CN103230605A - 一种靶向微泡造影剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种靶向微泡造影剂，将环状多肽配体c(RGDyK)与DSPE-PEG通过共价键偶联合成DSPE-PEG-c(RGDyK)，使配体与微泡之间插入PEG衍生物（PEG-DSPE）连接臂，采用超声振荡匀化、高速剪切法制备有连接臂的靶向微泡造影剂。配体与微泡之间插入PEG衍生物连接臂制备的靶向微泡造影剂，有助于增强配体与受体之间的粘附，能够有效增加靶向微泡配体-受体对形成数量，使微泡与靶器官之间的结合更加紧密，进一步提高载基因微泡基因转染率。

Description

一种靶向微泡造影剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种靶向微泡造影剂及其制备方法。 

背景技术

微泡造影剂作为基因治疗中的一种安全载体，在超声辐照下能够有效地进行靶向性基因转染，成为当前肿瘤基因治疗领域的研究热点。将载有目的基因的微泡造影剂经静脉注射后，在靶组织给予一定条件的超声照射，可使血管内的微泡破裂并释放基因，同时产生“空化效应”和“声孔效应”可使毛细血管穿透性及细胞膜通透性增加，从而促进释放基因大量进入靶细胞，具有安全、无创，并可作用于深部组织和器官的特点，是一种新型的基因靶向传输技术，具有广阔的发展空间。 

然而普通微泡载基因微泡造影剂本身并无主动靶向性，与组织没有特异性结合位点，经血管注射后，微泡在体内将随机分布，只有超声辐照处的微泡才能定向破裂释放基因，大量的微泡流经超声辐照以外的部位，自由分解消化，从而造成微泡及基因的大量流失破坏。因此在微泡上连接肿瘤特异性靶向配体或抗体，导致更多的“配体-受体对”形式，使微泡和靶器官之间结合的更紧密。尽管如此，在体内环境下，由于血液具有流动性，靶向微泡与受体接触时间短暂，靶向微泡配体-受体对形成数量不足，而且血流冲刷作用又会将一部分结合的靶向微泡冲刷掉，导致有效的靶向微泡配体-受体数量有限，基因转染率仍达不到理想水平。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够有效增加靶向微泡配体-受体对形成数量，进一步提高载基因微泡基因转染率的靶向微泡造影剂及其制备方法。 

本发明提供的靶向超声微泡造影剂，为平均粒径为1-4微米的微泡混悬液，球壁材料包括DSPE和DPPA和聚乙二醇和泊洛沙姆，包裹气体为氟碳类组织相容性惰性气体，溶液为去离子双蒸馏水，球壁材料中还含有结合多肽配体c(RGDyK)的PEG连接臂，其结构为DSPE-PEG-c(RGDyK)。 

所述DSPE的重量百分含量为造影剂的0.2%-0.8%，DPPA的重量百分含量为造影剂的0.02%-0.2%。 

所述球壁材料中聚乙二醇分子量为4000-6000，其重量百分含量为造影剂的0.05%-0.4%。 

所述泊洛沙姆的重量百分含量为造影剂的0.01%-0.1%。 

所述氟碳类组织相容性惰性气体为全氟丙烷。 

所述PEG连接臂中PEG分子量为800-2000，DSPE-PEG-c(RGDyK)的重量百分含量为造影剂的0.1%-0.2%。 

上述的靶向超声微泡造影剂的制备方法，包括以下步骤： 

（1）将c(RGDyK)和DSPE-PEG和DIEA（N’N-二异丙基乙胺）加入到乙腈中，加入HBTU,室温下反应得到DSPE-PEG-c(RGDyK)； 

（2）将DSPE、DPPA和泊洛沙姆，40-60℃充分混悬于双蒸水中，制成混悬液A，将DSPE-PEG-c(RGDyK)溶于无水乙醇中，溶解完全，制成溶液B； 

（3）混悬液A于探头超声仪中进行超声处理，在超声过程中逐滴加入溶液B，得到澄清液C； 

（4）将聚乙二醇加入澄清液C中，溶解完全；再将氟碳类组织相容性惰性气体通入溶液C中，充分饱和的同时，应用高速机械剪切设备处理，形成平均 粒径为1-4微米的微泡混悬液。 

