CN110621333A - 炎性皮肤病的预防和/或治疗 - Google Patents

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Abstract

公开了下调MAST基因的活性或者MAST基因的转录或翻译产物的活性的物质，其用于预防和/或治疗哺乳动物受试者的炎性皮肤病症。

Description

炎性皮肤病的预防和/或治疗
技术领域
本发明涉及用于预防和/或治疗哺乳动物受试者，特别是人类受试者的炎性皮肤病症的物质，以及用于鉴定此类物质的分析方法。
背景技术
脂溢性皮炎(SD)是一种常见的慢性炎性复发性皮肤病，其特征是油性脱屑(greasy scaling)，主要发生在皮脂丰富的区域，例如头皮、面部和胸部。SD的总体发病率尚未得到充分记录，但估计约为4％(Gupta AK,Bluhm R.Seborrheic dermatitis.J EurAcad Dermatol.2004；18(1):13-26；Palamaras等,Seborrheic dermatitis:lifetimedetection rates.J Eur Acad Dermatol Venereol.2012；26(4):524-6)。SD具有高的社会经济影响力，2004年在美国超过14亿美元。尽管具有相对高的疾病负担，但对SD的发病机理知之甚少(Bickers等,J Am Acad Dermatol.2006；55(3):490-500；Szepietowski等,Mycoses.2009；52(4):357-63)。
头皮屑是涉及皮肤鳞片形成的常见病症，且其症状在外观上通常与SD的症状相似。由于这一原因，这两个术语有时可互换使用，其中头皮的SD被认为是严重的头皮屑。但是，就本发明的目的而言，这两种病症被认为是不同的，并且以下区别是在头皮屑和SD之间公认的：(i)头皮屑只在头皮上发生，而SD可以在身体的其他部位(例如面部和胸部)上发生；(ii)头皮屑特征是松散粘着的小皮肤鳞片的斑块，颜色为灰色或白色，通常伴有瘙痒，而在SD中，皮肤鳞屑是丰富的，通常表现为粘着的丘堆，其颜色为油黄色(greasy yellow)；(iii)SD可伴有可见的皮肤发红(红斑)，其在头皮屑中从不存在。然而，尽管有这些区别，这两种病症确实有许多相似之处。
马拉色酵母似乎在SD的发病机理中起重要作用，因为消除该酵母导致疾病的改善。然而，这种酵母可以被认为是一种共生体，其存在于健康的和受影响的个体的皮肤上，表明其他因素也具有影响(Dawson,J.Investig.Dermatol.Symp.Proc.2007；12(2):15-19)。主体风险因素与SD相关，包括角质层屏障的功能障碍、对马拉色菌代谢产物的免疫反应的改变和皮脂腺分泌的增加(Turner等,Int J Cosmet Sci.2012；34(4):298-306；Schwartz等,Acta Derm Venereol.2013；93(2):131-7)。此外，SD在男性中更为常见，且在获得性免疫缺陷综合征、移植接受者和患帕金森氏病的人群中具有很高的发病率(Mastrolonardo等,Med Hypotheses.2003；60(6):907-11；Lally等,J Eur Acad DermatolVenereol.2010；24(5):561-4,Chatzikokkinou等,Acta Dermatovenerol Croat.2008；16(4):226-30)。环境、生活方式和卫生因素也与SD相关，例如压力、气候、酒精滥用和肥胖症(Gupta和Bluhm.，2004，上文引用的)。
SD的遗传易感性尚未得到研究，导致没有涉及SD疾病发生的候选基因。但是，可以说SD与在遗传学上更好地表征的其他慢性炎性皮肤病(尤其是与牛皮癣(PSO)(有时也称为“脂漏性干癣(sebopsoriasis)”)和特应性皮炎(AD))共有几种临床特征(Genetics EA,Lifecourse Epidemiology Eczema C,Australian Asthma Genetics C,AustralianAsthma Genetics Consortium A.Multi-ancestry genome-wide association study of21,000cases and 95,000controls identifies new risk loci for atopicdermatitis.Nat Genet.2015；Stuart等Nat Genet.2010；42(11):1000-4)。皮肤屏障的功能障碍和对外部刺激的免疫介导反应的不足是这三种皮肤疾病发病机理中的共同因素。在最近的研究中，发现头皮屑、AD和PSO的头皮组织的基因转录谱中的重叠，表明可能的共有遗传易感性(Ginger等,J Invest Dermatol.2015；135,S1-S17)。尚不清楚AD和PSO的已知基因变体是否也与SD相关。
本发明旨在提供炎性皮肤病症的预防和/或治疗，和更特别地SD和/或头皮屑的预防和/或治疗中的或与之相关的改进。
发明内容
在第一方面，本发明提供了下调MAST4基因的活性或者MAST4基因的转录或翻译产物的活性的物质，其用于预防和/或治疗哺乳动物受试者的炎性皮肤病症。(MAST＝微管相关的丝氨酸苏氨酸激酶)。
除了丝氨酸苏氨酸激酶活性外，MAST蛋白还具有由PDZ结构域介导的蛋白结合活性。
直接或间接下调的MAST4基因或基因产物的活性通常可以(但不是必然)包括丝氨酸苏氨酸激酶活性和/或PDZ结构域蛋白结合活性。
在一些实施方案中，该物质可以调节MAST4基因或基因产物的比活性(即降低每mgMAST4基因或基因产物的激酶活性)，或者可以通过引起MAST4基因或MAST4基因产物量的降低来调节活性。在其他实施方案中，该物质可以通过调节MAST4蛋白与MAST4蛋白的一种或多种蛋白结合伴体之间的相互作用来间接调节MAST4蛋白的活性。
如上所述，MAST蛋白包含PDZ结构域。PDZ结构域存在于多种来源(细菌、酵母、植物、昆虫和脊椎动物)的蛋白质中。通常，它们与蛋白质的C末端氨基酸残基结合，或者较不常见地与蛋白质的内部肽序列结合。
