JP2021522820A

JP2021522820A - 癌を治療するための方法及び組成物

Info

Publication number: JP2021522820A
Application number: JP2020563430A
Authority: JP
Inventors: アレクサンダーテレットジョナサン; カライツィディスデメトリオス; デケアンメアリー−リ; サミールパダリアジンカル
Original assignee: クリスパーセラピューティクスアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2021-09-02
Also published as: CL2020002914A1; CN112105420A; US20210246425A1; PE20210666A1; WO2019215500A1; AU2019266398A1; PH12020551923A1; CO2020015255A2; US20200063100A1; BR112020022879A2; CA3099364A1; US11254912B2; SG11202011080QA; MX2020012028A; US20210261919A1; US11649438B2; KR20210008502A; ZA202006627B; US20210060072A1; EP3790629A1

Abstract

本明細書では、いくつかの実施形態において、癌の治療のための方法及び組成物（例えば、細胞組成物）が提供される。

Description

関連出願
本出願は、２０１８年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／６７０，４１７号；２０１８年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／７０１，３４０号；２０１８年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６２／７５６，６４３号；２０１８年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７７３，６５８号；及び２０１９年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／８２６，６００号の利益を主張する。上で参照した特許出願の全内容は、この参照により本明細書に組み込まれる。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、遺伝的に改変されたＴ細胞を使用して、癌細胞をより特異的に且つ効率的に標的化し且つ死滅させる。Ｔ細胞が血液から回収された後、細胞は、それらの表面上にＣＡＲを含むように操作される。ＣＡＲは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用してＴ細胞に導入され得る。これらの異質遺伝子型のＣＡＲＴ細胞が患者に注射されるとき、受容体は、Ｔ細胞が癌細胞を死滅させることを可能にする。

いくつかの態様では、本開示は、操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）及び内在性のＣＤ７０発現を破壊する（ノックアウトＣＤ７０）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用して編集された免疫細胞を生成する方法を提供する。

本開示のいくつかの態様では、ＣＤ７０遺伝子の破壊を含む操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、破壊されたＣＤ７０遺伝子及びＣＡＲをコードする核酸を含む異質遺伝子型のＴ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＡＲをコードする核酸の挿入によって破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む異質遺伝子型のＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子、及びＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）はさらに、破壊されたＰＤ−１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、腫瘍抗原（例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３３又はＣＤ７０）を標的化する。

いくつかの態様では、提供される操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、早期枯渇の予防、ＣＡＲＴ細胞増殖の増強、及び癌細胞死滅の効率の増大を含むＴ細胞機能の向上を示す。いくつかの態様では、提供される操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、未編集のＴ細胞又はＣＤ７０を発現する編集されたＴ細胞と比較して、継続性の安定した細胞増殖を示し、且つ細胞傷害性及びサイトカイン（例えば、ＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−ガンマ）分泌の増加を示す。

いくつかの態様では、本開示は、破壊されたＣＤ７０遺伝子及びＣＤ７０に結合しないＣＡＲをコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を提供する。いくつかの態様では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴ細胞受容体アルファ定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子を含む。いくつかの態様では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、ＣＤ７０に結合しないＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの態様では、操作されたＴ細胞は、破壊されたベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を含む。

いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子；及び（ｉｖ）ＣＤ７０に結合しないＣＡＲをコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、破壊されたＣＤ７０遺伝子及びＣＤ７０に結合しないＣＡＲをコードする核酸を含む細胞の集団を提供する。

いくつかの態様では、細胞の集団中の操作されたＴ細胞は、破壊されたＴ細胞受容体アルファ定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子を含む。いくつかの態様では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、ＣＤ７０に結合しないＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの態様では、細胞の集団中の操作されたＴ細胞は、破壊されたベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を含む。

いくつかの態様では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子；及び（ｉｖ）ＣＤ７０に結合しないＣＡＲをコードする核酸を含む細胞の集団を提供する。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、ＣＡＲは、ｉ−Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する外部ドメインを含む。いくつかの態様では、外部ドメインは、抗ＢＣＭＡ抗体を含む。いくつかの態様では、外部ドメインは、抗ＢＣＭＡ一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの態様では、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖは、可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び参照抗体と同じ可変軽（ＶＬ）鎖ＣＤＲを含み、参照抗体は、配列番号６０として記載されるＶＨ及び配列番号６１として記載されるＶＬを含む。いくつかの態様では、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖは、それぞれ配列番号６０及び６１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む。いくつかの態様では、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖは、配列番号５７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖは、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖは、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖは、（ｉ）配列番号８０、配列番号８２、及び／若しくは配列番号８４又は（ｉｉ）配列番号８１、配列番号８３、若しくは配列番号８５のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＨを含み；且つ／又は抗ＢＣＭＡｓｃＦｖは、（ｉ）配列番号７４、配列番号７６、及び／又は配列番号７８のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、ＣＡＲは、ＣＤ３３に結合する外部ドメインを含む。いくつかの場合、外部ドメインは、抗ＣＤ３３抗体を含む。いくつかの態様では、外部ドメインは、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖを含む。いくつかの態様では、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖは、参照抗体と同じＶＨＣＤＲ及び同じＶＬ鎖ＣＤＲを含み、参照抗体は、配列番号１４０として記載されるＶＨ及び配列番号１４１として記載されるＶＬを含む。いくつかの態様では、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号１４０及び１４１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む。いくつかの態様では、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する外部ドメインを含む。いくつかの態様では、外部ドメインは、抗ＣＤ１９抗体を含む。いくつかの態様では、外部ドメインは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを含む。いくつかの態様では、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖは、参照抗体と同じＶＨＣＤＲ及び同じＶＬ鎖ＣＤＲを含み、参照抗体は、配列番号１５２として記載されるＶＨ及び配列番号１５３として記載されるＶＬを含む。いくつかの態様では、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号１５２及び１５３において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む。いくつかの態様では、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖは、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子；及び（ｉｖ）ＣＤ７０に結合するＣＡＲをコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を提供する。いくつかの態様では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、ＣＡＲをコードする核酸を含む。

いくつかの態様では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子；及び（ｉｖ）ＣＤ７０に結合するＣＡＲをコードする核酸を含む細胞の集団を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子
（ｉｖ）（ａ）抗ＣＤ７０ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｃ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含む外部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含む細胞の集団を提供する。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、ＣＤ７０に結合するＣＡＲは、抗ＣＤ７０抗体を含む外部ドメインを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖを含む外部ドメインを含む。いくつかの態様では、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖは、参照抗体と同じＶＨＣＤＲ及び同じＶＬＣＤＲを含み、参照抗体は、配列番号５１として記載されるＶＨ及び配列番号５２として記載されるＶＬを含む。いくつかの態様では、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号５１及び５２において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む。いくつかの態様では、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖは、配列番号４８又は５０のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖは、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖは、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖは、（ｉ）配列番号６８、配列番号７０、及び／若しくは配列番号７２又は（ｉｉ）配列番号６９、配列番号７１、及び／若しくは配列番号７３のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＨを含み；且つ／又は抗ＣＤ７０ｓｃＦｖは、（ｉ）配列番号６２、配列番号６４、及び／若しくは配列番号６６又は（ｉｉ）配列番号配列番号６３、配列番号６５、及び／若しくは配列番号６７のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、ＣＡＲは、ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインを含む。前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、ＣＡＲは、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、未改変Ｔ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子の欠失がある。いくつかの態様では、欠失は、１５〜３０塩基対である。いくつかの態様では、欠失は、２０塩基対である。いくつかの態様では、欠失は、配列番号８６を含む。いくつかの態様では、欠失は、配列番号８６である。

いくつかの態様では、本開示は、破壊されたＣＤ７０遺伝子及びＣＤ７０に結合するＣＡＲをコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を提供し、ＣＡＲは、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、本開示は、破壊されたＣＤ７０遺伝子、及びＣＤ７０に結合するＣＡＲをコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を提供し、核酸配列は、配列番号４５と少なくとも９０％同一である。いくつかの態様では、本開示は、破壊されたＣＤ７０遺伝子、及びＣＤ７０に結合するＣＡＲをコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を提供し、核酸配列は、配列番号４５である。

いくつかの実施形態では、ＣＤ７０遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によって破壊される。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によって破壊される。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によって破壊される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によって破壊される。

いくつかの態様では、本開示は、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む操作されたＴ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号４５と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。

他の態様では、本開示は、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号４５と少なくとも９０％同一である破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む操作されたＴ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号４５又は配列番号４４に記載されるヌクレオチド配列を含むドナー配列を含む。

いくつかの態様では、本開示は、
（ｉ）配列番号４４と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む操作されたＴ細胞を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、
（ｉ）配列番号４４の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む操作されたＴ細胞を提供する。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、操作されたＴ細胞は、破壊されたＰＤ−１遺伝子を含む。いくつかの態様では、操作された免疫細胞は、ＣＡＲをコードする核酸の挿入によって破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、及び破壊されたＰＤ−１遺伝子を含む異質遺伝子型のＴ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）はさらに、破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、操作されたＴ細胞は、標的細胞であって、標的細胞が、ＣＡＲに特異的な抗原を発現する標的細胞による５回の再チャレンジの後に細胞傷害性を維持する。いくつかの態様では、操作されたＴ細胞は、標的細胞による１０回の再チャレンジの後に細胞傷害性を維持する。いくつかの態様では、標的細胞は、癌細胞である。いくつかの態様では、標的細胞は、血液癌又は固形腫瘍の癌細胞である。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、操作されたＴ細胞又は細胞の集団は、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＡＲを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、配列番号５６と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、操作されたＴ細胞又は細胞の集団は、配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＡＲを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、配列番号１３６と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、操作されたＴ細胞又は細胞の集団は、配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＡＲを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、配列番号１４８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、操作されたＴ細胞又は細胞の集団は、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＡＲを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、配列番号４５と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。

本開示の他の態様は、本明細書に記載される操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）のいずれかを含む細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、ＣＡＲをコードする核酸の挿入によって破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含むＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子、及びＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含むＴ細胞を含み、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、ＣＡＲをコードする核酸、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。

いくつかの態様では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、（ａ）抗ＣＤ７０抗原結合断片を含む外部ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｃ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含む外部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む細胞の集団を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む細胞の集団を提供する。

他の態様では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号４５と少なくとも９０％同一である破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む細胞の集団を提供する。いくつかの態様では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号４５に記載される核酸配列を含む。

いくつかの態様では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）配列番号４４と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む細胞の集団を提供する。いくつかの態様では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号４４に記載される核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインを含む。

細胞の集団の前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号９〜１４のいずれか１つから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。細胞の集団の前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、破壊されたＣＤ７０遺伝子は、配列番号１２９〜１３４のいずれか１つから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号４５のヌクレオチド配列を含み、且つ／又は抗ＣＤ７０ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号４５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号４５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号５６のヌクレオチド配列を含み、且つ／又は抗ＢＣＭＡＣＡＲをコードする核酸は、配列番号５６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号５６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号５５のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１５６のヌクレオチド配列を含み、且つ／又は抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号１４８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１４８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１５６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１３５のヌクレオチド配列を含み、且つ／又は抗ＣＤ３３ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号１３６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１３６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１３５のヌクレオチド配列を含む。

前述の態様のいずれかにおいて、操作されたＴ細胞は、対照Ｔ細胞であって、対照Ｔ細胞が内在性ＣＤ７０タンパク質を発現する対照Ｔ細胞と比較して、（ａ）細胞増殖能の増大を示すか；
（ｂ）細胞溶解の増大を示すか；
（ｃ）細胞枯渇の減少を示すか；
（ｄ）サイトカイン依存性増殖を維持するか；
（ｅ）サイトカイン分泌の増大を示すか；又は
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組合せ
を示す。

いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞の少なくとも５０％、任意選択により５０％〜６５％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現せず、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現せず、且つ／又は検出可能なレベルのＣＡＲを発現する。

いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞の少なくとも９０％、任意選択により９０〜１００％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞の９９．５％より多くは、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の少なくとも６０％、任意選択により６０〜７５％は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の少なくとも８０％、任意選択により８０〜１００％は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の少なくとも８０％、任意選択により８０％〜９５％は、検出可能なレベルのＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ７０ＣＡＲ又は抗ＢＣＭＡＣＡＲ）を発現する。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）はさらに、破壊されたＰＤ−１遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞の少なくとも５０％、任意選択により５０％〜７０％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現せず、検出可能なレベルのＰＤ１表面タンパク質を発現せず、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現せず、且つ／又は検出可能なレベルのＣＡＲを発現する。

いくつかの態様では、本開示は、操作されたＴ細胞を生成するための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞に
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、
ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、及び
ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターを送達すること；並びに
（ｂ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含み且つＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞を生成することを含む方法を提供する。

いくつかの態様では、方法はさらに、Ｔ細胞にＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することを含み；操作されたＴ細胞はさらに、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲをコードする核酸は、ＴＲＡＣ遺伝子に対する左及び右の相同性アームと隣接し；且つ操作されたＴ細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子中にＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの態様では、方法はさらに、Ｔ細胞にβ２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することを含み；操作されたＴ細胞はさらに、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む。

本明細書ではまた、操作されたＴ細胞を生成するための方法であって、（ａ）Ｔ細胞にＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、及びＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターを送達すること（任意選択により、ＣＡＲをコードする核酸は、ＴＲＡＣ遺伝子座位に対する左及び右の相同性アームと隣接する）、及び（ｂ）操作されたＴ細胞を生成することを含む方法が提供される。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、任意選択によりストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。他のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが使用されてもよく、下に記載される。

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、配列番号９８のヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１１８のヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、配列番号３０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、配列番号９９のヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１１９のヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、配列番号９４若しくは９５のヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１１４若しくは１１５のヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、配列番号２６又は２７のヌクレオチド配列を含む。

前述の態様のいずれかにおいて、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、リボ核タンパク質（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｒｏｔｅｉｎ）粒子（ＲＮＰ）中で複合体を形成する。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、Ｔ細胞にＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することを含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、配列番号１００のヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１２０のヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、ＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、配列番号３２のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様では、本開示は、標的細胞に対する免疫療法のための操作されたＴ細胞を生成するための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞中のＣＤ７０遺伝子を破壊すること、及び
（ｂ）標的細胞上で発現される抗原（抗原は、ＣＤ７０ではない）に結合するＣＡＲを発現させることを含む方法を提供する。いくつかの態様では、標的細胞は、癌細胞である。いくつかの態様では、方法は、エクスビボである。いくつかの態様では、方法はさらに、Ｔ細胞中のＴＲＡＣ遺伝子を破壊することを含むことを含む。いくつかの態様では、方法はさらに、Ｔ細胞中のβ２Ｍ遺伝子を破壊することを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子中の核酸によってコードされる。いくつかの態様では、ＣＡＲは、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか１つである。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される方法のいずれか１つによって生成される操作されたＴ細胞の集団を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、Ｔ細胞の増殖を増大させる方法であって、Ｔ細胞中のＣＤ７０遺伝子を破壊することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、Ｔ細胞の枯渇を減少させる方法であって、Ｔ細胞中のＣＤ７０遺伝子を破壊することを含む方法を提供する。前述の態様のいずれかにおいて、ＣＤ７０遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集によって破壊される。いくつかの態様では、方法はさらに、Ｔ細胞中のＴＲＡＣ遺伝子、β２Ｍ遺伝子、又はＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子の両方を破壊することを含む。いくつかの態様では、ＴＲＡＣ遺伝子、β２Ｍ遺伝子又はＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子の両方は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集によって破壊される。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む。

いくつかの態様では、本開示は、対象に本明細書に記載される細胞又は操作されたＴ細胞の集団を投与するための方法を提供する。いくつかの態様では、操作されたＴ細胞は、操作されたヒトＴ細胞である。いくつかの態様では、対象は、癌を有する。いくつかの態様では、癌は、ＣＤ７０、ＢＭＣＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３３又はこれらの組合せを発現する。いくつかの態様では、細胞の集団は、癌を治療するのに有効な量で対象に投与される。いくつかの態様では、癌は、固形悪性腫瘍又は血液悪性腫瘍である。いくつかの態様では、固形悪性腫瘍は、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、腎臓腫瘍、肺腫瘍、及び腸腫瘍からなる群から選択される。いくつかの態様では、細胞の集団は、対象における腫瘍の体積を減少させるのに有効な量で対象に投与される。

いくつかの態様では、本開示は、対象における癌を治療するための方法であって、対象に本明細書に記載される細胞又は操作されたＴ細胞の集団を投与することを含む方法を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、対象における癌を治療するための方法であって、操作されたＴ細胞であって、破壊されたＣＤ７０遺伝子及びＣＡＲをコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を含む細胞の集団を患者に投与し、それにより対象における癌を治療することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７０に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７０に結合しない。

他の態様では、本開示は、対象における癌を治療するための方法であって、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子；及び
（ｉｖ）ＣＡＲをコードする核酸を含む細胞の集団を患者に投与し、
それにより対象における癌を治療することを含む方法を提供する。

さらに他の態様では、本開示は、対象における癌を治療するための方法であって、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子；及び
（ｉｖ）（ａ）抗ＣＤ７０抗原結合断片を含む外部ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｃ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含む外部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含む細胞の集団を患者に投与し、それにより対象における癌を治療することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号４５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号４５又は配列番号４４のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様では、本開示は、対象における癌を治療する方法であって、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む細胞の集団を対象に投与し、
それにより対象における癌を治療することを含む方法を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、対象における癌を治療する方法であって、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号４５と少なくとも９０％同一である破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む細胞の集団を対象に投与し、
それにより対象における癌を治療することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号４５に記載される核酸配列を含む。

いくつかの態様では、本開示は、対象における癌を治療する方法であって、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）配列番号４４と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む細胞の集団を対象に投与し、
それにより対象における癌を治療することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号４４に記載される核酸配列を含む。

前述の又は関連する態様のいずれかにおいて、操作されたＴ細胞は、操作されたヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、操作された異質遺伝子型のＴ細胞である。

ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ−１−／ＣＤ７０−（四重ノックアウト）Ｔ細胞における非常に効率的な多重遺伝子編集を示すグラフを含む。多重遺伝子編集された細胞の間で同様の増殖を示すグラフを含む。ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（すなわち、３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）Ｔ細胞における効率的な多重遺伝子編集を示すグラフを含む。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の正常な集団が、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞集団の間で維持されることを示すグラフを含む。ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞における効率的な多重遺伝子編集を示すグラフを含む。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の正常な集団が、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（すなわち、４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）Ｔ細胞集団の間で維持されることを示すグラフを含む。多重遺伝子編集による抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞の特徴付けに関連するデータを示すグラフを含む。二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ（図７Ａ）、ＰＤ−１及びＣＤ７０（図７Ｂ）、並びにＢＣＭＡＣＡＲ（図７Ｃ）発現について染色された。抗ＢＣＭＡＣＡＲは、二重及び四重ノックアウトＣＡＲＴ細胞の両方においておよそ８０％で発現された。（同上）（同上）３週間にわたって２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞と比較した３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞におけるＣＤ４＋細胞の減少の阻止を示すフローサイトメトリープロットを含む。ＣＤ７０ＫＯが、２週間にわたって抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞において細胞増殖を増強したことを示すグラフを含む。生存細胞の総数は、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）及び２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞において定量化された。ＣＤ７０ＫＯが、２週間にわたって抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞において細胞増殖を増強したことを示すグラフを含む。生存細胞の総数は、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）及び２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞において定量化された。ＣＤ７０ＫＯが、抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞における細胞増殖を増強し、且つＢＣＭＡＣＡＲ細胞増殖に対するＰＤ１ＫＯの有害な作用をレスキューしたことを示すグラフを含む。生存細胞の総数は、４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／ＰＤ１−）、３ＸＫＯ（ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）、３ＸＫＯ（ＰＤ１）（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−）及び２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞において定量化された。ＣＤ７０ＫＯが、抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞における細胞増殖を増強し、且つＢＣＭＡＣＡＲ細胞増殖に対するＰＤ１ＫＯの有害な作用をレスキューしたことを示すグラフを含む。生存細胞の総数は、４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／ＰＤ１−）、３ＸＫＯ（ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）、３ＸＫＯ（ＰＤ１）（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−）及び２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞において定量化された。抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞は、図１１に示されるＣＡＲＴ細胞と異なるドナーＴ細胞に由来した。２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−）抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞及び３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞における抗原暴露に起因するアポトーシス性の細胞死の比較を示すグラフを含む。ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、プレート結合ＢＣＭＡ抗原に２４時間暴露され、２４時間毎の再チャレンジを伴い、アポトーシスは、フローサイトメトリーによって各抗原チャレンジの後に評価された。抗原チャレンジに起因するアポトーシスの誘導は、それらがないものと比較して、ＣＤ７０ＫＯを有する抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞において低かった。２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−）抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞及び３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞における抗原暴露後のＣＡＲＴ細胞増殖の比較を示すグラフを含む。ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、プレート結合ＢＣＭＡ抗原に２４時間暴露され、２４時間毎の再チャレンジを伴い、細胞増殖は、各抗原チャレンジの後に評価され、０時間での細胞数に標準化された。抗原チャレンジ後の細胞数の増殖は、それらがないものと比較して、ＣＤ７０ＫＯを有する抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞において高かった。ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞における強い細胞増殖を示すグラフを含む。生存細胞の総数は、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）及び２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞において定量化された。３ＸＫＯ細胞は、ＣＤ７０ｓｇＲＮＡＴ７又はＴ８のいずれかにより生成された。ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞における強い細胞増殖を示すグラフを含む。生存細胞の総数は、４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／ＣＤ７０−）、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−）及び２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞において定量化された。抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ１９ＣＡＲ^＋又はＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ１９ＣＡＲ^＋Ｔ細胞）によるＮａｌｍ６（上部パネル）細胞及びＲａｊｉ（下部パネル）細胞の両方の強い細胞の死滅を示すグラフを含む。抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ３３ＣＡＲ^＋又はＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ３３ＣＡＲ^＋Ｔ細胞）によるＭＶ４１１細胞の強い細胞の死滅を示すグラフを含む。２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞と比較した３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻）抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞によるＡ４９８細胞の強い細胞の死滅を示すグラフを含む。ＭＶ４１１標的細胞によるチャレンジの後の３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）又は２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞の細胞増殖を示すグラフを含む。Ｎａｌｍ６標的細胞によるチャレンジの後の３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）又は２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞の細胞増殖を示すグラフを含む。連続的な再チャレンジの後の抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞によるＡ４９８細胞の死滅を示すグラフを含む。４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／ＰＤ１⁻）、３ＸＫＯ（ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻）、３ＸＫＯ（ＰＤ１）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻）及び２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞が利用された。３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、及び４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、最も効果的であった。連続的な再チャレンジの後の抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞によるＡＣＨＮ細胞の死滅を示すグラフを含む。図２２Ａと同じ細胞が利用された。３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が、最も効果的であった。様々なエフェクター：標的比での抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞によるＡＣＨＮ細胞の死滅を示すグラフを含む。４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／ＰＤ１⁻）、３ＸＫＯ（ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻）、３ＸＫＯ（ＰＤ１）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻）及び２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞が利用された。３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が、複数回の連続的な再チャレンジの後に優れたキラーであった。８回の再チャレンジの後の図２３Ａに由来する細胞におけるＬＡＧ３（左）及びＰＤ１（右）発現を示すグラフを含む。ＰＤ−１及びＣＤ７０のノックアウトが、多発性骨髄腫細胞株（ＭＭ．１Ｓ）による連続的な再チャレンジを介して測定されるとおり、抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞を死滅させる活性を増強することを示すグラフを含む。二重ノックアウト（２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞（丸）は、およそ４回の再チャレンジの後にＭＭ．１Ｓ細胞に対してそれらの効力を失い始めたが、四重ノックアウト（４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／ＰＤ１⁻）抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞（四角）は、１０回の再チャレンジの後にＭＭ．１Ｓ細胞の１００％を死滅させることができた（図２４Ａ）。これと一致して、四重ノックアウト抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、１０回の再チャレンジの後に標的細胞に応答してＩＦＮ−ｇを分泌し続けたが、二重ノックアウト抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、３回目の再チャレンジの後にＩＦＮ−ｇ分泌の減少を示した（図２４Ｂ）。四重ノックアウト抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞はまた、標的細胞への暴露に応答して二重ノックアウト抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞より高い増殖を示した（図２４Ｃ）。（同上）二重ノックアウト（２ＸＫＯ）ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞及び三重ノックアウト（３ＸＫＯ（ＰＤ１）ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と比較して、四重ノックアウト（４ＸＫＯ）ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び三重ノックアウト（３ＸＫＯ（ＣＤ７０））ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を使用するＡ４９８ＰＤ−Ｌ１腎臓癌細胞（ＰＤ−Ｌ１を過剰発現する）における最も高い細胞死滅活性を示すグラフを含む。２：１のＣＡＲＴ細胞：Ａ４９８−ＰＤ−Ｌ１細胞比が、図２５Ａにおいて使用され、１：１のＣＡＲＴ細胞：Ａ４９８−ＰＤ−Ｌ１細胞比が、図２５Ｂにおいて使用され、且つ０．５：１のＣＡＲＴ細胞：Ａ４９８−ＰＤ−Ｌ１細胞比が、図２５Ｃにおいて使用された。（同上）（同上）四重ノックアウト（４ＸＫＯ）ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、三重ノックアウト（３ＸＫＯ（ＣＤ７０）ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、二重ノックアウト（２ＸＫＯ）ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び三重ノックアウト（３ＸＫＯ（ＰＤ１）ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と比較して、最も高いレベルのサイトカインＩＦＮ−ガンマ（図２６Ａ）及びＩＬ−２（図２６Ｂ）を分泌する。１：１のＣＡＲＴ細胞：Ａ４９８−ＰＤ−Ｌ１細胞比が使用された。（同上）２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞；３ＸＫＯ（ＰＤ−１）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞；３ＸＫＯ（ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞；又は４ＸＫＯ（ＰＤ−１、ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻／ＣＤ７０⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞に暴露された皮下Ａ４９８腎細胞癌モデルにおける腫瘍体積の減少を評価するために設計された実験からの結果を示すグラフを含む。皮下Ａ４９８腎細胞癌再チャレンジモデルにおける腫瘍増殖の予防を評価するために設計された実験からの結果を示すグラフを含む。図２７Ａからのマウスが、２５日目にＡ４９８腫瘍細胞で再チャレンジされ、腫瘍体積が経時的に評価された。３ＸＫＯ（ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞；４ＸＫＯ（ＰＤ−１、ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻／ＣＤ７０⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞；２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞；又は３ＸＫＯ（ＰＤ−１）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞に暴露された皮下Ａ４９８腎細胞癌モデル（ＣＡＲ−Ｔ注射時に約１５０ｍｍ３の大型の腫瘍）における腫瘍体積の減少を評価するために設計された実験からの結果を示すグラフを含む。２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞；３ＸＫＯ（ＰＤ−１）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻）、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞；３ＸＫＯ（ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻）、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞；又は４ＸＫＯ（ＰＤ−１、ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻／ＣＤ７０⁻）、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞に暴露された皮下ＭＭ．１Ｓモデルにおける腫瘍体積の減少を示すグラフを含む。腫瘍細胞再チャレンジ後の皮下ＭＭ．１Ｓにおける腫瘍体積の減少を示すグラフを含む。図２８Ａからのマウスが、４５日目にＭＭ．１Ｓ細胞の２回目の接種で再チャレンジされ、腫瘍体積が経時的に評価された。投与の１週間後（右のグラフ）、２週間後（中央のグラフ）、及び３週間後（左のグラフ）のヒトＣＤ４５^＋２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞；ヒトＣＤ４５^＋３ＸＫＯ（ＰＤ−１）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻）、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞；ヒトＣＤ４５^＋３ＸＫＯ（ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻）、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞；及びヒトＣＤ４５^＋４ＸＫＯ（ＰＤ−１、ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻／ＣＤ７０⁻）、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞の数を示すグラフを含む。１×１０^５、３×１０^５、１×１０^６、又は３×１０^６細胞／マウスの用量でＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ／−抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞（２ＸＫＯ、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞）；ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞（３ＸＫＯ（ＰＤ−１）、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞）；ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞（３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞）；又はＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞（４ＸＫＯ（ＰＤ−１、ＣＤ７０）、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞）に暴露された皮下ＲＰＭＩ−８２２６腫瘍異種移植モデルにおける腫瘍体積の減少を評価するために設計された実験からの結果を示すグラフを含む。ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が、サイトカイン依存性増殖を維持することを示すグラフを含む。ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞におけるサイトカイン依存性増殖を示す。４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻）、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞が、サイトカイン依存性を維持することを示すグラフを含む。２４時間様々な比でＡ４９８腎臓癌細胞と共培養した場合、２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞によるサイトカイン（ＩＬ−２）放出の増強を示すグラフを含む。ＴＣＲ＋Ｔ細胞と比較して、抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞（２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋；３ＸＫＯ（ＰＤ−１）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋；及び４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻）ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）によるＡ４９８細胞の強い細胞の死滅を示すグラフを含む。Ｔ細胞は、２４時間様々な比でＡ４９８細胞と共培養され、細胞溶解のパーセンテージが測定された。二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（すなわち、２ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）Ｔ細胞及び三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（すなわち、３ＸＫＯ（ＰＤ−１）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）Ｔ細胞と比較して、四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）及び三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）を使用するＡ４９８腎臓癌細胞において最も高い細胞死滅活性を示すグラフを含む。０．２５：１のＣＡＲＴ細胞：Ａ４９８細胞比が使用された。Ａ４９８細胞の細胞溶解のパーセンテージは、共培養の２４時間後に測定された。四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）及び三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）が、二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（２ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）及び三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（３ＸＫＯ（ＰＤ−１）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）と比較して、最も高いレベルのサイトカインＩＦＮ−ガンマ（図３７Ａ）及びＩＬ−２（図３７Ｂ）を分泌することを示すグラフを含む。０．２５：１のＣＡＲＴ細胞：Ａ４９８細胞比が使用された。ＩＦＮ−ガンマ及びＩＬ−２分泌は、共培養の２４時間後に測定された。（同上）抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞（３ＸＫＯ（ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋；３ＸＫＯ（ＰＤ−１）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋；及び４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／ＰＤ−１⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）においてＣＤ７０をノックアウトすることにより、内在性ＣＤ７０を発現する抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞（２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）ＣＤ７０ＣＡＲ＋）と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＰＤ−１発現のレベルが減少したことを示すグラフを含む。抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞（３ＸＫＯ（ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋；３ＸＫＯ（ＰＤ−１）（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋；及び４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／ＰＤ−１⁻）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）においてＣＤ７０をノックアウトすることにより、内在性ＣＤ７０を発現する抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞（２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）ＣＤ７０ＣＡＲ＋）と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３９Ａ）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（図３９Ｂ）における枯渇マーカーＬＡＧ３のレベルが減少したことを示すグラフを含む。（同上）５種の異なる癌細胞株における相対的なＣＤ７０発現（左パネル）及び３種の異なる癌細胞株における相対的なＣＤ７０発現（右パネル）を示すグラフを含む。９種の異なる癌細胞株における相対的なＣＤ７０発現を示すグラフを含む。二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（２ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）及び三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（３ＸＫＯ（ＰＤ−１）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）と比較して、四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）及び三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）を使用するＡＣＨＮ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６１１（商標））腎臓癌細胞（低いレベルのＣＤ７０を発現する）において最も高い細胞死滅活性を示すグラフを含む。０．５：１のＣＡＲＴ細胞：ＡＣＨＮ細胞比が、図４０Ｃにおいて使用され、且つ０．２５：１のＣＡＲＴ細胞：ＡＣＨＮ細胞比が、図４０Ｄにおいて使用された。（同上）様々なレベルのＣＤ７０発現（４：１、１：１、又は０．２５：１エフェクター：標的細胞比）による追加の固形腫瘍株に対して四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（図４０Ｅ）及び三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（図４０Ｆ）を使用して細胞死滅活性を示すグラフを含む。（同上）２４時間又は９６時間の共培養期間の後の固形腫瘍細胞株に対して三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を使用して細胞死滅活性を示すグラフを含む。様々なエフェクター：標的比でＣＤ７０欠損慢性骨髄性白血病（Ｋ５６２）細胞（図４０Ｈ）、ＣＤ７０発現多発性骨髄腫（ＭＭ．１Ｓ）細胞（図４０Ｉ）及びＣＤ７０発現Ｔ細胞リンパ腫（ＨｕＴ７８）細胞（図４０Ｊ）に対して三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（３ＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）を使用して細胞死滅活性を示すグラフを含む。（同上）（同上）四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）及び三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）が、二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（２ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）及び三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（３ＸＫＯ（ＰＤ−１）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋）と比較して、最も高いレベルのサイトカインＩＦＮ−ガンマ（図４１Ａ）及びＩＬ−２（図４１Ｂ）を分泌することを示すグラフを含む。０．２５：１のＣＡＲＴ細胞：ＡＣＨＮ細胞比が使用された。（同上）３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞に暴露されたヒト卵巣腫瘍異種移植モデル（例えば、ＳＫＯＶ−３腫瘍細胞）における腫瘍体積の減少を評価するために設計された実験からの結果を示すグラフを含む。３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞に暴露されたヒト非小細胞肺腫瘍異種移植モデル（例えば、ＮＣＩ−Ｈ１９７５腫瘍細胞）における腫瘍体積の減少を評価するために設計された実験からの結果を示すグラフを含む。３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞に暴露されたヒト膵臓腫瘍異種移植モデル（例えば、Ｈｓ７６６Ｔ腫瘍細胞）における腫瘍体積の減少を評価するために設計された実験からの結果を示すグラフを含む。３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞に暴露されたヒトＴ細胞リンパ腫異種移植モデル（例えば、ＨｕＴ７８腫瘍細胞）における腫瘍体積の減少を評価するために設計された実験からの結果を示すグラフを含む。個々のマウスの腫瘍体積（左）及び平均腫瘍体積（右）が示される。

本開示は、抗原標的化部分（例えば、ＣＡＲ）を発現するように操作された免疫細胞においてＣＤ７０遺伝子を破壊することが、抗腫瘍効果を含む免疫に基づく療法に重要ないくつかの特徴を増強するという発見に少なくとも部分的に基づく。特に、そのような操作された免疫細胞は、長期間増強された抗腫瘍効果をもたらす増殖の延長及びインビボでの持続を含む予想外の優れた特徴を示した。注目すべきことに、これらの予想外の特徴は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３３及びＣＤ７０を含む様々な抗原に特異的な標的化部分により実証された。

