KR20210105344A - 암 치료용 물질 및 방법 - Google Patents

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KR20210105344A
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cell
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카메론 듀런트
데일 채플
사드 제이. 켄데리안
로잘리 엠. 스터너
미셸 제이. 콕스
레오나 세이크무라
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휴머니건, 아이엔씨.
메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치
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Abstract

본 발명은 암 치료와 관련된 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들어, GM-CSF의 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포는 제공한다. 또한, GM-CSF 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 및 이용 방법을 제공한다.

Description

암 치료용 물질 및 방법
본원은 암 치료에 관여하는 방법 및 물질에 관한 것이다. 예를 들어, 본원은 암에 걸린 포유류 (예, 인간)를 치료하기 위한 입양 세포 요법 (예, 키메라 항원 수용체 T 세포 요법)에서 하나 이상의 사이토카인 (예, GM-CSF)의 발현 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포를 이용하는 방법 및 물질을 제공한다.
CD19 특이적인 키메라 항원 수용체 T 세포 (CART19)의 안전성과 효능을 평가하는 중심적인 시험으로부터 도출된 전례없는 결과들로, 최근 FDA로부터 재발성 난치성 급성 림프모구성 백혈병 (ALL)에 대해 CART19 (Tisagenlecleucel)가, 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL)에 대해 CART19 (Axi-Cel)가 승인받게 되었다. CAR-T 세포 요법의 이용은 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 및 신경독성을 일으키는 독성과 관련있다. 또한, CAR-T 세포 요법의 효과는 림프종에서 불과 영구적인 관해 40%, 급성 백혈병에서 영구적인 관해 50-60%로 제한적이다.
본원은 하나 이상의 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF) 폴리펩타이드의 발현 수준이 저하된 T 세포 (예를 들어, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 (CART))를 구축하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들어, T 세포 (예를 들어, CART)는 (예를 들어, 입양 세포 요법에 이용하기 위해) GM-CSF 폴리펩타이드 발현이 저하되도록 조작할 수 있다. 일부 경우에, T 세포 (예를 들어, CART)는 하나 이상의 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)를 코딩하는 핵산을 넉아웃 (KO)하도록 조작하여, T 세포에서 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드) 발현을 감소시킬 수 있다. 본원은 또한 하나 이상의 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준이 저하된 T 세포 (예를 들어, CART)를 이용하는 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드의 발현이 저하된 T 세포 (예를 들어, CART)는 포유류를 치료하기 위해 암에 걸린 포유류에 (예, 입양 세포 요법에서) 투여할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, GM- CSF 유전자 불활성화, GM- CSF 유전자 넉다운 또는 유전자 넉아웃 (GM- CSF k /o CAR-T 세포)을 포함하는 CAR-T 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하고, CAR-T 세포의 투여가 면역요법-관련 독성을 낮추거나 또는 방지하는, 면역요법의 항-종양 효과를 강화하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, GM- CSF 유전자 불활성화, GM- CSF 유전자 넉다운 또는 유전자 넉아웃 (GM-CSFk /o CAR-T 세포)을 포함하는 CAR-T 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역요법으로 치료된 개체에서 non-GM-CSF 사이토카인의 수준을 낮추는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은, 표적화된 게놈 편집 또는 GM-CSF 유전자 침묵화를 포함하는, 세포에서 GM- CSF 유전자 불활성화, GM- CSF 유전자 넉다운 또는 GM- CSF 넉아웃 (KO)을 수행하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은, 핵산 구조체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 핵산 구조체가 a) 가이드 RNA를 코딩하는 핵산으로서, 가이드 RNA가 GM-CSF 메신저 RNA에 상보적인, 핵산; b) Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산; 및 c) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩타이드의 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 복합체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계; 및 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하고, 복합체가 a) GM-CSF 메신저 RNA에 상보적인 가이드 RNA; 및 b) Cas 뉴클레아제를 포함하는, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩타이드의 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은, 핵산 구조체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 핵산 구조체가 a) 가이드 RNA를 코딩하는 핵산으로서, 가이드 RNA가 사이토카인 메신저 RNA에 상보적인, 핵산; b) Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 및 c) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는, 사이토카인 폴리펩타이드의 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 복합체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계; 및 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하고, 복합체가 a) 사이토카인 메신저 RNA에 상보적인 가이드 RNA; 및 b) Cas 뉴클레아제를 포함하는, 사이토카인 폴리펩타이드의 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, a) 가이드 RNA를 코딩하는 핵산으로서, 가이드 RNA가 GM-CSF 메신저 RNA에 상보적인, 핵산; b) Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산; 및 c) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 구조체를, 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체 T 세포의 T 세포 작동자 기능을 개선하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은, a) GM-CSF 메신저 RNA에 상보적인 가이드 RNA; 및 b) Cas 뉴클레아제를 포함하는 복합체를, 생체외 T 세포에 도입하는 단계; 및 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체 T 세포의 T 세포 작동자 기능을 개선하는 방법을 제공한다.
본원에서 입증된 바와 같이, GM-CSF KO CART는 시험관내 및 생체내 모델 둘다에서 GM-CSF를 감소된 수준으로 생산되며, 정상적으로 계속 기능한다. 또한, 본원에서 입증된 바와 같이, GM-CSF KO CART는 강화된 CAR-T 세포 기능 및 항-종양 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 강화된 CAR-T 세포 증식 및 항-종양 활성은 GM-CSF 고갈 후 관찰할 수 있다. 단핵구의 존재 하의 CART19 항원 특이적인 증식은 GM-CSF 고갈 후 시험관내에서 증가할 수 있다. ALL 환자 유래 이종이식에서, CART19 세포는, 렌질루맵과 조합할 경우, 보다 지속적인 질환 제어를 달성할 수 있으며, GM-CSFk /o CAR-T 세포는 NALM6 이종이식에서 백혈병을 제어하는데 보다 효과적일 수 있다. 일부 경우에, GM-CSF KO CART는 입양 T 세포 요법 (예, CAR-T 세포 요법)에 통합하여, 예를 들어 암에 걸린 포유류를 CRS 및/또는 신경독성을 유발하지 않으면서 치료할 수 있다. 예를 들어, GM-CSF KO CART는 입양 T 세포 요법 (예, CAR-T 세포 요법)에 통합하여 CAR-T 세포 요법 후 치료학적 범위를 강화할 수 있다. 일부 경우에, 단일 구조체를 이용해, CAR을 세포 (예, T 세포)에 도입하고, 동일 세포에서 하나 이상의 사이토카인 폴리펩타이드의 발현을 감소시키거나 또는 넉아웃시킬 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩타이드의 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포를 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 포유류를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 사이토카인 폴리펩타이드의 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포를 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 포유류를 치료하는 방법을 제공한다.
일반적으로, 본원의 일 측면은 사이토카인 폴리펩타이드의 수준이 저하된 CAR-T 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 핵산 구조체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있으며, 이때 핵산 구조체는 a) 사이토카인 메신저 RNA (mRNA)에 상보적인 가이드 RNA (gRNA)를 코딩하는 핵산; b) Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 및 c) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함한다. 사이토카인 폴리펩타이드는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩타이드, 인터루킨 6 (IL-6) 폴리펩타이드, IL-1 폴리펩타이드, M-CSF 폴리펩타이드 및/또는 MIP-lB 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 사이토카인 폴리펩타이드는 GM-CSF 폴리펩타이드일 수 있으며, gRNA는 서열번호 1에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제일 수 있다. CAR을 코딩하는 핵산은 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 핵산 구조체는 바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)일 수 있다. CAR은 종양-관련 항원 (예를 들어, CD19)을 표적화할 수 있다. 도입하는 단계는 형질도입을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본원은 사이토카인 폴리펩타이드의 수준이 저하된 CAR-T 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 복합체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계; 및 CAR을 코딩하는 핵산을 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있으며, 여기서 복합체는 a) 사이토카인 mRNA에 상보적인 gRNA; 및 b) Cas 뉴클레아제를 포함한다. 사이토카인 폴리펩타이드는 GM-CSF 폴리펩타이드 및/또는 IL-6 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 사이토카인 폴리펩타이드는 GM-CSF 폴리펩타이드일 수 있으며, gRNA는 서열번호 1에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제일 수 있다. CAR을 코딩하는 핵산은 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 복합체는 리보핵산단백질 (RNP)일 수 있다. CAR은 종양-관련 항원 (예를 들어, CD19)을 표적화한다. 도입하는 단계는 전기천공 (electroporation)을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본원은 GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 CAR-T 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 이 방법은 핵산 구조체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있으며, 이때 핵산 구조체는 a) GM-CSF mRNA에 상보적인 gRNA를 코딩하는 핵산; b) Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 및 c) CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. gRNA는 서열번호 1에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제일 수 있다. CAR을 코딩하는 핵산은 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 핵산 구조체는 바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)일 수 있다. CAR은 종양-관련 항원 (예를 들어, CD19)을 표적화할 수 있다. 도입하는 단계는 형질도입을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본원은 GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 CAR T 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 이 방법은 복합체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계; 및 CAR을 코딩하는 핵산을 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있으며, 이때 복합체는 a) GM-CSF mRNA에 상보적인 gRNA; 및 b) Cas 뉴클레아제를 포함한다. gRNA는 서열번호 1에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제일 수 있다. CAR을 코딩하는 핵산은 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 복합체는 RNP일 수 있다. CAR은 종양-관련 항원 (예를 들어, CD19)을 표적화할 수 있다. 도입하는 단계는 전기천공을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본원은 암에 걸린 포유류를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 사이토카인 폴리펩타이드의 수준이 저하된 CAR-T 세포를 암에 걸린 포유류에 투여하는 단계를 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있다. 사이토카인 폴리펩타이드는 GM-CSF 폴리펩타이드 및/또는 IL-6 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 사이토카인 폴리펩타이드는 GM-CSF 폴리펩타이드일 수 있으며, gRNA는 서열번호 1에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 포유류는 인간일 수 있다. 암은 림프종 (예를 들어, DLBCL)일 수 있다. 암은 백혈병 (예를 들어, ALL)일 수 있다. CAR은 종양-관련 항원 (예를 들어, CD19)을 표적화할 수 있다.
다른 측면에서, 본원은 암에 걸린 포유류를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 CAR T 세포를 암에 걸린 포유류에 투여하는 단계를 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있다. 포유류는 인간일 수 있다. 암은 림프종 (예를 들어, DLBCL)일 수 있다. 암은 백혈병 (예를 들어, ALL)일 수 있다. CAR은 종양-관련 항원 (예를 들어, CD19)을 표적화할 수 있다.
달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 바와 비슷하거나 또는 등가의 방법 및 물질을 사용해 본 발명을 실시할 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 아래에 기술한다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 비롯해 본원의 내용을 따를 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예들은 예시하기 위한 것일 뿐 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에 대한 상세 내용은 첨부된 도면과 후술한 설명에 기술된다. 본 발명의 기타 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면으로부터, 청구항으로부터 명확해질 것이다.
도 1은 CRISPR을 이용해 GM-CSF 넉아웃 (KO) 세포를 조작하는 예시적인 방법에 대한 도표를 포함한다. GM-CSF (콜로니-자극 인자 2 (CSF2)라고도 함)의 엑손 3를 표적화하는 가이드 RNA (GACCTGCCTACAGACCCGCC; 서열번호 1)를 합성하여, 렌티바이러스 (LV) 플라스미드에 클로닝하였다. 이 LV 플라스미드를 이용해 293T 세포에 형질도입하고, 24시간 후 렌티바이러스 입자를 수집하여 농축하였다. GM-CSF 넉아웃 CAR-T 세포를 구축하기 위해, T 세포를 0일에 CD3/CD28 비드로 자극하였다. 1일차에, T 세포에 CAR19 렌티바이러스 입자를 형질도입하였으며, 동시에 GM-CSF 넉아웃 CRISPR/Cas9 렌티바이러스 입자를 형질도입하였다. T 세포는 8일간 증폭시킨 후 회수하였다.
도 2A-2B는 CAR 형질도입 및 GM-CSF 넉아웃 효율을 보여준다. 도 2A는 CRISPR/Cas9 렌티바이러스가 GM-CSF의 엑손 3를 겨냥하는 가이드 RNA와 함께 24.1%의 넉아웃 효율을 달성함을 보여주는 그래프가 수록되어 있다. 증폭 종료시, CAR-T 세포를 회수해 DNA를 단리하고, 대조군 서열과 비교하기 위해 서열분석을 의뢰하였다. 넉아웃 효율 24.1%가 달성되었다. 도 2B는 렌타바이러스를 이용한 형질도입 후 CAR 형질도입 효율이 73%임을 보여주는 유세포 측정 분석 결과를 포함한다. 유세포 측정 분석은 렌티바이러스 형질도입 후 6일차에 수행하였다.
도 3은 GM-CSF KO CART19 세포가 CAR-T 세포와 비교해 GM-CSF를 더 적게 생산하고, GM-CSF 넉아웃 대조군 T 세포가 형질도입되지 않은 대조군 T 세포 (UTD)와 비교해 GM-CSF를 더 적게 생산함을 보여준다. CART19, GM-CSF KO CART19, UTD 또는 GM-CSF KO UTD는 CD19 양성 세포주 NALM6와 1:5의 비율로 공동-배양하였다. 4시간 후, 세포를 회수하여 투과화 및 고정한 다음 세포내 사이토카인 염색을 수행하였다.
도 4는 GM-CSF KO CART19 세포가 CART19와 비교해 더 활발하게 증폭함을 보여준다. T 세포에 바이러스로 형질도입한 후, 증폭 카이네틱스를 추적하였다. GM-CSF KO는 CART19 단독과 비교해 더 활발하게 증폭한다.
도 5는 CD19 (CAR19)을 표적화하는 CAR을 코딩하는 핵산 서열의 예 (서열번호 2)를 보여준다.
도 6A-6D는 GM-CSF 중화가 시험관내에서 단핵구의 존재 하에 CAR-T 세포 증식을 강화하고 CAR-T 세포 작동자 기능을 손상시키지 않는다는 것을 보여준다. 도 6A는, 배지 단독에서 CART19 또는 NALM6와 공동-배양한 CART19을 3일 배양한 후 멀티플렉스에 의해 분석한, 렌지루맵이 이소형 대조군 처리와 비교해 시험관내에서 CAR-T 세포에 의해 생산된 GM-CSF를 중화함을 보여주는 그래프를 포함한다 (실험 n=2, 실험 당 2세트, 대표적인 실험을 도시함, *** 렌질루맵과 이소형 대조군 처리 간의 p<0.001, T-검정, 평균 ± SEM). 도 6B는, CD3 생 세포의 CSFE 유세포 측정 증식 분석에 의해 측정한 바에 따른, GM-CSF 중화 항체 처리가 CAR-T 세포의 증식 능력을 저해하지 않음을 보여주는 그래프를 포함한다 (실험 n=2, 실험 당 2세트, 3일 시점의 대표적인 실험을 도시함, 렌질루맵과 이소형 대조군 처리 간의 ns p>0.05, T-검정, 평균 ± SEM. 단독: 배지 단독 중의 CART19, MOLM13: CART19 + MOLM13, PMA/ION: CART19 + 5 ng/mL PMA/0.1 ㎍/mL ION, NALM6: CART19 + NALM6). 도 6C는, 렌질루맵이 단핵구와 공동-배양할 경우 CART19 처리된 이소형 대조군과 비교해 CART19의 증식을 강화함을 보여주는 그래프를 포함한다 (3일 시점에 생물학적 레플리케이트 n=3, 생물학적 레플리케이트 당 2세트, **** p<0.0001, 평균 ± SEM). 도 6D는 렌질루맵 처리가 NALM6와 함께 배양하였을 때 CART19 또는 비-형질도입 T 세포 (UTD)의 세포독성을 저해하지 않았음을 보여주는 그래프를 포함한다 (실험 n=2, 실험 당 2세트, 48시간 시점의 대표적인 실험을 도시함, 렌질루맵과 이소형 대조군 처리 간의 ns p>0.05, T-검정, 평균 ± SEM).
도 7A-7E는 GM-CSF 중화가 생체내에서 이종이식 모델에서 CAR-T 세포의 항-종양 활성을 강화함을 보여준다. 도 7A는 실험 개요를 포함한다: NSG 마우스에 CD19+ 루시퍼라제+ 세포주 NALM6 (마우스 당 세포 1x106주, I.V)를 주사하였다. 4-6일 후, 마우스의 이미지를 촬영하고, 무작위 분할한 다음 다음날 렌질루맵 또는 대조군 IgG와 함께 1-1.5x106 CAR-T19 또는 동일한 수의 대조군 UTD 세포를 총수로 투여하였다 (10 mg/kg, CAR-T 주사 당일부터 10일간 매일 IP 투여). CAR-T 세포 주입 후 7일째부터 질병 부담을 평가하기 위해 마우스에서 연속적인 생물발광 이미지 촬영을 수행하고, 전체 생존율을 추적하였다. CAR-T 세포 주입 후 7-8일차에 꼬리 정맥으로부터 채혈하였다. 도 7B는 렌질루맵이 GM-CSF 싱글플렉스 (singleplex)에 의해 분석된 바와 같이 이소형 대조군 처리와 비교해 생체내 CAR-T에 의해 생산된 혈청내 GM-CSF를 중화함을 보여주는 그래프를 포함한다 (실험 n=2, 마우스 7-8마리/군, 대표적인 실험, CAR-T 세포/UTD 주사 후 8일차부터의 혈청, 렌질루맵과 이소타입 대조군 처리 간의 *** p<0.001, T-검정, 평균 ± SEM). 도 7C는, 렌질루맵 처리된 CAR-T가, 종양 부담이 높은 재발성 이종이식 ALL 모델에서 이소형 대조군 처리된 CAR-T와 비교해, 생체내에서 종양 부담을 제어하는데 동일하게 효과적임을 보여주는 그래프를 포함한다 (CAR-T 주사 후 7일, 실험 n=2, 마우스 7-8마리/군, 대표적인 실험을 도시함, *** p<0.001, * p<0.05, ns p>0.05, T-검정, 평균 ± SEM). 도 7D는 NSG 마우스에 ALL 환자로부터 유래한 모세포 (blast)를 주사 (마우스 당 세포 1x106주, I.V)하는 것을 도시한 실험 개요를 포함한다. 마우스에서 연속 채혈하고, CD19+ 세포가 >1/㎕이 되면 마우스를 무작위 할당하여 렌질루맵 또는 대조군 IgG와 함께 5x106 CART19 (형질도입 효율 약 50%) 또는 UTD 세포를 투여하였다 (10 mg/kg, CAR-T 주사 당일부터 시작해 10일간 매일 IP 투여). CAR-T 세포 주입 후 14일차부터 시작해 질환 부담을 평가하기 위해, 연속적인 꼬리 정맥 채혈을 통해 마우스를 추적하였으며, 전체 생존율을 추적하였다. 도 7E는 CAR-T 요법을 이용한 렌질루맵 처리가, CAR-T 요법을 이용한 이소형 대조군 처리와 비교해, 원발성 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 이종이식 모델에서 경시적으로 종양 부담을 보다 지속적으로 제어함을 보여주는 그래프를 포함한다 (마우스 6마리/군, ** p<0.01, * p<0.05, ns p>0.05, T-검정, 평균 ± SEM).
