EA016186B1 - Человеческие моноклональные антитела к cd70 и их применение - Google Patents

Человеческие моноклональные антитела к cd70 и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA016186B1
EA016186B1 EA200800953A EA200800953A EA016186B1 EA 016186 B1 EA016186 B1 EA 016186B1 EA 200800953 A EA200800953 A EA 200800953A EA 200800953 A EA200800953 A EA 200800953A EA 016186 B1 EA016186 B1 EA 016186B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
cells
antibodies
human
variable region
Prior art date
Application number
EA200800953A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200800953A1 (ru
Inventor
Джонатан Александер Терретт
Ли-Шэн Лу
Дэвид Джон Кинг
Жозефин М. Кардарелли
Чинь Пань
Хайчунь Хуан
Марко А. Коччия
Original Assignee
Медарекс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Медарекс, Инк. filed Critical Медарекс, Инк.
Publication of EA200800953A1 publication Critical patent/EA200800953A1/ru
Publication of EA016186B1 publication Critical patent/EA016186B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

В настоящем изобретении предлагаются выделенные моноклональные антитела, в особенности человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с CD70 с высокой степенью сродства. Также предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела по изобретению, предлагаются экспрессирующие векторы, клетки-хозяева и способы экспрессии антител по изобретению. Также предлагаются иммуноконъюгаты, биспецифичные молекулы и фармацевтические композиции, включающие антитела по изобретению. В изобретении также предлагаются способы лечения рака, аутоиммунного заболевания, воспаления и вирусных инфекций.

Description

В настоящем изобретении предлагаются выделенные моноклональные антитела. в частности человеческие моноклональные антитела. которые связываются с СЭ70 и которые проявляют многочисленные желаемые свойства. Эти свойства включают высокую степень сродства связывания с СЭ70 человека. Также предлагаются способы лечения множества заболеваний. опосредованных СЭ70. с применением антител и композиций по настоящему изобретению.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку. где антитело (а) связывается с СЭ70 человека с Кс 1 х 10-7 М или менее и (Ь) связывается с клетками опухолевой клеточной линии почечно-клеточной карциномы.
Предпочтительно антитело связывается с клетками опухолевой клеточной линии почечноклеточной карциномы. выбранной из группы. состоящей из 786-О (АТСС № доступа СКЕ-1932). А-498 (АТСС № доступа НТВ-44). АСШ (АТСС № доступа СКЕ-1611). Сак1-1 (АТСС № доступа НТВ-46) и Сак1-2 (АТСС № доступа НТВ-47).
Предпочтительно антитело представляет собой человеческое антитело. хотя в альтернативных воплощениях антитело может представлять собой мышиное антитело. химерное антитело или гуманизированное антитело.
В более предпочтительных воплощениях антитело связывается с СЭ70 человека с Кс 5.5х10-9 М или менее. или связывается с СЭ70 человека с Кс 3х10-9 М или менее. или связывается с СЭ70 человека с К 2х 10-9 М или менее. или связывается с СЭ70 человека с Кс 1.5х 10-9 М или менее.
В другом воплощении антитело интернализуется опухолевыми клетками 786-О почечно-клеточной карциномы после связывания с СЭ70. который экспрессируется на этих клетках.
В другом воплощении антитело связывается с клетками опухолевой клеточной линии В-клеток. Предпочтительно опухолевая клеточная линия В-клеток выбрана из группы. состоящей из клеточных линий ЭлиШ (АТСС № доступа ССЬ-213). НиТ 78 (АТСС № доступа Т1В-161). Кац (АТСС № доступа ССЬ-86) и Сгап!а-519 (Ό8ΜΖ № доступа 342).
В другом воплощении в настоящем изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок. где антитело перекрестно конкурирует с эталонным антителом за связывание с СЭ70. где эталонное антитело (а) связывается с СЭ70 человека с Кс 1х 10-7 М или менее и (Ь) связывается с клетками опухолевой клеточной линии почечно-клеточной карциномы.
- 1 016186
В многочисленных воплощениях эталонное антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕЦ ГО N0: 1; и (b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕЦ ГО N0: 6;
или эталонное антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕЦ ГО N0: 2; и (b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕЦ ГО N0: 7;
или эталонное антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕЦ ГО N0: 3; и (b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕЦ ГО N0: 8;
или эталонное антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕЦ ГО N0: 4; и (b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕЦ ГО N0: 9;
или эталонное антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕЦ ГО N0: 5; и (b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕЦ ГО N0: 10.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, включающим вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт гена Ун 3-30.3 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с СГО70. В настоящем изобретении также предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт гена Ун 3-33 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с СГО70. В настоящем изобретении также предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт гена Ун 4-61 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с СГО70. В настоящем изобретении еще дополнительно предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена Ук Ь6 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с СГО70. В настоящем изобретении еще дополнительно предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена Ук Ь18 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с СГО70. В настоящем изобретении дополнительно предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена Ук Ь15 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с СГО70. Предпочтительная комбинация включает:
a) вариабельный участок тяжелой цепи СТОК1, включающий 8ЕЦ ГО N0: 11;
b) вариабельный участок тяжелой цепи СГОВ2. включающий 8ЕЦ ГО N0: 16;
c) вариабельный участок тяжелой цепи 0ΌΚ3, включающий 8ЕЦ ГО N0: 21;
б) вариабельный участок легкой цепи 0ΌΒ1, включающий 8ЕЦ ГО N0: 26;
е) вариабельный участок легкой цепи 0ΌΒ2, включающий 8ЕЦ ГО N0: 31;
1) вариабельный участок легкой цепи 0ΌΚ3, включающий 8ЕЦ ГО N0: 36.
Другая предпочтительная комбинация включает:
a) вариабельный участок тяжелой цепи СТОК1, включающий 8ЕЦ ГО N0: 12;
b) вариабельный участок тяжелой цепи 0ΌΚ2, включающий 8ЕЦ ГО N0: 17;
c) вариабельный участок тяжелой цепи 0ΌΚ3, включающий 8ЕЦ ГО N0: 22;
б) вариабельный участок легкой цепи СТОК1, включающий 8ЕЦ ГО N0: 27;
е) вариабельный участок легкой цепи 0ΌΒ2, включающий 8ЕЦ ГО N0: 32;
1) вариабельный участок легкой цепи 0ΌΚ3, включающий 8ЕЦ ГО N0: 37.
Другая предпочтительная комбинация включает:
a) вариабельный участок тяжелой цепи СТОК1, включающий 8ЕЦ ГО N0: 13;
b) вариабельный участок тяжелой цепи 0ΌΚ2, включающий 8ЕЦ ГО N0: 18;
c) вариабельный участок тяжелой цепи 0ΌΚ3, включающий 8ЕЦ ГО N0: 23;
б) вариабельный участок легкой цепи СТОК1, включающий 8ЕЦ ГО N0: 28;
- 2 016186
е) вариабельный участок легкой цепи СЭВ2. включающий 8Е0 ГО N0: 33;
1) вариабельный участок легкой цепи СЭВ3. включающий 8Е0 ГО N0: 38.
Другая предпочтительная комбинация включает:
a) вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΒ1. включающий 8Е0 ГО N0: 14;
b) вариабельный участок тяжелой цепи СЭВ2. включающий 8Е0 ГО N0: 19;
c) вариабельный участок тяжелой цепи СЭВ3. включающий 8Е0 ГО N0: 24;
б) вариабельный участок легкой цепи СЭВ1. включающий 8Е0 ГО N0: 29;
е) вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΒ2. включающий 8Е0 ГО N0: 34;
1) вариабельный участок легкой цепи СЭВ3. включающий 8Е0 ГО N0: 39.
Другая предпочтительная комбинация включает:
a) вариабельный участок тяжелой цепи СОВ1. включающий 8Е0 ГО N0: 15;
b) вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΕ2. включающий 8Е0 ГО N0: 20;
c) вариабельный участок тяжелой цепи СЭВ3. включающий 8Е0 ГО N0: 25;
б) вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΕ1. включающий 8Е0 ГО N0: 30;
е) вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΕ2. включающий 8Е0 ГО N0: 35;
1) вариабельный участок легкой цепи СЭВ3. включающий 8Е0 ГО N0: 40.
Другие предпочтительные антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки включают:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи. включающий аминокислотную последовательность из 8Е0 ГО N0: 1; и (b) вариабельный участок легкой цепи. включающий аминокислотную последовательность из 8Е0 ГО N0: 6.
Другая предпочтительная комбинация включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи. включающий аминокислотную последовательность из 8Е0 ГО N0: 2; и (b) вариабельный участок легкой цепи. включающий аминокислотную последовательность из 8Е0 ГО N0: 7.
Другая предпочтительная комбинация включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи. включающий аминокислотную последовательность из 8Е0 ГО N0: 3; и (b) вариабельный участок легкой цепи. включающий аминокислотную последовательность из 8Е0 ГО N0: 8.
Другая предпочтительная комбинация включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи. включающий аминокислотную последовательность из 8Е0 ГО N0: 4; и (b) вариабельный участок легкой цепи. включающий аминокислотную последовательность из 8Е0 ГО N0: 9.
Другая предпочтительная комбинация включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи. включающий аминокислотную последовательность из 8Е0 ГО N0: 5; и (b) вариабельный участок легкой цепи. включающий аминокислотную последовательность из 8Е0 ГО N0: 10.
Антитела по изобретению могут представлять собой. например. полноразмерные антитела. например антитела изотипа Ι§01 или изотипа Ι§04. В качестве альтернативы антитела могут представлять собой фрагменты антитела. такие как ЕаЬ- или ЕаЬ'г-фрагменты. или могут представлять собой одноцепочечные антитела.
В изобретении также предлагается иммуноконъюгат. включающий антитело по изобретению или его антигенсвязывающий участок. связанные с терапевтическим агентом. таким как цитотоксин или радиоактивный изотоп. В изобретении также предлагается биспецифичная молекула. включающая антитело или его антигенсвязывающий участок по изобретению. связанные со вторым функциональным компонентом. обладающим специфичностью связывания. отличной от специфичности связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего участка.
Также предлагаются композиции. включающие антитело либо его антигенсвязывающий участок. или иммуноконъюгат. или биспецифичную молекулу по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Также охвачены настоящим изобретением молекулы нуклеиновой кислоты. кодирующие антитела или их антигенсвязывающие участки. а также экспрессирующие векторы. включающие такие нуклеиновые кислоты. также охвачены настоящим изобретением клетки-хозяева. включающие такие экспрессирующие векторы. и способы получения антител к ί.Ό70 с применением таких клеток-хозяев. Кроме того. в изобретении предлагается трансгенная мышь. включающая трансгены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека. где мышь экспрессирует антитело по изобретению. а также предлагаются гибридомы. полученные из такой мыши. где гибридома продуцирует антитело по изобретению.
- 3 016186
Еще в другом аспекте в изобретении предлагается способ лечения или предотвращения заболевания, которое характеризуется ростом опухолевых клеток, экспрессирующих ί.Ό70. включающий введение субъекту человеческого антитела к ί.Ό70 по настоящему изобретению в количестве. эффективном для лечения или предотвращения заболевания. Заболевание может представлять собой рак. например почечно-клеточную карциному или лимфому.
Еще в другом аспекте в изобретении предлагается способ лечения аутоиммунного заболевания. включающий введение субъекту человеческого антитела к ί.Ό70 по настоящему изобретению в количестве. эффективном для лечения аутоиммунного заболевания.
Другие свойства и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и примеров. которые не должны быть истолкованы как ограничения изобретения. Содержание всех ссылок. записей СеиЬапк. патентов и опубликованных патентных заявок. которые цитируются по всему настоящему описанию. с точностью введены в настоящее описание с помощью ссылки.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А показана нуклеотидная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 41) и аминокислотная последовательность (8ЕС ΙΌ N0: 1) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2Н5. Участки СЭЕ1 (8ЕС ΙΌ N0: 11). С12Е2 (8ЕЕ) ΙΌ N0: 16) и С1Ж3 (8ЕЕ) ΙΌ N0: 21) разграничены и указаны эмбриональные участки V и 1.
На фиг. 1В показана нуклеотидная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 46) и аминокислотная последовательность (8ЕС ΙΌ N0: 6) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2Н5. Участки СЭВ1 (8ЕЕ) ΙΌ N0: 26). ССН2 (8ЕЕ) ΙΌ N0: 31) и С1Ж3 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 36) разграничены и указаны эмбриональные участки V и 1.
На фиг. 2А показана нуклеотидная последовательность (8ЕС ΙΌ N0: 42) и аминокислотная последовательность (8ЕС ΙΌ N0: 2) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 10В4. Участки СЭВ1 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 12). ССН2 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 17) и ССН3 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 22) разграничены и указаны эмбриональные участки V. Ό и 1.
На фиг. 2В показана нуклеотидная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 47) и аминокислотная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 7) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела 10В4. Участки СЭК.1 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 27). ССН2 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 32) и ССН3 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 37) разграничены и указаны эмбриональные участки V и 1.
На фиг. 3А показана нуклеотидная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 43) и аминокислотная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 3) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 8В5. Участки СЭВ1 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 13). ССН2 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 18) и ССН3 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 23) разграничены и указаны эмбриональные участки V. Ό и 1.
На фиг. 3В показана нуклеотидная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 48) и аминокислотная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 8) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела 8В5. Участки СЭВ1 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 28). ССН2 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 33) и С1)1С (ЗЕС Ц) N0: 38) разграничены и указаны эмбриональные участки V и 1.
На фиг. 4А показана нуклеотидная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 44) и аминокислотная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 4) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 18Е7. Участки СЭВ1 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 14). ССН2 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 19) и ССН3 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 24) разграничены и указаны эмбриональные участки V. Ό и 1.
На фиг. 4В показана нуклеотидная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 49) и аминокислотная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 9) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела 18Е7. Участки СЭК! (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 29). ССН2 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 34) и С1№3 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 39) разграничены и указаны эмбриональные участки V и 1.
На фиг. 5А показана нуклеотидная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 45) и аминокислотная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 5) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 69А7. Участки СЭВ1 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 15). ССН2 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 20) и ССН3 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 25) разграничены и указаны эмбриональные участки V. Ό и 1.
На фиг. 5В показана нуклеотидная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 50) и аминокислотная последовательность (ЗЕЦ ΙΌ N0: 10) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела 69А7. Участки СЭВ1 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 30). ССН2 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 35) и ССН3 (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 40) разграничены и указаны эмбриональные участки V и 1.
На фиг. 6 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антител 2Н5 и 10В4 с эмбриональной аминокислотной последовательностью VII 3-30.3 человека (ЗЕЕ) ΙΌ N0: 51).
На фиг. 7 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антител 8В5 и 18Е7 с эмбриональной аминокислотной последовательностью V 3-33 (ЗЕЦ ΙΌ N0: 52).
На фиг. 8 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела 69А7 с эмбриональной аминокислотной последовательностью V 4-61 человека (ЗЕЦ ΙΌ N0: 53).
- 4 016186
На фиг. 9 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела 2Н5 с эмбриональной аминокислотной последовательностью νκ Ь6 человека (8ЕО Ш N0: 54).
На фиг. 10 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела 10В4 с эмбриональной аминокислотной последовательностью νκ Ь18 человека (8Е0 Ш N0: 55).
На фиг. 11 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи антител 8В5 и 18Е7 с эмбриональной аминокислотной последовательностью νκ Ь15 человека (8Е0 Ш N0: 56).
На фиг. 12 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела 69А7 с эмбриональной аминокислотной последовательностью νκ Ь6 человека (8Е0 Ш N0: 54).
На фиг. 13 показаны результаты экспериментов ЕЬ18А, демонстрирующие, что антитела против ί.Ό70 человека специфично связываются с СЭ70.
На фиг. 14 показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческое моноклональное антитело 2Н5 против ί.Ό70 связывается с клетками клеточных линий почечно-клеточной карциномы.
На фиг. 15 А, 15В показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела против ί.Ό70 человека связываются с клетками клеточных линий почечно-клеточной карциномы (ЯСС) зависимым от концентрации антитела образом. (А) Клеточная линия ЯСС 786-0; (В) клеточная линия ЯСС А498.
На фиг. 15С показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела против ί.Ό70 человека связываются с клетками клеточной линии почечно-клеточной карциномы 786-0.
На фиг. 15Ό показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческое моноклональное антитело (НитАЬ) 69А7 против СЭ70 человека связывается с клетками клеточных линий почечно-клеточной карциномы (ЯСС) зависимым от концентрации антитела образом.
На фиг. 16 показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческое моноклональное антитело 2Н5 против ί.Ό70 связывается с клетками клеточных линий лимфомы человека.
На фиг. 17А, 17В показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческое моноклональное антитело 2Н5 против ί.Ό70 связывается с клетками клеточных линий лимфомы человека зависимым от концентрации антитела образом. (А) Клеточная линия лимфомы Яа_ц; (В) клеточная линия лимфомы Сгал1а-519.
На фиг. 17С показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела против ί.Ό70 человека связываются с клетками клеточной линии лимфомы Яа_ц.
На фиг. 17Ό показаны результаты экспериментов конкурентного анализа проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела 2Н5 и 69А7 используют похожие эпитопы связывания.
На фиг. 17Е показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела против СЭ70 человека связываются с клетками клеточной линии лимфомы Оаиф| и клеточной линии почечно-клеточной карциномы 786-0.
На фиг. 18 показаны результаты экспериментов Ηιιιη-Ζηρ интернализации, демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела против ί.Ό70 человека могут интернализоваться в СЭ70+ клетках.
На фиг. 19А-19С показаны результаты анализов пролиферации клеток, демонстрирующие, что конъюгированные с токсином человеческие моноклональные антитела к СЭ70 убивают клетки клеточных линий почечно-клеточной карциномы (ЯСС). (А) Сак1-2 ЯСС; (В) 786-0 ЯСС; (С) АСНЫ ЯСС.
На фиг. 20Л-20Э показаны результаты анализов зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (АЭСС). демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела к СЭ70 убивают клетки клеточных линий лейкемии и лимфомы человека в зависимости от АЭСС. (А) Клеточная линия лейкемии АЯН-77; (В) клеточная линия лимфомы НиТ 78; (С) клеточная линия лимфомы Яа_ц и (Ό) клеточная линия Ь-540, которая не экспрессирует СЭ70.
На фиг. 21 показаны результаты анализа пролиферации клеток, демонстрирующие, что конъюгированные с токсином человеческие моноклональные антитела к ί.Ό70 убивают клетки клеточных линий лимфомы человека.
На фиг. 22А, 22В показаны результаты анализов пролиферации клеток, демонстрирующие, что конъюгированные с токсином человеческие моноклональные антитела к ί.Ό70 проявляют цитотоксичность по отношению к клеткам Яа_ц (А) при условии трехчасовой отмывки и (В) при условии продолжительной отмывки.
На фиг. 23А, 23В показаны результаты ίη νίνο исследования модели опухоли мыши, демонстри
- 5 016186 рующие. что обработка с помощью конъюгированного с токсином антитела к СЭ70. 2Н5, имеет непосредственный ингибирующий эффект на опухоли почечно-клеточной карциномы (КСС) ίη νίνο. (А) Опухоли КСС А-498; (В) опухоли КСС АСНЫ.
На фиг. 24А-24Р показаны результаты анализа зависимой от антитела клеточной цитотоксичности в (АЭСС). демонстрирующие. что дефукозилированные человеческие моноклональные антитела к СЭ70 обладают увеличенной цитотоксичностью клеток по отношению к клеткам лейкемии в зависимости от АЭСС. (А) Клетки АКН-77; (В) клетки МЕС-1; (С) клетки МЕС-1. обработанные антителом к СЭ16; (Ό) клетки Ш-ЭНЬ-б; (Е) клетки ΙΜ-9; (Р) клетки НиТ 78.
На фиг. 25 показаны результаты анализа зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (АЭСС). демонстрирующие. что человеческие моноклональные антитела к СЭ70 убивают клетки лейкемии человека зависимым от АЭСС образом.
На фиг. 26 показаны результаты анализа зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (АЭСС). демонстрирующие. что человеческие моноклональные антитела к СЭ70 убивают клетки лейкемии человека зависимым от АЭСС образом. но цитотоксичность зависит от СЭ16.
На фиг. 27 показаны результаты анализа зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (АЭСС). демонстрирующие. что человеческие моноклональные антитела к СЭ70 убивают активированные Т-клетки человека. причем данный эффект является обратимым при добавлении антитела к СЭ16.
На фиг. 28 показаны результаты блокирующего анализа. демонстрирующие. что некоторые человеческие моноклональные антитела к СЭ70 блокируют связывание СЭ70 с СО27. тогда как другие человеческие моноклональные антитела к СЭ70 не блокируют связывание СЭ70 с СО27.
На фиг. 29А. 29В показаны результаты ίη νίνο исследования модели опухоли мыши. демонстрирующие. что обработка с помощью изолированного антитела к СЭ70. 2Н5. имеет непосредственный ингибирующий эффект на опухоли лимфомы ίη νίνο. (А) Опухоли Кар; (В) опухоли АКН-77.
На фиг. 30А-30С показаны результаты ίη νίνο исследования модели опухоли мыши. демонстрирующие. что обработка с помощью конъюгированного с токсином антитела к СЭ70. 2Н5. имеет непосредственный ингибирующий эффект на опухоли лимфомы ίη νίνο. (А) Опухоли АКН-77; (В) опухоли Стайн 519; (С) опухоли Кар.
На фиг. 31 показаны результаты исследования. показывающего. что антитело к СЭ70. 69А7. перекрестно реагирует с СЭ70. который экспрессируется на СЭ70+ В-клетках клеточной линии лимфомы макаки резус.
На фиг. 32 показаны результаты блокирующего анализа. демонстрирующие. что человеческое моноклональное антитело к СЭ70 блокирует связывание известного мышиного антитела к СЭ70 человека.
На фиг. 33А. 33В показаны результаты обработки с помощью антитела к СЭ70 или с помощью нефукозилированной формы антитела. (А) Антитела к СЭ70 ингибируют стимулированную совместно с СЭ70 пролиферацию клеток зависимым от дозы антитела образом; (В) антитела к СЭ70 ингибируют стимулированную совместно с СЭ70 секрецию ΙΡΝ-γ зависимым от дозы антитела образом.
На фиг. 34А-34С показаны результаты обработки с помощью антитела к СЭ70 или с помощью нефукозилированной формы антитела клеток. стимулированных пептидом. (А) Антитела к СЭ70 ингибируют опосредованный пептидом рост СЭ8+ Т-клеток; (В) не наблюдалось значительного уменьшения общей выживаемости клеток; (С) не наблюдалось значительного уменьшения общего количества СЭ8+ клеток.
На фиг. 35 показано. что эффект антител к СЭ70 на опосредованный пептидом рост СЭ8+ Т-клеток блокируется при добавлении антител к СЭ16.
На фиг. 36 А. 36В показаны результаты ίη νίνο исследования модели опухоли мыши. демонстрирующие. что обработка с помощью конъюгированного с токсином антитела к СЭ70. 2Н5. имеет непосредственный ингибирующий эффект на опухоли почечно-клеточной карциномы ίη νίνο. (А) Опухоли 786-0; (В) опухоли Сак1-1.
- 6 016186
Подробное описание
Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, в особенности к человеческим моноклональным антителам, которые специфически связываются с СЭ70 с высокой степенью сродства. В определенных воплощениях антитела по изобретению выведены из конкретных эмбриональных последовательностей тяжелой и легкой цепей и/или включают конкретные структурные черты, такие как участки СЭВ, включающие конкретные аминокислотные последовательности. В настоящем изобретении предлагаются выделенные антитела, способы получения указанных антител, иммуноконъюгаты и биспецифичные молекулы, включающие указанные антитела, и предлагаются фармацевтические композиции, содержащие антитела, иммуноконъюгаты или биспецифичные молекулы по изобретению. Настоящее изобретение также относится к способам применения антител, таким способам, как лечение заболеваний, таких как рак.
Для того чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, некоторым терминам были даны определения.
Дополнительные определения представлены по тексту подробного описания.
Путь сигнальной трансдукции означает биохимическую связь между множеством молекул сигнальной трансдукции, которые играют роль в передаче сигнала от одного участка клетки к другому. Как применяется в настоящем описании, фраза поверхностный клеточный рецептор включает, например, молекулы и комплексы, способные получать сигнал и передавать указанный сигнал через плазматическую мембрану клетки. Примером поверхностного клеточного рецептора по настоящему изобретению является рецептор СЭ70.
Термин антитело, как обозначено здесь, включает цельные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. антигенсвязывающий участок) или их одноцепочечные формы. Антитело означает гликопротеин, включающий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или их антигенсвязывающий участок. Каждая тяжелая цепь включает вариабельный участок тяжелой цепи (обозначенный в настоящем описании как νΗ) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи включает три домена: СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь включает вариабельный участок легкой цепи (обозначенный в настоящем описании как УД и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи включает один домен Сь. Участки νΗ и могут быть дополнительно разделены на участки гипервариабельности, определенные как участки, определяющие комплементарность (СОЯ), перемежающиеся с участками, которые являются более консервативными, определенными как каркасные участки (ЕЯ). Каждый участок νΗ и включает три участка СОЯ и четыре участка ЕЯ, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: ЕЯ1, СОЯ1, ЕЯ2, СОЯ2, ЕЯ3, СОЯ3, ЕЯ4. Вариабельные участки тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные участки антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или с факторами, включающими разнообразные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (С1с.|) классической системы комплемента.
Термин антигенсвязывающий участок антитела (или участок антитела), как применяется в настоящем описании, означает один или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфического связывания с антигеном (например, СЭ70). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченные термином антигенсвязывающий участок антитела, включают (ί) ЕаЬфрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов У^ νΗ, С|. и СН1; (й) Е(аЬ')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, включающий два ЕаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком на шарнирном участке; (ш) ЕаЬ'-фрагмент, который, по существу, представляет собой ЕаЬ с частью шарнирного участка (см. Еипбатеп!а1 1ттипо1оду (Раи1 еб., 3гб еб. 1993)); (ίν) Еб-фрагмент, состоящий из доменов νΗ и СН1; (ν) Εν-фрагмент, состоящий из доменов У, и νΗ одного плеча антитела; (νί) бАЬ-фрагмент (\Уагб е! а1. (1989), №11иге 341:544-546), который состоит из домена νΗ; (νίί) выделенный участок, определяющий комплементарность (СОЯ). Кроме того, хотя два домена Εν-фрагмента, и νΗ, кодируются отдельными генами, они могут быть объединены с применением рекомбинантных методов с помощью синтетического линкера, который дает им возможность существовать в виде одной белковой цепи, в которой участки ν и νΗ спарены с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Εν (ксЕУ); см., например, В1гб е! а1. (1988), 8с1епсе 242:423-426; ИнЦоп е! а1. (1988), Ргос. №111. Асаб. 8с1 И8А 85:58795883). Подразумевается также, что такие одноцепочечные антитела будут охвачены термином антигенсвязывающий участок антитела. Эти фрагменты антитела получают с применением подходящих методик, известных специалисту в данной области, и фрагменты скринируют на предмет их применимости таким же способом, как и интактные антитела.
Подразумевается, что выделенное антитело, как применяется в настоящем описании, означает антитело, которое, по существу, свободно от других антител, обладающих отличными антигенными специфичностями (например, выделенное антитело, которое специфично связывается с СЭ70, является, по существу, свободным от антител, которые специфично связывают антигены, отличные от СЭ70). Выделенное антитело, которое специфично связывается с СЭ70, может, однако, иметь перекрестную реакци
- 7 016186 онноспособность по отношению к другим антигенам, таким как молекулы С.П70 других видов. В определенных воплощениях выделенное антитело специфично связывается с С.П70 человека и не реагирует перекрестно с другими, нечеловеческими антигенами С.П70. Кроме того, выделенное антитело может быть, по существу, свободным от другого клеточного материала и/или химических веществ.
Термины моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела, как применяется в настоящем описании, означает препарат молекул антитела одной молекулярной композиции. Композиция моноклонального антитела проявляет одну связывающую специфичность и сродство для конкретного эпитопа.
Подразумевается, что термин человеческое антитело, как применяется в настоящем описании, включает антитела, имеющие вариабельные участки, в которых оба участка - каркасный и СПЯ выведены из эмбриональных иммуноглобулиновых последовательностей человека. Кроме того, если антитело содержит константный участок, то он также выведен из эмбриональных иммуноглобулиновых последовательностей человека. Человеческие антитела могут включать поздние модификации, включающие природные или синтетические модификации. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, которые не кодируются эмбриональными иммуноглобулиновыми последовательностями человека (например, мутации, вводимые путем случайного или сайтспецифического мутагенеза ίη νίίτο или путем соматической мутации ίη νίνο). Однако подразумевается, что термин человеческое антитело, как применяется в настоящем описании, не включает антитела, в которых последовательности СОЯ, выделенные из эмбрионального источника других видов млекопитающих, таких как мышь, были пересажены на человеческие каркасные последовательности.
Термин человеческое моноклональное антитело означает антитела, проявляющие одну связывающую специфичность, которые имеют вариабельные участки, в которых оба участка - каркасный и С.ПЯ - выделены из эмбриональных иммуноглобулиновых последовательностей человека. В одном воплощении человеческие моноклональные антитела получают с помощью гибридомы, которая включает иммортализованную клетку, образующую гибрид с В-клеткой, полученной из трансгенного животного, отличного от человека, например из трансгенной мыши, имеющей геном, включающий трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи.
Термин рекомбинантное человеческое антитело, как применяется в настоящем описании, включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами, такие как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным для иммуноглобулиновых генов человека, или полученная из них гибридома (описано дополнительно ниже); (Ь) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии человеческого антитела, например, из трасфектомы; (с) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител; (й) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей иммуноглобулиновых генов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные участки, в которых каркасный и СОЯ-участки выделены из эмбриональных иммуноглобулиновых последовательностей человека. Однако в определенных воплощениях такие рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвергнуты ίη νίίτο мутагенезу (или ίη νίνο соматическому мутагенезу, когда применяется трансгенное животное для последовательностей 1д человека) и, таким образом, аминокислотные последовательности участков Ун и Уъ рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи выделенными из эмбриональных последовательностей ΥΗ и VI, человека и являясь им родственными, не могут в естественных условиях существовать в эмбриональном наборе антител человека ίη νίνο.
Как применяется в настоящем описании, изотип означает класс антитела (например, 1дМ или !дС1), который кодируется константными участками генов тяжелой цепи.
Фразы антитело, распознающее антиген и антитело, специфичное для антигена, применяются в настоящем описании взаимозаменяемо с термином антитело, которое специфично связывается с антигеном.
Термин модификации человеческого антитела означает любую модифицированную форму человеческого антитела, например конъюгат антитела, с другим агентом или антителом.
Подразумевается, что термин гуманизированное антитело означает антитела, в которых СОЯ последовательности, выведенные из эмбриональных источников других видов млекопитающих, таких как мышь, были пересажены на человеческие каркасные последовательности. Дополнительные модификации каркасного участка могут быть произведены внутри каркасных последовательностей человека.
Подразумевается, что термин химерное антитело означает антитела, в которых последовательности вариабельного участка выведены из одного вида, а последовательности константного участка выведены из другого вида, такие антитела, как антитело, в котором последовательности вариабельного участка выделены из мышиного антитела, а последовательности константного участка выделены из человеческого антитела.
Как применяется в настоящем описании, подразумевается, что антитело, которое специфично свя
- 8 016186 зывается с СБ70 человека, означает антитело, которое связывается с СБ70 человека с Кс 5х10-8 М или менее, более предпочтительно 1х10-8 М или менее, более предпочтительно 6х10'9 М или менее, более предпочтительно 3х 10-9 М или менее, еще более предпочтительно 2х 109 М или менее.
Подразумевается, что термин Кажос или Ка, как применяется в настоящем описании, означает скорость ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как подразумевается, что термин К^ или Ка, как применяется в настоящем описании, означает скорость диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Подразумевается, что термин Кс, как применяется в настоящем описании, означает константу диссоциации, которая получается из отношения Ка к Ка (т.е. Ка/Ка) и выражается в виде молярной концентрации (М). Значения Кс для антител могут быть определены с применением способов, хорошо известных из уровня техники. Предпочтительным способом для определения К антитела является способ с применением плазмонного резонанса, предпочтительно с применением такой биосенсорной системы, как система В1асоге®.
Как применяется в настоящем описании, термин высокое сродство для 1дС антитела означает антитело, имеющее Кс 10-7 М или менее, более предпочтительно 10-8 М или менее, более предпочтительно 10-9 М или менее и еще более предпочтительно 10-10 М или менее для антигена мишени. Однако высокое сродство связывания может варьироваться для других изотипов антител. Например, высокое сродство связывания для 1дМ изотипа означает антитело, имеющее Кс 10-7 М или менее, более предпочтительно 10-8 М или менее, еще более предпочтительно 10-9 М или менее.
Как применяется в настоящем описании, термин субъект включает любое животное, включая человека и отличное от человека. Термин отличное от человека животное включает всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как отличные от человека приматы, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рыба, рептилии и т.д.
Различные аспекты изобретения описаны в дополнительных подробностях в следующих подразделах.
Антитела к СБ70.
Антитела по изобретению характеризуются конкретными функциональными чертами или свойствами антител. Например, антитела специфически связываются с СБ70 человека. Предпочтительно антитело по изобретению связывается с СБ70 с высокой степенью сродства, например с Кс 5х10-7 М или менее, еще более предпочтительно 5,5х10-9 или менее, еще более предпочтительно 3х10-9 или менее, еще более предпочтительно 2х10-9 или менее или еще более предпочтительно 1,5х10-9 или менее. Стандартные анализы для оценки способности связывания антител с СБ70 известны из уровня техники, включают, например, ЕЬ18А, \Уе51егп-блоттинг и ΚΙΑ. Подходящие анализы подробно описаны в примерах. Кинетику связывания (например, сродство связывания) антител также оценивают с помощью стандартных анализов, известных из уровня техники, таких как ЕЫ8А, ЗсаЮйагб и В1асоге. В качестве другого примера антитела по настоящему изобретению могут связываться с клетками опухолевой клеточной линии почечно-клеточной карциномы, например с клеточными линиями 786-0, А-498, ΑΟΗΝ, Сак1-1 или Сак1-
2. В качестве еще одного другого примера антитела по настоящему изобретению могут связываться с клетками опухолевой клеточной линии В-клеток, например с клеточными линиями Баиб1, НиТ 78, Вар или Сгап1а-519.
Моноклональные антитела 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7.
Взятые для примера антитела по изобретению включают человеческие моноклональные антитела 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7, выделенные и структурно охарактеризованные, как описано в примерах 1 и
2. Аминокислотные последовательности νΗ из 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7 показаны в ЗЕО ΙΌ N0: 1, 2,
3, 4 и 5 соответственно. Аминокислотные последовательности V из 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7 показаны в ЗЕО ΙΌ N0: 6, 7, 8, 9 и 10 соответственно.
Поскольку каждое из этих антител может связываться с СБ70, νΗ- и νι,-последовательности могут быть перемешаны и подобраны для создания других молекул по изобретению, связывающихся с СБ70. Связывание с СБ70 таких смешанных и подобранных антител может быть протестировано с применением анализов связывания, описанных выше и в примерах (например, ЕАС8 или ЕЫ8А). Предпочтительно, когда νΗ- и VI-цепи смешивают и подбирают, ^-последовательность из конкретной пары νΗ/ν^ заменяется структурно подобной ^-последовательностью. Подобным образом, предпочтительно ν.последовательность из конкретной пары νΗ/ν^ заменяется структурно подобной ν^ последовательностью.
Соответственно в одном аспекте в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 1, 2, 3, 4 и 5; и (b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 6, 7, 8, 9 и 10; где антитело специфично связывается с СБ70.
