例中，多个双特异性抗体中的一个或多个的Fc区是沉默的。在一些实施例中，多个双特异性抗体中的一个或多个一起缀合为多聚体。在一些实施例中，多聚体以图37B和图48B中提供的多特异性方案中的任一种配置。

在一些实施例中，本文所述的多特异性结合分子包含Fc区，例如，其中Fc区是Fc沉默的。在一些实施例中，Fc区包含在D265、N297、和P329中的一个或多个(例如，全部)处的突变，其根据Eu编号系统进行编号。在一些实施例中，Fc区包含突变D265A、N297A、和P329A(DANAPA)，其根据Eu编号系统进行编号。

在一些实施例中，本文所述的多特异性结合分子包含第一结合结构域和第二结合结构域。例如，第一结合结构域可以是抗CD3结合结构域，第二结合结构域可以是共刺激分子结合结构域；或者第一结合结构域可以是共刺激分子结合结构域，第二结合结构域可以是抗CD3结合结构域。在一些实施例中，共刺激分子结合结构域与CD2、CD28、CD25、CD27、IL6Rb、ICOS、或41BB结合。在一些实施例中，共刺激分子结合结构域激活CD2、CD28、CD25、CD27、IL6Rb、ICOS、或41BB。在一些实施例中，本文所述的多特异性结合分子包含Fc区，该Fc区突变以具有与Fc受体降低的结合或降低的ADCC、ADCP、或CDC活性，例如，包含突变D265A、N297A、和P329A(DANAPA)的Fc区，其根据Eu编号系统进行编号。

在一些实施例中，第一结合结构域(例如，scFv)是第二结合结构域的VH的N末端(例如，Fab片段)，例如，经由肽接头连接。在一些实施例中，多特异性结合分子进一步包含CH1、CH2、和CH3中的一个或多个(例如，全部)，例如，以从N末端至C末端的顺序。在一些实施例中，多特异性结合分子的多肽从N末端至C末端包含以下序列：第一结合结构域的VH、第一肽接头(例如，(G4S)4接头(SEQ ID NO:29))、第一结合结构域的VL、第二肽接头(例如，(G4S)4接头(SEQ ID NO:29))、第二结合结构域的VH、CH1、CH2和CH3。在一些实施例中，多特异性结合分子的多肽包含以下序列(从N末端至C末端)：第二结合结构域的VL和CL。在一些实施例中，多特异性结合分子包含Fc区，所述Fc区突变以具有与Fc受体降低的结合或降低的ADCC、ADCP、或CDC活性，例如，包含突变D265A、N297A、和P329A(DANAPA)的Fc区，其根据Eu编号系统进行编号。在一些实施例中，第一结合片段包含抗CD3结合结构域，例如抗CD3scFv，例如，包含披露于表19的抗CD3序列。在一些实施例中，第二结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD2结合结构域，例如抗CD2 Fab，例如，包含披露于表19的抗CD2序列。在一些实施例中，第二结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD28结合结构域，例如抗CD28 Fab，例如，包含披露于表19的抗CD28序列。在一些实施例中，第一结合片段包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD2或抗CD28结合结构域，例如抗CD2或抗CD28 scFv，例如，包含披露于表19的抗CD2或抗CD28序列。在一些实施例中，第二结合结构域包含抗CD3结合结构域，例如抗CD3 Fab，例如，包含披露于表19的抗CD3序列。此类多特异性结合分子的实例描述为图37A中左上构建体；图48A中的构建体1或构建体2；和表20中的构建体1或构建体2。

在一些实施例中，第一结合结构域(例如，Fab片段)是第二结合结构域的N末端(例如，scFv)，例如其中Fc区位于第一和第二结合结构域之间。在一些实施例中，Fc区突变以具有与Fc受体降低的结合或降低的ADCC、ADCP、或CDC活性，例如，包含突变D265A、N297A、和P329A(DANAPA)的Fc区，其根据Eu编号系统进行编号。在一些实施例中，Fc区包含突变L234A、L235A、S267K、和P329A(LALASKPA)，其根据Eu编号系统进行编号。在一些实施例中，Fc区包含突变L234A、L235A、和P329G(LALAPG)，其根据Eu编号系统进行编号。在一些实施例中，Fc区包含突变G237A、D265A、P329A、和S267K(GADAPASK)，其根据Eu编号系统进行编号。在一些实施例中，多特异性结合分子进一步包含CH1、CH2、和CH3中的一个或多个(例如，全部)，例如，以从N末端至C末端的顺序。在一些实施例中，多特异性结合分子的多肽从N末端至C末端包含以下序列：第一结合结构域的VH、CH1、CH2、CH3、第一肽接头(例如，(G4S)4接头(SEQ ID NO:29))、第二结合结构域的VH、第二肽接头(例如，(G4S)4接头(SEQ ID NO:29))、和第二结合结构域的VL。在一些实施例中，多特异性结合分子的多肽包含以下序列(从N末端至C末端)：第一结合结构域的VL和CL。在一些实施例中，第一结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD2结合结构域，例如抗CD2 Fab，例如，包含披露于表19的抗CD2序列。在一些实施例中，第一结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD28结合结构域，例如抗CD28 Fab，例如，包含披露于表19的抗CD28序列，例如，抗CD28(1)或抗CD28(2)。在一些实施例中，第二结合结构域包含抗CD3结合结构域，例如抗CD3 scFv，例如，包含披露于表19的抗CD3序列，例如抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)、或抗CD3(4)。在一些实施例中，第一结合结构域包含抗CD3结合结构域，例如抗CD3 Fab，例如，包含披露于表19的抗CD3序列，例如抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)、或抗CD3(4)。在一些实施例中，第二结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD2或抗CD28结合结构域，例如抗CD2或抗CD28scFv，例如，包含披露于表19的抗CD2或抗CD28序列。此类多特异性结合分子的实例描述为图37A中上行从左第二个构建体；图48A中的构建体3或构建体4；和表20中的构建体3或构建体4。

在一些实施例中，第一结合结构域(例如，Fab片段)是第二结合结构域的N末端(例如，scFv)，例如，经由肽接头。在一些实施例中，多特异性结合分子进一步包含CH1、CH2、和CH3中的一个或多个(例如，全部)，例如，以从N末端至C末端的顺序。在一些实施例中，多特异性结合分子的多肽从N末端至C末端包含以下序列：第一结合结构域的VH、CH1、第一肽接头(例如，(G4S)2接头(SEQ ID NO:767))、第二结合结构域的VH、第二肽接头(例如，(G4S)4接头(SEQ ID NO:29))、第二结合结构域的VL、第三肽接头(例如，(G4S)4接头(SEQ ID NO:29))、CH2、和CH3。在一些实施例中，多特异性结合分子的多肽包含以下序列(从N末端至C末端)：第一结合结构域的VL和CL。在一些实施例中，多特异性结合分子包含Fc区，所述Fc区突变以具有与Fc受体降低的结合或降低的ADCC、ADCP、或CDC活性，例如，包含突变D265A、N297A、和P329A(DANAPA)的Fc区，其根据Eu编号系统进行编号。在一些实施例中，第一结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD2结合结构域，例如抗CD2 Fab，例如，包含披露于表19的抗CD2序列。在一些实施例中，第一结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD28结合结构域，例如抗CD28 Fab，例如，包含披露于表19的抗CD28序列，例如，抗CD28(1)或抗CD28(2)。在一些实施例中，第一结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD25结合结构域(例如抗CD25 Fab)、抗CD27结合结构域(例如抗CD27 Fab)、抗IL6Rb结合结构域(例如抗IL6Rb Fab)、抗ICOS结合结构域(例如抗ICOS Fab)、或抗41BB结合结构域(例如抗41BB Fab)。在一些实施例中，第二结合结构域包含抗CD3结合结构域，例如抗CD3scFv，例如，包含披露于表19的抗CD3序列，例如抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)、或抗CD3(4)。在一些实施例中，第一结合结构域包含抗CD3结合结构域，例如抗CD3 Fab，例如，包含披露于表19的抗CD3序列，例如抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)、或抗CD3(4)。在一些实施例中，第二结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD2结合结构域(例如抗CD2scFv)、抗CD28结合结构域(例如抗CD28 scFv)、抗CD25结合结构域(例如抗CD25 scFv)、抗CD27结合结构域(例如抗CD27 scFv)、抗IL6Rb结合结构域(例如抗IL6Rb scFv)、抗ICOS结合结构域(例如抗ICOS scFv)、或抗41BB结合结构域(例如抗41BB scFv)。此类多特异性结合分子的实例描述为图37A中上行从左第三个构建体；图48A中的构建体5或构建体6；和表20中的构建体5或构建体6。

在一些实施例中，第一结合结构域(例如，scFv)是第二结合结构域的N末端(例如，Fab片段)，例如其中Fc区位于第一和第二结合结构域之间。在一些实施例中，Fc区突变以具有与Fc受体降低的结合或降低的ADCC、ADCP、或CDC活性，例如，包含突变D265A、N297A、和P329A(DANAPA)的Fc区，其根据Eu编号系统进行编号。在一些实施例中，多特异性结合分子进一步包含CH2、CH3、和CH1中的一个或多个(例如，全部)，例如，以从N末端至C末端的顺序。在一些实施例中，多特异性结合分子的多肽从N末端至C末端包含以下序列：第一结合结构域的VH、第一肽接头(例如，(G4S)4接头)(SEQ ID NO:29)、第一结合结构域的VL、第二肽接头(例如，(G4S)接头(SEQ ID NO:768))、CH2、CH3、第三肽接头(例如，(G4S)4接头(SEQ IDNO:29))、第二结合结构域的VH、和CH1。在一些实施例中，多特异性结合分子的多肽包含以下序列(从N末端至C末端)：第二结合结构域的VL和CL。在一些实施例中，第一结合结构域包含抗CD3结合结构域，例如抗CD3 scFv，例如，包含披露于表19的抗CD3序列。在一些实施例中，第二结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD2结合结构域，例如抗CD2 Fab，例如，包含披露于表19的抗CD2序列。在一些实施例中，第二结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD28结合结构域，例如抗CD28 Fab，例如，包含披露于表19的抗CD28序列。在一些实施例中，第一结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD2或抗CD28结合结构域，例如抗CD2或抗CD28 scFv，例如，包含披露于表19的抗CD2或抗CD28序列。在一些实施例中，第二结合结构域包含抗CD3结合结构域，例如抗CD3 Fab，例如，包含披露于表19的抗CD3序列。此类多特异性结合分子的实例描述为图37A中上行最右构建体；图48A中的构建体7或构建体8；和表20中的构建体7或构建体8。

在一些实施例中，第一结合结构域(例如Fab片段)位于第一Fc区的N末端。在一些实施例中，多特异性结合分子包含第一CH1、第一CH2、和第一CH3中的一个或多个(例如，全部)，例如，以从N末端至C末端的顺序。在一些实施例中，第二结合结构域(例如scFv)位于第二Fc区的N末端，例如，在第二多肽链中。在一些实施例中，多特异性结合分子(例如，在第二多肽链中)包含第二CH2和第二CH3中的一个或多个(例如，两者)，例如，以从N末端至C末端的顺序。在一些实施例中，多特异性结合分子包含异二聚体抗体分子，例如，其中第一和第二Fc区包含杵臼突变。在一些实施例中，第一Fc区与第二Fc区的结合比第一Fc区与第一Fc区的另一拷贝的结合更牢固。在一些实施例中，多特异性结合分子的第一多肽从N末端至C末端包含以下序列：第一结合结构域的VH、第一CH1、第一CH2、和第一CH3。在一些实施例中，多特异性结合分子的第二多肽从N末端至C末端包含以下序列：第二结合结构域的VH、第一肽接头(例如，(G4S)接头(SEQ ID NO:768))、第二结合结构域的VL、第二CH2、和第二CH3。在一些实施例中，多特异性结合分子的第三多肽包含以下序列(从N末端至C末端)：第一结合结构域的VL和CL。在一些实施例中，多特异性结合分子的第二多肽进一步包含同源多聚化结构域，例如，Matrilin1蛋白质或软骨寡聚基质蛋白卷曲螺旋结构域(COMPcc)、第二CH3的C末端，例如，经由肽接头(例如，(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、(G4S)接头(SEQ ID NO:768)、或(G4S)3接头(SEQ ID NO:30))。在一些实施例中，多特异性结合分子包含第一结合结构域的两个、三个、四个、或五个和相同数量的第二结合结构域的拷贝，例如，如图37B中所示。在一些实施例中，第一结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD2结合结构域(例如抗CD2 Fab)。在一些实施例中，第一结合结构域包含共刺激分子结合结构域，例如抗CD28结合结构域(例如抗CD28 Fab)。在一些实施例中，第二结合结构域包含抗CD3结合结构域，例如抗CD3scFv。此类多特异性结合分子的实例描述为图37A中下行最左构建体；图37B中的构建体，图48B中的构建体9、构建体10、构建体12、构建体13、构建体15、和构建体16；和表20中的构建体9、构建体10、构建体12、构建体13、构建体15、和构建体16。

在一些实施例中，本文所述的结合分子包含结合结构域。在一些实施例中，结合结构域(例如scFv)位于Fc区的N末端。在一些实施例中，结合分子包含异二聚体抗体分子，例如，其中第一和第二Fc区包含杵臼突变。在一些实施例中，第一Fc区与第二Fc区的结合比第一Fc区与第一Fc区的另一拷贝的结合更牢固。在一些实施例中，结合分子包含CH2、和CH3中的一个或多个(例如，全部)，例如，以从N末端至C末端的顺序。在一些实施例中，结合分子的第二多肽从N末端至C末端包含以下序列：结合结构域的VH、第一肽接头(例如，(G4S)4接头(SEQ ID NO:29))、结合结构域的VL、第二肽接头(例如，(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)或(G4S)接头(SEQ ID NO:768))、CH2、和CH3。在一些实施例中，结合分子的第二多肽进一步包含同源多聚化结构域，例如，Matrilin1蛋白质或软骨寡聚基质蛋白卷曲螺旋结构域(COMPcc)、第二CH3的C末端，例如，经由肽接头(例如，(G4S)4接头(SEQ ID NO:29)、(GS4)3接头(SEQ ID NO:878)、或(G4S)接头(SEQ ID NO:768))。在一些实施例中，结合分子包含该结合的两个、三个、四个、或五个，例如，图37B中所示。在一些实施例中，结合结构域包含抗CD3结合结构域，例如抗CD3 scFv。在一些实施例中，共刺激分子结合结构域不存在。此类结合分子的实例描述为图37A中下行最右构建体；图48B中的构建体11、构建体14、和构建体17；和表20中的构建体11、构建体14、和构建体17。

在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含抗CD28结合结构域，例如抗CD28 Fab，例如，包含表19的抗CD28(2)序列(或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列)，以及抗CD3 scFv，例如，包含表19的抗CD3(4)序列(或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列)。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含Fc区，其中抗CD28 Fab与该Fc区融合，该Fc区进一步融合到抗CD3 scFv。在一些实施例中，Fc区包含L234A、L235A、S267K、和P329A突变(LALASKPA)，其根据Eu编号系统进行编号。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含重链，该重链包含SEQ ID NO:726或1416的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:726或1416具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO:728或730的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:728或730具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO:726或1416的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:726或1416具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，该轻链包含SEQ IDNO:728或730的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:728或730具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO:726的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO:728的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO:726的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO:730的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含重链和轻链，该重链包含SEQID NO:1416的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO:728的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO:1416的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO:730的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含抗CD28结合结构域，例如抗CD28 Fab，例如，包含表19的抗CD28(2)序列(或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列)，以及抗CD3 scFv，例如，包含表19的抗CD3(2)序列(或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列)。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含Fc区，其中抗CD28 Fab与该Fc区融合，该Fc区进一步融合到抗CD3 scFv。在一些实施例中，Fc区包含L234A、L235A、S267K、和P329A突变(LALASKPA)，其根据Eu编号系统进行编号，其根据Eu编号系统进行编号。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含重链，该重链包含SEQ ID NO:893或1417的氨基酸序列，或与SEQID NO:893或1417具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO:892的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO:893的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO:892的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO:1417的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO:892的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含抗CD28结合结构域，例如抗CD28 Fab，例如，包含表19的抗CD28(1)序列(或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列)，以及抗CD3 scFv，例如，包含表19的抗CD3(4)序列(或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列)。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含Fc区，其中抗CD28 Fab与该Fc区融合，该Fc区进一步融合到抗CD3 scFv。在一些实施例中，Fc区包含L234A、L235A、S267K、和P329A突变(LALASKPA)，其根据Eu编号系统进行编号。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含重链，该重链包含SEQ ID NO:895的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO:894的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多特异性结合蛋白包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO:895的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO:894的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。

应当理解，在本文的许多实施例中，多特异性结合分子包含两条或更多条多肽链，所述多肽链例如通经由二硫桥彼此共价连接。然而，在一些实施例中，多特异性结合分子的两条或更多条多肽链可以彼此非共价结合。

还应理解，Fab片段可以作为较大蛋白的一部分存在，例如，Fab片段可以与CH2和CH3融合，因此是全长抗体的一部分。

预期包含本文披露的刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂的多特异性结合分子可用作本文披露的细胞活化剂。

Fc变体

在一些实施例中，本文所述的多特异性结合分子包含Fc区，例如如本文所述的。在一些实施例中，Fc区是野生型Fc区，例如野生型人Fc区。在一些实施例中，Fc区包含变体，例如在Fc区中包含至少一个氨基酸残基的添加、取代或缺失，其导致例如对至少一个Fc受体的亲和力降低或消除的Fc区。在一些实施例中，多特异性结合分子包含表20中提供的Fc区的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。

在一些实施例中，抗体的Fc区与许多受体或配体相互作用，所述受体或配体包括Fc受体(例如，FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA)、补体蛋白CIq以及其他分子，例如蛋白质A和G。这些相互作用促进了多种效应子功能和下游信号传导事件，包括：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。上表20提供了具有这些和本文所披露的其他沉默修饰的非限制性示例性Fc区。

在一些实施例中，包含变体Fc区的本文所述的多特异性结合分子降低了，例如消除了Fc受体的亲和力，例如，本文所述的Fc受体。在一些实施例中，将降低的亲和力与除具有野生型Fc区外其他相似抗体进行比较。

在一些实施例中，包含变体Fc区的本文所述的多特异性结合分子具有以下特性中的一个或多个：(1)降低的效应子功能(例如，降低的ADCC、ADCP和/或CDC)；(2)降低的与一种或多种Fc受体的结合；和/或(3)降低的与C1q补体的结合。在一些实施例中，将特性(1)-(3)中任一项或全部的减少与除具有野生型Fc区外其他相似抗体进行比较。

示例性Fc区变体在表34中提供，并且还披露于Saunders O,(2019)Frontiers inImmunology；[免疫学前言]第10卷,第1296条，所述文献的全部内容通过引用并入本文。

在一些实施例中，本文所述的多特异性结合分子包含表34中披露的Fc区变体例如突变的任何一个或全部或任何组合。在一些实施例中，本文所述的多特异性结合分子的Fc区是沉默的。在一些实施例中，本文所述的多特异性结合蛋白的Fc区通过选自下组的氨基酸取代的组合而被沉默，该组由以下组成：LALA、DAPA、DANAPA、LALADANAPS、LALAGA、LALASKPA、DAPASK、GADAPA、GADAPASK、LALAPG、和LALAPA(其根据Eu编号系统进行编号)。

在一些实施例中，本文所述的多特异性结合分子包含突变的任何一个或全部或任何组合，该突变包含在IgG1 Fc氨基酸序列中的L234，例如L234A和/或L235，例如L234A突变(LALA)(其根据Eu编号系统进行编号)；D265，例如D265A和/或P329，例如P329A(DAPA)(其根据Eu编号系统进行编号)；N297，例如N297A(其根据Eu编号系统进行编号)；DANAPA(D265A、N297A、和P329A)(其根据Eu编号系统进行编号)；和/或L234，例如L234A、L235，例如L235A、D265，例如D265A、N297，例如N297A、和P331，例如P331S(LALADANAPS)(其根据Eu编号系统进行编号)。在一些实施例中，本文所述的多特异性结合分子包含野生型人IgG1 Fc区的人IgG1 Fc变体，其中该Fc变体包含以下中的任一个或全部：L234(例如L234A)、L235(例如L235A)、和/或G237(例如G237A)突变(LALAGA)，其根据Eu编号系统进行编号；L234(例如L234A)、L235(例如L235A)、S267(例如S267K)、和/或P329(例如P329A)突变(LALASKPA)，其根据Eu编号系统进行编号；D265(例如D265A)、P329(例如P329A)、和/或S267(例如S267K)突变(DAPASK)，其根据Eu编号系统进行编号；G237(例如G237A)、D265(例如D265A)、和/或P329(例如P329A)突变(GADAPA)，其根据Eu编号系统进行编号；G237(例如G237A)、D265(例如D265A)、P329(例如P329A)、和/或S267(例如S267K)突变(GADAPASK)，其根据Eu编号系统进行编号；L234(例如L234A)、L235(例如L235A)、和/或P329(例如P329G)突变(LALAPG)，其根据Eu编号系统进行编号；或L234(例如L234A)、L235(例如L235A)、和/或P329(例如P329A)突变(LALAPA)，其中氨基酸残基根据Eu编号系统进行编号。

在一些实施例中，本文所述的多特异性结合蛋白的Fc区包含导致与Fc受体结合降低或ADCC、ADCP或CDC活性降低的突变，例如，Fc区包含：D265(例如D265A)、N297(例如N297A)、和P329(例如P329A)突变(DANAPA)，其根据Eu编号系统进行编号；L234(例如L234A)、L235(例如L235A)、和G237(G237A)突变(LALAGA)，其根据Eu编号系统进行编号；L234(L234A)、L235(例如L235A)、S267(例如S267K)、和P329(例如P329A)突变(LALASKPA)，其根据Eu编号系统进行编号；D265(例如D265A)、P329(例如P329A)、和S267(例如S267K)突变(DAPASK)，其根据Eu编号系统进行编号；G237(例如G237A)、D265(例如D265A)、和P329(P329A)突变(GADAPA)，其根据Eu编号系统进行编号；G237(例如G237A)、D265(例如D265A)、P329(例如P329A)、和S267(例如S267K)突变(GADAPASK)，其根据Eu编号系统进行编号；L234(例如L234A)、L235(例如L235A)、和P329(例如P329G)突变(LALAPG)，其根据Eu编号系统进行编号；或L234(例如L234A)、L235(例如L235A)、和P329(例如P329A)突变(LALAPA)，其根据Eu编号系统进行编号。

