KR20230152175A - 암 면역요법을 위한 crispr-cas-관련 방법, 조성물 및 구성성분 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
Abstract
암 치료를 위한 CRISPR/CAS-관련 조성물 및 방법.
Description
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2014년 4월 18일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/981,636 및 2015년 3월 25일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/138,246의 이익을 주장하며, 이들의 개시 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열목록
본 명세서는 서열목록(2015년 4월 17일의 .txt 파일명 "SEQUENCE LISTING 2011271-0005 EM034PCT.txt"로서 전자적으로 제출됨)을 언급한다. .txt 파일은 2015년 4월 17일에 생성되었고, 용량이 11,400,000 바이트이다. 서열목록의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 표적 핵산 서열을 편집하거나, 또는 표적 핵산 서열의 발현을 조절하기 위한 CRISPR/CAS-관련 방법, 조성물 및 구성성분, 및 이들의, 조작된(engineered) T 세포 또는 T 세포 전구체의 입양 전달(adoptive transfer)을 포함하는 암 면역요법과 관련된 적용에 관한 것이다.
유전자 조작된 T 세포의 입양 전달은 암 치료 양상으로서 임상 시험에 들어갔다. 통상적으로, 접근은, 1) 대상체로부터 분리반출법에 의해 백혈구를 얻는 단계; 2) T 세포를 선택/풍부화하는 단계; 3) T 세포를 사이토카인 처리에 의해 활성화하는 단계; 4) 클로닝된 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR) 유전자 또는 키메라 항원 수용체(CAR) 유전자를 레트로바이러스 형질도입, 렌티바이러스 형질도입 또는 전기천공법에 의해 도입하는 단계; 5) T 세포를 사이토카인 처리에 의해 확장시키는 단계; 6) 대상체를 보통 림프구고갈에 의해 조건화하는 단계; 및 7) 조작된 T 세포를 대상체 내로 주입하는 단계로 이루어진다.
클로닝된 TCR 유전자(TRAC 및 TRBC)의 공급원은 특정 악성종양을 지니는 개체로부터 단리된 희귀 T 세포 집단 및 특이적 종양 항원 또는 종양 세포에 의해 면역화된 T 세포 수용체-인간화 마우스로부터 단리된 T 세포 클론을 포함한다. 입양 전달 후에, TCR-조작된 T 세포는 종양 세포 표면 상의 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC) 단백질에 의해 제시된 TCR-조작된 T 세포의 동족 항원 펩타이드를 인식한다. 항원 맞물림(engagement)은 T 세포 활성화 및 증식을 야기하는 신호 형질도입 경로를 자극한다. 이어서, 자극된 T 세포는 종양 세포 세포자멸사를 유도하는 그랜자임 B(Granzyme B), 퍼포린 및 그라눌리신을 포함하는 분비 복합체가 통상적으로 연루된 세포독성 항-종양 세포 반응을 시작한다.
키메라 항원 수용체(CAR) 유전자는 세포질 효과기 도메인에 대해 힌지 및 막관통 도메인을 통해 융합된 단클론성 항체의 단일쇄 항체 가변 단편(scFv) 도메인으로부터 통상적으로 유래된 세포외 종양 항원 결합 도메인을 포함하는 인공 T 세포 수용체를 암호화한다. 효과기 도메인은 T 세포 공동-수용체 복합체의 CD3-제타 사슬로부터 통상적으로 유래되고, 또한 CD28 및/또는 CD137 수용체 단백질로부터 유래된 도메인을 포함할 수 있다. CAR 세포외 도메인은 T 세포 활성화 및 증식을 야기하는 MHC-독립적 방식으로 종양 항원에 결합하여 TCR 조작된 T 세포에 대해 기재된 바와 같은 세포독성 항-종양 활성이 절정을 이루게 된다.
지금까지, 적어도 15 종의 상이한 종양 항원이 조작된 T 세포의 임상 시험에서 표적화되었다. 몇몇 시험에서, 항-종양 활성이 보고되었다. 가장 큰 성공은 혈액학적 악성종양에서 달성되었다. 예를 들어, B 세포 항원인 CD19를 표적화하는 조작된 CAR-T 세포의 입양 전달은 림프종, 급성 림프아구성 백혈병, 급성 림프성 백혈병 및 B-세포 급성 림프성 백혈병을 지니는 대상체에서 다양한 부분적 및 완전한 반응을 야기하였다. 대조적으로, 기타 다른 종양 유형, 특히 신세포암종, 신경아세포종, 결장직장암, 유방암, 난소암, 흑색종, 육종 및 전립선암을 포함하는 고형 종양을 표적화하는 시험은 덜 성공적이었다. 다수의 이들 시험에서, 객관적 반응을 경험한 환자는 매우 소수였다. 따라서, 입양 전달되는 조작된 T 세포의 항-종양 효능을 개선시키기 위한 필요가 있다.
본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 대상체에 대한 유전자 조작된 T 세포 또는 T 세포 전구체의 투여를 포함하는 면역요법 접근을 사용하는 암 치료를 제공한다. 암을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 접근은 대상체로부터 T 세포를 단리시키는 것, 암 세포에 의해 발현된 항원을 표적화하기 위해 상기 T 세포를 유전자 변형시키는 것, 이어서, 상기 T 세포를 대상체에게 재도입시키는 것(입양 세포 전달로서 지칭되는 과정임)이다. T 세포를 유전자 변형시키기 위한 방법은 특정 암 항원을 특이적으로 인식하는, 각각 막관통 TCR 또는 CAR 단백질을 암호화하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR) 유전자의 도입을 포함한다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, TCR 또는 CAR 단백질의 항원 결합 도메인과 종양-발현 항원의 맞물림은 T 세포 활성화, 증식 및 궁극적으로 세포독성 면역 반응을 통한 암 세포의 파괴를 야기하는 신호전달 캐스케이드를 개시하는 것으로 여겨진다(Kershaw et al., 2013 NatRevCancer 13, 525-541).
유전자 변형된 T 세포를 이용하는 입양 세포 전달은 고형 종양 및 혈액학적 악성종양에 대한 치료제로서의 임상 시험에 들어갔다. 지금까지의 결과는 혼합되었다. 혈액학적 악성종양(특히, 림프종, CLL 및 ALL)에서, 몇몇 1상 및 2상 시험에서 대다수의 환자는 적어도 부분적인 반응을 나타내었으며, 일부는 완전한 반응을 나타내었다(Kochenderfer, J. N. et al., 2012 Blood 119, 2709-2720). 그러나, 대부분의 종양 유형(흑색종, 신세포암종 및 결장직장암을 포함함)에서, 반응은 거의 관찰되지 않았다(Johnson, L. A. et al., 2009 Blood 114, 535-546; Lamers, C. H. et al., 2013 Mol. Ther. 21, 904-912; Warren, R. S. et al., 1998 Cancer Gene Ther. 5, S1-S2). 따라서, 암 치료에서 변형된 T 세포의 입양 전달 효능을 개선시키기 위한 필요가 존재한다.
암 치료제로서 유전자 변형된 T 세포의 효능을 제한하는 인자는 (1) T 세포 증식, 예를 들어 입양 전달 후 T 세포의 제한된 증식; (2) T 세포 생존, 예를 들어 종양 환경에서 인자에 의한 T 세포 세포자멸사의 유도; 및 (3) T 세포 기능, 예를 들어 숙주 면역 세포 및 암 세포에 의해 분비되는 저해 인자에 의한 세포독성 T 세포 기능의 저해를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 T 세포 증식, 생존 및/또는 기능에 영향을 미치는 T-세포 발현 유전자의 발현을 변형시킴으로써 이들 제한을 처리한다.
구현예에서, 본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 (예를 들어, T 세포 증식을 저해하는 유전자를 불활성화함으로써) T 세포 증식에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 (예를 들어, T 세포 세포자멸사를 매개하는 유전자를 불활성화함으로써) T 세포 생존에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 (예를 들어, 면역억제 및 저해(예를 들어, 아네르기(anergy)-유도성) 신호전달 인자를 암호화하는 유전자를 불활성화시킴으로써) T 세포 기능에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 상기 기재한 방법 및 조성물은 암 치료제로서 유전자 변형된 T 세포의 효능, 예를 들어 T 세포 증식, T 세포 생존, T 세포 기능 또는 이들의 임의의 조합을 제한하는 인자 중 하나 이상에 영향을 미치기 위해 개개로 또는 조합으로 이용될 수 있다는 것이 상정된다.
본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 하나 이상의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 중 하나 이상을 변경시킴으로써 T 세포 증식, 생존 및/또는 기능에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 하나 이상의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 CBLB 및/또는 PTPN6 유전자를 변경시킴으로써 T 세포 증식에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 하나 이상의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS 및/또는 BID 유전자를 변경시킴으로써 T 세포 생존에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 하나 이상의 T-세포 발현 유전자 또는 유전자들, 예를 들어 CTLA4 및/또는 PDCD1 및/또는 TRAC 및/또는 TRBC 유전자를 변경시킴으로써 T 세포 기능에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다.
일 접근에서, 하나 이상의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자는, 예를 들어 T 세포 증식, 생존 및/또는 기능에 영향을 미치기 위해 표적화된 넉아웃 또는 넉다운으로서 독립적으로 표적화된다. 구현예에서, 상기 접근은 1 종의 T-세포 발현 유전자(예를 들어, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자)를 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접근은 2 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 둘을 독립적으로 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접근은 3 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 셋을 독립적으로 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접근은 4 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 넷을 독립적으로 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접근은 5 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 다섯을 독립적으로 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접근은 6 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 여섯을 독립적으로 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접근은 7 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 일곱을 독립적으로 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접근은 8 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 각각을 독립적으로 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다.
상기 기재한 유전자에 추가적으로, 다수의 기타 다른 T-세포 발현 유전자는 조작된 T 세포의 효능에 영향을 미치도록 표적화될 수 있다. 이들 유전자는 TGFBRI, TGFBRII 및 TGFBRIII을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Kershaw et al. 2013 NatRevCancer 13, 525-541). 본 명세서에서 TGFBRI, TGFBRII 또는 TGFBRIII 유전자 중 하나 이상은 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 개개로 또는 조합으로 변경될 수 있다는 것이 상정된다. 추가로 TGFBRI, TGFBRII 또는 TGFBRIII 유전자 중 하나 이상은 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 개개로 또는 상기 기재한 8 종의 유전자(즉, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자) 중 임의의 하나 이상과의 조합으로 변경될 수 있다는 것이 상정된다.
일 양태에서, 본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 유전자, 예를 들어 비 암호 또는 암호 영역, 예를 들어 프로모터 영역, 또는 전사 서열, 예를 들어 인트론 또는 엑손 서열을 표적화함으로서 T 세포 증식, 생존 및/또는 기능에 영향을 미치는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 중 하나 이상을 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 암호 서열, 예를 들어 암호 영역, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 초기 암호 영역은 발현의 변경 및 넉아웃을 위해 표적화된다.
다른 양태에서, 본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 암호 서열을 표적화함으로써 T 세포 증식, 생존 및/또는 기능에 영향을 미치는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자를 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 암호 서열은 각각 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 중 하나 이상을 넉아웃하기 위해, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 중 하나 이상의 발현을 제거하기 위해, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 중 하나 이상의 1 개 또는 2 개의 대립유전자를 넉아웃하기 위해, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 중 하나 이상에서의 결실 또는 돌연변이를 포함하는 변경의 유도에 의해 표적화된다. 구현예에서, 상기 방법은 삽입 또는 결실을 포함하는 변경을 제공한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은, 표적화된 넉아웃 접근은 효소적으로 활성인 Cas9(eaCas9)를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 비-상동성 말단 결합(non-homologous end joining: NHEJ)에 의해 매개된다.
구현예에서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 초기 암호 서열은 각각 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 중 하나 이상을 넉아웃하기 위해 표적화된다. 구현예에서, 표적화는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 중 1 개 또는 2 개의 대립유전자에 영향을 미친다. 구현예에서, 표적화된 넉아웃 접근은 기능성 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 산물의 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 구현예에서, 상기 방법은 삽입 또는 결실을 포함하는 변경을 제공한다.
다른 양태에서, 본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인트론, 3'UTR, 및/또는 폴리아데닐화 신호의 비 암호 서열을 표적화함으로써 T 세포 기능에 영향을 미치는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자를 변경하기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 비 암호 서열은 유전자를 넉아웃하기 위해, 예를 들어 유전자의 발현을 제거하기 위해, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 1 개 또는 2 개의 대립유전자를 넉아웃하기 위해, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자에서의 결실 또는 돌연변이를 포함하는 변경의 유도에 의해 표적화된다. 구현예에서, 상기 방법은 삽입 또는 결실을 포함하는 변경을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 FAS 넉아웃 위치"는, NHEJ-매개 변경에 의해 변경된다면, 기능성 FAS 유전자 산물의 발현의 감소 또는 제거(예를 들어, 기능성 FAS 유전자 산물 발현의 넉아웃)를 야기하는, FAS 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 위치는 FAS 유전자 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역에 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 BID 넉아웃 위치"는, NHEJ-매개 변경에 의해 변경된다면, 기능성 BID 유전자 산물의 발현의 감소 또는 제거(예를 들어, 기능성 BID 유전자 산물 발현의 넉아웃)를 야기하는, BID 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 위치는 BID 유전자 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역에 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 CTLA4 넉아웃 위치"는, NHEJ-매개 변경에 의해 변경된다면, 기능성 CTLA4 유전자 산물의 발현의 감소 또는 제거(예를 들어, 기능성 CTLA4 유전자 산물 발현의 넉아웃)를 야기하는, CTLA4 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 위치는 CTLA4 유전자 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역에 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 PDCD1 넉아웃 위치"는, NHEJ-매개 변경에 의해 변경된다면, 기능성 PDCD1 유전자 산물의 발현의 감소 또는 제거(예를 들어, 기능성 PDCD1 유전자 산물 발현의 넉아웃)를 야기하는, PDCD1 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 위치는 PDCD1 유전자 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역에 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 CBLB 넉아웃 위치"는, NHEJ-매개 변경에 의해 변경된다면, 기능성 CBLB 유전자 산물의 발현의 감소 또는 제거(예를 들어, 기능성 CBLB 유전자 산물 발현의 넉아웃)를 야기하는, CBLB 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 위치는 CBLB 유전자 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역에 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 PTPN6 넉아웃 위치"는, NHEJ-매개 변경에 의해 변경된다면, 기능성 PTPN6 유전자 산물의 발현의 감소 또는 제거(예를 들어, 기능성 PTPN6 유전자 산물 발현의 넉아웃)를 야기하는, PTPN6 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 위치는 PTPN6 유전자 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역에 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 TRAC 넉아웃 위치"는, NHEJ-매개 변경에 의해 변경된다면, 기능성 TRAC 유전자 산물의 발현의 감소 또는 제거(예를 들어, 기능성 TRAC 유전자 산물 발현의 넉아웃)를 야기하는, TRAC 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 위치는 TRAC 유전자 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역에 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 TRBC 넉아웃 위치"는, NHEJ-매개 변경에 의해 변경된다면, 기능성 TRBC 유전자 산물의 발현의 감소 또는 제거(예를 들어, 기능성 TRBC 유전자 산물 발현의 넉아웃)를 야기하는, TRBC 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 위치는 TRBC 유전자 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역에 있다.
다른 양태에서, 본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 프로모터 영역을 표적화함으로써 T 세포 기능에 영향을 미치는 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 발현을 변경하기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 프로모터 영역은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 또는 PTPN6 유전자의 넉다운 발현에 대해 표적화된다. 표적화된 넉다운 접근은 기능성 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 및/또는 PTPN6 유전자 산물의 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은, 표적화된 넉다운은 전사를 변경하기 위해, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 및/또는 PTPN6 유전자의 전사를 차단하거나, 저감시키거나 또는 감소시키기 위해 전사 리프레서 도메인 또는 염색질 변형 단백질에 융합된 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9를 표적화함으로써 매개된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 FAS 넉다운 위치"는 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질에 의해 표적화된다면, 기능성 FAS 유전자 산물 발현의 감소 또는 제거를 야기하는, 예를 들어 FAS 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 전사는 감소되거나 또는 제거된다. 구현예에서, 위치는 FAS 프로모터 서열에 있다. 구현예에서, FAS 유전자의 프로모터 서열 내의 위치는 본 명세서에 기재된 바와 같은 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9-융합 단백질에 의해 표적화된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 BID 넉다운 위치"는 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질에 의해 표적화된다면, 기능성 BID 유전자 산물 발현의 감소 또는 제거를 야기하는, 예를 들어 BID 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 전사는 감소되거나 또는 제거된다. 구현예에서, 위치는 BID 프로모터 서열에 있다. 구현예에서, BID 유전자의 프로모터 서열 내의 위치는 본 명세서에 기재된 바와 같은 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9-융합 단백질에 의해 표적화된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 CTLA4 넉다운 위치"는 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질에 의해 표적화된다면, 기능성 CTLA4 유전자 산물 발현의 감소 또는 제거를 야기하는, 예를 들어 CTLA4 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 전사는 감소되거나 또는 제거된다. 구현예에서, 위치는 CTLA4 프로모터 서열에 있다. 구현예에서, CTLA4 유전자의 프로모터 서열 내의 위치는 본 명세서에 기재된 바와 같은 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9-융합 단백질에 의해 표적화된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 PDCD1 넉다운 위치"는 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질에 의해 표적화된다면, 기능성 PDCD1 유전자 산물 발현의 감소 또는 제거를 야기하는, 예를 들어 PDCD1 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 전사는 감소되거나 또는 제거된다. 구현예에서, 위치는 PDCD1 프로모터 서열에 있다. 구현예에서, PDCD1 유전자의 프로모터 서열 내의 위치는 본 명세서에 기재된 바와 같은 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9-융합 단백질에 의해 표적화된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 CBLB 넉다운 위치"는 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질에 의해 표적화된다면, 기능성 CBLB 유전자 산물 발현의 감소 또는 제거를 야기하는, 예를 들어 CBLB 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 전사는 감소되거나 또는 제거된다. 구현예에서, 위치는 CBLB 프로모터 서열에 있다. 구현예에서, CBLB 유전자의 프로모터 서열 내의 위치는 본 명세서에 기재된 바와 같은 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9-융합 단백질에 의해 표적화된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 PTPN6 넉다운 위치"는 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질에 의해 표적화된다면, 기능성 PTPN6 유전자 산물 발현의 감소 또는 제거를 야기하는, 예를 들어 PTPN6 유전자 내의 위치를 지칭한다. 구현예에서, 전사는 감소되거나 또는 제거된다. 구현예에서, 위치는 PTPN6 프로모터 서열에 있다. 구현예에서, PTPN6 유전자의 프로모터 서열 내의 위치는 본 명세서에 기재된 바와 같은 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9-융합 단백질에 의해 표적화된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 FAS 위치"는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 임의의 T 세포 표적 FAS 넉아웃 위치 및/또는 T 세포 표적 FAS 넉다운 위치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 BID 위치"는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 임의의 T 세포 표적 BID 넉아웃 위치 및/또는 T 세포 표적 BID 넉다운 위치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 CTLA4 위치"는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 임의의 T 세포 표적 CTLA4 넉아웃 위치 및/또는 T 세포 표적 CTLA4 넉다운 위치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 PDCD1 위치"는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 임의의 T 세포 표적 PDCD1 넉아웃 위치 및/또는 T 세포 표적 PDCD1 넉다운 위치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 CBLB 위치"는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 임의의 T 세포 표적 CBLB 넉아웃 위치 및/또는 T 세포 표적 CBLB 넉다운 위치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 PTPN6 위치"는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 임의의 T 세포 표적 PTPN6 넉아웃 위치 및/또는 T 세포 표적 PTPN6 넉다운 위치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 TRAC 위치"는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 임의의 T 세포 표적 TRAC 넉아웃 위치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 TRBC 위치"는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 임의의 T 세포 표적 TRBC 넉아웃 위치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 넉아웃 위치"는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 임의의 T 세포 표적 FAS 넉아웃 위치, T 세포 표적 BID 넉아웃 위치, T 세포 표적 CTLA4 넉아웃 위치, T 세포 표적 PDCD1 넉아웃 위치, T 세포 표적 CBLB 넉아웃 위치, T 세포 표적 PTPN6 넉아웃 위치, T 세포 표적 TRAC 넉아웃 위치, 또는 T 세포 표적 TRBC 넉아웃 위치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 넉다운 위치"는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 임의의 T 세포 표적 FAS 넉다운 위치, T 세포 표적 BID 넉다운 위치, T 세포 표적 CTLA4 넉다운 위치, T 세포 표적 PDCD1 넉다운 위치, T 세포 표적 CBLB 넉다운 위치, 또는 T 세포 표적 PTPN6 넉다운 위치를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 표적 위치"는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 임의의 T 세포 표적 넉아웃 위치 또는 T 세포 표적 넉다운 위치를 지칭한다.
일 양태에서, 본 명세서에서 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자로부터의 표적 도메인과 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자, 예를 들어 단리된 또는 비천연 유래 gRNA 분자가 개시된다.
구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서 T 세포 표적 위치의 변경, 예를 들어 NHEJ와 연관된 변경을 허용하는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치에 충분히 가까운 절단 사건, 예를 들어 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손을 제공하도록 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 절단 사건, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손이 T 세포 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350 개, 400 개, 450 개 또는 500 개의 뉴클레오타이드 내에 위치되도록 구성된다. 파손, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치의 상류 또는 하류에 위치될 수 있다.
구현예에서, 제2 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA 분자는 단독으로 또는 제1 gRNA 분자에 의해 위치된 파손과 조합하여 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치의 변경, 예를 들어 NHEJ와 연관된 변경을 허용하는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치에 충분히 가까운 절단 사건, 예를 들어 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손을 제공하도록 구성된다. 구현예에서, 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350 개, 400 개, 450 개 또는 500 개의 뉴클레오타이드 내의 각각의 gRNA 분자에 독립적으로 절단 사건, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손이 위치되도록 제1 및 제2 gRNA 분자의 표적화 도메인이 구성된다. 구현예에서, 파손, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치의 뉴클레오타이드의 양 측면 상에 위치된다. 구현예에서, 파손, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중의 T 세포 표적 위치의 뉴클레오타이드의, 예를 들어 상류 또는 하류의 한 측면 상에 위치된다.
구현예에서, 단일 가닥 파손은 이하에 논의되는 바와 같은 제2 gRNA 분자에 의해 위치되는 추가적인 단일 가닥 파손을 수반한다. 예를 들어, 절단 사건, 예를 들어 2 개의 단일 가닥 파손이 T 세포 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350 개, 400 개, 450 개 또는 500 개의 뉴클레오타이드 내에 위치되도록 표적화 도메인이 구성된다. 구현예에서, Cas9 틈내기효소를 가이딩할 때, 단일 가닥 파손이 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치의 변경을 초래하기 위해 서로 충분히 가까운 제2 gRNA에 의해 위치되는 추가적인 단일 가닥 파손을 수반하도록 제1 및 제2 gRNA 분자가 구성된다. 구현예에서, 예를 들어 Cas9가 틈내기효소일 때, 제2 gRNA에 의해 위치된 단일 가닥 파손이 제1 gRNA 분자에 의해 위치된 파손의 10 개, 20 개, 30 개, 40 개 또는 50 개의 뉴클레오타이드 내에 있도록 제1 및 제2 gRNA 분자가 구성된다. 구현예에서, 2 개의 gRNA 분자는, 예를 들어 이중 가닥 파손을 본질적으로 모방하는 상이한 가닥 상에서, 서로 동일한 위치에 또는 약간의 뉴클레오타이드 내에 절단부를 위치시키도록 구성된다.
구현예에서, 이중 가닥 파손은 이하에 논의하는 바와 같이 제2 gRNA 분자에 의해 위치되는 추가적인 이중 가닥 파손을 수반할 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥 파손이 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서, 예를 들어 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350 개, 400 개, 450 개 또는 500 개의 뉴클레오타이드 내의 T 세포 표적 위치의 상류에 위치되도록 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인이 구성되고; 이중 가닥 파손이 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서, 예를 들어 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350 개, 400 개, 450 개 또는 500 개의 뉴클레오타이드 내의 T 세포 표적 위치의 하류에 위치되도록 제2 gRNA 분자의 표적화 도메인이 구성된다.
구현예에서, 이중 가닥 파손은 제2 gRNA 분자 및 제3 gRNA 분자에 의해 위치되는 2 개의 추가적인 단일 가닥 파손을 수반할 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥 파손이 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서, 예를 들어 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350개, 400 개, 450 개 또는 500 개의 뉴클레오타이드 내의 T 세포 표적 위치의 상류에 위치되도록 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인이 구성되고; 2 개의 단일 가닥 파손이 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서, 예를 들어 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350 개, 400 개, 450 개 또는 500 개의 뉴클레오타이드 내의 T 세포 표적 위치의 하류에 위치되도록 제2 gRNA 분자 및 제3 gRNA 분자의 표적화 도메인이 구성된다. 구현예에서, 절단 사건, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손이 각각의 gRNA 분자에 대해 독립적으로 위치되도록, 제1, 제2 및 제3 gRNA 분자의 표적화 도메인이 구성된다.
구현예에서, 제1 및 제2 단일 가닥 파손은 제3 gRNA 분자 및 제4 gRNA 분자에 의해 위치된 2 개의 추가적인 단일 가닥 파손을 수반할 수 있다. 예를 들어, 2 개의 단일 가닥 파손이 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서, 예를 들어 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350 개, 400 개, 450 개 또는 500 개의 뉴클레오타이드 내의 T 세포 표적 위치의 상류에 위치되도록 제1 및 제2 gRNA 분자의 표적화 도메인이 구성되며; 2 개의 단일 가닥 파손이 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서, 예를 들어 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350 개, 400 개, 450 개 또는 500 개의 뉴클레오타이드 내의 T 세포 표적 위치의 하류에 위치되도록 제3 및 제4 gRNA 분자의 표적화 도메인이 구성된다.
본 명세서에서 (1) 매우 근접한 2 개의 단일 가닥 파손, (2) 예를 들어 (예를 들어, DNA 조각을 제거하기 위한, 예를 들어 결실 돌연변이를 생성하기 위한) 위치에 측접하거나, 또는 유전자 내의, 예를 들어 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역 내의 하나 이상의 삽입결실을 생성하는 2 개의 이중 가닥 파손, (3) (예를 들어, DNA 조각을 제거하기 위해, 예를 들어 결실을 삽입하기 위한) 위치에 측접하는 하나의 이중 가닥 파손 및 2 개의 짝지어진 틈, 또는 (4) 4 개의 단일 가닥 파손, 즉 위치의 각각의 측면 상에서 2 개의 파손을 생성하기 위해 다중 gRNA가 사용될 때, 다중 gRNA는 동일한 T 세포 표적 위치를 표적화한다는 것이 상정된다. 추가로 본 명세서에서 다중 gRNA는 동일한 유전자 내의 하나 초과의 위치를 표적화하기 위해 사용될 수 있다는 것이 상정된다.
2 개 이상의 gRNA가 표적 핵산에서 2 개 이상의 절단 사건, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손을 위치시키기 위해 사용될 때, 2 개 이상의 절단 사건이 동일 또는 상이한 Cas9 단백질에 의해 생성될 수 있다는 것이 상정된다. 예를 들어, 2 개의 gRNA가 표적 핵산 내 2 개의 이중 가닥 파손을 위치시키기 위해 사용될 때, 단일 Cas9 뉴클레아제는 이중 가닥 파손을 둘 다 생성하는 데 사용될 수 있다. 2 개 이상의 gRNA가 표적 핵산 내 위치 2 개 이상의 단일 가닥 파손(또한 틈으로서 지칭됨)을 위치시키기 위해 사용될 때, 단일 Cas9 틈내기효소가 2 개 이상의 틈을 생성하는 데 사용될 수 있다. 2 개 이상의 gRNA가 표적 핵산 내 적어도 하나의 이중 가닥 파손 및 적어도 하나의 단일 가닥 파손을 위치시키기 위해 사용될 때, 2 개의 Cas9 단백질, 예를 들어 하나의 Cas9 뉴클레아제 및 하나의 Cas9 틈내기효소가 사용될 수 있다. 2 개 이상의 Cas9 단백질이 사용될 때, 2 개 이상의 Cas9 단백질이 표적 핵산 내 목적으로 하는 위치에서 단일 가닥 파손에 비한 이중 가닥 파손의 특이성을 제어하기 위해 순차적으로 전달될 수 있다는 것이 상정된다. 다른 구현예에서, 2 개 이상의 Cas9 단백질이 사용될 때, Cas9 단백질은 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 2 개 이상의 gRNA가 표적 핵산 내 적어도 하나의 이중 가닥 파손 및 적어도 하나의 단일 가닥 파손을 위치시키기 위해 사용될 때, 이중 가닥 파손을 생성하는 Cas9 뉴클레아제는 하나의 박테리아 종으로부터 유래될 수 있고, 단일 가닥 파손을 생성하는 Cas9 틈내기효소는 상이한 박테리아 종으로부터 유래될 수 있다.
하나 초과의 유전자가 세포 내 변경을 위해 표적화될 때, 표적화된 핵산은 변경될 수 있고, 예를 들어 하나 이상의 Cas9 단백질에 의해 절단될 수 있다. 예를 들어, 2 개의 유전자가 변경을 위해 표적화된다면, 예를 들어 유전자는 둘 다 넉아웃을 위해 표적화되고, 동일한 또는 상이한 Cas9 단백질은 각각의 유전자를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 유전자는 둘 다(또는 세포에서 표적화된 각각의 유전자) 이중 가닥 파손을 생성하기 위해 Cas9 뉴클레아제에 의해 절단된다. 다른 구현예에서, 유전자는 둘 다(또는 세포에서 표적화된 각각의 유전자) 이중 가닥 파손을 생성하기 위해 Cas9 뉴클레아제에 의해 절단된다. 다른 구현예에서, 세포 내의 하나 이상의 유전자는 Cas9 뉴클레아제에 의한 절단에 의해 변경될 수 있고, 동일한 세포 내의 하나 이상의 유전자는 Cas9 틈내기효소에 의한 절단에 의해 변경될 수 있다. 표적 핵산, 예를 들어 세포 내의 상이한 유전자를 절단하기 위해 2 개 이상의 Cas9 단백질이 사용될 때, Cas9 단백질은 상이한 박테리아 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 세포 내의 하나 이상의 유전자는 박테리아 종으로부터 유래된Cas9 단백질에 의한 절단에 의해 변경될 수 있고, 동일한 세포 내의 하나 이상의 유전자는 상이한 박테리아 종으로부터 유래된 Cas9 단백질에 의한 절단에 의해 변경될 수 있다. 상이한 종으로부터 유래된 2 개 이상의 Cas9 단백질이 사용될 때, 그들이 표적 핵산 내 목적으로 하는 위치에서 목적으로 하는 유전자 내 절단의 특이성을 제어하기 위해 동시에 전달되거나 또는 순차적으로 전달될 수 있다는 것이 상정된다.
일부 구현예에서, 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인 및 제2 gRNA 분자의 표적화 도메인은 표적 핵산 분자의 반대 가닥에 대해 상보적이다. 일부 구현예에서, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 PAM가 밖으로 배향되도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 표적 도메인에서 원치않는 표적 염색체 구성요소, 예컨대 반복체 구성요소, 예를 들어 Alu 반복체를 피하도록 구성된다. gRNA 분자는 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA 분자일 수 있다.
구현예에서, 뉴클레오타이드가 변경되지 않도록, gRNA 분자의 표적화 도메인은 사전선택되는 뉴클레오타이드, 예를 들어 암호 영역의 뉴클레오타이드로부터 충분히 떨어진 절단 사건을 위치시키도록 구성된다. 구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 엑손 서열 또는 원치않는 스플라이싱 사건의 변경을 피하기 위해 인트론/엑손 경계, 또는 천연 유래 스플라이스 신호로부터 충분히 떨어진 인트론 절단 사건을 위치시키도록 구성된다. gRNA 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA 분자일 수 있다.
다른 구현예에서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자의 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역 내의 위치는, 예를 들어 넉아웃을 위해 표적화된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 표 1A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 5A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 17A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31 또는 표 32 중 임의의 하나로부터의 표적화 도메인 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하거나 동일한 서열을 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표 1A 내지 I의 표적화 도메인으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GACUGACAUCAACUCCA(서열번호 8640);
GACUGCGUGCCCUGCCAAGA(서열번호 8641);
GAGGGCUCACCAGAGGUAGG(서열번호 8642);
GCGUGCCCUGCCAAGAA(서열번호 8643);
GCUAGGGACUGCACAGUCAA(서열번호 8644);
*GCUCACCAGAGGUAGGA(서열번호 8645);
GGACUGCACAGUCAAUG(서열번호 8646);
GGCUCACCAGAGGUAGG(서열번호 8647);
GUGACUGACAUCAACUCCAA(서열번호 8648);
GUGUAACAUACCUGGAGGAC(서열번호 8649);
GUUGAGACUCAGAACUUGGA(서열번호 8650); 또는
GUUUUGUGUAACAUACC(서열번호 8651).
구현예에서, 표적화 도메인은 표 3A 내지 H의 표적화 도메인으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GAACACCAGCCGGUCGG(서열번호 10760);
GAACACCAGCCGGUCGGAGG(서열번호 10761);
GAACCGUUGUUGACCUG(서열번호 10762);
GAAUGUGCAGCGGUGCU(서열번호 10763);
GACCGUAGCAUCCCUCC(서열번호 10764);
GAUGGCUCGGUGGGCAGCGA(서열번호 10765);
GCACCUCGCCCAGGUCG(서열번호 10766);
GCGGAUUCUGUAAGUGGGCU(서열번호 10767);
GCUCAUCGUAGCCCUCCCAC(서열번호 10768);
GCUCGGUGGGCAGCGAG(서열번호 10769);
GGAACCGUUGUUGACCUGAG(서열번호 10770);
GGACCGUAGCAUCCCUC(서열번호 10771);
GGCCCGGAGGGAUGCUA(서열번호 10772);
GGGCCUGAGGACCGCGU(서열번호 10773);
GGGUCAUGAUGGCUCGG(서열번호 10774);
GGUCAUGAUGGCUCGGU(서열번호 10775);
GGUCCAUGCUGUCCCCGACC(서열번호 10776);
GGUUCACAGUGUCCCAG(서열번호 10777);
GUCCAUGCUGUCCCCGACCU(서열번호 10778);
GUCCCAGUGGCGACCUGGAA(서열번호 10779);
GUCCCUUUCCAGGUCGCCAC(서열번호 10780);
GUGCAUCACAAACCUAC(서열번호 10781);
GUGCGGAUUCUGUAAGU(서열번호 10782); 또는
GUGUCCCAGUGGCGACC(서열번호 10783).
구현예에서, 표적화 도메인은 표 5A 내지 I의 표적화 도메인으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GGUGACAGUGCUUCGGC(서열번호 13286);
GUGCGGCAACCUACAUGAUG(서열번호 13287);
GCGGCAACCUACAUGAU(서열번호 13288);
GGCCACGUGCAUUGCUAGCA(서열번호 13289); 또는
GCUUUAUGGGAGCGGUGUUC(서열번호 13290).
구현예에서, 표적화 도메인은 표 7A 내지 H의 표적화 도메인으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GUCUGGGCGGUGCUACAACU(서열번호 563);
GCCCAGACGACUGGCCA(서열번호 564);
GCUCGUGGUGACCGAAG(서열번호 565);
GUGUCACACAACUGCCCAAC(서열번호 566);
GCGUGACUUCCACAUGAGCG(서열번호 567);
GCCCGGCGCAAUGACAG(서열번호 568);
GGUGACAGGUGCGGCCUCGG(서열번호 569);
GACAGGUGCGGCCUCGG(서열번호 570);
GUGGAAGUCACGCCCGU(서열번호 571);
GAAGCUCUCCGAUGUGU(서열번호 572); 또는
GUCACCACGAGCAGGGC(서열번호 573).
구현예에서, 표적화 도메인은 표 9A 내지 I의 표적화 도메인으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GGGTATTATTGATGCTATTC(서열번호 6119);
GATCTGCGGCAGCTTGCTTA(서열번호 6120);
GCAGGACCGTGGAGAAGACT(서열번호 6121);
GGATTTCCTCCTCGACCACC(서열번호 6122);
GATTTCCTCCTCGACCACCA(서열번호 6123);
GTACTCATTCTCACTGAGTT(서열번호 6124);
GTATGAAGAACAGTCAC(서열번호 6125); 또는
GCGGCAGCTTGCTTAGG(서열번호 6126).
구현예에서, 표적화 도메인은 표 11A 내지 I의 표적화 도메인으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GGUUUCACCGAGACCUCAGU(서열번호 3749);
GGGAUCAGGUGACCCAUAUU(서열번호 3750);
GUUUGCGACUCUGACAGAGC(서열번호 3751);
GAGUACUACACUCAGCAGCA(서열번호 3752);
GUGGGAUCGGAGCAGUUCAG(서열번호 3753);
GUCACCCUGGUUCUUGCGAC(서열번호 3754);
GGACACCUCGGCCCUUGAGC(서열번호 3755);
GCCCAGUCGCAAGAACC(서열번호 3756);
GUCCUGCAGGACCGCGA(서열번호 3757);
GAAAGCACGAAGUCUCC(서열번호 3758);
GGAUCGGAGCAGUUCAG(서열번호 3759);
GAUCGGAGCAGUUCAGC(서열번호 3760);
GGAUGAUGGUGCCGUCG(서열번호 3761); 또는
GUUCUGGAUCCGAAUAU(서열번호 3762).
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉아웃 위치가 FAS 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역일 때, 그리고 하나 초과의 gRNA가 파손, 예를 들어 2 개의 단일 가닥 파손 또는 2 개의 이중 가닥 파손, 또는 단일 가닥과 이중 가닥 파손의 조합을 위치시키기 위해, 예를 들어 하나 이상의 삽입결실을 생성하기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 1A 내지 F 또는 표 13A 내지 K 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉아웃 위치가 BID 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역일 때, 그리고 하나 초과의 gRNA가 파손, 예를 들어 2 개의 단일 가닥 파손 또는 2 개의 이중 가닥 파손, 또는 단일 가닥과 이중 가닥 파손의 조합을 위치시키기 위해, 예를 들어 하나 이상의 삽입결실을 생성하기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 3A 내지 H 또는 표 15A 내지 F 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉아웃 위치가 CTLA4 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역일 때, 그리고 하나 초과의 gRNA가 파손, 예를 들어 2 개의 단일 가닥 파손 또는 2 개의 이중 가닥 파손, 또는 단일 가닥과 이중 가닥 파손의 조합을 위치시키기 위해, 예를 들어 하나 이상의 삽입결실을 생성하기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 5A 내지 I 또는 표 17A 내지 K 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉아웃 위치가 PDCD1 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역일 때, 그리고 하나 초과의 gRNA가 파손, 예를 들어 2 개의 단일 가닥 파손 또는 2 개의 이중 가닥 파손, 또는 단일 가닥과 이중 가닥 파손의 조합을 위치시키기 위해, 예를 들어 하나 이상의 삽입결실을 생성하기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 7A 내지 H, 표 19A 내지 J, 표 31 또는 표 32 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GGUGCUACAACUGGGCUGGCGGC(서열번호 481);
GUGCUACAACUGGGCUGGCGGC(서열번호 482);
GCUACAACUGGGCUGGCGGC(서열번호 483);
GACGACUGGCCAGGGCGCCUG(서열번호 484);
GACUGGCCAGGGCGCCUG(서열번호 485);
GCAUGCCUGGAGCAGCCCCAC(서열번호 486);
GGGGGGUUCCAGGGCCUGUCUG(서열번호 487);
GGGGGUUCCAGGGCCUGUCUG(서열번호 488);
GGGGUUCCAGGGCCUGUCUG(서열번호 489);
GAGAGCCUGCGGGCAGAGCU(서열번호 490);
GAGCCUGCGGGCAGAGCU(서열번호 491);
GGGGGGGUUCCAGGGCCUGUCUG(서열번호 492);
*GCAGGGCUGGGGAGAAGGUGG(서열번호 493);
GGGCUGGGGAGAAGGUGG(서열번호 494);
GAGCAGGGCUGGGGAGAAGGUGG(서열번호 495);
GGCCGCCCACGACACCAACCAC(서열번호 496);
GCCGCCCACGACACCAACCAC(서열번호 497);
GCCCACGACACCAACCAC(서열번호 498);
GGUUUGGAACUGGCCGGCUGGC(서열번호 499);
GUUUGGAACUGGCCGGCUGGC(서열번호 500);
GGGCAGCCUGGUGCUGCUAGU(서열번호 501);
GGCAGCCUGGUGCUGCUAGU(서열번호 502);
GCAGCCUGGUGCUGCUAGU(서열번호 503);
GGCUGGCCUGGGUGAGGGGC(서열번호 504);
GGGUUUGGAACUGGCCGGCUGGC(서열번호 505);
GCUGGGCAGCCUGGUGCUGCUAGU(서열번호 506);
GGCCGGCUGGCCUGGGUGAGGGGC(서열번호 507);
GUCUGGGCGGUGCUACAACU(서열번호 508);
GGCGCCCUGGCCAGUCGUCU(서열번호 509);
GGGCGGUGCUACAACUGGGC(서열번호 510);
GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(서열번호 511);
GGAUGGUUCUUAGGUAGGUG(서열번호 512);
GAAGGCGGCACUCUGGU(서열번호 513);
GCCCUGGCCAGUCGUCU(서열번호 514);
GCCCAGACGACUGGCCA(서열번호 515);
GAUGGUUCUUAGGUAGG(서열번호 516);
GGCGGAGGUGAGCGGAA(서열번호 517);
GGAAGGGAAACUGUCCC(서열번호 518);
GCGUGACUUCCACAUGAGCG(서열번호 519);
*GCCCUGCUCGUGGUGACCGA(서열번호 520);
GGUGCCGCUGUCAUUGCGCC(서열번호 521);
GCUCUCUUUGAUCUGCGCCU(서열번호 522);
GAAGGUGGCGUUGUCCCCUU(서열번호 523);
GUGUCACACAACUGCCCAAC(서열번호 524);
GCUUGUCCGUCUGGUUGCUG(서열번호 525);
GAUCUGCGCCUUGGGGGCCA(서열번호 526);
GGGCCCUGACCACGCUCAUG(서열번호 527);
GCAGUUGUGUGACACGGAAG(서열번호 528);
GACAGCGGCACCUACCUCUG(서열번호 529);
GUGGAAGUCACGCCCGU(서열번호 530);
GCUCGUGGUGACCGAAG(서열번호 531);
GCCCGGCGCAAUGACAG(서열번호 532);
GCCGCUGUCAUUGCGCC(서열번호 533);
GCGGCACCUACCUCUGU(서열번호 534);
GGUGGCGUUGUCCCCUU(서열번호 535);
GAAGCUCUCCGAUGUGU(서열번호 536);
GUUGUGUGACACGGAAG(서열번호 537);
GCUGGCUGCGGUCCUCG(서열번호 538);
GCUGCGGUCCUCGGGGA(서열번호 539);
GACGUUACCUCGUGCGGCCC(서열번호 540);
GGUGUCGUGGGCGGCCUGCU(서열번호 541);
GCCCACGACACCAACCACCA(서열번호 542);
GCAGCCUGGUGCUGCUAGUC(서열번호 543);
GGUGCUGCUAGUCUGGGUCC(서열번호 544);
GGACCCAGACUAGCAGCACC(서열번호 545);
GGCACUUCUGCCCUUCUCUC(서열번호 546);
GGGCGGCCUGCUGGGCAGCC(서열번호 547);
GCAGCACCAGGCUGCCCAGC(서열번호 548);
GCUGGCCUGGGUGAGGGGCU(서열번호 549);
GUUACCUCGUGCGGCCC(서열번호 550);
*GUCGUGGGCGGCCUGCU(서열번호 551);
GUUUGGAACUGGCCGGC(서열번호 552);
GGCCGUCAUCUGCUCCC(서열번호 553);
GCUGCUAGUCUGGGUCC(서열번호 554); 또는
GCCUGGUGCUGCUAGUC(서열번호 555).
게다가, 다른 구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉아웃 위치가, 예를 들어 하나 이상의 삽입결실을 생성하기 위해, PDCD1 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역일 때, 각각의 가이드 RNA는 표 7A 내지 H, 표 19A 내지 J, 표 31 또는 표 32 중 하나로부터 독립적으로 선택되고, 따라서 파손은 10% 초과의 효율로 생성된다.
구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GCAUGCCUGGAGCAGCCCCAC(서열번호 486);
GGGGGUUCCAGGGCCUGUCUG(서열번호 488);
GCAGGGCUGGGGAGAAGGUGG(서열번호 493);
GGGCUGGGGAGAAGGUGG(서열번호 494);
GCCGCCCACGACACCAACCAC(서열번호 497);
GCCCACGACACCAACCAC(서열번호 498);
GUUUGGAACUGGCCGGCUGGC(서열번호 500);
GUCUGGGCGGUGCUACAACU(서열번호 508);
GGCGCCCUGGCCAGUCGUCU(서열번호 509);
GGCCAGGAUGGUUCUUAGGU(서열번호 511);
GGAUGGUUCUUAGGUAGGUG(서열번호 512);
GAAGGCGGCACUCUGGU(서열번호 513);
GCCCAGACGACUGGCCA(서열번호 515);
GGCGGAGGUGAGCGGAA(서열번호 517);
GCCCUGCUCGUGGUGACCGA(서열번호 520):
GCUCUCUUUGAUCUGCGCCU(서열번호 522);
GAAGGUGGCGUUGUCCCCUU(서열번호 523);
GCUUGUCCGUCUGGUUGCUG(서열번호 525);
GAUCUGCGCCUUGGGGGCCA(서열번호 526);
GGGCCCUGACCACGCUCAUG(서열번호 527);
GCAGUUGUGUGACACGGAAG(서열번호 528);
GACAGCGGCACCUACCUCUG(서열번호 529);
GCCGCUGUCAUUGCGCC(서열번호 533);
GGUGGCGUUGUCCCCUU(서열번호 535);
GAAGCUCUCCGAUGUGU(서열번호 536);
GUUGUGUGACACGGAAG(서열번호 537);
GCUGGCUGCGGUCCUCG(서열번호 538);
GCUGCGGUCCUCGGGGA(서열번호 539);
GACGUUACCUCGUGCGGCCC(서열번호 540);
GGUGCUGCUAGUCUGGGUCC(서열번호 544);
GGACCCAGACUAGCAGCACC(서열번호 545); 또는
GGCACUUCUGCCCUUCUCUC(서열번호 546).
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉아웃 위치가 CBLB 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역일 때, 그리고 하나 초과의 gRNA가 파손, 예를 들어 2 개의 단일 가닥 파손 또는 2 개의 이중 가닥 파손, 또는 단일 가닥과 이중 가닥 파손의 조합을 위치시키기 위해, 예를 들어 하나 이상의 삽입결실을 생성하기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 9A 내지 I 또는 표 21A 내지 K 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉아웃 위치가 PTPN6 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역일 때, 그리고 하나 초과의 gRNA가 파손, 예를 들어 2 개의 단일 가닥 파손 또는 2 개의 이중 가닥 파손, 또는 단일 가닥과 이중 가닥 파손의 조합을 위치시키기 위해, 예를 들어 하나 이상의 삽입결실을 생성하기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 11A 내지 I 또는 표 23A 내지 J 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉아웃 위치가 TRAC 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역일 때, 그리고 하나 초과의 gRNA가 파손, 예를 들어 2 개의 단일 가닥 파손 또는 2 개의 이중 가닥 파손, 또는 단일 가닥과 이중 가닥 파손의 조합을 위치시키기 위해, 예를 들어 하나 이상의 삽입결실을 생성하기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 25A 내지 G 또는 표 29 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
UCUCUCAGCUGGUACACGGC(서열번호 449);
UGGAUUUAGAGUCUCUCAGC(서열번호 450);
ACACGGCAGGGUCAGGGUUC(서열번호 451);
GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU(서열번호 452);
GCUGGUACACGGCAGGGUCA(서열번호 453);
CUCAGCUGGUACACGGC(서열번호 454);
UGGUACACGGCAGGGUC(서열번호 455);
GCUAGACAUGAGGUCUA(서열번호 456);
GUCAGAUUUGUUGCUCC(서열번호 457);
UCAGCUGGUACACGGCA(서열번호 458);
GCAGACAGACUUGUCAC(서열번호 459);
GGUACACGGCAGGGUCA(서열번호 460);
CUUCAAGAGCAACAGUGCUG(서열번호 461);
AGAGCAACAGUGCUGUGGCC(서열번호 462);
AAAGUCAGAUUUGUUGCUCC(서열번호 463);
ACAAAACUGUGCUAGACAUG(서열번호 464);
AAACUGUGCUAGACAUG(서열번호 465);
UGUGCUAGACAUGAGGUCUA(서열번호 466);
GGCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC(서열번호 467);
GCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC(서열번호 468);
GGGGAAGAAGGUGUCUUC(서열번호 469);
GUUUUGUCUGUGAUAUACACAU(서열번호 470);
GGCAGACAGACUUGUCACUGGAUU(서열번호 471);
GCAGACAGACUUGUCACUGGAUU
(서열번호 472);
GACAGACUUGUCACUGGAUU(서열번호 473);
GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(서열번호 474);
GAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(서열번호 475);
GAGUCUCUCAGCUGGUACACGG(서열번호 476);
GUCUCUCAGCUGGUACACGG(서열번호 477); 또는
GGUACACGGCAGGGUCAGGGUU(서열번호 478).
다른 구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉아웃 위치가 TRAC 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역일 때, 그리고 하나 초과의 gRNA가 파손, 예를 들어 2 개의 단일 가닥 파손 또는 2 개의 이중 가닥 파손, 또는 단일 가닥과 이중 가닥 파손의 조합을 위치시키기 위해, 예를 들어 하나 이상의 삽입결실을 생성하기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 25A 내지 G 또는 표 29 중 하나로부터 독립적으로 선택되고, 따라서 파손은 10% 초과의 효율로 생성된다.
구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GGCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC(서열번호 467);
GCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC(서열번호 468);
GUUUUGUCUGUGAUAUACACAU(서열번호 470);
GGCAGACAGACUUGUCACUGGAUU(서열번호 471);
GCAGACAGACUUGUCACUGGAUU(서열번호 472);
GACAGACUUGUCACUGGAUU(서열번호 473);
GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(서열번호 474);
GAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(서열번호 475);
GAGUCUCUCAGCUGGUACACGG(서열번호 476);
GUCUCUCAGCUGGUACACGG(서열번호 477);
GGUACACGGCAGGGUCAGGGUU(서열번호 478);
GUACACGGCAGGGUCAGGGUU(서열번호 49451);
GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU(서열번호 452);
GCUAGACAUGAGGUCUA(서열번호 456);
GCAGACAGACUUGUCAC(서열번호 459);
GGUACACGGCAGGGUCA(서열번호 460);
CUUCAAGAGCAACAGUGCUG(서열번호 461);
AGAGCAACAGUGCUGUGGCC(서열번호 462);
ACAAAACUGUGCUAGACAUG(서열번호 464);
AAACUGUGCUAGACAUG(서열번호 465); 또는
UGUGCUAGACAUGAGGUCUA(서열번호 466).
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉아웃 위치가 TRBC 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역일 때, 그리고 하나 초과의 gRNA가 파손, 예를 들어 2 개의 단일 가닥 파손 또는 2 개의 이중 가닥 파손, 또는 단일 가닥과 이중 가닥 파손의 조합을 위치시키기 위해, 예를 들어 하나 이상의 삽입결실을 생성하기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 26A 내지 G 또는 표 27 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
CACCCAGAUCGUCAGCGCCG(서열번호 387);
CAAACACAGCGACCUCGGGU(서열번호 388);
UGACGAGUGGACCCAGGAUA(서열번호 389);
GGCUCUCGGAGAAUGACGAG(서열번호 390);
GGCCUCGGCGCUGACGAUCU(서열번호 391);
GAAAAACGUGUUCCCACCCG(서열번호 392);
AUGACGAGUGGACCCAGGAU(서열번호 393);
AGUCCAGUUCUACGGGCUCU(서열번호 394);
CGCUGUCAAGUCCAGUUCUA(서열번호 395);
AUCGUCAGCGCCGAGGCCUG(서열번호 396);
UCAAACACAGCGACCUCGGG(서열번호 397);
CGUAGAACUGGACUUGACAG(서열번호 398);
AGGCCUCGGCGCUGACGAUC(서열번호 399);
UGACAGCGGAAGUGGUUGCG(서열번호 400);
UUGACAGCGGAAGUGGUUGC(서열번호 401);
UCUCCGAGAGCCCGUAGAAC(서열번호 402);
CGGGUGGGAACACGUUUUUC(서열번호 403);
GACAGGUUUGGCCCUAUCCU(서열번호 404);
GAUCGUCAGCGCCGAGGCCU(서열번호 405);
GGCUCAAACACAGCGACCUC(서열번호 406);
UGAGGGUCUCGGCCACCUUC(서열번호 407);
AGGCUUCUACCCCGACCACG(서열번호 408);
CCGACCACGUGGAGCUGAGC(서열번호 409);
UGACAGGUUUGGCCCUAUCC(서열번호 410);
CUUGACAGCGGAAGUGGUUG(서열번호 411);
AGAUCGUCAGCGCCGAGGCC(서열번호 412);
GCGCUGACGAUCUGGGUGAC(서열번호 413);
UGAGGGCGGGCUGCUCCUUG(서열번호 414);
GUUGCGGGGGUUCUGCCAGA(서열번호 415);
AGCUCAGCUCCACGUGGUCG(서열번호 416);
GCGGCUGCUCAGGCAGUAUC(서열번호 417);
GCGGGGGUUCUGCCAGAAGG(서열번호 418);
UGGCUCAAACACAGCGACCU(서열번호 419);
ACUGGACUUGACAGCGGAAG(서열번호 420);
GACAGCGGAAGUGGUUGCGG(서열번호 421);
GCUGUCAAGUCCAGUUCUAC(서열번호 422);
GUAUCUGGAGUCAUUGAGGG(서열번호 423);
CUCGGCGCUGACGAUCU(서열번호 424);
CCUCGGCGCUGACGAUC(서열번호 425);
CCGAGAGCCCGUAGAAC(서열번호 426);
CCAGAUCGUCAGCGCCG(서열번호 427);
GAAUGACGAGUGGACCC(서열번호 428);
GGGUGACAGGUUUGGCCCUAUC(서열번호 429);
GGUGACAGGUUUGGCCCUAUC(서열번호 430);
GUGACAGGUUUGGCCCUAUC(서열번호 431);
GACAGGUUUGGCCCUAUC(서열번호 432);
GAUACUGCCUGAGCAGCCGCCU(서열번호 433);
GACCACGUGGAGCUGAGCUGGUGG(서열번호 434);
GUGGAGCUGAGCUGGUGG(서열번호 435);
GGGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열번호 436);
GGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열번호 437);
GCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열번호 438);
GGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열번호 439);
GGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열번호 440);
GCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열번호 441);
GGUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG(서열번호 442);
GUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG(서열번호 443); 또는
GAAUGGGAAGGAGGUGCACAG(서열번호 444).
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉아웃 위치가 TRBC 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역일 때, 그리고 하나 초과의 gRNA가 파손, 예를 들어 2 개의 단일 가닥 파손 또는 2 개의 이중 가닥 파손, 또는 단일 가닥과 이중 가닥 파손의 조합을 위치시키기 위해, 예를 들어 하나 이상의 삽입결실을 생성하기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 26A 내지 G 또는 표 27 중 하나로부터 독립적으로 선택되고, 따라서 파손은 10% 초과의 효율로 생성된다.
구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GGGUGACAGGUUUGGCCCUAUC(서열번호 429);
GGUGACAGGUUUGGCCCUAUC(서열번호 430);
GUGACAGGUUUGGCCCUAUC(서열번호 431);
GAUACUGCCUGAGCAGCCGCCU(서열번호 433);
GACCACGUGGAGCUGAGCUGGUGG(서열번호 434);
GGGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열번호 436);
GGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열번호 437);
GCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열번호 438);
GGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열번호 439);
GGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열번호 440);
GCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열번호 441);
GGUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG(서열번호 442);
GUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG(서열번호 443);
GAAUGGGAAGGAGGUGCACAG(서열번호 444).
UGACGAGUGGACCCAGGAUA(서열번호 389);
GGCUCUCGGAGAAUGACGAG(서열번호 390);
AGGCUUCUACCCCGACCACG(서열번호 408);
UGAGGGCGGGCUGCUCCUUG(서열번호 414); 또는
GACAGCGGAAGUGGUUGCGG(서열번호 421).
