JP2022516389A - 血液悪性腫瘍を治療するためのゲノム編集インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞 - Google Patents

Abstract

本明細書では、ゲノム編集インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞、及びそれらを使用して免疫療法を行うための方法を開示する。とりわけ、本開示は、遺伝子改変キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有ｉＮＫＴ細胞（ＣＡＲ－ｉＮＫＴ）、及びがんの治療におけるその使用方法に関する。【選択図】図１

Description

本出願は、２０１８年５月３１日に出願された米国仮出願第６２／６７８，８８３号の優先権の利益を主張するものであり、その開示は、その全体が本明細書に記載されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書では、ゲノム編集インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞、及びそれらを使用して免疫療法を行うための方法を開示する。とりわけ、本開示は、遺伝子改変キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有ｉＮＫＴ細胞（ＣＡＲ－ｉＮＫＴ）、及びがんの治療におけるその使用方法に関する。

キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）免疫療法は、ますます広く知られるようになっている。Ｔ細胞は、抗原認識部分及びＴ細胞活性化ドメインで構成される融合タンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、遺伝的に修飾されている。ＣＡＲは、がん細胞上に過剰発現した抗原を認識するように設計されている。ＣＡＲ－Ｔは、Ｂ細胞悪性腫瘍に対する優れた臨床効果を示しており、２種の治療薬、キムリア（商標）（チサゲンレクロイセル、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びイエスカルタ（商標）（アキシカブタゲンシロロイセル、Ｋｉｔｅ／Ｇｉｌｅａｄ）は、最近ＦＤＡにより承認された。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ療法の広い応用範囲は、２つの点で限定されている。第１に、Ｔ細胞悪性腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞治療薬の開発には、ＣＡＲ－Ｔ細胞上における標的抗原の発現が、ＣＡＲ－Ｔ細胞の同胞殺し及び有効性の低下を誘導し得ることから、悪性Ｔ細胞とエフェクターＴ細胞の間における標的抗原の共通発現を一因とする未解決問題があることが判明している。第２に、ＣＡＲ－Ｔ療法において、個々の患者自身のＴ細胞（同種異系）以外のＴ細胞を使用すると、移植片対宿主病を含む同種異系反応が引き起こされる場合がある。

インバリアントナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞またはＩ型ＮＫＴ細胞とも呼ばれる）とは、インバリアントＴ細胞受容体α鎖及び特定ＴＣＲβ鎖（Ｖβ１１と結合したＶα２４－Ｊα１８）の発現を特徴とする、独特なリンパ球集団のことを意味する。ｉＮＫＴ ＴＣＲ介在性応答は、非多型ＣＤ１抗原を提示するタンパク質ファミリーのメンバーであり、内在性脂質抗原及び病原体由来脂質抗原のＴＣＲへの提示を促進するＣＤ１ｄによって制限されている。インバリアント受容体のプロトタイプリガンドは、α－ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）である。インバリアントＴＣＲがＣＤ１ｄ－αＧａｌＣｅｒに結合すると、ｉＮＫＴが増殖する。ＣＤ１ｄ遺伝子は、単型であり、ほんのわずかの細胞型のみが発現しているため、自家または同種異系環境におけるＮＫＴ細胞の潜在的な毒性は限定的なものである。

１種または複数種の標的、例えば、ＣＤ７を標的とするゲノム編集ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製するための方法を示す。 ２種の標的、ここでは、ＣＤ７及びＣＤ２を標的とするゲノム編集タンデムＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製するための方法を示す。 ＣＤ７を標的とするゲノム編集ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製するための方法を示す。 「Ａ」と呼ばれる別の標的を標的とするゲノム編集ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製するための方法を示す。 ＣＤ７及びＣＤ２を標的とするゲノム編集タンデムＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製するための方法を示す。 「Ａ」及び「Ｂ」と呼ばれる２種のその他の標的を標的とするゲノム編集デュアルＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製するための方法を示す。 遺伝子編集ｉＮＫＴ細胞を調製して注入することによりがん（例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍）を治療するための方法のフローチャートを示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍細胞を効果的に殺傷するＣＡＲ－ｉＮＫＴ。Ａは、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ－ＢＣＭＡを有するｉＮＫＴの形質導入効率を示す。Ｂは、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ－ＢＣＭＡが、４時間のＣｒ放出アッセイにおいて、抗原陽性標的細胞（Ｒａｍｏｓ）を特異的に殺傷することを示す。Ｃは、ｉＮＫＴ－ＢＣＭＡが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＭＭ１．ｓ細胞を効果的に殺傷することを示す。Ｄは、ｉＮＫＴ－ＢＣＭＡが、多発性骨髄腫の異種ＭＭ１．ｓマウスモデルにおいて、マウスの生存を延長することを示す。 ＣＡＲ２－ｉＮＫＴ細胞が、ＣＤ２^＋Ｔ－ＡＬＬ細胞株及びＣＤ２^＋ＣＴＣＬ細胞株をｉｎ ｖｉｔｒｏで効果的に殺傷することを示す。

以下の開示は、遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞、例えば、ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、デュアルＣＡＲ ｉＮＫＴ細胞、及びタンデムＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の実施形態、選択肢、及び使用、ならびに、例えば、疾患を治療するための、免疫療法及び養子細胞移入におけるこのような細胞の使用を詳述する。それゆえ、本明細書では以下の実施形態を提供する。

実施形態１．ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞。

実施形態２．前記ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞は、凍結させることなく少なくとも３週間にわたり維持または増殖させることが可能な、複数のドナーに由来する、実施形態１に記載のゲノム編集ｉＮＫＴ細胞の集団。

実施形態３．１種または複数種の抗原を標的とする少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、前記ＣＡＲが特異的に結合する抗原を欠損している、実施形態１に記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態４．前記キメラ抗原受容体は、悪性Ｔ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１から実施形態３のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態５．前記抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、及びＴＣＲβ、から選択される、実施形態１から実施形態４のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態６．前記キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１から実施形態５のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態７．前記抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、及びＣＤ１９、から選択される、実施形態１から実施形態６のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態８．前記キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方を効果的に共標的とする、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに対するリガンドである、ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分を発現する、実施形態１から実施形態７のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態９．前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は自殺遺伝子を更に含む、実施形態１から実施形態８のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態１０．内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、前記ｉＮＫＴ細胞内においてごくわずかである、実施形態１から実施形態９のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態１１．アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない、実施形態１から実施形態１０のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態１２．同胞殺しを誘導しない、実施形態１から実施形態１１のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態１３．前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性Ｂ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１から実施形態１２のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態１４．悪性Ｂ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、及びＣＤ４５、から選択される、実施形態１３に記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態１５．悪性Ｂ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ１９及びＣＤ２０から選択される、実施形態１４に記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態１６．デュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞である、実施形態１から実施形態１５のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞。

実施形態１７．それぞれが異なるＴ細胞抗原を標的とする２つまたはそれ以上のＣＡＲを含む、実施形態１６に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態１８．前記異なるＴ細胞抗原は、ＣＤ２ｘＣＤ３ε、ＣＤ２ｘＣＤ４、ＣＤ２ｘＣＤ５、ＣＤ２ｘＣＤ７、ＣＤ３εｘＣＤ４、ＣＤ３εｘＣＤ５、ＣＤ３εｘＣＤ７、ＣＤ４ｘＣＤ５、ＣＤ４ｘＣＤ７、ＣＤ５ｘＣＤ７、ＴＲＡＣｘＣＤ２、ＴＲＡＣｘＣＤ３ε、ＴＲＡＣｘＣＤ４、ＴＲＡＣｘＣＤ５、ＴＲＡＣｘＣＤ７、ＴＣＲβｘＣＤ２、ＴＣＲβｘＣＤ３ε、ＴＣＲβｘＣＤ４、ＴＣＲβｘＣＤ５、ＴＣＲβｘＣＤ７、ＢＣＭＡｘＣＳ１、ＢＣＭＡｘＣＤ１９、ＢＣＭＡｘＣＤ３８、ＣＳ１ｘＣＤ１９、ＣＳ１ｘＣＤ３８、ＣＤ１９ｘＣＤ３８、ＡＰＲＩＬｘＣＳ１、ＡＰＲＩＬｘＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬｘＣＤ１９、及びＡＰＲＩＬｘＣＤ３８、から選択される、実施形態１６及び実施形態１７に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態１９．それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、及びＣＤ３、から選択される異なる抗原を認識するｓｃＦｖに由来する、実施形態１６から実施形態１８に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態２０．それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、異なり、配列番号：１２～配列番号：３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、実施形態１６から実施形態１９に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態２１．それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、異なり、配列番号：１２～配列番号：３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を示す、実施形態１６及び実施形態２０に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態２２．それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、異なり、配列番号：１２～配列番号：３１から選択される配列である、実施形態１６及び実施形態２１に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態２３．ＣＤ２８及び４－１ＢＢから選択される少なくとも１種の共刺激ドメインを含む、実施形態１６及び実施形態２２に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態２４．前記共刺激ドメインはＣＤ２８である、実施形態１６及び実施形態２３に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態２５．ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態１６及び実施形態２４に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態２６．前記それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、ＣＤ２を認識するｓｃＦｖまたはＣＤ３を認識するｓｃＦｖに由来する、実施形態１６及び実施形態２５に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態２７．２種またはそれ以上のＴ細胞抗原を標的とする１つのＣＡＲを含む、実施形態１から実施形態１５に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態２８．前記抗原対は、ＣＤ２ｘＣＤ３ε、ＣＤ２ｘＣＤ４、ＣＤ２ｘＣＤ５、ＣＤ２ｘＣＤ７、ＣＤ３εｘＣＤ４、ＣＤ３εｘＣＤ５、ＣＤ３εｘＣＤ７、ＣＤ４ｘＣＤ５、ＣＤ４ｘＣＤ７、ＣＤ５ｘＣＤ７、ＴＲＡＣｘＣＤ２、ＴＲＡＣｘＣＤ３ε、ＴＲＡＣｘＣＤ４、ＴＲＡＣｘＣＤ５、ＴＲＡＣｘＣＤ７、ＴＣＲβｘＣＤ２、ＴＣＲβｘＣＤ３ε、ＴＣＲβｘＣＤ４、ＴＣＲβｘＣＤ５、ＴＣＲβｘＣＤ７、ＢＣＭＡｘＣＳ１、ＢＣＭＡｘＣＤ１９、ＢＣＭＡｘＣＤ３８、ＣＳ１ｘＣＤ１９、ＣＳ１ｘＣＤ３８、ＣＤ１９ｘＣＤ３８、ＡＰＲＩＬｘＣＳ１、ＡＰＲＩＬｘＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬｘＣＤ１９、及びＡＰＲＩＬｘＣＤ３８、から選択される、実施形態２７に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態２９．前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｌ１と呼ばれる第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｌ２及びＶ_Ｈ２と呼ばれる第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態２７及び実施形態２８に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態３０．前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｈ２及びＶ_Ｌ２と呼ばれる第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｌ１と呼ばれる第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態２７から実施形態２９に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態３１．前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｌ１及びＶ_Ｈ１と呼ばれる第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ２及びＶ_Ｌ２と呼ばれる第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態２７及び実施形態３０に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態３２．前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｌ２及びＶ_Ｈ２と呼ばれる第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｌ１と呼ばれる第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態２７及び実施形態３１に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態３３．前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、６－Ｉ～６－ＸＸＸＩＩから選択される構造物を含む、実施形態２７及び実施形態３２に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態３４．前記ＣＡＲ構築物はヘアピンｔＣＡＲ構築物である、実施形態２７及び実施形態３３に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態３５．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｈ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｌ２及びＶ_１２と呼ばれる、前記第２のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態２７及び実施形態３４に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態３６．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｈ２及びＶ_Ｈ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｌ１及びＶ_Ｌ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態２７及び実施形態３５に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態３７．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｌ１及びＶ_Ｌ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ２及びＶ_Ｈ１と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態２７及び実施形態３６に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態３８．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｌ２及びＶ_Ｌ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｈ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態２７及び実施形態３７に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態３９．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、８－Ｉ～８－ＸＸＸＩＩから選択される構造物を含む、実施形態２７及び実施形態３８に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態４０．前記ＣＡＲ構築物は、前記リンカー内に（Ｃｙｓ＝Ｃｙｓ）二本鎖結合（ＤＳＢ）を有するヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物である、実施形態２７及び実施形態３９に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態４１．前記ヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｈ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｌ２及びＶ_１２と呼ばれる、前記第２のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_０～１－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_１～２－（ＧＧＧＧＰ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_２～３－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_０～１リンカーにより、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態２７及び実施形態４０に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態４２．前記ヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｈ２及びＶ_Ｈ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｌ１及びＶ_Ｌ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_０～１－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_１～２－（ＧＧＧＧＰ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_２～３－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_０～１リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態２７及び実施形態４１に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態４３．前記ヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｌ１及びＶ_Ｌ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ２及びＶ_Ｈ１と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_０～１－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_１～２－（ＧＧＧＧＰ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_２～３－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_０～１リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態２７及び実施形態４２に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態４４．前記ヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｌ２及びＶ_Ｌ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｈ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_０～１－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_１～２－（ＧＧＧＧＰ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_２～３－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_０～１リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態２７及び実施形態４３に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態４５．前記ヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物は、１０－Ｉ～１０－ＸＸＸＩＩから選択される構造物を含む、実施形態２７及び実施形態４４に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態４６．それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、及びＣＤ３、から選択される異なる抗原を認識するｓｃＦｖに由来する、実施形態２７及び実施形態４５に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態４７．それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、異なり、配列番号：１２～配列番号：３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、実施形態２７及び実施形態４６に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態４８．それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、異なり、配列番号：１２～配列番号：３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を示す、実施形態２７及び実施形態４７に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態４９．それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、異なり、配列番号：１２～配列番号：３１から選択される配列である、実施形態２７及び実施形態４８に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態５０．ＣＤ２８及び４－１ＢＢから選択される少なくとも１種の共刺激ドメインを含む、実施形態２７及び実施形態４９に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態５１．前記共刺激ドメインはＣＤ２８である、実施形態２７及び実施形態５０に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態５２．ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態２７及び実施形態５１に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態５３．前記それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、ＣＤ２を認識するｓｃＦｖまたはＣＤ３を認識するｓｃＦｖに由来する、実施形態２７及び実施形態５２に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態５４．前記ｔＣＡＲ構築物は、クローン５、クローン６、クローン７、クローン８、クローン１３、クローン１４、クローン１５、及びクローン１６、から選択される、実施形態２７及び実施形態５３に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態５５．前記ｔＣＡＲ構築物は、配列番号：４１～配列番号：４６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、実施形態２７及び実施形態５４に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。