PDZ结构域的功能通常是定位细胞蛋白和/或调节细胞途径。已经鉴定了数百种不同的PDZ结构域，且尽管它们在其氨基酸序列(长度约为80-90个残基)方面表现出相当大的多样性，它们一般包含4-6个β链、一个短α螺旋和一个长α螺旋，以紧密的球状结构排列。
哺乳动物受试者优选是人类受试者。
炎性皮肤病症可以选自：特应性皮炎(AD)、牛皮癣(PSO)、脂溢性皮炎、头皮屑、酒渣鼻和痤疮。通常，炎性皮肤病症是慢性炎性皮肤病症，并且优选包括SD或头皮屑。
已知四种MAST基因(MAST1、MAST2、MAST3和MAST4)存在于人类基因组中，并在人类皮肤中以不同的水平表达。该化合物调节至少MAST4基因的活性或者MAST4基因的转录或翻译产物的活性。根据他们自己的实验数据，发明人相信MAST4基因在人类皮肤中以高于MAST1-3基因任一的水平表达。
解释一下，本发明人(作为全基因组关联研究的结果)发现，映射到MAST4基因的内含子区域的单核苷酸多态性(SNP)以具有统计学意义的水平与脂溢性皮炎强相关。这表示在核酸和/或多肽水平上调或下调MAST4基因的活性的化合物可能对脂溢性皮炎或类似的炎性皮肤病症(如头皮屑、特应性皮炎、牛皮癣、酒渣鼻或痤疮)发挥有益的预防和/或治疗作用的可能性。
物质可以在核酸和/或多肽水平上调或下调MAST4基因的活性。作为非穷举的代表性实例，可以通过施用引起MAST基因的转录和/或翻译增加的物质或施用指导全部或部分MAST基因产物的表达的核酸分子来实现上调。例如，发明人已经确定了MAST4基因中两个转录因子的结合位点，该转录因子可以增强MAST4基因的转录。调节这些转录因子之一或两者与MAST4基因之间的相互作用可调节MAST4基因的表达水平。
为了避免疑问，MAST基因活性的调节可以包括递送额外的MAST基因编码序列，从而通过引起受试者中MAST基因(特别是MAST4基因)表达水平的提高而产生“基因给药(genedosing)”效果。同样地，本发明可包括将MAST多肽(尤其是MAST4多肽)直接应用于受试者的皮肤，从而引起其中受试者皮肤中或皮肤上需要上调的MAST多肽的浓度的局部提高。
MAST基因活性的下调可以通过施用抑制MAST基因表达的多肽的活性或功能的化合物而在多肽水平实现。一类这样的化合物是免疫球蛋白和免疫球蛋白分子的抗原结合部分或片段。免疫球蛋白可以是对MAST基因表达的多肽具有结合活性的任何类别的抗体(尽管通常IgG、IgA或IgM是优选的)。或者，该化合物可以是免疫球蛋白分子的许多众所周知的部分或片段之一，其保留结合MAST基因表达的多肽的能力。这些包括Fab、F(ab’)2、单链F v(scFv)、单结构域抗体(dAb)等。
免疫球蛋白或者免疫球蛋白部分或片段对于MAST多肽的解离常数KD优选为10-8或更小，更优选10-9或更小，最优选至少10-10或更小。KD通常在10-8至10-11的范围内。
免疫球蛋白或者免疫球蛋白部分或片段优选在其与MAST多肽的结合上是相对特异性的。本领域技术人员公认，描述为对特定抗原“特异性的”免疫球蛋白与以下事实相关：位于轻链和重链可变域内的抗原结合位点(定义为“互补位”)将或多或少排他性地结合触发该抗体产生的抗原。这通常涉及由多种协作的分子相互作用而产生的高亲和力结合。但是，抗体分子存在可以被其他分子(如Fc受体、补体蛋白和各种细菌蛋白，例如来自金黄色葡萄球菌的蛋白A)结合的其他区域。此外，作为相对大的蛋白质，抗体分子具有发生所有非特异性结合相互作用的倾向，该相互作用一般可导致蛋白质或多或少急切地与它们接触的表面结合。这些非特异性的结合相互作用一般在相同类别的所有抗体之间共享，而不管其抗原特异性如何。因此，抗体通常以比其与大多数其他分子结合的亲和力大几个数量级的亲和力与其同源抗原结合。
同样，本领域技术人员公认，术语“免疫球蛋白”不一定表示必需是单一分子种类。相反，该术语可以涵盖分子的异质混合物或群体，并且“特异性免疫球蛋白”可以指混合物中对所讨论的抗原具有特异性的那部分。
一些MAST多肽特异性的免疫球蛋白是可商购的，且包括例如ab87734(来自AbCam，Cambridge UK)，其是与人MAST4多肽的氨基酸1900和1905之间的表位结合的兔多克隆抗体；ab196777，另一种与人MAST4多肽结合的兔多克隆抗体(可从AbCam获得；且也可从GeneTex GTX87899获得)；PA5-36976(来自ThermoFisher)，一种对人MAST4多肽特异性的兔多克隆抗体；和HPA000544(Sigma)，一种与位于人MAST4多肽的氨基酸残基1545-1652中的表位结合的兔多克隆抗体。
可以抑制MAST多肽，特别是MAST4多肽的活性的其他分子包括小的有机化合物(例如，相对分子质量低于5,000，优选低于4,000，最优选低于3,000)。
特别地，MAST多肽的优选小有机分子抑制剂包括喹喔啉类及其衍生物的种类。喹喔啉和喹喔啉衍生物包含由1和4位处的氮原子组成的杂环复合物。喹喔啉的结构如图2所示。喹喔啉及其衍生物由Pereira等，2014(European Journal of Medicinal Chemistry97,p664-672)和由Tristan-Manzano等，2015(Current Medicinal Chemistry 22,p 3075-3108)进行综述。喹喔啉衍生物易于合成(Porter等,“Pyrazines and their benzoderivatives”,Boulton&McKillop Eds.Compr.Heterocycl.Chem.Pergamon Press,Oxford1984,3.；Sato等,“Pyrazines and their benzo derivatives”,Katritzky,Ramsden,Scriven&Taylor Eds.Compr.Heterocycl.Chem.III,Elsevier Oxford 2008,8)。
已显示许多喹喔啉衍生物是MAST蛋白的强效抑制剂(参见Li等，Biorganic&Medicinal Chemistry Letters 2013,23,p 5217-5222)。
用于本发明的优选的喹喔啉衍生物包括咪唑并喹喔啉类。Li等(上文引用)鉴定了几种喹喔啉衍生物，其是MAST多肽激酶活性的强效和相对选择性的抑制剂。因此，用于本发明的优选的喹喔啉衍生物包括以下：咪唑并[1,2-α]-喹喔啉类，尤其是4-氯咪唑并[1,2-α]喹喔啉。MAST多肽激酶活性的其他优选喹喔啉衍生物抑制剂示于图3中。Li等公开了这些化合物的合成(上文)。
