CN111569092B - 一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，包括：a、阳离子微泡的制备；b、载药阳离子微泡制备；c、载药阳离子氟碳液滴的制备；d、β‑glucan修饰载药阳离子氟碳液滴的制备；e、巨噬细胞超声诊疗剂的制备。本发明利用低温相变纳米液滴标记细胞可解决以往超声造影剂标记细胞稳定性差，寿命短，体内安全性低的缺陷。通过制备特异性靶向巨噬细胞的超声诊疗剂可解决以往超声造影剂细胞标记率低的限制。利用“特洛伊木马”效应可以靶向到目标区域，增加靶器官的成像效果及药物浓度，从而增加药物疗效，减少毒副作用。可应用于各种巨噬细胞参与的相关疾病。将超声成像与药物治疗相结合，实现诊疗一体化。
Description
技术领域
本发明涉及超声造影与生物材料技术领域，特别涉及一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法。
背景技术
近年来，很多研究利用细胞的生物学功能，将活细胞作为生物载体用于疾病机制的研究及其诊断治疗。常用修饰后的干细胞及T细胞，联合光声、超声、MRI、CT等多种成像模态诊断疾病。在超声成像方面，有研究报道用介孔硅作为超声造影剂标记骨髓干细胞用于成像，但其存在生物降解性差的缺陷。也有用传统超声造影剂微泡(Microbubbles)标记细胞的，比如，申请号CN201610017740.5的专利公开了一种双靶向超声造影剂及其制备方法，造影剂是Integrinαvβ3/MCP-1双靶向微泡，双靶向微泡包括脂质外壳和气体内芯，脂质外壳的外表面连接有Integrinαvβ3单克隆抗体和MCP-1单克隆抗体。但由于微泡稳定性差，标记率较低，故成像效果不明显。
目前，巨噬细胞超声成像的报道较少。巨噬细胞在免疫调节、器官发育及器官功能上有着重要作用，在各种疾病中发挥着调节作用。已有研究表明，巨噬细胞相关疾病发生时，巨噬细胞将会像单核细胞一样直接快速不经循环地被招募至病变组织，这一生物学特性为巨噬细胞作为载体靶向递送诊断试剂及药物至病变部位奠定了坚实的基础。然而，尽管巨噬细胞拥有较强吞噬能力，但药物与巨噬细胞直接结合药物会被提前释放，载药量低且药物活性被巨噬细胞影响。因此，先将药物负载至新型超声造影剂制备超声造影剂，再予以修饰特异性靶向巨噬细胞配体，最后与巨噬细胞结合构成“巨噬细胞-超声造影剂”递送系统，既可以提高巨噬细胞标记率与载药率，又能够减少诊疗剂在到达靶器官前的提前释放，降低药物对细胞的直接毒性，对于诊断治疗巨噬细胞相关疾病有重大意义。
纳米氟碳液滴(NDs)由一种可相变的全氟化碳制备而成，可用于标记巨噬细胞。为增加巨噬细胞标记率，选择可特异性识别巨噬细胞表面dectin-1(树突状凝集素受体1)和CR3(补体受体3)的β-glucan修饰NDs(β-glucan PEI NDs)。被相变液滴标记的巨噬细胞在一定超声刺激下，液滴达到气化阈值，能够从NDs变为Microbubbles，从而被超声仪器检测，定位显像。由于全氟化碳化学性质为惰性化合物，小剂量低毒，因此其具有较好稳定性及安全性。虽然其性能优越，但并非所有全氟化碳皆可用于细胞标记示踪。碳链短的全氟化碳在体温下(37℃)缺乏稳定，易于气化，而碳链长的全氟化碳在体内安全性较低，其过于稳定，气化阈值高，所需超声能量高于FDA规定的上限。例如，最近新竹清华大学研究了用巨噬细胞吞噬氟碳液滴C5F12进行药物递送的可行性。其采用的C5F12沸点虽然为29℃，但体温下并不足以使之气化，且气化需要高达9MPa以上的声压，远超出临床安全许可范围，气化过程对正常细胞及组织易造成损伤，仅适用于肿瘤消融治疗，限制了其作为超声造影剂的使用。
发明内容
(一)解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，以解决现有的超声造影剂生物降解性差，体内安全性低，稳定性差，标记率较低，成像效果不明显的问题。
(二)技术方案
为实现上述以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法解决现有的超声造影剂生物降解性差，体内安全性低，稳定性差，标记率较低，成像效果不明显的问题，本发明提供如下技术方案：
