WO2009102229A1 - Липид-протеиновый рафтовый комплекс из оболочки вируса гриппа а для противогриппозных вакцин и способ его выделения, способ получения вирусоподобных частиц из таких комплексов - Google Patents

Липид-протеиновый рафтовый комплекс из оболочки вируса гриппа а для противогриппозных вакцин и способ его выделения, способ получения вирусоподобных частиц из таких комплексов Download PDF

Info

Publication number
WO2009102229A1
WO2009102229A1 PCT/RU2008/000085 RU2008000085W WO2009102229A1 WO 2009102229 A1 WO2009102229 A1 WO 2009102229A1 RU 2008000085 W RU2008000085 W RU 2008000085W WO 2009102229 A1 WO2009102229 A1 WO 2009102229A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
virus
detergent
influenza
detergents
protein
Prior art date
Application number
PCT/RU2008/000085
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Viktor Alekseevich Radyukhin
Original Assignee
A.N. Belozersky Institute Of Physico-Chemical Biology, Moscow State University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by A.N. Belozersky Institute Of Physico-Chemical Biology, Moscow State University filed Critical A.N. Belozersky Institute Of Physico-Chemical Biology, Moscow State University
Priority to PCT/RU2008/000085 priority Critical patent/WO2009102229A1/ru
Publication of WO2009102229A1 publication Critical patent/WO2009102229A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the invention relates to the field of medical biotechnology, is associated with obtaining the original lipid-protein raft complex from influenza A virus by fragmenting its shell and can be used in the manufacture of vaccines that can be used in the prevention of influenza.
  • Influenza A virus is a single-stranded RNA virus of the Orthomuchovirus family, the diameter of the viral particles is from 80 to 120 nm, the virions have a pleomorphic lipoprotein membrane with large surface protrusions in the form of spikes formed by hemagglutinin (HA) and neuraminidase (HA),
  • HA hemagglutinin
  • HA neuraminidase
  • GA is a surface glycoprotein located on the surface of the virus envelope and anchored in it by its transmembrane segment;
  • Ml is the main structural (matrix) protein of the virus, located under the viral lipid membrane and associated with it, as well as with surface HA and HA through their membrane-bound domains;
  • M2 - minor viral protein which is a transmembrane proton channel
  • PA - polymerases associated with viral RNA PA - polymerases associated with viral RNA.
  • Hemagglutinin and neuraminidase are the most immunogenic components of the influenza virus that determine the subtypes of the influenza virus.
  • the high content of HA and HA in the virus allows their use in the form of subunit vaccines.
  • Matrix Ml protein is one of the main internal virus antigens specific for virus types A and B.
  • the total antiviral activity of Ml as was shown to be structurally related to the so-called zinc-binding motif of this protein, and functionally apparently based on the ability of the protein to inhibit its own viral polymerases.
  • EH Nasser, et al. (1996) J. Virol., V. 70, 8639-8644; E. Ka- Wai Hui, et al. (2006) J. Virol., V. 80, 5697-5707].
  • M2 protein being a minor component of the viral membrane, has a pronounced antigenic activity.
  • Live and inactivated vaccines are known. Live attenuated vaccines, unlike inactivated ones, can elicit a local immune response. In most countries, inactivated influenza vaccines are currently used for influenza prophylaxis, the strain composition of which is periodically changed in accordance with WHO recommendations. Three types of inactivated influenza vaccines are known: whole-virion, split (split-vaccines) and subunit.
  • the Whole Virus Influenza Vaccine is a suspension of inactivated, highly purified, intact, virions of the influenza virus. This vaccine is considered the most reactogenic, but is recommended in many countries only for use by adult recipients.
  • split and subunit vaccines are preferable, since they are purified from the lipid components of the virus, which are associated with the main adverse reactions. These vaccines are recommended for people of all ages.
  • Subunit and split vaccines contain purified basic antigenic components HA and HA isolated from virion. Such vaccines are obtained by selective solubilization with detergents from intact native virions in suspension, for example, p-octyl- ⁇ -D-glucopyranoside, also known as octyl glucoside. [E. S. Isaeva et al. Orthomyxovirus glycoproteins. Ed. Science, Alma-Ata, 1988, pp. 119 - 126].
  • Influenza virus like many other pathogens, is introduced through the mucous membranes, primarily the respiratory tract. Therefore, the mucosal immune response is an essential component of the overall immune response.
  • the current injection vaccines stimulate the production of a general immune response through GA-specific serum immunoglobulins G (IgG)
  • the production of immunoglobulins A (IgA) by the mucous membrane lymphoid tissue is extremely important for a stable and long-lasting response.
  • Obtaining such a complex immune response is possible, in addition to live viral particles, only through virosomes, including HPV, when they are injected and / or intranasally administered.
  • micro- and nanoparticles can be composed of a variety of different components, including lipids, proteins or amino acids, polysaccharides, substances based on polyacrylates or organic acids.
  • these microparticles serve to deliver and preserve the antigens associated with them, they also contribute to the attraction of the cells of the immune system representing antigens to the corresponding site, thus guaranteeing an effective presentation of the antigen to the immune system.
  • microparticles on the basis of lipid compositions, namely liposomes and the so-called immunostimulating complexes (ISCOMs).
  • Liposomes and ISKOMs have a long history as a means of delivering antigens. Liposomes can carry both membrane-associated antigens and water-soluble molecules. The physical properties of liposomes are variable and depend both on the composition and on the method of preparation. This is what makes it possible to optimize their design depending on the specific task (targeted delivery of active molecules, joint inclusion of antigens and adjuvants, etc.).
  • ISCOMs are lipid-protein complexes of the micellar type based on cholesterol and saponins. [BUT. Nukriet et al. (2005) Vassipe, 23Sl, S 1/26 - Sl / 38; U. B. Schaad, et al. (2000), v. 44 (5), 1163-1167; F. A. Gideop, et al. (2003) Vassipe, v. 21, Iss. 9-10, 915-920].
  • HPV of various nature is the closest functional analogue of live attenuated vaccines and thus is at the center of modern research to develop highly effective new generation vaccines.
  • Such structures closer to native virions are obtained by budding them from recombinant cultured animal cells containing gene constructs expressing the main viral components.
  • the expression of the main viral matrix protein Ml is necessary for the formation of closed bilayer lipid layers.
  • the main surface antigen of the influenza virus - HA - is able to specifically direct such improved virosomes to antigen-presenting cells and lead to the fusion of these liposomes with endosomal cell membranes.
  • the composition of HPV may vary depending on the method of preparation and objectives. Their size is tens of nanometers and is comparable with the virion, and the surface antigens of HA and / or HA are exposed on their surface [T. Latham, et al. (2001) J. Virol., V. 75, 6154-6165; J. M. Galarza et al. (2005) Viral Imm ⁇ iol. ,, v. 18, 244 -251; Bm Liapg, et al. (2001) J. Virol., V. 75, 5416-5420; N. Etchart, et al. (2006) EUR. J. Immshiol., V. 36, 1136 - 1144; U.