隐马尔可夫模型文库算法SUPERFAMILY(所有蛋白质和基因组的结构和功能注释的数据库)定位开始于氨基酸残基1139和结束于氨基酸残基1231的MAST4 PDZ结构域(http://supfam.org/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop.cgi？ipid＝SSES0156)。其他算法(Gene3D、Prosite、Smart和Pfam)鉴定了在分子的同一区域(大约残基1137至1231)中MAST4处的PDZ结构域。
MAST4 PDZ结构域的晶体结构已被解析和发表(Elkins等2010ProteinSci.2010Apr；19(4):731-741)。
MAST家族蛋白序列的比对表明，尽管不完全相同，但PDZ结构域在MAST蛋白家族成员之间是高度保守的。
因此，有可能设计特异地靶向MAST4 PDZ结构域的小肽，其可以破坏MAST4与其靶蛋白的相互作用，从而调节其功能。下拉研究(Valiente等2005J.Biol.Chem.289(32)28936-28943)支持设计选择性MAST4 PDZ抑制剂的可能，因为在这些研究中，MAST4 PDZ结构域不结合PTEN，而MAST2和MAST3 PDZ结构域结合。
MAST4 PDZ结构域结合的生理靶蛋白尚未确定，但使用文本挖掘的String DB的分析(http://string-db.org/cgi/)、共表达分析和预测蛋白质/蛋白质相互作用的实验数据鉴定了以下为推定的MAST4功能伴体：GALNS、DNAJC6、TPTE2、TENC1、ARID4B、SPG21、PTEN、TNS3、SRL和TPTE。另外，Colland等人在SMAD蛋白相互作用的酵母2-杂交筛选之后报告了MAST4和SMAD1之间的相互作用(Colland等2004Functional proteomics mapping of ahuman signaling pathway.Genome Res.2004Jul；14(7):1324-32)。
鉴于上述情况，结合在MAST4蛋白的激酶结构域或PDZ结构域处或附近的免疫球蛋白或其抗原结合片段应成功地抑制其活性。同样地，考虑到已经确定了MAST4 PDZ结构域的晶体结构，对于本领域技术人员而言，设计可以结合MAST蛋白PDZ结构域或以另外的方式抑制PDZ结构域与其配体之间的相互作用的小分子(例如肽)是相对简单的。
也已证明27-羟基胆固醇调节MAST4(参见Nelson,Molecular and CellularEndocrinology Volume 466,5May 2018,73-80页)。
其他分子可以在核酸水平上抑制MAST活性(例如抑制MAST基因，特别是MAST 4基因的转录和/或翻译)。例如，由于MAST基因的序列是已知的(例如，MAST4基因位于5号染色体的正向链上，并且包含核苷酸66,596,361至37,169,595(人类基因组构建GRCh 38:CM000667.2))，因此可以容易地制备短干扰RNA(siRNA)分子，其通常大约20-30bp及在每个末端具有一个或两个核苷酸的突出端。据预测MAST4基因编码21个转录物，其中许多已通过实验验证。转录物：MAST4-001 ENST00000403625.6编码具有29个外显子的最长多肽(2623个氨基酸)和目前注释有40个结构域和特征，并映射到85个寡核苷酸探针。
其他MAST基因的详细信息如下：
MAST1基因位置：染色体19：12,833,951-12,874,951正向链(人类基因组构建GRCh38:CM000681.2)。MAST1同义名：SAST170，SAST，KIAA0973。
在MAST1基因产物中，蛋白激酶结构域位于氨基酸残基372-647周围，而PDZ域位于氨基酸残基958-1057周围。
MAST2基因位置：染色体1：45,786,987-46,036,124正向链(人类基因组构建GRCh38:CM000663.2)。MAST2同义名：KIAA0807，GN MAST205，KIAA0807，MTSSK，MAST205。
在MAST2蛋白中，蛋白激酶结构域位于氨基酸残基510-860的区域中，更特别地残基512-785。
MAST3基因位置：染色体19：18,097,793-18,151,692正向链(人类基因组构建GRCh38:CM000681.2)。MAST3同义名：KIAA0561。
在MAST3蛋白中，蛋白激酶结构域位于残基365-719周围，且更特别地残基367-640处。
MAST基因，特别是MAST4基因，在核酸水平上的活性提高可以通过施用增加MAST基因转录的转录因子来实现。已知或很可能增强MAST基因转录的转录因子包括CCAAT/增强子结合蛋白(缩写为CEBP beta)，因为发明人发现MAST4基因包括CEBP beta转录因子结合位点。或者，调节CEBP beta与MAST4的结合的物质可以上调或下调MAST4的转录水平。
CEBP beta可获自商业来源，例如作为纯化的蛋白质或作为编码多肽的核酸序列，例如购自Genscript、Cloud-Clone和OriGene。同样地，CEBP beta特异性的抗体可从商业来源(如AbCam)获得。CEBP beta的已知激动剂蛋白/激动剂基因包括INS、EGR2、CDK2、GSK3B、MAPK3、ABL1、ABL2和MAPK1。相反地，CEBP beta的已知拮抗剂基因/蛋白质包括：GATA3、SOX9、GATA2、SMAD3和SMAD4。
因此，存在多种可商购或容易地产生的物质，其可用于上调或下调CEBP beta的表达和/或抑制该蛋白质与MAST4基因的相互作用。特别地，对CEBP beta特异性的抗体(或抗体的抗原结合部分)可以抑制MAST4序列的蛋白质的结合。