一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤a、阳离子微泡的制备：将二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG2000、阳离子材料分别按照摩尔质量比0.75～0.85∶0.05～0.15∶0.05～0.2混合于有机溶剂，氮吹成膜，真空除去有机溶剂，超声水化，置换氟碳化合物，摇泡仪摇泡30s，离心洗涤，即得阳离子微泡；
步骤b、载药阳离子微泡制备：在所述a步骤中，投入疏水性药物至有机溶剂中与磷脂混合均匀，其余操作一致，即得载药阳离子微泡；
步骤c、载药阳离子氟碳液滴的制备：将上述b步骤中载药阳离子微泡置于冰浴中混匀，使用20mL注射器25G针头进行加压操作，观察载药阳离子微泡变化，当出现一致性变化时表明载药阳离子氟碳液滴形成，拔出针头，在溶液上方保持一定压力，存放备用；
步骤d、β-glucan修饰载药阳离子氟碳液滴的制备：将上述c步骤中载药阳离子氟碳液滴与β-glucan混合，摇床孵育30～120min，离心洗涤，收集样品，即超声造影剂；
步骤e、巨噬细胞超声造影剂的制备：将上述d步骤中所得超声造影剂与巨噬细胞按照一定比例共孵育，PBS洗涤3遍，使用细胞刮刀刮取细胞，洗涤收集得到以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂。
优选的，所述步骤a中所述阳离子材料为阳离子脂质材料DOTAP、DODMA、DC胆固醇、DOPE任意一种，或者硬脂酸修饰的聚醚酰亚胺(PEI)。
优选的，所述步骤a中所述有机溶剂为二氯甲烷或者三氯甲烷。
优选的，所述步骤b中所述疏水性药物投料量为1～3mg。
优选的，所述步骤b中所述疏水性药物为抗炎药物、免疫抑制剂、抗肿瘤药物的任意一种。
优选的，所述步骤c中所述冰浴温度为-5℃～-15℃。
优选的，所述步骤d中所述载药阳离子氟碳液滴与β-glucan按照体积比1∶1～1∶3。
优选的，所述步骤d中所述β-glucan浓度为1％-3％。
优选的，所述步骤e中所述超声造影剂和巨噬细胞比例为500∶1～2000∶1。
优选的，所述步骤e中所述超声造影剂和巨噬细胞孵育时间为2h～12h。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，具备以下有益效果：
(1)本发明的低温相变液滴由惰性化合物全氟化碳组成，经超声刺激才会气化为微泡，且选择合适碳链长度的全氟化碳可在安全超声能量下气化，故低温相变纳米液滴标记细胞可解决以往超声造影剂标记细胞稳定性差，寿命短，体内安全性低的缺陷。
(2)本发明利用可特异性识别巨噬细胞表面dectin-1的β-glucan修饰相变纳米液滴，被相变液滴标记的巨噬细胞在一定超声刺激下，液滴达到气化阈值，能够从NDs变为Microbubbles，从而被超声仪器检测，定位显像，其稳定好，寿命较长，可增加细胞标记率。
(3)本发明适应性广，可应用于各种巨噬细胞相关疾病如肠炎、关节炎、动脉粥样硬化、心脏移植的急性排斥反应等，当疾病发生时，受趋化因子、炎性因子等招募作用，巨噬细胞的超声造影剂可趋化至疾病部位发挥作用。
(4)本发明将超声成像与药物治疗相结合，实现诊疗一体化。
附图说明
图1为本发明实施例的载药氟碳微泡示意图。
图2为本发明实施例的载药氟碳液滴制备及功能图。
图3为本发明实施例的体内实现载药氟碳液滴功能途径图。
图4为本发明实施例氟碳液滴制备实物图。
图5为本发明实施例微泡及纳米氟碳液滴粒径坐标图。
图6为本发明实施例β-glucan修饰前后纳米液滴(NDs)的zeta电位坐标图。
图7为本发明实施例氟碳液滴(NDs)的细胞毒性坐标图。
图8为本发明实施例激光共聚焦验证巨噬细胞吞噬NDs图。
图9为本发明实施例流式细胞术定量验证巨噬细胞吞噬NDs图。
图10为本发明实施例体外琼脂糖凝胶孔NDs成像效果图。
图11为本发明实施例大鼠皮下NDs成像效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤a、阳离子微泡的制备：将二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG2000、阳离子材料分别按照摩尔质量比0.75～0.85∶0.05～0.15∶0.05～0.2混合于有机溶剂，氮吹成膜，真空除去有机溶剂，超声水化，置换氟碳化合物，摇泡仪摇泡30s，离心洗涤，即得阳离子微泡；
