BR112020022879A2

BR112020022879A2 - métodos e composições para tratamento de câncer

Info

Publication number: BR112020022879A2
Application number: BR112020022879-6A
Authority: BR
Inventors: Jonathan Alexander Terrett; Demetrios Kalaitzidis; Mary-Lee DEQUÉANT; Zinkal Samir PADALIA
Original assignee: Crispr Therapeutics Ag
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2021-02-23
Also published as: JP2021522820A; KR20210008502A; US20210060072A1; ZA202006627B; US11254912B2; US20200063100A1; CO2020015255A2; CL2020002914A1; CA3099364A1; PE20210666A1; US20210246425A1; EP3790629A1; US11649438B2; AU2019266398A1; CN112105420A; WO2019215500A1; PH12020551923A1; US20210261919A1; SG11202011080QA; MX2020012028A

Abstract

A presente invenção refere-se a, em algumas modalidades, métodos e composições (por exemplo, composições celulares) para o tratamento do câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTO- DOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO DE CÂNCER”,

PEDIDOS RELACIONADOS 1] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Pro- visório dos EUA No. de Série 62/670,417 depositado em 11 de maio de 2018; Pedido de Patente Provisório dos EUA No. de Série 62/701,340 depositado em 20 de julho de 2018; Pedido de Patente Provisório dos EUA No. de Série 62/756,643 depositado em 7 de novembro de 2018; Pedido de P atente Provisório dos EUA No. de Série 62/773,658 deposi- tado em 30 de novembro de 2018; e Pedido de Patente Provisório dos EUA No. de Série 62/826,600 depositado em 29 de março de 2019. Todo o conteúdo dos pedidos de patente acima mencionados é incor- porado neste documento por esta referência.

ANTECEDENTES

[2] A terapia de células T de receptor de antígeno quimérico (CAR) usa células T geneticamente modificadas para direcionar e matar de forma mais específica e eficiente as células cancerígenas. Depois das células T terem sido coletadas do sangue, as células são manipu- ladas para incluir CARS em sua superfície. Os CARS podem ser intro- duzidos nas células T usando a tecnologia de edição de genes CRISPR/Cas9. Quando essas células T CAR alogênicas são injetadas em um paciente, os receptores permitem que as células T matem as células cancerígenas.

SUMÁRIO

[3] Em alguns aspectos, a presente invenção descriçãorefere- se a células imunes manipuladas (por exemplo, células T) e métodos de produção de células imunes que foram editadas usando a tecnologia de edição de gene CRISPR/Cas9 para interromper a expressão de CD70 endógeno (CD70 inativado).

[4] Em alguns aspectos da presente descrição, fornece uma cé- lula imune manipulada (por exemplo, célula T) compreendendo uma in- terrupção no gene CD70. Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas são células T alogênicas que compreendem um gene CD70 interrompido e um ácido nucleico que codifica um CAR. Em algu- mas modalidades, as células imunes manipuladas são células T alogê- nicas que compreendem um gene TRAC interrompido pela inserção de um ácido nucleico que codifica um CAR, um gene B2M interrompido, e um geneC D70 interrompido. Em algumas modalidades, as células T são células T humanas. Em algumas modalidades, as células imunes mani- puladas (por exemplo, células T) compreendem um genebTRAC inter- rompido, um gene B2M interrompido, um gene CD70 interrompido, e um ácido nucleico que codifica um CAR. Em algumas modalidades, o gene TRAC interrompido compreende o ácido nucleico que codifica o CAR. Em algumas modalidades, a célula imune manipulada (por exemplo, cé- lula T) compreende ainda um gene PD-1 interrompido. Em algumas mo- dalidades, o ácido nucleico que codifica um CAR tem como alvo um an- tígeno tumoral (por exemplo, BCMA, CD19, CD33 ou CD70).

[5] Em alguns aspectos, a célula imune manipulada (por exem- plo, células T) fornecida exibem função de células T melhorada, inclu- indo a prevenção de exaustão prematura, expansão aumentada de cé- lulas T CAR e maior eficiência de morte de células cancerígenas. Em alguns aspectos, a célula imune manipulada (por exemplo, células T) fornecida exibe crescimento celular contínuo e estável, em relação às células T não editadas ou em relação às células T editadas que expres- sam CD70, bem como mostram citotoxicidade e secreção de citocina aumentadas (por exemplo, IL-2 e/ou IFN-gama).

[6] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma célula T ma- nipulada que compreende um gene CD70 e um ácido nucleico que co- difica um CAR que não se liga a CD70. Em alguns aspectos, a célula T manipulada compreende um gene interrompido da região constante alfa do receptor de células T (TRAC). Em alguns aspectos, o gene TRAC interrompido compreende o ácido nucleico que codifica o CAR que não se liga a CD70. Em alguns aspectos, a célula T manipulada compreende um gene interrompido de beta-2-microglobulina (B2M).

[7] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma célula T ma- nipulada que compreende: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; (ili) um gene CD70 interrompido; e (iv) um ácido nu- cleico que codifica um CAR que não se liga a CD70.

[8] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem um gene CD70 interrompido e um ácido nu- cleico que codifica um CAR que não se liga a CD70.

[9] Em alguns aspectos, a célula T manipulada na população de células compreende um gene interrompido da região constante alfa do receptor de células T (TRAC). Em alguns aspectos, o gene TRAC inter- rompido compreende o ácido nucleico que codifica o CAR que não se liga a CD70. Em alguns aspectos, a célula T manipulada na população de células compreende um gene de beta-2-microglobulina (B2M) inter- rompido.

[10] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; (iii) um gene CD70 interrompido; e (iv) um ácido nucleico que codifica um CAR que não se liga a CD70.

[111] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, o CAR compreende um ectodomínio que se liga ao antígeno de matura- ção de células i-B (BCMA). Em alguns aspectos, o ectodomínio compre- ende um anticorpo anti-<BCMA. Em alguns aspectos, o ectodomínio compreende um fragmento variável de cadeia única anti-BCMA (scFv).

Em alguns aspectos, o scFv antirBCMA compreende regiões determi- nantes de complementaridade (CDRs) de cadeia variável pesada (VH) e as mesmas CDRs de cadeia variável leve (VL) como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH es- tabelecida como SEQ ID NO: 60 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 61. Em alguns aspectos, o scFv antirBCMA compreende cadeias VH e VL compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 60 e 61, respectivamente. Em alguns aspectos, o scFv anti-<BCMA compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

59. Em alguns aspectos, o scFv anti-BCMA é codificado por uma se- quência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 57.

[12] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, o scFv anti-BCMA compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59. Em algumas modalidades, o scFv anti-8BCMA compreende um VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60. Em algumas modalidades, o scFv anti-8BCMA compreende um VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61. Em algu- mas modalidades, o scFv anti-BCMA compreende um VH que compre- ende as sequências de aminoácidos CDR de (i) SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, e/ou SEQ ID NO: 84 ou (ii) SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, ou SEQ ID NO: 85; e/ou o scFv anti-BCMA compreende uma sequência VL compreendendo as sequências de aminoácidos CDR de (i) SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, e/ou SEQ ID NO: 78.

[13] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, o CAR compreende um ectodomínio que liga o CD33. Em alguns, o ecto- domínio compreende um anticorpo anti-CD33. Em alguns aspectos, o ectodomínio compreende um scFv anti-CD33. Em alguns aspectos, o scFv anti-CD33 compreende as mesmas CDRs de VH e as mesmas

CDRs de cadeia VL como um anticorpo de referência, em que o anti- corpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 140 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 141. Em alguns as- pectos, o scFv anti-CD33 compreende cadeias VH e VL compreen- dendo as sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 140 e 141, respectivamente. Em alguns aspectos, o scFv anti-CD33 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137.

[14] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, o CAR compreende um ectodomínio que liga o CD19. Em alguns aspec- tos, em que o ectodomínio compreende um scFv anti-CD19. Em alguns aspectos, o ectodomínio compreende um scFv anti-CD19. Em alguns aspectos, o scFv anti-CD19 compreende as mesmas CDRs de VH e as mesmas CDRs de cadeia VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 152 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 153. Em alguns aspectos, o scFv anti-CD19 compreende cadeias VH e VL compreen- dendo as sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 152 e 153, respectivamente. Em alguns aspectos, o scFv anti-CD19 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 151.

[15] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma célula T ma- nipulada que compreende: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; (ili) um gene CD70 interrompido; e (iv) um ácido nu- cleico que codifica um CAR que se liga a CD70. Em alguns aspectos, o gene TRAC interrompido compreende o ácido nucleico que codifica o CAR.

[16] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; (iii) um gene CD70 interrompido; e (iv) um ácido nucleico que codifica um CAR que se liga a CD70.

17] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; (iii) um gene CD70 interrompido; (iv) um ácido nucleico que codifica um CAR compreendendo (a) um ec- todomínio que compreende um scFv anti-CD70, (b) um domínio trans- membranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório 41BB e um domínio de sinalização CD3z.

[18] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, o CAR que se liga ao CD70 compreende um ectodomínio que compre- ende um anticorpo anti-CD70. Em alguns aspectos, o CAR compreende um ectodomínio que compreende um scFv anti-CD70. Em alguns as- pectos, o scFv anti-CD70 compreende as mesmas CDRs de VH e às mesmas CDRs de cadeia VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 51 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 52. Em alguns aspectos, o scFv anti-CD70 compreende cadeias VH e VL compreen- dendo as sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 51 e 52, respectivamente. Em alguns aspectos, o scFv anti-CD70 com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 ou 50. Em al- guns aspectos, o scFv anti-CD70 compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 50.

[19] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, o scFv anti-CD70 compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51. Em algumas modalidades, o scFv anti- CD70 compreende um VL que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, o scFv anti-CD70 compreende um VH que compreende as sequências de aminoácidos

CDR de (i) SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, e/ou SEQ ID NO: 72 ou (ii) SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, e/ou SEQ ID NO: 73; e/ou o scFv anti- CD70 compreende uma sequência VL compreendendo as sequências de aminoácidos CDR de (i) SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, e/ou SEQ ID NO: 66 ou (ii) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, e/ou SEQ ID NO: 67.

[20] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, o CAR compreende um domínio coestimulatório CD28 ou 41BB. Em qual- quer um dos aspectos anteriores ou relacionados, o CAR compreende um domínio de sinalização CD36. Em qualquer um dos aspectos anteri- ores ou relacionados, o CAR compreende um domínio transmembranar CD8.

[21] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, há uma deleção no gene TRAC relativo às células T não modificadas. Em alguns aspectos, a deleção é de 15-30 pares de bases. Em alguns aspectos, a deleção é de 20 pares de bases. Em alguns aspectos, a deleção compreende a SEQ ID NO: 86. Em alguns aspectos, a deleção é de SEQ ID NO: 86.

[22] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma célula T ma- nipulada que compreende um gene CD70 interrompido e um ácido nu- cleico que codifica um CAR que se liga a CD70, em que o CAR compre- ende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 46. Em alguns aspectos, a descrição fornece uma célula T manipulada compre- endendo um gene CD70 interrompido e um ácido nucleico que codifica um CAR que se liga a CD70, em que a sequência de ácido nucleico é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 45. Em alguns aspectos, a des- crição fornece uma célula T manipulada compreendendo um gene CD70 interrompido e um ácido nucleico que codifica um CAR que se liga ao CD70, em que a sequência de ácido nucleico é SEQ ID NO: 45.

[23] Em algumas modalidades, o gene CD70 é interrompido pela edição do gene CRISPR/Cas9. Em algumas modalidades, o gene TRAC é interrompido pela edição do gene CRISPR/Cas9. Em algumas moda- lidades, o gene B2M é interrompido pela edição do gene CRISPR/Cas9. Em algumas modalidades, o gene PD-1 é interrompido pela edição do gene CRISPR/Cas9.

[24] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma célula T ma- nipulada que compreende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido. Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico que codifica o CAR compreende uma sequência pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 45.

[25] Em outros aspectos, a descrição fornece uma célula T mani- pulada que compreende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequên- cia de ácido nucleico é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 45; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido. Em algumas modalidades, o gene TRAC interrompido compreende uma sequência doadora que compre- ende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 44.

[26] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma célula T ma- nipulada que compreende: (i) um gene TRAC interrompido compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 44; (ii) um gene B2M interrompido; e

(iii) um gene CD70 interrompido.

[27] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma célula T ma- nipulada que compreende: (i) um gene TRAC interrompido compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 44; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido.

[28] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, a célula T manipulada compreende um gene PD-1. Em alguns aspectos, as células imunes manipuladas são células T alogênicas que compre- endem um gene TRAC interrompido pela inserção de um ácido nucleico que codifica um CAR, um gene B2M interrompido, e um gene PD-1 in- terrompido. Em algumas modalidades, a célula imune manipulada (por exemplo, célula T) compreende ainda um geneCD70 interrompido.

[29] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, a célula T manipulada mantém a citotoxicidade após 5 reexames com uma célula alvo, em que a célula alvo expressa um antígeno específico para o CAR. Em alguns aspectos, a célula T manipulada mantém a ci- totoxicidade após 10 reexames com a célula alvo. Em alguns aspectos, a célula alvo é uma célula cancerígena. Em alguns aspectos, a célula- alvo é uma célula cancerígena de um câncer hematológico ou tumor sólido.

[30] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, a célula T manipulada ou população de células compreende um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57. Em alguns aspectos, o CAR é codificado por uma sequência de ácido nu- cleico com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 56.

[31] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, a célula T manipulada ou população de células compreende um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 139. Em alguns aspectos, o CAR é codificado por uma sequência de ácido nu- cleico com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 136.

[32] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, a célula T manipulada ou população de células compreende um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 149. Em alguns aspectos, o CAR é codificado por uma sequência de ácido nu- cleico com pelo menos 90% de identidade com à SEQ ID NO: 148.

[33] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, a célula T manipulada ou população de células compreende um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. Em alguns aspectos, o CAR é codificado por uma sequência de ácido nu- cleico com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 45.

[34] Outros aspectos da presente descrição fornecem uma popu- lação de células compreendendo qualquer uma das células imunes ma- nipuladas (por exemplo, células T) aqui descritas. Em algumas modali- dades, uma população de células compreende células T que compre- endem um gene TRAC interrompido pela inserção de um ácido nucleico que codifica um CAR, um gene B2M interrompido e um gene CD70 in- terrompido. Em algumas modalidades, a população de células compre- ende células T que compreendem um gene TRAC interrompido, um gene B2M interrompido, um gene CD70 interrompido, e um ácido nu- cleico que codifica um CAR. Em algumas modalidades, uma população de células compreende células T que compreendem um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, um gene B2M interrompido, e um gene CD70 interrompido.

[35] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR compreendendo (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antí- geno anti-CD70, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodo- mínio que compreende um domínio coestimulatório 41BB e um domínio de sinalização CD3z; (ii) um gene beta-2-microglobulina (B2M) interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido. Em alguns aspectos, a descrição fornece uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipula- das compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido.

[36] Em outros aspectos, a descrição fornece uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequên- cia de ácido nucleico é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 45; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido. Em alguns aspectos, o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 45.

[37] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 44;

(ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido. Em alguns aspectos, o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 44.

[38] Em algumas modalidades, o CAR compreende um domínio de sinalização CD3z. Em algumas modalidades, o CAR compreende um domínio transmembranar CD8. Em algumas modalidades, o CAR com- preende um domínio coestimulatório CD28 ou 41BB.

[39] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados da população de células, o gene B2M interrompido compreende pelo me- nos uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOS: 9-14. Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados da população de células, o gene CD70 interrompido compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOS: 129-134.

[40] Em algumas modalidades, o gene TRAC compreende a se- quência nucleotídica da SEQ ID NO: 45 e/ou o ácido nucleico que codi- fica o CAR anti-CD70 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o gene TRAC compreende a se- quência nucleotídica da SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o gene TRAC compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, o gene TRAC compreende a sequência nu- cleotídica da SEQ ID NO: 56 e/ou o ácido nucleico que codifica o CAR anti-<BCMA compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:

56. Em algumas modalidades, o gene TRAC compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, o gene TRAC compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 55.

[41] Em algumas modalidades, o gene TRAC compreende a se- quência nucleotídica da SEQ ID NO: 156 e/ou o ácido nucleico que co- difica o CAR anti-CD19 compreende a sequência de nucleotídeos de

SEQ ID NO: 148. Em algumas modalidades, o gene TRAC compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 148. Em algumas modalida- des, o gene TRAC compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 156. Em algumas modalidades, o gene TRAC compreende a se- quência nucleotídica da SEQ ID NO: 135 e/ou o ácido nucleico que co- difica o CAR anti-CD33 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 136. Em algumas modalidades, o gene TRAC compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 136. Em algumas modalida- des, o gene TRAC compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 135.

[42] Em qualquer um dos aspectos anteriores, as células T mani- puladas: (a) exibem capacidade proliferativa celular aumentada; (b) exibem aumento da lise celular; (c) exibem exaustão celular reduzida; (d) mantêm a proliferação dependente de citocinas; (e) exibem secreção aumentada de citocinas; ou (f) qualquer combinação de (a) - (e),

[43] em relação às células T de controle, em que as células T de controle expressam a proteína CD70 endógena.

[44] Em algumas modalidades, pelo menos 50%, opcionalmente 50%-65%, das células T manipuladas não expressam um nível detectá- vel de proteína de superfície TCR, não expressam um nível detectável de proteína de superfície B2M, não expressam um nível detectável de proteína de superfície CD70 e/ou expressam um nível detectável do CAR.

[45] Em algumas modalidades, pelo menos 90%, opcionalmente 90%-100%, das células T manipuladas não expressam um nível detec- tável de proteína de superfície TCR. Em algumas modalidades, mais de 99,5% das células T manipuladas não expressam um nível detectável de proteína de superfície TCR.

[46] Em algumas modalidades, pelo menos 60%, opcionalmente 60%-75%, das células imunes manipuladas (por exemplo, células T) não expressam um nível detectável de proteína de superfície B2M.

[47] Em algumas modalidades, pelo menos 80%, opcionalmente 80%-100%, das células T manipuladas (por exemplo, células T) não ex- pressam um nível detectável de proteína de superfície CD70.

[48] Em algumas modalidades, pelo menos 80%, opcionalmente 80%-95%, das células imunes manipuladas (por exemplo, células T) ex- pressam um nível detectável do CAR (por exemplo, um CAR anti-CD70 ou um CAR anti-BCMA).

[49] Em algumas modalidades, a célula imune manipulada (por exemplo, células T) compreende ainda um gene PD-1 interrompido.

[50] Em algumas modalidades, pelo menos 50%, opcionalmente 50%-70%, das células T manipuladas não expressam um nível detectá- vel de proteína de superfície TCR, não expressam um nível detectável de proteína de superfície B2M, não expressam um nível detectável de proteína de superfície PD-1, não expressam um nível detectável de pro- teína de superfície CD70 e/ou expressam um nível detectável do CAR.

[51] Em alguns aspectos, a descrição fornece um método para produzir uma célula T manipulada, o método compreendendo: (a) entrega a uma célula T uma nuclease guiada por RNA, um gRNA com alvo em um gene CD70, e um vetor que compreende um modelo doador que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR; e (b) produzir uma célula T manipulada compreendendo um gene CD70 interrompido e expressando o CAR.

[52] Em alguns aspectos, o método compreende ainda a entrega à célula T de um gRNA com alvo em um gene TRAC; em que a célula

T manipulada compreende ainda um gene TRAC interrompido. Em al- guns aspectos, o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado por braços de homologia esquerdo e direito para o gene TRAC; e em que à célula T manipulada compreende o ácido nucleico que codifica o CAR no gene TRAC. Em alguns aspectos, o método compreende ainda a entrega à célula T de um gRNA com alvo em um gene B2M; em que à célula T manipulada compreende ainda um gene B2M interrompido.

[53] Também são aqui fornecidos métodos para a produção de uma célula T manipulada, o método compreendendo (a) entregar a uma célula T uma nuclease guiada por RNA, um gR NA com alvo em um gene TRAC, um gRNA com alvo em um gene B2M, um gRNA com alvo em um gene CD70 e um vetor compreendendo um modelo de doador que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, opcionalmente em que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado pelos braços de homologia esquerdo e direito para o locus do gene TRAC, e (b) pro- duzir uma célula T manipulada.

[54] Em algumas modalidades, a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcionalmente uma nuclease Cas9 Streptococcus pyogenes. Outras nucleases guiadas por RNA podem ser utilizadas e são descritas abaixo.

[55] Em algumas modalidades, em que o gRNA com alvo no gene TRAC compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 98 ou tem alvo na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 118, e opcionalmente em que o gRNA com alvo no gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o gRNA com alvo no gene B2M compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 99 ou tem alvo na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 119, e opcionalmente em que o gRNA com alvo no gene B2M compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31. Em algumas modalida-

des, o gRNA com alvo no gene CD70 compreende a sequência nucleo- tídica de SEQ ID NOS: 94 ou 95 ou tem alvo na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 114 ou 115, e opcionalmente em que o gRNA com alvo no gene CD70 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 26 ou 27.

[56] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a nuclease guiada por RNA e o gRNA são complexados em uma partícula de ribonucleoro- teína (RNP).

[57] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda entregar à célula T um gRNA com alvo em um gene PD-1.

[58] Em algumas modalidades, o gRNA com alvo no gene PD-1 compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 100 ou tem alvo na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 120, e opcionalmente em que o gRNA com alvo no gene PD-1 compreende a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 32.

[59] Em alguns aspectos, a descrição fornece um método para a produção de uma célula T manipulada para imunoterapia contra uma célula alvo, compreendendo: (a) interrompendo um gene CD70 em uma célula T, e (b) expressar um CAR que se liga a um antígeno expresso na célula alvo, em que o antígeno não é CD70. Em alguns aspectos, a célula alvo é uma célula cancerígena. Em alguns aspectos, o método é ex vivo. Em alguns aspectos, o método compreende ainda interromper um gene TRAC na célula T. Em alguns aspectos, o método compreende ainda interromper um gene B2M na célula T. Em alguns aspectos, o CAR é codificado por um ácido nucleico no gene TRAC interrompido. Em al- guns aspectos, o CAR é qualquer um dos CARs aqui descritos.

[60] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma população de células T manipuladas produzidas por qualquer um dos métodos aqui descritos.

[61] Em alguns aspectos, a descrição fornece um método para aumentar a proliferação de células T, compreendendo interromper o gene CD70 nas células T. Em alguns aspectos, a descrição fornece um método para reduzir a exaustão de células T, compreendendo interrom- per o gene CD70 nas células T. Em qualquer um dos aspectos anterio- res, o gene CD70 é interrompido pela edição do gene CRISPR/Cas. Em alguns aspectos, o método compreende ainda interromper o gene TRAC, o gene B2M, ou ambos os genes TRAC e B2M nas células T. Em alguns aspectos, o gene TRAC, gene B2M ou ambos os genes TRAC e B2M são interrompidos pela edição do gene CRISPR/Cas.

[62] Em algumas modalidades, o vetor compreende um ácido nu- cleico que codifica um CAR que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57. Em algumas modalidades, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 149. Em algumas modali- dades, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 139.

[63] Em alguns aspectos, a descrição fornece métodos para ad- ministrar a população de células ou células T manipuladas aqui descri- tas a um sujeito. Em alguns aspectos, as células T manipuladas são células T humanas manipuladas. Em alguns aspectos, o sujeito tem câncer. Em alguns aspectos, o câncer expressa CD70, BMCA, CD19, CD33 ou suas combinações. Em alguns aspectos, a população de cé- lulas é administrada ao sujeito em uma quantidade eficaz para tratar o câncer. Em alguns aspectos, o câncer é uma malignidade de tumor só- lido ou uma malignidade hematológica. Em alguns aspectos, a maligni- dade do tumor sólido é selecionada do grupo que consiste em: tumor ovariano, tumor pancreático, tumor renal, tumor pulmonar e tumor intes- tinal. Em alguns aspectos, a população de células é administrada ao sujeito em uma quantidade eficaz para reduzir o volume de um tumor no sujeito.

[64] Em alguns aspectos, a descrição fornece um método para tratar o câncer em um sujeito, compreendendo a administração da po- pulação de células ou células T manipuladas aqui descritas a um sujeito.

[65] Em alguns aspectos, a descrição fornece um método para o tratamento de câncer em um sujeito, compreendendo a administração ao paciente de uma população de células compreendendo células T ma- nipuladas, em que as células T manipuladas compreendem um gene CD70 interrompido e um ácido nucleico que codifica um CAR, tratando assim câncer no sujeito. Em algumas modalidades, o CAR se liga ao CD70. Em algumas modalidades, o CAR não se liga ao CD70.

[66] Em outros aspectos, a descrição fornece um método para o tratamento de câncer em um sujeito, compreendendo a administração ao paciente de uma população de células compreendendo células T ma- nipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; (ii) um gene CD70 interrompido; e (iv) um ácido nucleico que codifica um CAR; tratando assim o câncer no sujeito.

[67] Em ainda outros aspectos, a descrição fornece um método para o tratamento de câncer em um sujeito, compreendendo a adminis- tração ao paciente de uma população de células compreendendo célu- las T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; (iii) um gene CD70 interrompido; e

(iv) um ácido nucleico que codifica um CAR compreendendo (a) um ec- todomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti- CD70, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório 41BB e um domínio de sinali- zação CD37z,

[68] tratando assim o câncer no sujeito. Em algumas modalida- des, o CAR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

46. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o CAR com- preende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o gene TRAC interrompido compreende a sequência nu- cleotídica da SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 44.

[69] Em alguns aspectos, a descrição fornece um método de tra- tamento de câncer em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma população de células compreendendo células T manipu- ladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido, tratando assim o câncer no sujeito.

[70] Em alguns aspectos, a descrição fornece um método de tra- tamento de câncer em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma população de células compreendendo células T manipu- ladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequên- cia de ácido nucleico é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 45; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido,

[171] tratando assim o câncer no sujeito. Em alguns aspectos, o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 45.

[72] Em alguns aspectos, a descrição fornece um método de tra- tamento de câncer em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma população de células compreendendo células T manipu- ladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 44; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido,

[73] tratando assim o câncer no sujeito. Em alguns aspectos, o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 44.

[74] Em qualquer um dos aspectos anteriores ou relacionados, as células T manipuladas são células T humanas manipuladas. Em algu- mas modalidades, as células T manipuladas são células T alogênicas manipuladas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[75] FIG. 1 inclui um gráfico que mostra a edição de múltiplos ge- nes altamente eficiente em células T TRAC-/B2M-/PD-1-/CD70- (inati- vação quádrupla).

[76] FIG. 2 inclui um gráfico que mostra uma expansão similar em células editadas por vários genes.

[77] FIG. 3 inclui gráficos que mostram a edição eficiente de múl- tiplos genes em células TRAC/B2M"//CD70/anti-CD70 CAR* (ou seja, 3X KO (CD70), CD70 CAR*)

[78] FIG. 4 inclui um gráfico que mostra que as razões normais de células T CD4+e CD8+ são mantidas entre a população de células T TRAC/B2M/ CD70/anti-CD70 CAR*.

[79] FIG. 5 inclui um gráfico que mostra a edição eficiente de múl- tiplos genes em células TTRAC/B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 CAR*.

[80] FIG. 6 inclui um gráfico que mostra que as razões normais de células T CD4+e CD8+ são mantidas entre a população de células T TRAC/B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 CAR* (ou seja, 4X KO, CD70 CAR*).

[81] FIGS. 7A-7C incluem gráficos que mostram dados relaciona- dos à caracterização de células T ant-BCMA CAR+ com edições de múltiplos genes. Células TTRAC/B2M/anti-BCMA CAR * de inativação dupla e células TTRAC/B2M/PD-1//CD70/anti-8BCMA CAR * de inativa- ção quádrupla foram coradas para a expressão de TRAC e B2M (FIG. 7A), PD-1 e CD70 (FIG. 7B), e BCMA CAR (FIG.7C). O CAR anti-BCMA foi expresso em aproximadamente 80% nas células T CAR de inativa- ção dupla e quádrupla.

[82] FIG. 8 inclui gráficos de citometria de fluxo mostrando pre- venção da perda de células CD4+ em células T 3X KO (TRAC-/B2M- ICD70-) anti-CD33 CAR em comparação com células T 2X KO (TRAC- I/B2M-) anti-CD33 CAR ao longo de três semanas.

[83] FIG. 9 inclui um gráfico que mostra a proliferação celular au- mentada de CD70 KO em células T anti-CD33 CAR ao longo de duas semanas. O número total de células viáveis foi quantificado em células T 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) e 2X KO (TRAC-/B2M-) anti-CD33 CAR.

[84] FIG. 10 inclui um gráfico que mostra a proliferação celular aumentada de CD70 KO em células T anti-CD19 CAR ao longo de duas semanas. O número total de células viáveis foi quantificado em células T 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) e 2X KO (TRAC-/B2M-) anti-CD33 CAR.

[85] FIG. 11 inclui gráficos que mostram a proliferação celular au- mentada de CD70 KO em células T anti-BCMA CAR e resgatou o efeito prejudicial de PD1 KO na proliferação de células BCMA CAR. O número total de células viáveis foi quantificado em células T anti-CD33 CAR 4X

KO (TRAC-/B2M-/CD70-/PD1-), 3X KO (CD70) (TRAC-/B2M-/CD70-), 3X KO (PD1) (TRAC-/B2M-/PD1-) e 2X KO (TRAC-/B2M-).

[86] FIG. 12 inclui gráficos que mostram a proliferação celular au- mentada de CD70 KO em células T anti-BCMA CAR e resgatou o efeito prejudicial de PD1 KO na proliferação de células BCMA CAR. O número total de células viáveis foi quantificado em células T anti-CD33 CAR 4X KO (TRAC-/B2M-/CD70-/PD1-), 3X KO (CD70) (TRAC-/B2M-/CD70-), 3X KO (PD1) (TRAC-/B2M-/PD1-) e 2X KO (TRAC-/B2M-). As células T CAR anti-BCMA foram derivadas de células T de doadores diferentes como as células T CAR mostradas na FIG. 11.

[87] FIG. 13 inclui um gráfico que mostra uma comparação da morte celular por apoptose devido à exposição ao antígeno em células T antrBCMA CAR +2X KO (TRAC-/B2M-) e 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70- ). As células T CAR + foram expostas ao antígeno BCMA ligado à placa por 24 horas com um novo desafio a cada 24 horas e a apoptose foi avaliada após cada desafio de antígeno por citometria de fluxo. A indu- ção de apoptose devido ao desafio de antígeno foi menor em células T anti-BCMA CAR + com CD70 KO em comparação com aquelas sem.

[88] FIG. 14 inclui um gráfico que mostra uma comparação da expansão de células T CAR a seguir à exposição ao antígeno em célu- las T antirBCMA CAR+ 2X KO (TRAC-/B2M-) e células T anti-8BCMA CAR+3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-). As células T CAR + foram expostas ao antígeno BCMA ligado à placa por 24 horas com um novo desafio a cada 24 horas e a expansão celular foi avaliada após cada desafio com antígeno e normalizada para a população no tempo Oh. A expansão da população após o desafio com antígeno foi maior em células T anti- BCMA CAR+ com um CD70 KO em comparação com aquelas sem.

[89] FIG. 15 inclui um gráfico que mostra a expansão robusta de células TCAR*TRAC/B2M/ CD707/ anti-CD70. O número total de célu- las viáveis foi quantificado em células T 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) e

2X KO (TRAC-/B2M-) anti-CD70 CAR. Células 3X KO foram geradas com sgRNA CD70 T7 ou Tê.

[90] FIG. 16 inclui um gráfico que mostra a expansão robusta de células TCAR*+TRAC/B2M'/PD-1/CD70/anti-CD70. O número total de células viáveis foi quantificado em células T anti-CD70 CAR 4X KO (TRAC-/B2M-/PD1-/CD70-), 3X KO (TRAC-/B2M-/PD1-) e 2X KO (TRAC-/B2M-).

[91] FIG. 17 inclui gráficos que mostram morte celular robusta de células Nalm6 (painel superior) e células Raji (painel inferior) por células T CAR anti-CD19 (TRAC/B2M/CD70/anti-CD19 CAR* ou células T CAR+TRAC/B2M/anti-CD19).

[92] FIG. 18 inclui um gráfico que mostra a morte celular robusta de células MV411 por células T CAR anti-CD33 (TRAC/B2M/CD70 lanti-CD33 CAR * ou células TCAR+TRAC/B2M/anti-CD33).

[93] FIG. 19 inclui um gráfico que mostra a morte celular robusta de células A498 por células T anti-CD70 CAR* 3X KO (TRAC/B2M/ CD70) em comparação com células T anti-CD70 CAR*+ 2X KO (TRAC' IB2M).

[94] FIG. 20 inclui um gráfico que mostra a expansão celular de células T CAR anti-CD33 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) ou 2X KO (TRAC-/B2M-) após desafio com células alvo MV411.

[95] FIG. 21 inclui um gráfico que mostra a expansão celular de células T CAR anti-CD70 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) ou 2X KO (TRAC-/B2M-) após desafio com células alvo Nalm6.

[96] FIG. 22A inclui um gráfico que mostra a morte de células A498 por células T CAR anti-CD70 após novo desafio em série. Foram utilizadas células T anti-CD70 CAR+4X KO (TRAC/B2M/CD70/PD1), 3X KO (CD70) (TRAC/B2M/CD70), 3X KO (PD1) (TRAC/B2M/PD1) e 2X KO (TRAC/B2M). As células TCAR*3X KO (CD70), CD70 e células

T CAR+4X KO, CD70 foram as mais eficazes. FIG. 22B inclui um grá- fico que mostra a morte de células ACHN por células T CAR anti-CD70 após novo desafio em série. As mesmas células da FIG. 22A foram uti- lizadas. As células T CAR* 3X KO (CD70), CD70 e as células T CAR + 4X KO, CD70 foram as mais eficazes.

[97] FIG. 23A inclui um gráfico que mostra a morte de células ACHN por células T anti-CD70 CAR em várias razões efetor:alvo. Foram utilizadas células T anti-CD70 CAR+4X KO (TRAC/B2M/CD70/PD1), 3X KO (CD70) (TRAC/B2M/CD70), 3X KO (PD1) (TRAC/B2M/PD1) e 2X KO (TRAC/B2M). Células T CAR* 3X KO (CD70), CD70 e células T CAR* 4X KO, CD70 foram assassinas superiores após vários desafios em série. FIG. 23B inclui um gráfico que mostra a expressão de LAG3 (esquerda) e PD1 (direita) nas células da FIG. 23A após oito novos de- safios.

[98] FIGS. 24A-24C incluem gráficos que mostram que a inativa- ção de PD-1 e CD70 aumenta a atividade de morte celular de células T anti-<BCMA CAR +, conforme medido através de novos desafios em série com uma linha celular de mieloma múltiplo (MM.1S). As células T anti- BCMA CAR* (2X KO (TRAC/B2M') de inativação dupla (círculos) come- çaram a perder sua potência em relação às células MM.1S após apro- ximadamente 4 novos desafios, enquanto as células T anti-BCMA CAR * (4X KO (TRAC/B2M/CD70/PD1') de inativação quádrupla (quadrados) foram capazes de matar 100% das células MM.1S após 10 novos desa- fios (FIG. 24A) Consistente com isto, as células T anti-8BCMA CAR * de inativação quádrupla continuaram a secretar IFN-g em resposta às cé- lulas alvo após 10 novos desafios, enquanto as células T anti-<BCMA CAR* de inativação dupla mostraram redução da secreção de IFN-g após o terceiro novo desafio (FIG. 24B). As células T ant:-BCMA CAR* de inativação quádrupla também mostraram maior proliferação em res- posta à exposição às células T anti-5BCMA CAR* de inativação dupla

(FIG. 24C).

[99] FIGS. 25A-25C incluem gráficos que mostram a atividade de morte celular mais alta em células de câncer renal A498 PD-L1 (que sobre-expressam PD-L1) usando células T CAR* (4X KO) TRAC/B2M" IPD-1/CD70/anti-CD70 de inativação quádrupla e células T CAR* (3X KO (CD70)) TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 de inativação tripla, em rela- ção a células T CAR* (2X KO) TRAC/B2M/anti-CD70 de inativação du- pla e células TCAR*(3X KO (PD1) TRAC/B2M'/PD-1/anti-CD70 de ina- tivação tripla. Uma razão célula CAR T:célula A498-PD-L1 de 2:1 foi usada na FIG. 25A, uma razão célula CAR T:célula A498-PD-L1 de 1:1 foi usada na FIG. 25B, e uma razão célula CAR T:célula A498-PD-L1 de 0,5:1 foi usada na FIG. 25C.

[100] FIG. 26A e FIG. 26B incluem gráficos que mostram que cé- lulas TCAR*+(4X KO) TRAC/B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 de inativação quádrupla secretam os níveis mais elevados de citocinas IFN-gama (FIG. 26A) e IL-2 (FIG. 26B), em relação a células T CAR* (3X KO (CD70) TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 de inativação tripla, células T CAR* (2X KO) TRAC/B2M/anti-CD70 de inativação dupla e células T CAR* (3X KO (PD1) TRAC/B2M/PD-17/anti-CD70 de inativação tripla. Foi usada uma razão célula T CAR :célula A498-PD-L1 de 1:1.

[101] FIG. 27A inclui um gráfico que mostra os resultados de uma experiência projetada para avaliar a redução do volume do tumor em um modelo de carcinoma de células renais A498 subcutâneo exposto a: células TCAR*2X KO (TRAC/B2M'), CD70; células TCAR*+3X KO (PD- 1) (TRAC/B2M'/PD1), CD70; células T CAR* 3X KO (CD70) (TRAC' IB2M/CD70), CD70; ou células T CAR*+ 4X KO (PD-1, CD70) (TRAC' IB2M/PD1/CD70)), CD70. FIG. 27B inclui um gráfico que mostra os re- sultados de uma experiência projetada para avaliar a prevenção do crescimento do tumor em um modelo de novo desafio de carcinoma de células renais A498 subcutâneo. Camundongos da FIG. 27A foram de- safiados novamente com células tumorais A498 no dia 25 e o volume do tumor foi avaliado ao longo do tempo. FIG. 27C inclui um gráfico que mostra os resultados de uma experiência projetada para avaliar a redu- ção do volume do tumor em um modelo de carcinoma de células renais A498 subcutâneo (grande tumor de — 150 mm3 no momento da injeção de CAR-T) exposto a: células T CAR* 3X KO (CD70) (TRAC/B2M ICD70), CD70; células TCAR*4X KO (PD-1, CD70) (TRAC/B2M'/PD1 ICD70), CD70; células TCAR* 2X KO (TRAC/B2M'), CD70; ou células T CAR* 3X KO (PD-1) (TRAC/B2M/PD1), CD70.

[102] FIG. 28A inclui um gráfico que mostra a redução do volume do tumor em um modelo MM.1S5 subcutâneo exposto a: células TCAR+ 2X KO (TRAC-/B2M-), BCMA; células T CAR+ 3X KO (PD-1) (TRAC- IB2M-/PD1-), BCMA; células T CAR+ 3X KO (CD70) (TRAC-/B2M- ICD70-), BCMA; ou células TCAR+4X KO (PD-1, CD70) (TRAC-/B2M- I/PD1-/CD70-), BCMA.

[103] FIG. 28B inclui um gráfico que mostra a redução do volume do tumor em um modelo MM.1S subcutâneo após um novo desafio de células tumorais. Camundongos da FIG. 28A foram desafiados nova- mente com uma segunda inoculação de células MM.15 no dia 45e€ o volume do tumor foi avaliado ao longo do tempo.

[104] FIG. 29 inclui gráficos que mostram o número de células T CAR* CD45* 2X KO (TRAC/B2M'), BCMA humanas; células T CAR* CD45* 3X KO (PD-1) (TRAC/B2M/PD1), BCMA humanas; células T CAR* CD45* 3X KO (CD70) (TRAC/B2M/CD70), BCMA; e células T CAR* CD45* 4X KO (PD-1, CD70) (TRAC/B2M/PD1/CD70), BCMA, 1 semana (gráfico à direita), 2 semanas (gráfico do meio) e 3 semanas (gráfico à esquerda) após a dosagem.

[105] FIG. 30 inclui gráficos que mostram os resultados de uma experiência projetada para avaliar a redução do volume do tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor RP M1-8226 subcutâneo exposto a: células T CAR* TRAC/B2M/-anti-BCMA (células T CAR* 2X KO, BCMA); células T CAR*+ TRAC/B2M/PD1/anti-BCMA (células T CAR* 3X KO (PD-1), BCMA); células T CAR* TRAC/B2M'/CD70/anti-BCMA (células TCAR*3X KO (CD70), BCMA); ou células TCAR*TRAC/B2M' IPD1/CD70/anti-BCMA (células T CAR*+ 4X KO (PD-1, CD70), BCMA), em doses de 1x10”, 3x105, 1x1056, ou 3x105 células/camundongo.

[106] FIG. 31 inclui um gráfico que mostra que as células T CAR*TRAC/B2M/ CD70/ anti-CD70 mantêm a proliferação depen- dente de citocinas.

[107] FIG. 32 mostra o crescimento dependente de citocinas de células TCAR* TRAC/B2M'/PD-1/CD70/anti-CD70.

[108] FIG. 33 inclui um gráfico que mostra células T CAR*+ 4X KO (TRAC/B2M/ PD-1/CD70), BCMA mantêm a dependência de citoci- nas.

[109] FIG. 34 inclui um gráfico que mostra a liberação de citocina (IL-2) aumentada por células T CAR +3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) anti- CD70 em comparação com células T CAR +2X KO (TRAC-/B2M-) anti- CD70 quando cocultivadas com células de câncer renal A498 em várias razões por 24 horas.

[110] FIG. 35 inclui um gráfico que mostra a morte celular robusta de células A498 por células T anti-CD70 CAR (2X KO (TRAC/B2M'), CD70 CAR+; 3X KO (PD-1) (TRAC/B2M/PD-1"), CD70 CAR+; e 4X KO (TRAC/B2M/PD-1/CD70-) CD70 CAR*+) em relação às células TTCR+. As células T foram cocultivadas com células A498 em várias razões du- rante 24 horas e a percentagem de lise celular foi medida.

[111] FIG. 36 inclui um gráfico que mostra a maior atividade de morte celular em células de câncer renal A498 usando células T CAR* TRAC/B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 de inativação quádrupla (4X KO,

CD70 CAR+) e células T CAR* TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 de inati- vação tripla (3X KO (CD70), CD70 CAR+), em relação a células TCAR* TRAC/B2M/anti-CD70 de inativação dupla (ou seja, 2X KO, CD70 CAR*) e células TCAR+TRAC/B2M/PD-17//anti-CD70 CAR* de inativa- ção tripla (ou seja, 3X KO (PD-1), CD70 CAR*). Foi usada uma razão célula T CAR:célula A498 de 0,25:1. A percentagem de lise celular de células A498 foi medida 24 horas após a cocultura.

[112] FIGS. 37A e 37B incluem gráficos que mostram que células T CAR* TRAC/B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 de inativação quádrupla (4X KO, CD70 CAR+) e células T CAR* TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 de inativação tripla (3X KO (CD70), CD70 CAR+), secretam os níveis mais altos de citocinas IFN-gama (FIG. 37A) e IL-2 (FIG. 37B), em rela- ção a células T CAR+ TRAC/B2M/anti-CD70 de inativação dupla (2X KO, CD70 CAR+) e células T CAR+ TRAC/B2M/PD-17/anti-CD70 de inativação tripla (3X KO (PD-1), CD70 CAR+). Foi usada uma razão cé- lula T CAR:célula A498 de 0,25:1. A secreção de IFN-gama e IL-2 foi medida 24 horas em cocultura.

[113] FIG. 38 inclui um gráfico que mostra que a inativação de CD70 em células T CAR anti-CD70 (3X KO (CD70) (TRAC/B2M/CD70 ), CD70 CAR+ 3X KO (PD-1) (TRAC/B2M/PD1), CD70 CAR+ e 4X KO (TRAC/B2M/CD70/PD-1-), CD70 CAR+) diminuiu os níveis de ex- pressão de PD-1 em células T CD4+em relação às células T CAR anti- CD70 que expressam CD70 endógeno (2X KO (TRAC/B2M) CD70 CAR+).

[114] FIG. 39A e FIG. 39B incluem gráficos que mostram que a inativação de CD70 em células T CAR anti-CD70 (3X KO (CD70) (TRAC/B2M/CD70), CD70 CAR+; 3X KO (PD-1) (TRAC/B2M/PD1), CD70 CAR+; e 4X KO (TRAC/B2M/CD70/PD-1"), CD70 CAR+) dimi- nuiu os níveis do marcador de exaustão LAG3 em células T CD8+(FIG. 39A) e células T CD4+ (FIG. 39B) em relação a células T CAR anti-

CD70 que expressam CD70 endógeno (2X KO (TRAC/B2M) CD70 CAR+).

[115] FIG. 40A inclui gráficos que mostram a expressão relativa de CD70 em cinco linhas de células cancerígenas diferentes (painel es- querdo) e a expressão relativa de CD70 em três linhas celulares dife- rentes de cancelamento (painel direito). FIG. 40B inclui gráficos que mostram a expressão relativa de CD70 em nove linhas de células can- cerígenas diferentes. FIGS. 40C-40D incluem gráficos que mostram a atividade de morte celular mais elevada em células cancerígenas renais ACHN (ATCCG6 CRL-16117TY) (que expressam níveis baixos de CD70) usando células TCAR* TRAC/B2M'/PD-1/CD70/anti-CD70 de inativa- ção quádrupla (4X KO, CD70 CAR+) e células T CAR* TRAC/B2M' ICD70/anti-CD70 de inativação tripla (3X KO (CD70), CD70 CARY+), em relação a células T CAR+TRAC/B2M/anti-CD70 de inativação dupla (2X KO, CD70 CAR+) e células T CAR* TRAC/B2M'/PD-1/anti-CD70 de inativação tripla (3X KO (PD-1), CD70 CAR+). Uma razão célula T CAR:célula ACHN de 0,5:1 foi usada na FIG. 40C e uma razão célula T CAR:célula ACHN de 0,25:1 foi usada na FIG. 40D. FIG. 40E e FIG. 40F incluem gráficos que mostram a atividade de morte celular usando cé- lulas TCAR+TRAC/B2M/PD-1//CD70/anti-CD70 de inativação quádru- pla (FIG. 40E) e células TCAR* TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 de inati- vação tripla (FIG. 40F) contra linhas de células tumorais sólidas adicio- nais com níveis variáveis de expressão de CD70 (razão célula efe- tora:alvo de 4:1, 1:1 ou 0,25:1). FIG. 40G inclui um gráfico que mostra a atividade de morte celular usando células T CAR? TRAC/B2M/CD70 /anti-CD70 de inativação tripla contra linhas de células tumorais sólidas após um período de cocultura de 24 horas ou 96 horas. FIGs. 40H-40) incluem gráficos que mostram a atividade de morte celular usando cé- lulas T CAR* TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 de inativação tripla (3KO

(CD70), CD70 CAR +) contra células de leucemia mieloide crônica defi- cientes em CD70 (K562) (FIG. 40H), células de mieloma múltiplo que expressam CD70 (MM.1S) (FIG. 40I), e células de linfoma de células T que expressam CD70 (HuT78) (FIG. 40) ) em várias razões efetora:alvo.