実施形態５５．実施形態１から実施形態５４のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞、ならびに、少なくとも１種の治療的に許容される担体及び／またはアジュバント、を含む、治療用組成物。

実施形態５６．ＩＬ－７、ＩＬ－１５、Ｉｌ－２、または上記のいずれかのアナログ、から選択される少なくとも１種のアジュバントを含む、実施形態１から実施形態５５のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞を含む治療用組成物。

実施形態５７．ＩＬ－２を含む、実施形態１から実施形態５６のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞を含む治療用組成物。

実施形態５８．ＩＬ－７、ＩＬ－１５、Ｉｌ－２、または上記のいずれかのアナログの、任意の２種またはそれ以上の組み合わせを含む、実施形態１から実施形態５７のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞を含む治療用組成物。

実施形態５９．ＩＬ－７、ＩＬ－１５、Ｉｌ－２を含む、実施形態１から実施形態５８のいずれか１つに記載のｉＮＫＴ細胞を含む治療用組成物。

実施形態６０．患者における血液悪性腫瘍を治療するための方法であって、ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞、実施形態１から実施形態５９のいずれか１つに記載のゲノム編集ｉＮＫＴ細胞、デュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞、もしくはタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の集団、または、請求項５５から請求項５９のいずれか１項に記載の治療用組成物を、血液悪性腫瘍の治療を必要とする前記患者に投与することを含む、前記方法。

実施形態６１．前記血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である、実施形態６０に記載の方法。

実施形態６２．前記Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）である、実施形態６１に記載の方法。

実施形態６３．前記Ｔ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である、実施形態６１に記載の方法。

実施形態６４．前記血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である、実施形態６０に記載の方法。

実施形態６５．
ａ）単離及び精製したｉＮＫＴ細胞を活性化させること、
ｂ）前記ｉＮＫＴ細胞における細胞表面タンパク質の発現を欠失または抑制すること、ならびに、
ｃ）任意選択的に、前記ｉＮＫＴ細胞に、１種または複数種の抗原標的または細胞表面タンパク質標的を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、
の工程を含む、遺伝子編集ｉＮＫＴ細胞を作製するための方法。

実施形態６６．前記ｉＮＫＴ細胞に、１種または複数種の抗原標的または細胞表面タンパク質標的を認識するキメラ抗原受容体を形質導入する工程を含む、実施形態６５に記載の方法。

実施形態６７．前記ＣＡＲの標的である前記抗原は、前記細胞から欠失されている、実施形態６６に記載の方法。

実施形態６８．複数のドナーに由来するゲノム編集ｉＮＫＴ細胞の集団を作製するための方法であって、
ａ）それぞれのドナーから単離及び精製したｉＮＫＴ細胞を活性化させること、
ｂ）前記ｉＮＫＴ細胞における細胞表面タンパク質の発現を欠失または抑制すること、
ｃ）任意選択的に、前記ｉＮＫＴ細胞に、１種または複数種の抗原標的または細胞表面タンパク質標的を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、
ｄ）ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞の前記集団を増殖させること、
ｅ）前記ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞をプールすること、
の工程を含む、前記方法。

実施形態６９．Ｃａｓ９－ＣＲＩＳＰＲ、及び本明細書で開示するｇＲＮＡから選択されるｇＲＮＡを使用して、上記の任意の実施形態または本明細書に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するための方法。

実施形態７０．Ｃａｓ９－ＣＲＩＳＰＲ、ならびに、表１２及び表１４～表２６で開示するｇＲＮＡから選択されるｇＲＮＡを使用して、上記の任意の実施形態または本明細書に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するための方法。

実施形態７１．Ｃａｓ９－ＣＲＩＳＰＲ、ならびに、表１２で開示するｇＲＮＡ及び表１４～表２６において太字体で示すｇＲＮＡから選択されるｇＲＮＡを使用して、上記の任意の実施形態または本明細書に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するための方法。

実施形態７２．Ｃａｓ９－ＣＲＩＳＰＲ、及び表１２で開示するｇＲＮＡから選択されるｇＲＮＡを使用して、上記の任意の実施形態または本明細書に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するための方法。

本明細書では、ゲノム編集インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞を開示する。

凍結させることなく少なくとも３週間にわたり維持または増殖させることが可能な、複数のドナーに由来するゲノム編集ｉＮＫＴ細胞の集団もまた提供する。

１種または複数種の抗原を標的とする少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、ＣＡＲが特異的に結合する抗原を欠損している、ｉＮＫＴ細胞もまた提供する。

特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、悪性Ｔ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する。

特定の実施形態では、抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ－３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される。

特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する。

特定の実施形態では、抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、及びＣＤ１９、から選択される。

特定の実施形態では、キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性Ｂ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する。

特定の実施形態では、悪性Ｂ細胞上に発現した抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、及びＣＤ４５、から選択される。

特定の実施形態では、悪性Ｂ細胞上に発現した抗原は、ＣＤ１９及びＣＤ２０から選択される。

特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方を効果的に共標的とする、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに対するリガンドである、ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分を発現する。

特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は自殺遺伝子を更に含む。

特定の実施形態では、内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、ｉＮＫＴ細胞において阻害される。

特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない。

特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は同胞殺しを誘導しない。

デュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲまたはタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲもまた提供する。

本明細書で開示するｉＮＫＴ細胞の集団、ならびに、少なくとも１種の治療的に許容される担体及び／またはアジュバントを含む、治療用組成物もまた提供する。

特定の実施形態では、組成物は、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、または上記のいずれかのアナログ、から選択される少なくとも１種のアジュバントを含む。

特定の実施形態では、組成物はＩＬ－２を含む。

特定の実施形態では、組成物は、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、または上記のいずれかのアナログの、任意の２種またはそれ以上の組み合わせを含む。

特定の実施形態では、組成物は、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２を含む。

ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞、本明細書で開示するゲノム編集ｉＮＫＴ細胞、デュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞、もしくはタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の集団、または、本明細書で開示する治療用組成物を、血液悪性腫瘍の治療を必要とする患者に投与することを含む、患者における血液悪性腫瘍を治療するための方法についてもまた提供する。

特定の実施形態では、血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である。

特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）である。

特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である。

特定の実施形態では、血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である。

ｄ）単離及び精製したｉＮＫＴ細胞を活性化させること、
ｅ）ｉＮＫＴ細胞における細胞表面タンパク質の発現を欠失または抑制すること、ならびに、
ｆ）任意選択的に、ｉＮＫＴ細胞に、１種または複数種の抗原標的または細胞表面タンパク質標的を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、
の工程を含む、遺伝子編集ｉＮＫＴ細胞を作製するための方法もまた提供する。

特定の実施形態では、方法は、ｉＮＫＴ細胞に、１種または複数種の抗原標的または細胞表面タンパク質標的を認識するキメラ抗原受容体を形質導入する工程を含む。

特定の実施形態では、ＣＡＲの標的である抗原は、細胞から欠失されている。

ｆ）それぞれのドナーから単離及び精製したｉＮＫＴ細胞を活性化させること、
ｇ）ｉＮＫＴ細胞における細胞表面タンパク質の発現を欠失または抑制すること、
ｈ）任意選択的に、ｉＮＫＴ細胞に、１種または複数種の抗原標的または細胞表面タンパク質標的を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、
ｉ）ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞の集団を増殖させること、ならびに、
ｊ）ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞をプールすること、
の工程を含む、複数のドナーに由来するゲノム編集ｉＮＫＴ細胞の集団を作製するための方法もまた提供する。

その他の実施形態については以下で開示する。

ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞及びゲノム編集ｉＮＫＴ－ＣＡＲ
同胞殺し抵抗性。本明細書で開示するｉＮＫＴ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損していることにより、同胞殺し抵抗性であってもよい。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞の抗原は、キメラ抗原受容体が修飾抗原にもはや特異的に結合しないように、修飾されている。例えば、キメラ抗原受容体が認識する抗原のエピトープは、１つもしくは複数のアミノ酸変異（例えば、置換または欠失）によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい。その他の実施形態では、抗原の発現は、ｉＮＫＴ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上低下する。タンパク質の発現を低下させるための方法は当技術分野において周知であり、タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結するプロモーターを修飾または置換することが挙げられるがこれらに限定されない。更にその他の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、例えば、抗原をコードする遺伝子を欠失または破壊することにより、抗原が発現しないように修飾される。上記の実施形態のそれぞれでは、ｉＮＫＴ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１種または好ましくは全ての抗原を欠損していてもよい。抗原を欠損させるｉＮＫＴ細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については上に記載している。例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を用いて、抗原、例えば、以下に記載する抗原を欠損させるｉＮＫＴ細胞を修飾してもよい。代替的に、ＴＡＬＥＮを用いて遺伝子を編集してもよい。

上記方法の変化形態では、編集工程もしくは編集工程の一部、または、ＣＡＲ形質導入の一部のいずれかとして、１種または複数種のタンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）をコードする構築物を、細胞に形質導入してもよい。例えば、ＣＤ３εに特異的な抗体由来単鎖可変フラグメントをコードする構築物を、例えば、レンチウイルスベクターにより、形質導入してもよい。一旦発現すると、ＰＥＢＬはＣＤ３εと細胞内で共局在化し、表面ＣＤ３及びＴＣＲαβの発現を阻害する。それゆえ、ＰＥＢＬによる表面ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現の阻害は、同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するための代替法である。更に、ＰＥＢＬ及びＣＡＲの発現を、単一の構築物内で組み合わせてもよい。本明細書で開示する方法を用いてこれらの方法のいずれかを実施してもよく、本明細書で開示する遺伝子抑制標的のいずれかを阻害するためのＰＥＢＬを作製してもよい。

上記の方法を適応させて、抗原、細胞表面タンパク質、または分泌可能なタンパク質、例えば、サイトカインなど、をコードする遺伝子用の遺伝子座に、ＣＡＲを挿入してもよい。この方法では、ゲノムの編集は、ＣＡＲのトランスフェクションによりもたらされる。その後、本明細書に記載するとおりに細胞を活性化させて、特定の実施形態における独立したゲノム編集工程を取り除いてもよい。理論上、このような工程は、細胞が活発に分裂している間に実施する必要がある。このような方法はまた、遺伝子改変細胞の強力な増殖をもたらすと予想されている。

特定の状況では、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原の欠損で、ｉＮＫＴ細胞を選択してもよい。ある特定のｉＮＫＴ細胞は、より少ない任意の表面タンパク質を産生及び提示するが、その代わりに、ｉＮＫＴ－ＣＡＲの標的となる抗原を欠失または非機能化する場合には、ｉＮＫＴ細胞を、抗原の欠損で選択して、抗原欠損細胞の集団をＣＡＲの形質導入用に増殖させてもよい。このような細胞はまた、同胞殺し抵抗性であり得る。

ＣＡＲ抗原。本明細書で開示するｉＮＫＴ細胞を用いてゲノム編集される好適な抗原、及び本明細書で開示するｉＮＫＴ－ＣＡＲにおけるＣＡＲが認識する好適な抗原としては、血液悪性腫瘍に特異的な抗原が挙げられる。これら好適な抗原としては、Ｔ細胞特異的抗原、及び／またはＴ細胞に特異的ではない抗原を挙げることができる。抗原は、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞のキメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原であってもよく、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞が欠損している抗原は、悪性Ｔ細胞上に発現した抗原、好ましくは、非悪性Ｔ細胞と比較して悪性Ｔ細胞上に過剰発現した抗原（すなわち、Ｔ細胞悪性腫瘍に由来するＴ細胞）である。このような抗原の例としては、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ－３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３ε、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、ＴＲＡＣ、ならびにＴＣＲβ、が挙げられる。

