BRPI0906903B1 - anticorpo monoclonal e método de detecção da expressão de cd70 - Google Patents

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL E MÉTODO DE DETECÇÃO DA EXPRESSÃO DE CD70 A presente invenção fornece métodos diagnósticos, prognósticos, profiláticos e de tratamento para cânceres de ovário, pancreáticos e outros cânceres usando anticorpos que se ligam especificamente ao CD70 desnaturado.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente US 61/044.457, depositado em 11 de abril de 2008, cuja divulgação é incorporada ao presente como referência, em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a métodos diagnósticos, prognósticos, profiláticos e de tratamento para cânceres de ovário, pancreáticos e outros cânceres usando anticorpos específicos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A CD70 é membro da família do fator de necrose tumoral (TNF) de moléculas secretadas e ligadas à membrana celular que são expressas por uma variedade de tipos celulares normais e malignos. A CD70 é uma proteína transmembrana tipo II, com sua extremidade carboxi-terminal exposta para fora das células e sua extremidade amino-terminal encontrada no lado citosólico da membrana plasmática (Bowman etal., 1994, J. Immunol 152:1756- 61; Goodwin et al. 1993, Cell 73:447-56).A CD70 humana contém um domínio citoplasmático de 20 aminoácidos, um domínio transmembrana de 18 AA, e um domínio extracelular de 155 AA, com dois sítios potenciais de glicosilação N- ligados (Bowman et al., supra', Goodwin et al., supra).A imunoprecipitação específica de células expressando CD70 radiomarcadas com radioisótopo por anticorpos anti-CD70 formam polipeptídeos de 29 e 50 kDa (Goodwin et al., supra', Hintzen et al., 1994, J. Immunol 152:1762-73.). Com base na sua homologia com o TNF-alfa e TNF-beta, uma estrutura trimérica é prevista para o CD70 (Petsch et al. 1995, Mol. Immunol. 32:761-72).

[004] A CD70 tem uma expressão limitada nos tecidos normais em humanos.Isso toma a CD70 um alvo atraente para terapias contra o câncer. A expressão de CD70 foi identificada, entretanto, apenas em um pequeno número de cânceres, como o carcinoma de células renais, câncer de on, e alguns tipos de linfoma não-Hodgkin e mieloma múltiplo. A expressão de CD70 em células cancerosas é geralmente detectada através de anticorpos que se ligam a CD70 nativas, tal como por imuno-histoquímica. A detecção da expressão da CD70 em amostras fixadas de pacientes revelou-se problemática, devido à presença de anticorpos de baixa qualidade que carecem de especificidade suficiente para a CD70. Especificamente, a reatividade cruzada e a coloração de fundo interferem com a detecção do CD70 em amostras fixadas. A presente invenção resolve esta e outras necessidades.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção fornece métodos diagnósticos, prognósticos, profiláticos e de tratamento e monitoramento do tratamento de cânceres de ovário, pâncreas e outros, usando os anticorpos para CD70. A presente invenção fornece ainda métodos diagnósticos, prognósticos, profiláticos e de tratamento e monitoramento de tratamento de cânceres de pulmão, cabeça e pescoço (laringe ou faringe), melanoma, glioblastoma, mieloma múltiplo, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, tal como linfoma folicular, carcinoma de células renais, incluindo de células claras e papilares, carcinoma colorretal e de bexiga.

[006] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente ao CD70 desnaturado em relação à ligação com o CD70 nativo.Em alguns exemplos de realização, o anticorpo se liga especificamente ao CD70 desnaturado em linhagens celulares fixadas de câncer de ovário SK-OV-3 ou pancreática PANC-1, em comparação com ligação ao CD70 nativo. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, tal como um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Preferencialmente, o anticorpo se liga ao CD70 desnaturado em células ou tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina com uma especificidade de ligação que é a mesma ou melhor do que a do anticorpo SG-21.101, produzida pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-8733 ou anticorpo SG-21.5D12, produzido pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA- 8734. Em particular, a reatividade cruzada não específica do anticorpo é menor do que a do anticorpo SG-21.1C1 ou anticorpo SG-21.5D12.Em alguns exemplos de realização, o anticorpo pode competir pela ligação específica ao CD70 desnaturado com o anticorpo SG-21.1C1 ou com o anticorpo SG-21.5D12.

[007] Em outro aspecto, é fornecido um kit diagnóstico que compreende um anticorpo que se liga especificamente ao CD70 desnaturado em relação ao CD70 nativo. Em um aspecto relacionado, é fornecido um método de detecção da expressão de CD70 em uma amostra de tecido de um paciente.A amostra de tecido pode ser proveniente do pâncreas, ovário, pulmão, laringe, faringe, mama, rim, cérebro, cólon, sangue ou pele do paciente. O tecido é fixado e a proteína CD70 é desnaturada. A amostra de tecido fixado é colocada em contato com um anticorpo que se liga especificamente a CD70 desnaturado em relação a CD70 nativo, e a ligação do anticorpo com a amostra de tecido fixada é detectada para determinar se a CD70 está expressa na amostra. A expressão de CD70 na amostra de tecido fixada indica uma probabilidade do paciente possuir câncer que expresse CD70. Em alguns exemplos de realização, a amostra é fixada em formalina e emblocada em parafina.

[008] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar, prognosticar, determinar um protocolo de tratamento ou monitorar o tratamento de um paciente com câncer de pâncreas, ovário, pulmão, laringe, faringe, mama e pele. O método inclui a determinação da expressão de CD70 em células em uma amostra de pâncreas, ovário, pulmão, laringe, faringe, mama ou pele do paciente, onde a presença detectável da expressão de CD70 é usada no diagnóstico, prognóstico, determinação do protocolo de tratamento ou monitoramento do tratamento do paciente. A amostra pode ser uma amostra fixada em formalina e emblocada em parafina. O método pode incluir ainda a administração de uma dosagem eficaz de um anticorpo CD70 ou conjugado de droga-anticorpo CD70 ao paciente se a etapa de determinação indicar um nível detectável de CD70.

[009] Em outro aspecto, é fornecido um método de tratar um câncer CD70 positivo. O método inclui a administração de um regime eficaz de um agente de ligação ao CD70 a um paciente com câncer de pâncreas, ovário, pulmão, laringe, faringe, mama ou pele, que possui uma expressão detectável de CD70, onde o agente de ligação é um anticorpo, anticorpos derivados ou conjugado droga-anticorpo. O anticorpo pode ter função efetora. O paciente pode já ter sido previamente submetido ao tratamento através de cirurgia, radioterapia e/ou quimioterapia com agentes não direcionados ao CD70, sem indução da remissão do câncer. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano, tal como uma forma quimérica ou humanizada do anticorpo monoclonal 1F6 ou 2F2. O conjugado droga-anticorpo pode incluir um agente citotóxico, tal como um agente antitubulina, um agente que interage com a fenda menor do DNA ou um agente alquilante da fenda menor do DNA. O anticorpo no conjugado droga-anticorpo pode estar conjugado com o agente citotóxico ou citostático através de um ligante, tal como um ligante que é passível de ser clivado sob condições intracelulares.

[010] Em outro aspecto, é fornecida uma combinação de um kit diagnóstico e um kit farmacêutico compreendendo um anticorpo que se liga especificamente ao CD70 desnaturado para uso diagnóstico e um anticorpo que se liga especificamente a um domínio extracelular do CD70 nativo para uso terapêutico.

[011] Aspectos da presente invenção serão mais bem compreendidos pela referência a seguinte descrição detalhada das realizações exemplares, em conjunto com os esquemas, figuras e tabelas anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[012] A Figura 1 exibe um Western blot de extratos proteicos utilizando anticorpos SG-21.1C1 e SG-21.5D12 para detectar CD70 desnaturado em extratos proteicos de células transfectadas 786-0, 293F:CD70 e células 293F não transfectadas.

[013] A Figura 2 exibe a expressão da proteína CD70 em linhagem de células pancreáticas PANC-1 fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE) utilizando o anticorpo SG21.1C1.

[014] A Figura 3 exibe a expressão da proteína CD70 em linhagens de células de ovário OVCAR-3, SK-OV-3, Ca-OV-3 e TOV-21G usando o anticorpo SG21.1C1.

[015] A Figura 4 exibe a expressão da proteína CD70 em amostras de tumor pancreático detectada pelos anticorpos SG-21.1C1 ou SG-21.5D12 versus IgGm controle.

[016] A Figura 5 exibe a expressão da proteína CD70 em células pancreáticas normais e células pancreáticas tumorais detectadas pelo anticorpo SG-21.1C1 usando o cromógeno Fast Red (cor mais escura).

[017] A Figura 6 exibe uma avaliação da expressão da proteína CD70 em células de câncer pancreático. O eixo x indica a intensidade da coloração para CD70 e o eixo y indica a porcentagem da área que é CD70- positiva.

[018] A Figura 7 exibe uma avaliação da expressão da proteína CD70 em tumores ovarianos. O eixo x indica a intensidade da coloração para CD70 e o eixo y indica a porcentagem da área que é CD70-positiva.

[019] A Figura 8 exibe a avaliação da atividade citotóxica in vitro de vários conjugados anticorpo 1F6 humanizado / droga contra uma linhagem de célula de câncer ovariano, SKOV-3.

[020] As Figuras 9A-C exibem avaliações da atividade citotóxica in vitro de um conjugado droga / anticorpo 1F6 humanizado nas seguintes linhagens de células: (A) linhagem de célula pancreática CD70-transfectada, HPAFII; (B) uma linhagem de célula pancreática CD70 transfectadas, PANC-1, e (C) uma linhagem de célula MiaPaCa-2 CD70 transfectada.

[021] A Figura 10 exibe uma avaliação da eficácia in vivo de um conjugado droga / anticorpo 1F6 humanizado em tumores de carcinoma pancreático MiaPaCa CD70-transfectados em camundongos nude.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[022] Salvo quando disposto de outra forma, os seguintes termos e frases utilizados no presente documento visam a ter os seguintes significados.

[023] O termo “anticorpo” refere-se a (um) polipeptídeo de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas dos polipeptídeos de imunoglobulinas, ou seja, polipeptídeos da família das imunoglobulinas, ou fragmentos destas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que se liga imuno-específicamente a um antígeno específico (por exemplo, CD70); ou (b) derivados conservadoramente substituídos de tais polipeptídeos de imunoglobulina ou fragmentos que se ligam imuno-específicamente ao antígeno (por exemplo, CD70). Os anticorpos estão descritos de maneira geral, por exemplo, em Harlow & Lane; Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Salvo quando disposto de outra forma aparente a partir do contexto em referência, um anticorpo também inclui derivados de anticorpos ou conjugados de drogas, conforme descrito abaixo em maiores detalhes.

[024] A expressão "anticorpo derivativo" significa um anticorpo, conforme definido anteriormente, que é modificado por ligações covalentes de uma molécula heteróloga, como, por exemplo, pelo acoplamento de um polipeptídeo heterólogo, ou por glicosilação, deglicosilação, acetilação e fosforilação que não estão normalmente associados ao anticorpo e similares.

[025] A expressão "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de um único clone celular, incluindo qualquer clone de células eucarióticas ou procarióticas, ou um clone de fago, e não ao método pelo qual ele é produzido. Desse modo, o termo "anticorpo monoclonal" não se limita à presença de anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridoma.

[026] Um "antígeno" é uma entidade à qual um anticorpo se liga de maneira específica.

[027] O termo "inibe" ou "inibição" significa uma redução em uma quantidade mensurável, ou prevenção completa.

[028] O termo "agente" significa um elemento, composto, ou entidade molecular, incluindo, por exemplo, um composto farmacêutico, terapêuticos ou compostos farmacológicos.Os agentes podem ser naturais ou sintéticos, ou uma combinação destes.Um "agente terapêutico" é um agente que exerce um efeito terapêutico (por exemplo, benéfico) em células cancerosas, isoladamente ou em combinação com outro agente (por exemplo, uma enzima conversora de pró-droga em combinação com uma pró-droga). Normalmente, os agentes terapêuticos úteis, de acordo com os métodos e composições descritas na presente invenção, são aqueles que exercem um efeito citotóxico ou citostático.

[029] "Efeito citotóxico", em referência ao efeito de um agente sobre uma célula, significa matar a célula.

[030] "Efeito citostático" significa uma inibição da proliferação celular.

[031] Um "agente citotóxico" significa um agente que tem um efeito citotóxico ou citostático sobre uma célula, dessa forma, é capaz de depletar ou inibir o crescimento, respectivamente, das células dentro de uma população celular.

[032] O termo "depletar", no contexto do efeito de um anticorpo CD70 sobre células que expressam CD70, refere-se a uma redução no número, ou eliminação das células que expressam CD70.

[033] O termo "funcional", no contexto de um anticorpo anti-CD70, ou derivado deste a ser utilizado de acordo com os métodos descritos na presente invenção, indica que o anticorpo ou derivado do mesmo é (1) capaz de se ligar ao CD70 e/ou (2) depletar ou inibir a proliferação de células que expressam CD70 sozinho ou quando conjugado a um agente citotóxico.

[034] O termo "profilaxia" refere-se à administração de um conjugado droga com anticorpo anti-CD70 (ADC) ou derivados de ADC a um paciente antes do aparecimento de um sintoma clínico ou diagnóstico de câncer, expressando CD70 (por exemplo, a administração a um indivíduo com predisposição ou com alto risco de adquirir câncer de pâncreas ou ovário) para (a) bloquear a ocorrência ou surgimento do câncer expressando CD70, ou um ou mais dos sintomas clínicos ou diagnóstico dos mesmos, (b) inibir a gravidade do surgimento do câncer expressando CD70, ou (c) diminuir a probabilidade de aparecimento do câncer expressando CD70.

[035] Os termos "tratamento" ou "tratar" referem-se a retardar, parar ou reverter a progressão de um câncer expressando CD70 em um paciente, conforme evidenciado por uma diminuição ou eliminação de um sintoma clínico ou diagnóstico da doença, através da administração de um anticorpo anti-CD70, conjugado anticorpo-droga ou derivados de ADC ao paciente após o início do sintoma clínico ou diagnóstico do câncer expressando CD70, em qualquer fase clínica. O tratamento pode incluir, por exemplo, uma diminuição na gravidade de um sintoma, no número de sintomas, ou na frequência de recaídas.

[036] A expressão “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do Governo Federal ou de um governo estadual ou inscrita na Farmacopeia Norte-Americana ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais especificamente para uso em seres humanos. A expressão “ingrediente farmaceuticamente compatível” refere-se a um diluente farmaceuticamente aceitável, adjuvante, excipiente, ou veículo com o qual um anticorpo CD70 é administrado.

[037] A expressão “quantidade eficaz”, no contexto da administração de um agente farmacêutico refere-se à quantidade do agente que é suficiente para inibir a ocorrência ou melhorar um ou mais sintomas clínicos ou diagnósticos de um câncer pancreático ou de ovário expressando CD70 em um paciente. Uma quantidade eficaz de um agente é administrada de acordo com os métodos descritos na presente invenção em um “regime eficaz”. A expressão “regime eficaz” refere-se a uma combinação de quantidade do agente e frequência de dosagem adequada para realizar o tratamento de um câncer expressando CD70.

[038] O termo "paciente" inclui humanos e outros indivíduos mamíferos que recebem o tratamento diagnóstico, profilático ou terapêutico.

