ES2588194T3 - Detección y tratamiento de cáncer pancreático, de ovario y otros cánceres - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal que se une específicamente a CD70 humana desnaturalizada en una muestra de células o tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina que expresan CD70 humana, y que tiene regiones determinantes de complementariedad (CDR) de región variable de cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR de la región variable de cadena pesada del anticuerpo SG-21.1C1 y de las CDR de región variable de cadena ligera que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR de la región variable de cadena ligera del anticuerpo SG-21.1C1, como se produce por el hibridoma depositado en la ATCC y con el número de registro PTA-8733, o de las CDR de región variable de cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR de la región variable de cadena pesada del anticuerpo SG-21.5D12 y de las CDR de región variable de cadena ligera que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR de la región variable de cadena ligera del anticuerpo SG-21.5D12, como se produce por el hibridoma depositado en la ATCC y el número de registro PTA-8734.

Description

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Un anticuerpo anti-CD70 también puede ser un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos pueden producirse mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica tales como métodos de presentación en fagos (véase supra) usando bibliotecas de anticuerpos procedentes de secuencias de inmunoglobulina humanas. Véanse también, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n.º 4.444.887 y 4.716.111; y los documentos WO 98/46645, WO 5 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741. Además, puede generarse un anticuerpo humano que reconoce un epítopo seleccionado usando una técnica denominada “selección guiada” en la que se usa un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo (véase, por ejemplo, Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903). También pueden producirse anticuerpos humanos usando ratones transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno a partir de los ratones transgénicos inmunizados usando la tecnología de hibridoma. Para una descripción general de la tecnología de producción de anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar, 1995, Int. Rev. lmmunol. 13:65-93. Para un análisis detallado de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos, véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT

15 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; la patente europea n.º 0 598, 877; las Patentes de Estados Unidos n.º 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598.

En los anticuerpos se puede ensayar la unión específica a CD70 por métodos conocidos, tales como, por ejemplo, sistemas de inmunoensayo competitivos y no competitivos usando técnicas tales como transferencia de Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayo de tipo “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina con difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación al complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos con proteína A. (Véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds., Short

25 Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 4ª edición, 1999); Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999.)

Además, la afinidad de unión de un anticuerpo a CD70 y la velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-CD70 puede determinarse por ensayos de unión competitiva. Un ejemplo de un ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de CD70 marcada (por ejemplo, 3H o 125I) con el anticuerpo de interés en presencia de cantidades crecientes de CD70 no marcada, y la detección del anticuerpo unido a la proteína CD70 marcada. La afinidad del anticuerpo por CD70 y las velocidades de disociación de la unión pueden determinarse después a partir de los datos por análisis de gráficos de Scatchard. La competición con un segundo anticuerpo también puede determinarse usando radioinmunoensayos. En este caso, CD70 se incuba con el anticuerpo

35 de interés conjugado con un compuesto marcado (por ejemplo, 3H or125I) en presencia de cantidades crecientes de un segundo anticuerpo no marcado. Como alternativa, la afinidad de unión de un anticuerpo por CD70 y las velocidades de asociación y disociación de una interacción de anticuerpo-CD70 pueden determinarse por resonancia de plasmón superficial.

Pueden obtenerse anticuerpos a partir de fragmentos que contienen antígeno de la proteína CD70 por procedimientos convencionales según el tipo de anticuerpo (véase, por ejemplo, Kohler, et al., Nature, 256:495, (1975); Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (C.S.H.P., NY, 1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) y el documento WO 90/07861; Dower et al., documento WO 91/17271 y McCafferty et al., documento WO 92/01047. Como ejemplo, pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando una amplia diversidad de técnicas

45 que incluyen, por ejemplo, el uso de las tecnologías de hibridoma, recombinante y de presentación en fago o una combinación de las mismas. Las técnicas de hibridoma se analizan, en general, por ejemplo, en Harlow et al., supra, y Hammerling, et al., en Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, págs. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). Los ejemplos de métodos de presentación en fagos que pueden usarse para fabricar los anticuerpos anti-CD70 incluyen, por ejemplo, los divulgados en Briinnan et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las patentes de Estados Unidos n.º 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.

55 También se conocen en general en este campo técnicas para generar fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos. Por ejemplo, pueden producirse fragmentos Fab y F(ab’)2 por escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentes Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab’)2). Los fragmentos F(ab’)2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. También pueden emplearse técnicas para producir de forma recombinante fragmentos Fab, Fab’ y F(ab’)2, usando, por ejemplo, los métodos divulgados en el documento WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; y Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; y Better et al., 1988, Science 240:1041-1043 (cuyas divulgaciones se incorporan al presente documento por referencia).

65 Los ejemplos de técnicas que puede usarse para producir Fv y anticuerpos monocatenarios incluyen los descritos en las Patentes de Estados Unidos n.º 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203:46-88;

Shu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999; y Skerra et al., 1988, Science 240:1038-1040.

También pueden producirse anticuerpos anti-CD70 y derivados de los mismos que son útiles en los presentes métodos por técnicas de expresión recombinante. La expresión recombinante de un anticuerpo o derivado del mismo 5 que se une a CD70 y/o reduce o inhibe la proliferación de células que expresan CD70 requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica al anticuerpo o derivado del mismo. Una vez que se ha obtenido un ácido nucleico que codifica dicha proteína, el vector para la producción de la molécula de proteína puede producirse por la tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en este campo. Pueden usarse técnicas convencionales tales como las descritas en Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3ª edición, 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2ª edición, 1989); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Nueva York, 4ª edición, 1999); y Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 2ª edición, 1998) para métodos de ácidos nucleicos recombinantes, síntesis de ácidos nucleicos, cultivos celulares, incorporación de

15 transgenes y expresión de proteínas recombinantes.

Por ejemplo, para la expresión recombinante de un anticuerpo anti-CD70, un vector de expresión puede codificar una cadena pesada o ligera del mismo o un dominio variable de cadena pesada o ligera, unido operativamente a un promotor. Un vector de expresión puede incluir, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véanse, por ejemplo, los documentos WO 86/05807; WO 89/01036; y la Patente de Estados Unidos n.º 5.122.464), y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en dicho vector para la expresión de la cadena pesada o ligera completa. El vector de expresión se introduce por transfección en una célula hospedadora mediante técnicas conocidas y las células transfectadas se cultivan después para producir el anticuerpo anti-CD70. Típicamente, para la expresión de anticuerpos bicatenarios, pueden co-expresarse vectores que codifican

25 tanto la cadena pesada como la cadena ligera en la célula hospedadora para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa.

Puede utilizarse una diversidad de sistemas de hospedador procariota y eucariota-vector de expresión para expresar un anticuerpo anti-CD70 o derivado del mismo. Típicamente, se usan células eucariotas, particularmente para moléculas de anticuerpo anti-CD70 recombinantes enteras, para la expresión de la proteína recombinante. Por ejemplo, las células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, DG44 o CHO-S) junto con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano inmediato principal del citomegalovirus humano o el promotor de EF-1α de ovario de hámster chino, es un sistema de expresión eficaz para la producción de anticuerpos anti-CD70 y derivados de los mismo (véase, por ejemplo Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990,

35 Bio/Technology 8:2; Allison, Patente de Estados Unidos n.º 5.888.809).

Otros sistemas de expresión en hospedador incluyen sistemas de expresión basados en plásmidos en células bacterianas (véase, por ejemplo, Ruther et al., 1983, EMBO 1,2:1791; Inouye e Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke y Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); sistemas de insecto tales como el uso del vector de expresión del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) en células de Spodoptera frugiperda; y sistemas de expresión basados en virus en células de mamífero, tales como sistemas basados en adenovirus (véanse, por ejemplo, Logan y Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359; Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).

