CN110954514B - 适用于研究脂质体体内外分布的荧光示踪系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于研究脂质体体内外分布的荧光示踪系统和方法，本方法基于生物正交反应原理，结合荧光示踪技术。所述系统主要包括反式环辛烯脂质体和四嗪荧光探针。采用本方法可以对载药脂质体的体内外分布进行研究，为脂质体的体内分布研究提供了一种方便可行的方法。

Description

适用于研究脂质体体内外分布的荧光示踪系统和方法

技术领域

本发明涉及一种药物体内研究领域，特别是涉及一种适用于研究脂质体体内外分布的荧光示踪系统和方法。

背景技术

脂质体(Liposome)是一种人工制成的球型磷脂双分子层囊泡，其内腔能包载药物。因为脂质体具有和生物膜相似的成分和结构，所以具有良好的生物相容性，与此同时具有生物可降解性、无明显毒性、免疫原性小等优势。由于在药物释放前，脂质体囊泡和药物的体内分布呈一定相关性，所以可以用研究脂质体囊泡分布的方法研究脂质体药物的体内分布。目前，脂质体的体内分布研究一般借助检测组织内药物含量的方法，该方法存在如下缺点：需要处死动物取样、不能进行动态分析、不能对单个动物多个时间点分析。因此需要寻找一种合适的方案直接分析脂质体体内分布。

目前可以利用分子影像学方法检测脂质体的体内分布，分子成像能够反映标记物的时间、空间分布，可以更进一步了解标记物在活体动物体内的相关生物学过程。该方法能对同一个研究个体进行长时间反复跟踪成像，可以提高数据的可比性，避免个体差异对试验结果的可影响。其中常用的光学成像方法，是利用荧光标记对脂质体进行体内示踪。常用的荧光标记方法包括在脂质体包载的药物上进行荧光标记、在脂质体囊泡上进行荧光标记等。以上方法具有简单、易得的优点，但同时也具有一些缺点：由于体内化学环境的复杂性，在体内循环较久后荧光染料会出现降解、淬灭等问题，从而影响脂质体在体内长时间的荧光示踪。

生物正交反应指可以在活体细胞或组织中发生，并且不会影响生物自身生化反应的化学反应，目前已经有多种生物正交反应用来标记生物分子。生物正交反应通常有两个模块，被称为生物正交反应对。传统的生物正交反应对有叠氮和末端炔基的环加成反应，但由于其使用金属铜催化，可能有一定的细胞毒性。反式环辛烯与四嗪之间的生物正交反应无需催化、反应效率高，是用于影响诊断和制剂示踪的理想生物正交反应对。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种适用于研究脂质体体内外分布的荧光示踪系统和方法，用于解决现有技术中脂质体体内外分布研究困难的问题。

技术原理：其中预靶向的反式环辛烯脂质体是由反式环辛烯脂质制备的胶束和预先制备的粒径大小合适、粒径分布均匀的脂质体共孵育得到的；四嗪荧光探针由四嗪活性酯和具有标记位点的近红外荧光染料合成。使用时先向动物体内注射反式环辛烯脂质体，等到需要观测脂质体体内分布的时间点，再向动物体内注射四嗪荧光探针。反式环辛烯脂质体和四嗪荧光探针能通过生物正交反应在体内特异性结合，从而达到特定时间点脂质体在体内荧光示踪的效果。在本技术中，近红外荧光基团没有直接连在脂质体上，而是利用生物正交反应对将脂质体与近红外荧光基团分隔开。从而一方面解决了常规荧光脂质体在体内长循环后荧光基团降解、淬灭、脱落的问题；另一方面可以在脂质体注入体内后任意时间注射荧光探针，从而达到在任意时间检测脂质体体内分布的目的。利用此种方法检测脂质体的体内分布，能够避免多次取组织带来的不便，也能够长时间、多次检测脂质体在同一动物体内的分布。该示踪技术的给药途径均为静脉注射，能用于药物研发、脂质体药物体内分布研究等过程。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种反式环辛烯脂质体制剂，所述制剂内含有脂质体颗粒，所述脂质体颗粒表面结合有反式环辛烯活性酯，所述反式环辛烯活性酯游离端含有反式环辛烯。