[039] A abreviatura "AFP" refere-se a dimetilvalina-valina dolaisoleuina-dolaproina-fenilalanina-p-fenilenodiamina.

[040] A abreviatura "MMAE" refere-se auristatina monometil E.

[041] A abreviatura "AEB" refere-se a um éster produzido pela reação da auristatina E com ácido paraacetil benzoico.

[042] A abreviatura "AEVB" refere-se a um éster produzido pela reação da auristatina E com ácido benzoilvalérico.

[043] A abreviatura "MMAF" refere-se a dovalina-valina dolaisoleunina-dolaproina-fenilalanina.

[044] As abreviações "fk" e "phe-lys" referem-se ao dipeptídeo fenilalanina-lisina.

[045] As abreviações "vc" e "val-cit" referem-se ao dipeptideo valina-citrulina.

[046] Agentes terapêuticos normalmente são substancialmente puros de contaminantes indesejados. Isto significa que um agente é normalmente de pelo menos 50% p/p (peso/peso) de pureza, bem como substancialmente livre de proteínas e contaminantes interferentes. Às vezes, os agentes são, pelo menos, cerca de 80% p/p e, preferencialmente, pelo menos 90 ou cerca de 95% p/p de pureza. No entanto, usando técnicas convencionais de purificação de proteínas, podem ser obtidos peptídeos homogêneos com pelo menos 99% de pureza p/p.

I. GERAL

[047] A presente invenção fornece métodos diagnósticos, prognósticos, profiláticos e de tratamento e monitoramento do tratamento de cânceres de ovário e pâncreas usando anticorpos para CD70. A presente invenção fornece ainda métodos diagnósticos, prognósticos, profiláticos e de tratamento e monitoramento de tratamento de cânceres de pulmão, cabeça e pescoço (laringe ou faringe), melanoma, glioblastoma, mieloma múltiplo, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, tal como linfoma folicular, carcinoma de células renais, incluindo de células claras e papilares, carcinoma colorretal e de bexiga. Os métodos têm como premissa, em parte, os resultados apresentados nos Exemplos que mostram que o CD70 é expresso em níveis elevados em certos tipos de cânceres. A expressão elevada foi detectada em amostras de tecidos de câncer de ovário e pâncreas fixados em formalina e emblocados em parafina (FFPE) através de anticorpos que se ligam especificamente ao CD70 desnaturado. Além disso, a expressão elevada de CD70 também foi detectada em amostras de tecidos de outros cânceres fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE) utilizando anticorpos contra o domínio extracelular do CD70 desnaturado.

[048] Embora a prática da presente invenção não seja dependente do entendimento do mecanismo, acredita-se que o sucesso na detecção do CD70 nas amostras FFPE de tecidos de ovário e pâncreas em particular, e outros tipos de cânceres em geral, reside na utilização de anticorpos que se ligam preferencialmente ao CD70 desnaturado em tais amostras em comparação com o CD70 nativo. Embora a frequência de CD70 detectável no câncer de pâncreas e ovário e/ou seu nível não tão alto como em alguns outros tecidos cancerosos nos quais o CD70 foi previamente associado, eles são muito específicos para o tecido canceroso em comparação com o tecido normal. Assim, em pacientes com câncer de ovário ou câncer de pâncreas em que CD70 é detectável, o CD70 apresenta um alvo particularmente útil para direcionar seletivamente a toxicidade para as células cancerosas. Da mesma forma, em pacientes com outros cânceres (como o de pulmão, cabeça e pescoço (laringe ou faringe), melanoma, glioblastoma, mieloma múltiplo, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, tal como o linfoma folicular, carcinoma de células renais, incluindo o de células claras e papilares, carcinoma colorretal e de bexiga), a presente invenção fornece uma maneira fácil para detectar a expressão de CD70 em amostras fixadas proveniente de tais pacientes.

II. ANTICORPOS PARA CD70

[049] A descrição a seguir considera primeiramente as propriedades dos anticorpos para CD70 aplicáveis para a detecção de CD70 em cânceres de ovário e de pâncreas e tratamento destes, e depois se concentra nas propriedades preferidas dos anticorpos para as respectivas aplicações.

A. ANTICORPOS PARA CD70 EM GERAL

[050] Os anticorpos anti-CD70 incluem anticorpos monoclonais, quiméricos (por exemplo, possuindo uma região constante humana e região variável de camundongo), humanizado, do tipo veneered ou humanos, anticorpos de cadeia simples, ou similares. As moléculas de imunoglobulinas podem ser de qualquer tipo ou classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) ou subclasse (por exemplo, IgGi, lgG2, IgGs, lgG4, IgAi e lgA2).

[051] Os anticorpos anti-CD70 podem ser um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, tais como, um Fab, F(ab'), F(ab')2, uma cadeia Fd, um Fv de cadeia simples (scFv), uma anticorpo de cadeia simples, um Fv ligado por dissulfetos (sdFv), um fragmento compreendendo tanto um domínio VL quanto um domínio VH, incluindo nanocorpos ou fragmentos de camelos, lhamas ou similares, ou fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, ou fragmentos de ligação ao CD70 de quaisquer anticorpos descritos acima. Fragmentos de anticorpos de ligação ao antígeno, incluindo anticorpos de cadeia simples, podem compreender a(s) região(ões) variável(is) isoladamente ou em combinação com a totalidade ou parte dos seguintes: região de dobradiça, domínios CH1, CH2, CH3 e CL. Além disso, fragmentos de ligação ao antígeno podem incluir qualquer combinação de região(ões) variável(eis) com uma região de dobradiça, domínios CH1, CH2, CH3 e CL. Normalmente, os anticorpos são humanos, de roedores (por exemplo, camundongo e rato), burro, carneiro, coelho, cabra, cobaia, camelídeos, cavalo ou galinha.

[052] Os anticorpos podem ser mono-específicos, bi-específicos, tri-específicos, ou de maior especificidade multi-específicos. Anticorpos multi- específicos podem ser específicos para diferentes epítopos do CD70 ou podem ser específicos para ambos CD70, bem como para uma proteína heteróloga. (Vide, por exemplo, Documento WO 93/17715; Documento WO 92/08802; Documento WO 91/00360; Documento WO 92/05793; Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Patentes US 4.474.893; US 4.714.681; US 4.925.648; US 5.573.920; e US 5.601.819; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553.) Anticorpos multi-específicos, incluindo anticorpos bi-específicos e tri-específicas, úteis para a prática dos métodos descritos na presente invenção são os anticorpos que se ligam imuno-específicamente tanto a CD70 quanto a um segundo receptor de superfície celular ou complexo receptor, tal como um membro da superfamília do gene da imunoglobulina, um membro da superfamília do receptor TNF, uma integrina, um receptor de citocina, um receptor de quimiocinas, uma proteína principal de histocompatibilidade, uma lectina (tipo C- , tipo-S, ou tipo-l), ou uma proteínas de controle do complemento.

[053] Os anticorpos anti-CD70 também podem ser descritos em termos de sua afinidade com o CD70, de 10’7 M, 5 x 10’8 M, 10~8 M, 5 x 10’9 M, 10'9M, 5x 10-1°M, 10-1°M, 5x 10’11 M, 10’11 M, 5x 10~12M, 10~12M, 5x 10’13 M, 10’13 M, 5 x 10’14 M, 10’14 M, 5 x 1O-15 M, ou 10’15 M.

[054] Um anticorpo anti-CD70 pode ser um anticorpo monoclonal quimérico. Um anticorpo monoclonal quimérico é uma molécula na qual diferentes partes do anticorpo são derivados de diferentes espécies animais, tais como anticorpos que possuem uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal rnurino e uma região constante da imunoglobulina humana. Métodos para a produção de anticorpos quiméricos são conhecidos no estado da técnica. (Vide, por exemplo, Morrison, Science, 1985, 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J Immunol Methods 125:191-202;. Patentes US 5.807.715, US 4.816.567 e US 4.816.397).

[055] Um anticorpo anti-CD70, também pode ser um anticorpo humanizado, incluindo um anticorpo do tipo veneered. Os anticorpos são moléculas de anticorpo humanizado que se ligam ao antígeno desejado e possuem uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma espécie não humana, e regiões de arcabouço e constantes de uma molécula de imunoglobulina humana. Muitas vezes, os resíduos de arcabouço nas regiões de arcabouço humano serão substituídos com os resíduos correspondentes do anticorpo doador de CDR para alterar, ou preferencialmente, melhorar a ligação ao antígeno. Estas substituições na região de arcabouço são identificadas por métodos bem conhecidos no estado da técnica, por exemplo, pela modelagem das interações dos resíduos de CDR e do arcabouço para identificar resíduos do arcabouço importantes para a ligação ao antígeno e comparação da sequência para identificar resíduos do arcabouço incomuns em posições específicas. (Vide, por exemplo, Queen et al., Patente US 5.585.089; Riecbmann et al., 1988, Nature 332:323). Os anticorpos podem ser humanizados, utilizando uma variedade de técnicas conhecidas no estado da técnica, como o enxerto de CDR (Patente EP 0 239 400; Documento WO 91/09967, Patente US 5.225.539; US 5.530.101 e US 5.585.089), veneering ou com recomposição da superfície (resurfacing) (Patentes EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan, Molecular Immunology, 1991, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7 (6):805-814; Roguska et al., 1994, PNAS 91: 969- 973), e combinação de cadeias (shuffling) (Patente US 5.565.332) (todas essas referências são incorporadas a presente invenção como referência).

[056] Um anticorpo anti-CD70, também pode ser um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica, tais como os métodos de exibição por fago (vide supra), utilizando bibliotecas de anticorpos derivados de sequências de imunoglobulina humana. Vide também, por exemplo, as Patentes US 4.444.887 e US 4.716.111; e Documentos WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91/10741. Além disso, um anticorpo humano que reconhece um epítopo selecionado pode ser gerado usando uma técnica conhecida como "seleção guiada", em que um anticorpo monoclonal não humano específico, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é usado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epítopo (vide, por exemplo, Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903). Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando camundongos transgênicos que expressam genes da imunoglobulina humana.Os anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno podem ser obtidos a partir de camundongos transgênicos, imunizados utilizando a tecnologia de hibridoma. Para uma visão geral da tecnologia para a produção de anticorpos humanos, vide Lonberg Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93. Para uma discussão detalhada sobre esta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para a produção de tais anticorpos, vide, por exemplo, as publicações PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patente Europeia EP 0598877 e Patentes US 5.413.923; US 5.625.126; US 5.633.425; US 5.569.825; US 5.661.016; US 5.545.806; US 5.814.318; US 5.885.793; US 5.916.771; e US 5.939.598.

[057] Os anticorpos podem ser analisados pela ligação específica ao CD70 por métodos conhecidos, por exemplo, por sistemas de imunoensaios competitivos e não competitivos, utilizando técnicas tais como a de Western blot, radioimunoensaio, ELISA (ensaio imunoenzimático), imunoensaios do tipo "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitação, reações de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação do complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes e imunoensaios com proteína A. (Vide, por exemplo, Ausubel et al., Eds., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, 4° Ed. 1999); Harlow & Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1999).

[058] Além disso, a afinidade de ligação de um anticorpo ao CD70 e uma constante de dissociação (off-rate) de uma interação de anticorpo CD70 pode ser determinada por ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação do CD70 marcado (por exemplo, H3, ou I125) com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de CD70 marcado, e a detecção do anticorpo ligado ao CD70 marcado. A afinidade do anticorpo para o CD70 e as taxas de dissociação pode ode ser determinado pela análise do gráfico de Scatchard. A competição com um segundo anticorpo também pode ser determinada por meio de radioimunoensaios. Neste caso, o CD70 é incubado com o anticorpo de interesse conjugado a um composto marcado (por exemplo, H3 ou I125) na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não marcado. Alternativamente, a afinidade de ligação de um anticorpo ao CD70 e a taxa de associação da interação anticorpo-CD70 pode ser determinada por ressonância plasmônica de superfície.

[059] Os anticorpos podem ser produzidos a partir de fragmentos contendo antígeno da proteína CD70 através de procedimentos padronizados de acordo com o tipo de anticorpo (vide, por exemplo, Kohler, et al., Nature, 256:495, (1975); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP, NY, 1988); Queen et al., Proc Acad Natl. Sci USA 86:10029-10033 (1989) e documento WO 90/07861;. Dower et al., WO 91/17271 e McCafferty et al., WO 92/01047 (cada um dos quais é incorporado a presente invenção como referência para todos os fins). Como exemplo, anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando uma grande variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o uso de tecnologias de hibridomas, recombinante, e tecnologias de exibição por fago, ou uma combinação destas. Técnicas de hibridomas são discutidas de maneira geral, por exemplo, em Harlow et al. supra, e Hammerling, et al. Em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, págs 563-681 (Elsevier, NY, 1981). Exemplos de métodos de exibição por fago que podem ser usados para produção dos anticorpos anti-CD70 incluem, por exemplo, aqueles revelados em Briinnan et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; Pedido PCT/GB91/01 134; Publicações PTC WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e Patentes US 5.698.426; US 5.223.409; US5.403.484; US 5.580.717; US 5.427.908; US 5.750.753; US 5.821.047; US5.571.698; US 5.427.908; US 5.516.637; US 5.780.225; US 5.658.727; US5.733.743 e US 5.969.108 (as revelações dos quais são incorporadas a presente invenção como referência).

[060] Técnicas para produção dos fragmentos de anticorpos que reconhecem epítopos específicos são também conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, fragmentos Fab e F(ab')2 podem ser produzidos por divagem proteolítica das moléculas de imunoglobulinas utilizando enzimas como a papaína (para produzir fragmentos Fab) e pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2). Fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante da cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada. As técnicas para produzir por recombinação fragmentos Fab, Fab', e F(ab')2 também pode ser empregada utilizando, por exemplo, os métodos divulgados no documento WO 92/22324; Mullinax etal., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; e Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; e Better et al., 1988, Science 240:1041-1043 (cujas divulgações estão incorporadas a presente invenção como referência).

[061] Exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fvs de cadeia simples e anticorpos incluem aquelas descritas nas Patentes US 4.946.778 e US 5.258.498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203:46- 88; Shu etal., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:7995-7999 e Skerra et al., 1988, Science 240:1038-1040.

[062] Anticorpos anti-CD70 e derivados deste que são úteis nos métodos da presente invenção também podem ser produzidos por técnicas de expressão recombinante.A expressão recombinante de um anticorpo ou derivado deste que se liga ao CD70 e/ou depleta ou inibe a proliferação de células que expressam CD70 requer a construção de um vetor de expressão contendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou derivado deste. Uma vez que o ácido nucleico que codifica tal proteína foi obtido, o vetor para a produção da molécula de proteína pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante, utilizando técnicas bem conhecidas no estado da técnica. Técnicas padrões tais com as descritas em Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3° Ed., 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2a Ed., 1989); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Nova Iorque, 4a Ed., 1999); e Glick & Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 2a Ed. 1998) podem ser utilizadas nos métodos de recombinação de ácidos nucleicos, síntese de ácido nucleico, cultura de células, incorporação do transgene e expressão de proteínas recombinantes.