구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 또는 PTPN6 유전자의 발현을 감소시키거나,줄이거나 또는 억제하기 위해 T 세포 넉다운 표적 위치에 충분히 가깝게 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9 융합 단백질(예를 들어, 전사 리프레서 도메인에 융합된 eiCas9)을 표적화하도록 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 전사 개시, 하나 이상의 전사 인핸서 또는 활성체, 및/또는 RNA 중합효소의 결합을 차단하기 위해 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 프로모터 영역을 표적화하도록 구성된다. 하나 이상의 gRNA는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 프로모터 영역에 eiCas9를 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
구현예에서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 프로모터 영역이, 예를 들어 넉다운을 위해 표적화될 때, 표적화 도메인은 표 2A 내지 I, 표 4A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 8A 내지 H, 표 10A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 14A 내지 K, 표 16A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 20A 내지 J, 표 22A 내지 K 또는 표 24A 내지 K 중 임의의 하나로부터의 표적화 도메인 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하거나 동일한 서열을 포함할 수 있다. 구현예에서, 표적화 도메인은 표 2A 내지 I의 표적화 도메인으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GAAGCGGUUUACGAGUGACU(서열번호 9236);
GUUGGUGGACCCGCUCAGUA(서열번호 9237);
GGACCCGCUCAGUACGGAGU(서열번호 9238);
GACCCGCUCAGUACGGAGUU(서열번호 9239);
GGGAAGCUCUUUCACUUCGG(서열번호 9240);
GGAUUGCUCAACAACCAUGC(서열번호 9241);
GGCUUACCCCGUCUUAGUCC(서열번호 9242);
GCUUACCCCGUCUUAGUCCC(서열번호 9243);
GUCCCGGGGAUAGGCAAAGU(서열번호 9244);
GCGGGACGCGUGCGGGAUUG(서열번호 9245);
GCCUAUCCCCGGGACUAAGA(서열번호 9246);
GACGGGGUAAGCCUCCACCC(서열번호 9247);
GAGCGGGUCCACCAACCCGC(서열번호 9248);
GACGAGCUCACGAAAAGCCC(서열번호 9249);
GAGCUCACGAAAAGCCCCGG(서열번호 9250);
GAAAAGCCCCGGUGGUCAGG(서열번호 9251);
GCUCCAUUGAUUCAGCAACU(서열번호 9252);
GUCAGGGUUCGUUGCACAAA(서열번호 9253);
GUCCCGGGGCGUUCCUGCAG(서열번호 9254);
GUGGCUGGCAUGCUCACUUC(서열번호 9255);
GCUUCUGCUGUAGUUCAACC(서열번호 9256);
GUAGUUCAACCUGGGAAGUU(서열번호 9257);
GACUUGCGGGGCAUUUGACU(서열번호 9258);
GAGAGGCUCACAGACGUUUC(서열번호 9259);
GCGCCAUAGGGCUCUGAAAA(서열번호 9260);
GCUGGGGCUAUGCGAUU(서열번호 9261);
GCGCAAGAGUGACACAC(서열번호 9262);
GUGUUCAAAGACGCUUC(서열번호 9263);
GCGGUUUACGAGUGACU(서열번호 9264);
GGUGGACCCGCUCAGUA(서열번호 9265);
GGGAAGCUCUUUCACUU(서열번호 9266);
GUCUUAGUCCCGGGGAU(서열번호 9267);
GGAUAGGCAAAGUGGGG(서열번호 9268);
GGACGCGUGCGGGAUUG(서열번호 9269);
GGCGCACGCGGGCACCU(서열번호 9270);
GGGGUAAGCCUCCACCC(서열번호 9271);
GCGGGUCCACCAACCCG(서열번호 9272);
GAGCUCACGAAAAGCCC(서열번호 9273);
GAAAAGCCCCGGUGGUC(서열번호 9274);
GCAACUUGGCCUGCGCG(서열번호 9275);
GGGUUCGUUGCACAAAU(서열번호 9276);
GCUGGCAUGCUCACUUC(서열번호 9277);
GUUCAACCUGGGAAGUU(서열번호 9278); 또는
GCCAUAGGGCUCUGAAA(서열번호 9279).
구현예에서, 표적화 도메인은 표 4A 내지 I의 표적화 도메인으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GAAAACCCGCGGGCCUGGCC(서열번호 11440);
GAAAGACCACGGUGUGGGCG(서열번호 11441);
GAAGCGCGCGGGGCGCCAUA(서열번호 11442);
GAAUGACCCCAGGGGACCCU(서열번호 11443);
GACUACCCGCUUCCUCCUUA(서열번호 11444);
GAGGAGAAAACCCGCGGGCC(서열번호 11445);
GAGGGUCGGGUCCGCCUCGG(서열번호 11446);
GCGCGCGGGGCGCCAUAAGG(서열번호 11447);
GCGGAUUCUGUAAGUGGGCU(서열번호 11448);
GCGGGAGAGACCCGGCCCUC(서열번호 11449);
GCUCCUCCCGAGCGGAGCUC(서열번호 11450);
GCUCGGCGCGUACCCCGGGA(서열번호 11451);
GCUGAGGGUCGGGUCCGCCU(서열번호 11452);
GGAUUCCGAUCCGCCGGCAA(서열번호 11453);
GGCCACCCUUGCCGGCGGAU(서열번호 11454);
GGCUCGGCGCGUACCCCGGG(서열번호 11455);
GGGAUUCCGAUCCGCCGGCA(서열번호 11456);
GGGCGCCAUAAGGAGGAAGC(서열번호 11457);
GGGCGGGGAUUCCGAUCCGC(서열번호 11458);
GGUCAGAGCGGCCGCUUACU(서열번호 11459);
GGUCGGGUCCGCCUCGGAGG(서열번호 11460);
GUCAGAGCGGCCGCUUACUG(서열번호 11461);
GUCGACCGUGUCCGCGCGCC(서열번호 11462);
GUCGGGUCCGCCUCGGAGGC(서열번호 11463);
GUCUCCCAGGCGCGCGGACA(서열번호 11464);
GUGCAGGCCACCCUUGCCGG(서열번호 11465);
GAAUGUGCAGCGGUGCU(서열번호 11466);
GACCGUGUCCGCGCGCC(서열번호 11467);
GAGAAAACCCGCGGGCC(서열번호 11468);
GAGGGUCGGGUCCGCCU(서열번호 11469);
GAUUCUGUAAGUGGGCU(서열번호 11470);
GCAGGUGUCUGCGGUGC(서열번호 11471);
GCCGGUCCAGCCGCAGA(서열번호 11472);
GCGCGCGGGGCGCCAUA(서열번호 11473);
GCUCGGGAGGAGCCGGC(서열번호 11474);
GGAGAGACCCGGCCCUC(서열번호 11475);
GGAGAGGAGAAAACCCG(서열번호 11476);
GGAUUCUGUAAGUGGGC(서열번호 11477);
GGCUCGGCGCGUACCCC(서열번호 11478);
GGGCGAGCCCCAGUAAG(서열번호 11479);
GGGCUCGGCGCGUACCC(서열번호 11480);
GGGUCCGCCUCGGAGGC(서열번호 11481);
GGGUUUUCUCCUCUCCG(서열번호 11482);
GGUCAUGAUGGCUCGGU(서열번호 11483);
GGUCCGCCUCGGAGGCG(서열번호 11484);
GGUCGGGUCCGCCUCGG(서열번호 11485); 또는
GUGCGGAUUCUGUAAGU(서열번호 11486).
구현예에서, 표적화 도메인은 표 6A 내지 I의 표적화 도메인으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GCUCAGAACAGAGCGCC(서열번호 13746);
GAGCGCCAGGUAUUUAGUAG(서열번호 13747);
GCGCCAGGUAUUUAGUA(서열번호 13748);
GCUUUAUGGGAGCGGUGUUC(서열번호 13749);
GGAGCGGUGUUCAGGUCUUC(서열번호 13750);
GCGGUGUUCAGGUCUUC(서열번호 13751); 또는
UUAUGGGAGCGGUGUUC(서열번호 13752).
구현예에서, 표적화 도메인은 표 8A 내지 H의 표적화 도메인으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GCCCCAAGGACCGGCUGAGA(서열번호 1517);
GUCUGGGCGGUGCUACAACU(서열번호 1518);
GGGCGGUGCUACAACUGGGC(서열번호 1519);
GCGUGUUUCUGUAGAAUGAC(서열번호 1520);
GCCCAGACGACUGGCCA(서열번호 1521);
GGGCAGCUCGAACUCCU(서열번호 1522); 또는
GGGCGGGAUAUGGAAAG(서열번호 1523).
구현예에서, 표적화 도메인은 표 10A 내지 I의 표적화 도메인으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GAAAGTGAAGTTTCTGCGTA(서열번호 7635);
GATAGGACCTTCAGTTGTTC(서열번호 7636);
GGTTTTGCTCTAATCGATGG(서열번호 7637);
GGGTATTATTGATGCTATTC(서열번호 7638);
GCAGGACCGTGGAGAAGACT(서열번호 7639);
GTGTATGGCCATAGAATGCT(서열번호 7640);
GATCTGCGGCAGCTTGCTTA(서열번호 7641);
GGATTTCCTCCTCGACCACC(서열번호 7642);
GATTTCCTCCTCGACCACCA(서열번호 7643);
GCTCACGTTTCAAGTAGCTA(서열번호 7644);
GAAGGTCCTATCATACATTT(서열번호 7645);
GATGAATCCGGAACTTT(서열번호 7646);
GGTTTTGCTCTAATCGA(서열번호 7647);
GGAGGAAATCCCCGAAA(서열번호 7648);
GGACCGTGGAGAAGACT(서열번호 7649);
GCGGCAGCTTGCTTAGG(서열번호 7650); 또는
GGTCCTATCATACATTT(서열번호 7651).
구현예에서, 표적화 도메인은 표 12A 내지 I의 표적화 도메인으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 하기와 같다:
GGCCCUUUGGUUUCCGCCUA(서열번호 4701);
GGGUAAGUCCCGGGCACCAU(서열번호 4702);
GGUAAGUCCCGGGCACCAUC(서열번호 4703);
GCCUGCUGUACUCCCGCUUU(서열번호 4704);
GGGGGAAACCUCUCCGUAGG(서열번호 4705);
GGUCCUCACACCUUGCGGGA(서열번호 4706);
GGCGGAAACCAAAGGGCCUA(서열번호 4707);
GGACGUGGGAGGGCCUUCGC(서열번호 4708);
GCACUCACGUUCACACACGU(서열번호 4709);
GUCCUCACACCUUGCGGGAA(서열번호 4710);
GGUUUCCGCCUACGGAG(서열번호 4711);
GUCCCGUGGGUAAGUCC(서열번호 4712);
GGAAACCUCUCCGUAGG(서열번호 4713);
GACCGGAAACAGGCGCA(서열번호 4714);
GGGGGAAACCUCUCCGU(서열번호 4715); 또는
GGACCGGAAACAGGCGC(서열번호 4716.
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉다운 위치가 FAS 프로모터 영역일 때 그리고 하나 초과의 gRNA가 eiCas9 또는 eiCas9-융합 단백질(예를 들어, eiCas9-전사 리프레서 도메인 융합 단백질)을 위치시키기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 2A 내지 I 또는 표 14A 내지 K 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉다운 위치가 BID 프로모터 영역일 때 그리고 하나 초과의 gRNA가 eiCas9 또는 eiCas9-융합 단백질(예를 들어, eiCas9-전사 리프레서 도메인 융합 단백질)을 위치시키기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 4A 내지 I 또는 표 16A 내지 K 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉다운 위치가 CTLA4 프로모터 영역일 때 그리고 하나 초과의 gRNA가 eiCas9 또는 eiCas9-융합 단백질(예를 들어, eiCas9-전사 리프레서 도메인 융합 단백질)을 위치시키기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 6A 내지 I 또는 표 18A 내지 K 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉다운 위치가 PDCD1 프로모터 영역일 때 그리고 하나 초과의 gRNA가 eiCas9 또는 eiCas9-융합 단백질(예를 들어, eiCas9-전사 리프레서 도메인 융합 단백질)을 위치시키기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 8A 내지 H 또는 표 20A 내지 J 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉다운 위치가 CBLB 프로모터 영역일 때 그리고 하나 초과의 gRNA가 eiCas9 또는 eiCas9-융합 단백질(예를 들어, eiCas9-전사 리프레서 도메인 융합 단백질)을 위치시키기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 10A 내지 I 또는 표 22A 내지 K 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, 표적 핵산 서열에서, T 세포 표적 넉다운 위치가 PTPD6 프로모터 영역일 때 그리고 하나 초과의 gRNA가 eiCas9 또는 eiCas9-융합 단백질(예를 들어, eiCas9-전사 리프레서 도메인 융합 단백질)을 위치시키기 위해 사용될 때, 각각의 가이드 RNA는 표 12A 내지 I 또는 표 24A 내지 K 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, gRNA, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자와 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 모듈 gRNA이다. 다른 구현예에서, gRNA는 단분자 또는 키메라 gRNA이다.
구현예에서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자와 상보성인 표적화 도메인은 길이로 16 개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자로부터의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인은 길이로 16 개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA는 5'으로부터 3'까지, 표적화 도메인( "코어 도메인", 및 선택적으로 "2차 도메인"을 포함함); 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 단일 도메인으로서 함께 취해진다.
구현예에서, 표적화 도메인은 16 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 17 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 18 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 19 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 20 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 21 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 22 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 23 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 24 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 25 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 26 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA은 5'으로부터 3'까지, 표적화 도메인("코어 도메인", 및 선택적으로 "2차 도메인"을 포함함); 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 단일 도메인으로서 함께 취해진다.
구현예에서, gRNA는 길이로 25 개 이하의 연결 도메인; 함께 취해지며, 길이로 적어도 20 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 포함한다.
다른 구현예에서, gRNA는 길이로 25 개 이하의 연결 도메인; 함께 취해지며, 길이로 적어도 30 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 포함한다.
다른 구현예에서, gRNA는 길이로 25 개 이하의 연결 도메인; 함께 취해지며, 길이로 적어도 35 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 포함한다.
다른 구현예에서, gRNA는 길이로 25 개 이하의 연결 도메인; 함께 취해지며, 길이로 적어도 40 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 포함한다.
절단 사건, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은 Cas9 분자에 의해 생성된다. Cas9 분자는 효소적으로 활성인 Cas9(eaCas9) 분자일 수 있고, 예를 들어 표적 핵산 또는 eaCas9 분자에서 이중 가닥 파손을 형성하는 eaCas9 분자는 표적 핵산에서 단일 가닥 파손을 형성한다(예를 들어, 틈내기효소 분자). 대안적으로, 일부 구현예에서, Cas9 분자는 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 분자 또는 변형된 eiCas9 분자일 수 있으며, 예를 들어 eiCas9 분자는 크루펠-연관 박스(Kruppel-associated box: KRAB)에 융합되어 eiCas9-KRAB 융합 단백질 분자를 생성된다.
구현예에서, eaCas9 분자는 이중 가닥 파손을 촉진한다.
일부 구현예에서, eaCas9 분자는 HNH-유사 도메인 절단 활성을 포함하지만, N-말단 RuvC-유사 도메인 절단 활성이 전혀 없거나 상당하지 않다. 이 경우에, eaCas9 분자는 HNH-유사 도메인 틈내기효소이며, 예를 들어 eaCas9 분자는 D10에서 돌연변이, 예를 들어 D10A를 포함한다. 다른 구현예에서, eaCas9 분자는 N-말단 RuvC-유사 도메인 절단 활성을 포함하지만, HNH-유사 도메인 절단 활성이 전혀 없거나 상당하지 않다. 구현예에서, eaCas9 분자는 N-말단 RuvC-유사 도메인 틈내기효소이고, 예를 들어 eaCas9 분자는 H840에서 돌연변이, 예를 들어 H840A를 포함한다. 구현예에서, eaCas9 분자는 N-말단 RuvC-유사 도메인 틈내기효소이고, 예를 들어 eaCas9 분자는 N863에서 돌연변이, 예를 들어 N863A를 포함한다.
구현예에서, 단일 가닥 파손은 gRNA의 표적화 도메인이 상보성인 표적 핵산의 가닥에서 형성된다. 다른 구현예에서, 단일 가닥 파손은 gRNA의 표적화 도메인이 상보성인 가닥 이외의 표적 핵산 가닥에서 형성된다.
다른 양태에서, 본 명세서에서 핵산, 예를 들어 단리된 또는 비천연 유래 핵산, 예를 들어 (a) 본 명세서에 개시된 바와 같은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서 표적 도메인과, 예를 들어 T 세포 표적 위치와 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA가 개시된다.
구현예에서, 핵산은 각각 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치의 변경, 예를 들어 NHEJ와 연관된 변경을 허용하는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치에 충분히 가까운 절단 사건, 예를 들어 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 발현을 감소시키거나, 줄이거나 또는 억제하기 위해 T 세포 넉다운 표적 위치에 충분히 가까운 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9 융합 단백질(예를 들어, 전사 리프레서 도메인에 융합된 eiCas9)를 표적화하도록 구성된 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32 중 임의의 하나로부터의 표적화 도메인 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하거나 동일한 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 구현예에서, 핵산은 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 모듈 gRNA를 암호화하며, 예를 들어 하나 이상의 핵산은 모듈 gRNA를 암호화한다. 다른 구현예에서, 핵산은 키메라 gRNA를 암호화한다. 핵산은 길이로 16 개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화할 수 있다. 핵산은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화할 수 있다. 구현예에서, 핵산은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 5'으로부터 3'까지, 표적화 도메인("코어 도메인", 및 선택적으로 "2차 도메인"을 포함함); 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는 gRNA를 암호화한다. 일부 구현예에서, 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 단일 도메인으로서 함께 취해진다.
구현예에서, 핵산은 길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인; 함께 취해지고, 길이로 적어도 20 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개 이상의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인; 함께 취해지고, 길이로 적어도 30 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개 이상의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인; 함께 취해지고, 길이로 적어도 35 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개 이상의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인; 함께 취해지고, 길이로 적어도 40 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개 이상의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 (a) 본 명세서에 개시된 바와 같은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서 표적 도메인과 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자, 예를 들어 제1 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함하고, 추가로 (b) Cas9 분자를 암호화하는 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산은 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다.
Cas9 분자는 효소적으로 활성인 Cas9(eaCas9) 분자, 예를 들어 표적 핵산에서 이중 가닥 파손을 형성하는 eaCas9 분자일 수 있거나 또는 eaCas9 분자는 표적 핵산에서 단일 가닥 파손을 형성한다(예를 들어, 틈내기효소 분자). 대안적으로, 일부 구현예에서, Cas9 분자는 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 분자 또는 변형된 eiCas9 분자일 수 있고, 예를 들어 eiCas9 분자는 크루펠-연관 박스(KRAB)에 융합되어 eiCas9-KRAB 융합 단백질 분자를 생성한다.
본 명세서에 개시된 핵산은 (a) 본 명세서에 개시된 바와 같은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 암호화하는 서열; (b) Cas9 분자를 암호화하는 서열을 포함할 수 있으며; 추가로 (c)(i) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자의 제2 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 본 명세서에 기재된 제2 gRNA 분자를 암호화하는 서열, 및 선택적으로 (ii) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자의 제3 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 본 명세서에 기재된 제3 gRNA 분자를 암호화하는 서열; 및 선택적으로 (iii) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자의 제4 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 갖는 본 명세서에 기재된 제4 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함한다.
구현예에서, 핵산은 단독으로 또는 제1 gRNA 분자에 의해 위치된 파손과 조합하여 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치의 변경, 예를 들어 NHEJ와 연관된 변경을 허용하는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치에 충분히 가까운 절단 사건, 예를 들어 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 발현을 감소시키거나, 줄이거나 또는 억제하기 위해 T 세포 넉다운 표적 위치에 충분히 가까운 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9 융합 단백질(예를 들어, 전사 리프레서 도메인에 융합된 eiCas9)을 표적화하도록 구성된 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 단독으로 또는 제1 및/또는 제2 gRNA 분자에 의해 위치된 파손과 조합하여 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치의 변경, 예를 들어 NHEJ와 연관된 변경을 허용하는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치에 충분히 가까운 절단 사건, 예를 들어 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함하는 제3 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 발현을 감소시키거나, 줄이거나 또는 억제하기 위해 T 세포 넉다운 표적 위치에 충분히 가까운 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9 융합 단백질(예를 들어, 전사 리프레서 도메인에 융합된 eiCas9)을 표적화하도록 구성된 표적화 도메인을 포함하는 제3 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 단독으로 또는 제1 gRNA 분자, 제2 gRNA 분자 및 제3 gRNA 분자에 의해 위치된 파손과 조합하여 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치의 변경, 예를 들어 NHEJ와 연관된 변경을 허용하는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내의 T 세포 표적 위치에 충분히 가까운 절단 사건, 예를 들어 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함하는 제4 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 발현을 감소시키거나, 줄이거나 또는 억제하기 위해 T 세포 넉다운 표적 위치에 충분히 가까운 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9 융합 단백질(예를 들어, 전사 리프레서 도메인에 융합된 eiCas9)을 표적화하도록 구성된 표적화 도메인을 포함하는 제4 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 제2 gRNA 분자를 암호화한다. 제2 gRNA는 제1 gRNA 분자와 동일한 T 세포 표적 위치를 표적화하도록 선택된다. 선택적으로, 핵산은 제3 gRNA를 암호화할 수 있고, 추가로 선택적으로, 핵산은 제4 gRNA 분자를 암호화할 수 있다. 구현예에서, 제3 gRNA 분자 및 제4 gRNA 분자는 제1 및 제2 gRNA 분자와 동일한 T 세포 표적 위치를 표적화하도록 선택된다.
구현예에서, 핵산은 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 또는 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32 중 하나로부터의 표적화 도메인 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하거나 동일한 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA 분자를 암호화한다. 구현예에서, 핵산은 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 또는 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31 또는 표 32에서의 표적화 도메인으로부터 선택되는 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA 분자를 암호화한다. 구현예에서, 제3 또는 제4 gRNA 분자가 존재할 때, 제3 및 제4 gRNA 분자는 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32 중 하나로부터 독립적으로 선택되는 표적화 도메인 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하거나 동일한 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함할 수 있다. 추가 구현예에서, 제3 또는 제4 gRNA 분자가 존재할 때, 제3 및 제4 gRNA 분자는 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에서의 표적화 도메인으로부터 독립적으로 선택되는 표적화 도메인을 포함할 수 있다.
구현예에서, 핵산은 모듈 gRNA인 제2 gRNA를 암호화하되, 예를 들어 하나 이상의 핵산 분자는 모듈 gRNA를 암호화한다. 다른 구현예에서, 제2 gRNA를 암호화하는 핵산은 키메라 gRNA이다. 다른 구현예에서, 핵산이 제3 또는 제4 gRNA를 암호화할 때, 제3 및 제4 gRNA는 모듈 gRNA 또는 키메라 gRNA일 수 있다. 다중 gRNA가 사용될 때, 모듈 또는 키메라 gRNA의 임의의 조합이 사용될 수 있다.
핵산은 길이로 16 개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적화 도메인을 포함하는 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA를 암호화할 수 있다. 구현예에서, 핵산은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다. 구현예에서, 핵산은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다. 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 16 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 17 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 18 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 19 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 20 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 21 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 22 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 23 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 24 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 25 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 26 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 핵산 5'으로부터 3'까지, 표적화 도메인("코어 도메인", 및 선택적으로 "2차 도메인"을 포함함); 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA를 암호화한다. 일부 구현예에서, 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 단일 도메인으로서 함께 취해진다.
구현예에서, 핵산은 길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인; 함께 취해지며, 길이로 적어도 20 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 포함하는 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인; 함께 취해지며, 길이로 적어도 30 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 포함하는 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인; 함께 취해지며, 길이로 적어도 35 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 포함하는 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인; 함께 취해지며, 길이로 적어도 40 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 포함하는 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA를 암호화한다.
상기 기재한 바와 같이, 핵산은 (a) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 암호화하는 서열, 및 (b) Cas9 분자를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, (a) 및 (b)는 동일한 핵산 분자, 예를 들어 동일한 벡터, 예를 들어 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어 동일한 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 상에 존재한다. 구현예에서, 핵산 분자는 AAV 벡터이다. 임의의 기재된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 AAV 벡터는 AAV1 벡터, 변형된 AAV1 벡터, AAV2 벡터, 변형된 AAV2 벡터, AAV3 벡터, AAV4 벡터, 변형된 AAV4 벡터, AAV5 벡터, 변형된 AAV5 벡터, 변형된 AAV3 벡터, AAV6 벡터, 변형된 AAV6 벡터, AAV7 벡터, 변형된 AAV7 벡터, AAV8 벡터, AAV9 벡터, AAV.rh10 벡터, 변형된 AAV.rh10 벡터, AAV.rh32/33 벡터, 변형된 AAV.rh32/33 벡터, AAV.rh43 벡터, 변형된 AAV.rh43 벡터, AAV.rh64R1 벡터 및 변형된 AAV.rh64R1 벡터를 포함한다. 다른 구현예에서, (a)는 제1 핵산 분자, 예를 들어 제1 벡터, 예를 들어 제1 바이러스 벡터, 예를 들어 제1 AAV 벡터 상에 존재하고; (b)는 제2 핵산 분자, 예를 들어 제2 벡터, 예를 들어 제2 AAV 벡터 상에 존재한다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
다른 구현예에서, 핵산은 (c)(i) 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 (a), (b) 및 (c)(i)를 포함한다. 각각의 (a) 및 (c)(i)은 동일한 핵산 분자, 예를 들어 동일한 벡터, 예를 들어 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어 동일한 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 상에 존재할 수 있다. 구현예에서, 핵산 분자는 AAV 벡터이다.
다른 구현예에서, (a) 및 (c)(i)은 상이한 벡터 상에 있다. 예를 들어, (a) 제1 핵산 분자, 예를 들어 제1 벡터, 예를 들어 제1 바이러스 벡터, 예를 들어 제1 AAV 벡터 상에 존재할 수 있고; (c)(i)은 제2 핵산 분자, 예를 들어 제2 벡터, 예를 들어 제2 벡터, 예를 들어 제2 AAV 벡터 상에 존재할 수 있다. 구현예에서, 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터이다.
다른 구현예에서, 각각의 (a), (b) 및 (c)(i)은 동일한 핵산 분자, 예를 들어 동일한 벡터, 예를 들어 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 벡터 상에 존재한다. 구현예에서, 핵산 분자는 AAV 벡터이다. 대안의 구현예에서, (a), (b) 및 (c)(i) 중 하나는 제1 핵산 분자, 예를 들어 제1 벡터, 예를 들어 제1 바이러스 벡터, 예를 들어 제1 AAV 벡터 상에서 암호화되고; 제2 및 제3의 (a), (b) 및 (c)(i)은 제2 핵산 분자, 예를 들어 제2 벡터, 예를 들어 제2 AAV 벡터 상에서 암호화된다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
구현예에서, (a)는 제1 핵산 분자, 예를 들어 제1 벡터, 예를 들어 제1 바이러스 벡터,제1 AAV 벡터 상에 존재하고; (b) 및 (c)(i)은 제2 핵산 분자, 예를 들어 제2 벡터, 예를 들어 제2 AAV 벡터 상에 존재한다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
다른 구현예에서, (b)는 제1 핵산 분자, 예를 들어 제1 벡터, 예를 들어 제1 바이러스 벡터, 예를 들어 제1 AAV 벡터 상에 존재하고; (a) 및 (c)(i)은 제2 핵산 분자, 예를 들어 제2 벡터, 예를 들어 제2 AAV 벡터 상에 존재한다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
다른 구현예에서, (c)(i)은 제1 핵산 분자, 예를 들어 제1 벡터, 예를 들어 제1 바이러스 벡터, 예를 들어 제1 AAV 벡터 상에 존재하고; (b) 및 (a)는 제2 핵산 분자, 예를 들어 제2 벡터, 예를 들어 제2 AAV 벡터 상에 존재한다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
다른 구현예에서, 각각의 (a), (b) 및 (c)(i)은 상이한 핵산 분자, 예를 들어 상이한 벡터, 예를 들어 상이한 바이러스 벡터, 예를 들어 상이한 AAV 벡터 상에 존재한다. 예를 들어, (a)는 제1 핵산 분자 상에, (b)는 제2 핵산 분자 상에, 그리고 (c)(i)은 제3 핵산 분자 상에 있을 수 있다. 제1, 제2 및 제3 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
다른 구현예에서, 제3, 및/또는 제4 gRNA 분자가 존재할 때, 각각의 (a), (b), (c)(i), (c)(ii) 및 (c)(iii)은 동일한 핵산 분자, 예를 들어 동일한 벡터, 예를 들어 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 벡터 상에 존재할 수 있다. 구현예에서, 핵산 분자는 AAV 벡터이다. 대안의 구현예에서, 각각의 (a), (b), (c)(i), (c)(ii) 및 (c)(iii)은 상이한 핵산 분자, 예를 들어 상이한 벡터, 예를 들어 상이한 바이러스 벡터, 예를 들어 상이한 AAV 벡터 상에 존재할 수 있다. 추가 구현예에서, 각각의 (a), (b), (c)(i), (c)(ii) 및 (c)(iii)은 하나 초과의 핵산 분자 상에, 그러나 5 개보다 더 적은 핵산 분자, 예를 들어 AAV 벡터 상에 존재할 수 있다.
본 명세서에 기재된 핵산은 (a), 예를 들어 본 명세서에 기재된 프로모터의 gRNA 분자를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 핵산은 (c), 예를 들어 본 명세서에 기재된 프로모터의 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA 분자를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 프로모터 및 제2 프로모터는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 프로모터와 제2 프로모터는 동일하다.
본 명세서에 기재된 핵산은 (b), 예를 들어 본 명세서에 기재된 프로모터의 Cas9 분자를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 명세서에서 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 포함하는 조성물이 개시된다. (a)의 조성물은 (b) Cas9 분자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 Cas9 분자를 추가로 포함할 수 있다. (a) 및 (b)의 조성물은 (c) 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA 분자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA 분자를 추가로 포함할 수 있다. 구현예에서, 조성물은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 2 개 이상을 표적화하는 적어도 2 개의 gRNA 분자를 포함할 수 있다. 구현예에서, 조성물은 지배적인 gRNA 분자, 또는 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본 명세서에서 세포를 (a) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자를 표적화하는 gRNA, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA; (b) Cas9 분자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 Cas9 분자; 및 선택적으로, (c) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자를 표적화하는 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포를 변경하는, 예를 들어 세포의 표적 핵산의 구조를 변경하는, 예를 들어 세포의 표적 핵산의 서열을 변경하는 방법이 개시된다. 구현예에서, 상기 방법은 지배적인 gRNA 분자를 세포 내로 도입하는 단계, 또는 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 (a) 및 (b)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 (a), (b) 및 (c)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
*(a) 및 선택적으로 (c)의 gRNA는 임의의 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32, 또는 임의의 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32로부터 독립적으로 선택되는 표적화 도메인 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 gRNA로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
구현예에서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 2 개 이상을 변경시키는 것을 포함하는, 세포를 변경시키는 것, 예를 들어 세포의 표적 핵산의 구조를 변경시키는 것, 예를 들어 세포의 표적 핵산의 서열을 변경시키는 방법. 2 개 이상의 유전자가 세포에서 변경될 때, 상기 세포는 (a) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 2 개 이상, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA 중 2 개 이상을 표적화하는 gRNA; (b) Cas9 분자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 Cas9 분자; 및 선택적으로 (c) (a)에서 선택되는 2 개 이상의 유전자를 각각 표적화하는 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA와 접촉된다. 구현예에서, 상기 방법은 지배적인 gRNA 분자를 세포 내로 도입하는 단계, 또는 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
구현예에서, 세포를 변경하는 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 2 개 이상을 변경하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 세포를 변경하는 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 3 개 이상을 변경하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 세포를 변경하는 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 4 개 이상을 변경하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 세포를 변경하는 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 5 개 이상을 변경하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 세포를 변경하는 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 6 개 이상을 변경하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 세포를 변경하는 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 7 개 이상을 변경하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 세포를 변경하는 방법은 각각의 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자를 변경하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 암을 앓고 있는 대상체로부터의 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 세포는 T 세포 표적 위치에서 돌연변이를 갖는 것이 유리할 대상체로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 방법에서 접촉되는 세포는 T 세포이다. 접촉시키는 단계는 생체외에서 수행될 수 있고, 접촉된 세포는 접촉시키는 단계 후에 대상체의 신체로 복귀될 수 있다. T 세포는 조작된 T 세포, 예를 들어 조작된 CAR(키메라 항원 수용체) T 세포 또는 조작된 TCR(T-세포 수용체) T 세포일 수 있다. T 세포는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 하나 이상에서 T 세포 표적 위치 돌연변이를 도입하기 전에, 후에 또는 동시에 TCR 또는 CAR을 발현시키도록 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포를 변경하는 방법은 접촉시키는 단계 전에 세포 내 T 세포 표적 위치의 서열의 지식을 획득하는 단계를 포함한다. 세포 내 T 세포 표적 위치의 서열의 지식을 획득하는 단계는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자, 또는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자의 일부를 서열분석(sequencing)하는 것에 의할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법의 접촉시키는 단계는 세포를 (a), (b) 및 (c) 중 적어도 하나를 발현시키는 핵산, 예를 들어 벡터, 예를 들어 AAV 벡터, 예를 들어 본 명세서에 기재된 AAV 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법의 접촉시키는 단계는 세포를 각각의 (a), (b) 및 (c)를 발현시키는 핵산, 예를 들어 벡터, 예를 들어 AAV 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법의 접촉시키는 단계는 세포에 (b)의 Cas9 분자 및 gRNA(a)를 암호화하는 핵산, 및 선택적으로 제2 gRNA (c)(i)(및 추가로 선택적으로, 제3 gRNA (c)(iv) 및/또는 제4 gRNA (c)(iii)를 전달하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법의 접촉시키는 단계는 세포를 (a), (b) 및 (c) 중 적어도 하나를 발현시키는 핵산, 예를 들어 벡터, 예를 들어 AAV 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법의 접촉시키는 단계는 세포를 각각의 (a), (b) 및 (c)를 발현시키는 핵산, 예를 들어 벡터, 예를 들어 AAV 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 구현예에서, 접촉시키는 단계는 세포를 핵산, 예를 들어 벡터, 예를 들어 AAV 벡터, AAV1 벡터, 변형된 AAV1 벡터, AAV2 벡터, 변형된 AAV2 벡터, AAV3 벡터, 변형된 AAV3 벡터, AAV4 벡터, 변형된 AAV4 벡터, AAV5 벡터, 변형된 AAV5 벡터, AAV6 벡터, 변형된 AAV6 벡터, AAV7 벡터, 변형된 AAV7 벡터, AAV8 벡터, AAV9 벡터, AAV.rh10 벡터, 변형된 AAV.rh10 벡터, AAV.rh32/33 벡터, 변형된 AAV.rh32/33 벡터, AAV.rh43벡터, 변형된 AAV.rh43벡터, AAV.rh64R1벡터 및 변형된 AAV.rh64R1벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, 접촉시키는 단계는 세포에 (b)의 Cas9 분자를, 단백질 또는 mRNA, 및 (a) 및 선택적으로 (c)를 암호화하는 핵산으로서 전달하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 접촉시키는 단계는 세포에 (b)의 Cas9 분자를, 단백질 또는 mRNA Cas9 분자로서, RNA로서 (a)의 gRNA, 및 선택적으로 RNA로서 (c)의 제2 gRNA를 전달하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 접촉시키는 단계는 세포에 RNA로서 (a)의 gRNA, 선택적으로 RNA로서 (c)의 제2 gRNA, 및 (b)의 Cas9 분자를 암호화하는 핵산을 전달하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 명세서에서 대상체(또는 대상체로부터의 세포)를, 하기와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법, 예를 들어 대상체의 표적 핵산의 구조, 예를 들어 표적 핵산의 서열을 변경시키는 것이 개시된다:
(a) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자를 표적화하는 gRNA, 예를 들어 본 명세서에 개시된 gRNA;
(b) Cas9 분자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 Cas9 분자; 및
선택적으로, (c)(i) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자를 표적화하는 제2 gRNA, 예를 들어 본 명세서에 개시된 제2 gRNA, 및
추가로 선택적으로, (c)(ii) 제3 gRNA, 및 또한 추가로 선택적으로, (c)(iii) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자를 표적화하는 제4 gRNA, 예를 들어 본 명세서에 개시된 제3 및 제4 gRNA. 구현예에서, 상기 방법은 추가로 대상체 또는 대상체의 세포 내로 지배적인 gRNA 분자, 또는 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 접촉시키는 단계는 (a) 및 (b)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 접촉시키는 단계는 (a), (b) 및 (c)(i)과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 접촉시키는 단계는 (a), (b), (c)(i) 및 (c)(ii)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 접촉시키는 단계는 (a), (b), (c)(i), (c)(ii) 및 (c)(iii)과 접촉시키는 단계를 포함한다.
(a) 또는 (c)(예를 들어, (c)(i), (c)(ii) 또는 (c)(iii))의 gRNA는 임의의 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32, 또는 임의의 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32로부터 독립적으로 선택되는 표적화 도메인 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 gRNA로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
구현예에서, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 2 개 이상을 변경시키는 단계, 예를 들어 대상체의 2 개 이상(예를 들어, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 2 개 이상)의 표적 핵산의 구조, 예를 들어 상기 표적 핵산의 서열을 변경시키는 단계를 포함한다. 2 개 이상의 유전자가 대상체(또는 대상체로부터의 세포)에서 변경될 때, 대상체(또는 대상체로부터의 세포)는 (a) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 2 개 이상을 표적화하는 gRNA, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA 중 2 개 이상; (b) Cas9 분자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 Cas9 분자; 및 선택적으로, (c) (a)에서 선택되는 2 개 이상의 유전자를 각각 표적화하는 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA와 접촉된다. 구현예에서, 상기 방법은 추가로 대상체, 또는 대상체의 세포 내로 지배적인 gRNA 분자, 또는 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 도입하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 2 개 이상을 변경시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 3 개 이상을 변경시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 4 개 이상을 변경시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 5 개 이상을 변경시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 6 개 이상을 변경시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 7 개 이상을 변경시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 각각의 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자를 변경시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 대상체에서의 T 세포 표적 위치에서 서열의 지식을 획득하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 하나 이상 또는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 하나 이상의 일부를 서열분석함으로써 대상체에서의 T 세포 표적 위치에서 서열의 지식을 획득하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내 T 세포 표적 위치에서 돌연변이를 유도하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 하나 이상에서의 T 세포 표적 위치에서 돌연변이를 유도하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 2 개 이상에서의 T 세포 표적 위치에서 돌연변이를 유도하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 3 개 이상에서의 T 세포 표적 위치에서 돌연변이를 유도하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 4 개 이상에서의 T 세포 표적 위치에서 돌연변이를 유도하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 5 개 이상에서의 T 세포 표적 위치에서 돌연변이를 유도하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 6 개 이상에서의 T 세포 표적 위치에서 돌연변이를 유도하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 7 개 이상에서의 T 세포 표적 위치에서 돌연변이를 유도하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 각각의 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자에서의 T 세포 표적 위치에서 돌연변이를 유도하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 NHEJ에 의해 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 하나 이상에서의 T 세포 표적 위치에서 돌연변이를 유도하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 대상체의 세포는 생체외에서 (a), (b), 및 선택적으로 (c)와 접촉된다. 구현예에서, 세포는 대상체의 신체로 복귀된다. 구현예에서, 생체외에서 접촉되는 대상체의 세포는 T 세포이다. T 세포는 조작된 T 세포, 예를 들어 조작된 CAR(키메라 항원 수용체) T 세포 또는 조작된 TCR(T-세포 수용체) T 세포일 수 있다. T 세포는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 하나 이상에서 T 세포 표적 위치 돌연변이를 도입하기 전에, 후에 또는 동시에 TCR 또는 CAR을 발현시키도록 조작될 수 있다.
상기 방법이 (1) NHEJ에 의해 T 세포 표적 위치에서 돌연변이를 유도하는 단계 또는 (2) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 발현을, 예를 들어 프로모터 영역을 표적화함으로써 넉다운시키는 단계를 포함할 때, (b)의 Cas9 및 적어도 하나의 가이드 RNA, 예를 들어 (a)의 가이드 RNA는 접촉시키는 단계에 포함된다.
다른 양태에서, 본 명세서에서, gRNA, 핵산, 또는 본 명세서에 기재된 조성물 및 세포, 예를 들어 암을 갖는 대상체, 또는 T 세포 표적 위치에서의 돌연변이가 유리한 대상체로부터의 세포를 포함하는 반응 혼합물이 개시된다.
다른 양태에서, 본 명세서에서 (a) 본 명세서에 기재된 gRNA 분자, 또는 gRNA를 암호화하는 핵산, 및 다음 중 하나 이상을 포함하는 키트가 개시된다:
(b) Cas9 분자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 Cas9 분자, 또는 Cas9를 암호화하는 핵산 또는 mRNA;
(c)(i) 제2 gRNA 분자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 제2 gRNA 분자 또는 (c)(i)을 암호화하는 핵산;
(c)(ii) 제3 gRNA 분자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 제2 gRNA 분자 또는 (c)(ii)를 암호화하는 핵산;
(c)(iii) 제4 gRNA 분자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 제2 gRNA 분자 또는 (c)(iii)을 암호화하는 핵산.
구현예에서, 키트는 (a), (b), (c)(i), (c)(ii) 및 (c)(iii) 중 하나 이상을 암호화하는 핵산, 예를 들어 AAV 벡터, 예를 들어 본 명세서에 기재된 AAV 벡터를 포함한다. 구현예에서, 키트는 지배적인 gRNA 분자, 또는 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
양태에서, 개시 내용은 세포 또는 대상체 내로 도입되는 CRISPR/Cas 시스템의 구성성분을 암호화하는 핵산 상에서 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함하는, 본 명세서에서 지배적인 gRNA 분자로 지칭되는 gRNA 분자를 특징으로 한다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 또는 표적 유전자 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 표적화한다. 구현예에서, 지배적인 gRNA는 Cas9 구성성분, 예를 들어 Cas9 분자 또는 표적 유전자 gRNA 분자를 암호화하는 서열에서 표적 도메인에 대해 상보성인 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 표적 도메인은, 예를 들어 오프-타겟 절단을 최소화하기 위해 세포 내 기타 다른 핵산 서열에 대해 최소로 상동성을 지니도록 설계되거나 또는 최소로 상동성을 가진다. 예를 들어, 지배적인 gRNA 상의 표적화 도메인은 오프-타겟 효과를 감소시키거나 또는 최소화하도록 선택될 수 있다. 구현예에서, 지배적인 gRNA에 대한 표적 도메인은 Cas9 분자의 제어 또는 암호 영역에 배치될 수 있거나 또는 제어 영역과 전사 영역 사이에 배치될 수 있다. 구현예에서, 지배적인 gRNA에 대한 표적 도메인은 표적 유전자 gRNA 분자의 제어 또는 암호 영역 내에 배치될 수 있거나 또는 표적 유전자 gRNA의 제어 영역과 전사 영역 사이에 배치될 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 구현예에서, Cas9 분자를 암호화하는 핵산 또는 표적 유전자 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 변경하는 것, 예를 들어 불활성화하는 것은 표적화된 핵산 서열의 절단에 의해 또는표적화된 핵산 서열에 대한 Cas9 분자/지배적인 gRNA 분자 복합체의 결합에 의해 달성될 수 있다는 것이 여겨진다.
본 명세서에 개시된 조성물, 반응 혼합물 및 키트는 또한 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 지배적인 gRNA 분자를 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
수치 및 알파벳 표제 및 부표제를 포함하는 표제는 조직화 및 제시를 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 상세한 설명, 도면으로부터 그리고 청구범위로부터 명확하게 될 것이다.
우선 도면을 간략하게 설명한다.
도 1a 내지 도 1g는 몇몇 예시적인 gRNA의 표현이다.
도 1a는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes(S. pyogenes))로부터 부분적으로 유래된(또는 부분적으로 서열 상에서 모델링된) 모듈 gRNA 분자를 도시한다(나오는 순서대로 각각 서열번호 42 및 43);
도 1b는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자(또는 키메라) gRNA 분자를 도시한다(서열번호 44);
도 1c는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(서열번호 45);
도 1d는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(서열번호 46);
도 1e는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(서열번호 47);
도 1f는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus(S. thermophilus))로부터 부분적으로 유래된 모듈 gRNA 분자를 도시한다(나오는 순서대로 각각 서열번호 48 및 49);
도 1g는 스트렙토코커스 피오게네스 및 스트렙토코커스 써모필루스의 모듈 gRNA 분자의 정렬을 도시한다(나오는 순서대로 각각 서열번호 50 내지 53).
도 2a 내지 도 2g는 문헌[Chylinski et al., RNA Biol. 2013; 10(5): 726-737]으로부터의 Cas9 서열의 정렬을 도시한다. N-말단의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있으며, "y"로 표시한다. 다른 2 개의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있으며, "b"로 표시한다. HNH-유사 도메인은 박스 표시되어 있고 "g"로 표시한다. Sm: 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)(서열번호 1); Sp: 스트렙토코커스 피오게네스(서열번호 2); St: 스트렙토코커스 써모필루스(서열번호 3); Li: 리스테리아 이노큐아(L. innocua)(서열번호 4). 모티프: 이는 4 개의 서열에 기반한 모티프이다: 4 개의 서열 모두에서 보존된 잔기는 한 글자 아미노산 약어로 표시되고; "*"는 4 개 서열 중 어떤 것의 대응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 표시하며; "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어 임의의 20 종의 천연 유래 아미노산을 표시한다.
도 3a 내지 3b는 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 N-말단의 RuvC-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 54 내지 103). 도 3b의 마지막 선은 4 개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 4a 내지 4b는 서열 분리물이 제거된 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 N-말단의 RuvC-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 104 내지 177). 도 4b의 마지막 선은 3 개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 5a 내지 5c는 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 HNH-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 178 내지 252). 도 5c의 마지막 선은 보존된 잔기를 나타낸다.
도 6a 내지 6b는 서열 분리물이 제거된 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 HNH-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 253 내지 302). 도 6b의 마지막 선은 3 개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 7a 내지 7b는 스트렙토코커스 피오게네스 및 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis(N. meningitidis))로부터 Cas9 서열의 정렬을 도시한다. N-말단의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "Y"로 표시된다. 다른 2 개의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "B"로 표시된다. HNH-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "G"로 표시된다. Sp: 스트렙토코커스 피오게네스; Nm: 네이세리아 메닌기티디스. 모티프: 이는 2 개의 서열에 기반한 모티프이고: 2 개의 서열 모두에서 보존된 잔기는 단일 아미노산 표기로 표시되며; "*"는 임의의 2 개의 서열의 대응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 표시하고; "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어 20 종의 천연 유래 아미노산을 표시하며, "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어 20 종의 천연 유래 아미노산을 표시하거나, 없음을 표시한다.
도 8은 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9를 암호화하는 핵산 서열(서열번호 303)을 나타낸다. "R"로 표시되는 서열은 SV40 NLS이고; "G"로 표시되는 서열은 HA 태그이며; "O"으로 표시되는 서열은 합성 NLS 서열이고; 남아있는(표시없음) 서열은 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)이다.
도 9의 A는 Cas9의 2 개의 로브(lobe)(인식(REC) 및 뉴클레아제(NUC) 로브)에 대해 아미노산 위치를 포함하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas 9의 도메인 조직화 및 Cas9 도메인의 조직화의 개략적 표현을 나타낸다.
도 9의 B는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas 9의 도메인 조직화의 개략적 표현 및 83 개의 Cas9 오솔로그에 걸친 각각의 도메인의 백분율 상동성을 나타낸다.
도 10의 A는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자의 예시적인 구조를 나타낸다(서열번호 40).
도 10의 B는 이중가닥 구조로서 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자의 예시적인 구조를 나타낸다(서열번호 41).
도 11은 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 293 세포에서 TRBC 유전자에 대해 지시되는 gRNA의 활성을 평가하는 실험들의 결과를 나타낸다. 293개 세포들은 2 개의 플라스미드(하나는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 암호화하고, 다른 하나는 상기 열거된 gRNA를 암호화함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중가닥 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한, 각각의 gRNA에 대한 TRBC2 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 요약한다.
도 12는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 293 세포에서 TRBC 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293 세포는 2 개의 플라스미드(하나는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 암호화하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 암호화함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중가닥 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 TRBC1과 TRBC2 좌위 둘 다에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 13은 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 293 세포에서 TRAC 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293 세포는 2 개의 플라스미드(하나는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 암호화하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 암호화함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중가닥 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 TRAC 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 14는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 293 세포에서 TRAC 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293 세포는 2 개의 플라스미드(하나는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 암호화하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 암호화함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중가닥 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 TRAC 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 15는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 293 세포에서 PDCD1 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293 세포는 2 개의 플라스미드(하나는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 암호화하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 암호화함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중가닥 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 PDCD1 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 16은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 293 세포에서 PDCD1 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293 세포는 2 개의 플라스미드(하나는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 암호화하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 암호화함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중가닥 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 PDCD1 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 17a 내지 도 17c는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 mRNA 및 TRBC 및 TRAC 유전자 특이적 gRNA의 전달에 기인하는 CD4+ T 세포에서 CD3 발현의 상실을 나타내는 결과를 도시한다.
도 17a는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 mRNA 및 표시된 gRNA(TRBC-210 (GCGCUGACGAUCUGGGUGAC)(서열번호 413), TRAC-4(GCUGGUACACGGCAGGGUCA)(서열번호 453) 또는 AAVS1(GUCCCCUCCACCCCACAGUG)(서열번호 51201))로 전기천공되고, APC-CD3 항체를 이용하여 염색되고, FACS에 의해 분석된 CD4+ T 세포를 나타내다. 세포는 전기천공법 후 제2 일 및 제3 일에 분석하였다.
도 17b는 (a)에서 플롯으로부터의 CD3 음성 집단의 정량화를 나타낸다.
도 17c는 TRBC2 및 TRAC 좌위 상에서 수행한 T7E1 분석으로부터의 NHEJ% 결과를 나타낸다.
도 18a 내지 도 18c는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9/gRNA RNP 표적화 TRAC 유전자의 전달에 기인하는 저캇(Jurkat) T 세포의 CD3 발현의 상실을 나타내는 결과를 도시한다.
도 18a는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9/gRNA TRAC-233(GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA)(서열번호 474) RNP 표적화 TRAC 유전자를 이용하여 전기천공되고, APC-CD3 항체로 염색되며, FACS에 의해 분석된 저캇 T 세포를 나타낸다. 세포를 전기천공법 후 제1 일, 제2 일 및 제3 일에 분석하였다.
도 18b는 (a)에서 플롯으로부터 CD3 음성 집단의 정량화를 나타낸다.
도 18c는 TRAC 좌위에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터의 NHEJ% 결과를 나타낸다.
도 19는 5' ARCA 캡의 구조를 나타낸다.
도 20은 Cas9 mRNA 및 AAVS1 gRNA를 이용하는 전기천공법 후 살아있는 저캇 T 세포의 정량화로부터의 결과를 도시한다. 저캇 T 세포는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 mRNA 및 각각의 변형된 gRNA를 이용하여 전기천공되었다. 전기천공법 후 24 시간에, 1 x 105 개 세포를 15 분 동안 실온에서 FITC-컨쥬게이팅된 아넥신-V(Annexin-V) 특이적 항체를 이용하여 염색한 다음, 유세포 분석에 의한 분석 직전에 요오드화 프로피디움을 이용하여 염색하였다. 아넥신-V 또는 PI 중 하나에 대해 염색하지 않은 세포의 백분율을 막대 그래프로 제시한다.
도 21a 내지 도 21c는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9/gRNA RNP 표적화 TRAC의 전달에 기인하는 나이브 CD3+ T 세포에서의 CD3 발현의 상실을 도시한다.
도 21a는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9/gRNA(표적화 도메인 GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(서열번호 474)를 지님)) RNP 표적화 TRAC을 이용하여 전기천공된 나이브 CD3+ T 세포가 APC-CD3 항체로 염색되고, FACS에 의해 분석된 것을 도시한다. 세포를 전기천공법 후 제4 일에 분석하였다. 음성 대조군은 기능성 Cas9가 없는 표적화 도메인 GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(서열번호 474)를 지니는 gRNA를 지니는 세포이다.
도 21b는 도 21a에서의 플롯으로부터의 CD3 음성 집단의 정량화를 도시한다.
도 21c는 TRAC 좌위에서 수행한 T7E1 분석으로부터의 NHEJ% 결과를 도시한다.
도 22는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 mRNA 및 PDCD1 gRNA(표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(서열번호 508)을 지님) 또는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9/gRNA(표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(서열번호 508)을 지님) RNP 표적화 PDCD1의 전달 후 저캇 T 세포 내 PDCD1 좌위에서의 게놈 편집을 도시한다. 24 시간, 48 시간 및 72 시간에 PDCD1 좌위에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터의 NHEJ% 결과의 정량화. 더 고수준의 NHEJ%를 RNP 대 mRNA 전달을 이용하여 검출하였다.
도 1a 내지 도 1g는 몇몇 예시적인 gRNA의 표현이다.
도 1a는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes(S. pyogenes))로부터 부분적으로 유래된(또는 부분적으로 서열 상에서 모델링된) 모듈 gRNA 분자를 도시한다(나오는 순서대로 각각 서열번호 42 및 43);
도 1b는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자(또는 키메라) gRNA 분자를 도시한다(서열번호 44);
도 1c는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(서열번호 45);
도 1d는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(서열번호 46);
도 1e는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(서열번호 47);
도 1f는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus(S. thermophilus))로부터 부분적으로 유래된 모듈 gRNA 분자를 도시한다(나오는 순서대로 각각 서열번호 48 및 49);
도 1g는 스트렙토코커스 피오게네스 및 스트렙토코커스 써모필루스의 모듈 gRNA 분자의 정렬을 도시한다(나오는 순서대로 각각 서열번호 50 내지 53).
도 2a 내지 도 2g는 문헌[Chylinski et al., RNA Biol. 2013; 10(5): 726-737]으로부터의 Cas9 서열의 정렬을 도시한다. N-말단의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있으며, "y"로 표시한다. 다른 2 개의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있으며, "b"로 표시한다. HNH-유사 도메인은 박스 표시되어 있고 "g"로 표시한다. Sm: 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)(서열번호 1); Sp: 스트렙토코커스 피오게네스(서열번호 2); St: 스트렙토코커스 써모필루스(서열번호 3); Li: 리스테리아 이노큐아(L. innocua)(서열번호 4). 모티프: 이는 4 개의 서열에 기반한 모티프이다: 4 개의 서열 모두에서 보존된 잔기는 한 글자 아미노산 약어로 표시되고; "*"는 4 개 서열 중 어떤 것의 대응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 표시하며; "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어 임의의 20 종의 천연 유래 아미노산을 표시한다.
도 3a 내지 3b는 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 N-말단의 RuvC-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 54 내지 103). 도 3b의 마지막 선은 4 개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 4a 내지 4b는 서열 분리물이 제거된 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 N-말단의 RuvC-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 104 내지 177). 도 4b의 마지막 선은 3 개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 5a 내지 5c는 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 HNH-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 178 내지 252). 도 5c의 마지막 선은 보존된 잔기를 나타낸다.
도 6a 내지 6b는 서열 분리물이 제거된 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 HNH-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 253 내지 302). 도 6b의 마지막 선은 3 개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 7a 내지 7b는 스트렙토코커스 피오게네스 및 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis(N. meningitidis))로부터 Cas9 서열의 정렬을 도시한다. N-말단의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "Y"로 표시된다. 다른 2 개의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "B"로 표시된다. HNH-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "G"로 표시된다. Sp: 스트렙토코커스 피오게네스; Nm: 네이세리아 메닌기티디스. 모티프: 이는 2 개의 서열에 기반한 모티프이고: 2 개의 서열 모두에서 보존된 잔기는 단일 아미노산 표기로 표시되며; "*"는 임의의 2 개의 서열의 대응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 표시하고; "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어 20 종의 천연 유래 아미노산을 표시하며, "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어 20 종의 천연 유래 아미노산을 표시하거나, 없음을 표시한다.
도 8은 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9를 암호화하는 핵산 서열(서열번호 303)을 나타낸다. "R"로 표시되는 서열은 SV40 NLS이고; "G"로 표시되는 서열은 HA 태그이며; "O"으로 표시되는 서열은 합성 NLS 서열이고; 남아있는(표시없음) 서열은 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)이다.
도 9의 A는 Cas9의 2 개의 로브(lobe)(인식(REC) 및 뉴클레아제(NUC) 로브)에 대해 아미노산 위치를 포함하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas 9의 도메인 조직화 및 Cas9 도메인의 조직화의 개략적 표현을 나타낸다.
도 9의 B는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas 9의 도메인 조직화의 개략적 표현 및 83 개의 Cas9 오솔로그에 걸친 각각의 도메인의 백분율 상동성을 나타낸다.
도 10의 A는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자의 예시적인 구조를 나타낸다(서열번호 40).
도 10의 B는 이중가닥 구조로서 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자의 예시적인 구조를 나타낸다(서열번호 41).
도 11은 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 293 세포에서 TRBC 유전자에 대해 지시되는 gRNA의 활성을 평가하는 실험들의 결과를 나타낸다. 293개 세포들은 2 개의 플라스미드(하나는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 암호화하고, 다른 하나는 상기 열거된 gRNA를 암호화함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중가닥 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한, 각각의 gRNA에 대한 TRBC2 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 요약한다.
도 12는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 293 세포에서 TRBC 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293 세포는 2 개의 플라스미드(하나는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 암호화하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 암호화함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중가닥 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 TRBC1과 TRBC2 좌위 둘 다에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 13은 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 293 세포에서 TRAC 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293 세포는 2 개의 플라스미드(하나는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 암호화하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 암호화함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중가닥 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 TRAC 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 14는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 293 세포에서 TRAC 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293 세포는 2 개의 플라스미드(하나는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 암호화하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 암호화함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중가닥 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 TRAC 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 15는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 293 세포에서 PDCD1 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293 세포는 2 개의 플라스미드(하나는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 암호화하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 암호화함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중가닥 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 PDCD1 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 16은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 293 세포에서 PDCD1 유전자를 향하는 gRNA의 활성을 평가하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 293 세포는 2 개의 플라스미드(하나는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 암호화하고, 다른 하나는 열거된 gRNA를 암호화함)로 형질감염되었다. 그래프는 이중가닥 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터 계산한 각각의 gRNA에 대한 PDCD1 좌위에서 관찰된 평균 NHEJ%를 나타낸다.
도 17a 내지 도 17c는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 mRNA 및 TRBC 및 TRAC 유전자 특이적 gRNA의 전달에 기인하는 CD4+ T 세포에서 CD3 발현의 상실을 나타내는 결과를 도시한다.
도 17a는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 mRNA 및 표시된 gRNA(TRBC-210 (GCGCUGACGAUCUGGGUGAC)(서열번호 413), TRAC-4(GCUGGUACACGGCAGGGUCA)(서열번호 453) 또는 AAVS1(GUCCCCUCCACCCCACAGUG)(서열번호 51201))로 전기천공되고, APC-CD3 항체를 이용하여 염색되고, FACS에 의해 분석된 CD4+ T 세포를 나타내다. 세포는 전기천공법 후 제2 일 및 제3 일에 분석하였다.
도 17b는 (a)에서 플롯으로부터의 CD3 음성 집단의 정량화를 나타낸다.
도 17c는 TRBC2 및 TRAC 좌위 상에서 수행한 T7E1 분석으로부터의 NHEJ% 결과를 나타낸다.
도 18a 내지 도 18c는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9/gRNA RNP 표적화 TRAC 유전자의 전달에 기인하는 저캇(Jurkat) T 세포의 CD3 발현의 상실을 나타내는 결과를 도시한다.
도 18a는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9/gRNA TRAC-233(GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA)(서열번호 474) RNP 표적화 TRAC 유전자를 이용하여 전기천공되고, APC-CD3 항체로 염색되며, FACS에 의해 분석된 저캇 T 세포를 나타낸다. 세포를 전기천공법 후 제1 일, 제2 일 및 제3 일에 분석하였다.
도 18b는 (a)에서 플롯으로부터 CD3 음성 집단의 정량화를 나타낸다.
도 18c는 TRAC 좌위에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터의 NHEJ% 결과를 나타낸다.
도 19는 5' ARCA 캡의 구조를 나타낸다.
