CN110520156A - 针对外源抗原和/或自身抗原的免疫调控方法 - Google Patents

Abstract

本发明针对治疗增生性疾病诸如癌症的组合物和使用包含免疫检查点拮抗剂和抗原的组合物治疗增生性疾病诸如癌症的方法。已经发现所述组合物引起免疫应答，允许以其他方式被抑制的免疫系统激活从而使T细胞攻击癌细胞。组合物可以存在于包含编码所述拮抗剂和抗原的核酸的载体中，并且可以包含基因编辑系统，诸如CRISPR‑Cas9系统。

Description

针对外源抗原和/或自身抗原的免疫调控方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.35 USC§119(e)要求于2017年1月29日提交的美国申请系列号62/451,759的优先权权益。该优先权申请的公开内容被认为是本申请的公开内容的一部分并且通过引用并入本申请的公开内容中。

技术领域

本发明涉及增强对外源抗原或自身抗原的免疫应答，并且可以用来提高用于各种疾病的治疗性和/或预防性疫苗的功效，所述疾病包括癌症、感染性疾病、神经变性疾病、自身免疫性疾病、移植排斥和动物自身免疫性疾病模型生成。具体地，本文描述了开发新的肿瘤疫苗平台，该平台将抗原表达与调节抗原递呈细胞内的免疫检查点相关蛋白相结合，从而提高免疫疗法的功效和安全性。

背景技术

已经成功地对免疫检查点进行调控以增强免疫应答或释放免疫抑制以治疗各种肿瘤。某些癌细胞和配体可以结合激活T细胞上的受体从而将这些细胞关闭。免疫检查点抑制剂通过防止T细胞被关闭，从而允许激活T细胞攻击感染的细胞或癌性肿瘤细胞，由此增加患者的自身免疫应答来起作用。

目前，免疫检查点抑制剂，诸如针对PD-1/PDL1和CTLA-4的抗体代表了在癌症治疗方面的革命。然而，仍迫切需要许多改进。检查点抑制剂仅在各种实体肿瘤类型的一小部分患者(20％-30％)中引起持久的反应，并且由于它们对免疫应答的非选择性/普遍的脱抑制，它们也诱发大量自身免疫相关的不良事件，主要包括胃肠、皮肤、肝脏和内分泌毒性(Gelao,2014.)。尽管导致低应答率的确切机制还未知，但一个潜在的机制可能是在免疫检查点抑制剂治疗前在患者的T细胞库中缺少肿瘤抗原反应性克隆。几方面的证据表明检查点蛋白，除了作用于T效应细胞以外，还由抗原递呈细胞(APC)表达，并且可以在早期抗原致敏和免疫应答中具有重要作用。(Spoonas,2015；Raya等人,2015；Weiskopf,2015)动物数据证明利用阻断的单克隆抗体靶向PD-1/PD-L1通路可以增强由肿瘤疫苗所引起的治疗性保护作用(Remy-Ziller,2017)，CTLA-4阻断可以扩充外周T-细胞受体库(Robert 2014)。由免疫细胞表达的PD-L1还在CD8⁺T细胞致敏、缩减、和分化成记忆群体(Johnson,2017)或记忆性T细胞扩充中具有重要地位。临床研究显示受疫苗致敏的患者可能是比未接受疫苗的患者更好的用于免疫检查点和其他免疫调节疗法的候选者(Lutz,2014)。所有这些数据支持了进一步开发肿瘤疫苗与免疫检查点调控的组合的可行性。

免疫检查点在抗原致敏中的确切地位还不清楚。可能相似的分子机制可以用于APC中的抗原致敏以及T效应细胞中的肿瘤杀伤。对抗原有反应性的T细胞可能在未接受疫苗的患者中的丰度低，即使在具有高突变负荷的肿瘤诸如黑色素瘤中(Ott,Nature 2017),新抗原(neoantigen)特异性免疫效应细胞克隆和/或记忆性T细胞扩充的预致敏和扩增将具有巨大潜力。据推测B7-CD28相互作用在不同的免疫应答或在应答的不同阶段具有不同的作用：CD28:B7相互作用在激活天然T细胞中是重要的，CTLA-4:B7抑制二级淋巴器官中的T细胞初始激活，而PD1:PDL1抑制效应细胞的激活。(Abbas,2018.)免疫检查点对免疫致敏的确切影响仍需要进一步评估。

本发明涉及新抗原的表达以及使用分子技术来调控(例如，下调)抗原递呈细胞(APC)内的检查点和配体(例如，PDL-1/2，B7H4，B7-1/2等)的活性，从而引起对新抗原表位的有效免疫识别/致敏，扩充了新抗原特异性T记忆细胞克隆的丰度，通过扩充患者中已经存在的特异性抗原的记忆T细胞或通过致敏天然T细胞针对所述新抗原，来增加整个T细胞库中抗-新抗原T细胞克隆的比率。此方式可以单独使用，在采用一种或多种检查点抑制剂之前使用，或与一种或多种检查点抑制剂同时使用，或在采用一种或多种检查点抑制剂之后使用。以此方式，代替目前免疫检查点抑制剂疗法的普遍的免疫脱抑制，改良的疗法将首先选择性地扩充新抗原反应性T细胞克隆，并增加随后免疫检查点疗法成功的可能性。由于T细胞应答中的表位优势和亲和性成熟是携带抗原的APC和T细胞亚组之间的竞争性相互作用的结果，因此本发明还可以通过减少自身反应性T细胞克隆在T细胞池中的相对比例来减少自身免疫副作用。还可以使用溶解载体、纳米粒子包覆的抗原表位以及免疫调节剂。此配置可以与或不与抗原递呈细胞(APC)内的至少一种其他的免疫增强的细胞因子/蛋白(例如，IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、GM-CSF、Flt-3配体等)一起使用，以诱发对肿瘤表位的免疫激活。

本发明的另一配置涉及自身抗原的表达以及使用分子技术来调控(例如，上调)抗原递呈细胞(APC)内的检查点和配体(例如，PDL-1/2、B7H4、B7-1/2等)以及与或不与至少一种其他的免疫抑制性细胞因子/蛋白(例如，IL-1Ra、IL-4、IL-10、IL-11、IL-13、TGF-b、IL-33、IL-35、IL-37等)的活性，从而诱发对自身抗原表位的免疫耐受。

发明内容

本发明针对新的肿瘤疫苗平台，其组合了抗原表达与对抗原递呈细胞(APC)内的免疫检查点的调控，从而提高免疫疗法的功效和安全性。在一个实施方案中，产物可以是表达肿瘤特异性抗原和免疫检查点调控元件的疫苗递送载体或纳米粒子。在一个实施方案中，所述载体可以包含编码例如，Cas9蛋白的核酸，以及编码PDL1的核酸和/或CTLA4敲除或敲低。

本发明针对至少一种免疫检查点拮抗剂与至少一种抗原的组合。优选地，所述组合物包含至少一种编码免疫检查点拮抗剂的核酸，所述免疫检查点拮抗剂可以是结合或以其他的方式干扰免疫检查点相关蛋白的功能或表达的多肽或蛋白或其RNA。在另一个实施方案中，多肽或蛋白是抗体，诸如单克隆抗体、人源化抗体、完全人抗体、融合蛋白或其组合。备选地，多肽可以是结合免疫检查点相关蛋白的此类抗体或蛋白的片段。进一步可能的是，免疫检查点拮抗剂是小分子，所述小分子干扰、抑制或以其他方式破坏免疫检查点相关蛋白的功能或其表达。

在本发明的一个方面，免疫检查点相关蛋白是配体,诸如PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOS配体、B7-H3、B7-H4、4-1BBL、HVEM、OX40L、CD70、CD40L、半乳凝集素-9、腺苷、GITRL、IDO、TDO、CEACAM1、VISTA、CD47、CD155、CD48、HHLA2、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTNL3和BTNL9。

在本发明的另一个方面，所述免疫检查点相关蛋白是选自由下列各项组成的组的可溶性受体：PD-1、CTLA-4、CD28、ICOS、4-1BB、BTLA、CD160、LIGHT、LAG3、OX40、CD27、CD40、TIM-3、腺苷A2a受体、GITR、CEACAM1、SIPR-α、DNAM-1、TIGIT、CD96、2B4、TMIGD2和DC-SIGN。

在进一步的实施方案中，所述免疫检查点拮抗剂优选地是用于削弱或消除免疫检查点相关蛋白表达或功能的核酸，其可以是siRNA、微小RNA、双链RNA、切丁酶(dicer)底物RNA、核酶、适配体、ALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)或ZFNS(锌指核酸酶)的形式。所述免疫检查点相关蛋白选自由下列各项组成的组：PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOS配体、B7-H3、B7-H4、4-1BBL、HVEM、OX40L、CD70、CD40L、半乳凝集素-9、腺苷、GITRL、IDO、TDO、CEACAM1、VISTA、CD47、CD155、CD48、HHLA2、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTNL3、BTNL9、PD-1、CTLA-4、CD28、ICOS、4-1BB、BTLA、CD160、LIGHT、LAG3、OX40、CD27、CD40、TIM-3、腺苷A2a受体、GITR、CEACAM1、SIPR-α、DNAM-1、TIGIT、CD96、2B4、TMIGD2和DC-SIGN。适宜的拮抗剂包括，但不限于CTLA-4拮抗剂、维罗非尼(vermurafenib)、伊匹单抗(ipilimumab)、达卡巴嗪(dacarbazine)、IL-2、替莫唑胺(temozolomide)、伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、舒尼替尼(sunitinib)、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostins)、PD-1激动剂/拮抗剂和特拉替尼(telatinib)。在一个实施方案中，所述拮抗剂是抗体，诸如CTLA-4拮抗剂、阿维鲁单抗(avelumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、伊匹单抗、德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、纳武单抗(nivolumab)和PD-1激动剂/拮抗剂。在本发明的其他实施方案中，核酸进行密码子优化从而与没有进行这样的优化的编码相同蛋白的核酸相比产生更稳定的mRNA。

在另一个实施方案中，所述免疫检查点拮抗剂包含至少一组能够削弱或消除免疫检查点相关蛋白的表达的编码CRISPR-CAS9的核酸序列，所述免疫检查点相关蛋白选自由下列各项组成的组：PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOS配体、B7-H3、B7-H4、4-1BBL、HVEM、I类MHC、II类MHC、OX40L、CD70、CD40L、半乳凝集素-9、腺苷、GITRL、IDO、TDO、CEACAM1、VISTA、CD47、CD155、CD48、HHLA2、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTNL3、BTNL9、PD-1、CTLA-4、CD28、ICOS、4-1BB、BTLA、CD160、LIGHT、LAG3、OX40、CD27、CD40、TIM-3、腺苷A2a受体、GITR、CEACAM1、SIPR-α、DNAM-1、TIGIT、CD96、2B4、TMIGD2和DC-SIGN。在此实施方案中，所述免疫检查点拮抗剂可以进一步包含至少一种靶向编码免疫检查点相关蛋白的基因的向导RNA。

根据本发明，所述抗原可以是自身抗原、外源抗原或新抗原。其可以是肿瘤相关抗原，诸如睾丸癌相关抗原。在本发明的实施方案中，抗原是衍生自下述的肽：MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、-联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白/亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

根据一个实施方案，本发明的组合物包含以编码抗原的核苷酸序列的形式存在的抗原。因此，编码抗原的核苷酸序列存在于载体上，所述载体与免疫检查点拮抗剂的递送一起被递送到患者。

在另一个实施方案中，所述抗原可以包含至少一种新抗原多肽，所述新抗原多肽相对于野生型是突变的。此突变的多肽可以结合I类MHC或II类MHC分子。而且，新抗原多肽中相对于野生型的突变任选地通过对肿瘤细胞的基因组的一部分测序并且将该肿瘤序列与健康供体细胞的基因组的对应部分比较而鉴定。在一个实施方案中，所述测序通过二代测序(NGS)完成。

在本发明的范围内的新抗原可以存在于特定的患者群体和肿瘤类型。任选地，其由癌基因编码。在一个实施方案中，所述抗原被T细胞受体(TCR)识别。

本发明的组合物可以包含至少一种编码至少一种免疫检查点拮抗剂的核酸和至少一种编码至少一种抗原的核酸。在本发明的实施方案中，免疫检查点拮抗剂和抗原由相同的核酸分子编码。在另一个实施方案中，免疫检查点拮抗剂和抗原由不同的核酸分子编码。所述组合物可以包含单个、两个或更多个质粒或核酸分子。

本发明的组合物可以进一步包含佐剂。在本发明的实施方案中，佐剂选自由下列各项组成的组：montanide ISA-51、QS-21、破伤风辅助肽、GM-CSF、环磷酰胺、卡介菌(BCG)、小棒杆菌(corynbacterium parvum)、左旋咪唑(levamisole)、azimezone、isoprinisone、二硝基氯苯(DNCB)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、矿物凝胶、氢氧化铝(Alum)、溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronic polyols)、多聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚和白喉毒素(DT)。

本发明的组合物被递送到需要治疗性或预防性治疗的患者。在本发明的一个方面，所述组合物可以包含已经在体外被操作以插入所述至少一种免疫检查点拮抗剂和所述至少一种抗原的细胞。这样的细胞可以是患者自体的或异体的。优选地，所述细胞是自体的。在另一个实施方案中，所述细胞是抗原递呈细胞(APC)。

本发明进一步针对治疗需要本发明的组合物的患者的方法。例如，患者可以患有疾病，所述疾病是增生性疾病，诸如癌症。本公开的主题的组合物可以在一些实施方案中用作癌症的治疗，并且更具体地用于黑色素瘤、白血病、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌或肺鳞癌、肉瘤、肾细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状肿瘤、脑癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌。

在本发明的实施方案中，治疗患者的方法将相对于不采用所述组合物的标准治疗导致癌症肿瘤大小减少至少或大约10-20％。在另一个实施方案中，治疗患者以预防增生性疾病,诸如癌症。

在另一个实施方案中，所述组合物可以包含疫苗递送载体，例如，改良安卡拉痘苗病毒(MVA)、腺相关病毒(AAV)或慢病毒载体，或表达自身抗原和免疫检查点蛋白的纳米粒子。在一个实施方案中，所述载体还可以编码至少一种其他的免疫抑制性细胞因子/蛋白，诸如IL-1Ra、IL-4、IL-10、IL-11、IL-13、TGF-b、IL-33、IL-35、IL-37等。

上述实施方案中的自身抗原可以包括，但不限于，组氨酸-tRNA连接酶、核糖核蛋白、snRNP核心蛋白、I型拓扑异构酶、组蛋白、核孔蛋白62、Sp100核抗原、核孔蛋白210Kda、肌动蛋白、环瓜氨酸肽、凝血酶、外切体复合物蛋白、烟碱性乙酰胆碱受体、肌肉特异性激酶、电压门控钙通道、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、TSH受体、神经元核蛋白、谷氨酸受体、双载蛋白(amphiphysin)、谷氨酸脱羧酶、塌陷反应介导蛋白5、N-甲基-D-天冬氨酸受体、水通道蛋白，并且还包括来自文献中充分描述的抗体分析技术的个体特异性自身抗体(ISA)。其还包括与器官移植排斥相关的供体抗原。

本发明公开的主题的组合物在一些实施方案中可以用作自身免疫性疾病的治疗，并且更具体地用于系统性红斑狼疮、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、SLE、混合结缔组织病、原发性胆汁性肝硬化、乳糜泻、类风湿性关节炎、重症肌无力、硬化性肌炎、格雷夫斯病(Graves disease)、桥本氏甲状腺炎、副肿瘤性小脑变性、边缘叶脑炎、脑脊髓炎、舞蹈手足徐动症、亚急性感觉神经元病、僵人综合征、1型糖尿病、视神经病变、舞蹈症和德维克氏综合征(Devics syndrome，视神经脊髓炎)。

