RU2822224C1

RU2822224C1 - Малоинвазивный способ дифференциальной ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и жирового гепатоза

Info

Publication number: RU2822224C1
Application number: RU2023128574A
Authority: RU
Inventors: Екатерина Анатольевна Юрьева; Александр Васильевич Шапошников; Денис Сергеевич Кутилин
Filing date: 2023-11-03
Publication date: 2024-07-03

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к малоинвазивному способу дифференциальной ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и жирового гепатоза. Указанный способ включает выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови, определение копийности генов GOT1, CYC1, ALPL относительно референсного гена GAPDH методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и высокоспецифичных праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 1-8, расчёт относительной копийности гена (rC) и сравнение полученных значений rC с прогностическим интервалом копийности. Настоящее изобретение обеспечивает простой в исполнении, недорогостоящий и точный способ с высокоспецифичными последовательностями праймеров для малоинвазивной дифференциальной ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и жирового гепатоза. 1 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной онкологии, и может быть использовано для малоинвазивной ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и жирового гепатоза.

Рак печени является четвертым по летальности онкологическим заболеванием в мире, а гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) составляет 75-85% случаев рака печени. В 2018 году смертность от ГЦК составила 782 000 случаев в мире, несмотря на появление многих современных методов диагностики и лечения, что составляет около 3,5% всех смертей в мире. В России показатель смертности составляет около 9 800 случаев в год. Помимо высокой смертности, прогноз и лечение ГЦК неоптимальны, у большинства пациентов злокачественное новообразование прогрессирует в течение года после постановки диагноза (см. Шапошников А.В., Кит О.И., Кутилин Д.С., Юрьева Е.А. Генетические и эпигенетические особенности и маркеры гепатоцеллюлярных карцином // Современные проблемы науки и образования. 2021. № 5.;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=31086).

В значительной мере высокая летальность обусловлена не только поздней диагностикой и распространённостью процесса, но и развивающейся, как правило, гепатоцеллюлярной недостаточностью. В России и за рубежом опубликовано значительное количество фундаментальных исследований, посвящённых определенным аспектам функциональных состояний печени при различных заболеваниях (см. Бредер В.В., Лактионов К.К., Давыдов М.М. Лекарственное лечение гепатоцеллюлярного рака: практические вопросы и решения. Медицинский Совет. 2017;(14):11-23).

Однако научные достижения последних 10-20 лет могут позволить по-новому взглянуть на функции печени при онкологической патологии. В практике врачебной деятельности важнейшее значение приобретают многофакторные методы оценки функции печени на основании клинических, биохимических, морфологических и аппаратно- инструментальных данных. Большое, иногда определяющее, значение эта информация приобретает в онкологии, поскольку ряд злокачественных новообразований печени - гепатоцеллюлярный рак, холангиокарциномы, опухоли желчевыводящих протоков, а также коморбидные заболевания, изменяют как морфологическую структуру, так и её функции. Кроме того, печень нередко подвергается побочным токсическим влияниям целого ряда химиотерапевтических, системных и таргетных препаратов, широко применяемых в онкологии (см. Ozougwu J.C. Physiology of the liver. International Journal of Research in Pharmacy and Biosciences 4.8 (2017): 13-24).

Развитие гепатотоксичности имеет место у 10-50% онкологических больных. В этих условиях особое значение приобретают методы клинической оценки функции печени, основанные на биохимических показателях (аспартат-аминотрансфераза (АСТ), аланин - аминотрансфераза (АлТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), гамма - глутамилтрансфераза, общий билирубин, альбумин) (см. Church R.J., Watkins P.B. The transformation in biomarker detection and management of drug-induced liver injury. Liver International. 2017;37:1582-1590).