发明人还已经确定(通过检查Open Regulatory Annotation Database，也称为“ORegAnno”)，在MAST4基因的区域中存在另一个预测的转录因子结合位点，其被鉴定为具有特殊的相关性。这一转录因子是SMARCA4(OReg ID 1274278)，也称为BRG1。SMARCA4是一种“染色质重塑蛋白(chromatin remodeller)”，且促进参与表皮屏障修复的基因的表达(Botchkarev,Journal of Invest.Dermatol.Symposium 2015,17[18-19])，以及控制毛囊组织重建(Xiong等,Developmental Cell 2013,25,169-181)。因此，这一转录因子的结合位点的存在支持了MAST4在维持表皮完整性中的作用，可以预测其与皮肤炎症的易感性相关。
因此，作为调节CEBP beta和MAST4之间相互作用的替代方式或补充，可以通过调节SMARCA4和MAST基因之间的相互作用来调节MAST4的表达。存在SMARCA4蛋白/核酸，及SMARCA4特异性的抗体(如对于CEBP beta)的商业来源。SMARCA4的已知激动剂包括MYOD1和MYOG。已知的拮抗剂包括PFI3，它是SMARCA4的强效和选择性的抑制剂，Kd值为89nM(Vangamudi等,Cancer Res.2015,pii:canres.3798.2015)。
在第二方面，本发明提供了一种体外分析方法以鉴定具有治疗和/或预防人类受试者的炎性皮肤病症的潜在功效的物质，该分析方法包括以下步骤：单独地将多种候选物质与MAST4基因或MAST4基因产物接触；和鉴定对MAST4基因或MAST4基因产物的活性具有下调作用的那些候选物质。
候选物质可以对MAST4基因或MAST4基因产物的活性具有直接或间接的调节作用。在本发明的情况中，调节作用是下调。在替代方案中，调节作用可以是上调。
该分析可以包括表达MAST基因的体外表达系统。通常，合适的体外表达系统是可商购的并且是本领域技术人员已知的。
MAST4基因或MAST4基因产物活性的量可以通过任何合适的方法直接测量或推断。例如，有许多用于测定基因的表达水平的技术，且这些包括，例如，使用关联的标志物或报告基因，如荧光素酶、荧光蛋白(例如GFP)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)分析。
测定MAST多肽的量或活性的方法包括测定MAST多肽的激酶活性的方法。通常，可用于本发明的这一方面的合适的激酶测定技术包括：
(a)在表达或含有目标激酶(例如MAST4)的系统中测量从ATP产生的ADP。这可以通过一系列直接和间接报告体如放射性同位素标记、抗体偶联的荧光或发光来评估，例如在Promega ADP-GloTM Kinase AssayADP-GloTM Kinase AssayADP-GloTM分析中，其中通过激酶反应产生的ADP被荧光素酶转化为光；
(b)在与表达的激酶靶标反应后检测肽底物中的磷酸丝氨酸。该检测可以使用与报告体系统(如GE lifesciences Discover-RX分析中的β-半乳糖苷酶)偶联的抗体，或如Thermofisher LanthaScreen平台中与通过TR-FRET与荧光报告体偶联的抗体。
(c)使用对与报告体系统偶联的目标激酶特异性的修饰的底物肽；和
(d)细胞途径分析，例如Thermofisher细胞系，其经稳定工程化以在途径特异性反应元件的控制下表达β-内酰胺酶报告体。
J.Fraser Glickman，M.S.P.H.，Ph.D.Rockefeller University,New York,NY,10065的Assay Development for Protein Kinase Enzymes的表1中总结了激酶测定途径的全面综述。
候选物质可以方便地使用已知在调节MAST4基因或MAST4基因产物的活性方面具有活性的化合物(例如MAST多肽特异性的免疫球蛋白；或小分子抑制剂，如4-氯咪唑并[1,2-α]喹喔啉)，与阳性对照平行地测试：优选地候选物质在调节MAST基因或MAST基因产物的活性方面至少与阳性对照一样有效，更优选地候选化合物在调节MAST基因或MAST基因产物的活性方面与阳性对照相比方面效力提高10％、20、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至高达100％(在等同摩尔浓度下)。
在第三方面，本发明提供了MAST4基因产物或表达MAST4基因产物的核酸分子在筛选分析中鉴定调节MAST4基因产物或表达MAST4基因产物的核酸分子的活性的物质，且因此鉴定可用于治疗和/或预防人类受试者的炎性皮肤病症的物质的用途。在本发明的情况中，调节作用是下调。在替代方案中，调节作用可以是上调。
本发明还可以提供一种制备用于适当地预防和/或治疗人类受试者的炎性皮肤病症的预防和/或治疗制剂的方法，该方法包括将有效调节MAST4基因或MAST4基因产物活性的活性物质与合适的稀释剂、赋形剂或载体混合，所述活性物质通过本发明第二方面的分析方法鉴定。
本发明各个方面的活性物质可以是复杂的混合物(例如天然植物提取物等)，或者可以是基本上纯化或分离的化合物。此外，活性物质可以包含单一的活性化合物，或者可以包含多种活性化合物，其可以在调节MAST基因或基因产物的活性方面加合地或更优选协同地起作用。
优选地，制剂包含一种或多种另外的活性化合物，并且这些可以方便地包括已知的抗炎化合物，尤其是已知并且被批准用于局部应用的抗炎化合物。此类化合物包括皮质类固醇类，如下所述。
本领域技术人员可以通过常规的反复试验的方法确定一种或多种活性化合物的合适剂量，并因此确定制剂中的合适浓度，这种反复试验的方法不构成本发明的发明性部分。
递送机制
用于递送活性剂以上调或下调MAST基因或者其转录或翻译产物的活性的机制可以是递送有效剂量的活性剂而同时避免明显的不可接受的副作用的任何机制。出于本发明的目的，活性剂的有效剂量是在炎性皮肤病(尤其是SD)的情况中产生明显改善以达到治疗效果，或者预防炎性皮肤病(尤其是SD)的发生以起到预防作用的剂量。
活性剂可以口服或通过注射(优选皮下，或次优地，肌肉内)递送。然而，最优选地，活性剂将通过局部施用递送至受试者的皮肤，其在受试者具有活动性病症时可以方便地是受炎性皮肤病影响的皮肤区域，和/或如果受试者在施用该制剂时没有症状，其可以是易患炎性皮肤病的皮肤部分。例如，在疾病为SD的情况下，可以将活性剂局部施用于头皮、面部或胸部中的一个或多个，但是如果其它区域也受到影响，则可以同样地施用于皮肤的那些其它区域。
