CN105535973A - 用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒及制备方法，步骤为：(1)制备本征态聚苯胺；(2)磷脂包裹的聚苯胺纳米粒子的合成：将本征态聚苯胺和十二烷基苯磺酸钠溶于氯仿中；搅拌，获得绿色的导电态聚苯胺溶液，将导电态聚苯胺溶液、氯仿、DPPC、DSPE-PEG2000和FA-DSPE-PEG2000加到容器中，超声分散；蒸发除去氯仿，加水，超声分散，离心；上清液为澄清透亮的绿色溶液，冷冻干燥。本发明方法简单、反应可控性强、低耗能、易规模化，原料易得；制备的纳米粒表现出好的水溶性，生物相容性，强的近红外吸收和良好的光热稳定性，可同时用于光热治疗、光声成像、红外热成像。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种用于光声成像和光热治疗的聚苯胺纳米粒及制备方法。
背景技术
光热治疗是近年来发展的一种微创肿瘤治疗技术，主要是通过将光能直接照射到肿瘤部位而使其局部温度升高来杀伤肿瘤细胞，大大降低了全身系统毒性，因此光热治疗被看作是非常有潜力替代手术的治疗肿瘤的技术之一。为了提高激光诱导的光热治疗的效率和肿瘤选择性，通常会将具有光吸收性能的光热治疗剂导入肿瘤部位。由于生物组织内水和蛋白质对近红外光的吸收较弱，所以近红外光对组织的穿透性最好，理想的光热治疗剂应该在近红外光区域(650-950nm)具有较强的吸收，低毒性，表面可以连接上功能基团实现靶向性。另外，成功的光热治疗手段需要依赖合适的成像技术来确定肿瘤的位置、大小及光热治疗剂在体内的分布及在肿瘤组织的富集情况；其次需要实时监测光热治疗过程中肿瘤及周围健康组织温度的变化；最后借助于成像技术来进行治疗效果的评价。
光声成像是近年来发展起来的一种非入侵式新型生物医学成像方法，能够有效的进行生物组织结构和功能成像，为研究生物组织的形态结构，生理特征，病理特征等提供了重要的手段，特别适合于癌症的治疗监控。由于光声成像造影剂和光热治疗剂都具有在近红外区域有强吸收的性质，因此基于单一近红外光响应的纳米材料，可实现实时光声成像且同时进行光热治疗，是一类很有前景的诊疗材料。
近年来，人们发现聚苯胺作为一种有机导电聚合物，由于其在近红外区域表现出较强的光学吸收并且具有良好的生物相容性，在药物输送和光热治疗等领域展现了良好的应用价值。而现有报道的用于光热治疗的聚苯胺纳米粒通过泊洛沙姆等表面活性剂，聚乙二醇等作为稳定剂，生物相容性较低，并且制备过程复杂，产率较低。另外，目前有关聚苯胺纳米材料作为光声成像造影剂鲜有报道。因此，开发一种更为简便的方法和采用更低成本的聚苯胺纳米材料，并合理进行修饰生物相容性配体，开发其在生物医学诊疗方面的应用具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒。
本发明的第二个目的是提供一种用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒的制备方法。
本发明的第三个目的是提供用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒在制备光声成像和光热治疗药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒在制备光声成像药物中的应用。
本发明的第五个目的是提供用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒在制备光热治疗药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)用氧化聚合法制备分子量为5000的本征态聚苯胺；
(2)磷脂包裹的聚苯胺纳米粒子的合成：按比例，将5mg步骤(1)获得的本征态聚苯胺和35-62mg十二烷基苯磺酸钠溶于5-10mL氯仿中；室温下搅拌12-24小时，获得绿色的导电态聚苯胺溶液，将5-10mL导电态聚苯胺溶液、20mL氯仿、35.2mgDPPC、4-6mgDSPE-PEG2000和1.2-1.6mgFA-DSPE-PEG2000加入到容器中，超声分散2-5分钟；在40-60℃,100-140rpm的条件下减压蒸发20-30分钟除去氯仿，并在真空状态下静置6-12小时除去残余的氯仿，加5mL水，超声分散5-10分钟，在10000rpm离心3-8分钟；上清液为澄清透亮的绿色溶液，冷冻干燥即得到用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒。