- 9 016186
Предпочтительные комбинации тяжелой и легкой цепей включают:
(а) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕС ГО N0: 1; и (Ь) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕС ГО N0: 6; или (а) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕС ГО N0: 2; и (Ь) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 5ЕС ГО N0: 7; или (а) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕС ГО N0: 3; и (Ь) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕС ГО N0: 8; или (а) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕС ГО N0: 4; и (Ь) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 5ЕС ГО N0: 9; или (а) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 8ЕС ГО N0: 5; и (Ь) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из 5ЕС ГО N0: 10.
В другом аспекте в изобретении предлагаются антитела, которые включают участки СЭК.1, СЭК2 и СЭКЗ тяжелой цепи и легкой цепи из 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7 или их комбинации. Аминокислотные последовательности νΗ СЭК.1 из 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7 показаны в 8ЕС ГО N0: 11, 12, 13, 14 и 15 соответственно. Аминокислотные последовательности νΗ СЭК2 из 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7 показаны в 8Е0 ГО N0: 16, 17, 18, 19 и 20 соответственно. Аминокислотные последовательности νΗ СЭК3 из 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7 показаны в 8ЕС ГО N0: 21, 22, 23, 24 и 25 соответственно. Аминокислотные последовательности νκ СЭК.1 из 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7 показаны в 8ЕС ГО N0: 26, 27, 28, 29 и 30 соответственно. Аминокислотные последовательности νκ СЭК2 из 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7 показаны в 8ЕС ГО N0: 31, 32, 33, 34 и 35 соответственно. Аминокислотные последовательности νκ ί.ΌΡ3 из 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69 А7 показаны в 8ЕС ГО N0: 36, 37, 38, 39 и 40 соответственно. СОК. участки разделены с применением системы КаЬа! (КаЬа1, Е.А., с1 а1. (1991), 8сс.|испес5 οί РгоЮнъ οί 1ттипо1од1са1 1п1сгс51. ΕίΠΙι Ебйюп, И8 Оераг1теп1 οί НеаПП апб Нитап 8егу1се5, МН РиЬНсабоп № 913242).
Поскольку каждое из этих антител может связываться с ί.Ό70 и специфичность связывания с антигеном обеспечивается главным образом участками СЭК.1, СЭК2 и СОК.3, последовательности νΗ СЭКЕ ί.ΌΚ2 и СЭК3 и последовательности νκ СЭКЕ СЭК2 и СЭК3 могут быть смешаны и подобраны (т.е. СОК из различных антител могут быть смешаны и подобраны, хотя каждое антитело должно содержать νΗ СЭКЕ СЭК2 и СЭК3 и νκ СОК.1, СЭК2 и СЭК3) для создания других анти-СЭ70 связывающих молекул по изобретению. Связывание с СЭ70 таких смешанных и подобранных антител может быть протестировано с применением анализов, описанных выше и в примерах (например, анализы ЕАС8, ЕЫ8А, В1асоге). Предпочтительно, когда νΗ СЭК. последовательности смешивают и подбирают, СЭК.1, СЭК2 и/или СЭК.3 последовательность из конкретной ^-последовательности заменяется структурно подобной СЭК последовательностью. Подобным образом, когда νκ СЭК последовательности смешивают и подбирают, СЭК.1, СЭК2 и/или СЭК.3 последовательность из конкретной У|<-последовательности заменяется структурно подобной СЭК. последовательностью. Будет совершенно очевидно специалисту в данной области, что новые νΗ- и ^.-последовательности могут быть созданы путем замены одной или более последовательностям участка νΗ и/или ν СЭВ на структурно подобные последовательности из СЭК. последовательностей, описанных в настоящем описании для моноклональных антител 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7.
Соответственно в другом аспекте в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, включающие:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК.1, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 51ЕС ГО N0: 11-15;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК.2, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 51ЕС ГО N0: 16-20;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК.3, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 51ЕС ГО N0: 21-25;
(б) вариабельный участок легкой цепи СЭК.1, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 51ЕС ГО N0: 26-30;
(е) вариабельный участок легкой цепи СЭК2, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 51ЕС ГО N0: 31-35;
(ί) вариабельный участок легкой цепи СЭК.3, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 51ЕС ГО N0: 36-40;
где антитело специфично связывается с СЭ70, предпочтительно с СЭ70 человека.
В предпочтительном воплощении антитело включает:
(а) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК.1, включающий 8ЕС ГО N0: 11;
- 10 016186 (b) вариабельный участок тяжелой цепи СЭВ2. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 16;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи СЭЯХ. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 21;
(б) вариабельный участок легкой цепи СЭВ1. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 26;
(е) вариабельный участок легкой цепи СЭВ2. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 31;
(1) вариабельный участок легкой цепи СЭЯ3. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 36.
В другом предпочтительном воплощении антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΒ1. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 12;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи СЭВ2. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 17;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи СЭЯ3. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 22;
(б) вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΒ1. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 27;
(е) вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΒ2. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 32;
(1) вариабельный участок легкой цепи СЭЯ3. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 37.
В другом предпочтительном воплощении антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΒ1. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 13;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи СЭВ2. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 18;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи СЭЯ3. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 23;
(б) вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΒ1. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 28;
(е) вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΒ2. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 33;
(1) вариабельный участок легкой цепи СЭВ3. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 38.
В другом предпочтительном воплощении антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΒ1. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 14;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи СЭВ2. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 19;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи С0Я3. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 24;
(б) вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΒ1. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 29;
(е) вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΒ2. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 34;
(1) вариабельный участок легкой цепи СЭВ3. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 39.
В другом предпочтительном воплощении антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΒ1. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 15;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи СЭВ2. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 20;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи С0Я3. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 25;
(б) вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΒ1. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 30;
(е) вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΒ2. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 35;
(1) вариабельный участок легкой цепи СЭВ3. включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 40.
Хорошо известно из уровня техники. что СЭВ3 домен сам по себе. независимо от СЭВ1 и/или СЭЯ2 домена(ов). может определять специфичность связывания антитела для родственного антигена и что. как и ожидалось. могут быть получены многочисленные антитела. обладающие такой же специфичностью связывания. основанной на обычной СЭЯ3 последовательности. См.. например. КНшка е! а1.. Вгй18Й 1. о1 Сапсег 83(2): 252-260 (2000) (описание получения гуманизированного антитела к СЭ30 с применением только вариабельного домена тяжелой цепи СЭЯ3 мышиного антитела К1-4 к СЭ30); Ве1Ьоег е! а1.. 1. Мо1. Вю1. 296:833-849 (2000) (описание рекомбинантных антител к эпителиальному гликопротеину-2 (ЕСР-2) с применением только СЭЯ3 последовательности тяжелой цепи родительского мышиного антитела МОС-31 к ЕСР-2); Яабег е! а1.. Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А. 95:8910-8915 (1998) (описание панели гуманизированных антител к интегрину ανβ3 с применением вариабельного домена СЭЯ3 тяжелой и легкой цепей мышиного антитела ЬМ609 к интегрину ανβ3. где каждый член из панели антител включает отдельную последовательность вне СЭЯ3 домена и способен связывать тот же эпитоп. что и родительское мышиное антитело с высокой степенью сродства или с более высокой степенью сродства. чем родительское мышиное антитело); ВагЬаз е! а1.. 1. Ат. Сйет. 8ос. 116:2161-2162 (1994) (описание того. что СЭЯ3 домен обеспечивает наиболее значительный вклад в связывание с антигеном); ВагЬаз е! а1.. Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А. 92:2529-2533 (1995) (описание пересадки СЭВ3 последовательностей тяжелой цепи из трех ЕаЬ (8Ι-1. 8Ι-40 и 8Ι-32) против человеческой плацентарной ДНК на тяжелую цепь ЕаЬ к анатоксину столбняка. таким образом заменяя существующий домен СЭЯ3 тяжелой цепи и демонстрируя. что СЭЯ3 домен сам по себе отвечает за специфичность связывания); 0Цхе1 е! а1.. 1. Iттиηо1. 157:739-749 (1996) (описание исследований по пересадке. где переноса только домена СЭЯ3 тяжелой цепи родительского полиспецифичного ЕаЬ ЕХА^, на тяжелую цепь моноспецифичного ЦС ЕаЬ р313 антитела. связывающего анатоксин столбняка. было достаточно для сохранения специфичности связывания родительского ЕаЬ). Каждая из этих ссылок введена в настоящее описание полностью с помощью ссылки.
Соответственно в настоящем изобретении предлагаются моноклональные антитела. включающие один или более СЭЯ3 домен(ов) тяжелой и/или легкой цепи из антитела. выделенного из человека или из животного. отличного от человека. где моноклональное антитело способно специфично связываться с СЭ70. В определенных аспектах в настоящем изобретении предлагаются моноклональные антитела.
- 11 016186 включающие один или более ί.ΌΚ3 доменов тяжелой и/или легкой цепи из антитела животного, отличного от человека, такие как мышиное или крысиное антитело, где моноклональное антитело способно специфично связываться с СЭ70. В некоторых воплощениях указанные антитела по изобретению, включающие один или более ί.ΌΚ3 доменов тяжелой и/или легкой цепи из антитела животного, отличного от человека, (а) способны конкурировать за связывание с антигеном; (Ь) сохраняют функциональные характеристики; (с) связываются с тем же эпитопом и/или (й) имеют сродство связывания как у соответствующего родительского антитела из отличного от человека животного.
В других аспектах в настоящем изобретении предлагаются моноклональные антитела, включающие один или более СЭЯ3 доменов тяжелой и/или легкой цепи из человеческого антитела, такого как, например, человеческое антитело, полученное из животного, отличного от человека, где человеческое антитело способно специфично связываться с ί.Ό70. В других аспектах в настоящем изобретении предлагаются моноклональные антитела, включающие один или более СЭКЗ доменов тяжелой и/или легкой цепи из первого человеческого антитела, такого как, например, человеческое антитело, полученное из животного, отличного от человека, где первое человеческое антитело способно специфично связываться с ί.Ό70 и где СЭКЗ домен из первого человеческого антитела заменяет СЭЯЗ домен в человеческом антителе, которое лишено специфичности связывания с ί.Ό70. с получением второго человеческого антитела, которое способно специфично связываться с ί.Ό70. В некоторых воплощениях указанные антитела по изобретению, включающие один или более СЭКЗ доменов тяжелой и/или легкой цепи из первого человеческого антитела, (а) способны конкурировать за связывание с антигеном; (Ь) сохраняют функциональные характеристики; (с) связываются с тем же эпитопом и/или (й) имеют сродство связывания как у соответствующего родительского первого человеческого антитела.
Антитела, имеющие конкретные эмбриональные последовательности.
В определенных воплощениях антитело по изобретению включает вариабельный участок тяжелой цепи из конкретного эмбрионального иммуноглобулинового гена тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи из конкретного эмбрионального иммуноглобулинового гена легкой цепи.
Например, в предпочтительном воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт гена Ун 3-30.3 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с ί.Ό70. В другом предпочтительном воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт гена Ун 3-33 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с ί.Ό70. В другом предпочтительном воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт гена Ун 4-61 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с ί.Ό70. В другом предпочтительном воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена Ук Ь6 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с ί.Ό70. В другом предпочтительном воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена Ук Ь18 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с СЭ70. В другом предпочтительном воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена Ук Ь15 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с ΟΌ70.
Еще в одном другом воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, где антитело:
(a) включает вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт гена Ун 330.3, 3-33 или 4-61 человека или выделен из них (эти гены кодируют аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ N0: 51, 52 и 53 соответственно);
(b) включает вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена Ук Ь6, Ь18 или Ь15 человека или выделен из них (эти гены кодируют аминокислотные последовательности, представленные в 8Е0 ΙΌ N0: 54, 55 и 56 соответственно);
(c) антитело специфично связывается с ί.Ό70.
Примером антитела, имеющего Ун и Ук из Ун 3-30.3 и Ук Ь6 соответственно, является 2Н5. Примером антитела, имеющего Ун и Ук из Ун 3-30.3 и Ук Ь18 соответственно, является 10В4. Примерами антител, имеющих Ун и Ук из Ун 3-33 и Ук Ь15 соответственно, являются 8В5 и 18Е7. Примером антитела, имеющего Ун и Ук из Ун 4-61 и Ук Ь6 соответственно, является 69А7.
Как применяется в настоящем описании, человеческое антитело включает вариабельные участки тяжелой или легкой цепи, которое является продуктом или выведено из конкретной эмбриональной последовательности, если вариабельные участки антитела получены из системы, в которой применяются эмбриональные иммуноглобулиновые гены человека. Такие системы включают иммунизацию трансген
- 12 016186 ной мыши. несущей иммуноглобулиновые гены человека. с помощью интересующего антигена. или указанные системы включают скрининг библиотеки фагового дисплея иммуноглобулиновых генов человека с помощью интересующего антигена. Человеческое антитело. которое является продуктом или выведено из эмбриональной последовательности иммуноглобулина человека. может быть идентифицировано. по существу. путем сравнения аминокислотной последовательности человеческого антитела с аминокислотными последовательностями эмбриональных иммуноглобулинов человека и путем селекции эмбриональной последовательности иммуноглобулина человека. которая является ближайшей по последовательности (т.е. с наибольшим процентом идентичности) с последовательностью человеческого антитела. Человеческое антитело. которое является продуктом или выведено из конкретной эмбриональной последовательности иммуноглобулина человека. может содержать аминокислотные отличия по отношению к эмбриональной последовательности. благодаря. например. природным соматическим мутациям или намеренному введению сайт-направленной мутации. Однако селектированное человеческое антитело обычно по меньшей мере на 90% идентично по аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью. кодируемой эмбриональным геном иммуноглобулина человека. и содержит аминокислотные остатки. по которым человеческое антитело идентифицируют как человеческое при сравнении с эмбриональными аминокислотными последовательностями иммуноглобулина из других видов (например. мышиными эмбриональными последовательностями). В определенных случаях человеческое антитело может быть по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96. 97. 98 или 99% идентично по аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью. кодируемой эмбриональным геном иммуноглобулина. Обычно человеческое антитело. выделенное из конкретной эмбриональной последовательности человека. проявляет не более чем 10 аминокислотных отличий от аминокислотной последовательности. кодируемой эмбриональным геном иммуноглобулина человека. В определенных случаях человеческое антитело может проявлять не более чем 5 или даже не более чем 4.
3. 2 или 1 аминокислотное отличие от аминокислотной последовательности. кодируемой эмбриональным геном иммуноглобулина.
Гомологичные антитела.
Еще в одном другом воплощении антитело по изобретению включает вариабельные участки тяжелой и легкой цепей. включающие аминокислотные последовательности. которые являются гомологичными аминокислотным последовательностям предпочтительных антител. описанных в настоящем описании. и где антитела сохраняют желательные функциональные свойства антител к СЭ70 по изобретению.
Например. в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок. включающие вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи. где:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность. которая является по меньшей мере на 80% гомологичной аминокислотной последовательности. выбранной из группы. состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 1-5;
(b) вариабельный участок легкой цепи включает аминокислотную последовательность. которая является по меньшей мере на 80% гомологичной аминокислотной последовательности. выбранной из группы. состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 6-10;
(c) антитело специфично связывается с ί.Ό70.
В других воплощениях аминокислотные последовательности Ун и/или Уъ могут быть на 85. 90. 95. 96. 97. 98 или на 99% гомологичны последовательностям. представленным выше. Антитело. имеющее Ун- и Уь-участки. имеющее высокую (т.е. 80% или больше) гомологию с Ун- и Уъ-участками последовательностей. представленных выше. может быть получено путем мутагенеза (например. сайтнаправленного или опосредованного ПЦР мутагенеза) молекул нуклеиновой кислоты. кодирующих 8Е0 ΙΌ N0: 41-50. с последующим тестированием кодируемых измененными последовательностями антител на сохранившуюся функцию (т.е. связывание с ί.Ό70 человека с Кс 5х10-8 М или менее) с применением функциональных анализов. описанных в настоящем изобретении.
Как применяется в настоящем описании. процент гомологии между двумя аминокислотными последовательностями является эквивалентным проценту идентичности между двумя последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от количества идентичных положений. разделяемых последовательностями (т.е. % 1юшо1оду = # количество идентичных положений/общее количество # положений х 100). принимая во внимание количество пропусков и размер каждого пропуска. которые необходимо вводить для оптимального сравнения двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с применением математического алгоритма. как описано ниже в не ограничивающих изобретение примерах.
Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с применением алгоритма Е. Меуегк и ^. МШег (Сотри!. Αρρί. Βίοκα.. 4:11-17 (1988)). который вводится в программу АЫСН (версия 2.0). использующей таблицу весового остатка РАМ120. штраф на
- 13 016186 длину пропуска - 12 и штраф на пропуск - 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с применением алгоритма №еФ1етап и ^ипксй (Ф. Μο1. Βίο1. 48:444-453 (1970)), который вводится в программу САР в пакете программного обеспечения ССС (доступного на ййр://^тете.дсд.сот), использующего матрицу В1о88ит 62 или матрицу РАМ250 и размер пропуска 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и размер длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Дополнительно или альтернативно, белковые последовательности по настоящему изобретению могут дополнительно применяться в качестве входной последовательности для осуществления поиска против общедоступной базы данных, например для идентификации родственных последовательностей. Такие поиски осуществляются с применением программы ХВЬА8Т (версия 2.0) АИясйи1, е1 а1. (1990), Ф. Μο1. Βίο1. 215:403-10. ВЬА8Т поиски по белку могут быть осуществлены с помощью программы ХВЬА8Т, счет равен 50, размер слова равен 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам антител по изобретению. Для целей сравнения может быть применен СарреФ ВЬА8Т для получения сравнений, содержащих пропуски, как описано у Л115сйи1 е1 а1. (1997), НисЫс Ас1Ф§ Яе§. 25(17): 3389-3402. При применении программ ВЬА8Т и СарреФ ВЬА8Т могут использоваться стандартные параметры соответствующих программ (например, ХВЬА8Т и NΒ^А§Т). См. 1Шр://\ν\ν\ν.ηсЬ^.η1т.η^11.80ν.
Антитела с консервативными модификациями.
В определенных воплощениях антитело по изобретению включает вариабельный участок тяжелой цепи, включающий последовательности СЭЯ1, СЭЯ2 и СЭЯ3, и вариабельный участок легкой цепи, включающий последовательности СЭЯ1, СЭЯ2 и СЭЯ3, где одна или более из этих СЭЯ последовательностей включает определенные аминокислотные последовательности, основанные на предпочтительных антителах, описанных в настоящем описании (например, 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 или 69А7), или их консервативные модификации, и где антитела сохраняют желательные функциональные свойства антител к СЭ70 по изобретению. Соответственно в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок тяжелой цепи, включающий последовательности СЭЯ1, СЭЯ2 и СЭЯ3, и вариабельный участок легкой цепи, включающий последовательности СЭЯ1, СЭЯ2 и СЭЯ3, где:
(a) последовательность вариабельного участка тяжелой цепи СЭЯ3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8ЕС Ш N0: 21-25 и их консервативных модификаций;
(b) последовательность вариабельного участка легкой цепи СЭЯ3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8ЕС Ш N0: 36-40 и их консервативных модификаций; и (c) антитело специфично связывается с СЭ70.
В предпочтительном воплощении последовательность СЭЯ2 вариабельного участка тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из 8ЕС Ш N0: 16-20 и их консервативных модификаций; и последовательность СЭЯ2 вариабельного участка легкой цепи включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из 8ЕС Ш N0: 31-35 и их консервативных модификаций. В другом предпочтительном воплощении последовательность СЭЯ1 вариабельного участка тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из 8ЕС Ш N0: 11-15 и их консервативных модификаций; и последовательность СЭЯ1 вариабельного участка легкой цепи включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из 8ЕС Ш N0: 26-30 и их консервативных модификаций.
Подразумевается, что термин консервативные модификации последовательности, как применяется в настоящем описании, означает аминокислотные модификации, которые не оказывают значительного влияния на характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотную последовательность, или не изменяют их. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, вставки или делеции. Модификации могут вводиться в антитело по изобретению с помощью стандартных методик, известных из уровня техники, таких как сайт-направленный мутагенез или опосредованный ПЦР мутагенез. Консервативные аминокислотные замены представляют собой те, в которых аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим подобную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих подобные боковые цепи, определены из уровня техники. Эти семейства включают боковые цепи со свойствами основания (например, лизин, аргинин, гистидин), боковые цепи со свойствами кислоты (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков внутри СЭЯ участков антитела по изобретению могут быть заменены другими аминокислотными остатками из того же семейства боковой цепи, и измененное антитело может быть
- 14 016186 протестировано на сохранившуюся функцию (т.е. функцию, представленную в (с)) с применением функциональных анализов, описанных в настоящем описании.
Антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и антитела к ί.Ό70 по изобретению.
В другом воплощении в изобретении предлагаются антитела, которые связываются с тем же эпитопом на ί.Ό70 человека, как и любое из моноклональных антител к СЭ70 по изобретению (т.е. антитела, которые способны перекрестно конкурировать за связывание с СЭ70 с любым из моноклональных антител по изобретению). В предпочтительных воплощениях эталонное антитело для исследований перекрестной конкуренции может представлять собой моноклональное антитело 2Н5 (имеющее Ун- и Уъпоследовательности, как показано в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 и 6 соответственно), или моноклональное антитело 10В4 (имеющее Ун- и Ун-последовательности, как показано в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 и 7 соответственно), или моноклональное антитело 8В5 (имеющее Ун- и Ун-последовательности, как показано в 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 и 8 соответственно), или моноклональное антитело 18Е7 (имеющее Ун- и Ун-последовательности, как показано в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4 и 9 соответственно), или моноклональное антитело 69А7 (имеющее Ун- и Унпоследовательности, как показано в 8ЕЦ ΙΌ N0: 5 и 10 соответственно). Такие перекрестно конкурирующие антитела могут быть идентифицированы на основе их способности перекрестно конкурировать с 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 или 69А7 в стандартных анализах на связывание с ί.Ό70. Например, анализ ЫАсоге, анализ ЕЫ8А или проточная цитометрия могут быть применены для того, чтобы продемонстрировать перекрестную конкуренцию с антителами по настоящему изобретению. Способность тестируемого антитела ингибировать связывание, например, 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 или 69А7 с ί.Ό70 человека демонстрирует, что тестируемое антитело может конкурировать с 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 или 69А7 за связывание с СЭ70 человека, и, таким образом, связывается с тем же эпитопом на СЭ70 человека, что и 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 или 69А7. В предпочтительном воплощении антитело, которое связывается с тем же эпитопом на СЭ70 человека, что и 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 или 69А7, является человеческим моноклональным антителом. Такие человеческие моноклональные антитела могут быть получены и выделены, как описано в примерах.
Сконструированные и модифицированные антитела.
Антитело по изобретению дополнительно может быть получено с применением антитела, имеющего одну или более Ун- и/или Ун-последовательностей, описанных в настоящем описании, в качестве стартового материала для конструирования модифицированного антитела, которое может иметь измененные свойства по сравнению со стартовым антителом. Антитело может быть сконструировано путем модификации одного или более остатков внутри одного или обоих вариабельных участков (т.е. Ун и/или Уь), например, внутри одного или более СЭЕ участков и/или внутри одного или более каркасных участков. Дополнительно или альтернативно, антитело может быть сконструировано путем модификации остатков внутри константного(ых) участка(ов), например, для изменения эффекторной(ых) функции(й) антитела.
Один тип конструкции вариабельного участка, которая может быть осуществлена, представляет собой пересадку СЭЕ. Антитела взаимодействуют с антигенами мишенями преимущественно через амино кислотные остатки, которые расположены в шести участках тяжелой и легкой цепей, определяющих комплементарность (СЭК). По этой причине аминокислотные последовательности внутри СЭК являются более разнотипными между индивидуальными антителами, чем последовательности вне СЭК. Поскольку СЭК последовательности ответственны за большинство взаимодействий антитело-антиген, то возможно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических природных антител, путем конструкции экспрессирующих векторов, которые включают СЭК последовательности из специфического природного антитела, пересаженные на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, Шесйтапп, Ь. е1 а1. (1998), №1Ц.1ге 332:323-327; 1оие8, Р. е1 а1. (1986), Х/Пиге 321:522-525: Сиееп, С. е1 а1. (1989), Ргос. ЫаЙ. Асаб. 81е. И8А, 86:10029-10033; И8 патент № 5225539, А'пПег и И8 патенты № 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, Сиееп е1 а1.).
Соответственно другое воплощение изобретения относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, включающим вариабельный участок тяжелой цепи, включающий СЭК1, СЭК2 и СЭК3 последовательности, включающие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 11-15, 8ЕЦ ΙΌ N0: 16-20 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 21-25 соответственно, и вариабельный участок легкой цепи, включающий СЭК1, СЭК2 и СЭК3 последовательности, включающие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 2630, 8ЕЦ ΙΌ N0: 31-35 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 36-40 соответственно. Таким образом, такие антитела содержат Ун и Уь СЭК последовательности моноклональных антител 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 или 69А7, при этом могут содержать различные каркасные последовательности из этих антител.
Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК или из опубликованных ссылок, которые включают эмбриональные последовательности генов антител. Например, эмбриональные последовательности ДНК для генов вариабельного участка тяжелой и легкой цепей можно обнаружить в УВаке, базе данных эмбриональных последовательностей человека (доступной в сети Интернет по адресу те^^.тгс-сре.сат.ас.ик/уЬа8е), а также у КаЬаЕ Е.А., е1 а1. (1991), 8едиеисек оГ Ргсйепъ оГ Ιιηιηι.ιηο1θβ№ι1 йИегекЕ ΕίΠΙι ЕбШои, И8 ИерайтеШ оГ ИеаИИ апб нитап Зегуюек,
- 15 016186
Ы1Н публикация № 91-3242; Τοιηΐίηδοη. Ι.Μ.. е! а1. (1992). ТНс Кере^ие οΓ Нитан Ссгтйнс УН 8еЦНСНСС5 КсусаЬ АЬοиΐ ΡίΓΐν бгоирк οΓ УН §едтей8 \νί11ι О1ГГсгсп( НурсгсапаЫс Εοορδ ί. Μο1. Βίο1. 227:776-798; и ί,’οχ. 1.Р.Ь. е! а1. (1994). А ОйесЮгу οΓ Нитаη 0егт-1те УН §едтей8 КеуеаР а 8ίτοη§ Βίηδ ίη Шеи Икаде Еиг. ί. ^титоР 24:827-836; содержание каждой из статей в точности введено в настоящее описание с помощью ссылки. В качестве другого примера эмбриональные последовательности ДНК для генов вариабельного участка тяжелой и легкой цепей человека можно обнаружить в базе данных СспЬаик. Например. следующие эмбриональные последовательности тяжелой цепи. обнаруженные у мыши в НитАЬ НС.о7. являются доступными в СснЬниК и сопровождаются присвоенными номерами СснЬниК: 169 (Ν0_0010109. ΝΤ_024637 и ВС070333). 3-33 (ЫС_0010109 и ΝΤ_024637) и 3-7 (ЫС_0010109 и ΝΤ_024637). В качестве другого примера следующие эмбриональные последовательности тяжелой цепи. обнаруженные у мыши в НитАЬ НСо12. являются доступными в СенЫ-тк и сопровождаются присвоенными номерами 6еиЬаηк: 1-69 (Ν0_0010109. ΝΤ_024637 и ВС070333). 5-51 (Ν0_0010109 и ΝΤ_024637).
4-34 (Ν0_0010109 и ΝΤ_024637). 3-30.3 (СА1556644) и 3-23 (А1406678).
Предпочтительными каркасными последовательностями для применения в антителах по изобретению являются те. что структурно подобны каркасным последовательностям. применяемым в выбранных антителах по изобретению. например подобны УН 3-30.3 каркасным последовательностям (8Е0 ΙΌ Ν0: 51). и/или УН 3-33 каркасным последовательностям (8Е0 ΙΌ Ν0: 52). и/или УН 4-61 каркасным последовательностям (8Е0 ΙΌ Ν0: 53). и/или Ук Ь6 каркасным последовательностям (8Е0 ΙΌ Ν0: 54). и/или Ук Ь18 каркасным последовательностям (8Е0 ΙΌ Ν0: 55). и/или Ук Ь15 каркасным последовательностям (8Е0 ΙΌ Ν0: 56). применяемым предпочтительными антителами по изобретению. УН СЭК1. СЭК2 и СЭК3 последовательности и Ук СЭК1. СЭК2 и СЭК3 последовательности могут быть пересажены на каркасные участки. которые имеют идентичные последовательности тем. что обнаружены у эмбрионального гена иммуноглобулина. из которого каркасная последовательность выделена. или СОК последовательности могут быть пересажены на каркасные участки. которые содержат одну или более мутаций по сравнению с эмбриональными последовательностями. Например. было обнаружено. что в некоторых случаях бывает полезно вводить мутации в остатки внутри каркасных участков для поддержания или усиления антигенсвязывающей способности антитела (см.. например. И8 патенты № 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 Онеем с! а!).
Другой тип модификации вариабельного участка представляет собой мутации аминокислотных остатков внутри УН и/или Ук СЭК1. СЭК2 и/или СЭК3 участков с тем. чтобы таким образом улучшить связывающие свойства (например. сродство) интересующего антитела. Может быть осуществлен сайтнаправленный мутагенез или ПЦР-опосредованный мутагенез для введения мутации(й). и с помощью ίη νίΐτο или ίη νίνο анализов. как описано в настоящем описании и предлагается в примерах. можно оценить эффект мутации на связывание антитела или другое интересующее функциональное свойство. Предпочтительно вводят консервативные модификации (как обсуждалось выше). Мутации могут представлять собой аминокислотные замены. вставки или делеции. но предпочтительно замены. Кроме того. обычно внутри СОК участка изменено не более одного. двух. трех. четырех или пяти остатков.
Соответственно в другом воплощении в изобретении предлагаются выделенные моноклональные антитела к СП70 или их антигенсвязывающие участки. включающие вариабельной участок тяжелой цепи. включающий (а) УН СЭК1 участок. включающий аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8ЕО ΙΌ Ν0: 11-15. или включающий аминокислотную последовательность. имеющую одну. две. три. четыре или пять аминокислотных замен. делеций или вставок по сравнению с 8Е0 ΙΌ Ν0: 11-15; (Ь) УН СЭК2 участок. включающий аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8Е0 ΙΌ Ν0: 16-20. или включающий аминокислотную последовательность. имеющую одну. две. три. четыре или пять аминокислотных замен. делеций или вставок по сравнению с 8ЕО ΙΌ Ν0: 16-20; (с) УН СЭК3 участок. включающий аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8ЕО ΙΌ Ν0: 21-25. или включающий аминокислотную последовательность. имеющую одну. две. три. четыре или пять аминокислотных замен. делеций или вставок по сравнению с 8ЕО ΙΌ Ν0: 21-25; (б) Ук СЭК1 участок. включающий аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8ЕО ΙΌ Ν0: 26-30. или включающий аминокислотную последовательность. имеющую одну. две. три. четыре или пять аминокислотных замен. делеций или вставок по сравнению с 8ЕО ΙΌ Ν0: 26-30; (е) Ук СЭК2 участок. включающий аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8ЕО ΙΌ Ν0: 31-35. или включающий аминокислотную последовательность. имеющую одну. две. три. четыре или пять аминокислотных замен. делеций или вставок по сравнению с 8ЕО ΙΌ Ν0: 31-35; и (Γ) Ук СЭК3 участок. включающий аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8ЕО ΙΌ Ν0: 36-40. или включающий аминокислотную последовательность. имеющую одну. две. три. четыре или пять аминокислотных замен. делеций или вставок по сравнению с 8ЕО ΙΌ Ν0: 36-40.
Сконструированные антитела по изобретению включают те. в которых были произведены модификации на остатках каркасного участка в УН и/или Ук. например. для улучшения свойств антитела. Обычно такие модификации каркасного участка производят для уменьшения иммуногенности антитела. Например. один из способов представляет собой обратную мутацию одного или более остатков каркасно
- 16 016186 го участка до соответствующей эмбриональной последовательности. Более конкретно, антитело, которое было подвергнуто соматической мутации, может содержать остатки каркасного участка, которые отличаются от эмбриональной последовательности, из которой выделено антитело. Такие остатки могут быть идентифицированы путем сравнения последовательностей каркасного участка антитела с эмбриональными последовательностями, из которых выделено антитело. Подразумевается, что такие антитела с обратными мутациями охвачены изобретением. Например, для 10В4 аминокислотный остаток #2 (внутри РК1) из Ун представляет собой изолейцин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности Ун 3-30.3 представляет собой валин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, соматические мутации могут быть подвергнуты обратной мутации до эмбриональной последовательности с помощью, например, сайт-направленного мутагенеза или ПЦР-опосредованного мутагенеза (например, остаток 2 из РК.1 Ун 10В4 может быть подвергнут обратной мутации из изолейцина в валин).
В качестве другого примера для 10В4 аминокислотный остаток #30 (внутри РК1) из Ун представляет собой глицин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности Ун 330.3 представляет собой серин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 30 из РК1 Ун 10В4 может быть подвергнут обратной мутации из глицина в серин.
В качестве другого примера для 8В 5 аминокислотный остаток #24 (внутри РК1) из Ун представляет собой треонин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности Ун 3-33 представляет собой аланин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 24 из РК1 Ун 8В5 может быть подвергнут обратной мутации из треонина в аланин.
В качестве другого примера для 8В5 аминокислотный остаток #77 (внутри РК3) из Ун представляет собой лизин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности Ун 3-33 представляет собой аспарагин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 11 из РК3 Ун 8В5 может быть подвергнут обратной мутации из лизина в аспарагин.
В качестве другого примера для 8В 5 аминокислотный остаток #80 (внутри РК3) из Ун представляет собой серин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности Ун 3-33 представляет собой тирозин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 14 из РК3 Ун 8В5 может быть подвергнут обратной мутации из серина в тирозин.
В качестве другого примера для 69А7 аминокислотный остаток #50 (внутри РК2) из Ун представляет собой лейцин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности Ун 4-61 представляет собой изолейцин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 13 из РК2 Ун 69А7 может быть подвергнут обратной мутации из лейцина в изолейцин.
В качестве другого примера для 69А7 аминокислотный остаток #85 (внутри РК3) из Ун представляет собой аргинин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности Ун 4-61 представляет собой серин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 18 из РК3 Ун 69А7 может быть подвергнут обратной мутации из аргинина в серин.
В качестве другого примера для 69А7 аминокислотный остаток #89 (внутри РК3) из Ун представляет собой треонин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности Ун 4-61 представляет собой аланин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 22 из РК3 Ун 69А7 может быть подвергнут обратной мутации из треонина в аланин.
В качестве другого примера для 10В4 аминокислотный остаток #46 (внутри РК2) из Уъ представляет собой фенилаланин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности Уъ Ь18 представляет собой лейцин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 12 из РК2 Уь 10В4 может быть подвергнут обратной мутации из фенилаланина в лейцин.
В качестве другого примера для 69А7 аминокислотный остаток #49 (внутри РК2) из Уъ представляет собой фенилаланин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности Уъ Ь6 представляет собой тирозин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 15 из РК2 Уъ 69А7 может быть подвергнут обратной мутации из фенилаланина в тирозин.
Другой тип модификаций каркасного участка включает мутирование одного или более остатков внутри каркасного участка или даже внутри одного или более СЭК участков с удалением Т-клеточных эпитопов с тем, чтобы таким образом уменьшить потенциальную иммуногенность антитела. Этот способ также обозначается как деиммунизация и описан в дополнительных подробностях в И8 публикации патента № 20030153043, Сагг е! а1.
- 17 016186
Сконструированные антитела по изобретению также включают те антитела, в которых были произведены модификации аминокислотных остатков для увеличения или уменьшения иммуногенных ответов через аминокислотные модификации, которые изменяют взаимодействие Т-клеточного эпитопа на антителе (см., например, И8 патенты № 6835550, 6897049 и 6936249).
