CN111394457B

CN111394457B - 生物标志物的应用、检测肾透明细胞癌的试剂及其试剂盒

Info

Publication number: CN111394457B
Application number: CN202010199057.4A
Authority: CN
Inventors: 高山; 顾殷敏
Original assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2040-03-20
Also published as: WO2021184453A1; CN111394457A

Abstract

本发明涉及一种生物标志物的应用、检测肾透明细胞癌的试剂及其试剂盒。该生物标志物在制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或装置中的应用，生物标志物包括DMDRMR基因，检测包括检测DMDRMR基因启动子的甲基化状态或甲基化程度。上述生物标志物能够用于制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或装置中的生物标志物，检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或装置能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后。

Description

生物标志物的应用、检测肾透明细胞癌的试剂及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种生物标志物的应用、检测肾透明细胞癌的试剂及其试剂盒。

背景技术

肾癌是起源于肾脏系统的恶性肿瘤的总称，约90％左右的肾癌起源于肾上皮细胞，即肾细胞癌。根据组织和分子特性又可以分成10个以上的亚型。其中，透明细胞肾癌是最为常见的，约占肾细胞癌的85％，其也是引起肾癌患者死亡常见的亚型。当前诊断透明细胞肾癌的技术包括：影像学技术(B超、多层螺旋CT、磁共振成像、PEI-CT全身扫面检查技术等)，病理学技术(肾脏穿刺活检)、及分子生物学技术(荧光原位杂交技术、免疫组织化学技术)等。然而，由于肾癌患者临床症状不明显，被确诊时多表现为晚期症状，此时患者已失去了根治性手术的机会。因此，有必要寻找一种能够对肾透明细胞癌进行早期诊断和预后的方式，以满足实际需求。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够用于制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或装置中的生物标志物，检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或装置能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后。

此外，还提供一种检测肾透明细胞癌的试剂及其试剂盒。

一种生物标志物在制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或装置中的应用，所述生物标志物包括DMDRMR基因，所述检测包括检测所述DMDRMR基因启动子的甲基化状态或甲基化程度。

经过在肾透明细胞癌的生物标志物方面进行了大量的探索，预料不到地发现，DMDRMR基因启动子的甲基化水平与肾透明细胞癌的恶化程度具有较高相关性，因此，能够作为生物标志物应用于制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或检测装置中，以能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后。经试验验证，将上述DMDRMR基因作为生物标志物研发的检测试剂盒对肾透明细胞癌检测的ROC曲线下面积为0.963，能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后。

一种生物标志物在制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或装置中的应用，所述生物标志物包括DMDRMR基因，所述检测包括检测所述DMDRMR基因的表达水平。

在其中一个实施例中，所述生物标志物还包括IGF2BP3基因，所述检测包括检测所述IGF2BP3基因的表达水平。

在其中一个实施例中，检测所述IGF2BP3基因的表达水平包括检测所述IGF2BP3基因的转录水平及检测所述IGF2BP3基因的蛋白质表达水平中的至少一种。

在其中一个实施例中，检测所述DMDRMR基因的表达水平包括检测所述DMDRMR基因的转录水平。

一种检测肾透明细胞癌的试剂，包括检测DMDRMR基因启动子的甲基化状态或甲基化程度的试剂。

一种检测肾透明细胞癌的试剂，包括检测DMDRMR基因的表达水平的试剂。

在其中一个实施例中，所述检测DMDRMR基因的表达水平的试剂包括第一扩增引物对及第一原位杂交探针中的至少一种，所述第一扩增引物对用于扩增所述DMDRMR基因，所述第一原位杂交探针能够与所述DMDRMR基因杂交。

在其中一个实施例中，还包括检测IGF2BP3基因的表达水平的试剂。

在其中一个实施例中，所述检测IGF2BP3基因的表达水平的试剂包括第二扩增引物对，所述第二扩增引物对用于扩增所述IGF2BP3基因。

在其中一个实施例中，所述第二扩增引物对的序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示。

在其中一个实施例中，所述第一扩增引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示；

及/或，所述第一原位杂交探针的序列如SEQ ID No.8所示。

一种检测肾透明细胞癌的试剂盒，包括上述检测肾透明细胞癌的试剂。

附图说明

图1为实施例1中TCGA数据集的DMDRMR启动子在肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异甲基化图；

图2为实施例1中TCGA数据集的DMDRMR启动子在肾透明细胞癌肿瘤不同临床性状的不同恶化分级中的差异甲基化图；

图3为实施例1中TCGA数据集的DMDRMR启动子甲基化在肾透明细胞癌的ROC曲线图；

图4为实施例1中TCGA数据集的DMDRMR启动子甲基化高、中、低三个程度对肾透明细胞癌患者的生存预后图；

图5为实施例1中GEO数据集的DMDRMR启动子在肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异甲基化图；

图6为实施例1中DMDRMR启动子上cg00440032位点在在48对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中的差异甲基化图；

图7为实施例2中TCGA数据集的DMDRMR基因在肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异表达图；

图8为实施例2中TCGA数据集的DMDRMR基因在肾透明细胞癌肿瘤不同临床性状的不同恶化分级中的差异表达图；

图9为实施例2中TCGA数据集的DMDRMR基因表达在肾透明细胞癌肿瘤的ROC曲线图；

图10为实施例2中TCGA数据集的DMDRMR基因高低表达对肾透明细胞癌患者的生存预后图；

图11为实施例2中GEO数据集的DMDRMR基因在肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异表达图；

图12为实施例2中DMDRMR基因在15对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异表达图；

图13为实施例2中DMDRMR基因在48对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异表达图；

图14为实施例2中DMDRMR基因在90对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁(左)及在高分期患者与低分期患者(右)的原位杂交差异分析图；

图15为实施例2中DMDRMR基因原位杂交的高低染色强度对肾透明细胞癌患者的生存预后图；

图16为实施例3中TCGA数据集的IGF2BP3基因在肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异表达图；

图17为实施例3中TCGA数据集的IGF2BP3基因高低表达对肾透明细胞癌患者的生存预后图；

图18为实施例3中TCGA数据集的IGF2BP3基因在肾透明细胞癌肿瘤不同临床性状的不同恶化分级中的差异表达图；

图19为实施例3中IGF2BP3蛋白质在90对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁(左)及在高分期患者与低分期患者(右)的免疫组化差异分析图；

