JP2021525518A - 細胞をゲノム編集及び活性化するための方法 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、Ｔ細胞のゲノム編集及び形質導入を行うための方法、ならびにそれらを用いて免疫療法を行うための方法を開示する。とりわけ、本開示は、遺伝子改変キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有Ｔ細胞、及びがんの治療におけるその使用方法に関する。【選択図】図１

Description

本出願は、２０１８年５月３１日に出願された米国仮出願第６２／６７８，８８６号の利益を主張するものであり、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書では、Ｔ細胞のゲノム編集及び形質導入を行うための方法、ならびにそれらを用いて免疫療法を行うための方法を開示する。とりわけ、本開示は、遺伝子改変キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）、ならびに、Ｔ細胞悪性腫瘍及びＢ細胞悪性腫瘍の治療におけるその使用方法に関する。
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）免疫療法は、ますます広く知られるようになっている。Ｔ細胞は、抗原認識部分及びＴ細胞活性化ドメインで構成される融合タンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、遺伝的に修飾されている。ＣＡＲは、がん細胞上に過剰発現した抗原を認識するように設計されている。ＣＡＲ−Ｔは、Ｂ細胞悪性腫瘍に対する優れた臨床効果を示しており、２種の治療薬、キムリア（商標）（チサゲンレクロイセル、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びイエスカルタ（商標）（アキシカブタゲンシロロイセル、Ｋｉｔｅ／Ｇｉｌｅａｄ）は、最近ＦＤＡにより承認された。これら治療薬のそれぞれは、それぞれの患者自身のＴ細胞にＣＡＲを形質導入すること、及び、疾患標的化自家ＣＡＲ−Ｔ細胞を患者に養子細胞移入すること、を含む。このプロセスは、かなり長い時間を要し、非常に費用がかかる。
ＣＡＲ−Ｔ療法の広い応用範囲は、２つの別の点で限定されている。第１に、Ｔ細胞悪性腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ細胞治療薬の開発には、ＣＡＲ−Ｔ細胞上における標的抗原の発現が、ＣＡＲ−Ｔ細胞の同胞殺し及び有効性の低下を誘導し得ることから、悪性Ｔ細胞とエフェクターＴ細胞の間における標的抗原の共通発現を一因とする未解決問題があることが判明している。第２に、ＣＡＲ−Ｔ療法において、個々の患者自身のＴ細胞（同種異系）以外のＴ細胞を使用すると、移植片対宿主病を含む同種異系反応が引き起こされる場合がある。
更に、ＣＡＲ−Ｔ細胞の作製は非効率的であり、ＣＡＲ−Ｔ療法を含む、安価で容易に利用可能な養子細胞移入療法の最終目的は、所望の特性を有する同種異系細胞の増殖を促進させる改良された方法により、十分に満たされ得る。本明細書では、このような方法、及びそれらの方法を用いて作製される細胞を開示する。
図１は、本明細書で開示するゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するための代替法の２つの実施形態を示し、遺伝子編集は活性化に先行する。上部のパネルは、期間及び工程間の長さの選択肢を示すフローチャートを示し、下部のパネルは、あるより具体的な実施形態を示している。
図２は、ＴＲＡＣのゲノム編集後におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の欠失を確認するためのフローサイトメトリーによるＴ細胞を示す。
図３〜８は、＋４日目のＴ細胞におけるＴＣＲα及びＣＤ３εの表面発現により測定したＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ３−Ｔ細胞の増殖について、Ｔ細胞のゲノム編集（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡのエレクトロポレーション（ＥＰ））と活性化（例えば、抗ＣＤ３ｍＡｂ及び抗ＣＤ２８ｍＡｂを用いた刺激による）の間の期間を長くすることの影響を示す。それぞれの図において、上部のパネルは、ＴＣＲ発現、具体的には、ＣＤ３発現（ＡＰＣ（アロフィコシアニン）によるＦＬ６−Ａ、横軸）に対するＴＲＡＣ発現（ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）によるＦＬ１−Ａ、縦軸）を示す、フローサイトメトリー結果の散布図である。下部のパネルは、ＣＤ３抗原発現（ＡＰＣによるＦＬ６−Ａ、横軸）に対する、ＣＤ３＋細胞及びＣＤ３−細胞のカウント（縦軸）を示す。
図３は、活性化の前にゲノム編集（ＥＰ）を実施しなかった場合の、＋４日目のＴ細胞におけるＴＣＲα及びＣＤ３εの表面発現により測定したＣＤ３＋細胞及びＣＤ３−細胞の増殖を示す。
図４は、ゲノム編集（ＥＰ）の直後、すなわち、意図的な遅延なしに、細胞を活性化させた場合の、＋４日目のＴ細胞におけるＴＣＲα及びＣＤ３εの表面発現により測定したＣＤ３＋細胞及びＣＤ３−細胞の増殖を示す。
図５は、ゲノム編集（ＥＰ）の４時間後に細胞を活性化させた場合の、＋４日目のＴ細胞におけるＴＣＲα及びＣＤ３εの表面発現により測定したＣＤ３＋細胞及びＣＤ３−細胞の増殖を示す。
図６は、ゲノム編集（ＥＰ）の８時間後に細胞を活性化させた場合の、＋４日目のＴ細胞におけるＴＣＲα及びＣＤ３εの表面発現により測定したＣＤ３＋細胞及びＣＤ３−細胞の増殖を示す。
図７は、ゲノム編集（ＥＰ）の２０時間後に細胞を活性化させた場合の、＋４日目のＴ細胞におけるＴＣＲα及びＣＤ３εの表面発現により測定したＣＤ３＋細胞及びＣＤ３−細胞の増殖を示す。
図８は、遺伝子編集Ｔ細胞におけるＴＲＡＣ欠失の動態を示す。
図９は、理論上のＴ細胞活性化ウィンドウを示す。
図１０は、遺伝子編集Ｔ細胞におけるＴ細胞増殖の動態を示す。上部のパネルは絶対細胞カウント数を示し、下部のパネルは増殖倍率を示している。
図面の更なる説明については以下に記載する。
それゆえ、本明細書では、実施形態１として、
ａ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）保有免疫エフェクター細胞の集団のゲノムを編集すること、
ｂ．免疫エフェクター細胞集団を活性化させること、及び、
ｃ．ゲノム編集免疫エフェクター細胞の前記集団を増殖させること、
の工程を含む、ゲノム編集免疫エフェクター細胞の集団を作製するための方法を開示する。
細胞の集団を増殖させるために、編集前における細胞の活性化が必要であることは、従来の方法が教示するところである。本明細書で示すとおり、一部の状況においては、逆の順番がより効果的であり、効率的な、細胞のゲノム編集及び編集集団の増殖を可能とする。
編集は多くの形態を取り得る。タンパク質または核酸のいずれか、とりわけ、ＲＮＡを、広範な目的のために、細胞に形質導入してもよい。遺伝子の欠失または抑制、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の挿入または発現、及びタンパク質または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現を全て実施してもよい。ＣＲＩＳＰＲ（とりわけ、Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡを使用した）などの技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いた編集を使用してもよく、ベクターもまた、発現及び／または遺伝子導入用の構築物を送達することができる。コア編集と、それに続く活性化に付随して、それに先行するまたはそれに続く編集工程もまた実施してもよい。
以下の開示は、本方法の実施形態、選択肢、及び用途に加え、本方法を用いて作製した遺伝子改変細胞、ならびに、例えば、疾患を治療するための、免疫療法及び養子細胞移入におけるこのような細胞の使用を詳述する。それゆえ、本明細書では以下の実施形態を提供する。
実施形態２．前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）保有免疫エフェクター細胞は、１種または複数種のタンパク質を認識する少なくとも１種のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形質導入されている、実施形態１に記載の方法。
実施形態３．前記ゲノム編集工程（ａ）は、前記免疫エフェクター細胞集団に、前記１種または複数種のＣＡＲを形質導入することを含む、実施形態２に記載の方法。
実施形態４．工程（ｂ）と工程（ｃ）の間に実施される、前記免疫エフェクター細胞集団に、前記１種または複数種のＣＡＲを形質導入する追加の工程を含む、実施形態２に記載の方法。
実施形態５．ゲノム編集キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞の集団を作製するための方法であって、
ａ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）保有免疫エフェクター細胞の集団のゲノムを編集すること、
ｂ．前記免疫エフェクター細胞集団を活性化させること、
ｃ．前記免疫エフェクター細胞集団に、１種または複数種のタンパク質を認識する少なくとも１種のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形質導入すること、及び、
ｄ．ゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の前記集団を増殖させること、
の工程を含む、前記方法。
実施形態６．前記ＴＣＲ保有免疫エフェクター細胞は精製されている、実施形態１から実施形態５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７．前記免疫エフェクター細胞はＴ細胞である、実施形態１から実施形態６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８．前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が認識する前記１種または複数種のタンパク質は、抗原及び細胞表面タンパク質から選択される、実施形態１から実施形態７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９．ゲノムは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、編集されて前記細胞内に送達される、実施形態１から実施形態８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０．ゲノムは、Ｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲを使用して編集される、実施形態９に記載の方法。
実施形態１１．前記ゲノムは、Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲを使用して編集される、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２．前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡまたはタンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態１１に記載の方法。
実施形態１３．前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとして前記細胞内に送達される、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１４．前記Ｃａｓ９は、タンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１５．編集される前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、前記Ｃａｓ９と同時に送達される、実施形態９から実施形態１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６．ゲノムは、前記細胞に、タンパク質またはｓｈＲＮＡをコードする核酸を形質導入することにより編集される、実施形態１から実施形態１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７．前記形質導入することは、ウイルスまたはウイルスベクターによる、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８．前記形質導入することは、レンチウイルスベクターによる、実施形態１７に記載の方法。
実施形態１９．前記形質導入することは、アデノ随伴ウイルスによる、実施形態１７に記載の方法。
実施形態２０．前記送達または形質導入することは、エレクトロポレーションによる、実施形態９から実施形態１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１．前記ゲノム編集は、１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質の発現を欠失または抑制することを含む、実施形態１から実施形態２０に記載の方法。
実施形態２２．欠失／抑制される細胞表面タンパク質は、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣＩ）またはそのサブユニットである、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３．欠失／抑制される細胞表面タンパク質はβ２ミクログロブリンである、実施形態２２に記載の方法。
実施形態２４．欠失／抑制される細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそのサブユニットである、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２５．欠失／抑制される細胞表面タンパク質は、ＴＲＡＣ（ＴＣＲ−α）、ＴＣＲ−β、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γ、から選択される、実施形態２４に記載の方法。
実施形態２６．欠失／抑制される細胞表面タンパク質はＴＲＡＣである、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７．欠失／抑制される細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞の消耗を防止するタンパク質である、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２８．Ｔ細胞の消耗を防止する細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞上の免疫チェックポイントである、実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９．Ｔ細胞の消耗を防止する前記表面タンパク質は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、及びＣＴＬＡ−４、から選択される、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３０．前記ゲノム編集は、１種または複数種の分泌可能なタンパク質の発現を欠失または抑制することを含む、実施形態２１に記載の方法。
実施形態３１．前記分泌可能なタンパク質はサイトカインである、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３２．前記サイトカインは、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＭＣＰ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｉｌ−４、及びＩＦＮγ、から選択される、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３３．前記サイトカインはＧＭ−ＣＳＦである、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３４．前記分泌可能なタンパク質は転写因子である、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３５．前記転写因子は、ＡＨＲ、ＢＣＬ６、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＭＡＦ、ＲＯＲＣ、ＳＰＩ１、ＴＢＸ２１、から選択される、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３６．欠失／抑制される前記細胞表面タンパク質または抗原は、前記ＣＡＲの標的である、実施形態２１に記載の方法。
実施形態３７．前記ゲノム編集は、タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）を発現するように形質導入することを含む、実施形態２１に記載の方法。
実施形態３８．前記ゲノム編集は、ｓｈＲＮＡを発現するように形質導入することを含む、実施形態２１に記載の方法。
実施形態３９．前記細胞は、編集後最長４８時間静置されてから活性化される、実施形態１から実施形態３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４０．前記細胞は、編集後最長２４時間静置されてから活性化される、実施形態１から実施形態３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４１．前記細胞は、編集後最長８時間静置されてから活性化される、実施形態１から実施形態３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４２．前記細胞は、編集後最長４時間静置されてから活性化される、実施形態１から実施形態３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４３．前記細胞は、編集後２４〜４８時間静置されてから活性化される、実施形態１から実施形態３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４４．前記細胞は、ゲノム編集の直後に活性化される、実施形態１から実施形態３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４５．前記免疫エフェクター細胞の前記活性化は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、または上記のいずれかの機能性フラグメントに、前記細胞集団を曝露することによって行われる、実施形態１から実施形態４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４６．前記免疫エフェクター細胞の前記活性化は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び抗ＣＤ２抗体、または上記のいずれかの機能性フラグメントに、前記細胞集団を曝露することによって行われる、実施形態１から実施形態４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７．前記抗体はビーズに固定されている、実施形態４５から実施形態４６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４８．前記ゲノム編集細胞は、最長５日間にわたり活性化される、実施形態１から実施形態４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４９．前記ゲノム編集細胞は、最長２日間にわたり活性化される、実施形態１から実施形態４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５０．前記ゲノム編集細胞は、最長１日間にわたり活性化される、実施形態１から実施形態４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５１．前記抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び／または抗ＣＤ２抗体は、磁場の印加または洗浄により、前記細胞集団から取り除かれる、実施形態４５から実施形態５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５２．前記ＣＡＲは、活性化後４８時間未満において、前記細胞に形質導入される、実施形態２から実施形態５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５３．前記ＣＡＲは、活性化後２４時間未満において、前記細胞に形質導入される、実施形態２から実施形態５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５４．前記ＣＡＲは、前記ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いて、前記細胞に形質導入される、実施形態２から実施形態５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５．細胞の前記集団を、２０日間未満にわたり増殖させる、実施形態１から実施形態５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６．細胞の前記集団を、１２日間未満にわたり増殖させる、実施形態１から実施形態５４に記載の方法。
実施形態５７．細胞の前記集団を、１０日間未満にわたり増殖させる、実施形態１から実施形態５４に記載の方法。
実施形態５８．細胞の前記集団を、８日間未満にわたり増殖させる、実施形態１から実施形態５４に記載の方法。
実施形態５９．細胞の前記集団を、６日間未満にわたり増殖させる、実施形態１から実施形態５４に記載の方法。
実施形態６０．約２５℃〜約４０℃の温度で実施される、実施形態１から実施形態５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１．約３０℃〜約３７℃の温度で実施される、実施形態１から実施形態５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２．約３７℃で実施される、実施形態１から実施形態５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６３．約３０℃で実施される、実施形態１から実施形態５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６４．フローサイトメトリーを用いて前記細胞を解析して、前記ＣＡＲ（または、複数を形質導入する場合、複数のＣＡＲ）の発現、及び／または、形質導入タンパク質の発現、及び／または、タンパク質の発現（または、その欠如、すなわち、欠失または抑制）、を確認する追加の工程を含む、実施形態１から実施形態６３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６５．ＴＣＲ＋細胞を枯渇させる追加の工程を含む、実施形態２４から実施形態６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６６．使用する前記免疫エフェクター細胞は、健康なドナー（または、臍帯血から、もしくはＰＢＭＣから）から採取される、実施形態１から実施形態６５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６７．前記ドナーはヒトである、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８．前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態２から実施形態６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６９．悪性細胞上に発現した前記１種または複数種の抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０．前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性Ｔ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７１．悪性Ｔ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＣＲＡ、及びＴＣＲβ、から選択される、実施形態７０に記載の方法。
