BRPI0617549A2

BRPI0617549A2 - anticorpo monoclonal humano isolado, anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porÇço ligante ao antÍgeno do mesmo, composiÇço, imunoconjugado, molÉcula de Ácido nuclÉico isolada, vetor de expressço, cÉlula hospedeira, mÉtodo para preparar um anticorpo anti-cd70, mÉtodo para tratar ou prevenir uma doenÇa, mÉtodo para tratar uma doenÇa autoimune em um indivÍduo, mÉtodo para tratar uma inflamaÇço em um indivÍduo, mÉtodo para tratar uma infecÇço viral em um indivÍduo, anticorpo ou porÇço ligante ao antÍgeno do mesmo e uso de um anticorpo ou de uma porÇço ligante ao antÍgeno do mesmo

Info

Publication number: BRPI0617549A2
Application number: BRPI0617549-0A
Authority: BR
Inventors: Jonathan Alexander Terrett; David John King; Josephine M Cardarelli; Chin Pan; Haichun Huang; Marco A Coccia; Li-Sheng Lu
Original assignee: Medarex Inc
Priority date: 2005-09-26
Filing date: 2006-09-26
Publication date: 2011-07-26
Also published as: EP1934261A2; NO20081987L; EA200800953A1; IL189788A0; EA016186B1; WO2007038637A3; AU2006294663B2; US20090028872A1; JP2009509510A; CA2623236A1; ES2527961T3; EP1934261B1; KR20080056167A; WO2007038637A2; NZ566395A; AU2006294663A1; US8124738B2

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO, ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO OU UMA PORÇçO LIGANTE AO ANTIGENO DO MESMO, COMPOSIÇçO, IMUMOCONJUGADO, MOLÉCULA DE AGIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSçO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-CD7O,MÉTODO PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DOENÇA, MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA AUTOIMUNE EM UM INDIVIDUO, MÉTODO PARA TRATAR UMA INFLAMAÇçO EM UM INDIVIDUO, MÉTODO PARA TRATAR UMA INFECÇçO VIRAL EM UM INDIVIDUO, ANTICORPO OU PORÇçO LIGANTE AO ANTIGENO DO MESMO E USO DE UM ANTICORPO OU DE UMA PORÇçO LIGANTE AO ANTIGENO DO MESMO. A presente descrição provê anticorpos monoclonais isolados, particularmente, anticorpos monoclonaishumanos, que se ligam especificamente ao CD7O com alta afinidade. Moléculas de ácido nucléico que codificam os anticorpos da presente descrição, vetores de expressão, células hospedeiras e métodos para expressar os anticorpos da presente descrição são também providos. Imunoconjugados, moléculas biespecíficas e composições farmacêuticas, compreendendo os anticorpos da invenção também são providos. A descrição também provê métodos para tratar câncer, doenças autoimunes, inflamação e infecções virais.

Description

"ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO, ANTICORPOMONOCLONAL HUMANO ISOLADO OU UMA PORÇÃO LIGANTE AOANTÍGENO DO MESMO, COMPOSIÇÃO, IMUNOCONJUGADO, MOLÉCULADE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULAHOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-CD7 0,MÉTODO PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DOENÇA, MÉTODO PARATRATAR UMA DOENÇA AUTOIMUNE EM UM INDIVÍDUO, MÉTODO PARATRATAR UMA INFLAMAÇÃO EM UM INDIVÍDUO, MÉTODO PARA TRATARUMA INFECÇÃO VIRAL EM UM INDIVÍDUO, ANTICORPO OU PORÇÃOLIGANTE AO ANTÍGENO DO MESMO E USO DE UM ANTICORPO OU DEUMA PORÇÃO LIGANTE AO ANTÍGENO DO MESMO".

Histórico da invenção

O receptor de citocina CD2 7 é um membro da superfamília(TFNR) do receptor do fator de necrose tumoral, que oqual participa de uma regra no crescimento e nadiferenciação celular, bem como apoptose ou morte celularprogramada. O ligante para CD2 7 é CD70, o qual pertence àfamília do fator de necrose tumoral dos ligantes. 0 CD70é um polipeptídeo de aminoácidos 193 tendo um domínio N-terminal de 20 aminoácidos e um domínio C-terminalcontendo 2 sítios de glicosilação N-Iigadospotencialmente (goodwin, R.G., et al. , (1993) nCell"73^:447-56; Bowman et al . , (1994) nImmunol" , 152 :1756-61).Baseado nestas características, CD70 foi determinado porser um tipo II de proteína de transmembrana tendo umaporção C-terminal extracelular.

CD70 é descoberto por ser transitoriamente na ativação,mas não cessar os linfócitos T e B e as célulasdendríticas (Hintzen et al. , (1994), "J. Immunol." 152:1762-1773; Oshima et al . , (1998) nInt. Immunol." 10:517-26; Tesselaar et al. , (2003), "J". Immunol." 170:33-40) .Em adição à expressão normal das células, a expressão deCD70 foi relatada em diferentes tipos de cânceresincluindo carcinoma de células renais, câncer metásticode seio, tumor cerebral, leucemias, Iinfomas e carcinomasnasofaringeais (Junker, et al. , (2005), J. Urol.173:2150-3 ; Sloan eta 1., (2004), Am J Pathol. 164:315-23; Held-Feindt e Mentlein (2002) Int. J. Câncer 98:352-6; Hishima et al. (2000) Am J. Surg. Pathol. 24:742-6;Lens et al. (1999) Br J. Haematol. 106:941-503).

Adicionalmente, descobriu-se que CD70 pode sersuperexpresso em células T tratadas com inibidores demetiltransferase de DNA ou inibidores da rota ERK,conduzindo, possivelmente, ao lupus idiopático e induzidopor fármacos (Oelke et al. (2004) Arthritis Rheum.J50:1850-60). A interação de CD70 com CD27 também tem sidoproposta por participar de uma regra em doençasautoimunes mediadas por células e a inibição da produçãode alfa-TNF (Nakajima et la. (2000) J. Neuroimmunol.109 :188-96).

Conseqüentemente, CD70 representa um alvo valoroso para otratamento do câncer, distúrbios autominues e umavariedade de outras doenças caracterizadas pela expressãode CD70.

Sumário da invenção

A presente invenção provê anticorpos monoclonaisisolados, em particular anticorpos monoclonais humanosque se ligam ao CD70 e que exibem numerosas propriedadesdesejáveis. Essas propriedades incluem ligação de altaafinidade ao CD70 humano. Também são providos métodospara tratar uma variedade de doenças mediadas por CD70usando os anticorpos e as composições da descriçãoimediata.

Em um aspecto, esta invenção refere-se a um anticorpomonoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno domesmo, sendo que o anticorpo (a) liga-se ao CD70 humanocom um Kd de IxlO-7M ou menos; e (b) liga-se a linha decélula do tumor de carcinoma de células renais.

Preferivelmente, o anticorpo liga-se à linha de célula dotumor de carcinoma de células renais selecionados dogrupo consistindo de 786-0 (ATTC - acesso No.: CRL-1932),A-4 98 (ATTC - acesso No.: HTB-44), ACHN (ATTC - acessoNo.: CRL-1511), Caki-I (ATTC - acesso No.: HTB-44) eCaki-2 (ATTC - acesso No.: HTB-47).Preferivelmente, ο anticorpo é um anticorpo humano,embora em concretizações alternativas o anticorpo possaser, por exemplo, um anticorpo murino, um anticorpoquimérico ou um anticorpo humanizado.

Em uma configuração mais preferida, o anticorpo liga-seao CD70 humano com um Kd de 5,5 χ IO-9M ou menos ou liga-se ao CD70 humano com um K0 de 3 χ ICT9M ou menos ou liga-se ao CD70 humano com um Kd de 2 χ ICT9M ou menos ou liga-se ao CD70 humano com um Kd de 1,5 χ IO-9M ou menos. Em uma outra concretização, o anticorpo é internalizadopor meio das células do tumor de carcinoma de célulasrenais 786-0 após a ligação ao CD70 expresso naquelascélulas.

Em ainda uma outra concretização, o anticorpo liga-se às linhas de célula de tumor de célula B. Preferivelmente, alinha de célula de tumor de célula B são slecionadas dogrupo consistindo de Daudi (ATTC - acesso No.: CCL-213),HuT 78 (ATTC - acesso No.: TIB-1612), Raji (ATTC - acessoNo.: CCL-86) e Granta-519 (DSMZ - acesso No.:342). Ainda em uma outra concretização, esta descrição provê umanticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante aoantígeno do mesmo, de modo que o anticorpo faz competiçãocruzada para ligar-se ao CD70 com um anticorpo dereferência compreendendo, de modo que o anticorpo de referência: (a) liga-se ap CD70 com um Kd de 1 χ IO-7M oumenos; e (b) liga-se às linhas de células tumorais docarcinoma de células renais.

Em diversas concretizações, o anticorpo de referênciacompreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidoss de SEQ ID NO:1; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidoss de SEQ ID NO:6;ou o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidoss de SEQ ID NO:2; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidoss de SEQ ID NO:7;ou o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidoss de SEQ ID NO:3; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidoss de SEQ ID NO: 8;ou o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidoss de SEQ ID NO:4; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:9;ou o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidoss de SEQ ID NO:5; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidoss de SEQ ID NO:10.

Em um aspecto, esta invenção refere-se a um anticorpomonoclonal isolado ou a uma porção ligante ao antígeno domesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada

que é o produto ou derivada de um gene Vh 3-30,3 humano,sendo que o anticorpo liga-se especif icamente ao CD70.Esta descrição também provê um anticorpo monoclonalisolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo,compreendendo uma região variável de cadeia pesada que éo produto de ou derivada de um gene Vh 3-33 humano, sendoque o anticorpo liga-se especificamente ao CD70. Estadescrição provê ainda um anticorpo monoclonal isolado ouuma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendouma região variável de cadeia pesada que é o produto deou derivada de um gene Vh 4-61 humano, sendo que oanticorpo liga-se especificamente ao CD70. Esta descriçãoprovê ainda um anticorpo monoclonal isolado ou uma porçãoligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma regiãovariável de cadeia leve que é o produto de ou derivada deum gene Vk L6 humano, sendo que o anticorpo liga-seespecificamente ao CD70. Esta descrição provê ainda umanticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante aoantígeno do mesmo, compreendendo uma região variável decadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene VkL18 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamenteao CD70. Esta descrição provê ainda um anticorpomonoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno domesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leveque é o produto de ou derivada de um gene Vk Ll5 humano,sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao CD70.

Uma combinação preferida compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID MO: 11;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO:16;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 21;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:26;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:31; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:36.

Uma outra combinação preferida compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 12;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO:17;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 22;

(d) uma CDR1 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO-.27;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:32; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:37.

Uma outra combinação preferida compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 13;(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO:18;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 23;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:28;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:33; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:38.

Uma outra combinação preferida compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 14;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:19;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 24;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:29;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:34; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:39.

Uma outra combinação preferida compreende:(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 15;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO:20;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 25;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:30;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:35; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:40.

Outros anticorpos preferidos da descrição ou porções deligação ao antígeno do mesmo compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendouma seqüência de aminoácidoss da SEQ ID NO:1; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo umaseqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

Uma outra combinação preferida compreende:

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:7.

Uma outra combinação preferida compreende:

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidoss de SEQ ID NO:8.

Uma outra combinação preferida compreende:

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidoss de SEQ ID NO:9.

Uma outra combinação preferida compreende:

Os anticorpos da descrição podem ser, por exemplo,anticorpos de extensão completa, por exemplo, de umisótopo IgGl ou IgG4. Alternativamente, os anticorpospodem ser fragmentos de anticorpos, tais como fragmentosFab ou Fab'2 ou anticorpos de cadeia simples.

A descrição também provê um imunoconjugado compreendendoum anticorpo da descrição ou uma porção ligante aoantígeno do mesmo, ligada a um agente terapêutico, taiscomo uma citotoxina ou um isótopo radioativo. A descriçãotambém provê uma molécula biespecífica compreendendo umanticorpo ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, dadescrição, ligada a uma segunda porção funcional tendouma especificidade de ligação diferente àquela do citadoanticorpo ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo.

As composições compreendendo um anticorpo ou uma porçãoligante ao antígeno do mesmo, ou imunoconjugado oumolécula biespecíifica da descrição e um veículofarmaceuticamente aceitável são também provida.

As moléculas de ácido nucléico codificando os anticorposou porções ligantes ao antígeno dos mesmos, da invenção,são também abrangidas pela invenção, bem como os vetoresde expressão compreendendo tais ácidos nucleicos ecélulas hospedeiras compreendendo tais vetores deexpressão e métodos para fazer os anticorpos anti-CD70usando as referidas células hospedeiras. Além disso, ainvenção provê um camundongo transgênico compreendendotransgenes de cadeia leve e pesada de imunoglobulinahumana, sendo que o camundongo expressa um anticorpo dainvenção, bem como hibridomas preparados do referidocamundongo, sendo que o hibridoma produz o anticorpo dainvenção.

Em ainda um outro aspecto, a invenção provê um métodopara tratar ou prevenir uma doença caracterizada pelocrescimento de células de tumor expressando CD70,compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo anti-CD70 da presente invenção em uma quantidade eficaz paratratar ou prevenir a doença. A doença pode ser um câncer,por exemplo, câncer carcinoma de célula renal ou linfoma.Ainda em um outro aspecto, a invenção provê um métodopara tratar um distúrbio autoimune, compreendendo aadministração a um indivíduo de um anticorpo anti-CD70humano da presente invenção em uma quantidade eficaz paratratar o distúrbio autoimune.

Outras características e vantagens da presente invençãoserão evidentes a partir da descrição e exemplosdetalhados a seguir que não devem ser interpretados comorestritivos. Os conteúdos de todas as referências,registros no Genbank, patentes e pedidos de patentespublicados citados em toda a descrição são expressamenteincorporados por referência nesta patente.Breve descrição dos desenhos

A Figura IA mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 41) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO :1) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonalhumano 2h5. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID N0:11),CDR2 (SEQ ID NO: 16) e CDR3 (SEQ ID NO:21) e indicadas asderivações de linha germinal V e D;

A Figura IB mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 46) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) daregião variável de cadeia leve do anticorpo monoclonalhumano 2H5. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID NO:26),CDR2 (SEQ ID NO: 31) e CDR3 (SEQ ID NO: 36) e indicadas asderivações de linha germinal V e J; A Figura 2A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO:42) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:2) daregião variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonalhumano 10B4. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 12) , CDR2 (SEQ ID N0:17) e CDR3 (SEQ ID NO:22) eindicadas as derivações de linha germinal V, D e J;

A Figura 2B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO:47) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:7) daregião variável de cadeia leve do anticorpo monoclonalhumano 10B4. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID NO: 2 7) , CDR2 (SEQ ID NO:32) e CDR3 (SEQ ID NO:37) eindicadas as derivações de linha germinal V e J;A Figura 3A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 43) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) daregião variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonalhumano 8B5. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID N0:13),CDR2 (SEQ ID NO: 18) e CDR3 (SEQ ID NO: 23) e indicadas asderivações de linha germinal V, D e J;

A Figura 3B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 48) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonalhumano 8B5. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID NO:28),CDR2 (SEQ ID NO: 33) e CDR3 (SEQ ID NO: 38) e indicadas asderivações de linha germinal V e J;

A Figura 4A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO:44) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:4) daregião variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonalhumano 18E7. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 14) , CDR2 (SEQ ID NO:19) e CDR3 (SEQ ID NO:24) eindicadas as derivações de linha germinal V, D e J;A Figura 4B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO:49) e a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:9) daregião variável de cadeia leve do anticorpo monoclonalhumano 18E7. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 2 9) , CDR2 (SEQ ID NO:34) e CDR3 (SEQ ID NO:39) eindicadas às derivações de linha germinal V e J;A Figura 5A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 45) e a seqüência de aminoácidoss (SEQ ID NO: 5) daregião variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonalhumano 69A7. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 15) , CDR2 (SEQ ID N0:20) e CDR3 (SEQ ID NO:25) eindicadas às derivações de linha germinal V, D e J;

A Figura 5B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 50) e a seqüência de aminoácidoss (SEQ ID NO: 10) daregião variável de cadeia leve do anticorpo monoclonalhumano 69A7. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 30), CDR2 (SEQ ID NO: 35) e CDR3 (SEQ ID NO: 40) eindicadas as derivações de linha germinal V e J;

A Figura 6 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácidoss da região variável de cadeia pesada de 2H5 e10B4 com a seqüência de aminoácidoss Vh 3-30,3 da linhagerminal humana (SEQ ID NO:51);

A Figura 7 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácidoss da região variável de cadeia pesada de 8B5 e18E7 com a seqüência de aminoácidoss Vh 3-33 da linhagerminal humana (SEQ ID NO:52);

A Figura 8 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácidoss da região variável de cadeia pesada de 6 9A7com a seqüência de aminoácidoss Vh 4-61 da linha germinalhumana (SEQ ID NO:53);A Figura 9 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácidoss da região variável de cadeia leve de 2H5 coma seqüência de aminoácidoss Vk L6 da linha germinalhumana (SEQ ID NO:54);

A Figura 10 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácidoss da região variável de cadeia leve de 10B4com a seqüência de aminoácidoss Vk L18 da linha germinalhumana (SEQ ID NO:55);

A Figura 11 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácidoss da região variável de cadeia leve de 8B5 e18E7 com a seqüência de aminoácidoss Vk L15 da linhagerminal humana (SEQ ID NO:56);

A Figura 12 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácidoss da região variável de cadeia leve de 69A7com a seqüência de aminoácidos Vk L-6 da linha germinalhumana (SEQ ID NO:54);

A Figura 13 mostra o resultado dos experimetnos de ELISAdemonstrando que o anticorpo monoclonal humano anti-CD702H5 liga-se às linhas de célula de carcinoma renal;

A Figura 14 mostra os resultados dos experimentos decitometria de fluxo demonstrando que os anticorposmonoclonais humanos anti-CD70 2H5 liga-se às linhas decélulas de carcinoma renal;

As Figuras 15A e 15B mostram os resultados deexperimentos de citometria de fluxo demonstrando que osanticorpos monoclonais humanos contra o CD70 humanoligam-se de uma maneira dependente da concentração daslinhas de célula. (A) linha de célula 786-0 (RCC), (B)linha de célula A4 98 RCC;

A Figura 15C mostra os resultados de experimentos decitometria de fluxo que os anticorpos monoclonais humanoscontra o CD70 humano liga-se à linha de célula 786-0carcinoma renal;

A Figura 15D mostra os resultados de experimentos decitometria de fluxo que o anticorpo HuMAb 69A7 contra oCD7 0 humano liga-se de uma maneira dependente daconcentração das linhas de célula (RCC) do carcinoma decélulas renais;

A Figura 16 mostra os resultados de experimentos decitometria de fluxo demonstrando que o anticorpomonoclonal humano anti-CD70 2H5 liga-se às linhas decélula de Iinfoma humano;

As Figuras 17A-17B mostra os resultados de experimentosde citometria de fluxo demonstrando que os anticorposmonoclonais 2H5 humanos anti-CD70 liga-se às linhas decélula de linfoma humana de uma maneira dependente da concentração. (A) Raji, linha de célula de linfoma, (B)Granta-519, linha de célula de linfoma;

A Figura 17C mostra os resultados de experimentos decitometria de fluxo demonstrando que os anticorposmonoclonais humanos contra a CD70 humana ligam-se às linhas de célula de linfoma Raji;

A Figura 17D mostra os resultados de um ensaio decompetição de citometria de fluxo demonstrando que asHuMAbs 2H5 e 69A7 dividem um epítopo de ligação similar;A Figura 17E mostra os resultados de experimentos decitometria de fluxo demonstrando que os anticorposmonoclonais humanos contra CD70 humana ligam-se às linhasde célula de linfoma Daudi e as linhas de célula decarcinoma renal 786-0;

A Figura 18 mostra os resultados de experimentos de internaiização de Hum-Zap demonstrando que os anticorposmonoclonais humanos contra CD70 humano podeminternalizar-se dento das células CD70+;

As Figuras 19A-C mostram os resultados de ensaios deproliferação demonstrando que os anticorpos anti-CD70monoclonais humanos toxina-conjugados matam as linhas decélulas de carcinoma de células renais (RCC), (A) Caki-2RCCs (B) 786-0 RCCs (C)ACHN RCCs;

As figuras 2OA-D mostra os resultados do ensaio dacitotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC)demonstrando que os anticorpos anti-CD70 monoclonaishumanos matam a leucemia humana e as linhas de célula delinfoma de uma maneira dependente da ADCC. (A) ARH-77linha de célula de leucemia (B) linha de células delinfoma HuT 78 (C) linha e célula de linfoma Raji (D)linha de célula L-540 as quais não expressão CD70;

A figura 21 mostra os resultados de um ensaio deproliferação demonstrando que os anticorpos anti-CD70monoclonais humanos toxina-conjuntados matam as linhas decélula de linfoma humano;

As figuras 22A-B mostram os resultados de um ensaio depreoliferação demonstrando que os anticorpos anti-CD70monoclonais humanos toxina-conjuntados demonstram acitotoxicidade para as células Raji (A) com uma lavagemde três horas e (B) com uma lavagem contínua;

As Figuras 23A-B mostram os resultados de um estudo invivo em modelo tumoral em camundongo demonstrando que otratamento com o anticorpo anti-CD70 toxina-conjugado 2H5tem um efeito inibitório direto em tumores (RCC) decarcinoma de célula renal in vivo. (A) tumores A-498 RCC(B) tumores ACHN RCC;

As figuras 24A-F mostra os resultados de um ensaio (ADCC)dependente da citotoxicidade celular demonstrando que osanticorpos anti-CD70 monoclonais humanos defucosiladostem citotocidade celular aumentada nas células deleucemia humana de uma maneira dependente de ADCC. (A)células ARH-77; (B) células MEC-I; (C) células MEC-Itratadas com anticorpos anti-CD16; (D) células SU-DHL-6;(E) células IM-9; (F) células HuT 78;

A figura 25 mostra os resultados de um ensaio decitotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC)demonstrando que os anticorpos anti-CD70 monoclonaishumanos matam as células de leucemia humana de umamaneira dependente da concentração ADCC.

A figura 26 mostra os resultados de um ensaio decitotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC)demonstrando que os anticorpos anti-CD70 monoclonaishumanos matam as células de leucemia humana de umamaneira dependente da concentração ADCC, mas acitotoxidade é dependente da CD16.A figura 2 7 mostra os resultados de um ensaio decitotoxicidade celular dependente do. anticorpo (ADCC)demonstrando que os anticorpos anti-CD70 monoclonaishumanos matam as células T humanas ativadas e o efeito éreverso com a adição do anticorpo anti-CD16.

A figura 2 8 mostra os resultados de um ensaio de bloqueiodemonstrando que alguns anticorpos anti-CD70 monoclonaishumanos bloqueiam a ligação de CD70 para CD27 e outrosanticorpos anti-CD70 monoclonais humanos não bloqueiam aligação de CD70 a CD27.

As figuras 2 9A-B mostram os resultados e um estudo demodelo de tumor em camundongos in vivo demonstrando que otratamento com o anticorpo 2H5 anti-CD70 descoberto temum efeito inibidor direto nos tumores de linfoma in vivo.(A) tumores Raji; (B) tumores ARH-77;

As figuras 3OA-B mostram os resultados e um estudo demodelo de tumor em camundongos in vivo demonstrando que otratamento com o anticorpo 2H5 anti-CD70 toxina conjugadatem um efeito inibidor direto nos tumores de linfoma invivo. (A) tumores ARH-77; (B) tumores Granta 519; (C)tumores Raji;

A figura 31 mostra os resultados de um estudo mostrandoque o anticorpo 69A7 anti-CD70 tem reação cruzada comCD70 expresso em uma linha de célula de linforma CD70+Bde macaco Rhesus;

A figura 32 mostra os resultados de um ensaio de bloqueiodemonstrando que um anticorpo anti-CD70 humano bloqueia aligação conhecida de um anticorpo CD70 anti-humano decamundongo;

As figuras 3 3A e 3 3B mostram os resultados do tratamentotanto com o anticorpo anti-CD70 quanto da forma não-fucosilada do anticorpo. (A) anticorpos anti-CD70 inibema proliferação das células CD70 co-estimuladas de umaforma dependente da dose. (B) anticorpos anti-CD70 inibema secreçao de IFN-γ co-estimulada por CD70 de uma formadependente da dose;

As figuras 34A e 34C mostram os resultados do tratamentotanto com o anticorpo anti-CD70 quanto da forma não-fucosilada do anticorpo nas células estimuladas porpeptídeos. (A) anticorpos anti-CD70 inibem a expansão dacélula CD 8 + T peptídeo-específica. (B) não existeredução significante da viabilidade celular totalobservada. (C) não existe redução significante do númerototal de células CD8+ observada;

A figura 3 5 mostra que o efeito dos anticorpos anti-CD70na expansão celular de CD8+T peptídeo específica ébloqueado por meio da adição dos anticorpos anti-CD16;

As figuras 3 6A-3 6B mostram os resultados de um estudo demodelo de tumor em camundongos in vivo demonstrando que otratamento com o anticorpo 2H5 anti-CD70 toxina-conjugadotem um efeito inibidor direto nos tumores de carcinomarenal in vivo. (A) tumores 786-0; (B) tumores Caki-1;

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonaisisolados, particularmente anticorpos monoclonais humanos,que ligam-se especificamente aos CD70. Em certasconcretizações, os anticorpos da invenção exibem sãoderivados de seqüências de linhas germinais de cadeiapesada e leve específicas e/ou compreende característicasestruturasi particulares tais como regiões CDRcompreendendo seqüências de aminoácidos particulares.

Esta descrição provê anticorpos isolados, métodos parafazer os referidos anticorpos, imunoconjugados emoléculas biespecíficas compreendendo os referidosanticorpos e composições farmacêuticas contendo osanticorpos, imunoconjugados ou moléculas biespecíficas dadescrição. Esta descrição também se refere aos métodos deuso dos anticorpos, tais como para tratar doenças comocâncer.

De modo que a presente descrição possa ser maisfacilmente entendida, determinados termos são definidos.

Definições adicionais estão representadas durante adescrição detalhada da invenção.

Uma "via de transdução de sinal" refere-se à relaçãobioquímica entre uma variedade de moléculas de transduçãode sinal que desempenham um papel na transmissão de umsinal de uma porção de uma célula para outra porção deuma célula. Conforme aqui utilizado, a frase "receptor de superfície celular" inclui, por exemplo, moléculas ecomplexos de moléculas capazes de receber um sinal e atransmissão de tal sinal através da membrana plasmáticade uma célula. Um exemplo de um "receptor de superfíciecelular" da presente invenção é o receptor CD70. 0 termo "anticorpo", conforme aqui citado, incluianticorpos inteiros e qualquer fragmento ligante aoantígeno (ou seja, "porção ligante ao antígeno") oucadeias simples dos mesmos. Um "anticorpo" refere-se auma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeiaspesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas porligações bissulfeto ou uma porção ligante ao antígeno domesmo. Cada cadeia pesada compreende uma região variávelde cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma regiãoconstante de cadeia pesada. A região constante de cadeiapesada compreende três domínios, ChI , CH2 e CH3 . Cadacadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve(aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeialeve. A região constante de cadeia leve compreende umúnico domínio, Cl. As regiões Vh e Vl podem ainda, serem subdivididas em regiões de hipervariabilidade,denominadas regiões determinantes de complementaridade(CDR) , intercaladas com regiões que são mais conservadas,denominadas regiões estruturais (FR) . Cada Vh e Vl écomposta por três CDRs e quatro FRs, dispostas determinal-amino para terminal-carboxi na seguinte ordem:FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiõesvariáveis de cadeias leves e pesadas contêm um domínio deligação que interage com um antígeno. As regiõesconstantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos hospedeiros ou fatores,incluindo diversas células do sistema imune (ex: célulasefetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema decomplemento clássico.

0 termo "porção ligante ao antígeno" de um anticorpo (ousimplesmente "porção de anticorpo"), conforme aquiutilizado, refere-se a um ou mais fragmentos de umanticorpo que mantém a capacidade de ligar-seespecificamente a um antígeno (ex: CD70). Foi demonstradoque a função de ligação ao antígeno de um anticorpo podeser realizada através de fragmentos de um anticorpo deextensão completa. Exemplos de fragmentos ligantesabrangidos pelo termo "porção ligante ao antígeno" de umanticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmentomonovalente consistindo dos domínios VL, VH, Cl e ChI;(ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalentecompreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma pontede bissulfeto na região de dobra ("hinge"); (iii) umfragmento Fab', que é essencialmente um Fab com parte daregião de dobra (ver, "Fundamental Immunoloyg (Paul ed.,3rd ed., 1993); (iv) um fragmento Fd consistindo dosdomínios Vl e Vh de um braço único de um anticorpo; (v) umfragmento Fv consistindo dos domínios Vl e Vh de um braçoúnico de um anticorpo; (vi) um fragmento dAb (Ward etal., (1989) Nature 341:544-546), que consiste de umdomínio Vh ; (vii) uma região determinante decomplementaridade isolada (CDR). Além disso, embora osdois domínios do fragmento Fv, Vl e VH, sejam codificadospor genes separados, eles podem ser unidos, utilizandométodos recombinantes, através de um ligante sintéticoque permite que sejam preparados como uma cadeia deproteína simples na qual as regiões Vl e Vh emparelham-separa formar moléculas monovalentes (conhecidas comocadeia simples Fv (scFv); vide, por exemplo, Bird etal (1988) Science 242 :423-426; e Huston et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883). Tais anticorpos decadeia simples também pretendem ser abrangidos pelo termo"porção ligante ao antígeno" de um anticorpo. Essesfragmentos de anticorpo são obtidos utilizando-setécnicas convencionais conhecidas pelos habilitados natécnica, e os fragmentos são identificados quanto àutilidade da mesma forma que os anticorpos intactos.Um "anticorpo isolado", conforme aqui utilizado, pretendese referir a um anticorpo que é substancialmente livre deoutros anticorpos tendo especificidades antigênicasdiferentes (ex: um anticorpo isolado que especificamenteliga-se ao CD70 é substancialmente livre de anticorposque ligam-se especificamente a antígenos que não o CD70) .Um anticorpo isolado que liga-se especificamente a CD70 pode, porém, ter reatividade cruzada a outros antígenos,tais como moléculas de CD70 de outras espécies. Emdeterminadas concretizações, um anticorpo isolado podeser especificamente ligado ao CD70 humano e não terreação cruzada com outros antígenos CD70 não-humanos. Além disso, um anticorpo isolado pode sersubstancialmente livre de outro material celular e/ousubstâncias químicas.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição deanticorpo monoclonal" conforme aqui utilizados, referem- se a uma preparação de moléculas de anticorpo decomposição molecular simples. Uma composição de anticorpomonoclonal exibe uma especificidade de ligação simples eafinidade por um epítopo particular.

0 termo "anticorpo humano", conforme aqui utilizado, pretende incluir anticorpos que possuem regiões variáveisnas quais tanto as regiões estruturais como as regiõesCDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina delinha germinal humana. Além disso, se o anticorpo tiveruma região constante, a região constante também é derivada de seqüências de imunoglobulina de linhagerminal humana. Os anticorpos humanos da invenção podemincluir modificações posteriores, incluindo modificaçõesnaturais ou sintéticas. Os anticorpos humanos dadescrição podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por seqüências de imunoglobulina de linhagerminal humana (ex: mutações introduzidas por mutagênesealeatória ou sítio-específicas in vitro ou através demutação somática in vivo). Porém, o termo "anticorpohumano", conforme aqui utilizado, não pretende incluiranticorpos nos quais as seqüências CDR derivadas da linhagerminal, de outras espécies mamíferas, tal como umcamundongo, foi enxertado em seqüências estruturais dehumanos.

