CN111150716B - 一种普适性的抗原自递呈肿瘤疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种普适性的抗原自递呈肿瘤疫苗及其制备方法。本发明提供了一种用于抗肿瘤的、可以进行抗原递呈，并具有打破免疫耐受机制的基于DC囊泡的制备方法，本发明将膜表达修饰的抗PD‑1抗体质粒转染DC，使DC表面表达抗PD‑1抗体；然后将肿瘤特异性抗原基因构建至复制缺陷型腺病毒中，通过将腺病毒感染上述DC，腺病毒感染所表达的肿瘤抗原以内源性抗原递呈途径(MHC‑I类途径)递呈至DC表面，形成MHC I‑Ag复合体；再通过表面活化剂诱导及超声破碎处理，制备出同时展示抗PD‑1抗体及MHC I‑Ag复合体的DC囊泡，经纯化及均一化处理后，得到尺寸均一的具有免疫抑制阻断功效的抗原自递呈纳米囊泡。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有免疫抑制阻断功效的抗原自递呈纳米囊泡疫苗(AntigenSelf-Presenting Nanovaccine with Immunosuppressive Checkpoint BlockadeEnhancing， ASPIRING)，可以展示抗PD-1抗体，及各种肿瘤特异性抗原相关的MHC I-Ag抗原表位递呈复合体，其制备方法及所属纳米材料不仅可作为预防性疫苗用于肿瘤的预防，还能作为一种治疗性疫苗策略用于肿瘤的治疗，属于生物医药材料以及纳米医学领域和预防医学领域。
背景技术
肿瘤疫苗通常是通过激活机体自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞/体液免疫反应，增强机体的抗肿瘤能力。与传统疫苗不同，肿瘤疫苗既着眼于肿瘤的预防，更重要的是用于肿瘤的治疗并已成为目前国内外肿瘤治疗领域的研究热点。目前可用于肿瘤治疗的疫苗包括蛋白疫苗、亚单位疫苗、DC(dendritic cell，树突状细胞)疫苗以及核酸疫苗。随着对组织相容性复合体(MHC)分子的结构及其与抗原表位相互作用的深入揭示，使得一些基于抗原表位筛选的蛋白分子短肽进行肿瘤免疫治疗成为可能。DC细胞诱导的特异性免疫治疗已成为恶性肿瘤生物治疗研究领域热点。DC疫苗的疗效与肿瘤抗原的选择、肿瘤抗原的负载方式、DC数量、DC的成熟度及DC注射方式等多种因素密切相关。大量研究证明基于DC的肿瘤疫苗是安全而有效的，在恶性黑素瘤、脑胶质瘤、前列腺癌及肾癌中， DC疫苗与新兴的免疫检查点疗法的联合策略，进一步提高了客观缓解率及中位生存期。细胞膜源囊泡疫苗载体系统不仅保护抗原或抗体免于机体酶解，而且其具有的较好的生物相容性、缓释抗原、易于进行多功能设计改造等特点。通过将DC疫苗技术、免疫检查点疗法抗PD-1抗体治疗与纳米囊泡疫苗载体技术有机结合，将有助于寻求改善或克服肿瘤治疗的难题的新策略。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种普适性的抗原自递呈肿瘤疫苗,所述的肿瘤疫苗为抗原自递呈纳米囊泡疫苗ASPIRING，抗PD-1抗体与MHC I-Ag复合体同时展示在囊泡疫苗表面，所述的囊泡为树突状细胞产生，抗PD-1抗体构建表达至树突状细胞表面，肿瘤特异性抗原以内源性抗原递呈途径即MHC-I类途径递呈至树突状细胞表面。
