CN114732796B - 一种双靶向载药微泡及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种双靶向载药微泡及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明提供的双靶向载药微泡，包括壳层和内核，所述壳层为双靶向配体修饰的脂质单分子层，所述的双靶向配体修饰的脂质单分子层载有化疗药物紫杉醇。所述内核的组分为惰性气体。本发明提供的双靶向载药微泡能够靶向肿瘤部位，提高化疗药物紫杉醇在肿瘤部位的积聚量以改善化疗疗效。

Description

一种双靶向载药微泡及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种双靶向载药微泡及其制备方法和应用。
背景技术
目前化疗仍是治疗胰腺癌的主要方式，但因为化疗药物紫杉醇无法靶向递送到肿瘤部位所以仍存在化疗的疗效差以及全身副作用大的问题。然而，基于纳米技术发展出的化疗药物紫杉醇递送系统(Nat Rev Clin Oncol 2016,13(12),750-765)被发现可用于增加化疗药物紫杉醇的靶向递送，因此其可作为增加化疗药物紫杉醇靶向递送已改善化疗疗效的新策略。
在临床前研究或者临床研究中，微泡作为一种微米级的化疗药物紫杉醇递送系统，可联合现有技术—超声靶向爆破技术(Theranostics 2020,10(2),462-483,SciTransl Med 2016,8(343),343-343re2)产生空化效应,用于增加肿瘤血管以及肿瘤细胞的通透性从而促进化疗药物紫杉醇的靶向递送。然而该手段仍受限于胰腺癌血供差的特点，从而导致该手段增加胰腺癌化疗药物紫杉醇靶向递送的程度仍有限，通过在微泡表面修饰上主动靶向配体来进一步增加微泡的靶向递送效率是一种更有效的靶向递送策略。现有技术(Theranostics 2020,10(24),10973-10992)公开了通过在微泡表面修饰上靶向血管内皮生长因子抗体来增加化疗药物紫杉醇的靶向递送。现有技术(Oncology reports,35(2),801–808)公开了通过在微泡表面修饰上靶向肿瘤细胞的利妥昔单克隆抗体来增加化疗药物紫杉醇的靶向递送。但上述手段未解决胰腺癌微环境中大量增生的基质会阻碍化疗药物紫杉醇进入肿瘤细胞的问题。
修饰上cRGD和cCLT1多肽的双靶载药微泡通过联合超声靶向爆破技术，首先微泡联合超声靶向爆破技术产生的空化效应可增加胰腺癌血管的通透性从而先突破第一道肿瘤的生理屏障，使化疗药物紫杉醇从血管内递送到肿瘤组织间隙，接着cCLT1多肽靶向胰腺癌基质中存在的大量的纤连蛋白从而带着化疗药物紫杉醇突破第二道肿瘤的生理屏障，使化疗药物紫杉醇从肿瘤基质中达到肿瘤细胞，最后在cRGD多肽靶向肿瘤细胞促进细胞摄取化疗药物紫杉醇的作用下突破第三道肿瘤的生理屏障，使化疗药物紫杉醇更多的进入肿瘤细胞从而增加化疗的疗效。综上所述，开发的双靶向载药微泡可联合超声定向爆破技术通过按序靶向肿瘤的血管、基质以及肿瘤细胞并突破阻碍化疗药物紫杉醇递送到胰腺癌中的三重屏障达到增加肿瘤的靶向递送效率和改善化疗疗效的目的，这将是一种不错的策略。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双靶向载药微泡及其制备方法和应用。本发明提供的双靶向载药微泡具有靶向递送的特性，可增加化疗药物紫杉醇在肿瘤部位的积聚，从而可以提高化疗疗效。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种可以增加化疗药物紫杉醇靶向递送而提高肿瘤化疗疗效的双靶向载药微泡，其中：双靶向载药微泡包括壳层和内核，所述壳层为双靶向配体修饰的脂质单分子层，所述脂质单分子层由二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状RGD肽和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状CLT1肽以摩尔比85:5:5:5自组装而成；所述内核的组分为惰性气体。