45 B. Anticuerpos para la detección de CD70

La selección de anticuerpos contra CD70 para su uso en métodos de detección depende de si se detecta CD70 mediante una técnica que requiera la detección de CD70 desnaturalizada o de CD70 nativa (como se expresa en las células). En métodos, tales como la trasferencia de Western o la detección inmunohistoquímica, en la que la proteína CD70 diana esta desnaturalizada, se prefiere usar un anticuerpo que se una a CD70 en forma desnaturalizada (por ejemplo, CD70 humana o de cinomolgo). Típicamente, dichos anticuerpos se unen preferentemente a la forma desnaturalizada con respecto a la forma nativa, es decir, CD70 según se produce de forma natural o cuando se aísla sin exponerse a condiciones desnaturalizantes, tales como disolvente, detergentes o temperaturas elevadas (por ejemplo, mayores de 50 °C)). Dichos anticuerpos pueden inducirse usando un inmunógeno de CD70 desnaturalizado

55 (por ejemplo, CD70 humana o de cinomolgo), o un fragmento inmunogénico del mismo procedente de la parte extracelular. La desnaturalización puede realizarse tratando el inmunógeno con SDS (por ejemplo, al 0,5 %) y opcionalmente calentando a 80 °C. La desnaturalización también puede realizarse simplemente eluyendo un inmunógeno de un gel de SDS usado para purificar el inmunógeno. Como alternativa, pueden producirse anticuerpos que se unen preferentemente a la proteína CD70 desnaturalizada, usando péptidos sintéticos procedentes del dominio extracelular de CD70 como inmunógeno. Algunos de esos péptidos son demasiado cortos como para conservar la conformación de un segmento correspondiente del péptido nativo. Los péptidos sintéticos pueden estar desnaturalizados, pero normalmente no requieren desnaturalización para usarse como un inmunógeno.

Los anticuerpos generados por estos u otros métodos se exploran para seleccionar los de unión preferente a CD70

65 desnaturalizada con respecto a CD70 nativa. El antígeno CD70 desnaturalizado y nativo puede ensayarse mediante el mismo ensayo o mediante ensayos diferentes. En particular, si se usa el ultimo enfoque, la selección puede realizarse

con un anticuerpo de control que se sabe que se une a CD70 nativa, tal como anticuerpos terapéuticos descritos más adelante (por ejemplo, 1F6 o 2F2 humanizados; véanse las publicaciones de solicitudes de Patente de Estados Unidos n.º 2006-0233794 y 2006-0083736 y la publicación de patente internacional WO 06/113909). Si un anticuerpo muestra una mayor relación de unión a CD70 desnaturalizada con respecto a CD70 nativa con respecto a la relación del

5 anticuerpo de control, entonces el anticuerpo se une preferentemente a CD70 desnaturalizada.

Los anticuerpos preferidos para la detección de CD70 en cánceres pancreáticos y de ovario son los que se unen específicamente a CD70 en muestras de cáncer pancreático o de ovario que están fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE). Estos anticuerpos reconocen preferentemente epítopos en CD70 que se revelan por el tratamiento FFPE con respecto a antígenos CD70 nativos en células de cáncer pancreático o de ovario no tratadas. Dichos anticuerpos se denominan anticuerpos anti-CD70 específicos de FFPE. Dichos anticuerpos carecen de unión específica detectable a la proteína CD70 nativa. Preferentemente, la unión específica de los anticuerpos es igual o mejor que la del anticuerpo SG-21.1C1 o SG-21.5D12. En particular, los anticuerpos tienen preferentemente una reactividad cruzada detectable igual o menor con otras proteínas celulares, según se determina por transferencia de

15 Western o tinción de células fijadas, en condiciones de unión específicas, en comparación con los anticuerpos SG-21.1C1 o SG-21.5D12.

Los anticuerpos preferidos para la detección de CD70 en otros cánceres (como se describe más adelante en los ejemplos) son aquellos que se unen específicamente a CD70 en estos especímenes de cáncer que están fijados con formalina e incluidos en parafina (FFPE). Estos anticuerpos reconocen preferentemente epítopos en CD70 que se revelan por el tratamiento FFPE con respecto a los antígenos CD70 nativos presentes en células de cáncer pancreático o de ovario sin tratar. Dichos anticuerpos carecen de unión específica detectable a la proteína CD70 nativa. Preferentemente, la unión específica de los anticuerpos es igual o mejor que la de los anticuerpos SG-21.1C1 o SG-21.5D12. En particular, los anticuerpos tienen preferentemente una reactividad cruzada detectable igual o menor

25 con otras proteínas celulares, según se determina por transferencia de Western o tinción de células fijadas, en condiciones de unión específicas, en comparación con los anticuerpos SG-21.1C1 o SG-21.5D12.

Algunos anticuerpos anti-CD70 específicos de FFPE ejemplares son los mAb SG-21.1C1 (también denominado como SG-21.1C1.B3) y SG-21.5D12.C3 (también denominado SG-21.5D12.C3). Otros anticuerpos preferidos compiten con SG-12. 1C1.B3 o SG-21.5D12.C3 por la unión específica a la proteína CD70 desnaturalizada. Otros anticuerpos preferidos comprenden una cadena pesada que comprende las tres CDR de la cadena pesada de SG-21.1C1.B3 y una cadena ligera que comprende las tres CDR de la cadena ligera de SG-12.1C1.B3. Otros anticuerpos preferidos comprenden una cadena pesada que comprende las tres CDR de la cadena pesada de SG-21.5D12.C3 y una cadena ligera que comprende las tres CDR de la cadena ligera de SG-21.5D12.C3. Otros anticuerpos preferidos comprenden

35 una región variable de cadena pesada madura que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la región variable de cadena pesada madura de SG-21.1C1.B3 y una región variable de cadena ligera madura que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la región variable de cadena ligera madura de SG-21.1C1.B3. Otros anticuerpos preferidos comprenden una región variable de cadena pesada madura que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con región variable de cadena pesada madura de SG-21.5D12.C3 y una región variable de cadena ligera madura que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la región variable de cadena ligera madura de SG-21.5D12.C3.

C. Anticuerpos contra CD70 para aplicaciones terapéuticas.

45 Los anticuerpos usados para aplicaciones terapéuticas se unen específicamente a un dominio extracelular de antígenos CD70 nativos en células de cáncer pancreático o de ovario. Los anticuerpos usados para aplicaciones terapéuticas también pueden unirse específicamente a un dominio extracelular del antígeno CD70 nativo en cánceres de pulmón, de cabeza y cuello (faringe o laringe), melanoma, glioblastoma, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodking, tal como linfoma folicular, carcinoma de células renales, incluyendo de células claras y papilar, carcinoma colorrectal y carcinoma de vejiga. Los anticuerpos pueden ser agonistas, no agonistas o antagonistas con respecto a la unión de CD70 a su ligando, CD27. Aunque la práctica de la invención no depende de la comprensión del mecanismo, se cree que los anticuerpos pueden ejercer un efecto citotóxico o citostático como resultado de la unión a CD70 y su internalización dentro de la célula o mediante la unión a CD70 y la acumulación en el exterior de las células. En cualquier caso, el efecto citotóxico o citostático puede promoverse conjugando el anticuerpo con un agente

55 citotóxico o citostático. El efecto citotóxico o citostático ejercido desde el exterior de la célula por un anticuerpo unido a CD70 puede promoverse además o como alternativa por una función constante de anticuerpo (efectora). Los dominios constantes de anticuerpo median diversas funciones efectoras de Ig, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP). Opcionalmente, la función efectora de un agente de unión a Cd70 puede aumentarse mediante diversas estrategias, tal como se describe en el documento WO 2006/113909. El efecto citotóxico o citostático ejercido por los anticuerpos también puede promoverse bloqueando la interacción de CD70 con su ligando CD27.

Un anticuerpo anti-CD70 preferido es el mAb 1F6 o 2F2 o una forma quimérica o humanizada de los mismos, como se

65 describe en el documento WO 2004/073656 y la solicitud de Patente de Estados Unidos publicada n.º 2006-0233794 y en el documento WO2006/113909. Una región variable madura de cadena pesada preferida tiene la secuencia SEQ ID

NO: 1 y una región variable madura de cadena ligera preferida tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2.