  • HPVs obtained by recombinant technology are closed vesicular structures having a lipid membrane with associated structural components of the virus: HA, HA, Ml, M2 in various combinations [T. Latham, J. M. Galarza. (2001) J. Virol., V. 75, 6154-6165].
  • HPV-based vaccines are more immunogenic and lead to higher seroconversion than conventional subunit vaccines, and at the same time should be better tolerated than whole-virion vaccines. These qualities of HPV have been shown in a number of studies, especially when using HPV for intranasal administration. [T. Latham, J. M. Galarza. (2001) J. Virol., V. 75, 6154-6165; J. M. Galarza et al. (2005) Viral Immopol, v. 18, 244 -251].
  • HPVs were obtained, including the HA surface antigen and the Ml submembrane protein (double construct).
  • Two-fold intranasal immunization of mice with such an HPV vaccine yielded a pronounced immune response with a titer of A A antibodies in serum one and a half times higher than the result of the control immunization (one third of the living virus LDs).
  • Intramuscular immunization gave an antibody titer in excess of 50% of the control, and significantly increased with the use of adjuvant (IL-2). Mucosal immunization not only provided a protective effect against infection, but also led to a greater balance of the humoral and cellular immune response.
  • IL-2 adjuvant
  • viral glycoproteins can be isolated from the lipoprotein membrane of the virus by solubilization of the membranes using detergents with the formation of macromolecular complexes (aggregates) under certain conditions.
  • detergents usually only one detergent is used to treat the solutions.
  • detergents can be divided into two groups: ionic and nonionic, which differ in the nature of their action on viral proteins.
  • ionic detergents for example: sodium dodecyl sulfate (SDS), cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), are very strong disintegrants of viral particles. In most cases, their treatment leads to delipidization of viral particles and complete dissociation of protein-protein interactions. [E.S.
  • Non-ionic detergents that have a mild and selective effect on the viral envelope are more suitable for isolating the surface antigens of influenza A virus. It is known that p-octyl- ⁇ -D-glucopyranoside (GO) has the ability to selectively extract both glycoproteins from the shell of native intact virions, preserving their molecular structure and biological activity. Using this detergent allows you to get basic subunits of the virion, GA and HA, in the form of a micellar solution in detergent, where they are included in the micelles of the detergent and separated from the lipids of the viral membrane. When the detergent is removed, these antigenic subunits are organized into rosette-like complexes, usually including 8 to 12 subunits. [E.S.
  • Exhaust gas is widely used for the solubilization of viral glycoproteins. Many researchers recommend using this detergent in the production of influenza subunit vaccines.
  • a known method of producing antigens for influenza vaccines according to patent RU 2 283 239, based on the cleavage of the viral concentrate of exhaust gas at room temperature.
  • such an application of OG allows simultaneous isolation of not only surface but also internal antigens, namely, the membrane protein and nucleocapsid protein, while avoiding protein denaturation.
  • the last statement raises serious doubts, since the widespread use of GO for many years for treating intact virions shows that its main advantage is precisely the ability to selectively solubilize only surface glycoproteins at room temperature. [T. Stegmapp, et al. (1987) EMBO J. v. 6, 2651-2659].
  • Rafts that exist in the plasma membranes of cells are believed to be strong complexes or ensembles of membrane proteins and lipids that have flat platforms and fix the structural features of the original object. It has been shown that detergent-resistant membranes (or rafts) have a peculiar lipid composition, they have an increased content of cholesterol and sphingolipids in comparison with the lipid composition of the cell membrane as a whole. When the detergent is removed, the membrane raft complex is reconstructed into liposomes. [LH Schamblairip, (2004), v. 559, 1-5; K. Jacob, et al.
  • the technical task of the present invention is to develop an original method for solubilizing a purified virus-containing liquid to obtain an original raft-type lipid-protein complex from the influenza A virus envelope, which is a macromolecular structure — a detergent-resistant fragment of the influenza virus envelope containing hemagglutinin (HA) and neuraminidase (HA) surface antigens ), as well as the associated matrix protein (Ml).
  • the technical task is also to develop a method for producing a new type of HPV, which are associates of the obtained raft lipid protein complex and the use of raft lipid protein complex as an effective part of the vaccine (vaccine composition) for the prevention of influenza A virus.
  • Non-ionic detergents for the implementation of the method may vary, however, each pair of detergents in the mixture must meet the following requirements: (i) one of the detergents must contain a carbohydrate component with the general formula: Rl - O - R2, where Rl is a carbohydrate residue consisting of mono- or oligopyranoses, and R2 is alkyl with a carbon chain length of C8 - C12, (ii) the second detergent from the pair can be any detergent used to solubilize and isolate detergent-resistant membranes (rafts), namely either NP40, or Tritop X-IOO, or TWEEN 20, or TWEEN 80, or brij 98, and and brij 96 or Lubrol.
  • rafts detergent-resistant membranes
  • the proposed fragmentation method is based on the combined action of two used non-ionic detergents, is simple to perform, and leads to the formation of stable fragments of the viral envelope of raft nature, which include, along with viral lipids, the main surface antigens hemagglutinin (HA) and neuraminidase (HA), as well as the main structural protein of the virus Ml (Fig.l). Fragments are easily reconstructed into vesicular structures about 80 - 90 nm in size and represent a new analogue of virosomes or virus-like particles (HPV) (Fig. 2).
  • the main difference and advantage of the proposed method when using a combination of two detergents is the ability to selectively solubilize the main antigenic components (subunits) of the virus, HA, HA and Ml (and possibly M2), in combination with membrane lipids, without the capsid ribonucleoprotein, which is the carrier of the infectious component of the virion.
  • the action of the generally accepted raft-solubilizing detergents Tritop X-100, NP40 on influenza A virus in the absence of GO leads only to non-selective solubilization of all major viral components.
  • Another potential advantage of isolating fragments in the form of detergent-resistant membranes may be their aforementioned property to fix in their rigid structure the features of the initial natural structure of the components of the viral envelope. So for example, the human immunodeficiency virus preliminary data were obtained on the importance of conserving native conservative epitopes in surface antigen proteins to obtain an optimal immune response. [BUT. Sharma, et al., (2006) Virology, v. 352, 131 - 144].
  • the object of the present invention is also a method for producing new type of virus-like particles containing HA, HA and Ml from the proposed lipid-protein raft complex of the influenza A virus shell, solubilized directly from ordinary purified preparations of influenza A virus.
  • the technical result obtained is that new vesicular structures are HPV types that contain the main viral antigens in the complete absence of an infectious component. Such HPV can be used as influenza vaccine effectors.
