CN109718380A - 肿瘤抗原呈递系统及其在制备抗肿瘤药物中的应用、免疫系统激活剂和抗肿瘤组合物 - Google Patents
肿瘤抗原呈递系统及其在制备抗肿瘤药物中的应用、免疫系统激活剂和抗肿瘤组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种肿瘤抗原呈递系统及其在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明的肿瘤抗原呈递系统由红细胞膜制备而来，通过将本发明的肿瘤抗原呈递系统与肿瘤细胞膜经超声融合、挤出后形成融合膜的纳米质膜囊泡，该纳米质膜囊泡能够有效激活免疫系统。本发明的肿瘤抗原呈递系统来源于生物体自身，来源安全，且在其制备过程中未添加任何化学改性试剂，因而进一步确保其使用安全性。本发明还公开了一种抗肿瘤组合物，其包括红细胞膜‑肿瘤细胞膜融合膜的纳米质膜囊泡和免疫检查点抑制剂，本抗肿瘤组合物能够有效提高DC细胞、NK细胞、B细胞和T细胞等的活性，而且能有效抑制肿瘤细胞的生长。此外，本发明的抗肿瘤组合物可有效降低肿瘤复发及转移。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤抗原呈递系统及在制备抗肿瘤药物中的应用、免疫系统激活剂和抗肿瘤组合物。
背景技术
癌症(cancer)是恶性肿瘤中最常见的一类，目前，癌症仍是对人类身体健康具有巨大威胁的疾病，虽然有部分癌症患者已得到治愈，但是，目前癌症仍是我国居民的第一位死因。目前，癌症的主要治疗方式包括手术、化疗、放疗、靶向治疗、中药治疗。但以上方式治疗效果有限，且毒副作用较大。近些年，癌症的免疫治疗疗法的应用逐渐普遍，但是效果仍有待提高。
免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade,ICB)疗法能够重新激活免疫系统而在多种癌症治疗中发挥对癌细胞的抑制作用。但是，这种疗法在多种恶性肿瘤的治疗过程中响应率低且会造成免疫治疗相关不良反应(immune-related adverse events,irAEs)，严重时会导致病人的死亡。因此这种疗法仍在降低毒性和增加抗癌活性上存在较大改进空间。人们普遍认为，将ICB与其他治疗方法结合使用能够提高治愈率。目前，已有一些临床试验证明通过癌症疫苗免疫疗法能够激活癌症患者的免疫反应，但是，在临床应用中取得的成果仍不显著。临床中单纯依靠疫苗的使用来治愈肿瘤的可能性很小，只能作为传统治疗的辅助治疗手段，用以降低肿瘤的复发率、抑制肿瘤的转移来延长患者的生命，提高生活质量。肿瘤疫苗效果欠佳的可能原因包括肿瘤内免疫抑制微环境(如肿瘤细胞PD-L1高水平表达等)、缺乏能够针对癌细胞引发强烈免疫防御的新抗原(neoantigen)等，都会导致肿瘤疫苗免疫应答弱、引起的免疫应答持续时间短，抗肿瘤效果弱。另一方面，如何将肿瘤抗原高效递送到抗原呈递细胞也是肿瘤疫苗疗法面临的挑战，由于肿瘤相关抗原(包括蛋白、多肽、DNA、RNA抗原)易降解且很难被免疫细胞摄取，因此其免疫原性较差，需要借助疫苗载体或者佐剂才能诱导有效的抗肿瘤免疫反应。低效率的抗原呈递将无法有效激活抗原呈递细胞(APCs)启动抗癌免疫应答。