Otros anticuerpos útiles comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera maduras que tienen al menos un 90 % y preferentemente al menos un 95 % o 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 1 y 2, 5 respectivamente. Se proporciona orientación en cuanto a qué restos de la región marco conservada de la región variable se necesitan para la unión en el documento WO 2006/113909. Otros anticuerpos anti-CD70 útiles o derivados de los mismos pueden inhibir competitivamente la unión del mAb 1F6 o 2F2 a CD70 como se determina, por ejemplo, mediante inmunoensayo. La inhibición competitiva significa que un anticuerpo, cuando está presente en un exceso de al menos dos veces y preferentemente de 5 veces, inhibe la unión de 1F6 o 2F2 a CD70 en al menos un 50 %, más

10 típicamente en al menos un 60 %, aún más típicamente en al menos un 70 % y aún más típicamente en al menos un 75 % o el anticuerpo inhibe competitivamente la unión de 1F6 o 2F2 a CD70 en al menos un 80 %, en al menos un 85%, en al menos un 90% o en al menos un 95%.

Otros anticuerpos preferidos comprenden una cadena pesada que comprende las tres CDR de la región variable de

15 cadena pesada de 1F6 y una cadena ligera que comprende las tres CDR de la región variable de cadena ligera de 1F6. Otros anticuerpos preferidos comprenden una región variable de cadena pesada madura que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la región variable de cadena pesa madura de 2F2 y una región variable de cadena ligera madura que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la región variable de cadena ligera madura de 2F2. Otros anticuerpos preferidos comprenden una región variable de cadena pesada madura que tiene al menos un 90, 95

20 o 99 % de identidad de secuencia con la región variable de cadena pesada madura de 1F6 y una región variable de cadena ligera madura que tiene al menos un 90, 95 o 99 % de identidad de secuencia con la región variable de cadena ligera madura de 1F6. Otros anticuerpos preferidos comprenden una región variable de cadena pesada madura que tiene al menos un 90, 95 o 99 % de identidad de secuencia con la región variable de cadera pesada madura de 2F2 (SEQ ID NO: 3) y una región variable de cadena ligera madura que tiene al menos un 90, 95 o 99 % de identidad de

25 secuencia con la región variable de cadena ligera madura de 2F2 (SEQ ID NO: 4).

Se describen numerosos anticuerpos distintos contra CD70, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente n.º 2005-0191299; y la publicación internacional n.º WO 07/038637. Otros anticuerpos que se unen a un dominio extracelular de CD70 pueden seleccionarse con respecto a la idoneidad bien solos o como derivados y/o conjugados

30 como se describe más adelante. La selección puede evaluar la internalización en células que expresan CD70 usando anticuerpos marcados. La selección también puede evaluar la citotoxicidad. Pueden realizarse una selección adicional en modelos animales de cáncer pancreático o de ovario y otros cánceres. Por ejemplo, pueden usarse la línea celular de carcinoma de ovario SKOV-3, la línea celular de carcinoma endometrial AN3CA, la célula de carcinoma o de ovario TOV21G. Además, pueden usarse las líneas de células pancreáticas PANC1 y MiaPaCa2.

35 En la práctica de los presentes métodos, también puede usarse un derivado de un anticuerpo anti-CD70. Las modificaciones típicas incluyen, por ejemplo, glicosilación, desglicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína y similares. Pueden realizarse cualquiera de numerosas modificaciones químicas, por

40 ejemplo, por escisión química específica, cetilación, formilación o síntesis metabólica en presencia de tunicamicina. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

El derivado de anticuerpo puede ser un multímero, tal como un dímero, que comprende uno o más monómeros, en el que cada monómero incluye (i) una región de unión a antígeno de un anticuerpo anti-CD70 o una región de polipéptido

45 derivado del mismo (por ejemplo, por sustitución conservativa de uno o más aminoácidos) y (ii) una región de multimerización de polipéptido (por ejemplo dimerización), de tal forma que el derivado de anticuerpo forma multímeros (por ejemplo, homodímeros) que se unen específicamente a CD70. Típicamente, una región de unión a antígeno de un anticuerpo anti-CD70, o una región de polipéptido derivada del mismo, se fusiona de forma recombinante o química con una proteína heteróloga, en el que la proteína heteróloga comprende un dominio de

50 dimerización o multimerización. Antes de la administración del derivado de anticuerpo a un sujeto, con el objetivo de tratar o prevenir cánceres que expresan CD70, el derivado se somete a condiciones que permiten la formación de un homodímero o heterodímero. Un heterodímero puede comprender dominios de dimerización idénticos pero diferentes regiones de unión a antígeno de CD70, regiones de unión a antígeno de CD70 idénticas pero diferentes dominios de dimerización o regiones de unión a antígeno CD70 y dominios de dimerización diferentes.

55 Un derivado de un anticuerpo anti-CD70 puede formarse conjugando un anticuerpo anti-CD70 con un segundo anticuerpo (un “heteroconjugado de anticuerpo”) (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.º 4.676.980). Los heteroconjugados útiles para poner en práctica los presentes métodos comprenden un anticuerpo que se une a CD70 (por ejemplo, un anticuerpo que tiene las CDR y/o las cadenas pesadas de los anticuerpos monoclonales 1F6 o

60 2F2) y un anticuerpo que se une a un receptor de superficie o complejo de receptor, tal como un miembro de la súper familia de genes de inmunoglobulina, un miembro de la súper familia de receptores de TNF, una integrina, un receptor de citocinas, un receptor de quimiocinas, una proteína de histocompatibilidad principal, una lectina (de tipo, C, tipo S o tipo I) o una proteína de control del complemento.

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La unidad de aminoácido (-W-), si está presente, une la unidad de estiramiento (-A-) a la unidad espaciadora (-Y-) si está presente en la unidad espaciadora y une la unidad de estiramiento al agente citotóxico o citostatico (unidad de fármaco; D) si está ausente la unidad espaciadora.

5 Si está presente, -WW-es una unidad de dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido. w es un número entero que varía de 2 a 12.

La unidad espaciadora (-Y-), cuando está presente, une una unidad de aminoácido a la unidad de fármaco. Las

10 unidades espaciadoras son de dos tipos generales: Autoinmolativas y no autoinmolativas. Una unidad espaciadora no autoinmolativa es una en la que parte o toda la unidad espaciadora permanece unida a la unidad de fármaco después de la escisión enzimática de una unidad de aminoácido del conjugado anticuerpo anti-CD70-enlazador-fármaco o el compuesto de fármaco-enlazador. Los ejemplos de una unidad espaciadora no autoinmolativa incluyen una unidad espaciadora de (glicina/glicina) y una unidad espaciadora de glicina. Cuando un conjugado de anticuerpo

15 anti-CD70-enlazador-fármaco que contiene una unidad espaciadora de glicina-glicina o una unidad espaciadora de glicina sufre escisión enzimática a través de una proteasa asociada a células tumorales, una proteasa asociada a células cancerosas o una proteasa a linfocitos, se escinde un resto de glicina-glicina fármaco o un resto de glicina-fármaco de Ab-Aa-Ww-. Para liberar el fármaco, debe tener lugar una reacción de hidrolisis independiente dentro de la célula diana para escindir el enlace de la unidad de glicina-fármaco.

20 Como alternativa, un conjugado de anticuerpo anti-CD70 y fármaco que contiene una unidad espaciadora autoinmolativa pueden liberar el fármaco (D) sin necesidad de una etapa de hidrólisis separada. En estas realizaciones, -Y-es una unidad de alcohol p-aminobencílico (PAB) que se une a -Ww-a través del átomo de nitrógeno del grupo PAB y se conecta directamente a -D a través de un grupo carbonato, carbamato o éter. Otros ejemplos de

25 espaciadores autoinmolativos incluyen compuestos aromáticos que son electrónicamente equivalentes al grupo PAB tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (véase, para ejemplos, Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) y orto o para-aminobencilacetales. Pueden usarse espaciadores que experimenten una ciclación fácil tras la hidrolisis del enlace amida, tales como amidas de ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillo biclo[2.2.1] y biclo[2.2.2] apropiadamente sustituidos (Storm et al.,

30 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) y amidas del ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). También son ejemplos de estrategias de espaciadores autoinmolativos que pueden aplicarse a los conjugados de anticuerpo anti-CD70-enlazador-fármaco la eliminación de fármacos que contienen amina que están sustituidos en la posición α de la glicina (Kingsbury, et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447). Como alternativa, la unidad espaciadora es una unidad de bis(hidroximetil)estireno ramificado (BHMS), que puede usarse para incorporar

35 fármacos adicionales.

