JP5122441B2 - ヒト化抗ｃｄ７０結合剤およびその使用 - Google Patents

Description

（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願第６０／６７３，０７０号（２００５年４月１９日出願）の優先権を主張し、この米国出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される。

（背景）
ＣＤ７０は種々の正常及び悪性の細胞型により発現される細胞膜結合型及び分泌型の分子の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーである。ＤＣ７０の一次アミノ酸（ＡＡ）配列は、自身のカルボキシル末端を細胞の外側に露出させ、そしてアミノ末端を原形質膜のシトゾル側に存在させている膜貫通ＩＩ型の蛋白を予測させるものである（非特許文献１；非特許文献２）。ヒトＣＤ７０は２０ＡＡの原形質ドメイン、１８ＡＡの膜貫通ドメイン及び１５５ＡＡの原形質外ドメインを有し、２つの潜在的にＮ連結性のグリコシル化部位を有する（非特許文献１；非特許文献２）。抗ＣＤ７０抗体を用いた放射性同位体標識ＣＤ７０発現細胞の特異的免疫沈降では２９および５０ｋＤａのポリペプチドが得られる（非特許文献２；非特許文献３）。特に構造的な鎖Ｃ、Ｄ、Ｈ及びＩにおけるＴＮＦ−アルファ及びＴＮＦ−ベータのとのその相同性に基づけば、３量体構造がＣＤ７０について予測される（非特許文献４）。

当初の免疫組織学的試験によれば、ＣＤ７０は胚中心Ｂ細胞及び稀少なＴ細胞上で、扁桃、皮膚及び腸において発現されることがわかった（非特許文献５）。その後、ＣＤ７０は最近抗原活性化されたＴ及びＢリンパ球の細胞表面上に発現されることが報告され、そしてその発現は抗原刺激除去後には減衰する（非特許文献６；非特許文献７）。リンパ様の系内では、活性化されたナチュラルキラー細胞（非特許文献８）及びマウス成熟末梢樹状細胞（非特許文献９）も又ＣＤ７０を発現する。非リンパ様系統においては、ＣＤ７０は胸腺髄質上皮細胞上で検出されている（非特許文献５；非特許文献１０）。

ＣＤ７０は正常な非造血細胞上に発現されない。ＣＤ７０発現は生理学的条件下において最近活性化されたＴ及びＢ細胞に大部分が限定され、そしてその発現は抗原刺激が停止すればダウンレギュレートされる。動物実験から得られた証拠によれば、ＣＤ７０は免疫学的障害、例えば慢性関節リウマチ（非特許文献１１）、乾癬性関節炎（非特許文献１１）及び狼瘡（非特許文献１２）に寄与している可能性があることが示唆されている。炎症応答におけるその潜在的役割に加えて、ＣＤ７０は種々の形質転換細胞、例えばリンパ腫Ｂ細胞、ホジキン及びリード−スターンバーグ細胞、神経起源の悪性細胞及び多くの癌においても発現されている。
Ｂｏｗｍａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４年，第１５２巻，ｐ．１７５６−６１ Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｃｅｌｌ，１９９３年，第７３巻，ｐ．４４７−５６ Ｈｉｎｔｚｅｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４年，第１５２巻，ｐ．１７６２−７３ Ｐｅｔｓｃｈら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５年，第３２巻，ｐ．７６１−７２ Ｈｉｎｔｚｅｎら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４年，第６巻，ｐ．４７７−８０ Ｌｅｎｓら，Ｅｕｒ Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．，１９９６年，第２６巻，ｐ．２９６４−７１ Ｌｅｎｓら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９７年，第９０巻，ｐ．３８−４５ Ｏｒｅｎｇｏら，Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７年，第１０７巻，ｐ．６０８−１３ Ａｋｉｂａら，Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．，２０００年，第１９１巻，ｐ．３７５−８０ Ｈｉｓｈｉｍａら，，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０００年，第２４巻，ｐ．７４２−４６ Ｂｒｕｇｎｏｎｉら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９９７年，第５５巻，ｐ．９９−１０４ Ｏｅｌｋｅら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，２００４年，第５０巻，ｐ．１８５０−６０

従って、特に非ＣＤ７０発現細胞に対して望ましくない作用を示すことなく、ＣＤ７０発現細胞に対して臨床的に有用な細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示すことができる抗ＣＤ７０抗体及び他のＣＤ７０結合剤が必要とされている。そのような化合物はＣＤ７０を発現する癌又はＣＤ７０発現細胞により媒介される免疫障害に対する有用な治療薬となりえる。

（簡潔な要旨）
本発明はＣＤ７０抗体及び関連するＣＤ７０結合剤、及び、ＣＤ７０を発現する癌又はＣＤ７０発現細胞が存在する免疫障害の予防又は治療のためのこのような結合剤の使用に関する方法を提供する。ＣＤ７０結合剤は単独又は治療薬と組み合わせた場合に、ＣＤ７０発現細胞に対して細胞毒性、細胞増殖抑制性及び／又は免疫調節性の作用を示す。

１つの態様において、ＣＤ７０結合剤が提供される。ＣＤ７０結合剤は例えば抗体であることができる。一部の実施形態においては、結合剤は対象においてＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ又はＣＤＣ応答を少なくとも媒介するエフェクタードメイン少なくとも１つを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は治療薬へのコンジュゲーションの非存在下において細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す。一部の実施形態においては、結合剤は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す治療薬にコンジュゲートされる。抗体はＣＤ７０への結合についてモノクローナル抗体１Ｆ６又は２Ｆ２と競合することができる。

別の態様において、対象におけるＣＤ７０発現癌を治療するための方法が提供される。方法は一般的にＣＤ７０結合剤の有効量を対象に投与することを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は対象においてＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ又はＣＤＣ応答を少なくとも媒介するエフェクタードメイン少なくとも１つを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は治療薬へのコンジュゲーションの非存在下において細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す。一部の実施形態においては、結合剤は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す治療薬にコンジュゲートされる。

ＣＤ７０結合剤は例えば抗体であることができる。抗体は例えばヒトＩｇＭ又はＩｇＧ抗体のエフェクタードメインを包含することができる。ＩｇＧ抗体は例えばヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブタイプであることができる。一部の実施形態においては、抗体はヒト定常領域を包含する。一部の実施形態においては、ＣＤ７０結合剤はＣＤ７０への結合についてモノクローナル抗体１Ｆ６又は２Ｆ２と競合することができる。他の実施形態において、抗体はヒト化１Ｆ６である。他の実施形態において、抗体はヒト化２Ｆ２である。抗体は例えば１価、２価又は多価であることができる。

ＣＤ７０発現癌は腎臓腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、結腸癌、ホジキン病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、非ホジキンリンパ腫、外膜細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、鼻咽頭抗、脳腫瘍又は胸腺癌であることができる。腎臓腫瘍は例えば腎細胞癌であることができる。脳腫瘍は例えば神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫又は髄膜腫であることができる。対象は例えば哺乳類、例えばヒトであることができる。

別の態様において、免疫学的障害を治療するための方法が提供される。方法は一般的にＣＤ７０結合剤の有効量を対象に投与することを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は対象においてＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ又はＣＤＣ応答を少なくとも媒介するエフェクタードメイン少なくとも１つを包含する。一部の実施形態においては、結合剤は治療薬へのコンジュゲーションの非存在下において細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す。一部の実施形態においては、結合剤は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す治療薬にコンジュゲートされる。ＣＤ７０結合剤は例えば抗体であることができる。抗体は例えばヒトＩｇＭ又はＩｇＧ抗体のエフェクタードメインを包含することができる。ＩｇＧ抗体は例えばヒトＩｇＧ_１又はＩｇＧ_３サブタイプであることができる。一部の実施形態においては、抗体はヒト定常領域を包含する。

免疫学的障害は例えばＴ細胞媒介免疫学的障害であることができる。一部の実施形態においてはＴ細胞媒介免疫学的障害はＣＤ７０を発現する活性化Ｔ細胞を含む。一部の実施形態においては、休止期のＴ細胞は抗体薬剤コンジュゲートの投与により実質的に枯渇されない。Ｔ細胞媒介免疫学的障害は例えば慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、血小板減少性紫斑病、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁性肝硬変、ヴェーゲナー肉芽腫症、結核又は対宿主性移植片病であることができる。他の実施形態においては、免疫学的障害は活性化Ｂリンパ球障害である。対象は例えば哺乳類、例えばヒトであることができる。

関連する態様において、ＣＤ７０発現癌又は免疫学的障害の治療のための医薬組成物が提供される。組成物はＣＤ７０結合剤及び少なくとも１つの薬学的に適合性のある成分を包含する。更に又、ＣＤ７０結合剤が凍結乾燥されている薬剤を包含する容器、及び、製薬上許容しうる希釈剤を含む第２の容器を包含する薬学的キットも提供される。

本発明は本発明の以下の詳細な説明、及び本発明の特定の実施形態の非限定的な例及び添付の図面及び配列表を参照することにより更に十分に理解される。

（詳細な説明）
本発明はＣＤ７０結合剤及びＣＤ７０発現癌及び免疫学的障害の予防又は治療のためのこのような結合剤の使用のための方法を提供する。ＣＤ７０結合剤はＣＤ７０（例えば細胞外ドメイン）に特異的に結合する。結合剤はＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣ応答を媒介するエフェクタードメイン少なくとも１つを包含してよい。結合剤は治療薬へのコンジュゲーションの非存在下で細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示してよい。結合剤は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す治療薬にコンジュゲートしてよい。

１つの態様において、組成物及び方法はＣＤ７０結合剤、例えば抗体及び抗体誘導体に関する。抗ＣＤ７０抗体はモノクローナル、キメラ又はヒト化抗体、又はそのフラグメント又は誘導体であることができる。一部の実施形態において、抗ＣＤ７０抗体は抗体定常領域又はドメインを包含する。抗体定常領域又はドメインは例えばＩｇＧサブタイプのものであることができる。例示される実施形態において、抗ＣＤ７０抗体、そのフラグメントはＣＤ７０への結合についてマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１Ｆ６又は２Ｆ２と競合し、そしてヒト抗体定常領域配列を含む。別の例示される実施形態において、抗ＣＤ７０抗体又はそのフラグメント又は誘導体は、エフェクター細胞又は補体と相互作用することによりＣＤ７０発現細胞の枯渇又は増殖抑制をもたらす細胞毒性、細胞増殖抑制性及び／又は免疫調節性の作用を媒介することができるエフェクタードメイン（例えばＦｃ部分）を有する。別の例示される実施形態において、抗ＣＤ７０抗体はエフェクター機能を欠失している。別の例示される実施形態において、抗ＣＤ７０抗体は治療薬にコンジュゲートされる。

更に包含されるものは、ＣＤ７０結合剤（例えばヒト化抗ＣＤ７０抗体）を含むキット及び製造品である。

開示の明確化の為に、そして限定することなく、本発明の詳細な説明を以下の通りサブセクションに分割する。
Ｉ．定義及び略記法
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての技術的及び科学的な用語は記載した方法及び組成物に関連する当業者の一般的に理解するものと同様の意味を有する。商品名を本明細書において使用する場合は、出願人は商品名の製品の製剤、ジェネリック薬品、及び、商品名の製品の薬学的活性成分を独立して包含することを意図している。本明細書においては、以下の用語及び表現は特段の記載が無い限りそれらに割り付けられた意味を有するものとする。

「ＣＤ７０結合剤」及び「抗ＣＤ７０結合剤」という用語は本明細書においては、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７０抗体の誘導体又はフラグメント、又はＣＤ７０に結合しＣＤ７０結合抗体又はその誘導体の少なくとも１つのＣＤＲ又は可変領域を含む他の薬剤を意味する。

「特異的に結合する」という用語は非抗、結合剤が高度に選択的な様態においてその相当する抗原とは反応するが、他の抗原（例えば非ＣＤ７０分子）の多くとは反応しないことを意味する。

本明細書においては、ＣＤ７０結合剤に関する場合の「機能的」という用語は結合剤がＣＤ７０に結合することができることを意味する。

「抑制する」又は「抑制」という用語は本明細書においては、測定可能な量まで低減すること、又は完全に防止することを意味する。

「枯渇させる」という用語は、ＣＤ７０発現細胞に対するＣＤ７０結合剤の作用に関する場合、ＣＤ７０発現細胞の数の低減又はその消失を指す。

「インタクトな抗体」及び「インタクトな免疫グロブリン」とは２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖よりなる典型的には約１５０，０００ダルトンのヘテロ４量体糖蛋白として本明細書においては定義される。各軽鎖はジスルフィド結合により重鎖に連結してヘテロ２量体を形成する。ヘテロ４量体はこのようなヘテロ２量体の２つの同じ重鎖の間の共有結合ジスルフィド連結により形成される。軽鎖及び重鎖はジスルフィド結合により共に連結されているが、２つの重鎖の間のジスルフィド連結の数は免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプにより変動する。各重鎖及び軽鎖は又規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖はアミノ末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）、それに続く３又は４つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３及び／又はＣ_Ｈ４）並びにＣ_Ｈ１とＣ_Ｈ２の間のヒンジ（Ｊ）領域を有する。各軽鎖は２つのドメイン、アミノ酸末端可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）及びカルボキシ末端定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を有する。Ｖ_ＬドメインはＶ_Ｈドメインと非共有結合的に会合しているのに対し、Ｃ_Ｌドメインは共通してＣ_Ｈ１ドメインにジスルフィド結合を介して共有結合している。特定のアミノ酸残基が軽鎖及び重鎖可変ドメインの間の界面を形成していると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１−６６３）。

「超可変」という用語は抗体間の配列において広範に異なっており、そして各特定の抗体のその特異的抗原決定基に対する結合及び特異性に直接関与する残基を含有する可変ドメイン内の特定の配列を指す。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方における超可変性は相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変ループ（ＨＶＬ）として知られている３セグメントに集中している。ＣＤＲはＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤにおける配列比較により定義され、一方、ＨＶＬはＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７に記載される可変ドメインの３次元構造に従って構造的に定義される。これ等の２種の方法がＣＤＲを僅かに異なって識別する場合は、構造的な定義のほうがこの抗しい。Ｋａｂａｔによる定義（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｐｕｂ．Ｎｏ．９１−３２４２、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ＆Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．，１９９１参照）によれば、ＣＤＲ−Ｌ１は軽鎖可変ドメイン内の残基約２４〜３４、ＣＤＲ−Ｌ２は残基約５０〜５６そしてＣＤＲ−Ｌ３は残基約８９〜９７に、そして重鎖の可変ドメインの約３１〜３５がＣＤＲ−Ｈ１に、約５０〜６５がＣＤＲ−Ｈ２に、そして約９５〜１０２がＣＤＲ−Ｈ３に位置している。

重鎖及び軽鎖の各々内の３つのＣＤＲは低可変性の配列を含有するフレームワーク（ＦＲ）により分離されている。重鎖及び軽鎖の可変ドメインのアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ及びＣＤＲはＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４の順序に配置している。ＦＲの概ねβシートの配置により、鎖の各々の内部のＣＤＲは相互に、そして他の鎖のＣＤＲに対し、極めて近接する。結果として生じるコンホーメーションは抗原結合部位に寄与している（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２，Ｖｏｌ．Ｉ，ｐ．６４７−６６９参照）が、全てのＣＤＲ残基が必ずしも抗原結合に直接関与するわけではない。

ＦＲ残基及びＩｇ定常ドメインは典型的には抗原結合に直接関与しないが、抗原結合に寄与するか、又は、抗体エフェクター機能を媒介することができる。一部のＦＲ残基は少なくとも３つの態様において、即ちエピトープに直接非共有結合的に結合することにより、ＣＤＲ残基１つ以上と相互作用することにより、及び、重鎖及び軽鎖の間の界面に影響することにより、抗原結合に対する顕著な作用を有することができる。定常ドメインは種々のＩｇエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞性細胞毒性（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞性貪食作用（ＡＤＣＰ）における抗体の関与を媒介する。

脊椎動物の軽鎖を定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）と称される２つの明確に異なった片の１つに割り付けることができる。比較のために、哺乳類免疫グロブリンの重鎖は、定常ドメインの配列に従って以下の５種の主要なクラス、即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに割り付けられる。ＩｇＧ及びＩｇＡは更にサブクラス（アイソタイプ）例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分割される。免疫グロブリンの種々のクラスに相当する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。ネイティブの免疫グロブリンのクラスのサブユニット構造及び三次元配置はよく知られている。

「抗体」、「抗ＣＤ７０抗体」、「ヒト化抗ＣＤ７０抗体」及び「改変体ヒト化抗ＣＤ７０抗体」という用語は本明細書においては、最も広範な意味において使用され、そして特に完全長のネイティブの抗体、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）及び抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば可変ドメイン及び所望の生物学的活性、例えばＣＤ７０結合を示す抗体の他の部分を包含する。

「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し；即ち、集団を構成する個々の抗体は僅かな量において存在するかもしれない天然に存在する突然変異を除き同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、エピトープとも称される一の抗原決定基に指向されている。修飾語「モノクローナル」とは同一のエピトープに指向された抗体の実質的に均質な集団を示すものであり、何れかの特定の方法による抗体の生産を要求するものではない。モノクローナル抗体は当該分野で知られた何れかの手法又は方法；例えばＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５により最初に報告されたハイブリドーマ法、又は当該分野で知られた組み換えＤＮＡ法（例えば米国特許４，８１６，５６７参照）により製造できる。別の例においては、モノクローナル抗体はＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載の手法を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。

一方、ポリクローナル抗体の製造における抗体は典型的には免疫グロブリンのアイソタイプ及び／又はクラスの不均質な集団であり、そして種々のエピトープ特異性を示す。

「キメラ」抗体という用語は本明細書においては、重鎖及び／又は軽鎖の領域又はドメインの１つ以上におけるアミノ酸配列の一部又は全体が別の種由来、又は別の免疫グロブリンクラス又はアイソタイプに属するか、又はコンセンサス配列由来のモノクローナル抗体の中の相当する配列と同一、相同又はその改変体であるモノクローナル抗体の型である。キメラ抗体はそのような抗体のフラグメントを包含するが、ただし抗体フラグメントはその親抗体の望ましい生物学的活性、例えば同じエピトープへの結合を示さなければならない（例えば米国特許４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５参照）。キメラ抗体を製造するための方法は当業者の知る通りである。（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許５，８０７，７１５；４，８１６，５６７；及び４，８１６，３９７参照）。

「抗体フラグメント」、「抗ＣＤ７０抗体フラグメント」、「ヒト化抗ＣＤ７０抗体フラグメント」及び「改変体ヒト化抗ＣＤ７０抗体フラグメント」という用語は可変領域又は機能的能力、例えば特異的ＣＤ７０エピトープ結合が保持されている完全長抗ＣＤ７０抗体の一部分を指す。抗体フラグメントの例は限定しないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント、ダイアボディ、トリアボディー、直鎖抗体、１本鎖抗体及び抗体フラグメントから形成される他の多重特異性抗体を包含する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６参照）。

「１本鎖Ｆｖ」即ち「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを含む１本鎖Ｆｖ改変体であり、この場合ドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在し、そしてこれは抗原を認識して結合することができる。ｓｃＦｖポリペプチドは場合により、ｓｃＦｖが抗原結合の為の望ましい三次元構造の形成を可能にするＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインの間に位置するポリペプチドリンカーを含有する（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９４，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５）。

「ダイアボディ」という用語は２つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントを指す。各フラグメントは軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）と連鎖状となった重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含有し、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ又はＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈポリペプチドを形成している。同じ鎖上の２ドメインの間の対形成を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、連結されたＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌドメインはもう一方の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させられ、これにより２つの抗原結合部位が生じる。ダイアボディは例えばＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８により詳細に説明されている。

「直鎖状抗体」という用語は抗原結合領域の対を形成する直列のＦｄセグメントの対（Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１−Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１）を含む抗体を指す。直鎖状抗体はＺａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２に記載のように二重特異性又は単一特異性であることができる。

「ヒト化抗体」とは所定の抗原に結合することができ、そして、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域及び非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲを有する可変領域ポリペプチド鎖を含む免疫グロブリンアミノ酸配列改変体又はそのフラグメントを指す。

一般的に、ヒト化抗体は非ヒトの原料からそこに導入されたアミノ酸残基１つ以上を有する。これ等の非ヒトアミノ酸残基は本明細書においては、「インポート」残基と称し、これは典型的には「インポート」抗体ドメイン、特に可変ドメインから取られる。インポート残基、配列又は抗体は所望の親和性及び／又は特異性、又は、本明細書において考察する他の所望の抗体生物学的活性を有する。

一般的に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含むことになり、その場合、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれらに相当し、そして、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列、例えばコンセンサス又は生殖細胞系の配列由来のそれらとなる。ヒト化抗体は場合により典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも一部分を含むことにもなる。例えば抗体は軽鎖並びに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有してよい。抗体はまた適宜、重鎖のＣ_Ｈ１、ヒンジ（Ｊ）、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３及び／又はＣ_Ｈ４領域を包含してよい。

ヒト化抗体は何れかのクラスの免疫グロブリン、例えばＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ、及び何れかのアイソタイプ、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３及びＩｇＧ_４から選択することができる。定常領域又はドメインは例えば、ヒト化抗体が細胞毒性活性を示すことが望ましい（例えばＩｇＧ_１）補体固定定常ドメインを包含できる。そのような細胞毒性が望まれない場合は、定常ドメインは別のクラス（例えばＩｇＧ_２）のものであってよい。ヒト化抗体は１つより多いクラス又はアイソタイプ由来の配列を含んでよく、そして所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは当業者の知る通りである。

ヒト化抗体のＦＲ及びＣＤＲ領域は親配列に厳密に相当している必要はなく、例えば、インポートＣＤＲ又はコンセンサスＦＲは少なくとも１つの残基の置換、挿入又は欠失により改変されていることによりその部位におけるＣＤＲ又はＦＲ残基がコンセンサス又はインポート抗体の何れにも相当しなくなってもよい。このような突然変異は典型的には広範にならない。通常はヒト化抗体の残基の少なくとも７５％、より頻繁には少なくとも９０％、最も頻繁には９５％超が親ＦＲ及びＣＤＲ配列のものに相当する。