Ｔ細胞悪性腫瘍は、Ｔ細胞前駆細胞、成熟Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞、に由来する悪性腫瘍を含む。Ｔ細胞悪性腫瘍の例としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）性白血病、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ－１＋）成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、ならびに、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、ＡＬＫ陽性未分化大細胞リンパ腫、及びＡＬＫ陰性未分化大細胞リンパ腫を含むがこれらに限定されない、様々な末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、が挙げられる。

好適なＣＡＲ抗原としてはまた、多発性骨髄腫細胞、すなわち、悪性形質細胞の表面上に認められる抗原、例えば、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、及びＣＤ１９などを挙げることができる。代替的に、多発性骨髄腫を治療するための、ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方を効果的に共標的とする、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに対するリガンドである、ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分を発現するように、ＣＡＲを設計してもよい。

本明細書で開示するｉＮＫＴ細胞を用いてゲノム編集される好適な抗原、及び本明細書で開示するｉＮＫＴ－ＣＡＲにおけるＣＡＲが認識する好適な抗原の別の例については、以下の表４、５、１１に記載する。これらの抗原としては、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ－３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３ε、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、ならびにＴＣＲβ、が挙げられる。

自殺遺伝子。代替的にまたは加えて、ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞は、１種または複数種の自殺遺伝子を更に含んでいてもよい。本明細書で使用する場合、「自殺遺伝子」とは、活性化した場合にｉＮＫＴ細胞の死をもたらす、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いてｉＮＫＴ細胞に導入された核酸配列のことを意味する。自殺遺伝子により、必要に応じ、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｉＮＫＴ細胞の効果的な追跡及び除去を促進してもよい。自殺遺伝子を活性化させることにより促進された殺傷は、当該技術分野において周知の方法を用いて生じさせてもよい。当該技術分野において周知の好適な自殺遺伝子療法システムとしては、様々な単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）自殺遺伝子療法システム、または誘導性カスパーゼ９タンパク質、が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な実施形態では、自殺遺伝子は、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ自殺遺伝子である。

ＣＡＲ及びｉＮＫＴ－ＣＡＲを構築するための方法
「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」とは、本明細書で使用する場合、及び当該技術分野において一般的に使用する場合、抗原が細胞外ドメインに結合すると、細胞に特殊機能を実行させる細胞内ドメイン（シグナル伝達ドメイン）に結合した、抗原特異的細胞外ドメイン（抗原認識ドメイン）を有する組換え融合タンパク質のことを意味する。キメラ抗原受容体は、ＭＨＣ非依存性抗原に結合するその能力と、その細胞内ドメインを介して活性化シグナルを変換するその能力の両方により、その他の抗原結合因子とは区別される。

臨床グレードのｉＮＫＴ細胞集団のＣＡＲ設計、送達及び発現、ならびに製造を行うための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０１２，１８（１０）：２７８０－９０を参照されたい。ＣＡＲをコードする遺伝子改変キメラ抗原受容体ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド、細胞外リガンド結合ドメイン、すなわち、抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、を含む。

キメラ抗原受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、抗原（一般的には、悪性腫瘍の表面に発現した抗原）を認識してそれに特異的に結合する。「抗原特異的細胞外ドメイン」（すなわち、「抗原結合ドメイン」）は抗原に特異的に結合するが、その際、例えば、約０．１ｐＭ～約１０μＭ、好ましくは約０．１ｐＭ～約１μＭ、より好ましくは約０．１ｐＭ～約１００ｎＭの親和性定数または相互作用（ＫＤ）の親和性で抗原に結合する。相互作用の親和性を測定するための方法は、当該技術分野において周知である。本開示のＣＡＲに用いるのに好適な細胞外リガンド結合ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであってもよく、多種多様なそれらは、当技術分野において周知である。一部の例においては、抗原結合ドメインは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。その他の抗体ベース認識ドメイン、ｃＡｂ Ｖ_ＨＨ（ラクダ科抗体可変ドメイン）及びそれらのヒト化型、ＩｇＮＡＲ Ｖ_Ｈ（サメ抗体可変ドメイン）及びそれらのヒト化型、ｓｄＡｂ Ｖ_Ｈ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）、ならびに、「ラクダ化」抗体可変ドメイン、が使用に好適である。一部の例においては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベース認識ドメイン、例えば、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶαＶβを含む一本鎖２ドメインＴＣＲ）などもまた、使用に好適である。

本開示のキメラ抗原受容体はまた、抗原特異的細胞外ドメインに抗原が結合すると、ｉＮＫＴ細胞に細胞内シグナルをもたらす、「細胞内ドメイン」を含む。本開示のキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体を発現するｉＮＫＴ細胞における少なくとも１種のエフェクター機能の活性化に影響を及ぼす。用語「エフェクター機能」とは、ｉＮＫＴ細胞などの分化細胞における特殊機能のことを意味する。例えば、ｉＮＫＴ細胞のエフェクター機能は、ＮＫのトランス活性化、Ｔ細胞の活性化及び分化、Ｂ細胞の活性化、樹状細胞の活性化及びクロスプレゼンテーション活性、ならびにマクロファージの活性化、であってもよい。それゆえ、用語「細胞内ドメイン」とは、抗原が細胞外ドメインに結合すると、エフェクター機能シグナルを伝達してｉＮＫＴ細胞に特殊機能を実行させる、ＣＡＲの部分のことを意味する。好適な細胞内ドメインの非限定例としては、Ｔ細胞受容体のζ鎖またはそのホモログ（例えば、η、δ、γ、またはε）のいずれか、及びＣＤ３ζとＣＤ２８などのシグナル伝達分子の組み合わせ、ＣＤ２７、４－１ ＢＢ、ＤＡＰ－１０、ＯＸ４０及びこれらの組み合わせ、ならびにその他の類似した分子及びフラグメント、が挙げられる。活性化タンパク質ファミリーのその他のメンバーの細胞内シグナル伝達部位、例えば、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩなどを使用してもよい。通常は、完全な細胞内ドメインを採用するが、多くのケースでは、完全な細胞内ポリペプチドの使用は必須ではない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケート部分が有用となり得る範囲において、エフェクター機能シグナルをなおも伝達する限りにおいて、このようなトランケート部分をインタクト鎖の代わりに使用してもよい。それゆえ、用語「細胞内ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内ドメインの任意のトランケート部分を含むことを意味する。

通常、抗原特異的細胞外ドメインは、「膜貫通ドメイン」により、キメラ抗原受容体の細胞内ドメインに連結している。膜貫通ドメインは細胞膜を貫通し、ＣＡＲをＴ細胞表面に固定し、細胞外ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結させることにより、Ｔ細胞表面上におけるＣＡＲの発現に影響を及ぼす。キメラ抗原受容体はまた、１種もしくは複数種の共刺激ドメイン及び／または１種もしくは複数種のスペーサーを更に含んでいてもよい。「共刺激ドメイン」は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるサイトカインの産生、増殖、細胞傷害性、及び／または持続性を向上させる共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインから誘導される。「ペプチドヒンジ」は抗原特異的細胞外ドメインを膜貫通ドメインに連結させる。膜貫通ドメインは共刺激ドメインに融合し、任意選択的に、共刺激ドメインは第２の共刺激ドメインに融合し、共刺激ドメインは、ＣＤ３ζに限定されないシグナル伝達ドメインに融合する。例えば、抗原特異的細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、及び複数のｓｃＦｖ（タンデムＣＡＲの場合）間にスペーサードメインを設けて、抗原結合ドメイン（複数可）の柔軟性に影響を及ぼすことにより、ＣＡＲ機能に影響を及ぼしてもよい。好適な膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びスペーサーは、当該技術分野において周知である。

モノｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞（ｍｉＮＫＴ）
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ７に特異的に結合する単一のＣＡＲを含む遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞を提供し、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ７を欠損している（例えば、ＣＤ７－ｉＮＫＴ－ＣＡＲΔＣＤ７細胞）。非限定的な例では、ＣＤ７の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ７にもはや特異的に結合しないように、ｉＮＫＴ細胞が発現するＣＤ７を修飾すること、（ｂ）ＣＤ７の発現が、ｉＮＫＴ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、ｉＮＫＴ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７が発現しないように、ｉＮＫＴ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型－チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする、ＣＤ７－ｉＮＫＴ－ＣＡＲΔＣＤ７細胞内で発現している自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４ ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合している。

商業的に合成された抗ＣＤ７一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、ＣＤ２８及び４－１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する第３世代のＣＡＲ骨格にクローニングすることにより、ＣＤ７特異的ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞用のＣＡＲを作製してもよい。Ｐ２Ａペプチドの後に細胞外ｈＣＤ３４ドメインを加えて、ウイルス形質導入及び抗ｈＣＤ３４磁性ビーズを用いた精製の後における、ＣＡＲによる両方の検出を可能としてもよい。その他の悪性Ｔ細胞抗原に特異的なＣＡＲを作製するために、同様の方法を続けてもよい。

ｉＮＫＴ細胞に由来する、ゲノム編集されたｉＮＫＴ細胞の表面上に発現させることのできるＣＡＲアミノ酸配列の実施形態について開示する。

類似の方法を用いて、その他のモノｉＮＫＴ細胞を構築してもよく、それらについては以下の表４に記載する。

タンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞
特定の実施形態では、本開示は、タンデム（ｔａｎｄｅｍ）ＣＡＲ（ｔＣＡＲ）、すなわち、ＣＤ７及びＣＤ２に特異的に結合する単一の細胞内ドメインを共有する２つのｓｃＦｖ、を含む遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞を提供し、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ７及びＣＤ２を欠損している（例えば、ＣＤ７ｘＣＤ２－ｉＮＫＴ－ｔＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞）。非限定的な例では、ＣＤ７及びＣＤ２の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ７もしくはＣＤ２にもはや特異的に結合しないように、ｉＮＫＴ細胞が発現するＣＤ７及びＣＤ２を修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＣＤ２の発現が、ｉＮＫＴ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、ｉＮＫＴ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７及びＣＤ２が発現しないように、ｉＮＫＴ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７及び／またはＣＤ２をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型－チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする、ＣＤ７＊ＣＤ２－ｉＮＫＴ－ｔＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞内で発現している自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４ ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合している。

商業的に合成された抗ＣＤ７一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）及び抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、ＣＤ２８及び４－１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する第３世代のＣＡＲ骨格にクローニングすることにより、ゲノム編集タンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞用のｔＣＡＲ、すなわち、ＣＤ７＊ＣＤ２－ｉＮＫＴ－ｔＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２を作製してもよい。Ｐ２Ａペプチドの後に細胞外ｈＣＤ３４ドメインを加えて、ウイルス形質導入及び抗ｈＣＤ３４磁性ビーズを用いた精製の後における、ＣＡＲによる両方の検出を可能としてもよい。その他の悪性Ｔ細胞抗原に特異的なｔＣＡＲを作製するために、同様の方法を続けてもよい。

直鎖状タンデムＣＡＲ構築物
直鎖状タンデムＣＡＲ構築物の一実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｈ１及びＶ_Ｌ１と呼ばれる重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｌ２及びＶ_Ｈ２と呼ばれる軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。

直鎖状タンデムＣＡＲ構築物の第２の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｈ２及びＶ_Ｌ２と呼ばれる重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｌ１及びＶ_Ｈ１と呼ばれる軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。

直鎖状タンデムＣＡＲ構築物の第３の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｌ１及びＶ_Ｈ１と呼ばれる重（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＨ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｈ２及びＶ_Ｌ２と呼ばれる軽（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び重（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。

直鎖状タンデムＣＡＲ構築物の第４の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｌ２及びＶ_Ｈ２と呼ばれる重（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び軽（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｈ１及びＶ_Ｌ１と呼ばれる軽（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び重（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。

直鎖状タンデムＣＡＲ構築物の実施形態のそれぞれにおいて、第１及び第２の細胞外リガンド結合ドメインは、表面分子、すなわち、限定するわけではないが、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ－３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３ε、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、ＴＲＡＣ、ならびにＴＣＲβ、から選択される、悪性Ｔ細胞上に発現した抗原を標的とする。

直鎖状タンデムＣＡＲの更なる例については、以下の表５に記載する。

例えば、本明細書では、上の表５の例に記載の抗原対のいずれかを標的とする、ｓｃＦｖのＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインを組み込まれていてもよい直鎖状タンデムＣＡＲ構築物を提供する。

ヘアピンタンデムＣＡＲ構築物
ヘアピンタンデムＣＡＲ構築物の一実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｈ１及びＶ_Ｈ２と呼ばれる２つの重鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｌ２及びＶ_Ｌ１と呼ばれる２つの軽鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。

ヘアピンタンデムＣＡＲ構築物の第２の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｈ２及びＶ_Ｈ１と呼ばれる２つの重鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｌ１及びＶ_Ｌ２と呼ばれる２つの軽鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。

ヘアピンタンデムＣＡＲ構築物の第３の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｌ１及びＶ_Ｌ２と呼ばれる２つの軽鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｈ２及びＶ_Ｈ１と呼ばれる２つの重鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。

ヘアピンタンデムＣＡＲ構築物の第４の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｌ２及びＶ_Ｌ１と呼ばれる２つの軽鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）_２～６により連結されたＶ_Ｈ１及びＶ_Ｈ２と呼ばれる２つの重鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。