Однако всё большую ценность приобретают не их изолированные изменения, а интегральные показатели - индексы. В литературе известны более 20 индексов: индекс соотношения аспартатаминотрансферазы и тромбоцитов (APRI) (см. Wai CT, Greenson JK, Fontana RJ, Kalbfleisch JD, Marrero JA, Conjeevaram HS, Lok AS. A simple noninvasive index can predict both significant fibrosis and cirrhosis in patients with chronic hepatitis C. Hepatology. 2003 Aug;38(2):518-26); система подсчета FIB-4 - комбинация возраста пациента, количества тромбоцитов, АСТ и АлТ (см. Sterling RK, Lissen E, Clumeck N, Sola R, Correa MC, Montaner J, S Sulkowski M, Torriani FJ, Dieterich DT, Thomas DL, Messinger D, Nelson M; APRICOT Clinical Investigators. Development of a simple noninvasive index to predict significant fibrosis in patients with HIV/HCV coinfection. Hepatology. 2006;43(6):1317-25); индекс ALBI, рассчитываемый на основании уровня альбумина и общего билирубина плазмы крови; показатель R- отношение активности АлТ (кратность к верхнему пределу нормы (ВПН)) к ЩФ (кратность к ВПН), в том числе его повторная оценка в процессе наблюдения за больным и другие (см. Ивашкин В.Т., Барановский А.Ю., Райхельсон К.Л., Пальгова Л.К., Маевская М.В., Кондрашина А., Марченко Н.В., Некрасова .П., Никитин И.Г. Лекарственные поражения печени (клинические рекомендации для врачей). Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2019;29(1):85-115).

Вместе с тем, очевидно, что функциональное состояние печени регулируется на генетическом и транскриптомном уровне. При этом регуляция функций печени на молекулярном уровне недостаточно изучена, имеются лишь отдельные работы, посвящённые этой проблеме (см. Sookoian S, Pirola CJ. Genetic predisposition in nonalcoholic fatty liver disease. Clin Mol Hepatol. 2017;23(1):1-12.).

Известно, что пациенты с ГЦК и неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП, жировым гепатозом) имеют различные генетические профили, и эти различия могут быть применены для раннего скрининга и прогнозирования течения заболевания, оценки функционального состояния печени. Огромный потенциал в этом направлении имеет определение таких показателей как копийность генов (CNV) и уровень транскриптов микроРНК в плазме крови больных ГЦК и НАЖБП для дифференциальной диагностики этих двух патологий. Также важно провести ассоциативный и корреляционный анализ уровня стандартных биохимических маркеров и молекулярных.

Copy number variation (CNV) представляет собой особый тип вариабельности генетической информации, отражающий дозу гена (число его копий) и опосредованно влияющий на его транскрипционную активность (см. Kutilin D.S., Tsandekova M.R., Porkhanova N.V. Features of the copy number variation of certain genes in tumor cells in patients with serous ovarian adenocarcinoma. Bull Exp Biol Med 2021;170(3):332–9). Уровень CNV можно определять во внеклеточной ДНК (внДНК), циркулирующей в плазме крови (см. Цандекова М.Р., Порханова Н.В., Кит О.И., Кутилин Д.С. Малоинвазивная молекулярная диагностика серозной аденокарциномы яичника высокой и низкой степени злокачественности. Онкогинекология 2021;4(40):35–49).

Анализ открытых баз данных и собственные исследования показали, что больные ГЦК и НАЖБП отличаются по копийности генов: GOT1(кодирует фермент АСТ), CYC1 (кодирует цитохром С1) и ALPL(кодирует фермент щелочную фосфатазу) во внДНК плазмы крови.

Поэтому, в качестве маркеров для дифференциальной ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и жирового гепатоза допустимо использование показателя относительной копийности GOT1, CYC1 и ALPL.

Анализ патентных источников (www.fips.ru) показал отсутствие действующих патентов и заявок на «Малоинвазивный способ дифференциальной ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и жирового гепатоза», а также отсутствие изобретений, близких (подобных) нашему.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении, не дорогостоящего и точного способа с уникальными высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для малоинвазивной дифференциальной ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и жирового гепатоза.