도 8은 종양 부담이 높은 재발성 ALL 이종이식 모델에서 렌질루맵 + CAR-T 세포 처리된 마우스가 이소형 대조군 + CAR-T 세포 처리된 마우스와 비교해 비슷한 생존성을 가짐을 보여주는 그래프를 포함한다 (실험 n=2, 마우스 7-8마리/군, 대표적인 실험을 도시함, **** p<0.0001, *** p<0.001, * p<0.05, 로그-순위).
도 9는 GM-CSF CRISPR Cas9 넉아웃 CAR-T 세포에서 게놈 변형을 검증하기 위한 대표적인 TIDE 서열을 나타낸 그래프를 포함한다 (실험 n=2, 대표적인 실험을 도시함).
도 l0A - l0E는 GM-CSF CRISPR 넉아웃 CAR-T 세포가 주요 사이토카인의 수준과 비슷하게 GM-CSF의 발현 감소를 나타내고, 항-종양 활성을 강화함을 보여준다. 도 10A는 CRISPR Cas9 GMCSFk /o CAR-T가 야생형 CART19와 비교해 GM-CSF 생산 저하를 나타내지만, 다른 사이토카인의 생산 및 탈과립화 (degranulation)는 GM-CSF 유전자 파괴에 의해 저해되지 않음을 보여주는 그래프를 포함한다 (실험 n=3, 실험 당 2세트, GM-CSF k/o CAR-T 대 CAR-T *** p<0.001, * p<0.05, ns p>0.05, T-검정, 평균 ± SEM). 도 l0B는 멀티플렉스에 의해 분석한 바에 따른, GM-CSF k/o CAR-T가 CAR-T 처리와 비교해 혈청내 인간 GM-CSF를 감소시킴을 보여주는 그래프를 포함한다 (마우스 5-6마리/군 (채혈시 4-6마리, CART 주사 후 8일차), GM-CSF k/o CAR-T 세포와 야생형 CAR-T 세포 간의 **** p<0.0001, *** p<0.001, T-검정, 평균 ± SEM). 도 10C는 종양 부담이 높은 재발성 이종이식 ALL 모델에서 GM-CSFk /o CART19이 야생형 CART19과 비교해 생체내에서 전체 생존율을 강화함으로 보여주는 그래프를 포함한다 (마우스 5-6마리/군, ** p<0.01, 로그-순위). 도 10D 및 10E는 인간 GM-CSF 이외의 다른, 혈청의 멀티플렉스에 따른, 인간 (도 10D) 및 마우스 (도 10E) 사이토카인이, GM-CSF k/o CAR-T 세포와 야생형 CAR-T 세포 간에 통계적 차이가 없음을 보여주는 히트 맵을 포함하며, 이는 추가적으로 주요 T-세포 사이토카인이 GM-CSF 발현 감소에 의해 불리하게 고갈되지 않음을 시사해준다 (마우스 5-6 마리/군 (채혈시 4-6 마리), **** p<0.0001, T-검정).
도 11은 종양 부담이 높은 재발성 이종이식 ALL 모델에서 GM-CSF 넉아웃 CAR-T 세포가 생체내에서 CAR-T와 비교해 종양 부담의 제어를 다소 강화함을 보여주는 그래프를 포함한다. x축에는 CAR-T 주입 후 경과 일수를 나타낸다 (마우스 5-6마리/군 (UTD 군의 경우에는 13일에 2마리만 남음), 대표적인 실험을 도시함, **** p<0.0001, * p<0.05, 이원식 ANOVA, 평균 ± SEM).
도 12A-12D는 사이토카인 방출 증후군 및 신경독성에 대한 환자 유래 이동이식 모델을 도시한다. 도 12A는 마우스에 원발성 ALL 환자의 말초혈 유래 일차 모세포 1-3xl06주를 주입하는 것을 나타낸 실험 개요를 포함한다. 마우스는 꼬리 정맥 채혈을 통해 10-13주 동안 생착을 모니터링하였다. 혈청 CD19+ 세포가 2:10 세포/㎕가 되면, 표시된 바와 같이, 마우스에 CART19 (세포 2-5x106주)를 투여하고, 총 10일간 항체 요법을 개시하였다. 마우스는 웰빙의 척도로서 매일 체중을 측정하였다. CART19 주사 후 5-6일에 마우스 뇌 MRI를 촬영하고, 사이토카인 및 T 세포 분석을 위해 CART19 주사 후 4-11일에 꼬리 정맥으로부터 채혈하였다 (2번의 독립 실험). 도 12B는 GM-CSF 중화와 CART19의 조합이 ALL 세포의 CD19+ 부담을 제어하는데 있어 CART19 및 이소형 대조군 항체의 조합과 동일하게 효과적임을 보여주는 그래프를 포함한다 (대표 실험, 마우스 3마리/군, CART19 주사 후 11일, GM-CSF 중화 + CART19 및 이소형 대조군 + CART19 간의 *p<0.05, T-검정, 평균 ± SEM). 도 12C는 CART19 요법을 이용하는 경우 뇌 MRI에서 뇌 혈액-뇌 장벽 파괴 및 잠재적인 부종을 시사하는 T1 강화 (T1 enhancement)가 관찰됨을 보여주는 사진을 포함한다 (마우스 3마리/군, CART19 주사 후 5-6일, 대표적인 사진). 도 12D는 CART19으로 처리된 종양 부담이 높은 원발성 ALL 이종이식 모델에서 무처리 PDX 대조군과 비교해 뇌에서 인간 CD3 세포가 침윤됨을 보여주는 그래프를 포함한다 (마우스 3 마리/군, 대표 사진).
도 13A-13D는 생체내 GM-CSF 중화가 이종이식 모델에서 CART19 요법 후 사이토카인 방출 증후군을 완화함을 보여준다. 도 13A는 렌질루맵 및 항-마우스 GM-CSF 항체가 CART19 및 이소형 대조군 항체로 처리된 마우스와 비교해 CRS 유발성 체중 감소를 방지함을 보여주는 그래프를 포함한다 (마우스 3마리/군, 이원식 ANOVA, 평균 ± SEM). 도 13B는 렌질루맵 및 마우스 GM-CSF 중화 항체로 처리된 환자 유래 이종이식 모델에서 인간 GM-CSF가 중화됨을 보여주는 그래프를 포함한다 (마우스 3마리/군, *** p<0.001, * p<0.05, T-검정, 평균 ± SEM). 도 13C는 인간 사이토카인 (CART19 주사 후 11일에 수집한 혈청)이 CART19 처리 후 CRS의 전형적인 사이토카인 증가를 나타냄을 보여주는 히트 맵을 포함한다. GM-CSF 중화시, 패널에 표시된 바와 같이, CART19 및 이소형 대조군 항체로 처리된 마우스와 비교해, 수종의 골수 관련 사이토카인을 비롯하여 수종의 사이토카인이 현저하게 감소된다 (마우스 3마리/군, CART19 주사 후 11일차 혈청, GM-CSF 중화 항체 처리된 마우스와 CAR-T 세포 요법을 투여받은 이소형 대조군 처리된 마우스 간에 *** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05, T-검정). 도 13D는 마우스 사이토카인 (CART19 주사 후 11일째에 수집한 혈청)이 CART19 처리 후 CRS의 전형인 마우스 사이토카인의 증가를 나타냄을 보여주는 히트 맵을 포함한다. GM-CSF 중화는 패널에 표시된 바와 같이 대조군 항체를 이용한 CART19 처리와 비교해 수종의 골수 분화 사이토카인을 비롯하여 여러가지 사이토카인을 현저하게 감소시킨다 (마우스 3마리/군, CART19 주사 후 11일차 혈청, GM-CSF 중화 항체 처리된 마우스와 CAR-T 세포 요법을 받은 이소형 대조군 처리된 마우스 간에 * p<0.05, T-검정).
도 14A-14D는 이종이식 모델에서 생체내 GM-CSF 중화가 CART19 요법 후 신경염증을 완화함을 보여준다. 도 14A 및 14B는 가돌리늄 보강된 T1-고강도신호 (입방 mm) MRI를 나타낸 것으로, GM-CSF 중화가 이소형 대조군 (A)과 비교해 뇌 염증 감소, 혈액-뇌 장벽 파괴 저하 및 가능한 부종 저하에 유용함을 보여준다 ((A) 대표 사진, (B) 마우스 3마리/군, ** p<0.01, * p<0.05, 일원식 ANOVA, 평균 ± SD). 도 14C는 CART19 요법으로 처리한 후 인간 CD3 T 세포가 뇌에 존재함을 보여주는 그래프를 포함한다. GM-CSF 중화시, 뇌 반구에서 유세포 분석에 의해 분석한 바와 같이, 뇌에서 CD3 침윤이 감소하는 경향이 관찰되었다 (마우스 3마리/군, 평균 ± SEM). 도 14D는 뇌 반구에서 유세포 분석에 의해 분석한 바와 같이, CD11b+ bright 대식세포가 CAR-T 요법 중의 이소형 대조군과 비교해 CAR-T 요법 중에 GM-CSF 중화를 투여받은 마우스의 뇌에서 감소함을 보여주는 그래프를 포함한다 (마우스 3마리/군, 평균 ± SEM).
도 15는 GM-CSFk /o CART19 세포의 구축 예를 보여준다. 실험 계획은 개요 (도 15A), gRNA 서열 (도 15B) 및 GM-CSFk/o CART19을 구축하기 위한 프라이머 서열 (도 15B)을 기술한다. GM-CSFk /o CART19 세포를 구축하기 위해, gRNA를 U6 프로모터의 통제 하에 Cas9 렌티바이러스 벡터에 클로닝하고, 렌티바이러스 생산에 이용하였다. 정상 공여체로부터 유래된 T 세포를 CD3/CD28 비드로 자극하고, 24시간 후 CAR19 바이러스 및 CRISPR/Cas9 바이러스로 이중 형질도입하였다. CD3/CD28 자기 비드는 6일차에 제거하고, GM-CSFk /o CART19 세포 또는 대조군 CART19 세포는 8일에 냉동보존하였다.
도 16은 RNA 서열분석에 사용된 절차의 순서도를 도시한다. 바이너리 베이스 콜 데이터 (binary base call data)를 Illumina bcl2fastq 소프트웨어를 사용해 fastq로 변환하였다. 어댑터 서열을 Trimmomatic를 사용해 제거하고, FastQC를 이용해 정성적으로 체크하였다. 최신 인간 (GRCh38) 및 마우스 (GRCm38) 기준 게놈을 NCBI에서 내려받았다. STAR30으로 게놈 인덱스 파일을 생성하고, 쌍 형성된 엔드 리드를 각 조건에 대해 게놈에 맵핑하였다. HTSeq를 이용해 각 유전자에 대한 발현 수치를 구하고, DeSeq2를 이용해 차별적인 발현을 계산하였다. Enrichr를 이용해 유전자 온톨로지를 평가하였다.
도 17A-17B는, 실시예 4에 상세히 기술된 바와 같이, 3기 또는 그 이상 병기의 신경독성 인간 환자에서 CD14+ 세포가 CNS 세포 집단의 높은 비율을 차지하며 (도 17A), 항-hGM-CF 항체, 렌질루맵이 NT 실험에 사용된 원발성 ALL 마우스 모델에서 CD11b+ 세포 및 CD14+ 세포에 의한 CNS 침윤을 감소시킴을 (도 17B), 각각 보여준다.
본원은 하나 이상의 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준이 저하된 T 세포 (예를 들어, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 (CART))를 구축하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 일부 경우에, T 세포 (예를 들어, CART)는 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 KO 시키도록 조작되지 않은 T 세포와 비교해) T 세포에서 GM-CSF 폴리펩타이드 발현을 감소시키기 위해 GM-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 넉아웃 (KO) 시키도록 조작할 수 있다. GM-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 KO 시키도록 조작된 T 세포는, 본원에서, 또한, GM-CSF KO T 세포로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법 및 물질을 이용해 골수 세포를 조절할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법 및 물질을 이용해 골수 세포를 고갈시킬 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법 및 물질을 이용해 T 세포 (예를 들어, CART)의 효능을 강화할 수 있다.
본원에 제공된 T 세포 (예를 들어, CART)는 임의의 적절한 사이토카인 폴리펩타이드 또는 사이토카인 폴리펩타이드들의 조합의 발현 수준이 저하되도록 설계할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 T 세포 (예를 들어, CART)는 GM-CSF 폴리펩타이드, 인터루킨 6 (IL-6) 폴리펩타이드, G-CSF, 인터페론 γ (IFN-g) 폴리펩타이드, IL-lB 폴리펩타이드, IL-10 폴리펩타이드, 단핵구 화학주성인자 단백질 1 (MCP-1) 폴리펩타이드, γ (MIG) 폴리펩타이드에 의해 유도된 모노카인, 대식세포 염증성 단백질 (MIP) 폴리펩타이드 (예를 들어, MIP-1β 폴리펩타이드), 종양 괴사 인자 α (TNF-α) 폴리펩타이드, IL-2 폴리펩타이드, 퍼포린 (perforin) 폴리펩타이드 또는 이들의 임의 조합의 발현 수준이 저하되도록 설계할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 GM-CSF 및 IL-6 폴리펩타이드 둘다의 발현 수준이 저하되도록 설계할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, GM- CSF 유전자 불활성화, GM- CSF 유전자 넉다운 또는 유전자 넉아웃 (GM- CSF k /o CAR-T 세포)을 포함하는 CAR-T 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하며, CAR-T 세포의 투여가 면역요법-관련 독성을 낮추거나 또는 방지하는, 개체에서 면역요법의 항-종양 효과를 강화하는 방법을 제공한다. 본원에 제공된 방법에 대한 일 구현예에서, 본 방법은 개체에게 항-hGM-CSF 항체를 투여하는 단계를 더 포함하며, 항-hGM-CSF 항체는 인간 GM-CSF에 결합하여 중화하는 재조합 항-hGM-CSF 항체이다. 특정 구현예에서, 본 방법은 개체에게 항-hGM-CSF 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역요법-관련 독성 CAR-T는 사이토카인 방출 증후군 (CRS), 신경독성 (NT), 신경염증 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 제공된 방법에 대한 특정 구현예에서, (i) GM- CSF 유전자 불활성화, GM-CSF 유전자 넉다운 또는 유전자 넉아웃 (GM- CSF k /o CAR-T 세포)을 포함하는, CAR-T 세포, 또는 (ii) CAR-T 세포; 및 항-hGM-CSF 항체의 투여는, 개체의 중추 신경계 (CNS)로의 CD14+ 골수 세포 이동을 감소시키거나 또는 방지한다. 일 구현예에서, 개체의 중추 신경계 (CNS)에서 높은 수준의 CD14+ 골수 세포는 신경독성의 지표이다. CNS에서 CD14+ 골수 세포의 수준은 요추 천자를 수행하여 뇌척수액 (CSF) 샘플을 취한 다음 CSF에서, 예를 들어 유세포 측정 분석 (유세포 측정)), ELISA, 항-CD14-FITC 단일클론 항체 또는 기타 적합한 측정 기법에 의해 CD14+ 세포를 측정함으로써, 결정한다.
본원에 제공된 방법에 대한 일 구현예에서, 항-hGM-CSF 항체가 투여된 개체의 객관적 반응률 (objective response rate)이 항-hGM-CSF 항체가 투여되지 않은 개체와 비교해 개선된다. 특정 구현예에서, 객관적 반응률은 완전 반응률 또는 부분 반응률이다. 다른 구현예에서, 개체의 무진행 생존 및/또는 생존이 항-hGM-CSF 항체 및/또는 GM- CSF 유전자 불활성화, GM- CSF 유전자 넉다운 또는 유전자 넉아웃 (GM-CSF k/o CAR-T 세포)을 포함하는 CAR-T 세포를 투여하지 않은 개체와 비교해 개선된다. 추가적인 구현예에서, 생존은 개체의 전체 생존 (overall survival)이다. 다른 구현예에서, 항-hGM-CSF 항체는, GM- CSF 유전자 불활성화, GM- CSF 유전자 넉다운 또는 GM- CSF k /o CAR-T 세포를 포함하는 CAR-T 세포를 투여하기 전, 투여하는 중 또는 투여한 후, 개체에 투여한다.
본원에 제공된 방법에 대한 특정 구현예에서, 면역요법은 키메라 항원 수용체-발현성 T 세포 (CAR T-세포)의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, CAR T-세포는 CART19 세포이다. 본원에 제공된 청구항 1의 방법에 대한 다른 구현예에서, 면역요법은 T-세포 수용체 (TCR) 변형된 T-세포, 종양-침윤성 림프구 (TIL), 키메라 항원 수용체 (CAR)-변형된 자연 살상 세포 또는 수지상 세포 또는 이들의 임의 조합의 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 입양 세포 전달을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역요법은 단일클론 항체, 사이토카인, 암 백신, T 세포 관련 이중 특이성 항체 (T cell engaging bispecific antibody) 또는 이들의 임의 조합의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 개체는 암에 걸린 개체이다. 특정 구현예에서, 암은 림프종 또는 백혈병이다. 다른 구현예에서, 림프종은 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL)이다. 또 다른 구현예에서, 백혈병은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL)이다.
다른 측면에서, 본 발명은, GM- CSF 유전자 불활성화, GM- CSF 유전자 넉다운 또는 유전자 넉아웃 (GM-CSFk /o CAR-T 세포)를 포함하는 CAR-T 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역요법으로 처치된 개체에서 non-GM-CSF 사이토카인의 수준을 낮추는 방법을 제공한다. 본원에 제공된 방법에 대한 특정 구현예에서, 이 방법은 개체에 항-hGM-CSF 항체를 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서, non-GM-CSF 사이토카인은 IP-10, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-1Ra, IL-9, IL-10, VEGF, TNF-a, FGF-2, IFN-γ, IL-12p40, IL-12p70, sCD40L, KC, MDC, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b 또는 이들의 조합이다. 본원에 제공된 방법에 대한 다른 구현예에서, 면역요법-관련 독성 CAR-T는 CRS, NT, 신경염증 또는 이들의 조합을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 표적화된 게놈 편집 또는 GM-CSF 유전자 침묵화를 포함하는 세포에서 GM- CSF 유전자 불활성화, GM- CSF 유전자 넉다운 또는 GM- CSF 넉아웃 (KO)을 달성하는 방법을 제공한다. 본원에 제공된 방법에 대한 일 구현예에서, 이 방법은 핵산 절단 효소로서 엔도뉴클레아제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 Fok1 제한 효소 또는 flap 엔도뉴클레아제 1 (FEN-1)이다. 특정 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 Cas9　CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9)이다. 특정 구현예에서, CRISPR/Cas9에 의한 GM- CSF 유전자 불활성화는 GM-CSF 유전자를 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3 또는 엑손 4에서 표적화하고, 편집한다. 일 구현예에서, CRISPR/Cas9을 포함하는 GM-CSF 유전자 불활성화는 GM-CSF 유전자를 엑손 3에서 표적화하고, 편집한다. 다른 구현예에서, CRISPR/Cas9을 포함하는 GM- CSF 유전자 불활성화는 GM-CSF 유전자를 엑손 1에서 표적화하고, 편집한다.