本发明公开的主题的组合物在一些实施方案中要可以用作器官移植排斥的治疗。以此方式，移植排斥相关抗原包括，但不限于，所有供体不匹配的HLA类型和非-HLA抗原。供体不匹配的HLA类型可以使用公共可获得的计算机算法来鉴定，所述计算机算法在表位水平确定HLA匹配(例如，HLAMatchmaker)，诸如HLA AI(Eplet163RG)、A1+A36(44KM₂)、A2(66RKH)、A2+A28(142MT)、A2+A69(107W)、A3(161D)、A9(66GKH)、A10(149TAH)、A11(151AHA)、A25+A32(76ASI)、A29(62LQ)、A30(152RW)、A30+A31(56R)、A31+A33(73ID)、A68(245VA)、B5+B35(193PV)、B7(177DK)、B8+Cw7(9D)、B12(167ES)、B13(144QL)、B15(163LW)、B16(158T)、B17(71SA)、B18(30G)、B18+B35(44RT)、B27(71KA)、B40(44RK)、B44(199V),B48(245TA)、Bw4(82LR)、Bw6(80ERN)、Cwl(6K)、Cw2(211T)、Cw3(173K)、Cw4(17WR)、DR51(96EN₃)、Cw5+8(138K)、Cw7(193PL)、DR1(12LKF₂)、DR1+10(13FEL)、DR1+51(96EV)、DR2(142M₂)、DR3(74R)、DR4(96Y2)、DR3+6(31YYFH)、DR7(25Q₃)、DR7+9(78V2)、DR8(25YRF)、DR8+12(16Y)、DR9(13FEY)、R10(40YD₂)、DR11(57DE)、DR12(37L)、DR13(71DEA)、DR14(57AA)、DR15(71A)、DR17(26TYD)、DR51(96EN₃)、DR52(98Q)、DR53(48YQ6)、DQ7+9(56PPD)、DQ8(56PPA)、DQ7(45EV)、DQ6(125G)、DQ5(74SR₃)、DQ4(56L₂)、DQ3MICA、(55PP)、DQ2(45GE₃)和DQ1(52PQ₂)。非HLA抗原包括，但不限于，VACM1、ICAM1、波形蛋白、心肌肌球蛋白、V型胶原蛋白、k-α1微管蛋白和血管紧张素II受体I型。

在另一个实施方案中，本发明针对生成动物自身免疫性疾病模型的方法，该方法包括向动物施用本发明的包含抗原的组合物。在此方法中，动物的免疫系统用一种或多种免疫检查点拮抗剂针对所述抗原进行调节。在另一个实施方案中，所述抗原是自身抗原。

附图说明

当结合后续的详细描述考虑时，可以参考附图获得对本发明公开的主题的更完全的理解。在附图中图示的实施方案意在仅是示例性的，并且不应该被理解为将本发明公开的主题限于图示的实施方案。

图1描绘了在本发明范围内的包含拮抗剂和抗原的载体的备选实施方案，所述载体包含在CMV启动子控制下的CRISPR-Cas9蛋白、在T7启动子控制下的向导RNA和在hEFla启动子控制下的β-淀粉样蛋白。备选方案包括将β-淀粉样蛋白置换为Her2/Neu或MUC1和/或WT1和/或CEA。

图2描绘了载体的备选实施方案，所述载体包含由CMV启动子表达的CRISPR-Cas9蛋白、由T7启动子表达的两个向导RNA和由h-EFla启动子表达的Her2/Neu。显示的备选方案包括将β-淀粉样蛋白置换为截短的PDL1、Her2/Neu、或MUC1和/或WT1和/或CEA。在此配置中，两个免疫检查点相关蛋白将被削弱或消除。

图3描绘了载体的备选实施方案，所述载体包含由CMV启动子表达的CRISPR-Cas9蛋白、由T7启动子表达的针对PDL1的向导RNA和由α病毒复制子的亚基因组启动子表达的β-淀粉样蛋白。

图4描绘了本发明的构建DNA载体的实施方案，其中PDL1和/或CTLA4蛋白在CMV启动子的控制下，PDL1蛋白在PGK启动子的控制下，BRAF在hEFla启动子的控制下表达和/或肽基精氨酸脱亚胺酶-4蛋白在SV40启动子的控制下表达。

图5描绘了包含在CMV启动子控制下表达的CTLA4蛋白、在PGK启动子的控制下表达的PDL1抗原、在hEFla启动子控制下表达的VACM1和/或在SV40启动子控制下表达的供体不匹配的HLA DQ7+9(56PPD)的构建体。

具体实施方式

本发明针对包含至少一种免疫检查点拮抗剂和少一种抗原的组合物和方法。

I.定义

尽管相信下面的术语被本领域普通技术人员所充分理解，但给出下面的定义以助于对本发明公开的主题的解释。

本文使用的所有技术和科学术语，除非下面另外定义，否则均意在具有与本领域普通技术人员所普遍理解的相同的含义。对本文所采用的技术的提及意在是指如本领域所普遍理解的技术，包括对于本领域技术人员来说显而易见的那些技术的变化形式或等效技术的替代。尽管相信下面的术语被本领域普通技术人员所充分理解，但给出下面的定义以助于对本发明公开的主题的解释。

根据长期的专利法惯例，术语“一个”、“一种”和“该”当在本申请(包括权利要求书)中使用时是指“一个或多个/一种或多种”。因此，在一些实施方案中，短语“肽”是指一种或多种肽。

术语“大约”当在本文中使用时是指可测量值，诸如重量、时间、剂量(例如，治疗剂量)等的量，在一些实施方案中其意在涵盖偏离指定量的+/-20％的变化，在一些实施方案中+/-10％的变化，在一些实施方案中+/-5％的变化，在一些实施方案中+/-1％的变化，在一些实施方案中+/-0.1％的变化，在一些实施方案中+/-0.5％的变化,以及在一些实施方案中+/-0.01％的变化，因为这样的变化适合执行本发明公开的方法。

当在本文中使用时，术语“和/或”当在实体列表的上下文中使用时，是指所述实体单个存在或以任意可能的组合或子组合存在。因此，例如，短语“A、B、C和/或D”包括单独的A、B、C和D，而且也包括A、B、C和D的任意和全部组合和子组合。

术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指任意长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是线性的或带分支的，其可以包括修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸隔开。该术语还涵盖已经被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任意的其他操作或修饰，诸如，与标记元件缀合。该定义内还包括，例如，含有氨基酸的一个或多个类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域中已知的其他修饰。要理解的是，因为本发明的多肽基于抗体，因此多肽可以作为单链或缔合链出现。

“多核苷酸”或“核酸”或“核苷酸序列”当在本文中可互换使用时是指任意长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物，或可以被DNA或RNA聚合酶掺入到聚合物中的任意底物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸以及它们的类似物。如果存在，可以在聚合物的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸元件隔开。多核苷酸可以在聚合后被进一步修饰，诸如通过与标记元件缀合。其他类型的修饰包括，例如，“帽”，用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间的修饰诸如，例如，具有无电荷键(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)的那些和具有带电荷键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有悬垂部分的那些，诸如，例如，蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)，具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些，含有烷化剂的那些，具有修饰的键的那些(例如，α异头核酸等)，以及多核苷酸的未修饰形式。此外，糖类中普遍存在的任一个羟基可以被例如，磷酸酯基、磷酸基替换，被标准的保护基保护，或被活化以制备连接额外的核苷酸的额外键，或可以缀合于固相载体。5′和3′末端OH可以被磷酸化或用胺或1-20个碳原子的有机封端基团部分置换。其他羟基也可以被衍生化为标准的保护基。多核苷酸还可以含有本领域中通常知晓的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括，例如，2′-O-甲基-，2′-O-烯丙基，2′-氟-或2′-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-异头糖类、差向异构糖类诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖糖类，呋喃糖糖类，景天庚酮糖，无环类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。一个或多个磷酸二酯键可以被备选的连接基团替换。这些备选的连接基团包括，但不限于，其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、(O)NR₂(“酰胺酯”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH₂(“甲缩醛(formacetal)”)替换的实施方案，其中每个R或R′独立地是H或是任选地含有醚(—O—)键的取代的或未取代的烷基(1-20C)、芳基、链烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。多核苷酸中的所有键不需要是相同的。前面的叙述适用于在本文中提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“优先地结合”或“特异性地结合”(在本文中可互换使用)抗体或多肽的表位是在本领域中被充分理解的术语，并且确定这样的特异性的或优先的结合的方法也是本领域中所熟知的。如果与备选细胞或物质相比，分子与特定的细胞或物质的反应或缔合更频繁、更迅速、具有更长的持续时间和/或更大的亲和性，则该分子被称为表现出“特异性结合”或“优先结合”。如果同抗体与其他物质结合相比，抗体以更大的亲和力、抗体亲抗原性、更容易地、和/或具有更长的持续时间结合靶标，则该抗体“特异性地结合”或“优先地结合”所述靶标。例如，特异性地或优先地结合特定表位的抗体是与其他非特定表位结合相比以更大的亲和力、抗体亲抗原性、更容易地、和/或具有更长的持续时间结合此表位的抗体。通过阅读此定义还要理解，例如，特异性或优先地结合第一靶标的抗体(或部分或表位)可以特异性地或优先地结合第二靶标或可以不特异性地或优先地结合第二靶标。就其本身而言，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可以包括)专一结合。通常，但非必须地，提及结合意指优先结合。

当在本文中使用时，“治疗”是获得有益的或需要的临床结果的方式。为了本发明的目的，有益的或需要的临床结果包括，但不限于，下列中的一种或多种：在消除增生性病症诸如癌症、神经变性病症诸如阿尔兹海默病、自身免疫性疾病、感染性疾病或器官移植排斥的症状的任何方面的改善。

“减轻”癌症的一个或多个症状意指与不施用本发明的包含免疫检查点拮抗剂与抗原的组合的组合物相比，减少或改善癌症患者的一个或多个症状。“减轻”通常还包括缩短或减少症状的持续时间。

头痛的“发展”或“进展”意指病症的初始表现和/或随后的进展。头痛的发展可以使用本领域中熟知的标准临床技术检测到和评估。然而，发展还指可能是无法检测到的进展。为了本发明的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。当在本文中使用时，头痛的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。

“个体”或“受试者”是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物还包括，但不限于，家畜、运动动物、宠物、灵长类动物、马、犬、猫、小鼠和大鼠。

当在本文中使用时，“载体”意指构建体，所述构建体能够在宿主细胞中递送、且优选地表达一种或多种目的基因或序列。载体的实例包括，但不限于，病毒载体，例如，MVA、AAV和慢病毒，裸DNA或RNA表达载体，质粒，粘粒或噬菌体载体，与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体，包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞，诸如生产细胞。

“拮抗剂”是指干扰或抑制另一物质的生理作用的物质。因此，“免疫检查点拮抗剂”将涵盖干扰递送此类拮抗剂的患者中的免疫检查点相关蛋白的生理作用的任何物质。

“靶肽或核酸组合物”是指包含本发明的肽(或包含如上所定义的氨基酸的聚合物)的组合物，其可以是所述组合物的免疫检查点拮抗剂和/或抗原，或编码该靶肽的核酸序列。因此，“靶肽或核酸组合物”是指肽形式或核酸形式的拮抗剂和/或抗原。

II.免疫检查点拮抗剂

免疫检查点相关蛋白调节某些免疫系统细胞(诸如T细胞)的免疫激活。检查点相关蛋白帮助抑制免疫应答并且可以防止这些免疫系统细胞杀死感染的细胞或癌性细胞。然而，免疫检查点相关蛋白的抑制剂可以阻断和抑制免疫系统遏制，从而允许T细胞更好地攻击和杀死感染的细胞或癌细胞。

免疫检查点相关蛋白可以包括配体或它们各自的受体。例如，免疫检查点相关蛋白包括，但不限于，CTLA-4、PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOS配体、B7.1/2、B7-H3、B7-H4、4-1BBL、HVEM、I类MHC、II类MHC、OX40L、CD70、CD40L、半乳凝集素-9、腺苷、GITRL、IDO、TDO、CEACAM1、VISTA、CD40、CD47、CD155、CD48、HHLA2、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTNL3、BTNL9、PD-1、CTLA-4、CD28、ICOS、4-1BB、BTLA、CD160、LIGHT、LAG3、OX40、CD27、CD40、TIM-3、腺苷A2a受体、GITR、CEACAM1、SIPR-α、DNAM-1、TIGIT、CD96、2B4、TMIGD2、DC-SIGN、4.1BBL、A2Ar、BTNL2、CD30、CD244、CSFIR、CXCR4-CXCL12、ICOSL、IgSF、ILTs、LIK、MICA/MICB、神经毡蛋白、NKG2A、磷脂酰丝氨酸、Siglec3、TGF-B、TLIA和TNFRSF25。

在本发明的一些实施方案中，免疫检查点相关蛋白是配体诸如PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOS配体、B7-H3、B7-H4、4-1BBL、HVEM、I类MHC、II类MHC、OX40L、CD70、CD40L、半乳凝集素-9、腺苷、GITRL、IDO、TDO、CEACAM1、VISTA、CD47、CD155、CD48、HHLA2、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTNL3和BTNL9。在本发明的另一个方面，免疫检查点相关蛋白是可溶性受体，包括但不限于PD-1、CTLA-4、CD28、ICOS、4-1BB、BTLA、CD160、LIGHT、LAG3、OX40、CD27、CD40、TIM-3、腺苷A2a受体、GITR、CEACAM1、SIPR-α、DNAM-1、TIGIT、CD96、2B4、TMIGD2和DC-SIGN。

免疫检查点拮抗剂或抑制剂以减少、干扰、损害或以其他的方式消除检查点蛋白表达或发挥功能的能力的方式与免疫检查点相关蛋白相互作用。拮抗剂可以通过与配体或受体竞争结合，或以其他的方式干扰免疫检查点相关蛋白的表达来起作用。优选地，拮抗剂是针对靶免疫检查点的敲除元件。拮抗剂可以是生物治疗分子或小分子。例如，拮抗剂可以是肽。肽可以以小分子/多肽的形式或作为编码肽的载体或涂覆在纳米/微米粒子上递送。在一些实施方案中，免疫检查点拮抗剂是对免疫检查点相关蛋白特异的单克隆抗体、人源化抗体、完全人抗体、融合蛋白或其组合。在另一个实施方案中，拮抗剂是竞争配体或受体的结合的蛋白。

合适的拮抗剂包括，但不限于，CTLA-4拮抗剂、维罗非尼、伊匹单抗、达卡巴嗪、IL-2、替莫唑胺、伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、舒尼替尼、酪氨酸磷酸化抑制剂、PD-1激动剂/拮抗剂和特拉替尼。

在本发明的一些方面，拮抗剂以核酸的形式递送到有需要的患者。在本发明的其他实施方案中，核酸进行密码子优化从而与没有进行这样优化的编码相同蛋白的核酸相比产生更稳定的mRNA。拮抗剂可以在病毒或非病毒载体中递送。在一个实施方案中，载体是裸DNA、质粒、脂质体或纳米粒子。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，诸如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、单纯疱疹病毒或α病毒。在另一实施方案中，载体是病毒和非病毒载体的组合，诸如在脂质体中的AAV病毒的递送。本发明的病毒和非病毒递送载体可以使用本领域技术人员熟知的技术制备。这样的技术可容易地在例如，Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecule Cloning:A Laboratory Manual,第三版(1994)；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(1992)；Miller和Calos(编辑),GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(1987)；Kriegler,Gene Transfer andExpression:A Laboratory Manual(1991)中获得，所有这些文献均通过引用并入本文。

作为核酸的拮抗剂的递送可以包括允许敲除方法的系统，诸如对患者细胞的基因编辑。例如，在一个实施方案中，本发明的组合物可以进一步包括CRISPR-Cas9系统。在此实施方案中，包含编码所述拮抗剂的核酸的组合物进一步包含编码Cas9酶的核酸与向导RNA的组合，所述编码Cas9酶的核酸任选地连接有转录调控因子。向导RNA促进Cas9蛋白的酶活性，如本领域中已知的那样，并且例如，在WO2017023974中显示，WO2017023974通过引用并入本文。所述组合物可以备选地进一步包含核酸，所述核酸是反式激活crRNA(tracrRNA)或CRISPR RNA(crRNA)或其组合。备选地，敲除方法可以包括siRNA、dsRNA、微小RNA、核酶、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)和ZFNS(锌指核酸酶)。