Дополнительно или альтернативно, модификациям, произведенным внутри каркасных участков или СОЯ участков, антитела по изобретению могут быть сконструированы так, что они включают модификации внутри Ес-участка, обычно для изменения одного или более функциональных свойств антитела, таких как сывороточный период полужизни, фиксация комплемента, связывание Ес-рецептора и/или антигензависимая клеточная цитотоксичность. Кроме того, антитело по изобретению может быть химически модифицировано (например, к антителу может быть присоединен один или более химических компонентов) или может быть модифицировано для изменения его гликозилирования и еще для изменения одного или более функциональных свойств антитела. Каждое из этих воплощений описано в дополнительных подробностях ниже. Нумерация остатков в Ес-участке соответствует индексу ЕЙ КаЬа!.
В одном воплощении шарнирный участок ΟΗ1 модифицируют так, что изменяется количество цистеиновых остатков в шарнирном участке, например увеличивается или уменьшается. Указанный способ описан дополнительно в И8 патенте № 5677425, Вобтег е! а1. Количество цистеиновых остатков в шарнирном участке ΟΗ1 изменяется, например, для облегчения сборки легкой и тяжелой цепей или для увеличения или уменьшения стабильности антитела.
В другом воплощении Ес шарнирный участок антитела подвергают мутации для уменьшения биологического периода полужизни антитела. Более конкретно, одну или более аминокислотных мутаций вводят в СН2-СН3 домен контактного участка Ес-шарнирного фрагмента так, что у антитела ослабевает связывание стафилококкового белка А (8рА) по отношению к связыванию с 8рА нативного Есшарнирного домена. Этот способ описан в дополнительных подробностях в И8 патенте № 6165745, \Уагб е! а1.
В другом воплощении антитело модифицируют для увеличения его биологического периода полужизни. Возможны разнообразные способы. Например, может быть введена одна или более из следующих мутаций: Т252Ь, Т2548, Т256Е, как описано в И8 патенте № 6277375, \Уагб. Альтернативно, для увеличения биологического периода полужизни антитело может быть изменено внутри ΟΗ1- или Сь-участка так, чтобы оно содержало эпитоп связывания с утилизирующим рецептором, заимствованный из двух шпилек СН2-домена Ес-участка 1дС, как описано в И8 патентах № 5869046 и 6121022, Рге§!а е! а1.
Еще в других воплощениях Ес-участок изменяют путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком для изменения эффекторной функции(й) антитела. Например, одна или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322, может быть заменена другим аминокислотным остатком, так что у антитела изменяется сродство к эффекторному лиганду, но сохраняется антигенсвязывающая способность родительского антитела. Эффекторный лиганд, к которому изменяется сродство, может представлять собой, например, Есрецептор или С1 компонент комплемента. Этот способ описан в дополнительных подробностях в И8 патентах № 5624821 и 5648260, оба \Ут1ег е! а1.
В другом примере одна или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322, может быть заменена другим аминокислотным остатком, так что у антитела изменяется С1с.|связывание и/или уменьшается или отменяется комплементзависимая цитотоксичность (СЭС). Этот способ описан в дополнительных подробностях в И8 патенте № 6194551, Инюще е! а1.
В другом примере изменяют один или более аминокислотных остатков на участке между положениями аминокислот 231 и 239, таким образом изменяя способность антитела фиксировать комплемент. Этот способ описан в дополнительных подробностях в РСТ публикации \УО 94/29351, Вобтег е! а1.
Еще в другом примере модифицируют Ес-участок для увеличения способности антитела опосредовать зависимую от антитела цитотоксичность клеток (АЭСС) и/или для увеличения сродства антитела к Есу-рецептору путем модификации одной или более аминокислот в следующих положениях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Этот способ описан дополнительно в РСТ публикации \УО 00/42072, Рге§!а. Кроме того, сайты связывания на 1дС1 человека для ЕсуЯ1, ЕсуЯ11, ЕсуЯШ и ЕсЯп были картированы, варианты для улучшения связывания описаны (см. 8Ые1б§, Я.Ь. е! а1. (2001), I. Вю1 СНет. 276:6591-6604). Было показано, что конкретные мутации в положениях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 улучшают связывание с ЕсуЯШ. Дополнительно, было показано, что следующая комбинация мутаций улучшает связывание с ЕсуЯШ: Т256А/8298А, 8298А/Е333А, 8298А/К224А и 8298А/Е333А/К334А.
Еще в одном воплощении модифицируют гликозилирование антитела. Например, может быть получено дегликозилированное антитело (т.е. антитело лишено гликозилирования).
Гликозилирование может быть изменено, например, для увеличения сродства антитела к антигену. Такие углеводные модификации могут быть выполнены, например, путем изменения одного или более
- 18 016186 сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Например. может быть произведена одна или более аминокислотных замен. что приводит в результате к исключению одного или более вариабельных участков каркасных сайтов гликозилирования. таким образом исключая гликозилирование по этому сайту. Такое гликозилирование может увеличить сродство антитела к антигену. Такой способ описан в дополнительных подробностях в И8 патентах № 5714350 и 6350861. Со е! а1.
Дополнительно или альтернативно. может быть получено антитело. которое имеет измененный тип гликозилирования. такое антитело. как гипофукозилированное антитело. имеющее уменьшенное количество фукозных остатков. или антитело. имеющее увеличенное количество бисекторных С1с№1с структур. Было продемонстрировано. что такие образцы с измененным гликозилированием увеличивают АЭСС способность антител. Такие углеводные модификации могут быть выполнены. например. путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Описание клеток с измененным механизмом гликозилирования известно из уровня техники. и они могут применяться в качестве клеток-хозяев. в которых экспрессируются рекомбинантные антитела по изобретению и. таким образом. продуцируются антитела с измененным гликозилированием. Например. клеточные линии Мк704. Мк705 и Мк709 лишены гена фукозилтрансферазы. ЕИТ8 (альфа (1.6) фукозилтрансфераза). так что углеводы антител. экспрессирующихся в клеточных линиях Мк704. Мк705 и Мк709. лишены фукозы. Клеточные линии Мк704. Мк705 и Мк709 ЕИТ8-/- были созданы путем направленного нарушения гена ЕИТ8 в клетках СНО/ИС44 с применением двух замещающих векторов (см. И8 публикацию патента № 20040110704 от Уатапе е! а1. и Уатапе-ОЬпцк1 е! а1. (2004). Вю!есЬпо1 Вюепд 87:614-22). В качестве другого примера. в ЕР 1176195 от Напа1 е! а1. описана клеточная линия с функционально нарушенным геном ЕИТ8. который кодирует фукозилтрансферазу. так что антитела. экспрессирующиеся в такой клеточной линии. проявляют гипофукозилирование путем уменьшения или исключения альфа 1.6 связанного фермента. Напа1 е! а1. также описывают клеточные линии. которые обладают низкой ферментативной активностью. связанной с добавлением фукозы к Ν-ацетилглюкозамину. который связывается с Ес-участком антитела. или не обладают ферментативной активностью. например крысиная клеточная линия миеломы ΥΒ2/0 (АТСС СРЕ 1662). РСТ публикация АО 03/035835 от Ргек!а описывает вариант клеточной линии СНО. клетки Ьес13. с уменьшенной способностью присоединять фукозу к Акп(297)-связанным углеводам. что также приводит в результате к гипофукозилированию антител. экспрессирующихся в такой клетке-хозяине (см. также ЗЫеШв. К.Ь. е! а1. (2002). 1. Вю1. СНет. 277:26733-26740). РСТ публикация АО 99/54342 от Итапа е! а1. описывает клеточные линии. сконструированные для экспрессии модифицированных по гликопротеину гликозилтрансфераз (например. бета (1.4)-Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (СпТШ)). так что антитела. экспрессирующиеся в сконструированных клеточных линиях. проявляют увеличенные бисекторные структуры С1с№1с. которые приводят в результате к увеличенной АЭСС активности антител (см. также Итапа е! а1. (1999). №11. Вю!есЬ. 1. 7:176-180). Альтернативно. фукозные остатки антитела могут быть отщеплены с применением фермента фукозидазы. Например. фукозидаза альфа-Ь-фукозидаза - удаляет фукозильные остатки из антитела (Тагепбпо. А.Ь. е! а1. (1975). ВюсНет. 14:5516-23).
Другая модификация антител по изобретению. которая предлагается в настоящем описании. представляет собой пегилирование. Антитело может быть пегилировано. например. для увеличения биологического (например. сывороточного) периода полужизни антитела. Для того чтобы пегилировать антитело. обычно проводят взаимодействие антитела или его фрагмента с полиэтиленгликолем (РЕС). таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное РЕС. при условиях. в которых одна или более РЕС групп присоединяется к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно пегилирование проводится через реакцию ацилирования или реакцию алкилирования с реакционноспособной молекулой РЕС (или с аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером).
Подразумевается. что термин полиэтиленгликоль. как применяется в настоящем описании. охватывает любую из форм РЕС. которая применялась для модификации других белков. таких форм. как моно (С1-С10) алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. В определенных воплощениях антитело будет пегилировано. если оно является дегликозилированным. Способы пегилирования белков известны из уровня техники и могут применяться к антителам по изобретению. См.. например. ЕР 0154316 от МкЫтига е! а1. и ЕР 0401384 от НЫкатеа е! а1.
Физические свойства антитела.
Антитела по настоящему изобретению могут быть дополнительно охарактеризованы с помощью разнообразных физических свойств антител к СИ19. Могут применяться разнообразные анализы для того. чтобы детектировать и/или дифференцировать антитела на различные классы на основе этих физических свойств.
В некоторых воплощениях антитела по настоящему изобретению могут содержать один или более сайтов гликозилирования в вариабельном участке легкой или тяжелой цепи. Присутствие одного или более сайтов гликозилирования в вариабельном участке может привести в результате к увеличенной иммуногенности антитела или к изменению рК антитела благодаря изменению в связывании антигена (Маг81а11 е! а1. (1972). Ати Кеу. ВюсНет. 41:673-702; Са1а ЕА и Мот коп 8.Ь. (2004). 1. Iттиηο1. 172:5489-94; АаШск е! а1. (1988). 1. Ехр. Меб. 168:1099-109; 8рио К.С. (2002). С1усоЬю1оду 12:43К-56К;
- 19 016186
РагекБ е! а1. (1985), №11иге 316:452-7; М1тига е! а1. (2000), Мо1. ^типоГ 37:697-706). Известно, что гликозилирование встречается на мотивах, содержащих последовательность №Х-8/Т. Гликозилирование вариабельного участка может быть протестировано с применением анализа Гликоблот, при котором антитело расщепляется с получением ГаЬ, и затем тестируется на гликозилирование с применением анализа, при котором измеряется окисление периодатом и образование основания Шиффа. Альтернативно, гликозилирование вариабельного участка может быть протестировано с применением хроматографии с рассеянием света (Бюпех-ЬС), при которой сахариды отщепляются от ГаЬ до моносахаридов, и анализируется содержание индивидуального сахарида. В некоторых случаях предпочтительно иметь антитело к СБ19, которое не содержит гликозилирования в вариабельном участке. Этого можно достичь путем селекции антител, которые не содержат мотива гликозилирования в вариабельном участке, или путем введения мутаций в остатки внутри мотива гликозилирования с применением стандартных методик, хорошо известных из уровня техники.
В предпочтительном воплощении антитела по настоящему изобретению не содержат сайтов изомеризации аспарагина. Деамидирование или эффект изоаспарагиновой кислоты может встречаться на N-0 или Э-С последовательностях соответственно. Деамидирование или эффект изоаспарагиновой кислоты приводит в результате к созданию изоаспарагиновой кислоты, которая уменьшает стабильность антитела путем создания ломаной структуры скорее благодаря карбоксиконцу боковой цепи, чем основной цепи. Создание изоаспарагиновой кислоты может быть измерено с применением изоквантового анализа, при котором применяется ВЭЖХ с обращенной фазой для тестирования на изоаспарагиновую кислоту.
Каждое антитело будет иметь уникальную изоэлектрическую точку (ρί), но в основном антитела попадают в предел рН между 6 и 9,5. ρί для Ι§61 антитела обычно попадает в предел рН 7-9,5, и ρί для Ιβ04 антитела обычно попадает в предел рН 6-8. Антитела могут иметь ρί, которая находится вне этого предела. Хотя эффекты в основном не изучены, существуют предположения, что антитела с ρί вне нормального предела могут иметь частично неправильную сборку и проявлять нестабильность при ίη у1уо условиях. Изоэлектрическая точка может быть протестирована с применением капиллярного анализа изоэлектрического фокусирования, при котором создается градиент рН и может применяться лазерное фокусирование для увеличенной точности (.Ташш е! а1. (2002), Е1есί^оρйо^е8^8 23:1605-11; Ма е! а1. (2001), СΊ1^о1ηаЮβ^аρ11^а 53: 875-89; Нип! е! а1. (1998), Г СБгота!одг А 800:355-67). В некоторых случаях предпочтительно иметь антитело СБ19, которое содержит ρί с величиной, которая попадает в нормальный предел. Этого можно достичь или путем селекции антител с ρί в нормальном пределе, или путем введения мутаций в заряженные поверхностные остатки с применением стандартных методик, хорошо известных из уровня техники.
Каждое антитело будет иметь температуру плавления, которая является индикатором термостабильности (КгЫтатийНу К. и Маптпд М.С. (2002), Сигг РНагт. Вю!есБпо1. 3:361-71). Большая термостабильность указывает на большую стабильность антитела ίη у1уо и в целом. Точка плавления антитела может быть измерена с применением таких методик, как дифференциальная сканирующая калориметрия (СБеп е! а1. (2003), РНагт. Кез. 20:1952-60; 6Ыг1апбо е! а1. (1999), Iттиηо1. Ьей 68:47-52). Тм1 указывает на температуру начала разборки антитела. Тм2 указывает на температуру полной разборки антитела. В основном предпочтительно, чтобы Тм1 антитела по настоящему изобретению была выше 60°С, предпочтительно выше 65°С, еще более предпочтительно выше 70°С. Альтернативно, термостабильность антитела может быть измерена с применением циклического дихроизма (Миггау е! а1. (2002), Г СБгота!одг 8с1. 40:343-9).
В предпочтительном воплощении селектируются антитела, которые не деградируют быстро. Фрагментация антитела к СБ19 может быть измерена с применением капиллярного электрофореза (СЕ) и МАГЭ[-М8. как хорошо понятно из уровня техники (А1ехапбег А.Г и НидБез Б.Е. (1995), Апа1. СБет. 67:3626-32).
В другом предпочтительном воплощении селектируются антитела, которые обладают минимальными эффектами агрегации. Агрегация может приводить к запуску нежелательного иммунного ответа и/или к измененным или неблагоприятным фармакокинетическим свойствам. В основном антитела являются приемлемыми с агрегацией 25% или менее, предпочтительно 20% или менее, еще более предпочтительно 15% или менее, еще более предпочтительно 10% или менее и еще более предпочтительно 5% или менее. Агрегация может быть измерена с помощью нескольких методик, хорошо известных из уровня техники, включающих эксклюзионную колоночную (8ЕС) высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и светорассеяние для идентификации мономеров, димеров, тримеров или мультимеров.
Способы конструирования антител.
Как обсуждалось выше, антитела к СБ70, имеющие последовательности νΗ и ν., описанные в настоящем изобретении, могут применяться для создания новых антител к СБ70 путем модификации νΗи/или ^-последовательностей или присоединенного к ним константного участка(ов). Таким образом, в другом аспекте изобретения структурные черты антитела к СБ70 по изобретению, например 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 или 69А7, применяются для создания родственных по структуре антител к СБ70, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител по изобретению, такое как связывание с СБ70 человека. Например, один или более СЭК участков из 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 или 69А7 или их
- 20 016186 мутированные формы могут быть рекомбинантно объединены с известными каркасными участками и/или другими СОВ участками для создания дополнительных рекомбинантно сконструированных антител к ί.Ό70 по изобретению. как обсуждалось выше. Другие типы модификаций включают те. что описаны в предыдущем разделе. Стартовый материал для способа конструирования представляет собой одну или более Ун- и/или УК-последовательностей. предложенных здесь. или один или более СОВ участков из них. Для создания сконструированного антитела не является необходимым фактическое получение (т. е. экспрессия в виде белка) антитела. имеющего одну или более Ун- и/или УК-последовательностей. предложенных здесь. или один или более СЭВ участков из них. Чаще. информация. содержащаяся в последовательности^). применяется в качестве стартового материала для создания второй генерации последовательностей). выделенных из исходной последовательности(ей). и затем получают вторую генерацию последовательности(ей) и экспрессируют в виде белка.
Соответственно в другом воплощении в изобретении предлагается способ получения антитела к ί.Ό70. включающий:
(a) предоставление (ί) последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела. включающей ί.ΌΒ1 последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 11-15. СЭВ2 последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 16-20. и/или СЭВ3 последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 21-25; и/или (ίί) последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела. включающей СЭВ 1 последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 26-30. СЭВ2 последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 31-35. и/или СЭВ3 последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 36-40;
(b) изменение по меньшей мере одного аминокислотного остатка внутри последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела и/или внутри последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела; и (c) экспрессию измененной последовательности антитела в виде белка.
Стандартные методики молекулярной биологии могут применяться для получения и экспрессии измененной последовательности антитела.
Предпочтительно антитело. кодируемое измененной последовательностью(ями) антитела. представляет собой антитело. которое сохраняет одну. некоторые или все функциональные свойства антител к ί.Ό70. описанных в настоящем описании. причем функциональные свойства включают. но не ограничены специфическим связыванием с ί.Ό70.
Функциональные свойства измененных антител можно оценить с применением стандартных анализов. доступных из уровня техники и/или описанных в настоящем описании. таких как те. что представлены в примерах (например. проточная цитометрия. анализы связывания).
В определенных воплощениях способов конструирования антител по изобретению могут случайно или выборочно вводиться мутации по всей последовательности. кодирующей антитело к ί.Ό70. или в части последовательности. и полученные в результате модифицированные антитела к ί.Ό70 можно проскринировать на связывающую активность и/или на другие свойства. как описано в настоящем описании. Описание способов введения мутаций известно из уровня техники. Например. РСТ публикация \У0 02/092780 от 81юг1 описывает способы создания и скрининга мутаций с применением насыщенного мутагенеза. сборки синтетического лиганда или их комбинации. Альтернативно. РСТ публикация \У0 03/074679 от Ьахаг е1 а1. описывает способы применения компьютерного скрининга для оптимизации физико-химических свойств антитела.
Молекулы нуклеиновой кислоты. кодирующие антитела по изобретению.
Другой аспект изобретения относится к молекулам нуклеиновой кислоты. которые кодируют антитела по изобретению. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках. в клеточном лизате или в частично очищенной или. по существу. в чистой форме. Нуклеиновая кислота является выделенной или представлена. по существу. в чистом виде при очистке от других клеточных компонентов или других загрязнений. например других клеточных нуклеиновых кислот или белков с помощью стандартных методик. включающих обработку щелочью/δΌδ. разделение на СзС1. колоночную хроматографию. электрофорез на агарозном геле и другие методики. хорошо известные из уровня техники. См.. Р. Аи8иЬе1. е1 а1.. еб. (1987). Снггеп! РгоФсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду. Сгеепе РиЫЫнпд апб \УПеу [п1ег8С1епсе. №\ν Уогк. Нуклеиновая кислота по изобретению может представлять собой. например. ДНК или РНК и может содержать или не содержать интронных последовательностей. В предпочтительном воплощении нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК.
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть получены с применением стандартных методик молекулярной биологии. Для антител. экспрессирующихся с помощью гибридом (например. гибридом. полученных из трансгенных мышей. несущих гены иммуноглобулинов человека. как описано дополнительно ниже). кДНК. кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела. полученного с помощью гибридомы. могут быть получены с помощью стандартных методик ПЦР-амплификации или клонирования кДНК. Для антител. полученных из библиотеки иммуноглобулиновых генов (например. с применением методик фагового дисплея). нуклеиновая кислота. кодирующая антитело. может быть получена из библиотеки.
- 21 016186
Предпочтительные молекулы нуклеиновых кислот по изобретению представляют собой молекулы, кодирующие Ун- и Уъ-последовательности моноклональных антител 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 или 69А7. Последовательности ДНК, кодирующие ^-последовательности из 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7, показаны в 8ЕО ΙΌ N0: 41, 42, 43 , 44 и 45 соответственно. Последовательности ДНК, кодирующие Уъпоследовательности из 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7, показаны в 8Е0 ΙΌ N0: 46, 47, 48, 49 и 50 соответственно.
С однажды полученными фрагментами ДНК, кодирующими Ун- и Уъ-сегменты, могут дополнительно производиться манипуляции посредством стандартных методик рекомбинантной ДНК, например, для превращения генов вариабельного участка в полноразмерные гены цепей антитела, в гены ЕаЬфрагмента или в хсЕу. В указанных манипуляциях фрагмент ДНК, кодирующий Уъ или Ун, является функционально связанным с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константный участок антитела или гибкий линкер. Подразумевается, что термин функционально связанный, как применяется в настоящем описании, обозначает два фрагмента ДНК, объединенные так, что аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются в одной рамке.
Выделенная ДНК, кодирующая Ун-участок, может быть превращена в полноразмерный ген тяжелой цепи путем функционального связывания Ун-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные участки тяжелой цепи (СН1, Сн2 и СН3). Последовательности генов константного участка тяжелой цепи человека известны из уровня техники (см., например, КаЬаЕ Е.А., е1 а1. (1991), 8ес|испсс8 οί РгоЮнъ οί Iттиηο1οд^са1 [Щегех!, ΕίίΐΗ Εώ^οη, И8 ОераПтегИ οί неаНН анй Ηитаη 8егу1се5, Мн ΡΗΜκπΐίοη № 91-3242), и ДНК-фрагменты, охватывающие эти участки, могут быть получены путем стандартной ПЦР-амплификации. Константный участок тяжелой цепи может представлять собой константный участок из 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА, 1дЕ, 1дМ или Ι§ϋ, но наиболее предпочтительно представляет собой константный участок из Ι§01, Ι§02, ΙβΟ3 или ΙβΟ4. Для гена ЕаЬ-фрагмента тяжелой цепи, Ун-кодирующая ДНК может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константный участок Сн1 тяжелой цепи.
Выделенная ДНК, кодирующая Уъ-участок, может быть превращена в полноразмерный ген легкой цепи (а также ЕаЬ ген легкой цепи) путем функционального связывания Уъ-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константный участок легкой цепи Сь. Последовательности генов константного участка легкой цепи человека известны из уровня техники (см., например, КаЬа!, Е.А., с1 а1. (1991), 8α.|ΐκη^8 οί РгоЮиъ οί Iттиηο1οд^са1 Ιηΐοκδΐ, ΕίίΐΗ ЕйНюгт ϋ8 ОераПтеШ οί неа1(Н анй Ηитаη 8егу1се5, МН Ρ^Ι^^οη № 91-3242), и ДНК-фрагменты, охватывающие эти участки, могут быть получены путем стандартной ПЦР-амплификации. Константный участок легкой цепи может представлять собой константный участок каппа или лямбда, но наиболее предпочтительно представляет собой константный участок каппа.
Для создания гена хсЕу, Ун- и Уь-кодирующие ДНК-фрагменты функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующим аминокислотную последовательность (С1у4-8ег)3, так что Ун- и У|-последовательности могут экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка с Уъ- и Ун-участками, объединенными с помощью гибкого линкера (см., например, В1гй е! а1. (1988), 8с1спсс 242:423-426; НихЮи е! а1. (1988), Ргос. №111. Асай. 8с1. И8А 85:5879-5883; МсСайейу е! а1. (1990), №11игс 348:552-554).
Получение моноклональных антител по изобретению.
Моноклональные антитела (тАЬ) по настоящему изобретению могут быть получены с помощью разнообразных методик, включающих подходящую методологию моноклонального антитела, например стандартную методику гибридизации соматических клеток по ΚοΙιΜ и ΜίΕΜη (1975), №11иге 256:495. Хотя процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе, могут применяться другие методики получения моноклонального антитела, например вирусная или онкогенная трансформация В-лимфоцитов.
Предпочтительной животной системой для получения гибридом является мышиная система. Получение гибридомы с помощью мыши представляет собой хорошо изученную процедуру. Протоколы иммунизации и методики выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны из уровня техники. Партнеры для слияния (например, мышиные клетки миеломы) и процедуры слияния также известны.
Химерные и гуманизированные антитела по настоящему изобретению могут быть получены на основе последовательности мышиного моноклонального антитела, полученного, как описано выше. ДНК, кодирующие иммуноглобулиновые гены тяжелой и легкой цепей, могут быть получены из интересующей мышиной гибридомы и сконструированы с применением стандартных методик молекулярной биологии так, чтобы они содержали немышиные (например, человеческие) иммуноглобулиновые последовательности. Например, для создания химерного антитела мышиный вариабельный участок может быть связан с человеческими константными участками с применением способов, известных из уровня техники (см., например, И8 патент № 4816567 от СаЕ11у е! а1.). Для создания гуманизированного антитела, мышиные СОЯ участки могут быть вставлены в человеческие каркасные участки с применением способов, известных из уровня техники (см., например, И8 патент № 5225539 от ХУпИег и И8 патенты № 5530101;
- 22 016186
5585089; 5693762 и 6180370 от Сиееп е! а1.).
В предпочтительном воплощении антитела по изобретению являются человеческими антителами. Такие человеческие моноклональные антитела непосредственно против СЭ70 могут быть получены с применением трансгенных или трансхромосомных мышей, чаще несущих части иммунной системы человека, чем иммунной системы мыши. Указанные трансгенные или трансхромосомные мыши включают мышей, обозначенных в настоящем описании как НишЛЬ Мойке® и КМ Мойке® соответственно и вместе обозначены в настоящем описании как мыши с человеческими 1д.
НишЛЬ Мойке® (Мебагех, 1пс.) содержит минилокусы человеческих иммуноглобулиновых генов, которые кодируют несгруппированные последовательности тяжелой (μ и γ) и легкой цепи к иммуноглобулинов человека, вместе с направленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы μ и к цепей (см., например, ЬопЬегд, е! а1. (1994), №1Шге 368(6474): 856-859). Соответственно мыши проявляют пониженную экспрессию мышиного 1дМ или к, и в ответ на иммунизацию введенные трансгены тяжелой и легкой цепей человека подвергаются переключению классов и соматической мутации для получения высокоаффинных 1дСк моноклональных антител человека (ЬопЬегд, N. е! а1. (1994), указано выше; обзор ЬопЬегд, N. (1994), НапбЬоок о! Ехрептеп!а1 Рйагтасо1о§у 113:49-101; ЬопЬегд, N. и Ник/аг Ό. (1995), 1п!егп. Неу. 1шшипо1. 13:65-93, и Нагбшд, Е. и ЬопЬегд, N. (1995), Апп. N. Υ. Асаб. 8с1. 764:536-546). Получение и применение НишЛЬ мышей и геномные модификации, проведенные с помощью таких мышей, дополнительно описаны у Тау1ог, Ь. е! а1. (1992), №с1ею Асйк Некеагсй 20:6287-6295; Сйеп. 1. е! а1. (1993), 1п!егпа!юпа1 1шшипо1о§у 5:647-656; ТиаШоп е! а1. (1993), Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А, 90:3720-3724; СЬо1 е! а1. (1993), ХаИие Сепейск 4:117-123; Сйеп, 1. е! а1. (1993), ЕМВО 1. 12:821-830; ТиаШоп е! а1. (1994), 1. 1шшипо1. 152:2912-2920; Тау1ог, Ь. е! а1. (1994), 1п!егпа!юпа1 1шшипо1о§у 6:579-591; и Е1кйМ1б, Ό. е! а1. (1996), №Шге Вю!есйпо1о§у 14:845-851, содержание каждой из которых в точности полностью введено в настоящее описание с помощью ссылки. См. дополнительно И8 патенты № 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; все от ЬопЬег§ и Кау; И8 патент № 5545807 от 8игаш е! а1.; РСТ публикации № АО 92/03918, АО 93/12227, АО 94/25585, АО 97/13852, АО 98/24884 и АО 99/45962, все от ЬопЬег§ и Кау; и РСТ публикация № АО 01/14424 от Когтап е! а1.
В другом воплощении человеческие антитела по изобретению могут быть получены с применением мыши, которая несет человеческие иммуноглобулиновые последовательности на трансгенах и трансхромосомах, такой мыши, которая несет трансген тяжелой цепи человека и трансхромосому легкой цепи человека. Указанные мыши, обозначенные в настоящем описании как КМ Мойке®, подробно описаны в РСТ публикации АО 02/43478 от 1кЫба е! а1.
Кроме того, альтернативные трансгенные животные системы, экспрессирующие человеческие иммуноглобулиновые гены, доступны из уровня техники и могут применяться для получения антител к СЭ70 по изобретению. Например, может применяться альтернативная трансгенная система, обозначенная как Ксеномышь (АЬдешх, 1пс.); указанные мыши описаны, например, в И8 патентах № 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963 от Кисйег1арай е! а1.
Кроме того, альтернативные трансхромосомные животные системы, экспрессирующие человеческие иммуноглобулиновые гены, доступны из уровня техники и могут применяться для получения антител к СЭ70 по изобретению. Например, могут применяться мыши, несущие обе трансхромосомы тяжелой цепи человека и легкой цепи человека, обозначенные как ТС-мыши; указанные мыши описаны Топи/ика е! а1. (2000), Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 97:722-727. В качестве другого примера описание коров, несущих трансхромосомы тяжелой цепи человека и легкой цепи человека, известны из уровня техники (Киго1^а е! а1. (2002), №1Шге Вю!есйио1о§у 20:889-894) и могут применяться для получения антител к ί.Ό70 по изобретению.
Человеческие моноклональные антитела по изобретению также могут быть получены с применением способов фагового дисплея для скрининга библиотек человеческих иммуноглобулиновых генов. Указанные способы фагового дисплея для выделения человеческих антител установлены из уровня техники. См., например, И8 патенты № 5223409; 5403484 и 5571698 от Ьабпег е! а1.; И8 патенты № 5427908 и 5580717 от Эо^ег е! а1.; И8 патенты № 5969108 и 6172197 от МсСаГГеПу е! а1. и И8 патенты № 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 от СпШШк е! а1.
Человеческие моноклональные антитела по изобретению также могут быть получены с применением мышей 8СГО, в которых человеческие иммунные клетки были восстановлены так, чтобы при иммунизации генерировался ответ человеческого антитела. Такие мыши описаны, например, в И8 патентах № 5476996 и 5698767 от Айкоп е! а1.
Иммунизация мышей с человеческим 1д.
Когда для получения человеческих антител по изобретению применяются мыши с человеческим 1д, такие мыши могут быть иммунизированы с помощью клеточной линии, экспрессирующей СЭ70, очищенного или обогащенного препарата антигена СЭ70 и/или рекомбинантного СЭ70 или сшитого с СЭ70 белка, как описано ЬопЬегд, N. е! а1. (1994), №1Шге 368(6474):856-859; Е1кйМ1б, Ό. е! а1. (1996), №1Шге Вю!есйпо1о§у 14:845-851; и в РСТ публикации АО 98/24884 и АО 01/14424. Предпочтительно возраст
- 23 016186 мышей достигает 6-16 недель при первой иммунизации. Например, очищенный или рекомбинантный препарат (5-50 мкг) антигена С.Б70 может применяться для иммунизации мышей с человеческим 1д внутрибрюшинно.
Подробные процедуры для основательного получения человеческих моноклональных антител к СБ70 описаны в примере 1 ниже. Накопленный опыт с разнообразными антигенами показал, что трансгенные мыши реагируют при начальной внутрибрюшинной иммунизации (ΙΡ) с антигеном в полном адъюванте Фрейнда (Ртеииб), с последующими иммунизациями ΙΡ каждую неделю общим количеством из 6 иммунизаций в неполном адъюванте Фрейнда. Однако обнаружено, что адъюванты, отличные от адъюванта Фрейнда, также являются эффективными. Кроме того, обнаружено, что цельные клетки в отсутствие адъюванта являются высокоиммуногенными. Можно проследить за иммунным ответом в течение курса протокола иммунизации с образцами плазмы, полученными, например, при ретроорбитальных отборах крови. Плазма может быть проскринирована с помощью ЕЫ8А, и мыши с подходящими титрами человеческого иммуноглобулина к СБ70 могут применяться для слияний (как описано в примере 1). Мышам можно вводить внутривенно антиген в течение 3 дней перед умерщвлением и удалением селезенки. Ожидается, что может быть необходимо осуществить 2-3 слияния для каждой иммунизации. Обычно иммунизируется от 6 до 24 мышей для каждого антигена. Обычно применяются обе линии НСо7 и НСо12. Получение мышиных линий НСо7 и НСо12 описано в И8 патенте № 5770429 и примере 2 из РСТ публикации XVО 01/09187 соответственно. Кроме того, оба трансгена, НСо7 и НСо12, могут быть размножены вместе в одной мыши, имеющей два различных трансгена тяжелой цепи человека (НСо7/НСо12). Альтернативно или дополнительно, может применяться линия КМ мыши®, как описано в РСТ публикации νθ 02/43478.
Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела по изобретению.
Чтобы получить гибридомы, продуцирующие человеческие моноклональные антитела по изобретению, спленоциты и/или клетки лимфатического узла из иммунизированных мышей могут быть выделены и может быть проведено их слияние с подходящей иммортализованной клеточной линией, такой как мышиная клеточная линия миеломы. Полученные в результате гибридомы могут быть проскринированы на продуцирование антиген-специфических антител. Например, одноклеточные суспензии лимфоцитов селезенки из иммунизированных мышей могут быть слиты с одной шестой от количества Р3Х63-Ад8.653 несекретирующихся мышиных клеток миеломы (АТСС, СКЬ 1580) в 50% РЕО. Альтернативно, может быть проведено слияние одноклеточных суспензий лимфоцитов селезенки из иммунозированных мышей с применением способа электрослияния на основе электрического поля с применением СуЮ Рике крупнокамерного электропоратора для слияния клеток (Су!о Рике 8аепсе5. 1пс., О1еи Витше, МБ). Клетки высевают с плотностью приблизительно 2х105 на дно ячейки планшета для микротитрования с последующей инкубацией в течение одной недели в среде БМЕМ с высоким содержанием глюкозы с Ьглутамином и пируватом натрия (Меб1а1есб, 1ис., нетибои, У А) и дополнительно содержащей 20% фетальную бычью сыворотку (нус1оие, Ьодаи, ИТ), 18% кондиционирующую среду Р388Б1, 5% фактор клонирования гибридомы Олден (ВюУепк, ОайбегаЬигд, УА), 4 мМ Ь-глутамин, 5 мМ нЕРЕ8, 0,055 мМ β-меркаптоэтанол, 50 единиц/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина и 1х среду гипоксантинаминоптерин-тимидин (нАТ) (81дта; нАТ добавляют через 24 ч после слияния). Через одну неделю клеткам, культивированным в среде, в которой применялся нАТ, заменяют его на НТ. Индивидуальные ячейки могут быть затем проскринированы с помощью ЕЫ8А на человеческие моноклональные антитела 1дМ и 1дО. Рост гибридомы обычно может наблюдаться через 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитела, могут быть пересеяны, проскринированы снова, и если все равно остается положительная реакция на человеческий 1дО, то моноклональные антитела могут быть субклонированы по меньшей мере дважды путем ограничивающего разведения. Стабильные субклоны могут затем культивироваться ш νίΙΐΌ для получения небольших количеств антитела в среде для культивирования тканевых и клеточных культур для характеризации.
