ES2905315T3 - Anticuerpos terapéuticos y sus usos - Google Patents

Anticuerpos terapéuticos y sus usos Download PDF

Info

Publication number
ES2905315T3
ES2905315T3 ES16714547T ES16714547T ES2905315T3 ES 2905315 T3 ES2905315 T3 ES 2905315T3 ES 16714547 T ES16714547 T ES 16714547T ES 16714547 T ES16714547 T ES 16714547T ES 2905315 T3 ES2905315 T3 ES 2905315T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
seq
bcma
cell
lymphoma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16714547T
Other languages
English (en)
Inventor
Tracy Chia-Chien Kuo
Riggers Javier Fernando Chaparro
Wei Chen
Amy Shaw-Ru Chen
Edward Derrick Pascua
Blarcom Thomas John Van
Leila Marie Boustany
Weihsien Ho
Yik Andy Yeung
Pavel Strop
Arvind Rajpal
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Inc
Original Assignee
Pfizer Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Inc filed Critical Pfizer Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2905315T3 publication Critical patent/ES2905315T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/69—Boron compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

Un anticuerpo biespecífico en el que el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo humano de longitud completa, que comprende un primer dominio variable de anticuerpo que se une específicamente a CD3 y un segundo dominio variable de anticuerpo que se une específicamente a BCMA, en el que el primer dominio variable de anticuerpo comprende: una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una CDR1 de VH que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 332; (ii) una VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 417; y (iii) una VH CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 335; y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 343; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 341; y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 342; y el segundo dominio variable del anticuerpo comprende: una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una CDR1 de VH que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 151; (ii) una VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 159; y (iii) una VH CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 155; y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 209; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 221; y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 225.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos terapéuticos y sus usos
Campo
La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a CD3 y BCMA. También se proporcionan composiciones que comprenden dichos anticuerpos biespecíficos, y su uso en la terapéutica.
Antecedentes
El antígeno de maduración de células B (BCMA, CD269 o TNFRSF17) es un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR). El BCMA se identificó en un linfoma humano de células T maligno que contenía una translocación t(4;16). El gen se expresa selectivamente en el linaje de las células B, con la máxima expresión en los blastos plasmáticos y las células plasmáticas, células secretoras de anticuerpos. El BCMA se une a dos ligandos, el factor de activación de las células B (BAFF) (también llamado estimulador de los linfocitos B (BLyS) y el ligando expresado por los leucocitos relacionados con el APOL (TALL-1)) y un ligando inductor de la proliferación (APRIL) con una afinidad de 1uM y 16nM, respectivamente. La unión de APRIL o BAFF a BCMA promueve una cascada de señalización en la que participan NF-kappa B, Elk-1, c-Jun N-terminal quinasa y la proteína quinasa activada por mitógenos p38, que producen señales de supervivencia y proliferación celular.
El BCMA también se expresa en las células B malignas y en varios cánceres que implican a los linfocitos B, como el mieloma múltiple, el plasmocitoma, el linfoma de Hodgkin y la leucemia linfocítica crónica. En las enfermedades autoinmunes en las que están implicados los plasmoblastos, como el lupus eritematoso sistémico (SLE) y la artritis reumatoide, las células productoras de anticuerpos que expresan BCMA secretan autoanticuerpos que se atacan a sí mismos.
En el caso del mieloma múltiple, cada año se diagnostican aproximadamente 24.000 nuevos casos en los Estados Unidos, y esta cifra representa aproximadamente el 15% de los cánceres hematológicos diagnosticados recientemente en los Estados Unidos. El mieloma múltiple provoca una media de 11.000 muertes al año, y la tasa media de supervivencia a cinco años es de aproximadamente el 44%, con una supervivencia media de 50-55 meses. El tratamiento actual del mieloma múltiple se centra en la apoptosis de las células plasmáticas y/o en la disminución de la actividad de los osteoclastos (por ejemplo, quimioterapia, talidomida, lenalidomida, bifosfonatos y/o inhibidores del proteasoma como bortezomib (VELCADE®) o carfilzomib). Sin embargo, el mieloma múltiple sigue siendo una enfermedad incurable, y casi todos los pacientes han desarrollado resistencia a estos agentes y acaban recayendo. En consecuencia, un tratamiento alternativo al mieloma múltiple, como el uso de un antagonista anti-BCMA que incluya anticuerpos y otros agentes inmunoterapéuticos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos o conjugados anticuerpofármaco), constituiría un agente terapéutico superior.
Los anticuerpos biespecíficos contra BCMA y CD3 se mencionan en EP2762497 y en WO2012/066058.
Sumario
La invención se define en las reivindicaciones.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico en el que el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo humano de longitud completa, que comprende un primer dominio variable de anticuerpo que se une específicamente a CD3 y un segundo dominio variable de anticuerpo que se une específicamente a BCMA, en el que el primer dominio variable de anticuerpo comprende: una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una CDR1 de VH que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 332; (ii) una VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 417; y (iii) una VH CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 335; y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 343; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 341; y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 342; y el segundo dominio variable del anticuerpo comprende: una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una CDR1 de VH que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 151; (ii) una VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 159; y (iii) una VH CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 155; y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 209; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 221; y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 225.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende la primera y la segunda regiones constantes IgG2 humanas respectivas que comprenden modificaciones de aminoácidos en las posiciones 223, 225 y 228, o 223 y 228, respectivamente, en la región bisa, y en la posición 409 o 368, en la región CH3, de acuerdo con el esquema de numeración de la UE. En algunas realizaciones, las regiones constantes comprenden además una modificación de aminoácidos en la posición 265.
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo biespecífico de la invención.
En otro aspecto, la invención también proporciona líneas celulares que producen recombinantemente cualquiera de los anticuerpos biespecíficos de la invención.
En otro aspecto, la invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los anticuerpos biespecíficos de la invención.
En otro aspecto, la invención también proporciona un vector que comprende el ácido nucleico que codifica un anticuerpo biespecífico de la invención, y además una célula huésped que comprende el ácido nucleico o el vector.
La invención también proporciona el anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer relacionado con las células B que se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin de predominio linfocítico nodular, Enfermedad de Kahler y mielomatosis, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma no Hodgkin de células B (LNH), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (LLC) leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico B precursor, leucemia mieloide, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma difuso de células B grandes, linfoma del tejido linfático asociado a las mucosas, linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma mediastínico primario de células B grandes, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células B de la zona marginal nodal, linfoma de la zona marginal esplénica, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de efusión primaria, granulomatosis linfomatoide, linfoma de células B grandes rico en histiocitos, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma primario cutáneo difuso de células B grandes (tipo de pierna), linfoma difuso de células B grandes positivo para el VEB de los ancianos, linfoma difuso de células B grandes asociado a la inflamación, Linfoma de células B grandes positivo para ALK, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada al HHV8, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Burkitt, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Hodgkin clásico, y otros linfomas relacionados con las células B.
En algunas realizaciones, se inhibe el crecimiento o la progresión del tumor en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA. En algunas realizaciones, se inhibe la metástasis de las células malignas que expresan BCMA en un sujeto. En algunas realizaciones, se induce la regresión tumoral en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA.
La invención también proporciona el anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del mieloma múltiple en un sujeto que lo necesita, en el que el anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica se administra con uno o más agentes terapéuticos. En algunas realizaciones, el otro agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en bortezomib, lenalidomida, carfilzomib y doxorrubicina.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS/DIBUJOS
La Figura 1A - Figura 1D representan los sensorgramas de doble referencia con curvas de ajuste para las interacciones entre los anticuerpos anti-BCMA seleccionados de la presente divulgación y el BCMA humano.
La Figura 2 muestra los estudios de eficacia in vivo de varios ADCs anti-BCMA en el modelo ortotópico de mieloma múltiple MM1S, incluyendo P6E01_VHVL-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; P5A2_VHVL-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; P5C1_VHVL-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; P4G4-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; and P1A11-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101. NNC es un control negativo de anticuerpos no-BCMA. "LCQ05" y "LCQ04" corresponden a la etiqueta transglutaminasa que contiene glutamina SEQ ID NOs: 474 y 475, respectivamente.
La Figura 3 muestra la eficacia in vivo de los ADCs anti-BCMA en el modelo ortotópico de mieloma múltiple MM1S, incluyendo L3.Anticuerpo PY/P6E01 conjugado con 1) H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-3377, 2) N297Q/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-0101, 3) LCQ05/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-0101, 4) H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-0131, y 5) N297Q/K222R/LCQ05-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur01. NNC es un anticuerpo de control no BCMA. "LCQ05" y H7c corresponden a la etiqueta transglutaminasa que contiene glutamina SEQ ID NO: 474 y SEQ ID NO: 454, respectivamente
La Figura 4 también muestra la eficacia in vivo de los ADCs anti-BCMA en el modelo de mieloma múltiple ortotópico MM1S, incluyendo L3.Anticuerpo PY/P6E01 conjugado con 1) H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-3377, 2) N297Q/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur01, 3) LCQ05/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 4) H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-0131, y 5) N297Q/K222R/LCQ05-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur01. NNC es un anticuerpo de control no-BCMA (anticuerpo-N297Q/K222R-AcLys-VC-PABC-0101). "LCQ05" y H7c corresponden a la etiqueta transglutaminasa que contiene glutamina SEQ ID NO: 474 y SEQ ID NO: 454, respectivamente.
La Figura 5 también muestra la eficacia in vivo de un ADC anti-BCMA en el modelo de mieloma múltiple ortotópico MM1S. El anticuerpo anti-BCMA COMBO_Rd4_0.6nM-C29 ("Combo C29 DI") se conjuga con H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-131 a dosis que van desde 0,1 mg/kg, 0,38 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1,5mg/kg en comparación con NNC, un anticuerpo de control no-BCMA (anticuerpo-N297Q/K222R-AcLys-VC-PABC-0101) a 3 mg/kg. H7c corresponden a la etiqueta transglutaminasa que contiene glutamina SEQ ID NO: 454.
Las figuras 6A - 6F muestran la eficacia in vivo de un anticuerpo biespecífico anti-CD3/anti-CD20 en monos cynomolgus. La depleción de células B tras una dosis única de anticuerpos biespecíficos se muestra como porcentaje de los recuentos previos al estudio.
Las figuras 7A - 7F muestran la eficacia in vivo de un anticuerpo biespecífico anti-CD3/anti-CD20 en monos cynomolgus. Se siguió la cinética de las células T CD8+ tras una dosis única de anticuerpos biespecíficos.
Las figuras 8A y 8B muestran la eficacia in vivo de un anticuerpo biespecífico anti-CD3/anti-CD20 en monos cynomolgus. Se analizó el efecto del anticuerpo CD3 monovalente sobre la cinética y la proliferación de las células T.
Las figuras 9A - 9D muestran la eficacia in vivo de un anticuerpo biespecífico anti-CD3/anti-CD20 en monos cynomolgus. Se analizó el efecto de la afinidad del brazo anti-CD3 en la depleción de células B.
Las figuras 10A y 10B muestran que los anticuerpos anti-CD3 seleccionados tenían una lectura de incorporación de timidina en PBMC humanas y de cynomolgus.
Las figuras 11A - 11D muestran que todos los anticuerpos biespecíficos humanos anti-EpCam_h2B4 tienen actividad de eliminación de células en la configuración in vitro.
La figura 12 muestra que una dosis única de anticuerpo biespecífico humano anti-BCMA/CD3 produjo una regresión tumoral de forma dependiente de la dosis en un modelo de mieloma ortotópico MM1.S.
La Figura 13 muestra que dos dosis de anticuerpo biespecífico humano anti-BCMA/CD3 dieron lugar a una mayor regresión del tumor en un modelo de mieloma Molp8 ortotópico.
La figura 14 muestra que el anticuerpo biespecífico anti-BCMA/CD3 solo o en combinación con el tratamiento estándar para el mieloma múltiple (lenalidomida o bortezomib) es más eficaz que la lenalidomida y el bortezomib combinados en el modelo tumoral ortotópico Molp8.
La Figura 15A - Figura 15C, respectivamente, muestran que el carfilzomib, la lenalidomida y la doxorrubicina no tienen un efecto negativo sobre la función del anticuerpo biespecífico anti-BCMA/CD3 en las células OPM2 en comparación con el anticuerpo biespecífico anti-BCMA/CD3 solo.
La figura 16 muestra los efectos sinérgicos en la función del anticuerpo biespecífico anti-BCMA/CD3 cuando se combina con carfilzomib y lenalidomida en comparación con cada molécula por separado.
Descripción detallada
La invención aquí divulgada proporciona anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a CD3 y BCMA. La invención también proporciona polinucleótidos que codifican estos anticuerpos, composiciones que comprenden estos anticuerpos y los anticuerpos biespecíficos para su uso en el tratamiento del cáncer.
Técnicas generales
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la habilidad del arte. Dichas técnicas se explican ampliamente en la literatura, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984) Methods in Molecular Biology, Humana Press Biología celular: A Laboratory Notebook(J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mathery P.E. Roberts, 1998) Plenum Press Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987) Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994) Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991) Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997) Anticuerpos (P. Finch, 1997) Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989) Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) The Antibodies (M. Zanetti y J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
Definiciones
Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana, como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, situado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se utiliza en el presente documento, el término abarca no sólo los anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también los fragmentos de los mismos (como Fab, Fab', F(ab')2 , Fv), los anticuerpos de cadena única (ScFv) y de dominio (incluyendo, por ejemplo, los anticuerpos de tiburón y de camélidos), y las proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, como IgG, IgA o IgM (o subclase de las mismas), y el anticuerpo no necesita ser de ninguna clase en particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la región constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse a su vez en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
El término "fragmento de unión a antígeno" o "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo intacto que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno determinado (por ejemplo, BCMA o CD3). Las funciones de unión al antígeno de un anticuerpo pueden ser realizadas por fragmentos de un anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de unión comprendidos en el término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo se incluyen Fab; Fab'; F(ab')2; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo de un solo dominio (dAb) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), y una región aislada determinante de la complementariedad (CDR).
Un anticuerpo, un conjugado de anticuerpo o un polipéptido que se "une preferentemente" o "se une específicamente" (utilizados indistintamente en el presente documento) a una diana (por ejemplo, la proteína BCMA o la proteína CD3) es un término bien conocido en la técnica, y los procedimientos para determinar dicha unión específica o preferente también son bien conocidos en la técnica. Se dice que una molécula presenta una "unión específica" o una "unión preferente" si reacciona o se asocia con más frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia concreta que con otras células o sustancias alternativas. Un anticuerpo se "une específicamente" o "se une preferentemente" a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específica o preferentemente a un epítopo BCMA o a un epítopo CD3 es un anticuerpo que se une a este epítopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que se une a otros epítopos BCMA, epítopos no BCMA, epítopos CD3 o epítopos no CD3. También se entiende que al leer esta definición, por ejemplo, un anticuerpo (o fracción o epítopo) que se une específica o preferentemente a una primera diana puede o no unirse específica o preferentemente a una segunda diana. Como tal, la "unión específica" o "unión preferente" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) la unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a la unión significa la unión preferente.
Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Como se sabe en la técnica, las regiones variables de la cadena pesada y ligera constan cada una de cuatro regiones marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en la variabilidad de la secuencia entre especies (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273, 525 a 948). Tal y como se utiliza en el presente documento, una CDR puede referirse a las CDR definidas por cualquiera de los dos enfoques o por una combinación de ambos.
Una "CDR" de un dominio variable son residuos de aminoácidos dentro de la región variable que se identifican de acuerdo con las definiciones de Kabat, Chothia, la acumulación de ambas Kabat y Chothia, AbM, contacto, y/o definiciones conformacionales o cualquier procedimiento de determinación de CDR bien conocido en el arte. Las c Dr de los anticuerpos pueden identificarse como las regiones hipervariables definidas originalmente por Kabat et al. Véase, por ejemplo Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. Las posiciones de las CDR también pueden identificarse como las estructuras de bucle estructural descritas originalmente por Chothia y otros. Véase, por ejemplo Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989. Otros enfoques para la identificación de las CDR incluyen la "definición AbM", que es un compromiso entre Kabat y Chothia y se deriva utilizando el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (ahora Accelrys®), o la "definición de contacto" de las CDR basada en los contactos observados con el antígeno, establecida en MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996. En otro enfoque, denominado aquí "definición conformacional" de las CDR, las posiciones de las CDR pueden identificarse como los residuos que hacen contribuciones entálpicas a la unión del antígeno. Véase, por ejemplo Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008. Otras definiciones de los límites de las CDR pueden no seguir estrictamente uno de los enfoques anteriores, pero sin embargo coincidirán con al menos una parte de las CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de la predicción o de los hallazgos experimentales de que determinados residuos o grupos de residuos o incluso CDR enteras no tienen un impacto significativo en la unión al antígeno. Tal y como se utiliza en el presente documento, una CDR puede referirse a las CDR definidas por cualquier enfoque conocido en la técnica, incluyendo combinaciones de enfoques. Los procedimientos utilizados aquí pueden utilizar CDRs definidos según cualquiera de estos enfoques. Para cualquier realización que contenga más de una CDR, las CDR pueden definirse de acuerdo con cualquiera de las definiciones de Kabat, Chothia, extendida, AbM, de contacto y/o conformacional.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, ya que se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que suelen incluir diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por un procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a utilizar de acuerdo con la presente divulgación pueden hacerse mediante el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975 o por procedimientos de ADN recombinante como los descritos en U.S. Pat. N° 4.816.567. Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse a partir de bibliotecas de fagos generadas mediante las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990 por ejemplo.
Tal como se utiliza en el presente documento, el anticuerpo "humanizado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Preferentemente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como el ratón, la rata o el conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (Fv) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o marco importadas, pero que se incluyen para refinar y optimizar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado, de manera óptima, también comprenderá al menos una porción de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Se prefieren los anticuerpos que tienen regiones Fc modificadas como se describe en WO 99/58572. Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 o CDR H3) que están alteradas con respecto al anticuerpo original, lo que también se denomina una o más CDR "derivadas de" una o más CDR del anticuerpo original.
Tal como se utiliza en el presente documento, "anticuerpo humano" significa un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que se ha fabricado utilizando cualquiera de las técnicas para fabricar anticuerpos humanos conocidas por los expertos en la materia o divulgadas en el presente documento. Esta definición de anticuerpo humano incluye los anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido humano de cadena pesada o al menos un polipéptido humano de cadena ligera. Un ejemplo de ello es un anticuerpo que comprende polipéptidos murinos de cadena ligera y humanos de cadena pesada. Los anticuerpos humanos pueden producirse mediante diversas técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, en la que dicha biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996 Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998 Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). Los anticuerpos humanos también pueden fabricarse mediante la inmunización de animales en los que se han introducido transgénicamente loci de inmunoglobulina humana en lugar de los loci endógenos, por ejemplo, ratones en los que se han inactivado parcial o totalmente los genes de inmunoglobulina endógena. Este enfoque se describe en la Pat. de EE.UU. N° 5.545.807, 5.45.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425 y 5.661.016. Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse inmortalizando linfocitos B humanos que produzcan un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (dichos linfocitos B pueden recuperarse de un individuo o de la clonación unicelular del ADNc, o pueden haber sido inmunizados in vitro). Véase, por ejemplo Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985 Boerneretal., J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991yPat. de EE.UU. N° 5.750.373.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a los anticuerpos en los que las secuencias de la región variable se derivan de una especie y las secuencias de la región constante se derivan de otra especie, como un anticuerpo en el que las secuencias de la región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante se derivan de un anticuerpo humano.
Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, preferentemente, relativamente cortas (por ejemplo, 10-100 aminoácidos). La cadena puede ser lineal o ramificada, puede comprender aminoácidos modificados y/o puede estar interrumpida por no aminoácidos. Los términos también abarcan una cadena de aminoácidos que ha sido modificada de forma natural o por intervención; por ejemplo, la formación de enlaces disulfuro, la glicosilación, la lipidación, la acetilación, la fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de etiquetado. También se incluyen en la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que los polipéptidos pueden presentarse como cadenas simples o asociadas.
Un "anticuerpo monovalente" comprende un sitio de unión al antígeno por molécula (por ejemplo, IgG o Fab). En algunos casos, un anticuerpo monovalente puede tener más de un sitio de unión al antígeno, pero los sitios de unión son de diferentes antígenos.
Un "anticuerpo monoespecífico" comprende dos sitios de unión al antígeno idénticos por molécula (por ejemplo, IgG), de manera que los dos sitios de unión se unen a un epítopo idéntico en el antígeno. Así, compiten entre sí en la unión a una molécula de antígeno. La mayoría de los anticuerpos que se encuentran en la naturaleza son monoespecíficos. En algunos casos, un anticuerpo monoespecífico también puede ser un anticuerpo monovalente (por ejemplo, Fab)
Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión al antígeno por molécula (por ejemplo, IgG). En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos.
Un "biespecífico" o "dual-específico" es un anticuerpo híbrido que tiene dos sitios de unión a antígenos diferentes. Los dos sitios de unión al antígeno de un anticuerpo biespecífico se unen a dos epítopos diferentes, que pueden residir en la misma o en diferentes proteínas diana.
Un anticuerpo "bifuncional" es un anticuerpo que tiene sitios de unión al antígeno idénticos (es decir, secuencias de aminoácidos idénticas) en los dos brazos, pero cada sitio de unión puede reconocer dos antígenos diferentes.
Un "heteromultimero", "complejo heteromultimérico" o "polipéptido heteromultimérico" es una molécula que comprende al menos un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido en al menos un residuo de aminoácido. El heteromultimero puede comprender un "heterodímero" formado por el primer y el segundo polipéptido o puede formar estructuras terciarias de orden superior en las que estén presentes otros polipéptidos además del primer y el segundo polipéptido.
Un "heterodímero", "proteína heterodimérica", "complejo heterodimérico" o "polipéptido heteromultimérico" es una molécula que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido en al menos un residuo de aminoácido.
La "región bisagra", la "secuencia bisagra" y sus variaciones, tal como se utilizan en el presente documento, incluyen el significado conocido en la técnica, que se ilustra en, por ejemplo, Janeway et al., ImmunoBiology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4a ed., 1999) Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415 Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202.
La "región bisagra similar a la inmunoglobulina", la "secuencia bisagra similar a la inmunoglobulina" y sus variaciones, tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a la región bisagra y a la secuencia bisagra de una molécula similar a la inmunoglobulina o al anticuerpo (por ejemplo, inmunoadhesinas). En algunas realizaciones, la región bisagra similar a la inmunoglobulina puede ser de o derivada de cualquier subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, o de IgA, IgE, IgD o IgM, incluyendo formas quiméricas de las mismas, por ejemplo, una región bisagra quimérica IgG1/2.
El término "célula efectora inmunitaria" o "célula efectora", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una célula dentro del repertorio natural de células del sistema inmunitario humano que puede activarse para afectar a la viabilidad de una célula objetivo. La viabilidad de una célula objetivo puede incluir la supervivencia celular, la proliferación y/o la capacidad de interactuar con otras células.
Los anticuerpos de la divulgación pueden producirse utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, por ejemplo, tecnologías recombinantes, tecnologías de visualización de fagos, tecnologías sintéticas o combinaciones de dichas tecnologías u otras tecnologías fácilmente conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Jayasena, S.D., Clin. Chem.
1628-50, 1999 y Fellouse, F.A., et al, J. Mol. Biol., 373(4):924-40, 2007).
Como se conoce en la técnica, "polinucleótido" o "ácido nucleico", como se utilizan indistintamente en este documento, se refieren a cadenas de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen el ADN y el ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda ser incorporado a una cadena por la ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, como los nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura de los nucleótidos puede impartirse antes o después del montaje de la cadena. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede modificarse aún más después de la polimerización, por ejemplo, mediante la conjugación con un componente de etiquetado. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, los "protectores", la sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, las modificaciones internucleotídicas como, por ejemplo, las que tienen enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriesteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que contienen elementos colgantes, como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), los que contienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), los que contienen alquiladores, los que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como las formas no modificadas de los polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilos normalmente presentes en los azúcares puede ser sustituido, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar, o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden ser conjugados a soportes sólidos. Los OH terminales 5' y 3' pueden estar fosforilados o sustituidos por aminas o por grupos orgánicos de cobertura de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivarse a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que son generalmente conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoroo 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos azúcares alfa- o beta-anoméricos, azúcares epiméricos como la arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosas, azúcares furanosas, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos abásicos de nucleósidos como el ribosido de metilo. Uno o más enlaces fosfodiésteres pueden ser sustituidos por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, realizaciones en las que el fosfato se sustituye por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces de un polinucleótido sean idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en este documento, incluidos el ARN y el ADN.
Como se sabe en la técnica, una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo o a la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "sustancialmente puro" se refiere a un material con una pureza de al menos el 50% (es decir, libre de contaminantes), más preferentemente, con una pureza de al menos el 90%, más preferentemente, con una pureza de al menos el 95%, aún más preferentemente, con una pureza de al menos el 98%, y más preferentemente, con una pureza de al menos el 99%.
Una "célula huésped" incluye una célula individual o un cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor de vector(es) para la incorporación de insertos de polinucleótidos. Las células huésped incluyen la progenie de una sola célula huésped, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico) a la célula madre original debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido(s) de esta divulgación.
Como se conoce en la técnica, el término "región Fc" se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "región Fc" puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de la IgG humana suele definirse para que se extienda desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el carboxilo-terminal de la misma. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice UE como en Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. La región Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos regiones constantes, CH2 y CH3.
Tal como se utiliza en la técnica, "receptor Fc" y "FcR" describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es el que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluidas las variantes alélicas y las formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen el FcYRIIA(un "receptor activador") y el FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. Los FcRs se revisan en Ravetch y Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994y de Haas et al., J. Lab. J. Clin. Med., 126:330-41, 1995. "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976; y Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994).
El término "competir", tal como se utiliza en el presente documento con respecto a un anticuerpo, significa que un primer anticuerpo, o un fragmento (o porción) de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo de una manera suficientemente similar a la unión de un segundo anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de tal manera que el resultado de la unión del primer anticuerpo con su epítopo afín disminuye de manera detectable en presencia del segundo anticuerpo en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. La alternativa, en la que la unión del segundo anticuerpo a su epítopo también disminuye de forma detectable en presencia del primer anticuerpo, puede ser el caso, pero no necesariamente. Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epítopo sin que ese segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su respectivo epítopo. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe de forma detectable la unión del otro anticuerpo con su epítopo o ligando afín, ya sea en la misma, mayor o menor medida, se dice que los anticuerpos "compiten de forma cruzada" entre sí por la unión de sus respectivos epítopos. La presente divulgación abarca tanto los anticuerpos competidores como los de competencia cruzada. Independientemente del mecanismo por el que se produzca dicha competencia o competencia cruzada (por ejemplo, impedimento estérico, cambio conformacional o unión a un epítopo común o a una porción del mismo), el artesano experto apreciaría, basándose en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que dichos anticuerpos competidores y/o de competencia cruzada están incluidos y pueden ser útiles para los procedimientos divulgados en el presente documento.
Una "región Fc funcional" posee al menos una función efectora de una región Fc de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" ejemplares incluyen la unión de C1q; la citotoxicidad dependiente del complemento; la unión del receptor Fc; la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos; la fagocitosis; la regulación a la baja de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B), etc. Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable del anticuerpo) y pueden evaluarse mediante diversos ensayos conocidos en la técnica para evaluar dichas funciones efectoras del anticuerpo.
Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos, pero que conserva al menos una función efectora de la región Fc de secuencia nativa. En algunas realizaciones, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido original, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferentemente, de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido original. La variante de la región Fc poseerá preferentemente al menos un 80% de identidad de secuencia con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido original, y más preferentemente, al menos un 90% de identidad de secuencia con la misma, más preferentemente, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% de identidad de secuencia con la misma.
El término "función efectora" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), la unión del receptor Fc, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la fagocitosis, la unión de C1q y la regulación descendente de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B; BCR). Véase, por ejemplo Pat. de EE.UU. n° 6.737.056. Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable del anticuerpo) y pueden evaluarse mediante diversos ensayos conocidos en la técnica para evaluar dichas funciones efectoras del anticuerpo. Un ejemplo de medición de la función efectora es a través de la unión de Fcy3 y/o C1q.
Tal como se utiliza en el presente documento, la "citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en la que las células citotóxicas inespecíficas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y, posteriormente, causan la lisis de la célula diana. La actividad ADCC de una molécula de interés puede evaluarse mediante un ensayo ADCC in vitro , como el descrito en Patente estadounidense n° 5.500.362 o 5.821.337. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se encuentran las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células NK. Alternativa o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el divulgado en Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.
La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de un objetivo en presencia del complemento. La vía de activación del complemento se inicia con la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) complejada con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, se utiliza un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Procedimientos, 202: 163 (1996), puede realizarse.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. A efectos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: reducción de la proliferación de (o destrucción de) células neoplásicas o cancerosas, inhibición de la metástasis de células neoplásicas, remisión de un cáncer asociado a BCMA, disminución de los síntomas resultantes de un cáncer asociado a BCMA, aumento de la calidad de vida de quienes padecen un cáncer asociado a BCMA, disminución de la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar un cáncer asociado a BCMA, retraso de la progresión de un cáncer asociado a BCMA, curación de un cáncer asociado a BCMA, y/o prolongación de la supervivencia de los pacientes que padecen un cáncer asociado a BCMA.
"Mejorar" significa una disminución o mejora de uno o más síntomas en comparación con la no administración de un anticuerpo BCMA o un conjugado de anticuerpos BCMA. "Mejorar" también incluye acortar o reducir la duración de un síntoma.
Tal como se utiliza en el presente documento, una "dosis efectiva" o "cantidad efectiva" de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para efectuar uno o más resultados beneficiosos o deseados. Para el uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen la eliminación o la reducción del riesgo, la disminución de la gravedad o el retraso del inicio de la enfermedad, incluidos los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para el uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos como la reducción de la incidencia o la mejora de uno o más síntomas de diversas enfermedades o afecciones asociadas al BCMA (como el mieloma múltiple), la disminución de la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, la potenciación del efecto de otro medicamento y/o el retraso de la progresión de la enfermedad asociada al BCMA de los pacientes. Una dosis efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. Para los fines de esta divulgación, una dosis efectiva de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr un tratamiento profiláctico o terapéutico, ya sea directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una dosis efectiva de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o no lograrse en conjunto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Así, una "dosis eficaz" puede considerarse en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y puede considerarse que un solo agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes, puede lograrse o se logra un resultado deseable.
Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, más preferentemente, un humano. Los mamíferos también incluyen, entre otros, a los animales de granja, los animales deportivos, los animales de compañía, los primates, los caballos, los perros, los gatos, los ratones y las ratas.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "vector" significa un constructo capaz de liberar y, preferentemente, expresar uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes condensadores catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucariotas, como las células productoras.
Tal como se utiliza en el presente documento, "secuencia de control de expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de expresión puede ser un promotor, como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. La secuencia de control de expresión está enlazada de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir.
Tal como se utiliza en el presente documento, "portador farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente activo, permite que el ingrediente retenga la actividad biológica y no sea reactivo con el sistema inmunológico del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones como la emulsión aceite/agua, y varios tipos de agentes humectantes. Los diluyentes preferidos para la administración en aerosol o parenteral son la solución salina tamponada con fosfato (PBS) o la solución salina normal (0,9%). Las composiciones que comprenden dichos portadores se formulan mediante procedimientos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Editorial Mack, 2005).
El término "etiqueta que contiene glutamina donante de acilo" o "etiqueta de glutamina", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido o una proteína que contiene uno o más residuos de Gln que actúa como aceptor de amina de la transglutaminasa. Véase, por ejemplo WO2012059882 y WO2015015448.
El término "kactivo" o "ka", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de asociación de un anticuerpo a un antígeno. En concreto, se miden las constantes de velocidad (kactivo/ka y kinactivo/kd) y las constantes de disociación de equilibrio utilizando anticuerpos enteros (es decir, bivalentes) y proteínas BCMA monoméricas.
El término "k inactivo" o "kd", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.
El término "Kd", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno.
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se dirigen a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción referida a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X" Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.
Se entiende que dondequiera que las realizaciones se describan en el presente documento con el lenguaje "que comprende", también se proporcionan realizaciones análogas descritas en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
Cuando los aspectos de la divulgación se describen en términos de un grupo de Markush u otra agrupación de alternativas, la presente divulgación abarca no sólo todo el grupo enumerado como un todo, sino cada miembro del grupo individualmente y todos los posibles subgrupos del grupo principal, pero también el grupo principal ausente de uno o más de los miembros del grupo. La presente divulgación también contempla la exclusión explícita de uno o varios de los miembros del grupo en la divulgación.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta divulgación. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluidas las definiciones. A lo largo de esta especificación y de las reivindicaciones, se entenderá que la palabra "comprende", o variaciones como "comprenden" o "que comprende", implica la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicado, pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros. Salvo que el contexto exija lo contrario, los términos singulares incluirán los plurales y los términos plurales el singular.
Anticuerpos BCMA y procedimientos de fabricación de los mismos
La presente divulgación proporciona un anticuerpo que se une a BCMA (por ejemplo, BCMA humano (por ejemplo, SEQ ID NO: 353 o número de acceso: Q02223-2) y caracterizado por una o más de las siguientes características: (a) tratar, prevenir, mejorar uno o más síntomas de una condición asociada con células malignas que expresan BCMA en un sujeto (por ejemplo, Cáncer relacionado con las células B, como el mieloma múltiple); (b) inhibir el crecimiento o la progresión del tumor en un sujeto (que tiene un tumor maligno que expresa BCMA); (c) inhibir la metástasis de las células cancerosas (malignas) que expresan BCMA en un sujeto (que tiene una o más células malignas que expresan BCMA); (f) inducir la regresión (por ejemplo, regresión a largo plazo) de un tumor que exprese BCMA; (d) ejercer una actividad citotóxica en las células malignas que expresen BCMA; y (e) bloquear la interacción de BCMA con otros factores aún no identificados.
En un aspecto, se divulga un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al antígeno de maduración de células B (BCMA), en el que el anticuerpo comprende (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una región determinante complementaria VH uno (CDR1) que comprende la secuencia SYX1MX2 , en la que X1 es A o P; y X2 es T, N o S (SEQ ID NO: 301), GFTFX1SY, donde X1 es G o S (SEQ ID NO: 302), o GFTFX1SYX2MX3, donde X1 es G o S, X2 es A o P; y X3 es T, N o S (SEQ ID NO: 303); ii) una VH CDR2 que comprende la secuencia AX1X2X3X4GX5X6X7X8YADX9X10KG, en la que X1 es I, V, T, H, L, A o C; X2 es S, D, G, T, I, L, F, M o V; X3 es G, Y, L, H, D, A, S o M; X4 es S, Q, T, A, F o W; X5 es G o T; Xa es N, S, P, Y, W o F; X7 es S, T, I, L, T, A, R, V, K, G o C; Xa es F, Y, P, W, H o G; X9 es V, R o L; y X10 es G o T (SEQ ID NO: 305), o X1X2X3X4X5X6 , donde X1 es S, V, I, D, G, T, L, F o M; X2 es G, Y, L, H, D, A, S o M; X3 es S, G, F o W; X4 es G o S; X5 es G o T; y X6 es N, S, P, Y o W (SEQ ID NO: 306); y iii) una VH CDR3 que comprende la secuencia VSPIX1X2X3X4 , en la que X1 es A o Y; X2 es A o S; y X3 es G, Q, L, P o E (SEQ ID NO: 307), o YWPMX1X2 , donde X1 es D, S, T o A; y X2 es I, S, L, P o D (SEQ ID NO: 308); y/o una región variable de cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12, en la que X1 es R, G, W, A o C; X2 es A, P, G, L, C o S; X3 es S, G o R; X4 es Q, C, E, V o I; X5 es S, P, G, A, R o D; Xa es V, G, I o L; X7 es S, E, D, P o G; Xa es S, P, F, A, M, E, V, N, D o Y; X9 es I, T, V, E, S, A, M, Q, Y, H, R o F; X10 es Y o F; X11 es L, W o P; y X 12 es A, S o G (SEQ ID NO: 309); (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia X1ASX2RAX3 , en la que X1 es G o D; X2 es S o I; y X3 es T o P (SEQ iD NO: 310); y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia QQYX1X2X3PX4T, en la que X1 es G, Q, E, L, F, A, S, M, K, R o Y; X2 es S, R, T, G, V, F, Y, D, A, H, V, E, K o C; X3 es W, F o S; y X4 es L o I (SEQ ID NO: 311), o QQYX1X2X3PX4, donde X1 es G, Q, E, L, F, A, S, M, R, K o Y; X2 es S, R, T, G, R, V, D, A, H, E, K, C, F o Y; X3 es W, S o F; y X4 es L o I (SEQ ID NO: 312).
En otro aspecto, se divulga un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a BCMA, en el que el anticuerpo comprende: una región VH que comprende una VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 de la secuencia VH mostrada en la SEQ ID NO: 2, 3, 7, 8, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 83, 87, 92, 95, 97, 99, 101, 104, 106, 110, 112, 114, 118, 120, 122, 112, 125, 127, 313, 314, 363 o 365; y/o una región VL que comprende VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 de la secuencia VL mostrada en la SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 34, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 317, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 100, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 126, 128, 315, 316 o 364.
En algunas realizaciones, se divulga un anticuerpo que tiene cualquiera de las secuencias parciales de cadena ligera enumeradas en la Tabla 1 y/o cualquiera de las secuencias parciales de cadena pesada enumeradas en la Tabla 1.
