RU2750472C1 - Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1 - Google Patents

Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1 Download PDF

Info

Publication number
RU2750472C1
RU2750472C1 RU2021101636A RU2021101636A RU2750472C1 RU 2750472 C1 RU2750472 C1 RU 2750472C1 RU 2021101636 A RU2021101636 A RU 2021101636A RU 2021101636 A RU2021101636 A RU 2021101636A RU 2750472 C1 RU2750472 C1 RU 2750472C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cyp1b1
sult1e1
esr1
copy number
serous ovarian
Prior art date
Application number
RU2021101636A
Other languages
English (en)
Inventor
Денис Сергеевич Кутилин
Мариэтта Рафаэловна Цандекова
Екатерина Владимировна Вереникина
Original Assignee
федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority to RU2021101636A priority Critical patent/RU2750472C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2750472C1 publication Critical patent/RU2750472C1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной биологии и онкологии. Предложен малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1. Осуществляют выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови. Определяют копийность генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1 относительно референсного гена GAPDH методом ПЦР-РВ. Рассчитывают относительную копийность гена (rC) по формуле rC=2-ΔCt. Сравнивают полученные значения rC с прогностическим интервалом копийности. При значениях rC CYP1B1 от 6,67*10-3 до 7,13*10-3 , rCESR1 от 10,0*10-3 до 10,2*10-3 и rCSULT1E1 от 5,12*10-3 до 5,28*10-3 диагностируют серозную аденокарциному яичников высокой степени злокачественности. При значениях rC CYP1B1 от 3,19*10-3 до 3,81*10-3 , rCESR1 от 1,91*10-3 до 2,09*10-3 и rCSULT1E1 от 2,23*10-3 до 2,57*10-3 диагностируют отсутствие злокачественных опухолей яичников. Изобретение обеспечивает создание нового, простого в исполнении, недорогостоящего и точного способа с уникальными высокоспецифичными последовательностями праймеров для малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии, онкологии, и может быть использовано для малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномой яичников высокой степени злокачественности.
Рак яичников является ведущей причиной летальных исходов от гинекологических злокачественных опухолей в развитых странах мира и обычно диагностируется уже на поздней стадии. Серозная аденокарцинома - одним из самых распространенных подтипов опухолей яичников (см. Цандекова М.Р., Порханова Н.В., Кутилин Д.С. Молекулярная характеристика серозной аденокарциномы яичника: значение для диагностики и лечения // Современные проблемы науки и образования. 2020. №1.; URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=29428). Число летальных исходов от этой патологии является самым высоким среди гинекологических опухолей в мире и ежегодно увеличивается. Установлено, что серозная аденокарцинома яичника гетерогенна на гистологическом и молекулярном уровнях (см. Blagden S.P. Harnessing Pandemonium: The clinical implications of tumor heterogeneity in ovarian cancer // Front. Oncol. 2015. Vol. 5. P. 149). Выделяют два подтипа этого рака: серозную аденокарциному высокой степени злокачественности и серозную аденокарциному низкой степени злокачественности (см. Kurman R.J. Origin and molecular pathogenesis of ovarian high-grade serous carcinoma // Ann. Oncol. 2013. Vol. 24. P. 16-21). Серозной аденокарциноме низкой степени злокачественности свойственен стабильный молекулярно-генетический и эпигенетический профиль и относительно благоприятное клиническое течение. Серозная аденокарцинома высокой степени злокачественности имеет агрессивное клиническое течение (см. Цандекова М.Р., Порханова Н.В., Кутилин Д.С. Молекулярная характеристика серозной аденокарциномы яичника: значение для диагностики и лечения // Современные проблемы науки и образования. 2020. №1.; URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=29428), при этом, для нее в настоящее время не существует одобренного скринингового теста, что препятствует ранней диагностике данного заболевания (см. Bell R., Petticrew M., Luengo S., Sheldon T.A. Screening for ovarian cancer: A systematic review. Health Technol. Assess. 1998. vol. 2. P. 1-84).