Las clases de agentes citotóxicos útiles incluyen, por ejemplo, antraciclinas, agentes antitubulina, agentes de unión al surco menor del ADN, inhibidores de la replicación del ADN, sensibilizadores a la quimioterapia o similares.

40 Los ejemplos de clases útiles de agentes citotóxicos incluyen auristatinas, camptotecinas, duocarmicinas, etopósidos, maitansinoides y alcaloides de la vinca.

Los agentes citotóxicos adecuados incluyen, por ejemplo, auristatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE), agentes de unión al surco menor del ADN (por ejemplo, endiinas y lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (por

45 ejemplo, paclitaxel and docetaxel), alcaloides de la vinca, doxorrubicina, morfolino-doxorrubicina y cianomorfolino-doxorrubicina.

El agente citotóxico puede ser un agente quimioterapéutico tal como, por ejemplo, doxorrubicina, paclitaxel, melfalano, alcaloides de la vinca, metotrexato, mitomicina C o etopósido. Además, a los anticuerpos anti-CD70 o derivados de los

50 mismos se pueden unir agentes potentes tales como análogos de CC-1065, caliceamicina, maitasina, análogos de dolastatina 10, rizoxina y palitoxina.

En realizaciones ejemplares, el agente citotóxico o citostático puede ser auristatina E o un derivado de la misma. Típicamente, el derivado de auristatina E es, por ejemplo, un éster formado entre auristatina E y un ceto ácido. Por

55 ejemplo, la auristatina E puede hacerse reaccionar con ácido paraacetil benzoico o ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otras auristatinas típicas incluyen AFP, MMAF y MMAE. La síntesis y estructura de la auristatina E y sus derivados se describen, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de Patente de Estados Unidos n.º 2005-0238649 y 2006-0074008.

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El agente citotóxico puede ser un agente de unión al surco menor del ADN. (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.º 6.130.237). Por ejemplo, el agente de unión al surco menor puede ser un compuesto de CBI o una enediina (por ejemplo, caliceamicina).

5 El ADC o derivado de ADC puede comprender un agente anti-tubulina. Los ejemplos de agentes anti-tubulina incluyen, pero sin limitación, taxanos (por ejemplo, Taxol® (paclitaxel)), (Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik), alcaloides de la vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina, y vinorelbina), y auristatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB). (A continuación, se muestran ejemplos de auristatinas en las Formulas MI-XMI) Otros agentes anti-tubulina adecuados incluyen, por ejemplo, derivados de baccatina, análogos de taxano (por ejemplo,

10 epotilona A y B), nocodazol, colchicina y colcimid, estramustina, criptofisinas, cemadotin, maitansinoides,

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determinación de un nivel de expresión de CD70. La presencia y/o nivel de CD70 en una muestra de tejido pancreático de ovario en cuestión puede determinarse (pero no necesariamente) con respecto a uno o más patrones. Los patrones pueden estar determinados histórica o contemporáneamente. El patrón puede ser, por ejemplo, una muestra pancreática o de ovario que se sabe que no es cancerosa procedente de un sujeto diferente, un tejido del paciente o de

5 otro sujeto que se sabe que no expresa CD70 o una línea celular pancreática o de ovario. El patrón también puede ser la muestra de paciente bajo análisis en contacto con un anticuerpo irrelevante (por ejemplo, un anticuerpo inducido contra un antígeno bacteriano. Debido a que CD70 no se expresa en un grado significativo en el tejido pancreático u ovárico no canceroso, puede usarse dicho tejido no canceroso como un patrón de expresión cero (de fondo).

La presencia de una señal detectable de la unión de un anticuerpo anti-CD70 a CD70 con respecto a un patrón (si se usa) indica la presencia de CD70 en la muestra de tejido y el nivel de unión detectable proporciona una indicación del nivel de expresión de CD70. En ensayos realizados en secciones de tejido, el nivel de expresión puede expresarse como un porcentaje del área de superficie de la muestra que muestra expresión detectable de CD70. Como alternativa o adicionalmente, el nivel (intensidad de expresión) puede usarse como medida de la expresión total en la muestra o

15 de las células que expresan CD70 en la muestra.

IV. Diagnóstico, pronóstico, diseño y supervisión del tratamiento

La detección de la expresión de CD70 en una muestra de tejido pancreático o de ovario es una indicación de que la muestra es cancerosa. De forma similar, la detección de expresión de CD70 en otra muestra de paciente es una indicación de que el paciente tiene cáncer de pulmón, de cabeza y cuello (laringe o faringe), melanoma, glioblastoma, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, tal como linfoma folicular, carcinoma de células renales, incluyendo de células claras y papilar, carcinoma colorrectal o carcinoma de vejiga. Los anticuerpos usados para aplicaciones terapéuticas se unen específicamente a un dominio extracelular de los antígenos CD70 nativos. La

25 indicación de cáncer proporcionada por la presencia y/o nivel de CD70 puede combinarse con medios de diagnóstico, tales como el examen interno o externo de un paciente por un médico, rayos X, exploración CT (tomografía computarizada), exploración PET (tomografía de emisión de positrones), exploración PET/CT, ultrasonidos MRi (imágenes de resonancia magnética), endoscopia, ERCP (colangiopancreatografía retrograda endoscópica), examen histológico y cultivo de tejidos para llegar a un diagnóstico global.

Quizás de mayor relevancia para el médico, la presencia y nivel de CD70 proporciona información útil para diseñar un protocolo de tratamiento para el paciente, y en particular administrar un anticuerpo contra CD70, un derivado, un ADC u otro agente de unión a un paciente. Debido a la ausencia esencial de expresión detectable de CD70 en el tejido pancreático o de ovario normal, la presencia de este receptor en un cáncer proporciona una diana para el tratamiento

35 terapéutico. Cuando mayor es el nivel de expresión de CD70 y/o el porcentaje de un tumor que expresa CD70, es más probable que el tratamiento sea eficaz. El análisis continuado de CD70 después del tratamiento proporciona un medio para supervisar si el tratamiento es eficaz, una reducción en el nivel de la señal positiva para CD70 (es decir, como una indicación de la presencia de células cancerosas positivas para CD70) indica que el tratamiento es eficaz.

V. Pacientes susceptibles de tratamiento

Los pacientes susceptibles de tratamiento por los métodos normalmente tienen niveles detectables de CD70 en su tejido pancreático, de ovario u otros tejidos junto con otros signos o síntomas de cáncer como se ha descrito anteriormente. Existe una diversidad de subtipos y estadios del cáncer, tanto pancreático como de ovario, como se

45 describe con más detalle más adelante. Algunas veces, los pacientes tratados por los presentes métodos se han sometido a otros tipos de tratamiento previamente (por ejemplo, cirugía, quimioterapia y/o radiación) sin inducir la remisión o incluso la ralentización del crecimiento del cáncer. En algunos de estos pacientes, el cáncer es refractario al tratamiento por una o más de dichas terapias.

Algunos pacientes con riesgo de cáncer pancreático también pueden tratarse profilácticamente antes de que aparezcan los signos y síntomas de la enfermedad. Dichos individuos incluyen los que tienen parientes que han experimentado estas enfermedades y aquellos cuyo riesgo se determina por análisis de marcadores genéticos o bioquímicos.