所述拮抗剂以有效提高对免疫应答的致敏、提高免疫应答的有效性和/或获得在APC中的过表达从而诱发针对所述组合物中存在的抗原的免疫性的量递送。因此，拮抗剂将调控免疫检查点相关蛋白以解除免疫抑制或激活例如由自身组织、针对肿瘤的免疫效应(T)细胞引发的免疫系统。在新抗原与检查点拮抗剂组合的情况下，所述组合物将下调免疫检查点相关蛋白的活性并且(1)引发对新抗原表位的免疫识别或致敏；(2)扩充新抗原特异性T记忆细胞克隆的丰度；和(3)通过扩充患者中已经存在的针对特定抗原的记忆T细胞或通过致敏天然T细胞针对所述新抗原，来增加整个T细胞库中抗-新抗原T细胞克隆的比率。在自身抗原与检查点拮抗剂组合的情况下，所述组合物将上调APC内检查点相关蛋白的活性从而诱发对自身抗原表位的免疫耐受。

II.抗原

本发明针对进一步包含抗原或抗原肽(例如，表位)的组合物。优选地，所述抗原或抗原肽被自体T细胞识别。任意抗原可以在本发明中使用，其在肿瘤细胞或感染细胞的表面上展示或被检测到。此类抗原包括外源抗原和自身抗原两者。在许多情况下，患者将这种抗原识别为“非自身的”或外来的。抗原可以是野生型抗原或相对于其野生型突变的抗原；或可以是相对于野生型翻译后差别修饰的。

根据本发明，所述抗原可以是自身抗原或外源抗原。在本发明的实施方案中，所述抗原是肿瘤相关抗原，诸如睾丸癌相关抗原。所述抗原可以是新抗原，并且具体地是癌新抗原。癌新抗原是在肿瘤细胞中出现的由基因突变生成的肿瘤特异性抗原。存在着在恶性转化期间发生的患者特异性体细胞突变并且可特别地用于本发明中。

被T细胞识别的抗原，无论是辅助T淋巴细胞还是CTL，都不被认为是完整的蛋白，而是与细胞表面上的I类或II类MHC蛋白缔合的小肽。在天然发生的免疫应答的过程期间，与抗原递呈细胞(APC)上的I类或II类MHC分子缔合而被识别的抗原从细胞外部被获取，内化并被加工成与I类或II类MHC分子缔合的小肽。

产生与I类MHC分子缔合而被识别的蛋白的抗原通常是在细胞内产生的蛋白，并且这些抗原被加工并与I类MHC分子缔合。现在要理解与指定的I类或II类MHC分子缔合的肽被表征为具有共同结合基序，并且已经确定了用于大量不同的I类和II类MHC分子的结合基序。还可以合成与指定的抗原的氨基酸序列对应并且含有用于指定的I类或II类MHC分子的结合基序的合成肽。然后这些肽可以添加至适宜的APC，并且所述APC可以用来在体外或体内刺激T辅助细胞或CTL应答。结合基序，用于合成肽的方法，以及用于刺激T辅助细胞或CTL应答的方法均是本领域普通技术人员所公知的并且容易获得的。

在本发明的实施方案中，所述抗原是衍生自下述的肽：MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、b-淀粉样蛋白、CA125、CD40、EGFR、G17DT、GD2/3L、gp100、IMA950、KOC1、肽基精氨酸脱亚胺酶-4、MUC-1、OFA、PANVAC、PAP、PSA、PSMA、SL701、SSX-2、TTK、TACAS、URLC10、vEGFR、WT-1、BRAF、假单胞菌外毒素A或白喉毒素。在一个实施方案中，所述抗原选自患者特异性新抗原或b-淀粉样蛋白或具有高突变负荷的肿瘤抗原。

在另一个实施方案中，所述抗原存在于患有癌症的患者的癌细胞上，所述癌症诸如黑色素瘤、白血病、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌或肺鳞癌、肉瘤、肾细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状肿瘤、脑癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌。

在本发明的特定实施方案中，所述抗原是弱抗原，当在检查点拮抗剂的存在下组合时其免疫应答增强。例如，在治疗乳腺癌的方法中，所述抗原可以是HER-2/neu。此类HER-2/neu抗原的实例可公共地获得，并且包括HER-2/neu的突变，包括，但不限于HER-2激酶结构域突变G309A、D769H、D769Y、V777L、P780ins、V842I和R896C突变。在另一个实施方案中，在治疗自身免疫反应的方法中，所述抗原是细胞毒性蛋白，诸如假单胞菌外毒素A或白喉毒素。在另一个实施方案中，在治疗或预防阿尔茨海默病和癌症的方法中，所述抗原是β-淀粉样蛋白抗原。另一实施方案针对在治疗诸如膀胱癌和非小细胞肺癌的疾病的方法中使用针对PDL1的自身抗体和靶向PDL1和/或CTLA-4的向导RNA。

在另一个实施方案中，所述抗原可以对自身免疫性疾病特异。在这种情况下，所述抗原可以与系统性红斑狼疮、干燥综合征、SLE、混合结缔组织病、原发性胆汁性肝硬化、乳糜泻、类风湿性关节炎、重症肌无力、硬化性肌炎、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、副肿瘤性小脑变性、边缘叶脑炎、脑脊髓炎、舞蹈手足徐动症、亚急性感觉神经元病、僵人综合征、1型糖尿病、视神经病变、舞蹈症或德维克氏综合征(视神经脊髓炎)相关。

另一实施方案包括使用与移植排斥相关的抗原。以此方式，移植排斥相关抗原包括，但不限于，根据公共可获得的计算机算法得到的所有供体不匹配的HLA类型，所述计算机算法在表位水平确定HLA匹配(例如，HLAMatchmaker)，诸如HLA AI(Eplet163RG)、A1+A36(44KM₂)、A2(66RKH)、A2+A28(142MT)、A2+A69(107W)、A3(161D)、A9(66GKH)、A10(149TAH)、A11(151AHA)、A25+A32(76ASI)、A29(62LQ)、A30(152RW)、A30+A31(56R)、A31+A33(73ID)、A68(245VA)、B5+B35(193PV)、B7(177DK)、B8+Cw7(9D)、B12(167ES)、B13(144QL)、B15(163LW)、B16(158T)、B17(71SA)、B18(30G)、B18+B35(44RT)、B27(71KA)、B40(44RK)、B44(199V)、B48(245TA)、Bw4(82LR)、Bw6(80ERN)、Cwl(6K)、Cw2(211T)、Cw3(173K)、Cw4(17WR)、DR51(96EN₃)、Cw5+8(138K)、Cw7(193PL)、DR1(12LKF₂)、DR1+10(13FEL)、DR1+51(96EV)、DR2(142M₂)、DR3(74R)、DR4(96Y2)、DR3+6(31YYFH)、DR7(25Q₃)、DR7+9(78V2)、DR8(25YRF)、DR8+12(16Y)、DR9(13FEY)、R10(40YD₂)、DR11(57DE)、DR12(37L)、DR13(71DEA)、DR14(57AA)、DR15(71A)、DR17(26TYD)、DR51(96EN₃)、DR52(98Q)、DR53(48YQ6)、DQ7+9(56PPD)、DQ8(56PPA)、DQ7(45EV)、DQ6(125G)、DQ5(74SR₃)、DQ4(56L₂)、DQ3 MICA、(55PP)、DQ2(45GE₃)、DQ1(52PQ₂)。另外，可以在本发明中使用的非-HLA抗原包括，但不限于，VACM1、ICAM1、波形蛋白、心肌肌球蛋白、V型胶原蛋白、k-α1微管蛋白和I型血管紧张素II受体。

另外的合适的自身抗原包括，但不限于，组氨酸-tRNA连接酶、核糖核蛋白、snRNP核心蛋白、I型拓扑异构酶、组蛋白、核孔蛋白62、Sp100核抗原、核孔蛋白210Kda、肌动蛋白、环瓜氨酸肽、凝血酶、外切体复合物蛋白、烟碱性乙酰胆碱受体、肌肉特异性激酶、电压门控钙通道、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、TSH受体、神经元核蛋白、谷氨酸受体、双载蛋白、谷氨酸脱羧酶、塌陷反应介导蛋白5、N-甲基-D-天冬氨酸受体和水通道蛋白。本发明进一步包括使用被个体特异性自身抗体(ISA)识别的抗原，如使用本领域中已知的抗体分析技术鉴定。在另一个实施方案中，本发明包括与器官移植排斥有关的供体抗原。

根据一个实施方案，本发明的组合物包含编码抗原或表位的抗原核苷酸序列。因此，编码所述抗原的核苷酸序列可以存在于载体上，所述载体与免疫检查点拮抗剂的递送一起被递送到患者。值得注意的是，一种或多种抗原肽可以在所述组合物中递送。

在另一个实施方案中，所述抗原可以包含至少一种相对于野生型突变的新抗原多肽。此突变多肽可以结合于I类MHC或II类MHC分子。

本发明的范围内的新抗原可以存在于特定的患者群体和肿瘤类型中。这些是患者特异性突变，并且因此，本发明涵盖鉴定用于单个患者的新抗原。任选地，其由癌基因编码。在一个实施方案中，所述抗原由T细胞受体(TCR)识别。在一些实施方案中,新抗原多肽中相对于野生型的突变任选地通过本领域中所公知的大规模平行测序、表位预测算法或用于表位验证的体外T细胞测定来鉴定。测序可以通过对肿瘤细胞的基因组的一部分测序并且将该肿瘤序列与健康供体细胞的基因组的对应部分比较来进行。优选地，测序通过二代测序(NGS)来完成。

III.组合物

在一些实施方案中，本发明公开的主题的组合物可以包含大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、50-55、55-65、65-80、80-120、90-150、100-175或175-250种不同的检查点拮抗剂和/或抗原。

短语“拮抗剂/抗原组合物”当在本文中使用时是指至少一种针对免疫检查点相关蛋白的检查点拮抗剂与本发明的抗原组合，其被配制为例如，免疫原性组合物，诸如疫苗；或配制为用于以使得致敏的(pulsed)细胞(例如，树突细胞)在过继性T细胞治疗的情况下将在其表面上向T细胞展示所述组合物的至少一种抗原肽的方式使细胞致敏的制剂。检查点拮抗剂和抗原可以是肽，它们可以是相同的或不同的。拮抗剂可以作为小分子、核酸、肽或蛋白递送，条件是其发挥作用以消除、损害或以其他的方式破坏免疫检查点相关蛋白的功能或表达。所述抗原可以作为核酸、肽或蛋白递送。所述抗原被选择为与所述拮抗剂组合以调节(例如，上调或下调)患者的免疫系统。在一些实施方案中,免疫系统响应于抗原与免疫检查点拮抗剂的组合被致敏、诱导或增强。

本发明的组合物涵盖此类拮抗剂/抗原组合物的任意变化形式。优选地，所述拮抗剂/抗原组合物是核酸。在另一个实施方案中，所述拮抗剂/抗原组合物在一个或多个载体中递送。

本发明公开的主题的组合物在一些实施方案中可以包括I类MHC特异性肽作为抗原，而且还可以包含一种或多种对II类MHC特异的抗原肽，或其他与肿瘤相关的肽(例如，肿瘤相关抗原("TAA"))，诸如，但不限于，表2中公开的那些。

包含抗原肽的组合物可以通过合成制备或通过纯化从生物来源制备。它们可以经重组制备。合乎需要地是，在一些实施方案中它们的纯度为至少90％，在一些实施方案中纯度为至少92％，在一些实施方案中纯度为至少93％，在一些实施方案中纯度为至少94％，在一些实施方案中纯度为至少95％，在一些实施方案中纯度为至少96％，在一些实施方案中纯度为至少97％，在一些实施方案中纯度为至少98％，以及在一些实施方案中纯度为至少99％。对于人的施用，它们通常不含有可能对人受者有害的其他组分(本文中称作“对于在人中使用是药学上可接受的”)。所述组合物典型地不包含细胞，不包含人细胞和重组生产细胞两者。然而，如下面所述，在一些情况下，其可以合乎需要地用靶肽负载树突细胞并且使用这些负载的树突细胞本身作为免疫治疗剂或使用这些负载的树突细胞作为离体刺激患者T细胞的试剂。受刺激的T细胞可以用作免疫治疗剂。

在某些情况下，可以合乎需要地向所述组合物添加附加的抗原蛋白或抗原肽，例如，制成具有刺激许多不同HLA类型宿主中的免疫应答的能力的混合物。备选地，附加的蛋白和/或肽可以提供单一宿主内的相互作用功能，诸如但不限于佐剂功能或稳定功能。作为非限制性实例，肿瘤抗原可以与抗原肽混合使用使得在单一患者中诱发多种不同的免疫应答。

抗原肽向哺乳动物受者的施用可以使用长抗原肽(例如，大于15个残基)，和/或使用负载抗原肽的树突细胞(Melief,2009.)来实现。在一些实施方案中,施用靶肽的直接目标是诱导受试者中的CD8⁺T细胞的激活。可以同时或时间上接近地(诸如但不限于彼此在3、5、7、10、14、17或21天内，或甚至更长)施用至同一受试者的附加组分包括TLR-配体寡核苷酸CpG和具有至少6个氨基酸残基的重复序列的相关的抗原肽。为了确保功效，哺乳动物受者应当表达适当的人HLA分子以结合靶肽。例如，转基因哺乳动物可以用作受者，如果它们表达适当的人HLA分子。如果哺乳动物自身的免疫系统识别类似的靶肽，则其可以直接用作没有引入转基因的模型系统。有用的模型和受者可以处于发生转移癌，诸如转移性黑色素瘤的增加风险中。其他有用的模型和受者可以易于(例如，遗传上和/或环境上)发生黑色素瘤或其他癌症。

III.A.拮抗剂和抗原的选择

本文公开了下面的发现：如在健康个体和患病个体中检测到的那样，免疫应答可以被检查点拮抗剂和抗原肽增强，优选地，抗原肽是在癌细胞表面上发现或检测到的那些。与这些免疫应答相关的T细胞能够识别并杀死恶性组织(已建系的细胞系和原代肿瘤样品两者)。

当选择本发明公开的主题的抗原包括在免疫治疗中，例如，在过继性细胞治疗中或在疫苗的情况下，一些实施方案中可以在使用下面标准中的一个或多个来挑选靶肽：1)与特定的疾病/移植排斥/癌症/肿瘤细胞类型相关的肽；2)来源于与细胞增殖、转化和/或恶性相关的基因产物(例如，多肽)的肽；3)对待治疗患者组携带的HLA等位基因特异的肽；和/或4)能够在首次暴露于包含所选择的靶肽的组合物后在待治疗患者中诱发靶肽特异性记忆T细胞应答的肽。

III.B.抗原肽疫苗

检查点拮抗剂和抗原肽和编码拮抗剂和/或抗原的核酸也可以被用在被设计用于对个体接种疫苗的组合物中。这些肽同时或相继地一起递送。此外，有可能的是所述拮抗剂作为小分子、肽、蛋白或编码肽或蛋白的核酸递送，而所述抗原作为肽、蛋白或编码抗原肽或蛋白的核酸递送。在一些实施方案中,所述拮抗剂和抗原肽单个地注射，或单独地注射，并且在一些实施方案中可以与佐剂和/或药学上可接受的载体组合施用。疫苗被设想通常用于预防和/或治疗某些疾病，并且特别是癌症。

在一些实施方案中，本发明公开的主题的拮抗剂/抗原组合物可以用作用于癌症的疫苗，并且更具体地用于黑色素瘤、白血病、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌或肺鳞癌、肉瘤、肾细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状肿瘤、脑癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌。备选地，所述疫苗可以用来保护免受器官移植、感染性疾病或自身免疫性疾病。

所述组合物包含抗原肽或编码抗原肽的核酸。在一些实施方案中，除了已经被鉴定的其他癌症抗原以外，本发明的疫苗组合物包含抗原肽，或本文公开的肽。所述组合物可以包含一种或多种抗原肽。

本发明公开的主题的疫苗组合物可以预防地使用用于预防当前未患有疾病的个体中疾病的发生、减少当前未患有疾病的个体中疾病的发生的风险和/或延缓当前未患有疾病的个体中疾病的发生的目的。备选地，它们可以用来治疗已经患有疾病的个体，使得所述疾病的复发或发展被延缓和/或预防。预防涉及预防的过程，其中在疾病的诱发或发作之前对所述个体进行免疫。例如，在一些实施方案中,具有疾病史的处于风险中的个体可以在疾病的发作之前进行免疫接种。