一种双靶向载药微泡，所述的双靶向载药微泡的平均粒径为1.59微米。
一种能够靶向递送化疗药物紫杉醇，增加肿瘤部位的化疗药物紫杉醇积聚量从而提高化疗疗效的双靶向载药微泡的制备方法，包括如下步骤：
(1)将二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状RGD肽、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状CLT1肽和紫杉醇分别溶解在氯仿溶液中，得到混合液A；
(2)将混合液A进行旋干后，在真空干燥箱中烘干过夜，得到薄膜B；
(3)将薄膜B溶解在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，加热到50℃，水化1小时，形成透明液C；
(4)将透明液C水浴超声5分钟，再进行1分钟的探头超声，将其均质化；
(5)探头超声完后，分别将丙二醇、丙三醇加入上述溶液中，形成混合液D；所述丙二醇、丙三醇和溶液的体积比为1:1:8；
(6)将混合液D转移到容积为3ml的西林瓶中，并向其充入六氟化硫气体，最后机械振荡40-50秒，以800转/分钟转速离心5分钟，水洗3次去除多余的化疗药物紫杉醇，获得双靶向载药微泡。
其中，在双靶向载药微泡的合成过程中，所述脂质单分子层中的二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状RGD肽和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状CLT1肽的摩尔比为85:5:5:5；所述脂质单分子层总质量与紫杉醇的质量比为5:1。
本发明还提供了上述技术方案所述的双靶向载药微泡或上述技术方案所述的制备方法得到的双靶向载药微泡用于改善肿瘤化疗疗效的用途。
在本发明中，将二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状RGD肽、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状CLT1肽以及紫杉醇通过薄膜水化法合成出双靶向载药微泡。同时，双靶向微泡可以增加化疗药物紫杉醇的靶向递送并联合超声可控的释放出化疗药物紫杉醇，进一步增加了肿瘤部位化疗药物紫杉醇积聚量以及改善化疗疗效。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过将双靶向微泡作为化疗药物紫杉醇的载体，可以实现其亲水性的改造使其更容易进入血液循环系统同时延长其在体内的循环时间。
2、本发明提供的双靶向载药微泡，在微泡表面修饰的两种多肽的作用下，可以特异性将化疗药物紫杉醇靶向递送到肿瘤部位，提高肿瘤局部的化疗药物紫杉醇浓度。
3、本发明提供的双靶向载药微泡可在超声的作用下快速释放出化疗药物紫杉醇，实现定向可控释放化疗药物紫杉醇，并且通过微泡联合超声产生的空化效应增加邻近组织的通透性，从而进一步提高肿瘤局部的化疗药物紫杉醇的浓度。
4、本发明提供的提供了双靶向化疗药物紫杉醇的合成方法，合成的双靶向载药微泡在双靶向多肽的作用下可靶向递送到肿瘤内部，并在超声作用下可控的释放出化疗药物紫杉醇提高邻近组织的通透性从而增加化疗药物紫杉醇在肿瘤部位的浓度，为改善化疗药物紫杉醇治疗肿瘤疗效提供了新策略。
附图说明
图1为双靶向载药微泡的光学显微镜图。
图2为双靶向载药微泡的粒径分布图。
图3为双靶向载药微泡在超声作用下转变为纳米粒子后，纳米粒子的透射电镜图和动态光散射的结果图。
图4为双靶向载药微泡在体外成像的效果图。
图5为双靶向载药微泡在不同温度下随着时间化疗药物紫杉醇泄露的结果图。
