CN105106977A - 一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法 - Google Patents
一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，属基础研究领域；本发明超声微泡制备使用的材料为：DSPC、DSPE-PEG2000-malei？mide、DSPE-PEG2000-Biotin、iRGD肽、抗CCR2抗体、硬脂酸、支链聚醚酰亚胺-600、N，N’-羰基二咪唑、抗生物素蛋白；本发明将靶向Integrinαvβ3的iRGD穿膜肽与抗CCR2抗体结合至微泡表面，构建双靶向阳离子超声造影剂，具有携载质粒DNA和靶向肿瘤细胞双重功能，联合超声介导的生物学效应和iRGD的穿膜作用，促进基因进入肿瘤细胞内，提高基因转染效率，有望发展应用于可视化超声控释基因治疗肿瘤。
Description
所属技术领域
本发明属于基础研究领域，涉及超声微泡的制备方法，尤其涉及一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法。
背景技术
超声微泡(microbubble，MB)，即超声造影剂的主要成分，具有安全性高、能增强超声散射强度和产生丰富谐波信号的特点，被广泛应用于多种类型的疾病诊断，显著提高疾病诊断的灵敏性和特异性，运用超声造影剂进行超声成像已经成为超声诊断工作中重要的组成部分。
近年来，随着超声分子影像学的发展，超声微泡的使用不再仅仅局限于成像领域，通过生化技术对超声微泡进行适当改造，可以将药物或基因携载于微泡表面、壳层或内部而用于疾病治疗，具有广阔的发展及运用前景。给予一定声强的超声辐照时，微泡发生振动、膨胀和压缩运动，当声场较强时甚至发生破裂崩溃，这时微泡周围引发高温高压、微射流、冲击波、切边应激力等多种能量释放，产生的生物学效应不仅能够引起辐照区域血管内皮细胞间隙增宽，为基因、药物穿越内皮屏障创造有利条件，还可影响细胞膜流动性，使细胞膜磷脂双分子层结构发生可自我修复的断裂，导致瞬时可逆的细胞膜微孔产生，Ca2+内流促使细胞膜通透性增加，将更多的药物或基因传递入细胞内发挥作用，从而改善治疗效果。研究证明，超声微泡联合超声辐照介导的肿瘤治疗具有安全系数高、靶向破坏微泡释放治疗物质、促进治疗物质渗透入病变组织的特点，尤其在递送基因具有巨大的应用潜力和独特的优势，例如提高细胞对质粒DNA的摄取，通过调节超声参数及改变超声辐照部位更方便有效地调控基因转染等。
然而，与其他基因传递系统相比，目前超声微泡携带质粒DNA的能力较低，且难以实现微泡在肿瘤细胞周围的聚集，以至给予超声辐照时进入肿瘤细胞内的基因数量受到限制，从而影响转染率。阳离子材料聚醚酰亚胺(PEI)是一种多用途的阳离子聚合物，能够中和DNA电荷，增加DNA与细胞膜的相互作用并促进细胞内吞，是常用的转染试剂。研究表明，PEI与超声具有协同作用，PEI修饰的微泡能通过正负电荷相吸作用携带更多的DNA，在超声介导下有效地提高基因转染效率。对于质粒DNA靶向聚集问题，微泡进行靶向修饰是一个很好的解决方案，通过在微泡表面连接上针对某种肿瘤的特异性抗体或配体，使其能够特异性识别靶细胞而靶向聚集到病灶内。利用靶向微泡携带传输基因不仅可以实现基因在靶细胞富集，为实现基因高效转染提供必要的先决条件，同时也大大降低微泡在正常组织的浓度，极大地减少了对正常组织产生副作用的可能。有研究表明，双靶向微泡能与不同的肿瘤细胞表面标记性分子结合，更好地克服血流剪切力的影响，增加超声微泡与肿瘤靶细胞的粘附机会，增强微泡的靶向效能，从而提高其所携带基因在靶组织的富集程度。整合素是细胞黏附分子家族中的一类生物分子，由125kDa的αv亚基和105kDa的β亚基形成跨膜异二聚体，在肿瘤血管内皮细胞及部分肿瘤细胞上均呈高表达，而在休眠状态的内皮细胞和正常细胞上几乎不表达，广泛参与细胞之间的相互作用及肿瘤血管的生成，与肿瘤细胞的粘附，增殖和迁移密切相关，其中整合素αvβ3(Integrinαvβ3)的作用尤为重要，是许多抗肿瘤血管生成药物的靶点。含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的iRGD肽是一种环状的穿膜肽，与整合素αvβ3受体具有高亲和力，同时具有靶向Neuropilin-1受体和加速大分子物质(基因或药物)递送入肿瘤细胞的功能。