图20为实施例3中IGF2BP3蛋白质免疫组化的高低染色强度对肾透明细胞癌患者的生存预后图；

图21为实施例3中DMDRMR基因联合IGF2BP3蛋白质的高低染色强度对肾透明细胞癌患者的生存预后图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一实施方式的生物标志物在制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或装置中的应用。生物标志物包括DMDRMR基因。检测包括检测DMDRMR基因启动子的甲基化状态或甲基化程度。

肾癌是起源于肾脏系统的恶性肿瘤的总称，约90％左右的肾癌起源于肾上皮细胞，即肾细胞癌。根据组织和分子特性又可以分成10个以上的亚型。其中，透明细胞肾癌是最为常见的，约占肾细胞癌的85％，其也是引起肾癌患者死亡常见的亚型。当前诊断透明细胞肾癌的技术包括：影像学技术(B超、多层螺旋CT、磁共振成像、PEI-CT全身扫面检查技术等)，病理学技术(肾脏穿刺活检)、及分子生物学技术(荧光原位杂交技术、免疫组织化学技术)等。然而，由于肾癌患者临床症状不明显，被确诊时多表现为晚期症状，此时患者已失去了根治性手术的机会。研究发现，遗传性突变基因VHL、MTOR、MET等是诱发肾透明细胞癌发生的起因。VHL的缺失表达能诱导致癌性的低氧诱导因子HIF1与HIF2的异常增加，从而导致调控血管生成、糖酵解与凋亡的靶基因激活。MTOR通常发生错义突变和功能性激活，从而促进肾透明细胞癌的发生进展。当前，治疗发生转移的恶性肾透明细胞癌患者主要使用靶向血管内皮生长因子VEGF及其受体VEGFA的药物(如sorafenib、sunitinib等)和靶向mTOR的药物(如everolimus、temsirolimus等)，然而治疗效果不一，大部分患者最终发生进展。因此，急需一种能够对肾透明细胞癌进行早期诊断和预后的方式，以满足实际需求。

本研究经过在肾透明细胞癌的生物标志物方面进行了大量的探索，预料不到地发现，DMDRMR基因启动子的甲基化水平及表达水平、IGF2BP3的表达水平均与肾透明细胞癌的恶化程度具有较高相关性，因此，能够作为生物标志物应用于制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或检测装置中，以能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后，为今后透明细胞肾癌的分子靶向治疗提供理论基础。

其中，DMDRMR基因启动子的序列如SEQ ID No.5所示。DMDRMR基因的序列如SEQ IDNo.6所示。

具体地，如SEQ ID No.5所示的序列为：5’-CTCCCCAGGAGATTAGAATGGCAAAGCCACACTCTATGGGATCTCAAGAACCCAAGTGTGAGATTTGCTTTCAGTATTTAGCAGAATTGGTGTTTCTGGGGCGGCAATCTCCTCCTGGAGATGTGTTAATCATTTACAGAATAGCCTGGACTAGTGTATGGGCCCTGCCCTTAGAGCCAATGCCACATTTATTTTTATTTTGCGAGATCTGCACTGACATGAAAACCGAAAATTCTATTGACGTTTCCTGTTCAACCTAAAAGCTAAATCCAGTTCATCACTGAAATCCCACAATGCCCTGAGACAAATAGTGCTTTAAAATATGTGGTGATTTTTAGGTCAGGTGCGGTGTAATCCCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGTGGATCACGAGGTCAGGAGGTTGAGATCAGCCTGATCAATATGGTGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAACATTAGCCAGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGAAGAATGGCACGAACCCGGGAGGCGGAGGCTGCAATGAGCCAAGGTCGCGCCATTGCATTCCAACCTGGGCAACAGAACGAGACTCCGTCTCTAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAGTGGTGATTTTTTTAAAAAGGAGTGGTTCATTCAGTTAAATGGGAAGAGTTGTAATGAGGGACTAAGTGGCTAAGTTGGCTGGACTTCCTGGGTCAATAGGGACTTCCCTAAGGGGACTTTCCCCTAAGCCAAAATGAGTCATAGCTGAAAGCTAAGGGATGGAAACTTCAACCAATCAAAGGGGACTTTCCCCTAAGACAAACTGACTCATAGCTGCAAGCTAAGTGGTTGAAACTTGAACCAGTCATATAGGGAGTTTAAGCTCTAGCTTCAGCCTGATGTTTTTAACCAACTAGGCCCGCCAACCCACAAGCAGATAGAAAATAAGCTGATTCTATAGGACAGAAAAAGGAAGAGGGCAGGGGTCATAAGGGGATGTAAGCATAAGATACCCAAGCCAGAAACAGCAACCCTTCCAGGTCCCCTTCCCCCACGTGGAAGCTTTCCTTTCACTTTCGCTTTAATAAATCTTGCCGCAGCACACTCTCTAATCGAGCTGTAACACTCGCCACTGCCGTCCACGGCTTCATTCCTTGAAGCCGTGAGACCACGAACCCTTCGATTGAGAAGA-3’。

如SEQ ID No.6所示的序列为：5’-GGGGATGTAAGCATAAGATACCCAaGCCAGAAACAGCAACCCTtCCAGGTCCCCTTCCCCCACGTGGAAGCTTTCCTTTCACTTTCGCTTTAATAAATCTTGCCGCAGCACACTCTCTAATCGAGCTGTAACACTCGCCACTGCcGTCCACgGCTTCATTCCTTGAAGCCGTGAGACCACGAACCCTTCGATTGAGAAGAACCTTCGGTcGGAAGAAGACTTCTCGTCTCAGTAACAATAACAAGAAAAACAGCCTAGACTAGACGCACATCAGGAAGACAGACAGAGAGAGAGAATGATAGAAATGCTGGAAGAACGAGCCTTGGGGCGGTATCGCCCAGATCTGAATCCACACAGCAGCTGCTTCGGTCCCTGTAACTCAAGGCTTCCTCTTAATCCTCTGTCCTCCATCAACACCTGGCTGAGCAGGAACAACTATGACCTAGGACCAGGGCCTTCAGGAATCTTCACCCCTAACTTGAACTTCATAACACTGGAGAGAGAGACTGTGGAATGGAATGACTCTCCAGAGCTGCAGATTGAAGGCATATTTTCATCTGACTTTGATCTCAATGGCGGGAACACCTTCATGGCCCCTTTATAGCTGGTATGTTTTCTTCTTATGGACAATGAGAAACATGTAATAAACTGTGTTTCCTTCTCGCTAGG-3’。