0 termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se aanticorpos que exibem uma especificidade de ligaçãosimples que possuem regiões variáveis nas quais tanto asregiões estruturais como as regiões CDR são derivadas deseqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Emuma concretização, os anticorpos monoclonais humanos sãoproduzidos por um hibridoma que inclui uma célula Bobtida de um animal não-humano transgênico, como porexemplo, um camundongo transgênico, tendo um genomacompreendendo um transgene humano de cadeia pesada e umtransgene de cadeia leve humano fundido com uma célulaimortalizada.

O termo "anticorpo recombinante humano", conforme aquiutilizado, inclui todos os anticorpos humanos que sãopreparados, expressados, criados ou isolados através demeios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados deum animal (ex: um camundongo), que é transgênico outranscromossômico para-genes de imunoglobulina humana ouum hibridoma preparado com o mesmo (descrito abaixo), (b)anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformadapara expressar o anticorpo humano, como por exemplo, deum transfectoma, (c) anticorpos isolados de um banco deanticorpo humano combinatorial recombinante, e (d)anticorpos preparados, expressos, criados ou isoladosatravés de quaisquer outros meios que envolvemalinhamento de seqüências gênicas de imunoglobulinahumana com outras seqüências de DNA. Tais anticorposrecombinantes humanos possuem regiões variáveis nas quaisas regiões estruturais e CDR são derivadas de seqüênciasde imunoglobulina de linha germinal humana. Em certasconcretizações, porém, tais anticorpos recombinanteshumanos podem ser submetidos à mutagênese in vitro (ouquando for utilizado um animal transgênico paraseqüências Ig humana, mutagênese somática in vivo) eassim as seqüências de aminoácido das regiões Vh e Vl dosanticorpos recombinantes são seqüências que, emboraderivadas de e relacionadas com seqüências Vh e Vl delinha germinal humana, não podem existir naturalmentedentro do repertório de linha germinal de anticorpohumano in vivo.

Conforme aqui utilizado, "isótopo" refere-se à classe deanticorpo (ex: IgM ou IgGl) que é codificada pelos genesda região constante de cadeia pesada.

As expressões "um anticorpo reconhecendo um antígeno" e"um anticorpo particular para um antígeno" são utilizadasintercambiadamente na presente invenção com o termo "umanticorpo que se liga especificamente a um antígeno".

A expressão "derivados de anticorpo humano" refere-se aqualquer forma modificada do anticorpo humano, como porexemplo, um conjugado do anticorpo e outro agente ouanticorpo.

O termo "anticorpo humanizado" pretende referir-se aanticorpos nos quais as seqüências CDR derivadas da linhagerminal de outra espécie mamífera, tal como, umcaraundongo, foram enxertadas em seqüências estruturaishumanas. Modificações adicionais da região estruturalpodem ser feitas nas seqüências estruturais humanas.

O termo "anticorpo quimérico" pretende se referir aanticorpos nos quais as seqüências de região variável sãoderivadas de uma espécie e as seqüências de regiãoconstante são derivadas de outra espécie, tal como umanticorpo no qual as seqüências de região variável sãoderivadas de um anticorpo de camundongo e as seqüênciasde região constante são derivadas de um anticorpo humano.

Conforme aqui utilizado, um anticorpo que "liga-seespecificamente ao CD70 humano" pretende referir-se a umanticorpo que liga-se ao CD70 humano com um K0 de 5xlO~8Mou menos, mais preferivelmente 1 χ IO-8M ou menos, maispreferivelmente 6 χ IO-9M ou menos, mais preferivelmente3 χ IO"9 M ou menos, ainda mais preferivelmente entre 2 χ10"9M ou menos.

0 termo "KaSsoc" ou "Ka", conforme aqui utilizado, pretende se referir à taxa de associação de uma interaçãoanticorpo-antigeno específica, ao passo que o termo "KdiS"ou "Kd" conforme aqui utilizado, pretende se referir àtaxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígenoespecífica. 0 termo "KD" conforme aqui utilizado, pretende se referir à constante de dissociação, que éobtida da relação de Kd para Ka (ou seja, Kd/Ka) e éexpressa como uma concentração molar (M). Valores Kd paraanticorpos podem ser determinados utilizando-se métodosestabelecidos no estado da técnica. Um método preferido para determinar o Kd de um anticorpo consiste em utilizarressonância de plásmon de superfície, preferivelmente,utilizando um sistema biosensor tal como um sistemaBiacore®.

Conforme aqui utilizado, o termo "alta afinidade" por um anticorpo IgG refere-se a um anticorpo com um Kd de IO-7Mou menos, mais pref erivelmente IO-8M ou menos e aindamais pref erivelmente IO-9M ou menos, e ainda maispref erivelmente IO-10M ou menos, para um antígeno alvo.Porém, a ligação de "alta afinidade" pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, ligação de"alta afinidade" por um isotipo IgM refere-se a umanticorpo com um Kd de IO-7M ou menos, maispreferivelmente IO-8M ou menos, ainda maispreferivelmente IO-9M ou menos.

Conforme aqui utilizado, o termo "indivíduo" incluiqualquer animal humano ou não-humano. 0 termo "animalnão-humano" inclui todos os vertebrados, como porexemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatasnão-humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, frangos, anfíbios, peixes, répteis, etc.

Diversos aspectos do relatório são descritos em maioresdetalhes nas subseções seguintes.Anticorpos Anti-CD7 0

Os anticorpos da invenção são caracterizados porcaracterísticas ou propriedades funcionais particularesdos anticorpos. Por exemplos, os anticorpos ligam-seespecificamente ao CD70 humano. Preferivelmente, umanticorpo da invenção liga-se a CD70 com alta afinidade,por exemplo, com um K0 de 5 χ 10-7M ou menos, ainda maispref erivelmente 5,5 χ 10"9 ou menos, ainda maispreferivelmente, 3 χ 10"9 ou menos, ainda maispref erivelmente 2 χ 10-9M ou menos ou, ainda maispreferivelmente 1,5 χ 10-9M ou menos.

Ensaios padrão para avaliar a capcidade de ligação dosanticorpos para CD70 são conhecidos na técnica, incluindopor exemplo, ELISAs, Western blots e RIAs. Ensaiosapropriados são descritos em detalhes nos exemplos. Acinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação)dos anticorpos também podem ser avaliadas por ensaiospadrões conhecidos da técnica, tais como por ELISA,análise de Scatchard e Biacore. Como um outro exemplo, osanticorpos da presente descrição podem ligar-se a umalinha celular do tumor de carcinoma renal, por exemplo,linhas de célula 786-0, A-498, ACHN, Caki-I ou Caki-2.Ainda em um outro exemplo, os anticorpos da presenteinvenção podem ligar-se a uma linha de célula de tumor decélula-B, por exemplo, linhas de célula Daudi, HuT 78,Raji ou Granta-519.

Anticorpos Monoclonais 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e 69A7.Anticorpos preferidos da invenção são os anticorposmonoclonais humanos 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e 69A7, isoladose estruturalmente caracterizados conforme descrito nosExemplos 1 e 2. As. seqüências de aminoácido Vh de 2H5,10B4, 8B5, 18E7 e 69A7 são mostradas nas SEQ ID NOs:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10, respectivamente. Asseqüências de aminoácido Vl de 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e69A7 são mostradas nas SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19 e 20, respectivamente.

Dado que cada um desses anticorpos pode ligar-se ao CD70,as seqüências Vh e Vl podem ser "mistas e combinadas"para criar outras moléculas de ligação a anti-CD70 dainvenção. A ligação ao CD70 de tais anticorpos "mistos ecombinados" pode ser testada utilizando-se os ensaios deligação descritos acima e nos Exemplos (ex: ELISAs).

Preferivelmente, quando as cadeias Vh e Vl são mistas ecombinadas, uma seqüência Vh de um emparelhamento VH/VLparticular é substituída por uma seqüência Vh deestrutura similar. Da mesma forma, preferivelmente umaseqüência Vl de um emparelhamento VH/VL particular ésubstituída por uma seqüência Vl de estrutura similar.

Conseqüentemente, num aspecto, a invenção provê umanticorpo monoclonal isolado, ou uma porção ligante aoantígeno do mesmo compreendendo:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendouma seqüência de aminoácidos selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 e 5; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindodas SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9 e 10;

sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao CD70.

Combinações preferidas de cadeia pesada e leve incluem:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID N0:1; e (b) uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:6; ou

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (b) uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:7; ou

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e (b) uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:8; ou

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:4; e (b) uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:9; ou

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:5; e (b) uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:10.

Em outro aspecto, a invenção provê anticorpos quecompreendem a cadeia pesada e a cadeia leve CDRls, CDR2se CDR3 S de 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e 69A7 ou suascombinações. As seqüências de aminoácido de CDRls Vh de2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e 69A7 são mostradas nas SEQ IDNOs:11,12, 13, 14 e 15, respectivamente. As seqüências deaminoácido das CDR2s Vh de 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e 69A7são mostradas nas SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19 e 20respectivamente. As seqüências de aminoácido de CDR3s Vhde 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e 69A7 são mostradas nas SEQ IDNOs: 21, 22, 23, 24 e 25, respectivamente. As seqüênciasde aminoácido das CDRls Vk de 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e 69A7são mostradas nas SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29 e 30,respectivamente. As seqüências de aminoácido de CDR2s Vkde 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e 69A7 são mostradas nas SEQ IDNOs: 31, 32, 33, 34 e 35, respectivamente. As seqüênciasde aminoácido das CDR3s Vk de 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e 69ΑΊsão mostradas nas SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39 e 40,respectivamente. As regiões CDR são delineadas utilizandoo sistema Kabat (Kabat, E.A. et al.(1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest, Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services, NIHPublication No.91-3242).

Dado que cada um desses anticorpos pode ligar-se ao CD70e que a especificidade de ligação a antígeno é providaprincipalmente pelas regiões CDRl, CDR2 e CDR3, asseqüências CDRl, CDR2 e CDR3 Vh e as seqüências CDRl,CDR2 e CDR3 Vk podem ser "misturadas e combinadas" (ouseja, as CDRs de anticorpos diferentes podem sermisturadas e combinadas, embora cada anticorpo devaconter uma CDRl, CDR2 e CDR3 Vh e uma CDRl, CDR2 e CDR3VK) para criar outras moléculas ligantes ao anti-CD70 dainvenção. A ligação ao CD70 de tais anticorpos"misturados e combinados" pode ser testada utilizando osensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (ex:FACS, ELISAs, análise Biacore®) . Preferivelmente, quandoas seqüências CDR Vh são misturadas e combinadas, aseqüência CDRl, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência Vhespecífica é substituída por uma seqüência(s) CDR deestrutura similar. Da mesma forma, quando seqüências CDRVk são misturadas e combinadas, a seqüência CDRl, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência Vk específica épreferivelmente substituída por uma seqüência (s) CDR deestrutura similar. Será evidente para o habilitado natécnica que seqüências Vh e Vl novas podem ser criadassubstituindo-se uma ou mais seqüências da região CDR Vh e/ou Vl por seqüências de estrutura similar dasseqüências CDR aqui descritas para os anticorposmonoclonais 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e 69A7.

Conseqüentemente, em outro aspecto, a invenção provê umanticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante aoantígeno do mesmo, compreendendo:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 e 15;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19 e 20;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24 e 25;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29 e 30;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34 e 35; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39 e 40;sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao CD70,preferivelmente CD7 0 humano.

Em uma concretização preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 11;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 16;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 21;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 26;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 31; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 36.

Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 12;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 17;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 22;

(d) uma CDR1 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 2 7;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 32; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 37.

Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 13;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 18;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 23;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 28;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 33; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 38.

Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 14;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 19;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 24;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 29;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 34; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 39.

Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 15;

(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 20;

(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 25;

(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 3 0;

(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 35; e

(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 40.

É bastante conhecido no estado da técnica que o domínioCDR3, independentemente do(s) domínio(s) CDRl e/ou CDR2,isoladamente pode determinar a especificidade de ligaçãode um anticorpo por um antígeno cognato e que anticorposmúltiplos podem previsivelmente ser gerados tendo a mesmaespecificidade de ligação baseada numa seqüência CDR3comum. Vide, por exemplo, Klimka et al., British J. ofCâncer 83^(2) :252-260 (2000) (descrevendo a produção de umanticorpo anti-CD30 humanizado utilizando apenas odomínio variável de cadeia pesada CDR3 de anticorpo anti-CD30 murino Ki-4); Beiboer et al.,J.Mol.Biol. 296 : 833-849(2000) (descrevendo anticorpos de glicoproteína-2epitelial recombinante (EGP-2) utilizando apenas aseqüência CDR3 de cadeia pesada do anticorpo anti-EGP-2M0C-31 murino parental); Rader et al.,Proc.Natl.Acad. Sci. USA 915:8910-8915 (1998) (descrevendoum painel de anticorpos αν/63 anti-integrina humanizadosutilizando um domínio CDR3 variável de cadeia leve epesada de um anticorpo LM609 αν/33 anti-integrina murino,sendo que cada anticorpo membro compreende uma seqüênciadistinta fora do domínio CDR3 e capaz de ligar o mesmoepítopo como o anticorpo murino parental com afinidadestão altas ou mais altas que o anticorpo murino parental);Barbas et al., J.Am.Chem.Soc. 116:2161-2162 (1994)(revelando que o domínio CDR3 prove a contribuição maissignificativa para ligação ao antígeno) ; Barbas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U. S.A. 92:2529-2533 (1995)(descrevendo o enxerto de seqüências CDR3 de cadeiapesada de três Fabs (SI-1, SI-40 e SI-32) contra DNAplacentário humano sobre a cadeia pesada de um Fabtoxóide anti-tetânico, substituindo assim a CDR3 decadeia pesada existente e demonstrando que o domínio CDR3isoladamente conferiu a especificidade de ligação); eDitzel et al., J.Immunol., 157-739-749 (1996)(descrevendo estudos de enxerto em que a transferênciaapenas de CDR3 de cadeia pesada de um Fab LNA3poliparticular parental para uma cadeia pesada de umanticorpo Fab p313 ligante ao toxóide tetânico IgGmonoparticular foi suficiente para reter a especificidadede ligação do Fab parental). Cada uma dessas referênciasé aqui incorporada por referência em sua íntegra.

Conseqüentemente, em certos aspectos, a presente invençãoprovê anticorpos monoclonais compreendendo um ou maisdomínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorponão-humano, sendo que o anticorpo monoclonal é capaz deligar-se especificamente ao CD70. Dentro de determinadosaspectos, a presente invenção provê anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR decadeia leve ou pesada a partir de anticorpos não-humanos,tais como um anticorpo de camundongo ou de rato, onde oanticorpo monoclonal é capaz de se ligar especificamenteao CD70. Em algumas concretizações, tais anticorpos inventivos compreendendo um ou mais domínios CDR3 decadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não-humano (a)são capazes de competir para ligação com; (b) mantém ascaracterísticas funcionais; (c) ligam-se ao mesmoepítopo; e/ou (d) possuem uma afinidade de ligaçãosimilar à do anticorpo parental não-humanocorrespondente.

Em outros aspectos, a presente invenção provê anticorposmonoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 decadeia pesada e/ou leve de um primeiro anticorpo humano,tal como, por exemplo, um anticorpo humano obtido de umanimal não-humano, sendo que o anticorpo humano é capazde ligar-se especificamente ao CD70. Em outros aspectos,a presente invenção provê anticorpos monoclonaiscompreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadei pesada e/ou leve a partir de um primeiro anticorpo humano, talcomo, por exemplo, um anticorpo humano obtidoa partir deum animal não-humano, sendo o primeiro anticorpo humanocapaz de se ligar especificamente ao CD70 e onde odomínio CDR3 a partir do primieor anticorpo humanosubstitui um domíjio CDR3 em um anticorpo humano no qualfalta especificidade de ligação para o CD70 para gerar umsegundo anticorpo humano que seja capaz de ligar-seespecificamente ao CD70. Em algumas concretizações, osanticorpos da presente descrição compreendem um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve do primeiroanticorpo humano (a) são capazes de competir para ligar-se com; (b) manter as características funcionais; (c)ligar-se ao mesmo epítopo; e/ou (d) possuem uma afinidadede ligação similar à do primeiro anticorpo humanoparental correspondente.

Anticorpos com Seqüências de Linha Germinal Específicas

Em certas concretizações, um anticorpo da invençãocompreende uma região variável de cadeia pesada de umgene de imunoglobulina de cadeia pesada de linha germinalparticular e/ou uma região variável de cadeia leve de umgene de imunoglobulina de cadeia leve de linha germinalparticular.

Por exemplo, numa concretização preferida, a invençãoprovê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porçãoligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma regiãovariável de cadeia pesada que é o produto de ou derivadade um gene Vh 3-30,3 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao CD70. Em outra concretizaçãopreferida, a invenção provê um anticorpo monoclonalisolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo,compreendendo uma região variável de cadeia pesada que éo produto de ou derivada de um gene Vh 3-33 humano, sendoque o anticorpo liga-se especificamente ao CD70. Ainda,em outra concretização preferida, a invenção provê umanticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante aoantígeno do mesmo, compreendendo uma região variável decadeia pesada que é o produto de ou derivada de um geneVh 4-61 humano, sendo que o anticorpo liga-seespecificamente ao CD70. Em outra concretizaçãopreferida, a invenção provê um anticorpo monoclonalisolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo,compreendendo uma região variável de cadeia leve que é oproduto de ou derivada de um gene Vk L6, sendo que oanticorpo liga-se especificamente ao CD70. Em outraconcretização preferida ainda, a invenção provê umanticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante aoantígeno do mesmo, compreendendo uma região variável decadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene VkL18 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamenteao CD70. Em outra concretização preferida ainda, ainvenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou umaporção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo umaregião variável de cadeia leve que é o produto de ouderivada de um gene Vk Ll5 humano, sendo que o anticorpoliga-se especificamente ao CD70.

Ainda em outra concretização preferida, a invenção provêum anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante aoantígeno do mesmo, sendo que o anticorpo:

(a) compreende uma região variável de cadeia pesada que éo produto de ou derivada de um gene Vh 3-30,3, 3-33 ou4-61 humano (que codifica as seqüências de aminoácidosestabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 52 e 53,respectivamente);

(b) compreende uma região variável de cadeia leve que é oproduto de ou derivada de um gene Vk L6, L18 ou L15 (quecodifica as seqüências de aminoácido estabelecidas nasSEQ ID NOs: 54, 55 e 56, respectivamente); e

(c) o anticorpo que se liga especificamente ao CD70.

Um exemplo de anticorpo tendo Vh e Vk de Vh 3-30,3 e VkL6, respectivamente é o 2H5. Exemplos de anticorpos tendoVh e Vk de Vh de 3-30,3 e Vk L18, respectivamente, 10B4.Um exemplo de anticorpo tendo Vh e Vk de Vh 3-33 e Vk L15,respectivamente são 8B5 e 18E7. Um exemplo de anticorpotendo Vh e Vk de Vh 4-61 e Vk L6, respectivamente, é o 69A7.

Conforme aqui utilizado, um anticorpo humano compreenderegiões variáveis de cadeia pesada ou leve que é "oproduto de" ou "derivado de" uma seqüência de linhagerminal específica se as regiões variáveis do anticorpoforem obtidas de um sistema que utiliza genes deimunoglobulina de linha germinal humana. Tais sistemasincluem imunizar um camundongo transgênico portando genesde imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ouidentificar um banco de gene de imunoglobulina humanaexibindo um fago com o antígeno de interesse. Umanticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de"uma seqüência de imunoglobulina de linha germinal humanapode ser identificado como tal comparando-se a seqüênciade aminoácidoss do anticorpo humano com as seqüências deaminoácidos de imunoglobulinas de linha germinal humanas e selecionando-se a seqüência de imunoglobulina de linhagerminal humana que está mais próxima em seqüência (ouseja, com a maior % de identidade) da seqüência doanticorpo humano. Um anticorpo humano que é "o produtode" ou "derivado de" uma seqüência de imunoglobulina delinha germinal humana particular pode conter diferençasde aminoácidos se comparada com à seqüência de linhagerminal, devido, por exemplo, a mutações somáticas deocorrência natural ou a introdução intencional de mutaçãosítio-direcionada. Porém, um anticorpo humano selecionado é tipicamente pelo menos 90% idêntico em seqüência deaminoácidoss a uma seqüência de aminoácidos codificadapor um gene de imunoglobulina de linha germinal humana econtém resíduos de aminoácidos que identificam oanticorpo humano como sendo humano quando comparado comas seqüências de aminoácido de imunoglobulina de linhagerminal de outras espécies (ex: seqüências de linhagerminal de murino). Em certos casos, um anticorpo humanopode ser pelo menos 95%, ou ainda pelo menos 96%, 97%,98%, ou 99% idêntico em seqüência de aminoácidoss àseqüência de aminoácidoss codificada pelo gene deimunoglobulina de linha germinal. Tipicamente, umanticorpo humano derivado de uma seqüência de linhagerminal humana particular poderá exibir não mais que 10aminoácidos diferentes da seqüência de aminoácidoss codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinal.Em certos casos, o anticorpo humano pode apresentar nãomais que 5 ou ainda não mais que 4, 3, 2 ou 1 aminoácidodiferente daquela seqüência de aminoácidoss codificadapelo gene da imunoglobulina de linha germinal.

Anticorpos Homólogos

Em outra concretização ainda, um anticorpo da invençãocompreende regiões variáveis de cadeia pesada e levecompreendendo seqüências de aminoácidos que são homólogasàs seqüências de aminoácido dos anticorpos preferidasaqui descritas, e sendo que os anticorpos retêm aspropriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-CD7 0 da invenção.

Por exemplo, a invenção provê um anticorpo monoclonalisolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo,compreendendo uma região variável de cadeia pesada e umaregião variável de cadeia leve, sendo que:

(a) a região variável de cadeia pesada compreende umaseqüência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga àseqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindodas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 e 5;

(b) a região variável de cadeia leve compreende umaseqüência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga àseqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindode SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9 e 10;

(c) o anticorpo liga-se especificamente ao CD70.Em outras concretizações, as seqüências de aminoácido Vhe/ou Vl podem ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%homólogas às seqüências acima citadas. Um anticorpo tendoregiões Vh e Vl com alta homologia (ou seja, de 80% oumais) com as regiões Vh e Vl das seqüências acimacitadas, pode ser obtido através de mutagênese (ou seja,mutagênese sítio-direcionada ou mediada por PCR) demoléculas de ácido nucléico codificando SEQ ID NOs: 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50, seguido de teste doanticorpo codificado alterado quanto à função retida (ouseja, ligação ao CD7 O humano com um Kd de 5 χ 10-8 M oumenos) usando os ensaios funcionais descritos aqui.

Conforme aqui utilizada, a homologia percentual entre asseqüências de aminoácidos é equivalente ao percentual deidentidade entre as duas seqüências. O percentual deidentidade entre as duas seqüências é uma função donúmero de posições idênticas compartilhadas pelasseqüências (ou seja, % homologia # de posiçõesidênticas/total de # de posições χ 100), levando emconsideração o número de espaços ("gaps") e a extensão decada espaço, que precisam ser introduzidos paraalinhamento ótimo das duas seqüências. A comparação dasseqüências e a determinação do percentual de identidade,entre as duas seqüências, podem ser realizadasutilizando-se um algoritmo matemático, conforme descritonos exemplos não restritivos abaixo.

O percentual de identidade entre as duas seqüências deaminoácidos pode ser determinado utilizando-se oalgoritmo de E.Meyers e W.Miller (Comput.Appl.Biosci.4:11-17 (1988)) que foi incorporado noprograma ALIGN (versão 2.0) utilizando a tabela deresíduo de peso PAM12 0, uma penalidade de extensão deespaços de 12 e uma penalidade por inserção de espaço de4. Além disso, o percentual de identidade entre as duasseqüências de aminoácidos pode ser determinadoutilizando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453 (1970)) que foi incorporado aoprograma GAP no pacote de software CGC (disponível emwww.gcg.com), utilizando ou uma matriz Blossum 62 ou umamatriz PAM250 e um peso de espaço de 16, 14, 12, 10, 8, 6ou 4 e um peso de extensão de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.Adicional ou alternativamente, as seqüências de proteínada presente descrição podem ser ainda utilizadas como"seqüência de pesquisa/consulta ("query")" para realizaruma busca em bancos de dados públicos para, por exemplo,identificar seqüências relacionadas. Tais buscas podemser efetuadas utilizando-se o programa XBLAST (versão2.0) de Altschul, et al.(1990) J.Mol.Biol.215:403-10. Asbuscas BLAST de proteína podem ser efetuadas com oprograma XBLAST, escore=50, extensão de palavra=3 paraobter seqüências de aminoácido homólogas às moléculas deanticorpo da invenção. Para obter alinhamentos com espaçopara fins de comparação, o " Gapped BLAST" pode serutilizado conforme descrito em Altschul et al. , (1997)Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402. Ao utilizar osprogramas BLAST e "Gapped BLAST", podem ser utilizados osparâmetros de valor padrão dos respectivos programas (ex:XBLAST e NBLAST). Vide www.ncbi.nlm.nih.gov.Anticorpos com Modificações Conservativas

Em certas concretizações, um anticorpo da invençãocompreende uma região variável de cadeia pesadacompreendendo seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 e uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo seqüências CDRl,CDR2 e CDR3, sendo que uma ou mais dessas seqüências CDRcompreendem seqüências de aminoácido especificadas combase nos anticorpos preferidos aqui descritos (ex: 2H5,10B4, 8B5, 18E7 ou 69A7) ou suas modificaçõesconservativas, e sendo que os anticorpos mantêm aspropriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-CD7 0 da invenção. Conseqüentemente, a invenção provê umanticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante aoantígeno do mesmo, compreendendo uma região variável decadeia pesada compreendendo seqüências CDRl, CDR2 e CDR3e uma região variável de cadeia leve compreendendoseqüências CDRl, CDR2 e CDR3, onde:

(a) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia pesadacompreende uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo consistindo de seqüências de aminoácido de SEQ IDNOs: 21, 22, 23, 24 e 25, e suas modificaçõesconservativas;

(b) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia levecompreende uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo consistindo de seqüência de aminoácidos de SEQ IDNOs: 36, 37, 38, 39 e 40 e suas modificaçõesconservativas; e

(c) o anticorpo liga-se especificamente ao CD70.

Em uma concretização preferida, a seqüência CDR2 daregião variável de cadeia pesada compreende uma seqüênciade aminoácidos selecionada do grupo consistindo deseqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19 e20 e suas modificações conservativas; e a seqüência CDR2da região variável de cadeia leve compreende umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindode seqüências de aminoácido de SEQ ID NOS: 31, 32, 33, 34e 35 e suas modificações conservativas. Em outraconcretização preferida, a seqüência CDRl da regiãovariável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo deseqüências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 e15, e suas modificações conservativas; e a seqüência CDRlda região variável de cadeia leve compreende umaseqüência de aminoácidoss selecionada do grupo consistindo de seqüências de aminoácido de SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 e 30 e suas modificações conservativas.Conforme aqui utilizado, o termo "modificaçõesconservativas de seqüência" pretende se referir amodificações de aminoácidos que não afetam nem alteram significativamente as características de ligação doanticorpo contendo a seqüência de aminoácidoss. Taismodificações conservativas incluem substituições, adiçõese deleções de aminoácidos. As modificações podem serintroduzidas num anticorpo da invenção através detécnicas padrão conhecidas no estado da técnica, taiscomo mutagênese sítio-direcionada e mutagênese mediadapor PCR. Substituições conservativas de aminoácidos sãoaquelas em que o resíduo aminoácido é substituído por umresíduo aminoácido que possui uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos aminoácidos tendo cadeias lateraissimilares foram definidas no estado da técnica. Essasfamílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas(ex: lisina, arginina, histidina), cadeias lateraisácidas (ex: ácido aspártico, ácido glutâmico) , cadeiaslaterais polares não carregadas (ex: glicina, asparagina,glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína,triptofano), cadeias laterais não-polares (ex: alanina,valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina,metionina), cadeias laterais com ramificação beta (ex: treonina, valina, isoleucina) e cadeias lateraisaromáticas (ex: tirosina, fenilalanina, triptofato,histidina). Assim, um ou mais resíduos aminoácido dentrodas regiões CDR de um anticorpo da invenção podem sersubstituídos por outros resíduos de aminoácidos da mesmafamília de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode sertestado quanto à função retida (ou seja, a funçãoestabelecida em (c) ) utilizando os ensaios funcionaisaqui descritos.

Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo como anticorposanti-CD7 0 da invenção

Em outra concretização, a invenção provê anticorpos quese ligam ao mesmo epítopo em CD7 0 humano como qualquer umdos anticorpos monoclonais CD70 da invenção (ou seja,anticorpos que possuem a capacidade de fazer competiçãocruzada para ligar-se ao CD70 com qualquer um dosanticorpos monoclonais da invenção). Em concretizaçõespreferidas, o anticorpo de referência para estudos decompetição cruzada pode ser o anticorpo monoclonal 2H5(tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ IDNOs: 1 e 6, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal10B4 (tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQID NOs: 2 e 7, respectivamente), ou o anticorpomonoclonal 8B5 (tendo seqüências Vh e Vl conformemostrado nas SEQ ID NOs: 3 e 8, respectivamente) , ou oanticorpo monoclonal 18E7 (tendo seqüências Vh e Vlconforme mostrado nas SEQ ID NOs: 4 e 9 respectivamente),ou o anticorpo monoclonal 6 9A7 (tendo seqüências Vh e Vlconforme mostrado nas SEQ ID NOs: 5 e 10,respectivamente). Tais anticorpos de competição cruzadapodem ser identificados com base em sua capacidade defazer competição cruzada com 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 ou 69A7em ensaios padrão de ligação ao CD70. Por exemplo, aanálise BIAcore®, ensaios ELISA ou a citometria de fluxopodem ser usados para demonstrar a competição cruzada comos anticorpos da presente invenção. A capacidade de umanticorpo de teste inibir a ligação, por exemplo, de 2H5,10B4, 8B5, 18E7 ou 69A7 ao CD7 0 humano demonstra que oanticorpo de teste pode competir com 2H5, 10B4, 8B5, 18E7ou 69A7 para ligar-se ao CD70 humano e assim liga-se aomesmo epítopo em CD70 humano como 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 ou69A7. Em uma concretização preferida, o anticorpo queliga-se ao mesmo epítopo em CD70 humano como 2H5, 10B4,8B5, 18E7 ou 69A7 é um anticorpo monoclonal humano. Taisanticorpos monoclonais humanos podem ser preparados eisolados conforme descrito nos Exemplos.Anticorpos Construídos e Modificados

Um anticorpo da invenção pode ser ainda preparadoutilizando-se um anticorpo que possua uma ou mais dasseqüências Vh e/ou Vl aqui descritas pode ser usado comomaterial de partida para construir um anticorpomodificado que pode ter propriedades alteradas em relaçãoao anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser construídomodificando-se um ou mais resíduos dentro de uma ou deambas as regiões variáveis (ou seja, Vh e/ou Vl) , porexemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro deuma ou mais regiões estruturais. Adicionalmente oualternativamente, um anticorpo pode ser construídomodificando-se resíduos dentro da região(s) constante(s) ,por exemplo, para alterar a função(ões) efetora(s) doanticorpo.

Um tipo de construção em região variável que pode serrealizada é o enxerto em CDR. Os anticorpos interagem comos antígenos alvo predominantemente através de resíduosaminoácido que estão localizados nas seis regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs) de cadeiapesada e leve. Por essa razão, as seqüências deaminoácidos dentro das CDRs são mais diversas entreanticorpos individuais do que as seqüências fora dasCDRs. Uma vez que as seqüências de CDR são responsáveispela maioria das interações anticorpo-antígeno, épossível expressar anticorpos recombinantes que imitem aspropriedades de anticorpos específicos de ocorrêncianatural construindo-se vetores de expressão que incluamseqüências CDR do anticorpo específico de ocorrêncianatural enxertado nas seqüências estruturais de umanticorpo diferente com propriedades diferentes (vide,por exemplo, Riechmann, L.et al.(1998) Nature 332:323-327; Jones, P.et al.(1986) Nature 321:522-525; Queen,C.et al.(1989) Proc.Natl.Acad.vide U.S.A. 86:10029-10033;Patente americana 5.225.539 a Winter, e patentesamericanas Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e6.180.370 a Queen et al.).