应理解，术语“LALA”、“DAPA”、“DANAPA”、“LALADANAPS”、“LALAGA”、“LALASKPA”、“DAPASK”、“GADAPA”、“GADAPASK”、“LALAPG”、和“LALAPA”代表本文所述不同取代组合的简写术语，而不是连续的氨基酸序列。

表34：示例性Fc修饰

介孔二氧化硅颗粒、病毒载体、和细胞活化剂的组合物

本文还描述了一种组合物，该组合物包含缓释剂，例如介孔二氧化硅颗粒的群体和病毒载体。本文还描述了一种组合物，所述组合物包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体。在一些实施例中，MSP(例如MSR)还包含多个吸附或共价键合在孔衬里和/或纳米通道衬里的表面上或表面的官能团。在一些实施例中，官能团是-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐。在一些实施例中，可以将官能团(即-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、二硫化物、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐)直接附接至MSP的表面。在一些实施例中，官能团经由C₁至C₂₀烷基接头共价键合至MSP(例如MSR)表面。在其他实施例中，官能团经由聚乙二醇接头共价键合至MSP表面。在特定的实施例中，聚乙二醇接头具有式(-O(CH2-CH₂-)_1-25。在特定的实施例中，表面修饰是C₁至C₂₀烷基全卤代烷基或C₁至C₂₀烷基全氟代烷基。

在一些实施例中，用伯胺、仲胺、叔胺或季胺对MSP(例如，MSR)进行表面修饰。在特定的实施例中，介孔二氧化硅棒用聚乙烯亚胺修饰。在特定的实施例中，聚乙烯亚胺是支链的或非支链的。在可替代实施例中，如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量，聚乙烯亚胺基团具有约1000至20,000道尔顿(Da)的平均分子量。在一些实施例中，如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量，聚乙烯亚胺基团具有约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da、或约10,000Da的平均分子量。

在一些实施例中，病毒载体缀合至介孔二氧化硅颗粒。在一些实施例中，将病毒载体静电地或共价地缀合至介孔二氧化硅颗粒。在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒和病毒载体之间的静电缀合是由于病毒载体和介孔二氧化硅颗粒表面电荷相反。例如但不受理论的束缚，通过聚乙烯亚胺或带正电荷的伯铵、仲铵、叔铵或季铵基团表面修饰的介孔二氧化硅颗粒可以与表面带负电荷的病毒载体缀合。因此，在一些实施例中，病毒载体带负电，而介孔二氧化硅颗粒带正电。在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒和病毒载体之间的共价缀合通过本领域技术人员已知的方法、通过接头或不通过接头来实现。例如但不限于，接头可以是聚乙二醇、烷基基团、聚合物、聚酰胺键等。

在一些方面，本文提供药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的介孔二氧化硅颗粒，其被配制用于制造免疫效应细胞例如T淋巴细胞的群体。在一些实施例中，用CAR转导T淋巴细胞。在一些实施例中，MSP与本文所述的病毒载体缀合。在一些实施例中，MSP与细胞活化剂缀合。在一些实施例中，细胞活化剂被吸附在MSP上。在一些实施例中，用于制造免疫效应细胞例如T淋巴细胞的群体的MSP可以如本文所述进行表面修饰。

在一些实施例中，组合物适合用作包含介孔二氧化硅颗粒、病毒载体、以及任选地细胞活化剂的可注射组合物，其中所述病毒载体包含表达载体，所述表达载体包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。在一些实施例中，病毒载体缀合至如本文所述的介孔二氧化硅颗粒。在一些实施例中，细胞活化剂被吸附在或缀合至如本文所述的介孔二氧化硅颗粒。对MSP(例如MSR)表面的吸附通常被理解为分子粘附于所述表面。

不希望受理论束缚，在一些实施例中，与缺乏MSP的其他类似组合物相比，MSP-病毒组合物(例如，包含MSP和病毒载体(例如编码CAR的病毒载体)的组合物)限制病毒载体向引流淋巴结的引流，减少潜在的部位外转导。

在本文所述的介孔二氧化硅颗粒的组合物中，MSP(例如MSR)可以以0.01μg/ml至1000μg/ml的浓度存在。在可替代实施例中，本文所述的组合物中的MSP或MSR的浓度可以是0.1μg/ml至500μg/ml、0.5μg/ml至100μg/ml、1μg/ml至90μg/ml、1μg/ml至80μg/ml、1μg/ml至70μg/ml、1μg/ml至60μg/ml、1μg/ml至50μg/ml或1μg/ml至40μg/ml。

在特定的实施例中，MSP(例如MSR)可以以下浓度存在：约1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml或150μg/ml。

一般而言，本文所述的组合物将经由本领域中已知的任何常用和可接受的方式，以如上所述的治疗有效量单独地或与一种或多种治疗剂组合施用。

可注射的组合物可以是水性等渗悬浮液。这些组合物可以是灭菌的和/或含有佐剂(如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂)。另外，它们还可以包含其他治疗有效物质。

本发明的药物组合物能以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的总量和频率将由如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重程度等因素来确定，然而适当的剂量可以通过临床试验来确定。

在一些实施例中，药物组合物基本上不含，例如不存在可检测水平的例如选自下组的污染物，该组由以下组成：内毒素、支原体、复制型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一些实施例中，细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、以及酿脓链球菌A组。

用于施加的药物组合物(或配制品)可以根据用于施用本文所述组合物的方法而以多种方式包装。一般来说，用于分配的物件包括药物配制品以适当形式在其内贮存的容器。适合的容器对于本领域的技术人员是熟知的并且包括材料如瓶(塑料和玻璃)、小袋、安瓿、塑料袋、金属圆筒及其类似物。容器还可以包括防干扰组件，以防止不小心接触到包装的内容物。另外，容器设有描述容器的内容物的标签。标签还可以包括适当的警示语。

在一些实施例中，本文所述的组合物进一步包括细胞活化剂。在一些实施例中，细胞活化剂是T细胞刺激化合物、针对CAR抗原结合结构域的抗独特型抗体、和/或肿瘤抗原。在一些实施例中，细胞活化剂缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体上。在另外的或可替代的实施例中，T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第二群体上。在进一步的实施例中，T细胞刺激化合物或肿瘤抗原是IL-2、IL-15、GM-CSF、抗CD2 mAb、抗CD3 mAb、抗CD28 mAb、新抗原肽、来自共享抗原(例如TRP2、gp100、肿瘤细胞裂解物、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、和/或MAGE A3 TCR)的肽。在一些实施例中，细胞活化剂包含CD3/TCR复合物和/或刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂，任选地，其中该细胞活化剂是包含刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂的多特异性结合分子

在细胞活化剂缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体的实施例中，T细胞刺激化合物或肿瘤抗原可以缀合至介孔二氧化硅颗粒的第二群体的表面上的脂质双层。在介孔二氧化硅颗粒上制备脂质双层的方法是已知的。参见例如国际申请公开号WO 2018/013797。简而言之，含有预定量的标记如生物素的脂质体用于包被MSP。然后可以使用互补标记例如链霉亲和素将标记用于附着至T细胞刺激化合物。用于制备脂质体的脂质是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于具有两个烃链(通常为酰基链)和极性头基的形成囊泡的脂质。此类脂质包括磷脂，例如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)，其中两个烃链长度通常是约14-22个碳原子，并且具有不同程度的不饱和度。在一些实施例中，脂质是相对不饱和的磷脂(在烃链中具有一个、两个或三个双键)。在一些实施例中，脂质是磷脂酰胆碱。磷脂酰胆碱是一种以胆碱为头基并组合甘油磷酸和两个脂肪酸的磷脂。在一些实施例中，磷脂酰胆碱是棕榈酰基磷脂酰胆碱或油酰基磷脂酰胆碱或1-棕榈酰基、2-油酰基-磷脂酰胆碱。在制备脂质体组合物中可以使用一种类型以上的脂质。脂质和比例的选择可以改变，以实现所需程度的流动性或刚性，和/或控制稳定性。在制备脂质体组合物中使用一种类型以上的脂质的情况下，应使用适量的相对不饱和的脂质(例如PC)以形成稳定的脂质体。在一些实施例中，在配制品中使用的脂质的至少45mol％-50mol％是PC。脂质体还可以包括用亲水性聚合物例如聚乙二醇(PEG)衍生的脂质。合适的亲水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺和亲水性肽序列。制备用亲水性聚合物衍生的脂质的方法是已知的(参见，例如，美国专利号5,395,619，其通过引用并入本文)。

在一些实施例中，介孔二氧化硅颗粒的第一群体或第二群体还包括细胞因子。细胞因子可以是但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、或转化生长因子β(TGF-β)或其激动剂，其模拟物，其变体，其功能片段或其组合。在特定的实施例中，细胞因子缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一或第二群体上。在实施例中，当细胞因子吸附到介孔二氧化硅颗粒的第二群体时，MSP(例如MSR)的第二群体可以进一步被脂质双层覆盖，如上所述。

方法

本文披露的方面涉及体内转导细胞的方法，该方法包括向受试者施用包含细胞募集因子的生物材料；缓释剂，例如介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；以及，任选地细胞活化剂。在一些实施例中，同时或顺序地施用这些组分。在一些实施例中，首先施用包含细胞募集因子的生物材料。在一些实施例中，同时地，并且任选地在生物材料之后，施用介孔二氧化硅棒的第一群体、病毒载体、以及任选地细胞活化剂。

本文披露的方面涉及体内转导细胞的方法，该方法包括向受试者施用生物材料和细胞募集因子；缓释剂，例如介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；以及，任选地细胞活化剂。在一些实施例中，同时或顺序地施用这些组分。在一些实施例中，首先施用生物材料和细胞募集因子。在一些实施例中，同时地，并且任选地在生物材料和细胞募集因子之后，施用介孔二氧化硅棒的第一群体、病毒载体、以及任选地细胞活化剂。

在一些实施例中，所述方法还包括：使T淋巴细胞与包含介孔二氧化硅颗粒(例如MSR)的第一群体、病毒载体、以及任选地细胞活化剂的组合物接触；其中所述病毒载体包含表达载体，所述表达载体包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。

在当前描述的方法的一些实施例中，所述方法导致群体中T淋巴细胞的比例增加。在一些实施例中，方法包括将病毒载体递送至受试者中所需的作用位点。

另一方面涉及治疗患有疾病、障碍或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用包含细胞募集因子的生物材料；缓释剂，例如介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；及，任选地细胞活化剂。在一些实施例中，同时或顺序地施用这些组分。在一些实施例中，首先施用包含细胞募集因子的生物材料。在一些实施例中，同时地，并且任选地在生物材料之后，施用介孔二氧化硅棒的第一群体、病毒载体、以及任选地细胞活化剂。

另一方面涉及治疗患有疾病、障碍或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用生物材料和细胞募集因子；缓释剂，例如介孔二氧化硅颗粒的第一群体；病毒载体；以及，任选地细胞活化剂。在一些实施例中，同时或顺序地施用这些组分。在一些实施例中，首先施用生物材料和细胞募集因子。在一些实施例中，同时地，并且任选地在生物材料和细胞募集因子之后，施用介孔二氧化硅棒的第一群体、病毒载体、以及任选地细胞活化剂。

在一些实施例中，受试者患有癌症。在一些实施例中，受试者患有表达选自下组的一种或多种肿瘤抗原的癌症，该组由以下组成：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、HPVE7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。

在一些实施例中，所述方法还包括：向受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物；其中所述病毒载体包含表达载体，所述表达载体包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至核苷酸序列的表达控制序列，所述核苷酸序列表达被工程改造以靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。

在一些实施例中，组合物还包含T细胞刺激化合物或肿瘤抗原，所述T细胞刺激化合物或肿瘤抗原缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一群体或介孔二氧化硅颗粒的第二群体或MSP(例如MSR)的两个群体上。可替代地，该方法包括将第二缓释剂，例如介孔二氧化硅颗粒的第二群体与MSP(例如，MSR)的第一群体的施用组合(例如，同时或之后不久)地施用。可替代地，可以在MSP的第一群体施用之后较长时间之后施用MSP(例如，MSR)的第二群体。

在一些实施例中，缓释剂包含MSP的第一群体，并且第二缓释剂包含MSP的第二群体。

在一些实施例中，方法包括施用细胞活化剂，其中该细胞活化剂缀合至或吸附到介孔二氧化硅颗粒的第一或第二群体上。

在一些实施例中，MSP(例如，MSR)的第二群体与MSP的第一群体同时向受试者施用(例如，在同一天施用)，或在MSP的第一群体施用之后不久向受试者施用(例如，施用之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、或7天施用)。在其他实施例中，在MSP的第一群体施用之后较长时间(例如，例如，至少2周、3周、4周、6周、8周、10周、或更长)之后，向受试者施用细胞因子。

在前述方法或用途中的任一种的一些实施例中，与肿瘤抗原(例如，本文描述的肿瘤抗原)相关的疾病、障碍或病症选自增生性疾病如癌症或恶性肿瘤，或癌前病症如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期，或是与本文描述的肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症。在一些实施例中，疾病是本文描述的癌症，例如本文描述为与本文描述的靶标相关的癌症。在一些实施例中，疾病是血液癌症。在一些实施例中，血液癌症是白血病。在一些实施例中，该癌症选自下组，该组由以下组成：一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；另外的血液癌症或血液病症包括但不限于B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、华氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症、和为由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)联合在一起的各种血液病症集合的“白血病前期”，并且与本文描述的肿瘤抗原的表达相关的疾病包括但不限于表达如本文描述的肿瘤抗原的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增生性疾病；以及它们的任何组合。在另一个实施例中，与本文描述的肿瘤抗原相关的疾病是实体瘤。

在实施例中，所述癌症选自下组，该组由以下组成：结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症、所述癌症的组合、以及所述癌症的转移性病灶。

在一些实施例中，可以用本发明的表达CAR的细胞治疗的癌症是多发性骨髓瘤。通常，通过流式细胞术，骨髓瘤细胞被认为对于如本文描述的癌症相关抗原表达是阴性的。因此，在一些实施例中，例如如本文描述的CD19 CAR可以用于靶向骨髓瘤细胞。在一些实施例中，本发明的car疗法可以与一种或多种另外的疗法(例如来那度胺治疗)组合使用。

在各个方面，在向患者施用T细胞或NK细胞后，通过本文所述的方法产生并施用于患者的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)或其后代在患者中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年、或五年。

本发明还包括一种类型的细胞疗法，其中例如通过体外或体内转录的RNA修饰免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)。所得细胞能够杀死受试者或患者中的肿瘤细胞。因此，在各个方面，在施用如本文所述的组合物之后，免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)存在少于一个月，例如，三周、两周、一周。

不希望受任何特定理论的束缚，由CAR修饰的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答，或者可替代地可以是由于直接与间接免疫应答。在一些方面，CAR转导的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)表现出响应于表达如本文描述的癌症相关抗原的人癌细胞的特异性促炎性细胞因子分泌和有效细胞溶解活性，抵抗可溶性如本文描述的癌症相关抗原抑制，介导旁观者(bystander)杀伤并介导已确立的人肿瘤的消退。例如，表达如本文描述的癌症相关抗原的肿瘤的异质区域内的无抗原肿瘤细胞可能易受先前已经针对邻近的抗原阳性癌细胞反应的如本文描述的癌症相关抗原重定向的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的间接破坏。

在一些方面，本发明的完全人CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)可以是用于哺乳动物的离体免疫和/或体内疗法的一类疫苗。在一些方面，哺乳动物是人。

在一些方面，本发明的表达CAR的细胞可用于治疗增生性疾病，如癌症或恶性肿瘤、或是癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)。与如本文描述的癌症相关抗原表达相关的其他疾病包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或表达如本文描述的癌症相关抗原的增生性疾病。与如本文描述的癌症相关抗原的表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮)、炎性病症(过敏症和哮喘)和移植。

在一些方面，本发明的表达CAR的细胞可用于治疗自身免疫性疾病、炎性疾病、或移植。示例性自身免疫性疾病包括但不限于艾迪生病(Addison’s disease)、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、轴突和神经元神经病变(Axonal&neuronalneuropathy，AMAN)、白塞氏病(Behcet’s disease)、大疱性类天疱疮、卡斯尔曼病(CD)、乳糜泻、恰加斯病(Chagas disease)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多发性骨髓炎(CRMO)、变应性肉芽肿、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、科干综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨基病毒性心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST综合征、克罗恩病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(Devic’s disease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、杜丝勒综合征(Dressler’s syndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸细胞性食管炎(EoE)、嗜酸细胞性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合型冷球蛋白血症、埃文斯综合征、纤维肌痛、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎(Glomerulonephritis)、肺出血-肾炎综合征、伴有多血管炎的肉芽肿病、格雷夫斯病、格巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜(HSP)、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(PG)、低血球蛋白血症(hypogammalglobulinemia)、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、幼年型关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎(JM)、川崎病(Kawasaki disease)、兰伯特综合征、白细胞碎屑性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木质性结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮、慢性莱姆病、梅尼埃病、显微镜下多血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、蚕蚀性角膜溃疡、哈二氏病、多发性硬化症(MS)、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、回文性风湿病(PR)、PANDAS(链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神疾病)、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、帕里伯格综合症、睫状体扁平部炎(外周葡萄膜炎)、Parsonnage-Turner综合征、天疱疮、周围神经病变、周围性脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征(多发性神经病、器官肿大、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、皮肤改变)、结节性多动脉炎、风湿性多肌通、多发性肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、黄体酮皮炎、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺现象、反应性关节炎、反射交感性营养不良、莱特尔氏综合征、复发性多软骨炎、多动腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎(RA)、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、精子和睾丸自身免疫病、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征(Susac’s syndrome)、交感性眼炎(SO)、发性大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、痛性眼肌麻痹综合征(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、或韦格纳氏肉芽肿病(伴有多血管炎的肉芽肿病(GPA))。在一些实施例中，CAR结合B细胞抗原，例如CD19、CD20、CD22、CD123、FcRn5、FcRn2、BCMA、CS-1和CD138。

本发明的CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)可以单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分(如IL-2或其他细胞因子或细胞群体)组合施用。

血液癌症

血液癌症病症是癌症的类型，如白血病、淋巴瘤以及影响血液、骨髓和淋巴系统的恶性淋巴组织增生性病症。

白血病可以分类为急性白血病和慢性白血病。急性白血病可以进一步分类为急性髓细胞性白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性髓细胞性白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。其他相关病症包括骨髓增生异常综合征(MDS，以前称为“白血病前期”)，其是由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)和转化为AML的风险联合的血液病症的多样化集合。淋巴瘤是一组从淋巴细胞发展的血细胞肿瘤。示例性淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。

本发明还提供了抑制增生或减少如本文所述的癌症相关抗原的方法，所述方法包括使包含如本文所述的癌症相关抗原的细胞群体与包含介孔二氧化硅颗粒和病毒载体的组合物接触。在特定方面，如本文所述对MSP进行表面修饰。在其他实施例中，所述病毒载体包含表达载体，所述表达载体包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。示例性核苷酸序列表达嵌合抗原受体(CAR)、工程改造的TCR、细胞因子、趋化因子、用于阻断抑制性分子的shRNA、或用于诱导蛋白质表达的mRNA。在一些方面，在患有骨髓性白血病或与表达如本文描述的癌症相关抗原的细胞相关的另一种癌症的受试者中、或骨髓性白血病或与表达如本文描述的癌症相关抗原的细胞相关的另一种癌症的动物模型中，相对于阴性对照，本发明的表达CAR的T细胞或NK细胞使细胞和/或癌细胞的数量(quantity)、数目(number)、量(amount)或百分比减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％、或至少99％。在一些方面，受试者是人。

组合疗法

如本文所用，“组合”施用意指在受试者患病期间将两种(或更多种)不同的治疗递送至受试者，例如在受试者被诊断患有病症后并且在所述病症被治愈或清除前或者在由于其他原因终止治疗前递送两种或多种治疗。在一些实施例中，第一治疗的递送在第二治疗的递送开始时仍在进行，所以就施用而言存在重叠。这在本文中有时被称为“同时递送”或“并行递送”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。在每一种情况的一些实施例中，治疗因组合施用而更有效。例如，第二治疗更有效，例如，与第一治疗不存在的情况下施用第二治疗所观察到的结果相比，使用较少的第二治疗观察到等效的作用，或者第二治疗使症状减少更大的程度，或对第一治疗观察到类似的情况。在一些实施例中，与一种治疗不存在的情况下递送另一种治疗所观察到的结果相比，递送使得症状或与所述障碍相关的有他参数减少更多。两种治疗的作用可以部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可以使得当递送第二治疗时，递送的第一治疗的作用仍然是可检测的。

在一些实施例中，这些方法或用途与增加免疫效应细胞的功效的药剂(例如，如本文描述的药剂)组合进行。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，介孔二氧化硅棒组合物与增加免疫效应细胞的功效的药剂，例如蛋白磷酸酶抑制剂、激酶抑制剂、细胞因子、免疫抑制性分子的抑制剂；或降低T_REG细胞的水平或活性的药剂中的一个或多个组合施用。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，蛋白磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂和/或SHP-2抑制剂。

在本文描述的方法或用途的其他实施例中，激酶抑制剂选自以下中的一种或多种：CDK4抑制剂、CDK4/6抑制剂(例如，帕博西尼)、BTK抑制剂(例如，依鲁替尼或RN-486)、mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素或依维莫司(RAD001))、MNK抑制剂或双重P13K/mTOR抑制剂。在一些实施例中，BTK抑制剂不会降低或抑制白细胞介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性。

在本文描述的方法或用途的其他实施例中，抑制免疫抑制性分子的药剂包括抗体或抗体片段、抑制性核酸、聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或对抑制性分子的表达进行抑制的锌指核酸内切酶(ZFN)。

在本文描述的方法或用途的其他实施例中，降低TREG细胞的水平或活性的药剂选自环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减或它们的组合。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，免疫抑制性分子选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ、CEACAM-1、CEACAM-3和CEACAM-5。