如果将活性剂局部施用，则可能需要其中存在活性剂的制剂进一步掺入渗透促进剂。
化学渗透促进剂的例子包括经皮吸收加速剂如肉豆蔻酸异丙酯、表面活性剂、醇等，包括C6-C20脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、酰胺或醚、芳族有机酸、芳族醇、芳族脂肪酸酯或醚(它们可以是饱和或不饱和的，并且可以是环状、直链或支链的)，尤其是乳酸酯、乙酸酯、单萜化合物、倍半萜化合物、氮酮、氮酮衍生物、1-[2-(癸基硫代)乙基]氮杂-环戊-2-酮(pirotiodecane)、甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(Span型)、聚山梨酸酯(型)、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油(HCO型)、聚氧乙烯烷基醚、蔗糖脂肪酸酯、植物油等。特定的实例包括辛酸、癸酸、己酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、异硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、月桂醇、肉豆蔻醇、油醇、异硬脂醇、鲸蜡醇、月桂酸甲酯、月桂酸己酯、癸二酸二乙酯、月桂酸二乙醇酰胺、三乙醇胺、肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、肉豆蔻酸辛基癸酯、棕榈酸十六烷基酯、水杨酸、水杨酸甲酯、水杨酸乙二醇酯、肉桂酸、肉桂酸甲基酯、甲酚、乳酸十六烷基酯、乳酸月桂酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、香叶醇、百里酚、丁子香酚、松油醇、1-薄荷醇、冰片、d-柠檬烯、异丁香酚、异冰片、橙花醇、dl-莰酮、单辛酸甘油酯、单癸酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、单油酸甘油酯、单月桂酸脱水山梨醇酯、蔗糖单月桂酸酯、聚山梨酸酯20、丙二醇、单月桂酸丙二醇酯、单月桂酸聚乙二醇酯、单硬脂酸聚乙二醇酯、聚氧乙烯月桂基醚、焦硫代癸烷(pyrothiodecane)。经皮吸收也可以使用水凝胶媒介、微乳液、纳米颗粒或固体脂质纳米颗粒来增强。
递送机制包括以下：将含有活性剂的液体(如洗发剂和/或护发素)、乳膏、凝胶、洗液、糊剂、贴片等直接应用到皮肤上；将包含掺入脂质体、醇质体(ethosome)、传递体(transfersome)或类似的包括脂质双层的合成囊泡中的活性剂的制剂应用到皮肤上；将包含负载在纳米颗粒上、掺入纳米颗粒中或附着到纳米颗粒上的活性剂的制剂应用到皮肤上。制备脂质体、醇质体、传递体等的方法是本领域技术人员众所周知的。传递体是特殊的脂质体种类，其由于在双脂质层中包含表面活性剂和/或其他两亲性分子而是高度可变形的。本质上，醇质体是包含相对大量(通常20-45％w/w)的乙醇的脂质体。为了本发明的目的，术语“脂质双层”包括由改性脂质如磷脂、糖脂、磷酸糖脂形成或包含该改性脂质的双层。
上述机制可任选地与化学渗透促进剂和/或物理渗透促进剂的使用结合。
物理渗透增强可以包括以下一种或多种：离子电渗、电穿孔、超声处理或者使用微针或其他磨皮技术，其可以在应用制剂到受试者的皮肤之前和/或与其同时和/或在其之后使用。
siRNA的局部递送使用病毒或非病毒方法及非病毒方法与用于皮肤疾病治疗的主动渗透方法(如离子电渗、超声促渗或微针疗法)的结合实现。
Zheng等2012(http://www.pnas.org/content/109/30/11975.摘要)描述了使用球形核酸纳米颗粒共轭物(“SNA-NCs”，被高度定向的、共价固定的siRNA的致密外壳包围的金核心)，其在应用后数小时内自由渗透几乎100％的体外角质细胞、小鼠皮肤和人表皮。显著地，这些结构可以在市售的保湿剂或磷酸盐缓冲盐水中递送，并且不需要屏障破坏或转染剂，例如脂质体、肽或病毒。另外，Chong等人报道了通过涂覆的钢微针将siRNA递递至皮肤后的基因沉默(Chong等,2013.Journal of Controlled Release 166(3),pp.211-219)。
此外，最近关于Crispr/Cas9组分递送的工作表明，这也可以是用于递送可直接或间接调节MAST基因活性的相关核酸分子的可能途径。
制剂
本发明的实施通常涉及与填充剂、稀释剂、赋形剂、载体等组合施用一种或多种活性剂(即，具有上调或下调MAST基因或者MAST基因的转录或翻译产物的活性的活性)。
合适的稀释剂、赋形剂和载体是本领域技术人员已知的，并且特别地包括水溶液(如盐水、磷酸盐缓冲盐水或其他缓冲制剂)、乳液、油等。
制剂的精确组成尤其取决于其施用方法。方便地，该制剂适应于和配置为用于局部应用于人类受试者的皮肤，并且可以采取特别是乳膏、洗剂、糊剂、凝胶或贴片的形式，尤其是自粘和/或斑贴贴片的形式。在一些实施方案中，制剂可以是洗发剂和/或护发素的制剂，其可以被配制为被冲洗掉或留在头发上。洗发剂和/或护发素制剂是本领域技术人员已知的，并且通常包括以下一种或多种：水、洗涤剂、表面活性剂、增稠剂、甜菜碱、保湿剂、香料或香精及染料或颜料。
通常优选的是，该制剂可以另外包含一种或多种已知的常规抗炎剂，尤其是已知并批准用于局部使用的抗炎剂。大多数此类化合物是皮质类固醇类。非皮质类固醇抗炎剂包括煤焦油制剂。抗炎皮质类固醇类包括：倍他米松二丙酸酯、丙酸氯倍他索、醋酸双氟拉松、丙酸卤倍他索、安西奈德、去羟米松、醋酸氟轻松、氯氟舒松、糠酸莫米松、丙酸氟替卡松、曲安奈德、肤轻松醋酸酯、氟氢缩松、戊酸倍他米松、地奈德、氢化可的松、氢化可的松丁酸盐、氢化可的松戊酸酯、醋酸氢化可的松和盐酸普莫卡因。
附图说明
现在将通过说明性实施例并参考附图进一步描述本发明，其中：
图1显示了人MAST4基因的在被发明人鉴定为与脂溢性皮炎的易感性相关的单核苷酸多态性周围的部分的核苷酸序列。
图2显示喹喔啉及其衍生物的一般化学结构。
图3说明对用于本发明优选的某些喹喔啉衍生物的结构。
具体实施方式
实施例
实施例1–候选基因关联研究(CGAS)和全基因组关联研究(GWAS)