在本发明中，肿瘤特异性抗原包括黑色素瘤新抗原B16-M27、B16-M33、TRP2180-188中的至少一种，肿瘤特异性抗原被MHC-I分子所递呈形成的MHC I-Ag免疫组织相容性复合体。
优选地，所述的抗PD-1抗体为抗小鼠PD-1抗体。
优选地，所述的抗原自递呈纳米囊泡疫苗粒径为50-150nm。
在本发明中，抗PD-1抗体通过疏水性跨膜肽段锚定于细胞质膜和ASPIRING的脂质膜表面；肿瘤特异性抗原表位通过内源性递呈途径以MHC I-Ag免疫组织相容性复合体形式递呈到细胞质膜和ASPIRING的脂质膜表面。
优选地，ASPIRE中被掺入了表面活化剂胆酸钠盐，可调控该囊泡的纳米粒径与均一性, 同时增强ASPIRE的结构稳定性与柔韧性。
优选地，树突状细胞包括DC2.4细胞系、骨髓来源树突状细胞，或者患者外周血自体分离的树突状细胞中的至少一种。
优选地，该ASPIRE进一步装载T细胞激动剂。
本发明还提供所述的一种普适性疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1)将抗PD-1抗体进行膜表达修饰构建至质粒载体，转染树突状细胞，继而采用带有肿瘤抗原基因的重组复制缺陷型腺病毒，感染所述树突状细胞；该质粒为pDC316真核表达质粒载体系统，该腺病毒为五型复制缺陷腺病毒，为AdMax腺病毒载体系统：
将重组质粒pDC316-αPD1转染未成熟树突状细胞，获得表面表达抗PD-1抗体的未成熟DC；继而将带有肿瘤特异性抗原基因的重组腺病毒感染所述树突状细胞，之后收集细胞，便可进一步获得膜展示的抗PD-1抗体及MHC I-Ag抗原递呈复合体的目标细胞；
2)将0.01-0.02％的胆酸钠加入到上述细胞中，冰上孵育20-40min后，使用低功率超声破碎细胞，诱导细胞产生ASPIRING；低功率超声的范围为15-30W。
3)加入PMSF蛋白酶抑制剂，采用多次差速离心法纯化ASPIRE，首先分别用1500-2500g、 3500-4500g低温离心4-6min，收集上清，以去除细胞核、细胞器及大粒径囊泡，然后20000-30000g低温离心0.5-1.5h收集沉淀,即为初步纯化的ASPIRE。
本发明还提供所述的一种普适性的肿瘤疫苗该疫苗作为包括肝癌、肺癌、黑色素瘤在内恶性肿瘤的治疗剂的用途。
本发明提供了一种新形式的兼具抗原自递呈与免疫抑制阻断性能的纳米囊泡作为通用的肿瘤新型疫苗，它可以在生物膜表面同时展示免疫检查点抗体及肿瘤特异MHC I-Ag抗原递呈复合体，在表面活化剂及低功率超声诱导下，自发形成组装出纳米级的抗原自递呈囊泡疫苗 ASPIRING；该ASPIRING纳米疫苗可直接特异性刺激激活CD8+T细胞，诱导强劲的CTL细胞毒作用；该ASPIRE纳米疫苗可直接封锁T细胞表面PD-1通路，重新活化被耗竭的效应T细胞，并通过CD80/86共刺激信号的共递送增强免疫抑制阻断；该ASPIRE纳米疫苗可以进一步装载T细胞激动剂，形成一种新的免疫复合物，以增强调节刺激T细胞活化的效果。利用仿生纳米囊泡用于抗原递呈与抗体递送，具有非细胞治疗的安全性，具备大规模生产的可能性，为世界抗肿瘤研究提供了一种新的策略和思路。