在其他实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含含有抑制性分子的第一多肽或其片段以及向细胞提供阳性信号的第二多肽，并且其中所述第一多肽和第二多肽在含有CAR的免疫细胞上表达，其中(i)所述第一多肽包含PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ、CEACAM-1、CEACAM-3、以及CEACAM-5或其片段；和/或(ii)所述第二多肽包含细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，初级信号传导结构域包含CD3ζ的功能性结构域；和/或共刺激信号传导结构域包含选自41BB、CD27和CD28的蛋白质的功能性结构域。在其他实施例中，细胞因子选自IL-7、IL-15或IL-21、或其组合。

在其他实施例中，包含CAR分子的免疫效应细胞和第二，例如本文披露的任何组合疗法(例如，增加免疫效应细胞的功效的药剂)基本上同时或顺序地施用。

在其他实施例中，包含CAR分子的免疫细胞与靶向GITR和/或调节GITR功能的分子组合施用。在一些实施例中，靶向GITR和/或调节GITR功能的分子在表达CAR的细胞或细胞群体之前或在单采血液成分术之前施用。

在一些实施例中，淋巴细胞输注(例如同种异体淋巴细胞输注)用于治疗癌症，其中淋巴细胞输注包含至少一种本发明的表达CAR的细胞。在一些实施例中，自体淋巴细胞输注用于治疗癌症，其中自体淋巴细胞输注包含至少一种本文描述的表达CAR的细胞。

在一些实施例中，细胞是T细胞，并且所述T细胞是甘油二酯激酶(DGK)缺陷的。在一些实施例中，细胞是T细胞，并且所述T细胞是Ikaros缺陷的。在一些实施例中，细胞是T细胞，并且所述T细胞是DGK和Ikaros两者缺陷的。

在前述方法或用途中的任一种的实施例中，可以进一步施用治疗与肿瘤抗原表达相关的疾病的药剂，例如本文披露的第二种或第三疗法中的任何一种。另外的示例性组合包括以下中的一种或多种。

在另一个实施例中，可以进一步施用另一种药剂，例如本文所述的激酶抑制剂和/或检查点抑制剂。例如，可以进一步施用增强表达CAR的细胞的活性的药剂。

例如，在一些实施例中，增强表达CAR的细胞的活性的药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂(例如，免疫抑制剂分子)。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。

在一些实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂是抑制性核酸，是dsRNA、siRNA或shRNA。在实施例中，所述抑制性核酸与编码CAR分子的组分的核酸连接。例如，抑制性分子可以在表达CAR的细胞上表达。

在另一个实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂例如是本文描述的分子，例如包含第一多肽(例如，抑制性分子)的药剂，所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文描述的细胞内信号传导结构域)缔合。在一些实施例中，药剂包含例如抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ、或这些中的任一者的片段(例如，这些中的任一者的细胞外结构域的至少一部分))的第一多肽，和第二多肽，该第二多肽是本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文描述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文描述的CD3ζ信号传导结构域)。在一些实施例中，所述药剂包含PD1或其片段(例如PD1的细胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，和本文描述的细胞内信号传导结构域(例如本文描述的CD28信号传导结构域和/或本文描述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。

在一些实施例中，将本发明的表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用至已接受先前干细胞移植(例如自体干细胞移植)的受试者。

在一些实施例中，将本发明的表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用至已接受先前剂量的美法仑的受试者。

在一些实施例中，将表达CAR分子(例如，本文描述的CAR分子)的细胞与增加表达CAR分子的细胞的功效的药剂(例如本文描述的药剂)组合施用。

在一些实施例中，表达CAR分子(例如，本文描述的CAR分子)的细胞与改善与表达CAR分子的细胞的施用相关的一种或多种副作用的药剂(例如，本文描述的药剂)组合施用。

在一些实施例中，表达CAR分子(例如，本文描述的CAR分子)的细胞与治疗与如本文描述的癌症相关抗原相关的疾病的药剂(例如，本文描述的药剂)组合施用。

在一些实施例中，将表达两种或更多种CAR分子(例如，如本文描述)的细胞施用至有需要的受试者以治疗癌症。在一些实施例中，将包含表达CAR的细胞的细胞群体(例如，如本文描述)施用至有需要的受试者以治疗癌症。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，所述CAR分子与另一种药剂组合施用。在一些实施例中，所述药剂可以是激酶抑制剂，例如CDK4/6抑制剂、BTK抑制剂、mTOR抑制剂、MNK抑制剂或双重PI3K/mTOR激酶抑制剂、以及它们的组合。在一些实施例中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如本文所述的CDK4抑制剂，例如CD4/6抑制剂，如6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称为帕博西尼(palbociclib)或PD0332991)。在一些实施例中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如本文描述的BTK抑制剂，例如像依鲁替尼。在一些实施例中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如本文描述的mTOR抑制剂，例如像雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。所述mTOR抑制剂可以是例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如本文描述的mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一些实施例中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，例如本文描述的MNK抑制剂，例如像4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。所述MNK抑制剂可以是例如MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。所述双重PI3K/mTOR抑制剂可以是例如PF-04695102。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，激酶抑制剂是选自以下的CDK4抑制剂：aloisine A；flavopiridol或HMR-1275，2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S，4R)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]-4-色满酮；克唑替尼(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-[(2R，3S)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮，盐酸(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；英迪舒兰(E7070)；roscovitine(CYC202)；帕博西尼(PD0332991)；地那西利(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基噁唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2，6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5，4-d][2]苯并氮杂-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)-1H-吡唑-3-甲酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；和XL281(BMS908662)。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如帕博西尼(PD0332991)，并且将帕博西尼以每天约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如75mg、100mg或125mg)的剂量施用持续一段时间，例如每天施用28天周期的14-21天、或每天施用21天周期的7-12天。在一些实施例中，施用帕博西尼的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，激酶抑制剂是选自以下的BTK抑制剂：依鲁替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在一些实施例中，BTK抑制剂不会降低或抑制白细胞介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性，并且选自GDC-0834、RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，激酶抑制剂是BTK抑制剂(例如，依鲁替尼(PCI-32765))，并且将依鲁替尼以每天约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)的剂量施用持续一段时间，例如每天施用持续21天周期，或每天施用持续28天周期。在一些实施例中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依鲁替尼。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，激酶抑制剂是不会抑制ITK(例如RN-486)的激酶活性的BTK抑制剂，并且将RN-486以每天约100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg(例如，150mg、200mg或250mg)的剂量施用一段时间，例如28天周期。在一些实施例中，施用RN-486的1、2、3、4、5、6、7或更多个周期。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，激酶抑制剂是选自以下的mTOR抑制剂：替西罗莫司；地磷莫司(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.0^4,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；塞马莫德(simapimod)；(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N²-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-(SEQ ID NO:692)内盐(SF1126)；和XL765。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如雷帕霉素，并且将雷帕霉素以每天约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如6mg)的剂量施用持续一段时间，例如每天施用持续21天周期、或每天施用持续28天周期。在一些实施例中，施用雷帕霉素的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。在一些实施例中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如依维莫司，并且将依维莫司以每天约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如10mg)的剂量施用持续一段时间，例如每天施用持续28天周期。在一些实施例中，施用依维莫司的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，激酶抑制剂是选自以下的MNK抑制剂：CGP052088；4-氨基-3-(对氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢素酰胺(cercosporamide)；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，激酶抑制剂是双重磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR抑制剂，其选自2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]尿素(PF-05212384，PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；阿托利司(GDC-0980，RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲基氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-(3H)-马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3'，2':4，5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(XL765)。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，可以进一步施用蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂，例如本文描述的蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂。在一些实施例中，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂，例如本文描述的SHP-1抑制剂，例如像葡萄糖酸锑钠。在一些实施例中，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-2抑制剂。

在本文描述的方法或用途的一些实施例中，可以进一步施用另一种药剂，并且所述药剂是细胞因子。所述细胞因子可以是例如IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合。在另一个实施例中，将CAR分子与检查点抑制剂(例如本文描述的检查点抑制剂)组合施用。例如，在一些实施例中，检查点抑制剂抑制选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ的抑制性分子。

在本文描述的方法或用途的其他实施例中，可以进一步施用改善与表达CAR分子的细胞相关的一种或多种副作用的药剂。与表达CAR的细胞相关的副作用可以选自细胞因子释放综合征(CRS)或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)。

本发明还提供了预防、治疗和/或管理与表达本文所述的癌症相关抗原的细胞相关的疾病(例如，表达如本文所述的癌症相关抗原的血液癌症或非典型癌症)的方法，该方法包括向受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物，且其中所述病毒载体包含表达载体，所述表达载体包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至核苷酸序列的表达控制序列，所述核苷酸序列表达被工程改造以靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，受试者是人。与表达如本文描述的癌症相关抗原的细胞相关的病症的非限制性实例包括自身免疫性病症(如狼疮)、炎性病症(如过敏症和哮喘)和癌症(如表达如本文描述的癌症相关抗原的血液癌症或非典型癌症)。

本发明还提供了预防、治疗和/或管理与表达本文所述的癌症相关抗原的细胞相关的疾病的方法，这些方法包括向受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物，且其中所述病毒载体包含表达载体，所述表达载体包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至核苷酸序列的表达控制序列，所述核苷酸序列表达被工程改造以靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，受试者是人。

本发明提供了预防与表达本文所述的癌症相关抗原的细胞相关的癌症复发的方法，这些方法包括向受试者施用包含介孔二氧化硅颗粒的第一群体和病毒载体的组合物，且其中所述病毒载体包含表达载体，所述表达载体包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至核苷酸序列的表达控制序列，所述核苷酸序列表达被工程改造以靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。

当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待施用的本发明组合物的精确量。

在一些方面，可能希望向受试者施用活化的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并且然后随后重抽血液(或进行单采血液成分术)，根据本发明活化并且扩增免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并用这些活化和扩增的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)回输患者。所述过程可以每隔几周进行多次。在一些方面，可以将来自从10cc至400cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)活化。在一些方面，将来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)活化。

能以任何常规方式施用主题组合物，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。可以向患者经动脉、皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或者腹膜内施用本文描述的组合物。在一些方面，通过真皮内或皮下注射向患者施用本发明的MSP(例如MSR)组合物。在一些方面，本发明的T细胞组合物肠胃外施用。术语“肠胃外”施用T细胞组合物包括例如鞘内、硬膜外、颅内，皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。在特定实施例中，T细胞组合物静脉内施用。在一些实施例中，MSP(例如MSR)和病毒载体的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。

实例

实例A.介孔二氧化硅颗粒的合成和后官能化

除非另有说明，否则所有试剂均从商业来源获得并按原样使用。

1.介孔二氧化硅颗粒的示例性合成

将聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)平均Mn约5,800(普朗尼克P-123，80.0g，487mmol；西格玛公司(Sigma))表面活性剂在室温下溶解于3L 1.6M HCl中，在5L带夹套的烧瓶中加热至40摄氏度，并通过顶置式搅拌器以0-600rpm(但最通常地为300rpm)的速率机械搅拌。原硅酸四乙酯(TEOS，184mL，826mmol；西格玛公司)在<5分钟内以一个部分添加，并在40摄氏度下加热并保持搅拌至少2小时，但最通常地为20小时。将得到的浆料加热至80-130摄氏度(最通常地为100摄氏度)6-72小时(但最通常地为24小时)以进行水热处理，之后冷却至室温。将浆料在布氏漏斗中过滤，先后用去离子水和乙醇洗涤，并在室温下风干。将得到的二氧化硅材料在炉中煅烧，其中在8小时内从室温缓慢升温至550摄氏度，然后在550摄氏度下再保持8个小时，然后冷却至室温，以得到47g介孔二氧化硅颗粒。

搅拌速率的变化可以使微颗粒的纵横比变化。改变水热温度和持续时间的条件是介孔材料常用的孔径控制。有关更多信息，请参见J.Chem.Educ.[化学教育杂志]2017,94,91-94及其内的参考文献。

通过光学显微镜、Malvern Morphologi G3、扫描电子显微镜(SEM)、热重分析(TGA)对最终的介孔材料进行表征。

2.二氧化硅微颗粒的后修饰

实例2(a)：乙基膦酸二乙酯官能化的微颗粒

乙基膦酸二乙酯官能化的二氧化硅微颗粒通过在New J.Chem[新化学杂志].,2014，38,3853中报道的改进的方法制备，其中进行了一些修改。将二乙基磷酸乙基三乙氧基硅烷(4.15mL，13.03mmol)添加到悬浮在300mL甲苯中的2.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中。将浆料搅拌并在110摄氏度下回流14小时，然后冷却至室温并过滤。将所述颗粒先后用去离子水和乙醇洗涤，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时，以得到乙基膦酸二乙酯官能化的颗粒。

实例2(b)：乙基膦酸官能化的微颗粒

乙基膦酸官能化的微颗粒是通过对New J.Chem[新化学杂志].,2014,38,3853中报道的程序改进的方法制备的。将三甲基甲硅烷基氯硅烷(1.388mL，10.86mmol)添加到悬浮在150mL甲苯中的2.0g乙基膦酸二乙酯官能化的微颗粒的浆料中，并加热至110摄氏度持续24小时。将浆料冷却至室温并过滤，用去离子水和乙醇洗涤，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时。然后将介孔二氧化硅颗粒悬浮在100mL的12MHCl中，并加热至100摄氏度持续18小时。将浆料冷却至室温，过滤并用去离子水和乙醇洗涤，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时，以得到乙基膦酸官能化的微颗粒。

实例2(c)：丙胺官能化的微颗粒

丙胺官能化的微颗粒是通过对Langmuir 2015,31,6457-6462中报道的程序改进的方法制备的。将(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(3.05ml，19.54mmol；APTMS，西格玛公司)添加到在150mL试剂级乙醇中的3.0克介孔二氧化硅微颗粒的浆料中。将浆料在75摄氏度下回流7小时。冷却至室温后，过滤浆料，先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时。

实例2(d)：生物素官能化的微颗粒

将(+)-生物素N-琥珀酰亚胺酯(246mg，0.720mmol)添加到在10.0mL PBS缓冲液(调节至pH 7.4)中的1.0g丙胺官能化的微颗粒的浆料中，并在室温下搅拌18小时。将浆料过滤并用去离子水和乙醇洗涤，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时，以得到生物素官能化的微颗粒。

实例2(e)：生物素-PEG4官能化的微颗粒

将PEG4-生物素N-羟基琥珀酰亚胺(106mg，0.180mmol；赛默飞世尔公司(ThermoFischer)EZ-连接(EZ-Link)NHS-PEG4-生物素)添加到在2.5mL PBS缓冲液(调节至pH 7.4)中的0.25g丙胺官能化的微颗粒的浆料中，并在室温下搅拌18小时。将浆料过滤并用去离子水和乙醇洗涤，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时，以得到生物素-PEG4官能化的微颗粒。

实例2(f)：3(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)己酸酯官能化的微颗粒

将琥珀酰亚胺基6-(3(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)己酸酯(112mg，0.360mmol；LC-SPDP，赛默飞世尔公司)添加到在2.5mL PBS缓冲液(调节至pH 7.4)中的0.50g丙胺官能化的微颗粒的浆料中，并在室温下搅拌18小时。将浆料过滤并用去离子水和乙醇洗涤，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时，以得到3(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)己酸酯官能化的微颗粒。

实例2(g)：4-氧代-4-(丙基氨基)丁酸官能化的微颗粒

将琥珀酸酐(4g，40.0mmol)添加到在无水DMF中的1.0g丙胺官能化的微颗粒的浆料中，并在室温下搅拌24小时。将所述浆料过滤并用去离子水和乙醇洗涤，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时，以得到4-氧代-4-(丙基氨基)丁酸官能化的微颗粒。

实例2(h)：丙基二亚乙基三胺官能化的微颗粒

将三甲氧基甲硅烷基丙基二亚乙基三胺(1.678mL，6.51mmol)添加到悬浮在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒中。将浆料在75摄氏度下搅拌7小时。冷却至室温后，过滤浆料，先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时以得到丙基二亚乙基三胺官能化的颗粒。

实例2(i)：3-丙基二氢呋喃-2,5-二酮官能化的微颗粒(琥珀酸酐)

将3-(3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基)二氢呋喃-2,5-二酮(4.94mL，17.37mmol)添加到在300mL甲苯中的3.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中。将浆料加热至110摄氏度20小时，然后冷却至室温，过滤并用去离子水和乙醇洗涤。将官能化的微颗粒在烘箱中在100摄氏度下干燥24小时。

实例2(j)：支链聚乙烯亚胺官能化的微颗粒

将聚乙烯亚胺(25.1g，47.0mmol；支链的，平均Mw约25,000，西格玛公司)溶于600mL无水DMF中，然后添加6.0g 3-丙基二氢呋喃-2,5-二酮官能化的微颗粒，并在室温下搅拌20小时。将浆料过滤，并先后用去离子水和乙醇洗涤所述颗粒，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时，以得到支链的聚乙烯亚胺官能化的微颗粒。

实例2(k)：N,N,N-三甲基丙-1-铵官能化的微颗粒

将三甲氧基甲硅烷基丙基三甲基氯化铵(3.61mL，6.51mmol；在甲醇中的50％溶液)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中，并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后，过滤浆料，先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时，以得到N,N,N-三甲基丙-1-铵官能化的微颗粒。

以三甲氧基甲硅烷基丙基三甲基氯化铵与二氧化硅微颗粒的不同比例(0.25mmol三甲氧基甲硅烷基三甲基氯化铵/克微颗粒)重复上述步骤，以实现改变功能密度的比例。

实例2(l)：辛基官能化的微颗粒

将三乙氧基(辛基)硅烷(2.05mL，6.51mmol)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中，并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后，过滤浆料，先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时，以得到辛基官能化的微颗粒。

实例2(m)：十六烷基官能化的微颗粒

将十六烷基三甲氧基硅烷(2.54mL，6.51mmol)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中，并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后，过滤浆料，先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时，以得到十六烷基官能化的微颗粒。

实例2(n)：11-叠氮基十一烷基官能化的微颗粒

将(11-叠氮基十一烷基)三甲氧基硅烷(1.0g，3.15mmol)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中，并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后，过滤浆料，先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时，以得到11-叠氮基十一烷基官能化的微颗粒。

实例2(o)：3-叠氮基丙基官能化的微颗粒

将(3-叠氮基丙基)三甲氧基硅烷(1.0g，4.87mmol)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中，并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后，过滤浆料，先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时，以得到3-叠氮基丙基官能化的颗粒。

实例2(p)：3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三烷氟辛基官能化的微颗粒

将三乙氧基(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三烷氟辛基)硅烷(2.499mL，6.51mmol)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中，并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后，过滤浆料，先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时，以得到3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三烷氟辛基官能化的微颗粒。

实例B.针对病毒结合来测试MSR表面修饰

为了测试慢病毒与MSP的结合，制备了多种具有不同表面化学性质的MSP(图1)。将干燥的MSR批次以10mg/ml重悬于冰冷的pH 7.5的Tris-NaCl-EDTA缓冲液(NTE缓冲液)中。将表达绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒(FCT067，Kerafast公司)的储备液在冰冷的NTE缓冲液中稀释至3x 10⁶/ml的效价。将MSR悬浮液和稀释的病毒以1:1体积/体积的比例混合，并在冰上孵育30分钟。将对照颗粒与不含病毒的NTE缓冲液以1:1体积/体积孵育。孵育后，在4℃下用含1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，然后在4℃下用PBS洗涤一次。然后将样品用PBS中的4.2％多聚甲醛固定。样品用抗病毒包膜的抗体(来自Kerafast公司的抗VSV-G，8G5F11；1:50稀释)染色，然后用Dylight-488标记的抗小鼠IgG(英杰公司(Invitrogen))染色。样品用PBS洗涤两次，并使用配备有GFP LED灯箱的Evos荧光显微镜成像(图2)。成像显示染色剂与未携带病毒的MSR没有可检测的结合。缀合病毒的棒显示不同水平的定量结合，其中三甲基铵和胺官能团显示最大结合。

实例C.使用MSR对GFP慢病毒转导T细胞的体外测定

MSR用于T细胞病毒转导的示意图如图3所示。用Dynabead T细胞活化剂珠以3:1的珠:细胞比例刺激原初人T细胞两天。使用磁铁去除珠子，并将细胞转移到新鲜的培养基中。如上所述制备病毒缀合的MSR，并以80μg/ml重悬于细胞培养基中。如图3所示对其进行系列稀释。将所述悬浮液与T细胞5x 10⁵/ml以1:1合并，并孵育4天。在培养物中的活单线态细胞中评估GFP表达，以评估转导效率。结果(图4)表明与仅在培养基中给予的病毒相比，缀合MSR的病毒的转导发生的水平更高。三甲基铵官能化的MSR提供了最高水平的转导。

实例D.T细胞与呈递CD3/CD28激动性抗体、EGFRvIII肽或BCMA蛋白的MSR的相互作用；

如Cheung,A.S.,等人中所述制备具有固定在表面的配体的MSR，模拟抗原呈递细胞的支架使原代T细胞能够离体扩增。Nature Biotechnology[自然生物技术],36(2),160–169。所述方法的方案示于图5中。

简而言之，使用薄膜再水化方法并通过100nm聚碳酸酯膜挤出形成主要由具有1mol％PE-生物素的POPC构成的脂质体。将羟基官能化的MSR与所述脂质体一起孵育，以允许在MSR表面上形成支撑的脂质双层(图6)。为了用CD3和CD28激动性抗体官能化MSR，用PBS洗涤MSR数次，与链霉亲和素孵育，然后与生物素化的CD3和CD28抗体拴系在一起。对于EGFRvIII CAR结合肽的MSR固定化，使用生物素化的EGFRvIII CAR结合肽(图7)。对于BCMACART刺激，使用生物素-NHS对重组BCMAFc蛋白进行生物素化，并类似地偶联至MSR表面。

与所需的配体一起孵育后，MSR用PBS洗涤数次，并以各种浓度重悬于培养基中，并与T细胞孵育。使用CFSE标记T细胞并通过流式细胞术评估染料稀释度来读出T细胞增殖。使用多重细胞因子分析方法(Mesoscale Delivery V-Plex)评估细胞因子的产生。

EGFRvIII CART响应结合在MSR表面的EGFRvIII CAR结合肽而产生干扰素γ和IL-2，而溶液中的游离EGFRvIII CAR结合肽(MSR上呈递的非刺激性肽(OVA))，或未修饰的MSR没有给出来自CART的响应(图8)。在另一个实验中，使用细胞计数来监测EGFRvIII CART响应于各种刺激的增殖(图9)。