또 다른 구현예에서, GM- CSF 유전자 불활성화는 복수의 CRISPR/Cas9 효소를 포함하며, 각각의 Cas9 효소는 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3 또는 엑손 4에서 GM-CSF 유전자의 여러 서열들을 표적화하고, 편집한다. 다른 구현예에서, GM- CSF 유전자 불활성화는 GM-CSF 유전자를 표적화하여 넉아웃/불활성화하는 이중 대립유전자 (bi-allelic) CRISPR/Cas9을 포함한다.
본원에 제공된 방법에 대한 특정 구현예에서, 이 방법은 이중 대립유전자 넉아웃/불활성화를 강화하기 위해 일차 T 세포에 발프로산을 처리하는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화된 게놈 편집은 징크 핑거 (ZnF) 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 표적화된 게놈 편집은 전사 활성인자-유사 작동자 뉴클레아제 (transcription activator-like effector nucleases, TALENS)를 포함한다. 특정 구현예에서, 표적화된 게놈 편집은 호밍 ((homing) 엔도뉴클레아제를 포함하며, 여기서 호밍 엔도뉴클레아제는 ARC 뉴클레아제 (ARCUS) 또는 메가뉴클레아제이다. 본원에 제공된 방법에 대한 일 구현예에서, 표적화된 게놈 편집은 flap 엔도뉴클레아제 (FEN-1)를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 CAR T 세포이다. 특정 구현예에서, CAR T 세포는 CD19 CAR-T 세포이다. 다른 구현예에서, CAR T 세포는 BCMA CAR-T 세포이다. 다른 구현예에서, GM-CSF 유전자 침묵화는 RNA 간섭 (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA) 및 DNA-특이적인 RNA 간섭 (ddRNAi)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 측면에서, 본 발명은, 핵산 구조체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 핵산 구조체가 a) 가이드 RNA를 코딩하는 핵산으로서, 가이드 RNA가 GM-CSF 메신저 RNA에 상보적인, 핵산; b) Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 및 c) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩타이드의 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 방법을 제공한다. 본원에 제공된 방법에 대한 일 구현예에서, 가이드 RNA는 서열번호 1에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이다. 추가적인 구현예에서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산은 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 구조체는 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 추가적인 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 종양-관련 항원을 표적화한다. 다른 구현예에서, 종양-관련 항원은 CD19이다. 추가적인 구현예에서, 도입하는 단계는 형질도입을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 복합체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계; 및 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 복합체가 a) GM-CSF 메신저 RNA에 상보적인 가이드 RNA; 및 b) Cas 뉴클레아제를 포함하는, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩타이드의 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 방법을 제공한다. 본원에 제공된 방법에 대한 일 구현예에서, 가이드 RNA는 서열번호 1에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이다. 특정 구현예에서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산은 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 복합체는 리보핵산단백질이다. 추가적인 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 종양-관련 항원을 표적화한다. 특정 구현예에서, 종양-관련 항원은 CD19이다. 본원에 제공된 방법에 대한 다른 구현예에서, 도입하는 단계는 전기천공을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩타이드의 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포를 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 포유류를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 포유류는 인간이다. 다른 구현예에서, 암은 림프종이다. 추가적인 구현예에서, 림프종은 미만성 거대 B 세포 림프종이다. 다른 구현예에서, 암은 백혈병이다. 다른 구현예에서, 백혈병은 급성 림프모구성 백혈병이다. 일 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 종양-관련 항원을 표적화한다. 특정 구현예에서, 종양-관련 항원은 CD19이다.
일 측면에서, 본 발명은, 핵산 구조체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 핵산 구조체가 a) 가이드 RNA를 코딩하는 핵산으로서, 가이드 RNA가 사이토카인 메신저 RNA에 상보적인, 핵산; b) Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 및 c) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는, 사이토카인 폴리펩타이드의 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 방법을 제공한다. 본원에 제공된 방법에 대한 특정 구현예에서, 사이토카인 폴리펩타이드는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩타이드 및/또는 인터루킨 6 (IL-6) 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 사이토카인 폴리펩타이드는 GM-CSF 폴리펩타이드이고, 가이드 RNA는 서열번호 1에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산은 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 핵산 구조체는 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 종양-관련 항원을 표적화한다. 다양한 구현예들에서, 종양-관련 항원은 CD19이다. 다른 구현예에서, 도입하는 단계는 형질도입을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 복합체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계; 및 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 복합체가 a) 사이토카인 메신저 RNA에 상보적인 가이드 RNA; 및 b) Cas 뉴클레아제를 포함하는, 사이토카인 폴리펩타이드의 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 방법을 제공한다. 본원에 제공된 방법에 대한 일 구현예에서, 사이토카인 폴리펩타이드는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩타이드 및/또는 인터루킨 6 (IL-6) 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 사이토카인 폴리펩타이드는 GM-CSF 폴리펩타이드이며, 가이드 RNA는 서열번호 1에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산은 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 복합체는 리보핵산단백질이다. 또 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 종양-관련 항원을 표적화한다. 특정 구현예에서, 종양-관련 항원은 CD19이다. 다른 구현예에서, 도입하는 단계는 전기천공을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 사이토카인 폴리펩타이드의 수준이 저하된 키메라 항원 수용체 T 세포를 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 암에 걸린 포유류를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 제공된 방법에 대한 일 구현예에서, 사이토카인 폴리펩타이드는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩타이드 및/또는 인터루킨 6 (IL-6) 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 폴리펩타이드는 GM-CSF 폴리펩타이드이고, 가이드 RNA은 서열번호 1에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 포유류는 인간이다. 다른 구현예에서, 암은 림프종이다. 또 다른 구현예에서, 림프종은 미만성 거대 B 세포 림프종이다. 다른 구현예에서, 암은 백혈병이다. 추가적인 구현예에서, 백혈병은 급성 림프모구성 백혈병이다. 일 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 종양-관련 항원을 표적화한다. 특정 구현예에서, 종양-관련 항원은 CD19이다.
일 측면에서, 본 발명은, 핵산 구조체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 핵산 구조체가 a) 가이드 RNA를 코딩하는 핵산으로서, 가이드 RNA가 GM-CSF 메신저 RNA에 상보적인, 핵산; b) Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 및 c) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는, 키메라 항원 수용체 T 세포의 T 세포 작동자 기능을 개선하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 복합체를 생체외 T 세포에 도입하는 단계; 및 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 생체외 T 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 복합체가 a) GM-CSF 메신저 RNA에 상보적인 가이드 RNA; 및 b) Cas 뉴클레아제를 포함하는, 키메라 항원 수용체 T 세포의 T 세포 작동자 기능을 개선하는 방법을 제공한다.
본원에서, 사이토카인 (예, GM-CSF)의 발현 수준과 관련하여, 용어 "수준이 저하된"은, 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF)의 기준 발현 수준보다 낮은 임의의 수준을 의미한다. 본원에서, 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF)과 관련하여, 용어 "기준 수준"은, 본원에 기술된 바와 같이, 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준이 저하되도록 조작되지 않은 하나 이상의 포유류 (예, 인간) 샘플 (예, 대조군 샘플)에서 전형적으로 관찰되는 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF)의 수준을 의미한다. 대조군 샘플은, 비-제한적으로, 야생형 T 세포 (예, GM-CSF KO T 세포가 아닌 T 세포)인 T 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준 저하는 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF)의 검출가능한 수준일 수 있다. 일부 경우에, GM-CSF 폴리펩타이드의 발현 수준 저하는 GM-CSF의 수준 소실일 수 있다.
일부 경우에, GM-CSF KO T 세포와 같이, 하나 이상의 사이토카인 폴리펩타이드의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) T 세포는 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준이 저하되도록 조작되지 않은 CART와 비교해) T 세포 탈과립 및 사이토카인의 방출과 같은 정상적인 T 세포 기능을 유지할 수 있다.
일부 경우에, GM-CSF 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF KO T 세포)의 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) T 세포는 (예, 본원에 기술된 바와 같이, GM-CSF의 수준이 감소되도록 조작되지 않은 CART와 비교해) 항-종양 활성, 증식, 세포 사멸, 사이토카인 생산, 고갈 감수성 (exhaustion susceptibility), 항원 특이 작동자 기능, 지속성 (persistence) 및 분화와 같은 CART 기능이 강화될 수 있다.
일부 경우에, GM-CSF 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF KO T 세포)의 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) T 세포는, (예, 본원에 기술된 바와 같이, GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 감소되도록 조작되지 않은 CART와 비교해) T 세포 증폭성이 강화될 수 있다.
GM-CSF KO T 세포와 같이 하나 이상의 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) T 세포는 임의의 적절한 T 세포일 수 있다. T 세포는 나이브 (naive) T 세포일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 사이토카인의 발현 수준이 저하되도록 설계될 수 있는 T 세포의 예로는, 비-제한적으로, 세포독성 T 세포 (예를 들어, CD4+ CTL 및/또는 CD8+ CTL)를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하되도록 조작할 수 있는 T 세포는 CART일 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 T 세포는 포유류 (예, 암에 걸린 포유류)로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 본원에 기술된 물질 및 방법으로 치료할 포유류로부터 수득할 수 있다.
GM-CSF KO T 세포와 같이 하나 이상의 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) T 세포는 임의의 적절한 방법을 이용해 구축할 수 있다. 일부 경우에, T 세포 (예를 들어, CART)는 GM-CSF 폴리펩타이드를 KO 시켜 T 세포에서 GM-CSF 폴리펩타이드의 발현을 감소시키도록 조작할 수 있다.
일부 경우에, T 세포 (예를 들어, CART)가 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)을 코딩하는 핵산을 KO 시켜 T 세포에서 사이토카인 폴리펩타이드의 발현을 저하하도록 조작되는 경우, 임의의 적절한 방법을 이용해 사이토카인을 코딩하는 핵산을 KO 시킬 수 있다. 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)를 코딩하는 핵산 서열을 넉아웃시키기 위해 이용할 수 있는 기법의 예로는, 비-제한적으로, 유전자 편집, 상동적인 재조합, 비-상동적인 말단 연결 (non-homologous end joining) 및 미세상동성 말단 연결 (microhomology end joining)을 포함한다. 예를 들어, (예, 조작된 뉴클레아제를 이용한) 유전자 편집을 이용해 GM-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 KO 시킬 수 있다. 게놈 편집에 이용가능한 뉴클레아제로는, 비-제한적으로, CRISPR-부속 (Cas) 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 작동자 (TALE) 뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제 (HE; 메가뉴클레아제라고도 함)를 포함한다.
일부 경우에, CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) / Cas 시스템을 이용해 (예를 들어, 하나 이상의 T 세포에 도입할 수 있음), 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)를 코딩하는 핵산을 KO 시킬 수 있다 (예를 들어, 도 1 및 실시예 1 참조). 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)를 코딩하는 핵산을 KO 시키기 위해 사용되는 CRISPR/Cas 시스템은 임의의 적절한 가이드 RNA (gRNA)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, gRNA는 GM-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, GM-CSF mRNA)에 상보적일 수 있다. GM-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 특이적인 gRNA에 대한 예로는, 비-제한적으로, GACCTGCCTACAGACCCGCC (서열번호 1), GCAGTGCTGCTTGTAGTGGC, TCAGGAGACGCCGGGCCTCC (서열번호 3), CAGCAGCAGTGTCTCTACTC (서열번호 4), CTCAGAAATGTTTGACCTCC (서열번호 5) 및 GGCCGGTCTCACTCCTGGAC (서열번호 6)를 포함한다. 일부 경우에, GM-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 KO 시키기 위해 설계된 CRISPR/Cas 시스템의 gRNA 구성성분은 서열번호 1에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다.
사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)를 코딩하는 핵산을 KO 시키기 위해 이용되는 CRISPR/Cas 시스템은 임의의 적절한 Cas 뉴클레아제를 포함할 수 있다. Cas 뉴클레아제의 예로는, 비-제한적으로, Cas1, Cas2, Cas3, Cas9, Cas10 및 Cpf1을 포함한다. 일부 경우에, 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)를 코딩하는 핵산을 KO 시키기 위해 설계된 CRISPR/Cas 시스템의 Cas 구성성분은 Cas9 뉴클레아제일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 CRISPR/Cas9 시스템의 Cas9 뉴클레아제는 lentiCRISPRv2일 수 있다 (예를 들어, Shalem et al., 2014 Science 343:84-87; 및 Sanjana et al., 2014 Nature methods 11:783-784를 참조하며, 이들 각각은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)를 코딩하는 핵산을 KO 시키기 위해 사용되는 CRISPR/Cas 시스템의 구성성분 (예를 들어, gRNA 및 Cas 뉴클레아제)은, 임의의 적절한 형태로 하나 이상의 T 세포 (예를 들어, CART)에 도입할 수 있다. 일부 경우에, CRISPR/Cas 시스템의 구성성분은 gRNA를 코딩하는 핵산 및/또는 Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산으로서 하나 이상의 T 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 gRNA를 코딩하는 핵산 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 특이적인 gRNA 서열) 및 하나 이상의 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 뉴클레아제)를 코딩하는 핵산을 하나 이상의 T 세포에 도입할 수 있다. 일부 경우에, CRISPR/Cas 시스템의 구성성분을 gRNA로서 및/또는 Cas 뉴클레아제로서 하나 이상의 T 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 gRNA (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 특이적인 gRNA) 및 하나 이상의 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 뉴클레아제)를 하나 이상의 T 세포에 도입할 수 있다.
일부 경우에, CRISPR/Cas 시스템의 구성성분 (예를 들어, gRNA 및 Cas 뉴클레아제)이 구성성분을 코딩하는 핵산 (예를 들어, gRNA를 코딩하는 핵산 및 Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산)으로서 하나 이상의 T 세포에 도입하는 경우, 핵산은 임의의 적절한 형태일 수 있다. 예를 들어, 핵산은 구조체 (예를 들어, 발현 구조체)일 수 있다. 하나 이상의 gRNA를 코딩하는 핵산 및 하나 이상의 Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 개별 핵산 구조체 또는 동일한 핵산 구조체 상에 존재할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 gRNA를 코딩하는 핵산 및 하나 이상의 Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 단일한 핵산 구조체 상에 존재할 수 있다. 핵산 구조체는 임의의 적절한 유형의 핵산 구조체일 수 있다. 하나 이상의 gRNA 및/또는 하나 이상의 Cas 뉴클레아제를 발현하기 위해 이용할 수 있는 핵산 구조체에 대한 예로는, 비-제한적으로, 발현 플라스미드 및 바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터) 등이 있다. 하나 이상의 gRNA를 코딩하는 핵산과 하나 이상의 Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산이 개별 핵산 구조체 상에 존재하는 경우, 핵산 구조체는 동일한 유형의 구조체 또는 서로 다른 유형의 구조체일 수 있다. 일부 경우에, 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)를 코딩하는 핵산에 특이적인 하나 이상의 gRNA를 코딩하는 핵산 및 하나 이상의 Cas 뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 단일한 렌티바이러스 벡터 상에 존재할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하여, 하나 이상의 gRNA를 코딩하는, 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)를 코딩하는 핵산에 특이적인 하나 이상의 gRNA 서열과 하나 이상의 Cas9 뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스 벡터는, 사이토카인 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준이 저하되도록 T 세포를 생체외 조작하는데 이용할 수 있다.
일부 경우에, CRISPR/Cas 시스템의 구성성분 (예를 들어, gRNA 및 Cas 뉴클레아제)은 (예를 들어, gRNA로서 및/또는 Cas 뉴클레아제로서) 하나 이상의 T 세포에 직접 도입할 수 있다. gRNA 및 Cas 뉴클레아제를 하나 이상의 T 세포에 함께 도입하는 경우, gRNA 및 Cas 뉴클레아제는 복합체 형태일 수 있다. gRNA 및 Cas 뉴클레아제가 복합체 형태일 경우, gRNA 및 Cas 뉴클레아제는 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합할 수 있다. 일부 경우에, gRNA 및 Cas 뉴클레아제를 포함하는 복합체는 또한 하나 이상의 부가적인 구성성분을 포함할 수 있다. CRISPR/Cas 시스템의 구성성분 (예를 들어, gRNA 및 Cas 뉴클레아제)을 포함할 수 있는 복합체의 예로는, 비-제한적으로, 리보핵산단백질 (RNP) 및 작동자 복합체 (예를 들어, CRISPR RNA (crRNA) Cas 뉴클레아제 함유)를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 gRNA 및 하나 이상의 Cas 뉴클레아제는 RNP에 포함될 수 있다. 일부 경우에, RNP는 gRNA 및 Cas 뉴클레아제를 약 1:1 내지 약 10:1 (예를 들어, 약 1:1 내지 약 10:1, 약 2:1 내지 약 10:1, 약 3:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 10:1, 약 8:1 내지 약 10:1, 약 1:1 내지 약 9:1, 약 1:1 내지 약 7:1, 약 1:1 내지 약 5:1, 약 1:1 내지 약 4:1, 약 1:1 내지 약 3:1, 약 1:1 내지 약 2:1, 약 2:1 내지 약 8:1, 약 3:1 내지 약 6:1, 약 4:1 내지 약 5:1, 또는 약 5:1 내지 약 7:1)의 비율로 포함할 수 있다. 예를 들어, RNP는 gRNA 및 Cas 뉴클레아제를 약 1:1의 비율로 포함할 수 있다. 예를 들어, RNP는 gRNA 및 Cas 뉴클레아제를 약 2:1의 비율로 포함할 수 있다. 일부 경우에, GM-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 특이적인 (예를 들어, 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하여, 하나 이상의 gRNA를 코딩하는) 하나 이상의 gRNA 및 하나 이상의 Cas9 뉴클레아제를 포함하는 RNP를 T 세포의 생체외 조작으로 이용함으로써, GM-CSF 폴리펩타이드의 수준을 저하시킬 수 있다.