実施形態７２．前記キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７３．悪性形質細胞上に発現した前記抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８、及びＣＤ１９、から選択される、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７４．前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性Ｂ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７５．悪性Ｂ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、及びＣＤ４５、から選択される、実施形態７４に記載の方法。
実施形態７６．悪性Ｂ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３８、及びＣＤ４５、から選択される、実施形態７５に記載の方法。
実施形態７７．前記キメラ抗原受容体は、悪性中皮細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７８．悪性中皮細胞上に発現した前記抗原はメソテリンである、実施形態７７に記載の方法。
実施形態７９．ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を作製するための方法であって、
ａ．Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲ、及び抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）をコードする遺伝子（複数可）を標的とするｇＲＮＡを用いて、Ｔ細胞集団における前記１種または複数種の抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）の発現を欠失または抑制すること、
ｂ．前記Ｔ細胞集団を活性化させること、
ｃ．前記Ｔ細胞集団に、１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、ならびに、
ｄ．ＣＡＲ−Ｔ細胞の前記集団を増殖させること、
の工程を含む、前記方法。
実施形態８０．欠失／抑制される細胞表面タンパク質または抗原は、ＴＲＡＣ（ＴＣＲ−α）、ＴＣＲ−β、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γ、から選択される、実施形態７９に記載の方法。
実施形態８１．欠失／抑制される細胞表面タンパク質または抗原はＴＲＡＣである、実施形態８０に記載の方法。
実施形態８２．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を欠損したゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を作製するための方法であって、
ａ．前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそのサブユニットの発現を欠失または抑制し、任意選択的に、Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲ、及び抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）をコードする遺伝子（複数可）を標的とするｇＲＮＡを用いて、Ｔ細胞集団における前記１種または複数種の抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）の発現を欠失または抑制すること、
ｂ．前記Ｔ細胞集団を活性化させること、
ｃ．前記Ｔ細胞集団に、１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、ならびに、
ｄ．ＴＣＲ欠損ＣＡＲ−Ｔ細胞の前記集団を増殖させること、
の工程を含む、前記方法。
実施形態８３．欠失／抑制される前記ＴＣＲサブユニットは、ＴＲＡＣ（ＴＣＲ−α）、ＴＣＲ−β、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γ、から選択される、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８４．欠失／抑制される前記ＴＣＲサブユニットはＴＲＡＣである、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８５．前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡまたはタンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態７９から実施形態８３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８６．前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとして前記細胞内に送達される、実施形態８５に記載の方法。
実施形態８７．前記Ｃａｓ９は、タンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態８６に記載の方法。
実施形態８８．１種または複数種の抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）の発現を欠失または抑制することを含む、実施形態８２から実施形態８７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８９．欠失／抑制される前記細胞表面タンパク質または抗原は、前記ＣＡＲの標的である、実施形態８８に記載の方法。
実施形態９０．ゲノムは、前記細胞に、タンパク質またはｓｈＲＮＡをコードする核酸を形質導入することにより編集される、実施形態７９から実施形態８９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９１．前記形質導入することは、ウイルスまたはウイルスベクターによる、実施形態９０に記載の方法。
実施形態９２．前記形質導入することは、レンチウイルスベクターによる、実施形態９１に記載の方法。
実施形態９３．前記形質導入することは、アデノ随伴ウイルスによる、実施形態９１に記載の方法。
実施形態９４．前記送達または形質導入することは、エレクトロポレーションによる、実施形態７９から実施形態９３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９５．欠失／抑制される細胞表面タンパク質は、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣＩ）またはそのサブユニットである、実施形態７９から実施形態９４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９６．前記サブユニットはβ２ミクログロブリンである、実施形態９４に記載の方法。
実施形態９７．欠失／抑制される細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞の消耗を防止するタンパク質である、実施形態７９から実施形態９３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９８．Ｔ細胞の消耗を防止する細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞上の免疫チェックポイントである、実施形態９７に記載の方法。
実施形態９９．Ｔ細胞の消耗を防止する前記表面タンパク質は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、及びＣＴＬＡ−４、から選択される、実施形態９８に記載の方法。
実施形態１００．前記ゲノム編集は、タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）を発現するように形質導入することを含む、実施形態７９から実施形態９３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０１．前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態７９から実施形態１００のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０２．悪性細胞上に発現した前記１種または複数種の抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される、実施形態１０１に記載の方法。
実施形態１０３．前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性Ｔ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１０１に記載の方法。
実施形態１０４．悪性Ｔ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＣＲＡ、及びＴＣＲβ、から選択される、実施形態１０３に記載の方法。
実施形態１０５．前記キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１０１に記載の方法。
実施形態１０６．悪性形質細胞上に発現した前記抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８、及びＣＤ１９、から選択される、実施形態１０５に記載の方法。
実施形態１０７．前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性Ｂ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１０１に記載の方法。
実施形態１０８．悪性Ｂ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、及びＣＤ４５、から選択される、実施形態１０７に記載の方法。
実施形態１０９．悪性Ｂ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３８、及びＣＤ４５、から選択される、または、ＣＤ１９及びＣＤ２０から選択される、実施形態１０８に記載の方法。
実施形態１１０．前記キメラ抗原受容体は、悪性中皮細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１０１に記載の方法。
実施形態１１１．悪性中皮細胞上に発現した前記抗原はメソテリンである、実施形態１１０に記載の方法。
実施形態１１２．ＣＡＲがＣＤ７を標的とし、ＴＲＡＣ及びＣＤ７が欠失している、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞（ＵＣＡＲＴ７細胞）の集団を作製するための方法であって、
ａ．Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲ、及び抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）をコードする遺伝子を標的とするｇＲＮＡを使用して、健康なヒトドナーに由来するＴ細胞の集団内のＣＤ７遺伝子及びＴＲＡＣ遺伝子を編集して、ＣＤ７及びＴＲＡＣを欠失／抑制すること、
ｂ．前記Ｔ細胞集団を活性化させること、
ｃ．前記Ｔ細胞集団に、ＣＤ７を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、ならびに、
ｄ．ＵＣＡＲＴ７細胞の前記集団を増殖させること、
の工程を含む、前記方法。
実施形態１１３．ＣＡＲが、ＣＤ２及びＣＤ３εを標的とするタンデムＣＡＲであり、ＣＤ３ε及びＣＤ２が欠失している、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞（ｔＵＣＡＲＴ２／３細胞）の集団を作製するための方法であって、
ａ．Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲ、及び抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）をコードする遺伝子を標的とするｇＲＮＡを使用して、健康なヒトドナーに由来するＴ細胞の集団内のＣＤ２遺伝子及びＣＤ３ε遺伝子を編集して、ＣＤ２及びＣＤ３εを欠失／抑制すること、
ｂ．前記Ｔ細胞集団を活性化させること、
ｃ．前記Ｔ細胞集団に、ＣＤ及びＣＤ３εを認識するタンデムキメラ抗原受容体を形質導入すること、ならびに、
ｄ．ｔＵＣＡＲＴ２／３細胞の前記集団を増殖させること、
の工程を含む、前記方法。
実施形態１１４．前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡまたはタンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態７９から実施形態１１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１５．前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとして前記細胞内に送達される、実施形態１１４に記載の方法。
実施形態１１６．前記Ｃａｓ９は、タンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態１１４に記載の方法。
実施形態１１７．１種または複数種の抗原（複数可）、細胞表面タンパク質（複数可）、または分泌可能なタンパク質の発現を欠失または抑制することを含む、実施形態７９から実施形態１１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１８．ゲノムは、前記細胞に、タンパク質またはｓｈＲＮＡをコードする核酸を形質導入することにより編集される、実施形態７９から実施形態１１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１９．前記形質導入することは、ウイルスまたはウイルスベクターによる、実施形態１１８に記載の方法。
実施形態１２０．前記形質導入することは、レンチウイルスベクターによる、実施形態１１９に記載の方法。
実施形態１２１．前記形質導入することは、アデノ随伴ウイルスによる、実施形態１１８に記載の方法。
実施形態１２２．前記送達または形質導入することは、エレクトロポレーションによる、実施形態７９から実施形態１２１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２３．欠失／抑制される細胞表面タンパク質は、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣＩ）またはそのサブユニットである、実施形態１１７から実施形態１２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２４．前記サブユニットはβ２ミクログロブリンである、実施形態１２３に記載の方法。
実施形態１２５．欠失／抑制される細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞の消耗を防止するタンパク質である、実施形態１１７から実施形態１２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２６．Ｔ細胞の消耗を防止する細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞上の免疫チェックポイントである、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２７．Ｔ細胞の消耗を防止する前記表面タンパク質は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、及びＣＴＬＡ−４、から選択される、実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１２８．前記ゲノム編集は、タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）を発現するように形質導入することを含む、実施形態１１７から実施形態１２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２９．前記細胞は、編集後最長４８時間静置されてから活性化される、実施形態７９から実施形態１２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３０．前記細胞は、編集後最長２４時間静置されてから活性化される、実施形態７９から実施形態１２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３１．前記細胞は、編集後最長８時間静置されてから活性化される、実施形態７９から実施形態１２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３２．前記細胞は、編集後最長４時間静置されてから活性化される、実施形態７９から実施形態１２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３３．前記細胞は、編集後２４〜４８時間静置されてから活性化される、実施形態７９から実施形態１２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３４．前記細胞は、ゲノム編集の直後に活性化される、実施形態７９から実施形態１２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３５．前記免疫エフェクター細胞の前記活性化は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、または上記のいずれかの機能性フラグメントに、前記細胞集団を曝露することによって行われる、実施形態７９から実施形態１３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３６．前記免疫エフェクター細胞の前記活性化は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び抗ＣＤ２抗体、または上記のいずれかの機能性フラグメントに、前記細胞集団を曝露することによって行われる、実施形態７９から実施形態１３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３７．前記抗体はビーズに固定されている、実施形態１０７から実施形態１３６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３８．前記ゲノム編集細胞は、最長５日間にわたり活性化される、実施形態７９から実施形態１３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３９．前記ゲノム編集細胞は、最長２日間にわたり活性化される、実施形態７９から実施形態１３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４０．前記ゲノム編集細胞は、最長１日間にわたり活性化される、実施形態７９から実施形態１３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４１．前記抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び／または抗ＣＤ２抗体は、磁場の印加または洗浄により、前記細胞集団から取り除かれる、実施形態７９から実施形態１３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４２．前記ＣＡＲは、活性化後４８時間未満において、前記細胞に形質導入される、実施形態７９から実施形態１４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４３．前記ＣＡＲは、活性化後２４時間未満において、前記細胞に形質導入される、実施形態７９から実施形態１４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４４．前記ＣＡＲは、前記ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いて、前記細胞に形質導入される、実施形態７９から実施形態１４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４５．細胞の前記集団を、２０日間未満にわたり増殖させる、実施形態７９から実施形態１４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４６．細胞の前記集団を、１２日間未満にわたり増殖させる、実施形態７９から実施形態１４４に記載の方法。
実施形態１４７．細胞の前記集団を、１０日間未満にわたり増殖させる、実施形態７９から実施形態１４４に記載の方法。
実施形態１４８．細胞の前記集団を、８日間未満にわたり増殖させる、実施形態７９から実施形態１４４に記載の方法。
実施形態１４９．細胞の前記集団を、６日間未満にわたり増殖させる、実施形態７９から実施形態１４４に記載の方法。
実施形態１５０．約２５℃〜約４０℃の温度で実施される、実施形態７９から実施形態１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５１．約３０℃〜約３７℃の温度で実施される、実施形態７９から実施形態１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５２．約３７℃で実施される、実施形態７９から実施形態１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５３．約３０℃で実施される、実施形態７９から実施形態１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５４．フローサイトメトリーを用いて前記細胞を解析して、前記ＣＡＲ（または、複数を形質導入する場合、複数のＣＡＲ）の発現、及び／または、形質導入タンパク質の発現、及び／または、タンパク質の発現（または、その欠如、すなわち、欠失または抑制）、を確認する追加の工程を含む、実施形態７９から実施形態１５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５５．ＴＣＲ＋細胞を枯渇させる追加の工程を含む、実施形態７９から実施形態１５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５６．使用する前記免疫エフェクター細胞は、健康なドナー（または、臍帯血から、もしくはＰＢＭＣから）から採取される、実施形態７９から実施形態１５５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５７．前記ドナーはヒトである、実施形態１５６に記載の方法。
実施形態１５８．実施形態１から実施形態１５７のいずれか１つに記載の方法を用いて作製された、ゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の集団。
実施形態１５９．前記キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞は、自殺遺伝子を更に含む、実施形態１５８に記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞。
実施形態１６０．内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、前記細胞内において阻害される、実施形態１５８から実施形態１５９のいずれか１つに記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞。
実施形態１６１．アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない、実施形態１６０に記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞。
実施形態１６２．前記細胞は同胞殺しを誘導しない、実施形態１６０または実施形態１６１に記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞。
実施形態１６３．デュアルＣＡＲ保有ゲノム編集免疫エフェクター細胞またはタンデムＣＡＲ保有ゲノム編集免疫エフェクター細胞である、実施形態１５８から実施形態１６２のいずれか１つに記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞。
実施形態１６４．実施形態１５８から実施形態１６２のいずれか１つに記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の集団、ならびに、少なくとも１種の治療的に許容される担体及び／またはアジュバント、を含む、治療用組成物。
実施形態１６５．がん、自己免疫疾患、または感染症の治療を必要とする対象において、前記がん、自己免疫疾患、または感染症の治療を行うための方法であって、実施形態１から実施形態１５７のいずれか１つに記載のゲノム編集免疫エフェクター細胞、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞、またはゲノム編集タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
実施形態１６６．がんの治療のための、実施形態１６５に記載の方法。
実施形態１６７．前記がんは血液悪性腫瘍である、実施形態１６６に記載の方法。