Tabla 1
Figure imgf000012_0001
continuación
Figure imgf000013_0001
(continuación)
mAb Cadena ligera Cadena pesada
L1.LG F/L3.N
Y/H3.A L EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSLGSFYLAWYQQKPGQAP ASGFTFGSYAMTWVRQAPGKGLE RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGS WVSAISGSGGNTFYADSVKGRFTI GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQH SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YNYPPSFTFGQGTKVEIK (SEQ YYCARVSPIAALMDYWGQGTLVT
ID NO: 10) VSS (SEQ ID NO: 7)
L1.LG F/L3.N
Y/H3.A P EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSLGSFYLAWYQQKPGQAP ASGFTFGSYAMTWVRQAPGKGLE RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGS WVSAISGSGGNTFYADSVKGRFTI GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQH SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YNYPPSFTFGQGTKVEIK (SEQ YYCARVSPIAAPMDYWGQGTLVT
ID NO: 10) VSS (SEQ ID NO: 8)
L1.LG F/L3.N
Y/H3.AQ EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSLGSFYLAWYQQKPGQAP ASGFTFGSYAMTWVRQAPGKGLE RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGS WVSAISGSGGNTFYADSVKGRFTI GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQH SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YNYPPSFTFGQGTKVEIK (SEQ YYCARVSPIAAQMDYWGQGTLVT
ID NO: 10) VSS (SEQ ID NO: 3)
L1.GD F/L3.K
C/H3. AL EIVLTQS PGTLS LS PGE RATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVGDFYLAWYQQKPGQAP ASGFTFGSYAMTWVRQAPGKGLE RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGS WVSAISGSGGNTFYADSVKGRFTI GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCKHY SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV GWPPSFTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARVSPIAALMDYWGQGTLVT
NO: 11) VSS (SEQ ID NO: 7)
L1.GD F/L3.K
C/H3. AP EIVLTQS PGTLS LS PGE RATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVGDFYLAWYQQKPGQAP ASGFTFGSYAMTWVRQAPGKGLE RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGS WVSAISGSGGNTFYADSVKGRFTI GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCKHY SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV continuación
Figure imgf000015_0001
continuación
Figure imgf000016_0001
continuación
Figure imgf000017_0001
continuación
Figure imgf000018_0001
continuación
Figure imgf000019_0001
continuación
Figure imgf000020_0001
continuación
Figure imgf000021_0001
continuación
Figure imgf000022_0001
continuación
Figure imgf000023_0001
continuación
Figure imgf000024_0001
continuación
Figure imgf000025_0001
continuación
Figure imgf000026_0001
continuación
Figure imgf000027_0001
continuación
Figure imgf000028_0001
continuación
Figure imgf000029_0001
continuación
Figure imgf000030_0001
(continuación)
mAb Cadena ligera Cadena pesada
A02 R = 6,
nM_C0 = 9 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAISDSGGSMWYADSVKGRF GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA YQSWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID VYYCARYWPMSLWGQGTLVTVS
NO: 38) S (SEQ ID NO: 37)
A02 R d4 6n
M_C16 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSDIYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG WVSAISDFGGSTYYADSVKGRFTI TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV
QTWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDIWGQGTLVTVSS
NO: 40) (SEQ ID NO: 39)
A02 R d4 6n
M_C03 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSNLYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAISDSGGSTYYADSVKGRFTI GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YQGWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDIWGQGTLVTVSS
NO: 41) (SEQ ID NO: 33)
A02 R d4 6n
M_C01 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSAYYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAITASGGSTYYADSVKG R FTI GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YERWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMSLWGQGTLVTVSS
NO: 43) (SEQ ID NO: 42)
A02 R d4 6n EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA M_C26
ASQSVSSLYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG WVSAISDSGGSTYYADSVKGRFTI TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV QVWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMSLWGQGTLVTVSS
NO: 45) (SEQ ID NO: 44)
(continuación)
mAb Cadena ligera Cadena pesada
A02 R d4 6n
M_C25 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAISDSGGSRWYADSVKGRFT GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YLDWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMTPWGQGTLVTVSS
NO: 47) (SEQ ID NO: 46)
A02 R d4 6n
M_C22 EIVLTQS PGTLS LS PG E RATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAVLDSGGSTYYADSVKGRFT GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV
YQVWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMTPWGQGTLVTVSS
NO: 49) (SEQ ID NO: 48)
A02 R d4 6n
M_C19 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSVIYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG WVSAISDSGGSRWYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYL ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV AWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMSDWGQGTLVTVSS
NO: 51) (SEQ ID NO: 50)
A02 R = 6,
nM_C0 = 3 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAISDSGGSKWYADSVKGRFT GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YFTWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMSLWGQGTLVTVSS
NO: 53) (SEQ ID NO: 52)
A02 R d4 6n EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA M_C07
ASQSVSPvYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYE ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV RWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 55) (SEQ ID NO: 54)
(continuación)
mAb Cadena ligera Cadena pesada
A02 R d4 6n
M_C23 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSVEYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAISDSGGSGWYADSVKGRF GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA YARWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID VYYCARYWPMSLWGQGTLVTVS
NO: 57) S (SEQ ID NO: 56)
A02 R = 6,
nM_C1= 8 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSEIYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG WVSAVLDSGGSTYYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYF ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV
GWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMSLWGQGTLVTVSS
NO: 59) (SEQ ID NO: 58)
A02 R d4 6n
M_C10 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVEMSYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAISDSGGSCWYADSVKGRFT GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YAHWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMTPWGQGTLVTVSS
NO: 61) (SEQ ID NO: 60)
A02 R d4 6n
M_C05 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAIFDSGGSTYYADSVKGRFTI GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YQRWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMTPWGQGTLVTVSS
NO: 63) (SEQ ID NO: 62)
A02 R = 6, EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA nM_C1= 0
ASQSVSAQYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAISDWGGSLPYADSVKGRFT GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YQRWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 65) (SEQ ID NO: 64)
(continuación)
mAb Cadena ligera Cadena pesada
A02 R d4 6n
M_C04 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSAIYLAW YQQKPGQAPR ASGFTFSSYAMNW VRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG W VSAIMSSGGPLYYADSVKGRFTI TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV QVW PLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYW PMALW GQGTLVTVSS
NO: 67) (SEQ ID NO: 66)
A02 R = 6,
nM_C2 = 6 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCG EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA PSQSVSSSYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYAMNW VRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG W VSAILMSGGSTYYADSVKGRFTI TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV
YYCARYW PMSLW GQGTLVTVSS
Figure imgf000034_0001
(SEQ ID NO: 68)
A02 R = 6,
nM_C1= 3 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSSYW AW YQQKPGQAP ASGFTFSSYAMNW VRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAISDSGGYRYYADSVKGRFTI GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YESW PLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYW PMSLW GQGTLVTVSS
NO: 71) (SEQ ID NO: 70)
A02 R = 6,
nM_C0 = 1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA GGQSVSSSYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYAMNW VRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS W VSAILSSGGSTYYADSVKGRFTI GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YQSW PLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYW PMDIWGQGTLVTVSS
NO: 73) (SEQ ID NO: 72)
A02 R d4 6n EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA M_C08
ASQSVSFIYLAW YQQKPGQAPR ASGFTFSSYAMNW VRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG W VSAILDSGGSTYYADSVKGRFTI TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV GSW PLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYW PMSPW GQGTLVTVSS
NO: 75) (SEQ ID NO: 74)
(continuación)
mAb Cadena ligera Cadena pesada
P5C1_ VHVL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSTYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLIYDASSRAPGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSTYYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYS ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV TSPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 77) (SEQ ID NO: 76)
C01 R d4 6n
M_C24 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSPEYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE RLLIYDASSRAPGIPDRFSGSGS WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV
YSVWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 79) (SEQ ID NO: 78)
C01 R d4 6n
M_C26 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSAIYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLIYDASSRAPGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYS ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV AWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 317) (SEQ ID NO: 78)
C01 R d4 6n
M_C10 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSvYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLIYDASSRAPGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYS ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV TWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 79) (SEQ ID NO: 78)
C01 R = 6, EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA nM_C2 = 7
ASQSVSSTYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLIYDASSRAPGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYS ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV RWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 81) (SEQ ID NO: 78)
(continuación)
mAb Cadena ligera Cadena pesada
C01 R d4 6n
M_C20 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSPIYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLIYDASSRAPGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYS ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV AFPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 82) (SEQ ID NO: 78)
C01 R d4 6n
M_C12 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA WLSQSVSSTYLAWYQQKPGQA ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE PRLLIYDASSRAPGIPDRFSGSG WVSAIGGSGGWSYYADSVKG R F SGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA
QYSEWPLTFGQGTKVEIK (SEQ VYY CAR YWP M DS WGQGT LVTVS
ID NO: 84) S (SEQ ID NO: 83)
C01 R = 6,
nM_C1 = 6 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSTYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLIYDASSRAPGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYS ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV SWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 85) (SEQ ID NO: 78)
C01 R = 6,
nM_C0 = 9 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSIFLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLIYDASSRAPGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYS ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV AWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 86) (SEQ ID NO: 78)
C01 R d4 6n EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA M_C09
CSQSVSSTYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLIYDASSRAPGIPDRFSGSGSG WVSATVGSGGSIGYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYS ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV AWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 88) (SEQ ID NO: 87)
(continuación)
mAb Cadena ligera Cadena pesada
C01 R = 6,
nM_C0 = 3 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASCDVSSTYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLIYDASSRAPGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV MRSPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 89) (SEQ ID NO: 78)
C01 R = 6,
nM_C0 = 6 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASEAVPSTYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLIYDASSRAPGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLPYADSVKGTIS TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY
AFPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 90) (SEQ ID NO: 78)
C01 R d4 6n
M_C04 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA SSQSVSSTYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLIYDASSRAPGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYS ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV AFPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 91) (SEQ ID NO: 78)
COMB O Rd4
_0.6n M_C22 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASVRVSSTYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG WVSAISGSGGSRWYADSVKGRF TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA MKWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID VYYCTRYWPMDIWGQGTLVTVSS
NO: 93) (SEQ ID NO: 92)
COMB O Rd4 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA _6nM_ C21
ASQSVSAAYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YMCWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 94) (SEQ ID NO: 78)
(continuación)
mAb Cadena ligera Cadena pesada
COMB O Rd4
_6nM_ C10 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSSYWGWYQQKPGQAP ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAIGGSGGSIHYADSVKGRFTI GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YQCWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 96) (SEQ ID NO: 95)
COMB O Rd4
_0.6n M_C04 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSTYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG WVSAHIGSGGSTYYADSVKGRFTI TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV
QSWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 98) (SEQ ID NO: 97)
COMB O Rd4
_6nM_ C25 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSdYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSTYYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV QSWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDPWGQGTLVTVSS
NO: 100) (SEQ ID NO: 99)
COMB O Rd4
_0.6n M_C21 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YQSWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 38) (SEQ ID NO: 78)
COMB O Rd4 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA _6nM_ C11
ASQSVSPIYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLGYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV KAWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 102) (SEQ ID NO: 101)
(continuación)
mAb Cadena ligera Cadena pesada
COMB O Rd4
_0.6n M_C20 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSYLYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV MEWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 103) (SEQ ID NO: 78)
COMB O Rd4
_6nM_ C09 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSAQYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAIFASGGSTYYADSVKGRFTI GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV
YQAWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 105) (SEQ ID NO: 104)
COMB O Rd4
_6nM_ C08 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAIGGSGTWTYYADSVKG R FT GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YQKWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 107) (SEQ ID NO: 106)
COMB O Rd4
_0.6n M_C19 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSAVYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YRAWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 108) (SEQ ID NO: 78)
COMB O Rd4 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA _0.6n M_C02
ASIAVSSTYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV MVWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 109) (SEQ ID NO: 78)
(continuación)
mAb Cadena ligera Cadena pesada
COMB O Rd4
_0.6n M_C23 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA PRQSVSSSYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSALFGSGGSTYYADSVKGRFT GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YQDWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 111) (SEQ ID NO: 110)
COMB O Rd4
_0.6n M_C29 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV
YQSWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDIWGQGTLVTVSS
NO: 38) (SEQ ID NO: 112)
COMB O Rd4
_0.6n M_C09 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSTYLAWYQQKPGQAPR ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE LLMYDASIRATGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV QEWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDIWGQGTLVTVSS
NO: 113) (SEQ ID NO: 112)
COMB O Rd4
_6nM_ C12 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSASYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAALGSGGSTYYADSVKGRF GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA YMSWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID VYYCARYWPMDSWGQGTLVTVS
NO: 115) S (SEQ ID NO: 114)
COMB O Rd4 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA _0.6n M_C30
ASQSVSYMYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE RLLIYDASIRATGIPDRFSGSGSG WVSAIGGSGGSTYYADSVKGRFT TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV KSWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 116) (SEQ ID NO: 76)
continuación
Figure imgf000041_0001
(continuación)
mAb Cadena ligera Cadena pesada
COMB O Rd4
_6nM_ C22 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSACLDSGGSTYYADSVKGRFT GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YQGWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID YYCARYWPMDSWGQGTLVTVSS
NO: 126) (SEQ ID NO: 125)
COMB O Rd4
_0.6n M_C11 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASQSVSVRYLAWYQQKPGQAP ASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLE RLLMYDASIRATGIPDRFSGSGS WVSAALGSGGSTYYADSVKGRF GTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA
YGSWPITFGQGTKVEIK (SEQ ID VYYCARYWPMSLWGQGTLVTVS
Figure imgf000042_0001
NO: 128) S (SEQ ID NO: 127)
continuación
Figure imgf000043_0001
continuación
Figure imgf000044_0001
En la Tabla 1, las secuencias subrayadas son secuencias CDR según Kabat y en negrita según Chothia, excepto las siguientes secuencias CDR2 de la cadena pesada, en las que las secuencias CDR de Chothia están subrayadas y las secuencias CDR de Kabat están en negrita: P5A2_VHVL, A02_Rd4_0.6nM_C06, A02_Rd4_0.6nM_C09 A02_Rd4_6nM_C16, A02_Rd4_6nM_C03, A02_Rd4_6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C26 A02_Rd4_6nM_C25, A02_Rd4_6nM_C22, A02_Rd4_6nM_C19, A02_Rd4_0.6nM_C03 A02_Rd4_6nM_C07, A02_Rd4_6nM_C23, A02_Rd4_0.6nM_C18, A02_Rd4_6nM_C10 A02_Rd4_6nM_C05, A02_Rd4_0.6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C04, A02_Rd4_0.6nM_C26 A02_Rd4_0.6nM_C13, A02_Rd4_0.6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C08, P5C1_VHVL, C01_Rd4_6nM_C24, C01_Rd4_6nM_C26, C01_Rd4_6nM_C10, C01_Rd4_0.6nM_C27 C01_Rd4_6nM_C20, C01_Rd4_6nM_C12, C01_Rd4_0.6nM_C16, C01_Rd4_0.6nM_C09 C01_Rd4_6nM_C09, C01_Rd4_0.6nM_C03, C01_Rd4_0.6nM_C06, C01_Rd4_6nM_C04 COMBO_Rd4_0.6nM_C22, COMBO_Rd4_6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C10, COMBO_Rd4_0.6nM_C04, COMBO_Rd4_6nM_C25, COMBO_Rd4_0.6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C20, COMBO_Rd4_6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C08, COMBO_Rd4_0.6nM_C19, COMBO_Rd4_0.6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C23, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, COMBO_Rd4_0.6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C12, COMBO_Rd4_0.6nM_C30, COMBO_Rd4_0.6nM_C14, COMBO_Rd4_6nM_C07, COMBO_Rd4_6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C05, COMBO_Rd4_0.6nM_C17, COMBO_Rd4_6nM_C22 y COMBO_Rd4_0.6nM_C11.
La divulgación también proporciona porciones de CDR de anticuerpos contra BCMA (incluyendo Chothia, CDR de Kabat y regiones de contacto de CDR). La determinación de las regiones CDR es algo que está dentro de la técnica. Se entiende que en algunas realizaciones, las CDR pueden ser una combinación de las CDR de Kabat y Chothia (también denominados "CR combinados" o "CDR ampliadas"). En algunas realizaciones, las CDRs son las CDRs de Kabat. En otras realizaciones, las CDR son las CDR de Chothia. En otras palabras, en las realizaciones con más de una CDR, las CDR pueden ser cualquiera de las CDR de Kabat, Chothia, combinadas, o combinaciones de las mismas. La Tabla 2 proporciona ejemplos de secuencias CDR proporcionadas en el presente documento,
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que se une a BCMA y compite con el anticuerpo descrito en el presente documento, incluyendo P6E01/P6E01, P6E01/H3.AQ, L1.LGF/L3.KW/P6E01; L1.LGF/L3.NY/P6E01, L1.GDF/L3.NY/P6E01, L1.LGF/L3.KW/H3.AL, L1.LGF/L3.KW/H3.AP, L1.LGF/L3.KW/H3.AQ, L1.LGF/L3.PY/H3.AP, L1.LGF/L3.PY/H3.AQ, L1.LGF/L3.NY/H3.AL, L1.LGF/L3.NY/H3.AP, L1.LGF/L3.NY/H3.AQ, L1.GDF/L3.KW/H3.AL, L1.GDF/L3.KW/H3.AP, L1.GDF/L3.KW/H3.AQ, L1.GDF/L3.PY/H3.AQ, L1.GDF/L3.NY/H3.AL, L1.GDF/L3.NY/H3.AP, L1.GDF/L3.NY/H3.AQ, L3.KW/P6E01, L3.PY/P6E01, L3.NY/P6E01, L3.PY/L1.PS/P6E01, L3.PY/L1.AH/P6E01, L3.PY/L1.FF/P6E01, L3.PY/L1.PH/P6E01, L3.PY/L3.KY/P6E01, L3.PY/L3.KF/P6E01, L3.PY/H2.QR, L3.PY/H2.DY, L3.PY/H2.YQ, L3.PY/H2.LT, L3.PY/H2.HA, L3.PY/H2.QL, L3.PY/H3.YA, L3.PY/H3.AE, L3.PY/H3.AQ, L3.PY/H3.TAQ, L3.PY/P6E01 L3.PY/L1.PS/H2.QR, L3.PY/L1.PS/H2.DY, L3.PY/L1.PS/H2.YQ, L3.PY/L1.PS/H2.LT, L3.PY/L1.PS/H2.HA, L3.PY/L1.PS/H2.QL, L3.PY/L1.PS/H3.YA, L3.PY/L1.PS/H3.AE, L3.PY/L1.PS/H3.AQ, L3.PY/L1.PS/H3.TAQ, L3.PY/L1.AH/H2.QR, L3.PY/L1.AH/H2.DY, L3.PY/L1.AH/H2.YQ, L3.PY/L1.AH/H2.LT, L3.PY/L1.AH/H2.HA, L3.PY/L1.AH/H2.QL, L3.PY/L1.AH/H3.YA, L3.PY/L1.AH/H3.AE, L3.PY/L1.AH/H3.AQ, L3.PY/L1.AH/H3.TAQ, L3.PY/L1.FF/H2.QR, L3.PY/L1.FF/H2.DY, L3.PY/L1.FF/H2.YQ, L3.PY/L1.FF/H2.LT, L3.PY/L1.FF/H2.HA, L3.PY/L1.FF/H2.QL, L3.PY/L1.FF/H3.YA, L3.PY/L1.FF/H3.AE, L3.PY/L1.FF/H3.AQ, L3.PY/L1.FF/H3.TAQ, L3.PY/L1.PH/H2.QR, L3.PY/L1.PH/H2.HA, L3.PY/L1.PH/H3.AE, L3.PY/L1.PH/H3.AQ, L3.PY/L1.PH/H3.TAQ, L3.PY/L3.KY/H2.QR, L3.PY/L3.KY/H2.DY, L3.PY/L3.KY/H2.YQ L3.PY/L3.KY/H2.LT, L3.PY/L3.KY/H2.HA, L3.PY/L3.KY/H2.QL, L3.PY/L3.KY/H3.YA L3.PY/L3.KY/H3.TAQ, L3.PY/L3.KF/H2.DY, L3.PY/L3.KF/H2.YQ, L3.PY/L3.KF/H2.LT L3.PY/L3.KF/H2.QL, L3.PY/L3.KF/H3.YA, L3.PY/L3.KF/H3.AE, L3.PY/L3.KF/H3.AQ L3.PY/L3.KF/H3.TAQ P5A2_VHVL, A02 Rd4 0.6nM C06, A02_Rd4_0.6nM_C09 A02_Rd4_6nM_C16, A02_Rd4_6nM_C03, A02_Rd4_6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C26 A02_Rd4_6nM_C25, A02_Rd4_6nM_C22, A02_Rd4_6nM_C19, A02_Rd4_0.6nM_C03 A02_Rd4_6nM_C07, A02_Rd4_6nM_C23, A02_Rd4_0.6nM_C18, A02_Rd4_6nM_C10 A02_Rd4_6nM_C05, A02_Rd4_0.6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C04, A02_Rd4_0.6nM C26 A02 Rd4 0.6nM C13 A02 Rd4 0.6nM C01, A02 Rd4 6nM C08, P5C1_VHVL, C01 Rd4_6nM_C24 C01_Rd4_6nM_C26, C01_Rd4_6nM_C10, C01_Rd4_0.6nM_C27 C01_Rd4_6nM_C20, C01 Rd4 6nM C12, C01 Rd4 0.6nM C16, C01 Rd4 0.6nM C09 C01 Rd4 6nM C09, C01_Rd4_0.6nM_C03, C01_Rd4_0.6nM_C06, C01_Rd4_6nM_C04 COMBO_Rd4_0.6nM_C22, COMBO_Rd4_6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C10, COMBO_Rd4_0.6nM_C04, COMBO_Rd4_6nM_C25, COMBO_Rd4_0.6nM_C21 COMBO_Rd4_6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C20, COMBO_Rd4_6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C08, COMBO_Rd4_0.6nM_C19, COMBO_Rd4_0.6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C23, COMBO_Rd4_0.6nM_C29 COMBO_Rd4_0.6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C12, COMBO_Rd4_0.6nM_C30, COMBO_Rd4_0.6nM_C14 COMBO_Rd4_6nM_C07, COMBO_Rd4_6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C05, COMBO_Rd4_0.6nM_C17 COMBO Rd4 6nM C22, COMBO Rd4 0.6nM C11, COMBO Rd4 0.6nM C29, P4G4, o P1A11.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno, que se une específicamente a BCMA, donde el anticuerpo comprende una región VH que comprende una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 112; y/o una región VL que comprende una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATG IPDRFSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQYQSWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 357) y una cadena pesada que comprende la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLEWVSAIGGSGG SLPYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQLSLSPGK (SEQ ID NO: 358.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno, que se une específicamente a BCMA, donde el anticuerpo comprende una región VH que comprende una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2, 32, 42 o 78; y/o una región VL que comprende una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 6, 525 a 85).
En algunas realizaciones, la divulgación también proporciona porciones de CDR de anticuerpos a anticuerpos BCMA basados en regiones de contacto de CDR. Las regiones de contacto CDR son regiones de un anticuerpo que imprimen especificidad al anticuerpo para un antígeno. En general, las regiones de contacto de las CDR incluyen las posiciones de los residuos en las CDR y las zonas de Vernier, que están restringidas para mantener la estructura de bucle adecuada para que el anticuerpo se una a un antígeno específico. Véase, por ejemplo Makabe et al., J. Biol. Chem, 283:1156-1166, 2007. La determinación de las regiones de contacto de las CDRs está bien dentro de la habilidad del arte.
La afinidad de unión (Kd) del anticuerpo BCMA como se describe en el presente documento a BCMA (como BCMA humano (por ejemplo, (SEQ ID NO: 353) puede ser de aproximadamente 0,002 nM a aproximadamente 6500 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es aproximadamente cualquiera de 6500 nm, 6000 nm, 5986 nm, 5567 nm, 5500 nm, 4500 nm, 4000 nm, 3500 nm, 3000 nm, 2500 nm, 2134 nm, 2000 nm, 1500 nm, 1000 nm, 750 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nM, 193 nM, 100 nM, 90 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nm, 18 nm, 17 nm, 16 nm, 15 nM, 10 nM, 8 nM, 75 nM, 7 nM, 6,5 nM, 6 nM, 5,5 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,3 nM, 0,1 nM, 0,01 nM o 0,002 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es menor que cualquiera de 6500 nm, 6000 nm, 5500 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm, 2000 nm, 1000 nm, 900 nm, 800 nm, 250 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7,5 nM, 7 nM, 6,5 nM, 6 nM, 5 nM, 4,5 nM, 4 nM, 3,5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1 nM, o 0,5 nM.
En algunas realizaciones, la divulgación abarca composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden anticuerpos descritos en el presente documento o hechos por los procedimientos y que tienen las características descritas en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos que se unen a BCMA, y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más de estos anticuerpos. Estas composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, como excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo tampones, que son bien conocidos en la técnica.
La divulgación también proporciona procedimientos para hacer cualquiera de estos anticuerpos. Los anticuerpos de esta divulgación pueden hacerse por procedimientos conocidos en la técnica. Los polipéptidos pueden producirse por degradación proteolítica o de otro tipo de los anticuerpos, por procedimientos recombinantes (es decir, polipéptidos simples o de fusión) como se ha descrito anteriormente o por síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente los polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, se fabrican convenientemente por síntesis química. Los procedimientos de síntesis química son conocidos en el arte y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, un anticuerpo podría ser producido por un sintetizador automatizado de polipéptidos que emplee el procedimiento de fase sólida. Véase también, Pat. de EE.UU. N° 5.807.715,4.816.567, y 6.331.415.
La divulgación también abarca proteínas de fusión que comprenden uno o más fragmentos o regiones de los anticuerpos de esta divulgación. En una realización, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de la región variable de la cadena ligera mostrada en las SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 34, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 317, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 100, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 126, 128, 80, 315, 36, o 364, y/o al menos 10 aminoácidos de la región variable de la cadena pesada mostrada en las SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 8, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 83, 87, 92, 95, 97, 99, 101, 104, 106, 110, 112, 114, 118, 120, 122, 112, 125, 127, 313, 314, 363 o 365. En otras realizaciones, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, o al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de la región de la cadena ligera variable y/o al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, o al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de la región de la cadena pesada variable. En otra realización, el polipéptido de fusión comprende una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada, como se muestra en cualquiera de los pares de secuencias seleccionadas de entre las SEQ ID NOs: 1 y 2, 1 y 3, 4 y 2, 5 y 2, 6 y 2, 4 y 7, 4 y 8, 4 y 3, 9 y 8, 9 y 3, 10 y 7, 10 y 8, 10 y 3, 11 y 7, 11 y 8, 11 y 3, 12 y 3, 13 y 7, 13 y 8, 14 y 3, 15 y 2, 16 y 2, 17 y 2, 18 y 2, 19 y 2, 20 y 2, 21 y 2, 22 y 2, 23 y 2, 16 y 24, 16 y 25, 16 y 26, 16 y 27, 16 y 28, 16 y 29, 16 y 30, 16 y 31, 16 y 3, 16 y 32, 16 y 2, 18 y 24, 18 y 25, 18 y 26, 18 y 27, 18 y 28, 18 y 29, 18 y 30, 18 y 31, 18y3, 18y32, 19y24, 19y25, 19y26, 19y27, 19y28, 19y29, 19y30, 19 y 31, 19y3, 19 y 32, 20 y 24, 20 y 25, 20 y 26, 20 y 27, 20 y 28, 20 y 29, 20 y 30, 20 y 31, 20 y 3, 20 y 32, 21 y 24, 21 y 28, 21 y 31, 21 y 3, 21 y 32, 22 y 24, 22 y 25, 22 y 26, 22 y 27, 22 y 28, 22 y 29, 22 y 30, 22 y 32, 23 y 25, 23 y 26, 23 y 27, 23 y 29, 23 y 30, 23 y 31, 23 y 3, 23 y 32, 34 y 33, 36 y 35, 38 y 37, 40 y 39, 41 y 33, 43 y 42, 45 y 44, 47 y 46, 49 y 48, 51 y 50, 53 y 52, 55 y 54, 57 y 56, 59 y 58, 61 y 60, 63 y 62, 65 y 64, 67 y 66, 69 y 68, 71 y 70, 73 y 72, 75 y 74, 77 y 76, 79 y 78, 317 y 78, 79 y 78, 81 y 78, 82 y 78, 84 y 83, 85 y 78, 86 y 78, 88 y 87, 89 y 78, 90 y 78, 91 y 78, 93 y 92, 94 y 78, 96 y 95, 98 y 97, 38 y 78, 102 y 101, 103 y 78, 105 y 104, 107 y 106, 108 y 78, 109 y 78, 111 y 110, 38 y 112, 113 y 112, 115 y 114, 116y76, 117 y 112, 119 y 118, 121 y 120, 123y 122, 124 y 112, 126y 125, 128y 127, 80 y 363, o 364 y 365. En otra realización, el polipéptido de fusión comprende una o más CDR. En otras realizaciones, el polipéptido de fusión comprende CDR H3 (VH CDR3) y/o CDR L3 (VL CDR3). A efectos de la presente divulgación, una proteína de fusión contiene uno o más anticuerpos y otra secuencia de aminoácidos a la que no está unida en la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homóloga de otra región. Las secuencias heterólogas ejemplares incluyen, pero no se limitan a una "etiqueta" como una etiqueta FLAG o una etiqueta 6His. Las etiquetas son bien conocidas en la técnica.
La divulgación también proporciona polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos de la divulgación, y vectores y células huésped que comprenden el polinucleótido.
En una realización, un polinucleótido comprende una secuencia que codifica la cadena pesada y/o las regiones variables de la cadena ligera del anticuerpo P6E01/P6E01, P6E01/H3.AQ, L1.LGF/L3.KW/P6E01; L1.LGF/L3.NY/P6E01, L1.GDF/L3.NY/P6E01, L1.LGF/L3.KW/H3.AL, L1.LGF/L3.KW/H3.AP, L1.LGF/L3.KW/H3.AQ, L1.LGF/L3.PY/H3.AP, L1.LGF/L3.PY/H3.AQ, L1.LGF/L3.NY/H3.AL, L1.LGF/L3.NY/H3.AP, L1.LGF/L3.NY/H3.AQ, L1.GDF/L3.KW/H3.AL, L1.GDF/L3.KW/H3.AP, L1.GDF/L3.KW/H3.AQ, L1.GDF/L3.PY/H3.AQ, L1.GDF/L3.NY/H3.AL, L1.GDF/L3.NY/H3.AP, L1.GDF/L3.NY/H3.AQ, L3.KW/P6E01, L3.PY/P6E01, L3.NY/P6E01, L3.PY/L1.PS/P6E01, L3.PY/L1.AH/P6E01, L3.PY/L1.FF/P6E01, L3.PY/L1.PH/P6E01, L3.PY/L3.KY/P6E01, L3.PY/L3.KF/P6E01, L3.PY/H2.QR, L3.PY/H2.DY, L3.PY/H2.YQ, L3.PY/H2.LT, L3.PY/H2.HA, L3.PY/H2.QL, L3.PY/H3.YA, L3.PY/H3.AE, L3.PY/H3.AQ, L3.PY/H3.TAQ, L3.PY/P6E01, L3.PY/L1.PS/H2.QR, L3.PY/L1.PS/H2.DY L3.PY/L1.PS/H2.YQ, L3.PY/L1.PS/H2.LT, L3.PY/L1.PS/H2.HA, L3.PY/L1.PS/H2.QL, L3.PY/L1.PS/H3.YA, L3.PY/L1.PS/H3.AE, L3.PY/L1.PS/H3.AQ, L3.PY/L1.PS/H3.TAQ, L3.PY/L1.AH/H2.QR, L3.PY/L1.AH/H2.DY, L3.PY/L1.AH/H2.YQ, L3.PY/L1.AH/H2.LT, L3.PY/L1.AH/H2.HA, L3.PY/L1.AH/H2.QL, L3.PY/L1.AH/H3.YA, L3.PY/L1.AH/H3.AE, L3.PY/L1.AH/H3.AQ, L3.PY/L1.AH/H3.TAQ L3.PY/L1.FF/H2.QR, L3.PY/L1.FF/H2.DY, L3.PY/L1.FF/H2.YQ, L3.PY/L1.FF/H2.LT, L3.PY/L1.FF/H2.HA, L3.PY/L1.FF/H2.QL, L3.PY/L1.FF/H3.YA, L3.PY/L1.FF/H3.AE, L3.PY/L1.FF/H3.AQ, L3.PY/L1.FF/H3.TAQ, L3.PY/L1.PH/H2.QR, L3.PY/L1.PH/H2.HA, L3.PY/L1.PH/H3.AE, L3.PY/L1.PH/H3.AQ, L3.PY/L1.PH/H3.TAQ. L3.PY/L3.KY/H2.QR, L3.PY/L3.KY/H2.DY, L3.PY/L3.KY/H2.YQ L3.PY/L3.KY/H2.LT, L3.PY/L3.KY/H2.HA, L3.PY/L3.KY/H2.QL, L3.PY/L3.KY/H3.YA L3.PY/L3.KY/H3.TAQ, L3.PY/L3.KF/H2.DY, L3.PY/L3.KF/H2.YQ, L3.PY/L3.KF/H2.LT L3.PY/L3.KF/H2.QL, L3.PY/L3.KF/H3.YA, L3.PY/L3.KF/H3.AE, L3.PY/L3.KF/H3.AQ L3.PY/L3.KF/H3.TAQ P5A2_VHVL, A02_Rd4_0.6nM_C06, A02_Rd4_0.6nM_C09 A02_Rd4_6nM_C16, A02 Rd4 6nM C03, A02 Rd4 6nM C01, A02_Rd4_6nM_C26 A02_Rd4_6nM_C25, A02_Rd4_6nM_C22, A02_Rd4_6nM_C19, A02_Rd4_0.6nM_C03 A02_Rd4_6nM_C07, A02_Rd4_6nM_C23, A02_Rd4_0.6nM_C18, A02_Rd4_6nM_C10 A02_Rd4_6nM_C05, A02_Rd4_0.6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C04, A02_Rd4_0.6nM_C26 A02_Rd4_0.6nM_C13, A02_Rd4_0.6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C08, P5C1_VHVL, C01 Rd4_6nM_C24 C01_Rd4_6nM_C26, C01_Rd4_6nM_C10, C01_Rd4_0.6nM_C27 C01_Rd4_6nM_C20, C01 Rd4 6nM C12, C01 Rd4 0.6nM C16, C01 Rd4 0.6nM C09 C01 Rd4 6nM C09, C01_Rd4_0.6nM_C03, C01_Rd4_0.6nM_C06, C01_Rd4_6nM_C04 COMBO_Rd4_0.6nM_C22, COMBO_Rd4_6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C10, COMBO_Rd4_0.6nM_C04, COMBO_Rd4_6nM_C25, COMBO_Rd4_0.6nM_C21 COMBO_Rd4_6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C20, COMBO_Rd4_6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C08, COMBO_Rd4_0.6nM_C19, COMBO_Rd4_0.6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C23, COMBO_Rd4_0.6nM_C29 COMBO_Rd4_0.6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C12, COMBO_Rd4_0.6nM_C30, COMBO_Rd4_0.6nM_C14 COMBO Rd4 6nM C07, COMBO_Rd4_6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C05, COMBO Rd4 0.6nM _ C17 COMBO_Rd4_6nM_C22, COMBO_Rd4_0.6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, P4G4, o P1A11. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y la célula huésped puede entonces expandirse y congelarse para su uso futuro. En el presente documento se describen con más detalle los vectores (incluidos los vectores de expresión) y las células huésped.
La divulgación también abarca scFv de anticuerpos de esta divulgación. Los fragmentos de la región variable de cadena única se fabrican uniendo las regiones variables de cadena ligera y/o pesada mediante un péptido de enlace corto (Bird et al., Science 242:423-426, 1988). Un ejemplo de péptido de enlace es (GGGGS)3 (Se Q ID NO: 498), que hace de puente entre la terminación carboxi de una región variable y la terminación amino de la otra región variable, aproximadamente 3,5 nm. Se han diseñado y utilizado enlazadores de otras secuencias (Bird et al., 1988, supra). Los enlazadores deben ser polipéptidos cortos y flexibles y, preferentemente, estar compuestos por menos de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos. Los enlazadores pueden, a su vez, modificarse para realizar funciones adicionales, como la fijación de fármacos o la sujeción a soportes sólidos. Las variantes de cadena única pueden producirse de forma recombinante o sintética. Para la producción sintética de scFv, se puede utilizar un sintetizador automatizado. Para la producción recombinante de scFv, se puede introducir un plásmido adecuado que contenga el polinucleótido que codifica el scFv en una célula huésped adecuada, ya sea eucariótica, como la levadura, la planta, el insecto o las células de mamífero, o procariótica, como E. coli. Los polinucleótidos que codifican el scFv de interés pueden hacerse mediante manipulaciones rutinarias como la ligadura de polinucleótidos. El scFv resultante puede aislarse utilizando técnicas estándar de purificación de proteínas conocidas en la técnica.
También se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena única, como los diacuerpos o los minicuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los que los dominios variable de la cadena pesada (VH) y variable de la cadena ligera (VL) se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero utilizando un enlazador demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, lo que obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448, 1993 Poljak, R. J., etal., Structure 2:1121-1123, 1994). El minicuerpo incluye los dominios VL y VH de un anticuerpo nativo fusionados con la región bisagra y el dominio CH3 de la molécula de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo US5.837.821.
