JP2018510657A - 改変ｔ細胞ならびにそれを作製および使用する方法 - Google Patents

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Abstract

ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子が、同種健常ドナーから容易に入手可能な普遍的なＣＡＲ Ｔ細胞を作製するように編集されているゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞およびその集団であって、免疫拒絶または移植片対宿主病のリスクを低減または排除しながら任意の患者に投与可能であり、Ｔ細胞阻害の傾向がない改変初代ヒトＴ細胞およびその集団、ならびに細胞をこのような細胞を必要とする被験体に投与した場合に細胞が宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減するために、このような細胞を同種投与する方法が本明細書に開示される。

Description

関連出願
本願は、２０１５年３月２７日に出願された米国仮出願第６２／１３９，４７９号の利益を主張し、その教示全体が本明細書中に参照によって組み込まれる。
政府援助
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ０１ＤＫ０９７７６８のもとの政府援助によって行われた。政府は、本発明における権利を有する。
発明の背景
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いるＴ細胞療法は、癌免疫療法（例えば、養子免疫療法）における大きなブレイクスルーであり、とりわけ、ウイルス感染症および真菌感染症の新たな処置形式である。現在、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の自己反応性のリスク、癌性細胞または感染細胞によるＴ細胞阻害、ならびに自己Ｔ細胞移植への依存などのいくつかの障害が、ＣＡＲ Ｔ療法の安全な転用を妨げている。
内因性ＴＣＲの自己反応性、Ｔ細胞阻害を克服し、同種Ｔ細胞をＣＡＲ Ｔ療法に使用することを可能にする改変Ｔ細胞ならびにこのようなＴ細胞を作製および使用する方法が必要とされる。本発明は、他の望ましい特徴を有することに加えて、このような必要性に対処するさらなる解決策を対象とする。上記障害を除去するために、本発明は、ＣＲＩＳＰＲおよび／またはＴＡＬＥＮ系などのゲノム編集を利用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１であり得る。例えば、自己反応性を克服するために、本明細書で詳述される研究は、ＴＣＲａ鎖およびＴＣＲｂ鎖をターゲティングするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計および試験し、ジャーカットＴ細胞および初代ヒトＴ細胞におけるＴＣＲ表面発現の高いオンターゲット活性および喪失を実証した。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系を使用したゲノム編集の多重化能力により、他の分子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１）と組み合わせてＴＣＲａおよび／またはＴＣＲｂをターゲティングして、Ｔ細胞阻害を克服し、ＣＡＲ Ｔ療法を可能にすることもできる。本発明の組成物および方法は、臨床転用に適切であり、既存および新興のＴ細胞療法（例えば、養子免疫療法）を改善する。
いくつかの実施形態では、本発明は、改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞であって、２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子が、例えば、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように切断編集されている第１のゲノム改変；２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子が、例えば、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように切断または編集されている第２のゲノム改変；（ｉ）１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子が、例えば、ゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチを欠失させるように切断または編集されている第３のゲノム改変；および／または（ｉｉ）７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子が、例えば、ゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように切断または編集されている第４のゲノム改変；ならびに例えば、ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＢ２Ｍ発現もしくは活性ならびに／またはＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／もしくは活性を低減または排除するように切断または編集されている第５を含み、各細胞が、場合により、（ｉ）損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原もしくはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体、もしくは該少なくとも１つのキメラ抗原受容体をコードする外因性核酸、ならびに／または（ｉｉ）隣接細胞、組織もしくは器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つの外因性タンパク質、もしくは該タンパク質をコードする外因性核酸を含む改変初代ヒトＴ細胞を対象とする。
いくつかの実施形態では、本発明は、改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞であって、２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子が、隣接上流エクソンの少なくとも一部および隣接下流エクソンの少なくとも一部に隣接するイントロンを含むゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させるように編集されており、ゲノムＤＮＡの欠失された第１の連続ストレッチの５’末端の上流のゲノムＤＮＡの３’末端が、ゲノムＤＮＡの欠失された第１の連続ストレッチの３’末端の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合されて、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠く２番染色体上の改変ＣＴＬＡ４遺伝子が生じ、それにより、該細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除する第１のゲノム改変；ならびに／または２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子が、隣接上流エクソンの少なくとも一部および隣接下流エクソンの少なくとも一部に隣接するイントロンを含むゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させるように編集されており、ゲノムＤＮＡの欠失された第２の連続ストレッチの上流のゲノムＤＮＡの３’末端が、ゲノムＤＮＡの欠失された第２の連続ストレッチの３’末端の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合されて、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠く２番染色体上の改変ＰＤ１遺伝子が生じ、それにより、該細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除する第２のゲノム改変を含む改変初代ヒトＴ細胞を対象とする。
いくつかの実施形態では、本発明は、改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞であって、２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子が、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチが、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第１のゲノム改変；ならびに／または２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子が、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチが、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第２のペアとを接触させることによって欠失されている第２のゲノム改変を含む改変初代ヒトＴ細胞を対象とする。
いくつかの実施形態では、リボ核酸の第１のペアは配列番号１２８および配列番号７２を含み、リボ核酸の第２のペアは配列番号４６２および配列番号４２１を含む。
特定の実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞は、（ｉ）１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子が、コードエクソンの少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチを欠失させるように編集されている第３のゲノム改変；および／または（ｉｉ）７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子が、コードエクソンの少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第４のゲノム改変をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチは、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９５４５からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第３のペアとを接触させることによって欠失されており、ならびに／またはゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチは、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第４のペアとを接触させることによって欠失されている。特定の態様では、リボ核酸の第３のペアは配列番号５５０および配列番号５７３を含み、ならびに／またはリボ核酸の第４のペアは配列番号６５７および配列番号６６２を含む。
特定の実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞は、１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子が、ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第５のゲノム改変をさらに含む。特定の態様では、ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチは、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７を含む群より選択される配列を有するリボ核酸の第５のペアとを接触させることによって欠失されている。いくつかの実施形態では、リボ核酸の第５のペアは、配列番号７７３および配列番号７７８を含む。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞は、キメラ抗原受容体または該キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸をさらに含む。例えば、キメラ抗原受容体は、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原またはエピトープに特異的に結合し得る。
特定の実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞は、隣接細胞、組織または器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つの外因性タンパク質または該タンパク質をコードする外因性核酸をさらに含む。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、記憶Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、組織浸潤リンパ球およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の態様では、細胞は、自己免疫障害、癌、慢性感染性疾患および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群より選択される障害を患っているか、該障害について処置されているか、該障害と診断されているか、該障害を発症するリスクを有するか、または該障害を有すると疑われる被験体から得られる。
改変初代ヒトＴ細胞を生産するための方法であって、（ａ）初代ヒトＴ細胞における２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること；（ｂ）該細胞における２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること；（ｃ）（ｉ）該細胞における１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチを欠失させるように編集すること、および／または（ｃ）（ｉｉ）該細胞における７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること；ならびに（ｄ）該細胞における１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること；ならびに場合により（ｅ）（ｉ）該細胞が、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原もしくはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体を発現するようにすること、ならびに／または（ｅ）（ｉｉ）該細胞が、隣接細胞、組織もしくは器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つのタンパク質を発現するようにすることを含み、（ａ）〜（ｄ）における編集が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに（ａ）における該遺伝子からゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つの第１のペア、（ｂ）における該遺伝子からゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つの第２のペア、（ｃ）（ｉ）における該遺伝子からゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチを欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つの第３のペア、および／または（ｃ）（ｉｉ）における該遺伝子からゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチを欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つの第４のペア、ならびに（ｄ）における該遺伝子からゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチを欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つの第５のペアとを接触させることを含む方法も開示される。
改変初代ヒトＴ細胞を生産するための方法であって、（ａ）初代ヒトＴ細胞における２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子を、隣接上流エクソンの少なくとも一部および隣接下流エクソンの少なくとも一部に隣接するイントロンを含むゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させるように編集し、ゲノムＤＮＡの欠失された第１の連続ストレッチの５’末端の上流のゲノムＤＮＡの３’末端を、ゲノムＤＮＡの欠失された第１の連続ストレッチの３’末端の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合して、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠く２番染色体上の改変ＣＴＬＡ４遺伝子を生じさせ、それにより、該細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除すること；ならびに／または（ｂ）初代ヒトＴ細胞における２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を、隣接上流エクソンの少なくとも一部および隣接下流エクソンの少なくとも一部に隣接するイントロンを含むゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させるように編集し、ゲノムＤＮＡの欠失された第２の連続ストレッチの上流のゲノムＤＮＡの３’末端を、ゲノムＤＮＡの欠失された第２の連続ストレッチの３’末端の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合して、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠く２番染色体上の改変ＰＤ１遺伝子を生じさせ、それにより、該細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除することを含む方法も本明細書に開示される。
改変初代ヒトＴ細胞を生産するための方法であって、（ａ）初代ヒトＴ細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させ、それにより、２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させ、該細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること；ならびに／または（ｂ）初代ヒトＴ細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第２のペアとを接触させ、それにより、２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させ、該細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集することを含む方法も本明細書に開示される。
いくつかの態様では、改変初代ヒトＴ細胞を生産するため方法は、（ｃ）（ｉ）該細胞における１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子を、コードエクソンの少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチを欠失させるように編集すること、および／または（ｃ）（ｉｉ）該細胞における７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子を、コードエクソンの少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集することをさらに含む。特定の態様では、（ｃ）（ｉ）における編集は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第３のペアとを接触させることを含み、ならびに／または（ｃ）（ｉｉ）における編集は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第４のペアとを接触させることを含む。
いくつかの態様では、改変初代ヒトＴ細胞を生産するための方法は、（ｄ）該細胞における１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集することをさらに含む。特定の態様では、（ｄ）における編集は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第５のペアとを接触させることを含む。
本明細書に開示される本発明の特定の態様では、リボ核酸の第１のペアは配列番号１２８および配列番号７２を含み、リボ核酸の第２のペアは配列番号４６２および配列番号４２１を含む。本明細書に開示される本発明の特定の態様では、リボ核酸の第３のペアは配列番号５５０および配列番号５７３を含み、ならびに／またはリボ核酸の第４のペアは配列番号６５７および配列番号６６２を含む。本明細書に開示される本発明の特定の態様では、リボ核酸の第５のペアは配列番号７７３および配列番号７７８を含む。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞を生産するための方法は、該細胞が、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原もしくはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体を発現するようにすることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞を生産するための方法は、該細胞が隣接細胞、組織または器官の近傍にある場合に、該細胞が、該隣接細胞、組織または器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つのタンパク質を発現するようにすることをさらに含む。
本明細書に開示される本発明の特定の態様では、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、記憶Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、組織浸潤リンパ球およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。本明細書に開示される本発明の特定の態様では、細胞は、自己免疫障害、癌、慢性感染性疾患および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群より選択される障害を患っているか、該障害について処置されているか、該障害と診断されているか、該障害を発症するリスクを有するか、または該障害を有すると疑われる被験体から得られる。
処置を必要とする患者を処置する方法であって、（ａ）（ｉ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞を、このような細胞を必要とする患者に投与すること；（ａ）（ｉｉ）請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の方法にしたがって生産された改変Ｔ細胞を、このような細胞を必要とする患者に投与すること；または（ａ）（ｉｉｉ）請求項３０に記載の組成物を、このような細胞を必要とする患者に投与することを含む方法も本明細書に開示される。例えば、処置は、養子免疫療法を含み得る。
いくつかの実施形態では、患者を処置するための方法は、投与する工程の前に、改変Ｔ細胞をエクスパンドすることをさらに含む。いくつかの態様では、患者は、自己免疫障害、癌、慢性感染性疾患および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群より選択される障害を患っているか、該障害について処置されているか、該障害と診断されているか、該障害を発症するリスクを有するか、または該障害を有すると疑われる。
キメラ核酸を含む組成物であって、該キメラ核酸が、（ａ）Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列；ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７；（ｉｉ）配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５；（ｉｉｉ）配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０；（ｉｖ）配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２；（ｖ）配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７；および（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む組成物も本明細書に開示される。例えば、（ｂ）におけるリボ核酸配列のペアは、（ｉ）配列番号１２８および配列番号７２；（ｉｉ）配列番号４６２および配列番号４２１；（ｉｉｉ）配列番号５５０および配列番号５７３；（ｉｖ）配列番号６５７および配列番号６６２；（ｖ）配列番号７７３および配列番号７７８；ならびに（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、キメラ核酸を含む組成物は、検出可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラ核酸を含む組成物は、ヒト細胞における発現増加に最適化されたプロモーターであって、該キメラ核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、該プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素およびニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−１αプロモーターならびにユビキチンプロモーターからなる群より選択される。
いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、Ｃａｓ９タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。特定の態様では、ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、５−メチルシトシン（ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｄｉｎｅ）、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群より選択される少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む。本発明の特定の態様では、キメラ核酸は、プソイドウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群より選択される少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む。
細胞における標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列が切断され、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される方法も本明細書に開示される。特定の態様では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される。例えば、２つのリボ核酸は、配列番号１２８および配列番号７２を含み得る。
細胞における標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＰＤ１ポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列が切断され、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される方法も本明細書に開示される。特定の態様では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される。例えば、２つのリボ核酸は、配列番号４６２および配列番号４２１を含み得る。
細胞における標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列が切断され、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される方法も本明細書に開示される。特定の態様では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される。例えば、２つのリボ核酸は、配列番号５５０および配列番号５７３を含み得る。
細胞における標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列が切断され、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される方法も本明細書に開示される。特定の態様では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される。例えば、２つのリボ核酸は、配列番号６５７および配列番号６６２を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞であって、各細胞が、（ａ）２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号３６３８〜４０４６からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第１のゲノム改変；ならびに／または（ｂ）２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８９４６〜９１０１からなる群より選択される配列を有する第２のリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第２のゲノム改変を含む改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞を対象とする。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞は、（ｃ）（ｉ）１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子が編集されている第３のゲノム改変；および／または（ｃ）（ｉｉ）７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子が編集されており、それにより、該細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除する第４のゲノム改変をさらに含む。いくつかの態様では、ゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチは、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号９７５１〜９７９７からなる群より選択される配列を有する第３のリボ核酸とを接触させることによって編集されており、ならびに／またはゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチは、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号１０５３３〜１０５７３からなる群より選択される配列を有する第４のリボ核酸とを接触させることによって編集されている。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞は、（ｄ）１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子が編集されており、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除する第５のゲノム改変をさらに含む。特定の態様では、ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチは、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号１３２５８〜１３７１９からなる群より選択される配列を有する第５のリボ核酸とを接触させることによって編集されている。
いくつかの態様では、改変初代ヒトＴ細胞は、キメラ抗原受容体または該キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸をさらに含む。特定の態様では、キメラ抗原受容体は、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原またはエピトープに特異的に結合する。
いくつかの態様では、改変初代ヒトＴ細胞は、隣接細胞、組織または器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つの外因性タンパク質または該タンパク質をコードする外因性核酸をさらに含む。
改変初代ヒトＴ細胞を生産するための方法であって、（ａ）初代ヒトＴ細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号３６３８〜４０４６からなる群より選択される配列を有する第１のリボ核酸とを接触させ、それにより、２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子を、該細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること；ならびに／または（ｂ）初代ヒトＴ細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号８９４６〜９１０１からなる群より選択される配列を有する第２のリボ核酸とを接触させ、それにより、２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を、該細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集することを含む方法も本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、該方法は、（ｃ）（ｉ）該細胞における１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子を編集すること、および／または（ｃ）（ｉｉ）該細胞における７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子を編集し、それにより、該細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除することをさらに含む。特定の態様では、（ｃ）（ｉ）における編集は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号９７５１〜９７９７からなる群より選択される配列を有する第３のリボ核酸とを接触させることを含み、ならびに／または（ｃ）（ｉｉ）における編集は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１０５３３〜１０５７３からなる群より選択される配列を有する第４のリボ核酸とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、該方法は、（ｄ）該細胞における１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を編集し、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除することをさらに含む。特定の態様では、（ｄ）における編集は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１３２５８〜１３７１９からなる群より選択される配列を有する第５のリボ核酸とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、該方法は、該細胞が、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原もしくはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体を発現するようにすることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、該細胞が隣接細胞、組織または器官の近傍にある場合に、該細胞が、該隣接細胞、組織または器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つのタンパク質を発現するようにすることをさらに含む。
本明細書に開示される本発明の特定の実施形態では、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、記憶Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、組織浸潤リンパ球およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。本明細書に開示される本発明の特定の実施形態では、細胞は、自己免疫障害、癌、慢性感染性疾患および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群より選択される障害を患っているか、該障害について処置されているか、該障害と診断されているか、該障害を発症するリスクを有するか、または該障害を有すると疑われる被験体から得られる。
本明細書に開示される本発明の細胞、または本明細書に開示される本発明の方法にしたがって生産された細胞を含む組成物も本明細書に開示される。
キメラ核酸を含む組成物であって、該キメラ核酸が、（ａ）Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列；（ｂ）（ｉ）配列番号３６３８〜４０４６；（ｉｉ）配列番号８９４６〜９１０１；（ｉｉｉ）配列番号９７５１〜９７９７；（ｉｖ）配列番号１０５３３〜１０５７３；（ｖ）配列番号１３２５８〜１３７１９；および（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせからなる群より選択されるリボ核酸配列を含む組成物も本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、キメラ核酸は、検出可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含む。本明細書に開示される本発明のいくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質またはその機能的部分を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、Ｃｐｆ１タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得る。特定の態様（ｃｅｒｔａｉｎ ａｓｅｐｃｔｓ）では、ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群より選択される少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、キメラ核酸は、プソイドウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群より選択される少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む。
細胞における標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質およびリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列が切断され、該リボ核酸が配列番号３６３８〜４０４６からなる群より選択される方法も本明細書に開示される。
細胞における標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＰＤ１ポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質およびリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列が切断され、該リボ核酸が配列番号８９４６〜９１０１からなる群より選択される方法も本明細書に開示される。
細胞における標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質およびリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列が切断され、該リボ核酸が配列番号９７５１〜９７９７からなる群より選択される方法も開示される。
細胞における標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質およびリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列が切断され、該リボ核酸が配列番号１０５３３〜１０５７３からなる群より選択される方法も開示される。
本発明の上記で議論されるおよび多くの他の特徴および付随する利点は、以下の発明の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるであろう。
本発明のこれらのおよび他の特徴は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによって、より詳細に理解されるであろう。特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を伴う本特許または特許出願公報のコピーは、申請して必要な料金を支払えば、特許庁によって提供されるであろう。
図１は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を使用した養子免疫療法の概略図である。Ｔ細胞を腫瘍から単離し、エクスビボでエクスパンドし、続いて患者に再注入して、腫瘍細胞をターゲティングする。腫瘍環境は十分なＴ細胞増殖を支援しないので、この方法は、再注入前にＴ細胞を活性化してエクスビボで増殖させて、腫瘍に対する免疫攻撃を開始することを可能にする（Ｒｅｓｔｉｆｏら、２０１２）。
図２は、３つの世代のＣＡＲ Ｔ細胞の概略図である。抗原特異性を決定する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）結合ドメインが緑色で示されている。細胞内ドメインは、異なる態様のＴＣＲ伝達機構を組み込んでいる：（ＣＤ３ζ鎖／ＺＡＰ７０）、青色（ＣＤ２８／ＰＩ３Ｋ）および黄色（４−１ＢＢまたはＯＸ４０／ＴＲＡＦ）（出典Ｃａｓｕｃｃｉ ａｎｄ Ｂｏｎｄａｎｚａ，２０１１）。
図３は、Ｔ細胞活性化および阻害機構の概略図である。破線矢印は、ＭＨＣ−ＴＣＲおよびＣＤ２８−Ｂ７相互作用を介したＴ細胞活性化を示す。実線矢印は、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４およびＰＤ１を介して媒介される阻害作用を表す。Ｂ７−１およびＢ７−２は、それぞれＣＤ８０およびＣＤ８６である（出典Ｄｒａｋｅら、Ｃ．Ｇ，２０１４）。