[116] FIGS. 41A e 41B incluem gráficos que mostram que células T CAR+ TRAC/B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 de inativação quádrupla (4X KO, CD70 CAR+) e células T CAR+TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 de inativação tripla (3X KO (CD70), CD70 CAR+), secretam os níveis mais altos de citocinas IFN-gama (FIG. 41A) e IL-2 (FIG. 41B), em rela- ção a células T CAR+ TRAC/B2M/anti-CD70 de inativação dupla (2X KO, CD70 CAR+) e células T CAR+ TRAC/B2M'/PD-17/anti-CD70 de inativação tripla (3X KO (PD-1), CD70 CAR+). Foi usada uma razão cé- lula T CAR :célula ACHN de 0,25:1.

[117] FIG. 42A inclui um gráfico que mostra os resultados de uma experiência projetada para avaliar a redução do volume do tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor de ovário humano (por exemplo, células tumorais SKOV-3) expostas a células T CAR 3X KO (TRAC- IB2M-/CD70-) anti-CD70. FIG. 42B inclui um gráfico que mostra os re- sultados de uma experiência projetada para avaliar a redução do volume do tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor de pulmão de células não pequenas (por exemplo, células tumorais NCI-H1975) exposto a cé- lulas TCAR 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) anti-CD70. FIG. 42C inclui um gráfico que mostra os resultados de uma experiência projetada para avaliar a redução do volume do tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor pancreático humano (por exemplo, células tumorais Hs766T) expostas a células TCAR 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) anti-CD70. FIG. 42D inclui gráficos que mostram os resultados de uma experiência pro- jetada para avaliar a redução do volume do tumor em um modelo de xenoenxerto de linfoma de células T humanas (por exemplo, células tu- morais HuT78) expostas a células T CAR 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-)

anti-CD70. Os volumes do tumor de camundongos individuais (es- querda) e os volumes médios do tumor (direita) são mostrados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[118] A presente descrição é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que interromper o gene CD70 em células imunes mani- puladas para expressar uma fração de direcionamento de antígeno (por exemplo, CAR) melhora várias características importantes para a imu- noterapia baseada em células, incluindo eficácia antitumoral. Especifi- camente, tais células imunes manipuladas mostraram características superiores inesperadas, incluindo proliferação estendida e persistência in vivo resultando em eficácia antitumoral aumentada a longo prazo. No- tavelmente, essas características inesperadas foram demonstradas com frações de direcionamento específicas para vários antígenos, in- cluindo BCMA, CD19, CD33 e CD70.

[119] Conforme demonstrado neste documento, a interrupção do gene CD70 resultou na manutenção da citotoxicidade de células imunes manipuladas para expressar uma fração de direcionamento de antígeno após múltiplas rondas de desafios por células cancerígenas in vitro. Sem desejar ser limitado pela teoria, essa manutenção da citotoxicidade indica que a interrupção do gene CD70 torna as células imunes mani- puladas resistentes à exaustão e pode resultar em células que vivem mais.

[120] Também foi descoberto que a interrupção do gene CD70 em células imunes manipuladas para expressar uma porção de direciona- mento de antígeno aumentou a eficácia antitumoral contra grandes tu- mores e induziu uma resposta de memória anticâncer durável. Especi- ficamente, a resposta de memória anticâncer impediu o crescimento do tumor após novo desafio. Além disso, foi demonstrado que a interrupção do gene CD70 resulta em citotoxicidade aumentada de células imunes manipuladas para expressar uma fração de direcionamento de antígeno em razões mais baixas de células imunes manipuladas para células alvo, indicando a potencial eficácia de baixas doses de células imunes manipuladas.

[121] Também foi demonstrado que a interrupção do gene CD70 aumenta a proliferação celular e persistência in vivo de células imunes manipuladas. Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que as características superiores das células imunes manipuladas aqui descri- tas permitem populações de células mais consistentes, produção em maior escala devido à capacidade das células de sobreviver a mais di- visão celular e menos células iniciais necessárias para produzir as cé- lulas manipuladas. Essas características também podem ser benéficas em um ambiente clínico. Por exemplo, a expansão aumentada e a exa- ustão diminuída indicam eficácia aumentada por dose e a capacidade de obter eficácia com doses mais baixas.

[122] Também foi demonstrado que a interrupção do gene CD70 em células imunes manipuladas para expressar uma porção de direcio- namento de antígeno mantém a citotoxicidade contra células canceríge- nas que expressam moléculas supressoras altamente imunológicas, ou seja, PD-L1. Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que o sinal negativo interno de PD-1 expresso em células do sistema imunológico quando ligado a PD-L1 expresso em células cancerígenas é superado pela interrupção de CD70.

[123] Consequentemente, são aqui fornecidos métodos e compo- sições (por exemplo, composições celulares) para o tratamento de cân- cer, tal como malignidades BCMA*, CD19*, CD33*, e CD70*, envol- vendo o uso de células imunes manipuladas com eficácia e persistência aumentadas. Edição de Genes CD70

[124] Grupo de Diferenciação 70 (CD70) é um membro da super- família do fator de necrose tumoral e sua expressão é restrita a linfócitos

T e B ativados e células dendríticas maduras. O CD70 está implicado na sobrevivência das células tumorais e das células T regulatórias por meio da interação com seu ligando, o CD27. O CD70 e seu receptor CD27 têm vários papéis na função imunológica em vários tipos de célu- las, incluindo células T (ativadas e T regs) e células B. Não está claro exatamente como o CD70 funciona em todos esses tipos de células para controlar funções tal como a apoptose, com publicações indicando papéis contraditórios. Por exemplo, foi relatado que CD70 induz apop- tose ou sobrevivência de células T, dependendo da carga antigênica (Wensveen, F., etal.). Immunol, Vol 188: 4256-4267, 2012).

[125] Embora as células T CAR tenham provado ser eficazes imu- noterapeuticamente, vários desafios permanecem. Por exemplo, com o tempo, as células T CAR se tornam esgotadas e se tornam ineficazes in vivo. Em relação à fabricação, leva um tempo significativo para pro- duzir células suficientes para dosear um paciente. Para abordar essas limitações, a presente descrição fornece células T CAR que foram ma- nipuladas para interromper a expressão de CD70 endógeno enquanto, ao mesmo tempo, expressam uma fração de direcionamento de antí- geno (por exemplo, um scFv).

[126] Surpreendentemente, a presente descrição mostra que a in- terrupção do gene CD70 permite o aumento da saúde e função de T CAR (por exemplo, proliferação estendida, exaustão reduzida), inde- pendentemente do antígeno sendo direcionado pelo scFv em T CAR. Isto se aplica mesmo a antígenos expressos em células T, tais como CD33 e CD70, onde os efeitos do gene CD70 interrompido retêm a fun- ção T CAR, mesmo quando o fratricídio pode ser esperado. Ou seja, essas células de inativação de CD70 (por exemplo, em que o gene CD70 foi editado usando a tecnologia de edição de gene CRISPR/Cas9), independente da inserção do CAR, exibem crescimento celular contínuo e estável, em relação às células T não modificadas (ou células T editadas que expressam CD70) e expressam níveis mais bai- xos de marcadores de exaustão, tal como LAG3. As células T CAR da presente descrição podem incluir qualquer anticorpo (incluindo anticor- pos inteiros e fragmentos de anticorpos) ou outra molécula (por exem- plo, receptor ou ligando) que se liga especificamente a um antígeno de câncer para guiar a célula T CAR a uma célula cancerígena. Em algu- mas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-CD70 (por exemplo, um scFv anti-CD70). Em outras modalidades, o anticorpo é um anti- corpo anti-CD19 (por exemplo, um scFv anti-CD19). Em ainda outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-BCMA (por exemplo, um scFv anti-BCMA). Em outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-CD33 (por exemplo, um scFv anti-CD33). Outros antígenos de cân- cer são abrangidos pela presente descrição.

[127] Deve ser entendido que a interrupção do gene abrange a modificação do gene por meio da edição do gene (por exemplo, usando edição de gene CRISPR/Cas para inserir ou excluir um ou mais nucleo- tídeos). Em algumas modalidades, um gene interrompido é um gene que não codifica a proteína funcional. Em algumas modalidades, uma célula que compreende um gene interrompido não expressa (por exem- plo, na superfície da célula) um nível detectável (por exemplo, por anti- corpo, por exemplo, por citometria de fluxo) da proteína codificada pelo gene. Uma célula que não expressa um nível detectável da proteína pode ser referida como uma célula inativada. Por exemplo, uma célula com uma edição no geneCD70 pode ser considerada uma célula inati- vada de CD70 se a proteína CD70 não puder ser detectada na superfí- cie da célula usando um anticorpo que se liga especificamente à prote- Ína CD70.

[128] São fornecidas aqui, em algumas modalidades, as popula- ções de células nas quais uma certa percentagem das células foi edi-

tada (por exemplo, geneCD70 editado), resultando em uma certa per- centagem de células que não expressam um determinado gene e/ou proteína. Em certas modalidades, pelo menos 50% (por exemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 85%) das células de uma população de células editadas por genes são células inativadas em CD70. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células (por exemplo, células T) da população não expressam níveis detectáveis de proteína CD70. Em algumas modalidades, pelo menos 55%, pelo me- nos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células de uma população de células editadas por genes podem ser células inativadas em CD70.

[129] Em algumas modalidades, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% das células T manipuladas de uma população não expressam um nível detectável de proteína de superfície CD70. Em algumas modalidades, a percentagem de células T modificadas que não expressam um nível detectável de proteína de superfície CD70 aumenta ao longo do tempo. Assim, em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população de células T manipuladas não expressam um nível detectável de proteína de superfície CD70. Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T manipuladas de uma população pode não expressar um nível detectável de proteína de superfície CD70. Em algumas modalidades, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%-90%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%-100%, 80%-90%, ou 90%-100% das células T manipuladas de uma população não expressa um nível detectável de proteína de superfície CD70.

[130] Exemplos não limitativos de sequências de gRNA de CD70 modificadas e não modificadas que podem ser usadas conforme forne- cido neste documento para criar uma alteração genômica (por exemplo, interrupção, por exemplo, deleção, inserção, substituição) no gene CD70, estão listados na Tabela 5 (por exemplo, SEQ ID NOS: 23-29 e 33-39). Outras sequências de gRNA podem ser projetadas usando a sequência do gene CD70 localizada no cromossomo 19 (coordenadas GRCh38: Cromossomo 19: 6,583,183-6,604,103; Ensembl: ENSGOO0000125726). Em certas modalidades, gRNAs direcionados à região genômica de CD70 criam Indels (por exemplo: inserções, dele- ções ou substituições) em, ou ao redor do gene CD70 que interrompe a expressão do mMRNA e/ou proteína de CD70.

[131] Em algumas modalidades, uma partícula de ribonucleopro- teína (RNP) contendo uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, uma nuclease Cas, tal como uma nuclease Cas9) e um gRNA direcionado ao gene CD70 (ou qualquer outro gene de interesse) são entregues às células T (por exemplo, células T primárias). Em outras modalidades, a nuclease guiada por RNA e gRNA são entregues separadamente às cé- lulas T. Uma partícula de ribonucleoproteína (RNP) é simplesmente uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9) pré-complexado/comple- xado com (ligado a) um gRNA.

[132] Em algumas modalidades, o gRNA direcionado ao gene CD70 é um gRNA modificado sintético, tal como, mas não limitado a qualquer um dos gRNAs que compreendem a SEQ ID NO: 33-39. Em algumas modalidades, o gRNA direcionado ao gene CD70 é um gRNA sintético não modificado, tal como, mas não limitado a qualquer um dos gRNAs que compreendem a SEQ ID NO: 23-29.

[133] Em algumas modalidades, gRNAs direcionados à região ge- nômica de CD70 e nuclease guiada por RNA criam quebras da cadeia dupla no gene CD70. A reparação da quebra resulta em Indels no gene

CD70 em que a sequência do gene CD70 pode compreender uma se- quência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 129-134. Edição de Múltiplos Genes

[134] As células T manipuladas da presente descrição, em algu- mas modalidades, incluem mais de um gene interrompido (por exemplo: edição de mais de um gene), por exemplo, em mais de um gene. Por exemplo, uma célula T manipulada pode compreender um gene CD70 interrompido, um gene da região constante da cadeia alfa do receptor de células T (TRAC) interrompido, um gene da beta-2-microglobulina (B2M) interrompido, um gene de morte celular programada-1 (PD-1 ou PDCDI) interrompido ou qualquer combinação de dois ou mais dos ge- nes interrompidos anteriores. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende um gene TRAC interrompido, um gene B2M interrompido, e um gene CD70 interrompido. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende um gene TRAC interrompido, um gene B2M interrompido, e um gene PD-1 interrompido. Em algumas mo- dalidades, uma célula T manipulada compreende um gene TRAC inter- rompido, um gene B2M interrompido, um gene CD70 interrompido e um gene PD-1 interrompido. Edição do Gene TRAC

[135] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compre- ende um gene TRAC interrompido. Esta interrupção leva à perda de função de TCR e torna as células T manipuladas não-alorreativas e ade- quadas para o transplante alogênico, minimizando o risco de doença de enxerto versus hospedeiro. Em algumas modalidades, a expressão do gene TRAC endógeno é eliminada para evitar uma resposta de enxerto contra hospedeiro.

[136] Em algumas modalidades, uma interrupção na expressão do gene TRAC é criada inserindo um receptor de antígeno quimérico (CAR)

no gene TRAC (por exemplo, usando um vetor viral adenoassociado (AAV) e modelo de doador). Em algumas modalidades, uma interrupção na expressão do gene TRAC é criada com uma nuclease e gRNAs di- recionados à região genômica TRAC. Em algumas modalidades, uma deleção genômica no gene TRAC é criada por HDR, em que um recep- tor de antígeno quimérico (CAR) substitui um segmento do gene TRAC (por exemplo, usando um vetor viral adenoassociado (AAV) e modelo de doador). Em algumas modalidades, uma interrupção na expressão do gene TRAC é criada com uma nuclease e gRNAs direcionados à região genômica do TRAC e inserindo um receptor de antígeno quimé- rico (CAR) no gene TRAC.

[137] Exemplos não limitativos de sequências de gRNA TRAC mo- dificadas e não modificadas que podem ser usadas conforme fornecido neste documento para criar um genômico no gene TRAC estão listados em Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOS: 30 e 40). Ver também o Pe- dido Internacional No. PCT/US2018/032334, depositado a 11 de maio de 2018, aqui incorporado por referência. Outras sequências de gRNA podem ser manipuladas usando a sequência do gene CD70 localizada no cromossomo 14 (coordenadas GRCh38: 22,547,506-22,552,154;. Ensembl; ENSGO00000277734). Em algumas modalidades, gRNAs dire- cionados à região genômica do TRAC e nuclease guiada por RNA criam quebras na região genômica do TRAC, resultando em Indels no gene TRAC que interrompe a expressão do mRNA ou proteína.

[138] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população não expressam um nível detectável de proteína de superfície do receptor de células T (TCR). Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T manipuladas de uma população pode não expressar um nível detectável de proteína de superfície TCR. Em algumas modalida- des, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%- 100%, 60%-90%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%- 80%, 80%-100%, 80%-90%, ou 90%-100% das células T manipuladas de uma população não expressa um nível detectável de proteína de su- perfície TCR.

[139] Em algumas modalidades, uma partícula de ribonucleopro- teína (RNP) contendo uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, uma nuclease Cas, tal como uma nuclease Cas9) e um gRNA direcionado ao gene TRAC (ou qualquer outro gene de interesse) são entregues às células T (por exemplo, células T primárias). Em outras modalidades, a nuclease guiada por RNA e gRNA são entregues separadamente às cé- lulas T. Uma partícula de ribonucleoproteína (RNP) é simplesmente uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9) pré-complexado/comple- xado com um gRNA.

[140] Em algumas modalidades, gRNAs e nuclease guiada por RNA direcionados à região genômica TRAC resulta em Indels no gene TRAC compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências da Tabela 1: Tabela 1. [Sereia | AAGAGERACAGTGCTGTGGGECTGGAGCANCAMATCTGACTAAGAGCAACARATETGAET [6 | | ESSE TATI CT —

[141] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compre- ende uma deleção no gene TRAC relativo às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de 15-30 pares de bases no gene TRAC relativo às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 pares de bases no gene TRAC relativo às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de mais de 30 pares de bases no gene TRAC relativo às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de 20 pares de bases no gene TRAC relativo às células T não modificadas. Em algumas modali- dades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de SEQ ID NO: 86 no gene TRAC, em relação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma de- leção que compreende a SEQ ID NO: 86 no gene TRAC, em relação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T ma- nipulada compreende uma deleção de SEQ ID NO: 118 no gene TRAC, em relação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção que compreende a SEQ ID NO: 118 no gene TRAC, em relação às células T não modifica- das. Edição do Gene B2M

[142] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compre- ende um gene B2M interrompido. B2M é um componente comum (inva- riante) dos complexos MHC |. A interrupção da sua expressão por edi- ção de genes impedirá respostas hospedeiro versus células T alogêni- cas terapêuticas, levando ao aumento da persistência de células T alo- gênicas. Em algumas modalidades, a expressão do gene B2M endó- geno é eliminada para evitar uma resposta de enxerto contra hospe- deiro.

[143] Exemplos não limitativos de sequências de gRNA B2M mo- dificadas e não modificadas que podem ser usadas conforme fornecido neste documento para criar uma deleção genômica no gene B2M estão listados em Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOS: 31 e 41). Ver também o Pedido Internacional No. PCT/US2018/032334, depositado a 11 de maio de 2018, aqui incorporado por referência. Outras sequências de gRNA podem ser projetadas usando a sequência do gene B2M locali- zada no Cromossomo 15 (coordenadas GRCh38: Cromossomo 15: 44,711,477-44,718,877; Ensembl: ENSGO00000166710).

[144] Em algumas modalidades, gRNAs direcionados à região ge- nômica do B2M e nuclease guiada por RNA criam quebras na região genômica do B2M, resultando em Indels no gene B2M que interrompe a expressão do mMRNA ou proteína.

[145] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população não expressam um nível detectável de proteína de superfície B2M. Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T manipuladas de uma população pode não expressar um nível detectável de proteína de superfície B2M. Em algumas modalidades, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%-290%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%-100%, 80%-90%, ou 90%-100% das células T manipuladas de uma população não expressa um nível detectável de proteína de superfície B2M.

[146] Em algumas modalidades, menos de 50% das células T ma- nipuladas de uma população de células expressa um nível detectável de proteína de superfície B2M. Em algumas modalidades, menos de 30% das células T manipuladas de uma população expressa um nível detectável de proteína de superfície B2M. Por exemplo, menos de 50%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10% ou menos de 5% das células T manipuladas de uma população de células expressa um nível detectável de proteína de superfície B2M. Em algumas modalidades, 40% - 30%, 40%-20%, 40% - 10%, 40%-5%,

30%-20%, 30%-10%, 30%-5%, 20%-10%, 20%-5%, ou 10%-5% das cé- lulas T manipuladas de uma população não expressa um nível detectá- vel de proteína de superfície B2M.

[147] Em algumas modalidades, uma partícula de ribonucleopro- teína (RNP) contendo uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, uma nuclease Cas, tal como uma nuclease Cas9) e um gRNA direcionado ao gene B2M (ou qualquer outro gene de interesse) são entregues às células T (por exemplo, células T primárias). Em outras modalidades, a nuclease guiada por RNA e gRNA são entregues separadamente às cé- lulas T. Uma partícula de ribonucleoproteína (RNP) é simplesmente uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9) pré-complexado/comple- xado com um gRNA.

[148] Em algumas modalidades, um gene B2M editado compre- ende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências da Tabela 2. Tabela 2. CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTOTCTCTTITCTGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAG-

TCTCTCCTACCCTCCEGCT CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTOTCTCTTTCGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAG- 10

TCTCTCCTACCCTCCEGCT CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCOTCTCTTITCTGGAGGCTATCCAGCGTGAG- 11

TCTCTCCTACCCTCCEGCT CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTOTCTCTTITCTGGATAGCCTGGAGGCTATCCAGCG- 12

TGAGTCTCTCCTACCCTCCCEGCT CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTOTCTCTITCTGTGGCCTGGAGGCTATCCAGCG- 14

TGAGTCTCTCCTACCCTCCCEGCT Edição do Gene PD-1

[149] PD-1 é uma molécula de ponto de verificação imunológico que é regulada positivamente nas células T ativadas e serve para amor- tecer ou interromper as respostas das células T. A interrupção de PD-1 por edição de gene pode levar a respostas de células T terapêuticas mais persistentes e/ou potentes e/ou reduzir a supressão imunológica em um sujeito. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende um gene PD-1 interrompido. Em algumas modalidades, a expressão do gene PD-1 endógeno é eliminada para aumentar a eficá- cia antitumoral das células T CAR da presente descrição.

[150] Exemplos não limitativos de sequências de gRNA PD-1 mo- dificadas e não modificadas que podem ser usadas conforme fornecido neste documento para criar uma deleção genômica no gene PD-1 estão listadas na Tabela 5 (por exemplo, SEQ ID NOS: 32 e 42). Ver também o Pedido Internacional No. PCT/US2018/032334, depositado a 11 de maio de 2018, aqui incorporado por referência. Outras sequências de gRNA podem ser manipuladas usando a sequência do gene PD-1 loca- lizada no Cromossomo 2 (coordenadas GRCh38: Cromossomo 2: 241,849,881-241,858,908; Ensembl: ENSGO00000188389).

[151] Em algumas modalidades, o direcionamento de gRNAs e nu- clease guiada por RNA à região genômica PD-1 cria quebras na região genômica TRAC, resultando em Indels no gene PD-1 que interrompe a expressão do mMRNA ou proteína PD-1.

[152] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população não expressam um nível detectável de proteína de superfície PD-1. Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T manipuladas de uma população pode não expressar um nível detectável de proteína de superfície PD-1. Em algumas modalidades, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%-90%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%-100%, 80%-90%, ou 90%-100% das células T manipuladas de uma população não expressa um nível detectável de proteína de superfície PD-1.

[153] Em algumas modalidades, uma partícula de ribonucleopro- teína (RNP) contendo uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, uma nuclease Cas, tal como uma nuclease Cas9) e um gRNA direcionado ao gene PD-1 (ou qualquer outro gene de interesse) são entregues às células T (por exemplo, células T primárias). Em outras modalidades, a nuclease guiada por RNA e gRNA são entregues separadamente às cé- lulas T. Uma partícula de ribonucleoproteína (RNP) é simplesmente uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9) pré-complexado/comple- xado com um gRNA. Fenótipos Celulares

[154] Em algumas modalidades, uma ou mais edições de genes dentro de uma população de células resulta em um fenótipo associado a mudanças na capacidade proliferativa celular, exaustão celular, viabi- lidade celular, capacidade de lise celular (por exemplo, aumentar à pro- dução e/ou liberação de citocinas) ou qualquer combinação dos mes- mos.

[155] Em algumas modalidades, as células T manipuladas de uma população compreendem um CAR que inclui um ectodomínio scF v anti- CD70. Em algumas modalidades, as células T manipuladas de uma po- pulação compreendem um CAR que inclui um ectodomínio scFv anti- BCMA. Em algumas modalidades, as células T manipuladas de uma população compreendem um CAR que inclui um ectodomínio scF v anti- CD19. Em algumas modalidades, as células T manipuladas de uma po- pulação compreendem um CAR que inclui um ectodomínio scFv anti- CD33. Qualquer uma das células T manipuladas anteriores também pode compreender uma interrupção em um ou mais dos seguintes ge- nes: TRAC, B2M, PD-1, e/ou CD70 (por exemplo, TRAC/B2M/CD70'; TRAC/B2M/PD-1"; ou TRAC/B2M/PD-1/CD70).

[156] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da pre- sente descrição exibem capacidade proliferativa celular aumentada em relação às células de controle. Em algumas modalidades, as células T manipuladas da presente descrição exibem capacidade proliferativa ce- lular pelo menos 20% maior, em relação às células T de controle. Por exemplo, células T manipuladas (por exemplo, TRAC/ B2M/ CD70'; TRAC/ B2M/PD-1; ou TRAC/ B2M/PD-17/CD70; com ou sem CAR) podem apresentam pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% maior capacidade prolifera- tiva celular, em relação às células T de controle. Em algumas modalida- des, as células T manipuladas da presente descrição exibem capaci- dade proliferativa celular 20%-100%, 20%-90%, 20%-80%, 20%-70%, 20%-60%, 20%-50%, 30%-100%, 30%-90%, 30%-80%, 30%-70%, 30%-60%, 30%-50%, 40%-100%, 40%-90%, 40%-80%, 40%-70%, 40%-60%, 40%-50%, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, ou 50%-60% maior em relação às células T de controle. Os métodos de medição da proliferação celular são conhecidos pelos peritos na técnica e aqui descritos.

[157] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da pre- sente descrição exibem exaustão reduzida, em relação às células T de controle. Por exemplo, as células T manipuladas podem expressar ní- veis reduzidos de LAG3 (ou outros marcadores de exaustão), em rela- ção às células T de controle. Em algumas modalidades, os níveis de expressão de LAG3 são reduzidos em pelo menos 20%, em relação às células T de controle. Por exemplo, os níveis de expressão de LAG3 podem ser reduzidos em pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo me- nos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, em pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%, em relação às células T de controle. Em algumas modalidades, os níveis de expressão de LAG3 são reduzidos por 20%-100%, 20%-90%, 20%-80%, 20%- 70%, 20%-60%, 20%-50%, 30%-100%, 30%-90%, 30%-80%, 30%- 70%, 30%-60%, 30%-50%, 40%-100%, 40%-90%, 40%-80%, 40%-

70%, 40%-60%, 40%-50%, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%- 70%, ou 50%-60%, em relação às células T de controle. Em algumas modalidades, a exaustão reduzida é determinada medindo a expressão de superfície diminuída de marcadores de exaustão, incluindo TIGIT, PD-1, LAG-3 ou combinações dos mesmos. Os métodos para medir a expressão de superfície são conhecidos pelos peritos na técnica e aqui descritos.

[158] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da pre- sente descrição exibem viabilidade celular aumentada em relação às células de controle. Em algumas modalidades, as células T manipula- das da presente descrição exibem um aumento de pelo menos 20% na viabilidade celular, em relação às células de controle. Por exemplo, as células T manipuladas da presente descrição podem exibir pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60 %, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo me- nos 90% de aumento na viabilidade celular, em relação às células de controle. Em algumas modalidades, as células T manipuladas da pre- sente descrição exibem um aumento de 20%-100%, 20%-90%, 20%- 80%, 20%-70%, 20%-60%, 20%-50%, 30%-100%, 30%-90%, 30%- 80%, 30%-70%, 30%-60%, 30%-50%, 40%-100%, 40%-90%, 40%- 80%, 40%-70%, 40%-60%, 40%-50%, 50%-100%, 50%-90%, 50%- 80%, 50%-70%, ou 50%-60%da viabilidade celular em relação às célu- las de controle. Os métodos de medição da viabilidade celular são co- nhecidos pelos peritos na técnica e aqui descritos.

[159] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da pre- sente descrição exibem capacidade de lise celular aumentada em rela- ção às células de controle. Em algumas modalidades, as células T ma- nipuladas da presente descrição exibem um aumento de pelo menos 20% na capacidade de lise celular (mata pelo menos 20% mais células alvo), em relação às células de controle. Por exemplo, as células T ma- nipuladas da presente descrição podem exibir pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60 %, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de aumento na capacidade de lise celular, em relação às células de con- trole. Em algumas modalidades, as células T manipuladas da presente descrição exibem um aumento de 20%-100%, 20%-90%, 20%-80%, 20%-70%, 20%-60%, 20%-50%, 30%-100%, 30%-90%, 30%-80%, 30%-70%, 30%-60%, 30%-50%, 40%-100%, 40%-290%, 40%-80%, 40%-70%, 40%-60%, 40%-50%, 50%-100%, 50%-290%, 50%-80%, 50%-70%, ou 50%-60%da capacidade de lise celular aumentada em re- lação às células de controle.

[160] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da pre- sente descrição exibem secreção aumentada de citocinas em relação às células de controle. Por exemplo, em algumas modalidades o nível de citocinas (por exemplo, IL-2 e/ou IFN-gama) secretado pelas células T manipuladas é de pelo menos 2 vezes (por exemplo, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes) maior do que o nível de citocinas secretadas pelas células T de controle.

[161] As células T de controle, em algumas modalidades, são cé- lulas T manipuladas (por exemplo, células T editadas por genes) que expressam a proteína CD70 endógena (CD70 normalmente expresso por células T). Em algumas modalidades, as células T de controle são células T manipuladas que expressam a proteína CD70 endógena e compreendem um gene TRAC interrompido pela inserção de um ácido nucleico que codifica um CAR (por exemplo, um CAR anti-CD70 ou CAR anti-BCMA), um gene B2M interrompido, um gene PD-1 interrompido, ou qualquer combinação dos genes interrompidos anteriores. Em algu- mas modalidades, as células T de controle são células T não editadas.

[162] Surpreendentemente, as células T CAR editadas em múlti- plos genes da presente descrição (por exemplo, células TRAC/B2M' IPD-1/CD70) mantêm a citotoxicidade (capacidade de matar células cancerígenas), após múltiplos desafios (também chamados de desa- fios) com células cancerígenas.

Em algumas modalidades, as células T manipuladas mantêm a citotoxicidade após pelo menos 1 novo desafio com uma célula alvo, em que a célula alvo expressa um antígeno reco- nhecido pelas células T CAR.

Em algumas modalidades, as células T manipuladas mantêm a citotoxicidade após pelo menos 2 novos desa- fios com uma célula alvo, em que a célula alvo expressa um antígeno reconhecido pelas células T CAR.

Em algumas modalidades, as células T manipuladas mantêm a citotoxicidade após pelo menos 1 novo desafio com uma célula cancerígena.

Em algumas modalidades, as células T manipuladas mantêm a citotoxicidade após pelo menos 2 novos desa- fios com uma célula cancerígena.

Em algumas modalidades, as células T manipuladas mantêm a citotoxicidade após pelo menos 1, 2,3,4,5, 6,7, 8,9, ou 10 novos desafios com uma célula alvo, em que a célula alvo expressa um antígeno reconhecido pelas células T CAR.

Em algu- mas modalidades, as células T manipuladas mantêm a citotoxicidade após pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 novos desafios com uma célula alvo, em que a célula alvo expressa um antígeno reconhecido pelas células T CAR.

Em algumas modalidades, as células T manipula- das mantêm a citotoxicidade após 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 novos de- safios com uma célula cancerígena.

Em algumas modalidades, as célu- las T manipuladas mantêm a citotoxicidade após 10 ou mais novos de- safios com uma célula alvo, em que a célula alvo expressa um antígeno reconhecido pelas células T CAR.

Em algumas modalidades, as células T manipuladas mantêm a citotoxicidade após 10 ou mais novos desafios com uma célula cancerígena.

Em algumas modalidades, as células T manipuladas expressam um CAR específico para CD70 e a célula alvo

(por exemplo, célula cancerígena) expressa CD70. Em algumas moda- lidades, as células T manipuladas expressam um CAR específico para CD19 e a célula alvo (por exemplo, célula cancerígena) expressa CD19. Em algumas modalidades, as células T manipuladas expressam um CAR específico para CD33 e a célula alvo (por exemplo, célula cance- rígena) expressa CD33. Em algumas modalidades, as células T mani- puladas expressam um CAR específico para BCMA e a célula alvo (por exemplo, célula cancerígena) expressa BCMA.

Métodos de Edição de Genes

[163] A edição de genes (incluindo edição genômica) é um tipo de engenharia genética em que nucleotídeo(s)/ácido(s) nucleico(s) é/são inseridos, deletados e/ou substituídos em uma sequência de DNA, tal como no genoma de uma célula-alvo. A edição de genes direcionados permite a inserção, exclusão e/ou substituição em sítios pré-seleciona- dos no genoma de uma célula-alvo (por exemplo, em um gene direcio- nado ou sequência de DNA direcionada). Quando uma sequência de um gene endógeno é editada, por exemplo, por deleção, inserção ou substituição de nucleotídeo(s)/ácido(s) nucleico(s), o gene endógeno que compreende a sequência afetada pode ser inativado ou silenciado devido à alteração de sequência. Portanto, a edição direcionada pode ser usada para interromper a expressão do gene endógeno. "Integração direcionada" se refere a um processo que envolve a inserção de uma ou mais sequências exógenas, com ou sem deleção de uma sequência endógena no sítio de inserção. A integração direcionada pode resultar da edição do gene direcionado quando um modelo de doador contendo uma sequência exógena está presente. Tal como aqui utilizado, um "gene interrompido" se refere a um gene que compreende uma inser- ção, deleção ou substituição em relação a um gene endógeno de modo que a expressão de uma proteína funcional do gene endógeno seja re-

duzida ou inibida. Tal como aqui utilizado, "interromper um gene" se re- fere a um método de inserir, deletar ou substituir pelo menos um nucle- otídeo/ácido nucleico em um gene endógeno de modo que a expressão de uma proteína funcional do gene endógeno seja reduzida ou inibida. Os métodos de interrupção de um gene são conhecidos pelos peritos na técnica e descritos aqui.

[164] A edição direcionada pode ser alcançada por meio de uma abordagem independente de nuclease ou por meio de uma abordagem dependente de nuclease. Na abordagem de edição direcionada inde- pendente de nuclease, a recombinação homóloga é guiada por sequên- cias homólogas que flanqueiam um polinucleotídeo exógeno a ser intro- duzido em uma sequência endógena através da maquinaria enzimática da célula hospedeira. O polinucleotídeo exógeno pode introduzir dele- ções, inserções ou substituição de nucleotídeos na sequência endó- gena.

[165] Alternativamente, a abordagem dependente de nuclease pode alcançar a edição direcionada com maior frequência através da introdução específica de quebras de cadeia dupla (DSBs) por nucleases de corte raras específicas (por exemplo, endonucleases). Tal edição di- recionada dependente de nuclease também utiliza mecanismos de re- paração de DNA, por exemplo, junção de extremidades não homólogas (NHEJ ), que ocorre em resposta a DSBs. A reparação do DNA por NHEJ geralmente leva a inserções ou deleções aleatórias (indels) de um pequeno número de nucleotídeos endógenos. Em contraste com a reparação mediada por NHE), a reparação também pode ocorrer por uma reparação dirigida por homologia (HDR). Quando um modelo de doador contendo material genético exógeno flanqueado por um par de braços de homologia está presente, o material genético exógeno pode ser introduzido no genoma por HDR, o que resulta na integração direci- onada do material genético exógeno.

[166] Endonucleases disponíveis capazes de introduzir DSBs es- pecíficas e direcionadas incluem, mas não se limitando a, nucleases de dedo de zinco (ZFN), nucleases efetoras similares a ativador de trans- crição (TALEN) e nuclease CRISPR-Cas9 guiada por RNA (CRISPR/Cas9; Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas Regular- mente Intercaladas Associadas 9). Além disso, o sistema DICE (troca de cassete de integrase dupla) utilizando integrases phiC31 e Bxb1 tam- bém pode ser usado para integração direcionada.

[167] ZFNs são nucleases direcionadas que compreendem uma nuclease fundida a um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco (ZFBD), que é um domínio polipeptídico que se liga ao DNA de uma maneira específica de sequência através de um ou mais dedos de zinco. Um dedo de zinco é um domínio de cerca de 30 aminoácidos dentro do domínio de ligação do dedo de zinco, cuja estrutura é estabilizada pela coordenação de um fon de zinco. Exemplos de dedos de zinco incluem, mas não se limitam a, dedos de zinco C2H2, dedos de zinco C3H e dedos de zinco C4. Um domínio de dedo de zinco projetado é um domí- nio que não ocorre na natureza, cujo desenho/composição resulta prin- cipalmente de critérios racionais, por exemplo, aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processamento de in- formações em uma base de dados que armazena informações de dese- nhos ZFP existentes e dados de ligação. Ver, por exemplo, e a Patente US Nos. 6,140,081; 6,453,242; e 6,534,261; ver também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496. Um do- mínio de dedo de zinco selecionado é um domínio não encontrado na natureza, cuja produção resulta principalmente de um processo empí- rico, tal como exibição de fago, armadilha de interação ou seleção de híbrido. ZFNs são descritos em maior detalhe na Patente US No. 7,888,121 e Pat. US Nº 7,972,854. O exemplo mais conhecido de um ZFN é uma fusão da nuclease Fokl com um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco.

[168] Um TALEN é uma nuclease direcionada que compreende uma nuclease fundida a um domínio de ligação de DNA efetor de TAL. Um "domínio de ligação de DNA efetor de tipo ativador de transcrição", "domínio de ligação de DNA efetor de TAL" ou "domínio de ligação de DNA TALE" é um domínio polipeptídico de proteínas efetoras de TAL que é responsável pela ligação da proteína efetora de TAL ao DNA. As proteínas efetoras TAL são secretadas por patógenos de plantas do gê- nero Xanthomonas durante a infeção. Essas proteínas entram no núcleo da célula vegetal, ligam-se a sequências de DNA específicas do efetor por meio de seu domínio de ligação ao DNA e ativam a transcrição do gene nessas sequências por meio de seus domínios de transativação. A especificidade do domínio de ligação ao DNA efetor TAL depende de um número variável efetor de repetições imperfeitas de 34 aminoácidos, que compreendem polimorfismos em posições de repetição seleciona- das chamadas diresíduos variáveis de repetição (RVD). Os TALENs são descritos em mais detalhes no Pedido de Patente US No. 2011/0145940. O exemplo mais reconhecido de um TALEN na técnica é um polipeptídeo de fusão da nuclease Fokl a um domínio de ligação de DNA efetor de TAL.

[169] Exemplos adicionais de nucleases direcionadas adequadas para uso conforme fornecido neste documento incluem, mas não estão limitados a, Bxbl1, phic31, R4, PhiBT1 e WB/ SPBc/TP901-1, quer usado individualmente ou em combinação.

[170] Outros exemplos não limitativos de nucleases direcionadas incluem nucleases de ocorrência natural e recombinantes, por exemplo, CRISPR/Cas9, endonucleases de restrição, endonucleases de migra- ção de meganucleases e similares. Edição do Gene CRISPR-Cas9

[171] O sistema CRISPR-Cas9 é um mecanismo de defesa de ocorrência natural em procariotas que foi reaproveitado como uma pla- taforma de direcionamento de DNA guiado por RNA usada para edição de genes. Se baseia na nuclease de DNA Cas9 e em dois RNAs não codificantes, crisprRNA (crRNA) e RNA trans-ativador (tracrR NA), para direcionar a clivagem do DNA. CRISPR é uma abreviatura de Repeti- ções Palindrômicas Curtas Agrupadas Regularmente Intercaladas, uma família de sequências de DNA encontradas nos genomas de bactérias e arquéias que contêm fragmentos de DNA (DNA espaçador) com se- melhança com DNA estranho previamente exposto à célula, por exem- plo, por vírus que infetaram ou atacaram o procariota. Esses fragmentos de DNA são usados pelo procariota para detectar e destruir DNA estra- nho similar após a reintrodução, por exemplo, de vírus similares durante ataques subsequentes. A transcrição do locus CRISPR resulta na for- mação de uma molécula de RNA compreendendo a sequência espaça- dora, que se associa e tem como alvo proteínas Cas (associadas a CRISPR) capazes de reconhecer e cortar o DNA exógeno estranho. Nu- merosos tipos e classes de sistemas CRISPR/Cas foram descritos (ver, por exemplo, Koonin et al., (2017) Curr O pin Microbio!l 37:67-78).

[172] O crRNA conduz o reconhecimento de sequência e a espe- cificidade do complexo CRISPR-Cas9 através do emparelhamento de bases Watson-Crick, tipicamente com uma sequência de 20 nucleotí- deos (nt) no DNA alvo. Alterar a sequência de 5' 20nt no crRNA permite direcionar o complexo CRISPR-Cas9 para loci específicos. O complexo CRISPR-Cas9 só se liga a sequências de DNA que contêm uma se- quência correspondente aos primeiros 20 nt do crRNA, RNA guia único (S9RNA), se a sequência alvo for seguida por um motivo de DNA curto específico (com a sequência NGG) referido como um motivo adjacente de protoespaçador (PAM).

[173] TracrRNA hibridiza com a extremidade 3' de cr»RNA para for- mar uma estrutura duplex de RNA que é ligada pela endonuclease Cas9 para formar o complexo CRISPR-Cas9 cataliticamente ativo, que pode então clivar o DNA alvo.

[174] Uma vez que o complexo CRISPR-Cas9 é ligado ao DNA em um sítio alvo, dois domínios de nuclease independentes dentro da en- zima Cas9 clivam cada uma das cadeias de DNA a montante do sítio PAM, deixando uma quebra de cadeia dupla (DSB) onde ambas as ca- deias do DNA terminam em um par de bases (uma extremidade cega).

[175] Após a ligação do complexo CRISPR-Cas9 ao DNA em um sítio alvo específico e formação do DSB específico do sítio, a próxima etapa chave é a reparação do DSB. As células usam duas vias princi- pais de reparação de DNA para reparar o DSB: união de extremidade não homóloga (NHE)J ) e reparação dirigida por homologia (HDR).

[176] NHEJ é um mecanismo de reparação robusta que parece al- tamente ativo na maioria dos tipos de células, incluindo células que não se dividem. NHEJ é sujeito a erros e muitas vezes pode resultar na re- moção ou adição de entre uma e várias centenas de nucleotídeos no sítio do DSB, embora tais modificações sejam tipicamente <20 nt. As inserções e deleções resultantes (indels) podem interromper as regiões codificantes ou não codificantes dos genes. Alternativamente, HDR usa um longo trecho de DNA doador homólogo, fornecido de forma endó- gena ou exógena, para reparar o DSB com elevada fidelidade. HDR é ativo apenas na divisão das células e ocorre em uma frequência relati- vamente baixa na maioria dos tipos de células. Em muitas modalidades da presente descrição, NHEJ é utilizado como operante de reparação.

[177] Em algumas modalidades, a endonuclease Cas9 (proteína 9 associada a CRISPR) é de Streptococcus pyogenes, embora outros ho- mólogos Cas9 possam ser usados. Deve ser entendido que Cas9 de tipo selvagem pode ser usado ou versões modificadas de Cas9 podem ser usadas (por exemplo, versões evoluídas de Cas9 ou ortólogos ou variantes de Cas9), conforme fornecido neste documento. Em algumas modalidades, Cas9 pode ser substituída por outra endonuclease guiada por RNA, tal como Cpfl (de um sistema CRISPR/Cas de classe Il).

[178] Em algumas modalidades, o sistema CRISPR/Cas compre- ende componentes derivados de um sistema Tipo-l, Tipo-ll ou Tipo-lll. Os esquemas de classificação atualizados para os loci CRISPR/Cas de- finem sistemas CRISPR/Cas de Classe 1 e Classe 2, tendo Tipos la V ou VI (Makarova etal., (2015) NatRev Microbiol|, 13 (11): 722-36; Shma- kov et al., (2015) Mol Cell, 60:385-397). Os sistemas CRISPR/Cas Classe 2 têm efetores de proteína únicos. As proteínas Cas dos Tipos Il, V e VI são endonucleases guiadas por RNA de proteína única, aqui chamadas de "nucleases Cas de Classe 2". As nucleases Cas de classe 2 incluem, por exemplo, proteínas Cas9, Cpfl, C2c1, C2c2 e C2c03. À nuclease Cpfl (Zetsche et al., (2015) Cell 163:1-13) é homóloga a Cas9 e contém um domínio de nuclease similar a RuvC.

[179] Em algumas modalidades, a nuclease Cas é de um sistema CRISPR/Cas Tipo Il (por exemplo, uma proteína Cas9 de um sistema CRISPR/Cas9). Em algumas modalidades, a nuclease Cas é de um sis- tema CRISPR/Cas Classe 2 (uma única proteína Cas nuclease, tal como uma proteína Cas9 ou uma proteína Cpf1). A família de proteínas Cas9 e Cpfl são enzimas com atividade de endonuclease de DNA e podem ser direcionadas para clivar um alvo de ácido nucleico desejado, projetando um RNA guia apropriado, conforme descrito mais adiante neste documento.

[180] Em algumas modalidades, uma nuclease Cas pode compre- ender mais de um domínio de nuclease. Por exemplo, uma nuclease Cas9 pode compreender pelo menos um domínio de nuclease similar a RuvC (por exemplo, C pf1) e pelo menos um domínio de nuclease similar a HNH (por exemplo, Cas9). Em algumas modalidades, a nuclease Cas9 introduz um DSB na sequência alvo. Em algumas modalidades, a nuclease Cas9 é modificada para conter apenas um domínio de nu- clease funcional. Por exemplo, a nuclease Cas9 é modificada de modo que um dos domínios de nuclease seja mutado ou totalmente ou parci- almente deletado para reduzir sua atividade de clivagem de ácido nu- cleico. Em algumas modalidades, a nuclease Cas9 é modificada para não conter um domínio de nuclease similar a RuvC funcional. Em outras modalidades, a nuclease Cas9 é modificada para não conter domínio de nuclease similar a HNH funcional. Em algumas modalidades em que apenas um dos domínios de nuclease é funcional, a nuclease Cas9 é uma nickase que é capaz de introduzir uma quebra de cadeia simples (um "corte") na sequência alvo. Em algumas modalidades, um aminoá- cido conservado dentro de um domínio de nuclease de Cas9 é substitu- Ído para reduzir ou alterar uma atividade de nuclease. Em algumas mo- dalidades, a nickase Cas nuclease compreende uma substituição de aminoácido no domínio de nuclease similar a RuvC. Substituições de aminoácidos exemplificativas no domínio de nuclease similar a RuvC incluem D10A (com base na nuclease Cas9 de S. pyogenes). Em algu- mas modalidades, a nickase compreende uma substituição de aminoá- cido no domínio de nuclease similar a HNH. Substituições de aminoáci- dos exemplificativas no domínio de nuclease similar a HNH incluem E762A, H840A, N863A, H983A e D986A (com base na nuclease Cas9 de S. pyogenes).