도 20은 Cas9 mRNA 및 AAVS1 gRNA를 이용하는 전기천공법 후 살아있는 저캇 T 세포의 정량화로부터의 결과를 도시한다. 저캇 T 세포는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 mRNA 및 각각의 변형된 gRNA를 이용하여 전기천공되었다. 전기천공법 후 24 시간에, 1 x 105 개 세포를 15 분 동안 실온에서 FITC-컨쥬게이팅된 아넥신-V(Annexin-V) 특이적 항체를 이용하여 염색한 다음, 유세포 분석에 의한 분석 직전에 요오드화 프로피디움을 이용하여 염색하였다. 아넥신-V 또는 PI 중 하나에 대해 염색하지 않은 세포의 백분율을 막대 그래프로 제시한다.
도 21a 내지 도 21c는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9/gRNA RNP 표적화 TRAC의 전달에 기인하는 나이브 CD3+ T 세포에서의 CD3 발현의 상실을 도시한다.
도 21a는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9/gRNA(표적화 도메인 GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(서열번호 474)를 지님)) RNP 표적화 TRAC을 이용하여 전기천공된 나이브 CD3+ T 세포가 APC-CD3 항체로 염색되고, FACS에 의해 분석된 것을 도시한다. 세포를 전기천공법 후 제4 일에 분석하였다. 음성 대조군은 기능성 Cas9가 없는 표적화 도메인 GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(서열번호 474)를 지니는 gRNA를 지니는 세포이다.
도 21b는 도 21a에서의 플롯으로부터의 CD3 음성 집단의 정량화를 도시한다.
도 21c는 TRAC 좌위에서 수행한 T7E1 분석으로부터의 NHEJ% 결과를 도시한다.
도 22는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 mRNA 및 PDCD1 gRNA(표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(서열번호 508)을 지님) 또는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9/gRNA(표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(서열번호 508)을 지님) RNP 표적화 PDCD1의 전달 후 저캇 T 세포 내 PDCD1 좌위에서의 게놈 편집을 도시한다. 24 시간, 48 시간 및 72 시간에 PDCD1 좌위에 대해 수행한 T7E1 분석으로부터의 NHEJ% 결과의 정량화. 더 고수준의 NHEJ%를 RNP 대 mRNA 전달을 이용하여 검출하였다.
정의
본 명세서에서 사용되는 "도메인"은 단백질 또는 핵산의 세그먼트를 기재하기 위해 사용된다. 달리 표시되지 않는 한, 도메인은 임의의 특이적 기능적 특성을 가질 필요가 없다.
2 개 서열 사이의 상동성 또는 서열 동일성(상기 용어는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용됨)의 계산은 다음과 같이 수행된다. 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 갭은 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있고, 비교 목적을 위해 비상동성 서열은 무시될 수 있다). 최적 정렬은 갭 페널티 12, 갭 확장 페널티 4, 및 프레임 이동 갭 페널티 5로 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하는 최상 스코어로서 결정된다. 이어서, 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 제1 서열 내 위치가 제2 서열 내 대응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유되면, 상기 분자는 해당 위치에서 동일하다. 2 개의 서열 사이의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치 수의 함수이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "지배적인 gRNA 분자"는 세포 또는 대상체 내로 도입된 CRISPR/Cas 시스템의 구성성분을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 상의 표적 도메인에 대해 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 지칭한다. 지배적인 gRNA는 내인성 세포 또는 대상 서열을 표적화하지 않는다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 (a) Cas9 분자를 암호화하는 핵산; (b) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자를 표적화하는 표적화 도메인을 포함하는 gRNA(표적 유전자 gRNA)를 암호화하는 핵산; 또는 CRISPR/Cas 구성성분을 암호화하는 하나 초과의 핵산, 예를 들어 (a)와 (b) 둘 다에 대한 표적 서열에 상보성인 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, CRISPR/Cas 구성성분을 암호화하는, 예를 들어 Cas9 분자 또는 표적 유전자 gRNA를 암호화하는 핵산 분자는 지배적인 gRNA 표적화 도메인에 상보성인 하나 초과의 표적 도메인을 포함한다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 지배적인 gRNA 분자는 Cas9 분자와 복합체화하고, 예를 들어 절단에 의한 또는 핵산에 대한 결합에 의한, 표적화된 핵산의 Cas9 매개 비활성화를 초래하며, CRISPR/Cas 시스템 구성성분 생성의 중단 또는 감소를 초래하는 것으로 여겨진다. 구현예에서, Cas9 분자는 2 개의 복합체, 즉 표적 유전자 gRNA와 함께 Cas9 분자를 포함하는 복합체로서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자를 변경하는 복합체; 및 지배적인 gRNA 분자와 함께 Cas9 분자를 포함하는 복합체로서, CRISPR/Cas 시스템 구성성분, 예를 들어 Cas9 분자 또는 표적 유전자 gRNA 분자의 추가적인 생성을 방지하는 작용을 하는 복합체를 형성한다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체는 Cas9 분자를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 제어 영역 서열, 예를 들어 프로모터, Cas9 분자에 대해 전사 영역, 엑손 또는 인트론을 암호화하는 서열에 결합하거나 또는 이들의 절단을 촉진시킨다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체는 gRNA 분자에 작동가능하게 연결된 제어 영역 서열, 예를 들어 프로모터, 또는 gRNA 분자를 암호화하는 서열에 결합하거나 또는 이들의 절단을 촉진시킨다. 구현예에서, 지배적인 gRNA, 예를 들어 Cas9-표적화 지배적인 gRNA 분자, 또는 표적 유전자 gRNA-표적화 지배적인 gRNA 분자는 Cas9 분자/표적 유전자 gRNA 분자 복합체-매개 유전자 표적화의 효과를 제한한다. 구현예에서, 지배적인 gRNA는 Cas9 분자/표적 유전자 gRNA 분자 복합체의 활성에 대해 일시적 발현 수준을 두거나, 또는 다르게 제한한다. 구현예에서, 지배적인 gRNA는 오프-타겟 또는 기타 다른 원치않는 활성을 감소시킨다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 Cas9 시스템의 구성성분의 생성을 저해하고, 예를 들어 완전히 또는 실질적으로 완전히 저해하고, 이에 의해 그의 활성을 제한하거나 또는 지배한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "조절자(modulator)"는 독립체, 예를 들어 대상 분자 또는 유전자 서열의 활성(예를 들어, 효소 활성, 전사 활성 또는 번역 활성), 양, 분포 또는 구조를 변경시킬 수 있는 약물을 지칭한다. 구현예에서, 조절은 절단, 예를 들어 공유 또는 비공유 결합의 파손, 또는 공유 또는 비공유 결합의 형성, 예를 들어 대상 분자에 대한 모이어티의 부착을 포함한다. 구현예에서, 조절자는 대상 분자의 3차원, 2차, 3차 또는 4차 구조를 변경시킨다. 조절자는 대상 활성을 증가, 감소, 개시 또는 제거할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "거대 분자"는 분자량이 적어도 2 kD, 3 kD, 5 kD, 10 kD, 20 kD, 30 kD, 40 kD, 50 kD, 60 kD, 70 kD, 80 kD, 90 kD 또는 100 kD인 분자를 지칭한다. 거대 분자는 단백질, 폴리펩타이드, 핵산, 생물물질 및 탄수화물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "폴리펩타이드"는 100 개 미만의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산의 중합체를 지칭한다. 구현예에서, 이는 50 개, 20 개, 또는 10 개 미만의 아미노산 잔기를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "비상동성 말단 결합" 또는 "NHEJ"는, 예를 들어 정규 NHEJ(cNHEJ), 대안의 NHEJ(altNHEJ), 마이크로 상동성(microhomology)-매개 말단 결합(MMEJ), 단일-가닥 어닐링(SSA), 및 합성-의존적 마이크로 상동성-매개 말단 결합(SD-MMEJ)을 포함하는 결찰 매개 손상 및/또는 비-주형 매개 손상을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "기준 분자(reference molecule)", 예를 들어 기준 Cas9 분자 또는 기준 gRNA는 대상 분자, 예를 들어 대상 gRNA 분자의 대상 Cas9 분자, 예를 들어 변형 또는 후보 Cas9 분자가 비교되는 분자를 지칭한다. 예를 들어, Cas9 분자는 기준 Cas9 분자의 뉴클레아제 활성의 10% 이하를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 기준 Cas9 분자의 예는 천연 유래 비변형 Cas9 분자들, 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 써모필루스의 Cas9 분자를 포함한다. 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 그것이 비교되는 Cas9 분자와 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다. 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 서열, 예를 들어 변화, 예를 들어 돌연변이가 만들어지는 모 형태인 천연 유래 또는 공지된 서열이다.
분자의 변형과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "대체", 또는 "대체되는"은 처리 제한을 필요로 하지 않지만, 단지 대체 독립체가 존재한다는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 "소분자"는 분자량이 약 2 kD 미만, 예를 들어 약 2 kD 미만, 약 1.5 kD 미만, 약 1 kD, 또는 약 0.75 kD 미만인 화합물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "대상체"는 인간 또는 비-인간 동물 중 하나를 의미할 수 있다. 상기 용어는 포유류(예를 들어, 인간, 기타 다른 영장류, 돼지, 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트 또는 햄스터), 토끼, 기니피그, 소, 말, 고양이, 개, 양 및 염소)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 구현예에서, 대상체는 인간이다. 다른 구현예에서, 대상체는 가금류이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 (a) 질환을 저해하는 것, 즉 질환의 발생을 저지 또는 예방하는 것; (b) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환 상태의 퇴행을 야기하는 것; 및 (c) 질환을 치유하는 것을 포함하는, 포유류에서의, 예를 들어 인간에서의 질환의 치료를 의미한다.
아미노산 서열과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "X"는 달리 구체화되지 않는 한, 임의의 아미노산(예를 들어, 임의의 20 종의 천연 아미노산)을 지칭한다.
암 면역요법의 개선
양태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자를 변경함으로써 조작된 T 세포의 증식에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 조작된 T 세포가 효과적인 항-종양 반응을 시작하도록, 상기 반응은, 1) 대상체에게 충분한 수의 특이적 종양-표적화 T 세포를 전달한 후 적절하게 증식시키는 것; 2) 필요한 항-종양 활성을 유지하는데 충분한 시간 길이 동안 대상체에서 살아있는 것; 및 3) 면역세포, 종양 세포 및 종양 환경 내 기타 다른 세포에 의해 생성된 억제 인자의 영향을 피하고, 따라서 조작된 T 세포가 기능성 항-종양 표현형을 유지하는 것을 필요로 한다. 불충분한 증식 및/또는 생존뿐만 아니라 저해 인자에 대한 민감성은 암을 앓고 있는 대상체에서 조작된 T 세포의 효능의 결여에 기인할 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 암 치료 양상으로서 조작된 T 세포의 효능을 개선시키기 위해 이들 문제를 처리한다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 CBLB 유전자를 변경함으로써 조작된 T 세포의 증식에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 카시타스(Casitas) B-계통 림프종 b 단백질(CBLB에 의해 암호화됨)의 발현 감소 또는 발현 없음은 대상체에 대한 전달 후 조작된 T 세포의 증식을 촉진하기 위해 외인성 인터류킨 신호전달에 대한 필요를 감소시키는 것으로 고려된다(Stromnes, I. M. et al., 2010 J. Clin. Invest. 120, 3722-3734).
구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 PTPN6 유전자를 변경시킴으로써 조작된 T 세포의 증식에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, Src 상동성 영역 2 도메인-함유 포스파타제-1 단백질(PTPN6에 의해 암호화됨)의 발현 감소 또는 발현 없음은 후속적으로 개선된 항-종양 활성을 지니는 전달된 T 세포의 증가된 단기간 축적을 야기하는 것으로 고려된다(Stromnes, I. M. et al., 2012 J. Immunol. 189, 1812-1825).
구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 FAS 유전자를 변경시킴으로써 조작된T 세포의 증식에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, Fas 단백질의 발현 감소 또는 발현 없음은 Fas-리간드, 즉 다수 암 유형에 의해 발현되는 인자에 의한 T 세포 세포자멸사의 유도를 저해할 것으로 고려된다(Dotti, G. et al., 2005 Blood 105, 4677-4684).
구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 BID 유전자를 변경시킴으로써 조작된 T 세포의 증식에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, Bid 단백질의 발현 감소 또는 발현 없음은 Fas 경로의 활성화 후 T 세포 세포 자멸사의 유도를 방해하는 것으로 고려된다(Lei, X. Y. et al., 2009 Immunol. Lett. 122, 30-36).
구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 CTLA4 유전자를 변경함으로써 조작된 T 세포에 대한 면역 억제 인자의 효과를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 세포독성 T-림프구-연관 항원 4(CTLA4에 의해 암호화됨)의 발현 감소 또는 발현 없음은 종양 환경에서 항원 제시 세포에 의해 발현되는 CD80 또는 CD86의 결합 후 비반응 상태("아네르기")의 유도를 없애는 것으로 고려된다(Shrikant, P. et al, 1999 Immunity 11, 483-493).
구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 PDCD1 유전자를 변경시킴으로써 조작된 T 세포에 대한 면역 억제 인자의 효과를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 예정 세포사 단백질 1(PDCD1에 의해 암호화됨)의 발현 감소 또는 발현 없음은 종양 환경에서 종양 세포 또는 종양 환경 내 세포에 의해 발현된 PD1 리간드의 맞물림에 의해 T 세포 세포자멸사의 유도를 방지하는 것으로 고려된다(Topalian, S. L. et al., 2012 N. Engl. J. Med. 366, 2443-2454).
구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 TRAC 및/또는 TRBC 유전자를 변경함으로써 T 세포 특이성 및 안전성을 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, T-세포 수용체(TRAC 및 TRBC에 의해 암호화됨)의 발현 감소 또는 발현 없음은 숙주 조직의 T 세포 수용체 인식 및 숙주 조직에 대한 반응을 제거함으로써 이식편 대 숙주병을 예방하는 것으로 고려된다. 따라서, 이 접근은 "기성제품(off the shelf)" T 세포를 생성하는 데 사용될 수 있었다(Torikai et al., 2012 Blood 119, 5697-5705). 또한, 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 발현 감소 또는 발현 없음은 외인성으로 도입된 조작된 T 세포 수용체와 함께 내인성 T 세포 수용체의 잘못된 짝지어짐을 감소시키거나 또는 제거할 것이고, 따라서, 치료 효능을 개선시킬 것으로 고려된다(Provasi et al., 2012, Nature Medicine 18, 807-815).
구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 조작된 T 세포를 이용하는 암 면역요법의 치료를 개선시키기 위해 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 하나 이상을 줄이는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여 면역요법을 통해 암을 치료하는 접근이 개시된다.
일 접근에서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 하나 이상은, 예를 들어 T 세포 증식, 생존 및/또는 기능에 영향을 미치기 위해 표적화된 넉아웃 또는 넉다운으로서 표적화된다. 구현예에서, 상기 접근은 하나의 T-세포 발현 유전자(예를 들어, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자)를 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접근은 2 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 2 종을 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다.다른 구현예에서, 상기 접근은 3 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 3 종을 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접근은 4 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 4 종을 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접근은 5 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 5 종을 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접근은 6 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 6 종을 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접근은 7 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 7 종을 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접근은 8 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 각각의 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자를 넉아웃 또는 넉다운하는 것을 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 질환 개시 후 대상체의 치료를 개시하는 것을 포함한다. 구현예에서, 상기 방법은 질환 개시 후, 예를 들어 암의 개시 후 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 12 개월, 24 개월 또는 36 개월에 대상체의 치료를 잘 개시하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 질환의 진행된 단계에서 대상체의 치료를 개시하는 단계를 포함한다.
전반적으로, 질환의 모든 단계에서 대상체에 대한 치료의 개시는 대상체에게 유리한 것으로 예상된다.
본 명세서에 개시된 조성물 및 방법을 이용하여 치료될 수 있는 암은 혈액 및 고형 종양의 암을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법을 이용하여 치료될 수 있는 암은 림프종, 만성 림프성 백혈병(CLL), B 세포 급성 림프성 백혈병(B-ALL), 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종(NHL), 미만성 거대 세포 림프종(DELL), 다발성 골수종, 신세포암종(RCC), 신경아세포종, 결장직장암, 유방암, 난소암, 흑색종, 육종, 전립선암, 폐암, 식도암, 간세포 암종, 췌장암, 성상세포종, 중피종, 두경부암 및 수모세포종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자를 변경시키는 방법
본 명세서에 개시된 바와 같이, 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자는 유전자 편집에 의해, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CRISPR-Cas9 매개 방법을 이용하여 표적화(예를 들어, 변경)될 수 있다.
본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은, 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자에서 T 세포 표적 위치를 표적화(예를 들어, 변경)하는 것을 제공한다. T 세포 표적 위치는 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자에서 표적화(예를 들어, 변경)를 위한 유전자 편집, 예를 들어 CRISPR-Cas9 매개 방법을 이용함으로써 표적화(예를 들어, 변경)될 수 있다.
본 명세서에서 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자에서 T 세포 표적 위치를 표적화(예를 들어, 변경)하기 위한 방법이 개시된다.
T 세포 표적 위치를 표적화(예를 들어, 변경)하는 것은, 예를 들어 하기와 같이 달성된다,
(1) 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자를 넉아웃;
(a) 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 암호 영역에 매우 근접한 또는 암호 영역 내의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실(예를 들어, NHEJ-매개 삽입 또는 결실), 또는
(b) 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 적어도 일부를 포함하는 게놈 서열의 결실(예를 들어, NHEJ-매개 결실), 또는
(2) 유전자의 비-암호 영역, 예를 들어 프로모터 영역을 표적화함으로써 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 분자 또는 eiCas9-융합 단백질에 의해 매개되는 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 및/또는 PTPN6 유전자의 넉다운.
모든 접근은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 표적화(예를 들어, 변경)가 일어난다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 중 적어도 하나의 대립유전자에서 암호 영역 근처에 하나 이상의 파손을 도입한다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 적어도 일부에 측접하는 2 개 이상의 파손을 도입한다. 2 개 이상의 파손은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 적어도 일부를 포함하는 게놈 서열을 제거한다(예를 들어, 결실시킨다). 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 T 세포 표적 넉다운 위치의 프로모터 영역을 표적화함으로써 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 분자 또는 eiCas9-융합 단백질에 의해 매개된 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 및/또는 PTPN6 유전자를 넉다운하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기재된 모든 방법은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자를 표적화(예를 들어, 변경)하는 것을 초래한다.
하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 표적화(예를 들어, 변경)는 임의의 메커니즘에 의해 매개될 수 있다. 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 변경과 연관될 수 있는 예시적인 메커니즘은, 비-상동성 말단-결합(예를 들어, 고전적 또는 대안적), 마이크로 상동성-매개 말단 결합(MMEJ), 상동성-관련 수선(예를 들어, 내인성 공여체 주형 매개), SDSA(합성 의존적 가닥 어닐링), 단일 가닥 어닐링 또는 단일 가닥 침투를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자에서 삽입결실 또는 결실을 도입하는 것에 의한 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 넉아웃
구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 T 세포 표적 넉아웃 위치(예를 들어, 초기 암호 영역)에 매우 근접한 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실을 도입하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은, 일 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 T 세포 표적 넉아웃 위치, 예를 들어 암호 영역(예를 들어, 초기 암호 영역, 예를 들어 시작 코돈 또는 남아있는 암호 서열로부터 500 bp 이내, 예를 들어 출발 코돈으로부터 처음 500 bp의 하류)에 대한 하나 이상의 파손(예를 들어, 단일 가닥 파손 또는 이중 가닥 파손)의 도입을 포함한다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 파손(들)의 NHEJ-매개 수선은 T 세포 표적 넉아웃 위치에 매우 근접하여 내지는 T 세포 표적 넉아웃 위치 내에서 삽입결실의 NHEJ-매개 도입을 가능하게 하는 것으로 여겨진다.
구현예에서, 단일 가닥 파손은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자에서 T 세포 표적 넉아웃 위치에 매우 근접 내지는 T 세포 표적 넉아웃 위치에 도입된다(예를 들어, 하나의 gRNA 분자에 의해 위치된다). 구현예에서, 단일 gRNA 분자는 (예를 들어, Cas9 틈내기효소와 함께) T 세포 표적 넉아웃 위치, 예를 들어 암호 영역(예를 들어, 초기 암호 영역, 예를 들어 출발 코돈 또는 남아있는 암호 서열로부터 500 bp 내에서, 예를 들어 출발 코돈로부터 처음 500 bp의 하류)에서 또는 이에 매우 근접하게 단일 가닥 파손을 생성하는 데 사용된다. 구현예에서, 파손은 원치않는 표적 염색체 구성요소, 예컨대 반복체 구성요소, 예를 들어 Alu 반복부를 피하도록 위치된다.
구현예에서, 이중 가닥 파손은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 내 T 세포 표적 넉아웃 위치에서 또는 이에 매우 근접하게 도입된다(예를 들어, 하나의 gRNA 분자에 의해 위치된다). 구현예에서, 단일 gRNA 분자는 (예를 들어, Cas9 틈내기효소 이외의 Cas9 뉴클레아제와 함께) T 세포 표적 넉아웃 위치, 예를 들어 암호 영역(예를 들어, 초기 암호 영역, 예를 들어 출발 코돈 또는 남아있는 암호 서열로부터 500 bp 내에서, 예를 들어 출발 코돈로부터 처음 500 bp의 하류)에서 또는 이에 매우 근접하게 이중 가닥 파손을 생성하는 데 사용된다. 구현예에서, 파손은 원치않는 표적 염색체 구성요소, 예컨대 반복체 구성요소, 예를 들어 Alu 반복부를 회피하도록 위치된다.
구현예에서, 2 개의 단일 가닥 파손은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 내 T 세포 표적 넉아웃 위치에서 또는 이에 매우 근접하게 도입된다(예를 들어, 2 개의 gRNA 분자에 의해 위치된다). 구현예에서, 2 개의 gRNA 분자는 (예를 들어, 1 개 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소와 함께) T 세포 표적 넉아웃 위치, 예를 들어 암호 영역(예를 들어, 초기 암호 영역, 예를 들어 출발 코돈 또는 남아있는 암호 서열로부터 500 bp 내에서, 예를 들어 출발 코돈로부터 처음 500 bp의 하류)에서 또는 이에 매우 근접하게 2 개의 단일 가닥 파손을 생성하는 데 사용된다. 구현예에서, 단일 가닥 파손이 둘 다 T 세포 표적 넉아웃 위치의 상류 또는 하류에 위치되도록 gRNA 분자가 구성된다. 다른 구현예에서, 2 개의 gRNA 분자는 (예를 들어, 2 개의 Cas9 틈내기효소와 함께) 세포 표적 넉아웃 위치에서 또는 이에 매우 근접하게 2 개의 단일 가닥 파손을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 하나의 단일 가닥 파손가 상류에 위치되고 제2 단일 가닥 파손이 T 세포 표적 넉아웃 위치의 하류에 위치되도록 gRNA 분자가 구성된다. 구현예에서, 파손은 원치않는 표적 염색체 구성요소, 예컨대 반복체 구성요소, 예를 들어 Alu 반복부를 회피하도록 위치된다.
구현예에서, 파손의 2 개 세트(예를 들어, 2 개의 이중 가닥 파손)는 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 내 T 세포 표적 넉아웃 위치에서 또는 매우 근접하게 도입된다(예를 들어, 2 개의 gRNA 분자에 의해 위치된다). 구현예에서, 2 개의 gRNA 분자는 (예를 들어, Cas9 틈내기효소가 아닌 1 개 또는 2 개의 Cas9 뉴클레아제와 함께) T 세포 표적 넉아웃 위치, 예를 들어 암호 영역(예를 들어, 초기 암호 영역, 예를 들어 출발 코돈 또는 남아있는 암호 서열로부터 500 bp 내에서, 예를 들어 출발 코돈로부터 처음 500 bp의 하류)에 측접하는 2 개의 이중 가닥 파손을 생성하는 데 사용된다. 구현예에서, 파손의 세트가 둘 다 T 세포 표적 넉아웃 위치의 상류 또는 하류에 위치되도록 gRNA 분자가 구성된다. 구현예에서, 파손(들)의 하나의 세트는 상류에 위치되고, 파손(들)의 제2 세트는 T 세포 표적 넉아웃 위치의 하류에 위치되도록 gRNA 분자가 구성된다. 구현예에서, 파손은 원치않는 표적 염색체 구성요소, 예컨대 반복체 구성요소, 예를 들어 Alu 반복부를 회피하도록 위치된다.
구현예에서, 파손의 2 개 세트(예를 들어, 하나의 이중 가닥 파손 및 단일 가닥 파손의 쌍)는 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 내 T 세포 표적 넉아웃 위치에서 또는 이에 매우 근접하게 도입된다(예를 들어, 3 개의 gRNA 분자에 의해 위치된다). 구현예에서, 3 개의 gRNA 분자는 (예를 들어, Cas9 뉴클레아제 및 1 개 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소와 함께) T 세포 표적 넉아웃 위치, 예를 들어 암호 영역(예를 들어, 초기 암호 영역, 예를 들어 출발 코돈 또는 남아있는 암호 서열로부터 500 bp 내에서, 예를 들어 출발 코돈로부터 처음 500 bp의 하류)에 측접하도록 파손의 2 개 세트를 생성하는 데 사용된다. 구현예에서, 파손의 세트가 둘 다 T 세포 표적 넉아웃 위치의 상류 또는 하류에 위치되도록 gRNA 분자가 구성된다. 구현예에서, 파손(들)의 하나의 세트는 상류에 위치되고 파손(들)의 제2 세트는 T 세포 표적 넉아웃 위치의 하류에 위치되도록, gRNA 분자가 구성된다. 구현예에서, 파손은 원치않는 표적 염색체 구성요소, 예컨대 반복체 구성요소, 예를 들어 Alu 반복부를 회피하도록 위치된다.
구현예에서, 파손의 2 개 세트(예를 들어, 단일 가닥 파손의 2 개 쌍)은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 내 T 세포 표적 넉아웃 위치에서 또는 이에 매우 근접하게 도입된다(예를 들어, 4 개의 gRNA 분자에 의해 위치된다). 구현예에서, 4 개의 gRNA 분자(예를 들어, 하나 이상의 Cas9 틈내기효소와 함께)는 T 세포 표적 넉아웃 위치, 예를 들어 암호 영역(예를 들어, 초기 암호 영역, 예를 들어 출발 코돈 또는 남아있는 암호 서열로부터 500 bp 내에서, 예를 들어 출발 코돈로부터 처음 500 bp의 하류)에 측접하도록 파손의 2 개 세트를 생성하는 데 사용된다. 구현예에서, 파손의 세트는 둘 다 T 세포 표적 넉아웃 위치의 상류 또는 하류에 위치되도록 gRNA 분자가 구성된다. 구현예에서, 파손(들)의 하나의 세트는 상류에 위치되고 파손(들)의 제2 세트는 T 세포 표적 넉아웃 위치의 하류에 위치되도록 gRNA 분자가 구성된다. 구현예에서, 파손은 원치않는 표적 염색체 구성요소, 예컨대 반복체 구성요소, 예를 들어 Alu 반복부를 회피하도록 위치된다.
구현예에서, 2 개 이상의(예를 들어, 3 개 또는 4 개의) gRNA 분자는 하나의 Cas9 분자와 함께 사용된다. 다른 구현예에서, 2 개 이상의(예를 들어, 3 개 또는 4 개) gRNA가 2 개 이상의 Cas9 분자와 함께 사용될 때, 적어도 하나의 Cas9 분자는 기타 다른 Cas9 분자(들)가 아닌 상이한 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 2 개의 gRNA 분자가 2 개의 Cas9 분자와 함께 사용될 때, 하나의 Cas9 분자는 하나의 종으로부터 유래될 수 있고, 기타 다른 Cas9 분자는 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. Cas9 종은 둘 다 원한다면 단일 또는 이중-가닥 파손을 생성하기 위해 사용된다.
하나 초과의 유전자 세포 내 변경을 위해 표적화될 때, 표적화된 핵산은 하나 이상의 Cas9 단백질에 의해 변경, 예를 들어 절단될 수 있다. 예를 들어, 2 개의 유전자가 변경을 위해 표적화된다면, 예를 들어 유전자가 둘 다 넉아웃을 위해 표적화된다면, 동일한 또는 상이한 Cas9 단백질은 각각의 유전자를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 유전자는 둘 다(또는 세포에서 표적화된 각각의 유전자), 이중 가닥 파손을 생성하기 위해 Cas9 뉴클레아제에 의해 절단된다. 다른 구현예에서, 유전자는 둘 다(또는 세포에서 표적화된 각각의 유전자), 이중 가닥 파손을 생성하기 위해 Cas9 뉴클레아제에 의해 절단된다. 다른 구현예에서, 세포 내의 하나 이상의 유전자는 Cas9 뉴클레아제에 의한 절단에 의해 변경될 수 있고, 동일한 세포 내의 하나 이상의 유전자는 Cas9 틈내기효소에 의한 절단에 의해 변경될 수 있다. 표적 핵산, 예를 들어 세포 내 상이한 유전자를 절단하기 위해 2 개 이상의 Cas9 단백질이 사용될 때, Cas9 단백질 상이한 박테리아 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 세포 내의 하나 이상의 유전자는 하나의 박테리아 종으로부터의 Cas9 단백질에 의한 절단에 의해 변경될 수 있고, 동일한 세포 내의 하나 이상의 유전자 상이한 박테리아 종으로부터 유래된 Cas9 단백질에 의한 절단에 의해 변경될 수 있다. 상이한 종으로부터의 2 개 이상의 Cas9 단백질이 사용될 때, 그들은 표적 핵산 내 목적으로 하는 위치에서 목적으로 하는 유전자 내 절단의 특이성을 제어하기 위해 동시에 전달되거나 또는 순차적으로 전달될 수 있다는 것이 상정된다.
일부 구현예에서, 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인 및 제2 gRNA 분자의표적화 도메인은 표적 핵산 분자의 반대 가닥에 대해 상보성이다. 일부 구현예에서, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 PAM이 바깥으로 배향되도록 구성된다.
하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 적어도 일부를 포함하는 게놈 서열을 결실시키는 것에 의한(예를 들어, NHEJ-매개 결실) 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 넉아웃
구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 유전자의 적어도 일부를 포함하는 게놈 서열의 결실을 도입하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은, 구현예에서, 상기 방법은 2 개의 이중 가닥 파손(T 세포 표적 넉아웃 위치에 대해 하나는 5' 그리고 다른 하나는 3'임(즉, 측접함))의 도입을 포함한다. 구현예에서, 2 개의 gRNA, 예를 들어 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA 분자는 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 내 T 세포 표적 넉아웃 위치의 반대측 상에 파손의 2 개 세트(예를 들어, 2 개의 이중 가닥 파손, 1 개의 이중 가닥 파손 및 단일 가닥 파손의 쌍 또는 단일 가닥 파손의 2 개 쌍)를 위치시키도록 구성된다.
구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 적어도 일부를 포함하는 게놈 서열을 결실시키는 단계(예를 들어, NHEJ-매개 결실)를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은, 일 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 유전자(예를 들어, 암호 영역, 예를 들어 초기 암호 영역, 또는 비-암호 영역, 예를 들어 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 유전자의 비-암호 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인트론, 3'UTR, 및/또는 폴리아데닐화 신호) 내 영역에 측접하도록 파손의 2 개 세트(예를 들어, 이중 가닥 파손의 쌍, 하나의 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손의 쌍, 또는 단일 가닥 파손의 2 개 쌍)를 도입하는 단계를 포함한다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 파손(들)의 NHEJ-매개 수선은, 예를 들어 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 유전자의 대립유전자 중 하나 또는 둘 다를 넉아웃하기 위해 유전자의 발현을 감소 또는 제거하는 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 유전자의 변경을 가능하게 하는 것으로 여겨진다.
구현예에서, 파손의 2 개 세트(예를 들어, 2 개의 이중 가닥 파손)은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 내 T 세포 표적 넉아웃 위치에서 또는 이에 매우 근접하게 도입된다(예를 들어, 2 개의 gRNA 분자에 의해 위치된다). 구현예에서, 2 개의 gRNA 분자(예를 들어, Cas9 틈내기효소가 아닌 1 개 또는 2 개의 Cas9 뉴클레아제와 함께)는 T 세포 표적 넉아웃 위치에 측접하도록 파손의 2 개 세트를 생성하는 데 사용되며, 예를 들어 파손(들)의 하나의 세트는 상류에 위치되고 파손(들)의 제2 세트는 T 세포 표적 넉아웃 위치의 하루에 위치되도록 gRNA 분자가 구성된다. 구현예에서, 파손은 원치않는 표적 염색체 구성요소, 예컨대 반복체 구성요소, 예를 들어 Alu 반복부를 회피하도록 위치된다.
구현예에서, 파손의 2 개 세트(예를 들어, 하나의 이중 가닥 파손 및 단일 가닥 파손의 쌍)는 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 내 T 세포 표적 넉아웃 위치에서 또는 이에 매우 근접하게 (예를 들어, 3 개의 gRNA 분자에 의해 위치됨) 도입된다. 구현예에서, 3 개의 gRNA 분자는 (예를 들어, Cas9 뉴클레아제 및 1 개 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소와 함께) T 세포 표적 넉아웃 위치에 측접하도록 파손의 2 개 세트를 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 파손(들)의 하나의 세트는 상류에 위치되고 파손(들)의 제2 세트는 T 세포 표적 넉아웃 위치의 하류에 위치되도록 gRNA 분자가 구성된다. 구현예에서, 파손은 반복체 구성요소, 예를 들어 Alu 반복부와 같은 원치않는 표적 염색체 구성요소를 회피하도록 위치된다.
구현예에서, 파손의 2 개 세트(예를 들어, 단일 가닥 파손의 2 개 쌍)은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 내 T 세포 표적 넉아웃 위치에서 또는 이에 매우 근접하게 도입된다(예를 들어, 4 개의 gRNA 분자에 의해 위치된다). 구현예에서, 4 개의 gRNA 분자는 (예를 들어, Cas9 뉴클레아제 및 1 개 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소와 함께) T 세포 표적 넉아웃 위치에 측접하도록 파손의 2 개 세트를 생성하는 데 사용되며, 예를 들어 파손(들)의 하나의 세트는 상류에 위치되고 파손(들)의 제2 세트는 T 세포 표적 넉아웃 위치의 하류에 위치되도록 gRNA 분자가 구성된다. 구현예에서, 파손은 원치않는 표적 염색체 구성요소, 예컨대 반복체 구성요소, 예를 들어 Alu 반복부를 회피하도록 위치된다.
구현예에서, 2 개 이상의 (예를 들어, 3 개 또는 4 개의) gRNA 분자는 하나의 Cas9 분자와 함께 사용된다. 다른 구현예에서, 2 개 이상의(예를 들어, 3 또는 4 개의) gRNA가 2 개 이상의 Cas9 분자와 함께 사용될 때, 적어도 하나의 Cas9 분자는 기타 다른 Cas9 분자(들)가 아닌 상이한 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 2 개의 gRNA 분자가 2 개의Cas9 분자와 함께 사용될 때, 하나의 Cas9 분자는 하나의 종으로부터 유래될 수 있고, 기타 다른 Cas9 분자는 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. Cas9 종은 둘 다 목적으로 하는 단일 또는 이중-가닥 파손을 생성하기 위해 사용된다.
하나 초과의 유전자가 세포 내 변경을 위해 표적화될 때, 표적화된 핵산은 하나 이상의 Cas9 단백질에 의해 변경될 수 있고, 예를 들어 절단될 수 있다. 예를 들어, 2 개의 유전자가 변경을 위해 표적화된다면, 예를 들어 유전자가 둘 다넉아웃을 위해 표적화된다면, 동일한 또는 상이한 Cas9 단백질은 각각의 유전자를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 유전자(또는 세포 내 표적화된 각각의 유전자)는 둘 다, 이중 가닥 파손을 생성하기 위해 Cas9 뉴클레아제에 의해 절단된다. 다른 구현예에서, 유전자(또는 세포 내 표적화된 각각의 유전자)는 둘 다, 이중 가닥 파손을 생성하기 위해 Cas9 뉴클레아제에 의해 절단된다. 다른 구현예에서, 세포 내의 하나 이상의 유전자는 Cas9 뉴클레아제에 의한 절단에 의해 변경될 수 있고, 동일한 세포 내의 하나 이상의 유전자는 Cas9 틈내기효소에 의한 절단에 의해 변경될 수 있다. 표적 핵산, 예를 들어 세포 내 상이한 유전자를 절단하기 위해 2 개 이상의 Cas9 단백질이 사용될 때, Cas9 단백질은 상이한 박테리아 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 세포 내의 하나 이상의 유전자는하나의 박테리아 종으로부터의 Cas9 단백질에 의한 절단에 의해 변경될 수 있고, 동일한 세포 내의 하나 이상의 유전자 상이한 박테리아 종으로부터 유래된 Cas9 단백질에 의한 절단에 의해 변경될 수 있다. 상이한 종으로부터의2 개 이상의 Cas9 단백질이 사용될 때, 그들은 표적 핵산 내 목적으로 하는 위치에서 목적으로 하는 유전자 내 절단의 특이성을 제어하기 위해 동시에 전달되거나 또는 순차적으로 전달될 수 있다는 것이 상정된다.
일부 구현예에서, 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인 및 제2 gRNA 분자의 표적화 도메인은 표적 핵산 분자의 반대 가닥에 대해 상보적이다. 일부 구현예에서, PAM이 바깥으로 배향되도록 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자가 구성된다.
효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 분자에 의해 매개되는 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 및/또는 PTPN6 유전자의 넉다운
표적화된 넉다운 접근은 기능성 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 및/또는 PTPN6 유전자 산물의 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은, 구현예에서, 표적화된넉다운은, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 및/또는 PTPN6 유전자의 전사를 변경하기 위해, 예를 들어 전사를 차단하거나, 감소시키거나 또는 줄이기 위해 전사 리프레서 도메인 또는 염색질 변형 단백질에 융합된 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 분자 또는 eiCas9를 표적화함으로써 매개된다.
본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 및/또는 PTPN6 유전자의 프로모터 영역을 표적화함으로써 HIV 감염 또는 AIDS를 치료 또는 예방하기 위해 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 및/또는 PTPN6 유전자의 발현을 변경시키는 데 사용될 수 있다. 구현예에서, 프로모터 영역은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 및/또는 PTPN6 유전자의 발현을 넉다운시키도록 표적화된다. 표적화된넉다운 접근은 기능성 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 및/또는 PTPN6 유전자 산물의 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은, 구현예에서, 표적화된넉다운은 하나 이상의 T 세포-발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, P 및/또는 PTPN6 유전자의 전사를 변경하기 위해, 예를 들어 전사를 차단하거나, 감소시키거나 또는 줄이기 위해 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9 융합 단백질(예를 들어,전사 리프레서 도메인에 융합된 eiCas9 또는 염색질 변형 단백질)을 표적화함으로써 매개된다.
구현예에서, 하나 이상의 eiCas9는 하나 이상의 내인성 전사 인자의 결합을 차단하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, eiCas9는 염색질 변형 단백질에 융합될 수 있다. 염색질 상태를 변경시키는 것은 표적 유전자의 감소된 발현을 초래할 수 있다. 하나 이상의 염색질 변형 단백질에 융합된 하나 이상의 eiCas9는 염색질 상태를 변경하기 위해 사용될 수 있다.
하나 초과의 유전자 세포 내 변경을 위해 표적화될 때, 표적화된 핵산은, 예를 들어 하나 이상의 eiCas9 단백질 또는 eiCas9 융합 단백질에 의해 변용될 수 있다. 2 개 이상의 eiCas9 단백질 또는 eiCas9 융합 단백질이 사용될 때, eiCas9 단백질 또는 eiCas9 융합 단백질은 상이한 박테리아 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 세포 내의 하나 이상의 유전자는 하나의 박테리아 종으로부터의 eiCas9 단백질 또는 eiCas9 융합 단백질에 의해 변경될 수 있고, 동일한 세포 내의 하나 이상의 유전자는 상이한 박테리아 종으로부터의 eiCas9 단백질 또는 eiCas9 융합 단백질에 의해 변경될 수 있다. 상이한 종으로부터의 2 개 이상의 eiCas9 단백질 또는 eiCas9 융합 단백질이 사용될 때, 그들은 표적 핵산 내 목적으로 하는 위치에서 목적으로 하는 유전자 내 절단의 특이성을 제어하기 위해 동시에 전달되거나 또는 순차적으로 전달될 수 있다는 것이 상정된다.
이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 유전자 조작된 T 세포의 입양 전달은 암의 잠재적 치료를 제공할 수 있다는 것이 고려된다. 세포 표면 수용체를 암호화하는 유전자는 T 세포 내로 삽입된다. 유전자 조작된 T 세포는 대부분의 정상 조직으로부터 종양 세포를 식별하기 위해 사용될 수 있는 종양 연관 항원을 검출할 수 있다.
표적 유전자(예를 들어, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자) 중 1 개 또는 2 개의 대립유전자의 넉아웃 또는 넉다운은 질환 개시를 위해 수행될 수 있지만, 바람직하게는 질환 과정의 초기에 수행될 수 있다.
I. gRNA 분자
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어로서 gRNA 분자는 표적 핵산에 대한 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 특이적 표적화 또는 귀소를 촉진하는 핵산을 지칭한다. gRNA 분자는 때때로 본 명세서에서 "키메라" gRNA, 또는 모듈(하나 초과의, 그리고 통상적으로 2 개의 별개의 RNA 분자를 포함함)로서 지칭되는 단분자(단일 RNA 분자를 가짐)일 수 있다. gRNA 분자는 다수의 도메인을 포함한다. gRNA 분자 도멤인은 이하에 더 상세하게 기재된다.
도메인이 표시된 몇몇 예시적 gRNA 구조가 도 1에 제공된다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 3차원 형태 또는 gRNA의 활성 형태의 가닥내- 또는 가닥간 상호작용에 대해, 고 상보성 영역은 때때로 도 1에서 이중가닥 및 본 명세서에 제공된 다른 도시로서 나타낸다.
구현예에서, 단분자 또는 키메라, gRNA는 바람직하게는 5'으로부터 3'까지 하기를 포함한다:
표적화 도메인(FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내 표적 핵산에 상보성임), 예를 들어 임의의 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32로부터의 표적화 도메인;
제1 상보성 도메인;
연결 도메인;
제2 상보성 도메인(제1 상보성 도메인에 대해 상보성임);
근위 도메인; 및
선택적으로, 꼬리 도메인.
구현예에서, 모듈 gRNA는 하기를 포함한다:
바람직하게는 5'으로부터 3'까지 하기를 포함하는 제1 가닥;
표적화 도메인(FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 내 표적 핵산에 대해 상보성임), 예를 들어,표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32로부터의 표적화 도메인; 및
제1 상보성 도메인; 및
바람직하게는 5'으로부터 3'까지 하기를 포함하는 제2 가닥:
선택적으로, 5' 연장 도메인;
제2 상보성 도메인;
근위 도메인; 및
선택적으로, 꼬리 도메인.
도메인은 이하에 간략하게 논의된다:
표적화 도메인
도 1은 표적화 도메인의 위치의 예를 제공한다.
표적화 도메인은 표적 핵산 상에서 표적 서열에 상보성인, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상보적인, 예를 들어 완전하게 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 표적화 도메인은 RNA 분자의 부분이며, 따라서 염기 우라실(U)을 포함하는 한면, gRNA 분자를 암호화하는 임의의 DNA는 염기 티민(T)을 포함할 것이다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 구현예에서, 표적 서열을 지니는 표적화 도메인의 상보성은 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 표적 핵산과의 상호작용의 특이성이 기여하는 것으로 여겨진다. 표적화 도메인 및 표적 서열 쌍에서, 표적화 도메인 내 우라실 염기는 표적 서열 내 아데닌 염기와 쌍을 이룬다는 것이 이해된다. 구현예에서, 표적 도메인 그 자체는 5'에서 3' 방향으로 선택적 2차 도메인 및 코어 도메인을 포함한다. 구현예에서, 코어 도메인은 표적 서열과 완전히 상보성이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 5 개 내지 50 개의 뉴클레오타이드이다. 표적화 도메인과 상보적인 표적 핵산의 가닥은 본 명세서에서 상보적 가닥으로서 지칭된다. 도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는 변형, 예를 들어 본 명세서의 부문 VIII에서 발견되는 변형을 가질 수 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 16 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 17 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 18 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 19 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
*구현예에서, 표적화 도메인은 20 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 21 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 22 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 23 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 24 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 25 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 26 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
표적화 도메인은 이하에 더욱 상세하게 논의된다.
제1 상보성 도메인
도 1a 내지 도 1g는 제1 상보성 도메인의 예를 제공한다.
제1 상보성 도메인은 제2 상보성 도메인과 상보적이고, 구현예에서, 적어도 일부 생리학적 조건 하에서 이중가닥 영역을 형성하는데 제2 상보성 도메인에 대해 충분한 상보성을 가진다. 구현예에서, 제1 상보성 도메인은 길이로 5 개 내지 30 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제1 상보성 도메인은 길이로 5 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제1 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제1 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 22 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제1 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 18 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제1 상보적 도메인은 길이로 7 내지 15 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제1 상보적 도메인은 길이로 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개 또는 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인은 5'에서 3' 방향으로 5' 서브도메인, 중앙 서브도메인, 및 3' 서브도메인인 3 개의 서브도메인을 포함한다. 구현예에서, 5' 서브도메인은 길이로 4 개 내지 9 개, 예를 들어 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개 또는 9 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 중앙 서브도메인은 길이로 1 개, 2 개 또는 3 개, 예를 들어 1 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 3' 서브도메인은 길이로 3 개 내지 25 개, 예를 들어 4 개 내지 22 개, 4 개 내지 18 개, 또는 4 개 내지 10 개, 또는 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개 또는 25 개의 뉴클레오타이드이다.
제1 상보성 도메인은 천연 유래 제1 상보성 도메인과 상동성을 공유할 수 있거나, 또는 천연 유래 제1 상보성 도메인으로부터 유래될 수 있다. 구현예에서, 이는 본 명세서에 개시된 제1 상보성 도메인, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스트렙토코커스 써모필루스 제1 상보성 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
제1 상보성 도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는 변형, 예를 들어 본 명세서의 부문 VIII에서 발견되는 변형을 가질 수 있다.
제1 상보성 도메인은 이하에 더 상세하게 논의된다.
연결 도메인
도 1a 내지 도 1g는 연결 도메인의 예를 제공한다.
연결 도메인은 제1 상보성 도메인을 단분자 gRNA의 제2 상보성 도메인과 연결하는 작용을 한다. 연결 도메인은 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인을 공유적으로 또는 비공유적으로 연결할 수 있다. 구현예에서, 연결은 공유적이다. 구현예에서, 연결 도메인은 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인에 공유적으로 결합하며, 예를 들어 도 1b 내지 도 1e를 참조한다. 구현예에서, 연결 도메인은 제1 상보성 도메인 내지 제2 상보성 도메인 사이에 개재된 공유 결합이거나 또는 공유 결합을 포함한다. 통상적으로, 연결 도메인은 하나 이상의, 예를 들어 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 또는 10 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
모듈 gRNA 분자에서, 2 개의 분자는 상보성 도메인의 혼성화 때문에 결합되며, 예를 들어 도 1a를 참조한다.
매우 다양한 연결 도메인은 단분자 gRNA 분자에서 사용하기에 적합하다. 연결 도메인은 공유 결합으로 이루어질 수 있거나, 또는 하나 또는 소수의 뉴클레오타이드, 예를 들어 길이로 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드만큼 짧을 수 있다. 구현예에서, 연결 도메인은 길이로 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 15 개, 20 개 또는 25 개 이상의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 연결 도메인은 길이로 2 개 내지 50 개, 2 개 내지 40 개, 2 개 내지 30 개, 2 개 내지 20 개, 2 개 내지 10 개 또는 2 개 내지 5 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 연결 도메인은 천연 유래 서열, 예를 들어 제2 상보성 도메인에 대해 5'인 tracrRNA의 서열과 상동성을 공유하거나, 또는 이로부터 유래된다. 구현예에서, 연결 도메인은 본 명세서에 개시된 연결 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
연결 도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는 변형, 예를 들어 본 명세서의 부문 VIII에서 발견되는 변형을 가질 수 있다.
연결 도메인은 이하에서 더 상세하게 논의된다.
5' 연장 도메인
구현예에서, 모듈 gRNA는 본 명세서에서 5' 연장 도메인으로 지칭되는 제2 상보성 도메인에 대해 5'인 추가적인 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 도 1a를 참조한다. 구현예에서, 5' 연장 도메인은 길이로 2 개 내지 10 개, 2 개 내지 9 개, 2 개 내지 8 개, 2 개 내지 7 개, 2 개 내지 6 개, 2 개 내지 5 개, 또는 2 개 내지 4 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 5' 연장 도메인은 길이로 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이상의 뉴클레오타이드이다.
제2 상보성 도메인
도 1a 내지 도 1g는 제2 상보성 도메인의 예를 제공한다.
제2 상보성 도메인은 제1 상보성 도메인과 상보성이고, 구현예에서, 적어도 일부 생리학적 조건 하에서 이중가닥 영역을 형성하기 위해 제2 상보성 도메인과 충분한 상보성을 가진다. 구현예에서, 예를 들어 도 1a 내지 도 1b에 나타낸 바와 같이, 제2 상보성 도메인은 제1 상보성 도메인과의 상보성을 결여하는 서열, 예를 들어 이중가닥 영역으로부터의 고리에서 제외된(loop out) 서열을 포함할 수 있다.
구현예에서, 제2 상보성 도메인은 길이로 5 개 내지 27 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 이는 제1 상보성 영역보다 더 길다. 구현예에서, 제2 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 27 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제2 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제2 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 20 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제2 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 17 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 상보적 도메인은 길이로 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 제2 상보성 도메인은 5'에서 3' 방향으로 5' 서브도메인,중앙 서브도메인, 및 3' 서브도메인인 3 개의 서브도메인을 포함한다. 구현예에서, 5' 서브도메인은 길이로 3 개 내지 25 개, 예를 들어 4 개 내지 22 개, 4 개 내지 18 개, 또는 4 개 내지 10 개, 또는 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개 또는 25 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 중앙 서브도메인은 길이로 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개, 예를 들어 3 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 3' 서브도메인은 길이로 4 개 내지 9 개, 예를 들어 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개 또는 9 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인의 5' 서브도메인 및 3' 서브도메인은 각각, 제2 상보성 도메인의 3' 서브도메인 및 5' 서브도메인과 상보성, 예를 들어 완전히 상보성이다.
제2 상보성 도메인은 천연 유래 제2 상보성 도메인과 상동성을 공유할 수 있거나 또는 천연 유래 제2 상보성 도메인으로부터 유래될 수 있다. 구현예에서, 이는 본 명세서에 개시된 제2 상보성 도메인, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스트렙토코커스 써모필루스 제1 상보성 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
제2 상보성 도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는, 변형, 예를 들어 본 명세서의 부문 VIII에서 발견되는 변형을 가질 수 있다.
근위 도메인
도 1a 내지 도 1g는 근위 도메인의 예를 제공한다.
구현예에서, 근위 도메인은 길이로 5 개 내지 20 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 근위 도메인은 천연 유래 근위 도메인과 상동성을 공유하거나 또는 천연 유래 근위 도메인으로부터 유래될 수 있다. 구현예에서, 이는 본 명세서에 개시된 근위 도메인, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스트렙토코커스 써모필루스 근위 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
근위 도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는 변형, 예를 들어 본 명세서의 부문 VIII에서 발견되는 변형을 가질 수 있다.
꼬리 도메인
도 1a 내지 도 1g는 꼬리 도메인의 예를 제공한다.
도 1a 및 도 1b 내지 도 1f에서 꼬리 도메인의 조사에 의해 알 수 있는 바와 같이, 꼬리 도메인의 넓은 스펙트럼은 gRNA 분자에서 사용하기에 적합하다. 구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 0 개(없음), 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 꼬리 도메인 뉴클레오타이드는 천연 유래 꼬리 도메인의 5' 말단으로부터의 서열로부터 유래되거나 또는 이것과 상동성을 공유하며, 예를 들어 도 1d 또는 도 1e를 참조한다. 구현예에서, 꼬리 도메인은 서로에 대해 상보성이고, 적어도 일부 생리적 조건 하에서, 이중가닥 영역을 형성하는 서열을 포함한다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 없거나 또는 길이로 1 개 내지 50 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 꼬리 도메인은 천연 유래 근위 꼬리 도메인과 상동성을 공유하거나 또는 이로부터 유래될 수 있다. 구현예에서, 이는 본 명세서에 개시된 꼬리 도메인, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스트렙토코커스 써모필루스 꼬리 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 시험관내 또는 생체내 전사 방법과 관련된 3' 말단에서 뉴클레오타이드를 포함한다. T7 프로모터가 gRNA의 시험관내 전사를 위해 사용될 때, 이들 뉴클레오타이드는 DNA 주형의 3' 말단 앞에 존재하는 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다. U6 프로모터가 생체내 전사를 위해 사용될 때, 이들 뉴클레오타이드는 서열 UUUUUU일 수 있다. 대안의 pol-III 프로모터가 사용될 때, 이들 뉴클레오타이드는 다양한 수 또는 유라실 염기일 수 있거나 또는 대안의 염기를 포함할 수 있다.
gRNA 분자의 도메인은 이하에 더 상세하게 기재된다.
표적화 도메인
gRNA의 "표적화 도메인"은 표적 핵산 상의 "표적 도메인"에 대해 상보성이다. 코어 도메인 표적을 포함하는 표적 핵산의 가닥은 본 명세서에서 표적 핵산의 "상보성 가닥"으로서 지칭된다. 표적화 도메인의 선택에 대한 가이드는, 예를 들어 문헌[Fu Y et al., Nat Biotechnol 2014 (doi: 10.1038/nbt.2808) 및 Sternberg SH et al., Nature 2014 (doi: 10.1038/nature13011)]에서 찾을 수 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이다.
*구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 16 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 17 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 18 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 19 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 20 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 21 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 22 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 23 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 24 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 25 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
*구현예에서, 표적화 도메인은 26 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 10+/-5 개, 20+/-5 개, 30+/-5 개, 40+/-5 개, 50+/-5 개, 60+/-5 개, 70+/-5 개, 80+/-5 개, 90+/-5 개 또는 100+/-5 개 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 20+/-5 개의 뉴클레오타이드이다.
*구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 20+/-10 개, 30+/-10 개, 40+/-10 개, 50+/-10 개, 60+/-10 개, 70+/-10 개, 80+/-10 개, 90+/-10 개 또는 100+/-10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 30+/-10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 10 개 내지 100 개, 10 개 내지 90 개, 10 개 내지 80 개, 10 개 내지 70 개, 10 개 내지 60 개, 10 개 내지 50 개, 10 개 내지 40 개, 10 개 내지 30 개, 10 개 내지 20 개 또는 10 개 내지 15 개의 뉴클레오타이드이다.
다른 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 20 개 내지 100 개, 20 개 내지 90 개, 20 개 내지 80 개, 20 개 내지 70 개, 20 개 내지 60 개, 20 개 내지 50 개, 20 개 내지 40 개, 20 개 내지 30 개, 또는 20 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이다.
통상적으로 표적화 도메인은 표적 서열과 완전한 상보성을 가진다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 표적화 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보적이지 아니한 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개의 뉴클레오타이드를 갖거나 또는 포함한다.
구현예에서, 표적 도메인은 그의 5' 말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에서 표적화 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드와 상보적인 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 표적 도메인은 그의 3' 말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에서 표적화 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드와 상보적인 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적 도메인은 그의 5' 말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에서 표적화 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드와 상보적이지 아니한 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 표적 도메인은 그의 3' 말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에서 표적화 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드와 상보적이지 아니한 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, gRNA의 기타 다른 특성과 함께 상보성 정도는 표적 핵산에 대해 Cas9 분자를 표적화시키기에 충분하다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인에 상보적이지 아니한("비상보적 뉴클레오타이드") 2 개의 연속적 뉴클레오타이드, 예를 들어 표적화 도메인의 5' 말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에 있는, 표적화 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서, 또는 표적화 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 비상보적 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인에 대해 상보적이지 아니한 표적화 도메인의 5' 말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에 있는, 표적화 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서, 또는 표적화 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 뉴클레오타이드는 없다.
구현예에서, 표적화 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있는, 표적화 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있는, 또는 표적화 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 이상의 뉴클레오타이드인 영역 내의 비상보적 뉴클레오타이드는 없다.
구현예에서, 표적화 도메인 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어 부문 VIII에서 제공되는 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 표적화 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 표적화 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 표적화 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형, 예를 들어 2-아세틸화, 예를 들어 2' 메틸화 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개 이상의 변형을 포함한다. 구현예에서, 표적화 도메인은 그의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 변형을 포함한다. 구현예에서, 표적화 도메인은 그의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 2 개의 연속적 뉴클레오타이드, 예를 들어 표적화 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있는, 표적화 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있는, 표적화 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 뉴클레오타이드에서 변형을 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서, 표적화 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 또는 표적화 도메인 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 2 개의 연속적 뉴클레오타이드는 없다. 구현예에서, 표적화 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서, 표적화 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 또는 표적화 도메인 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 뉴클레오타이드는 없다.
표적화 도메인 내의 변형은 부문 IV에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택되는 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 표적화 도메인을 갖는 gRNA는 부문 IV의 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 표적화 도메인은 단독으로, 또는 선택되는 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 기타 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 모든 변형된 뉴클레오타이드는 표적 도메인 내에 존재하는 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성이고 표적 도메인 내에 존재하는 대응하는 뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있다. 다른 구현예에서, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개 이상의 변형된 뉴클레오타이드는 표적 도메인 내에 존재하는 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성이 아니거나 또는 혼성화할 수 없다.
구현예에서, 표적화 도메인은 바람직하게는 5'→3' 방향으로 2차 도메인 및 코어 도메인을 포함한다. 이들 도메인은 이하에서 더 상세하게 논의된다.
표적화 도메인의 코어 도메인 및 2차 도메인
표적화 도메인의 "코어 도메인"은 표적 핵산 상의 "코어 도메인 표적"에 대해 상보성이다. 구현예에서, 코어 도메인은 표적화 도메인의 3' 말단으로부터 약 8 개 내지 약 13 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 표적화 도메인의 가장 3'의 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드)를 포함한다.
구현예에서, 2차 도메인은 없거나 또는 선택적이다.