Для эффективной и одновременно малоинвазивной ранней диагностики серозной аденокарциномы высокой степени злокачественности большим потенциалом обладает определение молекулярных маркеров во внеклеточной ДНК плазмы крови. К внеклеточной ДНК (внДНК) относится ядерная и митохондриальная ДНК из соматических и опухолевых клеток, подвергшихся апоптозу или некрозу; ДНК из клеток крови, вирусная и бактериальная ДНК (см. Кутилин Д.С., Айрапетова Т.Г., Анистратов П.А., Пыльцин С.П., Лейман И.А., Чубарян А.В., Туркин И.Н., Водолажский Д.И., Николаева Н.В., Лысенко И.Б. Изменение относительной копийности генетических локусов во внеклеточной ДНК у пациентов с аденокарциномой легкого. Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2017. №3-2 (195-2). С. 74-82).
Анализ баз данных TCGA и DisGeNET позволил выделить ряд генов (регулирующих метаболизм эстрогена - SULT1E1, CYP1B1 и ESR1), показатель копийности которых можно использовать для малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномы яичников (см. Цандекова М.Р. Показатель копийность генов, регулирующих метаболизм и рецепцию эстрогенов, во внеклеточной ДНК как потенциальный маркер для диагностики серозной аденокарциномы яичника высокой степени злокачественности // Современные проблемы науки и образования. - 2020. - №5.; URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=30093).
Копийность генов (Copy Number Variation (CNV)) - генетический полиморфизм, приводящий к изменению числа копий определенного гена, и, следовательно, уровня продукта этого гена - белка или не кодирующей РНК (см. Кутилин Д.С., Айрапетова Т.Г., Анистратов П.А., Пыльцин С.П., Лейман И.А., Карнаухов Н.С., Кит О.И. Изменение копийности генов в опухолевых клетках и внеклеточной ДНК у больных аденокарциномой легкого // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019. 167(6). С. 731-738). Показатель CNV может выступать в качестве высокоспецифичного биологического маркера, позволяющего осуществлять как раннюю диагностику, так и молекулярное типирование опухолей (см. Колесников Е.Н., Максимов А.Ю., Кит О.И., Кутилин Д.С. Зависимость общей и без рецидивной выживаемости больных от молекулярно-генетического подтипа плоскоклеточного рака пищевода. Вопросы онкологии. 2019. 65(5). С. 691-700).
Ген CYP1B1 кодирует фермент из семейства цитохромов Р450, который катализирует гидроксилирование 17-β-эстрадиола в положении С-4. Метаболиты CYP1B1 (4-гидрокси эстрогены) играют важную роль в злокачественной трансформации. Из данных литературы известно, что в некоторых гинекологических опухолях повышена экспрессия генетических локусов, регулирующих гидроксилирование эстрадиола (CYP1B1), уровень ядерных (ESR1, SULT1E1 - гены сульфотрансферазы) и мембранных (GPER) рецепторов эстрогенов (см. Цандекова М.Р. Показатель копийность генов, регулирующих метаболизм и рецепцию эстрогенов, во внеклеточной ДНК как потенциальный маркер для диагностики серозной аденокарциномы яичника высокой степени злокачественности // Современные проблемы науки и образования. - 2020. - №5.; URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=30093).
Поэтому, в качестве маркеров для диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности допустимо использование показателя относительной копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1.
Из патентных источников известны следующее изобретения:
1. «Диагностика и лечение злокачественных опухолей поджелудочной железы, яичников и других злокачественных опухолей» (см. патент (19)RU(11)2556129(13)C2 от 10.07.2015). Изобретение относится к способам диагностики, прогнозирования, профилактики и лечения, и контроля лечения злокачественных опухолей яичников, поджелудочной железы и других злокачественных опухолей с использованием антител против CD70. Моноклональное антитело (SG-21.1C1 или SG-21.5D12) специфически связывается с денатурированным CD70 человека, экспрессируемым в образце клеток или тканей человека. В качестве биоматериала используется образец клеток или тканей человека фиксированный формалином и погруженный в парафин. Способ предусматривает получение образца ткани поджелудочной железы, яичника, легкого, гортани, глотки, молочной железы, почки, мозга, толстой кишки, крови или кожи от пациента; фиксацию образца ткани и денатурацию CD70 в образце ткани; приведение фиксированного образца ткани в контакт с антителом; и обнаружение связывания антитела с фиксированным образцом ткани для определения экспрессии CD70 в образце; где экспрессия CD70 указывает на вероятность того, что у пациента имеется экспрессирующая CD70 злокачественная опухоль.