[181] Em algumas modalidades, a nuclease Cas é de um sistema CRISPR/Cas Tipo |. Em algumas modalidades, a nuclease Cas é um componente do complexo Cascade de um sistema CRISPR/Cas Tipo |. Por exemplo, a nuclease Cas é uma nuclease Cas3. Em algumas mo- dalidades, a nuclease Cas é derivada de um sistema CRISPR/Cas Tipo Ill. Em algumas modalidades, a nuclease Cas é derivada de um sistema CRISPR/Cas Tipo IV. Em algumas modalidades, a nuclease Cas é de- rivada de um sistema CRISPR/Cas Tipo V. Em algumas modalidades,

a nuclease Cas é derivada de um sistema CRISPR/Cas Tipo VI. RNAs Guia

[182] A presente descrição fornece um ácido nucleico com alvo no genoma que pode direcionar as atividades de um polipeptídeo associ- ado (por exemplo, um polipeptídeo direcionado ao sítio) para uma se- quência alvo específica dentro de um ácido nucleico alvo. O ácido nu- cleico com alvo no genoma pode ser um RNA. Um RNA com alvo no genoma é referido aqui como "RNA guia" ou "RNA". Um RNA guia compreende pelo menos uma sequência espaçadora que hibrida com uma sequência alvo de ácido nucleico de interesse e uma sequência repetida de CRISPR. Nos sistemas do Tipo Il, o gRNA também compre- ende um segundo RNA chamado sequência tracrRNA. No gRNA Tipo Il, a sequência de repetição CRISPR e a sequência tracrRNA hibridam entre si para formar um duplex. No gRNA do Tipo V, o crRNA forma um duplex. Nos dois sistemas, o duplex se liga a um polipeptídeo direcio- nado ao sítio, de modo que o RNA guia e o polipeptídeo direcionado ao sítio formem um complexo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico com alvo no genoma fornece a especificidade do alvo para o complexo em virtude de sua associação com o polipeptídeo direcionado ao sítio. O ácido nucleico com alvo no genoma direciona assim a atividade do polipeptídeo direcionado ao sítio.

[183] Como é entendido pelo perito na técnica, cada RNA guia é concebido para incluir uma sequência espaçadora complementar à sua sequência alvo genômica. Ver] inek etal., Science, 337, 816-821 (2012) e Deltcheva et al., Nature, 471, 602-607 (2011).

[184] Em algumas modalidades, o ácido nucleico com alvo no ge- noma (por exemplo, gRNA) é um RNA guia de molécula dupla. Em al- gumas modalidades, o ácido nucleico com alvo no genoma (por exem- plo, gRNA) é um RNA guia de molécula simples.

[185] Um RNA guia de dupla molécula compreende duas cadeias de RNA. A primeira cadeia compreende na direção 5' a 3', uma sequên- cia opcional de extensão espaçadora, uma sequência espaçadora e uma sequência mínima de repetição CRISPR. A segunda cadeia com- preende uma sequência mínima de tracrRNA (complementar à sequên- cia mínima de repetição de CRISPR), uma sequência de tracrRNA 3' e uma sequência de extensão opcional de tracrRNA.

[186] Um RNA guia de molécula simples (também referido como um “sgRNA”) em um sistema Tipo Il compreende, na direção 5º a 3', uma sequência opcional de extensão espaçadora, uma sequência es- paçadora, uma sequência mínima de repetição CRISPR, um ligante guia de molécula simples, uma sequência mínima de tracrRNA, uma sequên- cia de tracrRNA em 3' e uma sequência de extensão opcional de tracrRNA. A extensão opcional do tracrRNA pode compreender elemen- tos que contribuem com funcionalidade adicional (por exemplo, estabili- dade) ao RNA guia. O ligante guia de molécula simples liga a repetição mínima de CRISPR e a sequência mínima de tracrRNA para formar uma estrutura em grampo. A extensão tracrRNA opcional compreende um ou mais grampos.

[187] Um RNA guia de molécula simples em um sistema Tipo V compreende, na direção 5 'a 3', uma sequência de repetição mínima de CRISPR e uma sequência espaçadora.

[188] Em algumas modalidades, o SsaRNA compreende uma se- quência espaçadora de 20 nucleotídeos na extremidade 5' da sequência de sgRNA. Em algumas modalidades, o sSsaRNA compreende uma se- quência espaçadora de menos de 20 nucleotídeos na extremidade 5' da sequência de saRNA. Em algumas modalidades, o saRNA compreende uma sequência espaçadora de mais de 20 nucleotídeos na extremidade 5' da sequência de sgaRNA. Em algumas modalidades, o saRNA com- preende uma sequência espaçadora de comprimento variável com 17- nucleotídeos na extremidade 5' da sequência de sgaRNA (ver Tabela

3).

[189] Em algumas modalidades, o saRNA não compreende ne- nhuma uracila na extremidade 3' da sequência de saRNA. Em algumas modalidades, o saRNA compreende uma ou mais uracilas na extremi- dade 3' da sequência de sgRNA. Por exemplo, o saRNA pode compre- ender 1 uracila (U) na extremidade 3' da sequência de saRNA. O saRNA pode compreender 2 uracilas (UU) na extremidade 3' da sequência de SgRNA. O saRNA pode compreender 3 uracilas (UUU) na extremidade 3' da sequência de sgaRNA. O sgRNA pode compreender 4 uracilas (UUUU) na extremidade 3' da sequência de saRNA. O saRNA pode compreender 5 uracilas (UUUUU) na extremidade 3' da sequência de SgRNA. O saRNA pode compreender 6 uracilas (UUUUUU) na extremi- dade 3' da sequência de saRNA. O saR NA pode compreender 7 uracilas (UUUUUUU) na extremidade 3' da sequência de saRNA. O sgRNA pode compreender 8 uracilas (UUUUUUUU) na extremidade 3' da sequência de saR NA.

[190] O SgRNA pode ser não modificado ou modificado. P or exem- plo, os saRNAs modificados podem compreender um ou mais nucleotí- deos de 2'-O-metil fosforotioato. Tabela 3. cguuaucaacuugaaaaaguggcacegagueggugeuuuu cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgaguegguge

[191] A título ilustrativo, os RNAs guia usados no sistema CRISPR/Cas/Cpfl ou outros RNAs menores podem ser facilmente sin- tetizados por meios químicos, tal como ilustrado abaixo e descrito na técnica. Embora os procedimentos químicos sintéticos estejam em constante expansão, a purificação desses RNAs por procedimentos como a cromatografia líquida de alta performance (HPLC, que evita o uso de géis como o PAGE) tende a se tornar mais desafiadora, pois os comprimentos dos polinucleotídeos aumentam significativamente além de cem nucleotídeos. Uma abordagem usada para gerar RNAs de maior comprimento é produzir duas ou mais moléculas que são ligadas entre si. RNAS muito mais longos, como os que codificam uma endonuclease Cas9 ou Cpfl, são mais facilmente gerados enzimaticamente. Vários tipos de modificações de RNA podem ser introduzidos durante ou após a síntese química e/ou geração enzimática de RNAs, por exemplo, mo- dificações que aumentam a estabilidade, reduzem a probabilidade ou o grau de resposta imune inata e/ou melhoram outros atributos, conforme descrito na técnica.

[192] Em algumas modalidades, a frequência indel (frequência de edição) pode ser determinada usando uma análise TIDE, que pode ser usada para identificar moléculas de gR NA altamente eficientes. Em al- gumas modalidades, um gR NA altamente eficiente produz uma frequên- cia de edição de gene superior a 80%. Por exemplo, um gRNA é consi- derado altamente eficiente se produzir uma frequência de edição de gene de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo me- nos 95% ou 100%.

[193] Em algumas modalidades, a interrupção do gene pode ocor- rer por deleção de uma sequência genômica usando dois RNAs guia. Métodos de uso da tecnologia de edição de genes CRISPR-Cas para criar uma deleção genômica em uma célula (por exemplo, para eliminar um gene em uma célula) são conhecidos (Bauer DE et al. Vis. Exp. 2015;95;652118). Sequência espaçadora

[194] Em algumas modalidades, um gRNA compreende uma se- quência espaçadora. Uma sequência espaçadora é uma sequência (por exemplo, uma sequência de 20 nucleotídeos) que define a sequência alvo (por exemplo, uma sequência de DNA alvo, tal como uma sequên- cia alvo genômico) de um ácido nucleico alvo de interesse. Em algumas modalidades, a sequência espaçadora tem 15 a 30 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência espaçadora tem 15, 16, 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sequência espaçadora tem 20 nucleotídeos.

[195] A "sequência alvo" é adjacente a uma sequência PAM e é a sequência modificada por uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9). O “ácido nucleico alvo” é uma molécula de cadeia dupla: uma cadeia compreende a sequência alvo e é referida como a “cadeia PAM”, e a outra cadeia complementar é conhecida como a “cadeia não-PAM”. Um perito na técnica reconhece que a sequência espaçadora de gRNA hibrida com o complemento reverso da sequência alvo, o qual está lo- Calizado na cadeia não-PAM do ácido nucleico alvo de interesse. Assim, a sequência espaçadora de gR NA é o equivalente de RNA da sequência alvo. Por exemplo, se a sequência alvo é 5-AGAGCAACAGTGCTG- TGGCC-3' (SEQ ID NO: 86), então a sequência espaçadora de gRNA é S-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3' (SEQ ID NO: 98). O espaçador de um gRNA interage com um ácido nucleico alvo de interesse de uma maneira específica de sequência via hibridação (isto é, emparelhamento de bases). A sequência de nucleotídeos do espaçador varia, portanto, dependendo da sequência alvo do ácido nucleico alvo de interesse.

[196] Em um sistema CRISPR/Cas aqui descrito, a sequência es- paçadora é concebida para hibridar com uma região do ácido nucleico alvo que está localizada a 5' de um PAM da enzima Cas9 usada no sistema. O espaçador pode corresponder perfeitamente à sequência alvo ou pode ter incompatibilidades. Cada enzima Cas9 possui uma se- quência PAM específica que reconhece um DNA alvo. Por exemplo, 5. pyogenes reconhece em um ácido nucleico alvo um PAM que compre- ende a sequência 5-NRG-3', em que R compreende A ou G, onde N é qualquer nucleotídeo e N é imediatamente 3' da sequência alvo de ácido nucleico alvo da sequência espaçadora.

[197] Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico alvo compreende 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo compreende menos de 20 nucleotídeos. Em algumas mo- dalidades, o ácido nucleico alvo compreende mais de 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo compreende pelo me- nos: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 ou mais nucleo- tídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo compreende no máximo: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico alvo compreende 20 bases imediatamente 5' do primeiro nucleotídeo de PAM. Por exemplo, em uma sequência compreendendo 5'- NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3', o ácido nucleico alvo compre- ende a sequência que corresponde a Ns, em que N é qualquer nucleo- tídeo e a sequência NRG sublinhada é PAM de S. pyogenes.

[198] Exemplos não limitativos de gRNAs que podem ser usados conforme fornecidos neste documento são fornecidos em PCT/IB2018/001619, depositado em 11 de maio de 2018, aqui incorpo- rado por referência. Métodos de Fabricação de gRNASs

[199] Os gRNAs da presente descrição são produzidos por um meio adequado disponível na técnica, incluindo, mas não se limitando a em vitro transcrição (IVT), métodos de síntese sintética e / ou química, ou uma combinação dos mesmos. São utilizados métodos sintéticos combinados, enzimáticos (IVT), de fase sólida, de fase líquida, síntese de pequenas regiões e métodos de ligação. Em uma modalidade, os gRNAs são feitos usando métodos de síntese enzimática IVT. Os méto- dos de preparação de polinucleotídeos por IVT são conhecidos na téc-

nica e são descritos no Pedido Internacional PCT/US2013/30062. Con- sequentemente, a presente descrição também inclui polinucleotídeos, por exemplo, DNA, construtos e vetores são usados para transcrever in vitro um gRNA aqui descrito.

[200] Em algumas modalidades, nucleobases modificadas não na- turais são introduzidas em polinucleotídeos, por exemplo, gRNA, du- rante a síntese ou pós-síntese. Em certas modalidades, as modificações são em ligações internucleosídicas, bases de purina ou pirimidina ou açúcar. Em algumas modalidades, uma modificação é introduzida no terminal de um polinucleotídeo; com síntese química ou com uma en- zima polimerase. Exemplos de ácidos nucleicos modificados e sua sín- tese são divulgados no pedido PCT No. PCT/US2012/058519. A síntese de polinucleotídeos modificados também é descrita em Verma e Ecks- tein, Annual Review of Biochemistry, vol. 76, 99-134 (1998).

[201] Em algumas modalidades, métodos de ligação enzimática ou química são usados para conjugar polinucleotídeos ou suas regiões com diferentes frações funcionais, tais como direcionamento ou agentes de entrega, marcadores fluorescentes, líquidos, nanopartículas, etc. Conjugados de polinucleotídeos e polinucleotídeos modificados estão revistos em Goodchild, Bioconjugate Chemistry, vol. 1(3), 165-187 (1990).

[202] Certas modalidades da invenção também fornecem ácidos nucleicos, por exemplo, vetores, que codificam gRNAs aqui descritos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é uma molécula de DNA. Em outras modalidades, o ácido nucleico é uma molécula de RNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um crRNA. Em algumas modalidades, a se- quência de nucleotídeos que codifica o cºRNA compreende um espaça- dor flanqueado por toda ou uma parte de uma sequência de repetição de um sistema CRISPR/Cas de ocorrência natural. Em algumas moda- lidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um tracrRNA. Em algumas modalidades, o crRNA e o tracrRNA são codificados por dois ácidos nucleicos separados. Em ou- tras modalidades, o crRNA e o tracrRNA são codificados por um único ácido nucleico. Em algumas modalidades, o crRNA e o tracrRNA são codificados por cadeias opostas de um único ácido nucleico. Em outras modalidades, o crRNA e o tracrRNA são codificados pela mesma cadeia de um único ácido nucleico.

[203] Em algumas modalidades, os gRNAs fornecidos pela des- crição são sintetizados quimicamente por qualquer meio descrito na téc- nica (ver, por exemplo, WO0/2005/01248). Embora os procedimentos químicos sintéticos estejam em constante expansão, a purificação des- ses RNAs por procedimentos como a cromatografia líquida de alta per- formance (HPLC, que evita o uso de géis como o PAGE) tende a se tornar mais desafiadora, pois os comprimentos dos polinucleotídeos au- mentam significativamente além de cem nucleotídeos. Uma abordagem usada para gerar RNAs de maior comprimento é produzir duas ou mais moléculas que são ligadas entre si.

[204] Em algumas modalidades, os gRNAs fornecidos pela descri- ção são sintetizados por métodos enzimáticos (por exemplo, transcrição in vitro, IVT).

[205] Vários tipos de modificações de RNA podem ser introduzidos durante ou após a síntese química e/ou geração enzimática de RNAs, por exemplo, modificações que aumentam a estabilidade, reduzem a probabilidade ou o grau de resposta imune inata e/ou melhoram outros atributos, conforme descrito na técnica.

[206] Em certas modalidades, mais de um RNA guia pode ser usado com um sistema de nuclease CRISPR/Cas. Cada RNA guia pode conter uma sequência de direcionamento diferente, de modo que o sis- tema CRISPR/Cas cliva mais de um ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, um ou mais RNAs guia podem ter propriedades iguais ou diferentes, tal como atividade ou estabilidade dentro do complexo Cas9 RNP. Onde mais de um RNA guia é usado, cada RNA guia pode ser codificado no mesmo ou em vetores diferentes. Os promotores usados para conduzir a expressão de mais de um RNA guia são iguais ou dife- rentes.

[207] O RNA guia pode ter como alvo qualquer sequência de inte- resse através da sequência de direcionamento (por exemplo, sequência espaçadora) do crRNA. Em algumas modalidades, o grau de comple- mentaridade entre a sequência alvo do RNA guia e a sequência alvo na molécula de ácido nucleico alvo é de cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em algumas modali- dades, a sequência de direcionamento do RNA guia e a sequência alvo na molécula de ácido nucleico alvo é 100% complementar. Em outras modalidades, a sequência de direcionamento do RNA guia e a sequên- cia alvo na molécula de ácido nucleico alvo podem conter pelo menos uma incompatibilidade. P or exemplo, a sequência de direcionamento do RNA guia e a sequência alvo na molécula de ácido nucleico alvo podem conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 incompatibilidades. Em algumas modalidades, a sequência de direcionamento do RNA guia e a sequên- cia alvo na molécula de ácido nucleico alvo podem conter 1 a 6 incom- patibilidades. Em outras modalidades, a sequência de direcionamento do RNA guia e a sequência alvo na molécula de ácido nucleico alvo podem conter 5 a 6 incompatibilidades.

[208] O comprimento da sequência de direcionamento pode de- pender do sistema CRISPR/Cas9 e dos componentes usados. Por exemplo, diferentes proteínas Cas9 de diferentes espécies bacterianas têm diferentes comprimentos de sequência de direcionamento ideal.

Consequentemente, a sequência de direcionamento pode compreender 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19, 20,21,22,23,24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, ou mais de 50 nucleotídeos de com- primento. Em algumas modalidades, a sequência de direcionamento pode compreender 18-24 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência de direcionamento pode compreender 19-21 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência de direcionamento pode compreender 20 nucleotídeos de comprimento.

[209] Em algumas modalidades da presente descrição, um sis- tema de nuclease CRISPR/Cas inclui pelo menos um RNA guia. Em algumas modalidades, o RNA guia e a proteína Cas podem formar uma ribonucleoproteína (RNP), por exemplo, um complexo CRISPR/Cas. O RNA guia pode guiar a proteína Cas para uma sequência alvo em uma molécula de ácido nucleico alvo (por exemplo, uma molécula de DNA genômico), onde a proteína Cas cliva o ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, o complexo CRISPR/Cas é um complexo Cpf1/RNA guia. Em algumas modalidades, o complexo CRISPR é um complexo CRISPR/Cas9 do Tipo Il. Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9. Em algumas modalidades, o complexo CRISPR/Cas9 é um complexo Cas9/RNA guia. Entrega de RNA quia e Nuclease

[210] Em algumas modalidades, um gRNA e uma nuclease guiada por RNA são entregues a uma célula separadamente, simultaneamente ou sequencialmente. Em algumas modalidades, um gRNA e uma nu- clease guiada por RNA são entregues a uma célula juntos. Em algumas modalidades, um gRNA e uma nuclease guiada por RNA são pré-com- plexados juntos para formar uma ribonucleoproteína (RNP).

[211] As RNPs são úteis para edição de genes, pelo menos porque minimizam o risco de interações promíscuas em um ambiente celular rico em ácido nucléico e protegem o RNA da degradação. Os métodos para formar RNPs são conhecidos na técnica. Em algumas modalida- des, uma RNP contendo uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, uma nuclease Cas, tal como uma nuclease Cas9) e um gRNA direcio- nado a um gene de interesse é entregue a uma célula (por exemplo: uma célula T). Em algumas modalidades, uma RNP é entregue a uma célula T por eletroporação.

[212] Conforme usado aqui, uma “RNP direcionando para TRAC” se refere a um gRNA que tem como alvo o gene TRAC pré-complexado com uma nuclease guiada por RNA. Conforme usado aqui, uma “RNP direcionando para B2M”se refere a um gR NA que tem como alvo o gene B2M pré-complexado com uma nuclease guiada por RNA. Conforme usado aqui, uma “RNP direcionando para CD70” se refere a um gRNA que tem como alvo o gene CD70 pré-complexado com uma nuclease guiada por RNA. Conforme usado aqui, uma “RNP direcionando para PD-1”se refere a um gRNA que tem como alvo o gene PD-1 pré-com- plexado com uma nuclease guiada por RNA.

[213] Em algumas modalidades, uma RNP direcionando para TRAC é entregue a uma célula. Em algumas modalidades, uma RNP direcionando para B2M é entregue a uma célula. Em algumas modali- dades, uma RNP direcionando para CD70 é entregue a uma célula. Em algumas modalidades, uma RNP direcionando para PD-1 é entregue à uma célula.

[214] Em algumas modalidades, mais de uma RNP é entregue a uma célula. Em algumas modalidades, mais de uma RNP é entregue a uma célula separadamente. Em algumas modalidades, mais de uma RNP é entregue a uma célula simultaneamente. Em algumas modalida- des, pelo menos uma das RNPs a seguir é entregue a uma célula: (i) uma RNP direcionando para TRAC; (ii) uma RNP direcionando para B2M; (iii) uma RNP direcionando para CD70; ou

(iv) uma RNP direcionando para PD-1. Em algumas modalidades, pelo menos duas das RNPs a seguir são entregues a uma célula: (i) uma RNP direcionando para TRAC; (ii) uma RNP direcionando para B2M; (iii) uma RNP direcionando para CD70; ou (iv) uma RNP direcionando para PD-1.

[215] Em algumas modalidades, uma nuclease guiada por RNA é entregue a uma célula em um vetor de DNA que expressa a nuclease guiada por RNA, um RNA que codifica a nuclease guiada por RNA ou uma proteína. Em algumas modalidades, um gRNA direcionado a um gene é entregue a uma célula como um RNA ou um vetor de DNA que expressa o gRNA.

[216] A entrega de uma nuclease guiada por RNA, gRNA e/ou um RNP pode ser por meio de injeção direta ou transfecção celular usando métodos conhecidos, por exemplo, eletroporação ou transfecção quíi- mica. Outros métodos de transfecção de células podem ser usados. Células T do receptor de antígeno quimérico (CAR)

[217] Um receptor de antígeno quimérico se refere a um receptor de célula imune artificial que é manipulado para reconhecer e se ligar a um antígeno expresso por células tumorais. Geralmente, um CAR é con- cebido para uma célula T e é uma quimera de um domínio de sinaliza- ção do complexo receptor de células T (TCR) e um domínio de reconhe- cimento de antígeno (por exemplo, um fragmento de cadeia simples (scFv) de um anticorpo ou outro fragmento de anticorpo) (Enblad etal,, Human Gene Therapy. 2015; 26(8):498-505). Uma célula T que ex- pressa um CAR é referida como uma célula T CAR. Os CARs têm a capacidade de redirecionar a especificidade e reatividade das células T para um alvo selecionado de uma maneira não restrita ao MHC O reco- nhecimento de antígeno não restrito a MHC dá às células T, que expres-

sam os CARS, a capacidade de reconhecer um antígeno independente- mente do processamento do antígeno, ignorando, assim, um meca- nismo principal de escape do tumor. Além disso, quando expressos em células T, os CARS vantajosamente não se dimerizam com as cadeias alfa e beta do receptor endógeno de células T (TCR). Os CARs são frequentemente referenciados pelo antígeno a que se ligam. Por exem- plo, um "CAR CD19", um "CAR CD70", um "CAR CD33" e um "CAR BCMA'"são CARs compreendendo domínios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a CD19, CD70, CD33 ou BCMA, respectiva- mente. Consequentemente, tais termos são intercambiáveis com CAR anti-CD19, CAR anti-CD70, CAR anti-CD33 e CAR anti-BCMA. Será en- tendido por aqueles peritos na técnica que um CAR que se liga especi- ficamente a um antígeno pode ser referido com qualquer terminologia.

[218] Existem quatro gerações de CARS, cada uma contendo com- ponentes diferentes. Os CARs de primeira geração unem um scF v deri- vado de anticorpo ao domínio de sinalização intracelular CD3zeta (6 ou z) do receptor de células T através de domínios de dobradiça e trans- membrana. Os CARs de segunda geração incorporam um domínio adi- cional, por exemplo, CD28, 4-1BB (41BB) ou ICOS, para fornecer um sinal coestimulatório. Os CARs de terceira geração contêm dois domí- nios coestimulatórios fundidos com a cadeia TOR CD37. Os domínios coestimulatórios de terceira geração podem incluir, por exemplo, uma combinação de CD37, CD27, CD28, 4-1BB, ICOS ou OX40. Os CARS, em algumas modalidades, contêm um ectodomínio comumente deri- vado de um fragmento variável de cadeia simples (scFv), uma dobra- diça, um domínio transmembranar e um endodomínio com um (primeira geração), dois (segunda geração), ou três domínios de sinalização (ter- ceira geração) derivados de CD3Z e/ou moléculas coestimulatórias (Maude et al., Blood. 2015; 125(26):4017-4023; Kakarla and Gottschalk, Cancer). 2014; 20(2):151-155).

[219] Os CARS normalmente se diferem em suas propriedades funcionais. O domínio de sinalização CD37 do receptor de células T, quando ativado, ativa e induz a proliferação de células T, mas pode levar à anergia (falta de reação pelos mecanismos de defesa do corpo, resul- tando em indução direta da tolerância linfocitária periférica). Os linfóci- tos são considerados anérgicos quando não respondem a um antígeno específico. A adição de um domínio coestimulatório nos CARs de se- gunda geração melhorou a capacidade replicativa e a persistência de células T modificadas. Efeitos antitumorais similares são observados in vitro com CARs CD28 ou 4-1BB, mas estudos pré-clínicos in vivo suge- rem que os CAR 4-1BB podem produzir proliferação e/ou persistência superiores. Os ensaios clínicos sugerem que ambos os CARs de se- gunda geração são capazes de induzir uma proliferação substancial de células T in vivo, mas os CARs contendo o domínio coestimulatório 4- 1BB parecem persistir por mais tempo. Os CARs de terceira geração combinam múltiplos domínios de sinalização (coestimulatórios) para au- mentar a potência.

[220] Em algumas modalidades, um receptor de antígeno quimé- rico é um CAR de primeira geração. Em outras modalidades, um recep- tor de antígeno quimérico é um CAR de segunda geração. Em ainda outras modalidades, um receptor de antígeno quimérico é um CAR de terceira geração.

[221] Um CAR, em algumas modalidades, compreende um domí- nio extracelular (ecto) compreendendo um domínio de ligação ao antí- geno (por exemplo, um anticorpo, tal como um scFv), um domínio trans- membranar e um domínio citoplasmático (endo). E ctodomínio

[222] O ectodomínio é a região do CAR que é exposta ao fluido extracelular e, em algumas modalidades, inclui um domínio de ligação ao antígeno e, opcionalmente, um peptídeo sinal, um domínio espaça- dor e/ou um domínio de dobradiça. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é um fragmento variável de cadeia única (scFv) que inclui VL e VH de imunoglobulinas conectadas a um peptídeo |i- gante curto. O ligante, em algumas modalidades, inclui resíduos hidro- fílicos com trechos de glicina e serina para flexibilidade, bem como tre- chos de glutamato e lisina para maior solubilidade. Um fragmento vari- ável de cadeia simples (scFv) não é realmente um fragmento de um anticorpo, mas sim uma proteína de fusão das regiões variáveis das ca- deias pesada (VH) e leve (VL) de imunoglobulinas, conectadas a um peptídeo ligante curto de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligante ge- ralmente é rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treo- nina para solubilidade, e pode conectar o terminal N de VH ao terminal C de VL ou vice-versa. Esta proteína retém a especificidade da imuno- globulina original, apesar da remoção das regiões constantes e da in- trodução do ligante. Em algumas modalidades, o scFv da presente des- crição é humanizado. Em outras modalidades, o scFv é totalmente hu- mano. Em ainda outras modalidades, o scFv é uma quimera (por exem- plo, sequência de camundongo e humana).

[223] Em algumas modalidades, o scFv é um scFv anti-CD70 (liga- se especificamente a CD70). Exemplos não limitativos de proteínas scFv anti-CD70 que podem ser usados conforme fornecido neste docu- mento podem incluir a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 50.

[224] Em algumas modalidades, o scFv é um scFv anti-BCMA (liga-se especificamente a BCMA). Exemplos não limitativos de proteí- nas scFv anti-BCMA que podem ser usados conforme fornecido neste documento podem incluir a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

59.

[225] Em algumas modalidades, o scFv é um scFv anti-CD19 (liga-

se especificamente a CD19). Exemplos não limitativos de proteínas scFv anti-CD19 que podem ser usados conforme fornecido neste docu- mento podem incluir a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 151.

[226] Em algumas modalidades, o scFv é um scFv anti-CD33 (liga- se especificamente a CD33). Exemplos não limitativos de proteínas scFv anti-CD33 que podem ser usados conforme fornecido neste docu- mento podem incluir a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137.

[227] Podem ser usadas outras proteínas scFv.

[228] O peptídeo sinal pode melhorar a especificidade do antígeno da ligação ao CAR. Os peptídeos sinal podem ser derivados de anticor- pos, tais como, mas não limitados a, CD8, bem como marcadores de epítopos tais como, mas não limitados a, GST ou FLAG. Exemplos de peptídeos de sinal incluem MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO: 88) e MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 89). Outros peptídeos de sinal podem ser usados.

[229] Em algumas modalidades, um domínio espaçador ou domí- nio de dobradiça está localizado entre um domínio extracelular (compre- endendo o domínio de ligação ao antígeno) e um domínio transmem- branar de um CAR, ou entre um domínio citoplasmático e um domínio transmembranar do CAR. Um domínio espaçador é qualquer oligopep- tídeo ou polipeptídeo que funciona para ligar o domínio transmembranar ao domínio extracelular e/ou ao domínio citoplasmático na cadeia poli- peptídica. Um domínio de dobradiça é qualquer oligopeptídeo ou poli- peptídeo que funciona para fornecer flexibilidade ao CAR, ou domínios do mesmo, ou para impedir impedimento estérico do CAR, ou domínios do mesmo. Em algumas modalidades, um domínio espaçador ou um domínio de dobradiça pode compreender até 300 aminoácidos (por exemplo, 10 a 100 aminoácidos ou 5 a 20 aminoácidos). Em algumas modalidades, um ou mais domínios espaçadores podem ser incluídos em outras regiões de um CAR. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é um domínio de dobradiça CD8. Outros domínios de dobra- diças podem ser usados. Domínio Transmembranar

[230] O domínio transmembranar é uma hélice alfa hidrofóbica que atravessa a membrana. O domínio transmembranar fornece estabili- dade ao CAR. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar de um CAR, conforme aqui fornecido, é um domínio transmembranar CDB8. Em outras modalidades, o domínio transmembranar é um domínio trans- membranar CD28. Em ainda outras modalidades, o domínio transmem- branar é uma quimera de um domínio transmembranar CD8 e CD28. Outros domínios trcansmembranares podem ser utilizados como aqui for- necido. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é um do- mínio transmembranar CD8a. FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIAS- QPLSLRPEACRPAAGG . AVHTRGLDFACDIYIVAPLAGTCGVLLLS- LVITLYCNHRNR (SEQ ID NO: 90). Podem ser usados outros domínios transmembranares.

[231] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD8a compreendendo a sequência de amino- ácidos: INIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY (SEQ ID NO: 126). E ndodomínio

[232] O endodomínio é o fim funcional do receptor. Após o reco- nhecimento do antígeno, os receptores se agrupam e um sinal é trans- mitido para a célula. O componente endodomínio mais comumente usado é o CD3-zeta, que contém três (3) motivos de ativação à base de imunorreceptor de tirosina (ITAM)s. Isso transmite um sinal de ativação para a célula T após a ligação do antígeno. Em muitos casos, o CD3- zeta pode não fornecer um sinal de ativação totalmente competente e, portanto, é utilizada uma sinalização coestimulatória. Por exemplo, CD28 e/ou 4-1BB podem ser usados com CD3-zeta (CD37) para trans-

mitir um sinal proliferativo/de sobrevivência. Assim, em algumas moda- lidades, a molécula coestimulatória de um CAR, como aqui fornecido, é uma molécula coestimulatória de CD28. Em outras modalidades, a mo- lécula coestimulatória é uma molécula coestimulatória de 4-1BB. Em al- gumas modalidades, um CAR inclui CD36 e CD28. Em outras modali- dades, um CAR inclui CD3-zeta e 4-1BB. Ainda em outras modalidades, um CAR inclui CD37, CD28 e 4-1BB. Tabela 4 fornece exemplos de domínios de sinalização derivados de 4-1BB, CD28 e CD3-zeta que po- dem ser usados aqui. Tabela 4 as RR smemnNe: | AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAAC- 8 4-1BB TACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG TCAAAGCGGAGTAGGTTGTTGCATTCCGATTACATGAATATGACTCCTCGCCGGCCTGGG- 11 CD28 CCGACAAGAAAACATTACCAACCCTATGCCCCCCCACGAGACTTCGCTGCGTACAGGTCC CGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTA-

TAACGAACTGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACC CGGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCA- an

GAAGGATAAGATGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAA CD3-zeta GGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATGCACTGCA-

TATGCAGGCCCTGCCTCCCAGA RVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN- 2

PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Antígenos de Câncer CD70

[233] Em algumas modalidades, as células T da presente descri- ção são manipuladas com um receptor de antígeno quimérico (CAR) desenhado para atingir CD70. O CD70 foi inicialmente identificado como o ligando para CD27, um receptor coestimulatório envolvido na prolife- ração e sobrevivência das células T. O CD70 é encontrado apenas em uma pequena percentagem de células T ativadas e células apresenta- doras de antígenos nos linfonodos de drenagem durante a infeção viral. Muitos tumores humanos também expressam CD70 incluindo, mas não se limitando a, cânceres sólidos, como câncer renal de células claras,

câncer de mama, câncer gástrico, câncer de ovário, glioblastoma e do- enças hematológicas malignas. Devido ao seu padrão de expressão restrito em tecidos normais e sobre-expressão em vários cânceres, o CD70 é um alvo terapêutico atraente.

[234] Assim, em algumas modalidades, as células T da presente descrição são manipuladas para expressar um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD70 (por exemplo, scFv anti-CD70). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD70 é um scFv anti-CD70 codificado pela sequência de SEQ ID NO: 47 ou 49. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD70 é um scFv anti-CD70 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 48 ou 50. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- CD70 é um scFv anti-CD70 que compreende uma VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 51. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD70 é um scFv anti-CD70 compreendendo uma VL compreen- dendo a sequência de SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD70 é codificado pela sequên- cia de SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, um CAR compreen- dendo um anticorpo anti-CD70 compreende a sequência de SEQ ID NO:

46.

[235] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD70 é um scFv anti-CD70 codificado por uma sequência de nucleotídeos com pelo me- nos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 47 ou 49. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD70 é um scFv anti-CD70 que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 48 ou 50. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- CD70 é um scFv anti-CD70 que compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%,

83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 51. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD70 é um scFv anti-CD70 que compreende uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de iden- tidade para SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, um CAR com- preendendo um anticorpo anti-CD70 é codificado por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD70 compreende uma se- quência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 46.

BCMA

[236] Em algumas modalidades, as células T da presente descri- ção são manipuladas com CAR desenhado para atingir BCMA. O antí- geno de maturação de células B (BCMA, CD269) é um membro da su- perfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNF). BCMA liga o fator de ativação de células B (BAFF) e um ligando indutor de prolifera- ção (APRIL). Entre as células não malignas, BCMA é expresso princi- palmente por células plasmáticas e subconjuntos de células B maduras. BCMA é expresso seletivamente por células da linhagem B, incluindo células de mieloma múltiplo e linfoma não Hodgkin, portanto, BCMA também é um alvo terapêutico atraente.

[237] Assim, em algumas modalidades, as células T da presente descrição são manipuladas para expressar um CAR compreendendo um anticorpo anti-BCMA (por exemplo, scFv anti-BCMA). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-<BCMA é um scFv anti-BCMA codificado pela sequência de SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, o anti- corpo anti-BCMA é um scFv anti-<BCMA compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 59. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-BCMA é um scFv anti-8BCMA que compreende uma VH compreendendo a se- quência de SEQ ID NO: 60. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- BCMA é um scFv anti-<BCMA que compreende uma VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 61. Em algumas modalidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti-BCMA é codificado pela sequência de SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti-BCMA compreende a sequência de SEQ ID NO: 57.

[238] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-BCMA é um scFv anti-BCMA codificado por uma sequência de nucleotídeos com pelo me- nos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-BCMA é um scFv anti-BCMA que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 59. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-BCMA é um scFv anti-8BCMA que compreende uma VH compreendendo uma se- quência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 60. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo anti-BCMA é um scFv anti-<8BCMA que compre- ende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 61. Em algumas modalidades, um CAR compreen- dendo um anticorpo anti-BCMA é codificado por uma sequência de nu- cleotídeos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,

87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti-8BCMA compreende uma se- quência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 57.

CD19

[239] Em algumas modalidades, as células T da presente descri- ção são manipuladas com CAR desenhado para atingir CD19. Grupo de Diferenciação 19 (CD19) é um determinante antigênico detectável em células precursoras de leucemia. As sequências de aminoácidos e áci- dos nucléicos humanos e murinos podem ser encontrados em uma base de dados pública, tal como GenBank, UniProt e Swiss-Prot. Por exem- plo, a sequência de aminoácidos do CD19 humano pode ser encontrada como No. de Acesso de UniProt/Swiss-Prot P15391 e a sequência de nucleotídeos que codifica o CD19 humano pode ser encontrada no No. de Acesso NM—O001178098. O CD19 é expresso na maioria dos cânce- res de linhagem B, incluindo, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocitária crônica e linfoma não Hodgkin. É também um mar- cador precoce de progenitores de células B. Ver, por exemplo, Nichol- son et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997).

[240] Assim, em algumas modalidades, as células T da presente descrição são manipuladas para expressar um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD19 (por exemplo, scFv anti-CD19). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD19 é um scFv anti-CD19 codificado pela sequência de SEQ ID NO: 150. Em algumas modalidades, o anti- corpo anti-CD19 é um scFv anti-CD19 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 151. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD19 é um scFv anti-CD19 que compreende uma VH compreendendo a se- quência de SEQ ID NO: 152. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-

CD19 é um scFv anti-CD19 que compreende uma VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 153. Em algumas modalidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD19 é codificado pela sequência de SEQ ID NO: 148. Em algumas modalidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD19 compreende a sequência de SEQ ID NO: 149.

[241] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD19 é um scFv anti-CD19 codificado por uma sequência de nucleotídeos com pelo me- nos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 150. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD19 é um scFv anti-CD19 que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 151. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD19 é um scFv anti-CD19 que compreende uma VH compreendendo uma se- quência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 152. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD19 é um scFv anti-CD19 que compre- ende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 153. Em algumas modalidades, um CAR compreen- dendo um anticorpo anti-CD19 é codificado por uma sequência de nu- cleotídeos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 148. Em algumas modalidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD19 compreende uma se- quência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,

97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 149.

CcD33

[242] Em algumas modalidades, as células T da presente descri- ção são manipuladas com CAR desenhado para atingir CD33. O CD33, também conhecido como Siglec3, é um receptor transmembranar ex- presso em células de linhagem mieloide que é conhecido por se ligar a ácidos siálicos. Como CD33 é expresso em células cancerígenas (por exemplo, leucemia mieloide aguda), acredita-se que CD33 represente um marcador de superfície celular para direcionar essas doenças ma- lignas.

[243] Assim, em algumas modalidades, as células T da presente descrição são manipuladas para expressar um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD33 (por exemplo, scFv anti-CD33). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD33 é um scFv anti-CD33 codificado pela sequência de SEQ ID NO: 138. Em algumas modalidades, o anti- corpo anti-CD33 é um scFv anti-CD33 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 137. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD33 é um scFv anti-CD19 que compreende uma VH compreendendo a se- quência de SEQ ID NO: 140. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- CD33 é um scFv anti-CD33 que compreende uma VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 141. Em algumas modalidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD33 é codificado pela sequência de SEQ ID NO: 136. Em algumas modalidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD33 compreende a sequência de SEQ ID NO: 139.

[244] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD33 é um scFv anti-CD33 codificado por uma sequência de nucleotídeos com pelo me- nos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 138. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD33 é um scFv anti-CD33 que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 137. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD33 é um scFv anti-CD19 que compreende uma VH compreendendo uma se- quência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 140. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD33 é um scFv anti-CD33 que compre- ende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 141. Em algumas modalidades, um CAR compreen- dendo um anticorpo anti-CD33 é codificado por uma sequência de nu- cleotídeos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 136. Em algumas modalidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD33 compreende uma se- quência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 139.

Anticorpos

[245] Um anticorpo (usado alternadamente na forma plural) é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., atra- vés de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Tal como aqui utili- zado, o termo "anticorpo" abrange não apenas anticorpos monoclonais intactos (ou seja, de comprimento total), mas também fragmentos de ligação ao antígeno (tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), fragmento variá-

vel de cadeia única (scFv), seus mutantes, proteínas de fusão compre- endendo uma porção de anticorpo, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, diacorpos, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio único (por exemplo, Anticorpos VxH de camelo ou lhama), anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespe- cíficos) e qualquer outra configuração modificada da molécula de imu- noglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno da especificidade necessária, incluindo variantes de glicosilação de an- ticorpos, variantes de sequência de aminoácidos de anticorpos e anti- corpos modificados covalentemente.

[246] Uma molécula de anticorpo típica compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), que geralmente estão envolvidas na ligação ao antígeno. Estas regiões/resíduos que são responsáveis pela ligação ao antígeno podem ser identificados a partir de sequências de aminoácidos das sequências VH/VL de um anticorpo de referência (por exemplo, um anticorpo anti- CD70 ou um anticorpo anti-BCMA como aqui descrito) por métodos co- nhecidos na técnica. As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, também conhecidas como "regiões deter- minantes de complementaridade" ("CDR'"), intercaladas com regiões que são mais conservadas, que são conhecidas como "regiões de es- trutura" ("FR"). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A extensão da região de estrutura e CDRs pode ser identificada com precisão usando metodolo- gia conhecida na técnica, por exemplo, pela definição de Kabat, defini- ção de Chothia, definição de ADM e/ou a definição de contato, todas as quais são bem conhecidas na técnica. Tal como aqui utilizado, uma CDR pode referir-se a CDR definida por qualquer método conhecido na técnica. Dois anticorpos com a mesma CDR significa que os dois anti- corpos têm a mesma sequência de aminoácidos dessa CDR conforme determinado pelo mesmo método. Ver, por exemplo, Kabat, E.A,, et al. (1991) Sequences of P roteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242, Chothia et al., (1989) Nature 342:877; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, Al-lazikani et al (1997) ) . Molec. Biol. 273:927- 948; and Almagro, J. Mol. Recognit. 17:132-143 (2004). Ver também hgmp.mrc.ac.uk e bioinf.org.uk/abs.

[247] Em algumas modalidades, um anticorpo é um scF v, tal como um scFv anti-CD70, um scFv anti-BCMA, um scFv anti-CD19 ou um scFv anti-CD33. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgD, IgE, IgG, IgA ou IgM (ou sua subclasse), e o anticorpo não precisa ser de nenhuma classe em particular. Dependendo da sequên- cia de aminoácidos do anticorpo do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ainda ser divididas em subclasses (isoti- pos), por exemplo, IgG1, I9G2, IgG3, I9G4, IgA1 e I9gA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridi- mensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conheci- das.

[248] Os anticorpos a serem usados conforme fornecidos aqui po- dem ser de murinos, ratos, humanos ou qualquer outra origem (incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados). Em alguns exemplos, o anti- corpo compreende uma região constante modificada, tal como uma re- gião constante que é imunologicamente inerte, por exemplo, não desen-

cadeia a lise mediada pelo complemento, ou não estimula a citotoxici- dade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC).

[249] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente descri- ção é um anticorpo humanizado. Os anticorpos humanizados se referem a formas não humanas (por exemplo, murino) que são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos de |i- gação ao antígeno dos mesmos que contêm uma sequência mínima de- rivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo destinatário) nos quais os resíduos de uma região determinante de complementarie- dade (CDR) do destinatário são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato ou coelho com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura Fv (FR) da imuno- globulina humana são substituídos por resíduos não humanos corres- pondentes. Além disso, o anticorpo humanizado pode compreender re- síduos que não se encontram nem no anticorpo destinatário nem nas sequências de CDR ou de estrutura importadas, mas são incluídos para refinar mais e otimizar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anti- corpo humanizado compreenderá substancialmente todos ou pelo me- nos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as re- giões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobu- lina humana. Um anticorpo humanizado otimamente também compre- enderá, pelo menos, uma porção de uma região ou domínio constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente o de uma imunoglobulina humana. Outras formas de anticorpos humanizados têm uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) que estão alteradas no que diz respeito ao anticorpo original, que são também denominadas uma ou mais CDRs “derivadas de” uma ou mais CDRs do anticorpo original. Os anticorpos humanizados também podem envolver maturação de afini- dade.

[250] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente descri- ção é um anticorpo quimérico, que pode incluir uma região constante pesada e uma região constante leve de um anticorpo humano. Os anti- corpos quiméricos se referem a anticorpos com uma região variável ou parte da região variável de uma primeira espécie e uma região cons- tante de uma segunda espécie. Normalmente, nestes anticorpos quimé- ricos, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada imita as re- giões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamífero (por exemplo, um mamífero não humano, tal como camundongo, coelho e rato), enquanto as porções constantes são homólogas às sequências em anticorpos derivados de outro mamífero, tal como o humano. Em algumas modalidades, modificações de aminoácidos podem ser feitas na região variável e/ou na região constante.

[251] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente descri- ção se liga especificamente a um antígeno alvo, tal como CD70 hu- mano, BCMA humano, CD19 humano ou CD33 humano. Um anticorpo que "se liga especificamente" a um alvo ou epítopo é um termo bem conhecido na técnica, e métodos para determinar tal ligação específica também são bem conhecidos na técnica. Diz-se que uma molécula exibe "ligação específica" se ela reage ou se associa com mais frequên- cia, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com um antígeno alvo particular do que com alvos alternativos. Um an- ticorpo "liga-se especificamente" a um antígeno alvo se ele se liga com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente (ou preferencialmente) a um epítopo CD70, BCMA, CD19 ou CD33 é um anticorpo que se liga a este epítopo CD70, BCMA,

CD19 ou CD33 com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outros epítopos CD70, BCMA, CD19 ou CD33 ou epítopos não CD70, não BCMA, não CD19 ou não CD33. Também é compreendido pela leitura desta definição que, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antí- geno alvo pode ou não pode ligar-se especificamente ou preferencial- mente a um segundo antígeno alvo. Como tal, "ligação específica" ou "ligação preferencial" não requer necessariamente (embora possa in- cluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, a refe- rência à ligação significa ligação preferencial.

[252] Em algumas modalidades, a constante de dissociação de equilíbrio (Kp) entre o anticorpo e o CD70 é de 100 pM a 1 UM. Em algumas modalidades, o Kp entre o anticorpo e o CD70 é de 1 nM a 100 nM.

[253] Em algumas modalidades, a constante de dissociação de equilíbrio (Kp) entre o anticorpo e BCMA é de 100 pM a 1 UM. Em algu- mas modalidades, o Kp entre o anticorpo e BCMA é de 1 nM a 100 nM.