Сущность способа заключается в том, что образцы крови (10 мл крови и 3 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 20 минут при 400 g при 15⁰С. Из плазмы крови выделяют внДНК фенол-хлороформным методом и проводят амплификацию с высокоспецифичными праймерами для генов GOT1, CYC1, ALPL и GAPDH, анализируют первичные данные и вычисляют относительную копийность (rC) по формуле 2 ^-ΔCt, где ΔCt=Ct(GOT1, CYC1 или ALPL) – Ct(GAPDH). Затем сравнивают полученные значения rC с прогностическими значениями копийности, и при значениях в интервале (41,7±2,7)*10^-3<rC_GOT1<(90,1±0,8)*10^-3, (14,2±5,1)*10^-3<rC_ALPL<(25,3±1,7)*10^-3 и (10,1±0,7)*10^-3 <rC_CYC1< (19,0±0,2)*10^-3 у пациента диагностируют НАЖБП (чувствительность 90%, специфичность 91%), а при значениях rC_GOT1>(121,0±0,9)*10^-3, rC_ALPL>(30,2±1,0)*10^-3 и rC_CYC1<(5,8±0,4)*10^-3 у пациента определяют гепатоцеллюлярную карциному (чувствительность 85%, специфичность 93%).

Заявленный анализ основан на определении количества копий генов GOT1, CYC1 и ALPL относительно референсного гена GAPDH во внДНК плазмы крови больных ГЦК и НАЖБ, и последующем сравнении полученных значений с интервалами копийности rC_GOT1, rC_ALPL и rC_CYC1характерными для ГЦК и НАЖБ.

Заявленный способ включает следующие приёмы:

• выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови с помощью метода фенол-хлороформной экстракции;

• определение относительной копийности генетических локусов GOT1, CYC1 и ALPL методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и специфичных праймеров на матрице выделенной внДНК;

• анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора;

• расчёт относительной копийности гена (rC) на основании соотношения сигналов, продуцируемых амплификатами изучаемой и референсной последовательностей,

• сравнением rC пробы с прогностическими значениями копийности rC_{стандарт}, определенными для ГЦК и НАЖБ.

Для осуществления способа были разработаны специфичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для генов GOT1, CYC1, ALPL и GAPDH. Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1) осуществлялся с использованием референсных последовательностей NCBI GenBank.

Таблица 1

Праймеры для малоинвазивного способа дифференциальной ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и жирового гепатоза

Наименование праймеров	Последовательность
GOT1_F GOT1_R	TTAAACCGGCCCCACATGAA (SeqID 1) GCCACACACAACACTCCTTT (SeqID 2)
CYC1_F CYC1_R	CCATAAAGCGGCACAAGTGG (SeqID 3) AGACACTGGACAGGGTCACT (SeqID 4)
ALPL_F ALPL_R	TCGATTGCATCTCTGGGCTC (SeqID 5) GGTGCCAATGGCCAGTACTAA (SeqID 6)
GAPDH_F GAPDH_R	GCTGAACGGGAAGCTCACT (SeqID 7) GCAGGTTTTTCTAGACGGCAG (SeqID 8)

Заявленный способ осуществляется следующим образом:

На первом этапе образцы крови (10 мл крови и 3 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 20 минут при 400 g при 15⁰С. Из плазмы крови ДНК выделяют фенол-хлороформным методом в нашей модификации. К плазме крови добавляют равный объем лизирующего буфера (2% SDS и 1% меркаптоэтанол) и 20 мкл протеиназы К, инкубируют в термостате при 58⁰С 1 час. К полученному лизату добавляют равный объем щелочного фенола и хлороформа (соотношение 1:1), центрифугируют 20 минут 3000 об/мин. После разделения фаз отбирают водную фазу в отдельную стерильную пробирку. К водной фазе добавляют равный объем 95% изопропилового спирта и раствор 5М NaCl до концентрации 100 mM, пробирку помещают в холодильник на -20⁰С на 60 минут. Далее центрифугируют 15 минут при 12700 об/мин, при -10⁰С, декантируют супернатант, а осадок промывают 80% этиловым спиртом, центрифугированием удаляют остатки этанола, высушивают осадок в твердотельном термостате и растворяют в 10 мМ ТЕ буфере.