구현예에서, 코어 도메인 및 표적화 도메인은 독립적으로 길이로 6+/-2 개, 7+/-2 개, 8+/-2 개, 9+/-2 개, 10+/-2 개, 11+/-2 개, 12+/-2 개, 13+/-2 개, 14+/-2 개, 15+/-2 개, 또는 16+/-2 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 코어 도메인 및 표적화 도메인은 독립적으로 길이로 10+/-2 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 코어 도메인 및 표적화 도메인은 독립적으로 길이로 10+/-4 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 코어 도메인 및 표적화 도메인은 길이로 독립적으로 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 또는 16 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 코어 도메인 및 표적화 도메인은 독립적으로 길이로 3 개 내지 20 개, 4 개 내지 20 개, 5 개 내지 20 개, 6 개 내지 20 개, 7 개 내지 20 개, 8 개 내지 20 개, 9 개 내지 20 개, 10 개 내지 20 개 또는 15 개 내지 20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 코어 도메인 및 표적화 도메인은독립적으로 길이로 3 개 내지 15 개, 예를 들어 6 개 내지 15 개, 7 개 내지 14 개, 7 개 내지 13 개, 6 개 내지 12 개, 7 개 내지 12 개, 7 개 내지 11 개, 7 개 내지 10 개, 8 개 내지 14 개, 8 개 내지 13 개, 8 개 내지 12 개, 8 개 내지 11 개, 8 개 내지 10 개 또는 8 개 내지 9 개의 뉴클레오타이드이다.
코어 도메인은 보어 도메인 표적과 상보적이다. 통상적으로 코어 도메인은 코어 도메인 표적과 정확한 상보성을 가진다. 일부 구현예에서, 코어 도메인은 코어 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드와 상보적이지 아니한 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA의 기타 다른 특성과 함께 상보성 정도는 Cas9 분자를 표적 핵산에 대해 표적화시키기에 충분하다.
gRNA의 표적화 도메인의 "2차 도메인"은 표적 핵산의 "2차 도메인 표적"에 대해 상보성이다.
구현예에서, 2차 도메인은 코어 도메인에 대해 5'에 위치된다.
구현예에서, 2차 도메인은 없거나 또는 선택적이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 12 개 내지 17 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 12 개 내지 17 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 11 개 내지 16 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 10 개 내지 15 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 9 개 내지 14 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 7 개 내지 12 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 6 개 내지 11 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 5 개 내지 10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 4 개 내지 9 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 3 개 내지 8 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 2차 도메인은 길이로 0 개, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개 또는 15 개의 뉴클레오타이드이다.
2차 도메인은 2차 도메인 표적과 상보성을 가진다. 통상적으로 2차 도메인은 2차 도메인 표적과 정확한 상보성을 가진다. 일부 구현예에서, 2차 도메인은 2차 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드와 상보성이 아닌 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 구현예에서, gRNA의 기타 다른 특성과 함께 상보성 정도는 표적 핵산에 Cas9 분자를 표적화시키는데 충분하다.
구현예에서, 코어 도메인 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어 부문 VIII에서 제공된 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 코어 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 코어 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 코어 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형(예를 들어, 리보스 상의 2' 위치에서의 변형), 예를 들어 2-아세틸화, 예를 들어 2' 메틸화 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)을 포함할 수 있다. 통상적으로, 코어 도메인은 1 개, 2 개 또는 3 개 이하의 변형을 함유할 것이다.
코어 도메인 내 변형은 부문 IV에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택되는 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 코어 도메인을 갖는 gRNA는 부문 IV의 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 코어 도메인은 단독으로, 또는 선택되는 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 기타 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, 2차 도메인 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어 부문 VIII에서 제공되는 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 2차 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 2차 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 2차 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형, 예를 들어 2-아세틸화, 예를 들어 2' 메틸화 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)을 포함할 수 있다. 통상적으로, 2차 도메인은 1 개, 2 개 또는 3 개 이하의 변형을 함유할 것이다.
2차 도메인 내 변형은 부문 IV에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택되는 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 2차 도메인을 갖는 gRNA는 부문 IV의 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 2차 도메인은 단독으로, 또는 선택되는 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 기타 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, (1) 코어 도메인과 그의 표적 사이의 상보성 정도, 및 (2) 2차 도메인과 그의 표적 사이의 상보성 정도는 상이할 수 있다. 구현예에서, (1)은 (2)보다 클 수 있다. 구현예에서, (1)은 (2)보다 적을 수 있다. 구현예에서, (1)과 (2)는 동일하고, 예를 들어 각각은 그의 표적과 완전히 상보성일 수 있다.
구현예에서, (1) 코어 도메인의 뉴클레오타이드의 변형(예를 들어, 부문 VIII로부터의 변형)의 수와 (2) 2차 도메인의 뉴클레오타이드의 변형(예를 들어, 부문 VIII로부터의 변형)의 수는 상이할 수 있다. 구현예에서, (1)은 (2)보다 적을 수 있다. 구현예에서, (1)은 (2)보다 클 수 있다. 구현예에서, (1)과 (2)는 동일할 수 있고, 예를 들어 각각은 변형이 없을 수 있다.
제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인
제1 상보성 도메인은 제2 상보성 도메인과 상보성이다.
통상적으로 제1 상보성 도메인은 제2 상보성 도메인 표적과 정확한 상보성을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인은 제2 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성이 아닌 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 구현예에서, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개, 예를 들어 3 개의 뉴클레오타이드는 이중가닥에서 짝지어지지 않을 것이며, 예를 들어 비이중가닥 또는 루프를 벗어난 영역을 형성한다. 구현예에서, 짝지어지지 않거나 또는 루프를 벗어난 영역, 예를 들어 3 개의 뉴클레오타이드의 루프를 벗어난 영역은 제2 상보성 도메인 상에 존재한다. 구현예에서, 짝지어지지 않은 영역은 제2 상보성 도메인의 5' 말단으로부터 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개, 예를 들어 4 개의 뉴클레오타이드가 시작한다.
구현예에서, gRNA의 기타 다른 특성과 함께 상보성 정도는 표적 핵산에 Cas9 분자를 표적화시키는데 충분하다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은:
독립적으로, 길이로 6+/-2 개, 7+/-2 개, 8+/-2 개, 9+/-2 개, 10+/-2 개, 11+/-2 개, 12+/-2 개, 13+/-2 개, 14+/-2 개, 15+/-2 개, 16+/-2 개, 17+/-2 개, 18+/-2 개, 19+/-2 개 또는 20+/-2 개, 21+/-2 개, 22+/-2 개, 23+/-2 개 또는 24+/-2 개의 뉴클레오타이드;
독립적으로, 길이로 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 14 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드; 또는
독립적으로, 길이로 5 개 내지 24 개, 5 개 내지 23 개, 5 개 내지 22 개, 5 개 내지 21 개, 5 개 내지 20 개, 7 개 내지 18 개, 9 개 내지 16 개, 또는 10 개 내지 14 개이다.
구현예에서, 제2 상보성 도메인은 제1 상보성 도메인, 예를 들어 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개, 예를 들어 6 개의 뉴클레오타이드보다 길다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로 변형, 예를 들어 부문 VIII에서 제공된 유형의 변형을 포함하지 않는다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로, 하나 이상의 변형, 예를 들어 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형, 예를 들어 2-아세틸화, 예를 들어 2' 메틸화 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)을 포함할 수 있다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개 이상의 변형을 포함한다. 구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로 그의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 변형을 포함한다. 구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로 그의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로 2 개의 연속적 뉴클레오타이드, 예를 들어 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 뉴클레오타이드에서 변형을 포함한다. 구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로, 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 2 개의 연속적 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로, 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
상보성 도메인 내의 변형은 부문 IV에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택되는 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 상보성 도메인을 갖는 gRNA는 부문 IV에 기재된 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 상보성 도메인은 단독으로, 또는 선택되는 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 기타 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인은 기준 제1 상보성 도메인, 예를 들어 천연 유래, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스트렙토코커스 써모필루스, 제1 상보성 도메인 또는 본 명세서, 예를 들어 도 1a 내지 도 1g에 기재된 제1 상보성 도메인으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개 이하의 뉴클레오타이드와 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성이거나, 또는 상이하다.
구현예에서, 제2 상보성 도메인은 기준 제2 상보성 도메인, 예를 들어 천연 유래, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스트렙토코커스 써모필루스, 제2 상보성 도메인, 또는 본 명세서, 예를 들어 도 1a 내지 도 1g에 기재된 제2 상보성 도메인으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개 이하의 뉴클레오타이드와 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성이거나, 또는 상이하다.
제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인에 의해 형성된 이중가닥 영역은 통상적으로 길이로 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개 또는 22 개의 염기쌍이다(임의의 루프를 벗어난 또는 짝지어지지 않은 뉴클레오타이드를 제외함).
일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은, 이중가닥일 때, 예를 들어 gRNA 서열에서 11 개의 짝지어진 뉴클레오타이드를 포함한다(하나의 짝지어진 가닥은 밑줄 표시 되어 있고, 하나는 볼드체임):
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일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은, 이중가닥일 때, 예를 들어 gRNA 서열에서 15 개의 짝지어진 뉴클레오타이드를 포함한다(하나의 짝지어진 가닥은 밑줄 표시 되어 있고, 하나는 볼드체임):
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일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은, 이중가닥일 때, 예를 들어 gRNA 서열 내 16 개의 짝지어진 뉴클레오타이드를 포함한다(하나의 짝지어진 가닥은 밑줄 표시 되어 있고, 하나는 볼드체임):
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일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인, 이중가닥일 때, 예를 들어 gRNA 서열 내 21 개의 짝지어진 뉴클레오타이드를 포함한다(하나의 짝지어진 가닥은 밑줄 표시 되어 있고, 하나는 볼드체임):
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드는, 예를 들어 gRNA 서열에서 폴리-U 지역을 제거하기 위해 교환된다(밑줄 표시된 뉴클레오타이드가 교환됨):
5' 연장 도메인
구현예에서, 모듈 gRNA는 제2 상보성 도메인에 대해 5'에 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 구현예에서, 5' 연장 도메인은 길이로 2 개 내지 10 개, 2 개 내지 9 개, 2 개 내지 8 개, 2 개 내지 7 개, 2 개 내지 6 개, 2 개 내지 5 개, 또는 2 개 내지 4 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 5' 연장 도메인은 길이로 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이상의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 5' 연장 도메인 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어 부문 VIII에 제공된 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 5' 연장 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 5' 연장 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 5' 연장 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형, 예를 들어 2-아세틸화, 예를 들어 2' 메틸화 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 5' 연장 도메인은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개만큼 많은 변형을 포함할 수 있다. 구현예에서, 5' 연장 도메인은, 예를 들어 모듈 gRNA 분자에서, 그의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다. 구현예에서, 5' 연장 도메인은, 예를 들어 모듈 gRNA 분자에서, 그의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 연장 도메인은 2 개의 연속적 뉴클레오타이드, 예를 들어 5' 연장 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 5' 연장 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 5' 연장 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 뉴클레오타이드에서 변형을 포함한다. 구현예에서, 5' 연장 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 5' 연장 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 5' 연장 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 2 개의 연속적 뉴클레오타이드는 없다. 구현예에서, 5' 연장 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 5' 연장 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 5' 연장 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 뉴클레오타이드는 없다.
5' 연장 도메인 내의 변형은 부문 IV에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택되는 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 5' 연장 도메인을 갖는 gRNA는 부문 IV에 기재된 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 5' 연장 도메인은 단독으로, 또는 선택되는 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 기타 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, 5' 연장 도메인은 기준 5' 연장 도메인, 예를 들어 천연 유래, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스트렙토코커스 써모필루스, 5' 연장 도메인, 또는 본 명세서에, 예를 들어 도 1a 및 도 1g에 기재된 5' 연장 도메인과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 가지거나, 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하다.
연결 도메인
단분자 gRNA 분자에서, 연결 도메인은 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인 사이에 배치된다. 모듈 gRNA 분자에서, 2 개의 분자는 상보성 도메인에 의해 서로 결합된다.
구현예에서, 연결 도메인은 길이로 10+/-5 개, 20+/-5 개, 30+/-5 개, 40+/-5 개, 50+/-5 개, 60+/-5 개, 70+/-5 개, 80+/-5 개, 90+/-5 개 또는 100+/-5 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 연결 도메인은 길이로 20+/-10 개, 30+/-10 개, 40+/-10 개, 50+/-10 개, 60+/-10 개, 70+/-10 개, 80+/-10 개, 90+/-10 개 또는 100+/-10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 연결 도메인은 길이로 10 개 내지 100 개, 10 개 내지 90 개, 10 개 내지 80 개, 10 개 내지 70 개, 10 개 내지 60 개, 10 개 내지 50 개, 10 개 내지 40 개, 10 개 내지 30 개, 10 개 내지 20 개 또는 10 개 내지 15 개의 뉴클레오타이드이다. 다른 구현예에서, 연결 도메인은 길이로 20 개 내지 100 개, 20 개 내지 90 개, 20 개 내지 80 개, 20 개 내지 70 개, 20 개 내지 60 개, 20 개 내지 50 개, 20 개 내지 40 개, 20 개 내지 30 개 또는 20 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 연결 도메인은 길이로 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 연결 도메인은 공유 결합이다.
구현예에서, 연결 도메인은 통상적으로 제1 상보성 도메인의 3' 말단 및/또는 제2 상보성 도메인의 5' 말단의 1 개, 2 개 또는 3 개의 뉴클레오타이드에 인접하거나 또는 1 개, 2 개 또는 3 개의 뉴클레오타이드 내인 이중가닥 영역을 포함한다. 구현예에서, 이중가닥 영역은 길이로 20+/-10 개의 염기쌍일 수 있다. 구현예에서, 이중가닥 영역은 길이로 10+/-5 개, 15+/-5 개, 20+/-5 개 또는 30+/-5 개의 염기쌍일 수 있다. 구현예에서, 이중가닥 영역은 길이로 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개 또는 15 개의 염기쌍일 수 있다.
통상적으로 이중가닥 영역을 형성하는 서열은 일부 구현예에서 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개만큼 많은 뉴클레오타이드가 대응하는 뉴클레오타이드와 상보성이 아님에도 불구하고, 서로 정확한 상보성을 가진다.
구현예에서, 연결 도메인은 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어 부문 VIII에서 제공된 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 연결 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 연결 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 연결 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형, 예를 들어 2-아세틸화, 예를 들어 2' 메틸화 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 연결 도메인은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개만큼 많은 변형을 포함할 수 있다.
연결 도메인 내의 변형은 부문 IV에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택되는 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 연결 도메인을 갖는 gRNA는 부문 IV에 기재된 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 연결 도메인은 단독으로, 또는 선택되는 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 기타 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, 연결 도메인은 기준 연결 도메인, 예를 들어 본 명세서, 예를 들어 도 1a 내지 도 1g에 기재된 연결 도메인과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 갖거나 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하다.
근위 도메인
구현예에서, 근위 도메인은 길이로 6+/-2 개, 7+/-2 개, 8+/-2 개, 9+/-2 개, 10+/-2 개, 11+/-2 개, 12+/-2 개, 13+/-2 개, 14+/-2 개, 14+/-2 개, 16+/-2 개, 17+/-2 개, 또는 18+/-2 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 근위 도메인은 길이로 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 14 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 근위 도메인은 길이로 5 개 내지 20 개, 7 개 내지 18 개, 9 개 내지 16 개, 또는 10 개 내지 14 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 근위 도메인 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어 부문 VIII에 제공된 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 근위 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 근위 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 근위 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형, 예를 들어 2-아세틸화, 예를 들어 2' 메틸화 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 근위 도메인은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개만큼 많은 변형을 포함할 수 있다. 구현예에서, 근위 도메인은, 예를 들어 모듈 gRNA 분자에서, 그의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다. 구현예에서, 표적 도메인은, 예를 들어 모듈 gRNA 분자에서, 그의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 근위 도메인은 2 개의 연속적 뉴클레오타이드, 예를 들어 근위 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 근위 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 근위 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 뉴클레오타이드에서 변형을 포함한다. 구현예에서, 근위 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 근위 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 근위 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 2 개의 연속적 뉴클레오타이드는 없다. 구현예에서, 근위 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 근위 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 근위 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 뉴클레오타이드는 없다.
근위 도메인 내의 변형은 부문 IV에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택되는 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 근위 도메인을 갖는 gRNA는 부문 IV에 기재된 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 근위 도메인은 단독으로, 또는 선택되는 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 기타 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, 근위 도메인은 기준 근위 도메인, 예를 들어 천연 유래, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스트렙토코커스 써모필루스, 근위 도메인, 또는 본 명세서에, 예를 들어 도 1a 및 도 1g에 기재된 근위 도메인과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 가지거나, 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하다.
꼬리 도메인
구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 10+/-5 개, 20+/-5 개, 30+/-5 개, 40+/-5 개, 50+/-5 개, 60+/-5 개, 70+/-5 개, 80+/-5 개, 90+/-5 개 또는 100+/-5 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 20+/-5 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 20+/-10 개, 30+/-10 개, 40+/-10 개, 50+/-10 개, 60+/-10 개, 70+/-10 개, 80+/-10 개, 90+/-10 개 또는 100+/-10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 25+/-10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 10 개 내지 100 개, 10 개 내지 90 개, 10 개 내지 80 개, 10 개 내지 70 개, 10 개 내지 60 개, 10 개 내지 50 개, 10 개 내지 40 개, 10 개 내지 30 개, 10 개 내지 20 개, 또는 10 개 내지 15 개의 뉴클레오타이드이다.
다른 구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 20 개 내지 100 개, 20 개 내지 90 개, 20 개 내지 80 개, 20 개 내지 70 개, 20 개 내지 60 개, 20 개 내지 50 개, 20 개 내지 40 개, 20 개 내지 30 개, 또는 20 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 1 개 내지 20 개, 1 개 내지 1 개, 1 개 내지 10 개, 또는 1 개 내지 5 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어 부문 VIII에서 제공된 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 꼬리 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 꼬리 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 꼬리 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형, 예를 들어 2-아세틸화, 예를 들어 2' 메틸화 또는 부문 VIII로부터의 기타 다른 변형(들)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 꼬리 도메인은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개만큼 많은 변형을 가질 수 있다. 구현예에서, 표적 도메인은 그의 5' 말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다. 구현예에서, 표적 도메인은 그의 3' 말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 꼬리 이중가닥 영역을 형성할 수 있는 꼬리 이중가닥 도메인을 포함한다. 구현예에서, 꼬리 이중가닥 영역은 길이로 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개 또는 12 개 염기쌍일 수 있다. 구현예에서, 추가 단일 표준 도메인은 꼬리 이중가닥 도메인에 대해 3'에 존재한다. 구현예에서, 이 도메인은 길이로 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 이는 길이로 4 개 내지 6 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 기준 꼬리 도메인, 예를 들어 천연 유래, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스트렙토코커스 써모필루스, 꼬리 도메인, 또는 본 명세서에, 예를 들어 도 1a 내지 도 1g에 기재된 꼬리 도메인과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 가지거나, 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하다.
구현예에서, 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인은 다음의 서열을 포함한다:
구현예에서, 예를 들어 U6 프로모터가 전사를 위해 사용된다면, 꼬리 도메인은 3' 서열 UUUUUU을 포함한다.
구현예에서, 예를 들어 H1 프로모터가 전사를 위해 사용된다면, 꼬리 도메인은 3' 서열 UUUU를 포함한다.
구현예에서, 예를 들어 사용된 pol-III 프로모터의 종결 신호에 따라서 꼬리 도메인은 3' U의 가변 수를 포함한다.
구현예에서, T7 프로모터가 사용된다면 꼬리 도메인은 DNA 주형으로부터 유래된 가변 3' 서열을 포함한다.
구현예에서, 예를 들어 시험관내 전사가 RNA 분자를 생성하기 위해 사용된다면, 꼬리 도메인은 DNA 주형으로부터 유래된 가변 3' 서열을 포함한다.
구현예에서, 예를 들어 pol-II 프로모터가 전사를 구동하기 위해 사용된다면, 꼬리 도메인은 DNA 주형으로부터 유래된 가변 3' 서열을 포함한다.
꼬리 도메인 내의 변형은 부문 IV에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택되는 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 꼬리 도메인을 갖는 gRNA는 부문 IV에 기재된 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 꼬리 도메인은 단독으로, 또는 선택되는 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 기타 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 꼬리 도메인은 2 개의 연속적 뉴클레오타이드, 예를 들어 꼬리 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 꼬리 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 꼬리 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 뉴클레오타이드에서 변형을 포함한다. 구현예에서, 꼬리 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 꼬리 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 꼬리 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 2 개의 연속적 뉴클레오타이드는 없다. 구현예에서, 꼬리 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 꼬리 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 꼬리 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 뉴클레오타이드는 없다.
구현예에서, gRNA는 다음의 구조를 가진다:
5' [표적화 도메인]-[제1 상보성 도메인]-[연결 도메인]-[제2 상보성 도메인]-[근위 도메인]-[꼬리 도메인]-3'
여기서,
표적화 도메인은 코어 도메인 및 선택적으로 2차 도메인을 포함하고,
길이로 10 개 내지 50 개의 뉴클레오타이드이며;
제1 상보성 도메인은 길이로 5 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이고, 구현예에서
본 명세서에 개시된 기준 제1 상보성 도메인과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 가지고;
연결 도메인은 길이로 1 개 내지 5 개의 뉴클레오타이드이며;
근위 도메인은 길이로 5 개 내지 20 개의 뉴클레오타이드이고, 구현예에서 본 명세서에 개시된 기준 근위 도메인과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 가지고; 그리고,
꼬리 도메인은 없거나 또는 뉴클레오타이드 서열은 길이로 1 개 내지 50 개의 뉴클레오타이드이며, 구현예에서 본 명세서에 개시된 기준 꼬리 도메인과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 가진다.
예시적인 키메라 gRNA
구현예에서, 단분자, 또는 키메라, gRNA는 바람직하게는 5'에서 3'으로:
예를 들어, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적화 도메인(이는 표적 핵산에 상보성임);
제1 상보성 도메인;
연결 도메인;
제2 상보성 도메인(이는 제1 상보성 도메인에 대해 상보성임);
근위 도메인; 및
꼬리 도메인을 포함하되,
여기서,
(a) 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함하고;
(b) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있으며; 또는
(c) 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, (a), (b) 또는 (c)로부터의 서열은 천연 유래 gRNA의 대응하는 서열과, 또는 본 명세서에 기재된 gRNA와 적어도 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 가진다.
구현예에서, 근위 도메인 및 꼬리 도메인은, 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과의 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에서 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 또는 53 개의 뉴클레오타이드가 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과의 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에서 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 또는 54 개의 뉴클레오타이드가 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과의 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에서 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 또는 53 개의 뉴클레오타이드가 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과의 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에서 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 또는 54 개의 뉴클레오타이드가 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 단분자 또는 키메라, gRNA 분자(표적화 도메인, 제1 상보성 도메인, 연결 도메인, 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로,꼬리 도메인을 포함함)는 다음의 서열을 포함하는데, 이때 표적화 도메인은 20 개의 N으로서 도시되지만, 16 ro 내지 26 개의 뉴클레오타이드의 임의의 서열 및 범위일 수 있고, gRNA 서열은 다음의 6 개의 U가 이어지는데, 이는 U6 프로모터에 대한 종결 신호로서 작용하지만, 없거나 수가 적을 수 있다:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU(서열번호 40). 구현예에서, 단분자, 또는 키메라, gRNA 분자는 스트렙토코커스 피오게네스 gRNA 분자이다.
일부 구현예에서, 단분자, 또는 키메라, gRNA 분자(표적화 도메인, 제1 상보성 도메인, 연결 도메인, 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및, 선택적으로, 꼬리 도메인을 포함함)는 다음의 서열을 포함하는데, 이때 표적화 도메인은 20 개의 N으로서 도시되지만, 16 ro 내지 26 개의 뉴클레오타이드의 임의의 서열 및 범위일 수 있고, gRNA 서열은 다음의 6 개의 U가 이어지는데, 이는 U6 프로모터에 대한 종결 신호로서 작용하지만, 없거나 수가 적을 수 있다:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUUU(서열번호 41). 구현예에서, 단분자, 또는 키메라, gRNA 분자는 스타필로코커스 아우레우스 gRNA 분자이다.
예시적인 키메라 gRNA의 서열 및 구조는 또한 도 10의 A 내지 도 10의 B에서 나타낸다.
예시적인 모듈 gRNAs
구현예에서, 모듈 gRNA는
바람직하게는 5'으로부터 3'으로;
예를 들어, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개, 또는 26 개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적화 도메인;
제1 상보성 도메인을 포함하는, 제1 가닥; 및
바람직하게는 5'으로부터 3'으로;
선택적으로 5' 연장 도메인;
제2 상보성 도메인;
근위 도메인; 및
꼬리 도메인을 포함하는 제2 가닥을 포함하되,
여기서:
(a) 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함하고;
(b) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있거나; 또는
(c) 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, (a), (b) 또는 (c)로부터의 서열은 천연 유래 gRNA의 대응하는 서열과, 또는 본 명세서에 기재된 gRNA와 적어도 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 가진다.
구현예에서, 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과의 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에서 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드가 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과의 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에서 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드가 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 21의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 22의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 23의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
II. gRNA의 설계방법
표적 도메인을 선택, 설계 및 확인하기 위한 gRNA의 설계방법이 본 명세서에 기재된다. 예시적인 표적화 도메인이 또한 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에서 논의되는 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 gRNA 내로 혼입될 수 있다.
표적 서열의 선택 및 확인 방법, 뿐만 아니라 오프-타겟 분석은, 예를 들어 문헌[Mali et al., 2013 Science 339(6121): 823-826; Hsu et al., Nat Biotechnol, 31(9): 827-32; Fu et al., 2014 Nat Biotechnol, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574; Heigwer et al., 2014 Nat Methods 11(2):122-3. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216; Bae et al., 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24463181; Xiao A et al., 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24389662]에 기재된다.
일부 구현예에서, 소프트웨어 툴을 사용하여 사용자의 표적 서열 내 gRNA 선택을 최적화할 수 있다, 예를 들어, 게놈 전체에 걸쳐 전체 오프-타겟 활성을 최소화할 수 있다. 오프-타겟 활성은 절단이 아닐 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 각각의 가능한 gRNA를 선택하기 위해, 소프트웨어 툴은 미스매칭된 염기쌍을 최대 특정 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)로 함유하는 게놈 전체에서 모든 잠재적 오프-타겟 서열들(NAG 또는 NGG PAM 보다 선행함)을 동정할 수 있다. 각각의 오프-타겟 서열에서, 예를 들어, 실험적으로 유도된 가중치법(weighting scheme)을 이용하여, 절단 효율을 예측할 수 있다. 이어서, 각각의 가능한 gRNA를 그의 총 예측된 오프-타겟 절단에 따라 랭크시킬 수 있고; 상위 랭크된 gRNA는 최대 온 타겟 그리고 최소한의 오프-타겟 절단이 존재할 가능성이 있는 것들을 나타낸다. 기타 다른 기능, 예를 들어 gRNA 벡터를 제작하기 위한 자동화된 시약 설계, 온 타겟 서베이어(Surveyor) 분석을 위한 프라이머 설계, 및 차세대 시퀀싱을 통해 오프-타겟 절단을 고처리량 검출하여 정량화하기 위한 프라이머 설계 또한 툴에 포함시킬 수 있다. 후보 gRNA 분자는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서의 섹션 IV에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스 및 네이세리아 메닌기티디스(N. meningitidis) Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA는 DNA 서열 검색 알고리즘을 이용하여, 예를 들어 공공 툴 cas-offinder에 기반한 통상적인 gRNA 설계를 이용하여 동정되었다(Bae et al. Bioinformatics. 2014; 30(10): 1473-1475). 상기 통상적인 gRNA 설계 소프트웨어는 가이드들을 그 게놈 전체에 대한 오프-타겟 경향을 계산한 후에 점수화한다. 통상적으로 완전 매치에서부터 7 개의 미스매치까지 범위의 매치가 17 개 내지 24 개 길이 범위의 가이드에 대해 고려된다. 일단 오프-타겟 부위가 컴퓨터에 의해 결정되면, 각각의 가이드에 대해 총 스코어를 계산하고, 웹-인터페이스를 사용하여 표로 산출하여 요약한다. PAM 서열에 인접한 잠재적 gRNA 부위를 동정하는 것에 추가로, 상기 소프트웨어는 또한 선택된 gRNA 부위들과 1 개, 2 개, 3 개 이상의 뉴클레오타이드만큼 다른 모든 PAM 인접 서열들을 동정한다. 각각의 유전자에 대한 게놈 DNA 서열을 UCSC 게놈 브라우즈로부터 얻고, 공중이 이용가능한 리피트마스커(RepeatMasker) 프로그램을 이용하여 반복 구성요소들에 대해 스크리닝되었다. 리피트마스커는 입력 DNA 서열들을 반복 구성요소 및 복잡성이 낮은 영역에 대해 검색한다. 산출물은 주어진 질의 서열에 존재하는 반복부에 대한 상세한 주석이 출력된다.
동정 후에, gRNA들을 표적 부위까지의 이들의 거리, 이들의 직교성 및 5' G의 존재(관련 PAM, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스의 경우에 NGG PAM, 스타필로코커스 아우레우스의 경우에 NNGRR(예를 들어, NNGRRT 또는 NNGRRV) PAM, 및 네이세리아 메닌기티디스의 경우에, NNNNGATT 또는 NNNNGCTT PAM을 함유하는 인간 게놈에서 밀접한 매칭의 동정에 기반함) 중 하나 이상에 기반하여 티어들에 랭크시킨다. 직교성은 표적 서열에 대한 미스매치를 최소한의 수로 함유하는 인간 게놈 내 서열 수를 지칭한다. "고수준의 직교성" 또는 "양호한 직교성"은, 예를 들어 의도된 표적 이외의 인간 게놈에서 동일한 서열을 갖지 않거나, 또는 표적 서열에서 1 개 또는 2 개의 미스매치를 함유하는 임의의 서열을 갖지 않는 20량체 표적화 도메인을 지칭할 수 있다. 양호한 직교성을 지니는 표적화 도메인은 오프-타겟 DNA 절단을 최소화하도록 선택된다. 이는 비제한적 예이며 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스 및 네이세리아 메닌기티디스 또는 기타 다른 Cas9 효소와 함께 사용하기 위해 gRNA를 동정하는 다양한 전략이 이용될 수 있음을 이해하여야 한다.
2가지 설계 및 티어링 전략을 이용하여 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스 및 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 효소와 함께 사용하기 위한 예시적인 gRNA를 동정하였다.
gRNA의 설계 및 티어링을 위한 제1 전략
제1 전략에서, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA를 공중이 이용가능한 웹 기반 ZiFiT 서버를 이용하여 동정하였다(문헌[Fu et al., Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 2014 Jan 26. doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574], 본래의 참고문헌에 대해, 문헌[Sander et al., 2007, NAR 35:W599-605; Sander et al., 2010, NAR 38: W462-8] 참조). PAM 서열에 인접한 잠재적 gRNA 부위를 동정하는 것에 추가로, 소프트웨어는 또한 선택되는 gRNA 부위로부터 1 개, 2 개, 3 개 이상의 뉴클레오타이드 만큼 차이가 있는 모든 PAM 인접 서열을 동정한다. 각각의 유전자에 대한 게놈 DNA 서열을 UCSC 게놈 브라우저로부터 얻었고, 서열을 공중이 이용가능한 리피트-마스커 프로그램을 이용하여 반복 구성요소에 대해 선별하였다. 리피트마스커는 반복된 구성요소 및 낮은 복잡성의 영역에 대해 입력 DNA 서열을 검색한다. 산출물은 주어진 질의 서열에 존재하는 반복체의 상세한 주석이다. 동정 후, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA를 5 개 티어로 랭크하였다.
제1 티어 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인들은 표적 부위에 대한 이들의 거리, 이들의 직교성 및 5' G의 존재에 기반하여(NGG PAM을 함유하는 인간 게놈에서 근접한 매치의 ZiFiT 동정에 기반하여) 선택되었다. 직교성은 표적 서열에 대해 미스매치를 최소 수로 함유하는 인간 게놈 내 서열 수를 지칭한다. "고수준의 직교성" 또는 "양호한 직교성"은 인간 게놈에서 동일한 서열을 갖지 않거나, 또는 표적 서열에서 1 개 또는 2 개의 미스매치를 함유하는 임의의 서열을 갖지 않는 20량체 gRNA를 지칭할 수 있다. 오프-타겟 DNA 절단을 최소화하도록 양호한 직교성을 지니는 표적화 도메인을 선택한다. 모든 표적에 대해, 17량체와 20량체 gRNA 두 가지 모두가 설계된다. gRNA는 또한 단일-gRNA 뉴클레아제 절단에 대해 그리고 이중 gRNA 틈내기효소 전략에 대해 선택되었다. gRNA의 선택에 대한 기준 및 gRNA가 본 전략을 위해 사용될 수 있다는 것은 몇몇 고려사항에 기반한다:
gRNA를 단일-gRNA 뉴클레아제 절단에 대해 그리고 이중-gRNA 쌍 "틈내기효소" 전략에 대해 동정되었다. gRNA를 선택하기 위한 기준 및 gRNA가 이중-gRNA 쌍 "틈내기효소" 전략에 대해 사용될 수 있는 기준은 2 가지 고려사항에 기반한다:
1. PAM가 무시되고 D10A Cas9 틈내기효소에 의한 절단이 5' 돌출부를 초래하도록 gRNA 쌍이 DNA 상에서 배향되어야 한다.
2. 이중 틈내기효소 쌍에 의한 절단이 합리적 빈도로 전체 개재 서열의 결실을 초래한다는 추정. 그러나, 이중 틈내기효소 쌍에 의한 절단은 또한 gRNA 중 단지 하나의 부위에서 종종 삽입결실 돌연변이를 초래할 수 있다. 후보 쌍 구성원은 그들이 하나의 gRNA 부위에서 단지 삽입결실 돌연변이를 야기하는 것에 대해 전체 서열을 효율적으로 제거하는 방법에 대해 시험될 수 있다.
제1 티어 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 (1) 표적 위치에 대한 합리적인 거리, 예를 들어 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내, (2) 고수준의 직교성, 및 (3) 5' G의 존재에 기반하여 선택되었다. 제2 티어 gRNA의 선택에 대해, 5'G에 대한 필요가 제거되지만, 거리 제한이 필요하며, 고수준의 직교성이 필요하다. 제3 티어 선택은 동일한 거리 제한 및 5'G에 대한 필요를 사용하였지만, 양호한 직교성의 필요를 제거하였다. 제4 티어 선택은 동일한 거리 제한을 사용하였지만, 양호한 직교성의 필요를 제거하며, 5'G로 시작하였다. 제5 티어 선택은 양호한 직교성 및 5'G의 필요를 제거하였고, 더 긴 서열(예를 들어, 암호 서열의 나머지, 예를 들어 전사 표적 부위에 대해 상류 또는 하류의 추가적인 500 bp)을 스캔하였다. 티어는 비포괄적이라는 것을 주목한다(각각의 gRNA는 단지 1 회 열거된다). 특정 예에서, gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 동정되지 않았다.
상기 논의한 바와 같이, gRNA는 표시한 바와 같이 단일-gRNA 뉴클레아제 절단에 대해서뿐만 아니라 이중-gRNA 쌍 "틈내기효소" 전략에 대해 동정되었다.
네이세리아 메닌기티디스 및 스타필로코커스 아우레우스 Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA를 PAM 서열의 존재에 대해 게놈 DNA 서열을 스캐닝함으로써 수동으로 동정하였다. 이들 gRNA는 2 개의 티어로 분리되었다. 제1 티어 gRNA에 대해, 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었다. 제2 티어 gRNA에 대해, 표적화 도메인은 (처음 500 bp의 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 선택되었다. Note that 티어는 비포괄적이라는 것을 주목한다(각각의 gRNA는 전략에 대해 단지 1 회 열거된다). 특정 예에서, gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 동정되지 않는다.
예시적 표적화 도메인(제1 전략)
이하는 제1 설계 및 티어링 전량에 따라 예시적인 표적화 도메인을 제공하는 표이다. 예로서, 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스 및 네이세리아 메닌기티디스에 대해 17량체를 표적화하거나, 또는 20량체 표적화 도메인을 설계하였다.
표 1A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다. 구현예에서, 2 개의 gRNA는 2 개의 Cas9 뉴클레아제 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소를 표적화하기 위해 사용되고, 예를 들어 그룹 A로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는표 1에 나타낸 바와 같은 그룹 B로부터의 임의의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있다.
[표 1]
표 1B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 1C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 1D는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 1E는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 1F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 1G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 1H는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 1I는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 2A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 2B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 2C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 2D는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 2E는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 2F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 2G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 2H는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 2I는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨)결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 3A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다. 구현예에서, 2 개의 gRNA는 2 개의 Cas9 뉴클레아제 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소를 표적화하기 위해 사용되고, 예를 들어 그룹 B로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 표 3에 나타낸 바와 같은 그룹 B로부터의 임의의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있거나 또는 그룹 C로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 표 3에 나타낸 바와 같은 그룹 D로부터의 임의의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있다.
[표 3]
표 3B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 3C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 3D는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 3E는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 3F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 3G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 3H는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 4A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 4B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 4C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 4D는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 4E는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여BID 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 4F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 4G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 4H는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 4I는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 5A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다. 구현예에서, 2 개의 gRNA는 2 개의 Cas9 뉴클레아제 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소를 표적화하기 위해 사용되고, 예를 들어 그룹 A로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 표 5에 나타낸 바와 같은 그룹 B로부터의 임의의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있거나, 또는 그룹 C로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 표 5에 나타낸 바와 같은 그룹 D로부터의 임의의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있다.
[표 5]
표 5B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 5C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 5D는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 5E는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 5F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 5G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 5H는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 5I는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 6A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 6B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 6C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 6D는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 6E는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 6F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 6G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 6H는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 6I는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 7A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다. 구현예에서, 2 개의 gRNA는 2 개의 Cas9 뉴클레아제 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소를 표적화하기 위해 사용되고, 예를 들어 그룹 A로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 표 7에 나타낸 바와 같은 그룹 B로부터의 임의의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있거나, 또는 그룹 C로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 표 7에 나타낸 바와 같은 그룹 D로부터의 임의의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있다.
[표 7]
표 7B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 7C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 7D는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 7E는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 7F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 7G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 7H는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 8A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 8B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 8C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 8D는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 8E는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 8F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 8G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 8H는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 9A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다. 구현예에서, 2 개의 gRNA는 2 개의 Cas9 뉴클레아제 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소를 표적화하기 위해 사용되고, 예를 들어 그룹 A로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 표 9에 나타낸 바와 같은 그룹 B로부터의 임의의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있거나, 또는 그룹 C로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 표 9에 나타낸 바와 같은 그룹 D로부터의 임의의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있다.
[표 9]
표 9B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 9C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 9D는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 9E는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 9F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 9G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 9H는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 9I는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 10A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 10B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 10C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 10D는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 10E는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 10F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 10G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 10H는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 10I는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 11A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다. 구현예에서, 2 개의 gRNA는 2 개의 Cas9 뉴클레아제 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소를 표적화하기 위해 사용되고, 예를 들어 그룹 A로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 표 11에 나타낸 바와 같은 그룹 B로부터의 임의의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있다.
[표 11]
표 11B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 11C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 11D는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합되며, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 11E는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 11F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 11G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 11H는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 11I는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 (처음 500 bp 하류의) 남아있는 암호 서열 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 12A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 12B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가지고, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 12C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, G로 시작한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 12D는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합하며, G로 시작하지 않는다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 12E는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 222 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류의 722 bp 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 12F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 12G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 222 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류의 722 bp 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 12H는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 12I는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉다운시키기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 222 bp 내에서(전사 시작 부위의 상류의 722 bp 및 하류의 1 kb로 연장됨) 결합한다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I에 기재된 17량체를 포함할 수 있으며, 예를 들어 18 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I에 기재된 17량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I에 기재된 20량체를 포함할 수 있으며, 예를 들어 21 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I에 기재된 20량체 gRNA를 포함할 수 있다.
gRNA의 설계 및 티어링을 위한 제2 전략
다음과 같은 제1 전략과 상이한 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스 및 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 효소와 함께 사용하기 위한 gRNA를 동정하기 위해 제2 전략을 사용하였다.
스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스 및 네이세리아 메닌기티디스 Cas9와 함께 사용하기 위한 가이드 RNA(gRNA)를 DNA 서열 검색 알고리즘을 이용하여 동정하였다. 가이드 RNA 설계를 공개적 툴 cas-offinder에 기반한 가이드 RNA 설계 소프트웨어를 이용하여 수행하였다(참고문헌:Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA 내지 Guided endonucleases., Bioinformatics. 2014 Feb 17. Bae S, Park J, Kim JS. PMID:24463181). 상기 관습적 gRNA 설계 소프트웨어 스코어는 그들의 게놈 전체의 오프-타겟 경향을 계산한 후에 가이딩한다. 통상적으로 완전한 매치로부터 7 개의 미스매치까지의 범위에 있는 매치는 길이로 17 개 내지 24 개의 범위에 있는 가이드에 대해 고려된다. 일단 오프-타겟 부위가 컴퓨터에 의해 결정되면, 총 스코어는 각각의 가이드에 대해 계산되었고, 웹-인터페이스를 이용하는 표 산출로 요약한다. PAM 서열에 인접한 잠재적 gRNA 부위를 동정하는 것에 추가로, 소프트웨어는 또한 선택되는 gRNA 부위로부터 1 개, 2 개, 3 개 이상의 뉴클레오타이드만큼 차이가 있는 모든 PAM 인접 서열을 동정한다. 각각의 유전자에 대한 게놈 DNA 서열을 UCSC 게놈 브라우즈로부터 얻었고, 공중이 이용가능한 리피트마스커를 이용하여 반복체 구성요소에 대해 선별하였다. 리피트마스커는 반복된 구성요소 및 낮은 복잡성의 영역에 대해 입력 DNA 서열을 검색한다. 산출물은 주어진 질의 서열에 존재하는 반복체의 상세한 주석이다.
동정 후에, gRNA를 표적 부위에 대한 그들의 거리, 그들의 직교성(적절한 PAM, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스의 경우에 NGG PAM, 스타필로코커스 아우레우스의 경우에 NNGRR(예를 들어, NNGRRT 또는 NNGRRV) PAM, 및 네이세리아 메닌기티디스의 경우에, NNNNGATT 또는 NNNNGCTT PAM을 함유하는 인간 게놈에서 밀접한 매칭의 동정에 기반함)에 기반하여 gRNA를 티어들로 랭크한다. 직교성은 표적 서열에 대한 최소 수의 미스매치를 함유하는 인간 게놈 내 서열 수를 지칭한다. "고수준의 직교성" 또는 "양호한 직교성"은, 예를 들어 의도된 표적 이외의 인간 게놈에서 동일한 서열을 갖지 않거나, 또는 표적 서열에서 1 개 또는 2 개의 미스매치를 함유하는 임의의 서열을 갖지 않는 20량체 표적화 도메인을 지칭할 수 있다. 양호한 직교성을 지니는 표적화 도메인은 오프-타겟 DNA 절단을 최소화하도록 선택된다.
예로서, 스트렙토코커스 피오게네스 및 네이세리아 메닌기티디스 표적에 대해, 17량체, 또는 20량체 gRNA가 설계되었다. 다른 예로서, 스타필로코커스 아우레우스 표적에 대해, 18량체, 19량체, 20량체, 21량체, 22량체, 23량체 및 24량체 gRNA가 설계되었다. 본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 본 명세서에 개시된 표적화 도메인에 기재된 17량체를 포함할 수 있고, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 17량체를 포함할 수 있으며, 예를 들어 18 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 17량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 18량체를 포함할 수 있고, 예를 들어 19 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 18량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 19량체를 포함할 수 있고, 예를 들어 20 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 19량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 20량체 gRNA를 포함할 수 있고, 예를 들어 21 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 20량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 21량체를 포함할 수 있고, 예를 들어 22 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 21량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 22량체를 포함할 수 있고, 예를 들어,23 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 22량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 23량체를 포함할 수 있고, 예를 들어 24 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 23량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 24량체를 포함할 수 있고, 예를 들어 25 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 24량체 gRNA를 포함할 수 있다.
gRNA를 단일-gRNA 뉴클레아제 절단을 위해 그리고 이중-gRNA 짝지어진 "틈내기효소" 전략을 위해 동정하였다. gRNA를 선택하기 위한 기준 및 어떤 gRNA가 어떤 전략에 대해 사용될 수 있는지의 결정은 하기 몇몇 고려사항에 기반한다:
1.
PAM이 바깥으로 향하고 D10A Cas9 틈내기효소에 의한 절단이 5' 돌출부를 생성하도록 gRNA 쌍은 DNA 상에서 배향되어야 한다.
2.
이중 틈내기효소 쌍에 의한 절단이 합리적인 빈도로 전체 개재 서열의 결실을 생성한다는 추정. 그러나, 이는 또한 종종 gRNA 중 단지 하나의 부위에서 삽입결실 돌연변이를 초래할 것이다. 후보 쌍 구성원은 그들이 하나의 gRNA의 부위에서 삽입결실 돌연변이를 단지 야기하는 것에 대해 전체 서열을 효율적으로 제거하는 방법에 대해 시험될 수 있다.
본 명세서에 논의된 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 gRNA 내로 혼입될 수 있다.
넉아웃 전략을 설계하기 위해, 일부 구현예에서, 스트렙토코커스 피오게네스에 대한 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 그들의 표적 부위에 대한 거리 및 그들의 직교성(PAM은 NGG임)에 기반하여 선택되었다. 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 (1) 표적 위치에 대한 합리적인 거리, 예를 들어 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 이내 및 (2) 고수준의 직교성에 기반하여 선택되었다. 티어 2 gRNA의 선택에 대해, 고수준의 직교성은 필요하지 않았다. 티어 3 gRNA는 양호한 직교성의 필요가 제거되었고, 더 긴 서열(예를 들어, 암호 서열의 나머지)이 스캐닝되었다. 티어는 비포괄적이라는 것을 주목한다(각각의 gRNA는 단지 1 회 열거됨). 특정 예에서, gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 동정되지 않았다.
넉아웃 전략을 설계하기 위해, 일부 구현예에서, 네이세리아 메닌기티디스에 대한 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 네이세리아 메닌기티디스에 대한 티어 2 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 네이세리아 메닌기티디스에 대한 티어 3 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 500 bp 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었다. 티어는 비포괄적이라는 것을 주목한다(각각의 gRNA는 단지 1 회 열거됨). 특정 예에서,gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 동정되지 않았다.
넉아웃 전략을 설계하기 위해, 일부 구현예에서, 스타필로코커스 아우레우스에 대한 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인을 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 스타필로코커스 아우레우스에 대한 티어 2 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성 수준은 필요하지 않았으며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 스타필로코커스 아우레우스에 대한 티어 3 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRT PAM을 함유하였다. 스타필로코커스 아우레우스에 대한 티어 4 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 스타필로코커스 아우레우스에 대한 티어 5 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 티어는 비포괄적이라는 것을 주목한다(각각의 gRNA는 단지 1 회 열거됨). 특정 예에서,gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 동정되지 않았다.
넉다운 전략을 위한 gRNA 분자의 설계를 위해, 일부 구현예에서, 스트렙토코커스 피오게네스에 대한 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 스트렙토코커스 피오게네스에 대한 티어 2 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 스트렙토코커스 피오게네스에 대한 티어 3 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되었다(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 티어는 비포괄적이라는 것을 주목한다(각각의 gRNA는 단지 1 회 열거됨). 특정 예에서,gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 동정되지 않았다.
넉다운 전략을 위한 gRNA 분자의 설계를 위해, 일부 구현예에서, 네이세리아 메닌기티디스에 대한 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 네이세리아 메닌기티디스에 대한 티어 2 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 네이세리아 메닌기티디스에 대한 티어 3 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되었다(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 티어는 비포괄적이라는 것을 주목한다(각각의 gRNA는 단지 1 회 열거됨). 특정 예에서, gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 동정되지 않았다.
넉다운 전략을 위한 gRNA 분자의 설계를 위해, 일부 구현예에서, 스타필로코커스 아우레우스에 대한 티어 1 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지며, PAM은 NNGRRT이다. 스타필로코커스 아우레우스에 대한 티어 2 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성은 필요하지 않으며, PAM은 NNGRRT이다.스타필로코커스 아우레우스에 대한 티어 3 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되었고(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨) PAM은 NNGRRT이다. 스타필로코커스 아우레우스에 대한 티어 4 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, PAM은 NNGRRV이다. 스타필로코커스 아우레우스에 대한 티어 5 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되었고(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨), PAM은 NNGRRV이다. 티어는 비포괄적이라는 것을 주목한다(각각의 gRNA는 단지 1 회 열거됨). 특정 예에서, gRNA는 특정 티어의 기준에 기반하여 동정되지 않았다.
예시적인 표적화 도메인(제2 전략)
이하는 제2 설계 및 티어링 전략에 따라 예시적인 표적화 도메인을 제공하기 위한 표이다. 예로서, 스트렙토코커스 피오게네스 및 네이세리아 메닌기티디스 표적에 대해, 17량체 또는 20량체 gRNA가 설계되었다. 다른 예로서, 스타필로코커스 아우레우스 표적에 대해, 18량체, 19량체, 20량체, 21량체, 22량체, 23량체 및 24량체 gRNA가 설계되었다.
표 13A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃 하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 13B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다.표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 13C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 이후이며, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 13D는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 13E는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다.표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성 수준은 필요하지 않았으며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 13F는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 13G는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 13H는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 13I는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 13J는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 13K는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 이후이며, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 14A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 14B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 14C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택된다(예를 들어 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 14D는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성이며, PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 14E는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성은 필요하지 않으며, PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 14F는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되고(예를 들어 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨), PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 14G는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, PAM은 NNGRRV이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 14H는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되며(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨), PAM은 NNGRRV이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 14I는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화는 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 14J는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 14K는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 FAS 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택된다(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 15A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃 하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하며, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 15B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다.표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 15C는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 15D는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성 수준은 필요하지 않았으며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 15E는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 15F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 16A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 16B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 16C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택된다(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 16D는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지고, PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 16E는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성은 필요하지 않으며, PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 16F는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되고(예를 들어 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨), PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 16G는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다.표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 16H는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 16I는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화는 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 16J는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 BID 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
들어 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 17A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 17B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 17C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 이후이며, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 17D는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 17E는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성 수준은 필요하지 않았으며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 17F는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 17G는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 17H는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 17I는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 17J는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 17K는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다.표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 이후이며, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 18A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 18B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 18C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택된다(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 18D는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지고 PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 18E는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성은 필요하지 않으며, PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 18F는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되고(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨) PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 18G는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, PAM은 NNGRRV이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 18H는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되고(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨) PAM은 NNGRRV이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 18I는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화는 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 18J는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 18K는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CTLA4 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택된다(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 19A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 19B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 19C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 이후이며, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 19D는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 19E는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성 수준은 필요하지 않았으며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 19F는 제3티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 19G는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 19H는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 19I는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 19J는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 이후이며, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 20A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 20B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 20C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택된다(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 20D는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지고, PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 20E는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성은 필요하지 않으며, PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 20F는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되고(예를 들어 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨) PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 20G는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, PAM은 NNGRRV이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 20H는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되고(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨), PAM은 NNGRRV이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 20I는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 20J는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PDCD1 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택된다(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 21A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 21B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 21C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 이후이며, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 21D는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 21E는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성 수준은 필요하지 않았으며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 21F는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 21G는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 21H는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 21I는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 21J는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 21K는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 이후이며, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 22A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 22B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 22C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택된다(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 22D는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지고, PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 22E는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성은 필요하지 않으며, PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 22F는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되고(예를 들어 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨), PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 22G는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, PAM은 NNGRRV이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 22H는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되며(전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨), PAM은 NNGRRV이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 22I는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 22J는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 22K는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 CBLB 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택된다(예를 들어, 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨). 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 23A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 23B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 23C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 이후이며, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 23D는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 23E는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성 수준은 필요하지 않았으며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 23F는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 23G는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 23H는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRV PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 23I는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 23J는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 이후이며, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 24A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 24B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 24C는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류의 추가적인 73bp 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었다(전사 시작 부위의 상류의 573bp 및 하류의 1 kb로 연장됨). 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스트렙토코커스 피오게네스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 24D는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성이며 PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 24E는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성은 필요하지 않으며, PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 24F는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 추가적인 500 bp 내에서 선택되고(예를 들어 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 1 kb까지 연장됨), PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 24G는 제4 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류의 추가적인 73bp 및 하류의 500 bp 내에서 선택되고(전사 시작 부위상류의 573bp 및 하류의 1 kb로 연장됨), PAM은 NNGRRT이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 24H는 제5 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류의 추가적인 73bp 및 하류의 500 bp 내에서 선택되고(전사 시작 부위상류의 573bp 및 하류의 1 kb로 연장됨), PAM은 NNGRRV이다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 24I는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가졌다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 24J는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 높은 직교성이 필요하지 않았다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 24K는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 PTPN6 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 전사 시작 부위의 상류의 추가적인 73bp 및 하류의 500 bp 내에서 선택되었다 (전사 시작 부위상류의 573bp 및 하류의 1 kb로 연장됨). 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 네이세리아 메닌기티디스 eiCas9 분자, 예를 들어 eiCas9 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다.
표 25A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 TRAC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다. 구현예에서, 2 개의 gRNA는 2 개의 Cas9 뉴클레아제 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소를 표적화하기 위해 사용되고, 예를 들어 그룹 A로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 표 25-1에서 나타내는 바와 같은 그룹 B로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있다.
표 25B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 TRAC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 25C는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 TRAC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다. 구현예에서, 2 개의 gRNA는 2 개의 Cas9 뉴클레아제 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소를 표적화하기 위해 사용되고, 예를 들어 그룹 A로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 표 25-2에서 나타내는 바와 같은 그룹 B로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있다.
표 25D는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 TRAC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성 수준은 필요하지 않았으며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 25E는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 TRAC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 25F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 TRAC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 25G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 TRAC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 26A는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 TRBC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어, 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다. 구현예에서, 2 개의 gRNA는 2 개의 Cas9 뉴클레아제 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소를 표적화하기 위해 사용되고, 예를 들어, 그룹 A로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 표 26-1에서 나타내는 바와 같은 그룹 B로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있다.
표 26B는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하여 TRBC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어, 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 26C는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 TRBC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 고수준의 직교성을 가지며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어, 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다. 구현예에서, 2 개의 gRNA는 2 개의 Cas9 뉴클레아제 또는 2 개의 Cas9 틈내기효소를 표적화하기 위해 사용되고, 예를 들어, 그룹 A로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 표 26-2에서 나타내는 바와 같은 그룹 B로부터의 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 짝지어질 수 있다.
표 26D는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 TRBC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 선택되었고, 직교성 수준은 필요하지 않았으며, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어, 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 26E는 제3 티어 매개변수에 따라 선택되는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 이용하여 TRBC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 하류의 암호 서열의 나머지 내에서 선택되었고, NNGRRT PAM을 함유하였다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어, 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 26F는 제1 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 TRBC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성을 가진다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어, 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
표 26G는 제2 티어 매개변수에 따라 선택되는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9를 이용하여 TRBC 유전자를 넉아웃하기 위한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 출발 코돈의 하류의 암호 서열의 처음 500 bp 내에서 결합하고, 양호한 직교성은 필요하지 않다. 본 명세서에서 표적화 도메인이 상보적 염기쌍을 통해 표적 도메인과 혼성화하는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일-가닥 파손(Cas9 틈내기효소)을 생성하는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 이중 표적화는 반대의 DNA 가닥에 대해 상보성인 2 개의 표적화 도메인을 지니는 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 틈내기효소를 이용함으로써 반대의 DNA 가닥 상에 2 개의 틈을 생성하는 데 사용되고, 예를 들어, 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 짝지어질 수 있으며, 단, PAM이 바깥으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0 bp 내지 50 bp가 되도록 2 개의 gRNA는 DNA 상에서 배향된다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 17량체를 포함할 수 있고, 예를 들어, 18 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 17량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 18량체를 포함할 수 있고, 예를 들어, 19 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 18량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 19량체를 포함할 수 있고, 예를 들어, 20 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 19량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 20량체 gRNA를 포함할 수 있고, 예를 들어, 21 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 20량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 21량체 gRNA를 포함할 수 있고, 예를 들어, 22 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 21량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 22량체 gRNA를 포함할 수 있고, 예를 들어, 23 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 22량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 23량체 gRNA를 포함할 수 있고, 예를 들어, 24 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 23량체 gRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 24량체 gRNA를 포함할 수 있고, 예를 들어, 25 개 이상의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인은 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32에 기재된 24량체 gRNA를 포함할 수 있다.
III. Cas9 분자
다양한 종의 Cas9 분자가 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 네이세리아 메닌기티디스 및 스트렙토코커스 써모필루스 Cas9 분자는 본 명세서에 개시한 상당수 개시 내용의 대상이지만, 본 명세서에 열거된 기타 다른 종의 Cas9 단백질의, 또는 이로부터 유래되거나, 또는 이에 기반한 Cas9 분자가 마찬가지로 사용될 수 있다. 다시 말해서, 본 명세서의 상당수의 기재가 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 네이세리아 메닌기티디스 및 스트렙토코커스 써모필루스 Cas9 분자를 사용하지만, 기타 다른 종으로부터의 Cas9 분자는 그들을 대체할 수 있다. 이와 같은 종은 아시도보락스 아베나에(Acidovorax avenae), 악티노바실러스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 악티노바실러스 수이스(Actinobacillus suis), 악티노마이세스 종(Actinomyces sp.), 사이클리필러스 데니트리피칸스(Cycliphilus denitrificans), 아미노모나스 파우시보란스(Aminomonas paucivorans), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 스미티(Bacillus smithii), 바실러스 트루린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테로이데스 종(Bacteroides sp.), 블라스토피레룰라 마리나(Blastopirellula marina), 브라디리조븀 종(Bradyrhizobium sp.), 브레비바실러스 라테로스포러스(Brevibacillus laterosporus), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 칸디다투스 푸니세이스피릴룸(Candidatus Puniceispirillum), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 코리네박테리움 악콜렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 마트루코티(Corynebacterium matruchotii), 디노로세오박터 쉬배(Dinoroseobacter shibae), 유박테리움 돌리춤(Eubacterium dolichum), 감마 프로테오박테리움(Gamma proteobacterium), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus), 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 스푸토룸(Haemophilus sputorum), 헬리코박터 카나덴시스(Helicobacter canadensis), 헬리코박터 시나에디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 무스텔라(Helicobacter mustelae), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus), 킨겔라 킨가에(Kingella kingae), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아세 박테리움(Listeriaceae bacterium), 메틸로시스티스 종(Methylocystis sp.), 메틸로시너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 모빌룬커스 물리에리스(Mobiluncus mulieris), 네이세리아 바실리포르미스(Neisseria bacilliformis), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 네이세리아 플라베센스(Neisseria flavescens), 네이세리아 락타미카, 네이세리아 메닌기티디스, 네이세리아 종(Neisseria sp.), 네이세리아 와드워티(Neisseria wadsworthii), 니트로소모나스 종(Nitrosomonas sp.), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스(Phascolarctobacterium succinatutens), 랄스토니아 시지기(Ralstonia syzygii), 로도슈모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도불룸 종(Rhodovulum sp.), 시몬시엘라 무엘레리(Simonsiella muelleri), 스핑고모나스 종(Sphingomonas sp.), 스포로락토바실러스 비니애(Sporolactobacillus vineae), 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.), 서브돌리그라눌룸 종(Subdoligranulum sp.), 티스텔라 모빌리스(Tistrella mobilis), 트레포네마 종(Treponema sp.) 또는 베르미네프로박터 에이세니아(Verminephrobacter eiseniae)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 gRNA 분자와 상호작용할 수 있고, gRNA 분자와 협력하여 표적 도메인 및 PAM 서열을 포함하는 부위로 귀소하거나 또는 편재화되는분자 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 해당 용어로서 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드는, 기준 서열, 예를 들어 가장 유사한 천연 유래 Cas9 분자 또는 표 100의 서열과, 예를 들어 적어도 하나의 아미노산 잔기만큼 상이한 천연 유래 Cas9 분자 및 조작, 변경 또는 변형된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 지칭한다.