步骤b、载药阳离子微泡制备：在a步骤中，投入疏水性药物至有机溶剂中与磷脂混合均匀，其余操作一致，即得载药阳离子微泡；
步骤c、载药阳离子氟碳液滴的制备：将上述b步骤中载药阳离子微泡置于冰浴中混匀，使用20mL注射器25G针头进行加压操作，观察载药阳离子微泡变化，当出现一致性变化时表明载药阳离子氟碳液滴形成，拔出针头，在溶液上方保持一定压力，存放备用；
步骤d、β-glucan修饰载药阳离子氟碳液滴的制备：将上述c步骤中载药阳离子氟碳液滴与β-glucan混合，摇床孵育30～120min，离心洗涤，收集样品，即超声造影剂；
步骤e、巨噬细胞超声造影剂的制备：将上述d步骤中所得超声造影剂与巨噬细胞按照一定比例共孵育，PBS洗涤3遍，使用细胞刮刀刮取细胞，洗涤收集得到以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂。
其中，步骤a中阳离子材料为阳离子脂质材料DOTAP、DODMA、DC胆固醇、DOPE任意一种，或者硬脂酸修饰的聚醚酰亚胺(PEI)。
其中，步骤a中有机溶剂为二氯甲烷或者三氯甲烷。
其中，步骤b中疏水性药物投料量为1～3mg。
其中，步骤b中疏水性药物为抗炎药物、免疫抑制剂、抗肿瘤药物的任意一种。
其中，步骤c中冰浴温度为-5℃～-15℃。
其中，步骤d中载药阳离子氟碳液滴与β-glucan按照体积比1∶1～1∶3。
其中，步骤d中β-glucan浓度为1％-3％。
其中，步骤e中超声造影剂和巨噬细胞比例为500∶1～2000∶1。
其中，步骤e中超声造影剂和巨噬细胞孵育时间为2h～12h。
实施例2
一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤a、阳离子微泡的制备：将二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG2000、阳离子材料分别按照摩尔质量比0.75～0.85∶0.05～0.15∶0.05～0.2混合于有机溶剂，氮吹成膜，真空除去有机溶剂，超声水化，置换氟碳化合物，摇泡仪摇泡30s，离心洗涤，即得阳离子微泡；
步骤b、载药阳离子微泡制备：在a步骤中，投入疏水性药物至有机溶剂中与磷脂混合均匀，其余操作一致，即得载药阳离子微泡；
步骤c、载药阳离子氟碳液滴的制备：将上述b步骤中载药阳离子微泡置于冰浴中混匀，使用20mL注射器25G针头进行加压操作，观察载药阳离子微泡变化，当出现一致性变化时表明载药阳离子氟碳液滴形成，拔出针头，在溶液上方保持一定压力，存放备用；
步骤d、β-glucan修饰载药阳离子氟碳液滴的制备：将上述c步骤中载药阳离子氟碳液滴与β-glucan混合，摇床孵育30～120min，离心洗涤，收集样品，即超声造影剂；
步骤e、巨噬细胞超声造影剂的制备：将上述d步骤中所得超声造影剂与巨噬细胞按照一定比例共孵育，PBS洗涤3遍，使用细胞刮刀刮取细胞，洗涤收集得到以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂。
其中，步骤a中阳离子材料为硬脂酸修饰的聚醚酰亚胺(PEI)。
其中，步骤a中有机溶剂为三氯甲烷。
其中，步骤b中疏水性药物投料量为2mg。
其中，步骤b中疏水性药物为抗炎药物、免疫抑制剂、抗肿瘤药物的任意一种。
其中，步骤c中冰浴温度为-8℃～-12℃。
其中，步骤d中载药阳离子氟碳液滴与β-glucan按照体积比1∶1。
其中，步骤d中β-glucan浓度为1％。
其中，步骤e中超声造影剂和巨噬细胞比例为1000∶1。
其中，步骤e中超声造影剂和巨噬细胞孵育时间为8h。
实施例3
一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤a、阳离子微泡的制备：将二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG2000、阳离子材料分别按照摩尔质量比0.75～0.85∶0.05～0.15∶0.05～0.2混合于有机溶剂，氮吹成膜，真空除去有机溶剂，超声水化，置换氟碳化合物，摇泡仪摇泡30s，离心洗涤，即得阳离子微泡；
