CN105148264A - 一种普适性的流感疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型流感疫苗及其制备方法,本发明将流感病毒HA基因转染真核细胞后，真核表达修饰后的流感血凝素(HA)蛋白插入宿主细胞质膜上，再通过表面活化剂诱导细胞出芽的方法，产生了较大的展示流感病毒包膜糖蛋白的囊泡，经纯化和再一次加入表面活化剂处理后，使其变为尺寸均一、可控的、纳米级的拟态病毒囊泡。同时通过稳定表达HA的细胞株的建立和生物反应器的使用，本方法也适用于大规模的流感疫苗生产。本发明该方法简单易行，可以展示大多数的流感病毒(包括禽流感和猪流感)的血凝素蛋白，具有良好的普适性，有巨大潜力可用于新出现的高致死性流感病毒疫苗的设计。

Description

一种普适性的流感疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种拟态流感病毒的纳米囊泡(VMV)，可以展示各种亚型的流感HA等抗原，其制备方法及所属纳米材料不仅可用于已知亚型的流感病毒的预防，还能用于防止新出现的未知流感病毒的爆发，属于生物医药材料以及纳米医学领域和预防医学领域。

背景技术

流行性感冒病毒简称流感病毒,流感病毒包膜糖蛋白是由HA(haemmagglutinin)和NA(neuraminidase)组成的,由于RNA病毒易变异，HA和NA具有高度变异性，这导致流感在世界各地每年都有不同规模的小流行或是若干年一次的世界范围的大流行，流感不但给人类身体健康而且给世界经济发展带来极大地危害。世界卫生组织警告:一场全球性的流行性大流感将会导致200万-700万人死亡，尤其,近几年高致病性禽流感和猪流感在世界各地发生后,以惊人的速度在世界传播,由此导致爆发的地区蒙受巨大经济损失。因此,如何获得高效及安全的疫苗来防控及预防流感一直是各国科学工作者关注的课题。

当前大部分的流感疫苗都是鸡胚生产的，生产的周期较长，同时禽流感病毒或其他流感病毒在鸡胚中生产过程中容易造成鸡胚死亡，降低了疫苗产量。此外,高致病性流感病毒的生产过程需要高安全等级的GMP环境，容易造成二次污染和病毒的泄露。

发明内容

本发明提出了一种新型的拟态流感病毒的纳米囊泡作为广谱的流感HA、NA等抗原的投递载体，它可以模拟流感病毒最外层的包膜及包膜蛋白部分，在表面活化剂A和B的作用下，形成纳米级的拟态病毒囊泡(VMV)，流感病毒抗原镶嵌于该拟态病毒囊泡上；该VMV可以进一步加入氢氧化铝佐剂或GPI糖苷佐剂，形成一种新的免疫复合物，以增强抗原的免疫原性。利用基因重组的方法在真核细胞中产生HA等病毒抗原，可以有效避免危险病毒的生产，有利于大规模的疫苗生产，满足世界范围内高致病性流感爆发时疫苗的需求。

本发明的技术方案如下：

一种普适性的流感疫苗,其包括可以模拟流感病毒最外层的包膜及包膜蛋白部分的纳米级的拟态病毒囊泡，流感病毒抗原镶嵌于该拟态病毒囊泡上；所述的囊泡为真核细胞经诱导出芽而得。

所述流感病毒抗原包括各种流感病毒的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA、流感病毒抗原的各种表位中的至少一种。还可以为其它适合作为抗原的物质。

所述的真核细胞包括T细胞、MDCK细胞、VERO细胞、S2细胞、昆虫细胞、胚胎干细胞、患者自体分离培养的细胞等各种真核细胞系中的至少一种。优选采用T细胞。

在本发明中，囊泡中还可以被掺入表面活化剂,以控制该囊泡的纳米尺寸和均一性,和增加了VMV的稳定性和柔韧性。

其中，表面活性剂优选为曲拉通X-100和/或去氧胆酸钠盐。其优选使用浓度为0.01-0.1％的去氧胆酸钠和0.01-0.1％曲拉通X-100。

在本发明中，将流感病毒HA基因转染真核细胞后，真核表达修饰后的流感血凝素(HA)蛋白插入宿主细胞质膜上，经过嘌呤霉素筛选后获得稳定表达细胞株,再通过表面活化剂诱导细胞出芽的方法，产生了较大的展示流感病毒包膜糖蛋白的囊泡，经纯化和再一次加入表面活化剂处理后，使其变为尺寸均一、可控的、纳米级的拟态病毒囊泡。