2. «Способ ранней диагностики неопластической трансформации эндометриоидных кист яичников» (см. патент (19)RU(11)2730952(13)C1 от 26.08.2020). Изобретение предназначено для диагностики риска неопластической трансформации эндометриоза яичников. При наличии повышенного уровня онкомаркера СА125 у пациенток берут операционный материал, который, после стандартной гистологической проводки, используют для иммуногистохимического исследования с антителом к WT1, а интерпретацию результатов иммуногистохимического исследования с указанным антителом осуществляют с учетом локализации позитивных клеток в эпителии эндометриоидных кистозных образований яичника путем подсчета количества окрашенных эпителиальных клеток и интенсивности окрашивания, выражая полученные количественные результаты в процентах. Изобретение обеспечивает возможность достоверной диагностики серозной дифференцировки эпителия эндометриоидных кистозных образований яичников, характерной для начала неопластической трансформации.
Однако, описанные выше способы принципиально отличаются от нашего, обладают меньшей точностью, чувствительностью или специфичностью, чем предлагаемый нами. При этом данные способы более сложны для клинической реализации и не являются малоинвазивными.
Анализ патентных источников (www.fips.ru) также показал отсутствие действующих патентов и заявок на «Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномой яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1».
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении, не дорогостоящего и точного способа с уникальными высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для малоинвазивной диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности.
Технический результат достигается тем, что проводят определение копийности генетических локусов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1 относительно референсного гена GAPDH методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и высокспецифичных праймеров на матрице выделенной внДНК, рассчитывают относительную копийности гена (rC) по формуле rC=2-ΔCt, где Ct - медиана сигналов флюоресценции, ΔCt=Ct(ген мишень) - Ct(референсный ген), и сравнивают полученные значения rC с прогностическим интервалом копийности, и при значениях rC CYP1B1 >(6,9±0,23)*10-3, rCESR1>(10,1±0,10)*10-3 и rCSULT1E1>(5,2±0,08)*10-3 диагностируют у пациентки серозную аденокарциному яичников высокой степени злокачественности, а при значениях rC CYP1B1 <(3,5±0,31)*10-3, rCESR1<(2,0±0,09)*10-3 и rCSULT1E1<(2,4±0,17)*10-3 у пациентки диагностируют отсутствие злокачественных опухолей яичников.
Сущность способа заключается в том, что образцы крови (10 мл крови и 3 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 15 минут при 400 g при 15°С. Из плазмы крови выделяют внДНК фенол-хлороформным методом и проводят амплификацию с высокоспецифичными праймерами для локусов SULT1E1, CYP1B1, ESR1 и GAPDH, анализируют первичные данные и вычисляют относительную копийность (rC) по формуле 2 - Δ Ct , где ΔCt=Ct(ген мишень) - Ct(референсный ген). Затем сравнивают полученные значения rC с прогностическими значениями копийности, и при значениях rC CYP1B1 >(6,9±0,23)*10-3, rCESR1>(10,1±0,10)*10-3 и rCSULT1E1>(5,2±0,08)*10-3 диагностируют у пациентки серозную аденокарциному яичников высокой степени злокачественности (чувствительность 98%, специфичность 90%), а при значениях rC CYP1B1 <(3,5±0,31)*10-3, rCESR1<(2,0±0,09)*10-3 и rCSULT1E1<(2,4±0,17)*10-3 у пациентки диагностируют отсутствие злокачественных опухолей яичников (чувствительность 98%, специфичность 90%).
Заявленный анализ основан на определении количества копий генов метаболизма и рецепции эстрогена SULT1E1, CYP1B1, ESR1 относительно референсного гена GAPDH во внДНК плазмы крови пациентов с риском развития рака яичников, и последующем сравнении полученных значений интервалов копийности rC для этих генов с характерными для серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности или ее отсутствия.
Заявленный способ включает следующие приемы:
• выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови с помощью метода фенол-хлороформной экстракции;
• определение относительной копийности генетических локусов SULT1E1, CYP1B1, ESR1 методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и специфичных праймеров на матрице выделенной внДНК;
• анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора;
• расчет относительной копийности гена (rC) на основании соотношения сигналов, продуцируемых амплификатами изучаемой и референсной последовательностей,
• сравнением rC пробы с прогностическими значениями копийности rC стандарт , определенными для больных серозной аденокарциномой яичников высокой степени злокачественности и условно здоровых доноров (без онкологических заболеваний).