En otro aspecto, la divulgación proporciona composiciones (tales como composiciones farmacéuticas) que comprenden cualquiera de los polinucleótidos de la divulgación. En algunas realizaciones, la composición comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. En otras realizaciones, la composición comprende uno o ambos polinucleótidos mostrados en la SEQ ID NO: 486 y SEQ ID NO: 485 abajo:
COMBO_Rd4_0.6nM_C29 región variable de la cadena pesada
GAAGT CCAACT CCT CGAAT CCGGT GGCGGCCTT GT CCAGCCT GG AGGTT CCTTGC
GCCT GT CAT GT GCCGCCAGCGGATT CACCTT CT CGT CCT ACCCGAT GT CGT GGGT
CCGCCAGGCT CCGGGAAAGGGCCTGGAAT GGGT GT CAGCCAT CGGAGGAT CGG
GGGGCT CCCT GCCCT ACGCCGAT AT CGT GAAGGGAAGGTT CACCATT AGCCGGG
ACAACT CCAAGAACACT CT GT ACCT CCAAAT GAACAGCCT GAGAGCGGAGGACAC
CGCAGT GT ACT ATTGCGCCCGGT ACT GGCCAATGGACAT CT GGGGCCAGGGGAC
TCTGGT CACCGT CT CCT CA (SEQ ID NO: 486)
COMBO_Rd4_0.6nM_C29 región variable de la cadena ligera
GAGAT CGTGCT GACT CAGT CCCCTGGAACCCT GT CCCT GT CACCT GGCGAAAGAG
CT ACCTT GTCCTGT CG CGCAT CACAAT CCGTGTCGT CG AGCT AT CT CG CGT GGTA
CCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCAAGGCT GCTT AT GT ACGACGCCT CCAT CCG
GGCCACT GGT AT CCCCGACCGCTT CT CGGGCT CCGGAAGCGGCACCGACTT CAC
CCT GACT ATTT CCCGGCT CGAACCGGAGGATTT CGCCGT GT ACT ACTGCCAACAG
TACCAGAGCTGGCCGCTGACGTTTGGGCAGGGGACCAAGGTCGAAATCAAA
(SEQ ID NO: 485)
En otras realizaciones, la composición comprende uno o ambos polinucleótidos mostrados en la SEQ ID NO: 488 y SEQ ID NO: 487 abajo:
Región variable de la cadena pesada L3.PY/H3TAQ
GAAGTGCAGCT GCT GGAAT CT GGCGGAGGACT GGT GCAGCCT GGCGGCT CT CT G
AGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGGCAGCTACGCTATGACCTGGG
T GCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACT GGAATGGGT GT CCGCCAT CT CTGGCAGCG
GCGGCAAT ACCTT CT ACGCCGAGAGCGT GAAGGGCCGGTT CACCAT CAGCCGGG
ACAACAGCAAGAACACCCT GT ACCT GCAGAT GAACAGCCTGCGGGCCGAGGACA
CCGCCGT GT ACT ATT GT ACACGGGT GT CCCCT AT CGCCGCGCAGATGGATT ATT G
GGGCCAGGGCACT CT GGT CACCGT CT CCT CA
(SEQ ID NO: 488)
Región variable de la cadena pesada L3.PY/H3TAQ
GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGCACCCTGAGCCTGTCTCCAGGCGAAAGA
GCCACCCT GT CCT GCAGAGCCAGCCAGAGCGT GT CCAGCAGCT ACCT GGCCT GG
T AT CAGCAGAAGCCCGGCCAGGCT CCCCGGCTGCT GAT CT AT GGCGCCT CTT CT A
GAGCCACCGGCAT CCCCGAT AGATT CAGCGGCT CT GGCAGCGGCACCGACTT CA
CCCT GACCAT CAGCAGACT GGAACCCGAGGACTT CGCCGT GT ACT ACTGCCAGCA
CTACCCTTATCCCCCCAGCTTCACATTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAA
(SEQ ID NO: 487)
En otras realizaciones, la composición comprende uno o ambos polinucleótidos mostrados en la SEQ ID NO: 490 y SEQ ID NO: 489 abajo:
A02_Rd4_0.6nM_C01 región variable de la cadena pesada
GAAGTT CAATT ATT GGAAT CT GGT GGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCT CT CT GA
GACT GT CTT GT GCCGCCAGCGGCTT CACCTT CAGCAGCT ACGCCAT GAACTGGGT
GCGCCAGGCCCCT GGT AAAGGTTT GGAATGGGTTT CT GCT ATT ACT GCGT CT GGT
GGTT CT ACTT ACT AT GCCGAT GTGGTT AAGGGT AGATT CACCATTT CT AGAGACAA
CT CT AAGAACACCTT GT ACTTGCAAAT GAACT CCTT GAGAGCT GAAGAT ACT GCTG
TTT ATT ACT GT GCT AGAT ACT GGCCAAT GT CGTT GTGGGGT CAAGGT ACT CTGGTC
ACCGTCTCCTCA
(SEQ ID NO: 490)
A02_Rd4_0.6nM_C01 región variable de la cadena ligera
GAGAT CGT GCT GACACAGAGCCCT GGCACCCT GAGCCT GT CT CCTGGT GAAAGA
GCT ACTTT GT CTT GT AGAGCTT CT CAAT CCGTTT CCGCGT ATT ATTT GGCTT GGT AT
CAACAAAAACCAGGT CAAGCT CCAAGATT ATT GAT GT ACGAT GCTT CT ATT AGAGC
CACCGGT ATT CCAGAT AGATTTT CT GGTT CT GGTT CCGGT ACT GATTT CACTTT GAC
T AT CT CT AGATT GGAACCAGAAGATTT CGCT GTTT ACT ACT GT CAACAAT AT GAGCG
TTGGCCATT GACTTTTGGT CAAGGT ACAAAGGTT GAAAT CAAACGT GAG
(SEQ ID NO: 489)
En otras realizaciones, la composición comprende uno o ambos polinucleótidos mostrados en la SEQ ID NO: 492 y SEQ ID NO: 491 abajo:
A02_Rd4_0.6nM_C16 región variable de la cadena pesada
GAAGTT CAATT ATT GGAAT CTGGT GGAGGACT GGT GCAGCCT GGCGGCT CT CT GA
GACT GT CTT GT GCCGCCAGCGGCTT CACCTT CAGCAGCT ACGCCAT GAACTGGGT
GCGCCAGGCCCCTGGT AAAGGTTTGGAAT GGGTTT CT GCT ATTT CT GATTTT GGT G
GTT CT ACTT ACT ATGCCGAT AT CGTT AAGGGT AGATT CACCATTT CT AGAGACAACT
CT AAGAACACCTT GT ACTT GCAAAT GAACT CCTT GAGAGCT GAAGAT ACT GCT GTT
T ATT ACT GT GCT AGAT ACT GGCCAAT GGAT ATTTGGGGT CAAGGT ACT CT GGT CAC
CGTCTCCTCA
(SEQ ID NO: 492)
A02_Rd4_0.6nM_C16 región variable de la cadena ligera
GAGAT CGT GCT GACACAGAGCCCT GGCACCCT GAGCCT GT CT CCTGGT GAAAGA
GCT ACTTT GT CTT GT AGAGCTT CT CAAT CCGTTT CCGAT CT GT ATTT GGCTT GGT AT
CAACAAAAACCAGGT CAAGCT CCAAGATT ATT GAT GT ACGAT GCTT CT ATT AGAGC
CACCGGT ATT CCAGAT AGATTTT CT GGTT CT GGTT CCGGT ACT GATTT CACTTT GAC
T AT CT CT AGATT GGAACCAGAAGATTT CGCT GTTT ACT ACT GT CAACAAT AT CAGAC
TTGGCCATT GACTTTTGGT CAAGGT ACAAAGGTT GAAAT CAAACGT GAG
(SEQ ID NO: 491).
En el presente documento se describen además los vectores de expresión y la administración de composiciones de polinucleótidos.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para hacer cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente documento.
Los polinucleótidos complementarios a cualquiera de estas secuencias también se incluyen en la presente divulgación. Los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de ARNhn, que contienen intrones y se corresponden con una molécula de ADN de manera unívoca, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no es necesario, estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente divulgación, y un polinucleótido puede, pero no es necesario, estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un anticuerpo o una porción del mismo) o pueden comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes de polinucleótidos contienen una o más sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones de manera que la inmunoreactividad del polipéptido codificado no disminuye, en relación con una molécula inmunoreactiva nativa. El efecto sobre la inmunorreactividad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en el presente documento. Las variantes exhiben preferentemente al menos aproximadamente 70% de identidad, más preferentemente, al menos aproximadamente 80% de identidad, aún más preferentemente, al menos aproximadamente 90% de identidad, y más preferentemente, al menos aproximadamente 95% de identidad con una secuencia polinucleotídica que codifica un anticuerpo nativo o una porción del mismo.
Se dice que dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para obtener la máxima correspondencia, como se describe a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan normalmente comparando las secuencias sobre una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a aproximadamente 75, o de 40 a 5 aproximadamente 0, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se hayan alineado de forma óptima.
La alineación óptima de las secuencias para su comparación puede realizarse utilizando el programa Megalign de la suite de software bioinformático Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), utilizando los parámetros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineación descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships.. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345­ 358 Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA Higgins, D.G. y Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153 Myers, E.W. y Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17 Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105 Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomythe Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CAWilbur, W.J. y Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
Preferentemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en la que la porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, brechas) del 20 por ciento o menos, normalmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparecen bases de ácido nucleico o residuos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de la secuencia.
Las variantes pueden también, o alternativamente, ser sustancialmente homólogas a un gen nativo, o a una porción o complemento del mismo. Dichas variantes polinucleotídicas son capaces de hibridarse en condiciones moderadamente estrictas con una secuencia de ADN natural que codifica un anticuerpo nativo (o una secuencia complementaria).
Unas "condiciones moderadamente estrictas" adecuadas incluyen el prelavado en una solución de 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridación a 50°C-65°C, 5 X SSC, durante la noche; seguida de dos lavados a 65°C durante 20 minutos con cada una de las soluciones 2X, 0,5Xy 0,2X SSC que contienen 0,1% SDS.
Tal y como se utiliza en el presente documento, las "condiciones altamente rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad" son aquellas que: (1) emplean una fuerza iónica baja y una temperatura alta para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/0,0015 M citrato de sodio/0,1% dodecil sulfato de sodio a 50°C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizador, como la formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con 0,1% de albúmina de suero bovino/0,1% de FicoII/0,1% de polivinilpirrolidona/50 mM de tampón fosfato de sodio a pH 6,5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42°C; o (3) emplean 50% de formamida, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sodio, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), 0,1% de SDS y 10% de sulfato de dextrano a 42°C, con lavados a 42°C en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55°C, seguidos de un lavado de alta intensidad consistente en 0,1 x SSC con EDTA a 55°C. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. según sea necesario para acomodar factores como la longitud de la sonda y similares.
Aquellos con conocimientos normales en el arte apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como el descrito en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos tienen una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a las diferencias en el uso de codones se contemplan específicamente en la presente divulgación. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en el presente documento están dentro del alcance de la presente divulgación. Los alelos son genes endógenos que están alterados como resultado de una o más mutaciones, como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, aunque no necesariamente, tener una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse mediante técnicas estándar (como la hibridación, la amplificación y/o la comparación de secuencias en bases de datos).
Los polinucleótidos de esta divulgación pueden obtenerse mediante síntesis química, procedimientos recombinantes o PCR. Los procedimientos de síntesis química de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica y no es necesario describirlos en detalle en el presente documento. Un experto en la materia puede utilizar las secuencias proporcionadas en el presente documento y un sintetizador de ADN comercial para producir una secuencia de ADN deseada.
Para preparar polinucleótidos utilizando procedimientos recombinantes, un polinucleótido que comprende una secuencia deseada puede insertarse en un vector adecuado, y el vector, a su vez, puede introducirse en una célula huésped adecuada para su replicación y amplificación, como se explica más adelante. Los polinucleótidos pueden insertarse en las células huésped por cualquier medio conocido en la técnica. Las células se transforman introduciendo un polinucleótido exógeno por captación directa, endocitosis, transfección, apareamiento F o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno puede mantenerse dentro de la célula como un vector no integrado (como un plásmido) o integrado en el genoma de la célula huésped. El polinucleótido así amplificado puede aislarse de la célula huésped por procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989.
Alternativamente, la PCR permite la reproducción de secuencias de ADN. La tecnología PCR es bien conocida en la técnica y se describe en la Patente de EE.UU. n° 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 y 4.683.202 así como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.
El ARN puede obtenerse utilizando el ADN aislado en un vector apropiado e insertándolo en una célula huésped adecuada. Cuando la célula se replica y el ADN se transcribe en ARN, el ARN se puede aislar utilizando procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia, como se expone en Sambrook et al., 1989, supra, por ejemplo.
Los vectores de clonación adecuados pueden construirse de acuerdo con técnicas estándar, o pueden seleccionarse de entre un gran número de vectores de clonación disponibles en el arte. Aunque el vector de clonación seleccionado puede variar en función de la célula huésped que se pretenda utilizar, los vectores de clonación útiles tendrán generalmente la capacidad de autorreplicarse, pueden poseer una única diana para una endonucleasa de restricción particular, y/o pueden llevar genes para un marcador que pueda utilizarse en la selección de clones que contengan el vector. Algunos ejemplos adecuados son los plásmidos y los virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por ejemplo, pBS SK+) y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, Rp4, ADN de fagos y vectores lanzadera como pSA3 y pAT28. Estos y muchos otros vectores de clonación están disponibles en proveedores comerciales como BioRad, Strategene e Invitrogen.
Los vectores de expresión generalmente son constructos polinucleotídicos replicables que contienen un polinucleótido según la divulgación. Se da por supuesto que un vector de expresión debe ser replicable en las células huésped, ya sea como episomas o como parte integrante del ADN cromosómico. Los vectores de expresión adecuados incluyen, entre otros, los plásmidos, los vectores virales, incluidos los adenovirus, los virus adeno-asociados, los retrovirus, los cósmidos y los vectores de expresión divulgados en la Publicación PCT n°WO 87/04462. Los componentes del vector generalmente pueden incluir, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal; un origen de replicación; uno o más genes marcadores; elementos de control transcripcional adecuados (como promotores, potenciadores y terminadores). Para la expresión (es decir, la traducción), también suelen ser necesarios uno o más elementos de control de la traducción, como los sitios de unión a los ribosomas, los sitios de iniciación de la traducción y los codones de parada.
Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula huésped por cualquiera de un número de medios apropiados, incluyendo la electroporación, la transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias; el bombardeo de microproyectos; la lipofección; y la infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso como el virus vaccinia). La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá a menudo de las características de la célula huésped.
La divulgación también proporciona células huésped que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente documento. Para aislar los genes que codifican el anticuerpo, el polipéptido o la proteína de interés, puede utilizarse cualquier célula huésped capaz de sobreexpresar ADN heterólogo. Ejemplos no limitantes de células huésped de mamíferos incluyen, pero no se limitan a las células COS, HeLa y CHO. Véase también Publicación PCT n° WO 87/04462. Las células huésped no mamíferas adecuadas incluyen procariotas (como E. coli o B. subtillis) y levaduras (como S. cerevisae, S. pombe; o K. lactis). Preferentemente, las células huésped expresan los ADNc a un nivel aproximadamente 5 veces mayor, más preferentemente, 10 veces mayor, incluso más preferentemente, 20 veces mayor que el del correspondiente anticuerpo endógeno o proteína de interés, si está presente, en las células huésped.
El cribado de las células huésped para una unión específica a BCMA o a un dominio BCMA (por ejemplo, los dominios 1-4) se realiza mediante un inmunoensayo o FACS. Se puede identificar una célula que sobreexprese el anticuerpo o la proteína de interés.
Los materiales representativos de la presente divulgación se depositaron en la American Type Culture Collection (ATCC) el 15 de abril de 2015. El vector con número de acceso ATCC PTA-122094 es un polinucleótido que codifica una región variable de la cadena pesada del anticuerpo BCMA humanizado, y el vector con número de acceso ATCC PTA-122093 es un polinucleótido que codifica una región variable de la cadena ligera del anticuerpo BCMA humanizado. Los depósitos se realizaron en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes y su reglamento (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del yacimiento durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El depósito será puesto a disposición por el ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Pfizer, Inc. y el ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del depósito al público tras la emisión de la patente estadounidense pertinente o tras la puesta a disposición del público de cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, lo que ocurra primero, y asegura la disponibilidad de la progenie a quien el Comisionado de Patentes y Marcas de EE.UU. determine que tiene derecho a ella de acuerdo con la Sección 122 del 35 U.S.C. y las normas del Comisionado en virtud de la misma (incluida la Sección 1.14 del 37 C.F.R. con especial referencia al 886 OG 638).
El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en depósito muriera, se perdiera o se destruyera cuando se cultivara en condiciones adecuadas, los materiales serán sustituidos rápidamente, previa notificación, por otro igual. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.
Conjugados de anticuerpos BCMA
La presente divulgación también proporciona un conjugado (o inmunoconjugado) del anticuerpo BCMA como se describe en el presente documento, o del fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno se conjuga con un agente (por ejemplo, un agente citotóxico) para la inmunoterapia dirigida (por ejemplo, conjugados anticuerpo-fármaco) ya sea directa o indirectamente a través de un enlazador. Por ejemplo, un agente citotóxico puede enlazarse o conjugarse con el anticuerpo BCMA o el fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describe en el presente documento, para la administración local dirigida de la fracción del agente citotóxico a los tumores (por ejemplo, al tumor que expresa BCMA).
En varias publicaciones se han descrito procedimientos para conjugar agentes citotóxicos u otros agentes terapéuticos con anticuerpos. Por ejemplo, se puede realizar una modificación química en los anticuerpos a través de aminas de la cadena lateral de la lisina o a través de grupos sulfhidrilos de la cisteína activados por la reducción de los enlaces disulfuro entre cadenas para que se produzca la reacción de conjugación. Véase, por ejemplo Tanaka et al., FEBS Letters 579:2092-2096, 2005y Gentle et al., Bioconjugate Chem. 15, 525 a 2004). También se han descrito residuos de cisteína reactivos diseñados en sitios específicos de los anticuerpos para la conjugación de fármacos específicos con estequiometría definida. Véase, por ejemplo Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925-932, 2008. La conjugación que utiliza una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo o una glutamina endógena que se hace reactiva (es decir, la capacidad de formar un enlace covalente como donante de acilo) mediante la ingeniería de polipéptidos en presencia de transglutaminasa y una amina (por ejemplo, un agente citotóxico que comprende o está unido a una amina reactiva) también se describe en las solicitudes internacionales WO2012/059882 y WO2015015448.
En algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o el conjugado descrito en el presente documento comprende una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo diseñada en un sitio específico del anticuerpo (por ejemplo, un extremo carboxilo, un extremo amino, o en otro sitio en el anticuerpo BCMA). En algunas realizaciones, la etiqueta comprende un aminoácido glutamina (Q) o una secuencia de aminoácidos LQG, LLQGG (SEQ ID NO:318), LLQG (SEQ ID NO:454), LSLSQG (SEQ ID NO: 455), GGGLLQGG (SEQ ID NO: 456), GLLQG (SEQ ID NO: 457), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID NO: 458), GLLQGGG (SEQ ID NO: 459), GLLQGG (SEQ ID NO: 460), GLLQ (SEQ ID NO: 461), LLQLLQGA (SEQ ID NO: 462), LLQGA (SEQ ID NO: 463), LLQYQGA (SEQ ID NO: 464), LLQGSG (SEQ ID NO: 465), LLQYQG (SEQ ID NO: 466), LLQLLQG (SEQ ID NO: 467), SLLQG (SEQ ID NO: 468), LLQLQ (SEQ ID NO: 469), LLQLLQ (SEQ ID NO: 470), LLQGR (SEQ ID NO: 471), LLQGPP (SEQ ID NO: 472), LLQGPA (SEQ ID NO: 473), GGLLQGPP (SEQ ID NO: 474), GGLLQGA (SEQ ID NO: 475), LLQGPGK (SEQ ID NO: 476), LLQGPG (SEQ ID NO: 477), LLQGP (SEQ ID NO: 478), LLQP (SEQ ID NO: 479), LLQPGK (SEQ ID NO: 480), LLQAPGK (SEQ ID NO: 481), LLQGAPG (SEQ ID NO: 482), LLQGAP (SEQ ID NO: 483), y LLQLQG (SEQ ID NO: 484.
En algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o el conjugado descrito en el presente documento comprende una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo diseñada en un sitio específico del anticuerpo, donde la etiqueta comprende una secuencia de aminoácidos GGLLQGPP (SEQ ID NO: 474) o GGLLQGA (SEQ ID NO: 475) diseñado en el extremo carboxilo de la cadena ligera del anticuerpo BCMA. En algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o el conjugado descrito en el presente documento comprende una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo en un sitio específico del anticuerpo, donde la etiqueta comprende una secuencia de aminoácidos LLQG (SEQ ID NO: 454) diseñado tras el residuo T135 de la cadena pesada del anticuerpo BCMA. En otras realizaciones, el anticuerpo BCMA o el conjugado descrito en el presente documento comprende una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo en un sitio específico del anticuerpo, donde la etiqueta comprende una secuencia de aminoácidos LLQGA (SEQ ID NO: 463) o LLQGPP (SEQ ID NO: 472) diseñado en el extremo carboxilo de la cadena pesada del anticuerpo BCMA y en el que se elimina el residuo de lisina en el extremo carboxilo de la cadena pesada. En algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o el conjugado aquí descrito comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 297 del anticuerpo BCMA (esquema de numeración EU). Por ejemplo, el aminoácido asparagina (N) puede ser sustituido por glutamina (Q) o alanina (A) en la posición 297 del anticuerpo BCMA.
También se proporciona un anticuerpo aislado que comprende una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo y una modificación de aminoácidos en la posición 222, 340 o 370 del anticuerpo (esquema de numeración de la UE), donde la modificación es una deleción, inserción, sustitución, mutación de aminoácidos o cualquier combinación de las mismas. En consecuencia, en algunas realizaciones, se proporciona el anticuerpo BCMA o el conjugado descrito en el presente documento que comprende la etiqueta que contiene glutamina donante de acilo (por ejemplo, Q, LQG, LLQGG (SEQ ID NO:318), LLQG (SEQ ID NO:454), LSLSQG (SEQ ID NO: 455), GGGLLQGG (SEQ ID NO: 456), GLLQG (SEQ ID NO: 457), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID NO: 458), GLLQGGG (SEQ ID NO: 459), GLLQGG (SEQ ID NO: 460), GLLQ (SEQ ID NO: 461), LLQLLQGA (SEQ ID NO: 462), LLQGA (SEQ ID NO: 463), LLQYQGA (SEQ ID NO: 464), LLQGSG (SEQ ID NO: 465), LLQYQG (SEQ ID NO: 466), LLQLLQG (SEQ ID NO: 467), SLLQG (SEQ ID NO: 468), LLQLQ (SEQ ID NO: 469), LLQLLQ (SEQ ID NO: 470), LLQGR (SEQ ID NO: 471), LLQGPP (SEQ ID NO: 472), LLQGPA (SEQ ID NO: 473), GGLLQGPP (SEQ ID NO: 474), GGLLQGA (SEQ ID NO: 475), LLQGPGK (SEQ ID NO: 476), LLQGPG (SEQ ID NO: 477), LLQGP (SEQ ID NO: 478), LLQP (SEQ ID NO: 479), LLQPGK (SEQ ID NO: 480), LLQAPGK (SEQ ID NO: 481), LLQGAPG (SEQ ID NO: 482), LLQGAP (SEQ ID NO: 483), y LLQLQG (SEQ ID NO: 484)) conjugado en un sitio específico (por ejemplo, en un extremo carboxilo de la cadena pesada o ligera, el residuo T135 en la cadena pesada del anticuerpo, o en otro sitio) del anticuerpo BCMA y una modificación de aminoácidos en la posición 222, 340 o 370 del anticuerpo (esquema de numeración EU). En algunas realizaciones, la modificación de aminoácidos es una sustitución de lisina por arginina (por ejemplo, K222R, K340R o K370R).
En algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o el conjugado descrito en el presente documento comprende una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo que comprende la secuencia GGLLQGPP (SEQ ID NO: 474) en el extremo C de la cadena ligera del anticuerpo BCMA y una sustitución de aminoácidos de lisina a arginina en la posición 222 del anticuerpo (esquema de numeración EU). En algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o el conjugado descrito en el presente documento comprende una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo que comprende la secuencia GGLLQGA (SEQ ID NO: 475) diseñado en el C-terminal de la cadena ligera del anticuerpo BCMA y una sustitución de aminoácidos de lisina a arginina en la posición 222 del anticuerpo (esquema de numeración EU). En algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o el conjugado descrito en el presente documento comprende una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo que comprende la secuencia LLQGA (SEQ ID NO: 463) diseñado en el extremo C de la cadena pesada del anticuerpo BCMA y una sustitución de aminoácidos de lisina a arginina en la posición 222 del anticuerpo (esquema de numeración EU), en la que se elimina el residuo de lisina en el extremo carboxilo de la cadena pesada. En algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o el conjugado descrito en el presente documento comprende una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo que comprende la secuencia LLQg (SEQ ID NO: 454) diseñado después del residuo T135 en la cadena pesada del anticuerpo BCMA y una sustitución de aminoácidos de lisina a arginina en la posición 222 del anticuerpo (esquema de numeración EU).
En algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o el conjugado descrito en el presente documento comprende una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo que comprende una glutamina modificada en la posición 297 o una sustitución de aminoácidos en la posición 297 de asparagina (N) a otro aminoácido en el anticuerpo BCMA y una sustitución de aminoácidos de lisina a arginina en la posición 222 del anticuerpo (esquema de numeración EU). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o el conjugado descrito en el presente documento comprende una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo que comprende la secuencia GGLLQGPP (SEQ ID NO: 474) en el extremo C de la cadena ligera del anticuerpo BCMA, una sustitución de aminoácidos en la posición 297 del anticuerpo BCMA de asparagina (N) a glutamina (Q), y una sustitución de aminoácidos de lisina a arginina en la posición 222 del anticuerpo (esquema de numeración EU). En algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o el conjugado descrito en el presente documento comprende una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo que comprende la secuencia LLQG (SEQ ID NO: 454) diseñado después del residuo T135 en la cadena pesada del anticuerpo BCMA, una sustitución de aminoácidos en la posición 297 del anticuerpo BCMA de asparagina (N) a alanina (A), y una sustitución de aminoácidos de lisina a arginina en la posición 222 del anticuerpo (esquema de numeración EU).
Los agentes que pueden conjugarse con los anticuerpos BCMA o los fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, agentes citotóxicos, agentes inmunomoduladores, agentes de formación de imágenes, proteínas terapéuticas, biopolímeros u oligonucleótidos.
Los ejemplos de un agente citotóxico incluyen, entre otros, una antraciclina, una auristatina, una dolastatina, una combretastatina, una duocamicina, un dímero de pirrolobenzodiazepina, un dímero de indolino-benzodiazepina, una enedina una geldanamicina, una maytansina, una puromicina, un taxano, un alcaloide de la vinca, una camptotecina, una tubulisina, una hemiasterlina, una espliceostatina, una pladienolida y sus estereoisómeros, isóteros, análogos o derivados.
Las antraciclinas se derivan de la bacteria Strepomyces y se han utilizado para tratar una amplia gama de cánceres, como las leucemias, los linfomas, los cánceres de mama, de útero, de ovarios y de pulmón. Las antraciclinas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, daunorubicina, doxorubicina (es decir, adriamicina), epirubicina, idarubicina, valrubicina y mitoxantrona.
Las dolastatinas y sus análogos y derivados peptídicos, las auristatinas, son agentes antimitóticos muy potentes que han demostrado tener actividad anticancerígena y antifúngica. Véase, por ejemplo Pat. de EE.UU. N° 5.663.149 y Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42, 525 a 1998). Las dolastatinas y auristatinas ejemplares incluyen, entre otras, la dolastatina 10, la auristatina E, la auristatina EB (Ae B), la auristatina EFP (AEFP), la m Ma D (monometil auristatina D o monometil dolastatina 10), MMAF (Monometil Auristatin F o N-metilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproinafenilalanina), MMAE (Monometil Auristatin E o N-metilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina-norefedrina), éster de ácido 5-benzoilvalérico-AE (AEVB), y otras auristatinas novedosas (como las descritas en Publicación estadounidense n.° 2013/0129753). En algunas realizaciones, la auristatina es O1 O1 (2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidina-1-il}-5-metil-1-oxoheptano-4-il]-N-metil-L-valinamida) con la siguiente estructura:
Figure imgf000065_0001
En algunas realizaciones, la auristatina es 3377 (N,2-dimetilalanilo-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxil-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidina-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000065_0002
En algunas realizaciones, la auristatina es 0131-OMe (N,2-dimetilalanilo-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropií]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metilL-valinamida) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000065_0003
En otras realizaciones, la auristatina es 0131 (2-metil-L-proli-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidina-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptano-4-il]-N-metil-L-valinamida) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000065_0004
En otras realizaciones, la auristatina es 0121 (2-metil-L-proli-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidina-1-il}-3-metoxi-5-metií-1-oxoheptano-4-il]-N-metil-L-valinamida) que tiene la siguiente estructura:
La camptotecina es un alcaloide de quinolina citotóxico que inhibe la enzima topoisomerasa I. Los ejemplos de camptotecina y sus derivados incluyen, pero no se limitan a, topotecán e irinotecán, y sus metabolitos, como el SN-38. Las combretastatinas son fenoles naturales con propiedades de disrupción vascular en los tumores. Algunos ejemplos de combretastatinas y sus derivados son, entre otros, la combretastatina A-4 (CA-4) y la ombrabulina.
La duocarmicina y el CC-1065 son agentes alquilantes del ADN con potencia citotóxica. Véase Bogery Johnson, PNAS 92:3642-3649 (1995). Los ejemplos de duocarmicina y CC-1065 incluyen, entre otros, la (+)-duocarmicina A y la (+)-duocarmicina Sa , la (+)-CC-1065 y los compuestos divulgados en la solicitud internacional PCT/IB2015/050280 incluyendo, pero sin limitarse a ello, N~2~-acetil-L-lisil-L-valilo-N~5~-carbamoil-N-[4-(2-{[(1S)-1-(clorometil)-3-[(5-{(1S)-1-(clorometil)-5-(fosfonooxi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il]carbonilo}tiofen-2-il)carbonilo]-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-il}oxi)carbonil](metil)amino}etil)(metil)carbamoil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida que tiene la estructura:
Figure imgf000066_0001
, N~2~-acetil-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(clorometil)-6-[ (3-{[(1S)-1-(clorometil)-8-metil-5-(fosfonooxi)-1,6-dihidropirrolo[3,2-e]indol-3(2H)-il]carbonil}biciclo[1.1.1]pent-1-il)carbonil]-1 -metil-3,6,7,8-tetrahidropirrolo[3,2-e]indol-4-il}oxi)carbonil](metil)amino}etil) (metil)carbamoil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida que tiene la estructura:
Figure imgf000066_0002
N~2~-acetil-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(clorometil)-6-[ (4-{[(1S)-1-(clorometil)-8-metil-5-(fosfonooxi)-1,6-dihidropirrolo[3,2-e]indol-3(2H)-il]carbonil}pentaciclo[4.2.0.0~2,5~.0~3,8~.0~4,7~]oct-1-il)carbonil]-1-metil-3,6,7,8-tetrahidropirrolo[3,2- e]indol-4-il}oxi)carbonil](metil)amino}etil)(metil)carbamoil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida que tiene la estructura
Figure imgf000067_0001
Los enediynes son una clase de productos bacterianos antitumorales caracterizados por anillos de nueve y diez miembros o por la presencia de un sistema cíclico de enlaces triple-doble-triple conjugados. Algunos ejemplos de enediynes son, entre otros, la calicheamicina, la esperamicina, la uncialamicina, la dinemicina y sus derivados.
Las geldanamicinas son antibióticos de benzoquinona ansamicina que se unen a la Hsp90 (Proteína de Choque Térmico 90) y se han utilizado como fármacos antitumorales. Las geldanamicinas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, 17-AAG (17-N-alilamino-17-demetoxigeldanamicina) y 17-DMAG (17-dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina).
La hemiasterlina y sus análogos (por ejemplo, HTI-286) se unen a la tubulina, interrumpen la dinámica normal de los microtúbulos y, en cantidades estequiométricas, despolimerizan los microtúbulos.
Las maytansinas o sus derivados maytansinoides inhiben la proliferación celular al inhibir la formación de microtúbulos durante la mitosis mediante la inhibición de la polimerización de la tubulina. Véase Remillard et al., Science 189:1002-1005,1975. Algunos ejemplos de maytansinas y maytansinoides son, entre otros, la mertansina (DM1) y sus derivados, así como la ansamitocina.
Los dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBDs) y los dímeros de indolino-benzodiazepina (IGNs) son agentes antitumorales que contienen uno o más grupos funcionales imínicos, o sus equivalentes, que se unen al ADN dúplex. Las moléculas PBD e IGN se basan en el producto natural atramicina, e interactúan con el ADN de forma selectiva en cuanto a la secuencia, con preferencia por las secuencias de purina-guanina-purina. Algunos ejemplos de PBDs y sus análogos incluyen, pero no se limitan a, SJG-136.
Las espliceostatinas y los pladienólidos son compuestos antitumorales que inhiben el splicing e interactúan con el espliceosoma, SF3b. Ejemplos de espliceostatinas incluyen, pero no se limitan a, espliceostatina A, FR901464, y (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-hidrocinil-2-oxoetil)-4-hidroxi-1,6-dioxaspiro[2.5]oct-5-yl]-3-metilpenta-2,4-dien-1-N}-2,5-dimetiltetrahidro-2H-pirano-3-N]amino}-5-oxopent-3-en-2-Il acetato que tiene la estructura de
Figure imgf000067_0002
. Los ejemplos de pladienólidos incluyen, pero no se limitan a, Pladienólido B, Pladienólido D o E7107.
Los taxanos son diterpenos que actúan como agentes anti-tubulina o inhibidores mitóticos. Los taxanos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel (por ejemplo, TAXOL®) y docetaxel (TAXOTERE®).
Las tubulisinas son productos naturales aislados de una cepa de mixobacterias que ha demostrado despolimerizar los microtúbulos e inducir la detención mitótica. Las tubulisinas ejemplares incluyen, entre otras, la tubulisina A, la tubulisina B y la tubulisina D.
Los alquilos de vinca también son agentes antitubulina. Algunos ejemplos de alquilos de vinca son, entre otros, la vincristina, la vinblastina, la vindesina y la vinorelbina.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en MMAD (Monometil Auristatina D), 0101 (2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3 {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N -metil-L-valinamida), 3377 (N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1 -carboxil-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}- N-metil-L-valinamida), 0131 (2-metil-L-proli-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[ (1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il] -N-metil-L-valinamida), 0131-oMe (N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R) -1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil -1-oxoheptan-4-il]-N-metilL-valinamida), 0121(2-metil-L-proli-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R ,2R)-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3- fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida) y (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S) -6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-hidrazinil-2-oxoetil)-4-hidroxi-1,6-dioxaespiro[2,5]oct-5 -il]-3-metilpenta-2,4-dien-1-il}-2,5-dimetiltetrahidro-2H-piran-3-il]amino}-5-oxopent-3-en-2-il acetato..
En algunas realizaciones, el agente es un agente inmunomodulador. Los ejemplos de un agente inmunomodulador incluyen, entre otros, ganciclovier, etanercept, tacrolimus, sirolimus, voclosporina, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina micofenolgate mofetil, metotrextrato, glucocorticoides y sus análogos, citoquinas, factores de crecimiento de células madre, linfotoxinas, factor de necrosis tumoral (TNF), factores hematopoyéticos, interleucinas (por ejemplo, interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 e IL-21), factores estimulantes de colonias (por ejemplo, el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y el factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF)), interferones (por ejemplo, interferones-a, -p y -y), el factor de crecimiento de células madre denominado "factor S 1", la eritropoyetina y la trombopoyetina, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la fracción del agente es un agente de imagen (por ejemplo, un fluoróforo o un quelante), como la fluoresceína, la rodamina, los fósforos de lantánidos y sus derivados, o un radioisótopo unido a un quelante. Los ejemplos de fluoróforos incluyen, pero no se limitan a, isotiocianato de fluoresceína (FITC) (por ejemplo, 5-FITC), amidita de fluoresceína (FAM) (por ejemplo, 5-FAM), eosina, carboxifluoresceína, eritrosina, Alexa Fluor® (por ejemplo, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 o 750), carboxitetrametilrhodamina (TAMRA) (por ejemplo, 5,-TAMRA), tetrametilrhodamina (TMR) y sulforhodamina (SR) (por ejemplo, SR101). Los ejemplos de quelantes incluyen, pero no se limitan a, el ácido 1,4,7,10-tetraaciclododecano-N,N',N",Nm-tetraacético (Do Ta ), el ácido 1,4,7-triazaciclonano-1,4,7-triacético (NOTA), el ácido 1,4,7-triazaciclonano, ácido 1-glutárico-4,7-acético (deferoxamina), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y ácido 1,2-bis(oaminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético) (BApTA).
Los ejemplos de fluoróforos incluyen, pero no se limitan a, isotiocianato de fluoresceína (FITC) (por ejemplo, 5-FITC), amidita de fluoresceína (FAM) (por ejemplo, 5-FAM), eosina, carboxifluoresceína, eritrosina, Alexa Fluor® (por ejemplo, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 o 750), carboxitetrametilrhodamina (TAMRA) (por ejemplo, 5,-TAMRA), tetrametilrhodamina (TMR) y sulforhodamina (SR) (por ejemplo, SR101).
En algunas realizaciones, se pueden incorporar radioisótopos terapéuticos o de diagnóstico u otros rótulos (por ejemplo, rótulos PET o SPECT) en el agente para su conjugación con los anticuerpos BCMA o los fragmentos de unión a antígeno como se describe en el presente documento. Los ejemplos de un radioisótopo u otras etiquetas incluyen, pero no se limitan a, 3H, 11C, 13N, 14C, 15N, 15O, 35S, 18F, 32P, 33P, 47Sc, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 75Se, 76Br, 77Br, 86Y, 89Zr, 90Y, 94Tc, 95Ru, 97Ru, 99Tc, 103Ru, 105Rh, 105Ru, 107Hg, 109Pd, 111Ag, 111In, 113In, 121Te, 122Te 123| 124| 125| 125Te 126| 1311131|n 133| 142pr 143pr 153pb 153Sm 161Tb 165Tm 166Dy 166h 167Tm 168Jm 169Yb 177Lu, 186Re, 188Re,' 189Re, 197Pt, 198Au, 199Au,' 201Tl, 203Hg,' 211At, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 223Ra, 224Ac, or 225Ac. ’
En algunas realizaciones, el agente es una proteína terapéutica que incluye, pero no se limita a, una toxina, una hormona, una enzima y un factor de crecimiento.
Los ejemplos de una proteína de toxina (o polipéptido) incluyen, pero no se limitan a, difteria (por ejemplo, cadena A de difteria), exotoxina y endotoxina de Pseudomonas , ricina (por ejemplo, cadena A de ricina), abrina (por ejemplo, cadena A de abrina), modeccina (por ejemplo, modeccina A), alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, ribonucleasa (RNasa), DNasa I, enterotoxina estafilocócica A, proteína antiviral de pokeweed, gelonina, toxina diftérica, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotin, inhibidor de sapaonaria officinalis, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricotecenos, péptidos inhibidores del nudo de cistina (ICK) (por ejemplo, ceratotoxinas), y conotoxina (por ejemplo, KIIIA o Smllla).