「抗体エフェクター機能」という用語は本明細書においては、ＩｇのＦｃドメインにより寄与される機能を指す。このような機能は例えば抗体依存性細胞性細胞毒性、抗体依存性細胞性貪食作用又は補体依存生細胞毒性であることができる。このような機能は、例えば貪食又は細胞溶解活性を有する免疫細胞上のＦｃ受容体へのＦｃエフェクタードメインの結合により、又は、補体系の成分へのＦｃドメインの結合により発揮されることができる。典型的には、Ｆｃ結合細胞又は補体成分により媒介される作用はＣＤ７０標的細胞の抑制及び／又は枯渇をもたらす。如何なる特定の理論にも制約されないが、抗体のＦｃ領域はＦｃ受容体（ＦｃＲ）発現細胞をリクルートし、それらを抗体コーティング標的細胞と並置させることができる。ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ６４）を包含するＩｇＧに対する表面ＦｃＲを発現する細胞はＩｇＧコーティング細胞の検出のためのエフェクター細胞として作用することができる。このようなエフェクター細胞は単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及び好酸球を包含する。ＩｇＧによるＦｃγＲのエンゲージメントは抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞性貪食作用（ＡＤＣＰ）を活性化させる。ＡＤＣＣは膜細孔形成蛋白及びプロテアーゼの分泌を介してＣＤ１６^＋エフェクター細胞により媒介され、貪食作用はＣＤ３２^＋及びＣＤ６４^＋エフェクター細胞により媒介される（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｐａｕｌ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｎ．Ｙ．，１９９７，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ３，１７，３０；Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９：１６５９−６９；Ａｋｅｗａｎｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：４０６１−６５；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．５３：１９９−２０７参照）。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰの他に、細胞結合抗体のＦｃ領域はまた補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を示す補体の古典的な経路を活性化させることができる。補体系のＣ１ｑは、抗体が抗原と複合体形成する場合にそのＦｃ領域に結合する。細胞結合抗体へのＣ１ｑの結合はＣ４及びＣ２の蛋白分解活性を包含する事象のカスケードを開始させ、Ｃ３コンバターゼを生成することができる。Ｃ３コンバターゼによるＣ３からＣ３ｂへの分解によりＣ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９を包含する末端補体成分の活性化が可能になる。全体として、これ等の蛋白は抗体コーティング細胞上の膜攻撃複合体細孔を形成する。これ等の細孔が細胞膜の一体性をはかいし、標的細胞を殺傷する（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，２００５，Ｃｈａｐｔｅｒ ２）。

「抗体依存性細胞性細胞毒性」即ちＡＤＣＣという用語は細胞溶解活性を保有する免疫細胞（エフェクター細胞とも称する）との抗体コーティング標的細胞の相互作用に依存した細胞死を誘導するための機序である。そのようなエフェクター細胞はナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージ及び好中球を包含する。エフェクター細胞は、標的細胞に結合したＩｇのＦｃエフェクタードメインに、それらの抗原複合化部位を介して結合する。抗体コーティング標的細胞の死滅はエフェクター細胞活性の結果として生じる。

「抗体依存性細胞性貪食作用」即ちＡＤＣＰという用語はＩｇのＦｃエフェクタードメインに結合する貪食性免疫細胞（例えばマクロファージ、好中球及び樹状細胞）により、抗体コーティング細胞が全体的又は部分的に内在化される過程を指す。

「補体依存性細胞性細胞毒性」即ちＣＤＣという用語は、標的結合抗体のＦｃエフェクタードメインが標的細胞膜内の孔部の形成を最終的にもたらす酵素反応のシリーズを活性化させる細胞死を誘導するための機序を指す。典型的には、抗体コーティング標的細胞上にあるもののような抗原−抗体複合体が補体成分Ｃ１ｑに結合して活性化し、次にこれが標的細胞死をもたらす補体カスケードを活性化する。補体の活性化は又、白血球上の補体受容体（例えばＣＲ３）に結合することによりＡＤＣＣを促進する標的細胞表面上への補体成分の付着ももたらす。

「免疫細胞」とは本明細書においては、免疫応答の調節に関与している造血細胞系統の細胞を指す。典型的な実施形態においては、免疫細胞はＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ又は樹状細胞である。

「エフェクター細胞」という用語は本明細書においては、免疫グロブリンのＦｃドメインに対する表面受容体（ＦｃＲ）を発現する細胞を指す。例えば、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ６４）を包含するＩｇＧに対する表面ＦｃＲを発現する細胞がエフェクター細胞として作用できる。このようなエフェクター細胞は単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及び好酸球を包含する。

「治療薬」とは癌細胞、活性化免疫細胞又は他の標的細胞集団に対して細胞毒性、細胞増殖抑制性及び／又は免疫調節性の作用を示す薬剤である。治療薬の例は細胞毒性剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤及び免疫調節剤を包含する。

「細胞毒性作用」とは標的細胞の枯渇、排除及び／又は殺傷を指す。細胞毒性剤とは細胞に対して細胞毒性作用を有する薬剤を指す。用語は放射性同位体（例えばＩ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０及びＲｅ^１８６）、化学療法剤及び毒素、例えば細菌、カビ、植物又は動物起源の酵素活性毒素及びこれ等のフラグメントを包含することを意図している。このような細胞毒性剤は、抗体、例えばヒト化抗ＣＤ７０抗体とカップリングさせることができ、そして例えば治療の適応症患者を治療するために使用できる。１つの実施形態において、「細胞毒性剤はモノクローナル抗体、例えば本明細書に記載するヒト化抗体と組み合わせて使用される抗体を包含する。

「化学療法剤」とは癌の治療において有用な化学的化合物である。化学療法剤の例はアルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ^ＴＭ）；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ及びウレドパ；エチレンイミン及びメチラメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホアミド、トリエチレンチオホスホアミド及びトリメチロールメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（例えば合成類縁体トポテカン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えばアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類縁体）及びその誘導体；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；オーリスタチン（例えば類似のモノメチルオーリスタチンＥ及びモノメチルオーリスタチンＦ（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる２００５年１０月２７日公開の米国特許出願２００５−０２３８６４９参照））；デュオカルマイシン（例えば合成類縁体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；窒素マスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムブシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムヌスチン；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質（例えばカリケミシン、特にカリケミシンガンマ１Ｉ及びカリケミシンファイＩ１、例えばＡｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６参照；ジネマイシン、例えばジネマイシンＡ；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラミシン；並びにネオカルイジノスタチン発色段及び関連の色素蛋白エネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ^ＴＭ）（例えばモルホリノススドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、マイコフェノール酸、ノガラマイシ、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類縁体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類縁体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類縁体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモファー、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフリジン、エノシタビン、フロクスイジン；アンドロゲン類、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給物、例えばフロリニック酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン；エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド、例えばマイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）及びドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ^ＴＭ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類縁体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ^ＴＭ）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチン酸；カペシタビン；及び上記の何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体を包含する。この定義に同様に包含されるものは、腫瘍に対するホルモンの作用を調節又は抑制する作用を有する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えばタモキシフェン（例えばＮｏｌｖａｄｅｘ^ＴＭ）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ^ＴＭ）；副腎におけるエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、メゲストロールアセテート（Ｍｅｇａｃｅ^ＴＭ）、エキセメスタン、フォルメスタニー、ファドロゾール、ボロゾール（Ｒｉｖｉｓｏｒ^ＴＭ）、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ^ＴＭ）及びアナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ^ＴＭ）；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン；及び上記の何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体である。

「プロドラッグ」という用語は本明細書においては、親薬剤と比較して腫瘍細胞に対して低細胞毒性であるが酵素的に活性化されるか、又はより活性な親化合物型に変換されることができる薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体の型を指す。例えばＷｉｌｍａｎ，，１９８６，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８６，６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ；及び、Ｓｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄ．，），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓを参照できる。有用なプロドラッグは限定しないが、より活性な細胞毒性の遊離の薬剤に変換されることができるホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ及び場合により置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグを包含する。プロドラッグ型に誘導できる細胞毒性剤の例は限定しないが上記した化学療法剤を包含する。

「細胞毒性作用」とは細胞の増殖の抑制を指す。「細胞毒性剤」とは細胞に対して細胞毒性作用を有し、これにより細胞の特定のサブセットの成育及び／又は増殖を抑制する薬剤を指す。

「免疫調節性作用」という用語は本明細書においては、免疫学的応答の発生又は維持の刺激（免疫刺激）又は抑制（免疫抑制）を指す。抑制は例えば免疫細胞（例えばＴ又はＢリンパ球）の排除；他の細胞の機能的能力をモジュレート（例えばダウンレギュレート）することができる免疫細胞の誘導又は形成；免疫細胞における未応答状態（例えばアネルギー）の誘導；又は免疫細胞の活性又は機能を増大、低減又は変化させること、例えばこれ等の細胞により発現される蛋白のパターンを改変すること（例えば特定のクラスの分子、例えばサイトカイン、ケモカイン、成長因子、転写因子、キナーゼ、同時刺激分子又は他の細胞表面受容体等の改変された生成及び／又は分泌）により行うことができる。「免疫調節剤」とは細胞に対する免疫調節作用を有する薬剤を指す。一部の実施形態においては、免疫調節剤は免疫応答を促進する免疫細胞に対して細胞毒性又は細胞増殖抑制性の作用を有する。

「標識」という用語は抗体に直接又は間接的にコンジュゲートされている検出可能な化合物又は組成物を指す。標識はそれ自体検出可能（例えば放射性同位体標識又は蛍光標識）であってよく、又は酵素標識の場合は検出可能な基質化合物又は組成物の化学的改変を触媒してよい。標識された抗ＣＤ７０抗体を作成し、そして種々の用途、例えばインビトロ及びインビボの診断に使用することができる。

「単離された」核酸分子は核酸の天然の原料中においてそれが通常会合している強ｚ巣夾雑核酸分子少なくとも１つから識別され、分離されている核酸分子である。単離された核酸分子はそれが天然に存在する形態又は状況とは異なる。従って単離された核酸分子はそれが天然の細胞中に存在する場合の核酸分子とは区別されるものである。しかしながら、単離された核酸分子は、核酸分子が天然の細胞のものとは異なる染色体位置にあるような、抗体を通常発現する細胞に含有される核酸分子を包含する。

「制御配列」という用語は特定の宿主生物において作動可能に連結下コーディング配列の発現の為に必要なポリヌクレオチド配列を指す。原核生物における使用に適する制御配列は例えばプロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合部位の配列を包含する。真核生物の制御配列は限定しないが、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを包含する。これ等の制御配列は原核生物及び真核生物の宿主細胞における抗ＣＤ７０結合剤の発現及び生成の為に使用することができる。

核酸はそれが別の核酸配列との機能的関連性の内部におかれる場合に「作動可能に連結」されている。例えば核酸のプレ配列又は分泌リーダーは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白として発現される場合にはポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結しており；プロモーター又はエンハンサーはそれが配列の転写に影響する場合にはコーディング配列に作動可能に連結しており；又は、リボソーム結合部位はそれが翻訳を促進するように位置付けられている場合にコーディング配列に作動可能に連結している。一般的に「作動可能に連結した」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、そして、分泌リーダーの場合は隣接し、そして読み込み期にある。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを用いてＤＮＡ配列を連結することができる。

「ポリペプチド」という用語はアミノ酸の重合体及びその等価物を指し、そして生成物の特定の長さを指すわけではなく；即ち、「ペプチド」及び「蛋白」はポリペプチドの定義に包含される。ポリペプチドの定義に同様に包含されるものは本明細書に定義した「抗体」である。「ポリペプチド領域」とはポリペプチドのセグメントを指し、そのセグメントは例えばドメイン又はモチーフの１つ以上を含有してよい（例えば抗体のポリペプチド領域は例えば相補性決定領域（ＣＤＲ）１つ以上を含有することができる）。「フラグメント」という用語は、典型的にはポリペプチドの少なくとも２０隣接又は少なくとも５０隣接アミノ酸を有するポリペプチドの一部分を指す。「誘導体」とは第２のポリペプチドと相対比較して非保存的又は保存的なアミノ酸置換１つ以上を有するポリペプチド又はそのフラグメント；又は、第２の分子の共有結合により、例えば非相同ポリペプチドの結合により、又はグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化等により、修飾されたポリペプチド又はそのフラグメントである。「誘導体」の定義に更に包含されるものは、例えばアミノ酸の類縁体（例えば非天然アミノ酸等）１つ以上を含有するポリペプチド、未置換の連結部又は当該分野で知られた他の修飾を有するポリペプチドであって、天然及び非天然存在の両方のものである。

「単離された」ポリペプチドとはその天然の環境の成分から識別及び分離及び／又は回収されているものである。その天然の環境の夾雑成分はポリペプチドの診断上又は治療上の使用を妨害する可能性のある物質であり、そして酵素、ホルモン及び他の蛋白性及び非蛋白性の溶質である。単離されたポリペプチドは単離された抗体、又はそのフラグメント又は誘導体を包含する。「抗体」は組み換え細胞内のインサイチュの抗体を包含するが、その理由は抗体の天然の環境の成分少なくとも１つが存在しないためである。

特定の実施形態においては抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法により測定した場合に抗体９５重量％超まで、他の態様においては９９重量％超まで、（２）スピニングカップシーケネーターを用いてＮ末端又は内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、又は、（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性となる程度まで精製される。

「非相同」という用語は、ポリペプチドに関する場合、別のポリペプチドと比較した場合に異なる原料（例えば細胞、組織、生物又は種）由来であるために２つのポリペプチドが異なることを意味する。典型的には、非相同ポリペプチドは異なる種に由来する。

免疫グロブリン又はそのフラグメントに関する場合、「保存的置換」とは、抗原への免疫グロブリンポリペプチド又はそのフラグメントの特異的結合（例えばＫ_Ｄにより測定した場合）を大きく低減しない１つ以上のアミノ酸の置換を意味する（即ち結合親和性を増大させる、結合親和性を大きく改変する、又は、結合親和性を、例えばＥＬＩＳＡのような標準的な結合試験により測定した場合に約４０％以下、典型的には約３０％以下、より典型的には約２０％以下、皿により典型的には約１０％以下、又は最も典型的には約５％以下低減する置換）。

「同一」又は「パーセント同一性」という用語は、核酸又はポリペプチド配列２つ以上に関する場合、同じであるか、又は、最大の相応性が得られるように比較してアラインした場合に同じである核酸又はアミノ酸残基の特定のパーセントを有する、２つ以上の配列又はサブ配列を指す。パーセント同一性を調べるためには、配列を最適な比較目的の為にアラインする（例えば第１のアミノ酸又は核酸配列の配列に、第２のアミノ酸又は核酸配列との最適なアライメントの為にギャップを導入することができる）。次に相当するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が第２の配列の相当する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占有されている場合、分子はその位置において同一である。２配列間のパーセント同一性は配列により共有される同一位置の数の関数である（即ち％同一性＝同一位置数／位置総数（例えばオーバーラップ位置）ｘ１００）。一部の実施形態においては、２配列は同じ長さである。

「実質的に同一」という用語は、２つの核酸又はポリペプチドに関する場合、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％又は少なくとも６５％の同一性；典型的には少なくとも７０％又は少なくとも７５％の同一性；より典型的には少なくとも８０％又は少なくとも８５％の同一性；更により典型的には少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の同一性を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す（例えば後述する方法の１つにより測定した場合）。

「同様性」又は「パーセント同様性」という用語は、ポリペプチド配列２つ以上に関する場合、後述する方法の１つを用いて測定した場合に、最大の相応性が得られるように比較してアラインした場合に同じか又は保存的に置換されているアミノ酸残基の特定のパーセントを有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。例えば、第１のアミノ酸配列は、第１の配列に含有される数と等しいアミノ酸数と比較した場合に、又は、例えば後述する方法の１つによりアラインされているポリペプチドのアライメントと比較した場合に、第１のアミノ酸配列が第２のアミノ酸配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％同一又であるか保存的に置換されている場合に、第２のアミノ酸配列と同様と考えることができる。

「実質的同様性」又は「実質的に同様である」という用語は、ポリペプチド配列に関する場合、ポリペプチド領域が少なくとも７０％、典型的には少なくとも８０％、より典型的には少なくとも８５％、又は少なくとも９０又は少なくとも９５％の比較対照配列との同様性を有することを示す。例えば、あるポリペプチドは、第２のポリペプチドに対し、例えば２つのペプチドが保存的置換１つ以上により異なる場合には、実質的に同様となる。

抗ＣＤ７０抗体又はその誘導体に関する場合、抗ＣＤ７０抗体の抗原結合領域（例えば重鎖又は軽鎖の可変領域又は重鎖又は軽鎖のＣＤＲ）１つ以上と実質的に同一又は実質的に同様であるポリペプチド領域１つ以上を有する蛋白は、当該分野で知られた、又は本明細書で言及する種々の標準的な免疫学的検定試験のいずれかを用いて測定した場合に、抗ＣＤ７０抗体により認識されるＣＤ７０のエピトープへの特異的結合を保持している。

２つの配列の間のパーセント同一性又はパーセント同様性の測定は数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。２つの配列の比較の為に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７に記載の通り変更されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレングス＝１２により実施することができ、これにより、目的の蛋白をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴ蛋白検索はＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３により実施することができ、これにより、目的の蛋白に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的の為にギャップのあるアライメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載の通りＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを利用できる。或いは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる（Ｉｄ）。ＢＬＡＳＴ、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用する場合は、対応するプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用できる。配列比較のために利用される数学的アルゴリズムの他の非限定的な例はＭｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはＧＣＧ配列アライメントソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０ウエイト残基表、ギャップ長ペナルティー１２及びギャップペナルティー４を使用できる。配列分析のための別のアルゴリズムは当業者の知る通りであり、そしてＴｏｒｅｌｌｉｓ ａｎｄ Ｒｏｂｏｔｔｉ，１９９４，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：３−５に記載されているＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ；及びＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４−８に記載されているＦＡＳＴＡを包含する。ＦＡＳＴＡ内では、ｋｔｕｐは検索の感度及び速度を設定する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合、比較するべき２配列における同様の領域はアラインされた残基のペアを見ることにより発見され；ｋｔｕｐ＝１の場合、シングルのアラインされたアミノ酸が調べられる。ｋｔｕｐは蛋白配列の場合は２又は１に、又はＤＮＡ配列の場合は１〜６に設定できる。ｋｔｕｐが特定されない場合はデフォルトは蛋白の場合２、ＤＮＡの場合は６となる。或いは、蛋白配列アライメントはＨｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２に記載されているＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムを用いて実施してよい。

本明細書においては、「細胞」、「細胞系統」及び「細胞培養物」という表現は互換的に私用され、全てこのような標記はその子孫を包含するものとする。即ち、「形質転換体」及び「形質転換細胞」は元の該当細胞及び形質転換回数とは無関係にそれから誘導された培養物を包含する。全ての子孫は、意図的又は天然に生じた突然変異により、ＤＮＡ含量において厳密に同一である必要はない。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異子孫は包含される。異なる標記を意図する場合は文脈より明確化される。

治療の目的のためには「対象」という用語は何れかの動物、特に哺乳類に分類される動物、例えばヒト、家畜及び牧畜動物、及び、動物園、競技用又は愛玩動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を指す。好ましくは、対象はヒトである。

本明細書における「障害」、及び「ＣＤ７０関連障害」及び「ＣＤ７０関連疾患」という用語は本明細書に記載した抗ＣＤ７０結合剤を用いた治療から利益を被る何れかの状態を指す。「ＣＤ７０関連障害」及び「ＣＤ７０関連疾患」は典型的には細胞表面上出ＣＤ７０又はそのフラグメントを発現する。これには問題となる障害に哺乳類を罹患しやすくする病理学的状態を包含する慢性及び急性の障害又は疾患が包含される。本発明において治療されるべき障害の非限定的な例は、癌、血液学的悪性疾患、良性及び悪性の腫瘍、白血病及びリンパ様悪性疾患、癌腫及び炎症性、血管形成性及び免疫学的な障害を包含する。障害の特定の例は後に開示する。

「治療」及び「施療」等の用語は、本明細書においては、疾患の症状１つ以上の軽減又は緩解、後退、進行の緩徐化又は停止を包含するがこれ等に限定されない、何れかの臨床上望ましいか有益である作用をもたらす、疾患又は障害に対する治療的並びに予防的、又は抑制的な手段を包含する意味を有する。即ち、例えば治療という用語は疾患又は障害の症状の発生の前又は後に薬剤を投与することにより疾患又は障害の全ての兆候を防止又は除去することを包含する。別の例として、用語は疾患の症状に対抗するために疾患の臨床的顕在化の後に薬剤を投与することを包含する。更に又、治療が疾患の緩和をもたらすか否かに関わらず、組織傷害の程度又は転移の量又は範囲のような、疾患又は障害の臨床パラメーターに投与が影響する発症後及び臨床兆候発生後の薬剤投与も、本明細書においては「治療」又は「施療」に相当する。

本明細書においては、「防止」又は「防止する」という用語は（ａ）ＣＤ７０発現癌又は免疫学的障害又はその臨床上又は診断上の症状の１つ以上の出現又は発症をブロックするため、（ｂ）ＣＤ７０発現癌又は免疫学的障害の発症の重症度を抑制するため、又は（ｃ）ＣＤ７０発現癌又は免疫学的障害の発症の可能性を低下させるために、ＣＤ７０発現癌又は免疫学的障害の臨床上又は診断上の症状の発症の前に対象に抗ＣＤ７０結合剤を投与すること（例えばＣＤ７０発現癌又は免疫学的障害の獲得の素因を有するかハイリスクである個体への投与）を指す。

「静脈内注入」という用語は薬剤、例えば治療薬を、約１５分間、一般的に約３０〜９０分の時間に渡って動物又はヒト患者の静脈内に導入することを指す。

「静脈内瞬時」又は「静脈内圧注」という用語は約１５分以下、一般的に５分以下で薬剤を身体が受容するように動物又はヒトの静脈内に薬剤を投与することを指す。

「皮下投与」という用語は比較的緩徐な、持続した薬剤からの送達により、典型的には皮膚と下部組織との間のポケット内において、動物又はヒト患者の皮膚下に薬剤、例えば治療薬を導入することを指す。皮膚を摘んで下部組織から離れるように引き上げることによりポケットが形成される。

「添付文書」という用語は治療用製品の市販用パッケージ内に慣用的に包含される説明書を指し、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、投与、禁忌及び／又は警告を含んでいる。

「リポソーム」は哺乳類への薬剤（例えば抗体）の送達の為に有用な脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤の種々の型よりなる小胞である。リポソームの成分は生体膜の脂質配置と同様に一般的に二層形態に配置している。