Для осуществления способа были разработаны специфичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для локусов SULT1E1, CYP1B1, ESR1 и GAPDH. Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров (см. таблица 1) осуществлялся с использованием референсных последовательностей NCBI GenBank.
Таблица 1
Праймеры для малоинвазивного способа диагностики серозной аденокарциномой яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1
Наименование праймеров Последовательность № ID
ESR1_F
ESR1_R		 GGACTGCACTTGCTCCCGT
AGCACAGCCCGAGGTTAGAG		 SEQ ID №1
SEQ ID №2
CYP1B1_F
CYP1B1_R		 TGCGACTCCAGTTGTGAGAG
GAGTCTCTTGGCGTCGTCAG		 SEQ ID №3
SEQ ID №4
SULT1E1_F
SULT1E1_R		 GAGGAGCTTGTGGACAGGATT
CCTTTCTCATGAAGGGCGACAT		 SEQ ID №5
SEQ ID №6
GAPDH_F
GAPDH_R		 GCTGAACGGGAAGCTCACT
GCAGGTTTTTCTAGACGGCAG		 SEQ ID №7
SEQ ID №8
Заявленный способ осуществляется следующим образом:
На первом этапе образцы крови (10 мл крови и 3 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 15 минут при 400 g при 15°С.
Из плазмы крови внДНК выделяют фенол-хлороформным методом в нашей модификации: к плазме крови добавляют равный объем лизирующего буфера (2% SDS и 1,5% меркаптоэтанол) и 40 мкл протеиназы К, инкубируют в термостате при 58°С 30 минут; к полученному лизату добавляют равный объем щелочного фенола и хлороформа (соотношение 1:1), центрифугируют 30 минут 3000 об/мин при 10°С. После разделения фаз отбирают водную фазу в отдельную стерильную пробирку. К водной фазе добавляют равный объем 95% изопропилового спирта и раствор 5М NaCl до концентрации 100 mM, пробирку охлаждают до -20°С и инкубируют при этой температуре 60 минут. Далее центрифугируют 15 минут при 12700 об/мин, и -10°С, декантируют супернатант, а осадок промывают 80% этиловым спиртом, центрифугированием удаляют остатки этанола, высушивают осадок в твердотельном термостате и растворяют в 10 мМ ТЕ-буфере. Концентрация полученных препаратов ДНК измеряется на флюориметре. Для проведения ПЦР-РВ концентрацию ДНК в каждом образце нормализуют до 0,4 нг/мкл.
Амплификацию проводят в 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей 2 нг внДНК, 0,20 мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl2, 1х ПЦР-буфер, 1х краситель EvaGreen, и 0,1 е.а./мкл реакционной смеси ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, и по 500 нМ прямого и обратного праймеров для референсного гена или гена-мишени.
Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводят на термоциклере по следующей программе: t=95°С в течение 3 мин. 40 циклов: t=95°С в течение 10 с, t=59°С (чтение сигнала) в течение 30 с, t=72°С в течение 30 с.
Относительную копийность локусов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1 вычисляется следующим образом: определяют Ct для каждого целевого локуса и референсного GAPDH, далее рассчитывается величина ΔCt=Ct(ген мишень-SULT1E1, CYP1B1 или ESR1) - Ct(референсный ген - GAPDH) и копийность генетического локуса относительно референсного гена (rC) по формуле 2 - Δ Ct .
Сравниваются полученные значения rC с интервалом прогностического коэффициента копийности:
• при значениях rC CYP1B1 >(6,9±0,23)*10-3, rCESR1>(10,1±0,10)*10-3 и rCSULT1E1>(5,2±0,08)*10-3 диагностируют у пациентки серозную аденокарциному яичников высокой степени злокачественности (чувствительность 98%, специфичность 90%),
• при значениях rC CYP1B1 <(3,5±0,31)*10-3, rCESR1<(2,0±0,09)*10-3 и rCSULT1E1<(2,4±0,17)*10-3 у пациентки диагностируют отсутствие злокачественных опухолей яичников (чувствительность 98%, специфичность 90%)
Предлагаемым способом было осуществлено обследование 50 пациенток, у которых была диагностирована серозная аденокарцинома яичников высокой степени злокачественности, и 30 условно здоровых доноров (без онкологических заболеваний).
