TW202405016A - 靶向epha2之抗體及其在癌症治療中的應用 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於抗-EphA2抗體及使用該抗-EphA2抗體之癌症偵測(或診斷)及治療。本發明創造抗-EphA2抗體，特別是單鏈抗體片段(scFv)及人類化抗體，其具有結合至抗-EphA2且抑制血管生成、遷移及癌細胞生長之能力。

Description

靶向EPHA2之抗體及其在癌症治療中的應用
本發明係關於癌症偵測(或診斷)及治療領域。特別地，本發明係關於靶向EphA2之抗體及其在癌症偵測(或診斷)及治療中的應用。
癌症係身體任何地方的異常細胞之不受控制的生長。該等異常細胞稱為癌細胞、惡性細胞或腫瘤細胞。產生紅血球生成素之肝細胞受體與艾普瑞林(ephrin) (Ephs/艾普瑞林)之間之相互作用控制寬廣範圍之亦已牽涉人類癌症之發病機理的生物功能。Eph A2型(EphA2) (酪胺酸激酶的一個成員)與艾普瑞林(例如：艾普瑞林-A1)相互作用以觸發細胞之間之雙向信號傳導。EphA2及艾普瑞林-A1之相互作用導致Ras-MAPK活性之抑制，導致抑制腫瘤生長。此外，研究亦已證實，EphA2過度表現可驅動配體獨立性信號傳導且誘導腫瘤發生。因此，咸信，EphA2可誘導對腫瘤生長之負面或正面效應。在腫瘤發生期間，EphA2與艾普瑞林-A1之間之定期相互作用受到干擾，導致EphA2過度表現且進展至癌症。EphA2之過度表現已識別為胰臟癌診斷及治療中之顯著腫瘤標靶。其較高基因表現亦與不良患者預後相關。近年來，已評估針對EphA2信號傳導之幾種酪胺酸激酶抑制劑(TKI)之抗腫瘤活性。然而，許多此等TKI具有多個標靶，使得其針對EphA2之特異性在臨床開發中造成缺陷。
因此，亦需要開發抗體對EphA2之特異性結合。
本發明提供一種分離的抗-EphA2抗體或其抗原結合部分，其包括以下之至少一者：包含SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO: 1之任何者具有至少80%一致性之胺基酸序列之變體之輕鏈CDR1 (L-CDR1)；包含SEQ ID NO: 2之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO: 2之任何者具有至少80%一致性之胺基酸序列之變體之輕鏈CDR2 (L-CDR2)；及包含胺基酸殘基SEQ ID NO: 3或具有與SEQ ID NO: 3之任何者具有至少80%一致性之胺基酸序列之變體之輕鏈CDR3 (L-CDR3)；及包括以下之至少一者：包含SEQ ID NO: 4之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO: 4之任何者具有至少80%一致性之胺基酸序列之變體之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)；包含SEQ ID NO: 5之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO: 5之任何者具有至少80%一致性之胺基酸序列之變體之重鏈CDR2 (H-CDR2)；及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO: 6之任何者具有至少80%一致性之胺基酸序列之變體之重鏈CDR3 (H-CDR3)；使得該分離的抗體或其抗原結合部分結合至EphA2。
在一些實施例中，本發明之抗體包括單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體。在一些實施例中，該分離的抗-EphA2抗體或其抗原結合部分為單鏈Fv ( scFv)、IgG、Fab、(Fab) 2或( scFv') 2。
在一些實施例中，該抗-EphA2抗體或其抗原結合部分包括包含含有SEQ ID NO: 7或8之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7或8具有至少80%一致性之變體之輕鏈、及包含含有SEQ ID NO: 9或10之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9或10具有至少80%一致性之變體之重鏈。在一些實施例中，該抗-EphA2抗體或其抗原結合部分含有包含SEQ ID NO: 7或8所示之胺基酸序列之輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或10之胺基酸序列之重鏈。
在一些實施例中，該抗-EphA2抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 11或12之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11或12具有至少80%一致性之變體。在一些實施例中，該抗-EphA2抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 11或12之胺基酸序列。
在其他實施例中，本發明提供一種分離的抗體(scFv SD5)，其包括具有包含SEQ ID NO: 7之序列所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7具有至少80%一致性之變體之輕鏈及具有包含SEQ ID NO: 9之序列所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有至少80%一致性之變體之重鏈。較佳地，如上提及的序列一致性為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
在另一個實施例中，本發明提供一種人類化抗體(人類化scFv hSD5)，其包含具有SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8具有至少80%一致性之變體之輕鏈及具有SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 10具有至少80%一致性之變體之重鏈。
在另一個實施例中，本發明提供一種分離的抗體(scFv SD5)，其包含SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有至少80%一致性之變體。在另一個實施例中，本發明包括人類化抗體，其包含SEQ ID NO: 12所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 12具有至少80%一致性之變體。
本發明亦提供一種抗體-藥物結合物(ADC)，其包含本發明之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分及包含經連接子連接至該抗體之抗腫瘤化合物之藥物-連接子結構。
在一些實施例中，該抗腫瘤化合物係選自奧瑞司他汀(auristatin) (諸如單甲基奧瑞司他汀E (MMAE)及單甲基奧瑞司他汀F (MMAF))、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、甲胺喋呤(methotrexate)、鉑基抗腫瘤劑(順鉑及其衍生物)、多柔比星(doxorubicin)、卡奇黴素(calicheamicin)、尾海兔素10 (dolastatin 10)、類美登素(maytansinoid)、吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)二聚物、喜樹鹼(camptothecin)衍生物、多卡米星(duocarmycin)、瓢菌素(amanitin)、道諾黴素(daunorubicin)、絲裂黴素C (mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、環胞苷(cyclocytidine)及紫杉醇(Taxol)及其衍生物。在一些實施例中，該抗腫瘤化合物為MMAE。
本發明提供一種包含本發明之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分或ADC及醫藥上可接受之載劑或賦形劑之醫藥組合物。
在一些實施例中，該醫藥組合物進一步包含一或多種另外抗癌劑或與其組合使用。
在一些實施例中，該一或多種另外抗癌劑為吉西他濱(Gemcitabine)。
本發明亦提供一種用於治療或預防個體中之EphA2相關癌症之方法，其包括對該個體投與本發明之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分或ADC。
本發明亦提供一種用於抑制個體中之EphA2相關癌細胞生長或癌症轉移之方法，其包括對該個體投與本發明之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分或ADC。
在一些實施例中，該EphA2相關癌症係選自膽管癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、胃癌(gastric cancer)、神經膠瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、胃癌(stomach cancer)、胸腺癌及外陰癌。在一些實施例中，該EphA2相關癌症係選自膀胱癌、腦癌、膽管癌、結腸癌、胃癌及胰臟癌。
在一些實施例中，上文識別的組合物及治療方法中之各者可另外包括另一抗腫瘤藥物及投與另外一或多種抗腫瘤藥物。
本發明進一步提供一種用於在個體中偵測或診斷EphA2相關癌症或癌症之未來發生之高風險，或預測個體中癌症之轉移或預後，或監測已經診斷為患有EphA2相關癌症的個體中癌症之進展之方法，其包括使來自個體之生物樣本與本發明之抗-EphA2抗體接觸，定量樣本中之EphA2抗原與抗體之結合，及將該結合與表示在來自未遭受癌症折磨的對照個體之樣本中測定的抗-EphA2抗體與EphA2抗原之間之結合之參考值進行比較。
本發明進一步提供一種用於在個體中偵測或診斷EphA2相關癌症或EphA2相關癌症之未來發生之高風險，或預測癌症之轉移或預後，或監測癌症進展之套組，其包括本發明之抗-EphA2抗體。
本文中的術語用於描述本發明之特定實施例，但除非如於申請範圍中所列出，否則其使用並不限制本發明。應理解，前述一般描述及隨後詳細描述均僅係實例及說明性的且不限制本申請案中所主張的標的。
術語諸如「一(a/an)」及「該」並非旨在僅指單數實體，而是包括其中一特定實例可用於說明之一般類別。
在本申請案中，除非另有說明，否則使用「或」意指「及/或」。此外，術語「包括(including)」以及其他術語(諸如「包括(includes)」及「包括(included)」的使用係非限制性的。
如本文所用，術語「腫瘤」、「癌症」及「癌」可互換使用且係指所有腫瘤細胞生長及增殖(無論為惡性或良性)、及所有癌前及癌症細胞及組織。
如本文所用，術語「生物樣本」係指自患者獲得的樣本。例如，生物樣本可自血液、組織(例如腫瘤)、血清、糞便、尿液、痰液、腦脊髓液、乳頭抽吸物(nipple aspirate)及來自細胞裂解物之上清液獲得。
如本文所用，術語「診斷」意指識別病理性病症之存在或性質且包括識別處於發展出癌症風險中的個體。診斷方法在其敏感性及特異性方面不同。診斷檢定之「敏感性」係測試陽性(「真陽性」之百分比)的患病個體之百分比。藉由檢定未偵測到的患病個體為「假陰性」。未患病且在檢定中測試陰性之個體稱為「真陰性」。診斷檢定之「特異性」係測定如此正確識別為陰性之比例(例如未患病且正確識別為不患有病症之個體之百分比)。
如本文所用，術語「偵測(detection)」、「偵測(detecting)」及類似者可用於偵測生物標記或偵測癌症(例如當獲得陽性檢定結果時)之情況下。在後一種情況下，「偵測」及「診斷」被認為是同義詞。
標記之「測試量」係指存在於所測試的樣本中之標記之量。
標記之「控制量」可為待與標記的測試量進行比較之任何量或量範圍。