[063] Por exemplo, para a expressão recombinante de urn anticorpo anti-CD70, um vetor de expressão pode codificar uma cadeia pesada ou leve deste, ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, operacionalmente ligado a um promotor. Um vetor de expressão pode incluir, por exemplo, a sequência de nucleotídeos que codifica a região constante da molécula do anticorpo (vide, por exemplo, documentos WO 86/05807; WO 89/01036; e Patente US 5.122.464), e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em tal vetor para a expressão de toda a cadeia pesada ou leve. O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira através de técnicas conhecidas, e as células transfectadas são, em seguida, cultivadas para produzir o anticorpo anti-CD70. Normalmente, para a expressão dos anticorpos de cadeia dupla, vetores que codificam ambas as cadeias pesadas e leves podem ser co- expressos dentro da célula hospedeira para a expressão da molécula de imunoglobulina inteira.

[064] Uma variedade de sistemas de vetores de expressão - hospedeiros procarióticos e eucarióticos podem ser utilizados para expressar um anticorpo anti-CD70 ou derivado deste. Normalmente as células eucarióticas, particularmente para moléculas de anticorpos recombinantes anti-CD70 completas, são utilizadas para a expressão da proteína recombinante. Por exemplo, células de mamíferos, como as células de ovário de hamster chinês (CHO) (por exemplo, DG44 ou CHO-S) em conjunto com um vetor como o elemento promotor do gene precoce imediato principal do citomegalovírus ou o promotor EF-la de ovário de hamster chinês, é um sistema de expressão eficaz para a produção de anticorpos anti-CD70 e derivados deste (vide, por exemplo, Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2; Allison, Patente US 5.888.809).

[065] Outros sistemas de expressão em hospedeiros incluem, os sistemas de expressão baseados em plasm ideo em células bacterianas (vide, por exemplo, Ruthereta/., 1983, EMBO 1,2:1791; Inouye & Inouye, 1985, AcidNucleics Res 13:3101-3109;. Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol Chem 24:5503-5509);. sistemas em insetos, tal como o uso do vetor de expressão do vírus da poliedrose nuclear da Autographa californica (AcNPV) em células de Spodoptera frugiperda e sistemas de expressão virai baseados em células de mamíferos, tal como, sistemas baseados em adenovirus (vide, por exemplo, Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359; Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol 153:51 -544).

B. ANTICORPOS PARA DETECÇÃO DO CD70

[066] A seleção de anticorpos para CD70 para uso nos métodos de detecção depende se o CD70 é detectado por uma técnica que requer a detecção do CD70 desnaturado ou CD70 nativo (como é expresso nas células). Nos métodos de detecção como o de Western blotting ou imuno-histoquímica em que o CD70 alvo está desnaturado, é preferível usar um anticorpo que se liga ao CD70 em sua forma desnaturada (por exemplo, CD70 humano ou de cinomolgo). Normalmente tais anticorpos se ligam preferencialmente à forma desnaturada em vez da forma nativa (ou seja, o CD70 como ocorre naturalmente ou quando isolado, sem exposição a condições de desnaturação, tal como solventes, detergentes ou temperaturas elevadas (por exemplo, superiores a 50 °C)). Esses anticorpos podem ser induzidos através de um imunógeno de CD70 desnaturado (por exemplo, CD70 humano ou cinomolgo), ou um fragmento imunogênico deste a partir da porção extracelular. A desnaturação pode ser afetada pelo tratamento do imunógeno com SDS (por exemplo, a 0,5%) e, opcionalmente, pelo aquecimento a 80 °C. A desnaturação também pode ser feita simplesmente pela eluição do imunógeno a partir do gel de SDS usado para purificar o imunógeno. Alternativamente, os anticorpos que se ligam preferencialmente ao CD70 desnaturado podem ser produzidos usando peptídeos sintéticos do domínio extracelular do CD70 como imunógeno. Alguns peptídeos como são curtos demais para manter a conformação de um segmento correspondente ao peptídeo nativo. Os peptídeos sintéticos podem, mas geralmente não necessitam, sofrer desnaturação para serem usados como imunógenos.

[067] Os anticorpos gerados por estes ou outros métodos são selecionados para uma ligação preferencial ao CD70 desnaturado em comparação ao CD70 nativo. Os antígenos CD70 desnaturado e nativo podem ser avaliados pelo mesmo ensaio ou por ensaios diferentes. Especificamente, se esta última abordagem é usada, o rastreamento pode ser realizado com um anticorpo controle conhecido por se ligar ao CD70 nativo, tal como os anticorpos terapêuticos descritos a seguir (por exemplo, 1F6 ou 2F2 humanizado; vide os Pedidos de Patente Publicados US 2006-0233794 e US 2006 -0083736 e Publicação Internacional de Patente WO 06/113909). Se um anticorpo apresenta uma maior taxa de ligação ao CD70 desnaturado em comparação com o CD70 nativo com relação a taxa do anticorpo controle, então o anticorpo se liga preferencialmente ao CD70 desnaturado.

[068] Os anticorpos preferidos para a detecção de CD70 em cânceres de pâncreas e ovário são aqueles que se ligam especificamente ao CD70 em espécimes de câncer de pâncreas ou de ovário, que estão fixados com formalina e emblocados em parafina (FFPE).Estes anticorpos preferencialmente reconhecem epítopos no CD70 que são revelados pelo tratamento FFPE em relação aos antígenos CD70 nativos em células não tratadas de câncer de pâncreas ou de ovário. Tais anticorpos são referidos como anticorpos anti-CD70 FFPE específicos. Tais anticorpos carecem de ligação específica detectável para o CD70 nativo.Preferencialmente, a ligação específica dos anticorpos é a mesma ou melhor do que a do anticorpo SG-21.1C1 ou SG-21.5D12. Em particular, os anticorpos de preferência, possuem a mesma ou menor reatividade cruzada detectável a outras proteínas celulares, conforme determinado por Western blot ou por coloração das células fixadas, sob condições específicas de ligação, em comparação com os anticorpos SG-21.1C1 ou SG-21.5D12.

[069] Os anticorpos preferidos para a detecção do CD70 em outros cânceres (conforme descrito abaixo nos Exemplos) são aqueles que se ligam especificamente ao CD70 nestes espécimes de câncer que são fixados em formalina e emblocados em parafina (FFPE). Estes anticorpos preferencialmente reconhecem epítopos no CD70 que são revelados pelo tratamento FFPE em relação aos antígenos CD70 nativos em células não tratadas de câncer de pâncreas ou de ovário.Tais anticorpos carecem de ligação específica detectável para o CD70 nativo.Preferencialmente, a ligação específica dos anticorpos é o mesma ou melhor do que a do anticorpo SG-21.1C1 ou SG-21.5D12. Em particular, os anticorpos de preferência, possuem a mesma ou menor reatividade cruzada detectável a outras proteínas celulares, conforme determinado por Western blot ou por coloração das células fixadas, sob condições específicas de ligação, em comparação com os anticorpos SG-21.1C1 ou SG-21.5D12.

[070] Alguns anticorpos anti-CD70 FFPE-específicos exemplares são mAbs SG-21.1C1 (também referido como SG-21.1C1-B3) e SG-21.5D12.C3 (também referido como SG-21.5D12.C3). Outros anticorpos preferidos competem com o SG-21.1C1.B3 ou SG-21.5D12.C3 pela ligação específica ao CD70 desnaturado. Outros anticorpos preferidos compreendem uma cadeia pesada que compreende as três CDRs da cadeia pesada do SG-21.1C1.B3 e uma cadeia leve que compreende as três CDRs da cadeia leve do SG- 21.1C1.B3. Outros anticorpos preferidos compreendem uma cadeia pesada que compreende as três CDRs da cadeia pesada do SG-21.5D12.C3 e uma cadeia leve que compreende as três CDRs da cadeia leve do SG-21.5D12.C3. Outros anticorpos preferidos compreendem uma região variável de cadeia pesada madura com identidade de sequência de pelo menos 90% para a região variável de cadeia pesada madura do SG-21.1C1.B3 e uma região variável de cadeia leve madura com identidade de sequência de pelo menos 90% com a região variável de cadeia leve madura do SG 21.1C1.B3. Outros anticorpos preferidos compreendem uma região variável de cadeia pesada madura com identidade de sequência de pelo menos 90% para a região variável de cadeia pesada madura do SG-21.5D12.C3 e uma região variável de cadeia leve madura com identidade de sequência de pelo menos 90% com a região variável de cadeia leve madura do SG-21.5D12.C3.

C. ANTICORPOS CD70 PARA APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS

[071] Os anticorpos usados para aplicações terapêuticas ligam-se especificamente a um domínio extracelular do antígeno CD70 nativo em células de câncer de pâncreas ou de ovário. Os anticorpos usados para aplicações terapêuticas também podem se ligar especificamente a um domínio extracelular do antígeno CD70 nativo em células de cânceres de pulmão, cabeça e pescoço (laringe ou faringe), melanoma, glioblastoma, mieloma múltiplo, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, tal como linfoma folicular, carcinoma de células renais, incluindo de células claras e papilares, carcinoma colorretal e de bexiga. Os anticorpos podem ser agonistas, não-agonistas ou antagonistas com relação a ligação do CD70 ao seu ligante CD27. Embora a prática da presente invenção não é dependente de uma compreensão do mecanismo, acredita-se que os anticorpos podem exercer um efeito citotóxico ou citostático, seja como resultado da ligação ao CD70 e internalização destes para dentro de uma célula, ou seja pela ligação ao CD70 e o acúmulo destes no exterior das células. Em qualquer caso, o efeito citotóxico ou citostático pode ser promovido pela conjugação do anticorpo a um agente citotóxico ou citostático. O efeito citotóxico ou citostático exercido a partir do exterior da célula por um anticorpo ligado ao CD70 pode, adicionalmente, ou, alternativamente, ser promovido por uma função constante (efetora) do anticorpo. Os domínios constantes do anticorpo medeiam diversas funções efetoras de lg, como a participação dos anticorpos na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e/ou fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP). Opcionalmente, a função efetora de um agente de ligação ao CD70 pode ser aumentada por várias abordagens, conforme descrito no Documento W02006/113909. O efeito citotóxico ou citostático exercido pelos anticorpos também pode ser promovido através do bloqueio da interação do CD70 com o seu ligante CD27.

[072] Um anticorpo anti-CD70 preferido é o mAb 1F6 ou 2F2, ou uma forma quimérica ou humanizada deste, conforme descrito no Documento WO 2004/073656 e Pedido de Patente Publicado US 2006-0233794 e no Documento W02006/113909. Uma região variável de cadeia pesada madura preferida possui a sequência SEQ ID No: 1 e uma região variável de cadeia leve preferida possui a sequência SEQ ID No: 2.

[073] Outros anticorpos úteis compreendem regiões variáveis maduras de cadeia pesada e leve possuindo pelo menos 90%, e preferencialmente, pelo menos 95% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID Nos: 1 e 2, respectivamente. A orientação sobre quais os resíduos da região variável e do arcabouço são necessários para a ligação é fornecida pelo documento W02006/113909. Outros anticorpos anti-CD70 úteis, ou derivados deste podem inibir competitivamente a ligação do mAb 1F6 ou 2F2 ao CD70, conforme determinado, por exemplo, por um imunoensaio. A inibição competitiva significa que um anticorpo quando presente em pelo menos um excesso de duas vezes e preferencialmente cinco vezes inibe a ligação do 1F6 ou 2F2 ao CD70 em pelo menos 50%, mais tipicamente, em pelo menos 60%, ainda mais tipicamente, em pelo menos 70%, e mais tipicamente, em pelo menos 75%, ou o anticorpo inibe competitivamente a ligação do 1F6 ou 2F2 ao CD70 em pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos, 95%.

[074] Outros anticorpos preferidos compreendem uma cadeia pesada que contenha as três CDRs da região variável de cadeia pesada do 1F6 e uma cadeia leve que compreende as três CDRs da região variável de cadeia leve do 1F6. Outros anticorpos preferidos compreendem uma região variável de cadeia pesada madura com identidade de sequência de pelo menos 90% com a região variável de cadeia pesada madura do 2F2 e uma região variável de cadeia leve madura com identidade de sequência de pelo menos 90% com a região variável de cadeia leve madura do 2F2. Outros anticorpos preferidos compreendem regiões variáveis de cadeia pesada madura possuindo pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade na sequência com a região variável de cadeia pesada madura do 1F6 e uma região variável de cadeia leve madura possuindo pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade na sequência com a região variável de cadeia leve madura do 1F6. Outros anticorpos preferidos compreendem regiões variáveis de cadeia pesada madura possuindo pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade na sequência com a região variável de cadeia pesada madura do 2F2 (SEQ ID No: 3) e uma região variável de cadeia leve madura possuindo pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade na sequência com a região variável de cadeia leve madura do 2F2 (SEQ ID No: 4).

[075] Diversos outros anticorpos para CD70 são descritos, por exemplo, no Pedido de Patente Publicado US 2005-0191299 e Publicação Internacional WO 07/038637. Outros anticorpos que se ligam ao domínio extracelular do CD70 podem ser selecionados para adequação tanto isoladamente quanto na forma de derivados e/ou conjugados, conforme descrito abaixo. A triagem pode avaliar a internalização nas células expressando CD70 utilizando anticorpos marcados. A triagem pode também avaliar a citotoxicidade.Uma triagem adicional pode ser realizada em modelos animais de câncer pancreático ou de ovário e em outros cânceres.Por exemplo, podem ser usadas as linhagens de células de carcinoma ovariano SKOV-3, linhagem de células de carcinoma endometrial AN3CA e células de carcinoma ovariano TOV21G.Além disso, linhagem de células pancreáticas PANCIand MiaPaca2 podem ser usadas.

[076] Um derivado de um anticorpo anti-CD70, também pode ser usado na prática dos métodos da presente invenção. Modificações típicas incluem, por exemplo, glicosilação, deglicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização pelo conhecimento de grupos de bloqueio/proteção, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína e similares. Qualquer uma dentre as inúmeras modificações químicas podem ser realizadas, por exemplo, a clivagem química específica, acetilação, form ilação ou síntese metabólica na presença de tunicamicina. Além disso, os derivados podem conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

[077] O derivado de anticorpo pode ser um multímero, tal como um dímero, compreendendo um ou mais monômeros, onde cada monômero inclui (i) uma região de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-CD70, ou uma região de polipeptídeos derivada deste (por exemplo, pela substituição conservadora de um ou mais aminoácidos), e (ii) uma região de polipeptídeos multimerizada (por exemplo, que sofreu dimerização), de modo que o anticorpo derivado forma multímeros (por exemplo, homodímeros) que se liga especificamente ao CD70. Normalmente, uma região de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-CD70, ou uma região de polipeptídeos derivada deste, é fundida quimicamente ou de forma recombinante com uma proteína heteróloga, em que a proteína heteróloga compreende um domínio de dimerização ou multimerização.Antes da administração do anticorpo derivado ao indivíduo com o objetivo de tratar ou prevenir cânceres que expressam CD70, o derivado é submetido a condições que permitam a formação de um homodímero ou heterodímero. A heterodímero pode incluir domínios de dimerização idênticos, mas com diferentes regiões de ligação ao antígeno CD70, regiões de ligação ao antígeno CD70 idênticas, mas com diferentes domínios de dimerização, ou regiões de ligação ao antígeno CD70 e domínios de dimerização diferentes.