[254] Em algumas modalidades, a constante de dissociação de equilíbrio (Kp) entre o anticorpo e o CD19 é de 100 pM a 1 UM. Em algumas modalidades, o Kp entre o anticorpo e o CD19 é de 1 nM a 100 nM.

[255] Em algumas modalidades, a constante de dissociação de equilíbrio (Kp) entre o anticorpo e o CD33 é de 100 pM a 1 UM. Em algumas modalidades, o Kp entre o anticorpo e o CD33 é de 1 nM a 100 nM.

[256] Também dentro do escopo da presente descrição estão as variantes funcionais de qualquer um dos anticorpos exemplificativos, conforme descrito neste documento. Uma variante funcional pode con- ter uma ou mais variações de resíduo de aminoácido em VH e/ou VL, ou em uma ou mais das CDRs de VH e/ou uma ou mais das CDRs de

VL em relação a um anticorpo de referência, embora retendo substan- cialmente similar ligação e atividades biológicas (por exemplo, afinidade de ligação, especificidade de ligação, atividade inibidora, atividade anti- tumoral substancialmente similares ou uma combinação das mesmas) como o anticorpo de referência.

[257] Em alguns exemplos, um anticorpo aqui descrito compre- ende uma VH CDR1, uma VH CDR2 e uma VH CDR3, que coletiva- mente não contém mais do que 10 variações de aminoácidos (por exem- plo, não mais do que 9, 8, 7,6, 5,4,3,2 ou 1 variação de aminoácido) em comparação com a VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 de um anti- corpo de referência, tal como o Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 51; VL: SEQ ID NO: 52) ou Anticorpo B (VH: SEQ ID NO: 60; VL: SEQ ID NO: 61). "Coletivamente" significa que o número total de variações de ami- noácidos em todas as três VH CDRs está dentro do intervalo definido. Alternativamente ou além disso, o anticorpo pode compreender uma VL CDR1, uma VL CDR2 e uma VL CDR3, que coletivamente não contém mais do que 10 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 9, 8, 7,6,5,4,3,2 ou 1 variação de aminoácido) em comparação com a VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 do anticorpo de referência.

[258] Em alguns exemplos, um anticorpo aqui descrito pode com- preender uma VH CDR1, uma VH CDR2 e uma VH CDR3, pelo menos uma das quais contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácidos) como a contraparte VH CDR de um anticorpo de referência, tal como o Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 51; VL: SEQ ID NO: 52) ou Anticorpo B (VH: SEQ ID NO: 60; VL: SEQ ID NO: 61). Em exemplos específicos, o anticorpo compreende uma VH CDR3, que contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 20u1 variação de aminoácido) como a VH CDR3 de um anticorpo de referên- cia, tal como o Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 51; VL: SEQ ID NO: 52)

ou Anticorpo B (VH: SEQ ID NO: 60; VL: SEQ ID NO: 61). Alternativa- mente ou além disso, um anticorpo pode compreender uma VL CDR1, uma VL CDR2 e uma VL CDR3, pelo menos uma das quais contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4,3, 2 ou 1 variação de aminoácidos) como a contraparte VL CDR do anticorpo de referência. Em exemplos específicos, o anticorpo compre- ende uma VL CDR3, que contém não mais do que 5 variações de ami- noácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de ami- noácido) como a VL CDR3 do anticorpo de referência.

[259] Em alguns casos, as variações de resíduos de aminoácidos podem ser substituições conservativas de resíduos de aminoácidos. Tal como aqui utilizado, uma "substituição de aminoácido conservativa" se refere a uma substituição de aminoácido que não altera a carga relativa ou as características de tamanho da proteína na qual a substituição de aminoácido é feita. As variantes podem ser preparadas de acordo com métodos para alterar a sequência polipeptídica conhecida por um perito na técnica, tais como são encontradas em referências que compilam tais métodos, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J . Sambrook, et al., eds., Segunda Ediçao, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1989, ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. As substituições conservativas de aminoácidos incluem substituições feitas entre os aminoácidos dentro dos seguintes grupos: (a) A>G,S;(bDDR>K H;(C)N>Q,H;(d)D>EN;(e)JC>SSA; (NQ>N;(g)JE>DQ;(h)G>SA(HOSNQ;G)ISLV; (OL, V;()K>R,H;(m)M>L1IY;(nN)F>Y,M,L;(0)P>A; (SST; (q) TD S;((NW >Y,F;(s)Y>W,F;e(t VS L.

[260] Em algumas modalidades, um anticorpo descrito neste do- cumento pode compreender VH CDRs que coletivamente são pelo me- nos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idênticas às VH CDRs de um anticorpo de referência, tal como o Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 51; VL: SEQ ID NO: 52) ou Anticorpo B (VH: SEQ ID NO: 60; VL: SEQ ID NO: 61). Alternativamente ou além disso, o anticorpo pode compre- ender VL CDRs que coletivamente são pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idênticas às VL CDRs do anticorpo de referên- cia. Em algumas modalidades, um anticorpo pode compreender uma VH que é pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idên- tica à VH de um anticorpo de referência, tal como o Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 51; VL: SEQ ID NO: 52) ou Anticorpo B (VH: SEQ ID NO: 60; VL: SEQ ID NO: 61) e/ou uma VL que é pelo menos 80% (por exem- plo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idêntica à VL do anticorpo de referência.

[261] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD70 (por exemplo, scFv anti-CD70) compreende uma VH e um VL compreen- dendo as sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 51 e 52, respectivamente. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- CD70 (por exemplo, scFv anti-CD70) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabelecida na SEQ ID NO: 51, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 52. Em al- gumas modalidades, um anticorpo anti-CD70 (por exemplo, scFv anti- CD70) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabele- cida na SEQ ID NO: 51, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 52, em que as CDRs são determinadas de acordo com Kabat. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD70 (por exemplo, scFv anti-CD70) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabelecida na SEQ ID NO: 51, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 52, em que as CDRs são determinadas de acordo com Chothia. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD70 (por exemplo, scFv anti-CD70) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabelecida na SEQ ID NO: 51, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID

NO: 52, em que as CDRs são determinadas de acordo com AbM. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD70 (por exemplo, scF v anti- CD70) compreende sequências de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 estabelecidas na SEQ ID NO: 68, 70 e 72, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas em SEQ ID NOs: 62, 64 e 66. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- CD70 (por exemplo, scFv anti-CD70) compreende sequências de ca- deia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 estabelecidas na SEQ ID NO: 69, 71 e 73, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas em SEQ ID NOs: 63, 65 e 67. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD70 é um scFv anti-CD70 compreen- dendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:50.Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD70 é um scFv anti-CD70 codificado pela sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:

49. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD70 é um scFv anti- CD70 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD70 é um scFv anti-CD70 codificado pela sequência de nucleotídeos apresen- tada na SEQ ID NO: 47.

[262] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-BCMA (por exemplo, scFv anti-BCMA) compreende uma VH e um VL compreen- dendo as sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 60 e 61, respectivamente. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- BCMA (por exemplo, scFv anti-BCMA) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabelecida na SEQ ID NO: 60, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 61. Em al- gumas modalidades, um anticorpo anti-BCMA (por exemplo, scFv anti- BCMA) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabe- lecida na SEQ ID NO: 60, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 61, em que as CDRs são determinadas de acordo com Kabat. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-BCMA (por exemplo, scFv anti-BCMA) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabelecida na SEQ ID NO: 60, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 61, em que as CDRs são determinadas de acordo com Chothia. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-BCMA (por exemplo, scFv anti-BCMA) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabelecida na SEQ ID NO: 60, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 61, em que as CDRs são determinadas de acordo com AbM. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-BCMA (por exemplo, scFv anti-BCMA) compreende sequências de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 estabelecidas na SEQ ID NO: 80, 82 e 84, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas em SEQ ID NOs: 74,76 e 78. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- BCMA (por exemplo, scFv anti-<BCMA) compreende sequências de ca- deia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 estabelecidas na SEQ ID NO: 81, 83 e 85, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas em SEQ ID NOs: 75, 77 e 79. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-BCMA é um scFv anti-BCMA compre- endendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 59. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-BCMA é um scFv anti- BCMA codificado pela sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 58.

[263] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD19 (por exemplo, scFv anti-CD19) compreende uma VH e um VL compreen- dendo as sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 152 e 153, respectivamente. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD19 (por exemplo, scFv anti-CD19) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabelecida na SEQ ID NO: 152, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 153.

Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD19 (por exemplo, scFv anti-CD19) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH esta- belecida na SEQ ID NO: 152, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 153, em que as CDRs são determina- das de acordo com Kabat. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- CD19 (por exemplo, scFv anti-CD19) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabelecida na SEQ ID NO: 152, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 153, em que as CDRs são determinadas de acordo com Chothia. Em algumas mo- dalidades, um anticorpo anti-CD19 (por exemplo, scFv anti-CD19) com- preende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabelecida na SEQ ID NO: 152, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 153, em que as CDRs são determinadas de acordo com AbM. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD19 (por exemplo, scFv anti-CD19) compreende sequências de cadeia pesada CDRI1, CDR2 e CDR3 estabelecidas na SEQ ID NO: 169, 170 e 171, respecti- vamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve esta- belecidas em SEQ ID NOs: 166, 167 e 168, respectivamente. Em algu- mas modalidades, um anticorpo anti-CD19 (por exemplo, scFv anti- CD19) compreende sequências de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 estabelecidas na SEQ ID NO: 175, 176 e 177, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas em SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respectivamente. Em algumas modalida- des, um anticorpo anti-CD19 é um scFv anti-CD19 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 151. Em algu- mas modalidades, um anticorpo anti-CD19 é um scFv anti-CD19 codifi- cado pela sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 150.

[264] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD33 (por exemplo, scFv anti-CD33) compreende uma VH e um VL compreen- dendo as sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs:

140 e 141, respectivamente.

Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD33 (por exemplo, scFv anti-CD33) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabelecida na SEQ ID NO: 140, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 141. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD33 (por exemplo, scFv anti-CD33) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH esta- belecida na SEQ ID NO: 140, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 141, em que as CDRs são determina- das de acordo com Kabat.

Em algumas modalidades, um anticorpo anti- CD33 (por exemplo, scFv anti-CD33) compreende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabelecida na SEQ ID NO: 140, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 141, em que as CDRs são determinadas de acordo com Chothia.

Em algumas mo- dalidades, um anticorpo anti-CD33 (por exemplo, scFv anti-CD33) com- preende três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR2) de VH estabelecida na SEQ ID NO: 140, e três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) de VL estabelecida na SEQ ID NO: 141, em que as CDRs são determinadas de acordo com AbM.

Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD33 (por exemplo, scFv anti-CD33) compreende sequências de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 estabelecidas na SEQ ID NO: 142, 143 e 144, respecti- vamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve esta- belecidas em SEQ ID NOs: 145, 146 e 147. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD33 (por exemplo, scF v anti-CD33) compreende se- quências de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 estabelecidas na SEQ ID NO: 178, 179 e 180, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR?2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas em SEQ ID NOs: 145, 146 e 147. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD33 é um scFv anti-CD33 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 137. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD33 é um scFv anti-CD33 codificado pela sequência de nucleotídeos apre- sentada na SEQ ID NO: 138. Construto do Receptor de Antígeno Quimérico de Direcionamento de Antígeno

[265] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas compreendem um antígeno tumoral direcionado a CAR. Em algumas modalidades, um antígeno tumoral é um "antígeno associado a tumor", referindo-se a uma molécula imunogênica, tal como uma pro- teína, que geralmente é expressa em um nível mais alto em células tu- morais do que em células não tumorais, nas quais pode não ser ex- pressa de todo, ou apenas em níveis baixos. Em algumas modalidades, as estruturas associadas ao tumor que são reconhecidas pelo sistema imunológico do hospedeiro que hospeda o tumor são referidas como antígenos associados ao tumor. Em algumas modalidades, um antígeno associado a tumor é um antígeno tumoral universal se for amplamente expresso pela maioria dos tumores. Em algumas modalidades, os antí- genos associados a tumor são antígenos de diferenciação, antígenos mutacionais, antígenos celulares sobre-expressos ou antígenos virais. Em algumas modalidades, um antígeno tumoral é um "antígeno tumoral específico" ou "TSA", referindo-se a uma molécula imunogênica, tal como uma proteína, que é única para uma célula tumoral. Antígenos tumorais específicos são expressos exclusivamente em células tumo- rais. Em algumas modalidades, o antígeno tumoral não é CD70.

[266] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas compreendem um CAR direcionando não para CD70 (por exemplo, um CAR que não se liga a CD70). CAR CD19

[267] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas compreendem um CAR direcionado ao CD19, também refe- rido neste documento como células T CAR anti-CD19, CAR anti-CD19 ou CAR CD19. Em algumas modalidades, o CAR anti-CD19 compre- ende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD19, (ii) um domínio transmembranar e (iii) um endodo- mínio que compreende pelo menos um domínio coestimulatório.

[268] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD19 compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD19, (ii) um domínio transmembranar CD8 e (li) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório CD28 ou 41BB e um do- mínio de sinalização CD3-zeta. Em algumas modalidades, o CAR anti- CD19 compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD19, (ii) um domínio transmembrana de CD8 e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de CD28 e um domínio de sinalização CD3-zeta. Em algumas modalida- des, o CAR anti-CD19 compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD19, (ii) um domínio trans- membrana de CD8 e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de 41BB e um domínio de sinalização CD3-zeta.

[269] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD19 compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD19, (ii) um domínio transmembranar CD8 compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 126, e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de CD28 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 20 e um domínio de sinalização CD3-zeta compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 22.

[270] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD19 compreende (i) um ectodomínio que compreende um scFv anti-CD19 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 151, (ii) um domínio transmembranar CD8 compreendendo a sequência de amino- ácidos estabelecida em SEQ ID NO: 126, e (li) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de CD28 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 20 e um domí- nio de sinalização CD3-zeta compreendendo a sequência de aminoáci- dos estabelecida em SEQ ID NO: 22.

[271] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD19 compreende (i) um ectodomínio que compreende um scFv anti-CD19 compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada e leve compreendendo as sequên- cias de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 152 e 153, respec- tivamente, (ii) um domínio transmembranar CD8 compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 126, e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de CD28 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 20 e um domínio de sinalização CD3-zeta compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 22.

[272] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD19 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 149. Em algu- mas modalidades, o CAR anti-CD19 é codificado pela sequência de nu- cleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 148. Em algumas modalidades, o CAR anti-CD19 é codificado por uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeos estabelecida em SEQ ID NO: 148. CAR CD33

[273] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas compreendem um CAR direcionado ao CD33, também refe- rido neste documento como células T CAR anti-CD33, CAR anti-CD33 ou CAR CD33. Em algumas modalidades, o CAR anti-CD33 compre- ende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD33, (ii) um domínio transmembranar e (iii) um endodo- mínio que compreende pelo menos um domínio coestimulatório.

[274] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD33 compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD33, (ii) um domínio transmembranar CD8 e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório CD28 ou 41BB e um do- mínio de sinalização CD3-zeta. Em algumas modalidades, o CAR anti- CD33 compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD33, (ii) um domínio transmembrana de CD8 e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de CD28 e um domínio de sinalização CD3-zeta. Em algumas modalida- des, o CAR anti-CD33 compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD33, (li) um domínio trans- membrana de CD8 e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de 41BB e um domínio de sinalização CD3-zeta.

[275] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD33 compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD33, (ii) um domínio transmembranar CD8 compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 126, e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de 41BB compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 19 e um domínio de sinalização CD3-zeta compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 22.

[276] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD33 compreende (i) um ectodomínio que compreende um scFv anti-CD33 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 137, (ii) um domínio transmembranar CD8 compreendendo a sequência de amino- ácidos estabelecida em SEQ ID NO: 126, e (li) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de 41BB compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 19 e um domí- nio de sinalização CD3-zeta compreendendo a sequência de aminoáci- dos estabelecida em SEQ ID NO: 22.

[277] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD33 compreende (i) um ectodomínio que compreende um scFv anti-CD33 compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada e leve compreendendo as sequên- cias de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 140 e 141, respec- tivamente, (ii) um domínio transmembranar CD8 compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 126, e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de 41BB compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 19 e um domínio de sinalização CD3-zeta compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 22.

[278] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD33 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 139. Em algu- mas modalidades, o CAR anti-CD33 é codificado pela sequência de nu- cleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 136. Em algumas modalidades, o CAR anti-CD33 é codificado por uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeos estabelecida em SEQ ID NO: 136.

CAR BCMA

[279] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas compreendem um CAR direcionado a BCMA, também referido neste documento como células T CAR anti-BCMA, CAR anti-BCMA ou CAR BCMA. Em algumas modalidades, o CAR anti-8BCMA compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-BCMA, (ii) um domínio transmembranar e (iii) um endodomínio que compreende pelo menos um domínio coestimulatório.

[280] Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-BCMA, (ii) um domínio transmembranar C D8 e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório CD28 ou 41BB e um do- mínio de sinalização CD3-zeta. Em algumas modalidades, o CAR anti- BCMA compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-BCMA, (ii) um domínio transmembrana de CD8 e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de CD28 e um domínio de sinalização CD3-zeta. Em algumas modalida- des, o CAR anti-BCMA compreende (i) um ectodomínio que compre- ende um domínio de ligação ao antígeno anti-BCMA, (ii) um domínio transmembrana de CD8 e (iii) um endodomínio que compreende um do- mínio coestimulatório de 41BB e um domínio de sinalização CD3-zeta.

[281] Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-BCMA, (ii) um domínio transmembranar CD8 compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 126, e (ili) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de 41BB compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 19 e um domínio de sinalização CD3-zeta compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 22.

[282] Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende (i) um ectodomínio que compreende um scFv anti-BCMA compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 59, (ii) um domínio transmembranar CD8 compreendendo a sequência de amino- ácidos estabelecida em SEQ ID NO: 126, e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de 41BB compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 19 e um domí- nio de sinalização CD3-zeta compreendendo a sequência de aminoáci- dos estabelecida em SEQ ID NO: 22.

[283] Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende (i) um ectodomínio que compreende um scFv anti-BCMA compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada e leve compreendendo as sequên- cias de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 60 e 61, respecti- vamente, (ii) um domínio transmembranar CD8 compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 126, e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de 41BB compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 19 e um domínio de sinalização CD3-zeta compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 22.

[284] Em algumas modalidades, o CAR anti-BCMA compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 57. Em algu- mas modalidades, o CAR anti-BCMA é codificado pela sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 56. Em algumas modalida- des, o CAR anti-BCMA é codificado por uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeos estabelecida em SEQ ID NO: 56. CAR CD70

[285] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas compreendem um CAR direcionado ao CD70, também refe- rido neste documento como células T CAR anti-CD70, CAR anti-CD70 ou CAR CD70. Em algumas modalidades, o CAR anti-CD70 compre- ende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD70, (ii) um domínio transmembranar e (iii) um endodo- mínio que compreende pelo menos um domínio coestimulatório.

[286] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD70 compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD70, (ii) um domínio transmembranar CD8 e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório CD28 ou 41BB e um do- mínio de sinalização CD3-zeta. Em algumas modalidades, o CAR anti- CD70 compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD70, (ii) um domínio transmembrana de CD8 e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de CD28 e um domínio de sinalização CD3-zeta. Em algumas modalida- des, o CAR anti-CD70 compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD70, (ii) um domínio trans- membrana de CD8 e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de 41BB e um domínio de sinalização CD3-zeta.

[287] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD70 compreende (i) um ectodomínio que compreende um domínio de ligação ao antígeno anti-CD70, (ii) um domínio transmembranar CD8 compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 126, e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de 41BB compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 19 e um domínio de sinalização CD3-zeta compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 22.

[288] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD70 compreende (i) um ectodomínio que compreende um scFv anti-CD70 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 50, (ii) um domínio transmembranar CD8 compreendendo a sequência de amino- ácidos estabelecida em SEQ ID NO: 126, e (li) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de 41BB compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 19 e um domí- nio de sinalização CD3-zeta compreendendo a sequência de aminoáci- dos estabelecida em SEQ ID NO: 22.

[289] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD70 compreende (i) um ectodomínio que compreende um scFv anti-CD70 compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada e leve compreendendo as sequên- cias de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 51 e 52, respecti- vamente, (ii) um domínio transmembranar CD8 compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 126, e (iii) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de 41BB compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 19 e um domínio de sinalização CD3-zeta compreendendo a se- quência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 22.

[290] Em algumas modalidades, o CAR anti-CD70 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 46. Em algu- mas modalidades, o CAR anti-CD70 é codificado pela sequência de nu- cleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o CAR anti-CD70 é codificado por uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeos estabelecida em SEQ ID NO: 45. Expressão do Construto Receptor de Antígeno Quimérico Modelo doador

[291] O ácido nucleico que codifica um CAR pode ser entregue a uma célula T que compreende o que é aqui referido como um modelo doador (também referido como um polinucleotídeo doador). Um modelo de doador pode conter uma sequência não homóloga, tal como o ácido nucleico que codifica um CAR, flanqueado por duas regiões de homolo- gia para permitir HDR eficiente em um sítio genômico de interesse. Al- ternativamente, um modelo de doador pode não ter regiões de homolo- gia com o sítio alvo no DNA e pode ser integrado por união de extremi- dade dependente de NHEJ após clivagem no sítio alvo.

[292] Um modelo de doador pode ser DNA ou RNA, cadeia sim- ples e/ou cadeia dupla, e pode ser introduzido em uma célula na forma linear ou circular. Se introduzido de forma linear, as extremidades da sequência doadora podem ser protegidas (por exemplo, da degradação exonucleolítica) por métodos conhecidos pelos peritos na técnica. Por exemplo, um ou mais resíduos de didesoxinucleotídeo são adicionados ao terminal 3' de uma molécula linear e/ou oligonucleotídeos auto-com- plementares são ligados a uma ou ambas as extremidades. Ver, por exempl Chang et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 84:4959-4963; Nehls et al., (1996) Science 272:886-889. Métodos adicionais para pro- teger polinucleotídeos exógenos da degradação incluem, mas não es- tão limitados a, adição de grupo(s) amino terminal(is) e o uso de liga- ções internucleotídicas modificadas, tais como, por exemplo, fosforotio- atos, fosforamidatos e resíduos de O-metil ribose ou desoxirribose.

[293] Um modelo de doador pode ser introduzido em uma célula como parte de uma molécula de vetor tendo sequências adicionais, tais como, por exemplo, origens de replicação, promotores e genes que co- dificam resistência a antibióticos. Além disso, um modelo de doador pode ser introduzido como ácido nucleico puro, como ácido nucleico complexado com um agente, como um lipossoma ou poloxâmero, ou pode ser distribuído por vírus (por exemplo, adenovírus, AAV, herpesví- rus, retrovírus, lentivírus e lentivírus defeituoso da integrase (IDLV)).

[294] Um modelo de doador, em algumas modalidades, é inserido de modo que sua expressão seja conduzida pelo promotor endógeno no sítio de integração, ou seja, o promotor que conduz a expressão do gene endógeno no qual o doador está inserido. No entanto, em algumas modalidades, o modelo de doador compreende um promotor e/ou inten- sificador exógeno, por exemplo, um promotor constitutivo, um promotor induzível ou promotor específico de tecido. Em algumas modalidades, o promotor exógeno é um promotor EF 1a compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 123. Podem ser usados outros promotores.

[295] Além disso, as sequências exógenas também podem incluir sequências regulatórias da transcrição ou tradução, por exemplo, pro- motores, potenciadores, isoladores, sítios de entrada de ribossoma in- terno, sequências que codificam os peptídeos 2A e/ou sinais de polia- denilação.

[296] Em algumas modalidades, o modelo de doador compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 98% de identidade com a SEQ ID NO: 44. Em algu- mas modalidades, o modelo de doador compreende a sequência nucle- otídica da SEQ ID NO: 44.

[297] Em algumas modalidades, o modelo de doador compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 98% de identidade com a SEQ ID NO: 55. Em algu- mas modalidades, o modelo de doador compreende a sequência nucle- otídica da SEQ ID NO: 55.

[298] Em algumas modalidades, o modelo de doador compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 98% de identidade com à SEQ ID NO: 135. Em al- gumas modalidades, o modelo de doador compreende a sequência nu- cleotídica da SEQ ID NO: 135.

[299] Em algumas modalidades, o modelo de doador compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 98% de identidade com à SEQ ID NO: 156. Em al- gumas modalidades, o modelo de doador compreende a sequência nu- cleotídica da SEQ ID NO: 156. Outros Métodos

[300] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um CAR é introduzido em uma célula manipulada por métodos conhe- cidos pelos peritos na técnica. Por exemplo, um CAR pode ser introdu- zido em uma célula manipulada por um vetor. Uma variedade de méto- dos diferentes conhecidos na técnica pode ser usada para introduzir qualquer um dos ácidos nucleicos ou vetores de expressão divulgados neste documento em uma célula efetora imune. Exemplos não limitati- vos de métodos para a introdução de ácido nucleico em uma célula in- cluem: lipofecção, transfecção (por exemplo, transfecção com fosfato de cálcio, transfecção usando compostos orgânicos altamente ramificados, transfecção usando polímeros catiônicos, transfecção baseada em den- drímero, transfecção óptica, transfecção baseada em partículas (por exemplo, transfecção de nanopartículas) ou transfecção usando lipos- somos (por exemplo, lipossomos catiônicos)), microinjeção, eletropora- ção, compressão de células, sonoporação, fusão de protoplastos, impa- lefecção, entrega hidrodinâmica, pistola de genes, magnetofecção, transfecção viral e nucleofecção. Métodos e Construtos de E ntrega

[301] Nucleases e/ou modelos de doadores podem ser entregues usando um sistema de vetor, incluindo, mas não se limitando a, vetores de plasmídeo, minicírculos de DNA, vetores retrovirais, vetores lentivi- rais, vetores de adenovírus, vetores de poxvírus; vetores de herpesvírus e vetores de vírus adenoassociados e combinações dos mesmos.

[302] Métodos convencionais de transferência de genes baseados em vírus e não virais podem ser usados para introduzir ácidos nucleicos que codificam nucleases e modelos de doadores em células (por exem- plo, células T). Os sistemas de entrega de vetor não viral incluem plas- mídeos de DNA, minicírculos de DNA, ácido nucleico nu e ácido nu- cleico complexado com um veículo de entrega, tal como um lipossomo ou poloxâmero. Os sistemas de entrega de vetor viral incluem vírus de DNA e RNA, que possuem genomas epissomais ou integrados após a entrega à célula.

[303] Os métodos de entrega não viral de ácidos nucleicos incluem eletroporação, lipofecção, microinjeção, biolística, virossomos, liposso- mos, imunolipossomos, policátion ou lipídeo: conjugados de ácido nu- cleico, DNA nu, RNA nu, RNA coberto, vírions artificiais e absorção in- tensificada por agente do DNA. Sonoporação usando, por exemplo, o sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) também pode ser usado para distri-

buição de ácidos nucleicos. Alguns exemplos específicos são forneci- dos abaixo. E ntrega Viral Adenoassociada

[304] O ácido nucleico doador que codifica um construto CAR pode ser entregue a uma célula usando um vírus adenoassociado (AAV). Os AAVs são pequenos vírus que se integram especificamente ao genoma do hospedeiro e podem, portanto, entregar um transgene, tal como o CAR. Repetições terminais invertidas (ITRs) estão presentes flanqueando o genoma de AAV e/ou o transgene de interesse e servem como origens de replicação. Também presentes no genoma de AAV es- tão as proteínas rep e cap que, quando transcritas, formam capsídeos que encapsulam o genoma de AAV para distribuição em células alvo. Receptores de superfície nesses capsídeos que conferem o sorotipo AAV, que determina quais órgãos-alvo os capsídeos se ligarão princi- palmente e, portanto, quais células o AAV infetará com mais eficiência. Existem doze sorotipos de AAV humanos atualmente conhecidos. Em algumas modalidades, o AAV é AAV sorotipo 6 (AAV6).

[305] Os vírus adenoassociados estão entre os vírus mais usados para terapia genética por várias razões. Em primeiro lugar, os AAVs não provocam uma resposta imunológica após a administração a mamiífe- ros, incluindo humanos. Em segundo lugar, os AAVs são efetivamente entregues às células alvo, particularmente quando se considera a sele- ção do sorotipo AAV apropriado. Finalmente, os AAVs têm a capacidade de infetar células em divisão e não em divisão porque o genoma pode persistir na célula hospedeira sem integração. Essa característica os torna um candidato ideal para terapia genética. Reparação Direcionada por Homologia (HDR)

[306] O ácido nucleico doador que codifica um CAR é inserido por reparação dirigida por homologia (HDR) no locus do gene alvo. Ambas as cadeias do DNA no locus alvo são cortadas por uma enzima CRISPR

Cas9. A HDR então ocorre para reparar a quebra da cadeia dupla (DSB) e inserir o DNA do doador. Para que isso ocorra corretamente, a se- quência doadora é concebida com resíduos flanqueadores que são complementares à sequência em torno do sítio DSB no gene alvo (do- ravante "braços de homologia"). Esses braços de homologia servem como modelo para a reparação de DSB e permitem que a HDR seja um mecanismo essencialmente livre de erros. A taxa de reparação direcio- nada à homologia (HDR) é uma função da distância entre a mutação e o sítio de corte, portanto é importante escolher sítios alvo sobrepostos ou próximos. Os modelos podem incluir sequências extras flanqueadas pelas regiões homólogas ou podem conter uma sequência que difere da sequência genômica, permitindo assim a edição da sequência.

[307] O gene alvo pode ser associado a uma resposta imune em um sujeito, em que a deleção permanente de pelo menos uma porção do gene alvo irá modular a resposta imune. Por exemplo, para gerar uma célula T CAR, o gene alvo pode ser a região constante TORa (TRAC). A interrupção do TRAC leva à perda da função do TCR endó- geno. Em algumas modalidades, o gene alvo está em um locus de porto se- guro. Células T manipuladas

[308] As células T CAR manipuladas (com edição de gene) da pre- sente descrição podem ser autólogas ("próprias") ou não autólogas ("não próprias", por exemplo, alogênicas, singênicas ou xenogênicas). "Autólogo" se refere a células do mesmo sujeito. "Alogênico" se refere a células da mesma espécie de um sujeito, mas que diferem genetica- mente das células do sujeito. Em algumas modalidades, as células T são obtidas de um mamífero. Em algumas modalidades, as células T são obtidas de um ser humano.

[309] As células T podem ser obtidas de várias fontes, incluindo,

mas não limitado a, células mononucleares do sangue periférico, me- dula óssea, tecido linfonodal, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um local de infeção, ascites, derrame pleural, tecido do baço e tumores. Em certas modalidades, as células T podem ser obtidas a partir de uma unidade de sangue coletada de um sujeito usando qual- quer número de técnicas conhecidas pelo perito, tal como sedimenta- ção, por exemplo, separação FICOLLTY,

[310] Em algumas modalidades, é usada uma população isolada de células T. Em algumas modalidades, após o isolamento das células mononucleares do sangue periférico (PBMC), tanto os linfócitos T cito- tóxicos quanto os auxiliares podem ser classificados em subpopulações de células T virgem, de memória e efetoras antes ou após a ativação, expansão e/ou modificação genética. [B11] Uma subpopulação específica de células T, expressando um ou mais dos seguintes marcadores de superfície celular: TCRab, CD3, CD4, CD8, CD27 CD28, CD38 CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD122, CD95, CD197, CCR7, KLRG1, proteínas MCH-I e/ou proteínas MCH-Il, podem ser ainda isoladas por técnicas de seleção positivas ou negativas. Em algumas modalidades, uma subpopulação específica de células T, expressando um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em TCRab, CD4 e/ou CD8, é ainda isolada por téc- nicas de seleção positiva ou negativa. Em algumas modalidades, as po- pulações de células T manipuladas não expressam ou não expressam substancialmente um ou mais dos seguintes marcadores: CD70, CD57, CD244,CD160, PD-1, CTLA4, HM3, e LAG3. Em algumas modalidades, as subpopulações de células T podem ser isoladas por seleção positiva ou negativa antes da engenharia genética e/ou pós-engenharia gené- tica.

[312] Em algumas modalidades, uma população isolada de células T expressa um ou mais dos marcadores, incluindo, mas não se limitando a um CD3+, CD4+, CD8+ ou uma combinação dos mesmos. Em algu- mas modalidades, as células T são isoladas de um doador, ou sujeito, e primeiro ativadas e estimuladas a proliferar in vitro antes de passar pela edição do gene.

[313] Para atingir doses terapêuticas suficientes de composições de células T, as células T são frequentemente submetidas a uma ou mais rondas de estimulação, ativação e/ou expansão. As células T po- dem ser ativadas e expandidas geralmente usando métodos como des- crito, por exemplo, nas Patentes dos EUA 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; e 6,867,041. Em algumas modalidades, as células T são ati- vadas e expandidas por cerca de 1 dia a cerca de 4 dias, cerca de 1 dia a cerca de 3 dias, cerca de 1 dia a cerca de 2 dias, cerca de 2 dias a cerca de 3 dias, cerca de 2 dias a cerca de 4 dias, cerca de 3 dias a cerca de 4 dias, ou cerca de 1 dia, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias ou cerca de 4 dias antes da introdução das composições de edição de ge- noma nas células T.

[3114] Em algumas modalidades, as células T são ativadas e ex- pandidas por cerca de 4 horas, cerca de 6 horas, cerca de 12 horas, cerca de 18 horas, cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 60 horas ou cerca de 72 horas antes da introdução das composições de edição de genes nas células T.

[315] Em algumas modalidades, as células T são ativadas ao mesmo tempo que as composições de edição de genoma são introdu- zidas nas células T. Populações de células T ou células T isoladas ge- radas por qualquer um dos métodos de edição de genes aqui descritos também estão dentro do escopo da presente descrição.

[316] Em algumas modalidades, é fornecida aqui uma população de células T compreendendo células T geneticamente modificadas, que compreendem um gene CD70 endógeno interrompido e um ácido nu- cleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), por exem- plo, aqueles aqui descritos. Em algumas modalidades, o CAR se liga a um antígeno expresso em uma célula patológica. Em algumas modali- dades, o CAR se liga ao CD70. Em outras modalidades, o CAR não se liga ao CD70. Tal população de células T pode compreender ainda cé- lulas T geneticamente modificadas com uma ou mais das seguintes edi- ções de genes: gene interrompido da proteína 1 (PD-1) da morte celular programada, um gene da região constante da cadeia alfa do receptor de célula T endógeno interrompido (TRAC), e um gene da beta-2-micro- globulina endógeno interrompido (B2M). Em alguns exemplos, o ácido nucleico que codifica o CAR pode ser inserido no locus TRAC.

[317] Em algumas modalidades, a população de células T divul- gada neste documento compreende células T geneticamente modifica- das, que compreendem um gene CD70 interrompido e um ácido nu- cleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) que se liga a um antígeno expresso em uma célula patológica. Em algumas moda- lidades, a população de células T divulgada neste documento compre- ende células T geneticamente modificadas, que compreendem um gene CD70 interrompido e um ácido nucleico que codifica um receptor de an- tígeno quimérico (CAR), em que o CAR se liga ao CD70. Em outras modalidades, a população de células T aqui divulgadas compreende cé- lulas T geneticamente modificadas que compreendem um gene CD70 interrompido e um ácido nucleico que codifica um CAR, em que o CAR não se liga ao CD70. Em algumas modalidades, a população de células T divulgada neste documento compreende células T geneticamente mo- dificadas, que compreendem um gene CD70 interrompido e um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) que se liga a um antígeno expresso em uma célula patológica, e compreen- dendo ainda um gene PD1 interrompido. Em algumas modalidades, o

CAR se liga ao CD70. Em algumas modalidades, o CAR não se liga ao CD70. Em alguns aspectos, o CAR se liga ao CD19. Em algumas mo- dalidades, o CAR se liga ao CD33. Em alguns aspectos, o CAR se liga ao BCMA. Qualquer uma das células T manipuladas recentemente men- cionadas pode compreender ainda um gene da região constante de ca- deia alfa do receptor de células T (TRAC) interrompido e/ou um gene da beta-2-microglobulina (B2M) interrompido.

[318] Em exemplos particulares, é fornecida aqui uma população de células T compreendendo células T geneticamente manipuladas, que compreendem um gene CD70, um gene da região constante de ca- deia alfa do receptor de células T (TRAC) interrompido, um gene da beta-2-microglobulina (B2M) interrompido, um ácido nucleico que codi- fica um receptor de antígeno quimérico (CAR), por exemplo, um CAR anti-BCMA, CAR anti-CD19, CAR anti-CD33 ou CAR anti-CD70, con- forme descrito neste documento e, opcionalmente, um gene da morte celular programada (PD-1) interrompido. Qualquer uma das células T manipuladas aqui divulgadas pode conter genes HLA nativos (não inter- rompidos).

[319] Em alguns exemplos, pelo menos 50% (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%) da população de células T expressam o CAR como aqui descrito e não expressam um nível detectável de CD70 de superfície. Essas células podem ainda possuir as características de não expressar um nível detectável de TCR de superfície, um nível detectável de B2M de superfície e/ou um nível detectável de PD-1 de superfície. Por exemplo, pelo menos 50% (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%) da população de células T expressam o CAR conforme descrito neste documento e não expressam um nível detectável de CD70 de su- perfície, um nível detectável de TCR de superfície e um nível detectável de B2M de superfície. Em alguns casos, pelo menos 50% (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%) da população de células T expressam o

CAR como aqui descrito e não expressam um nível detectável de CD70 de superfície, um nível detectável de TCR de superfície, um nível detec- tável de B2M de superfície, e um nível detectável de PD-1.

[320] Uma célula isolada que expressa o CAR como aqui descrito e não expressa um nível detectável CD70 de superfície também está dentro do escopo da presente descrição. Tal célula isolada pode não expressar um nível detectável de TCR de superfície, um nível detectável B2M de superfície e/ou um nível detectável de PD-1 de superfície. Em alguns exemplos, a célula isolada compreende um ácido nucleico que codifica o CAR, que é inserido no locus TRAC.

[321] Também é fornecida neste documento uma população de células T manipuladas compreendendo células T manipuladas compre- endendo uma nuclease guiada por RNA, por exemplo, aquelas aqui des- critos (por exemplo, uma nuclease Cas9) e um RNA guia (gRNA) dire- cionado a um gene CD70 (por exemplo, aqueles aqui descritos). Em alguns casos, pelo menos 50% (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%) das células T na população de células T compreendem a nuclease guiada por RNA e o gRNA direcionado ao gene CD70. Tal população de células T manipuladas pode compreender ainda células T manipula- das compreendendo um gRNA direcionado a um gene PD-1, um gRNA direcionado a um gene TRAC, um gRNA direcionado a um gene B2M e/ou um ácido nucleico (por exemplo, um vetor) compreendendo um modelo de doador que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um CAR (por exemplo, aqueles aqui descritos), que opcional- mente é flanqueado pelos braços de homologia esquerdo e direito para o locus do gene TRAC. Em alguns exemplos, pelo menos 50% (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%) das células T na população de células T compreendem a nuclease guiada por RNA, o gRNA direcio- nado ao gene CD70, e o ácido nucleico que codifica para o CAR. Quando a codificação de ácido nucleico para o CAR compreende ainda os braços de homologia esquerdo e direito para o locus do gene TRAC, as células T também podem compreender um gRNA direcionado ao gene TRAC. Além disso, as células T podem compreender ainda um gRNA direcionado a um gene PD-1, um gRNA direcionado a um gene B2M, ou uma combinação dos mesmos.

[322] Também dentro do escopo da presente descrição está uma célula T modificada isolada compreendendo a nuclease guiada por RNA, o gRNA direcionado ao gene CD70 e, opcionalmente, um ou mais de um gRNA direcionado a um gene PD-1, um gRNA direcionado a um gene TRAC, um gR NA direcionado a um gene B2M, e um ácido nucleico (por exemplo, um vetor) compreendendo um modelo de doador que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um CAR (por exemplo, aqueles aqui descritos). A sequência de nucleotídeos que co- difica o CAR pode ser flanqueada por braços de homologia esquerdo e direito para o locus do gene TRAC. Gerando Células CAR-T

[323] Em algumas modalidades, as células T manipuladas descri- tas neste documento são geradas pela modificação do genoma das cé- lulas. Em algumas modalidades, é induzida uma quebra de cadeia dupla (DSB) em um sítio em um gene alvo. Em algumas modalidades, a DSB é reparada usando uma ou mais vias de reparação de DNA endógeno. Em algumas modalidades, uma via de reparação de DNA não requer uma sequência homóloga (por exemplo, a via de junção de extremidade não homóloga ou via de NHEJ ). Em algumas modalidades, uma via de reparação requer uma sequência homóloga (por exemplo, a via direcio- nada por homologia ou via HDR).

[324] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas são geradas induzindo uma DSB com CRISPR-Cas9 como uma endonuclease e um ou mais RNAs não codificantes e reparando a DSB usando HDR e um modelo de polinucleotídeo doador aqui descrito.

[325] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas são geradas usando um gRNA complementar a uma sequên- cia de um gene alvo que é um TRAC. Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas são geradas usando um espaça- dor TRAC gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 98. Em algumas modalidades, as células T manipuladas descritas neste documento são geradas usando um TRAC gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o TRAC gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 98 tem como alvo a sequência TRAC estabelecida na SEQ ID NO:

118. Em algumas modalidades, o TRAC gRNA compreendendo a se- quência estabelecida na SEQ ID NO: 30 tem como alvo a sequência TRAC estabelecida na SEQ ID NO: 118.

[326] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas são geradas usando um espaçador TRAC gRNA compreen- dendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 108. Em algumas mo- dalidades, as células T manipuladas descritas neste documento são ge- radas usando um TRAC gRNA compreendendo a sequência apresen- tada na SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, o TRAC gRNA com- preendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 108 tem como alvo a sequência TRAC estabelecida na SEQ ID NO: 118. Em algumas modalidades, o TRAC gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 40 tem como alvo a sequência TRAC estabelecida na SEQ ID NO: 118.

[327] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas são geradas usando um gRNA complementar a uma sequên- cia de um gene alvo que é um B2M. Em algumas modalidades, as célu- las T manipuladas aqui descritas são geradas usando um espaçador B2M gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO:

99. Em algumas modalidades, as células T manipuladas descritas neste documento são geradas usando um B2M gRNA compreendendo a se- quência apresentada na SEQ ID NO: 31. Em algumas modalidades, o B2M gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 99 tem como alvo a sequência B2M estabelecida na SEQ ID NO: 119. Em algumas modalidades, o B2M gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 31 tem como alvo a sequência B2M esta- belecida na SEQ ID NO: 119.

[328] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas são geradas usando um espaçador B2M gRNA compreen- dendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 109. Em algumas mo- dalidades, as células T manipuladas descritas neste documento são ge- radas usando um B2M gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, o B2M gRNA compreen- dendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 109 tem como alvo a sequência B2M estabelecida na SEQ ID NO: 119. Em algumas modali- dades, o B2M gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 41 tem como alvo a sequência B2M estabelecida na SEQ ID NO:

119.

[329] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas são geradas usando um gRNA complementar a uma sequên- cia de um gene alvo que é um CD70. Em algumas modalidades, as cé- lulas T manipuladas aqui descritas são geradas usando um espaçador CD70 gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO:

94. Em algumas modalidades, as células T manipuladas descritas neste documento são geradas usando um CD70 gRNA compreendendo a se- quência apresentada na SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, o CD70 gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 94 tem como alvo a sequência CD70 estabelecida na SEQ ID NO: 114. Em algumas modalidades, o CD70 gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 26 tem como alvo a sequência CD70 es- tabelecida na SEQ ID NO: 114.

[330] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas são geradas usando um espaçador CD70 gRNA compreen- dendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 104. Em algumas mo- dalidades, as células T manipuladas descritas neste documento são ge- radas usando um CD70 gRNA compreendendo a sequência apresen- tada na SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o CD70 gRNA com- preendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 104 tem como alvo a sequência CD70 estabelecida na SEQ ID NO: 114. Em algumas modalidades, o CD70 gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 36 tem como alvo a sequência CD70 estabelecida na SEQ ID NO: 114.

[331] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas são geradas usando um gRNA complementar a uma sequên- cia de um gene alvo que é um CD70. Em algumas modalidades, as cé- lulas T manipuladas aqui descritas são geradas usando um espaçador CD70 gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO:

95. Em algumas modalidades, as células T manipuladas descritas neste documento são geradas usando um CD70 gRNA compreendendo a se- quência apresentada na SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, o CD70 gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 95 tem como alvo a sequência CD70 estabelecida na SEQ ID NO: 115. Em algumas modalidades, o CD70 gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 27 tem como alvo a sequência CD70 es- tabelecida na SEQ ID NO: 115.

[332] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas são geradas usando um espaçador CD70 gRNA compreen- dendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 105. Em algumas mo-

dalidades, as células T manipuladas descritas neste documento são ge- radas usando um CD70 gRNA compreendendo a sequência apresen- tada na SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o CD70 gRNA com- preendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 105 tem como alvo a sequência CD70 estabelecida na SEQ ID NO: 115. Em algumas modalidades, o CD70 gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 37 tem como alvo a sequência CD70 estabelecida na SEQ ID NO: 115.

[333] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas são geradas usando um gRNA complementar a uma sequên- cia de um gene alvo que é um PD-1. Em algumas modalidades, as cé- lulas T manipuladas aqui descritas são geradas usando um espaçador PD-1 gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO:

100. Em algumas modalidades, as células T manipuladas descritas neste documento são geradas usando um PD-1 gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o PD-1 gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 100 tem como alvo a sequência B2M estabelecida na SEQ ID NO: 120. Em algumas modalidades, o PD-1 gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 32 tem como alvo a sequência PD-1 esta- belecida na SEQ ID NO: 120.

[334] Em algumas modalidades, as células T manipuladas aqui descritas são geradas usando um espaçador PD-1 gRNA compreen- dendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 110. Em algumas mo- dalidades, as células T manipuladas descritas neste documento são ge- radas usando um PD-1 gRNA compreendendo a sequência apresen- tada na SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, o PD-1 gRNA com- preendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 110 tem como alvo a sequência PD-1 estabelecida na SEQ ID NO: 120. Em algumas modalidades, o PD-1 gRNA compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 tem como alvo a sequência PD-1 estabelecida na SEQ ID NO: 120.

[335] Em algumas modalidades, as células T manipuladas descri- tas neste documento são geradas usando um TRAC gRNA compreen- dendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 98, um B2M gRNA com- preendendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 99, um CD70 gRNA compreendendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 94 ou 95, e/ou um PD-1 gRNA compreendendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 100. Em algumas modalidades, as células T manipuladas descritas neste documento são geradas usando um TRAC gRNA com- preendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 108, um B2M gRNA compreendendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 109, um CD70 gRNA compreendendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 104 ou 105, e/ou um PD-1 gRNA compreendendo a sequência es- tabelecida em SEQ ID NO: 110.