図４は、Ｃａｓタンパク質の例示的なアミノ酸配列を示す。黄色ハイライトは、Ｒｕｖ−Ｃ様ドメインを示す。下線は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを示す。
図５は、Ｃａｓ９を使用してＣＴＬＡ４遺伝子をターゲティングするために有用な例示的なｇＲＮＡ配列を示す。実験例に記載されているｇＲＮＡは、赤色の文字で特定されている。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図６は、Ｃａｓ９を使用してＰＤ１遺伝子をターゲティングするために有用な例示的なｇＲＮＡ配列を示す。実験例に記載されているｇＲＮＡは、赤色の文字で特定されている。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図７は、Ｃａｓ９を使用してＴＣＲα遺伝子座をターゲティングするために有用な例示的なｇＲＮＡ配列を示す。実験例に記載されているｇＲＮＡは、赤色の文字で特定されている。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図８は、Ｃａｓ９を使用してヒトＴＣＲβ遺伝子座をターゲティングするために有用な例示的なｇＲＮＡ配列を示す。実験例に記載されているｇＲＮＡは、赤色の文字で特定されている。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図９は、Ｃａｓ９を使用してヒトＢ２Ｍ遺伝子をターゲティングおよび編集するために有用な例示的なｇＲＮＡ配列を示す。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図１０は、本発明の例示的なＴＣＲターゲティング戦略を実証する。図１０は、それぞれ、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の第１のコーディングエクソンをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡの位置を示す概略図である。
図１１Ａおよび図１１Ｂは、ジャーカットＴ細胞におけるＴ細胞受容体の欠失を実証する。図１１Ａは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを安定発現するジャーカットＴ細胞におけるＴＣＲ欠失の成功を明らかにする、抗ＣＤ３抗体を用いたＦＡＣＳ分析の結果を示す。図１１Ｂは、ＴＣＲａ遺伝子座およびＴＣＲｂ遺伝子座における切断を確認する、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイの結果を示す。
図１２Ａおよび図１２Ｂは、初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＴＣＲ欠失を実証する。図１２Ａは、２人の独立したドナーから得たＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＴＣＲａ遺伝子座およびＴＣＲｂ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ切断を実証する、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイの結果を示す。図１２Ｂは、ＦＡＣＳ分析によって実証されたＴＣＲ表面発現の喪失を示す
図１３Ａ、図１３Ｂおよび図１３Ｃは、本発明の例示的なＰＤ−１遺伝子座ターゲティング戦略を実証する。図１３Ａは、ＰＤ−１ターゲティング戦略の概略図である。図１３Ｂは、二重ＣＲＩＳＰＲ戦略が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＤ−１遺伝子座をターゲティングする両ＣＲＩＳＰＲによって切断をもたらすことを実証する。図１３Ｃは、配列番号７９３および７９４を参照して示されているように、ＰＤ−１遺伝子（ＰＤＣＤ１）をターゲティングする２つのＣＲＩＳＰＲのトランスフェクション後のＰＤ−１遺伝子座における予測欠失を確認した配列決定の概略図である。
図１４および図１４Ｂは、ジャーカットＴ細胞におけるＰＤ−１発現の喪失を実証する。図１４Ａは、活性化ジャーカットＴ細胞におけるＰＤ−１発現の喪失を実証する、ＦＡＣＳ分析の結果を示す。図１４Ｂは、ＰＤ−１遺伝子座における切断を確認する、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイの結果を示す。
図１５Ａ、図１５Ｂおよび図１５Ｃは、本発明の例示的なＣＴＬＡ４遺伝子座ターゲティング戦略を実証する。図１５Ａは、ＣＴＬＡ４ターゲティング戦略の概略図である。図１５Ｂは、二重ＣＲＩＳＰＲ戦略が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ４遺伝子座をターゲティングする両ＣＲＩＳＰＲによって切断をもたらすことを実証する。図１５Ｃは、配列番号７９５および７９６を参照して示されているように、ＣＴＬＡ４遺伝子（ＣＴＬＡ４）をターゲティングする２つのＣＲＩＳＰＲのトランスフェクション後のＣＴＬＡ４遺伝子座における予測欠失を確認した配列決定の概略図である。
図１６Ａおよび図１６Ｂは、ジャーカットＴ細胞におけるＣＴＬＡ−４遺伝子座における切断を実証する。図１６Ａは、二重ＣＲＩＳＰＲ戦略が、ジャーカットＴ細胞におけるＣＴＬＡ４遺伝子座をターゲティングする両ＣＲＩＳＰＲによって切断をもたらすことを実証する。図１６Ｂは、ジャーカットＴ細胞における両ＣＴＬＡ４ ＣＲＩＳＰＲによる切断の成功を実証する、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイの結果を示す。
図１７は、Ｃｐｆ１を使用してＣＴＬＡ４遺伝子をターゲティングするために有用な例示的なｇＲＮＡ配列を示す。 同上 同上 同上 同上 同上
図１８は、Ｃｐｆ１を使用してＰＤ１遺伝子をターゲティングするために有用な例示的なｇＲＮＡ配列を示す。 同上 同上
図１９は、Ｃｐｆ１を使用してＴＣＲα遺伝子座をターゲティングするために有用な例示的なｇＲＮＡ配列を示す。
図２０は、Ｃｐｆ１を使用してヒトＴＣＲβ遺伝子座をターゲティングするために有用な例示的なｇＲＮＡ配列を示す。
図２１は、Ｃｐｆ１を使用してヒトＢ２Ｍ遺伝子をターゲティングおよび編集するために有用な例示的なｇＲＮＡ配列を示す。 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図２２は、２９３Ｔ細胞における選択ガイドのＢ２Ｍ欠失効率を実証する。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイの矢印は、ヌクレアーゼ切断結合を示す。
図２３は、ＡｓＣｐｆ１およびガイドｃｒＢ２Ｍをトランスフェクトした場合の２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ表面発現の比較を実証する。
図２４は、ＬｂＣｐｆ１およびガイドｃｒＢ２Ｍをトランスフェクトした場合の２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ表面発現の比較を実証する。
図２５は、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡの設計およびクローニング情報を示す。
図２６Ａ、図２６Ｂ、図２６Ｃ、図２６Ｄ、図２６Ｅ、図２６Ｆおよび図２６Ｇは、ＴＡＬＥＮを使用したＢ２Ｍ ＫＯ ＪＥＧ３細胞の作製および特性評価を実証する。図２６Ａは、Ｂ２Ｍ ＴＡＬＥＮの設計および誘導された突然変異を示す。図２６Ｂは、転写産物およびタンパク質レベルにおけるＢ２Ｍの分析を示す。図２６Ｃは、表面発現レベルにおけるＢ２Ｍの分析を実証する。図２６Ｄは、ΔＢ２ＭクローンがＭＨＣ−Ｉ表面発現を欠くことを実証する。図２６Ｅは、ΔＢ２ＭクローンがＨＬＡ−Ｇの表面発現を欠くことを実証する。図２６Ｆは、ΔＢ２ＭクローンがＨＬＡ−Ｃ表面発現を欠くことを実証する。図２６Ｇは、ΔＢ２ＭクローンがＨＬＡ−Ｅの表面発現を欠くことを実証する。 同上 同上 同上 同上 同上 同上
特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を伴う本特許または特許出願公報のコピーは、申請して必要な料金を支払えば、特許庁によって提供されるであろう。
発明の詳細な説明
Ｔ細胞療法は、癌免疫療法における大きなブレイクスルーとして登場し、現在、主にＢ細胞悪性腫瘍の処置において改変Ｔ細胞を使用するいくつかの臨床試験がある。Ｔ細胞を、モノクローナル抗体の可変ドメイン由来の特異性を有する腫瘍特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変して、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に制限されずに免疫応答を腫瘍に集中させ得る。
これらの初期の成功にもかかわらず、既存のＣＡＲ Ｔ療法にはいくつかの障害がある。主な障害は、ＣＡＲ Ｔ細胞の同種移植を妨げる内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が常在することであり、細胞を同じ患者に戻したとしても、細胞が自己抗原と交差反応性である場合には、高用量で患者に投与すると、自己免疫攻撃をもたらし得る。Ｔ細胞療法における第２の障害は、腫瘍およびウイルスが、Ｔ細胞活性の重要なチェックポイント調節因子を利用することによってＴ細胞を抑制する機構を進化させたことである。本発明は、この新たな治療選択肢の安全な臨床転用を妨げる上記障害を克服する遺伝子編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥＮ系）の可能性を利用する。特に、本明細書に記載される研究は、同種健常ドナー由来の容易に入手可能で普遍的なＣＡＲ Ｔ細胞であって、免疫拒絶または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを伴わずに任意の患者に投与され得、Ｔ細胞阻害の傾向がないＣＡＲ Ｔ細胞を作製する実現可能性を実証する。また、本明細書に記載される研究は、内因性ＴＣＲおよびＴ細胞活性の重要なチェックポイント調節因子を効率的にターゲティングするＣＲＩＳＰＲガイド配列（ｇＲＮＡ）を開発することが実現可能であることを実証する。本明細書に記載される研究は、（１）ＴＣＲα鎖およびβ鎖をコードする遺伝子をターゲティングすることによって自己反応性を防止し、（２）ＴＣＲ遺伝子およびＢ２Ｍ遺伝子をターゲティングすることによってアロバリア（ａｌｌｏｂａｒｒｉｅｒ）を取り除き；および／または（３）チェックポイント阻害因子ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４をターゲティングすることによって自己反応性を克服するように設計および試験されたｇＲＮＡを提供する。
本発明は、例えば、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を利用して、当業者に利用可能な任意の方法で標的ポリヌクレオチド配列を変化させることを企図する。このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、様々なＣａｓタンパク質を用い得る（Ｈａｆｔら、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２００５；１（６）ｅ６０）。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１）およびＴＡＬＥＮを利用する方法の例が本明細書に詳細に記載されるが、本発明は、これらの方法／系の使用に限定されないことを理解すべきである。ポリヌクレオチド配列をターゲティングして標的細胞における発現を低減または除去する当業者に公知の他の方法が本明細書で利用され得る。
本発明の方法によれば、細胞における１つまたはそれを超える標的ポリヌクレオチド配列は、変化（例えば、改変または切断）される。本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を任意の目的で、しかし特に、コードされる産物の発現または活性が低減または排除されるように変化させることを企図する。いくつかの実施形態では、細胞における標的ポリヌクレオチド配列は、突然変異細胞を生産するように変化される。本明細書で使用される場合、「突然変異細胞」は、得られた遺伝子型がその元の遺伝子型と異なる細胞を指す。いくつかの場合では、例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して正常機能遺伝子を変化させた場合、「突然変異細胞」は、突然変異表現型を示す。他の場合では、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して突然変異遺伝子型を修正した場合、「突然変異細胞」は、野生型表現型を示す。いくつかの実施形態では、細胞における標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子突然変異を修正または修復するように（例えば、正常表現型を細胞に戻すように）変化される。いくつかの実施形態では、細胞における標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子突然変異を誘導するように（例えば、遺伝子またはゲノム要素の機能を破壊するように）変化される。
いくつかの実施形態では、変化は、インデルである。本明細書で使用される場合、「インデル」は、挿入、欠失またはそれらの組み合わせから生じる突然変異を指す。当業者であれば認識するように、インデルの長さが３の倍数ではない限り、ゲノム配列のコード領域におけるインデルは、フレームシフト突然変異をもたらすであろう。いくつかの実施形態では、変化は、点突然変異である。本明細書で使用される場合、「点突然変異」は、１つのヌクレオチドを置き換える置換を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的ポリヌクレオチド配列における任意の長さのインデルまたは点突然変異を誘導するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、変化は、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部のノックアウトをもたらす。例えば、細胞における標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、治療目的および研究目的の両方のためにインビトロで、インビボでまたはエクスビボで実施され得る。細胞における標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、（例えば、細胞における突然変異対立遺伝子をエクスビボでノックアウトし、ノックアウトした突然変異対立遺伝子を含む細胞を被験体に導入することによって）標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するために有用であり得る。本明細書で使用される場合、「ノックアウト」は、標的ポリヌクレオチド配列またはその発現産物の機能を妨害する方法で、標的ポリヌクレオチド配列の全部または一部を欠失させることを含む。
いくつかの実施形態では、変化は、標的ポリヌクレオチド配列の発現の低減をもたらす。「減少させる」、「低減された」、「低減」および「減少」という用語はすべて、本明細書では一般に、統計的に有意な量の減少を指すために使用される。しかしながら、誤解を避けるために、「減少された」、「低減された」、「低減」および「減少」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％もしくは少なくとも約３０％もしくは少なくとも約４０％もしくは少なくとも約５０％もしくは少なくとも約６０％もしくは少なくとも約７０％もしくは少なくとも約８０％もしくは少なくとも約９０％の減少もしくは最大１００％（それを含む）の減少（すなわち、参照サンプルと比較して非存在レベル）、または参照レベルと比較して１０〜１００％の任意の減少を含む。
「増加された」、「増加させる」または「増強する」または「活性化する」という用語はすべて、本明細書では一般に、統計的に有意な量の増加を意味するために使用される；いかなる誤解も避けるために、「増加された」、「増加させる」または「増強する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％もしくは少なくとも約３０％もしくは少なくとも約４０％もしくは少なくとも約５０％もしくは少なくとも約６０％もしくは少なくとも約７０％もしくは少なくとも約８０％もしくは少なくとも約９０％の増加もしくは最大１００％（それを含む）の増加、または参照レベルと比較して１０〜１００％の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約２倍もしくは少なくとも約３倍もしくは少なくとも約４倍もしくは少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍の増加もしくは２倍〜１０倍もしくはそれを超える任意の増加を意味する。
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般に、正常を２標準偏差（２ＳＤ）下回る（すなわち、低い）マーカーの濃度を意味する。この用語は、差異があるという統計的証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に正しい場合に、帰無仮説の棄却を判定する確率として定義される。判定は、多くの場合、ｐ値を使用して行われる。
いくつかの実施形態では、変化は、ホモ接合変化である。いくつかの実施形態では、変化は、ヘテロ接合変化である。
いくつかの実施形態では、変化は、望ましくない配列から所望の配列への標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的ポリヌクレオチド配列における任意の種類の突然変異またはエラーを修正するために使用され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、欠失により標的ポリヌクレオチド配列から消失したヌクレオチド配列を挿入するために使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はまた、挿入突然変異により標的ポリヌクレオチド配列からヌクレオチド配列を欠失させまたは切除するために使用され得る。いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、（例えば、機能喪失突然変異、すなわちＳＮＰにより損なわれた機能を標的ポリヌクレオチド配列に回復させるために）誤ったヌクレオチド配列を正しいヌクレオチド配列で置き換えるために使用され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、驚くほど高い効率で、標的ポリヌクレオチドを変化させ得る。特定の実施形態では、変化の効率は、少なくとも約５％である。特定の実施形態では、変化の効率は、少なくとも約１０％である。特定の実施形態では、変化の効率は、約１０％〜約８０％である。特定の実施形態では、変化の効率は、約３０％〜約８０％である。特定の実施形態では、変化の効率は、約５０％〜約８０％である。いくつかの実施形態では、変化の効率は、約８０％を超えるかまたはそれに等しい。いくつかの実施形態では、変化の効率は、約８５％を超えるかまたはそれに等しい。いくつかの実施形態では、変化の効率は、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％を超えるかまたはそれに等しい。いくつかの実施形態では、変化の効率は、約１００％に等しい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、細胞における任意の標的ポリヌクレオチド配列を変化させるために使用され得る。当業者であれば、任意の特定の細胞における変化させるべき所望の標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列の発現が障害に関連するか、または細胞への病原体の侵入を促進する任意のゲノム配列に対応し得ることを容易に認識するであろう。例えば、細胞における変化させるべき所望の標的ポリヌクレオチド配列は、疾患関連単一ポリヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含有するゲノム配列に対応するポリヌクレオチド配列であり得る。このような例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、野生型対立遺伝子で置き換えることによって、細胞における疾患関連ＳＮＰを修正するために使用され得る。別の例として、標的遺伝子の機能を破壊して病原体が細胞内に侵入しまたは細胞内で増殖することを防止するために、細胞への病原体の侵入または増殖に関与する標的遺伝子のポリヌクレオチド配列は、欠失または挿入のための適切な標的であり得る。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳動物ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物ゲノム配列である。
細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＴＬＡ４またはそのホモログ、オルソログもしくは変異体である（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１４９３、ＣＤ；ＧＳＥ；ＧＲＤ４；ＡＬＰＳ５；ＣＤ１５２；ＣＴＬＡ−４；ＩＤＤＭ１２；ＣＥＬＩＡＣ３としても公知である）。例示的なＣＴＬＡ４ヒト標的ポリヌクレオチド配列は、以下の表１に示されている（ＮＧ＿０１１５０２．１ ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ；配列番号７８２）。
ＣＴＬＡ４遺伝子は免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーであり、そのポリヌクレオチド配列は、阻害シグナルをＴ細胞に伝達するタンパク質をコードする。タンパク質は、Ｖドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を有する。選択的スプライス変異体によってコードされる様々なアイソフォームが特性評価されている。膜結合アイソフォームは、ジスルフィド結合によって統合されたホモダイマーとして作用するのに対して、可溶性アイソフォームはモノマーとして作用する。報告によれば、ＣＴＬＡ４遺伝子突然変異は、インスリン依存性糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、セリアック病、全身性エリテマトーデス、甲状腺関連眼窩疾患および他の自己免疫疾患に関連している。
いくつかの態様では、本開示は、改変初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）またはその集団であって、２番染色体上のＣＴＬＡ４遺伝子が、遺伝子編集系（例えば、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなど）を使用して、該細胞またはその集団におけるＣＴＬＡ４発現（例えば、細胞表面発現）および／または活性（例えば、タンパク質活性）を低減または排除するように編集されているゲノムを含む改変初代ヒト細胞またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、改変初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）またはその集団であって、２番染色体上のＣＴＬＡ４遺伝子が、例えば配列番号７８２からゲノムＤＮＡの連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＣＴＬＡ４発現（例えば、細胞表面発現）および／または活性（例えば、タンパク質活性）を低減または排除するように編集されているゲノムを含む改変初代ヒト細胞またはその集団を提供する。ゲノムＤＮＡの連続ストレッチは、初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択されるリボ核酸の少なくとも１つのペア（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ ＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡペア、例えば少なくとも１つのｇＲＮＡペア、少なくとも２つのｇＲＮＡペア、少なくとも３つのｇＲＮＡペア、少なくとも４つのｇＲＮＡペア、少なくとも５つのｇＲＮＡペアなど）とを接触させることによって欠失され得る。
本明細書で使用される場合、「接触させる」（例えば、ポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および／またはリボ核酸とを接触させる）という用語は、インビトロで細胞内のＣａｓタンパク質および／もしくはリボ核酸を一緒にインキュベートすること（例えば、培養液中でＣａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に追加すること）、またはエクスビボで細胞を接触させることを含むことを意図する。標的ポリヌクレオチド配列と、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質および／またはリボ核酸とを接触させる工程は、任意の適切な方法で行われ得る。例えば、細胞は、付着培養液または懸濁培養液中で処理され得る。また、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質および／またはリボ核酸と接触させた細胞と別の薬剤、例えば成長因子または他の分化剤または環境とを同時にまたは連続的に接触させて、細胞を安定化し、または細胞をさらに分化させ得ると理解される。
本開示は、任意の細胞株または初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）集団におけるＣＴＬＡ４発現および／または活性を低減または排除して、Ｔ細胞阻害を低減または排除する細胞を生産することを企図する。ゲノム編集のために使用される初代ヒト細胞は、自己免疫障害、癌、慢性感染性疾患および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群より選択される障害を患っているか、該障害について処置されているか、該障害と診断されているか、該障害を発症するリスクを有するか、または該障害を有すると疑われる被験体から得られ得る。細胞はまた、該障害を患っていないか、該障害について処置されていないか、該障害と診断されていないか、該障害を有すると疑われないか、または該障害を発症する高いリスクを有しない正常健常被験体から得られ得る。
本発明は、初代ヒト細胞を、ＣＴＬＡ４遺伝子配列を切断するようにゲノム編集すること、およびこのような細胞のゲノムを、１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＰＤ１、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、Ｂ２Ｍなど）を変化させるように編集することを企図する。１つまたはそれを超える本明細書に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアを使用したＣＴＬＡ４遺伝子配列の切断は、ＣＴＬＡ４ゲノムＤＮＡ配列（例えば、配列番号７８２）の部分的なまたは完全な欠失をもたらし得ると認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、各細胞が、（ａ）２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子が、隣接上流エクソンの少なくとも一部および隣接下流エクソンの少なくとも一部に隣接するイントロンを含むゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させるように編集されており、ゲノムＤＮＡの欠失された第１の連続ストレッチの５’末端の上流のゲノムＤＮＡの３’末端が、ゲノムＤＮＡの欠失された第１の連続ストレッチの３’末端の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合されて、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠く２番染色体上の改変ＣＴＬＡ４遺伝子が生じ、それにより、該細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するゲノム改変（例えば、第１のゲノム改変）を含む改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。
当業者であれば、ＣＴＬＡ４ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチの欠失は、ＣＴＬＡ４遺伝子におけるエクソンをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡの任意のペアであって、第１のＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡが、第１のエクソンの下流の第２のエクソンの上流に存在する第１のエクソンをターゲティングする任意のペアを使用して達成され得ることを認識するであろう。同様に、この戦略を使用して任意のエクソンペアをターゲティングして、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチの切断をもたらし得、その結果、このように改変された細胞のＤＮＡ修復機構は、第１のエクソンにおけるＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡ切断部位の上流のゲノムＤＮＡの３’末端を、ＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡ切断部位の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合する。この戦略の例は、配列番号１２８（ＣＲ１）および配列番号７２（ＣＲ２）を含むリボ核酸の第１のペアを使用して、図１５Ａおよび図１５Ｂに示されている。このような例では、ＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡの第１のペアは、ＣＴＬＡ４遺伝子のエクソン２およびエクソン３をターゲティングすることが示されている。当然のことながら、ＣＴＬＡ４遺伝におけるの任意の２つの隣接エクソンは、この戦略を使用してターゲティングされ得る（例えば、エクソン１およびエクソン２、エクソン３および４）。ＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡの第１のペアの各ＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡが、各隣接ＣＴＬＡ４エクソンにおける１つのＣＴＬＡ４標的モチーフに配向される限り、ＣＴＬＡ４標的モチーフを含有するこのようなＣＴＬＡ４エクソンの任意の部分は、この戦略を使用してターゲティングされ得ることをさらに認識すべきである。換言すれば、この戦略を達成するために、当業者であれば、第１のエクソンにおけるモチーフをターゲティングする配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７の中から第１のＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡを選択し、次いで、第１のエクソンの上流または下流の第２の（例えば、隣接）エクソンにおけるモチーフをターゲティングする配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７の中から第２のＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡを選択しさえすればよい。このようにして、ｇＲＮＡの第１のペアは、細胞におけるＣａｓタンパク質をそれぞれ第１および第２のエクソンにガイドし、それらのエクソンおよびイントロン（またはそれらの間の任意の他の配列）を切断し、それにより、細胞のＤＮＡ修復機構が２つの切断部位においてゲノムＤＮＡに共有結合して、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠くＣＴＬＡ４遺伝子を有する改変細胞またはその集団を作ることを可能にするであろう。隣接エクソンのターゲティングに加えてまたは代えて、エクソンにおける切断部位間のゲノムＤＮＡ配列が欠失され、それらの切断部位に隣接するゲノムＤＮＡ配列が共有結合されて、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠くＣＴＬＡ４遺伝子を有する改変細胞またはその集団が生じるように、ｇＲＮＡの第１のペアは、ＣＴＬＡ４遺伝子における任意の２つのエクソン（例えば、エクソン１および３、エクソン１および４、エクソン２および４など）をターゲティングするように選択され得る。
以下の表２は、例示的なヒトＣＴＬＡ４遺伝子における４つの各エクソンのゲノム配列を示す。当業者であれば、本明細書に概説されるＣＴＬＡ４ターゲティング戦略を使用して、以下の表２に示されている配列番号７８３〜７８６を含むエクソンをターゲティングするために、配列番号１〜１９５および配列番号７９７〜３６３７の中からＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡのペアを容易に選択して、様々な方法でこのような戦略を行い得る。あるいは、当業者であれば、本明細書に概説されるＣＴＬＡ４ターゲティング戦略を使用して、以下の表２に示されている配列番号７８３〜７８６を含むエクソンをターゲティングするために、配列番号３６３８〜４０４６の中から少なくとも１つのＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡを容易に選択して、様々な方法でこのような戦略を行い得る。この戦略を使用して欠失された上流エクソンの少なくとも一部および下流エクソンの少なくとも一部のサイズは、ＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡがそれぞれの各エクソンにおける切断を指令する位置に依存する。例えば、上流エクソンにおける切断部位の下流のエクソンの全部分と、下流エクソンにおける切断部位の上流のエクソンの全部分とが、この戦略を使用して欠失されるであろう。したがって、この戦略を使用して、上流エクソンの５’末端に最も近い、かつ隣接下流エクソンの３’末端に最も近いモチーフをターゲティングするＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡを選択することによって、標的エクソンのより大部分を欠失させ得る。反対に、上流エクソンの５’末端から最も遠い、かつ隣接下流エクソンの３’末端から最も遠いモチーフをターゲティングするＣＴＬＡ４ ｇＲＮＡを選択することによって、標的エクソンのより小部分を欠失させ得る。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、各細胞が、（ａ）２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子が、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第１の連続ストレッチ）を欠失させ、それにより、該細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第１の連続ストレッチ）が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペア（例えば、第１のペア）とを接触させることによって欠失されているゲノム改変（例えば、第１のゲノム改変）を含む改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。いくつかのの実施形態では、リボ核酸の第１のペアは、配列番号１２８および配列番号７２を含む。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸が該（例えば、）ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質を該標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させ、該標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列が切断され、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される方法を提供する。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、２つのリボ核酸は、配列番号１２８および配列番号７２を含む。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、各細胞が、（ａ）２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３６３８〜４０４６からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変（例えば、第１のゲノム改変）を含む改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、該少なくとも１つのリボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列が切断され、該リボ核酸が配列番号３６３８〜４０４６からなる群より選択される方法を提供する。特定の態様では、細胞における標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列に対するその後の変化は、標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列の第２の切断をもたらし、それにより、標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列を、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させるように編集する。
プログラム細胞死１（ＰＤ１）
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＤ１またはそのホモログ、オルソログもしくは変異体である（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１３３、ＰＤ−１、ＣＤ２７９、ＳＬＥＢ２、ｈＰＤ−１、ｈＰＤ−ＩおよびｈＳＬＥ１としても公知である）。例示的なＰＤ１ヒト標的ポリヌクレオチド配列は、以下の表３に示されている（ＮＧ＿０１２１１０．１ ＲｅｉＳｅｑＧｅｎｅ；配列番号７８７）。
ＰＤ１遺伝子は、プロＢ細胞において発現され、それらの分化に関与すると考えられる免疫グロブリンスーパーファミリー細胞表面膜タンパク質をコードする。抗ＣＤ３抗体をマウスに注射すると、この遺伝子の発現がマウスの胸腺において誘導され、多量の胸腺細胞のアポトーシスが起こる。この遺伝子の産物はまた、Ｔ細胞の機能において重要であり、自己免疫疾患の予防において役割を果たすと考えられる。
いくつかの態様では、本開示は、改変初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）またはその集団であって、２番染色体上のＰＤ１遺伝子が、遺伝子編集系（例えば、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなど）を使用して、該細胞またはその集団におけるＰＤ１発現（例えば、細胞表面発現）および／または活性（例えば、タンパク質活性）を低減または排除するように編集されているゲノムを含む改変初代ヒト細胞またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、改変初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）またはその集団であって、２番染色体上のＰＤ１遺伝子が、例えば配列番号７８７からゲノムＤＮＡの連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＰＤ１発現（例えば、細胞表面発現）および／または活性（例えば、タンパク質活性）を低減または排除するように編集されているゲノムを含む改変初代ヒト細胞またはその集団を提供する。ゲノムＤＮＡの連続ストレッチは、初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびにその少なくとも１つが配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択されるリボ核酸の少なくとも１つのペア（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ ＰＤ１ ｇＲＮＡペア、例えば少なくとも１つのｇＲＮＡペア、少なくとも２つのｇＲＮＡペア、少なくとも３つのｇＲＮＡペア、少なくとも４つのｇＲＮＡペア、少なくとも５つのｇＲＮＡペアなど）とを接触させることによって欠失され得る。
本開示は、任意の細胞株または初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）集団におけるＰＤ１発現および／または活性を低減または排除して、Ｔ細胞阻害を低減または排除する細胞を生産することを企図する。ゲノム編集のために使用される初代ヒト細胞は、自己免疫障害、癌、慢性感染性疾患および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群より選択される障害を患っているか、該障害について処置されているか、該障害と診断されているか、該障害を発症するリスクを有するか、または該障害を有すると疑われる被験体から得られ得る。細胞はまた、該障害を患っていないか、該障害について処置されていないか、該障害と診断されていないか、該障害を有すると疑われないか、または該障害を発症する高いリスクを有しない正常健常被験体から得られ得る。
本発明は、初代ヒト細胞を、ＰＤ１遺伝子配列を切断するようにゲノム編集すること、およびこのような細胞のゲノムを、１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＴＬＡ４、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、Ｂ２Ｍなど）を変化させるように編集することを企図する。１つまたはそれを超える本明細書に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアを使用したＰＤ１遺伝子配列の切断は、ＰＤ１ゲノムＤＮＡ配列（例えば、配列番号７８７）の部分的なまたは完全な欠失をもたらし得ると認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、各細胞が、（ｂ）２番染色体上のＰＤ１遺伝子が、隣接上流エクソンの少なくとも一部および隣接下流エクソンの少なくとも一部に隣接するイントロンを含むゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させるように編集されており、ゲノムＤＮＡの欠失された第２の連続ストレッチの５’末端の上流のゲノムＤＮＡの３’末端が、ゲノムＤＮＡの欠失された第２の連続ストレッチの３’末端の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合されて、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠く２番染色体上の改変ＰＤ１遺伝子が生じ、それにより、該細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するゲノム改変（例えば、第２のゲノム改変）を含む改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。