  • the present invention allows to obtain a new type of HPV by fragmentation of the sheath of purified live influenza virus is very simple, namely by solubilization of the purified suspension of native viral particles with a mixture of two available non-ionic detergents, for example, OG and NP40, in the cold, followed by removal of the detergents. Removal of solubilizing agents can be achieved using various techniques. The simplest is dialysis.
  • the average size of the obtained raft fragments of the viral envelope was estimated, the apparent hydrodynamic diameter of which was 28.1 ⁇ 7.6 nm.
  • the size of the nanoparticle, which is a supramolecular lipid-protein complex, is fully consistent with existing ideas about the size of raft structures existing in cell membranes.
  • the apparent molecular weight of the fragment in the micellar solution of detergents (-500 IdDa) was estimated, the apparent hydrodynamic diameter was 40.8 ⁇ 8.6 nm, and the stoichiometric ratio of the main antigens in it was determined by quantitative amino acid analysis in combination with electrophoresis: about two Ml molecules squirrel per one thorn trimer GA.
  • the presence of NA in the solubilizate was qualitatively shown by mass spectrometry.
  • the raft nature of the resulting fragments was confirmed by the standard method of isolating detergent-resistant membranes, namely ultracentrifugation of a detergent clarified solution of membrane fragments in the sucrose gradient (biomembrane flotation technique).
  • the pop-up fractions along with membrane lipids contained HA and Ml, which was shown by electrophoretic analysis in SDS-PAGE (standard Laemmli electrophoresis method).
  • SDS-PAGE standard Laemmli electrophoresis method.
  • the subsequent confirmation of the existence of a raft lipid-protein supramolecular complex was the fact of structural reorganization of membrane fragments into large vesicular structures during their flotation. Using dynamic light scattering, the formation of such structures with an average size of about 70 - 80 nm was confirmed.
  • influenza A virus The production method was carried out on several lines of the influenza A virus, namely A PR8 / 34 (HlNl), A / du contenderk / VN ⁇ 42/2001 (H5N1), A / FPV / Rostock / 34 (H7N1).
  • the used influenza virus preparation can be obtained from conventional cultures of virus-susceptible cells, for example, a substrate-independent MDCK line, Vero, or from infected chicken embryos widely used for the industrial production of vaccines.
  • Virus production is carried out under standard optimized conditions, followed by isolation of viral particles, for example, from allantoic (culture) fluid and purification of the viral preparation through a sucrose gradient by centrifugation. Suspension of virus for the implementation of the method prepared in any isotonic saline physiological buffer (Tris, phosphate and
  • A Treatment of the influenza virus preparation in the form of a purified suspension in isotonic saline buffer (pH 7.0 - 7.4) with an equal volume of a mixture of two detergents, for example, exhaust gas and NP40 (or exhaust gas and Triton X-IOO, or exhaust gas and TWEEN 20, or exhaust gas and brij 98), in water with a concentration of 4% exhaust gas and 2% NP40 at 0 ° - 4 ° C. Holding the reaction mixture at the indicated temperature for 20-40 minutes.
  • a mixture of two detergents for example, exhaust gas and NP40 (or exhaust gas and Triton X-IOO, or exhaust gas and TWEEN 20, or exhaust gas and brij 98)
  • micellar solution of viral envelope fragments containing HA / HA, Ml and lipids in a mixture of detergents Other concentrations of detergents can be used to prepare the micellar solution, however, those indicated here are preferred.
  • NP40 and Triton X-IOO are reasonably effective for maximum extraction of Ml protein, but all of them equally effectively solubilize surface glycoproteins HA and HA in detergent-resistant membranes.
  • the resulting colloidal solution is a supramolecular lipid-protein complex containing HA / HA and Ml, with a particle size of about 70 - 80 nm, which indicates a structural reorganization of viral fragments shells into vesicular structures with loss of micellar environment from detergents.
  • a dialyzed solution containing HA / HA and Ml consists of stable vesicles with an average size of about 80 - 90 nm and an admixture of spikes of surface virus antigens, as was shown by the data of a comprehensive analysis of the drug (electrophoresis, electron microscopy, dynamic light scattering). At the same time, part of these vesicles contains influenza antigens exposed on the surface in their lipid membrane.
  • Influenza virus was used, lines A PR8 / 34 (HlNl), A / du rechargek / VN 342/2001 (H5N1), A / FPV / Rostock / 34 (H7N1) viruses were propagated in the allantoic chamber of 10-day-old chicken embryos.
  • the allantoic fluid was clarified by low-speed centrifugation, concentrated by centrifugation at 30,000 g, 3 hours at 4 ° C (Beckman JA 14 rotor) and purified through a 20% sucrose cushion in CTE buffer (10 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4 ) at 75,000 g, 2.5 hours, 4 ° C (Beckman SW 28 rotor rotor).
  • the virus in the sediment was resuspended in CTE buffer to achieve a final virus concentration of about 8 mg / ml total protein.
  • the viral preparation was incubated with a mixture of TWEEN 20 / OG and brij 98 / OG for 30 min at O 0 C and the distribution of HA, NP, and Ml by electrophoresis was analyzed.
  • a standard technique for flotation of detergent-resistant membranes in sucrose density gradient is used.
  • Virus envelope fragments in a detergent solution (clarified supernatant) were adjusted with 85% sucrose in CTE buffer to a final sucrose concentration in solution of 47.5% (1.0 ml of clarified supernatant solution and 1.8 ml of 85% sucrose).
  • 2.8 ml of 35% sucrose in CTE buffer and 0.6 ml of 5% sucrose in CTE are successively layered onto the resulting solution.
  • the formed gradient is subjected to ultracentrifugation at 140,000 g, 19 hours, 4 ° C.
  • the zone of increased turbidity formed after centrifugation at the border of 35% and 5% sucrose is collected for further analysis and dialysis.
  • the collected fractions after ultracentrifugation (0.6 ml) are placed in a cellulose dialysis tube with a molecular weight retention of> 12,000 Da (Sigma) and left in a vessel with dialysis buffer (10 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 15 ⁇ M ZnBr 2 , pH 7.2) with a volume of 600 ml with stirring and 6 ° C for 16 hours.
  • the solution after dialysis is subjected to complex analysis (Lammley electrophoresis, dynamic light scattering, electron microscopy).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Липид-протеиновый комплекс рафтовой природы из оболочки вируса гриппа А для вакцины представляет собой макромолекулярную структуру - детергент устойчивый фрагмент оболочки вируса гриппа, имеющий размер около 28 нм, полученный при солюбилизации очищенной вируссодержащей жидкости одновременно двумя разными неионными детергентами, при этом каждая пара детергентов в смеси соответствует следующим требованиям: первый детергент содержит углеводную компоненту с общей формулой R1-O-R2, где Rl -углеводный остаток, состоящий из моно- или олигопиранозы, а R2-aлкил с длиной углеродной цепи C8-C12; а второй детергент представляет собой NP40, или Тritоп X-100, или TWEEN 20, или TWEEN 80, или brij 98, или brij 96, или Lubrоl. Комплекс содержит поверхностные антигены гемагглютинина (ГА) и нейроминидазу (НА), а также асоциированный с ним матриксный белок (Ml), при этом на один шип-тример ГА приходится около двух молекул Ml белка. Способ выделения липид-протеинового комплекса заключается в холодовой (0°-4°C) солюбилизации очищенного вирусного препарата , полученного из вируссодержащей жидкости, смесью двух вышеуказанных неионных детергентов.