图6为双靶向载药微泡在不同超声强度下化疗药物紫杉醇释放率的结果图。
图7为双靶向载药微泡联合超声促进胰腺癌细胞对化疗药物紫杉醇摄取的结果图。
图8为双靶向载药微泡联合超声促进化疗药物紫杉醇对胰腺癌细胞杀伤作用的结果图。
图9为双靶向载药微泡联合超声促进化疗药物紫杉醇在肿瘤部位积聚的结果图。
图10为双靶向载药微泡联合超声通过增加化疗药物紫杉醇载肿瘤部位的积聚抑制肿瘤生长曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
目前胰腺癌治疗仍以化疗为主，但由于胰腺癌具有大量基质以及血管密度低的特征导致了化疗药物紫杉醇难以递送到肿瘤内部，导致化疗疗效差，也是胰腺癌高复发率和高死亡率的重要原因。因此如何将化疗药物紫杉醇靶向递送到肿瘤内部，提高肿瘤局部化疗药物紫杉醇浓度进而改善化疗疗效的临床亟待解决的科学问题。
本发明提供的双靶向载药微泡，首先，超声的作用，一方面可转变成纳米粒子，另一方面微泡在超声作用下产生的空化效应可以破坏血管内皮细胞间的连接，因此通过上述两种效应可以促进化疗药物紫杉醇突破化疗药物紫杉醇递送到肿瘤部位的第一个屏障—血管。其次，在CLT1肽靶向肿瘤的细胞基质作用下，可以将化疗药物紫杉醇从细胞基质中转运到肿瘤细胞从而突破第二个屏障—细胞外基质。最后，在RGD肽靶向肿瘤细胞的作用下，将化疗药物紫杉醇从肿瘤细胞外转运到肿瘤细胞内从而突破第三个屏障——肿瘤细胞膜。通过这种按序靶向肿瘤的血管、基质以及肿瘤细胞并突破阻碍化疗药物紫杉醇递送到胰腺癌中的三重屏障，可以增加化疗药物紫杉醇在肿瘤部位的积聚量，达到改善化疗疗效的目的。
在本发明中，所述双靶向载药微泡的平均粒径为1.59微米。
本发明还提供了上述技术方案所述的双靶向载药微泡的制备方法，包括如下步骤：
(1)将二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状RGD肽、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状CLT1肽和紫杉醇分别溶解在氯仿溶液中，得到混合液A；
(2)将混合液A进行旋干后，在真空干燥箱中烘干过夜，得到薄膜B；
(3)将薄膜B溶解在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，加热到50℃，水化1小时，形成透明液C；
(4)将透明液C水浴超声5分钟，再进行1分钟的探头超声，将其均质化；
(5)探头超声完后，分别将丙二醇、丙三醇加入上述溶液中，形成混合液D；所述丙二醇、丙三醇和溶液的体积比为1:1:8；
(6)将混合液D转移到容积为3ml的西林瓶中，并向其充入六氟化硫气体，最后机械振荡40-50秒，以800转/分钟转速离心5分钟，水洗3次去除多余的化疗药物紫杉醇，获得双靶向载药微泡。
其中，在双靶向载药微泡的合成过程中，所述脂质单分子层中的二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状RGD肽和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状CLT1肽的摩尔比为85:5:5:5；所述脂质单分子层总质量与紫杉醇的质量比为5:1。
本发明还提供了上述技术方案所述的双靶向载药微泡或上述技术方案所述的制备方法得到的双靶向载药微泡在制备癌症的诊断试剂或治疗试剂中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种双靶向载药微泡及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.59微米双靶向微泡的制备：