Cas9 도메인
결정 구조는 2 종의 상이한 천연 유래 박테리아 Cas9 분자에 대해(Jinek et al., Science, 343(6176):1247997, 2014) 그리고 가이드 RNA(예를 들어, crRNA 및 tracrRNA의 합성 융합)를 이용하여 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9에 대해 결정되었다(Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014; 및 Anders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038/nature13579).
천연 유래 Cas9 분자는 2 개의 로브(인식(REC) 및 뉴클레아제(NUC) 로브)를 포함하며; 이들 각각은 본 명세서에 기재된 도메인을 추가로 포함한다. 도 8의 A 내지 B는 1차 구조에서 중요한 Cas9 도메인 조직화의 개략도를 제공한다. 본 개시 내용 전체적으로사용되는 도메인 명명 및 각각의 도메인에 의해 포함된 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Nishimasu et al]에 기재된 바와 같다. 아미노산 잔기의 넘버링은 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 Cas9를 참조로 한다.
REC 로브는 아르기닌-풍부 브릿지 나선(BH), REC1 도메인 및 REC2 도메인을 포함한다. REC 로브는 기타 다른 공지된 단백질과의 구조적 유사성을 공유하지 않는데, 이는 그것이 Cas9-특이적 기능성 도메인이라는 것을 나타낸다. BH 도메인은 긴 α-나선 및 아르기닌 풍부 영역이며, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 서열의 아미노산 60 내지 93을 포함한다. REC1 도메인은 반복부:안티-반복부 이중가닥의, 예를 들어gRNA 또는 tracrRNA의 인식에 중요하며, 따라서 표적 서열을 인식함으로써 Cas9 활성에 중요하다. REC1 도메인은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 서열의 아미노산 94 내지 179 및 308 내지 717에서 2 개의 REC1 모티프를 포함한다. 이들 2 개의 REC1 도메인은, 선형 1차 구조에서 REC2 도메인에 의해 분리되기는 하지만, 3차 구조로 조립되어 REC1 도메인을 형성한다. REC2 도메인 또는 이의 부분은 또한 반복부:안티-반복부 이중가닥의 인식에서 어떤 역할을 할 수 있다. REC2 도메인은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 서열의 아미노산 180 내지 307을 포함한다.
NUC 로브는 RuvC 도메인(또한 본 명세서에서 RuvC-유사 도메인으로서 지칭됨), HNH 도메인(또한 본 명세서에서 HNH-유사 도메인으로서 지칭됨), 및 PAM-상호작용(PI) 도메인을 포함한다. RuvC 도메인은 레트로바이러스 인테그라제 상과 구성원에 대해 구조적 유사성을 공유하며, 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 비-상보성 가닥을 절단한다. RuvC 도메인은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 서열의 아미노산 1 내지 59, 718 내지 769 및 909 내지 1098에서 각각 3 개의 분할 RuvC 모티프(종종 당업계에서 RuvCI 도메인, 또는 N-말단 RuvC 도메인, RuvCII 도메인 및 RuvCIII 도메인으로서 통상적으로 지칭되는 RuvC I, RuvCII 및 RuvCIII)로부터 조립된다. REC1 도메인과 유사하게, 3 개의 RuvC 모티프는 1차 구조에서 기타 다른 도메인에 의해 선형으로 분리되지만, 그러나, 3차 구조에서, 3 개의 RuvC 모티프는 RuvC 도메인을 조립하고 형성한다. HNH 도메인은 HNH 엔도뉴클레아제와 구조적 유사성을 공유하며, 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 상보성 가닥을 절단한다. HNH 도메인은 RuvC II와 III 모티프 사이에 놓이며, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 서열의 아미노산 775 내지 908을 포함한다. PI 도메인은 표적 핵산 분자의 PAM과 상호작용하며, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 서열의 아미노산 1099 내지 1368을 포함한다.
RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 HNH-유사 도메인 및 RuvC-유사 도메인을 포함한다. 구현예에서, 절단 활성은 RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인에 따른다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 다음의 도메인 중 하나 이상을 포함할 수 있다: RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인. 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 RuvC-유사 도메인, 예를 들어 이하에 기재하는 RuvC-유사 도메인, 및/또는 HNH-유사 도메인, 예를 들어 이하에 기재하는 HNH-유사 도메인을 포함한다.
RuvC-유사 도메인
구현예에서, RuvC-유사 도메인은 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 비-상보성 가닥을 절단한다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하나 초과의 RuvC-유사 도메인(예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개 이상의 RuvC-유사 도메인)을 포함할 수 있다. 구현예에서, RuvC-유사 도메인은 길이로 적어도 5 개, 6 개, 7 개, 8 개의 아미노산이지만, 길이로 20 개, 19 개, 18 개, 17 개, 16 개 또는 15 개 이하의 아미노산이다. 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 약 10 개 내지 20 개의 아미노산, 예를 들어 길이로 약 15 개의 아미노산의 N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함한다.
N-말단 RuvC-유사 도메인
일부 천연 유래 Cas9 분자는 하나 초과의 RuvC-유사 도메인을 포함하며, 절단은 N-말단 RuvC-유사 도메인에 의존적이다. 따라서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 N-말단 RuvC-유사 도메인은 이하에 기재된다.
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기 식 I의 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함한다:
D-X1-G-X2-X3-X4-X5-G-X6-X7-X8-X9(서열번호 8),
여기서,
X1는 I, V, M, L 및 T로부터 선택되고(예를 들어, I, V 및 L로부터 선택되고);
X2는 T, I, V, S, N, Y, E 및 L로부터 선택되며(예를 들어, T, V 및 I로부터 선택되며);
X3은 N, S, G, A, D, T, R, M 및 F로부터 선택되고(예를 들어, A 또는 N);
X4는 S, Y, N 및 F로부터 선택되며(예를 들어, S);
X5는 V, I, L, C, T 및 F로부터 선택되고(예를 들어, V, I 및 L로부터 선택되고);
X6은 W, F, V, Y, S 및 L로부터 선택되며(예를 들어, W);
X7은 A, S, C, V 및 G로부터 선택되고(예를 들어, A 및 S로부터 선택되고);
X8은 V, I, L, A, M 및 H로부터 선택되며(예를 들어, V, I, M 및 L로부터 선택되고); 및
X9는 임의의 아미노산으로부터 선택되거나 또는 없다(Δ로 표기)(예를 들어, T, V, I, L, Δ, F, S, A, Y, M 및 R로부터 선택되거나, 또는, 예를 들어,T, V, I, L 및 Δ로부터 선택됨).
구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 서열번호 8의 서열과 1 개만큼, 그러나 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 절단 적격이다.
구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 절단 부적격이다.
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기 식 II의 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함한다:
D-X1-G-X2-X3-S-X5-G-X6-X7-X8-X9(서열번호 9),
식 중,
X1은 I, V, M, L 및 T로부터 선택되고(예를 들어, I, V 및 L로부터 선택되고);
X2은 T, I, V, S, N, Y, E 및 L로부터 선택되며(예를 들어, T, V 및 I로부터 선택되며);
X3은 N, S, G, A, D, T, R, M 및 F로부터 선택되고(예를 들어, A 또는 N으로부터 선택되고);
X5는 V, I, L, C, T 및 F로부터 선택되며(예를 들어, V, I 및 L로부터 선택되며);
X6은 W, F, V, Y, S 및 L로부터 선택되고(예를 들어, W);
X7은 A, S, C, V 및 G로부터 선택되며(예를 들어, A 및 S로부터 선택되며);
X8은 V, I, L, A, M 및 H로부터 선택되고(예를 들어, V, I, M 및 L로부터 선택되고); 그리고
X9는 임의의 아미노산으로부터 선택되거나 또는 없다(예를 들어, T, V, I, L, Δ, F, S, A, Y, M 및 R로부터 선택되거나 또는, 예를 들어 T, V, I, L 및 Δ로부터 선택된다).
구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 서열번호 9의 서열과 1 개만큼, 그러나 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 하기 식 III의 아미노산 서열을 포함한다:
D-I-G-X2-X3-S-V-G-W-A-X8-X9(서열번호 10),
여기서
X2은 T, I, V, S, N, Y, E 및 L로부터 선택되고(예를 들어, T, V 및 I로부터 선택되고);
X3은 N, S, G, A, D, T, R, M 및 F로부터 선택되며(예를 들어, A 또는 N);
X8은 V, I, L, A, M 및 H로부터 선택되고(예를 들어, V, I, M 및 L로부터 선택되고); 그리고
X9는 임의의 아미노산으로부터 선택되거나 또는 없다(예를 들어, T, V, I, L, Δ, F, S, A, Y, M 및 R로부터 선택되거나 또는, 예를 들어 T, V, I, L 및 Δ로부터 선택된다).
구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 서열번호 10의 서열과 1 개만큼, 그러나 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 하기 식 III의 아미노산 서열을 포함한다:
D-I-G-T-N-S-V-G-W-A-V-X(서열번호 11),
식 중
*
X는 비극성 알킬 아미노산 또는 하이드록실 아미노산이고, 예를 들어 X는 V, I, L 및 T로부터 선택된다(예를 들어, eaCas9 분자는 도 2a 내지 도 2g에 나타낸 N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다(Y로서 도시함)).
구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 서열번호 11의 서열과 1 개만큼, 그러나 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 본 명세서에, 예를 들어 도 3a 내지 도 3b 또는 도 7a 내지 도 7b에서 개시된 N-말단 RuvC 유사 도메인의 서열과 1 개만큼, 그러나 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다. 구현예에서, 도 3a 내지 도 3b 또는 도 7a 내지 도 7b에서 동정된 고도로 보존된 잔기 중 1 개, 2 개 또는 모두 3 개가 존재한다.
구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인은 본 명세서에, 예를 들어 도 4a 내지 도 4b 또는 도 7a 내지 도 7b에서 개시된 N-말단 RuvC 유사 도메인의 서열과 1 개만큼, 그러나 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다. 구현예에서, 도 4a 내지 도 4b 또는 도 7a 내지 도 7b에서 동정된 고도로 보존된 잔기 중 1 개, 2 개, 3 개 또는 모두 4 개가 존재한다.
추가적인 RuvC-유사 도메인
N-말단 RuvC-유사 도메인에 추가로, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하나 이상의 추가적인 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 2 개의 추가적인 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가적인 RuvC-유사 도메인은 길이로 적어도 5 개의 아미노산, 예를 들어 길이로 15 개 미만의 아미노산, 예를 들어 길이로 5 개 내지 10 개의 아미노산, 예를 들어 길이로 8 개의 아미노산이다.
추가적인 RuvC-유사 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
I-X1-X2-E-X3-A-R-E(서열번호 12),
여기서
X1은 V 또는 H이고,
X2는 I, L 또는 V(예를 들어, I 또는 V)이며;
X3은 M 또는 T이다.
구현예에서, 추가적인 RuvC-유사 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
I-V-X2-E-M-A-R-E(서열번호 13),
여기서,
X2는 I, L 또는 V(예를 들어, I 또는 V)이다(예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g 또는 도 7a 내지 도 7b에 나타낸 추가적인 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다(B로서 도시함)).
추가적인 RuvC-유사 도메인은 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
H-H-A-X1-D-A-X2-X3(서열번호 14),
여기서,
X1은 H 또는 L이고;
X2는 R 또는 V이며;
*X3은 E 또는 V이다.
구현예에서, 추가적인 RuvC-유사 도메인은 아미노산 서열: H-H-A 내지 H-D-A-Y-L(서열번호 15)을 포함한다.
구현예에서, 추가적인 RuvC-유사 도메인은 서열번호 12, 13, 14 또는 15의 서열과 1 개만큼, 그러나 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
일부 구현예에서, N-말단 RuvC-유사 도메인에 측접하는 서열은 하기 식 V의 서열이다:
K-X1'-Y-X2'-X3'-X4'-Z-T-D-X9'-Y(서열번호 16),
여기서,
X1'은 K 및 P로부터 선택되고,
X2'는 V, L, I 및 F로부터 선택되며(예를 들어, V, I 및 L);
X3'은 G, A 및 S로부터 선택되고(예를 들어, G),
X4'은 L, I, V 및 F로부터 선택되며(예를 들어, L);
X9'은 D, E, N 및 Q로부터 선택되고; 그리고
Z는, 예를 들어 상기 기재한 바와 같은 N-말단 RuvC-유사 도메인이다.
HNH-유사 도메인
구현예에서, HNH-유사 도메인은 단일 가닥 상보성 도메인, 예를 들어 이중 가닥 핵산 분자의 상보성 가닥을 절단한다. 구현예에서, HNH-유사 도메인은 길이로 적어도 15 개, 20 개, 25 개의 아미노산이지만, 길이로 40 개, 35 개 또는 30 개 이하의 아미노산, 예를 들어 길이로 20 개 내지 35 개의 아미노산, 예를 들어 길이로 25 개 내지 30 개의 아미노산이다. 예시적인 HNH-유사 도메인은 이하에 기재된다.
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기 식 VI의 아미노산 서열을 갖는 HNH-유사 도메인을 포함한다:
X1-X2-X3-H-X4-X5-P-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-N-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-N(서열번호 17),
여기서,
X1는 D, E, Q 및 N로부터 선택되고(예를 들어, D 및 E);
X2는 L, I, R, Q, V, M 및 K로부터 선택되며;
X3은 D 및 E로부터 선택되고;
X4는 I, V, T, A 및 L로부터 선택되며(예를 들어, A, I 및 V);
X5는 V, Y, I, L, F 및 W로부터 선택되고(예를 들어, V, I 및 L);
X6은 Q, H, R, K, Y, I, L, F 및 W로부터 선택되며;
X7은 S, A, D, T 및 K로부터 선택되고(예를 들어, S 및 A);
X8은 F, L, V, K, Y, M, I, R, A, E, D 및 Q로부터 선택되며(예를 들어, F);
X9는 L, R, T, I, V, S, C, Y, K, F 및 G로부터 선택되고;
X10은 K, Q, Y, T, F, L, W, M, A, E, G 및 S로부터 선택되며;
X11은 D, S, N, R, L 및 T로부터 선택되고(예를 들어, D);
X12는 D, N 및 S로부터 선택되며;
X13은 S, A, T, G 및 R로부터 선택되고(예를 들어, S);
X14는 I, L, F, S, R, Y, Q, W, D, K 및 H로부터 선택되며(예를 들어, I, L 및 F);
X15는 D, S, I, N, E, A, H, F, L, Q, M, G, Y 및 V로부터 선택되고;
X16은 K, L, R, M, T 및 F(예를 들어, L, R 및 K)로부터 선택되며;
X17은 V, L, I, A 및 T로부터 선택되고;
X18은 L, I, V 및 A로부터 선택되며(예를 들어, L 및 I);
X19는 T, V, C, E, S 및 A로부터 선택되고(예를 들어, T 및 V);
X20은 R, F, T, W, E, L, N, C, K, V, S, Q, I, Y, H 및 A로부터 선택되며;
X21은 S, P, R, K, N, A, H, Q, G 및 L로부터 선택되고;
X22는 D, G, T, N, S, K, A, I, E, L, Q, R 및 Y로부터 선택되며; 그리고
X23은 K, V, A, E, Y, I, C, L, S, T, G, K, M, D 및 F로부터 선택된다.
구현예에서, HNH-유사 도메인은 서열번호 17과 적어도 1 개만큼 그러나 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, HNH-유사 도메인은 절단 적격이다.
구현예에서, HNH-유사 도메인은 절단 부적격이다.
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기 식 VII의 아미노산 서열을 포함하는 HNH-유사 도메인을 포함한다:
X1-X2-X3-H-X4-X5-P-X6-S-X8-X9-X10-D-D-S-X14-X15-N-K-V-L-X19-X20-X21-X22-X23-N(서열번호 18),
여기서,
X1은 D 및 E로부터 선택되고;
X2는 L, I, R, Q, V, M 및 K로부터 선택되며;
X3은 D 및 E로부터 선택되고;
X4는 I, V, T, A 및 L로부터 선택되며(예를 들어, A, I 및 V);
X5는 V, Y, I, L, F 및 W로부터 선택되고(예를 들어, V, I 및 L);
X6은 Q, H, R, K, Y, I, L, F 및 W로부터 선택되며;
X8은 F, L, V, K, Y, M, I, R, A, E, D 및 Q로부터 선택되고(예를 들어, F);
X9는 L, R, T, I, V, S, C, Y, K, F 및 G로부터 선택되며;
X10은 K, Q, Y, T, F, L, W, M, A, E, G 및 S로부터 선택되고;
X14는 I, L, F, S, R, Y, Q, W, D, K 및 H로부터 선택되며(예를 들어, I, L 및 F);
X15는 D, S, I, N, E, A, H, F, L, Q, M, G, Y 및 V로부터 선택되고;
X19는 T, V, C, E, S 및 A로부터 선택되며(예를 들어, T 및 V);
X20은 R, F, T, W, E, L, N, C, K, V, S, Q, I, Y, H 및 A로부터 선택되고;
X21은 S, P, R, K, N, A, H, Q, G 및 L로부터 선택되며;
X22는 D, G, T, N, S, K, A, I, E, L, Q, R 및 Y로부터 선택되고; 그리고
X23은 K, V, A, E, Y, I, C, L, S, T, G, K, M, D 및 F로부터 선택된다.
구현예에서, HNH-유사 도메인은 서열번호 18의 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기 식 VII의 아미노산 서열을 포함하는 HNH-유사 도메인을 포함한다:
X1-V-X3-H-I-V-P-X6-S-X8-X9-X10-D-D-S-X14-X15-N-K-V-L-T-X20-X21-X22-X23-N(서열번호 19),
여기서,
X1은 D 및 E로부터 선택되고;
X3은 D 및 E로부터 선택되며;
X6은 Q, H, R, K, Y, I, L 및 W로부터 선택되고;
X8은 F, L, V, K, Y, M, I, R, A, E, D 및 Q로부터 선택되며(예를 들어, F);
X9는 L, R, T, I, V, S, C, Y, K, F 및 G로부터 선택되고;
X10은 K, Q, Y, T, F, L, W, M, A, E, G 및 S로부터 선택되며;
X14는 I, L, F, S, R, Y, Q, W, D, K 및 H(예를 들어, I, L 및 F)로부터 선택되고;
X15는 D, S, I, N, E, A, H, F, L, Q, M, G, Y 및 V로부터 선택되며;
X20은 R, F, T, W, E, L, N, C, K, V, S, Q, I, Y, H 및 A로부터 선택되고;
X21은 S, P, R, K, N, A, H, Q, G 및 L로부터 선택되며;
X22는 D, G, T, N, S, K, A, I, E, L, Q, R 및 Y로부터 선택되고; 그리고
X23은 K, V, A, E, Y, I, C, L, S, T, G, K, M, D 및 F로부터 선택된다.
구현예에서, HNH-유사 도메인은 서열번호 19의 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 화학식 VIII의 아미노산 서열을 갖는 HNH-유사 도메인을 포함한다:
D-X2-D-H-I-X5-P-Q-X7-F-X9-X10-D-X12-S-I-D-N-X16-V-L-X19-X20-S-X22-23-N(서열번호 20),
여기서,
X2는 I 및 V로부터 선택되고;
X5는 I 및 V로부터 선택되며;
X7은 A 및 S로부터 선택되고;
X9는 I 및 L로부터 선택되며;
X10은 K 및 T로부터 선택되고;
X12는 D 및 N으로부터 선택되며;
X16은 R, K 및 L로부터 선택되고; X19는 T 및 V로부터 선택되며;
X20은 S 및 R로부터 선택되고;
X22는 K, D 및 A로부터 선택되며; 그리고
X23은 E, K, G 및 N으로부터 선택된다(예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 HNH-유사 도메인을 포함할 수 있다).
구현예에서, HNH-유사 도메인은 서열번호 20의 서열과 1 개만큼 그러나 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기 식 IX의 아미노산 서열을 포함한다:
L-Y-Y-L-Q-N-G-X1'-D-M-Y-X2'-X3'-X4'-X5'-L-D-I―X6'-X7'-L-S-X8'-Y-Z-N-R-X9'-K-X10'-D-X11'-V-P(서열번호 21),
여기서,
X1'은 K 및 R로부터 선택되고;
X2'는 V 및 T로부터 선택되며;
X3'은 G 및 D로부터 선택되고;
X4'은 E, Q 및 D로부터 선택되며;
X5'은 E 및 D로부터 선택되고;
X6'는 D, N 및 H로부터 선택되며;
X7'은 Y, R 및 N으로부터 선택되고;
X8'은 Q, D 및 N으로부터 선택되며; X9'은 G 및 E로부터 선택되고;
X10'은 S 및 G로부터 선택되고;
X11'은 D 및 N으로부터 선택되며;
Z는, 예를 들어 상기 기재한 바와 같은 HNH-유사 도메인이다.
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 서열번호 21의 서열과 1 개만큼 그러나 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
구현예에서, HNH-유사 도메인은 본 명세서에, 예를 들어 도 5a 내지 도 5c 또는 도 7a 내지 도 7b에 개시된 HNH-유사 도메인과 1 개만큼 그러나 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 구현예에서, 도 5a 내지 도 5c 또는 도 7a 내지 도 7b에서 동정된 고도로 보존된 잔기 중 1 개 또는 둘 다가 존재한다.
구현예에서, HNH -유사 도메인은 본 명세서에, 예를 들어 도 6a 내지 도 6b 또는 도 7a 내지 도 7b에 개시된 HNH-유사 도메인의 서열과 1 개만큼 그러나 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다. 구현예에서, 도 6a 내지 6b 또는 도 7a 내지 도 7b에서 동정된 고도로 보존된 잔기 중 1 개, 2 개, 모두 3 개가 존재한다.
Cas9 활성
뉴클레아제 및 헬리카제 활성
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 표적 핵산 분자를 절단할 수 있다. 통상적으로 야생형 Cas9 분자는 표적 핵산 분자의 가닥을 둘 다 절단한다. Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드는 뉴클레아제 절단(또는 기타 다른 특성)을 변경하기 위해, 예를 들어 틈내기효소이거나 또는 표적 핵산을 절단하는 능력이 없는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 제공하기 위해 조작될 수 있다. 표적 핵산 분자를 절단할 수 있는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 본 명세서에서 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드로서지칭된다.
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 다음의 활성 중 하나 이상을 포함한다:
틈내기효소 활성, 즉, 단일 가닥을 절단하는 능력, 예를 들어 핵산 분자의비-상보성 가닥 또는 상보성 가닥;
이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉, 구현예에서 2 개의 틈내기효소 활성의 존재 하에 이중 가닥 핵산의 가닥을 절단하고 이중 가닥 파손을 생성하는 능력;
엔도뉴클레아제 활성;
엑소뉴클레아제 활성; 및
헬리카제 활성, 즉, 이중 가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 능력.
구현예에서, 효소적으로 활성인 또는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 가닥을 둘 다 절단하며, 이중 가닥 파손을 초래한다. 구현예에서, eaCas9 분자는 하나의 가닥만을, 예를 들어 gRNA가 혼성화하는 가닥 또는 gRNA와 혼성화하는 가닥에 상보성인 가닥을 절단한다. 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 HNH-유사 도메인과 연관된 절단 활성을 포함한다. 구현예에서,eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 N-말단 RuvC-유사 도메인과 연관된 절단 활성을 포함한다. 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 HNH-유사 도메인과 연관된 절단 활성 및 N-말단 RuvC-유사 도메인과 연관된 절단 활성을 포함한다. 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 활성, 또는 절단 적격, HNH-유사 도메인 및 비활성, 또는 절단 부적격, N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함한다. 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 비활성, 또는 절단 부적격, HNH-유사 도메인 및 활성, 또는 절단 적격, N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함한다.
일부 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 gRNA 분자와 상호작용하는 능력을 가지며, gRNA 분자와 함께 코어 표적 도메인에 대해 국소화되지만, 표적 핵산을 절단할 수 없거나, 또는 효율적인 비율로 절단할 수 없다. 절단 활성이 없거나 또는 실질적으로 없는 Cas9 분자는 본 명세서에서 eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드로서 지칭된다. 예를 들어, eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여 절단 활성이 없거나 또는 실질적으로 없을 수 있고, 예를 들어 기준 Cas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드의 절단 활성의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만이다.
표적화 및 PAM
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 가이드 RNA(gRNA) 분자와 상호작용할 수 있고, gRNA 분자와 협력하여 표적 도메인 및 PAM 서열을 포함하는 부위로 국소화될 수 있는 폴리펩타이드이다.
구현예에서, 표적 핵산과 상호작용하고 절단하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드의 능력은 PAM 서열 의존적이다. PAM 서열은은 표적 핵산의 서열이다. 구현예에서, 표적 핵산의 절단은 PAM 서열로부터 상류에서 일어난다. 상이한 박테리아 종으로부터의 EaCas9 분자는 상이한 서열 모티프(예를 들어, PAM 서열)를 인식할 수 있다. 구현예에서, 스트렙토코커스 피오게네스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NGG, NAG, NGA를 인식하고, 해당 서열로부터의 상류의 표적 핵산 서열 1 개 내지 10 개, 예를 들어 3 개 내지 5 개 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Mali et al., Science 2013; 339(6121): 823-826] 참조. 구현예에서, 스트렙토코커스 써모필루스(S. thermophilus)의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NGGNG 및/또는 NNAGAAW(W = A 또는 T)를 인식하고, 이들 서열로부터의 상류의 표적 핵산 서열 1 개 내지 10 개, 예를 들어 3 개 내지 5 개 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Horvath et al., Science 2010; 327(5962):167-170, 및 Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400] 참조. 구현예에서, 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NGG 및/또는 NAAR(R = A 또는 G))를 인식하며, 이 서열로부터 상류의 코어 표적 핵산 서열 1 개 내지 10 개, 예를 들어 3 개 내지 5 개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400] 참조. 구현예에서, 스타필로코커스 아우레우스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNGRR(R = A 또는 G)를 인식하고, 해당 서열로부터 상류의 표적 핵산 서열 1 개 내지 10 개, 예를 들어 3 개 내지 5 개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 구현예에서, 스타필로코커스 아우레우스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNGRRT(R = A 또는 G)를 인식하고, 해당 서열로부터 상류의 표적 핵산 서열 1 개 내지 10 개, 예를 들어 3 개 내지 5 개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 구현예에서, 스타필로코커스 아우레우스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNGRRV(R = A 또는 G)를 인식하고, 해당 서열로부터 상류의 표적 핵산 서열 1 개 내지 10 개, 예를 들어 3 개 내지 5 개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 구현예에서, 네이세리아 메닌기티디스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNNNGATT 또는 NNNGCTT(R = A 또는 G, V = A, G 또는 C)를 인식하고, 해당 서열로부터 상류의 표적 핵산 서열 1 개 내지 10 개, 예를 들어 3 개 내지 5 개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6] 참조. PAM 서열을 인식하는 Cas9 분자의 능력은, 예를 들어 문헌[Jinek et al., Science 2012 337:816]에 기재된 형질전환 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 앞서 언급한 구현예에서, N은 임의의 뉴클레오타이드 잔기, 예를 들어 임의의 A, G, C 또는 T일 수 있다.
본 명세서에 논의된 바와 같이, Cas9 분자는 Cas9 분자의 PAM 특이성을 변경하도록 조작될 수 있다.
예시적인 천연 유래 Cas9 분자는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013; 10:5, 727-737]에 기재되어 있다. 이러한 Cas9 분자는 클러스터 1 박테리아과, 클러스터 2 박테리아과, 클러스터 3 박테리아과, 클러스터 4 박테리아과, 클러스터 5 박테리아과, 클러스터 6 박테리아과, 클러스터 7 박테리아과, 클러스터 8 박테리아과, 클러스터 9 박테리아과, 클러스터 10 박테리아과, 클러스터 11 박테리아과, 클러스터 12 박테리아과, 클러스터 13 박테리아과, 클러스터 14 박테리아과, 클러스터 15 박테리아과, 클러스터 16 박테리아과, 클러스터 17 박테리아과, 클러스터 18 박테리아과, 클러스터 19 박테리아과, 클러스터 20 박테리아과, 클러스터 21 박테리아과, 클러스터 22 박테리아과, 클러스터 23 박테리아과, 클러스터 24 박테리아과, 클러스터 25 박테리아과, 클러스터 26 박테리아과, 클러스터 27 박테리아과, 클러스터 28 박테리아과, 클러스터 29 박테리아과, 클러스터 30 박테리아과, 클러스터 31 박테리아과, 클러스터 32 박테리아과, 클러스터 33 박테리아과, 클러스터 34 박테리아과, 클러스터 35 박테리아과, 클러스터 36 박테리아과, 클러스터 37 박테리아과, 클러스터 38 박테리아과, 클러스터 39 박테리아과, 클러스터 40 박테리아과, 클러스터 41 박테리아과, 클러스터 42 박테리아과, 클러스터 43 박테리아과, 클러스터 44 박테리아과, 클러스터 45 박테리아과, 클러스터 46 박테리아과, 클러스터 47 박테리아과, 클러스터 48 박테리아과, 클러스터 49 박테리아과, 클러스터 50 박테리아과, 클러스터 51 박테리아과, 클러스터 52 박테리아과, 클러스터 53 박테리아과, 클러스터 54 박테리아과, 클러스터 55 박테리아과, 클러스터 56 박테리아과, 클러스터 57 박테리아과, 클러스터 58 박테리아과, 클러스터 59 박테리아과, 클러스터 60 박테리아과, 클러스터 61 박테리아과, 클러스터 62 박테리아과, 클러스터 63 박테리아과, 클러스터 64 박테리아과, 클러스터 65 박테리아과, 클러스터 66 박테리아과, 클러스터 67 박테리아과, 클러스터 68 박테리아과, 클러스터 69 박테리아과, 클러스터 70 박테리아과, 클러스터 71 박테리아과, 클러스터 72 박테리아과, 클러스터 73 박테리아과, 클러스터 74 박테리아과, 클러스터 75 박테리아과, 클러스터 76 박테리아과, 클러스터 77 박테리아과, 또는 클러스터 78 박테리아과의 Cas9 분자를 포함한다.
예시적인 천연 유래 Cas9 분자는 클러스터 1 박테리아과의 Cas9 분자를 포함한다. 예는 스트렙토코커스 피오게네스(예를 들어, 균주 SF370, MGAS10270, MGAS10750, MGAS2096, MGAS315, MGAS5005, MGAS6180, MGAS9429, NZ131 및 SSI-1), 스트렙토코커스 써모필루스(예를 들어, 균주 LMD-9), 스트렙토코커스 슈도포르시누스(S. pseudoporcinus)(예를 들어, 균주 SPIN 20026), 스트렙토코커스 뮤탄스(예를 들어, 균주 UA159, NN2025), 스트렙토코커스 마카카에(S. macacae)(예를 들어, 균주 NCTC11558), 스트렙토코커스 갈로리티쿠스(S. gallolyticus)(예를 들어, 균주 UCN34, ATCC BAA-2069), 스트렙토코커스 에쿠이네스(S. equines)(예를 들어, 균주 ATCC 9812, MGCS 124), 스트렙토코커스 디스달락티애(S. dysdalactiae)(예를 들어, 균주 GGS 124), 스트렙토코커스 보비스(S. bovis)(예를 들어, 균주 ATCC 700338), 스트렙토코커스 안기노서스(S. anginosus)(예를 들어, 균주 F0211), 스트렙토코커스 아갈락티애(S. agalactiae)(예를 들어, 균주 NEM316, A909), 리스테리아 모노사이토게네스(예를 들어, 균주 F6854), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)(리스테리아 이노큐아, 예를 들어 균주 Clip11262), 엔테로코커스 이탈리쿠스(Enterococcus italicus)(예를 들어, 균주 DSM 15952) 또는 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)(예를 들어, 균주 1,231,408)의 Cas9 분자를 포함한다. 다른 예시적인 Cas9 분자는 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 분자(Hou et al. PNAS Early Edition 2013, 1-6)이다.
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 임의의 Cas9 분자 서열, 또는 천연 유래 Cas9 분자서열, 예를 들어 본 명세서에 열거되거나 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737; Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6; 서열번호 1 내지 4]에 기재된 종으로부터의 Cas9 분자에 대해:
60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가지거나;
비교할 때 아미노산 잔기의 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40% 이하만큼 상이하거나;
적어도 1 개, 2 개, 5 개, 10 개 또는 20 개 아미노산만큼이지만, 100 개, 80 개, 70 개, 60 개, 50 개, 40 개 또는 30 개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
동일한 아미노산 서열을 포함한다. 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 다음의 활성 중 하나 이상을 포함한다:틈내기효소 활성;이중 가닥 절단 활성(예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성);헬리카제 활성; 또는 gRNA 분자와 함께, 표적 핵산으로 귀소하는 능력.
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g의 공통 서열의 아미노산 서열을 포함하되, "*"는 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 및 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9 분자의 아미노산 서열 내 대응하는 위치에서 발견된 임의의 아미노산을 나타내고, "-"은 임의의 아미노산을 나타낸다. 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 서열과 적어도 1 개만큼, 그러나 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이하다. 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 7a 내지 도 7b의 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하되, "*"는 스트렙토코커스 피오게네스, 또는 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 분자의 아미노산 서열 내 대응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 나타내고, "-"는 임의의 아미노산을 나타내며, "-"는 임의의 아미노산 또는 부재를 나타낸다. 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 7a 내지 도 7b에 개시된 서열번호 6 또는 7의 서열과 적어도 1 개만큼, 그러나 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이하다.
다수의 Cas9 분자의 서열의 비교는 특정 영역이 보존된다는 것을 나타낸다. 이들은 하기와 같이 동정된다:
영역 1(잔기 1 내지 180, 또는 영역 1'잔기 120 내지 180의 경우에)
영역 2(잔기 360 내지 480);
영역 3(잔기 660 내지 720);
영역 4(잔기 817 내지 900); 및
영역 5(잔기 900 내지 960);
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 생물학적 활성 분자, 예를 들어 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 활성을 갖는 Cas9 분자를 제공하기 위한 충분한 추가적인 Cas9 분자 서열과 함께 영역 1 내지 5를 포함한다. 구현예에서, 각각의 영역 1 내지 6은 독립적으로 본 명세서에 기재된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의 대응하는 잔기, 예를 들어 도 2a 내지 도 2g로부터의 또는 도 7a 내지 도 7b로부터의 서열과 50%, 60%, 70% 또는 80% 상동성을 가진다.
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 영역은 하기와 같은 영역 1로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함한다:
스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 180과 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가지거나(넘버링은 도 2a 내지 2g에서 모티프 서열에 따르며; 도 2a 내지 도 2g에서 4 개의 Cas9 서열의 잔기 중 52%는 보존됨);
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 180과 적어도 1 개, 2 개, 5 개, 10 개 또는 20 개의 아미노산, 그러나 90 개, 80 개, 70 개, 60 개, 50 개, 40 개 또는 30 개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 1 내지 180에 대해 동일하다.
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 영역 1'로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함한다:
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 120 내지 180과 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가지거나(도 2a 내지 도 2g에서 4 개의 Cas9 서열 내 잔기의 55%가 보존됨);
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 120 내지 180과 적어도 1 개, 2 개 또는 5 개 아미노산만큼, 그러나 35 개, 30 개, 25 개, 20 개 또는 10 개의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 120 내지 180과 동일하다.
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 영역 2로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함한다:
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 360 내지 480과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가지거나(도 2a 내지 도 2g에서 4 개의 Cas9 서열 내 잔기의 52%가 보존됨);
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 360 내지 480과 적어도 1 개, 2 개 또는 5 개의 아미노산, 그러나 35 개, 30 개, 25 개, 20 개 또는 10 개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 360 내지 480과 동일하다.
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 영역 3으로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함한다:
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 660 내지 720과 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지거나(도 2a 내지 도 2g에서 4 개의 Cas9 서열 내 잔기의 56%가 보존됨);
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 660 내지 720과 적어도 1 개, 2 개 또는 5 개의 아미노산, 그러나 35 개, 30 개, 25 개, 20 개 또는 10 개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 660 내지 720과 동일하다.
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 영역 4로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함한다:
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 817 내지 900과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가지거나(도 2a 내지 도 2g에서 4 개의 Cas9 서열 내 잔기의 55%가 보존됨);
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 817 내지 900과 적어도 1 개, 2 개 또는 5 개의 아미노산, 그러나 35 개, 30 개, 25 개, 20 개 또는 10 개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 817 내지 900과 동일하다.
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 영역 5로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함한다:
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 900 내지 960과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%상동성을 가지거나(도 2a 내지 도 2g에서 4 개의 Cas9 서열 내 잔기의 60%가 보존됨);
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 900 내지 960과 적어도 1 개, 2 개 또는 5 개의 아미노산, 그러나 35 개, 30 개, 25 개, 20 개 또는 10 개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노쿠아의 Cas9의 아미노산 서열의 900 내지 960과 동일하다.
조작된 또는 변경된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
본 명세서에 기재된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자는 틈내기효소 활성, 뉴클레아제 활성(예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 헬리카제 활성; gRNA 분자와 기능적으로 연관된 능력; 및 핵산 상의 부위를 표적화하는(또는 이 부위에 대해 국소화하는) 능력(예를 들어, PAM 인식 및 특이성)을 포함하는 임의의 다수의 특성을 가질 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 이들 특성의 모두 또는 부분을 포함할 수 있다. 통상적인 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 gRNA 분자와 상호작용하는 능력을 가지며, gRNA 분자와 협력하여, 핵산 내 부위에 대해 국소화한다. 기타 다른 활성, 예를 들어 PAM 특이성, 절단 활성 또는 헬리카제 활성은 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드에서 더 크게 변할 수 있다.
Cas9 분자는 조작된 Cas9 분자 및 조작된 Cas9 폴리펩타이드를 포함한다(본 내용에서 사용되는 바와 같은 조작된은 단지 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드가 기준 서열과 상이하고, 과정 또는 유래의 제한이 없다는 것을 의미하는 것을 의미한다). 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 변경된 효소적 특성, 예를 들어 변경된 뉴클레아제 활성, (천연 유래 또는 기타 다른 기준 Cas9 분자에 비해) 또는 변경된 헬리카제 활성을 포함할 수 있다. 본 명세서에 논의된 바와 같은, 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 틈내기효소 활성을 가질 수 있다(이중 가닥 뉴클레아제 활성과 대조적). 구현예에서, 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는, 예를 들어 하나 이상의, 또는 임의의 Cas9 활성에 대한 상당한 효과 없이, 그의 크기를 변경시키는 변경, 예를 들어 그의 크기를 감소시키는 아미노산 서열의 결실을 가질 수 있다. 구현예에서, 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 PAM 인식에 영향을 미치는 변경을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조작된 Cas9 분자는 내인성 야생형 PI 도메인에 의해 인식되는 것 이외의 PAM 서열을 인식하도록 변경될 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 서열에서 천연 유래 Cas9 분자와 상이할 수 있지만, 하나 이상의 Cas9 활성의 상당한 변경을 가지지 않는다.
목적으로 하는 특성을 지니는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 목적으로 하는 특성을 갖는 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 제공하도록다수의 방법으로, 예를 들어 모, 예를 들어 천연 유래, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의 변경에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 모 Cas9 분자, 예를 들어 천연 유래 또는 조작된 Cas9 분자에 대한 하나 이상의 돌연변이 또는 차이가 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이 및 차이는 치환(예를 들어, 보존적 치환 또는 비필수 아미노산의 치환); 삽입; 또는 결실을 포함한다. 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 기준, 예를 들어 모, Cas9 분자에 대해 하나 이상의 돌연변이 또는 차이, 예를 들어 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 40 개 또는 50 개의 돌연변이, 그러나 200 개, 100 개 또는 80 개 미만의 돌연변이를 포함할 수 있다.
구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 Cas9 활성, 예를 들어 본 명세서에 기재된 Cas9 활성에 대해 실질적인 효과를 갖지 않는다. 구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 Cas9 활성, 예를 들어 본 명세서에 기재된 Cas9 활성에 대해 실질적인 효과를 가진다.
비절단 및 변형된 절단 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 천연 유래 Cas9 분자와 상이한, 예를 들어 가장 가까운 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자와 상이한 절단 특성을 포함한다. 예를 들어, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 다음과 같은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9 분자와 상이할 수 있다: 예를 들어,천연 유래 Cas9 분자(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9 분자)에 비해 이중 가닥 핵산의 절단을 조절하는, 예를 들어 감소 또는 증가시키는 능력(엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9 분자)에 비해 핵산의 단일 가닥, 예를 들어 핵산 분자의 비-상보성 가닥 또는 핵산 분자의 상보성 가닥의 절단을 조절하는, 예를 들어 감소 또는 증가된 그의 능력(틈내기효소 활성); 또는 핵산 분자, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자를 절단하는 능력은 제거될 수 있다.
변형된 절단 eaCas9 분자 및 eaCas9 폴리펩타이드
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 다음의 활성 중 하나 이상을 포함한다: N-말단 RuvC-유사 도메인과 연관된 절단 활성; HNH-유사 도메인과 연관된 절단 활성; HNH-유사 도메인과 연관된 절단 활성 및 N-말단 RuvC-유사 도메인과 연관된 절단 활성.
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 활성, 또는 절단 적격, HNH-유사 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 HNH-유사 도메인, 예를 들어 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 또는 서열번호 21) 및 비활성, 또는 절단 부적격, N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함한다. 예시적인 비활성, 또는 절단 부적격 N-말단 RuvC-유사 도메인은 N-말단 RuvC-유사 도메인 내 아스파르트산, 예를 들어 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 위치 9에서 아스파르트산 또는 서열번호 7의 위치 10에서 아스파르트산의 돌연변이를 가질 수 있고, 예를 들어 알라닌으로 치환될 수 있다. 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여, N-말단 RuvC-유사 도메인에서의 야생형과 상이하고, 표적 핵산을 절단하지 않거나, 또는 상당히 더 적은 효율, 예를 들어 기준Cas9 분자의절단 활성의 20, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만으로 절단된다. 기준 Cas9 분자는 천연 유래 비변형 Cas9 분자, 예를 들어 a 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스, 또는 스트렙토코커스 써모필루스의 Cas9 분자에 의할 수 있다. 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다.
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 비활성, 또는 절단 부적격, HNH 도메인 및 활성, 또는 절단 적격, N-말단 RuvC-유사 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 N-말단 RuvC-유사 도메인, 예를 들어 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16)을 포함한다. 예시적인 비활성, 또는 절단 부적격 HNH-유사 도메인은 다음 중 하나 이상에서 돌연변이를 가질 수 있으며: HNH-유사 도메인 내 히스티딘, 예를 들어 도 2a 내지 도 2g의 위치 856에 나타낸 히스티딘(예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있음); HNH-유사 도메인에서 하나 이상의 아스파라긴, 예를 들어 도 2a 내지 도 2g의 위치 870에서 및/또는 도 2a 내지 도 2g의 위치 879에 나타낸 아스파라긴(예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있음). 구현예에서, eaCas9는 HNH-유사 도메인 내 야생형과 상이하고, 표적 핵산을 절단하지 않거나, 예를 들어 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여, 상당히 더 적은 효율, 예를 들어 기준Cas9 분자의 절단 활성의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만으로 절단한다. 기준 Cas9 분자는 천연 유래 비변형 Cas9 분자, 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스, 또는 스트렙토코커스 써모필루스의 Cas9 분자에 의할 수 있다. 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다.
구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 비활성, 또는 절단 부적격, HNH 도메인 및 활성, 또는 절단 적격, N-말단 RuvC-유사 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 N-말단 RuvC-유사 도메인, 예를 들어 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16)을 포함한다. 예시적인 비활성, 또는 절단 부적격 HNH-유사 도메인은 다음 중 하나 이상에서 돌연변이를 가질 수 있다: HNH-유사 도메인 내 히스티딘, 예를 들어 도 2a 내지 도 2g의 위치 856에 나타낸 히스티딘(예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있음); 및 HNH-유사 도메인 내 하나 이상의 아스파라긴, 예를 들어 도 2a 내지 도 2g의 위치 870에 및/또는 도 2a 내지 도 2g의 위치 879에 나타낸 아스파라긴(예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있음). 구현예에서, eaCas9는 HNH-유사 도메인 내 야생형과 상이하고, 표적 핵산을 절단하지 않거나, 또는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여 상당히 더 적은 효율, 예를 들어 기준 Cas9 분자의 절단 활성의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만으로 절단한다. 기준Cas9 분자는 천연 유래 비변형 Cas9 분자, 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스, 또는 스트렙토코커스 써모필루스의 Cas9 분자에 의할 수 있다. 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다.
표적 핵산의 가닥 중 하나 또는 둘 다를 절단하는 능력의 변형
구현예에서, 예시적인 Cas9 활성은 PAM 특이성, 절단 활성, 및 헬리카제 활성 중 하나 이상을 포함한다. 돌연변이(들)는, 예를 들어 하나 이상의 RuvC-유사 도메인, 예를 들어 N-말단 RuvC-유사 도메인; HNH-유사 도메인; RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인 외부의 영역에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이(들)는 RuvC-유사 도메인, 예를 들어 N-말단 RuvC-유사에 존재한다. 일부 구현예에서, 돌연변이(들)는 HNH-유사 도메인에 존재한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 RuvC-유사 도메인 둘 다에, 예를 들어 N-말단 RuvC-유사 도메인과 HNH-유사 도메인에 존재한다.
스트렙토코커스 피오게네스 서열을 참조하여 RuvC 도메인 또는 HNH 도메인에서 생성될 수 있는 예시적인 돌연변이는 다음을 포함한다:D10A, E762A, H840A, N854A, N863A 및/또는 D986A.
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 기준Cas9 분자에 비교하여 RuvC 도메인에서 및/또는 HNH 도메인에서 하나 이상의 차이를 포함하는 eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드이고, eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드는 핵산을 절단하지 않거나, 또는 야생형보다 상당히 더 적은 효율로 절단하고, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 절단 분석에서 야생형과 비교할 때, 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여 기준 Cas9 분자의 50%, 25%, 10% 또는 1% 미만으로 절단한다.
특정 서열, 예를 들어 치환이 하나 이상의 활성, 예컨대 표적화 활성, 절단 활성 등에 영향을 미칠 수 있든 아니든, 예를 들어 돌연변이가 보존적인지의 여부를 평가함으로써 또는 부문 IV에 기재된 방법에 의해 평가 또는 예측될 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자와 관련하여 사용된 바와 같은 "비필수" 아미노산 잔기는 Cas9 활성(예를 들어, 절단 활성)을 없애는 일 없이 또는 더 바람직하게는 실질적으로 변경시키는 일 없이 Cas9 분자, 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 eaCas9 분자의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기를 바꾸는 것은 활성(예를 들어, 절단 활성)의 실질적인 손실을 초래한다.
구현예에서, Cas9 분자또는 Cas9 폴리펩타이드는 천연 유래 Cas9 분자와 상이한, 예를 들어 가장 가까운 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자와 상이한 절단 특성을 포함한다. 예를 들어, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 다음과 같이 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 캄필로박터 제주니의 Cas9 분자와 상이할 수 있다: 예를 들어, 천연 유래 Cas9 분자(예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 캄필로박터 제주니의 Cas9 분자)에 비해 이중 가닥 파손(엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성)의 절단을 조절하는, 예를 들어 감소된 또는 증가된 그의 능력; 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자(예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 캄필로박터 제주니의 Cas9 분자)에 비해, 핵산의 단일 가닥, 예를 들어 핵산 분자(틈내기효소 활성)의 핵산 분자 또는 상보성 가닥의 비-상보성 가닥의 절단을 조절하는, 예를 들어 감소 또는 증가된 그의 능력; 또는 핵산 분자, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자를 절단하는 능력은 제거될 수 있다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 다음의 활성 중 하나 이상을 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이다: RuvC 도메인과 연관된 절단 활성; HNH 도메인과 연관된 절단 활성; HNH 도메인과 연관된 절단 활성 및 RuvC 도메인과 연관된 절단 활성.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 핵산 분자(이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자 중 하나)를 절단하지 않거나 또는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여, 상당히 더 적은 효율, 예를 들어 기준 Cas9 분자의 절단 활성의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만으로 핵산 분자를 절단하는 eiCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이다. 기준 Cas9 분자는 천연 유래 비변형 Cas9 분자, 예를 들어 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스, 캄필로박터 제주니 또는 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 분자일 수 있다. 구현예에서, 기준Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다. 구현예에서, eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드는 RuvC 도메인과 연관된 실질적인 절단 활성 및 HNH 도메인과 연관된 절단 활성이 없다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에 나타낸 스트렙토코커스 피오게네스의 고정된 아미노산 잔기를 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열 또는 서열번호 7에서 "-"로 나타내는 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2 개, 3 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 50 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 200 개 아미노산 잔기)에서스트렙토코커스 피오게네스의 아미노산 서열이 상이한(예를 들어, 치환을 갖는) 하나 이상의 아미노산을 가진다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 서열을 포함한다:
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 서열에 대응하는 서열은 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 서열의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하로 상이하고;
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "*"로 표시하는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자의 대응하는 서열로부터의 "*" 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이하로 상이하고; 그리고,
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 표시하는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자의 대응하는 서열로부터의 "-" 잔기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55% 또는 60% 이하로 상이하다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 나타낸 스트렙토코커스 써모필루스의 고정된 아미노산 잔기를 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 나타내는 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2 개, 3 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 50 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 200 개의 아미노산 잔기)에서 스트렙토코커스 써모필루스의 아미노산 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다(예를 들어, 치환을 가진다).
구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 서열을 포함한다:
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 서열에 대응하는 서열은 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 서열의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하로 상이하고;
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "*"로 표시하는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 스트렙토코커스 써모필루스 Cas9 분자의 대응하는 서열로부터의 "*" 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이하로 상이하며; 그리고,
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 표시하는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 스트렙토코커스 써모필루스 Cas9 분자의 대응하는 서열로부터의 "-" 잔기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55% 또는 60% 이하로 상이하다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 나타낸 스트렙토코커스 뮤탄스의 고정된 아미노산 잔기를 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 나타내는 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2 개, 3 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 50 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 200 개의 아미노산 잔기)에서 스트렙토코커스 뮤탄스의 아미노산 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다(예를 들어, 치환을 가진다).
구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 서열을 포함한다:
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 서열에 대응하는 서열은 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 서열의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하로 상이하고;
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "*"로 표시하는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 스트렙토코커스 뮤탄스 Cas9 분자의 대응하는 서열로부터의 "*" 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이하로 상이하며; 그리고,
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 표시하는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 스트렙토코커스 뮤탄스 Cas9 분자의 대응하는 서열로부터의 "-" 잔기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55% 또는 60% 이하로 상이하다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 나타낸 리스테리아 이노쿨라(L. innocula)의 고정된 아미노산 잔기를 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 나타내는 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2 개, 3 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 50 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 200 개의 아미노산 잔기)에서 리스테리아 이노쿨라의 아미노산 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다(예를 들어, 치환을 가진다).
구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하기와 같은 서열을 포함한다:
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 서열에 대응하는 서열은 도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열의 고정된 서열의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하로 상이하고;
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "*"로 표시하는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 리스테리아 이노쿨라 Cas9 분자의 대응하는 서열로부터의 "*" 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이하로 상이하며; 그리고,
도 2a 내지 도 2g에 개시된 공통 서열에서 "-"로 표시하는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어 리스테리아 이노쿨라 Cas9 분자의 대응하는 서열로부터의 "-" 잔기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55% 또는 60% 이하로 상이하다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자는, 예를 들어 2 개 이상의 상이한 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의, 예를 들어 상이한 종의 2 개 이상의 천연 유래 Cas9 분자의 융합일 수 있다. 예를 들어, 하나의 종의 천연 유래 Cas9 분자의 단편은 제2 종의 Cas9 분자의 단편에 융합될 수 있다. 예로서, N-말단 RuvC-유사 도메인을 포함하는 스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9 분자의 단편은 HNH-유사 도메인을 포함하는 스트렙토코커스 피오게네스(예를 들어, 스트렙토코커스 써모필루스) 이외의 종의 Cas9 분자의 단편에 융합될 수 있다.
변경된 PAM 인식을 지니거나 또는 PAM 인식이 없는 Cas9 분자
천연 유래 Cas9 분자는, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 스타필로코커스 아우레우스 및 네이세리아 메닌기티디스에 대해 상기 기재한 특이적 PAM 서열, 예를 들어 PAM 인식 서열을 인식할 수 있다.
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 천연 유래 Cas9 분자와 동일한 PAM 특이성을 가진다. 다른 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 천연 유래 Cas9 분자와 연관되지 않은 PAM 특이성, 또는 가장 밀접한 서열 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자와 연관되지 않은 PAM 특이성을 가진다. 예를 들어, 천연 유래 Cas9 분자는, 예를 들어 PAM 인식을 변경하기 위해, 예를 들어 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드가 오프-타겟 부위를 감소시키고/시키거나 특이성을 개선시키는 것을 인식하는 PAM 서열을 변경하기 위해 변경될 수 있거나; 또는 PAM 인식 필요를 제거한다. 구현예에서, Cas9 분자는, 예를 들어 PAM 인식 서열의 길이를 증가시키기 위해 그리고/또는 고수준의 동일성으로Cas9 특이성을 개선시키기 위해, 예를 들어 오프-타겟 부위를 감소시키고 특이성을 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 구현예에서, PAM 인식 서열의 길이는 길이로 적어도 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개 또는 15 개의 아미노산이다.
상이한 PAM 서열을 인식하고/인식하거나 감소된 오프-타겟 활성을 갖는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 관련된 진화를 이용하여 생성될 수 있다. Cas9 분자의 관련된 진화를 위해 사용될 수 있는 예시적인 방법 및 시스템은, 예를 들어 문헌[Esvelt et al. Nature 2011, 472(7344): 499-503]에 기재된다. 후보 Cas9 분자는, 예를 들어 부문 IV에 기재된 방법에 의해 평가될 수 있다.
PAM 인식을 매개하는 PI 도메인의 변경은 이하에 논의된다.
변경된 PI 도메인을 지니는 합성 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
현재의 게놈-편집 방법은 이용되는 Cas9 분자에 의해 인식되는 PAM 서열에 의해 표적화될 수 있는 표적 서열의 다양성이 제한된다. 본 명세서에서 사용되는 용어로서 합성 Cas9 분자(또는 Syn-Cas9 분자), 또는 합성 Cas9 폴리펩타이드(또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드)는 하나의 박테리아 종으로부터의 Cas9 코어 도메인 및 기능성 변경된 PI 도메인, 즉, 예를 들어 상이한 박테리아 종으로부터의 Cas9 코어 도메인과 자연적으로 연관된 것 이외의 PI 도메인을 포함하는 Cas9 분자또는 Cas9 폴리펩타이드를 지칭한다.
구현예에서, 변경된 PI 도메인은Cas9 코어 도메인이 유래된 천연 유래 Cas9에 의해 인식되는 PAM 서열과 상이한 PAM 서열을 인식한다. 구현예에서, 변경된 PI 도메인은 Cas9 코어 도메인으로부터 유래되지만, 상이한 친화도 또는 특이성을 지니는 천연 유래 Cas9에 인식되는 동일한 PAM 서열을 인식한다. Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 각각 Syn-eaCas9 분자 또는 Syn-eaCas9 폴리펩타이드 또는 Syn-eiCas9 분자 Syn-eiCas9 폴리펩타이드일 수 있다.
예시적인 Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 하기 a) 및 b)를 포함한다:
a) Cas9 코어 도메인, 예를 들어 표 100 또는 200,으로부터의 Cas9 코어 도메인, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 피오게네스, 또는 캄필로박터 제주니 Cas9 코어 도메인; 및
b) 표 400 및 500으로부터 선택되는 종 X Cas9 서열로부터의 변경된 PI 도메인.
구현예에서, 상기 변경된 PI 도메인의 RKR 모티프(PAM 결합 모티프)는 Cas9 코어 도메인과 연관된 천연 또는 내인성 PI 도메인의 RKR 모티프 서열과 비교하여,1, 2 또는 3 개 아미노산 잔기의 차이; 제1, 제2 또는 제3 위치에서 아미노산 서열의 차이; 제1과 제2 위치, 제1과 제3 위치, 또는 제2와 제3 위치에서 아미노산 서열의 차이를 포함한다.
구현예에서, Cas9 코어 도메인은 표 100으로부터의 종 X Cas9로부터의 Cas9 코어 도메인을 포함하고, 상기 변경된 PI 도메인은 표 100으로부터의 종 Y Cas9로부터의PI 도메인을 포함한다.
구현예에서, 종 X Cas9의 RKR 모티프는 종 Y Cas9의 RKR 모티프가 아니다.
구현예에서, 변경된 PI 도메인의 RKR 모티프는 XXY, XNG 및 XNQ로부터 선택된다.
구현예에서, 변경된 PI 도메인은 표 100으로부터의 상기 종 Y의 천연 유래 PI 도메인의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 상동성을 가진다.
구현예에서, 변경된 PI 도메인은 표 100으로부터의 상기 제2의 천연 유래 PI 도메인의 아미노산 서열로부터의 50 개, 40 개, 30 개, 25 개, 20 개, 15 개, 10 개, 5 개, 4 개, 3 개, 2 개 또는 1 개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, Cas9 코어 도메인은 스타필로코커스 아우레우스 코어 도메인을 포함하고, 변경된 PI 도메인은 알칼리게네스 데니트리피칸스(A. denitrificans) PI 도메인;캄필로박터 제주니 PI 도메인; 헬리코박터 무스텔라(H. mustelae) PI 도메인; 또는 종 X PI 도메인의 변경된 PI 도메인을 포함하되, 종 X는 표 500으로부터 선택된다.