Description

Липид-протеиновый рафтовый комплекс из оболочки вируса гриппа А для противогриппозных вакцин и способ его выделения, способ получения вирусоподобных частиц из таких комплексов.
Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, связано с получением оригинального липид-протеинового рафтового комплекса из вируса гриппа А путём фрагментации его оболочки и может быть использовано в производстве вакцин, которые могут найти применение в профилактике гриппа.
Вирус гриппа А - одноцепочечный РНК-содержащий вирус семейства Оrthоmухоviridае, диаметр вирусных частиц составляет от 80 до 120 нм, вирионы имеют плеоморфную липопротеиновую оболочку с большими поверхностными выступами в виде шипов, образованных гемагглютинином (ГА) и нейраминидазой (НА), Известны следующие его структурные элементы с существенной антигенной активностью:
ГА - поверхностный гликопротеин, расположенный на поверхности оболочки вируса и заякоренный в ней своим трансмембранным сегментом;
НА - поверхностный гликопротеин с ферментативной активностью, связанный с мембраной вируса трансмембранным сегментом;
Ml - основной структурный (матриксный) белок вируса, подлежащий под вирусной липидной мембраной и ассоциированный с ней, также как и с поверхностными ГА и НА через их мембрансвязанные домены;
M2 - минорный вирусный белок, являющийся трансмембранным протонным каналом;
НП - капсидный нуклеопротеин, связанный с вирусной РНК и с Ml белком;
ПА - полимеразы, связанные с вирусной РНК.
Гемагглютинин и нейраминидаза — это наиболее иммуногенные компоненты вируса гриппа, определяющие подтипы вируса гриппа. Высокое содержание ГА и НА в вирусе позволяет использовать их в виде субъединичных вакцин.
Матриксный Ml белок - это один из основных внутренних антигенов вируса, специфичных по типам вируса А и В. Общая антивирусная активность Ml, как было показано, структурно связана с так называемым цинк-связывающим мотивом этого белка, а функционально видимо основана на способности белка ингибировать собственные вирусные полимеразы. Это делает Ml белок потенциальным кандидатом в качестве активного компонента для разработки живых аттенуированных высокоспецифичных вакцин и, возможно, позволит получить новый класс антивирусных агентов не только против вируса гриппа, но и других вирусов. [E. H. Nаssеr, еt аl. (1996) J. Virоl., v. 70, 8639 - 8644; E. Ka- Wаi Нui, еt аl. (2006) J. Virоl., v. 80, 5697 - 5707].
M2 белок, будучи минорной компонентой вирусной мембраны, обладает выраженной антигенной активностью.
Известны живые и инактивированные вакцины. Живые аттенуированные вакцины, в отличии от инактивированных, способны вызывать местный иммунный ответ. В большинстве стран в настоящее время для профилактики гриппа применяют инактивированные гриппозные вакцины, штаммовый состав которых периодически меняется в соответствии с рекомендациями ВОЗ. Известны три вида инактивированных противогриппозных вакцин: цельновирионные, расщепленные (сплит-вакцины) и субъединичные. Цельновирионная гриппозная вакцина представляет собой суспензию инактивированных высокоочищенных неразрушенных вирионов вируса гриппа. Эта вакцина рассматривается как наиболее реактогенная, но рекомендована во многих странах только для использования для взрослых реципиентов. По сравнению с цельновирионными предпочтительнее использовать расщеплённые и субъединичные вакцины, поскольку они очищены от липидных компонентов вируса, с которыми связаны основные побочные реакции. Эти вакцины рекомендованы для людей всех возрастов. Субъединичные и расщепленные вакцины содержат выделенные из вириона очищенные основные антигенные компоненты ГА и НА. Такие вакцины получают избирательной солюбилизацией детергентами из интактных нативных вирионов в суспензии, например п-октил-β-D- глюкопиранозидом, известным также под названием октил-глюкозид. [E. С. Исаева и др. Гликопротеиды ортомиксовирусов. Изд. Наука, Алма-Ата, 1988, стр.119 - 126]. Однако существующие вакцины не способны давать длительный защитный эффект, и совершенно очевидно, что нужны новые вакцины с улучшенной иммуногенностью. Попытки увеличить иммуногенность повышением содержания антигенов в дозе не всегда приводит к улучшению иммунного ответа. Однако в опытах на животных было показано, что изменение формулы как цельновирионных, так и субъединичных вакцин с помощью новых адъювантов или новых систем доставки соответствующих антигенов в значительной степени усиливает иммунный ответ. [А. Нuсkriеdе еt аl. (2005) Vассiпе, 23Sl, S 1/26 - Sl/38; U. В. Sсhааd, еt аl. (2000), v. 44 (5), 1163 - 1167]. В то же время вряд ли можно гарантировать абсолютную безопасность адьювантов.
Вирус гриппа, подобно многим другим патогенам, внедряется через слизистые оболочки, в первую очередь дыхательных путей. Поэтому иммунный ответ слизистых оболочек является важнейшим компонентом общего иммунного ответа. Хотя применяемые ныне инъекционные вакцины стимулируют выработку общего иммунного ответа посредством ГА-специфичных сывороточных иммуноглобулинов G (IgG), крайне существенным для стабильного и длительного ответа является выработка иммуноглобулинов A (IgA), осуществляемая лимфоидной тканью слизистых. Получение такого комплексного иммунного ответа возможно, помимо живых вирусных частиц, только посредством виросом, включая ВПЧ, при их инъекционном и/или интраназальном введении.
В последнее время интенсивно разрабатываются системы нового типа для доставки различных антигенов на основе микро- и наночастиц. Такие частицы могут быть составлены из целого набора разных компонентов, включая липиды, белки или аминокислоты, полисахариды, субстанции на основе полиакрилатов или органических кислот. В любом случае эти микрочастицы служат для доставки и сохранения связанных с ними антигенов, они также способствуют притягиванию к соответствующему сайту клеток иммунной системы, представляющих антигены, гарантируя таким образом эффективную презентацию антигена иммунной системе. [А. Нuсkriеdе еt аl. (2005) Vассiпе, 23Sl, S 1/26 - Sl/38; патент RU 2164148 Cl, 20.03.2001]. В этом контексте наибольший интерес представляют микрочастицы на основе липидных композиций, а именно липосомы и так называемые иммуностимулирующие комплексы (ИСКОМ'ы).
Липосомы и ИСКОМ'ы имеют уже долгую историю как средства доставки антигенов. Липосомы могут переносить как мембран -ассоциированные антигены, так и водорастворимые молекулы. Физические свойства липосом изменчивы и зависят как от композиции, так и от способа получения. Именно это и позволяет оптимизировать их конструкцию в зависимости от конкретной задачи (направленная доставка активных молекул, совместное включение антигенов и адъювантов и др.). ИСКОМ'ы представляют собой липид-белковые комплексы мицеллярного типа на основе холестерина и сапонинов. [А. Нuсkriеdе еt аl. (2005) Vассiпе, 23Sl, S 1/26 - Sl/38; U. В. Sсhааd, еt аl. (2000), v. 44 (5), 1163 - 1167; F. А. Gidеоп, еt аl. (2003) Vассiпе, v. 21, Iss. 9 - 10, 915 - 920].
В этом контексте недавно на основе липосом разработаны совершенно новые системы для доставки вирусных вакцинных антигенов, так называемые виросомы, и вирусоподобные частицы (ВПЧ), которые состоят из поверхностных антигенов и других компонентов вируса гриппа А. Известно, что простые виросомы получают солюбилизацией поверхностных антигенов из вирионов специфическими детергентами. [J. dе Jопgе, еt аl. (2006) Вiосhim. Вiорhуs. Асtа, 1758, 527 - 536; А. Нuсkriеdе, еt аl. (2003) Меth. Епzуmоl, v. 373, 74 - 91; А. Нuсkriеdе, еt аl. (2005), Vассiпе, 23Sl, S 1/26 - Sl/38; J. dе Jопgе, еt аl. (2006) Gепе Тhеrару, v. 13, 400 - 411].