ヘアピンタンデムＣＡＲ構築物の実施形態のそれぞれにおいて、第１及び第２の細胞外リガンド結合ドメインは、表面分子、すなわち、限定するわけではないが、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ－３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３ε、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、ＴＲＡＣ、ならびにＴＣＲβ、から選択される、悪性Ｔ細胞上に発現した抗原を標的とする。

ヘアピンタンデムＣＡＲの別の例については、上の表５に記載する。

更に、本明細書では、（１）ＣＤ２及びＣＤ３、ならびに（２）ＣＤ２及びＣＤ７を標的とする、ｓｃＦｖのＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインを組み込まれていてもよいＣＡＲ構築物及びｉＮＫＴ細胞を提供し、以下の表７に記載する。

加えて、本明細書では、表５に記載の抗原対のいずれかを標的とする、ｓｃＦｖのＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインを組み込まれていてもよいヘアピンタンデムＣＡＲ構築物を提供する。

例えば、本明細書の表９では、ＣＤ２ ｓｃＦｖ及びＣＤ３ ｓｃＦｖのＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインを組み込んだヘアピンタンデムＣＡＲ構築物を提供する。

本明細書の表１０ではまた、表５に記載の抗原対のいずれかを標的とする、ｓｃＦｖのＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインを組み込まれていてもよい（Ｃｙｓ＝Ｃｙｓ）二本鎖結合（ＤＳＢ）を有するヘアピンタンデムＣＡＲ構築物を提供する。

デュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞
特定の実施形態では、本開示は、デュアル（ｄｕａｌ）ＣＡＲ（ｄＣＡＲ）、すなわち、ＣＤ７及びＣＤ２に特異的に結合する単一のレンチウイルス構築物から発現する２つのＣＡＲ、を含む遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞を提供し、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ７及びＣＤ２を欠損している（例えば、ＣＤ７ｘＣＤ２－ｉＮＫＴ－ｄＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞）。非限定的な例では、ＣＤ７及びＣＤ２の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ７もしくはＣＤ２にもはや特異的に結合しないように、ｉＮＫＴ細胞が発現するＣＤ７及びＣＤ２を修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＣＤ２の発現が、ｉＮＫＴ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、ｉＮＫＴ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７及びＣＤ２が発現しないように、ｉＮＫＴ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７及び／またはＣＤ２をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型－チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする、ＣＤ７＊ＣＤ２－ｉＮＫＴ－ｄＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞内で発現している自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４ ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合している。

類似の方法を用いて、その他のｉＮＫＴ－ＣＡＲを構築してもよく、それらについては以下の表１１に記載する。

更なる態様では、特定の状況において対照として使用するｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞を作製してもよい。例えば、Ｔ細胞抗原に結合するｉＮＫＴ－ＣＡＲを設計する場合、対照ｉＮＫＴ－ＣＡＲは、悪性Ｔ細胞上に発現していない抗原に結合する細胞外ドメインを含んでいてもよい。対照ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞が結合する抗原は、例えば、ＣＤ１９であってもよい。ＣＤ１９はＴ細胞上ではなくＢ細胞上に発現する抗原であることから、ＣＤ１９に結合するように適合させた細胞外ドメインを有するｉＮＫＴ－ＣＡＲは、Ｔ細胞に結合しない。これらのｉＮＫＴ－ＣＡＲをｉＮＫＴ－ＣＡＲ１９細胞と呼んでもよい。これらの対照ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞を対照として用いて、目的のがんを標的とする及び／または目的の抗原を認識するｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の、結合効率及び非特異的結合を解析してもよい。

当業者に周知の変化形態を任意選択的に採用して、ＷＯ２０１８０２７０３６Ａ１に開示されるように、ＣＡＲを更に設計してもよい。ＷＯ２０１８０２７０３６Ａ１に開示されるように、加えて、当該技術分野において周知の方法を用いて、また市販の供給元から、レンチウイルスベクター及び細胞株を得てもよく、ガイドＲＮＡを設計、検証及び合成してもよい。

レトロウイルスを用いて遺伝子改変ＣＡＲをｉＮＫＴ細胞内に導入してもよく、それにより、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を標的細胞ゲノム内に効率的かつ安定的に組み込むことが可能となる。当該技術分野において周知のその他の方法としては、レンチウイルス形質導入、トランスポゾンベースのシステム、直接的なＲＮＡトランスフェクション、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（すなわちＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（すなわちＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（すなわちＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（すなわちＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（すなわちＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６などの好適なＣａｓタンパク質を用いたＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のシステム）、が挙げられるがこれらに限定されない。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）もまた使用してもよい。例えば、Ｓｈｅａｒｅｒ ＲＦ ａｎｄ Ｓａｕｎｄｅｒｓ ＤＮ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ： ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ，”Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２０１５ Ｊａｎ；２０（１）：１－１０を参照されたい。

サイトカイン遺伝子の欠失または抑制
ＴＣＲならびに細胞表面タンパク質及び抗原を遺伝子編集することに加えて、分泌可能なタンパク質、例えば、サイトカイン及びケモカインなどの遺伝子を編集してもよい。このような編集を行って、例えば、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の発症または維持を抑制または予防してもよい。ＣＲＳは、免疫治療薬（またはその他の免疫学的刺激物）に応答した免疫細胞からの、大規模で急速なサイトカインの放出によって引き起こされる。当該技術分野において周知の方法、例えば、遺伝子の配列情報を変化または欠失させることにより遺伝子発現をなくす、遺伝子の除去（遺伝子サイレンシング）などを用いて、１つまたは複数のサイトカインまたはケモカインの遺伝子の修飾、破壊、または欠失を達成してもよい。これは、当該技術分野において周知の遺伝子操作ツール、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰＲなどを用いることにより、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形質導入により、サイトカインの遺伝子配列にＣＡＲを標的形質導入することなどにより、達成することができる。

例えば、Ｃａｓ９－ＣＲＩＳＰＲを用いることにより、または、サイトカインの遺伝子配列にＣＡＲを標的形質導入することにより、本明細書で開示する免疫エフェクター細胞から欠失させることができるサイトカインまたはケモカインとしては、以下、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＳＰ、Ａ２Ｍ、ＡＣＫＲ１、ＡＣＫＲ２、ＡＣＫＲ３、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＧＥＲ、ＡＧＲＮ、ＡＩＭＰ１、ＡＲＥＧ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ａ、ＢＭＰ８Ｂ、ＢＭＰＲ２、Ｃ１０ｏｒｆ９９、Ｃ１ＱＴＮＦ４、Ｃ５、ＣＣＬ２８、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＤ１０９、ＣＤ３６、ＣＤ４、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ７４、ＣＥＲ１、ＣＨＲＤ、ＣＫＬＦ、ＣＬＣＦ１、ＣＭＴＭ１、ＣＭＴＭ２、ＣＭＴＭ３、ＣＭＴＭ４、ＣＭＴＭ５、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ７、ＣＭＴＭ８、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＲ、ＣＯＰＳ５、ＣＲＬＦ１、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＴＦ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＥＢＩ３、ＥＤＮ１、ＥＬＡＮＥ、ＥＮＧ、ＦＡＭ３Ｂ、ＦＡＭ３Ｃ、ＦＡＭ３Ｄ、ＦＡＳ、ＦＡＳＬＧ、ＦＧＦ２、ＦＬＴ３ＬＧ、ＦＺＤ４、ＧＢＰ１、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ９、ＧＰＩ、ＧＲＥＭ１、ＧＲＥＭ２、ＧＲＮ、ＨＡＸ１、ＨＦＥ２、ＨＭＧＢ１、ＨＹＡＬ２、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＥ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ３、ＩＦＮＷ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｄ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ－１９、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３１、ＩＬ３１ＲＡ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３４、ＩＬ３６Ａ、ＩＬ３６Ｂ、ＩＬ３６Ｇ、ＩＬ３６ＲＮ、ＩＬ３７、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＨＢＢ、ＩＮＨＢＣ、ＩＮＨＢＥ、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ３、ＫＩＴ、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＨＬ２０、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＬＩＦＲ、ＬＴＡ、ＬＴＢ、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＬＴＢＰ４、ＭＩＦ、ＭＩＮＯＳ１－、ＭＳＴＮ、ＮＡＭＰＴ、ＮＢＬ１、ＮＤＰ、ＮＬＲＰ７、ＮＯＤＡＬ、ＮＯＧ、ＮＲＧ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＯＳＭＲ、ＰＡＲＫ７、ＰＤＰＮ、ＰＦ４、ＰＦ４Ｖ１、ＰＧＬＹＲＰ１、ＰＬＰ２、ＰＰＢＰ、ＰＸＤＮ、ＳＣＧ２、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＳＥＣＴＭ１、ＳＬＵＲＰ１、ＳＯＳＴＤＣ１、ＳＰ１００、ＳＰＰ１、ＴＣＡＰ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＢＳ１、ＴＨＮＳＬ２、ＴＨＰＯ、ＴＩＭＰ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１１、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１２－、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＲＩＭ１６、ＴＳＬＰ、ＴＷＳＧ１、ＴＸＬＮＡ、ＶＡＳＮ、ＶＥＧＦＡ、ＶＳＴＭ１、ＷＦＩＫＫＮ１、ＷＦＩＫＫＮ２、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ７Ａ、及びＺＦＰ３６、が挙げられるがこれらに限定されない。

これらの遺伝子の配列は当該技術分野において周知かつ入手可能である。

適応症、及び実際の（ｉＮＫＴ）療法における標準治療
一部の実施形態では、本明細書で開示する及び／または本明細書で開示する方法を用いて作製されるゲノム編集免疫エフェクター細胞は、１種または複数種のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、医薬品として、すなわち、疾患の治療用に使用され得る。多くの実施形態では、細胞はｉＮＫＴ細胞である。

本明細書で開示する及び／または本明細書で開示する方法を用いて作製される細胞は、がん、自己免疫疾患、感染症、及びその他の症状を治療するために、または、がん、自己免疫疾患、感染症、及びその他の症状を治療するための医薬品を製造するために、免疫療法及び養子細胞移入に使用され得る。

がんは、血液悪性腫瘍または固形腫瘍であってもよい。血液悪性腫瘍としては、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及びそれらの亜型、が挙げられる。リンパ腫は、様々な方法、多くの場合、悪性細胞の基本的なタイプに基づいて分類することができ、ホジキンリンパ腫（リードスタンバーグ細胞のがんであることが多いが、時としてＢ細胞から発生することもあり、全てのその他のリンパ腫は非ホジキンリンパ腫である）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のリンパ腫、が挙げられる。

Ｂ細胞リンパ腫としては、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のＢ細胞リンパ腫、が挙げられるがこれらに限定されない。

Ｔ細胞リンパ腫としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病（Ｔ－ＣＬＬ）、セザリー症候群、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のＴ細胞リンパ腫、が挙げられる。

白血病としては、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）（または骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ））白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性（または骨髄性）白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性（またはリンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞性白血病（時として、リンパ腫に分類される）、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他の白血病、が挙げられる。

形質細胞性悪性腫瘍としては、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞腫、及び多発性骨髄腫、が挙げられる。

一部の実施形態では、患者におけるがんを治療するために、とりわけ、固形腫瘍、例えば、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫など、または、がん、例えば、脳、頭頸部、乳房、肺（例えば、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）、生殖系（例えば、卵巣）、上部消化管、膵臓、肝臓、腎臓（ｒｅｎａｌ）系（例えば、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ））、膀胱、前立腺、及び結腸直腸の腫瘍など、を治療するために、医薬品を使用してもよい。

別の実施形態では、患者におけるがんを治療するために、とりわけ、多発性骨髄腫及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から選択される血液悪性腫瘍、ならびに、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、及びＴ細胞慢性リンパ性白血病（Ｔ－ＣＬＬ）から選択されるＴ細胞悪性腫瘍、を治療するために、医薬品を使用してもよい。

一部の実施形態では、自己免疫疾患、例えば、狼瘡、自己免疫（関節）リウマチ、多発性硬化症、移植拒絶反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、皮膚炎などの治療に、細胞を使用してもよい。一部の実施形態では、細胞は、抗体フラグメントの代わりに抗原またはそのフラグメントを提示するキメラ自己抗体受容体Ｔ細胞、すなわちｉＮＫＴであり、このタイプの養子細胞移入では、自己免疫疾患を引き起こすＢ細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞を攻撃しようとし、遺伝子改変Ｔ細胞を殺傷することで反応する。

一部の実施形態では、ＨＩＶ及び結核などの感染症の治療に、細胞を使用してもよい。

別の実施形態では、本開示のｉＮＫＴ細胞は、強力なｉｎ ｖｉｖｏＴ細胞増殖を受けてもよく、長時間にわたり持続し得る。

一部の実施形態では、本開示のｉＮＫＴ細胞を用いた患者の治療は、緩和、治癒的または予防的となり得る。その治療は、自家免疫療法治療の一部、または同種異系免疫療法治療の一部のいずれかであってもよい。自家とは、患者の治療に用いる細胞、細胞株、または細胞集団が、上記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナーに由来するということを意味する。同種異系とは、患者の治療に用いる細胞または細胞集団が、その患者ではなくドナーに由来するということを意味する。

本開示のｉＮＫＴ細胞を用いたがんの治療は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、放射線療法、レーザー光線療法、及び放射線療法、から選択される１種または複数種の治療法と組み合わされてもよい。