[078] Um derivado do anticorpo anti-CD70 pode ser formado pela conjugação de um anticorpo anti-CD70 a um segundo anticorpo (um "anticorpo heteroconjugado") (vide, por exemplo, Patente US 4.676.980). Heteroconjugados úteis para a prática dos métodos da presente invenção inclui um anticorpo que se liga ao CD70 (por exemplo, um anticorpo que possui o CDRs e/ou as cadeias pesadas do anticorpo monoclonal 1F6 ou 2F2) e um anticorpo que se liga a um receptor de superfície ou complexo receptor, tal como um membro da superfamília do gene da imunoglobulina, um membro da superfamília do receptor TNF, uma integrina, um receptor de citocina, um receptor de quimiocinas, uma proteína principal de histocompatibilidade, uma lectina (tipo C-, tipo-S, ou tipo-l), ou uma proteínas de controle do complemento.

[079] Os anticorpos para CD70 e seus derivados podem ser conjugados a uma molécula citotóxica ou citostática para formar um conjugado droga-anticorpo (ADC). Moléculas especialmente adequadas para a conjugação com anticorpos ou derivados de anticorpos são; agentes quimioterápicos, enzimas conversoras de pró-drogas, isótopos ou compostos radioativos, ou toxinas. Por exemplo, um anticorpo anti-CD70, ou derivado deste poderá ser conjugado a um agente citotóxico, tal como um agente quimioterápico, ou uma toxina (por exemplo, um agente citostático ou agente citocida (que destrói a célula) como, por exemplo, abrina, ricina A, exotoxina da pseudomonas, e toxina diftérica).

[080] O anticorpo anti-CD70, ou derivado deste poderá ser conjugado com uma enzima conversora de pró-droga. A enzima conversora de pró-droga pode ser fundida de forma recombinante ao anticorpo ou a um derivado deste ou pode ser quimicamente conjugada a este utilizando métodos conhecidos. Exemplos de enzimas conversoras de pró-drogas são; carboxipeptidase G2, beta-glucuronidase, penicilina-V-amidase, penicilina-G amidase, P-lactamase, P-glucosidase, nitrorredutase e carboxipeptidase A.

[081] Técnicas para conjugar agentes terapêuticos às proteínas, e em particular aos anticorpos, são bem conhecidas. (Vide, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” Em: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. Eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery1' Em Controlled Drug Delivery (Robinson et al. Eds., Marcel Dekker, Inc., 2a Ed. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," Em: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); e Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58. Vide também, por exemplo, Publicação PCT WO 89/12624.)

[082] O agente terapêutico pode ser conjugado de uma forma que reduza a sua atividade a menos que este seja clivado para fora do anticorpo (por exemplo, por hidrólise, pela degradação do anticorpo ou por um agente de clivagem). Tal agente terapêutico está ligado ao anticorpo ou derivado através de um ligante passível de ser clivado que é sensível à clivagem no ambiente intracelular da célula cancerosa que expressa CD70, mas não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular, de tal forma que o conjugado é clivado (separado) do anticorpo ou derivado deste quando é internalizado pela célula cancerosa que expressa CD70 (por exemplo, no endossoma ou, por exemplo, em virtude da sensibilidade ao pH ou sensibilidade ás proteases presentes no ambiente lisossomal ou no ambiente de caveolar).

[083] Normalmente, a ADC compreende uma região de ligação entre o agente terapêutico e o anticorpo anti-CD70 ou derivado deste. Conforme mencionado acima, normalmente, o ligante é passível de ser clivado sob condições intracelulares, de modo que a clivagem do ligante libera o agente terapêutico do anticorpo no meio intracelular (por exemplo, dentro de uma cavéola ou lisossomo ou endossomo). O ligante pode ser, por exemplo, um ligante peptidil que é clivado por uma peptidase intracelular ou enzima protease, incluindo uma protease lisossomal e endossomal. Normalmente, o ligante peptidil é de pelo menos dois aminoácidos ou pelo menos três aminoácidos. Agentes clivantes pode incluiras catepsinas B e D e plasmina (vide, por exemplo, Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Os ligantes peptidil mais comuns são os aqueles cliváveis por enzimas que estão presentes nas células que expressam CD70.Por exemplo, pode ser usado um ligante peptidil que é passível de ser clivado pela protease catepsina-B dependente de tiol, que é altamente expressa no tecido canceroso (por exemplo, um ligante compreendendo um peptídeo Phe-Leu ou um Gly-Phe-Leu-Gly). Outros ligantes são descritos, por exemplo, na patente US 6.214.345. Em exemplos de realização específicos, o ligante peptidil passível de ser clivado por uma protease intracelular compreende um ligante Val-Cit ou um dipeptídeo Phe-Lys (vide, por exemplo, a Patente US 6.214.345 que descreve a síntese de doxorrubicina com o ligante Val-Cit). Uma vantagem de usar a liberação proteolítica intracelular do agente terapêutico é que o agente é normalmente atenuado quando conjugado e a estabilidade no soro dos conjugados normalmente são maiores.

[084] O ligante passível de ser clivado pode ser sensível ao pH, ou seja, sensível a hidrólise em certos valores de pH. Normalmente, o ligante sensível ao pH é hidrolisável sob condições ácidas. Por exemplo, um ligante ácido-lábil, que é hidrolisável no lisossomo (por exemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal, ou similares) podem ser usado.(Vide, por exemplo, Patente US 5.122.368; US 5.824.805; US 5.622.929; Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville etal., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661). Tais ligantes são relativamente estáveis sob condições de pH neutro, tal como as condições no sangue, mas são instáveis em pH abaixo de 5,5 ou 5,0, o valor de pH aproximado do lisossomo. Em certos exemplos de realização, o ligante hidrolisável é um ligante tioéter (como, por exemplo, um tioéter ligado ao agente terapêutico através de uma ligação acilhidrazona (vide, por exemplo, a Patente US 5.622.929)).

[085] Outros ligantes são cliváveis sob condições redutoras (por exemplo, um ligante de dissulfeto). Ligantes de dissulfeto incluem aqueles que podem ser formados usando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N- succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2- piridilditiojbutirato) e SMTP (N-succinimidil oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil- ditio)tolueno), SPDB e SMPT. (Vide, por exemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel Eds., Oxford UI. Press, 1987. Vide também a Patente US 4.880.935).

[086] O ligante também pode ser um ligante de malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res 15:1387-93.), Um ligante de maleimidobenzoil (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem 3(10):1299-1304) ou uma 3'-N-amida análoga (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10) :1305- 12).

[087] O ligante também pode ser um ligante não passível de ser clivado, tal como um ligante maleimido-alquileno ou maleimida-aril que está diretamente ligado à unidade Droga. Uma ligante-droga ativo é liberado pela degradação do anticorpo.

[088] Normalmente, o ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular, o que significa que não mais do que cerca de 20%, e normalmente não mais do que cerca de 15%, e mais geralmente, não mais que cerca de 10%, e ainda mais geralmente, não mais que cerca de 5%, e não mais do que 3%, ou não mais do que 1% dos ligantes em uma amostra de ADC são clivados quando o ADC ou derivado de ADC está presente em um ambiente extracelular (por exemplo, no plasma). Pode se determinar se um ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular, por exemplo, através da incubação de forma independente com plasma tanto com (a) um ADC ou derivado de ADC (a "amostra ADC") quanto com (b) uma quantidade molar equivalente de anticorpos não conjugados ou agentes terapêuticos (a "amostra controle") por um período de tempo pré- determinado (por exemplo, 2, 4, 8, 16 ou 24 horas) e, em seguida, comparando a quantidade de anticorpos não conjugados ou agentes terapêuticos presentes na amostra ADC com a quantidade presente na amostra controle, mensurada, por exemplo, por cromatografia líquida de alta performance.

[089] O ligante também pode promover a internalização celular. 0 ligante pode promover a internalização celular quando conjugado com o agente terapêutico (ou seja, no meio da fração ligante-agente terapêutico do ADC ou derivado do ADC, conforme descrito na presente invenção). Alternativamente, o ligante pode promover a internalização celular quando conjugada tanto com o agente terapêutico quanto com o anticorpo anti- CD70, ou derivado deste (isto é, no meio da molécula ADC ou derivado de ADC, conforme descrito na presente invenção).

[090] Uma variedade de ligantes que podem ser usados com as composições da presente invenção está descrita no Documento WO 2004-010957 possuindo a forma:

onde: -A- é uma unidade extensora; a é 0 ou 1; cada -W- é independente uma unidade de aminoácido; w é independentemente um número inteiro variando de 0 a 12; -Y- é uma unidade espaçadora, e y é 0, 1 ou 2.

[091] Ligantes representativos são ilustrados dentro dos colchetes das fórmulas (la) e (lb; ver abaixo), onde A-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definido acima e R1 é selecionado a partir de -Ci-Cioalquileno, -Ca-Cscarbociclo, -O- (-C3-C8 alquil)-,-arileno-, Ci-Cw-alquileno-arileno, -arileno-Ci-Cio-alquileno, -C1-C10- alquileno-(C3-C8-carbociclo)-, -(C3-C8-carbociclo)-Ci-Cio-alquileno, C3- Cs-heterociclo, -Ci-Cio-alquileno(C3-C8-heterociclo)-, -(Cs-Cs-heterocicloj-C-i- Cw-alquileno-, -(CH2CH2O)r-, e -(CH2CH2O)r-CH2-, e r é um número inteiro variando de 1 a 10. Ab é de anticorpos.

[092] A unidade de aminoácido (-W-), se presente, liga a unidade extensora (-A-) à unidade espaçadora (-Y-) se a unidade espaçadora estiver presente, e liga a unidade extensora ao agente citotóxico ou citostático (unidade Droga; D) se a unidade espaçadora estiver ausente.

[093] Se -Ww- estiver presente, é uma unidade de dipeptídeo, tripeptídeo, tetra peptídeo, pentapeptídeo, hexapeptídeo, heptapéptido, octapeptídeo, nonapeptídeo, decapeptídeo undecapeptídeo ou dodecapeptídeo, w é um número inteiro que varia de 2 a 12.

[094] A unidade de espaçador (-Y-), quando presente, liga uma unidade de aminoácido com a unidade da Droga. As unidades espaçadoras são de dois tipos gerais: auto-imolativo e não auto-imolativo. Uma unidade de espaçadora não auto-imolativa é aquela em que parte ou a totalidade da unidade espaçadora permanece ligada à unidade Droga após a clivagem enzimática de uma unidade de aminoácidos, a partir do conjugado Droga-ligante-anticorpo anti- CD70, ou o composto-ligante-droga. Exemplos de uma unidade espaçadora não auto-imolativa incluem uma unidade espaçadora (glicina-glicina) e uma unidade espaçadora glicina. Quando um conjugado Droga-ligante-anticorpo anti-CD70 contendo uma unidade Espaçadora glicina-glicina ou uma unidade Espaçadora glicina sofre clivagem enzimática através de uma protease associada a célula tumoral, uma protease associada a célula cancerosa ou uma protease associada a linfócitos, uma porção glicina-glicina-droga ou uma porção glicina-droga é clivada a partir da Ab-Aa-Ww- Para liberar a droga, uma reação de hidrólise independente deve ter lugar dentro da célula alvo para quebrar a unidade glicina- droga ligada.

[095] Alternativamente, um conjugado droga-anticorpo anti-CD70 contendo uma unidade Espaçadora auto-imolativa pode liberar a droga (D) sem a necessidade de uma etapa de hidrólise distinta. Nesses exemplos de realização, -Y- é uma unidade álcool p- aminobenzil (PAB), que está ligada ao - Ww- pelo átomo de nitrogênio do grupo PAB, e ligado diretamente a -D através de um carbonato, carbamato ou grupo éter. Outros exemplos de espaçadores auto-imolativos incluem compostos aromáticos que são eletronicamente equivalentes ao grupo PAB, tais como os derivados de 2-aminoimidazol-5- metanol (vide Hay et al. 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237 para exemplos) e orto- ou para-aminobenzilacetal. Podem ser usados espaçadores que sofrem fácil ciclização sobre a hidrólise da ligação de am ida, tais como am idas de ácido 4-aminobutírico substituído e não substituído (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), sistemas de anéis biciclo [2.2.1] e biciclo [2.2.2] devidamente substituídos (Storm etal., 1972, J.Amer. Chem. Soc. 94:5815) e amidas de ácido 2-aminofenilpropiônico (Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). A eliminação de drogas contendo aminas que são substituídas na posição-cc da glicina (Kingsbury, et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447) também são exemplos de estratégias de espaçadores auto-imolativos que podem ser aplicados ao conjugado droga-ligante-anticorpo anti-CD70. Alternativamente, a unidade espaçadora é uma unidade ramificada bis (hidroximetil) estireno (BHMS), que pode ser usada para incorporar drogas adicionais.

[096] Classes de agentes citotóxicos úteis incluem, por exemplo, as antraciclinas, agentes anti-microtúbulos, agentes que interage com a fenda menor do DNA, inibidores da replicação de DNA, sensibilizadores quimioterápicos, ou similares.

[097] Exemplos de classes de agentes citotóxicos úteis incluem auristatinas, camptotecinas, duocarmicinas, etoposídeo, maitansinoides e alcaloides da vinca.

[098] Agentes citotóxicos apropriados incluem, por exemplo, auristatinas (por exemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE), ligantes da fenda menor do DNA (por exemplo, enediinos e lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (por exemplo, paclitaxel e docetaxel), alcaloides da vinca, doxorrubicina, doxorrubicina morfolina, e doxorrubicina cianomorfolina.

[099] O agente citotóxico pode ser um quimioterápico como, por exemplo, a doxorrubicina, paclitaxel, melfalano, alcaloides da vinca, metotrexato, mitomicina-C ou etoposide. Além disso, agentes potentes como os análogos do CC-1065, caliqueamicina, maitansina, análogos da dolastatina 10, rizoxina e palitoxina podem estar ligados aos anticorpos anti-CD70 ou derivados destes.

[0100] Em exemplos de realização, o agente citotóxico ou citostático pode ser a auristatina E ou um derivativo desta. Normalmente, o derivado da auristatina E é, por exemplo, um éster formado entre auristatina E e um cetoácido. Por exemplo, a auristatina E pode ser reagida com ácido benzoico ou ácido paraacetil benzoilvalérico para produzir AEB e AEVB, respectivamente. Outras auristatinas típicas incluem AFP, MMAF e MMAE.A síntese e estrutura da auristatina E e seus derivados estão descritas, por exemplo, nos Pedido de Patente Publicado US 2005-0238649 e US 2006-0074008.

[0101] O agente citotóxico pode ser um agente que interage com a fenda menor de DNA. (Vide, por exemplo, a Patente US 6.130.237). Por exemplo, o agente que interage com a fenda menor de DNA pode ser um composto CBI ou uma enediino (por exemplo, caliqueamicina).

[0102] O ADC ou derivado de ADC pode incluir um agente antitubulina.Exemplos de agentes antitubulina incluem, mas não estão limitados a, taxanos (por exemplo, Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik), alcaloides da vinca (por exemplo, vincristina vindesina, vinblastina e vinorelbina) e auristatinas (por exemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB).(Auristatinas exemplares são exibidas abaixo nas fórmulas III - XIII. Outros agentes antitubulinas adequados incluem, por exemplo, derivados da bacatina, análogos do taxano (por exemplo, epotilona A e B), nocodazol, colchicina e colcemidaa, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, combretastatinas, discodermolídeo, e eleuterobina.