Группу из 30 условно-здоровых доноров в возрасте от 25 до 63 лет обследовали заявляемым способом на копийность генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1 относительно GAPDH. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (указ Президента РФ от 24.12.1993 №2288) и с разрешения этического комитета ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России. У всех условно-здоровых доноров-добровольцев взяли кровь при помощи вакутейнера с антикоагулянтом. Из полученной после центрифугирования плазмы выделили внДНК, и провели анализ заявленным способом.
Значения rC CYP1B1 находились в интервале от 3,19*10-3 до 3,81*10-3 (у 27 доноров), rCESR1 в интервале от 1,91*10-3 до 2,09*10-3 (у 27 доноров) и rCSULT1E1 в интервале от 2,23*10-3 до 2,57*10-3 (у 27 доноров), что соответствует показателям rC характерным для отсутствия злокачественных опухолей яичников. У 3 доноров (в возрасте старше 60 лет) полученный результат был неопределенным (промежуточный интервал): rC CYP1B1 в интервале от 3,91*10-3 до 4,21*10-3, rCESR1 в интервале от 2,55*10-3 до 2,79*10-3, rCSULT1E1 в интервале от 3,13*10-3 до 3,60*10-3. Было проведено инструментальное и лабораторное обследование всех доноров (УЗИ органов брюшной полости, забрюшинного пространства и малого таза, компьютерная томографию с контрастом органов брюшной полости и полости малого таза, МРТ, определение опухоль-ассоциированного антиген СА-125).
Группу из 50 человек, первично обратившихся по поводу заболевания раком яичников (с гистологически подтвержденной серозной аденокарциномой яичника), обследовали заявляемым способом на копийность генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1 относительно GAPDH. Медиана возраста исследуемых составила 58,0±6,3 лет, на момент выполнения исследования 48 пациентов имели верифицированный диагноз серозной аденокарциномой яичника III стадии (от T3N1M0 до T3N2M1), и 2 пациентки диагноз серозной аденокарциномой яичника на стадиях T4N2M1 и T4N3M2. У всех больных до хирургического вмешательства была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК (как описано в способе).
Для 49 пациенток значения rC CYP1B1 находились в интервале от 6,67*10-3 до 7,13*10-3 , rCESR1 в интервале от 10,0*10-3 до 10,2*10-3 и rCSULT1E1 в интервале от 5,12*10-3 до 5,28*10-3, что соответствует показателям rC характерным для серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности. У 1 пациентки (в возрасте старше 64 лет) полученный результат был неопределенным (промежуточный интервал): rC CYP1B1 =6,01*10-3, rCESR1=5,15*10-3, rCSULT1E1=4,40*10-3.
Для доказательства прогностической ценности предлагаемого способа приводим следующие примеры.
Пример 1. Пациентка Б., 1960 года рождения. По данным УЗИ образование правого яичника до 10,5 см. Онкомаркеры CA125 - 6.72 Ед/мл, HE4 - 31.8 пмоль/л, СА19 - 5 Ед/мл. До хирургического вмешательства также была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК. Были получены значения rC CYP1B1 =3,67*10-3 , rCESR1=2,02*10-3 и rCSULT1E1=2,43*10-3, что соответствует показателям rC характерным для отсутствия злокачественных опухолей яичников. После хирургического вмешательства получен материал для гистологического анализа (ГА). Результаты ГА - серозная аденофиброма яичника (доброкачественное новообразование).
Пример 2. Пациентка Р., 1967 года рождения. По данным УЗИ многочисленные кисты правого яичника. Онкомаркеры CA125 - 60.3 Ед/мл, HE4 - 45.0 пмоль/л. До хирургического вмешательства также была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК. Были получены значения rC CYP1B1 =7,08*10-3 , rCESR1=10,1*10-3 и rCSULT1E1=5,15*10-3, что соответствует показателям rC характерным для серозной аденокарциномы яичников. После хирургического вмешательства получен материал для гистологического анализа (ГА). Результаты ГА - серозная аденокарцинома яичника высокой степени злокачественности.