所述DPPC为二棕榈酰磷脂胆碱的缩写；
所述DSPE-PEG2000为聚乙二醇修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的缩写；
所述FA-DSPE-PEG2000为叶酸接枝的聚乙二醇修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的缩写。
上述方法制备的用于光声成像和/光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒。
上述纳米粒在制备光声成像和光热治疗药物中的应用。
上述纳米粒在制备光声成像药物中的应用。
上述纳米粒在制备光热治疗药物中的应用。
有益效果
(1)本发明制备方法简单、反应可控性强、低耗能、易规模化，所用原料易得、价格便宜；
(2)本发明的用于光声成像和光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒表现出好的水溶性，生物相容性，强的近红外吸收和良好的光热稳定性，可同时用于光热治疗、光声成像、红外热成像；
(3)本发明的用于光声成像和光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒被叶酸修饰，能够通过主动靶向富集于肿瘤部位，肿瘤局部激光照射，使局部温度升高并产生光声信号从而实现肿瘤的可视化光热治疗。
附图说明
图1(a)合成的FA-Lipid-PANINPs和ESPANI在水中(上层)和氯仿中(下层)的溶解性测试；(b)合成的FA-Lipid-PANINPs电镜图；
图2为FA-Lipid-PANINPs的粒径分布图；
图3为FA-Lipid-PANINPs溶液的紫外可见光谱图；
图4为FA-Lipid-PANINPs溶液和水光热升温曲线及各自的近红外图像；
图5为FA-Lipid-PANINPs溶液光热稳定性曲线；
图6为MTT法测试的HeLa细胞经过生理盐水(对照)和本发明制备的Lipid-PANINPs/FA-Lipid-PANINPs溶液(给予或不给于NIR光照)处理24小时后的细胞活力；
图7为FA-Lipid-PANINPs不同时间点的光声成像图；
图8为静脉注射6小时后，于肿瘤局部施加NIR光照5分钟后的近红外成像图；
图9为实施例9中不同样品处理后的治疗效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
除特别标明外，所用试剂和测试设备均为市售。
实施例1
本征态聚苯胺的制备：(采用氧化聚合法，本方法是文献中报道过的)
将0.2mol苯胺单体，0.3mol浓盐酸加入到300mL水中得到溶液a；将0.1mol过硫酸铵，0.2mol浓盐酸加入到200毫升水中得到溶液b；在搅拌下，将溶液b滴加到溶液a中，在4℃，搅拌6小时，得聚合物盐溶液，过滤；将所得的全部绿色沉淀物分散到500毫升1M的氢氧化钠水溶液中进行脱掺杂反应，过滤，将所得的全部紫色沉淀物分散到500毫升丙酮中，过滤，在真空状态下干燥20小时，得到紫色的本征态聚苯胺粉末，本征态聚苯胺简称EBPANI。凝胶色谱柱检测分子量5000。
实施例2
用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)用氧化聚合法(见实施例1)制备分子量为5000的本征态聚苯胺(本征态聚苯胺简称EBPANI)；
(2)磷脂包裹的聚苯胺纳米粒子的合成：将5mg步骤(1)获得的本征态聚苯胺和50mg十二烷基苯磺酸钠溶于8mL氯仿中；室温下搅拌18小时，获得绿色的导电态聚苯胺溶液(导电态聚苯胺简称ESPANI)，将8mL导电态聚苯胺溶液、20mL氯仿、35.2mgDPPC、5mgDSPE-PEG2000和1.4mgFA-DSPE-PEG2000加入到容器中，超声分散4分钟；在50℃,120rpm的条件下减压蒸发25分钟除去氯仿，并在真空状态下静置9小时除去残余的氯仿，加5mL水，超声分散8分钟，在10000rpm离心5分钟；上清液为澄清透亮的绿色溶液，冷冻干燥即得到用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒(磷脂-聚苯胺纳米粒简称FA-Lipid-PANINPs)。
实施例3
用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)用氧化聚合法(见实施例1)制备分子量为5000的本征态聚苯胺；