実施形態１６８．前記血液悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、から選択される、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１６９．前記血液悪性腫瘍はホジキンリンパ腫である、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１７０．前記血液悪性腫瘍はＢ細胞リンパ腫である、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１７１．前記Ｂ細胞リンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、及びＢ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、から選択される、実施形態１７０に記載の方法。
実施形態１７２．前記血液悪性腫瘍はＴ細胞リンパ腫である、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１７３．前記Ｔ細胞リンパ腫は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）、及びセザリー症候群、から選択される、実施形態１７２に記載の方法。
実施形態１７４．前記血液悪性腫瘍は白血病である、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１７５．前記白血病は、急性骨髄性（または骨髄性）白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性（または骨髄性）白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性（またはリンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞性白血病（時として、リンパ腫に分類される）、から選択される、実施形態１７４に記載の方法。
実施形態１７６．前記血液悪性腫瘍は形質細胞性悪性腫瘍である、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１７７．前記血液悪性腫瘍は、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞腫、及び多発性骨髄腫から選択される形質細胞性悪性腫瘍である、実施形態１７６に記載の方法。
実施形態１７８．前記がんは固形腫瘍である、実施形態１６５に記載の方法。
本明細書で開示するのは、Ｔ細胞集団における１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質の発現を欠失または抑制すること、Ｔ細胞集団を活性化させて、Ｔ細胞集団に、１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、及び、ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を増殖させること、の工程を含む、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を作製するための方法である。
特定の実施形態では、形質導入工程は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを利用する。
特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、悪性Ｔ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する。
特定の実施形態では、抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＣＲＡ、及びＴＣＲβ、から選択される。
特定の実施形態では、細胞表面タンパク質は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、及びＣＴＬＡ−４に限定するわけではないがそれらから選択される、Ｔ細胞上の免疫チェックポイントである。
特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する。
自殺遺伝子を更に含むＣＡＲ−Ｔ細胞についてもまた開示する。
内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達が阻害されているＣＡＲ−Ｔ細胞についてもまた開示する。
アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しないＣＡＲ−Ｔ細胞についてもまた開示する。
特定の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は同胞殺しを誘導しない。
特定の実施形態では、本方法に記載のデュアルＣＡＲ−Ｔ細胞またはタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞を開示する。
特定の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、ならびに、少なくとも１種の治療的に許容される担体及び／またはアジュバントを含む、治療用組成物である。
ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞、タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、または治療用組成物を、固形腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、対象における固形腫瘍を治療するための方法についてもまた開示する。
ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞、タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、または治療用組成物を、血液悪性腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、対象における血液悪性腫瘍を治療するための方法についてもまた開示する。
特定の実施形態では、血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である。
特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）である。
特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である。
特定の実施形態では、血液悪性腫瘍はＢ細胞悪性腫瘍である。
特定の実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍はＢ細胞リンパ腫である。
特定の実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍はＢ細胞性白血病である。
特定の実施形態では、血液悪性腫瘍は骨髄性悪性腫瘍である。
特定の実施形態では、骨髄性悪性腫瘍は急性骨髄性白血病である。
Ｔ細胞集団における１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質の発現を欠失または抑制すること、Ｔ細胞集団を活性化させて、Ｔ細胞集団に、１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、及び、ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を増殖させること、の工程を含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を欠損したゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を作製するための方法についてもまた開示する。
ゲノム編集Ｔ細胞及びゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞
本開示は、キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）など、キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物、及び、がん、例えば、血液悪性腫瘍の治療用の免疫療法を行うための方法を提供する。
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞である。ＣＡＲ分子を発現するＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、またはガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞、であってもよい。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、１）細胞外リガンド結合ドメイン、すなわち、抗原認識ドメイン、２）膜貫通ドメイン、及び３）シグナル伝達ドメイン、を含む、組換え融合タンパク質である。
細胞外リガンド結合ドメインは、リガンドに結合可能なオリゴペプチドまたはポリペプチドである。細胞外リガンド結合ドメインは、標的の抗原、受容体、ペプチドリガンド、タンパク質リガンド、または標的のポリペプチドであってもよい、細胞表面分子と相互作用可能であることが好ましい。細胞外リガンド結合ドメインは、約０．１ｐＭ〜約１０ｐＭ、約０．１ｐＭ〜約１ｐＭ、または、より好ましくは、約０．１ｐＭ〜約１００ｎＭの親和性定数または相互作用（ＫＤ）の親和性で、抗原に特異的に結合することができる。親和性定数または相互作用（ＫＤ）の親和性を測定するための方法は、当該技術分野において周知である。一部の例では、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上における細胞表面マーカーとして機能するリガンドを認識するように選択される。
一実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ（２〜６））により連結された軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び重（ＶＨ）鎖可変フラグメントを含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、Ｔ細胞抗原またはＴ細胞に特異的ではない抗原のいずれかに対する特異性を付与する。一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞のキメラ抗原受容体は、ＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞）が欠損している抗原である、悪性Ｔ細胞上に発現または過剰発現したＴ細胞特異的抗原に結合し得る。
悪性Ｔ細胞上に発現した、ＣＡＲが標的とする抗原の非限定例としては、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、及びＣＤ３、が挙げられる。
白血病細胞（例えば、異常な骨髄芽球、赤血球、または血小板）の表面上に発現した、ＣＡＲが標的とする抗原の非限定例としては、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ３７１（ＣＬＬ−１、ＣＬＥＣ１２Ａ）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、及びＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＣＤ７、ならびにＴｉｍ３、が挙げられる。白血病、すなわち、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するために、これらの抗原を標的とする細胞外リガンド結合ドメインを有するＣＡＲを構築してもよい。
多発性骨髄腫細胞（例えば、悪性形質細胞）の表面上に発現した、ＣＡＲが標的とする抗原の非限定例としては、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８、及びＣＤ１９、が挙げられる。多発性骨髄腫を治療するために、これらの抗原を標的とする細胞外リガンド結合ドメインを有するＣＡＲを構築してもよい。別の実施形態では、多発性骨髄腫を治療するために、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）ならびに膜貫通型活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用因子（ＴＡＣＩ）のリガンドを標的とし、ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方を効果的に共標的とする、ＡＰＲＩＬタンパク質の一部を有するＣＡＲを構築してもよい。シグナルペプチドは、分泌されたタンパク質または膜貫通タンパク質の、細胞膜及び／または細胞表面への輸送を誘導し、ポリペプチドの適切な局在化を可能とする。とりわけ、本開示のシグナルペプチドは、付加ポリペプチド、すなわち、ＣＡＲ受容体を、細胞膜へと誘導するが、付加ポリペプチドの細胞外リガンド結合ドメインは細胞表面上に提示されており、付加ポリペプチドの膜貫通ドメインは細胞膜にまたがっており、付加ポリペプチドのシグナル伝達ドメインは細胞の細胞質部分内にある。一実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８αに由来するシグナルペプチドである。一実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチドの機能性フラグメントである。機能性フラグメントは、付加ポリペプチドを細胞膜及び／または細胞表面へと誘導するＣＤ８αシグナルペプチドの少なくとも１０アミノ酸のフラグメントとして定義される。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドの機能性フラグメントの例としては、アミノ酸配列ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡ、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰ、ＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬ、及びＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ、が挙げられる。
通常、細胞外リガンド結合ドメインは、膜貫通ドメイン（Ｔｍ）により、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のシグナル伝達ドメインに連結している。膜貫通ドメインは細胞膜を貫通し、ＣＡＲをＴ細胞表面に固定し、細胞外リガンド結合ドメインをシグナル伝達ドメインに連結させて、Ｔ細胞表面上におけるＣＡＲの発現に影響を及ぼす。
本開示における膜貫通ドメインの極めて特徴的な特性は、免疫細胞の表面に発現して、所定の標的細胞に対する免疫細胞応答を誘導する能力である。膜貫通ドメインは、天然または合成の供給源に由来していてもよい。代替的に、本開示の膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来していてもよい。
本開示の膜貫通ポリペプチドの非限定例としては、Ｔ細胞受容体のサブユニット、例えば、ＣＤ３複合体を構成するα、β、γまたはζのポリペプチドなど、ＩＬ−２受容体ｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖またはγ鎖）、及び、Ｆｃ受容体のサブユニット鎖、とりわけ、ＦｃγＩＩＩタンパク質またはＣＤタンパク質、が挙げられる。代替的に、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、主に疎水性アミノ酸残基（例えば、ロイシン及びバリン）を含んでいてもよい。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αから選択されるＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８α鎖Ｉ型アイソフォーム前駆体（ＮＰ＿００１１３９３４５．１）、及びＣＤ２８に由来する。
膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと上記膜貫通ドメインの間のヒンジ領域を更に含んでいてもよい。用語「ヒンジ領域」とは一般的に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結させるように機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドのことを意味する。とりわけ、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインに更なるフレキシビリティ及びアクセシビリティをもたらすために使用される。ヒンジ領域は、最大３００アミノ酸、好ましくは、１０〜１００アミノ酸、最も好ましくは、２５〜５０アミノ酸、を含んでいてもよい。ヒンジ領域は、天然分子、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３ζ、Ｔ細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４などの全てもしくは一部、または、抗体定常領域の全てもしくは一部、に由来していてもよい。代替的に、ヒンジ領域は、天然ヒンジ配列に相当する合成配列であってもよく、または、ヒンジ領域は、完全な合成ヒンジ配列であってもよい。一実施形態では、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８α、ＦｃγＲＩＩＩα受容体、またはＩｇＧ１（本明細書ではそのように呼ぶ）の一部を含み、それらのポリペプチドに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有する。
本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外リガンド結合ドメインが標的に結合した後に、細胞内シグナル伝達に影響を及ぼし、免疫細胞及び免疫応答の活性化をもたらす、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインを含む。言い換えると、シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫細胞における少なくとも１種の正常エフェクター機能の活性化に影響を及ぼす。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパーＴ細胞活性であってもよい。それゆえ、用語「シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達して細胞に特殊機能を実行させる、タンパク質の部分のことを意味する。
ＣＡＲに用いるシグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体の結合後にシグナル伝達を開始するために協同で作用するＴ細胞受容体及び共受容体の細胞質配列、ならびに、これら配列の任意の誘導体またはバリアント、及び同一の機能的性能を有する任意の合成配列であってもよい。シグナル伝達ドメインは、２種の異なる部類の細胞質シグナル伝達配列を含み、一方の部類は抗原依存的な一次活性化を開始し、もう一方の部類は抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルをもたらす。一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフとして知られているシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスのチロシンキナーゼ用の結合部位として機能する様々な受容体の細胞質内尾部に存在する、明確なシグナル伝達モチーフである。本開示において使用可能なＩＴＡＭの非限定例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄ、に由来するＩＴＡＭを挙げることができる。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、それらＩＴＡＭに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性のアミノ酸配列を有するＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。
加えて、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、１種または複数種の自殺遺伝子療法システムを更に含んでいてもよい。当該技術分野において周知の好適な自殺遺伝子療法システムとしては、いくつかの単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）、または誘導性カスパーゼ９タンパク質、が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、自殺遺伝子はキメラＣＤ３４／チミジンキナーゼである。
同胞殺し抵抗性。本明細書で開示するＴ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損していることにより、同胞殺し抵抗性であってもよい。一部の実施形態では、Ｔ細胞の抗原は、キメラ抗原受容体が修飾抗原にもはや特異的に結合しないように、修飾されている。例えば、キメラ抗原受容体が認識する抗原のエピトープは、１つもしくは複数のアミノ酸変異（例えば、置換または欠失）によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい。その他の実施形態では、抗原の発現は、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上低下する。タンパク質の発現を低下させるための方法は当技術分野において周知であり、タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結するプロモーターを修飾または置換することが挙げられるがこれらに限定されない。更にその他の実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、抗原をコードする遺伝子を欠失または破壊することにより、抗原が発現しないように修飾される。上記の実施形態のそれぞれでは、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１種または好ましくは全ての抗原を欠損していてもよい。抗原を欠損させるＴ細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については上に記載している。例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を用いて、抗原、例えば、以下に記載する抗原を欠損させるＴ細胞を修飾してもよい。代替的に、ＴＡＬＥＮを用いて遺伝子を編集してもよい。
特定の状況では、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原の欠損で、Ｔ細胞を選択してもよい。ある特定のＴ細胞は、より少ない任意の表面タンパク質を産生及び提示するが、その代わりに、Ｔ−ＣＡＲの標的となる抗原を欠失または非機能化する場合には、Ｔ細胞を、抗原の欠損で選択して、抗原欠損細胞の集団をＣＡＲの形質導入用に増殖させてもよい。このような細胞はまた、同胞殺し抵抗性であり得る。
アロ反応性の回避。本開示が包含するＣＡＲ−Ｔ及びその他のＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）−ＣＤ３複合体の一部を欠失させた結果として、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を更に欠損していてもよい。様々な実施形態では、本明細書で開示するＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を用いて、内在性ＴＣＲシグナル伝達を除去または抑制することが望ましい場合がある。例えば、同種異系Ｔ細胞を用いてＣＡＲ−Ｔ細胞を作製する場合に、ＣＡＲ−Ｔ細胞における内在性ＴＣＲシグナル伝達を抑制または除去することにより、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防または抑制してもよい。内在性ＴＣＲシグナル伝達を除去または抑制するための方法は当該技術分野において周知であり、ＴＣＲ−ＣＤ３受容体複合体の一部、例えば、ＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）、ＴＣＲ受容体β鎖（ＴＲＢＣ）、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及び／またはＣＤ３ζ、を欠失させること、が挙げられるがこれらに限定されない。ＴＣＲ受容体複合体の一部を欠失させることにより、ＴＣＲ介在性シグナル伝達を阻害することができ、それにより、生命を脅かすＧｖＨＤを誘導することなく、ＣＡＲ−Ｔ細胞の供給源として同種異系Ｔ細胞を安全に使用することを可能としてもよい。