術語「處於......風險中」旨在指與正常個體相比或與對照組相比處於增加之風險中。因此，「處於發展出癌症風險中」的個體與正常群體相比處於增加之風險中，及「處於癌症復發風險中」的個體可被認為與所有所治療癌症患者當中復發風險相比處於增加之具有復發之風險。
如本文所用，術語「增加之風險」或「提高之風險」意指例如體將發展出癌症或其復發之概率之任何統計學顯著增加。
如本文所用，術語「預後」係指癌症歸因性死亡或進展(包括腫瘤病(諸如卵巢癌)之復發、轉移性擴散及耐藥性)之可能性之預測。術語「不良預後」意指儘管採用用於治療癌症(例如前列腺癌)之照護保準，亦即手術、放射、化療，但疾病之存活期及恢復之前景不太可能。不良預後係其存活期小於中位數存活期之患者類別。
如本文所用，術語「轉移」定義為癌症自身體的一部分擴散至另一部分。由已擴散的細胞形成之腫瘤稱為「轉移性腫瘤」或「轉移」。
如本文所用，術語「轉移風險」係指特定患者(特別是人類患者)中之癌症將基於統計預測因子進展至轉移狀態之預後指示。不需要實際進展至轉移狀態，且預計會採用治療方式來嘗試延遲或防止實現此種風險。
如本文所用，表述「參考值」係指用作藉助於自個體獲得的樣本獲得之數值/數據之參考之實驗室值。
如本文所用，「測定……之水準(determination of a level)」、「測定……之水準(determining a level)」或「測量……之水準(measuring a level)」通常係指計算特定物質之量或濃度，或定量來自探針之表示特定物質之量或濃度之信號之強度。
如本文所用，術語「抗體」在最廣義而言上使用且具體涵蓋例如單一單株抗體(包括促效劑、拮抗劑及中和抗體)、具有多抗原決定基特異性之抗體組合物、多株抗體、單鏈抗-抗體、及抗體之片段(參見下文)，只要其特異性結合天然多肽及/或展現本發明之生物活性或免疫活性即可。根據一個實施例，該抗體結合至標靶蛋白質之寡聚形式，例如三聚體形式。抗體之片語「功能性片段或類似物」為與其所指的抗體具有相同定性生物活性之化合物。例如，本發明之抗體之功能性片段或類似物可為可特異性結合至EGFR者。在一個實施例中，該抗體可阻止或實質上降低EGFR誘導細胞增殖之能力。
如本文所用，術語「分離的抗體」為已經識別且自其天然環境之組分分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染物組分為將干擾抗體之診斷或治療用途之材料，且可包括酵素、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，該抗體將經純化(1)至大於95重量%抗體，藉由洛瑞法(Lowry method)測定，且最佳大於99重量%，(2)至足以藉由使用旋杯式定序儀(spinning cup sequenator)獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度，或(3)至同質性，藉由SDS-PAGE，在還原或非還原條件下，使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色。分離的抗體包括原位在重組細胞內的抗體，因為該抗體的天然環境之至少一種組分將不會存在。通常，然而，分離的抗體將藉由至少一個純化步驟來製備。
如本文所用，關於肽、多肽或抗體序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」及「同源性」係指在比對該等序列且必要時引入空位以達成最大序列一致性百分比之後，候選序列中與特定肽或多肽序列中之胺基酸殘基相同之胺基酸殘基之百分比，且不考慮任何保守性取代為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以在此項技術中的技藝範圍內的各種方式，例如，使用公開可得之電腦軟體(諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN (DNASTAR)軟體)來達成。熟習此項技術者可確定用於測定比對之適宜參數，包括此項技術中已知的達成所比較序列之全長上最大比對所需之任何演算法。
如本文所用，術語「Fab」指示Ig之抗原結合片段(無論如何製備)，包括可變域及第一恆定域。
如本文所用，術語「Fv」為含有完整抗原識別及結合位點之最小抗體片段。該片段由呈緊密、非共價締合之一個重鏈可變區域及一個輕鏈可變區域之二聚體組成。自此兩個域之折疊發出貢獻於用於抗原結合之胺基酸殘基且賦予抗體抗體結合特異性之六個超變環(3個環，各來自於H及L鏈)。然而，甚至單個可變域(或僅包含對抗原具有特異性之三個HVR之Fv的一半)具有識別且結合抗原之能力，儘管親和力低於整個結合位點。
如本文所用，術語「單鏈Fv」 (亦縮寫為「sFv」或「scFv」)為包含連接至單個多肽鏈中之VH及VL抗體域之抗體片段。較佳地，該sFv多肽進一步包含在VH域與VL域之間之多肽連接子，其使得該sFv能夠形成用於抗原結合之期望結構。關於sFv的評論，請參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag，New York，第 269至315 (1994)頁。
如本文所用，術語「互補決定區」 (CDR)係指在重鏈及輕鏈多肽之可變區內發現的非連續抗原組合位點。CDR已由Kabat等人，J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)；Kabat等人，U.S. Dept. of Health and Human Services，「Sequences of proteins of immunological interest」 (1991)；Chothia等人，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；及MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)描述，其中該等定義包括彼此比較時胺基酸殘基之重疊或子組。
如本文所用，術語「人類化抗體」係指其中將來自一個物種之抗體；例如，鼠類或雞抗體之CDR自該物種之抗體之重及輕可變鏈轉移至人類重及輕可變域(框架區)中之重組蛋白質。該抗體分子之恆定域衍生自人類抗體之彼等。在一些情況下，人類化抗體之框架區之特定殘基(特別是接觸或接近CDR序列之彼等)可經修飾，例如經來自於原始鼠類、嚙齒動物、次人類的靈長類動物或其他抗體之對應殘基置換。該人類化抗體可藉由各種方法來達成，包括(a)僅將非人類的CDR接枝至人類框架及恆定區上，保留或不保留關鍵框架殘基，或(b)移植該等整個非人類的可變域，但藉由置換表面殘基用人類樣部分「掩蔽」其。可用於實踐本發明之此類方法包括揭示於Padlan，Mol. Immunol.，31(3):169-217 (1994)中之方法。
如本文所用，術語「嵌合抗體」係指含有重及輕抗體鏈二者之可變域(包括衍生自一個物種之抗體(較佳嚙齒動物抗體或雞抗體，更佳鼠類抗體)之互補決定區(CDR))之重組蛋白質，而該抗體分子之該等恆定域係衍生自人類抗體之彼等。
如本文所用，術語疾病之「治療(treatment/treating)」為用於獲得有益或期望結果(包括臨床結果)之方法。出於本發明之目的，有益或期望臨床結果包括(但不限於)以下中之一或多者：緩解由於疾病所致之一或多種症狀、消除疾病之程度、穩定疾病(例如防止或延遲疾病之惡化)、防止或延遲疾病之擴散(例如轉移)、防止或延遲疾病之復發、延遲或減慢疾病之進展、改善疾病狀態、提供疾病之緩解(部分或完全)、減少為治療疾病所需的一或多種其他藥物之劑量、延遲疾病之進展、增加或改良生活品質、增加體重增加及/或延長存活期。「治療」亦涵蓋癌症之病理後果(諸如(例如)腫瘤體積)之減少。本文所提供的方法涵蓋治療之此等態樣中之任何一者或多者。
如本文所用，術語「投與(administer/administration)」係指在其存在於體外時注射或以其他方式物理遞送物質(例如本發明之調配物)至患者中之動作，諸如藉由本文所述或此項技術中已知之黏膜、皮內、靜脈內、肌肉內遞送及/或物理遞送之任何其他方法。當正在治療疾病或其症狀時，投與物質通常在疾病或其症狀發作之後進行。當正在預防疾病或其症狀時，投與物質通常在疾病或其症狀發作之前進行。
如本文中可互換使用，術語「個體(individual)」、「個體(subject)」、「宿主(host)」及「患者(patient)」係指哺乳動物，包括(但不限於)鼠類(大鼠、小鼠)、非人類的靈長類動物、人類、犬、貓、有蹄類動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。
如本文所用，術語「治療有效量」或「有效量」係指個體抗-EphA2抗體在投與至哺乳動物或其他個體以治療疾病時足以實現疾病之此種治療之量。
下一代抗體藥物之開發係目前癌症治療中引人注目的趨勢。本發明旨在開發抗-EphA2抗體及建構針對EphA2相關癌症；特別是胰臟癌之抗體-藥物結合物(ADC)。用抗體靶向腫瘤特異性抗原(EphA2)以抑制癌細胞生長且誘導細胞胞吞作用，該抗體結合抗腫瘤化合物(諸如小分子單甲基奧瑞司他汀E (MMAE))將導致更有效的腫瘤細胞毒性。
本發明建立抗-EphA2抗體，特定言之，單鏈抗體片段(scFv)及人類化抗體，其具有結合至EphA2且抑制血管生成及癌細胞生長的能力。
在另一個態樣中，本發明提供一種分離的抗-EphA2抗體或其抗原結合部分，其包括以下之至少一者：包含SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO: 1之任何者具有至少80%一致性之胺基酸序列之變體之輕鏈CDR1 (L-CDR1)；包含SEQ ID NO: 2之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO: 2之任何者具有至少80%一致性之胺基酸序列之變體之輕鏈CDR2 (L-CDR2)；及包含胺基酸殘基SEQ ID NO: 3或具有與SEQ ID NO: 3之任何者具有至少80%一致性之胺基酸序列之變體之輕鏈CDR3 (L-CDR3)；及 包括以下之至少一者：包含SEQ ID NO: 4之胺基酸殘基或與SEQ ID NO: 4之任何者具有至少80%一致性之胺基酸序列之變體之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)；包含SEQ ID NO: 5之胺基酸殘基或與SEQ ID NO: 5之任何者具有至少80%一致性之胺基酸序列之變體之重鏈CDR2 (H-CDR2)；及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸殘基或與SEQ ID NO: 6之任何者具有至少80%一致性之胺基酸序列之變體之重鏈CDR3 (H-CDR3)；使得該分離的抗體或其抗原結合部分結合至EphA2。較佳地，如上提及的序列一致性為至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
輕鏈及重鏈中之互補決定區之胺基酸序列列於下文。
輕鏈之CDR
L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
SGSYG (SEQ ID NO: 1) DND (SEQ ID NO: 2) GSADSSTYVGM (SEQ ID NO: 3)
重鏈之CDR
H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3
GFTFSDYG (SEQ ID NO: 4) ISAAGSFT (SEQ ID NO: 5) ARIPSGYRAGEIYT (SEQ ID NO: 6)
在一些實施例中，該分離的抗-EphA2抗體為單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一些實施例中，該分離的抗-EphA2抗體為單鏈抗體(諸如Fv ( scFv)、IgG、Fab、(Fab) 2或( scFv') 2)。
根據本發明，本發明之抗體之輕鏈及重鏈之胺基酸之實施例列於下文。
輕鏈之胺基酸序列之實施例
重鏈之胺基酸序列之實施例
在一些實施例中，本發明提供包括包含SEQ ID NO: 7或8之胺基酸序列之輕鏈。
在一些實施例中，本發明提供包括包含SEQ ID NO: 9或10之胺基酸序列之重鏈。