在本发明中，流感病毒抗原包括各种流感病毒的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA、流感病毒抗原等各种表位。

在本发明中，流感病毒抗原是通过疏水性跨膜肽段锚定于细胞质膜和VMV的脂质膜表面。

本发明的又一技术方案为：

一种普适性的流感疫苗的生产方法,包括如下步骤：

1)将流感病毒基因转染真核细胞后，真核表达修饰后的病毒蛋白插入宿主细胞质膜上；

2)筛选获得稳定表达细胞株；

3)诱导细胞出芽，产生展示流感病毒包膜糖蛋白的囊泡。

4)经纯化和处理，使其囊泡变为尺寸均一、可控的、纳米级的拟态病毒囊泡。

其中，步骤1)基因转染的方法包括电转法、脂质体转染法、PEI转染、磷酸钙转染法、慢病毒或腺病毒转染中的至少一种。或是其它合适的方法。

在本发明的较佳实施例中，步骤1)通过慢病毒转染病毒抗原基因，获得稳定表达HA的细胞株的方法，其中该慢病毒转染系统使用四质粒慢病毒系统，将PRRE、REV、VSVG、PLV四质粒转染真核细胞，转染后收集上清，获得慢病毒，再用慢病毒感染目标细胞，经筛选后，最终可以获得稳定表达的细胞株，用于进一步的生产VMV。

在本发明中，步骤4)的处理方法为采用表面活化剂处理。

在本发明的较佳实施例中，所述的表面活性剂为曲拉通X-100和去氧胆酸钠盐。

在本发明的较佳实施例中，拟态流感病毒囊泡的制备方法，包括以下步骤：

(1)取稳定表达HA在细胞质膜上的稳转细胞株

(2)将0.015-0.02％的去氧胆酸钠加入到表达HA和NA的细胞中，混合30min后，再使用漩涡震荡器，高速旋转，目的是通过表面活化剂诱导细胞出芽的产生较大的VMV。

(3)加入PMSF蛋白酶抑制剂后，大囊泡通过多次差速离心法进行纯化，先分别用800g、2000g、4000g离心5min(4℃)，去除细胞核和细胞器,然后使用25000g离心30min去除上清,从而获得较大的展示抗原的囊泡。为了获得更高纯度的囊泡，还可以再使用蔗糖密度梯度离心法或超滤膜过滤法进一步分离纯化较大的囊泡。

(4)将上述纯化好的展示抗原的较大的囊泡在PBS溶液中吹打悬浮后，与0.045％的去氧胆酸钠和0.05％的曲拉通X-100在PBS溶液中混合30min后并超声15s，就可以产生尺寸均一的VMV，-80℃保存备用.

一种普适性的流感疫苗中的VMV纳米颗粒的用途，该纳米囊泡可用于各种亚型的流感病毒HA等抗原的展示，包括猪流感病毒、人流感病毒和禽流感病毒的HA等抗原的投递。

在本发明中，该VMV可以进一步加入氢氧化铝佐剂、GPI糖苷佐剂或其他佐剂，以增强投递抗原的免疫原性。

在本发明中，VMV的制备方法可按如下步骤：

(1)可以通过以下基因转染的方法包括电转法、脂质体转染法、PEI转染、磷酸钙转染法、慢病毒或腺病毒转染等，将流感病毒抗原基因HA或NA基因表达质粒转入真核细胞中，表达该流感病毒抗原蛋白在细胞的质膜上。

(2)在转染48h后，使用2-3μg/ml的嘌呤霉素，对转染的真核细胞进行筛选，2-3星期后可获得多个团状细胞群，将其小心挑出并胰酶消化后，通过有限稀释法在96孔板中获得稳定表达抗原的单克隆细胞株。

(3)往筛选出的细胞中加入0.015-0.02％的去氧胆酸钠，混合20-30min后，再使用漩涡震荡器，高速旋转，目的是通过表面活化剂诱导细胞出芽的产生较大的展示抗原的囊泡。