步骤1、将二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状RGD肽、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状CLT1肽和紫杉醇分别溶解在氯仿溶液得到混合液A；
步骤2、将混合液A进行旋干后在真空干燥箱中烘干八个小时得到薄膜B；
步骤3、将薄膜B溶在pH＝7.4磷酸盐缓冲液中并加热到50℃进行水化，水化一个小时形成透明液C；
步骤4、将透明液C进行水浴超声5分钟后，再进行一分钟的探头超声将其均质化；
步骤5、探头超声完后，按体积比1:1:8分别将丙二醇、丙三醇加入上述溶液形成混合液D；
步骤6、将混合液D转移到容积为3ml的西林瓶中，并向其充入六氟化硫气体，最后机械振荡45秒，以800转/分钟转速离心5分钟，水洗3次去除多余的化疗药物紫杉醇，获得双靶向载药微泡。
如图1所示，为本实施例所得双靶向载药微泡的光学显微镜图。由图1可知，所得双靶向载药微泡大小分布均匀，呈圆球形。
实施例2
1.59微米双靶向微泡的制备：
步骤1、将二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状RGD肽、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状CLT1肽和紫杉醇分别溶解在氯仿溶液得到混合液A；
步骤2、将混合液A进行旋干后在真空干燥箱中烘干八个小时得到薄膜B；
步骤3、将薄膜B溶在pH＝7.4磷酸盐缓冲液中并加热到50℃进行水化，水化一个小时形成透明液C；
步骤4、将透明液C进行水浴超声5分钟后，再进行一分钟的探头超声将其均质化；
步骤5、探头超声完后，按体积比1：1:8分别将丙二醇、丙三醇加入上述溶液形成混合液D；
步骤6、将混合液D转移到容积为3ml的西林瓶中，并向其充入六氟化硫气体，最后机械振荡45秒，以800转/分钟转速离心5分钟，水洗3次去除多余的化疗药物紫杉醇，获得双靶向载药微泡。
如图2所示，为库尔特计数仪测试实施例2所得双靶向载药微泡修饰的粒径分布图。由图2可知，所得双靶向载药微泡的平均粒径为1.59±0.54微米，且粒径分布集中，粒径较小符合微泡进入血液循环的粒径要求(小于8微米)。
实施例3
双靶向载药微泡在超声作用后的表征
向实施例1所得的双靶向载药微泡进行超声爆破，爆破后的纳米粒子进行电镜和动态光散射测试。
图3为实施例3所得的双靶向载药微泡经超声爆破后的表征数据。其中(a)双靶向载药微泡经超声爆破后的的透射电镜图，(b)为采用动态光散射法测试所得实施例3的双靶向载药微泡经超声爆破后粒径分布图。由图3可知，双靶向载药微泡在经超声爆破后转变成纳米粒子，形貌呈类圆球形，平均粒径约为100纳米，且粒径分布均匀，微泡经超声爆破后转变为纳米粒子的粒径符合纳米化疗药物紫杉醇用于肿瘤被动聚集的粒径，有利于通过肿瘤组织的渗透与滞留效应(EPR)富集在肿瘤组织，从而突破肿瘤的第一道屏障—血管。
实施例4
双靶向载药微泡在体外成像的效果图
为了观察实施例1所得的双靶向载药微泡在体外成像的效果，采用临床用的超声成像系统对不同浓度的微泡进行成像(105个/毫升-108个/毫升)，并以生理盐水为对照组，观察不同浓度的双靶向载药微泡的成像效果以及成像维持时间，其中超声成像系统采用的超声参数为1兆赫兹，0.05机械指数。具体操作为：将不同浓度的双靶向载药微泡注射进模拟人体血管的橡胶管中，将橡胶管置于脱气处理的去离子水中，用上述的超声成像系统进行成像。
图4为本实施例所得的双靶向载药微泡的体外成像能力的结果。其中(a)PBS组没有超声增强信号，而双靶向载药微泡的超声增强信号随着微泡的浓度增加而增强，当微泡浓度达到107个/毫升时，超声增强信号达到饱和，表明合成的双靶向载药微泡具有良好的增强成像能力。其中(b)对浓度为107个/毫升的微泡进行成像时间的检测发现，成像时间可以维持20分钟，并且在超声爆破下，超声信号减弱表明微泡在超声的作用下转变为纳米粒子。以上结果表明，双靶向载药微泡具有良好的稳定性和超声响应性，可以用于超声引导下的治疗。