Conseqüentemente, outra concretização refere-se a umanticorpo monoclonal isolado ou a uma porção ligante aoantígeno do mesmo, compreendendo uma região variável decadeia pesada que compreende seqüências CDRl, CDR2, eCDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidosselecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 11, 12,13, 14 e 15, SEQ ID NOS: 16, 17, 18, 19 e 20, e SEQ IDNOs: 21, 22, 23, 24 e 25, respectivamente, e uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo seqüências CDRl,CDR2 e CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29 e 30, SEQID NOs: 31, 32, 33, 34 e 35, e SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39e 40, respectivamente. Assim, tais anticorpos contêm asseqüências CDR Vh e Vll de anticorpos monoclonais 2H5,10B4, 8B5, 18E7 ou 69A7, podendo ainda conter seqüênciasestruturais diferentes desses anticorpos.

Tais seqüências estruturais podem ser obtidas de bancosde dados públicos de DNA ou de referências publicadas queincluam seqüências gênicas de anticorpo de linhagerminal. Por exemplo, as seqüências de DNA de linhagerminal para genes humanos da região variável de cadeiapesada e leve podem ser encontradas no banco de dados deseqüência de linha germinal humana "VBase" (disponível nainternet no www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como emKabat, E. A. et al.(1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition, U. S.Department ofHealth and Human Services, NIH Publication No. 91-3242;Tomlinson, I.M.,et al.(1992) "The Repertoire of HumanGermline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of VhSegments with Different Hypervariable Loops"J.Mol.Biol.227:776-798; e Cox, J.P.L.et al. (1994) "ADirectory of Human Germ-Iine Vh segments Reveals a StrongBias in Their Usage" Eur.J.Immunol. Z4:827-836; cujoconteúdo de cada um foi aqui expressamente incorporadopor referência.

Como um outro exemplo, as seqüências de DNA de linhagerminal para os genes de regiões variáveis de cadeiaspesadas e leves podem ser encontradas em bancos de dadosde seqüências Genbank com números de acesso: 1-69(NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 3-33 (NG_0010109 eNT_024637) e 3-7 (NG_0010109 e N_024637) . Como um outroexemplo, as seqüências de cadeia pesada de linha germinala seguir encontradas em camundongos Hcol2 HuMAb estãodisponíveis em bancos de seqüências GenBank acompanhandoo número de acesso: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 eBC070333), 5-51 (NG_0010109 e NT_024637), 4-34(NG_0 01010 9 e NT-24637), 3-30,3 (CAJ556644) e 3-23 (A-J4 0 6678).

Seqüências estruturais preferidas para uso nos anticorposda invenção são estruturalmente similares às seqüênciasestruturais utilizadas por anticorpos selecionados dainvenção, por exemplo, similares às seqüênciasestruturais Vh 3-30,3 (SEQ ID NO:51) e/ou as seqüênciasestruturais Vh 3-33 (SEQ ID NO: 52) e/ou as seqüênciasestruturais Vh 4-61 (SEQ ID NO: 53) e/ou as seqüênciasestruturais Vk L6 (SEQ ID NO:54), e/ou as seqüênciasestruturais Vk L18 (SEQ ID NO.:55), e/ou as seqüênciasestruturais Vk A15 (SEQ ID NO:56), utilizadas poranticorpos monoclonais preferidos da invenção. Asseqüências CDRl, CDR2 e CDR3 Vh e as seqüências CDRl,CDR2 e CDR3 Vk podem ser enxertadas em regiõesestruturais que possuam a seqüência idêntica à encontradano gene de imunoglobulina de linha germinal do qualderiva a seqüência estrutural, ou as seqüências de CDRpodem ser enxertadas em regiões estruturais que contenhamuma ou mais mutações se comparadas com as seqüências delinha germinal. Por exemplo, descobriu-se que em certoscasos, é benéfico alterar resíduos dentro das regiõesestruturais para manter ou aumentar a capacidade deligação do anticorpo ao antígeno (vide, por exemplo, aspatentes americanas 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e6.180.370 de Queen et al).

Outro tipo de modificação na região variável consiste emmutar os resíduos aminoácidos dentro das regiões CDRl,CDR2 e/ou CDR3 Vh e/ou Vk melhorando, assim, uma ou maispropriedades de ligação (ex: afinidade) do anticorpo deinteresse. A mutagênese sítio-direcionada ou a mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s)mutação(ões) e o efeito sobre a ligação ao anticorpo, ouem outra propriedade funcional de interesse, pode seravaliado em ensaios in vitro ou in vivo, conforme aquidescrito e fornecido nos Exemplos. São introduzidasmodificações conservativas preferidas (conforme discutidoacima). As mutações podem ser substituições, adições oudeleções de aminoácidos, porém, são preferivelmentesubstituições. Além disso, tipicamente não são alteradosmais que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR.

Conseqüentemente, em outra concretização, a invençãoprovê anticorpos monoclonais anti-CD70 isolados ouporções ligantes ao antígeno dos mesmos, compreendendouma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a)uma região CDRl Vh compreendendo uma seqüência deaminoácidoss selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs: 11, 12, 13, 14 ou 15, ou uma seqüência de aminoácidostendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições,deleções ou adições de aminoácido, se comparada com asSEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 ou 15; (b) uma região CDR2 Vhcompreendendo uma seqüência de aminoácidoss selecionadado grupo consistindo de SEQ ID NOS: 16, 17, 18, 19 e 20,ou uma seqüência de aminoácidos tendo uma, duas, três,quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos, se comparada com as SEQ ID NOs: 16, 17, 18,19 e 20; (c) uma região CDR3 Vh compreendendo umaseqüência de aminoácidoss selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24 e 25, ou umaseqüência de aminoãcidoss tendo uma, duas, três, quatroou cinco substituições, deleções ou adições deaminoácidos se comparada com SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24 e25; (d) uma região CDRl Vk compreendendo uma seqüência deaminoácidoss selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs: 26, 27, 28, 29 e 30, ou uma seqüência de aminoácidostendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições,deleções ou adições de aminoácidos se comparada com SEQID NOs: 26, 27, 28, 29 e 30; (e) uma região CDR2 Vkcompreendendo uma seqüência de aminoácidoss selecionadado grupo consistindo de SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34 e 35,ou uma seqüência de aminoácidoss tendo uma, duas, três,quatro ou cinco substituições, deleções ou adições deaminoácidos, se comparada com SEQ ID NOS: 31, 32, 33, 34e 3 5; e (f) uma região CDR3 Vk compreendendo umaseqüência de aminoácidoss selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39 e 40, ou umaseqüência de aminoácidoss tendo uma, duas, três, quatroou cinco substituições, deleções ou adições deaminoácidos, se comparada com SEQ ID NOS: 36, 37, 38, 39 e 40.

Anticorpos construídos da invenção incluem aqueles cujasmodificações foram efetuadas em resíduos estruturais emVh e/ou VK< por exemplo, para melhorar as propriedades doanticorpo. Tipicamente, tais modificações estruturais sãofeitas para reduzir a imunogenicidade do anticorpo. Porexemplo, um método consiste em fazer retro-mutação("backmutate") em um ou mais resíduos estruturais para aseqüência de linha germinal correspondente. Maisespecificamente, um anticorpo que tiver sido submetido àmutação somática poderá conter resíduos estruturais quediferem da seqüência da linha germinal da qual deriva oanticorpo. Tais resíduos podem ser identificadoscomparando-se as seqüências estruturais do anticorpo comas seqüências de linha germinal da qual deriva oanticorpo. Os referidos anticorpos "retro-mutados" tambémestão abrangidos pela descrição. Por exemplo, para 10B4,o resíduo de aminoácido #2 (dentro de FRl) de Vh é umaisoleucina sendo que este resíduo na seqüência de linhagerminal Vh 3-30,3 correspondente é uma valina. Pararetornar as seqüências de região estrutural para suaconfiguração de linha germinal, às mutações somáticaspodem ser retro-mutadas ("backmutated") para a seqüênciade linha germinal, por exemplo, através de mutagênesesítio-direcionada ou mediada por PCR (ex: resíduo #2 deFRl de Vh de 10B5 podem ser retro-mutadas de isoleucinapara valina).

Como outro exemplo, para 10B4, o resíduo aminoácido #30(dentro de FRl) de Vh é uma glicina, sendo que esseresíduo na seqüência de linha germinal Vh 3-30,3correspondente é uma serina. Para retornar as seqüênciasda região estrutural à sua configuração de linhagerminal, por exemplo, o resíduo #30 do Vh de 10B4 podeser retro-mutado ("backmutated") de glicina para serina.

Como outro exemplo, para 8B5, o resíduo aminoácido #24(dentro de FRl) de Vh é uma treonina, sendo que esseresíduo na seqüência de linha germinal Vh 3-33correspondente é uma alanina. Para retornar as seqüênciasda região estrutural à sua configuração de linhagerminal, por exemplo, o resíduo #24 de FRl de Vh de 8B5pode ser retro-mutado de treonina para alanina.

Como outro exemplo, para 8B5, o resíduo aminoácido #77(dentro de FR3) de Vh é uma lisina, sendo que esseresíduo na seqüência de linha germinal Vh 3-33correspondente é uma asparagina. Para retornar asseqüências da região estrutural à sua configuração delinha germinal, por exemplo, o resíduo #11 de FR3 de Vhde 8B5 pode ser retro-mutado de lisina para asparagina.

Como outro exemplo, para 8B5, o resíduo aminoácido #80(dentro de FR3) de Vh é uma serina, sendo que esseresíduo na seqüência de linha germinal Vh 3-33correspondente é uma tirosina. Para retornar asseqüências da região estrutural à sua configuração delinha germinal, por exemplo, o resíduo 14 de FR3 de Vhde 8B5 pode ser retro-mutado de serina para tirosina.Como outro exemplo, para 69A7, o resíduo aminoácido #50(dentro de FR2) de Vh é uma leucina, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal Vh 4-61correspondente é uma isoleucina. Para retornar asseqüências da região estrutural à sua configuração delinha germinal, por exemplo, o resíduo 13 de FR2 de Vh de69A7 pode ser retro-mutado de leucina para isoleucina.

Como outro exemplo, para 69A7, o resíduo aminoácido #85(dentro de FR3) de Vh é uma arginina, sendo que esseresíduo na seqüência de linha germinal Vh 4-61correspondente é uma serina. Para retornar as seqüênciasda região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo 18 de FR3 de Vh de 69A7pode ser retro-mutado de arginina para serina.Como outro exemplo, para 6 9A7, o resíduo aminoácido #8 9(dentro de FR3) de Vh é uma treonina, sendo que esseresíduo na seqüência de linha germinal Vh 4-61 correspondente é uma alanina. Para retornar as seqüênciasda região estrutural à sua configuração de linhagerminal, por exemplo, o resíduo 22 de FR3 de Vh de 69A7pode ser retro-mutado de treonina para alanina.Como outro exemplo, para 10B4, o resíduo aminoácido #4 6 (dentro de FR2) de Vl é uma f enilalanina, sendo que esseresíduo na seqüência de linha germinal Vl L18correspondente é uma leucina. Para retornar as seqüênciasda região estrutural à sua configuração de linhagerminal, por exemplo, o resíduo 12 de FR2 de Vl de 10B4 pode ser retro-mutado de fenilalanina para leucina.

Como outro exemplo, para 69A7, o resíduo aminoácido #49(dentro de FR2) de Vl é uma fenilalanina, sendo que esseresíduo na seqüência de linha germinal Vl L6correspondente é uma tirosina. Para retornar as seqüências da região estrutural â sua configuração delinha germinal, por exemplo, o resíduo 15 de FR2 de Vl de69A7 pode ser retro-mutado de fenilalanina para tirosina.Outros tipos de modificação estrutural envolvem mutar umou mais resíduos dentro da região estrutural, ou atémesmo dentro de uma ou mais regiões CDRi para remover osepítopos de célula T para assim reduzir a imunogenicidadepotencial do anticorpo. Esse método é também designado"desimunização" e está descrito em maiores detalhes napublicação de patente americana No. 20030153043 por Carr et al.

Os anticorpos construídos da presente invenção tambémincluem àqueles nos quais a modificação foi feita para oresíduo de aminoácido aumentar ou diminuir a respostaimunogênica por meio das modificações do aminoácido quealteram a interação com o epítopo da célula T noanticorpo (ver, por exemplo, as patentes U.S. Nos.:6,835,550; 6,897 e 6,936,249).

Adicionalmente ou alternativamente às modificaçõesefetuadas dentro das regiões estruturais ou CDR, osanticorpos da invenção podem ser construídos para incluirmodificações dentro da região Fc, tipicamente paraalterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo,tal como a meia-vida sérica, fixação de complemento,ligação a receptor Fc, e/ou citotoxicidade celularantígeno-dependente. Além disso, um anticorpo da invençãopode ser quimicamente modificado (ex: uma ou mais porçõesquímicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou modificadopara alterar sua glicosilação, novamente para alterar umaou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada umadessas concretizações é descrita em maiores detalhesabaixo. A numeração dos resíduos na região Fc é a doíndice EU de Kabat.

Em uma concretização, a região de dobra de CHl émodificada de forma tal que o número de resíduos cisteínana região de dobra é alterado, como por exemplo,aumentado ou reduzido. Esse método é descrito maisdetalhadamente na patente americana No. 5.677.425 deBodmer et al. O número de resíduos de cisteína na regiãode dobra de CHl é alterado, por exemplo, para facilitar amontagem das cadeias leve e pesada ou para aumentar oureduzir a estabilidade do anticorpo.

Em outra concretização, a região de dobra Fc de umanticorpo é mutada para reduzir a meia-vida biológica doanticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações deaminoácidos são introduzidas na região de interface dodomínio CH2-CH3 do fragmento de dobra-Fc, até que oanticorpo tenha danificado a ligação da proteína Aestafilocócica (SpA) em relação à ligação a SpA dedomínio de dobra Fc nativo. Esse método é descrito maisdetalhadamente na patente americana No. US 6.165.745 deWard et al.

Em outra concretização, o anticorpo é modificado paraaumentar sua meia-vida biológica. Diversos métodos sãopossíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintesmutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F,conforme descrito na patente americana No. 6.2 77.3 75 deWard. Alternativamente, para aumentar a meia-vidabiológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da regiãoCH1 ou Cl para conter um epítopo ligante ao receptor deresgate tomado de duas alças de um domínio CH2 de umaregião Fc de uma IgG, conforme descrito nas patentesamericanas Nos. 5.869.046 e 6.121.022, de Presta et al.

Em outras concretizações ainda, a região Fc é alteradasubstituindo-se pelo menos um resíduo de aminoácido porum resíduo de aminoácido diferente para alterar a(s)função(ões) efetoras do anticorpo. Por exemplo, um oumais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácidos234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem sersubstituídos por um resíduo de aminoácido diferente, deforma que o anticorpo tenha uma afinidade alterada por umligante efetor, mas que mantenha a capacidade de ligaçãoao antígeno do anticorpo parental. O ligante efetor noqual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, umreceptor Fc ou o componente Cl de complemento. Essemétodo é descrito com maiores detalhes nas patentesamericanas Nos. 5.624.821 e 5.648.260, ambas de Winter etal.

Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados deresíduos de aminoácidos 329, 331 e 322 podem sersubstituídos por um resíduo aminoácido diferente, de forma que o anticorpo altere a ligação a Clq e/ou reduzaou anule a citotoxicidade dependente de complemento(CDC) . Esse método é descrito com maiores detalhes napatente americana No. 6.194.551 de Idusogie et al.Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido nasposições de aminoácido 231 e 239 são alterados para assimalterar a capacidade de o anticorpo fixar o complemento.Esse método é descrito na publicação PCT WO 94/29351 deBodmer et al.

Em outro exemplo ainda, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade de o anticorpo mediar acitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)e/ou aumentar a afinidade do anticorpo por um receptor

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detalhadamente na Publicação PCT WO 00/42072 de Presta.Além disso, os sítios de ligação em IgGl humana paraFcyRl, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados e asvariantes com ligação melhorada foram descritas (videShields, R.L.et al.(2001) J.Biol.Chem 276:6591-6604).Mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334e 339 demonstraram melhorar a ligação a FcyRIII. Alémdisso, os seguintes mutantes de combinação demonstrarammelhorar a ligação a FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.

Em outra concretização, a glicosilação de um anticorpo émodificada. Por exemplo, pode-se preparar um anticorpoaglicosilado (ou seja, o anticorpo carece deglicosilação). A glicosilação pode ser alterada, porexemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo peloantígeno. Tais modificações de carboidrato podem serrealizadas, por exemplo, alterando-se um ou mais sítiosde glicosilação dentro da seqüência do anticorpo. Porexemplo, podem ser feitas uma ou mais substituições deaminoácido que resultem em eliminação de um ou maissítios de glicosilação na região estrutural variável paraassim eliminar a glicosilação naquele sítio. Essaaglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo peloantígeno. Tal método é descrito mais detalhadamente naspatentes americanas Nos. 5.714.350 e 6.350.861 de Co et al.

Em certas outras concretizações, pode-se preparar umanticorpo que tenha um tipo alterado de glicosilação, talcomo um anticorpo hipofucosilado tendo quantidadesreduzidas de resíduos fucosila ou um anticorpo comestruturas GlcNac bisegmentantes aumentadas. Tais padrõesde glicosilação alterada demonstraram aumentar acapacidade de ADCC dos anticorpos. Tais modificações decarboidrato podem ser efetuadas, por exemplo,expressando-se o anticorpo numa célula hospedeira commaquinário de glicosilação alterada. As células commaquinário de glicosilação alterados foram descritas noestado da técnica e podem ser usadas como célulashospedeiras nas quais são expressos os anticorposrecombinantes da invenção, para assim produzir umanticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, aslinhagens celulares Ms704, Ms705 e Ms709 carecem do genede fucosiltransferase, FUT8 (alfa(1,6)fucosiltransferase), de forma que os anticorposexpressados nas linhagens celulares Ms704, Ms705, e Ms709carecem de fucose em seus carboidratos. As linhagenscelulares Ms704, Ms705, e Ms709FUT8"/~ foram criadas pelorompimento direcionado do gene FUT8 em células CH0/DG44utilizando dois vetores de substituição (vide Publicaçãode patente americana No. 20040110704 de Yamana et al eYamame-Ohnuki et al (2004) Biotechnol Bioeng. 87:614-22) .Outro exemplo, EP 1.176.195 de Hanai et al. descreve umalinhagem celular com um gene FUT8 funcionalmente rompido,que codifica uma fucosil transferase, de forma que osanticorpos expressados em tal linhagem celular exibemhipofucosilação mediante redução ou eliminação da enzimarelacionada à ligação alfa 1,6. Hanai et al. tambémdescrevem as linhagens celulares que possuem baixaatividade enzimática para adicionar fucose à N-acetilglucosamina que se liga à região Fc do anticorpo ouque não possuem a atividade enzimática, por exemplo alinhagem celular de mieloma de rato YB2/0(ATCC CRL 1662).

A Publicação PCT WO 03/035835 de Presta descreve umalinhagem celular CHO variante, células Lecl3, comcapacidade reduzida de ligar fucose a carboidratosligados a Asn(297), o que também resulta emhipofucosilação de anticorpos expressados naquela célulahospedeira (vide também Shields, R.L. et al(2002)J.Biol.Chem. 277 :26733-26740) . A publicação PCT WO99/54342 de Umana et al. , descreve linhagens celularesconstruídas para expressar glicosil transferasesmodificadoras de glicoproteína (ex: beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII) de forma queos anticorpos expressados nas linhagens celularesconstruídas exibam estruturas GlcNac bisegmentantesaumentadas, o que resulta em atividade aumentada de ADCCdos anticorpos (vide também Umana et al.(1999) Nat.Biotech.l_7:176-180) . Alternativamente, os resíduos defucose do anticorpo podem ser clivados utilizando-se umaenzima fucosidase. Por exemplo, a fucosidase alfa-L-fucosidase remove resíduos fucosila de anticorpos(Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).

Outra modificação dos anticorpos prevista na presenteinvenção é a peglicosilação ("pegylation") . Um anticorpopode ser submetido a peglicosilação para, por exemplo,aumentar a meia-vida biológica (ex: sérica) do anticorpo.Para tratar com peglicosilação o anticorpo, o anticorpoou o fragmento do mesmo é tipicamente reagido compolietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ouderivado de aldeído de PEG, sob condições nas quais um ou mais grupos PEG ficam ligados ao anticorpo ou aofragmento de anticorpo. Preferivelmente, a peglicosilaçãoé conduzida via reação de acilação ou reação dealquilação com uma molécula de PEG reativo(ou um polímeroreativo análogo solúvel em água). Conforme aqui utilizado, o termo "polietileno glicol" pretende abrangerqualquer uma das formas de PEG que tenha sido utilizadapara derivatizar outras proteínas, tais como mono(Cl-C10)alcoxi- ou ariloxi-polietileno glicol ou polietileno-glicol-maleimida. Em certas concretizações, o anticorpo a ser tratado com PEG é um anticorpo aglicosilado. Métodospara tratar proteínas com PEGlicosilação são conhecidosno estado da técnica e podem ser aplicados aos anticorposda invenção. Vide, por exemplo, EP 0 154 316 de Nishimuraet al. e EP 0 401 384 de Ishikawa et al.

Propriedades Físicas do Anticorpo

Os anticorpos da presente invenção podem ser aindacaracterizados pelas várias propriedades físicas dosanticorpos anti-CD19. Diversos ensaios podem ser usadospara detectar e/ou diferenciar classes diferentes de anticorpos com base nessas propriedades físicas.

Em algumas concretizações, os anticorpos da presenteinvenção podem conter um ou mais sítios de glicosilaçãona região variável de cadeia leve ou pesada. A presençade um ou mais sítios de glicosilação na região variável pode resultar em imunogenicidade aumentada do anticorpoou numa alteração do pK do anticorpo devido à ligação aoantígeno alterado (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem4_1 :673-702 ; Gala FA e Morrison SL (2004) J Immunol172:5489-94; Wallick et al. (1988), J.Exp Med 168 :1099- 109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh etal (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al.(2000) MolImmunol . 37_: 697-706) . Sabe-se que a glicosilação ocorreem padrões contendo uma seqüência N-X-S/T. A glicosilaçãoem região variável pode ser testada utilizando um ensaioGlycoblot que cliva o anticorpo para produzir um Fab, eque então testa a glicosilação utilizando um ensaio quemede a oxidação de periodato e a formação de base Schiff.

Alternativamente, a glicosilação em região variável podeser testada utilizando-se cromatografia de luz Dionex(Dionex-LC) que cliva sacarídeos de um Fab emmonossacarídeos e analisa o teor de sacarídeo individual.

Em alguns casos, é preferido ter um anticorpo anti-CD19que não contenha glicosilação na região variável. Issopode ser obtido selecionando-se anticorpos que nãocontenham o padrão de glicosilação na região variável oumutando-se resíduos dentro do padrão de glicosilaçãoutilizando técnicas padrão conhecidas no estado datécnica.

Em uma concretização preferida, os anticorpos da presenteinvenção não contêm sítios de isomerismo de asparagina.Um efeito de desamidação ou de ácido isoaspártico podeocorrer em seqüências N-G ou D-G, respectivamente. 0efeito de desamidação ou de ácido isoaspártico resulta nacriação de ácido isoaspártico que reduz a estabilidade deum anticorpo, criando uma estrutura dobrada fora de umterminal carboxi de cadeia lateral ao invés de na cadeiaprincipal. A criação de ácido isoaspártico pode sermedida utilizando-se um ensaio iso-quant que utiliza umaHPLC de fase reversa para testar o ácido aspártico.

Cada anticorpo terá um ponto isoelétrico inédito (pl),mas geralmente os anticorpos enquadram-se na faixa de pHde 6 e 9,5. O pi para um anticorpo IgGl enquadra-setipicamente na faixa de pH de 7-9,5 e o pi para umanticorpo IgG4 enquadra-se tipicamente na faixa de pH de6-8. Os anticorpos podem ter um pi que esteja fora dessafaixa. Embora os efeitos sejam geralmente desconhecidos,existe uma especulação de que os anticorpos com um pIfora da faixa normal podem apresentar alguma não-dobra einstabilidade nas condições ín vivo. 0 ponto isoelétricopode ser testado utilizando-se um ensaio de focalizaçãoisoelétrica capilar que cria um gradiente de pH e quepode utilizar focalização a laser para aumentar aprecisão (Janini et al.(2002) Electrophoresis 23:1605-11;

Ma et al. (2 001) Chromatographia 53:S75:89; Hunt et al.(1998) J.Chromatogr A 800:355-67) . Em alguns casos, épreferido ter um anticorpo anti-CD19 que contenha umvalor de pi enquadrado na faixa normal. Isso pode serobtido selecionando-se anticorpos com um pi na faixanormal, ou mutando-se resíduos de superfície carregada,utilizando técnicas padrão bastante conhecidas no estadoda técnica.

Cada anticorpo terá uma temperatura de fusão indicativade estabilidade térmica (Krishnamurthy R and Manning MC(2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Uma estabilidadetérmica mais alta indica maior estabilidade global doanticorpo in vivo. 0 ponto de fusão de um anticorpo podeser medido utilizando-se técnicas tais como calorimetriadiferencial de varredura (Chen et al.(2003) Pharma Res20:1952-60; Ghirlando et al(1990) Immunol Lett 68:47-52).Tmi indica a temperatura de não-dobra inicial doanticorpo. TM2 indica a temperatura de não-dobra completado anticorpo. Geralmente, é preferido que a Tmi de umanticorpo da presente invenção seja superior a 60°C, preferivelmente superior a 65°C, e ainda maispreferivelmente superior a 70°C. Alternativamente, aestabilidade térmica de um anticorpo pode ser medidautilizando-se dicroismo circular (Murray et al. (2002)J.Chromatogra Sci 4^:343-9).

Em uma concretização preferida, são selecionados osanticorpos que não se degradam rapidamente. Afragmentação de um anticorpo anti-CD19 pode ser medidautilizando-se eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS,conforme é entendido no estado da técnica (Alexander AJ eHughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).

Em outra concretização preferida, são selecionados osanticorpos que possuam efeitos de agregação mínimos. Aagregação pode levar à ativação de uma resposta imuneindesejada e/ou a propriedades farmacocinéticas alteradasou desfavoráveis. Geralmente, são aceitáveis osanticorpos com agregação de 25% ou menos, preferivelmente20% ou menos, ainda mais preferivelmente de 15% ou menos,ainda mais pref erivelmente 10% ou menos ou ainda maispreferivelmente 5% ou menos. A agregação pode ser medidaatravés de diversas técnicas bastante conhecidas noestado da técnica, incluindo cromatografia líquida dealto desempenho (HPLC) com coluna de exclusão pordimensão (SEC) e dispersão de luz para identificarmonômeros, dímeros, trímeros ou multímeros.

Métodos para Construir Anticorpos

Conforme discutido acima, os anticorpos anti-CD70 tendoseqüências Vh e Vk aqui descritos podem ser usados paracriar novos anticorpos anti-CD70 modificando-se asseqüências Vh e/ou VK, ou a(s) região(ões) constantes aelas ligadas. Assim, em outro aspecto da invenção, ascaracterísticas estruturais de um anticorpo anti-CD70 dainvenção, por exemplo, 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 ou 69A7, sãousadas para criar anticorpos anti-CD70 estruturalmenterelacionados que retenham pelo menos uma propriedadefuncional dos anticorpos da invenção, tal como ligação aoCD70 humano. Por exemplo, uma ou mais regiões CDR de 2H5,10B4, 8B5, 18E7 ou 69A7, ou suas mutações, podem sercombinadas recombinantemente com regiões estruturaisconhecidas e/ou com outras CDRs conhecidas para criaranticorpos anti-CD70 adicionais recombinantementeconstruídos da invenção, conforme discutido acima. Outrostipos de modificações incluem àquelas descritas na seçãoanterior. O material de partida para o método deconstrução é uma ou mais das seqüências Vh e/ou Vk aquiprovidas, ou uma ou mais de suas regiões CDR. Para criaro anticorpo construído, não é necessário efetivamentepreparar (ou seja, expressar como proteína) um anticorpotendo uma ou mais das seqüências Vh e/ou Vk aquiprovidas, ou uma ou mais de suas regiões CDR. Em vezdisso, as informações contidas na(s) seqüência(s) sãoutilizadas como o material de partida para criar umaseqüência (s) de "segunda geração" derivada(s) daseqüência(s) original e então a seqüência(s) de "segundageração" é preparada e expressada como uma proteína.

Conseqüentemente, em outra concretização, a invençãoprovê um método para preparar um anticorpo anti-CD70compreendendo:

(a) prover: (i) uma seqüência de anticorpo de regiãovariável de cadeia pesada compreendendo uma seqüênciaCDRl selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs:11,12, 13, 14 e 15, uma seqüência CDR2 selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19 e 20 e/ouuma seqüência CDR3 selecionada do grupo consistindo deSEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24 e 25; e/ou (ii) uma seqüênciade anticorpo de região variável de cadeia levecompreendendo uma seqüência CDRl selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29 e 30, umaseqüência CDR2 selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs: 31, 32, 33, 34 e 35 e/ou uma seqüência CDR3selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 3 9 e 40;

(b) alterar pelo menos um resíduo aminoácido dentro daseqüência de anticorpo da região variável de cadeiapesada e/ou da seqüência de anticorpo da região variávelde cadeia leve para criar pelo menos uma seqüência deanticorpo alterado; e

(c) expressar a seqüência de anticorpo alterado como umaproteína.

Técnicas padrão de biologia molecular podem ser usadaspara preparar e expressar a seqüência de anticorpoalterado.

Preferivelmente, o anticorpo codificado pela(s)seqüência(s) de anticorpo alterado(s) é aquele que retêmuma, algumas ou todas as propriedades funcionais dosanticorpos anti-CD70 aqui descritos, cujas propriedadesfuncionais incluem, porém não se restringem a ligar-se aoCD70 .

As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podemser avaliadas utilizando-se ensaios padrão disponíveis noestado da técnica e/ou aqui descritos, tais como os estabelecidos nos Exemplos (ex: citometria de fluxo,ensaios de ligação).

Em certas concretizações dos métodos para construiranticorpos da invenção, mutações podem ser introduzidasaleatória ou seletivamente ao longo de toda ou de parte de uma seqüência de codificação de anticorpo anti-CD70 eos anticorpos anti-CD70 modificados resultantes podem seridentificados quanto à atividade de ligação e/ou outraspropriedades funcionais conforme aqui descrito. Métodosmutacionais foram descritos no estado da técnica. Por exemplo, a publicação PCT WO 02/092780 de Short descrevemétodos para criar e identificar mutações de anticorposutilizando mutagênese de saturação, montagem de ligaçãosintética, ou uma combinação dos mesmos.

Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 de Lazar et al., descreve métodos para utilizar métodoscomputacionais de identificação para otimizar aspropriedades físico-químicas dos anticorpos.

Moléculas de ácido nucléico que codificam anticorpos dainvenção

Um outro aspecto da invenção refere-se a moléculas deácido nucléico que codificam os anticorpos da invenção.

Os ácidos nucléicos podem estar presentes em célulascompletas, num lisado de células, ou numa formaparcialmente purificada ou substancialmente pura. Umácido nucléico é "isolado" ou "tornado substancialmentepuro" quando purificado separadamente de outroscomponentes celulares ou outros contaminantes, como porexemplo, outros ácidos nucléicos celulares ou proteínas,através de técnicas padrão, incluindo o tratamentoalcalino/SDS, bandeamento CsCl, cromatografia de coluna,eletroforese em gel de agarose e outros muito conhecidosno estado da técnica. Vide, F.Ausubel et al. , ed. (1987)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishingand Wiley Interscience, New York. Um ácido nucléico dainvenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou nãoconter seqüências intrônicas. Numa concretizaçãopreferida, o ácido nucléico é uma molécula de cDNA.