iRGD穿膜肽能与肿瘤血管形成有关的整合素蛋白结合，然后这种肽被劈开，成为激活的CendR肽，后者与neuropilin-1相结合。CendR/neuropilin-1的结合调控着一种激活的运输系统，让同时注射的治疗物质从血管中渗出。这种倾注在血管外的肿瘤组织中继续发生，从而让治疗分子越来越深地渗透到肿瘤组织中。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，主要表达于单核细胞、上皮细胞和内皮细胞，是一类参与血管形成的趋化因子，许多肿瘤细胞均可分泌MCP-1因子促进肿瘤血管的生成，在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌等肿瘤中MCP-1因子的分泌与肿瘤微血管的密度及侵袭能力密切相关。MCP-1介导血管生成的途径主要依赖于MCP-1与其特异性受体——CC类趋化因子受体2(CCR2)之间的相互作用。CCR2被发现在部分肿瘤血管内皮细胞上呈现高表达状态，MCP-1直接作用于内皮细胞上的CCR2受体，诱导内皮细胞趋化。MCP-1/CCR2的激活直接参与肿瘤血管的生成和进展，促进肿瘤的侵袭转移，且这种作用与内皮细胞上的CCR2受体表达情况呈正相关。
发明内容
本发明提供了一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法；本发明将靶向Integrinαvβ3的iRGD穿膜肽与抗CCR2抗体结合至微泡表面，构建双靶向阳离子超声造影剂，该双靶向阳离子超声微泡粒径分布均匀，具有携载质粒DNA和靶向肿瘤细胞双重功能，可作为质粒DNA的传输载体，使质粒在肿瘤组织周围富集，联合超声介导的生物学效应和iRGD的穿膜作用，促进基因进入肿瘤细胞内，提高基因转染效率，有望发展应用于可视化超声控释基因治疗肿瘤。
本发明的技术方案的实施如下：
一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)DSPE-PEG2000-iRGD的制备
①称量：按照摩尔比1.5∶1称量药品iRGD和DSPE-PEG2000-maleimide；
②溶解：将药品iRGD和DSPE-PEG2000-maleimide移入西林瓶中，加双蒸水4ml溶解，吹匀；
③反应：将装有药品的西林瓶置于冰块中，磁力搅拌24h；
④透析：取一大烧杯，装满蒸馏水，将反应后的溶液转移至透析袋内(Mw：3500)置于大烧杯内，将大烧杯维持在冰块环境中，磁力搅拌透析48h，每隔4h换一次双蒸水以及冰块；
⑤冷冻干燥：透析完毕后，将透析好的溶液转移至西林瓶中，置于-80℃中冻存约4h至固体，取出置冷冻干燥机中干燥48h；
⑥存放：干燥完毕后，封口，贴标签，于-20℃中保存；
(2)Stearie-PEI600的制备
①取0.35gN，N’-羰基二咪唑(CDI)和0.6g硬脂酸(Stearic)分别溶解于10ml无水氯仿中，0.7g支链PEI600溶解于20ml无水氯仿中，分别得N，N’-羰基二咪唑溶液、硬脂酸溶液、支链PEI600溶液备用；
②将①中所得的N，N’-羰基二咪唑溶液进行磁力搅拌，在不断磁力搅拌下，将①中所得的硬脂酸溶液逐滴加入N，N’-羰基二咪唑溶液中，得混合物溶液一，将混合物溶液在氩气保护下反应2小时后，再将其逐滴加入支链PEI600溶液中，得混合物溶液二备用；
③将②中所得的混合物溶液二在氩气保护下于室温环境中进一步搅拌24小时，所得产物在冷乙醚中沉淀纯化，然后放入大型离心机中清洗除去未反应的溶剂10min，收集上清液得到纯化的Stearic-PEI600；然后将清洗收集后的Stearic-PEI600溶液放入真空干燥机中干燥数小时，完毕后置于-20℃储物箱中保存，制备微泡时将其融于无水氯仿中使用；
(3)双靶向阳离子超声微泡的制备
①将DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-iRGD、DSPE-PEG2000-Biotin溶解于三氯甲烷中，按摩尔比8.5∶0.5∶0.5∶0.5取上述配制的溶液于干净试管中，将试管置于旋转仪，使用干燥的N2气流除去溶剂使其在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中干燥3小时以上，备用；