步骤b、载药阳离子微泡制备：在a步骤中，投入疏水性药物至有机溶剂中与磷脂混合均匀，其余操作一致，即得载药阳离子微泡；
步骤c、载药阳离子氟碳液滴的制备：将上述b步骤中载药阳离子微泡置于冰浴中混匀，使用20mL注射器25G针头进行加压操作，观察载药阳离子微泡变化，当出现一致性变化时表明载药阳离子氟碳液滴形成，拔出针头，在溶液上方保持一定压力，存放备用；
步骤d、β-glucan修饰载药阳离子氟碳液滴的制备：将上述c步骤中载药阳离子氟碳液滴与β-glucan混合，摇床孵育30～120min，离心洗涤，收集样品，即超声造影剂；
步骤e、巨噬细胞超声造影剂的制备：将上述d步骤中所得超声造影剂与巨噬细胞按照一定比例共孵育，PBS洗涤3遍，使用细胞刮刀刮取细胞，洗涤收集得到以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂。
其中，步骤a中阳离子材料为阳离子脂质材料DOTAP、DODMA、DC胆固醇、DOPE任意一种。
其中，步骤a中有机溶剂为二氯甲烷。
其中，步骤b中疏水性药物投料量为2.5mg。
其中，步骤b中疏水性药物为抗炎药物、免疫抑制剂、抗肿瘤药物的任意一种。
其中，步骤c中冰浴温度为-9℃～-13℃。
其中，步骤d中载药阳离子氟碳液滴与β-glucan按照体积比1∶2。
其中，步骤d中β-glucan浓度为2％。
其中，步骤e中超声造影剂和巨噬细胞比例为2000∶1。
其中，步骤e中超声造影剂和巨噬细胞孵育时间为9h。
本发明上述实施例选用低沸点的全氟化碳气体C4F8制备体内安全性高，气化阈值低(仅用临床许可的超声能量产生气化)的氟碳液滴(NDs)，易于推广至非肿瘤疾病的诊断与治疗。其氟碳液滴(NDs)相较于阳离子磷脂微泡(Microbubble)而言，长期稳定性好，生物半衰期长，更加适合标记细胞。通过静电作用引入巨噬细胞表面Dectin-1(巨噬细胞表面存在的受体)的特异性配体β-glucan可提高巨噬细胞标记率与载药能力(图9，β-glucan修饰NDs前后巨噬细胞吞噬率)，为增强巨噬细胞成像效果，药物递送效率奠定基础。随后将巨噬细胞细胞超声造影剂通过尾静脉注射回输至疾病模型，利用病理状态下产生的炎症因子、趋化因子、补体等对巨噬细胞的招募，巨噬细胞细胞超声造影剂通过自身的趋化迁移功能，聚集至病变部位，通过探索筛选不同疾病模型巨噬细胞迁移时间，选择细胞回输后最佳时间使用超声仪器给予超声能量刺激使纳米液滴气化为微泡进行超声成像，同时将药物释放至靶器官，从而达到利用对巨噬细胞的超声标记和刺激，实现巨噬细胞相关疾病的诊疗一体化。另外，利用“特洛伊木马”效应可以靶向到目标区域，增加靶器官的成像效果及药物浓度，从而增加药物疗效，减少毒副作用。
以下对上述实施例的制备步骤进行具体实验分析
1.超声造影剂粒径电位考察
将实施例1步骤b，c中制备的微泡与纳米氟碳液滴稀释至合适的浓度，通过Brookhaven ZetaPALS粒度分析仪，测量其粒径以考察纳米氟碳液滴的成功制备(图5)。氟碳液滴为纳米级别，由惰性化合物全氟化碳及脂质组成，具有较好稳定性。将实施例1步骤c，d中制备的纳米氟碳液滴与超声造影剂稀释至合适的浓度，测量其电位以考察超声造影剂的成功制备(图6)。
2.超声造影剂细胞毒性考察
设阴性对照组与实施例1步骤d制备的超声造影剂组，其中超声造影剂组设不同浓度亚组(超声造影剂与巨噬细胞比例：500∶1、1000∶1、及2000∶1)，阴性对照组为DMEM培养液，阳性对照组为苯酚培养液，每组同时设6个平行组。用MTT法检测细胞活性(图7)。大剂量PEI有一定细胞毒性，而β-glucan修饰后可降低其毒性，从细胞毒性结果分析超声造影剂安全可靠。
3.超声造影剂标记巨噬细胞考察
将实施例1步骤d制备的超声造影剂用荧光染料DiI标记，与巨噬细胞孵育8h，PBS洗涤3次，收集巨噬细胞，以DiO染细胞膜，DAPI染细胞核，通过激光共聚焦验证巨噬细胞可吞噬超声造影剂(图8)，并用流式细胞术进行验证(图9)。结果表明β-glucan修饰相变纳米液滴后能够被巨噬细胞吞噬，并增加细胞标记率，为成像与药物递送奠定基础。