사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)를 코딩하는 핵산을 KO 시키기 위해 사용되는 CRISPR/Cas 시스템의 구성성분 (예를 들어, gRNA 및 Cas 뉴클레아제)은, 임의의 적절한 방법을 이용해, 하나 이상의 T 세포 (예를 들어, CART)에 도입할 수 있다. CRISPR/Cas 시스템의 구성성분을 T 세포에 도입하는 방법은 물리적인 방법일 수 있다. CRISPR/Cas 시스템의 구성성분을 T 세포에 도입하는 방법은 화학적인 방법일 수 있다. CRISPR/Cas 시스템의 구성성분을 T 세포에 도입하는 방법은 입자에 기반한 방법일 수 있다. CRISPR/Cas 시스템의 구성성분을 하나 이상의 T 세포에 도입하기 위해 이용할 수 있는 방법의 예로는, 비-제한적으로, 전기천공, 형질감염 (예를 들어, 리포펙션), 형질도입 (예를 들어, 바이러스 벡터 매개 형질도입), 미세주입법 및 뉴클레오펙션 (nucleofection)을 포함한다. 일부 경우에, CRISPR/Cas 시스템의 구성성분을 구성성분을 코딩하는 핵산으로서 하나 이상의 T 세포에 도입할 경우, 하나 이상의 T 세포에 구성성분을 코딩하는 핵산을 형질도입할 수 있다. 예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 특이적인 하나 이상의 gRNA 서열 (예를 들어, 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하여, 하나 이상의 gRNA를 코딩함)과 하나 이상의 Cas9 뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 T 세포 (예를 들어, 생체외 T 세포)에 도입할 수 있다. 일부 경우에, CRISPR/Cas 시스템의 구성성분을 하나 이상의 T 세포에 직접 도입하는 경우, 구성성분은 하나 이상의 T 세포에 전기천공으로 도입할 수 있다. 예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 특이적인 하나 이상의 gRNA 서열 (예를 들어, 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하여, 하나 이상의 gRNA를 코딩함) 및 하나 이상의 Cas9 뉴클레아제를 포함하는 RNP를 T 세포 (예를 들어, 생체외 T 세포)에 전기천공으로 도입할 수 있다. 일부 경우에, CRISPR/Cas 시스템의 구성성분은 하나 이상의 T 세포에 생체외로 도입할 수 있다. 예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 T 세포의 생체외 조작은 단리된 T 세포에 CRISPR/Cas 시스템의 구성성분을 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 T 세포의 생체외 조작은 단리된 T 세포에 CRISPR/Cas 시스템의 구성성분을 포함하는 복합체를 전기천공으로 도입하는 것을 포함할 수 있다. T 세포를 GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하되도록 생체외 조작하는 경우, T 세포는 적절한 소스 (예, 치료할 포유류 또는 공여 포유류와 같은 포유류 또는 세포주)로부터 입수할 수 있다.
일부 경우에, T 세포 (예를 들어, CART)는, (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드 발현 또는 GM-CSF 폴리펩타이드 활성에 대한 하나 이상의 저해제로 처리되지 않은 T 세포와 비교해) GM-CSF 폴리펩타이드 발현 또는 GM-CSF 폴리펩타이드 활성에 대한 하나 이상의 저해제를 처리해, GM-CSF 폴리펩타이드 발현을 T 세포에서 감소시킬 수 있다. GM-CSF 폴리펩타이드 발현 또는 GM-CSF 폴리펩타이드 활성에 대한 저해제는 임의의 적절한 저해제일 수 있다. GM-CSF 폴리펩타이드 발현 또는 GM-CSF 폴리펩타이드 활성에 대한 저해제의 예로는, 비-제한적으로, RNA 간섭을 도입하도록 설계된 핵산 분자 (예를 들어, siRNA 분자 또는 shRNA 분자), 안티센스 분자, miRNA, 수용체 차단제 (blockade) 및 항체 (예를 들어, 길항 항체 및 중화 항체)를 포함한다.
하나 이상의 사이토카인의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) T 세포 (예를 들어, GM-CSF KO T 세포)는 임의의 적절한 항원 수용체를 발현할 수 있다 (예를 들어, 발현하도록 조작할 수 있다). 일부 경우에, 항원 수용체는 이종의 항원 수용체일 수 있다. 일부 경우에, 항원 수용체는 CAR일 수 있다. 일부 경우에, 항원 수용체는 종양 항원 (예를 들어, 종양-특이 항원) 수용체일 수 있다. 예를 들어, T 세포는 암에 걸린 포유류에서 암 세포에 의해 발현되는 종양-특이 항원 (예, 세포 표면 종양-특이 항원)을 표적화하는 종양-특이 항원 수용체를 발현하도록 조작할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현이 저하된 T 세포에서 발현된 항원 수용체에 의해 인지가능한 항원의 예로는, 비-제한적으로, CD19 (cluster of differentiation 19), mucin 1 (MUC-1), 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (HER-2), 에스트로겐 수용체 (ER), 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), 알파페토프로테인 (AFP), 암태아성 항원 (CEA), CA-125, 상피 종양 항원 (ETA), 흑색종-관련 항원 (MAGE), CD33, CD123, CLL-1, E-카드헤린, 폴레이트 수용체 α, 폴레이트 수용체 β, IL13R, EGFRviii, CD22, CD20, κ 경쇄, λ 경쇄, 데스모프레신, CD44v, CD45, CD30, CD5, CD7, CD2, CD38, BCMA, CD138, FAP, CS-1 및 C-met를 포함한다. 예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 T 세포는 CD19을 표적화하는 항원 수용체를 발현하도록 설계될 수 있다. CD19을 표적화하는 CAR (CAR19)을 코딩하는 예시적인 핵산 서열은 도 5에 도시된다.
임의의 적절한 방법을 이용해, 하나 이상의 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) T 세포 (예, GM-CSF KO T 세포) 상에서 항원 수용체를 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 하나 이상의 T 세포에 도입할 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 형질도입을 이용해, 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 비-분열성 세포에 도입할 수 있다. 항원 수용체를 코딩하는 핵산은 임의의 적절한 방법을 이용해 T 세포에 도입할 수 있다. 일부 경우에, 항원 수용체를 코딩하는 핵산은 형질도입 (예, 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터를 이용한 바이러스 형질도입) 또는 형질감염에 의해 T 세포에 도입할 수 있다. 일부 경우에, 항원 수용체를 코딩하는 핵산은 하나 이상의 T 세포에 생체외로 도입할 수 있다. 예를 들어, 항원 수용체를 발현하는 T 세포의 생체외 조작은 단리된 T 세포에 항원 수용체를 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입하는 것을 포함할 수 있다. 항원 수용체를 발현하도록 T 세포를 생체외 조작하는 경우, T 세포는 임의의 적절한 소스 (예, 치료할 포유류 또는 공여 포유류와 같은 포유류 또는 세포주)로부터 입수할 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) T 세포 (예, GM-CSF KO T 세포)가 항원 수용체를 또한 발현 (예, 발현하도록 조작)하는 경우, T 세포는 임의의 적절한 방법을 이용해 사이토카인의 발현 수준이 저하되도록 조작하고 항원 수용체를 발현하도록 조작할 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 먼저 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준이 저하되도록 조작한 다음 항원 수용체를 발현하도록 조작할 수 있거나 또는 그 역순도 가능하다. 일부 경우에, T 세포는 하나 이상의 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준을 낮추고 항원 수용체를 발현하도록 동시에 조작할 수 있다. 예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드와 같은 사이토카인 폴리펩타이드의 발현을 낮추기 위해 사용되는 하나 이상의 핵산 (예를 들어, 사이토카인을 코딩하는 핵산에 특이적인 하나 이상의 gRNA 및 하나 이상의 Cas9 뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스 벡터 또는 사이토카인의 mRNA에 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 코딩하는 핵산) 및 항원 수용체 (예, CAR)를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 동시에 하나 이상의 T 세포에 도입할 수 있다. 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현을 감소시키기 위해 사용되는 하나 이상의 핵산 및 항원 수용체를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 개별 핵산 구조체 또는 단일한 핵산 구조체 상에서 하나 이상의 T 세포로 도입될 수 있다. 일부 경우에, 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현을 감소시키기 위해 사용되는 하나 이상의 핵산 및 항원 수용체를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 단일한 핵산 구조체 상에서 하나 이상의 T 세포로 도입될 수 있다. 일부 경우에, 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현을 감소시키기 위해 사용되는 하나 이상의 핵산 및 항원 수용체를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 T 세포로 생체외 도입될 수 있다. 하나 이상의 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준을 감소시키고 항원 수용체를 발현시키기 위해 T 세포를 생체외 조작하는 경우, T 세포는 임의의 적절한 소스 (예를 들어, 치료할 포유류 또는 공여 포유류와 같은 포유류 또는 세포주)로부터 입수할 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) T 세포 (예, GM-CSF KO T 세포)는 자극 처리될 수 있다. 하나 이상의 사이토카인 폴리펩타이드의 수준이 저하되도록 조작함과 동시에 또는 하나 이상의 사이토카인 폴리펩타이드의 수준이 저하되도록 조작하는 것과는 독립적으로, T 세포는 자극 처리될 수 있다. 예를 들어, 입양 세포 요법에 이용되는 GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하되는 하나 이상의 T 세포에 먼저 자극을 처리한 다음, GM-CSF 폴리펩타이드의 발현 수준이 저하되도록 조작할 수 있으며, 그 역순도 가능하다. 일부 경우에, 입양 세포 요법에 이용되는 사이토카인 폴리펩타이드 (예, GM-CSF 폴리펩타이드)의 수준이 저하되는 하나 이상의 T 세포에 먼저 자극 처리한 다음, 사이토카인 폴리펩타이드의 발현 수준이 저하되도록 조작할 수 있다. T 세포는 임의의 적절한 방법으로 자극될 수 있다. 예를 들어, T 세포를 하나 이상의 CD 폴리펩타이드와 접촉시킴으로써 T 세포를 자극할 수 있다. T 세포를 자극하기 위해 이용가능한 CD 폴리펩타이드의 예로는, 비-제한적으로, CD3, CD28, 유도성 T 세포 공동-자극인자 (ICOS), CD137, CD2, OX40 및 CD27을 포함한다. 일부 경우에, CRISPR/Cas 시스템의 구성성분 (예를 들어, gRNA 및/또는 Cas 뉴클레아제)을 T 세포에 도입하여, 하나 이상의 사이토카인 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)를 코딩하는 핵산을 KO 시키기 전에, T 세포를 CD3 및 CD28로 자극할 수 있다.
본원은 또한 암 치료에 관여하는 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들어, 사이토카인 폴리펩타이드의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) 하나 이상의 T 세포 (예를 들어, GM-CSF KO T 세포)는 (예를 들어, CART 요법과 같은 입양 세포 요법에서) 암에 걸린 포유류 (예를 들어, 인간)에 투여하여 포유류를 치료할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같이, 암에 걸린 포유류를 치료하는 방법은 포유류에서 암 세포 (예를 들어, 종양 항원을 발현하는 암 세포)의 수를 줄일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같이, 암에 걸린 포유류를 치료하는 방법은 포유류에서 하나 이상의 종양 (예, 종양 항원을 발현하는 종양)의 크기를 줄일 수 있다.
일부 경우에, 포유류에 사이토카인 폴리펩타이드의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) T 세포 (예를 들어, GM-CSF KO T 세포)의 투여시, CRS는 발생하지 않는다. 예를 들어, 포유류에 GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 T 세포의 투여시, CRS와 관련된 사이토카인 (예, CRS의 주요 사이토카인) 방출은 발생되지 않는다. CRS와 관련된 사이토카인의 예로는, 비-제한적으로, IL-6, G-CSF, IFN-g, IL-lB, IL-10, MCP-1, MIG, MIP, MIP lb, TNF-a, IL-2 및 퍼포린을 포함한다.
일부 경우에, 포유류에 사이토카인 폴리펩타이드의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) T 세포 (예를 들어, GM-CSF KO T 세포)의 투여시, 신경독성은 나타나지 않는다. 예를 들어, 포유류에 GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 T 세포의 투여시, 백혈구 세포의 분화 및/또는 활성화, 신경독성과 관련있는 분화 및/또는 활성화는 발생하지 않는다. 신경독성과 관련있는 분화 및/또는 활성화되는 백혈구 세포의 예로는, 비-제한적으로, 단핵구, 대식세포, T-세포, 수지상 세포, 미세아교세포, 성상 세포 및 호중구를 포함한다.
암에 걸린 임의의 적절한 포유류 (예를 들어, 인간)는 본원에 기술된 바와 같이 치료할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이 치료가능한 포유류의 예로는, 비-제한적으로, 인간, 영장류 (예, 원숭이), 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 마우스 및 랫을 포함한다. 예를 들어, 암에 걸린 인간은 사이토카인 폴리펩타이드의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) 하나 이상의 T 세포 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드)로, 예를 들어 본원에 기술된 방법 및 물질을 이용한 CAR-T 세포 요법과 같은 입양 T 세포 요법으로, 치료할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 암에 걸린 포유류 (예를 들어, 인간)를 치료하는 경우, 암은 임의의 적절한 암일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같이 치료되는 암은 고형 종양일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같이 치료되는 암은 혈액암일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같이 치료되는 암은 원발성 암일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같이 치료되는 암은 전이 암일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같이 치료되는 암은 난치성 암일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같이 치료되는 암은 재발성 암일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같이 치료되는 암은 종양-관련 항원 (예를 들어, 암 세포에 의해 생산되는 항원 물질)을 발현할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이 치료가능한 암에 대한 예로는, 비-제한적으로, B 세포 암 (예를 들어, 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL) 및 B 세포 백혈병), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 소포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 다발성 골수종, 두경부암, 육종, 유방 암, 악성 위장암, 방광암, 요로상피암, 신장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 생식기 암 (예를 들어, 남성 생식기 암 및 여성 생식기 암) 및 골암을 포함한다. 예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) 하나 이상의 T 세포 (예를 들어, GM-CSF KO T 세포)를 이용해 DLBCL에 걸린 포유류를 치료할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 GM-CSF 폴리펩타이드 (예를 들어, GM-CSF KO T 세포)의 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) T 세포를 이용해 ALL에 걸린 포유류를 치료할 수 있다.
임의의 적절한 방법을 이용해 암에 걸린 포유류를 식별할 수 있다. 예를 들어, 이미지 촬영 기법 및 생검 기법을 이용해 암에 걸린 포유류 (예, 인간)를 식별할 수 있다.
포유류는, 암 (예를 들어, DLBCL 또는 ALL)에 걸린 것으로 식별되면, 본원에 기술된 사이토카인 폴리펩타이드의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) 하나 이상의 T 세포 (예를 들어, GM-CSF KO T 세포)를 투여할 수 있다.
예를 들어, 사이토카인 폴리펩타이드의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) 하나 이상의 T 세포 (예를 들어, GM-CSF KO T 세포)는, 암에 걸린 포유류를 치료하기 위해, 입양 T 세포 요법 (예를 들어, CAR-T 세포 요법)에서 이용할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 T 세포는 포유류 (예를 들어, 암에 걸린 포유류)에서 임의의 적절한 항원을 표적화하는 입양 T 세포 요법 (예를 들어, CAR-T 세포 요법)에 이용할 수 있다. 일부 경우에, 항원은 종양-관련 항원 (예를 들어, 암 세포에 의해 생산되는 항원 물질)일 수 있다. 본원에 제공된 입양 T 세포 요법에 의해 표적화 가능한 종양-관련 항원의 예로는, 비-제한적으로, CD19 (DLBCL, ALL 및 CLL 관련), AFP (생식세포종 및/또는 간세포암 관련), CEA (장암, 폐암 및/또는 유방암 관련), CA-125 (난소암 관련), MUC-1 (유방암 관련), ETA (유방암 관련), MAGE (악성 흑색종 관련), CD33 (AML 관련), CD123 (AML 관련), CLL-1 (AML 관련), E-카드헤린 (상피 종양 관련), 폴레이트 수용체 α (난소암 관련), 폴레이트 수용체 β (난소암 및 AML 관련), IL13R (뇌암 관련), EGFRviii (뇌암 관련), CD22 (B 세포 암 관련), CD20 (B 세포 암 관련), κ 경쇄 (B 세포 암 관련), λ 경쇄 (B 세포 암 관련), CD44v (AML 관련), CD45 (혈액암 관련), CD30 (호지킨 림프종 및 T 세포 림프종 관련), CD5 (T 세포 림프종 관련), CD7 (T 세포 림프종 관련), CD2 (T 세포 림프종 관련), CD38 (다발성 골수종 및 AML 관련), BCMA (다발성 골수종 관련), CD138 (다발성 골수종 및 AML 관련), FAP (고형 종양 관련), CS-1 (다발성 골수종 관련) 및 c-Met (유방암 관련)를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 T 세포는 본원에 기술된 바와 같이 암을 치료하기 위해 CD19을 표적화하는 CAR-T 세포 요법 (예를 들어, CART19 세포 요법)에 사용할 수 있다.
일부 경우에, 사이토카인 폴리펩타이드의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) 하나 이상의 T 세포 (예를 들어, GM-CSF KO T 세포)는 입양 T 세포 요법 (예를 들어, CAR-T 세포 요법)에 사용해 암 이외의 다른 질환 또는 장애를 가진 포유류를 치료할 수 있다. 예를 들어, GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 하나 이상의 T 세포는 포유류에서 임의의 적절한 질환-관련 항원 (예를 들어, 특정 질환에 의해 영향을 받은 세포에 의해 생산되는 항원 물질)을 표적화하는 입양 T 세포 요법 (예를 들어, CAR-T 세포 요법)에 사용할 수 있다. 본원에 제공된 입양 T 세포 요법에 의해 표적화 가능한 질환-관련 항원에 대한 예로는, 비-제한적으로, 데스모프레신 (자가면역 피부 질환 관련)을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 입양 T 세포 요법에 의해 표적화 가능한 질환-관련 항원에 대한 예로는, 비-제한적으로, DSG3 항원, 심상성 천포창에서 DSG3에 결합하는 B 세포 수용체 (BCR) 또는 항원 MuSK를 포함한다. 추가적인 구현예에서, 본원에 제공된 입양 T 세포 요법에 의해 표적화 가능한 질환-관련 항원에 대한 예로는, 비-제한적으로, MuSK 중증 근무력증에서 MuSK에 대한 BCR을 포함한다.
일부 경우에, 입양 T 세포 요법 (예를 들어, CAR-T 세포 요법)에서 사용되는 사이토카인 폴리펩타이드의 발현 수준이 저하된 (예, 저하되도록 조작된) 하나 이상의 T 세포 (예를 들어, GM-CSF KO T 세포)는, 암을 치료하기 위해 사용되는 하나 이상의 부가적인 물질과의 병용 요법으로서 암에 걸린 포유류에 투여할 수 있다. 예를 들어, 입양 세포 요법에서 사용되는 하나 이상의 GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 T 세포는 하나 이상의 항암 치료 (예를 들어, 수술, 방사선 요법, 화학요법 (예를 들어, 부설판 (busulfan)과 같은 알킬화제), 표적 요법 (예를 들어, 렌질루맵과 같은 GM-CSF 저해제), 호르몬 요법, 혈관신생 저해제, 면역억제제 (예를 들어, 톡실리주맵 (tocilizumab)과 같은 인터루킨-6 저해제)) 및/또는 하나 이상의 CRS 치료제 (예를 들어, 룩솔리티닙 (ruxolitinib) 및 이브루티닙 (ibrutinib))와 조합하여 포유류에 투여할 수 있다. 입양 세포 요법에 사용되는 하나 이상의 GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 T 세포가 암을 치료하는 부가적인 물질과 함께 사용될 경우, 하나 이상의 부가적인 물질은 동시에 또는 독립적으로 투여할 수 있다. 일부 경우에, 입양 세포 요법에 사용되는 하나 이상의 GM-CSF 폴리펩타이드의 수준이 저하된 T 세포를 먼저 투여한 다음 하나 이상의 부가적인 물질을 투여할 수 있거나, 또는 그 역순도 가능하다.