55 A. Pacientes con cáncer pancreático

El cáncer pancreático es un tumor maligno dentro de la glándula pancreática. Casi el 90 % de los pacientes con cáncer pancreático tienen más de 55 años. La edad media en el momento en el que se encuentra este cáncer es 72. Los factores de riesgo de cáncer pancreático incluyen: la edad, el género masculino, etnia africana, hábito tabáquico, dietas altas en carne, obesidad, diabetes, pancreatitis crónica (se ha asociado, pero no se sabe que sea causal), exposición ocupacional a ciertos pesticidas, colorantes y agentes químicos relacionados con la gasolina, antecedentes familiares, infección por Helicobacter pylori, gingivitis o enfermedad periodontal. (Pancreatic Cáncer. Von Hoff et al., ed., Maine; 2005). Solo del 10 al 15 % del cáncer pancreático se considera hereditario. Algunos marcadores genéticos que están relacionados con el cáncer pancreático pueden incluir mutaciones en el gen PNCA1, PALLD o BRCA2

65 (véase, por ejemplo, Banke et al., 2000, Med. Clin. North Am. 84: 677-690; Meckler et al., 2001, Am. J. Surg. Path. 25: 1047-1053; Pogue-Geile et al., 2006, PLoS Med. 3: e516; Murphy et al., 2002, Cáncer Res. 62: 3789-3793).

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Como alternativa, los agentes pueden liberarse en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, puede usarse una bomba (véase Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Como alternativa, pueden usarse materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release (Langer & Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Florida,

5 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen & Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger & Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. Véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). Otros sistemas de liberación controlada se analizan, por ejemplo, en Langer, supra.

Los agentes pueden administrarse como composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del agente y uno o más ingredientes farmacéuticamente compatibles. Por ejemplo, la composición farmacéutica típicamente incluye uno o más vehículos farmacéuticos (por ejemplo, líquidos estériles tales como agua y aceites, incluyendo los procedentes de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares). El agua es un vehículo más típico cuando 15 la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse soluciones salinas y soluciones de acuosas de dextrosa y glicerol cómo vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen, por ejemplo, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, harina de arroz, carbonato cálcico, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes, agentes para tamponar el pH (por ejemplo, aminoácidos) y/o agentes de solubilización o estabilización (por ejemplo, tensioactivos no iónicos tales como tween o azúcares tales como lactosa, trehalosa o similares. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y vehículos

25 tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados en Remington’s Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del ácido nucleico o proteína, típicamente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma para la administración apropiada al paciente. Las formulaciones corresponden al modo de administración.

Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando es necesario, el agente farmacéutico también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para reducir el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por

35 separado o se mezclan conjuntamente en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado en un recipiente cerrado herméticamente tal como una ampolla o sobrecillo que indica la cantidad de agente activo. Cuando el agente farmacéutico se va a administrar por infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contiene solución salina o agua de calidad farmacéutica, estéril. Cuando el agente farmacéutico se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de forma que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración.

La cantidad del agente que es eficaz en el tratamiento o profilaxis del cáncer pancreático o de ovario puede determinarse por técnicas clínicas convencionales. Además, opcionalmente pueden emplearse ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa a emplear en la formulación también

45 depende de la vía de administración, y del estadio del cáncer pancreático o de ovario, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta obtenidas a partir de sistemas de ensayo in vitro o de modelos animales. Una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentraciones en plasma circulante que incluya la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue una inhibición semimáxima de los síntomas) como se determina en un cultivo celular.

Por ejemplo, la toxicidad y eficacia terapéutica de los agentes puede determinarse en cultivos celulares o animales experimentales por procedimientos farmacéuticos convencionales para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población. La relación de dosis entre

55 efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50 /DE50. Se prefieren los agentes que presentan grandes índices terapéuticos. Cuando un agente presenta efectos secundarios tóxicos, puede usarse un sistema de liberación que dirija el agente al sitio del tejido afectado para minimizar los posibles daños en células que no expresan CD70 y, de esta manera, reducir los efectos secundarios.

En general, la dosificación de un anticuerpo, derivado o ADC administrado a un paciente con un cáncer que expresa CD70 típicamente es de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal del sujeto. Más típicamente, la dosis administrada a un sujeto es de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal del sujeto, incluso más típicamente de 0,1 mg/kg a 5 mg/kg o de 0,1 mg/kg a 3 mg/kg de peso corporal del sujeto. En general, los anticuerpos humanos tienen una mayor semivida dentro del cuerpo humanos que los anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmunitaria contra las

65 proteínas extrañas. De esta manera, con frecuencia es posible utilizar dosificaciones inferiores de ADC que comprenden anticuerpos humanizados, quiméricos o humanos y una administración menos frecuente.

Los anticuerpos contra CD70, derivados y ADC también pueden administrarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos distintos para el tratamiento o profilaxis del cáncer pancreático o de ovario. Por ejemplo, una terapia de combinación puede incluir un segundo agente citostático o citotóxico (por ejemplo, un agente citostático o citotóxico no conjugado tal como los usados convencionalmente para el tratamiento de cánceres). La terapia de combinación 5 también puede incluir, por ejemplo, la administración de un agente que se dirige a un receptor o complejo receptor distinto de CD70 en la superficie de células cancerosas que expresan CD70. Típicamente, dicho anticuerpo o ligando se une a un receptor de la superficie celular en células cancerosas que expresan CD70 y aumenta el efecto citotóxico

o citostático del anticuerpo anti-CD70 liberando una señal citostática o citotóxica en las células cancerosas que expresan CD70.

Otros fármacos que pueden administrarse con el agente incluyen inhibidores de factores de crecimiento, o factores anti-angiogénesis. Por ejemplo, un fármaco denominado erlotinib, un inhibidor de la tirosina quinasa del receptor del factor del crecimiento epidérmico, puede usarse para tratar el cáncer pancreático avanzado. (Bareschino et al., 2007, Ann Oncol. Suppl 6: 35-4). Dicha administración combinatoria puede tener un efecto aditivo o sinérgico sobre

15 parámetros de la enfermedad (por ejemplo, gravedad de un síntoma, el número de síntomas o la frecuencia de recaídas).

Los presentes métodos pueden combinarse con otros medios de tratamiento tales como cirugía, radiación, terapia dirigida, inmunoterapia, uso de inhibidores de factores de crecimiento o factores anti-angiogénesis.

La cirugía es un tratamiento preferido y frecuentemente es necesaria para obtener un espécimen de tejido para el diagnóstico diferencial mediante su histología. Se atribuye una mayor supervivencia a una estadificación más precisa de la enfermedad y una mayor tasa de escisión quirúrgica agresiva del tumor en el abdomen. El tipo de cirugía depende de lo extendido que esté el cáncer cuando se diagnostica (del estadio del cáncer), así como del supuesto tipo

25 y grado del cáncer.

En el caso de pacientes que padecen adenocarcinoma pancreático, el cirujano puede realizar el procedimiento de Whipple (también denominado pancreaticoduodenectomía). En este procedimiento, se retira la cabeza del páncreas y algunas veces el cuerpo de páncreas junto con partes del estómago y el intestino delgado, la vesícula biliar, parte del conducto biliar común y algunos ganglios linfáticos cercanos. (Véase, por ejemplo, Michalski et al., 2007, Nat. Clin. Pract. Oncol. 4(9): 526-35). En el caso de pacientes que sufren tumores endocrinos del páncreas (tumores de células de islotes), la cirugía es una opción viable. (Véase, por ejemplo, Akerstrom y Flellman, 2007, Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 21 (1): 87-109).

35 En las pacientes con cáncer de ovario, el cirujano puede extirpar uno (ooforectomía unilateral) o los dos ovarios (ooforectomía bilateral), las trompas de Falopio (salpingectomía) y el útero (histerectomía). En el caso de algunos tumores en un estadio muy temprano tales como los que están en estadio I, solo se retirará el ovario y la trompa de Falopio implicados (“salpingo-ooforectomía unilateral” USO), especialmente en mujeres jóvenes que desean conservar su fertilidad. En caso de malignidad avanzada, cuando no es posible la resección completa, se elimina el máximo de tumor posible (cirugía reductora). En los casos en los que este tipo de cirugía es satisfactoria, el pronóstico mejora en comparación con pacientes en los que se dejan masas tumorales grandes (de más de 1 cm de diámetro). Las técnicas quirúrgicas mínimamente invasivas pueden facilitar la eliminación segura de tumores muy grandes (mayores de 10 cm) con menos complicaciones quirúrgicas. (Véase, por ejemplo, Ehrlich et al., 2007, J. Pediatr. Surg. 42 (5): 890-3).