实施例5
化疗药物紫杉醇泄露测试
为了考察实例1所得的双靶向载药微泡在不同温度下随着时间化疗药物紫杉醇泄露的情况。具体的操作如下：将合成的双靶向载药微泡分别与PBS共孵育在4摄氏度或者37摄氏度的条件下，在孵育后的不同的时间点取出样品进行离心，取下层澄清的液体并用高效液相对泄露的化疗药物紫杉醇进行定量检测。
结果如图5所示，在4摄氏度的条件下，化疗药物紫杉醇在孵育4小时后的泄露率只有4.24±0.06％，而孵育24小时后的泄露率也只到7.58±0.15％；而在37摄氏度的条件下，化疗药物紫杉醇在孵育4小时后的泄露率达到了18.84±0.13％，在孵育24小时后化疗药物紫杉醇泄露率到了70.42±1.66％。上述结果表明，双靶向载药微泡储存在4摄氏度条件下，化疗药物紫杉醇泄露较慢，具有良好的稳定性。
实施例6
化疗药物紫杉醇释放测试
为了考察实施例1所得的双靶向载药微泡在不同超声强度下化疗药物紫杉醇释放率。实验中用未进行超声作为对照，具体包括以下4组：不进行超声组，超声强度为2W/cm2组，超声强度为2.5W/cm2组,超声强度为3W/cm2组。实验所用的超声参数为为1兆赫兹，50％占空比，超声持续时间1分钟。具体的操作如下：取300微升双靶向载药微泡置于12孔板中，按照不同分组进行相应的处理后，将样品进行离心取下层澄清的液体进行高效液相检测释放的化疗药物紫杉醇量。
结果如图6所示，没有超声组，化疗药物紫杉醇释放率只有0.39±0.24％，而加了超声组的化疗药物紫杉醇释放率随着超声强度的增加而增强，超声强度为2W/cm2组，2.5W/cm2组，3W/cm2组的化疗药物紫杉醇释放率分别是63.04±0.12％,77.10±3.21％和84.05±2.32％。以上结果表明，双靶向载药微泡可在超声爆破作用下快速释放化疗药物紫杉醇具有良好的超声响应性。
实施例7
细胞摄取测试
取处于对数生长期的PANC-1细胞接种于12孔板中，每个孔板细胞密度为1×105个，置于37摄氏度、含5％二氧化碳浓度的条件下培养过夜。为了将细胞摄取可视化，将与化疗药物紫杉醇性质类似的荧光染料Cy5模拟成化疗药物紫杉醇包载在微泡中。细胞分为5组：载Cy5微泡联合超声组、RGD单靶载Cy5微泡联合超声组、CLT1单靶载Cy5微泡联合超声Cy5微泡组，RGD/CLT1双靶载Cy5微泡联合超声组和RGD/CLT1双靶载Cy5微泡组。将培养基按照分组进行替换，其中Cy5的浓度为0.64微克/毫升，超声参数为1兆赫兹，2.5瓦/平方厘米，10％占空比，1分钟。在37摄氏度、含5％二氧化碳浓度的条件下培养4小时后，用多聚甲醛固定30分钟后，用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)进行染色5分钟，最后用激光共聚焦荧光显微镜进行拍摄，或者将培养4小时的样品用胰酶进行消化，然后进行流式细胞术分析。
图7为实施例1所得的双靶向载药微泡联合超声促进胰腺癌细胞对化疗药物紫杉醇摄取的激光共聚焦荧光显微镜和流式细胞术结果图。其中(a)激光共聚焦荧光显微镜结果显示RGD/CLT1双靶载Cy5微泡联合超声组的荧光强度高于RGD/CLT1双靶载Cy5微泡组，表明RGD/CLT1双靶载Cy5微泡联合超声可以产生空化效应提高细胞膜的通透性从而增加细胞对化疗药物紫杉醇的摄取。除此之外，RGD/CLT1双靶载Cy5微泡联合超声组和RGD单靶载Cy5微泡联合超声组的荧光强度强于载Cy5微泡联合超声组和CLT1单靶载Cy5微泡联合超声组，表明RGD可以靶向肿瘤细胞从而促进细胞对化疗药物紫杉醇的摄取。其中(b)流式细胞术的结果与激光共聚焦荧光显微镜的结果一致，而且通过流式细胞术的定量分析表明RGD/CLT1双靶载Cy5微泡联合超声组的荧光强度分别是RGD/CLT1双靶载Cy5微泡组、载Cy5微泡联合超声组和CLT1单靶载Cy5微泡联合超声组的3倍、1.8倍和1.8倍。因此RGD修饰的微泡联合超声可以显著的增加细胞摄取利用其空化效应以及主动靶向细胞效应。