在其中一个实施例中，生物标志物是指可以标记系统、器官、组织及细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标。

在其中一个实施例中，检测DMDRMR基因启动子的甲基化状态或甲基化程度的方式为焦磷酸测序法。

经过在肾透明细胞癌的生物标志物方面进行了大量的探索，预料不到地发现，DMDRMR基因启动子的甲基化水平与肾透明细胞癌的恶化程度具有较高相关性，因此，能够作为生物标志物应用于制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或检测装置中，以能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后，为今后透明细胞肾癌的分子靶向治疗提供理论基础。经试验验证，将上述DMDRMR基因作为生物标志物研发的检测试剂盒对肾透明细胞癌检测的ROC曲线下面积为0.963，能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后。

一实施方式的生物标志物在制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或装置中的应用，生物标志物包括DMDRMR基因，检测包括检测DMDRMR基因的表达水平。

本研究发现，DMDRMR基因的表达水平与肾透明细胞癌的恶化程度具有较高相关性，因此，能够作为生物标志物应用于制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或检测装置中，以能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后，为今后透明细胞肾癌的分子靶向治疗提供理论基础。

在其中一个实施例中，检测DMDRMR基因的表达水平包括检测DMDRMR基因的转录水平。

在其中一个实施例中，检测DMDRMR基因的转录水平的方式为荧光定量PCR或原位杂交技术。

其中，检测DMDRMR基因的转录水平的扩增引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ IDNo.2所示。具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为：5’-ATGCTGGAAGAACGAGCCTT-3’。如SEQ IDNo.2所示的序列为：5’-GGCCCTGGTCCTAGGTCATA-3’。

其中，检测DMDRMR基因的转录水平的原位杂交探针如SEQ ID No.8所示。具体地，如SEQ ID No.8所示的序列为：5’-CTTGTTATTGTTACTGAGACGAGAAGTCTTCTTCCgACCGAAGGTTCTTCTCAATCGAAGGGTTCGTGGTCTCACGGCTTCAAGGAATGAAGCcGTGGACgGCAGTGGCGAGTGTTACAGCTCGATTAGAGAGTGTGCTGCGGCAAGA-3’。

在其中一个实施例中，生物标志物还包括IGF2BP3基因。检测包括检测IGF2BP3基因的表达水平。研究发现，IGF2BP3基因的表达水平与肾透明细胞癌的恶化程度具有较高相关性，因此，能够与DMDRMR基因联合作为生物标志物应用于制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或检测装置中，以能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后，为今后透明细胞肾癌的分子靶向治疗提供理论基础。

其中，IGF2BP3基因的序列如SEQ ID No.7所示。

具体地，如SEQ ID No.7所示的序列为：5’-ATGAACAAACTGTATATCGGAAACCTCAGCGAGAACGCCGCCCCCTCGGACCTAGAAAGTATCTTCAAGGACGCCAAGATCCCGGTGTCGGGACCCTTCCTGGTGAAGACTGGCTACGCGTTCGTGGACTGCCCGGACGAGAGCTGGGCCCTCAAGGCCATCGAGGCGCTTTCAGGTAAAATAGAACTGCACGGGAAACCCATAGAAGTTGAGCACTCGGTCCCAAAAAGGCAAAGGATTCGGAAACTTCAGATACGAAATATCCCGCCTCATTTACAGTGGGAGGTGCTGGATAGTTTACTAGTCCAGTATGGAGTGGTGGAGAGCTGTGAGCAAGTGAACACTGACTCGGAAACTGCAGTTGTAAATGTAACCTATTCCAGTAAGGACCAAGCTAGACAAGCACTAGACAAACTGAATGGATTTCAGTTAGAGAATTTCACCTTGAAAGTAGCCTATATCCCTGATGAAATGGCCGCCCAGCAAAACCCCTTGCAGCAGCCCCGAGGTCGCCGGGGGCTTGGGCAGAGGGGCTCCTCAAGGCAGGGGTCTCCAGGATCCGTATCCAAGCAGAAACCATGTGATTTGCCTCTGCGCCTGCTGGTTCCCACCCAATTTGTTGGAGCCATCATAGGAAAAGAAGGTGCCACCATTCGGAACATCACCAAACAGACCCAGTCTAAAATCGATGTCCACCGTAAAGAAAATGCGGGGGCTGCTGAGAAGTCGATTACTATCCTCTCTACTCCTGAAGGCACCTCTGCGGCTTGTAAGTCTATTCTGGAGATTATGCATAAGGAAGCTCAAGATATAAAATTCACAGAAGAGATCCCCTTGAAGATTTTAGCTCATAATAACTTTGTTGGACGTCTTATTGGTAAAGAAGGAAGAAATCTTAAAAAAATTGAGCAAGACACAGACACTAAAATCACGATATCTCCATTGCAGGAATTGACGCTGTATAATCCAGAACGCACTATTACAGTTAAAGGCAATGTTGAGACATGTGCCAAAGCTGAGGAGGAGATCATGAAGAAAATCAGGGAGTCTTATGAAAATGATATTGCTTCTATGAATCTTCAAGCACATTTAATTCCTGGATTAAATCTGAACGCCTTGGGTCTGTTCCCACCCACTTCAGGGATGCCACCTCCCACCTCAGGGCCCCCTTCAGCCATGACTCCTCCCTACCCGCAGTTTGAGCAATCAGAAACGGAGACTGTTCATCTGTTTATCCCAGCTCTATCAGTCGGTGCCATCATCGGCAAGCAGGGCCAGCACATCAAGCAGCTTTCTCGCTTTGCTGGAGCTTCAATTAAGATTGCTCCAGCGGAAGCACCAGATGCTAAAGTGAGGATGGTGATTATCACTGGACCACCAGAGGCTCAGTTCAAGGCTCAGGGAAGAATTTATGGAAAAATTAAAGAAGAAAACTTTGTTAGTCCTAAAGAAGAGGTGAAACTTGAAGCTCATATCAGAGTGCCATCCTTTGCTGCTGGCAGAGTTATTGGAAAAGGAGGCAAAACGGTGAATGAACTTCAGAATTTGTCAAGTGCAGAAGTTGTTGTCCCTCGTGACCAGACACCTGATGAGAATGACCAAGTGGTTGTCAAAATAACTGGTCACTTCTATGCTTGCCAGGTTGCCCAGAGAAAAATTCAGGAAATTCTGACTCAGGTAAAGCAGCACCAACAACAGAAGGCTCTGCAAAGTGGACCACCTCAGTCAAGACGGAAGTAA-3’。