所述脂质体颗粒粒径分布为100至150nm。

所述反式环辛烯活性酯，一端(游离端)为可以与四嗪发生生物正交反应的反式环辛烯，另一端(结合端)为可以与氨基、巯基等活性基团反应的活性酯基团，包括但不限于NHS、SCM。

进一步地，所述脂质体颗粒的双层膜结构可以采用现有技术中常规物质制备。

所述脂质体颗粒可以为空白脂质体。当需要研究具体药物时，所述双层磷脂膜结构内可以载有需要被研究的药物。

本发明的另一方面提供了上述反式环辛烯脂质体制剂的制备方法，选自：

a)将反式环辛烯活性酯与双层膜原料混合，再利用现有技术制备反式环辛烯脂质体制剂；或

b)先利用现有技术制备空白脂质体，再将反式环辛烯活性酯插入空白脂质体。

进一步地，所述现有技术可以为薄膜分散法、乙醇注入法、或逆向蒸发法等。

进一步地，所述方法b)的具体步骤为：

(1)提供空白脂质体制剂；

(2)提供反式环辛烯脂质胶束；

(3)向空白脂质体制剂中加入适量的反式环辛烯脂质胶束，振摇、孵育；除去未插入的反式环辛烯脂质。

进一步地，所述步骤(1)中空白脂质体制剂的制备方法可以采用现有技术。例如可以采用以下方法：配制浓度合适的脂质储备液，取适当比例的脂质储备液，混合均匀，加入内水相溶液；采用薄膜分散法、乙醇注入法等常规方法，制备粒径大小合适、粒径分布均一的空白脂质体。

优选地，脂质储备液的溶剂可以是无水乙醇、氯仿、二氯甲烷等；更优选为无水乙醇。

进一步地，所述步骤(2)中反式环辛烯活性酯与脂质的摩尔比小于等于3％。

进一步地，所述步骤(2)中式环辛烯脂质胶束的制备方法包括：

1)将反式环辛烯活性酯和氨基脂质配制成浓度合适的储备液；

2)按比例将反式环辛烯活性酯溶液和氨基脂质溶液混合、孵育，

3)除去未反应的反式环辛烯活性酯和氨基脂质；

4)将反式环辛烯脂质用有机溶剂溶解，除去溶剂，在瓶底形成薄膜，加入适当量的缓冲液，振摇、超声，即可得到反式环辛烯脂质胶束。

进一步地，所述步骤2)中包括使用催化剂，所述催化剂包括但不限于三乙胺。

进一步地，所述步骤2)中孵育时间为4至12h，温度为25至40℃。

进一步地，反式环辛烯活性酯的溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基亚胺等；氨基脂质的溶剂为无水乙醇、二氯甲烷、氯仿等；形成胶束时加入的缓冲液可以为生理盐水、PBS、HEPES等缓冲液。