目前已有多个用于动物模型的抗原呈递系统(APC)的报道，如Lena M.Kr等人利用阳离子脂质载体作为抗原呈递系统，将RNA抗原高效的呈递至DC(树突状细胞)，从而有效的激活了免疫系统并取得了良好的抗癌效果(Lena M.Kranz,Mustafa Diken,HeinrichHaas,Sebastian Kreiter,Carmen Loquai,Kerstin C.Reuter,Martin Meng,DanielFritz,Nature.2016Jun；534:396–401)。Min Luo等人利用高分子聚合物颗粒作为抗原呈递系统，使得淋巴结中的抗原呈递量明显增加(Luo M,Wang H,Wang Z,Cai H,Lu Z,Li Y,DuM,Huang G,Wang C,Chen X,Porembka MR,Lea J,Frankel AE,Fu YX,Chen ZJ,Gao J.NatNanotechnol.2017Jul；12(7):648-654)。Jaeyun Kim等人利用介孔二氧化硅棒为抗原呈递系统有效的激活了免疫系统(Jaeyun Kim,Weiwei Aileen Li,Youngjin Choi,SarahA.Lewin,Catia S.Verbeke,Glenn Dranoff,David J.Mooney.NatBiotechnol.2015January；33(1):64–72.)。由此可见，目前绝大多数的抗原递送系统采用合成材料，或需要化学的修饰和偶联反应，工艺相对复杂，在体内参与的生物化学反应和降解产物往往不够明确，这些都是临床转化面临的挑战。因此，对人体健康的潜在风险较大。因此，将利用化学物质改性或缔合的抗原呈递系统用于人体时，其使用的安全性是最大的问题。
发明内容
为克服上述缺点，本发明的目的之一在于提供一种肿瘤抗原呈递系统，其由红细胞膜制备得到。由于红细胞来自于生物体，因此红细胞是可以完全生物降解，参与了体内的新陈代谢，没有毒副产品的产生，因而来源于红细胞的红细胞膜也具有良好的生物相容性，利用本发明的肿瘤抗原呈递系统无需使用异源或是化学类物质作为抗原呈递载体，生物安全性高。此外，由于脾脏的抗原呈递细胞对红细胞碎片具有极强的靶向吸附能力，因而利用红细胞膜来源的抗原呈递系统能够利于将肿瘤抗原运送至免疫器官-脾脏。
进一步的，所述肿瘤抗原呈递系统的制备方法为：
(1)将血液分散于缓冲液中，离心处理后弃去上清液得到红细胞；
(2)向步骤(1)得到的红细胞中加入含有EDTA的去离子水，震荡均匀后离心处理，分别将沉淀物与上清液收集；
(3)在步骤(2)得到的沉淀物中加入含有EDTA的去离子水，超声处理后低温离心处理，收集得到红细胞膜；将步骤(2)得到的上清液离心处理，收集得到红细胞膜；
(4)将步骤(3)离心得到的红细胞膜用含有EDTA的去离子水洗两次并离心，得到红细胞膜，将红细胞膜重悬在缓冲液中，备用。
本发明的目的之二在于提供一种所述肿瘤抗原呈递系统在制备抗肿瘤药物中的应用，通过将肿瘤细胞膜与本发明的目的之一所提供的抗原呈递系统融合、挤出以实现肿瘤抗原与呈递系统的结合。由此，将肿瘤抗原与呈递系统紧密融合，通过荧光成像分析证明，经过融合、挤出后得到肿瘤抗原与呈递系统的融合膜结构均匀，且对肿瘤抗原具有良好的携带效果。
进一步的，所述肿瘤抗原呈递系统与肿瘤细胞膜融合包括如下步骤：
(1)将抗原呈递系统与肿瘤细胞膜混合；
(2)对步骤(1)得到的混合物超声，至体系变透明，在超声过程加入冰块；
(3)将步骤(2)得到的混合物在震荡以促进膜融合；
(4)将步骤(3)的得到的混合膜超声处理后用微孔滤膜反复过滤后即实现肿瘤抗原与呈递系统的结合。