本发明的微泡造影剂采用的靶向配体为环状五肽c(RGDyK)，即cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)，其分子片段小，且易进行共价偶联。该配体既可与微泡采用共价方法稳定连接，又可与整合素靶向性结合；而整合素由于仅在肿瘤毛细血管及肿瘤细胞有高表达，而在正常细胞不表达或表达甚微，所以c(RGDyK)是较理想的配体，具有肿瘤新生血管靶向和肿瘤细胞特异性靶向功能。 

PEG为亲水性高聚合度的柔性连接臂。运用其作为连接臂的靶向微泡水溶性好，在体内具有较长的半衰期。可使微泡在体内有较长的时间与靶器官更加紧密的结合。 

二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE），具有性质稳定，抗氧化性强，成品稳定等特点，是首选的辅料。 

本发明的靶向微泡造影剂，以肿瘤组织中的整合素为靶点，采用共价偶联法，通过PEG衍生物连接臂（PEG-DSPE）将c(RGDyK)以共价结合法连于自制脂质微泡上制备出带连接臂的靶向微泡造影剂，使PEG连接臂一端连着含有RGD结构的与之结合力强的环状五肽c(RGDyK)配体，另一端与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）相连。 

本发明插入柔软的连接臂作为一种链绳结构，其系着配体的游离端活动度大，在靶区能提供配体与受体结合所需的相对较长的接触时间与更多的接触机会；再者，有了连接臂后配体能充分暴露在造影剂表面，而直接连接时部分配体可能掩埋在造影剂外壳材料之中，造成配体的浪费。运用PEG及其衍生物作为连接臂的靶向微泡水溶性好，在体内具有较长的半衰期，此外PEG长链还具有很好的柔韧性，且可产生较好的空间位阻作用，综合作用的结果是使血液中调理蛋白对纳米粒的粘附性下降，从而降低了MPS吞噬细胞对微泡的识别和吞 噬作用。该种连接臂上面都含有可供共价修饰的官能团，如氨基，羧基，羟基等，这为它们与配体和微泡之间的共价偶联提供了物质基础。所以连接臂的加入十分有助于增强配体与受体之间的粘附，会有更多的靶向微泡配体－受体对形成，微泡与靶器官之间的结合便更加紧密，不易被循环血液带走，靶向结合力便会大大提高，从而获得更好的基因转染率和肿瘤治疗效果。 

本发明微泡造影剂的制备工艺采用超声匀化、高速剪切机剪切生成微泡的方法，具有制备原料少，制备工艺简单、方便，制备的超声微泡大小适宜、粒径分布均一、靶向探针结合率高等特点。 

附图说明

图1为不带连接臂的靶向微泡造影剂示意图。 

图2为本发明的带连接臂的靶向微泡造影剂示意图。 

图3为本发明的靶向微泡造影剂的光学显微镜图（×400）。 

图4为本发明的靶向微泡造影剂的荧光显微镜图片（×400）。 

图5为实施例5组Ⅰ荧光显微镜观察肿瘤组织的EGFP显影强度(100×)。 

图6为实施例5组Ⅱ荧光显微镜观察肿瘤组织的EGFP显影强度(100×)。 

图7为实施例5组Ⅲ荧光显微镜观察肿瘤组织的EGFP显影强度(100×)。 

具体实施方式

实施例1：合成本发明的DSPE-PEG-c(RGDyK)靶向微泡造影剂 

本发明的DSPE-PEG-c(RGDyK)靶向微泡造影剂如图2所示，通过下述步骤制备： 

（1）合成DSPE-PEG-c(RGDyK)：将10毫摩尔c(RGDyK)和10毫摩尔DSPE-PEG2000，30毫摩尔的DIEA（N’N-二异丙基乙胺）加入到15mL乙腈中，随后加入20毫摩尔的HBTU,室温反应30分钟，环状五肽c(RGDyK)的-NH₂基与 DSPE-PEG的-OH基通过共价偶联得产物DSPE-PEG-c(RGDyK)，减压蒸干溶剂，柱色谱层析，经高效液相色谱分析，纯度>95%，质谱鉴定分子结构正确； 