本明細書で実証されるとおり、ＣＤ７０遺伝子を破壊することは、インビトロでの癌細胞によるチャレンジの繰り返しの後に抗原標的化部分を発現するように操作された免疫細胞の細胞傷害性の維持をもたらした。理論に束縛されるものではないが、細胞傷害性のこの維持は、ＣＤ７０遺伝子を破壊することが、枯渇に耐性の操作された免疫細胞を産生することを示し、より長く生存する細胞をもたらし得る。

抗原標的化部分を発現するように操作された免疫細胞においてＣＤ７０遺伝子を破壊することは、大型腫瘍に対する抗腫瘍効果を増強し、且つ耐久性のある抗癌記憶応答を誘導したことも見出された。特に、抗癌記憶応答は、再チャレンジ時に腫瘍増殖を防いだ。さらに、ＣＤ７０遺伝子を破壊することは、操作された免疫細胞と標的細胞の比較的低い比で抗原標的化部分を発現するように操作された免疫細胞の細胞傷害性の増強をもたらし、低用量の操作された免疫細胞の潜在的な有効性を示すことが実証された。

ＣＤ７０遺伝子の破壊が、操作された免疫細胞の細胞増殖及びインビボでの持続を増強することも示された。理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載される操作された免疫細胞の優れた特徴は、より一貫した細胞集団、より多くの細胞分裂を生き延びる細胞の能力による大規模な産生、及び操作された細胞を産生するのに必要なより少ない開始細胞を可能にすると考えられる。そのような特徴はまた、臨床現場において有益であると判明し得る。例えば、増殖の増大及び枯渇の減少は、１用量当たりの有効性の増大及びより少ない用量で有効性を得る能力を示す。

抗原標的化部分を発現するように操作された免疫細胞においてＣＤ７０遺伝子を破壊することは、高度に免疫抑制性の分子、すなわち、ＰＤ−Ｌ１を発現する癌細胞に対する細胞傷害性を維持することも実証された。理論に束縛されるものではないが、癌細胞上で発現されるＰＤ−Ｌ１に結合したときに免疫細胞上で発現されるＰＤ−１の内的な負のシグナルは、ＣＤ７０を破壊することによって克服されると考えられる。

したがって、本明細書では、有効性及び持続の増大を伴う操作された免疫細胞の使用を含む、ＢＣＭＡ^＋、ＣＤ１９^＋、ＣＤ３３^＋、及びＣＤ７０^＋悪性腫瘍などの癌の治療のための方法及び組成物（例えば、細胞組成物）が提供される。

ＣＤ７０遺伝子編集
表面抗原分類７０（ＣＤ７０）は、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーであり、且つその発現は、活性化Ｔ及びＢリンパ球及び成熟樹状細胞に限定される。ＣＤ７０は、そのリガンドであるＣＤ２７との相互作用を通して、腫瘍細胞及び制御性Ｔ細胞の生存に関係づけられる。ＣＤ７０及びその受容体であるＣＤ２７は、Ｔ細胞（活性化及びＴｒｅｇ）、及びＢ細胞を含む複数の細胞型における免疫機能において複数の役割を有する。これらの細胞型の全てにおいてＣＤ７０がどのように機能してアポトーシスなどの機能を制御しているのかは正確には不明であり、相反する役割を示す論文がある。例えば、ＣＤ７０は、抗原負荷に依存してＴ細胞のアポトーシス又は生存を誘導することが報告されている（Ｗｅｎｓｖｅｅｎ，Ｆ．，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ１８８：４２５６−４２６７，２０１２）。

ＣＡＲＴ細胞は、効果的な免疫療法であることがわかってきているが、様々な課題が残ったままである。例えば、ＣＡＲＴ細胞は、インビボにおいて経時的に枯渇し、且つ無効になる。製造に関しては、患者に投与するのに十分な細胞を産生するために著しく時間がかかる。これらの制約に対処するために、本開示は、内在性のＣＤ７０発現を破壊するが、同時に抗原標的化部分（例えば、ｓｃＦｖ）を発現するように操作されたＣＡＲＴ細胞を提供する。

驚くべきことに、本開示は、ＣＤ７０遺伝子を破壊することにより、抗原がＣＡＲＴ中のｓｃＦｖにより標的化されているにもかかわらず、ＣＡＲＴの活力及び機能の増大（例えば、増殖の延長、枯渇の減少）を可能にすることを示す。このことは、ＣＤ３３及びＣＤ７０などのＴ細胞上で発現される抗原にさえ適用され、ここで、破壊されたＣＤ７０遺伝子の効果は、兄弟殺しが予想される場合でさえＣＡＲＴ機能を保持する。すなわち、これらのＣＤ７０ノックアウト細胞（例えば、ここで、ＣＤ７０遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用して編集された）は、ＣＡＲの挿入とは独立して、未改変のＴ細胞（又はＣＤ７０を発現する編集されたＴ細胞）と比較して、継続性の安定した細胞増殖を示し、且つ比較的低いレベルのＬＡＧ３などの枯渇マーカーを発現する。本開示のＣＡＲＴ細胞は、ＣＡＲＴ細胞を癌細胞に誘導する癌抗原に特異的に結合する任意の抗体（完全抗体及び抗体断片を含む）又は他の分子（例えば、受容体又はリガンド）を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ）である。他の実施形態では、抗体は、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）である。さらに他の実施形態では、抗体は、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ）である。他の実施形態では、抗体は、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ）である。他の癌抗原が、本開示によって包含される。

遺伝子破壊は、遺伝子編集（例えば、１つ以上のヌクレオチドを挿入するか又は欠失させるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集を使用する）を介する遺伝子改変を包含することが理解されるはずである。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、機能性タンパク質をコードしない遺伝子である。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子を含む細胞は、遺伝子によってコードされる検出可能なレベル（例えば、抗体によって、例えば、フローサイトメトリーによって）のタンパク質を、（例えば、細胞表面で）発現しない。検出可能なレベルのタンパク質を発現しない細胞は、ノックアウト細胞と呼ばれ得る。例えば、ＣＤ７０遺伝子編集を有する細胞は、ＣＤ７０タンパク質が、ＣＤ７０タンパク質に特異的に結合する抗体を使用して細胞表面で検出できない場合、ＣＤ７０ノックアウト細胞とみなされ得る。

本明細書では、いくつかの実施形態において、一定のパーセンテージの細胞が編集されて（例えば、ＣＤ７０遺伝子が編集される）、特定の遺伝子及び／又はタンパク質を発現しない一定のパーセンテージの細胞をもたらす細胞の集団が提供される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集された細胞の集団のうちの少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は８５％）の細胞は、ＣＤ７０ノックアウト細胞である。いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも５０％の細胞（例えば、Ｔ細胞）が、検出可能なレベルのＣＤ７０タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、遺伝子編集された細胞の集団のうちの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の細胞は、ＣＤ７０ノックアウト細胞であってもよい。

いくつかの実施形態では、集団のうちの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない操作されたＴ細胞のパーセントは、経時的に増加する。したがって、いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの５０％〜１００％、５０％〜９０％、５０％〜８０％、５０％〜７０％、５０％〜６０％、６０％〜１００％、６０％〜９０％、６０％〜８０％、６０％〜７０％、７０％〜１００％、７０％〜９０％、７０％〜８０％、８０％〜１００％、８０％〜９０％、又は９０％〜１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない。

ＣＤ７０遺伝子におけるゲノム改変（例えば、破壊、例えば、欠失、挿入、置換）をもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のＣＤ７０ｇＲＮＡ配列の非限定的な例は、表５において列挙される（例えば、配列番号２３〜２９及び３３〜３９）。他のｇＲＮＡ配列は、１９番染色体上に位置するＣＤ７０遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８の座標：１９番染色体：６，５８３，１８３〜６，６０４，１０３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２５７２６）。ある種の実施形態では、ＣＤ７０ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、ＣＤ７０ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現を破壊するＣＤ７０遺伝子内、又は周囲でインデル（例えば：挿入、欠失又は置換）をもたらす。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼ）を含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）及びＣＤ７０遺伝子（又は任意の他の目的の遺伝子）を標的化するｇＲＮＡが、Ｔ細胞（例えば、一次Ｔ細胞）に送達される。他の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、Ｔ細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）は単に、ｇＲＮＡと予め複合体を形成した／複合体を形成した（結合した）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。

いくつかの実施形態では、ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、配列番号３３〜３９を含むｇＲＮＡのいずれか１つなどであるが、これに限定されない合成的に改変されたｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、配列番号２３〜２９を含むｇＲＮＡのいずれか１つなどであるが、これに限定されない合成的に改変されていないｇＲＮＡである。

いくつかの実施形態では、ＣＤ７０ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＣＤ７０遺伝子における二重鎖切断をもたらす。切断の修復は、ＣＤ７０遺伝子においてインデルをもたらし、ここで、ＣＤ７０遺伝子配列は、配列番号１２９〜１３４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。

多重遺伝子編集
本開示の操作されたＴ細胞は、いくつかの実施形態において、例えば、２つ以上の遺伝子における２つ以上の破壊された遺伝子（例えば、２つ以上の遺伝子編集）を含む。例えば、操作されたＴ細胞は、破壊されたＣＤ７０遺伝子、破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子、破壊されたベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子、破壊されたプログラム細胞死−１（ＰＤ−１又はＰＤＣＤ１）遺伝子、又は前述の破壊された遺伝子の２つ以上の任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、及び破壊されたＰＤ−１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子及び破壊されたＰＤ−１遺伝子を含む。

ＴＲＡＣ遺伝子編集
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含む。この破壊は、ＴＣＲの機能喪失をもたらし、且つ操作されたＴ細胞に同種移植への非アロ反応性及び適合性を与え、移植片対宿主疾患のリスクを最小化する。いくつかの実施形態では、内在性のＴＲＡＣ遺伝子の発現は、移植片対宿主反応を予防するために除去される。

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及びドナー鋳型を使用して）ＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることによってもたらされる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するヌクレアーゼ及びｇＲＮＡによりもたらされる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子におけるゲノム欠失は、ＨＤＲによってもたらされ、ここで、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＴＲＡＣ遺伝子のセグメントを（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及びドナー鋳型を使用して）置き換える。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることによりもたらされる。

ＴＲＡＣ遺伝子においてゲノムをもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のＴＲＡＣｇＲＮＡ配列の非限定的な例は、表７において列挙される（例えば、配列番号３０及び４０）。また、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３２３３４号明細書も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１４番染色体上に位置するＴＲＡＣ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８：１４番染色体：２２，５４７，５０６〜２２，５５２，１５４；．Ｅｎｓｅｍｂｌ；ＥＮＳＧ０００００２７７７３４）。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊するＴＲＡＣ遺伝子におけるインデルをもたらすＴＲＡＣゲノム領域における切断をもたらす。

いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの５０％〜１００％、５０％〜９０％、５０％〜８０％、５０％〜７０％、５０％〜６０％、６０％〜１００％、６０％〜９０％、６０％〜８０％、６０％〜７０％、７０％〜１００％、７０％〜９０％、７０％〜８０％、８０％〜１００％、８０％〜９０％、又は９０％〜１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼ）を含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）及びＴＲＡＣ遺伝子（又は任意の他の目的の遺伝子）を標的化するｇＲＮＡが、Ｔ細胞（例えば、一次Ｔ細胞）に送達される。他の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、Ｔ細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）は単に、ｇＲＮＡと予め複合体を形成した／複合体を形成したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、以下の表１における配列から選択されるヌクレオチド配列を含むＴＲＡＣ遺伝子においてインデルをもたらす。

いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子において１５〜３０塩基対の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子において１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子において３０塩基対より多い欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子において２０塩基対の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子において配列番号８６の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子において配列番号８６を含む欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子において配列番号１１８の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子において配列番号１１８を含む欠失を含む。

β２Ｍ遺伝子編集
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む。β２Ｍは、ＭＨＣＩ複合体の共通の（不変の）構成要素である。遺伝子編集によってその発現を破壊することは、宿主対治療用異質遺伝子型Ｔ細胞反応を予防することになり、異質遺伝子型Ｔ細胞の持続の増大をもたらす。いくつかの実施形態では、内在性のβ２Ｍ遺伝子の発現は、宿主対移植片反応を予防するために除去される。

β２Ｍ遺伝子においてゲノム欠失をもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のβ２ＭｇＲＮＡ配列の非限定的な例は、表７において列挙される（例えば、配列番号３１及び４１）。また、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３２３３４号明細書も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１５番染色体上に位置するβ２Ｍ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８の座標：１５番染色体：４４，７１１，４７７−４４，７１８，８７７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６６７１０）。

いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊するβ２Ｍ遺伝子におけるインデルをもたらすβ２Ｍゲノム領域における切断をもたらす。

いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの５０％〜１００％、５０％〜９０％、５０％〜８０％、５０％〜７０％、５０％〜６０％、６０％〜１００％、６０％〜９０％、６０％〜８０％、６０％〜７０％、７０％〜１００％、７０％〜９０％、７０％〜８０％、８０％〜１００％、８０％〜９０％、又は９０％〜１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。

いくつかの実施形態では、細胞の集団のうちの５０％未満の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、細胞の集団のうちの３０％未満の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現する。例えば、細胞の集団のうちの５０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、細胞の集団のうちの４０％〜３０％、４０％〜２０％、４０％〜１０％、４０％〜５％、３０％〜２０％、３０％〜１０％、３０％〜５％、２０％〜１０％、２０％〜５％、又は１０％〜５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現する。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼ）を含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）及びＢ２Ｍ遺伝子（又は任意の他の目的の遺伝子）を標的化するｇＲＮＡが、Ｔ細胞（例えば、一次Ｔ細胞）に送達される。他の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、Ｔ細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）は単に、ｇＲＮＡと予め複合体を形成した／複合体を形成したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。

いくつかの実施形態では、編集されたβ２Ｍ遺伝子は、以下の表２における配列から選択されるヌクレオチド配列を含む。

ＰＤ−１遺伝子編集
ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞において下方制御される免疫チェックポイント分子であり、Ｔ細胞の応答を弱めるか又は止める働きをする。遺伝子編集によってＰＤ−１を破壊すれば、より多くの持続的且つ／又は強力な治療的Ｔ細胞応答をもたらし、且つ／又は対象における免疫抑制を低減できるであろう。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＰＤ−１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、内在性のＰＤ−１遺伝子の発現は、本開示のＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍効果を増強するめに除去される。

ＰＤ−１遺伝子においてゲノム欠失をもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のＰＤ−１ｇＲＮＡ配列の非限定的な例は、表５において列挙される（例えば、配列番号３２及び４２）。また、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３２３３４号明細書も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、２番染色体上に位置するＰＤ−１遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８の座標：２番染色体：２４１，８４９，８８１〜２４１，８５８，９０８；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８８３８９）。

いくつかの実施形態では、ＰＤ−１ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＰＤ−１ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊するＰＤ−１遺伝子におけるインデルをもたらすＴＲＡＣゲノム領域における切断をもたらす。

いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＰＤ−１表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＰＤ−１表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの５０％〜１００％、５０％〜９０％、５０％〜８０％、５０％〜７０％、５０％〜６０％、６０％〜１００％、６０％〜９０％、６０％〜８０％、６０％〜７０％、７０％〜１００％、７０％〜９０％、７０％〜８０％、８０％〜１００％、８０％〜９０％、又は９０％〜１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＰＤ−１表面タンパク質を発現しない。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼ）を含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）及びＰＤ−１遺伝子（又は任意の他の目的の遺伝子）を標的化するｇＲＮＡが、Ｔ細胞（例えば、一次Ｔ細胞）に送達される。他の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、Ｔ細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）は単に、ｇＲＮＡと予め複合体を形成した／複合体を形成したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。

細胞表現型
いくつかの実施形態では、細胞の集団内の１つ以上の遺伝子編集は、細胞の増殖能、細胞の枯渇、細胞の生存能、細胞溶解能（例えば、サイトカイン産生及び／又は放出を増加させる）、又はこれらの任意の組合せにおける変化と関連する表現型をもたらす。

いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞は、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ外部ドメインを含むＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞は、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ外部ドメインを含むＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞は、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ外部ドメインを含むＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞は、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ外部ドメインを含むＣＡＲを含む。前述の操作されたＴ細胞のいずれかは、以下の遺伝子の１つ以上における破壊も含み得る：ＴＲＡＣ、β２Ｍ、ＰＤ−１、及び／又はＣＤ７０（例えば、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻；ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻；又はＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻）。

いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して細胞増殖能の増大を示す。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも２０％高い細胞増殖能を示す。例えば、操作されたＴ細胞（例えば、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻；ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻；又はＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻；ＣＡＲを伴うか又は伴わない）は、対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％高い細胞増殖能を示し得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して、２０％〜１００％、２０％〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、３０％〜１００％、３０％〜９０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、４０％〜１００％、４０％〜９０％、４０％〜８０％、４０％〜７０％、４０％〜６０％、４０％〜５０％、５０％〜１００％、５０％〜９０％、５０％〜８０％、５０％〜７０％、又は５０％〜６０％高い細胞増殖能を示す。細胞増殖を測定する方法は、当業者に知られており、本明細書に記載される。

いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して、枯渇の減少を示す。例えば、操作されたＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して、ＬＡＧ３（又は他の枯渇マーカー）のレベルの低減を示し得る。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ３発現のレベルは、対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも２０％低減される。例えば、ＬＡＧ３発現のレベルは、対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％低減され得る。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ３発現のレベルは、対照Ｔ細胞と比較して、２０％〜１００％、２０％〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、３０％〜１００％、３０％〜９０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、４０％〜１００％、４０％〜９０％、４０％〜８０％、４０％〜７０％、４０％〜６０％、４０％〜５０％、５０％〜１００％、５０％〜９０％、５０％〜８０％、５０％〜７０％、又は５０％〜６０％低減される。いくつかの実施形態では、枯渇の減少は、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３又はこれらの組合せを含む枯渇マーカーの表面発現の減少を測定することによって決定される。表面発現を測定するための方法は、当業者に知られており、本明細書に記載される。

いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞生存能の増大を示す。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞生存能において少なくとも２０％の増大を示す。例えば、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞生存能において少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の増大を示し得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞生存能において２０％〜１００％、２０％〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、３０％〜１００％、３０％〜９０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、４０％〜１００％、４０％〜９０％、４０％〜８０％、４０％〜７０％、４０％〜６０％、４０％〜５０％、５０％〜１００％、５０％〜９０％、５０％〜８０％、５０％〜７０％、又は５０％〜６０％の増大を示す。細胞生存能を測定する方法は、当業者に知られており、本明細書に記載される。

いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞溶解能の増大を示す。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞溶解能において少なくとも２０％の増大（少なくとも２０％多く標的細胞を死滅させる）を示す。例えば、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞溶解能において少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の増大を示し得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞溶解能において２０％〜１００％、２０％〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、３０％〜１００％、３０％〜９０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、４０％〜１００％、４０％〜９０％、４０％〜８０％、４０％〜７０％、４０％〜６０％、４０％〜５０％、５０％〜１００％、５０％〜９０％、５０％〜８０％、５０％〜７０％、又は５０％〜６０％の増大を示す。

いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、サイトカイン分泌の増加を示す。例えば、いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞によって分泌されるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−ガンマ）のレベルは、対照Ｔ細胞によって分泌されるサイトカインのレベルより少なくとも２倍（例えば、少なくとも３倍、少なくとも４倍、又は少なくとも５倍）高い。

対照Ｔ細胞は、いくつかの実施形態において、内在性のＣＤ７０タンパク質（Ｔ細胞によって通常発現されるＣＤ７０）を発現する操作されたＴ細胞（例えば、遺伝子編集されたＴ細胞）である。いくつかの実施形態では、対照Ｔ細胞は、内在性のＣＤ７０タンパク質を発現する操作されたＴ細胞であり、且つＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ７０ＣＡＲ又は抗ＢＣＭＡＣＡＲ）をコードする核酸の挿入によって破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、破壊されたＰＤ−１遺伝子、又は前述の破壊された遺伝子の任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、対照Ｔ細胞は、未編集のＴ細胞である。

驚くべきことに、本開示の多重遺伝子編集されたＣＡＲＴ細胞（例えば、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻細胞）は、癌細胞による複数回のチャレンジ（再チャレンジとも呼ばれる）の後に細胞傷害性（癌細胞を死滅させる能力）を維持する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、標的細胞による少なくとも１回の再チャレンジの後に細胞傷害性を維持し、標的細胞は、ＣＡＲＴ細胞によって認識される抗原を発現する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、標的細胞による少なくとも２回の再チャレンジの後に細胞傷害性を維持し、標的細胞は、ＣＡＲＴ細胞によって認識される抗原を発現する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、癌細胞による少なくとも１回の再チャレンジの後に細胞傷害性を維持する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、癌細胞による少なくとも２回の再チャレンジの後に細胞傷害性を維持する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、標的細胞による１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回の再チャレンジの後に細胞傷害性を維持し、標的細胞は、ＣＡＲＴ細胞によって認識される抗原を発現する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、標的細胞による２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回の再チャレンジの後に細胞傷害性を維持し、標的細胞は、ＣＡＲＴ細胞によって認識される抗原を発現する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、癌細胞による２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回の再チャレンジの後に細胞傷害性を維持する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、標的細胞による１０回以上の再チャレンジの後に細胞傷害性を維持し、標的細胞は、ＣＡＲＴ細胞によって認識される抗原を発現する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、癌細胞による１０回以上の再チャレンジの後に細胞傷害性を維持する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、ＣＤ７０に特異的なＣＡＲを発現し、且つ標的細胞（例えば、癌細胞）は、ＣＤ７０を発現する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、ＣＤ１９に特異的なＣＡＲを発現し、且つ標的細胞（例えば、癌細胞）は、ＣＤ１９を発現する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、ＣＤ３３に特異的なＣＡＲを発現し、且つ標的細胞（例えば、癌細胞）は、ＣＤ３３を発現する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、ＢＣＭＡに特異的なＣＡＲを発現し、且つ標的細胞（例えば、癌細胞）は、ＢＣＭＡを発現する。

遺伝子編集方法
遺伝子編集（ゲノム編集を含む）は、ヌクレオチド／核酸が、標的化された細胞のゲノム中などのＤＮＡ配列中に挿入され、欠失され、且つ／又は置換される一種の遺伝子操作である。標的化された遺伝子編集により、標的化された細胞のゲノム中（例えば、標的化された遺伝子又は標的化されたＤＮＡ配列中）の予め選択された部位での挿入、欠失、及び／又は置換が可能になる。内在性の遺伝子の配列が、例えば、ヌクレオチド／核酸の欠失、挿入又は置換によって編集されるとき、影響を受けた配列を含む内在性の遺伝子は、配列改変のためにノックアウト又はノックダウンされ得る。したがって、標的化された編集は、内在性の遺伝子発現を破壊するために使用され得る。「標的化された組込み」は、挿入部位での内在性の配列の欠失の有無にかかわらず、１つ以上の外来性の配列の挿入を含むプロセスを指す。標的化された組込みは、外来性の配列を含有するドナー鋳型が存在する場合、標的化された遺伝子編集から生じ得る。本明細書で使用する場合、「破壊された遺伝子」は、内在性の遺伝子と比較して、内在性の遺伝子から機能性タンパク質の発現が減少又は阻害されるような挿入、欠失又は置換を含む遺伝子を指す。本明細書で使用する場合、「遺伝子を破壊すること」は、内在性の遺伝子中で、内在性の遺伝子から機能性タンパク質の発現が減少又は阻害されるような少なくとも１つのヌクレオチド／核酸を挿入するか、欠失させるか又は置換する方法を指す。遺伝子を破壊する方法は、当業者に知られており、本明細書に記載される。

標的化された編集は、ヌクレアーゼ非依存的な手法、又はヌクレアーゼ依存的な手法のいずれかを介して達成され得る。ヌクレアーゼ非依存的な標的化された編集手法において、相同組換えは、宿主細胞の酵素機構を介して内在性の配列に導入されることになる外来性のポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって誘導される。外来性のポリヌクレオチドは、内在性の配列中においてヌクレオチドの欠失、挿入又は置換を導入し得る。

或いは、ヌクレアーゼ依存的な手法は、特異的なレアカッティングヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）による二重鎖切断（ＤＳＢ）の特異的な導入を介して比較的高い頻度を有して標的化された編集を達成できる。このようなヌクレアーゼ依存的な標的化された編集はまた、ＤＮＡ修復機構、例えば、ＤＳＢに応答して生じる非相同末端連結（ＮＨＥＪ）を利用する。ＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、少数の内在性のヌクレオチドのランダムな挿入又は欠失（インデル）を引き起こす場合が多い。ＮＨＥＪに媒介される修復とは反対に、修復はまた、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって生じる場合がある。一対の相同性アームに隣接する外来性の遺伝子材料を含有するドナー鋳型が存在するとき、外来性の遺伝子材料は、外来性の遺伝子材料の標的化された組込みをもたらすＨＤＲによってゲノムに導入され得る。

特異的且つ標的化されたＤＳＢを導入できる利用可能なエンドヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連９）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ｐｈｉＣ３１及びＢｘｂ１インテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（二重インテグラーゼカセット交換）システムも、標的化された組込みのために使用され得る。

ＺＦＮは、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインであるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＢＤ）に融合されたヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。ジンクフィンガーは、構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化されるジンクフィンガー結合ドメイン内の約３０アミノ酸のドメインである。ジンクフィンガーの例としては、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー、Ｃ３Ｈジンクフィンガー、及びＣ４ジンクフィンガーが挙げられるが、これらに限定されない。設計されたジンクフィンガードメインは、設計／組成物が主に、合理的な基準、例えば、既存のＺＦＰ設計及び結合データの情報を保管するデータベース中の情報を処理するための置換規則及びコンピューター処理されたアルゴリズムの適用からもたらされる、天然には存在しないドメインである。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；及び同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたい；国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレット及び国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットも参照されたい。選択されたジンクフィンガードメインは、生成が主に、ファージディスプレイ、相互作用トラップ又はハイブリッド選択などの実験的なプロセスからもたらされる、天然には存在しないドメインである。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号明細書及び米国特許第７，９７２，８５４号明細書においてより詳細に記載される。ＺＦＮの最も認知されている例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの融合物である。

ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合されたヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、又は「ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン」は、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合に関与するＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインである。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原体によって感染中に分泌される。これらのタンパク質は、植物細胞の核に入り、それらのＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的なＤＮＡ配列に結合し、且つそれらの転写活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、２アミノ酸残基からなる可変領域（ＲＶＤ）と呼ばれる選択された反復位置で多型を含むエフェクターにより可変の数の不完全な３４アミノ酸反復に依存する。ＴＡＬＥＮは、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号明細書においてより詳細に記載される。当該技術分野におけるＴＡＬＥＮの最も認知された例は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに対するＦｏｋＩヌクレアーゼの融合ポリペプチドである。

本明細書に提供されるとおりの使用に好適な標的化ヌクレアーゼのさらなる例としては、個別に使用されようと、組み合わせて使用されようと、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴ１、及びＷβ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０１−１が挙げられるが、これらに限定されない。

標的化ヌクレアーゼの他の非限定的な例としては、天然に存在するヌクレアーゼ及び組換えヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼホーミングエンドヌクレアーゼなどが挙げられる。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されてきた原核生物において天然に存在する防御機構である。それは、ＤＮＡの切断を標的化するＤＮＡヌクレアーゼＣａｓ９、並びに２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に依拠する。ＣＲＩＳＰＲは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートの略称であり、例えば、原核生物を感染させたか又は攻撃したウイルスによって、細胞に以前に暴露した外来ＤＮＡと類似性を有するＤＮＡの断片（スペーサーＤＮＡ）を含有する細菌及び古細菌のゲノムにおいて見出されるＤＮＡ配列のファミリーである。ＤＮＡのこれらの断片が原核生物によって使用されて、例えば、引き続く攻撃の間に同様のウイルスからの再導入時に同様の外来ＤＮＡを検出し、且つ破壊する。ＣＲＩＳＰＲ座位の転写により、スペーサー配列を含むＲＮＡ分子の形成がもたらされ、これが、外来の外来性ＤＮＡを認識し、且つ切断できるＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質と相互作用し、且つ標的化する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのいくつかの種類及びクラスが記載されている（例えば、Ｋｏｏｎｉｎｅｔａｌ．，（２０１７）ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ３７：６７−７８を参照のこと）。

ｃｒＲＮＡは、通常標的ＤＮＡ中の２０ヌクレオチド（ｎｔ）配列とワトソン−クリック塩基対を介してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の配列認識及び特異性を促進する。ｃｒＲＮＡ中の５’ ２０ｎｔの配列の変化は、特定の座位へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の標的化を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体は単に、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを有する）に続いている場合、ｃｒＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の最初の２０ｎｔに一致する配列を含有するＤＮＡ配列に結合する。

ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖構造を形成し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによって結合されて触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体を形成し、続いてこれにより標的ＤＮＡを切断できる。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体が標的部位でＤＮＡに結合すると、Ｃａｓ９酵素内の２つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれＰＡＭ部位の上流のＤＮＡ鎖の一方を切断し、ＤＮＡの両鎖が塩基対（平滑末端）で終結する二本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体が特定の標的部位でＤＮＡに結合し、部位特異的なＤＳＢが形成された後、次の鍵となるステップはＤＳＢの修復である。細胞は、ＤＳＢを修復するために２つの主要なＤＮＡ修復経路を使用する：非相同末端連結（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）。

ＮＨＥＪは、非分裂細胞を含む大多数の細胞型において高度に活性であるように見える堅固な修復機構である。ＮＨＥＪは誤りがちであり、多くの場合、ＤＳＢの部位にて１〜数百のヌクレオチド間で除去又は付加をもたらす場合があるが、そのような改変は通常＜２０ｎｔである。得られた挿入及び欠失（インデル）は、遺伝子のコード又は非コード領域を破壊する場合がある。代わりに、ＨＤＲは、内在的又は外因的に提供される長い一続きの相同性ドナーＤＮＡを使用して、高い忠実度を有してＤＳＢを修復する。ＨＤＲは、分裂細胞においてのみ活性であり、大部分の細胞型において相対的に低い頻度で生じる。本開示の多くの実施形態では、ＮＨＥＪが、修復オペラントとして利用される。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するが、他のＣａｓ９ホモログが使用されてもよい。本明細書に提供されるとおり、野生型Ｃａｓ９が使用されてもよいし、Ｃａｓ９の改変されたバージョンが使用されてもよい（例えば、Ｃａｓ９の発展させたバージョン、又はＣａｓ９オルソログ若しくは変異体）ことが理解されるはずである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃｐｆ１（クラスＩＩＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）などの別のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと置き換えられてもよい。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型のシステムに由来する構成要素を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ座位に関する最新の分類スキームは、Ｉ〜Ｖ又はＶＩ型を有するクラス１及びクラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを定義する（Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．，（２０１５）ＮａｔＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２−３６；Ｓｈｍａｋｏｖｅｔａｌ．，（２０１５）ＭｏｌＣｅｌｌ，６０：３８５−３９７）。クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、単一のタンパク質エフェクターを有する。ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型のＣａｓタンパク質は、「クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ」と本明細書で呼ばれる単一タンパク質のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ３タンパク質が挙げられる。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ（Ｚｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．，（２０１５）Ｃｅｌｌ１６３：１−１３）は、Ｃａｓ９のホモログであり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに由来するＣａｓ９タンパク質）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する（Ｃａｓ９タンパク質又はＣｐｆ１タンパク質などの単一タンパク質Ｃａｓヌクレアーゼ）。タンパク質のＣａｓ９及びＣｐｆ１ファミリーは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼを有する酵素であり、それらは、本明細書にさらに記載されるとおり、適切なガイドＲＮＡを設計することによって所望の核酸標的を切断するように誘導され得る。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、２つ以上のヌクレアーゼドメインを含んでもよい。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、少なくとも１つのＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃｐｆ１）及び少なくとも１つのＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的配列においてＤＳＢを導入する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ただ１つの機能性ヌクレアーゼドメインを含有するように改変される。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインの１つが、変異されるか又は完全に若しくは部分的に欠失されて、その核酸切断活性が低減するように改変される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、機能性ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有しないように改変される。他の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、機能性ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含有しないように改変される。ヌクレアーゼドメインのただ１つが機能的であるいくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、一本鎖切断（「ニック」）を標的配列に導入できるニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのヌクレアーゼドメイン内の保存されたアミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低減又は改変するために置換される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼニッカーゼは、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン中においてアミノ酸置換を含む。ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン中における例示的なアミノ酸置換は、Ｄ１０Ａを含む（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼに基づく）。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン中においてアミノ酸置換を含む。ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン中における例示的なアミノ酸置換は、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、及びＤ９８６Ａを含む（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼに基づく）。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのカスケード複合体の構成要素である。例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。

ガイドＲＮＡ
本開示は、会合したポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の標的核酸内の特定の標的配列に対する活性を誘導できるゲノム標的化核酸を提供する。ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書で「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列、及びＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含む。ＩＩ型システムにおいて、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡを含む。ＩＩ型ｇＲＮＡにおいて、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ｇＲＮＡにおいて、ｃｒＲＮＡが、二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果、ガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドは、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、その部位特異的ポリペプチドとの会合により、複合体に標的特異性をもたらす。したがって、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。

当業者によって理解されるとおり、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計される。Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６−８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２−６０７（２０１１）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、単一分子ガイドＲＮＡである。

二重分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの二本鎖を含む。第１の鎖は、５’から３’方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。

ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる）は、５’から３’方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、ガイドＲＮＡに対する追加の機能性（例えば、安定性）に寄与する要素を含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成する。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、１つ以上のヘアピンを含む。

Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡは、５’から３’方向において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で２０ヌクレオチドのスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で２０ヌクレオチドより長いスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で１７〜３０ヌクレオチドを有する可変長スペーサー配列を含む（表３を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含む。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１個のウラシル（Ｕ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に２個のウラシル（ＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に３個のウラシル（ＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に４個のウラシル（ＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に５個のウラシル（ＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に６個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に７個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に８個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。

ｓｇＲＮＡは、改変されない場合もあるし、改変される場合もある。例えば、改変されたｓｇＲＮＡは、１つ以上の２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。

実例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１システムにおいて使用されるガイドＲＮＡ、又は他のより小さいＲＮＡは、下に説明され且つ当該技術分野において記載されるとおり、化学的手段によって容易に合成され得る。化学合成法が拡大し続けている一方で、ポリヌクレオチドの長さが百数十ヌクレオチドを超えて大幅に長くなると、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの方法によるそのようなＲＮＡの精製は、より難しくなる傾向がある。比較的長いＲＮＡを生成するために使用される１つの手法は、ともに連結される２つ以上の分子を生成することである。Ｃａｓ９又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするものなどのはるかに長いＲＮＡは、より容易に酵素的に生成される。当該技術分野において記載されるとおり、様々な種類のＲＮＡ修飾、例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性若しくは程度を低減し、且つ／又は他の特質を増強する修飾が、ＲＮＡの化学合成及び／若しくは酵素的生成の間又は後に導入され得る。