当業者であれば、ＰＤ１ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチの欠失は、ＰＤ１遺伝子におけるエクソンをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡの任意のペアであって、第１のＰＤ１ ｇＲＮＡが、第１のエクソンの下流の第２のエクソンの上流に存在する第１のエクソンをターゲティングする任意のペアを使用して達成され得ることを認識するであろう。同様に、この戦略を使用して任意のエクソンペアをターゲティングして、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチの切断をもたらし得、その結果、このように改変された細胞のＤＮＡ修復機構は、第１のエクソンにおけるＰＤ１ ｇＲＮＡ切断部位の上流のゲノムＤＮＡの３’末端を、ＰＤ１ ｇＲＮＡ切断部位の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合する。この戦略の例は、配列番号４６２（ＣＲ１）および配列番号４２１（ＣＲ２）を含むリボ核酸の第１のペアを使用して、図１３Ａおよび図１３Ｂに示されている。このような例では、ＰＤ１ ｇＲＮＡの第１のペアは、ＰＤ１遺伝子のエクソン２およびエクソン３をターゲティングすることが示されている。当然のことながら、ＰＤ１遺伝におけるの任意の２つの隣接エクソンは、この戦略を使用してターゲティングされ得る（例えば、エクソン１およびエクソン２、エクソン３および４、エクソン４および５）。ＰＤ１ ｇＲＮＡの第１のペアの各ＰＤ１ ｇＲＮＡが、各隣接ＰＤ１エクソンにおける１つのＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ ＰＤ１標的モチーフに配向される限り、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ ＰＤ１標的モチーフを含有するこのようなＰＤ１エクソンの任意の部分は、この戦略を使用してターゲティングされ得ることをさらに認識すべきである。換言すれば、戦略を達成するために、当業者であれば、第１のエクソンにおけるモチーフをターゲティングする配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５の中から第１のＰＤ１ ｇＲＮＡを選択し、次いで、第１のエクソンの上流または下流の第２の（例えば、隣接）エクソンにおけるモチーフをターゲティングする配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５の中から第２のＰＤ１ ｇＲＮＡを選択しさえすればよい。このようにして、ｇＲＮＡの第１のペアは、細胞におけるＣａｓタンパク質をそれぞれ第１および第２のエクソンにガイドし、それらのエクソンおよびイントロン（またはそれらの間の任意の他の配列）を切断し、それにより、細胞のＤＮＡ修復機構が２つの切断部位においてゲノムＤＮＡに共有結合して、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠くＰＤ１遺伝子を有する改変細胞またはその集団を作ることを可能にするであろう。隣接エクソンのターゲティングに加えてまたは代えて、エクソンにおける切断部位間のゲノムＤＮＡ配列が欠失され、それらの切断部位に隣接するゲノムＤＮＡ配列が共有結合されて、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠くＰＤ１遺伝子を有する改変細胞またはその集団が生じるように、ｇＲＮＡの第１のペアは、ＰＤ１遺伝子における任意の２つのエクソン（例えば、エクソン１および３、エクソン１および４、エクソン１および５、エクソン２および４、エクソン２および５など）をターゲティングするように選択され得る。
以下の表４は、例示的なヒトＰＤ１遺伝子における５つの各エクソンのゲノム配列を示す。当業者であれば、本明細書に概説されるＰＤ１ターゲティング戦略を使用して、以下の表４に示されている配列番号７８８〜７９２を含むエクソンをターゲティングするために、配列番号１９６〜５３１および配列番号４０４７〜８９４５の中からＰＤ１ ｇＲＮＡのペアを容易に選択して、様々な方法でこのような戦略を行い得る。あるいは、当業者であれば、本明細書に概説されるＰＤ１ターゲティング戦略を使用して、以下の表４に示されている配列番号７８８〜７９２を含むエクソンをターゲティングするために、配列番号８９４６〜９１０１の中から少なくとも１つのＰＤ１ ｇＲＮＡを容易に選択して、様々な方法でこのような戦略を行い得る。この戦略を使用して欠失された上流エクソンの少なくとも一部および下流エクソンの少なくとも一部のサイズは、ＰＤ１ ｇＲＮＡがそれぞれの各エクソンにおける切断を指令する位置に依存する。例えば、上流エクソンにおける切断部位の下流のエクソンの全部分と、下流エクソンにおける切断部位の上流のエクソンの全部分とが、この戦略を使用して欠失されるであろう。したがって、この戦略を使用して、上流エクソンの５’末端に最も近い、かつ隣接下流エクソンの３’末端に最も近いモチーフをターゲティングするＰＤ１ ｇＲＮＡを選択することによって、標的エクソンのより大部分を欠失させ得る。反対に、上流エクソンの５’末端から最も遠い、かつ隣接下流エクソンの３’末端から最も遠いモチーフをターゲティングするＰＤ１ ｇＲＮＡを選択することによって、標的エクソンのより小部分を欠失させ得る。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、各細胞が、（ｂ）２番染色体上のＰＤ１遺伝子が、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第２の連続ストレッチ）を欠失させ、それにより、該細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第２の連続ストレッチ）が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペア（例えば、第２のペア）とを接触させることによって欠失されているゲノム改変（例えば、第２のゲノム改変）を含む改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。いくつかのの実施形態では、リボ核酸の第２のペアは、配列番号４６２および配列番号４２１を含む。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＰＤ１ポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列が切断され、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される方法を提供する。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、２つのリボ核酸は、配列番号４６２および配列番号４２１を含む。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、各細胞が、（ｂ）２番染色体上のＰＤ１遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８９４６〜９１０１からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変（例えば、第２のゲノム改変）を含む改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＰＤ１ポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、該少なくとも１つのリボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列が切断され、該リボ核酸が配列番号８９４６〜９１０１からなる群より選択される方法を提供する。特定の態様では、細胞における標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列に対するその後の変化は、標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列の第２の切断をもたらし、それにより、標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列を、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させるように編集する。
Ｔ細胞受容体α鎖（ＴＣＲＡ）およびＴ細胞受容体β鎖（ＴＣＲＢ）遺伝子座
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座（ＴＣＲＡ）またはそのホモログ、オルソログもしくは変異体である（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１３３、ＩＭＤ７、ＴＣＲＤ、ＴＲＡ＠、ＴＲＡＣとしても公知であり、本明細書ではＴＣＲａ、ＴＣＲＡ、ＴＣＲαなどと称される）。例示的なＴＣＲＡ、ヒト標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１４．９である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞受容体α遺伝子座（ＴＣＲＢ）またはそのホモログ、オルソログもしくは変異体である（Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９５７、ＴＣＲＢ；ＴＲＢ＠としても公知であり、本明細書ではＴＣＲｂ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲβなどと称される）。Ｔ−リンパ球による抗原認識は、Ｂ細胞によって作られた免疫グロブリンを使用したものと類似の機構を介して起こる。２つの主な成熟Ｔ細胞サブタイプが存在する（すなわち、αおよびβ鎖を発現するもの、ならびにγおよびδ鎖を発現するもの）。分泌型Ｉｇ分子とは対照的に、Ｔ細胞受容体鎖は膜結合しており、細胞間接触を介して機能する。Ｔ細胞受容体α鎖をコードする遺伝子は、１４番染色体上に集まっている。
Ｎ末端抗原認識ドメインをコードする少なくとも７０個の可変（Ｖ）遺伝子の１個が、６１個の連結（Ｊ）遺伝子セグメントの１個に再構成されて、機能的Ｖ領域エクソンが形成され、これが、Ｃ末端部分をコードする定常領域遺伝子（ＴＲＡＣ）セグメントに転写およびスプライシングされると、Ｔ細胞受容体α鎖が形成される。Ｎ末端抗原認識ドメインをコードする５２個の可変（Ｖ）遺伝子の１個が、多様性（Ｄ）遺伝子および連結（Ｊ）遺伝子に再構成されて、機能的Ｖ領域エクソンが形成され、これが、Ｃ末端部分をコードする定常（Ｃ）領域遺伝子セグメントに転写およびスプライシングされると、Ｔ細胞受容体β鎖が形成される。α鎖遺伝子座とは対照的に、β鎖遺伝子座は、Ｖ遺伝子の後に２個の別個の遺伝子クラスタを有し、それぞれがＤ遺伝子、いくつかのＪ遺伝子およびＣ遺伝子を含有する。合成後、αおよびβ鎖は一体化して、α−βＴ細胞受容体ヘテロダイマーが生成される（Ｊａｎｅｗａｙら、２００５）。
いくつかの態様では、本開示は、改変初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）またはその集団であって、１４番染色体上のＴＣＲα鎖遺伝子座が、遺伝子編集系（例えば、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなど）を使用して、該細胞またはその集団におけるＴＣＲ発現（例えば、細胞表面発現）および／または活性（例えば、タンパク質活性）を低減または排除するように編集されているゲノムを含む改変初代ヒト細胞またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、改変初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）またはその集団であって、１４番染色体上のＴＣＲα鎖遺伝子座が、例えばコードエクソンを含むゲノムＤＮＡの連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＴＣＲ発現（例えば、細胞表面発現）および／または活性（例えば、タンパク質活性）を低減または排除するように編集されているゲノムを含む改変初代ヒト細胞またはその集団を提供する。ゲノムＤＮＡの連続ストレッチは、初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択されるリボ核酸の少なくとも１つのペア（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ ＴＣＲＡ ｇＲＮＡペア、例えば少なくとも１つのｇＲＮＡペア、少なくとも２つのｇＲＮＡペア、少なくとも３つのｇＲＮＡペア、少なくとも４つのｇＲＮＡペア、少なくとも５つのｇＲＮＡペアなど）とを接触させることによって欠失され得る。
いくつかの態様では、本開示は、改変初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）またはその集団であって、７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座が、遺伝子編集系（例えば、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなど）を使用して、該細胞またはその集団におけるＴＣＲ発現（例えば、細胞表面発現）および／または活性（例えば、タンパク質活性）を低減または排除するように編集されているゲノムを含む改変初代ヒト細胞またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、改変初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）またはその集団であって、７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座が、例えばコードエクソンを含むゲノムＤＮＡの連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＴＣＲ発現（例えば、細胞表面発現）および／または活性（例えば、タンパク質活性）を低減または排除するように編集されているゲノムを含む改変初代ヒト細胞またはその集団を提供する。ゲノムＤＮＡの連続ストレッチは、初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択されるリボ核酸の少なくとも１つのペア（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ ＴＣＲＡ ｇＲＮＡペア、例えば少なくとも１つのｇＲＮＡペア、少なくとも２つのｇＲＮＡペア、少なくとも３つのｇＲＮＡペア、少なくとも４つのｇＲＮＡペア、少なくとも５つのｇＲＮＡペアなど）とを接触させることによって欠失され得る。
本開示は、任意の細胞株または初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）集団におけるＴＣＲ発現および／または活性を低減または排除して、自己反応性を低減または排除する細胞を生産することを企図する。本開示はさらに、初代ヒト細胞を、ＴＣＲα鎖遺伝子座および／またはＴＣＲβ鎖遺伝子座配列を切断するようにゲノム編集すること、ならびにこのような細胞のゲノムを、１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１および／またはＢ２Ｍ）を変化させるように編集することを企図する。本明細書に記載される１つまたはそれを超えるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアおよびＣａｓタンパク質を使用したＴＣＲα鎖遺伝子座配列および／またはＴＣＲβ鎖遺伝子座配列の切断は、標的ＴＣＲα鎖遺伝子座および／またはＴＣＲβ鎖遺伝子座ＤＮＡ配列（例えば、コードエクソン、例えば第１のコードエクソン）の部分的なまたは完全な欠失をもたらし得ると認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、各細胞が、（ｃ）（ｉ）１４番染色体上のＴＣＲα鎖遺伝子座が、コードエクソンの少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第３の連続ストレッチ）を欠失させるように編集されているゲノム改変（例えば、第３のゲノム改変）、および／または（ｃ）（ｉｉ）７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座が、コードエクソンの少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第４の連続ストレッチ）を欠失させるように編集されているゲノム改変（例えば、第４のゲノム改変）を含む改変ゲノムを含み、１４番染色体上のＴＣＲα鎖遺伝子座からのゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失、および／または７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座からのゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失が、該細胞またはその集団におけるＴＣＲ表面発現および／またはＴＣＲ活性を低減または排除する改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、各細胞が、（ｃ）（ｉ）１４番染色体上のＴＣＲα鎖遺伝子座が、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第３の連続ストレッチ）を欠失させ、それにより、該細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変（例えば、第３のゲノム改変）を含む改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第３の連続ストレッチ）は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペア（例えば、第３のペア）とを接触させることによって欠失されている。いくつかの実施形態では、リボ核酸の第３のペアは、配列番号５５０および配列番号５７３を含む。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、各細胞が、（ｃ）（ｉｉ）７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座が、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第４の連続ストレッチ）を欠失させ、それにより、該細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変（例えば、第４のゲノム改変）を含む改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第４の連続ストレッチ）は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペア（例えば、第４のペア）とを接触させることによって欠失されている。いくつかの実施形態では、リボ核酸の第４のペアは、配列番号７７３および配列番号７７８を含む。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＴＲＣＡポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列が切断され、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される方法を提供する。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、２つのリボ核酸は、配列番号５５０および配列番号５７３を含む。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＴＲＣＢポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列が切断され、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０３２１からなる群より選択される方法を提供する。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０３２１からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、２つのリボ核酸は、配列番号６５７および配列番号６６２を含む。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、各細胞が、（ｃ）（ｉ）１４番染色体上のＴＣＲα鎖遺伝子座が、該細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変（例えば、第３のゲノム改変）を含む改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、第３のゲノム改変は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号９７５１−９７９７からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって起こる。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、各細胞が、（ｃ）（ｉｉ）７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座が、該細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変（例えば、第４のゲノム改変）を含む改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、第４のゲノム改変は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号１０５３３〜１０５７３からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって起こる。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＴＲＣＡポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、該少なくとも１つのリボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列が切断され、該リボ核酸が配列番号９７５１〜９７９７からなる群より選択される方法を提供する。特定の態様では、細胞における標的ＴＲＣＡポリヌクレオチド配列に対するその後の変化は、標的ＴＲＣＡポリヌクレオチド配列の第２の切断をもたらし、それにより、標的ＴＲＣＡポリヌクレオチド配列を、ゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチを欠失させるように編集する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＴＲＣＢポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、該少なくとも１つのリボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列が切断され、該リボ核酸が配列番号１０５３３〜１０５７３からなる群より選択される方法を提供する。特定の態様では、細胞における標的ＴＲＣＢポリヌクレオチド配列に対するその後の変化は、標的ＴＲＣＢポリヌクレオチド配列の第２の切断をもたらし、それにより、標的ＴＲＣＢポリヌクレオチド配列を、ゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチを欠失させるように編集する。
β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、β２−ミクログロブリンである（Ｂ２Ｍ；Ｇｅｎｅ ＩＤ：５６７）。Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列は、実質的にすべての有核細胞の表面上で発現される主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の重鎖に関連する血清タンパク質をコードする。Ｂ２Ｍタンパク質は、特定の病的症状においてアミロイド原線維を形成することが見出されたβプリーツシート構造を含む。Ｂ２Ｍ遺伝子は、約８ｋｂに及ぶ４つのエクソンを有する。Ｂ２Ｍは、正常個体の血清中で観察され、ウィルソン病、カドミウム中毒、および腎尿細管機能不全につながる様々な症状を有する患者由来の尿中では多量に観察されている。Ｂ２Ｍに関連することが公知の他の病的症状としては、限定されないが、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるホモ接合突然変異（例えば、ａｌａ１１ｐｒｏ）（これは、家族性異化亢進性低タンパク血症を有する個体において報告されている）、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるヘテロ接合突然変異（例えばａｓｐ７６ａｓｎ）（これは、家族性内臓アミロイドーシスを有する個体において報告されている）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍの変異体である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのホモログである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのオルソログである。
いくつかの態様では、本開示は、改変初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）またはその集団であって、１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子が、遺伝子編集系（例えば、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなど）を使用して、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む改変初代ヒト細胞またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、１５番染色体上のＢ２Ｍ遺伝子が、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿＿０１２９２０．１のゲノムＤＮＡの連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。ゲノムＤＮＡの連続ストレッチは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３７１９からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
本開示は、任意の細胞株または初代ヒト細胞集団（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現を除去して、移植（例えば、同種移植）した場合に望ましくない宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減または排除する細胞を生産することを企図する。Ｂ２Ｍは、ＭＨＣクラスＩタンパク質の補助鎖であり、細胞表面上におけるＭＨＣクラスＩタンパク質の発現に必要である。表面ＭＨＣクラスＩを欠く人工細胞（例えば、突然変異細胞）は、人工細胞を宿主に投与した場合に、人工細胞が細胞傷害性Ｔ細胞によって検出される可能性を低減し得ると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、細胞または細胞集団におけるＢＭ２をコードする標的ポリヌクレオチド配列の切断は、得られる１つまたは複数の細胞を被験体に投与した場合に、該細胞が宿主免疫応答をトリガーする可能性を低減する。
本発明は、初代ヒト細胞を、Ｂ２Ｍ遺伝子配列を切断するようにゲノム編集すること、およびこのような細胞のゲノムを、１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＴＣＲＡおよび／またはＴＣＲＢ）を変化させるように編集することを企図する。本明細書に記載される１つまたはそれを超えるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアおよびＣａｓタンパク質を使用したＢ２Ｍゲノム配列の切断は、標的Ｂ２Ｍゲノム配列の部分的なまたは完全な欠失をもたらし得ると認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、各細胞が、（ｄ）１５番染色体上のＢ２Ｍ遺伝子が、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第５の連続ストレッチ）を欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変（例えば、第５のゲノム改変）を含む改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第５の連続ストレッチ）は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号７６６〜７８０および１０５７４−１３２５７からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペア（例えば、第５のペア）とを接触させることによって欠失されている。いくつかのの実施形態では、リボ核酸の第５のペアは、配列番号７７３および配列番号７７８を含む。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列が切断され、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７からなる群より選択される方法を提供する。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、リボ核酸の第５のペアは、配列番号７７３および配列番号７７８を含む。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団であって、各細胞が、（ｄ）１５番染色体上のＢ２Ｍ遺伝子が、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変（例えば、第５のゲノム改変）を含む改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、第５のゲノム改変は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号１３２５８〜１３７１９からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって起こる。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、該Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、該少なくとも１つのリボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、該標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列が切断され、該リボ核酸が配列番号１３２５８−１３７１９からなる群より選択される方法を提供する。特定の態様では、細胞における標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列に対するその後の変化は、標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列の第２の切断をもたらし、それにより、標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列を、ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチを欠失させるように編集する。
キメラ抗原受容体
本発明の態様は、キメラ抗原受容体を含むように改変された初代ヒト細胞に関する。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫細胞を、細胞表面上で発現される特定の分子標的にターゲティングするように設計された分子である。最も基本的な形態では、それらは、細胞に導入された受容体であって、特異性ドメインがその標的と相互作用すると、細胞が活性化するように、細胞の外側で発現される特異性ドメインを細胞の内側のシグナル伝達経路にカップリングする受容体である。多くの場合、ＣＡＲは、ｓｃＦｖまたはいくつかの種類の受容体などの特異性ドメインがＴＣＲのシグナル伝達ドメインに融合されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の変異体から作製される。次いで、これらの構築物をＴ細胞に導入し、標的抗原を発現する細胞の存在下でＴ細胞を活性化すると、活性化Ｔ細胞が標的細胞を非ＭＨＣ依存的に攻撃する（Ｃｈｉｃａｙｂａｍら、（２０１１）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：２９４−３１１を参照のこと）。現在、様々な異なる癌の処置のために、様々な腫瘍抗原をターゲティングする腫瘍特異的ＣＡＲが臨床で試験されている。これらの癌およびターゲティングされるそれらの抗原の例としては、濾胞性リンパ腫（ＣＤ２０またはＧＤ２）、神経芽細胞腫（ＣＤ１７１）、非ホジキンリンパ腫（ＣＤ２０）、リンパ腫（ＣＤ１９）、膠芽細胞腫（ＩＬ１３Ｒα２）、慢性リンパ性白血病またはＣＬＬおよび急性リンパ性白血病またはＡＬＬ（両方ともＣＤ１９）が挙げられる。ＨＩＶなどのウイルスを有する細胞を攻撃するために、ウイルス特異的ＣＡＲも開発されている。例えば、ＨＩＶの処置のために、Ｇｐ１００に特異的なＣＡＲを使用して、臨床試験が開始された（Ｃｈｉｃａｙｂａｍ、前掲）。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、リンパ球におけるシグナル伝達に関与する免疫受容体に連結された特異性または認識（すなわち、結合）ドメインを含む人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。典型的には、結合ドメインは、特異性ドメイン内の抗体鎖間のフレキシブルリンカーの導入を介して一本鎖ｓｃＦｖにされたＦａｂ抗体断片に由来する。他の可能な特異性ドメインは、ホルモンまたはサイトカイン分子のシグナル伝達部分、受容体の細胞外ドメイン、およびライブラリー（例えば、ファージ）スクリーニングによって単離されたペプチドリガンドまたはペプチドを含み得る（Ｒａｍｏｓ ａｎｄ Ｄｏｔｔｉ，（２０１１）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏ Ｔｈｅｒ １１（７）：８５５を参照のこと）。ＣＡＲのシグナル伝達部分と結合部分との間のフレキシビリティは、標的ドメインと結合ドメインとの間のより最適な相互作用を可能にするための望ましい特徴であり得るので、多くの場合、ヒンジ領域が含まれる。使用され得る構造の一例は、ＩｇＧ分子などの免疫グロブリン由来のＣＨ２−ＣＨ３領域である。典型的なＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ζ鎖などのＴＣＲ−ＣＤ３複合体の細胞内ドメインを含む。あるいは、Ｆｃ受容体のγ鎖が使用され得る。典型的なＣＡＲの膜貫通部分は、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２８などのタンパク質の膜貫通部分を含み得る（Ｒａｍｏｓ ａｎｄ Ｄｏｔｔｉ、前掲）。いくつかのＣＡＲの特徴としては、Ｔ細胞特異性および反応性を選択標的に非ＭＨＣ依存的に再配向させる能力が挙げられる。非ＭＨＣ依存的な標的認識は、抗原プロセシングとは無関係に標的を認識して腫瘍回避の主な機構の回避する能力を、ＣＡＲを発現するＴ細胞に与える。
本発明の改変細胞、組成物、方法、およびキットにおける使用が企図される少なくとも３つの異なる世代のキメラ抗原受容体が図２に示されている。いわゆる「第１世代」ＣＡＲは、多くの場合、ＣＤ３ζ鎖などの単一の内部シグナル伝達ドメインを含み、おそらくは不完全な活性化により臨床ではやや無力であると考えられる。これらのＣＡＲを有するＴ細胞の性能を増加させるために、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、Ｌｃｋ、ＩＣＯＳおよびＤＡＰ１０などの他の受容体の細胞間ドメインに由来することが多い別の刺激ドメインを含めることによって、Ｔ細胞のさらなる活性化シグナルを証明する能力を有する第２世代ＣＡＲが作製された。加えて、ＣＡＲが３つまたはそれを超える刺激ドメインを含有する第３世代ＣＡＲも開発された（Ｒａｍｏｓ ａｎｄ Ｄｏｔｔｉ、前掲）。いくつかの場合では、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、場合により、ＣＤ８を含む細胞内ヒンジドメインと、ＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとを含み得る。ＣＤ２８は、Ｔ細胞共刺激において重要なＴ細胞マーカーである。ＣＤ８もまた、Ｔ細胞マーカーである。４−１ＢＢは、強力な共刺激シグナルをＴ細胞に伝達して、分化を促進し、Ｔリンパ球の長期生存を増強する。ＣＤ３ζは、ＴＣＲと会合してシグナルを生成し、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。他の場合では、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、ＣＤ２８およびＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとを含み得る。さらなる場合では、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメインと、ＣＤ８を含む膜貫通ドメインと、ＣＤ２８およびＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとを含み得る。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）は、キメラ抗原受容体または該キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸をさらに含む。キメラ抗原受容体は、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原またはエピトープに特異的に結合する。多数の癌抗原が当技術分野で公知であり、特定のＣＡＲによってターゲティングされ得る。非限定的な例として、ＣＡＲによってターゲティングされ得る腫瘍関連抗原に関する表５を参照のこと（Ｒａｍｏｓ ａｎｄ Ｄｏｔｔｉ、前掲およびＯｒｅｎｔａｓら、（２０１２），Ｆｒｏｎｔ ｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２：１を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原に対する特異性を有し得、ＣＡＲの特異性ドメインは、ｓｃＦｖである。他の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原に特異的であり得、ＣＡＲの特異性ドメインは、リガンドまたはポリペプチドを含む。非限定的で例示的なＣＡＲとしては、ＣＤ３３（Ｄｕｔｏｕｒら、（２０１２）Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１２；２０１２：６８３０６５を参照のこと）、ＧＤ２（Ｌｏｕｉｓら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１８（２３）：６５０−６）、ＣＤ １９（Ｓａｖｏｌｄｏら、（２０１１）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２１（５）：１８２２およびＴｏｒｉｋａｉら、（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １１９（２４）：５６９７）、ＩＬ−１１Ｒα（Ｈｕａｎｇら、（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７２（１）：２７１−８１）、ＣＤ２０（Ｔｉｌｌら、（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １１９（１７）：３９４０−５０）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｓｃｈｕｂｅｒｔｈら、（２０１２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ２０１２．４８）、ＥｒｂＢ２（Ｚｈａｏら、（２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３（９）：５５６３−７４）、ＣＤ７０（Ｓｈａｆｆｅｒら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１６（１６）：４３０４−４３１４）、ＣＤ３８（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒａｙｙａら、（２０１２）Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃ Ｊ２（６）ｐ．ｅ７５）、ＣＤ２２（Ｈａｓｏら、（２０１２）Ｃａｎｃ Ｒｅｓ ７２（８）Ｓ１，ｄｏｉ：１１５８／１１５８−７４４５ ＡＭ２０１２−３５０４）、ＣＤ７４（Ｓｔｅｉｎら、（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０４：３７０５−３７１１）、ＣＡＩＸ（Ｌａｍｅｒｓら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７（１）：７２−８２）ＳＴＥＡＰ１（標的の総説については、Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇら、（２０１２）Ｃａｎｃｅｒｓ ４：１９３−２１７を参照のこと）ＶＥＧＦ−Ｒ２（米国特許出願公開第２０１２０２１３７８３号）、葉酸受容体（国際公開第２０１２０９９９７３号）およびＩＬ−１３ Ｒａ（米国特許第７，５１４，５３７号）にターゲティングされるものが挙げられる。
改変細胞を介して送達される外因性分子