Амплификацию проводят в 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей 1 нг внДНК, 0,22 мМ dNTPs, 2,3 мМ MgCl₂, 1х ПЦР-буфер, 1х краситель EvaGreen, и 0,2 е.а./мкл реакционной смеси ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, и по 440 нМ прямого и обратного праймеров для референсного гена или гена-мишени.

Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводят на термоциклере по следующей программе: t=95⁰С в течение 5 мин. 40 циклов: t=95⁰С в течение 10 с, t=57⁰С (чтение сигнала) в течение 25 с, t=72⁰С в течение 35 с.

Относительная копийность генов вычисляется следующим образом:

- рассчитывается C_t для целевого (GOT1, CYC1 или ALPL) и референсного локуса (GAPDH),

- рассчитывается величина ΔC_t = C_t(целевой локус) – C_t(референсный локус);

- рассчитывается копийность целевого локуса относительно референсного (rC) по формуле 2 ^-ΔCt.

Полученные значения rC сравнивают с интервалом прогностического коэффициента копийности:

• при значениях в интервале (41,7±2,7)*10^-3<rC_GOT1<(90,1±0,8)*10^-3, (14,2±5,1)*10^-3<rC_ALPL<(25,3±1,7)*10^-3 и (10,1±0,7)*10^-3 <rC_CYC1< (19,0±0,2)*10^-3 у пациента диагностируют НАЖБП (чувствительность 90%, специфичность 91%),

• при значениях rC_GOT1>(121,0±0,9)*10^-3, rC_ALPL>(30,2±1,0)*10^-3 и rC_CYC1<(5,8±0,4)*10^-3 у пациента определяют гепатоцеллюлярную карциному (чувствительность 85%, специфичность 93%).

Предлагаемым способом было осуществлено обследование 40 пациентов с ГЦК и 20 пациентов с НАЖБ.

Для доказательства прогностической ценности предлагаемого способа приводятся два клинических примера применения способа.

1. Пациент О. 48 лет. Из анамнеза: хронический вирусный гепатит «С», перенесенный. Алкоголь, курение - отрицает. Гистологический анализ - Морфологическая картина в объеме трепан-биоптатов более всего характерна для гепатоцеллюлярной карциномы. УЗИ ОБП - В правой доле в S5-6 определяется объемное гипоэхогенное образование, с ровными, четкими контурами, неоднородной структуры размерами 6,7х6,8 см.

СРКТ ОГК, ОБП и ОМТ - в легких участков повышения плотности легочной ткани по типу «матового стекла», по типу консолидации, а также объемных образований не определяется. Контуры печени ровные, четкие. Край не закруглен. В размерах печень не увеличена. Плотность паренхимы равномерна, объемное образование в S5-6 правой доли 6,9х6,2х5,1 см, неравномерно накапливающее контрастное вещество во все фазы контрастирования. Забрюшинные лимфоузлы: в воротах печени до 1,6 см. Простата 3,1х3,8 см. МРТ ОБП - билобарный размер 214х161 мм, в S6-S5 конгломерат опухолевой ткани солидного строения размерами 83х70х58 мм. Возможно, ГЦК. Под капсулой S7 печени по задне-диафрагмальной поверхности очаг 8 мм. Отечна стенка бульбарного отдела двенадцатиперстной кишки, отек прослеживается до ее нисходящей части. Асцита нет. В большом сальнике без очагов. Лимфоузлы воротного коллектора 16х8 мм, 14х8 мм, парапанкреатические 9 мм и 13х8 мм, в клетчатке корня брыжейки 9 мм и 10 мм и парагастральный лимфоузел 9 мм метастатически поражены.

На основании морфологического заключения, данных анамнеза и клинико-лабораторных данных установлен диагноз: (С22) Гепатоцеллюлярная карцинома T3aN1M0 st.IIIA, кл.гр. 2, по Барселонской классификации BCLC «B».