(4)在加入PMSF蛋白酶抑制剂后，大囊泡通过多次差速离心法进行纯化，先分别用800g、2000g、3000g离心5min(4℃)，去除细胞核和细胞器,然后使用25000g离心30-45min去除上清,保留沉淀，从而获得较大的展示抗原的囊泡。

(5)将该沉淀用PBS吹打起来，低功率超声分散后，使用蔗糖密度梯度离心进一步纯化：将VMV悬液以不超过离心腔50％的空间体积的量上样，在0—55％的蔗糖密度梯度下3000rpm/min离心3h(4℃)，检测280nm波长的紫外吸收峰，并收集下来，测定各组分HA等抗原的含量，来确定最佳组分。

(6)浓缩后的大囊泡与0.045％的去氧胆酸钠和0.05％的曲拉通X-100在PBS溶液中混合30min后并超声15-30s，就可以产生尺寸均一的VMV。

(7)最后使用超滤清洗的方法去除多余的蔗糖、表面活化剂、和其他游离组分。超滤清洗的方法为：将处理后的VMV悬液用PBS稀释2-4倍，再用300万分子量的超滤膜进行超滤浓缩，边超滤边补加PBS，保持超滤期间液体量恒定，使得清洗用的PBS的液体总量至少是原液的6-8倍。

本发明的有益效果：

1.利用基因重组的方法在真核细胞中产生HA等病毒抗原，可以有效避免危险病毒的生产，有利于大规模的疫苗生产，满足世界范围内高致病性流感爆发时疫苗的需求。提供了一种拟态流感病毒的纳米囊泡(VMV)，可作为一种流感病毒HA等抗原的投递载体，流感病毒HA、NA等抗原镶嵌在囊泡脂质膜上，模拟了天然包膜病毒的最外层原始形态，具有良好的生物活性和免疫原性，可以有效诱导中和抗体来抵御流感病毒的入侵。

2.VMV可以有效展示所有亚型的流感病毒的HA蛋白在该囊泡的脂质膜上，包括猪流感病毒、人流感病毒和禽流感病毒的HA等抗原的投递，显示出了良好的普适性，一旦分离出新的流感的HA的基因序列，可以预防新出现的流感大爆发。

3.VMV可以进一步加入氢氧化铝佐剂、GPI糖苷佐剂等其他类型佐剂，形成一种新的免疫复合物，以增强抗原的免疫原性，减少抗原的使用量。

4.利用基因重组的方法在真核细胞中产生HA、NA等病毒抗原，可以有效地避免危险致命病毒的生产，同时稳定表达抗原的细胞株的建立和生物反应器的使用，将有利于大规模的疫苗制备，满足世界范围内高致病性流感爆发时疫苗的需求。

5.本发明使用表面活化剂A和B，可以制备出尺寸在50-200纳米范围内的、均一的纳米级拟态流感病毒的囊泡，具有良好的重复性和可操作性。

附图说明

图1:通过激光共聚焦显微镜确定流感HA蛋白的在细胞中的定位，同时，在表面活化剂的影响下，较大细胞囊泡的产生。

图2：冷冻电镜观察拟态病毒囊泡的大小和形貌表征。(标尺：100纳米)

图3：通过血凝试验检测拟态流感病毒囊泡VMV的血细胞凝结能力，以及胰酶对VMV的凝血能力的影响。

图4：将VMV通过肌肉途径免疫小鼠后的血清血凝抑制(HAI)反应。

图5：将VMV通过肌肉途径免疫小鼠后的血清的中和抗体滴度水平。

具体实施方式

以下合成步骤中的所使用的试剂为市售商品。

实施例1VMV的制备方法，包括以下步骤：

(1)转染前24h，用0.25％胰蛋白酶37℃消化对数生长期的293T细胞2-3min，以含10％血清的培养基调整细胞密度为1.2x10⁷细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。使用的HA基因来自于H1N1流感病毒(A/California/04/2009).通过全基因合成的方式直接获得。

(2)把稀释后的慢病毒包装质粒(PLV-HA、PRRE、REV、VSVG，按质量比1：1：1：1)与稀释后的Lipofectamine2000进行混合(1:2.5)，剧烈震荡后，在室温下温育20分钟，再将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液，混合液的体积占培养基体积的十分之一中，混匀，于37℃,5％CO₂的细胞培养箱中培养。培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，换上新鲜培养基，培养48h后，收集293T细胞的上清液，含慢病毒的上清液经过离心和0.45μm滤器过滤处理后，即获得了较纯的慢病毒产物。