[0103] O agente citotóxico pode ser um maitansinoide, outro grupo de agentes antitubulina. Por exemplo, o maitansinoide é maitansina ou uma maitansina contendo um ligante a droga como o DM-1 ou DM-4 (ImmunoGen, Inc., vide também Chari etal., 1992, Cancer Res 52:127-131.).

[0104] Outros agentes de ligação ao CD70 podem ser usados como uma alternativa aos anticorpos. Tais porções direcionadas ao CD70 podem incluir um ou mais CDRs de um anticorpo que se liga ao CD70 e depleta ou inibe a proliferação de células que expressam CD70 quando conjugados a um agente citotóxico. Normalmente, a proteína é uma multímero, mais tipicamente um dímero.

[0105] Outras porções direcionadas ao CD70 inclui o CD27 e variantes ou fragmentos deste que se ligam ao CD70.Porções direcionadas contra CD70 podem ainda incluir peptídeos e outras moléculas ligantes que se ligam especificamente ao CD70.

[0106] Outras porções direcionadas contra CD70 úteis para os métodos descritos na presente invenção podem ser identificadas usando qualquer método adequado para a triagem de interações proteína-proteína. Normalmente, as proteínas são identificadas inicialmente pela sua capacidade de se ligarem especificamente ao CD70, em seguida, sua capacidade de exercerem um efeito citostático ou citotóxico em linfócitos ativados ou células cancerosas que expressam CD70 quando conjugadas a um agente citotóxico ou citostático. Métodos que podem ser empregados incluem técnicas de "clonagem de interação” que envolve a sondagem de bibliotecas de expressão com o CD70 marcado de forma semelhante à técnica de sondagem de anticorpos de bibliotecas Àgt11 (vide, por exemplo, Blanar e Rutter, 1992, Science 256:1014 - 1018). Outro método é o sistema de dois híbridos (Chien etal., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei USA. 88:9578-9582) e está disponível comercialmente pela Clontech (Paio Alto, CA).

[0107] Uma vez que uma proteína de ligação ao CD70 é identificada, a sua capacidade (isoladamente ou quando multimerizada ou fundida a um domínio de dimerização ou multimerização ou conjugada a uma molécula citotóxica ou citostática) para exercer um efeito citostático ou citotóxico em células cancerosas que expressam CD70 (quando conjugado com um agente citotóxico) é determinada de modo semelhante ao de um anticorpo.

III. DETECÇÃO DO CD70

[0108] As amostras a serem avaliadas para aplicações diagnósticas podem ser obtidas por procedimentos cirúrgicos, por exemplo, biópsia. O CD70 é geralmente detectado por um imunoensaio em que uma amostra contendo células ou que se suspeita ser de um câncer (por exemplo, pâncreas ou ovário) é contatada com um anticorpo. Após o contato, é determinada a presença ou ausência de um evento de ligação do anticorpo com as células na amostra. A ligação está relacionada com a presença ou ausência do antígeno expresso nas células cancerosas nesse espécime. Geralmente, a amostra é contatada com um parceiro de ligação específico marcado do anticorpo anti-CD70 capaz de produzir um sinal detectável. Alternativamente, o próprio anticorpo anti-CD70 pode ser marcado.Exemplos de tipos de marcadores incluem marcadores enzimáticos, marcadores radioisotópicos, marcadores não radioativos, marcadores fluorescentes, toxinas marcadoras e marcadores quimioluminescentes.A detecção de um sinal a partir do marcador indica a presença do anticorpo específico ligado ao CD70 na amostra.

[0109] A amostra em que o ensaio é realizado pode ser fixada ou congelada para permitir cortes histológicos. Preferencialmente, as amostras de tecido excisado são fixadas em fixadores aldeído, tais como formaldeído, paraformaldeído, glutaraldeído, ou fixadores de metais pesados, tais como o cloreto de mercúrio. Mais preferivelmente, as amostras de tecido excisado são fixadas em formalina e emblocadas em parafina antes da incubação com o anticorpo. Uma vantagem oferecida pelos espécimes fixados em formalina em emblocados em parafina (FFPE) é a preservação da arquitetura e de detalhes morfológicos celulares nas secções de tecido (vide, por exemplo, Fox et al., 1985, J. Histochem. Cytochem. 33:845-853). Opcionalmente, os espécimes FFPE podem ser tratados com citrato, EDTA, com digestão enzimática ou calor para aumentar a acessibilidade aos epítopos (vide, por exemplo, Shiefa/., 1991, J Histochem Cytochem. 39:741-748).

[0110] Alternativamente, uma fração protéica pode ser isolada a partir das células, em que de sabe ou que há suspeitas de serem cancerosas, do pâncreas ou ovário e analisada pelo método de ELISA, Western blot, imunoprecipitação ou similares. Em outra variação, as células podem ser analisadas pela expressão de CD70 pela análise por FACS, preferencialmente em combinação com outro marcador de células pancreáticas ou de ovário.

[0111] Em uma variação adicional, o mRNA pode ser extraído de células que se sabe ou que há a suspeita de serem de câncer pancreático ou de ovário. O mRNA ou um ácido nucleico derivado deste, tal como cDNA pode então ser analisado pela hibridização com a ligação de uma sonda nucléica ao DNA que codifica o CD70.

[0112] Em outra variação, um câncer de pâncreas ou de ovário pode ser detectado in vivo pela administração de um anticorpo anti-CD70 marcado a um paciente e, em seguida, detectando o anticorpo por imagem in vivo.

[0113] A detecção do CD70 em amostras de tecido pode ser qualitativa ou quantitativa ou ambas. A detecção qualitativa significa detectar a presença ou ausência da expressão do CD70. A expressão quantitativa significa determinar um nível de expressão da expressão de CD70. A presença e/ou o nível de CD70 em uma amostra de tecido pancreático ou de ovário em questão pode (mas não necessariamente) ser determinado em comparação com um ou mais padrões.Os padrões podem ser historicamente ou contemporaneamente determinados. O padrão pode ser, por exemplo, uma amostra de pâncreas ou de ovário sabidamente não cancerosa de um paciente diferente, um tecido tanto do paciente em questão quanto de outro paciente conhecido por não expressar CD70, ou uma linhagem de células pancreáticas ou de ovário. O padrão também pode ser a amostra do paciente em análise contatada com um anticorpo irrelevante (por exemplo, um anticorpo feito para um antígeno bacteriano). Pelo fato do CD70 não ser expresso de forma significativa no tecido do pâncreas ou ovário não canceroso, o tecido não canceroso pode ser usado como padrão de expressão zero (de fundo).

[0114] A presença do sinal detectável da ligação de um anticorpo anti-CD70 ao CD70 em relação a um padrão (se utilizado) indica a presença de CD70 na amostra de tecido, e o nível de ligação detectável fornece uma indicação do nível de expressão do CD70. Nos ensaios realizados em cortes de tecido, o nível de expressão pode ser expresso como uma percentagem da área de superfície da amostra que exibe um nível de expressão detectável de CD70. Alternativamente, ou adicionalmente, o nível (intensidade) de expressão pode ser usada como uma medida da expressão total da amostra, ou das células que expressam CD70 na amostra.

IV. DIAGNÓSTICO, PROGNÓSTICO, ELABORAÇÃO E ACOMPANHAMENTO DO TRATAMENTO

[0115] A detecção da expressão de CD70 em uma amostra de tecido pancreático ou de ovário é uma indicação de que a amostra é cancerosa. Da mesma forma, a detecção da expressão de CD70 em uma outra amostra de paciente é um indício de que o paciente tem câncer de pulmão, cabeça e pescoço (laringe ou faringe), melanoma, glioblastoma, mieloma múltiplo, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, tal como linfoma folicular, carcinoma de células renais, incluindo de células claras e papilares, carcinoma colorretal ou de bexiga. Os anticorpos usados para aplicações terapêuticas ligam-se especificamente a um domínio extracelular do antígeno CD70 nativo. A indicação de câncer fornecida pela presença e/ou o nível de CD70 pode ser combinada com meios de diagnóstico, como o exame interno ou externo de um paciente por um médico, raio-X, CT-scan (tomografia computadorizada), PET-Scan (Tomografia por Emissão de Positrons), o PET/TC-scan, ultra-som, MRI (imagens por ressonância magnética), endoscopia, exame CPRE (Colangiopancreatografia retrógrada endoscópica), exame histológico e cultura de tecido para chegar a um diagnóstico geral.

[0116] Talvez de maior relevância para o médico, a presença e o nível de CD70 fornece informações úteis para a concepção de um protocolo de tratamento para o paciente e, em particular, para a administração de um anticorpo contra CD70, um derivado deste, um ADC ou outro agente de ligação ao paciente. Por causa da ausência essencial da expressão detectável de CD70 no tecido pancreático normal ou de ovário normal, a presença deste receptor em um câncer fornece um alvo para o tratamento terapêutico. Quanto maior o nível de expressão de CD70 e/ou a percentagem mais elevada de um tumor expressando CD70, mais provável é a eficácia do tratamento. A análise continuada de CD70 após o tratamento proporciona um meio de verificar se o tratamento é eficaz, uma redução do nível de sinal de CD70-positivo (ou seja, como um representante para a presença de células cancerosas CD70 positivas) indica que o tratamento é eficaz.

V. PACIENTES FAVORÁVEIS AO TRATAMENTO

[0117] Pacientes passíveis de tratamento pelos métodos geralmente têm níveis detectáveis de CD70 no tecido pancreático, de ovário ou de outro tecido acompanhado por outros sinais ou sintomas de câncer, conforme descrito acima.Existe uma variedade de subtipos e estágios de ambos os cânceres pancreático e ovariano conforme descrito em mais detalhes abaixo. Às vezes, os pacientes tratados pelos métodos atuais tenham sido submetidos anteriormente a outros tipos de tratamento (por exemplo, cirurgia, quimioterapia e/ou radioterapia), sem induzir a remissão ou mesmo retardar o crescimento do câncer. Em alguns pacientes, o câncer é refratário ao tratamento por uma ou mais dessas terapias.

[0118] Alguns pacientes com risco de câncer no pâncreas também podem ser tratados profilaticamente antes de aparecerem os sinais e sintomas da doença. Tais indivíduos incluem aqueles com parentes que tiveram essas doenças, e aqueles cujo risco é determinado pela análise de marcadores genéticos e bioquímicos.

A. PACIENTES COM CÂNCER PANCREÁTICO

[0119] O câncer pancreático é um tumor maligno na glândula pancreática. Quase 90% dos pacientes com câncer pancreático são de mais de 55 anos. A idade média no momento em que este câncer é diagnosticado é de 72 anos. Fatores de risco para câncer de pâncreas incluem: idade, sexo masculino, etnia africana, tabagismo, dieta rica em carne, obesidade, diabetes, pancreatite crônica (tem sido relacionado, mas não é conhecido por ser o fator causai), exposição ocupacional a determinados pesticidas, corantes e produtos químicos relacionados com a gasolina, histórico familiar, infecção pelo Helicobacter pylori, gengivite ou doença periodontal. (Pancreatic Cancer.Von Hoff et al., ed., Maine; 2005.) Apenas 10 a 15% dos cânceres de pâncreas são considerados hereditários. Alguns marcadores genéticos que estão ligados ao câncer pancreático podem incluir mutações nos genes PNCA1, PALLD ou BRCA2 (vide, por exemplo, Banke et al., 2000, Med. Clin. North Am. 84: 677- 690; Meckler et al., 2001, Am. J. Surg. Path. 25: 1047-1053; Pogue-Geile et al., 2006, PLoS Med. 3:e516; Murphy etal., 2002, Cancer Res. 62: 3789-3793).

[0120] No entanto, nem todos os pacientes nas categorias de risco atualmente reconhecidas irão desenvolver câncer pancreático. Muitos tipos de cânceres pancreáticos surgem "esporadicamente" (isto é, em pacientes sem história familiar).

[0121] Indivíduos que sofrem de câncer pancreático podem ser reconhecidos de acordo com a histologia do tumor, obtida em um relatório patológico. A histologia dita muitos aspectos do tratamento, conduta e prognóstico clínico. Existem dois tipos principais de câncer pancreático, dependendo se o tumor começa a partir da glândula exócrina ou endócrina do pâncreas. Tumores formados a partir da glândula exócrina do pâncreas são muito mais comuns.Cerca de 95 por cento dos tumores pancreáticos são adenocarcinomas. Os 5 por cento restantes incluem outros tumores pâncreas exócrino (por exemplo, cistadenomas serosos), cânceres de células acinares e tumores neuroendócrinos pancreáticos (tal como insulinomas).

[0122] Tumores endócrinos também são denominados de Tumores de células da ilhota e são divididos em vários subtipos. A maioria é benigna, mas há alguns que são cancerosos. Um tipo especial de câncer (câncer ampular) pode ocorrer quando o dueto biliar do fígado e o dueto pancreático vazio entram no intestino delgado. Devido a este tipo de câncer geralmente provocar sintomas como amarelecimento da pele e dos olhos, é normalmente encontrado em um estágio mais avançado do que a maioria dos cânceres de pâncreas. As chances de sucesso do tratamento são melhores para pacientes que sofrem de câncer ampular.

[0123] O estadiamento do câncer pancreático pode ser realizado de acordo com os critérios da Comissão Mista Americana de Estadiamento do Câncer (American Joint Committee on Cancer - AJCC). Os estágios do câncer são rotulados com algarismos romanos de I a IV, com estádio IV indicando que o câncer se espalhou e é mais grave. Especificamente, o estádio I do câncer pancreático inclui os tumores que não se espalharam para certas áreas sensíveis proscritas e que não acometeram nódulos regionais ou apresentaram metástase distai. O estádio II inclui os tumores que se espalharam para o duodeno, do dueto biliar, ou tecido "peripancreático" e que não tenham envolvido linfonodos regionais ou metástase distai. O câncer de estádio III inclui os tumores que podem ter ou não se espalhado para essas áreas e que acometeram linfonodos regionais, mas que não mostram nenhuma evidência da metástase distai. O estádio IVa inclui os tumores que se espalharam para o estômago, baço, intestino grosso ou grandes vasos adjacentes e que envolveram os linfonodos regionais, mas não mostram evidências de metástases distai. O estádio IVb inclui tumores pancreáticos de qualquer espécie com condição de linfonodos de qualquer tipo e com evidência de metástases distai. Embora referido, este sistema de estadiamento do câncer pancreático é raramente usado em sua forma pura, pois as fases não coincidem totalmente com o prognóstico do paciente ou opções de tratamento. Uma alternativa é a classificação em três estágios (potencialmente ressecável, localmente avançado e metastático), que é baseada nos achados radiológicos.Outros fatores prognósticos também são considerados. O grau do câncer que indica o quanto anormais as células se parecem sob um microscópio é por vezes classificado em uma escala de G1 a G4, com cânceres G1 se assemelhando mais com as células normais e tendo melhores perspectivas. Para os pacientes que passaram por cirurgia, a extensão da ressecção, ou seja, se todo tumor foi ou não removido, é também importante no que diz respeito às perspectivas. Isso às vezes é listado em uma escala de RO até R2 com o RO indicando que todo o tumor que pode ser visível foi removido e R2, indicando que qualquer tumor que pode ser observado não pôde ser removido.

[0124] Os primeiros sintomas do câncer pancreáticos são inespecíficos e variados. Os sintomas mais comuns incluem dor no abdome superior, que normalmente irradia para as costas e é aliviada pela inclinação para frente (observado no carcinoma do corpo ou cauda do pâncreas), perda de apetite, perda de peso significativa e icterícia indolor relacionada com a obstrução dos duetos biliares (carcinoma de cabeça do pâncreas). No entanto, todos estes sintomas podem ter várias outras causas e não se limitam ao câncer pancreático.