いくつかの実施形態では、インデル頻度（編集頻度）は、非常に効率的なｇＲＮＡ分子を同定するために使用され得るＴＩＤＥ分析を使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、非常に効率的なｇＲＮＡは、８０％より高い遺伝子編集頻度をもたらす。例えば、ｇＲＮＡは、それが、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の遺伝子編集頻度をもたらす場合、非常に効率的であるとみなされる。

いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、２つのガイドＲＮＡを使用するゲノム配列の欠失によって発生し得る。細胞においてゲノム欠失をもたらす（例えば、細胞において遺伝子をノックアウトする）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子編集技術を使用する方法が知られている（ＢａｕｅｒＤＥｅｔａｌ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１５；９５；ｅ５２１１８）。

スペーサー配列
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、スペーサー配列を含む。スペーサー配列は、目的の標的核酸の標的配列（例えば、ゲノム標的配列などのＤＮＡ標的配列）を定義する配列（例えば、２０個のヌクレオチド配列）である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５〜３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチドである。

「標的配列」は、ＰＡＭ配列に隣接し、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）によって改変される配列である。「標的核酸」は、二重鎖分子である：一方の鎖は、標的配列を含み、「ＰＡＭ鎖」と呼ばれ、また他方の相補鎖は、「非ＰＡＭ鎖」と呼ばれる。当業者は、ｇＲＮＡスペーサー配列が、目的の標的核酸の非ＰＡＭ鎖において位置する標的配列の逆相補鎖にハイブリダイズすることを認識している。したがって、ｇＲＮＡスペーサー配列は、標的配列のＲＮＡ等価物である。例えば、標的配列が、５’−ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ−３’（配列番号８６）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’−ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ−３’（配列番号９８）である。ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的な様式で目的の標的核酸と相互作用する。したがって、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の標的配列に依存して変化する。

本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、スペーサー配列は、システムにおいて使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’に位置する標的核酸の領域にハイブリダイズするように設計される。スペーサーは、標的配列と完全に一致してもよいし、ミスマッチを有してもよい。各Ｃａｓ９酵素は、それが標的ＤＮＡ中で認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸において配列５’−ＮＲＧ−３’（ここで、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列によって標的化される標的核酸配列の３’のすぐ近くにある）を含むＰＡＭを認識する。

いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個より多いヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも：５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大で：５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５’のすぐ近くに２０個の塩基を含む。例えば、

を含む配列において、標的核酸は、Ｎ（複数）（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、下線のＮＲＧ配列は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＰＡＭである）に対応する配列を含む。

本明細書に提供されるとおりに使用され得るｇＲＮＡの非限定的な例は、この参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日に出願されたＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９号において提供される。

ｇＲＮＡを作製する方法
本開示のｇＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）、合成及び／又は化学合成法、又はこれらの組合せを含むが、これらに限定されない、当該技術分野において利用可能な好適な手段によって生成される。酵素的（ＩＶＴ）、固相、液相、複合型の合成法、小領域合成、及びライゲーション法が利用される。一実施形態では、ｇＲＮＡは、ＩＶＴ酵素的合成法を使用して作製される。ＩＶＴによりポリヌクレオチドを作製する方法は、当該技術分野において知られており、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３００６２号明細書において記載される。したがって、本開示はまた、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡコンストラクトを含み、ベクターは、本明細書に記載されるｇＲＮＡをインビトロ転写するために使用される。

いくつかの実施形態では、非天然の修飾核酸塩基が、合成中又は合成後にポリヌクレオチド、例えば、ｇＲＮＡに導入される。ある種の実施形態では、修飾は、ヌクレオシド間結合、プリン若しくはピリミジン塩基、又は糖におけるものである。いくつかの実施形態では、修飾は、ポリヌクレオチドの末端で導入される；化学合成又はポリメラーゼ酵素を用いる。修飾核酸及びそれらの合成の例は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号明細書において開示される。修飾ポリヌクレオチドの合成はまた、ＶｅｒｍａａｎｄＥｃｋｓｔｅｉｎ，ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７６，９９−１３４（１９９８）において記載される。

いくつかの実施形態では、酵素的又は化学的ライゲーション法を使用して、ポリヌクレオチド又はそれらの領域を、標的化又は送達薬剤、蛍光標識、液体、ナノ粒子などの様々な機能性部分とコンジュゲートする。ポリヌクレオチド及び修飾ポリヌクレオチドのコンジュゲートは、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１（３），１６５−１８７（１９９０）において概説される。

本発明のある種の実施形態はまた、本明細書に記載されるｇＲＮＡをコードする核酸、例えばベクターを提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡ分子である。他の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸は、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する反復配列の全て又は一部に隣接するスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの別々の核酸によってコードされる。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一の核酸の逆鎖によってコードされる。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一の核酸の同じ鎖によってコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示によって提供されるｇＲＮＡは、当該技術分野において記載される任意の手段によって化学的に合成される（例えば、国際公開第２００５／０１２４８号パンフレットを参照のこと）。化学合成法が拡大し続けている一方で、ポリヌクレオチドの長さが百数十ヌクレオチドを超えて大幅に長くなると、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの方法によるそのようなＲＮＡの精製は、より難しくなる傾向がある。比較的長いＲＮＡを生成するために使用される１つの手法は、ともに連結される２つ以上の分子を生成することである。

いくつかの実施形態では、本開示によって提供されるｇＲＮＡは、酵素的方法（例えば、インビトロ転写、ＩＶＴ）によって合成される。

当該技術分野において記載されるとおり、様々な種類のＲＮＡ修飾、例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性若しくは程度を低減し、且つ／又は他の特質を増強する修飾が、ＲＮＡの化学合成及び／若しくは酵素的生成の間又は後に導入され得る。

ある種の実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムにより使用され得る。各ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが２つ以上の標的核酸を切断するように、異なる標的化配列を含有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体内での活性又は安定性などの同じ又は異なる特性を有し得る。２つ以上のガイドＲＮＡが使用される場合、各ガイドＲＮＡは、同じ又は異なるベクター上にコードされ得る。２つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同じであるか又は異なる。

ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的化配列（例えば、スペーサー配列）を介して目的の任意の配列を標的化し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列と標的核酸分子上の標的配列の間の相補性の程度は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列及び標的核酸分子上の標的配列は、１００％相補的である。他の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列及び標的核酸分子上の標的配列は、少なくとも１個のミスマッチを含有し得る。例えば、ガイドＲＮＡの標的化配列及び標的核酸分子上の標的配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを含有し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列及び標的核酸分子上の標的配列は、１〜６個のミスマッチを含有し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列及び標的核酸分子上の標的配列は、５又は６個のミスマッチを含有し得る。

標的化配列の長さは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及び使用される構成要素に依存し得る。例えば、異なる細菌種に由来する異なるＣａｓ９タンパク質は、可変の最適な標的化配列の長さを有する。したがって、標的化配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、又は５０を超えるヌクレオチド長を含み得る。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１８〜２４ヌクレオチド長を含み得る。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９〜２１ヌクレオチド長を含み得る。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２０ヌクレオチド長を含み得る。

本開示のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、少なくとも１個のガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成し得る。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を標的核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）上の標的配列に誘導し得るが、ここで、Ｃａｓタンパク質は、標的核酸を切断する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、Ｃｐｆ１／ガイドＲＮＡ複合体である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体である。

ガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼの送達
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、同時に又は逐次的に、別々に細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、細胞に一緒に送達される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ともに予め複合体を形成して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成する。

ＲＮＰは、少なくともそれらが、核酸が豊富な細胞環境中での乱雑な相互作用のリスクを最小化し、且つＲＮＡを分解から保護するため、遺伝子編集に有用である。ＲＮＰを形成するための方法は、当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼ）及び目的の遺伝子を標的化するｇＲＮＡを含有するＲＮＰが、細胞（例えば、Ｔ細胞）に送達される。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、エレクトロポレーションによってＴ細胞に送達される。

本明細書で使用する場合、「ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰ」は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと予め複合体を形成したＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを指す。本明細書で使用する場合、「β２Ｍ標的化ＲＮＰ」は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと予め複合体を形成したβ２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを指す。本明細書で使用する場合、「ＣＤ７０標的化ＲＮＰ」は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと予め複合体を形成したＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡを指す。本明細書で使用する場合、「ＰＤ−１標的化ＲＮＰ」は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと予め複合体を形成したＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡを指す。

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰが、細胞に送達される。いくつかの実施形態では、β２Ｍ標的化ＲＮＰが、細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０標的化ＲＮＰが、細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１標的化ＲＮＰが、細胞に送達される。

いくつかの実施形態では、２つ以上のＲＮＰが、細胞に送達される。いくつかの実施形態では、２つ以上のＲＮＰが、細胞に別々に送達される。いくつかの実施形態では、２つ以上のＲＮＰが、細胞に同時に送達される。いくつかの実施形態では、以下のＲＮＰの少なくとも１つが、細胞に送達される：
（ｉ）ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰ；
（ｉｉ）β２Ｍ標的化ＲＮＰ；
（ｉｉｉ）ＣＤ７０標的化ＲＮＰ；又は
（ｉｖ）ＰＤ−１標的化ＲＮＰ。いくつかの実施形態では、以下のＲＮＰの少なくとも２つが、細胞に送達される：
（ｉ）ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰ；
（ｉｉ）β２Ｍ標的化ＲＮＰ；
（ｉｉｉ）ＣＤ７０標的化ＲＮＰ；又は
（ｉｖ）ＰＤ−１標的化ＲＮＰ。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを発現するＤＮＡベクター、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするＲＮＡ、又はタンパク質において細胞に送達される。いくつかの実施形態では、遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、ＲＮＡ、又はｇＲＮＡを発現するＤＮＡベクターとして細胞に送達される。

ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、及び／又はＲＮＰの送達は、直接的な注射又は既知の方法、例えば、エレクトロポレーション又は化学的トランスフェクションを使用する細胞トランスフェクションを介するものであり得る。他の細胞トランスフェクション法が使用されてもよい。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞
キメラ抗原受容体は、腫瘍細胞によって発現される抗原を認識し、それに結合するように操作された人工の免疫細胞受容体を指す。一般に、ＣＡＲは、Ｔ細胞のために設計され、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のシグナル伝達ドメイン及び抗原認識ドメイン（例えば、抗体の一本鎖断片（ｓｃＦｖ）又は他の抗体断片）のキメラである（Ｅｎｂｌａｄｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８−５０５）。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲＴ細胞と呼ばれる。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式で選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再指示する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力を与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。さらに、Ｔ細胞において発現されるとき、ＣＡＲは、内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖と有利に二量体化しない。ＣＡＲは、それらが結合する抗原によって参照される場合が多い。例えば、「ＣＤ１９ＣＡＲ」、「ＣＤ７０ＣＡＲ」、「ＣＤ３３ＣＡＲ」及び「ＢＣＭＡＣＡＲ」は、それぞれＣＤ１９、ＣＤ７０、ＣＤ３３又はＢＣＭＡに特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲである。したがって、このような用語は、抗ＣＤ１９ＣＡＲ、抗ＣＤ７０ＣＡＲ、抗ＣＤ３３ＣＡＲ及び抗ＢＣＭＡＣＡＲと互換的である。抗原に特異的に結合するＣＡＲが、いずれかの用語法により参照され得ることは当業者によって理解されるであろう。

４つの世代のＣＡＲが存在し、その各々は異なる構成要素を含有する。第一世代のＣＡＲは、抗体に由来するｓｃＦｖをヒンジ及び膜貫通ドメインを介してＴ細胞受容体のＣＤ３ゼータ（ζ又はｚ）細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。第二世代のＣＡＲは、追加のドメイン、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（４１ＢＢ）、又はＩＣＯＳを組み込んで、共刺激シグナルを供給する。第三世代のＣＡＲは、ＴＣＲＣＤ３ζ鎖に融合した２つの共刺激ドメインを含有する。第三世代の共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、又はＯＸ４０の組合せを含み得る。ＣＡＲは、いくつかの実施形態において、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に一般に由来する外部ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、並びにＣＤ３Ｚ及び／若しくは共刺激分子に由来する１つ（第一世代）、２つ（第二世代）、又は３つ（第三世代）のシグナル伝達ドメインを有する内部ドメインを含有する（Ｍａｕｄｅｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０１７−４０２３；ＫａｋａｒｌａａｎｄＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，ＣａｎｃｅｒＪ．２０１４；２０（２）：１５１−１５５）。

ＣＡＲは通常、それらの機能特性が異なる。Ｔ細胞受容体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、結合される場合、Ｔ細胞の増殖を活性化し、且つ誘導することになるが、アネルギーを引き起こし得る（身体の防御機構による反応の欠如、末梢リンパ球寛容の直接的な誘導をもたらす）。リンパ球は、それらが特定の抗原に応答できない場合、アネルギー性であるとみなされる。第二世代のＣＡＲにおける共刺激ドメインの付加は、改変Ｔ細胞の複製能及び持続を向上させた。同様の抗腫瘍効果は、ＣＤ２８又は４−１ＢＢＣＡＲによりインビトロで観察されるが、前臨床インビボ研究は、４−１ＢＢＣＡＲが、優れた増殖及び／又は持続をもたらし得ることを示唆する。臨床試験は、これらの第二世代のＣＡＲの両方が、インビボで実質的なＴ細胞増殖を誘導できることを示唆するが、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含有するＣＡＲは、より長く持続するように見える。第三世代のＣＡＲは、効力を増強する複数のシグナル伝達ドメイン（共刺激）を組み合わせる。

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、第一世代のＣＡＲである。他の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第二世代のＣＡＲである。さらに他の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第三世代のＣＡＲである。

ＣＡＲは、いくつかの実施形態において、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖなどの抗体）、膜貫通ドメイン、及び細胞質（内）ドメインを含む細胞外（外部）ドメインを含む。

外部ドメイン
外部ドメインは、細胞外の体液に曝されるＣＡＲの領域であり、且ついくつかの実施形態において、抗原結合ドメイン、並びに任意選択によりシグナルペプチド、スペーサードメイン、及び／又はヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンのＶＬ及びＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。リンカーは、いくつかの実施形態において、可動性のための一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を加えるための一続きのグルタミン酸及びリジンとともに親水性残基を含む。一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、実際には抗体の断片ではないが、代わりに１０〜約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンの重（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、可動性のためにグリシン、及び溶解性のためにセリン又はスレオニンを豊富に含み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。いくつかの実施形態では、本開示のｓｃＦｖは、ヒト化されている。他の実施形態では、ｓｃＦｖは、完全ヒトである。さらに他の実施形態では、ｓｃＦｖは、（例えば、マウス及びヒト配列の）キメラである。

いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである（ＣＤ７０に特異的に結合する）。本明細書に提供されるとおりに使用され得る抗ＣＤ７０ｓｃＦｖタンパク質の非限定的な例は、配列番号４８又は配列番号５０のアミノ酸配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖである（ＢＣＭＡに特異的に結合する）。本明細書に提供されるとおりに使用され得る抗ＢＣＭＡｓｃＦｖタンパク質の非限定的な例は、配列番号５９のアミノ酸配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである（ＣＤ１９に特異的に結合する）。本明細書に提供されるとおりに使用され得る抗ＣＤ１９ｓｃＦｖタンパク質の非限定的な例は、配列番号１５１のアミノ酸配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖである（ＣＤ３３に特異的に結合する）。本明細書に提供されるとおりに使用され得る抗ＣＤ３３ｓｃＦｖタンパク質の非限定的な例は、配列番号１３７のアミノ酸配列を含み得る。

他のｓｃＦｖタンパク質が使用されてもよい。

シグナルペプチドは、ＣＡＲ結合の抗原特異性を増強し得る。シグナルペプチドは、ＣＤ８などであるがこれに限定されない抗体、及びＧＳＴ又はＦＬＡＧなどであるがこれらに限定されないエピトープタグに由来し得る。シグナルペプチドの例としては、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号８８）及びＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８９）が挙げられる。他のシグナルペプチドが使用されてもよい。

いくつかの実施形態では、スペーサードメイン又はヒンジドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインの間、又はＣＡＲの細胞質内ドメインと膜貫通ドメインの間に位置する。スペーサードメインは、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖中の細胞外ドメイン及び／又は細胞質内ドメインに連結するのに機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドである。ヒンジドメインは、ＣＡＲ、若しくはそのドメインに可動性をもたらすか、又はＣＡＲ、若しくはそのドメインの立体障害を妨げるのに機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドである。いくつかの実施形態では、スペーサードメイン又はヒンジドメインは、最大で３００個のアミノ酸（例えば、１０〜１００個のアミノ酸、又は５〜２０個のアミノ酸）を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のドメインが、ＣＡＲの他の領域に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインである。他のヒンジドメインが使用されてもよい。

膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜をまたがる疎水性アルファヘリックスである。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの安定性をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるとおりのＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。さらに他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。他の膜貫通ドメインが、本明細書に提供されるとおりに使用されてもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインである：

他の膜貫通ドメインが使用されてもよい。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、アミノ酸配列：ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹ（配列番号１２６）を含むＣＤ８ａ膜貫通ドメインである。

内部ドメイン
内部ドメインは、受容体の機能的な末端である。抗原認識の後、受容体クラスター及びシグナルは、細胞に伝達される。最も一般的に使用される内部ドメインの構成要素は、ＣＤ３−ゼータであり、これは、３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。これは、抗原が結合された後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。多くの場合、ＣＤ３−ゼータは、十分に能力のある活性化シグナルをもたらさない場合があり、したがって、共刺激シグナル伝達が使用される。例えば、ＣＤ２８及び／又は４−１ＢＢが、ＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）とともに使用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるとおりのＣＡＲの共刺激分子は、ＣＤ２８共刺激分子である。他の実施形態では、共刺激分子は、４−１ＢＢ共刺激分子である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８を含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ及び４−１ＢＢを含む。さらに他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、及び４−１ＢＢを含む。表４は、本明細書で使用され得る４−１ＢＢ、ＣＤ２８及びＣＤ３−ゼータに由来するシグナル伝達ドメインの例を提供する。

癌抗原
ＣＤ７０
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＣＤ７０を標的化するように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により操作される。ＣＤ７０は、Ｔ細胞の増殖及び生存に関与する共刺激受容体であるＣＤ２７についてのリガンドとして最初に同定された。ＣＤ７０は、ウイルス感染中の流入領域リンパ節において少ないパーセンテージの活性化Ｔ細胞及び抗原提示細胞上においてのみ見出される。明細胞腎臓癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、神経膠芽腫、及び血液悪性腫瘍などの固形癌を含むがこれらに限定されない多くのヒト腫瘍もまた、ＣＤ７０を発現する。正常組織におけるその限定的な発現パターン及び多くの癌における過剰発現のために、ＣＤ７０は、魅力的な治療標的である。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号４７又は４９の配列によってコードされる抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号４８又は５０の配列を含む抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号５１の配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号５２の配列を含むＶＬを含む抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体を含むＣＡＲは、配列番号４５の配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体を含むＣＡＲは、配列番号４６の配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号４７又は４９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号４８又は５０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号５１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号５２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体を含むＣＡＲは、配列番号４５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体を含むＣＡＲは、配列番号４６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ＢＣＭＡ
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＢＣＭＡを標的化するように設計されたＣＡＲにより操作される。Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９）は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーである。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合する。非悪性細胞の中で、ＢＣＭＡは、形質細胞及び成熟Ｂ細胞のサブセットによって主に発現される。ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫細胞及び非ホジキンリンパ腫を含むＢ系列細胞によって選択的に発現され、したがって、ＢＣＭＡもまた、魅力的な治療標的である。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号５８の配列によってコードされる抗ＢＣＭＡｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号５９の配列を含む抗ＢＣＭＡｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号６０の配列を含むＶＨを含む抗ＢＣＭＡｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号６１の配列を含むＶＬを含む抗ＢＣＭＡｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体を含むＣＡＲは、配列番号５６の配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体を含むＣＡＲは、配列番号５７の配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号５８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる抗ＢＣＭＡｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号５９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号６０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＢＣＭＡｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号６１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＢＣＭＡｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体を含むＣＡＲは、配列番号５６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体を含むＣＡＲは、配列番号５７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ＣＤ１９
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＣＤ１９を標的化するように設計されたＣＡＲにより操作される。表面抗原分類１９（ＣＤ１９）は、白血病前駆細胞上で検出可能な抗原決定基である。ヒト及びマウスのアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｐｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公的データベースにおいて見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１５３９１として見出すことができ、ヒトＣＤ１９のヌクレオチド配列のコード化は、受入番号ＮＭ−００１１７８０９８で見出すことができる。ＣＤ１９は、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球白血病及び非ホジキンリンパ腫を含む大部分のＢ細胞系列癌上で発現される。それはまた、Ｂ細胞前駆体の早期のマーカーである。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６−１７）：１１５７−１１６５（１９９７）を参照されたい。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１５０の配列によってコードされる抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１５１の配列を含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１５２の配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１５３の配列を含むＶＬを含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体を含むＣＡＲは、配列番号１４８の配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体を含むＣＡＲは、配列番号１４９の配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１５０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１５１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１５２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１５３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体を含むＣＡＲは、配列番号１４８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体を含むＣＡＲは、配列番号１４９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ＣＤ３３
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＣＤ３３を標的化するように設計されたＣＡＲにより操作される。Ｓｉｇｌｅｃ３としても知られるＣＤ３３は、シアル酸に結合することが知られる骨髄系列の細胞上で発現される膜貫通受容体である。ＣＤ３３は、癌細胞（例えば、急性骨髄性白血病）において発現されるため、ＣＤ３３は、これらの悪性腫瘍を標的化するための細胞表面マーカーとなると考えられる。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１３８の配列によってコードされる抗ＣＤ３３ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１３７の配列を含む抗ＣＤ３３ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１４０の配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１４１の配列を含むＶＬを含む抗ＣＤ３３ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体を含むＣＡＲは、配列番号１３６の配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体を含むＣＡＲは、配列番号１３９の配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１３８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ３３ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１３７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１４０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１４１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＣＤ３３ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体を含むＣＡＲは、配列番号１３６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体を含むＣＡＲは、配列番号１３９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

抗体
抗体（複数の形態において互換的に使用される）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合できる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、インタクトな（すなわち、全長）モノクローナル抗体だけでなく、抗原結合断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ又はラマＶ_ＨＨ抗体）、多重特異性抗体（例えば、二重特性抗体）並びに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、及び共有結合的に修飾された抗体を含む、要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された配置も包含する。

典型的な抗体分子は、通常、抗原結合に関与する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。抗原結合に関与するこれらの領域／残基は、当該技術分野において知られる方法によって参照抗体（例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ７０抗体又は抗ＢＣＭＡ抗体）のＶＨ／ＶＬ配列のアミノ酸配列から同定され得る。ＶＨ及びＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）として知られる、より保存されている領域が挿入された、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）として知られる超可変領域にさらに細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは通常、次の順でアミノ末端からカルボキシ末端に整列した、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、当該技術分野において知られる方法論を使用して、例えば、全てが当該技術分野においてよく知られるＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、及び／又はｃｏｎｔａｃｔ定義によって、正確に同定され得る。本明細書で使用する場合、ＣＤＲは、当該技術分野において知られる任意の方法によって定義されるＣＤＲを指し得る。同じＣＤＲを有する２つの抗体は、２つの抗体が、同じ方法によって決定された当該ＣＤＲの同じアミノ酸配列を有することを意味する。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔａｌ．（１９９１）ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１−３２４２，Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉｅｔａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８；及びＡｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２−１４３（２００４）を参照されたい。ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ及びｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓも参照されたい。

いくつかの実施形態では、抗体は、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ又は抗ＣＤ３３ｓｃＦｖなどのｓｃＦｖである。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ（又はそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、且つ抗体は、いずれかの特定のクラスのものである必要はない。重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、各種クラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けられ得る。免疫グロブリンの各種クラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。免疫グロブリンの各種クラスのサブユニット構造及び三次元配置は、よく知られている。

本明細書に提供されるとおりに使用されることになる抗体は、マウス、ラット、ヒト、又は任意の他の起源（キメラ抗体又はヒト化抗体を含む）であり得る。いくつかの例において、抗体は、免疫学的に不活性である、例えば、補体に媒介される溶解を誘発しないか、又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない定常領域などの改変された定常領域を含む。

いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその抗原結合断片である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基により置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見出されないが、抗体性能をさらに洗練させ、且つ最適化するために含まれる残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て又は実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的に全て含むことになる。最適なヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むことになる。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体からの１つ以上のＣＤＲに「由来する」１つ以上のＣＤＲとも呼ばれる、元の抗体に関して改変された１つ以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、又は６つ）を有する。ヒト化抗体はまた、親和性成熟を伴う場合がある。

いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒト抗体由来の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含み得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第１の種に由来する可変領域又は可変領域の部分及び第２の種に由来する定常領域を有する抗体を指す。通常、これらのキメラ抗体において、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、及びラットなどの非ヒト哺乳動物）の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣するが、定常部分は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体における配列と相同である。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、可変領域及び／又は定常領域においてなされ得る。

いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＣＤ７０、ヒトＢＣＭＡ、ヒトＣＤ１９又はヒトＣＤ３３などの標的抗原に特異的に結合する。標的又はエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当該技術分野でよく理解される用語であり、そのような特異的な結合を決定する方法もまた、当該技術分野でよく知られている。分子は、それが、代替の標的よりも、特定の標的抗原とより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、且つ／又はより高い親和性で反応又は会合する場合、「特異的な結合」を示すと言われる。抗体は、それが、他の基質に結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より迅速に、且つ／又はより長い持続時間で結合する場合、標的抗原に「特異的に結合する」。例えば、ＣＤ７０、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９又はＣＤ３３エピトープに特異的に（又は優先的に）結合する抗体は、それが、他のＣＤ７０、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９若しくはＣＤ３３エピトープ又は非ＣＤ７０、非ＢＣＭＡ、非ＣＤ１９若しくは非ＣＤ３３エピトープに結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より迅速に、且つ／又はより長い持続時間でこのＣＤ７０、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９又はＣＤ３３エピトープに結合する抗体である。それはまた、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体が、第２の標的抗原に特異的に又は優先的に結合する場合もあるし、結合しない場合もあるというこの定義を読むことによっても理解される。そのため、「特異的な結合」又は「優先的な結合」は、必ずしも排他的結合を（含むことはできるが）必要とするものではない。一般に、必ずしもそうではないが、結合への参照は、優先的な結合を意味する。

いくつかの実施形態では、抗体とＣＤ７０の間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、１００ｐＭ〜１μＭである。いくつかの実施形態では、抗体とＣＤ７０の間のＫ_Ｄは、１ｎＭ〜１００ｎＭである。

いくつかの実施形態では、抗体とＢＣＭＡの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、１００ｐＭ〜１μＭである。いくつかの実施形態では、抗体とＢＣＭＡの間のＫ_Ｄは、１ｎＭ〜１００ｎＭである。

いくつかの実施形態では、抗体とＣＤ１９の間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、１００ｐＭ〜１μＭである。いくつかの実施形態では、抗体とＣＤ１９の間のＫ_Ｄは、１ｎＭ〜１００ｎＭである。

いくつかの実施形態では、抗体とＣＤ３３の間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、１００ｐＭ〜１μＭである。いくつかの実施形態では、抗体とＣＤ３３の間のＫ_Ｄは、１ｎＭ〜１００ｎＭである。

本明細書に開示されるとおりの例示的な抗体のいずれかの機能的バリアントもまた本開示の範囲内である。機能的バリアントは、参照抗体を基準としてＶＨ及び／若しくはＶＬ、又はＶＨＣＤＲの１つ以上及び／若しくはＶＬＣＤＲの１つ以上において１つ以上のアミノ酸残基の変異を含有し得るが、参照抗体と実質的に同様の結合活性及び生物学的活性（例えば、実質的に同様の結合親和性、結合特異性、阻害活性、抗腫瘍活性、又はこれらの組合せ）を保持している。

いくつかの例において、本明細書で開示される抗体は、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号５１；ＶＬ：配列番号５２）又は抗体Ｂ（ＶＨ：配列番号６０；ＶＬ：配列番号６１）などの参照抗体のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を合わせて含有するＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、及びＶＨＣＤＲ３を含む。「合わせて」は、３つのＶＨＣＤＲの全てにおけるアミノ酸変異の総数が、既定の範囲内であることを意味する。或いは又は加えて、抗体は、参照抗体のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸変異）を合わせて含有するＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３を含み得る。

いくつかの例において、本明細書で開示される抗体は、少なくとも１つが、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号５１；ＶＬ：配列番号５２）又は抗体Ｂ（ＶＨ：配列番号６０；ＶＬ：配列番号６１）などの参照抗体の対応物のＶＨＣＤＲと同程度に、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、及びＶＨＣＤＲ３を含み得る。特定の例において、抗体は、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号５１；ＶＬ：配列番号５２）又は抗体Ｂ（ＶＨ：配列番号６０；ＶＬ：配列番号６１）などの参照抗体のＶＨＣＤＲ３と同程度に、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＶＨＣＤＲ３を含む。或いは又は加えて、抗体は、少なくとも１つが、参照抗体の対応物のＶＬＣＤＲと同程度に、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３を含み得る。特定の例において、抗体は、参照抗体のＶＬＣＤＲ３と同程度に、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＶＬＣＤＲ３を含む。

場合によっては、アミノ酸残基の変異は、保存的なアミノ酸残基置換であり得る。本明細書で使用する場合、「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対的な電荷又はサイズの特徴を変えないアミノ酸置換を指す。バリアントは、そのような方法をまとめた参考文献、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９，又はＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋに見出されるような、当業者に知られるポリペプチド配列を改変するための方法に従って作製され得る。アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸の中でなされる置換を含む：（ａ）Ａ→Ｇ、Ｓ；（ｂ）Ｒ→Ｋ、Ｈ；（ｃ）Ｎ→Ｑ、Ｈ；（ｄ）Ｄ→Ｅ、Ｎ；（ｅ）Ｃ→Ｓ、Ａ；（ｆ）Ｑ→Ｎ；（ｇ）Ｅ→Ｄ、Ｑ；（ｈ）Ｇ→Ａ；（ｉ）Ｈ→Ｎ、Ｑ；（ｊ）Ｉ→Ｌ、Ｖ；（ｋ）Ｌ→Ｉ、Ｖ；（ｌ）Ｋ→Ｒ、Ｈ；（ｍ）Ｍ→Ｌ、Ｉ、Ｙ；（ｎ）Ｆ→Ｙ、Ｍ、Ｌ；（ｏ）Ｐ→Ａ；（ｐ）Ｓ→Ｔ；（ｑ）Ｔ→Ｓ；（ｒ）Ｗ→Ｙ、Ｆ；（ｓ）Ｙ→Ｗ、Ｆ；及び（ｔ）Ｖ→Ｉ、Ｌ。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示される抗体は、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号５１；ＶＬ：配列番号５２）又は抗体Ｂ（ＶＨ：配列番号６０；ＶＬ：配列番号６１）などの参照抗体のＶＨＣＤＲと合わせて少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）同一のＶＨＣＤＲを含み得る。或いは又は加えて、抗体は、参照抗体のＶＬＣＤＲと合わせて少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）同一のＶＬＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号５１；ＶＬ：配列番号５２）若しくは抗体Ｂ（ＶＨ：配列番号６０；ＶＬ：配列番号６１）などの参照抗体のＶＨと少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）同一のＶＨ及び／又は参照抗体のＶＬと少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）同一のＶＬを含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号５１及び５２に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ）は、配列番号５１に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号５２に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ）は、配列番号５１に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号５２に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ）は、配列番号５１に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号５２に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ）は、配列番号５１に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号５２に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、ＡｂＭに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号６８、７０及び７２に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号６２、６４及び６６に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号６９、７１及び７３に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号６３、６５及び６７に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号４９に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号４７に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである。

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号６０及び６１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ）は、配列番号６０に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号６１に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ）は、配列番号６０に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号６１に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ）は、配列番号６０に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号６１に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ）は、配列番号６０に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号６１に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、ＡｂＭに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号８０、８２及び８４に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号７４、７６及び７８に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号８１、８３及び８５に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号７５、７７及び７９に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号５９に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号５８に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる抗ＢＣＭＡｓｃＦｖである。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１５２及び１５３に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）は、配列番号１５２に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号１５３に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）は、配列番号１５２に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号１５３に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）は、配列番号１５２に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号１５３に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）は、配列番号１５２に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号１５３に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、ＡｂＭに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１６９、１７０及び１７１に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びにそれぞれ配列番号１６６、１６７及び１６８に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１７５、１７６及び１７７に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びにそれぞれ配列番号１７２、１７３及び１７４に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１５１に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１５０に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１４０及び１４１に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ）は、配列番号１４０に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号１４１に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ）は、配列番号１４０に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号１４１に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ）は、配列番号１４０に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号１４１に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ）は、配列番号１４０に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号１４１に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、ＡｂＭに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１４２、１４３及び１４４に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号１４５、１４６及び１４７に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１７８、１７９及び１８０に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号１４５、１４６及び１４７に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１３７に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１３８に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ３３ｓｃＦｖである。

抗原標的化キメラ抗原受容体コンストラクト
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、腫瘍抗原標的化ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、通常、全く発現されない場合があるか、又は低レベルでのみ発現される場合がある非腫瘍細胞より腫瘍細胞においてより高レベルで発現されるタンパク質などの免疫原性分子を参照させる「腫瘍関連抗原」である。いくつかの実施形態では、腫瘍を内部に持つ宿主の免疫系によって認識される腫瘍関連構造は、腫瘍関連抗原と呼ばれる。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、大部分の腫瘍によって広範に発現される場合、普遍的な腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、分化抗原、変異性抗原、過剰発現された細胞抗原又はウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞に固有のタンパク質などの免疫原性分子を指す「腫瘍特異抗原」又は「ＴＳＡ」である。腫瘍特異抗原は、腫瘍細胞において排他的に発現される。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ７０ではない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、非ＣＤ７０標的化ＣＡＲ（例えば、ＣＤ７０に結合しないＣＡＲ）を含む。

ＣＤ１９ＣＡＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、ＣＤ１９ＣＡＲ、抗ＣＤ１９ＣＡＲ又は抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞とも本明細書で呼ばれるＣＤ１９標的化ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号１２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号２０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ２８共刺激ドメイン及び配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）配列番号１５１に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号１２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号２０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ２８共刺激ドメイン及び配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）それぞれ配列番号１５２及び１５３に記載されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び軽鎖領域を含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号１２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号２０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ２８共刺激ドメイン及び配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、配列番号１４９に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、配列番号１４８に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの態様では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、配列番号１４８に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。