为了进一步分析不同T细胞亚群的表型扩增，使用流式细胞术评估EGFRvIII CART的增殖。将CART用CFSE染色并通过流式细胞术监测染料稀释度以指示增殖(图10)。使用用MSR表面上呈递的BCMAFc蛋白抗原官能化的MSR进行类似的实验(图11)。

为了测试使用两种MSR(带有刺激性诱因的MSR和与慢病毒混合的MSR)同时用病毒刺激和转导T细胞，使用图12所示的实验方案。如上所述，将MSR的一个群体用脂质双层包被并接枝抗CD3/CD28抗体。用慢病毒孵育MSR的第二群体。图13所示的结果表明，与溶液中的游离病毒相比，当用抗CD3/CD28激动性抗体刺激T细胞并暴露于用PEI-MSR孵育的病毒时，转导水平更高。

为了测试在MSR的相同群体上两种诱因对T细胞的同时刺激和转导，T细胞暴露于(1)带有抗CD3/CD28激动性抗体的、脂质包被的刺激性MSR，和培养基中的病毒，(2)带有抗CD3/CD28激动性抗体的、脂质包被的刺激性MSR，和预先与病毒孵育的PEI-MSR，或(3)吸附有抗CD3/CD28激动剂抗体的PEI MSRS，然后与病毒孵育。培养三天后，评估T细胞的转导效率。图14显示在各种病毒量下，刺激性MSR浓度对条件(1)和(2)的MSR的影响。如图14所示，在PEI-MSR与病毒孵育的条件(2)下，总体转导得到增强。

图15比较了所有三个条件，其中条件(1)和(2)处于刺激性MSR的最高浓度。如图15所示，刺激性诱因与PEI-MSR结合的条件(3)产生最高的相对转导效率。相同的配制品用于研究人外周血单核细胞(PBMC)的MSR介导的转导。在图16中，显示对于条件(1)和(2)在最高刺激水平处的作为病毒浓度成函数的不同细胞群体的转导。图17显示对于条件(1)和(2)在最高刺激水平收集的在总GFP+转导的细胞级分中以及在总细胞群体中每个细胞群体的比例。

实例E.MSR诱导的T细胞转导的体内研究。

与病毒载体缀合的介孔二氧化硅颗粒的组合物被注射到小鼠的皮肤下。大约5-7天后，在所述位点注射吸附有编码抗小鼠CD19 CAR的病毒的MSR。小鼠血液中CD19+B细胞的耗减将被监测，以指示已产生的抗CD19 CART。在血液和骨髓中证实了这些CART的存在。使用原位杂交技术对CAR转基因进行所述注射位点以及引流淋巴结、脾脏和肝脏的详细组织学评估，以评估病毒向不希望的位点的漏出。

实例F.药物装载到介孔二氧化硅微颗粒上

可以将多种药物装载到介孔二氧化硅微颗粒上。

1.实例1：将TLR7激动剂装载到介孔二氧化硅微颗粒上。

将在氯仿中的咪喹莫特溶液添加到在2.0mL氯仿中的100mg二氧化硅微颗粒的浆料中(浓度为100μg-500μg咪喹莫特/10mg介孔二氧化硅颗粒)，并在40摄氏度下以500rpm振荡72小时。将MSP以1000rpm离心3分钟，然后除去剩余的溶液。将MSP用2.0mL氯仿洗涤，然后离心并除去上清液。用乙醇重复洗涤步骤，以去除过量和未吸收的咪喹莫特。将最终的微颗粒在水中制成浆液并冻干。

2.实例2：介孔二氧化硅颗粒的体外药物释放。

将10.0mg(或相当的300μg的装载药物的材料)的装载药物的MSP悬浮于1.0mL的pH7.4(0.0067M)的磷酸盐缓冲液中，并置于37摄氏度下。在1h、3h、6h、24h、2天和5天收集样品；通过UPLC对这些样品进行分析，并绘制成标准分析曲线。在每个时间点都将上清液去除并替换为新鲜的缓冲液。

前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践本发明。本发明的范围不受所保藏的构建体的限制，因为所保藏的实施例仅意图说明本发明的某些方面，并且任何功能等效的构建体都在本发明的范围之内。本文中材料的保藏并不构成承认本文所包含的书面描述不足以实现本发明的任何方面(包括其最佳模式)的实践，也不应被解释为限制权利要求书的范围。事实上，除了本文示出和描述的那些之外，本发明的各种修改将通过前述描述对于本领域技术人员变得清楚并且处于所附权利要求的范围内。

应当理解，根据本文所包含的传授内容，将本发明的传授内容应用于特定问题或情况将在本领域普通技术人员的能力范围内。

本说明书中每一个引用的披露内容通过引用明确地并入本文。

实例G.MSR诱导的CAR-T生成的体内研究

使用已知的方法建立植入人T细胞和B细胞的小鼠(人CD34+干细胞人源化小鼠或人外周血单核细胞注射小鼠)。将与CAR19慢病毒缀合的介孔二氧化硅颗粒的组合物注射到小鼠皮肤下以转导T细胞。使用流式细胞术对连续采血样品(注射前0天和注射MSR-病毒后第1天至第21天之间每周两次)监测用MSR-CAR19慢病毒缀合物处理的小鼠血液中表达CAR19的T细胞(使用抗CAR19独特型抗体染色)的存在和CD19+B细胞的耗减，并与注射MSR-GFP慢病毒的对照小鼠进行比较，以指示已经产生了抗CD19 CART，并且在杀死其靶标中发挥功能。从相同的血液样品中测定人干扰素-γ和肿瘤坏死因子α的浓度，以作为针对CD19CAR T细胞的产生和活化的第二种生物标志物。使用原位杂交技术对CAR转基因进行所述注射位点以及淋巴结、骨髓、脾脏和肝脏的详细组织学评估，以评估病毒向不希望的位点的漏出，并研究所产生的CAR19 T细胞至这些位点的运输。

在另一项实验中，含人T和B细胞的小鼠被静脉内注射表达萤光素酶报道基因的表达CD19的Nalm6白血病肿瘤。从肿瘤注射前7天至肿瘤注射后7天，向小鼠群组皮下注射与CAR19或GFP慢病毒缀合的介孔二氧化硅颗粒的组合物的单一注射，以转导T细胞。通过IVIS成像上的萤光素酶信号监测所述Nalm6肿瘤负荷，以研究产生的抗CD19 CART的抗肿瘤功效。对连续采血样品(注射前0天和注射MSR-病毒后第1天至第21天之间每周两次)监测用MSR-CAR19慢病毒缀合物处理的小鼠血液中表达CAR19的T细胞的存在和CD19+B细胞的耗减，并与注射MSR-GFP慢病毒的对照小鼠进行比较。从相同的血液样品中测定人干扰素-γ和肿瘤坏死因子α的浓度，以作为针对CD19 CAR T细胞的产生和活化的第二种生物标志物。

使用针对其它癌症/肿瘤靶标(包括但不限于BCMA、CD20、CD22、CD123、EGFRvIII、CLL-1及其组合(彼此和/或与CD19))的MSR-慢病毒缀合物重复这些研究。

实例H：包含含有VEGF-C的晶胶和具有缀合的病毒载体和吸附的细胞激活剂的MSRS的组合物的功能分析

实例1：VEGF-C的产生

HEK生产

DNA在基因艺术公司(GeneArt)(德国雷根斯堡(Regensburg,Germany))合成并使用基于限制酶-连接的克隆技术克隆到哺乳动物表达载体中。将所得质粒转染到HEK293T细胞中。为了瞬时表达蛋白，使用聚乙烯亚胺(PEI；目录号24765，聚合科学公司(Polysciences，Inc.))将针对野生型或工程改造的变体的载体转染入悬浮液适应的HEK293T细胞中。然后将重组表达载体引入宿主细胞中，并通过进一步培养细胞7天的时段来产生构建体，以允许分泌到培养基中。

然后使用固定化金属离子亲和色谱(IMAC)从无细胞上清液中纯化产生的构建体。

通过IMAC捕获His标记的蛋白质。将树脂在洗脱蛋白质之前洗涤。

最后，通过使用尺寸排阻色谱法(允许分离聚集体、单体和二聚体)精制洗脱的级分。使用SDS-PAGE进行纯化分析，并使用分析型尺寸排阻色谱法确定聚集含量。

表21：HEK293T细胞系中VEGF-C变体的生产产率

CHO生产

使用制造CHO MaKO的表达系统来生产VEGF-C变体8。将编码靶蛋白的基因引入质粒表达载体中由CMV启动子驱动的表达盒中。将载体一式三份转染到CHO MaKO细胞中。对于每次转染，将0.5μg的质粒转染到培养基中的活细胞中。将转染的细胞接种到摇瓶中具有低浓度叶酸的细胞培养基中。细胞在加湿振荡培养箱中生长。在转染后第3天，开始选择稳定的转染子。细胞进入了选择危机，并在21天内恢复。然后将选定的稳定池的小瓶冷冻。

对于VEGF-C变体8的生产，使用了分批补料方法。将一小瓶冷冻细胞解冻。解冻恢复后，将细胞接种到摇瓶中的生产细胞培养基中。培养物在加湿振荡培养箱中生长。接种培养物后第5天，降低生长温度。在接种后第3、4、5、6、7和10天添加进料溶液。在接种后第11天收获培养物。通过离心和无菌过滤从细胞培养基中分离细胞。从澄清的细胞培养上清液中纯化出靶蛋白，并按上述方法进行表征。

表22：CHO MaKO细胞系中VEGF-C变体8的生产产率

实例2：晶胶的产生

根据先前所述的方案(Koshy等人2018)配制海藻酸盐缀合物。

降冰片烯海藻酸盐(Alg-Nb)

将1克的Pronova UP MVG藻酸盐溶解在100ml 0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，并在室温下持续搅拌过夜。然后将280μl的5-降冰片烯-2-甲胺(降冰片烯)添加到海藻酸盐溶液中。将1464mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1085mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别溶解在20ml的MES缓冲液中，并且添加至海藻酸盐-降冰片烯溶液中，并且在室温下反应24小时。24小时后，将溶液在连续的5L盐浴(7、6、5、4、3、2、1、0、0、0g/L NaCl)中以每个浓度透析3小时。然后将溶液过滤两次(0.22m真空)并在-80C冷冻过夜。然后将冷冻溶液冻干5天，在-20C下储存直到用于实验。

四嗪海藻酸盐(Alg-Tz)

将1克的Pronova UP MVG藻酸盐溶解在0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，并在室温下持续搅拌过夜。然后将126mg的(4-(1，2,4,5-四嗪-3-基)苯基甲胺盐酸盐(四嗪)添加至海藻酸盐溶液中。将1464mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1085mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别溶解在20ml的MES缓冲液中，并且添加至海藻酸盐-四嗪溶液中，并且在室温下反应24小时。24小时后，将溶液用311mg的羟胺淬灭30min，并以最大RPM离心10分钟。然后将溶液过滤(0.22uM滤器)，并且在连续的5L盐浴(7、6、5、4、3、2、1、0、0、0g/L NaCl)中以每个浓度透析3小时。然后将溶液过滤两次(0.22uM滤器)并在-80C冷冻过夜。然后将冷冻溶液冻干5天，在-20C下储存直到用于实验。

晶胶配制(图21A)

用热混合器(37C，2000rpm)将Alg-Tz和Alg-Nb以20mg/ml溶解在DIH₂O中，持续1小时。另外，在室温下在不断混合下，将锂皂石以5mg/ml的浓度溶解在DI-H₂O中1小时。然后在无菌条件下过滤溶液(0.22uM滤器)。将VEGF-C(3mg/ml储备液)和锂皂石(锂皂石XLG)(5mg/ml储备液)溶液在室温下一起孵育1小时。然后以1:1的比例添加Alg-Tz溶液和Alg-Nb溶液，并将其稀释到最终浓度为10mg/ml(锂皂石最终浓度0.25mg/ml，10μg VEGF-C/凝胶)。立即将50ul的混合物移液到PEEK模具中，并在-20C冷冻过夜。在注射之前，将凝胶在模具中在室温解冻，然后放入16ga注射器针头中。然后将带有凝胶的针头放在1ml注射器上，注射器中含有100ul无菌PBS。

实例3：VEGF-C释放分析

海藻酸盐晶胶的体外VEGF-C释放测定(图21)

将VEGF-C晶胶(10μg蛋白+0.25mg/ml锂皂石)在37C在1ml的释放缓冲液(PBS中的1％ BSA溶液)中孵育。在整个实验过程中，在不同的时间点完全移除和替换释放缓冲液。将释放缓冲液的样品保存在-80C，直到解冻用于VEGF-C ELISA。

实例4：MSR合成

将聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)平均Mn约5,800(普朗尼克P-123，80.0g，487mmol；西格玛公司(Sigma))表面活性剂在室温溶解于3L的1.6M HCl中，在5L带夹套的烧瓶中加热至40C，并通过顶置式搅拌器以0-600rpm的速率机械搅拌。原硅酸四乙酯(TEOS，184mL，826mmol；西格玛公司)在<5min内分一批添加，并在40C加热并保持搅拌至少2小时，但最通常地为20小时。将所得浆料加热至80-130C持续6-72小时以进行水热处理，然后冷却至室温。将浆料在布氏漏斗中过滤，先后用去离子水和乙醇洗涤，并在室温下风干。将得到的二氧化硅材料在炉中煅烧，其中在8小时内从室温缓慢升温至550C，然后在550C下再保持8个小时，然后冷却至室温，以得到47g的孔二氧化硅颗粒。

搅拌速率的变化可以使微颗粒的纵横比变化。改变水热温度和持续时间的条件是介孔材料常用的孔径控制。

通过光学显微镜、Malvern Morphologi G3、扫描电子显微镜(SEM)、热重分析(TGA)对最终的介孔材料进行表征。

N,N,N-三甲基丙-1-铵官能化的微颗粒

将三甲氧基甲硅烷基丙基三甲基氯化铵(3.61mL，6.51mmol；在甲醇中的50％溶液)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中，并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后，过滤浆料，先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时，以得到N,N,N-三甲基丙-1-铵官能化的微颗粒(本文称为“三甲基铵MSR”)。

MSR尺寸减小

储存的MSR变体在合成后的长度大约为100-200μm。为了提高通过28.5ga胰岛素注射器的可注射性，将干燥的MSR在MP FastPrep-245G珠磨研磨机和裂解系统中匀质化80秒(图30)然后将MSR高压灭菌并在室温下储存，直到用于实验。

慢病毒在MSR上的装载及复合物的表征

将均质化的MSR批次以10mg/ml重悬于冰冷的pH 7.5的Tris-NaCl-EDTA缓冲液(NTE缓冲液)中。在冰冷的NTE缓冲液中将所希望的慢病毒储备液稀释至所希望的转导单位(TU)总量以进行装载。将MSR悬浮液和稀释的病毒以1:1体积/体积的比例混合，并在冰上孵育30分钟。在功能性体外试验或体内使用之前，对多余的DPB进行至少两个洗涤步骤，以去除多余的病毒。为了装载和保留研究(图27-28)，将2.5mg/ml MSR悬浮液与含有图中所示病毒的量的溶液以1:1混合，并在冰上孵育30分钟。使用可商购的试剂盒对装载溶液中的、与MSR结合的、以及从MSR释放的病毒量进行了定量。对于释放研究，将MSR-慢病毒复合物在培养基中于37C孵育，并在指定的时间点收集上清液用于qPCR分析。

装载病毒和起始物的MSR用于体内使用

将构建体2(表20，图48A-48B)和三甲基铵MSR共孵育，使细胞活化剂吸附在MSR表面。将构建体2添加到8mg/ml三甲基铵MSR悬浮液中，并在4C孵育1小时。将装载的MSR洗涤三次，并重悬于DPBS中至最终浓度为15mg/ml MSR。

将含有编码CD19 CAR(也称为CAR19)的慢病毒的NTE缓冲溶液与10mg/ml三甲基铵MSR悬浮液混合，并且在4C孵育30分钟。将MSR洗涤两次，并重悬于DPBS中至最终浓度为15mg/ml MSR。

最后，将MSR用力上下吸移，装回胰岛素注射器，并立即皮内注射到小鼠体内。

实例5：细胞的转导与功能测试

体外T细胞转导

使用美天旎(Miltenyi)人泛T细胞分离试剂盒从白细胞(leukopaks)中分离人T细胞，并在使用前冷冻。将细胞解冻，并且在格式4构建体存在下铺板在完全OpTmizer培养基中(表20，图48A-48B)。将编码CD19 CAR(也称为CAR19)的病毒(作为游离病毒或MSR-病毒复合物)添加到培养物中，然后孵育一天。在用于表征和功能测试之前，将细胞洗涤并铺板再持续三天(图29-30)。

CAR T细胞表征和功能测试(图29)

通过用与PE缀合的CD19 CAR抗独特型抗体染色并通过流式细胞术分析来分析CART细胞的CAR受体表达。Nalm6(RRID：CVCL_0092)为人急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞系。细胞在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中生长并且两者均悬浮生长。对细胞进行修饰以表达荧光素酶(Nalm6-Luc)，以便通过荧光素酶信号来评估它们在共培养物中的存在。将Nalm6-Luc细胞与使用MSR-病毒复合物的游离病毒产生的CD19-CART以不同的细胞比例共培养(图29)。将1天的共培养结束时的荧光素酶信号用于计算被CART杀伤的输入Nalm6的百分比。使用可商购的试剂盒对共培养结束时上清液中的干扰素-γ水平进行定量。

实例6：结果分析

管测定(图20)

接种人真皮淋巴内皮细胞(HDLEC)(p0)并在75％汇合时传代，直到p4或足够的细胞用于实验。然后将1ml等分到Eppendorf管中，用600μg的VEGF-C蛋白处理，并涡旋。将每种处理添加到6孔板中的温热的培养基中，并在37C(5％ CO₂)孵育过夜。为了成像分析，将细胞洗涤，然后用3.7％福尔马林-0.05％ Triton X-100溶液(固定缓冲液)固定，然后洗涤，并用0.1％ Triton X-100溶液(透化缓冲液)涂覆。用PBS洗涤两次后，将细胞用1％ BSA溶液中的0.05％ Triton X-100(阻断缓冲液)涂覆。根据已知方案进行DAPI和鬼笔环肽染色。染色后，将细胞用PBS洗涤两次并成像。

增殖测定(图20)

通过将WST-8溶液以1:10稀释到MV培养基中制备WST-8培养基。去除培养基，并将细胞在WST-8培养基中孵育。孵育后，从每个孔中一式三份取出培养基并添加到96孔板中。使用分光光度计读取每个孔在450nm下的吸光度。

体内实验后的组织处理

从小鼠获取组织，称重，并用剪刀剪成非常细的碎片。然后将样品在含有胶原酶4和DNA酶1的消化培养基中在不断搅拌下进行酶促消化。然后上下吸移样品。吸移后，将含有胶原酶D和DNA酶1的消化培养基添加到样品中。将样品上下吸移3个循环。添加EDTA(5mM)，并且将细胞通过70μm滤器和40uM筛网过滤，并重悬浮于Fc阻断缓冲液中。将细胞洗涤并染色用于FACS分析。

H&E和ISH染色(图32-33)

在尸检时收集皮肤/晶胶组织、邻近的皮肤和引流淋巴结，在10％中性福尔马林缓冲液中浸泡固定并加工成石蜡。将切片用苏木精和曙红(H&E)染色用于组织学评估。在福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片上进行原位杂交，以检测CAR转录物以及Hs-PPIB(阳性对照和组织质量控制)和DAPB(阴性对照)基因。阳性PPIB和阴性DAPB对照探针组被包括以分别用于优化预处理并确保mRNA质量和特异性。杂交方法遵循使用3,3’-二氨基联苯胺(DAB)色原的已知方案。简而言之，将5μm厚的组织切片放在载玻片上，烘烤60分钟并用于杂交。使用染色器进行去石蜡化和再水化方案。在1X修复缓冲液中进行离线手动预处理。通过首先评估PPIB和DAPB杂交信号，随后对所有载玻片使用相同的条件来进行优化。预处理后，将载玻片转移至自动染色机，以完成杂交程序，包括蛋白酶预处理；杂交，随后扩增；以及用HRP和苏木精复染进行检测。使用载玻片扫描仪对载玻片进行数字化处理，并采集有代表性的图像。

进一步的结果

在第0天将含有10μg的不同VEGF-C构建体的晶胶(0.25mg/ml锂皂石)表面注射到小鼠(N＝5/组)的真皮中。第14天，对小鼠实施安乐死，解剖皮肤/晶胶(组合)，用于消化和FACS分析。LEC(CD31⁺、PDPN⁺)的代表性FACS图在FSC-A/SSC-A和CD45^-上预门控(图22)。

图23的结果与VEGF-C的递送有关。向小鼠注射VEGF-C(N＝12)或如前所述合成的空白晶胶(N＝10)。在第7、14和21天的时间点收获小鼠的皮肤/凝胶，对其进行消化，并染色用于FACS。LEC在CD45^-CD31⁺PDPN⁺上门控。BEC在CD45^-CD31⁺PDPN^-上门控。CD4和CD8T细胞在CD45⁺CD11b^-CD11c^-Thy1⁺上门控。

在图25A中，向C57Bl6小鼠注射VEGF-C晶胶(N＝5)或空白晶胶(N＝5)，并在第14天评估淋巴管生成。此外，向NSG小鼠注射VEGF-C晶胶(N＝5)，以比较免疫活性小鼠(C57B16)和免疫受损小鼠(NSG)之间的LEC增殖。对于图25B，在第0天向NSG小鼠注射VEGF-C晶胶(N＝5)或空白晶胶(N＝5)。在第10天，所有的小鼠都经由其外侧尾静脉注射了PBMC。PBMC注射后七天，收集皮肤/凝胶组织用于消化和FACS分析。从人CD45^-小鼠CD11b^-小鼠CD31⁺小鼠PDPN⁺门控LEC。从人CD45⁺小鼠CD11b^-小鼠CD3⁺门控CD4和CD8 T细胞。从人CD45⁺小鼠CD11b^-人CD3^-人CD19+门控B细胞。