Для очистки человеческих моноклональных антител селектированные гибридомы могут быть выращены в двухлитровых роллерных флаконах для очистки моноклонального антитела. Супернатанты могут быть отфильтрованы и сконцентрированы перед аффинной хроматографией с протеин Асефарозой (Рбаттааа, Ркса1атау, Ν.Ρ). Элюированный 1дО можно проверить с помощью гельэлектрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии, чтобы удостовериться в чистоте. Буферный раствор можно заменить на РВ8 и концентрация может быть определена при ОБ280 с применением коэффициента угасания 1,43. Моноклональные антитела могут быть разделены на аликвоты и могут храниться при -80°С.
Получение трансфектом, продуцирующих моноклональные антитела по изобретению.
Антитела по изобретению также могут быть получены в клетке-хозяине трансфектомы с применением, например, комбинации методик рекомбинантной ДНК и способов трансфекции генов, которые хорошо известны из уровня техники (например, Могткои, 8. (1985), 8аеисе 229:1202).
Например, для экспрессии антител или фрагментов антител, ДНК, кодирующие части или полноразмерные гены легкой и тяжелой цепей, могут быть получены с помощью стандартных методик моле
- 24 016186 кулярной биологии (например, ПЦР-амплификации или клонирования кДНК с применением гибридомы, которая экспрессирует интересующее антитело), и ДНК могут быть вставлены в экспрессирующие векторы так, чтобы гены были функционально связанными с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. В данном случае подразумевается, что термин функционально связанный означает, что ген антитела лигируется в вектор так, чтобы последовательности контроля транскрипции и трансляции внутри вектора служили в соответствии со своей предназначенной функцией регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессирующий вектор и последовательности контроля экспрессии выбираются так, чтобы они были совместимы с применяемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельные векторы или, более типично, оба гена вставляют в один и тот же экспрессирующий вектор. Гены антитела вставляют в экспрессирующий вектор с помощью стандартных способов (например, лигирования комплементарных рестрикционных сайтов фрагмента гена антитела и вектора, или с помощью лигирования по тупым концам, если не присутствует никаких рестрикционных сайтов). Описанные в настоящем описании вариабельные участки легкой и тяжелой цепей антитела могут применяться для создания полноразмерных генов антитела любого изотипа антитела путем их вставки в экспрессирующие векторы, уже кодирующие константный участок тяжелой цепи и константный участок легкой цепи желаемого изотипа так, чтобы νΗсегмент был функционально связан с СН-сегментом(ами) внутри вектора и чтобы ^-сегмент был функционально связан с Сь сегментом внутри вектора. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть проклонирован в вектор так, чтобы сигнальный пептид был связан в одной рамке с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть иммуноглобулиновым сигнальным пептидом или гетерологичным сигнальным пептидом (т.е. сигнальным пептидом из белка, отличного от иммуноглобулина).
Дополнительно к генам цепей антитела рекомбинантные экспрессирующие векторы по изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клетке-хозяине. Подразумевается, что термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, Ооеббе1 (Оепе ЕхртекДоп ТесЬпо1о§у. МеШобк ш Епхуто1оду 185, Асабетю Рге88, 8ап П1едо, СА (1990)). Было бы удобно для специалистов в данной области, если бы разработка экспрессирующего вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, могла зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии целевого белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающего включают вирусные элементы, которые управляют экспрессией белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, выделенные из цитомегаловируса (СМУ), обезьяньего вируса 40 (8ν40), аденовируса, (например, главного позднего промотора аденовируса (АбМЬР)) и полиомы. Альтернативно, могут применяться невирусные регуляторные последовательности, такие как убиквитиновый промотор или β-глобиновый промотор. Более того, регуляторные элементы состоят из последовательностей из различных источников, таких как δΒα-промоторная система, которая содержит последовательности из раннего промотора ^40 и длинный концевой повтор из вируса Т-клеточной лейкемии типа 1 (ТакеЬе, Υ. е1 а1. (1988), Мо1. Се11. Вю1. 8:466-472).
Дополнительно к генам цепей антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные экспрессирующие векторы по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, последовательности начала репликации) и гены маркеров селекции. Ген маркера селекции облегчает селекцию клетокхозяев, в которые был введен вектор (см., например, И8 патенты № 4399216, 4634665 и 5179017, все от Ахе1 е1 а1.). Например, обычно ген маркера селекции дает устойчивость к лекарственным средствам, таким как 0418, гигромицин или метотрексат, в клетке-хозяине, в которую был введен вектор. Предпочтительные гены маркеров селекции включают ген дигидрофолатредуктазы (ЭНЕЕ) (для применения в бЫтклетках-хозяевах с селекцией на метотрексате/амплификации) и ген пео (для селекции на 0418).
Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессирующий вектор(ы), кодирующий тяжелую и легкую цепи, трансфецируют в клетку-хозяин с помощью стандартных методик. Подразумевается, что разнообразные формы термина трансфекция охватывают широкое разнообразие методик, обычно применяемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяин, например электропорацию, кальций-фосфатную преципитацию, ЭЕЛЕ-декстрановую трансфекцию и подобные. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению и в прокариотических или в эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках и наиболее предпочтительно в клетках-хозяевах млекопитающих является наиболее предпочтительной, так как такие эукариотические клетки и в особенности клетки млекопитающих собирают и секретируют иммунологически активные антитела в правильно собранной форме с большей вероятностью, чем прокариотические клетки. Было опубликовано, что прокариотическая экспрессия генов антитела является неэффективной для
- 25 016186 продуцирования активного антитела с высоким выходом (Во§8, М.А. и ^ооб, С.Я. (1985), 1ттипо1оду Тобау 6:12-13).
Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают клетки яичников китайского хомячка (клетки СНО) (включающие бЫг-клетки СНО, описанные Иг1аиЬ и Сйащп (1980), Ргос. №111. Асаб. 8с1 И8А 77:4216-4220, применяемые с маркером селекции ϋΗΓΈ, например, как описано Я.к КаиТтап и Р.А. 8Нагр (1982), Мо1. Вю1. 759:601-621), ΝδΟ-клетки миеломы, СО8-клетки и 8Р2-клетки. В особенности, для применения с ΝδΟ-клетками миеломы другой предпочтительной системой экспрессии является система экспрессии гена С8, описанная в XVО 87/04462, XVО 89/01036 и ЕР 338841. Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного, чтобы дать возможность экспрессии антитела в клетках-хозяевах или более предпочтительно дать возможность секреции антитела в культуральную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Антитела могут быть получены из культуральной среды с применением стандартных способов очистки белка.
Характеризация связывания антитела с антигеном.
Антитела по изобретению могут быть протестированы на связывание с СЭ70 с помощью, например, проточной цитометрии. Коротко, из только что собранных из флаконов для тканевых клеточных культур СИ70-экспрессирующих клеток готовят одноклеточную суспензию. Суспензии СИ70-экспрессирующих клеток или непосредственно инкубировали с первичным антителом, или после фиксации с 1% параформальдегидом в РВ8. Приблизительно 1 млн клеток повторно суспендируют в РВ8, содержащем 0,5% В8А и 50-200 мкг/мл первичного антитела, и инкубируют на льду в течение 30 мин. Клетки промывали дважды с РВ8, содержащим 0,1% В8А, 0,01% ΝιΝ3, повторно суспендировали в 100 мкл разведенного 1:100 Е1ТС-конъюгированного козьего антитела к человеческому 1дО (1аск§оп 1ттипоЯе8еагсй, ^е§! Сгоуе, РА) и инкубировали на льду дополнительные 30 мин. Клетки снова промывали дважды, повторно суспендировали в 0,5 мл буфера для промывания и анализировали для флуоресцентного окрашивания на цитометре ЕАС8Са11Ьиг (ВесЮп-Оюкпъоп, 8ап 1о§е, СА).
Альтернативно, антитела по изобретению могут быть протестированы на связывание с СЭ70 с помощью стандартного метода ЕЫ8А. Коротко, планшеты для микротитрования покрывали очищенным СЭ70 с концентрацией 0,25 мкг/мл в РВ8 и затем блокировали с 5% бычьим сывороточным альбумином в РВ8. Образцы с разведенным антителом (например, образцы разведенной плазмы из СЭ70иммунизированных мышей) добавляли в каждую ячейку и инкубировали в течение 1-2 ч при 37°С. Планшеты промывали в РВ8/Тдаееп и затем инкубировали с вторичным реагентом (например, для человеческих антител, с козьим Ес-специфическим поликлональным реагентом к человеческому 1дС), конъюгированным с щелочной фосфатазой, в течение 1 ч при 37°С. После промывания планшеты проявляли с рNРР субстратом (1 мг/мл) и анализировали при ОЭ 405-650. Предпочтительно мышей, которые проявили наибольший титр, использовали для слияний.
Анализ ЕЫ8А, описанный выше, также может применяться для скрининга гибридом, которые показывают положительную реакционноспособность с иммуногеном СЭ70. Гибридомы, которые связываются с СЭ70 с высокой авидностью, субклонируют и дополнительно охарактеризовывают. Один клон из каждой гибридомы, который сохраняет реакционноспособность родительских клеток (по ЕЬ18А), может быть выбран для создания клеточного банка из 5-10 пробирок, которые хранятся при -140°С, и может быть выбран для очистки антитела.
Для очистки антител к СЭ70 выбранные гибридомы могут быть выращены в двухлитровых роллерных флаконах для очистки моноклонального антитела. Супернатанты могут быть отфильтрованы и сконцентрированы перед аффинной хроматографией с протеин А-сефарозой (РНагтаста, Р1§са!адаау, Ν. I.). Элюированный 1дО можно проверить с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии, чтобы удостовериться в чистоте. Буферный раствор можно заменить на РВ8, концентрация может быть определена при ОЭ280 с применением коэффициента угасания 1,43. Моноклональные антитела могут быть разделены на аликвоты и могут храниться при -80°С. Чтобы определить, связываются ли выбранные моноклональные антитела к СЭ70 с уникальными эпитопами, каждое антитело может быть биотинилировано с применением коммерчески доступных реагентов (Р1егсе, ЯоскТогб, 1Ь). Исследования по конкурированию с применением немеченых моноклональных антител и биотинилированных моноклональных антител могут быть осуществлены с применением покрытых СЭ70 планшетов для ЕЫ8А, как описано выше. Связывание биотинилированного тАЬ может детектироваться с помощью зонда стрептавидина-щелочной фосфатазы. Альтернативно, исследования по конкурированию могут быть осуществлены с применением радиоактивно меченного антитела, и немеченые конкурирующие антитела могут детектироваться с помощью анализа 8са!сйагб, как дополнительно описано ниже в примерах.
Для определения изотипа очищенных антител может быть осуществлен метод ЕЫ8А для изотипов с применением специфических реагентов, специфичных для антител конкретного изотипа. Например, для определения изотипа человеческого моноклонального антитела ячейки планшетов для микротитрования могут быть покрыты с 1 мкг/мл антитела к человеческому иммуноглобулину в течение ночи при
- 26 016186
4°С. После блокирования с 1% ВЗА планшеты вступают во взаимодействие с 1 мкг/мл или менее тестируемых моноклональных антител очищенных контрольных изотипов при температуре окружающей среды в течение 1-2 ч. Ячейки могут затем вступить во взаимодействие или с человеческим, специфичным к 1дС1, конъюгированным с щелочной фосфатазой, зондом, или с человеческим, специфичным к 1дМ, конъюгированным с щелочной фосфатазой, зондом. Планшеты проявляют и анализируют, как описано выше.
1дС к СЭ70 человека могут быть дополнительно протестированы на реакционноспособность с антигеном СЭ70 с помощью ХУейегп-блоттинга. Коротко, СЭ70 может быть получен и подвергнут электрофорезу на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза разделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют с 10% фетальной телячьей сывороткой и гибридизуют с тестируемыми моноклональными антителами. Связывание человеческих 1дС может быть детектировано с применением 1дС к щелочной фосфатазе человека и проявлено с применением таблеток ВС'ЧР/НВТ субстрата (81дта Сйет. ^., 8ΐ. Εουίδ, Μο.).
Иммуноконъюгаты.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлено антитело к СИ 70 или его фрагмент, конъюгированные с терапевтическим компонентом, таким как цитотоксин, лекарственное средство (например, иммуносупрессант) или радиотоксин. Такие конъюгаты обозначены в настоящем описании как иммуноконъюгаты. Иммуноконъюгаты, которые включают один или более цитотоксинов, обозначены как иммунотоксины. Цитотоксин или цитотоксический агент включают любой агент, который является губительным (например, убивает) для клеток. Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин И, этидиум бромид, эметин, митомицин, этопосид, тенопосид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин И, 1дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Терапевтические агенты также включают, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (ВЗКи) и ломустин (ССИИ), циклотосфамид, бусулфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиамин платина и цис-дихлордиамин платина(11) (ИИР) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (известный как дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (известный как актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин).
Другие предпочтительные примеры терапевтических цитотоксинов, которые могут быть конъюгированы с антителом по изобретению, включают дуокармицины, калихеамицины, маитанзины и ауристатины и их производные. Пример конъюгата калихеамицина с антителом является коммерчески доступным (Μν1οΙηΓ§™; ^уеШ-Ауегй).
Цитотоксины могут быть конъюгированы с антителами по изобретению с применением технологии линкеров, доступной из уровня техники. Примеры типов линкеров, которые применялись для конъюгирования цитотоксина с антителом, включают, но не ограничены ими, гидразоны, тиоэфиры, сложные эфиры, дисульфиды и линкеры, содержащие пептид. Линкер может быть выбран так, чтобы он, например, был чувствителен к расщеплению при низком рН внутри лизосомного компартмента или был чувствителен к расщеплению протеазами, которые предпочтительно экспрессируются в опухолевой ткани, такие протеазы, как катепсины (например, катепсины В, С, И).
Для дополнительного обсуждения типов цитотоксинов линкеров и способов конъюгации терапевтических агентов с антителами, см. также δηίΐο, С. е1 а1. (2003), АФν. Игид ЭеКт. Яеν. 55:199-215; ТгаП, Р.А. е1 а1. (2003), Сапсег Iттиηο1. ИптигюШег. 52:328-337; Раупе, С. (2003), Сапсег Се11 3:207-212; А11еп, Т.М. (2002), №11. Яет. Сапсег 2:750-763; Райап, I. и Кгейтап, ЯЛ. (2002), Сигг. 0рт. ИггеШд. Игидк 3:1089-1091; 8еп1ег Р.И. и Зргтдег, СЛ. (2001), АФт. Игид Эейт. Яет. 53:247-264.
Антитела по настоящему изобретению также могут быть конъюгированы с радиоактивным изотопом с получением цитотоксических радиофармацевтических средств, также обозначенных как радиоиммуноконъюгаты. Примеры радиоактивных изотопов, которые могут быть конъюгированы с антителами для диагностического или терапевтического применения, включают, но не ограничены ими, йод , йод125, индий111, иттрий90 и лютеций177. Способы получения иммуноконъюгатов установлены из уровня техники. Примеры радиоиммуноконъюгатов коммерчески доступны и включают Зевалин™ (ШЕС РйагтасеиОсай) и Бексар™ (Веххаг™) (Сопха Рйагтасеийсак), подобные способы могут применяться для получения иммуноконъюгатов с применением антител по изобретению.
Конъюгаты антител по изобретению могут применяться для модификации данного биологического ответа и не следует понимать компонент лекарственного средства как ограниченный классическими химическими терапевтическими агентами. Например, компонент лекарственного средства может представлять собой белок или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, эксотоксин синегнойной палочки или дифтерийный токсин; такой белок, как фактор некроза
- 27 016186 опухоли или интерферон-γ; или такие модификаторы биологического ответа. как. например. лимфокины. интерлейкин-1 (ГЬ-Г'). интерлейкин-2 (ΙΕ-2). интерлейкин-6 (ΙΕ-6). гранулоцит макрофаг колониестимулирующий фактор (СМ-С8Е). гранулоцит колониестимулирующий фактор (С-С8Е) или другие факторы роста.
Методики конъюгации такого терапевтического компонента с антителами хорошо известны. см.. например. Атоп е1 а1.. Мопос1опа1 Ап!1Ьоб1ек Еог [ттипо1агде11пд 0£ Эгидк Ιη Сапсег Тйегару. ш Мопос1опа1 АпбЬоб1ек Апб Сапсег Тйегару. Ке1к£е1б е1 а1. (ебк.). р. 243-56 (А1ап К. Ыкк. Бчс. 1985); Не11к!гот е1 а1.. Ап!1Ьоб1ек Еог Эгид Эекуегу. Соп!го11еб Эгид ЭеНуегу (2пб Еб.). КоЫпкоп е! а1. (ебк.). р. 623-53 (Магсе1 Эеккег. Бчс. 1987); Тйогре. АпбЬобу Сатегк 0£ Су1о1ох1с Адеп!к Ш Сапсег Тйегару: А Кеу1е\\·. ш Мопос1опа1 Ап!1Ьоб1ек '84: Вю1одюа1 Апб С11шса1 Арр1юа!юпк. Ршсйега е! а1. (ебк.). р. 475-506 (1985); Апа1ук1к. Кеки11к апб Еи!иге Ргокресбуе 0£ ТНе Тйегареибс Ике 0£ Кабю1аЬе1еб АпбЬобу Ш Сапсег Тйегару. ш Мопос1опа1 Ап!1Ьоб1ек Еог Сапсег Эе!ес!юп Апб ТНегару. Ва1б\уш е! а1. (ебк.). р. 303-16 (Асабетк Ргекк. 1985) апб Тйогре е! а1.. ТНе Ргерагабоп Апб Су!о!ох1с Ргорегйек 0£ АпбЬобу-Тохш Соп)ида!ек. Iттиηо1. Кеу.. 62:119-58 (1982).
Биспецифичные молекулы.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлены биспецифичные молекулы. включающие антитело к СЭ70 или его фрагмент по изобретению. Антитело по изобретению или его антигенсвязывающие участки могут быть модифицированы или связаны с другой функциональной молекулой. например другим пептидом или белком (например. другим антителом или лигандом к рецептору) с получением биспецифичной молекулы. которая связывается по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания или молекулами мишенями. Антитело по изобретению может быть фактически модифицировано или связано с более чем одной функциональной молекулой с получением мультиспецифичных молекул. которые связываются с более чем двумя различными сайтами связывания и/или молекулами мишенями; подразумевается. что такие мультиспецифичные молекулы охвачены термином биспецифичная молекула. как применяется в настоящем описании. Для создания биспецифичной молекулы по изобретению антитело по изобретению может быть функционально связано (например. с помощью химической конденсации. генетической сшивки. нековалентной связи или по-другому) с одной или более связывающими молекулами. такими как другое антитело. фрагмент антитела. пептид или связывающий миметик. так что в результате получается биспецифичная молекула.
Соответственно настоящее изобретение включает биспецифичные молекулы. включающие по меньшей мере одну первую специфичность связывания с СЭ70 и вторую специфичность связывания со вторым эпитопом-мишенью. В конкретном воплощении изобретения второй эпитоп-мишень представляет собой Ес-рецептор. например человеческий ЕсγКI (СЭ64) или человеческий Еса-рецептор (СЭ89). Таким образом. изобретение включает биспецифичные молекулы. способные к связыванию с обоими типами эффекторных клеток - экспрессирующими Ес/К или экспрессирующими ЕсаК (например. с моноцитами. макрофагами или полиморфонуклеарными клетками (РМЫ)). и способные к связыванию с клетками-мишенями. экспрессирующими СЭ70. Эти биспецифичные молекулы направляют СЭ70экспрессирующие клетки к эффекторной клетке и передают опосредованные Ес-рецептором активности эффекторной клетки. такие как фагоцитоз СЭ70-экспрессирующих клеток. зависимая от антитела. опосредованная клеткой цитотоксичность (АЭСС). высвобождение цитокина или получение супероксидного аниона.
В воплощении по изобретению. в котором биспецифичная молекула является мультиспецифичной. молекула может дополнительно включать третью специфичность связывания в дополнение к специфичности связывания с Ес и специфичности связывания с СЭ70. В одном воплощении третья специфичность связывания представляет собой специфичность связывания с участком фактора усиления (ЕЕ). например участком молекулы. которая связывается с поверхностным белком. вовлеченным в цитотоксическую активность. и. посредством чего. усиливает иммунный ответ против клетки-мишени. Антитело к участку фактора усиления может представлять собой антитело. функциональный фрагмент антитела или лиганд. который связывается с указанной молекулой. например антиген или рецептор. и. посредством чего. приводит в результате к усилению эффекта связывающих детерминант для Ес-рецептора или антигена клетки-мишени. Антитело к участку фактора усиления может связывать Ес-рецептор или антиген клетки-мишени. Альтернативно. антитело к участку фактора усиления может связываться с объектом. который отличается от объекта. с которым связываются первая и вторая специфичности связывания. Например. антитело к участку фактора усиления может связывать цитотоксическую Т-клетку (например. через СЭ2. СЭ3. СЭ8. СЭ28. СЭ4. СЭ40. ЮАМ-1. или другую иммунную клетку. что приводит в результате к усилению иммунных ответов против клетки-мишени).
В одном воплощении биспецифичные молекулы по изобретению включают в качестве специфичности связывания по меньшей мере одно антитело или его фрагмент. включающий. например. ЕаЬ. ЕаЬ'. Е(аЬ')2. Еу или одноцепочечный Еу. Антитело также может представлять собой димер легкой цепи или тяжелой цепи или любой его минимальный фрагмент. такой как Еу. или одноцепочечную конструкцию. как описано Ьабпег е! а1.. И8 патент № 4946778. содержание которого в точности введено с помощью
- 28 016186 ссылки.
В одном воплощении специфичность связывания для Рсу рецептора представлена с помощью моноклонального антитела, связывание которого не блокируется человеческим иммуноглобулином С (1дС). Как применяется в настоящем описании, термин 1дС-рецептор представляет собой любой из восьми генов у цепи, локализованных на хромосоме 1. Эти гены кодируют в целом двенадцать трансмембранных или растворимых изоформ рецептора, которые сгруппированы в три класса Рсу-рецептора: РсуШ (СЭ64), РсуКЛ (СИ32) и РсуКШ (СИ16). В одном предпочтительном воплощении Рсу-рецептор представляет собой человеческий РсуК! с высоким сродством. Человеческий РсуК1 представляет собой молекулу с молекулярным весом 72 кДа, которая показывает высокое сродство к мономерному 1дС (108-109 М-1).
Получение и характеризация определенных предпочтительных моноклональных антител к Рсу описаны Рапдег е! а1. в РСТ публикации \УО 88/00052 и в И8 патенте № 4954617, руководства по которым полностью введены в настоящее описание с помощью ссылки. Эти антитела связываются с эпитопом РсуК1/РсуКП или РсуКШ в сайте, который является удаленным от Рсу-сайта связывания рецептора, и, таким образом, их связывание, по существу, не блокируется при физиологическом уровне 1дС. Специфические антитела к РсуК1, применяемые в настоящем изобретении, представляют собой тАЬ 22, тЛЬ 32, тАЬ 44, тАЬ 62 и тАЬ 197. Гибридома, продуцирующая тАЬ 32, является коммерчески доступной из Американской типированной коллекции клеточных культур, № доступа АТСС НВ9469. В других воплощениях антитело к Рсу-рецептору является гуманизированной формой моноклонального антитела 22 (Н22). Получение и характеризация антитела Н22 описаны Οπιζίαηο. К.Р. е! а1. (1995), 1. 1ттипо1. 155 (10): 4996-5002 и в РСТ публикации \УО 94/10332. Клеточная линия, продуцирующая антитело Н22, была депонирована в Американскую типированную коллекцию клеточных культур с обозначением НА022СЫ и имеет № доступа СКБ 11177.
Еще в других предпочтительных воплощениях специфичность связывания с Рс-рецептором представлена в виде антитела, которое связывается с человеческим 1дА-рецептором, например Рс-альфа рецептором (РсаК1 (СИ89)), связывание которого предпочтительно не блокируется человеческим иммуноглобулином А (1дА). Подразумевается, что термин 1дА-рецептор включает генный продукт одного α-гена (ЕсаКГ), локализованного на хромосоме 19. Известно, что указанный ген кодирует несколько альтернативно сплайсированных трансмембранных изоформ с молекулярным весом 55-110 кДа. РсаК1 (СЭ89) конститутивно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не экспрессируется на популяциях неэффекторных клеток. РсаК1 обладает средним сродством (приблизительно 5х107 М-1) к обоим 1дА1 и 1дА2, которая увеличивается под воздействием цитокинов, таких как 6-С8Р или 6М-С8Р (Μοτίοη, Н.С. е! а1. (1996), СтШса1 Ке\зе\\ъ ίη 1ттипо1оду 26:423-440). Были описаны четыре РсаК1-специфичных моноклональных антитела, идентифицированных как А3, А59, А62 и А77, которые связывают РсаК1 вне домена связывания с лигандом 1дА (Моп1е1то, К.С. е! а1. (1992), 1. 1ттипо1. 148:1764).
РсаК1 и РсуК1 являются предпочтительными передающими рецепторами для применения в биспецифичных молекулах по изобретению, так как они (1) экспрессируются главным образом на иммунных эффекторных клетках, например на моноцитах, ΡΜΝ, макрофагах и дендритных клетках; (2) экспрессируются с высоким уровнем (например, 5000-100000 на клетку); (3) являются медиаторами цитотоксических активностей (например, АИСС, фагоцитоза); (4) опосредуют увеличение антигенной представленности антигенов, включающих собственные антигены, направленные к ним.
В то время как человеческие моноклональные антитела являются предпочтительными, другие антитела, которые могут применяться в биспецифичных молекулах по изобретению, включают, например, мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела.
Биспецифичные молекулы по настоящему изобретению могут быть получены путем конъюгации компонентов специфичностей связывания, например специфичности связывания с РсК и специфичности связывания с СЭ70, с применением способов, известных из уровня техники. Например, каждая специфичность связывания биспецифичной молекулы может быть получена по отдельности и затем конъюгирована одна с другой. Когда специфичности связывания представляют собой белки или пептиды, для ковалентной конъюгации могут применяться разнообразные конденсирующие или перекрестносвязывающие агенты. Примеры перекрестно-связывающих агентов включают белок А, карбодиимид, Νсукцинимидил-8-ацетил-тиоацетат (8АТА), 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойную кислоту) (ΌΤΝΒ), офенилендималеимид (оРЭМ), №сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (8ΡΌΡ) и сульфосукцинимидил 4-(№малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-8МСС) (см., например, Катроукку е! а1. (1984), 1. Ехр. Меб. 160:1686; Ьщ, М.А. е! а1. (1985), Ргос. №111. Асаб. δα И8А 82:8648). Другие способы включают описанные Раи1и8 (1985), Вейппд Ιηκ. Мй1. № 78, 118-132; Вгеппап е! а1. (1985), 8аепсе 229:81-83) и 61епше е! а1. (1987), 1. 1ттипо1. 139:2367-2375). Предпочтительными конъюгированными агентами являются 8АТА и сульфо-8МСС, оба коммерчески доступны от Р1егсе Сйетюа1 Со. (КоскГотб, Ш).
Когда специфичности связывания представляют собой антитела, они могут быть конъюгированы через сульфгидрильное связывание С-концевых шарнирных участков двух тяжелых цепей. В конкретном
- 29 016186 предпочтительном воплощении шарнирный участок модифицируют. чтобы он перед конъюгацией содержал нечетное количество сульфгидрильных остатков. предпочтительно один.
Альтернативно. обе специфичности связывания могут кодироваться в одном и том же векторе и экспрессироваться и собираться в одной и той же клетке-хозяине. Этот способ в особенности применяется. где биспецифичная молекула представляет собой гибридный белок тАЬхтАЬ. тАЬхЕаЬ. ЕаЬхЕ(аЬ')2 или лигандхЕаЬ. Биспецифичная молекула по изобретению может быть одноцепочечной молекулой. включающей одну единичную цепь антитела и связывающую детерминанту. или может быть одноцепочечной молекулой. включающей две связывающие детерминанты. Биспецифичные молекулы могут включать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Способы получения биспецифичных молекул описаны. например. в И8 патентах № 5260203; 5455030; 4881175; 5132405; 5091513; 5476786; 5013653; 5258498 и 5482858.
Связывание биспецифичных молекул с их специфическими мишенями может быть подтверждено. например. с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А). радиоиммуноанализа (ША). ЕАС8-анализа. биоанализа (например. ингибирования роста) или Уек1ет-блот-анализа. Каждый из этих анализов в основном управляет присутствием представляющих конкретный интерес комплексов белокантитело с помощью применения меченого реагента (например. антитела). специфичного для интересующего комплекса. Например. комплексы ЕсЯ-антитело могут детектироваться с применением. например. связанных с ферментом антитела или фрагмента антитела. которые распознают и специфически связываются с комплексами антитело-ЕсЯ. Альтернативно. комплексы могут детектироваться с применением других разнообразных иммуноанализов. Например. антитело может быть радиоактивно помечено и применено в радиоиммуноанализе (К1А) (см.. например. статью ХУепИганЬ. В.. Рппс1р1е8 о1 Яабюштипоаккаук. 8е\геп111 Тгаштд Соигке оп Яабюбдапб Аккау Тес11пк|ие8. ТБе Епбосппе 8оае1у. МагсБ. 1986. которая введена в настоящее описание с помощью ссылки). Радиоактивный изотоп можно детектировать такими способами. как применение γ-счетчика или сцинтилляционного счетчика. или с помощью радиоавтографии.
Фармацевтические композиции.
В другом аспекте в настоящем изобретении предлагается композиция. например фармацевтическая композиция. содержащая одно или комбинацию моноклональных антител или их антигенсвязывающих участков по настоящему изобретению. включенных в состав вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут включать одно или комбинацию из (например. двух или более различных) антител или иммуноконъюгатов или биспецифичных молекул по изобретению. Например. фармацевтическая композиция по изобретению может включать комбинацию антител (или иммуноконъюгатов или биспецифичностей). которые связываются с различными эпитопами на антигене-мишени или которые имеют комплементарные активности.
Фармацевтические композиции по изобретению могут также вводиться при комбинированной терапии. т.е. совместно с другими агентами. Например. комбинированная терапия может включать антитело к СЭ70 по настоящему изобретению совместно по меньшей мере с одним отличным противовоспалительным или иммуноподавляющим. Примеры терапевтических агентов. которые могут применяться в комбинированной терапии. описаны более подробно ниже в разделе по применениям антител по изобретению.
Как применяется в настоящем описании. фармацевтически приемлемый носитель включает все подряд растворители. дисперсионные среды. покрытия. антибактериальные и антигрибковые агенты. изотонические агенты и агенты. задерживающие всасывание. и подобные. которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель является подходящим для внутривенного. внутримышечного. подкожного. парентерального. спинального или эпидермального введения (например. путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения активный компонент. т.е. антитело. иммуноконъюгат или биспецифичная молекула могут быть покрыты веществом для защиты компонента от воздействия кислот и других природных условий. которые могут инактивировать компонент.
Фармацевтические компоненты по изобретению могут включать одну или более фармацевтически приемлемых солей.
Фармацевтически приемлемая соль означает соль. которая сохраняет целевую биологическую активность исходного компонента и не придает нежелательных токсикологических эффектов (см.. например. Вегде. 8.М.. е! а1. (1977). 1. РНагт. 8сг 66:1-19). Примеры таких солей включают соли. полученные посредством добавления кислоты. и соли. полученные посредством добавления основания. Соли. полученные посредством добавления кислоты. включают соли. выделенные на основе нетоксичных неорганических кислот. таких как соляная. азотная. фосфорная. серная. бромисто-водородная. йодистоводородная. фосфористая и подобных. а также выделенные на основе нетоксичных органических кислот. таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты. фенилзамещенные алкановые кислоты. ароматические кислоты. алифатические и ароматические сульфокислоты и подобных. Соли. полученные посредством добавления основания. включают соли. выделенные на основе щелочно-земельных металлов. таких как натрий. калий. магний. кальций и подобных. а также выделенные на основе нетоксичных орга
- 30 016186 нических аминов, таких как ^№-дибензилэтилендиамин, Уметилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и подобных.
Фармацевтическая композиция по изобретению также может включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеин гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и подобные; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбил пальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропил галлат, альфа-токоферол и подобные; (3) металл-хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, тартаровая кислота, фосфорная кислота и подобные.
Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут применяться в фармацевтической композиции по изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и подобные) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло и органические эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Подходящая текучесть может поддерживаться, например, с помощью применения покрывающих веществ, таких как лецитин, с помощью поддержания требуемого размера частицы в случае дисперсионных растворов, и с помощью применения поверхностно-активных веществ. Эти композиции могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, увлажняющие агенты и диспергирующие агенты. Предотвращение присутствия микроорганизмов может быть обеспечено обеими процедурами - стерилизации, описанной выше, и включения разнообразных антибактериальных и антигрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и подобных. Также может быть желательным включать в композиции изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и подобные. Кроме того, продолжительное всасывание фармацевтической формы для инъекций может быть осуществлено путем включения агентов, которые задерживают всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин.
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсионные растворы и стерильные порошки для экстемпорального получения стерильных растворов для инъекций или дисперсионного раствора. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно из уровня техники. Предполагается применение любой обычной среды или агента в фармацевтических композициях, за исключением случаев их несовместимости с активным компонентом. Дополнительные активные компоненты также могут быть введены в композиции.
Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть включена в состав в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или в виде других упорядоченных структур, подходящих для высокой концентрации лекарственного средства. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и подобные) и их подходящие смеси. Подходящая текучесть может поддерживаться, например, с помощью применения покрывающих веществ, таких как лецитин, с помощью поддержания требуемого размера частицы в случае дисперсионных растворов, и с помощью применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях было бы предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как манит, сорбит или хлорид натрия. Продолжительное всасывание композиций для инъекций может быть осуществлено путем включения в композицию агентов, которые задерживают всасывание, например моностеаратные соли и желатин.
Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем введения активного компонента в требуемом количестве в подходящем растворителе с одним ингредиентом или с комбинацией вышеперечисленных ингредиентов, как требуется с последующей стерилизацией путем микрофильтрации. Обычно дисперсионные растворы получают путем введения активного компонента в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций, предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и сушка замораживанием (лиофилизация), что дает на выходе порошок с активным ингредиентом плюс любой дополнительный желаемый ингредиент, взятый из его ранее стерильно отфильтрованного раствора.
Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с веществом носителя для получения одной дозированной формы, будет варьироваться в зависимости от субъекта, которого необходимо подвергнуть лечению, и от конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с веществом носителя для получения одной дозированной формы, обычно будет таким количеством композиции, от которого получают терапевтический эффект. Обычно свыше 100% это количество будет находиться в пределе от примерно 0,01 до примерно 99% активного ингредиента, предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 70%, наиболее предпочтительно от примерно 1 до примерно 30% активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Режимы дозировок установлены так, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ (например, терапевтический ответ). Например, может вводиться один болюс, может вводиться несколько разделенных доз через какое-то время или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, что мо
- 31 016186 жет быть показано при острой необходимости соответственно терапевтической ситуации. особенно для того. чтобы составить парентеральные композиции в стандартной дозированной форме для легкого введения и единообразия дозировки. Стандартная дозированная форма. как применяется в настоящем описании. означает физически дискретные единицы. подходящие в качестве стандартных дозировок для субъектов. которых необходимо подвергнуть лечению; каждая единица содержит определенное количество активного компонента. рассчитанного на получение желаемого терапевтического эффекта совместно с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных дозированных форм по изобретению продиктована и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик активного компонента и конкретного терапевтического эффекта. который должен быть достигнут. и (Ь) от известных из уровня техники ограничений. характерных для композиций с таким активным компонентом. предназначенных для лечения индивидуумов в зависимости от их восприимчивости.