在其中一个实施例中，检测IGF2BP3基因的表达水平包括检测IGF2BP3基因的转录水平及检测IGF2BP3基因的蛋白质表达水平中的至少一种。

其中，检测IGF2BP3基因的转录水平的方式为荧光定量PCR。进一步地，检测IGF2BP3基因的转录水平的扩增引物对的序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示。

具体地，如SEQ ID No.3所示的序列为：5’-TCGAGGCGCTTTCAGGTAAA-3’。如SEQ IDNo.4所示的序列为：5’-AAACTATCCAGCACCTCCCAC-3’。

其中，检测IGF2BP3基因的蛋白质表达水平的方式为免疫印迹技术或者免疫组织化学技术。

研究发现，DMDRMR基因的表达水平与肾透明细胞癌的恶化程度具有较高相关性，因此，能够作为生物标志物应用于制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或检测装置中，以能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后，为今后透明细胞肾癌的分子靶向治疗提供理论基础。经试验验证，将上述DMDRMR基因作为生物标志物研发的检测试剂盒对肾透明细胞癌检测的ROC曲线下面积为0.838，能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后。

一实施方式的检测肾透明细胞癌的试剂，包括检测DMDRMR基因启动子的甲基化状态或甲基化程度的试剂。

具体地，检测DMDRMR基因启动子的甲基化状态或甲基化程度的试剂为检测DMDRMR基因启动子的甲基化状态或甲基化程度的焦磷酸测序试剂。

经试验验证，采用上述检测肾透明细胞癌的试剂对肾透明细胞癌的检测的ROC曲线下面积为0.963，能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后。

一实施方式的检测肾透明细胞癌的试剂，包括检测DMDRMR基因的表达水平的试剂。

在其中一个实施例中，检测DMDRMR基因的表达水平的试剂包括第一扩增引物对及第一原位杂交探针中的至少一种。第一扩增引物对用于扩增DMDRMR基因。第一原位杂交探针能够与所述DMDRMR基因杂交。具体地，第一扩增引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ IDNo.2所示。第一原位杂交探针如SEQ ID No.8所示。通过设计扩增DMDRMR基因的扩增引物对或者原位杂交探针，以对DMDRMR基因的表达水平进行检测，以便于对肾透明细胞癌进行及时有效地诊断。具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为：5’-ATGCTGGAAGAACGAGCCTT-3’。如SEQ ID No.2所示的序列为：5’-GGCCCTGGTCCTAGGTCATA-3’。如SEQ ID No.8所示的序列为：5’-CTTGTTATTGTTACTGAGACGAGAAGTCTTCTTCCgACCGAAGGTTCTTCTCAATCGAAGGGTTCGTGGTCTCACGGCTTCAAGGAATGAAGCcGTGGACgGCAGTGGCGAGTGTTACAGCTCGATTAGAGAGTGTGCTGCGGCAAGA-3’。

其中，检测IGF2BP3基因的表达水平的试剂包括第二扩增引物对。第二扩增引物对用于扩增IGF2BP3基因。具体地，第二扩增引物对的序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示。通过设计扩增IGF2BP3基因的扩增引物对，以对IGF2BP3基因的表达水平进行检测，以便于对肾透明细胞癌进行及时有效地诊断。具体地，如SEQ ID No.3所示的序列为：5’-TCGAGGCGCTTTCAGGTAAA-3’。如SEQ ID No.4所示的序列为：5’-AAACTATCCAGCACCTCCCAC-3’。

进一步地，检测IGF2BP3基因的表达水平的试剂还包括检测IGF2BP3基因的蛋白质表达水平的试剂。具体地，检测IGF2BP3基因的蛋白质表达水平的试剂为检测IGF2BP3基因的蛋白质表达水平的免疫印迹试剂或者免疫组织化学试剂。

需要说明的是，检测肾透明细胞癌的试剂不限于包括上述物质，还可以包括其他用于检测肾透明细胞癌的试剂，例如还可以包括与检测扩增引物对对应的检测探针等。

一实施方式的检测肾透明细胞癌的试剂盒，包括上述实施方式的检测肾透明细胞癌的试剂。上述检测肾透明细胞癌的试剂能够对待测样本中肾透明细胞癌进行检测，能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后。

在其中一个实施例中，待测样品为肾透明细胞癌的组织样本。

在其中一个实施例中，检测肾透明细胞癌的试剂盒还包括其他常见的试剂。例如可以为DNA聚合酶、DNA提取试剂、dNTPs、PCR反应液、Mg²⁺试剂、荧光染料、阳性对照品以及阴性对照品中的至少一种。

上述检测肾透明细胞癌的试剂盒包括上述实施方式的检测肾透明细胞癌的试剂，对肾透明细胞癌检测的灵敏度和特异性均较高，预后能力较强，能够提高肾透明细胞癌诊断和判断预后的精确度。

以下为具体实施例部分。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

实施例1

检测DMDRMR基因的启动子的甲基化水平

采用TCGA数据库与GEO数据库对肾透明细胞癌与癌旁样本的甲基化IlluminaHumanMethylation450 BeadChip芯片数据进行分析DMDRMR启动子的甲基化水平。统计分析方法包括：T检验分析，受试者工作特征(ROC)曲线分析、Kaplan-Meier统计分析等。分析结果详见图1～5。其中，图1表示TCGA数据集的DMDRMR启动子在肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异甲基化图，图2表示TCGA数据集的DMDRMR启动子在肾透明细胞癌肿瘤不同临床性状的不同恶化分级中的差异甲基化图，图3表示TCGA数据集的DMDRMR启动子甲基化在肾透明细胞癌的ROC曲线图，图4表示TCGA数据集的DMDRMR启动子甲基化高、中、低三个程度对肾透明细胞癌患者的生存预后图；图5表示GEO数据集的DMDRMR启动子在肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异甲基化图。