本発明の態様は、本発明の改変初代ヒト細胞またはその集団（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）を使用して外因性分子を細胞、組織または器官に送達し、該細胞、組織または器官における目的の生物学的活性／効果をモジュレートすることに関する。例えば、改変初代ヒト細胞またはその集団は、治療用生成物（例えば、抗炎症性Ｔｈ２型応答に対する自己免疫活性を媒介するための免疫調節サイトカインまたはそのアンタゴニスト、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｔｕｏｈｙ，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｍａｄａｍｅ Ｃｕｒｉｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅにさらに記載されているように、細胞をミエリンタンパク質にターゲティングし、活性ＣＮＳ病変におけるＴｈ１誘導およびマクロファージ活性化を阻害するための、ペプチドＭＢＰ８７−９９に特異的なＴ細胞ハイブリドーマへの、ＩＬ−４を構成的に発現するウイルスベクターの形質導入）または再生用生成物（例えば、損傷組織を修復し、新たな組織もしくは人工組織を生成し、またはその両方のためのもの、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）を中枢神経系（ＣＮＳ）に送達するための改変Ｔ細胞の使用、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を処置するための血小板由来成長因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）など）を、炎症および組織破壊の部位に送達し、細胞相互作用をモジュレートし（例えば、細胞間相互作用のモジュレーション、例えばシグナル伝達経路、アポトーシス誘導、停止エピトープ拡散、耐性誘導、耐性逆転および特異性プログラミングのモジュレーションなど）、またはそれ自体の遺伝子欠損を修正して疾患（例えば、自己免疫疾患）を改善するように改変され得る。
「外因性」分子は、細胞中に通常存在しないが、１つまたはそれを超える遺伝的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞に導入され得る分子である。「細胞における通常の存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、ニューロンの胚発生中にのみ存在する分子は、成人ニューロン細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全内因性分子の機能バージョンまたは正常機能内因性の分子の機能不全バージョンを含み得る。
外因性分子は、とりわけ、小分子、例えばコンビナトリアル化学プロセスによって作製されるもの、または高分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の改変誘導体、または上記分子の１つまたはそれよりも多くを含む任意の複合体であり得る。核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であり得；直鎖状、分岐状または環状であり得；任意の長さのものが挙げられる。核酸としては、二重鎖を形成することができるもの、および三重鎖形成核酸が挙げられる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および米国特許第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質としては、限定されないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、レコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられる。
外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば外因性タンパク質または核酸であり得る。このような場合では、外因性分子は、細胞における内因性分子のものよりも高い濃度で細胞に導入される。いくつかの場合では、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞に導入するための方法は当業者に公知であり、限定されないが、脂質媒介性の移入（すなわち、中性脂質およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的な注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられる。
いくつかの実施形態では、外因性分子は、融合分子（例えば、融合タンパク質または核酸）を含む。「融合」分子は、２つまたはそれを超えるサブユニット分子が好ましくは共有結合的に連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学種類の分子であり得るか、または異なる化学種類の分子であり得る。第１の種類の融合分子の例としては、限定されないが、融合タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの融合物）；融合核酸（例えば、上記融合タンパク質をコードする核酸）、および核酸とタンパク質との融合物（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系）が挙げられる。第２の種類の融合分子の例としては、限定されないが、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの融合物、および副溝結合物と核酸との融合物が挙げられる。
細胞における融合分子の発現は、細胞への融合分子の送達から、例えば融合タンパク質の場合には細胞への融合タンパク質の送達によって、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じ得、ポリヌクレオチドが転写され、転写産物が翻訳されて、融合タンパク質が生成される。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを細胞に送達するための方法は、本開示の他の箇所に示される。
本開示の目的のための「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照のこと）、および遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域（このような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接するか否かにかかわらない）を含む。したがって、遺伝子としては、必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位ならびに遺伝子座制御領域が挙げられる。
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報が遺伝子産物に変換されることを指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって生成されるタンパク質であり得る。遺伝子産物としては、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって改変されるＲＮＡ、ならびに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリストイル化，およびグリコシル化によって改変されるタンパク質も挙げられる。
遺伝子発現の「モジュレーション」は、遺伝子の発現レベルの変化を指す。発現のモジュレーションとしては、限定されないが、遺伝子活性化および遺伝子抑制が挙げられ得る。モジュレーションはまた、完全であり得る（この場合、すなわち、遺伝子発現は完全に不活性化されるか、または野生型レベルもしくはそれを超えて活性化される；または、それは部分的であり得、この場合、遺伝子発現は部分的に低減されるか、または野生型レベルの一部まで部分的に活性化される。「真核生物」細胞としては、限定されないが、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。
「作動的な連結」および「作動的に連結された」（または「作動可能に連結された」）という用語は、２つまたはそれを超える構成要素（例えば、配列要素）の並置に関して互換的に使用され、構成要素が両方とも正常に機能し、構成要素の少なくとも１つが、他の構成要素の少なくとも１つにより発揮される機能を媒介し得ることを可能にするように、構成要素は配置される。例示として、転写調節配列が、１つまたはそれを超える転写調節因子の存在または非存在に応じて、コード配列の転写のレベルを制御する場合、プロモーターなどの転写調節配列は、コード配列に作動的に連結されている。転写調節配列は、一般に、コード配列とシスで作動的に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーおよびコード配列が連続的ではないとしても、エンハンサーは、コード配列に作動的に連結された転写調節配列である。
融合ポリペプチドに関して、「作動的に連結された」という用語は、他の構成要素と連結された各構成要素が発揮する機能が、それがそのように連結されていない場合と同じであるという事実を指し得る。例えば、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することができる場合、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、作動的に連結されている。同様に、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが活性化または抑制ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、活性化ドメインが遺伝子発現をアップレギュレートすることができるか、または抑制ドメインが遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる場合、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化または抑制ドメインは、作動的に連結されている。
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然分子よりも多数の、少数のもしくはそれと同数の残基を有し得、および／または１つもしくはそれを超えるアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野で周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルタ結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって決定され得る。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。Ａｕｓｕｂｅｌら、前掲を参照のこと。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝的および生化学的の両方によって決定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号および国際公開第９８／４４３５０号を参照のこと。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指令することができる任意の核酸構築物であって、遺伝子配列を標的細胞に移入し得る任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクルならびに組み込みベクターを含む。
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、必須ではないが好ましくはルーチンなアッセイにおいて容易に測定されるタンパク質産物を生成する任意の配列を指す。適切なレポーター遺伝子としては、限定されないが、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）、ならびに細胞成長の増強および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が挙げられる。エピトープタグとしては、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つまたはそれを超えるコピーが挙げられる。「発現タグ」としては、目的の遺伝子の発現をモニタリングするための所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列が挙げられる。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒト細胞またはその集団は、隣接細胞、組織または器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つの外因性タンパク質または該タンパク質をコードする外因性核酸をさらに含む。
改変細胞を生産するための方法
本発明の態様は、改変初代ヒト細胞（例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞など）を生産するための方法に関する。いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法は、（ａ）初代ヒトＴ細胞またはその集団における２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第１の連続ストレッチ）を欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集する工程を含む。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法は、（ｂ）該細胞またはその集団における２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第２の連続ストレッチ）を欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集する工程を含む。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法は、（ｃ）（ｉ）該細胞またはその集団における１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子を、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第３の連続ストレッチ）を欠失させるように編集する工程、ならびに／または（ｃ）（ｉｉ）該細胞またはその集団における７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子を、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第４の連続ストレッチ）を欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集する工程を含む。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法は、（ｄ）該細胞またはその集団における１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第５の連続ストレッチ）を欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集する工程を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）〜（ｄ）における編集工程は、該細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ａ）における該遺伝子からゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第１の連続ストレッチ）を欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つのペア（例えば、第１のペア）、（ｂ）における該遺伝子からゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第２の連続ストレッチ）を欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つのペア（例えば、第２のペア）、（ｃ）（ｉ）における該遺伝子からゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第３の連続ストレッチ）を欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つのペア（例えば、第３のペア）、および／または（ｃ）（ｉｉ）における該遺伝子からゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第４の連続ストレッチ）を欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つのペア（例えば、第４のペア）、ならびに（ｄ）における該遺伝子からゲノムＤＮＡの連続ストレッチ（例えば、第５の連続ストレッチ）を欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つのペア（例えば、第５のペア）とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法は、（ｅ）（ｉ）該細胞またはその集団が、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原もしくはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体を発現するようにする工程、ならびに／または（ｅ）（ｉｉ）該細胞またはその集団が、隣接細胞、組織もしくは器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つのタンパク質を発現するようにする工程を場合により含む。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法であって、（ａ）初代ヒトＴ細胞またはその集団における２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子を、隣接上流エクソンの少なくとも一部および隣接下流エクソンの少なくとも一部に隣接するイントロンを含むゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させるように編集し、ゲノムＤＮＡの欠失された第１の連続ストレッチの５’末端の上流のゲノムＤＮＡの３’末端を、ゲノムＤＮＡの欠失された第１の連続ストレッチの３’末端の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合して、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠く２番染色体上の改変ＣＴＬＡ４遺伝子を生じさせ、それにより、該細胞またはその集団におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除すること；ならびに／または（ｂ）初代ヒトＴ細胞またはその集団における２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を、隣接上流エクソンの少なくとも一部および隣接下流エクソンの少なくとも一部に隣接するイントロンを含むゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させるように編集し、ゲノムＤＮＡの欠失された第２の連続ストレッチの上流のゲノムＤＮＡの３’末端を、ゲノムＤＮＡの欠失された第２の連続ストレッチの３’末端の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合して、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠く２番染色体上の改変ＰＤ１遺伝子を生じさせ、それにより、該細胞またはその集団におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除することを含む方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法であって、（ａ）初代ヒトＴ細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させ、それにより、２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させ、該細胞またはその集団におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること；ならびに／または（ｂ）初代ヒトＴ細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第２のペアとを接触させ、それにより、２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させ、該細胞またはその集団におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、リボ核酸の第１のペアは配列番号１２８および配列番号７２を含み、リボ核酸の第２のペアは配列番号４６２および配列番号４２１を含む。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法は、（ｃ）（ｉ）該細胞またはその集団における１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子を、コードエクソンの少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチを欠失させるように編集すること、および／または（ｃ）（ｉｉ）該細胞またはその集団における７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子を、コードエクソンの少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集することをさらに含む。いくつかの実施形態では、（ｃ）（ｉ）における編集工程は、該細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第３のペアとを接触させることを含み、ならびに／または（ｃ）（ｉｉ）における編集工程は、該細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第４のペアとを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の第３のペアは配列番号５５０および配列番号５７３を含み、ならびに／またはリボ核酸の第４のペアは配列番号６５７および配列番号６６２を含む。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法は、（ｄ）該細胞またはその集団における１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集することをさらに含む。いくつかの実施形態では、（ｄ）における編集工程は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第５のペアとを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の第５のペアは、配列番号７７３および配列番号７７８を含む。
いくつかの態様では、本発明は、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法であって、（ａ）初代ヒトＴ細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号３６３８〜４０４６からなる群より選択される配列を有する第１のリボ核酸とを接触させ、それにより、２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子を、該細胞またはその集団におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること；ならびに／または（ｂ）初代ヒトＴ細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号８９４６〜９１０１からなる群より選択される配列を有する第２のリボ核酸とを接触させ、それにより、２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を、該細胞またはその集団におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集することを含む方法を提供する。
特定の態様では、細胞における標的ＴＲＣＢポリヌクレオチド配列に対するその後の変化は、標的ＴＲＣＢポリヌクレオチド配列の第２の切断をもたらし、それにより、標的ＴＲＣＢポリヌクレオチド配列を、ゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチを欠失させるように編集する。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法は、（ｃ）（ｉ）該細胞またはその集団における１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子を編集すること、および／または（ｃ）（ｉｉ）該細胞またはその集団における７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子を編集し、それにより、該細胞またはその集団におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除することをさらに含む。いくつかの実施形態では、（ｃ）（ｉ）における編集工程は、該細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号９７５１〜９７９７からなる群より選択される配列を有する第３のリボ核酸とを接触させることを含み、ならびに／または（ｃ）（ｉｉ）における編集工程は、該細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号１０５３３〜１０５７３からなる群より選択される配列を有する第４のリボ核酸とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法は、（ｄ）該細胞またはその集団における１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を編集し、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除することをさらに含む。いくつかの実施形態では、（ｄ）における編集工程は、該細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号１３２５８〜１３７１９からなる群より選択される配列を有する第５のリボ核酸とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢおよび／またはＢ２Ｍ）の編集は、遺伝子のポリヌクレオチド配列の切断をもたらす。特定の態様では、改変初代ヒトＴ細胞を生産するための方法のその後の適用は、その遺伝子のポリヌクレオチド配列の第２の切断を引き起こし、それにより、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチを欠失させる。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法は、細胞またはその集団が、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原もしくはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体を発現するようにすることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、改変初代ヒトＴ細胞またはその集団を生産するための方法は、細胞またはその集団が隣接細胞、組織または器官の近傍にある場合に、該細胞またはその集団が、該隣接細胞、組織または器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つのタンパク質を発現するようにすることをさらに含む。
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、様々な方法で標的ポリヌクレオチド配列を切断し得ることを認識すべきである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖切断が生じるように切断される。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖切断が生じるように切断される。
細胞における任意の標的ポリヌクレオチド配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の少なくとも１つのリボ核酸がＣａｓタンパク質を標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズすることを可能にする適切な標的モチーフを含有する限り、本発明の方法は、細胞における任意の標的ポリヌクレオチド配列を変化させるために使用され得る。当業者であれば、特定のポリヌクレオチドをターゲティングする標的モチーフは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびターゲティングすべきポリヌクレオチドの配列に依存することを認識するであろう。
いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、少なくとも２０ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＲＧモチーフの直前にある。いくつかの態様では、ＮＲＧモチーフは、ＮＧＧまたはＮＡＧである。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＡＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、Ｇで始まる２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧである。いくつかの実施形態は、標的モチーフは、（Ｎ）２０ＮＧＧである。
いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＧＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＧＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＮＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＮＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＡＧＡＡＷモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、ＮＮＡＧＡＡＷモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＮＮＧＡＴＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＮＮＧＡＴＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＡＡＡＡＣモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＡＡＡＡＣモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、５’Ｔリッチ領域（例えば、ＴＴＴＮモチーフ）を有する１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、５’Ｔリッチ領域（例えば、ＴＴＴＮモチーフ）を有する２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。
いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるＮＲＧモチーフ（例えば、ＮＧＧまたはＮＡＧ）の直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるＮＮＧＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるＮＮＮＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるＮＮＡＧＡＡＷモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるＮＮＮＮＧＡＴＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるＮＡＡＡＡＣモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ Ｃｐｆ１タンパク質によって認識される５’Ｔリッチ領域（例えば、ＴＴＴＮモチーフ）を有する１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。
本発明の標的モチーフは、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のオフターゲット効果を最小化するように選択され得る。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される。当業者であれば、様々な技術が、オフターゲット効果を最小化するための適切な標的モチーフを選択するために使用され得ることを認識するであろう（例えば、バイオインフォマティクス分析）。
いくつかの実施形態では、標的モチーフは、ＣＴＬＡ遺伝子におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、ＰＤ１遺伝子におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、ＴＣＲＡ遺伝子におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、ＴＣＲＢ遺伝子におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的モチーフは、配列番号７８２におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、配列番号７８３におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、配列番号７８４におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、配列番号７８５におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、配列番号７８６におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、配列番号７８７におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、配列番号７８８におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、配列番号７８９におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、配列番号７９０におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、配列番号７９１におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、配列番号７９２におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的モチーフまたは標的モチーフの少なくとも一部は、配列番号１〜１９５および７９７〜４０４６からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフまたは標的モチーフの少なくとも一部は、配列番号１９６〜５３１および４０４７〜９１０１からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフまたは標的モチーフの少なくとも一部は、配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７９７からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフまたは標的モチーフの少なくとも一部は、配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５７３からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフまたは標的モチーフの少なくとも一部は、配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３７１９からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的モチーフは、ＣＴＬＡ遺伝子におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列と比較して、少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、ＰＤ１遺伝子におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列と比較して、少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、ＴＣＲＡ遺伝子におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列と比較して、少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、ＴＣＲＢ遺伝子におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列と比較して、少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列と比較して、少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的モチーフまたは標的モチーフの少なくとも一部は、配列番号１〜１９５および７９７〜２６０２からなる群より選択されるＤＮＡ配列におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列と比較して、少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフまたは標的モチーフの少なくとも一部は、配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８１２８からなる群より選択されるＤＮＡ配列におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列と比較して、少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフまたは標的モチーフの少なくとも一部は、配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９５４５からなる群より選択されるＤＮＡ配列におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列と比較して、少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフまたは標的モチーフの少なくとも一部は、配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０３２１からなる群より選択されるＤＮＡ配列におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列と比較して、少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的モチーフまたは標的モチーフの少なくとも一部は、配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１２３００からなる群より選択されるＤＮＡ配列におけるＧ（Ｎ）１９ＮＧＧまたは（Ｎ）２０ＮＧＧのＤＮＡ配列と比較して、少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを含むＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）を使用して標的ポリヌクレオチド配列を修正する。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）が起こる。いくつかの実施形態では、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）は、外因性導入ＤＮＡ修復鋳型を使用して実施される。外因性導入ＤＮＡ修復鋳型は、一本鎖または二本鎖であり得る。外因性導入ＤＮＡ修復鋳型は、任意の長さのものであり得る。当業者であれば、任意の特定のＤＮＡ修復鋳型の長さは、修正すべき標的ポリヌクレオチド配列に依存することを認識するであろう。ＤＮＡ修復鋳型は、任意の標的ポリヌクレオチド配列、特に疾患関連多型（例えば、ＳＮＰ）を含む標的ポリヌクレオチド配列を修復しまたは置き換えるように設計され得る。例えば、このようなＳＮＰを含む突然変異対立遺伝子の相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いて、突然変異対立遺伝子に隣接する２つの標的モチーフを選択し、野生型対立遺伝子にマッチするＤＮＡ修復鋳型を設計することによって達成され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、およびＣａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズすることができる少なくとも１〜２つのリボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、およびＣａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズすることができるリボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ）の少なくとも１つのペアを含む。本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ペプチド結合（すなわち、アミノ酸のポリマー）によって結合された一連のアミノ酸残基を指すために互換的に使用され、改変アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含む。例示的なポリペプチドまたはタンパク質としては、上記ものの遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、パラログ、断片および他の等価物、変異体ならびに類似体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれを超えるアミノ酸置換基または改変を含む。いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超えるアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの場合では、置換および／または改変は、タンパク質分解を防止もしくは低減し、および／または細胞におけるポリペプチドの半減期を延長し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ペプチド結合置換（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素など）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、代替アミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、部分を含む改変（例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、末端キャッピングなど）を含み得る。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、コアＣａｓタンパク質を含む。例示的なＣａｓコアタンパク質としては、限定されないが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８およびＣａｓ９が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、大腸菌サブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ２としても公知）を含む。大腸菌サブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４およびＣａｓ５ｅが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＹｐｅｓｔサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ３としても公知）を含む。Ｙｐｅｓｔサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３およびＣｓｙ４が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮｍｅｎｉサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ４としても公知）を含む。Ｎｍｅｎｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｎ１およびＣｓｎ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＤｖｕｌｇサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ１としても公知）を含む。Ｄｖｕｌｇサブタイプの例示的Ｃａｓタンパク質としては、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２およびＣａｓ５ｄが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＴｎｅａｐサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ７としても公知）を含む。Ｔｎｅａｐサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２およびＣａｓ５ｔが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質を含む。Ｈｍａｒｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２およびＣａｓ５ｈが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＡｐｅｒｎサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ５としても公知）を含む。Ａｐｅｒｎサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５およびＣａｓ５ａが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＭｔｕｂｅサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ６としても公知）を含む。Ｍｔｕｂｅサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４およびＣｓｍ５が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質を含む。例示的なＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質としては、限定されないが、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５およびＣｍｒ６が挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。Ｃａｓ９タンパク質は、典型的には、トランス−コード小ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）およびＣａｓタンパク質を含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のメンバーである。Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９／Ｃｓｎ１としても公知）は、１３６８アミノ酸を含むポリペプチドである。Ｃａｓ９タンパク質の例示的なアミノ酸配列（配列番号７８１）は、図４に示されている。Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡに非相補的な標的ＤＮＡを切断するＲｕｖＣ−様ドメイン（残基７〜２２、７５９〜７６６および９８２〜９８９）およびｃｒＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡを切断するＨＮＨヌクレアーゼドメイン（残基８１０〜８７２）を含む２つのエンドヌクレアーゼドメインを含有する。図４では、ＲｕｖＣ様ドメインは黄色で強調されており、ＨＮＨヌクレアーゼドメインは下線が付されている。