「皮下注入」という用語は例えば限定しないが３０分以下、又は９０分以下の時間、薬剤レセプタクルからの比較的緩徐な、持続した送達により、好ましくは皮膚と下部組織との間のポケット内において、動物又はヒト患者の皮膚下に薬剤を導入することをさす。場合により、注入は動物又はヒト患者の皮膚下部にインプラント処置された薬剤送達ポンプの皮下移植により行ってよく、その場合、ポンプは所定期間、例えば３０分間、９０分間又は治療計画の長期に渡る期間、所定量の薬剤を送達する。

「皮下ボーラス投与」という用語は動物又はヒト患者の皮膚下に薬剤を投与することを指し、この場合ボーラス投与薬物送達は約１５分以下；別の態様においては５分以下、そして更に別の態様においては６０秒以下となる。更に別の態様においては、投与は皮膚と下部組織との間のポケット内において行い、その場合、ポケットは、皮膚を摘んで下部組織から離れるように引き上げることにより形成してよい。

「有効量」という用語は対象におけるＣＤ７０発現癌又は免疫学的障害の臨床上又は診断上の症状１つ以上の出現の抑制又は緩和の為に十分な抗ＣＤ７０結合剤（例えば抗体又は誘導体又は他の結合剤）の量を指す。薬剤の有効量は「有効用法」において本明細書で説明する方法に従って投与する。「有効用法」という用語はＣＤ７０発現癌又は免疫学的障害の治療又は防止を達成するために十分な薬剤の量と投薬頻度の組合せを指す。

「治療有効量」という用語は有益な患者転帰、例えば細胞の成育停止作用又は枯渇を有する治療薬の量を指すために使用する。１つの態様において、治療有効量はアポトーシス活性を有するか、細胞死を誘導することができる。別の態様においては、治療有効量は例えば疾患の進行を緩徐化させる場合に有効なことが判っている標的血清中濃度を指す。薬効は治療すべき状態に応じて従来の方法において測定してよい。例えばＣＤ７０を発現する細胞を態様とする新生物形成性の疾患又は障害においては、薬効は疾患進行までの時間（ＴＴＰ）を試験するか、又は、応答率（ＲＲ）を測定することにより調べることができる。

「製薬上許容しうる」という用語は本明細書においては、連邦又は州政府の規制当局により認可されるか、又は、合衆国薬局方又は他の一般的に認知された動物、特にヒトにおける使用に関する薬局方に掲載されていることを意味する。「薬学的に適合性のある成分」という用語は、抗ＣＤ７０結合剤が共に投与される製薬上許容しうる希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。

「製薬上許容しうる塩」という表現は本明細書においては、抗ＣＤ７０結合剤又は治療薬の製薬上許容しうる有機又は無機の塩を指す。抗ＣＤ７０結合剤又は治療薬は少なくとも１つアミノ基をがんゆうし、従って、酸付加塩はこのアミノ基又は他の適当な基を用いて形成できる。例示される塩は限定しないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、集荷物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸塩（即ち１，１’−メチレンビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））の塩類を包含する。製薬上許容しうる塩は酢酸イオン、コハク酸イオン又は他の対イオンのような別の分子の包含も行ってよい。対イオンは親化合物上の電荷を安定化させる何れかの有機又は無機の部分であってよい。更に又、製薬上許容しうる塩はその構造中に荷電した原子１つより多くを有してよい。複数の荷電原子が製薬上許容しうる塩の部分である場合には複数の対イオンを有することができる。従って製薬上許容しうる塩は１つ以上の荷電原子及び／又は１つ以上の対イオンを有することができる。

「製薬上許容しうる溶媒和物」又は「溶媒和物」とは溶媒分子１つ以上と抗ＣＤ７０結合剤及び／又は治療薬の会合を指す。製薬上許容しうる溶媒和物を形成する溶媒の例は、限定しないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸及びエタノールアミンを包含する。

「ＡＦＰ」という略記はジメチルバリン−バリン−ドライソロイシ−ドラプロリン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミンを指す。

「ＭＭＡＥ」という略記はモノメチルオーリスタチンＥを指す。

「ＡＥＢ」という略記はパラアセチル安息香酸にオーリスタチンＥを反応させることにより生成するエステルを指す。

「ＡＥＶＢ」という略記はベンゾイル吉草酸にオーリスタチンＥを反応させることにより生成するエステルを指す。

「ＭＭＡＦ」という略記はドバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニンを指す。

「ｆｋ」および「ｐｈｅ−ｌｙｓ」という略記はリンカーフェニルアラニン−リジンを指す。
ＩＩ．抗ＣＤ７０抗体及びその誘導体
本明細書に記載した組成物及び方法はＣＤ７０に特異的に結合するＣＤ７０結合剤の使用を包含する。ＣＤ７０結合剤はＣＤ７０発現癌細胞、活性化免疫細胞又は他の標的細胞に対し、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を発揮する。ＣＤ７０結合剤は例えば抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７０抗体の抗原結合フラグメント、その誘導体、又は、ＣＤ７０結合抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）少なくとも１つを含む他のＣＤ７０結合剤であることができる。

１つの態様において、ＣＤ７０結合剤はモノクローナル抗体１Ｆ６の相補性決定領域（ＣＤＲ）１つ以上に同一、実質的に同一又は実質的に同様のＣＤＲ１つ以上を含む。（１Ｆ６の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸の配列はそれぞれ配列番号１及び配列番号２、及び、配列番号２１及び配列番号２２に示す通りであり、そして、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願ＷＯ０４／０７３６５６に開示されている。）例えば、結合剤はｍＡｂ１Ｆ６の相当する重鎖ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２又はＨ３領域）又は相当する軽鎖ＣＤＲ（Ｌ１、Ｌ２又はＬ３領域）と同一又は実質的に同一又は実質的に同様である重鎖ＣＤＲ及び／又は軽鎖ＣＤＲを包含できる。典型的な実施形態においては、抗ＣＤ７０結合剤はｍＡｂ１Ｆ６の相当する重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である２つ又は３つの重鎖ＣＤＲ及び／又は２つ又は３つの軽鎖ＣＤＲを有する。

例えば、一部の実施形態においては、抗ＣＤ７０結合剤がｍＡｂ１Ｆ６の重鎖ＣＤＲと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である重鎖ＣＤＲ少なくとも１つを有する場合は、結合剤は更にｍＡｂ １Ｆ６の軽鎖ＣＤＲと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である軽鎖ＣＤＲ少なくとも１つを包含することができる。

一部の実施形態においては、抗ＣＤ７０結合剤は重鎖又は軽鎖の可変ドメインを包含し、可変ドメインは、（ａ）ｍＡｂ １Ｆ６の相当するＣＤＲと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である３つのＣＤＲのセット、及び（ｂ）ヒト免疫グロブリン由来の４つの可変領域フレームワーク領域のセットを有する。例えば、抗ＣＤ７０抗体は重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインを包含することができ、可変ドメインは（ａ）ＣＤＲのセットがモノクローナル抗体Ｉ６Ｆ由来である３つのＣＤＲのセット、及び（ｂ）ヒトＩｇＧから誘導された４つのフレームワーク領域のセットを有する。抗体は場合によりヒンジ領域を包含できる。例示される実施形態においては抗ＣＤ７０抗体は完全にヒト化された抗体である。

別の態様において、ＣＤ７０結合剤はモノクローナル抗体２Ｆ２の相補性決定領域（ＣＤＲ）１つ以上に実質的に同一又は実質的に同様のＣＤＲ１つ以上を含む。（２Ｆ２の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸の配列はそれぞれ配列番号２７及び配列番号２８、及び、配列番号２９及び配列番号３０に示す通りであり、そして、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願ＷＯ０４／０７３６５６に開示されている。）例えば、結合剤はｍＡｂ ２Ｆ２の相当する重鎖ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２又はＨ３領域）又は相当する軽鎖ＣＤＲ（Ｌ１、Ｌ２又はＬ３領域）と同一又は実質的に同一又は実質的に同様である重鎖ＣＤＲ及び／又は軽鎖ＣＤＲを包含できる。典型的な実施形態においては、抗ＣＤ７０結合剤はｍＡｂ ２Ｆ２の相当する重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である２つ又は３つの重鎖ＣＤＲ及び／又は２つ又は３つの軽鎖ＣＤＲを有する。

例えば、一部の実施形態においては、抗ＣＤ７０抗体がｍＡｂ ２Ｆ２の重鎖ＣＤＲと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である重鎖ＣＤＲ少なくとも１つを有する場合は、抗体又はその誘導体は更にｍＡｂ ２Ｆ２の軽鎖ＣＤＲと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である軽鎖ＣＤＲ少なくとも１つを包含することができる。

一部の実施形態においては、抗ＣＤ７０結合剤は重鎖又は軽鎖の可変ドメインを包含し、可変ドメインは、（ａ）ｍＡｂ ２Ｆ２の相当するＣＤＲと同一又は実質的に同一又は実質的に同様である３つのＣＤＲのセット、及び（ｂ）ヒト免疫グロブリン由来の４つの可変領域フレームワーク領域のセットを有する。例えば、抗ＣＤ７０抗体は重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインを包含することができ、可変ドメインは（ａ）ＣＤＲのセットがモノクローナル抗体２Ｆ２由来である３つのＣＤＲのセット、及び（ｂ）ヒトＩｇＧから誘導された４つのフレームワーク領域のセットを有する。抗体は場合によりヒンジ領域を包含できる。例示される実施形態においては抗ＣＤ７０抗体は完全にヒト化された抗体である。

一部の実施形態においては、フレームワーク領域はヒト生殖細胞系統のエキソンＶ_Ｈ、Ｊ_Ｈ、Ｖκ及びＪκの配列から選択される。例えばｃ１Ｆ６Ｖ_ＨドメインのＦＲのヒト化のためのアクセプター配列は生殖細胞系統のＶ_ＨエキソンＶ_Ｈ１−１８（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：８８−９４）又はＶ_Ｈ１−２（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６４１−３６４５）及びヒンジ領域（Ｊ_Ｈ）についてはエキソンＪ_Ｈ−６（Ｍａｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２５７８−２５８２）から選択できる。他の実施形態においては生殖細胞系統ＶκエキソンＢ３（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６）及びＪκエキソンＪκ−１（Ｈｉｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１５１６−１５２２）をｃ１Ｆ６ Ｖ_Ｌドメインヒト化のためのアクセプター配列として選択できる。

一部の実施形態においては、ヒト化抗ＣＤ７０抗体のフレームワーク領域の配列は使用されるアクセプターヒト生殖細胞系エキソンの誘導体、例えばマウスドナー残基が再導入されている誘導体を包含する。これ等の残基はＫａｂａｔのナンバリング規則に従えばＶ_ＨドメインのＨ４６、Ｈ６７、Ｈ６８、Ｈ６９、Ｈ７０、Ｈ７１、Ｈ８０、Ｈ８１、Ｈ８２、Ｈ８２Ａ及びＨ９１位の１つ以上におけるマウスドナー残基の再導入を包含する。

以下の表は各配列番号が相当するヒト化１Ｆ６の領域を示す。

一部の実施形態においては、ＣＤ７０結合剤は抗体１Ｆ６又は２Ｆ２のヒト化抗体又は抗原結合フラグメントであることができる。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸２０〜１３７を有するポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む。

一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸２０〜１３７に少なくとも８０％同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸２０〜１３７に少なくとも８５％同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸２０〜１３７に少なくとも９０％同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸２０〜１３７に少なくとも９５％同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸２０〜１３７に少なくとも９９％同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、ポリペプチドは抗体１Ｆ６又は２Ｆ２の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有さない。

一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号２４のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号２４のアミノ酸配列に少なくとも８５％同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号２４のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号２４のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは配列番号２４のアミノ酸配列に少なくとも９９％同一であるポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態においては、ポリペプチドは抗体１Ｆ６又は２Ｆ２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有さない。

一部の実施形態においては、抗ＣＤ７０結合剤はヒトＣＤ７０への結合に関してモノクローナル抗体１Ｆ６または２Ｆ２と競合する。一部の実施形態においてはＣＤ７０結合剤はＣＤ７０への結合時にアゴニスト性又は拮抗性のシグナルを誘導しない（例えば増殖を刺激しない）。一部の実施形態においてはＣＤ７０結合剤はＣＤ７０へのＣＤ２７の結合を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％ブロックする。

ＣＤ７０結合剤は場合によりＣＤ７０発現標的細胞に対抗したＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣ応答を媒介又は刺激する抗体エフェクタードメインを包含する。エフェクタードメインは例えばＩｇ分子のＦｃドメインであることができる。このようなＣＤ７０結合剤は、ＣＤ７０発現癌細胞に対して細胞毒性又は細胞増殖抑制性の作用を示すか、又は、活性化されたリンパ球又は樹状細胞に対し、例えば、それぞれＣＤ７０発現癌又は免疫学的障害の治療において、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を示す。典型的にはＣＤ７０結合剤は細胞毒性白血球（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、貪食細胞（例えばマクロファージ）及び／又は血清補体成分）をリクルート及び／又は活性化する。

抗ＣＤ７０抗体はヒト化抗体、１本鎖抗体、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、Ｆａｂ、ミニボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆｖ等であることができる。一部の実施形態においては、ＣＤ７０の抗原結合領域はエフェクタードメイン、例えば免疫グロブリンのヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３ドメイン、エフェクター機能を有するエフェクタードメインの部分又はフラグメントに連結することができる。抗原結合抗体フラグメント、例えば１本鎖抗体は、例えばエフェクタードメインの全体又は部分と組み合わせて可変領域を含むことができる（例えばＣ_Ｈ２及び／又はＣ_Ｈ３ドメイン単独又はＣ_Ｈ１、ヒンジ及び／又はＣ_Ｌドメインと組み合わせたもの）。更に又、抗原結合フラグメントはエフェクタードメインの何れかの組合せを含むことができる。一部の実施形態においては、抗ＣＤ７０抗体はヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３ドメインに連結されたＣＤ７０結合可変領域を含む１本鎖抗体であることができる。

抗ＣＤ７０抗体のエフェクタードメインは何れかの適当なヒト免疫グロブリンアイソタイプ由来であることができる。例えば、ＣＤＣ及びＡＤＣＣ／ＡＤＣＰを媒介するヒト免疫グロブリンの能力は一般的にそれぞれＩｇＭ≒ＩｇＧ１≒ＩｇＧ３＞ＩｇＧ２＞ＩｇＧ４及びＩｇＧ１≒ＩｇＧ３＞ＩｇＧ２／ＩｈＭ／ＩｇＧ４である。ＣＤ７０結合ポリペプチドは所望のエフェクター機能を得るために適切な定常ドメインよりなる組み換え融合蛋白として発現させることができる。標的細胞への結合時に、抗ＣＤ７０抗体又は誘導体はＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びＡＤＣＰのような抗体エフェクター機能を介してインビトロ及びインビボの標的細胞破壊をトリガーすることができる。

ＣＤ７０結合剤は場合により治療薬、例えば細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤にコンジュゲートすることができる。

一部の実施形態においては、抗ＣＤ７０抗体は、ヒト又は非ヒトのＦｃ領域又はその部分を含むキメラであることができる。例えば、抗体は非ヒト機嫌、例えばげっ歯類（例えばマウス又はラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、ニワトリ又はサル（例えばマカク、アカゲザル等）のＦｃドメイン又は部分を包含できる。

抗ＣＤ７０結合剤、例えば抗体は単一特異性、二重特異性、３重特異性又はより高度な多重特異性であることができる。多重特異性抗体はＣＤ７０の種々のエピトープに対して特異的であってよく、及び／又は、ＣＤ７０及び非相同蛋白の両方に対して特異性であってよい。（例えばＰＣＴ出願ＷＯ９３／１７７１５、ＷＯ９２／０８８０２、ＷＯ９１／００３６０及びＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９；米国特許４，４７４，８９３；４，７１４，６８１；４，９２５，６４８；５，５７３，９２０；及び５，６０１，８１９；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３参照。）本明細書に記載した方法を実施するために有用である多重特異性抗体、例えば二重特異性及び３重特異性抗体は、ＣＤ７０（例えば限定していないがモノクローナル抗体２Ｆ２及び１Ｆ６のＣＤＲを有する抗体）及びＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣを媒介する第２の細胞表面受容体又は受容体複合体、例えばＣＤ１６／ＦｃγＲＩＩＩ、ＣＤ６４／ＦｃγＲＩ、キラー抑制又は活性化受容体又は補体制御蛋白ＣＤ５９の両方に免疫特異的に結合する抗体である。一部の実施形態においては、多重特異性抗体の部分の第２の細胞表面分子又は受容体複合体への結合は抗ＣＤ７０抗体又は他のＣＤ７０結合剤のエフェクター機能を増強する場合がある。

抗ＣＤ７０抗体及びその誘導体及び他の結合剤はまたＣＤ７０へのそれらの結合親和性に関して説明又は特定してよい。典型的な結合親和性は５ｘ１０^−２Ｍ、１０^−２Ｍ、５ｘ１０^−３Ｍ、１０^−３Ｍ、５ｘ１０^−４Ｍ、１０^−４Ｍ、５ｘ１０^−５Ｍ、１０^−４Ｍ、５ｘ１０^−６Ｍ、１０^−６Ｍ、５ｘ１０^−７Ｍ、１０^−７Ｍ、５ｘ１０^−８Ｍ、１０^−８Ｍ、５ｘ１０^−９Ｍ、１０^−９Ｍ、５ｘ１０^−１０Ｍ、１０^−１０Ｍ、５ｘ１０^−１１Ｍ、１０^−１１Ｍ、５ｘ１０^−１２Ｍ、１０^−１２Ｍ、５ｘ１０^−１３Ｍ、１０^−１３Ｍ、５ｘ１０^−１４Ｍ、１０^−１４Ｍ、５ｘ１０^−１５Ｍ又は１０^−１５Ｍ未満の解離定数即ちＫｄを有するものを包含する。

抗体は当該分野で知られた方法により形成できる。例えばモノクローナル抗体は広範な種類の手法、例えばハイブリドーマ、組み換え体及びファージディスプレイの技術又はこれ等の組合せの使用により製造できる。ハイブリドーマ手法は一般的に例えばＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８８）；及びＨａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，ｐｐ．５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）に記載されている。抗ＣＤ７０抗体を作成するために使用できるファージディスプレイ法の例は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１；Ｑｕａｎ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ，２００２，Ｔｈｅ ｒｉｓｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｎｔｉ−ＩｇＥ ａｎｄ Ａｌｌｅｒｇｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊａｒｄｉｅｕ ａｎｄ Ｆｉｃｋ Ｊｒ．，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２０，ｐｐ．４２７−４６９；Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０；Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９，ＷＯ９１／１０７３７，ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／１８６１９，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９５／１５９８２，ＷＯ９５／２０４０１及び米国特許５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３及び５，９６９，１０８（すべて参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものを包含する。

１本鎖抗体を作成するために使用できる手法の例は、米国特許４，９４６，７７８及び５，２５８，４９８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８；Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７９９５−７９９９；及びＳｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０３８−１０４０に記載されているものを包含する。

二重特異性抗体を作成するための方法は当業者の知る通りである。完全長二重特異性抗体の伝統的製造は２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいており、その場合、２つの鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−３９）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな取合せの為に、これ等のハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、これ等のうちの一部は正しい二重特異性構造を有する。応用の操作法は国際特許出願ＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−５９に開示されている。

異なる方法によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原複合化部位）を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。融合は典型的にはヒンジ、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３領域の少なくとも部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを用いる。一部の実施形態においては、融合は、融合の少なくとも１つにおいて存在する軽鎖結合の為に必要な部位を含有する第１の重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）を包含する。免疫グロブリン重鎖融合物及び所望により免疫グロブリン軽鎖をコードする配列を有する核酸を別個の発現ベクターに挿入し、そして適当な宿主生物内にトランスフェクトする。これは、構築において使用される等しくない比の３種のポリペプチド鎖が最適な収率をもたらす実施形態において３種のポリペプチドフラグメントの相互の比率を調節する場合に、多大な柔軟性をもたらす。しかしながら、等しい比の少なくとも２種のポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらすか、又は、比が特に重要ではない場合には、１つの発現ベクター中に２種又は３種全てのポリペプチド鎖に対するコーディング配列を挿入することが可能である。

この方法の１つの実施形態において、二重特異性抗体は１つのアームにおいて第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び、もう１つのアームにおいてハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を与える）を有する。この非対称の構造は、二重異性分子の僅か半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在することで容易な分離方法が可能となることから、より望ましくない免疫グロブリン鎖組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にする（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願ＷＯ９４／０４６９０参照）。

二重特異性抗体に関する更に詳細な考察は、例えばＳｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５１：６９５４−６１；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−６７；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ４：４６３−７０；Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：６７７−８１を参照できる。このような手法を使用することにより、二重特異性抗体を製造して本明細書に定義する疾患の治療又は防止において使用することができる。

二官能性抗体はまた欧州特許出願ＥＰＡ０１０５３６０に記載のものである。この参考文献に記載の通り、ハイブリッド又は二官能性の抗体は、生物学的に、即ち細胞融合の手法により、又は化学的に、特に交差結合剤又はジスルフィド架橋形成試薬を用いて、誘導することができ、そして抗体全体、又はそのフラグメントを含んでよい。このようなハイブリッド抗体を得るための方法は例えば参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願ＷＯ８３／０３６７９及び欧州特許出願ＥＰＡ０２１７５７７に開示されている。

一部の実施形態においては、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は抗原結合を改変、好ましくは向上させるためにＣＤＲドナー抗体由来の相当する残基で置換される。これ等のフレームワーク置換は当該分野で良く知られている方法により、例えばＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合及び配列比較の為に重要なフレームワーク残基を発見することにより特定の位置における通常ではないフレームワーク残基を発見することにより、発見される。（例えば米国特許５，５８５，０８９；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３参照）。抗体は当該分野で知られた種々の手法、例えばＣＤＲグラフティング（例えばＥＰ０２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許５，２２５，５３９；５，５３０，１０１；及び５，５８５，０８９）、ベニアリング又はリサーフィシング（例えばＥＰ０５９２ １０６；ＥＰ０５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１，２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９６９−９７３参照）及び鎖シャフリング（米国特許５，５６５，３３２参照）を用いてヒト化できる（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）。

ヒト化モノクローナル抗体は当該分野で知られた組み換えＤＮＡ手法により、例えば各々が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開ＷＯ ８７／０２６７１；欧州特許公開１８４，１８７；欧州特許公開１７１４９６；欧州特許公開１７３４９４；国際特許公開ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許４，８１６，５６７；欧州特許公開１２，０２３；Ｂｅｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−２６；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；及びＳｈａｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５２２５５３９；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；及びＢｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−６０に記載されている方法を用いて作成できる。