미국 특허 8,168,183 및 9,017, 674에 언급되고 본원에 기술된 구현예에 따른 hGM-CSF 중화 항체인 렌질루맵 (Humanigen, Burlingame, CA)은, 인간 GM-CSF를 중화하는 새로운 최초의 Humaneered® 단일클론 항체 클래스이며, 상기한 문헌들은 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가적으로 설명될 것이며, 실시예들은 청구항에 기술된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1
CAR-T 세포 요법의 치료 지수를 높이기 위한 결함성 CAR-T 세포로의 사이토카인 구축
본 실시예는 GM-CSF 넉아웃 (GM-CSF KO) CART19 세포의 개발을 기술하며, 제조된 GM-CSF KO CART19 세포가 정상적으로 기능하고 강화된 증폭성을 가짐을 보여준다.
실험 설계:
B 세포 백혈병 이종이식 모델에서 CAR19을 이용하였다. 본원에 기술된 바와 같이 패킹 및 렌티바이러스 생산하기 위해 플라스미드를 이용하였다. 마우스 모델로서, 2가지 모델을 이용하였다:
1. 이종이식 모델: NSG 마우스에 CD19 양성, 루시퍼라제 양성 세포주 NALM6를 피하 접종하였다. 생발광 이미지 촬영으로 생착을 검증하였다. 마우스에 인간 PBMC를 정맥내 처리하고, 렌티바이러스 입자를 종양내 주사하였다. 유세포 측정을 통해 CAR-T 세포의 구축을 확인하였다. 종양 부위로의 CART의 이동을 분석하였으며, 질환 부담의 척도로서 생발광 이미지 촬영을 통해 항-종양 반응을 측정하였다.
2. Jackson Laboratory 사의 인간화 면역 시스템 (Humanized Immune System, HIS) 마우스: 마우스에 태아 CD34+ 세포를 신생아로서 주사한 후 인간 조혈작용을 발생시켰다. 이들 마우스에 기존에 사용된 바와 같이 CD19+ 세포주 NALM6를 생착시켰다. 마찬가지로, 렌티바이러스 입자를 종양내 주사하여 CART19를 생체내 생성시켰다. 그런 후, CART19 세포의 NALM6 소거 활성을 측정하고, (현재 임상적으로 사용되는) 생체외 생성된 렌티바이러스가 형질도입된 CART19 세포와 비교하였다.
재료 및 방법:
CAR 플라스미드 제작:
CAR 백본에서 4lBB 및 CD3 zeta를 이용해 항-CD19 클론 FMC63를 신규 합성한 다음 3세대 렌티바이러스 백본에 클로닝하였다.
대조군 CART19 세포를 구축하기 위해, 정상 공여 T 세포를 pan T 세포 키트를 사용해 음성 선별하고, 항-CD3/CD28 Dynabeads (Invitrogen, 배양 첫날 첨가)를 사용해 생체외 증폭시켰다. T 세포는 자극 후 다음날 감염 다중도 (MOI) 3으로 렌티바이러스 상층액을 형질도입하였다. 6일에 항-CD3/CD28 Dynabead를 제거하고, T 세포 배지 (X-vivo 15 배지, 인간 혈청 5%, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민)에서 최대 15일간 T 세포를 배양한 다음 향후 실험을 위해 냉동보존하였다. T 세포는 모든 실험들에서 사용전 해동하여, 37℃에서 밤새 회복시켰다.
GM- CSF 넉아웃 CAR-T 세포의 구축:
GM-CSF 넉아웃 CAR-T 세포를 2가지 방법으로 CRISR-Cas9 시스템을 이용해 구축하였다:
1. gRNA를 제작해 렌티바이러스에 클로닝하여, Cas9 및 gRNA를 코딩하도록 구축하였다. T 세포의 증폭 중에, 1일에 렌티바이러스를 T 세포에 형질도입하고, 같은 날 CAR19 렌티바이러스 입자를 동시에 형질도입하였다. 8일간 세포를 증폭시킨 다음 T 세포를 회수하여 DNA를 단리하고, 서열분석하여 넉아웃 효율을 조사하였다. 이들 세포를 냉동보존하고, 향후 시험관내 또는 생체내 실험에 사용하였다. 이를 코딩하는 핵산 서열은 도 5에 도시한다.
2. gRNA로부터 mRNA를 제조하고, 이를 사용해 GM-CSF를 넉아웃시켰다. 이를 위해, gRNA를 RNP와 1:1 비율로 혼합한 다음 CD3/CD28 비드로 자극한지 3일 후 T 세포에 전기천공으로 도입하였다. 세포를 8일간 증폭시켜 T 세포를 회수하고, DNA를 단리 및 서열분석하여 넉아웃 효율을 조사하였다. 이들 세포를 냉동보존하고, 향후 시험관내 또는 생체내 실험에 이용하였다.
세포
NALM6 세포는 ATCC에서 입수하여, R10 배지 (RPMI 배지, 10% 소 태아 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신)에서 유지시켰다. EF1α 프로모터의 통제 하의 루시퍼라제-GFP로 형질도입된 NALM6 세포를 일부 실험들에서 지정된 바와 같이 이용하였다. 비-식별된 일차 인간 ALL 생검을 메이요 클리닉 바이오뱅크로부터 입수하였다. 모든 샘플은 고지에 의한 서면 동의 후 입수하였다. 모든 기능성 실험에서, 세포는 분석하기 적어도 12시간 전에 해동하여, 37℃에서 밤새 회복시켰다.
유세포 측정 분석
항-인간 항체는 BioLegend, eBioscience 또는 BD Biosciences 사에서 구입하였다. 시험관내 배양 또는 동물로부터 세포를 단리하고, 2% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에서 1번 세척하였으며, Fc 수용체를 차단한 후 4℃에서 염색하였다. 세포 수를 측정하기 위해, 카운트브라이트 (Countbright) 비드 (Invitrogen)를 제조사의 지침 (Invitrogen)에 따라 이용하였다. 모든 분석들에서, 대상 집단은 정방향 산란 특징 대 측면 산란 특징을 토대로 게이팅한 다음 싱글렛 게이팅을 수행하였으며, 살아있는 세포를 Live Dead Aqua (Invitrogen)를 이용해 게이팅하였다. Jackson Immunoresearch 사의 Alexa Fluor 647-접합된 염소 항-마우스 F(ab')2 항체로 염색하여, 항-CD19 CAR의 표면 발현을 검출하였다.
T 세포 기능 분석:
T 세포 탈과립 및 세포내 사이토카인 분석:
간략하게는, T 세포를 표적 세포와 함께 1:5 비율로 인큐베이션하였다. CAR 발현에 대해 염색 처리한 후, 인큐베이션 중에 CD107a, CD28, CD49d 및 모넨신을 첨가하였다. 4시간 후, 세포를 회수하고, CAR 발현, CD3 및 Live Dead staining (Invitrogen)으로 염색하였다. 세포를 고정 및 투과화 (FIX & PERM® Cell Fixation & Cell Permeabilization Kit, Life technologies)한 다음 세포내 사이토카인 염색을 수행하였다.
증식 분석:
T 세포를 헹구고, PBS 100 ㎕에 1x107/ml로 현탁한 후 CFSE 2.5μM (Life Technologies) 100 ㎕로 37℃에서 5분간 표지하였다. 그런 후, 반응물을 차가운 R10으로 퀀칭하고, 세포를 3회 세척하였다. 표적에 100 Gy를 조사하였다. T 세포를 방사선 조사 처리한 표적 세포와 함께 1:1 비율로 120시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후, 세포를 회수하여 CD3, CAR 및 Live Dead aqua (Invitrogen)로 염색하였으며, 카운트브라이트 비드 (Invitrogen)를 첨가한 후 유세포 측정 분석을 수행하였다.
세포독성 분석:
NALM6-Luc 세포 또는 CFSE (Invitrogen) 표지된 원발성 ALL 샘플로 세포독성 분석을 실시하였다. 간략하게는, 표적을 작동자 T 세포와 함께 지정된 비율로 4, 16, 24, 48 및/또는 72시간 동안 인큐베이션하였다. Xenogen IVIS-200 스펙트럼 카메라에서 생발광 이미지 촬영 또는 유세포 측정에 의해 사멸을 계산하였다. 후자의 경우, 세포를 회수하고; 카운트브라이트 비드 및 7-AAD (Invitrogen)를 첨가한 후 분석하였다.
잔류하는 표적 세포는 CFSE+ 7-AAD-이었다.
방출된 사이토카인 측정:
작동자 세포 및 표적 세포를 1:1 비율로 T 세포 배지에서 지정된 바와 같이 24시간 또는 72시간 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 회수하고, 제조사의 프로토콜 (Invitrogen)에 따라 30-plex Luminex 어레이에 의해 분석하였다.
결과
GM-CSF KO CAR-T 세포를 CRISR-Cas9 시스템을 사용해 구축하였다. T 세포 증폭 중에, gRNA 및 Cas9을 코딩하는 렌티바이러스 및 CAR19을 코딩하는 렌티바이러스를 T 세포에 형질도입하였다 (1일). 세포를 8일간 증폭시켰다. 8일 후, T 세포를 회수하여 DNA를 단리하였으며, 단리한 DNA는 서열분석하여 넉아웃 효율을 평가하였다. 예를 들어, 도 1을 참조한다. T 세포의 넉아웃 효율은 24.1%였으며 (도 2A), CAR 형질도입 효율은 73%이었다 (도 2B).
GM-CSF KO CAR-T 세포의 세포 작동자 기능을 조사하기 위해, CART19, GM-CSF KO CART19, UTD 또는 GM-CSF KO UTD를 CD19 양성 세포주 NALM6와 1:5의 비율로 공동-배양하였다. 4시간 후, 세포를 회수하여, 투과화 및 고정 처리한 후 사이토카인을 염색하였다 (도 3).
GM-CSF KO CAR-T 세포의 증식을 평가하기 위해, T 세포에 형질도입한 후 증폭 카이네틱스를 추적하였다. GM-CSF KO CAR-T 세포는 CART19 단독으로 형질도입된 세포와 비교해 더 활발하게 증폭하였다 (도 4).
이들 결과는, GM-CSF 넉아웃 CART가 CAR-T 세포 기능 및 항-종양 활성을 강화할 수 있음을, 보여준다. 이들 결과는, 또한, CART19과 조합하여 GM-CSF의 차단이 CAR-T 세포 작동자 기능에 영향을 미치지 않는다는 것을, 보여준다.
실시예 2
CART 요법 중의 GM- CSF 고갈은 사이토카인 방출 증후군 및 신경독성을 감소시키고, CAR-T 세포 기능을 강화할 수 있다
본 실시예는 CAR-T 세포 관련 독성을 다루기 위한 가능성있는 전략으로서 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 및 골수 세포의 고갈을 조사하였다. 중화 항체를 이용한 GM-CSF 차단은 시험관내 또는 생체내에서 CART 기능을 저해하지 않는 것으로 확인되었다. CAR-T 세포 증식이 시험관내에서 강화되었으며, CAR-T 세포는 GM-CSF 고갈 후 환자 유래 이종이식에서 백혈병을 더 효과적으로 제어하는 것으로 나타났다. 또한, CRS 및 NT의 일차 급성 림프모구성 백혈병 이종이식 모델에서는, GM-CSF 차단시 골수 세포 감소 및 뇌의 T 세포 침윤 저하가 나타났으며, CRS 및 NT 발생이 개선되었다. 마지막으로, CAR-T 세포 조작시 CRISPR/cas9에 의한 GM-CSF 파괴를 통해 GM-CSF 넉아웃 CAR-T 세포가 구축되었다. GM-CSFk /O CAR-T 세포는 계속 정상적으로 기능하였으며, 생체내 항-종양 활성이 강화되었다. 이는, GM-CSF 중화가 신경독성 및 CRS를 무력화할 수 있으며, 또한 CAR-T 세포 기능을 강화할 수 있다는 것을, 입증해준다.
재료 및 방법
세포주 및 일차 세포
NALM6 및 MOLM13은 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 입수하여, 루시퍼라제-ZsGreen 렌티바이러스 (addgene)를 형질도입하였으며, 순도 100%로 분류하였다. 세포주를 R1O (RPMI, 10% FCS v/v, 1% pen strep v/v)에서 배양하였다. 일차 세포는 메이오 클리닉 바이오뱅크에서 급성 백혈병 환자로부터 생명윤리위원회로부터 승인된 프로토콜에 따라 입수하였다. 실험실에서 재조합 DNA의 이용은 국제 생물안전 위원회 (IBC)로부터 승인받았다.
일차 T 세포 및 CAR-T 세포
말초혈 단핵 세포 (PBMC)는 피콜 프로토콜을 이용해 비-식별된 공여 혈액 성분채집 콘으로부터 단리하였다 (예, Dietz et al., 2006 Transfusion 46:2083-2089 참조, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). T 세포를 음성 선택 자기 비드 (Stemcell technologies)를 사용해 분리하고, 단핵구를 CD14+ 자기 비드 (Stemcell technologies)를 사용해 양성 선별하였다. 일차 세포를 5% 인간 혈청, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타맥스가 첨가된 X-Vivo 15 배지에서 배양하였다. 후술한 바와 같이 정상적인 공여 T 세포에 렌티바이러스의 형질도입을 통해 CD19 특이적인 CAR-T 세포를 구축하였다. 2세대 CAR19 구조체를 신규 합성 (IDT)하고, 3세대 렌티바이러스에 EF-la 프로모터의 통제 하에 클로닝하였다. CD19 특이 단쇄 가변성 단편은 클론 FMC63으로부터 입수하였다. 2세대 4lBB 공동-자극된 (FMC63-41BBz) CAR 구조체를 합성하여, 이들 실험에 사용하였다. 리포펙타민 3000, VSV-G 및 패킹 플라스미드의 존재 하에, 293T 바이러스 생산 세포에 플라스미드를 일시적으로 형질감염시켜, 렌티바이러스 입자를 생성하였다. 정상 공여체로부터 단리한 T 세포는 CD3/CD28 자극 비드 (StemCell)로 1:3 비율에서 자극한 다음, 자극한지 24시간 후 감염 다중도 3.0으로 렌티바이러스 입자를 형질도입하였다. 6일차에 자기 비드를 제거하고, CAR-T 세포를 회수하였으며, 8일차에 향후 실험을 위해 냉동보존하였다. 실험에 사용하기 전에 CAR-T 세포를 해동시켜, 12시간 동안 T 세포 배지에서 회복시켰다.
GM- CSF k /o CAR-T 세포 구축:
인간 GM-CSF에 대해 높은 효율을 가지는 것으로 기존에 보고된 gRNA 스크리닝을 통해 인간 GM-CSF의 엑손 3을 표적화하는 가이드 RNA (gRNA)를 선별하였다. 이 gRNA는 U6 프로모터 (GenScript, Township, NJ, USA) 하에 통제되는 CAS9 3세대 렌티바이러스 구조체 (lentiCRISPRv2)로 주문하였다. 이 구조체를 코딩하는 렌티바이러스 입자를 전술한 바와 같이 제조하였다. T 세포를 CD3/CD28 비드로 자극한 후, 24시간 후 T 세포에 CAR19 및 GM-CSFgRNA-lentiCRISPRv2 렌티바이러스를 이중 형질도입하였다. 그런 후, CAR-T 세포 증폭을 상기와 같이 수행하였다. GM-CSF 표적화 효율을 분석하기 위해, PureLink 게놈 DNA 미니 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용해 GM-CSFk/o CART19 세포로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 대상 DNA를 Choice Taq Blue Mastermix (Thomas Scientific, Minneapolis, MN, USA)를 사용해 PCR로 증폭시키고, QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen, Germantown, MD, USA)를 사용해 겔 추출하여 편집을 확인하였다. PCR 증폭산물을 Eurofins 서열분석 (Louisville, KY, USA)하고, 대립유전자 변형 빈도를 tide.nki.nl에서 이용가능한 TIDE (Tracking of lndels by Decomposition) 소프트웨어를 사용해 계산하였다. 도 15는 GM-CSFk/o CART 19 구조를 구축하기 위한 계획, 프라이머 서열 및 gRNA 서열을 도시한다.
GM- CSF 중화 항체 및 이소형 대조군
렌질루맵 (Humanigen, Brisbane, CA)은 미국 특허 8,168,183 및 9,017, 674에 기술된 바와 같이 인간 GM-CSF를 중화하는 인간화 항체로서, 이들 문헌은 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 시험관내 실험에서 렌질루맵 또는 이소형 대조군 10 ㎍/mL을 사용하였다. 생체내 실험에서는 렌질루맵 또는 이소형 대조군 10 mg/kg을 주사하였으며, 계획, 경로 및 빈도는 각각의 실험 계획에 표시한다. 일부 실험에서는 항-마우스 GM-CSF 중화 항체 (10 mg/kg)도 실험 계획이 표시된 바와 같이 사용하였다.
T 세포 기능 실험
지정된 바와 같이 CAR-T 세포를 표적과 1:1 비율로 공동-배양한 후 24시간 및 72시간 경과 후 사이토카인 분석을 수행하였다. 인간 GM-CSF 싱글플렉스 (Millipore), 30-플렉스 인간 멀티플렉스 (Millipore) 또는 30-플렉스 마우스 멀티플렉스 (Millipore)를 지정된 바와 같이 이들 실험으로부터 수집한 상층액에 대해 수행하였다. 이는 유세포 측정 비드 또는 루미넥스를 사용해 분석하였으며, CAR-T 세포와 표적을 1:5의 비율로 37℃에서 4시간 동안 모넨신, hCD49d 및 hCD28 하에 인큐베이션한 후, 세포내 사이토카인 분석 및 T 세포 탈과립 분석을 수행하였다. 4시간 후, 세포를 회수하여 세포 표면을 염색한 다음, 고정 및 투과화 (FIX & PERM Cell Fixation & Cell Permeabilization Kit, Life Technologies)하여 세포내 염색을 수행하였다. 증식을 분석하기 위해, CFSE (Life Technologies) 표지된 작동자 세포 (CART19)와 방사선 조사된 표적 세포를 1:1 비율로 공동 배양하였다. 일부 실험에서는, CD14+ 단핵구를 공동-배양물에 지정된 바와 같이 1:1:1 비율로 첨가하였다. 세포를 특정 실험에서 지정된 바와 같이 3-5일간 공동 배양한 다음 세포를 회수하고, 항-hCD3 및 live/dead aqua로 표면을 염색하였다. 특정 실험에서는 지정된 바와 같이 여러가지 농도의 PMA/이오노마이신을 T 세포의 양성 비-특이 자극제로 사용하였다. 사멸 분석에서는, CD19+ 루시퍼라제+ ALL 세포주 NALM6 또는 CD19- 루시퍼라제+ 대조군 MOLM13 세포를 특정 실험들에서 열거된 바와 같이 24시간 또는 48시간 동안 작동자 T 세포와 지정된 비율로 함께 인큐베이션하였다. 남아있는 생존 세포의 척도로서 Xenogen IVIS-200 스펙트럼 카메라 (PerkinElmer, Hopkinton, MA, USA)에서 생발광 이미지를 촬영함으로써 사멸을 계산하였다. 이미지 촬영하기 10분 전에, 샘플에 샘플 부피 100 ㎕ 당 1 ㎕로 D-루시페린 (30 ㎍/mL)을 처리하였다.