45 La quimioterapia se refiere al uso de fármacos anticancerosos o citotóxicos para destruir células cancerosas. La quimioterapia puede administrarse al paciente antes o después de la cirugía. Dependiendo de la histología del tumor, algunos tipos de tumores (particularmente el teratoma) no son sensibles a la quimioterapia. Puede usarse quimioterapia intravenosa con fármacos tales como, por ejemplo, gemcitabina, 5-fluorouracilo, cisplatino o mitomicina C para tratar el cáncer pancreático. Puede usarse quimioterapia intravenosa tal como gemcitabina, topotecán, doxorrubicina, doxorrubicina liposomal, carboplatino o paclitaxel para tratar el cáncer de ovario. La quimioterapia que es parcialmente intravenosa y particularmente intraperitoneal también puede mejorar el tiempo de supervivencia media. (The Chemotherapy Source Book (3ª edición). Ed. Perry. Lippincott, Williams y Wilkins, 2001; Oxford Textbook of Palliative Medicine. (2ª Ed.) Derek Doyle et al. Oxford University Press. 1999).

55 La radioterapia es un tratamiento con rayos de alta energía, tales como rayos X, para destruir o contraer las células cancerosas mientras se hace el mínimo daño posible a las células normales. La radiación puede administrarse al paciente antes o después de la cirugía. También puede usarse radioterapia para tratar el cáncer pancreático que no se ha extendido pero no puede extirparse por cirugía. La radioterapia no se usa con frecuencia para tratar el cáncer de ovario, pero puede usarse ocasionalmente si es apropiado. Puede usarse una combinación de radioterapia y quimioterapia para pacientes cuyos tumores están demasiado extendidos como para extirparse con cirugía.

A un paciente sometido a tratamientos de cirugía, quimioterapia o radioterapia se le puede administrar simultáneamente un anticuerpo anti-CD70, derivado o ADC. Como alternativa, un paciente puede someterse a cirugía,

65 quimioterapia o radioterapia antes o después de la administración de un anticuerpo anti-CD70, derivado o ADC, al menos una hora y hasta varios meses, por ejemplo, al menos una hora, cinco horas, 12 horas, un día, una semana, un

mes, o tres meses antes o después de la administración del ADC o derivado de ADC.

VII. Kits

5 Los presentes inventores describen kits de diagnóstico para uso con los métodos de detección anteriores. Los kits típicamente contienen un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a CD70 desnaturalizado útil para la detección como se ha descrito anteriormente. Uno o más recipientes adicionales pueden incluir elementos, tales como reactivos o tampones, a usar en el ensayo. Dichos kits pueden también, o como alternativa, contener un reactivo de detección que contiene un grupo indicador adecuado para la detección directa o indirecta de la unión del

10 anticuerpo.

Los presentes inventores también describen kits farmacéuticos para tratar canceres pancreáticos y de ovario. Típicamente, dichos kits contienen reactivos formulados como una composición terapéutica como se describe en el presente documento, y pueden estar en cualquiera de una diversidad de formas adecuadas para la distribución en un

15 kit. Dichas formas pueden incluir un líquido, polvo, comprimido, suspensión y formulación similar para proporcionar los agentes, tales como anticuerpos anti-CD70, derivados o ADC. Los kits también pueden incluir un diluyente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua estéril) para inyección, reconstitución o dilución del anticuerpo, derivado o ADC, liofilizados.

20 Los presentes inventores también describen kits combinados para diagnóstico y terapia. Dichos kits típicamente incluyen al menos un anticuerpo que se une preferentemente a CD70 desnaturalizado con respecto al CD70 nativo para uso en la detección en secciones de tejido fijadas, y un anticuerpo diferente que se une a CD70 nativo al menos tan bien, si no mejor, que a CD70 desnaturalizado para uso en tratamiento.

25 Los kits también incluyen típicamente una etiqueta o instrucciones para uso en los métodos de detección y/o tratamiento descritos en el presente documento. La etiqueta o las instrucciones se refieren a cualquier material escrito 41 o grabado que se adjunta o acompaña de otra manera a un kit en cualquier momento durante su fabricación, transporte, venta o uso. Puede ser una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, reflejando dicha nota la aprobación por la agencia de

30 fabricación, uso o venta para administración humana. La etiqueta o las instrucciones también pueden incluir folletos y prospectos de aviso, materiales de envasado, instrucciones, casetes de audio o vídeo, discos de ordenador, así como estar directamente impresos sobre los kits farmacéuticos.

El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones y cualquier información que no se incluya dentro

35 de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos. Las líneas celulares descritas en los siguientes ejemplos se mantuvieron en cultivo de acuerdo con las condiciones especificadas por la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania (DMSZ). Los reactivos de cultivo celular se obtuvieron en Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, u otros proveedores.

40 Ejemplos

Ejemplo 1. Preparación de anticuerpos monoclonales SG-21.1C1.B3 y SG-21.5D12.C3.

Se produjeron anticuerpos monoclonales SG-21.1C1.B3 y SG-21.5D12.C3 usando células B de bazo o ganglios

45 linfáticos extirpados de un ratón que se expuso varias veces al inmunógeno, el dominio extracelular de CD70 desnaturalizado (ECD de CD70). Estas células B después se fusionaron con células tumorales de mieloma para producir hibridomas. De esta manera se produjeron grandes cantidades de anticuerpos monoclonales a partir de estos hibridomas. Los hibridomas se diluyeron para asegurar la clonalidad y el crecimiento.

50 Se ensayaron anticuerpos de los diferentes clones con respecto a su capacidad de unirse al antígeno CD70 desnaturalizado con un ensayo tal como un ELISA usando Marcador-CD70 o una exploración FMAT diferencial (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando células 293F fijadas que expresaban CD70 de mono Cynomolgus ("cyno") y células L540cy desnaturalizadas, que expresan CD70. Como control negativo se usaron células 293F y L540cy no transfectadas. (Algunas células L540cy eran positivas para CD70).

55 Los resultados mostraron que más de 100 hibridomas fueron positivos en el ensayo con respecto a su capacidad de unirse a CD70 desnaturalizado. Se seleccionaron anticuerpos de dos posibles hibridomas, SG-21.1C1.B3 ("1C1") y SG-21.5D12.C3 ("5D12") para inmunohistoquímica.

60 Ejemplo 2: Preparación de muestras fijadas con formalina incluidas en parafina (FFPE)

Se prepararon tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina de acuerdo con métodos convencionales, como se describe en Theory and Practice of Histotechnology, segunda edición. 1980, Sheehan, D.C. y Hrapchak, B.B., editors (Battelle Press (Columbus, OH). Capítulo 3, pág. 59-78).

65

La preparación de las células por FFPE fue similar a la de la preparación de tejidos. En resumen, se cultivaron células en medio de cultivo adecuado a aproximadamente 15.000 células/ pocillo un día antes de la fijación. Las células se fijaron como se indica a continuación: las células se lavaron 2 veces con PBS y después se fijaron con formalina al 10 % a temperatura ambiente durante 45 minutos. Posteriormente, las células se lavaron 2 veces con PBS y después se

5 permeabilizaron con PBS + Tritón X-100 al 0,5 % a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células después se lavaron 1 vez con PBS y se almacenaron en PBS + azida sódica al 0,02 % a 4 °C. Antes de la exploración FMAT, se retiró el PBS + azida y la placa se bloqueó con PBS + suero de cabra al 5 % a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Ejemplo 3: Preparación de micromatrices de tejido para inmunohistoquímica

Se obtuvieron micromatrices de tejido con secciones de tejido FFPE a partir de fuentes comerciales, incluyendo US Biomax, TriStar o Cybrdi. También se prepararon micromatrices de tejido de acuerdo con los protocolos de construcción de Yale Tissue Microassay Construction Protocols, versión 1.0, y actualizaciones posteriores.