在其他實施例中，本發明提供一種分離的抗體(scFv SD5)，其包含具有包含SEQ ID NO: 7之序列所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7具有至少80%一致性之變體之輕鏈，及具有包含SEQ ID NO: 9之序列所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9具有至少80%一致性之變體之重鏈。較佳地，如上提及的序列一致性為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
在另一個實施例中，本發明提供一種人類化抗體(人類化scFv hSD5)，其包含具有SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8具有至少80%一致性之變體之輕鏈及具有SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 10具有至少80%一致性之變體之重鏈。
在另一個實施例中，本發明提供一種分離的抗體(scFv SD5)，其包含以下序列： 該scFv中之該連接子可為此項技術中已知的任何連接子。在一些實施例中，該連接子具有少於10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個胺基酸之序列。在一些實施例中，該連接子包含甘胺酸-絲胺酸(GS)連接子之胺基酸、RGRGRGRGRSRGGGS或GQSSRSS。
在另一個實施例中，本發明提供一種分離的抗體(scFv SD5)，其包含SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有至少80%一致性之變體。在另一個實施例中，本發明包括人類化抗體，其包含SEQ ID NO: 12所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 12具有至少80%一致性之變體。 scFv SD5 (SEQ ID NO: 11) ( GQSSRSS 為連接子序列) 人類化scFv hSD5 (SEQ ID NO: 12)
此項技術中熟知用於製備實質上對抗任何標靶抗原之單株抗體之技術。參見，例如，Kohler及Milstein，Nature 256: 495 (1975)，及Coligan等人(編)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第1卷，第2.5.1至2.6.7頁(John Wiley & Sons 1991)。簡言之，單株抗體可藉由對小鼠或雞注射包含抗原之組合物，移除脾臟以獲得B-淋巴細胞，將B-淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤，選殖該雜交瘤，選擇產生針對該抗原之抗體之陽性純系，培養產生針對該抗原之抗體之純系及自該等雜交瘤培養物分離抗體來獲得。
各種技術，諸如產生嵌合或人類化抗體，可涉及抗體選殖及建構之程序。受關注抗體之抗原結合可變輕鏈及可變重鏈序列可藉由各種分子選殖程序(諸如RT-PCR、5'-RACE及cDNA庫篩選)獲得。來自表現鼠類抗體之細胞之抗體之可變重鏈或輕鏈序列基因可藉由PCR擴增選殖及定序。為了確認其真實性(authenticity)，該等選殖的V L及V H基因可在細胞培養物中表現為嵌合抗體，如Orlandi等人(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA，86: 3833 (1989))所述。基於該可變重鏈或輕鏈基因序列，可設計及建構人類化抗體，如Leung等人(Mol. Immunol.，32: 1413 (1995))所述。
嵌合抗體為重組蛋白質，其中人類抗體之可變區域已由例如小鼠抗體之可變區(包括小鼠抗體之互補決定區(CDR))置換。嵌合抗體在投與個體時展現降低之免疫原性及增加之穩定性。用於建構嵌合抗體之方法係此項技術中熟知的(例如Leung等人，1994，Hybridoma 13:469)。
嵌合單株抗體可藉由雞CDR自雞免疫球蛋白之重及輕可變鏈轉移至人類抗體之對應可變域中人類化。該嵌合單株抗體中之雞框架區域(FR)亦經人類FR序列置換。為了保持人類化單株之穩定性及抗原特異性，一或多個人類FR殘基可經小鼠對應殘基置換。人類化單株抗體可用於個體之治療性治療。用於產生人類化單株抗體之技術係此項技術中熟知的(參見例如Jones等人，1986，Nature，321:522；Riechmann等人，Nature，1988，332:323；Verhoeyen等人，1988，Science，239:1534；Carter等人，1992，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA，89:4285；Sandhu，Crit. Rev. Biotech.，1992，12:437；Tempest等人，1991，Biotechnology 9:266；Singer等人，J. Immun.，1993，150: 2844)。
可使用噬菌體展示技術在活體外自未經免疫接種之供體之免疫球蛋白可變域(V)基因譜系產生該抗-EphA2抗體及抗體片段。根據此技術，將抗體V域基因以框內(in-frame)方式選殖至絲狀噬菌體(諸如M13或fd)之主要或次要外殼蛋白基因中，並以功能抗體片段展現在噬菌體顆粒表面上。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組之單股DNA複本，故基於抗體功能性質篩選亦可篩選編碼展現彼等性質之抗體之基因。因此，噬菌體模擬B細胞的部分性質。噬菌體展示可以多種形式進行，在例如，Johnson、Kevin S.及Chiswell，David J.，Curr. Opin Struct. Biol. 3: 564-571 (1993)中進行評論。數種來源的V-基因片段可用於噬菌體展示。Clackson等人，Nature 352: 624-628 (1991)自源自經免疫接種之小鼠之脾臟之V基因之小型隨機組合庫分離出各種抗-噁唑酮抗體。在其他實施例中，核糖體展示技術可用於產生抗-EphA2抗體及體外抗體片段。
已開發各種技術用於產生抗體片段。傳統上，經由完整抗體之蛋白水解消化衍生得此等片段。然而，此等片段現可藉由重組宿主細胞，例如，使用本發明之編碼抗-EphA2抗體之核酸直接產生。Fab、Fv及scFv抗體片段可在大腸杆菌中全部表現且自其分泌，因此允許直接產生大量此等片段。抗-EphA2抗體片段亦可自如上所討論的抗體噬菌體文庫分離。或者，Fab'-SH片段可直接自大腸桿菌( E. coli)回收且經化學偶聯以形成F(ab') 2片段。根據另一種方法，F(ab') 2片段可直接自重組宿主細胞培養物分離。具有增加之體內半衰期之Fab及F(ab') 2抗體片段之產生描述於US 5,869,046中。在其他實施例中，選擇的抗體為單鏈Fv片段(scFv)。
可對本文所述的編碼多肽之核酸進行修飾而不消除其生物活性。可進行一些修飾以促進將靶向分子選殖、表現或併入至融合蛋白中。此類修飾係熟習此項技術中熟知的且包括(例如)終止密碼子、在胺基末端添加以提供啟動之甲硫胺酸、位點、放置在任一末端以建立習知上定位的限制位點之另外胺基酸或有助於純化步驟之另外胺基酸(諸如poly His)。除了重組方法之外，本發明之抗體亦可使用此項技術中熟知的標準肽合成全部或部分建構。
作為對雙鏈抗體純化方案之修飾，將該等重鏈及輕鏈區域分開溶解且還原且然後在再折疊溶液中組合。在此兩種蛋白質以莫耳比混合使得不超過一種蛋白質相對另一種蛋白質之5倍莫耳過量時獲得示例性產率。在完成氧化還原重組(redox-shuffling)之後，可將過量氧化麩胱甘肽或其他氧化低分子量化合物添加至再折疊溶液。
除了重組方法之外，本文所揭示的抗體及其變體亦可使用標準肽合成全部或部分建構。多肽之固相合成可藉由將序列之C端胺基酸連接至不溶性支撐物接著依次在該序列中添加剩餘胺基酸來達成。用於固相合成之技術由Barany & Merrifield，The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. 第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis，部分A. 第3至284頁；Merrifield等人，J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156，1963，及Stewart等人，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chem. Co.，Rockford，Ill.，1984描述。更大長度之蛋白質可藉由較短片段之胺基端及羧基端之縮合來合成。
在初步資料中，本發明已藉由噬菌體顯示技術分離靶向EphA2之結構活性位點之特異性抗體SD5。結果已證實，該抗體SD5可顯著抑制癌細胞之生長及遷移，導致EphA2之分子降解且誘導靶向細胞之胞吞作用。因此，該抗體具有發展成ADC之潛力及價值。在初步實驗中，併入稱為hSD5-ADC的MMAE之人類化抗體在體外及體內顯示極佳腫瘤殺死效應，誘導癌細胞之凋亡。此等實驗結果顯示且支持繼續開發hSD5-ADC之價值。此外，本發明已透過完整細胞及動物實驗驗證ADC之治療效應。咸信，該ADC藥物可對EphA2相關癌症(特別是胰臟癌及甚至其他EphA2相關癌症)提供更有效且全面之治療效應。
本發明亦提供一種ADC，其包含本發明之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分及包含經連接子連接至抗體之抗腫瘤化合物之藥物-連接子結構。
本發明之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分可經由連接子結構部分結合至抗腫瘤化合物以製備抗-EphA2抗體-藥物結合物。該抗腫瘤化合物並無特定限制，只要其具有可連接至連接子結構之取代基或部分結構即可。
該抗腫瘤化合物之實例包括(但不限於)奧瑞司他汀(諸如單甲基奧瑞司他汀E (MMAE)及單甲基奧瑞司他汀F (MMAF))、長春新鹼、長春花鹼、甲胺喋呤、鉑基抗腫瘤劑(順鉑及其衍生物)、多柔比星、卡奇黴素、尾海兔素10、類美登素、吡咯并苯并二氮呯二聚物、喜樹鹼衍生物、多卡米星、瓢菌素、道諾黴素、絲裂黴素C、博來黴素、環胞苷及紫杉醇及其衍生物。
在本申請案之ADC中，將抗-EphA2抗體結合至藥物之連接子結構並無特定限制，只要ADC可使用即可。連接子結構可根據使用目的適當地選擇及使用。
亦提供包含本發明之抗-EphA2抗體或ADC之醫藥組合物。
某些實施例係關於包含本發明之抗-EphA2抗體或ADC及醫藥上可接受之載劑或賦形劑之醫藥組合物。術語「醫藥上可接受之載劑」旨在包括(但不限於)熟習此項技術者已知的任何類型之非毒性固體、半固體或液體填料、稀釋劑、封裝材料或調配助劑。稀釋劑諸如多元醇、聚乙二醇及聚葡萄糖可用於增加結合物之生物半衰期。
本發明之醫藥組合物可根據習知方法(例如Remington's Pharmaceutical Science，最新版，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A.)調配，且亦可含有醫藥上可接受之載劑及添加劑。實例包括(但不限於)表面活性劑、賦形劑、著色劑、矯味劑、防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸浮劑、等滲劑、黏結劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑及調味劑，且可適宜地使用其他常用載劑。載劑之特定實例包括輕質無水矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露糖、澱粉、交聯羧甲基纖維素鈣、交聯羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯基縮醛二乙基胺基乙酸酯、聚乙烯基吡咯啶酮、明膠、中鏈三酸甘油酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽等。