（2）将40mgDSPE、4mgDPPA、5mg泊洛沙姆，40-60℃充分混悬于5ml双蒸水中，制成混悬液A；将8mg DSPE-PEG2000-c(RGDyK)溶于150-250微升无水乙醇中，于40℃条件下溶解完全，制成溶液B； 

（3）混悬液A于探头超声仪中进行超声处理(工作3秒，暂停3秒，功率30%，3分钟,频率20kHz)，超声次数为一次或两次，在超声过程中逐滴加入溶液B，观察所制得的溶液均澄清，得到澄清液C； 

（4）将20mg PEG4000加入澄清液C中，溶解完全；再将全氟丙烷气体通入溶液C中，充分饱和的同时，应用高速机械剪切设备处理(1×10⁴r/min)2min，形成平均粒径为1-4微米的微泡混悬液。 

表征方法如下：将微泡分散于生理盐水中，显微镜下观察制备的超声微泡大小均匀适宜、粒径分布均一、分散良好（见图3）;测定微泡浓度为1.5×10⁹/mL,平均粒径为（1.5±0.5）μm,粒径均一，97%微泡直径小于5μm。新型靶向超声造影剂荧光显微镜图片（×400）：可见密集分布的表面呈绿色光环的微泡，其浓度密集，大小均一，形态规整。证实有靶向环状多肽配体连于微泡表面（见图4）。 

得到的靶向微泡造影剂，球壁材料各组成成分的重量百分比为： 

DSPE-PEG2000-c(RGDyK)，0.16% 

PEG4000（微泡膜材料），0.4% 

磷脂:DSPE（0.8%）、DPPA（0.08%） 

泊洛沙姆，0.1% 

包裹气体为全氟丙烷，溶液为去离子双蒸馏水。 

按实施例1的方法制备实施例2、3的DSPE-PEG-c(RGDyK)靶向微泡造影剂，所不同的是加入的原料质量，见表1，得到的微泡造影剂其球壁材料各组成成分的重量百分比也列在表1中。 

表1 

对比例：合成如图1所示的没有连接臂的靶向微泡造影剂。 

将40mgDSPE、4mgDPPA、5mg泊洛沙姆，40-60℃充分混悬于5ml双蒸水中，制成混悬液A;再将8mg结合探针c(RGDyK)的棕搁酸溶于250微升无水乙醇中，于60℃条件下溶解完全，制成溶液B;混悬液A于探头超声仪中进行超声处理(工作3秒，暂停3秒，功率30%，3分钟)，超声次数为一次或两次，在超声过程中逐滴加入溶液B，观察所制得的溶液C均澄清。再将10mg PEG-4000加入澄清液C中溶解;再将全氟丙烷气体通入溶液C中，充分饱和的同时，应用高速机械剪切设备处理(1×10⁴r/min)2min，形成平均粒径为1-4微米的微泡混悬液。 

实施例4：体外寻靶能力对比检测 

1)细胞培养：人肝癌细胞株HepG2及正常肝细胞L-O2培养于含10%新生胎牛血清、100U青霉素和链霉素的DMEM培养基中，于37℃,5%CO₂细胞培养箱中培养。 取1×10⁵对数生长期细胞，铺于24孔板培养。 

2)靶向微泡与HepG2细胞的靶向结合力对比实验 

①花环形成实验：以正常肝细胞L-O2细胞为对照组，取100μL HepG2细胞悬液分别加入20μL两种微泡造影剂，室温下反应10min后，光镜下观察细胞和微泡的结合情况。以花环中微泡数（简称微泡数）>5个的花环为标准花环，计数10个视野内的平均标准花环数即为花环形成率。分组如下： 

Ⅰ对比例的靶向微泡+HepG2细胞组 

Ⅱ对比例的靶向微泡+L-O2细胞组 

Ⅲ实施例1的靶向微泡+HepG2细胞组 

Ⅳ实施例1的靶向微泡+L-O2细胞组 

②花环形成阻断实验：取出HepG2细胞爬片，用PBS液冲洗后，分别加入20μL不同浓度的抗α_Vβ₃抗体，室温下反应20min后，用PBS液冲洗后，再加入两种微泡造影剂各20μL，室温下反应10min，用PBS液洗涤后计算花环形成率，检测花环形成的特异性，分组如下： 