Для введения антитела дозировка находится в пределах от примерно 0.0001 до 100 мг/кг и более часто 0.01-25 мг/кг веса тела-хозяина. Например. дозировка может быть 0.3 мг/кг веса тела. 1 мг/кг веса тела. 3 мг/кг веса тела. 5 мг/кг веса тела или 10 мг/кг веса тела. или находиться в интервале 1-10 мг/кг. Если необходимо. могут применяться более высокие дозировки. например. 15 мг/кг веса тела. 20 мг/кг веса тела или 25 мг/кг веса тела. Приведенный в качестве примера режим лечения представляет собой назначение введения один раз в неделю. один раз каждые две недели. один раз каждые три недели. один раз каждые четыре недели. один раз в месяц. один раз в каждые три месяца. или один раз каждые тришесть месяцев. Конкретные режимы дозировки антитела к ί.Ό70 по изобретению включают 1 мг/кг веса тела или 3 мг/кг веса тела посредством внутривенного введения указанного антитела с применением следующих графиков дозировки (ί) каждые четыре недели по шесть дозировок. затем каждые три месяца; (ίί) каждые три недели; (ίίί) 3 мг/кг веса тела один раз с последующей дозировкой 1 мг/кг веса тела каждые три недели.
В некоторых способах два или более моноклональных антител к ί.Ό70 по изобретению с различными специфичностями связывания вводят одновременно. в этом случае дозировка каждого вводимого антитела попадает в указанные пределы. Антитело обычно вводят многократными приемами. Интервалы между единичными дозировками могут представлять собой. например. еженедельные введения. ежемесячные. каждые три месяца или ежегодно. Интервалы также могут быть нерегулярными по показаниям измерения уровня антитела по отношению к антигену-мишени в крови пациента. В некоторых способах дозировка регулируется так. чтобы концентрация антитела в плазме достигала примерно 1-1000 мкг/мл и в некоторых способах примерно 25-300 мкг/мл.
Альтернативно. антитело может вводиться в виде состава с продолжительным высвобождением. в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируются в зависимости от периода полужизни антитела у пациента. В основном для человеческих антител показано. что они имеют наибольший период полужизни. за ними следуют гуманизированные антитела. химерные антитела и нечеловеческие антитела. Дозировка и частота введения могут варьироваться в зависимости от того. является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактических применениях вводится относительно низкая дозировка с относительно редкими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение в течение их всей оставшейся жизни. При терапевтических применениях. иногда. требуется относительно высокая дозировка с относительно короткими интервалами. пока не уменьшится или не закончится прогрессирование заболевания. и. предпочтительно. пока у пациента не будет показано частичное или полное улучшение симптомов заболевания. Соответственно пациенту может вводиться дозировка профилактического режима.
Фактический уровень дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению может варьироваться так. чтобы получить количество активного ингредиента. которое является эффективным для достижения желаемого терапевтического ответа для конкретного пациента. композиции и способа введения. и при этом не является токсичным для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от разнообразия фармакокинетических факторов. включающих активность конкретных применяемых композиций по настоящему изобретению. или сложного эфира. соли или амида на их основе. путь введения. время введения. скорость выведения конкретного применяемого компонента. продолжительность лечения. другие лекарственные средства. компоненты и/или вещества. применяемые в комбинации с конкретными применяемыми композициями. возраст. пол. вес. состояние. общее состояние здоровья и предшествующая история болезни пациента. которого необходимо подвергнуть лечению. и подобные факторы. хорошо известные из уровня медицины.
Терапевтически эффективная дозировка антитела к ί.Ό70 по изобретению предпочтительно приводит в результате к уменьшению серьезности симптомов заболевания. увеличению частоты и продолжительности периодов. свободных от симптомов. или к предотвращению ухудшения состояния и нетрудоспособности пациента. возникшим благодаря физическим недостаткам. связанным с заболеванием. Например. для лечения СИ70+ опухолей терапевтически эффективная дозировка предпочтительно ингибирует клеточный рост или опухолевый рост по меньшей мере примерно на 20%. более предпочтительно по меньшей мере примерно на 40%. еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80% по отношению к субъектам. не
- 32 016186 подвергнутым лечению. Способность компонента ингибировать опухолевый рост можно оценить в модельной системе животных. предсказывающей эффективность в опухолях человека. Альтернативно. указанное свойство композиции можно оценить путем определения способности компонента к ингибированию. которое можно провести ш νίΐΐΌ с помощью анализов. известных специалисту в данной области. Терапевтически эффективное количество терапевтического компонента может уменьшить размер опухоли или по-другому улучшить симптомы субъекта. Специалист в данной области способен определить необходимые количества на основе таких факторов. как габариты субъекта. серьезность симптомов субъекта и конкретная композиция или выбранный путь ее введения.
Композиция по настоящему изобретению может вводиться через один или более путей введения с применением одного или более разнообразных способов. известных из уровня техники. Было бы удобно для специалиста в данной области. если бы путь и/или способ введения варьировался в зависимости от желаемых результатов. Предпочтительные пути введения антител по изобретению включают внутривенное введение. внутримышечное. интрадермальное. внутрибрюшинное. подкожное. спинальное или другие парентеральные пути введения. например путем инъекции или инфузии. Как применяется в настоящем описании. фраза парентеральное введение означает отличные от энтерального и местного способы введения обычно с помощью инъекции и включает без ограничения введение с помощью инъекции и инфузии внутривенное. внутримышечное. внутриартериальное. интратекальное. интракапсулярное. внутриглазничное. внутрисердечное. интрадермальное. внутрибрюшинное. внутритрахейное. подкожное. субкутикулярное. внутрисуставное. субкапсулярное. субарахноидальное. интраспинальное. эпидуральное и интрастернальное.
Альтернативно. антитело по изобретению может вводиться через непарентеральный путь. такой как местный. эпидермальный и путь введения через слизистую оболочку. например интраназально. перорально. вагинально. ректально. подъязычно или местно.
Активные компоненты могут быть получены с носителями. которые будут защищать компонент против быстрого высвобождения. такой состав. как с контролируемым высвобождением. включающий имплантанты. трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут применяться биодеградируемые. биосовместимые полимеры. такие как этиленвинилацетат. полиангидриды. полигликолевая кислота. коллаген. полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения указанных составов запатентованы или в основном известны специалистам в данной области. См.. например. 8ик!атеб апб Соп1го11еб Ве1еаке Эгид Эек'егу 8ук!етк. 1.В. ВоЬткоп. еб.. Магсе1 Эеккег. Вчс.. Хеи Уогк. 1978.
Терапевтические композиции могут вводиться с помощью медицинских приспособлений. известных из уровня техники. Например. в предпочтительном воплощении терапевтическая композиция по изобретению может вводиться с помощью подкожного безыгольного инъектора. такого как приспособления. описанные в И8 патентах № 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 или 4596556. Примеры хорошо известных имплантантов и модулей. применяемых в настоящем изобретении. включают И8 патент № 4487603. который описывает имплантируемый микроинфузионный насос для распространения лекарственного средства с контролируемой скоростью; И8 патент № 4486194. который описывает терапевтическое приспособление для введения лекарственных средств через кожу; И8 патент № 4447233. который описывает инфузионный насос для доставки лекарственного средства с точной скоростью инфузии; И8 патент № 4447224. который описывает имплантируемый инфузионный прибор с изменяющимся потоком для подкожной доставки лекарственного средства; И8 патент № 4439196. который описывает осмотическую систему доставки лекарственного средства. имеющую многокамерные отделения; и И8 патент № 4475196. который описывает осмотическую систему доставки лекарственного средства. Эти патенты введены в настоящее описание с помощью ссылки. Многие другие такие имплантанты. системы доставки и модули известны специалистам в данной области.
В определенных воплощениях человеческие моноклональные антитела по изобретению могут быть включены в состав для обеспечения подходящего распределения ш νί\Ό. Например. гематоэнцефалический барьер (ВВВ) исключает многие высокогидрофильные компоненты. Чтобы убедиться. что терапевтические компоненты по изобретению пересекли ВВВ (если желательно). они могут быть включены в состав. например. в липосомах. Для способов получения липосом см.. например. И8 патенты 4522811; 5374548 и 5399331. Липосомы могут включать один или более компонентов. которые селективно транспортируются в специфические клетки или органы. таким образом усиливая направленную доставку лекарственного средства (см.. например. У.У. Вапабе (1989). ί. С1т. Ркагтасо1. 29:685). Приведенные в качестве примера направляющие компоненты включают фолат или биотин (см.. например. И8 патент 5416016 от Бо\\· е! а1.); маннозиды (итеха\\'а е! а1. (1988). Вюскет. Вюрйук. Век. Соттип.153:1038); антитела (Р.С. В1оетап е! а1. (1995). РЕВ8 Ьей. 357:140; М. 0\νηίκ е! а1. (1995). АпйтюгоЬ. Адеп!к СНето!йег. 39:180); рецептор поверхностно-активного белка А (Впксое е! а1. (1995). Ат. 1. Рйукю1. 1233:134); р120 (8сЬге1ег е! а1. (1994). 1. Вю1. С1ет. 269:9090); см. также К. Кетапеп; М.Ь. Ьаиккапеп (1994). РЕВ8 Ьей. 346:123; 1.1. К111юп; Ι.Ι. Р1б1ег (1994). Iттиηοте!йοбκ 4:273.
- 33 016186
Применения и способы по изобретению.
Антитела, в особенности человеческие антитела, композиции антител и способы по настоящему изобретению имеют многочисленные ш У1!го и ш у1уо диагностические и терапевтические применения, включающие диагностирование и лечение заболеваний, опосредованных СБ70. Например, указанные молекулы могут вводиться в клетки в клеточной культуре, ш ν 11го или ех у1уо или людям, например ш у1уо, для лечения, предотвращения и диагностирования разнообразных заболеваний. Как применяется в настоящем описании, подразумевается, что термин субъект включает человека и животных, отличных от человека. Термин животные, отличные от человека, включает всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как отличные от человека приматы, овцы, собаки, кошки, коровы, лошади, куры, амфибии и рептилии. Предпочтительные субъекты включают пациентов-людей, имеющих заболевания, опосредованные активностью СБ70. Способы особенно подходят для лечения пациентовлюдей, имеющих заболевание, связанное с абберантной экспрессией СБ70. Когда вводят антитела к СБ70 вместе с другим агентом, то два компонента могут вводиться в любом порядке или одновременно.
Учитывая специфическое связывание антител по изобретению с СБ70, антитела по изобретению могут применяться для специфической детекции экспрессии СБ70 на поверхности клеток и, кроме того, могут применяться для очистки СБ70 посредством иммуноаффинной очистки.
СБ70 экспрессируется в разнообразных опухолях человека, включающих почечно-клеточные карциномы, метастазирующие злокачественные заболевания груди, опухоли мозга, лейкемии, лимфомы и карциномы носоглотки (.Типкег е! а1. (2005), I. Иго1. 173:2150-3; 81оап е! а1. (2004), Ат I. Ра11ю1. 164:31523; НеШ-Ретй! и Меп!1ет (2002), Ш! 1 Сапсег 98:352-6; НЫнта е! а1.(2000), Ат 1 8игд Ра11ю1. 24:742-6; Ьепз е! а1. (1999), Вг 1 Наета!о1. 106:491-503). Антитело к СБ70 может применяться индивидуально для ингибирования роста злокачественных опухолей. Альтернативно, антитело к СБ70 может применяться совместно с другими иммуногенными агентами, со стандартным лечением раковых заболеваний или с другими антителами, как описано ниже.
Предпочтительные раковые заболевания, которые могут ингибироваться с применением антител по изобретению, включают раковые заболевания, обычно чувствительные к иммунотерапии. Неограничивающие примеры предпочтительных раковых заболеваний для лечения включают почечное раковое заболевание (например, почечно-клеточную карциному), рак груди, опухоли мозга, хронические или острые лейкемии, включающие острую миелоидную лейкемию, хроническую миелоидную лейкемию, острую лимфобластную лейкемию, хроническую лимфоцитарную лейкемию, лимфомы (например, лимфома Ходжкина или неходжкинская лимфома, лимфоцитарная лимфома, первичная лимфома ЦНС, Тклеточная лимфома) и карциномы носоглотки. Примеры других раковых заболеваний, которые могут быть подвергнуты лечению с применением способов по изобретению, включают меланому (например, метастазирующую злокачественную меланому), рак простаты, рак толстой кишки, рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичников, ректальное раковое заболевание, рак анальной области, рак желудка, рак яичка, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шеи, карциному влагалища, карциному вульвы, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак околощитовидной железы, рак надпочечной железы, саркому мягкой ткани, рак уретры, рак полового члена, детские твердые опухоли, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, карциному почечной лоханки, новообразование центральной нервной системы (ЦНС), ангиогенез опухоли, опухоль спинной оси, глиому стволовой части мозга, аденому слизистой оболочки, саркому Капоши, эпидермоидное раковое заболевание, плоскоклеточное раковое заболевание, раковые заболевания, индуцированные внешней средой, включающие заболевание, индуцированные асбестом, например мезотелиому и комбинации указанных раковых заболеваний.
Кроме того, благодаря экспрессии СБ70 на разнообразных опухолевых клетках человеческие антитела, композиции антител и способы по настоящему изобретению могут применяться для лечения субъекта с опухолевым заболеванием, например заболеванием, характеризующимся присутствием опухолевых клеток, экспрессирующих СБ70, включающих, например, почечно-клеточные карциномы (КСС), такие как светлоклеточная карцинома КСС, глиобластома, рак груди, опухоли мозга, карциномы носоглотки, неходжкинская лимфома (NΗ^), острая лимфоцитарная лейкемия (АЬЬ), хроническая лимфоцитарная лейкемия (СЬЬ), лимфома Беркитта, анапластические крупноклеточные лимфомы (АЬСЬ), множественная миелома, кожные Т-клеточные лимфомы, фолликулярные мелкоклеточные лимфомы с расщепленными ядрами, лимфоцитарные лимфомы, периферические Т-клеточные лимфомы, лимфома Леннерта, иммунобластные лимфомы, Т-клеточная лейкемия/лимфома (АТЬЬ), Т-клеточная лейкемия взрослых (Т-АЬЬ), раковые заболевания энтеробластных/центроцитарных фолликулярных лимфом, диффузные крупноклеточные лимфомы В-клеточной линии, Т-клеточная лимфома типа ангиоиммунобластной лимфаденопатии, ассоциированные с ВИЧ полостные лимфомы, эмбриональные карциномы, недифференцированные карциномы носоглотки (например, опухоль Шминке), болезнь Кастлемана, саркома Капоши, множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема и другие В-клеточные лимфомы.
Соответственно в одном воплощении в изобретении предлагается способ ингибирования роста опухолевых клеток субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества
- 34 016186 антитела к СЭ70 или его антигенсвязывающего участка. Предпочтительно антитело представляет собой человеческое антитело к СЭ70 (такое как любое из человеческих антител к СЭ70. описанных в настоящем описании). Дополнительно или альтернативно. антитело может быть химерным или гуманизированным антителом к СЭ70.
Кроме того. предположили. что взаимодействие СЭ70 с СЭ27 играет роль в клеточноопосредованных аутоиммунных заболеваниях. таких как экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ) (№1карта е! а1. (2000). ί. Nеи^οIттиηο1. 109:188-96). Считалось. что указанный эффект частично был опосредован ингибированием продуцирования ΤΝΡ-альфа. Кроме того. блокирование сигнальных путей СЭ70 ингибирует опосредованную СЭ40 клональную экспансию СЭ8+ Т-клеток и уменьшает генерацию СЭ8+ Т-клеток памяти (ΤηΓη^ιη с! а1. (2004). ί. Iттиηο1. 173:6542-6). Как таковые. человеческие антитела. композиции антител и способы по настоящему изобретению могут применяться для лечения субъекта с аутоиммунным заболеванием. например заболеванием. характеризующимся присутствием В-клеток. экспрессирующих СЭ70. заболеванием. включающим экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит. Дополнительные аутоиммунные заболевания. при которых могут применяться антитела по изобретению. включают. но не ограничены ими. системную красную волчанку (8ЬЕ). инсулинзависимый сахарный диабет (ΙΌΌΜ). воспалительную болезнь кишечника (ΙΒΌ) (включая болезнь Крона. язвенный колит и чревную болезнь). множественный склероз (Μ8). псориаз. аутоиммунный тироидит. ревматоидный артрит (КА) и гломерулонефрит. Кроме того. композиции антител по изобретению могут применяться для ингибирования и предотвращения отторжения трансплантанта или при лечении реакции трансплантант против хозяина (СУНЭ).
Кроме того. предположили. что взаимодействие СЭ70 с СЭ27 играет роль в сигнальных путях на СЭ4+ Т-клетках. Было показано. что некоторые вирусы участвуют в СЭ27 сигнальном пути. приводящем к нарушению нейтрализующих ответов антител (ΜηΙ^Γ е! а1. (2006). ί. Ехр Μеά 203:2145-55). Как таковые. человеческие антитела. композиции антител и способы по настоящему изобретению могут применяться для лечения субъекта с вирусными инфекциями. включающими. например. инфекции вируса иммунодефицита человека (ШУ). гепатит (А. В и С). герпес-вирус (например. У2У. Н8У-1. НАУ-6. Н8У-П и СΜУ. вирус Эпштейна-Барр). аденовирус. вирус гриппа. флавивирусы. эховирус. риновирус. коксаки вирус. коронавирус. респираторный синцитиальный вирус. вирус свинки. ротавирус. вирус кори. вирус краснухи. парвовирус. вирус вакцинии. вирус НШУ’. вирус тропической лихорадки. полиовирус. вирус бешенства. вирус 1С и вирус арбовирусного энцефалита. и вирус лимфоцитарного хориоменингита (^ΜΥ). или для лечения ШУ инфекции/АШ8. Кроме того. человеческие антитела. композиции антител и способы по настоящему изобретению могут применяться для ингибирования продуцирования ΤΝΡальфа.
В одном воплощении антитела (например. человеческие моноклональные антитела. мультиспецифичные и биспецифичные молекулы и композиции) по изобретению могут применяться для детекции уровня СЭ70 или клеток. которые содержат СЭ70 на поверхности своей мембраны. причем уровень может затем быть связан с определенными симптомами заболевания. Кроме того. антитела могут применяться для ингибирования или блокирования функции СЭ70. которая. в свою очередь. может быть связана с предотвращением или улучшением определенных симптомов заболевания. посредством чего СЭ70 вовлекается в качестве медиатора заболевания. Этого можно достичь путем введения в контакт экспериментального образца и контрольного образца с антителом к СЭ70 при условиях. которые дают возможность образованию комплекса между антителом и СЭ70. Любые комплексы. образованные между антителом и СЭ70. детектируют и сравнивают между экспериментальным образцом и контролем.
В другом воплощении антитела (например. человеческие антитела. мультиспецифичные и биспецифичные молекулы и композиции) по изобретению могут быть изначально протестированы несвязывающую активность. ассоциированную с терапевтическим или диагностическим применением ίη νίίτο. Например. композиции по изобретению могут быть протестированы с применением анализов проточной цитометрии. описанных в примерах ниже.
Антитела (например. человеческие антитела. мультиспецифичные и биспецифичные молекулы. иммуноконъюгаты и композиции) по изобретению имеют дополнительное применение в терапии и диагностировании заболеваний. связанных с СЭ70. Например. человеческие моноклональные антитела. мультиспецифичные и биспецифичные молекулы и иммуноконъюгаты могут применяться для определения ίη νίνο или ίη νίίτο одной или более из следующих биолигических активностей: ингибировать рост и/или убивать клетки. экспрессирующие СЭ70; опосредовать фагоцитоз или АЭСС клетки. экспрессирующей СЭ70. в присутствии человеческих эффекторных клеток; или блокировать связывание лиганда СЭ70 с СЭ70.
В конкретном воплощении антитела (например. человеческие антитела. мультиспецифичные и биспецифичные молекулы и композиции) применяются ίη νίνο для лечения. предотвращения или диагностирования разнообразных заболеваний. связанных с СЭ70. Примеры заболеваний. связанных с СЭ70. включают среди прочих аутоиммунные заболевания. экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ). рак. почечно-клеточные карциномы (КСС). такие как светлоклеточная карцинома КСС. глиобластома. рак груди. опухоли мозга. карциномы носоглотки. неходжкинская лимфома. острая лимфоци
- 35 016186 тарная лейкемия (АЬЬ), хроническая лимфоцитарная лейкемия (СЬЬ), лимфома Беркитта, анапластические крупноклеточные лимфомы (АЬСЬ), множественная миелома, кожные Т-клеточные лимфомы, фолликулярные мелкоклеточные лимфомы с расщепленными ядрами, лимфоцитарные лимфомы, периферические Т-клеточные лимфомы, лимфома Леннерта, иммунобластные лимфомы, Т-клеточная лейкемия/лимфома (АТЬЬ), Т-клеточная лейкемия взрослых (Т-АЬЬ), раковые заболевания энтеробластных/центроцитарных фолликулярных лимфом, диффузные крупноклеточные лимфомы В-клеточной линии, Т-клеточная лимфома типа ангиоиммунобластной лимфаденопатии (АГЬИ), ассоциированные с ВИЧ полостные лимфомы, эмбриональные карциномы, недифференцированные карциномы носоглотки (например, опухоль Шминке), болезнь Кастлемана, саркома Капоши, множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема и другие В-клеточные лимфомы.
Подходящие пути введения композиций антител (например, человеческих моноклональных антител, мультиспецифичных и биспецифичных молекул и иммуноконъюгатов) по изобретению ш у1уо и ш νίΙΐΌ хорошо известны из уровня техники и могут быть выбраны специалистами в данной области. Например, композиции антител могут вводиться путем инъекции (например, внутривенной или подкожной). Подходящие дозировки применяемых молекул будут зависеть от возраста и веса субъекта и от концентрации и/или состава композиции антител.
Как ранее было описано, человеческие антитела к СЭ70 по изобретению могут вводиться совместно с одним или более терапевтическими агентами, например цитотоксическим агентом, радиотоксическим агентом или иммуноподавляющим агентом. Антитело может быть связано с агентом (в виде иммунокомплекса) или может вводиться отдельно от агента. В последнем случае (отдельного введения) антитело может вводиться до, после или одновременно с агентом или может вводиться совместно с другими известными терапиями, например с противоопухолевой терапией, например совместно с облучением. Такие терапевтические агенты включают среди прочих противоопухолевые агенты, такие как доксорубицин (адриамицин), цисплатин, блеомицина сульфат, кармустин, хлорамбуцил и циклофосфамид гидроксимочевина, которые сами по себе являются эффективными только при уровне, который является токсичным или частично токсичным для пациента. Цисплатин вводят внутривенно в дозе 100 мг/мл один раз через каждые четыре недели, и адриамицин вводят внутривенно в дозе 60-75 мг/мл один раз через каждый 21 день. Совместное введение человеческих антител к СЭ70 или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению с химиотерапевтическими агентами предусматривает два противоопухолевых агента, которые действуют через различные механизмы, которые дают на выходе цитотоксический эффект для человеческих опухолевых клеток. Такое совместное введение может разрешить проблемы благодаря развитию устойчивости к лекарственным средствам или изменению антигенности опухолевых клеток, которая делает их нереакционноспособными с антителом.
Эффекторные клетки с направленной специфичностью, например эффекторные клетки, связанные с композициями (например, человеческих антител, мультиспецифичных и биспецифичных молекул) по изобретению, также могут применяться в качестве терапевтических агентов. Эффекторные клетки для направленного воздействия могут представлять собой человеческие лейкоциты, такие как макрофаги, нейтрофилы или моноциты. Другие клетки включают эозинофилы, природные клетки-киллеры и другие клетки, несущие 1д0- или 1дА-рецептор. Если желательно, эффекторные клетки могут быть получены от субъекта, которого следует подвергнуть лечению. Эффекторные клетки с направленной специфичностью могут вводиться в виде суспензии клеток в физиологически приемлемом растворе. Количество введенных клеток может быть порядка 108-109, но будет варьироваться в зависимости от терапевтической цели. В основном количество будет достаточным для получения локализации на клетке-мишени, например опухолевой клетке, экспрессирующей СИ70, и для осуществления убивания клетки, например, с помощью фагоцитоза. Пути введения также могут варьироваться. Терапия с эффекторными клетками с направленной специфичностью может быть осуществлена совместно с другими методиками удаления клеток-мишеней. Например, противоопухолевая терапия с применением композиций (например, человеческих антител, мультиспецифичных и биспецифичных молекул) по изобретению и/или эффекторных клеток, усиленных этими композициями, может применяться совместно с химиотерапией. Кроме того, комбинированная иммунотерапия может применяться для того, чтобы направить воздействие двух удаленных цитотоксических эффекторных популяций на отторжение опухолевой клетки. Например, антитела к СИ70, связанные с антителами к Ес-гамма К1 или с антителами к СИ3, могут применяться совместно со связывающими агентами, специфичными для 1д0- или 1дА-рецептора.
Биспецифичные и мультиспецифичные молекулы по изобретению также могут применяться для модулирования уровня ЕсуК. или Есу К. на эффекторных клетках таким способом, как кэппинг и исключение рецепторов на клеточной поверхности. Смеси антител к Ес-рецепторам также могут применяться для указанной цели.
Композиции (например, человеческих антител, мультиспецифичных и биспецифичных молекул и иммуноконъюгатов) по изобретению, которые имеют комплементарные сайты связывания, такие как участки из 1дО1, -2 или -3 или 1дМ, которые связывают комплемент, также могут применяться в присутствии комплемента. В одном воплощении ех у1уо обработка популяции клеток, включающих клеткимишени со связывающими агентами по изобретению и подходящие эффекторные клетки, может быть
- 36 016186 дополнена добавлением комплемента или сыворотки, содержащей комплемент. Фагоцитоз клетокмишеней, покрытых связывающим агентом по изобретению, может быть улучшен путем связывания белков комплемента. В другом воплощении клетки-мишени, покрытые композициями (например, человеческих антител, мультиспецифичных и биспецифичных молекул) по изобретению, могут также лизироваться с помощью комплемента. Еще в другом воплощении композиции по изобретению не активируют комплемент.
Композиции (например, человеческих антител, мультиспецифичных и биспецифичных молекул и иммуноконъюгатов) по изобретению также могут вводиться совместно с комплементом. Соответственно в границах изобретения находятся композиции, включающие человеческие антитела, мультиспецифичные или биспецифичные молекулы и сыворотку или комплемент. Эти композиции являются полезными в том, что комплемент локализован в непосредственной близости к человеческим антителам, мультиспецифичным или биспецифичным молекулам. Альтернативно, человеческие антитела, мультиспецифичные или биспецифичные молекулы по изобретению и комплемент или сыворотка могут вводиться отдельно. Также в границах настоящего изобретения находятся наборы, включающие композиции антител по изобретению (например, человеческих антител, биспецифичных или мультиспецифичных молекул или иммуноконъюгатов) и инструкции по применению. Набор может дополнительно содержать один или более дополнительных реагентов, таких как иммуноподавляющий реагент, цитотоксический агент или радиотоксический агент, или один или более дополнительных человеческих антител по изобретению (например, человеческое антитело, обладающее комплементарной активностью, которая связывается с эпитопом ί.Ό70 антигена, который удален от эпитопа для первого человеческого антитела).
Соответственно пациентам, подвергнутым лечению с помощью композиции антител по изобретению, может дополнительно вводиться (перед, одновременно или после введения человеческого антитела по изобретению) другой терапевтический агент, такой как цитотоксический или радиотоксический агент, который усиливает или повышает терапевтический эффект человеческих антител.
В других воплощениях субъект может быть дополнительно подвергнут лечению с агентом, который модулирует, например, усиливает или ингибирует экспрессию или активность Есу или Есу-рецепторов путем, например, лечения субъекта с помощью цитокина. Предпочтительные цитокины для введения во время лечения с помощью мультиспецифичной молекулы включают гранулоцит колониестимулирующий фактор (С-С8Е), гранулоцит макрофаг колониестимулирующий фактор (СМ-С8Е), интерферон-у (ГЕЛ-у) и фактор некроза опухоли (ТЛЕ).
Композиции (например, человеческие антитела, мультиспецифичные молекулы и биспецифичные молекулы) по изобретению также могут применяться для направленного воздействия на клетки, экспрессирующие ЕсуК или СЭ70, например для мечения таких клеток. Для такого применения связывающий агент может быть связан с молекулой, которую можно детектировать. Таким образом, в изобретении предлагаются способы локализации ех у1уо или ίη уйго клеток, экспрессирующих Ес-рецепторы, такие как ЕсуК или ί.Ό70. В качестве детектируемой метки может быть, например, радиоизотоп, флуоресцентный компонент, фермент или кофактор фермента.
В конкретном воплощении в изобретении предлагаются способы детекции присутствия ί.Ό70 антигена в образце или способы измерения количества ί.Ό70 антигена, включающие введение в контакт образца и контрольного образца с человеческим моноклональным антителом или его антигенсвязывающим участком, которые специфически связываются с СЭ70, при условиях, которые дают возможность образования комплекса между антителом или его участком и ί.Ό70. Затем детектируют образование комплекса, где сравнение различия в образовании комплекса с образцом и с контролем является показателем присутствия СЭ70 антигена в образце.
Еще в другом воплощении иммуноконъюгаты по изобретению могут применяться для направления компонентов (например, терапевтических агентов, меток, цитотоксинов, радиотоксинов, иммуноподавляющих агентов и т.д.) к клеткам, которые имеют поверхностные клеточные рецепторы СЭ70, путем связывания указанных компонентов с антителом. Например, антитело к СЭ70 может быть конъюгировано с любым из токсиновых компонентов, описанных в И8 патентах № 6281354 и 6548530, И8 патентных публикациях № 20030050331, 20030064984, 20030073852 и 20040087497 или опубликованных в \У0 03/022806, которые таким образом полностью введены в настоящее изобретение с помощью ссылки. Таким образом, в изобретении также предлагаются способы локализации ех угуо или ίη угуо клеток, экспрессирующих ί.Ό70 (например, с помощью детектируемой метки, такой как радиоизотоп, флуоресцентный компонент, фермент или кофактор фермента). Альтернативно, иммуноконъюгаты могут применяться для убивания клеток, которые имеют поверхностные клеточные рецепторы ί.Ό70 путем направления цитотоксинов или радиотоксинов к ί.Ό70.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано с помощью следующих примеров, которые не следует понимать как дополнительное ограничение. Содержание всех фигур и всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, цитированных на протяжении всего текста настоящего описания, в точности введено в настоящее изобретение с помощью ссылки.
- 37 016186
Примеры
Пример 1. Получение человеческих моноклональных антител против СБ70.
Антиген.
В протоколах иммунизации применяли антигенный рекомбинантный человеческий СБ70, сшитый с бифункциональной тус-Шк-последовательностью. Альтернативно, при некоторых иммунизациях применяли общеклеточную иммунизацию с применением клеточной линии почечно-клеточной карциномы 786-О (АТСС № доступа СКЬ-1932) и поддержанную клеточной линией почечно-клеточной карциномы А-498 (АТСС № доступа НТВ-44).
Трансгенная нитАЬ Мойке® и КМ Мойке®.
Человеческие моноклональные антитела к СБ70 были полностью получены с применением НСо7, НСо12 и НСо17 линий нитАЬ трансгенных мышей и КМ линии трансгенных трансхромосомных мышей, каждая из которых экспрессирует гены человеческого антитела. В этих мышиных линиях эндогенный мышиный ген легкой цепи каппа был гомозиготно нарушен, как описано СНеи е! а1. (1993), ЕМВО Σ. 12:811-820, и эндогенный мышиный ген тяжелой цепи был гомозиготно нарушен, как описано в примере 1 РСТ публикации АО 01/09187. Кроме того, эта мышиная линия несет человеческий трансген легкой цепи каппа КСо5, как описано Нк11\\з1б е! а1. (1996), №1иге В1о!есйио1оду 14:845-851, и человеческий трансген тяжелой цепи НСо7, НСо12 или НСо17, как описано в примере 2 РСТ публикации АО 01/09187. Линия КМ Мойке® содержит 8С20 трансхромосому, как описано в РСТ публикации АО 02/43478.
нитАЬ и КМ-иммунизации.
Для полного получения человеческих моноклональных антител к СБ70, мышей линий нитАЬ Мойке® и КМ Мойке® иммунизировали рекомбинантным человеческим СБ70 в виде антигена или цельных клеток, экспрессирующих СБ70 на клеточной поверхности. Основные схемы иммунизации для нитАЬ мышей описаны ЬоиЬегд, Ν. е! а1. (1994), №11иге 368 (6474): 856-859; РкН^М, Б. е! а1. (1996), №1иге В1о!есНио1оду 14:845-851 и в РСТ публикации АО 98/24884. Возраст мышей перед первой инфузией антигена составлял 6-16 недель. Применяли 5-10х106 клеток для иммунизации нитАЬ мышей внутрибрюшинно (1Р), подкожно (8с) или через инъекцию в подушечки лап.
Трансгенных мышей иммунизировали дважды антигеном в полном адъюванте Фрейнда или в адъюванте Риби (К1Ь1) 1Р способом иммунизации, с последующими 1Р в течение 3-21 дня (до общего количества - 11 иммунизаций) с антигеном в неполном адъюванте Фрейнда или в адъюванте Риби. Иммунный ответ отслеживали с помощью ретроорбитальных отборов крови. Плазму скринировали с помощью ЕЫ8А и РАС8 (как описано ниже) и мышей с достаточным титром человеческого иммуноглобулина к СБ70 использовали для слияний. Мышей поддерживали внутривенно антигеном за три дня до умерщвления и удаления селезенки. Обычно осуществляли 10-35 слияний для каждого антигена. Несколько десятков мышей иммунизировали с каждым антигеном.
Селекция мышей, продуцирующих антитела к СБ70 из линий нитАЬ Мойке® или КМ Мойке®.
Для селекции мышей нитАЬ Мойке® или КМ Мойке®, продуцирующих антитела, которые связывают СБ70, сыворотку из иммунизированных мышей скринировали с помощью проточной цитометрии на связывание с клеточной линией, экспрессирующей рекомбинантный человеческий СБ70, но не с контрольной клеточной линией, которая не экспрессирует СБ70. Кроме того, сыворотку скринировали с помощью проточной цитометрии на связывание с клетками 786-О или А-498. Коротко, связывание антител к СБ70 определяли путем инкубации экспрессирующих СБ70 клеток СНО, клеток 786-О или клеток А498 с антителом к СБ70 с разведением 1:20. Клетки отмывали и связывание детектировали с помощью Р1ТС-меченного АЬ к человеческому 1дО. Анализы проточной цитометрии осуществляли с применением РАС8Са11Ьиг проточной цитометрии (Вес!ои Бюкткои, 8аи .Токе, СА). Антитела, которые связываются с клетками СНО, экспрессирующими СБ70, но не связываются с родительскими клетками СНО, которые не экспрессируют СБ70, дополнительно тестировали на связывание с СБ70 с помощью ЕЬ18А, как описано РкНМ1б, Б. е! а1. (1996). Коротко, планшеты для микротитрования покрывали очищенным рекомбинантным СБ70-гибридным белком из трансфицированных клеток СНО с концентрацией 1-2 мкг/мл в РВ8, 100 мкл/ячейку инкубировали при 4°С в течение ночи, затем блокировали с 5% сывороткой цыпленка 200 мкл/ячейку в растворе РВ8/Тетееи (0,05%). Разведения сыворотки из СБ70-иммунизированных мышей добавляли в каждую ячейку и инкубировали в течение 1-2 ч при температуре окружающей среды. Планшеты промывали раствором РВ8/Тетееи и затем инкубировали с козьим поликлональным антителом к человеческому 1дО, конъюгированным с пероксидазой хрена (нКР) в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывания планшеты проявляли с помощью субстрата АВТ8 (81дта, А-1888, 0,22 мг/мл) и анализировали на спектофотометре при ОБ 415-495. Мышей, которые проявили наивысшие титры антител к СБ70, применяли для слияний. Слияния осуществляли, как описано ниже, и гибридомные супернатанты тестировали на активность антитела к СБ70 с помощью ЕЬ18А.