［０１２９］いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種由来のＣｐｆ１またはその機能的部分である。いくつかの態様では、Ｃｐｆ１は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの態様では、Ｃｐｆ１は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの態様では、Ｃｐｆ１は、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６タンパク質またはその機能的部分である。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系のメンバーである。Ｃｐｆ１タンパク質は、約１３００アミノ酸を含むポリペプチドである。Ｃｐｆ１は、ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有する。Ｃｐｆ１は、単一のリボヌクレアーゼドメインを使用して、互い違いのパターンで標的ＤＮＡを切断する。互い違いのＤＮＡ二本鎖切断は、４または５ｎｔの５’オーバーハングをもたらす。
本明細書で使用される場合、「機能的部分」は、少なくとも１つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体形成し、標的ポリヌクレオチド配列を切断する能力を保持するペプチドの一部を指す。いくつかの実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインからなる群より選択される作動可能に連結されたＣａｓ９タンパク質機能ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインからなる群より選択される作動可能に連結されたＣｐｆ１タンパク質機能ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、機能ドメインは、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。
本発明は、標的ポリヌクレオチド配列とＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）とを接触させる様々な方法を企図することを認識すべきである。いくつかの実施形態では、外因性Ｃａｓタンパク質は、ポリペプチド形態で細胞に導入され得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドにコンジュゲートまたは融合され得る。本明細書で使用される場合、「細胞透過性ポリペプチド」および「細胞透過性ペプチド」は、それぞれ、細胞への分子の取り込みを促進するポリペプチドまたはペプチドを指す。細胞透過性ポリペプチドは、検出可能な標識を含有し得る。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、（例えば、正、負または全中性の電荷を有する）荷電タンパク質にコンジュゲートまたは融合され得る。このような連結は、共有結合性であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質の細胞透過能力を有意に増加させるために、Ｃａｓタンパク質は、超正荷電ＧＦＰに融合され得る（Ｃｒｏｎｉｃａｎら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１０；５（８）：７４７−５２）。特定の実施形態では、細胞への侵入を促進するために、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合され得る。例示的ＰＴＤとしては、Ｔａｔ、オリゴアルギニンおよびペネトラチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、超正荷電ＧＦＰに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、超正荷電ＧＦＰに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）をコードする核酸の形態で、標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入され得る。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の適切な技術によって達成され得る。適切な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、およびウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載される改変ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載される改変ｍＲＮＡ（例えば、合成改変ｍＲＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および少なくとも１〜２つのリボ核酸がをコードする核酸は、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞に導入される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１〜２つのリボ核酸と複合体形成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体形成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体形成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載される改変核酸（例えば、合成改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。
本発明の方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸の使用を企図する。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、単一のリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を細胞における標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、Ｃａｓタンパク質を細胞における標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸は両方とも、Ｃａｓタンパク質を細胞における標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。当業者であれば認識するように、本発明のリボ核酸は、用いられる特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および標的ポリヌクレオチドの配列に応じて、様々な異なる標的モチーフにハイブリダイズするように選択され得る。１〜２つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択され得る。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフ（これは、標的モチーフ間に位置する突然変異対立遺伝子に隣接する）に直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。
いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つは、配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７のリボ核酸配列からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つは、配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５のリボ核酸配列からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つは、配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０のリボ核酸配列からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つは、配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２のリボ核酸配列からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つは、配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７のリボ核酸配列からなる群より選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は、配列番号３６３８〜４０４６のリボ核酸配列からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は、配列番号８９４６〜９１０１のリボ核酸配列からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は、配列番号９７５１〜９７９７のリボ核酸配列からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は、配列番号１０５３３〜１０５７３のリボ核酸配列からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は、配列番号１３２５８〜１３７１９のリボ核酸配列からなる群より選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つは、配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７のリボ核酸配列からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つは、配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５のリボ核酸配列からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つは、配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０のリボ核酸配列からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つは、配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２のリボ核酸配列からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つは、配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７のリボ核酸配列からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は、配列番号３６３８〜４０４６のリボ核酸配列からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は、配列番号８９４６〜９１０１のリボ核酸配列からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は、配列番号９７５１〜９７９７のリボ核酸配列からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は、配列番号１０５３３〜１０５７３のリボ核酸配列からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は、配列番号１３２５８〜１３７１９のリボ核酸配列からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、Ｃａｓタンパク質を細胞における標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の同一鎖上の配列に相補的であり、および／またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の逆鎖上の配列に相補的であり、および／またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の逆鎖上の配列に相補的ではなく、および／またはハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の重複する標的モチーフに相補的であり、および／またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列のオフセット標的モチーフに相補的であり、および／またはハイブリダイズする。
本発明はまた、多重ゲノム編集を企図する。当業者であれば、単一遺伝子のゲノム編集に関する上記説明は、多重ゲノム編集の下記実施形態にも等しく適用可能であることを認識するであろう。
本明細書で使用される場合、「投与」「導入」および「移植」という用語は、所望の部位における導入細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、本発明の方法にしたがって変化された標的ポリヌクレオチド配列を含む本明細書に記載される細胞などの細胞を被験体に配置する文脈で互換的に使用される。細胞は、所望の部位に直接埋め込まれ得るか、または被験体における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得、埋め込まれた細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部は、依然として生存可能である。被験体への投与後の細胞の生存期間は、数時間、例えば２４時間〜数日間ほどの短いものから、数年間ほどの長いものであり得る。いくつかの場合では、埋め込まれた細胞を埋め込み位置に維持し、埋め込まれた細胞の遊走を防ぐために、細胞はまた、例えばカプセルで、所望の部位以外の位置、例えば肝臓または皮下に投与され得る。
エクスビボ方法では、細胞としては、自己細胞、すなわち、１つまたは複数の細胞における標的ポリヌクレオチド配列の変化を必要とする被験体由来の１つまたは複数の細胞（すなわち、ドナーおよびレシピエントは、同じ個体である）が挙げられ得る。自己細胞は、細胞のいかなる免疫系拒絶も回避する利点を有する。あるいは、細胞は、異種（例えば、ドナーから採取されたもの）であり得る。第２の被験体は、同じ種ものまたは異なる種のものであり得る。典型的には、細胞がドナー由来である場合、それらは、レシピエントと十分に免疫学的適合性のドナーに由来するであろう（すなわち、移植拒絶をもたらさず、免疫抑制の必要性を減少させるかまたは取り除く）。いくつかの実施形態では、細胞は、異種供給源（すなわち、レシピエントまたはレシピエントの種と十分に免疫学的適合性であるように遺伝子操作された非ヒト哺乳動物）から採取される。免疫学的適合性を決定するための方法は当技術分野で公知であり、ＨＬＡおよびＡＢＯ決定因子のドナー−レシピエント適合性を評価する組織適合検査が挙げられる。例えば、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｃｈ ａｎｄ Ａｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ，Ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ １９９４）を参照のこと。
任意の適切な細胞培養物培地が本発明のエクスビボ方法に使用され得る。
「被験体」および「個体」という用語は本明細書では互換的に使用され、例えば、細胞を取得可能であり、および／または本明細書に記載される細胞を用いた処置（予防的処置を含む）が提供される動物、例えばヒトを指す。ヒト被験体などの特定の動物に特異的な感染症、症状または疾患状態の処置について、被験体という用語は、その特定の動物を指す。本明細書で互換的に使用される場合、「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」は、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタおよび非ヒト霊長類などの哺乳動物を含む。「被験体」という用語はまた、限定されないが、哺乳動物、爬虫類、両生類および魚類を含む任意の脊椎動物を包含する。しかしながら、有利には、被験体は、哺乳動物、例えばヒトまたは他の哺乳動物、例えば家畜哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマなど、または畜産哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタなどである。
いくつかの実施形態では、変化は、標的ポリヌクレオチド配列の発現の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、変化は、標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトをもたらす。いくつかの実施形態では、変化は、望ましくない配列から所望の配列への標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。いくつかの実施形態では、各変化は、ホモ接合変化である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座における変化の効率は、約５％〜約８０％である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座における変化の効率は、約１０％〜約８０％である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座における変化の効率は、約３０％〜約８０％である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座における変化の効率は、約５０％〜約８０％である。いくつかの実施形態では、各遺伝子座における変化の効率は、約８０％を超えるかまたはそれに等しい。いくつかの実施形態では、各遺伝子座における変化の効率は、約８５％を超えるかまたはそれに等しい。いくつかの実施形態では、各遺伝子座における変化の効率は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるかまたはそれに等しい。いくつかの実施形態では、各遺伝子座における変化の効率は、約１００％である）。
いくつかの実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖切断が生じるように切断される。いくつかの実施形態では、各標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖切断が生じるように切断される。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＴＬＡ４の複数の異なる部分を含む。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＤ１の複数の異なる部分を含む。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＴＣＲＡの複数の異なる部分を含む。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＴＣＲＢの複数の異なる部分を含む。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍの複数の異なる部分を含む。
いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、５’Ｔリッチ領域を有する２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、Ｇで始まる２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧである。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、（Ｎ）２０ＮＧＧである。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。
いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＧＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＧＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＮＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＮＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＡＧＡＡＷモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり、ＮＮＡＧＡＡＷモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＮＮＧＡＴＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＮＮＧＡＴＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＡＡＡＡＣモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＡＡＡＡＣモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、５’Ｔリッチ領域（例えば、ＴＴＴＮモチーフ）を有する１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、各標的モチーフは、５’Ｔリッチ領域（例えば、ＴＴＴＮモチーフ）を有する２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列の切断に続いて、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）が起こる。いくつかの実施形態では、相同組換え修復は、外因性導入ＤＮＡ修復鋳型を使用して実施される。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復鋳型は、一本鎖である。いくつかの実施形態では、外因性導入ＤＮＡ修復鋳型は、二本鎖である。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）は、少なくとも１つのリボ核酸と複合体形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、複数のリボ核酸と複合体形成する。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーション（例えば、単一の標的ポリヌクレオチド配列の複数の変化）を最小化するように選択される。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーション（例えば、複数の標的ポリヌクレオチド配列の１つまたはそれを超える変化）を最小化するように選択される。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸はそれぞれ、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸はそれぞれ、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸はそれぞれ、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸はそれぞれ、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフ（これは、標的モチーフ間に位置する突然変異対立遺伝子に隣接する）に直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）は、単一のリボ核酸と複合体形成する。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーション（例えば、単一の標的ポリヌクレオチド配列の複数の変化）を最小化するように選択される。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーション（例えば、複数の標的ポリヌクレオチド配列の１つまたはそれを超える変化）を最小化するように選択される。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフ（これは、標的モチーフ間に位置する突然変異対立遺伝子に隣接する）に直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸またはリボ核酸（例えば、配列番号１〜７８０および７９７〜１３７１９）はいずれも、プラスミドから発現され得ることを認識すべきである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはリボ核酸はいずれも、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞および／または前駆細胞）における発現増加に最適化されたプロモーターを使用して発現される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素およびニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−１αプロモーターならびにユビキチンプロモーターからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｃａｓタンパク質を発現する細胞を選択することをさらに含む。本発明は、細胞を選択するための任意の適切な方法を企図する。いくつかの実施形態では、細胞の選択は、ＦＡＣＳを含む。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳは、Ｃａｓタンパク質と、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群より選択される蛍光タンパク質とを共発現する細胞を選択するために使用される。
処置方法
本発明は、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する様々な障害を処置および／または予防することを企図する。
本発明はまた、本発明の改変初代ヒト細胞、それらの細胞を含む組成物、および本発明の組成物（例えば、キメラ核酸）を使用する様々な処置方法を企図する。単離された細胞に適用される「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、細胞を任意の種類のプロセスもしくは条件に供すること、または細胞に対して任意の種類の操作もしくは手順を実施することを含む。被験体に適用される場合、この用語は標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、Ｂ２Ｍなど）が、本明細書に記載される方法にしたがってエクスビボで変化されている細胞または細胞集団を個体に投与することを指す。通常、個体は病気でありもしくは負傷しているか、または集団の平均メンバーと比べて病気になる高いリスクを有し、注意、世話または管理を必要とする。
本明細書で使用される場合、「処置すること」および「処置」という用語は、被験体が、疾患の少なくとも１つの症候の低減または疾患の改善、例えば有益なまたは所望の臨床結果を有するように、本明細書に記載される方法にしたがってエクスビボで変化された標的ポリヌクレオチド配列を有する有効量の細胞を被験体に投与することを指す。本発明の目的のために、有益なまたは望ましい臨床結果としては、限定されないが、検出可能または検出不可能にかかわらず、１つまたはそれを超える症候の緩和、疾患の程度の低下、疾患状態の安定化（すなわち、非悪化）、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または軽減、および（一部または完全にかかわらず）寛解が挙げられる。処置は、処置を受けていない場合の予想される生存と比較して、生存を延長することを指し得る。したがって、当業者であれば、処置は疾患状態を改善し得るが、疾患の完全な治癒ではない可能性があることを理解する。本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、予防を含む。あるいは、疾患進行が低減または中断される場合、処置は「有効」である。「処置」はまた、処置を受けていない場合の予想される生存と比較して、生存を延長することを意味する。処置を必要とするものとしては、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害と既に診断されたもの、および遺伝的感受性または他の要因によりこのような障害を発症する可能性があるのものが挙げられる。
疾患または障害の「処置」、「予防」または「改善」は、このような疾患または障害の発生の遅延または予防、進行、重症化または悪化、このような疾患または障害に関連する症状の進行または重症度の回復、緩和、改善、阻害、減速または停止を意味する。一実施形態では、疾患または障害の症候は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％緩和される。
本明細書に記載される方法および組成物は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列の発現の増加および標的ポリヌクレオチド配列の発現の減少に関連する障害を処置または予防するために使用され得ることを認識すべきである。標的ポリヌクレオチド配列の発現の増加および減少としては、正常発現および／または活性レベルと比較して、標的ポリヌクレオチド配列の発現レベルがそれぞれ増加または減少する状況、ならびに標的ポリヌクレオチド配列の発現産物の機能および／または活性レベルがそれぞれ増加または減少する状況が挙げられる。当業者であれば、標的ポリヌクレオチド配列の発現の増加に関連する障害の処置または予防は、細胞と本明細書に記載される組成物とを接触させた後に、標的ポリヌクレオチド配列（またはその発現産物）のレベルおよび／または活性が、関連細胞において減少しているかを決定することによって評価され得ることを認識するであろう。当業者であればまた、標的ポリヌクレオチド配列の発現の減少に関連する障害の処置または予防は、細胞と本明細書に記載される組成物とを接触させた後に、標的ポリヌクレオチド配列（またはその発現産物）のレベルおよび／または活性が、関連細胞における増加しているかを決定することによって評価され得ることを認識するであろう。
いくつかの実施形態では、障害は、癌である。本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、そのユニークな特質−正常な制御の喪失−が無秩序な成長、分化の欠如、局所的な組織浸潤および転移をもたらす細胞の過剰増殖と定義される。本発明の方法に関して、癌は、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、胞巣型横紋筋肉腫、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、肛門、肛門管または肛門直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部、胆嚢または胸膜の癌、鼻、鼻腔または中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液体腫瘍、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、大網、腸間膜の癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌および膀胱癌のいずれかを含む任意の癌であり得る。本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、特に具体的な指示がない限り、悪性型の細胞または組織の異常成長を指し、良性型組織を含まない。
いくつかの実施形態では、障害は、遺伝性障害である。いくつかの実施形態では、障害は、一遺伝性障害である。いくつかの実施形態では、障害は、多遺伝子性障害である。いくつかの実施形態では、障害は、１つまたはそれを超えるＳＮＰに関連する障害である。１つまたはそれを超えるＳＮＰに関連する例示的な障害としては、米国特許第７，６２７，４３６号に記載されている複合病、国際公開第２００９／１１２８８２号に記載されているアルツハイマー病、米国特許出願公開第２０１１／００３９９１８号に記載されている炎症性疾患、米国特許出願公開第２０１２／０３０９６４２号に記載されている多嚢胞性卵巣症候群、米国特許第７，７３２，１３９号に記載されている心血管疾患、米国特許出願公開第２０１２／０１３６０３９号に記載されているハンチントン病、欧州特許出願公開第２５３５４２４号に記載されている血栓塞栓症、国際公開第２０１２／００１６１３号に記載されている神経血管疾患、米国特許出願公開第２０１０／０２９２２１１号に記載されている精神病、米国特許出願公開第２０１１／０３１９２８８号に記載されている多発性硬化症、国際公開第２００６／０２３７１９に記載されている統合失調症状、分裂情動障害および双極性障害、米国特許出願公開第２０１１／０１０４６７４号に記載されている双極性障害および他の疾病、国際公開第２００６／１０４３７０号に記載されている結腸直腸癌、米国特許出願公開第２００６／０２０４９６９号に記載されているＡＫＴ１遺伝子座に隣接するＳＮＰに関連する障害、国際公開第２００３／０１２１４３号に記載されている摂食障害、米国特許出願公開第２００７／０２６９８２７号に記載されている自己免疫疾患、米国特許第７，７９０，３７０号に記載されているクローン病患者における線維性狭窄疾患、ならびに米国特許第８，１８７，８１１号に記載されているパーキンソン病など（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。本発明の方法にしたがって処置または予防され得る１つまたはそれを超えるＳＮＰに関連する他の障害は、当事者には明らかであろう。
いくつかの実施形態では、障害は、慢性感染性疾患である。「慢性感染性疾患」は、感染病原体によって引き起こされる疾患であり、感染症が持続する。このような疾患としては、肝炎（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶおよびＥＢＶ）およびＨＩＶ／ＡＩＤＳが挙げられ得る。非ウイルスの例としては、慢性真菌性疾患、例えばアスペルギルス症、カンジダ症、コクシジオイデス症、ならびにＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびヒストプラズマ症に関連する疾患が挙げられ得る。慢性細菌感染病原体の非限定的な例は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであり得る。いくつかの実施形態では、障害は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である。いくつかの実施形態では、障害は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である。
いくつかの実施形態では、障害は、自己免疫障害である。「自己免疫疾患」という用語は、被験体が自身の組織に対して破壊性免疫応答を開始する任意の疾患または障害を指す。自己免疫性障害は、被験体（例えば、ヒト）におけるほぼすべての器官系に影響を与え得、限定されないが、神経、胃腸および内分泌系ならびに皮膚および他の結合組織、眼、血液および血管の疾患が挙げられる。自己免疫疾患の例としては、限定されないが、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、グレーブス病、強皮症、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症および糖尿病が挙げられる。
いくつかの実施形態では、障害は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。
本発明の方法は、様々な異なる細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変化させることができる（例えば、免疫学的チェックポイント調節因子遺伝子、例えばＣＴＬ４、ＰＤ１などを変化させてＴ細胞阻害を低減もしくは排除し、ＴＣＲα鎖およびβ鎖をコードする遺伝子を変化させてＴ細胞自己反応性を低減もしくは排除し、および／またはＢ２Ｍを変化させてＭＨＣクラスＩ表面発現を除去し、および場合により、標的ポリヌクレオチド配列の変化が有益である障害に関連する１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列を変化させ、および／または場合により、細胞が、少なくとも１つの生物学的プロセスをモジュレートするタンパク質を発現するようにする）。いくつかの実施形態では、被験体へのその後の導入のために、本発明の方法は、エクスビボで細胞における標的ポリヌクレオチド配列を変化させるために使用される。