Ⅰ对比例的靶向微泡+HepG2细胞 

Ⅲ实施例1的靶向微泡+HepG2细胞 

结果如下：显微镜下观察可见多个靶向微泡造影剂结合在细胞周围，形成花环。当花环中微泡数>5个时，在Ⅰ组的靶向造影剂微泡与HepG2细胞的花环形成率为（63.4±1.5）%，比Ⅱ组的靶向造影剂微泡与L-O2细胞的花环形成率为（5.2±4.5）%高（p<0.5），Ⅲ组的靶向造影剂微泡与HepG2细胞的花环形成率为（85.5±5.5）%，比Ⅳ组的靶向造影剂微泡与L-O2细胞的花环形成率为（10.4±3.5）%高（p<0.5）；Ⅰ对比例组与Ⅲ实施例1组间相比差异有统计意义（p<0.5）；当花环中微泡数≤5个时，Ⅲ组与Ⅰ组的结合率分别为（39.6± 1.2）%、（15.7±1.3）%、2组间相比差异均有统计学意义（P<0.05）；Ⅳ组与Ⅱ组的结合率分别为（9.6±2.4）%、（8.7±1.2）%、2组间相比差异均无统计学意义（P>0.05）。证实了新型靶向微泡与HepG2细胞有着较强的结合力与特异性。 

靶向微泡造影剂与HepG2细胞结合力的观察：取出已贴壁生长有HepG2细胞的盖玻片，PBS液冲洗之后分别加入对比例的、实施例1的靶向微泡造影剂20μL，室温下反应10min，用PBS液以微血管内0.6m/s的流速冲洗后，光镜下观察靶向微泡造影剂与HepG2细胞的结合率。结果如下：在Ⅰ组，恒速冲洗前花环形成率为（63.4±1.5）%，冲洗后为（52.1±3.1）%，冲洗前后差异无统计学意义（P<0.05）。Ⅲ组，靶向造影剂微泡与盖玻片上的HepG2细胞反应10min，见靶向造影剂微泡呈环状聚集在肝癌细胞周围，结合率为（85.5±5.5）%；PBS缓冲液冲洗之后，有少量结合在肝癌细胞周围的微泡被冲走结合率稍降为（84.4±3.7）%，冲洗前后比较差异无统计学意义（P>0.05），两组相比差异有统计学意义（P<0.05）。证实了本发明的靶向微泡可显著增加与HepG2细胞的结合力。 

实施例5：携载CD/TK双自杀基因质粒联合超声进行肝癌小鼠皮下移植瘤的体内基因转染对比实验 

（1）质粒提取 

将含有增强型绿色荧光蛋白序列的质粒pEGFP-KDRP-CD/TK（由前期构建）转化大肠杆菌DH5α，挑选氨苄抗性的单克隆，经大肠杆菌扩增后提取纯化质粒，经酶切后，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定备用。 

（2）小鼠肝癌皮下移植瘤模型的建立 

每只小鼠背侧腰肋部皮下注射0.1mL，后观察小鼠生长状况，以皮下结节直径达0.5-1.0cm为成瘤标准。 

（3）小鼠肝癌模型靶向基因转染实验 

1）基因转染率检测： 

①实验分组： 

将24只荷瘤小鼠按随机数字表法随机分为三组： 

Ⅰ质粒+生理盐水对照组 

Ⅱ质粒+对比例的靶向微泡组 

Ⅲ质粒+实施例1的靶向微泡组 

②载基因微泡制备： 

按照1μg/μL浓度配制质粒与靶向微泡或生理盐水的混合物，震荡混匀，室温孵育30min，吸去下层清亮液体，再用PBS冲洗2遍。 

③处理方法： 

每组将60μL含60μg质粒的微泡造影剂注入小鼠尾静脉后行超声辐照，超声辐照探头频率1MHz，声强2w／cm，脉冲辐照5min，脉冲工作周期50％（前期实验所得优化参数）。第二天重复治疗一次,继续饲养7d。 