ВПЧ различной природы являются ближайшим функциональным аналогом живых аттенуированных вакцин и таким образом находятся в центре современных исследований по разработке высокоэффективных вакцин нового поколения. Такие более близкие нативным вирионам структуры получаются при выпочковывании их из рекомбинантных культивируемых животных клеток, содержащих генные конструкты, экспрессирующие основные вирусные компоненты. При этом для производства клетками ВПЧ необходима экспрессия основного вирусного матриксного белка Ml для формирования замкнутых бислойных липидных слоев. При этом основной поверхностный антиген вируса гриппа - ГА - способен специфически направлять такие усовершенствованные виросомы к антиген- представляющим клеткам и приводить к слиянию этих липосом с эндосомальными мембранами клеток. [А. Нuсkriеdе еt аl. (2005) Vассiпе, 23Sl, S 1/26 - Sl/38; U. В. Sсhааd, еt аl. (2000), v. 44 (5), 1163 - 1167; T. Lаthаm, J. M. Gаlаrzа. (2001) J. Virоl., v. 75, 6154 - 6165; J. M. Gаlаrzа, еt аl. (2005) Virаl Immuпоl., v. 18, 244 -251].
Состав ВПЧ может варьировать в зависимости от способа получения и поставленных задач. Их размер составляет десятки нанометров и сравним с вирионом, при этом поверхностные антигены ГА и/или НА экспонированы на их поверхности [T. Lаthаm, еt аl. (2001) J. Virоl., v. 75, 6154 - 6165; J. M. Gаlаrzа, еt аl. (2005) Virаl Immшiоl.,, v. 18, 244 -251; Bm Liапg, еt аl. (2001) J. Virоl., v. 75, 5416 - 5420; N. Еtсhаrt, еt аl. (2006) Еur. J. Immшiоl., , v. 36, 1136 - 1144; U. Gltiсk, еt аl. (1999) J. Virоl., v. 73, 7780 - 7786]. Полученные по рекомбинантной технологии ВПЧ представляют собой замкнутые везикулярные структуры, имеющие липидную оболочку с ассоциированными структурными компонентами вируса: ГА, НА, Ml, M2 в различных сочетаниях [T. Lаthаm, J. M. Gаlаrzа. (2001) J. Virоl., v. 75, 6154 - 6165].
Вакцины, полученные на основе ВПЧ, более иммуногенны и приводят к более высокой сероконверсии, чем обычные субъединичные вакцины, и в то же время должны лучше переноситься, чем цельновирионные вакцины. Эти качества ВПЧ и были показаны в ряде исследований, особенно при использовании ВПЧ при интраназальном введении. [T. Lаthаm, J. M. Gаlаrzа. (2001) J. Virоl., v. 75, 6154 - 6165; J. M. Gаlаrzа, еt аl. (2005) Virаl Immuпоl, v. 18, 244 -251].
Так высвобождением с поверхности рекомбинантных клеток Sf9 в культуре получены ВПЧ, включающие поверхностный антиген ГА и подмембранный белок Ml (двойной конструкт). При двукратной интраназальной иммунизации мышей такой ВПЧ-вакциной был получен выраженный иммунный ответ с титром Г A- антител в сыворотке в полтора раза превышающим результат контрольной иммунизации (одна треть LDsо живого вируса). Внутримышечная иммунизация давала титр антител, превышающий 50% от контрольного, и значительно возрастающий при использовании адъюванта (IL-2). Иммунизация через слизистые, не только обеспечивала защитный эффект от инфекции, но и приводила к большей сбалансированности гуморального и клеточного иммунного ответа. [J. M. Gаlаrzа, еt аl. (2005) Virаl Immιmоl., v. 18, 244 -251]. Однако получение ВПЧ продукцией рекомбинантных клеток в культуре трудоемкая, технологически сложная и дорогостоящая задача, затрудняющая масштабное производство.
Известно, что вирусные гликопротеины можно выделить из липопротеиновой оболочки вируса путем солюбилизации мембран с помощью детергентов с образованием в определенных условиях макромолекулярных комплексов (агрегатов). С этой целью для обработки растворов используют обычно лишь один детергент. По физико-химическим свойствам детергенты можно разделить на две группы: ионные и неионные, отличающиеся по характеру действия на вирусные белки. Как правило, ионные детергенты, например: додецилсульфат натрия (ДСН), цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ), являются очень сильными дезинтеграторами вирусных частиц. В большинстве случаев, обработка ими приводит к делипидизации вирусных частиц и полной диссоциации межбелковых взаимодействий. [Е.С. Исаева и др. Гликопротеиды ортомиксовирусов. Изд. Наука, Алма-Ата, 1988, cтp.119 - 126]. Однако имеются факты избирательного и более щадящего действия ионных детергентов. Недавним достижением является способ солюбилизации поверхностных гликопротеидов ионным детергентом, короткоцепочечным аналогом фосфатидилхолина, что позволяет проводить последующую реконструкцию детергентного раствора этих поверхностных антигенов в однослойные везикулы (виросомы) размером около 60 нм. Это соединение является более биосовместимым по сравнению с традиционно применяемыми ионными детергентами и образует в отличие от них везикулярные, а не мицеллярные формы. [J. dе Jопgе, еt аl. (2006) Вiосhim. Вiорhуs. Асtа, 1758, 527 - 536; А. Нuсkriеdе, еt аl. (2003) Меth. Епzуmоl., v. 373, 74 - 91; А. Нuсkriеdе, еt аl. (2005) Vассiпе, 23Sl, Sl/26 - Sl/38; J. dе Jопgе, еt аl. (2006) Gепе Тhеrару, v. 13, 400 - 411].
Более приемлемыми для изоляции поверхностных антигенов вируса гриппа А являются неионные детергенты, которые оказывают мягкое и селективное действие на вирусную оболочку. Известно, что п-октил-β-D-глюкопиранозид (ОГ) обладает способностью селективно извлекать оба гликопротеина из оболочки нативных интактных вирионов, сохраняя их молекулярную структуру и биологическую активность. Использование этого детергента позволяет получить основные субъединицы вириона, ГА и НА, в виде мицеллярного раствора в детергенте, где они включены в мицеллы детергента и отделены от липидов вирусной мембраны. При удалении детергента эти антигенные субъединицы организуются в розеткообразные комплексы, включающие обычно 8 - 12 субъединиц. [Е.С. Исаева и др. Гликопротеиды ортомиксовирусов. Изд. Наука, Алма-Ата, 1988, cтp.119 - 126; T. Stеgmапп, еt аl. (1987) EMBO J. v. 6, 2651- 2659].
ОГ достаточно широко применяется для солюбилизации вирусных гликопротеинов. Многие исследователи рекомендуют использовать этот детергент в производстве гриппозной субъединичной вакцины. Известен способ получения антигенов для вакцины против гриппа по патенту RU 2 283 239, основанный на расщеплении вирусного концентрата ОГ при комнатной температуре. Как считают авторы этого изобретения, такое применение ОГ позволяет одновременно выделять не только поверхностные, но и внутренние антигены, а именно мембранный белок и белок нуклеокапсида, избежав при этом денатурации белков. Последнее утверждение вызывает большие сомнения, так как широкое применение в течение многих лет ОГ для обработки интактных вирионов показывает, что его основным преимуществом является именно способность селективной солюбилизации только поверхностных гликопротеинов при комнатной температуре. [T. Stеgmапп, еt аl. (1987) EMBO J. v. 6, 2651- 2659].
С другой стороны, в настоящее время известно большое количество работ, посвященных исследованию цитоплазматических мембран, получаемых в виде рафтов. Рафты (плоты), существующие в плазматических мембранах клеток, как считается, представляют собой прочные комплексы или ансамбли мембранных белков и липидов, имеющих плоскую форму платформ и фиксирующих структурные особенности исходного объекта. Было показано, что детергент-устойчивые мембраны (или рафты) имеют своеобразный липидный состав, в них повышено содержание холестерина и сфинголипидов в сравнении с липидным составом клеточной мембраны в целом. При удалении детергента происходит реконструкция мембранного рафтового комплекса в липосомы. [L. H. Сhаmbеrlаiп, (2004), v. 559, 1 — 5; К. Jасоbsоп, еt аl. ( 2007) Nаturе CeIl ВiоL, v. 9 (1), 7 - 14; Напсосk, J.F. (2006) Nаturе Rеv. MoI. CeIl ВiоL 7, 456-462]. Кроме того, известно, что липидный состав мембран оболочечных вирусов, включая вирусы гриппа и иммунодефицита человека, близок к составу именно мембранных рафтов и отличается от состава клеточных мембран. [В. Вruggеr, еt аl. (2006) Рrос. Nаtl. Асаd. Sсi. U.S.А. v.ЮЗ, 2641-2646; Нопg Jiп, еt аl. (1997) EMBO J. v.16, 1236 - 1247].