[336] Em algumas modalidades, as células T manipuladas descri- tas neste documento são geradas usando um TRAC gRNA compreen- dendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 30, um B2M gRNA com- preendendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 31, um CD70 gRNA compreendendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 26 ou 27, e/ou um PD-1 gRNA compreendendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, as células T manipuladas descritas neste documento são geradas usando um TRAC gRNA com- preendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 40, um B2M gRNA compreendendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 41, um CD70 gRNA compreendendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 36 ou 27, e/ou um PD-1 gRNA compreendendo a sequência esta- belecida em SEQ ID NO: 42.

[337] Em algumas modalidades, as células T manipuladas são ge- radas usando um modelo de doador que compreende uma sequência não homóloga que é um ácido nucleico que codifica um CAR. Em algu- mas modalidades, um modelo de doador é composto por braços de ho- mologia que correspondem a sequências em um gene alvo que é um TRAC. Em algumas modalidades, um braço de homologia 5' (braço de homologia esquerdo) do modelo doador compreende a sequência esta- belecida na SEQ ID NO: 122. Em algumas modalidades, um braço de homologia 3' do modelo de doador compreende a sequência estabele- cida na SEQ ID NO: 125.

[338] Em algumas modalidades, um promotor exógeno é um pro- motor EF1a que compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO:

123. Em algumas modalidades, o modelo doador compreende a se- quência estabelecida na SEQ ID NO: 135. Em algumas modalidades, o modelo doador compreende a sequência estabelecida na SEQ ID NO:

156. Em algumas modalidades, o modelo doador compreende a se- quência estabelecida na SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, o modelo doador compreende a sequência estabelecida na SEQ ID NO:

55.

[339] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam gRNAs, nucleases e modelos de doadores são introduzidos nas células (por exemplo, células T) usando métodos convencionais de transferên- cia de genes baseados em vírus e não virais.

[340] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo, tal como um gRNA, um saRNA, um MRNA que codifica uma nuclease ou um modelo de doador são entregues a uma célula usando um sistema de entrega de vetor não viral. Exemplos de um sistema de entrega de vetor não viral incluem, mas não estão limitados a, um plasmídeo de DNA, um minicírculo de DNA, um ácido nucleico nu, um lipossomo, uma partícula de ribonucleoproteína (RNP) ou um poloxâmero. Em algumas modali- dades, um método de introdução de polinucleotídeos em uma célula usando um sistema de entrega de vetor não viral inclui eletroporação,

lipofecção, microinjeção, biolística ou absorção melhorada por agente.

[341] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo, tal como um gRNA, um saRNA, um MRNA que codifica uma nuclease ou um modelo de doador são entregues a uma célula usando um sistema de entrega de vetor viral. Exemplos de um sistema de entrega de vetor viral in- cluem, mas não estão limitados a, vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores de adenovírus, vetores de poxvírus, vetores de herpesvírus e vetores de vírus adenoassociados (AAV).

[342] Em algumas modalidades, um modelo de doador que codi- fica um construto CAR é entregue a uma célula como um ou mais poli- nucleotídeos. Em algumas modalidades, um modelo de doador que co- difica um construto CAR é entregue por um veículo de entrega viral. Em algumas modalidades, um veículo de entrega viral é um vetor de vírus adenoassociado (AAV).

[343] Em algumas modalidades, uma endonuclease (por exemplo, Cas9) é entregue a uma célula como um polipeptídeo. Em algumas mo- dalidades, uma endonuclease (por exemplo, Cas9) é entregue a uma célula separadamente de um ácido nucleico de direcionamento ao ge- noma (por exemplo, um gRNA, um saR NA). Em algumas modalidades, uma endonuclease (por exemplo, Cas9) é entregue a uma célula como um complexo com um ou mais polinucleotídeos de direcionamento do genoma (por exemplo, um gRNA, um sgR NA). Em algumas modalida- des, uma endonuclease ou uma endonuclease pré-complexada é entre- gue por um veículo de entrega não viral que inclui, mas não está limitado a, uma nanopartícula, um lipossomo, uma ribonucleoproteína, um pep- tídeo carregado positivamente, um conjugado de RNA de pequena mo- lécula, uma quimera de aptâmero-RNA ou um complexo de proteína de fusão de RNA. Em algumas modalidades, um método de introdução de um polipeptídeo de endonuclease ou um polipeptídeo de endonuclease pré-complexado em uma célula inclui eletroporação, lipofecção, micro- injeção, biolística ou absorção melhorada por agente.

[344] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Cas9 é pré-com- plexado com um ou mais sgRNAs para formar uma partícula de ribonu- cleoproteína (RNP). Em algumas modalidades, um RNP Cas9/sgRNA é formulado usando uma nanopartícula de lipídeo. Em algumas modalida- des, um modelo de doador é formulado usando um vetor AAV. Em al- gumas modalidades, a entrega a uma célula de um Cas9/sgRNA RNP formulado é realizada por eletroporação da célula. Em algumas modali- dades, um modelo de doador formulado como um vetor AAV é entregue antes da eletroporação. Em algumas modalidades, um modelo de doa- dor formulado como um vetor AAV é entregue durante a eletroporação. Em algumas modalidades, um modelo de doador formulado como um vetor AAV é entregue após a eletroporação.

[345] Em algumas modalidades, uma edição de gene realizada usando uma endonuclease CRISPR/Cas9 resulta em uma célula T ma- nipulada com um gene TRAC interrompido. Em algumas modalidades, uma interrupção de um gene TRAC resulta na eliminação ou diminuição da expressão do produto do gene TRAC. Em algumas modalidades, uma interrupção de um gene TRAC interrompe ou inibe a transcrição e tradução de um produto de gene codificado. Em algumas modalidades, uma interrupção de um gene TRAC resulta na eliminação ou diminuição da expressão de um produto do gene TRAC. Em algumas modalidades, a expressão eliminada ou diminuída do gene TRAC está associada à perda de função do TCR. Em algumas modalidades, a perda da função TCR torna uma célula T manipulada adequada para transplante alogê- nico (isto é, minimizando o risco de induzir GVHD). Em algumas moda- lidades, uma interrupção de um gene TRAC é criada ao inserir um CAR no gene TRAC (por exemplo, usando um vetor AAV e um modelo de doador). Em algumas modalidades, uma interrupção na expressão do gene TRAC é criada por gRNAs direcionados à região genômica do TRAC e inserir em um CAR no gene CAR. Em algumas modalidades, um CAR knock-in é fornecido por um modelo de doador com braços de homologia que correspondem a sequências do TRAC em torno do sítio de uma DSB.

[346] Em algumas modalidades, uma edição de gene realizada usando uma endonuclease CRISPR/Cas9 resulta em uma célula T ma- nipulada com um gene B2M interrompido. Em algumas modalidades, os gRNAs direcionados à região genômica B2M criam indels no gene B2M que interrompem ou inibem a transcrição e tradução de um produto gê- nico codificado. Em algumas modalidades, uma interrupção de um gene B2M resulta na eliminação ou diminuição da expressão do polipeptídeo B2M. Em algumas modalidades, a expressão eliminada ou diminuída do polipeptídeo B2M está associada à perda de função do complexo MHC |. Em algumas modalidades, a perda da função MHC | torna uma célula T manipulada adequada para o transplante alogênico (isto é, minimi- zando o risco de resposta hospedeiro versus de célula T alogênica). Em algumas modalidades, a perda da função MHC | resulta no aumento da persistência de uma célula T manipulada em um receptor alogênico.

[347] Em algumas modalidades, uma edição de gene realizada usando uma endonuclease CRISPR/Cas9 resulta em uma célula T ma- nipulada com um gene CD70 interrompido. Em algumas modalidades, os gRNAs direcionados à região genômica CD70 criam indels no gene CD70 que interrompem ou inibem a transcrição e tradução de um pro- duto gênico codificado. Em algumas modalidades, uma interrupção de um gene CD70 resulta na eliminação ou diminuição da expressão do polipeptídeo CD70. Em algumas modalidades, a expressão eliminada ou diminuída do polipeptídeo CD70 está associada a proliferação celular aumentada, persistência in vivo, exaustão diminuída e/ou eficácia anti- tumoral aumentada.

[348] Em algumas modalidades, uma edição de gene realizada usando uma endonuclease CRISPR/Cas9 resulta em uma célula T ma- nipulada com um gene PD-1 interrompido. Em algumas modalidades, os gRNAs direcionados à região genômica PD-1 criam indels no gene PD-1 que interrompem ou inibem a transcrição e tradução de um pro- duto gênico codificado. Em algumas modalidades, uma interrupção de um gene PD-1 resulta na eliminação ou diminuição da expressão do polipeptídeo PD-1. Métodos e Composições

[349] São aqui fornecidos, em algumas modalidades, métodos para o tratamento do câncer. Exemplos não limitativos de cânceres que podem ser tratados conforme fornecido neste documento incluem mi- eloma múltiplo, leucemia (por exemplo, leucemia de células T, leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) e/ou leucemia linfocítica crônica (C-CLL)), linfoma (por exemplo, linfoma não-Hodgkin de células B (B- NHL), linfoma de Hodgkin e/ou linfoma de células T) e/ou carcinoma de células renais de células claras (ccRCC). Em algumas modalidades, os métodos compreendem a entrega de células T CAR (por exemplo, cé- lulas T CAR anti-BCMA, anti-CD19, anti-CD33 e/ou anti-CD70) da pre- sente descrição para um sujeito com mieloma múltiplo, leucemia ou lin- foma. Outros exemplos não limitativos de câncer (por exemplo, tumores sólidos) que podem ser tratados conforme fornecido neste documento incluem câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de mama, câncer renal, câncer de tireoide, câncer de nasofaringe, pulmão de células não pequenas (NSCLC), glioblastoma e/ou melanoma.

[350] O CD70 também foi detectado em tumores hematológicos e carcinomas. O padrão de expressão restrito de CD70 em tecidos nor- mais e sua expressão disseminada em várias doenças malignas torna um alvo atraente para a terapêutica baseada em anticorpos. O uso de terapia com células T CAR para direcionar para cânceres CD70*, no entanto, é potencialmente problemático por causa da expressão de CD70 nas células T. Para resolver este problema potencial, a presente descrição também fornece células T CAR que foram manipuladas para interromper a expressão de CD70 endógeno enquanto, ao mesmo tempo, expressam uma fração de ligação anti-CD70 (por exemplo, um scFv anti-CD70).

[351] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer CD70*. Em outras modalidades, o câncer é um câncer BCMA*. Em algumas moda- lidades, o câncer é um câncer CD19+. Em algumas modalidades, o cân- cer é um câncer CD33+. Deve ser entendido que outros cânceres, ex- pressando outros antígenos de câncer, podem ser tratados usando as células TCAR manipuladas com CD70 inativado da presente descrição.

[352] Os métodos, em algumas modalidades, compreendem a ad- ministração a um sujeito (por exemplo, um paciente com um câncer CD70*+, um câncer BCMA*, um câncer CD19+ ou um câncer CD33+) de uma população de células T CAR, conforme aqui fornecido. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração a um sujeito de uma população de células T CAR compreendendo um gene CD70 inativado. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a ad- ministração a um sujeito de uma população de células T CAR compre- endendo um gene CD70 inativado e um gene PD1 inativado. Em algu- mas modalidades, os métodos compreendem implantar as células no sujeito. Este passo de implantação pode ser realizado usando qualquer método de implantação conhecido na técnica. Por exemplo, as células modificadas podem ser injetadas diretamente no sangue de um sujeito ou de outra forma administradas ao sujeito.

[353] Conforme aqui demonstrado, as células CAR T compreen- dendo um gene CD70 inativado exibem proliferação estendida e au- mento da persistência in vivo. Em algumas modalidades, as células

CAR T compreendendo um gene CD70 inativado exibem maior eficácia antitumoral em relação às células CAR T que expressam CD70 endó- geno. Em algumas modalidades, as células CAR T compreendendo um gene CD70 inativado exibem maior eficácia antitumoral em tumores só- lidos em relação às células CAR T que expressam CD70 endógeno. Sem desejar ser limitado pela teoria, o aumento da persistência de cé- lulas T CAR in vivo compreendendo um gene CD70 inativado pode per- mitir a expansão em tumores sólidos e, portanto, fornecer eficácia anti- tumoral aumentada em tais tumores em relação às células T CAR que expressam CD70 endógeno.

[3514] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para tratar um tumor sólido com as células CAR T aqui descritas. Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para tratar um tumor sólido com as células T CAR anti-CD70 aqui descritas.

[355] A etapa de administração pode incluir a colocação (por exemplo, transplante) de células, por exemplo, células T manipuladas, em um sujeito, por um método ou via que resulta em pelo menos locali- zação parcial das células introduzidas em um sítio desejado, tal como um tumor, de modo que o(s) efeito(s) desejado(s) seja(m) produzido(s) As células T manipuladas podem ser administradas por qualquer via apropriada que resulte na entrega para um sítio desejado no sujeito, onde pelo menos uma porção das células implantadas ou componentes das células permaneçam viáveis. O período de viabilidade das células após a administração a um sujeito pode ser tão curto quanto algumas horas, por exemplo, vinte e quatro horas, a alguns dias, até vários anos, ou mesmo o tempo de vida do sujeito, ou seja, enxerto de longo prazo. Por exemplo, em alguns aspectos aqui descritos, uma quantidade eficaz de células T manipuladas é administrada por uma via sistêmica de ad- ministração, tal como uma via intraperitoneal ou intravenosa.

[356] Um sujeito pode ser qualquer sujeito para o qual o diagnós- tico, tratamento ou terapia é desejado. Em algumas modalidades, o su- jeito é um mamífero. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano.

[357] Um doador é um indivíduo que não é o sujeito a ser tratado. Um doador é um indivíduo que não é o paciente. Em algumas modali- dades, um doador é um indivíduo que não tem ou não é suspeito de ter o câncer a ser tratado. Em algumas modalidades, vários doadores, por exemplo, dois ou mais doadores, são usados.

[358] Em algumas modalidades, a população de células T manipu- ladas a ser administrada de acordo com os métodos aqui descritos com- preendem células T alogênicas obtidas a partir de um ou mais doadores. "Alogênico" se refere a uma célula, população celular ou amostras bio- lógicas compreendendo células, obtidas de um ou mais doadores dife- rentes da mesma espécie, onde os genes em um ou mais loci não são idênticos ao receptor (por exemplo, sujeito). Por exemplo, uma popula- ção de células T manipuladas, a ser administrada a um sujeito pode ser derivada de um ou mais doadores não relacionados, ou a partir de um ou mais irmãos não-idênticos. Em algumas modalidades, as populações de células singeneicas podem ser utilizadas, tais como as obtidas a par- tir de doadores geneticamente idênticos, (por exemplo, gémeos idênti- cos). Em algumas modalidades, as células são células autólogas; isto é, as células T manipuladas são obtidas ou isoladas de um sujeito e administradas ao mesmo sujeito, isto é, o doador e o receptor são os mesmos.

[359] Uma quantidade eficaz se refere à quantidade de uma popu- lação de células T manipuladas necessária para prevenir ou aliviar pelo menos um ou mais sinais ou sintomas de uma afeção médica (por exemplo, câncer) e se refere a uma quantidade suficiente de uma com- posição para fornecer o desejado efeito, por exemplo, para tratar um sujeito tendo uma afeção médica. Uma quantidade eficaz também inclui uma quantidade suficiente para impedir ou atrasar o desenvolvimento de um sintoma da doença, alterar o decurso de um sintoma da doença (por exemplo, mas não limitado a, retardar a progressão de um sintoma da doença), ou reverter um sintoma da doença. Entende-se que, para qualquer caso, uma "quantidade eficaz" apropriada pode ser determi- nada por um perito na técnica usando experimentação de rotina.

[360] Para uso nos vários aspectos aqui descritos, uma quanti- dade eficaz de células (por exemplo, células T manipuladas) compre- ende pelo menos 10? células, pelo menos 5 X 10º células, pelo menos 103 células, pelo menos 5 X 103 células, pelo menos 10º células, pelo menos 5 X 10º células, pelo menos 10º células, pelo menos 2 X 105 células, pelo menos 3 X 10º células, pelo menos 4 X 10º células, pelo menos 5 X 10º células, pelo menos 6 X 10º células, pelo menos 7 X 10º células, pelo menos 8 X 10º células, pelo menos 9 X 105 células, pelo menos 1 X 105 células, pelo menos 2 X 105º células, pelo menos 3 X 10º células, pelo menos 4 X 105 células, pelo menos 5 X 105º células, pelo menos 6 X 105 células, pelo menos 7 X 106 células, pelo menos 8 X 105 células, pelo menos 9 X 105 células, ou seus múltiplos. As células são derivadas de um ou mais doadores, ou são obtidas a partir de uma fonte autóloga. Em alguns exemplos aqui descritos, as células são expandi- das em cultura antes da administração a um sujeito em necessidade.

[361] Os modos de administração incluem injeção, infusão, instila- ção ou ingestão. Injeção inclui, sem limitação, injeção e infusão intrave- nosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intracapsu- lar, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraceal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinhal, intracérebro espinhal e intraesternal. Em algumas moda- lidades, a via é intravenosa.

[362] Em algumas modalidades, as células T manipuladas são ad- ministradas sistemicamente, o que se refere à administração de uma população de células que não seja diretamente em um sítio, tecido ou órgão alvo, de modo que entre, em vez disso, no sistema circulatório do sujeito e, assim, é sujeito ao metabolismo e outros processos similares.

[363] A eficácia de um tratamento compreendendo uma composi- ção para o tratamento de uma afecção médica pode ser determinada pelo médico especialista. Um tratamento é considerado "tratamento efi- caz", se algum ou todos os sinais ou sintomas de, como um exemplo, níveis de alvo funcional forem alterados de maneira benéfica (por exem- plo, aumentado em pelo menos 10%), ou outros sintomas clinicamente aceites ou marcadores da doença (por exemplo, cancro) são melhora- dos ou aperfeiçoados. A eficácia também pode ser medida pela falha de um sujeito em piorar, conforme avaliado por hospitalização ou necessi- dade de intervenções médicas (por exemplo, a progressão da doença é interrompida ou pelo menos retardada). Os métodos para medir esses indicadores são conhecidos dos peritos na técnica e/ou aqui descritos. O tratamento inclui qualquer tratamento de uma doença no sujeito e in- clui: (1) inibição da doença, por exemplo, interromper ou retardar a pro- gressão dos sintomas; ou (2) aliviar a doença, por exemplo, causando regressão dos sintomas; e (3) prevenir ou reduzir a probabilidade de desenvolvimento de sintomas.

[364] As terapias de combinação também são abrangidas pela presente descrição. Por exemplo, os anticorpos CD70 e/ou CD27 po- dem ser usados para ligar e/ou modular a atividade de CD70 e/ou CD27 em células T CAR e promover uma diminuição na exaustão, expansão aumentada de células T CAR e aumentar a eficácia da morte de células cancerígenas. Assim, os anticorpos CD70 e/ou CD27 podem ser admi- nistrados com qualquer célula T CAR conhecida na técnica para melho- rar a função das células T CAR. Por exemplo, qualquer uma das células T manipuladas fornecidas neste documento pode ser administrada em combinação com anticorpos anti-CD70, anticorpos anti-CD27 ou uma combinação de anticorpos anti-CD70 e anticorpos anti-CD27. Em algu- mas modalidades, células TCAR* TRAC/B2M (por exemplo, CAR anti- CD70 ou CAR anti-BCMA) são administradas em combinação com an- ticorpos anti-CD70 e/ou anti-CD27. Em algumas modalidades, células T CAR* TRAC/B2M/PD-1/CD70' (por exemplo, CAR anti-CD70 ou CAR anti-BCMA) são administradas em combinação com anticorpos anti- CD70 e/ou anti-CD27. Em algumas modalidades, células TCAR+TRAC'" /B2M'/PD-1" (por exemplo, CAR anti-CD70 ou CAR anti-BCMA) são ad- ministradas em combinação com anticorpos anti-CD70 e/ou anti-CD27. Em algumas modalidades, células T CAR* TRAC/B2M/CD70' (por exemplo, CAR anti-CD70 ou CAR anti-BCMA) são administradas em combinação com anticorpos anti-CD70 e/ou anti-CD27. Em algumas modalidades, os anticorpos administrados em combinação podem ser Varlilumab.

[365] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para reduzir a exaustão de células T, compreendendo interromper o gene CD70 nas células T. Em algumas modalidades, a descrição for- nece um método para aumentar a proliferação de células T, compreen- dendo interromper o gene CD70 nas células T. Em algumas modalida- des, a descrição fornece um método para aumentar a proliferação de células T, compreendendo interromper o gene CD70 nas células T. Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para superar o efeito inibitório de um ponto de verificação imunológico (por exemplo, PD-1) em células T compreendendo a interrupção do gene CD70 nas células T. Outras Modalidades

[366] A descrição refere-se às seguintes modalidades. Ao longo desta seção, o termo modalidade é abreviado como 'E' seguido por um ordinal. Por exemplo, E1 é equivalente à Modalidade 1. El. Uma célula T manipulada que compreende um geneCD70 interrompido, um gene da morte celular programada 1 (PD-1) interrom- pido e um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimé- rico (CAR).

E2. Uma célula T manipulada que compreende um gene CD70 interrompido e um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) que se liga ao CD70.

E3. Uma célula T manipulada que compreende um gene CD70 interrompido e um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) que não se liga a CD70.

EA4. A célula T manipulada da modalidade 2 ou 3, compreen- dendo ainda um gene PD-1 interrompido.

E5. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 1- 4 compreendendo ainda um gene da região constante de cadeia alfa do receptor de célula T (TRAC) interrompido.

E6. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 1- 5, compreendendo ainda um gene da beta-2-microglobulina (B2M) inter- rompido.

E7. Uma célula T manipulada, compreendendo um gene da região constante da cadeia alfa do receptor de células T (TRAC) interrompido; um gene da beta-2-microglobulina (B2M) interrompido; um geneC D70 interrompido; e um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR).

E8. A célula T manipulada da modalidade 7, em que o ácido nu- cleico que codifica o CAR é inserido no gene TRAC.

E9. A célula T manipulada da modalidade 7 ou 8, compreen- dendo ainda um gene PD-1 interrompido.

E10. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 1- 9, em que o CAR compreende um ectodomínio que compreende um anticorpo anti-CD70, opcionalmente em que o anticorpo anti-CD70 é um fragmento variável de cadeia única anti-CD70 (scFv). E1l1. A célula T manipulada da modalidade 10, em que o scFv anti- CD70 compreende as mesmas regiões determinantes de complemen- taridade (CDRs) da região variável da cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs da região variável da cadeia leve (VL) como um anticorpo de re- ferência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH esta- belecida como SEQ ID NO: 51 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 52. E1l2. A célula T manipulada da modalidade 11, em que o scFv anti- CD70 compreende as mesmas cadeias VH e VL que o anticorpo de re- ferência. E13. A célula T manipulada da modalidade 11, em que o scFv anti- CD70 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 ou

50. EM. A célula T manipulada da modalidade 11, em que o scFv anti- CD70 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. E1l5. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 1- 9, em que o CAR compreende um ectodomínio que compreende um anticorpo anti-BCMA, opcionalmente em que o anticorpo anti-BCMA é um fragmento variável de cadeia única anti-BCMA (scFv). E1l6. A célula T manipulada da modalidade 15, em que o scFv anti- BCMA compreende as mesmas regiões determinantes de complemen- taridade de VH (CDRs) e as mesmas CDRs de VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH) estabelecida como SEQ ID NO: 60 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 61. E17. A célula T manipulada da modalidade 16, em que o scFv anti- BCMA compreende as mesmas cadeias VH e VL que o anticorpo de referência.

E18. A célula T manipulada da modalidade 16, em que o scFv anti- BCMA compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59. E19. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 1- 18, em que o CAR compreende um domínio coestimulatório CD28 ou 41BB e, opcionalmente, um domínio de sinalização CD3C.

E20. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 5- 19, em que o gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 44 ou 55 e/ou o ácido nucleico que codifica o CAR compre- ende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 45 ou 56. E21. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 6- 20, em que o gene B2M compreende o gene de pelo menos uma se- quência de nucleotídeos selecionada a partir de qualguer uma das SEQ ID NOS: 9-14. E22. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 1- 21, em que a célula T manipulada mantém a citotoxicidade após 5 novos desafios com uma célula cancerígena.

E23. A célula T manipulada da modalidade 22, em que a célula T manipulada mantém a citotoxicidade após 10 novos desafios com uma célula cancerígena.

E24. Uma população de células que compreende células T mani- puladas que compreendem um gene CD70, um gene de morte celular programada-1 (P D-1) interrompido e um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR). E25. Uma população de células que compreende células T mani- puladas que compreendem um gene CD70, e um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) que se liga a CD70. E26. Uma população de células que compreende células T mani- puladas que compreendem um gene CD70 interrompido e um ácido nu- cleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) que não se liga a CD70.

E27. A população de células da modalidade 25 ou 26, compreen- dendo ainda um gene da morte celular programada-1 (PD-1) interrom- pido.

E28. A população de células de qualquer uma das modalidades 24-27 compreendendo ainda um gene da região constante de cadeia alfa do receptor de célula T (TRAC) interrompido.

E29. A população de células de qualquer uma das modalidades 24-28, compreendendo ainda um gene da beta-2-microglobulina (B2M) interrompido.

E30. A população de células compreendendo células T manipuladas que compreendem um gene da região constante da cadeia alfa do receptor de células T (TRAC) interrompido; um gene da beta-2-microglobulina (B2M) interrompido; um geneC D70 interrompido; e um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR).

E31. A população de células da modalidade 30, em que o ácido nucleico que codifica o CAR é inserido no gene TRAC.

E32. A população de células da modalidade 30 ou 31, em que as células T manipuladas compreendem ainda um gene de morte celular programada-1 (PD-1) interrompido.

E33. A população de células de qualquer uma das modalidades 24 ou 27-32, em que o CAR compreende um ectodomínio que compre- ende um anticorpo anti-CD70, opcionalmente em que o anticorpo anti- CD70 é um fragmento variável de cadeia única anti-CD70 (scFv).

E34. A população de células da modalidade 33, em que o scFv anti-CD70 compreende as mesmas regiões determinantes de comple- mentaridade de VH (CDRs) e as mesmas CDRs de VL como um anti- corpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma

VH estabelecida como SEQ ID NO: 51 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 52. E35. A população de células da modalidade 34, em que o scFv anti-CD70 compreende as mesmas cadeias VH e VL que o anticorpo de referência. E36. A população de células da modalidade 35, em que o scFv anti-CD70 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 ou 50. E37. A população de células da modalidade 35, em que o scFv anti-CD70 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. E38. A população de células de qualquer uma das modalidades 24-32, em que o CAR compreende um ectodomínio que compreende um anticorpo anti-BCMA, opcionalmente em que o anticorpo anti-BCMA é um fragmento variável de cadeia única anti-BCMA (scFv). E39. A população de células da modalidade 38, em que o scFv anti-BCMA compreende as mesmas regiões determinantes de comple- mentaridade de VH (CDRs) e as mesmas CDRs de VL como um anti- corpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 60 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 61. E40. A população de células da modalidade 39, em que o scFv anti-BCMA compreende as mesmas cadeias VH e VL que o anticorpo de referência. E41. A população de células da modalidade 39, em que o scFv anti-<BCMA compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

59. E42. A população de células de qualquer uma das modalidades 28-41, em que o gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 44 ou 55 e/ou o ácido nucleico que codifica o CAR com- preende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 45 ou 56.

E43. A população de células de qualquer uma das modalidades 29-42, em que o gene B2M compreende o gene de pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOS: 9-14. E4. A população de células de qualquer uma das modalidades 24-43, em que pelo menos 50% das células T manipuladas não expres- sam um nível detectável de proteína de superfície TCR, não expressam um nível detectável de proteína de superfície B2M, não expressam um nível detectável de proteína de superfície CD70, não expressam um níÍ- vel detectável de proteína de superfície PD-1 e/ou expressam um nível detectável do CAR.

E45. A população de células da modalidade 44, em que 50%-70% das células T manipuladas não expressam um nível detectável de pro- teína de superfície TCR, não expressam um nível detectável de proteína de superfície B2M, não expressam um nível detectável de proteína de superfície CD70, não expressam um nível detectável de proteína de su- perfície PD-1 e/ou expressam um nível detectável do CAR.

E46. A população de células de qualquer uma das modalidades 28-45, em que pelo menos 90%, opcionalmente 90%-100% das células T manipuladas não expressam um nível detectável de proteína de su- perfície TCR.

E47. A população de células de qualquer uma das modalidades 29-46, em que pelo menos 60%, opcionalmente 60% -75%, das células T manipuladas não expressam um nível detectável de proteína de su- perfície B2M.

E48. A população de células de qualquer uma das modalidades 24-47, em que pelo menos 80%, opcionalmente 80%-100% das células T manipuladas não expressam um nível detectável de proteína de su- perfície CD70. E49. A população de células de qualquer uma das modalidades 1-

48, em que pelo menos 80%, opcionalmente 80%-95% das células T manipuladas expressam um nível detectável de CAR.

E50. A população de células de qualquer uma das modalidades 24-49, em que as células T manipuladas exibem pelo menos 20% maior capacidade proliferativa celular, em relação às células T de controle.

E51. A população de células de qualquer uma das modalidades 24-50, em que as células T manipuladas exibem pelo menos 20% mais capacidade de lise celular, em relação às células T de controle.

E52. A população de células de qualquer uma das modalidades 24-51, em que o nível de citocinas secretadas pelas células T manipu- ladas é pelo menos 2 vezes maior do que o nível de citocinas secretadas pelas células T de controle.

E53. A população de qualquer uma das modalidades 24-52, em que as células T manipuladas exibem exaustão celular reduzida, em re- lação às células T de controle.

E54. A população de células da modalidade 53, em que as células T manipuladas expressam níveis reduzidos de LAG3, em relação às cé- lulas T de controle.

E55. A população de células de qualquer uma das modalidades 54, em que as células T de controle são células T manipuladas que ex- pressam a proteína CD70 endógena.

E56. A população de células de qualquer uma das modalidades 24-55, em que as células T manipuladas mantêm a proliferação depen- dente de citocinas.

E57. A população de células de qualquer uma das modalidades 24-56, em que as células T manipuladas mantêm a citotoxicidade após novos desafios com uma célula cancerígena.

E58. A população de células da modalidade 47, em que a célula T manipulada mantém a citotoxicidade após 10 novos desafios com uma célula cancerígena.

E59. Um método que compreende a administração a um sujeito da população de células de qualquer uma das modalidades 24-58.

E60. O método da modalidade 59, em que as células T manipula- das são células T humanas manipuladas.

E61. O método da modalidade 59 ou 60, em que o sujeito tem um câncer.

E62. O método da modalidade 61, em que o câncer expressa CD70 e/ou BCMA.

E63. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 59- 62, em que a população de células é administrada ao sujeito em uma quantidade eficaz para tratar o câncer.

EG64. O método de qualquer uma das modalidades 59-63, em que o câncer é uma malignidade de tumor sólido ou uma malignidade hema- tológica.

E65. O método da modalidade 64, em que a malignidade do tumor sólido é selecionada do grupo que consiste em: tumor ovariano, tumor pancreático, tumor renal, tumor pulmonar e tumor intestinal.

E66. O método da modalidade 63, em que a população de células é administrada ao sujeito em uma quantidade eficaz para reduzir o vo- lume de um tumor no sujeito.

E67. Um método para produzir uma célula T manipulada, o mé- todo compreendendo (a) entrega a uma célula T uma nuclease guiada por RNA, um gRNA com alvo em um gene CD70, e um vetor que compreende um modelo doador que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR; e (b) produzir uma célula T manipulada compreendendo um gene CD70 interrompido e expressando o CAR.

E68. O método da modalidade 67, compreendendo ainda na etapa (a) entregar à célula Tum gR NA direcionado a um gene PD-1; em que a célula T manipulada da etapa (b) compreende ainda um genePD- 1 interrompido.

E69. O método da modalidade 67 ou modalidade 68, compreen- dendo ainda na etapa (a) a entrega à célula T de um gRNA direcionado a um gene TRAC; em que a célula T manipulada da etapa (b) compre- ende ainda um gene TRAC interrompido.

E70. O método da modalidade 69, em que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado pelos braços de homologia esquerdo e di- reito para o locus do gene TRAC; e em que a célula T manipulada da etapa (b) compreende o ácido nucleico que codifica o CAR inserido no locus do gene TRAC.

E71. O método de qualquer uma das modalidades 67-70, compre- endendo ainda na etapa (a) entregar à célula T um gR NA direcionado a um gene B2M; em que a célula T manipulada da etapa (b) compreende ainda um gene B2M interrompido.

E72. Um método para produzir uma célula T manipulada, o mé- todo compreendendo (a) entrega a uma célula T uma nuclease guiada por RNA, um gRNA com alvo em um gene TRAC, um gRNA com alvo em um gene B2M, um gRNA com alvo em um gene CD70, e um vetor que compreende um modelo doador que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR; e (b) produzir uma célula T manipulada.

E73. O método da modalidade 72, em que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado pelos braços de homologia direito e es- querdo para o locus do gene TRAC.

E7A4. O método da modalidade 72 ou 73, compreendendo ainda a entrega à célula T de um gRNA direcionado a um gene PD-1. E75. O método de qualquer uma das modalidades 67-74, em que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcionalmente uma nuclease Cas9 de 5. pyogenes.

E76. O método de qualquer uma das modalidades 69-75, em que o gRNA direcionado ao gene TRAC compreende a sequência de nucle- otídeos de SEQ ID NO: 98 ou tem alvo na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 118, e opcionalmente em que o gRNA com alvo no gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 30. E77. O método de qualquer uma das modalidades 71-76, em que o gRNA direcionado ao gene B2M compreende a sequência de nucleo- tídeos de SEQ ID NO: 99 ou tem alvo na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 119, e opcionalmente em que o gRNA com alvo no gene B2M compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31. E78. O método de qualquer uma das modalidades 67-77, em que o gRNA direcionado ao gene CD70 compreende a sequência de nucle- otídeos de SEQ ID NOS: 94 ou 95 ou tem alvo na sequência nucleotí- dica de SEQ ID NO: 114 ou 115, e opcionalmente em que o gRNA com alvo no gene CD70 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 26 ou 27. E79. O método de qualquer uma das modalidades 68-71 e 74-78, em que o gR NA direcionado ao gene PD-1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 100 ou tem alvo na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 120, e opcionalmente em que o gRNA com alvo no gene PD-1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 32. E80. O método de qualquer uma das modalidades 67-79, em que o CAR compreende um ectodomínio que compreende um anticorpo anti- CD70, opcionalmente em que o anticorpo anti-CD70 é um fragmento variável de cadeia única anti-CD70 (scFv).

E81. O método da modalidade 80, em que o scFv anti-CD70 com- preende as mesmas regiões determinantes de complementaridade de VH (CDRs) e as mesmas CDRs de VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 51 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 52. E82. O método da modalidade 81, em que o scFv anti-CD70 com- preende as mesmas cadeias VH e VL que o anticorpo de referência.

E83. O método da modalidade 81, em que o scFv anti-CD70 com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 ou 50. E84. O método da modalidade 81, em que o scFv anti-CD70 com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. E85. O método de qualquer uma das modalidades 67-79, em que o CAR compreende um ectodomínio que compreende um anticorpo anti- BCMA, opcionalmente em que o anticorpo anti-BCMA é um fragmento variável de cadeia única anti-BCMA (scFv). E86. O método da modalidade 85, em que o scFv anti-BCMA com- preende as mesmas regiões determinantes de complementaridade de VH (CDRs) e as mesmas CDRs de VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 60 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 61. E87. O método da modalidade 86, em que o scFv anti-BCMA com- preende as mesmas cadeias VH e VL que o anticorpo de referência.

E88. O método da modalidade 86, em que o scFv anti-BCMA com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59. E89. O método de qualquer uma das modalidades 67-88, em que o CAR compreende ainda um domínio coestimulatório CD28 ou 41BB e, opcionalmente, um domínio de sinalização CD37z.

E90. O método da modalidade 72, em que o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46.

E91. O método da modalidade 72, em que o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57. E92. Uma célula T manipulada compreendendo uma nuclease guiada por RNA e um gRNA direcionado a um gene CD70, opcional- mente em que o gRNA direcionado ao gene CD70 compreende a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 94 ou 95 ou tem alvo na se- quência nucleotídica de SEQ ID NO: 114 ou 115, e opcionalmente em que o gRNA com alvo no gene CD70 compreende a sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NOS: 26 ou 27. E93. A célula T manipulada da modalidade 92, compreendendo ainda um gRNA direcionado a um gene PD-1, opcionalmente em que o gRNA direcionado ao gene PD-1, compreende a sequência de nucleo- tídeos de SEQ ID NO: 100 ou tem alvo na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 120, e opcionalmente em que o gRNA com alvo no gene PD-1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 32. E94. A célula T manipulada da modalidade 92 ou 93, compreen- dendo ainda um gRNA direcionado a um gene TRAC, opcionalmente em que o gRNA direcionado ao gene TRAC, compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 98 ou tem alvo na sequência nucleotí- dica de SEQ ID NO: 118, e opcionalmente em que o gRNA com alvo no gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:

30. E95. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 92- 94, compreendendo ainda um gRNA direcionado a um gene B2M, opci- onalmente em que o gRNA direcionado ao gene B2M, compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 99 ou tem alvo na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 119, e opcionalmente em que o gRNA com alvo no gene B2M compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31.

E96. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 92- 95, em que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcio- nalmente uma nuclease Cas9 de S. pyogenes. E97. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 92- 96 compreendendo ainda um vetor que compreende um modelo de do- ador que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, opcio- nalmente em que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado pe- los braços de homologia esquerdo e direito para o locus do gene TRAC. E98. A célula T manipulada da modalidade 97, em que o CAR compreende um ectodomínio que compreende um anticorpo anti-CD70, opcionalmente em que o anticorpo anti-CD70 é um fragmento variável de cadeia única anti-CD70 (scFv). E99. A célula T manipulada da modalidade 98, em que o scFv anti- CD70 compreende as mesmas regiões determinantes de complemen- taridade de VH (CDRs) e as mesmas CDRs de VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 51 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 52. E100. A célula T manipulada da modalidade 99, em que o scFv anti- CD70 compreende as mesmas cadeias VH e VL que o anticorpo de re- ferência. E101. A célula T manipulada da modalidade 99, em que o scFv anti- CD70 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 ou

50. E102. A célula T manipulada da modalidade 99, em que o scFv anti- CD70 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. E103. A célula T manipulada da modalidade 97, em que o CAR compreende um ectodomínio que compreende um anticorpo anti- BCMA, opcionalmente em que o anticorpo anti-BCMA é um fragmento variável de cadeia única anti-BCMA (scFv).

E104. A célula T manipulada da modalidade 103, em que o scFv anti-BCMA compreende as mesmas regiões determinantes de comple- mentaridade de VH (CDRs) e as mesmas CDRs de VL como um anti- corpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 60 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 61. E105. A célula T manipulada da modalidade 104, em que o scFv anti-BCMA compreende as mesmas cadeias VH e VL que o anticorpo de referência. E106. A célula T manipulada da modalidade 104, em que o scFv anti-<BCMA compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

59. E107. A célula T manipulada da modalidade 97, em que o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 ou 57. E108. Um método para aumentar a proliferação ou reduzir à exa- ustão de células T, o método compreendendo a interrupção do gene CD70 nas células T. E109. O método da modalidade 108, compreendendo ainda a inter- rupção nas células T de pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste em: gene da morte celular programada-1 PD-1), gene da região constante da cadeia alfa do receptor de células T TRAC) e gene da beta- 2-microglobulina (B2M). E110. O método de qualquer uma das modalidades 108-109, com- preendendo ainda expressar nas células T um ácido nucleico que codi- fica um receptor de antígeno quimérico (CAR). E111. O método de qualquer uma das modalidades 108-110, em que o gene CD70 é interrompido pela edição do gene CRISPR/Cas. E112. O método de qualquer uma das modalidades 110-111, em que o gene PD-1, TRAC, e/ou B2M é interrompido pela edição do gene

CRISPR/Cas.

E113. Um método para o tratamento de câncer em um sujeito, com- preendendo a administração ao paciente de uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipula- das compreendem um gene CD70 interrompido e um ácido nucleico que codifica um CAR, tratando assim câncer no sujeito.

E114. O método da modalidade 113, em que o CAR se liga ao CD70.

E115. O método da modalidade 113, em que o CAR não se liga ao CD70.

E1l16. O método de qualquer uma das modalidades 113-115, em que as células T manipuladas compreendem ainda um gene TRAC in- terrompido.

E117. O método de qualquer uma das modalidades 113-116, em que as células T manipuladas compreendem ainda um gene B2M inter- rompido.

E118. O método de qualquer uma das modalidades 113-116, em que as células T manipuladas compreendem ainda um gene PD-1 inter- rompido.

E119. Um método para o tratamento de câncer em um sujeito, com- preendendo a administração ao paciente de uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipula- das compreendem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; (ii) um gene CD70 interrompido; e (iv) um ácido nucleico que codifica um CAR; tratando assim o câncer no sujeito.

E120. O método de qualquer uma das modalidades 113-114 e 116- 119, em que o CAR compreende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD70, (b) um domínio trans- membranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório 41BB e um domínio coestimulatório CD3z. E121. O método da modalidade 119 ou 120, em que o gene TRAC interrompido compreende o ácido nucleico que codifica o CAR. E122. O método de qualquer uma das modalidades 120-121, em que o anticorpo anti-CD70 é um scFv anti-CD70. E123. O método da modalidade 122, em que o scFv anti-CD70 compreende as mesmas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da região variável da cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs da região variável da cadeia leve (VL) como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 51 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 52. E124. O método da modalidade 123, em que o scFv anti-CD70 compreende as mesmas cadeias VH e VL que o anticorpo de referência. E125. O método da modalidade 122, em que o scFv anti-CD70 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 ou 50. E126. O método da modalidade 122, em que o scFv anti-CD70 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. E127. O método de qualquer uma das modalidades 113 e 115-118, em que o CAR compreende um ectodomínio que compreende um anti- corpo anti-BCMA, opcionalmente em que o anticorpo anti-BCMA é um fragmento variável de cadeia única anti-BCMA (scFv). E128. O método da modalidade 127, em que o scFv anti-BCMA compreende as mesmas regiões determinantes de complementaridade de VH (CDRs) e as mesmas CDRs de VL como um anticorpo de refe- rência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabe- lecida como SEQ ID NO: 60 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO:

61. E129. O método da modalidade 128, em que o scFv anti-BCMA compreende as mesmas cadeias VH e VL que o anticorpo de referência.

E130. O método da modalidade 127, em que o scFv anti-BCMA compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.

E131. O método de qualquer uma das modalidades 113-130, em que as células T manipuladas são células T humanas manipuladas.

E 132. O método de qualquer uma das modalidades 113-131, em que o câncer expressa CD70 e/ou BCMA.

E133. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 113- 132, em que a população de células é administrada ao sujeito em uma quantidade eficaz para tratar o câncer.

E134. O método de qualquer uma das modalidades 113-133, em que o câncer é uma malignidade de tumor sólido ou uma malignidade hematológica.

E135. O método da modalidade 134, em que a malignidade do tu- mor sólido é selecionada do grupo que consiste em: tumor ovariano, tumor pancreático, tumor renal, tumor pulmonar e tumor intestinal.

E136. Uma população de células que compreende células T mani- puladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene da beta-2-microglobulina (B2M) interrompido; (iii) um gene CD70 interrompido; (iv) um ácido nucleico que codifica um CAR compreendendo (a) um ec- todomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti- CD70, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório 41BB e um domínio coestimu- latório CD3z.

E137. A população de células da modalidade 136, em que o gene TRAC interrompido compreende o ácido nucleico que codifica o CAR.

E138. A população de células de qualquer uma das modalidades 136-137, em que as células T manipuladas são células T humanas.

E139. Uma célula T manipulada compreendendo: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido. E140. A célula T manipulada da modalidade 139, em que o ácido nucleico que codifica o CAR compreende uma sequência pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 45. E141. Uma célula T manipulada compreendendo: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequên- cia de ácido nucleico é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 45; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido. E142. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 139-141, em que o gene TRAC interrompido compreende uma sequên- cia de doador que compreende a sequência de nucleotídeos estabele- cida na SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 44. E143. Uma célula T manipulada compreendendo: (i) um gene TRAC interrompido compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 44; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido. E144. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 139-143, em que a célula T é uma célula T humana.

EXEMPLOS Exemplo 1. Inativação Eficiente de CD70 por RNPs Cas9:sgRNA em Células T

[367] Este exemplo descreve a edição eficiente do gene CD70 em células T humanas primárias ex vivo usando a edição de genes CRISPR/Cas9. Segmentos genômicos do gene CD70 contendo os pri- meiros três (3) exons codificadores de proteínas foram usados como entrada no software de desenho de gRNA.

Os segmentos genômicos também incluíram sequências aceitadoras/doadoras no sítio de splice de flanqueamento.

Os gRNAs desejados foram aqueles que levariam a inserções ou deleções na sequência de codificação, interrompendo a sequência de aminoácidos do CD70, fazendo com que as funções de alelo(s) ficassem fora do quadro de leitura/levando à sua perda (referido como alelos “de inativação de CD70”). Todas as sete (7) sequências espaçadoras de gRNA identificadas in sílico que têm como alvo o gene CD70 foram sintetizadas, e os gRNAs foram especificamente modifica- dos, conforme indicado na Tabela 5. Enquanto os gRNAs na Tabela 5 foram modificados com modificações de 2'-O-metil fosforotioato, podem ser usados gRNAs não modificados, ou gRNAs com outras modifica- ções.

Ver também PCT/IB2018/001619, depositado a 11 de maio de 2018, aqui incorporado em sua totalidade como referência.