备选地，已经患有疾病的个体可以用本发明公开的主题的含抗原组合物免疫以便刺激免疫应答，所述免疫应答将针对所述疾病有反应性。临床上相关的免疫应答是其中疾病部分地或完全地消退并且从患者中消除的免疫应答，并且其还包括其中在疾病没有被消除的情况下疾病的进展被阻断的那些应答。类似地，预防不一定是全部地，但可以导致减少风险、延缓发作或延缓进展或转移。

在一些实施方案中,用本发明公开的主题的疫苗治疗的患者的5年存活率增加了统计学显著的量：例如，相对于平均5年生存率增加大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或甚至大于100％。

在一些实施方案中,与在提交本说明书时没有进行治疗的预期时间相比，本发明公开的主题的组合物在患有转移癌的患者中使生存率增加了统计学显著量的时间，诸如，但不限于，增加大约或至少0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.25、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0、8.25、8.5、8.75、9.0、9.25、9.50、9.75、10.0、10.25、10.5、10.75、11.0、11.25、11.5、11.75、或12个月或更多的时间。

在一些实施方案中,用本发明公开的主题的组合物治疗的患者的生存率(例如，1、2、3、4或5年存活率)相对于平均5年生存率增加统计学显著量，诸如但不限于大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或甚至大于100％。

在一些实施方案中，本发明公开的主题的组合物被设想引起T细胞相关免疫应答，诸如，但不限于生成对表达抗原肽/I类MHC的细胞特异的激活CD8⁺T细胞。在一些实施方案中，在向所述患者提供所述组合物后，对表达天然靶肽/I类MHC的细胞特异的CD8⁺T细胞对患者中的所述组合物中的至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种靶肽特异持续大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100天或更多天。

在一些实施方案中，用本发明公开的主题的组合物治疗的患者的治疗响应率相对于不采用所述组合物的治疗增加统计学显著的量，诸如，但不限于大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、07、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450或500％或更多。

在一些实施方案中,用本发明公开的主题的组合物治疗的患者的总中位数生存期相对于不采用所述组合物的治疗增加统计学显著的量，诸如，但不限于大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450或500％或更大。在一些实施方案中,用所述组合物治疗的癌症患者的总中位数生存期被设想为大约或至少10.0、10.25、10.5、10.75、11.0、11.25、11.5、11.75、12、12.25、12.5、12.75、13、13.25、13.5、13.75、14、14.25、14.5、14.75、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36个月或更多。

在一些实施方案中，用本发明公开的主题的组合物治疗的患者的肿瘤大小相对于不采用所述组合物的治疗减少统计学显著量，诸如，但不限于大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450或500％或更多。

在一些实施方案中,本发明公开的主题的组合物对基本上统计学显著量的用所述组合物治疗的患者提供了临床肿瘤消退，所述基本上统计学显著量诸如，但不限于用所述组合物治疗的患者的大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％。

在一些实施方案中,本发明公开的主题的组合物对基本上统计学显著量的用所述组合物治疗的患者提供对被治疗的癌症(例如，黑色素瘤)特异的CTL应答，所述基本上统计学显著量诸如，但不限于用所述组合物治疗的患者的大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％。

在一些实施方案中,本发明公开的主题的组合物与不用所述组合物治疗的患者的无进展生存期相比在被治疗的癌症(诸如但不限于黑色素瘤)中提供了无进展生存期的增加，所述增加为大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个月或更多。

在一些实施方案中,在大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15年或更多，或大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500周或更多的时期内对无进展生存期、CTL应答率、临床肿瘤消退率、肿瘤大小、生存率(诸如但不限于总生存率)和/或响应率中的一个或多个每周一次、每月一次、每两月一次、每季度一次、半年一次、每年一次和/或每两年一次进行确定、评估、计算和/或评价。

III.C.用于致敏T细胞的组合物

过继细胞转移(ACT)是细胞的被动转移，在一些实施方案中，免疫衍生细胞被动转移至受者宿主，目标是将免疫功能和特性转移到所述宿主中。在临床上，此种方式已经被利用来将免疫促进细胞或免疫耐受性细胞(经常是淋巴细胞)转移到患者中以增强针对癌症的免疫性。自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或遗传重定向的外周血单核细胞的过继转移已经被用来成功地治疗患有晚期实体肿瘤(包括黑色素瘤和结直肠癌)的患者以及患有表达CD19的血液恶性病的患者。在一些实施方案中，ACT疗法通过将自体肿瘤反应性T细胞群激活并扩充到大量细胞，然后将它们转移回到患者中，实现离体的T细胞刺激。参见Gattinoni等人,2006。

在一些实施方案中，本发明公开的主题的拮抗剂和抗原可以采用被配制在组合物中的抗原肽的形式，所述组合物被添加到自体树突细胞并被用来在体外刺激T辅助细胞或CTL应答。然后所述体外生成的T辅助细胞或CTL可以被输注到癌症患者中(Yee等人，2002)，并且具体地是患有表达一种或多种抗原肽的癌症形式的患者。

备选地，所述肽可以在体外被添加到树突细胞(DC)从而产生负载的DC，所述负载的DC随后被转移到患有癌症的个体以刺激免疫应答。备选地，所述负载的DC可以用来离体刺激CD8⁺T细胞，随后将经刺激的T细胞重新引入到患者中。尽管特定抗原可能在一个特定的癌细胞类型上被鉴定到，但其也可能存在于其他癌症类型上。

本发明公开的主题设想通过向患者提供用靶肽的组合物致敏的细胞来治疗癌症。使用用抗原肽致敏的DC能够以两种方式操作免疫原：改变注射的细胞的数目以及改变在每个细胞上递呈的抗原的密度。基于DC的治疗的非限制性的示例性方法可以参见，例如Mackensen等人,2000。III.D.存在于拮抗剂/抗原组合物中的附加肽

在一些实施方案中，本发明公开的主题的拮抗剂/抗原组合物(或包含它的抗原肽组合物试剂盒)可以还包含至少一种衍生自一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)的附加肽。TAA的实例包括MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白/亲环蛋白C-相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、前列腺酸性磷酸酶等。可以掺入到靶肽组合物(或包含它的靶肽组合物试剂盒)中的衍生自TAA的示例性的非限制性肽示于表1中。

¹以小写字符列举的数字表示每个TAA的肽序列的氨基酸位置。

此类肿瘤特异性肽可以是本发明的靶抗原肽，其以如同它们是如本文所述添加到靶肽组合物的附加靶肽的方式、数目和量存在。

III.E.联合疗法

在一些实施方案中,本发明的组合物或试剂盒作为疫苗或以致敏细胞的形式施用，作为疾病的一线、二线、三线或四线治疗，所述疾病包括阿尔兹海默病、癌症、自身免疫性疾病和移植排斥。在一些实施方案中,本发明公开的主题的组合物与一种或多种治疗剂联合施用于患者。示例性的非限制性治疗剂包括抗-程序性死亡-1(PD1)或PD1-拮抗剂，诸如抗-PD1抗体BMS-936558(Bristol-Myers Squibb Co.,New York,N.Y.,美国)；抗-CTLA-4或CTLA-4拮抗剂；维罗非尼；伊匹单抗；达卡巴嗪；IL-2；替莫唑胺；受体酪氨酸激酶抑制剂，包括但不限于伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、舒尼替尼、酪氨酸磷酸化抑制剂、特拉替尼；sipileucel-T；铂类药剂；紫杉烷；烷化剂；抗代谢药和/或长春花生物碱；及其组合。

在一些实施方案中,癌症对一种或多种化疗剂敏感和/或是难治性的、复发的和/或对一种或多种化疗剂耐药，所述化疗剂诸如，但不限于铂类药剂、紫杉烷、烷化剂、蒽环霉素(例如，多柔比星包括但不限于脂质体多柔比星)、抗代谢药和/或长春花生物碱。在一些实施方案中,癌症是卵巢癌，并且所述卵巢癌是难治性、复发的或对铂类药剂(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂)、紫杉烷(例如，紫杉醇、多西他赛、洛他赛(larotaxel)、卡巴他赛(cabazitaxel))和/或蒽环霉素(例如，多柔比星包括但不限于脂质体多柔比星)耐药。在一些实施方案中,癌症是结直肠癌，并且所述癌症是难治性、复发的或对抗代谢药(例如，抗叶酸制剂(例如，培美曲塞(pemetrexed)、氟脲苷、雷替曲塞(raltitrexed))、嘧啶类似物(例如，卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、5FU))和/或铂类药剂(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂)耐药。在一些实施方案中,癌症是肺癌，并且所述癌症是难治性、复发的或对紫杉烷(例如，紫杉醇、多西他赛、洛他赛、卡巴他赛)、铂类药剂(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂)、长春花生物碱(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、血管内皮生长因子(VEGF)通路抑制剂、表皮生长因子(EGF)通路抑制剂和/或抗代谢药(例如，抗叶酸制剂包括但不限于培美曲塞、氟脲苷或雷替曲塞)以及嘧啶类似物(例如，卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、5FU)耐药。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌，并且所述癌症是难治性、复发的或对紫杉烷(例如，紫杉醇、多西他赛、洛他赛、卡巴他赛)、VEGF通路抑制剂、蒽环霉素(例如，柔红霉素、多柔比星包括但不限于脂质体多柔比星、表柔比星、戊柔比星、伊达比星)、铂类药剂(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂)和/或抗代谢药(例如，抗叶酸制剂包括但不限于培美曲塞、氟脲苷或雷替曲塞)和嘧啶类似物(例如，卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、5FU)耐药。在一些实施方案中，癌症是胃癌，并且所述癌症是难治性、复发的或对抗代谢药(例如，抗叶酸制剂包括但不限于培美曲塞、氟脲苷、雷替曲塞)和嘧啶类似物(例如，卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、5FU)和/或铂类药剂(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂)耐药。

在晚期恶性黑色素瘤中单一药剂达卡巴嗪(DTIC)治疗通常仅产生10-15％响应率(Fecher&Flaherty,2009)。在晚期黑色素瘤患者的治疗中普遍使用两种联合方案。第一方案是顺铂、长春花碱和DTIC(CVD)方案。第二种普遍使用的方案是Dartmouth方案，其是顺铂、DTIC、卡莫司汀(carmustine)和他莫昔芬的组合。在III型跨膜受体酪氨酸激酶KIT有改变的晚期黑色素瘤患者中，用甲磺酸伊马替尼治疗在一个亚组患者中产生了临床上显著的响应(Carvajal等人，2011)。DTIC是第一个批准用于治疗转移性黑色素瘤的药物。在利用达卡巴嗪的初步研究中，总响应率为22％,对生存期没有影响。在达卡巴嗪与替莫唑胺对比的III期研究中，响应率为12％对13％(Middleton等人,2000)。在2个小型II期研究中测试了卡铂和紫杉醇，当与索拉非尼联合使用时，响应率为11-17％。在一些实施方案中,替莫唑胺包括在黑色素瘤的一线药物中。

在一些实施方案中,本发明公开的主题的组合物可以与抑制T细胞凋亡或无反应性的药剂缔合，由此增强T细胞应答(在本文中可互换地称作“T细胞增效剂”或“检查点拮抗剂”)。此类药剂包括B7RP1激动剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、HVEM拮抗剂、HVEM拮抗剂、GAL9拮抗剂或备选地CD27激动剂、OX40激动剂、CD137激动剂、BTLA激动剂、ICOS激动剂、CD28激动剂，或PDL1、PDL2、CD80、CD96、B7RP1、CD137L、OX40或CD70的可溶性形式。参见Pardoll,2012。

在一些实施方案中，T细胞增效剂是PD1拮抗剂。程序性死亡1(PD1)是由激活的T细胞表达的关键性免疫检查点受体，并且其介导免疫抑制。PD1主要在外周组织发挥作用，在外周组织T细胞可以遇到免疫抑制性PD1配体PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC),所述免疫抑制性PD1配体由肿瘤细胞、基质细胞或两者表达。在一些实施方案中,使用抗-PD1单克隆抗体BMS-936558(也称作MDX-1106和ONO-4538；Bristol-Myers Squibb)。在一些实施方案中,T细胞增效剂(例如，PD1拮抗剂)作为静脉内输注液每4、5、6、7、8、9或10周的治疗周期的至少或大约每1、1.5、2、2.5、3、3.5或4周施用一次，大约持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个周期。在一些实施方案中，PD1拮抗剂的示例性非限制性剂量为刚好、大约、或至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mg/kg或更高。参见Brahmer等人，2012。

上文列举的示例性治疗剂设想在一些实施方案中以大约1-100mg/m²的浓度施用，在一些实施方案中以大约10-80mg/m²,且在一些实施方案中以大约40-60mg/m²的浓度施用。进一步示例性的剂量包括，但不限于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100mg/m²或更高。备选地，示例性的剂量范围在一些实施方案中可以为大约或至少0.001-100mg/kg，在一些实施方案中为大约或至少0.1-1mg/kg,并且在一些实施方案中为大约或至少0.01-10mg/kg。

本发明公开的主题的检查点拮抗剂和抗原组合物或试剂盒在一些实施方案中可以与细胞因子诸如淋巴因子、单核因子、生长因子和传统的多肽激素共同施用。示例性的细胞因子是生长激素，包括但不限于人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，包括但不限于促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成素(LH)；肝细胞生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘泌乳素、OB蛋白；TNF-.α和TNF-.β；缪勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；VEGF；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，包括但不限于NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，包括但不限于TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子(IGF)-I和IGF-II；红细胞生成素(EPO)；骨生成诱导因子；干扰素(IFN)，包括但不限于IFNα、IFNβ、和IFNγ；集落刺激因子(CSF)，包括但不限于巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，包括但不限于IL-1、IL-1.α.、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17和IL-18；白血病抑制因子(LIF)、kit-配体；FLT-3；血管抑素；血小板反应蛋白；内皮抑素；和淋巴毒素(LT)。当在本文中使用时，术语细胞因子包括来自天然来源和/或来自重组细胞培养的蛋白及其生物活性等效物。

在一些实施方案中，本发明公开的主题的组合物可以在靶肽组合物的初始剂量的时候前后(包括但不限于之前和/或之后大约或至少1、2、3、或4周或天)提供细胞因子的施用。

在一些实施方案中，细胞因子的示例性非限制性剂量为在大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70天内大约或至少1-100、10-80、20-70、30-60、40-50或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10Mu/m²/天。在一些实施方案中，细胞因子可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时递送至少或大约一次。细胞因子治疗可以以至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周或更多的至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个周期提供，其中每个周期具有至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个细胞因子剂量。细胞因子治疗在一些实施方案中可以按与靶肽组合物的施用相同的用药方案或在一些实施方案中按不同的用药方案，不同的用药方案在一些实施方案中可以是重叠的用药方案。

在一些实施方案中,细胞因子是IL-2并且以大约或至少100,000-1,000,000；200,000-900,000；300,000-800,000；450,000-750,000；600,000-800,000；或700,000-800,000(在一些实施方案中为720,000)单位(IU)/kg的量给药，例如作为推注剂，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20小时给药，例如，在一个周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更长。

IV.疾病类型

在一些实施方案中,本发明公开的主题的组合物设想可用于治疗良性和/或恶性增生性疾病。细胞的过度增殖和细胞基质的更替显著地有助于数种疾病的发病机制，所述疾病包括但不限于癌症、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、银屑病、特发性肺纤维化、硬皮病和肝硬化、导管增生、小叶增生、乳头状瘤等等。

在一些实施方案中,增生性疾病是癌症，包括但不限于乳腺癌、结直肠癌、肺鳞癌、肉瘤、肾细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状肿瘤、白血病、脑癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌。在一些实施方案中,本发明公开的组合物和方法用来治疗黑色素瘤、急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、乳腺癌、肾癌、胰腺癌和/或卵巢癌。

在一些实施方案中,本发明公开的主题的靶肽组合物可以用来治疗黑色素瘤。黑色素瘤在一些实施方案中可以为I期，在一些实施方案中为II期(包括但不限于IIa和/或IIb期)、III期、IV期、转移性、恶性或复发性黑色素瘤。当为转移性黑色素瘤时，在一些实施方案中黑色素瘤在肺、骨、肝或脑中。