15 Ejemplo 4. Desarrollo de anticuerpos monoclonales SG-21.1C1.B3 y SG-21.5D12.C3 como reactivos de inmunohistoquímica para muestras de FFPE

A. Ensayo inmunohistoquímico de clones de CD70

Se fabricó una construcción de expresión que codificaba CD70 de mono Cynomolgus por clonación de un gen de CD70 de Cynomolgus de longitud completa en un vector de expresión. Esta construcción se introdujo por transfección en células 293F. Estas células transfectadas 293F:CD70 sirvieron como control positivo para la tinción con anticuerpos 1C1 y 5D12. La línea de células 293F parental sirvió como control negativo. Para la tinción del tejido, se utilizaron como

25 control positivo células 786-O, que expresan CD70.

Las células y tejidos se fijaron e incluyeron en cera de parafina de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo

2. La tinción IHC y la recuperación antigénica se realizaron usando un sistema Bond-max™ de Vision BioSystems (ahora Leica Microsystems). La recuperación antigénica se realizó durante 40 minutos usando el método de recuperación en EDTA. Como alternativa, la recuperación de antígeno se realizó usando el sistema de recuperación de antígeno Trilogy (Cell Marque, Hot Springs, AR) a una temperatura de 99-100 °C durante 1 hora.

Tanto el anticuerpo primario 1C1 como el anticuerpo primario 5D12 tiñeron fuertemente todas las células transfectadas 293F:CD70 fijadas, mientras que no se detectó ninguna tinción en las células 293 parentales. Los resultados también

35 mostraron una fuerte tinción en las células 786-O (un carcinoma de células renales), mientras que se detectó tinción de fondo en el control de xenoinjerto de Ramos.

El clon 1C1 se subclonó adicionalmente y se seleccionó un subclón, 1C1-B3 (SG-21.1C1.B3). De forma similar, se subclonó adicionalmente 5D12 y se seleccionó un subclón, 5D12-C3 (SG-21.5D12.C3). Estos dos subclones se purificaron y se usaron como anticuerpos primarios para teñir muestras de xenoinjerto 786-O y xenoinjerto de Ramos. Los resultados mostraron que la subclonación y purificación de 1C1-B3 5D12-C3 eliminó la tinción del fondo en el xenoinjerto de Ramos.

Se han depositado hibridomas que producen los anticuerpos anti-CD70 en la Colección Americana de Cultivos Tipo

45 (ATCC) en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. La línea celular denominada SG-21.1C1.B3, que produce el anticuerpo 1C1 que tiene el número de registro de ATCC PTA-8733 se ha depositado el 24 de octubre de 2007 en la ATCC; la línea celular denominada SG-21.5D12.C3 que produce el anticuerpo 5D12 que tiene el número de registro de ATCC PTA-8734 se ha depositado el 24 de octubre de 2007 en la ATCC.

B. Transferencia de Western con anticuerpos SG-21 1C1 y 5D12 en comparación con el anticuerpo 2B3

Para determinar si los anticuerpos SG-21 1C1 y 5D12 detectan CD70 en lisados de células y tejidos, se realizaron experimentos de trasferencia de Western. También se usó otro anticuerpo de unión a CD70, 2B3, para comparación. Se prepararon preparaciones de membrana a partir de células 786-O, 293F:cynoCD70 (que expresan CD70 cyno) y 55 células 293F como control negativo. Para preparar extractos de membrana, las células se lisaron en solución tampón hipotónica y se centrifugaron a 10.000 x g durante 10 minutos a 4 °C para retirar el desecho celular. Los sobrenadantes después se centrifugaron a 100.000 x g durante 30 minutos a 4 °C para sedimentar las fracciones de membrana. Las fracciones de membrana (sedimento) se disolvieron en NP40 al 0,5 % en Tris 50 mM más NaCl 150 mM y EDTA 5 mM. Toda la preparación de las muestras se realizó en presencia de inhibidores de proteasa para mantener intacto CD70. La cantidad de las proteínas se midió a 570 nm usando un kit BCA (Pierce). También se prepararon ECD de CD70 (dominio extracelular de CD70) y CD70-ECD con un marcador Flag por métodos convencionales. Las muestras de proteínas se desnaturalizaron a 90 °C durante 3 minutos y se enfriaron en hielo durante 3 minutos. Las muestras se separaron usando SDS-PAGE y después se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa para la detección. Se prepararon cuatro geles de SDS-PAGE y membranas idénticos. Las membranas se bloquearon en PBS con BSA al 65 1 % y leche desnatada al 2 % con Tween (polisorbato) al 0,05 %. Después se añadió cada anticuerpo primario a la solución a 0,5 μg/ml y se dejó incubar durante 4 horas a temperatura ambiente en PBS con Tween al 0,05 %. Las

membranas se lavaron y se añadió un conjugado de anticuerpo secundario-enzima, que reconocía el anticuerpo primario, y se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron y se incubaron con un sustrato quimioluminiscente para detectar CD70.

5 Haciendo referencia a la Figura 1, los resultados mostraron que los anticuerpos SG-21 1C1 y 5D12 detectaban CD70 en las células 786-O y los transfectantes 293F:CD70, pero no en el control negativo de células 293F. Particularmente, las bandas detectadas eran de tamaño idéntico en las células 786-O y los transfectantes 293F:CD70. El anticuerpo SG-21 2B3 no detectó CD70 en muestras de 786-O y 293:cynoCD70, pero detectó ECD de CD70 y marcador-ECD de CD70. El resultado indicó que los anticuerpos 1C1 y 5D12 detectaban CD70 en las muestras.

C. Expresión de CD70 en líneas de células tumorales y no tumorales usando el anticuerpo SG21.1C1

Se obtuvieron micromatrices de tejido a partir de fuentes comerciales o se prepararon a medida, que contenían muestras de los siguientes cánceres: carcinoma de mama, carcinoma de ovario, mesotelioma, osteosarcoma,

15 carcinoma de próstata, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, astrocitoma anaplásico, cáncer uterino, cáncer embrionario, carcinoma epidermoide, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma histiocítico no T, no B, linfoma no Hodgkin (NHL) linfoma de Burkitt, linfoma NHL folicular, leucemia mieloide aguda (AML), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), eritroleucemia, carcinoma de colon, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), carcinoma de células renales (RCC), RCC de tipo de células claras, RCC de tipo papilar, melanoma, carcinoma pancreático y carcinoma de vejiga. También se usaron las siguientes células o líneas celulares: línea celular linfoblastoide B transformada con virus de Epstein-Barr (EBV-LCL), células epiteliales mamarias humanas normales (HMEC), células endoteliales vasculares humanas normales (HUVEC), células mononucleares de sangre normal (PBMC), células endoteliales aórticas humanas normales (HAEC), células endoteliales renales humanas normales (HREC), células endoteliales microvasculares de pulmón humanas normales

25 (HMVEC-L), células endoteliales microvasculares dérmicas endoneonatales humanas normales (HMVEC-neo) y células endoteliales de arteria pulmonar humana normales (HPAEC).

Las micromatrices de tejidos se inmunotiñeron con anticuerpos SG21.1C1 usando el protocolo descrito anteriormente. Se observó tinción en las siguientes líneas celulares: línea celular de carcinoma de ovario SK-OV-3; línea celular de glioblastoma GMS-10; líneas celulares de mieloma múltiple LB, LP-1, AMO-1, I-310 (MM.1R), C2E3 (MM.1S), MOLP-8, JJN-3 y L363; líneas celulares de linfoma de Hodgkin KMH2, HS445, RPMI-1666, L248 y HD-M-YZ; EBV-LCL WIL2-S, Farage y IM-9; línea celular de NHL folicular WSU-NHL; líneas celulares de RCC de tipo de células claras Caki-1, Caki-2, 786-O y 769-P; líneas celulares de RCC de tipo papilar CAL54, A498; RCC SK-RC-6 y SK-RC-7; líneas celulares de melanoma A375M y A375SM, línea celular de carcinoma pancreático PANC-1 y carcinoma de

35 vejiga T24. La tinción de algunas líneas celulares no identificadas era débil o mixta. Algunas líneas celulares tienen tinción citoplasmática. Con respecto a la tinción de las líneas celulares pancreática y de ovario, véanse las Figuras 2 y 3, respectivamente.