进一步地，所述步骤(3)中孵育时间为12至24h，温度为25至40℃。

本发明的另一方面提供了一种四嗪荧光探针，所述四嗪荧光探针为结合有近红外荧光染料的四嗪活性酯。

进一步地，所述荧光染料为能用于荧光分光光度计分析、流式细胞分析，荧光显微镜成像﹑激光共聚焦显微镜成像或动物活体成像，并具有可与四嗪活性酯结合的活性基团。

本发明的另一方面提供了上述四嗪荧光探针的制备方法，包括：将四嗪活性酯溶液和带有可标记位点的近红外荧光染料混合、孵育；除去未反应的四嗪活性酯和近红外荧光染料即可。

进一步地，所述四嗪活性酯溶液与带有可标记位点的近红外荧光染料的摩尔比：1:3-10。

进一步地，所述孵育时间为4至12h，温度为25至40℃。

进一步地，所述制备方法包括利用催化剂，例如可以采用三乙胺等催化剂。

进一步地，所述方法包括采用高效液相色谱法分离未反应的四嗪活性酯和近红外荧光染料。

本发明的另一方面提供了上述反式环辛烯脂质体制剂和/或上述四嗪荧光探针在制备用于研究脂质体体内外分布的荧光示踪产品中的用途。

本发明的另一方面提供了一种适用于研究脂质体体内外分布的荧光示踪系统，所述系统包含上述反式环辛烯脂质体制剂和上述四嗪荧光探针。

本发明的另一方面提供了上述反式环辛烯脂质体制剂、四嗪荧光探针以及荧光示踪系统用于研究脂质体体内外分布的用途。

进一步地，所述脂质体体外分布可以包括脂质体细胞结合示踪。

本发明的另一方面提供了一种脂质体体内示踪方法，包括以下步骤：

(1)向动物体内通过静脉注射反式环辛烯脂质体制剂；

(2)待反式环辛烯脂质体制剂在动物体内分布适当时间后，向动物静脉注射四嗪荧光探针；

(3)待分布适当时间后，对动物进行荧光活体成像。

进一步地，所述动物可以是用于药物研究的常用动物，例如兔子、小鼠等。

本发明的另一方面提供了一种对脂质体进行细胞结合示踪的方法，包括以下步骤：

(1)将反式环辛烯脂质体制剂与细胞，孵育；

(2)除去上清液，加入四嗪荧光探针，孵育；

(3)将细胞加入流式细胞仪，或者将细胞装片，在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

进一步地，所述步骤(1)中细胞可使用贴壁细胞或悬浮细胞；反式环辛烯脂质体上可修饰用于靶向细胞的靶向基团。

进一步地，所述步骤(1)中孵育时间为1h，温度为37℃，培养箱维持5％的CO₂浓度。

进一步地，所述步骤(2)中四嗪荧光探针可用无血清培养基、PBS缓冲液等稀释后加入到含有细胞的培养皿中。

进一步地，所述步骤(2)中孵育时间为0.5h，温度为37℃，培养箱维持5％的CO₂浓度。

进一步地，所述步骤(3)中，装片时可以根据细胞的性质制成涂片或爬片；也可在制片时加入适量的抗荧光淬灭剂。

如上所述，本发明的适用于研究脂质体体内分布的荧光示踪系统和方法，具有以下有益效果：

1.制剂制备所需要的设备简单，易于操作，可重复性高。反式环辛烯脂质能够与脂质体的脂质成分混合，或制成胶束通过温和条件下孵育插入到空白脂质体中。四嗪荧光探针能通过一步反应制备，纯化方法简单。

2.制剂所需材料易得，安全无毒。脂质、反式环辛烯、四嗪活性酯、近红外荧光染料均易得到，价格低廉。脂质和近红外荧光染料在体内易分解和代谢，所有成分都无毒。

3.反式环辛烯脂质体粒径分布在100nm左右，表面几乎呈电中性，稳定性强，易于保存。该脂质体在动物体内可通过EPR效应聚集在肿瘤内，与四嗪荧光探针可以通过生物正交反应结合。

4.反式环辛烯脂质体可以根据需要进行载药，实现脂质体示踪与治疗同时进行的功能。

5.四嗪荧光探针在体内只与反式环辛烯脂质体通过生物正交反应结合，特异性强，反应速率快，且不会与体内其他成分结合，无毒无害，易于排出。

6.利用本发明研究制剂的体内分布，可根据需要在特定时间打入荧光探针，进行检测，无需考虑荧光淬灭问题。另外，可以研究同一动物体内多个时间点的制剂分布，而不需要杀死动物取出脏器，避免了组内差异。