在一些实施方案中,癌症是本文所述的癌症。例如，癌症可以是膀胱癌(包括但不限于加速和转移性膀胱癌)，乳腺癌(包括但不限于雌激素受体阳性乳腺癌、雌激素受体阴性乳腺癌、HER-2阳性乳腺癌、HER-2阴性乳腺癌、三阴乳腺癌和炎性乳腺癌)，结肠癌(包括但不限于结直肠癌)、肾癌(包括但不限于肾细胞癌)，肝癌，肺癌(包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌，诸如但不限于腺癌、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌和大细胞癌)，泌尿生殖道癌症，包括但不限于卵巢癌(诸如但不限于输卵管癌、子宫内膜癌和腹膜癌)、宫颈癌、前列腺癌和睾丸癌，淋巴系统癌症、直肠癌、喉癌、胰腺癌(包括但不限于外分泌胰腺癌)，胃癌(包括但不限于胃食管癌、上胃癌和下胃癌)，胃肠癌(包括但不限于肛门癌)，胆囊癌，甲状腺癌，淋巴瘤(包括但不限于伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)，白血病(包括但不限于急性髓性白血病)，尤因肉瘤，鼻食管癌，鼻咽癌，神经和胶质细胞癌(包括但不限于多形性胶质母细胞瘤)，和头颈部癌症。示例性的非限制性癌症还包括黑色素瘤、乳腺癌(包括但不限于转移性或局部进展性乳腺癌)，前列腺癌(包括但不限于激素难治性前列腺癌)、肾细胞癌、肺癌(包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌(包括腺癌、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌和大细胞癌)、胰腺癌、胃癌(包括但不限于胃食管癌、上胃癌和/或下胃癌)、结直肠癌、头颈部鳞状肿瘤、卵巢癌(包括但不限于晚期卵巢癌、铂类药剂耐药的和/或复发的卵巢癌)、淋巴瘤(包括但不限于伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤)、白血病(包括但不限于急性髓性白血病)，和胃肠癌。

本发明的组合物可以被设计用于治疗或预防自身免疫性疾病。在这种情况下，自身免疫性疾病可以包括系统性红斑狼疮、干燥综合征、SLE、混合结缔组织病、原发性胆汁性肝硬化、乳糜泻、类风湿性关节炎、重症肌无力、硬化性肌炎、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、副肿瘤性小脑变性、边缘叶脑炎、脑脊髓炎、舞蹈手足徐动症、亚急性感觉神经元病、僵人综合征、1型糖尿病、视神经病变、舞蹈症和德维克氏综合征(视神经脊髓炎)。

本发明公开的主题的组合物可以用于治疗或预防器官移植排斥。在这样的情况下，鉴定供体不匹配的HLA抗原和/或非-HLA抗原，并且其与检查点拮抗剂一起在本发明的组合物中递呈。在这种情况下，可以获得对此类不匹配的抗原的免疫耐受的诱导。

组合物可以进一步被设计用于使用对感染性疾病特异的抗原来治疗或预防感染性疾病。

另外，用于治疗神经变性疾病的方法在本发明的范围内。例如，本发明的组合物可以针对治疗或预防阿尔茨海默病的方法。

V.组合物的施用

V.A.施用途径

本发明公开的主题的拮抗剂/抗原组合物可以通过胃肠外、全身、局部或其任意组合施用。借助于实施例且是非限制的，组合物注射可以通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射和/或肌内(i.m.)注射来进行。可以采用一种或多种此类途径。例如，胃肠外施用可以通过推注或随时间推移的逐步输注。备选地或另外地，施用可以通过经口途径。

在一些实施方案中,注射是皮内(i.d.)注射。在一些实施方案中，组合物适合于通过任何可接受的途径施用拮抗剂和抗原，所述途径诸如但不限于经口(经肠)、经鼻、经眼和透皮，单独地或一起施用。在一些实施方案中,施用是皮下，并且在一些实施方案中皮下施用借助输液泵。

V.B.制剂

药物载体、稀释剂和赋形剂通常加入到组合物或试剂盒中，它们与活性成分是相容的并且对于药物用途是可接受的。这样的载体的实例包括但不限于水、盐溶液、葡萄糖(dextrose)和/或甘油。还可以使用载体的组合。

本发明公开的主题的组合物可以进一步掺入附加物质以稳定pH和/或作为佐剂、润湿剂和/或乳化剂起作用，所述附加物质可以用于提高疫苗的有效性。

拮抗剂/抗原组合物可以包含一种或多种佐剂诸如例如：montanide ISA-51(Seppic Inc.,Fiarfield,N.J.,美国)；QS-21(Aquila Biopharmaceuticals,Inc.,Framingham,Mass.,美国)；阿拉塞A；油酸；破伤风辅助肽(诸如但不限于QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO:2376)和/或AQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO:2377)；GM-CSF；环磷酰胺；卡介菌(BCG)；小棒杆菌；左旋咪唑、azimezone；isoprinisone；二硝基氯苯(DNCB)；匙孔血蓝蛋白(KLH)；弗氏佐剂(完全和不完全)；矿物凝胶；氢氧化铝(Alum)；溶血卵磷脂；复合多元醇；多聚阴离子；肽；油乳剂；核酸(诸如但不限于双链RNA；dsRNA)二硝基苯酚；白喉毒素(DT)；toll-样受体(TLR；诸如但不限于TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9)激动剂(包括但不限于内毒素诸如脂多糖(LPS)；单磷酰脂质A(MPL)；和/或多聚肌苷酸-多聚胞苷酸(poly-ICLC/HILTONOL.RTM.；Oncovir,Inc.,华盛顿特区,美国)；IMO-2055；吡喃葡糖苷脂质A(GLA)；QS-21(一种从皂树(Quillaja saponaria tree)的树皮提取的皂苷，皂树也称为皂荚树或皂皮树)；雷西莫特(TLR7/8激动剂)；CDX-1401(一种由对树突细胞受体DEC-205特异的全人单克隆抗体与NY-ESO-1肿瘤抗原连接组成的融合蛋白)；Juvaris阳离子脂质-DNA络合物；Vaxfectin；及其组合。

聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly IC)是双链RNA(dsRNA)，其作为TLR3激动剂起作用。为了增加半衰期，其已经利用多聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定成为poly-ICLC。其已经被用来在癌症患者中诱导干扰素，静脉内剂量达300μg/kg。像poly-IC一样，poly-ICLC是TLR3激动剂。TLR3在髓系DC的早期核内体中表达；因此poly-ICLC优先地激活髓系树突细胞，由此有助于Th1细胞毒T细胞应答。Poly-ICLC激活天然杀伤(NK)细胞，诱导细胞裂解潜能，并且从髓系DC诱导IFN.γ。

在一些实施方案中,佐剂以每次用药剂量中每剂或每千克大约或至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000μg提供。在一些实施方案中,佐剂以每次用药剂量中每剂或每千克至少或大约0.1、0.2、0.3、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、0.100、1.10、1.20、1.30、1.40、1.50、1.60、1.70、1.80、1.90、2.00、2.10、2.20、2.30、2.40、2.50、2.60、2.70、2.80、2.90、3.00、3.10、3.20、3.30、3.40、3.50、3.60、3.70、3.80、3.90、4.00、4.10、4.20、4.30、4.40、4.50、4.60、4.70、4.80、4.90、5.00、5.10、5.20、5.30、5.40、5.50、5.60、5.70、5.80、5.90、6.00、6.10、6.20、6.30、6.40、6.50、6.60、6.70、6.80、6.90、7.00、7.10、7.20、7.30、7.40、7.50、7.60、7.70、7.80、7.90、8.00、8.10、8.20、8.30、8.40、8.50、8.60、8.70、8.80、8.90、9.00、9.10、9.20、9.30、9.40、9.50、9.60、9.70、9.80、9.90、或10.00克的剂量提供。在一些实施方案中,佐剂以每剂大约或至少10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、500、525、550、575、600、625、675、700、725、750、775、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个内毒素单位("EU")提供。本发明公开的主题的组合物在一些实施方案中可以在所述组合物的初始剂量的时候前后(例如，之前和/或之后大约或至少1、2、3或4周或天)提供环磷酰胺的施用。环磷酰胺的示例性非限制性剂量为在大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天内大约或至少100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000Mg/m²/天。

组合物可以包含游离形式和/或药学上可接受的盐的形式的拮抗剂和/或抗原肽或编码所述拮抗剂和/或抗原的核酸。当在本文中使用时，“药学上可接受的盐”是指组合物的衍生物，其通过制备所述药剂的酸式盐或碱式盐来改性。例如，酸式盐由游离碱(典型地，其中药物的中性形式具有中性的--NH₂基团)参与与适宜的酸的反应而制备。用于制备酸式盐的适宜的酸包括有机酸以及无机酸两者，所述有机酸诸如但不限于乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等，所述无机酸诸如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。相反地，可以存在于肽或核酸上的酸部分的碱式盐在一些实施方案中使用药学上可接受的碱制备，所述药学上可接受的碱诸如但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等。作为实例且非限制，所述组合物可以包含肽或核酸作为乙酸的盐(乙酸盐)、铵的盐或盐酸的盐(氯化物)。

在一些实施方案中，组合物可以包含一种或多种糖类，糖醇，氨基酸诸如但不限于甘氨酸、精氨酸、谷氨酸和/或其他氨基酸作为框架形成物(framework former)。糖类可以是单糖、双糖或三糖。这些糖类可以单独使用和/或与糖醇组合使用。示例性的糖类包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、或山梨糖作为单糖；蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖作为二糖；和棉子糖作为三糖。糖醇可以是例如，甘露糖。在一些实施方案中，所述组合物包含蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露醇和/或山梨醇。在一些实施方案中，所述组合物包含甘露醇。

此外，在一些实施方案中，组合物可以包含生理学良好耐受的赋形剂(参见Handbook of Pharmaceutical Excipients,第5版，由Raymond Rowe,Paul Sheskey和SianOwen编辑，Pharmaceutical Press(2006))，诸如抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽；防腐剂，诸如苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、三氯叔丁醇、硫柳汞(thiomersal)和/或苯扎氯铵；稳定剂、框架形成物诸如蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和/或山梨醇；甘露醇和/或乳糖和增溶剂诸如聚乙二醇(PEG；例如，PEG 3000、3350、4000或6000)、环糊精(例如，羟丙基-β-环糊精、磺基丁基乙基-β-环糊精或γ-环糊精)、葡聚糖或泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆407或泊洛沙姆188)；或20或80。在一些实施方案中，可以包含一种或多种良好耐受的赋形剂，其任选地选自由下列各项组成的组：抗氧化剂、框架形成物和稳定剂。

在一些实施方案中，用于静脉内和/或肌内施用的pH选自pH 2-pH12。在一些实施方案中，用于皮下施用的pH选自pH 2.7-pH 9.0，因为体内稀释速率减小导致在注射部位处辐射的可能性更大(Strickley,2004)。

V.C.用药剂量

要理解的是拮抗剂/抗原组合物(其可以在相同或不同的制剂中施用)的合适剂量可以取决于受者的年龄、性别、健康和/或体重，同期治疗的种类(如果有的话)、治疗的频次，以及所需效应的性质。然而，要理解的是可以对单个受试者定制剂量，如由研究者或临床医生确定。对于任意指定治疗所需的总剂量在一些实施方案中将基于研究者或临床医生的经验关于标准参照剂量来确定，此剂量在单次治疗中施用或以一系列剂量施用，其成功将取决于产生所需的免疫学结果(诸如但不限于成功的产生T辅助细胞和/或CTL-介导的对检查点拮抗剂/抗原免疫原组合物的应答，所述应答产生所需的预防和/或治疗)。

在一些方面，所述拮抗剂/抗原组合物可以作为一种组合物或作为两种或更多种独立的组合物递送。所述两种或更多种独立的组合物包含一种或多种免疫检查点拮抗剂和一种或多种抗原，其可以同时地、同期地或序贯地施用。进一步可能地是在一种组合物的剂量给药相对于另一种组合物的剂量给药之间有延迟地施用此类组合物。

因此，在一些实施方案中，在下面几个方面考虑总的施用方案：确定疗程的成功性以及是否采用单一剂量，独立地给予，是否将产生所需的免疫学治疗结果或效应。就此而言，治疗有效量(即，在一些实施方案中产生所需的T辅助细胞和/或CTL-介导的应答的量)可以取决于所使用的拮抗剂/抗原组合物，疾病状况的性质，疾病状况的严重性，预防还没有被检测到的这种状况的任何需求的程度，由需要这种施用的情形所规定的施用方式，接受这种施用的个体的体重和健康状况，和/或临床医生或研究者的慎重判断。在一些实施方案中，施用额外剂量和/或增加或减少间隔时间的功效可以考虑受者的免疫活性(包括但不限于T辅助细胞的水平和/或关于肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的CTL活性)来继续进行再评价。

本发明公开的主题的T辅助或CTL刺激性抗原肽或核酸在药物制剂中的浓度可以进行宽泛的变化，包括从小于0.01重量％至多达50重量％或更大的范围。在一些实施方案中还可以考虑诸如所得组合物的体积和粘度的因素。用于此类组合物的溶剂或稀释剂可以包括水、磷酸缓冲盐水(PBS)和/或盐水，或任何其他可能的载体或赋形剂。

本发明公开的主题的拮抗剂/抗原组合物或免疫原在一些实施方案中还可以包含在人工形成的结构诸如脂质体中，所述结构在一些实施方案中可以包含附加的分子，诸如但不限于蛋白质或多糖，所述蛋白质或多糖插入在所述结构的外膜中并且具有使脂质体靶向身体的特定区域和/或指定器官或组织内的特定细胞的效应。这样的靶向分子在一些实施方案中可以包含免疫球蛋白。抗体可以特别好地发挥作用用于脂质体和/或其他骨架对肿瘤细胞的靶向。

可以提供约1-50μg，在一些实施方案中约1-100μg,在一些实施方案中约1-500μg，在一些实施方案中约1-1000μg，在一些实施方案中约1-50mg，在一些实施方案中约1-100mg，在一些实施方案中约1-500mg或在一些实施方案中约1-1000mg的组合物中的拮抗剂或抗原肽或其核酸的单次i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和/或i.v.剂量，并且所述剂量可以取决于各个肽或核酸组合物相对于所述组合物中所有肽或核酸的总量或备选地相对于所述组合物中每个单种靶肽或核酸的总量。单一剂量的本发明公开的主题的肽或核酸组合物在一些实施方案中可以具有大约或至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或950μg的肽或核酸量(例如，组合物中所有肽或核酸的总量或备选地所述组合物每个单种肽或核酸的总量)。在一些实施方案中，单一剂量的本发明公开的主题的肽或核酸组合物可以具有大约或至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或950mg的全部肽或核酸量(例如，所述组合物中的所有肽或核酸的总量或备选地所述组合物中每个单种肽或核酸的总量)。在一些实施方案中,本发明公开的主题的组合物的肽或核酸以每剂约100微克的等量存在，并与每剂约200微克的量存在的辅助肽或核酸组合。

在单一剂量的本发明公开的主题的肽或核酸组合物中，组合物中每种肽或核酸的量在一些实施方案中是相等的或基本上相等的。备选地，以最小量存在的肽或核酸相对于以最大量存在的肽或核酸的比率为大约或至少1:1.25、1:1.5、1:1.75、1:2.0、1:2.25、1:2.5、1:2.75、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:30；1:40、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000、1:5000；1:10,000；或1:100,000。备选地，以最小量存在的肽或核酸相对于以最大量存在的肽或核酸的比率为大约或至少1或2-25；1或2-20；1或2-15；1或2-10；1-3；1-4；1-5；1-6；1-7；1-10；2-3；2-4；2-5；2-6；2-7；2-10；3-4；3-5；3-6；3-7；3-10；5-10；10-15；15-20；20-25；1-40；1-30；1-20；1-15；10-40；10-30；10-20；10-15；20-40；20-30；或20-25；1-100；25-100；50-100；75-100；25-75、25-50或50-75；25-40；25-50；30-50；30-40；或30-75。

单一剂量可以给予患者或核酸大约或至少1、2、3、4或5次/天。单一剂量可以在前次剂量用药后大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23、24、36、48、60、或72小时给予患者。

单一剂量可以每周或每隔一天、每三天、每四天或每五天给予患者大约或至少1、2、3、4、5、6或7次。单一剂量还可以每周、每隔一周或每个月仅在1、2或3周的期间内给予。在一些实施方案中疗程可以持续大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。