更进一步的，所述肿瘤细胞膜的提取方法为：将肿瘤细胞悬浮至细胞破碎溶液中并进行超声处理后得到癌细胞破碎混合物；将得到的癌细胞破碎混合物离心处理后收集上清液，并进一步离心处理后，得到肿瘤细胞膜，将肿瘤细胞膜重悬在PBS中，备用。
更进一步的，所述红细胞膜与所述肿瘤细胞膜的添加比例为，以膜蛋白的添加量计，红细胞膜蛋白/肿瘤细胞膜蛋白的比值不小于1。本发明人在试验中发现，随着红细胞膜蛋白：肿瘤细胞膜蛋白的比例增加，呈递至脾脏中的肿瘤抗原信号也逐渐增强。
本发明的目的之三在于提供一种免疫系统激活剂，其为按照本发明的目的之二所述的肿瘤抗原与呈递系统的结合方法制备得到的红细胞膜-肿瘤细胞膜融合膜的纳米质膜囊泡。通过在小鼠体内注射本发明的免疫系统激活剂，使得小鼠的树突状细胞(DC)、NK(自然杀伤细胞)、B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的活性和分泌量均明显增加。
进一步的，所述红细胞膜-肿瘤细胞膜融合膜的纳米质膜囊泡的直径小于200nm，ζ电位小于0mW。
本发明的目的之四在于提供一种抗肿瘤组合物，其包括本发明的目的之三的红细胞膜-肿瘤细胞膜融合膜的纳米质膜囊泡和免疫检查点抑制剂。本发明的免疫检查点抑制剂为PD-1/PD-L1通路、CD80/CTLA-4、MHCⅡ/LAG-3、4-1BBL/4-1BB等免疫抑制通路中的任意一种免疫检查点抑制剂。通过将本发明的红细胞膜-肿瘤细胞膜融合膜的纳米质膜囊泡能够激活免疫系统，同时联合免疫检查点抑制剂可有效抑制肿瘤细胞的生长。
进一步的，所述抗肿瘤组合物的肿瘤细胞膜和红细胞膜来自于同一生物体。通过将同一生物体的肿瘤细胞膜与红细胞膜融合、挤出后制得红细胞膜-肿瘤细胞膜融合膜的纳米质膜囊泡后与免疫检查点抑制剂联合得到的抗肿瘤组合物，对于肿瘤切除手术后以及模拟的细胞转移模型中都取得了更佳的抗癌效果，因而本发明的抗肿瘤组合物能够有效预防肿瘤的转移和复发。
附图说明
图1为本发明的红细胞膜-肿瘤细胞膜融合膜的纳米质膜囊泡的显微镜检图；
图2为本发明的红细胞膜-肿瘤细胞膜融合膜的纳米质膜囊泡的粒径分布图；
图3为本发明的红细胞膜-肿瘤细胞膜融合膜的纳米质膜囊泡的ζ电位；
图4为本发明的融合膜的纳米质膜囊泡、B16F10细胞膜和红细胞膜中蛋白质的电泳分析图，图中1为marker，2为融合膜的纳米质膜囊泡、3为B16F10的细胞膜、4为红细胞的细胞膜；
图5为红细胞、B16F10细胞、融合膜的纳米质膜囊泡、红细胞膜片段、B16F10细胞膜中的gp100的western杂交分析结果；
图6为融合膜的纳米质膜囊泡在共聚焦显微镜下观察结果；
图7为经过融合膜的纳米质膜囊泡处理后的树突状细胞的流式细胞分析结果；
图8为融合膜的纳米质膜囊泡在小鼠体内分布的荧光成像分析结果图；
图9a为融合膜的纳米质膜囊泡对小鼠免疫系统的NK细胞、CD4+T细胞、CD11C+细胞、CD8+T细胞、CD19+B细胞、CD11c+细胞的影响，图中阴影部分代表处理前，曲线部分代表处理后；
图9b为注射融合膜的纳米质膜囊泡和注射红细胞膜的纳米质膜囊泡后小鼠免疫系统中NK细胞、CD4+T细胞、CD11C+细胞、CD8+T细胞、CD19+B细胞和CD11c+细胞的平均荧光指数；
图10为融合膜的纳米质膜囊泡与aPDL1联合作用下对小鼠体内的肿瘤组织体积大小的影响；
图11为融合膜的纳米质膜囊泡与aPDL1联合作用下对小鼠存活率的影响；
图12为各种处理方式下CD45+T细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞的占比；