いくつかの実施形態では、細胞またはその集団は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞またはその集団は、初代Ｔ細胞（例えば、ヒト）である。Ｔ細胞は、限定されないが、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞）、ヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞）、記憶Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、組織浸潤リンパ球（例えば、腫瘍浸潤リンパ球、例えばＴＩＬ、ＣＤ３＋細胞）およびそれらの組み合わせを含む任意のＴ細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞または多能性細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋動員末梢血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋臍帯血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋骨髄細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−系ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト多能性細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代ＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代ＣＤ４＋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、自己初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、自己初代体細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、同種初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、同種初代体細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、有核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、非形質転換細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト絨毛腫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＪＥＧ−３細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、単球細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔｈｐ−１細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、癌細胞ではない。いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍細胞ではない。いくつかの実施形態では、細胞は、形質転換細胞ではない。
細胞またはその集団は、任意の被験体、例えば自己免疫障害、癌、慢性感染性疾患および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群より選択される障害を患っているか、該障害について処置されているか、該障害と診断されているか、該障害を発症するリスクを有するか、または該障害を有すると疑われる被験体から得られ得る。
本発明はまた、本発明のＣａｓタンパク質またはその機能的部分、Ｃａｓタンパク質またはその機能的部分をコードする核酸、およびＣａｓタンパク質を細胞における標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズするリボ核酸配列を含む組成物を提供する。
いくつかの態様では、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの態様では、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列、配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択されるリボ核酸配列のペアを含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、第１のリボ核酸は、配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のリボ核酸は、配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のリボ核酸は、配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のリボ核酸は、配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸のペアは、配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される配列に対して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチまたは少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、リボ核酸配列のペアは、配列番号１２８および配列番号７２を含むか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、リボ核酸のペアは、配列番号１２８および配列番号７２に対して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチまたは少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの態様では、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの態様では、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列、配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択されるリボ核酸配列のペアを含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、第１のリボ核酸は、配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のリボ核酸は、配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のリボ核酸は、配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のリボ核酸は、配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸のペアは、配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される配列に対して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチまたは少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、リボ核酸配列のペアは、配列番号４６２および配列番号４２１を含むか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、リボ核酸のペアは、配列番号４６２および配列番号４２１に対して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチまたは少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの態様では、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの態様では、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列、配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択されるリボ核酸配列のペアを含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、第１のリボ核酸は、配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のリボ核酸は、配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のリボ核酸は、配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のリボ核酸は、配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸のペアは、配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される配列に対して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチまたは少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、リボ核酸配列のペアは、配列番号５５０および配列番号５７３を含むか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、リボ核酸のペアは、配列番号５５０および配列番号５７３に対して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチまたは少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの態様では、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの態様では、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列、配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択されるリボ核酸配列のペアを含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、第１のリボ核酸は、配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のリボ核酸は、配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のリボ核酸は、配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のリボ核酸は、配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸のペアは、配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される配列に対して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチまたは少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、リボ核酸配列のペアは、配列番号６５７および配列番号６６２を含むか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、リボ核酸のペアは、配列番号５５０および配列番号５７３に対して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチまたは少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの態様では、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列、ならびに配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの態様では、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列、配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７からなる群より選択されるリボ核酸配列のペアを含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、第１のリボ核酸は、配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のリボ核酸は、配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のリボ核酸は、配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のリボ核酸は、配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸のペアは、配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７からなる群より選択される配列に対して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチまたは少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、リボ核酸配列のペアは、配列番号７７３および配列番号７７８を含むか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、リボ核酸のペアは、配列番号７７３および配列番号７７８に対して少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチまたは少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの態様では、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする核酸配列、および配列番号３６３８〜４０４６からなる群より選択される配列を有するリボ核酸を含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、配列番号３６３８〜４０４６からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、配列番号３６３８〜４０４６からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの態様では、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする核酸配列、および配列番号８９４６〜９１０１からなる群より選択される配列を有するリボ核酸を含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、配列番号８９４６〜９１０１からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、配列番号８９４６〜９１０１からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの態様では、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする核酸配列、および配列番号９７５１〜９７９７からなる群より選択される配列を有するリボ核酸を含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、配列番号９７５１〜９７９７からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、配列番号９７５１〜９７９７からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの態様では、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする核酸配列、および配列番号１０５３３〜１０５７３からなる群より選択される配列を有するリボ核酸を含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、配列番号１０５３３〜１０５７３からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、配列番号１０５３３〜１０５７３からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの態様では、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする核酸配列、および配列番号１３２５８〜１３７１９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸を含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、配列番号１３２５８〜１３７１９からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸は、配列番号１３２５８〜１３７１９からなる群より選択される配列に対して２つのヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの態様では、本発明は、キメラ核酸を含む組成物であって、該キメラ核酸が、（ａ）Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列；ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７；（ｉｉ）配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５；（ｉｉｉ）配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０；（ｉｖ）配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２；および（ｖ）配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７；ならびに（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸配列を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、（ｂ）における少なくとも１つのリボ核酸配列は、（ｉ）配列番号１２８および配列番号７２；（ｉｉ）配列番号４６２および配列番号４２１；（ｉｉｉ）配列番号５５０および配列番号５７３；（ｉｖ）配列番号６５７および配列番号６６２；および（ｖ）配列番号７７３および配列番号７７８；ならびに（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの態様では、本発明は、キメラ核酸を含む組成物であって、該キメラ核酸が、（ａ）Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列；ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号３６３８〜４０４６；（ｉｉ）配列番号８９４６〜９１０１；（ｉｉｉ）配列番号９７５１〜９７９７；（ｉｖ）配列番号１０５３３〜１０５７３；および（ｖ）配列番号１３２５８〜１３７１９；ならびに（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせからなる群より選択されるリボ核酸配列を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、組成物は、検出可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、標的ポリヌクレオチド配列を変化させるための少なくとも１つのさらなるリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、標的ポリヌクレオチド配列を変化させるための少なくとも２つのさらなるリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、標的ポリヌクレオチド配列を変化させるための少なくとも３つのさらなるリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、標的ポリヌクレオチド配列を変化させるための少なくとも４つのさらなるリボ核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、組成物におけるリボ核酸の少なくとも１つは、本明細書に記載される改変リボ核酸（例えば、プソイドウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群より選択される１〜２つの改変ヌクレオチド、または本明細書に記載される任意の他の改変ヌクレオチドもしくは改変を含む合成改変リボ核酸）である。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｃｐｆ１タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、組成物におけるリボ核酸の少なくとも１つは、本明細書に記載される改変リボ核酸（例えば、プソイドウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群より選択される１〜２つの改変ヌクレオチド、または本明細書に記載される任意の他の改変ヌクレオチドもしくは改変を含む合成改変リボ核酸）である。いくつかの実施形態では、組成物におけるリボ核酸のペアは、本明細書に記載される改変リボ核酸（例えば、プソイドウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群より選択される１〜２つの改変ヌクレオチド、または本明細書に記載される任意の他の改変ヌクレオチドもしくは改変を含む合成改変リボ核酸）である。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｃｐｆ１タンパク質またはその機能的部分をコードする核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）をコードする核酸は、本明細書に記載される改変リボ核酸（例えば、プソイドウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群より選択される少なくとも１つの改変ヌクレオチド、または本明細書に記載される任意の他の改変ヌクレオチドもしくは改変を含む本明細書に記載される合成改変ｍＲＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、キメラ核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒト細胞における発現増加に最適化されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒト幹細胞における発現増加に最適化されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、初代ヒト細胞における発現増加に最適化されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素およびニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−１αプロモーターならびにユビキチンプロモーターからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質またはその機能的部分を含む。
本発明はまた、本発明の方法のいずれかを実施するためのキット、ならびに細胞またはその集団における標的ポリヌクレオチド配列を変化させるためのキットであって、本発明の組成物および該キットの使用説明書を含むキットを提供する。
細胞の投与
いくつかの態様では、本発明は、細胞を、このような細胞を必要とする被験体に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびにＣａｓタンパク質を該細胞またはその集団における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列（これは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、Ｂ２Ｍおよびそれらの組み合わせをコードする標的ポリヌクレオチド配列からなる群より選択される）に配向させてそれにハイブリダイズする少なくとも１つのリボ核酸とをエクスビボで接触させ、該少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を切断すること；ならびに（ｂ）（ａ）から得られた細胞を、このような細胞を必要とする被験体に投与することを含む方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞を、このような細胞を必要とする被験体に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団と、（ｉ）Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を該細胞または細胞集団における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列（これは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、Ｂ２Ｍおよびそれらの組み合わせをコードする標的ポリヌクレオチド配列からなる群より選択される）に配向させてそれにハイブリダイズするリボ核酸の少なくとも１つのペアとをエクスビボで接触させ、該標的ポリヌクレオチド配列を切断すること；ならびに（ｂ）（ａ）から得られた１つまたは複数の細胞を、このような細胞を必要とする被験体に投与することを含む方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞を、このような細胞を必要とする被験体に投与する方法であって、（ａ）細胞または細胞集団と、（ｉ）Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を該細胞または細胞集団における標的ポリヌクレオチド配列（これは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、Ｂ２Ｍおよびそれらの組み合わせをコードする標的ポリヌクレオチド配列からなる群より選択される）に配向させてそれにハイブリダイズする１つのリボ核酸とをエクスビボで接触させ、該標的ポリヌクレオチド配列を切断すること；ならびに（ｂ）（ａ）から得られた１つまたは複数の細胞を、このような細胞を必要とする被験体に投与することを含む方法を提供する。
細胞を投与する方法は、このような細胞の投与が望ましい任意の目的に（例えば、このような細胞を必要とする被験体への細胞の同種投与に）適合され得ることが企図される。いくつかの実施形態では、細胞の投与を必要とする被験体は、障害を患っている。例えば、被験体は、特定の細胞の機能または数が減少する障害を患っていてもよく、特定の細胞が適切に機能している健常または正常個体から得られた機能的細胞を投与すること、および十分な数の健常細胞を個体に投与して、その細胞（例えば、細胞数または機能が減少しているホルモン産生細胞、細胞数または機能が減少している免疫細胞など）によって提供される機能を回復させることが望ましい場合がある。このような場合では、健常細胞は、健常細胞の宿主拒絶の可能性を減少させるように操作され得る。いくつかの実施形態では、障害は、遺伝性障害を含む。いくつかの実施形態では、障害は、感染症を含む。いくつかの実施形態では、障害は、ＨＩＶまたはＡＩＤを含む。いくつかの実施形態では、障害は、癌を含む。いくつかの実施形態では、障害は、自己免疫疾患を含む。
細胞の投与前に、（例えば、ＦＡＣＳを使用して）細胞の集団を選別して、ゲノムが編集されている細胞を選択し得る。次いで、選別した細胞を、第２の被験体がこのような細胞を必要とする特定の障害のための移植に必要な細胞の量までエクスパンドし得る。いくつかの実施形態では、該方法は、投与工程の前に、ゲノム改変細胞と、Ｃａｓタンパク質、および第２の被験体（すなわち、レシピエント）がこのような細胞を必要とする障害に関連する１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチドをターゲティングする１つまたはそれを超えるガイドＲＮＡ配列とを接触させることを含み得る。例えば、ＨＩＶの場合、ゲノム改変細胞と、Ｃａｓタンパク質、およびＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子をターゲティングする１つまたはそれを超えるガイドＲＮＡ配列とを接触させ、それにより、ゲノム改変細胞のゲノムを、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４の表面発現を排除または低減するように編集し得る。このような細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子表面発現の欠如により望ましくない宿主免疫応答の可能性を排除または低減し、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４表面発現の欠如によりＨＩＶ感染症に対する感受性をあまりまたは全く示さないので、（例えば、ＨＩＶまたはＡＩＤＳを患っている）第２の被験体への投与に有益であろう。
本明細書で使用される場合、「核酸」は、その最も広い意味において、ホスホジエステル結合によって連結しているヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。例示的な核酸としては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはそれらのハイブリッドが挙げられる。それらはまた、ＲＮＡｉ誘発剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重ヘリックス形成を誘発するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、改変核酸（例えば、本明細書に記載される合成改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。
本発明は、当業者が利用可能な任意の核酸改変の使用を企図する。本発明の核酸は、任意の数の改変を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、および２−メトキシ−アデニン、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１つまたはそれを超える改変を含む。
本発明の改変ＲＮＡの製造または合成において使用される改変ヌクレオシドおよびヌクレオチドの調製は、様々な化学基の保護および脱保護を含み得る。当業者であれば、保護および脱保護の必要性ならびに適切な保護基の選択を容易に決定し得る。
保護基の化学的性質は、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９１（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）にみられ得る。
改変ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、Ｏｇａｔａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７４：２５８５−２５８８，２００９；Ｐｕｒｍａｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（１）：７２−７８，１９９４；Ｆｕｋｕｈａｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １（４）：５６３−５６８，１９６２；およびＸｕら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８（９）：１７２９−１７４０，１９９２（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている合成方法にしたがって調製され得る。
改変核酸（例えば、リボ核酸）は、分子の全長に沿って均一に改変する必要はない。異なるヌクレオチド改変および／または骨格構造は、核酸において様々な位置において存在し得る。当業者であれば、ヌクレオチド類似体または他の改変は、核酸の機能が実質的に減少しないように、核酸の任意の位置に配置し得ることを認識するであろう。改変はまた、５’または３’末端改変であり得る。核酸は、最小で１つの、および最大で１００％改変ヌクレオチド、または任意の中間の百分率、例えば、少なくとも５０％改変ヌクレオチド、少なくとも８０％改変ヌクレオチド、または少なくとも９０％改変ヌクレオチドを含有し得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は、改変リボ核酸である。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つは、改変リボ核酸である。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、改変リボ核酸である。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸の少なくとも１つは、改変リボ核酸である。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸の多数は、改変されている。いくつかの実施形態では、複数のリボ核酸はそれぞれ、改変されている。当業者であれば、改変リボ核酸は、本明細書に記載される核酸改変の１つまたはそれよりも多くを含み得ることを認識するであろう。
いくつかの態様では、ポリペプチドをコードする合成改変ＲＮＡ分子であって、細胞への該合成改変ＲＮＡ分子の導入が、１つまたはそれを超える改変を含まないポリペプチドをコードする合成ＲＮＡ分子と接触された細胞と比べて低減した先天性免疫応答をもたらすような１つまたはそれを超える改変を含む合成改変ＲＮＡ分子が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする合成改変ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質をコードする合成改変ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする合成改変ＲＮＡ分子を含む。
本明細書に記載される合成改変ＲＮＡは、エンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによる急速な分解を防止し、かつＲＮＡに対する細胞の先天性免疫またはインターフェロン応答を回避または低減する改変を含む。改変としては、限定されないが、例えば、（ａ）末端改変、例えば、５’末端改変（リン酸化、脱リン酸化、コンジュゲーション、逆連結など）、３’末端改変（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結など）、（ｂ）塩基改変、例えば、改変塩基、安定化塩基、不安定化塩基、または拡大されたレパートリーのパートナーと塩基対を作る塩基、またはコンジュゲートされた塩基による置換え、（ｃ）糖改変（例えば、２’位もしくは４’位における）または糖の置換え、ならびに（ｄ）ホスホジエステル連結の改変または置換えを含めたヌクレオシド間連結改変が挙げられる。このような改変が翻訳を妨げる（すなわち、例えば、ウサギ網状赤血球のインビトロでの翻訳アッセイにおいて改変の欠如と比べて翻訳における５０％またはそれを超える低減をもたらす）範囲内において、改変は、本明細書に記載される方法および組成物に適していない。本明細書に記載される方法において有用な合成改変ＲＮＡ組成物の具体例としては、限定されないが、改変または非天然ヌクレオシド間連結を含有するＲＮＡ分子が挙げられる。改変ヌクレオシド間連結を有する合成改変ＲＮＡは、とりわけ、ヌクレオシド間連結においてリン原子を有さないものを含む。他の実施形態では、合成改変ＲＮＡは、そのヌクレオシド間連結においてリン原子を有する。
改変ヌクレオシド間連結の非限定的な例としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデートを含めたホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’−５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’連結類似体、および逆極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接する対は、３’−５’が５’−３’と連結され、または２’−５’が５’−２’と連結される）が挙げられる。様々な塩、混合塩および遊離酸の形態も含まれる。
上記リン含有連結の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号；米国特許第４，４６９，８６３号；米国特許第４，４７６，３０１号；米国特許第５，０２３，２４３号；米国特許第５，１７７，１９５号；米国特許第５，１８８，８９７号；米国特許第５，２６４，４２３号；米国特許第５，２７６，０１９号；米国特許第５，２７８，３０２号；米国特許第５，２８６，７１７号；米国特許第５，３２１，１３１号；米国特許第５，３９９，６７６号；米国特許第５，４０５，９３９号；米国特許第５，４５３，４９６号；米国特許第５，４５５，２３３号；米国特許第５，４６６，６７７号；米国特許第５，４７６，９２５号；米国特許第５，５１９，１２６号；米国特許第５，５３６，８２１号；米国特許第５，５４１，３１６号；米国特許第５，５５０，１１１号；米国特許第５，５６３，２５３号；米国特許第５，５７１，７９９号；米国特許第５，５８７，３６１号；米国特許第５，６２５，０５０号；米国特許第６，０２８，１８８号；米国特許第６，１２４，４４５号；米国特許第６，１６０，１０９号；米国特許第６，１６９，１７０号；米国特許第６，１７２，２０９号；米国特許第６，２３９，２６５号；米国特許第６，２７７，６０３号；米国特許第６，３２６，１９９号；米国特許第６，３４６，６１４号；米国特許第６，４４４，４２３号；米国特許第６，５３１，５９０号；米国特許第６，５３４，６３９号；米国特許第６，６０８，０３５号；米国特許第６，６８３，１６７号；米国特許第６，８５８，７１５号；米国特許第６，８６７，２９４号；米国特許第６，８７８，８０５号；米国特許第７，０１５，３１５号；米国特許第７，０４１，８１６号；米国特許第７，２７３，９３３号；米国特許第７，３２１，０２９号；および米国再特許第ＲＥ３９４６４号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
その中にリン原子を含まない改変ヌクレオシド間連結は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、あるいは１つまたはそれを超える短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間連結または複素環式ヌクレオシド間連結によって形成されるヌクレオシド間連結を有する。これらは、モルホリノ連結（部分的に、ヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有する他のものを含む。
改変オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号；米国特許第５，１６６，３１５号；米国特許第５，１８５，４４４号；米国特許第５，２１４，１３４号；米国特許第５，２１６，１４１号；米国特許第５，２３５，０３３号；米国特許第５，６４，５６２号；米国特許第５，２６４，５６４号；米国特許第５，４０５，９３８号；米国特許第５，４３４，２５７号；米国特許第５，４６６，６７７号；米国特許第５，４７０，９６７号；米国特許第５，４８９，６７７号；米国特許第５，５４１，３０７号；米国特許第５，５６１，２２５号；米国特許第５，５９６，０８６号；米国特許第５，６０２，２４０号；米国特許第５，６０８，０４６号；米国特許第５，６１０，２８９号；米国特許第５，６１８，７０４号；米国特許第５，６２３，０７０号；米国特許第５，６６３，３１２号；米国特許第５，６３３，３６０号；米国特許第５，６７７，４３７号；および米国特許第５，６７７，４３９号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
本明細書に記載される合成改変ＲＮＡのいくつかの実施形態は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有する核酸、およびヘテロ原子ヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオシド、および特に、上記で引用される米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩとして公知である］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［天然ホスホジエステルヌクレオシド間連結は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、および上記で引用される米国特許第５，６０２，２４０号（これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）のアミド骨格を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で特徴付けられる核酸配列は、上記で引用される米国特許第５，０３４，５０６号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）のモルホリノ骨格構造を有する。
本明細書に記載される合成改変ＲＮＡはまた、１つまたはそれを超える置換糖部分を含有し得る。本明細書で特徴付けられる核酸は、２’位において以下の１つを含み得る。Ｈ（デオキシリボース）；ＯＨ（リボース）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されていても、もしくは置換されていなくてもよいＣ１〜Ｃ１０アルキルもしくはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルである）。例示的な改変としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、ｎおよびｍは、１〜約１０である。いくつかの実施形態では、合成改変ＲＮＡは、２’位において以下の１つを含む。Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、レポーター基、インターカレーター、ＲＮＡの薬物動態特性を改善させるための基、または合成改変ＲＮＡの薬力学的特性を改善させるための基、および同様の特性を有する他の置換基。いくつかの実施形態では、改変は、２’メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知である）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）、すなわち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な改変は、２’−ＤＭＡＯＥとしてまた公知である２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしてまた当技術分野で公知である）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。