在一些实施方案中，单一剂量的本发明公开的主题的组合物可以以至少两个阶段提供给患者：例如，初始阶段以及后面的后续阶段。初始阶段的长度可以为大约或至少1、2、3、4、5或6周。后续阶段可以持续至少或大约初始阶段的长度的1、2、3、4、5、6、7或8倍。初始阶段可以与后续阶段相隔大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周或月。

后续阶段期间肽或核酸组合物剂量可以比初始阶段期间的剂量大至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000倍。

后续阶段期间肽或核酸组合物剂量可以比初始阶段期间的剂量小至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000倍。

在一些实施方案中,初始阶段为大约3周，第二阶段为大约9周。肽或核酸组合物可以在或大约在第1、8、15、36、57和78天施用于患者。

如上所用，“肽或核酸”的剂量各自独立地是本发明的组合物中的免疫检查点拮抗剂或抗原。因此，所有肽的总量是指特定的拮抗剂或特异性抗原相对于组合物的其余组分的总量。

V.D.试剂盒和储存

在一些实施方案中,公开的试剂盒包含：(a)容器，其至少容纳以溶液形式或以冻干形式存在的如本文所述的检查点拮抗剂/抗原组合物，优选以编码所述拮抗剂和抗原的形式存在；(b)任选地，第二容器，其容纳用于冻干制剂的稀释剂或复配溶液；和(c)任选地，用于下列的说明书：(i)溶液的使用或(ii)冻干制剂的复配和/或使用。所述试剂盒可以进一步包含下列中的一种或多种：(iii)缓冲液，(iv)稀释剂，(v)滤器，(vi)针头，或(v)注射器。在一些实施方案中,容器选自由下列各项组成的组：瓶子、小瓶、注射器、测试管或多用途容器。在一些实施方案中，肽或核酸组合物被冻干。

所述试剂盒可以包含刚好、大约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51或更多种含抗原/拮抗剂的组合物。所述试剂盒中的每种组合物可以在相同的时间或在不同的时间施用。

在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含处于适当的容器中的本发明公开的组合物和/或疫苗的冻干制剂和用于其复配和/或使用的说明书。适当的容器包括，例如，瓶子、小瓶(例如，双腔小瓶)、注射器(诸如双腔注射器)和测试管。容器可以由多种多样的材料诸如玻璃或塑料形成。在一些实施方案中，所述试剂盒和/或容器包含关于指明复配的方向和/或冻干制剂的使用或与其相关联的说明书。例如，标签可以指示冻干制剂要被复配成如本文所述的抗原浓度。所述标签可以进一步指示所述制剂可用于或预期用于皮下施用。冻干的和液体的制剂典型地保存于-20℃至-80℃。

容纳检查点拮抗剂/抗原组合物的容器可以是多用途小瓶，在一些实施方案中其允许复配制剂的反复施用(例如，2-6次或更多次施用)。所述试剂盒可以进一步包含第二容器，所述第二容器包含适当的稀释剂(例如，碳酸氢钠溶液)。

所述试剂盒可以进一步包含商业和/或出于用户角度需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器和带有或不带有使用说明书的包装插页。

所述试剂盒可以具有单个容器，所述容器包含肽或核酸组合物的制剂，带有或不带有其他成分(例如，其他化合物或这些其他化合物的组合物)，或可以具有用于每种组分的不同容器。

另外，所述试剂盒可以包括肽或核酸组合物和/或疫苗的制剂，所述制剂被包装用于与第二化合物(诸如佐剂包括但不限于咪喹莫特)、化疗剂、天然产品、激素或拮抗剂、抗血管生成剂或抑制剂、细胞凋亡诱导剂或螯合剂或其组合物的共同施用组合使用。所述试剂盒的一种或多种成分可以预先络合或一种或多种组分可以在施用于患者之前处于单独的不同容器中。所述试剂盒的一种或多种成分可以在一种或多种液体溶液中提供。在一些实施方案中，液体溶液是水溶液。在进一步的实施方案中，所述液体溶液是无菌水溶液。所述试剂盒的一种或多种成分还可以作为固体提供，在一些实施方案中其可以通过添加适当的溶剂转变成液体，在一些实施方案中溶剂可以在另一不同容器中提供。

治疗性试剂盒的容器可以是小瓶、测试管、烧瓶、瓶子、注射器或适合于包装固体或液体的任何其他结构。典型地，当存在超过一种成分时，所述试剂盒包含允许单独地给药的第二小瓶或其他容器。所述试剂盒还可以包含用于药学上可接受的液体的另一容器。在一些实施方案中,治疗性试剂盒包含装置(例如，一个或多个针头、注射器、滴眼管、移液管等)，所述装置能够施用作为所述试剂盒的成分的本公开的药剂。

V.E.功效标志物

当施用于患者时，本发明公开的主题的组合物在一些实施方案中被设想具有特定的生理效应，包括但不限于诱导T细胞介导的免疫应答。

V.E.1.免疫组织化学、免疫荧光、蛋白质印迹、流式细胞术

可以使用用于免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)、流式细胞术(FC)和/或蛋白质印迹(WB)的市售抗体来表征新生物形成的细胞和分子特征。在一些实施方案中,可以采用这样的技术来测定患者样品(包括但不限于福尔马林固定的、石蜡包埋的组织样品)中CD1a、S100、CD83、DC-LAMP、CD3、CD4、CD8、CD20、CD45、CD79a、PNAd、TNF.α.、LIGHT、CCL19、CCL21、CXCL12、TLR4、TLR7、FoxP3、PD-1和Ki67基因产物中的一种或多种的存在或不存在和/或其表达水平。在一些实施方案中,使用流式细胞术来确定CD3、CD4、CD8、CD13、CD14、CD16、CD19、CD45RA、CD45RO、CD56、CD62L、CD27、CD28、CCR7、FoxP3(细胞内)和用于I MHC相关(磷酸化)-肽的MHC-肽四聚体中的一种或多种的表达水平。在一些实施方案中，采用阳性对照，在一些实施方案中所述阳性对照可以包含组织样品，所述组织样品包括正常人外周血淋巴细胞(PBL)、用CD3/CD28珠激活的PBL(激活的PBL)、来自非黑色素瘤患者的人淋巴结组织(LN)和/或来自克罗恩病(Crohn's)的手术标本的人体发炎组织，尽管可以采用任意的其他阳性对照细胞和/或组织。

V.E.2酶联免疫斑点测定(ELISpot)

在一些实施方案中,疫苗接种部位浸润淋巴细胞以及来自前哨免疫淋巴结(SIN)和接种部位的淋巴细胞可以通过酶联免疫斑点测定(ELISpot)来评价。ELISpot允许直接计数通过产生INFγ对抗原反应的T细胞。外周血淋巴细胞可以通过ELISpot测定检测肽反应性T细胞的数目进行评价。接种部位浸润淋巴细胞和SIN淋巴细胞可以与外周血的淋巴细胞进行比较。设想ELISpot测定的阳性结果与患者无进展生存期增加相关。无进展生存期被定义为从治疗开始至因任何原因死亡或最后一次随访时间的时间。

V.E.3四聚体测定

外周血淋巴细胞和来自SIN和接种部位的淋巴细胞可以在与MHC-肽四聚体孵育后通过流式细胞术测定肽反应性T细胞的数目来评价。

V.E.4增殖测定/细胞因子分析

可以使用³H-胸苷摄入测定评价外周血单核细胞(PBMC)、接种部位炎性细胞和/或来自从受试者分离的SIN的淋巴细胞的CD4⁺T细胞对例如破伤风辅助肽混合物的反应性。另外，来自该增殖测定中48小时的培养基中的Th1(IL-2、IFNγ、TNFα)、Th2(IL-4、IL-5、IL-10)、Th17(IL-17和IL23)和T-reg(TGF-β)细胞因子可以用来确定微环境是否支持Th1、Th2、Th17和/或T-reg应答的产生。在一些实施方案中，下述肽中的一种或两种用作阴性对照：破伤风肽和PADRE肽(aK(X)VAAWTLKAa；SEQ ID NO:2378)。

V.E.5对肿瘤的评价

在一些实施方案中，在治疗前或在进展的时候采集的肿瘤组织可以通过常规的组织学和免疫组织化学来评价。备选地或另外地，可以对肿瘤组织和肿瘤浸润性淋巴细胞进行体外评价。

V.E.6对归巢受体表达的研究

可以研究患者样品中的通过用本发明公开的主题的组合物免疫接种诱导的T细胞归巢受体。这些包括，但不限于，淋巴细胞上的整联蛋白(包括但不限于αEβ7、α1β1、α4β1)、趋化因子受体(包括但不限于CXCR3)和选择素配体(包括但不限于CLA和PSL)，以及接种部位和SIN中的它们的配体。在一些实施方案中，这些可以通过免疫组织化学、流式细胞术和/或任何其他适宜的技术来测定。

V.E.7基因和蛋白表达的研究

可以通过对从接种部位和/或SIN分离的样品的高通量筛选测定(例如，核酸芯片，蛋白阵列等)来确定基因表达的差异和/或蛋白表达谱的差异。

VI.抗体和抗体-样分子

对抗原肽和/或靶肽/MHC复合物特异的抗体和抗体-样分子(包括但不限于T细胞受体)在一些实施方案中可用于分析生物样品。在一些实施方案中，分析可以包括确定肿瘤边缘的病理学特性。

抗体和抗体-样分子还可以在所述组合物中用作检查点拮抗剂。在一些实施方案中，此类分子可以用作靶向细胞的治疗药物，所述细胞包括但不限于肿瘤细胞。

当在本文中使用时，术语“抗体”、“抗体肽”和“抗体-样分子”是指完整抗体、其结合片段(即，抗体的包含互补位的片段)、或可以特异性地识别抗原或表位并且与所述抗原或表位以模拟抗体结合的方式结合的多肽。在一些实施方案中,抗体、抗体肽和抗体-样分子与完整抗体竞争与抗原或表位的特异性结合。

在一些实施方案中，抗体片段可以通过重组DNA技术和/或通过对完整抗体的酶裂解和/或化学裂解来产生。抗体片段因此包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段、Fv和单链抗体，包括但不限于单链片段可变区(scFv)抗体。如果抗体的每一个互补位都相同和/或结合相同的表位，则该抗体被认为是“单特异性的”。类似地，“双特异性”或“双功能”抗体包括结合不同的抗原和/或表位的抗体结合部位。在一些实施方案中，当过量抗体将与反受体结合的受体的量减少至少约20％、40％、60％、80％、85％、90％、95％或更多，如通过例如，体外竞争性结合测定所测量，则该抗体基本上抑制受体与反受体的粘附。

术语“MHC”当在本文中使用时是指主要组织相容性复合物，其被定义为一组指定主要组织相容性抗原的基因的基因座。术语“HLA”当在本文中使用时，要被理解为是指人白细胞抗原，其被定义为在人中存在的组织相容性抗原。当在本文中使用时，“HLA”是“MHC”的人形式。在鼠物种中，MHC被称作“H-2”复合物。

术语“MHC轻链”和“MHC重链”当在本文中使用时是指MHC分子的特定部分。在结构上，I类分子是由两个非共价结合的多肽链[较大的“重”链(.α.)和较小的“轻”链(β2-微球蛋白或.β.2m)]组成的异二聚体。在人第6号染色体上的MHC内编码的多态的多基因重链(45kDa)被细分成三个细胞外结构域(标注为1、2和3)、一个细胞内结构域和一个跨膜结构域。两个最外面的细胞外结构域1和2一起形成与抗原肽和/或其他表位结合的沟槽。因此，在蛋白的此区域处发生与TCR的相互作用。分子的结构域3包含对CTL上的CD8蛋白的识别位点。此相互作用的作用是稳定T细胞和抗原递呈细胞(APC)之间的接触。在人第15号染色体上编码的恒定的轻链(12kDa)由单个细胞外多肽组成。术语“MHC轻链”、“β2-微球蛋白”和“β2m”在本文中可互换使用。

术语“表位”包括能够与如本文所定义的抗体、抗体肽和/或抗体-样分子(包括但不限于T细胞受体)特异性结合的任何蛋白决定簇。表位决定簇典型地由分子诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。当解离常数(K_d)在一些实施方案中小于约1μM,在一些实施方案中小于约100nM,以及在一些实施方案中小于约10nM时，抗体或抗体-样分子被认为“特异性地”结合抗原。抗体和抗体-样分子与表位之间的相互作用还可以通过亲和常数(K_a)来表征。在一些实施方案中，小于约10⁷/M的K_a被认为是“高亲和力”。

术语“抗体”以最宽的含义使用，并且涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性和/或三特异性抗体)和抗体片段(包括但不限于Fab、F(ab')₂和Fv片段)以及抗体-样分子，条件是它们表现出所需的生物活性(例如，抗原结合)。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是糖蛋白，其在一些实施方案中具有相同的结构特征。该术语还意在涵盖“抗体样分子”和免疫球蛋白超家族的其他成员包括，但不限于，T细胞受体、MHC分子，和含有一个或多个抗原结合区和/或可变区的其他多肽，包括，但不限于特异性地结合本文所公开的靶肽的互补决定区(CDR)。

术语“抗体”还涵盖可溶性T细胞受体(TCR)胞质结构域，其在低浓度下是稳定的并且可以识别MHC-肽复合物。参见，例如，美国专利申请公开号2002/0119149,该申请通过引用并入。此类可溶性TCR在一些实施方案中可以与免疫刺激肽和/或蛋白，和/或部分[诸如但不限于CD3激动剂(例如，抗-CD3抗体)]缀合。CD3抗原存在于成熟的人T细胞、胸腺细胞以及天然杀伤细胞亚群上。其与TCR缔合并参与TCR的信号转导。对人CD3抗原特异的抗体是众所周知的。一种这样的抗体是鼠单克隆抗体OKT3，其是被FDA批准的第一个单克隆抗体。据报道OKT3是强力的T细胞有丝分裂原(Van Wauve,1980；美国专利号4,361,539)和强力的T细胞杀伤剂(Wong,1990)。还报道了对CD3抗原特异的其他抗体(参见PCT国际专利申请公开号WO 2004/106380；美国专利申请公开号2004/0202657；美国专利号6,750,325；6,706,265；英国专利公开号GB2249310A；Clark等人,1989；美国专利号5,968,509；美国专利申请公开号2009/0117102)。对抗癌症的免疫动员mTCR(ImmTAC；Immunocore Limited,MiltonPartk,Abington,Oxon,英国)是双功能蛋白，其组合了亲和性单克隆T细胞受体(mTCR)靶向与治疗性作用机制(即，抗-CD3scFv)。

天然抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿(Da)的异源四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过共价二硫键连接到重链。二硫键还连接完整抗体的重链，尽管不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键数目可以发生变化。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链具有在一端的可变结构域(V_H)，紧接着是许多个恒定结构域。每条轻链具有在一端的可变结构域(V_L)和在其另一端的恒定结构域。轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定的氨基酸残基形成轻链和重链可变结构域之间的界面(Clothia等人,1985；Novotny&Haber,1985)。

“分离的”抗体是已经从其产生或以其他的方式存在的环境的成分中被鉴定和/或分离和/或回收的抗体。其产生环境的污染成分在一些实施方案中是干扰所述抗体的诊断性和/或治疗性用途的物质，并且在一些实施方案中可以包括酶、激素和其他蛋白性或非蛋白性溶质。在一些实施方案中，抗体可以被纯化，如通过下述方法中的一种或多种测量：1)纯化至按抗体的重量计大于50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，如通过Lowry法测定；2)通过使用转杯式测序仪纯化至足以获得至少10或15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度；或3)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或在一些实施方案中使用银染色纯化至同质。分离的抗体包括在重组细胞内原位的抗体，因为抗体的天然环境的至少一种成分将不存在。然而，通常，分离的抗体通过包括至少一个纯化步骤的方法来制备。

术语“抗体突变体”和“抗体变体”是指相对于参照抗体包括一个或多个氨基酸序列差异的抗体，其中一个或多个氨基酸残基已经被修饰，诸如但不限于置换和/或缺失。在一些实施方案中这样的突变体和/或变体包括与参考抗体的重链或轻链可变区结构域氨基酸序列的氨基酸序列具有小于100％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％或75％的序列同一性和/或相似性。