总之，本发明具有材料安全易得、制备操作简单、可重复性强的特点；脂质体粒径大小和均一性可控，插入反式环辛烯脂质后依然稳定、可长期保存，同时能根据需要进行载药、功能化修饰等。四嗪荧光探针与反式环辛烯脂质体在体内的结合特异性强、反应效率高。本发明为脂质体的体内分布研究提供了一种方便可行的方法。

附图说明

图1a为本发明反式环辛烯脂质的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)图

图1b为氨基脂质的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)图

图2a为反式环辛烯脂质的核磁共振氢谱(1H NMR)图

图2b为氨基脂质的核磁共振氢谱(1H NMR)图

图3a空白脂质体的粒径分布图

图3b空白脂质体的zeta电势分布图

图4为反式环辛烯脂质体生物透射电镜(B-TEM)形貌观测图

图5a为反式环辛烯脂质体(反式环辛烯插入比例为1％)的粒径变化图

图5b为反式环辛烯脂质体(反式环辛烯插入比例为3％)的粒径变化图

图5c为反式环辛烯脂质体(反式环辛烯插入比例为5％)的粒径变化图

图5d为载药反式环辛烯脂质体的粒径变化图

图6为四嗪荧光探针-反式环辛烯脂质体-细胞特异性结合的验证分析图

图7a为反式环辛烯脂质体和四嗪近红外荧光探针在体内结合研究24h时各组图像

图7b为反式环辛烯脂质体和四嗪近红外荧光探针在体内结合研究48h时各组图像

图8为反式环辛烯脂质体和四嗪近红外荧光探针在体内结合研究48h时各组肿瘤荧光图像

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1反式环辛烯标记的脂质体的制备和表征

(1)将反式环辛烯活性酯(TCO-NHS)和氨基脂质(本实例中以DSPE-PEG2000-NH₂为例)分别溶于有机溶剂(如二氯甲烷、氯仿、无水乙醇等)中，使其溶液的最终浓度为10mg/mL；将反式环辛烯活性酯溶液加入到氨基脂质溶液中，使得反式环辛烯活性酯的摩尔数为氨基脂质的2～5倍，加入体积比0.3％～0.5％的三乙胺，在室温条件下温和振摇，反应8h，用乙酸乙酯和乙醚混合溶液洗涤的方法除去未反应的反式环辛烯活性酯，从而获得反式环辛烯脂质(DSPE-PEG2000-TCO)。除去反式环辛烯脂质溶液中的有机溶剂，加入适量去离子水，使其浓度高于脂质CMC，能成为胶束。使用孔径小于脂质胶束的透析袋，透析除去未反应的反式环辛烯活性酯。

(2)将DSPE-PEG2000、HSPC、胆固醇溶于无水乙醇，加入内水相(如PBS、HEPES、硫酸铵溶液等)溶液水合后使用乙醇注入法制备脂质体。加入摩尔比0.5％～3％的DSPE-PEG2000-TCO胶束，轻轻吹打使胶束和脂质体混合均匀，置于恒温混匀仪上温和振摇24h。随后用100kD的透析袋透析除去未插入脂质体中的DSPE-PEG2000-TCO胶束。

如有载药，载药脂质体的包封率使用超滤法，通过酶标仪检测紫外吸收(UV)变化测定；如有靶向修饰，则通过激光共聚焦显微镜检测荧光探针-脂质体-细胞的结合情况。

如图1a和1b所示，为反式环辛烯脂质体(DSPE-PEG2000-TCO)通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)图谱，可见合成反式环辛烯脂质的分子量比反应物氨基脂质大约一个反式环辛烯的量。可见反式环辛烯脂质的质谱图与氨基脂质相比，整体向高值偏移300左右。

如图2a和2b所示，为反式环辛烯脂质体(DSPE-PEG2000-TCO)和氨基脂质核磁共振氢谱(1H NMR)中，反式环辛烯脂质在5.5ppm处有内烯特征峰，为反式环辛烯的标志。