本開示のｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、埋め込み、または移植、により実施される。本明細書に記載のｉＮＫＴ細胞組成物、すなわち、モノＣＡＲ、デュアルＣＡＲ、タンデムＣＡＲは、皮下、皮膚内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ管内注射、または腹腔内で、患者に投与され得る。一実施形態では、本開示の細胞組成物は、静脈注射で投与されることが好ましい。

ｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞の集団の投与は、体重１ｋｇあたり１０^４～１０^９の細胞、好ましくは、１０^５～１０^６の細胞／ｋｇ（体重）（これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む）、の投与で構成され得る。ｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞の集団は、１回または複数回の投与で投与されてもよい。別の実施形態では、有効量のｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞の集団は、単回投与で投与される。別の実施形態では、有効量の細胞は、ある期間にわたり２回以上の投与で投与される。投与のタイミングは健康管理提供者の良識の範囲内であり、患者の臨床症状によって決まる。ｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞の集団は、任意の供給源、例えば、血液銀行またはドナーなどから得てもよい。患者の要望は様々ではあるが、個々の疾患または症状のための、任意のｉＮＫＴ細胞集団（複数可）の有効量の至適範囲の算出は当業者の知るところである。有効量とは、治療効果または予防効果をもたらす量のことを意味する。投与量は、患者レシピエントの年齢、健康及び体重、併用治療の種類（ある場合、治療の頻度）、ならびに、望まれる効果の性質によって決まる。

別の実施形態では、有効量の、ｉＮＫＴ細胞もしくはｉＮＫＴ細胞の集団、またはそれらｉＮＫＴ細胞を含む組成物は、非経口で投与される。投与は、静脈内投与であってもよい。ｉＮＫＴ細胞もしくはｉＮＫＴ細胞の集団、またはそれらｉＮＫＴ細胞を含む組成物の投与は、腫瘍内への注射によって直接実施されてもよい。

本開示の一実施形態では、ｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞の集団は、ｉＮＫＴ細胞の増殖及び持続性を向上させる、サイトカイン、もしくはｉＮＫＴ細胞内のサイトカインの発現を用いた治療、ならびに、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５、またはそのアナログを用いることを含むがこれらに限定されない治療、を含むがこれらに限定されない多くの関連治療モダリティと共に、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に、患者に投与される。

一部の実施形態では、本開示のｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞の集団は、ＴＧＦβ、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、アデノシン、ＶＥＧＦ、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ２（ＩＤＯ２）、トリプトファン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、乳酸、低酸素症、アルギナーゼ、及びプロスタグランジンＥ２の阻害剤、を含むがこれらに限定されない、免疫抑制経路を阻害する薬剤と組み合わせて使用してもよい。

別の実施形態では、本開示のｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞の集団は、抗ＣＴＬＡ４（イピリムマブ）、抗ＰＤ１（ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ）、抗ＰＤＬ１（アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ）、抗ＰＤＬ２、抗ＢＴＬＡ、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３、抗ＶＩＳＴＡ、抗ＴＩＧＩＴ、及び抗ＫＩＲ、を含むがこれらに限定されないＴ細胞チェックポイント阻害薬、と組み合わせて使用してもよい。

別の実施形態では、本開示のｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞の集団は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ－４０、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭを刺激する抗体を含むがこれらに限定されないＴ細胞アゴニストと組み合わせて使用してもよい。

別の実施形態では、本開示のｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞の集団は、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びポックスウイルス、を含むがこれらに限定されない治療用腫瘍崩壊ウイルス、と組み合わせて使用してもよい。

別の実施形態では、α－ＧａｌＣｅｒとＩＬ－１２の両方がｉＮＫＴ活性化のために相乗的に作用することから、ｉＮＫＴ細胞を、これらの化合物と同時投与してもよい。

別の実施形態では、本開示のｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞の集団は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ９アゴニスト、を含むがこれらに限定されない、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストなどの免疫活性化治療薬、と組み合わせて使用してもよい。

別の実施形態では、本開示のｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞の集団は、環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）などのインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストと組み合わせて使用してもよい。

免疫エフェクター細胞無形成症、とりわけ、Ｔ細胞無形成症はまた、養子細胞移入療法後の懸念事である。治療する悪性腫瘍がＴ細胞悪性腫瘍でありｉＮＫＴ細胞がＴ細胞抗原を標的とする場合、抗原を発現する正常なＴ細胞及びその前駆細胞が枯渇し、免疫機構が損なわれる。それゆえ、これらの副作用を管理するための方法は、治療の案内係である。このような方法としては、後ほど、ｉＮＫＴ細胞が枯渇または不活性化した後に、増殖させて患者に再注入するために、自家または同種異系（任意選択的に、拒絶反応を引き起こさないまたは拒絶されないように遺伝子改変された）のいずれかの、非悪性のＴ細胞または前駆細胞を選択及び保持することが挙げられる。代替的に、ＴＣＲ保有細胞の亜型、例えば、正常及び悪性のＴＲＢＣ１^＋（しかし、ＴＲＢＣ２^＋細胞ではない）、または代替的に、ＴＲＢＣ２^＋（しかし、ＴＲＢＣ１^＋細胞ではない）などを認識して殺傷するｉＮＫＴ細胞を使用して、十分な正常Ｔ細胞を保持して正常な免疫機構の機能を維持しつつ、Ｔ細胞悪性腫瘍を根絶してもよい。

定義
本明細書において特に定義しない限り、使用する全ての技術用語及び科学用語は、遺伝子療法、生化学、遺伝学、及び分子生物学の分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の組成物及び方法と同様または同等の全ての開示される組成物及び方法を、本開示の実施または試験に使用することができる。

数値の範囲を開示する場合、また表記「ｎ_１…～ｎ_２」または「ｎ_１…～ｎ_２の間」を使用する場合、ｎ_１及びｎ_２は数字であり、そのため、特に明記しない限り、この表記は、数字自体及びそれらの間の範囲を含むことを意図している。この範囲は、数字間における整数または連続であってもよく、末端の数値を含む。例えば、「２～６個の炭素」の範囲は、炭素が整数単位で存在することから、２、３、４、５、及び６個の炭素を含むことを意図している。対照的に、例えば、「１～３μＭ（マイクロモル）」の範囲は、１μＭ、３μＭ、及び、数字間における任意数の有効数字（例えば、１．２５５μＭ、２．１μＭ、２．９９９９μＭなど）の全てを含むことを意図している。

用語「約」は、本明細書で使用する場合、その用語が修飾する数値を、このような数値が誤差の範囲内で変動することを表すように、限定することを意図している。誤差の範囲が特にない場合、例えば、データのグラフまたは表に記載された平均値に対する標準偏差が列挙されている場合などにおいて、用語「約」は、列挙された数値を包含し得る範囲、及び、同様に、有効数字を考慮して、その数値にまで切り上げるまたは切り下げることにより含まれ得る範囲を意味するものと理解すべきである。

細胞に関する用語「活性化」（及びその別の活用型）は通常、「刺激すること」と同義であると理解すべきであり、本明細書で使用する場合、細胞集団の増殖をもたらす細胞の処理のことを意味する。Ｔ細胞において、活性化は、ＣＤ２及びＣＤ２８（及び同様に、ＣＤ２の場合もある）アゴニスト、一般的には、任意選択的に、磁性ビーズ上にコーティングしたまたはコロイド状のポリマーマトリックスにコンジュゲートした、抗体、に曝露することによって達成されることが多い。

用語「抗原」は、本明細書で使用する場合、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体が認識する（すなわち、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体の標的である）細胞表面タンパク質である。古典的な意味において、抗原は、抗体が認識する物質、典型的にはタンパク質であるが、ＣＡＲが、１種または複数種の抗原（複数可）を認識する軽（Ｖ_Ｌ）鎖及び重（Ｖ_Ｈ）鎖などの抗体由来ドメインを含む限りにおいて、定義は重複するものである。

用語「がん」とは、体内における悪性腫瘍、または細胞の異常増殖のことを意味する。多くの異なるがんが、特定の細胞表面タンパク質または分子によって特性決定または同定され得る。それゆえ、一般的な用語において、本開示によるがんは、本明細書に記載のｉＮＫＴ細胞などの免疫エフェクター細胞を用いて治療可能なあらゆる悪性腫瘍のことを意味し得、免疫エフェクター細胞は、がん細胞上の細胞表面タンパク質を認識してそれに結合する。本明細書で使用する場合、がんとは、血液悪性腫瘍、例えば、多発性骨髄腫、Ｔ細胞悪性腫瘍、またはＢ細胞悪性腫瘍などのことを意味し得る。Ｔ細胞悪性腫瘍としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）または非ホジキンリンパ腫を挙げることができるがこれらに限定されない。がんはまた、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、及び肺癌、を含むがこれらに限定されない固形腫瘍のことを意味し得る。

「細胞表面タンパク質」は、本明細書で使用する場合、細胞の表面上で少なくとも部分的に、細胞が発現するタンパク質（またはタンパク質複合体）である。細胞表面タンパク質の例としては、ＴＣＲ（及びそのサブユニット）及びＣＤ７が挙げられる。

「キメラ抗原受容体」すなわち「ＣＡＲ」とは、本明細書で使用する場合、及び当該技術分野において一般的に使用する場合、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞外リガンド結合ドメインが標的細胞上に存在する構成要素に結合すると、細胞に特殊機能を実行させるシグナル伝達ドメイン、を有する、組換え融合タンパク質のことを意味する。例えば、ＣＡＲは、特定の抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を産生するための、Ｔ細胞受容体を活性化させる細胞内ドメインを有し、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する、抗体に基づいた特異性を有していてもよい。第１世代のＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン（一般的には、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγ）を含む。第２世代のＣＡＲは、細胞内共刺激ドメイン（一般的には、４－１ＢＢまたはＣＤ２８）を含ませることにより、第１世代のＣＡＲ構築物を土台に構築されている。これらの共刺激ドメインは、第１世代のＣＡＲと比較して、ｉＮＫＴ細胞の傷害性及び増殖を向上させるのに役立つ。第３世代のＣＡＲは、主として、ｉＮＫＴ細胞の増殖及び持続性を向上させるための、複数の共刺激ドメインを含む。キメラ抗原受容体は、ＭＨＣ非依存性抗原に結合するその能力と、その細胞内ドメインを介して活性化シグナルを変換するその能力の両方により、その他の抗原結合因子とは区別される。

「ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞」は、少なくとも１種のＣＡＲを形質導入された免疫エフェクター細胞である。「ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞」は、少なくとも１種のＣＡＲを形質導入されたｉＮＫＴ細胞であり、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、モノ、デュアル、またはタンデムＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞であってもよい。ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、自家（対象自身の細胞から遺伝子改変されたことを意味する）であってもよく、または、同種異系（細胞が健康なドナーを供給源としていることを意味する）であってもよく、多くの場合、宿主対移植片反応、または移植片対宿主反応を引き起こさないように遺伝子改変されている。ドナー細胞はまた、臍帯血に由来していてもよく、または、人工多能性幹細胞から作製してもよい。

用語「ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞」（すなわち、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ）とは、キメラ抗原受容体を発現するｉＮＫＴ細胞のことを意味する。

デュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞（すなわち、ｉＮＫＴ－ｄＣＡＲ）は、同一エフェクター細胞内に発現した異なる標的抗原に対する親和性を有する、２つの異なるキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞であり、それぞれのＣＡＲ機能は独立している。ＣＡＲは、単一または複数のポリヌクレオチド配列から発現してもよい。

タンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞（すなわち、ｉＮＫＴ－ｔＣＡＲ）は、異なる標的に対する親和性を有する、２つの異なる抗原認識ドメインを含有する単一キメラ抗原ポリペプチドを有するｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞であり、抗原認識ドメインは、ペプチドリンカーによって連結し、共通の共刺激ドメイン（複数可）を共有しており、いずれかの抗原認識ドメインの結合により、共通の共刺激ドメイン（複数可）、及びシグナル伝達ドメインにわたり、シグナルが伝達される。

用語「組み合わせ治療」とは、本開示に記載の治療症状または障害を治療するための、２種またはそれ以上の治療薬の投与のことを意味する。このような投与は、固定比率の活性成分を有する単一のカプセル剤、または、それぞれの活性成分用の複数の別々のカプセル剤などによる、これらの治療薬のほぼ同時の共投与を包含する。加えて、このような投与はまた、それぞれの種類の治療薬の連続的な使用を包含する。いずれの場合も、治療レジメンは、本明細書に記載の症状または障害の治療において、薬剤組み合わせの有益な効果をもたらす。

用語「組成物」とは、本明細書で使用する場合、１種または複数種の治療的に許容される担体と組み合わせた、免疫療法用の細胞集団のことを意味する。

用語「疾患」は、本明細書で使用する場合、全てが、正常な機能を損なっているヒトもしくは動物の体またはその部位の１つにおける、異常な状態を反映し、典型的には、徴候及び症状が際立つことにより顕在化し、またヒトまたは動物の寿命または生活の質を低下させるという点で、一般的に、用語「障害」、「症候群」及び「症状」（医学的症状と同様）と同義であり、それらと同じ意味で用いられることを意図している。