图13为利用取自小鼠自体的肿瘤细胞膜与红细胞膜制备的融合膜的纳米质膜囊泡与aPDL1联合作用于进行肿瘤切除后的小鼠体内的转移的肿瘤组织的荧光成像分析结果；
图14为利用取自小鼠自体的肿瘤细胞膜与红细胞膜制备的融合膜的纳米质膜囊泡与aPDL1联合作用于进行肿瘤切除后的小鼠体内的转移的肿瘤组织体积大小的影响，
在图10-14中，UnTx表示未经任何处理，Vesicle表示仅利用红细胞膜进行处理、aPDL1表示仅利用aPDL1进行处理。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所选用的免疫检查点抑制剂为PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂aPDL1，本发明的免疫检查点抑制剂也可以为aPD1,或是CD80/CTLA-4、MHCⅡ/LAG-3、4-1BBL/4-1BB等免疫抑制通路的免疫检查点抑制剂。
本发明各实施例中的材料来源为：
小鼠黑色素瘤细胞B16F10购自美国模式菌种保藏中心(简称ATCC)。荧光素酶标记的黑色素瘤细胞B16-luc购自PerkinElmer股份有限公司。B16F10于添加有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml的链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中保藏。使用第三代或第四代传代培养的细胞用于本发明的各实施例。
6-10周龄的C57BL/6小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司。小鼠按照中国科学院生化与细胞所实验动物管理委员会(IACUC)的指导操作方法进行处理。
PDL1抗体(aPDL1)购自Biox cell公司，(抗体编号为10F.9G2)。
细胞数目用CALIBUR流式细胞仪，通过FlowJo软件(10.0.7版本，TreeStar,USA,2014)进行流细胞计数。
实施例1：肿瘤抗原呈递系统的制备
从C57BL/6小鼠眼眶取出血液，储存在含有1％EDTA的PBS中。2000rpm离心5分钟，去上清，重复离心步骤直到得到纯净的红细胞。将含有1％EDTA的去离子水加入红细胞，轻轻震荡，5分钟后将混合物4000rpm离心10分钟。将沉淀与上清液分离开，在沉淀中加入含有1％EDTA的去离子水，以40kHZ的频率超声处理30秒，超声过程在水浴中加入冰块降温，然后在14800rpm，4℃条件下离心20分钟。将上清倒出后，在沉淀物中加入含有1％EDTA的去离子水后按照上述条件进行超声处理30秒，进一步在14800rpm，4℃条件下离心20分钟，并重复上述离心过程，直到4000rpm离心5分钟后无沉淀。为了去除多余的血红蛋白，将离心得到的红细胞膜用含有1％EDTA的去离子水洗两次并离心，最终得到纯净的红细胞膜，重悬在PBS中，即得到本发明的肿瘤抗原呈递系统。
实施例2：肿瘤细胞膜的提取
提取黑色素瘤细胞B16F10的细胞膜：
将黑色素瘤细胞B16F10重悬至细胞破碎溶液中(含有0.25M蔗糖，1mMEDTA,20mMHepes-NaOH以及蛋白酶抑制剂，pH值为7.4)用Selecta Sonopuls细胞超声仪在冰上超声30个循环(每次循环超声3秒，暂停7秒)，将得到的混合物在4000rpm下离心，并将上清液取出进一步在14800rpm，4℃下离心处理20分钟后，得到纯净的黑色素瘤细胞B16F10的细胞膜，重悬在PBS中。