采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒(购于Qiagen公司)从待测样本的肾透明细胞肿瘤组织中获得测试DNA样品，并采用焦磷酸测序法检测DMDRMR启动子位点的甲基化水平含量。其中，待测样本为肾透明细胞癌及癌旁样本。DMDRMR基因启动子的序列如SEQ ID No.5所示。DMDRMR基因的序列如SEQ ID No.6所示。焦磷酸测序法的具体实验过程如下：

1.焦磷酸测序

1)在PyroMark Q96软件中设计好需要运行的程序，并记录各种试剂需要的数量；

2)打开金属浴，设置为80℃，将Plate Holder(板架)放到上面预热；

3)在96孔反应板中预先加入40μL含有0.4μM测序引物的Annealing buffer(DNA退火缓冲液)，其中，测序引物的序列如SEQ ID No.11所示。具体地，如SEQ ID No.11所示的序列为：TGAATAGGAAAAGTTAATAGAATT。

4)在Vacuum prep workstation(真空制备工作台)中，五个槽位中依次加入110mL体积百分含量为70％的乙醇溶液、90mL Denaturation buffer(变性缓冲液)、110mL×Washbuffer(洗涤缓冲液)、110mL超纯水；

5)轻柔混匀Sepharose beads(琼脂糖珠)；

6)配置Sepharoe beads和Binding buffer(结合缓冲液)的Mix(混合液)，加入PCR产物中，体系配比如下：sepharoe beads 3μL；PCR product 10μL；binding buffer 40μL；water 27μL；total volume 80μL。

7)将PCR产物混合物在常温下水平振荡以1400rpm混匀10-15分钟，使得beads与生物素结合；

8)按照程序要求在试剂舱中加入相应的试剂，并将试剂舱放入PyroMark Q96中；

9)打开Vacuum prep workstation的泵，将Vacuum prep tool在高纯水中清洗3次，抽干180mL超纯水，抽干后都补满；

10)然后将Vacuum prep tool移到PCR板中，抓取Sepharose beads；

11)拿起PCR板，检查是否大部分beads都被吸附在了Vacuum prep tool上，如果发现Sepharose beads沉在PCR管底，未被Vacuum prep tool捕获，在相应的PCR孔中加入40uL的Binding buffer，重新悬浮Sepharose beads，再重复步骤7)；

12)将Vacuum prep tool放入体积百分含量为70％的乙醇溶液中，待液体顺畅的通过Vacuum prep tool开始计时，探针在体积百分含量为70％的乙醇溶液中抽取5s，取出Vacuum prep tool；

13)然后移到Denatureation buffer中，待液体顺畅的通过Vacuum prep tool开始计时，探针在Denatureation buffer中抽取5s，取出Vacuum prep tool；

14)再移到Wash buffer中清洗，待液体顺畅的通过Vacuum prep tool开始计时，探针在Wash buffer中抽取10s，取出Vacuum prep tool，竖直Vacuum prep tool超过90度，保持5s，请尽量沥干Washing buffer；

15)把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，悬停3秒钟；

16)将Vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放Sepharose beads；

17)将放有样品的PSQ 96板放在预热好的Plate Holder上，80℃加热2分钟，不把反应孔板从金属托盘上拿下来，而是继续保持反应孔板在金属托盘上的状态，放置在室温15-20min，使其缓慢退火到室温(15-25℃)，即可将样品放入PyroMark Q96中；

18)开始运行PyroMark程序；

19)将Vacuum prep tool在超纯水中震荡10s，移到下一个超纯水槽位，使用高纯水清洗Vacuum prep tool 3次，关闭Vacuum prep workstation；

20)运行结束，从软件上关闭仪器，再在仪器上关闭。

Sequenom MassArray系统甲基化检测

2.NaHSO₃处理待检测DNA样品

使用亚硫酸盐将样本DNA中没有甲基化的C全部转化为U(相当于DNA中的T)。

3.PCR扩增反应

1)将NaHSO₃处理且标化至10～20ng/μL的样本低速短暂离心备用；

2)将各PCR组份溶解后置于冰上备用；

3)PCR扩增反应组份如下：ddH₂O 4.9μL；10×PCR Buffer 1×0.8μL；dNTPs 200μM0.8μL；PCR Enzyme(5U/μL)0.4-0.6unit/reaction 0.1μL；Forward primer 200nM 0.2μL；Reverse primer 200nM 0.2μL；DNA templet(DNA模板)1μL；总体积为8μL。其中，Forwardprimer即为上游引物，其序列如SEQ ID No.9所示，如SEQ ID No.9所示的序列为5’-GAATTGGATTTAGTTTTTAGGTTGAATAG-3’。Reverse primer即为下游引物，其序列如SEQ IDNo.10所示，如SEQ ID No.10所示的序列为5’-AAACCAATACCACATTTATTTTTATTTTAC-3’。

4)将步骤3)述配好的试剂小心混匀后分在12孔的连排管中，每孔加入108μL混匀试剂；

5)用12道移液器吸取混合试剂9μL加入到384孔板中，其中H11、H12、P11、P12孔留作对照，其孔中不加入引物，只含其他组份；

6)每板按照标记好的样本板加入相应的模板，加入体积为1μL；

7)移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象；

8)使用ABI veriti-384PCR仪器进行PCR反应，循环步骤设置如下表1所示；

表1 PCR反应程序

Stage 1	94℃，4min	1个循环
			Stage 2	94℃，20sec；56℃，30sec；72℃，1min	45个循环
Stage 3	72℃，3min	1个循环
			Stage 4	4℃	∞

9)配置1.5％琼脂糖凝胶，每排留有25个孔，其中一个作为标记孔，其他加入PCR反应后的产物；

10)进行电泳，吸取3μL上样缓冲液，3μL PCR产物，电压110V，电流75mA，40分钟后观察结果，如结果良好可继续SAP反应。

4.SAP酶消化反应

1)按照385板配置SAP反应相关试剂配制组分如表2所示；

表2 SAP反应相关试剂的配比

2)将配置好的溶液均匀分配到96孔板中，每孔加入试剂量10μL/板；

3)使用机械臂加入试剂，从96孔板中移液2μL到384板的每个孔中；

4)移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象；

5)SAP反应程序：37℃，20min；85℃，5min；4℃，∞。

5.转录和酶切反应

1)按照385板配置T切反应/RNase A消化反应相关试剂配制组分如下表3；

表3 T切反应/RNase A消化反应相关试剂的配比

	单个反应最后的浓度	单个反应的体积
			RNase-free ddH<sub>2</sub>O	N/A	3.2μL
5×T7聚合酶缓冲液	N/A	0.89μL
			T Cleavage Mix(T分裂液)	N/A	0.22μL
DTT	3.14mM	0.22μL
			T7 RNA&DNA Polymerase	N/A	0.4μL
RNase A	0.09mg/mL	0.06μL
			总体积	N/A	5μL