用語「同胞殺し」とは、本明細書で使用する場合、標的とされる細胞が、両方の細胞上のキメラ抗原受容体が特異的に認識する抗原を発現していることから、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞が、そのｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の標的と同一のキメラ抗原受容体を含む別のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の標的となる際、または別のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞によって殺傷される際に生じるプロセスのことを意味する。キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損したキメラ抗原受容体を含むｉＮＫＴ－ＣＡＲは、「同胞殺し抵抗性」である。

用語「ゲノム編集」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子が、非機能的となるように付加、欠失、または修飾されているということを意味する。それゆえ、特定の実施形態では、「遺伝子編集ｉＮＫＴ細胞」は、少なくとも１種の抗原を認識するＣＡＲなどの遺伝子を付加された、及び／または、ＣＡＲが認識する抗原（複数可）の遺伝子（複数可）などの遺伝子を欠失された、ｉＮＫＴ細胞である。

本明細書で使用する場合、「自殺遺伝子」とは、活性化した場合にｉＮＫＴ細胞の死をもたらす、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いてｉＮＫＴ細胞に導入された核酸配列のことを意味する。必要に応じ、自殺遺伝子は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｉＮＫＴ細胞の追跡及び除去、すなわち、殺傷を促進し得る。自殺遺伝子を活性化することによりｉＮＫＴ細胞の殺傷を促進することは、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いて実施することができる。当該技術分野において周知の自殺遺伝子システムとしては、（ａ）非毒性プロドラッグのガンシクロビル（ＧＣＶ）をＧＣＶ－三リン酸に変換して、ＤＮＡ複製を停止させることにより細胞死をもたらす、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）－ｔｋ、（ｂ）ｉＣａｓｐ９が低分子ＡＰ１９０３に結合することにより二量体化が可能となり、内因性アポトーシス経路が活性化されること、及び、（ｃ）関連モノクローナル抗体の投与後、補体／抗体依存性細胞傷害（ＣＤＣ／ＡＤＣＣ）により、修飾細胞の効率的な除去を可能とする、形質導入ｉＮＫＴ細胞において発現する、標的となり得る表面抗原（例えば、ＣＤ２０及びトランケートＥＧＦＲ）、が挙げられるがこれらに限定されない。

例えば、「がん細胞」は、悪性Ｔ細胞、悪性Ｂ細胞、または悪性形質細胞である。

「悪性Ｂ細胞」は、Ｂ細胞悪性腫瘍に由来するＢ細胞である。Ｂ細胞悪性腫瘍としては、（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、及びＢ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、が挙げられるがこれらに限定されない。

「悪性Ｔ細胞」は、Ｔ細胞悪性腫瘍に由来するＴ細胞である。

用語「Ｔ細胞悪性腫瘍」とは、Ｔ細胞前駆細胞、成熟Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞に由来する、広く、極めて不均一なグループの悪性腫瘍のことを意味する。Ｔ細胞悪性腫瘍の非限定例としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ－１＋）成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病（ＨＴＬＶ－１関連）、アグレッシブＮＫ細胞性白血病、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、ＡＬＫ陽性未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、ＡＬＫ陰性血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、乳房インプラント関連未分化大細胞リンパ腫、ＮＫ細胞の慢性リンパ増殖性障害、節外性鼻型ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、腸疾患型Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ＧＩ管の無痛性Ｔ細胞リンパ増殖性障害、単形性上皮向性腸管Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ＴＦＨ表現型を伴う節性末梢Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、ＮＯＳ、原発性皮膚γδＴ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋アグレッシブ表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚先端型ＣＤ８＋Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ４＋小型／中型Ｔ細胞リンパ増殖性障害［原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫（Ｃ－ＡＬＣＬ）、リンパ球様丘疹症］、セザリー症候群、皮下脂肪組織炎様Ｔ細胞リンパ腫、小児期の全身性ＥＢＶ＋Ｔ細胞リンパ腫、及びＴ細胞大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）、が挙げられる。

「健康なドナー」は、本明細書で使用する場合、血液悪性腫瘍（例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍）を有していない健康なドナーである。

用語「治療的に許容される」とは、過度の毒性、炎症、及びアレルギー反応を伴わず、妥当な利益／リスク比に見合い、及び／または、その使用目的において有効である、患者の組織との接触に用いるのに適切な物質のことを意味する。

用語「治療的に有効」は、疾患もしくは障害の治療に使用する、または、臨床エンドポイントの効果に使用する、活性成分の量を適格とすることを意図している。

本明細書で使用する場合、「分泌可能なタンパク質」は、別の細胞に影響を及ぼす、細胞が分泌するタンパク質である。例えば、分泌可能なタンパク質としては、サイトカイン、ケモカイン、及び転写因子、が挙げられる。

用語「ドナー鋳型」とは、相同組換え修復（ＨＤＲ）ＤＮＡ修復経路により二本鎖切断を修復するための鋳型として細胞が使用する基準ゲノム物質のことを意味する。ドナー鋳型は、ゲノム内へと挿入される、二本鎖切断部位の側面を狙う２本のホモロジーアームを有するＤＮＡの断片（発現させる遺伝子、すなわち、ＣＡＲまたはマーカーの遺伝子を含有している）を含有している。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス、一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ、であってもよい。

用語「に曝露する」は、本明細書で使用する場合、目的の組成物（例えば、抗体など）を別の目的の組成物（例えば、細胞など）と密着させる状況において、「と培養する」と同義であることを意図しており、短い期間の接触は、用語「と培養する」の代わりに用語「に曝露する」を使用することを意図している。

用語「患者」は一般的に、用語「対象」と同義であり、ヒトを含む全ての哺乳動物を含む。

以下の実施例により本発明を更に説明する。

実施例１－ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞を作製するための方法
以下の工程を採用して、本明細書で開示する遺伝子編集ｉＮＫＴ細胞を得てもよい。当業者は理解するように、おそらく異なる効率をもたらすであろうが、ある特定の工程を、以下に記載する順で連続的に実施してもよく、または、順不同に実施してもよい。

工程１．１名または複数名の健康なドナーから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採取する。

工程２．次に、例えば、Ｖａｌｐｈａ２４に結合する、標識抗体をコーティングした磁性ビーズ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用した磁気選択を用いて、ドナーのＰＢＭＣからｉＮＫＴ細胞を単離／精製する。その他の精製技術は当該技術分野において周知であり、それらを使用してもよい。

工程３．その後、ｉＮＫＴ細胞を活性化させる。ｉＮＫＴを活性化させるための方法はいくつかある。精製後に残った非ｉＮＫＴ画分に照射（例えば、４０Ｇｙ）を行ってから、α－ＧａｌＣｅｒを添加してもよい（インバリアント受容体用のリガンドであるＣＤ１ｄ－α－ＧａｌＣｅｒを有する細胞を作製するために、例えば、２００ｎｇ／ｍｌを１時間、例えば、３７℃で）。次に、ｉＮＫＴ細胞を、照射α－ＧａｌＣｅｒパルス陰性細胞と培養する（１：１０）。代替的に、抗ｉＮＫＴ受容体抗体を使用してｉＮＫＴを活性化させてもよい。更に別の代替例では、α－ＧａｌＣｅｒと複合体を形成した精製ＣＤ－１ｄを使用して、ｉＮＫＴを活性化させてもよい。更に別の代替例では、α－ＧａｌＣｅｒをパルスしたＣＤ１ｄ発現細胞株を使用して、ｉＮＫＴを刺激してもよい。

工程４．１種または複数種の抗原を標的とするＣＡＲを細胞に形質導入する場合、ＣＡＲの標的である抗原を細胞表面から欠失させてもよく、または、その抗原の発現を抑制してそれに続く同胞殺しを防止してもよい。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、及び標的（複数可）に対するｇＲＮＡをエレクトロポレーションすることにより、標的の欠失を実施してもよい。しかしながら、その他の技術を使用して標的の発現を抑制してもよい。これらの技術としては、その他のゲノム編集技術、例えば、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、ＲＮＡ干渉、及び、抗原の内部結合を生じさせて細胞表面発現を防止することなどが挙げられる。標的の欠失は、全ての状況において必須ということでなくてもよい。例えば、ＣＤ７は、ｉＮＫＴの５０％において発現しているに過ぎず、それに対し、ＣＤ２は、ほぼ全てのｉＮＫＴにおいて発現している。使用可能なｇＲＮＡの例としては、表２に示すｇＲＮＡ、及び、当該技術分野において周知のその他のｇＲＮＡが挙げられる。

工程５．次に、１種または複数種の抗原標的またはタンパク質標的を標的とする、すなわち、認識する、ＣＡＲ、例えば、ＣＡＲ構築物を含有するレンチウイルスを、ｉＮＫＴに形質導入してもよい。形質導入／トランスフェクションの任意のその他の好適な方法を用いてもよく、例えば、転移因子を含有する、ＤＮＡを組み込んだウイルスもしくは非ウイルスベクター、または、一過性発現の、非ＤＮＡを組み込んだポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡなど、を使用したトランスフェクションを用いてもよく、あるいは、相同または非相同組換えを使用した、ヌクレアーゼ活性部位へのＣＡＲポリヌクレオチドの挿入を用いてもよい。

工程６．次に、ｉＮＫＴを培養してＣＡＲ－ｉＮＫＴ集団を増殖させる。この増殖を数週間にわたり継続してもよい。定期的にα－ＧａｌＣｅｒ添加細胞を加えることにより、ｉＮＫＴが刺激される状態を維持してもよいが、初回刺激の場合と同様に、その他の選択肢が利用可能である。培地は通常、高用量のＩＬ－２（本発明者らの手順においては目下、２００ユニット／ｍｌ）を含有している。ＩＬ－７、ＩＬ－１５、または、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５の組み合わせもまた使用して、ｉＮＫＴをｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させてもよい。力価または安定性が向上するように遺伝子改変されたこれらサイトカインのアナログもまた使用して、培養を増強してもよい。

工程７．任意選択的に、複数のドナーに由来する細胞をプールしてもよい。これはプロセスの最後の工程である必要はなく、照射α－ＧａｌＣｅｒパルス陰性細胞に代わる選択肢、例えば、抗体を使用してｉＮＫＴ細胞を刺激する場合、実際に、最初の工程のうちの１つ（例えば、工程３の前）であってもよい。これは、α－ＧａｌＣｅｒを添加した細胞集団が、複数のドナーに由来する試料をプールした場合に、細胞傷害性となり得るＴ細胞及びＮＫ細胞を含有するからである。

これらの工程を図１及び図７のフローチャートで示す。当業者は、図１に明記した期間にある程度の自由度が可能であることを理解するであろう。これらの方法を用いて作製した、ＣＤ７標的化ＣＡＲ（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ７）を有するＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を図３に、別の抗原を標的とするＣＡＲを有するＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を図４に示す。ｉＮＫＴ－ＣＡＲの別の例については、以下の実施例ＩＶに記載する。

実施例２－ゲノム編集タンデムＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製するための方法
実施例１における手順の変化形態では、２種の抗原を認識するタンデムＣＡＲ－ｉＮＫＴを作製してもよい。工程４では、細胞表面から２種の抗原を欠失させる、または、上記のとおり抑制してもよいが、２種の標的それぞれ用のｇＲＮＡ、及びＣａｓ９ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションする。次に、工程５では、２種の標的を認識するＣＡＲをｉＮＫＴに形質導入する。この変化形態を図２のフローチャートで示す。これらの方法を用いて作製した、タンデムＣＤ２及びＣＤ７標的化ＣＡＲ（Ｔ－ＣＡＲ７×２）を有するＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を図５に、Ａ及びＢと表記した２種のその他の抗原を標的とするＣＡＲ（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ（Ａ×Ｂ））を有するＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を図６に示す。タンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲの別の例については、以下の実施例ＩＶに記載する。

実施例３－ゲノム編集デュアルＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製するための方法
実施例１における手順の変化形態では、２種の抗原を標的とするデュアルＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製してもよい。この変化形態では、それぞれが異なる抗原を認識する２種の独立したＣＡＲを含有していてもよい。デュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲの別の例については、以下の実施例ＩＶに記載する。

実施例４－ゲノム編集ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞
上記の方法を使用して、いくつかのタイプのゲノム編集ｉＮＫＴ細胞を作製してもよい。図３及び図５は、２つの具体的な例を示している。ＣＡＲの抗原標的である表面タンパク質を欠失または抑制した別の例について、本明細書に記載する。通常、抗原を欠失または抑制した例は、同胞殺し抵抗性の利点を有する。特定の実施形態では、ｉＮＫＴ－ＣＡＲは、ＣＡＲの抗原標的である表面タンパク質を欠失または抑制している。

ＣＡＲの抗原標的である１種または複数種の表面タンパク質を欠失または抑制した、及び、欠失または抑制していない、タンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ及びデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲの別の例については、以下に記載する。通常、より多くの抗原を欠失または抑制した例は、より高い同胞殺し抵抗性の利点を有する可能性がより高い。タンデムＣＡＲにおいて抗原（ｓｃＦｖ）が配向する順番が以下の表３に記載されているが、限定することを意図するものではなく、どちらの配向のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲも含むということを、更に留意すべきである。例えば、ＣＤ２×ＣＤ３ε ｉＮＫＴ－ｔＣＡＲは、ＣＤ２－ＣＤ３εの配向を有するｔＣＡＲ、またはＣＤ３ε－ＣＤ２の配向を有するｔＣＡＲを包含する。