上記した通り、ＣＤ７０結合剤は抗ＣＤ７０抗体の誘導体であることができる。一般的に抗ＣＤ７０抗体誘導体は抗ＣＤ７０抗体（例えば抗原結合フラグメント又は保存的に置換されたポリペプチドを含む）及び抗ＣＤ７０抗体に対して非相同の少なくとも１つのポリペプチド領域又は他の部分を含む。例えば抗ＣＤ７０抗体は例えば何れかの型の分子の共有結合により修飾できる。典型的な修飾は、例えばグリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、ホスホリル化、アミド化、知られた保護／ブロッキング基による誘導体化、蛋白分解性の切断、細胞リガンド（例えばアルブミン結合分子）又は他の蛋白への連結等を包含する。多くの化学的修飾のいずれかを知られた手法、例えば限定しないが特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成等により行ってよい。

一部の実施形態においては、共有結合はエフェクター機能を妨害、例えば抗体誘導体が抗原結合領域又はそこから誘導された領域を介してＣＤ７０に特異的に結合することや、エフェクタードメインがＦｃ受容体に特異的に結合することすることを妨げない。

一部の実施形態においては、抗体誘導体は単量体１つ以上を含む多量体、例えば２量体であり、その場合、各単量体は（ｉ）抗ＣＤ７０抗体の抗原結合領域又はそこから誘導（例えばアミノ酸１つ以上の保存的置換により）されたポリペプチド領域；及び（ｉｉ）抗体誘導体がＣＤ７０に特異的に結合する多量体（例えばホモ２量体）を形成できるようにするための多量体化（例えば２量体化）ポリペプチド領域を包含する。典型的な実施形態においては、抗ＣＤ７０抗体の抗原結合領域又はそこから誘導されたポリペプチド領域は非相同の蛋白に組み換えによるか化学的に融合され、その場合、非相同蛋白は２量体化又は多量体化ドメインを含む。免疫学的障害又はＣＤ７０発現癌を治療又は防止する目的の為に対象に抗体誘導体を投与する前に、誘導体はホモ２量体又はヘテロ２量体の形成を可能にする条件に付す。ヘテロ２量体は、本明細書においては、同一の２量体化ドメインと異なるＣＤ７０抗体結合領域、同一のＣＤ７０抗体結合領域と異なる２量体化ドメイン、又は、異なるＣＤ７０抗体結合領域と２量体化ドメインを含んでよい。

典型的な２量体化ドメインは転写因子を起源とするものである。１つの実施形態において、２量体化ドメインは塩基性領域ロイシンジッパー（「ｂＺＩＰ」）のものである（Ｖｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：９１１−９１６参照）。有用なロイシンジッパードメインは例えばコウボ転写因子ＧＣＮ４、哺乳類転写因子ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合蛋白Ｃ／ＥＢＰ及び癌遺伝子産物Ｆｏｓ及びＪｕｎ中の核形質転換体のものを包含する。（例えばＬａｎｄｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９−６４；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ ａｎｄ Ｖｉｎｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖｅｌ．３：２７８−２８５；Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：５３８−５４２参照。）別の実施形態においては、２量体化ドメインは塩基性領域ヘリックス−ループ−ヘリックス（「ｂＨＬＨ」）蛋白のものである。（例えばＭｕｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｅｌｌ ５６：７７７−７８３参照。更にＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ ６０：７３３−７４６；Ｖｏｒｏｎｏｖａ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９９０，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：４７２２−２６参照。）得に有用なｈＨＬＨ蛋白はｍｙｃ、ｍａｘ及びｍａｃである。

更に別の実施形態において、２量体化ドメインは免疫グロブリン定常領域、例えば重鎖定常領域又はそのドメイン（例えばＣ_Ｈ１ドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメイン及び／又はＣ_Ｈ３ドメイン）である。（例えば米国特許５，１５５，０２７；５，３３６，６０３；５，３５９，０４６；及び５，３４９，０５３；ＥＰ０３６７１６６；ＷＯ９６／０４３８８参照。）
ヘテロ２量体はＦｏｓとＪｕｎとの間（Ｂｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１３８６−１３９２），ＡＴＦ／ＣＲＥＢファミリーのメンバーの間（Ｈａｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：２０８３−２０９０），Ｃ／ＥＢＰファミリーのメンバーの間（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１５３８−５２；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１５５３−６７；Ｒｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４：１４０４−１５）及びＡＴＦ／ＣＲＥＢ及びＦｏｓ／Ｊｕｎファミリーのメンバーの間（Ｈａｉ ａｎｄ Ｃｕｒｒａｎ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３７２０−２４）で形成されることが知られている。従って、ＣＤ７０結合蛋白を種々の２量体化ドメインを含むヘテロ２量体として対象に投与する場合、上記の何れかの組合せを使用してよい。

別の実施形態においては、抗ＣＤ７０抗体誘導体は第２の抗体にコンジュゲートされた抗ＣＤ７０抗体（「抗体ヘテロコンジュゲート」）である（例えば米国特許４，６７６，９８０参照）。本発明の方法を実施するために有用なヘテロコンジュゲートはＣＤ７０に結合する抗体（例えばモノクローナル抗体２Ｆ２又は１Ｆ６のＣＤＲ及び／又は重鎖を有する抗体）及びＡＤＣＣ、貪食作用及び／又はＣＤＣを媒介する表面受容体又は受容体複合体、例えばＣＤ１６／ＦｃｇＲＩＩＩ、ＣＤ６４／ＦｃｇＲＩ、キラー細胞活性化又は抑制性の受容体、又は、補体制御蛋白ＣＤ５９に結合する抗体を含む。典型的な実施形態においては、第２の細胞の表面分子又は受容体複合体への多重特異性抗体の部分の結合は、抗ＣＤ７０抗体のエフェクター機能を増強する。他の実施形態においては、抗体は治療薬であることができる。適当な抗体治療薬は本明細書に記載する。

一部の実施形態においては、抗ＣＤ７０抗体又はその誘導体は競合的結合を測定するための当該分野で知られた何れかの方法（例えば本明細書に記載する免疫学的検定試験）により測定した場合に、ＣＤ７０へのｍＡｂ１Ｆ６又は２Ｆ２の結合を競合的に抑制する。典型的な実施形態においては、抗体はＣＤ７０への１Ｆ６又は２Ｆ２の結合を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％又は少なくとも７５％競合的に抑制する。他の実施形態においては、抗体はＣＤ７０への１Ｆ６又は２Ｆ２の結合を少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％競合的に抑制する。

抗体は種々の知られた方法のいずれかによりＣＤ７０への特異的結合について試験することができる。使用できる免疫学的検定試験は例えばウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着試験）、「サンドイッチ」免疫学的検定試験、免疫沈降試験、プレシピチン反応、ゲル核酸プレシピチン反応、免疫拡散試験、凝集試験、補体個体試験、免疫放射計試験、蛍光免疫学的検定試験及びプロテインＡ免疫学的検定試験のような手法を用いる競合的及び非競合的な試験系を包含する。そのような試験は当該分野で良く知られている。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，４ｔｈ ｅｄ．１９９９）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９９参照）。

更に又、ＣＤ７０への抗体の結合親和性及び抗体ＣＤ７０相互作用のオフレートを競合的結合試験により測定することができる。競合的結合試験の１つの例は漸増量の未標識ＣＤ７０の存在下で目的の抗体と共に標識されたＣＤ７０（例えば^３Ｈ又は^１２５Ｉ）をインキュベートし、標識されたＣＤ７０に結合した抗体を検出することを含む、ラジオイムノアッセイである。次にＣＤ７０に対する抗体の親和性及び結合オフレートをスカッチャードプロットの分析によりデータから求めることができる。第２の抗体（例えばｍＡｂ１Ｆ６又は２Ｆ２）との競合もまたラジオイムノアッセイを用いて測定できる。この場合、漸増量の未標識の第２の抗体の存在下、標識された化合物（例えば^３Ｈ又は^１２５Ｉ）にコンジュゲートした目的の抗体と共にＣＤ７０をインキュベートする。或いは、ＣＤ７０への抗体の結合親和性及び抗体ＣＤ７０相互作用のオン及びオフレートは表面プラズモン共鳴により測定できる。一部の実施形態においては、抗ＣＤ７０抗体又はその誘導体はＣＤ７０発現細胞に向けてターゲティングし、その膜上に蓄積させることができる。

抗ＣＤ７０抗体及びその誘導体は、蛋白の合成に関する当該分野で知られた方法により、典型的には例えば組み換え発現の手法により、製造することができる。ＣＤ７０に結合する抗体又はその誘導体の組み換え発現は典型的には、抗体又はその誘導体をコードする核酸を含有する発現ベクターの構築を包含する。蛋白分子の製造のためのベクターは当該分野で知られた手法を用いた組み換えＤＮＡ技術により製造してよい。標準的な手法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，３ｒｄ ｅｄ．，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２ｎｄ ｅｄ．，１９８９）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，４ｔｈ ｅｄ．，１９９９）；及びＧｌｉｃｋ＆Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２ｎｄ ｅｄ．，１９９８）に記載のものを、組み換え核酸法、核酸合成、細胞培養、トランスジーン取り込み、及び、組み換え蛋白発現の為に使用することができる。

例えば、抗ＣＤ７０抗体の組み換え発現のためには、発現ベクターはプロモーターに作動可能に連結したその重鎖又は軽鎖、又は重鎖又は軽鎖の可変ドメインをコードしてよい。発現ベクターは例えば抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を包含してよく（例えばＰＣＴ公開ＷＯ ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開ＷＯ ８９／０１０３６；及び米国特許５，１２２，４６４参照）、そして抗体の可変ドメインは重鎖又は軽鎖全体の発現の為にベクターそのようなベクター内にクローニングしてよい。発現ベクターは従来の手法により宿主細胞に転移させ、そして次にトランスフェクトされた細胞を従来の手法により培養することにより抗ＣＤ７０抗体を製造する。二重鎖の抗体の発現のための典型的な実施形態においては、重全免疫グロブリン分子の発現のために、鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞内で同時発現することができる。

種々の原核生物及び真核生物の宿主発現ベクター系を利用して抗ＣＤ７０抗体又はその誘導体を発現することができる。典型的には、真核生物の細胞、特に全組み換え抗ＣＤ７０抗体分子用のものを、組み換え蛋白の発現の為に使用する。例えば、ヒトサイトメガロウィルス由来の主要中間体初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳類細胞が抗ＣＤ７０抗体及びその誘導体の製造のための有効な発現系である（例えばＦｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４５：１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２参照）。

他の宿主発現系は、例えば、細菌細胞中のプラスミド系の発現系（例えばＲｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ＥＭＢＯ １，２：１７９１；Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９参照）；昆虫系、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中のＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核粟粒熱ウィルス（ＡｃＮＰＶ）発現ベクター；及び哺乳類細胞中のウィルス系発現系、例えばアデノウィルス系の系（例えばＬｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９；Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４参照）を包含する。

更に又、挿入された配列の発現をモジュレートするか、又は、特定の所望の態様において遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞系統を選択することもできる。適切な細胞系統又は宿主系は、発現される蛋白の正確な修飾及びプロセシング（例えばグリコシル化、ホスホリル化及び切断）が確保されるように選択することができる。この目的のためには、一次転写物及び遺伝子産物の適切なプロセシングのための細胞機序を保有している真核生物宿主細胞を使用できる。そのような哺乳類宿主細胞は例えば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３，３Ｔ３及びＷ１３８を包含する。

安定な発現系は典型的には、組み換え抗ＣＤ７０抗体又はその誘導体又は他のＣＤ７０結合剤の長期の高収率の製造の為に使用される。例えば抗ＣＤ７０抗体又はその誘導体を安定に発現する細胞系統は、適切な発現制御エレメント（例えばプロモーター又はエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位）で制御されたＤＮＡ及び選択可能なマーカーによる宿主細胞の形質転換、その後の選択培地中における形質転換細胞の成育により作成することができる。選択可能なマーカーは選択に対する耐性を付与し、そして細胞が安定にＤＮＡをその染色体内に組み込んで細胞叢を形成できるようにし、それを次にクローニングして増殖させ、細胞系統とする。多くの選択系を使用でき、例えば単純疱疹ウィルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられ、これはそれぞれｔｋ⁻、ｈｇｐｒｔ⁻又はａｐｒｔ⁻細胞内で使用できる。更に又、代謝拮抗物質耐性を以下の遺伝子、即ちメトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ；マイコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ；アミノグリコシオＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ；ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏに対する選択の基準として使用できる。組み換えＤＮＡ技術の当該分野で一般的に知られた方法を日常的に適用することにより所望の組み換えクローンを選択することができ、そしてそのような方法は例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９０）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９４，Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３）；及びＣｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１に記載されている。

抗体又は誘導体の発現の水準はベクター増幅により増大させることができる。（一般的にＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎ＆Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照できる）。抗ＣＤ７０抗体又はその誘導体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合は、宿主細胞培養物中に存在する抑制剤の濃度を増大させることにより抑制剤に対する耐性を付与しているマーカー遺伝子の増大したコピー数を有する宿主細胞を選択できるようになる。関連する抗体遺伝子のコピー数もまた増大することができ、これにより抗体又はその誘導体の発現を増大させることができる（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７参照）。

抗ＣＤ７０抗体が重鎖及び軽鎖の両方又はその誘導体を含む場合、宿主細胞は２つの発現ベクター、即ち、重鎖蛋白をコードする第１のベクター及び軽鎖蛋白をコードする第２のベクターで同時トランスフェクトしてよい。２つのベクターは重鎖及び軽鎖の蛋白の等しい発現を可能とする同一の選択可能なマーカーを含有していてよい。或いは、重鎖及び軽鎖の蛋白の両方をコードしており、それらを発現することができる単一のベクターを使用してよい。そのような場合、軽鎖は典型的には重鎖の前に位置させることにより毒性の遊離の重鎖が過剰になることを回避する（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２；Ｋｏｈｌｅｒ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７参照）。重鎖及び軽鎖に関するコーディング配列はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含んでよい。

抗ＣＤ７０抗体又はその誘導体を製造（例えば動物、化学合成又は組み換え発現による）した後、それは何れかの適当な蛋白精製方法、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換又はアフィニティークロマトグラフィー（例えばインタクトなＦｃ領域を有する抗体の精製のためにはプロテインＡクロマトグラフィー））、遠心分離、溶解度の差によるか、又は、蛋白精製のための何れかの他の標準的な手法により精製することができる。抗ＣＤ７０抗体又はその誘導体は例えばマーカー配列、例えばペプチドと融合させることによりアフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にすることができる。適当なアミノ酸配列は、例えばヘキサヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）により与えられるタグ、及びインフルエンザヘマグルチニン蛋白から誘導されたエピトープに相当する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３７：７６７）及び「ｆｌａｇ」タグを包含する。

抗ＣＤ７０抗体又はその誘導体を製造した後、ＣＤ７０発現癌細胞に対する細胞増殖抑制性又は細胞毒性作用又はＣＤ７０発現免疫細胞に対する免疫調節性の作用を発揮するその能力を後述する、又は、当該分野で知られた方法により測定する。

活性化された免疫細胞又はＣＤ７０発現癌細胞の外部における抗ＣＤ７０抗体の活性を最小限にするために、活性化された免疫細胞又はＣＤ７０発現癌細胞の細胞表面上に抗ＣＤ７０抗体が濃縮されるように膜結合ＣＤ７０には特異的に結合するが、可溶性ＣＤ７０には結合しない抗体を用いることができる。

典型的には、抗ＣＤ７０抗体又は誘導体は、実質的に精製する（例えばその作用を制限するか望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に非含有とする）。一部の実施形態においては、抗ＣＤ７０抗体又は誘導体は少なくとも約４０％純粋、少なくとも約５０％純粋、又は少なくとも約６０％純粋である。一部の実施形態においては、抗ＣＤ７０抗体又は誘導体は少なくとも約６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％又は９５〜９８％純粋である。一部の実施形態においては抗ＣＤ７０抗体又は誘導体は約９９％純粋である。
ＩＩＩ．他のＣＤ７０結合剤
別のＣＤ７０結合剤は非相同蛋白（典型的には少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は少なくとも１００アミノ酸）との融合蛋白（即ち組み換え融合された、又は共有結合及び非共有結合コンジュゲーションの両方を包含する化学的にコンジュゲートされた蛋白）を包含する。そのようなＣＤ７０結合剤はＣＤ７０及び免疫グロブリンエフェクタードメイン又はその機能的等価物に結合する部分を包含することができる。本明細書においては、免疫グロブリンエフェクタードメインの機能的等価物は、貪食作用又は細胞溶解活性を用いて、又は、補体系の成分へのＦｃエフェクタードメインの結合により、免疫細胞上のＦｃ受容体に結合する。融合蛋白は必ずしも直接のものである必要はなく、リンカー配列を介して生じてもよい。

例えばＣＤ７０結合剤はＣＤＲの１つ以上のコーディング領域又は抗ＣＤ７０抗体の可変領域を非相同蛋白に対してコーディングしている配列とインフレームに融合することにより組み換えにより製造できる。非相同蛋白は例えばエフェクタードメイン、その機能的等価物、又は以下の特性、即ち、安定な発現を促進する；高収率の組み換え発現を容易にする手段を与える；細胞増殖抑制性、細胞毒性又は免疫調節性の活性を与える；及び／又は多量体化ドメインを与えることの１つ以上を与える他の機能的ドメインを包含することができる。

一部の実施形態においてはＣＤ７０結合剤は、細胞毒性剤へのコンジュゲーションを伴うことなく単独で、ＣＤ７０に結合し、ＣＤ７０発現細胞を枯渇させるか、その増殖を抑制する抗体に由来するＣＤＲ１つ以上を包含してよい。
ＩＶ．抗ＣＤ７０ターゲティング剤のエフェクター機能を向上させる方法
一部の実施形態においては、ＣＤ７０結合剤のエフェクター機能は、当該分野で知られた抗体操作法１つ以上を用いてそのエフェクター機能を向上させることにより増強することができる。そのような方法の例示される非限定的な例を以下に記載する。

ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰはエフェクター細胞上に発現されるＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）との細胞結合抗体の相互作用を介して媒介される。ＩｇＧＦｃ領域のグリコシル化状態及び一次アミノ酸配列の両方がＦｃγ−ＦｃγＲ相互作用に対して機能的作用を有している。より強力なＦｃγ−ＦｃγＲ相互作用はエフェクター細胞によるより良好な標的細胞の殺傷に関連している。

保存されたＡｓｎ２９７に共有結合したオリゴ糖がＦｃγＲに結合するためのＩｇＧのＦｃ領域に関与している（Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９；Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６−３１）。ＩｇＧ上のこのグリコ型の操作はＩｇＧ媒介ＡＤＣＣを顕著に向上させる。このグリコ型へのＮ−アセチルグルコサミン修飾の付加（Ｕｍａｎａ ｅｔａｌ．，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ．７４：２８８−９４）又はこのグリコ型からのフコースの除去（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：６５９１−６０４；Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：２１２７−３３）はＩｇＧＦｃとＦｃγＲとの間の結合を向上させることによりＩｇ媒介ＡＤＣＣ活性を増強するＩｇＧＦｃ操作の２つの例である。

ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の溶媒曝露アミノ酸の系統的置換は改変されたＦｃγＲ結合親和性を有するＩｇＧ改変体を形成している（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６０４）。親ＩｇＧ１と比較した場合、ＡｌａへのＴｈｒ２５６／Ｓｅｒ２９８、Ｓｅｒ２９８／Ｇｌｕ３３３、Ｓｅｒ２９８／Ｌｙｓ３３４又はＳｅｒ２９８／Ｇｌｕ３３３／Ｌｙｓ３３４における置換を含むこれらの改変体のサブセットはＦｃγＲに対する結合親和性及びＡＤＣＣ活性の両方における増大を示している（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６０４；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−４９）。

抗体媒介ＣＤＣは細胞結合ＩｇＧ分子へのＣ１ｑの結合と共に開始される。Ｃ１ｑ結合に関与するヒトＩｇＧ１上の特定のアミノ酸残基及びＣ１ｑ結合の種特異的な差が報告されている（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４）。Ｌｙｓ３２６及びＧｌｕ３３３における置換により抗体の補体固定活性が向上しており；例えばこのような置換はヒトＩｇＧ１抗体リツキシマブのＣ１ｑ結合及びＣＤＣ活性の両方を向上させることができる（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２５７１−２５７５）。ヒトＩｇＧ２骨格上の同じ置換はＣ１ｑへの結合が乏しく、そして補体活性化活性において大きく欠損している抗体アイソタイプをＣ１ｑに結合して更にＣＤＣを媒介することができるものに変換することができる（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２５７１−７５）。幾つかの他の方法もまた抗体の補体固定活性の向上の為に適用されている。例えばＩｇＧのカルボニル末端にＩｇＭの１８アミノ酸カルボキシ末端テール片をグラフとするとそのＣＤＣ活性は大きく増大する。これは通常は検出可能なＣＤＣ活性を有さないＩｇＧ４でも観察されている（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２２２６−３６）。また、Ｃｙｓと共にＩｇＧ１重鎖のカルボキシ末端に近接する位置にある置換Ｓｅｒ４４４は、単量体ＩｇＧ１におけるＣＤＣ活性２００倍での増加を伴いＩｇＧ１のｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ型の二量化誘発する（Ｓｈｏｐｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２２）。更に又、Ｃ１ｑに対する特異性を有する二重特異性のダイアボディコンストラクトもまたＣＤＣ活性を付与する（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：６２９−３１）。