Tabela 5. Sequências de gRNA de CD70/Sequências Alvo FER TERRIER REITTERE SegREIE MORRE CD70 sgRNA (E1 T1) UCACCAAGCCCGCGACCAAUguuuuagag- U*C*A*CCAAGCCCGCGACCAAU-

cuagaaauagcaaguuaaaavaaggcuague- guuuvagageuagaaauageaa-

cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagueggugcU | guuaaaavaaggcuague-

UUU cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucagug

(SEQ ID NO: 23) CUt*U*U*U

(SEQ ID NO: 33)

Espaçador CD70 saRNA (E1 T1) UCACCAAGCCCGCGACCAAU (SEQ ID NO U*C*A*CCAAGCCCGCGACCAAU (SEQ [rs e SS porca CD70 sgRNA (E1 13) AUCACCAAGCCCGCGACCAAguuuuagag- A*U*C*ACCAAGCCCGCGACCAA-

cuagaaauagcaaguuaaaavaaggcuague- guuuvagageuagaaauageaa-

cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagueggugcU | guuaaaavaaggcuague-

UUU cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucagug

(SEQ ID NO: 24) CUt*U*U*U

(SEQ ID NO: 34)

Espaçador CD70 saRNA (E1 73) AUCACCAAGCCCGCGACCAA (SEQ ID NO A*U*C*ACCAAGCCCGCGACCAA (SEQ [rs serem CD70 sgRNA (E1 T4) CGGUGCGEGCCGCAGGCCCUAUguuuuagag- | C*G*G*UGCGGCGCAGGCCCUAU-

cuagaaauagcaaguuaasaavaaggcuague- guuuvagageuagaaauageaa-

cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagueggugeU

UUU Qguuaaaauaaggcuague- (SEQ ID NO: 25) cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagueggug CU*U*U*U (SEQ ID NO: 35) Espaçador CD70 saRNA (E1 T4) CGGUGCGGCGCAGGCCCUAU (SEQ ID | C*G*G*UGCGGCGCAGGCCCUAU (SEQ [TA A RA] mm CD70 sgRNA (E1 T7)); também | GCUUUGGUCCCAUUGGUCGCguuuvagag- G*C*U*UUGGUCCCAUVGGUCG- conhecida como: T7 Cuagaaavagcaaguuaaaavaagacuague- Cguuuuagagcuagaaavageaa- cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagueggugcU | guuaaaavaaggcuague- UUU cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucagug (SEQ ID NO: 26) CU*U*U*U (SEQ ID NO: 36) Espaçador CD70 saRNA (E1 T7) GCUUUGGUCCCAUVUGGUCGC (SEQ ID | G*C*U*UUGGUCCCAUVGGUCGCE (SEQ Cm o a CD70 sgRNA (E1 T8); também co- | GCCCGCAGGACGCACCCAVAguuuuagag- G*C*C*CGCAGGACGCACCCAVA- nhecida como: T8 Cuagaaavagcaaguuaaaavaagacuague- guuuuagagcuagaaavageas- cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagueggugcU | guuaaaavaaggcuague- UUU cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucagug (SEQ ID NO: 27) CU*U*U*U (SEQ ID NO: 37) Espaçador CD70 saRNA (E1 T8) GCCCGCAGGACGCACCCAVA (SEQIDNO G*C*C*rCGCAGGACGCACCCAVA (SEQ nu cv vs ga | CD70 sgRNA (E1 T10) GUGCAUCCAGCGCUUVCGCACguuuuagag- G*U*G*CAUCCAGCGCUVCG- Cuagaaavagcaaguuaaaavaagacuague- CACguuuuagagcuagaaavageaa- cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagueggugcU | guuaaaavaaggcuague- UUU cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucagug (SEQ ID NO: 28) CU*U*U*U (SEQ ID NO: 38) Espaçador CD70 saRNA (E1 T10) | GUGCAUCCAGCGCUUCGCA C (SEQ ID | G*U*G*CAUCCAGCGCUVCGCAC (SEQ

MA PEA A CD70 sgRNA (E3 T1) CAGCUACGUAUCCAUCGUGAguuuvagag- C*A*G*CUACGUAUCCAUCGUGA- cuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuague- guuuuagagcuagasauageaa- cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagueggugcU | guuaaaavaaggcuague- UUU cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucagug (SEQ ID NO: 29) CU*U*U*U (SEQ ID NO: 39) Espaçador CD70 saRNA (E3 T1) CAGCUACGUAUCCAUCGUGA (SEQ ID NO C*A*G*CUACGUAUCCAUCGUGA (SEQ nn Bm

FERA ERREI E * Resíduo de 2'-O-metil fosforotioato

[368] As células T humanas primárias foram transfectadas (eletro- poradas) com uma partícula de ribonucleoproteína (RNP) contendo nu- clease Cas9 e um sgRNA sintético modificado direcionado ao gene CD70 (sequências na Tabela 5) ou controles (sem Cas9, sem gR NA).

Quatro a seis (4-6) dias após a transfecção, as células foram (1) sub- metidas a uma análise TIDE para avaliar a frequência indel e (2) pro- cessadas por citometria de fluxo (anticorpo primário: anticorpo CD70 anti-humano FITC, clone 113--16, Biolegend) para avaliar os níveis de expressão de CD70 na superfície celular.

[369] Sete (7) gRNAs produziram dados mensuráveis por análise TIDE, conforme indicado na Tabela 6. Quatro (4) sequências de gRNA produziram percentagens de indel (frequências de edição) acima de 85% com inativação da expressão de proteína acima de 80% (SEQ ID NOS: 23, 26, 27 e 29), indicando edição de genes altamente eficiente. Os dados na Tabela 6 são de um (1) doador. O nível de expressão da proteína CD70 (avaliada pela intensidade fluorescente média (MF1)) por amostra de teste foi normalizado para o nível de expressão da proteína CD70 presente nas células de controle. Tabela 6. Sequências de gRNA de CD70, eficiências de corte e ex- pressão de proteína de superfície CD70 em células T editadas por genes [e Tee [e | TEA são de proteína

UCACCAAGCCCGCGACCAAU CD70 EXON1 T1(E1 T1) 89,3% 0,97 84,8% me [ERTTT eee

AUCACCAAGCCCGCGACCAA CD70 EXON1 T3(E1 T3) 65,2% 0,93 84,0% Jomeoment [some o es de em |

CGGUGCGGCEGCAGGCCCUAU CD70 EXON1 T4(E1 T4) 81,6% 0,83 87,5% |oermmtta [same o es dee e |

GCUUUGGUCCCAVUGGUCGC CD70 EXON1 T7 (E1 T7) 97,8% 0,98 87,7% |omenm Tm [some o e do am

GCCCGCAGGACGCACCCAVA CD70 EXON1 T8(E1 T8) 90,1% 0,94 88,1% oem sam o ee de a |

GUGCAUCCAGCGCUUVCGCAC CD70 EXON1 T10(E1 T10) 28,3% 0,30 83,9% jeito [same o as de em |

CAGCUACGUAUCCAUCGUGA CD70 EXON3 T1(E3 T1) 85,6% 0,93 87,2% |menement [somem mm fem fes Análise de perfis de indel no alvo em células T

[370] A análise do amplicon no alvo foi conduzida no locus CD70 após a edição do gene usando o guia T7 (SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 36), com alvo no gene CD70:

[371] GCTTTGGTCCCATTGGTCGC (SEQ ID NO: 160; sequência alvo, com PAM SEQ ID NO: 114).

[372] Após a edição do gene, a análise do amplicon no alvo foi conduzida em torno do locus CD70 em células CAR+RAC-/B2M-/CD70- lanti-CD70 (geradas conforme descrito no Exemplo 3).

[373] Um PCR inicial foi realizado usando o kitde PCR KAPA HiFi (Kapa Biosystems, Wilmington, MA). 100 ng de gDNA de entrada foram combinados com 10 nM de cada iniciador. Os iniciadores CD70 F e CD70 R foram pareados para amplificar o locus CD70 (Tabela 7) Tabela 7. Iniciadores para preparação de biblioteca de amplicon CD70

[374] A análise do locus CD70 em uma população de células T após a edição do gene CRISPR/Cas9 para produzir células T CAR + TRAC/B2M/anti-CD70 resulta em frequências indel específicas e se- quências de genes editados no locus CD70 (Tabela 8; deleções como traços e inserções a negrito). Duas populações de células de células editadas foram geradas a partir de duas células T de doadores diferen- tes (1 e 2). As populações de células T editadas de cada doador foram analisadas em replicado: 1A/1B e 2A/2B. Tabela 8.

ENPPPNNNNPNNNIEADA CACACCACGAGGCAGATCACCAAG- CCCGCG--CAATGGGACCAAAGCAG- 10,4% 1,1% 14,4% 14,8% 12,71% 0,022 129 CCCGCAGGACG CACACCACGAGGCAGATCACCAAG- CCCGCGAACCAATGGGACCAAAG- 8,7% 10,0% 11,3% 11,1% 10,3% 0,012 130 CAGCCCGCAGGACG CACACCACGAGGCAGATC------------ ACCAATGGGACCAAAGCAGCCCG- 8,2% 7,8% 711% 6,8% 7,5% 0,006 131 CAGGACG CACACCACGAGGCAGATCACCAAG- CCCGCG-CCAATGGGACCAAAGCA- 3,9% 4,5% 4,2% 4,3% 4,2% 0,002 132 GCCCGCAGGACG CACACCACGAGGCAGATCACCAAG- CCCGC-ACCAATGGGACCAAAGCA- 2,2% 2,5% 2,4% 2,6% 2,4% 0,002 133 GCCCGCAGGACG

EPP NPNNNIEADA Bxempoo 2. Geração de células T cam múlipias mativações de ge" nes

[375] Este exemplo descreve o uso da tecnologia de edição de ge- nes CRISPR/Cas9 para produzir células T humanas sem expressão de dois, três ou quatro genes simultaneamente. Especificamente, o gene do receptor de células T (TCR) (gene editado na região constante alfa TCR (TRAC)), o gene da B2-microglobulina (B2M), o gene do Grupo de Diferenciação 70 (CD70) e/ou o gene da morte celular programada 1 (PD-1 ou PD1) foram editados pela edição do gene CRISPR/Cas9 para produzir células T deficientes em dois ou mais dos genes listados. São usadas as seguintes abreviações nas Figuras para concisão e clareza: 2X KO: TRAC/B2M 3X KO (PD-1): TRAC/B2M/PD-1 3X KO (CD70): TRAC/B2M/CD70 4X KO: TRAC/B2M/PD-1/CD70

[376] Células T humanas primárias ativadas foram eletroporadas com complexos RNP Cas9:9RNA. A mistura de nucleofecção continha a Solução Nucleofector'Y, 5x105 células, 1 uM de Cas9 e 5 uM de gRNA (conforme descrito em Hendel et a/., Nat Biotechnol. 2015; 33(9):985-- 989, PMID: 26121415). Para a geração de células T de inativação dupla (2X KO), as células foram eletroporadas com dois complexos RNP dife- rentes, cada um contendo a proteína Cas9 e um dos seguintes saRNAs: TRAC (SEQ ID NO: 40) e B2M (SEQ ID NO: 41) nas concentrações indicadas acima. Para a geração de células T de inativação tripla (3X KO), as células foram eletroporadas com três complexos RNP diferen- tes, cada complexo de RNA contendo a proteína Cas e um dos seguin- tes saRNAs: (a) TRAC (SEQ ID NO: 40), B2M (SEQ ID NO: 41), e PD-1 (SEQ ID NO: 42) nas concentrações indicadas acima; ou (b) TRAC

(SEQ ID NO: 40), B2M (SEQ ID NO: 41), e CD70 (SEQ ID NO: 36 ou 37) nas concentrações indicadas acima. Para a geração de células T de inativação quadrúpla (4X KO), as células foram eletroporadas com qua- tro complexos RNP diferentes, cada complexo de RNA contendo a pro- teína Cas9 e um dos seguintes sa RNAs: TRAC (SEQ ID NO: 40), B2M (SEQ ID NO: 41), PD-1 (SEQ ID NO: 42), e CD70 (SEQ ID NO: 36 ou 37) nas concentrações indicadas acima. As versões não modificadas (ou outras versões modificadas) dos gRNAs também podem ser usadas (por exemplo, SEQ ID NOS: 30, 31, 32, 26, e/ou 27). Sequências nas Tabelas 5e 9. Tabela 9. Sequências de gRNA/Sequências Alvo TRAC sgRNA AGAGCAACAGUGCUGUGG- A*G*A*GCAACAGUGCUGUGG- CCguuuuagageuagaaavageas- CCguuuuagageuagaaavageaa- guuaaaauaaggcuague- guuaaaauaaggcuague- cquuaucaacuugaaaaaguggcaccgaguegg | cuuaucaacuugaaaaaguggeaccgaguega ugeuuuu ugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 40) (SEQ ID NO: 30) Espaçador TRAC saRNA AGAGCAACAGUGCUGUGGCC (SEQ | A*G*A*GCAACAGUGCUGUGGCC

MMA A ES A B2M sgRNA GCUACUCUCUCUUUCUGG- G*C*U*ACUCUCUCUUUCUGG- CCguuuuagageuagaaavageas- CCguuuuagageuagaaavageaa- guuaaaauaaggcuague- guuaaaauaaggcuague- cquuaucaacuugaaaaaguggcaccgaguegg | cuuaucaacuugaaaaaguggeaccgaguega ugeuuuu ugeU*tuU*tU*U (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 41) Espaçador B2M sgaRNA GCUACUCUCUCUUUCUGGCC (SEQ | G*C*U*ACUCUCUCUUUCUGGCCE

MMA A E A PD-1 sagRNA CUGCAGCUUCUCCAACACAU- C*U*G*CAGCUUCUCCAACACAU- guuuuagageuagaaauageaa- guuuvagageuagaaauageas- guuaaaauaaggcuague- guuaaaauaaggcuague- cquuaucaacuugaaaaaguggcaccgaguegg | cuuaucaacuugaaaaaguggeaccgaguega ugcUUUU (SEQ ID NO: 32) ugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 42) Espaçador PD-1 saRNA CUGCAGCUUCUCCAACACAU (SEQ | C*U*G*CAGCUUCUCCAACACAU A bm enem

[377] Cerca de uma (1) semana após a eletroporação, as células foram deixadas sem tratamento ou tratadas com acetato de miristato de forbol (PMA)/ionomicina durante a noite. No dia seguinte, as células fo- ram processadas para citometria de fluxo (ver, por exemplo, Kalaitzidis D etal.)

[378] Clin Invest 2017; 127(4): 1405-1413) para avaliar níveis de expressão de o TRAC, B2M, PD-1 e CD70 na superfície celular da po- pulação de células editada. Os seguintes anticorpos primários foram usados (Tabela 10): Tabela 10. Anticorpos e Te TR esse Tons TST

[379] As Tabelas 11 e 12 mostram edição de múltiplos genes al- tamente eficiente. Para as células de inativação dupla (2X KO; TRAC" IB2M), 83% das células viáveis não apresentaram expressão de TCR e B2M (Tabela 11; 3X KO (PD1)) Para as células de inativação tripla, 70% das células viáveis não apresentavam expressão de TCR, B2M e PD-1 (Tabela 11); e 80% das células viáveis não apresentavam expressão de TCR, B2M e CD70, independentemente do gRNA de CD70 usado (Ta- bela 12) Para as células de inativação quádrupla (4X KO), 78% das cé- lulas viáveis não tinham expressão de TCR, B2M, PD-1 e CD70 (FIG. 1) Tabela 11. % de células viáveis sem expressão em populações de células 2KO e 3KO (PD1) E IR RR e e em Tabela 12. % de células viáveis sem expressão em populações de células 3KO (CD70) o ERR me we

[380] Para avaliar se a edição tripla e quádrupla de genes em cé- lulas T afeta a expansão celular, os números de células foram enume- rados entre células T editadas de genes duplos, triplos e quádruplos (células T não editadas foram usadas como controle) ao longo de um período de duas semanas após a edição. Foram geradas e plaqueadas 5x105 células para cada genótipo de células T.

[381] Como mostrado na FIG. 2, a proliferação (expansão) celular continuou ao longo do teste de janela pós-eletroporação. Foi observada proliferação celular similar entre células T de inativação dupla (B2M- ITRAC-), tripla (B2M-/TRAC-/PD-1-, ou B2M-/TRAC-/CD70-), e quádru- pla (B2M-/TRAC-/PD-1-/CD70), conforme indicado pelo número de cé- lulas viáveis. Estes dados sugerem que a edição de múltiplos genes (até triplicar e quadruplicar, com genes CD70 e PD-1) não afeta a viabilidade das células T, conforme medido pela proliferação de células T. Exemplo 3. Geração de células T CAR sem CD70 e/ou PD1 Geração de Células T CAR anti-CD70 com múltiplas inativações

[382] Este exemplo descreve a produção de células T humanas alogênicas que carecem de expressão do gene TCR, B2M, CD70 e/ou PD1, e expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR) direcionado a CD70. Estas células são designadas por TCR/B2M/CD70/anti-CD70 CAR* ou 3X KO (CD70) CD70 CAR*; TCR/B2M'/PD1/anti-CD70 CAR* ou 3X KO (PD1) CD70 CAR*; TCR/B2M/PD1/CD70/anti-CD70 CAR* ou 4X KO CD70 CAR* nas figuras.

[383] Um vetor adenoviral adenoassociado recombinante, sorotipo 6 (AAV6) (MOI 50, 000), compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 43 (compreendendo o modelo de doador em SEQ ID NO: 44, que codifica CAR anti-CD70 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46) foi entregue com Cas9:sgRNA RNPs (1 uM Cas9, 5 uM gRNA) a células T humanas alogênicas ativadas. Os seguintes saRNAs foram usados: TRAC (SEQ ID NO: 40), B2M (SEQ ID NO: 41), CD70 (SEQ ID NO: 36 ou 37) e PD1 (SEQ ID NO: 42). As versões não modificadas (ou outras versões modificadas) dos gRNAs também podem ser usadas (por exemplo, SEQ ID NOS: 30, 31,32,26, e/ou 27). Cerca de uma (1) semana após a eletroporação, as células foram processadas por citometria de fluxo para avaliar os níveis de ex- pressão de TRAC, B2M, CD70 e PD1 na superfície celular da população de células editada. Os seguintes anticorpos primários foram usados (Ta- bela 13): Tabela 13. Anticorpos [Area ar TRI TRT Te Fe re re tmn im

[384] Ensaio de Razão de células T. As razões de células CD4+ e CD8+ foram então avaliadas nas populações de células T editadas por citometria de fluxo usando os seguintes anticorpos (Tabela 14): Tabela 14. Anticorpos

[385] A edição de genes de alta eficiência e a expressão de CAR foram alcançadas nas populações de células T CAR anti-CD70 edita- das. Além disso, a edição não alterou adversamente as populações de células T CD4/CD8. FIG. 3 mostra edição de gene altamente eficiente e expressão de CAR anti-CD70 na célula T CAR de inativação tripla. Mais de 55% das células viáveis não apresentavam expressão de TCR, B2M e CD70, e também expressaram CAR anti-CD70. FIG. 4 mostra que as razões normais de subconjuntos de células T CD4/CD8 foram mantidas nas células CAR+TRAC-/B2M-/CD70-/anti-CD70, sugerindo que essas edições de múltiplos genes não afetam a biologia das células T con- forme medido pela razão de subconjuntos de células T CD4/CD8.

[386] FIG. 5 mostra edição de gene altamente eficiente e expres- são de CAR anti-CD70 na célula T CAR de inativação quadrupla. Mais de 60% das células viáveis não apresentavam expressão de TCR, B2M, PD-1, e CD70, e expressaram CAR anti-CD70. FIG. 6 mostra que as razões normais de subconjuntos de células T CD4/CD8 foram mantidas nas células CAR+ TRAC/B2M'/PD-1/CD70/anti-CD70, sugerindo que essas edições de múltiplos genes não afetam a biologia das células T conforme medido pela razão de subconjuntos de células T CD4/CD8.

Geração de Células T CAR anti-BCMA com múltiplas inativações

[387] Este exemplo descreve a produção de células T humanas alogênicas que carecem de expressão do gene TCR, o gene B2M, o gene PD-1, e/ou o gene CD70, e também expressa um receptor de an- tígeno quimérico (CAR) direcionado ao antígeno de maturação de célu- las B (BCMA).

[388] Um vetor adenoviral adenoassociado recombinante, sorotipo 6 (AAV6), compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 54 (compreendendo o modelo de doador em SEQ ID NO: 55, que codi- fica CAR anti-BCMA compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57) foi entregue com Cas9:9RNA RNPs (1 uM Cas9 e 5 uM gRNA) a células T humanas alogênicas ativadas. Os seguintes gRNAs foram usados: TRAC (SEQ ID NO: 40), B2M (SEQ ID NO: 41), PD-1 (SEQ ID NO: 42), e CD70 (SEQ ID NO: 36 ou 37). As versões não mo- dificadas (ou outras versões modificadas) dos gRNAs também podem ser usadas (por exemplo, SEQ ID NOS: 30, 31, 32, 26 e/ou 27). Cerca de uma (1) semana após a eletroporação, as células foram processadas para citometria de fluxo como descrito acima para células T CAR anti- CD70, com a seguinte diferença. A expressão de CAR anti-BCMA foi detectada usando BCMA humana recombinante biotinilada (ACROS Cat t BC7-H82F0). As células CAR* anti-BCMA de inativação dupla e quádrupla foram então caracterizadas como aqui descrito.

[389] FIGs. 7A-7B mostra edição de genes altamente eficiente do gene TRAC, gene B2M, gene CD70 e o gene PD-1. FIG. 7C mostra ele- vada expressão das células CAR + anti-BCMA em células de inativação dupla e inativação quádrupla. Geração de Células T CAR anti-CD19 com múltiplas inativações

[390] Foram geradas células T humanas alogênicas que expres- sam um receptor de antígeno quimérico (CAR) direcionado a CD19 e carecem da expressão do gene TCR, o gene B2M, e opcionalmente o gene CD70.

[391] Para gerar as células T alogênicas, células T humanas pri- márias ativadas foram eletroporadas com complexos Cas9:9RNA RNP e infetadas com vetores adenovirais adenoassociados (AAVs) contendo modelo de doador CAR anti-CD19 com homologia ao locus TRAC. O sorotipo 6 de AAV recombinante (AAV6) compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 155 (compreendendo o modelo de do- ador em SEQ ID NO: 156, que codifica CAR anti-CD19 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 149) foi entregue com Cas9:sgRNA RNPs (1 uM Cas9, 5 uM gR NA) a células T humanas alo- gênicas ativadas. Os seguintes saRNAs foram usados para inativar os respectivos genes: TRAC (SEQ ID NO: 40), B2M (SEQ ID NO. 41), CD70 (SEQ ID NO: 36). As versões não modificadas (ou outras versões modificadas) dos gRNAs também podem ser usadas (por exemplo, SEQ ID NOS: 30, 21 ou 27). Cerca de uma (1) semana após a eletroporação, as células foram processadas para citometria de fluxo como descrito acima para células T CAR anti-CD70, com a seguinte diferença. A ex- pressão de CAR anti-CD19 foi detectada usando CD19 humano recom- binante biotinilado (ACROBIOSYSTEMS INC; CD9-H825). As células T CAR*anti-CD19 deficientes em CD70 foram então caracterizadas como aqui descrito. Geração de Células T CAR anti-CD33 com múltiplas inativações

[392] Foram geradas células T humanas alogênicas que expres- sam um receptor de antígeno quimérico (CAR) direcionado a CD33 e carecem da expressão do gene do receptor de células T (TCR) (gene editado na região constante alfa TOR (TRAC)), o gene B2-microglobu- lina (B2M) e, opcionalmente, o gene CD70.

[393] Para gerar as células T alogênicas, células T humanas pri- márias ativadas foram eletroporadas com complexos Cas9:9RNA RNP e infetadas com vetores adenovirais adenoassociados (AAVs) contendo modelo de doador CAR anti-CD33 com homologia ao locus TRAC. O sorotipo 6 de AAV recombinante (AAV6) compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 87 (compreendendo o modelo de doa- dor em SEQ ID NO: 135, que codifica CAR anti-CD33 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 139 foi entregue com Cas9:sgRNA RNPs (1 uM Cas9, 5 uM gR NA) a células T humanas alo- gênicas ativadas. Os seguintes saRNAs foram usados para inativar os respectivos genes: TRAC (SEQ ID NO: 40), B2M (SEQ ID NO. 41), CD70 (SEQ ID NO: 36). As versões não modificadas (ou outras versões modificadas) dos gRNAs também podem ser usadas (por exemplo, SEQ ID NOS: 30, 21 ou 27).

[394] Populações de células T TCR+ (sem RNP) e células T TRAC-/B2M- (células deficientes em TOR e B2M sem um CAR) foram geradas de forma similar para uso como controles. Cerca de uma (1) semana após a eletroporação, as células foram processadas para cito- metria de fluxo como descrito acima para células T CAR anti-CD70, com a seguinte diferença. A expressão de CAR anti-CD33 foi detectada usando CD33 humano recombinante biotinilado (dados não mostrados). As células T CAR * anti-CD33 inativadas em CD70 foram então caracte- rizadas como aqui descrito. Caracterização de populações de células CD4/CD8 em células T CAR anti-CD33 com inativação de CD70

[395] O CD33 pode ser expresso em células T com níveis mais elevados observados em células CD4 em cultura do que em células CD8. Durante o decurso da produção de células CAR-T anti-CD33, as células CD4 tornam-se substancialmente reduzidas devido ao fratricida. Como mostrado na FIG. 8, as culturas de células CAR-T anti-CD33 com CD70 intacto exibiram uma redução de 97% nas células CD4 ao longo de um período de cultura de 3 semanas, enquanto as culturas de células com CD70 interrompido mostraram apenas uma redução de 61% ao longo deste período. Assim, a interrupção do gene CD70 parece reduzir o fratricida observado nas culturas de células CAR-T anti-CD33. Sem desejar ser limitado pela teoria, este efeito pode ocorrer por meio de uma função imunoestimulante que poderia ser potencializada por inte- rações CD70/CD27, e a interrupção genética do CD70 resulta em ra- zões CD4/CD8 mais equilibradas que podem ser mais ideais para o be- nefício terapêutico na malignidade. Exemplo 4: CD70 KO Melhora a Proliferação Celular Efeito de CD70 KO na proliferação celular de células T CAR anti-CD33 in vitro

[396] Para avaliar a capacidade das células de se expandirem em meio contendo citocinas (IL-2 IL-7), foram utilizadas células T CAR anti- CD33. Especificamente, um total de 5x105 células T CAR anti-CD33 compreendendo uma inativação dupla (TRAC-/B2M-) ou inativação tri- pla (TRAC-/B2M-/CD70-) foi gerado como descrito no Exemplo 3, pla- queadas e deixadas crescer em um volume de 10 mL de meio contendo citocinas. Após 1 semana, as células foram contadas. 5x105 células da cultura anterior foram então replantadas em volume de 10 mL (meio fresco contendo citocinas) e 1 semana depois o número total de células foi enumerado. Células CAR-T anti-CD33 alogênicas contendo uma in- terrupção no gene CD70 se expandiram para níveis maiores na primeira e segunda semanas de replantio (FIG. 9) Estes dados mostram que a inativação de CD70 pode resultar em maiores rendimentos de células em cultura. Efeito de CD70 KO na proliferação celular de células T CAR anti-CD19 in vitro

[397] Para ainda avaliar a capacidade das células de se expandi- rem em meio contendo citocinas (IL-2 IL-7), foram utilizadas células T CAR anti-CD19. Especificamente, um total de 5x10º células T CAR anti-

CD19 compreendendo uma inativação dupla (TRAC-/B2M-) ou inativa- ção tripla (TRAC-/B2M-/CD70-) foi gerado como descrito no Exemplo 3, plaqueadas e deixadas crescer em um volume de 10 mL de meio con- tendo citocinas. Após 1 semana, as células foram contadas. 5x105 célu- las da cultura anterior foram então replantadas em volume de 10 mL (meio fresco contendo citocinas) e 1 semana depois o número total de células foi enumerado. Células CAR-T anti-CD19 alogênicas contendo uma interrupção no gene CD70 se expandiram para níveis maiores na primeira e segunda semanas de replantio, em comparação com as cé- lulas de controle sem uma interrupção do gene CD70 (FIG. 10). Estes dados mostram que a inativação de CD70 pode resultar em maiores rendimentos de células em cultura. Efeito de CD70 KO na proliferação conduzida por citocinas e apoptose de células T CAR anti-BCMA in vitro

[398] Proliferação conduzida por citocinas. Para avaliar o efeito da inativação de CD70 e/ou PD1 na proliferação celular, foram utilizadas células T CAR anti-BCMA. Células T CAR anti-BCMA foram geradas conforme descrito no Exemplo 3. Foram gerados os seguintes grupos de células T editadas:

[399] TRAC-/B2M-/anti:rBCMA CAR+ (Controle; 2KO0, BCMA CAR +)

[400] TRAC-/B2M-/CD70-/anti:r5BCMA CAR + (3KO (CD70), BCMA CAR +)

[401] TRAC-/B2M-/PD1-/anti-BCMA CAR+ (3KO (PD1), BCMA CAR +)

[402] TRAC-/B2M-/CD70-/PD1-/anti:rBCMA CAR+ (4KO0, BCMA CAR+).

[403] As células editadas foram enriquecidas para células TRAC- /B2M- por depleção magnética de células CD3+B2M+. Resumidamente, as células foram marcadas com anticorpos anti-CD3 Biotina (Biolegend

Cat 300404) anti-B2M Biotina (Biolegend Cattt 316308), cada um a 0,5 ug por 1 x 1056 células em volume de 100 JL a 4ºC por 15 min, lavadas e incubadas com microesferas magnéticas marcadas com estreptavi- dina (Miltenyi Biotech, 130-048-101) por 15min a 4ºC. As células foram ressuspensas em tampão e passadas através de colunas LS (Miltenyi Biotech, 130-042-401) de acordo com o protocolo do fabricante. Para determinar o efeito de CD70 ou PD1 na proliferação de células T indu- zidas por IL-2/IL-7, as células T editadas (1E6 células/mL) foram culti- vadas em meio de crescimento (meio X-vivo (04-744, Lonza), suplemen- tado com 5% de soro AB humano (HP1022, Valley Biomedical)), 50 ng/mL de IL-2 (rhlL-2; 130-097--745, Miltenyi Biotech) e 10 ng/mL de IL- 7 (rhIL-7; Cellgenix 001410 -050) por até quatro semanas. Nos dias in- dicados, as células foram contadas e semeadas novamente em meio fresco a 1,5E6 células/mL em placas de cultura apropriadas.

[404] FIGs. 11 e 12 mostram que a inativação de CD70 melhorou a proliferação induzida por IL-2/IL-7 de células T CAR anti-BCMA in vi- tro, em comparação com controles suficientes de CD70 (ou seja, células T CAR anti-BCMA compreendendo CD70 endógeno). FIG. 11 também mostra que CD70 KO pode melhorar a saúde e a competência de proli- feração de células T CAR anti-BCMA, mesmo quando as células T deste doador parecem estar em declínio significativo após 17 dias, quando o gene CD70 está intacto (conforme mostrado pelo número reduzido de células de doador 1 (FIG. 11) em comparação com o doador 2 (FIG. 12)). Esta propriedade de manter a saúde das células T (ativada por KO do gene CD70 ) é amplamente aplicável a muitos aspectos do desen- volvimento de T CAR, incluindo: expansão estendida durante a fabrica- ção aumentando o rendimento e a consistência, resgate de células T exaustas/não saudáveis, permitindo doses potencialmente mais baixas em pacientes e respostas mais robustas, combinação com outros KOs que podem ser mais prejudiciais para a saúde das células T, mas têm outras vantagens, como superar a supressão da atividade das células T (por exemplo, PD1 KO). Como mostrado nas FIGs. 11 e 12, a deleção do gene PD1 por si só não mostra nenhum benefício para a expansão das células T CAR, mas quando combinada com um CD70 KO, mostra efeitos sinérgicos.

[405] Apoptose, O efeito de CD70 KO na morte celular apoptótica de células T CAR anti-BCMA após a exposição ao antígeno foi avaliado em um ensaio de novo desafio de antígeno. Resumidamente, para al- cançar a exposição ao antígeno, as células T CAR + anti-BCMA foram expostas à proteína BCMA recombinante aderida à placa. As placas com antígeno aderido foram preparadas revestindo placas de 24 poços com proteína BCMA recombinante em 1x PBS (1 ug/mL; Proteína BCMA humana biotinilada, ACRO Biosystems) durante a noite à 4ºC e, em seguida, lavando o antígeno não ligado. Após a lavagem, as placas ligadas ao antígeno foram então usadas para desafiar as células T CAR anti-BCMA com ou sem uma inativação de CD70. As células T CAR + 2X KO (TRAC-/B2M-) anti-BCMA e células T CAR+ 3X KO (TRAC- /B2M-/CD70-) anti-BCMA (1x10º células/mL) foram expostas à proteína BCMA recombinante ligada à placa (1 ug/mL) por 24 horas em meio de crescimento (meio X-vivo (04-744, Lonza), 5% de soro AB humano (HP1022, Valley Biomedical)) suplementado com IL-2 (rhIL-2; 130-097- 745, Miltenyi Biotech). As células foram então lavadas, contadas e de- safiadas novamente (1x105 células/mL) com antígeno ligado à placa fresco a cada 24 horas por um total de três novos desafios consecutivos (24 horas, 48 horas e 72 horas). No final de cada novo desafio, uma alíquota de células foi lavada e corada com anexina V conjugada com fluorocromo juntamente com iodeto de propídio em tampão de ligação de anexina V (BioLegend) por 15 minutos à temperatura ambiente. As células foram então lavadas e ressuspensas em tampão de ligação de anexina V para análise por citometria de fluxo. As células foram conta- das em cada ponto de tempo e a contagem de células por mL foi deri- vada. Para o cálculo da expansão em cada ponto de tempo, à expansão inicial no tempo 0 foi definida como 1. O número de vezes de expansão para todos os outros pontos de tempo foi calculado multiplicando a con- tagem de células por mL em cada ponto de tempo pelo número de vezes de expansão por mL para o ponto de tempo anterior. Por exemplo, o número de vezes de expansão em 72 horas foi calculado multiplicando a contagem de células por mL às 72 horas pelo número de vezes de expansão por mL às 48 horas.

[406] FIG. 13 demonstra que a deleção de CD70 (CD70 KO) res- gata as células T CAR anti-BCMA da apoptose, conforme mostrado pela diminuição na percentagem de células apoptóticas após o segundo (48h) e o terceiro (72h) novo desafio. Além disso, a ausência de expres- são de CD70 em células T CAR anti-BCMA aumenta surpreendente- mente a expansão das células T CAR anti-BCMA em resposta à expo- sição ao antígeno (FIG. 14). Efeito de CD70 KO na proliferação celular de células T CAR anti-CD70 in vitro

[407] Para avaliar ainda mais o impacto da interrupção do gene CD70 nas células T CAR, as células T CAR anti-CD70 foram geradas conforme descrito no Exemplo 3. Especificamente, as células T CAR anti-CD70 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) foram geradas usando dois gRNAs diferentes (T7 (SEQ ID NO: 36) e T8 (SEQ ID NO: 37)). Após à eletroporação, a expansão celular foi avaliada conforme descrito no Exemplo 2, contando as células viáveis. FIG. 15 mostra que as células T CAR*TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 de inativação tripla, geradas com gRNAs T7 ou T8 exibiram maior expansão celular em relação a células T CAR*TRAC/B2M/anti-CD70 de inativação dupla. Estes dados suge- rem que eliminar o gene CD70 dá uma vantagem de proliferação celular para células T CAR anti-CD70.

[408] A expansão da célula também foi avaliada nas células T CAR*TRAC/B2M/PD-1//CD70/anti-CD70 de inativação quádrupla. Es- tas células exibiram maior expansão em relação às células T CAR* TRAC/B2M/PD-1/anti-CD70 de inativação tripla e células T CAR* TRAC /B2M/anti-CD70 de inativação dupla (FIG. 16) Exemplo 5. CD70 KO aumenta a durabilidade e a potência das cé- lulas T CAR in vitro Função de morte celular de células T CAR anti-CD19 com inativação de CD70

[409] Seguindo a preparação de células T CAR anti-CD19 edita- das como descrito no Exemplo 3, a atividade funcional das células T CAR foi verificada usando um ensaio de citotoxicidade baseado em ci- tometria de fluxo. As células T CAR anti-CD19 (TRAC-/B2M-/CD19 CAR+e TRAC-/B2M-/CD70-/CD19 CAR +) foram cocultivadas com uma das duas linhas de células cancerígenas que expressam CD19 (células alvo): Nalm6 (ATCC crl3273) ou Raji (ATCC ccl-86). As células alvo fo- ram marcadas com 5 uM de efluor670 (eBiosciences), lavadas e incu- badas em coculturas com TRAC-/B2M-/anti-CD19 CAR+, ou TRAC- IB2M-/CD70-/anti-CD19 CAR + em razões variáveis (0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1:1 de células T:células alvo). As células alvo foram semeadas a 50.000 células por poço em uma placa de fundo em U de 96 poços. A cocultura foi incubada durante a noite. Após a incubação, os poços foram lavados e o meio foi substituído por 200 uL de meio contendo uma diluição 1:500 de 5 mg/mL de DAP! (Molecular Probes). 25 uL de esferas CountBright (Life Technologies) foram então adicionados a cada poço e as culturas de células foram analisadas quanto à viabilidade celular por citometria de fluxo (isto é, células viáveis sendo negativas para coloração DAPI).

[410] A percentagem de lise celular das células alvo (por exemplo: células Nalm6 ou R aji) foi então determinada usando a seguinte fórmula:

[411] Percentagem de lise celular = (1 - ((número total de células alvo em uma amostra de teste) + (número total de células alvo em uma amostra de controle)) X 100;

[412] em que uma amostra de teste era células alvo (por exemplo: células Nalm6 ou Raji) cocultivadas com 1) células TCAR+TRAC-/B2M- ICD19 ou 2) células TCAR+TRAC-/B2M-/CD70-/CD19; e

[413] uma amostra de controle consistia em células alvo sozinhas que não tinham sido cocultivadas.

[414] A interrupção do gene CD70 levou ao aumento da atividade citolítica das células CAR-T anti-CD19 contra a linha de células Raji em baixas taxas de CAR-T para alvos (FIG. 17, painel inferior). A interrup- ção de CD70 não aumentou a atividade de CAR-T anti-CD19 contra a linha celular Nalm6 (FIG. 17, Painel superior). De notar, a linha celular Nalm6 é relativamente mais fácil de lisar por essas células CAR-T (> 80% de lise na razão de células CAR-T de 0,1:1 para Nalm6 vs 0% para Raji nesta razão para as células do tipo selvagem provavelmente expli- cando a falta de eficácia aumentada resultante devido à interrupção de CD70 neste ensaio contra células Nalm6. O aumento da atividade con- ferida pela perda de CD70 contra a linha celular Raji indica que em am- bientes tumorais desafiadores, particularmente quando as razões CAR - T para tumor são baixas, a perda de CD70 pode ter um benefício subs- tancial para as células CAR-T na erradicação de células tumorais. Função de morte celular de células T CAR anti-CD33 com inativação de CD70

[415] A seguir à preparação das células T CAR anti-CD33 editadas como descrito no Exemplo 3, a atividade funcional das células T CAR foi verificada usando um ensaio de citotoxicidade baseado em citometria de fluxo. As células T CAR anti-CD33 (TRAC-/B2M-/CD33 CAR+ e TRAC-/B2M-/CD70-/CD33 CAR+) ou células T de controle (sem RNP) foram cocultivadas com a linha celular de câncer MV4-11 que expressa

CD33 (ATCC CRL-9591). As células alvo foram marcadas com 5 uM de efluor670 (eBiosciences), lavadas e incubadas em coculturas com TRAC-/B2M-/anti-CD33 CAR+, TRAC-/B2M-/CD70-/anti-CD33 CAR + ou controles em razões variáveis (0,01:1, 0,03:1, 0,06:1, 0,125:1, 0,25:1, 0,5:1, ou 1:1 de células T:células alvo). As células alvo foram semeadas a 50.000 células por poço em uma placa de fundo em U de 96 poços. À cocultura foi incubada durante a noite. Após 48 horas, os poços foram lavados e o meio foi substituído por 200 uL de meio contendo uma dilui- ção 1:500 de 5 mg/mL de DAPI (Molecular Probes). 25 ul de esferas CountBright (Life Technologies) foram então adicionados a cada poço e as culturas de células foram analisadas quanto à viabilidade celular por citometria de fluxo (isto é, células viáveis sendo negativas para colora- ção DAPI).

[416] A percentagem de lise celular das células alvo (por exemplo: MV4-11) foi então determinada usando a seguinte fórmula: Percentagem de lise celular =(1 - ((número total de células alvo em uma amostra de teste) + (número total de células alvo em uma amostra de controle)) X 100;

[417] em que uma amostra de teste era células alvo (por exemplo: células MV4-11) cocultivadas com 1) células T CAR+ TRAC-/B2M- /CD33; ou 2) células TCAR+TRAC-/B2M-/CD70-/CD33; e

[418] uma amostra de controle consistia em células alvo sozinhas que não tinham sido cocultivadas.

[419] Embora ambas as populações de células T CAR anti-CD33 mataram efetivamente as células MV4-11, atingindo quase 100% de morte das células em razões de 0,5 de célula T CAR: célula MV4-11, as células TCAR+TRAC-/B2M-/CD70-/CD33 demonstraram maior morte celular em menor CAR T para razões de células cancerígenas (FIG. 18) Estes dados demonstram que as células T CAR anti-CD33 alogênicas com a inativação de CD70 adicional são mais eficazes em razões mais baixas de células T CAR para células alvo. Função de morte celular de células T CAR anti-CD70 com inativação de CD70

[420] Um ensaio de morte celular foi usado para avaliar a capaci- dade de células CAR* TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 e células CAR* TRAC /B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 para matar uma linha de células derivada de carcinoma de células renais (RCC) aderente CD70* (células A498). As células aderentes foram semeadas em placas de 96 poços a

50.000 células por poço e deixadas durante a noite a 37 ºC. No dia se- guinte, células T CAR anti-CD70 editadas foram adicionadas aos poços contendo células alvo nas razões indicadas. Após o período de incuba- ção indicado, as células T foram removidas da cultura por aspiração e 100 uL de Cell titer-Glo (Promega) foram adicionados a cada poço da placa para avaliar o número de células viáveis restantes. A quantidade de luz emitida por poço foi então quantificada usando um leitor de pla- cas. As células exibiram morte celular potente de células derivadas de RCC após co-incubação de 24 horas (FIG. 19) As células T CAR anti- CD70 demonstraram maior potência quando CD70 foi eliminado, o que é claramente visível em baixas células T: Razões de A498 (1:1 e 0,5:1) onde a lise celular permanece acima de 90% para TRAC/B2M/CD70" /anti-CD70 CAR*, enquanto a lise das células cai abaixo de 90% para TRAC/B2M/anti-CD70 CART. Isto sugere que eliminar o gene CD70 dá uma maior potência de morte celular para células T CAR anti-CD70. Exemplo 6. Novo desafio de células T CAR deficientes em CD70 in vitro A inativação de CD70 melhora a morte de células T CAR + anti-CD33 após novo desafio em série

[421] Para avaliar a capacidade das células de se expandirem após o novo desafio e expressão com células que expressam antígeno (por exemplo: células alvo), as células T CAR anti-CD33 foram geradas como descrito no Exemplo 3 e utilizadas. Especificamente, um total de 5x105 células T foi plaqueado na presença de 5x10º células alvo irradi- adas (MV-4-11) e permitiram seu crescimento em um volume de 10 mL. Após 1 semana, as células foram contadas, 5x105 células da cultura anterior foram então replantadas em um volume de 10 mL juntamente com uma nova alíquota de 5x105 células alvo irradiadas e 1 semana depois o número total de células foi enumerado. O processo foi repetido conforme indicado, cada novo desafio começou com 5x105 células. O número de células viáveis foi contado conforme descrito no Exemplo 2. As células alogênicas anti-CD33 CAR-T contendo uma interrupção no gene CD70 se expandiram para níveis maiores na segunda semana após 2 desafios com células MV-4-11 FIG.20). Estes dados mostram que o CD70 pode limitar a expansão das células T na presença de cé- lulas que expressam o antígeno e sua perda pode resultar em uma maior expansão celular após a estimulação do antígeno.

A inativação de CD70 melhora a morte de células T CAR + anti-CD19 após novo desafio em série

[422] Para ainda avaliar a capacidade das células de se expandi- rem após o novo desafio e expressão com células que expressam antí- geno (por exemplo: células alvo), as células T CAR anti-CD19 foram geradas como descrito no Exemplo 3 e utilizadas. Especificamente, um total de 5x105 células T foi plaqueado na presença de 5x105 células alvo irradiadas (Nalm6) e permitiram seu crescimento em um volume de 10 mL. Após 1 semana, as células foram contadas, 5x105 células da cultura anterior foram então replantadas em um volume de 10 mL juntamente com uma nova alíquota de 5x105 células alvo irradiadas e 1 semana depois o número total de células foi enumerado. O processo foi repetido conforme indicado, cada novo desafio começou com 5x10º células. O número de células viáveis foi contado conforme descrito no Exemplo 2. Células CAR-T anti-CD19 alogênicas contendo uma interrupção no gene CD70 se expandiram para quantidades similares durante os 2 pri- meiros desafios. No entanto, em três desafios as células CAR-T anti- CD19 alogênicas contendo uma interrupção no gene CD70 se expandi- ram para um nível maior no terceiro desafio com células Nalm6 (FIG. 21). Estes dados mostram que a presença de CD70 pode limitar a ex- pansão das células T na presença de células que expressam o antígeno e sua perda pode resultar em uma maior expansão celular após a esti- mulação repetida do antígeno. Inativação de CD70 ou PD-1 mais CD70, Mantém a Morte de Células T CAR* anti-CD70 após Novo Desafio em Série

[423] As células T CAR* anti-CD70 geradas acima foram nova- mente desafiadas em série com a linha de células de câncer renal CD70+, A498, e avaliadas quanto à sua capacidade de matar as linhas de células de câncer renal CD70 A498 ou ACHN.

[424] As células A498 foram plaqueadas em um frasco T25 e mis- turadas a uma razão de 2:1 (célula T para A498) com 10x105º células T CAR* anti-CD70 contendo duas TRAC/B2M), três (TRAC/B2M/PD-1) ou (TRAC/B2M/CD70)), ou quatro (TRAC/B2M/PD-1/CD707) edições de gRNA.