実施例５－ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞

実施例６－ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞を用いた患者（複数可）の治療
図７に示す、上記の方法により作製した細胞を用いて、患者を治療してもよい。例えば、ｉＮＫＴ－ＣＡＲの増殖させた集団を患者に注入してもよい。

工程７．図７の工程７に示すとおり、治療前に数名のドナーに由来するｉＮＫＴを混合することが可能である。

工程８．ゲノム編集細胞であるｉＮＫＴを患者に注入する。

工程９．ｉＮＫＴは、アロ反応性を誘導せずに、がん細胞を標的とする。例えば、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ７細胞は、表面タンパク質としてＣＤ７を保有するがん細胞（及びその他の非がん細胞）を標的とし得る。ｉＮＫＴ－ＣＡＲ７×２細胞は、１種の表面タンパク質または複数種の表面タンパク質としてＣＤ７及び／またはＣＤ２を保有するがん細胞を標的とし得る。

工程１０．任意選択的に、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、αＧａｌＣｅｒ、または上記のいずれかのアナログを、単独でまたは組み合わせて、同時注入すると、ｉｎ ｖｉｖｏにおける機能が増強されると予想される。同時注入は、その同時注入が注入細胞の増殖を刺激するのになおも有効である限りにおいて、わずかな時間差があってもよい。

本明細書で開示するｉＮＫＴ－ＣＡＲで治療した患者は、有意に長期間にわたる生存、全身腫瘍組織量の低下、健康状態の改善、及び寛解を示すと予想される。

実施例７－バイオアッセイ
以下のアッセイまたはその変形形態を使用して、本明細書で開示するｉＮＫＴ－ＣＡＲの有効性を評価してもよい。

Ｔ－ＡＬＬ用のｉＮＫＴ－ＣＡＲ７。Ｔ－ＡＬＬの異種モデルを用いたｉＮＫＴ－ＣＡＲ７の有効性試験：１×１０^５のＣｌｉｃｋ Ｂｅｅｔｌｅ Ｒｅｄルシフェラーゼ（ＣＢＲ）標識ＣＣＲＦ－ＣＥＭ Ｔ－ＡＬＬ（ＦＡＣＳにより９９％ ＣＤ７＋）細胞をＮＳＧレシピエントにＩ．Ｖ．注射してから、２×１０^６～１×１０^７のｉＮＫＴ－ＣＡＲ７または非標的ｉＮＫＴ－ＣＡＲ１９対照細胞を＋４日目にＩ．Ｖ．注入する。ｉＮＫＴ－ＣＡＲＴ１９を投与されたマウスまたは腫瘍のみを注入されたマウスとは対照的に、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ７を投与されたマウスは、生物発光イメージングを用いて測定する際に、有意に長期間にわたる生存及び全身腫瘍組織量の低下を示す。

ＭＭ用のｉＮＫＴ－ＣＡＲ（ＣＳ１）。多発性骨髄腫の異種モデルを用いたｉＮＫＴ－ＣＡＲ－ＣＳ１の有効性試験：５×１０^５のＣｌｉｃｋ Ｂｅｅｔｌｅ Ｒｅｄルシフェラーゼ（ＣＢＲ）標識ＭＭ．１Ｓ（ＦＡＣＳにより９９％ ＣＳ１＋）細胞をＮＳＧレシピエントにＩ．Ｖ．注射してから、２×１０^６～１×１０^７のｉＮＫＴ－ＣＡＲ－ＣＳ１または非標的ｉＮＫＴ－ＣＡＲ１９対照細胞を＋４日目、または＋１４日目もしくは＋２８日目にＩ．Ｖ．注入する。ｉＮＫＴ－ＣＡＲ１９を投与されたマウスまたは腫瘍のみを注入されたマウスとは対照的に、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ－ＣＳ１を投与されたマウスは、生物発光イメージングを用いて測定する際に、有意に長期間にわたる生存及び全身腫瘍組織量の低下を示す。

実施例８－ｇＲＮＡ選択のためのオフターゲット解析
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＆ ｉＰＳＣにおいて、ガイドＲＮＡを設計して活性を確認した。Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＆ ｉＰＳＣにおいて、ガイドＲＮＡを設計して活性を確認した。任意のｇＲＮＡに対して相補的な配列は、標的遺伝子座を含むがこれらに限定されないゲノム中にわたり存在し得る。短い配列はオフターゲットにハイブリダイズする可能性がより高い。同様に、ｇＲＮＡ内のある程度長い配列は、ゲノム中にわたり、完全マッチ（長＿０）またはニアマッチ（それぞれ、単一のヌクレオチド差または２つのヌクレオチド差を表す、長＿１、長＿２）を有し得る。これらもまたオフターゲットにハイブリダイズする、要するに、関係ない遺伝子の編集をもたらして編集効率を低下させる場合がある。

ｈＣＤ２の２つのエキソン（ＣＦ５８及びＣＦ５９）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。エキソンＣＦ５８の結果を表１４に列挙し、エキソンＣＦ５９の結果を表１５に列挙する。

次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表１４及び表１５のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、ＣＦ５８．ＣＤ２．ｇ１（４１．２％）、ＣＦ５８．ＣＤ２．ｇ２３（１３．２％）、ＣＦ５９．ＣＤ２．ｇ２０（２６．６％）、ＣＦ５９．ＣＤ２．ｇ１３（６６．２％）、ＣＦ５９．ＣＤ２．ｇ１７（１７．５％）、を推奨した。１５％以上の正規化ＮＨＥＪ頻度を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、細胞株及び動物モデルの作製プロジェクト用の良好な候補である。

ｈＣＤ３Ｅについて、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。ｈＣＤ３Ｅの結果を表１６に列挙する。

次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表１６のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、ＭＳ１０４４．ＣＤ３Ｅ．ｓｐ２８（＞１５％）、及びＭＳ１０４４．ＣＤ３Ｅ．ｓｐ１２（＞１５％）、を推奨した。１５％以上の正規化ＮＨＥＪ頻度を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、細胞株及び動物モデルの作製プロジェクト用の良好な候補である。

ｈＣＤ５の３つのエキソン（エキソン３、エキソン４、及びエキソン５）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。エキソン３の結果を表１７に列挙し、エキソン４の結果を表１８に列挙し、エキソン５の結果を表１９に列挙する。

次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表１７、表１８、及び表１９のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、エキソン３：ＳＰ５９７．ｈＣＤ５．ｇ２（７６．５％）、ＳＰ５９７．ｈＣＤ５．ｇ２２（３６．３％）、ＳＰ５９７．ｈＣＤ５．ｇ３９（１６．０％）、ＳＰ５９７．ｈＣＤ５．ｇ４６、エキソン４：ＳＰ５９８．ｈＣＤ５．ｇ７、ＳＰ５９８．ｈＣＤ５．ｇ１０（５８．５％）、エキソン５：ＳＰ５９９．ｈＣＤ５．ｇ５（５１．０％）、ＳＰ５９９．ｈＣＤ５．ｇ３０、ＳＰ５９９．ｈＣＤ５．ｇ４２、ＳＰ５９９．ｈＣＤ５．ｇ５８（４１．０％）、を推奨した。

ｈＣＳＦ２について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。ｈＣＳＦ２の結果を表２０に列挙する。

次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表２０のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、ＭＳ１０８６．ＣＳＦ２．ｓｐ８（＞１５％）、及びＭＳ１０８６．ＣＳＦ２．ｓｐ１０（＞１５％）、を推奨した。

ｈＣＴＬＡ４の２つのエキソン（エキソン１及びエキソン２）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。ｈＣＴＬＡ４のエキソン１の結果を表２１に列挙し、ｈＣＴＬＡ４のエキソン２の結果を表２２に列挙する。

次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表２１及び表２２のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、エキソン１：ＳＰ６２１．ｈＣＴＬＡ４．ｇ２（＞１５％）、及びＳＰ６２１．ｈＣＴＬＡ４．ｇ１２（＞１５％）、エキソン２：ＳＰ６２２．ｈＣＴＬＡ４．ｇ２（＞１５％）、ＳＰ６２２．ｈＣＴＬＡ４．ｇ９（＞１５％）、及びＳＰ６２２．ｈＣＴＬＡ４．ｇ３３（＞１５％）、を推奨した。

ｈＰＤＣＤ１の２つのエキソン（ＣＦ６０及びＣＦ６１）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。エキソンＣＦ６０の結果を表２３に列挙し、エキソンＣＦ６１の結果を表２４に列挙する。

次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表２３及び表２４のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、ＣＦ６０．ＰＤＣＤ１．ｇ１２（６５．６％）、ＣＦ６０．ＰＤＣＤ１．ｇ３（６９．２％）、ＣＦ６１．ＰＤＣＤ１．ｇ６、ＣＦ６１．ＰＤＣＤ１．ｇ２（７２．７％）、及びＣＦ６１．ＰＤＣＤ１．ｇ３５（２４．０％）、を推奨した。

ｈＴＩＭ３の２つのエキソン（エキソン２及びエキソン３）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。エキソン２の結果を表２５に列挙し、エキソン３の結果を表２６に列挙する。

次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表２５及び表２６のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、エキソン２：ＳＰ６１９．ｈＴＩＭ３．ｇ１２（４５．０％）、ＳＰ６１９．ｈＴＩＭ３．ｇ２０（６０．９％）、及びＳＰ６１９．ｈＴＩＭ３．ｇ４９（４５．４％）、エキソン３：ＳＰ６２０．ｈＴＩＭ３．ｇ５（５８．０％）、及びＳＰ６２０．ｈＴＩＭ３．ｇ７（２．９％）、を推奨した。

実施例９－ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ｉＮＫＴを作製及び試験するための方法
実施例１における手順の変化形態では、工程１及び工程２におけるように、単一の抗原を認識するＣＡＲ－ｉＮＫＴを作製してもよい。本実施例では工程３及び工程４を省略する。工程５では、ＢＣＭＡを認識するＣＡＲをｉＮＫＴに形質導入する。これらの方法を用いて作製したＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を図８Ａに示す。
ＢＣＭＡ＋標的細胞（ＭＭ１．ｓ）に対する４時間のＣｒ放出アッセイで、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ ｉＮＫＴの有効性を試験した。図８Ｂ。５×１０^５のＭＭ．１Ｓ－ＣＧをＮＳＧマウスにＩ．Ｖ．で移植してから、２８日目に、１×１０ｅ^７のＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔまたは非標的ＣＡＲでマウスを治療することにより、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性を試験した。ＢＬＩイメージング（図８Ｃ）を用いて全身腫瘍組織量を測定することにより、また生存率（図８Ｄ）をモニタリングすることにより、有効性を評価した。

実施例１０－ＣＤ２＋Ｔ－ＡＬＬ細胞株及びＣＤ２＋ＣＴＣＬ細胞株をｉｎ ｖｉｔｒｏで効果的に殺傷するＣＡＲ２－ｉＮＫＴ細胞。
工程１．１名または複数名の健康なドナーから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採取した。

工程２．例えば、Ｖａｌｐｈａ２４に結合する、標識抗体をコーティングした磁性ビーズ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用した磁気選択を用いて、ドナーのＰＢＭＣからｉＮＫＴ細胞を単離／精製した。その他の精製技術は当該技術分野において周知であり、それらを使用してもよい。

工程３．その後、ｉＮＫＴ細胞を活性化させる。ｉＮＫＴを活性化させるための方法はいくつかある。精製後に残った非ｉＮＫＴ画分に照射（例えば、４０Ｇｙ）を行ってから、α－ＧａｌＣｅｒを添加してもよい（インバリアント受容体用のリガンドであるＣＤ１ｄ－α－ＧａｌＣｅｒを有する細胞を作製するために、例えば、２００ｎｇ／ｍｌを１時間、例えば、３７℃で）。次に、ｉＮＫＴ細胞を、照射α－ＧａｌＣｅｒパルス陰性細胞と培養する（１：１０）。代替的に、抗ｉＮＫＴ受容体抗体を使用してｉＮＫＴを活性化させてもよい。更に別の代替例では、α－ＧａｌＣｅｒと複合体を形成した精製ＣＤ－１ｄを使用して、ｉＮＫＴを活性化させてもよい。更に別の代替例では、α－ＧａｌＣｅｒをパルスしたＣＤ１ｄ発現細胞株を使用して、ｉＮＫＴを刺激してもよい。

工程４．ｉＮＫＴをカウントしてから、２０ｕｇのＣＤ２ｇＲＮＡ及び１５ｕｇのＣａｓ９を含有する１００ｕｌのエレクトロポレーション緩衝液中に５×１０^６で再懸濁した。次に、ｉＮＫＴをキュベットに移し、当該技術分野において周知のエレクトロポレーターを用いてエレクトロポレーションを行った。予め調整した培地に細胞を戻した。

工程５．ＣＤ２を標的とするＣＡＲをｉＮＫＴに形質導入した。

工程６．ｉＮＫＴを培養してＣＡＲ－ｉＮＫＴ集団を増殖させた。この増殖を数週間にわたり継続してもよい。定期的にα－ＧａｌＣｅｒ添加細胞を加えることにより、ｉＮＫＴが刺激される状態を維持してもよいが、初回刺激の場合と同様に、その他の選択肢が利用可能である。培地は通常、高用量のＩＬ－２（本発明者らの手順においては目下、２００ユニット／ｍｌ）を含有している。ＩＬ－７、ＩＬ－１５、または、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５の組み合わせもまた使用して、ｉＮＫＴをｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させてもよい。力価または安定性が向上するように遺伝子改変されたこれらサイトカインのアナログもまた使用して、培養を増強してもよい。フローサイトメトリーを用いて、ＣＡＲ形質導入の効率（ＣＤ３４を用いて試験した）及び標的欠失の効率（ＣＤ２）を評価した。