(3)最后将慢病毒(4ml)和4ug/ulpolybrene加入10cm盘的MDCK细胞中，保证polybrene的终浓度为8μg/ml，正常条件下培养。

(4)在转染48h后，使用终浓度2-3μg/ml的嘌呤霉素，对转染的真核细胞进行筛选，2-3星期后可获得多个团状细胞群，将其小心挑出并用0.25％胰酶消化3-5min后，通过有限稀释法在96孔板中获得稳定表达抗原的单克隆细胞株。

(5)再将筛选出的MDCK细胞中加入0.015-0.02％的去氧胆酸钠，混合20-30min后，再使用漩涡震荡器，高速旋转，目的是通过表面活化剂诱导细胞出芽的产生较大的展示抗原的囊泡。然后加入PMSF蛋白酶抑制剂(终浓度为1mM)后，大囊泡通过多次差速离心法进行纯化，先分别用800g、2000g、3000g离心5min(4℃)，去除细胞核和细胞器,然后使用25000g离心30-45min去除上清,保留沉淀，从而获得较大的展示抗原的囊泡。

(6)将该沉淀用PBS吹打起来，低功率超声分散后，使用蔗糖密度梯度离心进一步纯化：将VMV悬液以不超过离心腔50％的空间体积的量上样，在0—55％的蔗糖密度梯度下30000rpm/min离心3h(4℃)，检测280nm波长的紫外吸收峰，并收集下来，测定各组分HA等抗原的含量，来确定最佳组分。再将浓缩后的大囊泡与0.045％的去氧胆酸钠和0.05％的曲拉通X-100在PBS溶液中混合30min后并低功率超声15-30s，就可以产生尺寸均一的VMV(50-200nm)。

(7)最后使用超滤清洗的方法去除多余的蔗糖、表面活化剂、和其他游离组分。超滤清洗的方法为：将处理后的VMV悬液用PBS稀释2-4倍，再用300万分子量的超滤膜进行超滤浓缩，边超滤边补加PBS，保持超滤期间液体量恒定，使得清洗用的PBS的液体总量至少是原液的6-8倍。

实施例2流感HA蛋白的细胞定位，图1：

使用激光共聚焦显微镜来确定HA蛋白在真核细胞中的定位，同时使用表面活化剂来促进较大细胞囊泡的产生。具体来说，细胞过夜爬片后，将PLV-HA的质粒与liposome2000混合后，加入到无血清培养基中，6小时后换成正常培养基，转染48h后，将细胞爬片取出，固定，用DAPI染核后，再用PBS洗四次，接下来加抗-HA的鼠单克隆抗体进行孵育半小时，洗后再加入FITC-标记的羊抗鼠二抗进行免疫荧光，最终90％甘油封片，使用蔡司LSM-780激光共聚焦显微镜进行观察。可以看到绝大多数的HA蛋白都存在于细胞膜上，而且在表面活化剂(去氧胆酸钠)的影响下，该转染细胞产生了较大的展示HA蛋白的较大的细胞囊泡(500-2500纳米)

2.拟态流感病毒的形态学表征:

应用冷冻电镜对拟态流感病毒(VMV)进行形貌表征。如图2所示，在0.045％的去氧胆酸钠和0.05％曲拉通100的作用下，VMV囊泡的粒径显著变小(100纳米左右)；

实施例3.流感VMV粒子的体外受体结合功能评价(凝血试验)：

为了检测流感VMV粒子的体外受体结合能力,我们将来源于5×10⁵个的293T细胞的VMV倍比稀释后与0.5％的鸡血红细胞混合，室温静置40min后，观察红细胞凝集现象，我们发现使用TPCK-胰酶处理不同时间的相同数量的VMV，在胰酶处理后有显著提高的血凝滴度，且这种提高具有时间和细胞数量的正相关性，这些数据表明了流感拟态病毒囊泡可以像正常的活病毒一样与细胞膜受体结合，促使鸡血红细胞的相互交联(图3)。