抗体のインビボ半減期も又そのエフェクター機能に対して影響する場合がある。一部の実施形態においては、抗体の半減期を増大又は減少させることによりその治療活性を変更することが望ましい。ＦｃＲｎはβ２−ミクログロブリンと非共有結合的に会合するＭＨＣクラスＩ抗原と構造的に同様の受容体である。ＦｃＲｎはＩｇＧの異化及びそのトランスサイトーシスを組織に渡って調節する（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，２０００，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７３９−７６６；Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２５：９７−１１３）。ＩｇＧ−ＦｃＲｎの相互作用はｐＨ６．０（細胞内小胞のｐＨ）では生じるが、ｐＨ７．４（血液のｐＨ）では生じず；この相互作用はＩｇＧを循環系にリサイクル可能とする（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，２０００，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７３９−７６６；Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２５：９７−１１３）。ＦｃＲｎ結合に関与するヒトＩｇＧ_１上の領域はマッピングされている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６０４）。ヒトＩｇＧ_１のＰｒｏ２３８、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｐ３１２、Ｇｌｕ３８０、Ｇｌｕ３８２又はＡｓｎ４３４位におけるアラニン置換はＦｃＲｎ結合を増強する（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６０４）。これ等の置換を保有しているＩｇＧ_１分子はより長い血清中半減期を有することが予測される。その結果、これ等の修飾されたＩｇＧ_１分子は、未修飾のＩｇＧ_１と比較してより長い時間に渡り、そのエフェクター機能を実行することができ、そしてこれによりその治療効果を発揮することができる。
Ｖ．細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の活性に関する試験
抗体が標的細胞に対するエフェクター機能を媒介するかどうかを調べる方法は知られている。そのような方法の代表例を以下に記載する。

抗ＣＤ７０抗体又は誘導体が活性化免疫細胞又はＣＤ７０発現癌細胞に対して抗体依存性細胞性細胞毒性を媒介するかどうかを調べるためには、抗体及びエフェクター免疫細胞の存在下に標的細胞死を測定する試験を使用してよい。この種の細胞毒性を測定するために使用する試験はエフェクター細胞及び標的特異的抗体の存在下のインキュベーションの後の代謝的に標識された標的細胞からの^５１Ｃｒの放出の測定に基づいている（例えばＰｅｒｕｓｓｉａ ａｎｄ Ｌｏｚａ，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２１：１７９−９２；及び”^５１Ｃｒ Ｒｅｌｅａｓｅ Ａｓｓａｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）”，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９３参照）。例えば、Ｎａ_２ ^５１ＣｒＯ_４で標識され９６穴プレートのウェル当たり５０００個の細胞密度でプレーティングされた活性化免疫細胞（例えば活性化リンパ球）又はＣＤ７０発現癌細胞に種々の濃度の抗ＣＤ７０抗体を３０分間投与し、次に正常ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と４時間混合することができる。標的細胞死に付随する膜破壊により^５１Ｃｒが培地上澄み中に放出され、これを採取し、そして細胞毒性活性の尺度として放射能を測定する。ＡＤＣＣを測定する他の方法は、非放射標識を使用するか、又は、特定の酵素の誘導された放出に基づいてよい。例えば、時間分解蛍光分析に基づく非放射標識試験は市販されている（Ｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。この試験は細胞膜を貫通し、次いで加水分解して膜不透過性親水性リガンド（ＴＤＡ）を形成する蛍光増強リガンド（ＢＡＴＤＡ）のアセトキシメチルエステルで標的細胞をローディングすることに基づいている。標的特異的抗体とＰＢＭＣエフェクター細胞を混合すると、ＴＤＡは溶解した細胞から放出され、そしてユーロピウムと混合された時点で高蛍光のキレートを形成するために使用可能となる。時間分解蛍光計を用いて測定されたシグナルは細胞溶解の量と相関している。

抗ＣＤ７０抗体又は誘導体が活性化免疫細胞又はＣＤ７０発現癌細胞に対して抗体依存性細胞性貪食作用を媒介するかどうかを調べるためには、エフェクター免疫細胞（例えば新鮮培養マクロファージ又は樹立されたマクロファージ様細胞系統）による標的細胞内在化を測定する試験を用いてよい（例えばＭｕｎｎ ａｎｄ Ｃｈｅｕｎｇ，１９９０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２３１−３７；Ｋｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５７４６−５２；Ａｋｅｗａｎｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：４０６１−６５参照）。例えば、標的細胞を親油性膜染料、例えばＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ）で標識し、標的特異的抗体でコーティングし、そして４〜２４時間エフェクター免疫細胞と混合してよい。次に貪食細胞表面マーカー（例えばＣＤ１４）に特異的な蛍光色素標識抗体で逆染色することによりエフェクター細胞を発見し、そして２色フローサイトメトリー又は蛍光顕微鏡により細胞を分析する。二重陽性細胞が内在化標的細胞を有しているエフェクター細胞である。これ等の試験のためには、エフェクター細胞はＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦと共に５〜１０日間培養することによりマクロファージに分化しているＰＭＢＣから誘導された単球であることができる（例えば上出Ｍｕｎｎ ａｎｄ Ｃｈｅｕｎｇ参照）。ＡＴＣＣから入手可能なヒトマクロファージ様細胞系統Ｕ９３７（Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２５：６−１２）又はＴＨＰ−１（Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２６：１７１−７６）を代替の貪食細胞原料として使用してよい。

標的細胞結合時に抗体が補体依存性細胞毒性を媒介するかどうかを調べる方法もまた知られている。同じ方法をＣＤ７０結合剤が活性化免疫細胞又はＣＤ７０発現癌細胞に対してＣＤＣを媒介するかどうかを調べるためにも適用できる。そのような方法の代表例を以下に記載する。

活性補体原料は正常ヒト血清であるか、又はウサギのような実験動物から精製したものであることができる。標準的な試験においては、ＣＤ７０結合剤を補体の存在下、ＣＤ７０発現活性化免疫細胞（例えば活性化リンパ球）又はＣＤ７０発現癌細胞と共にインキュベートする。このようなＣＤ７０結合剤が細胞溶解を媒介する能力を数種の読み取り値により調べることができる。一例においては、Ｎａ^５１ＣｒＯ_４放出試験を使用する。この試験においては、標的細胞をＮａ^５１ＣｒＯ_４で標識する。未取り込みのＮａ^５１ＣｒＯ_４を洗浄し、９６穴プレート中、細胞を適当な密度、典型的には５０００〜５００００個／ウェルでプレーティングする。正常血清又は精製された補体の存在下、ＣＤ７０結合剤と共に、典型的には２〜６時間３７℃で５％ＣＯ_２雰囲気下にインキュベートする。細胞溶解を示す放出された放射能は、ガンマ線計数により培養上澄み少量を用いて測定する。最大細胞溶解は洗剤（０．５〜１％ＮＰ−４０又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）処理により取り込みＮａ^５１ＣｒＯ_４を放出させることにより測定する。自発的バックグラウンド細胞溶解は、ＣＤ７０結合剤非存在下の補体のみが存在するウェルにおいて測定する。パーセント細胞溶解は（ＣＤ７０結合剤誘導溶解−自発的溶解）／最大細胞溶解として計算する。第２の読み取り値は生細胞による代謝染料、例えばＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅの還元である。この試験においては、標的細胞を補体と共にＣＤ７０結合剤とインキュベートし、上記の通りインキュベートする。インキュベーション終了時、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）の１／１０容量を添加する。インキュベーションは１６時間まで３７℃５％ＣＯ_２雰囲気下に継続する。代謝的に活性な生細胞の指標としてのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅの還元は励起光５３０ｎｍ及び放射光５９０ｎｍにおいて蛍光分析することにより測定する。第３の読み取り値はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に対する細胞膜の透過性である。補体活性化の結果としての原形質膜の細孔形成により細胞内へのＰＩの進入が促進され、細胞内では核内へ拡散してＤＮＡに結合する。ＤＮＡへの結合により、６００ｎｍのＰＩ蛍光が顕著に増大する。ＣＤ７０結合剤及び補体の標的細胞への投与は上記の通り行う。インキュベーション終了時にＰＩを終濃度５μｇ／ｍＬとなるように添加する。次に細胞懸濁液を励起のための４８８ｎｍアルゴンレーザーを用いながらフローサイトメトリーにより調べる。溶解細胞は６００ｎｍにおける蛍光放射により検出される。
ＶＩ．免疫学的障害又はＣＤ７０発現癌の動物モデル
抗ＣＤ７０結合剤、例えば抗体又は誘導体は、免疫学的障害又はＣＤ７０発現癌の動物モデルにおいて試験又は確認することができる。免疫学的障害又はＣＤ７０発現癌の樹立された動物モデル多数が当該分野で知られており、その何れも抗ＣＤ７０抗体又は誘導体の薬効を試験するために使用できる。このようなモデルの非限定的な例を以下に記載する。

全身性及び臓器特異的な自己免疫疾患、例えば糖尿病、狼瘡、全身硬化症、シェーグレン症候群、実験的自己免疫性脳脊髄炎（多発性硬化症）、甲状腺炎、重症筋無力症、関節炎、ブドウ膜炎及び炎症性腸疾患の動物モデルはＢｉｇａｚｚｉ，“Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ：Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ Ｉｎｄｕｃｅｄ，”，Ｔｈｅ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｒｏｓｅ＆Ｍａｃｋａｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）及び“Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ，”，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９７）に記載されている。

アレルギー症状、例えば、喘息及び皮膚炎もまたげっ歯類においてモデル化できる。気道過敏症は卵白アルブミン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５７９２−８００）又はＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ卵抗原（Ｔｅｓｃｉｕｂａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１９９６−２００３）によりマウスにおいて誘導できる。マウスのＮｃ／Ｎｇａ系統は血清中ＩｇＥの顕著な上昇を示し、アトピー性皮膚炎様の患部を自発的に形成する（Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ ６：２０９−１０；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４６１−６６；Ｓａｓｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６：２３９−４７）。

免疫コンピテントなドナーリンパ球の致死性放射線照射組織不適合成宿主への注射はマウスにおいてＧＶＨＤを誘導する古典的な方法である。或いは、親Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスモデルは急性及び慢性のＧＶＨＤの両方を誘導する系を与える。このモデルにおいて、Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスはＣ５７ＢＬ／６及びＤＢＡ／２マウスの親系統の間の雑種に由来するＦ１子孫である。ＤＢＡ／２リンパ様細胞を非照射Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスに転移させると慢性ＧＶＨＤが生じるのに対し、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／１０又はＢ１０．Ｄ２リンパ様細胞の転移は急性ＧＶＨＤが生じる（Ｓｌａｙｂａｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌ．２６：９３１−９３８；Ｋａｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０３：３１０−３１８）。

更にまた、ヒト造血系肝細胞及び成熟末梢血リンパ様細胞は両方ともＳＣＩＤマウスに移植することができ、そしてこれ等のヒトリンパ造血系細胞はＳＣＩＤマウス内で機能性のまま存続する（ＭｃＣｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１６３２−１６３９；Ｋａｍｅｌ−Ｒｅｉｄ ａｎｄ Ｄｉｃｋ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１７０６−１７０９；Ｍｏｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３５：２５６−２５９）。これによりヒトリンパ様細胞に対する潜在的治療薬の直接の試験のための小型動物モデル系が得られている。（例えばＴｏｕｒｎｏｙ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：６９８２−６９９１参照。）
更に又、抗ＣＤ７０抗体又は誘導体のインビボの薬効を推定するための小型動物モデルは、適切な免疫不全のげっ歯類系統、例えば無胸腺ヌードマウス又はＳＣＩＤマウス内へのＣＤ７０発現ヒト腫瘍細胞系統の移植により作成することができる。ＣＤ７０発現ヒトリンパ腫細胞系統の例は、例えば、Ｄａｕｄｉ（Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８３：１３２９−３６；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｉｎｔ ＪＣａｎｃｅｒ １５：４８１−８５；ｄｅ Ｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１：７６５４−５９），ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ（Ｃａｔｔａｎ＆Ｍａｕｎｇ，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３８：５４８−５２；Ｃａｔｔａｎ ａｎｄ Ｄｏｕｇｌａｓ，１９９４，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ． １８：５１３−２２），Ｒａｊｉ（Ｏｃｈａｋｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７：１５０５−１０；Ｂｒｅｉｓｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：２９４４−４９），ａｎｄ ＣＡ４６（Ｋｒｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８１：１４８−５５）を包含する。ＣＤ７０発現ホジキンリンパ腫系統の非限定的な例はＬ４２８である（Ｄｒｅｘｌｅｒ，１９９３，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ ９：１−２５；Ｄｅｗａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９６：４６６−４７３）。ＣＤ７０発現ヒト腎細胞癌細胞系統の非限定的な例は７８６−Ｏ（Ａｎａｎｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：２２１０−１６；Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１：１７６８−７５），ＡＣＨＮ（Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｕｒｏｌ．１６６：２４９１−９４；Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｕｒｏｌ．１６７：２２０３−０８），Ｃａｋｉ−１（Ｐｒｅｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４：２９５７−６６；Ｓｈｉ ａｎｄ Ｓｉｅｍａｎｎ，２００２，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８７：１１９−２６）、及びＣａｋｉ−２（Ｚｅｌｌｗｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ３：３６０−６７）を包含する。ＣＤ７０発現鼻咽頭癌細胞系統の非限定的な例はＣ１５及びＣ１７（Ｂｕｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４２：５９９−６０６；Ｂｅｒｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．６６：１１−５）を包含する。ＣＤ７０発現ヒト神経膠腫細胞系統の非限定的な例はＵ３７３（Ｐａｌｍａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８２：４８０−７）及びＵ８７ＭＧ（Ｊｏｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９８：３９８−４０８）を包含する。多発性骨髄腫細胞系統の非限定的な例はＭＭ．１Ｓ（Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３１：２７１−２８２）及びＬ３６３（Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｂｌｕｔ ３６：３３１−３３８）を包含する。（Ｄｒｅｘｌｅｒ ａｎｄ Ｍａｔｓｕｏ，２０００，Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：６８１−７０３も参照できる。）これ等の腫瘍細胞系統は皮下注射による固形腫瘍として、又は、静脈内注射による播種性腫瘍として、免疫不全げっ歯類宿主中で樹立できる。宿主内で樹立された後、これ等の腫瘍モデルはインビボの腫瘍成育に関して本明細書において説明する通り、抗ＣＤ７０抗体又は誘導体の治療効果を評価するために適用できる。
ＶＩＩ．ＣＤ７０関連疾患
本明細書に記載した抗ＣＤ７０結合剤（例えば抗体又は誘導体）は免疫細胞（例えばリンパ球又は樹状細胞）の不適切な活性化によるＣＤ７０の発現を態様とするＣＤ７０発現癌又は免疫学的障害を治療又は防止するために有用である。そのようなＣＤ７０発現は例えば細胞表面上の上昇したＣＤ７０蛋白水準及び／又は発現されたＣＤ７０の改変された抗原性によるものである可能性がある。本明細書に記載した方法による免疫学的障害の治療又は防止は、そのような治療又は防止を必要とする対象に抗ＣＤ７０抗体又は誘導体の有用量を投与することにより、抗体又は誘導体が（ｉ）ＣＤ７０を発現し、そして失火状態に関連している活性化免疫細胞に結合し、そして（ｉｉ）活性化免疫細胞に対して細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の作用を発揮することにより達成される。一部の実施形態においては、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤へのコンジュゲーションを行うことなく発揮される。一部の実施形態においては、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性は細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤へのコンジュゲーションにより発揮される。

免疫細胞の不適切な活性化を態様とし、そして本明細書に記載した方法により治療又は防止できる免疫学的疾患は、例えば、障害に伏在する過敏性反応の型により分類することができる。これ等の反応は典型的には４種の型、即ちアナフィラキシー反応、細胞毒性（細胞溶解性）反応、免疫複合体反応、又は、細胞媒介免疫（ＣＭＩ）反応（遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応とも称される）に分類される。（例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｐａｕｌ ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，３ｒｄ ｅｄ．１９９３参照。）
このような免疫学的疾患の特定の例は以下のもの、即ち、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、自己免疫性脱髄疾患（例えば多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎）、内分泌性眼症、ブドウ膜網膜炎、全身エリテマトーデス、重症筋無力症、グレーブス病、糸球体腎炎、自己免疫性肝臓障害、炎症性腸疾患（例えばクローン病）、アナフィラキシー、アレルギー性反応、シェーグレン症候群、Ｉ型真性糖尿病、原発性胆汁性肝硬変、ヴェーゲナー肉芽腫症、線維性筋肉痛、多発性筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌障害、シュミット症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、アジソン病、副腎炎、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血、胃萎縮症、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、亜急性皮膚エリテマトーデス、上皮小体機能低下症、ドレスラー症候群、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑症、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、皮膚ヘルペス、円形脱毛症、類天疱瘡、硬皮症、進行性全身硬皮症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー減少、食道運動不全、手指硬化症及び毛細管拡張症）、雌雄の自己免疫性不妊、強直性脊椎炎、潰瘍性結腸炎、混合型結合組織疾患、結節性動脈周囲炎、全身壊死性血管炎、アトピー性皮膚炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、再発性流産、抗リン脂質、農夫肺、多形性紅斑、心臓切開後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、鳥飼育者肺。毒性表皮壊死症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、繊維性肺胞炎、肝質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽製膿皮症、輸液反応、高安動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング、脳脊髄炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼球陥没症、持久性隆起性紅斑、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異虹彩色性毛様体炎、フックス毛様体炎、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ‐シェーンライン紫斑病、対宿主性移植片病、移植拒絶、心筋症、イートン−ランバート症候群、回帰性多発性軟骨炎、クリオグロブリン症、ヴァルデンストレームマクログロブリン症、エバンス症候群及び自己免疫性生殖腺不全を包含する。

従って、本明細書に記載する方法はＢリンパ球（例えば全身エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、慢性関節リウマチ及びＩ型糖尿病）、Ｔｈ_１−リンパ球（例えば慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁性肝硬変、ヴェーゲナー肉芽腫症、結核又は対宿主性移植片病）又はＴｈ_２−リンパ球（例えばアトピー性皮膚炎、全身エリテマトーデス、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎、オーメン症候群、全身性硬化症又は慢性対宿主性移植片病）の障害の治療を包含する。一般的に、樹状細胞の関与する障害はＴｈ_１−リンパ球又はＴｈ_２−リンパ球の障害が関与している。

一部の実施形態においては、免疫学的障害はＴ細胞媒介免疫学的障害、例えば障害に関わっている活性化Ｔ細胞がＣＤ７０を発現するＴ細胞障害である。抗ＣＤ７０結合剤（例えば抗体又は誘導体）はそのようなＣＤ７０発現活性化Ｔ細胞を枯渇させるために投与できる。特定の実施形態においては、抗ＣＤ７０抗体又は誘導体の投与によりＣＤ７０発現活性化Ｔ細胞を枯渇させながら、休止期のＴ細胞は抗ＣＤ７０又は誘導体により実質的に枯渇されない。この点に関し、「実質的に枯渇されない」とは、休止期の細胞の約６０％未満、又は約７０％未満、又は約８０％未満が枯渇されないことを意味する。

抗ＣＤ７０結合剤（例えば抗体及び誘導体）は又、ＣＤ７０発現癌の治療又は防止のためにも有用である。本明細書に記載した方法によるＣＤ７０発現癌の治療又は防止は、そのような治療又は防止を必要とする対象に対し、抗ＣＤ７０抗体又は誘導体の有効量を投与することにより、抗体又は誘導体は（ｉ）ＣＤ７０発現癌細胞に結合し、そして（ｉｉ）ＣＤ７０発現癌細胞を枯渇又は増殖を抑制するための細胞毒性又は細胞増殖抑制性の作用を発揮することにより、達成される。一部の実施形態においては、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤とのコンジュゲーションを伴うことなく発揮される。一部の実施形態においては、細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性は細胞毒性、細胞増殖抑制性又は免疫調節性の薬剤とのコンジュゲーションにより発揮される。

本明細書に記載した方法により治療又は防止できるＣＤ７０発現癌は例えば、種々のサブタイプの非ホジキンリンパ腫（無痛性ＮＨＬ、濾胞性ＮＨＬ、小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞性ＮＨＬ、辺縁層ＮＨＬ）；ホジキン秒（例えばリード‐スターンバーグ細胞）；Ｂ細胞系統の癌、例えば播種性Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ブルキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ性白血病（例えば急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病）；エプスタイン−バーウィルス陽性Ｂ細胞リンパ腫；腎細胞癌（例えば明細胞及び乳頭）；鼻咽頭癌；胸腺癌；神経膠腫；神経膠芽腫；神経芽腫；星状細胞腫；髄膜腫；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；多発性骨髄腫；及び結腸、胃及び直腸の癌を包含する。癌は例えば新規に診断されたもの、以前に治療されたもの、又は難治性又は回帰性であることができる。一部の実施形態においては、ＣＤ７０発現癌は少なくとも約１５０００、少なくとも約１００００、又は少なくとも約５０００ＣＤ７０分子／細胞を有する。
ＶＩＩＩ．抗ＣＤ７０抗体及び誘導体を含む医薬組成物及びその投与
ＣＤ７０結合剤（例えば抗ＣＤ７０抗体又は誘導体）を含む組成物は免疫学的障害又はＣＤ７０発現癌を有する、又は、有する危険性のある対象に投与できる。本発明は更に、ＣＤ７０発現癌又は免疫学的障害の防止又は治療のための医薬の製造におけるＣＤ７０結合剤（例えば抗ＣＤ７０抗体又は誘導体）の使用を提供する。「対象」という用語は本明細書においては、ＣＤ７０結合剤を投与できる何れかの哺乳類患者、ヒト及び非ヒト哺乳類、例えば霊長類、げっ歯類及びイヌを意味する。本明細書に記載した方法を用いた治療の為に特に意図される対象はヒトを包含する。抗体又は誘導体は、免疫学的障害又はＣＤ７０発現癌の防止又は治療において、単独又は他の組成物と組み合わせて投与できる。

種々の送達系が知られており、ＣＤ７０結合剤を投与するために使用できる。導入方法は限定しないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜上及び経口の投与経路が包含される。ＣＤ７０結合剤は例えば注入又は瞬時注射（例えば静脈内又は皮下）により、表皮又は粘膜ライニングを介した吸収（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）により投与することができ、そして、化学療法剤のような他の生物学的活性剤と共に投与することができる。投与は全身又は局所であることができる。

特定の実施形態においては、ＣＤ７０結合剤組成物は注射により、カテーテル使用により、坐剤使用により、又は、インプラント使用により投与さ、インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン性の材料、例えば膜、例えばシアラスチック膜又は線維性のものである。典型的には、組成物を投与する場合、抗ＣＤ７０結合剤が吸収されない材料を使用する。

別の実施形態においては、抗ＣＤ７０結合剤は制御放出系において送達される。１つの実施形態において、ポンプを使用してよい（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８９，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４参照）。別の実施形態においては、重合体物質を使用できる。（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（Ｌａｎｇｅｒ＆Ｗｉｓｅ ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｓｍｏｌｅｎ＆Ｂａｌｌ ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ＆Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照できる。Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照できる。）他の制御放出系は、例えば上出Ｌａｎｇｅｒにおいて考察されている。