[425] Dois ou três dias após cada desafio, as células foram conta- das, lavadas, ressuspensas em meio de células T fresco e desafiadas novamente no dia seguinte com a mesma razão de dois de célula T CAR* anti-CD70 por um de célula A498 (2:1, CAR* T:alvo). O desafio de células T CAR* anti-CD70 com células A498 CD70+ foi repetido 13 vezes. Três a quatro dias após cada exposição a células A498 (e antes do próximo novo desafio), foram retiradas alíquotas da cultura e anali- sadas quanto à capacidade das células T CAR de matar células alvo A498 ou ACHN em uma razão de 2:1 (célula CAR T: célula alvo. A morte celular foi medida usando Cell titer-glo (Promega). Antes do primeiro desafio com A498, células T CAR + anti-CD70 com 2X KO (TRAC/B2M'

), 3X KO (TRAC/B2M/CD70), 3X KO (TRAC/B2M/PD-1), e 4X KO (TRAC/B2M/PD-1/CD70) cada uma exibiu uma morte de células alvo de células A498 se aproximando de 100%. No entanto, no desafio nove, as células T CAR* anti-CD70 2X KO (TRAC/B2M') e 3X KO (TRAC' IB2M'/PD-17) induziram a morte de células alvo de células A498 abaixo de 40%, enquanto as células T CAR* anti-CD70 3X KO (TRAC/B2M' ICD70) e 4X KO (TRAC/B2M/PD-1/CD70) exibiram morte de células alvo acima de 60% (FIG. 22A). A morte da célula alvo para células T CAR* anti-CD70 3X KO (TRAC/B2M/CD70) e 4X KO (TRAC/B2M/PD- 1/CD70) permaneceu acima de 60% mesmo após 13 novos desafios com células A498, demonstrando que essas células T CAR + eram re- sistentes à exaustão.

[426] As células T CAR anti-CD70 também foram avaliadas quanto à sua capacidade de matar células ACHN em uma razão de 2:1 (células T para ACHN) após novo desafio em série com células de carcinoma renal A498 (FIG. 22B). Antes do primeiro desafio com A498, as células T CAR+ TRAC/B2M/anti-CD70 de inativação dupla, as células T CAR* TRAC/B2M/PD-1'anti-CD70 de inativação tripla, as células T CAR* TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 de inativação tripla, as células T CAR* TRAC /B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 de inativação quádrupla exibiram uma eficiência de morte de células acima de 62%, 47%, 73% e 81%, respectivamente.

[427] Após o desafio cinco, as células TCAR* TRAC/B2M/CD70 /lanti-CD70 de inativação tripla, e as células TCAR* TRAC/B2M/PD-1" ICD70'/anti-CD70 de inativação quádrupla ainda mataram com eficiên- cia acima de 55% das células ACHN a uma razão de 2:1 (células T para ACHN), enquanto que a morte por células T CAR* TRAC/B2M/anti- CD70 de inativação dupla e células T CAR*+ TRAC/B2M/PD-17/anti- CD70 de inativação tripla caiu para menos de 11% das células ACHN. Esta tendência continuou, em que células T CAR* TRAC/B2M' anti-

CD70 de dupla inativação e células T CAR* TRAC/B2M/PD-1/anti- CD70 de tripla inativação não sobreviveram a mais de 10 novos desa- fios. Em contraste, as células TCAR*+ TRAC/B2M/CD707/anti-CD70 de tripla inativação e células T CAR* TRAC/B2M'/PD-1/CD70/anti-CD70 de inativação quádrupla continuaram a se expandir em cultura e a matar mais de 30% das células ACHN em uma razão de 2:1 (células T para ACHN) após dois novos desafios.

[428] Os dados demonstram que as células TCAR* CD70 4x KO e as células T CAR* CD70 3xKO (CD70), são mais potentes do que células T CAR* 2X KO, CD70 CAR* T ou 3X KO (PD1), CD70. Além disso, 3X (CD70) KO e o 4X KO evitam a exaustão das células T.

[429] Após 5 novos desafios, as células foram avaliadas quanto à sua capacidade de matar células de câncer. Surpreendentemente, as células T CAR + anti-CD70 3KO e 4KO permaneceram altamente efica- zes em matar células de câncer (FIG. 23A) mesmo após vários desafios com células de câncer. O efeito de morte celular das células T CAR + anti-CD70 em células ACHN é reproduzível mesmo em relações efeto- ras reduzidas para células alvo de 1:1, 0,5:1 e 0,25:1. (FIG. 23A).

[430] Para garantir o benefício a longo prazo com o tratamento CAR T, as células T CAR devem ser capazes de identificar e erradicar suas células alvo por um longo período de tempo, para descartar a pos- sibilidade de escape de células de câncer da morte celular mediada por CAR-T. O ensaio in vitro de re-desafio simula um encontro recorrente de células CAR-T com células alvo ao longo de vários ciclos de ativação de células CAR-T. Estes dados demonstram a superioridade das células T CAR*TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 de inativação tripla e das células T CAR+TRAC/B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 de inativação quádrupla, ao sustentar múltiplos desafios com células de câncer de rim, sem mos- trar redução de sua capacidade de matar células alvo, em comparação com células TCAR* TRAC /B2M/anti-CD70 de inativação dupla e célu- las TCAR*TRAC/B2M/PD-17/anti-CD70 de inativação tripla.

[431] Os marcadores de exaustão e ativação também foram medi- dos por citometria de fluxo nas células T anti-CD70 CAR após novo de- safio. Após 8 desafios, células T CAR* (TRAC-/B2M-/CD70-) Tripla e (TRAC-/B2M-/PD1-/CD70-) KO anti-CD70 Quádrupla exibiram maior ex- pressão do marcador de ativação LAG3 do que células T CAR*+(TRAC- IB2M-) Dupla e (TRAC-/B2M-/PD1-/CD70-) KO anti-CD70 Quádrupla, consistentes com seu nível de alta atividade de morte celular. Observou- se que a expressão de PD1 foi menor em células T CAR* (TRAC-/B2M- ICD70-) anti-CD70 Tripla (similares a células T CAR* (TRAC-/B2M- IPD1-) Tripla e (TRAC-/B2M-/PD1-/CD70-) KO anti-CD70 Quádrupla) em comparação com células T CAR*+ (TRAC-/B2M-) anti-CD70 Dupla, sugerindo que a inativação de CD70 tem um efeito na regulação nega- tiva da expressão de PD1 do marcador de exaustão nas células T CAR + Anti-CD70. (FIG. 23B). Inativação de PD-1 e CD70 Mantém Morte de Células T Anti-BCMA CAR* Após Novo Desafio em Série

[432] As células T CAR anti-BCMA geradas conforme descrito no Exemplo 3 foram novamente desafiadas em série e avaliadas quanto à sua capacidade de matar a linha celular de mieloma múltiplo BCMA+ MM.1S (ATCC CRL-2974). A capacidade de secretar citocinas após a ativação de células T em série por meio do engajamento de CAR tam- bém foi medida após cada novo desafio. As células MM.1S foram mar- cadas com 5 uM eFlour670 e misturadas a uma razão de 2:1 (MM.1S para células T) em um disco de cultura de tecido de 6 poços com 1x10º células T CAR anti-BCMA contendo duas (TRAC/B2M) ou quatro ((TRAC/B2M/PD-1/CD70) edições de gRNA. Um dia após a exposição às células MM.15, uma alíquota da cultura foi retirada e analisada para a morte da célula alvo e secreção de IFN-g pelas células CAR-T. Para medir a liberação de citocinas, células T e células alvo foram co-incuba- das por 24 horas nas razões indicadas. O meio sobrenadante foi cole- tado para uso em IL-2 ou IFNy ELISAs (RD Systems) em uma nova placa seguindo as instruções do fabricante (RD Systems). No dia se- guinte, os poços foram lavados e o meio foi substituído por 200 mL de meio contendo uma diluição 1:500 de DAP| 5 mg/mL (Molecular Probes) (para enumerar células mortas/a morrer). Finalmente, 25 mL de esferas CountBright (Life Technologies) foram adicionadas a cada poço. As cé- lulas foram então processadas por citometria de fluxo. 1) Células/L = ((número de eventos de células alvo ativas)/(nú- mero de eventos de esferas)) X ((Contagem de lotes de esferas atribuí- das (esferas/50 uL))/(volume de amostra)) 2) O total de células alvo foi calculado multiplicando as célu- las/mL x o volume total de células. 3) A percentagem de lise celular foi então calculada com a se- guinte equação:

[433] % de lise celular = (1-((Número total de células alvo na amos- tra de teste)/(Número total de células alvo na amostra de controle)) x 100

[434] Dois ou três dias após cada desafio, as células foram conta- das, lavadas, ressuspensas em meio de células T fresco e desafiadas novamente com a mesma razão de uma célula T CAR* anti-BCMA por duas células MM.1S marcadas com eFlour670. O desafio de células T CAR* anti-BCMA com células MM.15 BCMA + foi repetido 10 vezes se- quenciais. Antes de qualquer desafio com células MM.1S, a co-incuba- ção de células T CAR+ anti-BCMA 2X KO (TRAC-/B2M-) ou 4X KO (TRAC-/B2M-/CD70-/PD-1-) com células MM.1S resultou na morte com- pleta das células alvo. Além disso, a produção de IFNy pelas células T CAR+ anti-BCMA 2X KO e 4X KO foi similar. No entanto, após um 4º novo desafio com células MM.15, a morte de células alvo e a produção de IFNy pelas células T CAR + anti-BCMA 2X KO diminuiu em relação à induzida por células T CAR + anti-BCMA 4X KO. No 8º desafio, a morte de células alvo foi de apenas aproximadamente 20% para células T CAR+ anti-BCMA 2X KO, enquanto IFNg e a morte de células alvo por células T CAR + anti-BCMA 4X KO permaneceram comparáveis aos ob- servados antes de qualquer desafio com células MM.1S (FIGs. 24A- 24B). Além disso, as células T CAR + anti-BCMA de inativação quádru- pla mostraram maior proliferação em resposta à exposição às células alvo (FIG. 24C)

[435] Para garantir o benefício a longo prazo com o tratamento CAR T, as células T CAR devem ser capazes de identificar e erradicar suas células alvo por um longo período de tempo, para descartar a pos- sibilidade de escape de células de câncer da morte celular mediada por CAR-T. O ensaio de novo desafio in vitro imita um encontro recorrente de células CAR-T com células alvo ao longo de vários ciclos de ativação de células CAR-T, demonstrando, portanto, a superioridade de células T CAR+TRAC/B2M/PD-1/CD70/anti-BCMA 4X de inativação, em sus- tentar múltiplos desafios com células alvo, sem mostrar redução da ca- pacidade de morte celular, em comparação com as células T CAR* TRAC/B2M/anti-BCMA de dupla inativação (FIGs. 24A-24C). Exemplo 7. CD70 KO supera desafio de excesso de moléculas ini- bidoras Comparação dos Efeitos das Células T CAR +Anti-CD70 de Multi-inati- vação nas Células de Carcinoma Renal A498-PD-L1

[436] Ensaio de Morte Celular. À capacidade de células CAR* anti-CD70 editadas em vários genes para matar células de carcinoma renal A498 que sobre-expressam PD-L1 foi determinada usando o en- saio de morte de células aqui descrito. P ara criar células que sobre-ex- pressam PD-L1 (CD274), células A498 foram infetadas com lentivírus que codificam um cDNA de PD-L1 e um gene de resistência à puromi- cina (Genecopoeia). Após a seleção com puromicina, as células foram coradas com um anticorpo anti-PD-L1 para avaliar a expressão de PD- L1. As células A498 que expressam PD-L1 são referidas como A498- PD-L1 e foram utilizadas nos ensaios funcionais descritos.

[437] A células T TRAC/B2M/anti-CD70 CAR* (2X KO, CD70 CAR*), TRAC/B2M/PD-1/anticCD70 CAR* (3X KO (PD-1), CD70 CAR*), TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 CAR* (3X KO (CD70), CD70 CAR*) e TRAC/B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 CAR* (4X KO, CD70 CAR*) foram incubadas com as células A498-PD-L1 em uma razão cé- lulas T CAR :células alvo A498-PD-L1 de 2:1 (FIG. 25A), 1:1 (FIG. 25B), ou 0,5:1 (FIG. 25C). As células de inativação de CD70 exibiram morte celular potente de células derivadas de RCC após co-incubação de 24 horas (FIGs. 25A-25C). As células com inativação de PD1 sozinhas não lisaram efetivamente as células na presença de sobre-expressão de PD- L1. No entanto, a inativação de CD70 foi capaz de resgatar a inativação de PD1 e foi observada lise celular intensificada nas células CART com CD70 KO e PD1 KO. Estes dados demonstram que a perda de CD70 na superfície dessas células CAR-T aumenta sua função, mesmo na presença de moléculas supressoras altamente imunológicas expressas por células tumorais, tal como PD-L1.

[438] Ensaio de Liberação de Citocina. Um ensaio de liberação de citocina foi realizado como aqui descrito. A capacidade das células T CAR* anti-CD70 de inativação dupla, inativação tripla e inativação quá- drupla para produzir IL-2 e IFN-g quando cocultivadas na presença de células A948-PD-L1 após co-incubação de 24 horas a uma razão (célula T CAR: célula alvo A948-PD-L1) de 1:1 foi avaliada usando um ensaio ELISA. IL-2 e IFN-g de sobrenadantes de coculturas de células foram medidos. As células T CAR* TRAC/B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 de inativação quádrupla secretaram os níveis mais elevados de IFN-g (FIG.

26A) e I1L-2 (FIG. 26B) quando cultivadas com células A948-PD-L1. Es- tes dados demonstram que a inativação de CD70 aumenta a secreção de citocinas pelas células CAR-T, mesmo na presença de moléculas supressoras altamente imunológicas expressas por células tumorais, tal como PD-L1. A inativação de CD70 junto com uma inativação de PD-1 em células CAR-T aumenta ainda mais o efeito. Sem desejar estar limi- tado pela teoria, acredita-se que a inativação de CD70 em células T CAR anti-CD70 pode resgatar os fenótipos prejudiciais de outras inati- vações de células (por exemplo: PD1). Estes dados demonstram que a inativação de CD70 em células T CAR aumenta a morte de células alvo e a função de células T CAR em um contexto altamente imunossupres- sor. Exemplo 8. Inativação de CD70 Melhora a eficácia in vivo Eficácia da inativação de CD70 e PD1 em células CART Anti-CD70: o Modelo de Xenoenxerto de Tumor de Carcinoma de Células Renais Subcutâneo em Camundongos NOG Tratamento em modelo de tumor pequeno

[439] A capacidade das células T que expressam um CAR CD70 para eliminar células de carcinoma renal que expressam elevados níveis de CD70 foi avaliada in vivo usando um modelo de xenoenxerto de tu- mor de carcinoma de células renais subcutâneo (A498) em camundon- gos.

[440] CRISPR/Cas9 e AAV6 foram usados como acima (ver, por exemplo, Exemplo 3) para criar células T humanas que não têm expres- são de TCR, B2M e CD70 com expressão concomitante do locus TRAC usando um construto CAR direcionados a BCMA (SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46). Neste exemplo, as células T ativadas foram primeiro eletro- poradas com 2, 3 ou 4 complexos Cas9:sgRNA RNP distintos contendo SgRNAs direcionados a TRAC (SEQ ID NO: 40), B2M (SEQ ID NO: 41), PD1 (SEQ ID NO: 42), e CD70 (SEQ ID NO: 36 ou 37). A quebra de cadeia dupla do DNA no locus TRAC foi reparada por reparação direci- onada por homologia com um modelo de DNA entregue por AAV6 (SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45 (que codifica CAR anti-CD70 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45) contendo braços de homologia esquerdo e direito do locus de TRAC que flanqueiam um cassete de receptor de antígeno quimérico (-/+ elementos reguladores para a expressão do gene).

[441] As células T modificadas resultantes são células T 2X KO (TRAC-/B2M-), 3X KO (TRAC-/B2M-/PD1- ou TRAC-/B2M-/CD70-) e 4X KO (TRAC-/B2M-/PD1-/CD70-) anti-CD70 CAR + (com domínio coesti- mulatório 41BB). A capacidade destas células T CAR anti-CD70 para melhorar a doença causada por uma linha de células de carcinoma renal CD70+ foi avaliada em camundongos NOG usando métodos aplicados por Translational Drug Development, LLC (Scottsdale, AZ). Breve- mente, 12 camundongos fêmeas CIEA NOG (NOD.Cg-Prkdc”* cid 71 2rgtmiSu9/ ) jicTac) de 5-8 semanas de idade foram alojados individu- almente em gaiolas de micro-isolador ventiladas, mantidos sob condi- ções livres de patógenos, 5-7 dias antes do início do estudo. Os camun- dongos receberam uma inoculação subcutânea de 5x10º células A498 de carcinoma renal/camundongo no flanco posterior direito. Quando o tamanho médio do tumor atingiu 25-75 mm? (alvo de -— 50 mm?), os ca- mundongos foram divididos em 5 grupos de tratamento, conforme mos- trado na Tabela 15. No Dia 1, os grupos de tratamento 2 a 5 receberam uma única dose intravenosa de 200 JL de células T CAR anti-CD70 de acordo com Tabela 15. Tabela 15. Grupos de tratamento

[442] O volume do tumor foi medido 2 vezes por semana a partir do dia do início do tratamento. No dia 5, o tratamento com todos os quatro tipos de células T CAR anti-CD70 começou a mostrar uma dimi- nuição no volume do tumor e no dia 22, todos os quatro tipos de células T CAR anti-CD70 eliminaram completamente os tumores de câncer re- nal CD70+ durante a duração do estudo até o dia 91 (FIG. 27A). Estes dados demonstram que as células T CAR anti-CD70 podem regredir tu- mores de câncer de rim CD70+ in vivo.

[443] Para testar a atividade das células T CAR anti-CD70 após nova exposição, os camundongos sobreviventes foram inoculados no flanco posterior esquerdo subcutâneo com 5x105º células de carcinoma renal A498/camundongo no dia 25. (Tabela 16). A eficácia sustentada foi avaliada a partir do dia 46 em diante. Os resultados são mostrados na FIG. 27B. No dia 56, 5 de 5 camundongos tratados com células T CAR+CD70, 2X exibiram crescimento de tumores após novo desafio, 4 de 5 camundongos tratados com células T CAR+CD70, 3X (PD1), exi- biram crescimento de tumores após novo desafio, 2 de 5 camundongos tratadas com células T CAR+ CD70, 4X (CD70, PD1) exibiram novo crescimento de tumores após novo desafio, enquanto nenhum dos ca- mundongos tratados com células T CAR + CD70, 3X (CD70), exibiram crescimento de tumores após novo desafio. Esta tendência continuou, no dia 70, 4 de 5 camundongos tratados com células T CAR + CD70, 3X (PD1), exibiram crescimento de tumores após-novo desafio, 4 de 5 ca- mundongos tratados com células T CAR + CD70, 4X (CD70, PD1), exi- biram crescimento de tumores após-novo desafio, enquanto apenas um dos camundongos tratados com células T CAR + CD70, 3X (CD70) exi- biram um pequeno crescimento do tumor que começou a aparecer 34 dias após novo desafio. Mesmo até ao dia 91, apenas 1 de 5 camun- dongos tratados com células T CAR +CD70, 3X (CD70) estavam come- çando a exibir crescimento do tumor, indicando que as células TCAR+

TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 retêm uma maior eficácia in vivoapós nova exposição às células tumorais. Tabela 16. Tamanho dos tumores de novo desafio em camundon- gos não tratados ou camundongos tratados com células T CAR CD70 Fa o o As TA TEETEDIETTE

NC NS RE E O a a sa e

NS NS RE E O Tratamento em modelo de tumor grande

[444] Foi investigada a eficácia in vivo das células T CAR anti- CD70 contra tumores de carcinoma de células renais maiores. Como acima, forma usados CRISPR/Cas9 e AAV6 para criar células T huma- nas que não têm expressão de TCR, B2M, CD70 e/ou PD1 com expres- são concomitante a partir do locus TRAC usando um construto CAR di- recionado a CD70 (SEQ ID NO: 45). Neste exemplo, as células T ativa- das foram primeiro eletroporadas com 2, 3 ou 4 complexos Cas9:5sgRNA RNP distintos contendo saRNAs direcionados a TRAC (SEQ ID NO: 40), B2M (SEQ ID NO: 41), PD1 (SEQ ID NO: 42), e CD70 (SEQ ID NO: 36 ou 37). A quebra de cadeia dupla do DNA no locus TRAC foi reparada por reparação direcionada por homologia com um modelo de DNA AAV6-entregue (SEQ ID NO: 43 (que codifica CAR anti-CD70 compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5) contendo bra- ços de homologia esquerdo e direito do locus de TRAC que flanqueiam um cassete de receptor de antígeno quimérico (-/+ elementos regulado- res para a expressão do gene).

[445] As células T modificadas resultantes são células T 2X KO (TRAC-/B2M-), 3X KO (TRAC-/B2M-/PD1- ou TRAC-/B2M-/CD70-) e 4X KO (TRAC-/B2M-/PD1-/CD70-) anti-CD70 CAR + (com domínio coesti- mulatório 41BB). A capacidade destas células T CAR anti-CD70 para melhorar a doença causada por uma linha de células de carcinoma renal CD70+ foi avaliada em camundongos NOG usando métodos aplicados por Translational Drug Development, LLC (Scottsdale, AZ). Breve- mente, 12 camundongos fêmeas CIEA NOG (NOD.Cg-Prkdc”* cid 71 2rgtmiSu9/ ) jcTac) de 5-8 semanas de idade foram alojados individu- almente em gaiolas de micro-isolador ventiladas, mantidos sob condi- ções livres de patógenos, 5-7 dias antes do início do estudo. Os camun- dongos receberam uma inoculação subcutânea de 5x105 células de car- cinoma renal A498/camundongo. Quando o tamanho médio do tumor atingiu 125-175 mm? (alvo de — 150 mm?), os camundongos foram divi- didos em 5 grupos de tratamento, conforme mostrado na Tabela 17. No dia 1, os grupos de tratamento 2 a 5 receberam uma única dose intra- venosa de 200 uL de células T CAR anti-CD70 de acordo com Tabela

17. Tabela 17. Grupos de tratamento [3 Tess TOR ROO pacamETnoAS | cEETínAT 7 |

[446] O volume do tumor foi medido 2 vezes por semana a partir do dia do início do tratamento. No dia 4 de tratamento, apenas as células T CAR+anti-CD70 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) e células T CAR + anti- CD70 4X KO (TRAC-/B2M-/PD1-/CD70-) começaram a mostrar uma di- minuição no volume do tumor (FIG. 27C). Em contraste, o crescimento do tumor para animais tratados com células T CAR + anti-CD70 2X KO (TRAC-/B2M-) ou células T CAR + anti-CD70 3X KO (TRAC-/B2M-/PD1- ) foi similar ao grupo sem tratamento. No dia 23 de tratamento, as célu- las T CAR +anti-CD70 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) eliminaram comple- tamente os tumores de câncer renal CD70 in vivo. No dia 23 de trata- mento, a eliminação dos tumores em resposta a células T CAR + anti- CD70 4X KO (TRAC-/B2M-/PD1-/CD70-) estava quase completa, com 4 de 5 camundongos não exibindo tumores de câncer renal detectáveis in vivo.

[447] Estes dados mostram que células T CAR + anti-CD70 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) e células T CAR + anti-CD70 4X KO (TRAC-/B2M- IPD1-/CD70-) podem regredir significativamente grandes tumores de câncer renal CD70+in vivo. Modelo de Tumor in vivo para CAR anti-BCMA no contexto de PD1 CD70 e PD1 com inativação de CD70.

[448] Foi avalidada a eficácia de células TCAR+TRAC-/B2M-/anti- BCMA (4-1BB co-stim), células TCAR+TRAC-/B2M-/PD-1-/anti-BCMA (4-1BB co-stim), TRAC-/B2M-/CD70-/anti:rBCMA (4-1BB co-stim), e TRAC-/B2M-/PD-1-/CD70-/anti-BCMA (4-1BB co-stim) contra o modelo de xenoenxerto de tumor MM.1S subcutâneo em camundongos NOG. Brevemente, 25 camundongos fêmeas CIEA NOG (NOD.Cg-Prkdc”* cid 1 2rgtmiSu9/ ) jcTac) de 5-8 semanas de idade foram alojados individu- almente em gaiolas de micro-isolador ventiladas, mantidos sob condi- ções livres de patógenos, 5-7 dias antes do início do estudo. No dia 1,

25 camundongos receberam uma inoculação subcutânea no flanco di- reito de 5x10º células MM.15 em Matrigel a 50%/camundongo. Quando o volume médio do tumor atingiu entre 75 e 125 mm?, os camundongos foram divididos em 5 grupos de tratamento (N =5) e doseados com po- pulações de células T compreendendo — 50% de células T CAR* anti- BCMA, conforme indicado na Tabela 18. Tabela 18. Dosagem [oro TegeTe — astaues Tinesas — Teve Tanner TN x10º 2 TRAC-/B2M-/anti-BCMA 1x10' células/camundongo . 5 e eme E (5 milhões) 4 TRAC-/B2M-/CD70-/anti-BCMA 1x10' células/camundongo 5 x10º 5 o rea re eme — | 5 TRAC-/B2M-/PD-1-/CD70-/ant-BCMA 1x10' células/camundongo 5 x10º 5 A ÇA E |

[449] O volume do tumor e os pesos corporais foram medidos duas vezes por semana e os camundongos individuais foram sacrificados quando o volume do tumor atingiu 2 2.000 mm?.

[450] No dia 16, todos os grupos de tratamento mostraram regres- são do tumor a partir dos volumes iniciais, enquanto os animais no grupo de controle tinham tumores com média superior a 1500 mm3. No dia 27, todos os animais do grupo de controle atingiram o resultado final de vo- lume tumoral > 2.000 mm? enquanto todos os grupos de tratamento ti- veram um volume tumoral médio inferior a 20 mm3 (FIG. 28A). No dia 45, todos os camundongos de cada grupo de tratamento (Grupos 2-5) foram ainda submetidos a um desafio de tumor secundário (novo desa- fio). Os camundongos receberam uma segunda inoculação subcutânea no flanco esquerdo de 5x105 células MM.1S em Matrigel a 50%/camun- dongo. Um novo grupo de camundongos de controle foi inserido (N =5) e também recebeu uma inoculação de 5x105 células MM.1S em Matrigel a 50%/camundongo no flanco esquerdo.

[451] Todos os camundongos foram monitorados quanto ao cres- cimento do tumor tanto no tumor do flanco direito inicial quanto no tumor de novo desafio no flanco esquerdo. Todos os grupos de tratamento inibiram com sucesso o crescimento tumoral no tumor do flanco direito inicial na maioria dos indivíduos (FIG: 28A; Tabela 19). O crescimento do tumor foi inibido por todos os tratamentos antes e depois do novo desafio do tumor durante a experiência até o dia 77. Apenas um sujeito tratado com células TCAR*TRAC-/B2M-/CD70-/PD1-/anti-BCMA exibi- ram crescimento tumoral a partir do desafio inicial de células canceríge- nas (Tabela 19).

[452] Surpreendentemente, o crescimento do tumor após novo de- safio no flanco esquerdo também foi significativamente inibido por todos os grupos de tratamento desde a data do novo desafio (dia 45) ao dia 77 (FIG. 28B; Tabela 19). Estes dados demonstram que as células T CAR + persistem in vivo para inibir o crescimento inicial do tumor, bem como inibir o crescimento de novos tumores após um novo desafio com células de câncer adicionais, embora nenhuma outra célula CAR-T te- nha sido entregue a estes camundongos. Por exemplo, três dos quatro camundongos inicialmente tratados com populações de células T CAR* TRAC-/B2M-/anti-BCMA, três dos cinco camundongos inicialmente tra- tados com células T CAR? TRAC-/B2M-/CD70-/anti-BCMA, e três dos cinco camundongos inicialmente tratados com células T CAR+ TRAC- IB2M-/PD1-/anti-BCMA não exibiram nenhum novo crescimento tumo- ral, apesar de um segundo desafio (novo desafio) para novas células de câncer. Estes dados demonstram que, inesperadamente, as células T CAR*anti-BCMA são capazes de persistir por longos períodos de tempo in vivo, por exemplo, até pelo menos 77 dias após a injeção, e reter sua capacidade de inibir o crescimento de células tumorais e reduzir os vo- lumes do tumor por longos períodos in vivo. Estes resultados surpreen- dentes indicam que o uso de tais células T CAR*+ TRAC-/B2M-/anti- BCMA atingiriam efeito anticancerígeno superior de longo prazo in vivo.

[453] As células CD45+ humanas foram quantificadas a partir de sangue de camundongo usando tubos BD Trucount seguindo o proto- colo do fabricante e detectadas usando CDA45 anti-humano conjugado com Brilliant Violet 786 (Biolegend Cat & 368528). Todos os grupos apresentaram valores inferiores a 100 células hucD45+/uL em 1 se- mana. Duas semanas após a dosagem, o número de CD45+ circulante em todos os grupos atingiu o pico antes de cair para os valores da pré- semana 1 na semana 3 (FIG. 29). Após novo desafio no Dia 45, os indi- víduos tratados com células T CAR +anti-BCMA foram capazes de eli- minar ou inibir o crescimento do tumor sem a expansão subsequente das células T CAR circulantes após novo desafio do câncer. Estes da- dos demonstram ainda que, inesperadamente, as células T CAR + anti- BCMA são capazes de persistir por longos períodos de tempo in vivo, por exemplo, até pelo menos 77 dias após a injeção, e reter sua capa- cidade de inibir o crescimento de células tumorais e reduzir os volumes do tumor por longos períodos in vivo. Estes resultados surpreendentes indicam que o uso de células TCAR+TRAC-/B2M-/anti-BCMA, células T CARH+TRAC-/B2M-/CD70-/anti-BCMA e células TCAR+TRAC-/B2M- IPD1-/anti-BCMA atingiriam efeito anticancerígeno superior de longo prazo in vivo. Tabela 19. Tamanho dos tumores em camundongos não tratados ou camundongos tratados com células T CAR anti-BCMA Tratamento Camundongo Volume do tumor Volume do tumor no Dia 77 [A Es A os 2 TS TS TS ss 4 TS TS TS BCMA (MS no Dia 59) (MS no Dia 59:) 2 O Es

NM RC

Tratamento Camundongo Volume do tumor Volume do tumor no Dia 77

BCMA o

EM RR RA o o /fanti-BCMA o 3 o 2349 o [sem | sam | o o 1CDT70-/ant-BCMA o o

EM RR RA 1583 1560 PR wo | mam |

[454] TS =sacrificado devido ao volume do tumor; MS = sacrifício moribundo; FD-T = animal encontrado morto. Modelo de Tumor in vivo para CAR anti-BCMA no contexto de Ina- tivação de CD70: efeito de CD70 KO na dosagem moderada de CAR

T

[455] A eficácia de vários genótipos de células TCAR* anti-BCMA, com e sem inativações de CD70, foi avaliada contra o modelo de xeno- enxerto de tumor RP M1I-8226 subcutâneo em camundongos NOG. Bre- vemente, oitenta e cinco (85) camundongos fêmeas CIEA NOG (NOD.Cg-Prkdc*“d|12rg""!Su9/) jcTac) de 5 a 8 semanas de idade foram alojados individualmente em gaiolas de micro-isolador ventiladas, man- tidos sob condições livres de patógenos, 5-7 dias antes do início do es- tudo. No dia 1 os camundongos receberam uma inoculação subcutânea de 10x105 células RP MI-8226/camundongo. Dez (10) dias após a ino- culação com células RP MI-8226, os camundongos foram divididos em

17 grupos de tratamento (N =5) e doseados com populações de células T compreendendo — 80% de células T CAR anti-BCMA, conforme indi- cado na Tabela 20. Tabela 20. [sr Tess TamBENAEAr rasca THROS — ess TENHA TN 2,4 x10º (2,4 milhões) [o een Siena [mm | | 3 TRAC-/B2M-/anti-BCMA 1x10º células/camundongo 5 (0,8 milhões) 4 TRAC-/B2M-/anti-BCMA 3x10º células/camundongo 2,4 x105 5 e eme — | | TRAC-/B2M-/anti-BCMA 1x10º células/camundongo Bx10º 5 e esses — | |

MA EE 3x10º células/camundongo (2,4 milhões) 1x10º células/camundongo (0,8 milhões) TRAC-/B2M-/PD1-/anti-BCMA 3x10º células/camundongo 2,4 x105 5 nn un eo | | TRAC-/B2M-/PD1-/anti-BCMA 1x10º células/camundongo Bx10º 5 (0,08 milhões) 3x10º células/camundongo (2,4 milhões) 1x10º células/camundongo . (0,8 milhões) 12 TRAC-/B2M-/CD70-/anti-BCMA 3x10” células/camundongo 2,4 x10º 5 e e a eee — | | 123 TRAC-/B2M-/CD70-/anti-BCMA 1x10º células/camundongo Bx10º 5 e sa esses — | | 3x10º células/camundongo . (2,4 milhões) 1x10º células/camundongo (0,8 milhões) 16 TRAC-/B2M-/PD1-/CD70-/anti-BCMA 3x10º células/camundongo 2,4 x105 5

A MA 17 TRAC-/B2M-/PD1-/CD70-/anti-BCMA 1x10º células/camundongo Bx10º 5 dE A A

[456] O volume do tumor e o peso corporal foram medidos duas vezes por semana, e os camundongos individuais foram sacrificados quando o volume do tumor era >= 2000mm?. No dia 22, os dados mos- tram uma diminuição estatisticamente significativa no volume do tumor em resposta a doses mais altas de células T CAR anti-BCMA (1x10*- 3x105 doses de células) em comparação com qualquer genótipo de cé- lula T CAR anti-BCMA doseado em 100.000 células (grupos 5, 9, 13 e 17) (FIG. 30; Tabela 21).

[457] No dia 36, as células T CAR+ TRAC-/B2M-/CD70-/anti- BCMA dosadas a uma dose moderada de 3x10º de células, exibiram um efeito maior na diminuição do volume do tumor do que as células T CAR + anti-5BCMA sem CD70 KO (por exemplo, células TCAR+TRAC- IB2M-/anti-BCMA, células T CAR+ TRAC-/B2M-/PD1-/anti-BCMA, ou células TCAR+TRAC-/B2M-/PD1-/CD70-/anti-BCMA) (FIG. 30). Todas as doses mais elevadas de 1x105º ou superiores, todas as células T CAR + anti-BCMA (FIG. 30; 1 Mil, 3 Mil), mostraram regressão completa no volume do tumor. Esta tendência continuou até o Dia 57 do estudo.

[458] Estes resultados demonstram que a inibição da atividade de CD70 (por exemplo, inativando CD70) aumenta a eficácia e a potência de Células T CAR in vivo. Este efeito é independente da presença de um CAR anti-CD70. Tabela 21. Tratamento Células T Volume do tumor (mm”) Volume do tumor (mm”) anti-BCMA no Dia 36 no Dia 57 CAR+/dose Sem ve | NE LET Err rFFHFrFFFF. ro Eee [e e e e e o o o | 2 ; (2,4 milhões) Ta mucans [oemns | º | [o jo Jo e | je e || [| [TO uma | 9 [sm ps fe se Ds De Ds || . 6s 6s nm 56 516 27 | [am (0,24 milhões) Tao 2664 | 266 | 386 | 27% [185 [230 | 2263 | 2058 | 217 | 2350 A EFeFFFFFFFFFF

EXPO o Ee [e e e pe e o o o | | [ER [meme | o e e pe de a e o o | 7 TRAC-/B2M- " (0,8 milhões) IPoLant- - (0,24 milhões) Tao 261 | 25 | 265 | 25) fa [asse | 1557 | 2226 | 2000 | 2008 | eee | rm Ds [e de De Des [es Des Does | ro a [e e e pe e o e o | F 5 (2,4 milhões) | [em [eme | 9 e e pe de e e o | 2 TRAC-/B2M- " (0,8 milhões) IcDTO-fant ' = Ee e Ao (0,24 milhões) Tao v 202 | 20 | 26 | 33 [235 [205 | 2227 | 2006 | 1365 | 2350 FL EF FFrFFFFFFF TRAC-/B2M- 2,4 x10 EE E | Dr Err EE eantecma [Ex s [os [O teme | e e e pe de e e o |

Tratamento Células T Volume do tumor (mm”) Volume do tumor (mm"”) CT Ss" =" mm EEE Ee e ese Exemplo 9. Células T CAR de multi-inativação retêm dependência de citocinas

[459] Dependência de Citocinas. P ara determinar se a edição de genes resultou em edição fora do alvo indesejada que poderia gerar cé- lulas com propriedades adversas, tal como crescimento celular descon- trolado, foi avaliada a capacidade das células T CAR editadas pelo gene para crescer na ausência de citocinas e/ou soro.

[460] Células T CAR anti-CD70: A capacidade das células CAR* TRAC /B2M/CD70/anti-CD70 para crescerem na ausência de citocinas e/ou soro foi avaliada. 5x106 células CAR* TRAC/B2M/CD70/anti- CD70 foram semeadas — 2 semanas após a produção de células (Dia 0). O número de células viáveis foi enumerado 7 e 14 dias após o pla- queamento em meio completo, soro humano a 5% sem citocinas (IL-2 e IL-7) ou meio básico sem soro e citocinas. Não foram detectadas células aos 14 dias plaqueadas nas culturas que não tinham citocinas, suge- rindo que quaisquer efeitos potenciais fora do alvo devido à edição do genoma não induziram crescimento/proliferação independente do fator de crescimento às células (FIG. 31). As células apenas proliferaram na presença de citocinas (meio completo que contém citocinas) e não pro- liferaram na presença de soro sozinho. Assim, in vivo, as células TC1 provavelmente não cresceriam na ausência de citocina, fator de cresci- mento ou estimulação de antígeno devido a qualquer edição de genoma fora do alvo.

[461] A capacidade das células CAR* anti-CD70 TRAC/B2M' ICD70'/PD1' para crescerem na ausência de citocinas e/ou soro foi ava- liada. Plaquearam-se 2x10º células TC1 —2 semanas após a produção celular (Dia 0). O número de células viáveis foi enumerado até 26 dias após o plaqueamento em meio completo, soro humano à 5% sem cito- cinas (IL-2 e IL-7) ou meio básico sem soro e citocinas. Não foram de- tectadas células aos 26 dias plaqueadas nas culturas que não tinham citocinas, sugerindo que quaisquer efeitos potenciais fora do alvo devido à edição do genoma não induziram crescimento/proliferação indepen- dente do fator de crescimento às células (FIG. 32). As células apenas proliferaram na presença de citocinas (meio completo que contém cito- cinas) e não proliferaram na presença de soro sozinho. Assim, a edição do genoma não induziu nenhum evento adverso que permitisse o cres- cimento das células na ausência de citocina, fator de crescimento ou estimulação de antígeno.

[462] Células T CAR +anti-BCMA: A capacidade das células CAR * TRAC /B2M/CD70/PD-1//anti-8BCMA para crescerem na ausência de ci- tocinas e/ou soro foi avaliada. As células CAR+ TRAC/B2M/CD70/PD- 1/anti-BCMA também são referidas como células CAR* BCMA, 4X KO. 1x10º células CAR* BCMA, 4X KO foram plaqueadas a seguir aos 10 desafios descritos no Exemplo 6. O número de células viáveis foi enu- merado 7 e 14 dias após o plaqueamento em meio completo, soro hu- mano a 5% sem citocinas (IL-2 e IL-7) ou meio básico sem soro e cito- cinas. Não foram detectadas células aos 13 dias plaqueadas nas cultu- ras que não tinham citocinas, sugerindo que quaisquer efeitos poten- ciais fora do alvo devido à edição do genoma não induziram cresci- mento/proliferação independente do fator de crescimento às células (FIG. 33). As células apenas proliferaram na presença de citocinas (meio completo que contém citocinas) e não proliferaram na presença de soro sozinho. Portanto, in vivo, as células provavelmente não cres- ceriam de forma descontrolada.

[463] Outras células T CAR: Foi anteriormente demonstrado que as células T CAR + anti-CD33 e células T CAR + anti-CD19 exemplifica- das neste documento apenas proliferaram na presença de citocinas e não proliferam na presença de soro sozinho. Portanto, in vivo, as células provavelmente não cresceriam de forma descontrolada.

[464] Ensaio de Liberação de Citocina. Para medir a liberação de citocinas, células T e células alvo foram co-incubadas por 24 horas nas razões indicadas. O meio sobrenadante foi coletado para uso em ELISAs de IL-2 ou IFNy (RD Systems) em uma nova placa seguindo as instruções do fabricante (RD Systems).

[465] A capacidade das células CAR* TRAC/B2M'/CD70/anti- CD70 para produzir interleucina-2 (IL-2) quando cocultivadas na pre- sença de células A498 foi analisada usando o ensaio ELISA. Tanto as células TCAR* TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 de inativação tripla e cé- lulas TCAR* TRAC/B2M/anti-CD70 de inativação dupla secretam altos níveis de IL-2. Surpreendentemente, as células T CAR*+ TRAC/B2M' ICD70/anti-CD70 secretaram níveis mais elevados de IL-2 do que as células T CAR* TRAC/B2M/anti-CD70 quando cultivadas com células A498 (FIG. 34). Estes resultados sugerem que inativar o gene CD70 dá uma vantagem às células T CAR anti-CD70 para secretar mais IL-2. Exemplo 10. Efeito de Inativação múltipla em células T CAR + Anti-CD70 em Células de Carcinoma Renal A498 Efeito da multi-inativação na função das células T CAr+ anti-CD70.

[466] Ensaio de Morte Celular. À capacidade de edição de múlti- plos genes para matar células de carcinoma renal A498 foi determinada usando o ensaio de morte celular descrito acima. Em suma, as células TRAC/B2M/anti-CD70 CAR* (2X KO, CD70 CAR*), TRAC/B2M/PD-1" lanti-CD70 CAR* (3X KO (PD-1), CD70 CAR*), TRAC/B2M'/CD70/anti- CD70 CAR* (3X KO (CD70), CD70 CAR*) e TRAC/B2M'/PD-1/CD70" lanti-CD70 CAR* (4X KO, CD70 CAR*) foram incubadas com uma linha celular derivada de RCC aderente CD70* (células A498) em várias ra- zões de células T CAR :células alvo A498.

[467] A células CAR* TRAC/B2M'/PD-1/CD70/anti-CD70 exibi- ram morte celular potente de células derivadas de RCC após co-incu- bação de 24 horas (FIG. 35). As células T CAR* TRAC/B2M/PD-1 ICD70/anti-CD70 quádruplas demonstrou maior potência de morte ce- lular do que as células TCAR* TRAC/B2M/PD-17/anti-CD70 de inativa- ção tripla que demonstraram maior potência do que as células T CAR* TRAC /B2M/anti-CD70 de inativação dupla (visíveis em células T bai- xas: Razão de A498 de 0,5:1 e 0,25:1). Os resultados demonstram que a inativação de ambos os genes CD70 e PD-1 deram às células CAR + anti-CD70 maior potência de morte celular.

[468] As células editadas pelo gene também exibiram morte celu- lar potente de células derivadas de RCC após co-incubação de 24 horas em uma razão de célula CAR T:célula alvo A948 de 0,24:1. (FIG. 36). Especificamente, as células T CAR* TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 de inativação tripla e as células T CAR* TRAC/B2M'/PD-1/CD70/anti- CD70 de inativação quádrupla demonstraram maior potência do que as células TCAR*+ TRAC/B2M/anti-CD70 de inativação dupla ou as célu- las TCAR* TRAC/B2M/PD-17//anti-CD70 de inativação tripla. Estes da- dos indicam que a inativação de CD70 no contexto de um CAR anti- CD70 melhorou a capacidade de morte celular das células T CAR* anti- CD70.

[469] Ensaio de Liberação de Citocina. Um ensaio de liberação de citocina foi realizado como descrito acima. A capacidade das células T CAR* anti-CD70 de inativação dupla, inativação tripla e inativação qu- ádrupla para produzir IL-2 e interferon gama (IFN-gama (IF N-g)) quando cocultivadas na presença de células A498 após co-incubação de 24 ho- ras a uma razão (célula T CAR: célula alvo A498) de 0,25:1 foi avaliada usando um ensaio ELISA. IL-2 e IFN-g de sobrenadantes de coculturas de células foram medidos. As células T CAR+TRAC/B2M'/CD70/anti- CD70 de inativação tripla e as células TCAR*TRAC/B2M'/PD-1/CD70"

/anti-CD70 de inativação quádrupla secretaram os níveis mais elevados de IFN-g (FIG. 37A) e IL-2 (FIG. 37B) quando cultivadas com células A498. Efeito da Inativação de CD70 na Expressão do Marcador de E xaustão

[470] Os níveis dos marcadores de exaustão PD-1 e LAG3 foram avaliados nas células T TRAC/B2M/anti-CD70 CAR* (2X KO, CD70 CAR*), TRAC/B2M/PD-1/anticCD70 CAR* (3X KO (PD-1), CD70 CAR*), TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 CAR* (3X KO (CD70), CD70 CAR*) e TRAC/B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 CAR* (4X KO, CD70 CAR*) utilizadas nos exemplos acima. As células T CD4* foram avalia- das quanto à expressão de PD-1 (FIG. 38) e ambas as células T CD8* T e células T CD4* foram avaliadas quanto à expressão de LAG3 (FIG. 39A e FIG. 39B, respectivamente) por citometria de fluxo.

[471] Os dados demonstram que CD70 KO reduz a expressão do marcador de exaustão em células T CAR. Os dados na FIG. 38 mostra que a expressão de PD-1 é diminuída, como esperado, quando PD-1 é inativado, e também é diminuída quando CD70 é inativado.

[472] Os dados nas FIGs. 39A e 39B mostram que a inativação de CD70 reduz o marcador de expressão LAG3 em células CD4 e CD8.

[473] Os dados demonstram que a inativação de CD70, especifi- camente, poderia reduzir o potencial de exaustão de população de gene editado CD8* e CD4* de células T CAR + levando a melhores terapêuti- Cas. Exemplo 11. CD70 KO melhora a morte celular em vários tipos de células

[474] Expressão de CD70 em várias Linhas de Células de Cân- cer. A expressão relativa de CD70 foi medida em várias linhas de célu- las de câncer para avaliar ainda mais a capacidade de células T CAR*+ anti-CD70 para matar vários tipos de câncer. A expressão de CD70 foi medida por análise FACS usando anticorpo CD70 anti-humano Alexa

Fluor 647 (BioLegend Cat. Nº 355,115). FIG. 40A (gráfico à esquerda) mostra a expressão relativa de CD70 em células ACHN, medida por FACS, em comparação com outras linhas celulares de câncer renal A498, 786-0, cacki-1 e Caki-2. Além disso, as linhas de células de cân- cer não renal foram avaliadas quanto à expressão de CD70 por análise FACS (Tabela 22, FIG. 40A e FIG. 40B) usando um anticorpo Alexa Fluor 647 anti-CD70 humano (BioLegend Cat. No. 355115; FIG. 40A, painel direito) ou um anticorpo FITC anti-CD70 humano (BioLegend Cat. No. 355105) na FIG. 40B. SNU-1 (células de câncer intestinais) exibiu elevados níveis de expressão de CD70 que eram similares a A498 (FIG. 40A, painel direito). As linhas celulares SKOV-3 (ovariano), HuT 78 (lin- foma), NCI-H1975 (pulmão) e Hs-766T (pancreático) exibiram níveis de expressão de CD70 similares ou superiores a ACHN, mas inferiores a A498 (Tabela 22, FIG. 40B).