在该实施例中，发明人进行了候选基因关联研究(CGAS)以调查先前与AD和PSO相关的遗传变体是否也与增加的SD风险相关，并进行了首次全基因组关联研究(GWAS)以鉴定与SD相关的新遗传变体。
方法
研究群体
鹿特丹研究(Rotterdam Study)(RS)是一项正在进行的老年人慢性疾病(包括皮肤病)的前瞻性群组研究。可以在其他地方找到该研究的详细说明(Hofman等TheRotterdam Study:2016objectives and design update.Eur J Epidemiol.2015；30(8):661-708)。简而言之，鹿特丹研究由主群组(RS-I)和两个扩展群组(RS-II和RS-III)组成。RS-I始于1990年，且最初包括居住在荷兰鹿特丹的Ommoord区的7,983名参与者。RS-II始于2000年，且包括3011名参与者。RS-III是该群组的进一步扩展，始于2006年，且包括3,932名参与者。鹿特丹研究总共包括14926名年龄在45岁以上的受试者。该群组主要(90％)由北欧血统的参与者组成。
鹿特丹研究由Erasmus MC医学伦理委员会和荷兰卫生、福利和体育部批准。所有参与者均提供了书面知情同意书以参与该研究并从其主治医生处获得信息。
病例定义
鹿特丹研究的总共4454名参与者(具有可用的基因型数据)接受了经训练的医生的全身皮肤检查(FBSE)以评估参与者是否患有SD。临床诊断是基于油性脱屑的存在、红斑以及头皮、面部和/或胸部的特征性分布。包括没有活动性疾病的任何征兆和没有酮康唑使用史(使用药房连锁数据的≥3个处方)的参加者作为对照。
候选基因座的选择
在PubMed中搜索了功能强大的欧洲GWAS，其显示单核苷酸多态性(SNP)与PSO或AD之间的相关性。发明人选择了显著性水平<5.0x10-8的SNP。报告的(先导)SNP用于基于SNP的关联分析，并用于选择基于基因的候选基因关联研究的基因座区域。
对于位于基因内的先导SNP，增加30kb的区域(加基因下游的15kb和上游的15kb)以包括靠近基因的调控元件。如果先导SNP是基因间的并且位置距基因超过15kb，则发明人还增加从先导SNP的碱基对位置下游的15kb和上游的15kb。使用具有构建CRCh37的NCBIVariation Viewer(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/view/)来获取基因的基因组坐标。这些坐标用于获取鹿特丹研究群组的相应区域中的SNP。
基因分型和填补
如前所述(Hofman等Eur J Epidemiol.2015；30(8):661-708；Verkouteren等,JInvest Dermatol.2015；135(8):2135-8)，按照标准实验方案进行全血DNA提取、基因分型、填补和质量控制。Illumina Infinium II HumanHap550 BeadChip用于对RS-1和RS-II群组进行基因分型，而Illumina Human610-Quad BeadChips用于对RS-III群组进行基因分型。
单核苷酸多态性(SNP)上的质量控制包括去除具有Hardy-Weinberg平衡偏差(p-值<5x10-6)、基因型检出率<97％、性别失配和高的平均常染色体杂合性的SNP。如果一级亲属具有小于1％的次要等位基因频率或小于0.3的填补质量(Rsq)，则移除该一级亲属并过滤掉SNP。
候选基因研究
候选基因关联研究(CGAS)以两个步骤进行。首先，进行先前关联的PSO和AD SNP的基于SNP的关联研究，和其次，进行基于基因的关联分析以筛选目标区域内另外的变体。
SD病例和对照的基于SNP的CGAS采用具有加性模型的逻辑回归使用每个鹿特丹研究群组的填补剂量数据来进行。使用作为概要统计数据从似然比检验得出的p-值，对每个鹿特丹研究群组的每SNP的输出进行元分析(Willer等,METAL:fast and efficient meta-analysis of genomewide association scans.Bioinformatics.2010；26(17):2190-1；Aulchenko等,ProbABEL package for genome-wide association analysis of imputeddata.BMC Bioinformatics.2010；11:134)。
最佳猜测基因型用于基于基因的CGAS。使用具有默认参数的GCTA软件从填补的剂量数据估算三个鹿特丹研究群组的基因型(Yang等，Am J Hum Genet.2011；88(1):76-82)。
使用PLINK v.190(参数：p-值＝0.05，SNP最大数＝15，r2＝0.5，排列＝10000)中实施的基于集合的检验进行基于基因的逻辑回归(Purcell等PLINK:a tool set forwhole-genome association and population-based linkage analyses.Am J HumGenet.2007；81(3):559-75)。基于SNP和基于基因的关联两者针对年龄、性别和四种主要成分(PC)进行调整。
全基因组关联研究
使用各鹿特丹研究群组的填补剂量数据采用具有加性模型的逻辑回归进行SD病例和对照的GWAS。该模型针对年龄、性别和四种PC进行调整。GWAS分析在ProbABEL软件包(Aulchenko等人，以上引用)中实施。膨胀因子λ估计接近1.0，且不再考虑。
接下来，使用从似然比检验得出的p-值对每个鹿特丹研究群组的GWAS概要统计数据进行元分析。元分析使用METAL进行(Willer等，之前引用)。将全基因组显著性的p-值的阈值设置为p值≤5x 10-8。
结果
研究群体
4,454名参与者中的4,050名参加SD的CGAS和GWAS。其中，609名(15％)在FBSE期间被研究医师诊断为患有SD。男性比女性更有可能患SD(病例的60.4％与对照的41.8％为男性；p-值<0.001)，并且SD患者与没有SD的人相比年龄更大(68.94vs 67.97，p-值：0.018)。SD病例比对照组更可能诊断出牛皮癣(4.8％vs 3.0％；p＝0.035)。
候选基因法
在对于多重测试校正后，CGAS没有产生任何显著的SD的基因座。
全基因组关联研究
为了发现SD的新基因座，发明人针对对照对SD病例并对于超过700万个基因座进行了GWAS，并且发现了两个全基因组显著关联(表1)。最显著的SNP是r58331610，其映射到5号染色体上MAST4基因的内含子区域(p-值：1.75x 10-8)。第二个命中是rs16944244SNP，其映射到染色体17p12的基因PIRT和SHISA6之间的基因间区域(p值：2.10x 10-8)。此外，在这个相对小的SD患者样本中，发现七个不同基因座中的68个SNP与SD显著相关，其具有提示性的全基因组关联(p-值<5x10-6)。几个SNP映射到蛋白质编码基因，包括GRM3(rs6978155,5.24x 10-7)、KIAA1324L(rs73382367,6.51x 10-7)和SENP2(rs13081203,3.64x 10-6)，而其他是基因间的。这些基因座中没有一个之前与PSO或AD相关联。
表1
*统计学显著的
讨论
在该研究中，发明人未发现先前关联的PSO/AD SNP与SD之间统计学显著的相关性。但是，在对于SD的GWAS中，观察到两个具有全基因组显著关联的SNP。另外，在可能与SD发病机理有关的其他基因中发现了全基因组提示性关联，这需要在其他群组中确认。
在对于SD的先导GWAS中，几个SNP与SD显著相关(p值<5.0x10-8)，包括位于MAST4基因处的变体。MAST4属于蛋白激酶(PK)组，其在细胞内信号传递级联中起关键作用。MAST4的确切功能未知，但该基因在不同的皮肤细胞中表达(Garza等J Clin Invest.2011；121(2):613-22)。MAST4仅上游12MB存在基因CD180，其直接与TLR4信号传导复合体相互作用(Divanovic等，Nat Immunol.2005；6(6):571-8)。TLR4在皮肤的先天免疫中起重要作用。表达研究显示AD、PSO和接触性皮炎皮肤中TLR4表达的干扰，且在用葡萄糖酸锂治疗SD时也发现TLR4表达的降低(Elewa等,J Dermatol.2015；52(5):467-76；Ballanger等,ArchDermatol Res.2008；300(5):215-23)。MAST3，MAST4的一种旁系同源物，也已知影响TLR4(Labbe等Genes Immun.2008；9(7):602-12)。
MAST4基因之前未与任何皮肤病症如PSO或AD相关联。
SNP rs58331610映射到5号染色体的MAST4基因第一内含子中的9.6kb区域。紧靠该SNP周围的基因组DNA核苷酸序列如图1所示。在该图中，多态性的位置由R(嘌呤，即A或G)指示。
在撰写本文时，最新的人类基因组组装(GRCh 38/hg 38)提供了图1中显示序列的坐标，即：chr5:66,724,129至66,725,129(1001bp)。基因组的这一区域位于MAST4基因，内含子1(其具有座标66,597,019至66,759,708)内。
鹿特丹研究组(主要为欧洲白种人血统)的G等位基因频率为0.139。根据全基因组关联研究的发现，G等位基因与发生脂溢性皮炎的“保护”相关。
有趣的是，来自1000基因组项目的数据表明，这一保护性rs58331610'G等位基因'的频率在全球范围内不同祖先类群之间有很大变化，其范围从某些非洲群体的<10％到某些东亚和中南美祖先群体的最高50％。
SNP与SD强相关，因此有可能MAST4基因的表达水平与发生此病症的倾向相关。因此，向上或向下调节MAST4基因的活性可能对疾病的预防和/或治疗具有有益效果。
不仅如此，人类中已知存在其他三个MAST基因(MAST 1、2和3)，它们全部在皮肤中表达。有可能MAST 1-3中的一个或多个的上调或下调也可以对SD的预防和/或治疗具有有益效果。但是，MAST4似乎是在人类皮肤中最高表达的MAST基因，且因此是SD预防和/或治疗性干预的主要候选者。
使用MAPPER工具(http://genome.ufl.edu/mapper)，发明人发现了rs58331610SNP存在于预测的C/EBPβ转录因子结合位点内的证据。
C/EBPβ的活性在涉及免疫和炎性反应的基因的调节中是重要的。C/EBP-β转录因子调节IL-17反应性基因，并优先在分化的角质细胞中表达。与健康皮肤相比，C/EBPβ的表达在牛皮癣中上调。C/EBP-β结合位点特别地在与炎性反应相关的基因的调控序列中发现(http://europepmc.org/backend/ptpmcrender.fcgi？accid＝PMC4324884&blobtype＝pdf)。CEBPβ首先基于其响应于IL-1和IL-6而调节基因转录的能力鉴定(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1222736/pdf/12006103.pdf)。
可选名称包括NF-IL6、TCF5、IL-6DBP、LAP、CRP2、NF-M、AGP/EBP、ApC/EBP。
因此，一种假设是SNP位点处的遗传变异可能影响C/EBPβ结合位点并改变对转录因子的结合亲和力，且从而调节MAST基因的转录和表达。
实施例2-证明MAST4激酶是对微生物激发的炎性反应所必需的且抑制MAST4激酶 可以减少正常人表皮角质细胞中的炎性反应。
方法：
正常的人表皮角质细胞以40,000个细胞/孔接种在24孔板中，并在37℃，5％CO2下在培养基(培养基MEP1500CA)+HKGS补充剂(S-001-5)中生长16小时。细胞使用具有20nM的MAST4靶标特异性隐形siRNA(Thermofisher HSS180104)或中等GC特异性对照siRNA的RNAiMAX转染。48小时后，移除培养基，并且细胞用10μg/ml来自金黄色葡萄球菌的10肽聚糖(Sigma 77140)激发24小时。从细胞收获培养基，并使用Qiagen从每个细胞样品提取总RNA。
RNeasy微型试剂盒，和在NanoDrop上定量。使用标准基因表达分析条件和表达分析Hs00389519_m1测量MAST4基因表达。使用R&D系统IL8 duo-setELISA对来自每个实验孔的重复的100μl样品进行IL8的分析。
下表2显示了与媒介物对照相比，细胞样品中MAST4基因表达的相对定量(RQ)，并相对于“管家”(肌动蛋白)基因表达进行标准化。MAST4 siRNA敲低成功地将MAST4转录物水平降低>80％。
肽聚糖激发诱导MAST4转录物表达，从而在用对照siRNA转染的细胞中将其增加>25％。这表明MAST4基因表达被肽聚糖(其是细菌细胞壁成分)诱导，从而支持MAST4在表皮角质细胞炎性免疫反应中的作用(Wang等2001Infect.Immun.69(4),2270-2276)。肽聚糖被称为toll样受体2(TLR2)激活剂(Dziarski和Gupta 2005Infect.Immun.73(8),5212-5216)，且因此该数据支持MAST4在正常人表皮角质细胞中TLR2介导的信号传导中的作用。
表2
表2还显示了在不同细胞群中响应于肽聚糖激发的炎性细胞因子IL-8的产生。在对照siRNA转染的角质细胞中，肽聚糖激发导致IL-8产生>9倍的增加。相反，用MAST4激酶siRNA双链体转染的细胞显示出响应于肽聚糖激发的更适度的5倍IL-8诱导。该数据表明，在对肽聚糖激发的IL-8反应中，基因表达水平上MAST4的80％敲低伴随功能水平上35％的降低。该数据支持MAST4在响应于TLR2激动剂的表皮角质细胞炎性信号传导中的关键作用，并首次证明在皮肤炎症的体外表皮模型中MAST4激酶的抑制可以减少对微生物激发的炎性反应。
实施例3–表观遗传研究
在该实施例中，发明人进行了获自健康和头皮屑志愿者的人头皮活组织检查中DNA甲基化的全基因组研究，以调查是否存在与头皮屑相关的表观遗传学差异。
受试者
受试者是北欧血统(白种人)的女性、UK居民，且年龄为23至37岁。头皮屑患者定义为目前抗头皮屑剂的使用者，自我报告为患有头皮屑至少两年，并且定义为在使用非头皮屑美容洗发水5周后视觉评估过程中有头皮屑的迹象(Harding等,Arch Dermatol Res(2002)294:221–230)。健康受试者被定义为当前未使用抗头皮屑洗发水，未报告有头皮屑两年，并且在使用非头皮屑美容洗发水5周后无头皮屑的迹象。
样品和分析
从健康的(n＝25)和头皮屑的(n＝23)头皮上取4mm头皮活检样品，并在干冰上速冻。DNA使用标准的苯酚氯仿方法(Molecular Cloning A laboratory manual,3rdedition.Sambrook and Russell.Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)提取。通过首先使用Zymo亚硫酸氢盐转化方法(EPIC Methylation阵列:www.illumina.com)，然后在Infinium甲基化EPIC珠芯片850K阵列(Illumina)上查询来测量DNA甲基化。芯片数据的统计分析涉及将β值转换为m-值(Du等,BMC Bioinformatics 2010,11:587)。使用分位数标准化对原始m-值数据进行归一化，并且线性统计模型用于鉴定作为在头皮屑和健康对照受试者之间的差异甲基化区域的探针。在统计学过滤后，β值用于针对头皮屑与健康对照组之间的5％差异进行过滤。
发现
差异甲基化位点用<0.05的FDR调整的p值和>＝5％的delta-beta的统计截止值鉴定(Du等，2010年)。在这一水平上，相对于健康样品，701个甲基化位点在头皮屑中差异甲基化。这些差异甲基化位点之一是cg13811092，其位于5号染色体上的核苷酸66010095处，且另一个是cg03133881，其位于人类基因组组装GRCh37/hg37中1号染色体上的核苷酸46467354处。这前一个位点位于MAST4基因的内含子1内，且与健康头皮相比在头皮屑中明显低甲基化；该位点位于靠近增强子元件(因此在头皮中很可能有与该位点结合的转录因子)的“开放染色质”区域中和rs58331610的10kb上游，其是脂溢性皮炎的全基因组关联研究中鉴定的遗传变体。与健康头皮相比，后者的CpG位点在头皮屑中显著低甲基化。该位点位于MAST2基因的内含子6内，且也处于“开放染色质”的区域内。
在文献中，充分证明基因的调控区域内的低甲基化可能与基因表达的改变以及因此与其功能相关(Bonder等Nat Genet.2017Jan；49(1):131-138)。因此，在MAST4和MAST2基因中存在差异甲基化位点是支持性证据，其表明这些基因在头皮屑病因中起作用，特别是当它们与调控区域如开放染色质位点一致时。

Claims (12)

1.一种下调MAST4基因的活性或者MAST4基因的转录或翻译产物的活性的物质，其用于预防和/或治疗哺乳动物受试者的炎性皮肤病症。
2.根据权利要求1的物质，其中所述皮肤病症包括头皮屑。
3.根据权利要求1或2的物质，其在核酸水平上起作用，从而下调MAST4基因的转录和/或MAST4基因转录物的翻译。
4.根据权利要求3的物质，其包括在序列上与MAST4基因转录物的一部分基本上相同的短干扰RNA分子。
5.根据权利要求4的物质，其包含与MAST4基因转录物的一部分相同的20至30个核苷酸的序列。
6.一种用于预防和/或治疗人类受试者的炎性皮肤病症的局部制剂，所述制剂包含与皮肤病学可接受的填充剂、稀释剂、载体或赋形剂混合的有效量的根据权利要求1至5任一项的活性物质。
7.根据权利要求6的制剂，其包含皮肤渗透促进剂。
8.根据权利要求6或7的制剂，其为液体、乳膏、凝胶、洗剂、糊剂或贴片的形式。
9.根据权利要求6至8中任一项的制剂，其为洗发剂和/或护发素的形式。
10.一种鉴定具有治疗和/或预防人类受试者的炎性皮肤病症的潜在功效的物质的体外分析方法，该分析方法包括以下步骤：使多种候选物质单独地与MAST4基因或MAST4基因产物接触；和鉴定那些对MAST4基因或MAST4基因产物的活性有下调作用的候选物质。
11.MAST4基因产物或表达MAST4基因产物的核酸分子在鉴定下调MAST4基因产物或表达MAST4基因产物的核酸分子的活性的物质，且因此鉴定可用于治疗和/或预防人类受试者的炎性皮肤病症的物质的筛选分析中的用途。
12.根据权利要求10的方法或根据权利要求11的用途，其中所述物质与包括已知在下调MAST4基因或MAST4基因产物的活性方面具有活性的化合物的阳性对照平行地测试。
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