实施例4

Balb/c小鼠的VMV免疫：各组小鼠通过分别通过尾静脉、肌肉和尾静脉肌肉肉联合免疫途径，分别注射100μgVMV-HA和10μl的铝佐剂混合物或相同HA抗原量的灭活病毒或杆状病毒重组产生的HA蛋白。一共免疫三次，每次间隔两周，在最后一次免疫二十天后给老鼠眼眶采血，离心后获得血清。

血清学免疫检测：先将灭活的流感H1N1病毒包被96孔板，然后利用ELISA来检测免疫老鼠血清总IgG抗体滴度，图4显示各组免疫的老鼠均能产生较高的体液免疫反应，同时该结果与血凝抑制实验(图4)和中和实验(图5)结果一致，证明了通过肌肉免疫途径可以诱导强大的体液免疫反应。

Claims (10)

1.一种普适性的流感疫苗,其特征在于：包括可以模拟流感病毒最外层的包膜及包膜蛋白部分的纳米级的拟态病毒囊泡，流感病毒抗原镶嵌于该拟态病毒囊泡上；所述的囊泡为真核细胞经诱导出芽而得。

2.如权利要求1所述的一种普适性的流感疫苗,其特征在于：将流感病毒HA基因转染真核细胞后，真核表达修饰后的流感血凝素蛋白插入宿主细胞质膜上，经过嘌呤霉素筛选后获得稳定表达细胞株,再通过表面活化剂诱导细胞出芽的方法，产生了较大的展示流感病毒包膜糖蛋白的囊泡，经纯化和再一次加入表面活化剂处理后，使其变为尺寸均一、可控的、纳米级的拟态病毒囊泡。

3.如权利要求1所述的一种普适性的流感疫苗,其特征在于：流感病毒抗原包括各种流感病毒的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA、流感病毒抗原的各种表位。

4.如权利要求1所述的一种普适性的流感疫苗,其特征在于：流感病毒抗原是通过疏水性跨膜肽段锚定于细胞质膜和VMV的脂质膜表面。

5.如权利要求1所述的一种普适性的流感疫苗,其特征在于：拟态病毒囊泡中被掺入了不同浓度两种表面活化剂以控制该囊泡的纳米尺寸和均一性和增加拟态病毒囊泡的稳定性和柔韧性。

6.一种普适性的流感疫苗的生产方法,包括如下步骤：

1)将流感病毒基因转染真核细胞后，真核表达修饰后的病毒蛋白插入宿主细胞质膜上；

2)筛选获得稳定表达细胞株；

3)诱导细胞出芽，产生展示流感病毒包膜糖蛋白的囊泡；

4)经纯化和处理，使其囊泡变为尺寸均一、可控的、纳米级的拟态病毒囊泡。

7.根据权利要求6所述的一种普适性的流感疫苗的生产方法,其特征在于：步骤4)的处理方法为采用表面活化剂处理。

8.根据权利要求7所述的一种普适性的流感疫苗的生产方法,其特征在于：所述的表面活性剂为曲拉通X-100和去氧胆酸钠盐。

9.根据权利要求6所述的一种普适性的流感疫苗的生产方法,包括以下步骤：

(1)取稳定表达HA在细胞质膜上的稳转细胞株；

(2)将0.015-0.02％的去氧胆酸钠加入到表达HA和NA的细胞中，混合30min后，再使用漩涡震荡器，高速旋转，通过表面活化剂诱导细胞出芽的产生较大的VMV；

(3)加入PMSF蛋白酶抑制剂后，大囊泡通过多次差速离心法进行纯化，先分别用800g、2000g、4000g离心5min，去除细胞核和细胞器,然后使用25000g离心30min去除上清,从而获得较大的展示抗原的囊泡；

(4)将上述纯化好的展示抗原的较大的囊泡在PBS溶液中吹打悬浮后，与0.045％的去氧胆酸钠和0.05％的曲拉通X-100在PBS溶液中混合30min后并超声15s，产生尺寸均一的VMV，-80℃保存备用。

10.一种拟态病毒囊泡的用途，该拟态病毒囊泡包括可以模拟流感病毒最外层的包膜及包膜蛋白部分的纳米级的拟态病毒囊泡，流感病毒抗原镶嵌于该拟态病毒囊泡上；所述的囊泡为真核细胞经诱导出芽而得，该纳米囊泡的用途在于各种亚型的流感病毒抗原的展示，以及包括猪流感病毒、人流感病毒和禽流感病毒的HA抗原的投递。