ＣＤ３３ＣＡＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、ＣＤ３３ＣＡＲ、抗ＣＤ３３ＣＡＲ又は抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞とも本明細書で呼ばれるＣＤ３３標的化ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号１２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ＣＡＲは、（ｉ）配列番号１３７に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号１２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ＣＡＲは、（ｉ）それぞれ配列番号１４０及び１４１に記載されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び軽鎖領域を含む抗ＣＤ３３ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号１２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ＣＡＲは、配列番号１３９に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ＣＡＲは、配列番号１３６に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの態様では、抗ＣＤ３３ＣＡＲは、配列番号１３６に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。

ＢＣＭＡＣＡＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、ＢＣＭＡＣＡＲ、抗ＢＣＭＡＣＡＲ又は抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞とも本明細書で呼ばれるＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡＣＡＲは、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡＣＡＲは、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡＣＡＲは、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡＣＡＲは、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡＣＡＲは、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号１２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡＣＡＲは、（ｉ）配列番号５９に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号１２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡＣＡＲは、（ｉ）それぞれ配列番号６０及び６１に記載されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び軽鎖領域を含む抗ＢＣＭＡｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号１２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡＣＡＲは、配列番号５７に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡＣＡＲは、配列番号５６に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの態様では、抗ＢＣＭＡＣＡＲは、配列番号５６に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。

ＣＤ７０ＣＡＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、ＣＤ７０ＣＡＲ、抗ＣＤ７０ＣＡＲ又は抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞とも本明細書で呼ばれるＣＤ７０標的化ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ７０抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ７０抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ７０抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ７０抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ７０抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号１２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ＣＡＲは、（ｉ）配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号１２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ＣＡＲは、（ｉ）それぞれ配列番号５１及び５２に記載されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び軽鎖領域を含む抗ＣＤ７０ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号１２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ＣＡＲは、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ＣＡＲは、配列番号４５に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの態様では、抗ＣＤ７０ＣＡＲは、配列番号４５に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。

キメラ抗原受容体コンストラクトの発現
ドナー鋳型
ＣＡＲをコードする核酸は、ドナー鋳型と本明細書で呼ばれる（ドナーポリヌクレオチドとも呼ばれる）ものを含むＴ細胞に送達され得る。ドナー鋳型は、目的のゲノム位置で効率的なＨＤＲを可能にする２つの相同な領域に隣接したＣＡＲをコードする核酸などの非相同配列を含有し得る。或いは、ドナー鋳型は、ＤＮＡ中の標的化された位置と相同な領域を有しない場合があり、標的部位での切断後のＮＨＥＪ依存的末端連結によって組み込まれ得る。

ドナー鋳型は、一本鎖及び／又は二重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、直鎖状又は環状形態で細胞に導入され得る。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に知られる方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が、直鎖状分子の３’末端に付加され、且つ／又は自己相補的オリゴヌクレオチドが、一方又は両方の末端に連結される。例えば、Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４９５９−４９６３；Ｎｅｈｌｓｅｔａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：８８６−８８９を参照されたい。外来性のポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、末端アミノ基の付加、並びに、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、及びＯ−メチルリボース又はデオキシリボース残基などの修飾されたヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。

ドナー鋳型は、例えば、複製開始点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナー鋳型は、裸の核酸として、リポソーム又はポロクサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として導入され得るか、又はウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。

ドナー鋳型は、いくつかの実施形態において、その発現が、組込み部位の内在性プロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内在性遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように挿入される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、外来性プロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、内在性プロモーターは、配列番号１２３の配列を含むＥＦ１αプロモーターである。他のプロモーターが使用されてもよい。

さらに、外来性配列はまた、転写又は翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／又はポリアデニル化シグナルを含み得る。

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号５５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号５５のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号１３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号１３５のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号１５６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号１５６のヌクレオチド配列を含む。

他の方法
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、当業者に知られる方法によって操作された細胞に導入される。例えば、ＣＡＲは、ベクターによって操作された細胞に導入され得る。当該技術分野において知られる様々な異なる方法を使用して、本明細書で開示される核酸又は発現ベクターのいずれかを免疫エフェクター細胞に導入することができる。核酸を細胞に導入するための方法の非限定的な例としては、リポフェクション、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、高度に分岐した有機化合物を使用するトランスフェクション、カチオン性ポリマーを使用するトランスフェクション、デンドリマー系トランスフェクション、光学的トランスフェクション、粒子系トランスフェクション（例えば、ナノ粒子トランスフェクション）、又はリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）を使用するトランスフェクション）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、セルスクイージング、ソノポレーション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、水力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルストランスフェクション、及びヌクレオフェクションが挙げられる。

送達方法及びコンストラクト
ヌクレアーゼ及び／又はドナー鋳型は、プラスミドベクター、ＤＮＡ小環、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクター、及びその組合せを含むが、これらに限定されないベクター系を使用して送達され得る。

従来のウイルス及び非ウイルス系遺伝子導入方法を使用して、細胞（例えば、Ｔ細胞）においてヌクレアーゼをコードする核酸及びドナー鋳型を導入することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡ小環、裸の核酸、及びリポソーム又はポロクサマーなどの送達媒体と複合体を形成した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞に送達された後にエピソーム又は組込みゲノムのいずれかを有するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが挙げられる。

核酸の非ウイルス送達の方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、キャップ付きＲＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤で増強されたＤＮＡの取込みが挙げられる。例えば、ソニトロン２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションもまた、核酸の送達のために使用され得る。いくつかの具体例が、下に提供される。

アデノ随伴ウイルス送達
ＣＡＲコンストラクトをコードするドナー核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達され得る。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組込み、したがって、ＣＡＲなどの導入遺伝子を送達できる小型のウイルスである。逆位末端配列（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、ＡＡＶゲノムには、転写されたときにＡＡＶゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体は、ＡＡＶの血清型を付与し、カプシドが主にどの標的臓器に結合するかを決定し、したがって、ＡＡＶが最も効率的に感染することになる細胞を決定する。現在知られているヒトＡＡＶの血清型は１２種類である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。

アデノ随伴ウイルスは、いくつかの理由のために遺伝子療法に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。第一に、ＡＡＶは、ヒトを含む哺乳動物への投与時に免疫応答を誘発しない。第二に、ＡＡＶは、特に適切なＡＡＶ血清型を選択することを考慮するとき、標的細胞に効率的に送達される。最後に、ＡＡＶは、ゲノムが組込みを伴わずに宿主細胞において存続できるため、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。この形質により、それらが遺伝子療法の理想的な候補となる。

相同組換え修復（ＨＤＲ）
ＣＡＲをコードするドナー核酸は、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって標的遺伝子座位に挿入される。標的部位でのＤＮＡの両方の鎖が、ＣＲＩＳＰＲＣａｓ９酵素によって切断される。次に、ＨＤＲが発生して、二重鎖切断（ＤＳＢ）を修復し、ドナーＤＮＡを挿入する。これが正しく発生するために、ドナー配列は、標的遺伝子のＤＳＢ部位を取り囲む配列に相補的な隣接している残基（以下、「相同性アーム」）を有するように設計される。これらの相同性アームは、ＤＳＢ修復のための鋳型として機能し、本質的に誤りのない機構であるＨＤＲを可能にする。相同組換え修復（ＨＤＲ）の割合は、変異部位と切断部位の間の距離の関数であり、そのため、重複している配列又は近くの標的を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接した余分な配列を含んでもよいし、ゲノム配列と異なる配列を含有してもよく、したがって、配列編集が可能になる。

標的遺伝子は、対象において免疫応答と関連する場合があり、ここで、標的遺伝子の少なくとも一部を持続的に欠失させることが、免疫応答を調節することになる。例えば、ＣＡＲＴ細胞を生成するために、標的遺伝子は、ＴＣＲα定常領域（ＴＲＡＣ）であり得る。ＴＲＡＣの破壊は、内在性ＴＣＲの機能の喪失をもたらす。

いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、セーフハーバー座位にある。

操作されたＴ細胞
本開示の操作された（遺伝子編集された）ＣＡＲＴ細胞は、自己由来（「自己」）の又は非自己由来（「非自己」、例えば、異質遺伝子型、同一遺伝子又は異種間）であり得る。「自己由来」は、同じ対象からの細胞を指す。「異質遺伝子型」は、対象と同じ種であるが、対象中の細胞と遺伝的に異なる細胞を指す。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳動物から得られる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒトから得られる。

Ｔ細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺排出、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含むが、これらに限定されないいくつかの供給源から得ることができる。ある種の実施形態では、Ｔ細胞は、遠心沈降、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に知られる任意の数の技術を使用して対象から回収される血液の単位から得ることができる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の単離された集団が使用される。いくつかの実施形態では、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離の後、細胞傷害性及びヘルパーＴリンパ球の両方が、活性化、増殖、及び／又は遺伝的改変の前又は後のいずれかでナイーブ、メモリー、及びエフェクターＴ細胞亜集団に分別され得る。

以下の細胞表面マーカー：ＴＣＲａｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７ＣＤ２８、ＣＤ３８ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１２２、ＣＤ９５、ＣＤ１９７、ＣＣＲ７、ＫＬＲＧ１、ＭＣＨ−Ｉタンパク質及び／又はＭＣＨ−ＩＩタンパク質の１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団がさらに、陽性又は陰性選択手法によって単離され得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ、ＣＤ４及び／又はＣＤ８からなる群から選択されるマーカーの１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団はさらに、陽性又は陰性選択手法によって単離され得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞集団は、以下のマーカー：ＣＤ７０、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＨΜ３、及びＬＡＧ３の１つ以上を発現しないか又は実質的に発現しない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の亜集団は、遺伝子操作の前及び／又は遺伝子操作の後に陽性又は陰性選択によって単離され得る。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の単離された集団は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はその組合せを含むが、これらに限定されないマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ドナー、又は対象から単離され、遺伝子編集を受ける前に、最初に活性化され、インビトロで増殖するように刺激される。

Ｔ細胞組成物の十分な治療用量を実現するために、Ｔ細胞は、１回以上の刺激、活性化及び／又は増殖にかけられる場合が多い。Ｔ細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；及び同第６，８６７，０４１号明細書において記載されるとおりの方法を使用して、活性化及び増殖され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集組成物のＴ細胞への導入の前に約１日〜約４日、約１日〜約３日、約１日〜約２日、約２日〜約３日、約２日〜約４日、約３日〜約４日、又は約１日、約２日、約３日、若しくは約４日間活性化及び増殖される。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集組成物のＴ細胞への導入の前に約４時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、又は約７２時間活性化及び増殖される。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、遺伝子編集組成物がＴ細胞に導入されるのと同時に活性化される。本明細書に記載される遺伝子編集方法のいずれかによって生成されるＴ細胞集団又は単離されたＴ細胞もまた、本開示の範囲内である。

いくつかの実施形態では、本明細書では、破壊されたＣＤ７０遺伝子及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、本明細書に記載されるものをコードする核酸を含む、遺伝的に操作されたＴ細胞を含むＴ細胞の集団が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、病的な細胞上で発現される抗原に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７０に結合する。他かの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７０に結合しない。このようなＴ細胞集団はさらに、以下の遺伝子編集：破壊された内在性プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）遺伝子、破壊された内在性Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子、及び破壊された内在性ベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子の１つ以上を有する遺伝的に操作されたＴ細胞を含み得る。いくつかの例において、ＣＡＲをコードする核酸は、ＴＲＡＣ座位に挿入され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴ細胞の集団は、破壊されたＣＤ７０遺伝子及び病的な細胞上で発現される抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む、遺伝的に操作されたＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴ細胞の集団は、破壊されたＣＤ７０遺伝子及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む、遺伝的に操作されたＴ細胞を含み、ここで、ＣＡＲは、ＣＤ７０に結合する。他の実施形態では、本明細書で開示されるＴ細胞の集団は、破壊されたＣＤ７０遺伝子及びＣＡＲをコードする核酸を含む遺伝的に操作されたＴ細胞を含み、ここで、ＣＡＲは、ＣＤ７０遺伝子に結合しない。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴ細胞の集団は、破壊されたＣＤ７０遺伝子及び病的な細胞上で発現される抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含み、且つ破壊されたＰＤ１遺伝子をさらに含む、遺伝的に操作されたＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７０に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７０に結合しない。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３３に結合する。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡに結合する。すぐ上に記載された操作されたＴ細胞のいずれかはさらに、破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子及び／又は破壊されたベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を含み得る。

特定の例において、本明細書では、破壊されたＣＤ７０遺伝子、破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子、破壊されたベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡＣＡＲ、抗ＣＤ１９ＣＡＲ、抗ＣＤ３３ＣＡＲ、又は抗ＣＤ７０ＣＡＲをコードする核酸、及び任意選択により破壊されたプログラム細胞死−１（ＰＤ−１）遺伝子を含む、遺伝的に操作されたＴ細胞を含むＴ細胞の集団が提供される。本明細書で開示される操作されたＴ細胞のいずれかは、天然の（破壊されていない）ＨＬＡ遺伝子を含有し得る。

いくつかの例において、Ｔ細胞の集団の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％）は、本明細書で開示されるとおりのＣＡＲを発現し、且つ検出可能なレベルの表面ＣＤ７０を発現しない。このような細胞はさらに、検出可能なレベルの表面ＴＣＲ、検出可能なレベルの表面β２Ｍ、及び／又は検出可能なレベルの表面ＰＤ−１を発現しない特徴を持ち得る。例えば、Ｔ細胞の集団の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％）は、本明細書で開示されるとおりのＣＡＲを発現し、且つ検出可能なレベルの表面ＣＤ７０、検出可能なレベルの表面ＴＣＲ、及び検出可能なレベルの表面β２Ｍを発現しない。いくつかの場合において、Ｔ細胞の集団の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％）は、本明細書で開示されるとおりのＣＡＲを発現し、且つ検出可能なレベルの表面ＣＤ７０、検出可能なレベルの表面ＴＣＲ、検出可能なレベルの表面β２Ｍ、及び検出可能なレベルのＰＤ−１を発現しない。

本明細書に記載されるとおりのＣＡＲを発現し、且つ検出可能なレベルの表面ＣＤ７０を発現しない単離された細胞もまた、本開示の範囲内である。このような単離された細胞は、検出可能なレベルの表面ＴＣＲ、検出可能なレベルのβ２Ｍ、及び／又は検出可能なレベルの表面ＰＤ−１を発現しない場合がある。いくつかの例において、単離された細胞は、ＴＲＡＣ座位に挿入されるＣＡＲをコードする核酸を含む。

また、本明細書では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、例えば、本明細書に記載されるもの（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）、及びＣＤ７０遺伝子を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む操作されたＴ細胞を含む操作されたＴ細胞の集団が提供される。いくつかの場合において、Ｔ細胞集団におけるＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％）は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡを含む。このような操作されたＴ細胞集団はさらに、ＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、及び／又は任意選択によりＴＲＡＣ遺伝子座位に対して左及び右の相同性アームと隣接するＣＡＲ（例えば、本明細書に記載されるもの）をコードするヌクレオチド配列を含むドナー鋳型を含む核酸（例えば、ベクター）を含む操作されたＴ細胞を含み得る。いくつかの例において、Ｔ細胞集団におけるＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％）は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、及びＣＡＲをコードする核酸を含む。ＣＡＲをコードする核酸がさらに、ＴＲＡＣ遺伝子座位に対して左及び右の相同性アームを含むとき、Ｔ細胞はまた、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを含み得る。加えて、Ｔ細胞はさらに、ＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、又はその組合せを含み得る。

また、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、並びに任意選択によりＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、及びＣＡＲ（例えば、本明細書に記載されるもの）をコードするヌクレオチド配列を含むドナー鋳型を含む核酸（例えば、ベクター）のうちの１つ以上を含む単離された操作されたＴ細胞も、本開示の範囲内である。ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、ＴＲＡＣ遺伝子座位に対する左及び右の相同性アームと隣接し得る。

ＣＡＲ−Ｔ細胞の生成
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、細胞のゲノムを改変することによって生成される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子中の部位での二重鎖切断（ＤＳＢ）が誘導される。いくつかの実施形態では、ＤＳＢは、１つ以上の内在性のＤＮＡ修復経路を使用して修復される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復経路は、相同配列を必要としない（例えば、非相同末端連結経路又はＮＨＥＪ経路）。いくつかの実施形態では、修復経路は、相同配列を必要とする（例えば、相同組換え経路又はＨＤＲ経路）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、エンドヌクレアーゼ、及び１つ以上の非コードＲＮＡとしてのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によりＤＳＢを誘導すること、並びにＨＤＲ及び本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチド鋳型を使用してＤＳＢを修復することによって生成される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、ＴＲＡＣである標的遺伝子の配列に相補的なｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号９８に記載される配列を含むＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号３０に記載される配列を含むＴＲＡＣｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号９８に記載される配列を含むＴＲＡＣｇＲＮＡは、配列番号１１８に記載されるＴＲＡＣ配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号３０に記載される配列を含むＴＲＡＣｇＲＮＡは、配列番号１１８に記載されるＴＲＡＣ配列を標的化する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号１０８に記載される配列を含むＴＲＡＣｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号４０に記載される配列を含むＴＲＡＣｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号１０８に記載される配列を含むＴＲＡＣｇＲＮＡは、配列番号１１８に記載されるＴＲＡＣ配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号４０に記載される配列を含むＴＲＡＣｇＲＮＡは、配列番号１１８に記載されるＴＲＡＣ配列を標的化する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、β２Ｍである標的遺伝子の配列に相補的なｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号９９に記載される配列を含むβ２ＭｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号３１に記載される配列を含むβ２ＭｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号９９に記載される配列を含むβ２ＭｇＲＮＡは、配列番号１１９に記載されるβ２Ｍ配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号３１に記載される配列を含むβ２ＭｇＲＮＡは、配列番号１１９に記載されるβ２Ｍ配列を標的化する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号１０９に記載される配列を含むβ２ＭｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号４１に記載される配列を含むβ２ＭｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号１０９に記載される配列を含むβ２ＭｇＲＮＡは、配列番号１１９に記載されるβ２Ｍ配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号４１に記載される配列を含むβ２ＭｇＲＮＡは、配列番号１１９に記載されるβ２Ｍ配列を標的化する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、ＣＤ７０である標的遺伝子の配列に相補的なｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号９４に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号２６に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号９４に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡは、配列番号１１４に記載されるＣＤ７０配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号２６に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡは、配列番号１１４に記載されるＣＤ７０配列を標的化する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号１０４に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号３６に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号１０４に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡは、配列番号１１４に記載されるＣＤ７０配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号３６に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡは、配列番号１１４に記載されるＣＤ７０配列を標的化する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、ＣＤ７０である標的遺伝子の配列に相補的なｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号９５に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号２７に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号９５に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡは、配列番号１１５に記載されるＣＤ７０配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号２７に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡは、配列番号１１５に記載されるＣＤ７０配列を標的化する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号１０５に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号３７に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号１０５に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡは、配列番号１１５に記載されるＣＤ７０配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号３７に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡは、配列番号１１５に記載されるＣＤ７０配列を標的化する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、ＰＤ−１である標的遺伝子の配列に相補的なｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号１００に記載される配列を含むＰＤ−１ｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号３２に記載される配列を含むＰＤ−１ｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号１００に記載される配列を含むＰＤ−１ｇＲＮＡは、配列番号１２０に記載されるβ２Ｍ配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号３２に記載される配列を含むＰＤ−１ｇＲＮＡは、配列番号１２０に記載されるＰＤ−１配列を標的化する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号１１０に記載される配列を含むＰＤ−１ｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号４２に記載される配列を含むＰＤ−１ｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号１１０に記載される配列を含むＰＤ−１ｇＲＮＡは、配列番号１２０に記載されるＰＤ−１配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号４２に記載される配列を含むＰＤ−１ｇＲＮＡは、配列番号１２０に記載されるＰＤ−１配列を標的化する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号９８に記載される配列を含むＴＲＡＣｇＲＮＡ、配列番号９９に記載される配列を含むβ２ＭｇＲＮＡ、配列番号９４若しくは９５に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡ、並びに／又は配列番号１００に記載される配列を含むＰＤ−１ｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号１０８に記載される配列を含むＴＲＡＣｇＲＮＡ、配列番号１０９に記載される配列を含むβ２ＭｇＲＮＡ、配列番号１０４若しくは１０５に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡ、並びに／又は配列番号１１０に記載される配列を含むＰＤ−１ｇＲＮＡを使用して生成される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号３０に記載される配列を含むＴＲＡＣｇＲＮＡ、配列番号３１に記載される配列を含むβ２ＭｇＲＮＡ、配列番号２６若しくは２７に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡ、並びに／又は配列番号３２に記載される配列を含むＰＤ−１ｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作されたＴ細胞は、配列番号４０に記載される配列を含むＴＲＡＣｇＲＮＡ、配列番号４１に記載される配列を含むβ２ＭｇＲＮＡ、配列番号３６若しくは２７に記載される配列を含むＣＤ７０ｇＲＮＡ、並びに／又は配列番号４２に記載される配列を含むＰＤ−１ｇＲＮＡを使用して生成される。

いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸である非相同配列を含むドナー鋳型を使用して生成される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ＴＲＡＣである標的遺伝子における配列に対応する相同性アームで構成される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型の５’相同性アーム（左相同性アーム）は、配列番号１２２に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型の３’相同性アームは、配列番号１２５に記載される配列を含む。

いくつかの実施形態では、外来性プロモーターは、配列番号１２３に記載される配列を含むＥＦ１ａプロモーターである。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号１３５に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号１５６に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号４４に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号５５に記載される配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ、及びドナー鋳型をコードするポリヌクレオチドは、従来のウイルス及び非ウイルスに基づく遺伝子導入方法を使用して細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入される。

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、又はドナー鋳型などのポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター送達系を使用して細胞に送達される。非ウイルスベクター送達系の例としては、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡ小環、裸の核酸、リポソーム、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）又はポロクサマーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、非ウイルスベクター送達系を使用してポリヌクレオチドを細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、又は薬剤で増強された取込みが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、又はドナー鋳型などのポリヌクレオチドは、ウイルスベクター送達系を使用して細胞に送達される。ウイルスベクター送達系の例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲコンストラクトをコードするドナー鋳型は、１つ以上のポリヌクレオチドとして細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲコンストラクトをコードするドナー鋳型は、ウイルス送達媒体によって送達される。いくつかの実施形態では、ウイルス送達媒体は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ポリペプチドとして細胞に送達される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）と別々に細胞に送達される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、１つ以上のゲノム標的化ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）との複合体として細胞に送達される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ又は予め複合体を形成したエンドヌクレアーゼは、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正に荷電したペプチド、小分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー−ＲＮＡキメラ、又はＲＮＡー融合タンパク質複合体を含むが、これらに限定されない非ウイルス送達媒体によって送達される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼポリペプチド又は予め複合体を形成したエンドヌクレアーゼポリペプチドを細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、又は薬剤に増強された取込みが挙げられる。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、１つ以上のｓｇＲＮＡと予め複合体を形成して、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡＲＮＰは、脂質ナノ粒子を使用して製剤化される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ＡＡＶベクターを使用して製剤化される。いくつかの実施形態では、製剤化されたＣａｓ９／ｓｇＲＮＡＲＮＰの細胞への送達は、細胞のエレクトロポレーションによって実施される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターとして製剤化されるドナー鋳型は、エレクトロポレーションの前に送達される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターとして製剤化されたドナー鋳型は、エレクトロポレーション中に送達される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターとして製剤化されたドナー鋳型は、エレクトロポレーション後に送達される。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して実施される遺伝子編集は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を有する操作されたＴ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊は、ＴＲＡＣ遺伝子産物の発現の消失又は減少をもたらす。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊は、コードされる遺伝子産物の転写及び翻訳を破壊するか又は阻害する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊は、ＴＲＡＣ遺伝子産物の発現の消失又は減少をもたらす。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子の発現の消失又は減少は、ＴＣＲの機能の喪失を伴う。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ機能の喪失は、同種移植に好適な（すなわち、ＧｖＨＤを引き起こすリスクを最小化する）操作されたＴ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊は、（例えば、ＡＡＶベクター及びドナー鋳型を使用して）ＣＡＲにおいてＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることによって生成される。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化し、且つＣＡＲにおいてＣＡＲ遺伝子にノックインするｇＲＮＡによって生成される。いくつかの実施形態では、ノックインＣＡＲは、ＤＳＢの部位を取り囲むＴＲＡＣの配列に対応する相同性アームを有するドナー鋳型によって提供される。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して実施される遺伝子編集は、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を有する操作されたＴ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、コードされる遺伝子産物の転写及び翻訳を破壊するか又は阻害するβ２Ｍ遺伝子におけるインデルを生成する。いくつかの実施形態では、β２Ｍ遺伝子の破壊は、β２Ｍポリペプチドの発現の消失又は減少をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍポリペプチドの発現の消失又は減少は、ＭＨＣＩ複合体の機能の喪失を伴う。いくつかの実施形態では、ＭＨＣＩ機能の喪失は、同種移植に好適な（すなわち、宿主対異質遺伝子型Ｔ細胞応答のリスクを最小化する）操作されたＴ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、ＭＨＣＩ機能の喪失は、異質遺伝子型レシピエントにおいて操作されたＴ細胞の持続の増大をもたらす。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して実施される遺伝子編集は、破壊されたＣＤ７０遺伝子を有する操作されたＴ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、コードされる遺伝子産物の転写及び翻訳を破壊するか又は阻害するＣＤ７０遺伝子におけるインデルを生成する。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０遺伝子の破壊は、ＣＤ７０ポリペプチドの発現の消失又は減少をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０ポリペプチドの発現の消失又は減少は、細胞増殖の増強、インビボでの持続の増強、枯渇の減少、及び／又は抗腫瘍効果の増強を伴う。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して実施される遺伝子編集は、破壊されたＰＤ−１遺伝子を有する操作されたＴ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、コードされる遺伝子産物の転写及び翻訳を破壊するか又は阻害するＰＤ−１遺伝子におけるインデルを生成する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１遺伝子の破壊は、ＰＤ−１ポリペプチドの発現の消失又は減少をもたらす。

方法及び組成物
本明細書では、いくつかの実施形態において、癌を治療するための方法が提供される。本明細書に提供されるとおりに治療され得る癌の非限定的な例としては、多発性骨髄腫、白血病（例えば、Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、及び／又は慢性リンパ性白血病（Ｃ−ＣＬＬ））、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、及び／又はＴ細胞リンパ腫）、及び／又は明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、方法は、本開示のＣＡＲＴ細胞（例えば、抗ＢＣＭＡ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３３及び／又は抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞）を、多発性骨髄腫、白血病、又はリンパ腫を有する対象に送達することを含む。本明細書に提供されるとおりに治療され得る癌（例えば、固形腫瘍）の他の非限定的な例としては、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、腎臓癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽腫、及び／又は黒色腫が挙げられる。

ＣＤ７０はまた、血液腫瘍及び癌腫上で検出されてきた。正常組織におけるＣＤ７０の限定的な発現パターン及び様々な悪性腫瘍におけるその広範な発現は、それを抗体に基づく療法のための魅力的な標的にする。しかしながら、ＣＤ７０^＋癌を標的化するＣＡＲＴ細胞療法の使用は、Ｔ細胞におけるＣＤ７０発現のために潜在的に問題になる。潜在的な問題に対処するために、本開示はまた、内在性のＣＤ７０発現を破壊するが、同時に抗ＣＤ７０結合部分（例えば、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖ）を発現するように操作されたＣＡＲＴ細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、癌は、ＣＤ７０^＋癌である。他の実施形態では、癌は、ＢＣＭＡ^＋癌である。いくつかの実施形態では、癌は、ＣＤ１９＋癌である。いくつかの実施形態では、癌は、ＣＤ３３＋癌である。他の癌抗原を発現する他の癌は、本開示の操作されたＣＤ７０ノックアウトＣＡＲＴ細胞を使用して治療され得ることが理解されるはずである。

方法は、いくつかの実施形態において、対象（例えば、ＣＤ７０^＋癌、ＢＣＭＡ^＋癌、ＣＤ１９＋癌又はＣＤ３３＋癌を有する患者）に本明細書に提供されるとおりのＣＡＲＴ細胞の集団を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象にＣＤ７０遺伝子ノックアウトを含むＣＡＲＴ細胞の集団を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象にＣＤ７０遺伝子ノックアウト及びＰＤ１遺伝子ノックアウトを含むＣＡＲＴ細胞の集団を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を対象に移植することを含む。この移植工程は、当該技術分野において知られるいずれかの移植の方法を使用して達成され得る。例えば、操作された細胞は、対象の血液に直接的に注射されてもよいし、別の方法で対象に投与されてもよい。

本明細書で実証されるとおり、ＣＤ７０遺伝子ノックアウトを含むＣＡＲＴ細胞は、増殖の延長及びインビボでの持続の増大を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０遺伝子ノックアウトを含むＣＡＲＴ細胞は、内在性のＣＤ７０を発現するＣＡＲＴ細胞と比較して、抗腫瘍効果の増大を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０遺伝子ノックアウトを含むＣＡＲＴ細胞は、内在性のＣＤ７０を発現するＣＡＲＴ細胞と比較して、固形腫瘍における抗腫瘍効果の増大を示す。理論に束縛されるものではないが、ＣＤ７０遺伝子ノックアウトを含むＣＡＲＴ細胞のインビボでの持続の増大は、固形腫瘍における増殖を可能にし、したがって、内在性のＣＤ７０を発現するＣＡＲＴ細胞と比較して、そのような腫瘍における抗腫瘍効果の増強をもたらし得る。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲＴ細胞を有する固形腫瘍を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞を有する固形腫瘍を治療するための方法を提供する。

投与する工程は、所望の効果がもたらされるように、腫瘍などの所望の部位での導入細胞の少なくとも部分的な局在をもたらす方法又は経路による、対象への細胞、例えば、操作されたＴ細胞の配置（例えば、移植）を含み得る。操作されたＴ細胞は、移植された細胞又は細胞の構成要素の少なくとも一部が生存したままである対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間、例えば、２４時間という短い期間、数日、数年もの間、或いは対象の寿命、すなわち、長期の生着であり得る。例えば、本明細書に記載されるいくつかの態様において、有効量の操作されたＴ細胞は、腹腔内又は静脈内経路などの全身性の投与経路を介して投与される。

対象は、診断、治療、又は療法が望まれる任意の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

ドナーは、治療されている対象ではない個体である。ドナーは、患者ではない個体である。いくつかの実施形態では、ドナーは、治療されている癌を有しないか又は有すると疑われていない個体である。いくつかの実施形態では、複数のドナー、例えば、２以上のドナーが使用される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って投与されている操作されたＴ細胞集団は、１つ以上のドナーから得られた異質遺伝子型のＴ細胞を含む。異質遺伝子型は、１つ以上の座位での遺伝子がレシピエント（例えば、対象）と同一ではない細胞、細胞集団、又は同じ種の１つ以上の異なるドナーから得られた細胞を含む生体試料を指す。例えば、対象に投与されている操作されたＴ細胞集団は、１以上の血縁ではないドナー、又は１以上の同一ではない同胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、遺伝的に同一のドナー（例えば、同一の双子）から得られたものなど、同一遺伝子の細胞集団が使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、自己細胞である；すなわち、操作されたＴ細胞は、対象から得られるか又は単離され、同じ対象に投与される、すなわち、ドナー及びレシピエントが同じである。

有効量は、医学的状態（例えば、癌）の少なくとも１つ以上の徴候又は症状を予防するか又は軽減するのに必要な操作されたＴ細胞の集団の量を指し、所望の効果をもたらす、例えば、医学的状態を有する対象を治療する組成物の十分な量に関する。有効量はまた、疾患の症状の発症を予防するか若しくは遅らせるか、疾患の症状の経過を変えるか（例えば、疾患の症状の進行を遅くすることに限定されない）、又は疾患の症状を逆転させるのに十分な量を含む。任意の所与の場合に関して、適切な有効量は、当業者によって通常の実験を用いて決定され得ることが理解される。

本明細書に記載される様々な態様における使用に関して、有効量の細胞（例えば、操作されたＴ細胞）は、少なくとも１０^２細胞、少なくとも５×１０^２細胞、少なくとも１０^３細胞、少なくとも５×１０^３細胞、少なくとも１０^４細胞、少なくとも５×１０^４細胞、少なくとも１０^５細胞、少なくとも２×１０^５細胞、少なくとも３×１０^５細胞、少なくとも４×１０^５細胞、少なくとも５×１０^５細胞、少なくとも６×１０^５細胞、少なくとも７×１０^５細胞、少なくとも８×１０^５細胞、少なくとも９×１０^５細胞、少なくとも１×１０^６細胞、少なくとも２×１０^６細胞、少なくとも３×１０^６細胞、少なくとも４×１０^６細胞、少なくとも５×１０^６細胞、少なくとも６×１０^６細胞、少なくとも７×１０^６細胞、少なくとも８×１０^６細胞、少なくとも９×１０^６細胞、又はその複合を含む。細胞は、１つ以上のドナーに由来するか、又は自己の供給源から得られる。本明細書に記載されるいくつかの例において、細胞は、必要とする対象への投与の前に培養において増殖される。

投与の様式は、注射、注入、点眼、又は経口摂取を含む。注射としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内注射及び注入が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。

いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、全身的に投与され、これは、標的部位、組織、又は臓器に直接的ではなく、対象の循環系に入り、それにより代謝及び他の同様の過程にかけられるような細胞の集団の投与を指す。

医学的状態の治療のための組成物を含む治療の有効性は、熟達した臨床医によって判定され得る。治療は、一例ではあるが、任意の１つ又は全ての徴候又は症状の機能的標的のレベルが有利な様式で変えられる（例えば、少なくとも１０％増加する）、又は疾患（例えば、癌）の他の臨床的に認められている症状又はマーカーが改善又は緩和される場合、「有効な治療」とみなされる。有効性はまた、入院又は医学的介入の必要性によって評価されるとおり、対象が悪化しないことによって測定され得る（例えば、疾患の進行が止まるか、又は少なくとも遅くなる）。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られており、且つ／又は本明細書に記載される。治療は、対象における疾患の任意の治療を含み、且つ（１）疾患を阻害すること、例えば、症状の進行を止めるか、又は遅くすること；又は（２）疾患を軽減すること、例えば、症状の退行をもたらすこと；及び（３）症状の発症の可能性を予防するか又は減少させることを含む。