Tabela 22.

[475] Ensaio de Morte Celular. A capacidade de células CAR + anti-CD70 editadas em vários genes para matar células de carcinoma renal ACHN foi determinada usando o ensaio de morte de células des- cito acima. As células TRAC/B2M/anti-CD70 CAR* (2X KO, CD70 CAR*), TRAC/B2M/PD-1/anticCD70 CAR* (3X KO (PD-1), CD70 CAR*), TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 CAR* (3X KO (CD70), CD70 CAR*) e TRAC/B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 CAR* (4X KO, CD70

CAR*) foram incubadas com uma linha celular derivada de RCC ade- rente que expressa baixos níveis de antígeno CD70 (células ACHN) (FIG. 40A mostra a expressão relativa de CD70 em células ACHN, con- forme medido por FACS, em comparação com outras linhas celulares de câncer de rim A498, 786-0, cacki-1 e Caki-2) em uma razão célula T CAR: células alvo ACHN de 0,5:1 (FIG. 40C) e 0,25:1 (FIG. 40D). As células editadas por gene exibiram morte celular potente de células de- rivadas de RCC após co-incubação de 24 horas (FIGS. 40C e 40D). As células demonstraram potência mais elevada quando P D-1 foi inativado, quando CD70 foi inativado, e potência ainda ligeiramente maior quando PD-1 e CD70 foram inativados. Em conclusão, a inativação de PD-1 ou CD70 ou de PD-1 e CD70 juntos melhora a capacidade de morte celular das células CAR + anti-CD70 em células ACHN.

[476] Embora as células ACHN expressassem níveis moderados a baixos de CD70, elas foram surpreendentemente suscetíveis à morte por células TCAR+CD70, 3X KO (PD-1), células TCAR+CD70, 3X KO (CD70), e células T CAR+ CD70, 4X KO (FIG. 40C e 40D). Isto indica que a elevada expressão de CD70 não é um requisito para a morte efi- caz de uma célula alvo por células T editadas por genes que expressam um CAR anti-CD70. Adicionalmente, dado que os níveis de expressão de CD70 nas linhas de células SNU-1, SK-OV-3, NCI-H1975 e HS-766T foram considerados similares ou superiores a ACHN, esperava-se que as células T CAR +anti-CD70 também seriam especialmente eficientes em matar esses tipos de células de câncer. Na verdade, verificou-se que TRAC/B2M/PD-1/CD70/anti-CD70 CAR* (4X KO, CD70 CAR*) e TRAC/B2M/CD70/anti-CD70 CAR* (3X KO (CD70), CD70 CAR*) exi- biram morte celular surpreendentemente potente de numerosas linhas de células de tumor sólido após apenas 24 horas de cocultura (FIG. 40E mostra morte por células TCAR+4X KO e FIG. 40F mostra a morte por células T CAR 3X KO). Ambas as células TCAR+CD70 3X KO, e CAR +

CD70 4X KO, mataram >60% das células tumorais renais, pancreáticas e ovarianas (A498, ACHN, SK-OV-3 e Hs-766T) em uma razão de célula efetora:célula alvo de 4:1 e >50% em uma razão de célula efetora:célula alvo de 1:1. A morte celular de linhas de células de câncer que tinham expressão de CD70 de média a baixa (NCI-H1975, Calu-1 e DU 145) ainda foi eficaz com > 30% de morte em uma razão de célula efetora:cé- lula alvo de 4: 1 dentro de 24 horas de co- cultura (FIGS. 40E e 40F). À exposição mais longa (ou seja, 96 horas) a células T CD70 CAR + 3X KO ou 4X KO, resultou em um aumento na morte de células de câncer em todos os tipos de células, particularmente para células SKOV-3, Hs- 766T e NIC-H1975 em que matar era > 80% a uma razão de célula efe- tora:célula alvo de 1:1 (FIG. 40G). A morte de células SNU-1 foi avaliada por avaliação visual.

[477] A morte de células alvo após longa exposição a células T CAR+ também foi avaliada por microscopia para células de câncer SNU-1. As células SNU-1 foram plaqueadas a uma densidade de 1 mi- lhão de células por poço em uma placa de 6 poços e misturadas a uma razão de efetora:alvo de 4:1 com células T CAR* anti-CD70, 3X KO (CD70). A cocultura foi incubada por seis (6) dias e a presença de célu- las de câncer viáveis foi avaliada por microscópio. Todas as células alvo de carcinoma gástrico (SNU-1) foram eliminadas em poços contendo células TCAR* TRAC/B2M/CD70/anti-CD70, em comparação com os poços de controle, indicando que as células de câncer foram completa- mente eliminadas pelas células T CAR* anti-CD70 com uma cocultura estendida.

[478] A capacidade das células T CAR + anti-CD70 de matar sele- tivamente as células que expressam CD70 foi determinada. Um ensaio de citometria de fluxo foi concebido para testar a morte de linhas de suspensão de células de câncer (por exemplo, células de câncer K562, MM.1S e HuT78 que são referidas como "células alvo") por células T

CAR + anti-CD70 3X KO (CD70) (TRAC/B2M'//CD70). Duas das linhas de células alvo que foram usadas eram células de câncer que expres- sam CD70 (por exemplo, MM.1S e HuT78), enquanto uma terceira que foi usada como células de câncer de controle negativo não tem expres- são de CD70 (por exemplo, K562). As células T CAR+ TRAC'/B2M' ICD70/anti-CD70 foram cocultivadas com as linhas de células MM.1S ou HuT78 que expressam CD70 ou a linha de células K562 CD70-ne- gativa. As células alvo foram marcadas com 5 uM de efluor670 (eBios- ciences), lavadas e semeadas a uma densidade de 50.000 células alvo por poço em uma placa de fundo em U de 96 poços. As células alvo foram cocultivadas com células T CAR + anti-CD70 TRAC/B2M'//CD70 em razões variáveis (células T CAR + para células alvo de 0,5:1, 1:1, 2:1 e 4:1) e incubadas durante a noite. A morte das células alvo foi determi- nada após uma cocultura de 24 horas. As células foram lavadas e 200 uL de meio contendo uma diluição 1:500 de 5 mg/mL de DAP! (Molecu- lar Probes) (para enumerar células mortas/agonizantes) foi adicionado a cada poço. As células foram então analisadas por citometria de fluxo e a quantidade de células alvo vivas restantes foi quantificada.

[479] FIG. 40H, FIG. 40l e FIG. 40) demonstram a morte seletiva de células alvo por células TCAR+TRAC-/B2M-/CD70- anti-CD70. Uma cocultura de 24 horas com células T CAR + 3X KO (CD70) resultou na morte quase completa de células de linfoma de células T (HuT78), mesmo em uma razão baixa de células T CAR+ para células alvo que expressam CD70 de 0,5:1 (FIG. 40) ). Da mesma forma, uma cocultura de 24 horas resultou na morte quase completa de células de mieloma múltiplo (MM.1S) em todas as razões de células T CAR + para células alvo testadas (FIG. 401). Verificou-se que a morte de células alvo era seletiva, pois as células TCAR+TRAC-/B2M-/anti-CD70 não induziam a morte de células K562 deficientes em CD70 que estavam acima do nível das amostras de controle (por exemplo, células de câncer sozinhas ou cocultura sem células T RNP) em qualquer razão célula efetora:cé- lula alvo testada (FIG. 40H).

[480] Ensaio de Liberação de Citocina. Um ensaio de liberação de citocina foi realizado como descrito acima. A capacidade das células T CAR* anti-CD70 de inativação dupla, inativação tripla e inativação qu- ádrupla para produzir IL-2 e IFN-g quando cocultivadas na presença de células ACHN após co-incubação de 24 horas a uma razão (célula T CAR: célula alvo ACHN) de 0,25:1 foi avaliada usando um ensaio ELISA. IL-2 e IFN-g de sobrenadantes de coculturas de células foram medidos. As células TCAR+TRAC-/B2M-/CD70-/anti-CD70 de inativa- ção tripla e as células TCAR+TRAC-/B2M-/PD-1-/CD70-/anti-CD70 de inativação quádrupla secretaram os níveis mais elevados de IFN-g (FIG.41) e IL-2 (FIG. 41B) quando cultivadas com células ACHN. Em conclusão, a inativação de CD70 ou de ambos PD-1 e CD70 juntos me- lhora a capacidade de morte celular das células CAR + anti-CD70 em células ACHN. Exemplo 12. Eficácia de CD70 KO em células T CAR+ anti-CD70: O modelo de Xenoenxerto de Tumor em Camundongos NOG Tratamento no Modelo de Tumor Ovariano

[481] A capacidade das células T que expressam um CAR CD70 para eliminar células de adenocarcinoma ovariano que expressam níÍ- veis moderados de CD70 foi avaliada in vivo usando um modelo de xe- noenxerto de tumor de carcinoma de ovariano subcutâneo (SKOV-3) em camundongos.

[482] CRISPR/Cas9 e AAV6 foram usados como acima (ver, por exemplo, Exemplo 3) para gerar células T humanas que não têm ex- pressão de TCR, B2M e CD70 com expressão concomitante do locus TRAC usando um construto CAR com alvo em BCMA (SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46. Neste exemplo, as células T ativadas foram primeiro eletroporadas com 3 complexos Cas9:sgRNA RNP distintos contendo

SgRNAs direcionados a TRAC (SEQ ID NO: 40), B2M (SEQ ID NO: 41), e CD70 (SEQ ID NO: 36 ou 37). A quebra de cadeia dupla do DNA no locus TRAC foi reparada por reparação direcionada por homologia com um modelo de DNA entregue por AAV6 (SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45 (que codifica CAR anti-CD70 compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 45) contendo braços de homologia esquerdo e direito do locus de TRAC que flanqueiam um cassete de receptor de antígeno quimérico (-/+ elementos reguladores para a expressão do gene).

[483] As células T modificadas resultantes são células T CAR + anti-CD70 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-). A capacidade destas células T CAR anti-CD70 para melhorar a doença causada por uma linha de cé- lulas de carcinoma ovariano CD70+foi avaliada em camundongos NOG usando métodos aplicados por Translational Drug Development, LLC (Scottsdale, AZ). Brevemente, 12 camundongos fêmeas CIEA NOG (NOD.Cg-Prkdc*“d|12rg""!Su9/ J icTac), de 5-8 semanas de idade, foram alojados individualmente em gaiolas de micro-isolador ventiladas, man- tidos sob condições livres de patógenos, 5-7 dias antes do início do es- tudo. Os camundongos receberam uma inoculação subcutânea de 5x105 células SKOV-3 de carcinoma ovariano/camundongo no flanco posterior direito. Quando o tamanho médio do tumor atingiu 25-75 mm? (alvo de — 50 mm?3), os camundongos foram divididos em dois grupos de tratamento, conforme mostrado na Tabela 23. No Dia 1, o grupo 2 de tratamento recebeu uma única dose intravenosa de 200 uL de célu- las T CAR+ anti-CD70 de acordo com a Tabela 23. Tabela 23. Grupos de tratamento

[484] O volume do tumor foi medido 2 vezes por semana a partir do dia do início do tratamento. No dia 9 após a injeção, os tumores tra-

tados com células T CAR anti-CD70 começaram a mostrar uma diminui- ção no volume do tumor em relação aos tumores em animais não trata- dos. No dia 17 após a injeção, os tumores de câncer de ovário CD70+ em camundongos tratados com células T CAR anti-CD70 foram com- pletamente eliminados. Esta regressão completa do crescimento do tu- mor foi mantida em animais tratados até o dia 44 pós-injeção, após o que 4 de 5 camundongos tratados com células TCAR anti-CD70 perma- neceram livres de tumor até o final da observação (dia 69) (FIG. 42A). Estes dados demonstram que células CAR+ anti-CD70 (TRAC-/B2M- ICD70-) 3X KO são altamente potentes in vivo para o tratamento de tu- mores de ovário humanos. Tratamento no Modelo de Tumor de Carcinoma Pulmonar de Células não Pequenas (NSCLC)

[485] A capacidade das células T que expressam um CAR CD70 para eliminar células de adenocarcinoma pulmonar que expressam níÍ- veis moderados de CD70 foi avaliada in vivo usando um modelo de xe- noenxerto de tumor de carcinoma de pulmão subcutâneo (NCI-H1975) em camundongos.

[486] CRISPR/Cas9 e AAV6 foram usados como acima (ver, por exemplo, Exemplo 3) para criar células T humanas que não têm expres- são de TCR, B2M e CD70 com expressão concomitante do locus TRAC usando um construto CAR com alvo em BCMA (SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44). Neste exemplo, as células T ativadas foram primeiro eletro- poradas com 3 complexos Cas9:sgRNA RNP distintos contendo sgR- NAs direcionados a TRAC (SEQ ID NO: 40), B2M (SEQ ID NO: 41), e CD70 (SEQ ID NO: 36 ou 37). A quebra de cadeia dupla do DNA no locus TRAC foi reparada por reparação direcionada por homologia com um modelo de DNA AAV6-entregue (SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 (que codifica CAR anti-CD70 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 45) contendo braços de homologia esquerdo e direito do locus de TRAC que flanqueiam um cassete de receptor de antígeno quimérico (-/+ elementos reguladores para a expressão do gene).

[487] As células T modificadas resultantes são células T CAR + anti-CD70 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) (com domínio coestimulatório 41BB). A capacidade destas células T CAR anti-CD70 para melhorar a doença causada por uma linha de células de carcinoma pulmonar CD70+ foi avaliada em camundongos NOG usando métodos aplicados por Translational Drug Development, LLC (Scottsdale, AZ). Breve- mente, 12 camundongos fêmeas CIEA NOG (NOD.Cg-Prkdc”* cid 71 2rgtmiSu9/ ) jicTac) de 5-8 semanas de idade foram alojados individu- almente em gaiolas de micro-isolador ventiladas, mantidos sob condi- ções livres de patógenos, 5-7 dias antes do início do estudo. Os camun- dongos receberam uma inoculação subcutânea de 5x105 células NCI- H1975 de carcinoma pulmonar/camundongo no flanco posterior direito. Quando o tamanho médio do tumor atingiu 25-75 mm? (alvo de — 50 mm3?), os camundongos foram divididos em 2 grupos de tratamento, conforme mostrado na Tabela 24. No Dia 1, o grupo 2 de tratamento recebeu uma única dose intravenosa de 200 uL de células TCAR+anti- CD70 de acordo com a Tabela 24.

Tabela 24. Grupos de tratamento BP E CASES | TremeneceueTtthy NO)

[488] O volume do tumor foi medido 2 vezes por semana a partir do dia do início do tratamento. No dia 12 após a injeção, os tumores tratados com células T CAR anti-CD70 começaram a mostrar uma dimi- nuição no volume do tumor em relação aos tumores em animais não tratados. Esta regressão completa de tumores em animais tratados con- tinua até o dia 33 após a injeção. O tratamento com células T CAR anti- CD70 resultou em atividade potente contra xenoenxertos de câncer de pulmão H1975 estabelecidos durante 40 dias após a injeção (o cresci- mento do tumor foi suprimido em todos os camundongos até o dia 40 com tamanho do tumor <100 mm?), após o que os tumores começaram a crescer. (FIG. 42B). Estes dados demonstram que as células CAR + anti-CD70 (TRAC-/B2M-/CD70-) 3X KO têm atividade potente contra tu- mores de câncer de pulmão humano CD70+in vivo. Tratamento no Modelo de Tumor Pancreático

[489] A capacidade das células T que expressam um CAR CD70 para eliminar células de carcinoma pancreático que expressam níveis moderados de CD70 foi avaliada in vivo usando um modelo de xenoen- xerto de tumor de carcinoma pancreático subcutâneo (Hs766T) em ca- mundongos.

[490] CRISPR/Cas9 e AAV6 foram usados como acima (ver, por exemplo, Exemplo 3) para criar células T humanas que não têm expres- são de TCR, B2M e CD70 com expressão concomitante do locus TRAC usando um construto CAR com alvo em BCMA (SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44). Neste exemplo, as células T ativadas foram primeiro eletro- poradas com 3 complexos Cas9:sgRNA RNP distintos contendo sgR- NAs direcionados a TRAC (SEQ ID NO: 40), B2M (SEQ ID NO: 41), e CD70 (SEQ ID NO: 36 ou 37). A quebra de cadeia dupla do DNA no locus TRAC foi reparada por reparação direcionada por homologia com um modelo de DNA AAV6-entregue (SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 (que codifica CAR anti-CD70 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 45) contendo braços de homologia esquerdo e direito do locus de TRAC que flanqueiam um cassete de receptor de antígeno quimérico (-/+ elementos reguladores para a expressão do gene).

[491] As células T modificadas resultantes são células T CAR + anti-CD70 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-). A capacidade destas células T

CAR anti-CD70 para melhorar a doença causada por uma linha de cé- lulas de carcinoma pancreático CD70+ foi avaliada em camundongos NOG usando métodos aplicados por Translational Drug Development, LLC (Scottsdale, AZ). Brevemente, 12 camundongos fêmeas CIEA NOG (NOD.Cg-Prkdc*“12rg"m!5u9/) icTac) de 5-8 semanas de idade fo- ram alojados individualmente em gaiolas de micro-isolador ventiladas, mantidos sob condições livres de patógenos, 5-7 dias antes do início do estudo. Os camundongos receberam uma inoculação subcutânea de 5x105 células Hs766T de carcinoma pancreático no flanco posterior di- reito. Quando o tamanho médio do tumor atingiu 25-75 mm? (alvo de — 50 mm?), os camundongos foram divididos em 2 grupos de tratamento, conforme mostrado na Tabela 25. No Dia 1, o grupo de tratamento 2 recebeu uma única dose intravenosa de 200 uL de células T CAR anti- CD70 de acordo com Tabela 25. Tabela 25. Grupos de tratamento BP E o ESB ASTRR o rave ceu TA NO)

[492] O volume do tumor foi medido 2 vezes por semana a partir do dia do início do tratamento. No dia 15 pós-injeção, os tumores trata- dos com células T CAR anti-CD70 começaram a mostrar uma diminui- ção no volume do tumor em todos os camundongos tratados. O trata- mento com células T CAR anti-CD70 reduziu efetivamente o tamanho dos tumores de câncer pancreático CD70, em todos os camundongos testados (<37 mm?) sem evidência de crescimento adicional durante o estudo (até o Dia 67) (FIG. 42C). Estes dados demonstram que células CAR +anti-CD70 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) induzem regressão de tu- mores de câncer pancreático CD70 humano in vivo, com atividade po- tente contra xenoenxertos de câncer pancreático Hs766T estabelecidos e respostas duráveis além de 60 dias após o início do tratamento. Tratamento no Modelo de Xenoenxerto de Tumor de Linfoma de Células T Cutâneo

[493] A capacidade das células T que expressam um CAR anti- CD70 para eliminar o linfoma de células T foi avaliada in vivo usando um modelo de xenoenxerto de tumor de linfoma de células T subcutâneo (Hu T78) em camundongos.

[494] CRISPR/Cas9 e AAV6 foram usados como acima (ver, por exemplo, Exemplos 3) para criar células T humanas que não têm ex- pressão de TCR, B2M e CD70 com expressão concomitante do locus TRAC usando um construto CAR com alvo em BCMA (SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44). Neste exemplo, as células T ativadas foram primeiro eletroporadas com 3 complexos Cas9:sgRNA RNP distintos contendo SgRNAs direcionados a TRAC (SEQ ID NO: 40), B2M (SEQ ID NO: 41), e CD70 (SEQ ID NO: 36 ou 37). A quebra de cadeia dupla do DNA no locus TRAC foi reparada por reparação direcionada por homologia com um modelo de DNA AAV6-entregue (SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 (que codifica CAR anti-CD70 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 45) contendo braços de homologia esquerdo e direito do locus de TRAC que flanqueiam um cassete de receptor de antígeno quimérico (-/+ elementos reguladores para a expressão do gene).

[495] As células T modificadas resultantes são células T CAR + anti-CD70 (TRAC-/B2M-/CD70-) 3X KO. A capacidade dessas células T CAR anti-CD70 para melhorar a doença causada por uma linha de cé- lulas de linfoma de células T CD70 foi avaliada em camundongos NOG usando métodos aplicados por Translational Drug Development, LLC (Scottsdale, AZ). Brevemente, 12 camundongos fêmeas CIEA NOG (NOD.Cg-Prkdc*“d|12rg""!Su9/ JicTac) de 5-8 semanas de idade foram alojados individualmente em gaiolas de micro-isolador ventiladas, man- tidos sob condições livres de patógenos, 5-7 dias antes do início do es- tudo. Camundongos receberam uma inoculação subcutânea de 3x10º células de linfoma de células T HuT78 no flanco posterior direito.

Quando o tamanho médio do tumor atingiu 25-75 mm? (alvo de — 50 mm?), os camundongos foram divididos em 2 grupos de tratamento, conforme mostrado na Tabela 26. No Dia 1, o grupo de tratamento 2 recebeu uma única dose intravenosa de 200 uL de células T CAR anti- CD70 de acordo com Tabela 26. Tabela 26. Grupos de tratamento FR JE LOJA emesamettmm TT E ETERNO arame mraveeTaE

[496] O volume do tumor foi medido 2 vezes por semana a partir do dia do início do tratamento. No dia 12 pós-injeção, os tumores trata- dos com células T CAR anti-CD70 começaram a mostrar uma diminui- ção no volume do tumor em todos os camundongos tratados. O trata- mento com células T CAR + anti-CD70 reduziu efetivamente o tamanho dos tumores de linfoma de células T CD70+, em todos os camundongos testados no Dia 15 (FIG. 42C). Estes dados demonstram que células CAR +anti-CD70 3X KO (TRAC-/B2M-/CD70-) induzem regressão de tu- mores de linfoma de células T CD70+ humano invivo, com atividade po- tente contra xenoenxertos de linfoma de células T HuT78 estabelecidos. Resumo das Sequências E get ARGASERAE AAA E [8 | rgeTA | AAGAGCAACASTGCCTGGAGEAACAAATETGACTAMGAGEAMCAMATETGMET | [8 ger | AAGAGCAACASTOCTOTOGGCECTOGAGEAACAMATETGACTAMGAGEAAEAMATETGAET | E get | AAGAGCARCAGTGCTOTGTOCETGGAGCARCARATCTGACTARGAGERAEAAATETGAE Taere CGTOGTCTTAGETGTGCTCGCGCTACTCICTCITTCTGCCTGGAGGCTATCCAGEGTGAO-

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To70 GAGATGTANGGAGCTOCTGTGACTTOCTCAAGGCCTTATATCGAGTARACGGTAGTO- LHA a RHA CTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAMACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTG (scFV CD7OB com | ATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAMACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCC- 4188) TAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTITITCCCATGCCTGCCTITAC TCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTITTGAAGAAGATCCTATTAMATAMMAGAATAAGCAG-

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45 Sequência de nu- ATGGCGCTTCCGGTGACAGCACTGCOTCCOTCCCCETTGGCGCTGTTGCTCCACGCAGCAAGG- cleotídeos de CAR CCGCAGGTCCAGTTGGTGCAMAGCGGGGCGGAGGTGAMAMAACCCGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCCTGTAAGG (scFV CD70B com | CTGAAATGGATGGGGTGGATAAATACCTACACCGGCGAACCTACATACGCCGACGCTTTTAMAGGGCGAGTCACT Sequência de ami- MALPVTALLLPLALLLHAAR PQVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVR- noácidos de CAR QAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADAFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDYGDYGMDYWGQGTT (scFV CD70B com FMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYY CQHSREVPWTFGQGTKVEIKSA

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56 Sequência de nu- ATGGCGCTTCCGGTGACAGCACTGCOTCCOTCCCCETTGGCGCTGTTGCTCCACGCAGCAAGG- 57 Sequência de ami- MALPVTALLLPLALLLHAAR PQVOLVOSGAELKKPGASVKVSCKASGNTLTNYVIHWVR- noácidos de CAR QAPGQRLEWMGYILPYNDLTKYSQKFQGRVTITRDKSASTAY MELSSLRSEDTAVYY CTRWDWDGFFDPWGQGTTVY

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MKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 151 Sequência de ami- DIQMTQOTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIVHTSRLHSGVPS- noácidos CD19 | RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVA Ligante sublinhado | DNSKSQVFLKMNSLQTDDTANYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS Ds ENTE 153 VL ant-CD19 DIQMTOTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIVHTSRLHSGVPS- Fo ESET — og pe “2

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[497] Todas as referências, patentes e pedidos de patentes divul- gados neste documento são incorporados por referência em relação à matéria técnica para a qual cada uma é citada, o que em alguns casos pode abranger a totalidade do documento.

[498] Os artigos indefinidos "um" e "uma", conforme aqui usados na especificação e nas reivindicações, a menos que seja claramente indicado o contrário, devem ser entendidos como significando "pelo me- nos um".

[499] Também deve ser entendido que, a menos que seja clara- mente indicado o contrário, em quaisquer métodos reivindicados neste documento que incluam mais de uma etapa ou ato, a ordem das etapas ou atos do método não está necessariamente limitada à ordem em que as etapas ou atos do método são recitados.

[500] Nas reivindicações, bem como no relatório descritivo acima, todas as frases de transição, tais como "compreendendo", "incluindo", "transportando", "tendo", "contendo", "envolvendo", "segurando", "com- posto por," e similares devem ser entendidas como abertas, isto é, como incluindo, mas não se limitando a. Apenas as frases transitórias “consis- tindo em” e “consistindo essencialmente em” devem ser frases transitó-

rias fechadas ou semifechadas, respectivamente, conforme estabele- cido no Manual de Procedimentos de Exame de Patentes do Escritório de Patentes dos Estados Unidos, Seção 2111.03.

[501] Os termos "cerca de" e "substancialmente" precedendo um valor numérico significam +10% do valor numérico recitado.

[502] Quando uma gama de valores é fornecida, cada valor entre as extremidades superior e inferior da gama é especificamente contem- plado e descrito aqui.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que com- preende um gene CD70 interrompido e um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) que não se liga a CD70.

2. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um gene da região constante alfa do receptor de células T interrompido (TRAC).

3. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um gene interrom- pido beta-2-microglobulina (B2M).

4. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC interrompido compre- ende o ácido nucleico que codifica o CAR.

5. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende um ectodomínio que se liga ao antígeno de maturação de células anti- B (BCMA).

6. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o ectodomínio compreende um anticorpo anti-BCMA.

7. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o ectodomínio compreende um frag- mento variável de cadeia única anti-BCMA (scFv).

8. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-BCMA compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia variável pe- sada (VH) e as mesmas CDRs de cadeia variável leve (VL) como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 60 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 61.

9. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-<BCMA compreende cadeias VH e VL compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 60 e 61, respectivamente.

10. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-5BCMA compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.

11. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende um ectodomínio que se liga a CD33.

12. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o ectodomínio compreende um anticorpo anti-CD33.

13. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o ectodomínio compreende um scFv anti- CD33.

14. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD33 compreende as mes- mas CDRs VH e as mesmas CDRs de cadeia VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH es- tabelecida como SEQ ID NO: 140 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 141.

15. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD33 compreende cadeias VH e VL compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 140 e 141, respectivamente.

16. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que scFv anti-CD33 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137.

17. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende um ectodomínio que se liga a CD19.

18. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o ectodomínio compreende um anticorpo anti-CD19.

19. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o ectodomínio compreende um scFv anti- CD19.

20. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD19 compreende as mes- mas CDRs VH e as mesmas CDRs de cadeia VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH es- tabelecida como SEQ ID NO: 152 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 153.

21. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD19 compreende cadeias VH e VL compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 152 e 153, respectivamente.

22. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que scFv anti-CD19 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 151.

23. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; (iii) um gene CD70 interrompido; e (iv) um ácido nucleico que codifica um CAR que se liga a CD70.

24. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC interrompido compreende o ácido nucleico que codifica o CAR.

25. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende um ectodomí- nio compreendendo um anticorpo anti-CD70.

26. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende um ectodomí- nio compreendendo um scFv anti-CD70.

27. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD70 compreende as mes- mas CDRs VH e as mesmas CDRs VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 51 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 52.

28. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD70 compreende cadeias VH e VL compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51 e 52, respectivamente.

29. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que scFv anti-CD70 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 ou 50.

30. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que scFv anti-CD70 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.

31. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizada pelo fato de que o CAR compre- ende um domínio coestimulatório CD28 ou 41BB.

32. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizada pelo fato de que o CAR compre- ende um domínio de sinalização CD3C.

33. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizada pelo fato de que o CAR compre- ende um domínio transmembranar de CD8.

34. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 33, caracterizada pelo fato de que há uma deleção no gene TRAC relativo às células T não modificadas.

35. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a deleção é de 15-30 pares de bases.

36. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a deleção é de 20 pares de bases.

37. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a deleção compreende a SEQ ID NO: 86.

38. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido.

39. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequên- cia de ácido nucleico é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 45; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido.

40. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 45.

41. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um gene TRAC interrompido compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 44;

(ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido.

42. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 44.

43. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizada pelo fato de que a célula T manipu- lada compreende um gene interrompido de morte celular programada-1 (PD-1).

44. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizada pelo fato de que a célula T manipu- lada mantém a citotoxicidade após 5 novos desafios com uma célula alvo, em que a célula alvo expressa um antígeno específico para o CAR.

45. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que a célula T manipulada mantém a citoto- xicidade após 10 novos desafios com a célula alvo.

46. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizada pelo fato de que a célula alvo é uma célula de cân- cer.

47. População de células, compreendendo células T mani- puladas, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas com- preendem um gene CD70 interrompido e um ácido nucleico que codifica um CAR que não se liga a CD70.

48. População de células, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um gene TRAC inter- rompido.

49. População de células, de acordo com a reivindicação 47 ou 48, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um gene B2M interrompido.

50. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 49, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC interrompido compreende o ácido nucleico que codifica o CAR.

51. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 50, caracterizada pelo fato de que o CAR compre- ende um ectodomínio que se liga ao antígeno de maturação de células anti-B (BCMA).

52. População de células, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que o ectodomínio compreende um anticorpo anti-BCMA.

53. População de células, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que o ectodomínio compreende um frag- mento variável de cadeia única anti-BCMA (scFv).

54. População de células, de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-<BCMA compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia variável pe- sada (VH) e as mesmas CDRs de cadeia variável leve (VL) como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 60 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 61.

55. População de células, de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-BCMA compreende cadeias VH e VL compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 60 e 61, respectivamente.

56. População de células, de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-<BCMA compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.

57. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 50, caracterizada pelo fato de que o CAR compre- ende um ectodomínio que se liga a CD33.

58. População de células, de acordo com a reivindicação 57,

caracterizada pelo fato de que o ectodomínio compreende um anticorpo anti-CD33.

59. População de células, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que o ectodomínio compreende um scFv anti- CD33.

60. População de células, de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD33 compreende as mes- mas CDRs VH e as mesmas CDRs de cadeia VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH es- tabelecida como SEQ ID NO: 140 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 141.

61. População de células, de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD33 compreende cadeias VH e VL compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 140 e 141, respectivamente.

62. População de células, de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD33 compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137.

63. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 50, caracterizada pelo fato de que o CAR compre- ende um ectodomínio que se liga a CD19.

64. População de células, de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pelo fato de que o ectodomínio compreende um anticorpo anti-CD19.

65. População de células, de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pelo fato de que o ectodomínio compreende um scFv anti- CD19.

66. População de células, de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD19 compreende as mes- mas CDRs VH e as mesmas CDRs de cadeia VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH es- tabelecida como SEQ ID NO: 152 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 153.

67. População de células, de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD19 compreende cadeias VH e VL compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 152 e 153, respectivamente.

68. População de células, de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD19 compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151.

69. População de células que compreende células T mani- puladas, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas com- preendem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; (ii) um gene CD70 interrompido; e (iv) um ácido nucleico que codifica um CAR que se liga a CD70.

70. População de células, de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende um ectodomínio compreendendo um anticorpo anti-CD70.

71. População de células, de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende um ectodomínio compreendendo um scFv anti-CD70.

72. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 71, caracterizada pelo fato de que o CAR compre- ende um domínio coestimulatório CD28 ou 41BB.

73. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 72, caracterizada pelo fato de que o CAR compre- ende um domínio de sinalização CD3C.

74. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 73, caracterizada pelo fato de que o CAR compre- ende um domínio transmembranar de CD8.

75. População de células que compreende células T mani- puladas, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas com- preendem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; (iii) um gene CD70 interrompido; (iv) um ácido nucleico que codifica um CAR compreendendo (a) um ec- todomínio que compreende um scFv anti-CD70, (b) um domínio trans- membranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório 41BB e um domínio de sinalização CD3z.

76. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 75, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC interrompido compreende o ácido nucleico que codifica o CAR.

77. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 71 a 76, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD70 compreende as mesmas CDRs VH e as mesmas CDRs VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 51 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 52.

78. População de células, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD70 compreende cadeias VH e VL compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51 e 52, respectivamente.

79. População de células, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD70 compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 ou 50.

80. População de células, de acordo com a reivindicação 77,

caracterizada pelo fato de que o scFv anti-CD70 compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.

81. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 80, caracterizada pelo fato de que há uma deleção no gene TRAC relativo às células T não modificadas.

82. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que a deleção é de 15-30 pares de bases.

83. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que a deleção é de 20 pares de bases.

84. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que a deleção compreende a SEQ ID NO: 86.

85. População de células que compreende células T mani- puladas, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas com- preendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido.

86. População de células que compreende células T mani- puladas, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas com- preendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequên- cia de ácido nucleico é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 45; (ii) um gene B2M interrompido; e (ili) um gene CD70 interrompido.

87. População de células, de acordo com a reivindicação 86, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 45.

88. População de células que compreende células T mani- puladas, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas com- preendem: (i) um gene TRAC interrompido compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 44; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido.

89. População de células, de acordo com a reivindicação 88, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 44.

90. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 89, caracterizada pelo fato de que a célula T mani- pulada mantém a citotoxicidade após 5 novos desafios com uma célula alvo, em que a célula alvo expressa um antígeno específico para o CAR.

91. População de células, de acordo com a reivindicação 90, caracterizada pelo fato de que a célula T manipulada mantém a citoto- xicidade após 10 novos desafios com a célula alvo.

92. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a 91, caracterizada pelo fato de que a célula alvo é uma célula de câncer.

93. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 92, caracterizada pelo fato de que o gene B2M in- terrompido compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos se- lecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOS: 9-14.

94. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 93, caracterizada pelo fato de que o gene CD70 in- terrompido compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos se- lecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOS: 129-134.

95. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 94, caracterizada pelo fato de que pelo menos 90%

das células T manipuladas não expressam um nível detectável de pro- teína de superfície TOR.

96. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 95, caracterizada pelo fato de que as células T ma- nipuladas: (a) exibem capacidade proliferativa celular aumentada; (b) exibem aumento da lise celular; (c) exibem exaustão celular reduzida; (d) mantêm a proliferação dependente de citocinas; (e) exibem secreção aumentada de citocinas; ou (f) qualquer combinação de (a) - (e), em relação às células T de controle, em que as células T de controle expressam a proteína CD70 endógena.

97. Método, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um sujeito da população de células, como definida em qualquer uma das reivindicações 47 a 96.

98. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que as células T manipuladas são células T humanas ma- nipuladas.

99. Método, de acordo com a reivindicação 97 ou 98, carac- terizado pelo fato de que o sujeito tem um câncer.

100. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracteri- zado pelo fato de que o câncer expressa CD70, BMCA, CD19, CD33 ou suas combinações.

101. Método, de acordo com a reivindicação 99 ou 100, ca- racterizado pelo fato de que a população de células é administrada ao sujeito em uma quantidade eficaz para tratar o câncer.

102. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 99 a 101, caracterizado pelo fato de que o câncer é uma maligni- dade de tumor sólido ou uma malignidade hematológica.

103. Método, de acordo com a reivindicação 102, caracteri- zado pelo fato de que a malignidade do tumor sólido é selecionada do grupo que consiste em: tumor ovariano, tumor pancreático, tumor renal, tumor pulmonar e tumor intestinal.

104. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracteri- zado pelo fato de que a população de células é administrada ao sujeito em uma quantidade eficaz para reduzir o volume de um tumor no sujeito.

105. Método de tratamento de câncer em um sujeito carac- terizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito a popula- ção de células, como definida qualquer uma das reivindicações 47 a 96.

106. Método de tratamento de câncer em um sujeito, carac- terizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido, tratando assim o câncer no sujeito.

107. Método de tratamento de câncer em um sujeito, carac- terizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequên- cia de ácido nucleico é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 45; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido, tratando assim o câncer no sujeito.

108. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracteri- zado pelo fato de que o gene TRAC interrompido compreende a sequên- cia de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 45.

109. Método de tratamento de câncer em um sujeito, carac- terizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 44; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD70 interrompido, tratando assim o câncer no sujeito.

110. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracteri- zado pelo fato de que o gene TRAC interrompido compreende a sequên- cia de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 44.

111. Método para produzir uma célula T manipulada, carac- terizado pelo fato de que o método compreende: (a) entregar a uma célula T uma nuclease guiada por RNA, um gRNA com alvo em um gene CD70, e um vetor que compreende um modelo doador que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR; e (b) produzir uma célula T manipulada compreendendo um gene CD70 interrompido e expressando o CAR.

112. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracteri- zado pelo fato de que compreende ainda a entrega à célula T de um gRNA com alvo em um gene TRAC; em que a célula T manipulada com- preende ainda um gene TRAC interrompido.

113. Método, de acordo com a reivindicação 112, caracteri- zado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado por braços de homologia esquerdo e direito para o gene TRAC; e em que a célula T manipulada compreende o ácido nucleico que codifica o CAR no gene TRAC.

114. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 111 a 113, caracterizado pelo fato de que compreende ainda en- tregar à célula T um gRNA com alvo em um gene B2M; em que a célula T manipulada compreende ainda um gene B2M interrompido.

115. Método para produzir uma célula T manipulada, carac- terizado pelo fato de que o método compreende (a) entregar a uma célula T uma nuclease guiada por RNA, um gRNA com alvo em um gene TRAC, um gRNA com alvo em um gene B2M, um gRNA com alvo em um gene CD70, e um vetor que compreende um modelo doador que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR; e (b) produzir uma célula T manipulada.

116. Método, de acordo com a reivindicação 115, caracteri- zado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado pelos braços de homologia direito e esquerdo para o locus do gene TRAC.

117. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 111 a 116, caracterizado pelo fato de que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcionalmente uma nuclease Cas9 de S. pyogenes.

118. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 112 a 117, caracterizado pelo fato de que o gRNA com alvo no gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 98 ou tem alvo na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 118, e opcio-

nalmente em que o gRNA com alvo no gene TRAC compreende a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 30.

119. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 114 a 118, caracterizado pelo fato de que o gRNA com alvo no gene B2M compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 99 ou tem alvo na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 119, e opcional- mente em que o gRNA com alvo no gene B2M compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31.

120. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 111 a 119, caracterizado pelo fato de que o gRNA com alvo no gene CD70 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 94 ou 95 ou tem alvo na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 114 ou 115, e opcionalmente em que o gRNA com alvo no gene CD70 compre- ende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 26 ou 27.

121. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 111 a 120, caracterizado pelo fato de que a nuclease guiada por RNA e o gRNA são complexados em uma partícula de ribonucleoprote- ína (RNP).

122. Método para produzir uma célula T manipulada para imunoterapia contra uma célula alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) interromper um gene CD70 em uma célula T, e (b) expressar um CAR que se liga a um antígeno expresso na célula alvo, em que o antígeno não é CD70.

123. Método, de acordo com a reivindicação 122, caracteri- zado pelo fato de que a célula alvo é uma célula de câncer.

124. Método, de acordo com a reivindicação 122 ou 123, ca- racterizado pelo fato de que o método é ex vivo.

125. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 122 a 124, caracterizado pelo fato de que compreende ainda inter- romper um gene TRAC na célula T.

126. Método, de acordo com a reivindicação 125, caracteri- zado pelo fato de que o CAR é codificado por um ácido nucleico no gene TRAC interrompido.

127. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 122 a 126, caracterizado pelo fato de que compreende ainda inter- romper um gene B2M na célula T.

128. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 111 a 127, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende um ectodomínio que se liga ao antígeno de maturação de células anti-B (BCMA).

129. Método, de acordo com a reivindicação 128, caracteri- zado pelo fato de que o ectodomínio compreende um anticorpo anti- BCMA.

130. Método, de acordo com a reivindicação 128, caracteri- zado pelo fato de que o ectodomínio compreende um fragmento variável de cadeia única anti-BCMA (scFv).

131. Método, de acordo com a reivindicação 130, caracteri- zado pelo fato de que o scFv anti-BCMA compreende regiões determi- nantes de complementaridade (CDRs) de cadeia variável pesada (VH) e as mesmas CDRs de cadeia variável leve (VL) como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH es- tabelecida como SEQ ID NO: 60 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 61.

132. Método, de acordo com a reivindicação 130, caracteri- zado pelo fato de que o scFv anti-<BCMA compreende cadeias VH e VL compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 60 e 61, respectivamente.

133. Método, de acordo com a reivindicação 130, caracteri- zado pelo fato de que o scFv anti-BCMA compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.

134. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 111 a 127, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende um ectodomínio que se liga a CD33.

135. Método, de acordo com a reivindicação 134, caracteri- zado pelo fato de que o ectodomínio compreende um anticorpo anti- CD33.

136. Método, de acordo com a reivindicação 134, caracteri- zado pelo fato de que o ectodomínio compreende um scFv anti-CD33.

137. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracteri- zado pelo fato de que o scFv anti-CD33 compreende as mesmas CDRs VHe as mesmas CDRs de cadeia VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 140 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 141.

138. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracteri- zado pelo fato de que o scFv anti-CD33 compreende cadeias VH e VL compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 140 e 141, respectivamente.

139. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracteri- zado pelo fato de que o scFv anti-CD33 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137.

140. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 111 a 127, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende um ectodomínio que se liga a CD19.

141. Método, de acordo com a reivindicação 140, caracteri- zado pelo fato de que o ectodomínio compreende um anticorpo anti- CD19.

142. Método, de acordo com a reivindicação 140, caracteri- zado pelo fato de que o ectodomínio compreende um scFv anti-CD19.

143. Método, de acordo com a reivindicação 142, caracteri- zado pelo fato de que o scFv anti-CD19 compreende as mesmas CDRs VH e as mesmas CDRs de cadeia VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 152 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 153.

144. Método, de acordo com a reivindicação 142, caracteri- zado pelo fato de que o scFv anti-CD19 compreende cadeias VH e VL compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 152 e 153, respectivamente.

145. Método, de acordo com a reivindicação 142, caracteri- zado pelo fato de que o scFv anti-CD19 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 150.

146. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 111 a 127, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende um ectodomínio que se liga a CD70.

147. Método, de acordo com a reivindicação 146, caracteri- zado pelo fato de que o ectodomínio compreende um anticorpo anti- CD7O.

148. Método, de acordo com a reivindicação 146, caracteri- zado pelo fato de que o ectodomínio compreende um scFv anti-CD70.

149. Método, de acordo com a reivindicação 148, caracteri- zado pelo fato de que o scFv anti-CD70 compreende as mesmas CDRs VH e as mesmas CDRs VL como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende uma VH estabelecida como SEQ ID NO: 51 e uma VL estabelecida como SEQ ID NO: 52.

150. Método, de acordo com a reivindicação 148, caracteri- zado pelo fato de que o scFv anti-CD70 compreende cadeias VH e VL compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ

ID NOs: 51 e 52, respectivamente.

151. Método, de acordo com a reivindicação 148, caracteri- zado pelo fato de que o scFv anti-CD70 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 ou 50.

152. Método, de acordo com a reivindicação 148, caracteri- zado pelo fato de que o scFv anti-CD70 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.

153. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 111 a 152, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende um domínio coestimulatório CD28 ou 41BB.

154. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 111 a 153, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende um domínio de sinalização CD3C.

155. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 111 a 154, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende um domínio transmembranar de CD8.

156. População de células T manipuladas, caracterizada pelo fato de que são produzidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 111 a 155.

157. Método de aumento da proliferação de células T, carac- terizado pelo fato de que compreende interromper o gene CD70 nas células T.

158. Método de redução da exaustão de células T, caracte- rizado pelo fato de que compreende interromper o gene CD70 nas cé- lulas T.

159. Método, de acordo com a reivindicação 157 ou 158, ca- racterizado pelo fato de que o gene CD70 é interrompido pela edição do gene CRISPR/Cas.

160. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 157 a 159, caracterizado pelo fato de que compreende ainda inter- romper o gene TRAC, o gene B2M, ou ambos os genes TRAC e B2M nas células T.

161. Método, de acordo com a reivindicação 160, caracteri- zado pelo fato de que o gene TRAC, gene B2M ou ambos os genes TRAC e B2M são interrompidos pela edição do gene CRISPR/Cas.

162. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 57.

163. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 162, caracterizada pelo fato de que o CAR é codificado por uma sequên- cia de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 56.

164. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 139.

165. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 164, caracterizada pelo fato de que o CAR é codificado por uma sequên- cia de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 136.

166. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 149.

167. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 166, caracterizada pelo fato de que o CAR é codificado por uma sequên- cia de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 148.

168. População de células, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57.

169. População de células, de acordo com a reivindicação 168, caracterizada pelo fato de que o CAR é codificado por uma sequên- cia de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 56.

170. População de células, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 139.

171. População de células, de acordo com a reivindicação 170, caracterizada pelo fato de que o CAR é codificado por uma sequên- cia de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 136.

172. População de células, de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 149.

173. População de células, de acordo com a reivindicação 172, caracterizada pelo fato de que o CAR é codificado por uma sequên- cia de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 148.

174. Método, de acordo com a reivindicação 128, caracteri- zado pelo fato de que o CAR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57.

175. Método, de acordo com a reivindicação 174, caracteri- zado pelo fato de que o CAR é codificado por uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 56.

176. Método, de acordo com a reivindicação 134, caracteri- zado pelo fato de que o CAR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 139.

177. Método, de acordo com a reivindicação 176, caracteri- zado pelo fato de que o CAR é codificado por uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 136.

178. Método, de acordo com a reivindicação 140, caracteri- zado pelo fato de que o CAR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 149.

179. Método, de acordo com a reivindicação 178, caracteri- zado pelo fato de que o CAR é codificado por uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 148.

180. Método, de acordo com a reivindicação 146, caracteri- zado pelo fato de que o CAR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46.

181. Método, de acordo com a reivindicação 180, caracteri- zado pelo fato de que o CAR é codificado por uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 45.