②在试管中加入一定体积的Tris缓冲溶液，得到一定浓度的磷脂溶液，加热磷脂溶液到其相转变温度(55-60℃)以上，并用水浴超声制成透明的磷脂溶液，将所得磷脂溶液分装入洁净西林瓶中(1ml/瓶)，用全氟丙烷(C3F8)置换瓶中的空气，机械震荡器震荡30s后形成生物素化的阳离子MBiRGD微泡；
③将所得生物素化的阳离子MBiRGD微泡用PBS借助离心漂浮法清洗三次，然后加入60μg抗CCR2抗体孵育20分钟，离心清洗除去过量的未结合的抗体，制得携iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡。
制成所述超声微泡成分为：DSPC、DSPE-PE62000-maleimide、DSPE-PEG2000-Biotin、iRGD肽、抗CCR2抗体、硬脂酸、支链聚醚酰亚胺-600、N，N’-羰基二咪唑、抗生物素蛋白。
所述纯化的Stearic-PEI600在大型离心机清洗时转数为3000rpm。
所述Tris缓冲溶液含10％甘油和10％丙二醇，pH为7.4。
所述离心漂浮法清洗时，清洗速度设置为400g/min，每次清洗4min，所述生物素化的阳离子MBiRGD微泡用PBS进行离心漂浮法清洗之前，每1×108的生物素化的阳离子MBiRGD微泡加入50μg亲和素(AD)并在室温下孵育20分钟。
本发明双靶向超声微泡所具有的特性如下：
1、双靶向阳离子微泡的粒径及基本电荷：发明制备的靶向微泡的包封材料为脂质体，是通过磷脂之间较弱的疏水作用力和范德华力自组装形成，相对高分子聚合物材料而言更柔软，回声性能较好成像较稳定，对超声具有非常强的反应灵敏性，使用较低的超声能量便能快速爆破微泡释放基因，脂质微泡还有利于进行功能化靶向修饰。脂质微泡的粒径大小及分布需要控制在一定范围内，因其很大程度上影响微泡的稳定性、微泡声信号反射效能及靶向效能的发挥。制备的携iRGD双靶向阳离子超声微泡在光镜下均显示为大小、分布较均匀的球形气泡。制备的携iRGD双靶向阳离子超声微泡在光镜下均显示为大小、分布较均匀的球形气泡。粒度分析仪测得的微泡粒径为(0.84±0.06)μm，微泡直径分布在0.5～2μm范围，双靶向修饰并未对微泡粒径产生较大影响。Marlven电位分析仪测得的微泡表面电荷为(25.83±1.57)mV，与未进行PEI600修饰的微泡相比，电荷有较显著的提高，说明在微泡制备过程中加入Stearic-PEI600，能通过硬脂酸参与微泡壳的形成使阳离子材料PEI600连于微泡上，操作简便连接稳固，有效将微泡表面电荷逆转为正电荷。
微泡的粒径和电位(n＝4，)如下表：
注：MBcontrol：非靶向微泡
MBiRGD：携iRGD肽单靶向微泡
MBCCR2：携抗CCR2抗体单靶向微泡
MBiRGD/CCR2：携iRGD肽和抗CCR2抗体双靶向微泡
non-PEI600：没有加入PEI600制备材料
PEI600：加入PEI600制备材料
2、荧光显微镜下观察：非靶向微泡MBcontrol不能激发荧光；蓝光激发下，FITC标记的MBiRGD发绿色荧光，表明iRGD肽结合在微泡表面；绿光激发下，PE标记的MBCCR2发红色荧光，表明CCR2单抗连接到了微泡上；FITC和PE标记的MBiRGD/CCR2既能在蓝光激发下呈现绿色荧光，又能在绿光激发下呈现红色荧光，表明iRGD肽和CCR2单抗均连接到了微泡上，其融合图呈现黄色光。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明将靶向Integrinαvβ3的iRGD穿膜肽与抗CCR2抗体结合至微泡表面，构建双靶向阳离子超声造影剂，该双靶向阳离子超声微泡粒径分布均匀，具有携载质粒DNA和靶向肿瘤细胞双重功能，可作为质粒DNA的传输载体，使质粒在肿瘤组织周围富集，联合超声介导的生物学效应和iRGD的穿膜作用，促进基因进入肿瘤细胞内，提高基因转染效率，有望发展应用于可视化超声控释基因治疗肿瘤。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述。
实施例