併用療法もまた、本開示により包含される。例えば、ＣＤ７０及び／又はＣＤ２７抗体を使用して、ＣＡＲＴ細胞上のＣＤ７０及び／又はＣＤ２７に結合し、且つ／又はその活性を調節でき、且つ枯渇の減少、ＣＡＲＴ細胞増殖の増強及び癌細胞の死滅の有効性の増大を促進できる。したがって、ＣＤ７０及び／又はＣＤ２７抗体を、当該技術分野において知られる任意のＣＡＲＴ細胞とともに投与して、ＣＡＲＴ細胞の機能を向上させることができる。例えば、本明細書に提供される操作されたＴ細胞のいずれかが、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ２７抗体、又は抗ＣＤ７０抗体及び抗ＣＤ２７抗体の組合せと組み合わせて投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（例えば、抗ＣＤ７０ＣＡＲ又は抗ＢＣＭＡＣＡＲ）が、抗ＣＤ７０及び／又は抗ＣＤ２７抗体と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（例えば、抗ＣＤ７０ＣＡＲ又は抗ＢＣＭＡＣＡＲ）が、抗ＣＤ７０及び／又は抗ＣＤ２７抗体と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（例えば、抗ＣＤ７０ＣＡＲ又は抗ＢＣＭＡＣＡＲ）が、抗ＣＤ７０及び／又は抗ＣＤ２７抗体と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（例えば、抗ＣＤ７０ＣＡＲ又は抗ＢＣＭＡＣＡＲ）が、抗ＣＤ７０及び／又は抗ＣＤ２７抗体と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、組み合わせて投与される抗体は、バルリルマブであってもよい。

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の枯渇を減少させる方法であって、Ｔ細胞中のＣＤ７０遺伝子を破壊することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の増殖を増大させる方法であって、Ｔ細胞中のＣＤ７０遺伝子を破壊することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の細胞障害性を増大させる方法であって、Ｔ細胞中のＣＤ７０遺伝子を破壊することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｔ細胞における免疫チェックポイント（例えば、ＰＤ−１）の阻害効果を克服する方法であって、Ｔ細胞中のＣＤ７０遺伝子を破壊することを含む方法を提供する。

他の実施形態
本開示は、以下の実施形態に関する。この節全体にわたって、実施形態という用語は、順序の前の「Ｅ」として省略される。例えば、Ｅ１は、実施形態１に等しい。

Ｅ１．破壊されたＣＤ７０遺伝子、破壊されたプログラム細胞死−１（ＰＤ−１）遺伝子、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞。

Ｅ２．破壊されたＣＤ７０遺伝子及びＣＤ７０に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞。

Ｅ３．破壊されたＣＤ７０遺伝子及びＣＤ７０に結合しないキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞。

Ｅ４．破壊されたＰＤ−１遺伝子をさらに含む、実施形態２又は３の操作されたＴ細胞。

Ｅ５．破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子をさらに含む、実施形態１〜４のいずれか１つの操作されたＴ細胞。

Ｅ６．破壊されたベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子をさらに含む、実施形態１〜５のいずれか１つの操作されたＴ細胞。

Ｅ７．操作されたＴ細胞であって、
破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子；
破壊されたベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子；
破壊されたＣＤ７０遺伝子；及び
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む、操作されたＴ細胞。

Ｅ８．ＣＡＲをコードする核酸が、ＴＲＡＣ遺伝子に挿入される、実施形態７の操作されたＴ細胞。

Ｅ９．破壊されたＰＤ−１遺伝子をさらに含む、実施形態７又は８の操作されたＴ細胞。

Ｅ１０．ＣＡＲが、抗ＣＤ７０抗体を含む外部ドメインを含み、任意選択により、抗ＣＤ７０抗体が、抗ＣＤ７０一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態１〜９のいずれか１つの操作されたＴ細胞。

Ｅ１１．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、参照抗体と同じ重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲを含み、参照抗体が、配列番号５１として記載されるＶＨ及び配列番号５２として記載されるＶＬを含む、実施形態１０の操作されたＴ細胞。

Ｅ１２．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ及びＶＬ鎖を含む、実施形態１１の操作されたＴ細胞。

Ｅ１３．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号４８又は５０のアミノ酸配列を含む、実施形態１１の操作されたＴ細胞。

Ｅ１４．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、実施形態１１の操作されたＴ細胞。

Ｅ１５．ＣＡＲが、抗ＢＣＭＡ抗体を含む外部ドメインを含み、任意選択により、抗ＢＣＭＡ抗体が、抗ＢＣＭＡ一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態１〜９のいずれか１つの操作されたＴ細胞。

Ｅ１６．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じＶＬＣＤＲを含み、参照抗体が、配列番号６０として記載されるＶＨ及び配列番号６１として記載されるＶＬを含む、実施形態１５の操作されたＴ細胞。

Ｅ１７．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ及びＶＬ鎖を含む、実施形態１６の操作されたＴ細胞。

Ｅ１８．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、実施形態１６の操作されたＴ細胞。

Ｅ１９．ＣＡＲが、ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメイン及び任意選択によりＣＤ３シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１〜１８のいずれか１つの操作されたＴ細胞。

Ｅ２０．ＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４４又は５５のヌクレオチド配列を含み、且つ／又はＣＡＲをコードする核酸が、配列番号４５又は５６のヌクレオチド配列を含む、実施形態５〜１９のいずれか１つの操作されたＴ細胞。

Ｅ２１．破壊されたβ２Ｍ遺伝子が、配列番号９〜１４のいずれか１つから選択される遺伝子の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態６〜２０のいずれか１つの操作されたＴ細胞。

Ｅ２２．操作されたＴ細胞が、癌細胞による５回の再チャレンジ後に細胞傷害性を維持する、実施形態１〜２１のいずれか１つの操作されたＴ細胞。

Ｅ２３．操作されたＴ細胞が、癌細胞による１０回の再チャレンジ後に細胞傷害性を維持する、実施形態２２の操作されたＴ細胞。

Ｅ２４．破壊されたＣＤ７０遺伝子、破壊されたプログラム細胞死−１（ＰＤ−１）遺伝子、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を含む細胞の集団。

Ｅ２５．破壊されたＣＤ７０遺伝子、及びＣＤ７０に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を含む細胞の集団。

Ｅ２６．破壊されたＣＤ７０遺伝子及びＣＤ７０に結合しないキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を含む細胞の集団。

Ｅ２７．破壊されたプログラム細胞死−１（ＰＤ−１）遺伝子をさらに含む、実施形態２５又は２６の細胞の集団。

Ｅ２８．破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子をさらに含む、実施形態２４〜２７のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ２９．破壊されたベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子をさらに含む、実施形態２４〜２８のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ３０．細胞の集団であって、
破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子；
破壊されたベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子；
破壊されたＣＤ７０遺伝子；及び
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を含む、細胞の集団。

Ｅ３１．ＣＡＲをコードする核酸が、ＴＲＡＣ遺伝子に挿入される、実施形態３０の細胞の集団。

Ｅ３２．操作されたＴ細胞がさらに、破壊されたプログラム細胞死−１（ＰＤ−１）遺伝子を含む、実施形態３０又は３１の細胞の集団。

Ｅ３３．ＣＡＲが、抗ＣＤ７０抗体を含む外部ドメインを含み、任意選択により、抗ＣＤ７０抗体が、抗ＣＤ７０一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態２４又は２７〜３２のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ３４．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じＶＬＣＤＲを含み、参照抗体が、配列番号５１として記載されるＶＨ及び配列番号５２として記載されるＶＬを含む、実施形態３３の細胞の集団。

Ｅ３５．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ及びＶＬ鎖を含む、実施形態３４の細胞の集団。

Ｅ３６．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号４８又は５０のアミノ酸配列を含む、実施形態３５の細胞の集団。

Ｅ３７．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、実施形態３５の細胞の集団。

Ｅ３８．ＣＡＲが、抗ＢＣＭＡ抗体を含む外部ドメインを含み、任意選択により、抗ＢＣＭＡ抗体が、抗ＢＣＭＡ一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態２４〜３２のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ３９．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じＶＬＣＤＲを含み、参照抗体が、配列番号６０として記載されるＶＨ及び配列番号６１として記載されるＶＬを含む、実施形態３８の細胞の集団。

Ｅ４０．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ及びＶＬ鎖を含む、実施形態３９の細胞の集団。

Ｅ４１．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、実施形態３９の細胞の集団。

Ｅ４２．ＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４４又は５５のヌクレオチド配列を含み、且つ／又はＣＡＲをコードする核酸が、配列番号４５又は５６のヌクレオチド配列を含む、実施形態２８〜４１のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ４３．破壊されたβ２Ｍ遺伝子が、配列番号９〜１４のいずれか１つから選択される遺伝子の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態２９〜４２のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ４４．操作されたＴ細胞の少なくとも５０％が、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現せず、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現せず、検出可能なレベルのＰＤ−１表面タンパク質を発現せず、且つ／又は検出可能なレベルのＣＡＲを発現する、実施形態２４〜４３のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ４５．操作されたＴ細胞の５０％〜７０％が、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現せず、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現せず、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現せず、検出可能なレベルのＰＤ−１表面タンパク質を発現せず、且つ／又は検出可能なレベルのＣＡＲを発現する、実施形態４４の細胞の集団。

Ｅ４６．操作されたＴ細胞の少なくとも９０％、任意選択により９０〜１００％が、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない、実施形態２８〜４５のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ４７．操作されたＴ細胞の少なくとも６０％、任意選択により６０〜７５％が、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、実施形態２９〜４６のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ４８．操作されたＴ細胞の少なくとも８０％、任意選択により８０〜１００％が、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない、実施形態２４〜４７のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ４９．操作されたＴ細胞の少なくとも８０％、任意選択により８０〜９５％が、検出可能なレベルのＣＡＲを発現する、実施形態１〜４８のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ５０．操作されたＴ細胞が、対照Ｔ細胞と比較して少なくとも２０％高い細胞増殖能を示す、実施形態２４〜４９のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ５１．操作されたＴ細胞が、対照Ｔ細胞と比較して少なくとも２０％高い細胞溶解能を示す、実施形態２４〜５０のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ５２．操作されたＴ細胞によって分泌されるサイトカインのレベルが、対照Ｔ細胞によって分泌されるサイトカインのレベルより少なくとも２倍高い、実施形態２４〜５１のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ５３．操作されたＴ細胞が、対照Ｔ細胞と比較して細胞枯渇の減少を示す、実施形態２４〜５２のいずれか１つの集団。

Ｅ５４．操作されたＴ細胞が、対照Ｔ細胞と比較してＬＡＧ３のレベルの低減を示す、実施形態５３の細胞の集団。

Ｅ５５．対照Ｔ細胞が、内在性のＣＤ７０タンパク質を発現する操作されたＴ細胞である、実施形態５４のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ５６．操作されたＴ細胞が、サイトカイン依存性の増殖を維持する、実施形態２４〜５５のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ５７．操作されたＴ細胞が、癌細胞による５回の再チャレンジ後に細胞傷害性を維持する、実施形態２４〜５６のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ５８．操作されたＴ細胞が、癌細胞による１０回の再チャレンジ後に細胞傷害性を維持する、実施形態４７の細胞の集団。

Ｅ５９．対象に実施形態２４〜５８のいずれか１つの細胞の集団を投与することを含む方法。

Ｅ６０．操作されたＴ細胞が、操作されたヒトＴ細胞である、実施形態５９の方法。

Ｅ６１．対象が、癌を有する、実施形態５９又は６０の方法。

Ｅ６２．癌が、ＣＤ７０及び／又はＢＣＭＡを発現する、実施形態６１の方法。

Ｅ６３．細胞の集団が、癌を治療するのに有効な量で対象に投与される、実施形態５９〜６２のいずれか１つの方法。

Ｅ６４．癌が、固形悪性腫瘍又は血液悪性腫瘍である、実施形態５９〜６３のいずれか１つの方法。

Ｅ６５．固形悪性腫瘍が、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、腎臓腫瘍、肺腫瘍、及び腸腫瘍からなる群から選択される、実施形態６４の方法。

Ｅ６６．細胞の集団が、対象における腫瘍の体積を減少させるのに有効な量で対象に投与される、実施形態６３の方法。

Ｅ６７．操作されたＴ細胞を生成するための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞に
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、
ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、及び
ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターを送達すること；並びに
（ｂ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含み且つＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞を生成することを含む方法。

Ｅ６８．工程（ａ）においてＴ細胞にＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することをさらに含み；工程（ｂ）の操作されたＴ細胞がさらに、破壊されたＰＤ−１遺伝子を含む、実施形態６７の方法。

Ｅ６９．工程（ａ）においてＴ細胞にＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することをさらに含み；工程（ｂ）操作されたＴ細胞がさらに、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含む、実施形態６７又は実施形態６８の方法。

Ｅ７０．ＣＡＲをコードする核酸が、ＴＲＡＣ遺伝子座位に対する左及び右の相同性アームと隣接し；且つ工程（ｂ）の操作されたＴ細胞が、ＴＲＡＣ遺伝子座位中に挿入されたＣＡＲをコードする核酸を含む、実施形態６９の方法。

Ｅ７１．工程（ａ）においてＴ細胞にβ２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することをさらに含み；工程（ｂ）の操作されたＴ細胞がさらに、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む、実施形態６７〜７０のいずれか１つの方法。

Ｅ７２．操作されたＴ細胞を生成するための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞に
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、
ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、
β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、
ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、及び
ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターを送達すること；並びに
（ｂ）操作されたＴ細胞を生成することを含む方法。

Ｅ７３．ＣＡＲをコードする核酸が、ＴＲＡＣ遺伝子座位に対する左及び右の相同性アームと隣接する、実施形態７２の方法。

Ｅ７４．Ｔ細胞にＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することをさらに含む、実施形態７２又は７３の方法。

Ｅ７５．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、任意選択によりＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態６７〜７４のいずれか１つの方法。

Ｅ７６．ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号９８のヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１１８のヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号３０のヌクレオチド配列を含む、実施形態６９〜７５のいずれか１つの方法。

Ｅ７７．β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号９９のヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１１９のヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む、実施形態７１〜７６のいずれか１つの方法。

Ｅ７８．ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号９４又は９５のヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１１４又は１１５のヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号２６又は２７のヌクレオチド配列を含む、実施形態６７〜７７のいずれか１つの方法。

Ｅ７９．ＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号１００のヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１２０のヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、ＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号３２のヌクレオチド配列を含む、実施形態６８〜７１及び７４〜７８のいずれか１つの方法。

Ｅ８０．ＣＡＲが、抗ＣＤ７０抗体を含む外部ドメインを含み、任意選択により、抗ＣＤ７０抗体が、抗ＣＤ７０一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態６７〜７９のいずれか１つの方法。

Ｅ８１．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じＶＬＣＤＲを含み、参照抗体が、配列番号５１として記載されるＶＨ及び配列番号５２として記載されるＶＬを含む、実施形態８０の方法。

Ｅ８２．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ及びＶＬ鎖を含む、実施形態８１の方法。

Ｅ８３．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号４８又は５０のアミノ酸配列を含む、実施形態８１の方法。

Ｅ８４．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、実施形態８１の方法。

Ｅ８５．ＣＡＲが、抗ＢＣＭＡ抗体を含む外部ドメインを含み、任意選択により、抗ＢＣＭＡ抗体が、抗ＢＣＭＡ一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態６７〜７９のいずれか１つの方法。

Ｅ８６．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じＶＬＣＤＲを含み、参照抗体が、配列番号６０として記載されるＶＨ及び配列番号６１として記載されるＶＬを含む、実施形態８５の方法。

Ｅ８７．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ及びＶＬ鎖を含む、実施形態８６の方法。

Ｅ８８．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、実施形態８６の方法。

Ｅ８９．ＣＡＲがさらに、ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメイン及び任意選択によりＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含む、実施形態６７〜８８のいずれか１つの方法。

Ｅ９０．ベクターが、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む、実施形態７２の方法。

Ｅ９１．ベクターが、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む、実施形態７２の方法。

Ｅ９２．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡを含む操作されたＴ細胞であって、任意選択により、ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号９４又は９５のヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１１４又は１１５のヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号２６又は２７のヌクレオチド配列を含む操作されたＴ細胞。

Ｅ９３．ＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡをさらに含む実施形態９２の操作されたＴ細胞であって、任意選択により、ＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号１００のヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１２０のヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、ＰＤ−１遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号３２のヌクレオチド配列を含む操作されたＴ細胞。

Ｅ９４．ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡをさらに含む実施形態９２又は９３の操作されたＴ細胞であって、任意選択により、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号９８のヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１１８のヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号３０のヌクレオチド配列を含む操作されたＴ細胞。

Ｅ９５．β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡをさらに含む実施形態９２〜９４のいずれか１つの操作されたＴ細胞であって、任意選択により、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号９９のヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１１９のヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む操作されたＴ細胞。

Ｅ９６．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、任意選択によりＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態９２〜９５のいずれか１つの操作されたＴ細胞。

Ｅ９７．ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターをさらに含む実施形態９２〜９６のいずれか１つの操作されたＴ細胞であって、任意選択により、ＣＡＲをコードする核酸が、ＴＲＡＣ遺伝子座位に対する左及び右の相同性アームと隣接する操作されたＴ細胞。

Ｅ９８．ＣＡＲが、抗ＣＤ７０抗体を含む外部ドメインを含み、任意選択により、抗ＣＤ７０抗体が、抗ＣＤ７０一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態９７の操作されたＴ細胞。

Ｅ９９．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じＶＬＣＤＲを含み、参照抗体が、配列番号５１として記載されるＶＨ及び配列番号５２として記載されるＶＬを含む、実施形態９８の操作されたＴ細胞。

Ｅ１００．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ及びＶＬ鎖を含む、実施形態９９の操作されたＴ細胞。

Ｅ１０１．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号４８又は５０のアミノ酸配列を含む、実施形態９９の操作されたＴ細胞。

Ｅ１０２．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、実施形態９９の操作されたＴ細胞。

Ｅ１０３．ＣＡＲが、抗ＢＣＭＡ抗体を含む外部ドメインを含み、任意選択により、抗ＢＣＭＡ抗体が、抗ＢＣＭＡ一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態９７の操作されたＴ細胞。

Ｅ１０４．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じＶＬＣＤＲを含み、参照抗体が、配列番号６０として記載されるＶＨ及び配列番号６１として記載されるＶＬを含む、実施形態１０３の操作されたＴ細胞。

Ｅ１０５．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ及びＶＬ鎖を含む、実施形態１０４の操作されたＴ細胞。

Ｅ１０６．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、実施形態１０４の操作されたＴ細胞。

Ｅ１０７．ベクターが、配列番号４６又は５７のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む、実施形態９７の操作されたＴ細胞。

Ｅ１０８．増殖を増大させるか又はＴ細胞の枯渇を減少させる方法であって、Ｔ細胞中のＣＤ７０遺伝子を破壊することを含む方法。

Ｅ１０９．Ｔ細胞においてプログラム細胞死−１（ＰＤ−１）遺伝子、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子、及びベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を破壊することをさらに含む、実施形態１０８の方法。

Ｅ１１０．Ｔ細胞においてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を発現させることをさらに含む、実施形態１０８〜１０９のいずれか１つの方法。

Ｅ１１１．ＣＤ７０遺伝子が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集によって破壊される、実施形態１０８〜１１０のいずれか１つの方法。

Ｅ１１２．ＰＤ−１、ＴＲＡＣ、及び／又はβ２Ｍ遺伝子が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集によって破壊される、実施形態１１０〜１１１のいずれか１つの方法。

Ｅ１１３．対象における癌を治療するための方法であって、操作されたＴ細胞であって、破壊されたＣＤ７０遺伝子及びＣＡＲをコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を含む細胞の集団を患者に投与し、それにより対象における癌を治療することを含む方法。

Ｅ１１４．ＣＡＲが、ＣＤ７０に結合する、実施形態１１３の方法。

Ｅ１１５．ＣＡＲが、ＣＤ７０に結合しない、実施形態１１３の方法。

Ｅ１１６．操作されたＴ細胞がさらに、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含む、実施形態１１３〜１１５のいずれか１つの方法。

Ｅ１１７．操作されたＴ細胞がさらに、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子を含む、実施形態１１３〜１１６のいずれか１つの方法。

Ｅ１１８．操作されたＴ細胞がさらに、破壊されたＰＤ−１遺伝子を含む、実施形態１１３〜１１６のいずれか１つの方法。

Ｅ１１９．対象における癌を治療するための方法であって、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子；及び
（ｉｖ）ＣＡＲをコードする核酸を含む細胞の集団を患者に投与し、
それにより対象における癌を治療することを含む方法。

Ｅ１２０．ＣＡＲが、（ａ）抗ＣＤ７０抗原結合断片を含む外部ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｃ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ｚ共刺激ドメインを含む外部ドメインを含む、実施形態１１３〜１１４及び１１６〜１１９のいずれか１つの方法。

Ｅ１２１．破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含む、実施形態１１９又は１２０の方法。

Ｅ１２２．抗ＣＤ７０抗体が、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖである、実施形態１２０〜１２１のいずれか１つの方法。

Ｅ１２３．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、参照抗体と同じ重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲを含み、参照抗体が、配列番号５１として記載されるＶＨ及び配列番号５２として記載されるＶＬを含む、実施形態１２２の方法。

Ｅ１２４．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ及びＶＬ鎖を含む、実施形態１２３の方法。

Ｅ１２５．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号４８又は５０のアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。

Ｅ１２６．抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。

Ｅ１２７．ＣＡＲが、抗ＢＣＭＡ抗体を含む外部ドメインを含み、任意選択により、抗ＢＣＭＡ抗体が、抗ＢＣＭＡ一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態１１３及び１１５〜１１８のいずれか１つの方法。

Ｅ１２８．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じＶＬＣＤＲを含み、参照抗体が、配列番号６０として記載されるＶＨ及び配列番号６１として記載されるＶＬを含む、実施形態１２７の方法。

Ｅ１２９．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ及びＶＬ鎖を含む、実施形態１２８の方法。

Ｅ１３０．抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、実施形態１２７の方法。

Ｅ１３１．操作されたＴ細胞が、操作されたヒトＴ細胞である、実施形態１１３〜１３０のいずれか１つの方法。

Ｅ１３２．癌が、ＣＤ７０及び／又はＢＣＭＡを発現する、実施形態１１３〜１３１のいずれか１つの方法。

Ｅ１３３．細胞の集団が、癌を治療するのに有効な量で対象に投与される、実施形態１１３〜１３２のいずれか１つの方法。

Ｅ１３４．癌が、固形悪性腫瘍又は血液悪性腫瘍である、実施形態１１３〜１３３のいずれか１つの方法。

Ｅ１３５．固形悪性腫瘍が、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、腎臓腫瘍、肺腫瘍、及び腸腫瘍からなる群から選択される、実施形態１３４の方法。

Ｅ１３６．操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子；
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子
（ｉｖ）（ａ）抗ＣＤ７０抗原結合断片を含む外部ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｃ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ｚ共刺激ドメインを含む外部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含む細胞の集団。

Ｅ１３７．破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含む、実施形態１３６の細胞の集団。

Ｅ１３８．操作されたＴ細胞が、ヒトＴ細胞である、実施形態１３６〜１３７のいずれか１つの細胞の集団。

Ｅ１３９．操作されたＴ細胞であって、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む、操作されたＴ細胞。

Ｅ１４０．ＣＡＲをコードする核酸が、配列番号４５と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含む、実施形態１３９の操作されたＴ細胞。

Ｅ１４１．操作されたＴ細胞であって、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号４５と少なくとも９０％同一である破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む、操作されたＴ細胞。

Ｅ１４２．破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４５又は配列番号４４に記載されるヌクレオチド配列を含むドナー配列を含む、実施形態１３９〜１４１のいずれか１つの操作されたＴ細胞。

Ｅ１４３．操作されたＴ細胞であって、
（ｉ）配列番号４４の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む、操作されたＴ細胞。

Ｅ１４４．Ｔ細胞が、ヒトＴ細胞である、実施形態１３９〜１４３のいずれか１つの操作されたＴ細胞。

実施例１．Ｔ細胞におけるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰによるＣＤ７０の効率的なノックアウト
この実施例は、エクスビボでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して一次ヒトＴ細胞におけるＣＤ７０遺伝子の効率的な編集を記載する。第１の３つのタンパク質をコードするエクソンを含有するＣＤ７０遺伝子のゲノムセグメントは、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアにおける入力として使用された。ゲノムセグメントはまた、隣接するスプライス部位アクセプター／ドナー配列を含んだ。所望のｇＲＮＡは、ＣＤ７０のアミノ酸配列を破壊し、アウトオブフレーム／機能喪失アレル（「ＣＤ７０ノックアウト」アレルと呼ばれる）をもたらす、コード配列における挿入又は欠失を引き起こすことになるものであった。ＣＤ７０遺伝子を標的化するインシリコで同定されたｇＲＮＡスペーサー配列中の７つ全てが合成され、ｇＲＮＡは、表５において示されるとおり、特異的に修飾された。表５におけるｇＲＮＡは２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート修飾で修飾されたが、未修飾ｇＲＮＡ、又は他の修飾を有するｇＲＮＡが使用されてもよい。また、この参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日に出願されたＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９号を参照されたい。

一次ヒトＴ細胞は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びＣＤ７０遺伝子（表５の配列）を標的化する合成的に修飾されたｓｇＲＮＡを含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）又は対照（Ｃａｓ９なし、ｇＲＮＡなし）でトランスフェクト（電気穿孔）された。トランスフェクションの４〜６日後、細胞は、（１）インデル頻度を評価するためにＴＩＤＥ分析にかけられ、（２）細胞表面でのＣＤ７０発現レベルを評価するためにフローサイトメトリー（一次抗体：ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ７０抗体、クローン１１３〜１６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって処理された。

７種のｇＲＮＡは、表６に示されるとおり、ＴＩＤＥ分析によって測定可能なデータをもたらした。４種のｇＲＮＡ配列は、８０％を超えるタンパク質発現ノックダウンで８５％を超えるインデルパーセンテージ（編集頻度）を得たが（配列番号２３、２６、２７及び２９）、これは、非常に効率的な遺伝子編集を示している。表６におけるデータは、１種のドナーからのものである。試験試料当たりの（蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）によって評価された）ＣＤ７０タンパク質発現のレベルは、対照細胞に存在するＣＤ７０タンパク質発現のレベルに標準化された。

Ｔ細胞におけるオンターゲットインデルプロファイルの分析
オンターゲットアンプリコン分析は、ＣＤ７０遺伝子：
ＧＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＡＴＴＧＧＴＣＧＣ（配列番号１６０；ＰＡＭ配列番号１１４を有する標的配列）を標的化するＴ７ガイド（配列番号２６；配列番号３６）を使用する遺伝子編集の後にＣＤ７０座位で実施された。

遺伝子編集の後、オンターゲットアンプリコン分析は、ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞（実施例３に記載されるとおりに生成される）におけるＣＤ７０座位の周囲で実施された。

最初のＰＣＲは、ＫＡＰＡＨｉＦｉＰＣＲキット（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用して実施された。１００ｎｇの入力ｇＤＮＡは、１０ｕＭの各プライマーと組み合わされた。ＣＤ７０＿Ｆ及びＣＤ７０＿Ｒプライマーが、ＣＤ７０座位を増幅するように対にされた（表７）。

ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞を生成するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集後のＴ細胞の集団におけるＣＤ７０座位の分析は、特定のインデル頻度をもたらし、ＣＤ７０座位で編集された遺伝子配列をもたらす（表８；ダッシュとしての欠失及び太字の挿入）。編集された細胞の２つの細胞集団は、２つの異なるドナーＴ細胞（１及び２）から生成された。各ドナーからの編集されたＴ細胞の集団は、反復実験：１Ａ／１Ｂ及び２Ａ／２Ｂにおいて分析された。

実施例２．多重遺伝子ノックアウトを有するＴ細胞の生成
この実施例は、２、３つ又は４つの遺伝子の発現を同時に欠くヒトＴ細胞を生成するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術の使用を記載する。具体的には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（ＴＣＲアルファ定常（ＴＲＡＣ）領域において編集された遺伝子）、２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子、表面抗原分類７０（ＣＤ７０）遺伝子及び／又はプログラム細胞死１（ＰＤ−１又はＰＤ１）遺伝子が、列挙された遺伝子の２つ以上においてＴ細胞欠損を生成するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によって編集された。以下の略称が、簡潔さ及び明確さのために図において使用される：
２ＸＫＯ：ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻
３ＸＫＯ（ＰＤ−１）：ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻
３ＸＫＯ（ＣＤ７０）：ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻
４ＸＫＯ：ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻

活性化された一次ヒトＴ細胞は、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡＲＮＰ複合体で電気穿孔された。ヌクレオフェクション混合物は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液、５×１０^６細胞、１μＭＣａｓ９及び５μＭｇＲＮＡ（Ｈｅｎｄｅｌｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；３３（９）：９８５−９８９，ＰＭＩＤ：２６１２１４１５において記載される）を含有した。二重ノックアウトＴ細胞（２ＸＫＯ）の生成のために、細胞は、各々が上に示される濃度でＣａｓ９タンパク質並びに以下のｓｇＲＮＡ：ＴＲＡＣ（配列番号４０）及びβ２Ｍ（配列番号４１）の１つを含有する２つの異なるＲＮＰ複合体で電気穿孔された。三重ノックアウトＴ細胞（３ＸＫＯ）の生成のために、細胞は、各々が上に示される濃度でＣａｓタンパク質並びに以下のｓｇＲＮＡ：（ａ）ＴＲＡＣ（配列番号４０）、β２Ｍ（配列番号４１）、及びＰＤ−１（配列番号４２）；又は上に示される濃度で（ｂ）ＴＲＡＣ（配列番号４０）、β２Ｍ（配列番号４１）、及びＣＤ７０（配列番号３６又は３７）の１つを含有するＲＮＡ複合体である３つの異なるＲＮＰ複合体で電気穿孔された。四重ノックアウトＴ細胞（４ＸＫＯ）の生成のために、細胞は、各々が上に示される濃度でＣａｓ９タンパク質並びに以下のｓｇＲＮＡ：ＴＲＡＣ（配列番号４０）、β２Ｍ（配列番号４１）、ＰＤ−１（配列番号４２）、及びＣＤ７０（配列番号３６又は３７）の１つを含有するＲＮＡ複合体である４つの異なるＲＮＰ複合体で電気穿孔された。ｇＲＮＡの未改変のバージョン（又は他の改変バージョン）もまた使用され得る（例えば、配列番号３０、３１、３２、２６、及び／又は２７）。表５及び９における配列。

エレクトロポレーションの約１週間後、細胞は、未処理のままであるか又は酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）／イオノマイシンで一晩処理された。翌日、細胞をフローサイトメトリーのために処理して（例えば、ＫａｌａｉｔｚｉｄｉｓＤｅｔａｌ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２０１７；１２７（４）：１４０５−１４１３）、編集された細胞集団の細胞表面でＴＲＡＣ、β２Ｍ、ＰＤ−１、及びＣＤ７０発現レベルを評価した。以下の一次抗体が使用された（表１０）：

表１１及び１２は、非常に効率的な多重遺伝子編集を示す。二重ノックアウト細胞（２ＸＫＯ；ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）に関して、生存細胞の８３％が、ＴＣＲ及びβ２Ｍの発現を欠いた（表１１；３ＸＫＯ（ＰＤ１））。三重ノックアウト細胞に関して、生存細胞の７０％が、ＴＣＲ、β２Ｍ、及びＰＤ−１の発現を欠き（表１１）；且つ生存細胞の８０％が、ＴＣＲ、β２Ｍ、及び使用されるＣＤ７０ｇＲＮＡに無関係にＣＤ７０の発現を欠いた（表１２）。四重ノックアウト細胞（４ＸＫＯ）に関して、生存細胞の７８％が、ＴＣＲ、β２Ｍ、ＰＤ−１、及びＣＤ７０の発現を欠いた（図１）。

Ｔ細胞における三重及び四重遺伝子編集が細胞の増殖に影響するかどうかを評価するため、細胞数を、二重、三重、及び四重遺伝子編集されたＴ細胞（未編集のＴ細胞が、対照として使用された）の間で編集後２週間にわたって数え上げた。５×１０^６細胞が生成され、Ｔ細胞の各遺伝子型について蒔かれた。

図２に示されるとおり、細胞増殖（拡大）は、エレクトロポレーション後の期間の試験にわたって継続した。同様の細胞増殖は、生存細胞の数によって示されるとおり、二重（β２Ｍ−／ＴＲＡＣ−）、三重（β２Ｍ−／ＴＲＡＣ−／ＰＤ−１−、又はβ２Ｍ−／ＴＲＡＣ−／ＣＤ７０−）、及び四重（β２Ｍ−／ＴＲＡＣ−／ＰＤ−１−／ＣＤ７０）ノックアウトＴ細胞の間で観察された。これらのデータは、多重遺伝子編集（最大で三重及び四重、ＣＤ７０及びＰＤ−１遺伝子を有する）が、Ｔ細胞増殖によって測定されるとおりＴ細胞の活力に影響を及ぼさないことを示唆する。

実施例３．ＣＤ７０及び／又はＰＤ１を欠くＣＡＲＴ細胞の生成
多重ノックアウトを有する抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞の生成
この実施例は、ＴＣＲ遺伝子、β２Ｍ遺伝子、ＣＤ７０遺伝子及び／又はＰＤ１遺伝子の発現を欠き、且つＣＤ７０を標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する異質遺伝子型ヒトＴ細胞の産生を記載する。これらの細胞は、図においてＴＣＲ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋又は３ＸＫＯ（ＣＤ７０）ＣＤ７０ＣＡＲ^＋；ＴＣＲ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋又は３ＸＫＯ（ＰＤ１）ＣＤ７０ＣＡＲ^＋；ＴＣＲ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋又は４ＸＫＯＣＤ７０ＣＡＲ^＋と呼ばれる。

配列番号４３のヌクレオチド配列を含む（配列番号４６のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ＣＡＲをコードする、配列番号４４におけるドナー鋳型を含む）組換えアデノ随伴アデノウイルスベクター、血清型６（ＡＡＶ６）（ＭＯＩ５０，０００）が、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ（１μＭＣａｓ９、５μＭｇＲＮＡ）とともに活性化異質遺伝子型ヒトＴ細胞に送達された。以下のｓｇＲＮＡが使用された：ＴＲＡＣ（配列番号４０）、β２Ｍ（配列番号４１）、ＣＤ７０（配列番号３６又は３７）及びＰＤ１（配列番号４２）。ｇＲＮＡの未改変のバージョン（又は他の改変バージョン）もまた使用され得る（例えば、配列番号３０、３１、３２、２６、及び／又は２７）。エレクトロポレーションの約１週間後、細胞をフローサイトメトリーのために処理して、編集された細胞集団の細胞表面でのＴＲＡＣ、β２Ｍ、ＣＤ７０、及びＰＤ１発現レベルを評価した。以下の一次抗体が使用された（表１３）：