ＣＡＲ抗原。本明細書で開示するＴ細胞を用いてゲノム編集される好適な抗原、及び本明細書で開示するＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＡＲが認識する好適な抗原としては、血液悪性腫瘍に特異的な抗原が挙げられる。これら好適な抗原としては、Ｔ細胞特異的抗原、及び／またはＴ細胞に特異的ではない抗原を挙げることができる。抗原は、ＣＡＲ−Ｔ細胞のキメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原であってもよく、Ｔ−ＣＡＲ細胞が欠損している抗原は、悪性Ｔ細胞上に発現した抗原、好ましくは、非悪性Ｔ細胞と比較して悪性Ｔ細胞上に過剰発現した抗原（すなわち、Ｔ細胞悪性腫瘍に由来するＴ細胞）である。このような抗原の例としては、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、及びＴＣＲβ、が挙げられる。
Ｔ細胞悪性腫瘍は、Ｔ細胞前駆細胞、成熟Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞、に由来する悪性腫瘍を含む。Ｔ細胞悪性腫瘍の例としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）性白血病、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ−１＋）成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、ならびに、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、ＡＬＫ陽性未分化大細胞リンパ腫、及びＡＬＫ陰性未分化大細胞リンパ腫を含むがこれらに限定されない、様々な末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、が挙げられる。
好適なＣＡＲ抗原としてはまた、多発性骨髄腫細胞、すなわち、悪性形質細胞の表面上に認められる抗原、例えば、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、及びＣＤ１９などを挙げることができる。代替的に、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、及び骨髄性白血病を治療するための、ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方を効果的に共標的とする、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに対するリガンドである、ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分を発現するように、ＣＡＲを設計してもよい。
本明細書で開示するＴ細胞を用いてゲノム編集される好適な抗原、及び本明細書で開示するＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＡＲが認識する好適な抗原の別の例については、以下の表２〜４に記載する。これらの抗原としては、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、ＴＣＲβ、ＣＳ１、ＣＤ３８、が挙げられる。
自殺遺伝子。代替的にまたは加えて、ゲノム編集Ｔ細胞は、１種または複数種の自殺遺伝子を更に含んでいてもよい。本明細書で使用する場合、「自殺遺伝子」とは、活性化した場合にＣＡＲ−Ｔ細胞の死をもたらす、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いてＣＡＲ−Ｔ細胞に導入された核酸配列のことを意味する。自殺遺伝子により、必要に応じ、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の効果的な追跡及び除去を促進してもよい。自殺遺伝子を活性化させることにより促進された殺傷は、当該技術分野において周知の方法を用いて生じさせてもよい。当該技術分野において周知の好適な自殺遺伝子療法システムとしては、様々な単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）自殺遺伝子療法システム、または誘導性カスパーゼ９タンパク質、が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な実施形態では、自殺遺伝子は、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ自殺遺伝子である。
ＣＡＲ及びＣＡＲ−Ｔを構築するための方法
「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」とは、本明細書で使用する場合、及び当該技術分野において一般的に使用する場合、抗原が細胞外ドメインに結合すると、細胞に特殊機能を実行させる細胞内ドメイン（シグナル伝達ドメイン）に結合した、抗原特異的細胞外ドメイン（抗原認識ドメイン）を有する組換え融合タンパク質のことを意味する。キメラ抗原受容体は、ＭＨＣ非依存性抗原に結合するその能力と、その細胞内ドメインを介して活性化シグナルを変換するその能力の両方により、その他の抗原結合因子とは区別される。
臨床グレードのＣＡＲ−Ｔ細胞集団のＣＡＲ設計、送達及び発現、ならびに製造を行うための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０１２，１８（１０）：２７８０−９０を参照されたい。ＣＡＲをコードする遺伝子改変キメラ抗原受容体ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、少なくとも１種の共刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、を含む。
キメラ抗原受容体の抗原特異的細胞外ドメインは、抗原（一般的には、悪性腫瘍の表面に発現した抗原）を認識してそれに特異的に結合する。「抗原特異的細胞外ドメイン」（すなわち、「抗原結合ドメイン」）は抗原に特異的に結合するが、その際、例えば、約０．１ｐＭ〜約１０μＭ、好ましくは約０．１ｐＭ〜約１μＭ、より好ましくは約０．１ｐＭ〜約１００ｎＭの親和性定数または相互作用（ＫＤ）の親和性で抗原に結合する。相互作用の親和性を測定するための方法は、当該技術分野において周知である。本開示のＣＡＲに用いるのに好適な抗原特異的細胞外ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであってもよく、多種多様なそれらは、当技術分野において周知である。一部の例においては、抗原結合ドメインは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。その他の抗体ベース認識ドメイン、ｃＡｂ ＶＨＨ（ラクダ科抗体可変ドメイン）及びそれらのヒト化型、ＩｇＮＡＲ ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びそれらのヒト化型、ｓｄＡｂ ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）、ならびに、「ラクダ化」抗体可変ドメイン、が使用に好適である。一部の例においては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベース認識ドメイン、例えば、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶαＶβを含む一本鎖２ドメインＴＣＲ）などもまた、使用に好適である。
本開示のキメラ抗原受容体はまた、抗原特異的細胞外ドメインに抗原が結合すると、Ｔ細胞に細胞内シグナルをもたらす、「細胞内ドメイン」を含む。本開示のキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体を発現するＴ細胞における少なくとも１種のエフェクター機能の活性化に影響を及ぼす。用語「エフェクター機能」とは、Ｔ細胞などの分化細胞における特殊機能のことを意味する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、ＮＫのトランス活性化、Ｔ細胞の活性化及び分化、Ｂ細胞の活性化、樹状細胞の活性化及びクロスプレゼンテーション活性、ならびにマクロファージの活性化、であってもよい。それゆえ、用語「細胞内ドメイン」とは、抗原が細胞外ドメインに結合すると、エフェクター機能シグナルを伝達してＴ細胞に特殊機能を実行させる、ＣＡＲの部分のことを意味する。好適な細胞内ドメインの非限定例としては、Ｔ細胞受容体のζ鎖またはそのホモログ（例えば、η、δ、γ、またはε）のいずれか、ＭＢ１鎖、８２９、Ｆｅ Ｒｉｌｌ、Ｆｅ Ｒｌ、及びＣＤ３ζとＣＤ２８などのシグナル伝達分子の組み合わせ、ＣＤ２７、４−１ ＢＢ、ＤＡＰ−１０、ＯＸ４０及びこれらの組み合わせ、ならびにその他の類似した分子及びフラグメント、が挙げられる。活性化タンパク質ファミリーのその他のメンバーの細胞内シグナル伝達部位、例えば、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩなどを使用してもよい。通常は、完全な細胞内ドメインを採用するが、多くのケースでは、完全な細胞内ポリペプチドの使用は必須ではない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケート部分が有用となり得る範囲において、エフェクター機能シグナルをなおも伝達する限りにおいて、このようなトランケート部分をインタクト鎖の代わりに使用してもよい。それゆえ、用語「細胞内ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内ドメインの任意のトランケート部分を含むことを意味する。
通常、抗原特異的細胞外ドメインは、「膜貫通ドメイン」により、キメラ抗原受容体の細胞内ドメインに連結している。膜貫通ドメインは細胞膜を貫通し、ＣＡＲをＴ細胞表面に固定し、細胞外ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結させることにより、Ｔ細胞表面上におけるＣＡＲの発現に影響を及ぼす。キメラ抗原受容体はまた、１種もしくは複数種の共刺激ドメイン及び／または１種もしくは複数種のスペーサーを更に含んでいてもよい。「共刺激ドメイン」は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるサイトカインの産生、増殖、細胞傷害性、及び／または持続性を向上させる共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインから誘導される。「スペーサー」は、（ｉ）抗原特異的細胞外ドメインを膜貫通ドメインに連結させる、（ｉｉ）膜貫通ドメインを共刺激ドメインに連結させる、（ｉｉｉ）共刺激ドメインを細胞内ドメインに連結させる、及び／または（ｉｖ）膜貫通ドメインを細胞内ドメインに連結させる。例えば、抗原特異的細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサードメインを設けて、抗原結合ドメインの柔軟性に影響を及ぼすことにより、ＣＡＲ機能に影響を及ぼしてもよい。好適な膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びスペーサーは、当該技術分野において周知である。
モノＣＡＲ−Ｔ細胞
特定の実施形態では、本開示は、抗原または細胞表面タンパク質に特異的に結合する単一のＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、その抗原または細胞表面タンパク質を任意選択的に欠損している（例えば、ＣＤ７ＣＡＲＴΔＣＤ７細胞）。非限定的な例では、抗原または細胞表面タンパク質の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾された抗原もしくは細胞表面タンパク質にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現する抗原もしくは細胞表面タンパク質を修飾すること（例えば、キメラ抗原受容体が認識する１種もしくは複数種の抗原のエピトープは、１つもしくは複数のアミノ酸変異（例えば、置換または欠失）によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい）、（ｂ）抗原もしくは細胞表面タンパク質の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）抗原もしくは細胞表面タンパク質が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、抗原または細胞表面タンパク質をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。上記の実施形態のそれぞれでは、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１種または好ましくは全ての抗原または細胞表面タンパク質を欠損していてもよい。１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を欠損させるＴ細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については本明細書に記載している。以下に記載する実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いて、１種または複数種の抗原を欠損させるＴ細胞を修飾する。これら実施形態のうちのいずれかは、本明細書で開示する方法を用いて実施してもよい。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。
例えば、商業的に合成された抗ＣＤ７一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、ＣＤ２８及び／または４−１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する第３世代のＣＡＲ骨格にクローニングすることにより、ＣＤ７特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞用のＣＡＲを作製してもよい。Ｐ２Ａペプチドの後に細胞外ｈＣＤ３４ドメインを加えて、ウイルス形質導入及び抗ｈＣＤ３４磁性ビーズを用いた精製の後における、ＣＡＲによる両方の検出を可能としてもよい。その他の悪性Ｔ細胞抗原に特異的なＣＡＲを作製するために、同様の方法を続けてもよい。
本開示が包含するＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）−ＣＤ３複合体の一部を欠失させた結果として、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を更に欠損していてもよい。様々な実施形態では、本明細書で開示するＣＡＲ−Ｔ細胞を用いて、内在性ＴＣＲシグナル伝達を除去または抑制することが望ましい場合がある。例えば、同種異系Ｔ細胞を用いてＣＡＲ−Ｔ細胞を作製する場合に、ＣＡＲ−Ｔ細胞における内在性ＴＣＲシグナル伝達を抑制または除去することにより、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防または抑制してもよい。内在性ＴＣＲシグナル伝達を除去または抑制するための方法は当該技術分野において周知であり、ＴＣＲ−ＣＤ３受容体複合体の一部、例えば、ＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）、ＴＣＲ受容体β鎖（ＴＣＲβ）もしくはそのサブタイプ、ＴＣＲδ、ＴＣＲγ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及び／またはＣＤ３δ、を欠失させること、が挙げられるがこれらに限定されない。ＴＣＲ受容体複合体の一部を欠失させることにより、ＴＣＲ介在性シグナル伝達を阻害することができ、それにより、生命を脅かすＧｖＨＤを誘導することなく、ＣＡＲ−Ｔ細胞の供給源として同種異系Ｔ細胞を安全に使用することを可能としてもよい。
加えて、本開示が包含するＣＡＲ−Ｔ細胞は、本明細書に記載の１種または複数種の自殺遺伝子を更に含んでいてもよい。
類似の方法を用いて、その他のモノＣＡＲ−Ｔ細胞を構築してもよく、それらについては以下の表１に記載する。
Figure 2021525518
Figure 2021525518
細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、またはガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞に由来する、ゲノム編集されたＣＡＲ−Ｔ細胞の表面上に発現させることのできるＣＡＲアミノ酸配列の実施形態について以下の表２に開示する。
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
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タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞
タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞（ｔＣＡＲ−Ｔ）は、２つの異なる細胞表面分子（例えば、抗原／タンパク質）と相互作用可能な２つの異なる細胞外リガンド結合（抗原／タンパク質認識）ドメインを含む単一キメラ抗原ポリペプチドを有するＴ細胞であり、細胞外リガンド結合ドメインは、１つまたは複数のフレキシブルリンカーによって互いに連結し、１種または複数種の共刺激ドメインを共有しており、第１または第２の細胞外リガンド結合ドメインの結合により、１種または複数種の共刺激ドメイン（複数可）、及びシグナル伝達ドメインにわたり、シグナルが伝達される。
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ７＊ＣＤ２−ｔＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞用のＣＤ７及びＣＤ２、または、ＣＤ３＊ＣＤ２−ｔＣＡＲΔＣＤ３ΔＣＤ２細胞用のＣＤ２）を欠損している。非限定的な例では、抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾された抗原（複数可）もしくは細胞表面タンパク質（複数可）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現する抗原もしくは細胞表面タンパク質を修飾すること（例えば、キメラ抗原受容体が認識する１種もしくは複数種の抗原のエピトープは、１つもしくは複数のアミノ酸変異（例えば、置換または欠失）によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい）、（ｂ）抗原（複数可）もしくは細胞表面タンパク質（複数可）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）抗原（複数可）もしくは細胞表面タンパク質（複数可）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、抗原または細胞表面タンパク質をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。上記の実施形態のそれぞれでは、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１種または好ましくは全ての抗原または細胞表面タンパク質を欠損していてもよい。１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を欠損させるＴ細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については本明細書に記載している。以下に記載する実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いて、１種または複数種の抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）を欠損させるＴ細胞を修飾する。これら実施形態のうちのいずれかは、本明細書で開示する方法を用いて実施してもよい。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。
ペプチドリンカーによって分離された、商業的に合成された抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）及び抗ＣＤ３一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、例えば、ＣＤ２８及び／または４−１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する第２または第３世代のＣＡＲ骨格を含有するレンチウイルスベクターにクローニングすることにより、ゲノム編集タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞用のｔＣＡＲ、すなわち、ＣＤ２＊ＣＤ３−ｔＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３εを作製してもよい。Ｐ２Ａペプチドの後に細胞外ｈＣＤ３４ドメインを加えて、ウイルス形質導入及び抗ｈＣＤ３４磁性ビーズを用いた精製の後における、ＣＡＲによる両方の検出を可能としてもよく、代替的に、その他のマーカーも利用可能であり、バイシストロン性構築物を作製するためのその他の方法も利用可能である。その他の悪性Ｔ細胞抗原に特異的なｔＣＡＲを作製するために、同様の方法を続けてもよい。
タンデムＣＡＲは、異なるリンカー構造を有していてもよく、すなわち、直鎖状またはヘアピンであってもよく、ヘアピンリンカーは、（Ｃｙｓ＝Ｃｙｓ）二本鎖結合（ＤＳＢ）を任意選択的に含んでいてもよい。
直鎖状タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞は、第１のシグナルペプチド、第１の細胞外リガンド結合ドメイン、第２の細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、１種または複数種の共刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを含み、第１の細胞外リガンド結合抗原認識ドメイン及び第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、異なる細胞表面分子、すなわち、がん細胞、例えば、悪性Ｔ細胞、悪性Ｂ細胞、または悪性形質細胞上の抗原に対する親和性を有し、直鎖状タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞は、直鎖状タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞における細胞表面分子の発現低下をもたらす、１つまたは複数の遺伝子修飾、欠失、または破壊を有する。
別の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８αに由来するシグナルペプチドである。
第３の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）により連結されたＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、２、３、４、５、または６回繰り返されている。一部の実施形態では、第１の抗原認識ドメインは、１）ＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１、または２）ＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１から選択することができる。
一部の実施形態では、第２の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）により連結されたＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、２、３、４、５、または６回繰り返されている。一部の実施形態では、第１の抗原認識ドメインは、１）ＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２、または２）ＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２から選択することができる。
更なる実施形態では、第１の抗原認識ドメイン及び第２の抗原認識ドメインは、５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）の短いリンカーペプチドにより連結されている。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、２、３、４、５、または６回繰り返されている。
タンデムＣＡＲ構築物
一実施形態では、第１の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）により連結されたＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含み、細胞表面分子、すなわち、悪性Ｔ細胞上に発現した抗原を標的とする、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