D. Tinción comparativa de anticuerpos 1C1 y 5D12

Se compararon anticuerpos 1C1 y 5D12 tiñendo líneas celulares 293F, 293F-cynoCF0, RCC Caki-1, amígdala normal, músculo esquelético, vejiga, tejidos linfoides (ganglio linfático, timo, bazo) de monos cynomolgus normales, tejidos de timo, riñón y músculo esquelético humanos normales y tejidos de tumor pancreático. El protocolo de inmunotinción fue como se ha descrito anteriormente.

45 Los resultados mostraron que 1C1 y 5D12 teñían de forma similar las líneas celulares 293F y 293-cyno CD70 (datos no mostrados); RCC Caki-1 y tejido de amígdala de mono Cynomolgus (datos no mostrados); tejidos linfoides (ganglio linfático, timo, bazo) de monos Cynomolgus normales (datos no mostrados) y tejidos de tumor pancreático (véase la Figura 4). Se observó alguna tinción diferencial de 1C1 y 5D12 en tejidos de músculo esquelético humano y de mono normales y en tejidos de vejiga de mono normales en los que 5D12 teñía los tejidos, pero 1C1 no lo hacía. También se observó tinción diferencial en tejidos de riñón y timo humanos normales en los que 5D12 teñía el citoplasma.

Ejemplo 5: Expresión de CD70 en tejidos de colon normal y de cáncer colorrectal y en tejidos de páncreas normal y de cáncer pancreático con anticuerpo 1C1

55 Antes de evaluar el panel entero de tejidos tumorales de diferentes tipos de cáncer, primero se ensayó la expresión de CD70 en cánceres de colon y pancreático. El protocolo de inmunotinción se describió en el Ejemplo 4. El cromágeno usado para estos estudios fue Fast Red.

Los resultados mostraron que, en tejidos de colon normales, muy pocos linfocitos se tiñeron de forma positiva para CD70. Otras células fueron negativas para CD70. En una muestra de tejido de cáncer de colon, las células tumorales se tiñeron de forma positiva. En una segunda muestra de tejido de colon, las células tumorales fueron negativas, pero el estroma fue positivo. Análogamente, en tejidos pancreáticos normales, la tinción fue negativa para CD70. En una muestra de tejidos de cáncer pancreático las células tumorales fueron positivas y en una segunda muestra las células

65 tumorales fueron negativas pero el estroma fue positivo (véase la Figura 5).

Ejemplo 6: Expresión de CD70 en tejidos tumorales con anticuerpo SG21.1C1

Se obtuvieron tejidos tumorales de los siguientes tipos de tumor: linfoma de Hodgkin, riñón, linfoma, mieloma múltiple, páncreas, laringe/faringe, ovario, colon y mama. Los tejidos normales y tumorales se prepararon de acuerdo con el 5 protocolo de matriz de tejidos descrito en el Ejemplo 3 y el protocolo de inmunotinción fue como el descrito en el Ejemplo 4A. Como anticuerpo primario se usó el anticuerpo 1C1. La expresión inmunohistoquímica (IHC) se evaluó posteriormente basándose en la intensidad de tinción y el porcentaje de tumor implicado. La intensidad de tinción se clasificó de 1 a 4, indicando 1 tinción mínima; 2, tinción leve; 3, tinción moderada y 4, tinción fuerte. El porcentaje de tumor implicado también se clasificó de 1 a 4, indicando 1 0-5 %; 2, 5-25 %; 3, 25-75 % y 4, 75 %-100 %. Las

10 mediciones fueron cualitativas. Para el linfoma de Hodgkin, se ensayó la expresión IHC de células positivas para CD70 basándose en la evaluación de células de Reed-Sternberg. Las células de Reed-Sternberg son células grandes de origen desconocido, normalmente multinucleadas, cuya presencia es la característica histológica común del linfoma de Hodgkin.

15 Los tejidos del tumor de linfoma de Hodgkin tuvieron el mayor porcentaje (97 % o 33/34) de células tumorales positivas para CD70 con respecto a las células en los tumores totales. El tumor de riñón tuvo el segundo porcentaje más alto (70 % o 14/20) de las células tumorales positivas para CD70 con respecto a las células en los tumores totales. El linfoma tuvo el tercer porcentaje más alto (61 % o 72/119) de células tumorales positivas para CD70 con respecto a las células en los tumores totales. El mieloma múltiple tuvo el cuarto porcentaje más alto (42 % o 13/31) de las células

20 tumorales positivas para CD70 con respecto a las células en los tumores totales. El cáncer de páncreas tuvo el quinto porcentaje más alto (25 % o 35/140) de las células tumorales positivas para CD70 con respecto a las células en los tumores totales.

La Figura 6 ilustra un gráfico de intensidad de tinción y % de tinción de tumor para 35 de 140 muestras pancreáticas

25 que dan una señal positiva para CD70. La figura muestra una relación compleja entre la intensidad de tinción y el porcentaje de tinción del tumor. Es decir, algunos tumores tienen un alto porcentaje de células que se tiñen, pero a baja intensidad, otros tienen un bajo porcentaje de células que se tiñen pero a alta intensidad y otros muestran intensidad de tinción intermedia y porcentaje intermedio de tinción de células. El cáncer de laringe/faringe tiene el sexto porcentaje más alto (22 % o 18/82) de células tumorales positivas para CD70 con respecto a las células en los tumores

30 totales. El cáncer de ovario tuvo el séptimo porcentaje más alto (15 % o 37/241) de células tumorales positivas para CD70 con respecto a las células en los tumores totales.

La Figura 7 ilustra la intensidad de tinción y el porcentaje de tinción de tumores para 37 de 241 cánceres de ovario que tiñen CD70. Hubo alguna asociación entre la intensidad de tinción y el porcentaje de tinción de células. El cáncer

35 colorrectal tuvo el séptimo porcentaje más alto (9 % o 17/194) de células tumorales positivas para CD70 con respecto a las células en los tumores totales. El cáncer de mama tuvo el menor porcentaje (2 % o 5/204) de células tumorales positivas para CD70 con respecto a las células en los tumores totales.

En resumen, basándose en la relación de tumores positivos para CD70/tumores totales, la intensidad de tinción

40 (expresión de diana celular) y el porcentaje de implicación de tumor positivo para CD70 (expresión de diana del tumor), la clasificación de indicación general de los tipos de tumor es la siguiente: Hodgkin > riñón > linfoma > mieloma múltiple > pancreático > laringe/faringe > ovario > colorrectal > mama. Los resultados de todos los tejidos tumorales se muestran en la Tabla 1.

45 Tabla 1. Expresión de CD70 en diversos cánceres

Tipo de tumor CD70+/Total % de CD70+

Hodgkin 33/34 97 Riñón 204/283 72 Linfoma 72/119 61 Mieloma múltiple 13/31 42 Páncreas 35/140 25 Laringe/faringe 18/82 22 Ovario 37/241 15 Piel 4/30 13 Pulmón (todo) 40/475 8 Adenocarcinoma de pulmón 17/172 10 Colon 17/194 9 Mama 5/204 2

Ejemplo 7: Los conjugados de h1F6-fármaco muestran eficacia en una línea celular de carcinoma de ovario

Para confirmar la eficacia de conjugados del anticuerpo anti-CD70-fármaco conocidos contra líneas celulares

50 representativas para estos nuevos cánceres, se prepararon células SKOV-3 y se ensayaron como se ha descrito, en general, previamente para otras líneas celulares. (Véase la publicación de patente internacional WO 2006-113909.) Las células se incubaron con los siguientes conjugados de anticuerpo anti-CD70-fármaco: h1F6-vc-MMAF(4), h1F6vc-MMAE(4), 1F6mc-MMAF(4), o h1F6mc-MMAF(8) o MMAF libre. (Véase en la memoria descriptiva y la

Claims (1)

1. imagen1