다중-매개변수 유세포 측정
항-인간 항체는 Biolegend, eBioscience 또는 BD Biosciences 사에서 구입하였다. 세포를 시험관내 배양물 또는 동물의 말초혈로부터 (ACK 세포용해 후) 분리하고, 2% 소 태아 혈청이 첨가된 포스페이트-완충 염수에서 2번 헹군 다음 4℃에서 염색하였다. 세포수를 측정하기 위해, 카운트브라이트 비드 (Invitrogen)를 제조사의 지침 (Invitrogen)에 따라 사용하였다. 전체 분석에서, 대상 집단을 정방향 산란 특징 대 측면 산란 특징을 토대로 게이팅한 다음 싱글렛 게이팅을 수행하였으며, 살아있는 세포를 Live Dead Aqua (Invitrogen)를 이용해 게이팅하였다. 염소 항-마우스 F(ab')2 항체로 염색하여, CAR의 표면 발현을 검출하였다. 4-레이저 Canto II 분석기 (BD Biosciences)에서 유세포 측정을 수행하였다. 모든 분석은 FlowJo Xl0.0.7r2를 사용해 수행하였다.
이종 마우스 모델
8-12주령의 NOD-SCID-IL2ry-/- (NSG) 마우스 수컷과 암컷을 동물 관리 및 이용 위원회 (IACUC)로부터 승인받은 사육 프로토콜에 따라 메이오 클리닉의 비교 의학 분과에서 사육 및 관리하였다. 마우스는 BSL2+ 수준 실험을 위해 생물안전위원회로부터 승인된 동물 장벽 공간에서 유지시켰다.
NALM6 세포주 이종이식
CD19+ 루시퍼라제+ ALL NALM6 세포주를 이용해 ALL 이종이식을 확립하였다. 이러한 이종이식 실험은 여러가지 IACAC 프로토콜에 의해 승인받았다. 이에, 세포 1xl06주를 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 주사하였다. 동물은, 주사 후 6일차에 Xenogen IVIS-200 스펙트럼 카메라로 생발광 이미지를 촬영하여, 생착을 검증하였다. D 루시페린 (15 mg/ml)을 10 ㎕/g로 복막내 주사한 후 이미지를 촬영하였다. 그런 후, 마우스를 생발광 이미지를 토대로 무작위 분류하여, 특정 실험에 개략적으로 기술된 바와 같이 여러가지 처리를 실시하였다. 전형적으로, CAR-T 세포 또는 UTD 세포 1-2 x 106주를 주사하였으며, 실제 용량은 특정 실험 설명에 기술하였다. 매주 사진을 촬영하여 질환 부담을 분석 및 추적하였다. CAR-T 세포를 주사하고 7-10일차에 꼬리 정맥을 통해 채혈해, T 세포 증폭을 분석하였으며, 필요에 따라 추적하였다. 마우스 말초혈을 ACK 세포용해 완충제 (Thermofisher)로 세포용해시킨 후 유세포 측정 실험에 사용하였다. Xenogen IVIS-200 스펙트럼 카메라 (PerkinElmer, Hopkinton, MA, USA)로 생발광 이미지를 획득하고, Living Image version 4.4 (Caliper LifeSciences, PerkinElmer)로 분석하였다. 항체 처리된 마우스의 경우, 항체 요법 (10 mg/kg 렌질루맵 또는 이소형 대조군)을 총 10일간 IP로 개시하였다.
원발성 환자 유래 ALL 이종이식
원발성 ALL 이종이식을 확립하기 위해, 먼저 NSG 마우스에 30 mg/kg 부설판을 IP로 투여하였다. 다음날, 마우스에 재발성 불치성 ALL 환자의 말초혈로부터 유래된 일차 모세포 2x106주를 주사하였다. 4-6주 동안 마우스에서 생착을 모니터링하였으며, CD19+ 세포가 혈중에서 일정한 수준으로 (>1 세포/㎕) 관찰되면, 무작위로 분류하여, 항체 요법 (CAR-T 세포 요법 투여 당일부터 시작해 총 10일간 10 mg/kg 렌질루맵 또는 이소형 대조군 IP)과 함께 또는 항체 요법 없이, 여러가지 CART19 또는 UTD (세포 1 x l06주) 처리를 수행하였다. 마우스에서 꼬리 정맥 채혈을 통해 백혈병 부담을 주기적으로 모니터링하였다.
CRS/NT에 대한 원발성 환자 유래 ALL 이종이식
상기 실험들과 마찬가지로, 마우스에 부설판 30 mg/kg을 IP로 주사하였다. 다음날, 마우스에 재발성 불치성 ALL 환자의 말초혈로부터 유래된 일차 모세포 1-2x106주를 주사하였다. 4-6주 동안 마우스에서 생착을 모니터링하였으며, CD19+ 세포가 혈중에서 고 수준으로 (≥10 세포/㎕) 관찰되면, 마우스에 CART19 (세포 2-5x106주)를 투여하고, 개별 실험에 상세히 기술된 바와 같이, 총 10일간 항체 요법을 개시하였다. 마우스는 웰빙의 척도로서 체중을 매일 측정하였다. 마우스의 MRI를 CART 주사 후 5-6일째에 촬영하였으며, CART 주사 후 4-11일차에 꼬리 정맥을 통해 채혈하였다. 뇌 MRI 이미지를 Azalyze로 분석하였다.
MRI 획득
Bruker Avance II 7 Tesla 버티컬 보어 소형 동물 MRI 시스템 (Bruker Biospin)을 사용해, 중추 신경계 (CNS) 혈관 투과성을 평가하기 위한 이미지를 획득하였다. 흡입 마취를 유도하였으며, 3-4% 이소플루란으로 유지시켰다. MRI 호환성 활력 징후 모니터링 시스템 (Model 1030; SA Instruments, Stony Brook, NY)을 사용해 획득 기간 동안 호흡수를 모니터링하였다. 마우스에 체중에 따라 100 mg/kg 투여로 가돌리늄을 IP 주사하였으며, 15분간 표준적인 지연 후, 용적 획득 (volume acquisition) T1-가중 스핀 에코 시퀀스를 적용해 (반복 시간 = 150 ms, 에코 시간 = 8 ms, 관심영역: 32 mm x 19.2 mm x 19.2 mm, 매트릭스: 160 x 96 x 96; 평균 횟수 = 1), T1-가중 사진을 입수하였다. 가돌리늄-보강된 MRI 변화는 혈액-뇌-장벽 파괴를 의미한다. 용적 분석을 메이오 클리닉의 바이오메디칼 이미징 리소스에 의해 개발된 분석 소프트웨어를 사용해 수행하였다.
마우스 뇌 조직에 대한 RNA- Seq
miRNeasy 마이크로 키트 (Qiagen, Gaithersburg, MD, USA)를 사용해 RNA를 단리하고, RNase-Free DNase Set (Qiagen, Gaithersburg, MD, USA)를 처리하였다. 메이오 클리닉의 게놈 분석 코어에서 Illumina HTSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, USA)으로 RNA-seq를 수행하였다. 바이너리 베이스 콜 데이터를 Illumina bcl2fastq 소프트웨어를 사용해 fastq로 변환하였다. Trimmomatic를 사용해 어댑터 서열을 제거하고, FastQC로 정성적으로 체크하였다. 최신 인간 (GRCh38) 및 마우스 (GRCm38) 기준 게놈을 NCBI에서 내려받았다. STAR을 사용해 게놈 인덱스 파일을 생성하고, 쌍 형성된 말단 리드를 각 조건에서 게놈에 맵핑하였다. HTSeq3 l을 이용해 각 유전자에 대한 발현 수치를 구하였으며, DeSeq2로 차별적인 발현을 계산하였다. 게놈 온톨로지를 Enrichr를 사용해 분석하였다. 도 16은 전술한 단계들을 요약 개시한다. RNA 서열분석 데이터는 유전자 발현 옴니부스에서 등재 번호 GSE121591로 이용가능하다.
통계
Prism Graph Pad 및 마이크로소프트 엑셀을 사용해 데이터를 분석하였다. Prism을 사용해 히트 맵에서 높은 사이토카인 농도는 "1"로 표준화하고, 낮은 농도는 "0"으로 표준화하였다. 통계학적 검정은 도면 설명에 기술한다.
결과
시험관내 GM- CSF 중화는 단핵구의 존재 하에 CAR-T 세포 증식을 강화하고, CAR-T 세포 작동자 기능을 손상시키지 않는다.
CAR-T 세포 요법 후 GM-CSF 중화를 CRS 및 NT를 방지하기 위한 전략으로서 이용하고자 한다면, CAR-T 세포는 저해되지 않아야 한다. 이에, 본 발명의 초기 실험에서는 CAR-T 세포 작동자 기능에 대한 GM-CSF 중화 효과를 조사하고자 하였다. 이에, CART19 세포를, CD19+ALL 세포주 NALM6와 함께 또는 이의 첨가 없이, 렌질루맵 (GM-CSF 중화 항체) 또는 이소형 대조군 (IgG)의 존재 하에 공동-배양하였다. 렌질루맵은 실제 GM-CSF를 완전히 중화할 수 있었던 반면 IgG 대조군 항체는 그렇지 못하였으며 (도 6A), CAR-T 세포 항원 특이적인 증식을 저해하지 않는 것으로 (도 6B), 확인되었다. CART19 세포를 CD19+ 세포주 NALM6와 단핵구의 존재 하에 공동-배양하였을 때, 렌질루맵은 CART19와 조합하여 항원 특이적인 CART19 증식을 CART19 + 이소형 대조군 IgG와 비교해 기하급수적으로 증가시켰다 (P<0.0001, 도 6C). CAR-T 특이적인 세포독성을 조사하기 위해, CART19 또는 대조군 UTD T 세포를 루시퍼라제+ CD19+ NALM6 세포주와 함께 배양하였으며, 이소형 대조군 항체 또는 GM-CSF 중화 항체를 처리하였다 (도 1D). GM-CSF 중화 항체 처리시 CAR-T 세포의 NALM6 표적 세포 사멸 능력이 저해되지 않았다 (도 6D). 요컨대, 이들 결과는 렌질루맵이 CAR-T 세포 기능을 시험관내에서 저해하지 않으며 단핵구의 존재 하에 CART19 세포 증식을 강화함을 보여주는 것으로, GM-CSF 중화가 CAR-T 세포 매개 효과를 개선할 수 있다는 것을 시사해준다.
생체내 GM- CSF 중화는 이종이식 모델에서 CAR-T 세포의 항-종양 활성을 강화한다.
GM-CSF 고갈이 CART19 작동자 기능을 저해하지 않는다는 것을 검증하기 위해, 이종이식 모델에서 CART19 항-종양 활성에 대한 GM-CSF 중화 효과를 렌질루맵을 이용해 조사하였다. 먼저, CART19 세포의 항-종양 활성이 GM-CSF 중화에 의해 영향을 받는지를 명확하게 조사하기 위해 고안한 재발 모델을 이용하였다. NSG 마우스에 루시퍼라제+ NALM6 세포 1x106주를 주사하고, 마우스가 매우 높은 종양 부담에 도달하기 위한 충분한 시간을 허용하여 6일 후 사진을 촬영하였다. 마우스를 무작위 분류하여 CART19 또는 UTD 세포를 1회 주사하고, 이소형 대조군 항체 또는 렌질루맵을 10일간 주사하였다 (도 7A). CART19 주사 후 8일에 수집한 혈청에 대한 GM-CSF 분석에서는, 렌질루맵이 CART19 요법에서 GM-CSF를 성공적으로 중화하는 것으로 밝혀졌다 (도 7B). CART19 주사 후 1주일 경과 시점의 생발광 사진에서, CART19는 렌질루맵과 조합하여 종양 부담이 높은 재발 모델에서 백혈병을 효과적으로 제어하고, 대조군 UTD 세포에 비해 더 유의한 것으로, 확인되었다 (도 7C). CART19의 처리는, 렌질루맵과 조합하여, GM-CSF 수준을 중화함에도 불구하고, CART19과 대조군 항체와 비슷하게, 강력한 항-종양 활성을 발휘하였으며, 전체 생존율을 개선시키는 것으로 나타났으며, 이는 GM-CSF가 CAR-T 세포 활성을 생체내에서 손상시키지 않는다는 것을 의미한다 (도 8). 이차로, 더 적절한 이종 모델인, 원발성 ALL 환자 유래 이종이식 모델에서, 인간 PBMC의 존재 하에 이들 실험을 수행하였다. 마우스를 부설판 화학요법으로 컨디셔닝화한 후, 수 주간 꼬리 정맥을 통해 연속 채혈하여 생착을 모니터링하였으며, 혈중 CD19+ 모세포가 ≥ 1 ㎕이 되면, 마우스를 무작위 할당하여, CART19 또는 UTD 처리를 PBMC와 조합하여 총 10일간 CART19 주사 당일에 시작하여 렌질루맵 + 항-마우스 GM-CSF 중화 항체 또는 이소형 대조군 IgG 항체와 함께 투여하였다 (도 7D). 이러한 원발성 ALL 이종이식 모델에서, GM-CSF 중화는 CART19 요법과 조합하여, CART19 투여 후 35일보다 장기간 동안 CART19 + 이소형 대조군과 비교해 백혈병 질환을 제어하는 유의한 개선을 나타내었다 (도 7E). 이는, GM-CSF 중화가 CART19 세포 요법 후 재발을 줄이고 지속적인 완전 반응을 높이는데 역할을 할 수 있음을, 시사해준다.
GM- CSF CRISPR 넉아웃 CAR-T 세포는 주요 사이토카인의 수준과 마찬가지로 GM-CSF의 발현을 감소시키고, 항-종양 활성을 강화한다.
CAR-T 세포에서 중요한 GM-CSF의 임의의 역할을 확실히 배제하기 위해, CAR-T 세포 구축에 고 효율성인 것으로 보고되고 CRISPR 렌티바이러스 백본에 클로닝된 gRNA를 이용해 GM-CSF 유전자를 파괴하였다. 이 gRNA를 이용해, CART19 세포에서 약 60%의 넉아웃 효율이 달성되었다 (도 9). CAR-T 세포를 CD19+ 세포주 NALM6로 자극하였을 때, GM-CSFk /o CAR-T 세포는 야생형 GM-CSF 유전자 좌를 가진 CART19 ("야생형 CART19 세포")와 비교해 GM-CSF를 통계학적으로 유의하게 적게 생산하였다. CAR-T 세포에서 GM-CSF 넉아웃시, IFN-γ, IL-2 또는 CAR-T 세포 항원 특이적인 탈과립화 (CD107a) 등의 기타 주요 T 세포 사이토카인의 생산은 손상되지 않았지만 (도 l0A), GM-CSF의 발현은 감소되었다 (도 l0B). GM-CSFk /o CAR-T 세포가 계속 정상적인 기능을 발휘하는지를 검증하기 위해, (도 7A에 기술된 바와 같이) 종양 부담이 높은 재발성 ALL 이종이식 모델에서 생체내 효율을 조사하였다. 이러한 이종이식 모델에서, 야생형 CART19 대신 GM-CSFk /o CART19을 이용한 경우, CART19 처리 후 7일째에 인간 GM-CSF의 혈청내 수준이 현저하게 감소하였다 (도 10B). 생발광 이미지 데이터는, GM-CSFk /o CART19 세포가 이 모델에서 CART19와 비교해 강화된 백혈병 제어성을 나타냄을, 시사해준다 (도 11). 중요하게도, GM-CSFk /o CART19 세포는 야생형 CART19 세포와 비교해 전체 생존율을 유의하게 개선하였다 (도 10C). GM-CSF 이외에는, 인간 (도 l0D) 또는 대조군 (도 10E) 사이토카인에서는 통계학적으로 유의한 변화가 검출되지 않았다. 요컨대, 이들 결과는 도 6 및 7의 결과를 검증해주었으며, GM-CSF 고갈이 CAR-T 효능 기능에 중요한 사이토카인은 손상시키지 않는다는 것을 보여준다. 아울러, 도 10의 결과는, GM-CSFk/o CART가 CAR-T 제조시 변형으로서 GM-CSF 대조군을 "빌트 인"하기 위한 치료학적 옵션일 수 있음을 의미한다.
신경독성 및 사이토카인 방출 증후군에 대한 환자 유래 이종이식 모델
이 모델에서, 컨디셔닝화된 NSG 마우스에 일차 ALL 모세포를 생착시키고, 질환 부담이 고 수준에 도달할 때까지 수주간 생착을 모니터링하였다 (도 12A). 말초혈에서 CD19+ 모세포 수준이 ≥10/㎕에 도달하면, 마우스를 무작위 할당하여 지정된 바와 같이 여러가지 처리를 투여하였다 (도 12A). (대조군 IgG 항체 또는 GM-CSF 중화 항체와 함께) CART19 처리시, 질환이 성공적으로 해소되었다 (도 12B). CART19 처리 후 4-6일 이내에, 마우스에서 운동 장애, 구부러진 신체 및 점진적인 체중 감소; CRS 및 NT에 상응하는 증상들이 나타나기 시작하였다. 이는, CAR-T 세포 요법 후 인간 CRS에서 관찰되는 바와 마찬가지로, CART10 주사 후 4-11일에 혈청내 주요 사이토카인의 상승과 연관되어 있었다 (인간 GM-CSF, TNF-a, IFN-y, IL-10, IL-12, IL-13, IL-2, IL-3, IP-10, MDC, MCP-1, MIP-la, MIP-1, 및 마우스 IL-6, GM-CSF, IL-4, IL-9, IP-10, MCP-1 및 MIG). CART19가 처리된 이들 마우스에서는, 또한, 뇌-장벽 파괴 및 잠재적으로 뇌 부종을 의미하는, 비정상적인 T1 강화가 관찰되는 뇌 MRI 분석 (도 12D) 및 인간 CART19 세포의 침윤이 관찰되는 뇌에 대한 유세포 측정 분석 (도 12E)에서 확인된 바와 같이, NT가 발생하였다. 아울러, 이러한 NT 징후가 나타난 마우스로부터 회수한 뇌 단편을 RNA-seq 분석한 바, T 세포 수용체, 사이토카인 수용체, T 세포 면역 활성화, T 세포 이동 및 T 세포와 골수 세포의 분화를 조절하는 유전자들의 유의한 상향 조절이 확인되었다 (표 1).
표 1. CART19 세포 처리 후 환자 유래 이종이식 모델로부터 입수한 뇌에서 변형된 표준 경로들.