Ｔ細胞比率アッセイ次に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の比率が、以下の抗体（表１４）を使用するフローサイトメトリーによって、編集されたＴ細胞集団において評価された。

高効率の遺伝子編集及びＣＡＲ発現は、編集された抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞集団において達成された。加えて、編集は、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞集団を不利に変化させなかった。図３は、三重ノックアウトＣＡＲＴ細胞における非常に効率的な遺伝子編集及び抗ＣＤ７０ＣＡＲ発現を示す。５５％を超える生存細胞が、ＴＣＲ、β２Ｍ、及びＣＤ７０の発現を欠き、抗ＣＤ７０ＣＡＲも発現した。図４は、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞サブセットの正常な比率が、ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞において維持されたことを示し、これは、これらの多重遺伝子編集が、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞サブセットの比率によって測定されるとおり、Ｔ細胞の生態に影響を及ぼさないことを示唆している。

図５は、四重ノックアウトＣＡＲＴ細胞における非常に効率的な遺伝子編集及び抗ＣＤ７０ＣＡＲ発現を示す。６０％を超える生存細胞が、ＴＣＲ、β２Ｍ、ＰＤ−１、及びＣＤ７０の発現を欠き、抗ＣＤ７０ＣＡＲを発現した。図６は、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞サブセットの正常な比率が、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋細胞において維持されたことを示し、これは、これらの多重遺伝子編集が、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの比率によって測定されるとおり、Ｔ細胞の生態に影響を及ぼさないことを示唆している。

多重ノックアウトを有する抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞の生成
この実施例は、ＴＣＲ遺伝子、β２Ｍ遺伝子、ＰＤ−１遺伝子、及び／又はＣＤ７０遺伝子の発現を欠き、且つＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も発現する異質遺伝子型ヒトＴ細胞の産生を記載する。

配列番号５４のヌクレオチド配列を含む（配列番号５７のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡＣＡＲをコードする、配列番号５５におけるドナー鋳型を含む）組換えアデノ随伴アデノウイルスベクター、血清型６（ＡＡＶ６）が、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡＲＮＰ（１μＭＣａｓ９、及び５μＭｇＲＮＡ）とともに活性化異質遺伝子型ヒトＴ細胞に送達された。以下のｇＲＮＡが使用された：ＴＲＡＣ（配列番号４０）、β２Ｍ（配列番号４１）、ＰＤ−１（配列番号４２）、及びＣＤ７０（配列番号３６又は３７）。ｇＲＮＡの未改変のバージョン（又は他の改変バージョン）もまた使用され得る（例えば、配列番号３０、３１、３２、２６、及び／又は２７）。エレクトロポレーションの約１週間後、細胞を、抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞について上記のとおりにフローサイトメトリーのために処理したが、以下の相違を有した。抗ＢＣＭＡＣＡＲ発現は、ビオチン化組換えヒトＢＣＭＡ（ＡＣＲＯＳＣａｔ＃ＢＣ７−Ｈ８２Ｆ０）を使用して検出された。次に、二重及び四重ノックアウト抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋細胞が、本明細書に記載されるとおりに特徴付けされた。

図７Ａ〜７Ｂは、ＴＲＡＣ遺伝子、β２Ｍ遺伝子、ＣＤ７０遺伝子及びＰＤ−１遺伝子の非常に効率的な遺伝子編集を示す。図７Ｃは、二重ノックアウト及び四重ノックアウト細胞における抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋細胞の高い発現を示す。

多重ノックアウトを有する抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の生成
ＣＤ１９を標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、且つＴＣＲ遺伝子、β２Ｍ遺伝子、及び任意選択によりＣＤ７０遺伝子の発現を欠く、異質遺伝子型ヒトＴ細胞が生成された。

異質遺伝子型Ｔ細胞を生成するため、活性化一次ヒトＴ細胞を、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡＲＮＰ複合体で電気穿孔し、ＴＲＡＣ座位と相同性を有する抗ＣＤ１９ＣＡＲドナー鋳型を含有するアデノ随伴アデノウイルスベクター（ＡＡＶ）で感染させた。配列番号１５５のヌクレオチド配列を含む（配列番号１４９のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードする、配列番号１５６におけるドナー鋳型を含む）組換えＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）が、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ（１μＭＣａｓ９、５μＭｇＲＮＡ）とともに活性化ヒトＴ細胞に送達された。以下のｓｇＲＮＡを使用して、対応する遺伝子をノックアウトした：ＴＲＡＣ（配列番号４０）、β２Ｍ（配列番号４１）、ＣＤ７０（配列番号３６）。ｇＲＮＡの未改変のバージョン（又は他の改変バージョン）もまた使用され得る（例えば、配列番号３０、２１又は２７）。エレクトロポレーションの約１週間後、細胞を、抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞について上記のとおりにフローサイトメトリーのために処理したが、以下の相違を有した。抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現は、ビオチン化組換えヒトＣＤ１９（ＡＣＲＯＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳＩＮＣ；ＣＤ９−Ｈ８２５）を使用して検出された。次に、ＣＤ７０欠損抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が、本明細書に記載されるとおりに特徴付けされた。

多重ノックアウトを有する抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞の生成
ＣＤ３３を標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、且つＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（ＴＣＲアルファ定常（ＴＲＡＣ）領域において編集された遺伝子）、β２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子、及び任意選択によりＣＤ７０遺伝子の発現を欠く、異質遺伝子型ヒトＴ細胞が生成された。

異質遺伝子型Ｔ細胞を生成するため、活性化一次ヒトＴ細胞を、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡＲＮＰ複合体で電気穿孔し、ＴＲＡＣ座位と相同性を有する抗ＣＤ３３ＣＡＲドナー鋳型を含有するアデノ随伴アデノウイルスベクター（ＡＡＶ）で感染させた。配列番号８７のヌクレオチド配列を含む（配列番号１３９のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ＣＡＲをコードする、配列番号１３５におけるドナー鋳型を含む）組換えＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）が、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ（１μＭＣａｓ９、５μＭｇＲＮＡ）とともに活性化ヒトＴ細胞に送達された。以下のｓｇＲＮＡを使用して、対応する遺伝子をノックアウトした：ＴＲＡＣ（配列番号４０）、β２Ｍ（配列番号４１）、ＣＤ７０（配列番号３６）。ｇＲＮＡの未改変のバージョン（又は他の改変バージョン）もまた使用され得る（例えば、配列番号３０、２１又は２７）。

ＴＣＲ＋Ｔ細胞（ＲＮＰなし）及びＴＲＡＣ−／β２Ｍ− Ｔ細胞（ＣＡＲを有しないＴＣＲ及びβ２Ｍ欠損細胞）の集団が、対照としての使用のために同様に生成された。エレクトロポレーションの約１週間後、細胞を、抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞について上記のとおりにフローサイトメトリーのために処理したが、以下の相違を有した。抗ＣＤ３３ＣＡＲ発現は、ビオチン化組換えヒトＣＤ３３を使用して検出された（データは示さず）。次に、ＣＤ７０ノックアウト抗ＣＤ３３ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が、本明細書に記載されるとおりに特徴付けされた。

ＣＤ７０ノックアウトを有する抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞におけるＣＤ４／ＣＤ８細胞集団の特徴付け
ＣＤ３３は、Ｔ細胞上で発現され得るが、培養されたＣＤ４細胞上においてＣＤ８細胞より高いレベルで観察される。抗ＣＤ３３ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成する経過中、ＣＤ４細胞は、兄弟殺しのために実質的に減少する。図８に示されるとおり、インタクトなＣＤ７０を有する抗ＣＤ３３ＣＡＲ−Ｔ細胞培養物は、３週間の培養期間にわたってＣＤ４＋細胞において９７％の減少を示したが、破壊されたＣＤ７０を有する細胞の培養物は、この時間経過にわたってわずか６１％の減少を示した。したがって、ＣＤ７０遺伝子を破壊することは、抗ＣＤ３３ＣＡＲ−Ｔ細胞培養物において観察される兄弟殺しを減少させるように見える。理論に束縛されるものではないが、この効果は、ＣＤ７０／ＣＤ２７相互作用によって増強され得る免疫刺激機能を介して生じる可能性があり、ＣＤ７０の遺伝子破壊は、悪性腫瘍における治療効果により最適であり得るよりバランスのとれたＣＤ４／ＣＤ８比をもたらす。

実施例４：ＣＤ７０ＫＯは細胞増殖を増進させる
インビトロでの抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞の細胞増殖に対するＣＤ７０ＫＯの効果
サイトカイン含有培地（ＩＬ−２＋ＩＬ−７）において細胞の増殖する能力を評価するため、抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞が利用された。具体的には、二重ノックアウト（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−）又は三重ノックアウト（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−）を含む５×１０^６個の総抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞が、実施例３に記載されるとおりに生成され、蒔かれ、１０ｍＬ体積のサイトカイン含有培地中で増殖させられた。１週間後に細胞が計数された。次に、前の培養由来の５×１０^６細胞が、１０ｍＬ体積（新鮮なサイトカイン含有培地）に再び蒔かれ、１週間後、細胞の総数が数え上げられた。ＣＤ７０遺伝子における破壊を含有する異質遺伝子型抗ＣＤ３３ＣＡＲ−Ｔ細胞は、第１週及び第２週の再播種においてより高いレベルまで増殖した（図９）。これらのデータは、ＣＤ７０ノックアウトが、培養においてより高い細胞収量をもたらし得ることを示す。

インビトロでの抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の細胞増殖に対するＣＤ７０ＫＯの効果
サイトカイン含有培地（ＩＬ−２＋ＩＬ−７）において細胞の増殖する能力をさらに評価するため、抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞が利用された。具体的には、二重ノックアウト（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−）又は三重ノックアウト（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−）を含む５×１０^６個の総抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞が、実施例３に記載されるとおりに生成され、蒔かれ、１０ｍＬ体積のサイトカイン含有培地中で増殖させられた。１週間後に細胞が計数された。次に、前の培養由来の５×１０^６細胞が、１０ｍＬ体積（新鮮なサイトカイン含有培地）に再び蒔かれ、１週間後、細胞の総数が数え上げられた。ＣＤ７０遺伝子における破壊を含有する異質遺伝子型抗ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ７０遺伝子破壊を伴わない対照細胞と比較して、第１週及び第２週の再播種においてより高いレベルまで増殖した（図１０）。これらのデータは、ＣＤ７０ノックアウトが、培養においてより高い細胞収量をもたらし得ることを示す。

インビトロでの抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞のサイトカインに駆動される増殖及びアポトーシスに対するＣＤ７０ＫＯの効果
サイトカインに駆動される増殖。細胞増殖に対するＣＤ７０及び／又はＰＤ１ノックアウトの効果を評価するため、抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞が利用された。抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞は、実施例３に記載されるとおりに生成された。以下の編集されたＴ細胞の群が生成された：
ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋（対照；２ＫＯ、ＢＣＭＡＣＡＲ＋）
ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋（３ＫＯ（ＣＤ７０）、ＢＣＭＡＣＡＲ＋）
ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＰＤ１−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋（３ＫＯ（ＰＤ１）、ＢＣＭＡＣＡＲ＋）
ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−／ＰＤ１−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋（４ＫＯ、ＢＣＭＡＣＡＲ＋）

編集された細胞は、ＣＤ３＋Ｂ２Ｍ＋細胞の磁性の枯渇によってＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−細胞について濃縮された。簡潔には、細胞は、抗ＣＤ３ビオチン（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄＣａｔ＃３００４０４）抗β２Ｍビオチン（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄＣａｔ＃３１６３０８）抗体により、それぞれ１００μｌ体積中１×１０^６細胞当たり０．５μｇにて４℃で１５分間標識され、洗浄され、ストレプトアビジン標識磁性マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ、１３０−０４８−１０１）とともに４℃で１５分間インキュベートされた。細胞は、緩衝液中で再懸濁され、製造業者のプロトコルに従ってＬＳカラム（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ、１３０−０４２−４０１）に通された。ＩＬ−２／ＩＬ−７に駆動されるＴ細胞増殖に対するＣＤ７０又はＰＤ１の効果を決定するために、編集されたＴ細胞（１Ｅ６細胞／ｍｌ）は、増殖培地（５％ヒトＡＢ血清（ＨＰ１０２２、ＶａｌｌｅｙＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ）が添加されたＸ−ｖｉｖｏ培地（０４−７４４、Ｌｏｎｚａ）、５０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２；１３０−０９７−７４５、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）及び１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−７（ｒｈＩＬ−７；Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ００１４１０−０５０）中で最大４週間培養された。指定された日に、細胞は計数され、適切な培養皿中において１．５Ｅ６細胞／ｍｌで新鮮な培地に再播種された。

図１１及び１２は、ＣＤ７０のノックアウトが、ＣＤ７０が十分にある対照（すなわち、内在性ＣＤ７０を含む抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞）と比較して、インビトロで抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞のＩＬ−２／ＩＬ−７に駆動される増殖を増進させたことを示す。図１１はまた、ＣＤ７０遺伝子が損なわれていない場合、このドナーからのＴ細胞が１７日後に有意に減少しているように見える場合さえ、ＣＤ７０ＫＯが、抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞の活力及び増殖能を増進できることを示す（ドナー２（図１２）と比較して、ドナー１（図１１）の減少した細胞数によって示されるとおり）。Ｔ細胞の活力を維持するこの特性（ＣＤ７０遺伝子のＫＯによって可能になる）は、収量及び一貫性を増大させる製造時の増殖の拡大、患者における潜在的により少ない用量を可能にする枯渇した／活力のないＴ細胞のレスキュー、並びにより堅牢な応答、Ｔ細胞の活力に対してより有害であり得るが、Ｔ細胞活性の抑制を克服することなど他の利点を有する他のＫＯ（例えば、ＰＤ１ＫＯ）との組合せを含むＣＡＲＴの開発の多くの側面に広範に適用可能である。図１１及び１２に示されるとおり、単独でＰＤ１遺伝子を欠失させることは、ＣＡＲＴ細胞の増殖に対する利益を示さないが、ＣＤ７０ＫＯと組み合わせた場合、相乗効果を示す。

アポトーシス。抗原に対する暴露後の抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞のアポトーシス性の細胞死に対するＣＤ７０ＫＯの効果は、抗原再チャレンジアッセイにおいて評価された。簡潔には、抗原暴露を達成するために、抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞が、プレートに接着した組換えＢＣＭＡタンパク質に暴露された。接着した抗原を有するプレートは、２４ウェルプレートを１ｘＰＢＳ（１μｇ／ｍｌ；ビオチン化ヒトＢＣＭＡタンパク質、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中の組換えＢＣＭＡタンパク質により４℃で一晩コーティングし、続いて未結合の抗原を洗い流すことによって作製された。洗浄後、抗原結合プレートは、ＣＤ７０ノックアウトを有するか又は有しないいずれかの抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞をチャレンジするために使用された。２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−）抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞及び３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞（１×１０^６細胞／ｍｌ）が、ＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２；１３０−０９７−７４５、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）が添加された増殖培地（Ｘ−ｖｉｖｏ培地（０４−７４４、Ｌｏｎｚａ）、５％ヒトＡＢ血清（ＨＰ１０２２、ＶａｌｌｅｙＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ）中においてプレート結合組換えＢＣＭＡタンパク質（１μｇ／ｍｌ）に２４時間暴露された。次に、細胞は洗浄され、計数され、合計３回の連続した再チャレンジ（２４時間、４８時間、及び７２時間）のために２４時間毎に新鮮なプレート結合抗原で再チャレンジ（１×１０^６細胞／ｍｌ）された。各再チャレンジの最後に、一定分量の細胞を洗浄し、アネキシンＶ結合緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中においてヨウ化プロピジウムとともに蛍光色素がコンジュゲートされたアネキシンＶにより室温で１５分間染色した。次に、細胞は、洗浄され、フローサイトメトリーによる分析のためにアネキシンＶ結合緩衝液中で再懸濁された。各時点で細胞が計数され、１ｍｌ当たりの細胞数が導き出された。各時点での増殖率の計算のために、０時点での最初の増殖率が１に設定された。全ての他の時点に関する増殖率は、各時点での１ｍｌ当たりの細胞数に前の時点に関する１ｍｌ当たりの増殖率を掛けることによって計算された。例えば、７２時間での増殖率は、７２時間での１ｍｌ当たりの細胞数に４８時間での１ｍｌ当たりの増殖率を掛けることによって計算された。

図１３は、ＣＤ７０（ＣＤ７０ＫＯ）の欠失が、第２（４８時間）及び第３（７２時間）の再チャレンジ後のアポトーシス細胞のパーセンテージにおける減少によって示されるとおり、アポトーシスから抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞をレスキューすることを実証している。さらに、抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＣＤ７０発現の欠如は、抗原暴露に応答する抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞の増殖を驚くほど増強する（図１４）。

インビトロでの抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞の細胞増殖に対するＣＤ７０ＫＯの効果
ＣＡＲＴ細胞においてＣＤ７０遺伝子を破壊することの影響をさらに評価するため、抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞が、実施例３に記載されるとおりに生成された。具体的には、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞が、異なるｇＲＮＡ（Ｔ７（配列番号３６及びＴ８（配列番号３７））を使用して生成された。エレクトロポレーションの後、細胞増殖が、生存細胞を計数することによって実施例２に記載されるとおりに評価された。図１５は、三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／Ｔ７又はＴ８ｇＲＮＡのいずれかで生成された抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して高い細胞増殖を示した。これらのデータは、ＣＤ７０遺伝子をノックアウトすることが、抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞に細胞増殖の優位性をもたらすことを示唆する。

細胞増殖はまた、四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞において評価された。これらの細胞は、三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と比較して、より高い増殖を示した（図１６）。

実施例５．ＣＤ７０ＫＯは、インビトロでＣＡＲＴ細胞の耐久性及び効力を増大させる。
ＣＤ７０ノックアウトを有する抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の細胞を死滅させる機能
実施例３に記載されるとおりの編集された抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の作製の後、ＣＡＲＴ細胞の機能活性を、フローサイトメトリーに基づく細胞障害性アッセイを使用して検証した。抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ１９ＣＡＲ＋及びＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／ＣＤ１９ＣＡＲ＋）は、２つのＣＤ１９発現癌細胞株（標的細胞）：Ｎａｌｍ６（ＡＴＣＣｃｒｌ３２７３）又はＲａｊｉ（ＡＴＣＣｃｃｌ−８６）の１つと共培養された。標的細胞は、５μＭｅｆｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識され、洗浄され、ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋、又はＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋との様々な比（０．０１、０．０５、０．１、０．５、１：１Ｔ細胞：標的細胞）での共培養物中においてインキュベートされた。標的細胞は、９６ウェル、Ｕ底プレートにおいてウェル当たり５０，０００細胞で播種された。共培養物は、一晩インキュベートされた。インキュベーションの後、ウェルは洗浄され、培地は、５ｍｇ／ｍＬＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）の１：５００希釈物を含有する２００μＬの培地で置き換えられた。次に、２５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が、各ウェルに加えられ、細胞培養物が、フローサイトメトリーによって細胞生存率について分析された（すなわち、生存細胞はＤＡＰＩ染色について陰性である）。

次に、標的細胞（例えば、Ｎａｌｍ６又はＲａｊｉ細胞）の細胞溶解パーセントが、以下の式を使用して決定された：
細胞溶解パーセント＝（１−（（試験試料における標的細胞の総数）÷（対照試料における標的細胞の総数））×１００；
式中、試験試料は、１）ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞又は２）ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞と共培養された標的細胞（例えば、Ｎａｌｍ６又はＲａｊｉ細胞）であり；且つ
対照試料は、共培養されていない単独の標的細胞であった。

ＣＤ７０遺伝子の破壊は、低いＣＡＲ−Ｔと標的の比率でＲａｊｉ細胞株に対する抗ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞溶解活性の増強をもたらした（図１７、下のパネル）。ＣＤ７０の破壊は、Ｎａｌｍ６細胞株に対して抗ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ活性を増強しなかった（図１７、上のパネル）。注目すべきことに、Ｎａｌｍ６細胞株は、これらのＣＡＲ−Ｔ細胞により溶解することが比較的容易であり（Ｎａｌｍ６に関して０．１：１ＣＡＲ−Ｔ細胞と標的比で＞８０％溶解対Ｒａｊｉに関して野生型細胞に関してこの比で０％）、Ｎａｌｍ６細胞に対するこのアッセイにおいて、ＣＤ７０枯渇による結果として得られる有効性の増大の欠如を説明していると考えられる。Ｒａｊｉ細胞株に対してＣＤ７０の喪失により付与される活性の増大は、困難な腫瘍環境において、特に、ＣＡＲ−Ｔと腫瘍の比率が低い場合、ＣＤ７０の喪失が、腫瘍細胞を根絶する際にＣＡＲＴ細胞への実質的な利益を有し得ることを示す。

ＣＤ７０ノックアウトを有する抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞の細胞を死滅させる機能
実施例３に記載されるとおりの編集された抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞の作製の後、ＣＡＲＴ細胞の機能活性を、フローサイトメトリーに基づく細胞障害性アッセイを使用して検証した。抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ３３ＣＡＲ＋及びＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／ＣＤ３３ＣＡＲ＋）又は対照Ｔ細胞（ＲＮＰなし）は、ＣＤ３３発現癌細胞株ＭＶ４−１１（ＡＴＣＣＣＲＬ−９５９１）とともに共培養された。標的細胞は、５μＭｅｆｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識され、洗浄され、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ３３ＣＡＲ＋、ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／抗ＣＤ３３ＣＡＲ＋、又は対照との様々な比（０．０１：１、０．０３：１、０．０６：１、０．１２５：１、０．２５：１、０．５：１、又は１：１Ｔ細胞：標的細胞）での共培養物中においてインキュベートされた。標的細胞は、９６ウェル、Ｕ底プレートにおいてウェル当たり５０，０００細胞で播種された。共培養物は、一晩インキュベートされた。４８時間後、ウェルは洗浄され、培地は、５ｍｇ／ｍＬＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）の１：５００希釈物を含有する２００μＬの培地で置き換えられた。次に、２５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が、各ウェルに加えられ、細胞培養物が、フローサイトメトリーによって細胞生存率について分析された（すなわち、生存細胞はＤＡＰＩ染色について陰性である）。

次に、標的細胞（例えば、ＭＶ４−１１）の細胞溶解パーセントが、以下の式を使用して決定された：
細胞溶解パーセント＝（１−（（試験試料における標的細胞の総数）÷（対照試料における標的細胞の総数））×１００；
式中、試験試料は、１）ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ３３ＣＡＲ＋Ｔ細胞；又は２）ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／ＣＤ３３ＣＡＲ＋Ｔ細胞と共培養された標的細胞（例えば、ＭＶ４−１１細胞）であり、且つ
対照試料は、共培養されていない単独の標的細胞であった。

抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞の両方の集団は、効率的にＭＶ４−１１細胞を死滅させ、０．５ＣＡＲＴ細胞：ＭＶ４−１１細胞の比率でほぼ１００％の細胞の死滅に達したが、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−／ＣＤ３３ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、より低いＣＡＲＴと癌細胞の比率でより高い細胞の死滅を実証した（図１８）。これらのデータは、追加のＣＤ７０ノックアウトを有する異質遺伝子型の抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞が、より低いＣＡＲＴ細胞と標的細胞の比率でより効果的であることを実証している。

ＣＤ７０ノックアウトを有する抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞の細胞を死滅させる機能
細胞死滅アッセイを使用して、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋細胞及びＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋細胞のＣＤ７０^＋接着腎細胞癌（ＲＣＣ）由来細胞株（Ａ４９８細胞）を死滅させる能力を評価した。接着細胞を、ウェル当たり５０，０００細胞で９６ウェル中に播種し、３７℃で一晩置いた。翌日、編集された抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞を、指定の比率で標的細胞を含有するウェルに加えた。指定されたインキュベーション期間の後、ＣＡＲＴ細胞を、吸引によって培養物から除去し、１００μＬのＣｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をプレートの各ウェルに加えて、残留している生存細胞の数を評価した。次に、ウェル当たりの放出された光の量を、プレートリーダーを使用して定量化した。細胞は、２４時間の共インキュベーション後にＲＣＣ由来細胞の強力な細胞の死滅を示した（図１９）。抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ７０がノックアウトされた場合により高い効力を示したが、これは、低いＴ細胞：Ａ４９８比（１：１及び０．５：１）で明白に目に見え、ここで、細胞溶解は、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋については９０％を超えたままであるが、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋については細胞溶解が９０％未満に落ちる。このことは、ＣＤ７０遺伝子をノックアウトすることが、抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞により高い細胞死滅の能力をもたらすことを示唆する。

実施例６．インビトロでのＣＤ７０欠損ＣＡＲＴ細胞の再チャレンジ
ＣＤ７０ノックアウトは、連続的な再チャレンジ時に抗ＣＤ３３ＣＡＲ＋Ｔによる細胞の死滅を増進する
抗原発現細胞（例えば：標的細胞）によるチャレンジ及び再チャレンジ後に細胞の増殖する能力を評価するため、抗ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞が、実施例３において記載されるとおりに生成され、且つ利用された。具体的には、合計５×１０^６個のＴ細胞が、５×１０^６個の照射された標的細胞（ＭＶ−４−１１）の存在下で蒔かれ、１０ｍＬ体積において増殖させられた。１週間後、細胞は計数され、続いて、前の培養物からの５×１０^６細胞が、新鮮な一定分量の５×１０^６個の照射された標的細胞とともに１０ｍＬ体積において再度蒔かれ、１週間後に細胞の総数が数え上げられた。この工程が示されるとおりに繰り返され、各再チャレンジは５×１０^６細胞で開始された。生存細胞の数は、実施例２において示されるとおりに計数された。ＣＤ７０遺伝子における破壊を含有する異質遺伝子型抗ＣＤ３３ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＭＶ−４−１１細胞による２回のチャレンジの後の第２週においてより高いレベルまで増殖した（図２０）。これらのデータは、ＣＤ７０が、抗原発現細胞の存在下でＴ細胞増殖を制限でき、その減少が、抗原刺激後により高い細胞増殖をもたらすことができることを示す。

ＣＤ７０ノックアウトは、連続的な再チャレンジ時に抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔによる細胞の死滅を増進する
抗原発現細胞（例えば：標的細胞）によるチャレンジ及び再チャレンジ後に細胞の増殖する能力をさらに評価するため、抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞が、実施例３において記載されるとおりに生成され、且つ利用された。具体的には、合計５×１０^６個のＴ細胞が、５×１０^６個の照射された標的細胞（Ｎａｌｍ６）の存在下で蒔かれ、１０ｍＬ体積において増殖させられた。１週間後、細胞は計数され、続いて、前の培養物からの５×１０^６細胞が、新鮮な一定分量の５×１０^６個の照射された標的細胞とともに１０ｍＬ体積において再度蒔かれ、１週間後に細胞の総数が数え上げられた。この工程が示されるとおりに繰り返され、各再チャレンジは５×１０^６細胞で開始された。生存細胞の数は、実施例２において示されるとおりに計数された。ＣＤ７０遺伝子における破壊を含有する異質遺伝子型抗ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞は、最初の２回のチャレンジ中に同様の量まで増殖した。しかしながら、３回のチャレンジで、ＣＤ７０遺伝子における破壊を含有する異質遺伝子型抗ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｎａｌｍ６細胞による３回目のチャレンジにおいてより高いレベルまで増殖した（図２１）。これらのデータは、ＣＤ７０の存在が、抗原発現細胞の存在下でＴ細胞増殖を制限でき、その減少が、繰り返された抗原刺激後により高い細胞増殖をもたらすことができることを示す。

ＣＤ７０、又はＰＤ−１とＣＤ７０のノックアウトは、連続的な再チャレンジ時に抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔによる細胞の死滅を維持する
上で生成された抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＣＤ７０＋腎臓癌細胞株Ａ４９８で連続的に再チャレンジされ、それらのＣＤ７０＋腎臓癌細胞株Ａ４９８又はＡＣＨＮを死滅させる能力について評価された。

Ａ４９８細胞は、Ｔ２５フラスコ中に蒔かれ、２つ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）、３つ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻）若しくは（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻））、又は４つ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻）のｇＲＮＡ編集のいずれかを含有する１０×１０^６個の抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞とともに２：１（Ｔ細胞対Ａ４９８）の比で混合された。

各チャレンジの２日又は３日後、細胞は計数され、洗浄され、新鮮なＴ細胞培地中で再懸濁され、１個のＡ４９８細胞当たり２個の抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の同じ比（２：１、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞：標的）で翌日に再チャレンジされた。ＣＤ７０＋Ａ４９８細胞による抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋ ^Ｔ細胞のチャレンジは、１３回繰り返された。Ａ４９８細胞に対するそれぞれの暴露の後の３〜４日後（及び次の再チャレンジの前）、一定分量の培養物を採取し、２：１（ＣＡＲＴ細胞：標的細胞）の比でＡ４９８又はＡＣＨＮ標的細胞を死滅させるＣＡＲＴ細胞の能力について分析した。細胞の死滅は、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定された。Ａ４９８による最初のチャレンジの前、２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０）、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻）、及び４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻）を有する抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞はそれぞれ、１００％に近づくＡ４９８細胞の標的細胞死滅を示した。しかしながら、チャレンジ９までに、２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）及び３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻）抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、Ａ４９８細胞の標的細胞死滅を４０％未満に誘導したが、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０）及び４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻）抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、６０％を超える標的細胞の死滅を示した（図２２Ａ）。３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０）及び４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻）抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞に関する標的細胞の死滅は、Ａ４９８細胞による１３回の再チャレンジ後でさえ６０％を超えたままであり、これらのＣＡＲ＋Ｔ細胞が枯渇に耐性であると実証している。

抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞はまた、Ａ４９８腎癌細胞による連続的な再チャレンジの後に２：１（Ｔ細胞対ＡＣＨＮ）の比でＡＣＨＮ細胞を死滅させるそれらの能力について評価された（図２２Ｂ）。Ａ４９８による最初のチャレンジの前に、二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ、三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔはそれぞれ、６２％、４７％、７３％及び８１％を超える死滅の効率を示した。

チャレンジ５の後、三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞は依然として、２：１（Ｔ細胞対ＡＣＨＮ）の比で５５％を超えるＡＣＨＮ細胞を効率的に死滅させたが、二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔによる細胞死滅は、１１％未満のＡＣＨＮ細胞に落ちた。この傾向は継続したが、二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、１０回の再チャレンジを超えて生存できなかった。対照的に、三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、培養物中で増殖し続け、且つ２回の再チャレンジの後に２：１（Ｔ細胞対ＡＣＨＮ）の比で３０％を超えるＡＣＨＮ細胞を死滅させ続けた。

データは、４ｘＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び３ｘＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋細胞が、２ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ又は３ＸＫＯ（ＰＤ１）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞より強力であることを実証している。加えて、３Ｘ（ＣＤ７０）ＫＯ及び４ＸＫＯは、Ｔ細胞枯渇を防ぐ。

５回の再チャレンジの後、細胞は、癌細胞を死滅させるそれらの能力について評価された。驚くべきことに、３ＫＯ及び４ＫＯ抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、複数回の癌細胞チャレンジの後でさえ、癌細胞を死滅させる際に非常に有効なままであった（図２３Ａ）。ＡＣＨＮ細胞に対する抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞死滅効果は、１：１、０．５：１、及び０．２５：１の減少したエフェクター対標的細胞比でさえ再現性がある。（図２３Ａ）。

ＣＡＲＴ治療時の長期間の利益を確実にするため、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＡＲ−Ｔに媒介される細胞の死滅から癌細胞が脱出する可能性を除外するために、長期間にわたってそれらの標的細胞を同定し、且つ根絶することができるべきである。インビトロでの再チャレンジアッセイは、複数のサイクルのＣＡＲ−Ｔ細胞活性化にわたる標的細胞とＣＡＲ−Ｔ細胞の反復性の遭遇を模倣する。これらのデータは、二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と比較して、それらの標的細胞を死滅させる能力の低減を示すことなく、腎臓癌細胞による複数回のチャレンジを持続する際の三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の優位性を実証している。

枯渇及び活性化マーカーはまた、再チャレンジ後の抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞においてフローサイトメトリーによって測定された。８回のチャレンジの後、三重（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）及び四重（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／ＣＤ７０−）ＫＯ抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、それらの高い細胞死滅活性のレベルと一致して、二重（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）及び四重（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／ＣＤ７０−）ＫＯ抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞より高い活性化マーカーＬＡＧ３の発現を示した。三重（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞（三重（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−）及び四重（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／ＣＤ７０−）ＫＯ抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞と同様）において、二重（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して、ＰＤ１の発現が低いことが観察されたが、これは、ＣＤ７０をノックアウトすることが、抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞における枯渇マーカーＰＤ１発現の下方制御に効果を及ぼすことを示唆している。（図２３Ｂ）。

ＰＤ−１及びＣＤ７０のノックアウトは、連続的な再チャレンジ時に抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔによる細胞の死滅を維持する
実施例３に記載されるとおりに生成される抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞は、連続的に再チャレンジされ、且つＢＣＭＡ＋多発性骨髄腫細胞株ＭＭ．１Ｓ（ＡＴＣＣＣＲＬ−２９７４）を死滅させるそれらの能力について評価された。ＣＡＲ結合を介する連続的なＴ細胞活性化時にサイトカインを分泌する能力もまた、各再チャレンジの後に測定された。ＭＭ．１Ｓ細胞は、５μＭｅＦｌｏｕｒ６７０で標識され、２つ（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻）又は４つ（（ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻）のｇＲＮＡ編集のいずれかを含有する１×１０^６個の抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞を有する６ウェルの組織培養皿において２：１（ＭＭ．１Ｓ対Ｔ細胞）の比で混合された。ＭＭ．１Ｓ細胞に対する暴露の１日後、一定分量の培養物を採取し、ＣＡＲ−Ｔ細胞による標的細胞の死滅及びＩＦＮ−ｇ分泌の両方について分析した。サイトカイン放出を測定するため、Ｔ細胞及び標的細胞を、指定の比で２４時間共インキュベートした。上清培地を、製造業者の指示書（ＲＤＳｙｓｔｅｍｓ）に従って新しいプレート上でのＩＬ−２又はＩＦＮγＥＬＩＳＡ（ＲＤＳｙｓｔｅｍｓ）における使用のために回収した。細胞の死滅を定量するため、細胞は洗浄され、培地は、５ｍｇ／ｍＬＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）の１：５００希釈物を含有する２００μＬの培地で置き換えられた（死／瀕死細胞を数え上げるため）。最後に、２５ｍＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、各ウェルに加えた。次に、細胞は、フローサイトメトリーによって処理された。
１）細胞／ｍＬ＝（（生存標的細胞イベントの数）／（ビーズイベントの数））ｘ（（ロットの割り当てられたビーズカウント（ビーズ／５０μＬ））／（試料の体積））
２）合計の標的細胞は、細胞／ｍＬに細胞の総体積を掛けることによって計算された。
３）次に、細胞溶解のパーセントが、以下の式：
％細胞溶解＝（１−（（試験試料中の標的細胞の総数）／（対照試料中の標的細胞の総数））×１００
により計算された。