(2)磷脂包裹的聚苯胺纳米粒子的合成：将5mg步骤(1)获得的本征态聚苯胺和35mg十二烷基苯磺酸钠溶于5mL氯仿中；室温下搅拌12小时，获得绿色的导电态聚苯胺溶液(导电态聚苯胺简称ESPANI)，将5mL导电态聚苯胺溶液、20mL氯仿、35.2mgDPPC、4mgDSPE-PEG2000和1.2mgFA-DSPE-PEG2000加入到容器中，超声分散2分钟；在40℃,100rpm的条件下减压蒸发20分钟除去氯仿，并在真空状态下静置6小时除去残余的氯仿，加5mL水，超声分散5分钟，在10000rpm离心3分钟；上清液为澄清透亮的绿色溶液，冷冻干燥即得到用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒(磷脂-聚苯胺纳米粒简称FA-Lipid-PANINPs)。
实施例4
用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)用氧化聚合法(见实施例1)制备分子量为5000的本征态聚苯胺；
(2)磷脂包裹的聚苯胺纳米粒子的合成：将5mg步骤(1)获得的本征态聚苯胺和62mg十二烷基苯磺酸钠溶于10mL氯仿中；室温下搅拌24小时，获得绿色的导电态聚苯胺溶液(导电态聚苯胺简称ESPANI)，将10mL导电态聚苯胺溶液、20mL氯仿、35.2mgDPPC、6mgDSPE-PEG2000和1.6mgFA-DSPE-PEG2000加入到容器中，超声分散5分钟；在60℃,140rpm的条件下减压蒸发30分钟除去氯仿，并在真空状态下静置12小时除去残余的氯仿，加5mL水，超声分散10分钟，在10000rpm离心8分钟；上清液为澄清透亮的绿色溶液，冷冻干燥即得到用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒(磷脂-聚苯胺纳米粒简称FA-Lipid-PANINPs)。
实施例5
用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)用氧化聚合法(见实施例1)制备分子量为5000的本征态聚苯胺；
(2)磷脂包裹的聚苯胺纳米粒子的合成：按比例，将5mg步骤(1)获得的本征态聚苯胺和35mg十二烷基苯磺酸钠溶于5mL氯仿中；室温下搅拌24小时，获得绿色的导电态聚苯胺溶液，将5mL导电态聚苯胺溶液、20mL氯仿、35.2mgDPPC、6mgDSPE-PEG2000和1.4mgFA-DSPE-PEG2000加入到容器中，超声分散2分钟；在50℃,120rpm的条件下减压蒸发25分钟除去氯仿，并在真空状态下静置6小时除去残余的氯仿，加5mL水，超声分散5分钟，在10000rpm离心5分钟；上清液为澄清透亮的绿色溶液，冷冻干燥即得到用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒。
所制备的FA-Lipid-PANINPs，外观如图1a所示，表明其具有良好的水溶性，透射电镜下微观形态如图1b所示，表明其呈完整球形，大小均一。用马尔文激光粒度仪测得其粒径为120nm，见图2；FA-Lipid-PANINPs经紫外-可见分光光度计测得其吸收光谱见图3所示，FA-Lipid-PANINPs的主吸收峰位于810nm附近。
实施例6
测试磷脂-聚苯胺纳米粒溶液的光热升温曲线：
取1ml实施例5中制备的澄清透亮的绿色的磷脂-聚苯胺纳米粒溶液，放在圆形表面皿中(光程1cm，面积1cm2)，调节激光功率密度为2W·cm-2，测量808nm激光照射下溶液在0-5分钟之间的温度变化曲线。利用一台配有热电偶微探针(φ＝0.5mm)的温度监测器，将微探针浸入溶液中，微探针在溶液中的位置要避免受到激光的直接照射和接触表面皿底部或侧面，每隔0.5分钟记录一次溶液的温度。
如图4为磷脂-聚苯胺纳米粒溶液的光热升温曲线。可见磷脂-聚苯胺纳米粒溶液在光照下可以快速升温，有望用于光热治疗。
图5为磷脂-聚苯胺纳米粒溶液光热稳定性曲线，从图中可看出，磷脂-聚苯胺纳米粒溶液样品经过4次往复光照(808nm激光器照射)，每次升温的效果差异很小，说明磷脂-聚苯胺纳米粒溶液的光热稳定性好。
实施例7
测定不同浓度下的磷脂-聚苯胺纳米粒溶液对于子宫颈癌癌细胞(Hela)的毒性：
采用MTT的方法对Lipid-PANINPs/FA-Lipid-PANINPs(实施例5制备)的体外毒性进行表征。
取对数生长期细胞以8×103个/孔接种于96孔板，每组设6个复孔。将不同浓度的Lipid-PANINPs/FA-Lipid-PANINPs纳米溶液分别与Hela细胞孵育6h后，其中每组的三个复孔给以激光照射(2W/cm2，5min)，另三个复孔不做处理。继续孵育18h后，加入20μL四甲基偶氮唑盐溶液(5mg/mL)进行孵育3.5-4h后，吸出孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪在490nm处测量各孔的吸光值。