在抗体的可变结构域的情形中，术语“可变的”是指可变结构域的某些部分在抗体间序列广泛地不同，并且用于每种特定的抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，序列可变性在抗体的整个可变结构域中通常不是均匀分布的。典型地，序列可变性集中在轻链和重链可变结构域两者中称作互补决定区(CDR；也称作超变区)的三个节段中。

确定CDR有至少两种技术：(1)基于跨物种序列可变性的方式(即，Kabat等人，1991)；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方式(Chothia等人,1989)。可变结构域的更加高度保守的部分称作框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含4个FR区，大部分采取β-片层构型，通过三个CDR连接，CDR形成连接β-片层结构的环，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧靠在一起，并且来自另一条链的CDR参与形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，1991)。恒定结构域通常不直接参与抗体和抗原之间的结合，但表现出各种各样的效应器功能，诸如但不限于抗体参与抗体依赖性细胞毒性。

术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，通常是抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，每个具有单一的抗原结合位点，以及残留的“Fc”片段，之所以这样命名是因其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')₂片段，其具有能够交联抗原的两个抗原结合片段，和残余的另一片段(称作pFc')。当在本文中使用时，术语“功能片段”关于抗体在一些实施方案中是指包含至少一个抗原结合结构域(称作“互补位”)的片段，并且因此包括，但不限于Fv、F(ab)和F(ab')₂片段。

“Fv”片段是最小的抗体片段，其含有完整的抗原识别和结合位点。此区由一个重链和一个轻链可变区紧密的非共价或共价缔合的异源二聚体(V_H-V_L二聚体)组成。在此构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用从而在V_H-V_L二聚体的表面上限定抗原结合位点(互补位)。共同地，6个CDR赋予抗体以抗原结合特异性。然而，在一些实施方案中甚至单个可变结构域(或Fv的一半，仅包含对抗原特异的3个CDR)具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力比整个结合位点低。

Fab或F(ab)片段也包含轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处是在重链CH1结构域的羧基末端处加入了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本文中是其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab'的名称。F(ab')片段通过裂解在F(ab')₂胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键而产生。抗体片段的其他化学偶联是本领域普通技术人员已知的。

基于相应恒定结构域的氨基序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的轻链可以被归为两个明确不同的类型中的一个，称作kappa(κ)和lambda(λ)。

取决于其重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被归为不同的类型。有至少五(5)种主要类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且这些中的几种可以进一步分成亚类或同种型(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁、IgA₂等)。与不同类型的免疫球蛋白对应的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

术语“单克隆抗体”当在本文中使用时是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即所述群体包含的单个抗体是相同的，除了可能有天然存在的突变以外，所述突变可以以微量存在。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与传统(多克隆)抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体可以是有利的，因为它们一般由杂交瘤合成，因此可以以不被其他免疫球蛋白污染的形式被分离。用于生成杂交瘤的方法在本领域中是已知的。修饰语“单克隆”表示抗体的获自基本上均质的抗体群体的特性，并且不应被解释为需要通过任何特定的方法产生抗体。作为实例且非限制地，根据本发明公开的主题使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler&Milstein,1975描述的杂交瘤法制备，或可以通过重组法制备(参见例如，美国专利号4,816,567；Harlow&Lane,1988)。在一些实施方案中,与本发明公开的主题一起使用的单克隆抗体可以使用Clackson等人,1991和/或Marks等人,1991中所述的技术从噬菌体抗体库分离。

对本发明公开的主题的单克隆抗体的利用在一些实施方案中可以包括向受试者施用一种或多种单克隆抗体，所述受试者诸如但不限于人受试者。然而，当单克隆抗体在非人动物诸如啮齿类动物中产生时，此类抗体向人患者的施用可以引起免疫应答，其中所述免疫应答针对所施用的抗体本身。这样的反应可以限制这种疗法的持续时间和有效性。为了克服这一问题，本发明公开的主题的单克隆抗体在一些实施方案中可以被“人源化”，即，所述抗体被工程化使得其抗原部分被去除，并用人抗体的类似部分替代，而保留抗体对特异性肽/MHC复合物的亲和性。此工程化可以涉及几个氨基酸，或可以包括抗体的整个框架区，仅留下亲代抗体的互补决定区是完整的。人源化抗体的几种方法在本领域中是已知的，并且公开在美国专利号6,180,370；6,054,927；5,869,619；5,861,155；5,712,120；和4,816,567中,每一篇专利的全部公开内容特别地通过引用全部合并于本文中。

抗体的人源化形式因此是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗体的其他抗原结合子序列)，它们主要由人免疫球蛋白的序列构成，但却含有衍生自非人免疫球蛋白的至少一些子序列。人源化可以根据Winter和同事的方法通过将啮齿动物CDR或CDR序列替换为人抗体的相应序列来进行(Jones等人,1986；Riechmann等人,1988；Verhoeyen等人,1988；还参见美国专利号5,225,539)。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被来自目的抗体的相应的非人残基替换。人源化抗体还可以包括在受者抗体以及输入的CDR或框架序列中均不存在的残基。通常，人源化抗体包括基本上所有可变结构域，至少一个可变结构域，和典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。人源化抗体最适地还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地包含人免疫球蛋白的恒定区的一部分(Jones等人,1986；Riechmann等人,1988；和Presta,1992)。

涉及人源化抗体的生成和/或用途的示例性出版物包括Sandborn等人,2001；Mihara等人,2001；Yenari等人,2001；Morales等人,2000；Richards等人,1999；Yenari等人,1998；和Shinkura等人,1998；每一篇的全部内容都特别地通过引用并入本文。例如，可以在此类方法中利用的治疗方案包括单一剂量，通常静脉内施用的10-20mg人源化mAb/kg(参见例如，Sandborn等人,2001)。在一些实例中，交替的用药方案可以是适宜的，诸如使用三次输注，每2周施用一次800-1600mg或甚至更大量的人源化mAb(参见例如，Richards等人,1999)。然而，要理解的是本发明公开的主题不限于本文所述的治疗方法，并且进一步地，本领域普通技术人员已知的其他治疗方案可以在本发明公开的主题的方法中被采用。

在一些实施方案中,本发明公开的主题进一步涉及针对特异性靶肽/MHC复合物的全人单克隆抗体。全人抗体基本上涉及其中轻链和重链两者的全部序列(包括CDR)均来自人基因的抗体分子。这样的抗体在本文中称作“人抗体”或“全人抗体”。

人单克隆抗体可以通过三源杂交瘤(trioma)技术(参见美国专利号4,714,681；PCT国际专利申请公开号WO 1999/047929)；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人,1983)和/或EBV杂交瘤技术(参见Cole等人,1985)制备。在一些实施方案中,人单克隆抗体可以被用于实施本发明公开的主题并且可以通过使用人杂交瘤(参见Cote等人,1983)或通过利用EB病毒体外转化人B细胞(参见Cole等人,1985)来生产。另外，人抗体还可以使用其他技术来生产，诸如但不限于噬菌体展示文库(Hoogenboom等人,1991；Marks等人,1991)。类似地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座引入到转基因动物中来制备，所述转基因动物例如，其中内源性免疫球蛋白基因已经被部分或完全地灭活的小鼠。在激发后，观察到人抗体产生，这在各方面都非常类似于在人中所观察到的那样，包括基因重排、组装和抗体库。这种方式描述于，例如，美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016,以及Marks等人,1992；Lonberg等人,1994；Fishwild等人,1996；Neuberger,1996；和Lonberg&Huszar,1995。

另外可以使用转基因非人动物产生人抗体，所述转基因非人动物已经被修饰，以响应于抗原的激发而除了非人动物的内源抗体以外还产生全人抗体，或产生全人抗体而不产生非人动物的内源抗体。参见PCT国际专利申请公开号WO 1994/02602。在一些实施方案中，非人动物中存在的编码重链和轻链免疫球蛋白的内源基因已经被去除或以其他的方式被失活，并且编码人重链和轻链免疫球蛋白的核酸已经被插入到宿主的基因组中。例如，使用含有必要的人DNA节段的酵母人工染色体掺入人基因。然后将含有比修饰的全部互补序列更少的中间转基因动物杂交获得作为子代的提供所有所需的修饰的动物。

这种非人动物的一个实施方案是称为XENOMOUSE^TM的小鼠，其描述于PCT国际专利申请公开号WO 1996/33735和WO 1996/34096中。XENOMOUSE^TM产生分泌全人免疫球蛋白的B细胞。在用目的免疫原免疫接种后，抗体可以作为例如，多克隆抗体制剂，从动物直接获得，或备选地从来自被免疫的动物的永生化B细胞(诸如产生单克隆抗体的杂交瘤)获得。另外地，编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因可以被恢复并表达以直接获得抗体和/或可以进一步被修饰以获得抗体的类似物，诸如，例如，单链Fv分子。

产生非人动物的方法的实例公开于美国专利号5,939,598，该专利通过引用并入本文，所述非人动物诸如但不限于缺少内源性免疫球蛋白重链表达的小鼠。这样的非人动物可以通过包括下面步骤的方法获得：在胚胎干细胞中从至少一个内源性重链基因座删除J节段基因，从而防止所述基因座的重排以及形成编码重排的免疫球蛋白重链基因座的RNA。在一些实施方案中,所述删除可以通过靶向载体来实现，所述靶向载体含有可选择性标记。此后，可以从胚胎干细胞产生具有含有编码所述可选择性标记的基因的体细胞和生殖细胞的转基因动物(例如，小鼠)。所述转基因动物预期将不能重排其内源性免疫球蛋白重链基因座，并且因此预期不能产生内源性免疫球蛋白。

产生目的抗体，诸如人抗体的方法还公开于美国专利号5,916,771，该专利通过引用并入本文。其包括将含有编码重链的核苷酸序列的第一表达载体引入到培养的一个哺乳动物宿主细胞中，将含有编码轻链的核苷酸序列的第二表达载体引入至另一个哺乳动物宿主细胞中，并将两个细胞融合以形成杂交细胞。该杂交细胞因此可以表达由被第一和第二表达载体编码的重链和轻链组成的抗体。

本文公开的检查点拮抗剂和抗原在一些实施方案中表达于多种疾病，包括各种癌细胞类型、自身免疫性疾病、神经变性疾病和感染性疾病等。因此，在一些实施方案中，针对检查点相关肽的抗体和抗体-样分子可以从核酸载体表达为检查点拮抗剂,并且与肿瘤相关抗原组合用于治疗、诊断、疫苗接种、预防、延缓和减轻癌症，诸如但不限于黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、肺鳞癌、肉瘤、肾细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状肿瘤、白血病、脑癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌。备选地，所述组合物可以包括是与本发明的抗原组合使用的已知抗体的拮抗剂。

生成的对如本文所公开的抗原具有特异性的抗体可以用来检测生物样品中的相应靶肽。在一些实施方案中，生物样品分离自被怀疑患有癌症的个体，并且因此检测可以用来诊断癌症。备选地，生物样品可以分离自已知患有癌症的个体，并且对其中靶肽的检测可以用作疾病预后、癌症表征、疗效、疾病进展或其任意组合的指标。可以被采用用于这些目的的免疫测定在本领域中是已知的，并且包括，但不限于，免疫组织化学、流式细胞术、放射免疫测定、蛋白质印迹和ELISA。适合于此类测试的生物样品包括，但不限于，细胞、组织活检样品、全血、血浆、血清、痰、脑脊液、胸水和尿。

可以制备试剂盒以辅助疾病的诊断、监测和/或预后。在一些实施方案中,所述试剂盒有助于检测和/或测量癌症特异性磷肽和/或磷蛋白。这样的试剂盒可以在单一容器或分开的容器中包含含有抗原结合区的分子。在一些实施方案中,这样的分子是抗体或抗体-样分子。可以包含在试剂盒中的其他成分包括固相载体、检测试剂、二抗、使用说明书、用于运行测定的容器、凝胶、对照样品等中的一种或多种。在一些实施方案中，抗体或抗体-样分子可以任选地被直接或间接标记。

备选地，对被靶向的免疫检查点相关蛋白和抗原特异的抗体或抗体-样分子可以与治疗剂缀合。示例性的治疗剂包括，但不限于下列：

烷化剂：烷化剂是直接与基因组DNA相互作用以防止细胞增殖的药物。此类化疗药物代表了影响细胞周期的所有阶段的药剂(即，它们不是细胞周期阶段特异性的)。烷化剂包括，但不限于氮芥、乙撑亚胺(ethylenimene)、甲基三聚氰胺、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三嗪。特别的示例性的烷化剂包括但不限于白消安、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(cytoxan)、达卡巴嗪、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(氮芥)和美法仑。

抗代谢药：抗代谢药破坏DNA和RNA合成。不像烷化剂，它们特别地在S期期间影响细胞周期。抗代谢药可以分成多种类别，诸如叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和相关的抑制性化合物。抗代谢药包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、氟达拉滨、吉西他滨和甲氨蝶呤。

天然产品：天然产品通常是指原始地从天然来源分离并被鉴定为具有所需的药理学活性的化合物。此类化合物，包括其类似物和衍生物，可以分离自天然来源、化学合成和/或通过本领域技术人员已知的任何技术重组产生。天然产品包括诸如下列的类别：有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、酶和生物反应调节剂。

有丝分裂抑制剂包括植物生物碱和其他天然药剂，它们在一些实施方案中可以抑制细胞分裂所需的蛋白合成，并且在一些实施方案中抑制有丝分裂。它们典型地在细胞周期的特定阶段期间发挥作用。有丝分裂抑制剂包括，例如，多西他赛、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷、紫杉醇、紫杉酚、长春花碱、长春新碱和长春瑞滨等。

紫杉烷类化合物是从灰树短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮分离的一类相关化合物。紫衫烷类化合物包括但不限于诸如多西他赛和紫杉醇的化合物。紫杉醇结合微管蛋白(在与长春花生物碱所使用的位点不同的位点处)并且促进微管的组装。

长春花生物碱是被鉴定具有药物活性的一类植物生物碱。示例性的长春花生物碱包括长春花碱(VLB)和长春新碱。

抗生素：某些抗生素具有抗微生物和/或细胞毒活性。这些药物还通过化学抑制酶和有丝分裂或改变细胞膜来干扰DNA。这些药剂典型地不是细胞周期阶段特异的。细胞毒性抗生素的实例包括但不限于博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、光神霉素(光辉霉素)和伊达比星。

杂类药剂：杂类细胞毒药剂不属于前面的类别，包括但不限于铂配位络合物、蒽二酮、取代脲、甲基肼衍生物、安吖啶、L-天冬酰胺酶和维甲酸。铂配位络合物包括诸如卡铂和顺铂(cis-DDP)的化合物。示例性的蒽二酮是米托蒽醌。示例性的取代脲是羟基脲。示例性的甲基肼衍生物是甲基苄肼(N-甲基肼,MIH)。这些实例是非限制性的并且考虑任何已知的细胞毒剂、细胞生长抑制剂和/或杀细胞剂可以连接到本发明公开的主题的靶向肽并且被施用至被靶向的器官、组织和/或细胞类型。

化疗(细胞毒)剂包括，但不限于，5-氟尿嘧啶、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、美法仑、丝裂霉素、诺维本、亚硝基脲、林可霉素(plicomycin)、甲基苄肼、雷洛昔芬、他莫昔芬、紫杉酚、替莫唑胺(DTIC的水溶液形式)、反式铂、长春花碱、甲氨蝶呤、长春新碱和前述各项的任何类似物和/或衍生物或变体。大多数化疗剂属于烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、皮质类固醇激素、有丝分裂抑制剂、和亚硝基脲、激素剂、杂类药剂及其任何类似物、衍生物或变体的类别。

上面的公开内容大体地描述了本发明公开的主题。通过参考下面的具体实施例可以获得更完全的理解，在本文中所述具体实施例仅提供用于说明的目的，并不意在限制本发明公开的主题的范围。

实施例

下面的实施例提供进一步说明性的实施方案。根据本公开和本领域技术人员的一般水平，技术人员将理解下面的实施例意在仅是示例性的，并且可以在不背离本发明公开的主题的范围的前提下采用大量的改变、改进和变化。

实施例1

利用具有下表2中的序列的一个或多个靶向人PDL1的向导RNA、CRISPR-Cas9蛋白和抗原蛋白β-淀粉样蛋白设计并构建质粒：

表2.