Os ácidos nucléicos da invenção podem ser obtidosutilizando-se técnicas padrão de biologia molecular. Paraanticorpos expressos por hibridomas (ex: hibridomaspreparados a partir de camundongos transgênicos portando genes de imunoglobulina humana conforme descrito logoabaixo) cDNAs codificando as cadeias leve e pesada doanticorpo produzido pelo hibridoma podem ser obtidosatravés de técnicas de amplificação PCR padrão declonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos de um banco degene de imunoglobulina (ex: utilizando técnicas deexibição de fago), o ácido nucléico codificador doanticorpo pode ser recuperado do banco.

As moléculas preferidas de ácido nucléico da invenção sãoàquelas codificadoras das seqüências VH e VL dos anticorpos monoclonais 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 ou 69A7. Asseqüências de DNA codificantes das seqüências VH de 2H5,10B4, 8B5, 18E7 ou 69A7 estão mostradas nas seqüênciasSEQ ID Nos: 41, 42, 43, 44 e 45, respectivamente. Asseqüências de DNA codificantes das seqüências VL de 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 ou 69A7 estão mostradas nas SEQ ID Nos:46, 47, 48, 49 e 50, respectivamente.

Uma vez que os fragmentos de DNA codificantes dossegmentos VH e VL são obtidos, estes fragmentos de DNApodem ser então manipulados por técnicas de DNArecombinante padrão, por exemplo, para converter os genesda região variável para os genes da cadeia de extensãocompleta do anticorpo, para o gene do fragmento Fab oupara um gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento deDNA codificante de VL ou VH é operativãmente ligado a um outro fragmento de DNA codificante de uma outra proteína,tal como uma região constante do anticorpo ou um liganteflexível. 0 termo "operativamente ligado" como utilizadoneste contexto, entende-se significar que os doisfragmentos de DNA estão ligados de modo que as seqüênciasde aminoácidos, codificadas pelos dois fragmentos de DNApermaneçam na estrutura.

O DNA isolado codificante da região VH pode serconvertido em um gene de cadeia pesada de extensãocompleta por ligação operativa com o DNA codificante deVH em uma outra molécula de DNA codificante das regiõesconstantes de cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). Asseqüências dos genes de região constante de cadeia pesadahumana são conhecidas do estado da técnica (ver, porexemplo, Kabt, E.A., et al., (1991), Sequences ofProteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIH PublicationNo. 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo estas regiõespodem ser obtidos por amplificação por PCR padrão. Aregião constante da cadeia pesada pode ser uma regiãoconstante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ouIgD, mas mais preferivelmente, é uma região constante deIgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Para o gene de cadeia pesada dofragmento Fab, o DNA codificante de VH pode ser ligadooperativamente a uma outra molécula de DNA codificanteapenas da região constante de CHl de cadeia pesada.

O DNA isolado codificante da região de VL pode serconvertido em um gene de cadeia leve de extensão completa(bem como um gene de cadeia leve do fragmento Fab) porligação operativa do DNA codificante de VL a uma outramolécula de DNA codificante da região constante de cadeialeve, CL. As seqüências de genes de região constante decadeia leve humana são conhecidas do estado da técnica(ver, por exemplo, Kabt, E.A. et al. , (1991), Sequencesof Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,U.S. Department of Health and Human Services, NIHPublication No. 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendoestas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCRpadrão. A região constante de cadeia leve pode ser umaregião constante Kappa ou Lambda, mas maispreferivelmente, é uma região constante de Kappa.Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNAcodificantes de VH e VL são operativamente ligados a umoutro fragmento codificante de uma ligação flexível, porexemplo, codificante de seqüência de aminoácidoss (Gly4-Ser)3, de modo que as seqüências VH e VL possam serexpressas como uma proteína de cadeia única contínua, comas regiões VH e VL ligadas por uma ligação flexível (ver,por exemplo, Bird et al. , (1988) Science 242:423-426;Huston et al. , (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; Mc Cafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).

Produção de anticorpos monoclonais da invenção

Os anticorpos monoclonais (mAbs) da presente invençãopodem ser produzidos através de uma variedade detécnicas, incluindo a metodologia convencional deanticorpo monoclonal, como por exemplo, a técnica padrãode hibridação de célula somática de Kohler e Milstein(1975) Nature 256:495. Embora os procedimentos dehibridação de célula somática sejam preferidos, emprincípio, outras técnicas para produzir anticorpomonoclonal podem ser empregadas, como por exemplo, atransformação viral ou oncogênica de linfócitos B.O sistema animal preferido para preparar hibridomas é osistema murino. A produção de hibridoma no camundongo éum procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos etécnicas de imunização para isolamento de esplenócitosimunizados para fusão são conhecidos no estado datécnica. Pares de fusão (ex: células de mieloma murino) eprocedimentos de fusão são também conhecidos.

Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invençãopodem ser preparados com base na seqüência de umanticorpo monoclonal murino preparado conforme acimadescrito. O DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeialeve e pesada pode ser obtido do hibridoma murino deinteresse e construído para conter seqüências deimunoglobulina não-murina (ex: humana) utilizando astécnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, paracriar um anticorpo quimérico, regiões murinas variáveispodem ser ligadas a regiões humanas constantes utilizandoos métodos conhecidos no estado da técnica (vide, porexemplo, a patente americana No. 4.816.567 de Cabilly etal. ) . Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDRmurinas podem ser inseridas em uma estrutura humanautilizando os métodos conhecidos no estado da técnica(vide, por exemplo, a patente americana No. 5.22 5.53 9 deWinter, e as patentes americanas Nos. 5.530.101;5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al.).

Em uma concretização preferida, os anticorpos da invençãosão anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorposmonoclonais humanos dirigidos contra CD70 podem sergerados utilizando camundongos transgênicos ou transcromossômicos que carregam partes do sistema imunehumano em vez do sistema camundongo. Esses camundongostransgênicos e transcromossômicos incluem camundongosdesignados como camundongos HuMAb® e KM mice®,respectivamente, e são coletivamente designados napresente invenção como "camundongos contendo Ig humana".

O camundongo HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.) contémminilocais ("miniloci") de gene de imunoglobulina humanaque codificam seqüências de imunoglobulina humana não re-arranjadas de cadeia pesada (μ e γ) e leve κ, juntamentecom mutações direcionadas que inativam os locais decadeia μ e κ endógena (vide, por exemplo, Lonberg, et al.(1994) Nature 368(6474):856-859). Conseqüentemente, oscamundongos exibem expressão reduzida de IgM ou κ decamundongo e, em resposta à imunização, os transgeneshumanos de cadeia pesada e leve introduzidos sofremmudança de classe e mutação somática para geraranticorpos monoclonais humanos Ig Gk de alta afinidade(Lonberg, N.et al.(1994), supra; revisado em Lonberg,N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49- 101; Lonberg N. e Huszar, D. (1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93 e Harding, F. e Lonberg,N. (1995) Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546) . A preparação e ouso de camundongos HuMAb bem como as modificaçõesgenômicas carregadas por tais camundongos, são aindadescritas em Taylor, L.et al.(1992) Nucleic AcidsResearch 210:6287-6295; Chen, JH.et al.(1993)International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724; Choi et al.(1993)Nature Genetics 4:117-123; Chen, J.et al.(1993) EMBOJ. 12 .-821-830; Tuaillon et al.(1994) J.Immunol.152:2 912-2920; Taylor, L.et al.(1994) International Immunology6:579-591; e Fishwild, D.et al.(1996) NatureBiotechnology 14^845-851, cujos conteúdos foram aquiincorporados especificamente por referência em suatotalidade. Vide, ainda, as patentes americanas Nos.5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650;5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429;todos de Lonberg e Kay; patente americana No. 5.54 5.807de Surani et al. ; Publicação PCT Nos. WO 92/03918,W093/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO99/45962, todos de Lonberg e Kay; e Publicação PCT No. WO01/14424 de Korman et al.

Em outra concretização, os anticorpos humanos da invençãopodem ser produzidos utilizando um camundongo que carregaseqüências de imunoglobulina humana em transgenes etranscromossomos, tal como um camundongo que carrega umtransgene humano de cadeia pesada e um transcromossoraohumano de cadeia leve. Tais camundongos, aqui designadoscamundongos "KM mice®" são descritos detalhadamente naPublicação PCT WO 02/43478 de Ishida et al.

Os sistemas animais transgênicos alternativos expressandogenes de imunoglobulina humana estão disponíveis noestado da técnica e podem ser usados para produziranticorpos anti-CD7 0 da invenção. Por exemplo, um sistematransgênico alternativo designado Xenomouse (Abgenix,Inc.) pode ser usado; tais camundongos são descritos, porexemplo, nas patentes americanas Nos. 5.93 9.598;6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 deKucherlapati et al.Além disso, sistemas animais transcromossômicosalternativos expressando genes de imunoglobulina humanaestão disponíveis no estado da técnica e podem ser usadospara produzir anticorpos anti-CD70 da invenção. Porexemplo, camundongos carregando tanto um transcromossomohumano de cadeia pesada como um transcromossomo humano decadeia leve, designados como "camundongos TCn podem serusados; tais camundongos são descritos em Tomizuka etal.(2000) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 97:722-727. Além disso,vacas portando os transcromossomos humanos de cadeia levee pesada foram descritas no estado da técnica (Kuroiwa etal.(2002) Nature Biotechnology 20:889-894) e podem serusadas para produzir anticorpos anti-CD70 da invenção.Anticorpos monoclonais humanos da invenção também podemser preparados utilizando métodos de exibição de fagopara identificar bancos de genes de imunoglobulinahumana. Tais métodos de exibição de fago para isolaranticorpos humanos são estabelecidos no estado datécnica. Vide, por exemplo, as patentes americanas Nos.5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 de Ladner et al;Patentes americanas Nos. 5.427.908 e 5.580.717 de Doweret al. ; Patentes Americanas Nos. 5.9698.108 e 6.172.197de McCafferty et al. ; e patentes americanas Nos.5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915, e6.593.081 de Griffiths et al.

Os anticorpos monoclonais humanos da invenção tambémpodem ser preparados utilizando camundongos SCID nosquais as células imunes humanas foram reconstituídas deforma que uma resposta a anticorpo humano possa sergerada quando da imunização. Tais camundongos sãodescritos, por exemplo, nas patentes americanas NOs.5.476.996 e 5.698.767 de Wilson et al.

Imunização de Camundongos com Ig Humana

Quando camundongos com Ig humana são utilizados paraproduzir anticorpos humanos da invenção, tais camundongospodem ser imunizados com uma preparação purificada ou umaenriquecida de antígeno CD70 e/ou uma CD70 recombinante,ou uma proteína de fusão CD70, conforme descrito porLonberg N.et al.(1994) Nature 368 (6474) : 856-859;Fishwild, D.et al.(1996) Nature Biotechnology 14:845-851;e publicação PCT WO 98/24884 e WO 01/14424.

Preferivelmente, os camundongos terão de 6-16 semanas devida quando da primeira infusão. Por exemplo, umapreparação purificada ou recombinante (5-50^g) deantígeno CD70 pode ser utilizada para imunizar ocamundongo com Ig humana intraperitonealmente. Procedimentos detalhados para gerar anticorposmonoclonais totalmente humanos para CD70 são descritos noExemplo 1 abaixo. A experiência cumulativa com diversosantígenos tem demonstrado que os camundongos transgênicosrespondem, quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (IP) , com o antígeno adjuvante deFreund completo, seguido de imunizações IP semana sim,semana não, (até um total de 6) com antígeno em adjuvantede Freund incompleto. Porém, adjuvantes outros que não ode Freund também se mostraram eficazes. Além disso, células completas na ausência do adjuvante demonstraramser altamente imunogênicas. A resposta imune pode sermonitorada durante o curso do protocolo de imunização comamostras de plasma sendo obtidas por sangramentos retro-orbitais. 0 plasma pode ser identificado através de teste ELISA e camundongos com títulos suficientes deimunoglobulina humana anti-CD70 podem ser usados para asfusões (conforme descrito no Exemplo 1 abaixo). Oscamundongos podem receber antígeno intravenosamente 3dias antes do sacrifício e remoção do baço. Espera-se que precisem ser realizadas de 2-3 fusões para cadaimunização. Entre 6 e 24 camundongos são tipicamenteimunizados para cada antígeno. Geralmente, são utilizadastanto as cepas HCo7 como HCol2. A produção de cepas decamundongo Hco7 e Hcol2 está descrita na patente U.S. No. 5,770,429 e no Exemplo 2 da Publicação Internacional doPCT - WO 01/09187, respectivamente. Além disso, tanto otransgene HCo7 como HCol2 pode ser gerado junto em umúnico camundongo que tenha dois transgenes humanodiferente de cadeia pesada (HCo7/HCol2).Alternativamente,ou adicionalmente, a cepa do KM Mouse® pode ser usada,como descrito na Publicação do PCT WO 02/43478.

Geração de hibridomas que produzem anticorpos monoclonaishumanos da invenção

Para gerar hibridomas que produzam os anticorposmonoclonais humanos da invenção, esplenócitos e/oucélulas de nódulos linfáticos de camundongos imunizadospodem ser isolados e fundidos a uma linhagem celularimortalizada apropriada, tal como uma linhagem celular demieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podemser identificados quanto à produção de anticorposantígeno-específicos. Por exemplo, suspensões celularessimples de linfócitos esplênicos de camundongosimunizados podem ser fundidas até um sexto do número decélulas de mieloma de camundongo não-secretoras P3X63-Ag8 .653 (ATCC, CRL 1580) com PEG a 50%.

Alternativamente, a suspensão de células dos linfócitosesplênicos de camundongos imunizados pode ser fundidausando um método de eletrofusão baseado em campoelétrico, usando um eletroporador de fusão celular comuma câmara de Cyto Pulse grande (uCyto Pulse Sciences",Inc., Glen Burnie, MD). As células são plaqueadas emaproximadamente 2 χ IO5 em uma placa de microtitulação defundo plano, seguido de incubação por duas semanas em ummeio de DMEM com alto teor de glicose com L-glutamina epirivato de sódio (Mediatech, Inc., Herndon, VA) e aindaum meio contendo soro fetal Bovino a 20% (Hyclone, Logan,UT), 18% de meio condicional P388DI, 5% de fator declonagem Origen Hybridoma (Bio Veris, Gaithersburg, VA),4mM L-glutamina, 5mM HEPES, 0,055 mM β-mercaptoetanol, 50unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml estreptomicina e IXde Hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Sigma; theHAT é adicionado 24 horas após a fusão). Apósaproximadamente duas semanas, as células podem sercultivadas em meio no qual HAT é substituído por HT. Ospoços individuais podem então ser identificados atravésde ELISA quanto aos anticorpos monoclonais humanos IgM eIgG. Ocorrido o crescimento extensivo do hibridoma, omeio pode ser observado geralmente após 10-14 dias. Oshibridomas secretores de anticorpos podem ser re-plaqueados, identificados novamente, e se ainda forempositivos para IgG humana, os anticorpos monoclonaispodem ser subclonados pelo menos duas vezes limitando-sea diluição. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades deanticorpo em meio de cultura de tecidos paracaracterização.

Para purificar os anticorpos monoclonais humanos,hibridomas selecionados podem ser crescidos em frascos tipo "spinner" de dois litros para purificação deanticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem serfiltrados e concentrados antes da cromatografia porafinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway,N.J.) . A IgG eluída pode ser examinada através de eletroforese em gel e cromatograf ia líquida de altodesempenho para garantir a pureza. A solução tampão podeser trocada por PBS e a concentração pode ser determinadapor OD280 utilizando coeficiente de extinção de 1,43. Osanticorpos monoclonais podem ser aliquotados earmazenados a -80°C.

Geração de anticorpos monoclonais Produtores detransfectomas da invenção

Os anticorpos da invenção podem ser também produzidos emum transfectoma de célula hospedeira utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante emétodos de transfecção gênica conforme é conhecido noestado da técnica (ex: Morrison, S.(1985) Science229:1202) .

Por exemplo, para expressar anticorpos, ou os fragmentos de anticorpos dos mesmos, os DNAs que codificam cadeiasleves e pesadas de extensão parcial ou completa, podemser obtidos através de técnicas padrão de biologiamolecular (ex: amplificação PCR ou clonagem CDNAutilizando um hibridoma que expresse o anticorpo deinteresse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores deexpressão de forma que os genes sejam operativamenteligados às seqüências de controle transcricionais etranslacionais. Neste contexto, o termo "operativamenteligado" pretende significar que um gene de anticorpo éligado num vetor de forma que as seqüências de controletranscricionais e translacionais dentro do vetor realizemsua função pretendida de regular a transcrição etranslação do gene de anticorpo. O vetor de expressão eas seqüências de controle de expressão são selecionadospara serem compatíveis com a célula hospedeira deexpressão usada. O gene de cadeia leve do anticorpo e ogene de cadeia pesada do anticorpo pode ser inserido emvetor separado ou, mais tipicamente, ambos os genes sãoinseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes deanticorpo são inseridos no vetor de expressão através demétodos padrão (ex: ligação de sítios de restriçãocomplementares no fragmento de gene de anticorpo e vetor,ou ligação da extremidade enfraquecida ("blunt-endligation") se nenhum sítio de restrição estiverpresente). As regiões variáveis de cadeia leve e pesadados anticorpos aqui descritos podem ser utilizadas paracriar genes de anticorpo de extensão completa de qualquerisótopo de anticorpo inserindo-os em vetores de expressãoque já codificam regiões constantes de cadeia pesada e decadeia leve do isótopo desejado, de forma que o segmentoVh seja operativamente ligado ao(s) segmento(s) Ch dentrodo vetor e o segmento Vk seja operativamente ligado aosegmento Cl dentro do vetor. Adicionalmente oualternativamente, o vetor de expressão recombinante podecodificar um peptídeo sinal que facilite a secreção dacadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. 0 gene decadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de formaque o peptídeo sinal seja ligado na estrutura ("in-frame") ao terminal amino do gene de cadeia de anticorpo.O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal deimunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (ou seja,um peptídeo sinal de uma proteína não de imunoglobulina) .

Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vetores deexpressão recombinantes da invenção carregam seqüênciasregulatórias que controlam a expressão dos genes decadeia de anticorpo numa célula hospedeira. 0 termo"seqüência regulatória" pretende incluir promotores,intensificadores e outros elementos de controle deexpressão (ex: sinais de poliadenilação) que controlam atranscrição ou translação dos genes de cadeia deanticorpo. Tais seqüências regulatórias são descritas,por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)). Será apreciado pelos habilitados na técnica queo desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção deseqüências regulatórias, podem depender de fatores taiscomo a seleção da célula hospedeira a ser transformada,do nível de expressão da proteína desejada, etc. Asseqüências regulatórias preferidas para expressão decélula hospedeira de mamífero incluem os elementos viraisque dirigem altos níveis de expressão de proteína emcélulas de mamífero, tais como os promotores e/ouintensificadores derivados de citomagalovírus (CMV),Vírus Símio (SV40), adenovírus (ex: o promotor tardiomaior do adenovírus (AdMLP)e polioma). Alternativamente,as seqüências regulatórias não-virais podem ser usadas,tal como o promotor de ubiquitina ou promotor de β-globina. Outrossim, os elementos regulatórios compostosde seqüências de fontes diferentes, tal como o sistemapromotor SRct, que contém seqüências do promotor precoceSV40 e o terminal de repetição longa do vírus de leucemiade célula T humana do tipo 1 (Takebe, Y. et al.(1988) MolCell Biol.8:466-472).

Além dos genes de cadeia de anticorpo e das seqüênciasregulatórias, os vetores de expressão recombinante dainvenção podem carregar seqüências adicionais, tais comoseqüências que regulam a replicação do vetor em célulashospedeiras (ex:origens de replicação) e genes marcadoresselecionáveis. 0 gene marcador selecionável facilita aseleção de células hospedeiras nas quais o vetor foiintroduzido (vide, por exemplo, as patentes americanasNos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todos de Axel etal. ). Por exemplo, tipicamente o gene marcadorselecionável confere resistência a fármacos, tais comoG418, higromicina ou metotrexato, em uma célulahospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genesmarcadores selecionáveis preferidos incluem o gene dedihidrofolato reductase (DHFR) (para uso em célulashospedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato)e o neo-gene (para seleção de G418).

Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es)de expressão que codificam as cadeias leve e pesada étransfectado numa célula hospedeira através de técnicaspadrão. As diversas formas do termo "transfecção"pretendem abranger uma ampla variedade de técnicascomumente utilizadas para a introdução de DNA exógenodentro de uma célula hospedeira procariótica oueucariótica, como por exemplo, eletroporação,precipitação cálcio-fosfato, transfecção DEAE-dextrano esimilares. Embora seja teoricamente possível expressar osanticorpos da invenção em células hospedeirasprocarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorposem células eucarióticas, e o mais preferivelmente emcélulas hospedeiras de mamífero, é a mais preferida poistais células eucarióticas e, em especial, células demamífero, têm mais probabilidade de montar e secretar umanticorpo adequadamente revelado e imunologicamente ativodo que as células procarióticas. A expressão procarióticade genes de anticorpo foi reportada como ineficaz paraprodução de altos rendimentos de anticorpo ativo (Boss,M.A. e Wood, C.R.(1985) Immunology Today 6:12-13).

Células hospedeiras de mamífero preferidas para expressaros anticorpos recombinantes da invenção incluem célulasde Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindocélulas CHO dhfr-, descritas em Urlaub e Chasin, (1980)Proc. Natl.Acad.Sci. USA 77:16-4220, utilizadas com ummarcador selecionável DHFR, como por exemplo, conformedescrito em R.J.Kaufman e P.A.Sharp (1982)J.Mol.Biol.159 : 601-621), células de mieloma NSO, célulasCOS e células SP2. Em especial, para uso com células demieloma NSO, outro sistema de expressão preferido é osistema de expressão gênica GS descrito em WO 87/04462,WO 89/01036 e EP 338.841. Quando os vetores de expressãorecombinante codificando genes de anticorpo sãointroduzidos em células hospedeiras de mamífero, osanticorpos são produzidos cultivando-se as célulashospedeiras por um período de tempo suficiente parapermitir expressão do anticorpo nas células hospedeirasou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meiode cultura no qual as células hospedeiras são crescidas.Os anticorpos podem ser recuperados do meio de culturautilizando-se métodos padrão de purificação de proteína.

Caracterização de Ligação do Anticorpo a Antígeno

Os anticorpos da invenção podem ser testados quanto àligação aO CD7 0 por, por exemplo, citometria de fluxo.Resumidamente, as células expressando CD70 são colhidasrecentemente a partir da cultura de tecido em frascos euma suspensão de células única foi preparada. Assuspensões de célula expressando CD70 foram tambémcoradas com o anticorpo primário diretamente ou após afixação com 1% de paraf ormaldeído em PBS.

Aproximadamente, um milhão de células foram suspensas emPBS contendo 0,5% de BSA e 50-200 μg/ml do anticorpoprimário e incubadas em gelo por 3 0 minutos. As célulasforam lavadas duas vezes com PBS contendo 0,1% de BSA,0,01% de NaN3, re-suspensas em 10 0 μΐ de uma IgG decabra-anti-humana FITC-conjugada diluída a 1:100 (JacksonImmunoResearch, West Grove, PA) e incubada em gelo por umperíodo adicional de 3 0 minutos. As células foramnovamente lavadas duas vezes, re-suspensas em 0,5 ml detampão aquoso e analisadas para coloração fluorescentesem um citômetro FACSCalibur (Becton-Dickinson, San Jose,CA) .

Alternativamente, os anticorpos da invenção podem sertestados quanto à ligação ao CD70 por ELISA padrão.Resumidamente, as placas de microtitulação são revestidascom CD70 purificado a 0,25^g/ml em PBS, e entãobloqueadas com albumina de soro bovino a 5% em PBS. Asdiluições de anticorpo (ex: diluições de plasma decamundongos imunizados com CD70) são adicionadas em cadapoço e incubadas durante 1-2 horas a 37°C. As placas sãolavadas com PBS/Tween e então incubadas com um reagentesecundário (ex: para anticorpos humanos, um reagentepoliclonal Fc-específico IGc anti-humano de cabra) conjugado a fosfatase alcalina durante 1 hora a 37°C.Após lavagem, as placas são desenvolvidas com substratopNPP (1 mg/ml) e analisadas em OD de 405-650.Preferivelmente, os camundongos que desenvolverem astitulações mais altas serão usados nas fusões.

Um ensaio ELISA, conforme acima descrito, pode também serusado para identificar hibridomas que mostram reatividadepositiva com imunógeno CD70. Hibridomas que se ligam comalta avidez ao CD70 são subclonados e entãocaracterizados. Um clone de cada hibridoma, que retém areatividade das células parentais (através de ELISA) podeser selecionado para preparar um banco de células de 5-10frascos armazenados a -140°C e para purificação deanticorpo.

Para purificar anticorpos anti-CD70, hibridomasselecionados podem ser crescidos em frascos tipo"spinner" de dois litros para purificação de anticorposmonoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados econcentrados antes da cromatografia de afinidade comproteína A-sefarose (Pharmacia Piscataway, NJ) . A IgGeluída pode ser verificada através de eletroforese em gele cromatografia líquida de alto desempenho para garantira pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBS e aconcentração pode ser determinada por OD2So utilizandocoeficiente de extinção de 1,43. Os anticorposmonoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.

Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-CD70selecionados ligam-se a um único epítopo, cada anticorpopode ser biotinilado utilizando reagentes disponíveis nomercado (Pierce, Rockford, IL). Os estudos de competiçãoutilizando anticorpos monoclonais não marcados eanticorpos monoclonais biotinilados podem ser conduzidosutilizando-se placas ELISA revestidas com CD70 conformeacima descrito. A ligação a mAb biotinilado pode serdetectada com uma sonda de estrepavidina-fosfatasealcalina. Alternativamente, os estudos de competiçãopodem ser realizados usando um anticorpo radio-marcado eanticorpos de competição não marcados podem serdetectados em uma análise Scatchar, como descrito aindanos exemplos abaixo.

Para determinar o isótipo de anticorpos purificados,ensaios ELISA de isótipo podem ser conduzidos utilizandoreagentes específicos para anticorpos de um isótipoespecífico. Por exemplo, para determinar o isótipo de umanticorpo monoclonal humano, os poços das placas demicrot itulação podem ser revestidas com l/xg/ml deimunoglobulina anti-humana da noite para o dia a 4°C.

Após o bloqueio com BSA 1%, as placas são reagidas com1ug/ml ou menos de anticorpos monoclonais de teste oucontroles de isótipos purificados, à temperatura ambientepor uma ou duas horas. Os poços podem então ser reagidoscom IgGl humana ou sondas de conjugado de fosfatasealcalina IgM-específica humana. As placas sãodesenvolvidas e analisadas conforme descrito acima.IgGs anti-CD70 humanas podem ainda ser testadas quanto àreatividade com o antígeno CD70 através do método deWestern Blot. Resumidamente, o CD70 pode ser preparado esubmetido à eletroforese em gel de dodecil sulfato depoliacrilamida. Após a eletroforese, os antígenosseparados são transferidos para membranas denitrocelulose, bloqueados com soro fetal bovino a 10%, esondadas com os anticorpos monoclonais a serem testados.A ligação a IgG humana pode ser detectada utilizandofosfatase alcalina de IgG anti-humana e desenvolvida comcomprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem.Cp.,St.Louis, Mo).

Imunoconjugados

Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza umanticorpo anti-CD70 ou um fragmento do mesmo, conjugado auma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, umfármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou umaradiotoxina. Tais conjugados são aqui designados"imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma oumais citotoxinas são designados "imunotoxinas". Umacitotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agenteque seja nocivo (por exemplo, que mate) às células.

Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D,brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo,tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colquicina,doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona,mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrostestosterona, glucocorticóides, procaína,tetracaína, lidocaína, propanolol, e puromicina e seusanálogos ou homólogos. Agentes terapêuticos tambémincluem, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo:metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina,5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes, (porexemplo: mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan,carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida,busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C,e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina),antraciclinas (por exemplo: daunorubicina (anteriormentedenominada daunomicina) e doxorubicina), antibióticos(por exemplo: dactinomicina (anteriormente denominadaActinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina(AMC) e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristinae vinblastina).Outros exemplos preferidos de citotoxinas terapêuticasque podem ser conjugadas a um anticorpo da invençãoincluem duocarmicinas, caligueamicinas, maitansinas eauristatinas, e seus derivados. Um exemplo de conjugado de anticorpo de caliqueamicina está disponível no mercado(Mylotarg®; Wyeth-Ayerst).

As citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos dainvenção utilizando tecnologia de ligante disponível noestado da técnica. Exemplos de tipos de ligante que foramutilizados para conjugar uma citotoxina a um anticorpoincluem, porém não se restringem a hidrazonas, tioéteres,ésteres, dissulfetos, e ligantes contendo peptídeo. Pode-se selecionar um ligante que seja, por exemplo,suscetível à clivagem por pH baixo dentro do compartimento lisossômico ou suscetível à clivagem porproteases, tais como proteases, preferencialmente,expressa em tecido tumoral tal como catepsinas (porexemplo, catepsinas B, C, D).

Para mais discussão sobre os tipos de citotoxinas, ligantes e métodos para conjugar agentes terapêuticos aanticorpos, vide também Saito, G. et al.(2003) Adv DrugDel iv. Rev. 55^:199-215; Trail, P.A.et al.(2003) CâncerImmunol. Immunother. 52:328-337; Payne G.(2003) CâncerCell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat Rev.Câncer 2:750-763; Pastani I. e Kreitman, R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. eSpringer, C.J.(2001) Adv.Drug Delivery Rev. 53:247-264.Os anticorpos da presente invenção podem também serconjugados a um isótopo radioativo para gerarradiofarmacêuticos citotóxicos, também designadosradioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioativosque podem ser conjugados a anticorpos para usodiagnóstico ou terapêutico incluem, porém não serestringem a iodo131, iodo125, índio111, ítrio90 e lutécio177. O método para preparar radioimunoconjugadosestá estabelecido no estado da técnica. Exemplos deradioimunoconjugados estão disponíveis no mercado,inclusive Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) eBexxar™ (Corixa Pharmaceuticals) e métodos similarespodem ser usados para preparar radioimunoconjugadosutilizando os anticorpos da invenção.

Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser usadospara modificar uma determinada resposta biológica e, aporção de fármaco não deve ser interpretada como limitadaaos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo,a porção de fármaco pode ser uma proteína ou umpolipeptídio que possua uma atividade biológica desejada.

Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxinaenzimaticamente ativa, ou um fragmento ativo da mesma,tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, outoxina de difteria; uma proteína tal como fator denecrose tumoral ou interferon-y; ou modificadores deresposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas,interleucina-1 ("IL-l"), interleucina-2 ("IL-2"),interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulante de colônias demacrófagos e granulócitos ("GM-CSF"), fator estimulantede colônia de granulócitos ("G-CSF") ou outros fatores decrescimento.

Técnicas para conjugar tal porção terapêutica aanticorpos são conhecidas, vide, por exemplo, Arnon etal. , "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugsin Câncer Therapy" in Monoclonal Antibodies and CâncerTherapy, Reisfeld et al.(eds), pp.243-56 (Alan R.Liss,Inc.1985); Hellstrom et al. , "Antibodies for DrugDelivery" in Controlled Drug Delivery (2nd.ed), Robinsonet al.(eds.), pp.623-53 (Mareei Dekker, Inc.1987);Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in CâncerTherapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84:Biological and Clinicai Applications, Pinchera et al(eds) , pp.475-506 (1985); "Analysis, Results, and FutureProspective of the Therapeutic Use of RadiolabeledAntibody in Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies forCâncer Detection and Therapy, Baldwin et al.(eds.)pp.303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe et al. , "ThePreparation and Cytotoxic Properties of Antibody-ToxinConjugates, " Inununol .Rev. 62:119-58 (1982).