一個實施例係關於一種用於治療或預防個體中之EphA2相關癌症之方法，其包括對該個體投與本發明之抗-EphA2抗體或ADC。或者，一個實施例係關於一種本發明之抗-EphA2抗體或ADC於製造用於治療或預防個體中之血管生成病症之藥物之用途。
另一個實施例係關於一種用於抑制個體中之EphA2相關癌細胞生長或EphA2相關癌症轉移之方法，其包括對該個體投與本發明之抗-EphA2抗體或ADC。或者，另一個實施例係關於一種本發明之抗-EphA2抗體或ADC於製造用於抑制個體中之EphA2相關癌細胞生長或EphA2相關癌症轉移之藥物之用途。
在一些實施例中，該EphA2相關癌症係選自膽管癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、胃癌(gastric cancer)、神經膠瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、胃癌(stomach cancer)、胸腺癌及外陰癌。
本方法亦包括與其他標準療法同時或在其之後投與本發明之抗-EphA2抗體或ADC，其中該標準療法係選自由放射療法、手術及化學療法組成之群。
該抗-EphA2抗體、ADC或其醫藥組合物可經靜脈內、經腹膜內、經動脈內、經鞘內、經膀胱內或經瘤內投與。一般技術者應明瞭，可憑經驗確定抗-EphA2抗體之有效量。應理解，當投與至人類患者時，該抗-EphA2抗體或組合物之總每日用量將由主治醫師在合理醫學判斷範圍內決定。任何特定患者之特定治療有效量劑量將取決於各種因素：待達成的細胞反應之類型及程度；所採用的特定抗-EphA2抗體、ADC或組合物之活性；患者之年齡、體重、一般健康、性別及飲食；抗-EphA2抗體之投與時間、投與途徑及排泄率；治療之持續時間；與抗-EphA2抗體、ADC或組合物組合或合併使用之藥物；及醫學技術中熟知的類似因素。
上文識別的組合物及治療方法中之各者可另外包括另一抗腫瘤藥物及投與另外一或多種抗腫瘤藥物。適合與本發明一起使用之抗腫瘤藥物包括(但不限於)誘導凋亡之藥劑、抑制腺苷脫胺酶功能之藥劑、抑制嘧啶生物合成之藥劑、抑制嘌呤環生物合成之藥劑、抑制核苷酸互變之藥劑、抑制核糖核苷酸還原酶之藥劑、抑制胸苷單磷酸酶(TMP)合成之藥劑、抑制二氫葉酸還原之藥劑、抑制DNA合成之藥劑、與DNA形成加成物之藥劑、損壞DNA之藥劑、抑制DNA修復之藥劑、嵌入DNA之藥劑、使天冬醯胺酸脫胺化之藥劑、抑制RNA合成之藥劑、抑制蛋白質合成或穩定性之藥劑、抑制微管合成或功能之藥劑及類似者。另外抗腫瘤藥物之實例包括(但不限於) 1)生物鹼，包括微管抑制劑(例如長春新鹼、長春花鹼及長春地辛(vindesine)等)、微管穩定劑(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel) (TAXOL)及多烯紫杉醇等)、及染色質功能抑制劑，包括拓樸異構酶抑制劑，諸如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin) (例如依託泊苷(etoposide) (VP-16)及替尼泊苷(teniposide) (VM-26)等)、及靶向拓樸異構酶I (例如喜樹鹼及伊絲立替康(isirinotecan) (CPT-11)等)之藥劑；2)共價DNA-結合劑(烷基化劑)，包括氮芥(例如甲基二氯乙基胺(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、環磷醯胺、異環磷醯胺(ifosphamide)及白消安(busulfan) (MYLERAN)等)、亞硝基脲(例如卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)及司莫司汀(semustine)等)及其他烷基化劑(例如替莫唑胺(temozolomide)、達卡巴嗪(dacarbazine)、羥甲基三聚氰胺、噻替哌(thiotepa)及絲裂黴素等)；3)單價DNA-結合劑(抗腫瘤抗生素)，包括核酸抑制劑(例如放線菌素(放線菌素D)等)、蒽環黴素(anthracycline) (例如道諾黴素(道諾黴素(daunomycin)及柔紅黴素)、多柔比星(阿黴素)及伊達比星(idarubicin) (埃得黴素(idamycin))等)、蒽二酮(例如蒽環黴素類似物，諸如米托蒽醌(mitoxantrone)等)、博來黴素(BLENOXANE)等及普卡黴素(plicamycin) (米沙黴素(mithramycin))等；4)抗代謝物，包括抗葉酸劑(例如甲胺喋呤、FOLEX及MEXATE等)、嘌呤抗代謝物(例如6-巰基嘌呤(6-MP、PURINETHOL)、6-硫鳥嘌呤(6-TG)、硫唑嘌呤、阿昔洛韋(acyclovir)、更昔洛韋(ganciclovir)、氯脫氧腺苷(chlorodeoxyadenosine)、2-氯脫氧腺苷(CdA)及2'-去氧助间型黴素(deoxycoformycin) (噴托他丁(pentostatin))等)、嘧啶拮抗劑(例如氟嘧啶(例如5-氟尿嘧啶(ADRUCIL)、5-氟脫氧尿苷(FdUrd) (氟尿苷))等)、及胞嘧啶阿拉伯醣苷(arabinoside) (例如CYTOSAR (ara-C)及氟達拉濱(fludarabine)等)；5)酵素，包括L-天冬醯胺酸酶及羥基脲等；6)激素，包括糖皮質素、抗雌激素(例如他莫昔芬(tamoxifen)等)、非類固醇抗雄激素(例如氟他胺(flutamide)等)、及芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole) (ARIMIDEX)等)；7)鉑化合物(例如順鉑及卡鉑等)；8)與抗癌藥物、毒素及/或放射性核素等結合之單株抗體；9)生物反應改質劑(例如干擾素(例如IFN-α等)及介白素(例如IL-2等)等)；10)過繼性免疫療法；11)造血生長因子；12)誘導腫瘤細胞分化之藥劑(例如全反式視黃酸等)；13)基因療法技術；14)反義療法技術；15)腫瘤疫苗；16)針對於腫瘤轉移之療法(例如巴馬司他(batimastat)等)；17)血管生成抑制劑；18)蛋白酶體抑制劑(例如VELCADE)；19)乙醯化及/或甲基化之抑制劑(例如HDAC抑制劑)；20) NFκB之調節劑；21)細胞週期調節之抑制劑(例如CDK抑制劑)；及22) p53蛋白質功能之調節劑。
本發明亦顯示EphA2水準與癌症嚴重度之間存在關聯；因此，與對照樣本中EphA2或其片段之參考表現程度相比，生物樣本中EphA2或其片段以高程度表現指示預測轉移或不良預後。本發明意外地發現，本發明之抗-EphA2抗體可用作診斷或預測個體中之預後或轉移或未來癌症發生之風險升高之指標。因此，本發明提供一種用於偵測或診斷癌症或癌症之未來發生之高風險、或預測個體中癌症之轉移或預後之方法，其包括使來自個體之生物樣本與本發明之抗-EphA2抗體接觸，定量樣本中之EphA2抗原與抗體之結合，及將該結合與表示在來自未遭受癌症折磨的對照個體之樣本中測定的抗-EphA2抗體與EphA2抗原之間之結合之參考值進行比較。
在一個實施例中，該生物樣本可為細胞、組織、器官、器官樣本、組織活檢、血液、血漿、血清、腹水(ascetic fluid)、淋巴細胞、尿液、骨髓流體、淋巴液、唾液、淚液(lachrymal fluid)、黏膜流體、羊水或其組合。
適合結合至抗體及其他結合試劑之可偵測之標籤包括放射性同位素、螢光標籤、酵素-受質標籤、發色標籤、化學發光標籤及膠態金顆粒。
測量方法之實例包括(但不限於)螢光免疫檢定(FIA)法、酵素免疫檢定(EIA)法、放射免疫檢定(RIA)法、西方墨點(Western blotting)法、點狀墨點(dot blot)、免疫組織化學檢定、螢光活化細胞分選儀(FACS)、體內成像及放射成像檢定。
本發明進一步提供一種用於監測已經診斷為患有癌症的個體中之癌症之進展之方法。在一些實施例中，監測可用於評估特定治療是否成功。
在一些實施例中，監測癌症進展包括藉由本發明之抗-EphA2抗體確定自診斷為患有癌症的個體獲得的第一生物樣本中EphA2或其片段之第一水準；及在一段預定時間期之後藉由本發明之抗-EphA2抗體確定自該個體獲得的第二生物樣本中EphA2或其片段之第二水準；將EphA2或其片段之該第一及第二水準進行比較；其中與該第一樣本相比該第二樣本中EphA2或其片段之水準更高指示疾病進展及惡化。類似地，與該第一樣本相比，該第二樣本中EphA2或其片段之水準降低指示改良。
本發明之診斷方法可與用於診斷癌症之已知方法組合。
本發明之另一個態樣涵蓋一種用於在個體中偵測或診斷癌症或癌症之未來發生之高風險、或預測癌症之轉移或預後、或監測癌症進展之套組。其通常在含有所有所有要素(視情況包括使用說明)之包裝中。該包裝可經分割使得組分在需要之前不被混合。個別組分可單獨包裝於該套組內。該套組可含有偵測標記基因之表現程度所必需的試劑。套組為任何製品(例如包裝或容器)，其包含至少一種試劑，例如抗體試劑，該試劑用於特異性偵測及/或測量樣本中標記基因之表現程度。
本發明涵蓋具有不同組分之各種套組。一般而言，該套組將包括用於定量個體中之EphA2或更多生物標記之構件。在另一個實施例中，該套組將包括用於收集生物樣本之構件、用於定量生物樣本中之EphA2或更多生物標記之構件、及套組內容物之使用說明。在某些態樣中，該套組包括用於定量定量生物標記之量之構件。在其他態樣中，該用於定量生物標記之量之構件包括偵測生物標記之量所必需的試劑。
已描述本發明之許多實施例。然而，應理解，可在不脫離本發明之精神及範疇下做出各種修改。因此，以下實例旨在說明但不限制本發明之描述於申請專利範圍中之範疇。 實例
材料及方法
細胞培養及動物免疫接種
人類PAAD細胞系AsPc-1、BxPc-3、Panc-1及Mia PaCa-2購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC) (Manassas，VA，USA)。所有細胞系均根據ATCC標準方案培養且在37℃下在增濕之5% CO 2氣氛中培養。雌性白來亨雞(white leghorn) (烏骨雞(Gallus domesticus))及具有嚴重複合型免疫缺陷之非肥胖型糖尿病小鼠(NOD/SCID)購自國家實驗室動物中心(National Laboratory Animal Center，臺灣)，且飼養於臺北醫學大學動物設施(the animal facility of Taipei Medical University)中。
生物資訊分析
為了研究EphA2基因表現與PAAD發生之間的關聯，吾人使用基因表現譜互動分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis) (GEPIA；http://gepia.cancer-pku.cn)資料庫以分析臨床癌症樣本及正常樣本中之EphA2表現之差異且分析EphA2表現與PAAD存活率之間的相關性(Nucleic Acids，Res 45(W1): W98-W102 (2017))。
抗體文庫建構及生物淘選 (biopanning)
基於艾普瑞林A1–EphA2之複合蛋白質結構(蛋白質資料庫[PDB] ID：3CZU)之基礎，吾人設計EphA2標靶分子之肽免疫原；該肽免疫原(EphA2pep)含有抗原決定基1 GWDLMQNIMNDMPIYMYSV及抗原決定基2 VSSDFEARHV，其藉由使用連接子GGGGGGS連接在一起。EphA2pep含有六個連續重複序列。在基因合成(GENEWIZ)之後，其建構於pET21a載體(Novagen)上且轉化至大腸埃希氏菌( Escherichia coli) BL-21 (DE3)品系以表現其為重組蛋白質。在藉由使用Ni 2+-帶電瓊脂糖凝膠(GE Healthcare Life Sciences)純化之後，將該重組EphA2pep蛋白質用於動物免疫接種。雌性白來亨雞透過每次肌肉內注射50 μg與佐劑混合之重組EphA2pep蛋白質進行免疫接種。在免疫接種期間，吾人第一次使用弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant) (Sigma-Aldrich)及在其他所有時間使用弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant) (SigmaAldrich)。該免疫接種時間表包括以7天的時間間隔進行的四次免疫接種。在最終免疫接種後7天收穫雞之脾臟以建構scFv抗體文庫。該文庫係根據公開的方案建構，且輕微修改(J Immunol Methods.，242(1-2):159-181 (2000))。