肿瘤组织中肿瘤细胞膜的提取：
将B16-luc肿瘤组织切片后，利用Selecta Sonopuls细胞超声仪在冰上超声30个循环(每次循环超声3秒，暂停7秒)。将B16-luc肿瘤组织以6000rpm离心处理10分钟以去除色素，然后，收集上清液，并进一步在14800rpm，4℃下离心处理20分钟后，即可得到B16-luc细胞膜。
实施例3：肿瘤抗原呈递系统与肿瘤细胞膜的融合(免疫系统激活剂的制备)
用BCA试剂盒测出实施例1和实施例2中得到的红细胞膜和肿瘤细胞膜的蛋白质含量，并按红细胞膜蛋白比肿瘤细胞膜蛋白比例分别按照比例(20：1、10:1、5:1、2:1、1:1和0:1)进行混合，水浴超声15分钟至体系变透明，在超声过程加入冰块，以防止体系温度过高引起蛋白失活。随后将体系在37℃金属浴下震荡30分钟，这一步是为了促进膜融合的过程。最后将混合膜在水浴超声器中超声2分钟，并用Millipore的450nm针筒过滤头反复过滤，最终得到融合膜的纳米质膜囊泡，即得到本发明的免疫系统激活剂。
融合膜的纳米质膜囊泡利用TCANAIG2F20透射电子显微镜观察，样品用磷钨酸钠盐转染。融合膜的纳米质膜囊泡的显微镜观察结果、直径以及ζ电位结果如图1-3所示，不同的红细胞膜蛋白比肿瘤细胞膜蛋白的比例对融合膜的纳米质膜囊泡的体积及表面电位影响不大，本实施例得到的融合膜的纳米质膜囊泡的直径约为150nm-200nm左右，ζ电位约为-10mW。
实施例4：对融合膜的纳米质膜囊泡的定性分析
(1)对融合膜的纳米质膜囊泡中B16F10细胞膜蛋白质的定性分析
利用SDS-PAGE凝胶电泳对融合膜的纳米质膜囊泡、B16F10细胞膜和红细胞膜中蛋白质进行分析，结果如图4所示。由此，可看出融合膜囊泡已将抗原-B16F10细胞膜有效的融合。
(2)对融合膜的纳米质膜囊泡中肿瘤抗原(gp100)的定性分析
在B16F10细胞、B16F10细胞膜、红细胞、红细胞膜片段以及融合膜的纳米质膜囊泡中的gp100的表达利用western杂交方法进行测定。上述样品的水解产物经过15％的SDS-PAGE凝胶电泳后转到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上后，用abcam的抗体ab137078进行标记，然后利用abcam的抗体BA1054通过过氧化物酶标记羊抗兔IgG。然后用AMERSHAM IMAGER 600超灵敏多功能成像仪对gp100的含量进行荧光成像分析。结果如图5所示，由此可见，融合膜的纳米质膜囊泡中包含B16F10细胞抗原。
(3)对融合膜的纳米质膜囊泡的荧光成像分析
首先将红细胞膜用DID染色，B16F10细胞膜用DIL染色后制备得到融合膜纳米质膜囊泡。分别将融合膜的纳米质膜囊泡与红细胞膜囊泡和B16F10细胞膜囊泡的混合物分别与树突状细胞DC2.4共培养2小时，然后用DAPI染色后利用共聚焦显微镜观察，结果如图6所示。由图6可看出，融合膜的纳米质膜囊泡中红细胞膜和B16F10细胞膜融合紧密，而仅将红细胞膜囊泡和B16F10细胞膜囊泡进行混合得到的混合物，红细胞膜与B16F10细胞膜并未结合在一起。
(4)融合膜的纳米质膜囊泡对DC的促进效果分析
将融合膜的纳米质膜囊泡、与树突状细胞DC2.4共培养12小时后对DC2.4细胞通过流式细胞仪进行分析，结果如图7所示。由此可见，本发明的融合膜的纳米质膜囊泡系统能够明显激活树突状细胞(DC)的CD80和CD86的表达。