在图34中，向NSG小鼠(N＝45)经由尾静脉在第0天注射VEGF-C晶胶，在第10天注射PBMC。在第17天，向小鼠皮内注射1)PBS(N＝15总数/5，用于终点FACS分析)，2)具有构建体2的MSR(15mg/ml MSR当量的10μl注射)，随后是游离的编码CD19 CAR的慢病毒(在起始物注射后1小时的10μl注射，含有4.26e6 TU病毒)(N＝15总数/6，用于终点FACS分析)或3)与编码CD19 CAR的慢病毒结合的MSR跟具有构建体2的MSR以1:1混合(15mg/ml MSR的20ul单次注射)(N＝15总数/5，用于终点FACS分析)。第14天，对3或4只小鼠组小鼠实施安乐死并分析皮肤/凝胶区域的淋巴管生成，而在第20天和第35天，对小鼠实施安乐死并收集皮肤/凝胶和脾用于组织学分析以观察局部和全身的转导的细胞(N＝3/组/时间点)。将小鼠定期放血，用于循环的CD19 CAR+细胞的FACS分析(第25天、30天、35天)。最后，在第35天对小鼠实施安乐死，用于皮肤/凝胶和脾的FACS分析，以观察CART扩增和B细胞耗减。

实例I：体内CART制造的功能分析

概要

本实例描述了体内CART制造方法，该方法涉及细胞募集因子的局部递送，以诱导淋巴管生成和/或吸引T细胞(例如初始T细胞)，这些T细胞随后可以被激活，并用编码CAR的病毒载体转导，在体内产生功能性CART细胞(图18)。在一些实施例中，经由晶胶向受试者施用(例如，局部)细胞募集因子，其中该细胞募集因子是VEGF-C(例如，缓释VEGF-C蛋白晶胶配制品)。不希望受理论束缚，VEGF-C的释放诱导预先存在的皮肤淋巴毛细血管的淋巴管生成，激活淋巴内皮细胞(LEC)。激活的LEC分泌趋化因子(如CCL21)，其反过来将免疫细胞(例如初始T细胞)募集到施用部位(例如凝胶顶部真皮部位)。在一些实施例中，在7至21天，例如14天的时间段后，向受试者施用(例如，局部)编码CAR的病毒载体和细胞活化剂(由介孔二氧化硅棒(MSR)递送)，用于T细胞的转导和体内CART细胞的产生。不希望受理论束缚，例如使用抗CD3/抗CD28(例如双特异性抗体)，简短的CD3和CD28活化促进T细胞的有效转导。不希望受理论束缚，在一些实施例中，这些转导的T细胞将通过皮肤淋巴管、淋巴结和胸导管返回到体循环中，并将应答于肿瘤抗原而进一步扩增。

实例1：VEGF-C蛋白和功能性变体的产生和表征

本实例描述了各种细胞募集因子(包括VEGF-C及其功能性变体)的产生和表征。例如，本实例中描述的细胞募集因子可在晶胶中用于在施用编码CAR的病毒载体之前促进受试者的部位的淋巴管生成。

如图19A所示，VEGF-C可以天然和修饰形式存在。典型地在细胞内发现未成熟VEGF-C(图19A，#1)，其具有N末端和C末端前肽序列。一旦释放，VEGF-C蛋白就会进行蛋白水解切割，并以二聚体或单体形式作为主要或次要成熟形式(图19A，分别为#2(SEQ ID NO:731)或#7(SEQ ID NO:733))存在于细胞外间隙中。通过在序列中插入C137A突变，工程改造了VEGF-C的主要成熟(图19A，#9(SEQ ID NO:737))和次要成熟(图19A，#8(SEQ ID NO:735))形式的稳定二聚体。与VEGF-C的主要成熟形式相比，次要成熟形式在次要成熟形式N末端包含额外的短前肽序列(TEETIKFAA(SEQ ID NO:740))。不希望受理论束缚，在一些实施例中，该额外的短前肽促进HEK293T和CHO MaKo细胞中二聚体的形成以及蛋白质的表达。

VEGF-C蛋白和功能性变体的HEK生产

DNA在基因艺术公司(德国雷根斯堡(Regensburg,Germany))合成并使用基于限制酶-连接的克隆技术克隆到哺乳动物表达载体中。将所得质粒转染到HEK293T细胞中。为了瞬时表达蛋白，使用聚乙烯亚胺(PEI；目录号24765，聚合科学公司(Polysciences,Inc.))将针对野生型或工程改造的变体的载体转染入悬浮液适应的HEK293T细胞中。然后将重组表达载体引入宿主细胞中，并通过进一步培养细胞7天的时段来产生构建体，以允许分泌到培养基中。然后使用固定化金属离子亲和色谱(IMAC)从无细胞上清液中纯化产生的构建体。通过IMAC捕获His标记的蛋白质。将树脂在洗脱蛋白质之前洗涤。最后，通过使用尺寸排阻色谱法(允许分离聚集体、单体和二聚体)精制洗脱的级分。使用SDS-PAGE(图19B-19C)在还原和非还原条件下进行纯化分析，并使用分析型尺寸排阻色谱法确定聚集含量。

如图19B-19C所示，具有全长前肽的未成熟VEGF-C(图19A，#1(SEQ ID NO:727))作为二聚体产生(孔2和3)，并且去除前肽会产生两种主要成熟VEGF-C形式(#2(SEQ ID NO:731))，一种非共价二聚体形式(孔5，6)和单体形式(孔8，9)。短的N末端前肽附着在蛋白质上，以产生非共价二聚体(孔11、12)或单体形式(孔15、16)的次要成熟、野生型VEGF-C形式(#7(SEQ ID NO:733))。将突变C137A添加到VEGF-C的#2主要成熟形式中以产生具有VEGF-C的突变的#9主要成熟形式(SEQ ID NO:737)，导致产生共价二聚体(孔21、22)和单体形式(孔24、25)。将C137A突变引入#7次要成熟VEGF-C形式以产生具有VEGF-C的突变形式的#8次要成熟(SEQ ID NO:735)，导致仅可检测到产生VEGF-C二聚体(孔18、19)。不希望受理论束缚，在一些实施例中，这种具有VEGF-C的突变形式的#8次要成熟(SEQ ID NO:736或735)可能适合大规模生产。

在表21中计算并总结了使用HEK细胞的总生产产率。

表21：HEK293T细胞系中VEGF-C变体的生产产率

VEGF-C#8次要成熟变体的CHO生产

然后使用制造CHO MaKO的表达系统生产VEGF-C变体#8(具有突变的次要成熟形式，SEQ ID NO:736或735)。将编码靶蛋白的基因引入质粒表达载体中由CMV启动子驱动的表达盒中。将载体一式三份转染到CHO MaKO细胞中。对于每次转染，将0.5μg的质粒转染到培养基中的活细胞中。将转染的细胞接种到摇瓶中具有低浓度叶酸的细胞培养基中。细胞在加湿振荡培养箱中生长。在转染后第3天，开始选择稳定的转染子。细胞进入了选择危机，并在21天内恢复。然后将选定的稳定池的小瓶冷冻。

使用分批补料方法用于生产VEGF-C变体#8(具有突变的次要成熟形式，SEQ IDNO:736或735)。将一小瓶冷冻细胞解冻。解冻恢复后，将细胞接种到摇瓶中的生产细胞培养基中。培养物在加湿振荡培养箱中生长。接种培养物后第5天，降低生长温度。在接种后第3、4、5、6、7和10天添加进料溶液。在接种后第11天收获培养物。通过离心和无菌过滤从细胞培养基中分离细胞。从澄清的细胞培养上清液中纯化出靶蛋白，并按上述方法进行表征。VEGF-C变体#8(具有突变的次要成熟形式，SEQ ID NO:736或735)的生产产率总结在表22中。

表22：CHO MaKO细胞系中VEGF-C变体8的生产产率

VEGF-C体外活性的研究

研究了VEGF-C和上述产生的变体形式的体外生物活性。测量了VEGF-C对人真皮淋巴管内皮细胞(HDLEC)(包括芽生和增殖)(图20A-20C)的影响。本实例中研究的各种VEGF-C变体包括：具有全长前肽的未成熟VEGF-C(#1)；作为单体(2M)或二聚体(2D)的主要成熟形式#2；作为单体(7M)或二聚体(7D)的次要成熟形式#7；作为单体(9M)或二聚体(9D)的具有突变(C137A)的主要成熟形式#9；以及作为单体(8M)或二聚体(8D)的具有突变(C137A)的次要成熟形式#8。

图20A显示对HDLEC进行体外芽生测定的实验设置的概述，以测试VEGF-C变体的生物活性。首先接种HDLEC(p0)并在75％汇合时传代，直到p4或获得足够的细胞用于实验。然后将约1mL的HDLEC等分到Eppendorf管中，用600μg的VEGF-C蛋白处理，并涡旋。将每种处理添加到6孔板中的温热的培养基中，并在37C(5％ CO₂)孵育过夜。为了成像分析，将细胞洗涤，然后用3.7％福尔马林-0.05％ Triton X-100溶液(固定缓冲液)固定，然后洗涤，并用0.1％ Triton X-100溶液(透化缓冲液)涂覆。用PBS洗涤两次后，将细胞用1％ BSA溶液中的0.05％ Triton X-100(阻断缓冲液)涂覆。根据已知方案进行DAPI和鬼笔环肽染色。鬼笔环肽染色后，将细胞用PBS洗涤两次并成像用于管形成。

为了测量增殖，进行了WST-8测定(图20B)，其中首先通过将WST-8溶液以1:10稀释到MV培养基中来制备WST-8培养基。去除培养基，并将细胞在WST-8培养基中孵育。孵育后，从每个孔中一式三份取出培养基并添加到96孔板中。使用分光光度计读取每个孔在450nm下的吸光度。

如图20B所示，所有VEGF-C成熟形式(野生型或突变型主要和次要成熟形式)导致HDLEC的增殖水平相似，这相对于与具有全长前肽的未成熟VEGF-C(#1)孵育的HDLEC的增殖水平有所提高。如图20C所示，管形成图像显示，野生型的主要和次要成熟形式(分别为#2和#7)或包含C137A突变的主要和次要成熟形式(分别为#9和#8)的主要和次要成熟形式比未成熟形式(#1)更能促进HDLEC的芽生。此外，各种VEGF-C的二聚体形式(D)似乎表现出良好的体外活性(图20B-20C)。不希望受理论束缚，在一些实施例中，与单体形式相比，野生型的主要和次要成熟形式的二聚体形式(分别为#2D和#7D)或包含C137A突变的主要和次要成熟形式的二聚体形式(分别为#9D和#8D)包含增强的芽生活性。

实例2：含有VEGF-C的晶胶的产生和表征

产生并研究了含有VEGF-C或功能性变体的晶胶。将锂皂石添加到晶胶的形成中，以导致VEGF-C的缓慢、更可控地释放。

为了形成晶胶，根据先前所述的方案(Koshy等人,Acta Biomater.[生物材料学报]2018年1月；65:36-43)配制海藻酸盐缀合物并混合。

降冰片烯海藻酸盐(Alg-Nb)

将1克的Pronova UP MVG藻酸盐溶解在100ml 0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，并在室温下持续搅拌过夜。然后将280μl的5-降冰片烯-2-甲胺(降冰片烯)添加到海藻酸盐溶液中。将1464mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1085mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别溶解在20ml的MES缓冲液中，并且添加至海藻酸盐-降冰片烯溶液中，并且在室温下反应24小时。24小时后，将溶液在连续的5L盐浴(7、6、5、4、3、2、1、0、0、0g/L NaCl)中以每个浓度透析3小时。然后将溶液过滤两次(0.22m真空)并在-80℃冷冻过夜。然后将冷冻溶液冻干5天，在-20C下储存直到用于实验。

四嗪海藻酸盐(Alg-Tz)

将1克的Pronova UP MVG藻酸盐溶解在0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，并在室温下持续搅拌过夜。然后将126mg的(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基甲胺盐酸盐(四嗪)添加至海藻酸盐溶液中。将1464mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1085mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别溶解在20ml的MES缓冲液中，并且添加至海藻酸盐-四嗪溶液中，并且在室温下反应24小时。24小时后，将溶液用311mg的羟胺淬灭30min，并以最大RPM离心10分钟。然后将溶液过滤(0.22uM滤器)，并且在连续的5L盐浴(7、6、5、4、3、2、1、0、0、0g/L NaCl)中以每个浓度透析3小时。然后将溶液过滤两次(0.22uM滤器)并在-80℃冷冻过夜。然后将冷冻溶液冻干5天，在-20C下储存直到用于实验。

晶胶配制

然后用热混合器(37C，2000rpm)将Alg-Tz和Alg-Nb以20mg/ml溶解在DIH₂O中，持续1小时。另外，在室温下在不断混合下，将锂皂石以5mg/ml的浓度溶解在DI-H₂O中1小时。然后在无菌条件下过滤溶液(0.22uM滤器)。

对于不含锂皂石的晶胶，然后与所希望的量的VEGF-C一起添加1:1比例的Alg-Tz溶液和Alg-Nb溶液，并稀释到最终浓度为10mg/ml(10μg VEGF-C/凝胶)。

对于含有锂皂石的晶胶配制品，将VEGF-C(3mg/ml储备液)和锂皂石(锂皂石XLG)(5mg/ml储备液)溶液在室温下一起孵育1小时。然后以1:1的比例添加Alg-Tz溶液和Alg-Nb溶液，并将其稀释到最终浓度为10mg/ml(锂皂石最终浓度0.25mg/ml，10μg VEGF-C/凝胶)。

立即将50μl的含有或不含有锂皂石的晶胶和VEGF-C混合物移液到PEEK模具中，并在-20℃冷冻过夜。在注射之前，将凝胶在模具中在室温解冻，然后放入16ga注射器针头中。然后将带有凝胶的针头放在1ml注射器上，注射器中含有100μl无菌PBS。

海藻酸盐晶胶的体外VEGF-C释放

研究了包含锂皂石的海藻酸盐晶胶配制品的体外VEGF-C释放速率。如上所述，将海藻酸盐液体预聚物与锂皂石和VEGF-C混合，然后冷冻，并且在注射前再次解冻以产生多孔基质(图21A)。

首先，测量含有和不含锂皂石的海藻酸盐晶胶的VEGF-C释放。形成了不同类型的含有VEGF-C(10μg蛋白质)的海藻酸盐凝胶，用于VEGF-C释放测定：海藻酸盐纳米多孔(凝胶化发生，无晶胶化，所以没有形成大规模孔)、海藻酸盐晶胶(冷冻和晶胶化之后，多孔)、以及具有0.25％锂皂石的海藻酸盐晶胶。为进行释放测定，将VEGF-C晶胶(10μg蛋白±0.25mg/ml锂皂石)在37℃在1ml的释放缓冲液(PBS中的1％ BSA溶液)中孵育。在整个实验过程中，在添加释放缓冲液后的0到超过500小时内，在不同的时间点完全移除和替换释放缓冲液。将收集的释放缓冲液的样品保存在-80℃，直到解冻用于VEGF ELISA。如图21B所示，具有0.25％锂皂石的海藻酸盐晶胶显示出最可控且最持久的VEGF-C体外释放。

接下来，测量了从装载有10μg或50μg VEGF-C的0.25％锂皂石海藻酸盐晶胶或装载有50μg VEGF-C的0.5％锂皂石海藻酸盐晶胶对VEGF-C体外释放的调节。如图21C所示，约30％的总VEGF-C从凝胶中释放，并且0.25％锂皂石海藻酸盐晶胶显示出最大的受控释放曲线。

使用16G针头在小鼠皮下注射晶胶。图21D显示晶胶成功植入小鼠皮肤。

VEGF-C晶胶的体内研究

在小鼠中研究了经由晶胶(0.25mg/ml锂皂石)递送的VEGF-C植入并体内诱导淋巴管生成和募集体内T细胞的能力。这一系列实验研究了不同的VEGF-C变体(包括包含C137A突变的变体和通过不同方法产生的VEGF-C变体)诱导淋巴管生成的能力。还研究了不同量的VEGF-C晶胶诱导注射有人外周血单核细胞(PBMC)的野生型小鼠和免疫力低下的NSG小鼠的淋巴管生成和募集T细胞的能力。

首先，在第0天将含有10μg不同VEGF-C形式的晶胶(0.25mg/ml锂皂石)(包括野生型的主要和次要成熟形式(分别为#2和#7)和包含C137A突变的主要和次要成熟形式(分别为#9和#8)的二聚体形式)表面注射到小鼠(N＝5/组)的真皮中。第14天，对小鼠实施安乐死，解剖皮肤/晶胶(组合)，用于消化和FACS分析(图22A)。特别地，从小鼠获取组织，称重，并用剪刀剪成非常细的碎片。然后将样品在含有胶原酶4和DNA酶1的消化培养基中在不断搅拌下进行酶促消化。然后上下吸移样品。吸移后，将含有胶原酶D和DNA酶1的消化培养基添加到样品中。将样品上下吸移3个循环。添加EDTA(5mM)，并且将细胞通过70μm滤器和40μM筛网过滤，并重悬浮于Fc阻断缓冲液中。将细胞洗涤并染色用于FACS分析。

将在注射晶胶后第14天分离出的淋巴内皮细胞(LEC)(CD31⁺、PDPN⁺)的代表性FACS图在FSC-A/SSC-A和CD45^-上进行预门控(图22B)，并显示诱导了体内淋巴管生成。如图22C所示，小鼠皮肤淋巴管生成的量被定量为每mg组织的LEC计数。与野生型的主要和次要成熟形式(分别为#2和#7)的二聚体相比，包含C137A突变的主要和次要成熟形式(分别为#9和#8)的共价二聚体导致更高量的LEC，从而导致晶胶植入后更高水平的体内淋巴管生成(图22C)。

此外，对上述在CHO MaKo细胞中产生的VEGF-C变体#8(具有C137A突变的次要成熟形式)的功能性进行了体内研究，并与在HEK细胞中产生的相同突变形式进行了比较。尽管在不同的细胞类型中产生，但这两个#8变体在体外HDLEC芽生测定中显示出相当的活性。如图24B所示，与不含VEGF-C的空白晶胶对照相比，CHO-MaKo细胞中产生的VEGF-C变体#8能够在体内诱导淋巴管生成。通过在晶胶递送后14天皮肤消化后对LEC进行染色，也在体内证实了由不同细胞类型产生的两个#8变体的相当的生物活性(图24C)。将注射了空白晶胶(无VEGF-C)或装载了由HEK细胞(#8HEK)产生的#8VEGF-C变体或由MaKo细胞(#8CHO)产生的#8VEGF-C变体的晶胶的小鼠的淋巴管生成量化为总LEC计数/mg组织。血液血管内皮细胞(BEC)(CD45-CD31+PDPN-)不受#8变体VEGF-C(无论其在哪种细胞类型中产生)递送的影响。还观察到在具有#8变体VEGF-C(无论其由哪种细胞类型产生)递送的晶胶递送后的第14天，淋巴管生成峰值对应于晶胶顶部皮肤中升高的LEC水平以及CD4和CD8 T细胞(CD45+)的免疫浸润峰值。

此外，还测量了皮肤淋巴管对由海藻酸盐晶胶递送的10μg VEGF-C的应答。向小鼠注射VEGF-C海藻酸盐晶胶(N＝12)或如前所述合成的空白晶胶(不包含VEGF-C)(N＝10)。在第7、14和21天的时间点收获如上所述小鼠的皮肤/凝胶，对其进行消化，并染色用于FACS。LEC在CD45^-CD31⁺PDPN⁺上门控。BEC在CD45^-CD31⁺PDPN^-上门控。CD4和CD8 T细胞在CD45⁺CD11b^-CD11c^-Thy1⁺上门控。将每mg的组织中的细胞数量进行定量。

图23A描述了装载到海藻酸盐晶胶中的VEGF-C(1、10、20、50μg)的体内剂量应答和淋巴管生成诱导(表示为总淋巴内皮细胞(LEC)计数/mg组织，上图)以及在递送10μg VEGF-C后淋巴管生成的时间过程(下图)。这些结果表明，10μg的VEGF-C诱导体内高淋巴管生成，并且在皮下晶胶递送后14天观察到了淋巴管生成的峰值。凝胶植入后14天，C57/BL6小鼠皮肤消化后分离的LEC(CD45-CD31+PDPN+)和血液内皮细胞(BEC，CD45-CD31+PDPN-)染色的代表性图(图23B)以及作为总细胞计数/mg组织的内皮细胞定量(图23C)还表明，与不含VEGF-C的空白凝胶对照相比，10μg的VEGF-C诱导较高的体内淋巴管生成。此外，以CD4+T细胞和CD8+T细胞的总细胞数/mg组织表示的定量表明，在10μg的VEGF-C海藻酸盐晶胶递送后，T细胞浸润也增加，并且LEC计数与T细胞浸润相关，尤其是与初始表型(CD62L+、CD44-)的T细胞浸润相关。如图23E所示，皮下递送VEGF-C海藻酸盐晶胶后14天观察到淋巴管生成峰值，在第14天也观察到T细胞浸润峰值。

研究了VEGF-C在免疫力低下的NSG小鼠中诱导淋巴管生成的能力以及小鼠LEC有效地募集人外周血单核细胞(PBMC)的能力。在图25A中，向C57B6小鼠注射VEGF-C晶胶/0.25％锂皂石(N＝5)或空白晶胶(N＝5)，并在第14天评估淋巴管生成。此外，向NSG小鼠注射VEGF-C晶胶(N＝5)，以比较免疫活性小鼠(C57Bl6)和免疫受损小鼠(NSG)之间的LEC增殖。在VEGF-C或空白晶胶递送后14天，NSG、C57/BL6小鼠皮肤LEC和BEC染色的代表性流式细胞术图表明在NSG和C57B6小鼠中，VEGF-C晶胶递送后，LEC增加，从而体内淋巴管生成更高(图25A)。在图25B中，在第0天向NSG小鼠注射VEGF-C晶胶(N＝5)或空白晶胶(N＝5)。在第10天，所有的小鼠都经由其外侧尾静脉注射了PBMC。PBMC注射后七天，收集皮肤/凝胶组织用于消化和FACS分析。在人CD45^-小鼠CD11b^-小鼠CD31⁺小鼠PDPN⁺上门控LEC。在人CD45⁺小鼠CD11b^-小鼠CD3⁺上门控CD4和CD8 T细胞。在人CD45⁺小鼠CD11b^-人CD3^-人CD19+上门控B细胞。这些数据表明，与空白晶胶对照(无VEGF-C)相比，施用VEGF-C晶胶的NSG小鼠皮肤中CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞都增加，并且T细胞是NSG小鼠中募集的PBMC的主要细胞类型。