特定の実施形態では、ＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される、悪性Ｔ細胞上に発現した抗原を標的とする。
特定の実施形態では、第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）により連結されたＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含み、細胞表面分子、すなわち、悪性細胞上に発現した抗原を標的とする、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
特定の実施形態では、ＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される、悪性細胞上に発現した抗原を標的とし、ＣＡＲ分子の第１の細胞外リガンド結合ドメインの可変重（ＶＨ１）鎖配列及び可変軽（ＶＬ１）鎖配列とは異なる。
タンデムＣＡＲの別の例については、以下の表３に記載する。
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
例えば、表４では、上の表３に記載の抗原対のいずれかを標的とする、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインを組み込まれていてもよい直鎖状タンデムＣＡＲ構築物を提供する。
Figure 2021525518
Figure 2021525518
以下の表５では、上の表３に記載の抗原対のいずれかを標的とする、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインを組み込まれていてもよいヘアピンタンデムＣＡＲ構築物も提供する。
Figure 2021525518
Figure 2021525518
以下の表６では、ＣＤ２ ｓｃＦｖ及びＣＤ３ ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインを組み込んだヘアピンタンデムＣＡＲ構築物も提供する。
Figure 2021525518
以下の表７では、上の表３に記載の抗原対のいずれかを標的とする、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインを組み込まれていてもよいヘアピンタンデムＣＡＲ構築物も提供する。
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞
特定の実施形態では、本開示は、同一エフェクター細胞内に発現した異なる抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）に対する親和性を有する、２つの異なるキメラ抗原受容体ポリペプチドを有する遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、それぞれのＣＡＲ機能は独立している。ＣＡＲは、異なる抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）に特異的に結合する単一または複数のポリヌクレオチド配列から発現してもよく、Ｔ細胞は、ＣＡＲが結合する抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）を欠損している（例えば、ＣＤ７＊ＣＤ２−ｄＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞）。非限定的な例では、抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾された抗原（複数可）もしくは細胞表面タンパク質（複数可）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現する抗原もしくは細胞表面タンパク質を修飾すること（例えば、キメラ抗原受容体が認識する１種もしくは複数種の抗原のエピトープは、１つもしくは複数のアミノ酸変異（例えば、置換または欠失）によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい）、（ｂ）抗原（複数可）もしくは細胞表面タンパク質（複数可）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）抗原（複数可）もしくは細胞表面タンパク質（複数可）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、抗原または細胞表面タンパク質をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。上記の実施形態のそれぞれでは、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１種または好ましくは全ての抗原または細胞表面タンパク質を欠損していてもよい。１種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を欠損させるＴ細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については本明細書に記載している。以下に記載する実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いて、１種または複数種の抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）を欠損させるＴ細胞を修飾する。これら実施形態のうちのいずれかは、本明細書で開示する方法を用いて実施してもよい。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。
商業的に合成された抗ＣＤ２一本鎖可変フラグメントを、例えば、ＣＤ２８及び／または４−１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する第２または第３世代のＣＡＲ骨格を含有するレンチウイルスベクターにクローニングしてから、商業的に合成された抗ＣＤ３ε一本鎖可変フラグメントを、ＣＤ２８及び／または４−１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する別の第２または第３世代のＣＡＲ骨格を含有する同一レンチウイルスベクターにクローニングして、２種のＣＡＲ構築物が同一ベクターから発現するプラスミドを生じさせることにより、ゲノム編集デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞用のｄＣＡＲ、すなわち、ＣＤ２＊ＣＤ３ε−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３εを作製してもよい。Ｐ２Ａペプチドの後に細胞外ｈＣＤ３４ドメインを加えて、ウイルス形質導入及び抗ｈＣＤ３４磁性ビーズを用いた精製の後における、ＣＡＲによる両方の検出を可能としてもよい。その他の悪性Ｔ細胞抗原に特異的なｔＣＡＲを作製するために、同様の方法を続けてもよい。
類似の方法を用いて、その他のデュアルＣＡＲを構築してもよく、それらについては以下の表３〜４に記載する。
一実施形態では、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞は、（ｉ）第１のシグナルペプチド、第１の抗原認識ドメイン、第１のヒンジ領域、第１の膜貫通ドメイン、第１の共刺激ドメイン、及び第１のシグナル伝達ドメイン、を含む、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、ならびに、（ｉｉ）第２のシグナル伝達ペプチド、第２の抗原認識ドメイン、第２のヒンジ領域、第２の膜貫通ドメイン、第２の共刺激ドメイン、及び第２のシグナル伝達ドメイン、を含む、第２のキメラ抗原受容体ポリペプチド、を含み、第１の抗原認識ドメイン及び第２の抗原認識ドメインは、異なる標的抗原に対する親和性を有し、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞は、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞における標的抗原の発現低下をもたらす、１つまたは複数の遺伝子破壊を有する。
第２の実施形態では、第１のシグナルペプチドはＣＤ８ａシグナル配列である。
第３の実施形態では、第１の抗原認識ドメインは、５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）の短いリンカーペプチドにより連結された、第１の抗原認識ドメイン用の、ＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、３または４回繰り返されている。一部の実施形態では、第１の抗原認識ドメインは、ＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１、またはＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１から選択することができる。
一部の実施形態では、第１のヒンジ領域はＣＤ８ａを含む。
一部の実施形態では、第１の膜貫通ドメインはＣＤ８またはＣＤ２８である。
一部の実施形態では、第１の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、またはいずれかの順番の両方の組み合わせ、すなわち、４−１ＢＢ−ＣＤ２８、もしくはＣＤ２８−４−１ＢＢを含む。
一部の実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、またはＣＤ３ζバイペプチド、すなわち、ＣＤ３ζ−ＣＤ３ζである。
一部の実施形態では、第２のシグナルペプチドは、配列番号：１のＣＤ８ａシグナル配列である。
一部の実施形態では、第２の抗原認識ドメインは、５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）の短いリンカーペプチドにより連結された、第２の抗原認識ドメイン用の、ＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、３または４回繰り返されている。一部の実施形態では、第２の抗原認識ドメインは、ＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２、またはＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２から選択することができる。
一部の実施形態では、第２のヒンジ領域はＣＤ８ａを含む。
一部の実施形態では、第２の膜貫通ドメインはＣＤ８またはＣＤ２８である。
一部の実施形態では、第２の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、またはいずれかの順番の両方の組み合わせ、すなわち、４−１ＢＢ−ＣＤ２８、もしくはＣＤ２８−４−１ＢＢを含む。
一部の実施形態では、第２のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、またはＣＤ３ζバイペプチド、すなわち、ＣＤ３ζ−ＣＤ３ζである。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２の第１の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１の第２の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、少なくとも１つの高効率開裂部位を含み、その高効率開裂部位は、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａから選択される。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは自殺遺伝子を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドはサイトカインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは変異サイトカインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドはサイトカイン受容体を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは変異サイトカイン受容体を含む。
一部の実施形態では、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ３７１（ＣＬＬ−１、ＣＬＥＣ１２Ａ）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８、及びＣＤ１９、ＡＰＲＩＬ、ならびにＴＡＣＩ、から選択される２種の抗原を標的とする。
デュアルＣＡＲの別の例については、以下の表８に記載する。
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
更なる態様では、ＣＡＲ−Ｔ細胞対照を作製してもよい。例えば、対照ＣＡＲ−Ｔ細胞は、悪性Ｔ細胞上に発現していない抗原に結合する細胞外ドメインを含んでいてもよい。例えば、治療用ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＤ７などのＴ細胞抗原、または、ＣＤ２及びＣＤ３などの複数のＴ細胞抗原を標的とする場合、対照ＣＡＲ−Ｔ細胞が結合する抗原は、ＣＤ１９であってもよい。ＣＤ１９はＴ細胞上ではなくＢ細胞上に発現する抗原であることから、ＣＤ１９に結合するように適合させた細胞外ドメインを有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞に結合しない。これらのＣＡＲ−Ｔ細胞を対照として用いて、目的のがんを標的とする及び／または目的の抗原を認識するＣＡＲ−Ｔ細胞の、結合効率及び非特異的結合を解析してもよい。
当業者に周知の変化形態を任意選択的に採用して、ＷＯ２０１８０２７０３６Ａ１に開示されるように、ＣＡＲを更に設計してもよい。ＷＯ２０１８０２７０３６Ａ１に開示されるように、加えて、当該技術分野において周知の方法を用いて、また市販の供給元から、レンチウイルスベクター及び細胞株を得てもよく、ガイドＲＮＡを設計、検証及び合成してもよい。
レトロウイルスを用いて遺伝子改変ＣＡＲをＴ細胞内に導入してもよく、それにより、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を標的細胞ゲノム内に効率的かつ安定的に組み込むことが可能となる。当該技術分野において周知のその他の方法としては、レンチウイルス形質導入、トランスポゾンベースのシステム、直接的なＲＮＡトランスフェクション、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（すなわちＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（すなわちＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（すなわちＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（すなわちＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（すなわちＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６などの好適なＣａｓタンパク質を用いたＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のシステム）、が挙げられるがこれらに限定されない。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）もまた使用してもよい。例えば、Ｓｈｅａｒｅｒ ＲＦ ａｎｄ Ｓａｕｎｄｅｒｓ ＤＮ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ： ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ，”Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２０１５ Ｊａｎ；２０（１）：１−１０を参照されたい。
ＰＩ３Ｋシグナル伝達の操作を使用して、構成的なＣＡＲの自己シグナル伝達による変異ＣＡＲ−Ｔ細胞の分化を防止してもよく、長命メモリーＴ細胞の発現を促進させてもよい。ＣＡＲ−Ｔの製造中及びｅｘ ｖｉｖｏ増殖中にＰＩ３Ｋを薬理学的に阻害することにより、優先的なエフェクターＴ細胞の発現を阻害して、ＣＡＲ−Ｔのエフェクター／メモリー比率を、空のベクターを形質導入したＴ細胞に認められる比率にまで回復させることができ、それにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の持続性及び治療活性を向上させることができる。ｐ１１０δ ＰＩ３Ｋを阻害することにより腫瘍特異的治療用ＣＤ８Ｔ細胞の有効性及び記憶を向上させることができる一方で、ｐ１１０α ＰＩ３Ｋを阻害することによりサイトカイン産生及び抗腫瘍効果を向上させることができる。
Ｔ細胞の表面上にＣＡＲが存在することにより、リガンドがない場合であってもＴ細胞の活性化及び分化に変化が生じ得ることから、このＰＩ３Ｋの阻害が提案されている。ｓｃＦｖフレームワークとシグナル伝達ドメインの両方に関連する、ＣＡＲによる構成的な自己シグナル伝達により、分化の変異及び生存率の低下を含む、異所性のＴ細胞挙動がもたらされ得る。この異所性のＴ細胞挙動は、患者におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性がそれらＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ寿命と直接関係している場合に重要である。ＣＤ２８共刺激ドメインが存在すると、持続的なＣＡＲの自己シグナル伝達が引き起こすＣＡＲ−Ｔ細胞の消耗が増加し、４−１ＢＢ共刺激ドメインの効果はより少ない。更に、ＣＤ３−ｚｅｔａは、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ及び解糖経路の構成的活性化を有意に向上させ、セントラル／ステムメモリー細胞よりも短命エフェクター細胞の形成を促進させる。例えば、Ｚｈａｎｇ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＩ３Ｋ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１８ Ｎｏｖ ９；９（８８）：３５８０７−３５８０８を参照されたい。
サイトカイン／ケモカイン／転写因子の遺伝子の欠失または抑制
ＴＣＲならびに細胞表面タンパク質及び抗原を遺伝子編集することに加えて、分泌可能なタンパク質、例えば、サイトカインなどの遺伝子を、本明細書で開示する方法を用いて編集してもよい。ケモカイン及び転写因子を編集してから活性化させてもよい。このような編集を行って、例えば、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の発症または維持を抑制または予防してもよい。ＣＲＳは、免疫治療薬（またはその他の免疫学的刺激物）に応答した免疫細胞からの、大規模で急速なサイトカインの放出によって引き起こされる。本明細書で開示する方法を用いて、１つまたは複数のサイトカインまたはケモカインの遺伝子の修飾、破壊、または欠失を達成してもよい。
例えば、Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲを用いることにより、または、サイトカイン、ケモカイン、もしくは転写因子の遺伝子配列にＣＡＲを標的形質導入することにより、本明細書で開示する免疫エフェクター細胞から欠失させることができるサイトカイン、ケモカイン、及び転写因子としては、以下、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ−１α（ＩＬ１Ａ）、ＩＬ−１β（ＩＬ１Ｂ）、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＣＤ１５４、ＬＴ−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、４−１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ−１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＳＰ、Ａ２Ｍ、ＡＣＫＲ１、ＡＣＫＲ２、ＡＣＫＲ３、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＧＥＲ、ＡＧＲＮ、ＡＨＲ、ＡＩＭＰ１、ＡＲＥＧ、ＢＣＬ６、ＢＭＰ１、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ａ、ＢＭＰ８Ｂ、ＢＭＰＲ２、Ｃ１０ｏｒｆ９９、Ｃ１ＱＴＮＦ４、Ｃ５、ＣＣＬ２８、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＤ１０９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３６、ＣＤ４、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８ａ、ＣＥＲ１、ＣＨＲＤ、ＣＫＬＦ、ＣＬＣＦ１、ＣＭＴＭ１、ＣＭＴＭ２、ＣＭＴＭ３、ＣＭＴＭ４、ＣＭＴＭ５、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ７、ＣＭＴＭ８、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＲ、ＣＯＰＳ５、ＣＲＬＦ１、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＴＦ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＥＢＩ３、ＥＤＮ１、ＥＬＡＮＥ、ＥＮＧ、ＦＡＭ３Ｂ、ＦＡＭ３Ｃ、ＦＡＭ３Ｄ、ＦＡＳ、ＦＡＳＬＧ、ＦＧＦ２、ＦＬＴ３ＬＧ、ＦＯＸＰ３、ＦＺＤ４、ＧＡＴＡ３、ＧＢＰ１、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ９、ＧＰＩ、ＧＲＥＭ１、ＧＲＥＭ２、ＧＲＮ、ＨＡＸ１、ＨＦＥ２、ＨＭＧＢ１、ＨＹＡＬ２、ＩＣＡＭ３、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＥ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ３、ＩＦＮＷ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｄ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ−１９、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３１、ＩＬ３１ＲＡ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３４、ＩＬ３６Ａ、ＩＬ３６Ｂ、ＩＬ３６Ｇ、ＩＬ３６ＲＮ、ＩＬ３７、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＨＢＢ、ＩＮＨＢＣ、ＩＮＨＢＥ、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ３、ＫＩＴ、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＨＬ２０、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＬＩＦＲ、ＬＴＡ、ＬＴＢ、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＬＴＢＰ４、ＭＡＦ、ＭＩＦ、ＭＩＮＯＳ１−、ＭＳＴＮ、ＮＡＭＰＴ、ＮＢＬ１、ＮＤＰ、ＮＬＲＰ７、ＮＯＤＡＬ、ＮＯＧ、ＮＲＧ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、ＰＡＲＫ７、ＰＤＰＮ、ＰＦ４、ＰＦ４Ｖ１、ＰＧＬＹＲＰ１、ＰＬＰ２、ＰＰＢＰ、ＰＸＤＮ、ＲＯＲＣ、ＳＣＧ２、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＳＥＣＴＭ１、ＳＬＵＲＰ１、ＳＯＳＴＤＣ１、ＳＰ１００、ＳＰＩ１、ＳＰＰ１、ＴＢＸ２１、ＴＣＡＰ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＢＳ１、ＴＨＮＳＬ２、ＴＨＰＯ、ＴＩＭＰ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１２−、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＲＩＭ１６、ＴＳＬＰ、ＴＷＳＧ１、ＴＸＬＮＡ、ＶＡＳＮ、ＶＥＧＦＡ、ＶＳＴＭ１、ＷＦＩＫＫＮ１、ＷＦＩＫＫＮ２、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ７Ａ、及びＺＦＰ３６、が挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、サイトカインは、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＭＣＰ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｉｌ−４、及びＩＦＮγ、から選択される。