En algunas realizaciones, el agente es un polímero biocompatible. Los anticuerpos BCMA o los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden conjugarse con el polímero biocompatible para aumentar la semivida y la bioactividad en el suero, y/o para ampliar la semivida in vivo . Entre los ejemplos de polímeros biocompatibles se encuentran los polímeros solubles en agua, como el polietilenglicol (PEG) o sus derivados, y los polímeros biocompatibles que contienen zwitteriones (por ejemplo, un polímero que contiene fosforilcolina).
En algunas realizaciones, el agente es un oligonucleótido, como los oligonucleótidos antisentido.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un conjugado del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno como se describe en el presente documento, en el que el conjugado comprende la fórmula: anticuerpo-(etiqueta que contiene glutamina donante de acilo)-(enlazador)-(agente citotóxico), en el que la etiqueta que contiene glutamina donante de acilo está diseñada en un sitio específico del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, en un extremo carboxilo de la cadena pesada o ligera, después del residuo T135 en la cadena pesada del anticuerpo, o en otro sitio), en el que la etiqueta se conjuga con un enlazador (por ejemplo, un enlazador que contiene una o más aminas reactivas (por ejemplo, amina primaria NH2)), y en el que el enlazador se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, MMAD u otras auristatinas como 0101, 0131 o 3377).
Los ejemplos de un enlazador que contiene una o más aminas reactivas incluyen, pero no se limitan a, Ac-Lys-Gly (acetil-lisina-glicina), ácido aminocaproico, Ac-Lys-p-Ala (acetil-lisina-p-alanina), amino-PEG2 (polietilenglicol)-C2, amino-PEG3-C2, amino-PEG6-C2 (o amino PEG6-propionilo), Ac-Lys-Val-Cit-PABC (acetil-lisina-valina-citrulina-paminobenzoxicarbonilo), amino-PEG6-C2-Val-Cit-PABC, aminocaproil-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC, [(3S,5s )-1-{3-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC, putrescina o Ac-Lys-putrescina.
En algunas realizaciones, el conjugado es 1) anticuerpo-GGLLQGPP (SEQ ID NO: 474)- AcLys-VC-PABC-0101; 2) anticuerpo-AcLys-VC-PABC-0101 y comprende N297Q; 3) anticuerpo-GGLLQGPP (s Eq ID NO: 474)-AcLys-VC-PABC-0101 y comprende N297Q; 4) anticuerpo-LLQG (SEQ ID NO: 454)-amino-PEG6-C2-0131 y comprende N297A; 5) anticuerpo-LLQG (SEQ ID NO: 454)-amino-PEG6-c2-3377 y comprende N297A; 6) anticuerpo-GGLLQGA (SEQ ID NO: 475)-AcLys-VC-PABC-0101. En algunas realizaciones, la etiqueta que contiene glutamina donante de acilo que comprende, por ejemplo, GGLLQGPP (SEQ ID NO: 474) o GGLLQGA (SEQ ID NO: 475), está diseñado en el extremo C de la cadena ligera del anticuerpo. En otras realizaciones, la etiqueta que contiene glutamina donante de acilo (por ejemplo, LLQGA (SEQ ID NO: 463) o LLQGPP (SEQ ID NO: 472)) está diseñado en el C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo, donde el residuo de lisina en el C-terminal está eliminado. En algunas realizaciones, la etiqueta que contiene glutamina donante de acilo que comprende, por ejemplo, LLQG (SEQ ID NO: 454) está diseñado después del residuo T135 en la cadena pesada del anticuerpo o sustituye a los residuos de aminoácidos E294-N297 en la cadena pesada del anticuerpo. Los ejemplos del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, P6E01/P6E01, P6E01/H3.AQ, L1.LGF/L3.KW/P6E01; L1.LGF/L3.NY/P6E01, L1.GDF/L3.NY/P6E01, L1.LGF/L3.KW/H3.AL, L1.LGF/L3.KW/H3.AP, L1.LGF/L3.KW/H3.AQ, L1.LGF/L3.PY/H3.AP, L1.LGF/L3.PY/H3.AQ, L1.LGF/L3.NY/H3.AL, L1.LGF/L3.NY/H3.AP, L1.LGF/L3.NY/H3.AQ, L1.GDF/L3.KW/H3.AL, L1.GDF/L3.KW/H3.AP, L1.GDF/L3.KW/H3.AQ, L1.GDF/L3.PY/H3.AQ, L1.GDF/L3.NY/H3.AL, L1.GDF/L3.NY/H3.AP, L1.GDF/L3.NY/H3.AQ, L3.KW/P6E01, L3.PY/P6E01, L3.NY/P6E01, L3.PY/L1.PS/P6E01, L3.PY/L1.AH/P6E01, L3.PY/L1.FF/P6E01, L3.PY/L1.PH/P6E01, L3.PY/L3.KY/P6E01, L3.PY/L3.KF/P6E01, L3.PY/H2.QR, L3.PY/H2.DY, L3.PY/H2.YQ, L3.PY/H2.LT, L3.PY/H2.HA, L3.PY/H2.QL, L3.PY/H3.YA, L3.PY/H3.AE, L3.PY/H3.AQ, L3.PY/H3.TAQ, L3.PY/P6E01, L3.PY/L1.PS/H2.QR, L3.PY/L1.PS/H2.DY, L3.PY/L1.PS/H2.YQ, L3.PY/L1.PS/H2.LT, L3.PY/L1.PS/H2.HA, L3.PY/L1.PS/H2.QL, L3.PY/L1.PS/H3.YA, L3.PY/L1.PS/H3.AE, L3.PY/L1.PS/H3.AQ, L3.PY/L1.PS/H3.TAQ, L3.PY/L1.AH/H2.QR, L3.PY/L1.AH/H2.DY, L3.PY/L1.AH/H2.YQ, L3.PY/L1.AH/H2.LT, L3.PY/L1.AH/H2.HA, L3.PY/L1.AH/H2.QL, L3.PY/L1.AH/H3.YA, L3.PY/L1.AH/H3.AE, L3.PY/L1.AH/H3.AQ, L3.PY/L1.AH/H3.TAQ, L3.PY/L1.FF/H2.QR, L3.PY/L1.FF/H2.DY, L3.PY/L1.FF/H2.YQ, L3.PY/L1.FF/H2.LT, L3.PY/L1.FF/H2.HA, L3.PY/L1.FF/H2.QL, L3.PY/L1.FF/H3.YA, L3.PY/L1.FF/H3.AE, L3.PY/L1.FF/H3.AQ, L3.PY/L1.FF/H3.TAQ, L3.PY/L1.PH/H2.QR, L3.PY/L1.PH/H2.HA, L3.PY/L1.PH/H3.AE, L3.PY/L1.PH/H3.AQ, L3.PY/L1.PH/H3.TAQ, L3.PY/L3.KY/H2.QR, L3.PY/L3.KY/H2.DY, L3.PY/L3.KY/H2.YQ L3.PY/L3.KY/H2.LT, L3.PY/L3.KY/H2.HA, L3.PY/L3.KY/H2.QL, L3.PY/L3.KY/H3.YA L3.PY/L3.KY/H3.TAQ, L3.PY/L3.KF/H2.DY, L3.PY/L3.KF/H2.YQ, L3.PY/L3.KF/H2.LT L3.PY/L3.KF/H2.QL, L3.PY/L3.KF/H3.YA, L3.PY/L3.KF/H3.AE, L3.PY/L3.KF/H3.AQ L3.PY/L3.KF/H3.TAQ, P5A2_VHVL, A02_Rd4_0.6nM_C06, A02_Rd4_0.6nM_C09 A02_Rd4_6nM_C16, A02 Rd4 6nM C03, A02 Rd4 6nM C01, A02_Rd4_6nM_C26 A02_Rd4_6nM_C25, A02_Rd4_6nM_C22, A02_Rd4_6nM_C19, A02_Rd4_0.6nM_C03 A02_Rd4_6nM_C07, A02_Rd4_6nM_C23, A02_Rd4_0.6nM_C18, A02_Rd4_6nM_C10 A02_Rd4_6nM_C05, A02_Rd4_0.6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C04, A02_Rd4_0.6nM_C26 A02_Rd4_0.6nM_C13, A02_Rd4_0.6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C08, P5C1_VHVL, C01_Rd4_6nM_C24, C01_Rd4_6nM_C26, C01_Rd4_6nM_C10, C01_Rd4_0.6nM_C27 C01 Rd4 6nM C20, C01 Rd4 6nM C12, C01 Rd4 0.6nM C16, C01_Rd4_0.6nM_C09 C01 Rd4 6nM C09, C01 Rd4 0.6nM C03, C01 Rd4 0.6nM C06, C01 Rd4 6nM C04
COMBO Rd4 0.6nM C22, COMBO Rd4 6nM C21, COMBO_Rd4_6nM_C10, COMBO_Rd4_0.6nM_C04, COMBO Rd4 6nM C25, COMBO Rd4 0.6nM C21, COMBO_Rd4_6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C20, COMBO Rd4 6nM C09, COMBO Rd4 6nM C08, COMBO_Rd4_0.6nM_C19, COMBO_Rd4_0.6nM_C02, COMBO Rd4 0.6nM C23, COMBO Rd4 0.6nM C29, COMBO_Rd4_0.6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C12, COMBO Rd4 0.6nM C30, COMBO_Rd4_0.6nM_C14, COMBO_Rd4_6nM_C07, COMBO_Rd4_6nM_C02, COMBO Rd4 0.6nM C05, COMBO_Rd4_0.6nM_C17, COMBO_Rd4_6nM_C22, COMBO_Rd4_0.6nM_C11, COMBO Rd4 0.6nM C29, P4G4, o P1A11.
En una variación, el conjugado comprende además una sustitución de aminoácidos de lisina a arginina en la posición 222. En consecuencia, por ejemplo, el conjugado es 1) anticuerpo-GGLLQGPP (SEQ ID NO: 474)-AcLys-VC-PABC-0101 y comprende K222R; 2) anticuerpo-AcLys-VC-PABC-0101 y comprende N297Q y K222R; 3) anticuerpo-GGLLQGPP (SEQ ID NO: 474)-AcLys-VC-PABC-0101 y comprende N297Q y K222R; 4) anticuerpo-LLQG (SEQ ID NO: 454)-amino-PEG6-C2-0131 y comprende N297A y K222R; 5) anticuerpo-LLQG (SEQ ID NO: 454)-amino-PEG6-C2-3377 y comprende N297A y K222R; y 6) el anticuerpo-GGLLQGA (SEQ ID NO: 475)-AcLys-VC-PABC-0101 y comprende K222r . En algunas realizaciones, la etiqueta que contiene glutamina donante de acilo que comprende, por ejemplo, GGLLQGPP (SEQ ID NO: 474) o GGLLq Ga (s Eq ID NO: 475) está diseñado en el extremo C de la cadena ligera del anticuerpo. En otras realizaciones, la etiqueta que contiene glutamina donante de acilo (por ejemplo, LLQGA (SEQ ID NO: 473) o LLQGPP (SEQ ID NO: 472)) está diseñado en el C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo, donde el residuo de lisina en el C-terminal está eliminado. En algunas realizaciones, la etiqueta que contiene glutamina donante de acilo que comprende, por ejemplo, LLQG (SEQ ID NO: 454) está diseñado después del residuo T135 en la cadena pesada del anticuerpo o sustituye a los residuos de aminoácidos E294-N297 en la cadena pesada del anticuerpo. Los ejemplos del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, P6E01/P6E01, P6E01/H3.AQ, L1.LGF/L3.KW/P6E01; L1.LGF/L3.NY/P6E01 L1.GDF/L3.NY/P6E01, L1.LGF/L3.KW/H3.AL, L1.LGF/L3.KW/H3.AP, L1.LGF/L3.KW/H3.AQ, L1.LGF/L3.PY/H3.AP, L1.LGF/L3.PY/H3.AQ, L1.LGF/L3.NY/H3.AL, L1.LGF/L3.NY/H3.AP, L1.LGF/L3.NY/H3.AQ, L1.GDF/L3.KW/H3.AL, L1.GDF/L3.KW/H3.AP, L1.GDF/L3.KW/H3.AQ, L1.GDF/L3.PY/H3.AQ, L1.GDF/L3.NY/H3.AL, L1.GDF/L3.NY/H3.AP, L1.GDF/L3.NY/H3.AQ, L3.KW/P6E01, L3.PY/P6E01, L3.NY/P6E01, L3.PY/L1.PS/P6E01, L3.PY/L1.AH/P6E01, L3.PY/L1.FF/P6E01, L3.PY/L1.PH/P6E01, L3.PY/L3.KY/P6E01, L3.PY/L3.KF/P6E01, L3.PY/H2.QR, L3.PY/H2.DY, L3.PY/H2.YQ, L3.PY/H2.LT, L3.PY/H2.HA, L3.PY/H2.QL, L3.PY/H3.YA, L3.PY/H3.AE, L3.PY/H3.AQ, L3.PY/H3.TAQ, L3.PY/P6E01, L3.PY/L1.PS/H2.QR, L3.PY/L1.PS/H2.DY, L3.PY/L1.PS/H2.YQ, L3.PY/L1.PS/H2.LT, L3.PY/L1.PS/H2.HA, L3.PY/L1.PS/H2.QL, L3.PY/L1.PS/H3.YA, L3.PY/L1.PS/H3.AE, L3.PY/L1.PS/H3.AQ, L3.PY/L1.PS/H3.TAQ, L3.PY/L1.AH/H2.QR, L3.PY/L1.AH/H2.DY, L3.PY/L1.AH/H2.YQ, L3.PY/L1.AH/H2.LT, L3.PY/L1.AH/H2.HA, L3.PY/L1.AH/H2.QL, L3.PY/L1.AH/H3.YA, L3.PY/L1.AH/H3.AE, L3.PY/L1.AH/H3.AQ, L3.PY/L1.AH/H3.TAQ, L3.PY/L1.FF/H2.QR, L3.PY/L1.FF/H2.DY, L3.PY/L1.FF/H2.YQ, L3.PY/L1.FF/H2.LT, L3.PY/L1.FF/H2.HA, L3.PY/L1.FF/H2.QL, L3.PY/L1.FF/H3.YA, L3.PY/L1.FF/H3.AE, L3.PY/L1.FF/H3.AQ, L3.PY/L1.FF/H3.TAQ, L3.PY/L1.PH/H2.QR, L3.PY/L1.PH/H2.HA, L3.PY/L1.PH/H3.AE, L3.PY/L1.PH/H3.AQ, L3.PY/L1.PH/H3.TAQ, L3.PY/L3.KY/H2.QR, L3.PY/L3.KY/H2.DY, L3.PY/L3.KY/H2.YQ L3.PY/L3.KY/H2.LT, L3.PY/L3.KY/H2.HA, L3.PY/L3.KY/H2.QL, L3.PY/L3.KY/H3.YA L3.PY/L3.KY/H3.TAQ, L3.PY/L3.KF/H2.DY, L3.PY/L3.KF/H2.YQ, L3.PY/L3.KF/H2.LT L3.PY/L3.KF/H2.QL, L3.PY/L3.KF/H3.YA, L3.PY/L3.KF/H3.AE, L3.PY/L3.KF/H3.AQ L3.PY/L3.KF/H3.TAQ, P5A2_VHVL, A02_Rd4_0.6nM_C06, A02_Rd4_0.6nM_C09 A02_Rd4_6nM_C16, A02 Rd4 6nM C03, A02 Rd4 6nM C01, A02_Rd4_6nM_C26 A02_Rd4_6nM_C25, A02_Rd4_6nM_C22, A02_Rd4_6nM_C19, A02_Rd4_0.6nM_C03 A02_Rd4_6nM_C07, A02_Rd4_6nM_C23, A02_Rd4_0.6nM_C18, A02_Rd4_6nM_C10 A02_Rd4_6nM_C05, A02_Rd4_0.6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C04, A02_Rd4_0.6nM_C26 A02_Rd4_0.6nM_C13, A02_Rd4_0.6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C08, P5C1_VHVL, C01_Rd4_6nM_C24, C01_Rd4_6nM_C26, C01_Rd4_6nM_C10, C01_Rd4_0.6nM_C27 C01 Rd4 6nM C20, C01 Rd4 6nM C12, C01 Rd4 0.6nM C16, C01_Rd4_0.6nM_C09 C01 Rd4 6nM C09, C01 Rd4 0.6nM C03, C01 Rd4 0.6nM C06, C01 Rd4 6nM C04
COMBO_Rd4_0.6nM_C22, COMBO_Rd4_6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C10, COMBO_Rd4_0.6nM_C04, COMBO_Rd4_6nM_C25, COMBO_Rd4_0.6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C20, COMBO_Rd4_6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C08, COMBO_Rd4_0.6nM_C19, COMBO_Rd4_0.6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C23, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, COMBO_Rd4_0.6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C12, COMBO Rd4 0.6nM C30, COMBO_Rd4_0.6nM_C14, COMBO_Rd4_6nM_C07, COMBO_Rd4_6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C05, COMBO_Rd4_0.6nM_C17, COMBO_Rd4_6nM_C22, COMBO_Rd4_0.6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, o P4G4, o P1A11.
Anticuerpos CD3 y procedimientos de fabricación de los mismos
La presente divulgación proporciona además un anticuerpo que se une a CD3 (por ejemplo, CD3 humano (SEQ ID NO: 502; o número de acceso: Nm_000733
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a c D3, en el que el anticuerpo comprende una VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 de la secuencia VH mostrada en la SEQ ID NO: 320, 322, 324, 326, 328, 330, 345, 347, 349, 351, 444, 354, 356, 378, 442, 380, 382, 384386, 388, 390, 392, 394, 396, 398 o 400; y/o una región variable de cadena ligera (VL) que comprende VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 de la secuencia VL mostrada en la SEQ ID NO: 319, 321, 323, 325, 327, 329, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 377, 443, 445, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397 o 399.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD3, en el que la región VH comprende (i) una región determinante de complementariedad VH uno (CDR1) que comprende la secuencia mostrada en la SEQ iD NO: 331, 332, 333, 401, 402, 403, 407, 408, 415, 416, 418, 419, 420, 424, 425, 426, 446, 447, o 448 (ii) una VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 334, 336, 337, 338, 339, 404, 405, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 417, 418, 421, 422, 427, 428, 449 o 450; y iii) una VH CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 335, 406, 423, 429 o 451; y/o una región variable de la cadena ligera (VL) que comprenda (i) una CDR1 de VL que comprenda la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 340, 343, 430, 431,435, o 440, 441; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 341,433, 452, o 436; y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 342, 432, 434, 437, 438, 439, 446 o 453.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un anticuerpo que tiene cualquiera de las secuencias parciales de cadena ligera enumeradas en la Tabla 3 y/o cualquiera de las secuencias parciales de cadena pesada enumeradas en la Tabla 3.
Tabla 3
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000075_0002
En la Tabla 3, las secuencias subrayadas son secuencias CDR según Kabaty en negrita según Chothia.
La divulgación también proporciona porciones de CDR de anticuerpos contra CD3 (incluyendo Chothia, CDR de Kabat y regiones de contacto de CDR). La determinación de las regiones CDR es algo que está dentro de la técnica. Se entiende que en algunas realizaciones, las CDR pueden ser una combinación de las CDR de Kabat y Chothia (también denominadas "CR combinados" o "CDR ampliadas"). En algunas realizaciones, las CDRs son las CDRs de Kabat. En otras realizaciones, las CDR son las CDR de Chothia. En otras palabras, en las realizaciones con más de una CDR, las CDR pueden ser cualquiera de las CDR de Kabat, Chothia, combinadas, o combinaciones de las mismas. La Tabla 4 proporciona ejemplos de secuencias CDR proporcionadas en el presente documento.
Tabla 4
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000080_0001
La divulgación también proporciona polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos de la divulgación, y vectores y células huésped que comprenden el polinucleótido.
En una realización, un polinucleótido comprende una secuencia que codifica la cadena pesada y/o las regiones variables de la cadena ligera del anticuerpo h2B4, h2B4-VH-wt VL_TK, h2B4-VH-hnps VL_t K, h2B4-VH-yaes VL_TK, h2B4-VH-yads VL_TK, h2B4-VH-yaps VL_TK, h2B4-VH-hnps VL_TK-S55Y, h2B4-VH-hnps VL_TK-S105Q, h2B4-vH-hnps VL_TK-S55Y/S105Q, 2B4, h2B4-11, 1C10, 1A4, 7A3, 25A8, 16G7, h25A8-B5, h25A8-B8, h25A8-B12, h25A8-B13, h25A8-C5, h25A8-C8, h25A8-D13, h25A8-E13, h25A8-F13, oh25A8-G13. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y la célula huésped puede entonces expandirse y congelarse para su uso futuro. En el presente documento se describen con más detalle los vectores (incluidos los vectores de expresión) y las células huésped.
La divulgación también abarca proteínas de fusión que comprenden uno o más fragmentos o regiones de los anticuerpos de esta divulgación. En una realización, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de la región variable de la cadena ligera mostrada en las SEQ ID NOs: 319, 321, 323, 325, 327, 329, 344, 346, 348, 350, 445, 352, 355, 443, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, o 399, y/o al menos 10 aminoácidos de la región variable de la cadena pesada mostrada en las SEQ ID NOs: 320, 322, 324, 326, 328, 330, 345, 347, 349, 351, 354, 356, 444, 442, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398 o 400. En otras realizaciones, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25 o al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de la región de la cadena ligera variable y/o al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25 o al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos de la región de la cadena pesada variable. En otra realización, el polipéptido de fusión comprende una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada, como se muestra en cualquiera de los pares de secuencias seleccionadas de entre las SEQ ID NOs: 319 y 320, 321 y 322, 323 y 324, 325 y 326, 327 y 328, 329 y 330, 344 y 345, 346 y 347, 348 y 349, 350 y 351, 445 y 444, 352 y 354, 355 y 356, 443 y 442, 377 y 378, 379 y 380, 381 y 382, 383 y 384, 385 y 386, 387 y 388, 389 y 390, 391 y 392, 393 y 394, 395 y 396, 397 y 398, o 399 y 400. En otra realización, el polipéptido de fusión comprende una o más CDR. En otras realizaciones, el polipéptido de fusión comprende CDR h 3 (VH CDR3) y/o CDR L3 (VL CDR3). A efectos de la presente divulgación, una proteína de fusión contiene uno o más anticuerpos y otra secuencia de aminoácidos a la que no está unida en la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homóloga de otra región. Las secuencias heterólogas ejemplares incluyen, pero no se limitan a una "etiqueta" como una etiqueta FLAG o una etiqueta 6His. Las etiquetas son bien conocidas en la técnica.
Un polipéptido de fusión puede crearse por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, sintéticamente o recombinantemente. Típicamente, las proteínas de fusión de la presente divulgación se hacen preparando y expresando un polinucleótido que las codifica utilizando los procedimientos recombinantes descritos en el presente documento, aunque también pueden prepararse por otros medios conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la síntesis química.
Los materiales representativos del anticuerpo CD3 de la presente divulgación se depositaron en la American Type Culture Collection (ATCC) el 11 de septiembre de 2015. El vector con número de acceso ATCC PTA-122513 es un polinucleótido que codifica una región variable de la cadena pesada del anticuerpo CD3 humanizado, y el vector con número de acceso ATCC PTA-122512 es un polinucleótido que codifica una región variable de la cadena ligera del anticuerpo CD3 humanizado. Los depósitos se realizaron en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes y su reglamento (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del yacimiento durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El depósito será puesto a disposición por el ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Pfizer, Inc. y el ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del depósito al público tras la emisión de la patente estadounidense pertinente o tras la puesta a disposición del público de cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, lo que ocurra primero,, y asegura la disponibilidad de la progenie a quien el Comisionado de Patentes y Marcas de EE.UU. determine que tiene derecho a ella de acuerdo con la Sección 122 del 35 U.S.C. y las normas del Comisionado en virtud de la misma (incluida la Sección 1.14 del 37 C.F.R. con especial referencia al 886 OG 638).
El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en depósito muriera o se perdiera o destruyera al ser cultivado en condiciones adecuadas, los materiales serán sustituidos rápidamente, previa notificación, por otro igual. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.
Anticuerpos biespecíficos y procedimientos de fabricación
Los anticuerpos biespecíficos, anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes, pueden prepararse utilizando los anticuerpos aquí divulgados. Los procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986). Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basaba en la coexpresión de dos pares de inmunoglobulinas de cadena pesada-cadena ligera, con las dos cadenas pesadas de diferente especificidad (Millstein y Cuello, Nature 305, 537-539, 1983).
Según un enfoque para fabricar anticuerpos biespecíficos, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de la región constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de la cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, esté presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad para ajustar las relaciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en las realizaciones en las que las relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en el constructo proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones iguales da lugar a altos rendimientos o cuando las relaciones no son especialmente significativas.
En un enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada de inmunoglobulina híbrida-cadena ligera (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Esta estructura asimétrica, con una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica, facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas. Este enfoque se describe en la Publicación PCT n°WO 94/04690.
En otro enfoque, los anticuerpos biespecíficos se componen de la modificación de aminoácidos en la primera región bisagra en un brazo, y el aminoácido sustituido/reemplazado en la primera región bisagra tiene una carga opuesta al aminoácido correspondiente en la segunda región bisagra en otro brazo. Este enfoque se describe en la solicitud de patente internacional No. PCT/US2011/036419 (WO2011/143545).
En otro enfoque, la formación de una proteína heteromultimérica o heterodimérica deseada (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) se mejora mediante la alteración o ingeniería de una interfaz entre una primera y una segunda región Fc similar a la inmunoglobulina (por ejemplo, una región bisagra y/o una región CH3). En este enfoque, los anticuerpos biespecíficos pueden estar compuestos por una región CH3, en la que la región CH3 comprende un primer polipéptido CH3 y un segundo polipéptido CH3 que interactúan juntos para formar una interfaz CH3, en la que uno o más aminoácidos dentro de la interfaz CH3 desestabilizan la formación del homodímero y no son electrostáticamente desfavorables para la formación del homodímero. Este enfoque se describe en la solicitud de patente internacional No. PCT/US2011/036419 (WO2011/143545).
En otro enfoque, los anticuerpos biespecíficos pueden generarse utilizando una etiqueta peptídica que contenga glutamina, diseñada para el anticuerpo dirigido a un epítopo (por ejemplo, BCMA) en un brazo y otra etiqueta peptídica (por ejemplo, una etiqueta peptídica que contenga Lys o una Lys endógena reactiva) diseñada para un segundo anticuerpo dirigido a un segundo epítopo en otro brazo en presencia de transglutaminasa. Este enfoque se describe en la solicitud de patente internacional núm PCT/IB2011/054899 (WO2012/059882).
En otro aspecto de la divulgación, la proteína heterodimérica (por ejemplo, el anticuerpo biespecífico) tal como se describe en el presente documento comprende un anticuerpo humano de longitud completa, en el que un primer dominio variable del anticuerpo de la proteína heterodimérica es capaz de reclutar la actividad de una célula efectora inmunitaria humana mediante la unión específica a un antígeno efector situado en la célula efectora inmunitaria humana, y en el que un segundo dominio variable del anticuerpo de la proteína heterodimérica es capaz de unirse específicamente a un antígeno diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo humano tiene un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunas realizaciones, la proteína heterodimérica comprende una región Fc inmunológicamente inerte.
La célula inmune efectora humana puede ser cualquiera de una variedad de células inmunes efectoras conocidas en el arte. Por ejemplo, la célula efectora inmunitaria puede ser un miembro del linaje celular linfoide humano, incluyendo, pero sin limitarse a, una célula T (por ejemplo, una célula T citotóxica), una célula B y una célula asesina natural (NK). La célula efectora inmune también puede ser, por ejemplo sin limitación, un miembro del linaje mieloide humano, incluyendo, pero sin limitarse a, un monocito, un granulocito neutrófilo y una célula dendrítica. Dichas células efectoras inmunitarias pueden tener un efecto citotóxico o apoptótico sobre una célula diana u otro efecto deseado tras la activación por la unión de un antígeno efector.
El antígeno efector es un antígeno (por ejemplo, una proteína o un polipéptido) que se expresa en la célula inmune efectora humana. Los ejemplos de antígenos efectores que pueden ser unidos por la proteína heterodimérica (por ejemplo, un anticuerpo heterodimérico o un anticuerpo biespecífico) incluyen, pero no se limitan a, CD3 humano (o complejo CD3 (Cluster of Differentiation)), CD16, NKG2D, NKp46, CD2, CD28, CD25, CD64 y CD89.
La célula diana puede ser una célula nativa o extraña a los humanos. En una célula diana nativa, la célula puede haber sido transformada para ser una célula maligna o modificada patológicamente (por ejemplo, una célula diana nativa infectada con un virus, un plasmodio o una bacteria). En una célula objetivo extraña, la célula es un patógeno invasor, como una bacteria, un plasmodio o un virus.
El antígeno diana se expresa en una célula diana en una condición de enfermedad (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad proliferativa (por ejemplo, cáncer), un trastorno inmunológico, una enfermedad neurológica, una enfermedad neurodegenerativa, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa (por ejemplo, una infección viral o una infección parasitaria), una reacción alérgica, una enfermedad de injerto contra huésped o una enfermedad de huésped contra injerto). Un antígeno objetivo no es un antígeno efector. Algunos ejemplos de antígenos diana son, entre otros, BCMA, EpCAM (Molécula de Adhesión de Células Epiteliales), CCR5 (Receptor de Quimioquinas tipo 5), CD19, HER (Receptor del factor de crecimiento epidérmico humano)-2/neu, HER-3, He R-4, EGFR (Receptor del factor de crecimiento epidérmico), PSMA, CEA, MUC-1 (mucina), MUC2, Mu C3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, ClhCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, gangliósido GD3, 9-O-Acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosil GM1, Poly SA, GD2, Carboanhidrasa IX (MN/CA IX), CD44v6, Shh (Sonic Hedgehog), Wue-1, Antígeno de células plasmáticas, (unido a la membrana) IgE, MCSP (Proteoglicano de Condroitina Sulfato de Melanoma), CCR8, precursor del TNF-alfa, STEAP, mesotelina, Antígeno A33, PSCA (Antígeno de Células Madre de Próstata), Ly-6; desmogleína 4, neoepítopo de E-cadherina, receptor de acetilcolina fetal, CD25, marcador CA19-9, marcador CA-125 y receptor MIS (sustancia inhibidora muelleriana) tipo II, sTn (antígeno Tn sialilado; TAG-72), FAP (antígeno de activación de fibroblastos), endosialina, EGFRvIII, LG, SAS y CD63.
En algunas realizaciones, la proteína heterodimérica (por ejemplo, el anticuerpo biespecífico) como se describe en el presente documento comprende un anticuerpo humano de longitud completa, en el que un primer dominio variable de anticuerpo de la proteína heterodimérica es capaz de reclutar la actividad de una célula efectora inmunitaria humana mediante la unión específica a un antígeno efector (por ejemplo, el antígeno CD3) situado en la célula efectora inmunitaria humana, en el que un segundo dominio variable de anticuerpo de la proteína heterodimérica es capaz de unirse específicamente a un antígeno diana (por ejemplo, Antígeno CD20 o EpCAM), donde el primer y segundo dominio variable de anticuerpo de la proteína heterodimérica comprenden modificaciones de aminoácidos en las posiciones 223, 225 y 228 (por ejemplo, (C223E o C223R), (E225R) y (P228E o P228R)) en la región bisagra y en la posición 409 o 368 (por ejemplo, K409R o L368E (esquema de numeración EU)) en la región CH3 de la IgG2 humana (SEQ ID NO: 493.
En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios variables de anticuerpos de la proteína heterodimérica comprenden modificaciones de aminoácidos en las posiciones 221 y 228 (por ejemplo, (D221R o D221E) y (P228R o P228E)) en la región bisagra y en la posición 409 o 368 (por ejemplo, K409r o L368e (esquema de numeración de la UE)) en la región CH3 de la IgG1 humana (SEQ ID NO: 494.
En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios variables de anticuerpos de la proteína heterodimérica comprenden modificaciones de aminoácidos en las posiciones 228 (por ejemplo, (P228E o P228R)) en la región bisagra y en la posición 409 o 368 (por ejemplo, R409 o L368E (esquema de numeración EU)) en la región CH3 de la IgG4 humana (SEQ ID NO: 495.
En otra realización, el primer dominio variable de anticuerpo de la proteína heterodimérica comprende una región VH que comprende una v H CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 de la secuencia VH mostrada en la SEQ ID NO: 320, 322, 324, 326, 328, 330, 345, 347, 349, 351,444, 354, 356, 378, 442, 380, 382, 384386, 388, 390, 392, 394, 396, 398 o 400; y/o una región variable de cadena ligera (VL) que comprende VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 de la secuencia VL mostrada en la SEQ ID NO: 319, 321, 323, 325, 327, 329, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 377, 443, 445, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397 o 399, y el segundo dominio variable de anticuerpos de la proteína heterodimérica comprende la región VH que comprende la secuencia VH mostrada en la SEQ ID n O: 2, 3, 7, 8, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 83, 87, 92, 95, 97, 99, 101, 104, 106, 110, 112, 114, 118, 120, 122, 125, 127, 313, 314, 363 o 365; y/o una región VL que comprende VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 de la secuencia VL mostrada en la SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 34, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 317, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 100, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 126, 128, 315 o 364.
En otra realización, el primer dominio variable del anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una v H CDR1, una VH CDR2 y una VH CDR3 de la secuencia VH mostrada en la SEQ ID NO: 324 o 388; y/o una región variable de cadena ligera (VL) que comprende VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 de la secuencia VL mostrada en la SEQ ID NO: 323 o 387; y el segundo dominio variable del anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una VH CDR1, una VH CDR2 y una VH CDR3 de la secuencia VH mostrada en la SEQ ID NO: 112; y/o una región variable de cadena ligera (VL) que comprende VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 de la secuencia VL mostrada en la SEQ ID NO: 38.
Los anticuerpos útiles en la presente divulgación pueden abarcar anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos heteroconjugados, de cadena única (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de dominio), anticuerpos humanizados y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, incluidas las variantes de glicosilación de los anticuerpos, las variantes de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos y los anticuerpos modificados covalentemente. Los anticuerpos pueden ser murinos, de rata, humanos o de cualquier otro origen (incluidos los anticuerpos quiméricos o humanizados).
En algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o CD3 descrito aquí es un anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, el anticuerpo BCMA o CD3 es un anticuerpo monoclonal humanizado o un anticuerpo monoclonal quimérico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante modificada, como, por ejemplo, sin limitación, una región constante que tiene un mayor potencial para provocar una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, la región constante puede modificarse para que tenga mayor afinidad con un receptor Fc gamma como, por ejemplo, FcyRI, FcyRIIA o FcyIII.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante modificada, como una región constante que es inmunológicamente inerte, es decir, que tiene un potencial reducido para provocar una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, la región constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol., 29:2613-2624, 1999 Solicitud PCT n° PCT/GB99/01441y/o Solicitud de patente del Reino Unido n° 98099518. El Fc puede ser IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana o IgG4 humana. El Fc puede ser una IgG2 humana que contenga la mutación A330P331 a S330S331 (IgG2Aa), en la que los residuos de aminoácidos están numerados con referencia a la secuencia de IgG2 de tipo salvaje. Eur. J. Immunol., 29:2613-2624, 1999. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de IgG4 que comprende las siguientes mutaciones (Armour et al., Molecular Immunology 40585-593, 2003): E233F234L235 a P233V234A235 (IgG4Ac), en la que la numeración es con referencia a la IgG4 de tipo salvaje. En otra realización, el Fc es IgG4 humana E233F234L235 a P233V234A235 con deleción G236 (IgG4Ab). En otra realización, el Fc es cualquier Fc IgG4 humano (IgG4, IgG4Ab o IgG4Ac) que contenga la mutación estabilizadora de bisagra S228 a P228 (Aalberse et al., Immunology 105, 9-19, 2002). En otra realización, el Fc puede ser un Fc aglucosilado.
En algunas realizaciones, la región constante se aglutina mutando el residuo de unión del oligosacárido (tal como Asn297) y/o los residuos flanqueantes que forman parte de la secuencia de reconocimiento de la glicosilación en la región constante. En algunas realizaciones, la región constante se aglutina para la glicosilación ligada al N enzimáticamente. La región constante puede ser aglucosilada para la glicosilación ligada a N enzimáticamente o por expresión en una célula huésped deficiente en glicosilación.