CRISPR-Cas9蛋白在CMV启动子的控制下表达，向导RNA由T7启动子表达，β-淀粉样蛋白在hEFla启动子的控制下表达，如图1中所绘。尽管图1显示了单质粒构建体，但这些元件表达在多个DNA质粒中也在本发明的范围内。将该质粒递送至患有例如阿尔兹海默病的患者。当前载体可以基于可公共获得的序列信息化学合成。

实施例2

如上面实施例1中所述使用靶向PDL1和/或CTLA4(上面的表1)的向导RNA、CRISPR-Cas9蛋白和Her2/Neu构建单质粒。图2描绘了单质粒，其中CRISPR-Cas9蛋白由CMV启动子表达，向导RNA由T7启动子表达，Her2/Neu由h-EFla启动子表达。这样的组合物可以用于治疗疾病，诸如，但不限于，乳腺癌或其他表达Her2/Neu的癌症。

实施例3

如上面实施例1中所述使用靶向PDL1和/或CTLA4(上面的表1)的向导RNA、CRISPR-Cas9蛋白和Her2/Neu构建单质粒。图2描绘了单质粒，其中CRISPR-Cas9蛋白由CMV启动子表达，PDL1向导RNA由T7启动子表达，CTLA4 gRNA在启动子的控制下表达，Her2/Neu由h-EFla启动子表达。

实施例4

如上面实施例1中所述使用在PGK启动子的控制下的编码细胞毒性蛋白(诸如假单胞菌外毒素A或白喉毒素)的表达单元构建单质粒，如图2中所示。这样的配置充当安全卫士防止免疫检查点敲除的APC继续递呈自身抗原从而引起自身免疫反应。

实施例5

图2描绘了使用可以由相同或不同的启动子转录(图2)的多个向导RNA(针对相同或不同的免疫检查点抑制剂)。在图2中，PDL1 gRNA和CTLA4 gRNA两者均在T7p启动子的控制下。在备选方案中，考虑使用不同的启动子。

实施例6

构建含有α病毒复制子的单个或多个DNA载体。在此配置中，靶向PDL1和/或CTLA4序列(表1)的向导RNA、CRISPR-Cas9蛋白和β-淀粉样蛋白从含有α病毒复制子的单个或多个DNA载体表达。在此情况下，图3描绘了CRISPR-Cas9蛋白由CMV启动子表达，向导RNA由T7启动子表达，β-淀粉样蛋白在α病毒复制子的亚基因组启动子控制下表达。溶解性α病毒载体优选用来提供额外的安全引导。这样的组合物可以用于治疗疾病，诸如，但不限于，阿尔兹海默病和癌症。

实施例7

如上面实施例1中所述构建单质粒。靶向PDL1和/或CTLA4(表1)的向导RNA、CRISPR-Cas9蛋白和截短(跨膜结构域缺失)的人或不同物种的PDL1(表2)从单个DNA质粒表达。图1和2描绘了CRISPR-Cas9蛋白在CMV启动子的控制下表达，向导RNA在T7启动子的控制下表达，截短的PDL1在h-EFla启动子的控制下表达。这样的组合物可以产生针对PDL1的自身抗体，并且可以用于治疗疾病，诸如，但不限于，膀胱癌、NSCLC，或可以用于产生自身免疫性疾病动物模型。

实施例8

如图3中所绘，靶向PDL1和/或CTLA4(表1，向导RNA序列被选择为与截短的PDL1基因没有互补序列)的向导RNA、CRISPR-Cas9蛋白和截短的(没有跨膜结构域)PDL1从含有α病毒复制子的单个或多个DNA载体表达。在此实施例中，CRISPR-Cas9蛋白由CMV启动子表达，向导RNA由T7启动子表达，截短的PDL1由α病毒复制子的亚基因组启动子表达。溶解性α病毒载体优选用来提供额外的安全引导。这样的组合物可以用于治疗疾病，诸如，但不限于，膀胱癌和NSCLC(非小细胞肺癌)。备选地，其可以用于产生自身免疫性疾病动物模型。

实施例9

作为实施例8中给出的配置的替代方案，靶向PDL1和/或CTLA4序列(表1)的向导RNA、CRISPR-Cas9蛋白和Her2/Neu(表1)从含有α病毒复制子的单个或多个DNA载体表达。如图3中所示，CRISPR-Cas9蛋白由CMV启动子表达，向导RNA由T7启动子表达，Her2/Neu由α病毒复制子的亚基因组启动子表达。溶解性α病毒载体优选用来提供额外的安全引导。这样的组合物可以用于治疗疾病，诸如，但不限于，乳腺癌或其他表达Her2/Neu的癌症。

实施例10

构建DNA载体，其中PDL1和/或CTLA4蛋白在CMV启动子的控制下，PDL1蛋白在PGK启动子的控制下，BRAF在hEFla启动子的控制下表达和/或肽基精氨酸脱亚胺酶-4蛋白在SV40启动子的控制下表达。此载体描绘于图4中。

实施例11

如图5中所绘构建载体，所述载体包含在CMV启动子控制下表达的CTLA4蛋白、在PGK启动子控制下表达的PDL1抗原、在hEFla启动子控制下表达的VACM1和/或在SV40启动子控制下表达的供体不匹配的HLA DQ7+9(56PPD)。

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Claims (70)

1.一种组合物，所述组合物包含：

a)至少一种免疫检查点拮抗剂；和

b)至少一种抗原。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种编码所述至少一种免疫检查点拮抗剂的核酸。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述免疫检查点拮抗剂是结合免疫检查点相关蛋白的多肽。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述多肽是抗体。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述免疫检查点相关蛋白是选自由下列各项组成的组的配体：PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOS配体、B7-H3、B7-H4、4-1BBL、HVEM、OX40L、CD70、CD40L、半乳凝集素-9、腺苷、GITRL、IDO、TDO、CEACAM1、VISTA、CD47、CD155、CD48、HHLA2、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTNL2、BTNL3、BTNL9、A2Ar、CD30、CD244、CSFIR、CXCR4-CXCL12、ICOSL、IgSF、ILTs、LIK、MICA/MICB、神经毡蛋白、NKG2A、磷脂酰丝氨酸、Siglec3、TGF-B、TLIA、TNFRSF25、4.1BBL、A2Ar、BTNL2、CD30、CD244、CSFIR、CXCR4-CXCL12、ICOSL、IgSF、ILTs、LIK、MICA/MICB、神经毡蛋白、NKG2A、磷脂酰丝氨酸、Siglec3、TGF-B和TLIA。

6.根据权利要求3所述的组合物，其中所述免疫检查点相关蛋白是选自由下列各项组成的组的可溶性受体：PD-1、CTLA-4、CD28、ICOS、4-1BB、BTLA、CD160、LIGHT、LAG3、OX40、CD27、CD40、TIM-3、腺苷A2a受体、GITR、CEACAM1、SIPR-α、DNAM-1、TIGIT、CD96、2B4、TMIGD2和DC-SIGN。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫检查点拮抗剂选自由下列各项组成的组：CTLA-4拮抗剂、维罗非尼、伊匹单抗、达卡巴嗪、IL-2、替莫唑胺、伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、舒尼替尼、酪氨酸磷酸化抑制剂、PD-1激动剂/拮抗剂和特拉替尼。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫检查点拮抗剂选自由下列各项组成的组：siRNA、微小RNA、双链RNA、切丁酶底物RNA、核酶和适配体、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)和ZFNS(锌指核酸酶)。

9.根据权利要求2所述的组合物，其中所述至少一种核酸已经被密码子优化从而比没有被如此优化的编码相同蛋白的核酸产生更稳定的mRNA。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫检查点拮抗剂包括至少一组编码能够削弱或消除免疫检查点相关蛋白的表达的核酸序列的CRISPR-CAS9，所述免疫检查点相关蛋白选自由下列各项组成的组：PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOS配体、B7-H3、B7-H4、4-1BBL、HVEM、OX40L、CD70、CD40L、半乳凝集素-9、腺苷、GITRL、IDO、TDO、CEACAM1、VISTA、CD47、CD155、CD48、HHLA2、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTNL3、BTNL9、PD-1、CTLA-4、CD28、ICOS、4-1BB、BTLA、CD160、LIGHT、LAG3、OX40、CD27、CD40、TIM-3、腺苷A2a受体、GITR、CEACAM1、SIPR-α、DNAM-1、TIGIT、CD96、2B4、TMIGD2和DC-SIGN。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述至少一组编码核酸序列的CRISPR-CAS9编码至少一种向导RNA(gRNA)，所述向导RNA靶向编码免疫检查点相关蛋白的基因。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗原包括衍生自下述的肽：MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、b-淀粉样蛋白、CA125、CD40、EGFR、G17DT、GD2/3L、gp100、IMA950、KOC1、肽基精氨酸脱亚胺酶-4、MUC-1、OFA、PANVAC、PAP、PSA、PSMA、SL701、SSX-2、TTK、TACAS、URLC10、vEGFR和WT-1。

13.根据权利要求1所述的组合物，其包含编码所述抗原的核苷酸序列。

14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗原是自身抗原。

15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗原是外源抗原。

16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。

17.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗原是睾丸癌相关抗原。

18.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗原包括至少一种相对于野生型突变的新抗原多肽。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述至少一种突变多肽结合I类MHC或II类MHC分子。

20.根据权利要求18所述的组合物，其中所述新抗原多肽中的相对于野生型的突变已经通过对肿瘤细胞的基因组的一部分测序并且将该肿瘤序列与健康供体细胞的基因组的对应部分比较而鉴定。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述新抗原存在于特定患者群体和肿瘤类型中。

22.根据权利要求20所述的组合物，其中所述新抗原由癌基因编码。

23.根据权利要求20所述的组合物，其中所述抗原被T细胞受体(TCR)识别。

24.根据权利要求20所述的组合物，其中所述测序通过二代测序(NGS)完成。

25.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种编码所述至少一种抗原的核酸。

26.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种编码所述至少一种免疫检查点拮抗剂的核酸和至少一种编码所述至少一种抗原的核酸。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述至少一种编码所述至少一种免疫检查点拮抗剂的核酸和所述至少一种编码所述至少一种抗原的核酸是相同的核酸分子。

28.根据权利要求26所述的组合物，其中所述至少一种编码所述至少一种免疫检查点拮抗剂的核酸和所述至少一种编码所述至少一种免疫检查点激动剂的核酸是不同的分子。

29.根据权利要求25所述的组合物，其中所述免疫检查点拮抗剂是抗体。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述抗体选自由下列各项组成的组：CTLA-4拮抗剂、阿维鲁单抗、派姆单抗、伊匹单抗、德瓦鲁单抗、阿特珠单抗、纳武单抗和PD-1激动剂/拮抗剂。

31.根据权利要求25所述的组合物，其中所述至少一种核酸存在于载体中。

32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述载体是溶解载体。

33.根据权利要求31所述的组合物，其中所述载体是包覆以抗原表位的纳米粒子。

34.根据权利要求27所述的组合物，其中所述相同的核酸分子是单个质粒。

35.根据权利要求28所述的组合物，其中所述不同的核酸分子包括至少两种质粒。

36.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含佐剂。

37.根据权利要求29所述的组合物，其中所述佐剂选自由下列各项组成的组：montanideISA-51、QS-21、破伤风辅助肽、GM-CSF、环磷酰胺、卡介菌(BCG)、小棒杆菌、左旋咪唑、azimezone、isoprinisone、二硝基氯苯(DNCB)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、矿物凝胶、氢氧化铝(Alum)、溶血卵磷脂、复合多元醇、多聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚和白喉毒素(DT)。

38.根据权利要求1所述的组合物，其包含已经在体外被操作以插入所述至少一种免疫检查点拮抗剂和所述至少一种抗原的细胞。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述细胞是自体细胞。

40.根据权利要求38所述的组合物，其中所述细胞是异源细胞。

41.根据权利要求36所述的组合物，其中所述细胞是抗原递呈细胞(APC)。

42.一种治疗疾病的方法，所述方法包括利用根据权利要求1所述的组合物治疗有需要的患者。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述疾病是增生性病症。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述增生性病症是癌症。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述治疗相对于不采用所述组合物的标准治疗导致癌症肿瘤大小减少至少10-20％或减少约10-20％。

46.根据权利要求42所述的方法，其中所述疾病是感染性疾病。

47.根据权利要求42所述的方法，其中所述疾病是神经变性疾病。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默病。

49.根据权利要求42所述的方法，其中所述疾病涉及器官移植排斥。

50.根据权利要求42所述的方法，其中所述疾病是自身免疫性疾病。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自由下列各项组成的组：系统性红斑狼疮、干燥综合征、SLE、混合结缔组织病、原发性胆汁性肝硬化、乳糜泻、类风湿性关节炎、重症肌无力、硬化性肌炎、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、副肿瘤性小脑变性、边缘叶脑炎、脑脊髓炎、舞蹈手足徐动症、亚急性感觉神经元病、僵人综合征、1型糖尿病、视神经病变、舞蹈症和德维克氏综合征。

52.一种预防疾病的方法，所述方法包括利用根据权利要求1所述的组合物治疗有需要的患者。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述疾病是增生性病症。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述增生性病症是癌症。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述治疗相对于不采用所述组合物的标准治疗导致癌症肿瘤大小减少至少10-20％或减少约10-20％。

56.根据权利要求52所述的方法，其中所述疾病是感染性疾病。

57.根据权利要求52所述的方法，其中所述疾病是神经变性疾病。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默病。

59.根据权利要求52所述的方法，其中所述疾病涉及器官移植排斥。

60.根据权利要求52所述的方法，其中所述疾病是自身免疫性疾病。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自由下列各项组成的组：系统性红斑狼疮、干燥综合征、SLE、混合结缔组织病、原发性胆汁性肝硬化、乳糜泻、类风湿性关节炎、重症肌无力、硬化性肌炎、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、副肿瘤性小脑变性、边缘叶脑炎、脑脊髓炎、舞蹈手足徐动症、亚急性感觉神经元病、僵人综合征、1型糖尿病、视神经病变、舞蹈症和德维克氏综合征。

62.一种调节有需要的患者的免疫系统的方法，所述方法包括以足以引起对新抗原表位的免疫应答的量向所述患者施用包含所述新抗原和免疫检查点拮抗剂的组合物。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述新抗原选自由衍生自下列的肽组成的组：MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、b-淀粉样蛋白、CA125、CD40、EGFR、G17DT、GD2/3L、gp100、IMA950、KOC1、肽基精氨酸脱亚胺酶-4、MUC-1、OFA、PANVAC、PAP、PSA、PSMA、SL701、SSX-2、TTK、TACAS、URLC10、vEGFR、WT-1、BRAF、假单胞菌外毒素A或白喉毒素。

64.根据权利要求62所述的方法，其中所述检查点相关蛋白的拮抗剂响应于所述新抗原下调所述患者的免疫系统。

65.一种调节有需要的患者的免疫系统的方法，所述方法包括以足以引起对自身抗原的免疫抑制的量向所述患者施用包含所述自身抗原和免疫检查点过表达产物的组合物。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述自身抗原选自由下列各项组成的组：组氨酸-tRNA连接酶、核糖核蛋白、snRNP核心蛋白、I型拓扑异构酶、组蛋白、核孔蛋白62、Sp100核抗原、核孔蛋白210Kda、肌动蛋白、环瓜氨酸肽、凝血酶、外切体复合物蛋白、烟碱性乙酰胆碱受体、肌肉特异性激酶、电压门控钙通道、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、TSH受体、神经元核蛋白、谷氨酸受体、双载蛋白、谷氨酸脱羧酶、塌陷反应介导蛋白5、N-甲基-D-天冬氨酸受体、水通道蛋白和个体特异性自身抗体(ISA)。

67.根据权利要求65所述的方法，其中所述组合物进一步包含至少一种免疫抑制性细胞因子。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述至少一种免疫抑制性细胞因子选自由下列各项组成的组：IL-1Ra、IL-4、IL-10、IL-11、IL-13、TGF-b、IL-33、IL-35和IL-37。

69.一种生成动物自身免疫性疾病模型的方法，所述方法包括向动物施用根据权利要求1所述的包含自身抗原的组合物以针对所述自身抗原调节所述动物的免疫系统。

70.一种生成动物自身免疫性疾病模型的方法，所述方法包括向动物施用根据权利要求1所述的包含抗原的组合物以针对所述抗原调节所述动物的免疫系统。