例えば、Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲを用いることにより、または、転写因子の遺伝子配列にＣＡＲを標的形質導入することにより、本明細書で開示する免疫エフェクター細胞から欠失させることができる転写因子は、ＡＨＲ、ＢＣＬ６、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＭＡＦ、ＲＯＲＣ、ＳＰＩ１、及びＴＢＸ２１、から選択される。
これらの遺伝子の配列は当該技術分野において周知かつ入手可能である。
適応症、及びＣＡＲ−Ｔ療法における標準治療
一部の実施形態では、本明細書で開示する及び／または本明細書で開示する方法を用いて作製されるゲノム編集免疫エフェクター細胞は、１種または複数種のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、医薬品として、すなわち、疾患の治療用に使用され得る。多くの実施形態では、細胞はＣＡＲ−Ｔ細胞である。
本明細書で開示する及び／または本明細書で開示する方法を用いて作製される細胞は、がん、自己免疫疾患、感染症、及びその他の症状を治療するために、または、がん、自己免疫疾患、感染症、及びその他の症状を治療するための医薬品を製造するために、免疫療法及び養子細胞移入に使用され得る。
がんは、血液悪性腫瘍または固形腫瘍であってもよい。血液悪性腫瘍としては、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及びそれらの亜型、が挙げられる。リンパ腫は、様々な方法、多くの場合、悪性細胞の基本的なタイプに基づいて分類することができ、ホジキンリンパ腫（リードスタンバーグ細胞のがんであることが多いが、時としてＢ細胞から発生することもあり、全てのその他のリンパ腫は非ホジキンリンパ腫である）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のリンパ腫、が挙げられる。
Ｂ細胞リンパ腫としては、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のＢ細胞リンパ腫、が挙げられるがこれらに限定されない。
Ｔ細胞リンパ腫としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）、セザリー症候群、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のＴ細胞リンパ腫、が挙げられる。
白血病としては、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）（または骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ））白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性（または骨髄性）白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性（またはリンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞性白血病（時として、リンパ腫に分類される）、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他の白血病、が挙げられる。
形質細胞性悪性腫瘍としては、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞腫、及び多発性骨髄腫、が挙げられる。
一部の実施形態では、患者におけるがんを治療するために、とりわけ、固形腫瘍、例えば、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫など、または、がん、例えば、脳、頭頸部、乳房、肺（例えば、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）、生殖系（例えば、卵巣）、上部消化管、膵臓、肝臓、腎臓（ｒｅｎａｌ）系（例えば、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ））、膀胱、前立腺、及び結腸直腸の腫瘍など、を治療するために、医薬品を使用してもよい。
別の実施形態では、患者におけるがんを治療するために、とりわけ、多発性骨髄腫及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から選択される血液悪性腫瘍、ならびに、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、及びＴ細胞慢性リンパ性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）から選択されるＴ細胞悪性腫瘍、を治療するために、医薬品を使用してもよい。
一部の実施形態では、自己免疫疾患、例えば、狼瘡、自己免疫（関節）リウマチ、多発性硬化症、移植拒絶反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、皮膚炎などの治療に、細胞を使用してもよい。一部の実施形態では、細胞は、抗体フラグメントの代わりに抗原またはそのフラグメントを提示するキメラ自己抗体受容体Ｔ細胞、すなわちＣＡＡＲ−Ｔであり、このタイプの養子細胞移入では、自己免疫疾患を引き起こすＢ細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞を攻撃しようとし、遺伝子改変Ｔ細胞を殺傷することで反応する。
一部の実施形態では、ＨＩＶ及び結核などの感染症の治療に、細胞を使用してもよい。
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、強力なｉｎ ｖｉｖｏＴ細胞増殖を受けてもよく、長時間にわたり持続し得る。
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた患者の治療は、緩和、治癒的または予防的となり得る。その治療は、自家免疫療法治療の一部、または同種異系免疫療法治療の一部のいずれかであってもよい。自家とは、患者の治療に用いる細胞、細胞株、または細胞集団が、上記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナーに由来するということを意味する。同種異系とは、患者の治療に用いる細胞または細胞集団が、その患者ではなくドナーに由来するということを意味する。
本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞を用いたがんの治療は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、放射線療法、レーザー光線療法、及び放射線療法、から選択される１種または複数種の治療法と組み合わされてもよい。
本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、埋め込み、または移植、により実施される。本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞組成物、すなわち、モノＣＡＲ、デュアルＣＡＲ、タンデムＣＡＲは、皮下、皮膚内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ管内注射、または腹腔内で、患者に投与され得る。一実施形態では、本開示の細胞組成物は、静脈注射で投与されることが好ましい。
ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団の投与は、体重１ｋｇあたり１０４〜１０９の細胞、好ましくは、１０５〜１０６の細胞／ｋｇ（体重）（これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む）、の投与で構成され得る。ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、１回または複数回の投与で投与されてもよい。別の実施形態では、有効量のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、単回投与で投与される。別の実施形態では、有効量の細胞は、ある期間にわたり２回以上の投与で投与される。投与のタイミングは健康管理提供者の良識の範囲内であり、患者の臨床症状によって決まる。ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、任意の供給源、例えば、血液銀行またはドナーなどから得てもよい。患者の要望は様々ではあるが、個々の疾患または症状のための、任意のＣＡＲ−Ｔ細胞集団（複数可）の有効量の至適範囲の算出は当業者の知るところである。有効量とは、治療効果または予防効果をもたらす量のことを意味する。投与量は、患者レシピエントの年齢、健康及び体重、併用治療の種類（ある場合、治療の頻度）、ならびに、望まれる効果の性質によって決まる。
別の実施形態では、有効量の、ＣＡＲ−Ｔ細胞もしくはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、またはそれらＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物は、非経口で投与される。投与は、静脈内投与であってもよい。ＣＡＲ−Ｔ細胞もしくはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、またはそれらＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物の投与は、腫瘍内への注射によって直接実施されてもよい。
本開示の一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖及び持続性を向上させる、サイトカイン、もしくはＣＡＲ−Ｔ内のサイトカインの発現を用いた治療、ならびに、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５を用いることを含むがこれらに限定されない治療、を含むがこれらに限定されない多くの関連治療モダリティと共に、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に、患者に投与される。
第２の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、ＴＧＦβ、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、アデノシン、ＶＥＧＦ、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ２（ＩＤＯ２）、トリプトファン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、乳酸、低酸素症、アルギナーゼ、及びプロスタグランジンＥ２の阻害剤、を含むがこれらに限定されない、免疫抑制経路を阻害する薬剤と組み合わせて使用してもよい。
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、抗ＣＴＬＡ４（イピリムマブ）、抗ＰＤ１（ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ）、抗ＰＤＬ１（アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ）、抗ＰＤＬ２、抗ＢＴＬＡ、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３、抗ＶＩＳＴＡ、抗ＴＩＧＩＴ、及び抗ＫＩＲ、を含むがこれらに限定されないＴ細胞チェックポイント阻害薬、と組み合わせて使用してもよい。
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ−４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭを刺激する抗体を含むがこれらに限定されないＴ細胞アゴニストと組み合わせて使用してもよい。
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びポックスウイルス、を含むがこれらに限定されない治療用腫瘍崩壊ウイルス、と組み合わせて使用してもよい。
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ９アゴニスト、を含むがこれらに限定されない、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストなどの免疫活性化治療薬、と組み合わせて使用してもよい。
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）などのインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストと組み合わせて使用してもよい。
免疫エフェクター細胞無形成症、とりわけ、Ｔ細胞無形成症はまた、養子細胞移入療法後の懸念事である。治療する悪性腫瘍がＴ細胞悪性腫瘍でありＣＡＲ−Ｔ細胞がＴ細胞抗原を標的とする場合、抗原を発現する正常なＴ細胞及びその前駆細胞が枯渇し、免疫機構が損なわれる。それゆえ、これらの副作用を管理するための方法は、治療の案内係である。このような方法としては、後ほど、ＣＡＲ−Ｔ細胞が枯渇または不活性化した後に、増殖させて患者に再注入するために、自家または同種異系（任意選択的に、拒絶反応を引き起こさないまたは拒絶されないように遺伝子改変された）のいずれかの、非悪性のＴ細胞または前駆細胞を選択及び保持することが挙げられる。代替的に、ＴＣＲ保有細胞の亜型、例えば、正常及び悪性のＴＲＢＣ１＋（しかし、ＴＲＢＣ２＋細胞ではない）、または代替的に、ＴＲＢＣ２＋（しかし、ＴＲＢＣ１＋細胞ではない）などを認識して殺傷するＣＡＲ−Ｔ細胞を使用して、十分な正常Ｔ細胞を保持して正常な免疫機構の機能を維持しつつ、Ｔ細胞悪性腫瘍を根絶してもよい。
定義
本明細書で使用する場合、以下の用語は、示された意味を有する。本明細書の全体にわたり、その他の定義が現れる場合もある。
数値の範囲を開示する場合、また表記「ｎ１…〜ｎ２」または「ｎ１…〜ｎ２の間」を使用する場合、ｎ１及びｎ２は数字であり、そのため、特に明記しない限り、この表記は、数字自体及びそれらの間の範囲を含むことを意図している。この範囲は、数字間における整数または連続であってもよく、末端の数値を含む。例えば、「２〜６個の炭素」の範囲は、炭素が整数単位で存在することから、２、３、４、５、及び６個の炭素を含むことを意図している。対照的に、例えば、「１〜３μＭ（マイクロモル）」の範囲は、１μＭ、３μＭ、及び、数字間における任意数の有効数字（例えば、１．２５５μＭ、２．１μＭ、２．９９９９μＭなど）の全てを含むことを意図している。
用語「約」は、本明細書で使用する場合、その用語が修飾する数値を、このような数値が誤差の範囲内で変動することを表すように、限定することを意図している。誤差の範囲が特にない場合、例えば、データのグラフまたは表に記載された平均値に対する標準偏差が列挙されている場合などにおいて、用語「約」は、列挙された数値を包含し得る範囲、及び、同様に、有効数字を考慮して、その数値にまで切り上げるまたは切り下げることにより含まれ得る範囲を意味するものと理解すべきである。
細胞に関する用語「活性化」（及びその別の活用型）は通常、「刺激すること」と同義であると理解すべきであり、本明細書で使用する場合、細胞集団の増殖をもたらす細胞の処理のことを意味する。Ｔ細胞において、活性化は、ＣＤ２及びＣＤ２８（及び同様に、ＣＤ２の場合もある）アゴニスト、一般的には、任意選択的に、磁性ビーズ上にコーティングしたまたはコロイド状のポリマーマトリックスにコンジュゲートした、抗体、に曝露することによって達成されることが多い。
用語「抗原」は、本明細書で使用する場合、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体が認識する（すなわち、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体の標的である）細胞表面タンパク質である。古典的な意味において、抗原は、抗体が認識する物質、典型的にはタンパク質であるが、ＣＡＲが、１種または複数種の抗原（複数可）を認識する軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖などの抗体由来ドメインを含む限りにおいて、定義は重複するものである。
用語「がん」とは、体内における悪性腫瘍、または細胞の異常増殖のことを意味する。多くの異なるがんが、特定の細胞表面タンパク質または分子によって特性決定または同定され得る。それゆえ、一般的な用語において、本開示によるがんは、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞を用いて治療可能なあらゆる悪性腫瘍のことを意味し得、免疫エフェクター細胞は、がん細胞上の細胞表面タンパク質を認識してそれに結合する。本明細書で使用する場合、がんとは、血液悪性腫瘍、例えば、多発性骨髄腫、Ｔ細胞悪性腫瘍、またはＢ細胞悪性腫瘍などのことを意味し得る。Ｔ細胞悪性腫瘍としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）または非ホジキンリンパ腫を挙げることができるがこれらに限定されない。がんはまた、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、及び肺癌、を含むがこれらに限定されない固形腫瘍のことを意味し得る。
「細胞表面タンパク質」は、本明細書で使用する場合、細胞の表面上で少なくとも部分的に、細胞が発現するタンパク質（またはタンパク質複合体）である。細胞表面タンパク質の例としては、ＴＣＲ（及びそのサブユニット）及びＣＤ７が挙げられる。
「キメラ抗原受容体」すなわち「ＣＡＲ」とは、本明細書で使用する場合、及び当該技術分野において一般的に使用する場合、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞外リガンド結合ドメインが標的細胞上に存在する構成要素に結合すると、細胞に特殊機能を実行させるシグナル伝達ドメイン、を有する、組換え融合タンパク質のことを意味する。例えば、ＣＡＲは、特定の抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を産生するための、Ｔ細胞受容体を活性化させる細胞内ドメインを有し、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する、抗体に基づいた特異性を有していてもよい。第１世代のＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン（一般的には、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγ）を含む。第２世代のＣＡＲは、細胞内共刺激ドメイン（一般的には、４−１ＢＢまたはＣＤ２８）を含ませることにより、第１世代のＣＡＲ構築物を土台に構築されている。これらの共刺激ドメインは、第１世代のＣＡＲと比較して、ＣＡＲ−Ｔ細胞の傷害性及び増殖を向上させるのに役立つ。第３世代のＣＡＲは、主として、ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖及び持続性を向上させるための、複数の共刺激ドメインを含む。キメラ抗原受容体は、ＭＨＣ非依存性抗原に結合するその能力と、その細胞内ドメインを介して活性化シグナルを変換するその能力の両方により、その他の抗原結合因子とは区別される。
「ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞」は、少なくとも１種のＣＡＲを形質導入された免疫エフェクター細胞である。「ＣＡＲ−Ｔ細胞」は、少なくとも１種のＣＡＲを形質導入されたＴ細胞であり、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、モノ、デュアル、またはタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞であってもよい。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、自家（対象自身の細胞から遺伝子改変されたことを意味する）であってもよく、または、同種異系（細胞が健康なドナーを供給源としていることを意味する）であってもよく、多くの場合、宿主対移植片反応、または移植片対宿主反応を引き起こさないように遺伝子改変されている。ドナー細胞はまた、臍帯血に由来していてもよく、または、人工多能性幹細胞から作製してもよい。
用語「デュアルＣＡＲ」（ｄＣＡＲ−Ｔ）とは、同一エフェクター細胞内に発現した異なる標的抗原に対する親和性を有する、２つの異なるキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞のことを意味し、それぞれのＣＡＲ機能は独立している。ＣＡＲは、単一または複数のポリヌクレオチド配列から発現してもよい。
用語「タンデムＣＡＲ−Ｔ」（ｔＣＡＲ−Ｔ）とは、異なる標的に対する親和性を有する、２つの異なる抗原認識ドメインを含有する単一キメラ抗原ポリペプチドのことを意味し、抗原認識ドメインは、ペプチドリンカーによって連結し、共通の共刺激ドメイン（複数可）を共有しており、いずれかの抗原認識ドメインの結合により、共通の共刺激ドメイン（複数可）、及びシグナル伝達ドメインにわたり、シグナルが伝達される。
用語「組み合わせ治療」とは、本開示に記載の治療症状または障害を治療するための、２種またはそれ以上の治療薬の投与のことを意味する。このような投与は、固定比率の活性成分を有する単一のカプセル剤、または、それぞれの活性成分用の複数の別々のカプセル剤などによる、これらの治療薬のほぼ同時の共投与を包含する。加えて、このような投与はまた、それぞれの種類の治療薬の連続的な使用を包含する。いずれの場合も、治療レジメンは、本明細書に記載の症状または障害の治療において、薬剤組み合わせの有益な効果をもたらす。
用語「組成物」とは、本明細書で使用する場合、１種または複数種の治療的に許容される担体と組み合わせた、免疫療法用の細胞集団のことを意味する。
用語「欠失」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子に対する編集効果またはそのタンパク質産物における効果に関し、タンパク質産物の発現が抑制または防止されるように、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変または一部喪失させることを意味する。用語「抑制」とは、同一の文脈において、タンパク質産物の発現を低下させることを意味し、用語「除去」とは、同一の文脈において、タンパク質産物の発現を防止することを意味する。欠失は、抑制及び除去を包含する。
本明細書で使用する場合、遺伝子編集標的抗原の発現またはＴＣＲシグナル伝達における、「欠損」したとは、抗原またはシグナル伝達がその正常な作用を誘導する上で、十分な量の抗原またはシグナル伝達を欠いているということを意味する。ＣＤ７を「欠損」した細胞、例えば、（「ＣＤ７欠損」細胞）は、ＣＤ７を完全に欠いていてもよいが、また、存在するＣＤ７が、同胞殺しに対していかなる有効な形でも寄与し得ないほどに、ごくわずかな量のＣＤ７を発現し得る。
用語「疾患」は、本明細書で使用する場合、全てが、正常な機能を損なっているヒトもしくは動物の体またはその部位の１つにおける、異常な状態を反映し、典型的には、徴候及び症状が際立つことにより顕在化し、またヒトまたは動物の寿命または生活の質を低下させるという点で、一般的に、用語「障害」、「症候群」及び「症状」（医学的症状と同様）と同義であり、それらと同じ意味で用いられることを意図している。
用語「ドナー鋳型」とは、相同組換え修復（ＨＤＲ）ＤＮＡ修復経路により二本鎖切断を修復するための鋳型として細胞が使用する基準ゲノム物質のことを意味する。ドナー鋳型は、ゲノム内へと挿入される、二本鎖切断部位の側面を狙う２本のホモロジーアームを有するＤＮＡの断片（発現させる遺伝子、すなわち、ＣＡＲまたはマーカーの遺伝子を含有している）を含有している。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス、一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ、であってもよい。
用語「に曝露する」は、本明細書で使用する場合、目的の組成物（例えば、抗体など）を別の目的の組成物（例えば、細胞など）と密着させる状況において、「と培養する」と同義であることを意図しており、短い期間の接触は、用語「と培養する」の代わりに用語「に曝露する」を使用することを意図している。
用語「同胞殺し」とは、本明細書で使用する場合、標的とされる細胞が、両方の細胞上のキメラ抗原受容体が特異的に認識する抗原を発現していることから、ＣＡＲ−Ｔ細胞（またはその他のＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞）が、そのＣＡＲ−Ｔ細胞の標的と同一のキメラ抗原受容体を含む別のＣＡＲ−Ｔ細胞の標的となる際、または別のＣＡＲ−Ｔ細胞によって殺傷される際に生じるプロセスのことを意味する。キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損したキメラ抗原受容体を含むＣＡＲ−Ｔは、「同胞殺し抵抗性」である。