En algunas realizaciones, la región constante tiene una región constante modificada que elimina o reduce la unión del receptor Fc gamma. Por ejemplo, el Fc puede ser una IgG2 humana que contenga la mutación D265, en la que los residuos de aminoácidos están numerados con referencia a la secuencia de IgG2 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 493. En consecuencia, en algunas realizaciones, la región constante tiene una región constante modificada que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 496:
En algunas realizaciones, la región constante tiene una región constante modificada que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 497:
Una forma de determinar la afinidad de unión de los anticuerpos a BCMA o CD3 es midiendo la afinidad de unión de los fragmentos Fab monofuncionales del anticuerpo. Para obtener fragmentos Fab monofuncionales, un anticuerpo (por ejemplo, IgG) puede ser escindido con papaína o expresado recombinantemente. La afinidad de un fragmento Fab de BCMA de un anticuerpo puede determinarse mediante resonancia de plasmón superficial (sistema de resonancia de plasmón superficial (SPR) Biacore™3000™, Biacore™, INC, Piscataway NJ) equipado con chips sensores de estreptavidina preinmovilizados (SA) o Fc antiratón o Fc antihumano utilizando el tampón de funcionamiento HBS-EP (0,01M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v Surfactant P20). El BCMA humano biotinilado o de fusión Fc puede diluirse en el tampón HBS-EP hasta una concentración inferior a 0,5 pg/ml e inyectarse a través de los canales individuales del chip utilizando tiempos de contacto variables, para conseguir dos intervalos de densidad de antígeno, bien 50-200 unidades de respuesta (RU) para estudios cinéticos detallados o 800-1.000 RU para ensayos de cribado. Los estudios de regeneración han demostrado que 25 mM de NaOH en 25% v/v de etanol eliminan eficazmente el Fab unido mientras mantienen la actividad de BCMA en el chip durante más de 200 inyecciones. Normalmente, se inyectan diluciones en serie (que abarcan concentraciones de 0,1 a 10 veces la Kd estimada) de muestras de Fab purificado durante 1 minuto a 100 pl/minuto y se permiten tiempos de disociación de hasta 2 horas. Las concentraciones de las proteínas Fab se determinan mediante ELISA y/o electroforesis SDS-PAGE utilizando un Fab de concentración conocida (determinada por el análisis de aminoácidos) como estándar. Las tasas de asociación cinética (ka c tiv o ) y las tasas de disociación (km a c tiv o) se obtienen simultáneamente ajustando los datos globalmente a un modelo de unión 1:1 de Langmuir (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Procedimientos de Enzimología 6. 99-110) utilizando el programa BIAevaluación. Los valores de la constante de disociación de equilibrio (Kd ) se calculan como kin a c tiv o /ka c tiv o . Este protocolo es adecuado para determinar la afinidad de unión de un anticuerpo a cualquier BCMA, incluyendo el BCMA humano, el BCMA de otro mamífero (como el BCMA de ratón, el BCMA de rata o el BCMA de primate), así como diferentes formas de BCMA (por ejemplo, el BCMA glicosilado). La afinidad de unión de un anticuerpo se mide generalmente a 25°C, pero también puede medirse a 37°C.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden hacerse por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Para la producción de líneas celulares de hibridoma, la ruta y el calendario de inmunización del animal huésped se ajustan generalmente a las técnicas establecidas y convencionales de estimulación y producción de anticuerpos, como se describe más adelante. Las técnicas generales para la producción de anticuerpos humanos y de ratón son conocidas en la técnica y/o se describen en el presente documento.
Se contempla que cualquier sujeto mamífero, incluidos los seres humanos, o las células productoras de anticuerpos de los mismos, pueden ser manipulados para servir de base para la producción de líneas celulares de mamíferos, incluidos los humanos y los hibridomas. Típicamente, el animal huésped es inoculado por vía intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutánea, intraplantar y/o intradérmica con una cantidad de inmunógeno, incluyendo como se describe en el presente documento.
Los hibridomas pueden prepararse a partir de los linfocitos y las células de mieloma inmortalizadas utilizando la técnica general de hibridación de células somáticas de Kohler, B. y Milstein, C., Nature 256:495-497, 1975 o modificada por Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982. En la hibridación pueden utilizarse las líneas de mieloma disponibles, incluyendo, pero sin limitarse a, X63-Ag8.653 y las del Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU. En general, la técnica consiste en fusionar las células de mieloma y las células linfoides utilizando un fusógeno como el polietilenglicol, o por medios eléctricos bien conocidos por los expertos en la materia. Después de la fusión, las células se separan del medio de fusión y se cultivan en un medio de crecimiento selectivo, como el medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), para eliminar las células parentales no hibridadas. Cualquiera de los medios descritos en el presente documento, complementado con o sin suero, puede utilizarse para el cultivo de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales. Como otra alternativa a la técnica de fusión celular, pueden utilizarse células B inmortalizadas por el VEB para producir los anticuerpos monoclonales de la divulgación en cuestión. Los hibridomas se expanden y subclonan, si se desea, y los sobrenadantes se analizan para determinar la actividad antiinmunógena mediante procedimientos de inmunoensayo convencionales (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático o inmunoensayo de fluorescencia).
Los hibridomas que pueden utilizarse como fuente de anticuerpos abarcan todos los derivados, células progenitoras de los hibridomas originales que producen anticuerpos monoclonales específicos para BCMA, CD3 o porciones de los mismos.
Los hibridomas que producen dichos anticuerpos pueden cultivarse in vitro o in vivo utilizando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse del medio de cultivo o de los fluidos corporales, mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, como la precipitación con sulfato de amonio, la electroforesis en gel, la diálisis, la cromatografía y la ultrafiltración, si se desea. La actividad no deseada, si está presente, puede eliminarse, por ejemplo, haciendo pasar la preparación por adsorbentes hechos con el inmunógeno unido a una fase sólida y eluyendo o liberando los anticuerpos deseados del inmunógeno. Inmunización de un animal huésped con un BCMA o CD3 humano, o un fragmento que contenga la secuencia de aminoácidos diana conjugado con una proteína que sea inmunógena en la especie a inmunizar, por ejemplo hemocianina de lapa de ojo de cerradura, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCI2, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilos diferentes, puede producir una población de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales).
Si se desea, el anticuerpo (monoclonal o policlonal) de interés puede ser secuenciado y la secuencia de polinucleótidos puede entonces ser clonada en un vector para su expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y ésta puede expandirse y congelarse para su uso futuro. La producción de anticuerpos monoclonales recombinantes en cultivo celular puede llevarse a cabo mediante la clonación de genes de anticuerpos de células B por medios conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo Tiller et al., J. Immunol. Methods 329, 112, 2008 Pat. de EE.UU. N° 7.314.622.
En una alternativa, la secuencia de polinucleótidos puede ser utilizada para la manipulación genética para "humanizar" el anticuerpo o para mejorar la afinidad, u otras características del anticuerpo. Por ejemplo, la región constante puede ser diseñada para parecerse más a las regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmune si el anticuerpo se utiliza en ensayos clínicos y tratamientos en humanos. Puede ser deseable manipular genéticamente la secuencia del anticuerpo para obtener una mayor afinidad con BCMA o CD3 y una mayor eficacia en la inhibición de BCMA.
Hay cuatro pasos generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Estos son: (1) determinar la secuencia de nucleótidos y aminoácidos prevista de los dominios variables ligeros y pesados del anticuerpo de partida (2) diseñar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región marco del anticuerpo se utilizará durante el proceso de humanización (3) las metodologías/técnicas de humanización reales y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véase, por ejemplo, las Pat. U.S. N° 4.816.567, 5.807.715, 5.866.692, 6.331.415, 5.530.101, 5.693.761, 5.693.762, 5.585.089, y 6.180.370.
Se han descrito varias moléculas de anticuerpos "humanizados" que comprenden un sitio de unión al antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedores o de roedores modificados y sus CDR asociadas fusionadas a regiones constantes humanas. Véase, por ejemplo, Winter et al. Nature 349:293-299, 1991, Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224, 1989, Shaw et al. Immunol.
138:4534-4538, 1987 y Brown et al. Cancer Res. 47, 525 a 1987). Otras referencias describen CDRs de roedores injertados en una región marco de soporte (FR) humana antes de la fusión con una región constante de anticuerpos humanos apropiada. Véase, por ejemplo, Riechmann et al. Nature 332:323-327, 1988, Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536, 1988y Jones et al. Nature 321:522-525, 1986. Otra referencia describe CDRs de roedores apoyados por regiones marco de roedores de ingeniería recombinante. Véase, por ejemplo, La publicación de la patente europea n° 0519596. Estas moléculas "humanizadas" están diseñadas para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia las moléculas de anticuerpos antihumanos de los roedores, lo que limita la duración y la eficacia de las aplicaciones terapéuticas de esas moléculas en los receptores humanos. Por ejemplo, la región constante del anticuerpo puede diseñarse de forma que sea inmunológicamente inerte (por ejemplo, que no desencadene la lisis del complemento). Véase, por ejemplo, la publicación PCT No PCT/GB99/01441 , Solicitud de patente del Reino Unido n° 9809951.8. Otros procedimientos de humanización de anticuerpos que también pueden utilizarse son los descritos por Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471,-2476, 1991, y en la Pat. de los EE.UU. Números 6.180.377, 6,054,297, 5.997.867, 5.866.692, 6.210.671, y 6.350.861, y en la Publicación PCT n°WO 01/27160.
Los principios generales relacionados con los anticuerpos humanizados discutidos anteriormente también son aplicables a la personalización de anticuerpos para su uso, por ejemplo, en perros, gatos, primates, equinos y bovinos. Además, pueden combinarse uno o más aspectos de la humanización de un anticuerpo descrito en el presente documento, por ejemplo, el injerto de CDR, la mutación del marco y la mutación de CDR.
En una variación, los anticuerpos totalmente humanos pueden obtenerse utilizando ratones disponibles en el mercado que han sido diseñados para expresar proteínas de inmunoglobulina humanas específicas. Los animales transgénicos diseñados para producir una respuesta inmunitaria más deseable (por ejemplo, anticuerpos totalmente humanos) o más robusta también pueden utilizarse para generar anticuerpos humanizados o humanos. Ejemplos de esta tecnología son Xenomouse™ de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) y HuMAb-Mouse® y TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, NJ).
En una alternativa, los anticuerpos pueden ser hechos recombinantemente y expresados usando cualquier procedimiento conocido en el arte. En otra alternativa, los anticuerpos pueden fabricarse de forma recombinante mediante la tecnología de visualización de fagos. Véase, por ejemplo, La Pat. de los EE.UU. N° 5.565.332, 5,580,717, 5,733,743, y 6,265,150, y Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 525 a 1994). Como alternativa, la tecnología de visualización de fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. Según esta técnica, los genes del dominio V de los anticuerpos se clonan dentro del marco de un gen de la proteína de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, como M13 o fd, y se muestran como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula del fago. Dado que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan lugar a la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La visualización de fagos puede realizarse en una variedad de formatos; para una revisión, véase, por ejemplo Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993. Se pueden utilizar varias fuentes de segmentos de genes V para la visualización de fagos. Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991Clackson et al., aislaron un conjunto diverso de anticuerpos contra la oxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados del bazo de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos contra una gama diversa de antígenos (incluidos los autoantígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991o Griffith et al., EMBO J.
12:725-734, 1993. En una respuesta inmunitaria natural, los genes de los anticuerpos acumulan mutaciones a un ritmo elevado (hipermutación somática). Algunos de los cambios introducidos conferirán una mayor afinidad, y los linfocitos B que muestran inmunoglobulinas de superficie de alta afinidad se replican y diferencian preferentemente durante la posterior provocación de antígenos. Este proceso natural puede imitarse empleando la técnica conocida como "barajar en cadena" (Marks et al., Bio/Technol. 10, 525 a 1992). En este procedimiento, la afinidad de los anticuerpos humanos "primarios" obtenidos por visualización de fagos puede mejorarse sustituyendo secuencialmente los genes de la región V de la cadena pesada y ligera por repertorios de variantes naturales (repertorios) de genes del dominio V obtenidos de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el intervalo pM-nM. Una estrategia para hacer repertorios de anticuerpos fágicos muy grandes (también conocida como "la madre de todas las bibliotecas") ha sido descrita por Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21, 525 a 1993). La mezcla de genes también puede utilizarse para obtener anticuerpos humanos a partir de anticuerpos de roedores, cuando el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares a las del anticuerpo de roedor de partida. Según este procedimiento, que también se denomina "impresión de epítopos", el gen del dominio V de la cadena pesada o ligera de los anticuerpos de roedores obtenidos mediante la técnica de despliegue de fagos se sustituye por un repertorio de genes del dominio V humano, creando quimeras roedor-humano. La selección sobre el antígeno tiene como resultado el aislamiento de las regiones variables humanas capaces de restaurar un sitio de unión al antígeno funcional, es decir, el epítopo gobierna (imprime) la elección de la pareja. Cuando se repite el proceso para sustituir el dominio V restante del roedor, se obtiene un anticuerpo humano (véase Publicación PCT n° WO 93/06213). A diferencia de la humanización tradicional de los anticuerpos de roedores mediante el injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen marco ni residuos de CDR de origen roedor.
Los anticuerpos pueden fabricarse de forma recombinante aislando primero los anticuerpos y las células productoras de anticuerpos de los animales huéspedes, obteniendo la secuencia genética y utilizando la secuencia genética para expresar el anticuerpo de forma recombinante en las células huéspedes (por ejemplo, células CHO). Otro procedimiento que puede emplearse es expresar la secuencia de anticuerpos en plantas (por ejemplo, tabaco) o leche transgénica. Se han divulgado procedimientos para expresar anticuerpos de forma recombinante en plantas o leche. Véase, por ejemplo, Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001 Lonberg, N. y D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995; y Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999. Los procedimientos para fabricar derivados de anticuerpos, por ejemplo, humanizados, de cadena única, etc., son conocidos en la técnica.
Los inmunoensayos y las técnicas de clasificación por citometría de flujo, como la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), también pueden emplearse para aislar anticuerpos que sean específicos para BCMA, CD3 o antígenos tumorales de interés.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden unirse a muchos portadores diferentes. Los portadores pueden ser activos y/o inertes. Algunos ejemplos de portadores conocidos son el polipropileno, el poliestireno, el polietileno, el dextrano, el nailon, las amilasas, el vidrio, las celulosas naturales y modificadas, las poliacrilamidas, las agarosas y la magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble o insoluble a efectos de la divulgación. Los expertos en la materia conocerán otros portadores adecuados para la unión de anticuerpos, o podrán determinarlos mediante la experimentación rutinaria. En algunas realizaciones, el portador comprende una fracción que se dirige al miocardio.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como fuente preferente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión (como los vectores de expresión divulgados en la Publicación PCT n°WO 87/04462), que a continuación setransfectan en células huésped como células E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen proteínas de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Véase, por ejemplo la Publicación PCT n°WO 87/04462. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora de las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984 o mediante la unión covalente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulínico. De este modo, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal.
Los anticuerpos BCMA o antígeno tumoral de interés como se describe en el presente documento pueden ser identificados o caracterizados utilizando procedimientos conocidos en el arte, mediante los cuales se detecta y/o mide la reducción de los niveles de expresión de BCMA u otro antígeno tumoral. En algunas realizaciones, un anticuerpo BCMA se identifica incubando un agente candidato con BCMA y monitorizando la unión y/o la reducción concomitante de los niveles de expresión de BCMA. El ensayo de unión puede realizarse con polipéptido(s) BCMA purificado(s), o con células que expresan naturalmente, o transfectadas para expresar, polipéptido(s) BCMA. En una realización, el ensayo de unión es un ensayo de unión competitiva, donde se evalúa la capacidad de un anticuerpo candidato para competir con un anticuerpo BCMA conocido para la unión de BCMA. El ensayo puede realizarse en varios formatos, incluido el formato ELISA.
Después de la identificación inicial, la actividad de un anticuerpo candidato BCMA, CD3 u otro antígeno tumoral puede confirmarse y refinarse aún más mediante bioensayos, conocidos para probar las actividades biológicas dirigidas. Como alternativa, se pueden utilizar bioensayos para examinar directamente a los candidatos. Algunos de los procedimientos para identificar y caracterizar los anticuerpos se describen en detalle en los Ejemplos.
Los anticuerpos BCMA, CD3 u otros antígenos tumorales pueden caracterizarse utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento consiste en identificar el epítopo al que se une, o "mapeo de epítopos" Existen muchos procedimientos conocidos en la técnica para cartografiar y caracterizar la localización de los epítopos en las proteínas, incluida la resolución de la estructura cristalina de un complejo anticuerpo-antígeno, los ensayos de competencia, los ensayos de expresión de fragmentos de genes y los ensayos basados en péptidos sintéticos, como se describe, por ejemplo, en Capítulo 11 de Harlow y Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1999. En un ejemplo adicional, el mapeo de epítopos puede utilizarse para determinar la secuencia a la que se une un anticuerpo. El mapeo de epítopos está disponible comercialmente en varias fuentes, por ejemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 Ph Lelystad, Países Bajos). El epítopo puede ser un epítopo lineal, es decir, contenido en un único tramo de aminoácidos, o un epítopo conformacional formado por una interacción tridimensional de aminoácidos que puede no estar necesariamente contenido en un único tramo. Se pueden aislar o sintetizar (por ejemplo, de forma recombinante) péptidos de longitudes variables (por ejemplo, de al menos 4-6 aminoácidos) y utilizarlos para ensayos de unión con un anticuerpo BCMA, CD3 u otro antígeno tumoral. En otro ejemplo, el epítopo al que se une el anticuerpo BCMA, CD3 u otro antígeno tumoral puede determinarse en un cribado sistemático utilizando péptidos superpuestos derivados de la secuencia de BCMA, CD3 u otro antígeno tumoral y determinando la unión por el anticuerpo BCMA, CD3 u otro antígeno tumoral. Según los ensayos de expresión de fragmentos de genes, el marco de lectura abierto que codifica BCMA, CD3 u otro antígeno tumoral se fragmenta al azar o mediante constructos genéticos específicos y se determina la reactividad de los fragmentos expresados de BCMA, CD3 u otro antígeno tumoral con el anticuerpo que se va a analizar. Los fragmentos de genes pueden, por ejemplo, producirse por PCR y luego transcribirse y traducirse en proteínas in vitro, en presencia de aminoácidos radiactivos. La unión del anticuerpo a los fragmentos de BCMA, CD3 u otros antígenos tumorales marcados radiactivamente se determina entonces mediante inmunoprecipitación y electroforesis en gel. También se pueden identificar determinados epítopos utilizando grandes bibliotecas de secuencias peptídicas aleatorias expuestas en la superficie de partículas de fago (bibliotecas de fago). Alternativamente, una biblioteca definida de fragmentos peptídicos superpuestos puede ser probada para la unión al anticuerpo de prueba en ensayos de unión simples. En un ejemplo adicional, la mutagénesis de un dominio de unión a antígeno, los experimentos de intercambio de dominios y la mutagénesis de barrido de alanina pueden realizarse para identificar los residuos requeridos, suficientes y/o necesarios para la unión al epítopo. Por ejemplo, los experimentos de intercambio de dominios pueden realizarse utilizando un BCMA mutante, CD3 u otro antígeno tumoral en el que varios fragmentos de la proteína BCMA, CD3 u otro antígeno tumoral han sido sustituidos (intercambiados) con secuencias de BCMA de otra especie (por ejemplo, ratón), o una proteína estrechamente relacionada, pero antigénicamente distinta (por ejemplo, Trop-1). Al evaluar la unión del anticuerpo al BCMA mutante, al CD3 o a otro antígeno tumoral, se puede evaluar la importancia del fragmento particular de BCMA, CD3 u otro antígeno tumoral para la unión del anticuerpo.
Otro procedimiento que puede utilizarse para caracterizar un anticuerpo BCMA, CD3 u otro antígeno tumoral es utilizar ensayos de competencia con otros anticuerpos que se sabe que se unen al mismo antígeno, es decir, varios fragmentos de BCMA, CD3 u otro antígeno tumoral, para determinar si el anticuerpo BCMA, CD3 u otro antígeno tumoral se une al mismo epítopo que otros anticuerpos. Los ensayos de competencia son bien conocidos por los expertos en la materia.
Se puede utilizar un vector de expresión para dirigir la expresión de un anticuerpo BCMA, CD3 u otro antígeno tumoral. Un experto en la materia está familiarizado con la administración de vectores de expresión para obtener la expresión de una proteína exógena in vivo. Véase, por ejemplo la Pat. de EE.UU. N° 6,436,908, 6,413,942, y 6,376,471. La administración de los vectores de expresión incluye la administración local o sistémica, incluyendo la inyección, la administración oral, la administración con pistola de partículas o con catéter, y la administración tópica. En otra realización, el vector de expresión se administra directamente en el tronco o ganglio simpático, o en una arteria coronaria, aurícula, ventrículo o pericardio.
También puede utilizarse el suministro dirigido de composiciones terapéuticas que contengan un vector de expresión o polinucleótidos subgenómicos. Las técnicas de suministro de ADN mediadas por receptores se describen, por ejemplo, en Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 11:202 Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.AWolff, ed., 1994 Wu et al., J. Biol. Chem, 263:621, 1988 Wu et al., J. Biol. Chem, 269:542, 1994 Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3655, 1990 y Wu et al., J. Biol. Chem, 266:338, 1991. Las composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido se administran en un intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de ADN para su administración local en un protocolo de terapia génica. Durante un protocolo de terapia génica también pueden utilizarse intervalos de concentración de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 2 mg, de aproximadamente 5 |jg a aproximadamente 500 jg y de aproximadamente 20 jg a aproximadamente 100 jg de ADN. Los polinucleótidos y polipéptidos terapéuticos pueden administrarse utilizando vehículos de administración de genes. El vehículo de suminsistro de genes puede ser de origen viral o no viral (véase en general, Jolly, Cancer Gene Therapy,1:51, 1994 Kimura, Human Gene Therapy, 5:845, 1994 Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1:185y Kaplitt, Nature Genetics, 6:148, 1994). La expresión de estas secuencias codificantes puede inducirse utilizando promotores endógenos de mamíferos o heterólogos. La expresión de la secuencia codificadora puede ser constitutiva o regulada.
Los vectores basados en virus para el suministro de un polinucleótido deseado y la expresión en una célula deseada son bien conocidos en el arte. Los vehículos virales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los retrovirus recombinantes (véase, por ejemplo, Publicación PCT n° w O 90/07936 WO 94/03622 WO 93/25698 WO 93/25234 WO 93/11230 WO 93/10218 WO 91/02805 Pat. de EE.UU. Números 5.219.740 y 4,777,127 GB Pat. N°2.200.651y EP Pat. N° 0345242), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores del virus Sindbis, el virus del bosque Semliki (ATCC VR-67; ATc C VR-1247), el virus del río Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y el virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), y vectores del virus adeno-asociado (AAV) (véase, por ejemplo Publicación PCT n°WO 94/12649, WO 93/03769 WO 93/19191 WO 94/28938 WO 95/11984 y WO 95/00655). La administración de ADN ligado a adenovirus muertos como se describe en Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147 también puede emplearse.
También pueden emplearse vehículos y procedimientos de suministro no virales, incluyendo, pero sin limitarse a ello, el ADN condensado policíclico unido o no al adenovirus muerto solo (véase, p. ej, Curiel, Hum. Gene Ther., 3:147, 1992); ADN ligado a ligandos (véase, por ejemplo Wu, J. Biol. Chem., 264:16985, 1989); vehículos de suministro de células eucariotas (véase, por ejemplo U.S. Pat. N° 5.814.482 Publicación PCT n° WO 95/07994 WO 96/17072 WO 95/30763 y WO 97/42338) y la neutralización o fusión de la carga nucleica con las membranas celulares. También se puede emplear el ADN desnudo. Se describen procedimientos ejemplares de introducción de ADN desnudo en la Publicación PCT n° WO 90/11092 y en la Pat. de EE.UU. N° 5.580.859. Los liposomas que pueden actuar como vehículos de suministro de genes se describen en la Pat. de EE.UU. N° 5.422.120 Publicación PCT n° WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445, y EP 0524968. Otros enfoques se describen en Philip, Mol. Cell Biol., 14:2411, 1994 y en Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:1581, 1994.
En algunas realizaciones, la divulgación abarca composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden anticuerpos descritos en el presente documento o hechos por los procedimientos y que tienen las características descritas en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos que se unen a CD3 y a un antígeno tumoral (por ejemplo, BCMA), y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más de estos anticuerpos. Estas composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, como excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo tampones, que son bien conocidos en la técnica.
La divulgación también proporciona procedimientos para hacer cualquiera de estos anticuerpos. Los anticuerpos de esta divulgación pueden hacerse por procedimientos conocidos en la técnica. Los polipéptidos pueden producirse por degradación proteolítica o de otro tipo de los anticuerpos, por procedimientos recombinantes (es decir, polipéptidos simples o de fusión) como se ha descrito anteriormente o por síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente los polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, se fabrican convenientemente por síntesis química. Los procedimientos de síntesis química son conocidos en el arte y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, un anticuerpo podría ser producido por un sintetizador automatizado de polipéptidos que emplee el procedimiento de fase sólida. Véase también, las Pat. de EE.UU. N° 5.807.715, 4.816.567, y 6,331,415.
Los anticuerpos heteroconjugados, que comprenden dos anticuerpos unidos covalentemente, también están dentro del alcance de la divulgación. Dichos anticuerpos se han utilizado para dirigir las células del sistema inmunitario hacia las células no deseadas (Pat. de EE.UU. N° 4.676.980), y para el tratamiento de la infección por el VIH (Publicación PCT n° WO 91/00360 y w O 92/200373 EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden hacerse utilizando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes y técnicas de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, y se describen en la Pat. de EE.UU. N° 4.676.980.
Los anticuerpos quiméricos o híbridos también pueden prepararse in vitro utilizando procedimientos conocidos de química de proteínas sintéticas, incluidos los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Algunos ejemplos de reactivos adecuados para este fin son el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato.
En los anticuerpos humanizados recombinantes, la porción Fcy puede ser modificada para evitar la interacción con el receptor Fcy y los sistemas de complemento e inmunológico. Las técnicas para la preparación de dichos anticuerpos se describen en WO 99/58572. Por ejemplo, la región constante puede diseñarse para que se parezca más a las regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmunitaria si el anticuerpo se utiliza en ensayos clínicos y tratamientos en humanos. Véase, por ejemplo, la Pat. de los EE.UU. Números 5.997.867 y 5.866.692.
La divulgación abarca las modificaciones de los anticuerpos y polipéptidos de las variantes de la divulgación descritas en el presente documento, incluidos los anticuerpos funcionalmente equivalentes que no afectan significativamente a sus propiedades y las variantes que tienen una actividad y/o afinidad mejorada o disminuida. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede mutarse para obtener un anticuerpo con la afinidad de unión deseada a BCMA y/o CD3. La modificación de los polipéptidos es una práctica rutinaria en la técnica y no es necesario describirla en detalle en este documento. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, una o más supresiones o adiciones de aminoácidos que no cambian significativamente la actividad funcional, o que maduran (mejoran) la afinidad del polipéptido por su ligando, o el uso de análogos químicos.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasequencia de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a una etiqueta epitópica. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión con el extremo N o C del anticuerpo de una enzima o un polipéptido que aumenta la semivida del anticuerpo en la circulación sanguínea.
Las variantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo eliminado y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitutiva incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones de la FR. Las sustituciones conservadoras figuran en la Tabla 5 bajo el epígrafe "sustituciones conservadoras" Si dichas sustituciones dan lugar a un cambio en la actividad biológica, pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 5, o como se describe más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, y los productos pueden ser examinados.
Tabla 5: Sustituciones de aminoácidos
Figure imgf000089_0001
Figure imgf000090_0001
Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la espina dorsal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de aminoácidos presentes en la naturaleza se dividen en grupos basados en las propiedades comunes de las cadenas laterales:
(1) No polar: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) Polar sin carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) Ácido (con carga negativa): Asp, Glu;
(4) Básico (con carga positiva): Lys, Arg;
(5) Residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y
(6) Aromático: Trp, Tyr, Phe, His.
Las sustituciones no conservadoras se realizan intercambiando un miembro de una de estas clases por otro.
Cualquier residuo de cisteína que no esté implicado en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo también puede ser sustituido, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación aberrante. A la inversa, se pueden añadir enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad, especialmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, como un fragmento Fv.
Las modificaciones de aminoácidos pueden ir desde el cambio o la modificación de uno o más aminoácidos hasta el rediseño completo de una región, como la región variable. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad de unión y/o la especificidad. En algunas realizaciones, no se realizan más de una a cinco sustituciones conservadoras de aminoácidos dentro de un dominio CDR. En otras realizaciones, no se realizan más de una a tres sustituciones conservadoras de aminoácidos dentro de un dominio CDR. En otras realizaciones, el dominio CDR es CDR H3 y/o CDR L3.
Las modificaciones también incluyen polipéptidos glicosilados y no glicosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones postraduccionales, como, por ejemplo, glicosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Los anticuerpos están glicosilados en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis y Lund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997; Wrighty Morrison, TibTECH 15:26-32, 1997). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas afectan a la función de la proteína (Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996 Wittwe y Howard, Biochem. 29:4175-4180, 1990) y la interacción intramolecular entre porciones de la glicoproteína, que puede afectar a la conformación y a la superficie tridimensional presentada de la glicoproteína (Jefferis y Lund, supra Wyss y Wagner, Current Opin. Biotecnología. 7, 525 a 1996). Los oligosacáridos también pueden servir para dirigir una determinada glicoproteína a ciertas moléculas basándose en estructuras de reconocimiento específicas. También se ha informado de que la glicosilación de los anticuerpos afecta a la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En particular, se informó de que las células CHO con expresión regulada por tetraciclina de p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de GlcNAc bisecante, han mejorado la actividad ADCC (Umana et al., Mature Biotech. 17, 525 a 1999).
La glicosilación de los anticuerpos está típicamente ligada a N o a O. El término "ligado a la N" se refiere a la unión de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripéptidas asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina y asparagina-X-cisteína, donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptidas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La glucosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilación ligados al N). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glucosilación ligados a O).
El patrón de glicosilación de los anticuerpos también puede ser alterado sin alterar la secuencia de nucleótidos subyacente. La glicosilación depende en gran medida de la célula huésped utilizada para expresar el anticuerpo. Dado que el tipo de célula utilizado para la expresión de glicoproteínas recombinantes, por ejemplo, los anticuerpos, como potenciales terapéuticos, rara vez es la célula nativa, cabe esperar variaciones en el patrón de glicosilación de los anticuerpos (véase, por ejemplo Hse et al., J. Biol. Chem. 272, 525 a 1997).
Además de la elección de las células huésped, los factores que afectan a la glicosilación durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen el modo de crecimiento, la formulación de los medios, la densidad de cultivo, la oxigenación, el pH, los esquemas de purificación y similares. Se han propuesto varios procedimientos para alterar el patrón de glicosilación conseguido en un organismo huésped concreto, incluyendo la introducción o sobreexpresión de ciertas enzimas implicadas en la producción de oligosacáridos (Pat. de EE.Uu . N° 5.047.335 5.510.261 y 5,278,299). La glicosilación, o ciertos tipos de glicosilación, pueden eliminarse enzimáticamente de la glicoproteína, por ejemplo, utilizando endoglicosidasa H (Endo H), N-glicosidasa F, endoglicosidasa F1, endoglicosidasa f2, endoglicosidasa F3. Además, la célula huésped recombinante puede ser modificada genéticamente para que sea defectuosa en el procesamiento de ciertos tipos de polisacáridos. Estas y otras técnicas similares son bien conocidas en la técnica.
Otros procedimientos de modificación incluyen el uso de técnicas de acoplamiento conocidas en el arte, incluyendo, pero no limitado a, medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Las modificaciones pueden utilizarse, por ejemplo, para la fijación de etiquetas para el inmunoensayo. Los polipéptidos modificados se fabrican mediante procedimientos establecidos en la técnica y pueden ser examinados mediante ensayos estándar conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen a continuación y en los Ejemplos.
En algunas realizaciones de la divulgación, el anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que tiene afinidad aumentada a un receptor Fc gamma humano, es inmunológicamente inerte o parcialmente inerte, por ejemplo no desencadena la lisis mediada por complemento, no estimula la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), o no activa los macrófagos; o tiene actividades reducidas (en comparación con el anticuerpo no modificado) en uno o más de los siguientes aspectos: desencadenar la lisis mediada por complemento, estimular la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), o activar la microglía. Se pueden utilizar diferentes modificaciones de la región constante para conseguir un nivel y/o una combinación óptimos de funciones efectoras. Véase, por ejemplo, Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995 Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996 Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000 Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989y Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998. En algunas realizaciones, la región constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624; Solicitud PCT No PCT/GB99/01441 y/o Solicitud de patente del Reino Unido n° 9809951.8. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada humana IgG2 que comprende las siguientes mutaciones: A330P331 a S330S331 (numeración de aminoácidos con referencia a la secuencia de la IgG2 de tipo salvaje). Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624. En otras realizaciones, la región constante se aglutina para la glicosilación ligada al N. En algunas realizaciones, la región constante se aglutina para la glicosilación ligada a N mediante la mutación del residuo de aminoácido glicosilado o de los residuos flanqueantes que forman parte de la secuencia de reconocimiento de la glicosilación N en la región constante. Por ejemplo, el sitio de N-glicosilación N297 puede mutar a A, Q, K o H. Ver, Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989 y Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998. En algunas realizaciones, la región constante se aglutina para la glicosilación ligada al N. La región constante puede ser aglicosilada para la glicosilación ligada al N enzimáticamente (como la eliminación de carbohidratos por la enzima PNGasa), o por expresión en una célula huésped deficiente en glicosilación.
Otras modificaciones de anticuerpos incluyen anticuerpos que han sido modificados como se describe en la Publicación PCT n°WO 99/58572. Estos anticuerpos comprenden, además de un dominio de unión dirigido a la molécula diana, un dominio efector que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga a toda o parte de una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana. Estos anticuerpos son capaces de unirse a la molécula diana sin desencadenar una lisis significativa dependiente del complemento, o la destrucción mediada por células de la diana. En algunas realizaciones, el dominio efector es capaz de unirse específicamente a FcRn y/o FcYRIIb. Suelen basarse en dominios quiméricos derivados de dos o más dominios Ch2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos modificados de esta manera son particularmente adecuados para su uso en la terapia crónica de anticuerpos, para evitar las reacciones inflamatorias y otras reacciones adversas a la terapia convencional de anticuerpos.
La divulgación incluye realizaciones maduradas por afinidad. Por ejemplo, los anticuerpos madurados por afinidad pueden producirse mediante procedimientos conocidos en la técnica (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783, 1992 Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813, 1994 Schier et al., Gene, 169:147-155, 1995 Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004, 1995; Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9, 1995, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896, 1992 y Publicación PCT n° WO2004/058184).
Los siguientes procedimientos pueden utilizarse para ajustar la afinidad de un anticuerpo y para caracterizar una CDR. Una forma de caracterizar una CDR de un anticuerpo y/o alterar (por ejemplo, mejorar) la afinidad de unión de un polipéptido, como un anticuerpo, se denomina "mutagénesis de barrido de biblioteca". En general, la mutagénesis de barrido de biblioteca funciona de la siguiente manera. Una o más posiciones de aminoácidos en la CDR se sustituyen por dos o más (como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) aminoácidos utilizando procedimientos reconocidos en el arte. Esto genera pequeñas bibliotecas de clones (en algunas realizaciones, una por cada posición de aminoácido que se analiza), cada una con una complejidad de dos o más miembros (si se sustituyen dos o más aminoácidos en cada posición). Generalmente, la biblioteca también incluye un clon que comprende el aminoácido nativo (no sustituido). Un pequeño número de clones, por ejemplo, aproximadamente 20-80 clones (dependiendo de la complejidad de la biblioteca), de cada biblioteca se examinan para ver la afinidad de unión al polipéptido objetivo (u otro objetivo de unión), y se identifican los candidatos con aumento, igual, disminución o sin unión. Los procedimientos para determinar la afinidad de unión son bien conocidos en la técnica. La afinidad de unión puede determinarse mediante el análisis de resonancia de plasmón superficial Biacore™, que detecta diferencias en la afinidad de unión de aproximadamente 2 veces o más. Biacore™ es particularmente útil cuando el anticuerpo de partida ya se une con una afinidad relativamente alta, por ejemplo una Kd de aproximadamente 10 nM o inferior. El cribado mediante la resonancia de plasmón superficial Biacore™ se describe en los Ejemplos, en este documento.
La afinidad de unión puede determinarse mediante Kinexa Biocensor, ensayos de proximidad de centelleo, ELISA, inmunoensayo ORIGEN (IGEN), temple de fluorescencia, transferencia de fluorescencia, y/o visualización de levadura. La afinidad de unión también se puede comprobar mediante un bioensayo adecuado.
En algunas realizaciones, cada posición de aminoácido en una CDR se sustituye (en algunas realizaciones, una a la vez) con los 20 aminoácidos naturales utilizando procedimientos de mutagénesis reconocidos en el arte (algunos de los cuales se describen en el presente documento). Esto genera pequeñas bibliotecas de clones (en algunas realizaciones, una por cada posición de aminoácido que se analice), cada una con una complejidad de 20 miembros (si se sustituyen los 20 aminoácidos en cada posición).
En algunas realizaciones, la biblioteca que se va a examinar comprende sustituciones en dos o más posiciones, que pueden estar en la misma CDR o en dos o más CDR. Así, la biblioteca puede incluir sustituciones en dos o más posiciones de una CDR. La biblioteca puede incluir la sustitución en dos o más posiciones en dos o más CDR. La biblioteca puede comprender la sustitución en 3, 4, 5 o más posiciones, encontrándose dichas posiciones en dos, tres, cuatro, cinco o seis CDRs. La sustitución puede prepararse utilizando codones de baja redundancia. Véase, por ejemplo, la tabla 2 de Balint et al., Gene 137(1):109-18, 1993.
La CDR puede ser CDRH3 y/o CDRL3. La CDR puede ser uno o más de las CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, y/o CDRH3. La CDR puede ser una CDR de Kabat, una CDR de Chothia o una CDR ampliada.
Los candidatos con una unión mejorada pueden ser secuenciados, identificando así un mutante de sustitución de CDR que resulta en una afinidad mejorada (también denominada una sustitución "mejorada"). Los candidatos que se unen también pueden ser secuenciados, identificando así una sustitución de CDR que mantiene la unión.
Pueden realizarse múltiples rondas de cribado. Por ejemplo, los candidatos (cada uno de los cuales comprende una sustitución de aminoácidos en una o más posiciones de una o más CDR) con unión mejorada también son útiles para el diseño de una segunda biblioteca que contenga al menos el aminoácido original y el aminoácido sustituido en cada posición de CDR mejorada (es decir, la posición de aminoácido en la CDR en la que un mutante de sustitución mostró una unión mejorada). La preparación y el cribado o la selección de esta biblioteca se analizan más adelante.
La mutagénesis de exploración de bibliotecas también proporciona un medio para caracterizar una CDR, en la medida en que la frecuencia de clones con una unión mejorada, la misma unión, una unión disminuida o ninguna unión también proporciona información relativa a la importancia de cada posición de aminoácido para la estabilidad del complejo anticuerpo-antígeno. Por ejemplo, si una posición de la CDR retiene la unión cuando se cambian los 20 aminoácidos, esa posición se identifica como una posición que probablemente no sea necesaria para la unión del antígeno. Por el contrario, si una posición de la CDR conserva la unión en sólo un pequeño porcentaje de sustituciones, esa posición se identifica como una posición importante para la función de la CDR. Así, los procedimientos de mutagénesis de exploración de bibliotecas generan información sobre las posiciones de las CDR que pueden cambiarse por muchos aminoácidos diferentes (incluidos los 20 aminoácidos), y las posiciones de las CDR que no pueden cambiarse o que sólo pueden cambiarse por unos pocos aminoácidos.