Перед началом лечения в НМИЦ онкологии взята кровь для выделения внДНК. Результаты молекулярно-генетического анализа образцов внДНК: rC_GOT1=158,2*10^-3, rC_ALPL=37,4*10^-3 и rC_CYC1=0,9*10^-3 соответствуют прогностическим коэффициентам ГЦК.

2. Пациент С. 61 год. Из анамнеза: вирусные гепатиты - отрицает. Алкоголь, курение - отрицает. УЗИ ОБП и забрюшинного пространства- Гепатомегалия, диффузные изменения паренхимы печени, жировой гепатоз. Диффузные изменения паренхимы поджелудочной железы. На основании данных анамнеза и клинико-лабораторных данных установлен диагноз: (К76.0) Жировая дегенерация печени (НАЖБП).

Перед началом лечения взята кровь для выделения внДНК.

Результаты молекулярно-генетического анализа образцов внДНК: rC_GOT1=50,4*10^-3, rC_ALPL=15,0*10^-3 и rC_CYC1=14,5*10^-3 соответствуют прогностическим коэффициентам НАЖБ.

Технико-экономическая эффективность способа заключается в том, что заявляемый способ включает разработанные нами синтетические олигонуклеотиды (праймеры) и является экономически оправданным для малоинвазивной дифференциальной ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и жирового гепатоза, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), обладает высокой чувствительностью и специфичностью, осуществление анализа возможно с плазмой крови, занимает не более 5 часов.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Малоинвазивный

способ дифференциальной ранней диагностики гепатоцеллюлярной

карциномы и жирового гепатоза.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-04-03">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский

центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской

Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Natsional'nyy meditsinskiy

issledovatel'skiy tsentr onkologii</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Кутилин Денис

Сергеевич</InventorName>

<InventorNameLatin>Kutilin Denis</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Малоинвазивный способ

дифференциальной ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и

жирового гепатоза</InventionTitle>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttaaaccggccccacatgaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gccacacacaacactccttt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccataaagcggcacaagtgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agacactggacagggtcact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcgattgcatctctgggctc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtgccaatggccagtactaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctgaacgggaagctcact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcaggtttttctagacggcag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

Малоинвазивный способ дифференциальной ранней диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и жирового гепатоза, включающий выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови, заключающийся в том, что выделяют внеклеточную ДНК из плазмы крови, проводят определение копийности генов GOT1, CYC1, ALPL относительно референсного гена GAPDH методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и высокспецифичных праймеров: для GOT1 F - TTAAACCGGCCCCACATGAA (SEQ ID NO: 1); R - GCCACACACAACACTCCTTT (SEQ ID NO: 2); для CYC1 F - CCATAAAGCGGCACAAGTGG (SEQ ID NO: 3); R - AGACACTGGACAGGGTCACT (SEQ ID NO: 4); для ALPL F - TCGATTGCATCTCTGGGCTC (SEQ ID NO: 5); R GGTGCCAATGGCCAGTACTAA (SEQ ID NO: 6); для GAPDH F - GCTGAACGGGAAGCTCACT (SEQ ID NO: 7); R- GCAGGTTTTTCTAGACGGCAG (SEQ ID NO: 8) на матрице выделенной внДНК, рассчитывают относительную копийность гена (rC) по формуле rC=2^-ΔCt, где Ct - медиана сигналов флюоресценции, ΔCt=Ct, целевой ген, - Ct, референсный ген, и сравнивают полученные значения rC с прогностическим интервалом копийности, и при значениях в интервале (41,7±2,7)*10^-3<rCGOT1<(90,1±0,8)*10^-3, (14,2±5,1)*10^-3<rCALPL<(25,3±1,7)*10^-3 и (10,1±0,7)*10^-3<rCCYC1<(19,0±0,2)*10^-3 у пациента диагностируют жировой гепатоз печени, а при значениях rCGOT1>(121,0±0,9)*10^-3, rCALPL>(30,2±1,0)*10^-3 и rCCYC1<(5,8±0,4)*10^-3 у пациента определяют гепатоцеллюлярную карциному.