3)使用机械臂加入试剂，从96孔板中移液2μL到新的384孔板的每个孔中；

4)使用机械臂，从T切产物板中吸取5μL产物加入到步骤3)中的384板的对应孔中；

5)移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象；

6)T切/RNase A消化反应程序：94℃30sec；94℃5sec；52℃5sec 40cycles；80℃5sec 5cycles；72℃3min；4℃∞。

7)完成去盐，导入Assay中，样本表格输入，建板，点样，Mass ARRAY分析，质量控制及输出报告等实验工作。

6.树脂脱盐反应

1)在384/6MG Dimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干；

2)使用Liquid Handler机器臂在384样本板的每个孔中加16ul水；

3)将384样本板轻轻翻转过来扣在Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中；

4)将384样本板放置离心机中室温旋转混匀60分钟。

7.产物芯片点样，结晶

1)离心：去盐后的产物4,000转/分离心4分钟，使树脂沉淀；

2)核查体积：

a)在主菜单中选择Transfer；

b)加载一个Method；

c)设定Dispense Speed参数；

d)选定Volume Check；

e)选Run并且观察体积；

f)依据体积调整Dispense Speed参数获得合适的体积。

3)在芯片上点样，方法同体积核查步骤；

4)在芯片上点Calibrant，注意在Method里选中Calibrant。

8.MALDT-TOF-MS检测

1)在RT计算机上打开RT程序；

2)按下COMPACT上的Probe Scout Plate Out按钮，然后把芯片放到Scout板上并放回COMPACT中，然后按Probe In按钮；

3)打开Chip Linker并连接CHIP和Plate。

a)双击Chip Linker；

b)找到在Plate Editor里建立的板；

c)选择iPLEX模式；

d)选择Genotype或者Genotype+Area模式；

e)选择Dispenser类型；

f)输入实验名称；

g)输入芯片条形码；

h)选择添加、创建；

4)把条形码名称输入Acquire中，点击Barcode Report，结果正确后AUTO RUNSETUP tab；

5)CHIP扫描。

9.质量控制

1)打开Typer4.0，点击Type Analyzer；

2)打开扫描结果；

3)检查质控点；

4)查看Assay的得率和分型图。

测试结果详见图6。图6表示的DMDRMR启动子上cg00440032位点在在48对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中的差异甲基化图。

从图1～6可以看出，DMDRMR启动子的甲基化水平在肾透明细胞癌的肿瘤样本中显著低于癌旁样本，且随着肾透明细胞癌的恶化程度的升高，甲基化水平逐渐降低；DMDRMR启动子的低甲基化水平具有较差的预后生存。

实施例2

检测DMDRMR基因的转录水平

采用TCGA数据库与GEO数据库对肾透明细胞癌与癌旁样本的转录组测序数据或转录芯片数据对INC00944基因的转录水平进行分析。统计分析方法包括：T检验分析、卡方检验分析、受试者工作特征(ROC)曲线分析、Kaplan-Meier统计分析等。分析结果详见图7～11。图7表示TCGA数据集的DMDRMR基因在肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异表达图；图8表示TCGA数据集的DMDRMR基因在肾透明细胞癌肿瘤不同临床性状的不同恶化分级中的差异表达图；图9表示TCGA数据集的DMDRMR基因表达在肾透明细胞癌肿瘤的ROC曲线图；图10表示TCGA数据集的DMDRMR基因高低表达对肾透明细胞癌患者的生存预后图；图11表示GEO数据集的DMDRMR基因在肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异表达图。

采用TAKARA RNAiso Plus试剂盒(购于TAKARA公司)从待测样本的肾透明细胞肿瘤组织中获得测试RNA样品，并采用荧光定量PCR检测DMDRMR基因的转录水平。其中，待测样本为肾透明细胞癌及癌旁组织样本。用于扩增DMDRMR基因的扩增引物对的序列如SEQ IDNo.1～SEQ ID No.2所示。荧光定量PCR的反应体系如下表4所示，表4中的PCR ForwardPrimer和PCR Reverse Primer构成的引物对即为第一扩增引物对，其序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示；荧光定量PCR的反应条件如表5所示。

表4荧光定量PCR的反应体系

表5荧光定量PCR的反应条件

测试结果详见图12～13。图12表示DMDRMR基因在15对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异表达图，图13表示DMDRMR基因在48对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异表达图。

采用Nucleic Acid Labeling KitDIG RNA LABELING KIT(SP6/T7)试剂盒(购于Roche公司)体外对DMDRMR基因的原位杂交探针进行体外反转录，探针序列如SEQ ID No.8所示。使用300nM制备好的探针对肾透明细胞癌的组织样本于37℃杂交24h。使用生理盐水枸橼酸钠缓冲液洗涤后，使用山羊血清(购于碧云天公司)进行封闭30min，使用anti-DIG-AP Fab fragments(Boster):上样血清体积比为1:400的于4℃杂交过夜。磷酸缓冲液洗涤后，使用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂(购于碧云天公司)进行显色反应，使用核固红(购于索莱宝公司)进行核复染，显微镜下判断染色强度。分析结果详见图14～15。图14表示DMDRMR基因在90对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁(左)及在高分期患者与低分期患者(右)的原位杂交差异分析图；图15表示DMDRMR基因原位杂交的高低染色强度对肾透明细胞癌患者的生存预后图。

从图7～15可以看出，DMDRMR基因表达水平在肾透明细胞癌的肿瘤样本中显著高于癌旁样本，且随着肾透明细胞癌的恶化程度的升高，表达水平逐渐升高；DMDRMR基因的高表达水平具有较差的预后生存。

实施例3

检测IGF2BP3基因的转录水平和蛋白质表达水平

(1)采用TCGA数据库对肾透明细胞癌与癌旁样本的转录组测序数据对IGF2BP3基因的转录水平进行分析。统计分析方法包括：T检验分析，受试者工作特征(ROC)曲线分析、Kaplan-Meier统计分析等。其中，IGF2BP3基因的序列如SEQ ID No.7所示。分析结果详见图16-18。其中，图16表示TCGA数据集的IGF2BP3基因在肾透明细胞癌肿瘤与癌旁中差异表达图；图17表示TCGA数据集的IGF2BP3基因高低表达对肾透明细胞癌患者的生存预后图；图18表示的TCGA数据集的IGF2BP3基因在肾透明细胞癌肿瘤不同临床性状的不同恶化分级中的差异表达图。