他の改変は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の改変はまた、核酸配列上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’連結ヌクレオチド中の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位において作製され得る。合成改変ＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりに、糖模倣物、例えば、シクロブチル部分を有し得る。このような改変された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第４，９８１，９５７号；米国特許第５，１１８，８００号；米国特許第５，３１９，０８０号；米国特許第５，３５９，０４４号；米国特許第５，３９３，８７８号；米国特許第５，４４６，１３７号；米国特許第５，４６６，７８６号；米国特許第５，５１４，７８５号；米国特許第５，５１９，１３４号；米国特許第５，５６７，８１１号；米国特許第５，５７６，４２７号；米国特許第５，５９１，７２２号；米国特許第５，５９７，９０９号；米国特許第５，６１０，３００号；米国特許第５，６２７，０５３号；米国特許第５，６３９，８７３号；米国特許第５，６４６，２６５号；米国特許第５，６５８，８７３号；米国特許第５，６７０，６３３号；および米国特許第５，７００，９２０号（これらのいくつかは本出願と共有されており、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
非限定的な例として、本明細書に記載される合成改変ＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、２’−アミノ−改変ヌクレオシド、２’−アルキル−改変ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ヌクレオシドを含むホスホロアミデートもしくは非天然塩基、または任意のそれらの組み合わせを含めた少なくとも１つの改変ヌクレオシドを含み得る。
本明細書に記載されるこの態様およびすべての他のこのような態様のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２’フルオロウリジン、プソイドウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍ）、２’デオキシウリジン（２’ｄＵ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２’−Ｏ−メチルシチジン（Ｃｍ）、７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群より選択される。
あるいは、合成改変ＲＮＡは、少なくとも２つの改変ヌクレオシド、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０またはそれを超える、最大全長のヌクレオチドを含み得る。最小でも、少なくとも１つの改変ヌクレオシドを含む合成改変ＲＮＡ分子は、本明細書に記載される改変を有する単一のヌクレオシドを含む。所定の合成改変ＲＮＡにおけるすべての位置が均一に改変されることは必要なく、実際、上記改変の複数を、単一の合成改変ＲＮＡにおいて、または合成改変ＲＮＡ内の単一のヌクレオシドにおいてさえも組み込むことができる。しかしながら、分子における所定のヌクレオシドの出現毎に改変される（例えば、各シトシンは、改変シトシン、例えば、５ｍＣである）ことが好ましいが、絶対的に必要とは限らない。しかしながら、同じヌクレオシドが異なって出現する毎に、所定の合成改変ＲＮＡ分子において異なる方法で改変されることができることがまた企図される（例えば、いくつかのシトシンは５ｍＣとして改変され、他は２’−Ｏ−メチルシチジンまたは他のシトシン類似体として改変される）。改変は、合成改変ＲＮＡにおける複数の改変ヌクレオシドのそれぞれについて同じである必要はない。さらに、本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、合成改変ＲＮＡは、少なくとも２つの異なる改変ヌクレオシドを含む。本明細書に記載される態様のいくつかのこのような好ましい実施形態では、少なくとも２つの異なる改変ヌクレオシドは、５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンである。合成改変ＲＮＡはまた、改変および非改変ヌクレオシドの両方の混合物を含有し得る。
本明細書で使用される場合、「非改変」または「天然」ヌクレオシドまたは核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、合成改変ＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオシド（「塩基」）の改変または置換を含む。改変ヌクレオシドとしては、他の合成および天然核酸塩基、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、ツベルシジン、２−（ハロ）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２（アミノ）アデニン、２−（アミノアルキル）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６、Ｎ６（ジメチル）アデニン、２−（アルキル）グアニン、２（プロピル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６（メチル）グアニン、７（アルキル）グアニン、７（メチル）グアニン、７（デアザ）グアニン、８（アルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、Ｎ（メチル）グアニン、２−（チオ）シトシン、３（デアザ）５（アザ）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３（メチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、６−（アゾ）シトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、２−（チオ）ウラシル、５（メチル）２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル、４−（チオ）ウラシル、５（メチル）４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル、５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル、５（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５（アミノアリル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、ウラシル−５オキシ酢酸、５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、６（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、５−ウラシル（すなわち、プソイドウラシル）、２（チオ）プソイドウラシル、４（チオ）プソイドウラシル、２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）プソイドウラシル、５−（メチル）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、１置換プソイドウラシル、１置換２（チオ）−プソイドウラシル、１置換４（チオ）プソイドウラシル、１置換２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３−（メチル）イソカルボスチリリル、５−（メチル）イソカルボスチリリル、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、７−（アザ）インドリル、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、２，４，５−（トリメチル）フェニル、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンゾイミダゾール、４−（メチル）ベンゾイミダゾール、６−（アゾ）チミン、２−ピリジノン、５ニトロインドール、３ニトロピロール、６−（アザ）ピリミジン、２（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５置換ピリミジン、Ｎ２−置換プリン、Ｎ６−置換プリン、０６−置換プリン、置換１，２，４−トリアゾール、ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル、または任意のＯ−アルキル化もしくはＮ−アルキル化されたそれらの誘導体が挙げられる。改変ヌクレオシドはまた、コンジュゲート部分、例えば、リガンドを含む天然塩基を含む。本明細書で上記で考察されているように、改変ヌクレオシドを含有するＲＮＡは、宿主細胞において翻訳可能ではなくてはならない（すなわち、改変ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの翻訳を防止しない）。例えば、ｓ２Ｕおよびｍ６Ａを含有する転写産物は、ウサギ網状赤血球ライセートにおいて不十分に翻訳され、一方、プソイドウリジン、ｍ５Ｕ、およびｍ５Ｃは、効率的な翻訳と適合性である。加えて、転写産物のヌクレアーゼ抵抗性を増加させるのに有用な２’−フルオロ−改変塩基は、非常に非効率的な翻訳をもたらすことは当技術分野で公知である。当業者であれば、例えば、ウサギ網状赤血球ライセート翻訳アッセイを使用して、翻訳をアッセイし得る。
さらなる改変核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８に開示されているもの；２００９年３月２６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３８，４２５号に開示されているもの；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されているものが挙げられる。
上記改変核酸塩基および他の改変核酸塩基のいくつかの調製について教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、上記米国特許第３，６８７，８０８号ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；米国特許第５，１３０，３０号；米国特許第５，１３４，０６６号；米国特許第５，１７５，２７３号；米国特許第５，３６７，０６６号；米国特許第５，４３２，２７２号；米国特許第５，４５７，１８７号；米国特許第５，４５７，１９１号；米国特許第５，４５９，２５５号；米国特許第５，４８４，９０８号；米国特許第５，５０２，１７７号；米国特許第５，５２５，７１１号；米国特許第５，５５２，５４０号；米国特許第５，５８７，４６９号；米国特許第５，５９４，１２１号；米国特許第５，５９６，０９１号；米国特許第５，６１４，６１７号；米国特許第５，６８１，９４１号；米国特許第６，０１５，８８６号；米国特許第６，１４７，２００号；米国特許第６，１６６，１９７号；米国特許第６，２２２，０２５号；米国特許第６，２３５，８８７号；米国特許第６，３８０，３６８号；米国特許第６，５２８，６４０号；米国特許第６，６３９，０６２号；米国特許第６，６１７，４３８号；米国特許第７，０４５，６１０号；米国特許第７，４２７，６７２号；および米国特許第７，４９５，０８８号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）ならびに米国特許第５，７５０，６９２号（これもまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
本明細書に記載される合成改変ＲＮＡで使用するための別の改変は、ＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取込みを増強させる１つまたはそれを超えるリガンド、部分またはコンジュゲートをＲＮＡに化学的に連結させることを伴う。本明細書に記載される合成改変ＲＮＡは、５’キャップをさらに含み得る。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、合成改変ＲＮＡは、５’−５’トリホスフェート連結を使用してＲＮＡ分子の５’末端に連結した改変グアニンヌクレオチドを含む５’キャップを含む。本明細書で使用される場合、「５’キャップ」という用語はまた、例えば、５’ジグアノシンキャップ、メチレン−ビス（ホスホネート）部分を有するテトラホスフェートキャップ類似体（例えば、Ｒｙｄｚｉｋ，Ａ Ｍら、（２００９）Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ ７（２２）：４７６３−７６を参照のこと）、ホスホロチオエート改変を有するジヌクレオチドキャップ類似体（例えば、Ｋｏｗａｌｓｋａ，Ｊら、（２００８）ＲＮＡ １４（６）：１１１９−１１３１を参照のこと）、非架橋酸素のための硫黄置換を有するキャップ類似体（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅら、（２００７）ＲＮＡ １３（１０）：１７４５−１７５５を参照のこと）、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシドテトラホスフェート類似体（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅら、（２００４）ＲＮＡ １０（９）：１４７９−１４８７を参照のこと）、または抗リバースキャップ類似体（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊら、（２００３）ＲＮＡ ９（９）：１１０８−１１２２およびＳｔｅｐｉｎｓｋｉ，Ｊら、（２００１）ＲＮＡ ７（１０）：１４８６−１４９５を参照のこと）を含めて他の５’キャップ類似体を包含することを意図する。このような一実施形態では、５’キャップ類似体は、５’ジグアノシンキャップである。いくつかの実施形態では、合成改変ＲＮＡは、５’トリホスフェートを含まない。
５’キャップは、翻訳を開始させる、ｍＲＮＡの認識、およびリボソームへのｍＲＮＡの付着のために重要である。５’キャップはまた、合成改変ＲＮＡを５’エクソヌクレアーゼが媒介する分解から保護する。合成改変ＲＮＡが５’キャップを含むことは絶対に必要ではなく、したがって、他の実施形態では、合成改変ＲＮＡは、５’キャップを欠いている。しかしながら、５’キャップを含む合成改変ＲＮＡのより長い半減期、および翻訳の効率性の増加によって、５’キャップを含む合成改変ＲＮＡは、本明細書で好ましい。
本明細書に記載される合成改変ＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含み得る。非翻訳領域は、開始コドン（５’）の前および終止コドン（３’）の後のＲＮＡの領域であり、したがって、翻訳機構によって翻訳されない。非翻訳領域はリボヌクレアーゼおよびＲＮＡ分解に関与する他のタンパク質を妨げることができるため、１つまたはそれを超える非翻訳領域を有するＲＮＡ分子の改変は、ｍＲＮＡの安定性を改善させることができる。加えて、５’および／または３’非翻訳領域を有するＲＮＡの改変は、ｍＲＮＡへのリボソーム結合を変化させる結合タンパク質によって翻訳の効率性を増強させることができる。３’ＵＴＲを有するＲＮＡの改変を使用して、ＲＮＡの細胞質局在化を維持することができ、翻訳が細胞の細胞質において起こることを可能とする。一実施形態では、本明細書に記載される合成改変ＲＮＡは、５’または３’ＵＴＲを含まない。別の実施形態では、合成改変ＲＮＡは、５’または３’ＵＴＲを含む。別の実施形態では、本明細書に記載される合成改変ＲＮＡは、５’および３’ＵＴＲの両方を含む。一実施形態では、５’および／または３’ＵＴＲは、細胞において高い安定性を有することが公知であるｍＲＮＡから選択される（例えば、マウスのα−グロビン３’ＵＴＲ）。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または両方は、１つまたはそれを超える改変ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成改変ＲＮＡは、コザック配列をさらに含む。「コザック配列」は、コンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧを有する真核生物のｍＲＮＡ上の配列を指し、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、これに別の「Ｇ」が続く。コザックコンセンサス配列は、リボソームによって認識され、ポリペプチドの翻訳が開始する。典型的には、開始は、転写産物の５’末端の近位にある翻訳機構が遭遇する最初のＡＵＧコドンにおいて起こる。しかしながら、場合によって、このＡＵＧコドンは、リーキースキャニングと称されるプロセスにおいて迂回され得る。正しいポリペプチドの翻訳が起こるように、ＡＵＧコドンの近くのコザック配列の存在は、翻訳の開始部位としてそのコドンを強化する。さらに、開始コドンに関してアンビギュイティが存在しなくても、合成改変ＲＮＡへのコザック配列の付加は、より効率的な翻訳を促進する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成改変ＲＮＡは、所望の部位において翻訳の開始のためのコザックコンセンサス配列をさらに含み、正しい長さのポリペプチドを産生する。いくつかのこのような実施形態では、コザック配列は、１つまたはそれを超える改変ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成改変ＲＮＡは、「ポリ（Ａ）テイル」をさらに含み、これはアデニンヌクレオチドの３’ホモポリマーテイルを指し、これは長さが異なることができ（例えば、少なくとも５つのアデニンヌクレオチド）、数百までのアデニンヌクレオチドであり得る。３’ポリ（Ａ）テイルを含むことは、合成改変ＲＮＡを細胞における分解から保護することができ、また核外局在化を促進して、翻訳効率性を増強させる。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは、１〜５００のアデニンヌクレオチドを含む；他の実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００またはそれ超えるアデニンヌクレオチドを含む。一実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは、１〜１５０のアデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは、９０〜１２０のアデニンヌクレオチドを含む。いくつかのこのような実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは、１つまたはそれを超える改変ヌクレオシドを含む。
本明細書に記載される合成改変ＲＮＡへの１つまたはそれを超える改変は、細胞における合成改変ＲＮＡのより大きな安定性を可能とすることが企図される。このような改変が、翻訳を可能とし、改変を有する合成改変ＲＮＡに対する細胞の先天性免疫またはインターフェロン応答を低減し、または増悪させない程度まで、このような改変は、本明細書における使用のために特に企図される。一般に、合成改変ＲＮＡの安定性が高いほど、より多くのタンパク質をその合成改変ＲＮＡから生成し得る。典型的には、細胞タンパク質はＡＵリッチ領域にリクルートされ、転写産物のポリ（Ａ）テイルの除去を刺激するので、哺乳動物のｍＲＮＡにおけるＡＵリッチ領域の存在は、転写産物を不安定化する傾向がある。合成改変ＲＮＡのポリ（Ａ）テイルの喪失は、ＲＮＡ分解の増加をもたらすことができる。したがって、一実施形態では、本明細書に記載される合成改変ＲＮＡは、ＡＵリッチ領域を含まない。特に、３’ＵＴＲが、ＡＵＵＵＡ配列要素を実質的に欠くことが好ましい。
一実施形態では、リガンドは、細胞取込み、細胞におけるターゲティングまたはリガンドが組み込まれる合成改変ＲＮＡの半減期を変化させる。いくつかの実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドを欠いている組成物と比較して、選択した標的、例えば、分子、細胞または細胞型、細胞内コンパートメント、例えば、ミトコンドリア、細胞質、ペルオキシソーム、リソソームについて増強された親和性を実現する。好ましいリガンドは、合成改変ＲＮＡからのポリペプチドの発現を妨げない。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を撹乱することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを撹乱することによって、細胞への合成改変ＲＮＡまたはその組成物の取り込みを増加させることができる物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
別の態様では、リガンドは、宿主細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または例えば、癌細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス細胞透過剤である。好ましくは、薬剤は、両親媒性である。例示的な薬剤は、ペプチド、例えば、ｔａｔまたはアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）である。薬剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣物、逆転異性体、非ペプチドまたはプソイドペプチド連結、およびＤ−アミノ酸の使用を含めて、これは改変され得る。ヘリックス剤は好ましくは、親油性および疎油性相を好ましくは有するαヘリックス剤である。
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を透過することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、αヘリックス線状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７もしくはＣｅｒｏｐｉｎ Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシンもしくはバクテネシン）、または１つもしくは２つの主要なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９もしくはインドリシジン）であり得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、２つの部分からなる両親媒性ペプチド、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原のＨＩＶ−１ ｇｐ４１およびＮＬＳの融合ペプチドドメインに由来するＭＰＧであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
本明細書に記載される合成改変ＲＮＡは、当技術分野で十分に確立されている方法、例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌら、（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものによって合成および／または改変され得る。転写方法は、本明細書の実施例においてさらに記載される。本明細書に記載される態様の一実施形態では、合成改変ＲＮＡについての鋳型は、「スプリントが媒介するライゲーション」を使用して合成され、これは長いオリゴおよび／またはｄｓＤＮＡ ＰＣＲ産物の制御された鎖状体形成によるＤＮＡ構築体の急速な合成を可能とし、結合領域において制限部位を導入する必要性を伴わない。これを使用して、Ｔ７鋳型生成の間に遺伝子のコード配列に一般的な非翻訳領域（ＵＴＲ）を加えることができる。スプリントが媒介するライゲーションをまた使用して、オープンリーディングフレームに核局在化配列を加え、野性型オープンリーディングフレームから開始する点突然変異を有するドミナントネガティブな構築物を作製し得る。簡潔に言えば、一本鎖および／または変性ｄｓＤＮＡ構成要素を、スプリントオリゴにアニーリングし、これによって所望の末端を結合させ、末端を熱安定性ＤＮＡリガーゼによってライゲーションし、所望の構築物をＰＣＲによって増幅させる。次いで、合成改変ＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼをインビトロで使用して鋳型から合成する。合成改変ＲＮＡの合成が完了した後、本明細書に記載される方法による使用の前に、ＤＮＡ鋳型を転写反応から除去する。
これらの態様のいくつかの実施形態では、合成改変ＲＮＡを、アルカリホスファターゼでさらに処置する。
当業者であれば、本発明は、目的を果たし、記載した目標および利点、ならびにその中の固有のものを得るように良好に適合されていることを容易に認識する。本明細書における記載および実施例の詳細は、特定の実施形態の代表的なものであり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものとして意図しない。当業者であれば、その中の改変および他の使用を想到するであろう。これらの改変は、本発明の精神内に含有される。当業者であれば、本発明の範囲と精神から逸脱することなく、様々な置換および改変を本明細書に開示されている本発明に対して行い得ることは容易に明白であろう。
「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、本明細書で使用される場合、明細書および請求項において、それとは反対に明らかに示さない限り、複数の参照対象を含むと理解すべきである。群の１つまたはそれを超えるメンバーの間に「または」を含む請求項または記載は、それとは反対に示さない限り、または他の点で状況から明らかでない限り、群メンバーの１つ、複数、またはすべてが、所定の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所定の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所定の生成物もしくはプロセスと他の点で関連性がある場合、満足されると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所定の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所定の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所定の生成物もしくはプロセスと他の点で関連性がある実施形態を含む。本発明はまた、群メンバーの複数、またはすべてが所定の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所定の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所定の生成物もしくはプロセスと他の点で関連性がある実施形態を含む。さらに、本発明は、すべてのバリエーション、組み合わせ、および並べ替えを提供することを理解すべきであり、ここでは一覧表示した請求項の１つまたはそれよりも多くからの１つまたはそれを超える限度、要素、条項、記述用語などが、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、同じ基本請求項（または、関連性があれば、任意の他の請求項）応じて別の請求項に導入される。本明細書に記載されるすべての実施形態は、適切な場合には、本発明のすべての異なる態様に適用可能であることが企図される。実施形態または態様のいずれかを、適切と認められるときは、１つまたはそれを超える他のこのような実施形態または態様と自由に合わせることができることも企図される。要素が一覧として、例えば、マーカッシュ群または同様のフォーマットで提示される場合、要素の各部分群がまた開示されており、任意の要素を群から除去し得ることを理解すべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むと言及される場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴などからなり、またはこのような要素、特徴などから本質的になることを理解すべきである。簡潔さのために、これらの実施形態は、あらゆる場合において、本明細書で多くの言葉で具体的に記載してきたわけではない。特定の除外が明細書において記載されているかいないかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様を明示的に請求項から除外し得ることも理解すべきである。例えば、任意の１つまたはそれを超える活性剤、添加物、成分、任意選択の薬剤、生物の種類、障害、対象、またはそれらの組み合わせを除外し得る。
請求項または記載が対象の組成物に関する場合、本明細書に開示される方法のいずれかによって対象の組成物を作製または使用する方法、および本明細書に開示される目的のいずれかのために対象の組成物を使用する方法は、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、本発明の態様であることを理解すべきである。請求項または記載が方法に関する場合、例えば、方法を行うために有用な組成物を作製する方法、および方法によって生成される生成物が、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、本発明の態様であることを理解すべきである。
本明細書で範囲が示される場合、本発明は、エンドポイントが含まれる実施形態、両方のエンドポイントが除外される実施形態、および１つのエンドポイントが含まれ、他のエンドポイントが除外される実施形態を含む。両方のエンドポイントは他に示さない限り含まれることを想定すべきである。さらに、他に示さない限り、または他の点で状況および当業者の理解から明らかでない限り、文脈によって明らかにそれ以外のことの指示がない限り、範囲として表される値は、範囲の下限の１０分の１まで、任意の特定の値、または異なる本発明の実施形態では記述した範囲内の部分範囲を想定することができることを理解すべきである。一連の数値が本明細書で記述される場合、本発明は、任意のその間にある値またはその一連の任意の２つの値によって定義される範囲にアナログ的に関する実施形態を含み、かつ最も低い値は、最小として受け取り得、最も大きな値は、最大として受け取り得ることも理解される。数値は、本明細書で使用される場合、百分率として表す値を含む。数値が「約」または「概ね」によって前置きされる本発明の任意の実施形態について、本発明は、正確な値が記述される実施形態を含む。数値が「約」または「概ね」によって前置きされない本発明の任意の実施形態について、本発明は、値が「約」または「概ね」によって前置きされる実施形態を含む。
本明細書で使用される場合、「Ａおよび／またはＢ」（ＡおよびＢは、異なる請求項用語である）は一般に、Ａ、Ｂの少なくとも１つ、またはＡおよびＢの両方を意味する。例えば、別の配列に対して相補的であり、および／または別の配列にハイブリダイズする１つの配列は、（ｉ）すべての条件下で他の配列に必ずしもハイブリダイズし得るわけではないけれど、他の配列に対して相補的な１つの配列、（ｉｉ）他の配列に対して完全に相補的であるわけではないけれど、他の配列にハイブリダイズする１つの配列、ならびに（ｉｉｉ）他の配列に対して相補的であり、かつ他の配列にハイブリダイズするものの両方である配列を含む。
「概ね」または「約」は一般に、特に明記しない限り、または他の点で状況から明らかでない限り（このような数が、可能な値の１００％を許容されないほどに超える場合を除いて）、いずれかの方向（その数超またはその数未満）で、１％の範囲内、またはいくつかの実施形態では、数の５％の範囲内、またはいくつかの実施形態では、数の１０％の範囲内に入る数を含む。それとは反対に明らかに示さない限り、複数の実行を含む本明細書における特許請求する任意の方法において、方法の実行の順序は、必ずしも方法の実行が記述される順序に限定されないが、本発明は、順序がこのように限定されている実施形態を含むことを理解すべきである。他に示さない限り、または状況から明らかでない限り、本明細書に記載される任意の生成物または組成物は、「単離されている」と考え得ることも理解すべきである。
本明細書で使用される場合、「含むこと」または「含む」という用語は、本発明にとって必須である組成物、方法、およびそれぞれのその構成要素に関して使用するが、不特定の要素を含むことは、必須であろうと、またはそうではなくても自由である。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所定の実施形態のために必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のこの実施形態の基礎および新規または機能的特徴に物質的に影響を与えないさらなる要素の存在を可能とする。
「からなる」という用語は、実施形態のその記載において記述されないいずれの要素をも除いた、本明細書に記載される組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素を指す。
実施例１：初代ヒトＴ細胞から内因性ＴＣＲを効率的に除去してＣＡＲ Ｔ細胞の自己反応を防止するＣＲＩＳＰＲガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）の同定。
自己反応の防止は、既存のＴ細胞療法を改善するための最優先事項である。本発明者らは、オンターゲット活性が高く、オフターゲット活性が欠如した／低いｇＲＮＡであって、初代ヒトＴ細胞における内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の効率的かつ安全な欠失を可能にするｇＲＮＡを開発しようとした。本発明者らは、それぞれ１４番染色体および７番染色体上に位置するＴＣＲα鎖およびβ鎖遺伝子座（ＴＲＡおよびＴＲＢ）に対する複数のｇＲＮＡを設計した（図１０）。最初に、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における部位特異的突然変異を配向させる能力について、各ｇＲＮＡを試験した（データは示さず）。続いて、オンターゲット効率が最も高い候補ｇＲＮＡを、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）およびＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイを使用して、ジャーカットＴ細胞における機能的ＴＣＲ除去について評価した（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。レンチウイルス形質導入によって、またはヌクレオフェクションによって一過性に、ガイドを送達した。本発明者らは、ＦＡＣＳ分析によって、初代ヒトＴ細胞におけるＴＣＲ発現の喪失を観察し（図１２Ａ）、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイを使用して、２人の独立したドナーから得られたＴ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ切断を確認した（図１２Ｂ）。
実施例２：ＣＡＲ−Ｔ療法のための同種Ｔ細胞。
現在、Ｔ細胞療法は、同じ患者から得られた自己細胞の注入に限定されている。普遍的に適用可能な細胞製品を作ることによってＴ細胞起源を同種供給源まで拡大することは、コストを大幅に削減するだけではなく、この新規かつ有望なクラスの治療の機会をより広範な患者に与える。
ＭＨＣクラスＩ表面発現の完全な喪失は、補助鎖β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする遺伝子をターゲティングするＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡを使用して達成され得る。最近、本発明者らは、遺伝子療法に既に適切であり得る無類の高いオンターゲット効率でＢ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡを同定した（Ｍａｎｄａｌら、“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９”Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１５：５，６４３−６５２（２０１４）；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、“Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５４６，２７３−２９５（２０１４）；米国特許出願第６２／０７６，４２４号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５９６２１号（これらの教示は、参照により本明細書に組み込まれる））。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は多重化を可能にするので、例えば、同種Ｔ細胞をＣＡＲ−Ｔ療法に使用することを可能にするために、初代Ｔ細胞において、続いてヒト化マウスの養子移入モデルにおいて、ＴＣＲａおよびＴＣＲｂ鎖のためのｇＲＮＡと一緒にＢ２Ｍ ｇＲＮＡを上手く使用し得る。
加えて、最近、本発明者らは、ＴＡＬＥＮを使用してＢ２ＭノックアウトＪＥＧ３細胞を作製および特性評価した。これらの結果により、ＴＡＬＥＮゲノム編集系を使用したＢ２Ｍのゲノム欠失は、Ｂ２ＭおよびすべてのＭＨＣクラスＩ分子の表面発現の完全な無効化をもたらすことが実証された（図２６Ａ〜２６Ｇ）。
実施例３：Ｔ細胞活性化のチェックポイント調節因子であるＰＤ−１およびＣＴＬＡ４をターゲティングすることによるＴ細胞阻害の防止。
例えば癌性細胞または腫瘍環境によるＴ細胞阻害を克服するために、本発明者らは、Ｔ細胞活性の重要なチェックポイント調節因子をターゲティングするｇＲＮＡを開発した。ＴＣＲα鎖およびβ鎖について記載されているのと同様のアプローチを採用した：最初に、ＰＤ−１（ＰＤＣＤ１）およびＣＴＬＡ４（ＣＴＬＡ４）（これらは両方とも、ヒト２番染色体上に位置する）をコードする遺伝子に対して配向される複数ｇＲＮＡを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてオンターゲット切断効率について試験した（それぞれ図１３および図１５）。ＰＣＲベースの戦略とそれに続く配列決定を使用して（図１３Ｃおよび図１５Ｃ）、およびＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイによって（図１４Ｂおよび図１６Ｂ）、切断を両遺伝子座において確認した。活性化ジャーカットＴ細胞において、ＦＡＣＳ分析によって、ＰＤ−１発現の低減を確認した（図１４Ａ）。

Claims (86)

  1. 改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞であって、
    （ａ）２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子が、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第１のゲノム改変；
    （ｂ）２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子が、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第２のゲノム改変；
    （ｃ）（ｉ）１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子が、ゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチを欠失させるように編集されている第３のゲノム改変；および／または
    （ｃ）（ｉｉ）７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子が、ゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第４のゲノム改変；ならびに
    （ｄ）１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子が、ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第５のゲノム改変
    を含み、
    各細胞が、場合により、
    （ｅ）（ｉ）損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原もしくはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体、もしくは該少なくとも１つのキメラ抗原受容体をコードする外因性核酸、ならびに／または
    （ｅ）（ｉｉ）隣接細胞、組織もしくは器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つの外因性タンパク質、もしくは該タンパク質をコードする外因性核酸
    を含む、改変初代ヒトＴ細胞。
  2. 改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞であって、
    （ａ）２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子が、隣接上流エクソンの少なくとも一部および隣接下流エクソンの少なくとも一部に隣接するイントロンを含むゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させるように編集されており、前記ゲノムＤＮＡの欠失された第１の連続ストレッチの５’末端の上流のゲノムＤＮＡの３’末端が、前記ゲノムＤＮＡの欠失された第１の連続ストレッチの３’末端の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合されて、前記ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠く２番染色体上の改変ＣＴＬＡ４遺伝子が生じ、それにより、前記細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除する第１のゲノム改変；ならびに／または
    （ｂ）２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子が、隣接上流エクソンの少なくとも一部および隣接下流エクソンの少なくとも一部に隣接するイントロンを含むゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させるように編集されており、前記ゲノムＤＮＡの欠失された第２の連続ストレッチの上流のゲノムＤＮＡの３’末端が、前記ゲノムＤＮＡの欠失された第２の連続ストレッチの３’末端の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合されて、前記ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠く２番染色体上の改変ＰＤ１遺伝子が生じ、それにより、前記細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除する第２のゲノム改変
    を含む、改変初代ヒトＴ細胞。
  3. 改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞であって、
    （ａ）２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子が、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、前記ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチが、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第１のゲノム改変；ならびに／または