4.超声造影剂成像考察
将超声造影剂置于琼脂糖凝胶内，设置对照组，用临床超声仪器PHLIPS设置不同机械指数(MI)触发纳米氟碳液滴相变为气泡用以成像(图10)。大鼠脱毛后，将超声造影剂注射至大鼠皮下，考察其在大鼠体内成像效果(图11)。结果表明，制备的超声造影剂在正常体温下经安全许可范围的超声刺激可用于成像。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a、阳离子微泡的制备：将二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG2000、阳离子材料分别按照摩尔质量比0.75～0.85∶0.05～0.15∶0.05～0.2混合于有机溶剂，氮吹成膜，真空除去有机溶剂，超声水化，置换氟碳化合物全氟化碳气体C4F8，摇泡仪摇泡30s，离心洗涤，即得阳离子微泡；
步骤b、载药阳离子微泡制备：在所述a步骤中，投入疏水性药物至有机溶剂中与磷脂混合均匀，其余操作一致，即得载药阳离子微泡；
步骤c、载药阳离子氟碳液滴的制备：将上述b步骤中载药阳离子微泡置于冰盐浴中混匀，使用20mL注射器25G针头进行加压操作，观察载药阳离子微泡变化，当出现一致性变化时表明载药阳离子氟碳液滴形成，拔出针头，在溶液上方保持一定压力，存放备用；
步骤d、β-glucan修饰载药阳离子氟碳液滴的制备：将上述c步骤中载药阳离子氟碳液滴与β-glucan混合，摇床孵育30～120min，离心洗涤，收集样品，即超声造影剂；
步骤e、巨噬细胞超声造影剂的制备：将上述d步骤中所得超声造影剂与巨噬细胞按照一定比例共孵育，PBS洗涤3遍，使用细胞刮刀刮取细胞，洗涤收集得到以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂。
2.根据权利要求1所述的一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤a中所述阳离子材料为阳离子脂质材料DOTAP、DODMA、DC胆固醇、DOPE任意一种，或者硬脂酸修饰的聚醚酰亚胺(PEI)。
3.根据权利要求1所述的一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤a中所述有机溶剂为二氯甲烷或者三氯甲烷。
4.根据权利要求1所述的一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤b中所述疏水性药物投料量为1～3mg。
5.根据权利要求1所述的一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤b中所述疏水性药物为抗炎药物、免疫抑制剂、抗肿瘤药物的任意一种。
6.根据权利要求1所述的一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤c中所述冰盐浴温度为-5℃～-15℃。
7.根据权利要求1所述的一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤d中所述载药阳离子氟碳液滴与β-glucan按照体积比1∶1～1∶3。
8.根据权利要求1所述的一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤d中所述β-glucan浓度为1％-3％。
9.根据权利要求1所述的一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤e中所述超声造影剂和巨噬细胞比例为500∶1～2000∶1。
10.根据权利要求1所述的一种以巨噬细胞为载体的载药超声造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤e中所述超声造影剂和巨噬细胞孵育时间为2h～12h。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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