(2)采用免疫组织化学法检测IGF2BP3基因的蛋白质表达水平。其中，采用免疫组织化学法检测IGF2BP3基因的蛋白质表达水平的具体步骤如下：

1)石蜡切片，常规脱蜡至水。

2)体积百分含量为0.3％或3％H₂O₂的去离子水溶液孵育10-30分钟。

3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。

4)采用抗原修复：微波、高压、酶修复方法。自然冷却，此操作重复3次。

5)血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。

6)滴加适当比例稀释的一抗，4℃过夜。PBS冲洗，3分钟×5次。

7)滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育0.5h～1h。

8)PBS冲洗，3分钟×5次。

9)滴加SP(链霉亲和素-过氧化物酶)，室温或37℃孵育0.5h～1h。

10)PBS冲洗，3分钟×5次。

11)显色剂显色。

12)自来水充分冲洗。

13)可进行复染，脱水，透明。

测试结果详见图19-21。图19表示IGF2BP3蛋白质在90对肾透明细胞癌肿瘤与癌旁(左)及在高分期患者与低分期患者(右)的免疫组化差异分析图；图20表示IGF2BP3蛋白质免疫组化的高低染色强度对肾透明细胞癌患者的生存预后图；图21表示DMDRMR基因联合IGF2BP3蛋白质的高低染色强度对肾透明细胞癌患者的生存预后图；

从图16～图21可以看出，IGF2BP3的转录与蛋白质表达水平在肾透明细胞癌的肿瘤样本中显著高于癌旁样本，且随着肾透明细胞癌的恶化程度的升高，表达水平逐渐升高；IGF2BP3基因的高表达水平具有较差的预后生存。并且DMDRMR与IGF2BP3两个基因联合预后肾透明细胞癌与癌旁组织的样本的能力更强。

综上所述，DMDRMR基因的启动子的甲基化水平和DMDRMR基因的表达水平与肾透明细胞癌具有较高相关性，DMDRMR基因的启动子的甲基化水平和DMDRMR基因的表达水平均对诊断肾透明细胞癌具有高灵敏度和特异度，且预后能力较强，并且IGF2BP3基因的表达水平对诊断肾透明细胞癌具有高灵敏度和特异度，且预后能力较强，因此，DMDRMR基因和IGF2BP3基因能够作为生物标志物应用于制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或检测装置中，以能够用于肾透明细胞癌的早期诊断和预后，能够提高肾透明细胞癌诊断和判断预后的精确度，为今后透明细胞肾癌的分子靶向治疗提供理论基础。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

<120> 生物标志物的应用、检测肾透明细胞癌的试剂及其试剂盒

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgctggaag aacgagcctt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggccctggtc ctaggtcata 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgaggcgct ttcaggtaaa 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaactatcca gcacctccca c 21

<210> 5

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctccccagga gattagaatg gcaaagccac actctatggg atctcaagaa cccaagtgtg 60

agatttgctt tcagtattta gcagaattgg tgtttctggg gcggcaatct cctcctggag 120

atgtgttaat catttacaga atagcctgga ctagtgtatg ggccctgccc ttagagccaa 180

tgccacattt atttttattt tgcgagatct gcactgacat gaaaaccgaa aattctattg 240

acgtttcctg ttcaacctaa aagctaaatc cagttcatca ctgaaatccc acaatgccct 300

gagacaaata gtgctttaaa atatgtggtg atttttaggt caggtgcggt gtaatcccac 360

acctgtaatc ccagcacttt gggaggccga ggcgggtgga tcacgaggtc aggaggttga 420

gatcagcctg atcaatatgg tgaaacccca tctctactaa aaatacaaac attagccagc 480

gcctgtaatc ccagctactc aggaggctga ggcagaagaa tggcacgaac ccgggaggcg 540

gaggctgcaa tgagccaagg tcgcgccatt gcattccaac ctgggcaaca gaacgagact 600

ccgtctctaa gaaaaaaaaa aaaaaaaagt ggtgattttt ttaaaaagga gtggttcatt 660

cagttaaatg ggaagagttg taatgaggga ctaagtggct aagttggctg gacttcctgg 720

gtcaataggg acttccctaa ggggactttc ccctaagcca aaatgagtca tagctgaaag 780

ctaagggatg gaaacttcaa ccaatcaaag gggactttcc cctaagacaa actgactcat 840

agctgcaagc taagtggttg aaacttgaac cagtcatata gggagtttaa gctctagctt 900

cagcctgatg tttttaacca actaggcccg ccaacccaca agcagataga aaataagctg 960

attctatagg acagaaaaag gaagagggca ggggtcataa ggggatgtaa gcataagata 1020

cccaagccag aaacagcaac ccttccaggt ccccttcccc cacgtggaag ctttcctttc 1080

actttcgctt taataaatct tgccgcagca cactctctaa tcgagctgta acactcgcca 1140

ctgccgtcca cggcttcatt ccttgaagcc gtgagaccac gaacccttcg attgagaaga 1200

<210> 6

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggggatgtaa gcataagata cccaagccag aaacagcaac ccttccaggt ccccttcccc 60

cacgtggaag ctttcctttc actttcgctt taataaatct tgccgcagca cactctctaa 120

tcgagctgta acactcgcca ctgccgtcca cggcttcatt ccttgaagcc gtgagaccac 180

gaacccttcg attgagaaga accttcggtc ggaagaagac ttctcgtctc agtaacaata 240

acaagaaaaa cagcctagac tagacgcaca tcaggaagac agacagagag agagaatgat 300

agaaatgctg gaagaacgag ccttggggcg gtatcgccca gatctgaatc cacacagcag 360

ctgcttcggt ccctgtaact caaggcttcc tcttaatcct ctgtcctcca tcaacacctg 420

gctgagcagg aacaactatg acctaggacc agggccttca ggaatcttca cccctaactt 480

gaacttcata acactggaga gagagactgt ggaatggaat gactctccag agctgcagat 540

tgaaggcata ttttcatctg actttgatct caatggcggg aacaccttca tggccccttt 600

atagctggta tgttttcttc ttatggacaa tgagaaacat gtaataaact gtgtttcctt 660

ctcgctagg 669

<210> 7

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaacaaac tgtatatcgg aaacctcagc gagaacgccg ccccctcgga cctagaaagt 60