對於淘選，在4℃下將該重組EphA2蛋白預塗覆至微量滴定板之孔上過夜。第二天，移除該EphA2蛋白，且在室溫下用3% BSA阻斷該等孔1小時。然後，將該重組文庫噬菌體溶液(10 11噬菌體顆粒)添加至該孔且在室溫下培養2小時。移除上清液中之未結合的噬菌體，且透過移液具有0.05%吐溫(Tween) 20 (PBST)之磷酸鹽緩沖鹽水來洗滌該孔10次。隨後，結合的噬菌體用0.1 M HCl–甘胺酸(pH 2.2)/0.1% BSA洗脫緩衝液洗脫且用2 M Tris鹼性緩衝液中和。將經洗脫之噬菌體立即用於感染大腸桿菌ER2738品系以進行重組噬菌體擴增。經擴增之噬菌體透過先前的方法(Proc Natl Acad Sci.，88(18):7978-7982 (1991))沉澱及回收且用於下一輪淘選中。重複該淘選程序四次以有效富含抗-EphA2結合噬菌體。在淘選之後，總文庫DNA經純化且轉形至大腸桿菌品系TOP 10F’ (Invitrogen，一種非抑制型品系)中以用於scFv表現。根據製造商說明書(GE Healthcare Life Science)用Ni 2+-帶電瓊脂糖凝膠進一步純化經表現之scFv。
序列分析
為了定序所關注的scFv純系，吾人使用與輕鏈可變區上游的外膜蛋白A (ompA)信號序列互補之ompseq引物(5’-AAGACAGCTATCGCGATTGCAGTG-3’)。接下來，使用網站International ImMunoGeneTics information system/V-QUEry and Standardization (http://imgt.org)以基於生殖系基因之基礎上編譯及分析序列數據。
酶聯免疫吸附 檢定
在4℃下將該重組EphA2蛋白(0.5 μg/孔)塗覆至微量滴定板之孔上過夜。用5%脫脂牛奶阻斷該等孔，且然後在室溫下將scFv或噬菌體添加至該等孔1小時。在用PBST洗滌該等孔之後，然後，使用辣根過氧化物酶(HRP)結合山羊抗-雞輕鏈抗體(Bethyl Laboratories)或HRP-結合抗-M13抗體(GE Healthcare Life Science)偵測及開發該結合的scFv或噬菌體。最後，添加受質3,5,5-四甲基聯苯胺二鹽酸鹽(TMB)用於信號顯現。藉由添加1 N HCl來停止反應，且藉由確定在450 nm處之光學密度(OD)來測定吸光度。
西方墨點及免疫沉澱 檢定
在使用十二烷基硫酸鈉–聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)或天然聚丙烯醯胺凝膠(天然-PAGE)進行電泳之後，將該重組EphA2蛋白轉移至硝化纖維素膜(GE Healthcare Life Sciences)，且使用經純化之scFv抗體培養該等膜以測定結合反應性。該等膜用5%脫脂牛奶阻斷且然後在室溫下用scFv培養1小時。在用PBST洗滌之後，使用HRP結合山羊抗-雞輕鏈抗體偵測及顯影該等膜。最後，添加3,3’-二胺基聯苯胺受質以進行顯色直至達到期望顏色強度。
對於免疫沉澱檢定，在4℃下將300 μg每種PAAD細胞溶解產物與50 μg抗-EphA2 scFv (scFv與His標籤融合)培養過夜。第二天，將30 μL Ni 2+-帶電瓊脂糖凝膠添加至該混合物且在4℃下培養1小時。在用NiNTA洗滌緩衝液(50 mM NaH 2PO 4、300 mM NaCl及10 mM咪唑，pH 8.0)洗滌三輪之後，將該等scFv結合的瓊脂糖凝膠珠粒再懸浮於50 μL PBS緩衝液中。隨後，在95℃下使該瓊脂糖凝膠溶液變性10分鐘且使用SDS-PAGE分析。在將該等蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯膜之後，在4℃下使用抗-EphA2抗體(R&D Systems)及抗-His (Proteintech Group)抗體偵測該膜過夜。第二天，在用PBST洗滌之後，將該膜與HRP結合二級抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories)培養。最後，添加化學發光受質用於魯米那(luminal)信號偵測。
流動式細胞測量術分析
透過流動式細胞測量術分析具有內源EphA2分子表現之四種PAAD細胞AsPc-1、BxPc-3、Panc-1及Mia PaCa-2以確定所示scFv之結合反應性。收穫新鮮製備的癌細胞且用PBS洗滌兩次。然後，添加個別scFv且在室溫下培養1小時。使用與異硫氰酸螢光素(FITC；Jackson ImmunoResearch Laboratories)結合之山羊抗-雞輕鏈抗體及驢抗-山羊抗體將結合的scFv可視化。在該分析中，使用不相干scFv作為陰性對照，及使用市售山羊抗-EphA2抗體作為陽性對照(R&D Systems)。結果使用FACS can流式細胞儀(BD Biosciences，Systems and Reagents)分析。
為偵測scFv之結合特異性，用EphA1-A8質體單獨轉形293T細胞以過度表現不同EphA分子。細胞系係新鮮製備且用FACS緩衝液(2% FBS含在PBS中)洗滌。將該等細胞以1 × 10 5個細胞/孔接種至96孔U型底板中且在4℃下與scFv培養1小時。在用FACS緩衝液洗滌該板之後，添加該抗-血球凝集素(HA)抗體用於scFv結合偵測(scFv與HA標籤融合)且於隨後使用FITC結合二級抗體顯影。最後，使用FACS can流式細胞儀分析細胞結合信號。
細胞增殖 檢定
使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓(MTS)細胞增殖檢定套組(Promega)測定PAAD細胞增殖。將該等細胞以5000個細胞/孔之密度接種於96孔培養板中用於附著。然後，將各種濃度之scFv添加至該細胞培養物且培養5天。最後，添加MTS及甲基硫酸吩嗪(phenazine methosulfate)溶液且培養90分鐘用於顯影。在添加該SDS試劑以停止反應之後，藉由測定在490 nm處之OD來測定每個孔之吸光度。
細胞遷移及刮擦傷口癒合 檢定
將PAAD細胞以5 × 10 4個細胞/孔接種於24孔Transwell細胞遷移板(Corning)中且與scFv培養2天。在該檢定中，添加重組艾普瑞林-A1 (Sino Biological)作為陽性對照。在scFv處理之後，該等細胞用冷凍100%甲醇固定10分鐘且在室溫下用0.01%結晶紫染色1小時。在用ddH 2O洗滌該板之後，使用棉花拭子(cotton swab)移除上層細胞。細胞染色使用顯微鏡成像且使用ImageJ分析。對於刮擦傷口癒合檢定，將PAAD細胞接種於6孔培養板中。用吸移管尖端刮擦該孔中之該等經接種之細胞以模擬傷口。在用scFv處理並培養36或72小時後，使用顯微鏡對細胞進行成像。使用ImageJ分析傷口區域。
對於刮擦傷口癒合檢定，將PAAD細胞接種於6孔培養板中。用吸移管尖端刮擦該孔中之該等經接種之細胞以模擬傷口。在用scFv處理並培養36或72小時後，使用顯微鏡對細胞進行成像。使用ImageJ分析傷口區域。
分子信號傳導
為測定BxPc-3及Mia PaCa-2細胞中之分子信號傳導，將該等細胞培養於6孔培養板中且用scFv抗體在指定濃度下處理24小時。收集該等細胞且使用溶解緩衝液[50 mM Tris–HCl (pH 7.5)、50 mM NaCl、5 mM乙二胺四乙酸及1% Triton X-100]溶解，然後添加蛋白酶抑制劑混合物(Roche Applied Science)。透過Coomassie Plus (Bradford)蛋白質檢定(Thermo Fisher Scientific)測定該細胞溶解產物之蛋白質濃度。在還原SDS-PAGE上運行樣本用於西方墨點分析且使用針對p-EphA2、EphA2、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK、p-FAK、FAK、pSTAT3、STAT3 (Cell Signaling Technology)及β-肌動蛋白(GeneTex)之抗體偵測。
抗體內化 檢定
將BxPc-3細胞接種於放置在6孔培養板之孔中之罩蓋玻璃上。在37℃或4℃下將該等BxPc-3接種載玻片與艾普瑞林A1-Fc (Sino Biological)或IgG hSD5培養1小時。在用PBS洗滌之後，將該等細胞用100%冰甲醇固定10分鐘。接下來，該等細胞用FITC結合抗人類Fc抗體染色且於隨後利用用於核反染色之包含4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚之ProLong Diamond Antifade Mountant (Invitrogen)固定。使用共焦顯微鏡(Leica Microsystems)使該等細胞成像。
腫瘤異種移植模型
在對數生長階段期間收穫新鮮製備的BxPc-3及Mia PaCa-2癌細胞且再懸浮液PBS中用於腫瘤植入。隨後對每隻NOD/SCID小鼠接種癌細胞(BxPc-3為5 × 10 6個及Mia PaCa-2為1 × 10 7個)用於腫瘤形成。每週兩次測量腫瘤大小，且體積計算如下：V = 0.5l w 2，其中l = 長度及 w= 寬度。當腫瘤大小為約100 mm 3時，將動物分成接受以下之組：(a)單獨媒劑，透過靜脈內注射(i.v.)，每週一次(qwk)；(b)對照人類IgG1，20 mg/kg，透過i.v. qwk；(c)及(d) hSD5 IgG1，2或20 mg/kg，透過i.v. qwk；(e)及(f)吉西他濱，20或100 mg/kg，透過i.v.，每週兩次(biw)；或(g) hSD5 IgG1，2 mg/kg，透過i.v. qwk與吉西他濱，20 mg/kg，透過i.v. Biw之組合。在實驗結束時，該等抗腫瘤效應藉由將治療組中之腫瘤體積除以對照組中之腫瘤體積且將其乘以100以表示腫瘤生長抑制(TGI；%)來定量。亦頻繁地對該小鼠檢查不良藥物相關副作用的明顯跡象。
免疫組織化學染色
使用胰臟組織微陣列載玻片(US Biomax，PA483e)以偵測及分析臨床樣本之EphA2表現。在異種移植動物模型中，將切除的BxPc-3及Mia PaCa-2腫瘤固定於福爾馬林中，包埋於石蠟中，且切片用於免疫組織化學染色(IHC)。商業抗體(Cell signaling，Dako；Agilent Technologies；及Abcam)用於染色EphA2分子、細胞增殖標記Ki-67及凋亡標記裂解凋亡蛋白酶3。使用Zeiss Axioskop-2顯微鏡(Carl Zeiss)觀察到染色之效應。
相互作用殘基定義
吾人使用肽酶聯免疫吸附檢定(ELISA)以識別EphA2上之經設計抗原決定基；該等BSA結合肽EphA2pep_P1 (BSA-CGGGWDLM QNIMNDMPIYMYSV)及EphA2pep_P2 (BSA-CGGGGGGSVSSDFEARHV)分別表示設計於EphA2上之線性抗原決定基之兩個片段。EphA2pep_P1P2 (BSA-CGGGWDLMQNIMNDMPIYMYSVGGGGGGSVSSDFEARHV)表示經連接子連接之兩個線性抗原決定基序列。合成此等肽且與BSA (Kelowna International Scientific)結合。在4℃下將該等BSA結合肽單獨塗覆於96孔微板上過夜。在用3% BSA阻斷該等孔之後，添加IgG hSD5且培養。接下來，使用HRP結合抗-HA標籤抗體(Cell Signaling Technology)以偵測結合的scFv。最後，添加TMB受質用於顯影，且藉由添加1 N HCl來停止反應。藉由測定在450 nm處之OD來測定吸光度。使用點狀墨點檢定以偵測IgG hSD5與合成的肽之結合；將1 mL個別肽(1 mg/mL；一式三份)滴落於該NC膜上且在RT下維持完全吸收。在RT下進行利用3% BSA之阻斷1小時。然後，添加IgG hSD5 (10 μg/mL)，且在RT下允許該反應繼續進行1小時。在洗滌該膜之後，添加該HRP結合抗-HA標籤抗體，且在RT下允許該反應繼續進行1小時。最後，使用DAB以引發著色反應。