- 38 016186
Получение гибридом, продуцирующих человеческие антитела к СИ70.
Проводили слияние мышиных спленоцитов, выделенных из мышей НитАЬ Μοιι^® и/или КМ Μου^®, с мышиной клеточной линией миеломы или с применением стандартных протоколов на основе РЕС, или с применением электрослияния на основе электрического поля с применением крупнокамерного электропоратора СуЮ Рике для слияния клеток (СуЮ Рикс 8с1епсе5, Шс., С1сн Вигше, МО). Полученные гибридомы затем скринировали на предмет продуцирования антиген-специфичных антител. Проводили слияние одноклеточной суспензии спленоцитов из иммунизированных мышей с одной четвертой количества 8Р2/0 несекретирующих мышиных клеток миеломы (АТСС, СЯЬ 1581) с 50% РЕС (81дта). Клетки высевали с плотностью приблизительно 1х 105 на дно ячейки планшета для микротитрования с последующей инкубацией в течение одной недели в среде ИМЕМ с высоким содержанием глюкозы с Ьглутамином и пируватом натрия (Мей1а!есЕ, Шс., Ηе^ηйοη. УА), и дополнительно содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (Нускпе, Εο^ιπ, ИТ), 18% кондиционирующую среду Р388ИЕ 5% фактор клонирования гибридомы 0гщеп (ВюУегк, СаййегкЬигд, УА), 4 мМ Ь-глутамина, 5 мМ НЕРЕ8, 0,055 мМ β-меркаптоэтанола, 50 единиц/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина и 1х среду гипоксантинаминоптерин-тимидин (НАТ) (81дта; НАТ добавляли через 24 ч после слияния). Через одну неделю клеткам, культивированным в среде, в которой применялся нАТ, заменяли среду на содержащую НТ. Индивидуальные ячейки затем скринировали с помощью ЕАС8 или ЕЫ8А (как описано выше) на предмет человеческих моноклональных ^С антител к СИ70. Благодаря наблюдаемому интенсивному росту гибридомы среду обычно отслеживали через 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитела, пересевали, скринировали снова, и если все равно оставалась положительная реакция на человеческий ^С, то моноклональные антитела к СИ70 субклонировали по меньшей мере дважды путем ограничивающего разведения. Стабильные субклоны затем культивировали ίη νίίτο для получения небольших количеств антитела в среде для культивирования тканевых и клеточных культур для дополнительной характеристики.
Для дополнительного анализа были выбраны гибридомные клоны 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7.
Пример 2. Структурная характеристика человеческих моноклональных антител 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7.
Последовательности кДНК, кодирующие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, из моноклональных антител 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7 получали из гибридом 2Н5, 10В4, 8В5, 18Е7 и 69А7 соответственно с применением стандартных ПЦР методик и секвенировали с применением стандартных методик секвенирования ДНК.
Нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельного участка тяжелой цепи из 2Н5 показаны на фиг. 1А и в 8ЕС ГО N0: 41 и 1 соответственно.
Нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельного участка легкой цепи из 2Н5 показаны на фиг. 1В и в 8ЕС ГО N0: 46 и 6 соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина 2Н5 с известными человеческими эмбриональными последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина продемонстрировало, что в тяжелой цепи 2Н5 применяется Ун-сегмент из человеческого эмбрионального Ун 3-30.3, неопределенный И-сегмент и 1н-сегмент из человеческого эмбрионального 1н 4Ь. Сравнение ^-последовательности 2Н5 с эмбриональной последовательностью Ун 3-30.3 показано на фиг. 6. Дополнительный анализ Унпоследовательности 2Н5 с применением системы КаЬа! для определения СИЯ участка привел к выделению участков тяжелой цепи СИЯ1, СИЯ2 и СИЯ3, как показано на фиг. 1А и 6 и в 8ЕС ΙΌ N0: 11, 16 и 21 соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина 2Н5 с известными человеческими эмбриональными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина продемонстрировало, что в легкой цепи 2Н5 применяется Уъ-сегмент из человеческого эмбрионального Ук Ь6 и 1к-сегмент из человеческого эмбрионального Г< 4. Сравнение Уь-последовательности 2Н5 с эмбриональной последовательностью Ук Ь6 показано на фиг. 9. Дополнительный анализ Уь-последовательности 2Н5 с применением системы КаЬа! для определения СИЯ участка привел к выделению участков легкой цепи СИЯ1, СИЯ2 и СИЯ3, как показано на фиг. 1В и 9 и в 8ЕС ГО N0: 26, 31 и 36 соответственно.
Нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 10В4 показаны на фиг. 2А и в 8ЕС ГО N0: 42 и 2 соответственно.
Нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельного участка легкой цепи 10В4 показаны на фиг. 2В и в 8ЕС ГО N0: 47 и 7 соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина 10В4 с известными человеческими эмбриональными последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина продемонстрировало, что в тяжелой цепи 10В4 применяется Ун-сегмент из человеческого эмбрионального Ун 3-30.3, И-сегмент из человеческого эмбрионального сегмента 4-11 и 1н-сегмент из человеческого эмбрионального 1н 4Ь. Сравнение Ун-последовательности 10В4 с эмбриональной последовательностью Ун 3-30.3 показано на фиг. 6. Дополнительный анализ Ун-последовательности 10В4 с применением системы каЬа! для определения СИЯ участка привел к выделению участков тяжелой цепи СИЯ1, СИЯ2 и СИЯ3, как показано на
- 39 016186 фиг. 2А и 6 и в ЗЕО ГО NО: 12. 17 и 22 соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина 10В4 с известными человеческими эмбриональными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина продемонстрировало. что в легкой цепи 10В4 применяется Уъ-сегмент из человеческого эмбрионального УК Ь18 и 1К-сегмент из человеческого эмбрионального 1К 3. Сравнение Уь-последовательности 10В4 с эмбриональной последовательностью УК Ь18 показано на фиг. 10. Дополнительный анализ Уь-последовательности 10В4 с применением системы КаЬа! для определения СОК участка привел к выделению участков легкой цепи СЭК1. СГОК2 и СЭК3. как показано на фиг. 2В и 10 и в ЗЕО ГО NО: 27. 32 и 37 соответственно. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 8В5 показаны на фиг. 3А и в ЗЕО ГО NО: 43 и 3 соответственно.
Нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельного участка легкой цепи 8В5 показаны на фиг. 3В и в ЗЕО ГО NО: 48 и 8 соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина 8В 5 с известными человеческими эмбриональными последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина продемонстрировало. что в тяжелой цепи 8В5 применяется УН-сегмент из человеческого эмбрионального УН 3-33. Ό-сегмент из человеческого эмбрионального сегмента 3-10 и 1Н-сегмент из человеческого эмбрионального 1Н 4Ь. Сравнение УН-последовательности 8В 5 с эмбриональной последовательностью УН 3-33 показано на фиг. 7. Дополнительный анализ УН-последовательности 8В 5 с применением системы КаЬа! для определения СОК участка привел к выделению участков тяжелой цепи СГОК1. СГОК2 и СГОК3. как показано на фиг. 3А и 7 и в ЗЕО ГО NО: 13. 18 и 23 соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина 8В 5 с известными человеческими эмбриональными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина продемонстрировало. что в легкой цепи 8В 5 применяется Уь-сегмент из человеческого эмбрионального УК Ь15 и 1К-сегмент из человеческого эмбрионального 1К 4. Сравнение Уь-последовательности 8В5 с эмбриональной последовательностью УК Ь15 показано на фиг. 11. Дополнительный анализ Уь-последовательности 8В 5 с применением системы КаЬа! для определения СОК участка привел к выделению участков легкой цепи СГОК1. СГОК2 и СГОК3. как показано на фиг. 3В и 11 и в ЗЕО ГО NО: 28. 33 и 38 соответственно.
Нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 18Е7 показаны на фиг. 4А и в ЗЕО ГО NО: 44 и 4 соответственно.
Нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельного участка легкой цепи 18Е7 показаны на фиг. 4В и в ЗЕО ГО NО: 49 и 9 соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина 18Е7 с известными человеческими эмбриональными последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина продемонстрировало. что в тяжелой цепи 18Е7 применяется УН-сегмент из человеческого эмбрионального УН 3-33. Ό-сегмент из человеческого эмбрионального сегмента 3-10 и 1Н-сегмент из человеческого эмбрионального 1Н 4Ь. Сравнение УН-последовательности 18Е7 с эмбриональной последовательностью УН 3-33 показано на фиг. 7. Дополнительный анализ УН-последовательности 18Е7 с применением системы КаЬа! для определения СПК участка привел к выделению участков тяжелой цепи СГОКЕ СГОК2 и СГОК3. как показано на фиг. 4А и 7 и в ЗЕО ГО NО: 14. 19 и 24 соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина 18Е7 с известными человеческими эмбриональными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина продемонстрировало. что в легкой цепи 18Е7 применяется Уь-сегмент из человеческого эмбрионального УК Ь15 и 1К-сегмент из человеческого эмбрионального 1К 4. Сравнение Уь-последовательности 18Е7 с эмбриональной последовательностью УК Ь15 показано на фиг. 11. Дополнительный анализ Уь-последовательности 18Е7 с применением системы КаЬа! для определения СПК участка привел к выделению участков легкой цепи СПК1. СОК2 и СОК3. как показано на фиг. 4В и 11 и в ЗЕО ГО NО: 29. 34 и 39 соответственно.
Нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 69А7 показаны на фиг. 5А и в ЗЕО ГО NО: 45 и 5 соответственно.
Нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельного участка легкой цепи 69А7 показаны на фиг. 5В и в ЗЕО ГО NО: 50 и 10 соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина 69А7 с известными человеческими эмбриональными последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина продемонстрировало. что в тяжелой цепи 69 А7 применяется УН-сегмент из человеческого эмбрионального УН 4-61. Ό-сегмент из человеческого эмбрионального сегмента 4-23 и 1Н-сегмент из человеческого эмбрионального 1Н 4Ь. Сравнение УН-последовательности 69 А7 с эмбриональной последовательностью УН 4-61 показано на фиг. 8. Дополнительный анализ УН-последовательности 69А7 с применением системы КаЬа! для определения СПК участка привел к выделению участков тяжелой цепи СОК1. СПК2 и СПК3. как показано на фиг. 5А и 9 и в ЗЕО ГО NО: 15. 20 и 25 соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина 69А7 с известными человеческими эмбриональными последовательностями легкой цепи иммуноглобулина продемонстрировало. что в легкой цепи 69А7 применяется Уъ-сегмент из человеческого эмбрионального УК Ь6 и 1К-сегмент из человеческого эмбрионального 1К 4. Сравнение Уь-последовательности 69А7 с эмбриональной последователь
- 40 016186 ностью νκ Ь6 показано на фиг. 12. Дополнительный анализ Уь-последовательности 69А7 с применением системы КаЬа! для определения СОЯ участка привел к выделению участков легкой цепи СЭЯ1. СЭЯ2 и СЭВ3. как показано на фиг. 5В и 12 и в 8ЕЦ ΙΌ N0: 30. 35 и 40 соответственно.
Пример 3. Характеристика специфичности связывания моноклональных антител к СЭ70.
Сравнение связывания антител к СЭ70 с иммуноочищенным СЭ70 осуществляли с помощью стандартного анализа ЕЫ8А для определения специфичности связывания с СЭ70.
Рекомбинантным СЭ70 с присоединенным тус-тагом покрывали планшет в течение ночи. затем тестировали на связывание против человеческих моноклональных антител к СЭ70. 2Н5. 10В4. 8В5. 18Е7 и 69А7. Осуществляли стандартные процедуры ЕЫ8А. Человеческие моноклональные антитела к СЭ70 добавляли в концентрации 1 мкг/мл и с последовательными разведениями 1:2. Козье поликлональное антитело к человеческому ЦС (специфичное для Ес- или каппа-цепи). конъюгированное с пероксидазой хрена (НЯР). применяли в качестве вторичного антитела. Результаты показаны на фиг. 13. Человеческие моноклональные антитела к СЭ70. 2Н5. 10В4. 8В5 и 18Е7 связывались с высокой специфичностью с СО70.
Пример 4. Характеристика связывания антитела к СЭ70 с СЭ70. экспрессирующимся на поверхности клеток клеточных линий почечно-клеточной карциномы.
Антитела к СЭ70 тестировали с помощью проточной цитометрии на связывание с клетками почечно-клеточной карциномы. экспрессирующими на своей клеточной поверхности СЭ70.
Клеточные линии почечно-клеточной каруциномы А-498 (АТСС № доступа НТВ-44). 786-0 (АТСС № доступа СЯЬ-1932). АСНN (АТСС № доступа СЯЬ-1611). Сак1-1 (АТСС № доступа НТВ-46) и Сак1-2 (АТСС № доступа НТВ-47) тестировали на связывание с антителом. Связывание человеческого моноклонального антитела к СЭ70. НитАЬ 2Н5. определяли с помощью инкубации 1 х 105 клеток с 2Н5 в концентрации 1 мкг/мл. Клетки промывали и связывание детектировали с помощью ПТС-меченного АЬ к человеческому ЦС. Анализ проточной цитометрии осуществляли с помощью ЕАС8Са11Ьиг проточной цитометрии (Вес!оп О|скткоп. 8ап .Токе. СА). Результаты показаны на фиг. 14. Моноклональное антитело к СЭ70. 2Н5. связывалось с клетками клеточных линий почечно-клеточной карциномы А-498. 786-О. /\С11\. Сак1-1 и Сак1-2.
Клеточные линии почечно-клеточной карциномы 786-0 и А-498 тестировали на связывание с человеческими моноклональными антителами к СЭ70. НитАЬ 2Н5. 8В5. 10В4 и 18Е7. в различных концентрациях. Связывание человеческих моноклональных антител к СЭ70 определяли путем инкубации 5х105 клеток с антителом с начальной концентрацией 50 мкг/мл. и последующие концентрации представляли собой последовательные разведения антитела 1:3. Клетки промывали и связывание детектировали с помощью РЕ-меченного АЬ к человеческому ЦС. Анализы проточной цитометрии осуществляли с помощью ЕАС8Са11Ьиг проточной цитометрии (Вес!оп Оюкшкоп. 8ап .Токе. СА). Результаты показаны на фиг. 15А (786-0) и фиг. 15В (А-498). Сила связывания моноклональных антител к ί.Ό70. 2Н5. 8В5. 10В4 и 18Е7. с клетками клеточных линий почечно-клеточной карциномы 786-0 и А-498 представляла собой функцию от концентрации. как было измерено с помощью флуоресцентной интенсивности окрашивания (МП). Величины ЕС50 для моноклональных антител к СЭ70 находились в пределах от 1.844 до 6.669 нМ для клеточной линии 786-0 и от 3.984 до 11.84 нМ для клеточной линии А-498.
Связывание человеческих моноклональных антител к СЭ70. НитАЬ 2Н5 и 69А7. с клетками клеточной линии почечно-клеточной карциномы 786-0 определяли путем инкубации 2х105 клеток или с 2Н5. или с 69А7 в концентрации 10 мкг/мл. Контрольное антитело по изотипу применяли в качестве отрицательного контроля. Клетки промывали и связывание детектировали с помощью ЕПС-меченного АЬ к человеческому Ι§0. Анализы проточной цитометрии осуществляли с помощью ЕАС8Са11Ьиг проточной цитометрии (Вес!оп Оюкшкоп. 8ап .Токе. СА). Результаты показаны на фиг. 15С. Оба моноклональных антитела к СЭ70 связывались с клетками клеточной линии почечно-клеточной карциномы 786-0.
Клеточную линию почечно-клеточной карциномы 786-0 тестировали на связывание человеческого моноклонального антитела к СЭ70. НитАЬ 69А7. в различных концентрациях. Связывание человеческих моноклональных антител к СЭ70 определяли путем инкубации 5х105 клеток с антителом с начальной концентрацией 10 мкг/мл. и последующие концентрации представляли собой последовательные разведения антитела 1:3. Клетки промывали и связывание детектировали с помощью РЕ-меченного АЬ к человеческому Ι§0. Анализы проточной цитометрии осуществляли с помощью ЕАС8Са11Ьиг проточной цитометрии (Вес!оп Оюкшкоп. 8ап .Токе. СА). Результаты показаны на фиг. 15Ό. Сила связывания моноклонального антитела к СЭ70. 69А7. с клетками клеточной линии почечно-клеточной карциномы 786-0 представляла собой функцию от концентрации. как было измерено с помощью флуоресцентной интенсивности окрашивания (МП). Величина ЕС50 для моноклонального антитела к СЭ70 69А7 составляла 6.927 нМ для клеточной линии 786-0.
Эти данные демонстрируют. что НитАЬ к СЭ70 связываются с клетками клеточных линий почечно-клеточной карциномы.
Пример 5. Характеристика связывания антитела к СЭ70 с СЭ70. экспрессирующимся на поверхности клеток клеточных линий лимфомы.
- 41 016186
Антитела к СП70 тестировали с помощью проточной цитометрии на связывание с клетками лимфомы, экспрессирующими на своей клеточной поверхности СП70.
Каждую из клеточных линий лимфомы Οαιιάί (АТСС № доступа ССЬ-213), НиТ 78 (АТСС № доступа Т1В-161) и Кар (АТСС № доступа ССЬ-86) тестировали на связывание с антителом. Связывание человеческого моноклонального антитела к СЭ70. НитАЬ 2Н5, определяли путем инкубации 1х105 клеток с 2Н5 в концентрации 1 мкг/мл. Клетки промывали и связывание определяли с помощью Е1ТСмеченного АЬ к человеческому 1дС. Клетки клеточной линии 1итка1, которая не экспрессирует на своей клеточной поверхности СЭ70. применяли в качестве отрицательного контроля. Анализы проточной цитометрии осуществляли с помощью ЕАС8Са11Ьит проточной цитометрии (Вес1ои Пюктзои. 8аи 1озе, СА). Результаты показаны на фиг. 16. Моноклональное антитело к СЭ70. 2Н5, связывалось с клетками клеточных линий лимфомы Оаибт НиТ 78 и Кар. как было измерено с помощью флуоресцентной интенсивности окрашивания (ММ).
Клеточные линии лимфомы Кар и Сгаи1а 519 (Ό8ΜΖ № доступа 342) тестировали на связывание с человеческим моноклональным антителом к СЭ70. НитАЬ 2Н5, при различных концентрациях. Связывание человеческих моноклональных антител к СЭ70 определяли путем инкубации 5х105 клеток с антителом с начальной концентрацией 50 мкг/мл и последующие концентрации представляли собой последовательные разведения антитела 1:3. Контрольное антитело по изотипу применяли в качестве отрицательного контроля. Клетки промывали и связывание детектировали с помощью РЕ-меченного АЬ к человеческому 1дС. Анализы проточной цитометрии осуществляли с помощью ЕАС8Са11Ьит проточной цитометрии (Вес1ои Ωκΐίηχοη. 8аи 1озе, СА). Результаты показаны на фиг. 17А (Ка|1) и 17В (Сгаи1а 519). Сила связывания моноклонального антитела к СЭ70 2Н5 с клетками клеточных линий лимфомы Ка_р и СгагИа 519 представляла собой функцию от концентрации. как было измерено с помощью флуоресцентной интенсивности окрашивания (ΜΕΙ). Величины ЕС50 для моноклонального антитела к СЭ70 составили 1.332 нМ для клеток Кац и 1.330 нМ для клеток СгагИа 519.
Связывание человеческих моноклональных антител к СП70. НитАЬ 2Н5 и 69А7. с клетками клеточной линии лимфомы Ка_р определяли путем инкубации 2х105 клеток с антителом с концентрацией 10 мкг/мл. Клетки промывали и связывание детектировали с помощью Е1ТС-меченного АЬ к человеческому 1дС. Контрольное антитело по изотипу применяли в качестве отрицательного контроля. Анализы проточной цитометрии осуществляли с помощью ЕАС8Са11Ьит проточной цитометрии (Вес1ои Пюкшзои. 8аи 1охе. СА). Результаты показаны на фиг. 17С. Оба моноклональных антитела к СЭ70 связывались с клетками клеточной линии лимфомы Кац. как было измерено с помощью флуоресцентной интенсивности окрашивания (ΜΕΙ).
Конкурирующий анализ ЕАС8 проводили для выяснения специфичности связывания 69А7 против 2Н5. Клетки Ка_р инкубировали или со свободными антителами 69А7. 2Н5. с контрольным антителом по изотипу. или без антитела при концентрации 10 мкг/мл. После отмывки клетки инкубировали с Е1ТСконъюгированным 69А7 при концентрации 10 мкг/мл. Клетки промывали и связывание детектировали с помощью Е1ТС-меченного АЬ к человеческому 1дС. Анализы проточной цитометрии осуществляли с помощью ЕАС8Са11Ьит проточной цитометрии (Вес1ои Оюктхоп. 8аи 1охе. СА). Результаты показаны на фиг. 17Ό. Оба моноклональных антитела к СЭ70. 69А7 и 2Н5. блокировали связывание Е1ТС-меченного 69А7. что указывало на то. что оба антитела 69А7 и 2Н5 используют похожий эпитоп связывания.
Клеточные линии лимфомы Оаиб1 и почечно-клеточной карциномы 786-0 дополнительно тестировали на связывание с антителом. Связывание человеческого моноклонального антитела к СП70. НитАЬ 69А7. определяли путем инкубации 2х105 клеток с 69А7 в концентрации 1 мкг/мл. Клетки промывали и связывание определяли с помощью Е1ТС-меченного АЬ к человеческому 1дС. Клетки клеточной линии .ТигкаС которая не экспрессирует на своей клеточной поверхности СЭ70. применяли в качестве отрицательного контроля. Анализы проточной цитометрии осуществляли с помощью ЕАС8Са11Ьит проточной цитометрии (Вес1ои Оюктхоп. 8аи 1охе. СА). Результаты показаны на фиг. 17Е. Моноклональное антитело к СП70 69А7 связывалось с клетками клеточной линии лимфомы Ωοπάί и клетками клеточной линии почечно-клеточной карциномы 786-0. как было измерено с помощью флуоресцентной интенсивности окрашивания (ΜΕΙ).
Полученные данные демонстрируют. что НитАЬ антитела к СЭ70 связываются с клетками клеточных линий лимфомы.
Пример 6. Анализ хсаЮйагб сродства связывания моноклональных антител к СП70.
Сродство связывания моноклональных антител 2Н5. 8В5. 10В4 и 18Е7 тестировали на сродство связывания с клетками клеточной линии СНО. трансфецированными СЭ70. с применением анализа хсаЮйагб.
Клетки СНО трансфицировали полноразмерным СП70 с применением стандартных методик и выращивали в среде ΚΡΜΙ. содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ЕВ8). Клетки обрабатывали трипсином и промывали один раз в буфере для связывания на основе Тпх (24 мМ Тпх рН 7.2. 137 мМ №1С1. 2.7 мМ КС1. 2 мМ глюкозы. 1 мМ СаС12. 1 мМ МдС12. 0.1% В8А). концентрацию клеток доводили до 2х106 клеток/мл в буфере для связывания. Планшеты фирмы Мййроте (МАЕВ Ы0В) покрывали 1%
- 42 016186 раствором нежирного сухого молока в воде и хранили при 4°С в течение ночи. Планшеты промывали три раза с помощью 0,2 мл буфера для связывания. 50 мкл буфера индивидуально добавляли в ячейки максимального связывания (полное связывание). 25 мкл буфера индивидуально добавляли в контрольные ячейки (неспецифичное связывание). 1251-антитело к СЭ70 с различными концентрациями добавляли во все ячейки в объеме 25 мкл. Немеченое антитело со 100-кратным превышением добавляли с различными концентрациями в контрольные ячейки в объеме 25 мкл и добавляли во все ячейки 25 мкл клеток СНО в буфере для связывания, трансфецированных СЭ70 (2х106 клеток/мл). Планшеты инкубировали в течение 2 ч на шейкере при 200 об/мин при 4°С. По завершении инкубации планшеты фирмы М1Шроге промывали три раза с помощью 0,2 мл холодного буфера для промывания (24 мМ Тп5 ρΗ 7,2, 500 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 2 мМ глюкозы, 1 мМ СаС12, 1 мМ МдС12, 0,1 % В8А). Фильтры удаляли и считали на гаммасчетчике. Оценку равновесия связывания осуществляли с применением параметров для одного сайта связывания с помощью программы Ргып (8ап П1едо, СА).
В результате применения вышеописанного анализа 8са!сйагб связывания обнаружили, что Кс антитела для клеток СНО, трансфецированных 0Ό70, составило приблизительно 2,1 нМ для 2Н5, 5,1 нМ для 8В5, 1,6 нМ для 10В4 и 1,5 нМ для 18Е7.
Пример 7. Интернализация моноклонального антитела к 0.Ό70.
ΗитАЬ антитела к СЭ70 тестировали с применением анализа ^т^ар интернализации на способность интернализоваться клетками почечно-клеточной карциномы, экспрессирующими 0.Ό70. Анализ ^т^ар тестирует на интернализацию первичного человеческого антитела через связывание вторичного антитела со сродством как для человеческого 1дС, конъюгированного с токсином сапорин.
Клетки клеточной линии почечно-клеточной карциномы 786-О, экспрессирующие 0Ό70, высевали с плотностью 1,25х104 клеток/ячейку в ячейки объемом 100 мкл на ночь. Антитела к СЭ70, ΗитАЬ 2Н5, 8В5, 10В4 или 18Е7, добавляли в ячейки с начальной концентрацией 30 нМ, и последующие концентрации представляли собой последовательные разведения антитела 1:3. Контрольное антитело по изотипу, неспецифичное к СЭ70, применяли в качестве отрицательного контроля. ^т^ар (Абνаηсеб Тагдейпд 8у§!ет5, 8ап П1едо, СА, 1Т-22-25) добавляли в концентрации 11 нМ и планшетам давали возможность инкубироваться в течение 72 ч. Затем планшеты подвергали облучению с 1,0 мкКи 3Н-тимидина в течение 24 ч, клетки собирали и считали на сцинтилляционном счетчике верхнего счета (Раскагб [пЦгишепК Мепбеп, СТ). Результаты показаны на фиг. 18. Антитела к СЭ70, 2Н5, 8В5, 10В4 и 18Е7, показали зависимое от концентрации антитела уменьшение включения 3Н-тимидина в раковые клетки клеточной линии почечно-клеточной карциномы 786-О. Величина ЕС50 для антитела к СЭ70 2Н5 составила 0,9424 нМ. Полученные данные демонстрируют, что антитела к 0Ό70, 2Н5, 8В5, 10В4 и 18Е7, интернализуются раковыми клетками клеточной линии почечно-клеточной карциномы.
Пример 8. Определение убивания клеток с помощью антитела к 0Ό70, конъюгированного с токсином, на примере клеточных линий почечно-клеточной карциномы.
В настоящем примере антитела к 0Ό70, конъюгированные с токсином, тестировали с помощью анализа пролиферации клеток на способность убивать 0.Ό70+ клетки клеточных линий почечноклеточной карциномы.
ИнтЛЬ антитела к СЭ70, 2Н5, 8В5, 10В4 или 18Е7, конъюгировали с токсином через линкер, такой как пептидил, гидразон или дисульфидный линкер. Клетки клеточных линий почечно-клеточной карциномы АСΗN и Сак1-2, экспрессирующие СЭ70, высевали с плотностью 2,5х104 клеток/ячейку и высевали клетки клеточной линии почечно-клеточной карциномы 786-О, экспрессирующие 0Ό70, с плотностью 1,25х104 клеток/ячейку в ячейки объемом 100 мкл на 3 ч. Антитело к СЭ70, конъюгированное с токсином, добавляли в ячейки с начальной концентрацией 30 нМ, и последующие концентрации представляли собой последовательные разведения антитела 1:3. Контрольное антитело по изотипу, неспецифичное к СЭ70, применяли в качестве отрицательного контроля. Планшетам давали возможность инкубироваться в течение 69 ч. Затем планшеты подвергали облучению с 1,0 мкКи 3Н-тимидина в течение 24 ч, клетки собирали и считали на сцинтилляционном счетчике верхнего счета (Раскагб [пЦгишепК Мепбеп, СТ). Результаты показаны на фиг. 19А (Сак1-2), 19В (786-О) и 19С Антитела к СЭ70, 2Н5, 8В5, 10В4 и 18Е7, показали зависимое от концентрации антитело-токсин уменьшение включения 3Н-тимидина в клетки почечно-клеточной карциномы Сак1-2, 786-О и АСΗN, экспрессирующие 0.Ό70. Величины ЕС50 для антител к 0.Ό70 находились в пределах от 6,728 до 76,05 нМ у клеток САК1-2, от 1,635 до 3,940 нМ у клеток 786-О и от 9,406 до 108,5 нМ у клеток АСΗN. Полученные данные демонстрируют, что антитела к 0Ό70, 2Н5, 8В5, 10В4 и 18Е7, являются цитотоксичными для клеток почечно-клеточной карциномы, когда они конъюгированы с токсином.
Пример 9. Определение АЭСС активности антитела к 0.Ό70.
В настоящем примере моноклональные антитела к 0.Ό70 тестировали с помощью анализа цитотоксичности с применением флуоресценции на способность к убиванию 0.Ό70+ клеточных линий в присутствии эффекторных клеток посредством зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (АЭСС).
Человеческие эффекторные клетки получали из цельной крови, как следует далее. Мононуклеарные клетки человеческой периферической крови очищали из обработанной гепарином цельной крови с по
- 43 016186 мощью стандартного разделения с помощью Фиколл-пак. Клетки повторно суспендировали в среде ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% ЕВ8 и 200 Ед/мл 1Ь-2 человека, и инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующий день клетки собирали и промывали четыре раза в культуральной среде и повторно суспендировали до концентрации 2х107 клеток/мл. СЭ70+ клетки-мишени инкубировали с реагентом ВАТОА (Регкш Е1тег, ХУеНеМеу, ΜА) в 2,5 мкл ВАТОА на 1х106 клеток-мишеней/мл в течение 20 мин при 37°С. Клетки-мишени промывали четыре раза, осаждали центрифугированием и доводили до конечного объема 1х105 клеток/мл.
СЭ70+ клеточные линии АЯН-77 (лимфобластная лейкемия В-лимфоцитов человека; АТСС № доступа СЯЬ-1621), НиТ 78 (кожная лимфоцитарная лимфома человека; АТСС № доступа Т1В-161), Яа_ц (лимфома Беркитта В-лимфоцитов человека; АТСС № доступа ССЬ-86) и клеточную линию Ь540, которая представляла собой отрицательный контроль (ходжкинская лимфома человека; Ό8ΜΖ ^ерο8^ΐ № АСС 72) , тестировали на специфичную для антитела АЭСС к человеческим моноклональным антителам к СЬ70 с применением анализа флуоресцентной эмиссии Ое1Па, как следует далее. Каждую клеточную линию-мишень (100 мкл меченых клеток-мишеней) инкубировали с 50 мкл эффекторных клеток и 50 мкл антитела. Соотношение мишени к эффектору 1:50 применяли на протяжении всех экспериментов. Во всех исследованиях контроль по изотипу человеческий 1дС1 применяли в качестве отрицательного контроля. После осаждения кратким центрифугированием при 2000 об/мин и инкубировании в течение 1 ч при 37°С супернатанты собирали, снова быстро осаждали центрифугированием и 20 мкл супернатанта переносили на дно планшета, к которому добавляли 180 мкл раствора Ей (Регкш Е1тег, ХУеПеМеу, ΜА) и анализировали с помощью ридера ЯиЬу8!аг (ΒΜС ЬаЫесй). Процент лизиса рассчитывали, как следует далее: (высвобождение образца - спонтанное высвобождение х 100)/(максимальное высвобождение спонтанное высвобождение), где спонтанное высвобождение представляет собой флуоресценцию ячеек, которые содержат только клетки-мишени, и максимальное высвобождение представляет собой флуоресценцию ячеек, содержащих клетки-мишени и обработанных 2% Тритоном-Х. Клеточная цитотоксичность в виде процента лизиса для клеточных линий АЯН-77, НиТ 78, Яа_ц и Ь-540 показана на фиг. 20А20Ό соответственно. Каждая из СЭ70+ экспрессирующих клеточных линий АЯН-77, НиТ 78 и Яа_ц показала опосредованную антителом цитотоксичность с НитАЬ антителами к СЭ70 2Н5 и 18Е7, в то время как отрицательный контроль, клеточная линия Ь-540, не показал существенной цитотоксичности в присутствии антител к СЭ70. Полученные данные демонстрируют, что НитАЬ антитела к СЭ70 показывают специфичную для СЬ70+ экспрессирующих клеток цитотоксичность.
Пример 10. Определение убивания клеток с помощью антитела к СЭ70, конъюгированного с токсином, на примере клеточных линий лимфомы человека.
В настоящем примере моноклональные антитела к СЭ70, конъюгированные с токсином, тестировали с помощью анализа пролиферации клеток на способность к убиванию СЬ70+ клеточных линий лимфомы человека.
Антитело к СЭ70, НитАЬ 2Н5, конъюгировали с токсином через линкер, такой как пептидил, гидразон или дисульфидный линкер. Примеры токсиновых компонентов, которые могут быть конъюгированы с антителами по настоящему изобретению, описаны в одновременно поданной заявке А^теу ^οскеΐ № 04280/100Μ629ϋ83, поданной 26 сентября 2005 г. Опухолевые клеточные линии лимфомы человека ЬаиФг НиТ 78, Сгап!а 519 и Яа_ц, экспрессирующие СЭ70, высевали с плотностью 105 клеток/ячейку в ячейки объемом 100 мкл на 3 ч. Антитело к СЭ70, конъюгированное с токсином, добавляли в ячейки с начальной концентрацией 30 нМ, и последующие концентрации представляли собой последовательные разведения антитела 1:2. Антитело НитАЬ 2Н5, конъюгированное с токсином, также тестировали на клетках Фигка!, клеточной линии, которая являлась отрицательным контролем, поскольку не экспрессирует СЬ70 на своей клеточной поверхности. Планшетам давали возможность инкубироваться в течение 72 ч. Затем планшеты подвергали облучению с 0,5 мкКи 3Н-тимидина в течение 8 ч перед терминацией культуры, клетки собирали и анализировали на сцинтилляционном счетчике верхнего счета (РаскагФ 1пйгитепй). На фиг. 21 показано влияние 2Н5-конъюгата на клетки ПаиФ1, НиТ 78, Сгап!а 519 и Лика!. Антитело к СЭ70, 2Н5, показало зависимое от концентрации конъюгата антитело-токсин уменьшение включения 3Н-тимидина в опухолевые клетки В-клеточных лимфом ПаиФ1, НиТ 78 и СгапЧа 519, экспрессирующие СЭ70, но не в клетки Читка!.
В отдельном анализе клетки опухолевой клеточной линии лимфомы человека Яа_ц, экспрессирующие СЭ70, высевали с плотностью 104 клеток/ячейку в ячейки объемом 100 мкл на 3 ч. Конъюгат антитело к СЬ70 - токсин добавляли в ячейки с начальной концентрацией 30 нМ, и последующие концентрации представляли собой последовательные разведения антитела 1:3. Конъюгированное с токсином контрольное антитело по изотипу применяли в качестве контроля. Планшетам давали возможность инкубироваться в течение 72 ч с отмывкой в течение 3 ч или с продолжительной отмывкой. Затем планшеты подвергали облучению с 0,5 мкКи 3Н-тимидина в течение 8 ч перед терминацией культуры, клетки собирали и анализировали на сцинтилляционном счетчике верхнего счета (РаскагФ 1п8!гитеп!8). На фиг. 22 А и 22В показано зависимое от концентрации конъюгата антитело-токсин уменьшение включения 3Нтимидина в клетки Яа_ц после 3-часовой отмывки или после продолжительной отмывки соответственно.