Соединение этих двух независимых фактов послужило оригинальным теоретическим посылом для рассмотрения оболочки вируса гриппа в целом как конгломерата многочисленных мембранных рафтов и создания на этой основе метода фрагментации оболочки вируса гриппа в виде рафтовых структур.
Техническая задача настоящего изобретения заключается в разработке оригинального способа солюбилизации очищенной вирусосодержащей жидкости для получения оригинального липид-протеинового комплекса рафтовой природы из оболочки вируса гриппа А, представляющего собой макромолекулярную структуру - детергентоустойчивый фрагмент оболочки вируса гриппа, содержащую поверхностные антигены гемагглютинин (ГА) и нейраминидазу (НА), а также связанный с ними матриксный белок (Ml). Технической задачей также является разработка способа получения ВПЧ нового типа, представляющих собой ассоциаты полученного липид-протеинового комплекса рафтовой природы и применение липид-протеинового комплекса рафтовой природы в качестве составной эффективной части вакцины (вакцинной композиции) для профилактики вируса гриппа А.
Новизна предлагаемого метода выделения надмолекулярного липид- протеинового комплекса рафтовой природы (детергентоустойчивых мембран) из оболочки вируса гриппа А заключается в оригинальной комбинации (соединении) двух известных методов солюбилизации биологических мембран неионными детергентами:
1. Метод селективной солюбилизации поверхностных гликопротеидов из мембран нативных интактных вирионов оболочечных вирусов раствором неионного детергента ОГ при комнатной температуре как основная стадия получения субъединичных вакцин.
2. Стандартный метод выделения детергент-устойчивых мембран (рафтов) солюбилизацией их на холоду из мембран клеток растворами неионных детергентов Тritоп X-IOO, NP40 и др. с последующим ультрацентифугированием в градиенте плотности.
Неионные детергенты для осуществления метода могут варьироваться, однако каждая пара детергентов в смеси должна соответствовать следующим требованиям: (i) один из детергентов должен содержать углеводную компоненту с общей формулой: Rl - O - R2, где Rl - углеводный остаток, состоящий из моно- или олигопиранозы, а R2 - алкил с длиной углеродной цепи C8 - C12, (ii) второй детергент из пары может быть любым детергентом, применяемым для солюбилизации и выделения детергентоустойчивых мембран (рафтов), а именно: или NP40, или Тritоп X-IOO, или TWEEN 20, или TWEEN 80, или brij 98, или brij 96, или Lubrоl.
Предлагаемый метод фрагментации основан на сочетанном действии двух используемых неионных детергентов, прост в исполнении и ведет к образованию устойчивых фрагментов вирусной оболочки рафтовой природы, включающих наряду с вирусными липидами главные поверхностные антигены гемагглютинин (ГА) и нейраминидазу (НА), а также ассоциированный с ними основной структурный белок вируса Ml (фиг.l). Фрагменты легко реконструируются в везикулярные структуры размером около 80 - 90 нм и представляют собой новый аналог виросом или вирусоподобных частиц (ВПЧ) (фиг.2).
Основным отличием и преимуществом предложенного метода при использовании комбинации двух детергентов является возможность селективной солюбилизации главных антигенных компонентов (субъединиц) вируса, ГА, НА и Ml (и возможно M2), в комплексе с липидами оболочки, без капсидного рибонуклеопротеида, являющегося носителем инфекционной составляющей вириона. Действие общепринятых рафт-солюбилизирующих детергентов Тritоп X- 100, NP40 на вирус гриппа А в отсутствие ОГ приводит лишь к неселективной солюбилизации всех основных вирусных компонентов.
Другим потенциальным преимуществом выделения фрагментов в виде детергент-устойчивых мембран может быть вышеупомянутое их свойство фиксировать в своей жесткой структуре особенности исходной природной структуры компонентов вирусной оболочки. Так на примере вируса иммунодефицита человека получены предварительные данные о важности сохранения консервативных нативных эпитопов в поверхностных белках-антигенах для получения оптимального иммунного ответа. [А. Shаrmа, еt аl., (2006) Virоlоgу, v. 352, 131 - 144].
Объектом настоящего изобретения также является способ получения вирусоподобных частиц нового типа, содержащих ГА, НА и Ml, из предлагаемого липид-протеинового рафтового комплекса оболочки вируса гриппа А, солюбилизированного непосредственно из обычных очищенных препаратов вируса гриппа А. Полученный технический результат - везикулярные структуры являются ВПЧ нового типа, которые содержат основные вирусные антигены при полном отсутствии инфекционной составляющей. Такие ВПЧ можно использовать в качестве эффекторов противогриппозной вакцины.
Предлагаемое изобретение позволяет получать ВПЧ нового типа посредством фрагментации оболочки очищенного живого вируса гриппа очень просто, а именно солюбилизацией очищенной суспензии нативных вирусных частиц смесью двух доступных неионных детергентов, например ОГ и NP40, на холоду с последующим удалением детергентов. Удаление солюбилизирующих агентов может быть достигнуто с помощью различных приемов. Наиболее простым является диализ.
С помощью техники динамического светорассеяния проведена оценка усредненного размера полученных рафтовых фрагментов вирусной оболочки, видимый гидродинамический диаметр которых составил 28.1 ± 7.6 нм. Размер наночастицы, представляющей собой надмолекулярный липид-белковый комплекс, полностью соответствует существующим представлениям о размерах рафтовых структур, существующих в клеточных мембранах. С помощью гель-фильтрации была оценена кажущаяся молекулярная масса фрагмента в мицеллярном растворе детергентов (-500 IdDa), видимый гидродинамический диаметр составил 40.8 ± 8.6 нм, а количественньм аминокислотным анализом в сочетании с электрофорезом определено стехиометрическое соотношение основных антигенов в нем: около двух молекул Ml белка на один шип-тример ГА. Присутствие НА в солюбилизате было качественно показано методом масс-спектрометрии.
Рафтовая природа получаемых фрагментов была подтверждена стандартным методом выделения детергент-устойчивых мембран, а именно ультрацентрифугированием детергентного осветленного раствора мембранных фрагментов в градиенте сахарозы (техника флотации биомембран). При флотации всплывающие фракции наряду с мембранными липидами содержали ГА и Ml, что было показано электрофоретическим анализом в СДС - ПААГ (стандартный метод электрофореза по Лэммли). Последующим подтверждением существования рафтового липид-белкового надмолекулярного комплекса явился факт структурной реорганизации мембранных фрагментов в крупные везикулярные структуры в процессе их флотации. Методом динамического светорассеяния было подтверждено образование таких структур со средним размером около 70 - 80 нм. Последующий диализ полученного везикулярного раствора против стабилизирующего буфера, содержащего Ca2+, Mg2+, Zn2+, дает в результате везикулы в этом буферном растворе со средним размером около 80 — 90 нм, как это было показано независимо методами динамического светорассеяния и электронной микроскопии. Часть полученных везикул содержит на поверхности хорошо различимые шипы ГА/НА и имеет элементы необычной полигональной структуры поверхности (фиг.2). Последний факт указывает на генезис везикул, являющийся результатом ассоциации предшествующих жестких и плоских платформообразных структур.
Тесты на животных показали выраженную иммуностимулирующую активность предлагаемого рафтового комплекса из вирусной оболочки: иммунный ответ этого препарата при инъекционном введении мышам достигал 50% величины иммунного ответа на противогриппозную цельновирионную вакцину.