Los candidatos con afinidad mejorada pueden combinarse en una segunda biblioteca, que incluye el aminoácido mejorado, el aminoácido original en esa posición, y puede incluir además sustituciones adicionales en esa posición, dependiendo de la complejidad de la biblioteca que se desee, o que se permita utilizando el procedimiento de cribado o selección deseado. Además, si se desea, la posición del aminoácido adyacente puede ser aleatoria para al menos dos o más aminoácidos. La aleatorización de aminoácidos adyacentes puede permitir una flexibilidad conformacional adicional en la CDR mutante, lo que a su vez puede permitir o facilitar la introducción de un mayor número de mutaciones de mejora. La biblioteca también puede incluir sustituciones en posiciones que no mostraron una mejor afinidad en la primera ronda de cribado.
La segunda biblioteca se cribará o seleccionará en busca de miembros de la biblioteca con afinidad de unión mejorada y/o alterada utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluido el cribado mediante el análisis de resonancia de plasmón superficial Biacore™, y la selección mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica para la selección, incluido el despliegue de fagos, el despliegue de levaduras y el despliegue de ribosomas.
La presente divulgación también proporciona composiciones que comprenden anticuerpos conjugados (por ejemplo, enlazados) con un agente que facilita el acoplamiento a un soporte sólido (como biotina o avidina). Para simplificar, se hará referencia en general a los anticuerpos, entendiendo que estos procedimientos se aplican a cualquiera de las realizaciones de anticuerpos BCMA descritas en el presente documento. La conjugación se refiere generalmente a la unión de estos componentes como se describe aquí. La vinculación (que generalmente es la fijación de estos componentes en asociación próxima, al menos para la administración) puede lograrse de cualquier manera. Por ejemplo, una reacción directa entre un agente y un anticuerpo es posible cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo, como un grupo amino o sulfhidrilo, en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contenga carbonilo, como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contenga un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro) en el otro.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para hacer cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente documento.
Los polinucleótidos complementarios a cualquiera de estas secuencias también están comprendidos en la presente divulgación. Los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de ARNhn, que contienen intrones y se corresponden con una molécula de ADN de manera unívoca, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no es necesario, estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente divulgación, y un polinucleótido puede, pero no es necesario, estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un anticuerpo o una porción del mismo) o pueden comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes de polinucleótidos contienen una o más sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones de manera que la inmunoreactividad del polipéptido codificado no disminuye, en relación con una molécula inmunoreactiva nativa. El efecto sobre la inmunorreactividad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en el presente documento. Las variantes exhiben preferentemente al menos aproximadamente 70% de identidad, más preferentemente, al menos aproximadamente 80% de identidad, aún más preferentemente, al menos aproximadamente 90% de identidad, y más preferentemente, al menos aproximadamente 95% de identidad con una secuencia polinucleotídica que codifica un anticuerpo nativo o una porción del mismo.
Se dice que dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para obtener la máxima correspondencia como se describe a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan normalmente comparando las secuencias sobre una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a aproximadamente 75, o de 40 a aproximadamente 50, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se hayan alineado de forma óptima.
El alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación puede realizarse utilizando el programa Megalign de la suite de software bioinformático Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), utilizando los parámetros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineación descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345­ 358 Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA Higgins, D.G. y Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153 Myers, E.W. y Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105 Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425 Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CAWilbur, W.J. y Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
Preferentemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en la que la porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, brechas) del 20 por ciento o menos, generalmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparecen bases de ácido nucleico o residuos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de la secuencia.
Las variantes pueden también, o alternativamente, ser sustancialmente homólogas a un gen nativo, o a una porción o complemento del mismo. Dichas variantes polinucleotídicas son capaces de hibridarse en condiciones moderadamente estrictas con una secuencia de ADN natural que codifica un anticuerpo nativo (o una secuencia de complementariedad).
Unas "condiciones moderadamente estrictas" adecuadas incluyen el prelavado en una solución de 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridación a 50°C-65°C, 5 X SSC, durante toda la noche; seguida de dos lavados a 65°C durante 20 minutos con cada una de las soluciones 2X, 0,5Xy 0,2X SSC que contienen 0,1% SDS.
Tal y como se utiliza en el presente documento, las "condiciones altamente rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad" son aquellas que: (1) emplean una fuerza iónica baja y una temperatura alta para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/0,0015 M citrato de sodio/0,1% dodecil sulfato de sodio a 50°C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizador, como la formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con 0,1% de albúmina de suero bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50 mM detampón fosfato de sodio a pH 6,5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42°C; o (3) emplean 50% de formamida, 5 * SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sodio, 5 * solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), 0,1% de SDS y 10% de sulfato de dextrano a 42°C, con lavados a 42°C en 0,2 * SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55°C, seguidos de un lavado de alta intensidad consistente en 0,1 * SSC con EDTA a 55°C. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores como la longitud de la sonda y similares.
Los expertos en la materia apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, existen muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como el descrito en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos tienen una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a las diferencias en el uso de codones se contemplan específicamente en la presente divulgación. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en el presente documento están dentro del alcance de la presente divulgación. Los alelos son genes endógenos que están alterados como resultado de una o más mutaciones, como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, aunque no necesariamente, tener una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse mediante técnicas estándar (como la hibridación, la amplificación y/o la comparación de secuencias en bases de datos).
Los polinucleótidos de esta divulgación pueden obtenerse mediante síntesis química, procedimientos recombinantes o PCR. Los procedimientos de síntesis química de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica y no es necesario describirlos en detalle en el presente documento. Un experto en la materia puede utilizar las secuencias proporcionadas en el presente documento y un sintetizador de ADN comercial para producir una secuencia de ADN deseada.
Para preparar polinucleótidos utilizando procedimientos recombinantes, un polinucleótido que comprende una secuencia deseada puede insertarse en un vector adecuado, y el vector, a su vez, puede introducirse en una célula huésped adecuada para su replicación y amplificación, como se explica más adelante. Los polinucleótidos pueden insertarse en las células huésped por cualquier medio conocido en la técnica. Las células se transforman introduciendo un polinucleótido exógeno por captación directa, endocitosis, transfección, apareamiento F o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno puede mantenerse dentro de la célula como un vector no integrado (como un plásmido) o integrado en el genoma de la célula huésped. El polinucleótido así amplificado puede aislarse de la célula huésped por procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989.
Alternativamente, la PCR permite la reproducción de secuencias de ADN. La tecnología PCR es bien conocida en la técnica y se describe en laPatente de Ee .UU. Nos. 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 y 4.683.202 así como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.
El ARN puede obtenerse utilizando el ADN aislado en un vector apropiado e insertándolo en una célula huésped adecuada. Cuando la célula se replica y el ADN se transcribe en ARN, el ARN se puede aislar utilizando procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia, como se expone en Sambrook et al., 1989, supra, por ejemplo.
Los vectores de clonación adecuados pueden construirse de acuerdo con técnicas estándar, o pueden seleccionarse de entre un gran número de vectores de clonación disponibles en el arte. Aunque el vector de clonación seleccionado puede variar en función de la célula huésped que se pretenda utilizar, los vectores de clonación útiles tendrán generalmente la capacidad de autorreplicarse, pueden poseer una única diana para una endonucleasa de restricción particular, y/o pueden llevar genes para un marcador que pueda utilizarse en la selección de clones que contengan el vector. Algunos ejemplos adecuados son los plásmidos y los virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por ejemplo, pBS SK+) y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, Rp4, ADN de fagos y vectores lanzadera como pSA3 y pAT28. Estos y muchos otros vectores de clonación están disponibles en proveedores comerciales como BioRad, Strategene e Invitrogen.
Los vectores de expresión generalmente son constructos polinucleotídicos replicables que contienen un polinucleótido según la divulgación. Se da por supuesto que un vector de expresión debe ser replicable en las células huésped, ya sea como episomas o como parte integrante del ADN cromosómico. Los vectores de expresión adecuados incluyen, entre otros, los plásmidos, los vectores virales, incluidos los adenovirus, los virus adeno-asociados, los retrovirus, los cósmidos y los vectores de expresión divulgados en la Publicación PCT n°WO 87/04462. Los componentes del vector generalmente pueden incluir, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal; un origen de replicación; uno o más genes marcadores; elementos de control transcripcional adecuados (como promotores, potenciadores y terminadores). Para la expresión (es decir, la traducción), también suelen ser necesarios uno o más elementos de control de la traducción, como los sitios de unión a los ribosomas, los sitios de iniciación de la traducción y los codones de parada.
Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula huésped por cualquiera de un número de medios apropiados, incluyendo la electroporación, la transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, u otras sustancias; el bombardeo de microproyectos; la lipofección; y la infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso como el virus vaccinia). La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá a menudo de las características de la célula huésped.
La divulgación también proporciona células huésped que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente documento. Para aislar los genes que codifican el anticuerpo, el polipéptido o la proteína de interés, puede utilizarse cualquier célula huésped capaz de sobreexpresar ADN heterólogo. Ejemplos no limitantes de células huésped de mamíferos incluyen, pero no se limitan a las células COS, HeLa y CHO. Véase también la Publicación PCT n°WO 87/04462. Las células huésped no mamíferas adecuadas incluyen procariotas (como E. coli o B. subtillis) y levaduras (como S. cerevisae, S. pombe; o K. lactis). Preferentemente, las células huésped expresan los cDNAs a un nivel aproximadamente 5 veces mayor, más preferentemente, 10 veces mayor, incluso más preferentemente, 20 veces mayor que el del correspondiente anticuerpo endógeno o proteína de interés, si está presente, en las células huésped. El cribado de las células huésped para una unión específica a BCMA o a un dominio BCMA (por ejemplo, los dominios 1-4) se realiza mediante un inmunoensayo o FACS. Se puede identificar una célula que sobreexprese el anticuerpo o la proteína de interés.
Procedimientos de uso de los anticuerpos biespecíficos [Aplicaciones terapéuticas!
Los anticuerpos (por ejemplo, BCMA, CD3 o biespecíficos) y los conjugados de anticuerpos (por ejemplo, conjugados anticuerpo-fármaco BCMA) de la presente divulgación son útiles en diversas aplicaciones, incluyendo, pero sin limitarse a, procedimientos de tratamiento terapéutico y procedimientos de tratamiento diagnóstico.
En un aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar una condición asociada con la expresión de BCMA en un sujeto. En algunas realizaciones, el procedimiento para tratar una afección asociada con la expresión de BCMA en un sujeto comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende los anticuerpos BCMA o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento. Las condiciones asociadas con la expresión de la BCMA incluyen, pero no se limitan a, la expresión anormal del BCMA, la expresión alterada o aberrante del BCMA, las células malignas que expresan el BCMA, y un trastorno proliferativo (por ejemplo, el cáncer) o un trastorno autoinmune.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar un cáncer relacionado con células B o células malignas que expresan un antígeno tumoral. En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para tratar un cáncer relacionado con las células B en un sujeto que lo necesita, que comprende a) proporcionar el anticuerpo biespecífico como se describe en el presente documento, y b) administrar dicho anticuerpo biespecífico a dicho paciente. En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para tratar una afección asociada con células malignas que expresan un antígeno tumoral en un sujeto que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico como se describe en el presente documento.
En consecuencia, en algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para tratar un cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición que comprende los anticuerpos (por ejemplo, BCMA, o anticuerpos biespecíficos CD3-BCMA) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento. Tal como se utiliza en el presente documento, el cáncer puede ser un cáncer relacionado con las células B que incluye, entre otros, el mieloma múltiple, la neoplasia maligna de células plasmáticas, el linfoma de Hodgkin, el linfoma de Hodgkin de predominio linfocítico nodular, Enfermedad de Kahler y mielomatosis, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma no Hodgkin de células B (LNH), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC), linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico B precursor, leucemia mieloide, macroglobulienemia de Waldenstrom, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de la zona marginal, linfoma del tejido linfático asociado a las mucosas, linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma mediastínico primario (tímico) de células B grandes, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células B de la zona marginal nodal, linfoma de la zona marginal esplénica, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma primario de efusión, granulomatosis linfomatoide, linfoma de células B grandes rico en células T/histiocitos, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma cutáneo primario difuso de células B grandes (tipo de pierna), linfoma difuso de células B grandes positivo para el VEB de los ancianos, linfoma difuso de células B grandes asociado a la inflamación, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de células B grandes ALK positivo, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada al HHV8, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Burkitt, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Hodgkin clásico, y otros linfomas relacionados con las células B.
En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para inhibir el crecimiento o la progresión del tumor en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA, que comprende la administración al sujeto que lo necesita de una cantidad eficaz de una composición que comprende los anticuerpos BCMA, los anticuerpos biespecíficos CD3-BCMA o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, se proporciona un procedimiento para inhibir las células de metástasis que expresan BCMA en un sujeto, que comprende la administración al sujeto que lo necesita de una cantidad eficaz de una composición que comprende los anticuerpos BCMA, los anticuerpos biespecíficos CD3-BCMA o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, se proporciona un procedimiento para inducir la regresión tumoral en células malignas en un sujeto, que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición que comprende los anticuerpos BCMA, los anticuerpos biespecíficos CD3-BCMA o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para tratar un trastorno autoinmune en un sujeto que comprende la administración al sujeto que lo necesita de una cantidad eficaz de una composición que comprende los anticuerpos BCMA, los anticuerpos biespecíficos CD3-BCMA o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento.
Tal como se utiliza en el presente documento, los trastornos autoinmunes incluyen, entre otros, el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumatoide, la diabetes (tipo I), la esclerosis múltiple, la enfermedad de Addison, la enfermedad celíaca, la dermatomiositis, la enfermedad de Graves, la tiroiditis de hashimoto, la encefalopatía de hashimoto, la miastenia gravis, la anemia perniciosa, la artritis reactiva, el síndrome de Sjogren encefalomielitis aguda diseminada, agammaglobulinemia, esclerosis lateral amiotrófica, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, síndrome antisintetasa, alergia atópica, dermatitis atópica, enteropatía autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad autoinmune del oído interno, síndrome linfoproliferativo autoinmune, neuropatía periférica autoinmune, pancreatitis autoinmune, síndrome poliendorcrino autoinmune, dermatitis autoinmune por progesterona, púrpura trombocitopénica autoinmune, urticaria autoinmune, uveítis autoinmune, enfermedad de Bechet, enfermedad de Castleman, enfermedad de la aglutinina fría, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, fascitis eosinofílica, penfigoide gastrointestinal, síndrome de Goodpasture, Síndrome de Guillain-Barré, hidradenitis supurativa, púrpura trombocitopénica idiopática, narcolepsia, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, polimiositis, cirrosis biliar primaria, policondritis recidivante, fiebre reumática, arteritis temporal, mielitis transversa, colitis ulcerosa, enfermedad indiferenciada del tejido conectivo, vasculitis y granulomatosis de Wegener.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una cantidad eficaz de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento para tratar una afección (por ejemplo, cáncer o trastorno autoinmune) asociada con la expresión de BCMA en un sujeto que la necesita. En algunas realizaciones, se proporciona una cantidad eficaz de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento para inhibir el crecimiento o la progresión del tumor en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA. En algunas realizaciones, se proporciona una cantidad eficaz de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento para inhibir la metástasis de las células malignas que expresan BCMA en un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, se proporciona una cantidad eficaz de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento para inducir la regresión tumoral en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA.
En otro aspecto, la divulgación proporciona los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describen en el presente documento para su uso en el tratamiento de una condición (por ejemplo, cáncer o trastorno autoinmune) asociada con la expresión de BCMA en un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se proporcionan los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento para inhibir el crecimiento o la progresión del tumor en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA. En algunas realizaciones, se proporcionan los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento para inhibir la metástasis de las células malignas que expresan BCMA en un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, se proporcionan los anticuerpos (por ejemplo, BCMa o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento para inducir la regresión del tumor en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un uso de los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar una condición (por ejemplo, cáncer o trastorno autoinmune) asociada con la expresión de BCMA. En algunas realizaciones, se proporciona un uso de los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento o la progresión del tumor. En algunas realizaciones, se proporciona un uso de los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para inhibir la metástasis de las células malignas que expresan BCMA. En algunas realizaciones, se proporciona un uso de los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para inducir la regresión del tumor.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para detectar, diagnosticar y/o monitorizar una condición asociada con la expresión de Bc Ma . Por ejemplo, los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) descritos en el presente documento pueden marcarse con una fracción detectable, como un agente de imagen y una etiqueta de sustrato enzimático. Los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden utilizarse para ensayos de diagnóstico in vivo , como la obtención de imágenes in vivo (por ejemplo, PET o SPECT), o un reactivo de tinción.
En algunas realizaciones, los procedimientos aquí descritos comprenden además un paso de tratamiento de un sujeto con una forma adicional de terapia. En algunas realizaciones, la forma adicional de terapia es una terapia adicional contra el cáncer que incluye, pero no se limita a, quimioterapia, radiación, cirugía, terapia hormonal y/o inmunoterapia adicional.
En algunas realizaciones, la forma adicional de terapia comprende la administración de uno o más agentes terapéuticos además de los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento. El uno o más agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico que incluye, pero no se limita a, un segundo anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) (por ejemplo, AVASTIN®), un anticuerpo anti-HER2 (por ejemplo, HERCEPTIN®), un anticuerpo anti-CD25, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, RITUXAN®), un anticuerpo antiglicoproteína similar a la mucina, un anticuerpo anti-TNF, y/o un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, ERBITUX®)), un inhibidor de la angiogénesis, un agente citotóxico (por ejemplo, antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, valrubicina y mitoxantrona), taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), dolastatina, duocarmicina, enedina, geldanamicina, maytansina, puromicina, alcaloide de la vinca (por ejemplo, vincristina), un inhibidor de la topoisomerasa (por ejemplo, etopósido), tubulisina, un análogo de la pirimidina (por ejemplo, fluorouracilo), agentes que contienen platino (por ejemplo, cisplatino, carboplatino y oxaliplatino), agentes alquilantes (por ejemplo, melfalán, ciclofosfamida o carmustina) y hemiasterlina), agente inmunomodulador (por ejemplo, prednisona y lenalidomida (REVLIMID®)), un agente antiinflamatorio (por ejemplo, dexametasona), un inhibidor de la aromatasa (por ejemplo, anastrozol, exemestano, letrozol, vorozol, formestano o testolactona), un inhibidor del proteasoma (por ejemplo bortezomib como VELCADE® ([(1R)-3-metil-1-[(2S)-1-oxo-3-fenil-2-[(pirazinilcarbonil)amino]propy- l]amino]butil] ácido borónico o carfilzomib), y otros agentes como el tamoxifeno.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para tratar el mieloma múltiple que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de una composición que comprende los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento y uno o más agentes terapéuticos tales como un agente quimioterapéutico (por ejemplo, doxorrubicina o carfilzomib) o talidomida o su derivado (por ejemplo, lenalidomida (REVLIMID®)). En algunas realizaciones, el otro agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en bortezomib (por ejemplo, VELCADE®), melfalán, prednisona, doxorrubicina, lenalidomida, talidomida, prednisona, carmustina, etopósido, cisplatino, ciclofosfamida, carfilzomib y vincristina. En algunas realizaciones, el otro agente terapéutico es bortezomib (por ejemplo, VELCADE®), melfalán, lenalidomida (REVLIMID®), carfilzomib, doxorrubicina o prednisona. En consecuencia, se proporciona un procedimiento para tratar el mieloma múltiple que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad eficaz de una composición que comprende los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento y uno o más agentes terapéuticos que se seleccionan del grupo que consiste en bortezomib, lenalidomida, carfilzomib y doxorrubicina. En algunas realizaciones, el paciente es recidivante o refractario a la terapia previa del mieloma múltiple.
Los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA pueden administrarse a un individuo por cualquier vía adecuada. Los expertos en la materia deben entender que los ejemplos descritos en el presente documento no pretenden ser limitativos, sino ilustrativos de las técnicas disponibles. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o el conjugado de anticuerpos BCMA se administra a un individuo de acuerdo con procedimientos conocidos, como la administración intravenosa, por ejemplo como bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, intracraneal, transdérmica, subcutánea, intraarticular, sublingual, intrasinovial, por insuflación, intratecal, oral, por inhalación o tópica. La administración puede ser sistémica, por ejemplo, intravenosa, o localizada. Los nebulizadores disponibles en el mercado para formulaciones líquidas, incluidos los nebulizadores de chorro y los nebulizadores ultrasónicos, son útiles para su administración. Las formulaciones líquidas pueden nebulizarse directamente y el polvo liofilizado puede nebulizarse tras su reconstitución. Alternativamente, el anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o el conjugado de anticuerpos BCMA puede ser aerosolizado utilizando una formulación de fluorocarbono y un inhalador de dosis medida, o inhalado como un polvo liofilizado y molido.
En una realización, el anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o el conjugado de anticuerpos BCMA se administra a través de técnicas de administración local específica o dirigida. Entre los ejemplos de técnicas de administración local específica o dirigida se incluyen varias fuentes de depósito implantables del anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o el conjugado de anticuerpos BCMA o catéteres de administración local, como catéteres de infusión, catéteres permanentes o catéteres de aguja, injertos sintéticos, envolturas adventicias, derivaciones y stents u otros dispositivos implantables, portadores específicos del sitio, inyección directa o aplicación directa. Véase, por ejemplo la Publicación PCT n°WO 00/53211 y Pat. de EE.UU. N° 5.981.568.
Se pueden utilizar diversas formulaciones del anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o del conjugado de anticuerpos BCMA para su administración. En algunas realizaciones, el anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o el conjugado de anticuerpos BCMA puede administrarse puro. En algunas realizaciones, el anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o el conjugado de anticuerpos BCMA y un excipiente farmacéuticamente aceptable pueden estar en varias formulaciones. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos en la técnica, y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, entre otros, agentes estabilizadores, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones y potenciadores de la penetración en la piel. Los excipientes, así como las formulaciones para la administración de medicamentos parenterales y no parenterales, se exponen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Editorial Mack, 2005.
En algunas realizaciones, estos agentes están formulados para su administración por inyección (por ejemplo, por vía intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). En consecuencia, estos agentes pueden combinarse con vehículos farmacéuticamente aceptables, como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y similares. El régimen de dosificación concreto, es decir, la dosis, el momento y la repetición, dependerá de cada persona y de su historial médico.
Los anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o los conjugados de anticuerpos BCMA descritos en el presente documento pueden administrarse mediante cualquier procedimiento adecuado, incluyendo por inyección (por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). El anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o el conjugado de anticuerpos BCMA también puede administrarse por inhalación, como se describe en el presente documento. Generalmente, para la administración de un anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) y un conjugado de anticuerpos BCMA, una dosis inicial candidata puede ser de aproximadamente 2 mg/kg. A efectos de la presente divulgación, una dosis diaria típica puede oscilar entre 3 pg/kg y 30 pg/kg y 300 pg/kg y 3 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Por ejemplo, pueden utilizarse dosis de aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2,5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas o hasta que se alcanzan niveles terapéuticos suficientes, por ejemplo, para inhibir o retrasar el crecimiento/progresión del tumor o la metástasis de las células cancerosas. Un régimen de dosificación ejemplar comprende la administración de una dosis inicial de aproximadamente 2 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 1 mg/kg del anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o del conjugado de anticuerpos BCMA, o seguida de una dosis de mantenimiento de aproximadamente 1 mg/kg cada dos semanas. Otro régimen de dosificación ejemplar comprende la administración de dosis crecientes (por ejemplo, dosis inicial de 1 mg/kg y aumento gradual a una o más dosis más altas cada semana o período de tiempo más largo). También pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de decaimiento farmacocinético que el profesional desee lograr. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se contempla la dosificación de una a cuatro veces por semana. En otras realizaciones, se contempla la dosificación una vez al mes o una vez cada dos meses o cada tres meses. El progreso de esta terapia se puede controlar fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. El régimen de dosificación (incluyendo el anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o el conjugado de anticuerpos BCMA utilizado) puede variar con el tiempo.
A efectos de la presente divulgación, la dosis adecuada de un anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o un conjugado de anticuerpos BCMA dependerá del anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o el conjugado de anticuerpos BCMA (o composiciones de los mismos) empleado, el tipo y la gravedad de los síntomas a tratar, si el agente se administra con fines terapéuticos, la terapia anterior, el historial clínico del paciente y la respuesta al agente, la tasa de eliminación del paciente para el agente administrado, y la discreción del médico que lo atiende. Normalmente, el clínico administrará un anticuerpo (por ejemplo, BCMa o CD3-BCMA biespecífico) o un conjugado de anticuerpos BCMA hasta alcanzar una dosis que logre el resultado deseado. La dosis y/o la frecuencia pueden variar a lo largo del tratamiento. Las consideraciones empíricas, como la semivida, generalmente contribuirán a la determinación de la dosis. Por ejemplo, los anticuerpos que son compatibles con el sistema inmunitario humano, como los anticuerpos humanizados o los anticuerpos totalmente humanos, pueden utilizarse para prolongar la semivida del anticuerpo y evitar que éste sea atacado por el sistema inmunitario del huésped. La frecuencia de administración puede determinarse y ajustarse a lo largo de la terapia, y generalmente, pero no necesariamente, se basa en el tratamiento y/o la supresión y/o la mejora y/o el retraso de los síntomas, por ejemplo, la inhibición o el retraso del crecimiento del tumor, etc. Alternativamente, pueden ser apropiadas las formulaciones de liberación continua sostenida de anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o conjugados de anticuerpos BCMA. Se conocen en la técnica diversas formulaciones y dispositivos para lograr la liberación sostenida.
En una realización, las dosis de un anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o de un conjugado de anticuerpos BCMA pueden determinarse empíricamente en individuos que han recibido una o más administraciones del anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o del conjugado de anticuerpos BCMA. Los individuos reciben dosis increméntales de un anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o un conjugado de anticuerpos BCMA. Para evaluar la eficacia, se puede seguir un indicador de la enfermedad.
La administración de un anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o un conjugado de anticuerpos BCMA de acuerdo con el procedimiento de la presente divulgación puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, del estado fisiológico del receptor, de si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico, y de otros factores conocidos por los profesionales expertos. La administración de un anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o un conjugado de anticuerpos BCMA puede ser esencialmente continua durante un periodo de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas.
En algunas realizaciones, puede estar presente más de un anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o conjugado de anticuerpos BCMA. Pueden estar presentes al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco anticuerpos diferentes o más (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o conjugados de anticuerpos BCMA. Generalmente, estos anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o conjugados de anticuerpos BCMA pueden tener actividades complementarias que no se afectan mutuamente. Por ejemplo, pueden utilizarse uno o más de los siguientes anticuerpos: un primer anticuerpo BCMA o CD3 dirigido a un epítopo de BCMA o CD3 y un segundo anticuerpo BCMA o CD3 dirigido a un epítopo diferente de BCMA o CD3.
Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o el conjugado de anticuerpo BCMA utilizado de acuerdo con la presente divulgación se preparan para su almacenamiento mezclando un anticuerpo que tenga el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, y pueden comprender tampones como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; sales como el cloruro de sodio; antioxidantes como el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (como el cloruro de octadecildimetilbencilamonio; el cloruro de hexametonio; el cloruro de benzalconio, el cloruro de bencetonio; el fenol, el alcohol butílico o el bencílico; los alquilparabenos, como el metil o el propilparabeno; el catecol; el resorcinol; el ciclohexanol 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como la albúmina de suero, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como la polivinilpirrolidona; aminoácidos, como la glicina, la glutamina, la asparagina, la histidina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono como la glucosa, la manosa o las dextrinas; agentes quelantes como el EDTA; azúcares como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol; contra­ iones formadores de sal como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína).por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
Los liposomas que contienen el anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o el conjugado de anticuerpos BCMA se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, como los descritos en Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985 Hwang, etal., Proc. Acad. Nat. Sci. USA 77:4030, 1980 y Pat. de EE.UU. Números 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con mayor tiempo de circulación se divulgan en la Pat. de EE.UU. N° 5.013.556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles por el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado.
Los ingredientes activos también pueden quedar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Editorial Mack, 2005.
Pueden prepararse preparados de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrófobos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se encuentran los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el poli(2-hidroxietilmetacrilato), o el 'poli(vinilalcohol)'), los polilactidos (U.S. Pat. N° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y 7 etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), isobutirato de acetato de sacarosa y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Las formulaciones que se utilicen para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente, por ejemplo, mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones de anticuerpos terapéuticos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o de conjugados de anticuerpos BCMA se colocan generalmente en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
Las composiciones según la presente divulgación pueden estar en formas de dosificación unitarias como comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones, o supositorios, para administración oral, parenteral o rectal, o administración por inhalación o insuflación.
Para preparar composiciones sólidas como comprimidos, el ingrediente activo principal se mezcla con un portador farmacéutico, por ejemplo, ingredientes convencionales para la elaboración de comprimidos como almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato dicálcico o gomas, y otros diluyentes farmacéuticos, por ejemplo, agua, para formar una composición sólida de preformulación que contenga una mezcla homogénea de un compuesto de la presente divulgación, o una sal no tóxica farmacéuticamente aceptable del mismo. Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulación como homogéneas, se quiere decir que el ingrediente activo se dispersa uniformemente en la composición, de modo que ésta puede subdividirse fácilmente en formas de dosificación unitarias igualmente eficaces, como comprimidos, píldoras y cápsulas. Esta composición sólida de preformulación se subdivide entonces en formas de dosificación unitarias del tipo descrito anteriormente que contienen de 0,1 a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo de la presente divulgación. Los comprimidos o píldoras de la nueva composición pueden estar recubiertos o compuestos de otra manera para proporcionar una forma de dosificación que ofrezca la ventaja de una acción prolongada. Por ejemplo, el comprimido o píldora puede comprender un componente de dosificación interior y otro exterior, este último en forma de sobre sobre el primero. Los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración en el estómago y permite que el componente interno pase intacto al duodeno o se retrase su liberación. Para dichas capas o recubrimientos entéricos pueden utilizarse diversos materiales, entre los que se incluyen varios ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales como la goma laca, el alcohol cetílico y el acetato de celulosa.
Los agentes tensioactivos adecuados incluyen, en particular, agentes no iónicos, como los polioxietilenosorbitanos (por ejemplo, Tween™ 20, 40, 60, 80 u 85) y otros sorbitanos (por ejemplo, Span™ 20, 40, 60, 80 u 85). Las composiciones con un agente tensioactivo comprenderán convenientemente entre el 0,05 y el 5% de agente tensioactivo, y pueden estar entre el 0,1 y el 2,5%. Se apreciará que pueden añadirse otros ingredientes, por ejemplo manitol u otros vehículos farmacéuticamente aceptables, si es necesario.
Las emulsiones adecuadas pueden prepararse utilizando emulsiones grasas disponibles en el mercado, como Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ y Lipiphysan™. El ingrediente activo puede disolverse en una composición de emulsión premezclada o, alternativamente, puede disolverse en un aceite (por ejemplo, aceite de soja, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de maíz o aceite de almendras) y formarse una emulsión al mezclarse con un fosfolípido (por ejemplo, fosfolípidos de huevo, fosfolípidos de soja o lecitina de soja) y agua. Se apreciará que pueden añadirse otros ingredientes, por ejemplo glicerol o glucosa, para ajustar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones adecuadas suelen contener hasta un 20% de aceite, por ejemplo, entre un 5 y un 20%. La emulsión grasa puede comprender gotas de grasa de entre 0,1 y 1,0 pm, en particular de entre 0,1 y 0,5 pm, y tener un pH del orden de 5,5 a 8,0.
Las composiciones de emulsión pueden ser las que se preparan mezclando un anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o un anticuerpo BCMA conjugado con Intralipid™ o sus componentes (aceite de soja, fosfolípidos de huevo, glicerol y agua).
Las composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en disolventes acuosos u orgánicos farmacéuticamente aceptables, o mezclas de ellos, y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados, como se ha indicado anteriormente. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por vía oral o respiratoria nasal para un efecto local o sistémico. Las composiciones en disolventes preferentemente estériles y aceptables desde el punto de vista farmacéutico pueden nebulizarse mediante el uso de gases. Las soluciones nebulizadas pueden respirarse directamente desde el dispositivo de nebulización o el dispositivo de nebulización puede estar conectado a una máscara facial, una tienda de campaña o una máquina de respiración de presión positiva intermitente. Las composiciones en solución, en suspensión o en polvo pueden administrarse, preferentemente por vía oral o nasal, a partir de dispositivos que liberen la formulación de forma adecuada.
Composiciones
Las composiciones utilizadas en los procedimientos de la divulgación comprenden una cantidad efectiva de un anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o un conjugado de anticuerpos BCMA como se describe en el presente documento. En una sección anterior y a continuación se describen ejemplos de tales composiciones, así como la forma de formularlas. En algunas realizaciones, la composición comprende uno o más anticuerpos (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecíficos) o conjugados de anticuerpos BCMA. Por ejemplo, el anticuerpo BCMA o el anticuerpo biespecífico CD3-BCMA reconoce el BCMA humano o el CD3-BCMA. En algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o CD3-BCMA es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. En algunas realizaciones, el anticuerpo BCMA o el anticuerpo CD3-BCMA comprende una región constante que es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria deseada, como la lisis mediada por anticuerpos o la ADCC. En otras realizaciones, el anticuerpo BCMA o el anticuerpo CD3-BCMA comprende una región constante que no desencadena una respuesta inmunitaria no deseada o indeseable, como la lisis mediada por anticuerpos o la ADCC.
Se entiende que las composiciones pueden comprender más de un anticuerpo (por ejemplo, BCMA o CD3-BCMA biespecífico) o conjugado de anticuerpos BCMA (por ejemplo, una mezcla de anticuerpos BCMA o anticuerpos CD3-BCMA biespecíficos que reconocen diferentes epítopos de BCMA o CD3 y BCMA). Otras composiciones ejemplares comprenden más de un anticuerpo BCMA, anticuerpo CD3-BCMA, o conjugado de anticuerpos BCMA que reconocen el mismo epítopo(s), o diferentes especies de anticuerpos BCMA, anticuerpos biespecíficos CD3-BCMA, o conjugado de anticuerpos BCMA que se unen a diferentes epítopos de BCMA (por ejemplo, BCMA humano) o CD3 y BCMA (CD3 y BCMA humano).
La composición utilizada en la presente divulgación puede comprender además portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables (Remington: The Science and practice of Pharmacy 21a Ed., 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones, y pueden comprender tampones como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (como el cloruro de octadecildimetilbencilamonio; el cloruro de hexametonio; el cloruro de benzalconio, el cloruro de bencetonio; el fenol, el alcohol butílico o el bencílico; los alquilparabenos, como el metil o el propilparabeno; el catecol; el resorcinol; el ciclohexanol; el 3-pentanol; y el m-cresol) polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como la albúmina de suero, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como la polivinilpirrolidona; aminoácidos, como la glicina, la glutamina, la asparagina, la histidina, la arginina o la lisina monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono como la glucosa, la manosa o los dextranos; agentes quelantes como el EDTA; azúcares como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol; contra-iones formadores de sal como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína).por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos como TWEe N™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Los excipientes farmacéuticamente aceptables se describen además en el presente documento.
Kits
La divulgación también proporciona kits para su uso en los procedimientos actuales. Los kits de la divulgación incluyen uno o más envases que comprenden el anticuerpo BCMA, el anticuerpo biespecífico CD3-BCMA o el conjugado de anticuerpos BCMA tal como se describe en el presente documento y las instrucciones de uso de acuerdo con cualquiera de los procedimientos de la divulgación descritos en el presente documento. En general, estas instrucciones comprenden una descripción de la administración del anticuerpo BCMA, del anticuerpo biespecífico CD3-BCMAo del conjugado de anticuerpos BCMA para los tratamientos terapéuticos descritos anteriormente.
Las instrucciones relativas al uso de los anticuerpos BCMA, los anticuerpos biespecíficos CD3-BCMA o los conjugados de anticuerpos BCMA descritos en el presente documento incluyen generalmente información sobre la dosis, el programa de dosificación y la vía de administración para el tratamiento previsto. Los envases pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (por ejemplo, paquetes multidosis) o sub-dosis. Las instrucciones suministradas en los kits de la divulgación suelen ser instrucciones escritas en una etiqueta o prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero también son aceptables las instrucciones legibles por máquina (por ejemplo, las instrucciones transportadas en un disco de almacenamiento magnético u óptico).
Los kits de la presente divulgación se presentan en envases adecuados. Los envases adecuados incluyen, pero no se limitan a, viales, botellas, frascos, envases flexibles (por ejemplo, bolsas de plástico o Mylar selladas), y similares. También se contemplan envases para su uso en combinación con un dispositivo específico, como un inhalador, un dispositivo de administración nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo de infusión como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El contenedor también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo de la composición es un anticuerpo BCMA, un anticuerpo biespecífico CD3-BCMA o un conjugado de anticuerpos BCMA. El recipiente puede contener además un segundo agente farmacéutico activo.
Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como topes e información interpretativa. Normalmente, el kit comprende un envase y una etiqueta o prospecto en el envase o asociado a él.
Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en modo alguno.
Ejemplos
Ejemplo 1: Determinación de la cinética y afinidad de las interacciones hBCMA/IGG humana a 25°C y/o 37°C
Este ejemplo determina la cinética y afinidad de varios anticuerpos anti-BCMA a 25°C y 37°C.
Todos los experimentos se realizaron en un biosensor de resonancia de Plasmón de superficie Proteon XPR36 de Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Se preparó una matriz de anticuerpos anti-BCMA utilizando un procedimiento de acoplamiento de aminas en un GLC Sensor Chip de Bio-Rad similar al descrito en Abdiche, et al., Anal. Biochem. 411, 525 a 151). La temperatura de análisis para la inmovilización fue de 25°C y el tampón de funcionamiento fue HBS-T+ (10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 0,05% Tween-20, pH 7,4). Los canales se activaron en la dirección del analito (horizontal) inyectando una mezcla de 1 mM de ECD y 0,25 mM de NHS durante 3 minutos a un flujo de 30 pl/min. Las IgGs se inmovilizaron en las manchas activadas inyectándolas en la dirección del ligando (vertical) a 20 pg/ml en tampón Acetato 10 mM pH 4,5 durante 1,5 minutos a 30 pg/ml. Las superficies activadas se bloquearon inyectando etanolamina 1M, pH 8,5 en la dirección del analito durante 3 minutos a 30 pl/min.