Заявляемый способ, включает разработанные нами праймеры и является экономически оправданным для диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, осуществление анализа возможно с плазмой крови, занимает не более 5 часов.
<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii
<120> Low invasive method for diagnosing high-grade serous ovarian adenocarcinoma based on the copy number of SULT1E1, CYP1B1 and ESR1 genes.
<160> 1
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
GGACTGCACT TGCTCCCGT 19
<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii
<120> Low invasive method for diagnosing high-grade serous ovarian adenocarcinoma based on the copy number of SULT1E1, CYP1B1 and ESR1 genes.
<160> 2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
AGCACAGCCC GAGGTTAGAG 20
<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii
<120> Low invasive method for diagnosing high-grade serous ovarian adenocarcinoma based on the copy number of SULT1E1, CYP1B1 and ESR1 genes.
<160> 3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
TGCGACTCCA GTTGTGAGAG 20
<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii
<120> Low invasive method for diagnosing high-grade serous ovarian adenocarcinoma based on the copy number of SULT1E1, CYP1B1 and ESR1 genes.
<160> 4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
GAGTCTCTTG GCGTCGTCAG 20
<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii
<120> Low invasive method for diagnosing high-grade serous ovarian adenocarcinoma based on the copy number of SULT1E1, CYP1B1 and ESR1 genes.
<160> 5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
GAGGAGCTTG TGGACAGGAT T 21
<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii
<120> Low invasive method for diagnosing high-grade serous ovarian adenocarcinoma based on the copy number of SULT1E1, CYP1B1 and ESR1 genes.
<160> 6
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
CCTTTCTCAT GAAGGGCGAC AT 22
<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii
<120> Low invasive method for diagnosing high-grade serous ovarian adenocarcinoma based on the copy number of SULT1E1, CYP1B1 and ESR1 genes.
<160> 7
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
GCTGAACGGG AAGCTCACT 19
<110> Kutilin, Denis; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii
<120> Low invasive method for diagnosing high-grade serous ovarian adenocarcinoma based on the copy number of SULT1E1, CYP1B1 and ESR1 genes.
<160> 8
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
GCAGGTTTTT CTAGACGGCA G 21

Claims (4)

1. Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1, включающий выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови, отличающийся тем, что проводят определение копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1 относительно референсного гена GAPDH методом ПЦР-РВ в присутствии высокоспецифичных праймеров на матрице выделенной внДНК, рассчитывают относительную копийность гена (rC) по формуле rC=2-ΔCt, где Ct - медиана сигналов флюоресценции, ΔCt=Ct(ген мишень) – Ct(GAPDH), и сравнивают полученные значения rC с прогностическим интервалом копийности, и при значениях rC CYP1B1 в интервале от 6,67*10-3 до 7,13*10-3 , rCESR1 в интервале от 10,0*10-3 до 10,2*10-3 и rCSULT1E1 в интервале от 5,12*10-3 до 5,28*10-3 диагностируют серозную аденокарциному яичников высокой степени злокачественности, а при значениях rC CYP1B1 в интервале от 3,19*10-3 до 3,81*10-3 , rCESR1 в интервале от 1,91*10-3 до 2,09*10-3 и rCSULT1E1 в интервале от 2,23*10-3 до 2,57*10-3 диагностируют отсутствие злокачественных опухолей яичников.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки уровня копийности гена SULT1E1 используют праймеры: SEQ ID 5 и SEQ ID 6.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки уровня копийности гена CYP1B1 используют праймеры: SEQ ID 3 и SEQ ID 4.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки уровня копийности гена ESR1 используют праймеры: SEQ ID 1 и SEQ ID 2.