- 44 016186
Полученные данные демонстрируют, что антитела к СЭ70, конъюгированные с токсином, показывают специфичную цитотоксичность к опухолевым клеткам лимфомы человека.
Пример 11. Лечение при ш у1уо модели ксенотрансплантата опухоли с применением свободных и конъюгированных с цитотоксином антител к ί.Ό70.
Мышей с имплантированной опухолью почечно-клеточной карциномы подвергали лечению ш у1уо с помощью антител к СЭ70, конъюгированных с токсином для определения ш у1уо влияния антител на опухолевый рост.
Клетки А-498 (АТСС № доступа НТВ-44) и АСНN (АТСС № доступа СКЬ-1611) выращивали ш νί!го с применением стандартных лабораторных процедур. Самцам голых мышей №г (Тасошс, Нибкоп, ΚΥ) возрастом 6-8 недель имплантировали подкожно в правый бок 7,5х106 клеток АСН^ или А-498 в объеме 0,2 мл РВ8/матригель (1:1) на мышь. Мышей взвешивали и измеряли на предмет опухолей в трех направлениях с применением электронного кронциркуля дважды в неделю после имплантации. Объемы опухоли рассчитывали как высотахширинахдлина. Мышей с опухолями АСНN средним размером 270 мм3 или с опухолями А-498 средним размером 110 мм3 разбили случайным образом на группы для лечения. Мышам вводили внутрибрюшинно конюгированное с токсином контрольное по изотипу антитело с РВ8 в качестве носителя или конъюгированное с токсином антитело к СЭ70, НитАЬ 2Н5, в день 0. Примеры токсиновых компонентов, которые могут быть конъюгированы с антителами по настоящему изобретению, описаны в одновременно поданной заявке с ссылкой № МЕЭХ-0034и84. Мышей в группе образцов А-498 тестировали с тремя различными токсиновыми компонентами. Мышей отслеживали на предмет опухолевого роста в течение 60 дней после введения. Мышей умерщвляли, когда размер опухоли достигал конечной точки (2000 мм3). Результаты показаны на фиг. 23А (опухоли А-498) 23В (опухоли АСНЩ. Антитело к СЭ70, 2Н5, конъюгированное с токсином, увеличивало время достижения конечной точки размера опухоли (2000 мм3) и замедляло прогрессию опухолевого роста. Таким образом, лечение с помощью конъюгата антитело к СЭ70 - токсин имеет непосредственный ш νί\Ό ингибирующий эффект на опухолевый рост.
Пример 12. Иммуногистохимия с 2Н5.
Способность антитела к СЭ70 НитАЬ 2Н5 распознавать СЭ70 с помощью иммуногистохимии определяли с применением клинических биопсий из клеток пациентов со светлоклеточной почечноклеточной карциномой (ссКСС), лимфомой и глиобластомой.
Для иммуногистохимии применяли замороженные секции размером 5 мкм (Агба1к 1пс, И8А). После сушки в течение 30 мин секции фиксировали с ацетоном (при комнатной температуре в течение 10 мин) и высушивали на воздухе в течение 5 мин. Стекла промывали РВ8 и затем пре-инкубировали с 10% нормальной козьей сывороткой в РВ8 в течение 20 мин и последовательно инкубировали с 10 мкг/мл конъюгированного с й!с антитела 2Н5 в РВ8 с 10% нормальной козьей сывороткой в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем стекла промывали три раза с РВ8 и инкубировали в течение 30 мин с мышиным МТС-антителом (10 мкг/мл ОАКО) при комнатной температуре. Стекла промывали снова с РВ8 и инкубировали с НКР конъюгатом козьих антител к мышиным антителам (ОАКО) в течение 30 мин при комнатной температуре. Стекла промывали снова 3х с РВ8. Диаминобензидин (8щта) применяли в качестве субстрата, получая в результате коричневое окрашивание. После промывания дистиллированной водой стекла контрастно окрашивали гематоксилином в течение 1 мин. Впоследствии стекла промывали в течение 10 с под проточной дистиллированной водой и помещали в глицергель (ОАКО). Иммуногистохимическое окрашивание препарата клинической биопсии продемонстрировало положительную реакцию при окрашивании в случае секций неходжкинской лимфомы, плазмацитомы, ссКСС и глиобластомы. В каждом случае была положительная реакция только в злокачественных клетках, соседние нормальные ткани не окрашивались.
Пример 13. Получение дефукозилированных НитАЬ.
Было продемонстрировано, что антитела с уменьшенным количеством фукозных остатков увеличивают АЭСС способность антитела. В этом примере было получено НитАЬ 2Н5, лишенное фукозных остатков.
Проводили электропорацию клеточной линии СНО Мк704-РЕ, которая лишена гена фукозилтрансферазы БИТ 8 (Вюта, 1пс., Рппсе!оп, N1), с вектором, который экспрессирует тяжелую и легкую цепи антитела 2Н5. Клоны, устойчивые к лекарственному средству, селектировали по росту в среде Ех-Се11 325-РЕ СНО (ДКН Вюкшепсек, Ьепеха, К8) с 6 мМ Ь-глутамина и 500 мкг/мл С418 (1№1!годеп, Саг1кЬаб, СА). Клоны скринировали на предмет экспрессии 1дС с помощью стандартного анализа ЕЫ8А. Получили два отдельных клона, В8А6 и В8С11, которые имели скорости продуцирования, находящиеся в пределах от 1,0 до 3,8 пг на клетку в день.
Пример 14. Определение АОСС активности дефукозилированного антитела к СЭ70.
В этом примере дефукозилированное и недефукозилированное моноклональное антитело к СЭ70 тестировали с помощью анализа цитотоксичности с применением флуоресценции на способность убивать СЭ70+ клетки в присутствии эффекторных клеток посредством зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (АОСС).
- 45 016186
Человеческое моноклональное антитело к СБ70, 2Н5, дефукозилировали, как описано выше. Эффекторные клетки человека получали из цельной крови, как следует далее. Мононуклеарные клетки человеческой периферической крови очищали из обработанной гепарином цельной крови с помощью стандартного разделения с помощью Фиколл-пак. Клетки повторно суспендировали в среде КРМГ 1640, содержащей 10% ГВ8 и 200 Ед/мл ΙΕ-2 человека, и инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующий день клетки собирали и промывали один раз в культуральной среде и повторно суспендировали при 2х107 клеток/мл. СБ70+ клетки-мишени инкубировали с реагентом ВАТБА (Регкш Е1тег, ХУеПезЕу, МА) в 2,5 мкл ВАТБА на 1х 106 клеток-мишеней/мл, добавляли в культуральной среде с 2,5 мМ пробенецида (экспериментальная среда) в течение 20 мин при 37°С. Клетки-мишени промывали четыре раза в РВ8 с 20 мМ НЕРЕ8 и 2,5 мМ пробенецида, осаждали и доводили до конечного объема 1 х 105 клеток/мл в экспериментальной среде.
СБ70+ клеточные линии АКН-77 (лимфобластная лейкемия В-лимфоцитов человека; АТСС № доступа СКЬ-1621), МЕС-1 (хроническая В-клеточная лейкемия человека; Б8М2 № доступа АСС 497), 8И-БНЬ-6 (В-клеточная лимфома человека, Б8М2 № доступа Асс572), ^-9 (лимфобластома В-клеток человека; АТСС № доступа ССЬ-159) и НиТ 78 (кожная лимфоцитарная лимфома человека; АТСС № доступа ТГВ-161), тестировали на АБСС, специфичную для дефукозилированного и недефукозилированного моноклонального антитела к СБ70, 2Н5, с применением анализа флуоресцентной эмиссии Бе1йа, как следует далее. Клетки клеточной линии-мишени АКН77 (100 мкл меченых клеток-мишеней) инкубировали с 50 мкл эффекторных клеток и 50 мкл или антитела 2Н5, или дефукозилированного антитела 2Н5. Соотношение мишени к эффектору 1:50 применяли на протяжении всех экспериментов. Во всех исследованиях контроль по изотипу, человеческий Ι§01, применяли в качестве отрицательного контроля. После осаждения кратким центрифугированием при 2100 об/мин и инкубировании в течение 1 ч при 37°С супернатанты собирали, снова быстро осаждали центрифугированием и 20 мкл супернатанта переносили на дно планшета, к которому добавляли 180 мкл раствора Ей (Регкш Е1тег, ^е11ез1еу, МА) и анализировали с помощью гибридного ридера планшетов АфБа ТКР (Регкш Е1тег). Значение процента лизиса рассчитывали, как следует далее: (высвобождение образца - спонтанное высвобождение х 100)/(максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение), где спонтанное высвобождение представляет собой флуоресценцию ячеек, которые содержат только клетки-мишени, и максимальное высвобождение представляет собой флуоресценцию ячеек, содержащих клетки-мишени и обработанных 3% лизолом. Клеточная цитотоксичность в виде процента лизиса для клеточной линии АКН-77 показана на фиг. 24. СБ70+ экспрессирующие клеточные линии АКН-77, МЕС-1, 8И-БНЕ-6, ^-9 и НиТ 78 показали опосредованную антителом цитотоксичность с антителом к СБ70, НитАЬ 2Н5, и увеличенный процент специфического лизиса, ассоциированного с дефукозилированной формой антитела к СБ70, 2Н5. Кроме того, было показано, что антитело к СБ16 блокирует АБСС эффект в клеточной линии МЕС-1. Полученные данные демонстрируют, что дефукозилированные НитАЬ антитела к СБ70 показывают увеличенную цитотоксичность, специфичную к СБ70+ экспрессирующим клеткам.
Пример 15. Определение АБСС активности антитела к СБ70 с применением анализа 51Сгвысвобождения.
В настоящем примере моноклональное антитело к СБ70 тестировали с помощью анализа 51Сгвысвобождения на способность убивать СБ70+ В-лимфоциты клеток Кар в присутствии эффекторных клеток посредством зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (АБСС).
Мононуклеарные клетки периферической крови человека (эффекторные клетки) очищали от обработанной гепарином цельной крови с помощью стандартного разделения Фиколл-пак. Клетки повторно суспендировали до 2х106 клеток/мл в среде КРМI 1640, содержащей 10% ГВ8 и 200 Ед/мл К-2 человека, и инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующий день клетки собирали и промывали один раз в культуральной среде и повторно суспендировали при 2х107 клеток/мл. Два миллиона клеток-мишеней Кар (лимфома Беркитта В-лимфоцитов человека; АТСС № доступа ССЬ-86) инкубировали с 200 мкКи 51Сг в общем объеме 1 мл в течение 1 ч при 37°С. Клетки-мишени промывали один раз, повторно суспендировали в 1 мл среды и инкубировали при 37°С в течение дополнительных 30 мин. После последней инкубации клетки-мишени промывали один раз и доводили до конечного объема 1х 105 клеток/мл. Для конечного АБСС анализа 100 мкл меченых клеток Кар инкубировали с 50 мкл эффекторных клеток и 50 мкл антитела. Соотношение мишени к эффектору 1:100 применяли на протяжении всех экспериментов. Во всех исследованиях контроль по изотипу, человеческий Ι§01, применяли в качестве отрицательного контроля. В некоторых исследованиях перед добавлением РВМС в планшет для анализа культуру РВМС разделяли на равные части по пробиркам, не содержащим или содержащим 20 мкг/мл человеческого антитела к СБ16, представляющего собой иррелевантное мышиное Ιβ01 антитело. После инкубации в течение 15 мин при 27°С клетки крови применяли, как описано выше, без промывания. После инкубации в течение 4 ч при 37°С супернатанты собирали и анализировали на счетчике СоЬга ΙΙ аи!одатта (Раскагб Iη8!^итеη!8) с показанием окна индикатора 240-400 кэВ. Показания счетчика в минуту представили как функцию концентрации антитела и данные анализировали с помощью нелинейной регрессии, сигмоидальной кривой дозовой зависимости (с изменчивым наклоном) с применением программ
- 46 016186
Рпкт (Бап О|едо. СА). Процент лизиса определяли с помощью следующего уравнения: % лизиса = (образец СРМ - образец СРМ без антитела)/ТритонХ СРМ - образец СРМ без антитела) х 100. Кривая титрования антитела для клеточной цитотоксичности. процент лизиса специфического для клеточной линии Вац показаны на фиг. 25. Полученные данные демонстрируют. что антитела к СЭ70 обладают АЭСС эффектом на клетки клеточной линии Вар. Величина ЕС50 для антитела к СЭ70 против клеток Вац составила 36.61 нМ. График цитотоксичности для клеток Вац в присутствии антитела к СЭ16 показан на фиг. 26. Полученные данные демонстрируют. что АЭСС эффект антител к СЭ70 на клетки Вац зависит от СШ6.
Пример 16. Определение АЭСС активности антитела к СЭ70 на активированные Т-клетки.
В настоящем примере дефукозилированное и недефукозилированное моноклональное антитело к ί.Ό70 тестировали с помощью анализа цитотоксичности с применением флуоресценции на способность убивать активированные Т-клетки в присутствии эффекторных клеток посредством зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (АЭСС).
Человеческое моноклональное антитело к ί.Ό70. 2Н5. дефукозилировали. как описано выше. Эффекторные клетки человека получали. как описано выше. Т-клетки селезенки человека селектировали по положительной реакции с магнитными шариками. покрытыми антителом к СЭ3 (чистота больше 90%). Клетки стимулировали с применением магнитных шариков. покрытых антителом к СЭ3 и антителом к ί.Ό28. и с помощью 25 нг/мл ΙΕ-2 в среде Iксονе плюс 10% инактивированной нагреванием РСБ в течение 6 дней. Клетки собирали и анализировали на выживаемость с помощью включения пропидиум йодида (60% выживших клеток) и живые клетки отбирали и анализировали на экспрессию ί.Ό70 (приблизительно 65% ί.Ό70+ на живых клетках) перед участием в АЭСС анализах.
Активированные Т-клетки тестировали на АЭСС. специфичную для дефукозилированного и недефукозилированного человеческого моноклонального антитела к СЭ70. 2Н5. с применением анализа флуоресцентной эмиссии Иейа. как следует далее.
Активированные Т-клетки-мишени (100 мкл меченых клеток-мишеней) инкубировали с 50 мкл эффекторных клеток и 50 мкл или антитела 2Н5. или дефукозилированного антитела 2Н5. Соотношение мишени к эффектору 1:50 применяли на протяжении всех экспериментов. Во всех исследованиях контроль по изотипу. человеческий Ι§^. применяли в качестве отрицательного контроля. После осаждения кратким центрифугированием при 2100 об/мин и инкубации в течение 1 ч при 37°С супернатанты собирали. снова быстро осаждали центрифугированием и 20 мкл супернатанта переносили на дно планшета. к которому добавляли 180 мкл раствора Ей (Регкт Е1тег. ^е11ек1еу. МА) и анализировали с помощью гибридного ридера планшетов А1р1а ТВР (Регкт Е1тег). Значение процента лизиса рассчитывали. как следует далее: (высвобождение образца - спонтанное высвобождение х 100)/(максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение). где спонтанное высвобождение представляет собой флуоресценцию ячеек. которые содержат только клетки-мишени. и максимальное высвобождение представляет собой флуоресценцию ячеек. содержащих клетки-мишени и обработанных 3% лизолом. Клеточная цитотоксичность в виде процента специфического лизиса для активированных Т-клеток показана на фиг. 27. Активированные Т-клетки показали опосредованную антителом цитотоксичность с антителом к ί.Ό70. нитАЬ 2н5. и увеличенный процент специфического лизиса. ассоциированного с дефукозилированной формой антитела к ί.Ό70. 2Н5. Опосредованную антителом цитотоксичность блокировали путем добавления антитела к СЭ16 в обоих случаях дефукозилированной и недефукозилированной форм антитела к СЭ70. Контрольный еС не имел цитотоксического эффекта. Полученные данные демонстрируют. что дефукозилированные нитАЬ антитела к СЭ70 показывают увеличенную цитотоксичность. специфичную для активированных Т-клеток.
Пример 17. Анализ блокирования связывания рецептор-лиганд ί.Ό70-ί.Ό27.
В настоящем примере моноклональные антитела к ί.Ό70 тестировали с применением анализа блокирования на их способность блокировать взаимодействие ί.Ό70 с лигандом СЭ27.
Ячейки обрабатывали в течение ночи антителом к ^С (Рс-кр.) по 100 мкл/ячейку с концентрацией 2 мкг/мл при 4°С. Ячейки блокировали 1% раствором ВБА/РВБ по 200 мкл/ячейку в течение 1 ч при комнатной температуре. В каждую ячейку добавляли по 100 мкл/ячейку СЭ27-Ес-Ык с концентрацией 0.16 мкг/мл в течение 1 ч при 37°С при перемешивании. Каждую ячейку промывали 5 раз раствором РВБ/Т\гееп 20 (0.05% (об./об.)) по 200 мкл/ячейку. Антитело к СЭ70 разводили в 10% ХИБ плюс 1% ВБА/РВБ и смешивали с СО70-тус-1нк с концентрацией 0.05 мкг/мл. инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и промывали 5 раз раствором РВБ/Т\гееп 20 (0.05% (об./об.)) по 200 мкл/ячейку. Известное антитело. которое блокирует взаимодействие ί.Ό70/ί.Ό27. применяли в качестве положительного контроля. а контрольное антитело по изотипу применяли в качестве отрицательного контроля. Смесь СЭ70 и антитела к СЭ70 блокировали с помощью антитела к Рс и добавляли 100 мкл/ячейку СИ70-тус-Ык плюс антитело в ячейки. содержащие СЭ27-Ес-Ык. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 37°С. К смеси добавляли по 100 мкл/ячейку антитела к тус-нВР (разведенного 1:1000 в 10% ИнБ плюс 1% ВБА/РВБ) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С с перемешиванием. Сигнал детектировали путем добавления 100 мкл ТМВ субстрата. инкубированного в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
- 47 016186 затем добавляли 75 мкл 0.25 М Н2804 и результаты анализировали при А 450 нМ. Результаты показаны на фиг. 28. Полученные данные демонстрируют. что некоторые антитела к СЬ70. включая 2Н5. 8В5 и 18Е7. блокируют связывание СЬ70 с СЭ27 в то время. как другие антитела не влияют на взаимодействие между СЭ70 и СО27.
Пример 18. Лечение ш у1уо модели ксенотрансплантата опухоли с применением свободных антител к СО70.
Мышей с имплантированной опухолью лимфомы подвергали лечению ш у1уо с помощью антител к СЬ70 для определения ш у1уо влияния антител на опухолевый рост.
Клетки АКН-77 (лимфобластная лейкемия В-клеток человека АТСС № доступа СКЬ-1621) и Кац (лимфома Беркитта В-лимфоцитов человека; АТСС № доступа ССЬ-86) выращивали ш νίΙΐΌ с применением стандартных лабораторных процедур. Самцам голых мышей №г (Тасошс. Нибкоп. ИУ) возрастом
6-8 недель имплантировали подкожно в правый бок 5х106 клеток АКН-77 или Кац в объеме 0.2 мл РВ8/матригель (1:1) на мышь. Мышей взвешивали и измеряли на предмет опухолей в трех направлениях с применением электронного кронциркуля дважды в неделю после имплантации. Объемы опухоли рассчитывали как высотахширинахдлина/2. Мышей с АКН-77 опухолями средним размером 80 мм3 или с опухолями Кац средним размером 170 мм3 разбивали случайным образом на группы для лечения. Мышам вводили внутрибрюшинно контрольное по изотипу антитело с РВ8 в качестве носителя или свободное антитело к СЬ70. НитАЬ 2Н5. в день 0. Мышей умерщвляли. когда размер опухоли достигал конечной точки (2000 мм3). Результаты показаны на фиг. 29А (опухоли Кац) и 29В (опухоли АКН-77). Свободное антитело к СЬ70. 2Н5. увеличивало время достижения конечной точки размера опухоли (2000 мм) и замедляло прогрессию опухолевого роста. Таким образом. лечение с помощью индивидуального антитела к СЬ70 имеет непосредственный ш у1уо ингибирующий эффект на опухолевый рост.
Пример 19. Лечение ш у1уо модели ксенотрансплантата опухоли с применением конъюгированных с цитотоксином антител к СЬ70.
Мышей с имплантированной опухолью лимфомы подвергали лечению ш у1уо с помощью конъюгированных с токсином антител к СЬ70 для определения ш у1уо влияния антител на опухолевый рост.
Клетки АКН-77 (лимфобластная лейкемия В-клеток человека; АТСС № доступа СКЬ-1621). Огап!а 519 (ΌδΙΗΖ № доступа 342) и Кац (лимфома Беркитта В-лимфоцитов человека; АТСС № доступа ССЬ86) выращивали ш νίΙΐΌ с применением стандартных лабораторных процедур. Самцам голых мышей Мег (Тасошс. Нибкоп. NΥ) возрастом 6-8 недель имплантировали подкожно в правый бок 5х106 клеток АКН-77. 10х106 клеток Сгап!а 519 или 5х106 клеток Кац в 0.2 мл раствора РВ8/матригель (1:1) на мышь. Мышей взвешивали и измеряли на предмет опухолей в трех направлениях с применением электронного кронциркуля дважды в неделю после имплантации. Объемы опухоли рассчитывали как высотахширинахдлина/2. Мышей с опухолями средним размером 80 мм3 (АКН-77). 220 мм3 (Сгап!а 519) или 170 мм3 (Кац) разбивали случайным образом на группы для лечения. Мышам вводили внутрибрюшинно конюгированное с токсином контрольное по изотипу антитело с РВ8 в качестве носителя или конъюгированное с токсином антитело к СЭ70. НитАЬ 2Н5. в день 0. Примеры токсиновых компонентов. которые могут быть конъюгированы с антителами по настоящему изобретению. описаны в И8 предварительной заявке с серийным № 60/720499. поданной 26 сентября 2005 г. Мышей умерщвляли. когда размер опухоли достигал конечной точки (2000 мм3). Результаты показаны на фиг. 30А (АКН-77). 30В (Сгап!а 519) и 30С (опухоли Кац). Конъюгированное с токсином антитело к СЭ70. 2Н5. увеличивало время достижения конечной точки размера опухоли (2000 мм3) и замедляло прогрессию опухолевого роста. Таким образом. лечение с помощью конъюгированного с токсином антитела к СЬ70 имеет непосредственный ш У1уо ингибирующий эффект на опухолевый рост.
Пример 20. Перекрестная реакционноспособность антитела к СЭ70 с клетками В-клеточной лимфомы макаки-резус.
Также применяли ЕАС8-анализ для определения способности антитела к СЭ70. 69А7. перекрестно взаимодействовать с СЬ70+ клетками клеточной линии В-клеточной лимфомы макаки резус. ЬСЬ8664 (АТСС#: СКЬ-1805). Связывание человеческого моноклонального антитела к СЭ70. НитАЬ 69А7. определяли путем инкубации 1х105 клеток с 69А7 с концентрацией 1 мкг/мл. Клетки промывали и связывание детектировали с помощью НТС-меченного АЬ к ЦС человека. Контрольное антитело по изотипу применяли в качестве отрицательного контроля. Анализы проточной цитометрии осуществляли с применением ЕАС8Са11Ьиг проточной цитометрии (Вес!оп О|скшкоп. 8ап 1оке. СА). Результаты показаны на фиг. 31. Результаты продемонстрировали. что антитело к СЬ70 69А7 перекрестно взаимодействует с СЬ70+ клетками В-клеточной лимфомы.
Пример 21. Интернализация антитела к СЬ70 при связывании с клетками почечно-клеточной карциномы 786-О.
Клеточную линию почечно-клеточной карциномы 786-0 применяли для тестирования интернализации антител к СЭ70. НитАЬ 69А7 и 2Н5. при связывании с клетками с применением иммунофлуоресцентного окрашивания. Клетки 786-0 (1х 104 клеток на 100 мкл на ячейку в 96-ячеечный планшет) собирали из культурального флакона путем обработки с 0.25% раствором Трипсин/ЭДТА. затем инкубирова
- 48 016186 ли с каждым из нитАЬ антител к СЭ70 с концентрацией 5 мкг/мл в буфере ЕАС8 (РВ8 плюс 5% ЕВ8, среда) в течение 30 мин на льду. Контроль по изотипу в виде Ι§01 человека применяли в качестве отрицательного контроля. После 2 промываний со средой клетки повторно суспендировали в среде (100 мкл на ячейку) и затем инкубировали с конъюгированным с РЕ вторичным козьим антителом к человеческому антителу (^асккοη IттиηοКекеа^сЬ ЬАЬ) с разведением 1:100 на льду в течение 30 мин. Клетки или немедленно анализировали на морфологию и интенсивность иммунофлуоресценции с помощью флуоресцентного микроскопа (N1^^) в момент времени 0 мин, или инкубировали при 37°С в течение различных периодов времени. Флуоресценцию наблюдали в клетках, окрашенных с нитАЬ антителами к СЭ70, но не в контрольном антителе. Подобные результаты также получали в анализах с антителами к СЭ70 непосредственно конъюгированными с ЕЧТС. Результаты показали появление флуоресценции на поверхности клеточной мембраны с обоими нитАЬ к СЭ70 в момент времени 0 мин. После инкубации в течение 30 мин интенсивность флуоресценции на мембране существенно уменьшилась, в то время как внутренняя флуоресценция увеличилась. В момент времени 120 мин флуоресценции на мембране не наблюдали, но вместо этого наблюдали присутствие флуоресценции во внутриклеточных компартментах. Данные демонстрируют, что нитАЬ антитела к СЭ70 могут специфически интернализоваться при связывании с опухолевыми клетками, эндогенно экспрессирующими СЭ70.
Пример 22. нитАЬ к СЭ70 блокирует связывание известного мышиного антитела к СЭ70.
В настоящем эксперименте нитАЬ антитело к СИ70, 69А7, тестировали на его способность блокировать связывание известного мышиного антитела к СЭ70 с СЭ70+ клетками почечно-клеточной карциномы 786-0. Клетки 786-0 инкубировали с мышиным антителом к ί.Ό70 ВИ-69 (Апсей Ваурой, МХ) с концентрацией 1 мкг/мл и с нитАЬ антителом 69А7 с концентрацией 1, 5 или 10 мкг/мл в течение 20 мин на льду. Ι§01 и ΙβΟ2 контрольные антитела по изотипу применяли в качестве отрицательных контролей. Клетки промывали дважды и связывание детектировали с помощью ЕЧТС-меченного АЬ к Ι§0 человека. Анализы проточной цитометрии осуществляли с применением ЕАС8Са11Ьиг проточной цитометрии (Всйоп ^^ск^икοи. 8ηη .Токе, СА). Результаты показаны на фиг. 32. нитАЬ к СИ70 69А7 блокирует связывание мышиного антитела к СИ70 зависимым от концентрации образом.
Пример 23. нитАЬ к СИ70 ингибирует воспалительный ответ.
В настоящем эксперименте нитАЬ антитело к СИ70, 2Н5, тестировали на способность к ингибированию воспалительных ответов. Клетки СИ0-8, стабильно трансфецированные с мышиным геном СИ32 (Сн0-8/тСИ32 клетки), временно трансфицировали конструкцией с полноразмерным геном СЭ70 (ί.Ή0-8/ιηί.Ό32/ί.Ό70 клетки). Поверхностную экспрессию подтверждали с помощью проточной цитометрии с применением 2А5 и РЕ-конъюгированного вторичного АЬ к Ι§0 человека (данные не показаны). С помощью набора для обогащения Т-клеток человека Кокейе8ер® (Са1# 15061; 81етСе11 Тес1то1ощек Вс) очищенные СИ3+ Т-клетки периферической крови человека стимулировали ίη уйго - 1х106 клеток/ячейку с 1х105 ί.Ή0-8/ιηί.Ό32 или ί.Ή0-8/ιηί.Ό32/ί.Ό70 клеток/ячейку, 1 мкг/мл антитела к НСЭ3 (клон ОКТ3; ВИ В^кае^е), проводили последовательные разведения или нитАЬ 2Н5, или нефукозилированного антитела 2Н5 (2Н5 ХЕ), наносили в трех экземплярах в ячейки 96-ячеечного планшета. Через три дня собирали аликвоты супернатантов и измеряли секрецию интерферона-гамма (ЮТ-у) с помощью набора для количественного анализа ЕЫ8А (ВИ Вюкс1ег1сек). Планшеты подвергали облучению с
I мкКи/мл 3Н-тимидина, инкубировали в течение 8 ч, клетки собирали и анализировали включение 3Нтимидина на счетчике ТгПи.х® 1450 М1сгоЬе1а (^а11ас, Ιηο.). Контрольное антитело в виде изотипа Ι§Ο1 применяли в качестве отрицательного контроля. Результаты показаны на фиг. 33. Обе формы антитела 2Н5 и 2Н5 ИЕ полностью ингибировали СИ70-костимулированную пролиферацию зависимым от дозы образом (фиг. 33 А). Данные также показывают, что ингибирование с помощью 2Н5 является специфичным для СИ70-костимуляции, тогда как 2Н5 не влияет на пролиферацию, опосредованную антителом к СИ3 плюс Сн0-8/тСЭ32. А также обе формы антитела 2Н5 и 2Н5 Ж полностью ингибируют СИ70костимулированную секрецию ЮТ-у зависимым от дозы образом (фиг. 33В). Данные также показывают, что 2Н5 ингибирование является специфичным для СИ70-костимуляции, тогда как 2Н5 не влияет на секрецию ШЕ-у, опосредованную антителом к СИ3 плюс ί.Ή0-8/ιηί.Ό32. Вместе полученные данные показывают, что 2Н5 и 2Н5 № функционально блокируют совместную с СИ70 стимуляцию Т-клеток человека.
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) человека с гаплотипом В*3501+ МНС класса Ι, предварительно скринированные на специфический для цитомегаловируса (СМУ) Т-клеточный ответ (Айайе, Шс), культивировали в присутствии В*3501-связывающего СМУ пептида РЗШУИИУ с концентрацией 25 нг/мл (Р^οIттиηе, 0хГогб, ИК) и последовательных разведений нитАЬ 2н5 в течение
II дней. Культуры анализировали с помощью проточной цитометрии на СИ8+ Т-клетки с помощью окрашивания с РЕ-конъюгированным антителом к СИ8 (клон КРА-Т8, ВИ В^аемек), на пептидоспецифичные СИ8+ Т-клетки с помощью окрашивания с пентамерным олигомером - АРС-меченным пептидом-МНС класса Ι (Е114-4В; Рю^ти^), и на выживаемость по отсутствию окрашивания пропидиум йодидом. Контрольное антитело по изотипу применяли в качестве отрицательного контроля. Результаты показаны на фиг. 34. 2Н5 частично ингибировало пептидоспецифичный рост СИ8+ Т-клеток, и 2Н5 ПЕ и
- 49 016186 положительный контроль в виде АЬ к МНС класса I (клон \У6/32; ΒΌ Вюкаепсе) полностью ингибировали пептидоспецифичный рост СЭ8+ Т-клеток (фиг. 34А). Не наблюдали существенного уменьшения общей клеточной выживаемости (фиг. 34В). Не наблюдали существенного уменьшения общего количества СЭ8+ клеток (фиг. 34С). Вместе данные показывают, что влияние 2Н5 и 2Н5 ИЕ было специфичным для стимулированных пептидом СЭ8+ Т-клеток. Данные являются репрезентативными одного дополнительного эксперимента, осуществленного с тем же донором.
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) человека с гаплотипом В*3501+ МНС класса I, предварительно скринированные на специфической для цитомегаловируса (СМУ) Т-клеточный ответ (А8(аг(е, 1пс), культивировали в присутствии В*3501-связывающего СМУ пептида IР8INVΗΗΥ (Рго1ттипе) с концентрацией 25 мкг/мл и в присутствии НитАЬ 2Н5 с концентрацией 20 мкг/мл, в присутствии или в отсутствие последовательных разведений функционального блокирующего АЬ антитела к СЭ16 (ЕсКуШ) (клон 308; ΒΌ Вюкшепсек) в течение 11 дней и затем анализировали с помощью проточной цитометрии на пептидоспецифичное количество ΟΌ8+ клеток, как описано выше. Результаты показаны на фиг. 35. Дозозависимая инверсия опосредованного антителами 2Н5 и 2Н5 ХЕ ингибирования пептидоспецифичного роста ΟΌ8+ Т-клеток с помощью антитела к ΟΌ16 показывает, что ингибирование антителами 2Н5 и 2Н5 № опосредовано через взаимодействие 2Н5 и 2Н5 № с ΟΌ16+ эффекторными клетками. Требовалось приблизительно в 1000 раз больше 308 для инверсии опосредованного 2Н5 № ингибирования по сравнению с 2Н5. Не наблюдали ингибирования пептидоспецифичного роста ΟΌ8+ Тклеток с помощью отрицательного контроля по изотипу независимо от концентрации 308 и наблюдали небольшой эффект или его отсутствие от 308 на ингибирование пептидоспецифичного роста 0Ό8+ Тклеток с помощью функционального блокирования положительного контроля \У6/32.
Пример 24. Лечение ш у1уо модели ксенотрансплантата опухоли почечно-клеточной карциномы с применением конъюгированных с цитотоксином антител к ΟΌ70.
Мышей с имплантированной опухолью почечно-клеточной карциномы подвергали лечению ш у1уо с помощью конъюгированных с токсином антител к ΟΌ70 для определения ш у1уо влияния антител на опухолевый рост.
Клетки 786-0 (АТСС № доступа СКЕ-1932) и Сак1-1 (АТСС № доступа НТВ-46) выращивали ш νίΙΐΌ с применением стандартных лабораторных процедур. Самцам мышей СВ17.8С1Э (Тасошс, Нибкоп, ΚΥ) возрастом 6-8 недель имплантировали подкожно в правый бок 2,5 млн клеток 786-0 или Сак1-1 в объеме 0,2 мл раствора РВ8/Матригель (1:1) на мышь. Мышей взвешивали и измеряли на предмет опухолей в трех направлениях с применением электронного кронциркуля дважды в неделю после имплантации. Размеры опухоли рассчитывали как высотахширинахдлина. Мышей с опухолями средним размером 200 мм3 разбивали случайным образом на группы для лечения. Мышам вводили внутрибрюшинно конъюгированное с токсином контрольное по изотипу антитело с РВ8 в качестве носителя или конъюгированное с токсином антитело к ΟΌ70, НитАЬ 2Н5, в день 0. Примеры токсиновых компонентов, которые могут быть конъюгированы с антителами по настоящему изобретению, описаны в И8 предварительной заявке с серийным № 60/720499, поданной 26 сентября 2005 г. Мышей умерщвляли, когда размер опухоли достигал конечной точки (2000 мм3). Результаты показаны на фиг. 36А (786-0) и 36В (Сак1-1). Конъюгированное с токсином антитело к ΟΌ70, 2Н5, увеличивало время достижения конечной точки размера опухоли (2000 мм3) и замедляло прогрессию опухолевого роста. Наблюдали изменение веса подвергнутых лечению животных на менее чем 10%. Таким образом, лечение с помощью конъюгированного с токсином антитела к ΟΌ70 имеет непосредственный ш у1уо ингибирующий эффект на опухолевый рост.