总之，这些数据表明，包含VEGF-C(含有或不含有锂皂石)的海藻酸盐晶胶能够在体内局部诱导淋巴管生成和T细胞募集到晶胶施用的部位。

实例3：MSR合成用于转导T细胞以产生CART细胞

这个实例描述了介孔二氧化硅棒(MSR)的合成。介孔二氧化硅颗粒(MSP)(如MSR)可用于，例如，协助将编码CAR的病毒载体递送到患者的部位，该部位由于施用上述VEGF-C晶胶而进行淋巴管生成。

通过首先将聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)平均Mn约5,800(普朗尼克P-123，80.0g，487mmol；西格玛公司)表面活性剂在室温溶解于3L的1.6M HCl中，然后在5L带夹套的烧瓶中加热至40C，并通过顶置式搅拌器以0-600rpm的速率机械搅拌进行MSR合成。原硅酸四乙酯(TEOS，184mL，826mmol；西格玛公司)在<5min内分一批添加，并在40C加热并保持搅拌至少2小时，但最通常地为20小时。将所得浆料加热至80-130C持续6-72小时以进行水热处理，然后冷却至室温。将浆料在布氏漏斗中过滤，先后用去离子水和乙醇洗涤，并在室温下风干。将得到的二氧化硅材料在炉中煅烧，其中在8小时内从室温缓慢升温至550C，然后在550C下再保持8个小时，然后冷却至室温，以得到47g的孔二氧化硅颗粒。

搅拌速率的变化可以使微颗粒的纵横比变化。改变水热温度和持续时间的条件是介孔材料常用的孔径控制。

通过光学显微镜、Malvern Morphologi G3、扫描电子显微镜(SEM)、热重分析(TGA)对最终的介孔材料进行表征。

N,N,N-三甲基丙-1-铵官能化的微颗粒

将三甲氧基甲硅烷基丙基三甲基氯化铵(3.61mL，6.51mmol；在甲醇中的50％溶液)添加到在150mL试剂级乙醇中的1.0g介孔二氧化硅微颗粒的浆料中，并加热至75摄氏度持续7小时。冷却至室温后，过滤浆料，先后用去离子水和乙醇洗涤颗粒，然后在烘箱中在100摄氏度下干燥20小时，以得到N,N,N-三甲基丙-1-铵官能化的微颗粒(本文称为“三甲基铵MSR”)。

MSR尺寸减小

储存的MSR变体在合成后的长度大约为100-200μm。将MSR匀质化，以减小其尺寸并改善可注射性。特别地，为了提高通过28.5ga胰岛素注射器的可注射性，将干燥的MSR在MPFastPrep-24 5G珠磨研磨机和裂解系统中匀质化80秒(图30A)。在图30A中，在MSR的长度上观察到尺寸减小，这就允许通过直径较小的针头注射到皮内间隙。然后将MSR高压灭菌并在室温下储存，直到使用。

慢病毒在MSR上的装载及MSR+病毒载体的表征

将均质化的MSR批次以10mg/ml重悬于冰冷的pH 7.5的Tris-NaCl-EDTA缓冲液(NTE缓冲液)中。在冰冷的NTE缓冲液中将所希望的慢病毒储备液(以下所述)稀释至所希望的转导单位(TU)总量以进行装载。将MSR悬浮液和稀释的病毒以1:1体积/体积的比例混合，并在冰上孵育30分钟。在功能性体外试验或体内使用之前，对多余的DPB进行至少两个洗涤步骤，以去除多余的病毒。为了装载和保留研究(图27-28)，将2.5mg/ml MSR悬浮液与含有图中所示病毒的量的溶液以1:1混合，并在冰上孵育30分钟。使用可商购的试剂盒(例如，qRTPCR基础试剂盒，例如Lenti-X qRT-PCR滴定试剂盒)对装载溶液中的、与MSR结合的、以及从MSR释放的病毒量进行了定量。对于释放研究，将MSR-慢病毒复合物在培养基中于37℃孵育，并在指定的时间点收集上清液用于qPCR分析。

首先，测量具有编码GFP的慢病毒的MSR的装载能力。根据基于细胞的转导测定确定的功能效价，将三甲基铵MSR与表达GFP的慢病毒以不同量共同孵育。对三个级分中的病毒的量进行表征，该表征包括病毒装载液(添加到MSR的初始输入)、结合MSR的病毒(孵育和洗涤后保持与MSR结合的量)以及未结合的病毒(MSR和病毒共孵育后仍在溶液中的量)。将MSR和病毒在冰上共孵育30分钟，去除上清液(未结合的病毒)，并且在评估结合MSR的病毒之前，将MSR洗涤两次。还分析了每种条件下未接触过的病毒装载液。如图27A所示，与未结合的病毒相比，输入的病毒装载液中的大部分病毒在吸附和洗涤后被保留在结合MSR的病毒级分中。吸附在MSR上的病毒的量随着病毒装载液中病毒的量的增加也增加。如图27B所示，该图显示了病毒装载液的百分比相比于病毒的功能滴度，结合MSR的病毒相对于病毒装载液的计算分数对吸附和洗涤后在MSR上的装载和保留具有很强效率。

接下来，对病毒在MSR上的保留进行了表征。具体地，将慢病毒和MSR在冰上共孵育30分钟，并且将MSR洗涤两次。然后将MSR在含有10％ FCS的R10培养基或OpTmizer无血清培养基中培养，并将输入的病毒储备液也在培养基中培养。在孵育开始后的指定时间除去上清液，并分析总病毒含量。如图28所示，结果表明与未结合的病毒对照(在R10培养基中的病毒和在OpTmizer培养基中的病毒)相比，MSR在前18小时内只释放了输入病毒的一部分(在R10培养基中的MSR-病毒和在OpTmizer培养基中的MSR-病毒)。

实例4：用MSR和病毒载体以及任选地起始物转导T细胞，以及功能测试

本实例描述了使用编码CAR的病毒载体体外转导T细胞。不希望受理论束缚，将病毒载体与MSR(以促进载体的受控释放)以及任选地起始物(以促进T细胞的激活)一起施用。

用MSR+病毒载体+任选地起始物体外转导T细胞

使用美天旎(Miltenyi)人泛T细胞分离试剂盒从白细胞(leukopaks)中分离人T细胞，并在使用前冷冻。将细胞解冻，并且在起始物构建体4存在下铺板在完全OpTmizer培养基中(表20，图48A)。将编码CD19CAR(也称为CAR19)的病毒(作为游离病毒或MSR-病毒复合物)添加到培养物中，然后孵育一天。在用于表征和功能测试之前，将细胞洗涤并铺板再持续三天。

CAR T细胞表征和功能测试

通过用与PE缀合的CD19 CAR抗独特型抗体染色并通过流式细胞术分析来分析CART细胞的CAR受体表达。

为了测量CD19 CAR表达，在转导后第4天将CAR+细胞的百分比定量(图29A)。T细胞的体外转导效率与用CAR-MSR或无CAR(未结合的病毒)转导的T细胞的效率相当(图29A)。

为了测量用结合MSR的病毒或未结合的病毒转导的CD19 CAR T细胞的功能，使用了Nalm6-Luc细胞特异性杀伤测定和干扰素-γ(IFN-γ)释放测定。Nalm6(RRID：CVCL_0092)为人急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞系。细胞在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中生长并且悬浮生长。对细胞进行修饰以表达荧光素酶(Nalm6-Luc)，以便通过荧光素酶信号来评估它们在共培养物中的存在。将Nalm6-Luc细胞与使用游离病毒或MSR-病毒复合物产生的CD19-CART以不同的细胞比例(效应细胞与靶细胞的比率(E:T比率))共培养(图29B-29C)。将1天的共培养结束时的荧光素酶信号用于计算被CART杀伤的输入Nalm6的百分比。使用可商购的试剂盒对共培养结束时上清液中的IFN-γ水平进行定量。

这些测定的结果表明特异性杀伤活性(图29B)和IFN-γ释放(图29C)在共孵育24小时期间在用结合MSR的病毒转导的CART细胞(CAR-MSR)和用游离病毒转导的CART细胞(无CAR)之间是相当的，表明与传统的游离病毒转导相比，用MSR的配制品转导在体外产生同等功能的CART。

接下来，评估均质化后MSR的转导效率。如上所述均质化MSR，以允许通过较小直径的针进行注射(图30A)。如图30B所述，标准的三甲基铵MSR或均质化的MSR与慢病毒吸附在一起，并建立该复合物的稀释系列，并用于与编码GFP的慢病毒转染T细胞。MSR的均质化并没有实质性地改变体外转导性能。

体内施用晶胶/锂皂石，随后施用MSR+病毒载体

设计了实验来研究注射到小鼠中的晶胶，随后注射MSR-病毒复合物的定位和分布。皮下注射空白海藻酸盐晶胶，并且7天后用胰岛素注射器(对于MSR-病毒组)或汉密尔顿(Hamilton)注射器(对于游离病毒)在凝胶顶部的皮内间隙中注射游离或与MSR结合的病毒颗粒(4e6TU)。病毒递送后72h，对小鼠实施安乐死，并收获组织(皮肤和引流淋巴结)用于免疫组织化学分析。在尸检时收集皮肤/晶胶组织、邻近的皮肤和引流淋巴结，在10％中性福尔马林缓冲液中浸泡固定并加工成石蜡。将切片用苏木精和曙红(H&E)染色用于组织学评估。使用载玻片扫描仪对载玻片进行数字化处理，并采集有代表性的图像。图31A-31B描述了含有相邻晶胶和MSP的皮肤的苏木精和曙红(H&E)染色切片。

在图31A中，H&E染色切片显示了皮下晶胶在皮下组织中的膜肌表面的位置。MSP表现为轻度嗜酸性颗粒材料，与位于植入晶胶附近真皮-皮下交界处的单核细胞混合(图31B为特写图)。

图32A-32B显示了CAR mRNA在分离的小鼠皮肤切片上的原位杂交。在福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片上进行原位杂交，以检测CAR转录物以及Hs-PPIB(阳性对照和组织质量控制)和DAPB(阴性对照)基因。阳性PPIB和阴性DAPB对照探针组被包括以分别用于优化预处理并确保mRNA质量和特异性。杂交方法遵循使用3,3’-二氨基联苯胺(DAB)色原的已知方案。简而言之，将5μm厚的组织切片放在载玻片上，烘烤60分钟并用于杂交。使用染色器进行去石蜡化和再水化方案。在1X修复缓冲液中进行离线手动预处理。通过首先评估PPIB和DAPB杂交信号，随后对所有载玻片使用相同的条件来进行优化。预处理后，将载玻片转移至自动染色机，以完成杂交程序，包括蛋白酶预处理；杂交，随后扩增；以及用HRP和苏木精复染进行检测。使用载玻片扫描仪对载玻片进行数字化处理，并采集有代表性的图像。

如图32A所示，用于检测CAR mRNA转录物的原位杂交显示，在注射结合MSR的病毒的小鼠中与注射MSP对应的区域内的稳健信号。如图32B所述，在浸润晶胶的细胞以及游离病毒条件下与之相邻的细胞中，原位杂交检测到扩散信号。这些数据似乎支持这样的观点，即MSP可能维持病毒在真皮中的定位，在真皮处T细胞浸润皮肤。

图33A-33B显示，与游离病毒组相比，注射了MSR-病毒的小鼠在引流淋巴结中具有较少的CAR mRNA转录阳性细胞。如上所述，在引流淋巴结(dLN)切片上进行CAR mRNA的原位杂交。该原位杂交在注射了结合MSR的病毒的小鼠dLN内只检测到一个CAR mRNA转录阳性细胞(图33A)，而注射了游离病毒的小鼠在被膜下淋巴窦中显示出少许CAR mRNA转录阳性细胞，与病毒或细胞从晶胶植入部位的局部引流一致(图35B)。该研究表明MSP-病毒配制品限制了病毒向引流淋巴结的引流，从而减少了潜在的部位外转导并提高了安全性。

装载病毒和起始物的MSR用于体内使用

将起始物(特定地，表20，图37A中所示的起始物构建体2)和三甲基铵MSR共孵育，使细胞活化剂吸附在MSR表面。将起始物构建体2蛋白添加到8mg/ml三甲基铵MSR悬浮液中，并在4℃孵育1小时。将装载的MSR洗涤三次，并重悬于DPBS中至最终浓度为15mg/ml MSR。将含有编码CD19 CAR的慢病毒的NTE缓冲溶液与10mg/ml三甲基铵MSR悬浮液混合，并且在4℃孵育30分钟。将MSR洗涤两次，并重悬于DPBS中至最终浓度为15mg/ml MSR。最后，将MSR用力上下吸移，装回胰岛素注射器，并立即皮内注射到小鼠体内。

总之，这些数据表明，结合MSR的病毒与起始物构建体一起能够有效转导T细胞以生产功能性CART细胞。因此，本文考虑了VEGF-C在小鼠皮肤中递送，在注射与结合介孔二氧化硅颗粒(MSP)的起始物组合的与MSP结合的病毒颗粒(图26A)或与结合MSP的起始物组合的游离病毒(图26B)后，产生待培养和转导的T细胞的二级引发位点。

实例5：体内CART制造

进行了一项研究，以在体内小鼠模型中证明用编码CD19 CAR的慢病毒对人T细胞的病毒转导。特定地，向小鼠施用VEGF-C晶胶(0.25mg/ml锂皂石)以促进淋巴管生成和T细胞的募集。接下来，施用编码CD19 CAR的病毒载体、MSR和起始物的组合，以激活并转导进行了淋巴管生成的区域的T细胞。

方法

小鼠研究和流式细胞术分析

向NSG小鼠(N＝45)经由尾静脉在第0天注射VEGF-C晶胶，在第10天注射PBMC。七天后在第17天，向小鼠皮内注射：1)PBS(N＝15总数/5，用于终点FACS分析)，2)具有起始物构建体2的MSR(15mg/ml MSR当量的10μl注射，如上所述产生)，随后是游离的编码CD19 CAR的慢病毒(在起始物注射后1小时的10μl注射，含有4.26e6 TU病毒)(N＝15总数/6，用于终点FACS分析)或3)与编码CD19 CAR的慢病毒结合的MSR跟具有起始物构建体2的MSR以1:1混合(15mg/ml MSR的20μl单次注射)(N＝15总数/5，用于终点FACS分析)(图34A)。MSR-起始物用于促进T细胞激活和T细胞转导。第14天，对每组3或4只小鼠实施安乐死，并分析皮肤/晶胶注射区域的淋巴管生成。在第35天，对小鼠实施安乐死，并收集脾和血液，以确定编码CD19CAR的病毒体内递送是否能诱发由VEGF-C诱导的淋巴管生成所募集的T细胞的转导并观察局部和全身转导细胞(N＝3/组/时间点)。将小鼠定期放血，用于循环的CD19 CAR+细胞的FACS分析(第25天、30天、35天)。最后，在第35天对小鼠实施安乐死，用于皮肤/晶胶和脾的FACS分析，以观察CART扩增和B细胞耗减。对所有组小鼠脾中B细胞耗减和CAR-T细胞进行定量。

CAR的ISH染色

使用RNAscope 2.5VS探针CAR 3UTR(目录号438289)(检测CAR mRNA转录物)以及2.5VS探针Hs-PPIB(阳性对照和组织质量控制(目录号313909))和2.5VS探针DAPB(阴性对照(目录号3120390))，使用由高级细胞诊断公司(Advanced Cell Diagnostics，ACDBio)(海沃德，加利福尼亚州)和文塔纳医疗系统公司(Ventana Medical Systems)(罗氏公司(Roche)，图森，亚利桑那州)提供的试剂和设备在块上进行原位杂交。阳性PPIB和阴性DAPB对照探针组包括在内，以分别确保mRNA质量和特异性。杂交方法遵循由高级细胞诊断公司和文塔纳医疗系统公司建立的方案，使用3,3’-二氨基联苯胺(DAB)色原，并针对研究组织进行优化。简而言之，将5μm切片在60度烘烤60分钟并用于杂交。使用Sakura组织-Tek DR5染色器进行去石蜡化和再水化方案，步骤如下：3次二甲苯，每次持续3分钟；2次100％乙醇，持续3分钟；空气干燥5分钟。在98至104摄氏度下在1X修复缓冲液中进行离线手动预处理，持续15分钟。通过首先评估PPIB和DAPB杂交信号，随后对所有载玻片使用相同的条件来进行优化。预处理后，将载玻片转移至Ventana Ultra自动染色器，以完成ISH程序，包括蛋白酶预处理；在43摄氏度杂交2小时，随后进行扩增；以及用HRP和苏木精复染进行检测。

T细胞的IHC染色

使用标准Ventana Discovery XT试剂(文塔纳(Ventana)，印第安纳波利斯，印第安纳州)在Ventana Discovery XT自动染色器上使用兔单克隆抗体克隆2GV6(文塔纳，目录号790-431)针对CD3进行免疫组织化学染色(包括去石蜡化和抗原修复步骤)。将载玻片去石蜡，然后根据标准文塔纳修复方案，用细胞调节(Cell Conditioning)1(CC1/pH8)溶液覆盖载玻片进行热诱导抗原修复。将载玻片与一抗或非免疫同种型匹配的阴性对照孵育。通过与Ventana Discovery OmniMap HRP试剂，随后与Ventana Discovery ChromoMap 3,3’-二氨基联苯胺(DAB)孵育，获得可视化。使用文塔纳苏木精和文塔纳发蓝试剂(VentanaBluing reagent)进行复染，每者4分钟。将载玻片脱水，清洁，并用合成的封固培养基封片。

IF染色方案-用于体内CART-复用的小鼠组织

第1天，将载玻片洗涤，然后在4℃封闭过夜。第2天，将载玻片与AffiniPure Fab片段山羊抗小鼠IgG(H+L)一起孵育，然后与Alexa 647标记的抗CD19抗体在4℃孵育过夜。第3天，将载玻片洗涤，然后与Alexa488标记的抗CD3ζ抗体在4℃孵育过夜。第4天，将载玻片洗涤，用DAPI复染，然后再次洗涤。将载玻片用盖玻片封固，在成像前放入冰箱至少24小时。

结果

如图38所示，T细胞在小鼠皮肤的植入部位周围和凝胶周围有效募集。CAR ISH研究的结果显示，该区域的一些单核细胞(来自表型，可能是T细胞)被编码CAR的慢病毒载体转导(图39)。在一些内皮细胞(可能是淋巴管)中也观察到CAR RNA的表达(图39)。然而，通过流式细胞术分析，证实CD19 CAR蛋白在细胞表面的表达几乎完全在T细胞上(少数人单核细胞除外)，这表明游离病毒和MSR-病毒对非T细胞的转导最小(图35)。

将局部产生的CAR-T细胞迁移到脾(图40)。如图34B所示，在接受以下的小鼠中检测到CAR-T细胞以及检测到B细胞显著减少：(a)游离病毒和与起始物构建体2结合的MSR，或(b)结合MSR的编码CD19 CAR的慢病毒与具有起始物构建体2的MSR以1:1混合。脾中的B细胞数量与脾(图34C和36A)以及血液(图36B)中的CAR-T细胞(主要是CD8+)的数量呈负相关，这支持B细胞耗减是由体内产生的CD19特异性CAR-T细胞引起的。如图41A-41B所示，与T细胞接近的B细胞具有萎缩和不健康的形状，该形状表明细胞死亡，而未进入但与CD19特异性T细胞接触的B细胞显示出健康的表型(圆形并且较大的细胞，仅在细胞表面有CD19染色)。用CD3抗体染色的T细胞(点状染色)可能是CART细胞，尽管没有与CAR探针进行共染色。

这项研究证明，在局部施用含有生长/细胞募集因子(例如VEGF-C)的晶胶用于诱导淋巴管生成和募集T细胞(其随后由结合MSR的病毒或游离病毒和结合MSR的起始物转导)后，可在体内产生功能性CART细胞。

实例6：测试体内CART制造的另外的研究

在本实例中，进行了如图42A所示的另外的研究，以测试体内的CART制造。这些方法与实例5中描述的方法类似。简而言之，向NSG小鼠在第-24天皮下注射VEGF-C晶胶(0.25mg/ml锂皂石)，并且在第-14天注射人PBMC。在第0天，向小鼠皮内注射：1)游离病毒和具有起始物构建体2的MSP(称为游离病毒组)，2)具有病毒的MSP和具有起始物构建体2的MSP(称为MSP-病毒组)，或3)PBS和具有起始物构建体2的MSP(称为PBS组)。第四组小鼠在第-24天接受空白晶胶，第0天接受游离病毒和空白MSP(称为游离病毒对照组)。前两组(游离病毒组和MSP-病毒组)被称为全组合组或接受全组合治疗的组。将病毒剂量从4e6 TU(实例5，图34A)增加到1.1e7 TU(实例6，图42A)。

如图42B所述，人CD45循环细胞的数量随着时间的推移而增加。与对照小鼠(虚线框、灰色三角形、白色菱形)相比，全组合治疗(实线框、白色和黑色圆圈)进一步促进了T细胞扩增，尤其是CD8+T细胞。与实例5中描述的研究(在VEGF-C注射后17天以及在PBMC注射后7天注射病毒)不同，在这项新的研究中，病毒注射被推迟到VEGF-C注射后24天和PBMC注射后14天。这种修改导致CART细胞的产生更一致，这可能是由于在较晚的时间点(第24天)，VEGF-C晶胶植入物周围的T细胞密度更高。

如图43A所示，与对照小鼠(虚线框，灰色三角形、白色菱形)相比，在用全组合治疗(实线框，白色和黑色圆圈)处理的小鼠中体内产生的人CD3+CAR+T细胞数量随着时间的推移增加，特别是CD8表型的CAR-T细胞。与PBS对照组相比，观察到随着时间的推移，对应于CAR-T细胞数量的增加而循环中B细胞数量减少(图43B，上分图)。MSP-病毒组和游离病毒组的表现相似，而游离病毒对照组(图43B，下分图)也显示出部分B细胞耗减，尽管其程度与全组合组不同。事实上，来自游离病毒对照组的小鼠中循环的CAR-T细胞数量并没有全组合组的数量多。