    （ｂ）２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子が、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、前記ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチが、前記細胞と、前記Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第２のペアとを接触させることによって欠失されている第２のゲノム改変
    を含む、改変初代ヒトＴ細胞。
  4. リボ核酸の第１のペアが配列番号１２８および配列番号７２を含み、リボ核酸の第２のペアが配列番号４６２および配列番号４２１を含む、請求項３に記載の細胞。
  5. （ｃ）（ｉ）１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子が、コードエクソンの少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチを欠失させるように編集されている第３のゲノム改変；および／または
    （ｃ）（ｉｉ）７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子が、コードエクソンの少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第４のゲノム改変
    をさらに含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の細胞。
  6. 前記ゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチが、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９５４５からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第３のペアとを接触させることによって欠失されており、ならびに／または
    前記ゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチが、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第４のペアとを接触させることによって欠失されている、請求項５に記載の細胞。
  7. 前記リボ核酸の第３のペアが配列番号５５０および配列番号５７３を含み、ならびに／または前記リボ核酸の第４のペアが配列番号６５７および配列番号６６２を含む、請求項６に記載の細胞。
  8. （ｄ）１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子が、ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第５のゲノム改変をさらに含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の細胞。
  9. 前記ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチが、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７を含む群より選択される配列を有するリボ核酸の第５のペアとを接触させることによって欠失されている、請求項８に記載の細胞。
  10. 前記リボ核酸の第５のペアが配列番号７７３および配列番号７７８を含む、請求項９に記載の細胞。
  11. キメラ抗原受容体または該キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
  12. 前記キメラ抗原受容体が、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原またはエピトープに特異的に結合する、請求項１１に記載の細胞。
  13. 隣接細胞、組織または器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つの外因性タンパク質または該タンパク質をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
  14. 前記Ｔ細胞が細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、記憶Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、組織浸潤リンパ球およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
  15. 前記細胞が、自己免疫障害、癌、慢性感染性疾患および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群より選択される障害を患っているか、前記障害について処置されているか、前記障害と診断されているか、前記障害を発症するリスクを有するか、または前記障害を有すると疑われる被験体から得られる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞。
  16. 改変初代ヒトＴ細胞を生産するための方法であって、
    （ａ）初代ヒトＴ細胞における２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること；
    （ｂ）前記細胞における２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること；
    （ｃ）（ｉ）前記細胞における１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチを欠失させるように編集すること、および／または
    （ｃ）（ｉｉ）前記細胞における７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること；ならびに
    （ｄ）前記細胞における１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること
    を含み、場合により、
    （ｅ）（ｉ）前記細胞が、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原もしくはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体を発現するようにすること、ならびに／または
    （ｅ）（ｉｉ）前記細胞が、隣接細胞、組織もしくは器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つのタンパク質を発現するようにすること
    を含み、
    （ａ）〜（ｄ）における編集が、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに
    （ａ）における前記遺伝子から前記ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つの第１のペア、
    （ｂ）における前記遺伝子から前記ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つの第２のペア、
    （ｃ）（ｉ）における前記遺伝子から前記ゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチを欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つの第３のペア、および／または
    （ｃ）（ｉｉ）における前記遺伝子から前記ゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチを欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つの第４のペア、ならびに
    （ｄ）における前記遺伝子から前記ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチを欠失させるためのガイドＲＮＡ配列の少なくとも１つの第５のペアとを接触させることを含む、方法。
  17. 改変初代ヒトＴ細胞を生産するための方法であって、
    （ａ）初代ヒトＴ細胞における２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子を、隣接上流エクソンの少なくとも一部および隣接下流エクソンの少なくとも一部に隣接するイントロンを含むゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させるように編集し、前記ゲノムＤＮＡの欠失された第１の連続ストレッチの５’末端の上流のゲノムＤＮＡの３’末端を、前記ゲノムＤＮＡの欠失された第１の連続ストレッチの３’末端の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合して、前記ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠く２番染色体上の改変ＣＴＬＡ４遺伝子を生じさせ、それにより、前記細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除すること；ならびに／または
    （ｂ）初代ヒトＴ細胞における２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を、隣接上流エクソンの少なくとも一部および隣接下流エクソンの少なくとも一部に隣接するイントロンを含むゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させるように編集し、前記ゲノムＤＮＡの欠失された第２の連続ストレッチの上流のゲノムＤＮＡの３’末端を、前記ゲノムＤＮＡの欠失された第２の連続ストレッチの３’末端の下流のゲノムＤＮＡの５’末端に共有結合して、前記ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠く２番染色体上の改変ＰＤ１遺伝子を生じさせ、それにより、前記細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除すること
    を含む、方法。
  18. 改変初代ヒトＴ細胞を生産するための方法であって、
    （ａ）初代ヒトＴ細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させ、それにより、２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第１の連続ストレッチを欠失させ、前記細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること；ならびに／または
    （ｂ）初代ヒトＴ細胞と、前記Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第２のペアとを接触させ、それにより、２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第２の連続ストレッチを欠失させ、前記細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること
    を含む、方法。
  19. 前記リボ核酸の第１のペアが配列番号１２８および配列番号７２を含み、前記リボ核酸の第２のペアが配列番号４６２および配列番号４２１を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. （ｃ）（ｉ）前記細胞における１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子を、コードエクソンの少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチを欠失させるように編集すること、および／または
    （ｃ）（ｉｉ）前記細胞における７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子を、コードエクソンの少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること
    をさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. （ｃ）（ｉ）における編集が、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第３のペアとを接触させることを含み、ならびに／または
    （ｃ）（ｉｉ）における編集が、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第４のペアとを接触させることを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記リボ核酸の第３のペアが配列番号５５０および配列番号５７３を含み、ならびに／または前記リボ核酸の第４のペアが配列番号６５７および配列番号６６２を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. （ｄ）前記細胞における１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を、ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集することをさらに含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. （ｄ）における編集が、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第５のペアとを接触させることを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記リボ核酸の第５のペアが配列番号７７３および配列番号７７８を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記細胞が、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原もしくはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体を発現するようにすることをさらに含む、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記細胞が隣接細胞、組織または器官の近傍にある場合に、前記細胞が、前記隣接細胞、組織または器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つのタンパク質を発現するようにすることをさらに含む、請求項１７〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、記憶Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、組織浸潤リンパ球およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記細胞が、自己免疫障害、癌、慢性感染性疾患および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群より選択される障害を患っているか、前記障害について処置されているか、前記障害と診断されているか、前記障害を発症するリスクを有するか、または前記障害を有すると疑われる被験体から得られる、請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞、または請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の方法にしたがって生産された細胞を含む、組成物。
  31. 処置を必要とする患者を処置する方法であって、
    （ａ）（ｉ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞を、このような細胞を必要とする患者に投与すること；
    （ａ）（ｉｉ）請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の方法にしたがって生産された改変Ｔ細胞を、このような細胞を必要とする患者に投与すること；または
    （ａ）（ｉｉｉ）請求項３０に記載の組成物を、このような細胞を必要とする患者に投与すること
    を含む、方法。
  32. 前記処置が養子免疫療法を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記投与する工程の前に、前記改変Ｔ細胞をエクスパンドすることをさらに含む、請求項３０または３１に記載の方法。
  34. 前記患者が、自己免疫障害、癌、慢性感染性疾患および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群より選択される障害を患っているか、前記障害について処置されているか、前記障害と診断されているか、前記障害を発症するリスクを有するか、または前記障害を有すると疑われる、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. キメラ核酸を含む組成物であって、前記キメラ核酸が、
    （ａ）Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列；
    （ｂ）
    （ｉ）配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７；
    （ｉｉ）配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５；
    （ｉｉｉ）配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０；
    （ｉｖ）配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２；
    （ｖ）配列番号７６６〜７８０および１０５７４〜１３２５７；ならびに
    （ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせ
    からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸配列
    を含む、組成物。
  36. （ｂ）におけるリボ核酸配列のペアが、
    （ｉ）配列番号１２８および配列番号７２；
    （ｉｉ）配列番号４６２および配列番号４２１；
    （ｉｉｉ）配列番号５５０および配列番号５７３；
    （ｉｖ）配列番号６５７および配列番号６６２；
    （ｖ）配列番号７７３および配列番号７７８；ならびに
    （ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせ
    からなる群より選択される、請求項３５に記載の組成物。
  37. 検出可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項３４または３５に記載の組成物。
  38. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分を含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
  39. ヒト細胞における発現増加に最適化されたプロモーターであって、前記キメラ核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素およびニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−１αプロモーターならびにユビキチンプロモーターからなる群より選択される、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 前記キメラ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトシン（ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｄｉｎｅ）、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群より選択される少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が、Ｃａｓ９タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
  42. 前記ｍＲＮＡが、プソイドウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群より選択される少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の組成物。
  43. 細胞における標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、前記ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸がＣａｓタンパク質を前記標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、前記標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列が切断され、前記１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される、方法。
  44. 前記１〜２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１〜１９５および７９７〜３６３７からなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記２つのリボ核酸が配列番号１２８および配列番号７２を含む、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. 細胞における標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、前記ＰＤ１ポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸がＣａｓタンパク質を前記標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、前記標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列が切断され、前記１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される、方法。
  47. 前記１〜２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号１９６〜５３１および４０４７〜８９４５からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記２つのリボ核酸が配列番号４６２および配列番号４２１を含む、請求項４５または４６に記載の方法。
  49. 細胞における標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、前記ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸がＣａｓタンパク質を前記標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、前記標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列が切断され、前記１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される、方法。
  50. 前記１〜２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号５３２〜６０９および９１０２〜９７５０からなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記２つのリボ核酸が配列番号５５０および配列番号５７３を含む、請求項４９または５０に記載の方法。
  52. 細胞における標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、前記ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸がＣａｓタンパク質を前記標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、前記標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列が切断され、前記１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される、方法。
  53. 前記１〜２つのリボ核酸がそれぞれ、配列番号６１０〜７６５および９７９８〜１０５３２からなる群より選択される、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記２つのリボ核酸が配列番号６５７および配列番号６６２を含む、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 改変初代ヒトＴ細胞であって、各細胞が、
    （ａ）２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子が、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３６３８〜４０４６からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、前記細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第１のゲノム改変；ならびに／または
    （ｂ）２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子が、前記細胞と、前記Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８９４６〜９１０１からなる群より選択される配列を有する第２のリボ核酸とを接触させることによって、前記細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第２のゲノム改変
    を含む改変ゲノムを含む、改変初代ヒトＴ細胞。
  56. （ｃ）（ｉ）１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子が編集されている第３のゲノム改変；および／または
    （ｃ）（ｉｉ）７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子が編集されており、それにより、前記細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除する第４のゲノム改変
    をさらに含む、請求項５５に記載の細胞。
  57. ゲノムＤＮＡの第３の連続ストレッチが、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号９７５１〜９７９７からなる群より選択される配列を有する第３のリボ核酸とを接触させることによって編集されており、ならびに／または
    ゲノムＤＮＡの第４の連続ストレッチが、前記細胞と、前記Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１０５３３〜１０５７３からなる群より選択される配列を有する第４のリボ核酸とを接触させることによって編集されている、請求項５６に記載の細胞。
  58. （ｄ）１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子が編集されており、それにより、前記細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除する第５のゲノム改変をさらに含む、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の細胞。
  59. ゲノムＤＮＡの第５の連続ストレッチが、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１３２５８〜１３７１９からなる群より選択される配列を有する第５のリボ核酸とを接触させることによって編集されている、請求項５８に記載の細胞。
  60. キメラ抗原受容体または前記キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の細胞。
  61. 前記キメラ抗原受容体が、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原またはエピトープに特異的に結合する、請求項６０に記載の細胞。
  62. 隣接細胞、組織または器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つの外因性タンパク質または前記タンパク質をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の細胞。
  63. 前記Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、記憶Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、組織浸潤リンパ球およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５５〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
  64. 前記細胞が、自己免疫障害、癌、慢性感染性疾患および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群より選択される障害を患っているか、前記障害について処置されているか、前記障害と診断されているか、前記障害を発症するリスクを有するか、または前記障害を有すると疑われる被験体から得られる、請求項５５〜６３のいずれか一項に記載の細胞。
  65. 改変初代ヒトＴ細胞を生産するための方法であって、
    （ａ）初代ヒトＴ細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号３６３８〜４０４６からなる群より選択される配列を有する第１のリボ核酸とを接触させ、それにより、２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子を、前記細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること；ならびに／または
    （ｂ）初代ヒトＴ細胞と、前記Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号８９４６〜９１０１からなる群より選択される配列を有する第２のリボ核酸とを接触させ、それにより、２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を、前記細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集すること
    を含む、方法。
  66. （ｃ）（ｉ）前記細胞における１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子を編集すること、および／または
    （ｃ）（ｉｉ）前記細胞における７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子を編集し、それにより、前記細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除すること
    をさらに含む、請求項６５に記載の方法。
  67. （ｃ）（ｉ）における編集が、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号９７５１〜９７９７からなる群より選択される配列を有する第３のリボ核酸とを接触させることを含み、ならびに／または
    （ｃ）（ｉｉ）における編集が、前記細胞と、前記Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号１０５３３〜１０５７３からなる群より選択される配列を有する第４のリボ核酸とを接触させることを含む、請求項６６に記載の方法。
  68. （ｄ）前記細胞における１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を編集し、それにより、前記細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除することをさらに含む、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. （ｄ）における編集が、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号１３２５８〜１３７１９からなる群より選択される配列を有する第５のリボ核酸とを接触させることを含む、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記細胞が、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原もしくはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体を発現するようにすることをさらに含む、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記細胞が隣接細胞、組織または器官の近傍にある場合に、前記細胞が、前記隣接細胞、組織または器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つのタンパク質を発現するようにすることをさらに含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、記憶Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、組織浸潤リンパ球およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６５〜７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記細胞が、自己免疫障害、癌、慢性感染性疾患および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群より選択される障害を患っているか、前記障害について処置されているか、前記障害と診断されているか、前記障害を発症するリスクを有するか、または前記障害を有すると疑われる被験体から得られる、請求項６５〜７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 請求項５５〜６４のいずれか一項に記載の細胞、または請求項６５〜７３のいずれか一項に記載の方法にしたがって生産された細胞を含む、組成物。
  75. キメラ核酸を含む組成物であって、前記キメラ核酸が、
    （ａ）Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列；
    （ｂ）
    （ｉ）配列番号３６３８〜４０４６；
    （ｉｉ）配列番号８９４６〜９１０１；
    （ｉｉｉ）配列番号９７５１〜９７９７；
    （ｉｖ）配列番号１０５３３〜１０５７３；
    （ｖ）配列番号１３２５８〜１３７１９；および
    （ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせ
    からなる群より選択されるリボ核酸配列
    を含む、組成物。
  76. 検出可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項７５に記載の組成物。
  77. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃｐｆ１タンパク質またはその機能的部分を含む、請求項７５〜７６のいずれか一項に記載の組成物。
  78. ヒト細胞における発現増加に最適化されたプロモーターであって、前記キメラ核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素およびニワトリβ−アクチンプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子−１αプロモーターならびにユビキチンプロモーターからなる群より選択される、請求項７５〜７７のいずれか一項に記載の組成物。
  79. 前記キメラ核酸が、プソイドウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群より選択される少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む、請求項７５〜７８のいずれか一項に記載の組成物。
  80. 前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が、Ｃｐｆ１タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項７５〜７９のいずれか一項に記載の組成物。
  81. 前記ｍＲＮＡが、プソイドウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−ウリジン、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５，６−ジヒドロウリジン−５’−三リン酸および５−アザウリジン−５’−三リン酸からなる群より選択される少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む、請求項８０に記載の組成物。
  82. 細胞における標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、前記ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質およびリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸がＣａｓタンパク質を前記標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、前記標的ＣＴＬＡ４ポリヌクレオチド配列が切断され、前記リボ核酸が配列番号３６３８〜４０４６からなる群より選択される、方法。
  83. 細胞における標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、前記ＰＤ１ポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質およびリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸がＣａｓタンパク質を前記標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、前記標的ＰＤ１ポリヌクレオチド配列が切断され、前記リボ核酸が配列番号８９４６〜９１０１からなる群より選択される、方法。
  84. 細胞における標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、前記ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質およびリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸がＣａｓタンパク質を前記標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、前記標的ＴＣＲＡポリヌクレオチド配列が切断され、前記リボ核酸が配列番号９７５１〜９７９７からなる群より選択される、方法。
  85. 細胞における標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列を変化させるための方法であって、前記ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列と、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピートに関連する（Ｃａｓ）タンパク質およびリボ核酸とを接触させることを含み、前記リボ核酸がＣａｓタンパク質を前記標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズし、前記標的ＴＣＲＢポリヌクレオチド配列が切断され、前記リボ核酸が配列番号１０５３３〜１０５７３からなる群より選択される、方法。
  86. 改変ゲノムを含む改変初代ヒトＴ細胞であって、
    （ａ）２番染色体上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）遺伝子が、前記細胞におけるＣＴＬＡ４受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第１のゲノム改変；
    （ｂ）２番染色体上のプログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子が、前記細胞におけるＰＤ１受容体表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第２のゲノム改変；
    （ｃ）（ｉ）１４番染色体上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖遺伝子座をコードする遺伝子が、前記細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第３のゲノム改変；および／または
    （ｃ）（ｉｉ）７番染色体上のＴＣＲβ鎖遺伝子座をコードする遺伝子が、前記細胞におけるＴＣＲ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第４のゲノム改変；ならびに
    （ｄ）１５番染色体上のβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子が、前記細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第５のゲノム改変
    を含み、
    各細胞が、場合により、
    （ｅ）（ｉ）損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、突然変異細胞およびそれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上で発現される目的の抗原もしくはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体、もしくは前記少なくとも１つのキメラ抗原受容体をコードする外因性核酸、ならびに／または
    （ｅ）（ｉｉ）隣接細胞、組織もしくは器官における目的の生物学的効果をモジュレートする少なくとも１つの外因性タンパク質、もしくは前記タンパク質をコードする外因性核酸
    を含む、改変初代ヒトＴ細胞。
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