統計分析
數據表示為平均值 ± 平均值標準誤差且使用GraphPad Prism (GraphPad Software)分析。使用單向方差分析進行組間的統計比較，此後進行事後塔基忠實顯著性差異檢驗(post hoc Tukey’s honest significant difference test)。低於0.05之P值被認為是顯著。
實例 1. 使用 GEPIA 資料庫來分析具有高 EphA2 基因表現之癌症類型。癌症樣本為紅點，及正常樣本為綠點
使用GEPIA資料庫分析具有EphA2基因之高表現之癌症類型，包括子宮頸鱗狀細胞癌、結腸腺癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢漿液性囊腺癌、直腸腺癌、胃腺癌及胸腺瘤。該等紅點代表癌症樣本，而該等綠點代表正常樣本。(圖1)
已發現，具有EpHA2基因之高表現之癌症類型為子宮頸鱗狀細胞癌、結腸腺癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢漿液性囊腺癌、直腸腺癌、胃腺癌及胸腺瘤。消化道涉及器官為胃、胰臟及結腸直腸，表明EphA2之表現與消化器官之間的相關性。
實例 2. EphA2 表現與胰臟癌 (PAAD) 之間的相關性之分析及評估
使用GEPIA資料庫分析胰臟癌樣本(紅條)及正常樣本(灰條)中EphA2基因表現之差異。(圖2A)。該紅條代表癌症樣本(n = 179)，及該灰條代表正常樣本(n = 171)。發現在PAAD樣本中EphA2之基因表現展現有意義的增加。
圖2B說明胰臟癌患者中EphA2基因表現與存活之間的相關性。透過存活相關性之分析，發現具有高EphA2基因表現(紅線)的患者具有比低EphA2基因表現(藍線)低之存活率。(圖2B)
為分析EphA2分子之表現，藉由西方墨點使用四種PAAD細胞系AsPc-1、BxPc-3、Panc-1及Mia PaCa-2及一種正常胰臟內皮細胞系hTERT-HPNE以比較癌細胞中EphA2之表現。(圖2C)所有四個PAAD細胞系均展現EphA2蛋白表現高於對照hTERT-HPNE細胞系之EphA2蛋白表現。
使用組織陣列的IHC染色以分析臨床胰臟癌組織及正常胰臟組織中之EphA2分子之表現。(圖2D)。發現，EphA2水準在臨床PAAD組織標本之細胞膜中比在正常胰臟組織中高。在圖2D染色之標本中，使用含有38例胰臟癌及8例正常胰臟組織之組織微陣列載玻片用於IHC分析。在38例中，37例為腺癌，在組織病理學方面具有高、中等及低水準之分化。僅一例被歸類為鱗狀細胞癌。由病理學家的仔細顯微鏡研究顯示，37例腺癌中的34例中之EphA2分子在擴散性細胞質染色模式中強烈染色，而鱗狀細胞癌為完全陰性；局部染色在腺泡(acinus)區域中觀察到，但在八例正常胰臟組織中的5例的導管區室未觀察到。在具有低水準分化之三種腺癌之二者中，觀察到擴散性、細胞質及局部且典型之膜染色模式，表明EphA2為膜生物標記，經常在具有極高組織病理學分級之癌細胞中識別到。
該等結果指示，該EphA2生物標記可為癌症特異性且可應用於IHC染色達成胰臟之腺癌之診斷及預後目的；其在大多數癌病例中呈現特徵性細胞質染色模式。對於胰臟之低分化腺癌，EphA2傾向於易位至高級癌細胞之細胞表面或細胞膜。
實例 3. 使用噬菌體顯示技術分離的抗 -EphA2 scFv 之表徵。
為使該等分離的抗體識別EphA2上之活化位點，基於經公開之EphA2複合結構之基礎上設計不連續片段作為免疫原。根據PDB id：3CZU之X射線晶體結構，進行EphA2之活性位點中之不連續抗原肽之設計。艾普瑞林-A1為灰色，EphA2為藍綠色，及該紅色部分為位於EphA2上之兩個抗原肽(抗原決定基1及抗原決定基2)。EphA2pep藉由將兩個抗原肽連接來設計。(圖3A)如圖3A中所顯示，分析藉由EphA2 (藍綠色)及艾普瑞林-A1 (灰色)形成之複合蛋白(PDB ID：3CZU)之結構。將艾普瑞林-A1之結合位點擴增至5Å之範圍且確定EphA2分子中之可導致相互作用之胺基酸。基於該資訊之基礎上，建立具有不連續片段之肽序列(紅色：抗原決定基1及抗原決定基2)，且使用連接子序列(GGGGGGS)以連接EphA2pep：GWDLMQNMNDMPIYMYSVGGGGGGSVSSDFEARHV。在表現6-重複肽序列作為重組蛋白質之後，雞接著進行免疫接種。隨後，藉由使用噬菌體顯示技術來構建scFv抗體及分離的特異性抗體之高度複合文庫。發現結合的噬菌體之數量在第一輪與最後一輪之間增加約60倍(資料未顯示)，指示特異性結合品系藉由淘選富集。
使用噬菌體ELISA以在每一輪淘選之後測試經擴增之噬菌體抗體文庫，其中「原始」表示原始抗體文庫，及「M13」表示野生型噬菌體。(圖3B)如圖3B中所顯示，在噬菌體ELISA中，在該第一輪淘選後獲得的擴增噬菌體庫已經含有富集的特異性品系，其展現與初始抗體庫(原始)及野生型M13噬菌體相比對EphA2之顯著結合反應。
連續稀釋四種代表性scFvs以測試結合至EphA2分子之百分比。(圖3C)在基因定序之後，吾人連續地稀釋四種分離的代表性scFv以測試與EphA2之結合反應。scFv SA1及SD5在1.7及1.8 nM處之EC50值相似且Page 5/25 scFv SG3及SH2之EC50值分別為33.6及94 nM；結合能力差異由於該EphA2分子上不同抗體之CDR序列之相互作用產生。
使用該scFv SA1及SD5以在還原(SDS-PAGE)及非還原(天然-PAGE)條件下識別EphA2。Ctrl係使用商業Ab進行偵測之結果。(圖3D) 選擇具有最佳EC50值之scFv SA1及SD5用於後續測試。藉由使用NativePAGE (紅色箭頭)，確定scFv SA1及SD5可識別呈天然形式但不是呈變性形式之EphA2，此指示藉由scFv識別之抗原決定基為構象抗原決定基。
使用該scFv SA1及SD5藉由流動式細胞測量術分析識別4種胰臟癌細胞系上之內源EphA2分子。PC使用商業抗-EphA2抗體，及NC為未添加抗體之對照組。(圖3E)該等結果指示該等scFv展現對癌細胞上的EphA2分子之顯著結合反應。
為進一步探索結合至內源EphA2分子之能力，使用該scFv SA1及SD5藉由免疫沉澱檢定拉低4種胰臟癌細胞系之裂解物中之天然EphA2分子；NC為不相干scFv，沒有反應。(圖3F)與對照組中之不相干scFv (並不結合至EphA2)相比，scFv SA1及SD5二者均捕獲來自PAAD細胞之四種品系之溶解產物的游離EphA2分子，及scFv SD5之結合效應優於SA1之結合效應。
實例 4. 分離的 scFv 於 PAAD 細胞之增殖及遷移之抑制效應。
如圖4A至圖4B中所顯示，進行細胞存活期分析檢定(MTS檢定)以藉由添加不同濃度之抗體至細胞培養物來觀察四種PAAD細胞系上scFv SA1及SD5之生長抑制效應。在指定濃度下，scFv SA1及SD5與癌細胞相互作用5天，且觀察到於癌細胞之生長上之效應。到抗體反應的第5天，發現scFv SA1展現於癌細胞系AsPc-1及BxPc-3上之約18%至24%的抑制效應。然而，在20 mM之濃度下，scFv SD5抑制三種細胞系AsPc-1、Panc-1及Mia PaCa-2之生長約80%。另外，其抑制細胞系BxPc-3之生長58.5%。在不同抗體濃度下觀察到劑量依賴性反應；該結果指示在PAAD細胞之表面上scFv SD5結合至EphA2可抑制癌細胞之生長。
由於已證實EphA2之分子調節促進癌細胞之遷移，因此使用transwell遷移檢定及傷口癒合檢定二者以確定scFv SA1及SD5是否抑制PAAD細胞之遷移。該transwell遷移分析之結果呈現於圖5A中。該等癌細胞BxPc-3及Mia PaCa-2之實驗反應顯示在用劑量為20 mM之scFv SA1及SD5處理2天後，遷移的癌細胞之數量有效地減少。給予艾普瑞林-A1處理之相同條件作為實驗中之對照組。(圖5A)
該定量百分比說明在transwell遷移分析中scFv於四種胰臟癌細胞之遷移抑制效應。scFv SD5之實驗結果比scFv SA1之彼等實驗結果更佳。該scFv SD5可分別抑制癌細胞系Panc-1及BxPc-3之遷移65%及91%。(圖5B)
傷口癒合檢定之結果呈現於圖5C中。基於癌細胞BxPc-3及Mia PaCa-2之實驗反應，scFv SA1及SD5之處理抑制在用scFv處理36及72小時後癌細胞之遷移。給予相同濃度的艾普瑞林-A1處理作為實驗中之對照組。(圖5C)
該定量百分比說明在傷口癒合檢定中scFv於四種胰臟癌細胞之遷移抑制效應。scFv SD5之實驗結果優於scFv SA1之彼等實驗結果；scFv SD5展現對癌細胞系Mia PaCa-2及BxPc-3之更高反應性，且抑制效應分別為65%及67%。因此，吾人選擇scFv SD5用於後續實驗。(圖5D)
實例 5. 人類化抗體 hSD5 與 EphA2 之結合特異性及誘導之腫瘤抑制信號傳導。
圖6A證實人類化scFv hSD5與不同經過度表現之Eph家族蛋白質(EphA1-A8)細胞之結合反應性。為改良抗體之臨床適用性，進行雞衍生之scFv SD5之人類化。由於該等Ephs家族分子(EphA1–A8)在人類細胞生理學方面具有多種作用，因此必須確定分離的抗體對EphA2分子之特異性。藉由使用具有EphA1–A8分子之過度表現之細胞，證實人類化scFv hSD5特異性結合至EphA2分子且並不展現對其他家族蛋白質之交叉結合反應。(圖6A)
圖6B證實在胰臟癌細胞BxPC3上處理之人類化IgG hSD5之胞吞作用。該完整IgG hSD5經表現以進行基於胞吞作用之實驗。在用IgG hSD5處理PAAD細胞BxPc-3之後，將其在4℃及37℃下培養1小時用於觀察。EphA2之配體艾普瑞林-A1用作陽性對照以供比較。對照Ab為可誘導胞吞作用之商業抗-EphA2 IgG抗體。該等紅色箭頭顯示艾普瑞林-A1及IgG hSD5在靶向EphA2分子之後自細胞膜內吞至細胞質中。
在4℃下培養該等細胞將導致該等細胞進入休息狀態(resting state)。不像在對照IgG組中，用於識別EphA2之抗體之反應在4℃及37℃下在細胞膜上進行。當該IgG抗體hSD5在37℃下投與時，該等抗體透過細胞膜進入至該等細胞中，透過胞吞作用進入至細胞質(由紅色箭頭指示)中。此等實驗結果類似於投與艾普瑞林A1 (EphA2配體)之實驗之結果。(圖6B) 使用生物層干涉分析，吾人分析靶向EphA2蛋白之IgG hSD5之kon及koff參數；IgG hSD5之計算得的親和力(KD)為2.06 nM。
如圖6C中所顯示，觀察到投與scFv hSD5後癌細胞中分子信號傳導之變化。該等癌細胞BxPc-3及Mia PaCa-2在投與scFv後6小時降解EphA2分子且展現劑量依賴性反應。該溶酶體相關蛋白質LAMP1及LAMP2亦在該兩種癌細胞系中展現上調水準，此意指scFv hSD5可在作用於EphA2之後透過胞吞作用進入細胞中及該溶酶體參與蛋白質之降解。(圖6C)
在用不同濃度之人類化scFv hSD5處理癌細胞BxPc-3及Mia PaCa-2 24小時之後，分析細胞的分子信號傳導。如圖6D中所顯示，EphA2幾乎完全降解，且pEphA2之量亦減少。關於信號pERK及pAKT，其與癌細胞增殖及轉移相關，亦展現相似的減少。觀察兩種癌細胞系中pSTAT3及pFAK之兩種信號(與癌細胞存活及黏著有關的信號)呈劑量依賴性減少。用scFv hSD5處理導致兩種癌細胞系之分子信號傳導之相似的變化。(圖6D)
上述實例顯示抗體hSD5與癌細胞表面上之EphA2分子之結合引起EphA2分子之降解且誘導該細胞之胞吞作用，此使得該抗體分子能夠進入至細胞質中(圖6D)；此類似於抗體在EphA2活性位點處結合且產生靶向艾普瑞林A1之類似反應之過程。該觀察結果指示hSD5可發展成抗體藥物結合物。在初步實驗中，發現用MMAE之小分子標記hSD5有效於誘導癌細胞中之凋亡。
實例 6. 人類化 IgG hSD5 於 BxPc-3 異種移植小鼠之體內腫瘤生長抑制效應。