B. PACIENTES COM CÂNCER DE OVÁRIO

[0125] O câncer de ovário é o câncer que se inicia nos ovários. O câncer de ovário geralmente acontece em mulheres com mais de 50 anos, mas também pode afetar as mulheres mais jovens. Sua causa é desconhecida. Certas populações, como as mulheres da população judaica de Ashkenazi possuem maior risco, muitas vezes em uma idade mais precoce do que a população em geral. Pacientes com uma história pessoal de câncer de mama ou história familiar de câncer de mama, ovário, ou outros tipos de câncer relacionados, especialmente se em idade jovem, podem ter um risco aumento. Uma forte história familiar de câncer de útero, câncer de cólon, ou de outros cânceres gastrointestinais podem indicar a presença de uma síndrome conhecida como câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC, também conhecida como síndrome de Lynch II), que confere um maior risco de desenvolver câncer de ovário. Estudos citogenéticos e investigações da perda de heterozigosidade sugerem que alguns genes ou regiões cromossômicas estão envolvidas na iniciação e progressão do câncer de ovário (vide, por exemplo, Pejovic et al., 1992, Genes Chromosomes Cancer, 4:58-68; Testa et al., 1994, Cancer Res, 54:2778-2784:. Yang-Feng et al., 1993, Int. J. Cancer, 54:546-551). Marcadores genéticos de risco para câncer de ovário incluem, mas não estão limitados a, mutações no gene BRCA1 ou BRCA2 (Futreal etal., 1994, Science, 266:120-122). Pacientes com alto risco genético para o câncer de ovário pode considerar o uso da ooforectomia preventiva após o término da gravidez. Nem todas as mulheres atualmente reconhecidas em categorias de risco irá desenvolver câncer de ovário.A maioria dos cânceres de ovário surge esporadicamente.

[0126] Indivíduos que sofrem de câncer ovariano podem ser reconhecidos de acordo com a histologia do tumor, obtida em um relatório patológico. A histologia dita muitos aspectos do tratamento, conduta e prognóstico clínico. Existem três tipos principais de câncer de ovário com base no tipo de células do tumor inicial e se o tumor é benigno ou canceroso. Os tumores de células germinativas iniciam-se a partir das células que produzem os óvulos. Tumores do estroma começam a partir de células do tecido conjuntivo que mantêm os ovários em conjunto e produzem os hormônios femininos estrogênio e progesterona. Tumores epiteliais começam a partir das células que recobrem a superfície externa do ovário. A maioria dos cânceres de ovário são tumores epiteliais, com uma minoria de tumores resultantes das células germinais ou do estroma.

[0127] O câncer de ovário, muitas vezes é primário, mas também pode ser secundário como resultado da metástase de um câncer primário em outras partes do corpo. Por exemplo, a partir do câncer de mama ou câncer gastrintestinal (caso em que o câncer de ovário é o câncer de Krukenberg).Tumor estromal-superfície epitelial pode se originar no revestimento da cavidade abdominal, caso em que o câncer de ovário é secundário ao câncer peritoneal primário, mas o tratamento é basicamente o mesmo que o do câncer ovariano primário deste tipo.

[0128] No câncer de ovário, os estágios do câncer são os seguintes: estágio I é limitado a um ou ambos os ovários; estágio II envolve a extensão pélvica ou implantes; estágio III envolve metástases microscópicas no peritônio além da pélvis, ou está limitada a pelve com extensão para o intestino delgado ou omento e estágio IV que envolve metástases distantes, como no fígado ou fora da cavidade peritoneal.

[0129] O câncer de ovário precoce é frequentemente assintomático ou produz apenas sintomas leves que podem ser ignorados pela paciente, pois os sintomas são vagos, ou seja, não específicos. Os sintomas podem incluir inchaço, dor pélvica ou abdominal, dificuldade para comer ou rápida sensação de plenitude, sintomas urinários, tais como sentimento de urgência ou necessidade frequente de urinar, (vide, por exemplo, Smith et al., 2005, 104 Cancer (7): 1398-1407; A declaração do consenso divulgado pela Sociedade Americana do Câncer, a Fundação do Câncer Ginecológico e Sociedade de Oncologistas Ginecológicos em 12 de junho de 2007) Mais de 60% das pacientes que apresentam câncer de ovário já possuem estágio III ou câncer em estágio IV, quando ele já se espalhou para além dos ovários.

C. OUTROS PACIENTES COM CÂNCER

[0130] Outros pacientes passíveis de tratamento pelos métodos geralmente têm níveis detectáveis de CD70 nas amostras de cânceres de pulmão, cabeça e pescoço (laringe ou faringe), melanoma, glioblastoma, mieloma múltiplo, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, tal como linfoma folicular, carcinoma de células renais, incluindo de células claras e papilares, carcinoma colorretal ou de bexiga. Esses pacientes podem ser acompanhados por outros sinais ou sintomas de câncer. Às vezes, os pacientes tratados pelos métodos atuais tenham sido submetidos anteriormente a outros tipos de tratamento (por exemplo, cirurgia, quimioterapia e/ou radioterapia), sem induzir a remissão ou mesmo retardar o crescimento do câncer. Em alguns pacientes, o câncer é refratário ao tratamento por uma ou mais dessas terapias.

[0131] Alguns pacientes com risco de câncer também podem ser tratados profilaticamente antes de aparecerem os sinais e sintomas da doença. Tais indivíduos incluem aqueles com parentes que tiveram essas doenças, e aqueles cujo risco é determinado pela análise de marcadores genéticos e bioquímicos.

VI. MÉTODOS DE TRATAMENTO

[0132] A presente invenção fornece métodos de tratamento ou profiláticos do câncer pancreático ou de ovário pelos anticorpos, derivados e ADC, e outros agentes ligantes anti-CD70 (agentes coletivamente) divulgados na presente invenção. As composições podem ser administradas a um paciente.

[0133] Vários sistemas de entrega podem ser utilizados para administrar os agentes, incluindo as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, endovenosa, subcutânea, intranasal, peridural e via oral. Os agentes podem ser administrados, por exemplo, por infusão ou injeção na forma de bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, pela mucosa oral, mucosa retal e intestinal, e similares) e pode ser administrado junto com outros agentes biologicamente ativos, tais como quimioterápicos. A administração pode ser sistêmica ou local.

[0134] Os agentes podem ser administrados por injeção, por meio de um cateter, por meio de um supositório, ou por meio de um implante, sendo o implante de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo uma membrana, tal como uma membrana de sialástico, ou uma fibra.

[0135] Alternativamente, os agentes podem ser entregues em um sistema de liberação controlada. Por exemplo, uma bomba pode ser usada (vide Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit Ref Biomed Eng 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Alternativamente, podem ser utilizados materiais poliméricos (vide, Medicai Applications of Controlled Release (Langer & Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen & Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger & Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. Vide também, Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, Neurosurg. 71:105.) Outros sistemas de liberação controlada são discutidos, por exemplo, em Langer, supra.

[0136] Os agentes podem ser administrados como composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do agente e um ou mais ingredientes farmaceuticamente compatíveis. Por exemplo, a composição farmacêutica inclui normalmente um ou mais veículos farmacêuticos (por exemplo, líquidos estéreis, como a água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, animal, vegetal ou sintéticos, como o óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares). A água é um veículo mais típico quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Soluções salinas e soluções de dextrose aquosa e de glicerol também podem ser empregadas como veículos líquidos, especialmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem, por exemplo, amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, arroz, malte, farinha, cal, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno glicol, água, etanol e etc. A composição, se desejado, também pode conter pequenas quantidades de agentes umidificantes ou emulsionantes, agentes de tamponamento de pH (por exemplo, aminoácidos) e/ou solubilizantes ou agentes de estabilização (por exemplo, tensoativos não- iônicos, tais como tween ou açúcares como a sacarose, trealose, ou similares). Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, drágeas, cápsulas, pós, formulações de liberação controlada e etc. A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes e veículos tradicionais, como os triglicerídeos. A formulação oral pode incluir veículos padrões, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e etc. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados estão descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por EW Martin. Tais composições irão conter uma quantidade terapeuticamente eficaz de ácido nucleico ou proteína, geralmente na forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada de veículo de modo a fornecer uma forma para uma administração apropriada ao paciente. As formulações correspondem ao modo de administração.

[0137] Normalmente, composições para a administração intravenosa são soluções em tampão isotônico estéril aquoso. Quando necessário, o farmacêutico também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local como a lidocaína para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados na forma de dosagem unitária, por exemplo, na forma de pó liofilizado ou um concentrado em um recipiente hermeticamente fechado, como uma ampola ou sachette indicando a quantidade de agente ativo. Quando o farmacêutico deve ser administrado por infusão, pode ser dispensado com uma garrafa de infusão contendo água grau farmacêutico estéril ou salina. Quando o composto farmacêutico é administrado por injeção, uma ampola de água esterilizada para injeção ou solução salina pode ser fornecida para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[0138] A quantidade de agente que é eficaz no tratamento e profilaxia do câncer pancreático ou de ovário pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Além disso, ensaios in vitro podem, opcionalmente, ser empregados para ajudar a identificar os intervalos de dosagem ideal. A dose precisa que deve ser empregada na formulação também depende da via de administração, e o estádio do câncer pancreático ou de ovário, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e com as circunstâncias de cada paciente. Doses eficazes podem ser extrapoladas a partir da curva dose- resposta derivadas de sistemas de ensaio in vitro ou de modelos animais.Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração circulante no plasma que inclui o ICso (ou seja, a concentração do composto de ensaio que atinge a metade da inibição máxima dos sintomas), conforme determinado em cultura de células.

[0139] Por exemplo, a toxicidade e eficácia terapêutica dos agentes podem ser determinadas em culturas de células ou modelos experimentais em animais por procedimentos farmacêuticos padrão para a determinação da LDso (dose letal para 50% da população) e EDso (dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A relação de dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresso como a proporção LD50/ED50. Agentes que exibem grande índice terapêutico são os preferidos. Quando um agente exibe efeitos colaterais tóxicos, um sistema de entrega que direciona o agente para o local do tecido afetado pode ser usado para minimizar os possíveis danos às células que não expressam CD70 e, assim, reduzindo os efeitos colaterais.

[0140] Geralmente, a dosagem de um anticorpo, derivados ou ADC administrado a um paciente com câncer expressando CD70 é tipicamente de 0,1 mg/kg a100 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Mais tipicamente, a dose administrada a um indivíduo é de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo, ainda mais tipicamente de 0,1 mg/kg a 5 mg/kg ou 0,1 mg/kg a 3 mg/kg do peso corporal indivíduo. Geralmente, os anticorpos humanos possuem uma meia-vida maior no corpo humano do que os anticorpos de outras espécies devido à resposta imune às proteínas estranhas. Assim, doses menores de ADCs compreendendo anticorpos humanizados, ou quiméricos humano e administração menos frequente é frequentemente possível.

[0141] Os anticorpos para CD70, derivados e ADCs também podem ser administrados em combinação com um ou mais agentes terapêuticos para o tratamento ou profilaxia do câncer pancreático ou de ovário. Por exemplo, a terapia combinada pode incluir um segundo agente citostático ou citotóxico (por exemplo, um agente citostático ou citotóxico não conjugado, tal como os convencionalmente usados para o tratamento dos cânceres). A terapia combinada também pode incluir, por exemplo, a administração de um agente que tem como alvo outro complexo receptor que não o receptor de CD70 na superfície das células cancerosas que expressam CD70. Normalmente, esse um anticorpo ou ligante se liga a um receptor na superfície celular em células de câncer que expressam CD70 e aumenta o efeito citotóxico ou citostático do anticorpo anti-CD70, entregando um sinal citostático ou citotóxico para as células de câncer que expressam CD70.

[0142] Outras drogas que podem ser administradas com o agente incluem os inibidores do fator de crescimento, ou fatores anti-angiogênicos. Por exemplo, uma droga chamada erlotinib, um inibidor do receptor tirosina quinase do fator de crescimento epidérmico, pode ser usada para tratar o câncer pancreático avançado. (Bareschino , 2007, Ann Oncol. Suppl 6: 35-41.) Tal administração combinatória pode ter um efeito aditivo ou sinérgico sobre os parâmetros da doença (por exemplo, a gravidade de um sintoma, o número de sintomas, ou a frequência de recidiva).

[0143] Os métodos da presente invenção podem ser combinados com outros meios de tratamento, como a cirurgia, radioterapia, terapia direcionada, imunoterapia, uso de inibidores de fatores de crescimento, ou fatores anti-angiogênicos.

[0144] A cirurgia é um tratamento preferencial e é frequentemente necessária para obter uma amostra de tecido para o diagnóstico diferencial através da histologia. A melhora da sobrevida é atribuída a um estadiamento mais preciso da doença e uma maior taxa de ressecção cirúrgica agressiva de tumor no abdômen. O tipo de cirurgia depende de quão disseminado o câncer está quando é diagnosticado (o estádio do câncer), bem como o tipo presumido e o grau do câncer.

[0145] Para os pacientes que sofrem de adenocarcinoma pancreático, o cirurgião pode realizar o procedimento de Whipple (também chamado de Pancreaticoduodenectomia). Neste procedimento, a cabeça do pâncreas e, por vezes, o corpo do pâncreas são removidos juntamente com partes do estômago e intestino delgado, vesícula biliar, parte do duto biliar comum, e de alguns gânglios linfáticos vizinhos. (Vide, por exemplo, Michalski et al., 2007, Nat. Clin. Pract.Oncol. 4(9):526-35). Para os pacientes que sofrem de tumores endócrinos do pâncreas (tumor de células da ilhota), a cirurgia é uma opção viável. (Vide, por exemplo, Akerstrom e Hellman, 2007, Best Pract. Res. Clin. Endocrinol.Metab. 21(1):87-109.)

[0146] Em pacientes com câncer de ovário, o cirurgião pode remover um (ooforectomia unilateral) ou ambos os ovários (ooforectomia bilateral), as trompas de falópio (salpingectomia) e útero (histerectomia). Para alguns tumores muito precoces, como o estádio I, apenas o ovário e a trompa de Falópio envolvidos serão removidos ("salpingo-ooforectomia unilateral", OSU), especialmente em mulheres jovens que desejam preservar sua fertilidade. Em neoplasias em estado avançado, onde a ressecção completa não foi possível, a maior quantidade possível de tumor é removida (cirurgia de redução de volume ou debulking). Nos casos em que este tipo de cirurgia é bem-sucedido, o prognóstico é melhor em relação aos pacientes onde grandes massas tumorais (mais de 1 cm de diâmetro) são deixadas. Técnicas cirúrgicas minimamente invasivas podem facilitar a remoção segura de tumores muito grandes (maiores que 10 cm) com menos complicações oriundas da cirurgia. (Vide, por exemplo, Ehrlich etal., 2007, J. Pediatr. Surg. 42 (5): 890-3.)