本发明将疏水修饰的抗PD-1(programmed death-1，程序性细胞死亡蛋白-1)抗体基因构建至pDC316真核表达质粒，转染未成熟DC2.4细胞或者骨髓来源的DC细胞，获得膜表达抗体的未成熟DC,继而将肿瘤特异性抗原基因构建至复制缺陷型5型腺病毒载体中，获得过表达肿瘤特异性抗原的重组腺病毒，用重组腺病毒感染上述所获DC细胞，由腺病毒过表达的肿瘤特异性蛋白经胞质溶胶途径，以内源性抗原递呈方式由MHC-I分子递呈至细胞膜外表面，形成抗原表位递呈免疫复合物MHC I-Ag。再通过表面活化剂及超声诱导细胞出芽的方法，获得展示完整抗PD-1抗体及抗原表位递呈免疫复合物MHC I-Ag的囊泡，经进一步纯化处理，即可获得形态均一、尺寸可控的抗原自递呈纳米囊泡。
本发明的有益效果：
1.提供了一种具有免疫抑制阻断功效的抗原自递呈纳米囊泡疫苗(ASPIRING)，可作为一种整合了肿瘤特异性抗原表位递呈与检查点抗体递送的功能化载体，免疫检查点抗体及抗原表位递呈免疫复合物MHC I-Ag展示在囊泡脂质膜上，保护性展示检查点抗体的同时模拟了天然抗原递呈细胞，具有良好的生物活性及免疫原性，可以有效诱导强劲的体液免疫及CD8+T 细胞介导的CTL细胞毒效应，兼具免疫激活与免疫抑制阻断多位一体的性能。
2.ASPIRING可以有效展示所有肿瘤相关抗原表位或肿瘤特异性抗原表位相关MHC-I-Ag 免疫递呈复合物在该囊泡的脂质膜上，包括肝癌，肺癌，结肠癌，黑色素瘤等抗原表位的递送与递呈，具有良好的普适性，一旦筛选出新的肿瘤特异性蛋白基因序列，即可以用作有效疫苗预防或者治疗肿瘤。
3.ASPIRING实现免疫检查点抗体与共刺激分子的共递送，有效促进免疫抑制阻断的效能。
4.ASPIRING实现免疫激活与免疫抑制阻断一体化，并使二者相互促进，获取治疗效果的增益。
5.ASPIRING可进一步装载T细胞激动剂，形成一种新的免疫复合物，以增强调节刺激T 细胞活化的效果。
6.利用仿生纳米囊泡用于抗体递送与抗原递呈，具有非细胞治疗的安全性，具备大规模生产的可能性。这种免疫激活与免疫抑制阻断一体化整合的模式将为抗肿瘤研究提供了一种新的策略和思路。
7.本发明使用表面活化剂胆酸钠及低功率超声，可以制备出尺寸在100纳米左右的、形态均一的抗原自递呈纳米囊泡，具有良好的可重复性和可操作性。
附图说明
图1:通过荧光显微镜(a)确定抗PD-1抗体在树突状细胞表面大量表达，腺病毒导入目的基因的策略促进树突状细胞分化成熟，促进MHC-I分子在树突状细胞表面的表达(b)。
图2:冷冻电镜对ASPIRING大小和形貌表征。
图3：ASPIRE体外抗原自递呈。其中，a为IFN-γ产生细胞数ELISPOT测定结果；b为TNF-α产生细胞数ELISPOT测定结果。
图4：ASPIRE体内抗原自递呈并激活抗肿瘤免疫应答。
图5：整合免疫激活与免疫抑制阻断的ASPIRE疫苗强效增益抗肿瘤。
具体实施方式
ASPIRING的制备方法可按如下步骤：
(1)在抗PD-1抗体基因重链末端引入疏水跨膜区，构建至质粒载体pDC316，通过重组质粒pDC316-αPD1转染，将抗PD-1抗体基因导入DC2.4或骨髓、PBMC来源树突状细胞中，表达并展示完整抗PD-1抗体在细胞的质膜上。48h后，收获细胞。
(2)将肿瘤特异性重组腺病毒载体感染上述所获DC，并在培养基中加入刺激因子TNF-α，将肿瘤特异性抗原基因DC细胞中并刺激其成熟分化，以抗原表位递呈免疫复合物MHC I-Ag 在细胞的质膜上递呈肿瘤抗原。
(3)在感染48h后，收获被感染并刺激成熟的树突状细胞。
(4)往细胞中加入0.01-0.02％的胆酸钠，冰上孵育30min后，使用低功率(22.5W)超声破碎细胞，诱导细胞出芽并组装成囊泡。