구현예에서, Cas9 코어 도메인은 스트렙토코커스 피오게네스 코어 도메인을 포함하고, 변경된 PI 도메인은 알칼리게네스 데니트리피칸스 PI 도메인;캄필로박터 제주니 PI 도메인;헬리코박터 무스텔라 PI 도메인; 또는 종 X PI 도메인의 변경된 PI 도메인을 포함하되, 종 X는 표 500으로부터 선택된다.
구현예에서, Cas9 코어 도메인은 캄필로박터 제주니 코어 도메인을 포함하고, 변경된 PI 도메인은 알칼리게네스 데니트리피칸스 PI 도메인;헬리코박터 무스텔라 PI 도메인; 또는 종 X PI 도메인의 변경된 PI 도메인을 포함하되, 종 X는 표 500으로부터 선택된다.
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 추가로 상기 Cas9 코어 도메인과 상기 변경된 PI 도메인 사이에 배치된 링커를 포함한다.
구현예에서, 링커는 Cas9 코어 도메인과 이종성 PI 도메인 사이에 배치된 본 명세서의 다른 곳에 기재된 링커를 포함한다. 적합한 링커는 부문 V에서 추가로 기재된다.
Syn-Cas9 분자에서 사용하기 위한 예시적인 변경된 PI 도메인은 표 400 및 500에 기재되어 있다. 표 400 및 500에 언급된 83 개의 Cas9 오솔로그에 대한 서열은 표 100에서 제공된다. 표 300은 공지된 PAM 서열 및 대응하는 RKR 모티프를 지니는 Cas9 오솔로그를 제공한다.
구현예에서, Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 또한 크기-최적화될 수 있고, 예를 들어 Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 하나 이상의 결실, 및 선택적으로 결실에 측적하는 아미노산 잔기 사이에 배치된 하나 이상의 링커를 포함한다. 구현예에서, Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 REC 결실을 포함한다.
크기-최적화된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
본 명세서에 기재된 조작된 Cas9 분자 및 조작된 Cas9 폴리펩타이드는분자의 크기를 감소시키는 결실을 포함하는 한편, 여전히 목적으로 하는 Cas9 특성, 예를 들어 본질적으로 천연의 입체구조, Cas9 뉴클레아제 활성, 및/또는 표적 핵산 분자 인식을 보유하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에서 하나 이상의 결실 및 선택적으로 하나 이상의 링커를 포함하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드가 제공되되, 링커는 결실에 측접하는 아미노산 잔기 사이에 배치된다. 기준Cas9 분자에서 적합한 결실을 동정하는 방법, 결실 및 링커를 지니는 Cas9 분자를 생성하는 방법, 및 이러한 Cas9 분자를 이용하는 방법은 이 문헌의 검토 시 당업자에게 명확할 것이다.
결실을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 캄필로박터 제주니 Cas9 분자는 더 작으며, 예를 들어 대응하는 천연 유래 Cas9 분자보다 감소된 수의 아미노산을 가진다. 더 작은 크기의 Cas9 분자는 전달 방법에 대해 증가된 유연성을 허용하며, 이에 의해 게놈-편집을 위한 유용성을 증가시킨다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 얻어진 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않거나 또는 감소시키지 않는 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 결실을 포함하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드에 보유된 활성은 다음 중 하나 이상을 포함한다:
틈내기효소 활성, 즉, 핵산 분자의 단일 가닥, 예를 들어 비-상보성 가닥 또는 상보성 가닥을 절단하는 능력;이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉, 구현예에서 2 개의 틈내기효소 활성의 존재에 있는 이중 가닥 핵산의 가닥을 둘 다 절단하고 이중 가닥 파손을 생성하는 능력;
엔도뉴클레아제 활성;
엑소뉴클레아제 활성;
헬리카제 활성, 즉, 이중 가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 능력;
및 핵산 분자, 예를 들어 표적 핵산 또는 gRNA의 인식 활성.
본 명세서에 기재된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의 활성은 본 명세서에 또는 당업계에 기재된 활성 분석을 이용하여 평가될 수 있다.
결실에 적합한 영역의 동정
결실을 위한 Cas9 분자의 적합한 영역은 다양한방법에 의해 동정될 수 있다. 다양한 박테리아 종, 예를 들어 표 100에 열거된 것 중 임의의 하나로부터의 천연 유래 오솔로그 Cas9 분자는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 결정 구조로 모델링되어(Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014) 단백질의 3차원 입체구조에 대해 선택되는 Cas9 오솔로그에 걸친 보존 수준을 시험할 수 있다. Cas9 활성에 연루된 영역으로부터 떨어져서 공간적으로 위치된, 예를 들어,표적 핵산 분자 및/또는 gRNA와 경계를 이루는 덜 보존된 또는 비보존된 영역은 영역 또는 도메인이 Cas9 활성에 실질적으로 영향을 미치거나 또는 감소시키는 일 없이 결실에 대한 후보가 된다는 것을 나타낸다.
REC-최적화된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
본 명세서에서 사용되는 용어로서 REC-최적화된 Cas9 분자, 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 REC2 도메인 및 RE1CT 도메인 중 하나 또는 둘 다에서의 결실(총괄적으로 REC 결실)을 포함하는 Cas9 분자또는 Cas9 폴리펩타이드를 지칭하되, 결실은 동족 도메인에서 아미노산 잔기의 적어도 10%를 포함한다. REC-최적화된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드, 또는 eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드일 수 있다. 예시적인 REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 하기를 포함한다:
a) 하기 i) 내지 iii)으로부터 선택되는 결실:
i) REC2 결실;
ii) REC1CT 결실; 또는
iii) REC1SUB 결실.
선택적으로, 링커는 결실에 측접하는 아미노산 잔기 사이에 배치된다. 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 단지 하나의 결실, 또는 단지 2 개의 결실을 포함한다. Cas9 분자또는 Cas9 폴리펩타이드는 REC2 결실 및 REC1CT 결실을 포함할 수 있다. Cas9 분자또는 Cas9 폴리펩타이드는 REC2 결실 및 REC1SUB 결실을 포함할 수 있다.
일반적으로, 결실은 그의 동족 도메인 내 아미노산의 적어도 10%를 함유하며, 예를 들어 REC2 결실은 REC2 도메인 내 아미노산의 적어도 10%를 포함할 것이다. 결실은그의 동족 도메인의 아미노산 잔기의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%; 그의 동족 도메인의 모든 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인 외부의 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인 외부의 복수의 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인에 대한 N 말단 바로 옆의 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인에 대해 C 말단 바로 옆의 아미노산 잔기; 그의 동족에 대해 N 말단 바로 옆의 아미노산 잔기 및 그의 동족 도메인에 대해 C 말단 바로 옆의 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인에 대해 N 말단의 복수의, 예를 들어 5 개, 10 개, 15 개 또는 20 개까지의 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인에 대해 C 말단의 복수의, 예를 들어 5 개, 10 개, 15 개 또는 20 개까지의 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인에 대해 N 말단의 복수의, 예를 들어 5 개, 10 개, 15 개 또는 20 개까지의 아미노산 잔기 및 그의 동족 도메인에 대해 C 말단의 복수의, 예를 들어 5 개, 10 개, 15 개 또는 20 개까지의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
구현예에서, 결실은 그의 동족 도메인; 그의 동족 도메인의 N 말단 아미노산 잔기; 그의 동족 도메인의 C 말단 아미노산 잔기 이상으로 연장되지 않는다.
REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 결실에 측접하는 아미노산 잔기 사이에 배치된 링커를 포함할 수 있다. REC-최적화된 Cas9 분자에서의 REC 결실에 측접하는 아미노산 잔기 사이에서 사용하기 위한 적합한 링커는 부문 V에 개시된다.
구현예에서, REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 임의의 REC 결실 및 연관된 링커 이외에 천연 유래 Cas 9, 예를 들어 표 100에 기재된 Cas9 분자, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자, 또는 캄필로박터 제주니 Cas9 분자의 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
구현예에서, REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 임의의 REC 결실 및 연관된 링커 이외에 천연 유래 Cas 9, 예를 들어 표 100에 기재된 Cas9 분자, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자, 또는 캄필로박터 제주니 Cas9 분자의 아미노산 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 15 개, 20 개 또는 25 개 아미노산 잔기만큼 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
구현예에서, REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 임의의 REC 결실 및 연관된 링커 이외에 천연 유래 Cas 9, 예를 들어 표 100에 기재된 Cas9 분자, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자, 또는 캄필로박터 제주니 Cas9 분자의 아미노산 서열로부터의 아미노산 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 이하만큼 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열과 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 하위서열 배열이 설계되며, 필요하다면, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트 프로그램 매개변수가 사용될 수 있거나, 또는 대안의 매개변수가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수에 기반하여 기준 서열에 비교한 시험 서열에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은, 예를 들어 문헌[Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, by the homology alignment algorithm of Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 계산된 실행에 의해(위스콘신주 메디슨 사이언스 드라이브 575 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해(예를 들어, 문헌[Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology] 참조) 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 2 개의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘인데, 이들은 문헌[Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402]; 및 [Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다.
두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 이용하여 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함된 문헌[E. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 추가로, 2 개의 아미노산 서열 사이의동일성 백분율은 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 하나, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 이용하여, GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용가능) 내 GAP 프로그램에 포함된문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453] 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
예시적인 REC 결실을 위한 서열 정보는 표 100에서 83 개의 천연 유래 Cas9 오솔로그에 대해 제공된다. 상이한 박테리아 종으로부터의 예시적인 Cas9 분자의 아미노산 서열을 이하에 나타낸다.
[표 100]
[표 200]
[표 300]
PI 도메인이 표 400 및 표 500에서 제공된다.
[표 400]
[표 500]
이하는 표 100에서 열거된 Cas9 오솔로그에 대한 아미노산 서열이다.
Cas9 분자를 암호화하는 핵산
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 본 명세서에 제공된다.
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 예시적인 핵산은 문헌[Cong et al., Science 2013, 399(6121):819-823; Wang et al., Cell 2013, 153(4):910-918; Mali et al., Science 2013, 399(6121):823-826; Jinek et al., Science 2012, 337(6096):816-821]에 기재되어 있다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 다른 예시적인 핵산은 도 8에서 검정색으로 나타낸다.
구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 예시적인 핵산은 합성 핵산 서열일 수 있다. 예를 들어 합성 핵산 분자는, 예를 들어 부문 VIII에 기재하는 바와 같이 화학적으로 변형될 수 있다. 구현예에서, Cas9 mRNA는 다음 특성 중 하나 이상, 예를 들어 모두를 가진다: 이는 캡핑, 폴리아데닐화, 5-메틸시티딘 및/또는 슈도유리딘으로 치환된다.
추가로 또는 대안적으로, 합성 핵산 서열은 코돈 최적화될 수 있고, 예를 들어 적어도 하나의 비-통상적 코돈 또는 덜 통상적인 코돈은 통상적인 코돈에 ㅇ으의해 대체되었다. 예를 들어, 합성 핵산은 최적화된 전령 mRNA의 합성을 지시하며, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어 포유류 발현 시스템에서 발현을 위해 최적화될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 핵 국소화 서열(nuclear localization sequence: NLS)을 포함할 수 있다. 핵 국소화 서열은 당업계에 공지되어 있다.
이하에 스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9 분자를 암호화하는 예시적인 코돈 최적화된 핵산 서열이 제공된다.
이하에 스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9 분자의 대응하는 아미노산 서열이 제공된다.
이하에 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 분자를 암호화하는 예시적인 코돈 최적화된 핵산 서열이 제공된다.
이하에 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 분자의 대응하는 아미노산 서열이 제공된다.
이하에 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9 분자의 아미노산 서열이 제공된다.
이하에 스타필로코커스 아우레우스 Cas9의 Cas9 분자를 암호화하는 예시적인 코돈 최적화된 핵산 서열이 제공된다.
임의의 상기Cas9 서열이 C-말단에서 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합된다면, 중단 코돈은 제거된다는 것이 이해된다.
기타 다른 Cas 분자 및 Cas 폴리펩타이드
다양한 유형의 Cas 분자 또는 Cas 폴리펩타이드는 본 명세서에 개시된 본 발명의 실행을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, II형 Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 다른 구현예에서, 기타 다른 Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 예를 들어, I형 또는 III형 Cas 분자가 사용될 수 있다. 예시적인 Cas 분자(및 Cas 시스템)은, 예를 들어 문헌[Haft et al., PLoS Computational Biology 2005, 1(6): e60및 Makarova et al., Nature Review Microbiology 2011, 9:467-477]에 기재되어 있으며, 이들 참고문헌 둘 다의 내용은 본 명세서에 전체가 참고로 포함된다. 예시적인 Cas 분자(및 Cas 시스템)을 또한 표 600에 나타낸다.
[표 600]
IV. 후보 분자의 기능성 분석
후보 Cas9 분자, 후보 gRNA 분자, 후보 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 예를 들어, Cas9 분자의 엔도뉴클레아제 활성을 평가하는 예시적인 방법은, 예를 들어, 문헌[Jinek et al., Science 2012; 337(6096):816-821]에 기재되어 있다.
결합 및 절단 분석: Cas9 분자의 엔도뉴클레아제 활성의 시험
표적 핵산에 결합하고 표적 핵산을 절단하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 능력은 플라스미드 절단 분석에서 평가될 수 있다. 이 분석에서, 합성 또는 시험관내 전사 gRNA 분자를 95℃까지 가열하고 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 반응 전에 사전 어닐링한다. 천연 또는 제한 분해-선형화 플라스미드 DNA(300 ng (약 8 nM))를 10 mM MgCl2와 함께 또는 이것 없이 Cas9 플라스미드 절단 버퍼(20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA) 중에서 정제된 Cas9 단백질 분자(50 nM 내지 500 nM) 및 gRNA(50 nM 내지 500 nM, 1:1)와 함께 37℃에서 60 분 동안 인큐베이션시킨다. 5X DNA 장입 버퍼(30% 글리세롤, 1.2% SDS, 250 mM EDTA)를 이용하여 반응을 중단시키고 나서, 0.8% 또는 1% 아가로스겔 전기영동에 의해 분해하고, 브롬화에티듐 염색에 의해 시각화한다. 얻어진 절단 산물은 Cas9 분자가 DNA 가닥을 둘 다, 또는 두 가닥 중 단지 하나를 절단하는지의 여부를 나타낸다. 예를 들어, 선형 DNA 산물은 DNA 가닥 둘 다의 절단을 나타낸다. 틈 개방 원형 산물은 두 가닥 중 하나만이 절단된다는 것을 나타낸다.
대안적으로, 표적 핵산에 결합하고 표적 핵산을 절단하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 능력은 올리고뉴클레오타이드 DNA 절단 분석에서 평가될 수 있다. 이 분석에서, DNA 올리고뉴클레오타이드(10 pmol)를 50 ㎕ 반응물 중에서 37℃에서 30 분 동안 1X T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 반응 버퍼 중의 5 단위 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 및 약 3 pmol 내지 6 pmol(약 20 mCi 내지 40 mCi)[γ-32P]-ATP와 함께 인큐베이션시킴으로써 방사성 표지한다. 열 불활성화 후에(65℃에서 20 분 동안), 혼입되지 않은 표지를 제거하기 위해 칼럼을 통해 반응물을 정제한다. 95℃에서 3 분 동안 등몰량의 비표지 상보성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 표지된 올리고뉴클레오타이드를 어닐링한 후에, 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 이중가닥 기질(100 nM)을 생성한다. 절단 분석을 위해, gRNA 분자는 95℃로 30 분 동안 가열함으로써 어닐링한 후에 실온으로 서서히 냉각시킨다. Cas9(500 nM 최종 농도)는 총 용적 9 ㎕ 중에서 절단 분석 버퍼(20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% 글리세롤) 중에서 어닐링된 gRNA 분자(500 nM)와 함께 사전 인큐베이션시킨다. 1 ㎕ 표적 DNA(10 nM)의 첨가에 의해 반응을 개시하고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨다. 20 ㎕의 장입 염료(5 mM EDTA, 0.025% SDS, 포름아미드 중에서 5% 글리세롤)의 첨가에 의해 반응을 퀀칭시키고, 95℃로 5 분 동안 가열하였다. 7 M 유레아를 함유하는 12% 변성 폴리아클릴아미드 겔 상에서 절단 산물을 분해하고, 인광 영상화에 의해 시각화한다. 얻어진 절단 산물은 상보적 가닥, 비상보적 가닥 또는 둘 다가 절단되는지의 여부를 나타낸다.
이들 분석 중 하나 또는 둘 다는 후보 gRNA 분자 또는 후보 Cas9 분자의 적합성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
결합 분석: 표적 DNA에 대한 Cas9 분자의 결합 시험
표적 DNA에 대한 Cas9 분자의 결합을 평가하는 예시적인 방법은, 예를 들어 문헌[Jinek et al., Science 2012; 337(6096):816-821]에 기재되어 있다.
예를 들어, 전기영동 이동성 변화 분석(electrophoretic mobility shift assay)에서, 표적 DNA 이중가닥은 탈이온수 중에서 각각의 가닥(10 nmol)을 혼합하고, 95℃로 3 분 동안 가열하고 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 형성된다. 모든 DNA를 8% 천연 겔 함유 1X TBE 상에서 정제한다. DNA 밴드를 UV 투영법에 의해 시각화한 다음, 절단하고, DEPC-처리 H2O 중에 겔 조각을 침지시킴으로써 용리시킨다. 용리된 DNA는 에탄올 침전되고, DEPC-처리된 H2O 중에 용해된다. DNA 샘플을 37℃에서 30 분 동안 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 이용하여 [γ-32P]-ATP로 5' 말단 표지한다. 폴리뉴클레오타이드 키나제를 65℃에서 20 분 동안 열 변성시키고, 칼럼을 이용하여 비혼입 방사성 표지를 제거한다. 총 용적 10 ㎕로 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT 및 10% 글리세롤을 함유하는 버퍼 중에서 결합 분석을 수행한다. Cas9 단백질 분자는 등몰량의 사전 어닐링된 gRNA 분자에 의해 프로그래밍되고, 100 pM 내지 1 μM로 적정된다. 방사성 표지된 DNA를 최종 농도 20 pM로 첨가한다. 샘플을 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 4℃에서 1X TBE 및 5 mM MgCl2를 함유하는 8% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분해한다. 겔은 건조되고, DNA는 인광 영상화에 의해 시각화된다.
시차주사 형광측정법(DSF)
Cas9-gRNA 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체의 열 안정성은 DSF를 통해 측정될 수 있다. 이 기법은 결합 RNA 분자, 예를 들어 gRNA의 첨가와 같은 바람직한 조건 하에서 증가될 수 있는 단백질의 열 안정성을 측정한다.
상기 분석은 2 종의 상이한 프로토콜, 즉, gRNA:Cas9 단백질의 최고의 화학량론적 비를 시험하는 하나 및 RNP 형성을 위한 최고의 용액 조건을 결정하는 다른 하나를 이용하여 수행된다.
RNP 복합체를 형성하기 위한 최고의 용액을 결정하기 위해, 물+10x SYPRO Orangeㄾ(Life Techonologies cat#S-6650) 중의 Cas9의 2 uM 용액을 384 웰 플레이트에 제공한다. 이어서, 다양한 pH 및 염을 지니는 용액 중에 희석시킨 등몰량의 gRNA를 첨가한다. 실온에서 10 초 동안 인큐베에션 및 간단한 원심분리로 임의의 거품을 제거한 후에, Bio-Rad CFX 매니저 소프트웨어를 이용하는 Bio-Rad CFX384™ 실시간 시스템 C1000 Touch™ 유전자 증폭기(Thermal Cycler)를 사용하여 10 초마다 온도의 1ㅀ 증가에 의해 20℃ 내지 90℃의 구배로 실행한다.
제2 분석은 상기 분석 1로부터의 최적의 완충제 중의 2 uM Cas9와 다양한 농도를 혼합하는 것 및 384 웰 플레이트에서 10 초 동안 실온에서 인큐베이션시키는 것으로 이루어진다. 동일한 용적의 최적의 완충제 + 10x SYPRO Orangeㄾ(Life Techonologies cat#S-6650)를 첨가하고, 플레이트를 Microsealㄾ B 접착제(MSB-1001)로 밀봉한다. 간단한 원심분리로 임의의 거품을 제거한 후에, Bio-Rad CFX Manager 소프트웨어를 이용하는 Bio-Rad CFX384™ 실시간 시스템 C1000 Touch™ 유전자 증폭기를 사용하여 10 초마다 온도의 1ㅀ 증가에 의해 20℃ 내지 90℃의 구배로 실행한다.
V. 게놈 편집 접근
일반적으로, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 임의의 유전자의 변경은 임의의 메커니즘에 의해 매개될 수 있고 임의의 방법은 특정 메커니즘으로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 유전자의 변경과 연관될 수 있는 예시적인 메커니즘은 비-상동성 말단-결합(예를 들어, 고전적 또는 대안적), 마이크로 상동성-매개 말단 결합(MMEJ), 상동성-관련 수선(예를 들어, 내인성 공여체 주형 매개), SDSA(합성 의존적 가닥 어닐링), 단일 가닥 어닐링또는 단일 가닥 침입을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에서 NHEJ를 이용하는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN66, TRAC 또는 TRBC 유전자의 대립유전자 중 하나 또는 둘 다의 표적화된 넉아웃을 위한 예시적인 방법이 기재된다(부문 V.1 참조). 다른 구현예에서, 예시적인 방법은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 표적화된 넉다운을 위해 제공된다(부문 V.2 참조). 추가로 개시된 방법이 넉다운 또는 넉아웃 또는 이들의 조합을 위한 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자 중 2 개 이상을 표적화할 수 있다는 것이 상정된다.
V.1 유전자 표적화에 대한 NHEJ 접근
본 명세서에 기재된 바와 같이, 뉴클레아제-유도 비-상동성 말단-결합 (NHEJ)은 유전자-특이적 넉아웃(knockout)을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 뉴클레아제, 유도 NHEJ는 또한 관심 대상의 유전자에서 서열 삽입물을 제거하기 위해(예를 들어, 결실시키기 위해) 사용될 수 있다.
이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 연관된 게놈 변형은 뉴클레아제-유도 NHEJ 및 NHEJ 수선 경로의 오류 유발 특성에 의존한다고 여겨진다. NHEJ는 2 개의 말단과 함께 결합함으로써 DNA 내 이중가닥 파손을 수선하고; 그러나, 일반적으로, 본래의 서열은 2 개의 적합성 말단이 그들이 이중 가닥 파손에 의해 형성됨에 따라 완전히 결찰되어야만 복구된다. 이중-가닥 파손의 DNA 말단은 빈번하게는 효소적 가공 대상이며 말단의 재결합 전에 하나 또는 둘 다의 가닥에서 뉴클레오타이드의 첨가 또는 제거를 초래한다. 이는 NHEJ 수선 부위에서 DNA 서열에서 삽입 및/또는 결실(삽입결실)의 존재를 초래한다. 이들 돌연변이 통상적으로 중 2/3는 리딩 프레임을 변경시키며, 따라서, 비기능성 단백질을 생성한다. 추가적으로, 리딩 프레임을 유지하지만, 상당한 양의 서열을 삽입 또는 결실시키는 돌연변이는 단백질의 기능성을 파괴할 수 있다. 이는 중요한 기능적 도메인의 돌연변이가 단백질의 비중요 영역에서의 돌연변이보다 덜 용인될 가능성이 있기 때문에 좌위 의존적이다.
NHEJ에 의해 생성된 삽입결실 돌연변이는 천연에서 예측불가능하지만; 그러나, 주어진 파손 부위에서 특정 삽입결실 서열이 선호되며 집단에서 지나치게 표시되는데, 이는 마이크로상동성의 소 영역에 기인할 가능성이 있다. 결실의 길이는 가장 통상적으로는 1 bp 내지 50 bp 범위에서 크게 다를 수 있지만, 그들은 100 bp 내지 200 bp 초과로 용이하게 도달할 수 있다. 삽입은 더 짧게 되는 경향이 있으며, 종종 파손 부위를 바로 둘러싸는 서열의 짧은 중복을 포함한다. 그러나, 이는 큰 삽입을 얻을 수 있고, 이 경우에 삽입된 서열은 종종 게놈의 기타 다른 영역에 대해 또는 세포 내에 존재하는 플라스미드 DNA에 대해 추적되었다.
NHEJ는 돌연변이유발 과정이기 때문에, 이는 또한 특이적 최종 서열의 생성이 필요하지 않다면, 작은 서열 모티프를 결실시키는 데 사용될 수 있다. 이중-가닥 파손이 짧은 표적 서열 근처에서 표적화된다면, NHEJ 수선에 의해 야기되는 결실 돌연변이는 종종 걸쳐서 이어지고, 따라서 원치않는 뉴클레오타이드를 제거한다. 더 큰 DNA 세그먼트의 결실을 위해, 2 개의 이중-가닥 파손을 도입시키는 것은(서열의 각각의 측면 상에서 하나씩) 전체 개재 서열의 제거에 의해 말단들 사이에 NHEJ를 초래할 수 있다. 이들 접근은 둘 다 특이적 DNA 서열을 결실시키기 위해 사용될 수 있고; 그러나, NHEJ의 오류-유발 특성은 여전히 수선 부위에서 삽입결실 돌연변이를 생성할 수 있다.
eaCas9 분자를 절단하는 이중 가닥과 단일 가닥 둘 다, 또는 틈내기효소, eaCas9 분자는 NHEJ-매개 삽입결실을 생성하기 위해 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 유전자에 표적화된 NHEJ-매개 삽입결실, 예를 들어 암호 영역, 예를 들어 관심 대상 유전자의 초기 암호 영역은 관심 대상의 유전자를 넉아웃시키기 위해(즉, 유전자의 발현을 제거하기 위해) 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 대상의 유전자의 초기 암호 영역은 암호화 서열의 제1 엑손 내에서, 또는 전사 시작 부위의 500 bp 내에서(예를 들어, 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp 또는 50 bp 미만) 전사 시작 부위 바로 다음에 서열을 포함한다.
구현예에서, NHEJ-매개 삽입결실은 하나 이상의 T-세포 발현 유전자 내로 도입된다. Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 Cas9 단일 가닥 틈내기효소는 2 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 임의의 둘에 돌연변이를 도입하기 위해 사용되는 구현예에서, 유전자를 둘 다 표적화하는 개개 gRNA 또는 gRNA 쌍은 Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 단일 가닥 틈내기효소와 함께 제공된다. Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 Cas9 단일-가닥 틈내기효소가 3 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 임의의 셋에 돌연변이를 도입하기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 3 개의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 단일 가닥 틈내기효소와 함께 제공된다. Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 Cas9 단일 가닥 틈내기효소가 4 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 임의의 넷에돌연변이를 도입하기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 4 개의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 단일 가닥 틈내기효소와 함께 제공된다. Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 Cas9 단일 가닥 틈내기효소가 5 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 임의의 다섯에 돌연변이를 도입하기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 다섯개의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 단일 가닥 틈내기효소와 함께 제공된다. Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 Cas9 단일 가닥 틈내기효소가 6 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 임의의 여섯에 돌연변이를 도입하기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 여섯개의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 단일 가닥 틈내기효소와 함께 제공된다. Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 Cas9 단일 가닥 틈내기효소가 7 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 임의의 일곱에 돌연변이를 도입하기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 일곱개의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 단일 가닥 틈내기효소와 함께 제공된다.Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 Cas9 단일 가닥 틈내기효소가 8 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 각각에 돌연변이를 도입하기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 여덟개의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 단일 가닥 틈내기효소와 함께 제공된다.
표적 위치에 대한 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손의 배치
구현예에서, gRNA 및 Cas9 뉴클레아제가 NHEJ-매개 삽입결실을 유도하는 목적을 위해 이중 가닥 파손을 생성하는 경우, gRNA, 예를 들어 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA 분자는 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대한 근위에 가깝게 하나의 이중-가닥 파손을 위치시키도록 구성된다. 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치로부터 0 bp 내지 30 bp만큼 떨어져 있다(예를 들어, 표적 위치로부터 30 bp, 25 bp, 20 bp, 15 bp, 10 bp, 9 bp, 8 bp, 7 bp, 6 bp, 5 bp, 4 bp, 3 bp, 2 bp 또는 1 bp 미만).
구현예에서, Cas9 틈내기효소와 복합체화된 2 개의 gRNA가 NHEJ-매개 삽입결실을 유도할 목적을 위해 2 개의 단일 가닥 파손을 유도하는 경우, 2 개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 NHEJ 수선 표적 위치의 뉴클레오타이드를 제공하기 위한 2 개의 단일-가닥 파손을 위치시키도록 구성된다. 구현예에서, gRNA는 본질적으로 이중 가닥 파손을 모방하는 상이한 가닥 상에서, 동일한 위치에서 또는 서로의 소수의 뉴클레오타이드 내에서 절단을 위치시키도록 구성된다. 구현예에서, 더 가까운 틈은 표적 위치로부터 0 bp 내지 30 bp(예를 들어, 표적 위치로부터 30 bp, 25 bp, 20 bp, 15 bp, 10 bp, 9 bp, 8 bp, 7 bp, 6 bp, 5 bp, 4 bp, 3 bp, 2 bp 또는 1 bp 미만)만큼 떨어져 있고, 2 개의 틈은 서로 25 bp 내지 55 bp(예를 들어, 25 bp 내지 50 bp, 25 bp 내지 45 bp, 25 bp 내지 40 bp, 25 bp 내지 35 bp, 25 bp 내지 30 bp, 50 bp 내지 55 bp, 45 bp 내지 55 bp, 40 bp 내지 55 bp, 35 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 50 bp, 40 bp 내지 50 bp, 45 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 45 bp, 또는 40 bp 내지 45 bp) 내에 있고, 서로로부터 100 bp 이하(예를 들어, 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp 또는 10 bp 이하)로 떨어져 있다. 구현예에서, gRNA는 표적 위치의 뉴클레오타이드 중 측면 중 하나 상에 단일 가닥 파손을 위치시키도록 구성된다.
eaCas9 분자를 절단시키는 이중 가닥과 단일 가닥 둘 다, 또는 틈내기효소, eaCas9 분자는 표적 위치의 측면 둘 다에 파손을 생성하기 위해 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 이중 가닥 또는 짝지어진 단일 가닥 파손은 2 개의 절단 사이의 핵산 서열을 제거하기 위해(예를 들어, 두 파손 사이의 영역은 결실됨) 표적 위치의 양 측면 상에서 생성될 수 있다. 구현예에서, 2 개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 양 측면 상에서 이중-가닥 파손을 위치시키도록 구성된다. 대안의 구현예에서, 3 개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 측면 중 하나 상에 이중 가닥 파손(즉, cas9 뉴클레아제와 하나의 gRNA 복합체) 및 2 개의 단일 가닥 파손 또는 짝지어진 단일 가닥 파손(즉, Cas9 틈내기효소와의 2 개의 gRNA 복합체)을 위치시키도록 구성된다. 다른 구현예에서, 4 개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 측면 중 하나 상에서 단일 가닥 파손의 2 개의 쌍(즉, Cas9 틈내기효소와 2 개의 gRNA 복합체의 2 개의 쌍)을 생성하도록 구성된다. 이중 가닥 파손(들) 또는 쌍에서 2 개의 단일 가닥 틈 중 더 가까운 것은 이상적으로는 표적 위치의 0 bp 내지 500 bp 내에 있을 것이다(예를 들어, 표적 위치로부터 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 50 bp 또는 25 bp 이하). 틈내기효소가 사용될 때, 쌍에서 2 개의 틈은 서로 25 bp 내지 55 bp(예를 들어, 25 bp 내지 50 bp, 25 bp 내지 45 bp, 25 bp 내지 40 bp, 25 bp 내지 35 bp, 25 bp 내지 30 bp, 50 bp 내지 55 bp, 45 bp 내지 55 bp, 40 bp 내지 55 bp, 35 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 50 bp, 40 bp 내지 50 bp, 45 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 45 bp, 또는 40 bp 내지 45 bp) 내에 있고, 서로로부터 100 bp 이하(예를 들어, 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp 또는 10 bp 이하)로 떨어져 있다.
V.2 표적화된 넉다운
DNA 수준에서 유전자를 돌연변이시킴으로써 발현을 영구적으로 제거 또는 감소시키는 CRISPR/Cas-매개 유전자 넉아웃과 달리, CRISPR/Cas 넉아웃은 인공 전사 인자의 사용을 통해 유전자 발현을 일시적으로 감소시킨다. Cas9 단백질의 DNA 절단 도메인 둘 다에서 중요한 잔기의 돌연변이(예를 들어, D10A 및 H840A 돌연변이)는 촉매적 불활성 Cas9(사멸 Cas9 또는 dCas9로서도 알려진 eiCas9)의 생성을 초래한다. 촉매적 불활성 Cas9는 gRNA와 복합체화하고, gRNA의 표적화 도메인에 의해 구체화되는 DNA 서열을 국소화하지만, 그러나, 이는 표적 DNA를 절단하지 않는다. 효과기(effector) 도메인, 예를 들어 전사 억제 도메인에 대한 dCas9의 융합은 gRNA에 의해 구체화된 임의의 DNA부위에 대한 효과기의 동원을 가능하게 한다. eiCas9 그 자체는 암호화 서열 내 초기 영역에 동원될 때 전사를 차단할 수 있는 것으로 나타났지만, 더 강한 억제는 전사 억제 도메인(예를 들어, KRAB, SID 또는 ERD)을 Cas9에 융합시킴으로써 그리고 그것을 유전자의 프로모터 영역에 동원함으로써 달성될 수 있다. 프로모터의 표적화 DNAseI 과민감 영역을 표적화하는 것은 이들 영역이 Cas9 단백질에 접근가능하게 될 가능성이 더 많고 또한 내인성 전사 인자에 대한 부위를 보유할 가능성이 더 많기 때문에 더 효율적인 유전자 억제 또는 활성화를 수득할 수 있는 가능성이 있다. 특히 유전자 억제를 위해, 본 명세서에서 내인성 전사 인자의 결합 부위를 차단하는 것은 유전자 발현을 하향조절하는데 도움을 준다는 것이 상정된다. 다른 구현예에서, eiCas9는 염색질 변형 단백질에 융합될 수 있다. 염색질 상탤르 변경시키는 것은 표적 유전자의 감소된 발현을 초래할 수 있다.
구현예에서, gRNA 분자는 공지된 전사 반응 구성요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등), 공지된 상류의 활성화 서열(UAS) 및/또는 표적 DNA의 발현을 제어할 수 있는 것으로 의심되는 알려지지 않은 또는 알려진 기능의 서열에 표적화될 수 있다.
CRISPR/Cas-매개 유전자 넉다운은 원치않는 대립유전자 또는 전사체의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 유전자의 영구적인 파괴가 이상적이지 않은 시나리오가 상정된다. 이들 시나리오에서, 부위-특이적 억제는 발현을 일시적으로 감소시키거나 또는 제거하기 위해 사용될 수 있다. 또한 본 명세서에서 Cas-리프레서의 오프-타겟 효과는 뉴클레아제가 임의의 DNA 서열을 절단하고 돌연변이를 야기할 수 있기 때문에 Cas-뉴클레아제보다 덜 심각할 수 있는 반면, Cas-리프레서는 단지 그것이 활성적으로 전사된 유전자의 프로모터 영역을 표적화한다면 효과를 발휘할 수 있다고 상정된다. 그러나, 뉴클레아제-매개 넉아웃은 영구적이만, Cas-리프레서가 세포 내에 존재하는 한 억제는 단지 지속될 수 있다. 일단 리프레서가 더 이상 존재하지 않는다면, 내인성 전사 인자 및 유전자 조절 구성요소는 그의 천연 상태에 대한 발현을 회복시킬 가능성이 있다.
구현예에서, CRISPR/Cas-매개 유전자 넉다운은 하나 이상의 T-세포 발현 유전자의 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질이 2 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자 중 임의의 둘을 넉다운시키기 위해 사용되는 구현예에서, 유전자를 둘 다 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질과 함께 제공된다. 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질이 3 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자 중 임의의 셋을 넉다운시키기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 셋의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질과 함께 제공된다. 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질이 4 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자 중 임의의 넷을 넉다운시키기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 넷의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질과 함께 제공된다. 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질이 5 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자 중 임의의 다섯을 넉다운시키기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 다섯의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질과 함께 제공된다. 본 명세서에 기재된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질이 6 종의 T-세포 발현 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 각각을 넉다운시키기 위해 사용되는 구현예에서, 모두 여섯의 유전자를 표적화하는 개개의 gRNA 또는 gRNA 쌍은 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질과 함께 제공된다.
V.3 단일-가닥 어닐링
단일 가닥 어닐링(SSA)은 표적 핵산 중에 존재하는 2 개의 반복부 서열 사이의 이중 가닥 파손을 수선하는 다른 DNA 수선이다. SSA 경로에 의해 이용되는 반복부 서열은 일반적으로 길이로 30 개 초과의 뉴클레오타이드이다. 파손 말단에서 절단은 표적 핵산의 가닥 둘 다에 대해 반복부 서열을 나타내도록 일어난다. 절단 후, 반복부 서열을 함유하는 단일 가닥 돌출부는 반복체 서열이, 예를 들어 그 자체에 대해 부적절하게 어닐링되는 것을 방지하기 위해 RPA 단백질로 코팅된다. RAD52는 돌출부 상의 각각의 반복부 서열에 결합하고, 상보성 반복부 서열의 어닐링을 가능하게 하는 서열을 정렬한다. 어닐링 후에, 돌출부의 단일 가닥 플랩(flap)은 절단된다. 새로운 DNA 합성은 임의의 갭을 채우고, 결찰은 DNA 이중가닥을 복원한다. 가공의 결과로서, 2 개의 반복체 사이의 DNA 서열은 결실된다. 결실 길이는 이용되는 2 개의 반복체의 위치를 포함하는 다수의 인자 및 절단 경로 또는 진행도에 의존할 수 있다.
HDR 경로와 대조적으로, SSA는 표적 핵산 서열을 변경 또는 수정하기 위한 주형 핵산을 필요로 하지 않는다. 대신에, 상보성 반복부 서열이 이용된다.
V.4 기타 다른 DNA 수선 경로
SSBR(단일 가닥 파손 수선)
게놈 내 단일 가닥 파손(SSB)은 상기 논의된 DSB 수선 메커니즘과 별도의 메커니즘인 SSBR 경로에 의해 수선된다. SSBR 경로는 4 가지 주요 단계를 가진다: SSB 검출, DNA 말단 가공, DNA 갭 채우기, 및 DNA 결찰. 더 상세한 설명은 문헌[Caldecott, Nature Reviews Genetics 9, 619-631 (August 2008)]에서 제공되며, 본 명세서에서 요약이 제공된다.
제1 단계에서, SSB 형태일 때, PARP1 및/또는 PARP2는 파손을 인식하고 수선 기작을 동원한다. DNA 파손에서 PARP1의 결합 및 활성은 일시적이며, 손상부에서의 소상 축적 또는 SSBr 단백질 복합체의 안정성을 촉진함으로써 SSBr을 가속화하는 것으로 여겨진다. 거의 틀림없이 가장 중요한 이들 SSBr 단백질은 XRCC1인데, 이는 DNA 3' 및 5' 말단을 세정하는것을 초래하는 단백질을 포함하는 SSBr 가공의 다수의 효소적 구성성분과 상호작용하고, 안정화시키며, 자극하는 분자 스캐폴드로서 작용한다. 예를 들어, XRCC1은 말단 가공을 촉진하는 몇몇 단백질(DNA 중합효소 베타, PNK, 및 3 개의 뉴클레아제, APE1, APTX 및 APLF)과 상호작용한다. APE1은 엔도뉴클레아제 활성을 가진다. APLF는 엔도뉴클레아제 및 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다. APTX는 엔도뉴클레아제 및 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 활성을 가진다.
이 말단 가공은 전부는 아니라도 대부분의 SSB의3'- 및/또는 5'-말단이 '손상'되기 때문에 SSBR의 중요한 단계이다. 말단 가공은 일반적으로 손상된 3'-말단을 하이드록실화된 상태로 및/또는 손상된 5' 말단을 인산염 모이어티로 복구하는 것을 수반하며, 따라서 말단은 결찰 적격이 된다. 손상된 3' 말단을 가공할 수 있는 효소는 PNKP, APE1 및 TDP1을 포함한다. 손상된 5' 말단을 가공할 수 있는 효소는 PNKP, DNA 중합효소 베타 및 APTX를 포함한다. LIG3(DNA 리가제 III)는 Ehh한 말단 가공에 참여할 수 있다. 일단 말단이 정화되면(cleaned), 갭 채우기가 일어날 수 있다.
DNA 갭 채우기 단계에서, 통상적으로 존재하는 단백질은 PARP1, DNA 중합효소 베타, XRCC1, FEN1(플랩 엔도뉴클레아제 1), DNA 중합효소 델타/엡실론, PCNA 및 LIG1이다. 2 가지 방법의 갭 채우기, 즉, 짧은 패치 수선 및 긴 패치 수선이 있다. 짧은 패치 수선은 빠져있는 단일 뉴클레오타이드의 삽입을 수반한다. 일부 SSB에서, "갭 채우기"는 2 개 이상의 뉴클레오타이드를 대체하는 것을 계속할 수 있다(12 개까지의 염기의 대체가 보고되었다). FEN1은 대체된 5'-잔기를 제거하는 엔도뉴클레아제이다. Pol β를 포함하는 다중 DNA 중합효소는 SSB의 공급원 및 유형에 의해 영향받는 DNA 중합효소의 선택에 의해 SSB의 수선에 수반된다.
제4 단계에서, DNA 리가제, 예컨대 LIG1(리가제 I) 또는 LIG3(리가제 III)은 말단의 결합을 촉진한다. 짧은 패치 수선은 리가제 III을 이용하고, 긴 패치 수선은 리가제 I을 이용한다.
때때로, SSBR은 복제 결합된다. 이 경로는 CtIP, MRN, ERCC1 및 FEN1 중 하나 이상을 수반할 수 있다. SSBR을 촉진시킬 수 있는 추가적인 인자는 aPARP, PARP1, PARP2, PARG, XRCC1, DNA 중합효소 b, DNA 중합효소 d, DNA 중합효소, PCNA, LIG1, PNK, PNKP, APE1, APTX, APLF, TDP1, LIG3, FEN1, CtIP, MRN 및 ERCC1을 포함한다.
MMR(미스매치 수선)
세포는 3 개의 절단 수선 경로를 함유한다: MMR, BER 및 NER. 절단 수선 경로는 그들이 통상적으로 DNA의 한 가닥 상에서 손상부를 인식하고, 이어서 엑소/엔도뉴클레아제가 손상부를 제거하고 DNA 중합효소에 의해 하부에 순차적으로 채워지고 최종적으로 리가제에 의해 봉합되는 1 내지 30 개의 뉴클레오타이드 갭을 남긴다는 점에서 통상적인 특징을 가진다. 더 많은 완전한 그림은 문헌[Li, Cell Research (2008) 18:85-98]에서 제공되며, 본 명세서에서 요약이 제공된다.
미스매치 수선(MMR)은 잘못 짝지어진 DNA 염기 상에서 작용한다.
MSH2/6 또는 MSH2/3 복합체는 둘 다 미스매치 인식 및 수선의 개시에서 중요한 역할을 하는 ATP분해효소s 활성을 가진다. MSH2/6은 염기-염기 미스매치를 우선적으로 인식하며, 1 개 또는 2 개의 뉴클레오타이드의 미스매치를 동정하는 반면, MSH2/3은 더 큰 ID 미스매치를 우선적으로 인식한다.
hMLH1은 hPMS2와 이형이량체화하여 ATP분해효소 활성을 갖고 MMR의 다수의 단계에 대해 중요한 hMutLα를 형성한다. 이는 EXO1을 수반하는 3' 틈-지정 MMR에서 중요한 역할을 하는 PCNA/복제 인자 C (RFC)-의존적 엔도뉴클레아제 활성을 가진다. (EXO1은 HR과 MMR 둘 다에 참여한다.) 이는 미스매치 유발 절제의 종결을 조절한다. 리가제 I은 이 경로에 적절한 리가제이다. MMR을 촉진할 수 있는 추가적인 인자는 EXO1, MSH2, MSH3, MSH6, MLH1, PMS2, MLH3, DNA Pol d, RPA, HMGB1, RFC,및 DNA 리가제 I을 포함한다.
염기 절단 수선(BER)
염기 절단 수선(BER) 경로는 세포주기 전체적으로 활성이며; 이는 게놈으로부터 작은 비-나선-뒤틀림 염기 손상부를 제거하는 것을 주로 초래한다. 대조적으로, 관련된 뉴클레오타이드 절단 수선 경로(다음 부문에서 논의함)는 큰 나선-뒤틀림 손상부를 수선한다. 더 상세한 설명은 문헌[Caldecott, Nature Reviews Genetics 9, 619-631 (August 2008)]에서 제공되며, 본 명세서에서 요약이 제공된다.
DNA 염기 손상 시, 염기 절단 수선(BER)이 개시되고 5 개의 주요 단계로 단순화될 수 있다: (a) 손상된 DNA 염기의 제거; (b) 후속 염기 부위의 절단; (c) DNA 말단 정화; (d) 정확한 뉴클레오타이드의 수선 갭 내로의 삽입; 및 (e) DNA 백본 내 남아있는 틈의 결찰. 이들 마지막 단계는 SSBR과 유사하다.
제1 단계에서, 손상-특이적 DNA는 당 인산화 백본에 대해 염기를 연결하는 N-글리코사이드의 절단을 통해 손상된 염기를 절단한다. 이어서, AP 엔도뉴클레아제-1(APE1) 또는 리아제 활성과 연관된 2기능성 DNA 글리코실라제은 포스포디에스테르 백본을 절단하여 DNA 단일 가닥 파손(SSB)을 생성한다. BER의 제3 단계는 DNA 말단 정화를 수반한다. BER에서 제4 단계는 수선 갭 내로 새로운 상보성 뉴클레오타이드를 첨가하는 Pol β에 의해 수행되고, 최종 단계에서 XRCC1/리가제 III은 DNA 백본에 남아있는 틈을 봉입한다. 이는 대다수의(대략 80%)의 손상된 DNA 염기가 수선되는 짧은 패치 BER 경로를 완전하게 한다. 그러나, 단계 3에서 5'-말단이 말단 가공 활성에 대해 저항성이라면, Pol β에 의한 하나의 뉴클레오타이드 삽입 후에, 복제 DNA 중합효소인 Pol δ/ε에 대한 중합효소 전환이 있으며, 이어서 DNA 수선 갭 내로 대략 2 개 내지 8 개 더 많은 뉴클레오타이드를 첨가한다. 이는 5'-플랩 구조를 생성하는데, 이는 진행도 인자 증식 세포 핵 항원(proliferating cell nuclear antigen: PCNA)과 연관된 플랩 엔도뉴클레아제-1(FEN-1)에 의해 인식되고 절단된다. 이어서, DNA 리가제 I은 DNA 백본에 남아있는 틈을 봉합하고, 롱패치(long-patch) BER을 완전하게 한다. BER 경로를 촉진할 수 있는 추가적인 인자는 DNA 글리코실라제, APE1, Polb, Pold, Pole, XRCC1, 리가제 III, FEN-1, PCNA, RECQL4, WRN, MYH, PNKP 및 APTX를 포함한다.
뉴클레오타이드 절단 수선(NER)
뉴클레오타이드 절단 수선(NER)은 DNA로부터 큰 나선-뒤틀림 손상을 제거하는 중요한 절단 메커니즘이다. NER에 관한 추가적인 상세한 설명은 문헌[Marteijn et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 465-481 (2014)]에서 제공되고, 본 명세서에서 요약이 제공된다. NER은 2 개의 더 작은 경로를 포함하는 더 넓은 경로이다: 전반적 게놈 NER(global genomic NER: GG-NER) 및 전사 결합 수선 NER(TC-NER). GG-NER 및 TC-NER은 DNA 손상을 인식하기 위한 상이한 인자를 사용한다. 그러나, 그들은 손상부 절단, 수선 및 결찰을 위한 동일한 기작을 이용한다.
일단 손상이 인식되면, 세포는 손상부를 함유하는 짧은 단일 가닥 DNA 세그먼트를 제거한다. 엔도뉴클레아제 XPF/ERCC1 및 XPG(ERCC5에 의해 암호화됨)는 손상부의 측면 중 하나 상에서 손상된 가닥을 절단함으로써 손상부를 제거하여, 22 개 내지 30 개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 갭을 생성한다. 다음에, 세포는 DNA 갭 채우기 합성 및 결찰을 수행한다. 이 과정에 PCNA, RFC, DNA Pol δ, DNA Pol ε 또는 DNA Pol κ, 및 DNA 리가제 I 또는 XRCC1/리가제 III이 수반된다. 복제 세포는 DNA pol δ 및 DNA 리가제 I를 사용하는 경향이 있는 반면, 비-복제 세포는 결찰 단계를 수행하기 위해 DNA Pol δ, DNA Pol ε, 및 XRCC1/ 리가제 III 복합체를 사용하는 경향이 있다.
NER은 다음의 인자를 수반할 수 있다: XPA 내지 G, POLH, XPF, ERCC1, XPA 내지 G 및 LIG1. 전사 결합된 NER(TC-NER)은 다음의 인자를 수반할 수 있다: CSA, CSB, XPB, XPD, XPG, ERCC1, 및 TTDA. NER 수선 경로를 촉진할 수 있는 추가적인 인자는 XPA 내지 G, POLH, XPF, ERCC1, XPA 내지 G, LIG1, CSA, CSB, XPA, XPB, XPC, XPD, XPF, XPG, TTDA, UVSSA, USP7, CETN2, RAD23B, UV-DDB, CAK 서브복합체, RPA 및 PCNA을 포함한다.
가닥간 가교(Interstrand Crosslink: ICL)
ICL 수선 경로 수선으로 불리는 전용 경로가 가교된다. 가닥간 가교 또는 상이한 DNA 가닥 내 염기 사이의 공유적 가교는 복제 또는 전사 동안 일어날 수 있다. ICL 수선은 다중 수선 과정, 특히 핵산분해 활성, 손상통과 합성(translesion synthesis: TLS) 및 HDR의 동조(coordination)를 수반한다. 뉴클레아제는 가교된 염기의 측면 중 하나 상에서 ICL을 절단하기 위해 동원되는 반면, TLS 및 HDR은 절단 가닥을 수선하도록 동조된다. ICL 수선은 다음의 인자: 엔도뉴클레아제, 예를 들어 XPF 및 RAD51C, 엔도뉴클레아제, 예컨대 RAD51, 손상통과 중합효소, 예를 들어 DNA 중합효소 제타 및 Rev1), 및 판코니 빈혈(Fanconi anemia: FA) 단백질, 예를 들어 FancJ을 수반할 수 있다.
기타 다른 경로
몇몇 기타 다른 DNA 수선 경로가 포유류에서 존재한다.
손상통과 합성(TLS)은 결함 복제 사건 후에 남은 단일 가닥 파손의 수선을 위한 경로이며, 손상통과 중합효소, 예를 들어 DNA polζ 및 Rev1을 수반한다.
오류 없는 복제후 수선(postreplication repair: PRR)은 결함 복제 사건 후 남아있는 단일 가닥 파손을 수선하기 위한 다른 경로이다.
V.5 게놈 편집 방법에서 gRNA의 예
본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA 분자는 표적 핵산의 서열을 변경시키는 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손, 예를 들어 표적 위치 또는 표적 유전자 서명을 생성하는 Cas9 분자에 의해 사용될 수 있다. 이들 방법에서 유용한 gRNA 분자는 이하에 기재한다.
구현예에서, gRNA, 예를 들어 키메라 gRNA는 그것이 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하도록 구성된다:
a) 이것은, 예를 들어 이중 가닥 파손을 만드는 Cas9 분자를 표적화할 때,이중 가닥 파손을, (i) 표적 위치의 50 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350 개, 400 개, 450 개, 또는 500 개의 뉴클레오타이드 내에, 또는 (ii) 표적 위치가 말단 절제 영역 내에서 충분히 가까이 위치시킬 수 있고;
b) 이것은 적어도 16 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인, 예를 들어 (i) 16 개, (ii) 17 개, (iii) 18 개, (iv) 19 개, (v) 20 개, (vi) 21 개, (vii) 22 개, (viii) 23 개, (ix) 24 개, (x) 25 개, 또는 (xi) 26 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 가지며; 그리고
c)
(i) 근위 도메인 및 꼬리 도메인은, 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스, 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인 및 근위 도메인으로부터 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드, 또는 그것으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고;
(ii) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 gRNA의 대응하는 서열 또는 그것과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드가 있으며;
(iii) 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상동성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 gRNA의 대응하는 서열 또는 그것으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드가 있고;
(iv) 꼬리 도메인은 길이로 적어도 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개 또는 40 개의 뉴클레오타이드이며, 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인과 적어도 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개 또는 40 개의 뉴클레오타이드; 또는, 그것과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고; 또는
(v) 꼬리 도메인은 천연 유래 꼬리 도메인, 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인의 대응하는 부분의 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개의 뉴클레오타이드 또는 모두를 포함한다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(iii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(iv)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(v)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(vi)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(vii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(viii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(ix)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(x)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는특성: a 및 b(xi)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 c를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a, b 및 c를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(i) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(i) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는특성: a(i), b(iii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iv) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iv) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(v) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(v) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vi) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vi) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(viii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(viii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ix) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ix) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(x) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(x) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(xi) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(xi) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA, 예를 들어 키메라 gRNA는 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하도록 구성된다;
a) gRNA 중 하나 또는 둘 다는, 예를 들어 단일 가닥 파손을 만드는 Cas9 분자를 표적화할 때,(i) 표적 위치의 50 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350 개, 400 개, 450 개, 또는 500 개의 뉴클레오타이드 내이거나, 또는 (ii) 표적 위치가 말단 절단 영역 내에 있도록 충분히 가까운, 단일 가닥 파손을 위치시킬 수 있으며;
b) 하나 또는 둘 다 적어도 16 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인, 예를 들어 (i) 16 개, (ii) 17 개, (iii) 18 개, (iv) 19 개, (v) 20 개, (vi) 21 개, (vii) 22 개, (viii) 23 개, (ix) 24 개, (x) 25 개, 또는 (xi) 26 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 가지고; 그리고
c)
(i) 근위 및 꼬리 도메인은, 함께 취해질 때, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 및 근위 도메인으로부터의 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드, 또는 이들로부터의 뉴클레오타이드와 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5; 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열을 포함하거나;
(ii) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개 뉴클레오타이드, 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 gRNA의 대응하는 서열 또는 이들과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열부터의 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개 뉴클레오타이드가 있거나;
(iii) 제1 상보성 도메인의 제2 상보성 도메인 대응 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3'에 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개 뉴클레오타이드, 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 gRNA의 대응하는 서열, 또는 이들과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열로부터의 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드가 있거나;
(iv) 꼬리 도메인은 길이로 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40 개의 뉴클레오타이드이며, 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인으로부터의 적어도 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개 또는 40 개의 뉴클레오타이드, 또는 이들과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나; 또는
(v) 꼬리 도메인은 천연 유래 꼬리 도메인, 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인의 대응하는 부분의 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개의 뉴클레오타이드 또는 모두를 포함한다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(iii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(iv)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(v)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(vi)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(vii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(viii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(ix)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(x)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 b(xi)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a 및 c를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a, b 및 c를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(i) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(i) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iv) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(iv) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(v) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(v) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vi) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vi) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(vii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(viii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(viii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ix) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(ix) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(x) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(x) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(xi) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 특성: a(i), b(xi) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 HNH 활성을 갖는 Cas9 틈내기효소 분자, 예를 들어 불활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 D10에서 돌연변이, 예를 들어 D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
구현예에서, gRNA는 RuvC 활성을 갖는 Cas9 틈내기효소 분자, 예를 들어 불활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 H840에서 돌연변이, 예를 들어 H840A를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
구현예에서, 제1 gRNA 및 제2 gRNA를 포함하는 한 쌍의 gRNA, 예를 들어 한 쌍의 키메라 gRNA는 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하도록 구성된다:
a) gRNA 중 하나 또는 둘 다는, 예를 들어 단일 가닥 파손을 만드는 Cas9 분자를 표적화할 때, 단일 가닥 파손을 (i) 표적 위치의 50 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350 개, 400 개, 450 개, 또는 500 개의 뉴클레오타이드 내에서 또는 (ii) 표적 위치가 말단 절제 영역 내에서 충분히 가깝게 위치시킬 수 있고;
b) 하나 또는 둘 다는 적어도 16 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인, 예를 들어 (i) 16 개, (ii) 17 개, (iii) 18 개, (iv) 19 개, (v) 20 개, (vi) 21 개, (vii) 22 개, (viii) 23 개, (ix) 24 개, (x) 25 개, 또는 (xi) 26 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 가지며;
c) 하나 또는 둘 다는:
(i) 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인 및 근위 도메인으로부터 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드, 또는 그것으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고;
(ii) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 gRNA의 대응하는 서열 또는 그것과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드가 있으며;
(iii) 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상동성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 gRNA의 대응하는 서열 또는 그것으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드가 있고;
iv) 꼬리 도메인은 길이로 적어도 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개 또는 40 개의 뉴클레오타이드이며, 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인과 적어도 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개 또는 40 개의 뉴클레오타이드; 또는, 그것과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고; 또는
(v) 꼬리 도메인은 천연 유래 꼬리 도메인, 예를 들어 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인의 대응하는 부분의 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개의 뉴클레오타이드 또는 모두를 포함한다;
d) gRNA는 표적 핵산에 혼성화될 때, 그들이 0 개 내지 50 개, 0 개 내지 100 개, 0 개 내지 200 개, 적어도 10 개, 적어도 20 개, 적어도 30 개 또는 적어도 50 개의 뉴클레오타이드만큼 분리되도록 구성되고;
e) 제1 gRNA 및 제2 gRNA에 의해 만들어진 파손은 상이한 가닥 상에 있으며; 그리고
f) PAM은 바깥쪽으로 접한다.
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 b(i).
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 b(ii).
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 b(iii).
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a 및 b(iv)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a 및 b(v)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a 및 b(vi)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a 및 b(vii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a 및 b(viii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a 및 b(ix)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a 및 b(x)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a 및 b(xi)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a 및 c를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a, b 및 c를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(i) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(i) 및 c(ii).