ＣＤ７０結合剤（例えば抗抗ＣＤ７０抗体又は誘導体）は結合剤の治療有効量及び制約上適合性のある成分１つ以上を含む医薬組成物として投与できる。例えば、医薬組成物は典型的には製薬用の担体（例えば滅菌液体、例えば水及び油脂、例えば石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えばピーナツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等）１つ以上を包含する。医薬組成物が静脈内に投与される場合は、水がより典型的な担体である。食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた液体担体として、特に注射溶液の為に使用できる。適当な製薬用賦形剤は例えば、澱粉、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を包含する。組成物は所望により、少量の水和剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これ等の組成物は溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、除放性製剤等の形態をとることができる。組成物は伝統的なバインダー及び担体、例えばトリグリセリドを用いて坐剤として製剤できる。経口投与用製剤は標準的な担体、例えば医薬品等級のマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を包含できる。適当な製薬用担体の例はＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎにより「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。このような組成物は患者に適切な投与の形態がもたらされるような適当な量の担体と共に典型的には精製された形態で治療有効量の蛋白を含有することになる。製剤は投与様式に相当したものである。

典型的な実施形態においては、医薬組成物は人間への静脈内投与に適合された医薬組成物としての日常的操作法に従って製剤される。典型的には、静脈内投与のための組成物は滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて医薬品は可溶化剤及びリグノカインのような局所麻酔剤を含むことにより注射部位の疼痛を軽減することができる。一般的に、成分は個別に又は混合されて単位剤型として、例えば凍結乾燥粉末又は水分非含有濃縮物として、密閉密封容器、例えばアンプル又は個包装中において、活性剤の品質を表示しながら供給される。医薬品を注入により投与する場合は、それは滅菌された医薬品用等級の水又は食塩水を含有する注入ボトルを用いて分注することができる。医薬品を注射により投与する場合は、滅菌注射用水又は食塩水のアンプルを提供し、成分を投与前に混合できるようにする。

更にまた、医薬組成物は（ａ）ＣＤ７０結合剤（抗ＣＤ７０抗体又は誘導体）を凍結乾燥形態で含有する容器、及び（ｂ）製薬上許容しうる注射用の希釈剤（例えば滅菌水）を含有する第２の容器を含む医薬品キットとして提供できる。製薬上許容しうる希釈剤は凍結乾燥した抗ＣＤ７０抗体又は誘導体の復元又は希釈の為に使用できる。場合によりそのような容器に併設されているものは、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を管轄する政府当局により定められた注意書であり、その注意書はヒトへの投与に関する製造、使用又は販売の当局による認可を反映するものである。

免疫学的障害又はＣＤ７０発現癌の治療又は防止において有効なＣＤ７０結合剤（例えば抗ＣＤ７０抗体又は誘導体）の量は標準的な臨床手法により決定できる。更に、インビボの試験は場合により最適用量範囲の発見を容易にするために使用してよい。製剤中に使用する厳密な用量は投与経路及び免疫学的障害又はＣＤ７０発現癌の病期により変動し、そして、担当医師の判断及び各患者の状況に従って決定しなければならない。有効な用量はインビトロ又は動物モデルの試験系から誘導される用量応答曲線から推定してよい。

例えば、抗ＣＤ７０抗体又は誘導体の毒性及び治療効果は細胞培養物又は実験動物において、ＬＤ_５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ_５０（集団の５０％における治療有効量）を決定するための標準的な薬学的操作法により決定することができる。毒性及び治療効果の間の用量の比は治療指数であり、比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０で表すことができる。大きい治療指数を示すＣＤ７０結合剤（抗ＣＤ７０抗体又は誘導体）が好ましい。ＣＤ７０結合剤が毒性の副作用を示す場合、罹患組織の部位にＣＤ７０結合剤をターゲティングする送達系を使用することにより非ＣＤ７０発現細胞の潜在的損傷を最小限にし、これにより副作用を低減することができる。

細胞培養試験及び動物試験から得られたデータをヒトにおける使用の場合の用量範囲を設定する場合に使用できる。ＣＤ７０結合剤の用量は典型的には、毒性が殆ど又は全く内ＥＤ_５０を含む循環系中濃度の範囲内に入るものである。用量は使用する剤型及び利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動してよい。方法においてＣＤ７０結合剤を使用するためには、治療有効用量はまず細胞培養試験から推定できる。用量は動物モデルにおいて設定することによりＩＣ_５０（即ち症状の半最大抑制を達成する被験化合物の濃度）を含む循環系中の血漿中濃度を達成することができる。そのような情報を用いてヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中濃度は例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定できる。

一般的に免疫学的障害又はＣＤ７０発現癌を有する患者に投与されるべき抗ＣＤ７０抗体又は誘導体の用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ対象体重である。より典型的には、対象に投与されるべき用量は０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ対象体重、更により典型的には１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇ〜７．５ｍｇ／ｋｇ対象体重である。一般的に、ヒト抗体は外来性蛋白への免疫応答のため、他の種由来の抗体よりもヒト身体内でより長い半減期を有する。即ち、ヒト化又はキメラ抗体を含む抗ＣＤ７０抗体又は誘導体のより低用量及びより低頻度投与が可能な場合が多い。

抗ＣＤ７０結合剤の用量は例えば毎日、週１回（毎週）、週２回、週３回、週４回、週５回、隔週、月１回又はその他必要に応じて投与できる。

一部の実施形態においては、抗ＣＤ７０結合剤の用量は最適用量未満に相当する（即ち、抗ＣＤ７０結合剤（例えば抗体薬剤コンジュゲート）のＥＣ_５０より低値）。例えば、抗ＣＤ７０結合剤の用量は治療ウインドウの最低２５％、最低１５％、最低１０％又は最低５％から選択される用量を含むことができる。本明細書においては、「治療ウインドウ」という用語は安全で効果的な治療をもたらす薬剤の用量又は身体系内のその濃度の範囲を指す。

一部の実施形態においては抗ＣＤ７０結合剤（例えば抗体薬剤コンジュゲート）の用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．９ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約０．７５ｍｇ／ｋｇ対象体重である。このような用量は週当たり１〜約１５回投与できる。各用量は同じかまたは異なっていることができる。例えば、抗ＣＤ７０結合剤約０．１５ｍｇ／ｋｇの用量を４日、５日、６日又は７日の期間当たり、１〜１０回投与できる。

一部の実施形態においては、ＣＤ７０結合剤を含む医薬組成物は更に治療薬（例えば非コンジュゲートの細胞毒性剤又は免疫調節剤、例えば本明細書に記載のものの何れか）を含むことができる。抗ＣＤ７０結合剤は又免疫学的障害又はＣＤ７０発現癌の治療又は防止の為に治療薬１つ以上と組み合わせて同時投与することができる。例えば、複合療法は治療薬（例えば細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤又は免疫調節剤、例えば未コンジュゲートの細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤又は免疫調節剤、例えば癌又は免疫学的障害の治療の為に従来使用されているもの）を含むことができる。複合療法はまた活性化されたリンパ球、樹状細胞又はＣＤ７０発現癌細胞の表面上のＣＤ７０以外の受容体又は受容体複合体をターゲティングする薬剤の投与を包含できる。このような薬剤の例は、活性化されたリンパ球、樹状細胞又はＣＤ７０発現癌細胞の表面において分子に結合する第２の非ＣＤ７０抗体を包含する。別の例はこのような受容体又は受容体複合体をターゲティングするリガンドを包含する。典型的には、このような抗体又はリガンドは活性化されたリンパ球、樹状細胞又はＣＤ７０発現癌細胞の細胞表面受容体に結合し、そして、活性化されたリンパ球、樹状細胞又はＣＤ７０発現癌細胞に細胞増殖抑制性又は細胞毒性のシグナルを送達することにより、抗ＣＤ７０抗体の細胞毒性又は細胞増殖抑制性の作用を増強する。そのような組合せ投与は疾患パラメーター（例えば症状の重症度、症状数、又は回帰の頻度）に対して相加的又は相乗的な作用を有する。

組合せ投与に関する治療用法に関しては、特定の実施形態において、抗ＣＤ７０結合剤は治療薬と同時に投与する。別の特定の実施形態において、治療薬は抗ＣＤ７０抗体又は誘導体の投与の少なくとも１時間〜数ヶ月前又は後、例えば、抗ＣＤ７０抗体又は誘導体の投与の前又は後少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１ヶ月又は３ヶ月に投与する。一部の実施形態においては、対象は抗ＣＤ７０結合剤及び場合により治療薬の投与後にモニタリングする。

治療薬は例えば癌細胞又は活性化免疫細胞に対して治療効果を示す何れかの薬剤であることができる。典型的には、治療薬は細胞毒性又は免疫調節性の薬剤である。そのような組合せ投与は疾患パラメーター（例えば症状の重症度、症状数、又は回帰の頻度）に対して相加的又は相乗的な作用を有する。

細胞毒性又は免疫調節性の薬剤の有用なクラスは例えば抗チューブリン剤、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製抑制剤、アルキル化剤（例えば白金複合体、例えばシスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）及び３核系白金複合体及びカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸エステル剤、代謝拮抗剤、化学療法剤感作剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、前形成化合物、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線感作剤、ステロイド、タキサン類、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド等を包含する。

個々の細胞毒性又は免疫調節性の薬剤は例えば、アンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトセシン、カルボプラチン、カルムスチン）ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５、クロラムブシル、シスプラチン、コルチシン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、シトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（アクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、アンエストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトラマイシン、ミトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ラパマイシン（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、ストレプトゾトシン、テノポセイド、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ＶＰ−１６およびＶＭ−２６を包含する。

一部の典型的な実施形態においては、治療薬は細胞毒性剤である。適当な細胞毒性剤は、例えば、ドラスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）、ＤＮＡ副溝結合剤（例えば、エネジインおよびレキシトロプシン）、ドゥオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、プロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡおよびＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、ディスコデルモリド、エレウテロビンおよびミトキサントロンを包含する。

一部の実施形態においては、細胞毒性剤は従来の化学療法剤、例えばドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキセート、マイトマイシンＣ又はエトポシドである。一部の実施形態においては、治療薬は複合療法、例えば、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニソロン及びビンクリスチン）、ＣＨＯＰ−Ｒ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニソロン及びリツキシマブ）又はＡＢＶＤ（ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン及びダカルバジン）であることができる。ＣＣ−１０６５類縁体、カリケアマイシン、マイタンシン、ドラスタチン１０の類縁体、リゾキシン及びパリトキシンのような薬剤を抗ＣＤ７０抗体又はその誘導体に連結することができる。

特定の実施形態においては、細胞毒性又は細胞増殖抑制性の薬剤はオーリスタチンＥ（オラスタチン−１０としても当該分野では知られている）又はその誘導体である。典型的にはオーリスタチンＥ誘導体は例えばオーリスタチンＥとケト酸の間に形成されたエステルである。例えば、オーリスタチンＥをパラアセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させることによりＡＥＢ及びＡＥＶＢをそれぞれ生成することができる。他の型のオーリスタチン誘導体はＡＦＰ、ＭＭＡＦ及びＭＭＡＥを包含する。オーリスタチンＥ及びその誘導体の合成及び構造は米国特許出願公開２００３００８３２６３及び２００５０００９７５１）、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２４２０９，国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１３４３５及び米国特許６，３２３，３１５；６，２３９，１０４；６，０３４，０６５；５，７８０，５８８；５，６６５，８６０；５，６６３，１４９；５，６３５，４８３；５，５９９，９０２；５，５５４，７２５；５，５３０，０９７；５，５２１，２８４；５，５０４，１９１；５，４１０，０２４；５，１３８，０３６；５，０７６，９７３；４，９８６，９８８；４，９７８，７４４；４，８７９，２７８；４，８１６，４４４；及び４，４８６，４１４に記載されている。

特定の実施形態においては、細胞毒性剤はＤＮＡ副溝結合剤である（例えば米国特許６，１３０，２３７参照）。例えば、一部の実施形態においては、副溝結合剤はＣＢＩ化合物である。別の実施形態においては、副溝結合剤はエネジイン（例えばカリケアマイシン）である。

抗チューブリン剤の例は、限定しないが、タキサン類（例えば、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）（ドキセタキセル））、Ｔ６７（ツラリク）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデジンおよびビノレルビン）及びドラスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）を包含する。他の抗チューブリン剤は例えばバクカチン誘導体、タキサン類縁体（例えば、エポチロンＡ及びＢ）、ノコダゾール、コルチシンおよびコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリドおよびエレウテロビンを包含する。

一部の実施形態においては、細胞毒性剤はマイタンシノイド、即ち別のグループの抗チューブリン剤である。例えば、特定の実施形態においては、マイタンシノイドはマイタンシン又はＤＭ−１（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｃｈａｒｉ ｅｔａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２： １２７−１３１も参照）。

一部の実施形態においては、治療薬は放射性同位体ではない。一部の実施形態においては、治療薬はリシン又はサポリンではない。

特定の実施形態において、治療薬は抗ＶＥＧＦ剤、例えばＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ）又はＮＥＸＡＶＡＲ（ソラフェニブ）；ＰＤＧＦブロッカー、例えばＳＵＴＥＮＴ（スニチニブマレエート）；又はキナーゼ阻害剤、例えばＮＥＸＡＶＡＲ（ソラフェニブトシレト）である。

一部の実施形態においては、細胞毒性又は免疫調節性の薬剤は代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は例えば、プリン拮抗剤（例えば、アゾチオプリン又はマイコフェノレートモフェチル）、ジヒドロフォレート還元酵素阻害剤（例えば、メトトレキセート）、アシクロビル、ガングシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカルネット又はトリフルリジンであることができる。

他の実施形態においては、細胞毒性又は免疫調節性の薬剤はタクロリムス、シクロスポリン又はラパマイシンである。別の実施形態においては、細胞毒性剤はアルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、アルセニックトリオキシド、ベキサロテン、ベキサロテン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、クラドリビン、ダルベポエチンアルファ、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、オゾガミシン、ゴセレリン、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブメシレート、インターフェロンアルファ−２ａ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミゾール、メクロレタミン又は窒素マスタード、メゲストロール、メスナ、メトトレキセート、メトクスサレン、ミトマイシンＣ、ミトタン、ナンドロロンフェンプロピオネート、オプレルベキン、オキサリプラチン、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン又はゾレドロネートである。

別の実施形態において、治療薬は抗体、例えばヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、ＲＩＴＵＸＡＮ（リツキシマブ：Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）；ＯＶＡＲＥＸ（ＡｌｔａＲｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ）；ＰＡＮＯＲＥＸ（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ，ＮＣ；マウスＩｇＧ２ａ抗体）；セツキシマブエルビツクス（Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，ＮＹ；抗−ＥＧＦＲＩｇＧキメラ抗体）；ビタキシン（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ；Ｃａｍｐａｔｈ Ｉ／Ｈ（Ｌｅｕｋｏｓｉｔｅ，ＭＡ；ヒト化ＩｇＧ１抗体）；Ｓｍａｒｔ ＭＩ９５（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；ヒト化抗−ＣＤ３３ＩｇＧ抗体）；リムフォシド（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＮＪ；ヒト化抗−ＣＤ２２ＩｇＧ抗体）；Ｓｍａｒｔ ＩＤ１０（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；ヒト化抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体）；オンコリム（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；放射線標識マウス抗−ＨＬＡ−Ｄｒｌ ０ 抗体）；アロムン（ＢｉｏＴｒａｎｓｐｌａｎｔ，ＣＡ；ヒト化抗−ＣＤ２ ｍＡｂ）；アバスチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；抗−ＶＥＧＦヒト化抗体）；エプラツザマブ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＮＪ及びＡｍｇｅｎ，ＣＡ；抗−ＣＤ２２抗体）；及びＣＥＡｃｉｄｅ（ｈｍｎｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，ＮＪ；ヒト化抗−ＣＥＡ抗体）；又は抗ＣＤ４０抗体（例えば米国特許６，８３８，２６１に開示されているもの）である。

他の適当な抗体は、限定しないが、以下の抗原、即ち、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、Ｌ６、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｌｅｗｉｓ Ｘ、アルファフェトプロテイン、ＣＡ ２４２、プラセンタルアルカリフォスファターゼ、前立腺特異的膜抗原、前立腺酸フォスフェターゼ、表皮性成長因子、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、抗トランスフェリン受容体、ｐ９７、ＭＵＣ１−ＫＬＨ、ＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、前立腺特異的抗原、ＩＬ−２受容体、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピン、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ムチン、Ｐ２１、ＭＰＧ、及びノイオンコゲン生成物に対する抗体を包含する。

一部の実施形態においては、治療剤は免疫調節性の薬剤である。免疫調節性の薬剤は例えばガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シクロスポリン、ラパマイシン、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（レナリドマイド）、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコエノレートモフェチル又はメトトレキセートであることができる。或いは免疫調節性の薬剤は例えば糖質コルチコイド（例えばコルチゾール又はアルドステロン）又は糖質コルチコイド類縁体（例えばプレドニソン又はデキサメタゾン）であることができる。

一部の典型的な実施形態においては、免疫調節性の薬剤は抗炎症剤、例えばアリールカルボン酸誘導体、ピラゾール含有誘導体、オキシカム誘導体及びニコチン酸誘導体である。抗炎症剤のクラスは例えば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤及びロイコトリエン受容体拮抗剤を包含する。一部の実施形態において、免疫調節性の薬剤はサイトカイン、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ又はＩＬ−２である。

適当なシクロオキシゲナーゼ阻害剤はメクロフェナミン酸、メフェナミン酸、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサール、フェンブフェン、フェノプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナブメトン、ナプロキセン、スリンダック、タノキシカム、トルメチン及びアセチルサリチル酸を包含する。

適当なリポキシゲナーゼ阻害剤は、酸化還元系阻害剤（例えばカテコールブタン誘導体、ノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）、マソプロコール、フェニドン、イアノパレン、インダゾリノン、ナファザトロム、ベンゾフラノール、アルキルヒドロキシアミン）及び非酸化還元系阻害剤（例えばヒドロキシチアゾール、メトキシアルキルチアゾール、ベンゾピラン及びその誘導体、メトキシテトラヒドロピラン、ボスウエリック酸及びボスウエリック酸のアセチル化誘導体、及び、シクロアルキル基で置換されたキノリンメトキシフェニル酢酸）及び酸化還元系阻害剤の前駆体を包含する。

他の適当なリポキシゲナーゼ阻害剤は抗酸化剤（例えばフェノール、プロピルガレート、フラボノイド及び／又はフラボノイドを含有する天然に存在する基質、フラボンのヒドロキシル化誘導体、フラボノール、ジヒドロケルセチン、ルテオリン、ガランギン、オロボール、カルコンの誘導体、４，２’，４’−トリヒドロキシカルコン、オルト−アミノフェノール、Ｎ−ヒドロキシ尿素、ベンゾフラノール、エブセレン及び還元性セレノ酵素の活性を増大させる物質種）、鉄キレート化剤（例えばヒドロキサム酸及びその誘導体、Ｎ−ヒドロキシ尿素、２−ベンジル−１−ナフトール、カテコール、ヒドロキシルアミン、カルノソールトロックスＣ，カテコール、ナフトール、スルファサラジン、ジレウトン、５−ヒドロキシアントラニル酸及び４−（オメガ−アリールアルキル）フェニルアルカン酸）、イミダゾール含有化合物（例えばケトコナゾール及びイトラコナゾール）、フェノチアジン及びベンゾピラン誘導体を包含する。

更に他の適当なリポキシゲナーゼ阻害剤はエイコサノイド（例えば、オクタデカテトラエン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサヘキサエン酸及びドコサキサエン酸およびそれらのエステル、ＰＧＥ１（プロスタグランジンＥ１），ＰＧＡ２（プロスタグランジンＡ２），ビプロストール、１５−モノヒドロキシエイコサテトラエン酸、１５−モノヒドロキシ−エイコサトリエン酸及び１５−モノヒドロキシエイキサペンタセン酸、及びロイコトリエンＢ５、Ｃ５及びＤ５）、カルシウム流動を妨害する化合物、フェノチアジン、ジフェニルブチルアミン、ベラパミル、フォスコシド、クルクミン、クロロゲン酸、カフェイン酸、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（ＥＴＹＡ），ヒドロキシフェニルレチンアミド、イオナパレン、エスクリン、ジエチルカルバマジン、フェナントロリン、バイカレイン、プロキシクロミル、チオエーテル、ジアリールスルフィド及びジ（１−プロペニル）スルフィドを包含する。

ロイコトリエン受容体拮抗剤はカルシトリオール、オンタゾラスト、Ｂａｙｅｒ Ｂａｙ−ｘ−１００５、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ ＣＧＳ−２５０１９Ｃ、ｅｂｓｅｌｅｎ、Ｌｅｏ Ｄｅｎｍａｒｋ ＥＴＨ−６１５、Ｌｉｌｌｙ ＬＹ−２９３１１１、Ｏｎｏ ＯＮＯ−４０５７、Ｔｅｒｕｍｏ ＴＭＫ−６８８、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ ＢＩ−ＲＭ−２７０、Ｌｉｌｌｙ ＬＹ ２１３０２４、Ｌｉｌｌｙ ＬＹ ２６４０８６、Ｌｉｌｌｙ ＬＹ ２９２７２８、Ｏｎｏ ＯＮＯ ＬＢ４５７、Ｐｆｉｚｅｒ １０５６９６、Ｐｅｒｄｕｅ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ ＰＦ １００４２、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ ＲＰ ６６１５３、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ＳＢ−２０１１４６、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ＳＢ−２０１９９３、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ＳＢ−２０９２４７、Ｓｅａｒｌｅ ＳＣ−５３２２８、Ｓｕｍｉｔａｍｏ ＳＭ １５１７８、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｏｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＷＡＹ １２１００６、Ｂａｙｅｒ Ｂａｙ−ｏ−８２７６、Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ ＣＩ−９８７、Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ ＣＩ−９８７ＢＰＣ−１５ＬＹ ２２３９８２、Ｌｉｌｌｙ ＬＹ ２３３５６９、Ｌｉｌｌｙ ＬＹ−２５５２８３、ＭａｃｒｏＮｅｘ ＭＮＸ−１６０、Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ． ＭＫ−５９１、Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ． ＭＫ−８８６、Ｏｎｏ ＯＮＯ−ＬＢ−４４８、Ｐｕｒｄｕｅ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ ＰＦ−５９０１、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ ＲＧ １４８９３、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ ＲＰ ６６３６４、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ ＲＰ ６９６９８、Ｓｈｉｏｎｏｏｇｉ Ｓ−２４７４、Ｓｅａｒｌｅ ＳＣ−４１９３０、Ｓｅａｒｌｅ ＳＣ−５０５０５、Ｓｅａｒｌｅ ＳＣ−５１１４６、Ｓｅａｒｌｅ ＳＣ−５２７９８、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ＳＫ＆Ｆ−１０４４９３、Ｌｅｏ Ｄｅｎｍａｒｋ ＳＲ− ２５６６、Ｔａｎａｂｅ Ｔ−７５７及びＴｅｉｊｉｎ ＴＥＩ−１３３８を包含する。