atcttcaagg acgccaagat cccggtgtcg ggacccttcc tggtgaagac tggctacgcg 120

ttcgtggact gcccggacga gagctgggcc ctcaaggcca tcgaggcgct ttcaggtaaa 180

atagaactgc acgggaaacc catagaagtt gagcactcgg tcccaaaaag gcaaaggatt 240

cggaaacttc agatacgaaa tatcccgcct catttacagt gggaggtgct ggatagttta 300

ctagtccagt atggagtggt ggagagctgt gagcaagtga acactgactc ggaaactgca 360

gttgtaaatg taacctattc cagtaaggac caagctagac aagcactaga caaactgaat 420

ggatttcagt tagagaattt caccttgaaa gtagcctata tccctgatga aatggccgcc 480

cagcaaaacc ccttgcagca gccccgaggt cgccgggggc ttgggcagag gggctcctca 540

aggcaggggt ctccaggatc cgtatccaag cagaaaccat gtgatttgcc tctgcgcctg 600

ctggttccca cccaatttgt tggagccatc ataggaaaag aaggtgccac cattcggaac 660

atcaccaaac agacccagtc taaaatcgat gtccaccgta aagaaaatgc gggggctgct 720

gagaagtcga ttactatcct ctctactcct gaaggcacct ctgcggcttg taagtctatt 780

ctggagatta tgcataagga agctcaagat ataaaattca cagaagagat ccccttgaag 840

attttagctc ataataactt tgttggacgt cttattggta aagaaggaag aaatcttaaa 900

aaaattgagc aagacacaga cactaaaatc acgatatctc cattgcagga attgacgctg 960

tataatccag aacgcactat tacagttaaa ggcaatgttg agacatgtgc caaagctgag 1020

gaggagatca tgaagaaaat cagggagtct tatgaaaatg atattgcttc tatgaatctt 1080

caagcacatt taattcctgg attaaatctg aacgccttgg gtctgttccc acccacttca 1140

gggatgccac ctcccacctc agggccccct tcagccatga ctcctcccta cccgcagttt 1200

gagcaatcag aaacggagac tgttcatctg tttatcccag ctctatcagt cggtgccatc 1260

atcggcaagc agggccagca catcaagcag ctttctcgct ttgctggagc ttcaattaag 1320

attgctccag cggaagcacc agatgctaaa gtgaggatgg tgattatcac tggaccacca 1380

gaggctcagt tcaaggctca gggaagaatt tatggaaaaa ttaaagaaga aaactttgtt 1440

agtcctaaag aagaggtgaa acttgaagct catatcagag tgccatcctt tgctgctggc 1500

agagttattg gaaaaggagg caaaacggtg aatgaacttc agaatttgtc aagtgcagaa 1560

gttgttgtcc ctcgtgacca gacacctgat gagaatgacc aagtggttgt caaaataact 1620

ggtcacttct atgcttgcca ggttgcccag agaaaaattc aggaaattct gactcaggta 1680

aagcagcacc aacaacagaa ggctctgcaa agtggaccac ctcagtcaag acggaagtaa 1740

<210> 8

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttgttattg ttactgagac gagaagtctt cttccgaccg aaggttcttc tcaatcgaag 60

ggttcgtggt ctcacggctt caaggaatga agccgtggac ggcagtggcg agtgttacag 120

ctcgattaga gagtgtgctg cggcaaga 148

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaattggatt tagtttttag gttgaatag 29

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaccaatac cacatttatt tttattttac 30

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgaataggaa aagttaatag aatt 24

Claims

1.一种生物标志物在制备检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒或装置中的应用，其特征在于，所述生物标志物为DMDRMR基因，所述DMDRMR基因的序列如SEQ ID No.6所示；

所述检测包括检测所述DMDRMR基因启动子的甲基化状态、甲基化程度或DMDRMR基因的表达水平；

所述DMDRMR基因启动子的序列如SEQ ID No.5所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物还包括IGF2BP3基因，所述检测包括检测所述IGF2BP3基因的表达水平。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，检测所述IGF2BP3基因的表达水平包括检测所述IGF2BP3基因的转录水平及检测所述IGF2BP3基因的蛋白质表达水平中的至少一种。

4.根据权利要求2~3任一项所述的应用，其特征在于，检测所述DMDRMR基因的表达水平包括检测所述DMDRMR基因的转录水平。

5.一种检测肾透明细胞癌的试剂，其特征在于，包括检测DMDRMR基因启动子的甲基化状态或甲基化程度的试剂，或检测DMDRMR基因的表达水平的试剂；

所述DMDRMR基因的序列如SEQ ID No.6所示；

所述DMDRMR基因启动子的序列如SEQ ID No.5所示。

6.根据权利要求5所述的检测肾透明细胞癌的试剂，其特征在于，所述检测DMDRMR基因的表达水平的试剂包括第一扩增引物对及第一原位杂交探针中的至少一种，所述第一扩增引物对用于扩增所述DMDRMR基因，所述第一原位杂交探针能够与所述DMDRMR基因杂交。

7.根据权利要求5~6任一项所述的检测肾透明细胞癌的试剂，其特征在于，还包括检测IGF2BP3基因的表达水平的试剂。

8.根据权利要求7所述的检测肾透明细胞癌的试剂，其特征在于，所述检测IGF2BP3基因的表达水平的试剂包括第二扩增引物对，所述第二扩增引物对用于扩增所述IGF2BP3基因。

9.根据权利要求8所述的检测肾透明细胞癌的试剂，其特征在于，所述第二扩增引物对的序列如SEQ ID No.3~SEQ ID No.4所示。

10.根据权利要求6所述的检测肾透明细胞癌的试剂，其特征在于，所述第一扩增引物对的序列如SEQ ID No.1~SEQ ID No.2所示；

及/或，所述第一原位杂交探针的序列如SEQ ID No.8所示。

11.一种检测肾透明细胞癌的试剂盒，其特征在于，包括检测DMDRMR基因和IGF2BP3的试剂；

所述DMDRMR基因的序列如SEQ ID No.6所示。