实施例8
细胞毒性测试：
取处于对数生长期的PANC-1细胞接种于96孔板中，每孔细胞密度约为1×104个，置于37摄氏度、含5％二氧化碳的条件下培养过夜。将细胞分为8组：对照组、超声(US)组、双靶向未载药微泡联合超声组、双靶向载药微泡组、载药微泡联合超声组、RGD单靶载药微泡联合超声组、CLT1单靶载药微泡联合超声以及RGD/CLT1双靶载药微泡联合超声组。将培养基按照分组进行相应处理，其中化疗药物紫杉醇的浓度为0.5微克/毫升，微泡浓度为108个/毫升，超声的参数为：1兆赫兹，2.5瓦/平方厘米，10％占空比，1分钟。处理完成后，继续培养18小时。然后加入含有10％细胞计数试剂(CCK8)的新鲜培养基，在37摄氏度、含5％二氧化碳的条件下培养1小时后，用酶标仪以450纳米进行激发，并测得各孔的吸光度值(OD)。
结果如8所示。空白对照组和单纯超声组处理的细胞存活率仍然保持较高水平，说明单纯超声不会导致细胞死亡。虽然双靶向载药微泡联合超声组的细胞存活率有所下降，但其存活率仍维持在85％上证明其良好的安全性。然后双靶向载药微泡组的存活率由于化疗药物紫杉醇在37摄氏度条件下有一定的泄露所以细胞存活率下降到了75±2.5％。双靶向载药微泡组联合超声组细胞存活率下降到了24.45±2.38％，杀伤率分别是双靶向载药微泡组的3.3倍，表明双靶载药微泡联合超声产生的空化效应可以促进化疗药物紫杉醇摄取。而双靶向载药微泡组联合超声组的杀伤率与RGD单靶载药微泡联合超声组的一致，但是载药微泡联合超声组和CLT1单靶载药微泡联合超声组的1.7倍，表明修饰在微泡表面的RGD多肽可以靶向肿瘤细胞促进化疗药物紫杉醇的摄取，从而增强化疗药物紫杉醇的杀伤效果。
实施例9
生物分布测试
在18-20克雌性Balb/c裸鼠身上建立皮下PANC-1肿瘤模型，当肿瘤体积生长到约100立方毫米后，将荷瘤小鼠随机分为6组，每组3只，为了使药物在全身分布可视化，用与化疗药物紫杉醇性质类似的荧光染料Cy5.5模拟成药物包裹在微泡中：游离Cy5.5，载Cy5.5微泡联合超声组、RGD单靶载Cy5.5微泡联合超声组、CLT1单靶载Cy5.5微泡联合超声组，RGD/CLT1双靶载Cy5.5微泡联合超声组和RGD/CLT1双靶载Cy5.5微泡组。Cy5.5的浓度为16微克/毫升，超声参数为为:1兆赫兹，2.5瓦/平方厘米，10％占空比，3分钟。将不同处理组的药物经尾静脉注射进小鼠体内后，立马进行超声，并且全身荧光的分布用体内小动物荧光成像系统分别在注射后的12小时，24小时，36小时和48小时后进行检测。结果如图9所示，在注射后的12小时后，荧光信号呈现为全身分布，所有组中在肿瘤部位没有观测到特异性的富集，随着时间的延长，到24小时后结果显示荧光开始在肿瘤处有特异性聚集，并且36小时后肿瘤处的荧光信号最强，48小时开始减弱。注射36小时后各组结果显示，单靶载Cy5.5微泡联合超声组(RGD单靶载Cy5.5微泡联合超声组和CLT1单靶载Cy5.5微泡联合超声组)的荧光强于无靶向组(载Cy5.5微泡联合超声组)。而且RGD/CLT1双靶载Cy5.5微泡联合超声组的荧光信号强于单靶载Cy5.5微泡联合超声组和RGD/CLT1双靶载Cy5.5微泡组。除此之外，游离Cy5.5在肿瘤处的荧光强度是最弱的相比于其他组。以上结果表明，双靶向载药微泡联合超声可以通过双靶向效应以及空化效应促进化疗药物紫杉醇在肿瘤部位积聚。
实施例10
肿瘤抑制情况：