实施例5：融合膜的纳米质膜囊泡对免疫系统的影响的分析
(1)肿瘤抗原呈递系统的免疫器官的靶向效果分析
首先将B16F10细胞膜用DID染色后按照实施例3的方法进行融合。融合时分别将红细胞膜蛋白和B16F10细胞膜蛋白的添加比例按照20:1、5:1和0:1进行，然后注入C57B6小鼠体内1小时候进行荧光成像观察，结果如图8所示，由图8可看出，红细胞膜蛋白和B16F10细胞膜蛋白的比例按照20:1时，融合膜的纳米质膜囊泡主要集中在脾脏，说明其进入了小鼠的免疫系统。
(2)融合膜的纳米质膜囊泡对免疫系统的激活效果
将红细胞膜蛋白和B16F10细胞膜蛋白的添加比例按照20:1进行融合挤出后，将其注入C57B6小鼠体内24小时对小鼠脾脏中的免疫细胞因子进行分析，结果如图9(a)和图9(b)所示，由此可见，将红细胞膜与本发明的肿瘤抗原呈递系统融合后得到的融合膜的纳米质膜囊泡胞能够明显激活NK(自然杀伤细胞)、B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞。
实施例6：融合膜的纳米质膜囊泡与aPDL1的联合抗癌效果分析
对小鼠皮下注射B16F10(1*106个细胞/只),对小鼠随机分组，培养7天后注入实施例3得到的融合膜的纳米质膜囊泡10μg和aPDL1(按照2mg/kg鼠体重)。同时，设置对照组(分别为未经任何处理、仅注入红细胞膜和仅注入aPDL1)。随后，对小鼠体内的肿瘤组织体积大小和小鼠存活率进行监测。小鼠体内的肿瘤组织荧光成像分析方法为：肿瘤组织利用其荧光信号在IVIS荧光成像分析系统下进行分析。将15mg/ml的d-荧光素按照10μg/g鼠体重的剂量将其注射于小鼠腹部10分钟后，利用IVIS荧光成像分析系统进行分析，荧光照射时间为5分钟。肿瘤体积大小计算公式为：(长径*短径2)/2。结果分别如图10和图11所示。由图10和图11可看出，本发明的融合膜的纳米质膜囊泡与aPDL1联合作用下能够使肿瘤组织大小明显降低，且注射了肿瘤模型的小鼠的存活率更高，说明本发明的抗肿瘤组合物(肿瘤抗原呈递系统与aPDL1)具有良好的抗癌效果，经该抗肿瘤组合物处理的小鼠有44％的存活时间达到了40天。
对注射了肿瘤模型的小鼠的CD4+T细胞和CD8+T细胞在肿瘤细胞的CD45+中的占比进行分析，结果如图12所示，由图12可看出，本发明的抗肿瘤组合物(肿瘤抗原呈递系统与aPDL1)能够诱导小鼠产生体内产生更高比例的CD4+T细胞和CD8+T细胞，由此说明其具有更佳的抗癌效果。
实施例7：来源于自体的抗肿瘤组合物(肿瘤抗原呈递系统与aPDL1)在肿瘤切除后的抗癌效果分析
将B16-luc细胞(1*106个细胞/只)注射到小鼠C57的右腹部后，培养7天后切除，在第6天时，在小鼠左腹部注射B16-luc细胞(1*106个细胞/只)。然后，分别在切除手术后第1,3,5天按照实施例1-3的方法对红细胞和肿瘤细胞的细胞膜按照20:1进行融合挤出后得到的纳米质膜囊泡。每只老鼠的肿瘤细胞膜蛋白的使用量为10μg。分别在第1,3,5天制备的纳米质膜囊泡后并与aPDL1(按照2mg/kg鼠体重)同时注射到小鼠体内，随后对小鼠体内肿瘤组织的分布和大小进行监测，同时设置对照组(未做任何处理、单独注射aPDL1和单独注射的纳米质膜囊泡)。小鼠体内的肿瘤组织的分布情况如图13所示，肿瘤体积变化情况如图14所示。由图13可看出，注射于小鼠左腹部的肿瘤组织在15天后荧光染色的面积并未明显增加，由此可见，利用来自于自体的抗肿瘤组合物(肿瘤抗原呈递系统与aPDL1)在经肿瘤切除手术后，对转移的肿瘤细胞也可发挥抑制作用。由图14可看出，本发明的抗肿瘤组合物对转移的肿瘤细胞的生长也具有抑制作用，转移的肿瘤组织体积增长缓慢。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.肿瘤抗原呈递系统，其特征在于，由红细胞膜制备得到。