Moléculas Biespecíficas

Em outro aspecto, a presente invenção caracterizamoléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti-CD70, ou um fragmento do mesmo, da invenção. Um anticorpoda invenção ou porções ligantes ao antígeno do mesmo,pode ser derivatizado ou ligado a outra moléculafuncional, como por exemplo, a outro peptídeo ou proteína(por exemplo, outro anticorpo ou ligante para umreceptor) para gerar uma molécula biespecífica que seligue ã, pelo menos, dois sítios de ligação diferentes oua moléculas alvo. O anticorpo da invenção pode, de fato,ser derivatizado ou ligado a mais de uma outra moléculafuncional para gerar moléculas multiespecíficas que seligam a mais de dois sítios de ligação diferentes e/ou amoléculas alvo; tais moléculas multiespecíficas tambémpretendem serem abrangidas pelo termo "moléculasbiespecíficas" conforme aqui utilizado. Para criar umamolécula biespecífica da invenção, um anticorpo dainvenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, poracoplamento químico, fusão genética, associação não-covalente ou de outra forma) a uma ou mais outrasmoléculas ligantes, tal como outro anticorpo, fragmentode anticorpo, peptídeo ou mimética de ligação, de forma aresultar numa molécula biespecífica.

Conseqüentemente, a presente invenção inclui moléculasbiespecíficas compreendendo pelo menos uma primeiraespecificidade de ligação para CD70 e uma segundaespecificidade de ligação para um segundo epítopo alvo.

Em uma concretização específica da invenção, o segundoepítopo alvo é um receptor Fc, como por exemplo, FcyRIhumano (CD64) ou um receptor Fca humano (CD8 9). Portanto,a invenção inclui moléculas biespecíficas capazes deligar-se a células efetoras expressando tanto FcyR quantoFcaR (por exemplo, monócitos, macrófagos ou célulaspolimorfonucleares (PMNs)) e a células alvo expressandoCD70. Essas moléculas biespecíficas direcionam as célulasexpressando CD70 à célula efetora e disparam atividadesde célula efetora mediada por receptor Fc, tal como afagocitose de células expressando CD70, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ,liberação de citocinas, ou geração de ânion superóxido.Em uma concretização da invenção, na qual a moléculabiespecífica é multiespecífica, a molécula pode aindaincluir uma terceira especificidade de ligação, além de uma especificidade de ligação anti-Fc e umaespecificidade de ligação anti-CD70. Em umaconcretização, a terceira especificidade de ligação é umaporção de fator anti-intensificador (EF), como porexemplo, uma molécula que se liga a uma proteína superficial envolvida em atividade citotóxica e assimaumenta a resposta imune contra a célula alvo. A "porçãode fator anti-intensificador" pode ser um anticorpo, umfragmento de anticorpo funcional ou um ligante que seliga a uma determinada molécula, como por exemplo, um antígeno ou um receptor, e assim resulta numaintensificação no efeito dos determinantes de ligaçãopara o receptor Fc ou para o antígeno de célula alvo. A"porção de fator anti-intensificador" pode ligar-se a umreceptor Fc ou a um antígeno de célula alvo. Alternativamente, a porção de fator anti-intensificadorpode ligar-se a uma entidade que seja diferente daentidade à qual a primeira e segunda especificidades deligação se ligam. Por exemplo, a porção de fator anti-intensif icador pode ligar-se a uma célula T citotóxica(por exemplo, via CD2, CD3, CD8, CD2 8, CD4, CD4 0, ICAM-Iou outra célula imune que resulte numa resposta imuneaumentada contra a célula alvo).

Em uma concretização, as moléculas biespecíficas dainvenção compreendem como especificidade de ligação a pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo domesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab", F(ab")2, Fv,ou um Fv de cadeia simples. 0 anticorpo pode também serum dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada, ou qualquerfragmento mínimo do mesmo, tal como um Fv ou um construtode cadeia simples, conforme descrito na patente americanaNo. 4.946.778 de Ladner et al. cujo conteúdo foi aquiincorporado expressamente por referência.

Em uma concretização, a especificidade de ligação para umreceptor Fcy é provida por um anticorpo monoclonal, cujaligação não é bloqueada pela imunoglobulina G humana(IgG) . Conforme aqui utilizado, o termo "receptor de IgG"refere-se a qualquer um dos oito genes de cadeia-γlocalizados no cromossomo 1. Esses genes codificam umtotal de doze isoformas transmembrânicas ou de receptorsolúvel que são agrupadas em três classes de receptorFcy: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) . Em umaconcretização preferida, o receptor Fcy é um FcyRI humanode alta afinidade. 0 FcyRI humano é uma molécula de 72kDa, que mostra alta afinidade pela IgG monomérica (IO8 -10"9 M"1) .

A produção e caracterização de certos anticorposmonoclonais anti-Fcy preferidos são descritas naPublicação PCT WO 88/00052 e na patente americana No.4.954.617 de Fanger et al. , cujos ensinamentos são aquitotalmente incorporados por referência. Esses anticorposligam-se a um epítopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII em umsítio que é distinto do sítio de ligação Fcy do receptore, assim, sua ligação não é bloqueada substancialmentepor níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-FcyRIespecíficos úteis na presente invenção são mAb 22, mAb32,mAB 44, mAb 62 e mAb 197. O hibridoma que produz mAb 32está disponível na American Type Culture Collection,registro ATCC No. HB9469. Em outras concretizações, oanticorpo de receptor anti-Fcy é uma forma humanizada deanticorpo monoclonal 22 (H22) . A produção e acaracterização do anticorpo H22 é descrita em Graziano,R.F.et al . (1995) J.Immunol 155(10) :4996-5002 e PublicaçãoPCT WO 94/10332. A linhagem celular produtora deanticorpo H22 foi depositada no "American Type CultureCollection" sob a designação HA022CL1 e tem o número deregistro CRL 11177.

Em outras concretizações preferidas ainda, aespecificidade de ligação para um receptor Fc é providapor um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humana,como por exemplo, receptor Fc-alfa (FcaRI(CD89)), cujaligação é preferivelmente não bloqueada porimunoglobulina A humana (IgA). 0 termo "receptor de IgAnpretende incluir o produto gênico de um α-gene (FcaRI)localizado no cromossomo 19. Esse gene é conhecido porcodificar diversas isoformas transmembrânicasalternativamente alinhadas de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89)é constitutivamente expresso em monócitos/macrófagos,granulócitos eosinofílicos e neutrofílicos, porém não empopulações de células não-efetoras. 0 FcaRi possui umaafinidade pelo meio (-5 χ IO7M"1) tanto para IgAl comopara IgA2, que aumenta mediante exposição a citocinastais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al(1996)Critical Review in Immunology 16: 423-440). Quatroanticorpos monoclonais FcaRI-específicos, identificadoscomo A3, A59, A62 e A77, que se ligam a FcaRI fora dodomínio de ligação a ligante IgA, foram descritos(Monteiro, R.C. et al.(1992) J.Immunol., 148:1764).FcaRI e FcyRI são receptores de ativação para uso nasmoléculas biespecíficas da invenção, pois (1) sãoexpressas principalmente em células efetoras imunes como,por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos, e célulasdendríticas; (2) são expressas em altos níveis (porexemplo, 5.000-100.000 por célula); (3) são mediadores deatividades citotóxicas (ex: ADCC1 fagocitose); e (4)mediam a apresentação aumentada de antígenos, incluindoos auto-antígenos, a eles direcionados.

Embora os anticorpos monoclonais humanos sejampreferidos, outros anticorpos que podem ser empregadosnas moléculas biespecíficas da invenção são anticorposmonoclonais murinos, quiméricos e humanizados.

As moléculas biespecíficas da presente invenção podem serpreparadas conjugando-se as especificidades de ligaçãoconstituintes, como, por exemplo, as especificidades deligação anti-FcR e anti-CD70, utilizando métodosconhecidos no estado da técnica. Por exemplo, cadaespecificidade de ligação da molécula biespecífica podeser gerada separadamente e então conjugada entre si.Quando as especificidades de ligação forem proteínas oupeptídeos, uma variedade de agentes acoplantes oureticuladores pode ser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentes reticuladores incluem proteína A,carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA) ,5,5"-ditiobis(2-ácido nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato (SPDP) e sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato(sulfo-SMCC)(vide, por exemplo, Karpovsky et al. (1984) J.Exp.Med160:1686; Liu, MA et al.(1985) Proc.Nat1.Acad.Sci.USA8_2 :8 64 8) . Outros métodos incluem os descritos em Paulus(1985) Behring Ins.Mitt.No. 78, 118-132; Brennan et al.(1985) Science 229:81-83, e Glennie et al.(1987)J.Immunol., 139:2367-2375). Agentes conjugantespreferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis naPierce Chemical Co.(Rockford, IL).

Quando as especificidades de ligação forem anticorpos,eles podem ser conjugados via ligação de sulfidrila dasregiões de dobra de terminal C das duas cadeias pesadas.Em uma concretização especialmente preferida, a região dedobra é modificada para conter um número ímpar deresíduos sulfidrila, preferivelmente um, antes da conjugação.

Alternativamente, ambas especificidades de ligação podemser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas namesma célula hospedeira. Esse método é especialmente útilquando a molécula biespecífica for um mAb χ mAb, mAb χFab, Fab χ F(ab")2 ou ligante χ proteína de fusão Fab.Uma molécula biespecífica da invenção pode ser umamolécula de cadeia simples compreendendo um anticorpo decadeia simples e um determinante de ligação, ou umamolécula biespecífica de cadeia simples compreendendodois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficaspodem compreender pelo menos duas moléculas de cadeiasimples. Métodos para preparar moléculas biespecíficassão descritos, por exemplo, nas patentes americanas Nos.5.260.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405; 5.091.513;5.476.786; 5.013.653; 5.258.498; e 5.482.858.

A ligação das moléculas biespecíficas a seus alvosespecíficos pode ser confirmada, por exemplo, através doensaio por enzimas imuno-adsorvidas (ELISA),radioimunoensaío (RIA), análise FACS, bioensaio (porexemplo, inibição de crescimento) ou ensaio Western Blot.

Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença decomplexos proteína-anticorpo de interesse específicoempregando um reagente marcado (por exemplo, umanticorpo) específico para o complexo de interesse. Porexemplo, os complexos de anticorpo FcR podem serdetectados utilizando, por exemplo, um anticorpo ligado àenzima ou um fragmento de anticorpo que reconheça e queespecificamente ligue-se aos complexos de anticorpo-FcR.

Alternativamente, os complexos podem ser detectadosutilizando-se qualquer um de uma variedade de outrosimunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode serradioativamente marcado e utilizado em umradioimunoensaío (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B.,Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Courseon Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society,March, 1986, aqui incorporado por referência). 0 isótoporadioativo pode ser detectado por meios tal como o uso decontador γ ou um contador de cintilação ou através deautoradiografia.

Composições Farmacêuticas

Em outro aspecto, a presente invenção provê umacomposição, por exemplo, uma composição farmacêutica,contendo um ou uma combinações de anticorpos monoclonais,ou porção(ões) ligantes ao antígeno dos mesmos, dapresente invenção, formulada juntamente com um veículofarmaceuticamente aceitável. Tais composições podemincluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois oumais diferentes) anticorpos, ou imunoconjugados oumoléculas biespecíficas da invenção. Por exemplo, umacomposição farmacêutica da invenção pode compreender umacombinação de anticorpos (ou imunoconjugados oubiespecíficos) que se ligam a diferentes epítopos noantígeno alvo ou que tenham atividades complementares.Composições farmacêuticas da invenção também podem seradministradas em terapias combinadas, ou seja, combinadascom outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinaçãopode incluir um anticorpo anti-CD70 da presente invençãocombinado com pelo menos um outro agente antiinflamatórioou imunossupressor. Exemplos· de agentes terapêuticos quepodem ser usados na terapia de combinação são descritosem maiores detalhes abaixo na seção que trata dos usosdos anticorpos da invenção.

Conforme aqui utilizado, "veículo farmaceuticamenteaceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios dedispersão, revestimentos, agentes antibacterianos eantifúngicos, agentes isotônicos e agentes retardantes deabsorção, e similares que sejam fisiologicamentecompatíveis. Preferivelmente, o veículo é adequado paraadministração intravenosa, intramuscular, subcutânea,parenteral, espinhal ou epidérmica (ex: por injeção ouinfusão). Dependendo da rota de administração, o compostoativo, ou seja, o anticorpo, imunoconjugado, ou moléculabiespecí fica, pode ser revestido em um material paraproteger o composto da ação de ácidos e de outrascondições naturais que possam inativar o composto.Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir umou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "salfarmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retéma atividade biológica desejada do composto parental e quenão causa nenhum efeito toxicológico indesejado (vide,por exemplo, Berge, S.M.et al (1977) J.Pharm.Sci. 66:1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição deácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácidoincluem os derivados de ácidos inorgânicos atóxicos, taiscomo clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico,bromídrico, iodídrico, fosforoso e similares, bem como deácidos orgânicos atóxicos tais como os ácidos alifáticosmono- e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos substituídoscom fenila, ácido hidroxi alcanóicos, ácidos aromáticos,ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similares.

Sais de adição de base incluem os derivados de saismetálicos alcalinos terrosos, tais como sódio, potássio,magnésio, cálcio, e similares, bem como de aminasorgânicas atóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína,colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína esimilares.

Uma composição farmacêutica da invenção pode tambémincluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável.

Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveisincluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais comoácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato desódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio esimilares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais comopalmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA),hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil gaiato,alfa-tocoferol, e similares; e (3) agentes quelantesmetálicos, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácidofosfórico, e similares.

Exemplos de veículoes aquosos e não-aquosos apropriadosque podem ser empregados nas composições farmacêuticas dainvenção incluem água, etanol, polióis (tais comoglicerol, propileno glicol, polietileno glicol, esimilares), e misturas apropriadas dos mesmos, óleosvegetais, tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicosinjetáveis, tal como oleato de etila. A fluidezapropriada pode ser mantida, por exemplo, mediante o usode materiais de revestimento, tais como lecitina, pelamanutenção do tamanho de partícula necessário no caso dedispersões, e mediante o uso de surfactantes.Essas composições podem também conter adjuvantes, taiscomo preservativos, agentes umectantes, agentesemulsificantes, e agentes dispersantes. A prevenção dapresença de microorganismos pode ser garantida tantopelos procedimentos de esterilização acima citados comopela inclusão de diversos agentes antibacterianos eantifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenolácido sórbico, e similares. Pode também ser desejávelincluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloretode sódio, e similares nas composições. Além disso, aabsorção prolongada da forma farmacêutica injetável podeser obtida pela inclusão de agentes que retardam aabsorção, tais como o monoestearato de alumínio e agelatina.

Veículo farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções oudispersões aquosas estéreis e pó estéril para apreparação extemporânea de soluções ou dispersõesinjetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes parasubstâncias farmaceuticamente ativas é conhecido noestado da técnica. Exceto se qualquer meio ou agenteconvencional for incompatível com o composto ativo, éprevisto o uso dos mesmos nas composições farmacêuticasda invenção. Compostos ativos suplementares podem tambémser incorporados às composições.

As composições terapêuticas devem ser tipicamenteestéreis e estáveis sob as condições de fabricação earmazenamento. A composição pode ser formulada na formade uma solução, microemulsão, lipossoma ou outraestrutura ordenada adequada para alta concentração def ármaco. o veículo pode ser um solvente ou meio dedispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol(por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietilenoglicol líquido, e similares) e suas misturas apropriadas.A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo,mediante o uso de um revestimento tal como lecitina, pelamanutenção do tamanho de partícula requerido no caso dedispersão e mediante o uso de surfactantes. Em muitoscasos, será preferível incluir agentes isotônicos, porexemplo, açúcares, poliálcoóis, tais como manitol,sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorçãoprolongada das composições injetáveis pode ser obtidaincluindo-se na composição um agente que retarde aabsorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Soluções estéreis injetáveis podem ser preparadasincorporando-se o composto ativo na quantidade requeridanum solvente apropriado com um ou uma combinação deingredientes enumerados acima, conforme necessário,seguido de microfiltração para esterilização. Geralmente,as dispersões são preparadas incorporando-se o compostoativo num veículo estéril que contenha um meio dedispersão básico e os outros ingredientes necessáriosdaqueles citados acima. No caso de pós-estéreis para apreparação de soluções estéreis injetáveis, os métodospreferidos de preparação são secagem a vácuo e secagempor congelamento (liofilização) que produzem um pó doingrediente ativo mais qualquer outro ingredientedesejado de uma solução previamente filtrada-esterilizadado mesmo.

A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinadacom um material veículo para produzir uma forma dedosagem única variará dependendo do indivíduo a sertratado, e do modo específico de administração. Aquantidade de ingrediente ativo que pode ser combinadacom um material veículo para produzir uma forma dedosagem única será geralmente aquela quantidade dacomposição que produza um efeito terapêutico. Geralmente,de 100(cem) por cento, essa quantidade variará de cercade 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento doingrediente ativo, preferivelmente de cerca de 0,1 porcento a cerca de 70 por cento, o mais pref erivelmente decerca de 1 por cento a cerca de 3 0 por cento deingrediente ativo em combinação com um veículofarmaceuticamente aceitável.

Regimes de dosagem são ajustados para prover a respostaótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica).

Por exemplo, um bolus simples pode ser administrado,diversas doses divididas podem ser administradas ao longodo tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ouaumentada conforme indicado pelas exigências da situaçãoterapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma unitária de dosagem parafacilitar a administração e a uniformidade de dosagem. Aforma unitária de dosagem, conforme aqui utilizada,refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas comodosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada docomposto ativo, calculada para produzir o efeitoterapêutico desejado, em associação com o veículofarmacêutico requerido. A especificação para as formasunitárias de dosagem da invenção é ditada por e diretamente dependente(s) (a) das característicasinéditas do composto ativo e o efeito terapêuticoespecífico a ser obtido, e (b) das limitações inerentes àtécnica de se combinar tal composto ativo para otratamento de sensibilidade em indivíduos.

Para administração do anticorpo, a dosagem varia de cercade 0,0001 a 100 mg/kg e mais usualmente de 0,01 a 5 mg/kgdo peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagenspodem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg pesocorporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixade 1-10 mg/kg. Dosagens maiores, por exemplo, 15 mg/kg dopeso corporal, 20 mg/kg do peso corporal, ou 25 mg/kg dopeso corporal podem ser utilizadas quando necessário. Umregime de tratamento representativo envolve aadministração uma vez por semana, uma vez a cada duassemanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cadaquatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada trêsmeses, ou uma vez a cada três a 6 meses. Regimes dedosagem particulares para um anticorpo anti-CD70 dainvenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg depeso corporal via administração intravenosa, com oanticorpo sendo administrado utilizando-se um dosseguintes esquemas de dosagem: (i) a cada quatro semanaspara seis dosagens, e então a cada três meses; (ii) acada três semanas; (iii) 3 mg/kg peso corporal uma vezseguida de 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.

Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonaisanti-CD70 da invenção, com diferentes especificidades deligação são administrados simultaneamente, e neste caso adosagem de cada anticorpo administrado enquadra-se nasfaixas indicadas. 0 anticorpo é geralmente administradoem ocasiões múltiplas. Intervalos entre dosagens únicaspodem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cadatrês meses ou anualmente. Os intervalos podem ser tambémirregulares conforme indicado medindo-se os níveissangüíneos de anticorpo em relação ao antígeno alvo nopaciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada paraalcançar uma concentração plasmática de anticorpo decerca de 1-1000 μg/ml e em alguns métodos de cerca de 25-300 μg/ml.

Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado comouma formulação de liberação sustentada, onde é necessáriaa administração menos freqüente. A dosagem e a freqüênciavariam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente.

Em geral, anticorpos humanos mostram a meia-vida maislonga, seguido dos anticorpos humanizados, anticorposquiméricos, e anticorpos não-humanos. A dosagem efreqüência de administração podem variar dependendo se otratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicaçõesprofiláticas, uma dosagem relativamente baixa éadministrada em intervalos relativamente não freqüentesdurante um longo período de tempo. Alguns pacientescontinuam a receber tratamento pelo resto da vida. Emaplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente altaem intervalos relativamente curtos é às vezes necessáriaaté que a progressão da doença seja reduzida ou extinta,e preferivelmente, até que o paciente mostre melhoraparcial ou completa dos sintomas da doença. Em seguida, opaciente pode receber um regime profilático.

Os níveis efetivos de dosagem dos ingredientes ativos nascomposições farmacêuticas da presente invenção podemvariar de forma a se obter uma quantidade do ingredienteativo que seja eficaz para obter a resposta terapêuticadesejada para um paciente em particular, composição emodo de administração, sem ser tóxica para o paciente. 0nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedadede fatores farmacocinéticos incluindo a atividade dascomposições específicas da presente invenção empregadas,ou do éster, sal ou amida das mesmas, da rota deadministração, do tempo de administração, da taxa deexcreção do composto específico que estiver sendoempregado, da duração do tratamento, de outros fãrmacos,compostos e/ou materiais utilizados em combinação com ascomposições específicas empregadas, da faixa etária, dosexo, peso, condição, saúde geral e histórico médicoprévio do paciente sendo tratado, e fatores similaresbastante conhecidos na área médica.

Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpoanti-CD70 da invenção preferivelmente resulta em reduçãona severidade dos sintomas da doença, em um aumento nafreqüência e duração dos períodos livres de sintomas dadoença, ou na prevenção de deficiência ou incapacidadedevido â aflição causada pela doença. Por exemplo, para otratamento de tumores mediados por CD70+, uma "dosagemterapeuticamente eficaz" preferivelmente inibe ocrescimento celular ou o crescimento tumoral em cerca depelo menos 20%, mais preferivelmente em cerca de pelomenos 40%, ainda mais preferivelmente em cerca de pelomenos 60%, e ainda mais preferivelmente em cerca de pelomenos 80% em relação aos indivíduos não tratados. Acapacidade de um composto inibir o crescimento tumoralpode ser avaliada num sistema de modelo animal previsívelde eficácia em tumores humanos. Alternativamente, essapropriedade de uma composição pode ser avaliadaexaminando-se a capacidade de o composto inibir ocrescimento celular, tal inibição podendo ser medida invitro através de ensaios conhecidos no estado da técnica.Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um compostoterapêutico pode reduzir o tamanho do tumor, ou de outraforma melhorar sintomas num indivíduo. Um habilitado natécnica seria capaz de determinar tais quantidades combase em fatores tais como, tamanho do indivíduo,severidade dos sintomas do indivíduo, e a composiçãoespecífica ou via de administração escolhida.

Uma composição da presente invenção pode ser administradaatravés de uma ou mais vias de administração utilizandoum ou mais de uma variedade de métodos conhecidos noestado da técnica. Conforme será apreciado por um técnicono assunto, a rota e/ou o modo de administração variarãodependendo dos resultados desejados. As rotas preferidasde administração para anticorpos da invenção incluem asvias intravenosa, intramuscular, intradérmica,intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras viasparenterais de administração, como por exemplo, atravésde injeção ou infusão. A expressão "administraçãoparenteral" conforme aqui utilizada significa os modos deadministração que não a administração enteral e tópica,geralmente através de injeção, e inclui, sem limitação,injeção e infusão intravenosa, intramuscular,intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital,intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal,transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular,subcapsular, subaraquinóide, intraespinhal, epidural eintraesternal.

Alternativamente, um anticorpo da invenção pode seradministrado através de uma via não parenteral, tal comoa via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, porexemplo, por via intranasal, oral, vaginal, retal,sublingual ou tópica.

Os compostos ativos podem ser preparados com veículos queprotejam o composto contra liberação rápida, tal comoformulação de liberação controlada, incluindo osimplantes, adesivos transdérmicos, e sistemas deliberação microencapsulados. Polímeros biodegradáveis ebiocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinilacetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno,poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ougeralmente conhecidos no estado da técnica. Vide, porexemplo, Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems, J.R.Robinson, ed. Mareei Dekker, Inc.New York,1978 .

As composições terapêuticas podem ser administradas comdispositivos médicos conhecidos no estado da técnica. Porexemplo, em uma concretização preferida, uma composiçãofarmacêutica da invenção pode ser administrada com umdispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tais como os dispositivos descritos nas patentes americanas Nos.5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880;4.790.824; ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulosúteis na presente invenção incluem: patente americana No.4.487.603 que descreve uma bomba de micro-infusãoimplantável para dispensar medicação a uma taxacontrolada; a patente americana No. 4.486.194, quedescreve um dispositivo terapêutico para administrarmedicamentos através da pele; a patente americana No.4.447.233, que descreve uma bomba de infusão de medicaçãopara liberar medicação a uma taxa de infusão precisa; apatente americana 4.447.224 que descreve um aparelho deinfusão implantável de fluxo variável para liberaçãocontínua de fármaco; a patente americana No. 4.439.196que descreve um sistema osmótico de liberação de fármacotendo compartimentos de câmaras múltiplas; e a patenteamericana No. 4.475.196, que descreve um sistema osmóticode liberação de fármaco. Essas patentes são aquiincorporadas por referência. Muitos outros dessesimplantes, sistemas de liberação, e módulos sãoconhecidos no estado da técnica.

Em certas concretizações, os anticorpos monoclonaishumanos da invenção podem ser formulados para garantir adistribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreirahemato-encefálica (BBB) exclui muitos compostos altamentehidrofílicos. Para garantir que os compostos terapêuticosda invenção atravessem a barreira hemato-encefálica (BBB)(se desejado) eles podem ser formulados, por exemplo, emlipossomas. Para métodos de preparação de lipossomas,vide, por exemplo, as patentes americanas Nos. 4.522.811;5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomas podem compreenderuma ou mais porções que são seletivamente transportadaspara dentro de células ou órgãos específicos, para assimaumentar a liberação direcionada de fármaco (vide, porexemplo, V.V.Ranade (1989) J.Clin.Pharmacol.29:685) .Porções direcionadoras representativas incluem o folatoou a biotina (vide, por exemplo, a patente americana No.5.416.016 de Low et al. ) ; manosídeos (Umezawa etal., (1988) Biochem.Biophys.Res.Commun. 153 :1038);

anticorpos (P.G.Bloeman et al.(1995) FEBS Lett.357:140 ;M.Owais et al.(1995) Antimicrob.Agents Chemother.3_9:180) ; receptor de proteína A de surfactante (Briscoeet al. (1995) Am. J. Physiol. , 1233 :134) ; pl20 (Schreier etal. (1994) J.Biol.Chem., 269:9090) ; vide tambémK.Keinanen; M.L.Laukkanen (1994) FEBS Lett., 346 :123;J.J.Killion; I.J.Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

Usos e Métodos da Invenção

Os anticorpos, particularmente os anticorpos humanos,composições de anticorpos e métodos da presente invençãopossuem numerosas utilidades terapêuticas e dediagnásticos in vitro e in vivo, envolvendo o diagnósticoe o tratamento do distúrbio mediado por CD70. Porexemplo, estas moléculas podem ser administradas acélulas em cultura, in vitro ou ex vivo, ou em indivíduoshumanos, por exemplo, in vivo, para tratar, para prevenire para diagnosticar uma variedade de distúrbios. Conformeaqui utilizado, o termo "indivíduo" pretende incluiranimais humanos e não-humanos. 0 termo "animais não-humanos" inclui todos os vertebrados, por exemplo,mamíferos e não-mamíferos, tais como primatas não-humanos, carneiros, cães, gatos, vacas, cavalos,frangos, anfíbios e répteis. Indivíduos preferidosincluem pacientes humanos tendo distúrbios mediados pelaativadade CD70. Os métodos são especialmente apropriadospara tratar pacientes humanos que apresentam um distúrbioassociado com uma expressão anormal de CD70. Quando osanticorpos ao CD70 são administrados juntamente com umoutro agente, os dois podem ser administrados em qualquerordem ou simultaneamente.

Dada a ligação específica dos anticorpos da invenção parao CD70, os anticorpos da invenção podem ser utilizadospara detectar, especificamente, a expressão de CD70 nasuperfície das células e, além disso, podem serutilizados para purificação do CD70, através dapurificação por imunoafinidade.

0 CD70 é expresso em uma variedade de cânceres humano,incluindo carcinoma de células renais, câncer de mama commetãstase, tumores cerebrais, leucemias, Iinfornas ecarcinomas nasofaringeal (Junker et al., (2005) J. Urol.,173:2150-3 ; Sloan et al., (2004), Am. J. Pathol.,164 :315-23 ; Held-Feindt and Mentlein (2002), Int. J.Câncer, 98:352-6; Hishima et al., (2000) Am. J. Surg.Pathol., 24:742-6; Lens et al., (1999) Br. J. Haematol.,106:491-503). Um anticorpo anti-CD70 pode ser utilizadosozinho para inibir o crescimento dos tumorscancerígenos. Alternativamente, um anticorpo anti-CD70pode ser utilizado em conjunto com um outro agenteimunogênico, tratamento de câncer padrão ou outrosanticorpos, como descrito a seguir.

Cânceres preferidos cujo crescimento pode ser inibidoutilizando-se os anticorpos da invenção incluem câncerestipicamente responsivos a imunoterapia. Exemplos nãorestritivos de cânceres preferidos para tratamentoincluem câncer renal (por exemplo, carcinoma de célularenal), câncer de mama, leucemias crônica sou agudas,incluindo leucemia mielóide aguda, leucemia mielóidecrônica leucemia Iinfoblástica aguda, leucemialinfoblástica crônica, linfomas (por exemplo, linfoma deHodgkin e não-Hodgkin, linfoma linfocitico, linvoma CNSprimário, linfoma de célula T) e carcinoma nasofaringeal.

Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados usandoos métodos da invenção incluem melanoma (por exemplo,melanoma maligno metastático), câncer de próstata, câncerde cólon, câncer de pulmão, câncer ósseo, câncerpancreãtico, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço,melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino,câncer ovariano, câncer retal, câncer na região anal,câncer de estomago, câncer testicular, carcinoma dastrompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma dacérvix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncerdo esôfago, câncer do intestino delgado, câncer dosistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer daglândula paratirõide, câncer da glândula adrenal, sarcomade tecidos moles, câncer da uretra, câncer do pênis,tumores sólidos em crianças, câncer da bexiga, câncer dorim ou do ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasma dosistema nervoso central (SNC), angiogênese tumoral, tumordo eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenomapituitãrio, sarcoma de Kaposi, câncer epidermóide, câncerde células escamosas, cânceres induzidos pelo ambiente,incluindo os induzidos por amianto, por exemplo,mesotelioma e combinações dos referidos cânceres.

Além disso, dada a expressão de CD70 em varias célulastumorais, os anticorpos humanos, composições deanticorpos e métodos da presente invenção podem serutilizados para tratar um indivíduo com um distúrbiotumorigênico, por exemplo, um distúrbio caracterizadopela presença de células tumorais expressando CD70incluindo, por exemplo, carcinomas de célula renal (RCC) ,tais como célula limpa de RCC, glioblastoma, câncer demama, tumor cerebral, carcinomas nasofaringeal, linfomanão-Hodgkins (NHL), leucemia IinfocItica aguda (ALL),leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de Burkitt,linfomas de célula grande anaplástica (ALCL), mielomamúltiplo, linfoma de célula T cutâneo, linfoma de célulaclivada de pequenos nódulos, linfomas linfocítico,linfomas de célula T periférica, linfomas de Lenner,linfomas imunoblásticos, linfoma/leucemia de célula T(ATLL), leucemia de célula TC adulta (T-ALL), câncer delinfomas foliculares entroblástico/centrocítico (cb/cc),linfomas de células grandes difusas de linhagem de célulaB, linfoma de célula T do tipo (AILD) Iinfadenopatiaangioimunoblãstica, linfomas baseados na cavidadecorpórea associada com HIV, carcinomas embrionário,carcinomas não-diferenciados de rinofaringe (pore xemplo,tumor de Schmincke) doença de Castleman, Sarcoma deKaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia deWaldenstrom e outros linfomas de célula B.

Conseqüentemente, em uma concretização, a invenção preovêum método para inibir o crescimento de células tumoraisem um indivíduo, compreendendo a administração aoindivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de umanticorpo anti-CD70 ou uma porção ligante ao antígeno domesmo. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo anti-CD70 humano (tal como qualquer um dos anticorpos anti-humano CD70 humano descritos aqui). Adicional oualternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo anti-CD70 quimérico ou humanizado.