在18-20克雌性Balb/c裸鼠身上建立皮下PANC-1肿瘤模型，当肿瘤体积生长到约60立方毫米后，将荷瘤小鼠随机分成8组，每组3只：生理盐水、游离化疗药物紫杉醇、双靶向未载药微泡联合超声、双靶向载药微泡、载药微泡联合超声、RGD单靶载药微泡联合超声、CLT1单靶载药微泡联合超声和RGD/CLT1双靶载药微泡联合超声。在治疗过程中，通过尾静脉分别在第1、3、5天向对应的组注入生理盐水或含4毫克/千克的化疗药物紫杉醇，超声的参数为:1兆赫兹，2.5瓦/平方厘米，10％占空比，3分钟。在整个治疗过程中，每隔2天进行肿瘤体积测量和小鼠体重称量。结果如图10所示，注射RGD/CLT1双靶载药微泡联合超声组抑制肿瘤的效果最强，肿瘤体积只有53立方毫米。
游离化疗药物紫杉醇和双靶向载药微泡组抑制肿瘤效果强于双靶向未载药微泡联合超声组，表明双靶向未载药微泡联合超声组产生的空化效应对肿瘤的杀伤作用弱于化疗药物紫杉醇。除此之外，单靶载药微泡联合超声组(RGD单靶载药微泡联合超声和CLT1单靶载药微泡联合超声)抑制肿瘤生长的效果强于载药微泡联合超声组，表明RGD的靶向作用或者CLT1的靶向作用可以增加化疗药物紫杉醇在肿瘤部位的积聚从而提高化疗效果。而且RGD/CLT1双靶载药微泡联合超声组比单靶载药微泡联合超声组(RGD单靶载药微泡联合超声和CLT1单靶载药微泡联合超声)和RGD/CLT1双靶载药微泡组的抑制肿瘤效果都强，这表明双靶向载药微泡可以通过RGD/CLT1的双靶向效应以及微泡联合超声产生空化效应促进化疗药物紫杉醇在肿瘤部位的积聚，从而显著的提高化疗疗效。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.双靶向载药微泡在制备联合超声定向爆破技术用于治疗癌症的药物中的应用，所述癌症为胰腺癌；
所述双靶向载药微泡包括壳层和内核；所述壳层为双靶向配体修饰的脂质单分子层，所述脂质单分子层上载有化疗药物紫杉醇；所述脂质单分子层由二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状RGD肽和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状CLT1肽以摩尔比85:5:5:5自组装而成；所述脂质单分子层总质量与紫杉醇的质量比为5:1；所述内核的组分为惰性气体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述双靶向载药微泡的平均粒径为1.59微米。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，在超声波的作用下，所述双靶向载药微泡被破坏形成纳米粒子并释放出化疗药物紫杉醇，从而增加紫杉醇在肿瘤组织的积聚。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的双靶向载药微泡在表面修饰两种多肽的主动靶向的作用下，增加紫杉醇在肿瘤部位的积聚。
5.根据权利要求1-4任一项中的双靶向载药微泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状RGD肽、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环状CLT1肽和紫杉醇分别溶解在氯仿溶液中，得到混合液A；
(2)将混合液A进行旋干后，在真空干燥箱中烘干过夜，得到薄膜B；
(3)将薄膜B溶解在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，加热到50℃，水化1小时后，形成透明液C；
(4)将透明液C水浴超声5分钟，再进行1分钟的探头超声，将其均质化；
(5)探头超声后，分别将丙二醇、丙三醇加入上述溶液中，形成混合液D；所述丙二醇、丙三醇和溶液的体积比为1:1:8；
(6)将混合液D转移到容积为3ml的西林瓶中，并向其充入六氟化硫气体，最后机械振荡40-50秒，以800转/分钟转速离心5分钟，水洗3次去除多余的化疗药物紫杉醇，获得双靶向载药微泡。
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