与实例5中描述的结果一致，这项新研究还显示CAR-T细胞扩增与血液(图44A)和脾(图44B)中的B细胞耗减之间存在强相关性。虽然游离病毒对照组在循环中显示出中等水平的B细胞耗减(图44A)，但这种对照处理并没有导致脾中有效的B细胞耗减(图44B)。CAR-T细胞(特别是来自CD8表型)的存在，对应于经处理的小鼠的脾(图45A-45B)和皮肤(图46A-46C)中的B细胞耗减。在皮肤中，如通过淋巴内皮细胞(LEC)的数量测量，CART细胞扩增还与淋巴管生成相关(图46D)。

总之，这项研究表明，本文所述的体内CART制造方法可用于产生功能性CARTs，其扩增与B细胞耗减相关。

实例7：使用MSP共递送病毒和起始物。

该实例研究了使用相同的MSP共递送病毒和起始物。简单地说，将MSP与编码GFP的慢病毒载体和起始物构建体1同时共孵育(表20，图48A)。在共孵育和洗涤之后，将装载病毒和起始物的MSP在与T细胞孵育之前在96孔平底板中连续稀释。如图47所示，使用MSP共递送病毒和起始物导致初级泛T细胞中成功的转基因表达。

实例8：起始物分子的产生

该实例描述了包含抗CD3结合结构域和共刺激分子结合结构域的多特异性分子的产生。在一些实施例中，共刺激分子结合结构域与CD28、CD2、CD25、CD27、IL6Ra、IL6Rb、ICOS、或41BB结合。这种分子被称为起始物分子。

产生了抗CD3 x抗CD28或抗CD3 x抗CD2双特异性抗体及其多聚体缀合物的多种构型。这些分子的示意图在图48A-48B中提供(构建体1-17，也称为F1至F17；第一代起始物分子)。构建体1-17及其结合结构域的序列在表19和表20中披露。

产生第二代起始物分子以测试靶向不同共刺激分子(例如，CD25、IL6Rb、CD27、41BB、ICOS或CD2)的结合物。还比较了不同的抗CD3结合物(基于抗CD3(1)或抗CD3(2)的结合物)。所有第二代起始物分子(图49A)均具有图49B所示的构型。第二代起始物分子的不同结合物的序列可以在表19中找到。

不希望受理论束缚，减少起始物分子与FcR的结合可以减少或防止T细胞对FcR表达细胞的不需要的杀伤。第三代起始物分子是通过在IgG1 Fc区中引入D265A/N297A/P329A取代(根据Kabat的EU编号)(“DANAPA”)产生的。此外，还比较了不同的抗CD3结合物(基于抗CD3(1)、抗CD3(2)、或抗CD3(3)的结合物)和不同的抗CD28结合物(基于抗CD28(1)或抗CD28(2)的结合物)(图50A)。所有第三代起始物分子均具有图50B所示的构型。第三代起始物分子及其结合结构域的序列在表19和表20中发现。

起始物分子被证明可以介导T细胞被编码CAR的慢病毒载体转导。

例如，在PCT/US 2021/019889(将其通过引用以其全文并入本文)的实例16-19和22-23中披露了用于测定起始物活性的示例性方法。

实例J：起始物分子在体内CART制造中的用途

本实例描述了用于在体内CART制造中使用的起始物分子的表征。该起始物分子是包含与抗CD3 scFv融合的抗CD28抗体的抗CD3/抗CD28双特异性分子(图51A)。该起始物分子包含含有SEQ ID NO:726的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:728的氨基酸序列的轻链。起始物分子的Fc区包含L234A/L235A/S267K/P329A突变，其根据Eu编号系统进行编号。

在第一体外研究中，测试了起始物分子在经由MSP递送时介导T细胞激活和转导的能力。简而言之，将分离的T细胞解冻并以1e6个细胞/mL重悬于无血清的T细胞培养基(具有100单位/mL的IL2)中，然后添加到96孔板中。将每批20mg的MSP以30mg/mL重悬于杜氏PBS(Dulbecco’s PBS)(赛默公司(Thermo)：目录号14190144)中，并将1.5mg的MSP(或等体积的DPBS)添加到Eppendorf管中。向相同的Eppendorf管中添加2.1μg的起始物。将慢病毒在冰上解冻并用DPBS稀释至1.4e8 TU/mL，然后将7e7 TU的病毒添加到上述每个管中。将混合物在4℃孵育一小时后，在施用于铺板的T细胞之前，将这些混合物用T细胞培养基连续稀释。将组分与T细胞共培养三天，然后使用流式细胞术评估T细胞激活和转导。

在与T细胞体外共培养之前，将两批独立产生的MSP装载慢病毒和起始物分子。与分子的可溶性递送相比，递送与MSP结合的起始物分子增强了激活和转导，特别是在更稀的条件下(图51B和51C)。将MSP-病毒-起始物复合物与T细胞共培养三天，然后进行流式细胞术分析，以检查CD25表达(作为激活读数)(图51B)以及GFP表达(以测量转导)(图51C)。数据显示，与任何一批MSP形成的复合物都能够激活T细胞并介导T细胞转导。值得注意的是，用MSP激活和转导显示出钟形应答。不希望受理论束缚，T细胞培养物中高浓度的MSP会对T细胞活力产生负面影响，并随后会阻碍激活和转导效率。

第二体外研究测试了通过超声处理或珠均质化减小MSP的尺寸是否会影响MSP性能。将分离的T细胞解冻并以1e6个细胞/mL重悬于无血清的T细胞培养基(具有100单位/mL的IL-2)中，然后添加到96孔板中。将60mg的MSP以30mg/mL重悬在DPBS中。一部分MSP溶液通过珠均质化减小尺寸。此外，将30mg的MSP以5mg/mL浓度重悬于无菌水中，然后使用Q125系统(qSonica)超声探头以40％的振幅超声处理两分钟(以15秒间隔进行超声处理，休息30秒)。超声处理后，将MSP离心以吸出水并以30mg/mL重悬于DPBS中。将1.5mg的全尺寸或尺寸减小的MSP添加到新的Eppendorf管中，并将等体积的DPBS添加到单独的Eppendorf管中作为可溶性病毒对照。然后，将1.6μg的起始物分子添加到MSP或DPB中，之后添加8e7 TU的解冻病毒。将混合物在4℃孵育一小时，之后用T细胞培养基连续稀释，并添加至铺板的T细胞。将组分与T细胞共培养三天，然后使用流式细胞术评估T细胞激活和转导。

将编码GFP的慢病毒和起始物分子装载到全尺寸或尺寸减小的MSP上，其中使用MSP的珠均质化或超声处理实现尺寸减小。将MSP-病毒-起始物复合物与T细胞共培养三天，然后针对CD25表达(激活)和GFP表达(转导)进行流式细胞术分析。MSP的尺寸减小不会对T细胞激活(图52A)和转导(图52B)的体外效力产生负面影响，并且超声处理的MSP在所测试的MSP条件下表现出最大的峰值转导效率。

接下来，进行了体内研究(图53A)，以检查起始物分子在体内CART制造中的用途。简而言之，在第-16天注射装载VEGF-C的晶胶(图53A中的“可注射物1”)，随后在第-14天注射20e6个人PBMC。14天后，将共装载于MSP上的编码CD19 CAR的病毒和起始物分子的不同组合(图53B中的“可注射物2”)进行皮内注射在晶胶位置上方。对每周采血的血液进行流式细胞术分析，并评估淋巴细胞群的扩增。在第18天，对具有显著的CAR-T扩增的小鼠实施安乐死，将循环的淋巴细胞经由心脏穿刺收集，针对CAR％和细胞计数进行分析，在各组内汇集，并过继转移到4天前接受1e6个NALM6细胞激发的小鼠中。对肿瘤进行每周采血和每两周一次发光成像直至研究结束。本研究的目的是1)阐明每种可注射物中单一组分的必要性，以及2)证明体内制造的CAR-T控制肿瘤负担的能力。

如图53C所示，当过继转移到携带NALM6肿瘤的小鼠时，体内制造的CAR-T能够识别其靶CD19受体并耗减这些小鼠的B细胞。如图53D所示，与未治疗的NALM6肿瘤(图53D中的“NALM6”)相比，用来自没有CART的供体小鼠的转移的PBMC治疗的肿瘤(图53D中的“PBMC对照”)显示出相当的生长动力学。用使用游离病毒(图53D中的“游离病毒”)或MSP递送的病毒(图53D中的“MSP病毒”)制造的3e5 CAR-T剂量治疗的小鼠显示降低的肿瘤负荷。这些数据表明，体内产生的CART在体内表现出较强的抗肿瘤活性。

此外，还研究了体内产生的CART在循环中的扩增。在晶胶部位皮内注射可注射物2后13天，使用VEGF-C晶胶、病毒(MSP递送或游离)和MSP-起始物的组合治疗的小鼠显示出相当的CART，表现为总循环的T细胞中相似的CAR百分比(图53E)和血液中CART细胞的相似计数/μl(图53F)。未经全治疗组合治疗的小鼠表现出较低水平的CAR-T数和CAR+百分比(图53E和53F)。

皮内注射可注射物2后18天，与使用MSP递送的起始物和游离病毒组合治疗的小鼠相比，尽管循环的T细胞的量相似(图53H)，但使用共装载到MSP上的病毒和起始物治疗的小鼠具有更高的CAR-T数(图53I)和CAR+％(图53J)。第18天的数据用于确定汇集血淋巴细胞后的CAR+细胞数量，以确定施用到携带Nalm6肿瘤的小鼠中的细胞数量。

图53K和53L显示了对用于过继转移的小鼠和参加研究的其余小鼠的血液进行组合流式细胞术分析的结果。各组之间没有观察到循环T细胞数量的显著差异(图53K)。可注射物1和可注射物2的全组合诱导了循环中CART的最高绝对计数(图53L)。

实例K：HA-水凝胶用于持续释放VEGF-C的用途

本实例描述了透明质酸(HA)-水凝胶用于持续释放VEGF-C蛋白以实现注射部位的淋巴管生成和T细胞定位的用途。

实例1：透明质酸的官能化

此实例描述了叠氮化物官能化的透明质酸的合成，该透明质酸与交联部分反应以形成水凝胶。

透明质酸中间体[HA-N₃]的合成

透明质酸钠盐是一种线性聚合物，由葡糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺的重复二聚体单元组成，其中重复单元分子量为401.3Da。在此实例中，报告的透明质酸的摩尔数是指重复单元的摩尔数，并且相对于透明质酸的重复单元的摩尔数报告与透明质酸反应所用的试剂的当量。聚合物的平均分子量决定了每条聚合物链的重复单元的平均数。透明质酸钠盐获得自供应商生命中心生物医学公司(Lifecore Biomedical)，标签为HA700K-5，标称平均分子量为700kDa，并且各批次可能有所不同。

700KD[HA-N₃]-16％的合成

将透明质酸钠盐溶液(标称平均分子量700kDa；258.9mg，0.62mmol；生命中心生物医学有限责任公司(Lifecore Biomedical,LLC)；产品编号HA700K-5)完全溶解于37.5mL的MES缓冲液(50mM，pH5.5)中。向溶液中添加4-(4’，6’-二甲氧基-1’,3’,5’-三嗪-2’-基)-4-甲基吗啉-4-鎓氯化物(DMTMM，298.1mg，1.077mmol，1.736当量)，随后在5min后添加11-叠氮基-3，6，9-三氧杂十一-1-胺(201mg，0.921mmol)。将反应搅拌过夜。将粗反应混合物填充到透析膜(MWCO 50kDa)中，并且对0.25M NaCl透析1-3天，更换几次透析溶液，随后对去离子水进行1-3天的透析，也多次更换透析液。完成后，将样品从透析管中取出，快速冷冻，并且冻干以得到700kDa[HA-N₃]-16％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ4.45(bs,1.71H),4.0–3.1(m,16H),1.95(s,3H)。

DOSY-NMR。在带有5mm DCH冷冻探针的Bruker AVANCE III 400MHz(¹H-NMR)仪器上，使用具有一个破坏梯度脉冲序列(stegp1s1d)的受激回波收集一维扩散序NMR谱(DOSY)。扩散时间和扩散梯度时间分别设定为50ms和4ms。收集了两个光谱，梯度强度(gpz6)分别设定为2％和95％。这两个光谱的比较显示除了溶剂峰外没有差异，表明在聚合物中不存在小分子杂质。

经纯化的样品的元素分析显示出以下元素含量-C38.9％：H：5.42％；N：4.85％。

[HA-N₃]的取代度定义为其中的羧酸酯部分已经发生反应以给出所描绘的酰胺的重复单元的百分比。元素分析用于确定取代度。将通过经纯化的样品的元素分析确定的[％C/％N]比率输入以下公式以提供取代度。其中y＝[(％C)/(％N)]，则：

取代度＝

在此实例中，[HA-N₃]的取代度(DS)是16％。

将用16％的叠氮化物接头官能化的此700kDa的透明质酸标记为700kDa[HA-N₃]-16％。

200KD[HA-N₃]-24％的合成

在另一方面，如上文实例1所述，将透明质酸钠盐(标称平均分子量200kD)进行反应。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ4.45(bs,2H),4.0–3.1(m,18H),1.95(s,3H)。

元素分析：C：39.94％：H：5.53％；N：5.73％。

在剩余的实例中，将用X％的叠氮化物接头官能化的700kDa和200kDa的透明质酸分别标记为700kDa[HA-N₃]-X％和200kDa[HA-N₃]-X％。

也可以通过切向流过滤纯化[HA-N₃]中间体。将反应混合物用25mL的0.25M NaCl溶液稀释并且通过切向流过滤纯化。使用30kDa MWCO Vivaflow-50R Hydrosart滤筒(赛多利斯公司(Sartorius))进行切向流过滤(用400mL的0.25M NaCl溶液洗脱，然后用400mL水洗脱)。将产品快速冷冻并且冻干以获得最终产物。

实例2：交联剂(XL)的合成

XL-1合成

XL-1a.PEG(2000)-双-3-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基丙酸酯

将3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸(0.152g，0.75mmol)和Mn约2kDa的PEG(0.5g，0.250mmol)溶解于15mL二氯甲烷中。添加二甲基氨基吡啶(0.015g，0.125mmol)和EDC·HCl(0.192g，1.003mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过在二氧化硅上，用0–15％二氯甲烷:甲醇梯度的快速柱色谱，将该粗产物进行纯化。将包含产物的级分合并，并减压至干燥，以提供XL-1a。¹H NMR

(400MHz,甲醇-d4)δ4.23(m,4H),3.63(m,170H),3.22(m,4H)2.66(m，2H)，1.43(s,18H),1.13(m,6H)。

XL-1b.PEG(2000)-双-[甲基-3-氨基-2-甲基丙酸酯],双-三氟乙酸

将XL-1a(260mg，0.108mmol)溶解于二氯甲烷(3mL)中。添加三氟乙酸(0.415mL)，并且将反应混合物在室温搅拌4h。将溶剂在减压下除去。将该粗产物用Et₂O研磨两次，然后在真空下干燥，以提供XL-1b。¹H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.45(m,2H),4.22(m,2H),3.59(m,177H),3.12(m,4H),2.87(m,2H),1.22(m,6H)。

XL-1.PEG(2000)-双3-(((((1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-甲基丙酸酯

将XL-1b(200mg，0.086mmol)溶解于乙腈(3mL)中。添加三乙胺(0.599mL，4.30mmol)，随后添加((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(200mg，0.688mmol)，并将该反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物通过制备型反相HPLC与ELSD引发的级分收集直接纯化(方法如下)。将包含产物的级分合并，冷冻并冻干，以提供XL-1。出于储存目的，将XL-1作为乙腈、DMSO或甲醇溶液保存在冰箱中。分析型HPLC-CAD(方法如下)：保留时间＝2.75min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ4.23(m，4H)，4.14(m，4H)，3.63(m,188H),2.68(m,2H),2.22(m,12H),1.60(m,4H),1.37(m,2H),1.14(m,6H),0.94(m，4H)。

XL-2合成

将Mn约2kDa的PEG二胺盐酸盐(键凯科技公司(JenKem Technology)，300mg，0.148mmol)溶解于乙腈(3mL)中。添加三乙胺(0.413mL，2.96mmol)，随后添加((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(345mg，1.184mmol)，并将该反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物通过制备型反相HPLC与ELSD引发的级分收集直接纯化(方法如下)。将包含产物的级分合并，冷冻并冻干，以提供XL-2。出于储存目的，将XL-2作为乙腈、DMSO或甲醇溶液保存在冰箱中。分析型HPLC-CAD(方法如下)：保留时间＝2.61min。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.14(m,4H),3.63(br s,186H)，3.54(m,4H),2.22 15(m,12H),1.61(m,4H),1.38(m,2H),0.94(m,4H)。

制备型HPLC条件：Waters XBridge C18；粒径：5μm；柱尺寸：19×250mm；洗脱剂/梯度：5％ CH₃CN/H₂O/0.5min，5％-95％CH3CN/H2O/12.5min，95％ CH₃CN/H₂O/3min；流速：30mL/min；柱温：室温。

分析型HPLC-CAD条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18；粒径：1.7μm；柱尺寸：2.1×50mm；洗脱剂/梯度：2％ CH₃CN/H₂O/0.5min，2％-98％ CH₃CN/H₂O/5min(含有0.1％甲酸的CH₃CN和含有0.1％甲酸的H₂O)；流速：1mL/min；柱温：50℃。

实例3：用于体外和体内研究的HA-水凝胶配制品的制备

将实例2中制备的交联剂溶液(50mg/mL)在减压下干燥以除去ACN(乙腈)。将相同量的1X PBS添加到干燥残余物中，以在1X PBS缓冲液中得到50mg/mL浓度的交联剂。将这种新鲜制备的溶液用于制备用于体外和体内研究的配制品。

H1a.原位形成性HA-水凝胶合成

将200kDa[HA-N3]-24％(122.4mg，取代度＝24％)溶解于7.26mL1×PBS缓冲液(pH7.4)(16.9mg/mL，以重量浓度表示)中，并且在室温避光下搅拌过夜。未经取代的羧酸钠盐重复二聚体单元的分子量是401.3Da。叠氮化的重复二聚体单元的MW是579.6Da。200kDa[HA-N₃]-24％钠盐形式的二聚体单元的平均MW是444.1Da＝((401.3×0.76)+(579.6×0.24))。使用钠盐二聚体单元的平均MW，重复二聚体单元的总摩尔数是276μmol，并且叠氮化的重复二聚体单元的摩尔数是66.2μmol。从储备液等分200μL的200kDa HA-N₃ -24％(3.38mg，7.61μmol)，并且通过添加10.4μl的XL-2交联剂(0.52mg，0.221μmol的试剂，0.442μmol的反应官能度，50mg/mL于1X PBS中)进行凝胶化。这产生了具有预测的由XL-2交联的6.7％的200kDa[HA-N₃]-24％重复单元((0.442μmol[XL-2-反应官能度]/66.2μmol[HA单元])×100＝6.7％)的溶液。将混合物涡旋，并将混合溶液的50μl等分试样快速添加到Eppendorf管中，并在室温储存过夜。第二天，目视检查显示H1a凝胶形成。

H2a水凝胶合成

将VEGF-C蛋白与200kDa[HA-N₃]-24％溶液混合，并用如上所述的交联剂XL-2进行凝胶化反应以制备H2a凝胶。

H3a水凝胶合成

将VEGF-C蛋白与200kDa[HA-N₃]-24％溶液混合，并用2X量的如上所述的交联剂XL-1进行凝胶化反应以制备H3a凝胶。

H4a水凝胶合成

将VEGF-C蛋白与700kDa[HA-N₃]-16％溶液混合，并用2X量的如上所述的交联剂XL-2进行凝胶化反应以制备H4a凝胶。

H5a水凝胶合成

将VEGF-C蛋白与锂皂石XLG(BYK添加剂)复合，然后添加到700kDa[HA-N₃]-16％溶液中，最终凝胶中锂皂石浓度为0.25mg/mL。用2X量的如上所述的交联剂XL-2进行凝胶化反应以制备H5a凝胶。

H6a水凝胶合成

将VEGF-C蛋白与锂皂石XLG(BYK添加剂)复合，然后添加到700kDa[HA-N₃]-16％溶液中，最终凝胶中锂皂石浓度为1mg/mL。用2X量的如上所述的交联剂XL-2进行凝胶化反应以制备H6a凝胶。

H3b.HA水凝胶颗粒合成

将200μL的如上所述制备的H3a凝胶压迫穿过100目不锈钢筛网盘到1mL注射器中，从而得到粗凝胶颗粒。将100μL的1×PBS添加到该注射器中，随后涡旋以混合。将注射器保持在室温下6h以允许水凝胶溶胀。压迫H3a的溶胀的粗凝胶颗粒通过200目不锈钢筛网盘20次，从而产生细凝胶颗粒以得到H3b产物。

H5b水凝胶合成

将H5a凝胶挤压成细凝胶颗粒以得到最终的H5b产物。

H6b水凝胶合成

将H6a凝胶挤压成细凝胶颗粒以得到最终的H6b产物。

体外释放研究设置

将950μl PBS-2％BSA缓冲液添加到水凝胶的50μL等分试样中，并且在300rpm振荡下，在37℃孵育。在不同的时间点取出800μl等分试样，并且在这些时间点没有去除凝胶。用相同量的1X PBS-2％BSA缓冲液补充研究样品，以保持研究样品的体积相同。然后用ELISA分析释放样品的VEGF-C含量。

体内研究设置

将用于制备H3a凝胶的所有组分混合后，将管涡旋并迅速填充到胰岛素注射器的背面。将样品用柱塞推入注射器内，并除去形成的任何气泡。在混合的2-3分钟内将30μL皮内注射到小鼠中。

结果

使用HA-水凝胶的不同组合物在体外实现了VEGF-C的持续释放(图54A-54D)。对于用700kDa[HA-N₃]-16％和200kDa[HA-N₃]-24％制备的HA-水凝胶而言，没有观察到释放曲线方面的差异(图54A)。可以通过添加锂皂石来调节HA-水凝胶配制品中VEGF-C的释放。与不含锂皂石的配制品相比，含有锂皂石的HA-水凝胶配制品提供了浓度依赖性的较慢的VEGF-C蛋白释放(图54B)。含有锂皂石的原位形成性水凝胶和HA-水凝胶颗粒提供了VEGF-C蛋白的相似的释放曲线(图54C和54D)。