(5)加入PMSF蛋白酶抑制剂，采用多次差速离心法纯化ASPIRING，首先分别用2000g、 4000g 4℃低温离心5min，收集上清，以去除细胞核、细胞器及大粒径囊泡,然后25000g 4℃低温离心1h收集沉淀,即为初步纯化的ASPIRING。
(6)为了获取更高纯度的尺寸均一的ASPIRING，可进一步采用超滤膜压力过滤，裁剪成均一的ASPIRE：将悬液装载入挤压器，使其分别依次经过800nm、400nm、200nm孔径纤维膜反复挤压，收集产物，测定蛋白抗原的含量。
(7)使用超滤清洗的方法去除碎片、表面活化剂及其他游离组分。超滤清洗具体操作：将处理后的ASPIRE悬液用生理盐水稀释5倍，再用30KD的超滤管进行超滤浓缩，并持续补加生理盐水，保持超滤管中样品体积恒定，使得清洗用的生理盐水的液体总体积是原液的10倍。
(8)将上述纯化好的ASPIRE囊泡在生理盐水中适当稀释后，4℃暂存或-80℃长期保存。
实施例1：以下合成步骤中的所使用的试剂为市售商品。
ASPIRING的制备方法，包括以下步骤：
(1)将骨髓中分离得到的单个核细胞，用含10％FBS的1640培养基将细胞浓度调整至 1×107个/mL，接种于10cm培养皿中培养2h，轻轻摇晃培养瓶，倾倒培养液以去除未贴壁细胞，再用1640培养基轻轻洗涤3-4遍，以彻底洗去悬浮细胞。
(2)按照一定比例加入细胞因子(rmGM-CSF 80ng/ml,rmIL-4 40ng/ml),用含有10％FBS 的1640培养基，于37℃细胞培养箱中继续培养7天，观察细胞生长状况，每隔3天半量更换培养液。
(3)7天后，吹打收取悬浮细胞团，转移至15mL离心管中1 500rpm离心10min。弃上清，此时的细胞沉淀就是小鼠的未成熟树突状细胞。
(4)在抗PD-1抗体基因重链末端引入疏水跨膜区(参见Proc Natl Acad Sci U SA.2015 Nov 10；112(45):E6129-38.Virus-mimetic nanovesicles as a versatileantigen-delivery system.)，构建至质粒载体pDC316，获得重组质粒pDC316-αPD1。用1μg/2×104个细胞的比例将pDC316-αPD1重组质粒转染上述DC，培养48小时。
(5)加入细胞因子(rmGM-CSF 80ng/ml,rmIL-4 40ng/ml rmTNF-α20ng/ml),采用10 MOI滴度的带有肿瘤特异性抗原基因的重组腺病毒感染上述DC 48h，收获被肿瘤抗原刺激成熟的DC。
(6)将0.01-0.02％的胆酸钠加入到上述细胞中，冰上孵育30min后，使用低功率超声破碎细胞，目的是通过表面活化剂及超声刺激，诱导细胞产生ASPIRE。
(7)加入PMSF(苯甲基磺酰氟)蛋白酶抑制剂，采用多次差速离心法纯化ASPIRE，首先分别用2000g、4000g 4℃低温离心5min，收集上清，以去除细胞核、细胞器及大粒径囊泡,然后25000g 4℃低温离心1h收集沉淀,即为初步纯化的ASPIRE。为了获取更高纯度的尺寸均一的ASPIRE，可进一步采用超滤膜压力过滤，裁剪成均一的ASPIRE：将悬液装载入挤压器，使其分别依次经过800nm、400nm、200nm孔径纤维膜反复挤压五次，收集产物，测定蛋白抗原的含量。