Adicionalmente, a interação de CD70 com CD27 também foiproposta por participar de uma regra importante nasdoenças auto-imunes mediadas por célula, tais comoencefalomielitis autoimune experimental (EAE) (Jakajimaet al., (2000) J. Neuroimmunol. 109:188-96). Este efeitofoi uma noção por ser mediado em parte por uma inibiçãoda produção de TNF-alfa. Além disso, o bloequio do sinalde CD70 inibe a expansão clonal mediada por CD40 dascélulas T CD8+ e reduz a produção das células T dememória CD8+ (Taraban et al. , (2004), J. Immunol.,173:6542-6). Como tal, os anticorpos humanos, composiçõesde anticorpo e métodos da presente invenção podem serutilizados para tratar um indivíduo com um distúrbioauto-imune, por exemplo, um distúrbio caracterizado pelapresença de células B expressando CD70, incluindo, porexemplo, encefalomielite auto-imune experimental. Osdistúrbios auto-imunes adicionais aos quais o anticorpo da invenção pode ser utilizado, incluem, mas não selimitam ao lupus eritematoso sistêmico (SLE), diabetemielitus dependente de insulina (IDDM), doençainflamatória intestinal (IBD) (incluindo a Doença deCrohn, colite ulcerativa e doença Celiac), esclerose múltipla (MS), psoriases, tiroidite auto-imune, artritereumatóide (RA) e glomerulonefrite. Além disso, ascomposições de anticorpo da invenção podem ser utilizadaspara inibir ou prevenir a rejeição de transplantes ou notratamento de enxertos versus doença hospedeiro (GVHD).

Adicionalmente, a interação de CD7 0 com CD2 7 também foiproposta por desempenhar um papel importante nasinalização das células T CD4+. Algumas viroses têmdemonstrado sinalizar a via CD27, conduzindo à destruiçãoda resposta de neutralização do anticorpo (Matter et al. (2006) J. Exp. Med., 203:2145-55). Como tal, osanticorpos humanos, composições de anticorpo e métodos dapresente invenção podem ser utilizados para tratar umindivíduo com uma infecção viral incluindo, por exemplo,infecções do v'riuos da imunodeficiência humana (HIV), Hepatite (A, B, & C) , vírus da Herpes (por exemplo, VZV,HSV-1, HAV-6, HSV-II e CMV, vírus do Epstein Barr),adenovírus, vírus influenza, falvivírus, ecovírus,rinovírus, vírus Coxsackie, cornovírus, vírus sincitialrespiratório, vírus de caxumba, rotavírus, vírus de sarampo, vírus da rubéola, parvovírus, vírus da vaccínia,vírus HTLV, vírus da dengue, papilomavírus, vírus demolusco, poliovírus, vírus da raiva, vírus JC e vírus deencefalite arboviral e vírus da coriomeningitelinfocítica (LCMV), ou no tratamento de infecções deHIV/AIDS. Adicionalmente, os anticorpos humanos,composições de anticorpos e métodos da presente invençãopodem ser utilizados para inibir a produção de TNF-alfa.Em uma concretização, os anticorpos (por exemplo,anticorpos monoclonais humanos, moléculasmultiespecíficas e biespecíficas e composições) dainvenção podem ser utilizados para detectar os níveis deCD70 e os níves de células que contém CD70 em suasuperfície de membrana, no qual os níveis podem entãoestar ligados a determinados sintomas de doenças.Alternativamente, os anticorpos podem ser utilizados parainibir ou bloequear a função de CD7 0 que, em linha, podeestar ligado à prevenção ou a melhora de determinadossintomas de doenças, implicando, desse modo, que o CD70 éum mediador da doença. Isto pode ser alcançado pelocontato de uma amostra experimental e uma amostracontrole com o anticorpo anti-CD70 sob condições querpermitam à formação de um complexo entre o anticorpo eCD70. Qualquer complexo formado entre o anticorpo e CD70são detectáveis e comparados na amostra experimental e naamostra controle.

Em uma outra concretização, os anticorpos (por exemplo,anticorpos monoclonais humanos, moléculasmultiespecíficas e biespecíficas e composições) dainvenção pode ser testados inicialmente para a atividadede ligação associada com o uso terapêutico ou dediagnóstico in vitro. Por exemplo, composições dadescrição podem ser testadas usando os ensaios decitometria de fluxo descritos nos Exemplos abaixo.Os anticorpos (por exemplo, anticorpos humanos, moléculasmultiespecíficas e biespecíficas e composições) dainvenção têm uma utilidade adicional na terapia ediagnóstico de doenças relacionadas ao CD70. Por exemplo,os anticorpos monoclonais humanos, as moléculasmultiespecíficas ou biespecíficas e os imunoconjugadospodem ser utilizados para extrair in vivo ou in vitro umou mais das seguintes atividades biológicas: inibir ocrescimento de e/ou matar uma célula expressando CD70;mediar a fagocitose ou ADCC de uma célula expressandoCD70 em presença de células efeturas humanas; oubloquear o ligante do CD70 na ligação ao CD70.Em uma concretização particular, os anticorpos (porexemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ebiespecíficas e composições) da inventção são usados invivo para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedadede doenças relacionadas ao CD70. Exemplos de doençasrelacionados ao CD70 incluiem, dentre outros, distúrbiosautoimunes, encefalomielite auto-imune experimental(EAE), câncer, carcinoma de célula renal (RCC), tal comoRCC de célula limpa RCC, glioblastoma, câncer de mama,tumor cerebral, carcinoma de nasofaringe, Iinfoma de não-Hodgkin, leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemialinfocítica crônica (CLL), linfoma de Burkitt, linfomasde células anaplásticas grandes (ALCL), mieloma múltiplo,linfoma de célula T cutânea, linfomas de célulasclivadas de pequenos nódulos, linfomas Iinfocíticos,linfomas de célula T periférica, linfoma de Lennert,linfomas imunoblásticos, leucemia/linfomas de célula T(ATLL), leucemia de célula T adulta (T-ALL), câncer delinfoma folicular entroblástico/centrocítico (cb/cc),linfomas de células grandes difusas de linhagem B,linfoma de célula T do tipo Iinfoadenopatiaangioimunoblástica (AILD), linfomas baseados na cavidadecorpórea asociados ao HIV, carcinomas enbrionários,carcinomas não-diferenciados de rinofaringe (por exemplo,tumor de Schmincke), doença de Castleman, sarcoma deKaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia deWaldenstrom, e outros linformas de célula B.Rotas apropriadas de administração das composições deanticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais,moléculas multiespecíficas e biespecíficas eimunoconjugados) da invenção, in vivo e in vitro, são bemconhecidas do estado da técnica e podem ser selecionadaspelos técnicos no assunto. Por exemplo, as composiçõesde anticorpos podem ser administradas por injeção (porexemplo, intravenosa ou subcutânea). As dosagensapropriadas das moléculas utilizadas dependerão da idadee do peso do indivíduo e da concentração e/ou formulaçãoda composição de anticorpos.

Como previamente descrito, os anticorpos anti-CD70humanos da invenção podem ser co-adminisrados com um oumais de outros agentes terapêuticos, por exemplo, umagente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agenteimunosupressivo. 0 anticorpo pode estar ligado ao agente(como um imunocomplexo) ou pode ser administrado se formaseparada do agente. No último caso (administraçãoseparada), o anticorpo pode ser administrado antes, apósou concomitantemente com o agente ou, pode ser co-administrado com outras terapias conhecidas, por exemplo,terapia anticâncer, por exemplo, radiação. Os referidosagentes terapêuticos incluem, dentre outros, agentesanti-neoplásicos, tais como doxorubicina (adriamicina) ,sulfato de bleomicina cisplatina, carmustina, clorambucile hidroxiuréia de ciclofosfamida, que, por si mesmas, sãoeficiazes apenas em níveis que são tóxicos ou subtóxicosao paciente. A cisplatina é administrada intravenosamenteem uma dosagem de 100 mg/dose uma vez a cada quatrosemanas e a adriamicina é administrada intravenosamenteem uma dosagem de 60-75 mg/dose uma vez a cada 21 dias. Aco-administração dos anticorpos anti-CD70 humanos ou dosfragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, da presenteinvenção com os agentes quimioterapêuticos provêem doisagentes anticancer, que operam via mecanismos diferenteso que resulta em um efeito citotóxico para as célulastumorais humanas. A referida co-administração poderesolver o problema devido ao desenvolvimento deresistência ao fármaco ou a uma alteração naantigenicidade das células tumorais que resultariam emuma não-reatividade deles com o anticorpo.As células efetoras alvo-específicas, por exemplo, ascélulas efetoras ligadas à composição (por exemplo,anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ebiespecíficas) da descrição também podem ser utilizadascomo agentes terapêuticos. As células efetoras para alvopodem ser leucócitos humanos tais como, macrófagos,neutrõfilos ou monócitos. Outras células incluemeosinõfilos, células assassinas naturais e outras célulasinfluentes dos receptores IgG- ou IgA. Se desejado, ascélulas efetoras podem ser obtidas a partir do indivíduoa ser tratado. As células efetoras alvo-específicas podemser administradas como uma suspensão de células em umasolução fisiologicamente aceitável. 0 número de célulasadministradas pode ser da ordem de IO8-IO9, mas variarádependendo do propósito terapêutico. Em geral, aquantidade será suficient para obter localização dacélula alvo, por exemplo, uma célula tumoral expressandoCD70 e para agir na morte celular por, por exemplo,fagocitose. As rotas de administração também podemvariar.

A terapia com as células efetoras alvo-específicas podemser conduzida em conjunto com outras técnicas pararemoção das células alvo. Por exemplo, a terapia anti-tumor usando as composições (por exemplo, anticorposhumanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) dainvenção e/ou células efetoras armadas com estascomposições podem ser utilizadas em conjunto com aquimioterapia. Adicionalmente, a imunoterapia combinadapode ser utilizada para dirigir duas populações efetorascitotõxicas distintas em relação à rejeição da célulatumoral. Por exemplo, os anticorpos anti-CD70 ligados aoRI anti-Fc-gama ou anti-CD3 podem ser utilizados emconjunto com os agentes de ligação específica ao receptorde IgG- ou IgA-.

As moléculas biespecíficas e multiespecíficas dadescrição também podem ser utilizadas para modular FcyRou os níveis de FcyR nas células efetoras, tais como porcapeado e eliminação de receptores na superfície celular.Misturas de receptores anti-Fc também podem serutilizados para este propósito.

As composições (por exemplo, anticorpos humanos,moléculas multiespecíficas e biespecíficas eimunoconjugados) da invenção que tem sítios de ligação docomplento, tais como porções de IgGl, -2, ou -3 ou IgMque se liga ao complemento, também podem ser utilizadosem presença do complemento. Em uma concretização, otratamento ex vivo de uma população de células compreendeas células alvo com um agente de ligação da invenção e ascélulas efetoras apropriadas podem ser suplementadas pelaadição do complemento ou do soro contendo o complemento.

A fagocitose das células alvo revestidas com um agente deligação da invenção pode ser melhorada pela ligação dasproteínas do complemento. Em uma outra concretização, ascélulas alvo revestidas com as composições (por exemplo,anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ebiespecíficas) da invenção também podem ser lisadas pelocomplemento. Ainda em uma outra concretização, ascomposições da invenção não ativam o complemento.

As composições (por exemplo, anticorpos humanos,moléculas biespecíficas ou multiespecíficas eimunoconjugados) da invenção também podem seradministradas junto com o complemento. Conseqüentemente,dentro do escopo da invenção estão as composiçõescompreendendo anticorpos humanos, moléculas biespecíficasou multiespecí ficas e o soro ou o complemento. Estascomposições são vantajosas já que o complemento estálocalizado próximo à vizinhança dos anticorpos humanos,moléculas multiespecíficas ou biespecíficas.

Alternativamente, os anticorpos humanos, moléculasmultiespecíficas e biespecíficas da invenção e ocomplemento ou o soro podem ser administrados separadamente.

Também dentro do escopo da presente invenção estão oskits compreendendo as composições de anticorpos dainvenção (por exemplo, anticorpos humanos, moléculasbiespecíficas ou multiespecíficas ou imunoconjugados) einstruções para uso. 0 kit pode, conter ainda, um ou maisreagentes adicionais, tais como um reagente imunosupressivo, um agente citotóxico ou um agenteradiotóxico ou um ou mais anticorpos humanos adicionaisda invenção (por exemplo, anticorpos humanos tendo umaatividade complementar que se liga ao epítopo no antígenoCD7 0 distinto daquelo do primeiro anticorpo humano).Conseqüentemente, os pacientes tratados com ascomposições de anticorpo da invenção também podem seradministrados adicionalmente (antes de, simultaneamentecom ou uma administração seqüencial de um anticorpohumano da invenção) com um outro agente terapêutico, talcomo um agente citotóxico ou radiotóxico, que melhora ouaumenta o efeito terapêutico dos anticorpos humanos.Em uma outra concretização, o indivíduo pode seradicionalmente tratado com um agente que modula, porexemplo, melhora ou inibe, a expressão ou atividade Fcy ou dos receptores de Fcy pelo, por exemplo, tratamentocom a molécula multiespecífica incluindo o fatorestimulante da colônia de granulócitos (G-CSF), fatorestimulante da colônica de granulócito-macrõfago (GM-CSF) , interferon-y (IFN-γ) e fator de necrose tumoral (TNF) .

As composições (por exemplo, anticorpos humanos,moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invençãotambém podem ser utilizadas para as células alvoexpressando FcyR ou CD70, por exemplo, para marcar as referidas células. Para tal uso, o agente de ligação podeestar ligado a uma molécula que pode ser detectada.Assim, a invenção provê métodos para localizar ex vivo ouin vivo as células expresando os receptores Fc, taiscomo FcyR ou CD70. 0 marcador detectável pode ser, porexemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, umaenzima ou um co-fator da enzima.

Em uma concretização particular, a invenção provê métodospara detectar a prsença do antígeno CD70 em uma amostraou medir a quantidade do antígeno CD70, compreendendocontatar a amostra e uma amostra controle, com umanticorpo monoclonal humano ou uma porção de ligação aoantígeno do mesmo, que se liga especificamente ao CD70,sob uma condição que permita a formação de um complexoentre o anticorpo e a proção do mesmo e o CD70. aformação de um complexo é então detectada, onde umaformação de complexo diferente entre a amostra comparadae a mostra controle é indicativa da presença do antígenoCD70 na amostra.

Ainda, em uma outra concretização, imunoconjugados dainvenção podem ser utilizados para compostos alvos (porexemplo, agentes terapêuticos, marcadores, citotoxinas,imunosupressantes radiotoxinas, etc..) às células que temreceptores de superfície celular para CD70 por ligaçãodos referidos compostos ao anticorpo. Por exemplo, umantricorpo anti-CD70 pode ser conjugado a qualquer um dosCompostos descritos nas patentes norte-americanas Nos.:US 6,281,354 e 6,548,530, pedidos de patente publicadosNos.: 2003/0050331, 2003/0064984, 2003/0073852 e2004/0087497 ou publicação internacional No.: WO03/022806, os quais são incorporados aqui por referênciaem sua íntegra. Assim, a invenção também provê métodospara localização ex vivo ou in vivo das célulasexpressando CD7 0 (por exemplo, com um marcadordetectável, tal como um radioisótopo, um compostofluorescente, uma enzima e um co-fator de enzima) .

Alternativamente, os imunoconjugados podem ser utilizadospara matar as células que tem receptores de superfíciecelular de CD70 pelas citotxinas alvo ou radiotoxinaspara CD70.

A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos aseguir que não devem ser interpretados como restritivos.O conteúdo de todas as figuras e todas as referências,patentes, e pedidos de patente publicados citados em todao pedido são aqui expressamente incorporados porreferência.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Geração de Anticorpos Monoclonais HumanosContra CD70

Antígeno

Protocolos de imunização utilizados como antígenorecombinante CD7 0 humano fundido com uma Tag myc-Hisdual. Alternativamente, toda a imunização celular usandoa linha de célula de carcinoma renal 786-0 (ATCC númerode acesso No.: CRL-1932) e estimulada com a linha decélula de carcinoma renal A-498 (ATCC número de acessoNo.: HTB-44) foi utilizada em algumas imunizações.Camundongo Transgênico KM-Mouse® e HuMAb-Mouse®Anticorpos monoclonais totalmente humanos contra CD70foram preparados utilizando as cepas HCo7, HCol2 e HCol7do camundongo transgênico HuMab e a cepa KM decamundongos transcromossômicos transgênicos, cada umadelas expressando os genes de anticorpo humano. Nessascepas de camundongo, o gene de cadeia leve kappa decamundongo endógeno foi homozigotamente rompido conformedescrito em Chen et al.(1993) EMBO J. 12:811-820 e o genede cadeia pesada de camundongo endógeno foihomozigotamente rompido conforme descrito no Exemplo 1 daPublicação PCT WO 01/09187. Além disso, essa cepa decamundongo carrega um transgene de cadeia leve kappahumano, o KCo5, conforme descrito em Fishwild etal.(1996) Nature Biotechnology 14:845-851 e um trangenede cadeia pesada humano, HCo7, HC012 ou HCol7 coodescrito no Exemplo 2 da publicação do PCT WO 02/43478.

Imunizações KM e HuMab

Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos paraCD70, camundongos HuMAb-MOUSE® e KM-MOUSE® foramimunizados com CD70 humano recombinante como antígeno outoda a célula expressando CD70 na superfície celular.

Esquemas gerais de imunização para camundongos HuMabestão descritos em Lonberg, N. et al.(1994) Nature368 (6474) : 856-859; Fishwild, D. et al.(1996) NatureBiotechnology 14:845-851 e publicação PCT WO 98/24884. Oscamundongos tinham de 6-16 semanas de vida quando daprimeira infusão de antígeno. 5-10xl06 células foramutilizadas para imunizar os camundongos HuMab intraperitonealmente (IP) , subcutaneamente (Sc) ouatravés de injeção na pata.

Os camundongos transgênicos foram imunizados duas vezescom antígeno em adjuvante de Freund completo ou adjuvantede Ribi IP, seguido de 3-21 dias IP (até um total de 11 imunizações) com o antígeno em adjuvante de Freund ouRibi incompleto. A resposta imune foi monitorada atravésde sangramentos retroorbitais. 0 plasma foi examinadoatravés do teste ELISA e FACS (conforme descrito abaixo)e os camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-CD7 0 foram usados para asfusões. Os camundongos foram estimulados intrevenosamentecom o antígeno 3 dias antes do sacrifício e remoção dobaço. Tipicamente, foram realizadas de 10-35 fusões paracada antígeno. Diversas dúzias de camundongos foram imunizadas para cada antígeno.

Seleção de um HuMab-MOUSE® ou KM-MOUSE® Produtor deAnticorpos Anti-CD70

Para selecionar camundongos HuMab-Mouse® ou KM-MOUSE®produtores de anticorpos que se ligam ao CD70, os soros de camundongos imunizados foram testados através decitometria de fluxo para ligação às linhas de célulaexpressando o CD70 humano recombinante, mas não a linhade célula controle que não expressa CD70. em adição, ossoros foram testados por citometria de fluxo para ligaçãoàs células 786-0 ou A-498. Resumidamente, a 1 igação dosanticorpos anti-CD70 foi avaliada pela incubação dascélulas CHO expressando CD70, as células 786-0 ou A-498com o anticorpo anti-CD70 em diluções 1:20. As célulasforam lavadas e a ligação foi detectada com IgG Ab anti- humana marcada com FITC. A análise de citometria de fluxofoi realizada usando um citômetro de fluxo FACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA) . Os anticorpos que seligam às células CHO expressando CD70, mas não as célulasCHO parental não expressando CD70 foram testadasadicionalmente quanto à ligação ao CD70 por ELISA, comodescrito por Fishwild, D. et al., (1996). Resumidamente,as placas de microtitulação foram revestidas com proteínade fusão CD70 recombinante purificada de células CHOtransfectadas a l-2ug/ml em PBS, 100 μl/poço, incubadas a4 °C da noite para o dia e, então, bloqueadas com 200μl/poço de soro fetal bovino a 5% em PBS/Tween (0,05%).

As diluições de soros de camundongos imunizados, contraCD70, foram adicionadas em cada poço e incubadas durante1-2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadascom PBS/Tween e, então, incubadas com um anticorpopoliclonal IgG anti-humano de cabra conjugado comhorseradish peroxidase (HRP) durante 1 hora à temperaturaambiente. Após lavagem, as placas foram desenvolvidas comsubstrato ABTS (Sigma, A-1888, 0,22mg/ml) e analisadasatravés de espectrofotômetro a OD 415-495. Os camundongosque desenvolveram os títulos mais elevados de anticorposao anti-CD70 foram usados para as fusões. As fusões foramrealizadas conforme descrito abaixo e os sobrenadantes dehibridoma foram testados quanto à atividade anti-CD70através do ELISA.

Geração de Hibridomas Produtores de AnticorposMonoclonais Humanos para CD70

Os esplenócitos de camundongo, isolados de camundongo KMHuMab-mouse® e/ou KM-mouse®, foram fundidos a uma linhacelular, com mieloma de camundongo tanto com PEG,baseados em protocolos padrão ou em campo elétricobaseado em eletrofusão usando uma câmara grande de Pulso

Cyto, para fusão celular com o eletroporador (Cyto PulseSciences, Inc., Glen Burnie, MD). Os hibridomasresultantes foram então examinados quanto à produção dosanticorpos antígeno-específicos. Suspensões de célulassimples de esplenócitos de camundongos imunizados foramfundidas a um quarto do número de células de mieloma decamundongo não-secretoras SP2/0 (ATCC, CRL 1581) com 50%de PEG (Sigma). As células foram plaqueadas emaproximadamente lxl0^5/poço em placa de microtitulação defundo plano, seguido por uma semana de incubação em meioDMEM com alto teor de glicose com L-glutamina e piruvatode sóido (Mediatech, Inc., Herndon, VA) e ainda contendosoro fetal bovino a 10% (Hyclone, Logan, UT) , meiocondicionado P388D1 a 18%, 5% de fator de clonagem deorigem de hibridoma (Bio Veris, Gaithersburg, VA) , 4 mMde L-glutamina, 5mM de HEPES, 0,055 mM β-mercaptoetanol,50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina'e meio IX hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Sigma;o HAT é adicionado 24 horas após a fusão) . Após umasemana, as células cultivadas em meio no qual HAT foisubstituído por HT. Os poços individuais foram entãoexaminadas através de FACS ou ELISA (descrito acima) paradetectar os anticorpos IgG monoclonais anti-CD70 humanos.Uma vez ocorrido o crescimento extensivo do hibridoma, omeio foi monitorado geralmente após 10-14 dias. Oshibridomas secretores de anticorpo foram replaqueados,novamente examinados e, se ainda positivos para IgGhumana, os anticorpos monoclonais anti-CD70 foramsubclonados pelo menos duas vezes limitando-se adiluição. Os subclones estáveis foram então cultivados invitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo emmeio de cultura de tecidos para caracterização adicional.

Os clones de hibridoma 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e 69A7 foramselecionados para análise adicional.

Exemplo 2 : Caracterização Estrutural de AnticorposMonoclonais Humanos 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 e 69A7.

As seqüências de cDNA codificando as regiões variáveis decadeia pesada e leve dos anticorpos monoclonais 2H5, 10B,8B5, 18E7 e 69A7 foram obtidas dos hibridomas 2H5, 10B,8B5, 18E7 e 69A7 respectivamente, utilizando-se astécnicas PCR padrão e foram seqüenciadas utilizandotécnicas de seqüenciamento de DNA padrão.

As seqüências de nucleotídeos e de aminoácido da regiãovariável de cadeia pesada de 2H5 são mostradas na Figura1A e em SEQ ID MO: 41 e 1, respectivamente.As seqüências de nucleotídeo e de aminoácido da regiãovariável de cadeia leve de 2H5 são mostradas na Figura IBe em SEQ ID NO: 46 e 6, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeiapesada 2H5 com as conhecidas seqüências de cadeia pesadade imunoglobulina de linha germinal humana demonstrouque a cadeia pesada 2H5 utiliza um segmento Vh de linhagerminal humana Vh 3-30,3, um segmento D indeterminadoe um segmento Jh de linha germinal humana JH 6b. 0alinhamento da seqüência Vh 2H5 com a seqüência Vh 3-30,3de linha germinal é mostrado na Figura 6. Outra análiseda seqüência Vh 2H5 utilizando o sistema Kabat dedeterminação da região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CDR3, conformemostrado nas Figuras IA e 6, e nas SEQ ID NOs: 11, 16, e21, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeialeve 2H5 com as conhecidas seqüências de cadeia leve deimunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que acadeia leve 2H5 utiliza um segmento Vl da linha germinalhumana Vk L6 e um segmento Jk de linha germinal humana JK4 . o alinhamento da seqüência 2H5 VL com a seqüência VkL6 de linha germinal é mostrado na Figura 9. Outraanálise da seqüência Vl 2H5 utilizando o sistema Kabat dedeterminação da região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostramas Figuras IB e 9, e nas SEQ ID NOs: 26, 31 e 36,respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos da regiãovariável de cadeia pesada de 10B4 são mostradas na Figura2A e na SEQ ID No.:42 e 2, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos da regiãovariável de cadeia leve de 10B4 são mostradas na Figura2B e na SEQ ID NO: 4 7 e 7, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeiapesada 10B4 com as conhecidas seqüências de cadeia pesadade imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou quea cadeia pesada 10B4 utiliza um segmento Vh da linhagerminal humana Vh 3-30,3, um segmento D da linhagerminal humana 4-11, e um segmento Jh da linha germinalhumana JH 4b. 0 alinhamento da seqüência 10B4 Vh com aseqüência Vh 3-30,3 de linha germinal é mostrado naFigura 6. Outra análise da seqüência Vh 10B4 utilizando osistema Kabat de determinação de região CDR levou aodelineamento das regiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 eCDR3 conforme mostram as Figuras 2A e 6, e as SEQ ID NOs:12, 17, e 22, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeialeve 10B4 com as conhecidas seqüências de cadeia leve deimunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que acadeia leve 10B4 utiliza um segmento Vl da linha germinalhumana Vk Ll8 e um segmento Jk da linha germinal humanaJK3. O alinhamento da seqüência Vl 10B4 com a seqüênciade linha germinal Vk L18 é mostrado na Figura 10. Outraanálise da seqüência Vl 10B4 utilizando o sistema Kabatde determinação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostramas Figuras 2B e 10, e as SEQ ID NOs: 27, 32 e 37,respectivamente.

As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia pesada de 8B5 são mostradas na Figura3A e nas SEQ ID NO.:43 e 3, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia leve de 8B5 são mostradas na Figura 3Be SEQ ID NO: 48 e 8, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeiapesada 8B5 com as conhecidas seqüências de cadeia pesadade imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou quea cadeia pesada 8B5 utiliza um segmento Vh da linhagerminal humana Vh 3-33, um segmento D da linha germinalhumana 3-10, e um segmento Jh da linha germinal humana JH4b. O alinhamento da seqüência VH 8B5 com a seqüência Vh3-33 de linha germinal é mostrado na Figura 7. Outraanálise da seqüência Vh 8B5 utilizando o sistema Kabat dedeterminação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CDR3 conformemostrado nas Figuras 3A e 7, e nas SEQ ID NOs: 13, 18 e23, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeialeve 8B5 com as conhecidas seqüências de cadeia leve deimunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que acadeia leve 8B5 utiliza um segmento Vl de linha germinalhumana Vk Ll5 e um segmento JK de linha germinal humanaJK 4. O alinhamento da seqüência Vl 8B5 com a seqüênciade linha germinal Vk L15 é mostrado na Figura 11. Outraanálise da seqüência Vl 8B5 utilizando o sistema Kabat dedeterminação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostramas Figuras 3B e 11, e as SEQ ID NOs: 28, 33 e 38,respectivamente.

As seqüências de nucleotideo e aminoácido da regiãovariável de cadeia pesada de 18EF são mostradas naFigura 4A e nas SEQ ID NOs: 44 e 4, respectivamente.

As seqüências de nucleotideo e aminoácido da regiãovariável de cadeia leve de 18E7 são mostradas naFigura 4B e nas SEQ ID NOs: 4 9 e 9, respectivamente.A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeiapesada 18E7 com as conhecidas seqüências de cadeia pesadade imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou quea cadeia pesada 18E7 utiliza um segmento Vh de linhagerminal humana Vh 3-33, um segmento D da linha germinalhumana 3-10, e um segmento Jh de linha germinal humana JH4b. O alinhamento da seqüência Vh 18E7 com a seqüência dalinha germinal Vh 3-33 é mostrado na Figura 7. Outraanálise da seqüência Vh 18E7 utilizando o sistema Kabatde determinação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 nas Figuras 4Ae 7, e nas SEQ ID NOs: 14, 19, e 24, respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeialeve 18E7 com as conhecidas seqüências de cadeia leve deimunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que acadeia leve 18E7 utiliza um segmento Vl de linha germinalhumana Vk Ll5 e um segmento Jk de linha germinal humanaJK 4. O alinhamento da seqüência VL 18E7 com a seqüência Vk L15 de linha germinal é mostrado na Figura 11. Outraanálise da seqüência Vl 18E7 utilizando o sistema Kabatde determinação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostramas Figuras 4B e 11, e as SEQ ID NOs: 29, 34 e 39, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da regiãovariável de cadeia pesada de 69A7, são mostradas naFigura 5A e nas SEQ ID NOs: 45 e 5, respectivamente.As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da região variável de cadeia leve de 69A7, são mostradas na Figura5B e nas SEQ ID NOs: 50 e 10, respectivamente.A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeiapesada 69A7 com as conhecidas seqüências de cadeia pesadade imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou quea cadeia pesada 69A7 utiliza um segmento Vh de linhagerminal humana Vh 4-61, um segmento D da linha germinalhumana 4-23, e um segmento Jh de linha germinal humana JH4b. O alinhamento da seqüência Vh 6 9A7 com a seqüência Vh4-61 de linha germinal é mostrado na Figura 8. Outra análise da seqüência Vh 69A7 utilizando o sistema Kabatde determinação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CDR3 conformemostram as Figuras 5A e 9, e as SEQ ID NOs: 15, 20 e 25,respectivamente.

A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeialeve 69A7 com as conhecidas seqüências de cadeia leve deimunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que acadeia leve 69A7 utiliza um segmento Vl de linha germinalhumana Vk L6 e um segmento JK de linha germinal humana JK 4.0 alinhamento da seqüência Vl 69A7 com a seqüência VkL6 da linha germinal é mostrado na Figura 12. Outraanálise da seqüência Vl 69A7 utilizando o sistema Kabatde determinação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostramas Figuras 5B e 12, e as SEQ ID NOs: 30, 35 e 40,respectivamente.

Exemplo 3 : Caracterização de Especificidade de Ligaçãodos Anticorpos Monoclonais Humanos Anti-CD70Uma comparação dos anticorpos anti-CD70 na ligação aoCD7 0 imunopurificado foi realizado pelo ELISA padrão paraexaminar a especificidade de ligação para o CD70.

O CD7 0 myc-rotulado recombinante foi revestico em umaplaca durante a noite, então testado para a ligaçãocontra os anticorpos monoclonais humanos anti-CD70 2H5,10B4, 8B5, 18E7 e 69A7. Os procedimentos de ELISA padrãoforam realizados. Os anticorpos monoclonais anti-CD70humanos foram adicionados em uma concentração de 1 μg/mle com titulações de 1:2 em diluições seriais. 0anticorpo policlonal IgG anti-humano de cabra (cadeia-específica Fc ou Kappa) conjugado com horseradishperoxidase (HRP) foi utilizado como anticorpo secundário.

Os resultados foram estão mostrados na figura 13. Osanticorpos monoclonais anti-CD70 humanos, 2H5, 10B4, 8B5e 18E7 ligados com alta especificidade ao CD70.Exemplo 4 : Caracterização da ligação de anticorpo anti-CD70 ao CD7 0 expresso na superfície celular das linhas decélula de carcinoma de câncer renal.