使用IgG hSD5 (20 mg/kg，iv，qwk，指示為藍色填充倒三角形)及吉西他濱(100 mg/kg，iv，biw，指示為橙色填充正方形)之投與以測試於BxPc-3腫瘤生長之抑制效應，n=6，TGI表示腫瘤生長抑制。(圖7A)使用IgG hSD5 (2 mg/kg，iv，qwk，由實體黑色三角形指示)、吉西他濱(20 mg/kg，iv，biw，由黑色開放正方形指示)及同時組合IgG及吉西他濱處理之實驗組(由實體紅色菱形指示)之投與以測試BxPc-3於腫瘤之生長抑制效應。(圖7B)在處理期間，追蹤每個小鼠組之重量變化。(圖7C)藉由IHC染色分析切除腫瘤組中EphA2、細胞增殖標記Ki67及凋亡相關標記裂解凋亡蛋白酶3之表現程度。(圖7D)
使用異種移植小鼠以評估IgG hSD5在體內之生長抑制效應。在BxPc-3異種移植小鼠中，與對照IgG處理(其未展現抑制效應)相比，基於IgG hSD5之處理顯著抑制體內腫瘤生長。20 mg/kg，iv，qwk之IgG hSD5處理之TGI為53.1%，及100 mg/kg，iv，qwk之吉西他濱之處理為59.8% (圖7A)。在該相同實驗中，吉西他濱(20 mg/kg，iv，biw)之TGI為34.6%。然而，當將低劑量IgG hSD5及吉西他濱組合時，觀察到協同效應，其中TGI為57.4% (圖7B)，且未觀察到小鼠之體重之變化(圖7C)。此外，進行移除的腫瘤之組織切片上之IHC染色以觀察到BxPc-3腫瘤中之EphA2及組織中之細胞增殖標記Ki-67之表現程度。與對照IgG組之結果相比，該處理顯著減少腫瘤中EphA2及Ki-67之表現程度(圖7D)
實例 7. 人類化 IgG hSD5 於 Mia PaCa-2 異種移植小鼠之體內腫瘤生長抑制效應。
亦使用Mia PaCa-2異種移植小鼠以測定IgG hSD5於體內腫瘤生長之抑制效應。使用IgG hSD5 (20 mg/kg，iv，qwk，指示為藍色填充倒三角形)及吉西他濱(100 mg/kg，iv，biw，指示為橙色填充正方形)之投與以測試於BxPc-3腫瘤生長之抑制效應，n=6，TGI表示腫瘤生長抑制。(圖8A)使用IgG hSD5 (2 mg/kg，iv，qwk，由實體黑色三角形指示)、吉西他濱(20 mg/kg，iv，biw，由黑色開放正方形指示)及同時組合IgG及吉西他濱處理之實驗組(由實體紅色菱形指示)之投與以處理BxPc-3於腫瘤之生長抑制效應。(圖8B)在處理期間，追蹤每個小鼠組之重量變化。(圖8C)藉由IHC染色分析切除腫瘤組中EphA2、細胞增殖標記Ki67及凋亡相關標記裂解凋亡蛋白酶3之表現程度。(圖8D)
在投與20 mg/kg IgG hSD5後，該TGI為63.2%，而在投與100 mg/kg IgG吉西他濱後，該TGI為73.7% (圖8A)。當投與吉西他濱(20 mg/kg)後，該TGI為38.7% (圖8B)。然而，與在BxPc-3腫瘤移植小鼠中所觀察到的治療效應相似地，當投與由低劑量IgG hSD5及吉西他濱組成之組合療法時，觀察到顯著協同效應，且該TGI為76.8%。在小鼠中沒有觀察到體重之副作用或變化(圖8C)。Mia PaCa-2腫瘤組織切片之IHC染色之觀察結果顯示，該組織中EphA2及Ki-67之表現程度顯著降低。該等結果證實該IgG hSD5靶向EphA2有效地抑制體內腫瘤生長(圖8D)。
如自實例6及實例7可見，hSD5 (2 mg/kg，iv，qwk)與吉西他濱(20 mg/kg，iv，biw)之組合之投與對癌細胞BxPc-3及Mia PaCa-2產生強烈協同效應。此等結果指示，在組合療法中使用低劑量可導致腫瘤生長抑制，且其亦指示抗體hSD5用於治療應用之潛力。吉西他濱為針對胰腺癌之第一線治療藥物；其在進入細胞後可抑制DNA之合成，導致細胞毒性(J Clin Oncol.，15(6):2403-2413 (1997)；Mol Pharm.，10(2):430-444 (2013))。然而，當與由hSD5靶向癌細胞之表面上EphA2誘導之抑制效應組合時，可在PAAD中達成更全面之治療效應。
實例 8. IgG hSD5 之抗原決定基定義識別 EphA2 之活性位點。
為測定該抗體hSD5是否可同時識別兩個抗原片段，進行該兩個抗原片段之肽合成以測試抗體IgG hSD5之結合反應。使用ELISA以測試該抗體hSD5對合成肽之結合反應性。位於EphA2之設計活化位點上之兩個短肽分別為EphA2pep_P1及EphA2pep_P2。藉由連接該兩個短肽形成之長肽為EphA2pep_P1P2。NC1pep及NC2pep為作為陰性對照的兩種不相干肽。EphA2 ECD為重組EphA2胞外域蛋白質。
該IgG hSD5展現對長肽(EphA2pep_P1P2)連接該兩個抗原片段之結合反應，且IgG hSD5個別地識別該兩個合成短肽(EphA2pep_P1及EphA2pep_P2)。此外，IgG hSD5並未對該兩種不相干肽展現交叉結合反應。該等實驗結果指示該抗體hSD5結合至設計的抗原片段之位置，及該抗體hSD5與兩個抗原片段均相互作用；與EphA2pep_P1之相互作用強於與EphA2pep_P2之相互作用，指示該抗體結構上之構象抗原決定基可誘導免疫反應。(圖9A)
圖9B係點狀墨點檢定，其用於測試抗體hSD5與合成肽之結合之反應。藉由使用點狀墨點檢定，獲得類似於肽ELISA之實驗發現；IgG hSD5可識別抗原片段EphA2pep_P1及EphA2pep_P2，且其與肽EphA2pep_P1之結合反應強於與EphA2pep_P2之結合反應。(圖9B)
在靶向EphA2之治療策略中，使用可溶性艾普瑞林A1或將重組艾普瑞林A1融合至人類IgG Fc用於二聚合可有效地促進EphA2之磷酸化及降解且最終抑制腫瘤細胞之生長(Biochem Biophys Res Commun. 320(4):1096-1102 (2004))。然而，艾普瑞林A1與多個Eph家族分子相互作用，且此等因素可產生不良副作用，從而限制其功效。透過免疫原之結構設計，吾人製備靶向艾普瑞林A1在EphA2上的活化位點處之結合之特異性抗體；該等試驗結果指示該抗體可結合至由兩個不連續表面形成之構象抗原決定基(圖9A及圖9B)。因此，該抗體hSD5可誘導類似於靶向艾普瑞林A1之EphA2之正向腫瘤生長抑制效應。如前面在實例5之圖6A中所證實，該hSD5特異性結合至EphA2且不會交叉結合至其他Eph家族蛋白質。該結果反映抗體之優點：防止不良副作用且促進中和該EphA2分子之抑制反應。
實例 9. 用經連續稀釋之 MMAE 處理之不同胰臟癌細胞系之生長抑制反應。
如圖10中所顯示，該hTERT-HPNE為正常胰臟內皮细胞系。
單甲基奧瑞司他汀E或MMAE比多柔比星(阿黴素/Rubex)有效100至1000倍且本身不能用作藥物。然而，作為抗體-藥物結合物或ADC之一部分，將MMAE連接至識別癌細胞中之特異性標記表現且將MMAE導引至特異性靶向癌細胞之單株抗體(mAb)。(Int J Mol Sci. 21(9): 3286 (2020)) 在該實例中，MMAE於胰臟癌細胞系AsPc-1、BxPc-3、Mia PaCa-2之功效。相反地，其僅展現於正常胰臟細胞系hTERT HPNE之生長抑制之輕度效應。(圖10)
實例 10. 經連續稀釋之 hSD5-ADC 之投與 對 不同胰臟癌細胞系之生長抑制反應。
如自圖11A至圖11D可見，明顯地，投與單獨hSDS不對各種胰臟細胞系提供理想抑制效應。(hTERT HPNE、AsPC-1、BxPc-3及Mia PaCa-2)，而投與hSD5-ADC對彼等胰臟細胞系之生長抑制反應提供顯著效應。由於hSD5-ADC於正常胰臟細胞系具有有限效應，因此可得出結論，hSD5-ADC已展現針對胰臟癌細胞系(AsPC-1、BxPc-3及Mia PaCa-2)之高度選擇性。
實例 11. 胰臟癌細胞之細胞週期變化
圖12A至圖12B以堆疊長條圖說明細胞週期之不同階段中細胞群體之百分比。hSD5為作為比較組之不含MMAE之相同抗體。用不同劑量之hSD5-ADC處理後BxPc-3 (圖12A)及Mia PaCa-2 (圖12B)細胞系中之更大凋亡細胞群體(由Sub-G1條指示)表明hSD5-ADC有效於誘導癌細胞死亡。亦觀察到hSD5-ADC反應之劑量依賴性。
實例 12. 使用 BxPc-3 腫瘤移植小鼠模型以測試投與不同濃度之 hSD5-ADC 及對照組 IgG-ADC 後小鼠中於腫瘤生長之抑制效應。
在投與抗體療法期間測定腫瘤大小。抗體投與之條件為每週一次尾靜脈i.v.注射，n=5。%TGI為腫瘤生長抑制之百分比。(圖13A) 在抗體處理期間記錄各組中小鼠之體重變化。(圖13B)
如自圖13A可見，在投與IgG-ADC後於腫瘤生長之抑制效應受到限制，而在投與hSD5-ADC後於腫瘤生長之抑制效應更顯著。(1 mg/kg，iv，qwk之hSD5-ADC處理之TGI為56%)。亦觀察到劑量依賴性傾向。
如自圖13B可見，顯然地，在小鼠中沒有觀察到副作用或體重變化。
實例 13. hSD5-ADC 於 BxPc-3 異種移植小鼠之體內腫瘤生長抑制效應。
將該hSD5-ADC投與至該小鼠(2 mg/kg，iv，qwk)以測試腫瘤生長抑制效應。使用IgG-ADC作為實驗的對照組，在相同投與條件下，n=4。(圖14A)在處理期間，追蹤每個小鼠組之重量變化。(圖14B)在該實驗完成後，取出小鼠中之腫瘤進行記錄。(圖14C)
如自圖14A及圖14C可見，IgG-ADC投與於腫瘤生長僅有輕度抑制效應，而hSD5-ADC投與於腫瘤生長之抑制效應顯著。如自圖14B可見，顯然地，在小鼠中沒有觀察到副作用或體重變化。
實例 14. 抗 -EphA2 hSD5 可識別內源 EphA2 分子且抑制胃癌 上 之細胞生長。
使用流動式細胞測量術分析hSD5 IgG在識別胃癌細胞系之三個品系上之內源EphA2分子中之反應。PC表示使用商業Ab以測定癌細胞上EphA2之表現；NC表示不相干同型IgG1抗體之對照組。使用該hSD5藉由流動式細胞測量術分析識別胃癌細胞之三個品系上之內源EphA2分子。結果指示該hSD5展現對胃癌細胞上之EphA2分子之顯著結合反應。(圖15A)
在不同濃度下測試hSD5-ADC於胃癌細胞之三個品系之生長抑制效應。在指定濃度下與癌細胞相互作用3天，且藉由MTS檢定觀察到於癌細胞之生長之效應。如自圖15B可見，顯然地，投與單獨hSDS不能對三種不同胃癌細胞(SNU-16、N87及MKN-45)提供理想抑制效應，而投與hSD5-ADC對彼等胃癌細胞系之生長抑制反應提供顯著效應。結果顯示，hSD5-ADC已展現針對胃癌細胞細胞系之高度選擇性。此外，觀察到hSD5及hSD5 ADC之劑量依賴性抑制，且hSD5-ADC於胃癌細胞之三個品系之生長抑制效應比hSD5更顯著。(圖15B)
實例 15. EphA2 之表現及抗 -EphA2 hSD5 於 GBM 之結合能力
為分析EphA2分子之表現，使用四種腦腫瘤細胞系GBM8901、LN229、T98G及U87MG及一種正常細胞系SVGp12比較癌細胞中EphA2之表現。與正常SVGp12細胞系相比，所有四種腦腫瘤細胞系均展現中等或更高之EphA2蛋白(圖16A)
使用流動式細胞測量術分析hSD5 IgG在識別腦腫瘤細胞系之四個品系上之內源EphA2分子中之反應。PC表示使用商業Ab以測定癌細胞上EphA2之表現；NC表示不相干同型IgG1抗體之對照組。(圖16B)
使用該hSD5藉由流動式細胞測量術分析識別四種腦腫瘤細胞系上之內源EphA2分子。PC使用商業抗-EphA2抗體，且NC為不相干同型IgG1之對照組。結果指示該hSD5展現對腦癌細胞上之EphA2分子之顯著結合反應。
實例 16. 抗 -EphA2 hSD5 可識別內源 EphA2 分子且抑制基於膽管癌及膀胱癌之細胞生長。
使用西方墨點來分析EphA2分子在四種膽管癌細胞系HuCCT1、ssp-25、RBE、TFK及一種膀胱癌細胞PC-3中之表現。(圖17A) 與對照細胞系相比，四種膽管癌及一種膀胱癌細胞系展現EphA2蛋白之中等至高度表現。EphA2分子之表現之結果與對四種膽管癌細胞系中之EphA2分子之結合反應相關聯。
使用流動式細胞測量術分析hSD5 IgG在不同濃度下在識別膽管癌細胞系及膀胱癌細胞系之四個品系上之內源EphA2分子中之反應。PC表示使用商業Ab以測定癌細胞上EphA2之表現。(圖17B)結果指示該等hSD5展現對癌細胞上的EphA2分子之顯著結合反應。