(8)使用超滤清洗的方法去除碎片、表面活化剂及其他游离组分。超滤清洗具体操作：将处理后的ASPIRE悬液用生理盐水稀释5倍，再用30KD的超滤管进行超滤浓缩，并持续补加生理盐水，保持超滤管中样品体积恒定，使得清洗用的生理盐水的液体总体积是原液的10 倍。将纯化好的ASPIRE囊泡在生理盐水中适当稀释后，4℃暂存或-80℃长期保存。
1.目的蛋白的细胞定位，及DC分化成熟检测(图1)：
采用免疫荧光技术检测由真核表达质粒导入膜表达的PD1抗体，以及采用流式检测重组腺病毒导入模式抗原(OVA或GFP)至树突状细胞中后，DC成熟分化状态及MHC-I刺激性表达情况。具体来说，细胞接种培养皿中，将pDC316-αPD1重组质粒转染细胞48h，继而用10 MOI滴度的重组腺病毒感染树突状细胞，48h后，将细胞用0.5％的多聚甲醛固定，PBS洗四次，加Flag标签(膜表达抗体附带)特异性单克隆抗体作为一抗，室温孵育半小时，PBS洗四次，加入荧光标记二抗进行免疫荧光，最终90％甘油封片，使用荧光显微镜进行观察。通过显微镜可以观测到大量PD-1抗体在细胞膜上定位表达。通过对树突状细胞形态观察，及成熟分化的标志性表面分子CD80、CD86、CD11c进行测定，可检测到重组腺病毒感染及目的基因的表达促进了树突状细胞的分化成熟。进一步测定MHC I分子的表达状况，结果显示出病毒感染方式导入目的基因，相比于其他抗原导入方式，更有效促进树突状细胞的以胞质胶体途径递呈抗原表位，促进MHC I分子高表达。
2.抗原自递呈纳米囊泡的形态学表征(图2)：
应用透射电镜及DLS粒径测定仪器对抗原自递呈纳米囊泡(ASPIRING)进行形貌表征。如图2透射电镜照片所示，所制备的ASPIRE的形貌均匀，粒径在100nm左右。
3.ASPIRING体外抗原自递呈活化CD8+T细胞(图3)：
为了体外检测ASPIRE抗原自递呈能力,从小鼠脾脏中分离得到CD8+T细胞，并在所得 T细胞培养体系中加入不同浓度ASPIRE(对应抗原蛋白浓度1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml)进行共培养，在共培养10天后，采用ELISPOT法测定T细胞活化状况。发现ASPIRE与T细胞共培养能显著刺激CD8+T细胞活化成为效应CTL细胞，且这种促进活化的效率与ASPIRE相对浓度具有正相关性，这些数据表明了抗原自递呈纳米囊泡ASPIRE可体外直接将抗原递呈给CD8+T细胞，并使其活化。
4.ASPIRING疫苗体内抗原自递呈验证(图4)：
采用C57BL/6背景的抗原递呈缺陷小鼠进行随机分组后，各组小鼠分别通过皮下免疫途径，注射含有5μg抗原蛋白的ASPIRE。一共免疫三次，每次间隔两周，在最后一次免疫两周后对小鼠进行皮下接种Hep 1-6-OVA模式肿瘤，持续监测小鼠肿瘤生长状况，定期测量肿瘤体积及记录小鼠生存状况。在肿瘤接种后，ASPIRE免疫组肿瘤无生长，小鼠生存率依旧保持100％，表现出良好的抗肿瘤效果,而其他各组抗原递呈缺陷小鼠肿瘤迅速发展。表明了 ASPIRING能直接体内实现抗原自递呈，激活机体抗肿瘤免疫应答。
5.ASPIRE抗实体瘤效果增益(图5)：
将C57BL/6小鼠随机分组后，皮下接种黑色素瘤B16F10细胞，第10天，各组小鼠分别接受疫苗皮下免疫，共免疫三次，每次间隔一周，持续监测小鼠肿瘤生长状况，定期测量肿瘤体积及记录小鼠生存状况。游离的PD-1抗体对照组小鼠肿瘤迅速发展，小鼠持续出现死亡，单纯的抗体治疗方式未能有效抑制肿瘤的发展。自递呈囊泡疫苗与游离抗体联合治疗组有效减缓了肿瘤的发展，但是最终也未能清除肿瘤。相比之下，整合抗原自递呈与免疫抑制阻断的ASPIRE免疫组肿瘤全部消退清除，强效提高小鼠生存率，表现出ASPIRE优越的抗肿瘤增益效果。