Способ получения был осуществлен на нескольких линиях вируса гриппа А, а именно А PR8/34 (HlNl), А/duсk/VNЗ 42/2001 (H5N1), A/FPV/Rostock/34 (H7N1). В предлагаемом изобретении используемый препарат вируса гриппа может быть получен из общепринятых культур воспринимающих вирус клеток, например субстрат-независимой линии MDCK, Vеrо или из инфицированных куриных эмбрионов, широко используемых для промышленного производства вакцин.
Наработка вируса осуществляется в стандартных оптимизированных условиях с последующим выделением вирусных частиц, например, из аллантоисной (культуральной) жидкости и очисткой вирусного препарата через сахарозный градиент центрифугированием. Суспензия вируса для осуществления метода готовится в любом изотоническом солевом физиологическом буфере (Тris, фосфат и
ДР-)-
Для решения вышеуказанных задач необходимо осуществить:
A. Обработку препарата вируса гриппа в виде очищенной суспензии в буферном солевом изотоническом растворе (рН 7.0 - 7.4) равным объемом смеси двух детергентов, например: ОГ и NP40 (или ОГ и Triton X-IOO, или ОГ и TWEEN 20, или ОГ и brij 98), в воде с концентрацией 4% ОГ и 2% NP40 при 0° - 4°C. Выдерживание реакционной смеси при указанной температуре 20 - 40 мин.
Б. Центрифугирование смеси при центрифужном ускорении не менее 18 000 х g, не менее 40 минут при 0° - 4°C для отделения осадка. Осветленная надосадочная жидкость представляет собой мицеллярный раствор фрагментов вирусной оболочки, содержащий ГА/НА, Ml и липиды в смеси детергентов. Для получения мицеллярного раствора можно использовать и другие концентрации детергентов, однако указанные здесь являются предпочтительными. Из приведенного набора протестированных неионных детергентов, используемых в смеси с ОГ, только NP40 и Triton X-IOO являются приемлемо эффективными для максимальной экстракции Ml белка, однако все они одинаково эффективно солюбилизируют поверхностные гликопротеиды ГА и НА в составе детергент- устойчивых мембран.
B. Флотацию детергент-устойчивых мембран ультрацентифугированием в градиенте плотности. Для этой процедуры приготавливают смесь осветленного мицеллярного раствора фрагментов и 85% раствора сахарозы в изотоническом буфере с конечной концентрацией сахарозы в смеси 45 - 48 %, формируют сахарозный градиент последовательным наслаиванием на полученную смесь 35% и 5% растворов сахарозы и подвергают сформированный градиент ультрацентрифугированию при 140 000 х g, 19 час, 4°C. Сформировавшуюся зону повышенной мутности на границе раздела фаз 5% и 35% сахарозы собирают. Полученный коллоидный раствор по данным комплексного анализа (электрофорез, динамическое светорассеяние) представляет собой надмолекулярный липид- протеиновый комплекс, содержащий ГА/НА и Ml, с размером частиц около 70 - 80 нм, что свидетельствует о структурной реорганизации фрагментов вирусной оболочки в везикулярные структуры с потерей мицеллярного окружения из детергентов.
Г. Диализ коллоидного раствора детергент-устойчивых мембран против солевого изотонического буфера, рН 7.0 - 7.4 (в соотношении 1 : 1000 по объему), содержащего стабилизирующие ионы Ca2+, Mg2+, Zn2+ через диализную мембрану. Данная стадия осуществляется для стабилизации мембранной компоненты образующихся везикул и дополнительной очистки их от нежелательных компонентов с молекулярной массой 12000 Da и ниже. Диализованный раствор, содержащий ГА/НА и Ml, состоит из стабильных везикул со средним размером около 80 - 90 нм и примеси шипов поверхностных антигенов вируса, как это было показано данными комплексного анализа препарата (электрофорез, электронная микроскопия, динамическое светорассеяние). При этом часть этих везикул содержит в своей липидной оболочке экспонированные на поверхности антигены вируса гриппа.
Настоящее изобретение в его конкретных признаках станет более очевидным благодаря нижеприведенным примерам. Эти примеры представлены с целью иллюстрации изобретения, но не с целью какого бы то ни было его ограничения.
Выращивание и очистка вируса гриппа А.
Использовали вирус гриппа, линии А PR8/34 (HlNl), А/duсk/VN 342/2001 (H5N1), A/FPV/Rostock/34 (H7N1) вирусы размножали в аллантоисной камере 10- дневных куриных эмбрионов. Аллантоисную жидкость осветляли низкоскоростным центрифугированием, концентрировали центрифугированием при 30 000 g, 3 час при 4°C (ротор Beckman JA 14) и очищали через 20% сахарозную подушку в буфере CTE (10 mМ Тris, 100 mМ NaCl, 1 mМ EDTA, рН 7.4) при 75,000 g, 2.5 час, 4°C (ротор Beckman SW 28 rоtоr). Вирус в осадке ресуспендировали в буфере CTE с достижением конечной концентрации вируса около 8 мг/мл общего белка.
Экстракция фрагментов вирусной оболочки.
Равный объем охлажденного раствора смеси 4% ОГ и 2% NP40 в воде добавляют к вирусной суспензии в буфере CTE на льду и оставляют на 30 мин. Нерастворимый осадок удаляют центрифугированием при 18,000 g, 40C iп Мiсrоfugе 22R Сепtrifugе (Весkmап Соultеr) в течение 40 мин. Осветленный супернатантный раствор отбирают сверху, а осадок ресуспендируют в объеме, равном объему осветленного супернатанта. Осветленный супернатантный раствор и ресуспендированный осадок анализируют электрофорезом в полиакриламидном геле (12%) по Лэммли. Осветленный супернатант содержит ГА и Ml белок, а осадок содержит нуклеопротеин (НП) и Ml белок. НА данным методом анализа не определяется (фиг.l).
В других экспериментах вирусный препарат инкубировали со смесью TWEEN 20/OГ и brij 98/OГ 30 мин при O0C и анализировали распределение ГА, НП и Ml электорфорезом.
Выделение детергент-устойчивых мембран (флотация).
Используют стандартную методику флотации детергент-устойчивых мембран в градиенте плотности сахарозы. Фрагменты оболочки вируса в растворе детергентов (осветленный супернатант) доводят с помощью 85% сахарозы в буфере CTE до конечной концентрации сахарозы в растворе 47.5% (1.0 мл осветленного супернатантного раствора и 1.8 мл 85% сахарозы). На полученный раствор наслаивают последовательно 2.8 мл 35% сахарозы в буфере CTE и 0.6 мл 5% сахарозы в CTE. Сформированный градиент подвергают ультрацентрифугированию при 140 000 g, 19 час, 4°C. Зону повышенной мутности, образовавшуюся после центрифугирования на границе 35% и 5% сахарозы собирают для дальнейшего анализа и диализа.
Диализ фрагментов оболочки вируса в виде везикулярного раствора в сахарозе.
Собранные фракции после ультрацентрифугирования (0.6 мл) помещают в целлюлозную диализную трубку с удержанием по молекулярной массе >12 000 Da (Sigmа) и оставляют в сосуде с буфером для диализа (10 mМ Тris, 100 mМ NaCl, 2 mМ CaCl2, 1 mМ MgCl2, 15 μМ ZnBr2, рН 7.2) объемом 600 мл при перемешивании и 6°C на 16 час. Раствор после диализа подвергают комплексному анализу (электрофорез по Лэммли, динамическое светорассеяние, электронная микроскопия).
Таким образом, в настоящем изобретении с помощью предлагаемого способа фрагментации, основанного на сочетанном действии двух используемых неионных детергентов, из суспензии, содержащей очищенные вирионы вируса гриппа А, можно получить новую макромолекулярную структуру - липид-протеиновый рафтовый комплекс из оболочки вируса гриппа А для противогриппозной вакцины, который является детергентоустойчивым фрагментом оболочки вируса гриппа, служит исходным компонентом для получения стабильных вирусоподобных частиц нового типа путем ассоциации липид-протеинового рафтового комплекса, и может быть использован в качестве составной эффективной части вaкцины(вaкциннoй композиции) для профилактики вируса гриппа А. Для этого необходимо осуществить:
(i) солюбилизацию вирионов смесью двух разных неионных детергентов на холоду,
(ii) осветление солюбилизата центрифугированием,
(iii) выделение рафтового комплекса ультрацентрифугированием в градиенте плотности (флотации),
(iv) получение стабильных очищенных вирусоподобных частиц диализом флотированного раствора против стабилизирующего буфера.