2.根据权利要求1所述的肿瘤抗原呈递系统，其特征在于，所述肿瘤抗原呈递系统的制备方法为：
(1)将血液分散于缓冲液中，离心处理后弃去上清液得到红细胞；
(2)向步骤(1)得到的红细胞中加入含有EDTA的去离子水，震荡均匀后离心处理，分别将沉淀物与上清液收集；
(3)在步骤(2)得到的沉淀物中加入含有EDTA的去离子水，超声处理后低温离心处理，收集得到红细胞膜；将步骤(2)得到的上清液离心处理，收集得到红细胞膜；
(4)将步骤(3)离心得到的红细胞膜用含有EDTA的去离子水洗两次并离心，得到红细胞膜，将红细胞膜重悬在缓冲液中，备用。
3.权利要求1或按照权利要求2的方法制备得到的所述的抗原呈递系统在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，将所述抗原呈递系统与肿瘤细胞膜融合后用于制备抗肿瘤药物。
4.根据权利要求3所述的抗原呈递系统在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗原呈递系统与肿瘤细胞膜融合包括如下步骤：
(1)将所述抗原呈递系统与肿瘤细胞膜混合；
(2)对步骤(1)得到的混合物超声，至体系变透明，在超声过程加入冰块；
(3)将步骤(2)得到的混合物在震荡以促进膜融合；
(4)将步骤(3)的得到的混合膜超声处理后用微孔滤膜反复过滤后，实现肿瘤抗原与呈递系统的结合。
5.根据权利要求4所述的抗原呈递系统在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞膜的提取方法为：将肿瘤细胞悬浮至细胞破碎溶液中并进行超声处理后得到肿瘤细胞破碎混合物；将得到的肿瘤细胞破碎混合物在离心处理后收集上清液，并进一步在离心处理后，得到肿瘤细胞膜，将肿瘤细胞膜重悬在PBS中，备用。
6.根据权利要求5所述的抗原呈递系统在制备抗肿瘤药物中的应用，所述红细胞膜与所述肿瘤细胞膜的添加比例为，以膜蛋白的添加量计，红细胞膜蛋白/肿瘤细胞膜蛋白的比值不小于1。
7.免疫系统激活剂，其特征在于，为按照权利要求4-6中任一项所述的抗原呈递系统与肿瘤细胞膜融合制备得到的红细胞膜-肿瘤细胞膜融合膜的纳米质膜囊泡。
8.根据权利要求7所述的免疫系统激活剂，其特征在于，所述红细胞膜-肿瘤细胞膜融合膜的纳米质膜囊泡的直径小于200nm，ζ电位小于0mW。
9.抗肿瘤组合物，其特征在于，包括权利要求7所述的红细胞膜-肿瘤细胞膜融合膜的纳米质膜囊泡，还包括免疫检查点抑制剂。
10.根据权利要求9所述的抗肿瘤组合物，其特征在于，所述肿瘤细胞膜和红细胞膜来自于同一生物体。
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2019
- 2019-03-06 CN CN201910166781.4A patent/CN109718380B/zh not_active Expired - Fee Related
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