표준 경로 조정된 P-값 유전자
면역 반응의 조절 (G0:0050776) 9.45E-14 IFITM1, ITGB2, TRAC, ICAM3, CD3G, PTPN22, CD3E, ITGAL, SAMHD1, SLA2, CD3D, ITGB7, SLAMF6, B2M, NPDC1, CD96, BTN3A1, ITGA4, SH2D1A, HLA-B, HLA-C, BTN3A2, HLA-A, CD8B, SELL, CD8A, CD226, CD247, CLEC2D, HCST, B1RC3
사이토카인-매개 신호전달 경로 (G0:0019221) 1.36E-12 IFITM1, SP100, TRADD, ITGB2, IL2RG, SAMHD1, IL27RA, OASL, CNN2, IL18RAP, RIPK1, CCR5, IL12RB1, B2M, GBP1, IL6R, JAK3, CCR2, IL32, ANXA1, IL4R, TGFB1, IL10RB, IL10RA, STAT2, PRKCD, HLA-B, HLA-C, IL16, HLA-A, TNFRSF1B, CD4, IRF3, OAS2, IL2RB, FAS, TNFRSF25, LCP1, P4HB, IL7R, MAP3K14, CD44, IL18R1, IRF9, MYD88, B1RC3
T 세포 수용체 복합체 (G0:0042101) 1.30E-11 ZAP70, CD4, CD6, CD8B, CD8A, CD3G, CD247, CD3E, CD3D, CARD11
T 세포 활성화 (G0:0042110) 2.07E-11 ITK, RHOH, CD3G, NLRC3, PTPN22, CD3E, SLA2, CD3D, CO2, ZAP70, CD4, PTPRC, CD8B, CD8A, LCK, CD28, LCP1, LAT
T 세포 활성화의 조절 (G0:0050863) 2.46E-10 PTPN22, LAX1, CCDC88B, CD2, CD4, LCK, SIT1, TBX21, TIGIT, JAK3, LAT, PAG1, CCR2
T 세포 수용체 신호전달 경로 (G0:0050852) 4.35E-08 ITK, BTN3A1, TRAC, WAS, CD3G, PTPN22, BTN3A2, CD3E, CD3D, ZAP70, CD4, PTPRC, LCK, GRAP2, LCP2, CD247, CARD11, LAT, PAG1
사이토카인 과정의 양성 조절 ( G0:0001819 ) 1.57502E-
07		 GBP5, ANXA1, TGFB1, CYBA, PTPN22, PARK7, TMEM173, CCDC88B, MAVS, CD6, IRF3, CD28, RIPK1, SLAMF6, CD46, IL12RB1, TIGIT, IL6R, CARD11, MYD88, CCR2
T 세포 분화 ( G0:0030217 ) 2.36E-07 ZAP70, CD4, ANXA1, PTPRC, CD8A, LCK, CD28, RHOH, PTPN22, CD3D
사이토카인 수용체 활성 (G0:0004896) 2.43E-07 IL4R, IL10RB, IL10RA, IL2RG, CD4, CXCR3, IL2RB, CCR5, IL12RB1, IL7R, IL6R, CD44, CCR2
I형 인터페론 신호전달 경로 (G0:0060337) 3.27E-07 IFITM1, SP100, IRF3, OAS2, STAT2, HLA-B, HLA-C, HLA-A, SAMHD1, IRF9, MYD88, OASL
사이토카인에 대한 반응 (G0:0034097) 0.0004679 SIGIRR, IFITM1, SP100, HCLS1, RIPK1, PTPN7, IKBKE, IL6R, JAK3, IL18R1, MYD88, AES
선천적인 면역 반응이 조절 (G0:0045088) 0.001452 GBP5, GFI1, STAT2, ADAM8, NLRC3, PTPN22, SAMHD1, B1RC3
종양 괴사 인자 과정의 조절 ( G0:0032680 ) 0.003843 CD2, MAVS, CYBA, NLRC3, PTPN22, RIPK1, SLAMF1
T 세포 수용체 결합 (G0:0042608) 0.0102397 LCK, CD3G, CD3E
종양 괴사 인자-매개 신호전달 경로의 조절 (G0:0010803) 0.0124059 SHARPIN, TRADD, CASP4, RIPK1, TRAF1, B1RC3
골수 백혈구 분화의 양성 조절 ( G0:0002763 ) 0.0376647 CD4, HCLS1, RIPK1, EVl2B
생체내 GM- CSF 중화는 이종이식 모델에서 CART19 요법 후 사이토카인 방출 증후군 및 신경독성을 개선한다.
도 4A에 나타낸 NT 및 CRS에 대한 이종이식 환자 유래 모델을 이용해, CART19 독성에 대한 GM-CSF 중화 효과를 조사하였다. 마우스 GM-CSF에 의한 효과를 배제하기 위해, 마우스에, GM-CSF 항체 요법 (10 mg/kg 렌질루맵 및 10 mg/kg 항-마우스 GM-CSF 중화 항체) 또는 이소형 대조군 항체의 10일간의 투여와 조합하여, CART19 세포를 투여하였다. GM-CSF 중화 항체 요법은 CART19 요법 후 CRS로 인한 체중 감소를 방지하였다 (도 13A). CART19 세포 요법 후 11일째에 사이토카인을 분석한 결과, 인간 GM-CSF가 항체에 의해 중화되었다 (도 13B). 또한, GM-CSF 중화로 수종의 인간 (IP-10, IL-3, IL-2, IL-1Ra, IL-12p40, VEGF, GM-CSF) (도 5C) 및 마우스 (MIG, MCP-1, KC, IP-10) (도 13D) 사이토카인이 현저하게 감소하였다. 다른 세포 유형들 중에서도 단핵구에 의해 인터페론 γ-유발성 단백질 (IP-10, CXCL1O)이 생산되었으며, 이것은 단핵구, 대식세포 및 T 세포 등의 다수의 세포 타입들에서 화학주성인자로서 작용하였다. IL-3은 골수성 선조세포 분화에 역할을 담당하고 있다. IL-2는 주요 T 세포 사이토카인이다. 인터루킨-1 수용체 길항제 (IL-1Ra)는 IL-1을 저해한다. (IL-1은 대식세포에 의해 생산되며, 주요 염증성 사이토카인 계열에 속함). IL-12p40은 다른 세포 유형들 중에서도 대식세포에 의해 생산되는 IL-12의 서브타입으로, Th1 분화를 촉진할 수 있다. 혈관 내피 성장인자 (VEGF)는 혈관 형성을 촉진한다. γ 인터페론에 의해 유도되는 모노카인 (MIG, CXCL9)은 T 세포의 화학주성인자이다. 단핵구 화학주성인자 단백질 1 (MCP-1, CCL2)은 단핵구, T 세포 및 수지상 세포를 유인한다. KC (CXCL1)는 다른 세포 유형들 중에서도 대식세포에 의해 생산되며, 호중구와 같은 골수 세포를 유인한다. GM-CSF 중화 후 인간 및 마우스 사이토카인 수종이 감소되는 경향이 관찰되었다. 이는, GM-CSF가 CRS 및 NT를 야기하는 케스케이드에서 주요한 수종의 사이토카인의 하류 활성에 작용한다는 것을, 시사해준다.
CAR19 처리 후 5일째 뇌 MRI에서, GM-CSF 중화는, 뇌 염증, 혈액-뇌 장벽 파괴 및 잠재적으로 부종을, CART19 + 대조군 항체와 비교해, T1 강화를 감소시키는 것으로, 확인되었다. (렌질루맵 및 항-마우스 GM-CSF 항체를 이용한) GM-CSF 중화 후 MRI 이미지는 처리 전 베이스라인 스캔과 비슷하였으며, 이는 GM-CSF 중화가 CART19 요법과 관련된 NT를 소거하는데 효과적으로 유용하다는 것을 시사해준다 (도 14A, 14B). 환자-유래 이종이식 모델에서 인간 ALL 모세포 및 인간 CART19을 이용하여, CART19 이후 GM-CSF 중화로, 신경-염증이, CART19 + 이소형 대조군과 비교해, 59%까지 감소하였다 (도 14B). 이는 유의할만한 발견이며, CART19에 의해 유발되는 NT를 효과적으로 무력화시킬 수 있음을 최초로 생체내에서 입증해준다. 인간 CD3 T 세포는, 유세포 측정으로 분석한 결과, CART19 요법 후 뇌에 존재하였지만, GM-CSF 중화시 뇌 CD3 T 세포는 감소하는 경향이 관찰되었다 (도 14C). 마지막으로, CAR-T 세포 요법시 GM-CSF 중화 처리된 마우스의 뇌에서 이소형 대조군과 비교해 CD11b+ 브라이트 대식세포가 감소하는 경향이 CAR-T 요법 중에 관찰되었으며 (도 14D), 이는 GM-CSF 중화가 뇌에서 대식세포 감소를 돕는다는 것을 시사해준다.
실시예 3-A
CART19 세포에서 GM- CSF 유전자 KO (GM- CSF k /o CART19 ) 및 CAR19 T 유래 GM-CSF hGM-CSF 중화 항체 (렌질루맵)를 이용한 조합 요법
렌질루맵 (예, 10 mg/kg 또는 최대 30 mg/kg 또는 1,800 mg 고정 투여)을 GM-CSFk/o CART19 세포와 조합하여 개체에 투여하였다. GM-CSFk /o CAR-T 세포는 CAR-T 세포가 종양 세포에 접촉/결합시 GM-CSF 방출을 제어하는데 기여한다. 종양 부위에서 GM-CSF 방출 감소시, 염증성 골수 세포의 활성화 및 이동 저하가 나타났으며, 전신 측정시 MCP-1, IL-6, IP10, KC, MIP-1a, MIP-1b, MIG, VEGF, IL-1RA 및 IL-12p40 수준 저하가 확인되었다. 사이토카인 수준 감소는 CRS 및 NT의 발병 및 중증도를 예방하거나 또는 감소시킨다. 렌질루맵 첨가는, 모든 소스들로부터 GM-CSF를 중화시켜, 종양 미세환경으로부터 MDSC 고갈을 돕는다. 렌질루맵 투여는 2주 간격으로 반복하여, MDSC를 계속적으로 고갈시켰다. GM-CSFk /o CAR-T 세포와 렌질루맵의 조합으로, 대조군과 비교해, 병용 요법 처리 환자에서, 반응률 개선, 무진행 생존 개선 및 전체 생존율 개선이 달성되었다. 또한, 조합 요법으로 CRS 및 NT 등의 CAR-T 세포 요법과 관련된 독성 정도가 감소 (또는 소거)되었다.
실시예 3-B
CART19 세포에서 GM- CSF 유전자 KO (GM- CSF k /o CART19 ) 및 CAR19 T 유래 GM- CSF hGM-CSF 중화 항체 (렌질루맵)을 이용한 조합 요법
렌질루맵 (/600-1800 mg)을 GM-CSFk /o CART19 세포와 조합하여 개체에 투여하였다.
요법을 실시하기 전에 비-호지킨 림프종 암 환자를 미리 컨디셔닝화하였다. 환자에게 항-hGM-CSF 항체 (600-1800 mg)를 I.V.로 투여한 다음 형질도입된 자가 CD19CAR-T 세포 (GM-CSFKO) 2x106주를 투여하였다. 처리 후 특정 시점에 효과, 예를 들어 안전성, 혈액 화학특성, 신경학적 검사, 질환 상태를 평가하였다. 처리는 암이 더 이상 검출되지 않거나 또는 암 부하의 유의한 감소가 관찰되지 않을 때까지 매달 반복 실시하였다.
실시예 4
재조합 항- hGM - CSF 항체, 렌질루맵은 CNS에서 골수 세포 침윤을 감소시킨다
CD14+ 세포는, 도 17A에 나타낸 바와 같이, 3기 이상의 신경독성을 나타내는 인간 환자들에서 CNS 세포 집단의 더 높은 비율을 차지하고 있다. 인간 GM-CSF에 결합하여 중화하는 재조합 항-hGM-CSF 항체 (렌질루맵)를 CART10 요법으로 처리된 마우스에 투여하였을 경우, CART19 요법만 처리된 마우스 및 무처리 마우스와 비교해, 도 17B에 나타낸 바와 같이, CD14+ 세포 및 CD11b+ 세포에 의한 CNS 침윤 감소가 확인되었다. 원발성 ALL 마우스 모델은 NT 실험에서 후술한 바와 같이 이용하였다.
CRS/NT에 대한 원발성 환자 유래 ALL 이종이식 모델
상기 실험과 마찬가지로, 마우스에 부설판을 30 mg/kg으로 IP 주사하였다. 다음날, 재발성 난치성 ALL 환자의 말초혈로부터 유래된 일차 모세포 1-2x106주를 주사하였다. (실시예 2에 기술된 바와 같이) 4-6주간 마우스에서 생착을 모니터링하였으며, CD19+ 세포가 높은 수준 (≥10/㎕)에 도달하면, CART19 세포 2-5x106주를 투여하고, 개별 실험의 내용에 기술된 바와 같이 총 10일간 항체 요법을 개시하였다. 마우스는 웰빙의 척도로서 체중을 매일 측정하였다. 마우스의 뇌 MRI를 CART 주사 후 5-6일째에 촬영하였으며, CART 주사 후 4-11일에 꼬리 정맥을 통해 채혈하였다. 뇌 MRI 이미지를 Azalyze로 분석하였다.
실시예 5
T 세포에서 GM- CSF 유전자를 넉아웃하는 유전자 편집 기법
다양한 암을 치료하기 위한 차세대 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 개발하는데 유전자 편집 기법을 통합하기 위한 몇가지 전략들이 다양한 그룹들에 의해 연구 중에 있다. 중증 독성 (사이토카인 방출 증후군 및 신경독성)은 CAR T 세포 요법과 관련있으며, 환자의 경과가 좋지 않을 수 있다. 독성 과정에서 주요 개시물질은 CAR-T 세포 유래의 GM-CSF인 것으로 보인다.
(예, 조작된 뉴클레아제를 이용한) 유전자-편집을 이용해, T 세포에서 GM-CSF 유전자 및/또는 GM-CSF 유전자 발현에 필수적인 유전자/코딩 단백질을 KO 시킬 수 있다. 이러한 게놈 편집에 이용가능한 뉴클레아제로는, 비-제한적으로, CRISPR-부속 (Cas) 뉴클레아제, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 작동자 (TALE) 뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제 (HE) (메가뉴클레아제로도 알려짐)를 포함한다.
GM- CSF에 대해 징크 - 핑거 뉴클레아제 이용
CAR-T 세포에서 GM-CSF 유전자는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 기술을 이용해 불활성화할 수 있다. DNA 서열 특이적인 뉴클레아제는 GM-CSF 유전자를 자르고, DNA 이중 가닥 절단 복구에서 유전자의 불활성화가 발생한다. 서열 특이적인 뉴클레아제는 서열 특이적인 DNA 결합 도메인 (징크 핑거)을 Fok1 엔도뉴클레아제 도메인과 조합하여 구축한다. 표적화된 뉴클레아제는 다이머로 작용하며, 2종의 서로 다른 DNA 인지 도메인을 채택해 부위 특이적인 절단을 제공한다. Fok 1 엔도뉴클레아제의 조작으로 호모다이머가 아닌 헤테로다이머가 형성된다. 즉, 절대 (obligate) 헤테로다이머 Fok1-EL 변이체는 더 높은 수준의 특이성을 제공한다.
ZFN 기술을 이용한 유전자 KO 접근법에 대한 현재까지의 임상 경험은 제한적이다. 그러나, ZFN 기술을 사용해 CCR5 수용체를 넉아웃시키고 T 세포를 HIV 환자에 다시 도입하는 소규모 안전성 실험에서, 변형된 T 세포는, 항-레트로바이러스 약물 요법을 중단하였을 때, 비-변형된 경우와 비교해, 현저한 생존 이점을 나타내었다.
이중 대립유전자 파괴가 달성되었을 때 최상의 효과가 관찰되었다. 이는 유전자 파괴율이 가장 높은 KO 기술이 가장 효과적일 가능성이 있음을 시사해준다 (Singh 2017, Tebas 2014). 일부 인간 세포 유형들에서, 이중 대립유전자 표적화 효율은 발현 및 발프로산 처리에 비해 RAD51에 의해 증가된다 (Takayama 2017).
인간 GM-CSF 유전자의 엑손 1-4는 선택된 표적 영역 내에서 쌍을 형성하는 ZFN으로 표적화할 수 있다. DNA 서열에서 번역 개시 코돈에 근접하게 표적화하는 잠재적인 이점은, 유전자 넉아웃이 여전히 합성되는 단백질의 큰 단편을 합성하지 못하게 한다는 것이다. 이러한 단백질 단편은 원치 않는 생물학적 활성을 가질 수 있다.
특이적인 표적 서열에서 잠재적인 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 부위를 식별하기 위해 다양한 도구들을 이용할 수 있다. 이러한 도구들에 대한 예는 http://bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFiT/에서 찾아볼 수 있다. 이러한 방식으로 식별되는 ZFN 쌍을 발현시키기 위한 (GM-CSF 유전자 KO를 위해 사용되는) 벡터를, GM-CSF를 발현하는 인간 세포에서 조사하고, 각 쌍에 대한 유전자 파괴 효과를 세포 풀에서 GM-CSF 생산 변화에 의해 측정한다. 최대 GM-CSF 수준 감소를 나타내는 ZFN 쌍을 인간 CAR-T 세포에서 조사하기 위해 선택한다.
예를 들어, 자가 T-세포에 GM-CSF 특이적 ZFN 쌍을 코딩하는 복제 결함성 재조합 Ad5 바이러스 벡터를 생체외 형질도입하여, GM-CSF 유전자에 변형을 유발할 수 있다. 벡터는 벡터에 의해 코딩된 유전자의 일시적인 발현만 지원한다. 2개의 ZFN은 GM-CSF 유전자의 돌연변이 유발을 위해 선택 영역 (엑손 1,2, 3 또는 4 내)에서 특이적으로 발견되는 복합 bp 서열에 결합한다. GM-CSF 특이적인 ZFN의 발현은 세포 DNA에서 이중 가닥의 절단을 유도하며, 이는 세포 기전에 의해 복구되면서 형질도입된 세포에 무작위 서열 삽입 또는 결손을 유발한다. 이러한 삽입 및 결손은 GM-CSF 코딩 서열을 파괴하여, 프레임 이동 돌연변이 및 단백질 발현의 종결을 발생시킨다.
T 세포 제조/환자-특이적인 샘플
연구 개체들을 대상으로 10 L에서 백혈구 성분 채집술을 수행하여 백혈구 >109개를 수집하였다. 백혈구 성분 채집술 산물은, 역류 원심 세정 (counterflow centrifugal elutriation)을 통해 단핵구를 고갈시키고, CD8+ T-세포를 자기적으로 고갈시켜, CD4+ 세포를 농화하였으며, 이러한 방법 2종 모두 일회용 폐쇄 시스템 세트를 사용한다. 수득된 농화된 CD4+ T-세포는 항-CD3/항-CD28 mAb 코팅된 상자성 비드로 활성화하고, CAR T를 코딩하는 벡터 및 ZFN을 코딩하는 벡터를 형질도입하였다. 그런 다음, 세포를 폐쇄 시스템에서 증폭 및 배양하였다. 관류 조건에서 추가적으로 증폭시키기 위해 T-세포를 WAVE 생물반응기로 옮긴 후 계속 증폭시켰다. 배양 기간이 끝나면, 자기 비드로 세포를 고갈시키고, 세척, 농축 및 냉동 보존하였다.