各チャレンジの２日又は３日後、細胞は計数され、洗浄され、新鮮なＴ細胞培地中で再懸濁され、２つのｅＦｌｏｕｒ６７０で標識されたＭＭ．１Ｓ細胞当たり１つの抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞の同じ比で再チャレンジされた。ＢＣＭＡ＋ＭＭ．１Ｓ細胞による抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞のチャレンジは、連続的に１０回繰り返された。ＭＭ．１Ｓ細胞による任意のチャレンジの前に、２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−）又は４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−／ＰＤ−１−）抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞のいずれかとＭＭ．１Ｓ細胞の共インキュベーションが、標的細胞の完全な死滅をもたらした。

さらに、２ＸＫＯ及び４ＸＫＯ抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞の両方によるＩＦＮγ産生は同様であった。しかしながら、ＭＭ．１Ｓ細胞による４回目の再チャレンジの後、２ＸＫＯ抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞による標的細胞の死滅及びＩＦＮγ産生は、４ＸＫＯ抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞により誘導されるものと比較して減少した。８回目の再チャレンジまで、標的細胞の死滅は、２ＸＫＯ抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞についてはほんのおよそ２０％であったが、４ＸＫＯ抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞によるＩＦＮｇ及び標的細胞の死滅の両方は、ＭＭ．１Ｓ細胞によるいずれかのチャレンジの前に見られるものに匹敵したままであった（図２４Ａ〜２４Ｂ）。加えて、四重ノックアウト抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞は、標的細胞に対する暴露に応答してより高い増殖を示した（図２４Ｃ）。

ＣＡＲＴ治療時の長期間の利益を確実にするため、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＡＲ−Ｔに媒介される細胞の死滅から癌細胞が脱出する可能性を除外するために、長期間にわたってそれらの標的細胞を同定し、且つ根絶することができるべきである。インビトロでの再チャレンジアッセイは、複数のサイクルのＣＡＲ−Ｔ細胞活性化にわたる標的細胞とＣＡＲ−Ｔ細胞の反復性の遭遇を模倣し、したがって、二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞と比較して、細胞を死滅させる能力の低減を示すことなく、標的細胞による複数回のチャレンジを持続する際の４ＸノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞の優位性を実証している（図２４Ａ〜２４Ｃ）。

実施例７．ＣＤ７０ＫＯは、過剰な阻害分子の課題を克服する
多重ノックアウト抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞のＡ４９８−ＰＤ−Ｌ１腎癌細胞への効果の比較
細胞死滅アッセイ。多重に遺伝子編集された抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋細胞のＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＡ４９８腎癌細胞を死滅させる能力は、本明細書に記載される細胞死滅アッセイを使用して判定された。ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４）を過剰発現する細胞を作製するため、Ａ４９８細胞を、ＰＤ−Ｌ１ｃＤＮＡ及びピューロマイシン耐性遺伝子をコードするレンチウイルス（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）で感染させた。ピューロマイシンによる選択の後、細胞を抗ＰＤ−Ｌ１抗体で染色して、ＰＤ−Ｌ１の発現を評価した。ＰＤ−Ｌ１を発現するＡ４９８細胞は、Ａ４９８−ＰＤ−Ｌ１とも呼ばれ、記載される機能アッセイにおいて使用された。

ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（２ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（３ＸＫＯ（ＰＤ−１）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）及びＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）Ｔ細胞を、２：１（図２５Ａ）、１：１（図２５Ｂ）、又は０．５：１（図２５Ｃ）のＣＡＲＴ細胞：Ａ４９８−ＰＤ−Ｌ１標的細胞比でＡ４９８−ＰＤ−Ｌ１細胞とともにインキュベートした。ＣＤ７０ノックアウト細胞は、２４時間の共インキュベーション後にＲＣＣ由来細胞の強力な細胞の死滅を示した（図２５Ａ〜２５Ｃ）。ＰＤ１単独のノックアウトを有する細胞は、ＰＤ−Ｌ１過剰発現の存在下で細胞を効率的に溶解しなかった。しかしながら、ＣＤ７０ノックアウトは、ＰＤ１ノックアウトをレスキューすることができ、増強された細胞溶解が、ＣＤ７０ＫＯ及びＰＤ１ＫＯを有するＣＡＲＴ細胞において観察された。これらのデータは、これらのＣＡＲ−Ｔ細胞の表面上でのＣＤ７０の消失が、ＰＤ−Ｌ１などの腫瘍細胞により発現される高度に免疫抑制性の分子の存在下でさえそれらの機能を増強することを実証している。

サイトカイン放出アッセイ。サイトカイン放出アッセイは、本明細書に記載されるとおりに実施された。１：１の比（ＣＡＲＴ細胞：Ａ９４８−ＰＤ−Ｌ１標的細胞）での２４時間の共インキュベーション後にＡ９４８−ＰＤ−Ｌ１細胞の存在下で共培養された場合の二重ノックアウト、三重ノックアウト、及び四重ノックアウト抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇを産生する能力は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価された。細胞共培養物の上清に由来するＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇが測定された。四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、Ａ９４８−ＰＤ−Ｌ１細胞と培養されたときに最も高いレベルのＩＦＮ−ｇ（図２６Ａ）及びＩＬ−２（図２６Ｂ）を分泌した。これらのデータは、ＣＤ７０のノックアウトが、ＰＤ−Ｌ１などの腫瘍細胞により発現される高度に免疫抑制性の分子の存在下でさえＣＡＲ−Ｔ細胞のサイトカイン分泌を増強することを実証している。ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＰＤ−１のノックアウトと合わせたＣＤ７０のノックアウトはさらに、その効果を増強する。理論に束縛されるものではないが、抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞においてＣＤ７０をノックアウトすることは、他の細胞ノックアウト（例えば、ＰＤ１）の有害な表現型をレスキューできると考えられる。これらのデータは、ＣＡＲＴ細胞においてＣＤ７０をノックアウトすることが、高度に免疫抑制性の状況において標的細胞の死滅及びＣＡＲＴ機能を増強することを実証している。

実施例８．ＣＤ７０ノックアウトはインビボ有効性を向上させる
抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞におけるＣＤ７０及びＰＤ１ノックアウトの有効性：ＮＯＧマウスにおける皮下腎細胞癌腫瘍異種移植モデル
小型の腫瘍モデルにおける治療
高レベルのＣＤ７０を発現する腎癌細胞を除去するＣＤ７０ＣＡＲを発現するＴ細胞の能力は、マウスにおける皮下腎細胞癌（Ａ４９８）腫瘍異種移植モデルを使用してインビボで評価された。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６を、上のとおりに使用して（例えば、実施例３を参照のこと）、ＣＤ７０を標的化するＣＡＲコンストラクト（配列番号４５；配列番号４６）を使用してＴＲＡＣ座位からの同時の発現を伴ってＴＣＲ、β２Ｍ、ＣＤ７０及び／又はＰＤ１の発現を欠くヒトＴ細胞を作製した。この実施例において、活性化Ｔ細胞はまず、ＴＲＡＣ（配列番号４０）、β２Ｍ（配列番号４１）、ＰＤ１（配列番号４２）、及びＣＤ７０（配列番号３６又は３７）を標的化するｓｇＲＮＡを含有する２、３、又は４種の異なるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ複合体により電気穿孔された。ＴＲＡＣ座位でのＤＮＡ二重鎖切断は、キメラ抗原受容体カセット（遺伝子発現に関する−／＋調節エレメント）に隣接するＴＲＡＣ座位に対して右及び左の相同性アームを含有するドナー鋳型（配列番号４４；配列番号４５）（配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ＣＡＲをコードする）を含むＡＡＶ６に送達されるＤＮＡ鋳型による相同組換え修復によって修復された。

結果として得られる改変Ｔ細胞は、２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−又はＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）及び４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋（４１ＢＢ共刺激ドメインを有する）Ｔ細胞である。ＣＤ７０＋腎癌細胞株によって引き起こされる疾患を回復させるこれらの抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力は、ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）によって利用される方法を使用して、ＮＯＧマウスにおいて評価された。簡潔には、１２頭の５〜８週齢雌、ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスは、試験の開始の５〜７日前に病原体を含まない条件下で維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育された。マウスは、右後側腹部において５×１０^６個のＡ４９８腎癌細胞／マウスの皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、２５〜７５ｍｍ^３（約５０ｍｍ^３の標的）に達したとき、マウスはさらに、表１５に示されるとおりの５つの治療群に分けられた。１日目、治療群２〜５は、表１５に従って、単回の２００μｌの静注投与量の抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受容した。

腫瘍体積は、治療開始日から週に２回測定された。９１日目までの試験の期間中において、５日目までに、抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞の４種全ての治療は、腫瘍体積の減少を示し始め、２２日までに、抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞の４種全てが、ＣＤ７０＋腎臓癌腫瘍を完全に除去した（図２７Ａ）。これらのデータは、４種全ての抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞が、インビボでＣＤ７０＋腎臓癌腫瘍を退行させることができることを実証している。

再チャレンジ後の抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞の活性を試験するため、生存しているマウスの左後側腹部の皮下において、２５日目に５×１０^６個のＡ４９８腎癌細胞／マウスを接種した。（表１６）。持続性の有効性は、４６日目以降から評価された。結果は、図２７Ｂにおいて示される。５６日目において、２Ｘ、ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞で治療された５頭のマウスのうちの５頭が、再チャレンジ後に腫瘍の再増殖を示し、３Ｘ（ＰＤ１）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞で治療された５頭のマウスのうちの４頭が、再チャレンジ後に腫瘍の再増殖を示し、４Ｘ（ＣＤ７０、ＰＤ１）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞で治療された５頭のマウスのうちの２頭が、再チャレンジ後に腫瘍の再増殖を示したが、３Ｘ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞で治療されたマウスは、再チャレンジ後に腫瘍の再増殖を示さなかった。この傾向は継続したが、７０日目において、３Ｘ（ＰＤ１）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞で治療された５頭のマウスのうちの４頭は、再チャレンジ後に腫瘍の再増殖を示し、４Ｘ（ＣＤ７０、ＰＤ１）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞で治療された５頭のマウスのうちの４頭は、再チャレンジ後に腫瘍の再増殖を示したが、３Ｘ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞で治療されたマウスのうちの１頭だけは、再チャレンジ後の３４日目に現れ始めた小規模な腫瘍の再増殖を示した。９１日目からも、３Ｘ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞で治療された５頭のマウスのうちの１頭だけが、腫瘍の再増殖を示し始めたが、これは、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が、腫瘍細胞への再曝露後のより高いインビボでの有効性を保持することを示している。

大型の腫瘍モデルにおける治療
より大型の腎細胞癌腫瘍に対する抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞のインビボでの有効性が調査された。上のとおり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６を使用して、ＣＤ７０を標的化するＣＡＲコンストラクト（配列番号４５）を使用してＴＲＡＣ座位からの同時の発現を伴ってＴＣＲ、β２Ｍ、ＣＤ７０及び／又はＰＤ１の発現を欠くヒトＴ細胞を作製した。この実施例において、活性化Ｔ細胞はまず、ＴＲＡＣ（配列番号４０）、β２Ｍ（配列番号４１）、ＰＤ１（配列番号４２）、及びＣＤ７０（配列番号３６又は３７）を標的化するｓｇＲＮＡを含有する２、３、又は４種の異なるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ複合体により電気穿孔された。ＴＲＡＣ座位でのＤＮＡ二重鎖切断は、キメラ抗原受容体カセット（遺伝子発現に関する−／＋調節エレメント）に隣接するＴＲＡＣ座位に対して右及び左の相同性アームを含有するＡＡＶ６に送達されるＤＮＡ鋳型（配列番号４３）（配列番号５のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ＣＡＲをコードする）による相同組換え修復によって修復された。

結果として得られる改変Ｔ細胞は、２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−又はＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）及び４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋（４１ＢＢ共刺激ドメインを有する）Ｔ細胞である。ＣＤ７０＋腎癌細胞株によって引き起こされる疾患を回復させるこれらの抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力は、ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）によって利用される方法を使用して、ＮＯＧマウスにおいて評価された。簡潔には、１２頭の５〜８週齢雌マウス、ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）は、試験の開始の５〜７日前に病原体を含まない条件下で維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育された。マウスは、５×１０^６個のＡ４９８腎癌細胞／マウスの皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、１２５〜１７５ｍｍ^３（約１５０ｍｍ^３の標的）に達したとき、マウスはさらに、表１７に示されるとおりの５つの治療群に分けられた。１日目、治療群２〜５は、表１７に従って、単回の２００μｌの静注投与量の抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受容した。

腫瘍体積は、治療開始日から週に２回測定された。４日目の治療までに、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞及び４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞のみが、腫瘍体積における減少を示し始めた（図２７Ｃ）。対照的に、２ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞又は３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞で治療された動物についての腫瘍増殖は、治療しない群と同様であった。２３日目の治療までに、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、インビボでＣＤ７０＋腎臓癌腫瘍を完全に除去した。２３日目の治療までに、４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞に応答した腫瘍の除去は、ほぼ完全であり、５頭のマウスのうちの４頭が、インビボで検出可能な腎臓癌腫瘍を示さなかった。

これらのデータは、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞及び４ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、インビボで大型のＣＤ７０＋腎臓癌腫瘍を著しく退行させることができることを示す。

ＰＤ１、ＣＤ７０、及びＣＤ７０ノックアウトを伴うＰＤ１の文脈における抗ＢＣＭＡＣＡＲに関するインビボ腫瘍モデル
ＮＯＧマウスにおける皮下ＭＭ．１Ｓ腫瘍異種移植モデルに対するＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ共刺激）ＣＡＲ＋Ｔ細胞、ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ−１−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ共刺激）、ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ共刺激）、及びＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ−１−／ＣＤ７０−／抗ＢＣＭＡ（４−１ＢＢ共刺激）ＣＡＲ＋Ｔ細胞の有効性が評価された。簡潔には、２５頭の５〜８週齢雌、ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスは、試験の開始の５〜７日前に病原体を含まない条件下で維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育された。１日目において、２５頭のマウスは、５０％マトリゲル／マウス中にある５×１０^６個のＭＭ．１Ｓ細胞の右側腹部における皮下接種を受けた。平均腫瘍体積が、７５と１２５ｍｍ^３の間に達したとき、マウスは、５つの治療群（Ｎ＝５）に分けられ、表１８に示されるとおりの約５０％の抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を投与された。

腫瘍体積及び体重は、週に２回測定され、個々のマウスは、それらの腫瘍体積が≧２０００ｍｍ^３に達したときに安楽死させられた。

１６日目までに、全ての治療群は、開始の体積からの腫瘍退縮を示したが、対照群における動物は、平均して１５００ｍｍ^３より大きい腫瘍を有した。２７日目までに、対照群における全ての動物は、≧２０００ｍｍ^３の腫瘍体積の終点に達したが、全ての治療群は、２０ｍｍ^３未満の平均腫瘍体積を有した（図２８Ａ）。４５日目において、治療群（群２〜５）からの全てのマウスはさらに、２回目の腫瘍チャレンジ（再チャレンジ）にかけられた。マウスは、５０％マトリゲル／マウス中にある５×１０^６個のＭＭ．１Ｓ細胞の左側腹部における２回目の皮下接種を受けた。対照マウスの新たな群が登録され（Ｎ＝５）、また、左側腹部において５０％マトリゲル／マウス中にある５×１０^６個のＭＭ．１Ｓ細胞の接種を受けた。

全てのマウスは、最初の右側腹部腫瘍及び左側腹部における再チャレンジ腫瘍の両方において腫瘍増殖についてモニターされた。全ての治療群は、大部分の対象における最初の右側腹部腫瘍における腫瘍増殖を順調に阻害した（図２８Ａ；表１９）。腫瘍増殖は、７７日目までの実験期間の腫瘍再チャレンジの前及び後の両方での全ての治療によって阻害された。ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／ＰＤ１−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔで治療されたただ１つの対象が、最初の癌細胞チャレンジから腫瘍増殖を示した（表１９）。

驚くべきことに、左側腹部における再チャレンジの後の腫瘍増殖もまた、再チャレンジの日（４５日目）から７７日目までの全ての治療群によって著しく阻害された（図２８Ｂ；表１９）。これらのデータは、ＣＡＲ＋Ｔ細胞がインビボで持続して初期の腫瘍増殖を阻害し、さらに追加の癌細胞による再チャレンジ後には、これらのマウスにさらなるＣＡＲ−Ｔ細胞が送達されなかったにもかかわらず、新たな腫瘍の増殖を阻害することを実証している。例えば、ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞の集団で最初に治療された４頭のマウスのうちの３頭、ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞で最初に治療された５頭のマウスのうちの３頭、及びＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞で最初に治療された５頭のマウスのうちの３頭は、新たな癌細胞に対する２回目のチャレンジ（再チャレンジ）にもかかわらず新たな腫瘍増殖を示さなかった。これらのデータは、予想に反して、抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞が、インビボで長期間、例えば、注射後少なくとも７７日目まで持続でき、腫瘍細胞増殖を阻害し、且つインビボで長期間腫瘍体積を減少させるそれらの能力を保持することを実証している。これらの驚くべき結果は、そのようなＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞の使用が、インビボで優れた長期間の抗癌効果を達成することになることを示している。

ヒトＣＤ４５＋細胞は、製造業者のプロトコルに従ってＢＤＴｒｕｃｏｕｎｔチューブを使用してマウス血液から定量化され、且つＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ７８６コンジュゲート抗ヒトＣＤ４５（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄＣａｔ＃３６８５２８）を使用して検出された。全ての群は、１週目に１００個のｈｕＣＤ４５＋細胞／μｌ未満の値を示した。投与の２週間後、全ての群における循環しているＣＤ４５＋の数は、３週目までに前の１週目の値に落ちる前にピークになった（図２９）。４５日目の再チャレンジ時において、抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞で治療された対象は、癌の再チャレンジ後に循環しているＣＡＲＴ細胞のその後の増殖を伴わずに腫瘍増殖を除去するか又は阻害することができた。これらのデータはさらに、予想に反して、抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞が、インビボで長期間、例えば、注射後少なくとも７７日目まで持続でき、腫瘍細胞増殖を阻害し、且つインビボで長期間腫瘍体積を減少させるそれらの能力を保持することを実証している。これらの驚くべき結果は、ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞、ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞及びＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞の使用が、インビボで優れた長期間の抗癌効果を達成することになることを示している。

ＣＤ７０ノックアウトの文脈における抗ＢＣＭＡＣＡＲについてのインビボ腫瘍モデル：中程度のＣＡＲＴ投与に対するＣＤ７０ＫＯの効果
ＣＤ７０ノックアウトを伴うもの及び伴わないものの両方のいくつかの抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞遺伝子型の有効性は、ＮＯＧマウスにおける皮下ＲＰＭＩ−８２２６腫瘍異種移植モデルに対して評価された。簡潔には、８５頭の５〜８週齢雌、ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスは、試験の開始の５〜７日前に病原体を含まない条件下で維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育された。１目において、マウスは、１０×１０^６個のＲＰＭＩ−８２２６細胞の皮下接種を受けた。ＲＰＭＩ−８２２６細胞による摂取の１０日後、マウスは、１７種の治療群（Ｎ＝５）に分けられ、表２０に示されるとおりの約８０％の抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を投与された。

腫瘍体積及び体重は、週に２回測定され、個々のマウスは、腫瘍体積が≧２０００ｍｍ^３であったときに安楽死させられた。２２日までに、データは、１００，０００細胞で投与された任意の抗ＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞遺伝子型と比較して、より高い用量の抗ＢＣＭＡＣＡＲＴＴ細胞（１×１０^５〜３×１０^６細胞用量）に応答して腫瘍体積における統計的に有意な減少を示す（群５、９、１３及び１７）（図３０；表２１）。

３６日目において、３×１０^５細胞の中程度の用量で投与されたＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＣＤ７０ＫＯを伴わない抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞（例えば、ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞、ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞、又はＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＰＤ１−／ＣＤ７０−／抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞）より腫瘍体積を減少させることに対してより大きい効果を示した。１×１０^６個以上の全ての抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞のより高い用量の全て（図３０；１００万、３００万）は、腫瘍体積の完全な退縮を示した。この傾向は、試験の５７日目からも継続した。

これらの結果は、ＣＤ７０の活性を阻害すること（例えば、ＣＤ７０をノックアウトすることによる）は、インビボでＣＡＲ^＋Ｔ細胞の有効性及び効力を増加させる。この効果は、抗ＣＤ７０ＣＡＲの存在に依存しない。

実施例９．多重ノックアウトＣＡＲＴ細胞は、サイトカイン依存性を保持する
サイトカイン依存性。遺伝子編集が、制御されない細胞増殖などの有害な特性を有する細胞を生成し得る望まれないオフターゲット編集をもたらしたかどうかを判定するため、サイトカイン及び／又は血清の非存在下で増殖する遺伝子編集されたＣＡＲＴ細胞の能力が評価された。

抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞：サイトカイン及び／又は血清の非存在下で増殖するＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋細胞の能力が評価された。５×１０^６個のＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋細胞が、細胞生産の約２週間後に蒔かれた（０日目）。生存細胞の数は、完全培地、サイトカイン（ＩＬ−２及びＩＬ−７）を伴わない５％ヒト血清、又は血清及びサイトカインを欠く基本培地のいずれかにおいて蒔いた７日及び１４日後に数え上げられた。サイトカインを欠いた培養物において蒔かれた細胞は１４日目に検出されなかったが、これは、ゲノム編集によるいずれかの潜在的なオフターゲット効果が、細胞に対して増殖因子非依存性の成長／増殖を誘導しなかったことを示唆している（図３１）。細胞は、サイトカインの存在下（サイトカインを含有する完全培地）でのみ増殖し、血清単独の存在下では増殖しなかった。したがって、インビボでは、サイトカイン、増殖因子又は抗原刺激の非存在下では、任意のオフターゲットゲノム編集のために細胞は増殖しない可能性がある。

サイトカイン及び／又は血清の非存在下で増殖するＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／ＰＤ１⁻抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋細胞の能力もまた評価された。２×１０^６細胞が、細胞生産の約２週間後に蒔かれた（０日目）。生存細胞の数は、完全培地、サイトカイン（ＩＬ−２及びＩＬ−７）を伴わない５％ヒト血清、又は血清及びサイトカインを欠く基本培地のいずれかにおいて蒔いた２６日後まで数え上げられた。サイトカインを欠いた培養物において蒔かれた細胞は２６日目に検出されなかったが、これは、ゲノム編集によるいずれかの潜在的なオフターゲット効果が、細胞に対して増殖因子非依存性の成長／増殖を誘導しなかったことを示唆している（図３２）。細胞は、サイトカインの存在下（サイトカインを含有する完全培地）でのみ増殖し、血清単独の存在下では増殖しなかった。したがって、ゲノム編集は、細胞がサイトカイン、増殖因子又は抗原刺激の非存在下で増殖することを可能にする任意の有害事象を誘導しなかった。

抗ＢＣＭＡＣＡＲ＋Ｔ細胞：サイトカイン及び／又は血清の非存在下で増殖するＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／ＰＤ−１⁻抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋細胞の能力が評価された。ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＢＣＭＡＣＡＲ^＋細胞はまた、４ＸＫＯ、ＢＣＭＡＣＡＲ^＋細胞とも呼ばれる。１×１０^６個の４ＸＫＯ、ＢＣＭＡＣＡＲ＋細胞が、実施例６において記載される１０回の再チャレンジ後に蒔かれた。生存細胞の数は、完全培地、サイトカイン（ＩＬ−２及びＩＬ−７）を伴わない５％ヒト血清、又は血清及びサイトカインを欠く基本培地のいずれかにおいて蒔いた７日及び１４日後に数え上げられた。サイトカインを欠いた培養物において蒔かれた細胞は１３日目に検出されなかったが、これは、ゲノム編集によるいずれかの潜在的なオフターゲット効果が、細胞に対して増殖因子非依存性の成長／増殖を誘導しなかったことを示唆している（図３３）。細胞は、サイトカインの存在下（サイトカインを含有する完全培地）でのみ増殖し、血清単独の存在下では増殖しなかった。したがって、インビボにおいて、細胞は、制御されない様式で増殖しない可能性がある。

他のＣＡＲＴ細胞：本明細書で例示される抗ＣＤ３３ＣＡＲ＋Ｔ細胞及び抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、サイトカインの存在下でのみ増殖し、且つ血清単独の存在下で増殖しないことが以前に示されている。したがって、インビボにおいて、これらの細胞は、制御されない様式で増殖しない可能性がある。

サイトカイン放出アッセイ。サイトカイン放出を測定するため、Ｔ細胞及び標的細胞を、指定の比で２４時間共インキュベートした。上清培地を、製造業者の指示書（ＲＤＳｙｓｔｅｍｓ）に従って新しいプレート上でのＩＬ−２又はＩＦＮγＥＬＩＳＡ（ＲＤＳｙｓｔｅｍｓ）における使用のために回収した。

Ａ４９８細胞の存在下で共培養されたときにインターロイキン−２（ＩＬ−２）を産生するＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋細胞の能力は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して分析された。三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の両方が、高レベルのＩＬ−２を分泌した。際だったことに、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋細胞は、Ａ４９８細胞と培養されたときにＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋細胞より高いレベルのＩＬ−２を分泌した（図３４）。これらの結果は、ＣＤ７０遺伝子をノックアウトすることが、抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞により多くのＩＬ−２を分泌する優位性をもたらすことを示唆する。

実施例１０．Ａ４９８腎癌細胞における抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞に対する多重ノックアウトの効果
抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の機能に対する多重ノックアウトの効果
細胞死滅アッセイ。Ａ４９８腎癌細胞を死滅させる多重遺伝子編集の能力は、上記の細胞死滅アッセイを使用して判定された。簡潔には、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（２ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（３ＸＫＯ（ＰＤ−１）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）及びＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）細胞を、様々なＣＡＲＴ細胞：Ａ４９８標的細胞比でＣＤ７０^＋接着ＲＣＣ由来細胞株（Ａ４９８細胞）とインキュベートした。

ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋細胞は、２４時間の共インキュベーション後にＲＣＣ由来細胞の強力な細胞の死滅を示した（図３５）。四重ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔは、二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞より高い能力を実証した三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞より高い細胞死滅の能力を実証した（０．５：１及び０．２５：１の低いＴ細胞：Ａ４９８比で目に見える）。結果は、ＣＤ７０及びＰＤ−１遺伝子の両方をノックアウトすることが、抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞により高い細胞死滅の能力を与えたことを実証している。

遺伝子編集された細胞はまた、０．２４：１のＣＡＲＴ細胞：Ａ９４８標的細胞比での２４時間の共インキュベーション後にＲＣＣ由来細胞の強力な細胞死滅を示した。（図３６）。具体的には、三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、二重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞又は三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞より高い能力を実証した。これらのデータは、抗ＣＤ７０ＣＡＲの文脈におけるＣＤ７０のノックアウトが、抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の細胞を死滅させる能力を向上させたことを示す。

サイトカイン放出アッセイ。サイトカイン放出アッセイは、上記のとおりに実施された。０．２５：１の比（ＣＡＲＴ細胞：Ａ４９８標的細胞）での２４時間の共インキュベーション後にＡ４９８細胞の存在下で共培養された場合の二重ノックアウト、三重ノックアウト、及び四重ノックアウト抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩＬ−２及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−ｇ））を産生する能力は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価された。細胞共培養物の上清に由来するＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇが測定された。三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、Ａ４９８細胞と培養されたときに最も高いレベルのＩＦＮ−ｇ（図３７Ａ）及びＩＬ−２（図３７Ｂ）を分泌した。

枯渇マーカー発現に対するＣＤ７０ノックアウトの効果
枯渇マーカーＰＤ−１及びＬＡＧ３のレベルは、上の実施例において使用されるＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（２ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（３ＸＫＯ（ＰＤ−１）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）及びＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）Ｔ細胞に対して評価された。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＰＤ−１発現（図３８）について評価され、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞の両方が、フローサイトメトリーによってＬＡＧ３発現（それぞれ図３９Ａ及び３９Ｂ）について評価された。

データは、ＣＤ７０ＫＯが、ＣＡＲＴ細胞における枯渇マーカー発現を減少させることを実証している。図３８におけるデータは、ＰＤ−１発現が、ＰＤ−１がノックアウトされたときに予想通りに減少され、且つＣＤ７０がノックアウトされたときにも減少されることを示す。

図３９Ａ及び３９Ｂにおけるデータは、ＣＤ７０をノックアウトすることが、ＣＤ４及びＣＤ８細胞におけるＬＡＧ３発現マーカーを減少させることを示す。

データは、ＣＤ７０をノックアウトすることが、特に、ＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋遺伝子が編集されたＣＡＲ＋Ｔ細胞の集団の潜在的な枯渇を減少させて、より良好な治療をもたらすことができたことを実証する。

実施例１１．ＣＤ７０ＫＯは、複数の細胞型における細胞の死滅を増進する
様々な癌細胞株におけるＣＤ７０発現。相対的なＣＤ７０発現を様々な癌細胞株において測定して、様々な癌型を死滅させる抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の能力をさらに評価した。ＣＤ７０発現は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗ヒトＣＤ７０抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＣａｔ．Ｎｏ．３５５１１５）を使用するＦＡＣＳ分析によって測定された。図４０Ａ（左のグラフ）は、他の腎臓癌細胞株Ａ４９８、７８６−Ｏ、ｃａｃｋｉ−１及びＣａｋｉ−２と比較した、ＦＡＣＳによって測定されるとおりのＡＣＨＮ細胞における相対的なＣＤ７０の発現を示す。さらに、非腎臓癌細胞株は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗ヒトＣＤ７０抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＣａｔ．Ｎｏ．３５５１１５；図４０Ａ、右のパネル）又は図４０ＢにおけるＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ７０抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＣａｔ．Ｎｏ．３５５１０５）のいずれかを使用するＦＡＣＳ分析（表２２、図４０Ａ及び図４０Ｂ）によってＣＤ７０発現について評価された。ＳＮＵ−１（腸癌細胞）は、Ａ４９８と同様の高レベルのＣＤ７０発現を示した（図４０Ａ、右のパネル）。ＳＫＯＶ−３（卵巣）、ＨｕＴ７８（リンパ腫）、ＮＣＩ−Ｈ１９７５（肺）及びＨｓ−７６６Ｔ（膵臓）細胞株は、ＡＣＨＮと同様であるか又はより高いが、Ａ４９８より低いＣＤ７０発現のレベルを示した（表２２、図４０Ｂ）。

細胞死滅アッセイ。多重に遺伝子編集された抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞のＡＣＨＮ腎癌細胞を死滅させる能力は、上記の細胞死滅アッセイを使用して判定された。ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（２ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（３ＸＫＯ（ＰＤ−１）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）及びＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）細胞は、０．５：１（図４０Ｃ）及び０．２５：１（図４０Ｄ）のＣＡＲＴ細胞：ＡＣＨＮ標的細胞比で低レベルのＣＤ７０抗原を発現する接着ＲＣＣ由来細胞株（ＡＣＨＮ細胞）とともにインキュベートされた（図４０Ａは、他の腎臓癌細胞株Ａ４９８、７８６−Ｏ、ｃａｃｋｉ−１、及びＣａｋｉ−２と比較した、ＦＡＣＳによって測定されるとおりのＡＣＨＮ細胞における相対的なＣＤ７０の発現を示す）。遺伝子編集された細胞は、２４時間の共インキュベーション後にＲＣＣ由来細胞の強力な細胞の死滅を示した（図４０Ｃ及び４０Ｄ）。細胞は、ＰＤ−１がノックアウトされた場合、ＣＤ７０がノックアウトされた場合、より高い効力を示し、さらに、ＰＤ−１及びＣＤ７０の両方がノックアウトされた場合にわずかに高い効力を示した。結論として、ＰＤ−１若しくはＣＤ７０又はＰＤ−１及びＣＤ７０の両方を合わせたノックアウトは、ＡＣＨＮ細胞における抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞の細胞を死滅させる能力を向上させる。

ＡＣＨＮ細胞は、中程度から低レベルまでのＣＤ７０を発現することが見出されたが、それらは、驚くべきことに、３ＸＫＯ（ＰＤ−１）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞、３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞、及び４ＸＫＯＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞により死滅しやすかった（図４０Ｃ及び４０Ｄ）。これは、高いＣＤ７０発現が、抗ＣＤ７０ＣＡＲを発現する遺伝子編集されたＴ細胞による標的細胞の効率的な死滅に必要ではないことを示す。さらに、ＳＮＵ−１、ＳＫ−ＯＶ−３、ＮＣＩ−Ｈ１９７５及びＨＳ−７６６Ｔ細胞株のＣＤ７０発現レベルがＡＣＨＮと同様であるか又はそれ以上であることが判明したという状況から、抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、これらの癌細胞型を死滅させるのにも特に効率的であることが予想された。実際に、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）及びＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋（３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ＣＡＲ^＋）は、驚くべきことに、ほんの２４時間の共培養の後に多数の固形腫瘍細胞株の強力な細胞死滅を示したことが見出された（図４０Ｅは、４ＸＫＯＣＡＲ＋Ｔ細胞による死滅を示し、図４０Ｆは、３ＸＫＯＣＡＲ＋Ｔ細胞による死滅を示す）。３ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ＋及び４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の両方が、４：１のエフェクター：標的細胞比で腎臓、膵臓、及び卵巣腫瘍細胞（Ａ４９８、ＡＣＨＮ、ＳＫ−ＯＶ−３、及びＨｓ−７６６Ｔ）を＞６０％死滅させ、１：１のエフェクター：標的細胞比で＞５０％を死滅させた。中程度から低いＣＤ７０発現を有した癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１９７５、Ｃａｌｕ−１及びＤＵ１４５）の細胞の死滅は、共培養の２４時間以内で４：１のエフェクター：標的細胞比で＞３０％の死滅を有して依然として効率的であった（図４０Ｅ及び４０Ｆ）。３ＸＫＯ又は４ＸＫＯ、ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞のいずれかに対するより長い暴露（すなわち、９６時間）は、全ての細胞型、特に、ＳＫＯＶ−３、Ｈｓ−７６６Ｔ、及びＮＩＣ−Ｈ１９７５細胞全体にわたって癌細胞死滅の増加をもたらし、死滅は、１：１のエフェクター：標的細胞比で＞８０％であった（図４０Ｇ）。