本発明は更に以下の実施例において説明するが、これ等は本発明の範囲を制限する意図はない。以下の実施例に記載する細胞系統はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）又はＤｅｕｔｓｃｈｅ ＳａｍｍＬｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ（ＤＭＳＺ）により特定された、又は他の知られた条件に従った培養において維持した。細胞培養試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡより入手した。

（実施例１）：ヒト化抗ＣＤ７０抗体改変体の製造
抗ＣＤ７０マウスモノクローナル抗体である１Ｆ６、及び、１Ｆ６のキメラ改変体ｃ１Ｆ６の重鎖及び軽鎖の可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１、２，２１及び２２に示す通りである。（２００５年１月１９日出願の米国特許出願６０／６４５，３５５も参照）。１Ｆ６のヒト化の為にヒトアクセプター配列はヒト生殖細胞エキソンＶ_Ｈ、Ｊ_Ｈ、Ｖκ及びＪκの配列から選択した。ｃ１Ｆ６Ｖ_Ｈドメインのヒト化のためのアクセプター配列は生殖細胞系統のＶ_ＨエキソンＶ_Ｈ１−１８（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：８８−９４）又はＶ_Ｈ１−２（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６４１−３６４５）及びＪ_Ｈ−６（Ｍａｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２５７８−２５８２）から選択した。生殖細胞系統ＶκエキソンＢ３（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６）及びＪκエキソンＪκ−１（Ｈｉｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１５１６−１５２２）を１Ｆ６Ｖ_Ｌドメインヒト化のためのアクセプター配列として選択した。Ｋａｂａｔの定義に従って決定した１Ｆ６マウスＣＤＲは、選択されたヒト生殖細胞系統鋳型にグラフとした。慨すれば、ヒト化Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインに渡る合成のオーバーラップオリゴヌクレオチドを形成し、そしてＰＣＲオーバーラップ伸長を用いて各ドメインを組み立てた。ＰＣＲ産物に組み込んだ制限部位を用いてＶ_Ｈ又はＶ_ＬドメインをそれぞれヒトＩｇＧ１定常ドメイン又はカッパ定常ドメインにインフレームとなるようにｐＣＭＶ発現ベクター内に指向性にクローニングした。

幾つかのフレームワーク位置をマウスドナー残基再導入の為に選択した。それらはＫａｂａｔのナンバリング規則に従えばＶ_ＨドメインのＨ４６、Ｈ６７、Ｈ６８、Ｈ６９、Ｈ７０、Ｈ７１、Ｈ８０、Ｈ８１、Ｈ８２、Ｈ８２Ａ及びＨ９１位であった。Ｌ２５及びＬ３３位におけるマウスＣＤＲ１残基をその位置のヒトアクセプター残基の導入のために選択したが、Ｖ_Ｌドメインのフレームワーク位置は改変されなかった。

Ｖ_Ｈドメインにおけるマウスフレームワークドナー残基又はＶ_Ｌドメインにオ稀有ｒヒトＣＤＲ残基の異なる組合せを組み込むことによりヒト化１Ｆ６の幾つかの改変体を形成した。これ等の改変体を以下の表２及び３に総括する。

マウス及びヒトＶ_Ｈ配列を有するヒト化改変体の数種の間の相違を図１及び２に示す。１Ｆ６ｍＶ_Ｈ及びヒト生殖細胞系Ｖ_ＨエキソンＶ_Ｈ１−２及びＪ_ＨエキソンＪＨ６を有するヒト化１Ｆ６Ｖ_Ｈ改変体ｈＶ_ＨＥ及びｈＶ_ＨＪのアライメントを図１に示す。１Ｆ６ｍＶ_Ｈ及びヒト生殖細胞系Ｖ_ＨエキソンＶ_Ｈ１−１８及びＪ_ＨエキソンＪＨ６を有するヒト化１Ｆ６Ｖ_Ｈ化改変体ｈＶ_ＨＨ及びｈＶ_ＨＭのアライメントを図２に示す。１Ｆ６ｍＶ_Ｌ及びヒト生殖細胞系Ｖ_ＫエキソンＢ３及びＪ_ＫエキソンＪ_Ｋ−１を有するヒト化１Ｆ６Ｖ_Ｌ改変体ｈＶ_ＬＡのアライメントを図３に示す。

（実施例２）ヒト化１Ｆ６改変体の結合親和性
ヒト化１Ｆ６改変体ＨＤＬＡ（ｈＶ_ＨＤ及びｈＶ_ＬＡ）、ＨＨＬＡ（ｈＶ_ＨＨ及びｈＶ_ＬＡ）及びＨＪＬＡ（ｈＶ_ＨＪ及びｈＶ_ＬＡ）を結合親和性分析の為に選択した。各ヒト化抗体及びｃ１Ｆ６の１ｍｇを２９３細胞において一過性に発現させ、そしてＥｕ−Ｎ１ヨードアセトアミドキレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてユーロピウムで標識した。ＣＤ７０陽性細胞系統のパネルへの飽和結合を各標識抗体につき試験した。選択した細胞系統は、定量的フローサイトメトリー（又は蛍光活性化細胞ソーティング、即ちＦＡＣＳ）で調べた場合の抗原コピー／細胞がそれぞれ３０，０００、９９，０００，２３５，０００及び２５２，０００のＡＣＨＮ、Ｃａｋｉ−２、Ｃａｋｉ−１及び７８６−Ｏとした。

ユーロピウム標識抗体は９６穴プレート中ある範囲の濃度に渡って４℃において１時間細胞と共にインキュベートした。インキュベーションの後、をＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中に細胞を再懸濁することによりユーロピウムを放出させた。蛍光はＦｕｓｉｏｎＨＴプレートリーダーにおいて、トップディテクターフォーマット及び３３５ｎｍ励起及び６２０ｎｍ放射を用いて読み取った。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４を用いて１結合部位双曲線にフィットさせた。結果を表４において以下に示す。

ヒト化改変体に関するＫ_Ｄ値は試験した細胞系統の全てにおいてｃ１Ｆ６に極めて類似しており、ヒト化の過程が抗原結合活性を大きく低減しないことを裏付けていた。

（実施例３）ヒト化１Ｆ６のＡＤＣＣ活性
ヒト化１Ｆ６抗体改変体がＣＤ７０^＋細胞系統ＷＩＬ２−Ｓ、７８６−Ｏ及び７６９−Ｐに対してＡＤＣＣを媒介する能力を標準的な^５１Ｃｒ放出試験を用いて測定した。ヒト化１Ｆ６のＨＨＬＡ、ＨＪＬＡ及びＨＥＬＡ改変体は等しく、そして用量依存的な態様においてＷＩＬ−２Ｓ標的細胞を溶解した。これとは対照的に、ＣＤ７０結合マウス１Ｆ６（ｍ１Ｆ６）又は非結合対照ヒトＩｇ（ｈＩｇ）を投与した腫瘍細胞は殺傷されなかった（図４Ａ）。同様にヒト化１Ｆ６はキメラ１Ｆ６に匹敵する態様において２種の腎細胞癌標的の溶解を媒介した（図４Ｂ）。

（実施例４）ヒト化１Ｆ６のＣＤＣ活性
ＣＤＣを媒介するヒト化１Ｆ６の能力を多発性骨髄腫細胞系統（ＬＰ−１）及び２種のリンパ腫細胞系統（ＭＨＨＰｒｅＢ−１及びＷＩＬ２−Ｓ）を用いて調べた。標的細胞に段階的な用量のキメラ１Ｆ６、ヒト化１Ｆ６ＨＪＬＡ又は非結合ヒトＩｇ対照を正常ヒト血清存在下に投与した。２時間３７℃でインキュベートした後、溶解した細胞をヨウ化プロピジウム（５μｇ／ｍＬ）添加後にフローサイトメトリーにより識別した。ヨウ化プロピジウムで染色された細胞は、抗体媒介補体活性化及び膜攻撃複合体の形成の結果として、原形質膜の一体性を消失していると考えられる。この試験を用いた場合、キメラ１Ｆ６及びヒト化１Ｆ６は等しい態様において各標的の用量依存的溶解を媒介した（図５）。

（実施例５）ヒト化１Ｆ６のＡＤＣＰ活性
貪食作用を媒介するヒト化１Ｆ６の能力を赤色蛍光膜染料で予備標識したＣＤ７０＋腎細胞癌系統７８６−Ｏを用いて調べた。標的細胞に段階的な用量のキメラ１Ｆ６、ヒト化１Ｆ６ＨＪＬＡ又は非結合ヒトＩｇ対照を投与し、次にＧＭ−ＣＳＦ中で培養した付着末梢血単球から形成したマクロファージと混合した。１時間３７℃でインキュベートした後、マクロファージ細胞表面マーカーＣＤ１１ｂに対する緑色蛍光抗体でマクロファージを検出した。腫瘍細胞を貪食したマクロファージはフローサイトメトリーで検出した場合に二重赤色緑色蛍光により識別した。二重陽性集団におけるマクロファージ内の腫瘍細胞の存在は蛍光顕微鏡観察により確認した。図６に示す通り、キメラ及びヒト化１Ｆ６は抗体用量依存的態様において、そして等しい程度まで標的細胞の貪食を促進した。これとは対照的に、非結合対照抗体と共にインキュベートした標的細胞は最小限しかマクロファージにより取り込まれなかった。

（実施例６）ヒト化１Ｆ６改変体薬剤コンジュゲートのインビトロ細胞毒性活性
ヒト化１Ｆ６改変体ＨＥＬＡ（ｈＶ_ＨＥ及びｈＶ_ＬＡ）、ＨＨＬＡ，ＨＪＬＡ及びＨＭＬＡ（ｈＶ_ＨＭ及びｈＶ_ＬＡ）及びｃ１Ｆ６を２９３細胞において一過性に発現させ、抗体当たり平均８薬剤単位のローディング水準においてｖｃＭＭＡＦ（２００５年１０月２７日に米国特許公開２００５−０２３８６４９として公開された米国特許出願１０／９８３，３４０に記載）にコンジュゲートした。得られたコンジュゲート、ｈ１Ｆ６ＨＥＬＡ−Ｆ８、ｈ１Ｆ６ＨＨＬＡ−Ｆ８、ｈ１Ｆ６ＨＪＬＡ−Ｆ８、ｈ１Ｆ６ＨＭＬＡ−Ｆ８およびｃ１Ｆ６−Ｆ８を２種のＣＤ７０発現細胞系統７８６−Ｏ及びＣａｋｉ−１に対する細胞毒性について試験した。コンジュゲートは９２時間細胞と共にインキュベートし、その後、５０μＭレサズリンを添加した。４時間のインキュベート時間の後、染料の還元をＦｕｓｉｏｎＨＴ蛍光プレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）を用いて測定した。３連のサンプリングの結果を表５において以下に示す。４種全てのヒト化改変体のＩＣ５０値は試験した両方の細胞系統においてｃ１Ｆ６の２倍内の活性を有し、力価の順位はｃ１Ｆ６−Ｆ８＞ｈ１Ｆ６ＨＨＬＡ−Ｆ８＞ｈ１Ｆ６ＨＭＬＡ−Ｆ８＞ｈ１Ｆ６ＨＪＬＡ−Ｆ８＞ｈ１Ｆ６ＨＥＬＡ−Ｆ８であった。

（実施例７）ヒト化１Ｆ６薬剤コンジュゲートのインビボスクリーニング
ヒト化１Ｆ６改変体ＨＤＬＡ、ＨＨＬＡ，ＨＪＬＡ及びＨＥＬＡを２９３細胞において一過性に発現させ、抗体当たり８薬剤単位のローディング水準においてｖｃＭＭＡＦ（２００５年１０月２７日に米国特許公開２００５−０２３８６４９として公開された米国特許出願１０／９８３，３４０に記載）にコンジュゲートした。３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの単回用量の薬効試験をヌードマウスにおいて７８６−Ｏ腎細胞癌固形腫瘍モデルにおいて実施した。腫瘍体積は腫瘍移植後８０日間定期的に測定した。結果によれば、腫瘍の体積は未投与マウスと比較して全投与マウスにおいて大きく低減し、そしてｍｃＭＭＡＦにコンジュゲートした全てのヒト化１Ｆ６改変体はｃ１ＦｍｃＭＭＡＦに薬効において匹敵していた。

（実施例８）播種性リンパ腫及び多発性骨髄腫のＳＣＩＤマウス異種移植片モデルにおけるヒト化１Ｆ６のインビボの活性
ヒト化１Ｆ６（ＨＪＬＡ）のインビボの抗腫瘍活性を播種性リンパ腫及び多発性骨髄腫の異種移植片マウスモデルにおいて調べた。播種性疾患を樹立するために１ｘ１０^５Ｒａｊｉ又は１ｘ１０^７ＭＭ１．Ｓ又はＬ３６３細胞をＣ．Ｂ．−１７ＳＣＩＤマウスの外側尾静脈中に注射した。マウスにヒト化１Ｆ６（ＨＪＬＡ）又は対照非結合抗体を腹腔内（ｉｐ）注射により４日毎に合計６回（Ｒａｊｉ）又は外側尾静脈への静脈内注射により週一回合計４週間（ＭＭ．１Ｓ及びＬ３６３）、細胞移植後１日目から投与した。安楽死を要する疾患は屈曲姿勢及びグルーミングの消失、体重減少、頭部浮腫及び後肢の麻痺により、そしてＬ３６３担持マウスにおいては、触診可能なリンパ様組織関連の腫瘍の形成により顕在化した。

結果によれば、各腫瘍モデルにおいて（図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃ）、ヒト化１Ｆ６を投与したマウスの生存は未投与マウス又は非結合対照抗体投与マウスのものと比較して顕著に延長された。ヒト化１Ｆ６投与の作用は個々のマウスの血清中の腫瘍誘導モノクローナル蛋白（λ軽鎖）の濃度を測定することにより多発性骨髄腫異種移植片（Ｌ３６３及びＭＭ．１Ｓ細胞）において更に評価した。図７Ｂ及び７Ｃ（右パネル）に示す通り、循環系中のλ軽鎖の濃度は未投与マウスと比較してヒト化１Ｆ６投与マウスにおいて顕著に低下していた。ヒト化１Ｆ６を投与されたＬ３６３担持マウスのλ軽鎖の平均血清中濃度は０．００６μｇ／ｍＬであったのに対し、未投与マウスの血清では０．１０μｇ／ｍＬであった。同様に、ヒト化１Ｆ６投与ＭＭ．１Ｓ担持マウスにおけるλ軽鎖濃度は０．０３μｇ／ｍＬであったのに対し、未投与マウスでは１．２５μｇ／ｍＬであった。これ等の結果はマウスにおける上昇した生存率と合致していた（図７Ｂ及び７Ｃ、右パネル）。

（実施例９）ヒト化１Ｆ６抗体によるＣＤ７０^＋抗原特異的Ｔ細胞のインビトロの枯渇
抗原特異的活性化Ｔ細胞を枯渇させるヒト化１Ｆ６抗体の能力を試験するために、ＨＬＡ−Ａ０２０１を発現する正常ドナー由来のＰＢＭＣを種々の濃度のヒト化抗ＣＤ７０抗体の存在下又は非存在下にＭ１ペプチドで刺激した。ヒト化１Ｆ６抗体（ＨＪＬＡ）は上記の通り製造した。ＰＭＢＣはＩＬ−２及びＩＬ−５を添加した培地２ｍＬ中５μｇ／ｍＬのＭ１ペプチドと共に、５ｘ１０^６個／ｍＬの細胞密度で２４穴プレート中に播種した。第５日において、培養上澄み半分を新しいサイトカイン含有培地と交換した。第９日に、抗原反応性細胞（ＣＤ８^＋／Ｖβ１７^＋集団）のパーセントをＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｖβ１７及びＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート抗ＣＤ８抗体で染色した細胞のフローサイトメトリー分析により測定した。

図８Ａは抗原特異的ＣＤ８^＋／Ｖβ１７^＋細胞が抗体非存在下培養物中全生細胞の３３％となるまで増殖したことを示す。これとは対照的に、第０日に培地にヒト化１Ｆ６を添加した場合、抗体用量依存性態様において抗原反応性集団の増殖は顕著に制限された。これ等の結果はヒト化１Ｆ６が抗原活性化Ｔ細胞を選択的にターゲティングし、その増殖を防止することを示している。

第２の試験（図８Ｂ）においては、Ｍ１ペプチド刺激培養物を未投与とするか、又は、ヒト化１Ｆ６の投与をＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を特異的にブロックする抗体の非存在下又は存在下に行った。未投与の培養物においては、抗原特異的ＣＤ８＋Ｖβ１７^＋集団は培養物中の全生細胞の３９％となるまで増殖した。ヒト化１Ｆ６の天下により反応性集団の増殖は顕著に減衰した。この活性はＦｃγＲＩＩＩ受容体が抗ＣＤ１６特異的抗体によりブロックされた場合に大部分が温存され、ペプチド反応性細胞の欠失はＦｃｇＲＩＩＩ担持エフェクター細胞とのヒト化１Ｆ６の相互作用を介して媒介されたことを示していた。

（実施例１０）抗ＣＤ７０抗体は抗原陰性バイスタンダー細胞に影響しない。

抗原陰性バイスタンダーＴ細胞に対する１Ｆ６媒介枯渇の作用を測定するために、ＣＤ４及びＣＤ８リンパ球のＴＣＲＶβファミリー提示を、未投与又は１Ｆ６のキメラ改変体（ｃ１Ｆ６）（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）投与のＭ１活性化培養物中において調べ、休止期の非抗原刺激ＰＢＭＣと比較した。キメラ及びヒト化１Ｆ６改変体は結合親和性、エフェクター機能媒介能力及び活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを枯渇させる能力において同等である。

図９に示す通り、ＨＬＡ−Ａ０２０１^＋ＰＢＭＣのＭ１ペプチドによる刺激はＶβ１７ＴＣＲ担持ＣＤ８^＋細胞の増殖を約３０倍としたのに対し、ＣＤ８^＋細胞において試験した全ての他のＶβＴＣＲファミリー及びＣＤ４細胞集団において試験した全ファミリーは最小限の変化を示すのみであった。対照集団においては、細胞の増殖はＶβ１７^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットのみに限定され、これ等は＜１％ＣＤ８^＋細胞〜２７％に増大し；この観察結果はＭ１ペプチドの免疫応答の特異性を確認するものであった。ＣＤ７０特異的抗体の非存在に刺激したＴ細胞とは異なり、Ｍ１ペプチド特異的ＣＤ８^＋細胞の増殖は培地へのｃ１Ｆ６抗体の添加により防止された。ｃ１Ｆ６抗体の存在下において、パーセントＶβ１７^＋ＣＤ８^＋細胞は休止期の非ペプチド刺激細胞のものと同等であった。ｃ１Ｆ６抗体投与は他のＣＤ８^＋又はＣＤ４^＋ＶβＴＣＲファミリーの相対的提示を大きく変化させず；何れの群の排除も観察されなかった。これ等のデータはｃ１Ｆ６抗体への曝露は、バイスタンダーＴ細胞集団に検出可能な同時発生的損傷を生じさせること無く、ＣＤ７０^＋活性化Ｔ細胞を選択的に枯渇させることを示している。

（実施例１１）腎細胞癌のマウス異種移植片モデル
７８６−Ｏ皮下異種移植片モデルを用いて種々の用量と日程により投与した抗ＣＤ７０ＡＤＣの抗腫瘍活性を評価した。皮下７８６−Ｏ腫瘍は約３０ｍｍ^３の腫瘍フラグメント（群当たりＮ＝５又は６）を移植することによりヌードマウス中に発癌開始させた。腫瘍を生育させ、平均腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３となった時点で投与を開始した。腫瘍の寸法はカリパス計測により測定し、生育をモニタリングした。腫瘍サイズは（長さｘ幅^２）／２の式を用いて計算した。何れの投与も行わない場合、平均腫瘍体積は腫瘍移植後４０〜５０日以内に約６０ｍｍ^３にまで増大する（図１０参照）。腫瘍生育抑制における用量依存的作用はヒト化１Ｆ６−ｍｃＭＭＡＦ４（抗体当たり４薬剤単位の平均のローディング水準のＨＪＬＡ）又はヒト化１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ４（抗体当たり４薬剤単位の平均のローディング水準のＨＪＬＡ）を投与されたマウスにおいて観察された。腫瘍生育の検出可能な遅延はそれぞれ０．５及び０．１７ｍｇ／ｋｇのｈ１Ｆ６−ｍｃＭＭＡＦ４及びｈ１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ４においても観察された。

腫瘍生育は又、腫瘍のサイズが４倍になるために必要な時間によっても評価した（図１０Ｂ参照）。ｈ１Ｆ６−ｍｃＭＭＡＦ４又はｈ１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ４のいずれかを０．１７ｍｇ／ｋｇで投与することにより腫瘍生育は顕著に遅延した。この遅延はＡＤＣをｑ４ｄｘ４又はｑ４ｄｘ１０の日程で投与した場合に観察された。しかしながら、ｑ４ｄｘ１０の日程により例示される通り追加的投与はｑ４ｄｘ４日程と比較してより強力な生育抑制活性を有すると観察された。

（実施例１２）多発性骨髄腫細胞系統上のＣＤ７０の発現
細胞表面ＣＤ７０発現を多発性骨髄腫細胞系統のパネルにおいて評価した（表６）。ＱＩＦＩＫｉｔ（登録商標）（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いた定量的フローサイトメトリーにより各細胞系統により発現されたＣＤ７０分子のコピー数を測定した。これ等の細胞の抗ＣＤ７０ＡＤＣ媒介細胞毒性に対する応答を測定した。本モデルにおいては、キメラ抗ＣＤ７０ＡＤＣの活性はヒト抗ＣＤ７０ＡＤＣの活性に近似している。両方のキメラ１Ｆ６（ｃ１Ｆ６）−ｖｃＭＭＡＦ４及びｃ１Ｆ６−ｍｃＭＭＡＦ４はＣＤ７０発現多発性骨髄腫細胞に対して細胞毒性であった。ｃ１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ４で得られたＩＣ_５０値は１．２〜１６０ｎｇ／ｍＬの範囲であり、ｃ１Ｆ６−ｍｃＭＭＡＦ４で得られた値は１．７〜５００ｎｇ／ｍＬの範囲であった。