在不同條件下測試hSD5 scFv於膽管癌細胞之四個品系之生長抑制效應。在指定濃度下，hSD5 scFv與癌細胞相互作用5天，且藉由MTS檢定觀察到於癌細胞之生長之效應。(圖17C)
到抗體反應的第5天，在20 mM之濃度下，hSD5 scFv分別對四種細胞系HuCCT1、ssp-25、RBE及TFK之生長抑制約40%至70%抑制效應，基於癌細胞系%。在不同抗體濃度下觀察到劑量依賴性反應；該結果指示hSD5 scFv與膽管癌細胞之表面上之EphA2之結合可抑制癌細胞之生長。
實例 17. 抗 -EphA2 hSD5 可識別內源 EphA2 分子且抑制結腸癌 上 之細胞生長。
使用西方墨點來分析三種結腸癌細胞HCT116、SW480及SW460及一種正常結腸內皮細胞FHC中EphA2分子之表現。(圖18A) 與對照細胞系相比，所有三種結腸癌細胞系均展現EphA2蛋白之更高表現。
使用流動式細胞測量術分析hSD5 IgG在識別胃癌細胞系之三個品系上之內源EphA2分子中之反應。PC表示使用商業Ab以測定癌細胞上EphA2之表現；NC表示不相干同型IgG1抗體之對照組。(圖18B) 結果指示該等hSD5展現對癌細胞上的EphA2分子之顯著結合反應。
在不同濃度下測試hSD5-ADC於結腸癌細胞之三個品系之生長抑制效應。在指定濃度下與癌細胞相互作用3天，且藉由MTS分析觀察到於癌細胞之生長之效應。(圖18C)
如自圖18C可見，顯然地，投與單獨hSDS不能對三種不同結腸癌細胞(HCT116、SW480及SW460)提供理想抑制效應，而投與hSD5-ADC對彼等結腸癌細胞系之生長抑制反應提供顯著效應。該結果表明， hSD5-ADC已展現針對結腸癌細胞細胞系之高度選擇性。此外，觀察到hSD5及hSD5 ADC之劑量依賴性抑制，且hSD5-ADC於結腸癌細胞之三個品系之生長抑制效應比hSD5更顯著。
實例 18. hSD5-ADC 可抑制 HCT116 異種移植小鼠模型上之腫瘤生長。
觀察到hSD5-ADC (2 mg/kg，iv，qwk，實體紅色正方形標記)、對照IgG-ADC (2 mg/kg，iv，qwk，實體藍色三角形標記)及PBS組(實體黑色圓形標記)於HCT116腫瘤體積之生長抑制效應。(圖19A) hSD5-ADC及對照IgG-ADC處理後HCT116異種移植腫瘤之腫瘤重量(* p＜0.05。)(圖19B) 在投與抗體後，記錄HCT116異種移植小鼠之重量變化。(圖19C)。如自圖19A至圖19B可見，在投與IgG-ADC後於腫瘤生長之抑制效應受到限制，而在投與hSD5-ADC後於腫瘤生長之抑制效應更顯著。(2 mg/kg，iv，qwk之hSD5-ADC處理之TGI為60.7%)。如自圖19C可見，顯然地，在小鼠中沒有觀察到副作用或體重變化。
示例性實施例在參考的圖式中進行說明。希望本文所揭示的實施例及圖式應被視為說明性而非限制性。
圖1顯示使用GEPIA資料庫分析具有高EphA2基因表現之癌症類型。
圖2A至圖2D顯示EphA2表現與胰臟癌之間的相關性之分析及評估。
圖3A至圖3F顯示使用噬菌體顯示技術分離的抗-EphA2 scFv之表徵。
圖4A至圖4B顯示使用該等scFv測試在四種濃度下於胰臟癌細胞之四種品系之細胞生長抑制效應。
圖5A至圖5D顯示分離的scFv於PAAD細胞之增殖及遷移之抑制效應。
圖6A至圖6D顯示人類化抗體hSD5與EphA2之結合特異性及誘導之腫瘤抑制信號傳導。
圖7A至圖7D顯示人類化IgG hSD5於BxPc-3異種移植小鼠之體內腫瘤生長抑制效應。
圖8A至圖8D顯示人類化IgG hSD5於Mia PaCa-2異種移植小鼠之體內腫瘤生長抑制效應。
圖9A至圖9B顯示IgG hSD5之抗原決定基定義識別EphA2之活性位點。
圖10顯示用經連續稀釋之MMAE處理的不同胰臟癌細胞系之生長抑制反應。
圖11A至圖11D顯示不同胰臟癌細胞系之藉由投與經連續稀釋之hSD5-ADC之生長抑制反應。
圖12A至圖12B顯示胰臟癌細胞之細胞週期變化。
圖13A至圖13B顯示使用BxPc-3異種移植小鼠模型測試於投與不同濃度之hSD5-ADC及對照組IgG-ADC後小鼠中腫瘤生長之抑制效應。
圖14A至圖14C顯示hSD5-ADC於BxPc-3異種移植小鼠之體內腫瘤生長抑制效應。
圖15A至圖15B顯示抗-EphA2 hSD5可識別內源EphA2分子且抑制胃癌上之細胞生長。
圖16A至圖16B顯示EphA2之表現及抗-EphA2 hSD5於GBM之結合能力。
圖17A至圖17C顯示抗-EphA2 hSD5可識別內源EphA2分子且抑制膽管癌(cholagiocarcinoma)及膀胱癌上之細胞生長。
圖18A至圖18C顯示抗-EphA2 hSD5可識別內源EphA2分子且抑制結腸癌上之細胞生長。
圖19A至圖19C顯示hSD5-ADC可抑制HCT116異種移植小鼠模型上之腫瘤生長。
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Claims (21)

  1. 一種分離的抗-EphA2抗體或其抗原結合部分，其包括包含SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO: 1之任何者具有至少95%一致性之胺基酸序列之變體之輕鏈CDR1 (L-CDR1)；包含SEQ ID NO: 2之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO: 2之任何者具有至少95%一致性之胺基酸序列之變體之輕鏈CDR2 (L-CDR2)；及包含SEQ ID NO: 3之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO: 3之任何者具有至少95%一致性之胺基酸序列之變體之輕鏈CDR3 (L-CDR3)；及 包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 4之任何者具有至少95%一致性之胺基酸序列之變體之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)；包含SEQ ID NO: 5之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO: 5之任何者具有至少95%一致性之胺基酸序列之變體之重鏈CDR2 (H-CDR2)；及包含SEQ ID NO: 6之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO: 6中之任何者具有至少95%一致性之胺基酸序列之變體之重鏈CDR3 (H-CDR3)；使得該分離的抗體或其抗原結合部分結合至EphA2。
  2. 如請求項1之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分，其為單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
  3. 如請求項1之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分，其為單鏈Fv ( scFv)、IgG、Fab、(Fab) 2或( scFv') 2。
  4. 如請求項1之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分，其包括 包含含有SEQ ID NO: 7或8之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7或8具有至少95%一致性之變體之輕鏈；及 包含含有SEQ ID NO: 9或10之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9或10具有至少95%一致性之變體之重鏈。
  5. 如請求項4之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分，其包括 包含SEQ ID NO: 7或8之胺基酸序列之輕鏈；及 包含SEQ ID NO: 9或10之胺基酸序列之重鏈。
  6. 如請求項1之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 11或12之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11或12具有至少95%一致性之變體。
  7. 如請求項6之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 11或12之胺基酸序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分，其中該抗體為人類化抗體。
  9. 一種抗體-藥物結合物(ADC)，其包含如請求項1至8中任一項之抗-EphA2抗體或其抗原結合部分及包含抗腫瘤化合物經連接子連接至該抗體之藥物-連接子結構。
  10. 如請求項9之抗體-藥物結合物，其中該抗腫瘤化合物係選自奧瑞司他汀(auristatin)(諸如單甲基奧瑞司他汀E (MMAE)及單甲基奧瑞司他汀F (MMAF))、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、甲胺喋呤(methotrexate)、鉑基抗腫瘤劑(順鉑及其衍生物)、多柔比星(doxorubicin)、卡奇黴素(calicheamicin)、尾海兔素10 (dolastatin 10)、類美登素(maytansinoids)、吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)二聚物、喜樹鹼(camptothecin)衍生物、多卡米星(duocarmycins)、瓢菌素(amanitin)、道諾黴素(daunorubicin)、絲裂黴素C (mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、環胞苷(cyclocytidine)，及紫杉醇(Taxol)，及其衍生物。
  11. 如請求項9之抗體-藥物結合物，其中該抗腫瘤化合物為MMAE。
  12. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項之抗-EphA2抗體或如請求項9或10之ADC及醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
  13. 如請求項12之醫藥組合物，其進一步包含一或多種另外抗癌劑或與其組合使用。
  14. 如請求項13之醫藥組合物，其中該一或多種另外抗癌劑為吉西他濱(Gemcitabine)。
  15. 一種用於治療或預防個體之EphA2相關癌症之方法，其包括對該個體投與治療有效量之如請求項1至8中任一項之抗-EphA2抗體或如請求項9或10之ADC。
  16. 一種用於抑制個體中之EphA2相關癌細胞生長或癌轉移之方法，其包括對該個體投與治療有效量之如請求項1至8中任一項之抗-EphA2抗體或如請求項9或10之ADC。
  17. 如請求項15或16之方法，其中該EphA2相關癌症係選自膽管癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、胃癌(gastric cancer)、神經膠瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、胃癌(stomach cancer)、胸腺癌及外陰癌。
  18. 如請求項15或16之方法，其中該EphA2相關癌症係選自膀胱癌、腦癌、膽管癌、結腸癌、胃癌及胰臟癌。
  19. 如請求項15或16之方法，其進一步包含另外抗癌劑。
  20. 如請求項19之方法，其中該另外抗癌劑為吉西他濱。
  21. 一種套組，其用於在個體中偵測或診斷EphA2相關癌症或EphA2相關癌症之未來發生之高風險，或預測癌症之轉移或預後，或監測癌症進展，其包含如請求項1至8中任一項之-EphA2抗體或其抗原結合部分。
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