用語「ゲノム編集」または「遺伝子編集」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子、またはゲノムの一部が、非機能的となるように付加、欠失、または修飾（例えば、破壊）されているということを意味する。それゆえ、特定の実施形態では、「ゲノム編集Ｔ細胞」は、少なくとも１種の抗原を認識するＣＡＲなどの遺伝子を付加された、及び／または、ＣＡＲが認識する抗原（複数可）の遺伝子（複数可）などの遺伝子を欠失された、及び／または、ＴＣＲもしくはそのサブユニットの遺伝子が破壊された、Ｔ細胞である。
「健康なドナー」は、本明細書で使用する場合、悪性腫瘍（とりわけ、血液悪性腫瘍、例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍）を有していない健康なドナーである。
本明細書で使用する場合、「免疫エフェクター細胞」は、免疫応答を調節することができる白血球である。免疫エフェクター細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ｉＮＫＴ細胞（インバリアントＴ細胞受容体αナチュラルキラーＴ細胞）、及びマクロファージ、が挙げられる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）保有免疫エフェクター細胞は、当然、Ｔ細胞を含むが、Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子改変された細胞もまた含む。
「悪性Ｂ細胞」は、Ｂ細胞悪性腫瘍に由来するＢ細胞である。Ｂ細胞悪性腫瘍としては、（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、及びＢ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、が挙げられるがこれらに限定されない。
「悪性形質細胞」は、形質細胞性悪性腫瘍に由来する形質細胞である。用語「形質細胞性悪性腫瘍」とは、異常な形質細胞が過剰産生された悪性腫瘍のことを意味する。形質細胞性悪性腫瘍の非限定例としては、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞腫、及び多発性骨髄腫、が挙げられる。
「悪性Ｔ細胞」は、Ｔ細胞悪性腫瘍に由来するＴ細胞である。用語「Ｔ細胞悪性腫瘍」とは、Ｔ細胞前駆細胞、成熟Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞に由来する、広く、極めて不均一なグループの悪性腫瘍のことを意味する。Ｔ細胞悪性腫瘍の非限定例としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ−１＋）成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病（ＨＴＬＶ−１関連）、アグレッシブＮＫ細胞性白血病、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、ＡＬＫ陽性未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、ＡＬＫ陰性血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、乳房インプラント関連未分化大細胞リンパ腫、ＮＫ細胞の慢性リンパ増殖性疾患、節外性鼻型ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、腸疾患型Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ＧＩ管の無痛性Ｔ細胞リンパ増殖性疾患、単形性上皮向性腸管Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ＴＦＨ表現型を伴う節性末梢Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、ＮＯＳ、原発性皮膚α／βＴ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋アグレッシブ表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚先端型ＣＤ８＋Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ４＋小型／中型Ｔ細胞リンパ増殖性疾患［原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫（Ｃ−ＡＬＣＬ）、リンパ球様丘疹症］、セザリー症候群、皮下脂肪組織炎様Ｔ細胞リンパ腫、小児期の全身性ＥＢＶ＋Ｔ細胞リンパ腫、及びＴ細胞大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）、が挙げられる。
用語「患者」は一般的に、用語「対象」と同義であり、ヒトを含む全ての哺乳動物を含む。
本明細書で使用する場合、「分泌可能なタンパク質」は、別の細胞に影響を及ぼす、細胞が分泌するタンパク質である。例えば、分泌可能なタンパク質としては、サイトカイン、ケモカイン、及び転写因子、が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「自殺遺伝子」とは、活性化した場合にＣＡＲ−Ｔ細胞の死をもたらす、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いてＣＡＲ−Ｔ細胞に導入された核酸配列のことを意味する。必要に応じ、自殺遺伝子は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の追跡及び除去、すなわち、殺傷を促進し得る。自殺遺伝子を活性化することによりＣＡＲ−Ｔ細胞の殺傷を促進することは、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いて実施することができる。当該技術分野において周知の自殺遺伝子システムとしては、いくつかの単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）自殺遺伝子療法システム、及び誘導性カスパーゼ９タンパク質、が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、自殺遺伝子はキメラＣＤ３４／チミジンキナーゼである。
用語「治療的に許容される」とは、過度の毒性、炎症、及びアレルギー反応を伴わず、妥当な利益／リスク比に見合い、及び／または、その使用目的において有効である、患者の組織との接触に用いるのに適切な物質のことを意味する。
用語「治療的に有効」は、疾患もしくは障害の治療に使用する、または、臨床エンドポイントの効果に使用する、活性成分の量を適格とすることを意図している。
以下の実施例により本発明を更に説明する。
実施例１−ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するための方法
以下の工程を採用して、本明細書で開示する遺伝子編集ＣＡＲ−Ｔ細胞を得てもよい。当業者は理解するように、おそらく異なる効率をもたらすであろうが、ある特定の工程を、以下に記載する順で連続的に実施してもよく、または、順不同に実施してもよい。
工程１：単離。１名または複数名の健康なドナーから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採取する。
工程２：精製。次に、例えば、標識抗体をコーティングした磁性ビーズ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用した磁気選択を用いて、ドナーのＰＢＭＣ（臍帯血は代替供給源である）からＴ細胞を単離／精製する。その他の精製技術は当該技術分野において周知であり、それらを使用してもよい。
工程３：ゲノム編集。同種異系養子細胞移入療法に細胞を使用することが見込まれる場合、細胞表面からＴＣＲを欠失させてもよく、または、ＴＣＲもしくはそのサブユニット（例えば、ＴＲＡＣ）の標的遺伝子配列を編集することにより、ＴＣＲを不活性化させてもよい。１種または複数種の抗原を標的とするＣＡＲをＴ細胞に形質導入する場合、ＣＡＲの標的である抗原を細胞表面から欠失させてもよく、または、その抗原の発現を抑制してそれに続く同胞殺しを防止してもよい。いずれかのケースまたは両方のケースにおいて、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはタンパク質、及び標的（複数可）の遺伝子配列の一部に対するｇＲＮＡをエレクトロポレーションすることにより、欠失／抑制／不活性化を実施してもよい。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／タンパク質、及び標的配列に対するｇＲＮＡを、共にエレクトロポレーションしてもよく、または、順番に、すなわち、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／タンパク質をエレクトロポレーションしてから、標的（複数可）に対するｇＲＮＡをエレクトロポレーションしてもよい。加えて、異なる標的配列に対するｇＲＮＡを、多重ゲノム編集（すなわち、複数遺伝子の同時編集）用の単一のベクターに組み込んでもよい。活性化の前のゲノム編集は、活性化細胞の編集効率と少なくとも同等の効率でＴ細胞を活性化及びゲノム編集するための、潜在的に実行可能な方法である。
活性化後の早い段階、刺激が存在している間に、ＣＡＲを搭載したウイルスベクターを加えることが可能であることから、形質導入効率を向上させることもまた可能である。形質導入効率のこの向上は、ゲノム編集とタンパク質（すなわち、ＣＡＲ−Ｔの表面上のＴＣＲ）の低下の間に遅延があり、ＣＡＲがなおも活性化され得ることから、成功する。しかしながら、その他の技術を使用して標的の発現を抑制してもよい。これらの技術としては、その他のゲノム編集技術、例えば、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、ＲＮＡ干渉、及び、抗原の内部結合を生じさせて細胞表面発現を防止することなどが挙げられる。使用可能なｇＲＮＡの例としては、表９に示すｇＲＮＡ、及び、当該技術分野において周知のその他のｇＲＮＡが挙げられる。
ガイドＲＮＡ配列の例については以下に記載するが、それらは当業者に周知である。
Figure 2021525518
工程４：活性化。その後、Ｔ細胞を活性化させる。抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用して、ヒト初代Ｔ細胞を活性化させた。代替的に、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体、及び抗ＣＤ２８抗体を使用してもよい。活性化のために可溶性抗体を使用してもよいが、抗体をコーティングしたビーズ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓなどの磁性ビーズがより頻繁に使用される。ＴＣＲの欠失に関して、ＴＣＲはタンパク質で構成され、それらタンパク質は、ゲノム編集の前に、ＴＣＲの活性化が可能となる十分な量で、これらタンパク質の低下が生じるまで発現する。磁場を印加することにより活性化因子を取り除いてもよく、または、抗体マトリックスを使用する場合、リン酸緩衝生理食塩水もしくはその他の培地で希釈して、遠心分離にかけてから、上清を除去し、新鮮な培地に再懸濁することなど（洗浄）により、活性化因子を取り除いてもよい。
工程５：ＣＡＲ形質導入。次に、１種または複数種の抗原標的またはタンパク質標的を標的とする（すなわち、認識する）ＣＡＲ、例えば、ＣＡＲ構築物を含有するレンチウイルスを、Ｔ細胞に形質導入してもよい。例えば、形質導入の任意のその他の好適な方法を用いてもよい。様々な好適な機器、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃまたはＬｏｎｚａ製のエレクトロポレーション装置を使用して、ＣＡＲを細胞にエレクトロポレーションしてもよい。
工程６：増殖。ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を取り除いてから、ＣＡＲ−Ｔ集団を増殖させる。この増殖を、１週間、２週間、または数週間にわたり継続してもよい。
追加の工程。例えば、ＴＣＲまたはそのサブユニットに結合する抗体をコーティングしたビーズ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ αβキット）を使用することにより、ＴＣＲ＋細胞を枯渇させてＴＣＲ−細胞集団を作製してもよい。
これらの工程を図１のフローチャートで示す。当業者は、図１に明記した条件及び期間にある程度の自由度が可能であることを理解するであろう。図２では、フローサイトメトリーを用いてＣＡＲ−Ｔ細胞を解析して、ＣＡＲの発現及びＴＣＲ＋細胞の欠失を確認する。特定の実施形態では、最終作製物は、遺伝子編集標的（複数可）の発現を欠損している。特定の実施形態では、最終作製物は、ＣＡＲを保有し機能性ＴＣＲを欠損しており、更なる実施形態では、代替的にまたは加えて、最終作製物は、ＣＡＲの標的（複数可）である細胞表面タンパク質（複数可）／抗原（複数可）を欠損している。このように、上記の方法で作製された細胞は、それゆえ、同胞殺し抵抗性であり、移植片対宿主病を引き起こさない。
変化形態：ＰＥＢＬ。上記方法の変化形態では、編集工程もしくは編集工程の一部、または、ＣＡＲ形質導入の一部のいずれかとして、１種または複数種のタンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）をコードする構築物を、細胞に形質導入してもよい。例えば、ＣＤ３εに特異的な抗体由来単鎖可変フラグメントをコードする構築物を、例えば、レンチウイルスベクターにより、形質導入してもよい。一旦発現すると、ＰＥＢＬはＣＤ３εと細胞内で共局在化し、表面ＣＤ３及びＴＣＲαβの発現を阻害する。それゆえ、ＰＥＢＬによる表面ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現の阻害は、同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞を調製するための代替法である。更に、ＰＥＢＬ及びＣＡＲの発現を、単一の構築物内で組み合わせてもよい。本明細書で開示する方法を用いてこれらの方法のいずれかを実施してもよく、本明細書で開示する遺伝子抑制標的のいずれかを阻害するためのＰＥＢＬを作製してもよい。
変化形態：ＰＥＢＬ。上記方法の変化形態では、編集工程もしくは編集工程の一部、または、ＣＡＲ形質導入の一部のいずれかとして、１種または複数種のｓｈＲＮＡをコードする構築物を、細胞に形質導入してもよい。このようなｓｈＲＮＡはまた、本明細書で開示する遺伝子抑制標的のいずれかの阻害に有用である。
変化形態：サイトカイン及びその他のタンパク質。上記方法の変化形態では、編集工程もしくは編集工程の一部、または、ＣＡＲ形質導入の一部のいずれかとして、１種または複数種のサイトカインまたはサイトカイン受容体をコードする構築物を、細胞に形質導入してもよい。例えば、このようなサイトカインまたは受容体、例えば、ＩＬ−７Ｒもしくはその変異体、またはＩＬ−１５もしくはその変異体、をコードする構築物を、例えば、レンチウイルスベクターにより、形質導入してもよい。
上記の方法は、様々な好適な条件に適用可能である。異なる増殖培地を採用してもよく、様々な温度、例えば、ほぼ室温（２５℃）〜約４０℃、多くの場合、約３０℃〜約３７℃で、細胞を培養してもよい。
実施例２−活性化前の編集により作製したゲノム編集ＵＣＡＲＴ細胞
０日目に、解凍用の緩衝液中で細胞を解凍した。その後、細胞を培地に再懸濁し、編集後、２時間静置した。細胞を回収してカウントした。必要な数の細胞を、室温、１００×ｇで１０分間、遠心分離にかけた。上清を完全に除去し、細胞をＰＢＳ（１ｍｌ）中に再懸濁してから微量遠心チューブに移し、室温、１００×ｇで１０分間、遠心分離にかけた。上清を完全に除去してから、予め温めた緩衝液Ｐ３中に細胞を再懸濁し、カウントを行って、１ｍＬあたり５×１０７にカウントを調節した。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡを入れたチューブに１００μＬの細胞プール容量を加え、軽く混合してから、全てをＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）に移し、それを軽く叩いて気泡を除去した。その後、プログラム（ヒトＴ細胞刺激ＥＯ−１１５）を使用してエレクトロポレーションを開始した。この手順の後、予め温めた培地に活性化した細胞を移してから、２ｍＬのアリコートで１２ウェルプレートに分配した。アリコートした試料を２４時間静置した。
１日目に、表１０に示すとおり、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）を用いて細胞を活性化させる。
Figure 2021525518
２日目に、それぞれのｍｌの培地用に１μｌのポリブレンを加えた（８ｍｇ／ｍｌストック）。必要量のウイルスを加えて、必要とされるＭ．Ｏ．Ｉ（感染多重度）を得た。細胞及びウイルスを混合し、３７℃のインキュベータに戻した。
３日目に、活性化細胞を洗浄して刺激を除去した。
１２日目に、ＦＡＣＳ解析は、高純度のＣＤ３−ＣＤ２−／ＣＡＲ−Ｔ細胞を示した。（５１Ｃｒ）標識ゲノム編集ジャーカット細胞（ΔＣＤ２、ΔＣＤ３、及びΔＣＤ２ΔＣＤ３）を用いて、標準的な４時間のクロム放出（５１Ｃｒ）アッセイを実施した。これらの実験は、互いとは無関係に、ＣＤ２標的及びＣＤ３標的に対する機能的な腫瘍殺傷効果を示した。
上記の方法を使用して、様々なユニバーサル（ＴＣＲ欠失）ＣＡＲ−Ｔ細胞、例えば、ＣＤ７（ＵＣＡＲＴ７）、ｔＵＣＡＲＴ２／３、及びＣＤ３（ＵＣＡＲＴ３）を標的とするＵＣＡＲＴ細胞を作製した。
実施例３：Ｔ細胞におけるゲノム編集、活性化、及び増殖の動態
図３に示すとおり、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７を含有するＴｅｘＭａｃｓ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中、３７℃で、製造業者の取扱説明書に従いＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、ナイーブＴ細胞を活性化させた。図４〜図７に示すとおり、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４Ｄ（ＬｏｎｚａプログラムＥＯ−１１５）を使用して、ナイーブＴ細胞に、１００ｕｌのＬｏｎｚａ緩衝液Ｐ３中の２０ｕｇのＴＲＡＣ ｇＲＮＡ及び１５ｕｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７を含有するＴｅｘＭａｃｓ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中、３７℃で、細胞を、０時間（図４）、４時間（図５）、８時間（図６）、または２０時間（図７）静置してから、製造業者の取扱説明書に従いＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて活性化させた。
Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４Ｄ（ＬｏｎｚａプログラムＥＯ−１１５）を使用して、Ｔ細胞に、１００ｕｌのＬｏｎｚａ緩衝液Ｐ３中の２０ｕｇのＴＲＡＣ ｇＲＮＡ及びＣａｓ９（１５ｕｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡまたは１０ｕｇのＣａｓ９タンパク質）をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７を含有するＴｅｘＭａｃｓ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中、３７℃で、細胞を２０時間静置してから、製造業者の取扱説明書に従いＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて活性化させた。４８時間の培養後、細胞を洗浄することにより刺激を除去した。図８の上部のパネルに示すとおり、編集後の複数の時点でＴ細胞からＤＮＡを抽出し、ＴＲＡＣ遺伝子座の標的化ディープシークエンシングを使用して、遺伝子編集効率を評価した。図８の下段のパネルに示すとおり、ＦＡＣＳを用いて、編集後の複数の時点のＴＣＲ発現を解析した。ＴＣＲ発現用の代用市販品であるＣＤ３ε表面タンパク質発現を用いた。ＴＣＲ表面発現は遺伝子の欠失に対して遅れる。この遅れにより、ＴＣＲシグナル伝達によるＴ細胞の活性化を可能とする、活性化のウィンドウがもたらされる。
図９は、理論上のＴ細胞活性化ウィンドウを示している。上の実験が示すとおり、ＴＣＲ表面発現は遺伝子の欠失に対して遅れ、ＴＲＡＣ遺伝子機能の喪失後のＴＣＲ表面タンパク質発現により細胞が活性化可能となるウィンドウをもたらす。遺伝子編集が生じた後のＴＣＲによるＴ細胞の活性化により、活発に分裂している細胞における二本鎖切断の生成により誘導されるｐ５３介在性細胞周期停止が抑制されて、増殖が亢進する。ＴＣＲ表面タンパク質の低下直前にＴ細胞刺激を除去することにより、遺伝子編集細胞の増殖及び刺激が最大化され、遺伝子編集を免れたＴＣＲ＋Ｔ細胞の優先的な増殖が最小化される。
図１０は、Ｔ細胞増殖の動態を示している。ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４Ｄ（ＬｏｎｚａプログラムＥＯ−１１５）を使用して、Ｔ細胞に、１００ｕｌのＬｏｎｚａ緩衝液Ｐ３中の２０μｇのＴＲＡＣ ｇＲＮＡ及びＣａｓ９（１５μｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡまたは１０μｇのＣａｓ９タンパク質）をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７を含有するＴｅｘＭａｃｓ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中、３７℃で、細胞を２０時間静置してから、製造業者の取扱説明書に従いＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて活性化させた。４８時間の培養後、細胞を洗浄することにより刺激を除去した。上部のパネルは絶対細胞カウント数を示し、下部のパネルは増殖倍率を示している。群にまたがって強力な増殖が認められた。
上記及び本明細書で開示する方法は変化し得、例えば、連続的なゲノム編集工程を採用してもよい。例えば、活性化前に複数ラウンドのゲノム編集（エレクトロポレーション）を実施してもよく、または代替的に、最初の編集及び活性化の後に、それに続く１ラウンドもしくは複数ラウンドの編集を実施してもよい。
実施例４：遺伝子座にＣＡＲを挿入することによる遺伝子編集
ＣＡＲまたは任意の目的のタンパク質を、遺伝子座、例えば、Ｔ細胞受容体用の遺伝子に挿入してもよい。ＭａｃＬｅｏｄ ｅｔ ａｌ．（“Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＣＤ１９ ＣＡＲ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＴＣＲ Ａｌｐｈａ Ｃｈａｉｎ Ｌｏｃｕｓ Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｇｅｎｅ−Ｅｄｉｔｅｄ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５（４）：Ｐ９４９−９６１，２０１７）は、遺伝子改変ホーミングエンドヌクレアーゼ及びＡＡＶドナー鋳型を使用して、天然ＴＣＲの遺伝子座を標的としてＣＡＲ導入遺伝子を直接挿入することによる、同種異系ＣＡＲＴ細胞の生成について報告している。この方法で作製された抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞は、内在性の細胞表面ＴＣＲを発現せず、ｉｎ ｖｉｔｒｏで強力なエフェクター機能を示し、ｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおけるＣＤ１９＋腫瘍の排除を媒介する。得られた遺伝子編集ＣＡＲＴ細胞は、前臨床モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍活性を示し、ＣＤ１９＋血液悪性腫瘍を有する非血縁患者における養子細胞療法としての安全かつ有効な使用の可能性をこれらの細胞が有していることを示唆している。
上記の方法を適応させて、抗原、細胞表面タンパク質、または分泌可能なタンパク質、例えば、サイトカインなど、をコードする遺伝子用の遺伝子座に、ＣＡＲを挿入してもよい。この方法では、ゲノムの編集は、ＣＡＲのトランスフェクションによりもたらされる。その後、本明細書に記載するとおりに細胞を活性化させて、特定の実施形態における独立したゲノム編集工程を取り除いてもよい。理論上、このような工程は、細胞が活発に分裂している間に実施する必要がある。このような方法はまた、遺伝子改変細胞の強力な増殖をもたらすと予想されている。