- 50 016186
8ЕОГО ΝΟ: ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 8Е(3 Ю ΝΟ: ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
1 νΗ ак. 2Η5 26 Ук СОВ1 ак. 2Н5
2 Унак. 10Β4 27 Ук СОВ1 ак. 10В4
3 Ун ак. 8В5 28 Ук СОВ1 ак. 8В5
4 Унак. 18Е7 29 Ук СОВ1 ак. 18Е7
5 Ун ак. 69А7 30 Ук СОВ1 ак. 69А7
6 Ук ак. 2Н5 31 Ук СОВ2 ак. 2Н5
Ί Ук ак. 10В4 32 Ук СОВ2 ак. 10В4
8 Ук ак. 8В5 33 Ук СОВ2 ак. 8В5
9 Ук ак. 18Е7 34 УкСОК2ак. 18Е7
10 Ук ак. 69А7 35 Ук СОВ2 ак. 69А7
11 Ун СОВ1 ак. 2Н5 36 Ук СОВЗ ак. 2Н5
12 Ун СОВ! ак. 10В4 37 Ук СОВЗ ак. 10В4
13 Ун СОВ1 ак. 8В5 38 Ук СОВ.З ак. 8В5
14 УнСОВ.1 ак. 18Е7 39 Ук СОВЗ ак. 18Е7
15 Ун СОВ.1 ак. 69А7 40 Ук СОВЗ ак. 69А7
16 Ун СОВ2 ак. 2Н5 41 Ун нт. 2Н5
17 Ун СОВ2 ак. 10В4 42 Ун нт. 10В4
18 Ун СОВ2 ак. 8В5 43 Ун нт. 8В5
19 Ун СОВ2 ак. 18Е7 44 Ун нт. 18Е7
20 Ун СОВ2 ак. 69А7 45 Ун нт. 69А7
21 Ун СОВЗ ак. 2Н5 46 Ук нт. 2Н5
22 Ун СОВЗ ак. 10В4 47 Укнт. 10В4
23 Ун СОВЗ ак. 8В5 48 Ук нт. 8В5
24 Ун СОВ.З ак. 18Е7 49 Ук нт. 18Е7
25 Ун СОВЗ ак. 69А7 50 Ук нт. 69А7
51 Ун 3-30.3 эмбриональная ак. 54 Ук Ь6 эмбриональная ак.
52 Ун 3-33 эмбриональная ак. 55 Ук Ь18 эмбриональная ак.
53 Ун 4-61 эмбриональная ак. 56 Ук Ы5 эмбриональная ак.

Claims (46)

1. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, которая включает последовательности СЭК1, С1)1К2 и СЭКЗ, и вариабельную область легкой цепи, которая включает последовательности СЭК1, С1)1К2 и СЭК3, где последовательность С1Ж3 вариабельной области тяжелой цепи содержит 8ЕР И) NО: 21, а последовательность С1)1К3 вариабельной области легкой цепи содержит 8ЕР И) NО: 36 и их консервативные модификации; где антитело специфично связывается с СО70.
2. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие:
a) СОК1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е(7 И) NО: 11;
b) С1)1К2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8ЕР И) NО: 16;
c) С1)1К3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е(7 И) NО: 21;
б) СОК1 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е(7 И) NО: 26;
е) С1)1К2 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е(7 И) NО: 31;
ί) С1)1К3 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е(7 И) NО: 36;
где антитело специфично связывается с С1)70.
3. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие:
a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е(7 П) ^: 1; и
b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е(7 П) ^: 6;
где антитело специфично связывается с С1)70.
4. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности 8Е(7 И) NО: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности 8Е(7 П) NО: 6, где антитело специфично связывается с СО70.
5. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.14, где антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, которая выведена из гена Ун 3-30.3 человека, и вариабельную область легкой цепи, которая выведена из гена УК Б6 человека, где антитело специфично связывается с СО70.
6. Антитело по любому из пп.1-5, которое представляет собой:
а) полноразмерное антитело изотипа Ι§Ο1, Ι§θ2, Ι§Ο3 или Ι§Ο4 или
- 72 016186
Ь) фрагмент антитела или одноцепочечное антитело.
7. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5, где указанное антитело связывается с СИ70 человека с Кс 1 х 10-7 М или менее, с Кс 5,5х10-9 М или менее, такой как Кс 3х10-9 М или менее или Кс 2х10-9 М или менее.
8. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5, где указанное антитело интернализовано.
9. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5, где указанное антитело связывается с клетками опухолевой клеточной линии почечно-клеточной карциномы.
10. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.9, где опухолевая клеточная линия почечно-клеточной карциномы выбрана из группы, состоящей из клеточных линий 786-0, А-498, АСН^ Сак11 и Сак1-2.
11. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5, где указанное антитело связывается с клетками опухолевой клеточной линии В-клеток.
12. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.11, где опухолевая клеточная линия Вклеток выбрана из группы, состоящей из клеточных линий Иаий1, НиТ 78, Нац и Сгап!а 519.
13. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5, где указанное антитело лишено остатков фукозы.
14. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, где последовательность СИЯ 2 вариабельной области тяжелой цепи содержит 8ЕЭ ΙΌ N0: 16 и ее консервативные модификации, а последовательность СИЯ2 вариабельной области легкой цепи содержит 8ЕЭ ΙΌ N0: 31 и ее консервативные модификации.
15. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.14, где последовательность СИЯ1 вариабельной области тяжелой цепи содержит 8ЕЭ ΙΌ N0: 11 и ее консервативные модификации, а последовательность СИЯ1 вариабельной области легкой цепи содержит 8ЕЭ ΙΌ N0: 26 и ее консервативные модификации.
16. Композиция, включающая антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5 и фармацевтически приемлемый носитель.
17. Иммуноконъюгат, включающий антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5, связанные с терапевтическим агентом.
18. Композиция, включающая иммуноконъюгат по п.17 и фармацевтически приемлемый носитель.
19. Иммуноконъюгат по п.17, где терапевтический агент представляет собой цитотоксин.
20. Композиция, включающая иммуноконъюгат по п.19 и фармацевтически приемлемый носитель.
21. Иммуноконъюгат по п.17, где терапевтический агент представляет собой радиоактивный изотоп.
22. Композиция, включающая иммуноконъюгат по п.21 и фармацевтически приемлемый носитель.
23. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5.
24. Экспрессирующий вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.23.
25. Клетка-хозяин, включающая экспрессирующий вектор по п.24.
26. Способ получения антитела к СИ70, который включает экспрессирование антитела в клеткехозяине по п.25 и выделение антитела из клетки-хозяина.
27. Способ лечения или предотвращения заболевания, характеризующегося ростом опухолевых клеток, экспрессирующих СИ70, включающий введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 в количестве, эффективном для лечения или предотвращения заболевания.
28. Способ по п.27, где заболевание представляет собой раковое заболевание.
29. Способ по п.28, где раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из почечно-клеточных карцином (ЯСС), светлоклеточной ЯСС, глиобластомы, неходжкинской лимфомы (№Η^), острой лимфоцитарной лейкемии (АЬЬ), хронической лимфоцитарной лейкемии (СЬЬ), лимфомы Беркитта, анапластических крупноклеточных лимфом (АЬСЬ), множественной миеломы, кожных Т-клеточных лимфом, фолликулярных мелкоклеточных лимфом с расщепленными ядрами, лимфоцитарных лимфом, периферических Т-клеточных лимфом, лимфом Леннерта, иммунобластных лимфом, Т-клеточной лейкемии/лимфомы (АТЬЯ), Т-клеточной лейкемии взрослых (Т-АЬЬ), энтеробластных/центроцитарных фолликулярных лимфом, диффузных крупноклеточных лимфом В-клеточной линии, Т-клеточной лимфомы типа ангиоиммунобластной лимфаденопатии, ассоциированных с ВИЧ полостных лимфом, эмбриональных карцином, недифференцированных карцином носоглотки, опухоли Шминке, болезни Кастлемана, саркомы Капоши, множественной миеломы, макроглобулинемии Вальденстрема и В-клеточных лимфом.
30. Способ по п.28, где раковое заболевание представляет собой почечно-клеточную карциному.
31. Способ по п.28, где раковое заболевание представляет собой лимфому.
32. Способ по п.28, где антитело лишено остатков фукозы.
33. Способ лечения аутоиммунного заболевания у субъекта, который нуждается в указанном лече
- 73 016186 нии, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5, посредством чего симптомы аутоиммунного заболевания улучшаются.
34. Способ по п.31, где аутоиммунное заболевание представляет собой туберкулезную волчанку.
35. Способ предотвращения аутоиммунного заболевания у субъекта с риском развития аутоиммунного заболевания, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5, посредством чего развитие симптомов аутоиммунного заболевания предотвращается или ослабляется.
36. Способ лечения воспаления у субъекта, который нуждается в указанном лечении, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5, посредством чего симптомы воспаления улучшаются.
37. Способ по п.36, где антитело лишено остатков фукозы.
38. Способ лечения вирусной инфекции у субъекта, который нуждается в указанном лечении, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5, посредством чего симптомы вирусной инфекции улучшаются.
39. Способ по п.38, где вирусная инфекция вызвана вирусами, выбранными из группы вирусов, состоящей из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), гепатита (А, В и С), герпес-вируса, аденовируса, вируса гриппа, флавивирусов, эховируса, риновируса, вируса коксаки, короновируса, респираторного синцитиального вируса, вируса свинки, ротавируса, вируса кори, вируса краснухи, парвовируса, вируса вакцинии, вируса НТЬУ, вируса тропической лихорадки, папилломавируса, вируса контагиозного моллюска, полиовируса, вируса бешенства, вируса 1С и вируса арбовирусного энцефалита, вируса лимфоцитарного хориоменингита (ЬСМУ).
40. Способ по п.39, где указанный герпес-вирус выбран из группы, состоящей из νζν, Н8У-1, НАУ-6, НЕА-П, СМV и вируса Эпштейна-Барр.
41. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 для ингибирования роста опухолевых клеток.
42. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 для получения лекарственного средства для ингибирования роста опухолевых клеток.
43. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 для улучшения симптомов аутоиммунного заболевания.
44. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 для получения лекарственного средства для улучшения симптомов аутоиммунного заболевания.
45. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 для улучшения симптомов вирусной инфекции.
46. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 для получения лекарственного средства для улучшения симптомов вирусной инфекции.
EA200800953A 2005-09-26 2006-09-26 Человеческие моноклональные антитела к cd70 и их применение EA016186B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72060005P 2005-09-26 2005-09-26
US72669505P 2005-10-13 2005-10-13
US74882705P 2005-12-08 2005-12-08
PCT/US2006/037753 WO2007038637A2 (en) 2005-09-26 2006-09-26 Human monoclonal antibodies to cd70

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200800953A1 EA200800953A1 (ru) 2009-02-27
EA016186B1 true EA016186B1 (ru) 2012-03-30

Family

ID=37900443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800953A EA016186B1 (ru) 2005-09-26 2006-09-26 Человеческие моноклональные антитела к cd70 и их применение

Country Status (13)

Country Link
US (1) US8124738B2 (ru)
EP (1) EP1934261B1 (ru)
JP (1) JP2009509510A (ru)
KR (1) KR20080056167A (ru)
AU (1) AU2006294663B2 (ru)
BR (1) BRPI0617549A2 (ru)
CA (1) CA2623236A1 (ru)
EA (1) EA016186B1 (ru)
ES (1) ES2527961T3 (ru)
IL (1) IL189788A0 (ru)
NO (1) NO20081987L (ru)
NZ (1) NZ566395A (ru)
WO (1) WO2007038637A2 (ru)

Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58103228A (ja) * 1981-12-16 1983-06-20 Kaga Tsushin Kogyo Kk 光スイツチ方法
US20090017023A1 (en) * 2002-08-14 2009-01-15 Macrogenics, Inc. FcGammaRIIB Specific Antibodies and Methods of Use Thereof
AU2004213053C1 (en) 2003-02-20 2009-07-16 Seagen Inc. Anti-CD70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
US20080025989A1 (en) 2003-02-20 2008-01-31 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
US7641903B2 (en) 2004-10-15 2010-01-05 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
US8337838B2 (en) 2004-10-15 2012-12-25 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
JP5222559B2 (ja) 2004-10-15 2013-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 癌および免疫障害の処置および予防のための抗ｃｄ７０抗体ならびにその使用
CA2605507C (en) 2005-04-19 2016-06-28 Seattle Genetics, Inc. Humanized anti-cd70 binding agents and uses thereof
AU2006294663B2 (en) 2005-09-26 2012-03-22 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to CD70
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
ES2397441T5 (es) 2006-02-13 2022-09-14 Daiichi Sankyo Co Ltd Secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas implicadas en el proceso de remodelación ósea
AU2007333098A1 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Medarex, Inc. Human antibodies that bind CD70 and uses thereof
EP2185188B1 (en) 2007-08-22 2014-08-06 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
EP2276509B1 (en) * 2008-04-11 2016-06-15 Seattle Genetics, Inc. Detection and tratment of pancreatic, ovarian and other cancers
PL2282773T3 (pl) 2008-05-02 2014-08-29 Seattle Genetics Inc Sposoby i kompozycje do wytwarzania przeciwciał i pochodnych przeciwciał o obniżonej fukozylacji rdzeniowej
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
BR112012002460A2 (pt) * 2009-08-04 2016-11-08 Hoffmann La Roche anticorpo marcador de célula beta
SG10201908987VA (en) 2009-12-25 2019-11-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for searching and screening for target of anti-cancer agent using non-human animal model having nog established cancer cell line transplanted therein
JP6230789B2 (ja) 2010-10-06 2017-11-15 中外製薬株式会社 癌幹細胞集団及びその作製方法
DK2686347T3 (en) * 2011-03-16 2018-06-25 Argenx Bvba Antibodies against CD70
KR102023496B1 (ko) 2011-04-21 2019-09-20 시애틀 지네틱스, 인크. 신규 결합제-약물 콘주게이트 (adc) 및 그의 용도
ES2744226T3 (es) 2011-05-08 2020-02-24 Legochem Biosciences Inc Conjugados de proteína-agente activo y método para preparar los mismos
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
WO2013035824A1 (ja) 2011-09-07 2013-03-14 ファーマロジカルズ・リサーチ プライベート リミテッド 癌幹細胞の分離
MY173865A (en) * 2011-09-22 2020-02-25 Amgen Inc Cd27l antigen binding proteins
KR102096224B1 (ko) 2011-10-28 2020-04-03 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 폴리펩티드 구축물 및 이의 용도
EP3603671A3 (en) 2011-10-28 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cancer stem cell-specific molecule
LT2814829T (lt) 2012-02-13 2017-02-27 Bristol-Myers Squibb Company En-diino junginiai, jų konjugatai ir jų panaudojimas bei jo būdai
AU2013277169B2 (en) 2012-06-19 2017-02-02 Ambrx, Inc. Anti-CD70 antibody drug conjugates
EP2875051B1 (en) 2012-07-19 2019-02-20 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-siglec-15 antibodies
SG11201506243XA (en) 2013-02-14 2015-09-29 Bristol Myers Squibb Co Tubulysin compounds, methods of making and use
DK3677591T5 (da) 2013-04-29 2024-08-26 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antistoffer og fusioner til svækket interferon alpha-2b
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
US10501802B2 (en) * 2013-04-30 2019-12-10 Universite De Montreal Biomarkers for acute myeloid leukemia
EA201690388A1 (ru) 2013-08-14 2016-07-29 Уильям Марш Райс Юниверсити Новые производные унциаламицина, способы их синтеза и их применение в качестве противоопухолевых агентов
AU2014317009A1 (en) 2013-09-05 2016-03-10 Aduro Biotech Holdings, Europe B.V. CD70-binding peptides and method, process and use relating thereto
US10022453B2 (en) 2013-12-23 2018-07-17 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates (ADCs) with kinesin spindel protein (KSP)
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
US10391168B1 (en) 2014-08-22 2019-08-27 University Of Bern Anti-CD70 combination therapy
EA037749B1 (ru) 2014-10-29 2021-05-18 Тева Фармасьютикалз Острэйлиа Пти Лтд ВАРИАНТЫ ИНТЕРФЕРОНА 2b
US10077287B2 (en) 2014-11-10 2018-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin analogs and methods of making and use
DK3221346T3 (da) 2014-11-21 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Antistoffer omfattende modificerede konstante områder af tungkæden
KR20170102980A (ko) 2015-01-14 2017-09-12 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 벤조디아제핀 이량체, 그의 접합체, 및 제조 및 사용 방법
JP6676058B2 (ja) 2015-01-14 2020-04-08 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ ヘテロアリーレン架橋したベンゾジアゼピン二量体、そのコンジュゲート、ならびに製造および使用方法
MX2017017172A (es) 2015-06-22 2018-02-23 Bayer Pharma AG Conjugados de ligador-principio activo (adcs) y conjugados de ligador-profarmaco (apdcs) con grupos enzimaticamente escindibles.
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
MX2018007479A (es) 2015-12-21 2018-08-01 Squibb Bristol Myers Co Anticuerpos variantes para conjugacion especifica de sitio.
US10869929B2 (en) 2016-01-29 2020-12-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Phosphonate linkers and their use to facilitate cellular retention of compounds
RU2018136778A (ru) 2016-03-24 2020-04-24 Байер Фарма Акциенгезельшафт Пролекарства цитотоксических лекарственных средств, содержащие ферментативно расщепляемые группы
CN109069665A (zh) 2016-05-10 2018-12-21 百时美施贵宝公司 具有增强的稳定性的微管溶素类似物的抗体-药物缀合物
EP3919518A1 (en) 2016-06-15 2021-12-08 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
US11618784B2 (en) 2016-07-19 2023-04-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Anti-CD47 combination therapy
CN109641911B (zh) 2016-08-19 2023-02-21 百时美施贵宝公司 seco-环丙吡咯并吲哚化合物和其抗体-药物缀合物以及制备和使用方法
US10398783B2 (en) 2016-10-20 2019-09-03 Bristol-Myers Squibb Company Antiproliferative compounds and conjugates made therefrom
CN110072556B (zh) 2016-12-21 2023-05-02 拜耳制药股份公司 具有ksp抑制剂的特异性抗体药物缀合物(adc)
CA3047491A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
BR112019012883A2 (pt) 2016-12-21 2019-11-26 Bayer Ag conjugados de ligante-fármaco (adcs) que têm grupos enzimaticamente cliváveis
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
IL270415B2 (en) 2017-05-12 2024-08-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for cell engineering and their uses in immuno-oncology
EP3630833A1 (en) 2017-05-25 2020-04-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
GB2567613A (en) * 2017-06-16 2019-04-24 Argenx Bvba Treatment for acute myeloid leukaemia
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
GB201800649D0 (en) 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy
WO2019149743A1 (en) 2018-01-30 2019-08-08 Cellectis Combination comprising allogeneic immune cells deficient for an antigen present on both t-cells and pathological cells and therapeutic antibody against said antigen
MX2020008184A (es) 2018-02-01 2020-09-22 Pfizer Receptores de antigeno quimericos dirigidos a cd70.
KR20200115596A (ko) * 2018-02-01 2020-10-07 화이자 인코포레이티드 Cd70에 특이적인 항체 및 이의 용도
WO2019209811A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (tlr7) agonists
CN112105420A (zh) 2018-05-11 2020-12-18 克里斯珀医疗股份公司 用于治疗癌症的方法和组合物
EA202092747A1 (ru) 2018-05-29 2021-03-16 Бристол-Маерс Сквибб Компани Модифицированные саморазрушающиеся фрагменты для применения в пролекарствах и конъюгатах и способы применения и изготовления
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
WO2020041540A1 (en) * 2018-08-23 2020-02-27 Vanderbilt University Human monoclonal antibodies to a new universal influenza a hemagglutinin head domain epitope
US20210355216A1 (en) 2018-10-05 2021-11-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and systems for controlling the agonistic properties of antibody variable domains by light
EP3887397A1 (en) 2018-11-28 2021-10-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
ES2943474T3 (es) 2018-11-30 2023-06-13 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpo que comprende una extensión carboxiterminal de una cadena ligera que contiene glutamina, conjugados del mismo, y métodos y usos
WO2020123425A2 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies modified for transglutaminase conjugation, conjugates thereof, and methods and uses
UY38511A (es) 2018-12-18 2020-07-31 Argenx Bvba Terapia de combinación cd70
WO2020154889A1 (zh) * 2019-01-29 2020-08-06 上海鑫湾生物科技有限公司 具有Fc突变体的抗体与效应细胞的组合、用途和制法
WO2020222176A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
CN110699327B (zh) * 2019-10-31 2021-04-13 浙江蓝盾药业有限公司 杂交瘤细胞株6f9、抗体及其应用
TW202138388A (zh) 2019-12-30 2021-10-16 美商西根公司 以非海藻糖苷化抗－ｃｄ７０抗體治療癌症之方法
JPWO2021177438A1 (ru) 2020-03-06 2021-09-10
US20230257472A1 (en) 2020-06-30 2023-08-17 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-cd70 antibody and application thereof
EP4243839A1 (en) 2020-11-13 2023-09-20 Catamaran Bio, Inc. Genetically modified natural killer cells and methods of use thereof
CN116490210A (zh) * 2020-11-23 2023-07-25 山东先声生物制药有限公司 Cd70抗体及其应用
US20220162288A1 (en) 2020-11-25 2022-05-26 Catamaran Bio, Inc. Cellular therapeutics engineered with signal modulators and methods of use thereof
CN114685657B (zh) * 2020-12-31 2024-08-16 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种功能增强型抗体阻断剂的开发及其应用
TW202241454A (zh) 2021-02-01 2022-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－免疫賦活化劑共軛物之新穎製造方法
WO2022191313A1 (ja) 2021-03-12 2022-09-15 第一三共株式会社 糖鎖及び糖鎖を含む医薬品の製造方法
TW202308699A (zh) * 2021-04-23 2023-03-01 美商普方生物製藥美國公司 Ｃｄ７０結合劑、其結合物及其使用方法
CN116120451A (zh) * 2021-06-17 2023-05-16 南京蓝盾生物科技有限公司 抗cd70内化的抗体、抗体偶联物及其应用
CN113754769B (zh) 2021-10-13 2023-06-06 宜明昂科生物医药技术（上海）股份有限公司 靶向cd70的抗体及其制备和用途
WO2023198851A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for controlling the tumor cell killing by light
WO2024040195A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
WO2024153016A1 (zh) * 2023-01-16 2024-07-25 上海华奥泰生物药业股份有限公司 靶向cd70的抗体或结合cd70的抗原结合片段及其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002043478A2 (en) * 2000-11-30 2002-06-06 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
WO2004073656A2 (en) * 2003-02-20 2004-09-02 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
WO2004104045A1 (en) * 2003-05-23 2004-12-02 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Therapeutical use of anti-cd70 antibody for treating or preventing aids
WO2005023993A2 (en) * 2003-09-09 2005-03-17 Integrigen, Inc. Methods and compositions for generation of germline human antibody genes
WO2006044643A2 (en) * 2004-10-15 2006-04-27 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5332837A (en) * 1986-12-19 1994-07-26 The Upjohn Company CC-1065 analogs
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5162504A (en) * 1988-06-03 1992-11-10 Cytogen Corporation Monoclonal antibodies to a new antigenic marker in epithelial prostatic cells and serum of prostatic cancer patients
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
EP0527189A1 (en) * 1990-04-25 1993-02-17 PHARMACIA &amp; UPJOHN COMPANY Novel cc-1065 analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE408012T1 (de) 1991-12-02 2008-09-15 Medical Res Council Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69231123T2 (de) * 1992-03-25 2001-02-15 Immunogen Inc Konjugaten von Zell-bindender Mittel und Derivaten von CC-1065
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5573924A (en) 1992-09-08 1996-11-12 Immunex Corporation CD27 ligand
US7105159B1 (en) * 1992-11-05 2006-09-12 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antibodies to prostate-specific membrane antigen
EP0668777B2 (en) * 1992-11-05 2011-02-09 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
US6214345B1 (en) * 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
EP0647450A1 (en) * 1993-09-09 1995-04-12 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Improved prodrugs for enzyme mediated activation
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU727608B2 (en) 1995-10-03 2000-12-14 Scripps Research Institute, The CBI analogs of CC-1065 and the duocarmycins
US6667156B2 (en) * 1995-12-27 2003-12-23 Uab Research Foundation Diagnosis and treatment of neuroectodermal tumors
US5905027A (en) * 1995-12-27 1999-05-18 Uab Research Foundation Method of diagnosing and treating gliomas
WO1997035616A1 (en) 1996-03-25 1997-10-02 Pacific Northwest Cancer Foundation Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate specific membrane antigen
US6107090A (en) 1996-05-06 2000-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains
US6136311A (en) * 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US5843937A (en) * 1996-05-23 1998-12-01 Panorama Research, Inc. DNA-binding indole derivatives, their prodrugs and immunoconjugates as anticancer agents
US6124345A (en) * 1996-05-31 2000-09-26 Basf Aktiengesellschaft Carbamoyl carboxylic acid amide oximes
US6130237A (en) * 1996-09-12 2000-10-10 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed N-aclyindoles as antitumor agents
JP2002503228A (ja) 1997-05-22 2002-01-29 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート デュオカルマイシンおよびｃｃ−１０６５の類似体
EP1185559A2 (en) * 1999-04-28 2002-03-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
DE60037896D1 (de) 1999-07-29 2008-03-13 Medarex Inc Menschliche antikörper gegen her2/neu
KR100942863B1 (ko) 1999-08-24 2010-02-17 메다렉스, 인코포레이티드 인간 씨티엘에이-4 항체 및 그의 용도
KR20020093029A (ko) * 2000-04-11 2002-12-12 제넨테크, 인크. 다가 항체 및 그의 용도
WO2002020715A2 (en) * 2000-09-05 2002-03-14 Biosight Ltd. Peptide conjugated anti-cancer prodrugs
EP1243276A1 (en) * 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
ATE416235T1 (de) * 2001-05-14 2008-12-15 Dow Corning Toray Co Ltd Wärmeleitende silikonzusammensetzung
US6989452B2 (en) 2001-05-31 2006-01-24 Medarex, Inc. Disulfide prodrugs and linkers and stabilizers useful therefor
EP1399215A4 (en) 2001-06-08 2004-12-22 Utah Ventures Ii L P TISSUE-SPECIFIC ENDOTHELM MEMBRANE PROTEINS
ATE504315T1 (de) 2001-06-11 2011-04-15 Medarex Inc Methode für die ausarbeitung von cd10-aktivierten prodrug-verbindungen
US6792365B2 (en) * 2001-08-10 2004-09-14 Micron Technology, Inc. Sequential unique marking
CA2459308A1 (en) * 2001-09-07 2003-03-20 Dale L. Boger Cbi analogues of cc-1065 and the duocarmycins
US7091186B2 (en) * 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003046581A2 (en) 2001-11-27 2003-06-05 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd Methods for diagnosis and treatment of epithelial-derived cancers,such as colorectal cancers and kidney cancers
US7261892B2 (en) * 2001-11-27 2007-08-28 Celltech R&D Limited Methods for diagnosis and treatment of epithelial-derived cancers
WO2003065873A2 (en) * 2002-02-01 2003-08-14 Seattle Genetics, Inc. Sga-1m, a cancer associated antigen, and uses thereof
US7605125B2 (en) * 2002-02-27 2009-10-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA-binding polyamide drug conjugates
US6534660B1 (en) * 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US6756397B2 (en) * 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
WO2003097635A1 (en) * 2002-05-17 2003-11-27 Auckland Uniservices Limited Processes for preparing 3-substituted 1-(chloromethyl)-1,2-dihydro-3h-[ring fused indol-5-yl(amine-derived)] compounds and analogues thereof, and to products obtained therefrom
KR20050059001A (ko) 2002-07-01 2005-06-17 사비언트 파마슈티컬즈 인코퍼레이티드 치료적 처리를 위한 조성물 및 방법
US20040202665A1 (en) * 2002-07-01 2004-10-14 Janette Lazarovits Compositions and methods for therapeutic treatment
HUE027549T2 (hu) * 2002-07-31 2016-10-28 Seattle Genetics Inc Hatóanyagot tartalmazó konjugátumok és alkalmazásuk rák, autoimmun betegség vagy fertõzéses betegség kezelésére
AU2003243151A1 (en) * 2002-08-16 2004-03-03 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 251p5g2 useful in treatment and detection of cancer
US20080025989A1 (en) * 2003-02-20 2008-01-31 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
WO2005012493A2 (en) * 2003-07-31 2005-02-10 Immunomedics, Inc. Anti-cd19 antibodies
US20050282168A1 (en) * 2003-09-29 2005-12-22 Wyeth Cell surface molecules as markers and therapeutic agents against kidney cancers
DK2489364T3 (en) * 2003-11-06 2015-03-02 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds conjugated to antibodies
PL1691837T3 (pl) 2003-12-10 2012-11-30 Squibb & Sons Llc IP-10 przeciwciała i ich zastosowanie
WO2005070457A1 (en) * 2004-01-23 2005-08-04 Seattle Genetics, Inc. Melphalan prodrugs
US7615211B2 (en) * 2004-02-09 2009-11-10 Cbr Institute For Biomedical Research, Inc. CD70 inhibition for the treatment and prevention of inflammatory bowel disease
US7691962B2 (en) * 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
US8147827B2 (en) * 2004-06-18 2012-04-03 Genentech, Inc. Tumor treatment
AU2005259487A1 (en) 2004-06-30 2006-01-12 Novartis Ag Conjugates of antibody and duoarmycin derivatives as antitumor agents
US7641903B2 (en) * 2004-10-15 2010-01-05 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
JP2008521828A (ja) 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
AU2006214121B9 (en) * 2005-02-15 2013-02-14 Duke University Anti-CD19 antibodies and uses in oncology
JP2008538365A (ja) * 2005-04-15 2008-10-23 イミュノジェン・インコーポレーテッド 腫瘍内の不均一または混合細胞集団を排除する方法
CA2605507C (en) 2005-04-19 2016-06-28 Seattle Genetics, Inc. Humanized anti-cd70 binding agents and uses thereof
US20060257317A1 (en) * 2005-05-04 2006-11-16 Duke University Combination therapy in the treatment of cancer
CA2607699A1 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Galaxy Biotech, Llc Methods of treating brain tumors with antibodies
US8008453B2 (en) * 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
US20080279868A1 (en) 2005-09-26 2008-11-13 Medarex, Inc. Antibody-Drug Conjugates and Methods of Use
AU2006294663B2 (en) 2005-09-26 2012-03-22 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to CD70
ES2375843T3 (es) 2005-10-26 2012-03-06 Medarex, Inc. Procedimientos y compuestos para la preparación de an�?logos de cc-1065.
JP5346589B2 (ja) 2006-02-02 2013-11-20 シンタルガ・ビーブイ 水溶性ｃｃ−１０６５類似体及びその接合体
WO2007144882A2 (en) 2006-06-14 2007-12-21 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Targeted chimeric proteins
AU2007333098A1 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Medarex, Inc. Human antibodies that bind CD70 and uses thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002043478A2 (en) * 2000-11-30 2002-06-06 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
WO2004073656A2 (en) * 2003-02-20 2004-09-02 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
WO2004104045A1 (en) * 2003-05-23 2004-12-02 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Therapeutical use of anti-cd70 antibody for treating or preventing aids
WO2005023993A2 (en) * 2003-09-09 2005-03-17 Integrigen, Inc. Methods and compositions for generation of germline human antibody genes
WO2006044643A2 (en) * 2004-10-15 2006-04-27 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"BD Biosciences Product Catalog Pharmingen", 2003, BD BIOSCIENCES, XP002440779, page 138 *
ADAM P.J. ET AL.: "CD70 (TNFSF7) is expressed at high prevalence in renal cell carcinomas and is rapidly internalised on antibody binding". BRITISH JOURNAL OF CANCER 7 AUG 2006, vol. 95, no. 3, 7 August 2006 (2006-08-07), pages 298-306, XP002440598, ISSN: 0007-0920, the whole document *
BALINT R.F. ET AL.: "ANTIBODY ENGINEERING BY PARSIMONIOUS MUTAGENESIS", GENE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 137, no. 1, 27 December 1993 (1993-12-27), pages 109-118, XP002031537, ISSN: 0378-1119, page 110, right-hand column, paragraph 2 *
GARC?ìA PILAR ET AL.: "Signalling via CD70, a member of the TNF family, regulates T cell functions". JOURNAL OF LEUKOCYTE BIOLOGY JUL 2004, vol. 76, no. 1, July 2004 (2004-07), pages 263-270, XP002440597, ISSN: 0741-5400, abstract, page 264, left-hand column, paragraph 1 *
HINTZEN R.Q. ET AL.: "CHARACTERIZATION OF THE HUMAN CD27 LIGAND, A NOVEL MEMBER OF THE TNF GENE FAMILY", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, THE WILLIAMS AND WILKINS CO. BALTIMORE, US, vol. 152, no. 4, 1994, pages 1762-1773, XP009017718, ISSN: 0022-1767, abstract, page 1763, right-hand column, paragraph 5 - paragraph 6 *
SHIELDS R.L. ET AL.: "Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human FcgammaRIII and antibody-dependent cellular toxicity". JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOCHEMICAL BIOLOGISTS, BIRMINGHAM, US, vol. 277, no. 30, 26 July 2002 (2002-07-26), pages 26733-26740, XP002964542, ISSN: 0021-9258, abstract *
YANG F.S. ET AL.: "CD27/CD70 INTERACTION DIRECTLY INDUCES NATURAL KILLER CELL KILLING ACTIVITY", IMMUNOLOGY, BLACKWELL PUBLISHING, OXFORD, GB, vol. 88, no. 2, 1996, pages 289-293, XP000886773, ISSN: 0019-2805, abstract, page 289, right-hand column, paragraph 3 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1934261A2 (en) 2008-06-25
IL189788A0 (en) 2008-08-07
EA200800953A1 (ru) 2009-02-27
ES2527961T3 (es) 2015-02-02
JP2009509510A (ja) 2009-03-12
KR20080056167A (ko) 2008-06-20
NZ566395A (en) 2012-03-30
US8124738B2 (en) 2012-02-28
EP1934261B1 (en) 2014-10-29
NO20081987L (no) 2008-06-25
CA2623236A1 (en) 2007-04-05
AU2006294663B2 (en) 2012-03-22
US20090028872A1 (en) 2009-01-29
AU2006294663A1 (en) 2007-04-05
WO2007038637A3 (en) 2007-10-04
BRPI0617549A2 (pt) 2011-07-26
WO2007038637A2 (en) 2007-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA016186B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела к cd70 и их применение
ES2562790T3 (es) Anticuerpos monoclonales contra Glipicano-3
ES2625798T3 (es) Anticuerpos humanos que se unen a CXCR4 y usos de los mismos
ES2390476T3 (es) Anticuerpos monoclonales frente a fucosil-GM1 y procedimientos de uso de anti-fucosil-GM1
ES2399050T3 (es) Anticuerpos contra interferón alfa y sus usos
ES2406063T3 (es) Anticuerpos monoclonales humanos contra la proteína Tirosina Quinasa 7(PTK7) y su uso
KR101960004B1 (ko) Cldn6 생체내 표적-지향된 항체를 이용하는 암 치료법
ES2396220T3 (es) Anticuerpos monoclonales frente al factor 1 derivado del estroma (SDF-1)
PT1851250E (pt) Anticorpo monoclonal humano para o antigénio membranar específico da próstata (psma)
EA017086B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против о8е и их применение
PT1907424E (pt) Anticorpos monoclonais humanos para o ligando 1 de morte programada (pd-l1)
BRPI1009232B1 (pt) Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, ou um fragmento de anticorpo, composição que os compreende, molécula de ácido nucleico, hibridoma e métodos para a preparação de um anticorpo anti-cadm1
JP2008526260A (ja) Ｉｒｔａ−２抗体およびその使用法
CN105745224B (zh) 用于治疗癌症的针对ly75的偶联抗体
US9428586B2 (en) Heparanase splice variant
EP2616100B1 (en) Compositions and methods for treatment of drug resistant multiple myeloma
US20080253962A1 (en) Irta-4 Antibodies and Their Uses
ES2606762T3 (es) Anticuerpos contra CD38 para el tratamiento del mieloma múltiple
AU2019204903A1 (en) Human monoclonal antibodies against CD20
AU2013257387A1 (en) Monoclonal antibodies against glypican-3

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU