BR112019022550A2

BR112019022550A2 - substância, formulação tópica, método de ensaio e uso de um produto

Info

Publication number: BR112019022550A2
Application number: BR112019022550A
Authority: BR
Inventors: Michael Smith Adrian; Andrew Gunn David; Milena Pardo Cortes Luba; Gerard Hendrik Sanders Martijn; Susan Ginger Rebecca; Edmond Christoffel Nijsten Tamarius
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 2017-05-08
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2020-05-19
Also published as: US11788090B2; MX2019013257A; WO2018206409A1; CN110621333A; EP3621636A1; EP3621636B1; ZA201906964B; US20240110188A1; US20200063139A1; PH12019502388A1; EA201992210A1

Abstract

é revelada uma substância que regula negativamente a atividade de um gene mast, ou a atividade de um produto de transcrição ou tradução de um gene mast, para uso na prevenção e/ ou tratamento de uma condição inflamatória da pele em um indivíduo mamífero.

Description

“SUBSTÂNCIA, FORMULAÇÃO TÓPICA, MÉTODO DE ENSAIO E USO DE UM PRODUTO”

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a uma substância para uso na prevenção e/ ou tratamento de uma condição inflamatória da pele em um indivíduo mamífero, especialmente um ser humano, e um método de ensaio útil para identificar essas substâncias.

Antecedentes da Invenção

[002] A dermatite seborréica (SD) é uma doença cutânea recorrente inflamatória crônica caracterizada por descamação oleosa, ocorrendo principalmente em regiões ricas em sebo, tais como couro cabeludo, face e tórax. A prevalência geral de SD não está bem documentada, mas estima-se que seja aproximadamente 4% (Gupta AK, Bluhm R. Seborrheic dermatitis. J Eur Acad Dermatol. 2004; 18(1): 13-26; Palamaras et al., Seborrheic dermatitis: lifetime detection rates. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2012; 26(4): 524-6). A SD tem um alto impacto socioeconômico, superior a US $ 1,4 bilhão nos Estados Unidos em 2004. Apesar do peso relativamente alto da doença, sabe-se muito pouco sobre a patogênese de SD (Bickers et al., J Am Acad Dermatol. 2006; 55(3):490-500; Szepietowski et al., Mycoses. 2009; 52(4):357-63).

[003] A caspa é uma condição comum que envolve a formação de flocos na pele, e os sintomas geralmente apresentam aparência semelhante aos da SD. Por esse motivo, os dois termos às vezes são usados de forma intercambiável, com a SD do couro cabeludo sendo considerada como caspa grave. No entanto, para os propósitos atuais, as duas condições são consideradas diferentes e as seguintes distinções são reconhecidas entre a caspa e a SD: (i) a caspa só ocorre no couro cabeludo, enquanto a SD pode ocorrer em outras partes do corpo, tais como a face e o tórax; (ii) a caspa é

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2/34 caracterizada por pedaços de pequenos flocos de pele pouco aderentes, de cor cinza ou branca, frequentemente acompanhados de coceira, enquanto que, na SD, os flocos de pele são profusos, frequentemente aparecendo como montículos aderentes, de cor amarela oleosa; (iii) a SD pode ser acompanhada de vermelhidão visível (eritema) da pele, que nunca está presente na caspa. No entanto, apesar dessas distinções, as duas condições compartilham muitas semelhanças.

[004] Leveduras de Malassezia parecem desempenhar um papel significativo na patogênese da SD, uma vez que a eliminação da levedura fornece uma melhoria da doença. No entanto, essa levedura pode ser considerada comensal, presente na pele de indivíduos saudáveis e afetados, indicando a influência de outros fatores (Dawson, J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2007; 12(2):15-19). Os fatores de risco do hospedeiro foram associados à SD, incluindo disfunção da barreira do estrato córneo, resposta imune alterada aos metabólitos de Malassezia e aumento da secreção da glândula sebácea (Turner et al., Int J Cosmet Sei. 2012; 34(4): 298-306; Schwartz et al., Acta Derm Venereol. 2013; 93(2): 131-7). Além disso, a SD é mais comum em homens e tem uma prevalência notavelmente alta na Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, receptores de transplante e pessoas que sofrem da doença de Parkinson (Mastrolonardo et al., Med Hypotheses. 2003; 60(6): 90711; Lally et al., J Eur Acad Dermatol Venereol. 2010; 24(5): 561-4., Chatzikokkinou et al., Acta Dermatovenerol Croat. 2008; 16(4):226-30. Fatores ambientais, de estilo de vida e de higiene também foram associados à SD, por exemplo, estresse, clima, abuso de álcool e obesidade (Gupta & Bluhm., 2004 citado acima).

[005] A predisposição genética para SD não foi estudada, resultando na ausência de genes candidatos envolvidos na patogênese da SD. No entanto, podería ser argumentado que a SD compartilha várias

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3/34 características clínicas com outras doenças inflamatórias crônicas da pele, em particular com psoríase (PSO) (às vezes cunhada 'sebopsoríase') e dermatite atópica (AD), que são melhor caracterizadas geneticamente (Genetics EA, Lifecourse Epidemiology Eczema C, Australian Asthma Genetics C, Australian Asthma Genetics Consortium A. Multi-ancestry genome-wide association study of 21,000 cases and 95,000 controls identifies new risk loci for atopic dermatites. Nat Genet. 2015; Stuart et al. Nat Genet. 2010;42(11):1000-4). A disfunção da barreira cutânea e uma resposta imunomediada inadequada a estímulos externos são fatores compartilhados na patogênese dessas três doenças de pele. Em um estudo recente, foi encontrada uma sobreposição nos perfis de transcrição gênica do tecido do couro cabeludo de caspa, AD e PSO, sugerindo uma possível suscetibilidade genética compartilhada (Ginger et al., J Invest Dermatol. 2015; 135, S1-S17). É desconhecido se as variantes genéticas conhecidas de AD e PSO também estão associadas à SD.

[006] A presente invenção visa proporcionar melhorias em ou relacionadas à prevenção e/ ou tratamento de condições inflamatórias da pele e, mais especialmente, à prevenção e/ ou tratamento de SD e/ ou caspa.

Descrição Resumida da Invenção

[007] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece uma substância que regula negativamente a atividade de um gene MAST4, ou a atividade de um produto de transcrição ou tradução de um gene MAST4, para uso na prevenção e/ ou tratamento de uma condição inflamatória da pele em um indivíduo mamífero. (MAST = Serina Treonina quinase Associada a Microtúbulos).

[008] Além da atividade da serina treonina quinase, as proteínas MAST possuem uma atividade de ligação às proteínas, mediada por um domínio PDZ.

[009] A atividade do gene MAST4 ou do produto de gene que é

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4/34 regulado negativamente, direta ou indiretamente, pode tipicamente (mas não necessariamente) compreender a atividade da serina treonina quinase e/ ou a atividade de ligação às proteínas do domínio PDZ.

[010] Em algumas formas de realização, a substância pode modular a atividade específica do gene MAST4 ou do produto do gene (ou seja, diminuir a atividade da quinase por mg de gene MAST4 ou produto do gene) ou pode modular a atividade causando uma diminuição na quantidade do gene MAST4 ou produto do gene MAST4. Em outras formas de realização, a substância pode modular indiretamente a atividade da proteína MAST4 modulando uma interação entre uma proteína MAST4 e um ou mais parceiros de ligação a proteínas para proteínas MAST4.

[011] Como indicado acima, as proteínas MAST compreendem um domínio PDZ. Os domínios PDZ estão presentes em proteínas de uma ampla variedade de fontes (bactérias, leveduras, plantas, insetos e vertebrados). Tipicamente, eles se ligam aos resíduos de aminoácidos Cterminais das proteínas ou, menos comumente, às sequências peptídicas internas das proteínas.

[012] A função dos domínios PDZ é frequentemente localizar proteínas celulares e/ ou regular as vias celulares. Várias centenas de domínios PDZ diferentes foram identificadas e, embora exibam uma variedade considerável em termos de sua sequência de aminoácidos (cerca de 80-90 resíduos de comprimento), geralmente compreendem 4-6 fitas 8, uma hélice α curta e uma hélice α longa, dispostas em uma estrutura globular compacta.

[013] O indivíduo mamífero é, preferencialmente, um ser humano.

[014] A condição inflamatória da pele pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em: dermatite atópica (AD), psoríase (PSO), dermatite seborreica, caspa, rosácea e acne. Tipicamente, a condição

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5/34 inflamatória da pele é uma condição inflamatória crônica da pele e, de preferência, compreende SD ou caspa.

[015] Sabe-se que quatro genes MAST (MAST1, MAST2, MAST3 e MAST4) estão presentes no genoma humano e são expressos, em vários níveis, na pele humana. O composto modula a atividade de pelo menos o gene MAST4, ou a atividade de um produto de transcrição ou tradução do gene MAST4. A partir de seus próprios dados experimentais, os inventores acreditam que o gene MAST4 é expresso na pele humana em níveis mais altos do que qualquer um dos genes MAST 1 -3.

[016] A título de explicação, os presentes inventores verificaram (como resultado de uma Análise de Associação Genômica Ampla) que um único polimorfismo de nucleotídeo (SNP), mapeado para uma região intrônica do gene MAST4, está fortemente associado à dermatite seborreica até um nível estatisticamente significativo. Isso apresenta a possibilidade de que um composto que regula positivamente ou negativamente a atividade do gene MAST4 no nível de ácido nucleico e/ ou polipeptideo, possa exercer um efeito profilático e/ ou terapêutico benéfico na dermatite seborreica ou em uma condição inflamatória da pele semelhante, tal como caspa, dermatite atópica, psoríase, rosácea ou acne.

[017] As substâncias podem regula positivamente ou negativamente a atividade do gene MAST4 no nível de ácido nucleico e/ ou polipeptideo. Como exemplos representativos não exaustivos, a regulação positiva pode ser alcançada administrando substâncias que causam um aumento na transcrição e/ ou tradução do(s) gene(s) MAST, ou administrando uma molécula de ácido nucleico que direciona a expressão de todo ou parte de um produto do gene MAST. Por exemplo, os inventores identificaram sítios de ligação para dois fatores de transcrição no gene MAST4, fatores de transcrição esses que podem melhorar a transcrição do gene MAST4. Modular a interação

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6/34 entre um ou ambos esses fatores de transcrição e o gene MAST4 pode modular o nível de expressão do gene MAST4.

[018] Para evitar dúvidas, a modulação da atividade do gene MAST pode incluir a entrega de sequências adicionais de codificação do gene MAST, de modo a provocar um efeito de “dosagem do gene”, causando níveis aumentados de expressão do gene MAST (especialmente um gene MAST4) no indivíduo. Da mesma forma, a invenção pode abranger a aplicação direta de um polipeptídeo MAST (especialmente um polipeptídeo MAST4) na pele do indivíduo, de modo a provocar um aumento localizado na concentração do polipeptídeo MAST em ou sobre a pele do indivíduo, onde a regulação positiva é necessária.

[019] A regulação negativa da atividade do gene MAST pode ser alcançada no nível do polipeptídeo através da administração de um composto que inibe a atividade ou a função do polipeptídeo expresso no gene MAST. Uma classe de tais compostos são imunoglobulinas e porções ou fragmentos de ligação ao antígeno de moléculas de imunoglobulina. A imunoglobulina pode ser um anticorpo de qualquer classe (embora IgG, IgA ou IgM sejam geralmente preferidos) que possua atividade de ligação para o polipeptídeo expresso no gene MAST. Alternativamente, o composto pode ser uma das muitas porções ou fragmentos bem conhecidos de uma molécula de imunoglobulina que retém a capacidade de se ligar ao polipeptídeo expresso no gene MAST. Tais incluem Fab, F(ab’)2, F_v de cadeia única (scFv), anticorpos de domínio único (dAbs) e similares.

[020] A imunoglobulina ou porção ou fragmento de imunoglobulina terá, preferencialmente, uma constante de dissociação Kd para o polipeptídeo MAST de 10’⁸ ou menos, mais preferencialmente 10’⁹ ou menos e, mais preferencialmente, pelo menos 10’¹⁰ ou menos. A Kd geralmente estará na faixa de 10'⁸ a 10’¹¹.

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[021] A imunoglobulina ou porção ou fragmento de imunoglobulina será, preferencialmente, relativamente específica na sua ligação ao polipeptídeo MAST. O técnico no assunto reconhece que uma imunoglobulina descrita como “específica” para um antígeno específico se relaciona ao fato de que o sítio de ligação ao antígeno localizado dentro dos domínios variáveis das cadeias leve e pesada (definido como o “parátopo”) irá ligar-se mais ou menos exclusivamente ao antígeno que desencadeou a produção do anticorpo. Isso geralmente envolve ligação de alta afinidade, resultante de uma variedade de interações moleculares cooperativas. No entanto, existem outras regiões da molécula de anticorpo que podem ser ligadas por outras moléculas, como os receptores Fc, proteínas do complemento e várias proteínas bacterianas, tais como a proteína A do Staphylococcus aureus. Além disso, como uma proteína relativamente grande, uma molécula de anticorpo é propensa a todas as interações de ligação não específicas que podem fazer com que as proteínas, em geral, se liguem mais ou menos avidamente às superfícies com as quais entram em contato. Essas interações de ligação não específicas são geralmente compartilhadas entre todos os anticorpos da mesma classe, independentemente de sua especificidade de antígeno. Assim, um anticorpo geralmente se ligará ao seu antígeno cognato com uma afinidade que é de ordem de magnitude superior à afinidade com a qual se liga à maioria das outras moléculas.

[022] Igualmente, o técnico no assunto reconhecerá que o termo “imunoglobulina” não indica necessariamente que uma única espécie molecular é necessária. Em vez disso, o termo pode abranger uma mistura heterogênea ou população de moléculas, e uma “imunoglobulina específica” pode se referir à porção de uma mistura que é específica para o antígeno em questão.

[023] Algumas imunoglobulinas específicas do polipeptídeo MAST estão disponíveis comercialmente e incluem, por exemplo, ab87734 (de

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AbCam, Cambridge UK), que é um anticorpo policlonal de coelho que se liga a um epítopo entre os aminoácidos 1900 e 1905 do polipeptídeo MAST4 humano; ab196777, outro anticorpo policlonal de coelho que se liga ao polipeptídeo MAST4 humano (disponível da AbCam; e também da Gene Tex GTX87899); PA5-36976 (da ThermoFisher), um policlonal de coelho específico para o polipeptídeo MAST4 humano; e HPA000544 (Sigma), um policlonal de coelho que se liga a um epítopo localizado nos resíduos de aminoácidos 15451652 do polipeptídeo MAST4 humano.

[024] Outras moléculas que podem inibir a atividade de um polipeptídeo MAST, especialmente um polipeptídeo MAST4, incluem pequenos compostos químicos orgânicos (por exemplo, com uma massa molecular relativa abaixo de 5.000, preferencialmente abaixo de 4.000 e mais preferencialmente abaixo de 3.000).

[025] Em particular, um inibidor de molécula orgânica pequena preferido de polipeptídeos MAST compreende a classe de quinoxalinas e seus derivados. Os derivados de quinoxalina e quinoxalina compreendem um complexo de anel heterocíclico composto de um átomo de nitrogênio nas posições 1 e 4. A estrutura da quinoxalina é mostrada na Figura 2. A quinoxalina e seus derivados foram revisados por Pereira et al., 2014 (European Journal of Medicinal Chemistry 97, p. 664-672) e por TristanManzano et al., 2015 (Current Medicinal Chemistry 22, p. 3075-3108). Os derivados de quinoxalina são fáceis de sintetizar (Porter et al., “Pyrazines and their benzo derivatives, Boulton & McKillop Eds. Compre. Heterocycl. Chem. Pergamon Press, Oxford 1984, 3; Sato et al., “Pyrazines and their benzo derivatives’’, Katritzky, Ramsden, Scriven & Taylor Eds. Compr. Heterocycl. Chem. III., Elsevier Oxford 2008, 8).

[026] Foi demonstrado que vários derivados da quinoxalina são inibidores potentes das proteínas MAST (ver Li et al., Biorganic & Medicinal

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Chemistry Letters 2013, 23, p. 5217-5222).

[027] Os derivados quinoxalina preferidos para utilização na presente invenção incluem imidazo quinoxalinas. Li et al., (citado acima) identificaram vários derivados da quinoxalina que eram inibidores potentes e relativamente seletivos da atividade quinase do polipeptídeo MAST. Por conseguinte, os derivados de quinoxalina preferidos para utilização na presente invenção incluem o seguinte: imidazo [1, 2-a] - quinoxalinas, especialmente 4cloro imidazo [1, 2-a] quinoxalina. Outros derivados de quinoxalina preferidos inibidores da atividade quinase do polipeptídeo MAST estão ilustrados na Figura 3. A síntese desses compostos é revelada por Li etal. (acima).

[028] O algoritmo da biblioteca Hidden Markov Model SUPERFAMILY (urn banco de dados de anotações estruturais e funcionais para todas as proteínas e genomas) localiza o domínio PDZ de MAST4 começando no resíduo de aminoácido 1139 e terminando no resíduo de aminoácido 1231 (http://supfam.org/SUPERFAMILY/cgi- bin/scop.cgi?ipid=SSES0156). Outros algoritmos (Gene 3D, Prosite, Smart e Pfam) identificam o domínio PDZ em MAST4 na mesma região da molécula (de cerca do resíduo 1137 a 1231).

[029] A estrutura cristalina do domínio PDZ de MAST4 foi resolvida e publicada (Elkins et al., 2010, Protein Sci. 2010 Abr; 19(4): 731 741.)

[030] O alinhamento das sequências de proteínas da família MAST mostra que, embora não seja idêntico, o domínio PDZ é altamente conservado entre os membros da família de proteínas MAST.

[031] Por conseguinte, é possível projetar pequenos peptídeos que tenham como alvo específico o domínio PDZ de MAST4, o que podería perturbar as interações de MAST4 com as suas proteínas alvo, modulando assim a sua função. Os estudos pull-down (Valiente et al. 2005 J. Biol. Chem.

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289 (32)28936-28943) corroboram o potencial para projetar inibidores seletivos de PDZ de MAST4, uma vez que nesses estudos o domínio PDZ de MAST4 não se ligava ao PTEN, enquanto os domínios PDZ de MAST2 e MAST3 se ligavam.

[032] As proteínas alvo fisiológicas às quais o domínio PDZ de MAST4 se liga, ainda não foram determinadas, mas a análise com o String DB (http://string-db.org/cgi/), que usa exploração de texto, análise de co-expressão e dados experimentais para prever as interações proteína/ proteína, identifica o seguinte como parceiros funcionais putativos para MAST4: GALNS, DNAJC6, TPTE2, TENC1, ARID4B, SPG21, PTEN, TNS3, SRL e TPTE. Além disso, Colland et al. relataram uma interação entre MAST4 e SMAD1 após uma triagem de levedura 2-híbrida de interações proteicas SMAD (Colland et al. 2004, Functional proteomics mapping of a human signaling pathway. Genome Res. 2004 jul; 14(7):1324-32).

[033] Tendo em conta o que precede, as imunoglobulinas ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a ou próximo ao domínio quinase ou ao domínio PDZ da proteína MAST4, devem inibir com sucesso a sua atividade. Da mesma forma, dado que a estrutura cristalina do domínio PDZ de MAST4 foi determinada, seria relativamente simples para o técnico no assunto conceber uma molécula pequena, tal como um peptídeo, que podería se ligar ao domínio PDZ da proteína MAST ou, de outra forma, inibir a interação entre o domínio PDZ e seu ligante.

[034] Também foi demonstrado que o 27-hidroxicolesterol regula MAST4 (ver Nelson, Molecular and Cellular Endocrinology, Volume 466, 5 de maio de 2018, páginas 73-80).

[035] Outras moléculas podem inibir a atividade de MAST no nível de ácido nucleico (por exemplo, inibem a transcrição e/ ou tradução dos genes MAST, especialmente o gene MAST4). Como exemplo, moléculas curtas

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11/34 de RNA interferente (siRNA), tipicamente cerca de 20-30 bp com uma ou duas saliências (overhangs) nucleotídicas em cada extremidade, podem ser prontamente preparadas, uma vez que a sequência dos genes MAST é conhecida (por exemplo, o gene MAST4 está localizado na fita forward do cromossomo 5 e compreende nucleotídeos 66.596.361 a 37.169.595 (construção do genoma humano GRCh 38: CM 000667.2)). Prevê-se que o gene MAST4 codifique 21 transcritos, muitos dos quais foram validados experimentalmente. Transcrito: MAST4-001 ENST00000403625.6 codifica o polipetídeo mais longo (2623 aminoácidos) com 29 éxons e, atualmente, é anotado com 40 domínios e características, e mapeia para 85 sondas oligo.

[036] Os detalhes dos outros genes MAST são os seguintes: [037] Localização do gene MAST 1: Cromossomo 19: 12.833.951 12.874.951 fita forward (construção do genoma humano GRCh38: CM000681.2). Sinônimos de MAST1: SAST170, SAST, KIAA0973.

[038] No produto do gene MAST1, um domínio de proteína quinase está localizado em torno dos resíduos de aminoácidos 372-647 e o domínio PDZ em torno dos resíduos de aminoácidos 958-1057.

[039] Localização do gene MAST2: Cromossomo 1: 45.786.98746.036.124 fita forward (construção do genoma humano GRCh38: CM000663.2). Sinônimos de MAST2: KIAA0807, GN MAST205, KIAA0807, MTSSK, MAST205.

[040] Na proteína MAST2, os domínios de uma proteína quinase localizados na região dos resíduos de aminoácidos 510-860, mais especialmente os resíduos 512-785.

[041] Localização do gene MAST3: Cromossomo 19: 18.097.79318.151.692 fita forward (construção do genoma humano GRCh38: CM000681.2). Sinônimos de MAST3: KIAA0561.

[042] Na proteína MAST3, um domínio de proteína quinase está

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12/34 localizado em torno dos resíduos 365-719, e mais especialmente nos resíduos 367-640.

[043] O aumento da atividade dos genes MAST, especialmente o gene MAST4, no nível de ácido nucleico pode ser realizado através da administração de um fator de transcrição que aumenta a transcrição do gene MAST. Os fatores de transcrição conhecidos, ou prováveis, para melhorar a transcrição dos genes MAST incluem a proteína de ligação ao CCAAT/ intensificadora (abreviada como CEBP beta), uma vez que os inventores descobriram que o gene MAST4 inclui um sítio de ligação ao fator de transcrição CEBP beta. Alternativamente, substâncias que modulam a ligação de CEBP beta ao MAST4 podem regula positivamente ou negativamente o nível de transcrição de MAST4.

[044] O CEBP beta está disponível a partir de fontes comerciais, como uma proteína purificada ou como uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, a partir de, por exemplo, Genscript, Cloud-Clone e OriGene. Igualmente, os anticorpos CEBP beta específicos estão disponível a partir de fontes comerciais, como AbCam. As proteínas agonistas/ genes agonistas conhecidos do CEBP beta incluem INS, EGR2, CDK2, GSK3B, MAPK3, ABL1, ABL2 e MAPK1. Por outro lado, o gene/ proteínas antagonistas conhecidos do CEBP beta incluem: GATA3, SOX9, GATA2, SMAD3 e SMAD4.

[045] Por conseguinte, existe uma variedade de substâncias que são comercialmente disponíveis, ou prontamente produzidas, que podem ser usadas para regular positivamente ou negativamente a expressão de CEBP beta e/ ou para inibir a interação da proteína com o gene MAST4. Em particular, os anticorpos (ou porções de ligação ao antígeno de anticorpos) específicos para CEBP beta podem inibir a ligação da proteína da sequência MAST4.

[046] Os inventores também identificaram (por inspeção da Open

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Regulatory Annotation Database, também conhecido como “ORegAnno”) que existe outro sítio de ligação ao fator de transcrição previsto na região do gene MAST4 identificado como sendo de relevância especial. Esse fator de transcrição é SMARCA4 (OReg ID 1274278), também conhecido como BRG1. SMARCA4 é um “remodelador de cromatina” e promove a expressão de genes envolvidos no reparo da barreira epidérmica (Botchkarev, Journal of Invest. Dermatol. Symposium 2015, 17 [18-19]), além de controlar a remodelação do tecido folicular dos cabelos (Xiong et al., Developmental Cell 2013, 25, 169181). Assim, a presença de um sítio de ligação para esse fator de transcrição suporta um papel para o MAST4 na manutenção da integridade epidérmica, o que se pode prever será associado à suscetibilidade à inflamação da pele.

[047] Assim, como alternativa a, ou além de, modular a interação entre CEBP beta e MAST4, pode-se modular a expressão de MAST4 regulando a interação entre SMARCA4 e o gene MAST. Existem fontes comerciais da proteína SMARCA4/ ácido nucleico e também anticorpos específicos para SMARCA4, como para o CEBP beta. Os agonistas conhecidos de SMARCA4 incluem MYOD1 e MYOG. Antagonistas conhecidos incluem PFI3, que é um inibidor potente e seletivo de SMARCA4 com um valor de Kd de 89nM (Vangamudi etal., Cancer Res. 2015, pikcanres. 3798.2015).

[048] Em um segundo aspecto, a invenção fornece um método de ensaio in vitro para identificar substâncias com eficácia potencial no tratamento e/ ou prevenção de uma condição inflamatória da pele em um ser humano, o método de ensaio compreendendo as etapas de: colocar em contato, separadamente, uma pluralidade de substâncias candidatas com um gene MAST4 ou produto do gene MAST4; e identificar as substâncias candidatas que têm um efeito de regulação negativa na atividade do gene MAST4 ou do produto do gene MAST4.

[049] As substâncias candidatas podem ter um efeito modulador

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14/34 direto ou indireto sobre a atividade do gene MAST4 ou do produto do gene MAST4. No contexto da presente invenção, o efeito modulador é a regulação negativa. Em uma alternativa, o efeito modulador pode ser a regulação positiva.

[050] O ensaio pode incluir um sistema de expressão in vitro para expressar o gene MAST. Sistemas de expressão in vitro geralmente adequados estão disponíveis comercialmente e são conhecidos dos técnicos no assunto.

[051] A quantidade de atividade do produto do gene MAST4 ou do gene MAST4 pode ser diretamente medida ou inferida por qualquer método adequado. Por exemplo, existem inúmeras técnicas para avaliar o nível de expressão de um gene, e incluem, por exemplo, o uso de um gene marcador ou repórter vinculado, tal como luciferase, ensaios de proteína fluorescente (por exemplo, GFP) ou cloranfenicol acetil transferase (CAT).

[052] Os métodos de análise da quantidade ou atividade de polipeptídeo MAST incluem métodos de análise da atividade quinase do polipeptídeo MAST. As técnicas de ensaio de quinase geralmente adequadas que podem ser úteis neste aspecto da invenção incluem:

(a) Medir a produção de ADP a partir de ATP em um sistema que expressa ou contém a quinase alvo (por exemplo, MAST4). Isso pode ser avaliado através de uma variedade de repórteres diretos e indiretos, tais como marcadores de radioisótopos, fluorescência ou luminescência acoplada a anticorpos, por exemplo, no ensaio Promega ADP-Glo™ Kinase AssayADPGlo™ Kinase AssayADP-GIo™ onde o ADP produzido pela reação da quinase é convertido em luz por uma luciferase;

(b) Detecção de fosfo-serina em substratos peptídicos após reação com alvo quinase expresso. A detecção pode usar anticorpos acoplados a um sistema repórter como a β-galactosidase no ensaio DiscoverRX da GE lifesciences ou anticorpo acoplado a um repórter de fluorescência

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15/34 por TR-FRET como na plataforma Thermofisher LanthaScreen;

(c) Utilizar peptídeos de substrato modificados específicos para a quinase alvo acoplados a um sistema repórter; e (d) Análise da via celular, por exemplo, as linhagens celulares Thermofisher CelISenor® que são projetadas de maneira estável para expressar o repórter de beta-lactamase sob o controle de elementos de resposta específicos da via.

[053] Uma revisão abrangente de abordagens de ensaio de quinase está resumida na tabela 1 de Assay Development for Protein Kinase Enzymes de J. Fraser Glickman, M.S.P.H., PhD. Universidade Rockefeller, Nova York, NY, 10065.

[054] As substâncias candidatas podem ser convenientemente testadas em paralelo com um controle positivo, usando um composto conhecido por ser ativo na modulação da atividade de um gene MAST4 ou de um produto do gene MAST4 (por exemplo, uma imunoglobulina específica do polipeptideo MAST; ou um inibidor de molécula pequena, como 4-cloroimidazo [1, 2-a] quinoxalina): preferencialmente, as substâncias candidatas serão pelo menos tão eficazes quanto o controle positivo na modulação da atividade do gene MAST ou do produto do gene MAST, mais preferencialmente os compostos candidatos serão 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou até 100% mais eficaz (em uma concentração molar equivalente) do que o controle positivo na modulação da atividade do gene MAST ou do produto do gene MAST.

[055] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece a utilização de um produto do gene MAST4, ou uma molécula de ácido nucleico que expressa um produto do gene MAST4, em um ensaio de triagem para identificar substâncias que modulam a atividade de um produto do gene MAST4 ou molécula de ácido nucleico que expressa um produto do gene MAST4 e, assim, identificar substâncias que podem ser úteis para tratar e/ ou prevenir uma

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16/34 condição inflamatória da pele em seres humanos. No contexto da presente invenção, o efeito modulador é a regulação negativa. Em uma alternativa, o efeito modulador pode ser a regulação positiva.

[056] A invenção também pode fornecer um método para fazer uma formulação profilática e/ ou terapêutica para prevenção e/ ou tratamento, conforme apropriado, de uma condição inflamatória da pele em um ser humano, em que o método compreende misturar substâncias ativas eficazes na modulação da atividade de um gene MAST4 ou um produto do gene MAST4 com um diluente, excipiente ou veículo adequado, sendo a substância ativa identificada pelo método de ensaio do segundo aspecto da invenção.

[057] A substância ativa dos vários aspectos da invenção pode ser uma mistura complexa (por exemplo, um extrato natural da planta ou similar) ou pode ser um composto substancialmente purificado ou isolado. Além disso, a substância ativa pode compreender um único composto ativo, ou pode compreender uma pluralidade de compostos ativos, que podem atuar de forma aditiva ou, mais preferencialmente, de forma sinérgica na modulação da atividade do gene ou produto do gene MAST.

[058] De preferência, a formulação compreenderá um ou mais compostos ativos adicionais, e estes podem convenientemente compreender compostos anti-inflamatórios conhecidos, especialmente compostos antiinflamatórios que são conhecidos e aprovados para aplicação tópica. Tais compostos incluem corticosteróides, como descrito abaixo.

[059] O técnico no assunto pode estabelecer uma dose adequada do composto ou compostos ativos e, portanto, uma concentração adequada na formulação, por meio de tentativa e erro de rotina, e isso não constitui uma parte inventiva da presente invenção.

Mecanismos de Liberação

[060] O mecanismo para a liberação de um agente ativo, para

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17/34 regula positivamente ou negativamente a atividade de um gene MAST, ou seu produto de transcrição ou tradução, pode ser qualquer mecanismo que forneça uma dose eficaz de agente ativo, evitando efeitos colaterais inaceitáveis significativos. Para os propósitos atuais, uma dose eficaz de agente ativo é uma dose que produz uma melhoria discernível na condição de uma doença inflamatória da pele (especialmente a SD) para um efeito terapêutico ou que impede o desenvolvimento de uma doença inflamatória da pele (especialmente a SD), para um efeito profilático.

[061] O agente ativo pode ser administrado por via oral ou por injeção (de preferência subcutânea, ou menos preferencialmente, intramuscular). No entanto, mais preferencialmente, o agente ativo será administrado por aplicação tópica na pele de um indivíduo, o que pode ser convenientemente uma região da pele afetada por uma doença inflamatória da pele quando o indivíduo tem uma condição ativa e/ ou pode ser uma parte da pele que é suscetível a uma doença inflamatória da pele se o indivíduo não apresentar sintomas no momento da aplicação da formulação. Por exemplo, quando a doença é SD, o agente ativo pode ser aplicado topicamente a um ou mais dentre o couro cabeludo, face ou tórax, mas pode ser aplicado igualmente a outras áreas da pele se essas outras áreas também forem afetadas.

[062] Se o agente ativo for aplicado topicamente, pode ser desejável que a formulação na qual o agente ativo está presente incorpore ainda mais um intensificador de penetração.

[063] Exemplos de intensificadores de penetração químicos incluem um acelerador de absorção percutâneo, tal como miristato de isopropila, um tensoativo, álcool ou similares, incluindo ácidos graxos C6-C20, álcoois graxos, ésteres de ácidos graxos, amidas ou éteres, ácidos orgânicos aromáticos, álcoois aromáticos, ésteres ou éteres de ácidos graxos aromáticos (estes podem ser saturados ou insaturados e podem ser cíclicos, lineares ou

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18/34 ramificados), especialmente ésteres de ácido lático, ésteres de ácido acético, compostos de monoterpeno, compostos de sesquiterpeno, azona, derivados de azona, pirotiodecano, ésteres de ácidos graxos de glicerol, ésteres de ácidos graxos de propileno glicol, ésteres de ácidos graxos de sorbitano (tipo Span), polissorbatos (tipo Tween®), ésteres de ácidos graxos de polietileno glicol, óleos de rícino endurecidos com polioxietileno (tipo HCO), éteres de alquil polioxietileno, ésteres de ácidos graxos de sacarose, óleos vegetais e similares. Exemplos particulares incluem ácido caprílico, ácido cáprico, ácido capróico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido isoesteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, álcool laurílico, álcool miristílico, álcool oleílico, álcool isoestearílico, álcool cetílico, laurato de metila, laurato de hexila, sebacato de dietila, dietanolamida de ácido láurico, trietanolamina, miristato de isopropila, miristato de miristila, miristato de octildecila, palmitato de cetila, ácido salicílico, salicilato de metila, salicilato de etileno glicol, ácido cinâmico, cinamato de metila, cresol, lactato de cetila, lauril lactato, acetato de etila, acetato de propila, geraniol, timol, eugenol, terpineol, 1-mentol, borneol, d-limoneno, isoeugenol, isoborneol, nerol, dl-cânfora, monocaprilato de glicerol, monocaprato de glicerol, monolaurato de glicerol, monooleato de glicerol, monolaurato de sorbitano, monolaurato de sacarose, polissorbato 20, propileno glicol, monolaurato de propileno glicol, monolaurato de polietileno glicol, monoestearato de polietileno glicol, éter laurílico de polioxietileno, pirotiodecano. A absorção percutânea também pode ser melhorada usando veículos de hidrogel, microemulsões, nanopartículas ou nanopartículas lipídicas sólidas.

[064] Os mecanismos de administração incluem o seguinte: aplicação direta à pele de um líquido (tal como xampu e/ ou condicionador), creme, gel, loção, pasta, adesivo ou similar contendo o agente ativo; aplicação à pele de uma formulação compreendendo o agente ativo incorporado em

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19/34 lipossomos, etossomos, transferossomos ou vesícula sintética semelhante compreendendo uma bicamada lipídica; aplicação à pele de uma formulação compreendendo o agente ativo carregado, incorporado ou ligado a nanopartículas. Os métodos de preparação de lipossomos, etossomos, transferossomos etc. são bem conhecidos dos técnicos no assunto. Um transferossomo é um tipo especial de lipossomo que é altamente deformável como consequência da inclusão de um tensoativo e/ ou outra molécula anfifílica na camada bilipídica. Um etossomo é, em essência, um lipossomo que compreende uma quantidade relativamente grande (tipicamente 20-45% p/p) de etanol. Para os propósitos presentes, o termo “bicamada lipídica” inclui bicamadas formadas a partir de ou compreendendo lipídios modificados, tais como fosfolipídios, glicolipídios, fosfoglicolipídios.

[065] Os mecanismos descritos acima podem, opcionalmente, ser combinados com o uso de um intensificador de penetração químico e/ ou um intensificador de penetração físico.

[066] O intensificador de penetração físico pode incluir um ou mais dos seguintes: iontoforese, eletroporação, ultrassom ou o uso de microagulhas ou outras técnicas de dermoabrasão, que podem ser usadas antes e/ ou simultaneamente com e/ ou subsequentemente à aplicação da formulação na pele do indivíduo.

[067] A liberação tópica de siRNA foi alcançada usando métodos virais ou não virais, e a combinação de métodos não virais com um método de permeação ativa, como iontoforese, sonoforese ou microagulhas para o tratamento de doenças de pele.

[068] Zheng et al 2012 (http://www.pnas.org/content/109/30/11975.abstract) descrevem o uso de conjugados de nanopartículas de ácido nucleico esféricos (“SNA-NCs”, núcleos de ouro cercados por uma densa casca de siRNA covalentemente imobilizado

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20/34 de alta orientação) que penetrou livremente em quase 100% dos queratinócitos in vitro, pele de camundongo e epiderme humana poucas horas após a aplicação. Significativamente, essas estruturas podem ser entregues em um hidratante comercial ou solução salina tamponada com fosfato e não requerem agentes de interrupção ou transfecção de barreira, tais como lipossomos, peptídeos ou vírus. Além disso, Chong et al relatam silenciamento de genes após a liberação de siRNA à pele através de microagulhas de aço revestidas (Chong et al., 2013. Journal of Controlled Release 166 (3), p. 211 -219).

[069] Além disso, trabalhos recentes com a liberação de componentes Crispr/ Cas9 sugerem que esta também pode ser uma via possível para a liberação de moléculas relevantes de ácido nucleico que podem modular direta ou indiretamente a atividade de um gene MAST.

Formulações

[070] A prática da invenção envolverá tipicamente a administração de um ou mais agentes ativos (ou seja, ativos para regular positivamente ou negativamente a atividade de um gene MAST ou do produto de transcrição ou tradução de um gene MAST) em combinação com um agente de volume, diluente, excipiente veículo ou similar.

[071] Diluentes, excipientes e veículos adequados são conhecidos dos técnicos no assunto e incluem, entre outros, soluções aquosas (tais como solução salina, solução salina tamponada com fosfato ou outras preparações tampão), emulsões, óleos etc.

[072] A composição precisa da formulação dependerá, entre outros, do seu método de aplicação. Convenientemente, a formulação será adaptada e configurada para aplicação tópica na pele de um ser humano e pode assumir a forma de, entre outros, um creme, loção, pasta, gel ou adesivo, especialmente um adesivo auto-adesivo e/ ou oclusivo. Em algumas formas de realização, a formulação pode ser a de um xampu e/ ou condicionador, que

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21/34 pode ser formulado para ser lavado ou deixado no cabelo. As formulações de xampu e/ ou condicionador são conhecidas dos técnicos no assunto e incluem, tipicamente, um ou mais dos seguintes itens: água, detergente, tensoativo, agente espessante, betaína, umectante, perfume ou fragrância e corante ou pigmento.

[073] É geralmente preferido que a formulação possa adicionalmente compreender um ou mais agentes anti-inflamatórios convencionais conhecidos, especialmente um agente anti-inflamatório conhecido e aprovado para uso tópico. A maioria desses compostos são corticosteróides. Agentes anti-inflamatórios não corticosteróides incluem preparações de alcatrão mineral. Os corticosteróides anti-inflamatórios incluem: dipropionato de betametasona, propionato de clobetasol, diacetato de diflorasona, propionato de halobetasol, amcinonida, desoximetasona, fluocinonida, halcinonida, furoato de mometasona, propionato de fluticasona, acetonida de triancinolona, acetonida de fluocinolona, flurandrenolida, valerato de betametasona, desonida, hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, valerato de hidrocortisona, acetato de hidrocortisona e cloridrato de pramoxina.

[074] A invenção será agora descrita ainda a título de exemplo ilustrativo e com referência aos desenhos anexos, nos quais:

[075] A Figura 1 mostra a sequência nucleotídica de parte do gene MAST4 humano em torno de um único polimorfismo nucleotídico identificado pelos inventores como associado à suscetibilidade à dermatite seborreica;

[076] A Figura 2 mostra a estrutura química geral da quinoxalina e seus derivados;

[077] A Figura 3 ilustra a estrutura de certos derivados de quinoxalina que são preferidos para uso na presente invenção;

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Exemplos

Exemplo 1 - Estudo de Associação de Genes Candidatos (CGAS) e Análise de Associação Genõmica Ampla (GWAS)

[078] Neste exemplo, os inventores conduziram um estudo de associação de genes candidatos (CGAS) para investigar se variantes genéticas previamente associadas a AD e PSO também estão associadas a um risco aumentado de SD e conduziram a primeira análise de associação genõmica ampla (GWAS) para identificar novas variantes genéticas associadas ao SD.

Métodos

População de Estudo

[079] O Rotterdam Study (RS) é um estudo de coorte prospective contínuo de doenças crônicas, incluindo doenças de pele, em idosos. Uma descrição detalhada do estudo pode ser encontrada em outro local (Hofman et al. The Rotterdam Study: 2016 objectives and design update. Eur J Epidemiol. 2015; 30(8): 661-708). Em resumo, o Rotterdam Study consiste em uma coorte principal (RS-I) e duas extensões (RS-II e RS-III). O RS-I começou em 1990 e incluiu inicialmente 7.983 participantes que moravam no distrito de Ommoord, em Roterdã, nos Países Baixos. O RS-II começou em 2000 e inclui 3.011 participantes. O RS-III é uma extensão adicional da coorte, iniciado em 2006, e inclui 3.932 participantes. No total, o Rotterdam Study consiste em 14.926 indivíduos com 45 anos ou mais. A coorte consiste predominantemente (90%) de participantes de ascendência norte-europeia.

[080] O Rotterdam Study foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Erasmus MC e pelo Ministério da Saúde, Bem-Estar e Esporte dos Países Baixos. Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito para participar do estudo e obter informações de seus médicos responsáveis.

Definição de Caso

[081] Um total de 4.454 participantes do Rotterdam Study, com

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23/34 dados disponíveis sobre o genótipo, foi submetido a um exame cutâneo de corpo inteiro (FBSE) por médicos treinados para avaliar se um participante tinha SD. O diagnóstico clínico foi baseado na presença de descamação oleosa, eritema e uma distribuição característica do couro cabeludo, face e/ ou tórax. Os participantes que não apresentavam nenhum sinal de doença ativa e sem histórico de uso de cetoconazol (> 3 prescrições usando dados de ligação farmacêuticos) foram incluídos como controle.

Seleção de Loct/s Candidatos

[082] O PubMed foi pesquisado para GWAS europeu bem desenvolvido que mostrou uma associação entre polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) e PSO ou AD. Os inventores selecionaram SNPs com um nível de significância <5,0x10’⁸. O SNP (principal) relatado foi usado para a análise de associação baseada em SNP e foi usado para selecionar uma região locus para um estudo de associação de gene candidato baseado em gene.

[083] Para os SNPs principais localizados dentro de um gene, uma região de 30kb (mais 15kb a jusante e 15kb a montante do gene) foi adicionada para incluir elementos reguladores próximos ao gene. Se o SNP principal era intergênico e localizado a mais de 15kb de um gene, os inventores também adicionaram 15kb a jusante e 15kb a montante da posição do par de bases do SNP principal. O NCBI Variation Viewer (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/view/) com configuração CRCh37 foi usado para recuperar as coordenadas genômicas dos genes. Essas coordenadas foram usadas para recuperar SNPs nas regiões correspondentes das coortes do Rotterdam Study.

Genotipagem e Imputação

[084] A extração de DNA a partir da genotipagem do sangue total, imputação e controle de qualidade foi realizada seguindo protocolos

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24/34 padrão, conforme descrito anteriormente (Hofman et al. Eur J Epidemiol. 2015; 30(8): 661-708; Verkouteren etal., J Invest Dermatol. 2015; 135(8): 2135-8). Os BeadChips Illumina Infinium II HumanHap550 foram usados para genotipar as coortes RS-I e RS-II, enquanto os BeadChips Illumina Human610-Quad foram usados para genotipar a coorte RS-III.

[085] O controle de qualidade do polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) incluiu a remoção de SNPs com desvios de equilíbrio de HardyWeinberg (valor de p <5 x 10’⁶), taxa de chamada de genótipo <97%, incompatibilidade de gênero e alta heterozigosidade autossômica média. Os parentes de primeiro grau foram removidos e os SNPs foram filtrados se tivessem uma frequência alélica menor de menos de 1% ou uma qualidade de imputação (Rsq) menor que 0,3.

Estudo do Gene Candidato

[086] Os estudos de associação de genes candidatos (CGAS) foram realizados em duas etapas. Primeiro, um estudo de associação baseado em SNP de SNPs de PSO e AD previamente associados e, em segundo lugar, uma análise de associação baseada em genes foi realizada para fazer a triagem de variantes adicionais nas regiões de interesse.

[087] O CGAS baseado em SNP dos casos e controles de SD foi realizado usando os dados de dosagem imputados de cada coorte do Rotterdam Study, usando uma regressão logística com um modelo aditivo. A produção por SNP para cada coorte do Rotterdam Study foi meta-analisada usando valores de p derivados de um teste de razão de probabilidade como estatística resumida (Wilier et al., METAL: fast and efficient meta-analysis of genomewide association scans. Bioinformatics. 2010; 26(17): 2190-1; Aulchenko et al., ProbABEL package for genome-wide association analysis of imputed data. BMC Bioinformatics. 2010; 11:134).

[088] Os genótipos mais bem estimados foram usados para o

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CGAS baseado em genes. Os genótipos das três coortes do Rotterdam Study foram estimados a partir dos dados de dosagem imputados, usando o software GCTA com parâmetros padrão (Yang et al., Am J Hum Genet. 2011; 88(1): 7682).

[089] A regressão logística baseada em genes foi realizada usando o teste baseado em conjunto implementado no PLINK v.190 (parâmetros: valor p = 0,05, número máximo de SNPs = 15, r² = 0,5, permutações = 10000) (Purcell et al. PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am J Hum Genet. 2007; 81 (3): 559-75). As associações baseadas em SNP e baseadas em genes foram ajustadas por idade, sexo e quatro componentes principais (PCs).

Análise de Associação Genõmica Ampla

[090] Uma GWAS de casos e controles de SD foi realizada usando os dados de dosagem imputados de cada coorte do Rotterdam Study, usando uma regressão logística com um modelo aditivo. O modelo foi ajustado para idade, sexo e quatro PCs. As análises de GWAS foram implementadas no pacote ProbABEL (Aulchenko et al., citado acima). O fator de inflação λ foi estimado próximo a 1,0 e não foi mais considerado.

[091] Em seguida, as estatísticas de resumo de GWAS por coorte do Rotterdam Study foram meta-analisadas usando valores de p derivados de um teste de razão de probabilidade. A meta-análise foi realizada usando METAL (Wilier et al., citado anteriormente). O limiar para o valor p da significância genõmica ampla foi estabelecido em um valor p <5 x 10’⁸.

Resultados

População de Estudo

[092] 4.050 dos 4.454 participantes foram incluídos para o CGAS e GWAS de SD. Destes, 609 (15%) foram diagnosticados durante um FBSE por um médico pesquisador como tendo SD. Os homens apresentaram maior

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26/34 probabilidade de apresentar SD do que as mulheres (60,4% dos casos versus 41,8% dos controles eram do sexo masculino; valor de p <0,001) e os pacientes com SD eram mais velhos em comparação com aqueles sem SD (68,94 versus 67,97, valor de p: 0,018). Os casos de SD foram mais propensos a ter o diagnóstico de psoríase do que os controles (4,8% versus 3,0%; p = 0,035).

Abordagem de Genes Candidatos

[093] O CGAS não produziu nenhum locus significativo para SD após a correção para múltiplos testes.

Análise de Associação Genõmica Ampla

[094] Para descobrir novos loci para SD, os inventores realizaram uma GWAS em casos de SD contra controles e mais de 7 milhões de loci e encontraram duas associações genômicas amplas significativas (Tabela 1). O SNP mais significativo foi o r58331610 que foi mapeado para uma região intrônica do gene MAST4 no cromossomo 5 (valor de p: 1,75 x 10’ ⁸). O segundo acerto foi o SNP rs16944244, que mapeou para uma região intergênica no cromossomo 17p12, entre os genes PIRT e SHISA6 (valor de p: 2,10 x 10’⁸). Além disso, 68 SNPs em sete loci diferentes foram associados significativamente com SD com associações genômicas amplas sugestivas (valor de p <5x10^-6) nesta amostra relativamente pequena de pacientes com SD. Vários SNPs mapearam para genes codificadores de proteínas, incluindo GRM3 (rs6978155, 5,24 x 10 ⁷), KIAA1324L (rs73382367, 6,51 x 10 ⁷) e SENP2 (rs13081203, 3,64 x 10-6), enquanto outros eram intergênicos. Nenhum desses loci foi previamente associado a PSO ou AD.

Tabela 1

Gene	SNP	Chr	Localização	Alelo		Freq	Valor P
MAST4	rs58331610	5	66020457	a	g	0,8615	1,75x10-®*
Intergênico	rs16944244	17	11026693	c	g	0,9796	2,10 x IO⁸*

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Gene	SNP	Chr	Localização	Alelo		Freq	Valor P
Intergênico	rs78160483	17	11026297	t	g	0,9818	8,38 x 10 ⁸
Intergênico	rs16944241	17	11026414	a	g	0,9818	8,38 x 10 ⁸
Intergênico	rs6546997	2	75658780	t	c	0,1894	9,53 x 10 ⁸
Intergênico	rs8075550	17	11027059	a	g	0,9594	1,04x IO⁷
Intergênico	rs11870758	17	11015902	a	t	0,9722	1,21 x IO⁷
MAST4	rs12188593	5	66030069	t	c	0,1359	1,27 x 10 ⁷
Intergênico	rs182131544	17	11023964	a	g	0,9788	1,32 x 10 ⁷
Intergênico	rs111448323	17	11022815	a	g	0,9786	1,50 x 10 ⁷
Intergênico	rs4791451	17	11027570	c	g	0,9808	1,54 x 10 ⁷
Intergênico	rs77699632	17	11020937	a	t	0,0214	1,73 x 10 ⁷
Intergênico	rs111341744	17	11021220	a	g	0,9784	1,79 x 10 ⁷
Intergênico	rs75205996	17	11021311	t	c	0,9784	1,79 x 10 ⁷
Intergênico	rs58692658	17	11019423	t	c	0,022	2,32 x 10 ⁷
Intergênico	rs77592872	17	11018841	a	t	0,9781	2,34 x 10 ⁷
Intergênico	rs138424360	17	11018089	a	g	0,0219	2,37 x 10 ⁷
Intergênico	rs80298958	17	11016351	c	g	0,9784	3,39 x 10 ⁷
Intergênico	rs76730906	17	11019589	t	g	0,9754	3,85 x 10 ⁷
GRM3	rs6978155	7	86477894	a	t	0,0543	5,24 x 10 ⁷
GRM3	rs6957842	7	86477870	a	t	0,9457	5,28 x 10 ⁷
GRM3	7:86475369:1	7	86475369	d	i	0,9459	5,63 x 10 ⁷
GRM3	rs6960053	7	86473063	a	g	0,0541	5,68 x 10 ⁷
GRM3	rs6974507	7	86472032	t	g	0,9459	5,75 x IO⁷
GRM3	rs7801589	7	86470943	t	c	0,9459	5,76 x 10 ⁷
GRM3	rs6465087	7	86470488	t	c	0,9459	5,78 x 10 ⁷
GRM3	rs6954573	7	86472161	a	t	0,9455	5,86 x 10 ⁷
KIAA1324L	rs73382367	7	86525065	a	g	0,9436	6,51 x IO⁷
KIAA1324L	rs6465089	7	86564795	t	c	0,0563	7,17 x IO⁷
GRM3	7:86478749:1	7	86478749	d	i	0,9453	7,44 x 10 ⁷
GRM3	rs6947778	7	86476124	c	g	0,0545	8,11 x IO⁷

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Gene	SNP	Chr	Localização	Alelo		Freq	Valor P
GRM3	rs6967992	7	86476311	t	c	0,9455	8,11 x IO⁷
GRM3	rs6955565	7	86472484	a	g	0,0545	8,12 x 10 ⁷
GRM3	rs6955452	7	86472584	c	g	0,9455	8,15 x IO⁷
GRM3	rs6955917	7	86472763	a	g	0,0545	8,15 x IO⁷
KIAA1324L	rs6958716	7	86594383	t	c	0,943	1,18x10®

*estatisticamente significante

Discussão

[095] Neste estudo, os inventores não encontraram associações estatisticamente significativas entre os SN Ps de PSO/ AD anteriormente associados e SD. No entanto, na GWAS para SD, foram observados dois SNPs com associações genômicas amplas significativas. Além disso, associações sugestivas genômicas amplas foram encontradas em outros genes que podem ser relevantes para a patogênese de SD que precisam ser confirmadas em outras coortes.

[096] Na GWAS piloto para SD, vários SNPs foram significativamente associados (valor de p <5,0x10^-8) a SD, incluindo variantes localizadas no gene MAST4. O MAST4 pertence ao grupo da proteína quinase (PK), que desempenha um papel crítico nas cascatas de transmissão de sinal intracelular. A função precisa do MAST4 é desconhecida, mas o gene é expresso em diferentes células da pele (Garza et al. J Clin Invest. 2011; 121 (2): 613-22). Apenas 12 MB a montante do MAST4 está o gene CD180, que interage diretamente com o complexo de sinalização TLR4 (Divanovic et al. Nat Immunol. 2005; 6(6): 571-8). TLR4 desempenha um papel importante na imunidade inata da pele. Estudos de expressão mostraram um distúrbio na expressão de TLR4 na pele com AD, PSO e dermatite de contato e uma expressão diminuída de TLR4 também é encontrada no tratamento de SD com gluconato de lítio (Elewa et al., J Dermatol. 2015; 52(5): 467-76; Ballanger et

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29/34 al., Arch Dermatol Res. 2008; 300(5): 215-23). Sabe-se também que o MAST3, um parálogo do MAST4, influencia o TLR4 (Labbe et al. Genes Immun. 2008; 9(7):602-12).

[097] O gene MAST4 não foi associado anteriormente a nenhuma condição da pele, como PSO ou AD.

[098] O SNP rs58331610 mapeia para uma região de 9,6 kb do cromossomo 5 no primeiro intron do gene MAST4. A sequência nucleotídica do DNA genômico imediatamente ao redor do SNP é mostrada na Figura 1. Nessa figura, a localização do polimorfismo é indicada por R (purina, isto é, A ou G).

[099] No momento da redação, o conjunto mais recente do genoma humano (GRCh 38/hg 38) fornece as coordenadas para a sequência mostrada na Figura 1 como: chr5:66.724.129 a 66.725.129 (1001 pb). Essa região do genoma está localizada no gene MAST4, íntron 1 (que coordena de 66.597.019 a 66.759.708).

[0100] A frequência do alelo G no grupo de Rotterdam Study (que é amplamente de ascendência caucasiana europeia) é de 0,139. De acordo com as descobertas da Análise de Associação Genômica Ampla, o alelo G está associado à 'proteção' contra o desenvolvimento de dermatite seborreica.

[0101] Curiosamente, os dados do projeto genoma 1000 mostram que a frequência desse alelo rs58331610 'G' protetor varia substancialmente entre diferentes grupos ancestrais em todo o mundo, variando de <10% em alguns grupos africanos até 50% em algumas populações ancestrais do leste asiático e da América do Sul e Central.

[0102] O SNP está fortemente associado a SD, portanto, é possível que os níveis de expressão do gene MAST4 estejam associados a uma predisposição para o desenvolvimento da doença. Conclui-se que a modulação da atividade do gene MAST4, positivamente ou negativamente, pode ter um efeito benéfico na prevenção e/ ou tratamento da doença.

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[0103] Não apenas isso, mas existem três outros genes MAST conhecidos em humanos (MAST 1, 2 e 3), todos os quais são expressos na pele. É possível que a regulação positiva ou negativa de um ou mais dos MAST 1-3 também possa ter um efeito benéfico na prevenção e/ ou tratamento de SD. No entanto, o MAST4 parece ser o gene MAST que é mais altamente expresso na pele humana e, portanto, é o principal candidato à intervenção profilática e/ ou terapêutica em SD.

[0104] Usando a ferramenta MAPPER (http://genome.ufl.edu/mapper), os inventores encontraram evidências de que o SNP rs58331610 está presente em um sítio previsto de ligação do fator de transcrição C/ EBP 8.

[0105] A atividade de C/EBP β é importante na regulação dos genes envolvidos nas respostas imunes e inflamatórias. O fator de transcrição C/ΕΒΡ-β regula os genes responsivos à IL-17 e é expresso preferencialmente em queratinócitos diferenciados. A expressão de C/ΕΒΡβ é regulada positivamente na pele psoriática em comparação à saudável. Os sítios de ligação de C/ΕΒΡ-β são particularmente encontrados em sequências reguladoras de genes que estão associados à resposta inflamatória (http://europepmc.org/backend/ptpmcrender.fcgi?accid=PMC4324884&blobtype =pdf). O CEBPB foi identificado pela primeira vez com base em sua capacidade de regular a transcrição de genes em resposta a IL-1 e IL-6. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1222736/pdf/12006103.pdf).

[0106] Os nomes alternativos incluem NF-IL6, TCF5, IL-6DBP, LAP, CRP2, NF-M, AGP/EBP, ApC/EBP.

[0107] Consequentemente, uma hipótese é que a variação genética no locus SNP podería afetar o sítio de ligação de C/ΕΒΡβ e alterar a afinidade de ligação ao fator de transcrição e, portanto, modular a transcrição e expressão do gene MAST.

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Exemplo 2 - Demonstração de que o MAST4 quinase é necessário para a RESPOSTA INFLAMATÓRIA AO DESAFIO MICROBIANO E QUE A INIBIÇÃO DE MAST4 QUINASE PODE REDUZIR A RESPOSTA INFLAMATÓRIA NOS QUERATINÓCITOS EPIDÉRMICOS HUMANOS NORMAIS.

Método:

[0108] Os queratinócitos epidérmicos humanos normais foram semeados a 40.000 células por poço em placas de 24 poços e cultivados por 16 horas em meio (meio EpiLife® MEP1500CA) + suplemento HKGS (S-001-5) a 37 ^SC, CO2 a 5%. As células foram transfectadas usando RNAiMAX com 20nM de um siRNA stealth específico de alvo MAST4 (Thermofisher HSS180104) ou um siRNA controle específico de GC médio. Após 48 horas, 0 meio foi removido e as células foram desafiadas com 10 pg/ml de peptidoglicano de Staphylococcus aureus (Sigma 77140) por 24 horas. O meio foi colhido das células e 0 RNA total foi extraído de cada amostra de células usando Qiagen.

[0109] Realizado 0 mini-kit RNeasy e quantificado em um NanoDrop. A expressão do gene MAST4 foi medida usando condições padrão de análise de expressão gênica e ensaio de expressão TaqMan® Hs00389519_m1. Amostras em duplicatas de 100 μΙ de cada poço experimental foram analisadas para IL8 usando sistemas de R&D ELISA de conjunto duplo IL8.

[0110] A Tabela 2 abaixo mostra a quantificação relativa (RQ) da expressão do gene MAST4 nas amostras de células em comparação ao controle veículo e normalizada à expressão do gene “housekeeper¹’ (Actina). O knockdown do MAST4 siRNA reduziu com sucesso os níveis de transcrito de MAST4 em > 80%.

[0111] O desafio do peptidoglicano induziu a expressão do transcrito de MAST4, aumentando-o em > 25% nas células transfectadas com

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32/34 siRNA controle. Isto demonstra que a expressão do gene MAST4 é induzida pelo peptidoglicano, que é um componente da parede celular bacteriana, apoiando um papel do MAST4 na resposta imune inflamatória dos queratinócitos epidérmicos (Wang et al. 2001 Infect. Immun. 69(4), 2270-2276). O peptidoglicano é conhecido como ativador do receptor toll-like 2 (TLR2) (Dziarski e Gupta 2005 Infect. Immun. 73(8), 5212-5216) e, portanto, esses dados suportam um papel do MAST4 na sinalização mediada por TLR2 em queratinócitos epidérmicos humanos normais.

Tabela 2

siRNA	Tratamento	Quantificação relativa da expressão MAST4	IL-8 (pg/ml)	Indução de IL-8 pelo peptidoglicano (pg/ml)
Controle	Veículo	1	26,73 +/- 9,33	NA
MAST4	Veículo	0,166	32,94 +/- 10,96	NA
Controle	Peptidoglicano	1,257	245,94 +/- 49,86	219,21
MAST4	Peptidoglicano	0,18	175,30 +/-24,16	142,36

[0112] A Tabela 2 também mostra a produção de citocina inflamatória, IL-8 em resposta ao desafio peptidoglicano nas diferentes populações celulares. Nos queratinócitos transfectados com siRNA controle, o desafio do peptidoglicano resulta em um aumento de > 9 vezes na produção de IL-8. Em contraste, as células transfectadas com o duplex MAST4 quinase siRNA mostram uma indução de IL-8 mais modesta em 5 vezes em resposta ao desafio do peptidoglicano. Estes dados mostram que um knockdown de 80% de MAST4 no nível de expressão gênica é acompanhado por uma redução de 35% no nível funcional, na resposta de IL-8 ao desafio do peptidoglicano. Esses dados suportam um papel fundamental do MAST4 na sinalização inflamatória dos queratinócitos epidérmicos em resposta a um agonista de TLR2 e demonstram, pela primeira vez, que a inibição da quinase MAST4 pode reduzir a resposta inflamatória a um desafio microbiano em um modelo epidérmico in vitro de inflamação da pele.

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Exemplo 3 - Estudo Epigenético

[0113] Neste exemplo, os inventores realizaram uma análise genômica ampla da metilação do DNA em biópsias do couro cabeludo humano retiradas de voluntários saudáveis e com caspa, para investigar se existem diferenças epigenéticas associadas à caspa.

Indivíduos

[0114] Os indivíduos eram do sexo feminino, residentes no Reino Unido de ascendência do norte da Europa (caucasianos) e com idades entre 23 e 37 anos. Os casos de caspa foram definidos como usuários atuais de anticaspa, relatados como tendo caspa há pelo menos dois anos e com sinais de caspa durante uma avaliação visual (Harding et al., Arch Dermatol Res (2002) 294: 221-230) após 5 semanas de uso de um xampu de beleza anti-caspa. Indivíduos saudáveis foram definidos como não atualmente usando xampu anticaspa, não relataram ter caspa por 2 anos e não apresentaram sinais de caspa após 5 semanas de uso de um xampu de beleza anti-caspa.

Amostras e Análise

[0115] Biópsias do couro cabeludo de 4 mm foram retiradas de couro cabeludo saudável (n = 25) e com caspa (n = 23) e congeladas rapidamente em gelo seco. O DNA foi extraído usando um método padrão de fenol clorofórmio (Molecular Cloning, A laboratory manual, 3^â edição. Sambrook e Russell. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). A metilação do DNA foi medida usando primeiro o método de conversão de bissulfito Zymo (série de EPIC Methylation: www.illumina.com), seguido de interrogação sobre as séries de metilação EPK beadchip 850K da Infinium (Illumina). A análise estatística dos dados do chip envolveu a conversão de valores beta em valores m (Du et al., BMC Bioinformatics 2010, 11: 587.). Os dados brutos do valor m foram normalizados usando normalização quantil e modelos estatísticos lineares foram usados para identificar sondas que eram regiões diferencialmente

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34/34 metiladas entre indivíduos controle com caspa e saudável. Após a filtragem estatística, os valores beta foram usados para filtrar uma diferença de 5% entre controles com caspa e saudáveis.

Constatações

[0116] Os sítios diferencialmente metilados foram identificados com pontos de corte estatísticos de valor p ajustado a FDR <0,05 e delta-beta >= 5% (Du et al. 2010). Nesse nível, 701 sítios de metilação foram diferencialmente metilados em amostras com caspa em relação a amostras saudáveis. Um desses sítios diferencialmente metilados foi cg13811092, que está localizado no nucleotídeo 66010095 no cromossomo 5 e outro é cg03133881, que está localizado no nucleotídeo 46467354 no cromossomo 1 no conjunto do genoma humano GRCh37/hg37. Esse sítio anterior está localizado no íntron 1 do gene MAST4 e é significativamente hipo-metilado no couro cabeludo com caspa, em comparação com o couro cabeludo saudável; este sítio fica em uma região de 'cromatina abertá próxima a um elemento intensificador (portanto, é provável que haja fatores de transcrição que se ligam a este sítio no couro cabeludo) e 10kb a montante de rs58331610, a variante genética identificada na análise de associação genômica ampla de dermatite seborréica. O último sítio CpG é significativamente hipometilado no couro cabeludo com caspa, em comparação com o couro cabeludo saudável. O sítio está localizado dentro do íntron 6 do gene MAST2 e também dentro de uma região de 'cromatina abertá.

[0117] Na literatura, está bem documentado que a hipo-metilação dentro de uma região reguladora de um gene pode estar associada a expressão alterada do gene e, como resultado, sua função (Bonder etal. Nat Genet. 2017 Jan; 49(1)): 131-138.). Portanto, a presença de sítios diferencialmente metilados nos genes MAST4 e MAST2 é uma evidência de suporte de que esses genes desempenham um papel na etiologia da caspa, principalmente quando coincidem com uma região reguladora, tal como um sítio de cromatina aberta.

Claims

Reivindicações

1. SUBSTÂNCIA, caracterizada por regular negativamente a atividade de um gene MAST4, ou a atividade de um produto de transcrição ou tradução de um gene MAST4, para uso na prevenção e/ ou tratamento de uma condição inflamatória da pele em um indivíduo mamífero.
2. SUBSTÂNCIA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela condição da pele compreender caspa.
3. SUBSTÂNCIA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada por atuar no nível de ácido nucleico, regulando negativamente a transcrição de um gene MAST4 e/ ou a tradução de um transcrito do gene MAST4.
4. SUBSTÂNCIA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender uma molécula de RNA interferente curta que é essencialmente idêntica em sequência a uma parte de um transcrito do gene MAST4.
5. SUBSTÂNCIA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por compreender uma sequência de 20 a 30 nucleotídeos idêntica a uma parte de um transcrito do gene MAST4.
6. FORMULAÇÃO TÓPICA para prevenção e/ ou tratamento de uma condição inflamatória da pele em um ser humano, caracterizada pela formulação compreender uma quantidade eficaz de uma substância ativa conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em mistura com um agente de volume, diluente, veículo ou excipiente dermatologicamente aceitáveis.
7. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por compreender um intensificador de penetração na pele.
8. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizada por ser na forma de líquido, creme, gel,

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2/2 loção, pasta ou adesivo.
9. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada por ser na forma de um xampu e/ ou um condicionador.
10. MÉTODO DE ENSAIO in vitro para identificar substâncias com eficácia potencial no tratamento e/ ou prevenção de uma condição inflamatória da pele em um ser humano, caracterizado pelo método de ensaio compreender as etapas de: colocar em contato, individualmente, uma pluralidade de substâncias candidatas com um gene MAST4 ou produto do gene MAST4; e identificar as substâncias candidatas que têm um efeito de regulação negativa na atividade do gene MAST4 ou do produto do gene MAST4.
11. USO DE UM PRODUTO do gene MAST4, ou de uma molécula de ácido nucleico que expressa um produto do gene MAST4, caracterizado por ser em um ensaio de triagem para identificar substâncias que regulam negativamente a atividade de um produto do gene MAST4 ou molécula de ácido nucleico que expressa um produto do gene MAST4 e, assim, identificar substâncias que podem ser úteis para tratar e/ ou prevenir uma condição inflamatória da pele em um ser humano.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, ou uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelas substâncias serem testadas em paralelo com um controle positivo que compreende um composto conhecido por ser ativo na regulação negativa da atividade de um gene MAST4 ou de um produto do gene MAST4.