④基因表达的检测： 

实验结束后，处死小鼠，剥取瘤组织。 

a.流式细胞仪检测肿瘤组织内基因转染率：无菌条件下完整剥取肿瘤组织，置于无菌研磨器中,加入PBS，然后研磨器均匀研碎，无菌筛网过滤收集，离心5min，PBS重悬细胞，立即送流式细胞仪分析10000个细胞，检测肿瘤细胞中荧光蛋白的表达比例。结果显示:Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组悬液中结合了荧光标记的质粒与肝癌细胞的结合率分别为32.9±2.5%、51.03±3.0%，88.5±1.4%,3组间差异有统计学意义(P<0.05)。证实了本发明的靶向造影剂对肝癌细胞有显著的特异性结合能力。 

b.重组质粒基因转染率对比 

荧光显微镜观察肿瘤组织的EGFP显影强度：OCT胶包埋冷冻的肿瘤组织，冰冻切片，荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察肿瘤组织内绿色荧光蛋白的显影强度,被重组质粒成功转染的组织因为表达GFP而在蓝色激发光激发时，发射绿色荧光。据此来计算不同处理组标本中的基因转染率。 

Ⅲ组的肿瘤组织中可见大量的绿色荧光细胞，Ⅱ组肿瘤组织中的绿色荧光细胞明显少于Ⅲ组，Ⅰ组的肿瘤组织中偶尔可见1-2个绿色荧光细胞（图5）。说明Ⅲ组在超声微泡的联合作用下，其基因转染的效率要高于Ⅱ组，两者比较有统计学差异（P<0.05）；Ⅱ组与Ⅰ组比较，基因转染效率高，差异有统计学意义（P<0.05，表2）。 

表2各组肿瘤组织冰冻切片的基因转染 

Tab.2Gene transfection of tumor’s frozen section in each group 

注：Ⅲ组与Ⅱ组比较,*P<0.05；Ⅱ组与Ⅰ组比较，#P<0.05。 

Claims (7)

1.一种靶向超声微泡造影剂，为平均粒径为1-4微米的微泡混悬液，球壁材料包括DSPE和DPPA和聚乙二醇和泊洛沙姆，包裹气体为氟碳类组织相容性惰性气体，溶液为去离子双蒸馏水，其特征在于球壁材料中含有结合多肽配体c(RGDyK)的PEG连接臂，其结构为DSPE-PEG-c(RGDyK)。

2.根据权利要求1所述的靶向超声微泡造影剂，其特征在于所述DSPE的重量百分含量为造影剂的0.2%-0.8%，DPPA的重量百分含量为造影剂的0.02%-0.2%。

3.根据权利要求1所述的靶向超声微泡造影剂，其特征在于所述球壁材料中聚乙二醇分子量为4000-6000，其重量百分含量为造影剂的0.05%-0.4%。

4.根据权利要求1所述的靶向超声微泡造影剂，其特征在于所述泊洛沙姆的重量百分含量为造影剂的0.01%-0.1%。

5.根据权利要求1所述的靶向超声微泡造影剂，其特征在于所述氟碳类组织相容性惰性气体为全氟丙烷。

6.根据权利要求1所述的靶向超声微泡造影剂，其特征在于所述PEG连接臂中PEG分子量为800-2000，DSPE-PEG-c(RGDyK)的重量百分含量为造影剂的0.1%-0.2%。

7.一种权利要求1-6之一所述的靶向超声微泡造影剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将c(RGDyK)和DSPE-PEG和DIEA（N’N-二异丙基乙胺）加入到乙腈中，加入HBTU,室温下反应得到DSPE-PEG-c(RGDyK)；

（2）将DSPE、DPPA和泊洛沙姆，40-60℃充分混悬于双蒸水中，制成混悬液A，将DSPE-PEG-c(RGDyK)溶于无水乙醇中，溶解完全，制成溶液B；

（3）混悬液A于探头超声仪中进行超声处理，在超声过程中逐滴加入溶液B，得到澄清液C；

（4）将聚乙二醇加入澄清液C中，溶解完全；再将氟碳类组织相容性惰性气体通入溶液C中，充分饱和的同时，应用高速机械剪切设备处理，形成平均粒径为1-4微米的微泡混悬液。

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