[0147] A quimioterapia refere-se ao uso de drogas anti-câncer ou citotóxicas para matar células cancerosas. A quimioterapia pode ser administrada ao paciente antes ou após a cirurgia. Dependendo da histologia do tumor, alguns tipos de tumores (especificamente o teratoma) não são sensíveis à quimioterapia. A quimioterapia intravenosa com drogas, como, por exemplo, a gemcitabina, 5-flourouracil, cisplatina e mitomicina C pode ser usada para tratar o câncer de pancreático. A quimioterapia intravenosa tal como a gemcitabina, topotecano, doxorrubicina, doxorrubicina lipossomal, carboplatina, paclitaxel pode ser usada para tratar o câncer de ovário. A quimioterapia, que é parcialmente por via intravenosa e parcialmente por via intraperitoneal, também pode melhorar o tempo médio de sobrevida.(The Chemotherapy Source Book (3a Edição). Ed. Perry. Lippincott, Williams e Wilkins, 2001; Oxford Textbook of Palliative Medicine. (2° Ed.) Derek Doyle et al. Oxford University Press. 1999.).

[0148] A radioterapia é um tratamento com raios de alta energia, tal como raios-x, para matar ou diminuir as células cancerosas, enquanto causa o menor dano possível nas células normais. A radiação pode ser dada ao paciente antes ou após a cirurgia. A radioterapia também pode ser usada para tratar o câncer pancreático que não se espalhou, mas não pode ser removido por cirurgia. A radioterapia não é usada frequentemente para tratar o câncer de ovário, mas ocasionalmente pode ser usada, se for apropriada. A combinação de radiação e quimioterapia pode ser utilizada para os pacientes cujos tumores são muito difusos para serem removidos por cirurgia.

[0149] Um anticorpo anti-CD70, derivado ou ADC pode ser administrado concomitantemente a um paciente submetido a cirurgia, quimioterapia ou tratamentos radioterápicos. Alternativamente, o paciente pode se submetido a cirurgia, quimioterapia ou radioterapia antes ou após a administração de um anticorpo anti-CD70, derivado ou ADC, pelo menos, uma hora e até vários meses, por exemplo, pelo menos, uma hora, cinco horas, 12 horas, um dia, uma semana, um mês ou três meses, antes ou após a administração do ADC ou derivado de ADC.

VII. KITS

[0150] A presente invenção fornece kits diagnósticos para uso com os métodos de detecção descritos acima. Os kits contêm tipicamente um anticorpo ou fragmento deste, que se liga especificamente ao CD70 desnaturado útil para a detecção, conforme descrito anteriormente. Um ou mais recipientes adicionais podem incluir elementos, tais como reagentes ou tampões, para serem usados no ensaio. Esses kits também podem, ou, alternativamente, contêm um reagente de detecção, que contém um grupo repórter adequado para a detecção direta ou indireta da ligação do anticorpo.

[0151] A presente invenção ainda fornece kits farmacêuticos para o tratamento de cânceres de pâncreas e de ovário. Normalmente, tais kits contêm reagentes formulados como uma composição terapêutica conforme descrito na presente invenção, e pode ser de qualquer uma dentre uma variedade de formas adequadas para a distribuição de um kit. Tais formas podem incluir um pó, líquido, comprimido, suspensão e formulações similares para fornecer os agentes, tais como anticorpos anti-CD70, derivados deste ou ADCs. Os kits também podem incluir um diluente farmaceuticamente aceitável (por exemplo, água destilada) para a reconstituição da injeção, ou diluição do anticorpo liofilizado, derivados destes ou ADCs.

[0152] A presente invenção fornece ainda kits combinados para o diagnóstico e terapia. Esses kits incluem geralmente pelo menos um anticorpo que se liga mais preferencialmente ao CD70 desnaturado em relação ao CD70 nativo para uso na detecção em cortes de tecidos fixados e um anticorpo diferente que se liga ao CD70 nativo pelo menos tão bem se não melhor do que o anticorpo para o CD70 desnaturado para uso no tratamento.

[0153] Os kits também contêm normalmente um rótulo ou instruções para uso dos métodos de detecção e/ou tratamento, descritos na presente invenção. O rótulo ou instrução se refere a qualquer material escrito ou gravado que é anexado a, ou que acompanha o kit, a qualquer momento durante a sua fabricação, transporte, venda ou utilização. Ele pode ser um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, que reflete um aviso de aprovação pelo órgão de fabricação, uso ou venda para administração a seres humanos. O rótulo ou instrução pode englobar também folhetos publicitários e brochuras, bulas e materiais de embalagem, instruções, cassetes de áudio ou vídeo, discos de computador, bem como a escrita impressa diretamente sobre os kits farmacêuticos.

[0154] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não pretendem limitar o escopo da presente invenção. As linhagens celulares descritas nos exemplos a seguir foram mantidas em cultura de acordo com as condições estabelecidas pela Coleção Americana de Cultivo de Tipo (American Type Culture Collection - ATCC) e pela Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas de Células (Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH - DMSZ) Braunschweig, Alemanha. Os reagentes de cultura de células foram obtidos da Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, ou de outros fornecedores.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS SG21.1C1.B3 E SG-21.5D12.C3.

[0155] Os anticorpos monoclonais SG-21.1C1.B3 e SG21.5D12.C3 foram produzidos usando células-B do baço ou linfonodos retirados de um camundongo que foi desafiado várias vezes com o imunógeno, domínio extracelular do CD70 desnaturado (CD70-ECD). Essas células B foram fundidas com células tumorais de mieloma para produzir hibridomas.Desse modo, um grande número de anticorpos monoclonais foi produzido a partir desses hibridomas.Os hibridomas foram diluídos para garantir a clonalidade e crescimento.

[0156] Os anticorpos de diferentes clones foram testados quanto à capacidade de se ligar ao antígeno CD70 desnaturado pelo uso de um teste como o teste ELISA utilizando Flag-CD70, ou uma seleção diferencial por FMAT (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando células 293F fixadas expressando CD70 de macaco cinomolgo ("cyno") e L540cy desnaturadas que expressam CD70. As células 293F e L540cy não transfectadas foram utilizadas como controle negativo. (Algumas células L540cy foram positivas para CD70).

[0157] Os resultados mostraram que mais de 100 hibridomas testados foram positivos por suas capacidades de se ligar ao CD70 desnaturado. Anticorpos de dois hibridomas positivos, SG-21.1C1.B3 ("1C1") e SG- 21.5D12.C3 (5D12), foram selecionados para a imunohistoquímica.

EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS FIXADAS EM FORMALINA E EMBLOCADAS EM PARAFINA (FFPE)

[0158] Os tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina foram preparados de acordo com métodos padronizados, conforme descrito em Theory and Practice of Histotechnology, Segunda Edição.1980, Sheehan, D.C. e Hrapchak, B.B., (Battelle Press (Columbus, OH). Capitulo 3, págs. 59-78).

[0159] A preparação de células por FFPE foi semelhante à preparação do tecido. Resumidamente, as células foram semeadas em meios de cultura adequados a cerca de 15.000 células/poço um dia antes da fixação. As células foram fixadas da seguinte forma: As células foram lavadas 2X com PBS e, em seguida fixadas com formol a 10% em temperatura ambiente por 45 minutos. Posteriormente, as células foram lavadas 2x com PBS e, em seguida, permeabilizadas com PBS + Triton X-100 a 0,5% em temperatura ambiente por 15 minutos. As células foram então lavadas com PBS 1 x, e armazenadas em PBS + 0,02% de azida sódica a 4 °C. Antes da triagem FMAT, o PBS + azida foi retirado e a placa foi bloqueada com PBS + 5% de soro de cabra em temperatura ambiente por 30 minutos.

EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DE MICROARRANJOS TECIDUAIS (TISSUEMICROARRAYS) PARA IMUNOHISTOQUÍMICA

[0160] Microarranjos teciduais de secções de tecidos FFPE foram obtidos de fontes comerciais, incluindo a US Bíomax, TriStar ou Cybrdi.Os microarranjos teciduais também são preparados de acordo com os Protocolos de Construção de Microarranjos Teciduais de Yale, Versão 1.0, e atualizações posteriores.

EXEMPLO 4 DESENVOLVIMENTO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS SG21.1C1.B3 E SG-21.5D12.C3 COMO REAGENTES PARA IMUNOHISTOQUÍMICA DE AMOSTRAS FFPE A. TESTE DE IMUNOHISTOQUÍMICA DE CLONES CD70.

[0161] Uma construção de expressão codificando o CD70 de macaco cinomolgo foi feita pela clonagem de um gene CD70 de cinomolgo de comprimento total em um vetor de expressão. Esta construção foi transfectada em células 293F. Estas células 293F:CD70-transfectadas serviram como controle positivo para a imunocoloração com anticorpos 1C1 e 5D12. A linhagem de células 293F parentais serviram como controle negativo. Para coloração de tecidos, células que expressam CD70, serviram como controle positivo.

[0162] As células e tecidos foram fixados e emblocados em parafina de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 2. A imunocoloração por IHC e a recuperação antigênica foi realizada utilizando o sistema comercial “Vision BioSystems Bond-max™ system” (agora Leica Microsystems). A recuperação antigênica foi realizada por 40 minutos utilizando o método de recuperação em EDTA. Alternativamente, a recuperação antigênica foi realizada utilizando o sistema de recuperação antigênico “Trilogy antigen retrieval system" (Cell Marque, Hot Springs, AR) a uma temperatura de 99 a 100 °C por 1 hora.

[0163] Tanto o anticorpo 1C1 primário quanto o anticorpo 5D12 primário marcaram fortemente todas as células 293F:CD70-transfectadas fixadas, ao passo que nenhuma marcação foi detectada nas células 293 parentais. Os resultados também mostraram forte marcação nas células 786-0 (uma célula de carcinoma renal), enquanto que uma coloração de fundo foi detectada em um controle de xenoenxerto Ramos.

[0164] O clone 1C1 foi adicionalmente subclonado e um subclone, 1C1-B3 (SG-21.1C1.B3) foi selecionado. Da mesma forma, o 5D12 foi adicionalmente subclonado e um subclone, 5D12-C3 (SG-21.5D12.C3) foi selecionado. Estes dois subclones foram purificados e utilizados como anticorpo primário para marcação das amostras 786-0 e xenoenxerto Ramos. Os resultados mostraram que a subclonagem e purificação do 1C1-B3 e 5D12-C3 removeram a coloração de fundo no xenoenxerto Ramos.

[0165] Hibridomas que produzem os anticorpos anti-CD70 foram depositados na Coleção Americana de Cultura de Tipos (ATCC) na 10.801 University Boulevard Manassas, VA 20110-2209. A linhagem celular designada SG-21.1C1.B3, produzindo o anticorpo 1C1 recebeu o número acesso ATCC: PTA-8733 que foi depositada na ATCC em 24 de outubro de 2007; linhagem celular designada SG-21.5D12.C3 produzindo o anticorpo 5D12 teve o número de acesso ATCC: PTA-8734 que foi depositada na ATCC em 24 de outubro de 2007.

B. WESTERN BLOT COM OS ANTICORPOS SG-21 1C1 E 5D12 E COMPARAÇÃO COM O ANTICORPO 2B3.

[0166] Para determinar se os anticorpos SG-21 1C1 e anticorpos 5D12 detectam CD70 em lisados de células e tecidos, experimentos de Western blots foram realizados. Outro anticorpo que se liga ao CD70, o 2B3, também foi usado para comparação. As preparações de membrana foram preparadas a partir de células 786-0, células 293F:cynoCD70 (expressando CD70 cyno) e células 293F como controle negativo. Para preparar os extratos de membrana, as células foram lisadas em solução tampão hipotônica e centrifugadas a 10.000 xg por 10 minutos a 4 °C para remover os resíduos.Os sobrenadantes foram então centrifugados a 100.000 xg por 30 minutos a 4 °C para agregar as frações de membrana. As frações de membrana (sedimento) foram dissolvidas em NP40 a 0,5% em 50 mM de Tris acrescido de 150 mM de NaCI e 5 mM de EDTA. Toda a preparação da amostra foi feita na presença de inibidores da protease para manter o CD70 intacto. A quantidade de proteínas foi mensurada a 570 nm usando um kit BCA (Pierce). O ECD CD70 (domínio extracelular do CD70) e o ECD-CD70 marcado com FLAG também foram preparados por métodos convencionais. As amostras de proteína foram desnaturadas a 90 °C por 3 minutos e resfriadas em gelo por 3 minutos.As amostras foram separadas por SDS-PAGE e em seguida transferidas para uma membrana de nitrocelulose para a detecção.Quatro géis SDS-PAGE e membranas idênticas foram preparadas. As membranas foram bloqueadas em PBS com BSA 1% e leite desnatado 2% com 0,05% de Tween (polissorbato). Cada anticorpo primário foi então adicionado à solução a 0,5 pg/ml e incubado durante quatro horas em temperatura ambiente em PBS com 0,05% de Tween. As membranas foram lavadas e um conjugado anticorpo secundário-enzima, que reconheceu o anticorpo primário foi adicionado e incubado por 45 minutos em temperatura ambiente. As membranas foram lavadas e incubadas com o substrato quimioluminescente para detecção do CD70.

[0167] Referindo-se a Figura 1, os resultados mostraram que os anticorpos SG-21 1C1 e anticorpos 5D12 detectaram CD70 nas células 786-0 e 293F:CD70-transfectadas, mas não no controle negativo de células 293F. Notavelmente, as bandas detectadas foram de tamanho idêntico nas células 786-0 e 293F:CD70-transfectadas. O anticorpo SG-21 2B3 não detectou CD70 nas amostras 786-0 e 293:cynoCD70, mas detectou o ECDCD70 e ECD-CD70- Flag. 0 resultado indicou que os anticorpos 1C1 e 5D12 detectaram o CD70 nas amostras.

C. EXPRESSÃO DE CD70 EM CÉLULAS TUMORAIS E NÃO TUMORAIS UTILIZANDO O ANTICORPO SG21.1C1

[0168] Os microarranjos teciduais foram obtidos de fontes comerciais ou preparados sob encomenda contendo amostras dos seguintes cânceres: Carcinoma de mama, carcinoma ovariano, Mesotelioma, Osteossarcoma, carcinoma de próstata, carcinoma hepatocelular Glioblastoma, Astrocitoma Anaplásico, Câncer uterino, câncer embrionário, Carcinoma epidermoide, Mieloma Múltiplo, linfoma de Hodgkin Linfoma não-T, Linfoma não- B, todos os Linfomas Histiocíticos, Linfoma não-Hodgkin (NHL), linfoma de Burkitt, linfoma folicular (NHL), Leucemia Mieloide Aguda (LMA), linfoma anaplásico de grandes células (ALCL), eritroleucemia, Carcinoma de Cólon, câncer de pulmão de não pequenas células (NSCLC), câncer de pulmão de pequenas células (SCLC), Carcinoma de Células Renais (RCC), RCC do tipo células claras, RCC do tipo papilar, Melanoma, Carcinoma pancreático e Carcinoma de bexiga. As seguintes células ou linhagens de células também foram utilizadas: linhagens de células linfoblastoides B transformadas pelo vírus Epstein-Barr (EBV-LCL), células normais do epitélio mamário humano (HMEC), células endoteliais vasculares humanas normais (HUVEC), células mononucleares de sangue normal (PBMC), células endoteliais aórticas humanas normais (HAEC), células endoteliais renais humanas normais (HREC), células endoteliais da microvasculatura do pulmão humano normais (HMVEC-L), células endoteliais microvasculares dérmicas neonatais humanas normais (HMVEC neo-) e células endoteliais da artéria pulmonar humanas normais (HPAEC).