如图3a和3b所示，为空白脂质体经过动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位图；空白脂质体的粒径为101.1nm，粒径多分散系数(PDI)为0.005。

如图4所示，为反式环辛烯脂质体利用生物透射电子显微镜(B-TEM)进行形貌观测电镜图。

实施例2反式环辛烯脂质体制剂稳定性研究

将实施例1中制备好的反式环辛烯脂质体(反式环辛烯占脂质的摩尔比例为1％、3％、5％)重新分散于去离子水、PBS、HEPES、1640培养基和生理盐水中。在不同时间点使用动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径的多分散系数(PDI)以及zeta电位，考察其稳定性。

载药的反式环辛烯脂质体(反式环辛烯摩尔比例为1％、3％、5％)通过透析后用酶标仪检测紫外吸收(UV)来分析不同时间点药物的泄露情况，使用阿霉素作为模式药物。

如图5a-5d所示，反式环辛烯脂质体(1％)的粒径在去离子水、PBS、HEPES、1640培养基和生理盐水中均没有明显变化，且其电位、形态、PDI没有明显变化；反式环辛烯脂质体(3％)的粒径、PDI在各溶液中稍有变大；而反式环辛烯脂质体(5％)的粒径变化非常大，在测量时间120h时，已能看到肉眼可见的沉淀，无法继续测量粒径和PDI。

如图5d所示，载药的反式环辛烯脂质体(1％)在测试时间内没有明显的药物泄露问题；插入反式环辛烯脂质比例为3％的脂质体药物稍有泄露；插入反式环辛烯脂质比例为5％的脂质体，药物泄露较多。由此可见插入的反式环辛烯脂质比例在3％以下为益。

实施例3四嗪荧光探针的合成

将四嗪活性酯(Tetrazine-PEG5-NHS Ester)和近红外荧光染料(本实例中使用Cy5.5)分别溶于有机溶剂中，将二者混合，使四嗪活性酯的摩尔数为近红外荧光染料的3～5倍，加入体积比为0.3％～0.5％的三乙胺，于室温下避光温和振摇反应12h，反应结束后用乙醚和乙酸乙酯混合洗涤的方法分离得到蓝色固体，冷冻干燥后得到深蓝色粉末，即为四嗪近红外荧光探针(Tz-Cy5.5)。待使用时可用PBS、生理盐水、无血清培养基等缓冲液重新溶解。

实施例4四嗪荧光探针对反式环辛烯脂质体的细胞结合示踪

(1)制备RGD靶向肽修饰的反式环辛烯脂质体：将DSPE-PEG2000-NH2和RGD三肽溶解在缓冲液中，将二者混合，使RGD靶向肽的摩尔数为DSPE-PEG-NH2的3～5倍。缓慢搅拌8h，反应结束后加适量0.1M甘氨酸溶液终止反应。用截留分子量为1kD的透析袋透析过夜，冷冻干燥即得到DSPE-PEG2000-RGD。待使用时用缓冲液重新溶解DSPE-PEG2000-RGD，使其浓度超过CMC，便得到RGD靶向肽修饰脂质(DSPE-PEG2000-RGD)胶束。向反式环辛烯脂质体溶液中加入摩尔比1％的RGD靶向肽修饰脂质(DSPE-PEG2000-RGD)胶束，轻微涡旋混合均匀后，置于恒温混匀仪上振摇24h。随后用截留分子量为100kD的透析袋透析除去未插入的RGD靶向肽修饰脂质(DSPE-PEG2000-RGD)。

(2)制备RGD靶向肽修饰的空白脂质体：将上述RGD靶向肽修饰脂质(DSPE-PEG2000-RGD)胶束按摩尔比1％的比例加入到空白脂质体中，轻微涡旋混合均匀后，置于恒温混匀仪上振摇24h。随后用100kD透析袋透析除去未插入的RGD靶向肽修饰脂质(DSPE-PEG2000-RGD)，即得到RGD靶向肽修饰脂质体(RGD-liposome)。