工程７．ＣＡＲ形質導入ｉＮＫＴの濃縮について、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｐｒｏｄｉｇｙを使用したｔｒＣＤ３４（ＣＡＲ発現のマーカー）磁気選択を用いて、試験を行った。

工程８．ＣＡＲ－Ｔ殺傷の有効性について、図９に示すように、ＣＤ２＋標的に対するｉｎ ｖｉｔｒｏの４時間のＣｒ放出アッセイを用いて評価を行ったところ、ＣＤ２＋Ｔ－ＡＬＬ細胞株及びＣＤ２＋ＣＴＣＬ細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効果的な殺傷が認められた。非標的ｃＣＡＲ－ｉＮＫを対照として使用した。

当業者は、上で開示した方法を適宜変更して、本明細書で開示するその他のモノ、デュアル、及びタンデムｉＮＫＴ細胞を作製し、それらの活性を確認することができる。

上記実施例において、その特定の実施形態の特定の詳細を参照しながら、本発明を説明してきたが、変更及び変化形態が本発明の趣旨及び範囲に包含されるということを理解されたい。

Claims (68)

1. ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞。
2. 凍結させることなく少なくとも３週間にわたり維持または増殖させることが可能な、複数のドナーに由来するゲノム編集ｉＮＫＴ細胞の集団。
3. １種または複数種の抗原を標的とする少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むｉＮＫＴ細胞であって、前記ＣＡＲが特異的に結合する抗原を欠損している、前記ｉＮＫＴ細胞。
4. 前記キメラ抗原受容体は、悪性Ｔ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項３に記載のｉＮＫＴ細胞。
5. 前記抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、及びＴＣＲβ、から選択される、請求項４に記載のｉＮＫＴ細胞。
6. 前記キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項３に記載のｉＮＫＴ細胞。
7. 前記抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、及びＣＤ１９、から選択される、請求項６に記載のｉＮＫＴ細胞。
8. 前記キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方を効果的に共標的とする、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに対するリガンドである、ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分を発現する、請求項３に記載のｉＮＫＴ細胞。
9. 前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は自殺遺伝子を更に含む、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のｉＮＫＴ細胞。
10. 内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、前記ｉＮＫＴ細胞内においてごくわずかである、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のｉＮＫＴ細胞。
11. アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない、請求項１０に記載のｉＮＫＴ細胞。
12. 同胞殺しを誘導しない、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のｉＮＫＴ細胞。
13. タンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞またはデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
14. それぞれが異なる抗原を標的とする２つまたはそれ以上のＣＡＲを含む、請求項１３に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
15. 一対（すなわち、２種）のＴ細胞抗原を標的とする、請求項１４に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
16. 前記抗原対は、ＣＤ２ｘＣＤ３ε、ＣＤ２ｘＣＤ４、ＣＤ２ｘＣＤ５、ＣＤ２ｘＣＤ７、ＣＤ３εｘＣＤ４、ＣＤ３εｘＣＤ５、ＣＤ３εｘＣＤ７、ＣＤ４ｘＣＤ５、ＣＤ４ｘＣＤ７、ＣＤ５ｘＣＤ７、ＴＲＡＣｘＣＤ２、ＴＲＡＣｘＣＤ３ε、ＴＲＡＣｘＣＤ４、ＴＲＡＣｘＣＤ５、ＴＲＡＣｘＣＤ７、ＴＣＲβｘＣＤ２、ＴＣＲβｘＣＤ３ε、ＴＣＲβｘＣＤ４、ＴＣＲβｘＣＤ５、ＴＣＲβｘＣＤ７、ＢＣＭＡｘＣＳ１、ＢＣＭＡｘＣＤ１９、ＢＣＭＡｘＣＤ３８、ＣＳ１ｘＣＤ１９、ＣＳ１ｘＣＤ３８、ＣＤ１９ｘＣＤ３８、ＡＰＲＩＬｘＣＳ１、ＡＰＲＩＬｘＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬｘＣＤ１９、及びＡＰＲＩＬｘＣＤ３８、から選択される、請求項１４に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
17. それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、及びＣＤ３、から選択される異なる抗原を認識するｓｃＦｖに由来する、請求項１４から請求項１５のいずれか１項に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
18. それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、異なり、配列番号：１２～配列番号：３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、請求項１４に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
19. それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、異なり、配列番号：１２～配列番号：３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を示す、請求項１４に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
20. それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、異なり、配列番号：１２～配列番号：３１から選択される配列である、請求項１４に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
21. ＣＤ２８及び４－１ＢＢから選択される少なくとも１種の共刺激ドメインを含む、請求項１４に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
22. 前記共刺激ドメインはＣＤ２８である、請求項１４に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
23. ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１４に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
24. 前記それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、ＣＤ２を認識するｓｃＦｖまたはＣＤ３を認識するｓｃＦｖに由来する、請求項１４に記載のデュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
25. ２種またはそれ以上のＴ細胞抗原を標的とする１つのＣＡＲを含む、請求項１３に記載のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
26. 一対（すなわち、２種）の抗原を標的とする、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
27. 前記抗原対は、ＣＤ２ｘＣＤ３ε、ＣＤ２ｘＣＤ４、ＣＤ２ｘＣＤ５、ＣＤ２ｘＣＤ７、ＣＤ３εｘＣＤ４、ＣＤ３εｘＣＤ５、ＣＤ３εｘＣＤ７、ＣＤ４ｘＣＤ５、ＣＤ４ｘＣＤ７、ＣＤ５ｘＣＤ７、ＴＲＡＣｘＣＤ２、ＴＲＡＣｘＣＤ３ε、ＴＲＡＣｘＣＤ４、ＴＲＡＣｘＣＤ５、ＴＲＡＣｘＣＤ７、ＴＣＲβｘＣＤ２、ＴＣＲβｘＣＤ３ε、ＴＣＲβｘＣＤ４、ＴＣＲβｘＣＤ５、ＴＣＲβｘＣＤ７、ＢＣＭＡｘＣＳ１、ＢＣＭＡｘＣＤ１９、ＢＣＭＡｘＣＤ３８、ＣＳ１ｘＣＤ１９、ＣＳ１ｘＣＤ３８、ＣＤ１９ｘＣＤ３８、ＡＰＲＩＬｘＣＳ１、ＡＰＲＩＬｘＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬｘＣＤ１９、及びＡＰＲＩＬｘＣＤ３８、から選択される、請求項１３に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
28. 前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｌ１と呼ばれる第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｌ２及びＶ_Ｈ２と呼ばれる第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
29. 前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｈ２及びＶ_Ｌ２と呼ばれる第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｌ１と呼ばれる第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
30. 前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｌ１及びＶ_Ｈ１と呼ばれる第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ２及びＶ_Ｌ２と呼ばれる第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
31. 前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｌ２及びＶ_Ｈ２と呼ばれる第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｌ１と呼ばれる第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
32. 前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、６－Ｉ～６－ＸＸＸＩＩから選択される構造物を含む、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
33. 前記ＣＡＲ構築物はヘアピンｔＣＡＲ構築物である、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
34. 前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｈ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｌ２及びＶ_１２と呼ばれる、前記第２のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項３３に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
35. 前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｈ２及びＶ_Ｈ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｌ１及びＶ_Ｌ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項３３に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
36. 前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｌ１及びＶ_Ｌ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ２及びＶ_Ｈ１と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項３３に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
37. 前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｌ２及びＶ_Ｌ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｈ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_２～６リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項３３に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
38. 前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、８－Ｉ～８－ＸＸＸＩＩから選択される構造物を含む、請求項３３に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
39. 前記ＣＡＲ構築物は、前記リンカー内に（Ｃｙｓ＝Ｃｙｓ）二本鎖結合（ＤＳＢ）を有するヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物である、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
40. 前記ヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｈ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｌ２及びＶ_１２と呼ばれる、前記第２のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_０～１－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_１～２－（ＧＧＧＧＰ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_２～３－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_０～１リンカーにより、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項３９に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
41. 前記ヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｈ２及びＶ_Ｈ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｌ１及びＶ_Ｌ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_０～１－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_１～２－（ＧＧＧＧＰ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_２～３－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_０～１リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項３９に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
42. 前記ヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｌ１及びＶ_Ｌ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ２及びＶ_Ｈ１と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_０～１－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_１～２－（ＧＧＧＧＰ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_２～３－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_０～１リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項３９に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
43. 前記ヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物は、Ｖ_Ｌ２及びＶ_Ｌ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント、ならびに、Ｖ_Ｈ１及びＶ_Ｈ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）_０～１－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_１～２－（ＧＧＧＧＰ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_２～３－（ＧＧＧＧＣ）_１－（ＧＧＧＧＳ）_０～１リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽重（Ｖ_Ｈ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項３９に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
44. 前記ヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物は、１０－Ｉ～１０－ＸＸＸＩＩから選択される構造物を含む、請求項３９に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
45. それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、及びＣＤ３、から選択される異なる抗原を認識するｓｃＦｖに由来する、請求項２５から請求項４４のいずれか１項に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
46. それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、異なり、配列番号：１２～配列番号：３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
47. それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、異なり、配列番号：１２～配列番号：３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を示す、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
48. それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、異なり、配列番号：１２～配列番号：３１から選択される配列である、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
49. ＣＤ２８及び４－１ＢＢから選択される少なくとも１種の共刺激ドメインを含む、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
50. 前記共刺激ドメインはＣＤ２８である、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
51. ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
52. 前記それぞれのＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖は、ＣＤ２を認識するｓｃＦｖまたはＣＤ３を認識するｓｃＦｖに由来する、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
53. 前記ｔＣＡＲ構築物は、クローン５、クローン６、クローン７、クローン８、クローン１３、クローン１４、クローン１５、及びクローン１６、から選択される、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
54. 前記ｔＣＡＲ構築物は、配列番号：４１～配列番号：４６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、請求項２５に記載のｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞。
55. 請求項１、及び／または請求項３から請求項１３のいずれか１項に記載のｉＮＫＴ細胞、あるいは、請求項２に記載のｉＮＫＴ細胞の集団、ならびに、少なくとも１種の治療的に許容される担体及び／またはアジュバント、を含む、治療用組成物。
56. ＩＬ－７、ＩＬ－１５、Ｉｌ－２、または上記のいずれかのアナログ、から選択される少なくとも１種のアジュバントを含む、請求項５５に記載の治療用組成物。
57. ＩＬ－２を含む、請求項５５に記載の治療用組成物。
58. ＩＬ－７、ＩＬ－１５、Ｉｌ－２、または上記のいずれかのアナログの、任意の２種またはそれ以上の組み合わせを含む、請求項５５に記載の治療用組成物。
59. ＩＬ－７、ＩＬ－１５、Ｉｌ－２を含む、請求項５５に記載の治療用組成物。
60. 患者における血液悪性腫瘍を治療するための方法であって、ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞、請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載のゲノム編集ｉＮＫＴ細胞、デュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞、もしくはタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の集団、または、請求項５５から請求項５９のいずれか１項に記載の治療用組成物を、血液悪性腫瘍の治療を必要とする前記患者に投与することを含む、前記方法。
61. 前記血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である、請求項６０に記載の方法。
62. 前記Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）である、請求項６１に記載の方法。
63. 前記Ｔ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である、請求項６１に記載の方法。
64. 前記血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である、請求項６０に記載の方法。
65. ｇ）単離及び精製したｉＮＫＴ細胞を活性化させること、
    ｈ）前記ｉＮＫＴ細胞における細胞表面タンパク質の発現を欠失または抑制すること、ならびに、
    ｉ）任意選択的に、前記ｉＮＫＴ細胞に、１種または複数種の抗原標的または細胞表面タンパク質標的を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、
    の工程を含む、遺伝子編集ｉＮＫＴ細胞を作製するための方法。
66. 前記ｉＮＫＴ細胞に、１種または複数種の抗原標的または細胞表面タンパク質標的を認識するキメラ抗原受容体を形質導入する工程を含む、請求項６５に記載の方法。
67. 前記ＣＡＲの標的である前記抗原は、前記細胞から欠失されている、請求項６６に記載の方法。
68. 複数のドナーに由来するゲノム編集ｉＮＫＴ細胞の集団を作製するための方法であって、
    ａ）それぞれのドナーから単離及び精製したｉＮＫＴ細胞を活性化させること、
    ｂ）前記ｉＮＫＴ細胞における細胞表面タンパク質の発現を欠失または抑制すること、
    ｃ）任意選択的に、前記ｉＮＫＴ細胞に、１種または複数種の抗原標的または細胞表面タンパク質標的を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、
    ｄ）ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞の前記集団を増殖させること、
    ｅ）前記ゲノム編集ｉＮＫＴ細胞をプールすること、
    の工程を含む、前記方法。

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