[0169] Os microarranjos teciduais foram imunomarcados com os anticorpos SG21.1C1 utilizando o protocolo descrito acima. A coloração foi observada nas seguintes linhagens de células: Linhagem de células de carcinoma ovariano SK-OV-3; linhagem de células de Glioblastoma GMS-10; linhagem de células de Mieloma Múltiplo LB, LP-1, AMO-1,1-310 (MM.1R), C2E3 (MM.1S), MOLP-8 , JJN-3 e L363, linhagem de células de linfoma de Hodgkin KMH2, HS445, RPMI-1666, L248 e HD-M-YZ, EBV-LCL WIL2-S, Farage e MI-9, NHL; linhagem de células folicular WSU-NHL; linhagem de células RCC do tipo células claras caki-1, caki-2, 786-0 e 769-P; linhagem de células OCR do tipo papilar CAL54, A498; RCC SK-RC-6 e SK-RC-7; linhagem de células de melanoma A375SM e A375M, linhagem de células de carcinoma pancreático PANC-1 e de carcinoma de bexiga T24. A coloração de algumas linhagens de células não identificadas foi fraca ou mista.Algumas linhagens de células apresentaram marcação citoplasmática. Para a imunocoloração das linhagens de células de pâncreas e ovário, vide as Figuras 2 e 3, respectivamente.

D. COLORAÇÃO COMPARATIVA ENTRE OS ANTICORPOS 1C1 E 5D12

[0170] Os anticorpos 1C1 e 5D12 tiveram suas colorações (imunomarcação) comparadas nas linhagens de células 293F, 293F-cynoCF0, RCC caki-1, linhagens de células de tonsila normal, de músculo esquelético, bexiga, tecidos linfoides (linfonodos, timo, baço) de macacos Cinomolgos normais, linhagens de células normais de timo, rim e tecidos do músculo esquelético humano e tecidos de tumor pancreático. O protocolo de imunohistoquímica foi realizado conforme descrito anteriormente.

[0171] Os resultados mostraram que as colorações de 1C1 e 5D12 foram semelhantes nas linhagens de células 293F e 293-cyno-CD70 (dados não mostrados); RCC caki-1 e tecidos amigdalianos de cinomolgos (dados não mostrados); tecidos linfoides (linfonodos, timo, baço) de macacos Cinomologos normais (dados não mostrados) e tecidos de tumor pancreático (vide Figura 4). Uma coloração diferencial entre 1C1 e 5D12 foi observada nos tecidos de músculo esquelético normal de humanos e de macaco e no tecido da bexiga de macaco normal, de modo que os tecidos foram corados pelo 5D12, mas não pelo 1C1. A coloração diferente também foi observada em tecidos normais do timo humano de tecidos de rins em que o 5D12 corou o citoplasma.

EXEMPLO 5 EXPRESSÃO DE CD70 EM TECIDO DE CÓLON NORMAL E EM TECIDO DE CÂNCER COLORRETAL E EM TECIDO PE PÂNCREAS NORMAL E PE CÂNCER PANCREÁTICOCOM O ANTICORPO 1C1

[0172] Antes de avaliar todo o painel de tecidos tumorais de diferentes tipos de cânceres, a expressão do CD70 foi inicialmente testada em câncer de cólon e de pâncreas. O protocolo de imuno-histoquímica foi realizado conforme descrito no Exemplo 4. O Cromógeno utilizado para estes estudos foi o Fast Red.

[0173] Os resultados mostraram que no cólon normal, apenas raros linfócitos foram corados positivamente para CD70.Outras células foram negativas para CD70.Em uma amostra de tecido de câncer de cólon, as células tumorais foram positivamente coradas.Em uma segunda amostra de tecido de cólon, as células tumorais foram coradas negativamente.Da mesma forma, em tecidos normais de pâncreas, a coloração foi negativa para CD70. Em uma amostra de tecido de câncer pancreático, as células tumorais foram positivas e em uma segunda amostra, as células tumorais foram negativas, mas o estroma foi marcado positivamente. (Vide a Figura 5).

EXEMPLO 6 EXPRESSÃO DE CD70 EM TECIDOS TUMORAIS COM O ANTICORPO SG21.1C1

[0174] Os tecidos tumorais foram obtidos a partir dos seguintes tipos de tumores: Linfoma de Hodgkin, de rim, linfoma, mieloma múltiplo, de pâncreas laringe/faringe, ovário, cólon e mama. Os tecidos normal e tumoral foram preparados de acordo com o protocolo de arranjo tecidual descrito no Exemplo 3 e o protocolo de imunohistoquímica foi como descrito no Exemplo 4A. O anticorpo 1C1 foi utilizado como anticorpo primário. A expressão por imunohistoquímica (IHQ) foi posteriormente avaliada com base na intensidade da coloração e percentagem de tumor envolvido. A intensidade de coloração foi classificada de 1 a 4, com 1 indicando um mínimo de coloração; 2 coloração leve, 3 coloração moderada e 4 coloração forte. O percentual de tumor envolvido também foi classificado de 1 a 4, com 1 indicando 0-5%; 2 de 5 a 25%, 3 de 25 a 75% e 4 de 75% a 100%. As medidas foram qualitativas. Para o linfoma de Hodgkin, a expressão por IHC das células CD70 positivas foi analisada com base na avaliação de células de Reed-Sternberg. As células de Reed-Sternberg são grandes células de origem desconhecida, geralmente multinucleadas, cuja presença é a característica histológica comum do linfoma de Hodgkin.

[0175] Os tecidos tumorais de linfoma de Hodgkin apresentaram o maior percentual (97% ou 33/34) de células tumorais CD70- positivas sobre o total de células tumorais. O tumor de rim teve o segundo maior percentual (70% ou 14/20) de células tumorais CD70-positivas sobre o total de células tumorais. O linfoma teve o terceiro maior percentual (61% ou 72/119) de células tumorais CD70 positivas sobre o total de células tumorais. O Mieloma Múltiplo teve o quarto maior percentual (42% ou 13/31) de células tumorais CD70-positivas sobre o total de células tumorais. O câncer de pâncreas teve o quinto maior percentual (25% ou 35/140) de células tumorais CD70-positivas sobre o total de células tumorais.

[0176] A Figura 6 ilustra um gráfico de intensidade de coloração e % de coloração do tumor para 35 das 140 amostras de pâncreas que deram sinal positivo para CD70. A figura 7 exibe uma complexa relação entre a intensidade de coloração e a percentagem de coloração do tumor. Ou seja, alguns tumores têm uma alta porcentagem de células marcadas, mas baixa intensidade, outros têm uma baixa porcentagem de células marcadas, mas em alta intensidade, e outros mostram uma intermediária intensidade de coloração e porcentagem de células coradas. O câncer de laringe/faringe teve o sexto maior percentual (22% ou 18/82) de células tumorais CD70- positivas sobre o total de células tumorais. O câncer de ovário teve o sétimo maior percentual (15% ou 37/241) de células tumorais CD70-positivas sobre o total de células tumorais.

[0177] A Figura 7 ilustra a intensidade de coloração e porcentagem de coloração do tumor para 37 dos 241 cânceres ovarianos que coraram para CD70. Houve associação entre a intensidade da coloração e a porcentagem de células coradas. O câncer coloretal teve o sétimo maior percentual (9% ou 17/194) de células tumorais CD70-positivas sobre o total de células tumorais. O câncer de mama teve o percentual mais baixo (2% ou 5/204) de células tumorais CD70-positivas sobre o total de células tumorais.

[0178] Para resumir, com base em tumores CD70-positivos/total de tumores, a intensidade de marcação (expressão alvo celular), o percentual de participação do tumor CD70 positivo (expressão alvo tumoral), indicação geral de classificação dos tipos de tumor é a seguinte: Hodgkin > rim > Linfoma > Mieloma Múltiplo > pancreático > Laringe/faringe > ovário > Coloretal > mama. Os resultados de todos os tecidos tumorais estão são apresentados na Tabela 1.

TABELA 1 EXPRESSÃO DE CD70 EM DIVERSOS TIPOS DE CÂNCER

EXEMPLO 7 O CONJUGADO DROGA-H1F6 DEMONSTRA EFICÁCIA NA LINHAGEM DE CÉLULA DECARCINOMA OVARIANO

[0179] Para confirmar a eficácia do conhecido conjugado anticorpo anti-CD70-Droga contra a linhagens celulares representativas para esses novos cânceres, células SKOV-3 foram preparados e testadas conforme descrito anteriormente para as outras linhagens celulares. (Vide a Publicação Internacional de Patente WO 2006-113909). As células foram incubadas com os seguintes conjugados de droga-anticorpo anti-CD70: hi F6-VC-MMAF (4), h1F6vc-MMAE (4), 1 F6mc-MMAF (4), ou h1 F6mc-MMAF (8) ou MMAF livre. (Vide o relatório descritivo e os Pedidos de Patentes Publicados US 2005- 0238649 e US 2006-0233794 para obter uma descrição de Ligantes de drogas. O número entre parênteses após cada conjugado indica a carga média de droga por anticorpo). As células SKOV-3 foram incubadas com os conjugados nas concentrações indicadas por 96 horas. Para estes estudos, a viabilidade foi determinada utilizando o kit Promega CelltiterGIo.

TABELA 2

[0180] Referindo-se a Figura 8, todos os quatro ADCs anti-CD70 foram ativos contra esta linhagem de células de câncer ovariano.Com relação a Tabela 2, os são exibidos os valores de ICso.Estes valores de ICso são consistentes com aqueles reportados por outras linhagens de células tumorais expressando CD70. Estes resultados confirmam que os ADCs anti-CD70 ligados ao CD70 nesta linhagem de células cancerosas é internalizado e libera a carga de auristatina.

EXEMPLO 8 O CONJUGADO DROGA-H1F6 DEMONSTRA EFICÁCIA NA LINHAGEM DE CÉLULA DE CARCINOMA PANCREÁTICO TRANSFECTADAS COM CD70

[0181] Para confirmar a eficácia dos conjugados droga-anticorpo anti-CD70 conhecidos contra linhagens celulares representativas, as linhagens de células pancreáticas HPAFII, PANC-1 e MiaPaCa-2 foram transfectadas com um ácido nucleico que codifica o CD70 de cinomolgo modificado. As células MiaPaCa-2 não expressaram níveis detectáveis de proteína CD70. O h1F6 se liga a proteína CD70 nativa expressa por esta linhagem de células transfectada. A expressão de CD70 pelas linhagens de células transfectadas foi confirmada pela análise por FACS (dados não mostrados). A atividade do h1F6 mc-MMAF (4) (SGN-75) foi avaliada em linhagens de células pancreáticas transfectadas descritas anteriormente de maneira geral para outras linhagens celulares. (Vide a o Exemplo 7 e Publicação Internacional de Patente WO 2006-113909). O número entre parênteses após o conjugado indica a carga média de droga por anticorpo). Com relação as Figuras 9A-C As células SKOV-3 foram incubadas com os conjugados nas concentrações indicadas por 96 horas. Referindo-se a Figura 9A, é exibida a atividade do conjugado nas células HPAFII transfectadas. A viabilidade foi determinada utilizando o kit Promega CelltíterGIo. Referindo-se as Figura 9B e 9C, é exibida a atividade do conjugado nas células PANC-1 e MiaPACa-2 transfectadas. Para estes estudos, a viabilidade celular foi determinada utilizando a rezasurina, conforme descrito anteriormente. A atividade de PANC-1 da Promega CelltíterGIo. O conjugado exibiu atividade citotóxica em todas estas linhagens de células in vitro.

EXEMPLO 9 O CONJUGADO DROGA-H1F6 DEMONSTRA EFICÁCIA EM MODELOS DE XENOENXERTO DE CÂNCER PANCREÁTICO

[0182] Camundongos Nude (nu/nu) fêmeas (7 animais/grupo) foram implantados com os pedaços dos tumores MiaPaCa transfectados com CD70 (preparado conforme descrito no Exemplo 8) através de trocárte inserido no flanco lateral direito.A dosagem tanto com SGN-75 quanto com controle ADC não ligante (3 mg/kg) iniciou quando os tumores atingiram 100 mm (q4d x 4 ip). O volume dos tumores foi monitorado e os animais foram sacrificados quando o volume do tumor atingiu 1000 mm. Referindo-se a Figura 10, os dados foram plotados em duas formas: A. As plotagens do volume tumoral médio foram continuadas por cada grupo até que um ou mais animais foram sacrificados. B. a curva de Kaplan-Meier mostra o tempo para o tumor atingir 800 mm para animais individuais em cada grupo. O tratamento com SGN-75 foi eficaz neste modelo de xenoenxerto.

[0183] O escopo da presente invenção não é limitado pelos exemplos de realizações específicos descritos na presente invenção. Várias modificações da presente invenção além daquelas exibidas e descritas no presente tornar-se-ão evidentes para os técnicos do assunto a partir das descrições anteriormente expostas e figuras anexas. Tais modificações visam também serem abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas. Salvo quando aparentemente diverso a partir do contexto, qualquer etapa, elemento, exemplo de realização, característica ou aspecto da presente invenção pode ser usado em combinação com qualquer outro. Todos os pedidos de patentes e publicações científicas, números de acesso e similares referidos na presente invenção são incorporados a este pela referência, em sua totalidade para todos os efeitos com a mesma abrangência, como se fosse individualmente indicado.

Claims (6)

1. ANTICORPO MONOCLONAL, caracterizado por se ligar especificamente ao CD70 humano desnaturado em uma amostra células ou tecidos fixados em formalina, emblocados em parafina que expressam o CD70 humano, e que possuem regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da região variável de cadeia pesada possuindo as sequências de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia pesada do anticorpo SG-21.1C1 e CDRs da região variável de cadeia leve possuindo as sequências de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia leve do anticorpo SG-21.1C1 como produzido pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-8733, ou CDRs da região variável de cadeia pesada possuindo sequência de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia pesada do anticorpo SG-21.5D12 e CDRs da região variável de cadeia leve possuindo sequência de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia leve do anticorpo SG-21.5D12 como produzido pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA- 8734.

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser o anticorpo SG-21.1C1 como produzido pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-8733.

3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser o anticorpo SG-21.5D12, como produzido pelo hibridoma depositado na ATCC sob o número de acesso PTA-8734.

4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a região variável de cadeia pesada que é a região variável de cadeia pesada do anticorpo SG-21.1C1, e uma região variável de cadeia leve que é a região variável de cadeia leve do anticorpo SG-21.1C1.

5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a região variável de cadeia pesada que é a região variável de cadeia pesada do anticorpo SG-21.5D12, e uma região variável de cadeia leve que é a região variável de cadeia leve do anticorpo SG- 21.5D12.

6. MÉTODO DE DETECÇÃO DA EXPRESSÃO DE CD70, em uma amostra de tecido, caracterizado por compreender: fixar uma amostra de tecido de pâncreas, ovário, pulmão, laringe, faringe, mama, rim, cérebro, cólon, sangue ou pele, e desnaturar o CD70 em uma amostra de tecido;contatar a amostra de tecido fixado com um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5; e detectar a ligação do anticorpo à amostra de tecido fixado para determinar se o CD70 está expresso na amostra, que a expressão de CD70 em uma amostra de tecido fixado indica a probabilidade de o paciente ter um câncer que expressa CD70,em que a amostra é fixada com formalina e emblocada em parafina.

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