(3)四嗪荧光探针和RGD靶向肽修饰的反式环辛烯脂质体的预反应：将RGD靶向肽修饰的反式环辛烯脂质体(RGD/TCO-liposome)与四嗪近红外荧光探针(Tz-Cy5.5)按摩尔比10:1混合，在恒温混匀仪上保持37℃避光振摇4h，用截留分子量为100kD的超滤管超滤除去未反应的四嗪近红外荧光探针(Tz-Cy5.5)，得到四嗪荧光探针-RGD靶向肽修饰的反式环辛烯脂质体(即Cy5.5/RGD-liposome)。

细胞：

(1)培育人类非小细胞型肺癌细胞(A549)至生长状态稳定，待细胞融合度达80％时用胰酶消化，用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基重悬成细胞悬液，以10^5个细胞/玻片的数量向激光共聚焦显微镜专用玻片上滴加细胞悬液，在37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中培养。

(2)培养至融合度时80％时，弃去培养基，用PBS冲洗细胞。向竞争抑制组加入无血清培养基配制的RGD靶向肽溶液，阳性对照组(加入前述Cy5.5/RGD-liposome)、实验组(加入TCO/RGD-liposome后再加入Tz-Cy5.5)、RGD组(加入RGD-liposome)、TCO组(加入TCO-liposome)加入等量的无血清培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育30min后弃去上层液体。用PBS冲洗后，按每孔10ng的量向竞争抑制组和阳性对照组加入Cy5.5/RGD-liposome，向实验组加入等量的TCO/RGD-liposome，向RGD组和TCO组分别加入等量的RGD-liposome和TCO-liposome，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育1h后弃去上层液体。

(3)将四嗪荧光探针(Tz-Cy5.5)用无血清培养基溶解，向TCO组和RGD组加入摩尔比5：1的Tz-Cy5.5，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育1h后，弃去上层液体，用PBS冲洗3遍后取出玻片。加入免疫染色固定液将细胞固定，用DAPI(358nm/461nm)染核后制成装片，在激光共聚焦显微镜下观察Cy5.5荧光(678nm/701nm)。

结果如图6所示，为四嗪荧光探针-反式环辛烯脂质体-细胞特异性结合的验证分析，图像表明四嗪荧光探针可以对反式环辛烯脂质体进行细胞结合示踪。根据图片可以看出，阳性对照组(Cy5.5/RGD-liposome+Tz-Cy5.5)和实验组(RGD/TCO-liposome+Tz-Cy5.5)的A549细胞表面有明显的红色荧光信号，说明四嗪近红外荧光探针可以与反式环辛烯标记的脂质体在体外结合；竞争抑制组(RGD+RGD/TCO-liposome+Tz-Cy5.5)和TCO组(TCO-liposome+Tz-Cy5.5)视野内红色荧光信号很弱，说明制剂是通过RGD与整合素特异性识别而结合到A549细胞上的；RGD组(RGD-liposome+Tz-Cy5.5)红色荧光信号很弱，几乎无荧光，说明四嗪荧光探针是通过TCO和Tz之间的生物正交反应与脂质体结合的。

实施例5四嗪荧光探针对反式环辛烯脂质体的体内分布示踪

(1)培育人类非小细胞型肺癌(A549)细胞至状态稳定，用胰酶消化细胞后，离心除去上层液体，用生理盐水重悬成细胞悬液。用酒精棉球擦拭裸鼠腋下皮肤，按每只裸鼠种10^7个A549细胞的剂量，向无胸腺裸鼠腋下部位皮下注射细胞悬液。随后每天观察裸鼠饮食、精神、活动情况，观察肿瘤种植部位有无感染。