As linhas de célula de carcinoma de célula renal A-498(ATCC número de acesso No: HTB-44), 786-0 (ATCC número deacesso CRL-1932) , ACHN (ATCC número de acesso CRL-1611) ,Caki-I (ATCC número de acesso HTB-4 6) e Caki-2 (ATCCnúmero de acesso HTB-47) foram cada uma testadas paraavaliar por incubação de IxlO5 células com 2H5 em umaconcentração de 1 μg/ml. As células foram lavadas e aligação foi detectada como uma IgG Ab anti-humana marcadacom FITC. A análise da citometria de fluxo foi realizadausando um citômetro de fluxo FACSCalibur (BectonDickinson, San Jose, CA) . Os resultados são mostrados naFigura 14. Os anticorpos monoclonais anti-CD70 2H5,ligam-se às linhas de célula de carcinoma renal A-498,786-0, ACHN, Caki-I e Caki-2.

As linhas de célula de carcinoma de célula renal 786-0 eA-4 98 foram testadas quanto al igação dos anticorposmonoclonais anti-CD70 humanos HuMAb 2H5, 8B5, 10B4 E 18E7em diferentes concentrações. A ligação dos anticorposmonoclonais anti-CD70 humano foi avaliados através daincubação de 5xl05 células com o anticorpo em umaconcentração inicial de 50 μg/ml e diluições seriais deanticorpos em uma diluição de 1:3. As células foramlavadas e a ligação foi detectada com uma IgG Ab anti-humana marcada com PE. A análise de citometria de fluxofoi realizada usando um citômetro de fluxo FACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA). Os resultados sãomostrados na Figura 15A (786-0) e Figura 15B (A-498). Osanticorpos monoclonais anti-CD70 2H5, 8B5, 10B4 e 18E7ligam-se às linhas de célula de carcinoma renal 786-0 eA-4 98 em uma concentração dependente da maneira, comomedido pela intensidade do meio fluorescente (MFI) dacoloração. Os valores EC50 para os anticorpos monoclonaisanti-CD70 variou de 1,844 nM para 6,669 nM para a linhade célula 786-0 e 3,984 nM para 11,84 nM para a linha decélula A-498.

A ligação dos anticorpos monoclonais anti-CD70 humanosHuMAb 2H5 e 69A7 á linha de célula de carcinoma de célularenal 786-0 foi avaliada através da incubação de 2x105células tanto com 2H5 ou 69A7 em uma concentração de 10μg/ml. Um anticorpo controle isotipo foi utilizado comoum controle negativo. As células foram lavadas e aligação foi detectada com uma IgG Ab anti-humana marcadacom FITC. A análise da citometria de fluxo foi realizadausando um citômetro de fluxo FACSCalibur (BectonDickinson, San Jose, CA). Os resultados são mostrados naFigura 15C. Ambos os anticorpos monoclonais anti-CD70ligam-se à linha de célula de carcinoma renal 786-0.

A linha celular 786-0 de carcinoma celular renal foitestada para ligação do anticorpo monoclonal anti-CD70HuMAb humano em diferentes concentrações. A ligação dosanticorpos monoclonais anti-CD7 0 humano foi avaliadaatravés da incubação de 5x105 de células com anticorpo emuma concentração inicial de 10 μο/ιηΐ e diluições seriaisdo anticorpo em uma diluição 1:3. As células foramlavadas e a ligação foi detectada como uma IgG Ab anti-humana marcada com PE. A análise da citometria de fluxofoi realizada usando um citômetro de fluxo FACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA) . Os resultados sãomostrados na Figura 15D. Os anticorpos monoclonais anti-CD70 69A7, ligam-se as linhas de célula de carcinomarenal 786-0 em uma concentração dependente da maneira,como medido por meio da intensidade fluorescente (MFI dacoloração. 0 valor EC50 para o anticorpo monoclonal anti-CD7 0 69A7 de ligação às células 786-0 foi de 9,927 nM.

Estes dados demonstram que o HuMAbs anti-CD70 liga-se àslinhas de célula de carcinoma de célula renal.Exemplo 5: Caracterização de ligação de anticorpo anti-CD70 ao CD70 expresso na superfície celular de linhas de célula de limfoma

Os anticorpos anti-CD70 foram testados quanto à ligaçãoas células de linfoma expressando CD70 em sua superfíciecelular através da citometria de fluxo.

As linhas de célula de linfoma Daudi (ATCC número de acesso CCL-213), HuT 78 (ATCC número de acesso TIB-161) eRaji (ATCC número de acesso CCL-86) foram cada umatestada quanto à ligação ao anticorpo. A ligação doanticorpo monoclonal anti-CD70 humano HuMAb 2H5 foiavaliado através da incubação de IxlO5 células com 2H5 em uma concentração de 1 μg/ml. As células foram lavadas ea ligação detectada com uma IgG Ab anti-humano marcadocom FITC. A linha de célula Jurkat, que não expresa CD70na superfície celular, foi utilizada como um controlenegativo. As análises citométricas de fluxo foramconduzidas utilizando citometria de fluxo FACScalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA) . Os resultados sãomostrados nas Figuras 16. Os anticorpos monoclonais anti-CD7 0 2Η5 ligam-se as linhas de células de linfoma Daudi,HuT 78 e Raj i, como medido por meio da intensidadefluorescente (MFI) da coloração.

As linhas de célula de linfoma Raji e Granta 519 (DSMZ número de acesso 342) foram testadas para a ligação aoanticorpo monoclonal anti-CDA70 humano HuMAb 2H5 emconcentrações variadas. A ligação dos anticorposmonoclonais anti-CD70 humanos foi avaliados por incubaçãode 5xl05 células com o anticorpo em uma concentraçãoinicial de 50 μg/ml e diluições seriais do anticorpo emuma diluição de 1:3. Um anticorpo controle isotipo foiutilizado como um controle negativo. As células foramlavadas e a ligação foi detectada com uma IgG Ab anti-humano marcado com PE. A análise citométrica de fluxo foi conduzida utilizando citometria de fluxo FACScalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA) . Os resultados sãomostrados nas Figuras 17A(Raji) e 17B (Granta 519). Osanticorpos monoclonais anti-CD70 2H5 liga-se às linhas decélula de linfoma Raji e Granta 519 em uma concentração de forma dependente, como medido por meio da intensidadefluorescente (MFI) da coloração. 0 valor de EC50 pra oanticorpo anti-CD70 foi de 1,332 nM para as células Rajie 1,330 nM para as células Granta 519.

A ligação dos anticorpos monoclonais anti-CD70 humanosHuMAbs 2H5 e 69A7 às linha de célula de linfoma Raji foianalisada por incubação de 2 χ IO5 células com HuMAb emuma concentração de 10 μg/ml. As células foram lavadas ea ligação detectada com uma IgG Ab anti-humano marcadocom FITC. Um anticorpo controle isotipo e o anticorpo secundário sozinho foram utilizados como um controlenegativo. A análise citométrica foi realizada usando acitometria de fluxo FACScalibur (Becton Dickinson, SanJose, CA) . Os resultados são mostrados nas Figuras 17D.Ambos os anticorpos anti-CD70 69A7 e 2H5 bloquearam aligação ao 6 9A7 marcado com FITC, indicando que ambos 2H5e 69A7 divide um epítopo de ligação similar.

A linha de célula linfoma Daudi e a célula de carcinomarenal 786-0 foram testadas adicionalmente para a ligaçãoao anticorpo. A ligação do anticorpo monoclonal anti-CD70humano HuMAb 69A7 foi avaliada por incubação de 2 χ IO5células com 6 9A7 em uma concentração de 1 μg/ml. Ascélulas foram lavadas e a ligação detectada com uma IgGAb anti-humano marcado com FITC. Uma linha de célulaJurkat, que não se expressa o CD70 na superfíciecelular, foi utilizado como um controle negativo. Aanálise citométrica foi realizada usando a citometria de fluxo FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) . Osresultados são mostrados nas Figuras 17E. 0 anticorpomoncolonal anti-CD70 69A7 liga-se à linha de célula delinfoma Daudi e a linha de célula de carcinoma renal 786-0, como medido por meio da intensidade fluorecente (MFI)da coloração.

Estes dados demonstram que o HuMAbs anti-CD70 liga-se âslinhas de célula de linfoma.

Exemplo 6: Análise de Scatchard da afinidade de ligaçãodos anticorpos monoclonais anti-CD70

A afinidade de ligação dos anticorpos monoclonais 2H5,8B5, 10B4 e 18E7 foi testada quanto a afinidade deligação às células CHO transfectadas com CD70 usando umaanálise Scatchard.

As células CHO foram transfectadas com a extensãocompleta de CD70 usando técnia padrão e crescimento emmeio RPMI contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) . Ascélulas foram tripsinizada e lavadas umavez em Tris combase no tampão de ligação (24 mM de Tris, pH 7,2, 137 mMde NaCl, 2,7 mM de KCl, 2 mM de glicose, 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 0,1% de BSA) e as células foram ajustadas a2xl06 células/ml em um tampão de ligação. PlacasMillipore (MAFB N0B) foram revestidas com 1% de leite empó sem gordura em água e armazenadas a 4 o durante anoite. As placas foram lavadas três vezes com 0,2 ml detampão de ligação. Cinqüenta microlitros de tampãosozinho foram adicionados ao máximo de poços de ligação(total de ligação). Uma concentração variável doanticorpo anti-CD70-I125 foi adicionado em todos os poçosem um volume de 2 5 μl. Concentrações variadas deanticorpos não-marcados de 100 vezes o excesso foramadicionadas em um volume de 25 μl aos poços controle e 25μl de células CHO transf ectadas com CD70 ( 2 X IO6células/ml) em um tampão de ligação foram adicionados emtodos os poços. As placas forma incubadas durante 2 horasa 200 RPM em um agitador a 4°C. Em uma finalização daincubação as placas Millipore foram lavadas três vezescom 0,2 ml de tampão de lavagem frio (24 mM Tris, pH 7,2,500mM de NaCl, 2, 7mM de KCl, 2 mM de glicose, ImM deCaCl2, ImM de MgCl2, 0,1% de BSA). Os filtros formaremovidaos e cotnados em um contador gama. A avaliação doequilíbrio de ligação foi realizada usando um parâmetrode ligação em um sítio único com um Software Prism (SanDiego, CA).

Usando o ensaio de ligação Scatchard acima, o K0 doanticorpo para as células CHO transf ectadas pelo CD70 foide aproximadamente 2,1 nM para 2H5, 5, 1 nM ou 8B5, 1,6 nMpara 10B4 e 1,5 nM para 18E7.

Exemplo 7: Internalização dos anticorpos monoclonaisanti-CD70

Os HuMAbs anti-CD70 foram testados quanto a capacidadepara internalizar as células de carcinoma renalexpressando CD70 usando um ensaio de internalização Hum-Zap. Os testes dos ensaios Hum-Zap para internalização deum anticorpo humano primário através da ligação de umsegundo anticorpo com afinidade para o conjugado de IgGhumano a uma toxina saporina.

A linha de célula cancerígena de carcinoma de célulasrenais expressando CD70 foi semeada em l,25xl04células/poço em 100μl por poço durante a noite. Osanticorpos HuMAb anti-CD70 2H5, 8B5, 10B4 ou 18E7 foramadicionados aos poços em uma concentração inicial de 30nM e titulados em 1:3 de diluições seriais. Um anticorpocontrole isotipo que é não-específicao para CD70 foiutilizado como um controle negativo. 0 Hum-Zap (AdvancedTargetin Systems, San Diego, CA, IT-22-25) foi adicionadoem uma concentração de 11 nM e as placas foram deixadasem incubação durante 72 horas. As placas foram entãopulsadas com 1,0 μCi de 3H-timidina durante 24 horas,colhidas e lidas em um contador Top Count Scintillation(Packard Instruments, Meriden, CT). Os resultados estãodemonstrados na figura 18. Os anticorpos anti-CD70 2H5,8B5, 10B4 e 18E7 demonstraram uma concentração deanticorpo dependente da diminuição da incorporação de 3H-timidina nas células de câncer de carcinoma renal 786-0expressando CD70. 0 valor EC50 para o anticorpo anti-CD702H5 foi de 0,9424 nM. Estes dados demonstraram que osanticorpos anti-CD70 2H5, 8B5, 10B4 e 18E7 internalizauma linha de célula de câncer de carcinoma renal.

Exemplo 8: Avaliação da morte celular de um anticorpoanti-CD70 toxina-conjugado nas linhas de célula decarcinoma de célula renal.

Neste exemplo, os anticorpos monoclonais anti-CD70conjugados â toxina foram testados quanto a capacidade dematar as linhas de célula de carcinoma de células renaisCD7 0+ em um ensaio de proliferação celular.

Os anticorpos HuMAb anti-CD70 2H5, 8B5, 10B4 ou 18E7foram conjugados a uma toxina via um ligador, tal como umpeptidil, hidrazona ou ligante bissulfeto. As linhas decélula de câncer de carcinoma renal expressando CD70 ACHNe Caki-2 foram semeadas em 2,5xl04 células/poço e a linhade célula de câncer 786-0 do carcinoma renal expressandoCD70 foram semeadas a l,25xl04 células/poço em 100 μlpoços durante 3 horas. Um conjugado toxina-anticorpoanti-CD70 foi adicionado aos poços em uma concentraçãoinicial de 30 nM e titulada em diluições seriais de 1:3.

Um anticorpo controle isotipo que não é específico paraCD70 foi utilizado como um controle negativo. As placasforam deixadas em incubação durante 69 horas. As placasforam então pulsadas com 1,0 μCi de 3H-timidina durante24 horas, colhidas e lidas em um Contador de cintilaçãoTop Count (Packard Instrument, Meriden, CT). Osresultados estão mostrados nas figuras 19A (Caki-2), 19B(786-0) e 19C (ACHN). Os anticorpos anti-CD70 2H5, 8B5,10B4 e 18E7 demonstraram uma concentração de anticorpo-toxina dependente da diminuição da incorporação de 3H-timidina nas células de câncer carcinoma renal Caki-2,786-0 e ACHN. Os valores EC50 para os anticorpos anti-CD70 variaram de 6,728 nM para 76,05 nM nas células Caki-2, 1,635 nM para 3,940 nM nas células 786-0 e de 9,406 nMa 108,5 nM nas células ACHN. Estes dados demonstram queos anticorpos anti-CD70 2H5, 8B5, 10B4 e 18E7 sãocitotóxicos às células de carcinoma de células renaisquando conjugado a uma toxina.

Exemplo 9: Avaliação da atividade ADCC do anticorpo anti-CD70

Neste exemplo, os anticorpos monoclonais anti-CD70 foramtestados quanto à capacidade de matar as linhas de célulaCD4 + em presença das células efetoras através doanticorpo dependendo da citotoxicidade celular (ADCC) emum ensaio de citotoxicidade por fluorescência.

As células efetoras humanas foram preparadas a partir detodo o sangue como a seguir. As células mononucleares dosangue periférico humano foram purificadas a partir detodo sangue heparinizado por separação padrão Ficoll-paque. As células foram ressuspensas em meio RPMI1640contendo 10% de FBS e 200 U/ml de IL-2 humana e incubadasdurante a noite a 37°C. No dia seguinte, as células foramcolhidas e lavadas quatro vezes em um meio de cultura eressuspensas a 2xl07 células/ml. As células alvo CD4+foram incubadas com o reagente BATDA (Perkin Elmer,Wellesley, MA) em 2,5 μl de BATDA por células/ml alvoIxlO6 durante 20 minutos a 37°C. As células alvo foramlavadas quatro vezes, agitadas e induzidas a um volumefinal de IxlO5 células/ml.

As linhas ce célula CD70+ ARH-77 (leucemia IinfoblásticaB humana; ATCC número de acesso CRL-1621), HuT 78(linfoma linfócito cutâneo humano; ATCC número de acessoTIB-161), Raji (linfoma de Burkitt de linfócito B humano;ATCC número de acesso CCL-86) e uma linha de célula decontrole negativo L540 (linfoma de Hodgkin humano; DSMZdepósito No. : ACC 72 0) foram testadas quanto aespecificidade do anticorpo ADCC para o anticorpomonoclonal anti-CD70 humano usando a análise de emissãode fluorescência Delfia como a seguir. Cada linha decélula alvo (100 μl de células alvo marcadas) foiincubada com 50 μl de células efetoras e 50 μl doanticorpo. Um alavo para a proporção de efetor é de 1:50foi utilizado durante o experimento. Em todos os estudos,um IgGl isotipo controle humano foi utilizado como umcontrole negativo. Seguindo uma rotação em pulso de 2000rpm e uma incubação de uma hora a 37°C, o sobrenadanteforam colhidos, uma rotação rápida novamente e 2 0 μΐ dosobrenadante foi transferido para um frasco de fundoplano, ao qual 18 0 μl de uma solução Eu (Perkin Elmer,Wellesley, MA) foram adiconados e lidos em um leitorRubyStar (BMG Labtech) . A % de Iise foi calculada como aseguir: (liberação da amostra - liberação espontânea* 100)/(liberação máxima - liberação espontânea), onde aliberação espontânea é a fluorescência dos poços quecontém apenas as células alvo e a liberação máxima é afluorescência dos poços contendo as células alvo e tendosido tratada com 2% de Triton-X. A % da citotoxicidade das células para as linhas de células ARH-77, HuT 78,Raji e L-54 0 está demonstrada nas figuras 20A-D,respectivamente. Cada uma das linhas de célulaexpressando CD70+ ARH077, HuT 78 e Raji demonstraramumacitotoxicidade mediada pelo anticorpo com os anticorpos anti-CD7 0 HuMAb de 2H5 e 18E7, enquanto a linha de célulado controle negativo não teve a citotoxicidade celularapreciável em presença dos anticorpos anti-CD70. Estesdados demonstram que anticorpos anti-CD70 HuMAbdemonstram uma citotoxicidade específica às células expressando CD70+.

Exemplo 10: Avaliação da célula matadora de um anticorpoanti-CD70 toxina-conjugada em linhas de célula de linfomahumana.

Neste exemplo, os anticorpos monoclonais anti-CD70conjugados à uma toxina foram testadas para a capacidadede matar as linhas de célula de linfoma humano CD70+ emum ensaio de proliferação celular.

O anticorpo anti-CD70 HuMAb 2H5 foi conjugado â umataxina via um ligante, tal como um peptidil, hidrazona ouligante bisulfeto. Os exemplos de compostos de toxinasque podem ser conjugados aos anticorpos da invenção atualsão descritos no campo de aplicação atual com o pedido depatente No. 04280/100M629US3, despositado em 26 desetembro de 2005. As linhas de célula de câncer delinforma humano expressando CD70, Daudi, HuT 78, Granta519 e Raji foram semeadas a 10"5 células/poço em 100 μlpor poço durante 3 horas. 0 conjugado anticorpo-toxinaanti-CD70 foi adicionado aos poços em uma concentraçãoinicial de 30 nM e titulada em diluições seriais de 1:2.

O conjugado anticorpo-toxina 2H5 HuMAb também foi testadoem células Jukart, e uma linha de célula de controlenegativo que não expressão CD70 na superfície celular. Asplacas foram deixadas em incubação durante 72 horas. Asplacas foram então pulsadas com 0,5 μ(ϋ de 3H-timidinadurante 8 horas antes do término da cultura, colhidas elidas em um Contador de Cintilação Top Count (PackardInstruments) . A figura 21 demonstrou os efeitos doconjugado-2H5 nas células Daudi, HuT 78, Granta 519 eJukart. Os anticorpos anti-CD70 2H5 demonstraram umaconcentração anticorpo-toxina dependente da diminuição naincorporação de 3H-timidina pelas células de câncer delinfoma de células-B expressas por CD70, Daudi, HuT 78 eGranta 519, mas não pelas células Jukart.

Em um ensaio separado, a linha de célula Raji de câncerde linforma humano expressando CD70 foi semeada em 10"4células/poços em 100 μl por poço durante 3 horas. Umconjugado anticorpo-toxina anti-CD70 foi adicionado aospoços em uma concentração inciial de 30 nM e titulada emdiluições seriais de 1:3. Um anticorpo controle isotipotoxina-conjutado foi utilizado como controle. As placasforam deixadas em incubação durante 72 horas tanto comuma lavagem a 3 horas ou uma lavagem contínua. As placasforam então pulsadas com 0,5 μCί de 3H-timidina durante 8horas antes do término da cultura, colhidas e lidas em umContador de Cintilação Top Count (Packard Instruments).

As figuras 22A e 22B demonstraram uma concentraçãoanticorpo-toxina dependente da diminuição na incorporaçãode 3H-timidina pelas células Raji com 3 horas de lavagemou com uma lavagem contínua, respectivamente.

Estes dados demonstraram que o conjugado do anticorpoanti-CD70 à toxina mostra uma citotoxicidade específicaàs células de câncer de linfoma humano.

Exemplo 11: Tratamento de modelo de Xeno-enxertostumorais in vivo usando anticorpos anti-CD70 citotoxina-conjugados ou descobertos.

Os camundongos implantados com tumores de carcinoma decélulas renais foram tratados in vivo com anticorposanti-CD70 toxina-conjugado para examinar o efeito in vivodos anticorpos no crescimento do tumor.

Células A-4 98 (ATCC número de acesso HTB-44) e ACHN (ATCCnúmero de acesso CRL-1611) foram expandidas in vitrousando procedimentos de laboratório padrão. Machos decamundongos pelados Ncr atímicos (Taconic, Hudson, NY)com idade entre 6-8 semanas foram implantadossubcutaneamente no flanço direito com 7,5 X10^6 células deACHN ou A-4 98 em 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1) porcamundongo. Os camundongos foram pesados e medidos quantoa tridimensionalidade dos tumores usando um calibradoreletrônico duas vezes por semana após o implante. Osvolumes dos tumores foram calculados como altura χlargura χ comprimento. Os comundongos com tumores ACHNcom tamanho médio de 270 mm3 ou tumor A-498 com tamanhomédio de 110 mm3 foram introduzidos, aleatoriamente, nosgrupos de tratamento. Os camundongos foram dosadosintraperitonealmente com um veículo PBS, um anticorpocontrole isotipo toxina-conjugado ou um toxina-conjugadoanti-CD70 HuMAb 2H5 no dia 0 (zero). Os exemplos doscompostos de toxinas que podem ser conjugados aosanticorpos da invenção atual estão descritos no pedido depatente atual com o número de referência MEDX-0035US5. Ocamundongo no grupo da amostra A-4 98 foi testado com trêsdiferentes compostos de toxina. Os camundongos forammonitorados para o crescimento do tumor durante 60 diasapós a dosagem. Os camundongos foram eutanizados quandoos tumores alcançaram um ponto máximo de tumor (2000mm3). Os resultados estão mostrados na Figura 23A(tumores A-4 98) e 23B (tumores ACHN). O conjugadoanticorpo anti-CD70 2H5 à toxina extendida em um tempomédio para se conseguir o volume do ponto máximo do tumor(2000 mm3) e diminuir a progressão do crescimento dotumor. Assim, o tratamento com um conjugado anticorpo-toxina anti-CD70 teve um efeito inibitório in vivo diretono crescimento do tumor.

Exemplo 12: Imunohistoquímica com 2H5

A capacidade do HuMAb 2H5 anti-CD70 em reconhecer o CD70através da imunohistoquímica foi examinada usando biópsiaclínica a partir do carcinoma de célula renal límpida(ccRCC), pacientes com linfoma e glioblastoma.Para a imunohistoquímica, 5 μm de secções congeladasforam utilizadas (Ardais, Inc., USA). Após a secagemdurante 30 minutos, secções foram fixadas com acetona (emtemperatura ambiente durante 10 minutos) e secas ao ardurante 5 minutos. As lâminas foram lavadas em PBS eentão, pré-incubadas com 10% de soro normal de cabra emPBS durante 20 minutos e, subseqüentemente incubados com10 μg/ml 2H5 fitocilados em PBS com 10% de soro de cabranormal durante 30 minutos em temperatura ambiente. Emseguida, as lâminas foram lavadas três vezes com PBS eincubadas durante 30 minutos com anti-FITC de camundongo(10 μg/ml DAKO) em temperatura ambiente. As lâminas foramlavadas novamente com PBS e incubadas com conjugado HRPanti-camundongo de cabra (DAKO) durante 30 minutos atemperatura ambiente. As lâminas foram lavadas novamente3x com PBS. A diaminobenzidina (Sigma) foi utilizaadacomo substrato, resultando em uma coloração marrom. Apósa lavagem com água destilada, as lâminas foram contra-coradas com hematoxilina por 1 minuto. Subseqüentemente,as lâminas foram lavadadas durante 10 segundos em umacorrida com água destilada e montada em glicergel (DAKO).A imunohistoquímica da biópsia clínica corada reveloucoloração positiva nas colorações das secções de linfomanão-Hodgkins, plasmacitoma, ccRCC e de glioblastoma.Apenas as células malignas foram positivas em cada caso,tecido normal adjacente não foi corado.Exemplo 13: Produção de HuMAb defucosiladoOs anticorpos com quantidades reduzidas de resíduosfucosil demonstraram um aumento na capacidade de ADCC doanticorpo. Neste exemplo, o HuMAb 2H5 que foi produzidoperdeu os resíduos de fucosil.

A linha de célula CHO Ms704-F, que perde o genefucosiltransferase, FUT 8 (Biowa, Inc., Princeton, NJ)foi eletroporada com um vetor que expressa as cadeias pesada e leve do anticorpo 2H5. Os clones fármaco-resistente foram selecionados pelo crescimento no meioEx-Cell 325-PF CHO (JRH Biosciences, Lenexa, KS) com 6 mMde L-glutamina e 500 μg/ml G418 (Invitrogen, Carlsbad,CA) . Os clones foram classificados quanto a expressão de IgG pelo ensaio ELISA padrão. Dois clones separados foramproduzidos, B8A6 e B8C11, que teve faixas de prdouçãovariando de 1,0 a 3,8 picogramas de célula por dia.Exemplo 14: Avaliação da atividade ADCC do anticorpoanti-CD70 defucosilado

Neste exemplo, um anticorpo monoclonal anti-CD70 não-defucosilado e defucosilado foi testado para a capacidadepara matar as células CD70+ em presença das célulasefetoras via anticorpo dependente da citotoxicidadecelular (ADCC) em um ensio de citotoxicidade porfluorescência.

0 anticorpo monoclonal anti-CD70 humano 2H5 foidefucosilado como descrito acima. As células efetorashumanas foram preparadas a partir de todo o sangue como aseguir. As células mononucleares do sangue periféricohumano foram purificadas por heparinizaão de todo osangue por separação Ficoll-paque padrão. As célulasforam ressuspensas em meio RPMI1640 contendo 10% de FBS(meio de cultura) e 200 U/ml de IL-2 humano e incubadodurante a notie a 37°C. 0 dia seguinte, as células foramcolhidas e lavadas uma vez em meio de cultura eresuspensas em 2xl07 células/ml. As células alvo CD70+foram incubadas com o reagente BATDA (Perkin Elmer,Wellesley, MA) em 2,5 μl de BATDA por IxlO6 de célulasalvo/mL no meio de cultura suplementado com 2,5mM deprobenecida (meio de ensaio) durante 20 minutos a 37°C.

As células alvo foram lavadas quatro vezes em PBS com 20mM de HEPES e 2,5 mM de probenecida, agitadas e induzidasa um volume final de IxlO5 células/ml em meio de ensaio.As linhas de célula CD70+ ARH-77 (leucemia Iinfoblásticade célula B human; ATCC número de acesso CRL-1621), MEC-I(leucemia de célula B crônica humana; DSMZ número deacesso ACC 497), SU-DHL-6 (linfoma de célula B humana,DSMZ número de acesso Acc572), IM-9 (linfoblasto Bhumano; ATCC número de acesso CCL-159) e HuT 78 (linfomalinfócito cutâno humano; ATCC número de acesso TIB-161),foram testados para o anticorpo específico ADCC aoanticorpo monoclonal anti-CD70 humano defucosilado e não-defucosilado 2H5 usando a análise de emissão defluorescência Delfia como a seguir. As linhas de célulaalvo ARH77 (100 μl de células alvo marcada) foi incubadacom 50 μl de células efetoras e 50 μl tanto do 2H5 ou doanticorpo 2H5 defucosilado. Um alvo para a proporçãoefetora de 1:50 foi utilizado durante os experimentos. Umcontrole isotipo IgGl humano foi utilizado como umcontrole negativo. Seguindo uma rotação em pulso de 2100rpm e uma hora de incubação a 37 °C, os sobrenadantesforam colhidos, pulsados rapidamente novamente e 20 μl dosobrenadante foi transferido para um frasco de fundoplano, ao qual 180 μΐ de uma solução Eu (Perkin Elmer,Wellesley, MA) foram adicionados e a leitura em um leitorde placa Fusion Alpha TRF (Perkin Elmer). A % de Iise foicalculada como a seguir: (liberação da amostraliberação espontânea* 100)/ (liberação máxima - liberação espontânea), onde a liberação espontânea é afluorescência dos poços que contém apenas as células alvoe a liberação máxima é a fluorescência dos poços contendoas células alvo e tendo sido tratadas com 3% de lisol. A% da citotoxicidade específica da Iise para a linha de células ARH-77 é mostrado na figura 24. As linhas decélula expressando CD70+, ARH-77, MEC-1, SU-DHL-6, IM-9e HuT 78, demonstraram uma citotoxicidade mediada peloanticorpo com o anticorpo anti-CD70 2H5 HuMAb e umaporcentagem aumentada da Iise específica associada com a forma defucosilada do anticorpo anti-CD70 2H5. Em adição,o anticorpo anti-CD16 demonstrou bloquear o efeito ADCCna linha de célula MEC-1. Estes dados demonstram que osanticorpos anti-CD70 HuMAb defucosilados demonstram umacitotoxicidade específica aumentada para as células expressando CD70+.

Exemplo 15: Avaliação da atividade ADCC do anticorpoanti-CD70 usando um ensaio 51Cr-liberação.

Neste exemplo, um anticorpo monoclonal anti-CD70 foitestado para a capacidade em matar as células do linfócito de B Raji CD70+ em presença das célulasefetoras via anticorpo, dependente da citotoxicidadecelular (ADCC) em um ensaio 51Cr-liberação.

As células mononucleares do sangue periférico humano(células efetoras) foram purificadas a partir de todo o sangue heparinizado por sepração padrão Ficoll-paque. Ascélulas foram ressuspensas em 2xl06/ml em meio RPMI-1641contendo 10% de FBS e 200 U/ml de IL-2 humana e incubadasdurante a notie a 37°C. No dia seguinte, as células foramcolhidas e lavadas uma vez em meio de cultura e ressuspensas a 2xl07 células/ml. Dois milhões de célulasRaji (linfoma de Burkitt de linfócito B humano; ATCCnúmero de acesso CCL-86) foram incubadas com 200 μCi 51Crem Iml do volume total durante 1 hora a 37°C. As célulasalvo foram lavadas uma vez, ressuspensas em 1 ml de meio,e incubadas a 37°C por um período adicional de 30minutos. Após a incubação final, as células alvo foramlavadas uma vez e induzidas a um volume final de IxlO5células/ml. Para o final do ensaio ADCC, 100 μl dascélulas Raji marcada foram incubadas com 50 μl de célulasefetoras e 50 μl de anticorpo. Um alvo para a proporçãode efetor de 1:100 foi utilizado durante os experimentos.