实验证明(图6)，于808nm近红外光下照射5min，本发明用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒溶液可直接影响Hela细胞的增殖，光照组比不光照组细胞增殖抑制率约增加50％左右。另外，相比于无靶向的Lipid-PANINPs，本发明的主动靶向的FA-Lipid-PANINPs具有很好的抑制肿瘤细胞的功效。
本实施例中出现的Lipid-PANINPs为制备中DSPE-PEG2000的量为7.4mg而未加入FA-DSPE-PEG2000，其余制备方法同实施例5。
实施例8
磷脂-聚苯胺纳米粒子的体内肿瘤部位的光声成像及其对于肿瘤细胞的热疗作用：
200μL实施例5中所制备的澄清透明的绿色磷脂-聚苯胺纳米粒溶液通过尾静脉注射到接种有人子宫颈肿瘤的裸鼠(类型为BALB/C，体重20g)体内，并在注射后0h，2h，6h，24h后对其进行光声成像的扫描，以此可以观察各个时间点小鼠各部位及其肿瘤部位成像的变化和光声强度值的大小(图7)。结果发现当注射6小时后，FA-Lipid-PANINPs在肿瘤部位大量富集，因此此时于肿瘤局部施加NIR照射，用近红外成像仪观察5内肿瘤局部的升温情况。结果显示，在同样聚苯胺的浓度下，FA-Lipid-PANINPs比对照材料Lipid-PANINPs具有更好的升温效果(图8)。以上结果表明FA-Lipid-PANINPs能够有效用于光声成像和光热治疗肿瘤。
实施例9
负荷肿瘤的裸鼠(类型为BALB/C，体重20g)被分为三组(每组4只)，然后分别经过不同方式处理：
(a)静脉注射生理盐水(PBS)但不经过激光照射；
(b)静脉注射Lipid-PANINPs溶液；注射6小时后激光照射10分钟；
(c)静脉注射实施例5制备的澄清透亮的绿色的磷脂-聚苯胺纳米粒溶液；注射6小时后激光照射10分钟。
随后观察并记录各组老鼠的肿瘤治愈情况。从图9可以看出，10天后，a组裸鼠的肿瘤体积增加，而b，c组裸鼠的肿瘤体积经过照射后都有减小趋势。c组裸鼠的治疗效果最好，肿瘤体积最小并有结痂出现。因此表明，实施例5制备的FA-Lipid-PANINPs对肿瘤的光热治疗效果良好，能有效抑制肿瘤的生长。
实验证明，用实施例2、3、4制备的FA-Lipid-PANINPs分别替代实施例5制备的FA-Lipid-PANINPs所进行的实施例6、7、8、9的实验，其效果与实施例5相似。
Claims (5)
1.用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)用氧化聚合法制备分子量为5000的本征态聚苯胺；
(2)磷脂包裹的聚苯胺纳米粒子的合成：按比例，将5mg步骤(1)获得的本征态聚苯胺和35-62mg十二烷基苯磺酸钠溶于5-10mL氯仿中；室温下搅拌12-24小时，获得绿色的导电态聚苯胺溶液，将5-10mL导电态聚苯胺溶液、20mL氯仿、35.2mgDPPC、4-6mgDSPE-PEG2000和1.2-1.6mgFA-DSPE-PEG2000加入到容器中，超声分散2-5分钟；在40-60℃,100-140rpm的条件下减压蒸发20-30分钟除去氯仿，并在真空状态下静置6-12小时除去残余的氯仿，加5mL水，超声分散5-10分钟，在10000rpm离心3-8分钟；上清液为澄清透亮的绿色溶液，冷冻干燥即得到用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒。
所述DPPC为二棕榈酰磷脂胆碱的缩写；
所述DSPE-PEG2000为聚乙二醇修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的缩写；
所述FA-DSPE-PEG2000为叶酸接枝的聚乙二醇修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的缩写。
2.权利要求1的方法制备的用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒。
3.权利要求2所述的纳米粒在制备光声成像和光热治疗药物中的应用。
4.权利要求2所述的纳米粒在制备光声成像药物中的应用。
5.权利要求2所述的纳米粒在制备光热治疗药物中的应用。
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