ＳＮＵ−１細胞の死滅は、視覚的な評価によって評価された。ＣＡＲ＋Ｔ細胞への長い暴露後の標的細胞の死滅もまた、ＳＮＵ−１癌細胞についての顕微鏡観察によって評価された。ＳＮＵ−１細胞は、６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１００万細胞の密度で蒔かれ、３ＸＫＯ（ＣＤ７０）、抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と４：１のエフェクター：標的比で混合された。共培養物は、６日間インキュベートされ、生存癌細胞の存在が顕微鏡観察によって評価された。全ての胃癌標的細胞（ＳＮＵ−１）は、対照ウェルと比較して、ＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含有するウェルにおいて除去されたが、これは、癌細胞が、長期間の共培養により抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞によって完全に除去されたことを示している。

ＣＤ７０発現細胞を選択的に死滅させる抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力が判定された。フローサイトメトリーアッセイを設計して、３ＸＫＯ（ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞によって、癌細胞懸濁液株（例えば、「標的細胞」と呼ばれるＫ５６２、ＭＭ．１Ｓ及びＨｕＴ７８癌細胞）の死滅を試験した。使用された標的細胞株のうちの２つは、ＣＤ７０発現癌細胞（例えば、ＭＭ．１Ｓ及びＨｕＴ７８）であったが、陰性対照癌細胞として使用された３つ目は、ＣＤ７０発現を欠く（例えば、Ｋ５６２）。ＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＣＤ７０発現ＭＭ．１Ｓ若しくはＨｕＴ７８細胞株又はＣＤ７０陰性Ｋ５６２細胞株のいずれかと共培養された。標的細胞は、５μＭｅｆｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識され、洗浄され、９６ウェルＵ底プレートにおいて１ウェル当たり５０，０００標的細胞の密度で播種された。標的細胞は、様々な比（０．５：１、１：１、２：１及び４：１ＣＡＲ＋Ｔ細胞対標的細胞）でＴＲＡＣ⁻／Ｂ２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞と共培養され、一晩インキュベートされた。標的細胞の死滅は、２４時間の共培養後に判定された。細胞は洗浄され、５ｍｇ／ｍＬＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）の１：５００希釈物を含有する２００μＬの培地が各ウェルに加えられた（死／瀕死細胞を数え上げるため）。次に、細胞は、フローサイトメトリーによって分析され、残留している生存標的細胞の量が定量化された。

図４０Ｈ、図４０Ｉ、及び図４０Ｊは、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／ＣＤ７０−抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞による選択的な標的細胞の死滅を実証している。３ＸＫＯ（ＣＤ７０）ＣＡＲ＋Ｔ細胞との２４時間の共培養は、０．５：１の低いＣＡＲ＋Ｔ細胞とＣＤ７０発現標的細胞比でさえ、Ｔ細胞リンパ腫細胞（ＨｕＴ７８）のほぼ完全な死滅をもたらした（図４０Ｊ）。同様に、２４時間の共培養は、試験された全てのＣＡＲ＋Ｔ細胞と標的細胞の比で多発性骨髄腫細胞（ＭＭ．１Ｓ）のほぼ完全な死滅をもたらした（図４０Ｉ）。標的細胞の死滅は、ＴＲＡＣ−／Ｂ２Ｍ−／抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、試験されたいずれのエフェクター：標的細胞比でも対照試料（例えば、癌細胞単独又はＲＮＰＴ細胞を伴わない共培養物）のレベルを上回るＣＤ７０欠損Ｋ５６２細胞の死滅を誘導しなかったという点で選択的であることが見出された（図４０Ｈ）。

サイトカイン放出アッセイ。サイトカイン放出アッセイは、上記のとおりに実施された。０．２５：１の比（ＣＡＲＴ細胞：ＡＣＨＮ標的細胞）での２４時間の共インキュベーション後にＡＣＨＮ細胞の存在下で共培養された場合の二重ノックアウト、三重ノックアウト、及び四重ノックアウト抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇを産生する能力は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価された。細胞共培養物の上清に由来するＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇが測定された。三重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及び四重ノックアウトＴＲＡＣ⁻／β２Ｍ⁻／ＰＤ−１⁻／ＣＤ７０⁻／抗ＣＤ７０ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、ＡＣＨＮ細胞と培養されたときに最も高いレベルのＩＦＮ−ｇ（図４１）及びＩＬ−２（図４１Ｂ）を分泌した。結論として、ＣＤ７０又はＰＤ−１及びＣＤ７０の両方を合わせたノックアウトは、ＡＣＨＮ細胞における抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞の細胞を死滅させる能力を向上させる。

実施例１２．抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＣＤ７０ＫＯの有効性：ＮＯＧマウスにおける腫瘍異種移植モデル
卵巣腫瘍モデルにおける治療
中程度のレベルのＣＤ７０を発現する卵巣腺癌細胞を除去する抗ＣＤ７０ＣＡＲを発現するＴ細胞の能力は、マウスにおける皮下卵巣癌（ＳＫＯＶ−３）腫瘍異種移植モデルを使用してインビボで評価された。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６を、上のとおりに使用して（例えば、実施例３を参照のこと）、ＣＤ７０を標的化するＣＡＲコンストラクト（配列番号４５；配列番号４６）を使用してＴＲＡＣ座位からの同時の発現を伴ってＴＣＲ、β２Ｍ、ＣＤ７０の発現を欠くヒトＴ細胞を作製した。この実施例において、活性化Ｔ細胞はまず、ＴＲＡＣ（配列番号４０）、β２Ｍ（配列番号４１）、及びＣＤ７０（配列番号３６又は３７）を標的化するｓｇＲＮＡを含有する３種の異なるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ複合体により電気穿孔された。ＴＲＡＣ座位でのＤＮＡ二重鎖切断は、キメラ抗原受容体カセット（遺伝子発現に関する−／＋調節エレメント）に隣接するＴＲＡＣ座位に対して右及び左の相同性アームを含有するドナー鋳型（配列番号４４；配列番号４５）（配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ＣＡＲをコードする）を含むＡＡＶ６に送達されるＤＮＡ鋳型による相同組換え修復によって修復された。

得られた改変Ｔ細胞は、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞である。ＣＤ７０＋卵巣癌細胞株によって引き起こされる疾患を回復させるこれらの抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力は、ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）によって利用される方法を使用して、ＮＯＧマウスにおいて評価された。簡潔には、１２頭の５〜８週齢雌、ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスは、試験の開始の５〜７日前に病原体を含まない条件下で維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育された。マウスは、右後側腹部において５×１０^６個のＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞／マウスの皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、２５〜７５ｍｍ^３（約５０ｍｍ^３の標的）に達したとき、マウスはさらに、表２３に示されるとおりの２つの治療群に分けられた。１日目、治療群２は、表２３に従って、単回の２００μｌの静注投与量の抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受容した。

腫瘍体積は、治療開始日から週に２回測定された。注射後９日目までに、抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞で治療された腫瘍は、未治療の動物における腫瘍と比較して、腫瘍体積の減少を示し始めた。注射後１７日目までに、抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞で治療されたマウスにおけるＣＤ７０＋卵巣癌腫瘍は、完全に除去された。腫瘍増殖のこの完全退縮は、注射後４４日間を通して治療された動物において維持され、その後、抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞で治療された５頭のマウスのうちの４頭は、最後の観察（６９日目）まで腫瘍がないままであった（図４２Ａ）。これらのデータは、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞が、ヒト卵巣腫瘍を治療するのにインビボで非常に強力であることを実証している。

非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍モデルにおける治療
中程度のレベルのＣＤ７０を発現する肺腺癌細胞を除去するＣＤ７０ＣＡＲを発現するＴ細胞の能力は、マウスにおける皮下肺癌（ＮＣＩ−Ｈ１９７５）腫瘍異種移植モデルを使用してインビボで評価された。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６を、上のとおりに使用して（例えば、実施例３を参照のこと）、ＣＤ７０を標的化するＣＡＲコンストラクト（配列番号４３；配列番号４４）を使用してＴＲＡＣ座位からの同時の発現を伴ってＴＣＲ、β２Ｍ、ＣＤ７０の発現を欠くヒトＴ細胞を作製した。この実施例において、活性化Ｔ細胞はまず、ＴＲＡＣ（配列番号４０）、β２Ｍ（配列番号４１）、及びＣＤ７０（配列番号３６又は３７）を標的化するｓｇＲＮＡを含有する３種の異なるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡＲＮＰ複合体により電気穿孔された。ＴＲＡＣ座位でのＤＮＡ二重鎖切断は、キメラ抗原受容体カセット（遺伝子発現に関する−／＋調節エレメント）に隣接するＴＲＡＣ座位に対して右及び左の相同性アームを含有するＡＡＶ６に送達されるＤＮＡ鋳型（配列番号４３；配列番号４４）（配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ＣＡＲをコードする）による相同組換え修復によって修復された。

得られた改変Ｔ細胞は、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋（４１ＢＢ共刺激ドメインを有する）Ｔ細胞である。ＣＤ７０＋肺癌細胞株によって引き起こされる疾患を回復させるこれらの抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力は、ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）によって利用される方法を使用して、ＮＯＧマウスにおいて評価された。簡潔には、１２頭の５〜８週齢雌、ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスは、試験の開始の５〜７日前に病原体を含まない条件下で維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育された。マウスは、右後側腹部において５×１０^６個のＮＣＩ−Ｈ１９７５肺癌細胞／マウスの皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、２５〜７５ｍｍ^３（約５０ｍｍ^３の標的）に達したとき、マウスはさらに、表２４に示されるとおりの２つの治療群に分けられた。１日目、治療群２は、表２４に従って、単回の２００μｌの静注投与量の抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受容した。

腫瘍体積は、治療開始日から週に２回測定された。注射後１２日目までに、抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞で治療された腫瘍は、未治療の動物における腫瘍と比較して、腫瘍体積の減少を示し始めた。治療された動物における腫瘍のこの完全退縮は、注射後３３日間を通して継続する。抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞による治療は、注射後４０日目までの間、確立されたＨ１９７５肺癌異種移植片に対して強力な活性をもたらした（＜１００ｍｍ^３の腫瘍サイズを有する４０日目までの全てのマウスにおいて、腫瘍再増殖が抑制された）が、その後、腫瘍が増殖し始めた。（図４２Ｂ）。これらのデータは、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞が、インビボでヒトＣＤ７０＋肺癌腫瘍に対して強力な活性を有することを実証している。

膵臓腫瘍モデルにおける治療
中程度のレベルのＣＤ７０を発現する膵臓癌細胞を除去するＣＤ７０ＣＡＲを発現するＴ細胞の能力は、マウスにおける皮下膵臓癌（Ｈｓ７６６Ｔ）腫瘍異種移植モデルを使用してインビボで評価された。

得られた改変Ｔ細胞は、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞である。ＣＤ７０＋膵臓癌細胞株によって引き起こされる疾患を回復させるこれらの抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力は、ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）によって利用される方法を使用して、ＮＯＧマウスにおいて評価された。簡潔には、１２頭の５〜８週齢雌、ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスは、試験の開始の５〜７日前に病原体を含まない条件下で維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育された。マウスは、右後側腹部において５×１０^６個のＨｓ７６６Ｔ膵臓癌細胞の皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、２５〜７５ｍｍ^３（約５０ｍｍ^３の標的）に達したとき、マウスはさらに、表２５に示されるとおりの２つの治療群に分けられた。１日目、治療群２は、表２５に従って、単回の２００μｌの静注投与量の抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受容した。

腫瘍体積は、治療開始日から週に２回測定された。注射後１５日目までに、抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞で治療された腫瘍は、全ての未治療の動物において腫瘍体積の減少を示し始めた。抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞による治療は、試験された全てのマウスにおいてＣＤ７０＋膵臓癌腫瘍のサイズを効率的に減少させ（＜３７ｍｍ^３）、試験の期間（６７日目まで）にさらなる増殖の形跡を有しなかった（図４２Ｃ）。これらのデータは、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞が、確立されたＨｓ７６６Ｔ膵臓癌異種移植片に対する強力な活性及び治療開始後６０日を超える耐久性のある応答を有してインビボでヒトＣＤ７０＋膵臓癌腫瘍の退縮を誘導することを実証している。

皮膚Ｔ細胞リンパ腫腫瘍異種移植モデルにおける治療
Ｔ細胞リンパ腫を除去する抗ＣＤ７０ＣＡＲを発現するＴ細胞の能力は、マウスにおける皮下Ｔ細胞リンパ腫（ＨｕＴ７８）腫瘍異種移植モデルを使用してインビボで評価された。

得られた改変Ｔ細胞は、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞である。ＣＤ７０＋Ｔ細胞リンパ腫細胞株によって引き起こされる疾患を回復させるこれらの抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力は、ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）によって利用される方法を使用して、ＮＯＧマウスにおいて評価された。簡潔には、１２頭の５〜８週齢雌、ＣＩＥＡＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスは、試験の開始の５〜７日前に病原体を含まない条件下で維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育された。マウスは、右後側腹部において３×１０^６個のＨｕＴ７８Ｔ細胞リンパ腫細胞の皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、２５〜７５ｍｍ^３（約５０ｍｍ^３の標的）に達したとき、マウスはさらに、表２６に示されるとおりの２つの治療群に分けられた。１日目、治療群２は、表２６に従って、単回の２００μｌの静注投与量の抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受容した。

腫瘍体積は、治療開始日から週に２回測定された。注射後１２日目までに、抗ＣＤ７０ＣＡＲＴ細胞で治療された腫瘍は、全ての未治療の動物において腫瘍体積の減少を示し始めた。抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋Ｔ細胞による治療は、１５日目に試験された全てのマウスにおいてＣＤ７０＋Ｔ細胞リンパ腫腫瘍のサイズを効率的に減少させた（図４２Ｃ）。これらのデータは、３ＸＫＯ（ＴＲＡＣ−／β２Ｍ−／ＣＤ７０−）抗ＣＤ７０ＣＡＲ＋細胞が、確立されたＨｕＴ７８Ｔ細胞リンパ腫異種移植片に対する強力な活性を有してインビボでヒトＣＤ７０＋Ｔ細胞リンパ腫腫瘍の退縮を誘導することを実証している。

本明細書で開示される全ての参考文献、特許及び特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合によっては文書の全体を包含する場合がある。

本明細書及び特許請求の範囲において使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。

また、反対に明確に示されない限り、２つ以上の工程又は行為を含む本明細書で請求される任意の方法において、方法の工程又は行為の順序は、必ずしも方法の工程又は行為が列挙される順序に限定されないことが理解されるべきである。

特許請求の範囲及び上記明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する」、「有する」、「含有する」、「関与する」、「保持する」、「構成する」などの全ての移行句は、オープンエンド、すなわち、以下を含むがこれらに限定されないことを意味するものと理解される。「からなる」及び「本質的にからなる」という移行句のみが、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰａｔｅｎｔＯｆｆｉｃｅＭａｎｕａｌｏｆＰａｔｅｎｔＥｘａｍｉｎｉｎｇＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ２１１１．０３に規定されるとおり、それぞれクローズド又はセミクローズド移行句となるものとする。

数値に先行する「約」及び「実質的に」という用語は、列挙された数値の±１０％を意味する。

値の範囲が提供される場合、範囲の上限と下限の間の各値は、本明細書において具体的に企図され、記載される。

Claims

破壊されたＣＤ７０遺伝子及びＣＤ７０に結合しないキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞。
破壊されたＴ細胞受容体アルファ定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の操作されたＴ細胞。
破壊されたベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子をさらに含む、請求項１又は２に記載の操作されたＴ細胞。
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、前記ＣＡＲをコードする前記核酸を含む、請求項２〜３のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する外部ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
前記外部ドメインが、抗ＢＣＭＡ抗体を含む、請求項５に記載の操作されたＴ細胞。
前記外部ドメインが、抗ＢＣＭＡ一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項５に記載の操作されたＴ細胞。
前記抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び参照抗体と同じ可変軽（ＶＬ）鎖ＣＤＲを含み、前記参照抗体が、配列番号６０として記載されるＶＨ及び配列番号６１として記載されるＶＬを含む、請求項７に記載の操作されたＴ細胞。
前記抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、それぞれ配列番号６０及び６１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項７に記載の操作されたＴ細胞。
前記抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、ＣＤ３３に結合する外部ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ３３抗体を含む、請求項１１に記載の操作されたＴ細胞。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖを含む、請求項１１に記載の操作されたＴ細胞。
前記抗ＣＤ３３ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨＣＤＲ及び同じＶＬ鎖ＣＤＲを含み、前記参照抗体が、配列番号１４０として記載されるＶＨ及び配列番号１４１として記載されるＶＬを含む、請求項１３に記載の操作されたＴ細胞。
前記抗ＣＤ３３ｓｃＦｖが、それぞれ配列番号１４０及び１４１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項１１に記載の操作されたＴ細胞。
前記抗ＣＤ３３ｓｃＦｖが、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９に結合する外部ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ１９抗体を含む、請求項１７に記載の操作されたＴ細胞。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを含む、請求項１７に記載の操作されたＴ細胞。
前記抗ＣＤ１９ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨＣＤＲ及び同じＶＬ鎖ＣＤＲを含み、前記参照抗体が、配列番号１５２として記載されるＶＨ及び配列番号１５３として記載されるＶＬを含む、請求項１９に記載の操作されたＴ細胞。
前記抗ＣＤ１９ｓｃＦｖが、それぞれ配列番号１５２及び１５３において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項１９に記載の操作されたＴ細胞。
前記抗ＣＤ１９ｓｃＦｖが、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の操作されたＴ細胞。
操作されたＴ細胞であって、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子；及び
（ｉｖ）ＣＤ７０に結合するＣＡＲをコードする核酸を含む、操作されたＴ細胞。
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、前記ＣＡＲをコードする前記核酸を含む、請求項２３に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、抗ＣＤ７０抗体を含む外部ドメインを含む、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖを含む外部ドメインを含む、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
前記抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨＣＤＲ及び同じＶＬＣＤＲを含み、前記参照抗体が、配列番号５１として記載されるＶＨ及び配列番号５２として記載されるＶＬを含む、請求項２６に記載の操作されたＴ細胞。
前記抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、それぞれ配列番号５１及び５２において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項２６に記載の操作されたＴ細胞。
前記抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号４８又は５０のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の操作されたＴ細胞。
前記抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
未改変のＴ細胞と比較して前記ＴＲＡＣ遺伝子における欠失がある、請求項２〜３３のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
前記欠失が、１５〜３０塩基対である、請求項３４に記載の操作されたＴ細胞。
前記欠失が、２０塩基対である、請求項３４に記載の操作されたＴ細胞。
前記欠失が、配列番号８６を含む、請求項３４に記載の操作されたＴ細胞。
操作されたＴ細胞であって、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む、操作されたＴ細胞。
操作されたＴ細胞であって、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含み、前記核酸配列が、配列番号４５と少なくとも９０％同一である破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む、操作されたＴ細胞。
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４５に記載される核酸配列を含む、請求項３９に記載の操作されたＴ細胞。
操作されたＴ細胞であって、
（ｉ）配列番号４４と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む、操作されたＴ細胞。
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４４に記載される核酸配列を含む、請求項４１に記載の操作されたＴ細胞。
前記操作されたＴ細胞が、破壊されたプログラム細胞死−１（ＰＤ−１）遺伝子を含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
前記操作されたＴ細胞が、標的細胞であって、前記標的細胞が、前記ＣＡＲに特異的な抗原を発現する標的細胞による５回の再チャレンジの後に細胞傷害性を維持する、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
前記操作されたＴ細胞が、前記標的細胞による１０回の再チャレンジ後に細胞傷害性を維持する、請求項４４に記載の操作されたＴ細胞。
前記標的細胞が、癌細胞である、請求項４０〜４１のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたＴ細胞が、破壊されたＣＤ７０遺伝子及びＣＤ７０に結合しないＣＡＲをコードする核酸を含む細胞の集団。
破壊されたＴＲＡＣ遺伝子をさらに含む、請求項４７に記載の細胞の集団。
破壊されたβ２Ｍ遺伝子をさらに含む、請求項４７又は４８に記載の細胞の集団。
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、前記ＣＡＲをコードする前記核酸を含む、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する外部ドメインを含む、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記外部ドメインが、抗ＢＣＭＡ抗体を含む、請求項５１に記載の細胞の集団。
前記外部ドメインが、抗ＢＣＭＡ一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項５１に記載の細胞の集団。
前記抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び参照抗体と同じ可変軽（ＶＬ）鎖ＣＤＲを含み、前記参照抗体が、配列番号６０として記載されるＶＨ及び配列番号６１として記載されるＶＬを含む、請求項５３に記載の細胞の集団。
前記抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、それぞれ配列番号６０及び６１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項５３に記載の細胞の集団。
前記抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、ＣＤ３３に結合する外部ドメインを含む、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ３３抗体を含む、請求項５７に記載の細胞の集団。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖを含む、請求項５７に記載の細胞の集団。
前記抗ＣＤ３３ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨＣＤＲ及び同じＶＬ鎖ＣＤＲを含み、前記参照抗体が、配列番号１４０として記載されるＶＨ及び配列番号１４１として記載されるＶＬを含む、請求項５９に記載の細胞の集団。
前記抗ＣＤ３３ｓｃＦｖが、それぞれ配列番号１４０及び１４１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項５９に記載の細胞の集団。
前記抗ＣＤ３３ｓｃＦｖが、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９に結合する外部ドメインを含む、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ１９抗体を含む、請求項６３に記載の細胞の集団。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを含む、請求項６３に記載の細胞の集団。
前記抗ＣＤ１９ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨＣＤＲ及び同じＶＬ鎖ＣＤＲを含み、前記参照抗体が、配列番号１５２として記載されるＶＨ及び配列番号１５３として記載されるＶＬを含む、請求項６５に記載の細胞の集団。
前記抗ＣＤ１９ｓｃＦｖが、それぞれ配列番号１５２及び１５３において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項６５に記載の細胞の集団。
前記抗ＣＤ１９ｓｃＦｖが、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む、請求項６５に記載の細胞の集団。
操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子；及び
（ｉｖ）ＣＤ７０に結合するＣＡＲをコードする核酸を含む、細胞の集団。
前記ＣＡＲが、抗ＣＤ７０抗体を含む外部ドメインを含む、請求項６９に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖを含む外部ドメインを含む、請求項６９に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項４７〜７１のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項４７〜７２のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む、請求項４７〜７３のいずれか一項に記載の細胞の集団。
操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子
（ｉｖ）（ａ）抗ＣＤ７０ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、及び（ｃ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含む外部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含む細胞の集団。
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、前記ＣＡＲをコードする前記核酸を含む、請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨＣＤＲ及び同じＶＬＣＤＲを含み、前記参照抗体が、配列番号５１として記載されるＶＨ及び配列番号５２として記載されるＶＬを含む、請求項７１〜７６のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、それぞれ配列番号５１及び５２において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項７７に記載の細胞の集団。
前記抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号４８又は５０のアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の細胞の集団。
前記抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の細胞の集団。
未改変のＴ細胞と比較して前記ＴＲＡＣ遺伝子における欠失がある、請求項４８〜８０のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記欠失が、１５〜３０塩基対である、請求項８１に記載の操作されたＴ細胞。
前記欠失が、２０塩基対である、請求項８１に記載の操作されたＴ細胞。
前記欠失が、配列番号８６を含む、請求項８１に記載の操作されたＴ細胞。
操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む、細胞の集団。
操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含み、前記核酸配列が、配列番号４５と少なくとも９０％同一である破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む、細胞の集団。
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４５に記載される核酸配列を含む、請求項８６に記載の細胞の集団。
操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたＴ細胞が、
（ｉ）配列番号４４と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む、細胞の集団。
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４４に記載される核酸配列を含む、請求項８８に記載の細胞の集団。
前記操作されたＴ細胞が、標的細胞であって、前記標的細胞が、前記ＣＡＲに特異的な抗原を発現する標的細胞による５回の再チャレンジの後に細胞傷害性を維持する、請求項４７〜８９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記操作されたＴ細胞が、前記標的細胞による１０回の再チャレンジ後に細胞傷害性を維持する、請求項９０に記載の細胞の集団。
前記標的細胞が、癌細胞である、請求項９０〜９１のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記破壊されたβ２Ｍ遺伝子が、配列番号９〜１４のいずれか１つから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項４９〜９２のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記破壊されたＣＤ７０遺伝子が、配列番号１２９〜１３４のいずれか１つから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項４７〜９３のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記操作されたＴ細胞の少なくとも９０％が、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない、請求項４８〜９４のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記操作されたＴ細胞が、内在性のＣＤ７０タンパク質を発現する対照Ｔ細胞と比較して、
（ａ）細胞増殖能の増大を示すか；
（ｂ）細胞溶解の増大を示すか；
（ｃ）細胞枯渇の減少を示すか；
（ｄ）サイトカイン依存性増殖を維持するか；
（ｅ）サイトカイン分泌の増大を示すか；又は
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組合せを示す、
請求項４７〜９５のいずれか一項に記載の細胞の集団。
対象に請求項４７〜９６のいずれか一項に記載の細胞の集団を投与することを含む方法。
前記操作されたＴ細胞が、操作されたヒトＴ細胞である、請求項９７に記載の方法。
前記対象が、癌を有する、請求項９７又は９８に記載の方法。
前記癌が、ＣＤ７０、ＢＭＣＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３３又はこれらの組合せを発現する、請求項９９に記載の方法。
前記細胞の集団が、前記癌を治療するのに有効な量で前記対象に投与される、請求項９９〜１００のいずれか一項に記載の方法。
前記癌が、固形悪性腫瘍又は血液悪性腫瘍である、請求項９９〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
前記固形悪性腫瘍が、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、腎臓腫瘍、肺腫瘍、及び腸腫瘍からなる群から選択される、請求項１０２に記載の方法。
前記細胞の集団が、前記対象における腫瘍の体積を減少させるのに有効な量で前記対象に投与される、請求項９９に記載の方法。
対照において癌を治療する方法であって、前記対象に請求項４７〜９６のいずれか一項に記載の細胞の集団を投与することを含む方法。
対象における癌を治療するための方法であって、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む細胞の集団を前記対象に投与し、
それにより前記対象における前記癌を治療することを含む方法。
対象における癌を治療するための方法であって、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含み、前記核酸配列が、配列番号４５と少なくとも９０％同一である破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む細胞の集団を前記対象に投与し、
それにより前記対象における前記癌を治療することを含む方法。
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４５に記載される核酸配列を含む、請求項１０７に記載の方法。
対象における癌を治療するための方法であって、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたＴ細胞が、
（ｉ）配列番号４４と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む細胞の集団を前記対象に投与し、
それにより前記対象における前記癌を治療することを含む方法。
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４４に記載される核酸配列を含む、請求項１０９に記載の方法。
操作されたＴ細胞を生成するための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞に
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、
ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、及び
ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターを送達すること；並びに
（ｂ）破壊されたＣＤ７０遺伝子を含み且つ前記ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞を生成することを含む方法。
前記Ｔ細胞にＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することをさらに含み；前記操作されたＴ細胞がさらに、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含む、請求項１１１に記載の方法。
前記ＣＡＲをコードする前記核酸が、前記ＴＲＡＣ遺伝子に対する左及び右の相同性アームと隣接し；且つ前記操作されたＴ細胞が、前記ＴＲＡＣ遺伝子中に前記ＣＡＲをコードする前記核酸を含む、請求項１１２に記載の方法。
前記Ｔ細胞にβ２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することをさらに含み；前記操作されたＴ細胞がさらに、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む、請求項１１１〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
操作されたＴ細胞を生成するための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞に
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、
ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、
β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、
ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、及び
ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターを送達すること；並びに
（ｂ）操作されたＴ細胞を生成することを含む方法。
前記ＣＡＲをコードする前記核酸が、前記ＴＲＡＣ遺伝子座位に対する左及び右の相同性アームと隣接する、請求項１１５に記載の方法。
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、任意選択によりＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１１１〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
前記ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する前記ｇＲＮＡが、配列番号９８の前記ヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１１８の前記ヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、前記ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する前記ｇＲＮＡが、配列番号３０の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１１２〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
前記β２Ｍ遺伝子を標的化する前記ｇＲＮＡが、配列番号９９の前記ヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１１９の前記ヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、前記β２Ｍ遺伝子を標的化する前記ｇＲＮＡが、配列番号３１の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１１４〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ７０遺伝子を標的化する前記ｇＲＮＡが、配列番号９４又は９５の前記ヌクレオチド配列を含むか又は配列番号１１４又は１１５の前記ヌクレオチド配列を標的化し、且つ任意選択により、前記ＣＤ７０遺伝子を標的化する前記ｇＲＮＡが、配列番号２６又は２７の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１１１〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡが、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）中で複合体を形成する、請求項１１１〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
標的細胞に対する免疫療法のための操作されたＴ細胞を生成するための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞中のＣＤ７０遺伝子を破壊すること、及び
（ｂ）前記標的細胞上で発現される抗原（前記抗原は、ＣＤ７０ではない）に結合するＣＡＲを発現させることを含む方法。
前記標的細胞が、癌細胞である、請求項１２２に記載の方法。
前記方法が、エクスビボである、請求項１２２〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｔ細胞においてＴＲＡＣ遺伝子を破壊することをさらに含む、請求項１２２〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲが、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子中の核酸によってコードされる、請求項１２５に記載の方法。
前記Ｔ細胞においてβ２Ｍ遺伝子を破壊することをさらに含む、請求項１２２〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲが、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する外部ドメインを含む、請求項１１１〜１２７のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
前記外部ドメインが、抗ＢＣＭＡ抗体を含む、請求項１２８に記載の方法。
前記外部ドメインが、抗ＢＣＭＡ一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１２８に記載の方法。
前記抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、可変重（ＶＨ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び参照抗体と同じ可変軽（ＶＬ）鎖ＣＤＲを含み、前記参照抗体が、配列番号６０として記載されるＶＨ及び配列番号６１として記載されるＶＬを含む、請求項１３０に記載の方法。
前記抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、それぞれ配列番号６０及び６１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項１３０に記載の方法。
前記抗ＢＣＭＡｓｃＦｖが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、請求項１３０に記載の方法。
前記ＣＡＲが、ＣＤ３３に結合する外部ドメインを含む、請求項１１１〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ３３抗体を含む、請求項１３４に記載の方法。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖを含む、請求項１３４に記載の方法。
前記抗ＣＤ３３ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨＣＤＲ及び同じＶＬ鎖ＣＤＲを含み、前記参照抗体が、配列番号１４０として記載されるＶＨ及び配列番号１４１として記載されるＶＬを含む、請求項１３６に記載の方法。
前記抗ＣＤ３３ｓｃＦｖが、それぞれ配列番号１４０及び１４１において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項１３６に記載の方法。
前記抗ＣＤ３３ｓｃＦｖが、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、請求項１３６に記載の方法。
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９に結合する外部ドメインを含む、請求項１１１〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ１９抗体を含む、請求項１４０に記載の方法。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを含む、請求項１４０に記載の方法。
前記抗ＣＤ１９ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨＣＤＲ及び同じＶＬ鎖ＣＤＲを含み、前記参照抗体が、配列番号１５２として記載されるＶＨ及び配列番号１５３として記載されるＶＬを含む、請求項１４２に記載の方法。
前記抗ＣＤ１９ｓｃＦｖが、それぞれ配列番号１５２及び１５３において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項１４２に記載の方法。
前記抗ＣＤ１９ｓｃＦｖが、配列番号１５０のアミノ酸配列を含む、請求項１４２に記載の方法。
前記ＣＡＲが、ＣＤ７０に結合する外部ドメインを含む、請求項１１１〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ７０抗体を含む、請求項１４６に記載の方法。
前記外部ドメインが、抗ＣＤ７０ｓｃＦｖを含む、請求項１４６に記載の方法。
前記抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨＣＤＲ及び同じＶＬＣＤＲを含み、前記参照抗体が、配列番号５１として記載されるＶＨ及び配列番号５２として記載されるＶＬを含む、請求項１４８に記載の方法。
前記抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、それぞれ配列番号５１及び５２において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項１４８に記載の方法。
前記抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号４８又は５０のアミノ酸配列を含む、請求項１４８に記載の方法。
前記抗ＣＤ７０ｓｃＦｖが、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、請求項１４８に記載の方法。
前記ＣＡＲが、ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項１１１〜１５２のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲが、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１１１〜１５３のいずれか一項に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む、請求項１１１〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
請求項１１１〜１５５のいずれか一項に記載の方法によって産生される操作されたＴ細胞の集団。
Ｔ細胞の増殖を増大させる方法であって、前記Ｔ細胞中の前記ＣＤ７０遺伝子を破壊することを含む方法。
Ｔ細胞の枯渇を減少させる方法であって、前記Ｔ細胞中の前記ＣＤ７０遺伝子を破壊することを含む方法。
前記ＣＤ７０遺伝子が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集によって破壊される、請求項１５７〜１５８のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｔ細胞中の前記ＴＲＡＣ遺伝子、前記β２Ｍ遺伝子、又は前記ＴＲＡＣ及び前記β２Ｍ遺伝子の両方を破壊することをさらに含む、請求項１５７〜１５９のいずれか一項に記載の方法。
前記ＴＲＡＣ遺伝子、β２Ｍ遺伝子又はＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子の両方が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集によって破壊される、請求項１６０に記載の方法。
前記ＣＡＲが、配列番号５７のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、配列番号５６と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１６２に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、配列番号１３６と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１６４に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、配列番号１４８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１６６に記載の操作されたＴ細胞。
前記ＣＡＲが、配列番号５７のアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、配列番号５６と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１６８に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、配列番号１３６と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１７０に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、配列番号１４８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１７２に記載の細胞の集団。
前記ＣＡＲが、配列番号５７のアミノ酸配列を含む、請求項１２８に記載の方法。
前記ＣＡＲが、配列番号５６と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１７４に記載の方法。
前記ＣＡＲが、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、請求項１３４に記載の方法。
前記ＣＡＲが、配列番号１３６と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１７６に記載の方法。
前記ＣＡＲが、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む、請求項１４０に記載の方法。
前記ＣＡＲが、配列番号１４８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１７８に記載の方法。
前記ＣＡＲが、配列番号４６のアミノ酸配列を含む、請求項１４６に記載の方法。
前記ＣＡＲが、配列番号４５と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１８０に記載の方法。