또한, 일차 T 세포는 ZFN의 이중 대립유전자 표적 효율을 높이기 위해 다른 물질, 예를 들어 발프로산으로 처리할 수 있다.
추정의 표적 서열
엑손 1
ATG TGG CTG CAG AGC CTG CTG CTC TCG GGC
TAC ACC GAC GTC TCG GAC GAC GAG AGC CCG
CTC GCC CAG CCC CAG CAC GCA GCC
GAG CGG GTC GGG GTC GTG CGT CGG
엑손 2
AAT GAA ACA GTA GAA GTC ATC TCA GAA ATG
TTA CTT TGT CAT CTT CAG TAG AGT CTT TAC
GAA GTC ATC TCA GAA ATG TTT GAC
CTT CAG TAG AGT CTT TAC AAA CTG
설계 엑손 3
GAG CCG A CC TGC CTA CAG ACC CGC CTG GAG
CTC GGC TGG ACG GAT GTC TGG GCG GAC CTC
GCC TAC AGA CCCGCCT GGA GCT GTA
CGG ATG TCT GGGCGGA CCT CGA CAT
엑손 4
GAA ACT TCC TGT GCA ACC CAG ATT ATC ACC
CTT TGA AGG ACA CGT TGG GTC TAA TAG TGG
TGC AAC CCA GAT TATC ACC TTT GAA
ACG TTG GGT CTA ATAG TGG AAA CTT
TALEN
T 세포에서 GM-CSF 유전자는 활성인자-유사 작동자 뉴클레아제 (TALENS)를 이용해 불활성화할 수 있다. TALEN은 서열 특이적인 DNA 결합 도메인에 융합된 Fok1 뉴클레아제 도메인을 포함한다는 점에서 ZFN과 비슷하다. 표적화된 뉴클레아제는 이후 DNA에 이중 가닥 절단을 형성하며, 오류-경향성 (error-prone) 복구로 돌연변이된 표적 유전자가 생성된다. TALEN은 DNA 결합성 TALE (전사 활성인자-유사 작동자) 반복 도메인을 결합 부위의 개별 염기에 사용하는 간단한 단백질-DNA 코드를 이용해 쉽게 설계할 수 있다. TALEN의 견고성은 게놈 편집이 신뢰할 수 있고 손쉬운 과정이라는 것을 의미한다 (Reyon D., et al., 2012 Nat Biotechnol. 2012 May;30(5):460-5. doi: 10.1038/nbt.2170, 이 문헌은 그 전체가 본원에 원용에 의해 포함됨).
예를 들어, 인간 GM-CSF 유전자의 엑손 1 내의 일부 TALE 표적 서열은 다음과 같다:
1. TGGCTGCAGAGCCTGCTG CTCTTGGGCACTGTGG CCTGCAGCATCTCTGCA
2. TTGGGCACTGTGGCCTGC AGCATCTCTGCACCCG CCCGCTCGCCCAGCCCCA
인간 GM-CSF 유전자의 엑손 4에서 TALE 타겟 서열의 예:
TGTGCAACCCAGATTATC ACCTTTGAAAGTTTCA AAGAGAACCTGAAGGA
TCCTGTGCAACCCAGATT ATCACCTTTGAAAGTT TCAAAGAGAACCTGAA
3. TTATCACCTTTGAAAG TTTCAAAGAGAACCTGA AGGACTTTCTGCTTGTCA
일차 T 세포에서 CRISPR Cas -9 매개 GM- CSF 유전자의 KO.
CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), Cas-9 시스템은 Cas9, RNA-가이드 뉴클레아제 및 세포 내인성 기전에 의해 복구되는 부위-특이적인 DNA 절단을 쉽게 형성하는 짧은 가이드 RNA (gRNA)로 구성된다. 일차 인간 T 세포에 Cas9/gRNA RNP 전달시, 매우 효율적인 표적 유전자 변형이 이루어진다. GM-CSF 유전자를 넉아웃하는 CRISPR/Cas9 매개 방법은 상세한 프로토콜에 의해 기술되어 있다. Oh, S. A., Seki, A., & Rutz, S. (2018) Current Protocols in Immunology, 124, e69. doi: 10.1002/cpim.69, 및 Seki and Rutz, J Exp. Med. 2018 Vol. 215 No. 3 985-997을 참조한다 (이들 문헌 각각은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
유전자 KO에 의한 GM-CSF 불활성화는 종양 이종이식된 CAR T 처리 마우스에서 사이토카인 방출 증후군 및 신경독성을 줄이고, 항-종양 활성을 개선하는 것으로 발표된 바 있다 (Sterner RM et al., 2018 Blood 2018:blood-2018-10-881722; doi: https://doi.org/10.1182/blood-2018-10-881722, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
엑손 1 또는 2 또는 3 또는 4를 표적화 하는 CRISPR 접근 방식에 의한 GM-CSF 유전자의 불활성화
모든 샘플들에서 효과적인 유전자 활성을 보장하기 위해, GM-CSF 유전자 내 서로 다른 3가지 서열을 표적화하는 복수의, 예를 들어 3가지 Cas9 구조체를 이용할 수 있다. (이는 다른 유전자 편집 방법과 비교해 CRISPR로 쉽게 수행됨).
Cas9를 이용한 높은 빈도의 이중 대립유전자 KO가 발표되어 있다 (Zhang, Y., et al. Methods. 2014 September; 69(2): 171-178. doi:10.1016/j.ymeth.2014.05.003, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 이러한 높은 빈도의 이중 대립유전자 KO는 잠재적인 이점을 제공한다.
CAR T 세포에서 GM- CSF KO를 위한 기타 유전자 침묵화 기법
유전자 침묵화에 이용가능한 다른 방법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 비-제한적으로 메가뉴클레아제로도 알려져 있는 호밍 엔도뉴클레아제 (HE), RNA 간섭 (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA), DNA-특이적인 RNA 간섭 (ddRNAi)을 포함할 수 있다.
CAR T 세포에서 GM- CSF 유전자 KO와 비-CAR T 유래 GM- CSF에 대한 중화 항체의 조합.
환자에서 GM-CSF를 모두 제거/중화하기 위해, 항-GM-CSF 항체, 항-수용체 항체 또는 가용성 수용체-Fc 융합체를, CAR-T 세포에서 GM-CSF 유전자 KO와 조합하여, 사용하여야 한다. 투여되는 CAR-T 세포는, 비-제한적으로, GM-CSFk /o CAR-T 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 투여되는 GM-CSFk/o CAR-T 세포는 GM-CSFk /o CART19이다.
이러한 조합 요법에서는, 비-제한적인 예로, 렌질루맵 등의 항-GM-CSF 중화 항체를 투여한다. 렌질루맵은 신생의, 고 친화성의, 재조합 인간, 항-hGM-CSF 중화 항체이다. 인간을 제외한 영장류 실험에서, 이 항체는 6주간 심지어 >100mg/kg/wk의 고 용량에서도 반복 투여시 안전한 것으로, 입증되어 있다. 이 항체는, 반복 투여시 (중증 천식 환자에게 24주간 400 mg/투여로 7회 투여)에도 안전하다. 이 항체는 암 환자에서 GM-CSF KO CAR-T 세포 요법과 조합 사용해, 인간 GM-CSF의 완전한 중화를 제공할 수 있다. 암 환자에게 항-hGM-CSF 항체 (600-1800 mg)를 I.V.로 투여한 후, CAR T 세포 (GM-CSFKO) 세포 2x106주를 투여하였다. 처리 후 특정 시점에, 효과, 예를 들어, 안전성, 혈액 화학특성, 신경 검사, 질환 상태를 조사하였다. 처리는 매달 또는 3달 간격으로 반복할 수 있으며, 질환 관해 및 무진행 생존 개선이 달성될 수 있다.
또한, GM-CSF는 (Minter, RR, et al. 2012 DOI:10.1111/j.1476-5381.2012.02173.x에 기술된 바와 같이) 항-인간 GM-CSF 수용체 α (Rα) 항체를 사용해 중화될 수 있다. 암 환자에게 항-hGM-CSF 수용체 항체 (70-700 mg)를 I.V.로 투여한 다음 CAR T 세포 (GM-CSFKO) 2x106주를 투여한다. 처리 후 특정 시점에, 효과, 예를 들어, 안전성, 혈액 화학특성, 신경 검사, 질환 상태를 조사한다. 처리시 질환 관해 및 무진행 생존 개선이 달성된다. 처리는 암이 검출가능하지 않거나 또는 현저한 암 부하 감소가 관찰되지 않을 때까지 매달 반복 실시할 수 있다.
기타 구현예
본 발명은 상세한 설명을 들어 설명되지만, 전술한 설명은 예시하기 위한 것일 뿐 청구항의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 그외 측면, 이점 및 변형도 첨부된 청구항의 범위에 포함된다.
<110> HUMANIGEN, INC. MAYO FOUNDATION FOR MEDICAL EDUCATION AND RESEARCH <120> MATERIALS AND METHODS FOR TREATING CANCER <130> P-588784-PC1 <140> PCT/US19/59275 <141> 2019-10-31 <150> 62/753,485 <151> 2018-10-31 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> guideRNA targeting a GM-CSF nucleic acid <400> 1 gacctgccta cagacccgcc 20 <210> 2 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding a chimeric antigen receptor targeting CD19 (CAR19) <400> 2 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120 accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180 ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240 tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300 caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360 ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420 ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480 ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540 cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600 tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660 gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720 cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780 gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840 cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900 agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960 gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020 tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080 agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140 agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200 ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260 ggaaagccga 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nucleic acid having a deletion caused by a CRISPR/Cas system <400> 8 gacctgccta cagaccgcc 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF2 nucleic acid having an insertion caused by a CRISPR/Cas system <400> 9 gacctgccta cagaccccgc c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> guideRNA targeting a GM-CSF nucleic acid <400> 10 gcagtgctgc ttgtagtggc 20 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> guideRNA targeting a CSF2 gene nucleic acid <400> 11 ccgacctgcc tacagacccg cctgga 26 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 12 tgactacaga gaggcacaga 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 13 tcacctctga cctcattaac c 21 <210> 14 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human GM-CSF EXON 1 putative ZNF targeting sequence <400> 14 atgtggctgc agagcctgct gctctcgggc ctcgcccagc cccagcacgc agcc 54 <210> 15 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human GM-CSF EXON 1 complementary strand of putative ZNF targeting sequence <400> 15 tacaccgacg tctcggacga cgagagcccg gagcgggtcg gggtcgtgcg tcgg 54 <210> 16 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human GM-CSF EXON 2 putative ZNF targeting sequence <400> 16 aatgaaacag tagaagtcat ctcagaaatg gaagtcatct cagaaatgtt tgac 54 <210> 17 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human GM-CSF EXON 2 complementary strand of putative ZNF targeting sequence <400> 17 ttactttgtc atcttcagta gagtctttac cttcagtaga gtctttacaa actg 54 <210> 18 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> design Exon 3 human GM-CSF <400> 18 gagccgacct gcctacagac ccgcctggag gcctacagac ccgcctggag ctgta 55 <210> 19 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-CSF Exon 3 complementary strand <400> 19 ctcggctgga cggatgtctg ggcggacctc cggatgtctg ggcggacctc gacat 55 <210> 20 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon 4 <400> 20 gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tgcaacccag attatcacct ttgaa 55 <210> 21 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon 4 complementary strand <400> 21 ctttgaagga cacgttgggt ctaatagtgg acgttgggtc taatagtgga aactt 55 <210> 22 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-CSF Exon 1 <400> 22 tggctgcaga gcctgctgct cttgggcact gtggcctgca gcatctctgc a 51 <210> 23 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-CSF Exon 1 <400> 23 ttgggcactg tggcctgcag catctctgca cccgcccgct cgcccagccc ca 52 <210> 24 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-CSF Exon 4 <400> 24 tgtgcaaccc agattatcac ctttgaaagt ttcaaagaga acctgaagga 50 <210> 25 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-CSF Exon 4 <400> 25 tcctgtgcaa cccagattat cacctttgaa agtttcaaag agaacctgaa 50 <210> 26 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-CSF Exon 4 <400> 26 ttatcacctt tgaaagtttc aaagagaacc tgaaggactt tctgcttgtc a 51

Claims (38)

  1. 개체에서 면역요법의 항-종양 효능을 강화하는 방법으로서,
    GM- CSF 유전자 불활성화, GM- CSF 유전자 넉다운 또는 유전자 넉아웃 (GM-CSF k/o CAR-T 세포)을 포함하는 CAR-T 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하며,
    CAR-T 세포의 투여가 면역요법-관련 독성을 낮추거나 또는 방지하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    개체에 항-hGM-CSF 항체를 투여하는 단계를 더 포함하고,
    상기 항-hGM-CSF 항체가 인간 GM-CSF에 결합해 중화하는 재조합 항-hGM-CSF 항체인, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    개체에게 항-hGM-CSF 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    (i) GM- CSF 유전자 불활성화, GM- CSF 유전자 넉다운 또는 유전자 넉아웃 (GM-CSF k/o CAR-T 세포)을 포함하는 CAR-T 세포, 또는 (ii) CAR-T 세포 및 항-hGM-CSF 항체의 투여가, 개체의 중추 신경계 (CNS)로의 CD14+ 골수 세포 이동을 감소시키거나 또는 방지하고,
    개체의 CNS에서의 고 수준의 CD14+ 골수 세포가 신경독성의 지표인, 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    항-hGM-CSF 항체가 투여된 개체의 객관적 반응률이 항-hGM-CSF 항체의 비-투여 개체와 비교해 개선되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 객관적 반응률이 완전 반응률 또는 부분 반응률인, 방법.
  7. 제3항에 있어서,
    개체의 무진행 반응률 및/또는 생존율이 항-hGM-CSF 항체의 비-투여 개체와 비교해 개선되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 생존율이 개체의 전체 생존율인, 방법.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 항-hGM-CSF 항체는 GM- CSF 유전자 불활성화, GM- CSF 유전자 넉다운 또는 GM-CSF k/o CAR-T 세포를 포함하는 CAR-T 세포의 투여 전, 투여 중 또는 투여 후에 개체에 투여되는, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 면역요법이 키메라 항원 수용체-발현성 T 세포 (CAR T-세포)의 투여를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 CAR-T 세포가 CART19 세포인, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 면역요법이 T-세포 수용체 (TCR) 변형된 T-세포, 종양-침윤성 림프구 (TIL), 키메라 항원 수용체 (CAR)-변형된 자연 살상 세포 또는 수지상 세포 또는 이들의 임의 조합의 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 입양 세포 전달을 포함하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 면역요법이 단일클론 항체, 사이토카인, 암 백신, T 세포 관련 이중 특이성 항체 (T cell engaging bispecific antibody) 또는 이들의 임의 조합의 투여를 포함하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 개체가 암에 걸린, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 암이 림프종 또는 백혈병인, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 림프종이 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL)인, 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 백혈병이 급성 림프모구성 백혈병 (ALL)인, 방법.
  18. 개체에게 GM- CSF 유전자 불활성화, GM- CSF 유전자 넉다운 또는 유전자 넉아웃 (GM-CSFk/o CAR-T 세포)을 포함하는 CAR-T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 면역요법으로 치료받은 개체에서 non-GM-CSF 사이토카인의 수준을 낮추는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 개체에게 항-hGM-CSF 항체를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 non-GM-CSF 사이토카인이 IP-10, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-1Ra, IL-9, IL-10, VEGF, TNF-a, FGF-2, IFN-γ, IL-12p40, IL-12p70, sCD40L, KC, MDC, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b 또는 이들의 조합인, 방법.
  21. 표적화된 게놈 편집 또는 GM-CSF 유전자 침묵화를 포함하는 세포에서 GM- CSF 유전자 불활성화, GM-CSF 유전자 넉다운 또는 GM-CSF 넉아웃 (KO)을 달성하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    핵산 절단 효소로서 엔도뉴클레아제를 더 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 엔도뉴클레아제가 Fok1 제한 효소 또는 flap 엔도뉴클레아제 1 (FEN-1)인, 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 엔도뉴클레아제가 Cas9　CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9)인, 방법.
  25. 제21항에 있어서,
    CRISPR/Cas9에 의한 GM- CSF 유전자 불활성화가 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3 또는 엑손 4에서 GM-CSF 유전자를 표적화 및 편집하는, 방법.
  26. 제21항에 있어서,
    CRISPR/Cas9을 포함하는 GM-CSF 유전자 불활성화가 엑손 3에서 GM- CSF 유전자를 표적화 및 편집하는, 방법.
  27. 제21항에 있어서,
    CRISPR/Cas9을 포함하는 GM-CSF 유전자 불활성화가 엑손 1에서 GM- CSF 유전자를 표적화 및 편집하는, 방법.
  28. 제22항에 있어서,
    상기 GM- CSF 유전자 불활성화가 복수의 CRISPR/Cas9 효소를 포함하고, 각각의 Cas9 효소가 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3 또는 엑손 4에서 GM- CSF 유전자의 상이한 서열들을 표적화 및 편집하는, 방법.
  29. 제22항에 있어서,
    상기 GM- CSF 유전자 불활성화가 GM- CSF 유전자의 이중 대립유전자 CRISPR/Cas9 표적화 및 넉아웃/불활성화를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    이중 대립유전자 넉아웃/불활성화를 강화하기 위해 일차 T 세포를 발프로산으로 처리하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  31. 제21항에 있어서,
    상기 표적화 게놈 편집이 징크 핑거 (ZnF) 단백질을 포함하는, 방법.
  32. 제21항에 있어서,
    상기 표적화 게놈 편집이 전사 활성인자-유사 작동자 뉴클레아제 (TALENS)를 포함하는, 방법.
  33. 제21항에 있어서,
    상기 표적화 게놈 편집이 호밍 엔도뉴클레아제를 포함하고, 상기 호밍 엔도뉴클레아제가 ARC 뉴클레아제 (ARCUS) 또는 메가뉴클레아제인, 방법.
  34. 제21항에 있어서,
    상기 표적화 게놈 편집이 flap 엔도뉴클레아제 (FEN-1)를 포함하는, 방법.
  35. 제21항에 있어서,
    상기 세포가 CAR T 세포인, 방법.
  36. 제21항에 있어서,
    상기 CAR T 세포가 CD19 CAR-T 세포인, 방법.
  37. 제21항에 있어서,
    상기 CAR T 세포가 BCMA CAR-T 세포인, 방법.
  38. 제21항에 있어서,
    상기 GM-CSF 유전자 침묵화가 RNA 간섭 (RNAi), 짧은 간섭 RNS (siRNA) 및 DNA-특이적인 RNA 간섭 (ddRNAi)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
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