実施例５：ガイドＲＮＡの選択
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＆ ｉＰＳＣにおいて、ガイドＲＮＡを設計して活性を確認した。任意のｇＲＮＡに対して相補的な配列は、標的遺伝子座を含むがこれらに限定されないゲノム中にわたり存在し得る。短い配列はオフターゲットにハイブリダイズする可能性がより高い。同様に、ｇＲＮＡ内のある程度長い配列は、ゲノム中にわたり、完全マッチ（長＿０）またはニアマッチ（それぞれ、単一のヌクレオチド差または２つのヌクレオチド差を表す、長＿１、長＿２）を有し得る。これらもまたオフターゲットにハイブリダイズする、要するに、関係ない遺伝子の編集をもたらして編集効率を低下させる場合がある。
ｈＣＤ２。ｈＣＤ２の２つのエキソン（ＣＦ５８及びＣＦ５９）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。エキソンＣＦ５８の結果を表１１に列挙し、エキソンＣＦ５９の結果を表１２に列挙する。
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表１１及び表１２のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、ＣＦ５８．ＣＤ２．ｇ１（４１．２％）、ＣＦ５８．ＣＤ２．ｇ２３（１３．２％）、ＣＦ５９．ＣＤ２．ｇ２０（２６．６％）、ＣＦ５９．ＣＤ２．ｇ１３（６６．２％）、ＣＦ５９．ＣＤ２．ｇ１７（１７．５％）、を推奨した。１５％以上の正規化ＮＨＥＪ頻度を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、細胞株及び動物モデルの作製プロジェクト用の良好な候補である。
ｈＣＤ３Ｅ。ｈＣＤ３Ｅについて、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。ｈＣＤ３Ｅの結果を表１３に列挙する。
Figure 2021525518
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表１３のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、ＭＳ１０４４．ＣＤ３Ｅ．ｓｐ２８（＞１５％）、及びＭＳ１０４４．ＣＤ３Ｅ．ｓｐ１２（＞１５％）、を推奨した。１５％以上の正規化ＮＨＥＪ頻度を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、細胞株及び動物モデルの作製プロジェクト用の良好な候補である。
ｈＣＤ５。ｈＣＤ５の３つのエキソン（エキソン３、エキソン４、及びエキソン５）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。エキソン３の結果を表１４に列挙し、エキソン４の結果を表１５に列挙し、エキソン５の結果を表１６に列挙する。
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表１４、表１５、及び表１６のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、エキソン３：ＳＰ５９７．ｈＣＤ５．ｇ２（７６．５％）、ＳＰ５９７．ｈＣＤ５．ｇ２２（３６．３％）、ＳＰ５９７．ｈＣＤ５．ｇ３９（１６．０％）、ＳＰ５９７．ｈＣＤ５．ｇ４６、エキソン４：ＳＰ５９８．ｈＣＤ５．ｇ７、ＳＰ５９８．ｈＣＤ５．ｇ１０（５８．５％）、エキソン５：ＳＰ５９９．ｈＣＤ５．ｇ５（５１．０％）、ＳＰ５９９．ｈＣＤ５．ｇ３０、ＳＰ５９９．ｈＣＤ５．ｇ４２、ＳＰ５９９．ｈＣＤ５．ｇ５８（４１．０％）、を推奨した。
ｈＣＳＦ２。ｈＣＳＦ２について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。ｈＣＳＦ２の結果を表１７に列挙する。
Figure 2021525518
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表１７のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、ＭＳ１０８６．ＣＳＦ２．ｓｐ８（＞１５％）、及びＭＳ１０８６．ＣＳＦ２．ｓｐ１０（＞１５％）、を推奨した。
ｈＣＴＬＡ４。ｈＣＴＬＡ４の２つのエキソン（エキソン１及びエキソン２）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。ｈＣＴＬＡ４のエキソン１の結果を表１８に列挙し、ｈＣＴＬＡ４のエキソン２の結果を表１９に列挙する。
Figure 2021525518
Figure 2021525518
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表１８及び表１９のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、エキソン１：ＳＰ６２１．ｈＣＴＬＡ４．ｇ２（＞１５％）、及びＳＰ６２１．ｈＣＴＬＡ４．ｇ１２（＞１５％）、エキソン２：ＳＰ６２２．ｈＣＴＬＡ４．ｇ２（＞１５％）、ＳＰ６２２．ｈＣＴＬＡ４．ｇ９（＞１５％）、及びＳＰ６２２．ｈＣＴＬＡ４．ｇ３３（＞１５％）、を推奨した。
ｈＰＤＣＤ１。ｈＰＤＣＤ１の２つのエキソン（ＣＦ６０及びＣＦ６１）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。エキソンＣＦ６０の結果を表２０に列挙し、エキソンＣＦ６１の結果を表２１に列挙する。
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表２０及び表２１のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、ＣＦ６０．ＰＤＣＤ１．ｇ１２（６５．６％）、ＣＦ６０．ＰＤＣＤ１．ｇ３（６９．２％）、ＣＦ６１．ＰＤＣＤ１．ｇ６、ＣＦ６１．ＰＤＣＤ１．ｇ２（７２．７％）、及びＣＦ６１．ＰＤＣＤ１．ｇ３５（２４．０％）、を推奨した。
ｈＴＩＭ３。ｈＴＩＭ３の２つのエキソン（エキソン２及びエキソン３）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。エキソン２の結果を表２２に列挙し、エキソン３の結果を表２３に列挙する。
Figure 2021525518
Figure 2021525518
Figure 2021525518
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表２２及び表２３のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、エキソン２：ＳＰ６１９．ｈＴＩＭ３．ｇ１２（４５．０％）、ＳＰ６１９．ｈＴＩＭ３．ｇ２０（６０．９％）、及びＳＰ６１９．ｈＴＩＭ３．ｇ４９（４５．４％）、エキソン３：ＳＰ６２０．ｈＴＩＭ３．ｇ５（５８．０％）、及びＳＰ６２０．ｈＴＩＭ３．ｇ７（２．９％）、を推奨した。
本出願に列挙する全ての参照文献、米国または外国の特許または出願は、その全体が本明細書に記載されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。任意の矛盾が生じた場合には、本明細書で実際に開示する物質が優先される。
上記の記載内容から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に見極めることができ、また、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく本発明の様々な変更及び修正を行い、様々な用法及び条件に適合させることができる。

Claims (84)

  1. ゲノム編集免疫エフェクター細胞の集団を作製するための方法であって、
    ａ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）保有免疫エフェクター細胞の集団のゲノムを編集すること、
    ｂ．前記免疫エフェクター細胞集団を活性化させること、及び、
    ｃ．ゲノム編集免疫エフェクター細胞の前記集団を増殖させること、
    の工程を含む、前記方法。
  2. 前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）保有免疫エフェクター細胞は、１種または複数種のタンパク質を認識する少なくとも１種のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形質導入されている、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ゲノム編集工程（ａ）は、前記免疫エフェクター細胞集団に、前記１種または複数種のＣＡＲを形質導入することを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 工程（ｂ）と工程（ｃ）の間に実施される、前記免疫エフェクター細胞集団に、前記１種または複数種のＣＡＲを形質導入する追加の工程を含む、請求項２に記載の方法。
  5. ａ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）保有免疫エフェクター細胞の集団のゲノムを編集すること、
    ｂ．前記免疫エフェクター細胞集団を活性化させること、
    ｃ．前記免疫エフェクター細胞集団に、１種または複数種のタンパク質を認識する少なくとも１種のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形質導入すること、及び、
    ｄ．ゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の前記集団を増殖させること、
    の工程を含む、ゲノム編集キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞の集団を作製するための方法である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記免疫エフェクター細胞は精製されている、請求項５に記載の方法。
  7. 前記免疫エフェクター細胞はＴ細胞である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が認識する前記１種または複数種のタンパク質は、抗原及び細胞表面タンパク質から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. ゲノムは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、編集される、請求項８に記載の方法。
  10. ゲノムは、Ｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲを使用して編集される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ゲノムは、Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲを使用して編集される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡまたはタンパク質として前記細胞内に送達される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとして前記細胞内に送達される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記Ｃａｓ９は、タンパク質として前記細胞内に送達される、請求項１２に記載の方法。
  15. 編集される前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、前記Ｃａｓ９と同時に送達される、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記送達はエレクトロポレーションによる、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ゲノム編集は、１種または複数種の抗原、細胞表面タンパク質、または分泌可能なタンパク質の発現を欠失または抑制することを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 欠失／抑制される細胞表面タンパク質は、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣＩ）またはそのサブユニットである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記サブユニットはβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）である、請求項１８に記載の方法。
  20. 欠失／抑制される細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそのサブユニットである、請求項１７に記載の方法。
  21. 欠失／抑制される細胞表面タンパク質は、ＴＲＡＣ（ＴＣＲ−α）、ＴＣＲ−β、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γ、から選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 欠失／抑制される細胞表面タンパク質はＴＲＡＣである、請求項２１に記載の方法。
  23. 欠失／抑制される細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞の消耗を防止するタンパク質である、請求項１７に記載の方法。
  24. Ｔ細胞の消耗を防止する細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞上の免疫チェックポイントである、請求項２３に記載の方法。
  25. Ｔ細胞の消耗を防止する前記表面タンパク質は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、及びＣＴＬＡ−４、から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ゲノム編集は、１種または複数種の分泌可能なタンパク質の発現を欠失または抑制することを含む、請求項１６に記載の方法。
  27. 前記分泌可能なタンパク質はサイトカインである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記サイトカインは、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＭＣＰ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｉｌ−４、及びＩＦＮγ、から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記サイトカインはＧＭ−ＣＳＦである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記分泌可能なタンパク質は転写因子である、請求項２６に記載の方法。
  31. 前記転写因子は、ＡＨＲ、ＢＣＬ６、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＭＡＦ、ＲＯＲＣ、ＳＰＩ１、ＴＢＸ２１、から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 欠失／抑制される細胞表面タンパク質または抗原は、ＣＡＲ（複数可）の標的である、請求項１７に記載の方法。
  33. 前記細胞は、編集後最長４８時間静置されてから活性化される、請求項１に記載の方法。
  34. 前記細胞は、編集後最長２４時間静置されてから活性化される、請求項１に記載の方法。
  35. 前記細胞は、編集後最長８時間静置されてから活性化される、請求項１に記載の方法。
  36. 前記細胞は、編集後最長４時間静置されてから活性化される、請求項１に記載の方法。
  37. 前記細胞は、編集後２４〜４８時間静置されてから活性化される、請求項１に記載の方法。
  38. 前記細胞は、ゲノム編集の直後に活性化される、請求項１に記載の方法。
  39. 前記免疫エフェクター細胞の前記活性化は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、または上記のいずれかの機能性フラグメントに、前記細胞集団を曝露することによって行われる、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記免疫エフェクター細胞の前記活性化は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び抗ＣＤ２抗体、または上記のいずれかの機能性フラグメントに、前記細胞集団を曝露することによって行われる、請求項１に記載の方法。
  41. 前記抗体はビーズに固定されている、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記ゲノム編集細胞は、最長５日間にわたり活性化される、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記ゲノム編集細胞は、最長２日間にわたり活性化される、請求項３９に記載の方法。
  44. 前記ゲノム編集細胞は、最長１日間にわたり活性化される、請求項３９に記載の方法。
  45. 前記抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び／または抗ＣＤ２抗体は、磁場の印加または洗浄により、前記細胞集団から取り除かれる、請求項４２のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記ＣＡＲは、活性化後４８時間未満において、前記細胞に形質導入される、請求項４３に記載の方法。
  47. 前記ＣＡＲは、活性化後２４時間未満において、前記細胞に形質導入される、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記ＣＡＲは、前記ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いて、前記細胞に形質導入される、請求項４６に記載の方法。
  49. 細胞の前記集団を、２０日間未満にわたり増殖させる、請求項４８に記載の方法。
  50. 細胞の前記集団を、１２日間未満にわたり増殖させる、請求項４８に記載の方法。
  51. 細胞の前記集団を、１０日間未満にわたり増殖させる、請求項４８に記載の方法。
  52. 細胞の前記集団を、８日間未満にわたり増殖させる、請求項４８に記載の方法。
  53. 細胞の前記集団を、６日間未満にわたり増殖させる、請求項４８に記載の方法。
  54. 約２５℃〜約４０℃の温度で実施される、請求項４９に記載の方法。
  55. 約３０℃〜約３７℃の温度で実施される、請求項５４に記載の方法。
  56. フローサイトメトリーを用いて前記細胞を解析して、前記ＣＡＲ（または、複数を形質導入する場合、複数のＣＡＲ）の発現を確認する追加の工程を含む、請求項５５に記載の方法。
  57. ＴＣＲ＋細胞を枯渇させる追加の工程を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 使用する前記免疫エフェクター細胞は、健康なドナーから採取される、請求項２０に記載の方法。
  59. 前記ドナーはヒトである、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項５９に記載の方法。
  61. 悪性細胞上に発現した前記１種または複数種の抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性Ｔ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項６０に記載の方法。
  63. 悪性Ｔ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＣＲＡ、及びＴＣＲβ、から選択される、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項６０に記載の方法。
  65. 悪性形質細胞上に発現した前記抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８、及びＣＤ１９、から選択される、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性Ｂ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項６０に記載の方法。
  67. 悪性Ｂ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、及びＣＤ４５、から選択される、請求項６６に記載の方法。
  68. 悪性Ｂ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ１９及びＣＤ２０から選択される、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記キメラ抗原受容体は、悪性中皮細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項６０に記載の方法。
  70. 悪性中皮細胞上に発現した前記抗原はメソテリンである、請求項６９に記載の方法。
  71. ＣＡＲがＣＤ７を標的とし、ＴＲＡＣ及びＣＤ７が欠失している、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞（ＵＣＡＲＴ７細胞）の集団を作製するための方法であって、
    ａ．Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲ、及び抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）をコードする遺伝子を標的とするｇＲＮＡを使用して、健康なヒトドナーに由来するＴ細胞の集団内のＣＤ７遺伝子及びＴＲＡＣ遺伝子を編集して、ＣＤ７及びＴＲＡＣを欠失／抑制すること、
    ｂ．前記Ｔ細胞集団を活性化させること、
    ｃ．前記Ｔ細胞集団に、ＣＤ７を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、ならびに、
    ｄ．ＵＣＡＲＴ７細胞の前記集団を増殖させること、
    の工程を含む、前記方法。
  72. ＣＡＲが、ＣＤ２及びＣＤ３εを標的とするタンデムＣＡＲであり、ＣＤ３ε及びＣＤ２が欠失している、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞（ｔＵＣＡＲＴ２／３細胞）の集団を作製するための方法であって、
    ａ．Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲ、及び抗原（複数可）または細胞表面タンパク質（複数可）をコードする遺伝子を標的とするｇＲＮＡを使用して、健康なヒトドナーに由来するＴ細胞の集団内のＣＤ２遺伝子及びＣＤ３ε遺伝子を編集して、ＣＤ２及びＣＤ３εを欠失／抑制すること、
    ｂ．前記Ｔ細胞集団を活性化させること、
    ｃ．前記Ｔ細胞集団に、ＣＤ２及びＣＤ３εを認識するタンデムキメラ抗原受容体を形質導入すること、ならびに、
    ｄ．ｔＵＣＡＲＴ２／３細胞の前記集団を増殖させること、
    の工程を含む、前記方法。
  73. 請求項１に記載の方法を用いて作製された、ゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の集団。
  74. 請求項７３に記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の集団、ならびに、少なくとも１種の治療的に許容される担体及び／またはアジュバント、を含む、治療用組成物。
  75. 請求項１に記載のキメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む、患者における固形器官腫瘍を治療するための方法。
  76. 請求項１に記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む、患者における血液悪性腫瘍を治療するための方法。
  77. 前記血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）である、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記Ｔ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である、請求項７６に記載の方法。
  80. 前記血液悪性腫瘍はＢ細胞悪性腫瘍である、請求項７６に記載の方法。
  81. 前記Ｂ細胞悪性腫瘍はＢ細胞リンパ腫である、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記Ｂ細胞悪性腫瘍はＢ細胞性白血病である、請求項８０に記載の方法。
  83. 前記血液悪性腫瘍は骨髄性悪性腫瘍である、請求項７６に記載の方法。
  84. 前記骨髄性悪性腫瘍は急性骨髄性白血病である、請求項８３に記載の方法。
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