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(i), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(i), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(i), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(ii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(ii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(ii), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(ii), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(ii), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(iii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(iii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(iii), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(iii), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(iii), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(iv) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(iv) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(iv), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(iv), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(iv), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(v) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(v) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(v), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(v), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(v), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(vi) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(vi) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(vi), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(vi), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(vi), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(vii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(vii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(vii), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(vii), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(vii), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(viii) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(viii) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(viii), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(viii), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(viii), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(ix) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(ix) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(ix), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(ix), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(ix), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(x) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(x) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(x), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(x), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(x), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(xi) 및 c(i)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(xi) 및 c(ii)를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(xi), c 및 d를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(xi), c 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 중 하나 또는 둘 다는 특성: a(i), b(xi), c, d 및 e를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 HNH 활성를 갖는Cas9 틈내기효소 분자, 예를 들어 비활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 D10에서 돌연변이, 예를 들어 D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
구현예에서, gRNA는 RuvC 활성을 갖는 Cas9 틈내기효소 분자, 예를 들어 비활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 H840에서 돌연변이, 예를 들어 H840A를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다. 구현예에서, gRNA는 RuvC 활성을 갖는 Cas9 틈내기효소 분자, 예를 들어 비활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 N863에서 돌연변이, 예를 들어 N863A를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
VI. 표적 세포
Cas9 분자 및 gRNA 분자, 예를 들어 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 세포를 조작하기 위해, 예를 들어 매우 다양한 세포에서 표적 핵산을 편집하기 위해 사용될 수 있다.
구현예에서, 세포는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 표적 유전자를 편집함으로써(예를 들어, 하나 이상의 표적 유전자에서 돌연변이를 유도함으로써) 조작된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 유전자(예를 들어, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자)의 발현은 조절된다. 다른 구현예에서, 세포는 하나 이상의 표적 유전자를 편집하고(예를 들어, 하나 이상의 표적 유전자에서 돌연변이를 유도하고) 그리고/또는 하나 이상의 표적 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자의 발현을 조절함으로써 생체외에서 조작되고, 대상체에게 투여된다. 생체외 조직을 위한 표적 세포의 공급원은, 예를 들어 대상체의 혈액, 대상체의 제대혈, 또는 대상체의 골수를 포함할 수 있다. 생체외 조작을 위한 표적 세포의 공급원은 또한, 예를 들어 이종성 공여자 혈액, 제대혈, 또는 골수를 포함한다.
본 명세서에 기재된 Cas9 및 gRNA 분자는 표적 세포에 전달될 수 있다. 구현예에서, 표적 세포는 T 세포, 예를 들어 CD8+ T 세포(예를 들어, CD8+ 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 또는 효과기 기억 T 세포), CD4+ T 세포, 자연 살해 T 세포(NKT 세포), 조절 T 세포(Treg), 줄기 세포 기억 T 세포, 림프계 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 자연 살해 세포(NK 세포) 또는 수지상 세포이다. 구현예에서, 표적 세포는 유도 만능 줄기(iPS) 세포 또는 iPS 세포로부터 유도된 세포, 예를 들어 하나 이상의 표적 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는TRBC 유전자의 발현을 변경하거나(예를 들어 표적 유전자에서 돌연변이를 유도하거나) 또는 발현을 조작하도록 조작된 대상체로부터 생성된 iPS 세포로부터 유도되고, 예를 들어 T 세포, 예를 들어 CD8+ T 세포 (예를 들어, CD8+ 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 또는 효과기 기억 T 세포), CD4+ T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포, 림프계 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포로 분화된 세포이다.
구현예에서, 표적 세포는 특이적 T 세포 수용체(TCR) 유전자(예를 들어, TRAC 및 TRBC 유전자)를 함유하도록 변경되었다. 다른 구현예에서, TCR은 종양 연관 항원, 예를 들어 발암배아성 항원(carcinoembryonic antigen: CEA), GP100, T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(MART1), 흑색종 항원 A3(MAGEA3), NYESO1 또는 p53에 대해 결합 특이성을 가진다.
구현예에서, 표적 세포는 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)를 함유하도록 변경되었다. 구현예에서, CAR은 종양 연관 항원, 예를 들어 CD19, CD20, 탄산 무수화효소 IX(CAIX), CD171, CEA, ERBB2, GD2, 알파-엽산염 수용체, 루이스 Y 항원, 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 또는 종양 연관 당단백질 72(TAG72)에 대한 결합 특이성을 가진다.
다른 구현예에서, 표적 세포는, 예를 들어 TCR 또는 CAR에 의해 다음의 종양 항원 중 하나 이상에 결합하도록 변경되었다. 종양 항원은 AD034, AKT1, BRAP, CAGE, CDX2, CLP, CT-7, CT8/HOM-TES-85, cTAGE-1, 피불린-1, HAGE, HCA587/MAGE-C2, hCAP-G, HCE661, HER2/neu, HLA-Cw, HOM-HD-21/갈렉틴9(Galectin9), HOM-MEEL-40/SSX2, HOM-RCC-3.1.3/CAXII, HOXA7, HOXB6, Hu, HUB1, KM-HN-3, KM-KN-1, KOC1, KOC2, KOC3, KOC3, LAGE-1, MAGE-1, MAGE-4a,MPP11, MSLN, NNP-1, NY-BR-1, NY-BR-62, NY-BR-85, NY-CO-37, NY-CO-38, NY-ESO-1, NY-ESO-5, NY-LU-12, NY-REN-10, NY-REN-19/LKB/STK11, NY-REN-21, NY-REN-26/BCR, NY-REN-3/NY-CO-38, NY-REN-33/SNC6, NY-REN-43, NY-REN-65, NY-REN-9, NY-SAR-35, OGFr, PLU-1, Rab38, RBPJ카파, RHAMM, SCP1, SCP-1, SSX3, SSX4, SSX5, TOP2A, TOP2B, 또는 티로시나제를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
VII. 표적 세포에 대한 성분의 생체외 전달
구성성분, 예를 들어 Cas9 분자 및 gRNA 분자는 다양한 전달 방법 및 제형을 이용하여 다양한 형태로 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 표 700 및 800 참조. Cas9 또는 gRNA 구성성분이 전달을 위해 DNA로서 암호화될 때, DNA는 필수적으로는 아니지만 통상적으로 발현을 달성하기 위해, 예를 들어 프로모터를 포함하는 제어 영역을 포함할 수 있다. Cas9 분자 서열에 대한 유용한 프로모터는, 예를 들어 CMV, EF-1a, EFS, MSCV, PGK 또는 CAG 프로모터를 포함한다. gRNA에 대한 유용한 프로모터는, 예를 들어 H1, EF-1a, tRNA 또는 U6 프로모터를 포함한다. 유사한 또는 비유사한 강도를 지니는 프로모터는 구성성분의 발현을 조율하도록 선택될 수 있다. Cas9 분자를 암호화하는 서열은 핵 국소화 신호(NLS), 예를 들어 SV40 NLS를 포함할 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자 또는 gRNA 분자에 대한 프로모터는 독립적으로 유도성, 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다.
표 700은 구성성분이 표적 세포에 전달될 수 있는 형태의 예를 제공한다.
[표 700]
*
표 800은 본 명세서에 기재된 바와 같은 Cas 시스템의 구성성분, 예를 들어 Cas9 분자 구성성분 및 gRNA 분자 구성성분을 위한 다양한 전달 방법을 요약한다.
[표 800]
Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 DNA-기반 전달
Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자) 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 DNA는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9-암호화 및/또는 gRNA-암호화 DNA는, 예를 들어 벡터(예를 들어, 바이러스 또는 비바이러스 벡터), 비벡터 기반 방법(예를 들어, 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체를 이용), 또는 이들의 조합에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터/바이러스 또는 플라스미드)에 의해 전달된다.
벡터는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한, 예를 들어 Cas9 분자 서열에 융합된 (예를 들어, 핵 국소화, 인 국소화, 미토콘드리아 국소화를 위해) 단일 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 Cas9 분자를 암호화하는 서열에 융합된 (예를 들어, SV40으로부터의) 핵 국소화 서열을 포함할 수 있다.
하나 이상의 조절/제어 구성요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site: IRES), 2A 서열, 및 스플라이스 억셉터(acceptor) 또는 도너가 벡터 내에 포함될 수 있다. 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 II(예를 들어, CMV 프로모터)에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 III(예를 들어, U6 프로모터)에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 프로모터는 조절된 프로모터(예를 들어, 유도성 프로모터)이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 비바이러스 프로모터이다.
구현예에서, 벡터는 또는 전달 비히클은 (예를 들어, 재조합 바이러스의 생성에 대해) 바이러스 벡터이다. 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어, dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어, ssRNA 바이러스)이다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스는, 예를 들어 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스이다.
구현예에서, 바이러스는 분열 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 비분열 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 분열 세포와 비분열 세포를 둘 다 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다. 다른 구현예에서, 바이러스는, 예를 들어 인간에서 감소된 면역을 갖도록 조작된이다. 다른 구현예에서, 바이러스는 복제-적격이다. 다른 구현예에서, 바이러스는, 예를 들어 비리온 복제 및/또는 패키징의 추가적인 라운드에 필요한 유전자에 대해 하나 이상의 암호 영역이 기타 다른 유전자로 대체되거나 결실된, 복제-결함이다. 다른 구현예에서, 바이러스는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 일시적 발현을 야기한다. 다른 구현예에서, 바이러스는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 장기간 지속, 예를 들어 적어도 1 주, 2 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 6 개월, 9 개월, 1년, 2년 또는 영구적 발현을 야기한다. 바이러스의 패키징 능력은, 예를 들어 적어도 약 4 kb 내지 적어도 약 30 kb, 예를 들어 적어도 약 5 kb, 10 kb, 15 kb, 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb, 45 kb 또는 50 kb로 다를 수 있다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 재조합 레트로바이러스에 의해 전달된다. 다른 구현예에서, 레트로바이러스(예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스)는, 예를 들어 숙주 게놈 내로 통합되게 하는 역전사효소를 포함한다. 다른 구현예에서, 레트로바이러스는 복제-적격이다. 구현예에서, 레트로바이러스는, 예를 들어 비리온 복제 및/또는 패키징의 추가적인 라운드에 필수적인 유전자에 대해 하나 이상의 암호 영역이 기타 다른 유전자로 대체되거나 또는 결실된, 복제-결함이다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 재조합 렌티바이러스에 의해 전달된다. 예를 들어, 렌티바이러스는 복제-결함이며, 예를 들어 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 유전자를 포함하지 않는다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 재조합 아데노바이러스에 의해 전달된다. 다른 구현예에서, 아데노바이러스는 인간에서 감소된 면역을 갖도록 조작된이다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 재조합 AAV에 의해 전달된다. 구현예에서, AAV는 숙주 세포, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 세포 내로 그의 게놈을 혼입시킬 수 있다. 다른 구현예에서, AAV는 자기 상보적 아데노-연관 바이러스(scAAV), 예를 들어 이중 가닥 DNA를 형성하기 위해 함께 어닐링하는 가닥 둘 다를 패키징하는 scAAV이다. 개시된 방법에서 사용될 수 있는 AAV 혈청형은, AAV1, AAV2, 변형 AAV2(예를 들어, Y444F, Y500F, Y730F 및/또는 S662V에서의 변형), AAV3, 변형된 AAV3(예를 들어, Y705F, Y731F 및/또는 T492V에서의 변형), AAV4, AAV5, AAV6, 변형된 AAV6(예를 들어, S663V 및/또는 T492V에서의 변형), AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV rh 10, 및 위형 AAV를 포함하고, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6은 또한 개시된 방법에서 사용될 수 있다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 혼성 바이러스, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바이러스 중 하나 이상의 혼성체에 의해 전달된다.
패키징 세포를 사용하여 표적 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성한다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징할 수 있는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징할 수 있는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에서 사용되는 바이러스 벡터는 보통 바이러스 입자 내로 핵산 벡터를 패키징하는 생성자 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 통상적으로 패키징 및 (적용가능하다면) 숙주 또는 표적 세포 내로의 후속적 통합에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하며, 기타 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 암호화하는 발현 카세트, 예를 들어 Cas9에 의해 대체된다. 예를 들어, 유전자 요법에서 사용되는 AAV 벡터는 통상적으로 숙주 또는 표적 세포에서 패키징 및 유전자 발현에 필요한 AAV 게놈으로부터의 반전 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR) 서열만을 가진다. 상실된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 도중에 공급된다. 이후로, 바이러스 DNA는 기타 다른 AAV 유전자, 즉, rep 및 cap을 암호화하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만 ITR 서열은 없는 세포주에서 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터의 AAV 유전자의 발현을 촉진시킨다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결실에 기인하여 상단한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다.
구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 인식 능력을 가진다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 상이한/대안의 바이러스 외피 당단백질로 위형을 만들 수 있고; 세포 유형-특이적 수용체에 의해 공학 처리되며(예를 들어, 표적화 리간드, 예컨대 펩타이드 리간드, 단쇄 항체, 성장인자를 혼입시키기 위한 바이러스 외피 당단백질의 유전자 변형); 그리고/또는 바이러스 당단백질을 인식하는 하나의 말단 및 표적 세포 표면의 모이어티를 인식하는 다른 말단(예를 들어, 리간드-수용체, 단클론성 항체, 아비딘-바이오틴 및 화학적 컨쥬게이션)을 지니는 이중 특이성이 있는 분자 브릿지를 갖도록 조작된다.
구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 특이적 발현을 달성한다. 예를 들어, 조직-특이적 프로모터는 특이적 표적 세포에서만 이식유전자(Cas9 및 gRNA)의 발현을 제한하도록 구성될 수 있다. 벡터의 특이성은 또한 이식유전자 발현의 마이크로RNA-의존적 제어에 의해 매개될 수 있다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 및 표적 세포막의 융합 효율이 증가되었다. 예를 들어, 융합 단백질, 예컨대 융합-적격 혈구응집소(HA)는 바이러스 흡수를 증가시키기 위해 세포 내로 혼입될 수 있다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 핵 국소화 능력을 가진다. 예를 들어, (세포 분할 동안) 핵 막의 파괴를 필요로 하고 따라서 비분열 세포를 감염시키지 않을 바이러스는 바이러스의 매트릭스 단백질 내 핵 국소화 펩타이드를 혼입시키도록 변경될 수 있고, 이에 의해 비증식 세포의 형질도입을 가능하게 한다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 비벡터 기반 방법에 의해(예를 들어, 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체를 이용하여) 전달된다. 예를 들어, DNA는, 예를 들어 유기적으로 변형된 실리카 또는 실리케이트(오르모실(Ormosil)), 전기천공법, 일시적인 세포 압축 또는 스퀴징(예를 들어, 문헌[Lee, et al [2012] Nano Lett 12: 6322-27]에 기재되어 있음), 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 지질-매개 형질감염, 덴드리머, 무기 나노입자, 인산칼슘, 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다.
구현예에서, 전기천공법을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳 내에서 세포를 Cas9-및/또는 gRNA-암호화 DNA와 혼합하는 것 및 정해진 지속기간 및 진폭의 하나 이상의 전기적 임펄스를 적용하는 것을 포함한다. 구현예에서, 전기천공법을 통한 전달은 혼합물을 카트리지, 챔버 또는 큐벳 내로 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)와 연결된 용기에서 세포가 Cas9-및/또는 gRNA-암호화 DNA와 혼합되는 시스템을 이용하여 수행되되, 정해진 지속기간 및 진폭의 하나 이상의 전기적 임펄스는 세포가 제2 용기에 전달된 후에 적용된다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 벡터 기반 방법과 비벡터 기반 방법의 조합에 의해 전달된다. 예를 들어, 바이로좀은 비활성화 바이러스(예를 들어, HIV 또는 인플루엔자 바이러스)와 조합된 리포좀을 포함하는데, 이는 바이러스 또는 리포좀 방법 단독 중 하나보다 더 효율적인 유전자 전달을 초래할 수 있다.
구현예에서, 전달 비히클은 비바이러스 벡터이다. 구현예에서, 비바이러스 벡터는 무기 나노입자이다. 예시적인 무기 나노입자는, 예를 들어 자기 나노입자(예를 들어, Fe3MnO2) 및 실리카를 포함한다. 나노입자의 외면은 페이로드의 부착(예를 들어, 컨쥬게이션 또는 포착)을 가능하게 하는 양으로 하전된 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리세린)과 컨쥬게이팅될 수 있다. 구현예에서, 비바이러스 벡터는 유기 나노입자이다. 예시적인 유기 나노입자는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 코팅된 중성 헬퍼 지질및 지질로 코팅된 프로타민-핵산 복합체와 함께 양이온성 지질을 함유하는 SNALP 리포좀을 포함한다.
유전자 전달을 위한 예시적인 지질은 이하의 표 900에 나타낸다.
[표 900]
유전자 전달을 위한 예시적인 중합체를 표 1000에 나타낸다.
[표 1000]
구현예에서, 비히클은 나노입자 및 리포좀의 표적 세포 흡수를 증가시키기 위한 표적화 변형, 예를 들어 세포 특이적 항원, 단클론성 항체, 단쇄 항체, 앱타머, 중합체, 당 및 세포 침투 펩타이드를 가진다. 구현예에서, 비히클은 융합생성 및 엔도좀-탈안정화 펩타이드/중합체를 이용한다. 구현예에서, 비히클은 (예를 들어, 화물의 엔도좀 탈출을 가속화시키기 위해) 산-촉발 입체구조적 변화를 겪는다. 구현예에서, 자극-절단성 중합체는, 예를 들어 세포의 격막에서의 방출을 위해 사용된다. 예를 들어, 환원성 세포 환경에서 절단된 이황화-기반 양이온성 중합체가 사용될 수 있다.
구현예에서, 전달 비히클은 생물학적 비바이러스 전달 비히클이다. 구현예에서, 비히클은 약독화된 박테리아(예를 들어, 천연으로 또는 침습성이 되도록 인공적으로 공학 처리되었지만 발병을 예방하고 이식유전자(예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스, 특정 살모넬라 균주(Salmonella strains), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 및 변형된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli))를 발현시키도록 약독화됨, 표적 특이적 세포에 대해 영양적 및 조직 특이적 향성을 갖는 박테리아, 표적 세포 특이성을 변경시키도록 변형된 표면 단백질을 갖는 박테리아)이다. 구현예에서, 비히클은 유전자 변형된 박테리오파지이다(예를 들어, 거대 패키징 능력을 갖는 조작된 파지, 덜 면역원성, 포유류 플라스미드 유지 서열을 함유하고 혼입된 표적화 리간드를 가짐). 구현예에서, 비히클은 포유류 바이러스 유사 입자이다. 예를 들어, 변형된 바이러스 입자가 (예를 들어, "빈" 입자의 정제 후에 목적으로 하는 화물을 지니는 바이러스의 생체외 조립체에 의해) 생성될 수 있다. 비히클은 또한 표적 조직 특이성을 변경시키기 위해 표적화 리간드를 혼입하도록 공학 처리될 수 있다. 구현예에서, 비히클은 생물학적 리포좀이다. 예를 들어, 생물학적 리포좀은 인간 세포로부터 유래된 인지질 기반 입자이다(예를 들어, 대상체로부터 유래된 구체 구조로 분해된 적혈구인 적혈구 고스트(예를 들어, 조직 표적화는 다양한 조직 또는 세포-특이적 리간드의 부착에 의해 달성될 수 있음), 또는 식균 작용 유래의(예를 들어, 다양한 세포 유형으로부터 생성될 수 있고, 따라서 표적화 리간드에 대한 필요없이 세포에 의해 취해질 수 있음) 분비 엑소솜-대상체 유래 막-결합 나노소수포(30 nm 내지 100 nm)).
구현예에서, Cas 시스템의 구성성분, 예를 들어 Cas9 분자 구성성분 및/또는 본 명세서에 기재된 gRNA 분자 구성성분이 아닌 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자)가 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 구성성분 중 하나 이상이 전달됨과 동시에 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 구성성분이 전달되기 (예를 들어, 약 30 분 미만, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 6 시간, 9 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 1 주, 2 주 또는 4 주) 전에 또는 후에 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 구성성분, 예를 들어 Cas9 분자 구성성분 및/또는 본 명세서에 기재된 gRNA 분자 구성성분 중 하나 이상과 상이한 수단에 의해 전달된다. 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 임의의 전달 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스에 의해 전달될 수 있고, Cas9 분자 구성성분 및/또는 gRNA 분자 구성성분은 전기천공법에 의해 전달될 수 있다. 구현예에서, 핵산 분자는 TRAC 유전자, TRBC 유전자 또는 CAR 유전자를 암호화한다.
Cas9 분자를 암호화하는 RNA의 전달
Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질) 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 RNA는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포, 예를 들어 본 명세서에 기재된 표적 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9-암호화 및/또는 gRNA-암호화 RNA는, 예를 들어 미량주사법, 전기천공법, 일시적 세포 압축 또는 짜내기(squeezing)(예를 들어, 문헌[Lee, et al [2012] Nano Lett 12: 6322-27]에 기재된 바와 같음), 지질-매개 형질감염, 펩타이드-매개 전달 또는 이들의 조합에 의해 전달될 수 있다.
구현예에서, 전기천공법을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질) 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 RNA와 세포를 혼합하는 것 및 정해진 지속기간 및 진폭의 하나 이상의 전기적 임펄스를 적용하는 것을 포함한다. 구현예에서, 전기천공법을 통한 전달은 혼합물을 카트리지, 챔버 또는 큐벳 내로 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)와 연결된 용기에서 세포가 Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질) 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 RNA와 혼합되는 시스템을 이용하여 수행되되, 정해진 지속기간 및 진폭의 하나 이상의 전기적 임펄스는 세포가 제2 용기에 전달된 후에 적용된다.
Cas9 분자 단백질의 전달
Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질)는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9 단백질 분자는, 예를 들어 미량주사법, 전기천공법, 일시적 세포 압축 또는 짜내기(예를 들어, 문헌[Lee, et al [2012] Nano Lett 12: 6322-27]에 기재된 바와 같음), 지질-매개 형질감염, 펩타이드-매개 전달 또는 이들의 조합에 의해 전달될 수 있다. 전달은 gRNA를 암호화하는 DNA 또는 gRNA에 의해 수행될 수 있다.
구현예에서, 전기천공법을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 gRNA 분자와 함께 또는 gRNA 분자 없이 세포를 Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질)와 혼합하는 것 및 정해진 지속기간 및 진폭의 하나 이상의 전기적 임펄스를 적용하는 것을 포함한다. 구현예에서, 전기천공법을 통한 전달은 혼합물을 카트리지, 챔버 또는 큐벳 내로 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)와 연결된 용기에서 gRNA 분자와 함께 또는 gRNA 분자 없이 세포가 Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질)와 혼합되는 시스템을 이용하여 수행되되, 정해진 지속기간 및 진폭의 하나 이상의 전기적 임펄스는 세포가 제2 용기에 전달된 후에 적용된다.
VIII.변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 및 핵산
변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 핵산, 예를 들어 특히 gRNA뿐만 아니라 RNA의 기타 다른 형태, 예를 들어 mRNA, RNAi, 또는 siRNA에 존재할 수 있다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, "뉴클레오사이드"는 5탄당 분자(펜토즈 또는 리보스) 또는 이의 유도체, 및 유기 염기, 퓨린 또는 피리미딘, 또는 이의 유도체를 포함하는 화합물로서 정의된다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, "뉴클레오타이드"는 포스페이트기를 추가로 포함하는 뉴클레오사이드로서 정의된다.
변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) 포스포디에스테르 백본 연결에서 비결합 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 결합 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어 대체;
(ii) 리보스 당, 예를 들어 리보스 당에서 2' 하이드록실의 구성성분의 변경, 예를 들어 대체;
(iii) "데포스포" 링커를 지니는 포스페이트 모이어티의 대량 대체;
(iv) 천연 유래 핵염기의 변형 또는 대체;
(v) 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형;
(vi) 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어 말단 포스페이트 기의 제거, 변형 또는 대체, 또는 모이어티의 컨쥬게이션; 및
(vii) 당의 변형.
상기 열거된 변형은 조합되어 2 개, 3 개, 4 개 이상의 변형을 가질 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 제공할 수 있다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 구현예에서, gRNA의 모든 염기는 변형되어 있으며, 예를 들어 모든 염기는 변형된 포스페이트기를 가지고, 예를 들어 모든 변형된 포스페이트기는 포스포로티오에이트기이다. 구현예에서, 단분자 또는 모듈 gRNA 분자의 포스페이트기의 전부, 또는 실질적으로 전부는 포스포로티오에이트기로 대체된다.
구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형을 가지는 뉴클레오타이드는, 핵산, 예를 들어 "변형된 핵산"으로 포함된다. 일부 구현예에서, 변형된 핵산은 1 개, 2 개, 3 개 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 핵산에서 위치의 적어도 5%(예를 들어, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%)가 변형된 뉴클레오타이드이다.
변형되지 않은 핵산은, 예를 들어 세포 뉴클레아제에 의해 분해되는 경향이 있을 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 핵산은 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하여, 예를 들어 뉴클레아제에 대하여 안정성을 도입할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오사이드, 변형된 뉴클레오타이드, 및 변형된 핵산은, 세포의 집단으로 도입될 때, 감소된 선천성 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 "선천성 면역 반응"은, 일반적으로 바이러스 또는 박테리아 기원의 단일 가닥 핵산을 포함하여 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함하며, 이는 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론의 도입, 및 세포 사멸을 수반한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오사이드, 변형된 뉴클레오타이드, 및 변형된 핵산은 파트너와 핵산이 상호작용하는 주홈의 결합을 방해할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오사이드, 변형된 뉴클레오타이드, 및 변형된 핵산은, 세포의 집단으로 도입될 때, 감소된 선천성 면역 반응을 나타낼 수 있으며, 또한 파트너와 핵산이 상호작용하는 주홈의 결합을 방해할 수 있다.
화학적 기의 정의
본 명세서에서 사용되는 "알킬"은 직쇄 또는 분지형인 포화 탄화수소기를 말하는 것으로 의미된다. 알킬기의 예는 메틸(Me), 에틸(Et), 프로필(예를 들어, n-프로필 및 이소프로필), 부틸(예를 들어, n-부틸, 이소부틸, t-부틸), 펜틸(예를 들어, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸) 등을 포함한다. 알킬기는 1 개 내지 약 20 개, 2 개 내지 약 20 개, 1 개 내지 약 12 개, 1 개 내지 약 8 개, 1 개 내지 약 6 개, 1 개 내지 약 4 개, 또는 1 개 내지 약 3 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "아릴"은 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭(예를 들어, 2 개, 3 개 또는 4 개의 융합된 고리를 가짐) 방향족 탄화수소, 예를 들어 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 페난트레닐, 인다닐, 인데닐 등을 말한다. 일부 구현예에서, 아릴기는 6 개 내지 약 20 개의 탄소 원자를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 "알케닐"은 적어도 1 개의 이중 결합을 포함하는 지방족 기를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "알키닐"은 2 개 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하고, 하나 이상의 삼중 결합을 가지는 것을 특징으로 하는 직선 또는 분지형 탄화수소 사슬을 말한다. 알키닐 기의 예는 에티닐, 프로파르길, 및 3-헥시닐을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 "아릴알킬" 또는 "아랄킬"은 알킬 수소 원자가 아릴기로 대체된 알킬 모이어티를 말한다. 아랄킬은 하나 초과의 수소 원자가 아릴기로 대체된 기를 포함한다. "아릴알킬" 또는 "아랄킬"의 예는 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필, 9-플루오레닐, 벤즈하이드릴, 및 트리틸기를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "사이클로알킬"은 2 개 내지 12 개의 탄소를 가지는 사이클릭, 비사이클릭, 트리사이클릭, 또는 폴리사이클릭 비방향족 탄화수소기를 말한다. 사이클로알킬 모이어티의 예는 사이클로프로필, 사이클로펜틸, 및 사이클로헥실을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 "헤테로사이클릴"은 헤테로사이클릭 고리계의 1가 라디칼을 말한다. 대표적인 헤테로사이클릴은 제한없이, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티에닐, 피롤리디닐, 피롤리도닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 디아제피닐, 옥사제피닐, 티아제피닐, 및 모르폴리닐을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "헤테로아릴"은 헤테로방향족 고리계의 1가 라디칼을 말한다. 헤테로아릴 모이어티의 예는 이미다졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 티아졸릴, 피롤릴, 푸라닐, 인돌릴, 티오페닐 피라졸릴, 피리디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 인돌리지닐, 퓨리닐, 나프티리디닐, 퀴놀릴, 및 프테리디닐을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
포스페이트 백본 변형
포스페이트기
일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드의 포스페이트기는 하나 이상의 산소를 상이한 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 추가로, 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어 변형된 핵산에 존재하는 변형된 뉴클레오타이드는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 포스페이트로 비변형 포스페이트 모이어티를 대량 대체하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포스페이트 백본의 변형은 비하전된 링커 또는 하전된 링커 중 어느 하나가 비대칭 전하 분포를 갖도록 하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 일부 구현예에서, 포스페이트 백본 모이어티에서 비가교 포스페이트 산소 원자 중 하나는 다음의 기 중 임의의 것으로 대체될 수 있다: 황(S), 셀레늄(Se), BR3(여기서, R은, 예를 들어 수소, 알킬, 또는 아릴일 수 있음), C(예를 들어, 알킬기, 아릴기 등), H, NR2(여기서, R은, 예를 들어 수소, 알킬, 또는 아릴일 수 있음), 또는 OR(여기서, R은, 예를 들어 알킬 또는 아릴일 수 있음). 비변형 포스페이트기에서 인 원자는 아키랄이다. 그러나, 상기 원자 또는 원자 그룹 중 하나로 비가교 산소 중 하나를 대체하는 것은 인 원자를 키랄로 만들 수 있으며; 다시 말하면 이러한 방식으로 변형된 포스페이트기에서 인 원자가 입체 중심이다. 입체발생 인 원자는 "R" 배열(본 명세서에서는 Rp) 또는 "S" 배열(본 명세서에서는 Sp)을 가질 수 있다.
포스포로디티오에이트는 비가교 산소 둘 다 황으로 대체된다. 포스포로디티오에이트에서 인 중심은 올리고리보뉴클레오타이드 부분입체이성질체의 형성을 불가능하게 하는 아키랄이다. 일부 구현예에서, 비가교 산소 하나 또는 둘 다의 변형은 또한 S, Se, B, C, H, N, 및 OR(R은, 예를 들어 알킬 또는 아릴일 수 있음)로부터 독립적으로 선택되는 기로 비가교 산소를 대체하는 것을 포함할 수 있다.
포스페이트 링커는 또한 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌포스포네이트)로 가교 산소(즉, 뉴클레오사이드에 포스페이트를 연결하는 산소)를 대체함으로써 변형될 수 있다. 대체는 연결 산소 중 어느 하나 또는 연결 산소의 둘 다에서 일어날 수 있다.
포스페이트기의 대체
포스페이트기는 비-인 함유 커넥터(non-phosphrous containing connector)에 의해 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 하전 포스페이트기는 중성 모이어티로 대체될 수 있다.
포스페이트기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는, 예를 들어 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸렌하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
리보포스페이트 백본의 대체
포스페이트 링커 및 리보스 당이 뉴클레아제 내성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 대용물로 대체되는, 핵산을 모사할 수 있는 스캐폴드가 또한 구현될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는 대용물 백본에 의해 테터링될 수 있다. 예는, 제한없이, 모르폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘 및 펩타이드 핵산(PNA) 뉴클레오사이드 대용물을 포함할 수 있다.
당 변형
변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 당기에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실기(OH)는 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 대체되거나 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 하이드록실은 더 이상 탈양자화되지 않아 2'-알콕사이드 이온을 형성할 수 있으므로, 2' 하이드록실기에의 변형은 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있다. 2'-알콕사이드는 링커 인 원자 상에서 분자내 친핵성 공격에 의한 분해를 촉진시킬 수 있다.
"옥시"-2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 여기서 "R"은, 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음); 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR(여기서, R은, 예를 들어 H 또는 선택적으로 치환된 알킬일 수 있고, n은 0 내지 20(예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)의 정수일 수 있음)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, "옥시"-2' 하이드록실기 변형은 "잠금(locked)" 핵산(LAN)을 포함할 수 있으며, 여기서 2' 하이드록실은, 예를 들어 C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브릿지에 의해, 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있으며, 여기서 예시적인 브릿지는 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 또는 아미노 브릿지; O-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노) 및 아미노알콕시, O(CH2)n-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, "옥시"-2' 하이드록실기 변형은 메톡시에틸기(MOE)(OCH2CH2OCH3, 예를 들어 PEG 유도체)를 포함할 수 있다.
"데옥시" 변형은 수소(즉, 데옥시리보스 당, 예를 들어 부분적으로 ds RNA의 돌출된 부분에서); 할로(예를 들어, 브로모, 클로로, 플루오로, 또는 요오도); 아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디아킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같을 수 있음), -NHC(O)R(여기서, R은, 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 시아노; 메르캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시시; 및 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어 본 명세서에 기재된 아미노로 선택적으로 치환될 수 있다.
당기는 또한 리보스 중 상응하는 탄소와 반대의 위치화학 배열을 가지는 하나 이상의 탄소를 포함할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은, 당으로서 예를 들어 아라비노스를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 "단량체"는 당의 1' 위치에서 알파 연결, 예를 들어 알파-뉴클레오사이드를 가질 수 있다. 변형된 핵산은 또한 "비염기성" 당을 포함할 수 있으며, 상기 비염기성 당은 C-1'에서 핵염기가 없다. 이러한 비염기성 당은 또한 구성하는 당 원자 중 하나 이상에서 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 L 형태인 하나 이상의 당, 예를 들어 L-뉴클레오사이드를 포함할 수 있다.
일반적으로, RNA는 당기 리보스를 포함하며, 당기 리보스는 산소를 가지는 5-원 고리이다. 예시적인 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오사이드는 제한없이 리보스 중 산소의 (예를 들어, 황(S), 셀레늄(Se), 또는 알킬렌, 예를 들어 메틸렌 또는 에틸렌으로의) 대체;이중 결합의 첨가(예를 들어, 리보스를 사이클로펜테닐 또는 사이클로헥세닐로 대체); 리보스의 고리 축소(예를 들어, 사이클로부탄 또는 옥세탄의 4-원 고리 형성); 리보스의 고리 확장(예를 들어, 추가적인 탄소 또는 헤테로원자를 가지는 6원- 또는 7-원 고리, 예를 들어 안하이드로헥시톨, 알트리톨, 만니톨, 사이클로헥사닐, 사이클로헥세닐, 및 모르폴리노(이는 또한 포스포르아미데이트 백본을 가짐) 형성)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 멀티사이클릭 형태(예를 들어, 트리사이클로); 및 "비잠금(unlocked)" 형태, 예컨대 글리콜 핵산(GNA)(예를 들어, R-GNA 또는 S-GNA, 여기서 리보스는 포스포디에스테르 결합에 부착된 글리콜 단위에 의해 대체됨), 트레오스 핵산(TNA, 여기서 리보스는 α-L-트레오푸르노실-(3'→2')로 대체됨)을 포함할 수 있다.
핵염기 상의 변형
변형된 핵산으로 포함될 수 있는, 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는, 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예는 아데신(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 및 우라실(U)을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 이들 핵염기는 변형되거나 완전히 대체되어 변형된 핵산에 포함될 수 있는 변형된 뉴클로오타이드 및 변형된 뉴클레오사이드를 제공할 수 있다. 뉴클레오타이드의 핵염기는 퓨린, 피리미딘, 퓨린 또는 피리미딘 유사체로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는, 예를들어 자연-생성되고 합성된 염기의 유도체를 포함할 수 있다.
우라실
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 우라실이다. 변형된 우라실을 가지는 예시적인 뉴클레오사이드 및 핵염기는 제한없이, 슈도우리딘(ψ), 피리딘-4-온 리보뉴클레오사이드, 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘(s2U), 4-티오-우리딘(s4U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘(ho5U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘(예를 들어, 5-요오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 3-메틸-우리딘(m3U), 5-메톡시-우리딘(mo5U), 우리딘 5-옥시아세트산(cmo5U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르(mcmo5U), 5-카르복시메틸-우리딘(cm5U), 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘(chm5U), 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르(mchm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-우리딘(mcm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오-우리딘(mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘(nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-우리딘(mnm5U), 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘(mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘(mnm5se2U), 5-카르바모일메틸-우리딘(ncm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-우리딘(cmnm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘(cmnm 5s2U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-우리딘(τcm5U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘(τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘, 5-메틸-우리딘(m5U, 즉 핵염기 데옥시티민을 가짐), 1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸-2-티오-우리딘(m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘(m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘(m3ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘(D), 디하이드로슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 5-메틸-디하이드로우리딘(m5D), 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘(acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘(acp3ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘(inm5U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘(inm5s2U), α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘(Um), 5,2'-O-디메틸-우리딘(m5Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘(ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘(s2Um), 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘(mcm 5Um), 5-카르바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘(ncm 5Um), 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘(cmnm 5Um), 3,2'-O-디메틸-우리딘(m3Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘(inm 5Um), 1-티오-우리딘, 디옥시티미딘, 2'-F-아라-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-아라-우리딘, 5-(2-카보메톡시비닐) 우리딘, 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)우리딘, 피라졸로[3,4-d]피리미딘, 잔틴, 및 하이포잔틴을 포함한다.
사이토신
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 사이토신이다. 변형된 사이토신을 가지는 예시적인 뉴클레오사이드 및 핵염기는 제한없이, 5-아자-사이티딘, 6-아자-사이티딘, 슈도이소사이티딘, 3-메틸-사이티딘(m3C), N4-아세틸-사이티딘(act), 5-포르밀-사이티딘(f5C), N4-메틸-사이티딘(m4C), 5-메틸-사이티딘(m5C), 5-할로-사이티딘(예를 들어, 5-요오도-사이티딘), 5-하이드록시메틸-사이티딘(hm5C), 1-메틸-슈도이소사이티딘, 피롤로-사이티딘, 피롤로-슈도이소사이티딘, 2-티오-사이티딘(s2C), 2-티오-5-메틸-사이티딘, 4-티오-슈도이소사이티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소사이티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소사이티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소사이티딘, 제부라린, 5-아자-제부라린, 5-메틸-제부라린, 5-아자-2-티오-제부라린, 2-티오-제부라린, 2-메톡시-사이티딘, 2-메톡시-5-메틸-사이티딘, 4-메톡시-슈도이소사이티딘, 4-메톡시-1-메틸-슈도이소사이티딘, 라이시딘(k2C), α-티오-사이티딘, 2'-O-메틸-사이티딘(Cm), 5,2'-O-디메틸-사이티딘(m5Cm), N4-아세틸-2'-O-메틸-사이티딘(ac4Cm), N4,2'-O-디메틸-사이티딘(m4Cm), 5-포르밀-2'-O-메틸-사이티딘(f 5Cm), N4,N4,2'-O-트리메틸-사이티딘(m4 2Cm), 1-티오-사이티딘, 2'-F-아라-사이티딘, 2'-F-사이티딘, 및 2'-OH-아라-사이티딘을 포함한다.
아데닌
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 아데닌이다. 변형된 아데닌을 가지는 예시적인 뉴클레오사이드 및 핵염기는, 제한없이, 2-아미노-퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노-6-할로-퓨린(예를 들어, 2-아미노-6-클로로-퓨린), 6-할로-퓨린(예를 들어, 6-클로로-퓨린), 2-아미노-6-메틸-퓨린, 8-아지도-아데노신, 7-데아자-아데노신, 7-데아자-8-아자-아데노신, 7-데아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-아데노신(m1A), 2-메틸-아데노신(m2A), N6-메틸-아데노신(m6A), 2-메틸티오-N6-메틸-아데노신(ms2m6A), N6-이소펜테닐-아데노신(i6A), 2-메틸티오-N6-이소펜테닐-아데노신(ms2i6A), N6-(cis-하이드록시이소펜테닐)아데노신(io6A), 2-메틸티오-N6-(cis-하이드록시이소펜테닐)아데노신(ms2io6A), N6-글리시닐카바모일-아데노신(g6A), N6-트레오닐카바모일-아데노신(t6A), N6-메틸-N6-트레오닐카바모일-아데노신(m6t6A), 2-메틸티오-N6-트레오닐카바모일-아데노신(ms2g6A), N6,N6-디메틸-아데노신(m6 2A), N6-하이드록시노르발릴카바모일-아데노신(hn6A), 2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴카바모일-아데노신(ms2hn6A), N6-아세틸-아데노신(ac6A), 7-메틸-아데노신, 2-메틸티오-아데노신, 2-메톡시-아데노신, α-티오-아데노신, 2'-O-메틸-아데노신(Am), N6,2'-O-디메틸-아데노신(m6Am), N6-메틸-2'-데옥시아데노신, N6,N6,2'-O-트리메틸-아데노신(m6 2Am), 1,2'-O-디메틸-아데노신(m1Am), 2'-O-리보실아데노신(포스페이트)(Ar(p)), 2-아미노-N6-메틸-퓨린, 1-티오-아데노신, 8-아지도-아데노신, 2'-F-아라-아데노신, 2'-F-아데노신, 2'-OH-아라-아데노신, 및 N6-(19-아미노-펜타옥사논아데실)-아데노신을 포함한다.
구아닌
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 구아닌이다. 변형된 구아닌을 가지는 예시적인 뉴클레오사이드 및 핵염기는 제한없이, 이노신(I), 1-메틸-이노신(m1I), 와이오신(imG), 메틸와이오신(mimG), 4-데메틸-와이오신(imG-14), 이소와이오신(imG2), 와이부토신(yW), per옥시와이부토신(o2yW), 하이드록시와이부토신(OHyW), 저변형 하이드록시와이부토신(OHyW*), 7-데아자-구아노신, 케오신 (Q), 에폭케오신(oQ), 갈락토실-케오신(galQ), 만노실-케오신(manQ), 7-시아노-7-데아자-구아노신(preQ0), 7-아미노메틸-7-데아자-구아노신(preQ1), 아케오신(G+), 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신(m7G), 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸-이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸-구아노신(m'G), N2-메틸-구아노신(m2G), N2,N2-디메틸-구아노신(m2 2G), N2,7-디메틸-구아노신(m2,7G), N2, N2,7-디메틸-구아노신(m2,2,7G), 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신, α-티오-구아노신, 2'-O-메틸-구아노신(Gm), N2-메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2Gm), N2,N2-디메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2 2Gm), 1-메틸-2'-O-메틸-구아노신(m'Gm), N2,7-디메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2,7Gm), 2'-O-메틸-이노신(Im), 1,2'-O-디메틸-이노신(m'Im), O6-페닐-2'-디옥시이노신, 2'-O-리보실구아노신(포스페이트)(Gr(p)), 1-티오-구아노신, O6-메틸-구아노신, O6-메틸-2'-데옥시구아노신, 2'-F-아라-구아노신, 및 2'-F-구아노신을 포함한다.
예시적인 변형된 gRNA
일부 구현예에서, 변형된 핵산은 변형된 gRNA일 수 있다. 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32으로부터의 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA를 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 gRNA는 본 부문에 따라 변형될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에 논의된 바와 같은, 일시적으로 발현된 또는 전달된 핵산은, 예를 들어 세포의 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉬울 수 있다. 따라서, 일 양상에서, 본 명세서에 기재된 변형된 gRNA는 뉴클레아제에 안정성을 도입한 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 본 명세서에 기재된 특정 변형된 gRNA는 특정 세포, 특히 본 발명의 세포(예를 들어, T 세포)로부터의 감소된 선천성 면역 반응을 유발할 수 있다. 상기 주목한 바와 같은 용어 "선천성 면역 반응"은 사이토카인 발현의 유도를 수반하고, 특히 인터페론 및 세포사를 방출하는 일반적으로 바이러스 또는 박테리아 유래의 단일 가닥 핵산을 포함하는 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함한다.
예를 들어, 본 명세서에서 논의한 바와 같이, 본 발명자들은 gRNA의 5' 말단이 진핵생물 mRNA 캡 구조 또는 캡 유사체의 포함에 의해 변형될 때, 특정 세포 유형(예를 들어, T 세포)에서 유전자의 생체외 편집에서의 개선을 알 수 있었다. 본 발명은 5' 캡핑 gRNA에 의해 관찰된 개선이 동일한 유형의 구조적 또는 기능성 결과를 달성하기 위한 기타 다른 방법에서(예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 포함에 의해, 3' 폴리A 트랙의 포함에 의해 및/또는 시험관내 전사 gRNA가 5' 트리포스페이트기를 제거하기 위해 송아지 장 알칼리성 포스파타제와 같은 포스파타제에 의한 처리에 의해 변형될 때) 변형된 gRNA로 연장될 수 있다는 인식을 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 gRNA가 그들의 5' 말단에서 또는 근처에서(예를 들어, 그들의 5' 말단의 1 내지 10, 1 내지 5, 또는 1 내지 2 개의 뉴클레오타이드 내에서) 변형되는 방법 및 조성물을 제공한다. 구현예에서, gRNA의 5' 말단은 도 19에 도시되는 바와 같은 진핵생물 mRNA 캡 구조 또는 캡 유사체 (예를 들어, G(5')ppp(5')G 캡 유사체, m7G(5')ppp(5')G 캡 유사체, 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G 안티 리버스 캡 유사체 (ARCA))의 포함에 의해 변형된다. 캡 또는 캡 유사체는 gRNA의 화학적 합성 또는 시험관내 전사 동안 포함될 수 있다. 구현예에서, 시험관내 전사 gRNA는 5' 트리포스페이트기를 제거하기 위해 포스파타제(예를 들어, 송아지 장 알칼리성 포스파타제)에 의한 처리에 의해 변형된다.
일부 구현예에서, gRNA는 그의 3; 말단에서 또는 근처에서(예를 들어, 그들의 3' 말단의 1 개 내지 10 개, 1 개 내지 5 개, 또는 1 개 내지 2 개의 뉴클레오타이드 내에서) 변형을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, gRNA의 3' 말단은 하나 이상의 (예를 들어, 25 내지 200) 아데닌(A) 잔기의 첨가에 의해 변형된다. 폴리A 트랙은 gRNA를 암호화하는 핵산(예를 들어, 플라스미드, PCR 산물, 바이러스 게놈)에 함유될 수 있거나, 또는 화학적 합성 동안 또는 폴리아데노신 중합효소(예를 들어, 이콜라이 폴리(A)중합효소)를 이용하는 시험관내 전사 후에 gRNA에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 3' 말단의 U 리보스에서 변형될 수 있다. 예를 들어, U 리보스의 2 개의 말단의 하이드록실 기는 알데하이드기로 산화될 수 있고, 동시에 리보스 고리를 개방하여 이하에 나타내는 바와 같은 변형된 뉴클레오사이드를 얻을 수 있다:
식 중, "U"는 비변형 또는 변형된 유리딘일 수 있다. 다른 구현예에서, 3' 말단의 U는 이하에 나타내는 바와 같은 2'3' 사이클릭 포스페이트에 의해 변형될 수 있다:
식 중, "U"는 비변형 또는 변형된 유리딘일 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA 분자는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 혼입함으로써, 분해에 대해 안정화될 수 있는 3' 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 이 구현예에서, 예를 들어 유리딘은 변형된 유리딘, 예를 들어 5-(2-아미노)프로필 유리딘, 및 5-브로모 유리딘으로, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 변형된 유리딘으로 대체될 수 있고; 아데노신 및 구아노신은 변형된 아데노신 및 구아노신으로, 예를 들어 8-위치에서의 변형, 예를 들어 8-브로모 구아노신, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 변형된 아데노신 또는 구아노신으로 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, gRNA는 그의 5'에서 또는 근처에서의 변형과 그의 3'에서 또는 근처에서의 변형을 둘 다 포함한다. 구현예에서, 시험관내 전사 gRNA는 5' 캡 구조 또는 캡 유사체와 3' 폴리A 트랙을 둘 다 함유한다. 구현예에서, 시험관내 전사 gRNA는 포스파타제(예를 들어, 송아지 장 알칼리성 포스파타제)에 의한 처리에 의해 변형되어 5' 트리포스페이트기를 제거하고, 3' 폴리A 트랙을 포함한다.
앞의 언급은 말단 변형에 중점을 두었지만, 본 명세서에서 논의되는 방법 및 조성물은 gRNA 서열 내의 하나 이상의 비-말단 위치 및/또는 하나 이상의 말단 위치에서 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 gRNA를 이용할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, 당 변형 리보뉴클레오타이드는 gRNA 내로 혼입될 수 있되, 예를 들어 2' OH-기는 H, -OR, -R(여기서, R은, 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 할로, -SH, -SR(여기서, R은, 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); 또는 사이아노(-CN)로부터 선택되는 기에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 포스페이트 백본은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어 포스포티오에이트기로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 각각 독립적으로, 예를 들어 2'-F 또는 2'-O-메틸, 아데노신(A), 2'-F 또는 2'-O-메틸, 시티딘(C), 2'-F 또는 2'-O-메틸, 유리딘(U), 2'-F 또는 2'-O-메틸, 티미딘(T), 2'-F 또는 2'-O-메틸, 구아노신(G), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸유리딘(Teo), 2'-O-메톡시에틸아데노신(Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸시티딘(m5Ceo) 및 이들의 임의의 조합을 포함하는, 2'-당 변형, 예컨대, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 또는 2'-플루오로 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 변형 또는 비변형된 뉴클레오타이드일 수 있다.
일부 구현예에서, gRNA는 "잠긴" 핵산(LNA)일 수 있으며, 이때 2' OH-기는, 예를 들어 C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브릿지에 의해 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있으며, 여기서 예시적인 브릿지는 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 또는 아미노 브릿지; O-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음) 및 아미노알콕시 또는 O(CH2)n-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, gRNA는 멀티사이클릭(예를 들어, 트리사이클로; 및 "비잠금" 형태, 예컨대 글리콜 핵산(GNA)(예를 들어, R-GNA 또는 S-GNA, 여기서, 리보스는 포스포디에스테르 결합에 부착된 글리콜 단위로 대체됨), 또는 트레오스 핵산(TNA, 여기서, 리보스는 α-L-트레오푸라노실-(3'→2')로 대체됨)인 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일반적으로, gRNA 분자는 산소를 갖는 5-원 고리인 당기 리보스를 포함한다. 예시적인 변형된 gRNA는 리보스에서의 산소의 치환(예를 들어, 황(S), 셀레늄(Se) 또는 알킬렌, 예를 들어 메틸렌 또는 에틸렌); 이중결합의 첨가(예를 들어, 리보스의 사이클로펜텐일 또는 사이클로헥센일로의 치환); 리보스의 고리 수축(예를 들어, 사이클로부탄 또는 옥세탄의 4원 고리 형성); 리보스의 고리 확장(예를 들어, 추가적인 탄소 또는 헤테로원자를 갖는 6 또는 7원 고리, 예를 들어 또한 포스포르아미데이트 백본을 갖는무수헥시톨, 알트리톨, 만니톨, 사이클로헥산일, 사이클로헥센일 및 몰폴리노의 형성)을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 대다수의 당 유사체 변경은 2' 위치로 국소화되지만, 기타 다른 부위가 4' 위치를 포함하는 변형을 할 수 있다. 구현예에서, gRNA는 4'-S, 4'-Se 또는 4'-C-아미노메틸-2'-O-Me 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 데아자 뉴클레오타이드, 예를 들어 7-데아자-아데노신은 gRNA 내로 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, O- 및 N-알킬화된 뉴클레오타이드, 예를 들어 N6-메틸 아데노신은 gRNA 내로 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA 분자 내 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 모두는 데옥시뉴클레오타이드이다.
miRNA 결합 부위
마이크로RNA(또는 miRNA)는 천연 유래 세포의 19 내지 25 개 뉴클레오타이드 길이 비암호 RNA이다. 그들은, 예를 들어 mRNA의 3' UTR에서 적절한 miRNA 결합 부위를 갖는 핵산 분자에 결합하고, 유전자 발현을 하향조절한다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 하향 조절은 핵산 분자 안정성을 감소시키거나 또는 번역을 저해하는 것에 의한다는 것이 여겨진다. 본 명세서에 개시된 RNA 종, 예를 들어 Cas9를 암호화하는 mRNA는, 예를 들어 그의 3'UTR에서 miRNA 결합 부위를 포함할 수 있다.miRNA 결합 부위는 선택되는 세포 유형에서의 발현의 하향 조절을 촉진시키기 위해 선택될 수 있다. 예로서, 간에서 흔한 마이크로RNA인 miR-122에 대한 결합 부위의 혼입은 간에서 관심대상의 유전자의 발현을 저해할 수 있다.
XI. Cas9 시스템의 활성을 제한하기 위한 지배적인 gRNA 분자 및 이의 용도
Cas9 분자 또는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산, 예를 들어 DNA를 사용하거나 또는 포함하는 방법 및 조성물은 추가로 "지배적인 gRNA 분자"를 이용하거나 또는 포함할 수 있다. 지배적인 gRNA는 세포 또는 대상체 내로 도입된 기타 다른 CRISPR/Cas 구성성분의 활성을 제한할 수 있다. 구현예에서, gRNA 분자는 세포 또는 대상체 내로 도입된 CRISPR/Cas 시스템의 구성성분을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 상의 표적 도메인에 상보성인 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 (a) Cas9 분자를 암호화하는 핵산 상에서; (b) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는TRBC 유전자(표적 유전자 gRNA)를 표적화하는 표적화 도메인을 포함하는 gRNA를 암호화하는 핵산 상에서; 또는 CRISPR/Cas 구성성분, 예를 들어 (a)와 (b) 둘 다를 암호화하는 하나 초과의 핵산 상에서 표적 서열과 상보성인 표적화 도메인을 포함한다. 지배적인 gRNA 분자는 시스템의 구성성분을 비활성화하도록 Cas9 분자와 복합체화될 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자/지배적인 gRNA 분자 복합체는 Cas9 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 비활성화한다. 구현예에서, Cas9 분자/지배적인 gRNA 분자 복합체는 표적 유전자 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 비활성화한다. 구현예에서, Cas9 분자/지배적인 gRNA 분자 복합체는 Cas9 분자/표적 유전자 gRNA 분자 복합체의활성에 대한일시적, 발현 수준 또는 다른 제한을 둔다. 구현예에서, Cas9 분자/지배적인 gRNA 분자 복합체는 오프-타겟 또는 기타 다른 원치않는 활성을 감소시킨다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 음성으로 조절될 CRISPR/Cas 시스템 구성성분에 대한 암호 서열 또는 제어 영역, 예를 들어 프로모터를 표적화한다. 예를 들어, 지배적인 gRNA는 Cas9 분자 암호 서열, 또는 둘 사이에 배치된 서열의 발현을 조절하는 Cas9 분자, 또는 제어 영역, 예를 들어 프로모터에 대한 암호 서열을 표적화할 수 있다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 표적 유전자 gRNA에 대한 암호 서열, 또는 제어 영역, 예를 들어 프로모터를 표적화한다. 구현예에서, 지배적인 gRNA, 예를 들어 Cas9-표적화 또는 표적 유전자 gRNA-표적화, 지배적인 gRNA 분자, 또는 그것을 암호화하는 핵산은 그것을 암호화하는 Cas9 분자 또는 핵산과 별도로, 예를 들어 이후에 도입된다. 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 벡터는 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 및 하나 이상의 표적 유전자 gRNA 분자를 도입할 수 있고, 제2 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 벡터는 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어 Cas9-표적화 또는 표적 유전자 gRNA 표적화, gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 도입할 수 있다. 구현예에서, 제2 벡터는 제1 벡터 다음에 도입될 수 있다. 다른 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어 Cas9-표적화 또는 표적 유전자 gRNA 표적화, 지배적인 gRNA 분자, 또는 그것을 암호화하는 핵산은 Cas9 분자 또는 그것을 암호화하는 핵산과 함께, 예를 들어 동시에 또는 동일한 벡터에서, 그러나, 예를 들어 후기에 활성화되는 전사 제어 구성요소, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서 하에서, 일정 시간 후에 Cas9의 전사가 감소되도록, 도입될 수 있다. 구현예에서, 전사 제어 구성요소는 본질적으로 활성화된다. 구현예에서, 전사 구성요소는 외부 트리거(trigger)의 도입을 통해 활성화된다.
통상적으로 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어 Cas9-표적화 gRNA 분자를 암호화하는 핵산은 부정적으로 조절하는 구성성분, 예를 들어 Cas9 분자를 암호화하는 핵산과 상이한 제어 영역, 예를 들어 프로모터의 제어 하에 있다. 구현예에서, "상이한 제어 영역"은 단순히, 제어된 서열 둘 다에 기능적으로 결합된 하나의 제어 영역, 예를 들어 프로모터의 제어 하에 있지 않음을 지칭한다. 구현예에서, 상이한은 종류 또는 유형이 "상이한 제어 영역"을 말한다. 예를 들어 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어 Cas9-표적화 gRNA 분자를 암호화하는 서열은 제어 영역, 예를 들어 부정적으로 조절되는 구성성분을 암호화하는 서열, 예를 들어 Cas9 분자를 암호화하는 핵산보다 더 낮은 수준으로 발현되거나, 상기 서열보다 이후에 발현되는 제어영역, 예를 들어 프로모터의 제어 하에 있다.
예로서, 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어 Cas9-표적화 gRNA 분자를 암호화하는 서열은, 본 명세서에 기재된 제어 영역(예를 들어, 프로모터), 예를 들어 인간 U6 소형 핵 프로모터, 또는 인간 H1 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 구현예에서, 부정적으로 조절하는 구성성분을 암호화하는 서열, 예를 들어 Cas9 분자를 암호화하는 핵산은 본 명세서에 기재된 제어 영역(예를 들어, 프로모터), 예를 들어,CMV, EF-1a, MSCV, PGK, CAG 제어 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 단지 예시적이며 본 발명의 범주 또는 내용을 임의의 방법으로 제한하는 것으로 의도하지 않는다.
실시예 1:gRNA의 클로닝 및 초기 선별
후보 gRNA의 적합성을 본 실시예에 기재하는 바와 같이 평가할 수 있다. 키메라 gRNA에 대해 기재하였지만, 모듈 gRNA를 평가하기 위한 접근을 또한 사용할 수 있다.
벡터 내로 gRNA의 클로닝
각각의 gRNA에 대해, 중복 올리고뉴클레오타이드의 쌍을 설계하고 얻는다. 올리고뉴클레오타이드를 어닐링하고, 상류의 U6 프로모터를 함유하는 분해된 벡터 백본 및 긴 키메라 gRNA의 남아있는 서열 내로 결찰시킨다. 플라스미드를 서열 확인하고, 충분한 양의 형질감염 품질 DNA를 생성하도록 준비한다. 대안의 프로모터를 사용하여 생체내 전사(예를 들어, H1 프로모터) 또는 시험관내 전사(예를 들어, T7 프로모터)를 유발할 수 있다.