(2)待肿瘤接种部位出现明显结节后，用游标卡尺测量肿瘤大小，测量部位为肿瘤最长径和垂直方向最大横径。挑选肿瘤体积适中的裸鼠进行体内结合研究。

制剂：

(1)制备近红外荧光标记的脂质体(Cy5.5-liposome)：向前述反式环辛烯脂质体中按摩尔比1:3加入四嗪荧光探针，涡旋振摇10s后，在恒温混匀仪上保持37℃避光振摇4h。随后用截留分子量为100kD的透析袋透析除去未反应的四嗪近红外荧光探针，避光保存备用。

(2)将四嗪近红外荧光探针用生理盐水稀释至0.1mg/mL，避光保存备用。

动物：

(1)取15只荷瘤小鼠，随机分为每3只一组。0时刻时向TCO脂质体组、近红外荧光标记的脂质体组以及空白脂质体组分别尾静脉注射TCO脂质体、近红外荧光标记脂质体以及空白脂质体，注射剂量为脂质量10mg/kg。

(2)12h后，向TCO脂质体组和空白脂质体组注射上述四嗪荧光探针生理盐水溶液。向原位注射组的荷瘤裸鼠种瘤部位注射TCO脂质体，注射剂量为静脉注射TCO脂质体组的5％，随即注射上述生理盐水稀释的四嗪荧光探针。向近红外荧光探针组尾静脉注射等量的四嗪荧光探针。

(3)自实验开始24h后，拍摄各组裸鼠的荧光活体成像图像；自实验开始起48h后，再次拍摄各裸鼠荧光活体成像图像。处死荷瘤裸鼠，取出各脏器(肿瘤、肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肌肉)拍摄荧光成像图像。

结果如图7a和7b以及图8，根据图片可看出在24h、48h图像中尾静脉注射TCO脂质体、原位注射TCO脂质体和尾静脉注射荧光脂质体组肿瘤部位均有明显荧光。空白脂质体、四嗪荧光探针组肿瘤部位没有明显荧光。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种适用于研究脂质体体内外分布的荧光示踪系统，其特征在于：所述系统包含反式环辛烯脂质体制剂和四嗪荧光探针；所述反式环辛烯脂质体制剂内含有脂质体颗粒，所述脂质体颗粒表面结合有反式环辛烯活性酯，所述反式环辛烯活性酯游离端含有反式环辛烯；所述四嗪荧光探针为结合有近红外荧光染料的四嗪活性酯；所述反式环辛烯脂质体制剂的制备方法具体步骤为：（1）提供空白脂质体制剂；（2）提供反式环辛烯脂质胶束；（3）向空白脂质体制剂中加入适量的反式环辛烯脂质胶束，振摇、孵育；除去未插入的反式环辛烯脂质。

2.根据权利要求1所述的荧光示踪系统，其特征在于：所述脂质体颗粒为空白脂质体或者载有药物的脂质体。

3.根据权利要求1所述的荧光示踪系统，其特征在于，所述步骤（2）中反式环辛烯脂质胶束的制备方法包括：

1）将反式环辛烯活性酯和氨基脂质配制成浓度合适的储备液；

2）按比例将反式环辛烯活性酯溶液和氨基脂质溶液混合、孵育，

3）除去未反应的反式环辛烯活性酯和氨基脂质；

4）将反式环辛烯脂质用有机溶剂溶解，除去溶剂，在瓶底形成薄膜，加入适当量的缓冲液，振摇、超声，即可得到反式环辛烯脂质胶束。

4.如权利要求1所述的荧光示踪系统，其特征在于，所述近红外荧光染料为能用于荧光分光光度计分析、流式细胞分析、荧光显微镜成像﹑激光共聚焦显微镜成像或小动物活体成像，并具有可与四嗪活性酯结合的活性基团。

5.如权利要求4所述的荧光示踪系统，其特征在于，所述四嗪荧光探针的制备方法包括：将四嗪活性酯溶液和带有可标记位点的近红外荧光染料混合、孵育；除去未反应的四嗪活性酯和近红外荧光染料即可。

6.如权利要求1~5任一项所述的荧光示踪系统用于研究脂质体体内外分布的用途。

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