一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)DSPE-PEG2000-iRGD的制备
①称量：按照摩尔比1.5∶1称量药品iRGD和DSPE-PEG2000-maleimide；
②溶解：将药品iRGD和DSPE-PEG2000-maleimide移入西林瓶中，加双蒸水4ml溶解，吹匀；
③反应：将装有药品的西林瓶置于冰块中，磁力搅拌24h；
④透析：取一大烧杯，装满蒸馏水，将反应后的溶液转移至透析袋内(Mw：3500)置于大烧杯内，将大烧杯维持在冰块环境中，磁力搅拌透析48h，每隔4h换一次双蒸水以及冰块；
⑤冷冻干燥：透析完毕后，将透析好的溶液转移至西林瓶中，置于-80℃中冻存约4h至固体，取出置冷冻干燥机中干燥48h；
⑥存放：干燥完毕后，封口，贴标签，于-20℃中保存；
(2)Stearic-PEI600的制备
①取0.35gN，N’-羰基二咪唑(CDI)和0.6g硬脂酸(Stearic)分别溶解于10ml无水氯仿中，0.7g支链PEI600溶解于20ml无水氯仿中，分别得N，N’-羰基二咪唑溶液、硬脂酸溶液、支链PEI600溶液备用；
②将①中所得的N，N’-羰基二咪唑溶液进行磁力搅拌，在不断磁力搅拌下，将①中所得的硬脂酸溶液逐滴加入N，N’-羰基二咪唑溶液中，得混合物溶液一，将混合物溶液在氩气保护下反应2小时后，再将其逐滴加入支链PEI600溶液中，得混合物溶液二备用；
③将②中所得的混合物溶液二在氩气保护下于室温环境中进一步搅拌24小剂10min，收集上清液得到纯化的Stearic-PEI600；然后将清洗收集后的Stearic-PEI600溶液放入真空干燥机中干燥数小时，完毕后置于-20℃储物箱中保存，制备微泡时将其融于无水氯仿中使用；
(3)双靶向阳离子超声微泡的制备
①将DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-iRGD、DSPE-PEG2000-Biotin溶解于三氯甲烷中，按摩尔比8.5∶0.5∶0.5∶0.5取上述配制的溶液于干净试管中，将试管置于旋转仪，使用干燥的N2气流除去溶剂使其在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中干燥3小时以上，备用；
②在试管中加入一定体积的Tris缓冲溶液，得到一定浓度的磷脂溶液，加热磷脂溶液到其相转变温度(55-60℃)以上，并用水浴超声制成透明的磷脂溶液，将所得磷脂溶液分装入洁净西林瓶中(1ml/瓶)，用全氟丙烷(C3F8)置换瓶中的空气，机械震荡器震荡30s后形成生物素化的阳离子MBiRGD微泡；
③将所得生物素化的阳离子MBiRGD微泡用PBS借助离心漂浮法清洗三次，然后加入60μg抗CCR2抗体孵育20分钟，离心清洗除去过量的未结合的抗体，制得携iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡。
制成所述超声微泡成分为：DSPC、DSPE-PEG2000-maleimide、DSPE-PEG2000-Biotin、iRGD肽、抗CCR2抗体、硬脂酸、支链聚醚酰亚胺-600、N，N’-羰基二咪唑、抗生物素蛋白。
所述纯化的Stearic-PEi600在大型离心机清洗时转数为3000rpm。
所述Tris缓冲溶液含10％甘油和10％丙二醇，pH为7.4。
所述离心漂浮法清洗时，清洗速度设置为400g/min，每次清洗4min，所述生物素化的阳离子MBiRGD微泡用PBS进行离心漂浮法清洗之前，每1×108的生物素化的阳离子MBiRGD微泡加入50μg亲和素(AD)并在室温下孵育20分钟。
下面结合非靶向微泡(MBcontrol)和单靶向微泡(MBiRGD、MBCCR2)对本发明做进一步阐述。
1、微泡肽/抗体连接率检测：
(1)采用硫醇-马来酰亚胺连接法通过特定基团间的反应偶联iRGD肽，用生物素-亲和素连接法通过非共价键结合连接抗CCR2抗体，两种不同方法的使用，避免了只采用同一种连接方法造成的竞争引起两者连接数量过大的差异。