선형 dsDNA 분자(STITCHR)에서 gRNA의 클로닝
각각의 gRNA에 대해, 단일 올리고뉴클레오타이드를 설계하고 얻는다. U6 프로모터 및 gRNA 스캐폴드(예를 들어 표적화 도메인, 예를 들어 crRNA 및 tracrRNA로부터 유래된 서열을 포함하는, 예를 들어 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는 표적화 도메인을 제외한 모든 것을 포함함)를 별도로 PCR 증폭시키고, dsDNA 분자로서 정제한다. gRNA-특이적 올리고뉴클레오타이드를 PCR 반응에서 사용하여 올리고뉴클레오타이드에서 구체화된 표적화 도메인에 의해 연결된 U6 및 gRNA 스캐폴드와 함께 봉합한다. 얻어진 dsDNA 분자(STITCHR 산물)를 형질감염을 위해 정제한다. 대안의 프로모터를 사용하여 생체내 전사(예를 들어, H1 프로모터) 또는 시험관내 전사(예를 들어, T7 프로모터)를 유발할 수 있다. 임의의 gRNA 스캐폴드를 사용하여 임의의 박테리아 종으로부터의 Cas9에 적합한 gRNA를 생성할 수 있다.
초기 gRNA 선별
시험할 각각의 gRNA를 Cas9를 발현시키는 플라스미드 및 소량의 GFP-발현 플라스미드와 함께 인간 세포 내로 형질감염시킨다. 예비 실험에서, 이들 세포는 불멸 인간 세포주, 예컨대 293T, K562 또는 U2OS일 수 있다. 대안적으로, 1차 인간 세포를 사용할 수 있다. 이 경우에, 세포를 종국적 치료 세포 표적(예를 들어, 적혈구 세포)에 적합할 수 있다. 점재적 치료 vywur 세포 집단과 유사한 1차 세포의 사용은 내인성 염색질 및 유전자 발현에서 유전자 표적률에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있다.
형질감염은 지질 형질감염(예컨대 리포펙타민 또는 퓨겐(Fugene))을 이용하여 또는 전기천공법(예컨대 론자 뉴클레오펙션(Lonza Nucleofection))에 의해 수행할 수 있다. 형질감염 후, GFP 발현은 형광 현미경에 의해 또는 유세포 분석에 의해 결정하여 일정한 그리고 고수준의 형질감염을 확인할 수 있다. 이들 예비 형질감염은 gRNA/gRNA의 조합이 가장 큰 활성을 제공한다는 것을 결정하기 위해 상이한 gRNA 및 상이한 표적화 접근(17량체, 20량체, 뉴클레아제, 이중-틈내기효소 등)을 포함할 수 있다.
각각의 gRNA에 의한 절단 효율을 T7E1-형 분석에 의해 또는 서열분석에 의해 표적 좌위에서 NHEJ-유도 삽입결실 형성을 측정함으로써 평가할 수 있다. 대안적으로, 기타 다른 미스매치-민감 효소, 예컨대 CelI/서베이어(Surveyor) 뉴클레아제를 또한 사용할 수 있다.
T7E1 분석을 위해, PCR 앰플리콘은 대략 500 bp 내지 700 bp이며, 의도된 절단 부위는 앰플리콘 내에서 비대칭적으로 위치된다. PCR 산물의 증폭, 정제 및 크기 확인 후에, 95℃까지 가열함으로써 DNA를 변성시키고, 재혼성화시키고, 이어서 서서히 냉각시킨다. 이어서, 혼성화된 PCR 산물을 완전하지 않게 매칭된 DNA를 인식하고 절단하는 T7 엔도뉴클레아제 I(또는 기타 다른 미스매치 민감 효소)로 분해시킨다. 삽입결실이 본래의 주형 DNA에 존재한다면, 앰플리콘이 변성되고 재어닐링될 때, 이는 상이한 삽입결실을 보유하는 DNA 가닥의 혼성화를 초래하며, 따라서,완전하게 매칭되지 않는 이중 가닥 DNA를 야기한다. 분해 산물은 겔전기영동에 의해 또는 모세관 전기영동에 의해 시각화할 수 있다. 절단된 DNA의 분획(절단된 산물의 밀도를 절단 및 비절단의 밀도로 나눔)을 다음의 식을 이용하여 NHEJ%를 추정하는 데 사용할 수 있다: %NHEJ = (1-(1-절단된 분획)1/2). T7E1 분석은 약 2% 내지 5% NHEJ에 이르기까지 민감하다.
T7E1 분석 대신에, 또는 추가로 서열분석을 사용할 수 있다. 생어(Sanger) 서열분석을 위해, 정제된 PCR 앰플리콘을 플라스미드 백본 내로 클로닝하고 나서, 형질전환시키고, 미니프렙하고 나서, 단일 프라이머를 이용하여 서열분석한다. T7E1에 의한 NHEJ 비율을 결정한 후에 삽입결실의 정확한 특성을 결정하기 위하여 생어 서열분석을 사용할 수 있다.
차세대 서열분석 기법을 이용하여 서열분석을 또한 수행할 수 있다. 차세대 서열분석을 이용할 때, 앰플리콘은 비대칭적으로 놓인 의도된 절단 부위를 지니고 300 bp 내지 500 bp일 수 있다. PCR 후에, 차세대 서열분석 어댑터 및 바코드(예를 들어, 일루미나 멀티플렉스 어댑터 및 지수(Illumina multiplex adapters and indexe))를 앰플리콘의 말단에, 예를 들어 고속대량 서열분석(예를 들어, Illumina MiSeq 상에서)에 첨가할 수 있다. 이 방법은 매우 낮은 NHEJ 비율의 검출을 가능하게 한다.
실시예 2: NHEJ에 의한 유전자 표적화의 평가
유전자 표적화 효율의 추가적인 평가를 위해 초기 시험에서 가장 큰 수준의 NHEJ를 유도하는 gRNA를 선택할 수 있다. 이 경우에, 세포는 질환 대상체로부터 유래되며, 따라서 적절한 돌연변이를 보유한다.
형질감염 후(보통 형질감염 후 2 일 내지 3 일), 게놈 DNA를 형질감염 세포의 큰 집단으로부터 단리시킬 수 있고, PCR을 사용하여 표적 영역을 증폭시킬 수 있다. PCR 후에, 목적으로 하는 돌연변이(표적 유전자의 넉아웃 또는 표적 서열 모티프의 제거)를 생성하는 유전자 표적화 효율을 서열분석에 의해 결정할 수 있다. 생어 서열분석을 위해, PCR 앰플리콘은 500 bp 내지 700 bp 길이일 수 있다. 차세대 서열분석을 위해, PCR 앰플리콘은 300 bp 내지 500 bp 길이일 수 있다. 목적이 유전자 기능의 넉아웃이라면, 서열분석을 이용하여 대립유전자의 백분율이 유전자 기능을 파괴하는 것으로 예상된 프레임시프트 또는 큰 결실 또는 삽입을 야기하는 NHEJ-유도 삽입결실을 겪은 대립유전자%를 평가할 수 있다. 목적이 특이적 서열 모티프를 제거하는 것이라면, 서열분석을 이용하여 이 서열에 걸쳐있는 NHEJ 유도 결실을 겪은 대립유전자%를 평가할 수 있다.
실시예 3: 293 세포에서 gRNA의 선별
T 세포 수용체 베타(TRBC)에 대한 gRNA의 선별
가장 높은 표적 상의 NHEJ 효율을 지니는 gRNA를 동정하기 위해, 42 개의 스트렙토코커스 피오게네스 및 27 개의 스타필로코커스 아우레우스 gRNA를 선택하였다(표 27). DNA 주형은 U6 프로모터를 포함하였고, gRNA 표적 영역 및 적절한 TRACR 서열(스트렙토코커스 피오게네스 또는 스타필로코커스 아우레우스)를 PCR STITCHR 반응에 의해 생성하였다. 이 DNA 주형을 후속적으로 CMV 프로모터의 하류의 적절한 Cas9(스트렙토코커스 피오게네스 또는 스타필로코커스 아우레우스)를 암호화하는 DNA 플라스미드와 함께 리포펙타민 3000을 이용하여 293 세포 내로 형질감염시켰다. 게놈 DNA를 형질감염후 48 시간 내지 72 시간에 세포로부터 단리시켰다. T 세포 수용체 베타 유전자(TRBC)에서 변형률을 결정하기 위해, 표적 영역을 표 28에 열거한 프라이머들을 이용한 좌위 PCR을 이용하여 증폭시켰다. PCR 증폭 후에, PCR 산물에 대해 T7E1 분석을 수행하였다. 간략하게 말하면, 이 분석은 PCR 산물의 용융 단계 이후 재어닐링 단계를 수반한다. 유전자 변형이 일어난 경우, 일부 삽입 또는 결실 빈도로 인해 완전히 매칭되지 않는 이중 가닥 산물이 존재할 것이다. 이들 이중 가닥 산물은 미스매치 부위에서 T7 엔도뉴클레아제 1 효소에 의한 절단에 민감하다. 따라서 T7E1 절단의 양을 분석함으로써 Cas9/gRNA 복합체에 의한 절단 효율을 결정하는 것이 가능하다. T7E1 절단으로부터 NHEJ%의 측정을 제공하기 위해 사용한 식은 다음과 같다: (100*(1-((1-(절단된 분획))^0.5))). 이 분석의 결과를 도 11 및 도 12에 나타낸다.
[표 27]
[표 28]
T 세포 수용체 알파(TRAC)에 대한 gRNA의 선별
가장 높은 표적 상의 NHEJ 효율을 지니는 gRNA를 동정하기 위해, 18 개의 스트렙토코커스 피오게네스 및 13 개의 스타필로코커스 아우레우스 gRNA를 선택하였다(표 29). DNA 주형은 U6 프로모터를 포함하였고, gRNA 표적 영역 및 적절한 TRACR 서열(스트렙토코커스 피오게네스 또는 스타필로코커스 아우레우스)를 PCR STITCHR 반응에 의해 생성하였다. 이 DNA 주형을 후속적으로 CMV 프로모터의 하류의 적절한 Cas9(스트렙토코커스 피오게네스 또는 스타필로코커스 아우레우스)를 암호화하는 DNA 플라스미드와 함께 리포펙타민 3000을 이용하여 293 세포 내로 형질감염시켰다. 게놈 DNA를 형질감염후 48 내지 72 시간에 세포로부터 단리시켰다. T 세포 수용체 알파 유전자(TRAC)에서 변형률을 결정하기 위해, 표적 영역을 표 30에 열거한 프라이를 이용하는 좌위 PCR을 이용하여 증폭시켰다. PCR 증폭 후에, PCR 산물에 대해 T7E1 분석을 수행하였다. 간략하게, 이 분석은 PCR 산물의 용융 다음에 재어닐링 단계를 수반한다. 유전자 변형이 일어난다면, 삽입 또는 결실의 일부 빈도에 기인하여 완전한 매칭이 아닌 이중 가닥 산물이 존재할 것이다. 이들 이중 가닥 산물은 미스매치 부위에서 T7 엔도뉴클레아제 1 효소에 의한 절단에 민감하다. 따라서 T7E1 절단의 양을 분석함으로써 Cas9/gRNA 복합체에 의한 절단 효율을 결정하는 것이 가능하다. T7E1 절단으로부터 NHEJ%의 측정을 제공하기 위해 사용한 식은 다음과 같다: (100*(1-((1-(절단된 분획))^0.5))). 이 분석의 결과를 도 13 및 도 14에 나타낸다.
[표 29]
[표 30]
PD-1 수용체에 대한 gRNA의 선별
가장 높은 표적 상의 NHEJ 효율을 지니는 gRNA를 동정하기 위해, 48 개의 스트렙토코커스 피오게네스 및 27 개의 스타필로코커스 아우레우스 gRNA를 선택하였다(표 31 및 표 32 참조). DNA 주형은 U6 프로모터를 포함하였고, gRNA 표적 영역 및 적절한 TRACR 서열(스트렙토코커스 피오게네스 또는 스타필로코커스 아우레우스)를 PCR STITCHR 반응에 의해 생성하였다. 이 DNA 주형을 후속적으로 CMV 프로모터의 하류의 적절한 Cas9(스트렙토코커스 피오게네스 또는 스타필로코커스 아우레우스)를 암호화하는 DNA 플라스미드와 함께 리포펙타민 3000을 이용하여 293 세포 내로 형질감염시켰다. 게놈 DNA를 형질감염후 48 내지 72 시간에 세포로부터 단리시켰다. PD-1 유전자(PDCD1)에서 변형률을 결정하기 위해, 표적 영역을 표 33에 열거한 프라이를 이용하는 좌위 PCR을 이용하여 증폭시켰다. PCR 증폭 후에, PCR 산물에 대해 T7E1 분석을 수행하였다. 간략하게, 이 분석은 PCR 산물의 용융 다음에 재어닐링 단계를 수반한다. 유전자 변형이 일어난다면, 삽입 또는 결실의 일부 빈도에 기인하여 완전한 매칭이 아닌 이중 가닥 산물이 존재할 것이다. 이들 이중 가닥 산물은 미스매치 부위에서T7 엔도뉴클레아제 1 효소에 의한 절단에 민감하다. 따라서 T7E1 절단의 양을 분석함으로써 Cas9/gRNA 복합체에 의한 절단 효율을 결정하는 것이 가능하다. T7E1 절단으로부터 NHEJ%의 측정을 제공하기 위해 사용한 식은 다음과 같다: (100*(1-((1-(절단된 분획))^0.5))). 표 31에 나타낸 gRNA에 대한 분석의 결과를 도 15 및 도 16에 나타낸다. 표 32에 나타낸 것을 포함하는 본 명세서에 기재된 기타 다른 gRNA를 이용하여 유사한 실험을 수행할 수 있다.
[표 31]
[표 32]
[표 33]
실시예 4: 1차 T 세포에 대한 gRNA의 효소적 합성 및 전달
RNA 분자로서 Cas9 mRNA 및 gRNA의 T 세포에 대한 전달
1차 CD4+ T 세포에서 Cas9-매개 절단을 결정하기 위해, TCR 베타쇄(TRBC-210 (GCGCUGACGAUCUGGGUGAC)(서열번호 413)) 또는 TCR 알파쇄(TRAC-4 (GCUGGUACACGGCAGGGUCA)(서열번호 453))에 대해 설계한 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 및 gRNA를 전기천공법을 통해 T 세포에 RNA 분자로서 전달하였다. 이 구현예에서, Cas9와 gRNA는 둘 다 T7 중합효소를 이용하여 시험관내로 전사시켰다. 5' ARCA 캡을 전사와 동시에 RNA 종 둘 다에 첨가한 반면, 폴리A 꼬리를 이콜라이 폴리A 중합효소에 의한 RNA 종의 3' 말단에 대한 전사 후에 첨가하였다. TRBC1 및 TRBC2 좌위에서 변형된 CD4+ T 세포를 생성하기 위해, 10 ㎍의 Cas9 mRNA 및 10 ㎍의 TRBC-210(GCGCUGACGAUCUGGGUGAC)(서열번호 413) gRNA를 전기천공법에 의해 세포에 도입하였다. 동일한 실험에서, 본 발명자들은 또한 10 ㎍의 TRAC-4(GCUGGUACACGGCAGGGUCA)(서열번호 453) gRNA와 함께 10 ㎍의 Cas9 mRNA를 도입함으로써TRAC 유전자를 표적화하였다. AAVS1 (GUCCCCUCCACCCCACAGUG)(서열번호 51201) 게놈 부위를 표적화하는 gRNA를 실험 대조군으로서 사용하였다. 전기천공법 전에, T 세포를 10% FBS 및 재조합 IL-2로 보충한 RPMI 1640에서 배양시켰다. 세포를 CD3/CD28 비드를 이용하여 활성화시키고, 적어도 3 일 동안 확장시켰다. 활성화된 T 세포에 대한 mRNA의 도입에 후속적으로, 세포에 대한 CD3 발현을 CD3에 특이적인 플루오레세인(APC) 컨쥬게이팅 항체를 이용하는 유세포분석에 의해 전기천공법 후 24 시간, 48 시간 및 72 시간에 모니터링하였다. 72 시간에, CD3 음성 세포 집단을 관찰하였다(도 17a 및 도 17b). CD3 음성 세포의 생성이 TRBC 좌위에서 게놈 편집의 결과였다는 것을 확인하기 위해, 게놈 DNA를 채취하고, T7E1 분석을 수행하였다. 사실, 데이터는 TRBC2 좌위 및 TRAC 좌위에서 DNA 변형의 존재를 확인한다(도 17C).
T 세포에 대한 Cas9/gRNA RNP의 전달
저캇 T 세포에서 Cas9-매개 절단을 결정하기 위해, TCR 알파 쇄(TRAC-233(GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA)(서열번호 474))에 대해 설계한 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 및 gRNA를 전기천공법에 의해리보핵산 단백질 복합체(RNP)로서 전달하였다. 이 구현예에서, Cas9를 이콜라이에서 발현시키고, 정제하였다. 구체적으로, Cas9를 암호화하는 HJ29 플라스미드를 Rosetta™ 2(DE3) 화학적 적격 세포(EMD Millipore #71400-4)로 형질전환시키고, 선택을 위한 적절한 항생제를 지니는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고 나서, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 적절한 항생제를 지니는 뇌 심장 주입 브로스(Teknova #B9993)의 10mL 종균 배양물을 4 개의 콜로니로 접종하고 나서, 220 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 밤새 성장시킨 후에, 종균 배양물을 적절한 항생제 + 보충물을 지니는 1L의 테리픽 브로스 컴플리트(Terrific Broth Complete)(Teknova #T7060)에 첨가하고 나서,220rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 온도를 점진적으로 18℃로 감소시키고, OD600이 2.0 초과가 되었을 때, IPTG의 첨가에 의해 유전자 발현을 0.5 mM로 유도하였다. 유도를 밤새 계속한 후에, 원심분리 및 TG300(50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP, 프로테아제 저해제 정제(Thermo Scientific #88266)) 중에서 재현탁에 의해 세포를 채취하고 나서, -80℃에서 저장하였다.
냉동 현탁액을 해동시킴으로써 세포를 용해시킨 다음, 18000 psi로 설정한 LM10 Microfluidizerㄾ를 통해 2 회 계대시켰다. 추출물을 원심분리를 통해 정제하고 나서, 4℃에서 Ni-NTA 아가로스 수지(Qiagen #30230)와 함께 배취 인큐베이션을 통해 가용성 추출물을 포획하였다. 슬러리를 중력 유동 칼럼에 붓고 나서, TG300+30 mM 이미다졸로 세척하고, 이어서, TG300+300 mM 이미다졸을 이용하여 관심 대상의 단백질을 용리시켰다. Ni 용리액을 동일한 용적의 HG100(50 mM 헤페스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)로 희석시키고 나서, HiTrap SP HP 칼럼(GE Healthcare Life Sciences #17-1152-01) 상에 장입하고, HG100 내지 HG1000(50 mM 헤페스 pH 7.5, 1000 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)의 30 개 칼럼 용적 구배로 용리시켰다. SDS-PAGE 겔을 이용하여 분석한 후에 적절한 분획을 풀링하고 나서, HG150(10mM Hepes pH7.5, 150 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP) 중에서 평형상태로 만든 SRT10 SEC300 칼럼(Sepax #225300-21230) 상에 장입을 위해 농축시켰다. 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 나서, 적절하게 풀링하고, 적어도 5 mg/ml로 농축시켰다.
gRNA를 T7 중합효소를 이용하여 시험관내 전사에 의해 생성하였다. 5' ARCA 캡을 전사와 동시에 RNA에 첨가한 반면, 폴리A 꼬리를 이콜라이 폴리A 중합효소에 의한 RNA 종의 3' 말단에 대한 전사 후 첨가하였다. 세포 내로 도입 전, 정제한 Cas9 및 gRNA를 혼합하고 나서, 10분 동안 복합체가 형성되게 하였다. RNP 용액을 후속적으로 전기천공법에 의해 저캇 T 세포 내로 도입하였다. 전기천공법 전에 그리고 전기천공법 후에, 세포를 10% FBS로 보충한 RPMI1640 배지에서 배양시켰다. CD3에 특이적인 플루오레세인 컨쥬게이팅된 항체를 이용하여 세포 상의 CD3 발현을 유세포분석에 의한 전기천공법 후 24 시간, 48 시간 및 72 시간에 모니터링하였다. 48 시간 및 72 시간에, CD3 음성 세포의 집단을 관찰하였다(도 18a 및 도 18b). CD3 음성 세포의 생성이 TRAC 좌위에서 게놈 편집의 결과라는 것을 확인하기 위해, 게놈 DNA를 채취하였고, T7E1 분석을 수행하였다. 사실, 데이터는 TRAC 좌위에서 DNA 변형의 존재를 확인하였다(도 18c).
실시예 5: T 세포 생존도에 대한 gRNA 변형의 효과 평가
gRNA 변형이 T 세포 생존도에 영향을 미치는 방법을 평가하기 위해, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 mRNA를 변형과 함께 또는 변형 없이 AAVS1 gRNA(GUCCCCUCCACCCCACAGUG)(서열번호 51201)과 조합하여 저캇 T 세포에 전달하였다. 특이적으로, 4 종의 상이한 변형 조합물을 분석하였다. (1) 5' 안티-리버스 캡 유사체(ARCA) 캡을 지니는 gRNA(도 19 참조) 및 폴리A 꼬리, (2) 5' ARCA 캡만을 지니는 gRNA, (3) 폴리A 꼬리만을 지니는 gRNA, (4) 임의의 변형이 없는 gRNA. 변형된 gRNA의 앞서 언급한 형태의 모두 넷을 생성하기 위해, DNA 주형은 T7 프로모터, AAVS1 gRNA 표적 서열(GUCCCCUCCACCCCACAGUG)(서열번호 51201), 및 스트렙토코커스 피오게네스 TRACR 서열을 포함한다. 모든 gRNA에 대해, T7 중합효소를 이용하여 7.5 mM UTP, 7.5 mM GTP, 7.5 mM CTP 및 7.5 mM ATP의 존재 하에 gRNA를 생성하였다. 5' ARCA 캡을 지니는 gRNA를 변형시키기 위해, ARCA 유사체의 6.0 mM을 NTP 풀에 첨가하였다. 결과적으로, 1.5 mM의 GTP만을 첨가한 반면, NTP 풀의 나머지는 동일한 농도로 남아있었다: 7.5 mM UTP, 7.5 mM CTP 및 7.5 mM ATP. gRNA에 폴리A 꼬리를 첨가하기 위해, 시험관내 중합효소 반응이 종결된 후에 이콜라이로부터 정제한 재조합 폴리A 중합효소를 사용하여 전사 gRNA의 말단에 대해서와 같이 연속해서 첨가하였다. DNase I를 이용하여 DNA 주형을 제거함으로써 종결을 달성하였다.폴리A 꼬리 반응을 대략 40분동안 수행하였다. gRNA 변형에도 불구하고, 모든 gRNA 제제를 페놀:클로로포름 추출 다음에 이소프로판올 침전에 의해 정제하였다. 일단 gRNA가 생성되면, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 mRNA(5' ARCA 캡 및 폴리A 꼬리로 변형) 및 4 종의 상이한 변형된 AAVS1-특이적 gRNA 중 하나를 이용하여 저캇 T 세포를 전기천공시켰다. 전기천공법 후에 아넥신-V 및 요오드화 프로피디움 이중 염색을 수행함으로써 세포 생존도를 결정하였다. 아넥신-V 및 PI에 대한 염색이 아닌 살아있는 세포의 분획을 유세포분석에 의해 결정하였다. 결과를 도 20에서 정량화하였다. 살아있는 세포의 분획에 기반하여, 5' ARCA 캡과 폴리A 꼬리를 둘 다에 의해 변형된 gRNA는 전기천공법에 의해 도입될 때 저캇 T 세포에 대해 적어도 독성이라는결론을 내렸다.
실시예 6: 나이브 T 세포에 대한 Cas9/gRNA RNP의 전달
나이브 T 세포에서 Cas9 매개 절단을 입증하기 위해, 표적화 도메인 GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(서열번호 474)을 지니는 TCR 알파쇄에 대해 설계한 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 및 gRNA를 전기천공법에 의해 리보핵산 단백질 복합체(RNP)로서 전달하였다. 이 구현예에서, Cas9를 이콜라이에서 발현시키고, 정제하였다. 구체적으로, Cas9를 암호화하는 HJ29 플라스미드를 Rosetta™ 2(DE3) 화학적 적격 세포(EMD Millipore #71400-4)로 형질전환시키고, 선택을 위한 적절한 항생제를 지니는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고 나서, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 적절한 항생제를 지니는 뇌 심장 주입 브로스(Teknova #B9993)의 10 mL 종균 배양물을 4 개의 콜로니로 접종하고 나서, 220 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 밤새 성장시킨 후에, 종균 배양물을 적절한 항생제 + 보충물을 지니는 1 L의 테리픽 브로스 컴플리트(Terrific Broth Complete)(Teknova #T7060)에 첨가하고 나서, 220 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 온도를 점진적으로 18℃로 감소시키고, OD600이 2.0 초과가 되었을 때, IPTG의 첨가에 의해 유전자 발현을 0.5 mM로 유도하였다. 유도를 밤새 계속한 후에, 원심분리 및 TG300(50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP, 프로테아제 저해제 정제(Thermo Scientific #88266)) 중에서 재현탁에 의해 세포를 채취하고 나서, -80℃에서 저장하였다.
냉동 현탁액을 해동시킴으로써 세포를 용해시킨 다음, 18000psi로 설정한 LM10 Microfluidizerㄾ를 통해 2 회 계대시켰다. 추출물을 원심분리를 통해 정제하고 나서, 4℃에서 Ni-NTA 아가로스 수지(Qiagen #30230)와 함께 배취 인큐베이션을 통해 가용성 추출물을 포획하였다. 슬러리를 중력 유동 칼럼에 붓고 나서, TG300+30 mM 이미다졸로 세척하고, 이어서, TG300+300 mM 이미다졸을 이용하여 관심 대상의 단백질을 용리시켰다. Ni 용리액을 동일한 용적의 HG100(50 mM 헤페스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)로 희석시키고 나서, HiTrap SP HP 칼럼(GE Healthcare Life Sciences #17-1152-01) 상에 장입하고, HG100 내지 HG1000(50 mM 헤페스 pH7.5, 1000 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)의 30 개 칼럼 용적 구배로 용리시켰다. SDS-PAGE 겔을 이용하여 분석한 후에 적절한 분획을 풀링하고 나서, HG150(10 mM Hepes pH7.5, 150 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP) 중에서 평형상태로 만든 SRT10 SEC300 칼럼(Sepax #225300-21230) 상에 장입을 위해 농축시켰다. 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 나서, 적절하게 풀링하고, 적어도 5 mg/ml로 농축시켰다.
표적화 도메인 GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(서열번호 474)를 지니는 gRNA를 T7 중합효소를 이용하는 시험관내 전사에 의해 생성하였다. 5' ARCA 캡을 전사와 동시에 RNA에 첨가한 반면, 폴리A 꼬리를 이콜라이 폴리A 중합효소에 의한 RNA 종의 3' 말단에 대한 전사 후 첨가하였다. 이 구현예에서,T 세포를 피콜(Ficoll) 구배 다음에 CD3 자기 비드를 이용하는 양성 선택에 의해 새로운 제대혈로부터 단리시켰다. 세포를 후속적으로 10% FBS, IL-7(5ng/ml) 및 IL-15(5ng/ml)로 보충한 RPMI1640 배지에서 배양시켰다. 단리 후 24 시간에, 정제한 Cas9 및 gRNA를 10 분 동안 실온에서 인큐베이션시킴으로써 생성된 RNP 용액을 이용하여 세포를 전기천공시켰다. CD3에 특이적인 플루오레세인 컨쥬게이팅된 항체를 이용하여 세포 상의 CD3 발현을 유세포분석에 의한 전기천공법 후 96 시간에 모니터링하였다. CD3 음성 세포 집단을 gRNA 및 비-기능성 Cas9를 받은 음성 대조군에 비하여 기능성 RNP 복합체가 제공된 세포에서 관찰하였다(도 21a 및 도 21b). CD3 음성 세포의 생성이 TRAC 좌위에서 게놈 편집의 결과라는 것을 확인하기 위해, 게놈 DNA를 채취하였고, T7E1 분석을 수행하였다. 사실, 데이터는 TRAC 좌위에서 DNA 변형의 존재를 확인하였다(도 21c).
실시예 7: RNA 분자로서 또는 Cas9/gRNA RNP로서 Cas9 mRNA 및 gRNA의 저캇 T 세포에 대한 전달에 의한 PDCD1 좌위의 표적화
RNA 분자로서 Cas9 mRNA 및 gRNA 저캇 T 세포에 대한 전달
저캇 T 세포 내 PDCD1 좌위에서 Cas9-매개 절단을 입증하기 위해, PDCD1 좌위에 대해 설계한 표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(서열번호 508)을 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 및 gRNA를 전기천공법에 의해T 세포에 RNA 분자로서 전달하였다. 이 구현예에서, Cas9와 gRNA를 둘 다 T7 중합효소를 이용하여 시험관내로 전사시켰다. 5' ARCA 캡을 전사와 동시에 RNA에 첨가한 반면, 폴리A 꼬리를 이콜라이 폴리A 중합효소에 의한 RNA 종의 3' 말단에 대한 전사 후 첨가하였다. PDCD1 좌위에서 변형된 저캇 T 세포를 생성하기 위해, 표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(서열번호 508)를 지니는 10 ㎍의 Cas9 mRNA 및 10 ㎍의 gRNA를 전기천공법에 의해 세포에 도입하였다. 전기천공법 전에, T 세포를 10% FBS로 보충한 RPMI 1640에서 배양시켰다. 24 시간, 48 시간 및 72 시간에, 게놈 DNA를 단리시키고, T7E1 분석을 PDCD1 좌위에서 수행하였다. 사실, 상기 데이터는 PDCD1 좌위에서 DNA 변형의 존재를 확인한다(도 22).
저캇 T 세포에 대한 Cas9/gRNA RNP의 전달
저캇 T 세포 내 PDCD1 좌위에서 Cas9-매개 절단을 입증하기 위해, 표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(서열번호 508)을 지니는 PDCD1 좌위에 대해 설계한 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 및 gRNA를 전기천공법에 의해 리보핵산 단백질 복합체(RNP)로서 전달하였다. 이 구현예에서, Cas9를 이콜라이에서 발현시키고, 정제하였다. 구체적으로, Cas9를 암호화하는 HJ29 플라스미드를 Rosetta™ 2(DE3) 화학적 적격 세포(EMD Millipore #71400-4)로 형질전환시키고, 선택을 위한 적절한 항생제를 지니는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고 나서, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 적절한 항생제를 지니는 뇌 심장 주입 브로스(Teknova #B9993)의 10 mL 종균 배양물을 4 개의 콜로니로 접종하고 나서, 220rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 밤새 성장시킨 후에, 종균 배양물을 적절한 항생제 + 보충물을 지니는 1L의 테리픽 브로스 컴플리트(Terrific Broth Complete)(Teknova #T7060)에 첨가하고 나서, 220 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 온도를 점진적으로 18℃로 감소시키고, OD600이 2.0 초과가 되었을 때, IPTG의 첨가에 의해 유전자 발현을 0.5 mM로 유도하였다. 유도를 밤새 계속한 후에, 원심분리 및 TG300(50 mM Tris pH8.0, 300 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP, 프로테아제 저해제 정제(Thermo Scientific #88266)) 중에서 재현탁에 의해 세포를 채취하고 나서, -80℃에서 저장하였다.
냉동 현탁액을 해동시킴으로써 세포를 용해시킨 다음, 18000 psi로 설정한 LM10 Microfluidizerㄾ를 통해 2 회 계대시켰다. 추출물을 원심분리를 통해 정제하고 나서, 4℃에서 Ni-NTA 아가로스 수지(Qiagen #30230)와 함께 배취 인큐베이션을 통해 가용성 추출물을 포획하였다. 슬러리를 중력 유동 칼럼에 붓고 나서, TG300+30 mM 이미다졸로 세척하고, 이어서, TG300+300 mM 이미다졸을 이용하여 관심 대상의 단백질을 용리시켰다. Ni 용리액을 동일한 용적의 HG100(50 mM 헤페스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)로 희석시키고 나서, HiTrap SP HP 칼럼(GE Healthcare Life Sciences #17-1152-01) 상에 장입하고, HG100 내지 HG1000(50 mM 헤페스 pH7.5, 1000 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP)의 30 개 칼럼 용적 구배로 용리시켰다. SDS-PAGE 겔을 이용하여 분석한 후에 적절한 분획을 풀링하고 나서, HG150(10mM Hepes pH 7.5, 150 mM NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP) 중에서 평형상태로 만든 SRT10 SEC300 칼럼(Sepax #225300-21230) 상에 장입을 위해 농축시켰다. 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 나서, 적절하게 풀링하고, 적어도 5mg/ml로 농축시켰다.
표적화 도메인 GUCUGGGCGGUGCUACAACU(서열번호 508)를 지니는 gRNA를 T7 중합효소를 이용하는 시험관내 전사에 의해 생성하였다. 5' ARCA 캡을 전사와 동시에 RNA에 첨가한 반면, 폴리A 꼬리를 이콜라이 폴리A 중합효소에 의한 RNA 종의 3' 말단에 대한 전사 후 첨가하였다. 세포 내로 도입하기 전에, 정제한 Cas9 및 gRNA를 혼합하고 10 분 동안 복합체가 형성되게 하였다. RNP 용액을 후속적으로 전기천공법에 의해 저캇 T 세포 내로 도입하였다. 전기천공법 전에 그리고 전기천공법 후에, 세포를 10% FBS로 보충한 RPMI1640 배지에서 배양시켰다. 24 시간, 48 시간 및 72 시간에, 게놈 DNA를 단리시키고, PDCD1 좌위에서 T7E1 분석을 수행하였다. 사실, 데이터는 PDCD1 좌위에서 DNA 변형의 존재를 확인하였다(도 22).
참고문헌에 의한 포함
본 명세서에 언급한 모든 간행물, 특허, 서열목록 및 특허 출원은, 각각의 개개 간행물, 특허, 서열목록 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 표시되는 것과 같이, 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 상충되는 경우에, 본 명세서의 임의의 정의를 포함하는 본 출원으로 조절할 것이다.
균등물
당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본 명세서에 기재된 발명의 구체적인 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 알아낼 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 다음의 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 다른 구현예가 또한 다음의 청구범위 내에 있다.
Claims (202)
- FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자로부터의 표적 도메인과 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 T 세포 표적 넉아웃 위치의 500 개, 400 개, 300 개, 200 개, 100 개, 50 개, 25 개, 또는 10 개의 뉴클레오타이드 내에서 이중 가닥 파손 및 단일 가닥 파손으로부터 선택되는 절단 사건을 제공하도록 구성된 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 상기 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 또는 PTPN6 유전자의 발현을 감소시키거나, 줄이거나 또는 억제하기 위해 T 세포 표적 넉다운 위치에 충분히 가깝게 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9 융합 단백질을 표적화하도록 구성된 것인, gRNA 분자.
- 제3항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 상기 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 프로모터 영역을 표적화하도록 구성된 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 임의의 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32로부터의 표적화 도메인 서열과 동일하거나 또는 상기 표적화 도메인 서열과 3 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 1A 내지 F 또는 표 13A 내지 K에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 2A 내지 I 또는 표 14A 내지 K에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 3A 내지 H 또는 표 15A 내지 F에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 4A 내지 I 또는 표 16A 내지 K에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 5A 내지 I 또는 표 17A 내지 K에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 6A 내지 I 또는 표 18A 내지 K에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 7A 내지 H, 표 19A 내지 J, 표 31 또는 표 32에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 8A 내지 H 또는 표 20A 내지 J에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 9A 내지 I 또는 표 21A 내지 K에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 10A 내지 I 또는 표 22A 내지 K에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 11A 내지 I 또는 표 23A 내지 J에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 12A 내지 I 또는 표 24A 내지 K에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 25A 내지 G 또는 표 29에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 26A 내지 G 또는 표 27에서의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA은 모듈 gRNA 분자인, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA은 키메라 gRNA 분자인, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 16 개 또는 17 개 이상의 뉴클레오타이드인, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 16 개 또는 17 개의 뉴클레오타이드인, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드인, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드인, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드인, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드인, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드인, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드인, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드인, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3'까지,
표적화 도메인;
제1 상보성 도메인;
연결 도메인;
제2 상보성 도메인;
근위 도메인; 및
꼬리 도메인
을 포함하는 것인, gRNA 분자. - 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인;
함께 취해지며, 길이로 적어도 20 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및
길이로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인
을 포함하는 것인, gRNA 분자. - 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인;
함께 취해지며, 길이로 적어도 30 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및
길이로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인
을 포함하는 것인, gRNA 분자. - 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인;
함께 취해지며, 길이로 적어도 35 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및
길이로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인
을 포함하는 것인, gRNA 분자. - 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인;
함께 취해지며, 길이로 적어도 40 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및
길이로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인
을 포함하는 것인, gRNA 분자. - (a) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서 T 세포 표적 도메인과 상보성인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
- 제36항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 gRNA 분자인 것인, 핵산.
- 제36항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 상기 T 세포 표적 넉아웃 위치의 500 개, 400 개, 300 개, 200 개, 100 개, 50 개, 25 또는 10 개 뉴클레오타이드 내에서 이중 가닥 파손 및 단일 가닥 파손으로부터 선택되는 절단 사건을 제공하도록 구성된 것인, 핵산.
- 제36항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 상기 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 또는 PTPN6 유전자의 발현을 감소시키거나, 줄이거나 또는 억제하기 위해 T 세포 표적 넉다운 위치에 충분히 가깝게 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9 융합 단백질을 표적화하도록 구성된 것인, 핵산.
- 제36항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 상기 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 상기 프로모터 영역을 표적화하도록 구성된 것인, 핵산.
- 제36항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 임의의 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32로부터의 표적화 도메인 서열과 동일하거나 또는 상기 표적화 도메인 서열과 3 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하는 것인, 핵산.
- 제36항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 모듈 gRNA 분자인 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 키메라 gRNA 분자인 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 16 개 또는 17 개 이상의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 16 개 또는 17 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 24 개, 25 개, 또는 26 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3'까지
표적화 도메인;
제1 상보성 도메인;
연결 도메인;
제2 상보성 도메인;
근위 도메인; 및
꼬리 도메인
을 포함하는, 핵산. - 제36항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인;
함께 취해지며, 길이로 적어도 20 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및
길이로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인
을 포함하는 것인, 핵산. - 제36항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인;
함께 취해지며, 길이로 적어도 30 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인 길이로 적어도 30 개의 뉴클레오타이드를 함께 취한 근위 및 꼬리 도메인; 및
길이로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인
을 포함하는 것인, 핵산. - 제36항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인;
함께 취해지며, 길이로 적어도 35 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및
길이로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인
을 포함하는 것인, 핵산. - 제36항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인;
함께 취해지며, 길이로 적어도 40 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및
길이로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인
을 포함하는 것인, 핵산. - 제36항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, (b) Cas9 분자를 암호화하는 서열을 더 포함하는 것인, 핵산.
- 제59항에 있어서, 상기 Cas9 분자는 eaCas9 분자인 것인, 핵산.
- 제60항에 있어서, 상기 eaCas9 분자는 틈내기효소 분자인 것인, 핵산.
- 제60항에 있어서, 상기 eaCas9 분자는 표적 핵산에서 이중 가닥 파손을 형성하는 것인, 핵산.
- 제60항에 있어서, 상기 eaCas9 분자는 표적 핵산에서 단일 가닥 파손을 형성하는 것인, 핵산.
- 제63항에 있어서, 상기 단일 가닥 파손은 상기 gRNA 분자의 상기 표적화 도메인에 대해 상보성인 표적 핵산의 가닥에서 형성된 것인, 핵산.
- 제63항에 있어서, 상기 단일 가닥 파손은 상기 gRNA의 상기 표적화 도메인에 대해 상보성인 가닥이 아닌 표적 핵산의 가닥에서 형성된 것인, 핵산.
- 제60항에 있어서, 상기 eaCas9 분자는 HNH-유사 도메인 절단 활성을 포함하지만, N-말단 RuvC-유사 도메인 절단 활성이 없거나 또는 상당하지 않은 것인, 핵산.
- 제60항에 있어서, 상기 eaCas9 분자는 HNH-유사 도메인 틈내기효소인 것인, 핵산.
- 제60항에 있어서, 상기 eaCas9 분자는 D10에서 돌연변이를 포함하는 것인, 핵산.
- 제60항에 있어서, 상기 eaCas9 분자는 N-말단 RuvC-유사 도메인 절단 활성을 포함하지만, HNH-유사 도메인 절단 활성이 없거나 또는 상당하지 않은 것인, 핵산.
- 제60항에 있어서, 상기 eaCas9 분자는 N-말단 RuvC-유사 도메인 틈내기효소인 것인, 핵산.
- 제60항에 있어서, 상기 eaCas9 분자는 H840에서 돌연변이를 포함하는 것인, 핵산.
- 제59항에 있어서, 상기 Cas9 분자는 eiCas9 분자인 것인, 핵산.
- 제72항에 있어서, 상기 Cas9 분자는 eiCas9-융합 단백질 분자(예를 들어, eiCas9-전사 리프레서 도메인 융합, 예를 들어 eiCas9-KRAB 도메인 융합)인 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, (c) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자의 제2 표적 도메인에 대해 상보성인 표적화 도메인을 갖는 본 명세서에 기재된 제2 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 더 포함하는 것인, 핵산.
- 제74항에 있어서, 상기 제2 gRNA 분자는 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 gRNA 분자인 것인, 핵산.
- 제74항에 있어서, 상기 제2 gRNA의 상기 표적화 도메인은 상기 T 세포 표적 넉아웃 위치의 500 개, 400 개, 300 개, 200 개, 100 개, 50 개, 25 개, 또는 10 개의 뉴클레오타이드 내에서, 이중 가닥 파손 및 단일 가닥 파손으로부터 선택되는 절단 사건을 제공하도록 구성된 것인, 핵산.
- 제74항에 있어서, 상기 제2 gRNA의 상기 표적화 도메인은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, 또는 PTPN6 유전자의 발현을 감소시키거나, 줄이거나 또는 억제하기 위해 T 세포 표적 넉다운 위치에 충분히 가깝게 효소적으로 불활성인 Cas9(eiCas9) 또는 eiCas9 융합 단백질을 표적화하도록 구성된 것인, 핵산.
- 제74항에 있어서, 상기 제2 gRNA의 상기 표적화 도메인은 상기 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB 또는 PTPN6 유전자의 프로모터 영역을 표적화하도록 구성된 것인, 핵산.
- 제74항에 있어서, 상기 제2 gRNA의 상기 표적화 도메인은 임의의 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32로부터의 표적화 도메인 서열과 동일하거나 또는 상기 표적화 도메인 서열과 3 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하는 것인, 핵산.
- 제74항에 있어서, 상기 제2 gRNA의 상기 표적화 도메인은 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, 핵산.
- 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 gRNA 분자는 모듈 gRNA 분자인 것인, 핵산.
- 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 gRNA 분자는 키메라 gRNA 분자인 것인, 핵산.
- 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 16 개 또는 17 개 이상의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 16 개 또는 17 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 길이로 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드인 것인, 핵산.
- 제74항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 gRNA 분자는 5'으로부터 3'까지,
표적화 도메인;
제1 상보성 도메인;
연결 도메인;
제2 상보성 도메인;
근위 도메인; 및
꼬리 도메인
을 포함하는 것인, 핵산. - 제74항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 gRNA 분자는
길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인;
함께 취해지며, 길이로 적어도 20 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및
길이로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인
을 포함하는 것인, 핵산. - 제74항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 gRNA 분자는
길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인;
함께 취해지며, 길이로 적어도 30 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및
길이로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인
을 포함하는 것인, 핵산. - 제74항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 gRNA 분자는
길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인;
함께 취해지며, 길이로 적어도 35 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및
길이로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인
을 포함하는 것인, 핵산. - 제74항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 gRNA 분자는
길이로 25 개 이하의 뉴클레오타이드의 연결 도메인;
함께 취해지며, 길이로 적어도 40 개의 뉴클레오타이드인 근위 및 꼬리 도메인; 및
길이로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인
을 포함하는 것인, 핵산. - 제74항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 핵산.
- 제97항에 있어서, 제4 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 핵산.
- 제36항에 있어서, (b) 제59항 내지 제73항 중 어느 한 항의 Cas9 분자를 암호화하는 서열을 더 포함하는 것인, 핵산.
- 제99항에 있어서, 상기 핵산은 (c) 2 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함하지 않는 것인, 핵산.
- 제100항에 있어서, 각각의 (a) 및 (b)는 동일한 핵산 분자 상에 존재하는 것인, 핵산.
- 제100항에 있어서, 상기 핵산 분자는 AAV 벡터인 것인, 핵산.
- 제101항에 있어서, (a)는 제1 핵산 분자 상에 존재하고; (b)는 제2 핵산 분자 상에 존재하는 것인, 핵산.
- 제103항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터인 것인, 핵산.
- 제36항에 있어서,
(b) 제59항 내지 제73항 중 어느 한 항의 Cas9 분자를 암호화하는 서열; 및
(c) 제74항 내지 제96항의 제2 gRNA 분자를 암호화하는 서열
을 더 포함하는 것인 핵산. - 제105항에 있어서, 각각의 (a), (b) 및 (c)는 동일한 핵산 분자 상에 존재하는 것인, 서열.
- 제106항에 있어서, 상기 핵산 분자는 AAV 벡터인 것인, 핵산.
- 제105항에 있어서,
(a), (b) 및 (c) 중 하나는 제1 핵산 분자 상에서 암호화되고; 그리고
(a), (b) 및 (c) 중 제2 및 제3은 제2 핵산 분자 상에서 암호화되는 것인, 핵산. - 제108항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터인 것인, 핵산.
- 제108항에 있어서, (a)는 제1 핵산 분자 상에서 존재하고; 그리고 (b) 및 (c)는 제2 핵산 분자 상에서 존재하는 것인, 핵산.
- 제110항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터인 것인, 핵산.
- 제108항에 있어서, (b)는 제1 핵산 분자 상에 존재하고; (a) 및 (c)는 제2 핵산 분자 상에 존재하는 것인, 핵산.
- 제112항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터인 것인, 핵산.
- 제108항에 있어서, (c)는 제1 핵산 분자 상에 존재하고; 및 (b) 및 (a)는 제2 핵산 분자 상에 존재하는 것인, 핵산.
- 제114항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터인 것인, 핵산.
- 제103항, 제108항, 제110항, 제112항 또는 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 분자는 AAV 벡터가 아니고, 상기 제2핵산 분자는 AAV 벡터인 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 상기 (a)의 gRNA 분자를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것인, 핵산.
- 제74항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 상기 (c)의 제2 gRNA 분자를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 것인, 핵산.
- 제117항 또는 제118항에 있어서, 상기 프로모터 및 제2 프로모터는 서로 상이한 것인, 핵산.
- 제117항 또는 제118항에 있어서, 상기 프로모터와 제2 프로모터는 동일한 것인, 핵산.
- 제59항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 상기 (b)의 Cas9 분자를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 유전자를 표적화하는 gRNA를 더 포함하는 것인, 핵산.
- 제36항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적인 유전자를 표적화하는 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 핵산.
- (a) 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 gRNA 분자를 포함하는 조성물.
- 제124항에 있어서, (b) 제59항 내지 제73항 중 어느 한 항의 Cas9 분자를 더 포함하는 것인, 조성물.
- 제124항 또는 제125항에 있어서, (c) 제74항 내지 제96항 중 어느 한 항의 제2 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 조성물.
- 제126항에 있어서, 제3 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 조성물.
- 제127항에 있어서, 제4 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 조성물.
- FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 2 개 이상을 표적화하는 적어도 2 개의 gRNA 분자를 포함하는 조성물.
- 제129항에 있어서, 상기 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 2 개 이상을 표적화하는 적어도 2 개의 gRNA 분자는 임의의 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32로부터의 표적화 도메인 서열과 동일하거나 또는 상기 표적화 도메인 서열과 3 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제129항에 있어서, 상기 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 2 개 이상을 표적화하는 적어도 2 개의 gRNA 분자는 표 1A 내지 I, 표 2A 내지 I, 표 3A 내지 H, 표 4A 내지 I, 표 5A 내지 I, 표 6A 내지 I, 표 7A 내지 H, 표 8A 내지 H, 표 9A 내지 I, 표 10A 내지 I, 표 11A 내지 I, 표 12A 내지 I, 표 13A 내지 K, 표 14A 내지 K, 표 15A 내지 F, 표 16A 내지 K, 표 17A 내지 K, 표 18A 내지 K, 표 19A 내지 J, 표 20A 내지 J, 표 21A 내지 K, 표 22A 내지 K, 표 23A 내지 J, 표 24A 내지 K, 표 25A 내지 G, 표 26A 내지 G, 표 27, 표 29, 표 31, 또는 표 32의 표적화 도메인 서열로부터 선택되는 것인, 조성물.
- 제127항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 제59항 내지 제73항 중 어느 한 항의 Cas9 분자를 더 포함하는 것인, 조성물.
- 제129항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, (c) FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 2 개 이상을 표적화하는 제74항 내지 제96항 중 어느 한 항의 제2 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 조성물.
- 제133항에 있어서, 제3 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 조성물.
- 제134항에 있어서, 제4 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 조성물.
- 세포를 변경시키는 방법으로서, 상기 세포를
(a) 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 gRNA;
(b) 제59항 내지 제73항 중 어느 한 항의 Cas9 분자; 및
선택적으로, (c) 제74항 내지 제96항 중 어느 한 항의 제2 gRNA 분자
와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포를 변경시키는 방법. - 제136항에 있어서, 제3 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 방법.
- 제137항에 있어서, 제4 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 방법.
- 제136항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 (a), (b), 및 선택적으로 (c)와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제136항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)의 gRNA 분자는 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제136항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 암으로 고통받는 대상체로부터 유래된 것인, 방법.
- 제136항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 암을 갖거나 또는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자의 T 세포 표적 위치에서의 돌연변이가 달리 유리할 수 있는 대상체로부터 유래된 것인, 방법.
- 제136항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 T 세포인 것인, 방법.
- 제143항에 있어서, 상기 T 세포는 조작된 T 세포인 것인, 방법.
- 제144항에 있어서, 상기 조작된 T 세포는 조작된 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포인 것인, 방법.
- 제144항에 있어서, 상기 조작된 T 세포는 조작된 TCR(T-세포 수용체) T 세포인 것인, 방법.
- 제143항에 있어서, 상기 T 세포는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 하나 이상에서 T 세포 표적 위치 돌연변이를 도입하기 전에 TCR 또는 CAR을 발현시키도록 조작된 것인, 방법.
- 제143항에 있어서, 상기 T 세포는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 하나 이상에서 T 세포 표적 위치 돌연변이를 도입한 후에, TCR 또는 CAR을 발현시키도록 조작된 것인, 방법.
- 제143항에 있어서, 상기 T 세포는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 하나 이상에서 T 세포 표적 위치 돌연변이를 도입하는 것과 동시에 TCR 또는 CAR을 발현시키도록 조작된 것인, 방법.
- 제136항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 생체외에서 수행되는 것인, 방법.
- 제136항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉된 세포는 상기 대상체의 신체로 복귀되는 것인, 방법.
- 제136항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 암을 갖는 대상체로부터 유래된 것인, 방법.
- 제136항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포에서 상기 T 세포 표적 위치의 서열의 지식을 획득하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제153항에 있어서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자의 일부를 서열분석함으로써 상기 세포 내 상기 T 세포 표적 위치의 상기 서열의 지식을 획득하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제136항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 표적 위치 돌연변이를 유도하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제136항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 상기 세포를 (a), (b) 및 (c) 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제136항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 상기 세포를 제36항 내지 제123항 중 어느 한 항의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제136항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 상기 세포에 상기 (b)의 Cas9 분자, 및 (a) 및 선택적으로 (c)를 암호화하는 핵산을 전달하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제136항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 상기 세포에 상기 (b)의 Cas9 분자, 및 (a)의 gRNA 분자 및 선택적으로 (c)의 제2 gRNA 분자를 전달하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제136항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 상기 세포에 상기 (a)의 gRNA 분자, 선택적으로 (c)의 제2 gRNA 분자, 및 (b)의 Cas9 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 것인, 방법.
- 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체(또는 대상체로부터의 세포)를
(a) 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 gRNA;
(b) 제59항 내지 제73항 중 어느 한 항의 Cas9 분자; 및
선택적으로, (c) 제74항 내지 제96항 중 어느 한 항의 제2 Grna
와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법. - 제161항에 있어서, 제3 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 방법.
- 제162항에 있어서, 제4 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 방법.
- 제161항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체를 (a), (b), 및 선택적으로 (c)와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
- 제161항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 암으로 고통받고 있는 것인, 방법.
- 제165항에 있어서, 상기 암은 림프종, 만성 림프성 백혈병(CLL), B 세포 급성 림프성 백혈병(B-ALL), 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종(NHL), 미만성 거대 세포 림프종(DLCL), 다발성 골수종, 신세포암종(RCC), 신경아세포종, 결장직장암, 유방암, 난소암, 흑색종, 육종, 전립선암, 폐암, 식도암, 간세포 암종, 췌장암, 성상세포종, 중피종, 두경부암 및 수모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제161항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자의 상기 T 세포 표적 위치에서의 돌연변이가 유리한 것인, 방법.
- 제161항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 하나 이상에서의 돌연변이가 유리한 것인, 방법.
- 제161항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 둘 이상에서의 돌연변이가 유리한 것인, 방법.
- 제161항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 셋 이상에서의 돌연변이가 유리한 것인, 방법.
- 제161항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 넷 이상에서의 돌연변이가 유리한 것인, 방법.
- 제161항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 다섯 이상에서의 돌연변이가 유리한 것인, 방법.
- 제161항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 여섯 이상에서의 돌연변이가 유리한 것인, 방법.
- 제161항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자 중 일곱 이상에서의 돌연변이가 유리한 것인, 방법.
- 제161항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및 TRBC 유전자의 각각에서의 돌연변이가 유리한 것인, 방법.
- 제161항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 상기 T 세포 표적 위치의 서열의 지식을 획득하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제176항에 있어서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 또는 이의 일부 중 하나 이상을 서열분석함으로써 상기 대상체에서 상기 T 세포 표적 위치의 서열의 지식을 획득하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제161항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자에서 T 세포 표적 위치 돌연변이를 유도하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제161항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 세포는 생체외에서 (a), (b), 및 선택적으로 (c)와 접촉되는 것인, 방법.
- 제179항에 있어서, 상기 대상체의 상기 세포는 T 세포인 것인, 방법.
- 제180항에 있어서, 상기 T 세포는 TCR 또는 CAR을 발현시키도록 조작된 것인, 방법.
- 제180항에 있어서, 상기 T 세포는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 하나 이상에서 T 세포 표적 위치 돌연변이를 유도하기 전에 TCR 또는 CAR을 발현시키도록 조작된 것인, 방법.
- 제180항에 있어서, 상기 T 세포는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 하나 이상에서 T 세포 표적 위치 돌연변이를 유도한 후에 TCR 또는 CAR을 발현시키도록 조작된 것인, 방법.
- 제180항에 있어서, 상기 T 세포는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 하나 이상에서 T 세포 표적 위치 돌연변이를 유도하는 것과 동시에 TCR 또는 CAR을 발현시키도록 조작된 것인, 방법.
- 제179항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 대상체의 신체에 복귀되는 것인, 방법.
- 제179항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 상기 대상체의 신체 내로 세포를 도입하는 단계를 포함하되, 상기 세포 대상체는 생체외에서 (a), (b), 및 선택적으로 (c)와 접촉되는 것인, 방법.
- 제161항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 상기 대상체를 (a), (b) 및 (c) 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제161항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 상기 대상체를 제36항 내지 제123항 중 어느 한 항의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제161항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 상기 대상체에 (b)의 Cas9 분자, 및 (a) 및 선택적으로 (c)를 암호화하는 핵산을 전달하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제161항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 상기 대상체에 (b)의 Cas9 분자, 및 (a)의 gRNA 및 선택적으로 (c)의 제2 gRNA를 전달하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제161항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 상기 대상체에 (a)의 gRNA, 선택적으로 (c)의 제2 gRNA, 및 (b)의 Cas9 분자를 암호화하는 핵산을 전달하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- gRNA, 핵산, 또는 본 명세서에 기재된 조성물, 및 암을 갖는 대상체 또는 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 하나 이상에서 T 세포 표적 위치에서의 돌연변이가 유리한 대상체로부터의 세포를 포함하는 반응 혼합물.
- (a) 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 gRNA 분자, 또는 gRNA를 암호화하는 핵산, 및 다음 중 하나 이상:
(b) 제59항 내지 제73항 중 어느 한 항의 Cas9 분자;
(c) 제74항 내지 제96항 중 어느 한 항의 제2 gRNA 분자; 및
(d) (b) 및 (c) 중 하나 이상을 암호화하는 핵산
을 포함하는 키트. - 제193항에 있어서, (a), (b) 및 (c) 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 포함하는 것인, 키트.
- 제194항에 있어서, T 세포 표적 위치를 표적화하는 제3 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 키트.
- 제195항에 있어서, T 세포 표적 위치를 표적화하는 제4 gRNA 분자를 더 포함하는 것인, 키트.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 5' 말단에서 또는 근처에서(예를 들어, 5' 말단의 1 개 내지 10 개, 1 개 내지 5 개, 또는 1 개 내지 2 개의 뉴클레오타이드 내에서) 변형을 포함하는 것인, gRNA.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 3' 말단에서 또는 근처에서(예를 들어, 3' 말단의 1 개 내지 10 개, 1 개 내지 5 개, 또는 1 개 내지 2 개의 뉴클레오타이드 내에서) 변형을 포함하는 것인, gRNA.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 5' 말단에서 또는 근처에서(예를 들어, 5' 말단의 1 개 내지 10 개, 1 개 내지 5 개, 또는 1 개 내지 2 개의 뉴클레오타이드 내에서) 변형 및 3' 말단에서 또는 근처에서(예를 들어, 3' 말단의 1 개 내지 10 개, 1 개 내지 5 개, 또는 1 개 내지 2 개의 뉴클레오타이드 내에서) 변형을 포함하는 것인, gRNA.
- 제197항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형은 T 세포 내로 도입될 때 gRNA가 뉴클레아제에 대한 안정성의 증가를 나타내게 하는 것인, gRNA.
- 제197항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형은 T 세포 내로 도입될 때 gRNA가 감소된 선천성 면역 반응을 나타내게 하는 것인, gRNA.
- 제201항에 있어서, 상기 선천성 면역 반응은 사이토카인 발현의 유도를 수반하는 것인, gRNA.
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