RU2021101636A 2021-01-26 2021-01-26 Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1 RU2750472C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021101636A RU2750472C1 (ru) 2021-01-26 2021-01-26 Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021101636A RU2750472C1 (ru) 2021-01-26 2021-01-26 Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2750472C1 true RU2750472C1 (ru) 2021-06-28

Family

ID=76820175

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2021101636A RU2750472C1 (ru) 2021-01-26 2021-01-26 Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2750472C1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023086970A3 (en) * 2021-11-12 2023-06-22 Arna Genomics Us Incorporated Methods and compositions for analyzing nucleic acids and nucleases in a body fluid as indicators of disease
RU2822224C1 (ru) * 2023-11-03 2024-07-03 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации Малоинвазивный способ дифференциальной ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и жирового гепатоза

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009126934A2 (en) * 2008-04-11 2009-10-15 Seattle Genetics, Inc. Detection and tratment of pancreatic, ovarian and other cancers
US20150322530A1 (en) * 2012-10-17 2015-11-12 Cedars-Sinai Medical Center Molecular signatures of ovarian cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009126934A2 (en) * 2008-04-11 2009-10-15 Seattle Genetics, Inc. Detection and tratment of pancreatic, ovarian and other cancers
US20150322530A1 (en) * 2012-10-17 2015-11-12 Cedars-Sinai Medical Center Molecular signatures of ovarian cancer

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MUNGENAST F. et al. Estrogen Biosynthesis and Action in Ovarian Cancer. Front Endocrinol (Lausanne). 2014; 5: 192. *
TsANDEKOVA M.R. and other Features of the copy number of some genes in tumor cells in patients with serous ovarian adenocarcinoma. Materials of the V All-Russian Conference on Molecular Oncology December 16-18, 2019, Moscow. Pages 32-33. *
ЦАНДЕКОВА М.Р. и др. Особенности копийности некоторых генов в опухолевых клетках у больных серозной аденокарциномой яичника. Материалы V Всероссийской конференции по молекулярной онкологии 16-18 декабря 2019 г., Москва. Стр.32-33. MUNGENAST F. et al. Estrogen Biosynthesis and Action in Ovarian Cancer. Front Endocrinol (Lausanne). 2014; 5: 192. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023086970A3 (en) * 2021-11-12 2023-06-22 Arna Genomics Us Incorporated Methods and compositions for analyzing nucleic acids and nucleases in a body fluid as indicators of disease
RU2822224C1 (ru) * 2023-11-03 2024-07-03 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации Малоинвазивный способ дифференциальной ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и жирового гепатоза

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9416422B2 (en) Methods for detecting minimum residual disease
Huang et al. Quantitative analysis of plasma circulating DNA at diagnosis and during follow-up of breast cancer patients
WO2018086263A1 (zh) 一种实时荧光定量pcr检测方法及其标准品和检测试剂盒
Eissa et al. Integrative functional genetic-epigenetic approach for selecting genes as urine biomarkers for bladder cancer diagnosis
CN109825586B (zh) 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法
Millholland et al. Detection of low frequency FGFR3 mutations in the urine of bladder cancer patients using next-generation deep sequencing
CN105925681A (zh) 一种用于肺癌筛查的组合物及其应用
CN107326066A (zh) 用于膀胱癌检测的尿标记物
CN104745681A (zh) 多元基因组合物及其用途
CN111394457B (zh) 生物标志物的应用、检测肾透明细胞癌的试剂及其试剂盒
WO2020093040A1 (en) Methods to diagnose and treat cancer using non-human nucleic acids
Solmi et al. Search for epithelial-specific mRNAs in peripheral blood of patients with colon cancer by RT-PCR.
RU2750472C1 (ru) Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1
EP1605261B1 (en) Method of detecting colon cancer marker
CA3181473A1 (en) Tumor detection reagent and kit
US7217515B2 (en) HURP gene as a molecular marker for bladder cancer
EP3368684A1 (en) Biomarker for breast cancer
Malueka et al. Comparison of Polymerase Chain Reaction–Restriction Fragment Length Polymorphism, Immunohistochemistry, and DNA Sequencing for the Detection of IDH1 Mutations in Gliomas
CN106460047B (zh) 用于鉴定癌前结肠直肠息肉和结肠直肠癌的方法及试剂盒
Miura et al. A diagnostic evaluation of serum human telomerase reverse transcriptase mRNA as a novel tumor marker for gynecologic malignancies
CN114517233A (zh) 一种用于结直肠癌早期预警和临床诊断的引物探针组合
Thway et al. The comparative utility of fluorescence in situ hybridization and reverse transcription-polymerase chain reaction in the diagnosis of alveolar rhabdomyosarcoma
CN111363812B (zh) 基于dmrta2基因的肺癌诊断剂及试剂盒
CN112391478A (zh) 外泌体mRNA在乳腺疾病诊断中的应用
CN112322743A (zh) 检测人sept9基因甲基化的试剂盒及其使用方法、应用