Em todos os estudos, o controlo isotipo IgGl humano foiutilizado como um controle negativo. Em alguns estudos, acultura PBMC foi separada igualmente dentro de tuboscontendo tanto 2 0 μg/mL de um anticorpo CD16 anti-humano,um anticorpo IgGl de camundongo irrelevante, ou nenhumanticorpo antes da adição do PBMC para a placa de ensaio.Seguindo um período de incubação de 15 minutos a 27°C, ascélulas de sangue foram utilizadas coo descrito acima semlavagem. Seguindo um período de incubação de 4 horas a37°C, os sobrenadantes foram colhidos e contadas em umcontador Cobra II auto-gamma (Packard Instruments) comuma janela de leitura de 240-400 kev. A contagem porminuto foi organizada como uma função da concentração doanticorpo e os dados foram analisados por regressão não-linear, resposta a dose sigmoidal (inclinação variável)usando um Software Prism (San Diego, CA). A porcentagemda Iise foi determinada pela equação a seguir: % de Iise= Amostra COM - sem anticorpo COM / Triton X COM- semanticorpo COM X 100. Uma curva de titulação de anticorpopara a citotoxicidade celular Iise específica para alinha de célula de Raji é mostrada na Figura 25. Estesdados demonstram que o efeito ADCC dos anticorpos anti-CD70 nas células Raji é dependente de CD16.

Exemplo 16: Avaliação da atividade de ADCC do anticorpoanti-CD70 nas células T ativadas.

Neste exemplo, um anticorpo monoclonal anti-CD70defucosilada e não-defucosilada foi testada quanto àcapacidade para matar as células T ativadas em presençadas células efetoras via anticorpo, dependente dacitotoxicidade celular (ADCC) em um ensaio decitotoxicidade por fluorescência.

0 anticorpo monoclonal 2H5 anti-CD70 humano foidefucosilado como descrito acima. As células efetorashumanas foram preparadas como descrito acima. As célulasT de baço humano foram selecionadas positivamente comcontas magnéticas revestidas cm anti-CD3 (Pureza > 90%).As céluolas foram estimuladas com contas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28 e 25 ng/ml de IL-2 em meio de Iscove+ 10% de FCS inativado por calor durante 6 dias. Ascélulas foram colhidas e examinadas quanto à viabilidadepara incorporação de iodeto de propídio (60% viável) e ascélulas foram fechadas e analisadas para a expressão de CD70 (-65% de CD70 + em células vivas) antes da inclusãono ensaio ADCC.

As células T ativadas foram testadas para o anticorpoADCC específico para um anticorpo monoclonal 2H5 anti-CD70 defucosilado e não-defucosilado usando a análise de emissão de fluorescência Delfia como a seguir. As célulasT ativadas alvo (100 μΐ de células alvo marcadas) foramincubadas com 50 μΐ de células efetoras e 50 μΐ tanto de2H5 quanto do anticorpo 2H5 defucosilado. Um alvo para aproporção efetora de 1:50 foi utilizado durante os experimentos. Um controle isotipo IgGl humano foiutilizado como um controle negativo. Seguindo uma rotaçãoem pulso de 2100 rpm e uma hora de incubação a 37°C, ossobrenadantes foram colhidos, pulsados rapidamentenovamente e 20 μΐ do sobrenadante foram transferidos para um frasco de fundo plano, ao qual 180 μΐ de uma soluçãoEu (Perkin Elmer, Wellesley, MA) foram adicionados e aleitura em um leitor de placa Fusion Alpha TRF (PerkinElmer) A % de Iise foi calculada como a seguir:(liberação da amostra - liberação espontânea* 100)/(liberação máxima - liberação espontânea), onde aliberação espontânea é a fluorescência dos poços quecontém apenas as células alvo e a liberação máxima é afluorescência dos poços contendo as células alvo e tendosido tratadas com 3% de lisol. A % da citotoxicidadeespecífica da célula para as células T ativadas émostrado na figura 27. As células T ativadas mostraramuma citotoxicidade mediada pelo anticorpo com o anticorpoanti-CD70 2H5 HuMAb e uma porcentagem aumentada da Iiseespecífica associada com a forma defucosilada doanticorpo anti-CD70 2H5. A citotoxicidade mediada peloanticorpo foi bloqueada pela adição do anticorpo anti-CD16 tanto nas formas defucosilada e não-defucosilada doanticorpo anti-CD70. o controle IgG não teve efeito nacitotoxicidade. Estes dados demonstram que os anticorposanti-CD70 HuMAb defucosilados apresentam umacitotoxicidade específica aumentada para as células Tativadas.

Exemplo 17: Análise de bloqueio para a ligação CD70-CD27dos receptores-ligantes.

Neste exemplo, os anticorpos monoclonais anti-CD70 foramtestados quanto a sua capacidade em bloquear a interaçãodo CD70 com o ligante CD27 usando uma análise debloqueio.

Os poços foram revestidos durante a noite com 100 μl/poçode um anticorpo anti-IgG (Fc-sp) a 2 μg/ml a 4 °C. Ospoços foram bloqueados com 20 μΐ/poço de BSA/PBS a 1%durante 1 hora a tempratura ambiente. Em cada um dospoços foram adicionados 100 μl/poço de CD27-Fc-his a 0,16μg/ml durante 1 hora a 370C enquanto agitado. Cada um dospoços foi lavado 5 vezes com 200 μl/poço de PBS/Tween 20(0,05% (ν:v)). 0 anticorpo anti-CD70 foi diluído em 10%de NHS + 1% de BSA/PBS e misturado com CD70-myc-his a0,05 μm/ml, incubado durante 1 hora a temperaturaambiente e lavado 5 vezes com 200 μl/poço de PBS/Tween 20(0,05% (ν:v)). Um anticorpo conhecido que bloqueia ainteração CD70/CD27 foi utilizado como um controlepositivo e um anticorpo controle isotipo foi utilizadocomo um controle negativo. A mistura de CD70 e doanticorpo anti-CD70 foi bloqueado com um anticorpo anti-Fc e 100 μl/poço CD70-my-his + anticorpo foi adicionadoaos poços contendo CD27-Fc-his. A mistura foi incubadadurante 1 hora agitada a 37°C. Nesta mistura foramadicionados 100 μΐ/poço de um anti-myc-HRP (1:1000diluído em 10% de NHS + 1% de BSA/PBS) e incubado durante1 hora enquanto em agitação a 37°C. O sinal foi detectadopela adição de 100 ml de substrato TMB, incubado durante5-10 minutos a temperatura ambiente (RT), então 75 μl de0,25 M de H2S04 foram adicionados e os resultados foramlidos a 450 nm. Os resultados estão apresentados nafigura 28. Estes dados demonstram que alguns anticorposanti-CD70, incluindo, 2H5, 8B5, e 18E7, bloqueiam aligação de CD70 ao CD27, enquanto outros anticorpos nãoafetam a interação entre CD70 e CD27.

Exemplo 18: Tratamento do modelo de tumor Xeno-enxerto invivo usando anticorpos anti-CD70 despidos.

Os camundongos implantados com tumores de Iinfoma foramtratados in vivo com anticorpos anti-CD70 despidostoxina-conjugado para examinar o efeito in vivo dosanticorpos no crescimento do tumor.

Células ARH- 7 7 (leucemia linfoblástica B humana; ATCCnúmero de acesso CRL-1621) e Raji (linfoma de Brukitt delinfócito B; ATCC número de acesso CCL-86) foramexpandidas in vitro usando procedimentos de laboratóriopadrão. Machos de camundongos pelados Ncr atímicos(Taconic, Hudson, NY) com idade entre 6-8 semanas foramimplantados subcutaneamente no flanco direito com 5 χ IO6células de Raji ou ARH-77 em 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1)por camundongo.

Os camundongos foram pesados e medidos para atridimensionalidade dos tumores usando um calibradoreletrônico duas vezes por semana após o implante. Osvolumes dos tumores foram calculados como altura χlargura χ comprimento/2. Os comundongos com tumores ARH-77 com tamanho médio de 80 mm3 ou tumores Raji comtamanho médio de 170 mm3 foram introduzidos,aleatoriamente, nos grupos de tratamento. Os camundongosforam dosados intraperitonealmente com um veículo PBS, umanticorpo controle isotipo toxina-conjugado ou um anti-CD7 0 HuMAb 2H5 no dia 0 (zero) . Os camundongos forameutanizados quando os tumores alcançaram um ponto máximao de tumor (2000 mm3) . Os resultados estão mostrados naFigura 2 9A (tumores Raji) e 2 9B (tumores ARH-77). 0anticorpo anti-CD70 2H5 despido foi extendido em umtempo médio para se conseguir o volume do ponto máximo dotumor (2000 mm3) e diminuir a progressão do crescimento do tumor. Assim, o tratamento com o anticorpo anti-CD70sozinho teve um efeito inibitório in vivo direto nocrescimento do tumor.

Exemplo 19: Tratamento do modelo de tumor Xeno-enxerto invivo usando anticorpos anti-CD70 citotoxina-conjugado. Os camundongos implantados com tumores linfoma foramtratados in vivo com anticorpos anti-CD70 toxina-conjugado para examinar o efeito in vivo dos anticorposno crescimento do tumor.

Células ARH- 7 7 (leucemia Iinfoblástica B humana; ATCC número de acesso CRL-1621) e Granta 519 (DSMZ acesso No.:342) e Raji (linfoma de Brukit de linfócito B humano;ATCC número de acesso CCL-86) foram expandidas in vitrousando procedimentos de laboratório padrão. Machos decamundongos pelados Ncr atimicos (Taconic, Hudson, NY) com idade entre 6-8 semanas foram implantadossubcutaneamente no flanco direito com 5 χ IO6 células deARH-77, 10 χ IO6 células de Granta 519 ou 5 χ IO6 célulasde Raji, em 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por camundongo.Os camundongos foram pesados e medidos para atridimensionalidade dos tumores usando um calibradoreletrônico duas vezes por semana após o implante. Osvolumes dos . tumores foram calculados como altura χlargura χ comprimento/2. Os comundongos com tumores comtamanho médio de 80 mm3 (ARH-77) , 220 mm3 (tumores Granta 519), ou 170 mm3 (tumores Raji) foram introduzidos,aleatoriamente, nos grupos de tratamento. Os camundongosforam dosados intraperitonealmente com um veículo PBS, umanticorpo controle isotipo toxina-conjugado ou um anti-CD70 HuMAb 2H5 no dia 0 (zero). Exemplos de compostos detoxina que podem ser conjugados aos anticorpos dapresente invenção estão descritos no pedido de patentenorte-americano provisório No. 60/770,499, depositado em26.09.2005. Os camundongos foram eutanizados quando ostumores alcançaram um ponto máximao de tumor (2000 mm3).

Os resultados estão mostrados na Figura 30A (tumores ARH-77), 30B (Granta 519) e 30C (tumores Raji). O anticorpoanti-CD70 2H5 despido foi extendido por um tempo médiopara se conseguir o volume do ponto máximo do tumor (2000mm3) e diminuir a progressão do crescimento de tumor.Assim, o tratamento com o conjugado anticorpo-toxinaanti-CD70 sozinho teve um efeito inibitório in vivodireto no crescimento do tumor de linfoma.

Exemplo 20: Reatividade cruzada do anticorpo anti-CD70com células de linfoma B de Rhesus.

A análise FACS também foi empregada para acessar acapacidade do anticorpo anti-CD70 69A7 em apresentarreatividade-cruzada com a linha de célla de linfoma BCD70+ de Rhesus, LCL8664 (ATCC #: CRL-1805). A ligação doanticorpo monoclonal anti-CD70 humano HuMAb 69A7 foiexaminada através da incubação de IxlO5 células com 69Ά7em uma concentração de 1 μg/ml. As células foram lavadase a ligação foi detectada com IgG Ab anti-humana marcadacom FITC. Um anticorpo controle isotipo foi utilizadocomo um controle negativo. A análise por citometria defluxo foi realizada usando um citômetro de fluxoFACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) . Osresultados estão demonstrados na figura 31. 0 resultadodemonstrou que o anticorpo anti-CD70 69A7 têm reaçãocruzada com as células de linfoma B CD70+ de macaco.

Exemplo 21: Internalização do anticorpo anti-CD70 sobligação às células do carcinoma renal 786-0.

A linha de célula de câncer renal 786-0 humano foiutilizada para testar a internalização dos anticorposanti-CD70 HuMAb 69A7 e 2H5 sob ligação às células usandocoloração imuno-fluorescente. As células 786-0 (IxlO4células por 100 μΐ por poço em uma placa de 96-poços)foram colhidas a partir de um frasco de cultura de tecidopor tratamento com 0,25% de Tripsina/EDTA, entãoincubadas com uma com os anticorpos anti-CD70 HuMAb em5μ9/πι1 de tampão FACS (meio PBS + 5% FBS) durante 30minutos em gelo. Um controle IgGl isotipo humano foiutilizado como um controle negativo. Seguindo 2 lavagenscom o meio, as células forma re-suspensas no meio (100 μlpor poço) e então incubadas com um conjugado de anticorposecundário anti-humano de cabra com PE (JacksonImmunoResearch Lab) em diluições de 1:100 em gelo duranteminutos. As células foram assim imediatamentevisualizadas quanto à morfologia e intensidadeimunofluorescente sob um microscópio fluorescente (Nikon)em 0 minuto ou foram incubadas a 310C por várias vezes. Afluorescência foi observada nas células coradas com osanticorpos anti-CD70 HuMAb, mas não no anticorpocontrole. Resultados similares foram também obtidos com oanticorpo anti-CD70 HuMAb conjugado FITC-direto noexperimento. Os resultados demonstraram aparênciafluorescente na membrana superficial da célula com ambosos anticorpos anti-CD70 HuMAbs à 0 minuto. Seguindo umaincubação de 3 0 minutos, a intensidade de fluorescênciana membrana diminuiu significativamente enquanto afluorescência interna aumentou. Em um período de tempo de120 minutos, a fluorescência na membrana não foiaparente, mas ao contrário, parecer estar presente noscompartimentos intracelulares. Os dados demonstram que osanticorpos anti-CD7 0 HuMAb podem ser internalizadosespecificamente sob ligação às células de tumoresendógenos expressando CD70.

Exemplo 2 2: Bloqueio do anti-CD7 0 HuMAb na ligação de umanticorpo anti-CD7 0 de camundongo conhecido.Neste experimento, o anticorpo anti-CD70 HuMAb 69A7 foitestado para esta capacidade de bloquear a ligação de umanticorpo anti-CD70 de camundongo para as células 786-0de carcinoma renal CD70+. As células 786-0 foramincubadas com o anticorpo anti-CD70 de camundongo BU-69(Ancell, Bayportf MN) em 1 pg/ml e o HuMAB 69A7 em 1, 6ou 10 μg/ml por 20 minutos no gelo. Os anticorposcontrole isotipo IgGl e IgG2 foram utilizados comocontrole negativo. As células foram lavadas duas vezes ea ligação foi detectada com um citômetro de fluxoFACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). Osresultados estão demonstrados na figura 32. 0 bloqueio daligação pelo HuMAb 69A7 anti-CD70 de um anticorpo anti-CD70 de camundongo de uma forma dependente daconcentração.

Exemplo 23: HuMAb anti-CD70 inibe a respostainflamatória.

Neste experimento, o anticorpo HuMAb anti-CD70 2H5 foitestado para a inibição de respostas inflamatória. Ascélulas CHO-S transfectadas estavelmente com CD32 decamundongo (células CHO-S/mCD32) foram transitoriamentetransfectadas com uma extensão completa do constructoCD70 humano (células CHO-S/mCD32/CD70). A expresão desuperfície foi confirmada por citometria de fluxo usando2A5 e PE conjugado com IgG anti-humana secundária Ab(dados não ilustrados). 0 Kit RosetteSep® enriquecidocom célla T humana(Cat#15061; StemCell Technologies Inc,células T CD3+ de sangue periférico humano purificadoforam estimuladas in vitro em lxl06/poço com IxlO5 CHO-S/mCD32 ou CHO-S/mCD32/CD70 células por poço, 1 μg/ml deanti-hCD3 (clone 0KT3; BD Bioscience) e diluições seriaistanto do HuMAb 2H5 ou do não fucosilado 2H5 (2H5 NF) empoços triplicados em uma placa de 96 poços. Após 3 dias,alíquotas do sobrenadante foram colhidas e secreção dointerf eron-gama (INF-γ) foram medidas por um kit ELISAquantitativo (BD Biosciences). As placas foram pulsadascom 1 μCi/ml de 3H-timidina, incubadas durante 8 horas,as células foram colhidas e a incorporação de 3H-timidina, foi lida em um contador Trillux® 1450Microbeta (Wallac, Inc). Um anticorpo controle isotipoIgGl foi utilizado como um controle negativo. Osresultados estão demonstrados na figura 33. Ambos 2H5 e2H5-NF inibiram completamente a proliferação co-estimulada por CD70 de uma maneira dependente da dose(Figura 3 3A). Os dados também demonstram que a inibiçãode 2H5 é específica para a co-estimulação de CD70 como2H5 não têm efeito na proliferação mediada por anti-CD3 +CHO-S/mCD32. Ambos 2H5 e 2H5-NF inibiram completamente asecreção de INF-γ co-estimulada por CD70 de uma maneiradependente da dose também (Figura 33B). Os dados tambémdemonstram que a inibição de 2H5 é específica para a co-estimulação de CD7 0 como 2H5 não têm efeito na secreçãode INF-γ mediada por anti-CD3 + CHO-S/mCD32. Os dadosjuntos demonstraram que 2H5 e 2H5-NF bloqueiafuncionalmente a co-estimulação da célula T humana por CD70.

As classes I de MHC humana haplotipo B*3501 + célulasmononucleares periféricas (PBMC) pré-classifiçadas pararespostas de célula T específica para citomegalovírus(CMV) (Astarte, Inc) foram cultivadas em presença de 25ng/ml de B*3501, ligado ao peptídeo CMV IPSIN VHHY(Prolmmune, Oxford, UK) e diluições seriais do HuMAb 1H5por 11 dias. As culturas foram analisadas por citometriade fluxo para as células T CD8+ pela coloração para anti-CD8 conjugada PE (clone RPA-T8, BD biosciences) , para ascélulas T CD8+ peptídeo-especifica marcadas com acoloração de oligômero pentamérico MHC Classe I (F114-4B; Prolmmune) e quanto à viabilidade para perda dacoloração de iodeto de propídio. Um anticorpo controleisotipo foi utilizado como um controle negativo. Osresultados estão mostrados na figura 34. 0 2H5 inibiuparcialmente a expansão da célula T CD8+ peptídeo-específica e 2H5 NF e o controle positivo anti-MHC ClasseI Ab (clone W6/32; BD Bioscience) inibiram completamentea expansão da célula T CD8+ peptídeo-específica (Figura34A). Não hove redução significante da viabilidadecelular total observada (Figura 34B). Juntos, os dadosmostraram que os efeitos de 2H5 e 2H5 NF foramespecíficos para as células T CD8+ estimuladas pelopeptídeo. Os dados são representativos de um experimentoadicional realizado com o mesmo doador.

As classes I de MHC humana haplotipo B*3501 + PBMC pré-classifiçadas para resposta de células T específicas paracitomegalovírus (CMV) (Astarte, Inc) foram cultivadas empresença de 25 ng/ml de B*3501 ligado ao peptídeo CMVIPSINVHHY (ProImmune) e 20 μgs/ml de HuMAb 2H5 empresença ou na ausência de diluições seriais de um anti-CDl6 (FcRyI11) bloqueador funcional Ab (clone 3G8; BDBiosciences) por 11 dias e foram então analisadas porcitometria de fluxo para o número de célula CD8+peptídeo-específica como descrito acima. Os resultadosestão mostrados na figura 35. A reversão dependente dadose de 2H5 e de 2H5 NF que media a inibição da expansãoda célula T CD8+ peptídeo-especí fica por meio do anti-CD16 mostra que a inibição de 2H5 e 2H5 NF é mediadaatravés da interação de 2H5 e de 2H5 NF com as célulasefetoras CD16+. Aproximadamente, 1000 vezes mais que 3G8foi requerido para reverter à inibição mediada por 2H5 NFcomparada a do 2H5. Não houve inibição da expansão dacélula T CD8+ peptídeo-específica por meio do controleisotipo negativo independente da concentração de 3G8 emuito pequena para efetuar 3G8 na inibição da expansão dacélula T CD8+ peptídeo-específica por um controlepositivo de bloqueio funcional W6/32.

Exemplo 24: Tratamento do modelo de tumor Xeno-enxerto decarcinoma renal in vivo usando anticorpos citotoxina-conjugados anti-CD70.

Os camundongos implantados com tumor de carcinoma renalforam tratados in vivo com anticorpos anti-CD70citotoxina-conjugados para examinar do efeito in vivo dosanticorpos no crescimento do tumor.

Células 786-0 (ATCC número de acesso CRL-1932) e Caki-1(ATCC número de acesso htb-46) foram expandidas in vitrousando procedimentos de laboratório padrão. Machos dec amundongo s CB17.SCID (Taconic, Hudson, NY) com idadeentre 6-8 semanas foram implantados subcutaneamente noflanço direito com 2,5 milhões de células 786-0 e Caki-Iem 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por camundongo. Oscamundongos foram pesados e medidos para atridimensionalidade dos tumores usando um calibradoreletrônico duas vezes por semana após o implante. Osvolumes dos tumores foram calculados como altura χlargura χ comprimento. Os comundongos com tumores comtamanho médio de 2 00 mm3 foram introduzidos,aleatoriamente, nos grupos de tratamento. Os camundongosforam dosados intraperitonealmente com um veículo PBS, umanticorpo controle isotipo toxina-conjugado ou um anti-CD7 0 HuMAb 2H5 no dia 0 (zero) . Exemplos de compostos detoxina que podem ser conjugados aos anticorpos dapresente invenção estão descritos no pedido de patenteprovisório No. 60/720,499, depositado em 26 de setembrode 2 0 05. Os camundongos foram eutanizados quando ostumores alcançaram um ponto máximo de tumor (2 00 0 mm3).

Os resultados estão mostrados na Figura 36A (786-0) e 36B(Caki-I) . 0 anticorpo anti-CD70 2H5 foi conjugado àtoxina extendida em um tempo médio para se conseguir ovolume do ponto máximo do tumor (2 000 mm3) e diminuir aprogressão do crescimento do tumor. A alteração do pesodo corpo foi menor que 10% nos animais tratados. Assim, otratamento com um conjugado anticorpo-toxina anti-CD70teve um efeito inibitório in vivo direto no crescimentodo tumor.

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Claims

1. Anticorpo monoclonal humano isolado, ou uma porçãoligante ao antigeno do mesmo, caracterizado pelo fato de:(a) ligar-se ao CD70 humano com um K0 de IxlO"7 M ou menos; e (b) ligar-se a uma linha de célula tumoral decarcinoma de célula renal.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de ser um anticorpo de extensãocompleta de um isótopo IgGl, IgG2 ou IgG4.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de ser um fragmento de anticorpoou um anticorpo de cadeia simples.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de ligar-se a CD70 humano com umK0 de 5 χ IO"9 M ou menos.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o citado anticorpo ligar-se aoCD70 humano com um K0 de 3 χ IO"9 M ou menos.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o citado anticorpo ligar-se aoCD70 humano com um K0 de 2 χ 10~9 M ou menos.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o referido anticorpo serinternalizado.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de a linha de célula tumoral docarcinoma de célula renal ser selecionada a partir dogrupo consistindo das linhas de célula 786-0, A-498,ACHN, Caki-I e Caki-2.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o referido anticorpo se ligara uma linha de célula tumoral de célula-B.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de a linha de célula tumoral de célula B ser selecionada a partir do grupo consistindodas linhas de célula Daudi, HuT 78, Raji e Granta 519.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o referido anticorpo perderresíduos de fucose.

12. Anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porçãoligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato deo anticorpo fazer competição cruzada para ligar-se a CD70com um anticorpo de referência, sendo que o anticorpocompreende:(a) ligar-se ao CD70 humano com um K0 de 1 χ IO"7 M oumenos; e(b) ligar-se a linha de célula tumoral do carcinoma decélula renal.

13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de o anticorpo de referênciacompreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:5.

14. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de o anticorpo de referênciacompreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

15. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12,caracteri zado pelo fato de o anticorpo de referênciacompreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:7.

16. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de o anticorpo de referência compreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:8.

17. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de o referido anticorpo ligar-seà linha de célula tumoral de célula-B.

18. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de a linha de célula tumoral decélula B ser selecionada do grupo consistindo da linha decélula Daudi, HuT 78, Raji e Granta 519.

19. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante aoantigeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreenderuma região variável de cadeia pesada que é o produto deou derivada de um gene Vh 3-30,3 humano ou o gene Vh 3-33humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente aoCD70.

20. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante aoantigeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreenderuma região variável de cadeia leve que é produto de ouderivada de um gene Vk L6 humano, do gene Vk L18 humano,ou do gene Vk L15 humano, sendo que o anticorpo liga-seespecificamente ao CD70.

21. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante aoantigeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de compreender ainda, uma regiãovariável de cadeia pesada que é produto de ou derivada deum gene Vh 3-30,3 humano ou do gene, de um gene Vh 3-33humano .

22. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo a SEQ ID NO: 9;(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo a SEQ ID NO:13;(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo a SEQ ID NO:17;(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo a SEQ ID NO:21;(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo a SEQ ID NO:25 ; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo a SEQ ID NO:29 •

23. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo a SEQ ID NO:10 r (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo a SEQ ID NO:14 r (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo a SEQ ID NO:18 r (d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo a SEQ ID NO:22 r (e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo a SEQ ID NO:26 ; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo a SEQ ID NO:30 •

24. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO:11;(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 15;(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 19;(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:23;(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:27 e(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:31.

25. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO:12;(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO:16;(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO:20;(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:24;(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:28; e(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO:32.

26. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante aoantigeno do mesmo, caracterizado pelo fato decompreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, sendo que oanticorpo liga-se especificamente ao CD70.

27. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante aoantigeno do mesmo, caracterizado pelo fato decompreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, sendo que oanticorpo liga-se especificamente ao CD70.

28. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante aoantigeno do mesmo, caracterizado pelo fato decompreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, sendo que oanticorpo liga-se especificamente ao CD70.

29. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante aoantigeno do mesmo, caracterizado pelo fato decompreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, sendo que oanticorpo liga-se especificamente ao CD70.

30. Composição, caracterizada pelo fato de compreender oanticorpo ou a porção ligante ao antigeno do mesmo,conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-29, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

31. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato decompreender o anticorpo ou uma porção ligante ao antigenodo mesmo, conforme definido em qualquer uma dasreivindicações 1-29, ligado a um agente terapêutico.

32. Composição, caracterizada pelo fato de compreender oimunoconjugado, conforme definido na reivindicação 31 eum veiculo farmaceuticamente aceitável.

33. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de o agente terapêutico ser umacitotoxina.

34. Composição, caracterizada pelo fato de compreender oimunoconjugado, conforme definido na reivindicação 33 eum veiculo farmaceuticamente aceitável.

35. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de o agente terapêutico ser umisótopo radioativo.

36. Composição, caracterizada pelo fato de compreender oimunoconjugado, conforme definido na reivindicação 35 eum veiculo farmaceuticamente aceitável.

37. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizadapelo fato de codificar o anticorpo ou a porção ligante aoantigeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma dasreivindicações de 1-29.

38. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato decompreender a molécula de ácido nucléico conformedefinida na reivindicação 37.

39. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato decompreender o vetor de expressão conforme definido nareivindicação 38.

40. Método para preparar um anticorpo anti-CD70,caracterizado pelo fato de compreender a expressão doanticorpo na célula hospedeira, conforme definida nareivindicação 39, e o isolamento do anticorpo a partir dacélula hospedeira.

41. Método para tratar ou prevenir uma doença, definidapelo crescimento de células tumorais expressando CD70,caracterizado pelo fato de compreender administrar aoindivíduo o anticorpo, ou a porção ligante ao antígeno domesmo, conforme definido em qualquer uma dasreivindicações 1-29 em uma quantidade eficaz para tratarou prevenir a doença.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41,caracterizado pelo fato de a doença ser o câncer.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado pelo fato de o câncer ser selecionado dogrupo consistindo de carcinomas de célula renal (RCC) ,célula limpa de RCC, glioblastoma, linfoma não-Hodgkins(NHL), leucemia linfocitica aguda (ALL), leucemialinfocitica crônica (CLL), linfoma de Burkitt, linfomasde célula grande de anaplástica (ALCL), mieloma múltiplo,linfoma de célula T cutâneo, linfoma de célula clivada depequenos nódulos, linfomas linfocítico, linfomas decélula T periférica, linfomas de Lenner, linfomasimunoblásticos, Iinfoma/leucemia de célula T (ATLL) ,leucemia de célula TC adulta (T-ALL), câncer de linfomasfoliculares entroblástico/centrocítico (cb/cc), linfomasde células grandes difusas de linhagem de célula B,linfoma de célula T do tipo (AILD) Iinfadenopatiaangioimunoblástica, linfomas baseados na cavidadecorpórea associada com HIV, carcinomas embrionário,carcinomas não diferenciados de rinofaringe, tumor deSchmincke, doença de Castleman, Sarcoma de Kaposi,mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom elinfomas de célula B.

44. Método, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado pelo fato de o câncer ser carcinoma decélula renal.

45. Método, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado pelo fato de o câncer ser Iinfoma.

46. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de o anticorpo perder os resíduosde fucose.

47. Método para tratar uma doença autoimune em umindivíduo, necessitando do referido tratamento,caracterizado pelo fato de compreender administrar aoindivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo ou de umaporção ligante ao antígeno do mesmo, conforme definido emqualquer uma das reivindicações 1-29, de forma que ossintomas da doença autoimune sejam melhorados.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de a doença autoimune ser lupus.

49. Método para prevenir uma doença autoimune em umindivíduo em risco de desenvolver uma doença autoimune,caracterizado pelo fato de compreender administrar umaquantidade eficaz de um anticorpo ou de uma porção ligante ao antígeno do mesmo, de modo que odesenvolvimento dos sintomas da doença autoimune sejaprevenido ou atenuado.

50. Método para tratar uma inflamação em um indivíduo,necessitando do referido tratamento, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao indivíduo umaquantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou deuma porção ligante ao antígeno do mesmo, conformedefinido na reivindicação 1, de modo que a inflamaçãoseja melhorada.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50,caracterizado pelo fato de o anticorpo perder os resíduosde fucose.

52. Método para tratar uma infecção viral em umindivíduo, necessitando o referido tratamento,caracterizado pelo fato de compreender administrar aoindivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de umanticorpo, ou de uma porção ligante ao antígeno do mesmo,conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1--29, sendo que os sintomas da infecção viral sãomelhorados.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52,caracterizado pelo fato de a infecção viral serselecionada a partir do grupo de virus consistindo devirus da imunodeficiência humana (HIV), hepatite (A, B &C) , virus da herpes, (por exemplo, VZV, HSV-1, HAV-6,HSV-II e CMV, virus Epstein Barr), adenovirus, virusinfluenza, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virusCoxsackie, cornovirus, virus sincitial respiratório,virus de caxumba, rotavirus, virus de sarampo, virus darubéola, parvovirus, virus da vaccinia, virus HTLV, virusda dengue, papilomavirus, virus de molusco, poliovirus,virus da raiva, virus JC e virus de encefalite arboviral,e virus coriomeningite linfocitico (LCMV).

54. Anticorpo ou porção ligante ao antigeno do mesmo,conforme definido em qualquer uma das reivindicações de-1-29, caracterizado pelo fato de ser utilizado em ummétodo para inibir o crescimento de células tumorais.

55. Uso de anticorpo ou da porção ligante ao antigeno domesmo, conforme definido em qualquer uma dasreivindicações de 1-29, caracterizado pelo fato de seraplicado na preparação de um medicamento para inibir ocrescimento de células tumorais.

56. Anticorpo ou porção ligante ao antigeno do mesmo,conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1--29, caracterizado pelo fato de ser utilizado em um métodopara melhorar os sintomas de uma doença autoimune.

57. Uso de um anticorpo ou de uma porção ligante aoantigeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma dasreivindicações 1-29, caracterizado pelo fato de ser parapreparar um medicamento para melhorar os sintomas de umadoença autoimune.

58. Anticorpo ou uma porção ligante ao antigeno do mesmo,conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1--29, caracterizado pelo fato de ser para uso em um métodopara melhorar os sintomas de uma infecção viral.

59. Uso de um anticorpo ou de uma porção ligante aoantigeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma dasreivindicações de 1-29, caracterizado pelo fato de serpara preparação de um medicamento para melhorar ossintomas de uma infecção viral.