La temperatura de análisis para el análisis de unión de hBCMA fue de 37°C o 25°C en un tampón de funcionamiento de HBS-T+, complementado con 1 mg/ml de BSA. Se empleó un procedimiento de valoración cinética para el análisis de la interacción, tal como se describe en Abdiche, et al. El analito hBCMA (BCMA humano) se inyectó en la dirección del analito utilizando una serie de inyecciones de baja a alta concentración. Las concentraciones utilizadas fueron 0,08 nM, 0,4 nM, 2 nM, 10 nM y 50 nM (una serie de 5 miembros, con un factor de dilución de 5 veces y una concentración máxima de 50 nM). El tiempo de asociación para una determinada dilución del analito fue de dos minutos. Inmediatamente después de la inyección de 50 nM de hBCMA, se monitorizó la disociación durante 2 horas. Antes de las inyecciones de analito hBCMA, se inyectó tampón 5 veces utilizando los mismos tiempos de asociación y disociación en los ciclos de analito hBCMA para preparar un sensorgrama en blanco de tampón con fines de doble referencia (doble referencia como se describe en Myszka, J. Mol. Reconocer. 12, 525 a 284).
Los sensorgramas fueron doblemente referenciados y ajustados a un modelo de titulación cinética de Langmuir con transporte de masa 1:1 en el software BIAevaluation versión 4.1.1 (GE Lifesciences, Piscataway, NJ). Los sensorgramas y los ajustes se muestran en la Figura 1, y la cinética y los parámetros de afinidad para varios anticuerpos anti-BCMA de la presente divulgación se muestran en las Tablas 6A-6C.
Tabla 6A
Figure imgf000102_0001
Tabla 6B
Figure imgf000102_0002
Figure imgf000103_0001
Figure imgf000104_0001
Figure imgf000105_0001
Figure imgf000106_0001
Figure imgf000107_0001
Figure imgf000108_0001
Figure imgf000109_0001
Tabla 6C*
Figure imgf000110_0001
Figure imgf000111_0001
Figure imgf000112_0001
Ejemplo 2: Citometría de flujo de anticuerpos humanos anti-BCMA en células tumorales BCMA positivas Este ejemplo demuestra la unión de células tumorales BCMA positivas por varios anticuerpos BCMA de la presente divulgación.
La unión de anti-hBCMA humano expresado en IgG2a de ratón se evaluó en células que expresan BCMA (KMS12BM, L363, MM1S y KMS12PE) mediante citometría de flujo. Se incubaron 250.000 células con 0,5 ug de anticuerpo en 100uL de tampón de unión (PBS (solución salina tamponada con fosfato) 0,2% de BSA (albúmina de suero bovino)), seguido de la incubación con Alex Fluor 647 conjugado con IgG anti-ratón (Biolegend). La tabla 7 muestra la MFI (intensidad media de fluorescencia) en las células tumorales positivas a BCMA por varios anticuerpos BCMA (por ejemplo, Combo_Rd4_0.6nM_C29, A02_Rd4_6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C16, y P6E01/H3TAQ)
Tabla 7
Figure imgf000112_0002
Ejemplo 3: Citotoxicidad de los ADCs Anti-BCMA en células BCMA positivas
Este ejemplo ilustra la eficacia de los ADCs anti-BCMA en células BCMA positivas.
Los anticuerpos humanos anti-BCMA (L3.PY/P6E01, L3.PY/H3.TAQ, Combo_Rd4_0.6nM_C29, A02_Rd4_6nM_C01, y A02_Rd4_6nM_C16) se expresaron como subtipos de IgG1 humanos diseñados con etiquetas de transglutaminasa ("Q") que contienen glutamina (por ejemplo, LCQ05, H7c, N297A, N297Q, N297A/H7c, N297q /LCQ05) para relaciones de anticuerpos (DAR) de 2, 4 y 6. TG17 corresponde a SEQ ID NO: 472 (LLQGPP); LCQ05 corresponden a SEQ ID NO: 474 (GGLLQGp P), H7c corresponden a s Eq ID NO: 454 (LLQG), respectivamente, y conjugados con AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101 (Acetil-Lisina-Valina-Citrulina-p-aminobenziloxicarbonilo), amino-PEG6-C2-Aur3377, o amino-PEG6-C2-Aur0131 como se indica en la Tabla 8. En un caso, las etiquetas de transglutaminasa pueden ser diseñadas en la cadena ligera, la cadena pesada o una combinación de cadenas ligeras y pesadas. En otro caso, la etiqueta de transglutaminasa (por ejemplo, Q) se diseña en el sitio del anticuerpo, como en la posición 297 de la IgG humana (esquema de numeración de la UE). Por ejemplo, el aminoácido de tipo salvaje asparagina (N) se sustituye por glutamina o alanina en la posición 297 del anticuerpo BCMA (N297Q o N297A) de la presente divulgación. La conjugación del anticuerpo anti-BCMA con Aur0101, Aur3377 y Aur0131 se realizó mediante una reacción de transamidación catalizada por la transglutaminasa microbiana entre el anticuerpo anti-BCMA que lleva una etiqueta de glutamina o glutamina dirigida en el sitio específico (por ejemplo el extremo carboxilo o el extremo amino de la cadena pesada o de la cadena ligera, la posición 297, o en otro sitio del anticuerpo) y un derivado de la carga útil que contiene amina (por ejemplo, MMAD, Aur0101, Aur3377 o Aur0131). En algunos casos, el aminoácido de tipo salvaje lisina en la posición 222, 340 o 370 (de acuerdo con el esquema de numeración de la UE) fue sustituido por el aminoácido arginina ("K222R", "K340R" o "K370R"). Por ejemplo, se descubrió que la sustitución K222R tenía el sorprendente efecto de dar lugar a un conjugado de anticuerpo y carga útil más homogéneo, una mejor reticulación intermolecular entre el anticuerpo y la carga útil, y/o una disminución significativa de la reticulación entre cadenas con la etiqueta de glutamina en el extremo C de la cadena ligera del anticuerpo.
En la reacción de transamidación, la glutamina del anticuerpo actuó como donante de acilo, y el compuesto que contiene amina actuó como aceptor de acilo (donante de amina). El anticuerpo anti-BCMA purificado en la concentración de 1 -150 pM se incubó con un exceso de aceptor de acil de 5 -100 molar, que oscilaba entre 5 pM -15 mM, en presencia de 0,23 - 0,55% (p/v) de transglutaminasa de Streptoverticillium mobaraense (ACTIVA™, Ajinomoto, Japón) en 10 - 1000 mM de NaCl, y 25 mM de m Es , HEPES [ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico] o tampón Tris HCl aun intervalo de pH de 6,2 - 8,8. Las condiciones de reacción se ajustaron para cada uno de los derivados del aceptor de acilo, y la eficacia y especificidad óptimas se observaron normalmente para 33 pM de anticuerpo, 0,67 mM de derivado y 0,378% (p/v) de transglutaminasa en 75 mM de NaCl, 25 mM de Tris HCI, pH 8,5. Tras la incubación a 20-37 grados C durante 1-24 horas, el anticuerpo se purificó en resina de butil sefarosa de alto rendimiento (butil HP) (GE Healthcare, Waukesha, WI) utilizando procedimientos cromatográficos estándar conocidos por los expertos en la materia, como la cromatografía de interacción hidrófoba comercial de GE Healthcare.
Las células que expresan la diana (MM1.S, KMS12BM y L363) se sembraron entonces en placas de fondo transparente a 3000 células/pocillo. Las células se trataron con conjugados anticuerpo-fármaco diluidos en serie 4 veces por triplicado. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® 96 (Promega, Madison WI) 96 horas después del tratamiento. La viabilidad celular relativa se determinó como porcentaje del control no tratado. La EC50 se calculó con el software Prism. La Tabla 8 muestra que todos los anticuerpos humanos anti-BCMA de la presente divulgación conjugados con el agente citotóxico 0101, 3377 y 0131 a través de etiquetas y enlazadores de transglutaminasa ejercen una potente actividad de destrucción celular en células que expresan BCMA.
Tabla 8
Figure imgf000113_0001
Figure imgf000114_0001
Ejemplo 4: Los ADCs anti-BCMA inducen la regresión tumoral en un modelo ortotópico de mieloma múltiple
Este ejemplo ilustra la eficacia in vivo de los ADCs anti-BCMA en el modelo de mieloma múltiple ortotópico MM1S.
El estudio de eficacia in vivo de los BCMA ADCs se realizó con la línea celular de mieloma múltiple MM1.S que expresa luciferasa y GFP (Proteína Verde Fluorescente) en un modelo ortotópico. Se inyectaron diez millones de células MM1.S LucGFP por vía intravenosa a través de la vena de la cola en animales hembra CB17/SCID de 6-8 semanas de edad. La inyección intraperitoneal de D-luciferina (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200uL por animal a 15mg/ml), seguida de anestesia con isofluorano y la posterior obtención de imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero (BLI) permiten el seguimiento de la carga tumoral. Las señales bioluminiscentes emitidas por la interacción entre la luciferasa expresada por las células tumorales y la luciferina se capturaron mediante imágenes utilizando un IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, MA) y se cuantificaron como flujo total (fotones/seg) utilizando Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Cuando el flujo total alcanzó una media de 1-3E6 para todos los animales, éstos fueron distribuidos aleatoriamente en grupos y se les administró una dosis única de un anticuerpo humano anti-BCMA conjugado con 1) LCQ05/K222R-vc0101 en el extremo C de la cadena ligera del anticuerpo y conjugados de control mediante una inyección en bolo en la vena de la cola. Los animales fueron dados de baja cuando mostraron parálisis de las extremidades posteriores, un punto final para los modelos ortotópicos de MM1.S. La Figura 2 muestra que una dosis única de 3mg/kg de varios ADCs anti-BCMA humanos inhibe la progresión del tumor en comparación con el control negativo (NNC), incluyendo P6E01/P6E01-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; P5A2_VHVL-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; P5C1_VHVL-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; P4G4-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; y P1A11-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101.
Este estudio demuestra que el tratamiento con un BCMA-ADC inhibe la progresión del mieloma múltiple.
Ejemplo 5: Los ADCs anti-BCMA inducen la regresión e inhibición del tumor en un modelo ortotópico de mieloma múltiple
Este ejemplo también ilustra la eficacia in vivo de los ADCs anti-BCMA en los modelos de mieloma múltiple ortotópico MM1.S.
El estudio de eficacia in vivo de los BCMA ADCs se realizó con la línea celular de mieloma múltiple MM1.S que expresa luciferasa y GFP en un modelo ortotópico. Se inyectaron diez millones de células MM1.S LucGFP por vía intravenosa a través de la vena de la cola en animales hembra CB17/SCID de 6-8 semanas de edad. La inyección intraperitoneal de D-luciferina (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200uL por animal a 15mg/ml), seguida de anestesia con isofluorano y la posterior obtención de imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero (BLI) permiten el seguimiento de la carga tumoral. Las señales bioluminiscentes emitidas por la interacción entre la luciferasa expresada por las células tumorales y la luciferina se capturaron mediante imágenes utilizando un IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, MA) y se cuantificaron como flujo total (fotones/seg) utilizando Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Cuando el flujo total alcanzó una media de 1-3E6 para todos los animales, éstos fueron distribuidos aleatoriamente en grupos; 1) H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-3377, 2) N297Q/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 3) LCQ05/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101,4) H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-0131, 5) N297Q/K222R/LCQ05-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, y 6) conjugado de control LCQ04/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur01. Se administró una dosis única de ADCs anti-BCMA humanos y del conjugado de control mediante una inyección en bolo en la vena de la cola. Los animales fueron dados de baja cuando mostraron parálisis de las extremidades posteriores, un punto final para el modelo ortotópico MM1.S. La figura 3 muestra que una dosis única del anticuerpo humano anti-BCMA L3.PY/P6E01 conjugado con 1) H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-0131 y 2) H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-3377 produjo una regresión tumoral. Una dosis única del anticuerpo humano anti-BCMA L3.PY/P6E01 conjugado con 1) N297Q/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 2) LCQ05/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, y 3) N297Q/K222R/LCQ05-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101 dio lugar a la inhibición del tumor.
En consecuencia, este estudio demuestra que el tratamiento con un BCMA-ADC induce la regresión e inhibe la progresión del mieloma múltiple.
Ejemplo 6: Los ADCs anti-BCMA inducen la inhibición del tumor en un modelo ortotópico de mieloma múltiple
Este ejemplo también ilustra la eficacia in vivo de los ADCs anti-BCMA en los modelos de mieloma múltiple ortotópico KMS12BM
El estudio de eficacia in vivo de los BCMA ADCs se realizó con la línea celular de mieloma múltiple KMS12BM que expresa luciferasa y GFP en un modelo ortotópico. Animales hembra NSG de 6-8 semanas de edad fueron irradiados con 100cGy y 24 horas después de la irradiación, se inyectaron diez millones de células KMS12BM LucGFP por vía intravenosa a través de la vena de la cola. La inyección intraperitoneal de D-luciferina (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200uL por animal a 15mg/ml), seguida de anestesia con isofluorano y la posterior obtención de imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero (BLI) permiten el seguimiento de la carga tumoral. Las señales bioluminiscentes emitidas por la interacción entre la luciferasa expresada por las células tumorales y la luciferina se capturan mediante imágenes utilizando un IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, MA) y se cuantifican como flujo total (fotones/seg) utilizando Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Cuando el flujo total alcanzó una media de 5E6 para todos los animales, éstos fueron distribuidos aleatoriamente en grupos; 1) H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-3377, 2) N297Q/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur010, 3) LCQ05/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 4) H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-0131, 5) N297Q/K222R/LCQ05-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, y 6) conjugado de control LCQ04/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur01. Se administró una dosis única de ADCs anti-BCMA humanos y del conjugado de control mediante una inyección en bolo en la vena de la cola. Los animales fueron dados de baja cuando perdieron más del 15% del peso corporal total, un punto final para los modelos ortotópicos KMS12BM. La figura 4 muestra que una dosis única de anticuerpo humano anti-BCMA L3.PY/P6E01 conjugado con 1) H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-3377, 2) N297Q/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 3) LCQ05/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 4) H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-0131, y 5) N297Q/K222R/LCQ05-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101 dieron lugar a la inhibición del tumor.
En consecuencia, este estudio demuestra además que el tratamiento con un BCMA-ADC induce la regresión e inhibe la progresión del mieloma múltiple.
Ejemplo 7: Curva de respuesta a la dosis del ADC anti-BCMA en el modelo ortotópico MM1S
Este ejemplo ilustra además la eficacia in vivo de los ADCs anti-BCMA en los modelos de mieloma múltiple ortotópico MM1S
El estudio de eficacia in vivo de los BCMA ADCs se realizó con la línea celular de mieloma múltiple MM1.S que expresa luciferasa y GFP en un modelo ortotópico. Se inyectaron diez millones de células MM1.S LucGFP por vía intravenosa a través de la vena de la cola en animales hembra CB17/SCID de 6-8 semanas de edad. La inyección intraperitoneal de D-luciferina (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200uL por animal a 15mg/ml), seguida de anestesia con isofluorano y la posterior obtención de imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero (BLI) permiten el seguimiento de la carga tumoral. Las señales bioluminiscentes emitidas por la interacción entre la luciferasa expresada por las células tumorales y la luciferina se capturaron mediante imágenes utilizando un IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, MA) y se cuantificaron como flujo total (fotones/seg) utilizando Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Cuando el flujo total alcanzó una media de 1,2E6 para todos los animales, éstos fueron distribuidos aleatoriamente en grupos: 1) 0,1 mg/kg de H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-0131, 2) 038mg/kg de H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-0131, 3) 0,75 mg/kg de H7c/N297A/K222-amino-PEG6-C2-0131, 4) 1,5mg/kg de H7c/N297A/K222R-amino-PEG6-C2-0131, y 5) 3 mg/kg de conjugado de control N297Q/K222R-AcLys-VC-0101. Se administró una dosis única de ADCs anti-BCMA humanos y del conjugado de control mediante una inyección en bolo en la vena de la cola. Los animales fueron dados de baja cuando mostraron parálisis de las extremidades posteriores, un punto final para el modelo ortotópico MM1.S. La figura 5 muestra que una dosis única del anticuerpo humano anti-BCMA COMBO_Rd4_0,6nM_C29 conjugado con los grupos 1)-4) anteriores dio lugar a la regresión del tumor a partir de 0,1mg/kg y a la inhibición del tumor hasta 100 días a partir de 0,75mg/kg.
En consecuencia, este estudio demuestra que el tratamiento con un BCMA-ADC induce la regresión del tumor y la inhibición del mismo en el mieloma múltiple.
Ejemplo 8: Generación y purificación de anticuerpos heterodiméricos
Este ejemplo describe la generación y purificación de los anticuerpos heterodiméricos de la presente solicitud.
La región variable del anticuerpo humano específico anti-CD3 se clonó en una IgG1 o IgG2AA humana que contenía las siguientes mutaciones 221R, 228R y K409R; o 223R, 225R, 228R y K409R, respectivamente, y se denominó hlgGI RRR o IgG2AA-RRR.
La región variable del anticuerpo antiobjetivo se clonó en una IgG1 o IgG2AA humana que contenía las siguientes mutaciones 221E, 228E, L368E o 223E, 225E, 228E y L368E, respectivamente, y se denominó hlgGIEEE o hIgG2AA-EEEE.
Los heterodímeros se prepararon incubando la IgG1 o IgG2AA anti-CD3 con mutaciones hlgGI RRR o IgG2AA-RRR con un anticuerpo antiobjetivo con mutaciones hlgGIEEE o hIgG2AA-EEEE en PBS con 1 mM o 2 mM de GSH durante 24 horas a 37°C, como se describe en la Solicitud de Patente Internacional No PCT/US2011/036419 (WO2011/143545). El heterodímero se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico, como se describe a continuación.
Todos los heterodímeros se purificaron mediante cromatografía de intercambio iónico. Brevemente, la separación analítica por intercambio iónico de los Fc-hetero y Fc-homodímeros se llevó a cabo en el sistema LC de bomba cuaternaria Agilent 1100 (Agilent Inc, Santa Clara, Ca , USA) equipado con una columna de intercambio catiónico débil DIONEX Propac WCX-10G (4x50mm). Las proteínas se inyectaron en un 5% de tampón A (20 mM MES pH 5,4) y se eluyeron en un gradiente del 25% al 75% de tampón B (20 mM MES pH 5,4 y 500 mM de NaCl) durante un periodo de 20 minutos con un flujo de 1ml/min. La purificación del heterodímero Fc a mayor escala se realizó en un Akta Explorer (GE) equipado con una columna de intercambio catiónico débil DIONEX Propac WCX-10G (4x250mm). Las proteínas se inyectaron en un 5% de tampón A (20 mM MES pH 5,4) y se eluyeron en un gradiente del 15% al 75% de tampón B (20 mM MES pH 5,4 y 500 mM de NaCl) durante un periodo de 60 minutos con un flujo de 1ml/min.
Ejemplo 9: Determinación de la cinética y la afinidad de las interacciones hCD3/human IgG a 25°C y/o 37°C
Este ejemplo determina la cinética y afinidad de varios anticuerpos anti-CD3 a 25°C y 37°C.
Todos los experimentos se realizaron en un biosensor de resonancia de Plasmón de superficie Proteon XPR36 de Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Se preparó una matriz de anticuerpos anti-CD3 utilizando un procedimiento de acoplamiento de aminas en un GLC Sensor Chip de Bio-Rad similar al descrito en Abdiche, et al., Anal. Biochem. 411, 525 a 151). La temperatura de análisis para la inmovilización fue de 25°C y el tampón de funcionamiento fue HBS-T+ (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20, pH 7,4). Los canales se activaron en la dirección del analito (horizontal) inyectando una mezcla de 1 mM de ECD y 0,25 mM de NHS durante 3 minutos a un flujo de 30 pl/min. Las IgGs se inmovilizaron en las manchas activadas inyectándolas en la dirección del ligando (vertical) a 20 pg/ml en tampón Acetato 10 mM pH 4,5 durante 1,5 minutos a 30 pg/ml. Las superficies activadas se bloquearon inyectando etanolamina 1M, pH 8,5 en la dirección del analito durante 3 minutos a 30 pl/min.
La temperatura de análisis para el análisis de unión de hCD3 fue de 37°C o 25°C en un tampón de funcionamiento de HBS-T+, complementado con 1 mg/ml de BSA. Se empleó un procedimiento de valoración cinética para el análisis de la interacción, tal como se describe en Abdiche, et al. El analito hCD3 (CD3 humano) se inyectó en la dirección del analito utilizando una serie de inyecciones de baja a alta concentración. Las concentraciones utilizadas fueron 0,08 nM, 0,4 nM, 2 nM, 10 nM y 50 nM (una serie de 5 miembros, con un factor de dilución de 5 veces y una concentración máxima de 50 nM). El tiempo de asociación para una determinada dilución del analito fue de dos minutos. Inmediatamente después de la inyección de 50 nM de hCD3, se monitorizó la disociación durante 2 horas. Antes de las inyecciones del analito hCD3, se inyectó tampón 5 veces utilizando los mismos tiempos de asociación y disociación en los ciclos del analito hCD3 para preparar un sensorgrama en blanco de tampón con fines de doble referencia (la doble referencia se describe en Myszka, J. Mol. Reconocer. 12, 525 a 284).
Los sensorgramas fueron doblemente referenciados y ajustados a un modelo de titulación cinética de Langmuir con transporte de masa 1:1 en el software BIAevaluation versión 4.1.1 (GE Lifesciences, Piscataway, NJ). Los parámetros de cinética y afinidad para varios anticuerpos anti-CD3 de la presente divulgación se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9
Figure imgf000116_0001
Figure imgf000117_0001
Ejemplo 10: Citometría de flujo de anticuerpos biespecíficos humanos anti-CD3 en células B y células T CD8+
Este ejemplo demuestra la eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-CD3-anti-CD20 en células CD20+.
Los estudios con monos Cynomolgus se llevaron a cabo en los Laboratorios Charles River, Preclinical Services Nevada, de acuerdo con el Institutional Animal Care and Use Committee. Los animales (n=2) fueron dosificados mediante inyección intravenosa en bolo con el anticuerpo biespecífico anti-CD20/h2B4 en dosis de 500 ug/kg, 100 ug/kg, 20 ug/kg, 2 ug/kg, 0,2 ug/kg o 0,02 ug/kg. Los animales fueron observados dos veces al día y en cada punto de recogida de sangre. La sangre para la citometría de flujo y el análisis de citoquinas se recolectó en tubos de K2EDTA de un vaso periférico no utilizado para la dosificación i.v.
La eficacia se determinó midiendo las células B y T en la sangre periférica mediante citometría de flujo. Se recolectó sangre total en los momentos indicados y se conservó a 4° C hasta el análisis. Los eritrocitos se lisaron con el tampón ACK (Gibco) durante 5 minutos a temperatura ambiente y los glóbulos blancos se pelaron por centrifugación. Las células se tiñeron durante 1 hora a 4° C con un cóctel que contenía anticuerpos marcados con fluorescencia que reconocían cyno CD19 (Beckman Coulter), CD45, CD4, CD8, Ki67 (BD Biosciences) en PBS 2% FBS. Para el análisis de Ki67, las células se tiñeron primero con CD4 y CD8, y luego se fijaron/permeabilizaron con el kit BD cyotfix/cytoperm (BD Biosciences) según las instrucciones del fabricante antes de la tinción intracelular para Ki67. La adquisición de células en un citómetro de flujo BD LSRII se realizó inmediatamente después de la tinción.
El recuento de células B resultante se graficó como un porcentaje del recuento de células B previo al estudio en las figuras 6A - 6F. La depleción prolongada de células B tras una dosis única se logró con dosis tan bajas como 2 ug/kg. Se observó una disminución de las células B en todas las dosis. La duración del efecto de agotamiento dependió de la dosis.
El recuento de células T CD8+ resultante se graficó como porcentaje del recuento de células T CD8+ previo al estudio en las figuras 7A - 7F. Tras una relocalización inicial, los niveles de células T se restablecieron a los niveles iniciales o superiores durante la duración del estudio.
Ejemplo 11: Citometría de flujo de anticuerpos biespecíficos humanos anti-CD3 en células T CD8+
Este ejemplo demuestra la eficacia del anticuerpo monovalente anti-CD3 en la cinética y activación de las células T.
Se realizaron estudios con monos Cynomolgus y se determinó la eficacia midiendo las células T en la sangre periférica mediante citometría de flujo, como se describe en el Ejemplo 3. Los monos Cynomolgus (n=2) fueron dosificados semanalmente, vía i.v., a razón de 0,2 ug/kg con anti-CD20/h2B4 o NNC (anticuerpo no específico)/ h2B4. En contraste con el anticuerpo biespecífico dirigido a CD20, el NNC/ h2B4 tiene poco o ningún efecto sobre la cinética de las células T CD8+ en la sangre, medida por citometría de flujo. El Ki67 se utilizó como marcador de la activación de las células T.
El recuento de células T resultante se graficó como porcentaje del recuento de células T CD8+ previo al estudio en las figuras 8A y 8B. En los monos cynomolgus a los que se les administró el anticuerpo biespecífico CD20/h2B4, las células T Ki67+ aumentaron y alcanzaron un máximo entre el día 3 y el día 7 después de la dosis, lo que indica una activación de las células T. Sin embargo, en los monos cynomolgus dosificados con NNC/ h2B4, no hubo un aumento de las células T Ki67+.
Ejemplo 12: Citometría de flujo de anticuerpos biespecíficos humanos anti-CD3 en células B
Este ejemplo demuestra el efecto de la afinidad del brazo anti-CD3 en la depleción de células B.
Se realizaron estudios con monos Cynomolgus y se determinó la eficacia midiendo las células T en la sangre periférica mediante citometría de flujo, como se describe en el Ejemplo 10. Los anticuerpos biespecíficos se hicieron con un brazo anti-CD20 emparejado con 4 brazos de anticuerpos anti-CD3 con diferentes afinidades. Tras una dosis única i.v. de 0,2 ug/kg, se determinó la eficacia midiendo las células B en sangre periférica mediante citometría de flujo.
En las Figuras 9A - 9D, el recuento de células B resultante se graficó como un porcentaje del recuento de células B previo al estudio. La eficacia de la depleción de células B se correlaciona con la afinidad del brazo anti-CD3.
Ejemplo 13: Estudio in vitro del anticuerpo biespecífico sobre la eliminación mediada por células T de las células BCMA positivas
Este ejemplo ilustra la citotoxicidad in vitro del biespecífico Anti-BCMA/CD3hIgG2AA en células BCMA positivas.
Los anticuerpos humanos anti-BCMA (P5A2, A02_Rd4_0,6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C16, P5C1, C01_Rd4_6nM_C12, COMBO_Rd4_0,6nM_C22, Combo_Rd4_0.6nM_C29, L3PY/H3TAQ y A02_Rd4_6nM_C01) y los anticuerpos humanos anti-CD3 (H2B4) se expresaron como IgG2dA humanos diseñados con EEEE para el intercambio biespecífico como se describe en el Ejemplo 8.
Las células T CD3+ de PBMC fueron seleccionadas negativamente utilizando el kit de aislamiento de células T Pan, humanas (Miltenyi, San Diego CA). Las células que expresan la diana (KMS12PE, L363 y Molp8) y las células T CD3+ se sembraron en placas transparentes de fondo U a 20000 y 100000 células/pocillo respectivamente. Las células se trataron con anticuerpos biespecíficos diluidos en serie 10 veces por triplicado. La muerte celular se determinó mediante el ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96® (Promega, Madison WI) 20 horas después del tratamiento. La citotoxicidad de las células se determinó como porcentaje de los pocillos efectores no tratados más el control de la diana. La EC50 se calculó con el software Prism. La tabla 10 muestra que todos los anticuerpos biespecíficos humanos anti-BCMA_H2B4 ejercen una actividad de destrucción celular en las células que expresan BCMA.
Tabla 10
Figure imgf000118_0001
Ejemplo 14: Caracterización in vitro del anticuerpo anti-CD3 clonado de hibridoma de ratón
Este ejemplo ilustra la activación/proliferación de células T in vitro del anti-CD3 clonado a partir de un hibridoma de ratón en células PBMC humanas/cynomolgo para el cribado de anticuerpos.
Los anticuerpos humanos anti-CD3 se clonaron a partir de un ratón inmunizado, se expresaron como IgG1 de ratón y se purificaron mediante perlas de afinidad de proteína A. Las células mononucleares de sangre periférica humana/cinomolgo (hu/cyPBMC) se prepararon mediante Ficoll (Densidad: 1,083g/ml, GE) centrifugación en gradiente de densidad a partir de filtros de sangre obtenidos de bancos de sangre locales. Los eritrocitos se eliminaron incubando en tampón LCK (155 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 100 mM EDTA; Gibco) durante 3 minutos a temperatura ambiente. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 600g. El sobrenadante que contenía los eritrocitos lisados se desechó y las PBMC se lavaron dos veces en 50 ml de 1*PBS/1% BSA/1mM EDTA. Las células dispersas se ajustaron a 107 células por ml en un medio de cultivo, X-VIVO-15, libre de suero (Lonza,), y las PBMC se sembraron como 106 (100ul) por pocillo en placas de cultivo de tejidos de fondo redondo de 96 pocillos. Los Abs seleccionados están diluidos en serie 10x de 1000ng a 1ng por ml para mezclar con PBMC humanas y diluidos en serie 5x de 5000ng a 200ng por ml para mezclar con PBMC de cynomolgus. Para el análisis de la proliferación de células T de PBMC mediante la incorporación de 3 H-timidina, se realizaron cultivos de 2 días por triplicado. Durante las últimas 16 horas de cultivo se añadió 3 H-timidina (0,5 mCi/pocillo) y se midió la incorporación. Las células se recogen y lisan, el ADN se captura en un filtro de fibra de vidrio. Radioactividad (cpm) como medida de proliferación mediante recuento en un contador beta de centelleo.
Las Figuras 10A y 10B muestran que los anticuerpos anti-CD3 1A4, 1C10, 2B4 y 7A3 seleccionados tuvieron una lectura de incorporación de timidina en PBMC (células mononucleares de sangre periférica) humanas y de cinomolgo. La Tabla 11 muestra sus Kd por medición de Biacore. La caracterización in vitro muestra que los anticuerpos anti-CD3 1C10 y 2B4 son similares al control positivo SP34 anti-CD3 (BD Biosciences)
Tabla 11 resultados cinéticos anti-xCD3e ab / bsc_hCD3ed para los datos ajustados de 80nM - 0,64nM
Figure imgf000119_0001
Ejemplo 15: Estudio in vitro del anticuerpo biespecífico sobre la muerte mediada por células T
Este ejemplo ilustra la citotoxicidad in vitro del biespecífico anti-EpCam/CD3 en SW480 mezclado con células Pan T aisladas de un donante sano.
A: Anticuerpos anti-CD h2B4-1d, TK, hnpsTK y yaesTK
Los anticuerpos humanos anti-CD3 (h2B4-1d (o h2B4), h2B4-TK (o h2B4-VH-wt VL_TK), h2B4-hnpsTK (o h2B4-VH-hnps VL_TK) y h2B4-yaesTK (o h2B4-VH-yaes VL_TK)) y los anticuerpos humanos anti-EpCam se expresaron como IgG2dA humanos diseñados con RRRR o EEEE para el intercambio biespecífico como se describe en el Ejemplo 8.
El SW480 fue seleccionado como línea celular objetivo para el ensayo de muerte celular y las células efectoras y las células T humanas fueron purificadas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (huPBMC). Las células diana y efectoras se sembraron en placas de fondo redondo de 96 pocillos en un medio de cultivo celular que contenía un 5% de suero fetal bovino (FBS). El número de células objetivo se mantuvo constante en 2 * Í04 células/pocillo. Se añadió por triplicado a las células una dilución en serie de 10 veces del anticuerpo biespecífico, de 3ug a 3pg por ml. El volumen total de reacción fue de 200ul. Las reacciones se incubaron durante 48 y 72 horas. Para el análisis de la citotoxicidad, se midió cuantitativamente la lactato deshidrogenasa (LDH), una enzima citosólica estable que se liberaba en el momento de la lisis celular, mediante el kit CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, G1780). La placa se leyó en un lector cinético de microplacas Vmax (Molecular Devices) a 490 nM. Los valores de densidad óptica se corrigieron para tener en cuenta el fondo del medio y la lisis espontánea de las células diana y efectoras. La citotoxicidad específica se calculó según la siguiente fórmula:
[% lisis específica = 490 nM lectura de muestra - de control mixto E+T)/(490 nM lectura de lisis de T total - de control del medio)x100%]
Las Figuras 11Ay 11B muestran que todos los anticuerpos biespecíficos humanos anti-EpCam_h2B4 tuvieron actividad de eliminación de células en el ajuste in vitro , y la activación de células T mediada por el anticuerpo fue monitorizada por el marcador de activación de células T. La tabla 12A muestra su EC50. La Tabla 12B muestra el Kd de Biacore en el formato de anticuerpos biespecíficos.
Tabla 12A
Figure imgf000120_0001
Tabla 12B Tabla resumen de la cinética de los biespecíficos anti-CD3 hIgG2dA a 37°C
Figure imgf000120_0002
B: Anticuerpos anti-CD m25A8, h25A8-B12 y h25A8-B13
Los anticuerpos humanos anti-CD3 h2B4(h2B4_1d) y h25A8 (m25A8, h25A8-B12, y h25A8-B13) y los anticuerpos humanos anti-EpCam se expresaron como IgG2dA humanos diseñados con RRRR o EEEE para el intercambio biespecífico como se describe en el Ejemplo 8.
Las Figuras 11C y 11D muestran que todos los anticuerpos biespecíficos humanos anti-EpCam_anti-CD3 tenían actividad de eliminación de células en el ajuste in vitro , y la activación de células T mediada por el anticuerpo fue monitorizada por el marcador de activación de células T. La tabla 12C muestra la EC50 de la muerte celular in vitro . La Tabla 12D muestra la cinética de Biacore en el formato de anticuerpos biespecíficos a 37°C. La Tabla 12E muestra la caracterización in vitro mediante SEC-MALS (Cromatografía de Exclusión de Tamaño con Dispersión de Luz Multiángulo) y DSC (Calorimetría Diferencial de Barrido).
a a : e muere ceuar n v ro
Figure imgf000121_0001
Tabla 12D: Tabla resumen de la cinética de los biespecíficos anti-CD3 hIgG2dA a 37°C
Figure imgf000121_0002
Tabla 12E: caracterización in vitro
Figure imgf000121_0003
Ejemplo 16: Estudio in vitro del anticuerpo biespecífico sobre la muerte mediada por células T de muestras de pacientes con mieloma primario.
Este ejemplo ilustra la citotoxicidad in vitro del biespecífico anti-BCMA/CD3 en células primarias de mieloma.
Los anticuerpos humanos anti-BCMA (P5A2, A02_Rd4_0,6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C16, Combo_Rd4_0,6nM_C29, y P6E01 L3PY/H3TAQ) y los anticuerpos humanos anti-CD3 (h2B4) se expresaron como IgG2dA humanos diseñados con EEEE o RRRR para el intercambio biespecífico como se describe en el Ejemplo 8.
Las células mononucleares de médula ósea totales de pacientes con mieloma se sembraron en placas transparentes de fondo en U en números de células mononucleares de médula ósea totales que dieron como resultado 3000-5000 células de mieloma/pocillo. Las células se trataron con anticuerpos biespecíficos diluidos en serie 10 veces. Cinco días después del tratamiento, se determinaron las células viables totales mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos contra CD138 y CD38 (Biolegend, CA). Las células se incubaron con los anticuerpos a 4° en PBS 0,5% FBS durante 30 minutos. Se lavaron las células y se añadió el colorante de viabilidad fijable eFluor 780 (eBioscience, Inc., CA) en PBS a las células durante 30 minutos a 4°. Antes de la adquisición de células en un citómetro de flujo BD, se lavaron las células y se añadieron las cuentas de recuento absoluto CountBright (Molecular Probes, OR). El porcentaje de células vivas se determinó como el recuento de células vivas en los pocillos tratados frente a los no tratados utilizando perlas de recuento. La EC50 se calculó con el software Prism.
La Tabla 13A muestra que todos los anticuerpos biespecíficos humanos anti-BCMA_h2B4 tienen actividad de destrucción celular en muestras de pacientes con mieloma y las células T de los pacientes son células efectoras funcionales. La Tabla 13B muestra la eliminación de un biespecífico anti-BCMAen muestras de pacientes con mieloma múltiple con diferentes relaciones de efector a diana (E:T).
Tabla 13A
Figure imgf000122_0001
Tabla 13B
Figure imgf000122_0002
Ejemplo 17: ELISPOT de células secretoras de anticuerpos de monos cynomolgus administrados con anticuerpos biespecíficos anti-BCMA/CD3
Este ejemplo ilustra el agotamiento de las células secretoras de IgG en el mono cynomolgus con anticuerpos biespecíficos anti-BCMA/CD3.
Los monos Cynomolgus (n=2) fueron dosificados mediante inyección intravenosa en bolo con anticuerpos biespecíficos anti-BCMA_CD3 (h2B4-VH-hnps VL_TK), A02_Rd4_0.6nM_C01/H2B4 y Combo_Rd4_0.6nM_C29/H2B en dos dosis, el día 1 y el día 8, de 100 ug/kg y 300 ug/kg. Los animales fueron observados dos veces al día y en cada punto de recogida de sangre. Se tomaron muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en los días -6, 4 y 10. Las muestras de médula ósea se tomaron el día 10, cuando se realizó la necropsia de los animales.
La sangre se recolectó en tubos de preparación celular Becton Dickinson® CPT™ que contenían heparina sódica y un gradiente de densidad, y luego las PBMC se recolectaron en la interfaz del gradiente tras la centrifugación.