Claims

Формула изобретения
1. Липид-протеиновый комплекс рафтовой природы из оболочки вируса гриппа А для вакцины, представляющий собой макромолекулярную структуру - детергентоустойчивый фрагмент оболочки вируса гриппа, имеющий проявляющийся размер около 28 нм, полученный при солюбилизации очищенной вирусосодержащей жидкости одновременно двумя разными неионными детергентами, при этом каждая пара детергентов в смеси должна соответствовать следующим требованиям:
(i) один из детергентов должен содержать углеводную компоненту с общей формулой: Rl — О — R2, где Rl - углеводный остаток, состоящий из моно- или олигопиранозы, а R2 - алкил с длиной углеродной цепи C8 — С 12,
(ii) второй детергент из пары может быть любым детергентом, применяемым для солюбилизации и выделения детергентоустойчивых мембран (рафтов), а именно: NP40, или Triton X-IOO, или TWEEN 20, или TWEEN 80, или brij 98, или brij 96, или Lubrоl, содержащий поверхностные антигены гемагглютинин (ГА) и нейраминидазу (НА), а также ассоциированный с ними матриксный белок (Ml), при этом на один шип-тример ГА приходится около двух молекул Ml белка.
2. Способ выделения липид-протеинового комплекса рафтовой природы для вакцины по п.l, заключающийся в холодовой (0° - 4°C) солюбилизации очищенного вирусного препарата, полученного из вируссодержащей жидкости, смесью двух неионных детергентов, при этом каждая пара детергентов в смеси, обладающих сочетанным действием, должна соответствовать следующим требованиям:
(i) один из детергентов должен обладать способностью селективно солюбилизировать поверхностные антигены вируса гриппа (ГА и НА) и содержать углеводную компоненту с общей формулой: Rl - O - R2, где Rl - углеводный остаток, состоящий из моно- или олигопиранозы, а R2 - алкил с длиной углеродной цепи C8 - С 12,
(ii) второй детергент из пары может быть любым детергентом, применяемым для солюбилизации и выделения детергентоустойчивых мембран (рафтов), из группы: или NP40, или Triton X-IOO, или TWEEN 20, или TWEEN 80, или brij 98, или brij 96, или Lubrоl,
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют смесь, состоящую из октил- глюкозида и NP40, или TWEEN 20, или. brij 98, или Triton X-IOO
4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что предпочтительно используют смесь, с конечной концентрацией в солюбилизате 2% октил-глюкозида и l% NP40.
5. Способ получения стабильных вирусоподобных частиц, размером 80-90 нм, из липид-протеинового комплекса рафтовой природы по п.l, заключающийся в удалении детергентов, например диализом флотированного раствора детергентоустойчивых мембран оболочки вируса гриппа А.
6. Способ обеспечения защитного иммунитета для предотвращения гриппа А, включающий введение теплокровному животному эффективной вакцинной композиции, на основе липид-протеинового комплекса рафтовой природы по п.l
PCT/RU2008/000085 2008-02-15 2008-02-15 Липид-протеиновый рафтовый комплекс из оболочки вируса гриппа а для противогриппозных вакцин и способ его выделения, способ получения вирусоподобных частиц из таких комплексов WO2009102229A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2008/000085 WO2009102229A1 (ru) 2008-02-15 2008-02-15 Липид-протеиновый рафтовый комплекс из оболочки вируса гриппа а для противогриппозных вакцин и способ его выделения, способ получения вирусоподобных частиц из таких комплексов

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2008/000085 WO2009102229A1 (ru) 2008-02-15 2008-02-15 Липид-протеиновый рафтовый комплекс из оболочки вируса гриппа а для противогриппозных вакцин и способ его выделения, способ получения вирусоподобных частиц из таких комплексов

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009102229A1 true WO2009102229A1 (ru) 2009-08-20

Family

ID=40957148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2008/000085 WO2009102229A1 (ru) 2008-02-15 2008-02-15 Липид-протеиновый рафтовый комплекс из оболочки вируса гриппа а для противогриппозных вакцин и способ его выделения, способ получения вирусоподобных частиц из таких комплексов

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2009102229A1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2283139C1 (ru) * 2005-03-21 2006-09-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ получения антигенов для вакцины против вирусов гриппа
SG131116A1 (en) * 2003-07-11 2007-04-26 Novavax Inc Functional influenza virus-like particles (vlps)

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG131116A1 (en) * 2003-07-11 2007-04-26 Novavax Inc Functional influenza virus-like particles (vlps)
RU2283139C1 (ru) * 2005-03-21 2006-09-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ получения антигенов для вакцины против вирусов гриппа

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARMAN S. ET AL.: "Lipid raft disruption by cholesterol depletion enhances influenza A virus budding from MDCK cells.", J VIROL, vol. 81, no. 22, November 2007 (2007-11-01), pages 12169 - 12178 *
CHAMBERLAIN LH.: "Detergents as tools for the purification and classification of lipid rafts.", FEBS LETT, vol. 559, no. 1-3, 13 February 2004 (2004-02-13), pages 1 - 5 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4763197B2 (ja) 新規ワクチン
JP6643239B2 (ja) 免疫原性の中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）組成物および方法
JP4074582B2 (ja) 新規なワクチン
JP5714799B2 (ja) 機能的インフルエンザウイルス様粒子（ｖｌｐ）
ES2806412T3 (es) Señal para el empaquetamiento de vectores del virus de la gripe
KR20110113615A (ko) 인플루엔자 백신의 생산
JP4634997B2 (ja) ウィロソーム様粒子
US11739127B2 (en) Influenza vaccines
US20220175910A1 (en) Novel influenza antigens
JP5918870B2 (ja) インフルエンザに対する改善されたワクチン接種
ES2621487T3 (es) Nueva composición de vacuna contra la gripe
US9060972B2 (en) Recombinant hemagglutinin protein of influenza virus and vaccine containing the same
Kong et al. Supplementation of H7N9 virus-like particle vaccine With recombinant epitope antigen confers full protection against antigenically divergent H7N9 virus in chickens
US9603921B2 (en) Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus
WO2009102229A1 (ru) Липид-протеиновый рафтовый комплекс из оболочки вируса гриппа а для противогриппозных вакцин и способ его выделения, способ получения вирусоподобных частиц из таких комплексов
KR101302245B1 (ko) 넓은 범위의 교차 방어능력을 갖는 신규한 보강 인플루엔자 백신
US9060973B2 (en) Vaccine for enveloped viruses
Glück Immunopotentiating reconstituted influenza virosomes (IRIVs)
KR20040084916A (ko) 인플루엔자 바이러스 벡터의 패키징을 위한 신호

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08794002

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 08794002

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1