(2)流式细胞仪检测：MBiRGD主要于FL1-A通道(检测FITC)被检出，MBCCR2主要于FL2-A通道(检测PE)被检出，而MBiRGD/CCR2均能被上述两通道检出。MBiRGD上iRGD肽的结合率为(96.13±1.50)％，MBCCR2上抗CCR2抗体的结合率为(90.65±3.71)％，MBiRGD/CCR2上两者的结合率分别为(96.24±2.06)％和(90.91±3.53)％，靶向微泡肽或抗体的结合率均大于90％，使用的这两种连接方法均能较好地偶联配体或抗体，并且使肽和抗体较均匀地装载于微泡表面。
2、非靶向及靶向阳离子微泡体外黏附效果
(1)微泡与细胞的黏附情况于光学显微镜和荧光显微镜下观察。
(2)被DAPI荧光染料染色的bEnd.3细胞核呈现蓝色，在bEnd.3细胞周围，几乎无MBcontrol黏附，单靶向荧光微泡MBiRGD和MBCCR2能较多地聚集、结合在bEnd.3细胞周围，两者的黏附率分别为(1.79±0.22)微泡/细胞和(1.49±0.30)微泡/细胞，而双靶向荧光微泡MBiRGD/CCR2能更多地与bEnd.3细胞黏附，其黏附率为(2.88±0.56)微泡/细胞，黏附能力高于MBcontrol、MBiRGD和MBCCR2。
(3)皮细胞靶向黏附对照实验显示，游离iRGD肽或抗CCR2抗体提前与内皮细胞孵育大大减少了靶向微泡与bEnd.3细胞之间的黏附，进一步说明了靶向微泡与bEnd.3细胞之间的黏附，是由iRGD肽和抗CCR2抗体通过配体-受体、抗原-抗体结合方式特异性介导的。
3、双靶向阳离子微泡的体外超声显影及稳定性
(1)靶向超声造影剂的出现使得超声造影成像的分辨力、敏感性和特异性得到进一步的提升，实现感兴趣区域的分子显像，而双靶向或多靶向修饰的微泡是今后造影剂发展的趋势，在病灶区域富集的微泡会对超声波产生更多的散射，从而显著增强图像的对比度和信噪比，大大提高了超声造影诊断的灵敏性，有助于疾病的早期检出和疾病的鉴别诊断。
(2)Vevo2100超声成像探头下琼脂孔内的双靶向微泡MBiRGD/CCR2回声较为均匀，与MBcontrol的回声强度相似(Otime)，平均灰阶强度分别为(168.05±4.05)a.u和(166.63±3.61)a.u；随着时间的增加，MBcontrol和MBiRGD/CCR2的超声信号强度逐渐下降，但两者的信号强度差异没有统计学意义(P＞0.05)，表明连接iRGD肽和抗CCR2单抗后并未影响微泡的稳定性。该双靶向阳离子超声微泡能聚集于肿瘤组织而用于增强肿瘤显影。
4、双靶向阳离子微泡结合DNA能力检测
(1)用琼脂糖凝胶电泳法检测MBiRGD/CCR2结合承载质粒DNA能力。
(2)随着MBiRGD/CCR2浓度增加，迁移至凝胶中的DNA越少，表明更多的质粒DNA结合至MBiRGD/CCR2。根据公式计算，浓度为2×106，4×106，8×106，1.6×107的MBiRGD/CCR2分别可以结合(0.18±0.04)μg，(0.32±0.03)μg，(0.39±0.03)μg，(0.47±0.02)μg的质粒DNA，1.5×107的MBiRGD/CCR2约能结合0.5μg的质粒DNA。
5、MCF-7细胞基因转染率检测
(1)为了评估载质粒DNA阳离子微泡结合超声辐照是否能提高基因转染效率，阳离子微泡MBcontrol、MBiRGD、MBCCR2、MBiRGD/CCR2与DNA孵育后分别加入培养MCF-7细胞的板孔中，光镜下观察到微泡能聚集于MCF-7乳腺癌细胞周围。
(2)24小时转染后于荧光显微镜下观察，未给予超声辐照组中的对照组未见MCF-7细胞表达绿色荧光蛋白，加入质粒阳离子微泡复合物(质粒+MBcontrol，质粒+MBiRGD，质粒+MBCCR2，质粒+MBiRGD/CCR2)但未给予超声辐照组可见少量绿色荧光蛋白表达，而在加入质粒微泡复合物后给予超声辐照组中，绿色荧光蛋白表达明显增多，且同一倍数视野下，质粒+MBiRGD/CCR2+US组中的MCF-7细胞绿色荧光蛋白表达最多，其基因转染率为(25.43±3.31)％。
总结结论：
本发明具有以下优势：
1、制备的阳离子微泡粒径均匀。
2、操作简便连接稳固，有效将微泡表面电荷逆转为正电荷。
3、制备的双靶向阳离子超声微泡具有更优的靶向效能。
4、可以有效提高基因转染效率。
5、大幅度提高超声诊断的灵敏性。
Claims (5)
1.一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：
(1)DSPE-PEG2000-iRGD的制各