向小鼠皮内注射H1a和H3a原位形成性水凝胶进行体内研究。与对照(H1a)配制品相比，含有VEGF-C的配制品(H3a)在第7天分析后显示淋巴管内皮细胞(LEC)和T4细胞的增加(图55A和55B)。

等同物

本文引用的每一个专利、专利申请和出版物的披露内容据此通过引用以其全文并入本文。虽然已经参照某些实施例披露了本发明，但是本领域其他技术人员可以在不偏离本发明的真实精神以及范围的情况下设想本发明的另外的实施例以及变化。所附权利要求旨在理解为包括所有这类实施例以及等同变化。

Claims (54)

1.多种组合物，所述组合物包含：

第一组合物，所述第一组合物包含：

生物材料和细胞募集因子；以及

第二组合物，所述第二组合物包含：

病毒载体。

2.一种第一组合物，所述第一组合物包含：

生物材料和细胞募集因子，

其中所述生物材料包含水凝胶，例如，晶胶(例如，海藻酸盐晶胶)或透明质酸水凝胶(HA水凝胶)，并且

其中所述细胞募集因子包含根据SEQ ID NO:741的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:741的位置26处的氨基酸不是半胱氨酸(C)，任选地其中SEQ ID NO:741的位置26处的氨基酸是丙氨酸(A)。

3.一种体内转导受试者的细胞或治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括：

向所述受试者的部位(例如，高皮下间隙或与真皮相邻的皮下间隙)施用生物材料和细胞募集因子，以及

向所述受试者施用包含转基因的病毒载体或核酸；从而用所述转基因转导所述受试者的细胞。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述生物材料和所述细胞募集因子包含在第一组合物中，并且所述病毒载体或核酸包含在第二组合物中。

5.如权利要求1所述的多种组合物，或如权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述生物材料：

(i)包含水凝胶；

(ii)包含晶胶，例如，海藻酸盐晶胶；

(iii)包含透明质酸水凝胶(HA水凝胶)；

(iv)包含明胶、透明质酸、胶原蛋白、海藻酸盐、层粘连蛋白、壳聚糖、丝纤蛋白、琼脂糖、聚(乙二醇)、聚乙烯醇、和/或羟乙基甲基丙烯酸酯；

(v)包含海藻酸盐水凝胶，任选地其中所述海藻酸盐水凝胶进一步包含降冰片烯和/或四嗪，任选地其中所述降冰片烯和/或四嗪共价地与所述海藻酸盐缔合，例如，与其化学连接，或非共价地与其缔合，例如，吸附在其上；和/或

(vi)包含直径为约10μm至约300μm之间，例如，约50μm至约300μm之间的孔，或无孔；和/或

(vii)是化学交联的。

6.如前述权利要求中任一项所述的多种组合物、第一组合物、或方法，其中包含所述生物材料的所述第一组合物进一步包含锂皂石；或其中所述生物材料包含在进一步包含锂皂石的第一组合物内；任选地其中所述锂皂石以约0.15mg/mL至约0.35mg/mL，例如，约0.25mg/mL的浓度存在。

7.如前述权利要求中任一项所述的多种组合物、第一组合物、或方法，其中所述细胞募集因子：

(i)非共价地与所述生物材料缔合，例如，吸附在其上；或

(ii)共价地与所述生物材料缔合，例如，与其缀合。

8.如前述权利要求中任一项所述的多种组合物、第一组合物、或方法，其中所述细胞募集因子：

(i)诱导淋巴管生成；

(ii)诱导淋巴内皮细胞的生长；和/或

(ii)募集免疫细胞，任选地其中所述免疫细胞包含T细胞和/或NK细胞。

9.如权利要求8所述的多种组合物、第一组合物、或方法，其中淋巴管生成的诱导：

(i)包括淋巴内皮细胞(LEC)(例如，CD45-CD31+PDPN+细胞)水平的增加，任选地其中当通过测定法，例如，流式细胞术测定，例如，如实例H或I中所述测量时，与参考水平(例如，在注射所述多种组合物或所述第一组合物之前受试者的部位的LEC水平)相比，LEC水平增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、或200％；和/或

(ii)当通过测定法，例如，流式细胞术测定，例如，如实例H或I中所述测量时，每毫克的组织产生至少50个LEC(例如，至少75、100、125、150、200、225、或250个LEC)。

10.如前述权利要求中任一项所述的多种组合物、第一组合物、或方法，其中所述细胞募集因子募集T细胞，任选地其中所述T细胞包含初始T细胞(例如，CD45RA+CD62L+T细胞或CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+T细胞)。

11.如权利要求10所述的多种组合物、第一组合物、或方法，其中T细胞的募集包括T细胞水平的增加，任选地其中当通过测定法，例如，流式细胞术测定，例如，如实例H或I中所述测量时，与参考水平(例如，在注射所述多种组合物或所述第一组合物之前受试者的部位的T细胞水平)相比，T细胞水平增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、或300％。

12.如权利要求1或5-11中任一项所述的多种组合物，或如权利要求3-11中任一项所述的方法，其中所述细胞募集因子选自VEGF-C、IL-2、IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、GM-CSF、CXCL12、CXC3L1、CCL19、CCL21、CXCL10、或CXCL11。

13.如权利要求1或5-12中任一项所述的多种组合物，或如权利要求3-12中任一项所述的方法，其中所述细胞募集因子包含VEGF-C，任选地其中所述VEGF-C：

(i)包含成熟VEGF-C肽，任选地次要或主要成熟形式或其突变变体；

(ii)是单体或二聚体；和/或

(iii)以有效量，任选地，以小于或约1mg、小于或约10mg、大于或约10μg、大于或约1μg、约1μg与1mg之间、约10μg与1mg之间、约1μg与10mg之间、或约10μg与10mg之间的量存在。

14.如权利要求13所述的多种组合物或方法，其中所述VEGF-C包含：

(i)表18中提供的序列中的任一个的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列，任选地其中所述序列包含或不包含接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)和/或his标签；和/或

(ii)根据SEQ ID NO:725进行编号的C137A的氨基酸取代。

15.如权利要求1或5-14中任一项所述的多种组合物，或如权利要求3-14中任一项所述的方法，其中所述细胞募集因子包含：

(i)根据SEQ ID NO:741的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:741的位置26处的氨基酸不是半胱氨酸(C)，任选地其中SEQ ID NO:741的位置26处的氨基酸是丙氨酸(A)；

(ii)根据SEQ ID NO:743的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的序列氨基酸序列；

(iii)根据SEQ ID NO:740的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列；

(iv)根据SEQ ID NO:736的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列；

(v)接头，例如，其中所述接头具有Gly-Ser的序列，其中任选地所述接头在SEQ ID NO:743或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的序列的C末端；

(vi)根据SEQ ID NO:735的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列；

(vii)根据SEQ ID NO:734的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列；和/或

(viii)根据SEQ ID NO:733的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列。

16.如权利要求1或5-15中任一项所述的多种组合物，或如权利要求3-15中任一项所述的方法，其中所述细胞募集因子包含VEGF-C或其功能性变体；IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))或其功能性变体；IL-7或其功能性变体；或其组合。

17.如权利要求1或5-16中任一项所述的多种组合物，或如权利要求4-16中任一项所述的方法，其中所述第二组合物进一步包含颗粒。

18.如权利要求17所述的多种组合物或方法，其中所述颗粒是介孔颗粒、二氧化硅颗粒和/或介孔二氧化硅颗粒，任选地其中所述介孔二氧化硅颗粒是介孔二氧化硅棒。

19.一种第二组合物，所述第二组合物包含：

介孔二氧化硅颗粒；

病毒载体；以及

细胞活化剂。

20.如权利要求18所述的多种组合物或方法，或如权利要求19所述的第二组合物，其中所述介孔二氧化硅颗粒：

(i)包含表面修饰，任选地其中所述表面修饰包含：

(a)-OH(羟基)、胺、羧酸、膦酸酯、卤化物、叠氮化物、炔、环氧化物、巯基、聚乙烯亚胺、疏水部分、或其盐，任选地使用C₁至C₂₀烷基或(-O(CH2-CH₂-)_1-25接头；

(b)伯胺、仲胺、叔胺或季胺；和/或

(c)如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量，具有约1000至20,000Da、约1,200至15,000Da、约1,500至12,000Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约6,000Da、约7,000Da、约8,000Da、约9,000Da、或约10,000Da的平均分子量的聚乙烯亚胺；

(ii)是三甲基铵官能化的介孔二氧化硅颗粒，例如，N,N,N-三甲基丙-1-铵官能化的介孔二氧化硅颗粒；

(iii)包含多个孔，任选地其中所述孔的直径为2-50nm之间；和/或

(iv)包含至少约100m²/g的表面积。

21.如权利要求1、5-18、或20中任一项所述的多种组合物、如权利要求19或20所述的第二组合物、或如权利要求3-18或20中任一项所述的方法，其中：

(i)所述病毒载体非共价地，例如静电地，或共价地与所述介孔二氧化硅颗粒缔合；和/或

(ii)所述细胞活化剂非共价地或共价地与所述介孔二氧化硅颗粒缔合。

22.一种体内转导受试者的细胞或治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括：

向所述受试者的部位施用包含转基因的病毒载体或核酸，

其中所述受试者先前已经被以足以诱导淋巴管生成和/或募集T细胞到所述受试者的所述部位的量施用生物材料和细胞募集因子；

从而转导所述细胞。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述病毒载体非共价地，例如静电地，或共价地与颗粒，例如介孔二氧化硅颗粒缔合。

24.如权利要求1、5-18、或20-21中任一项所述的多种组合物、如权利要求19-21中任一项所述的第二组合物、或如权利要求3-18或20-23中任一项所述的方法，其中所述病毒载体包含：

(i)慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、或疱疹病毒；和/或

(ii)含有重组多核苷酸的表达载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。

25.如权利要求24所述的多种组合物、第二组合物、或方法，其中所述核苷酸序列编码：嵌合抗原受体(CAR)、工程改造的TCR、细胞因子、趋化因子、shRNA、或经工程改造以靶向肿瘤抗原的多肽。

26.如权利要求25所述的多种组合物、第二组合物、或方法，其中所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、以及其任何组合。

27.如权利要求1、5-18、20-21、或24-26中任一项所述的多种组合物、如权利要求19-21或24-26中任一项所述的第二组合物、或如权利要求3-18或20-26中任一项所述的方法，其中所述病毒载体编码CAR，所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和信号传导结构域，其中：

(i)所述抗原结合结构域结合抗原，所述抗原选自由以下组成的组：CD19、CD123、CD22、CD20、EGFRvIII、BCMA、间皮素、CD33、CLL-1、及其任何组合；

(ii)所述跨膜结构域包含CD8铰链；

(iii)所述共刺激信号传导区域选自4-1BB或CD28共刺激信号传导结构域；和/或

(iv)所述信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域。

28.如权利要求1、5-18、20-21或24-27中任一项所述的多种组合物，或如权利要求4-18或20-27中任一项所述的方法，其中所述第二组合物进一步包含细胞活化剂。

29.如权利要求28所述的多种组合物或方法，如权利要求19-21或24-27中任一项所述的第二组合物，其中所述细胞活化剂：

(a)包含刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激共刺激分子和/或生长因子受体的药剂；

(b)是多特异性结合分子，所述多特异性结合分子包含：(i)抗CD3结合结构域，以及(ii)共刺激分子结合结构域(例如，抗CD2结合结构域或抗CD28结合结构域)；

(c)表20中提供的任何重链的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和/或表20中提供的任何轻链的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和/或

(d)与所述颗粒，例如介孔二氧化硅颗粒缀合，或吸附在其上。

30.如权利要求29所述的多种组合物、方法、或第二组合物，其中：

(i)所述抗CD3结合结构域，例如抗CD3 scFv位于所述共刺激分子结合结构域，例如抗CD2 Fab或抗CD28 Fab的N末端；或

(ii)所述抗CD3结合结构域，例如抗CD3 scFv位于所述共刺激分子结合结构域，例如抗CD2 Fab或抗CD28 Fab的C末端，任选地其中：

Fc区位于所述抗CD3结合结构域和所述共刺激分子结合结构域之间；或

所述多特异性结合分子包含CH2，且所述抗CD3结合结构域位于所述CH2的N末端。

31.如权利要求29或30所述的多种组合物、方法、或第二组合物，其中所述多特异性结合分子包含：

(i)从N末端至C末端包含以下的第一多肽：所述抗CD3结合结构域的VH、所述抗CD3结合结构域的VL、所述共刺激分子结合结构域的VH、CH1、CH2、和CH3；以及

(ii)从N末端至C末端包含以下的第二多肽：所述共刺激分子结合结构域的VL、和CL。

32.如权利要求29或30所述的多种组合物、方法、或第二组合物，其中所述多特异性结合分子包含：

(i)从N末端至C末端包含以下的第一多肽：所述共刺激分子结合结构域的VH、CH1、CH2、CH3、所述抗CD3结合结构域的VH、和所述抗CD3结合结构域的VL；以及

(ii)从N末端至C末端包含以下的第二多肽：所述共刺激分子结合结构域的VL、和CL。

33.如权利要求29或30所述的多种组合物、方法、或第二组合物，其中所述多特异性结合分子包含：

(i)从N末端至C末端包含以下的第一多肽：所述共刺激分子结合结构域的VH、CH1、所述抗CD3结合结构域的VH、所述抗CD3结合结构域的VL、CH2、和CH3；以及

(ii)从N末端至C末端包含以下的第二多肽：所述共刺激分子结合结构域的VL、和CL。

34.如权利要求29或30所述的多种组合物、方法、或第二组合物，其中所述多特异性结合分子包含Fc区，所述Fc区包含：

(i)L234A、L235A、S267K、和P329A突变(LALASKPA)，其根据Eu编号系统进行编号；

(ii)L234A、L235A、和P329G突变(LALAPG)，其根据Eu编号系统进行编号；

(iii)G237A、D265A、P329A、和S267K突变(GADAPASK)，其根据Eu编号系统进行编号；

(iv)L234A、L235A、和G237A突变(LALAGA)，其根据Eu编号系统进行编号；

(v)D265A、P329A、和S267K突变(DAPASK)，其根据Eu编号系统进行编号；

(vi)G237A、D265A、和P329A突变(GADAPA)，其根据Eu编号系统进行编号；

(vii)L234A、L235A、和P329A突变(LALAPA)，其根据Eu编号系统进行编号；或

(viii)表20中Fc区中的任一个的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。

35.如权利要求29、30或34所述的多种组合物、方法、或第二组合物，其中所述多特异性结合分子包含：

(i)重链，所述重链包含SEQ ID NO:726、893、或895中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和/或

(ii)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:728、730、892、或894中任一个的氨基酸序列，或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

36.如权利要求29、30、或34-35中任一项所述的多种组合物、方法、或第二组合物，其中所述多特异性结合分子包含：

(i)含有SEQ ID NO:726的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:728的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链；

(ii)含有SEQ ID NO:726的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:730的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链；

(iii)含有SEQ ID NO:1416的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:728的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链；

(iv)含有SEQ ID NO:1416的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:730的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链；

(v)含有SEQ ID NO:893的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:892的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链；

(vi)含有SEQ ID NO:1417的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:892的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链；或

(vii)含有SEQ ID NO:895的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:894的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链。

37.如权利要求1、5-18、20-21或24-36中任一项所述的多种组合物，或如权利要求4-18或20-36中任一项所述的方法，其中所述第二组合物进一步包含颗粒的第一群体和颗粒的第二群体，例如，介孔二氧化硅颗粒的第一群体和介孔二氧化硅颗粒的第二群体，其中所述第一群体包含所述病毒载体，并且所述第二群体包含细胞活化剂，例如，其中所述病毒载体非共价地与所述第一群体的颗粒缔合，并且所述细胞活化剂非共价地与所述第二群体的颗粒缔合。

38.如权利要求1、5-18、20-21、或24-37中任一项所述的多种组合物、如权利要求2或6-11中任一项所述的第一组合物、或如权利要求19-21、24-27、或29-36中任一项所述的第二组合物，其中所述第一或第二组合物适合于注射使用。

39.如权利要求1、5-18、20-21、或24-38中任一项所述的多种组合物、如权利要求2、6-11、或38中任一项所述的第一组合物、或如权利要求19-21、24-27、29-36、或38中任一项所述的第二组合物，其进一步包含：

(i)Tet2抑制剂，任选地其中所述Tet2抑制剂包含：(1)靶向编码Tet2的基因或其相应调控元件中的一个或多个位点的基因编辑系统；(2)抑制Tet2表达的核酸(例如，siRNA或shRNA)；(3)蛋白质(例如，显性负性，例如，无催化活性的)Tet2、或Tet2的结合配偶体(例如，Tet2的显性负性结合配偶体)；(4)抑制Tet2的表达和/或功能的小分子；(5)编码(1)-(3)中任一项的核酸；或(6)(1)-(5)的任何组合；和/或

(ii)ZBTB32抑制剂，任选地其中所述ZBTB32抑制剂包含：(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分；(2)编码所述基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；或(3)(1)和(2)的组合；在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含：(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分；在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含(2)编码所述基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含(1)和(2)的组合。

40.如权利要求3-18或20-37中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用：

(i)Tet2抑制剂，任选地其中所述Tet2抑制剂包含：(1)靶向编码Tet2的基因或其相应调控元件中的一个或多个位点的基因编辑系统；(2)抑制Tet2表达的核酸(例如，siRNA或shRNA)；(3)蛋白质(例如，显性负性，例如，无催化活性的)Tet2、或Tet2的结合配偶体(例如，Tet2的显性负性结合配偶体)；(4)抑制Tet2的表达和/或功能的小分子；(5)编码(1)-(3)中任一项的核酸；或(6)(1)-(5)的任何组合；和/或

(ii)ZBTB32抑制剂，任选地其中所述ZBTB32抑制剂包含：(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分；(2)编码所述基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；或(3)(1)和(2)的组合；在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含：(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分；在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含(2)编码所述基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含(1)和(2)的组合。

41.一种体内转导受试者的细胞或治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括施用如权利要求1、5-18、20-21、或24-39中任一项所述的多种组合物的所述第一组合物和所述第二组合物。

42.一种体内转导受试者的细胞或治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括施用如权利要求2、6-11、38、或39中任一项所述的第一组合物，和如权利要求19-21、24-27、29-36、或38中任一项所述的第二组合物。

43.如权利要求3-18、20-21、24-37、或40-42中任一项所述的方法，其中依次施用所述第一组合物和所述第二组合物。

44.如权利要求3-18、20-21、24-37、或40-43中任一项所述的方法，其中在施用所述第二组合物之前施用所述第一组合物，任选地其中：

(i)在施用所述第二组合物之前约1-4周，例如约2周施用所述第一组合物；或

(ii)在施用所述第二组合物之前至少两周施用所述第一组合物。

45.如权利要求3-18、20-21、24-37、或40-44中任一项所述的方法，所述方法进一步包括评估，例如测量来自所述受试者的样品(例如，来自或接近施用部位的样品)中的淋巴管生成，其中在施用所述第一组合物之后和/或施用所述第二组合物之前测量淋巴管生成，

任选地，其中测量淋巴管生成包括获取所述样品中淋巴内皮细胞(LEC)(例如，CD45-CD31+PDPN+细胞)的水平和/或活性的值。

46.如权利要求3-18、20-21、24-37、或40-45中任一项所述的方法，所述方法进一步包括评估，例如测量来自所述受试者的样品(例如，来自或接近施用部位的样品)中的T细胞的募集，其中在施用所述第一组合物之后和/或施用所述第二组合物之前测量T细胞的募集，

任选地，其中测量T细胞的募集包括获取所述样品中T细胞(例如，初始T细胞，例如CD45RA+CD62L+T细胞和/或CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+T细胞)的水平和/或活性的值。

47.如权利要求1、5-18、20-21、或24-39中任一项所述的多种组合物，用于在体内转导受试者的细胞或治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法中使用。

48.如权利要求2、6-11、38、或39中任一项所述的第一组合物，与如权利要求19-21、24-27、29-36、或38中任一项所述的第二组合物组合，用于在体内转导受试者的细胞或治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法中使用。

49.如权利要求19-21、24-27、29-36、或38中任一项所述的第二组合物，与如权利要求2、6-11、38、或39中任一项所述的第一组合物组合，用于在体内转导受试者的细胞或治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法中使用。

50.如权利要求3-18、20-37、或40-46中任一项所述的方法，其中：

(i)所述受试者患有或已经被诊断出患有疾病、障碍或病症；和/或

(ii)所述受试者是人。

51.如权利要求3-18、20-37、40-46、或50中任一项所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症包含：

(i)癌症；

(ii)血液癌症，任选地其中所述血液癌症包含白血病或淋巴瘤；

(iii)选自以下的血液癌症：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增殖性肿瘤、滤泡性淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症、脾脏边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变异、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链疾病、浆细胞性骨髓瘤、骨单发性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、淋巴结边缘区淋巴瘤、小儿淋巴结边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯尔曼病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或无法分类的淋巴瘤；

(iv)实体癌；或

(v)选自以下的实体癌：间皮瘤、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、食管腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、肾癌、肝癌、脑癌、胸腺瘤、肉瘤、恶性上皮肿瘤、子宫癌、肾脏癌、胃肠癌、尿路上皮癌、咽癌、头颈癌、直肠癌、食道癌或膀胱癌，或其转移癌中的一种或多种；

(vi)自身免疫性疾病，任选地其中所述病毒载体或核酸编码与B细胞抗原，例如CD19、CD20、CD22、CD123、FcRn5、FcRn2、BCMA、CS-1和CD138结合的CAR。

52.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1、5-18、20-21、或24-39中任一项所述的多种组合物的所述第一组合物和所述第二组合物。

53.如权利要求1、5-18、20-21、或24-39中任一项所述的多种组合物、如权利要求3-18、20-37、40-46、或50-51中任一项所述的方法、或如权利要求19-21、24-27、29-36、或38中任一项所述的第二组合物，其中所述病毒载体或所述核酸编码：

(i)与B细胞抗原结合的第一CAR和与(a)实体瘤抗原、(b)骨髓肿瘤抗原、或(c)非B细胞谱系的血液肿瘤的抗原结合的第二CAR；或

(2)CAR，所述CAR包含与B细胞抗原结合的第一结合结构域和与(a)实体瘤抗原、(b)骨髓肿瘤抗原、或(c)非B细胞谱系的血液肿瘤的抗原结合的第二结合结构域。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是实体瘤。