（表６）
（多発性骨髄腫細胞系統に対するキメラ抗ＣＤ７０ＡＤＣの細胞毒性活性）

（実施例１３）多発性骨髄腫のマウス異種移植片モデル
多発性骨髄腫の異種移植片モデルにおける抗ＣＤ７０ＡＤＣのインビボ活性を更に調べた。ヒト多発性骨髄腫細胞系統ＭＭ−１Ｓ（図１１Ａ＆１１Ｂ）又はＬ３６３（図１２Ａ＆１２Ｂ）を１０ｘ１０６個／３００μＬの細胞濃度でＲＰＭＩ−１６４０培地中に再懸濁した。腫瘍を樹立するために、細胞懸濁液３００μＬをＳＣＩＤマウスの尾部静脈から静脈内注射した。ＭＭ−１Ｓモデルにおいては、未投与のマウスは注射された腫瘍が蔓延し、腫瘍移植後約４０日で後肢麻痺、屈曲姿勢、頭部浮腫及び／又は不良な表皮状態を包含する症状が顕在化した。これ等の症状の１つ以上を示したマウスは安楽死させた。ｈ１Ｆ６（ＨＪＬＡ）−ｖｃＭＭＡＦ４及びｈ１Ｆ６（ＨＪＬＡ）−ｍｃＭＭＡＦ４の両方とも対照の非結合ＩｇＧ−ｖｃＭＭＡＦ４及びＩｇＧ−ｍｃＭＭＡＦ４と比較して腫瘍担持マウスに顕著な生存の利益をもたらした（図１１Ａ参照）。ＭＭ−１Ｓモデルにおける腫瘍負荷はまたＭＭ−１Ｓ細胞により発現される血漿細胞マーカーであるヒトＣＤ１３８を発現している骨髄細胞の数を計数することによっても評価した。骨髄細胞は症状顕在化のため、又は、第１２２日の実験終了時に安楽死させたマウスから回収し、ＣＤ１３８発現ＭＭ−１Ｓ細胞の数をフローサイトメトリーにより測定した。未投与マウスと比較して、両方の対照ＩｇＧ−ｖｃＭＭＡＦ４及びＩｇＧ−ｍｃＭＭＡＦ４は骨髄中のＣＤ１３８発現細胞の数を顕著に低減しなかった。一方、ｈ１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ４及びｈ１Ｆ６−ｍｃＭＭＡＦ４は対照ＡＤＣと比較して、骨髄ＣＤ１３８発現細胞の遥かに低値の数により明らかにされる通り、腫瘍負荷を顕著に低減している（図１１Ｂ参照）。

Ｌ３６３モデルにおいては、播種性腫瘍塊は投与を受けないマウスでは複数個所に発生し、そして腫瘍塊は腫瘍注射後約４０日には触診可能となり、その時点で腫瘍担持マウスを安楽死させる。ＭＭ−１Ｓモデルと同様、対照のＩｇＧ−ｖｃＭＭＡＦ４は生存利点を全くもたらさなかったのに対し、ｈ１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ４は生存を顕著に延長した（図１２Ａ参照）。Ｌ３６３細胞は免疫グロブリンラムダ軽鎖（λＬＣ）を分泌するため、腫瘍負荷は腫瘍担持マウスの血漿中のヒトλＬＣの濃度をモニタリングすることにより測定できる。分泌されたλＬＣを検出するためにＥＬＩＳＡを使用した。９６穴平底イムノプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ，＃４４２４０４，Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を４℃で一夜０．１Ｍ炭酸／重炭酸ナトリウム中２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ＃２０１０−０１，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）１００μＬ／ウェルでコーティングした。ウェルを１ｘＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で５回洗浄し、そして室温で１時間１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）２００μＬ／ウェルでブロックした。１ｘＰＢＳＴで５回洗浄した後、連続希釈したヒトλＬＣ含有マウス血清試料を添加した。精製したヒトλＬＣ（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｓ，＃Ｐ８０−１２７，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）を標準物質として使用した。室温で１時間インキュベートした後、ウェルを１ｘＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中１：４０００希釈したＨＲＰ−ヤギ抗ヒトラムダ鎖特異的Ｆ（ａｂ’）_２（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，＃２０７２−０５）を添加した。室温で更に１時間インキュベートした後、ウェルを１ｘＰＢＳＴで５回洗浄した。ＴＭＢ基質１００μＬ／ウェル（Ｓｉｇｍａ，＃Ｔ８６６５，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて捕獲されたλＬＣを検出した。図１２ＢはＬ３６３細胞移植後４０日の血漿の結果を示す。λＬＣ濃度は未投与マウスとＩｇＧ−ｖｃＭＭＡＦ４投与マウスの間で同等であった。一方、ｈ１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ４投与マウスの血清中λＬＣ濃度は顕著に低値であり、多発性骨髄腫異種移植片担持マウスにおける腫瘍負荷を低減する抗ＣＤ７０ＡＤＣの能力を裏付けていた。

（実施例１４）ホジキン及び神経膠芽腫細胞系統上のＣＤ７０の発現
細胞表面ＣＤ７０発現はまたホジキン病（表７）及び神経膠芽腫細胞系統（表８）のパネルにおいても評価した。ＱＩＦＩＫｉｔ（登録商標）（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いた定量的フローサイトメトリーにより各細胞系統により発現されたＣＤ７０分子のコピー数を測定した。これ等の細胞のキメラ抗ＣＤ７０ＡＤＣ媒介細胞毒性に対する応答を測定した。本モデルにおいては、キメラ抗ＣＤ７０ＡＤＣの活性はヒト抗ＣＤ７０ＡＤＣの活性に近似している。両方のキメラ１Ｆ６（ｃ１Ｆ６）−ｖｃＭＭＡＦ４及びｃ１Ｆ６−ｍｃＭＭＡＦ４はＣＤ７０発現多発性骨髄腫細胞に対して細胞毒性であった。ホジキン病パネルにおいては、ｃ１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ４で得られたＩＣ_５０値は０．４１〜４２ｎｇ／ｍＬの範囲であり、ｃ１Ｆ６−ｍｃＭＭＡＦ４で得られた値は５．２〜３１０ｎｇ／ｍＬの範囲であった（表７）。神経膠芽腫パネルにおいては、ｈ１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ４で得られたＩＣ_５０値は２．３〜２７ｎｇ／ｍＬの範囲であり、ｈ１Ｆ６−ｍｃＭＭＡＦ４で得られた値は１５〜１１０ｎｇ／ｍＬの範囲であった（表８）。

本発明は本明細書に記載した特定の実施形態により範囲を限定されない。実際、本明細書に記載したものの他に本発明の種々の変更例が上記説明及び添付図面より当業者には明らかになる。このような変更例は添付請求項の範囲内に含まれることを意図している。

特許出願、特許及び特定の出版物を包含する種々の参考文献が本明細書において引用されており、その各々の開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。

図１は１Ｆ６ｍＶ_Ｈ及びヒト生殖細胞系Ｖ_ＨエキソンＶ_Ｈ１−２及びＪ_ＨエキソンＪＨ６を有するヒト化１Ｆ６Ｖ_Ｈヒト化改変体ｈＶ_ＨＥ及びｈＶ_ＨＪのアライメントである。アライメントにおいて、＜・＞はアミノ酸がマウス残基と同一であることを示す。ｈＶ_ＨｊのＨ４６におけるハイライトのリジン残基（Ｋ）はマウス残基への復帰突然変異を示す。下線を付されたアミノ酸残基はＫａｂａｔの定義に従ったＣＤＲ１及びＣＤＲ２における位置を示し、一方、箱内の残基はＣｈｏｔｈｉａの定義により識別される相当するＣＤＲにおける位置を示す。３７、３９、４５、４７、９５及び９７位にあるような＜＾＞はＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌインターフェイスに関与する残基を示す。 図２は１Ｆ６ｍＶ_Ｈ及びヒト生殖細胞系Ｖ_ＨエキソンＶ_Ｈ１−１８及びＪ_ＨエキソンＪＨ６を有するヒト化１Ｆ６Ｖ_Ｈヒト化改変体ｈＶ_ＨＨ及びｈＶ_ＨＭのアライメントである。アライメントにおいて、＜・＞はアミノ酸がマウス残基と同一であることを示す。ｈＶ_ＨＭのＨ４６、Ｈ６７、Ｈ６８、Ｈ６９、Ｈ７０及びＨ７１におけるハイライトの残基はマウス残基への復帰突然変異を示す。同様にｈＶ_ＨＨのＨ６７、Ｈ６８、Ｈ６９、Ｈ７０、Ｈ７１、Ｈ８０、Ｈ８２及びＨ８２Ａにおけるハイライトの残基はマウス残基への復帰突然変異を示す。下線を付されたアミノ酸残基はＫａｂａｔの定義に従ったＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３における位置を示し、一方、箱内の残基はＣｈｏｔｈｉａの定義により識別される相当するＣＤＲにおける位置を示す。３７、３９、４５、４７、９８及び１００位にあるような＜＾＞はＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌインターフェイスに関与する残基を示す。 図３は１Ｆ６ｍＶ_Ｌ及びヒト生殖細胞系Ｖ_ＫエキソンＢ３及びＪ_ＫエキソンＪ_Ｋ−１を有するヒト化１Ｆ６Ｖ_Ｌ改変体ｈＶ_ＬＡのアライメントである。アライメントにおいて、＜・＞はアミノ酸がマウス残基と同一であることを示す。下線を付されたアミノ酸残基はＫａｂａｔの定義に従ったＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３における位置を示し、一方、箱内の残基はＣｈｏｔｈｉａの定義により識別される相当するＣＤＲにおける位置を示す。４２、４４、５０、５２及び９３位にあるような＜＾＞はＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌインターフェイスに関与する残基を示す。 図４Ａはヒト化１Ｆ６抗ＣＤ７０抗体が抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介することを示す。Ｎａ_２ ^５１ＣｒＯ_４標識標的細胞（ＷＩＬ２−ＳＢリンパ芽様細胞、７８６−Ｏ腎癌細胞及び７６９−Ｐ腎細胞癌細胞）を抗体でコーティングし、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共に、１０ＣＤ１６^＋（ＦｃγＩＩＩ受容体）細胞ｖｓ１標的細胞のエフェクターｖｓ標的比においてインキュベートした。４時間後、溶解した細胞の上澄みをシンチレーションカウンター上で測定した。パーセント特異的溶解は｛（被験試料ｃｐｍ−自発的ｃｐｍ）÷（総ｃｐｍ−自発的ｃｐｍ）｝ｘ１００として計算した。点は３連の試料の平均±標準偏差を示す。図４Ａは非結合抗体対照ｈＩｇＧ_１及びマウス１Ｆ６抗体と比較した場合のヒト化１Ｆ６改変体ＨＨＬＡ、ＨＪＬＡ及びＨＥＬＡにより媒介されるＡＤＣＣ活性を示す。 図４Ｂはヒト化１Ｆ６抗ＣＤ７０抗体が抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介することを示す。Ｎａ_２ ^５１ＣｒＯ_４標識標的細胞（ＷＩＬ２−ＳＢリンパ芽様細胞、７８６−Ｏ腎癌細胞及び７６９−Ｐ腎細胞癌細胞）を抗体でコーティングし、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共に、１０ＣＤ１６^＋（ＦｃγＩＩＩ受容体）細胞ｖｓ１標的細胞のエフェクターｖｓ標的比においてインキュベートした。４時間後、溶解した細胞の上澄みをシンチレーションカウンター上で測定した。パーセント特異的溶解は｛（被験試料ｃｐｍ−自発的ｃｐｍ）÷（総ｃｐｍ−自発的ｃｐｍ）｝ｘ１００として計算した。点は３連の試料の平均±標準偏差を示す。図４Ｂはキメラ１Ｆ６及びヒト化１Ｆ６改変体ＨＪＬＡ及びｈＩｇＧ_１により媒介された腎細胞癌細胞系統の抗体指向性溶解を示す。 図５はヒト化１Ｆ６抗ＣＤ７０改変体ＨＪＬＡが補体依存性細胞性細胞毒性（ＣＤＣ）を媒介することを示している。ＬＰ−１、ＭＨＨＰｒｅＢ−１及びＷＩＬ−Ｓ標的細胞を補体原料としてのヒト血清の存在下にキメラ１Ｆ６、ヒト化１Ｆ６（ＨＪＬＡ）又は非結合ヒトＩｇと混合した。３７℃２時間の後、ヨウ化プロピジウムを添加し、フローサイトメトリーにより測定されるものとして細胞の生存性を調べ、そして溶解活性の量を計算した。バーは３連の試料の平均±標準偏差を示す。 図６はヒト化１Ｆ６抗ＣＤ７０抗体が抗体依存性細胞性貪食作用（ＡＤＣＰ）を媒介することを示す。７８６−ＯＣＤ７０^＋腎細胞癌標的細胞を赤色蛍光細胞膜染料（ＰＫＨ２６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で標識し、次に氷上３０分間、キメラ１Ｆ６、ヒト化１Ｆ６（ＨＪＬＡ）又は非結合ヒトＩｇでコーティングした。標識された抗体投与標的細胞を３７℃において、１マクロファージｖｓ４標的細胞の比で単球誘導マクロファージと混合した。マクロファージはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）抗ＣＤ１１ｂ抗体で染色し、そしてパーセント貪食活性はフローサイトメトリーで分析した場合に二重蛍光を示すマクロファージのパーセントにより求めた。 図７は播種性リンパ腫及び多発性骨髄腫の異種移植片モデルにおけるマウスの生存をヒト化１Ｆ６抗ＣＤ７０抗体が延長することを示している。（Ａ）Ｒａｊｉ細胞を注射し、そしてヒト化１Ｆ６抗体又は対照非結合抗体を投与したマウスの生存性。投与は腫瘍細胞注射後１日に開始し、そして合計６投薬につき４日毎に腹腔内注射により投与した（群当たりｎ＝１０）。（Ｂ、Ｃ、左パネル）Ｌ３６３−又はＭＭ．１Ｓ−細胞を注射し、そして細胞移植後１日からヒト化１Ｆ６投与を開始したマウスの生存性を示す。抗体は合計５投薬につき週一回の静脈内注射により投与した。マウスは週２回モニタリングし、疾患の顕在化の時点で安楽死させた（群当たりｎ＝７）。（Ｂ、Ｃ、右パネル）Ｌ３６３−又はＭＭ．１Ｓ−細胞を注射したマウスから採取した血清中のλ軽鎖濃度の分析。試料はそれぞれ腫瘍注射後３５及び４２日に採取した。全試験において、記載したｐ値はヒト化１Ｆ６投与群と未投与群の間のものである。 図８は抗原特異的ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞の枯渇をヒト化１Ｆ６が媒介することを示している。正常ＨＬＡ−Ａ０２０１ドナー由来のＰＢＭＣをＭ１ペプチドで刺激した。（Ａ）ペプチド刺激培養物は記載する通り、未投与とするか、又は、漸増用量のヒト化１Ｆ６抗体の同時添加により投与した。９日後のパーセントＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞をフローサイトメトリーにより測定した。（Ｂ）ペプチド刺激培養物は、未投与、又は第０日において１μｇ／ｍＬヒト化１Ｆ６投与を、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に対して特異的な１０μｇ／ｍＬ抗体の非存在下（黒色バー）又は存在下（斜線バー）において行った。９日後のパーセントＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞をフローサイトメトリーにより測定した。 図９はバイスタンダー休止期Ｔ細胞上の抗ＣＤ７０１Ｆ６抗体の最小限の影響を示す。正常ＨＬＡ−Ａ０２０１ドナー由来のＰＢＭＣを未投与、又はＭ１ペプチド刺激（ペプチドｓｔｉｍ）を１μｇ／ｍＬのｃｌＦ６の存在下又は非存在下に行った。培養９日後、各群由来のＣＤ４及びＣＤ８の間のＶβＴＣＲ提示をＩＯＴｅｓｔ（登録商標）Ｂｅｔａ Ｍａｒｋ ＴＣＲＶβレパートリーキットを用いてフローサイトメトリーにより分析した。 図１０は腎細胞癌のマウス異種移植片モデルを示す。（Ａ）皮下７８６−Ｏ腫瘍は約３０ｍｍ^３の腫瘍フラグメント（群当たりＮ＝５又は６）を移植することによりヌードマウス中に発癌開始させた。腫瘍を生育させ各群における平均腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３となった時点で投与を開始した。記載した用量のｈ１Ｆ６−ｍｃＭＭＡＦ４又はｈ１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ４は、矢印で示す通り、腫瘍移植後１７日から開始してｑ４ｄｘ４の日程で投与した。１０００ｍｍ３を超える腫瘍を有する動物を安楽死させた時点は交線で記載した。 図１０は腎細胞癌のマウス異種移植片モデルを示す。（Ｂ）７８６−Ｏ腫瘍移植及び投与開始は（Ａ）の場合と同様とする。マウスの群（Ｎ＝５〜７）に腫瘍移植後１３日から開始してｑ４ｄｘ４又はｑ４ｄｘ１０の日程でｈ１Ｆ６−ｍｃＭＭＡＦ４又はｈ１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ４を投与した。腫瘍の生育はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットにより示した。腫瘍を有するマウスが投与開始の第１３日と比較して４倍サイズとなった場合に事象を登録した。第４３日の実験終了時にサイズが４倍とならなかった腫瘍を有するマウスは削除した。対数順位検定を用いて投与群及び未投与群の間のｐ値を求めた。 図１１は多発性硬化症のマウス異種移植片モデルを示す。（Ａ）１０百万個のＭＭ−１Ｓ細胞を各ＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。マウスの群（Ｎ＝８〜１０）は未投与とするか、ＩｇＧ−ｖｃＭＭＡＦ４、ＩｇＧ−ｍｃＭＭＡＦ４、ｈ１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ４又はｈ１Ｆ６−ｍｃＭＭＡＦ４を所定の用量において、ｑ７ｄｘ５の日程で矢印に示す通り投与した。後肢麻痺の症状、屈曲姿勢、頭部浮腫及び／又は不良な表皮状態を示したマウスは安楽死させ、各群のパーセント生存をプロットした。対数順位検定を用いて投与群及び対照群の間のｐ値を求めた。 図１１は多発性硬化症のマウス異種移植片モデルを示す。（Ｂ）骨髄細胞を上記疾患状態の為に、又は、実験終了時の腫瘍細胞移植後１２２日に、安楽死させたマウスの大腿から回収した。各マウスの大腿中のＣＤ１３８発現ＭＭ−１Ｓ細胞のパーセントをフローサイトメトリーにより測定した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて所定群間のｐ値を求めた。 図１２は多発性硬化症のマウス異種移植片モデルを示す。（Ａ）１０百万個のＬ３６３細胞を各ＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。マウスの群（Ｎ＝７）は未投与とするか、ＩｇＧ−ｖｃＭＭＡＦ４又はｈ１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ４を所定の用量において、ｑ７ｄｘ５の日程で矢印に示す通り投与した。触診可能な腫瘍の塊を示したマウスは安楽死させ、各群のパーセント生存をプロットした。対数順位検定を用いて投与群及び未投与群の間のｐ値を求めた。 図１２は多発性硬化症のマウス異種移植片モデルを示す。（Ｂ）血清試料は腫瘍移植後４０日にマウスから採取した。各マウスの血清中のヒトλ軽鎖の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて所定群間のｐ値を求めた。

Claims (25)

1. ヒトＣＤ７０に特異的に結合するヒト化抗体または抗原結合フラグメントであって、
   （ｉ）配列番号６、配列番号１４又は配列番号４のアミノ酸２０〜１３７に示されるアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域と、
   （ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖可変領域と、
   を含む、ヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
2. 前記ヒト化重鎖可変領域は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
3. 前記ヒト化重鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
4. 前記ヒト化重鎖は、配列番号４に示される残基２０〜１３７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
5. 抗原結合フラグメントである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
6. ｓｃＦｖ、ダイアボディ、Ｆａｂ、ミニボディ又はｓｃＦｖ−Ｆｃである、請求項５に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
7. 抗体エフェクタードメインをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
8. 前記抗体エフェクタードメインは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ又はＣＤＣを媒介する、請求項７に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
9. 前記抗体エフェクタードメインは、ＡＤＣＰを媒介する、請求項８に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
10. 前記抗体エフェクタードメインがヒト抗体エフェクタードメインである、請求項７に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
11. 前記抗体または抗原結合フラグメントが治療薬にコンジュゲートされている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
12. 前記治療薬が化学療法剤又は免疫調節剤である、請求項１１に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
13. 前記治療薬が化学療法剤である、請求項１２に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
14. 前記化学療法剤は抗チューブリン剤である、請求項１３に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
15. 前記抗チューブリン剤がＭＭＡＥ又はＭＭＡＦである、請求項１４に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
16. 前記治療薬が免疫調節剤である、請求項１２に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント。
17. ＣＤ７０発現癌又は免疫学的障害の治療のための医薬組成物であって、該組成物が請求項１〜１６の何れか１項に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメントを含む、組成物。
18. ヒト対象における免疫学的障害の治療のための請求項１７に記載の医薬組成物であって、該免疫学的障害が、Ｔ細胞媒介性障害または活性化Ｂリンパ球障害である、組成物。
19. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗体のヒト化重鎖可変領域；または請求項１に記載のヒト化抗体のヒト化軽鎖可変領域；またはその両方をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
20. 配列番号１３または配列番号２３を含むヌクレオチド配列を有する、請求項１９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
21. 請求項１〜１６の何れか１項に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメント、及び対象または生物学的試料中のＣＤ７０蛋白を検出するために該ヒト化抗体または抗原結合フラグメントを使用するための説明書を含む、キット。
22. ＣＤ７０抗原を発現する細胞の成育を抑制するための医薬組成物であって、請求項１〜１６の何れか１項に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメントを、細胞成育を抑制するのに十分な量で含む、組成物。
23. 請求項１９または２０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
24. 請求項１９または２０に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項２３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
25. ＣＤ７０発現癌を有するヒト対象において癌を治療するための医薬組成物であって、該組成物は、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のヒト化抗体または抗原結合フラグメントを含む、組成物。

Images