①称量：按照摩尔比1.5∶1称量药品iRGD和DSPE-PEG2000-maleimide；
②溶解：将药品iRGD和DSPE-PEG2000-maleimide移入西林瓶中，加双蒸水4ml溶解，吹匀；
③反应：将装有药品的西林瓶置于冰块中，磁力搅拌24h；
④透析：取一大烧杯，装满蒸馏水，将反应后的溶液转移至透析袋内(Mw：3500)置于大烧杯内，将大烧杯维持在冰块环境中，磁力搅拌透析48h，每隔4h换一次双蒸水以及冰块；
⑤冷冻干燥：透析完毕后，将透析好的溶液转移至西林瓶中，置于-80℃中冻存约4h至固体，取出置冷冻干燥机中干燥48h；
⑥存放：干燥完毕后，封口，贴标签，于-20℃中保存；
(2)Stearic-PEI600的制备
①取0.35gN，N’-羰基二咪唑(CDI)和0.6g硬脂酸(Stearic)分别溶解于10ml无水氯仿中，0.7g支链PEI600溶解于20ml无水氯仿中，分别得N，N’-羰基二咪唑溶液、硬脂酸溶液、支链PEI600溶液备用；
②将①中所得的N，N’-羰基二咪唑溶液进行磁力搅拌，在不断磁力搅拌下，将①中所得的硬脂酸溶液逐滴加入N，N’-羰基二咪唑溶液中，得混合物溶液一，将混合物溶液在氩气保护下反应2小时后，再将其逐滴加入支链PEI600溶液中，得混合物溶液二备用；
③将②中所得的混合物溶液二在氩气保护下于室温环境中进一步搅拌24小时，所得产物在冷乙醚中沉淀纯化，然后放入大型离心机中清洗除去未反应的溶剂10min，收集上清液得到纯化的Stearic-PEI600；然后将清洗收集后的Stearic-PEI600溶液放入真空干燥机中干燥数小时，完毕后置于-20℃储物箱中保存，制备微泡时将其融于无水氯仿中使用；
(3)双靶向阳离子超声微泡的制备
①将DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-iRGD、DSPE-PEG2000-Biotin溶解于三氯甲烷中，按摩尔比8.5∶0.5∶0.5∶0.5取上述配制的溶液于干净试管中，将试管置于旋转仪，使用干燥的N2气流除去溶剂使其在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中干燥3小时以上，备用；
②在试管中加入一定体积的Tris缓冲溶液，得到一定浓度的磷脂溶液，加热磷脂溶液到其相转变温度(55-60℃)以上，并用水浴超声制成透明的磷脂溶液，将所得磷脂溶液分装入洁净西林瓶中(1ml/瓶)，用全氟丙烷(C3F8)置换瓶中的空气，机械震荡器震荡30s后形成生物素化的阳离子MBiRGD微泡；
③将所得生物素化的阳离子MBiRGD微泡用PBS借助离心漂浮法清洗三次，然后加入60μg抗CCR2抗体孵育20分钟，离心清洗除去过量的未结合的抗体，制得携iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡。
2.根据权利要求1所述的一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，其特征在于：制成所述超声微泡成分为：DSPC、DSPE-PEG2000-maleimide、DSPE-PEG2000-Biotin、iRGD肽、抗CCR2抗体、硬脂酸、支链聚醚酰亚胺-600、N，N’-羰基二咪唑、抗生物素蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，其特征在于：所述纯化的Stearic-PEI600在大型离心机清洗时转数为3000rpm。
4.根据权利要求1所述的一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制各方法，其特征在于：所述Tris缓冲溶液含10％甘油和10％丙二醇，pH为7.4。
5.根据权利要求1所述的一种携带iRGD穿膜肽双靶向阳离子超声微泡制备方法，其特征在于：所述离心漂浮法清洗时，清洗速度设置为400g/min，每次清洗4min，所述生物素化的阳离子MBiRGD微泡用PBS进行离心漂浮法清洗之前，每1×108的生物素化的阳离子MBiRGD微泡加入50μg亲和素(AD)并在室温下孵育20分钟。
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