Claims (10)
1.一种普适性的抗原自递呈肿瘤疫苗,其特征在于：所述的肿瘤疫苗为抗原自递呈纳米囊泡疫苗ASPIRING，抗PD-1抗体与MHC I-Ag复合体同时展示在囊泡疫苗表面，所述的囊泡是树突状细胞在表面活化剂及超声诱导下产生的，抗PD-1抗体构建表达至树突状细胞表面，肿瘤特异性抗原以内源性抗原递呈途径即MHC-I类途径递呈至树突状细胞表面。
2.如权利要求1所述的一种普适性的抗原自递呈疫苗，其特征在于，肿瘤特异性抗原包括黑色素瘤新抗原B16-M27、B16-M33、TRP2180-188中的至少一种，肿瘤特异性抗原被MHC-I分子所递呈形成的MHC I-Ag免疫组织相容性复合体。
3.如权利要求1所述的一种普适性的抗原自递呈疫苗，其特征在于，所述的抗PD-1抗体为抗小鼠PD-1抗体。
4.如权利要求1所述的一种普适性的抗原自递呈疫苗，其特征在于，所述的抗原自递呈纳米囊泡疫苗粒径为50-150nm。
5.如权利要求1所述的一种普适性的抗原自递呈疫苗， 其特征在于：抗PD-1抗体通过疏水性跨膜肽段锚定于细胞质膜和ASPIRING的脂质膜表面；肿瘤特异性抗原表位通过内源性递呈途径以MHC I-Ag免疫组织相容性复合体形式递呈到细胞质膜和ASPIRING的脂质膜表面。
6.如权利要求1所述的一种普适性的抗原自递呈疫苗，其特征在于: ASPIRING中被掺入了表面活化剂胆酸钠。
7.如权利要求1所述的一种普适性的抗原自递呈疫苗，其特征在于:树突状细胞包括DC2.4细胞系、骨髓来源树突状细胞，或者患者外周血自体分离的树突状细胞中的至少一种。
8.如权利要求1所述的一种普适性的抗原自递呈疫苗，其特征在于:该ASPIRING进一步装载T细胞激动剂。
9.如权利要求1至8任一项所述的一种普适性的抗原自递呈疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1）将抗PD-1抗体进行膜表达修饰构建至质粒载体，转染树突状细胞，继而采用带有肿瘤抗原基因的重组复制缺陷型腺病毒，感染所述树突状细胞；该质粒为pDC316真核表达质粒载体系统，该腺病毒为五型复制缺陷腺病毒，为AdMax腺病毒载体系统：
将重组质粒pDC316-αPD1转染未成熟树突状细胞，获得表面表达抗PD-1抗体的未成熟DC；继而将带有肿瘤特异性抗原基因的重组腺病毒感染所述树突状细胞，之后收集细胞，进一步获得膜展示的抗PD-1抗体及MHC I-Ag抗原递呈复合体的目标细胞；
2）将0.01-0.02%的胆酸钠加入到上述细胞中，冰上孵育20-40min后，使用低功率超声破碎细胞，诱导细胞产生ASPIRING；低功率超声的范围为15-30W；
3) 加入PMSF蛋白酶抑制剂，采用多次差速离心法纯化ASPIRING，首先分别用1500-2500g、3500-4500g 低温离心4-6min，收集上清，以去除细胞核、细胞器及大粒径囊泡，然后20000-30000g 低温离心0.5-1.5h收集沉淀,即为初步纯化的ASPIRING。
10.根据权利要求1至8任一项所述的一种普适性的抗原自递呈肿瘤疫苗在制备包括肝癌、肺癌、黑色素瘤在内的恶性肿瘤的治疗剂的用途。
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