Se recolectó una muestra de médula ósea (de fémur) mediante lavado con aproximadamente 5 ml de suero fetal bovino (FBS) al 100% y luego se prepararon suspensiones de células individuales suspendiendo la médula lavada en 50 ml de tampón.
Las células se contaron utilizando el Cellometer Vision y se ajustaron con medio de cultivo completo RPMI 1640 a una concentración de 5 *10® células por ml para PBMC y 2 *10® células por ml para células de médula ósea. Las células secretoras de IgG totales se enumeraron utilizando el kit ELISpotBASIC de Mabtech (#3850-2HW-Plus). Brevemente, se añadieron PBMC o células de médula ósea a pocillos triplicados a concentraciones específicas (PBMC a 5 *105/pocillo, y células de médula ósea a 2 *105/pocillo), y luego se diluyeron las células en serie en la placa. Tras una incubación de una noche, se lavaron las placas y se añadió un anticuerpo de detección biotinilado. Las placas se incubaron durante 2 horas y se añadió estreptavidina-HRP durante 1 hora. Las manchas de IgG se visualizaron con una solución de sustrato TMB y se contaron con el sistema ImmunoSpot Imaging Analyzer (CTL) y el software ImmunoSpot 5.1. Los datos se expresaron como la media (+/- SD) del número de células secretoras de IgG de muestras triplicadas.
El recuento resultante de células secretoras de IgG en PBMC y en la médula ósea se enumeran en las Tablas 14A y 14B, respectivamente. Se observó un agotamiento de las células secretoras de IgG para ambos anticuerpos biespecíficos anti-BCMA/CD3 en PBMC en comparación con la dosis previa y en la médula ósea en comparación con el vehículo y el control negativo. Se observó un efecto dependiente de la dosis en la médula ósea.
a a
Figure imgf000123_0001
Tabla 14B
Figure imgf000123_0002
Ejemplo 18: Los biespecíficos anti-BCMA/CD3 inducen la regresión e inhibición del tumor en el modelo tumoral MM1.S
Este ejemplo ilustra la regresión e inhibición del tumor en un modelo ortotópico de mieloma MM1.S.
El estudio de eficacia in vivo de los biespecíficos BCMA se realizó con el modelo ortotópico MM1.S, que expresa luciferasa y GFP. Un día antes de la inyección de células tumorales, los ratones fueron irradiados con 100cGy utilizando el irradiador RS 2000 Biological Research (RAD Source Technolgies, GA). Se inyectaron cinco millones de células MM1.S LucGFP por vía intravenosa a través de la vena de la cola en animales hembra Nod/Scid/IL2Rg-/- (NSG) de 6­ 8 semanas de edad. La inyección intraperitoneal de D-luciferina (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200uL por animal a 15mg/ml), seguida de anestesia con isofluorano y la posterior obtención de imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero (BLI) permitieron monitorizar la carga tumoral. Las señales bioluminiscentes emitidas por la interacción entre la luciferasa expresada por las células tumorales y la luciferina se capturaron mediante imágenes utilizando un IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, MA) y se cuantificaron como flujo total (fotones/seg) utilizando Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Cuando el flujo total alcanzó una media de 15E6 para todos los animales, éstos fueron inyectados a través de la vena de la cola en bolo con 20 millones de células T expandidas de PBMC. Brevemente, las células pan-T compradas a AllCells (Alameda, CA) se activaron con el kit de activación/expansión de células T humanas (Miltenyi, San Diego, CA). Después de tres días, se añadieron 15U/ml de IL2 (ebioscience, San Diego, CA) cada dos días hasta el día 11. Se recolectaron las células, se retiraron magnéticamente las perlas de activación/expansión y se lavaron y resuspendieron las células en PBS. Un día después de la inyección de células T, se tomaron imágenes de los ratones como se ha descrito anteriormente y los animales fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de siete ratones; A02_Rd4_0.6nM_C01 a 0,03 mg/kg y 0,3 mg/kg y Combo_Rd4_0.6nM_C29 a 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg y 0,3 mg/kg. Se administró una dosis única de anticuerpo biespecífico humano anti-BCMA/CD3 (h2B4-VH-wt VL_TK) y de control negativo (NNC) mediante una inyección en bolo en la vena de la cola. Los animales fueron sacrificados cuando mostraron parálisis de las extremidades posteriores, un punto final para el modelo ortotópico MM1.S. La figura 12 muestra que una dosis única de anticuerpo biespecífico humano anti-BCMA/CD3 produjo una regresión tumoral de forma dependiente de la dosis.
Ejemplo 19: Dos dosis de anti-BCMA/CD3 biespecíficos inducen la regresión tumoral en un modelo tumoral agresivo Molp8
Este ejemplo ilustra la regresión tumoral con dos dosis de anticuerpos biespecíficos anti-BCMA/CD3 en un modelo de mieloma Molp8 ortotópico.
El estudio de eficacia in vivo de los biespecíficos BCMA se realizó con Molp8, expresando luciferasa y GFP, en un modelo ortotópico. Se inyectaron dos millones de células Molp8 LucGFP por vía intravenosa a través de la vena de la cola en animales hembra NSG de 6-8 semanas de edad. La inyección intraperitoneal de D-luciferina (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200uL por animal a 15mg/ml), seguida de anestesia con isofluorano y la posterior obtención de imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero (BLI) permitieron monitorizar la carga tumoral. Las señales bioluminiscentes emitidas por la interacción entre la luciferasa expresada por las células tumorales y la luciferina se capturaron mediante imágenes utilizando un IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, MA) y se cuantificaron como flujo total (fotones/seg) utilizando Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Cuando el flujo total alcanzó una media de 25E6 para todos los animales fueron distribuidos al azar en tres grupos de siete ratones; 1) Combo_Rd4_0,6nM_C29, 0,3 mg/kg, 2) Combo_Rd4_0,6nM_C29, 0,3 mg/kg, dos dosis y 3) NNC_2B4, 0,3 mg/kg, dos dosis. Los animales fueron inyectados a través de la vena de la cola en bolo con 20 millones de células T expandidas como se describe en el Ejemplo 18. Dos días después de la inyección de células T, los ratones fueron dosificados con anticuerpos biespecíficos. Los animales fueron sacrificados cuando mostraron una pérdida de peso superior al 15%, un punto final para el modelo ortotópico Molp8. La figura 13 muestra que dos dosis del anticuerpo biespecífico humano anti-BCMA/CD3 (h2B4-VH-wt VL_TK) dieron lugar a una mayor regresión del tumor.
Ejemplo 20: Anti-BCMA/CD3 biespecífico en combinación con el tratamiento estándar para el mieloma múltiple en el modelo tumoral ortotópico Molp8
Este ejemplo demuestra que no hay efectos opuestos en los anticuerpos biespecíficos anti-BCMA/CD3 cuando se combinan con bortezomib o lenalidomida y una mejor potencia con los anticuerpos biespecíficos anti-BCMA/CD3 en comparación con bortezomib y lenalidomie combinados.
El estudio de eficacia in vivo de los biespecíficos BCMA se realizó con Molp8, expresando luciferasa y GFP, en un modelo ortotópico. Se inyectaron dos millones de células Molp8 LucGFP por vía intravenosa a través de la vena de la cola en animales hembra NSG de 6-8 semanas de edad. La inyección intraperitoneal de D-luciferina (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200uL por animal a 15mg/ml), seguida de anestesia con isofluorano y la posterior obtención de imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero (BLI) permitieron monitorizar la carga tumoral. Las señales bioluminiscentes emitidas por la interacción entre la luciferasa expresada por las células tumorales y la luciferina se capturaron mediante imágenes utilizando un IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, MA) y se cuantificaron como flujo total (fotones/seg) utilizando Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Los animales fueron inyectados a través de la vena de la cola en bolo el día 7 con 20 millones de células T expandidas como se describe en el Ejemplo 18. Dos días después de la inyección de células T, se tomaron imágenes de los ratones y se distribuyeron al azar en cinco grupos de siete ratones con una media de 17E6 de flujo total por grupo: 1) Combo_Rd4_0,6nM_C29, 0,3 mg/kg, 2) Combo_Rd4_0,6nM_C29, 0,3 mg/kg y 1mg/kg de bortezomib, 3) Combo_Rd4_0,6nM_C29, 0,3 mg/kg y 50 mg/kg de lenalidomida, 4) 1 mg/kg de bortezomib y 50 mg/kg de lenalidomida y 5) vehículo. El anti-BCMA/CD3 (en PBS) se inyectó en bolo en la vena de la cola, el bortezomib (en PBS) se administró por inyección intraperitoneal y la lenalidomida (30% PEG400/5% propilenglicol/0,5% Tween80) por vía oral. El vehículo consistió en un 30% de PEG400/5% de propilenglicol/0,5% de Tween80, que se administró por vía oral. Los animales fueron sacrificados cuando mostraron una pérdida de peso superior al 15%, un punto final para el modelo ortotópico Molp8. La figura 14 muestra que la combinación de un anticuerpo biespecífico anti-BCMA/CD3 (h2B4-VH-hnps VL-TK) con bortezomib o lenalidomida no tuvo un efecto negativo sobre la eficacia del anticuerpo biespecífico anti-BCMA/CD3. En este modelo, el anticuerpo biespecífico anti-BCMA/CD3 solo o en combinación con lenalidomida o bortezomib es más eficaz que la lenalidomida y el bortezomib combinados.
Ejemplo 21: Estudio in vitro del biespecífico anti-BCMA/CD3 en combinación con lenalidomida, carfilzomib o doxorrubicina en la línea celular OPM2
Este ejemplo ilustra que no hay efectos adversos en la función de las células T cuando se combina con carfilzomib, doxorrubicina y lenalidomida para la actividad del anticuerpo biespecífico anti-BCMA/CD3 en comparación con el anticuerpo biespecífico solo.
Las células T CD3+ de PBMC fueron seleccionadas negativamente utilizando el kit de aislamiento de células T Pan, humanas (Miltenyi, San Diego CA). Las células OPM2 y las células T CD3+ se sembraron en placas transparentes con fondo en U, a razón de 20000 y 100000 células/pocillo, respectivamente. Las células T OPM2 y CD3+ se incubaron primero con el estándar de cuidado durante dos horas a 37°. 1.Se diluyeron 56 nM de carfilzomib y 6,25 nM de doxorrubicina en PBS con 0,02% de DMSO. La lenalidomida se diluyó en PBS con 0,1% de DMSO a 195nM. Las células se trataron con anticuerpos biespecíficos diluidos en serie 10 veces. Tres días después del tratamiento, se determinaron las células viables totales mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos contra CD138, CD4 y CD8 (Biolegend). Las células se incubaron con los anticuerpos a 4° en PBS 0,5% FBS durante 30 minutos. Se lavaron las células y se añadió el colorante de viabilidad fijable eFluor 780 (eBioscience, Inc., CA) en PBS a las células durante 30 minutos a 4°. Antes de la adquisición de células en un citómetro de flujo BD, se lavaron las células y se añadieron las cuentas de recuento absoluto CountBright (Molecular Probes, OR). El porcentaje de células vivas se determinó como el recuento de células vivas en los pocillos tratados frente a los no tratados utilizando perlas de recuento. Las figuras 15A, 15B y 15C, respectivamente, muestran que el carfilzomib, la lenalidomida y la doxorrubicina no tienen un efecto negativo sobre la función del anticuerpo biespecífico Combo_Rd4_0.6nM_C29-CD3 (h2B4-VH-hnps VL-TK) en las células OPM2.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo biespecífico en el que el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo humano de longitud completa, que comprende un primer dominio variable de anticuerpo que se une específicamente a CD3 y un segundo dominio variable de anticuerpo que se une específicamente a BCMa , en el que el primer dominio variable de anticuerpo comprende: una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una CDR1 de VH que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 332; (ii) una VH CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 417; y (iii) una VH CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 335; y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende (i) una CDR1 de VL que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 343; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 341; y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 342; y el segundo dominio variable del anticuerpo comprende: una región variable de cadena pesada (VH) que comprende (i) una CDR1 de VH que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 151; (ii) una VH c Dr 2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 159; y (iii) una VH CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 155; y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende (i) una VL CDR1 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 209; (ii) una VL CDR2 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 221; y (iii) una VL CDR3 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 225.
2. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una primera y una segunda regiones constantes humanas IgG2 respectivas que comprenden modificaciones de aminoácidos en las posiciones 223, 225 y 228, o 223 y 228, respectivamente, en la región bisagra, y en la posición 409 o 368 en la región CH3, de acuerdo con el esquema de numeración de la UE.
3. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 2, en el que las regiones constantes comprenden además una modificación de aminoácidos en la posición 265.
4. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4.
6. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4 o el vector de la reivindicación 5.
7. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
8. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o la composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto..
9. El anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 8, en la que el cáncer es un cáncer relacionado con las células B que se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin de predominio linfocítico nodular, enfermedad de Kahler y mielomatosis, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma no Hodgkin de células B (LNH), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico B precursor, leucemia mieloide, macroglobulienemia de Waldenstrom, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de tejido linfático asociado a mucosas, linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma primario de células B grandes del mediastino (tímico), linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células B de la zona marginal nodal, linfoma de la zona marginal esplénica, linfoma de células B grandes intravascular, linfoma de efusión primaria, granulomatosis linfomatoide, linfoma de células B grandes rico en células T/histiocitos, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma difuso de células B grandes primario cutáneo (tipo de pierna), linfoma difuso de células B grandes positivo para el VEB de los ancianos, linfoma difuso de células B grandes asociado con la inflamación, linfoma de células B grandes positivo para ALK, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a h HV8, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Burkitt, linfoma de células B no clasificado con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Hodgkin clásico, y otros linfomas relacionados con las células B.
10. El anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 8 o 9, en la que se inhibe el crecimiento o la progresión del tumor en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA
11. El anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 8 o 9, en la que se inhibe la metástasis de las células malignas que expresan BCMA en un sujeto.
12. El anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 8 o 9, en la que se induce la regresión tumoral en un sujeto que tiene células malignas que expresan BCMA.
13. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso en un procedimiento de tratamiento del mieloma múltiple en un sujeto que lo necesita, en el que el anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica se administran con uno o más agentes terapéuticos.
14. El anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 13, en la que el otro agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en bortezomib, lenalidomida, carfilzomib y doxorrubicina.
ES16714547T 2015-04-13 2016-03-30 Anticuerpos terapéuticos y sus usos Active ES2905315T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562146504P 2015-04-13 2015-04-13
US201562146843P 2015-04-13 2015-04-13
US201662301582P 2016-02-29 2016-02-29
PCT/IB2016/051801 WO2016166629A1 (en) 2015-04-13 2016-03-30 Therapeutic antibodies and their uses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2905315T3 true ES2905315T3 (es) 2022-04-07

Family

ID=55661497

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16714547T Active ES2905315T3 (es) 2015-04-13 2016-03-30 Anticuerpos terapéuticos y sus usos

Country Status (27)

Country Link
US (6) US9969809B2 (es)
EP (3) EP3988117A1 (es)
JP (3) JP6913025B2 (es)
KR (3) KR102405099B1 (es)
CN (3) CN114773476A (es)
AU (3) AU2016248946B2 (es)
BR (1) BR112017019785B1 (es)
CA (4) CA3219665A1 (es)
CO (1) CO2017010495A2 (es)
DK (1) DK3283106T3 (es)
ES (1) ES2905315T3 (es)
HK (1) HK1255385A1 (es)
HU (1) HUE057285T2 (es)
IL (4) IL310723A (es)
MX (3) MX2017013297A (es)
MY (1) MY196625A (es)
PE (3) PE20221262A1 (es)
PH (1) PH12017501732A1 (es)
PL (1) PL3283106T3 (es)
PT (1) PT3283106T (es)
RU (1) RU2722381C2 (es)
SA (1) SA517390140B1 (es)
SG (3) SG10201912819XA (es)
SI (1) SI3283106T1 (es)
TW (3) TWI703157B (es)
WO (1) WO2016166629A1 (es)
ZA (1) ZA201807153B (es)

Families Citing this family (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20171653A1 (es) * 2015-04-13 2017-11-13 Pfizer Receptores del antigeno quimerico dirigidos al antigeno de maduracion de celulas b
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
US10221242B2 (en) 2016-01-21 2019-03-05 Pfizer Inc. Antibodies specific for epidermal growth factor receptor variant III and their uses
CN108778329B (zh) 2016-02-17 2022-09-16 西雅图基因公司 Bcma抗体和其用以治疗癌症和免疫病症的用途
SI3436079T1 (sl) 2016-04-01 2022-01-31 Kite Pharma, Inc. Himerni antigen in T celični receptorji ter način uporabe
CN109414455B (zh) 2016-04-01 2023-01-20 凯德药业股份有限公司 Bcma结合分子及其使用方法
WO2017173384A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Kite Pharma, Inc. Chimeric receptors and methods of use thereof
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
WO2018035710A1 (en) * 2016-08-23 2018-03-01 Akeso Biopharma, Inc. Anti-ctla4 antibodies
EP3577134A1 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
EP3579848A4 (en) 2017-02-08 2021-03-03 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR ACTIVATING NATURAL KILLER CELLS AND THEIR THERAPEUTIC USES FOR TREATING CANCER
JOP20190247A1 (ar) * 2017-04-20 2019-10-20 Lilly Co Eli أجسام بيتا ببتيد النشوانية المضادة لـ N3pGlu واستخداماتها
WO2018201056A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018201051A1 (en) * 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
EP3630841A1 (en) 2017-06-02 2020-04-08 Pfizer Inc. Antibodies specific for flt3 and their uses
WO2018231949A1 (en) * 2017-06-14 2018-12-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. B-cell maturation antigen (bcma)-directed nanoparticles
CN110831965B (zh) 2017-06-21 2023-03-07 吉利德科学公司 靶向hiv gp120和cd3的多特异性抗体
CR20200100A (es) 2017-08-01 2020-05-09 Medimmune Llc Conjugado de anticuerpo monoclonal contra bcma -fármaco
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
JP2020533383A (ja) * 2017-09-14 2020-11-19 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ 癌の組合せ治療
CA3075714A1 (en) * 2017-09-14 2019-03-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
US11447559B2 (en) 2017-09-29 2022-09-20 Mogam Institute For Biomedical Research Anti-BCMA antibody having high affinity for BCMA and pharmaceutical composition for treatment of cancer, comprising same
TWI829655B (zh) 2017-10-18 2024-01-21 瑞士商諾華公司 用於選擇性蛋白質降解的組合物及方法
JP2021502979A (ja) 2017-11-15 2021-02-04 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａターゲティングキメラ抗原受容体、ｃｄ１９ターゲティングキメラ抗原受容体及び併用療法
KR20200096253A (ko) 2017-11-30 2020-08-11 노파르티스 아게 Bcma-표적화 키메라 항원 수용체, 및 이의 용도
CN112218651A (zh) 2018-01-08 2021-01-12 诺华公司 用于与嵌合抗原受体疗法组合的免疫增强rna
US20210038659A1 (en) 2018-01-31 2021-02-11 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
US11377500B2 (en) 2018-02-01 2022-07-05 Pfizer Inc. Antibodies specific for CD70 and their uses
CN116041516A (zh) * 2018-02-01 2023-05-02 信达生物制药(苏州)有限公司 全人源的抗b细胞成熟抗原(bcma)单链抗体及其应用
JP7404247B2 (ja) 2018-02-01 2023-12-25 ファイザー・インク Ｃｄ７０を標的とするキメラ抗原受容体
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
US11401336B2 (en) 2018-02-21 2022-08-02 Celgene Corporation BCMA-binding antibodies and uses thereof
JP7449041B2 (ja) 2018-02-27 2024-03-13 ファイザー・インク 抗体精製
WO2019190969A1 (en) * 2018-03-26 2019-10-03 Sutro Biopharma, Inc. Anti-bcma receptor antibodies, compositions comprising anti bcma receptor antibodies and methods of making and using anti-bcma antibodies
EP4218762A3 (en) 2018-05-23 2023-08-16 Celgene Corporation Antiproliferative compounds and bispecific antibody against bcma and cd3 for combined use
TWI793325B (zh) 2018-05-23 2023-02-21 美商輝瑞大藥廠 對cd3具特異性之抗體及其用途
EP3796983A2 (en) 2018-05-23 2021-03-31 Pfizer Inc. Antibodies specific for gucy2c and uses thereof
AU2019277029C1 (en) 2018-06-01 2024-01-04 Novartis Ag Binding molecules against BCMA and uses thereof
WO2019241426A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2020004937A1 (ko) * 2018-06-26 2020-01-02 주식회사 티에스디라이프사이언스 항-bcma 항체-약물 접합체 및 그 용도
AU2019297451A1 (en) 2018-07-03 2021-01-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
MX2021000488A (es) 2018-07-19 2021-04-12 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-bcma x anti-cd3 biespecificos y usos de estos.
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3844267A2 (en) 2018-08-31 2021-07-07 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
TW202029980A (zh) * 2018-10-26 2020-08-16 美商免疫遺傳股份有限公司 Ｅ ｐ Ｃ Ａ Ｍ 抗體、可活化抗體及免疫偶聯物以及其用途
TW202039544A (zh) * 2018-12-01 2020-11-01 美商艾洛基因醫療公司 靶定ｂ細胞成熟抗原之嵌合抗原受體及其使用之方法
US20220370606A1 (en) 2018-12-21 2022-11-24 Pfizer Inc. Combination Treatments Of Cancer Comprising A TLR Agonist
MY198034A (en) 2018-12-21 2023-07-27 Hoffmann La Roche Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
EP3930763A1 (en) 2019-02-25 2022-01-05 Novartis AG Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
CA3130765A1 (en) * 2019-02-26 2020-09-03 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind bcma
JP2022522654A (ja) 2019-03-01 2022-04-20 アロジーン セラピューティクス，インコーポレイテッド Ｐｄ－１外部ドメインを担持するキメラサイトカイン受容体
WO2020191316A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Novartis Ag Car-t cell therapies with enhanced efficacy
AU2020240132A1 (en) 2019-03-21 2021-09-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination of IL-4/IL-13 pathway inhibitors and plasma cell ablation for treating allergy
EP3953455A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
JP2022538237A (ja) 2019-06-24 2022-09-01 ノバルティス アーゲー Ｂ細胞成熟抗原を標的にする多重特異性抗体のための投与計画及び組み合わせ治療
US11339159B2 (en) 2019-07-17 2022-05-24 Pfizer Inc. Toll-like receptor agonists
KR20220068984A (ko) * 2019-07-30 2022-05-26 상하이 한서 바이오메디컬 컴퍼니 리미티드 항-bcma 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도
JP2022543553A (ja) 2019-07-31 2022-10-13 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｇｐｒｃ５ｄに結合する抗体
JP2022543551A (ja) 2019-07-31 2022-10-13 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｇｐｒｃ５ｄに結合する抗体
CN114502593A (zh) * 2019-08-06 2022-05-13 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 生物药物组合物和相关方法
EP4065158A2 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Novartis AG Chimeric antigen receptors binding bcma and cd19 and uses thereof
JP2023505218A (ja) 2019-12-06 2023-02-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 二重特異性抗ｂｃｍａ×抗ｃｄ３抗体により多発性骨髄腫を治療する方法
IL293926A (en) 2019-12-17 2022-08-01 Pfizer Antibodies unique to d47, pd-l1 and their uses
CN112979807B (zh) * 2019-12-17 2022-07-26 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 Bcma结合抗体及其用途
TW202128176A (zh) 2019-12-18 2021-08-01 美商輝瑞股份有限公司 使用蛋白精胺酸甲基轉移酶５（ｐｒｍｔ５）抑制劑之每日一次癌症治療方案
KR20220012314A (ko) * 2020-01-03 2022-02-03 살루브리스 (청두) 바이오테크 코., 리미티드 Bcma에 결합하는 항체 및 그의 용도
CN111234020B (zh) * 2020-01-23 2020-10-23 和铂医药(苏州)有限公司 一种bcma结合蛋白及其制备方法和应用
IL295470A (en) * 2020-02-24 2022-10-01 Allogene Therapeutics Inc bcma car-t cells with enhanced activities
CA3173394A1 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP4110377A2 (en) 2020-02-27 2023-01-04 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP4114852A1 (en) * 2020-03-03 2023-01-11 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific glutamine tags, methods of their preparation and methods of their use
WO2021181233A2 (en) 2020-03-09 2021-09-16 Pfizer Inc. Fusion proteins and uses thereof
CN115279781A (zh) * 2020-03-26 2022-11-01 上海翰森生物医药科技有限公司 抗体药物偶联物及其医药用途
CA3182697A1 (en) * 2020-05-11 2021-11-18 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma
CN111808191A (zh) * 2020-05-11 2020-10-23 廊坊天光生物技术有限公司 一种用于检测血清中vegf含量的抗体对及其用途
KR20230008197A (ko) 2020-05-13 2023-01-13 화이자 인코포레이티드 암을 치료하기 위한 방법, 요법 및 용도
EP4165169A1 (en) 2020-06-11 2023-04-19 Novartis AG Zbtb32 inhibitors and uses thereof
TW202216779A (zh) 2020-07-17 2022-05-01 美商輝瑞股份有限公司 治療性抗體類和彼等之用途
WO2022040586A2 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Novartis Ag Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
US20230340137A1 (en) 2020-09-14 2023-10-26 Pfizer Inc. Methods, therapies and uses for treating cancer
WO2022097090A1 (en) 2020-11-05 2022-05-12 Novartis Ag Dosing regimen for combination therapies with multispecific antibodies targeting b-cell maturation antigen and gamma secretase inhibitors
WO2022153161A1 (en) 2021-01-14 2022-07-21 Pfizer Inc. Treatment of cancer using a prmt5 inhibitor
WO2022165171A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating cytokine release syndrome
WO2022177676A1 (en) * 2021-02-16 2022-08-25 City Of Hope Anti-domain iv egfr antibodies and uses thereof
BR112023020832A2 (pt) 2021-04-08 2023-12-19 Marengo Therapeutics Inc Moléculas multifuncionais ligadas a tcr e seus usos
CN113358546A (zh) * 2021-04-21 2021-09-07 贵州安康医学检验中心有限公司 一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法
TW202309294A (zh) 2021-04-27 2023-03-01 瑞士商諾華公司 病毒載體生產系統
US11931420B2 (en) 2021-04-30 2024-03-19 Celgene Corporation Combination therapies using an anti-BCMA antibody drug conjugate (ADC) in combination with a gamma secretase inhibitor (GSI)
WO2023010068A2 (en) * 2021-07-28 2023-02-02 Cartesian Therapeutics, Inc. Multiprotein-engineered cells secreting a multispecific antibody
CA3228311A1 (en) 2021-08-12 2023-02-16 Ke HE Bispecific recombinant protein and use thereof
CA3229746A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2023028612A2 (en) 2021-08-27 2023-03-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-tslpr (crlf2) antibodies
WO2023049922A1 (en) * 2021-09-27 2023-03-30 Xencor, Inc. B-cell maturation antigen (bcma) binding domain compositions
TW202336034A (zh) * 2021-10-29 2023-09-16 美商美國禮來大藥廠 靶向介白素-34之化合物及方法
WO2023166420A1 (en) 2022-03-03 2023-09-07 Pfizer Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
US20230357446A1 (en) 2022-04-11 2023-11-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing
WO2023218320A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. Anti-lymphotoxin beta receptor antibodies and methods of use thereof
WO2023242769A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 Pfizer Inc. Il-12 variants, anti-pd1 antibodies, fusion proteins, and uses thereof
WO2024003773A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Pfizer Inc. 2,7-naphthyridine compounds as mastl inhibitors
WO2024009191A1 (en) 2022-07-05 2024-01-11 Pfizer Inc. Pyrido[4,3-d]pyrimidine compounds
WO2024074977A1 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Pfizer Inc. Substituted 1 h-pyrazolo-pyridine and-pyrimidine compounds

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901464A (fr) 1943-01-23 1945-07-27 Boehringer & Soehne Gmbh Procédé d'obtention de vanilline
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8702816D0 (en) 1987-02-07 1987-03-11 Al Sumidaie A M K Obtaining retrovirus-containing fraction
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
US5422120A (en) 1988-05-30 1995-06-06 Depotech Corporation Heterovesicular liposomes
AP129A (en) 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO1990007936A1 (en) 1989-01-23 1990-07-26 Chiron Corporation Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
US6673776B1 (en) 1989-03-21 2004-01-06 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human
ES2200016T3 (es) 1989-03-21 2004-03-01 Vical Incorporated Expresion de secuencias polinucleotidicas exogenas en un vertebrado.
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
EP1001032A3 (en) 1989-08-18 2005-02-23 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
NZ237464A (en) 1990-03-21 1995-02-24 Depotech Corp Liposomes with at least two separate chambers encapsulating two separate biologically active substances
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
JPH06500011A (ja) 1990-06-29 1994-01-06 ラージ　スケール　バイオロジー　コーポレイション 形質転換された微生物によるメラニンの製造
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5278299A (en) 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
JP3534749B2 (ja) 1991-08-20 2004-06-07 アメリカ合衆国 アデノウイルスが介在する胃腸管への遺伝子の輸送
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
WO1993010218A1 (en) 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
WO1993010260A1 (en) 1991-11-21 1993-05-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
GB9125623D0 (en) 1991-12-02 1992-01-29 Dynal As Cell modification
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
JPH07507689A (ja) 1992-06-08 1995-08-31 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 特定組織のターゲティング方法及び組成物
WO1993025698A1 (en) 1992-06-10 1993-12-23 The United States Government As Represented By The Vector particles resistant to inactivation by human serum
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
ATE149570T1 (de) 1992-08-17 1997-03-15 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
US5837821A (en) 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
US6210671B1 (en) 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
AU680459B2 (en) 1992-12-03 1997-07-31 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
US5981568A (en) 1993-01-28 1999-11-09 Neorx Corporation Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells
WO1994023697A1 (en) 1993-04-22 1994-10-27 Depotech Corporation Cyclodextrin liposomes encapsulating pharmacologic compounds and methods for their use
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
ES2249761T3 (es) 1993-06-24 2006-04-01 Advec Inc. Vectores de adenovirus para terapia genica.
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
CA2523216C (en) 1993-09-15 2010-11-16 Chiron Corporation Recombinant alphavirus vectors
DK0797676T3 (da) 1993-10-25 2006-04-18 Canji Inc Rekombinant adenoviral vektor og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CA2176712C (en) 1993-11-16 2000-05-23 Mantripragada Sankaram Synthetic membrane vesicles with controlled release of encapsulated biologically active substances
US6436908B1 (en) 1995-05-30 2002-08-20 Duke University Use of exogenous β-adrenergic receptor and β-adrenergic receptor kinase gene constructs to enhance myocardial function
DE69535669T2 (de) 1994-05-09 2008-12-04 Oxford Biomedica (Uk) Ltd. Retrovirale vektoren mit verminderter rekombinationsrate
WO1996017072A2 (en) 1994-11-30 1996-06-06 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
ATE424463T1 (de) 1996-05-06 2009-03-15 Oxford Biomedica Ltd Rekombinationsunfähige retrovirale vektoren
US6376471B1 (en) 1997-10-10 2002-04-23 Johns Hopkins University Gene delivery compositions and methods
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU3734900A (en) 1999-03-09 2000-09-28 University Of Southern California Method of promoting myocyte proliferation and myocardial tissue repair
DK1210425T4 (en) * 1999-08-17 2015-08-10 Apotech R & D Sa BAFF receptor (BCMA), an immunoregulatory agent
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
AU2003221256A1 (en) 2002-02-21 2003-09-09 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
AU2003232456B2 (en) * 2002-05-30 2009-06-04 Macrogenics, Inc. CD16A binding proteins and use for the treatment of immune disorders
PT1575517E (pt) 2002-12-24 2012-05-28 Rinat Neuroscience Corp Anticorpos anti-ngf e métodos de utilização dos mesmos
EP1871417B1 (en) 2005-04-15 2013-09-11 Precision Biologics, Inc. Recombinant monoclonal antibodies and corresponding antigens for colon and pancreatic cancers
CN104877026B (zh) * 2009-03-10 2019-10-25 比奥根Ma公司 抗-bcma抗体
EP2496686A1 (en) 2009-11-04 2012-09-12 DSM IP Assets B.V. Talaromyces transformants
US9527926B2 (en) * 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
CA2813411C (en) 2010-11-05 2016-08-02 Rinat Neuroscience Corporation Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
EP3974453A3 (en) * 2010-11-16 2022-08-03 Amgen Inc. Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
US20130101599A1 (en) * 2011-04-21 2013-04-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bcma-based stratification and therapy for multiple myeloma patients
PT3415531T (pt) * 2011-05-27 2023-09-12 Glaxo Group Ltd Proteínas de ligação a bcma (cd269/tnfrsf17
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
SI2780039T1 (en) 2011-11-17 2018-06-29 Pfizer Inc. Cytotoxic peptides and their conjugates between the antibody and the drug
CA2869562C (en) 2012-04-11 2023-09-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
EP2839019A4 (en) 2012-04-20 2016-03-30 Emergent Product Dev Seattle CD3-BINDING POLYPEPTIDES
US10189906B2 (en) 2012-11-01 2019-01-29 Max-Delrück-Centrum Für Molekulare Medizin Antibody that binds CD269 (BCMA) suitable for use in the treatment of plasma cell diseases such as multiple myeloma and autoimmune diseases
TW201425336A (zh) * 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
US9243058B2 (en) 2012-12-07 2016-01-26 Amgen, Inc. BCMA antigen binding proteins
EP2762497A1 (en) * 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
JP6636803B2 (ja) * 2013-02-05 2020-01-29 エンクマフ エスアーエールエル Ｂｃｍａに対する抗体の選択のための方法
AR095374A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res (Munich) Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
US10195289B2 (en) 2013-07-31 2019-02-05 Rinat Neuroscience Corp. Engineered polypeptide conjugates using transglutaminase
GB201317928D0 (en) 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Molecule
DK3083689T3 (da) * 2013-12-17 2020-08-03 Genentech Inc Anti-CD3-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse
US10144782B2 (en) 2014-04-30 2018-12-04 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin In Der Helmholtz-Gemeinschaft Humanized antibodies against CD269 (BCMA)
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3029068A1 (en) 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
PE20171653A1 (es) 2015-04-13 2017-11-13 Pfizer Receptores del antigeno quimerico dirigidos al antigeno de maduracion de celulas b

Also Published As

Publication number Publication date
CN108136002A (zh) 2018-06-08
AU2016248946B2 (en) 2022-03-10
CA3219684A1 (en) 2016-10-13
ZA201807153B (en) 2022-08-31
EP4234581A3 (en) 2023-10-04
TWI787645B (zh) 2022-12-21
PH12017501732A1 (en) 2018-04-02
RU2017133826A3 (es) 2019-05-13
EP3283106A1 (en) 2018-02-21
EP4234581A2 (en) 2023-08-30
US10040860B2 (en) 2018-08-07
JP2023109898A (ja) 2023-08-08
TW201706311A (zh) 2017-02-16
HUE057285T2 (hu) 2022-04-28
IL254219A0 (en) 2017-10-31
CO2017010495A2 (es) 2018-01-05
SG10201912819XA (en) 2020-02-27
IL254219B (en) 2022-03-01
TW202115120A (zh) 2021-04-16
US11155630B2 (en) 2021-10-26
SI3283106T1 (sl) 2022-04-29
KR102110557B1 (ko) 2020-05-15
IL290488A (en) 2022-04-01
KR102405099B1 (ko) 2022-06-07
MX2022001830A (es) 2022-03-17
CA3219680A1 (en) 2016-10-13
KR102405104B1 (ko) 2022-06-07
RU2017133826A (ru) 2019-05-13
DK3283106T3 (da) 2022-01-10
EP3283106B1 (en) 2021-12-22
IL290488B1 (en) 2024-03-01
AU2022203620A1 (en) 2022-06-16
US20160297885A1 (en) 2016-10-13
BR112017019785B1 (pt) 2022-11-16
IL310723A (en) 2024-04-01
US10793635B2 (en) 2020-10-06
CA2925329C (en) 2024-01-02
SA517390140B1 (ar) 2021-11-24
PE20180046A1 (es) 2018-01-15
KR20170131699A (ko) 2017-11-29
TW201811833A (zh) 2018-04-01
US9969809B2 (en) 2018-05-15
US20210054087A1 (en) 2021-02-25
SG11201707192XA (en) 2017-10-30
CN108136002B (zh) 2022-05-31
JP2021169486A (ja) 2021-10-28
US20240018252A1 (en) 2024-01-18
US20180171018A1 (en) 2018-06-21
BR112017019785A2 (pt) 2018-05-22
CN114874331A (zh) 2022-08-09
MY196625A (en) 2023-04-23
AU2022203601A1 (en) 2022-06-16
JP6913025B2 (ja) 2021-08-04
US20210188991A1 (en) 2021-06-24
MX2022001831A (es) 2022-03-17
CN114773476A (zh) 2022-07-22
KR20200053641A (ko) 2020-05-18
TWI703159B (zh) 2020-09-01
AU2016248946A1 (en) 2017-09-21
EP3988117A1 (en) 2022-04-27
RU2722381C2 (ru) 2020-05-29
TWI703157B (zh) 2020-09-01
US20180298108A1 (en) 2018-10-18
WO2016166629A1 (en) 2016-10-20
PE20221580A1 (es) 2022-10-06
CA2925329A1 (en) 2016-10-13
CA3219665A1 (en) 2016-10-13
MX2017013297A (es) 2018-06-19
HK1255385A1 (zh) 2019-08-16
JP2018516068A (ja) 2018-06-21
PL3283106T3 (pl) 2022-05-02
US11814435B2 (en) 2023-11-14
IL290496A (en) 2022-04-01
SG10201912823PA (en) 2020-02-27
PE20221262A1 (es) 2022-08-16
PT3283106T (pt) 2022-02-02
KR20200053642A (ko) 2020-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2905315T3 (es) Anticuerpos terapéuticos y sus usos
ES2904593T3 (es) Anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos para la variante III del receptor del factor de crecimiento epidérmico y CD3 y sus usos
TW201333036A (zh) 營養層細胞表面抗原（Ｔｒｏｐ－２）之專一性抗體類及彼等之用途